(57)【要約】  新規の抗炎症剤として用いることのできる組成物を提供することを課題とする。  オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩を含む組成物を用いることで、口内炎、口腔粘膜炎、歯肉炎、肺炎等の炎症を改善及び／又は予防することができる。本発明の組成物は、好ましくはポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーをさらに含む。【選択図】図１８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩を含む、炎症の改善用及び／又は予防用の組成物。
【請求項２】
オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩が、オラネキシジングルコン酸塩であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーをさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
炎症が、口内炎、口腔粘膜炎、歯肉炎、及び肺炎から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
炎症ががんの治療による口腔粘膜炎であり、
０．０１〜１．５％（Ｗ／Ｖ）のオラネキシジングルコン酸塩と、
ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーと
を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ポロキサマーが、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５）、及びポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）から選択されることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ポロキサマーが、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）であることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
オラネキシジングルコン酸塩の濃度が、０．０５〜０．５％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
ポロキサマーの濃度が、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする請求項３〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
液剤又は含嗽剤であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
がんの治療が、化学療法、放射線治療、又は化学療法と放射線治療との同時併用療法であることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩を有効成分として含む抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オラネキシジンは、化学名１−（３，４−ジクロロベンジル）−５−オクチルビグアナイドという高い殺菌活性を有する化合物である。そのグルコン酸塩であるオラネキシジングルコン酸塩は、広い殺菌スペクトルを有し、殺菌効果が短時間で現れ、さらにその活性が長時間持続する。さらに、オラネキシジングルコン酸塩の水溶液は、安定性が高く、長期間保存でき、その上、皮膚に対する刺激性や毒性が低く、安全性の面でも優れている。加えて、オラネキシジングルコン酸塩の水溶液は、色、臭い及び味に問題がないため、製剤化しやすい（特許文献１）。そのため、オラネキシジングルコン酸塩は、手術部位（手術野）の皮膚の消毒に主に用いられている。【０００３】
しかしながら、オラネキシジンやその塩が抗炎症作用を示すことは、これまで知られていない。さらに、オラネキシジングルコン酸塩は粘膜に対して刺激性を有するため、オラネキシジングルコン酸塩の口腔粘膜等の粘膜への適用は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８９９５９公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、新規の抗炎症剤として用いることのできる組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、オラネキシジンやその塩が抗炎症作用を示すことを予想外に見いだした。さらに、オラネキシジングルコン酸塩と、ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーとを含む組成物を用いることで、オラネキシジングルコン酸塩の、口腔粘膜等の粘膜への適用が可能になることを見いだし、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩を含む、炎症の改善用及び／又は予防用の組成物。
（２）オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩が、オラネキシジングルコン酸塩であることを特徴とする上記（１）に記載の組成物。
（３）ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーをさらに含むことを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）炎症が、口内炎、口腔粘膜炎、歯肉炎、及び肺炎から選択されることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）炎症ががんの治療による口腔粘膜炎であり、
０．０１〜１．５％（Ｗ／Ｖ）のオラネキシジングルコン酸塩と、
ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーと
を含むことを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）ポロキサマーが、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５）、及びポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）から選択されることを特徴とする上記（３）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）ポロキサマーが、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）であることを特徴とする上記（６）に記載の組成物。
（８）オラネキシジングルコン酸塩の濃度が、０．０５〜０．５％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）ポロキサマーの濃度が、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする上記（３）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）液剤又は含嗽剤であることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
（１１）がんの治療が、化学療法、放射線治療、又は化学療法と放射線治療との同時併用療法であることを特徴とする上記（５）〜（１０）のいずれかに記載の組成物。【０００８】
また、本発明の実施の他の形態として、上記本発明の炎症の改善用及び／又は予防用の組成物を炎症の改善や予防（治療）を必要とする患者に投与することにより、炎症の改善や予防（治療）する方法や、上記本発明のがんの治療による口腔粘膜炎の改善用及び／又は予防用組成物を、がんの治療による口腔粘膜炎の改善や予防（治療）を必要とする患者に投与することにより、がんの治療による口腔粘膜炎の改善や予防（治療）する方法や、炎症の改善や予防（治療）に使用するためのオラネキシジン又はその薬理学上許容される塩を含む組成物や、がんの治療による口腔粘膜炎の改善や予防（治療）に使用するための、０．０１〜１．５％（Ｗ／Ｖ）のオラネキシジングルコン酸塩と、ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーとを含む組成物や、上記本発明の炎症の改善用及び／又は予防用組成物を調製するための、オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩の使用や、上記本発明のがんの治療による口腔粘膜炎の改善用及び／又は予防用組成物を調製するための、０．０１〜１．５％（Ｗ／Ｖ）のオラネキシジングルコン酸塩と、ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であるポロキサマーの使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、新規の炎症の改善用及び／又は予防用の組成物が提供される。本発明の組成物は、肺炎、口内炎、歯肉炎、肺炎等の幅広い炎症に適用可能である。さらに、本発明の炎症の改善用及び／又は予防用の組成物（抗炎症剤）は、がんの化学療法、放射線治療、又は化学療法と放射線治療の併用療法を受けている患者の口腔粘膜炎を改善及び／又は予防することができ、ひいては、患者のコミュニケーション機能の阻害、睡眠障害、疼痛、嚥下障害（食事摂取量の減少）などのＱＯＬの低下や、化学療法、放射線治療のＤｏｓｅ遵守妨害を防ぐことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１の、好気性培養による口腔内細菌数の測定結果を示す図である。縦軸の細菌数は対数値で表した。
【図２】実施例１の、レンサ球菌選択培地での培養による口腔内細菌数の測定結果を示す図である。縦軸の細菌数は対数値で表した。
【図３】実施例１の、嫌気性培養による口腔内細菌数の測定結果を示す図である。縦軸の細菌数は対数値で表した。
【図４】実施例１の、細菌カウンタによる口腔内細菌数の測定結果を示す図である。縦軸の細菌数は対数値で表した。
【図５】実施例２の、オラネジン（登録商標）消毒液（ＯＰＢ）と他剤との比較試験結果を示す図である。縦軸の細菌数は対数値で表した。
【図６】実施例３の、殺菌効力に及ぼすオラネキシジン濃度の影響を検討した結果を示す図である。縦軸の細菌数は対数値で表した。
【図７】実施例４の、各群の体重変化を示す図である。
【図８】実施例４の、肉眼的観察結果を示す表である。表中の数値は口内炎ｇｒａｄｅを示し、網掛けは白板様症状（角化亢進、肥厚等）を呈した群を示す。
【図９】実施例４の、最終日の各群の頬袋の写真である。
【図１０】実施例４の、病理組織学的検査結果を示す表である。
【図１１】実施例５の、肉眼的観察結果を示す表である。表中の数値は口内炎ｇｒａｄｅを示し、網掛けは白板様症状（角化亢進、肥厚等）を呈した群を示す。
【図１２】実施例５の、病理組織学的検査結果を示す表である。
【図１３】実施例６の、ハムスター口腔における生残菌数を示す図である。縦軸の細菌数は対数値で表した。
【図１４】実施例６の口内炎ｇｒａｄｅを示す図である。口内炎ｇｒａｄｅを縦軸に示す。
【図１５】実施例７の口内炎ｇｒａｄｅを示す図である。口内炎ｇｒａｄｅを縦軸に示す。
【図１６】実施例８の口内炎ｇｒａｄｅを示す図である。口内炎ｇｒａｄｅを縦軸に示す。
【図１７】実施例９の、病理学的検査結果を示す図である。
【図１８】実施例９の、ＨＥ染色標本の顕微鏡写真である。
【図１９】実施例１０の、血液学的検査及び生化学的検査の結果を示す図である。
【図２０】実施例１１の、オラネジン（登録商標）消毒液（ＯＰＢ）によるＳＥＡＰ発現の阻害率を示す図である。
【図２１】実施例１２の、オラネジン（登録商標）消毒液（ＯＰＢ）によるＮＯ産生阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の組成物は、オラネキシジン又はその薬理学上許容される塩を含む炎症の改善用及び／又は予防用の組成物である。オラネキシジンの薬理学上許容される塩としては、薬理学上公知のものを用いることができ、例えば、塩酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、グルセプテート、酒石酸塩等を例示することができるが、水への溶解性の観点からオラネキシジングルコン酸塩が好ましい。
【００１２】
本発明の組成物において、オラネキシジンは抗炎症作用を示すことのできる濃度で含まれていればよく、オラネキシジングルコン酸塩換算で０．００１〜２０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．００５〜１５％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．０１〜１０％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは０．１〜５％（Ｗ／Ｖ）を例示することができる。また、本発明の組成物を口腔粘膜等の粘膜に適用する場合、オラネキシジンの濃度は、オラネキシジングルコン酸塩換算で０．０１〜１．５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、０.０５〜０．５％（Ｗ／Ｖ）がより好ましく、０．１〜０．３％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。なお、本発明の組成物を口腔粘膜に適用する場合、オラネキシジングルコン酸塩の濃度が０．０１％（Ｗ／Ｖ）より低いと、口腔細菌の殺菌効力が十分に得られず、１．５％（Ｗ／Ｖ）を超えると、口腔粘膜への刺激が強くなりすぎるため望ましくない。
【００１３】
本発明の組成物は、適用部位への刺激を低減するため、１種又は２種以上のポロキサマーをさらに含んでもよい。ここでポロキサマーとしては、ポリオキシプロピレン鎖（ＰＯＰ）及び該ＰＯＰを挟む２個のポリオキシエチレン鎖（ＰＯＥ）からなるブロック共重合体であって、適用部位への刺激を低減するものであれば特に制限されないが、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５）、及びポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）から選択される１種又は２種以上のポロキサマーが好ましく、中でもポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）、ポリオキシエチレン（３）ポリオキシプロピレン（１７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−３１）、ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４）、ポリオキシエチレン（１２０）ポリオキシプロピレン（４０）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−８７）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）を例示することができる。
【００１４】
上記ポロキサマーの中でも、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５）、及びポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７）から選択される１種又は２種以上のポロキサマーが好ましく、中でもポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３）がより好ましい。
【００１５】
ポロキサマーの濃度としては、特に制限されるものではないが、０．１〜５．０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０．１〜４．０％（Ｗ／Ｖ）、より好ましくは０．１〜３．０％（Ｗ／Ｖ）、さらに好ましくは０．１〜２．０％（Ｗ／Ｖ）、最も好ましくは０．１〜１．５％（Ｗ／Ｖ）を挙げることができる。また、オラネキシジングルコン酸塩とポロキサマーの濃度比は、１：２〜１：２０が好ましく、１：５〜１：１０であることがより好ましい。本発明の組成物を口腔粘膜に適用する場合、オラネキシジングルコン酸塩濃度０．３％（Ｗ／Ｖ）以上の高濃度域では、オラネキシジングルコン酸塩による口腔粘膜への刺激がより強いため、ポロキサマー量をより多くした方が、オラネキシジングルコン酸塩による刺激（角化亢進）を抑えるうえで好ましい。
【００１６】
本明細書において、「炎症」とは、自己免疫疾患等の内的要因、又は、細菌・ウイルス感染、外傷、物理的刺激（熱、寒冷、放射線、電気等）、化学物質等の外的要因により、発赤、熱感、腫脹、疼痛という徴候が生じる生体反応を意味する。本発明における炎症としては、本発明の組成物を適用することのできる炎症であれば特に制限されないが、好ましくはＴｏｌｌ様受容体が関与する炎症、より好ましくは細菌感染による炎症を挙げることができる。また、炎症部位としては、脳、眼、気管、血管、肺、肝臓、心臓、膵臓、胃、腸、腸間膜、腎臓、皮膚、鼻炎膜、口腔粘膜、歯肉あるいは関節を例示することができ、具体的には、脳炎、気管支炎、血管炎、肺炎、肝炎、心筋炎、膵炎、腸炎、胃炎、腹膜炎、腎炎、口内炎、口腔粘膜炎、歯肉炎、関節炎、虚血後再潅流障害に起因する炎症、移植後免疫拒絶に起因する炎症、火傷、多発性臓器障害に起因する炎症、手術後に生じる炎症、及び動脈硬化症に起因する炎症を挙げることができ、中でも、口内炎、口腔粘膜炎、歯肉炎、及び肺炎を好適に例示することができる。本明細書において口腔粘膜炎とは、がんの治療によって口腔粘膜に生じた炎症をいい、口内炎とは、がんの治療によらないで口腔粘膜に生じた炎症をいう。また、本発明の組成物は、がんの治療による口腔粘膜炎の改善用及び／又は予防用という特定の用途を有する組成物であってもよいが、一態様において、本発明は、がんの治療による口腔粘膜炎の改善用及び／又は予防用という用途を有する組成物を除外する。
【００１７】
本発明の組成物は、炎症部位の皮膚や、口腔粘膜、歯肉、消化管、気管、肺等の粘膜に適用することができる。投与方法としては、注射（静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内等）、経口、経皮、吸入、口腔内への塗布、歯肉への塗布、含嗽などを挙げることができ、これらの投与方法に応じて適宜製剤化することができる。また、選択し得る剤形も特に限定されず、例えば注射剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、含嗽剤、リポ化剤、軟膏剤、ゲル剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤等から広く選択することができる。また、これらの製剤調製にあたり、慣用の賦形剤、安定化剤、結合剤、滑沢剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、その他着色剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
【００１８】
本発明の組成物を口腔内に適用する場合、口腔内に適用するのに適したいかなる剤形であってもよいが、好ましくは液剤、含嗽剤を挙げることができる。また、飴類、キャンディー類、グミ類、トローチ類、ガム類等の、口中で徐々に溶解又は崩壊する固形組成物であってもよい。さらに、必要に応じて、風香味を付与したり、着色したりする目的で用いられる種々の添加物を更に含有することができる。風香味付与を目的とする添加物としては、例えば合成香料、天然香料、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、スクラロース、アリテーム、ネオテーム、カンゾウ抽出物（グリチルリチン）、サッカリン、サッカリンナトリウム、ステビア抽出物、ステビア末等の甘味料を挙げることができる。着色を目的とする添加物としては、カラメル、天然着色料、合成着色料を挙げることができる。また、本発明の組成物は、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチンなど）、安定剤、防腐剤等の添加物を含有してもよい。これらの添加剤は、単独で使用しても、２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００１９】
本発明の組成物を液剤又は含嗽剤として投与する場合の１回あたりの投与量としては、炎症が生じた部位や重篤度によって任意に決定することができるが、１〜１００ｍＬ、好ましくは２〜５０ｍＬ、より好ましくは５〜４０ｍＬ、最も好ましくは１０〜３０ｍＬを挙げることができる。
【００２０】
本発明の組成物を投与する時期としては、炎症が生じた部位や重篤度、又は炎症の改善度によって任意に決定することができるが、食後又は起床後もしくは就寝前を挙げることができる。あるいは、２〜８時間間隔で、好ましくは４〜６時間間隔で投与することもできる。また、本発明の組成物は、手術前の患者、オーラルケア後の患者に投与することにより、炎症を予防することができる。
【００２１】
本発明の組成物の投与期間としては、炎症の改善度により任意に決定することができるが、１週間〜３か月、好ましくは１週間〜２か月、より好ましくは１週間〜１か月、最も好ましくは１〜２週間を挙げることができる。
【００２２】
本発明において、がんの治療としては、がんの化学療法、放射線治療、又は化学療法と放射線治療との同時併用療法を挙げることができる。がんの化学療法とは、抗がん剤によるがんの治療全般を指す。本発明で使用される抗がん剤としては、口腔粘膜炎を起こしやすいフルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（Ｓ−１）、テガフール・ウラジル（ＵＦＴ）等のフッ化ピリミジン系代謝拮抗剤、メトトレキサート等の葉酸代謝拮抗剤、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、アクチノマイシンＤ等の抗腫瘍性抗生物質、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、エトポシド等の植物アルカロイド、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等の白金製剤を挙げることができ、特に５−ＦＵ等のフッ化ピリミジン系代謝拮抗剤を好適に例示することができる。これらの抗がん剤は、単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００２３】
また、本発明において、放射線治療とは、悪性腫瘍部に放射線を照射してがん細胞の増殖を抑制することを目的とした治療であり、その治療に使用される放射線としては、Ｘ線、電子線などが挙げられる。また、化学療法と放射線治療との同時併用療法とは、がんの局所療法である放射線療法を抗がん剤と併用することにより、放射線の効果を強める治療法を指す。放射線治療の対象部位は特に制限されるものではないが、頭頸部、特に口腔内や咽頭部への放射線治療を例示することができる。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
１．カニクイザルを用いた口腔内殺菌効力試験
本試験では簡易細菌カウンタと培養法を併用して、試験物質（殺菌消毒剤として０．１％（ｗ／ｖ）オラネキシジングルコン酸塩及び０．４７％ポビドンヨード、陰性対照薬として生理食塩液）のカニクイザル口腔内細菌に対する殺菌効力を比較、検討した。【００２６】
１−１  試験物質
被験物質はオラネジン（登録商標）消毒液１．５％（以下「１．５％ＯＰＢ」などという、オラネキシジングルコン酸塩として１．５０８％（ｗ／ｖ）を含む液、株式会社大塚製薬工場製）を１５倍希釈し、オラネキシジングルコン酸塩濃度が０．１％（ｗ／ｖ）となるように調製した（０．１％  ＯＰＢ）。対照物質のイソジンガーグル液７％（以下「７％ＰＶＰ−Ｉ」などという、Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａ  ファルマ株式会社製）は１５倍希釈し（０．４７％ＰＶＰ−Ｉ）、生理食塩液（Ｓａｌｉｎｅ、株式会社大塚製薬工場製）はそのまま用いた。【００２７】
１−２  試験動物
使用時年齢２歳１１ヶ月〜３歳１１ヶ月齢のカニクイザル（雄、カンボジア産、株式会社イブバイオサイエンス製）を用いた。【００２８】
１−２−１  群構成
各動物の口腔内を試験部位とした。９頭の動物を使用し、０．１％  ＯＰＢ、０．４７％  ＰＶＰ−Ｉ及びＳａｌｉｎｅを塗布するため、１群当たりの試験部位は３箇所とした。試験物質塗布前、塗布１０分後、６時間後及び２４時間後の計４回細菌を採取した。【００２９】
１−２−２  動物番号及び試料番号
以下の表１のように動物番号及び試料番号を割り振った。尚、動物番号１〜３のベースライン細菌数を測定し、細菌数が多い順にｓａｌｉｎｅ、０．１％  ＯＰＢ、０．４７％  ＰＶＰ−Ｉによる試験に供した。同様に、動物番号４〜６は細菌数が多い順に０．１％  ＯＰＢ、０．４７％  ＰＶＰ−Ｉ、ｓａｌｉｎｅによる試験に供し、動物番号７〜９は細菌数が多い順に０．４７％  ＰＶＰ−Ｉ、ｓａｌｉｎｅ、０．１％  ＯＰＢによる試験に供した。【００３０】
【表１】
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【００３１】
１−３  試験方法【００３２】
１−３−１  麻酔
カニクイザルにケタラール（ケタミンとして５０ｍｇ／ｍＬ、第一三共プロファーマ株式会社製）とセラクタール２％注射液（キシラジンとして２．０ｇ／１００ｍＬ、バイエル薬品株式会社製）の２：１の混合液を体重１ｋｇ当たり０．５ｍＬを筋注し、全身麻酔した。【００３３】
１−３−２  塗布
〔１〕マウスピュア口腔ケアスポンジ（川本産業株式会社製）を２本入れたコンテナ（２５０ｍＬ、コーニング株式会社製）に試験物質１００ｍＬを注いだ。
〔２〕スポンジ内の空気を抜き十分に浸した。
〔３〕口腔内に約２分間塗布した。【００３４】
１−３−３  細菌採取１
〔１〕滅菌済み手袋で滅菌綿棒を用いて、サル口腔内から細菌を採取した（口腔内両側壁を２回ずつ前後にこすり取った）。
〔２〕５ｍＬサンプリング液（１０％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、０．０４％（ｗ／ｖ）リン酸二水素カリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．０１％（ｗ／ｖ）無水リン酸一水素ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）大豆レシチン、５％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、Ｈ７．８〜７．９）の中に綿棒を入れた。【００３５】
１−３−４  細菌採取２
〔１〕定圧検体採取器具（ＤＵ−ＡＥ０１ＮＴ−Ｈ、パナソニックヘルスケア社製）に測定消耗品（ＤＵ−ＡＣ０２ＮＰ−Ｈ、パナソニックヘルスケア社製）の綿棒を取り付けた。
〔２〕サルの舌上に綿棒を定圧で押し当て、約１ｃｍの間隔で３回前後にこすった。【００３６】
１−３−５  平板培養法による口腔内細菌数測定
新ＧＭＰ微生物試験法２）、食品衛生検査指針３）を参考にカンテン平板混釈法及びカンテン平板表面塗沫法を実施した。
〔１〕１−３−３で細菌を回収したサンプリング液を激しく攪拌し、これを回収菌液とした。
〔２〕回収菌液０．５ｍＬを１０倍希釈し、更に同様の操作により希釈を繰り返して１０倍希釈系列（５段階）を作製した。
〔３〕回収菌液及び段階希釈された希釈液を１ｍＬずつシャーレに分注した。これに約４７℃で保存した測定培地（ＴＳＡ＋）を約１５ｍＬ加えて混釈平板を作製した。また、回収菌液及び段階希釈された希釈液を１００μＬずつ血液寒天培地及びＭＳ寒天培地に分注し、コンラージ棒を用いて表面塗沫した。
〔４〕測定培地（ＴＳＡ＋）の固化後、混釈平板を倒置し、コロニー計数が可能となるまで培養した。また、表面塗沫平板は倒置し、コロニー計数が可能となるまで、嫌気性条件下で培養した。
〔５〕混釈平板及び表面塗沫平板で増殖したコロニーをコロニーカウンター（ＤＣ−３、アズワン株式会社）を用いて計数した。コロニー数が多すぎてコロニー間の区別ができない混釈平板は、ＴＮＴＣ（too numerous to count）とし計数しなかった。【００３７】
１−３−６  細菌カウンタによる口腔内細菌数測定
〔１〕細菌カウンタ（ＤＵ−ＡＡ０１、パナソニックヘルスケア社製）の蓋を開けた。
〔２〕測定消耗品のセンサーチップを細菌カウンタに取り付けた。
〔３〕測定消耗品のディスポーザブルカップを細菌カウンタにセットした。
〔４〕ディスポーザブルカップ中心に、細菌を採取した綿棒をセットした。
〔５〕細菌カウンタの蓋を閉じた。【００３８】
１−４  結果【００３９】
１−４−１  平板培養法による口腔内細菌数測定【００４０】
（１）好気性培養
結果を図１に示す。ベースライン口腔内細菌数は１．７３×１０５〜４．２０×１０６であった。Ｓａｌｉｎｅ塗布後の口腔内細菌数はほぼ一定であった。試験物質塗布１０分後の生菌数は、Ｓａｌｉｎｅ、０．１％ＯＰＢ及び０．４７％ＰＶＰ−Ｉでそれぞれ、６．４８×１０５ＣＦＵ、４．６５×１０３ＣＦＵ及び２．３５×１０４ＣＦＵ、塗布６時間後でそれぞれ、１．６６×１０６ＣＦＵ、１．４７×１０３ＣＦＵ及び４．９３×１０５ＣＦＵ、２４時間後でそれぞれ、４．６７×１０５ＣＦＵ、５．５８×１０４ＣＦＵ及び１．２２×１０６ＣＦＵであった。【００４１】
（２）レンサ球菌選択培地での培養
結果を図２に示す。ベースライン口腔内細菌数は２．８５×１０５〜７．６０×１０７であった。Ｓａｌｉｎｅ塗布後の口腔内細菌数はほぼ一定であった。試験物質塗布１０分後の生菌数は、Ｓａｌｉｎｅ、０．１％ＯＰＢ及び０．４７％ＰＶＰ−Ｉでそれぞれ、１．２６×１０６ＣＦＵ、５．９７×１０３ＣＦＵ及び７．３３×１０４ＣＦＵ、塗布６時間後でそれぞれ、５．５１×１０６ＣＦＵ、２．７９×１０４ＣＦＵ及び２．２０×１０６ＣＦＵ、２４時間後でそれぞれ、１．７１×１０６ＣＦＵ、４．３０×１０５ＣＦＵ及び７．８１×１０６ＣＦＵであった。【００４２】
（３）嫌気性培養
結果を図３に示す。ベースライン口腔内細菌数は２．４５×１０５〜１．６５×１０７であった。Ｓａｌｉｎｅ塗布後の口腔内細菌数はほぼ一定であった。試験物質塗布１０分後の生菌数は、Ｓａｌｉｎｅ、０．１％ＯＰＢ及び０．４７％ＰＶＰ−Ｉでそれぞれ、２．７０×１０６ＣＦＵ、１．３３×１０４ＣＦＵ及び７．３３×１０４ＣＦＵ、塗布６時間後でそれぞれ、３．２２×１０６ＣＦＵ、１．３８×１０４ＣＦＵ及び１．８０×１０６ＣＦＵ、２４時間後でそれぞれ、１．７１×１０６ＣＦＵ、３．０４×１０５ＣＦＵ及び１．４０×１０６ＣＦＵであった。【００４３】
１−４−２  細菌カウンタによる口腔内細菌数測定
結果を図４に示す。ベースライン口腔内細菌数は１．２９×１０６〜＞１．００×１０８であった。試験物質塗布１０分後の生菌数は、Ｓａｌｉｎｅ、０．１％ＯＰＢ及び０．４７％ＰＶＰ−Ｉでそれぞれ、２．８４×１０６ＣＦＵ、＜３．４９×１０５ＣＦＵ及び５．０９×１０５ＣＦＵ、塗布６時間後でそれぞれ、２．０４×１０７ＣＦＵ、５．５８×１０５ＣＦＵ及び８．９８×１０６ＣＦＵ、２４時間後でそれぞれ、４．１０×１０７ＣＦＵ、３．１４×１０７ＣＦＵ及び３．１４×１０７ＣＦＵであった。【００４４】
平板培養法による細菌数測定、細菌カウンタによる細菌数測定のいずれにおいても、同様な傾向の結果が得られた。つまり、０．１％ＯＰＢ群は塗布６時間後まで細菌数を低値に保つが、０．４７％ＰＶＰ−Ｉ群は塗布１０分後までしか効果を示さなかった。しかし、両群とも２４時間後には細菌数が回復していた。０．４７％ＰＶＰ−Ｉ群の持続性が認められなかったのは、ＰＶＰ−Ｉが口腔内の有機物により不活化の影響を受けやすいからだと考えられる。口腔内殺菌消毒効果は、０．１％ＯＰＢの方が持続性を持ち優れていると考えられた。
【実施例２】
【００４５】
２．ハムスターを用いた口腔内殺菌試験１
本試験では、正常ハムスター口腔内粘膜に対する含嗽剤（殺菌消毒剤）の殺菌効力を、他剤と比較検討することを目的とした。殺菌活性の持続性を検討するため、試験物質含嗽後〜２４時間まで時点（前置、直後、８時間後、２４時間後）をとり、細菌カウンタ及び培養法を用い細菌数を計測した。【００４６】
２−１  試験物質
被験物質と対照物質を合わせて試験物質とした。【００４７】
２−１−１  被験物質１
名称      ：０．１％ＯＰＢ−１
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩          ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４          ０．０７ｗ／ｖ％  
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３        １．０ｗ／ｖ％【００４８】
２−１−２  被験物質２
名称      ：０．１％  ＯＰＢ−２
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩          ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４          ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３        １．０ｗ／ｖ％
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）        １．０ｗ／ｖ％【００４９】
２−１−３  対照物質１
名称／略称：基剤／Ｂａｓｅ
組成      ：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４          ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３        １．０ｗ／ｖ％【００５０】
２−１−４  対照物質２
名称／略称：Ｐｅｒｉｄｅｘ（登録商標）／０．１２％ＣＨＧ
組成      ：クロルヘキシジングルコン酸塩        ０．１２ｗ／ｖ％【００５１】
２−１−５  対照物質３
名称／略称：イソジンガーグル液０．４７％／０．４７％ＰＶＰ−Ｉ
組成      ：イソジンガーグル液７％（７％ＰＶＰ−Ｉ、Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ株式会社製）の１５倍希釈液【００５２】
２−２  使用動物
入荷時６週齢のハムスター、Slc:Syrian、雄を用い、各群４匹で試験を行った。【００５３】
２−３  試験方法【００５４】
２−３−１  麻酔
ガス麻酔［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社製）、持続麻酔は適宜濃度を調整］を実施した。【００５５】
２−３−２  試験物質投与
麻酔下にて、ハムスターを仰臥位に固定し、片頬袋に試験物質を１ｍＬずつ注入した。３０秒後、試験物質を排出し、余分な頬袋内の試験物質を滅菌綿棒で吸い取った。【００５６】
２−３−３  細菌採取
試験物質投与前、０ｈｒ、８ｈｒ、２４ｈｒの計４時点に、麻酔下で両頬袋内から滅菌綿棒を用いて細菌を採取した。採取後の綿棒は５ｍＬ  ＳＣＤＬＰ培地に浸漬後撹拌し、細菌計数用サンプルとした。【００５７】
２−３−４  生残菌数の測定
新ＧＭＰ微生物試験法１）、食品衛生検査指針２）を参考にカンテン平板混釈法を実施した。
〔１〕細菌計数用サンプル５００μＬを採取し、４．５ｍＬの希釈液を用いて、１０１倍〜１０６倍の１０倍希釈系列を作製した。
〔２〕細菌計数用サンプル原液及び各希釈菌液１ｍＬずつ滅菌シャーレに分注した。
〔３〕上記のシャーレに、速やかに約４７℃に設定した恒温槽で保温した測定培地（ＴＳＡ＋）１５ｍＬを分注した。
〔４〕測定培地の固化後、混釈平板をインキュベーター内に倒置し、コロニーが計数できるまで３５℃で培養した（約２日間）。
〔５〕培養後、混釈平板で増殖したコロニーを目視にて計数した。コロニー数が多すぎてコロニー間の区別ができない混釈平板は、ＴＮＴＣ（too numerous to count）とし計数
しなかった。
〔６〕コロニー数に希釈倍率を乗じて、生残菌数を算出した。【００５８】
２−４  結果
結果を図５及び表２に示す。【００５９】
【表２】
2018193904.tif 000004
【００６０】
試験物質投与前の口腔内細菌数は、群間に差が無かった。試験物質投与直後の殺菌効力は、０．１％ＯＰＢ−１＝０．１％ＯＰＢ−２＞０．１２％ＣＨＧ＞０．４７％ＰＶＰ−Ｉ＞Ｂａｓｅであり、投与８時間後は、０．１％ＯＰＢ−１＝０．１％ＯＰＢ−２＝０．１２％ＣＨＧ＞０．４７％ＰＶＰ−Ｉ＝Ｂａｓｅであり、２４時間後は群間に差は無かった。以上の結果から、口腔内殺菌効力は０．１％ＯＰＢと０．１２％ＣＨＧは同等程度であり、０．４７％ＰＶＰ−Ｉは即効性が弱く持続活性は認められなかった。【００６１】
本試験で０．４７％ＰＶＰ−Ｉの殺菌活性が低かった理由として、口腔内のたんぱく等による不活化が大きく寄与していると考えられた。０．１２％ＣＨＧは０．１％ＯＰＢと同様に持続活性を有する口腔内殺菌消毒剤であると考えられた。
【実施例３】
【００６２】
３．ハムスターを用いた口腔内殺菌試験２
本試験では、正常ハムスター口腔内粘膜に対する含嗽剤（殺菌消毒剤）の殺菌効力に及ぼすオラネキシジン濃度の影響を検討することを目的とした。【００６３】
３−１  試験物質
被験物質と対照物質を合わせて試験物質とした。【００６４】
３−１−１  被験物質１
名称：０．１％ＯＰＢ−１
組成：オラネキシジングルコン酸塩．．．０．１０ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール．．．０．０７ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール．．．０．１０ｗ／ｖ％【００６５】
３−１−２  被験物質２
名称：０．１％ＯＰＢ−２
組成：オラネキシジングルコン酸塩．．．０．１０ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール．．．０．０７ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）．．．１．００ｗ／ｖ％【００６６】
３−１−３  被験物質３
名称：０．５％ＯＰＢ−３
組成：オラネキシジングルコン酸塩．．．０．５０ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）．．．０．３６ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）．．．５．００ｗ／ｖ％【００６７】
３−１−４  被験物質４
名称：１％ＯＰＢ−２
組成：オラネキシジングルコン酸塩．．．１．００ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール．．．０．７２ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール．．．１０．００ｗ／ｖ％【００６８】
３−１−５  対照物質
名称：基剤
組成：ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール．．．０．０７ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール．．．０．１０ｗ／ｖ％【００６９】
３−２  使用動物
入荷時６週齢のハムスター、Slc:Syrian、雄を用い、各群３匹で試験を行った。【００７０】
３−３  試験方法【００７１】
３−３−１  麻酔
ガス麻酔［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社製）、持続麻酔は適宜濃度を調整］を実施した。【００７２】
３−３−２  試験物質投与
麻酔下にて、ハムスターを仰臥位に固定し、片頬袋に試験物質を１ｍＬずつ注入した。１分後、試験物質を排出し、余分な頬袋内の試験物質を滅菌綿棒で吸い取った。【００７３】
３−３−３  細菌採取
試験物質投与前、０ｈｒ、１ｈｒ、３ｈｒ、６ｈｒの計５時点に、麻酔下で両頬袋内から滅菌綿棒を用いて細菌を採取した。採取後の綿棒は５ｍＬ  ＳＣＤＬＰ培地に浸漬後撹拌し、細菌計数用サンプルとした。【００７４】
３−３−４  生残菌数の測定
生残菌数の測定は、２−３−４と同様の方法で行った。【００７５】
３−４  結果
結果を図６に示す。結果より、０．１％ＯＰＢで持続的（６時間後）に細菌数を低値に抑えることができることがわかった。また、ＯＰＢ濃度が０．５ｗ／ｖ％以上で、持続活性がより優れていた。
【実施例４】
【００７６】
４．ハムスターを用いた口腔粘膜刺激性試験１
本試験では、０．１％オラネキシジングルコン酸塩の基剤組成を変えた検討製剤をハムスターの頬袋に１４日間反復投与し、刺激性の程度を比較検討した。【００７７】
４−１  被験物質【００７８】
４−１−１  被験物質１
名称      ：０．１％ＯＰＢ−１
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％【００７９】
４−１−２  被験物質２
名称      ：０．１％ＯＰＢ−２
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−３１      １．０ｗ／ｖ％【００８０】
４−１−３  被験物質３
名称      ：０．１％ＯＰＢ−３
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３    １．０ｗ／ｖ％【００８１】
４−１−４  被験物質４
名称      ：０．１％ＯＰＢ−４
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５      １．０ｗ／ｖ％【００８２】
４−１−５  被験物質５
名称      ：０．１％ＯＰＢ−５
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７    １．０ｗ／ｖ％【００８３】
４−１―６  被験物質６
名称      ：０．１％ＯＰＢ−６
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．１４ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８      １．０ｗ／ｖ％【００８４】
４−１−７  被験物質７
名称      ：０．１％ＯＰＢ−７
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ              ５．０ｗ／ｖ％【００８５】
４−２  使用動物
入荷時８週齢のハムスター、Slc:Syrian、雄を用い、各群３匹で試験を行った。【００８６】
４−３  試験方法【００８７】
４−３−１  被験物質適用方法【００８８】
（１）適用量
右頬袋に被験物質１ｍＬを適用した。【００８９】
（２）適用方法
〔１〕ガス麻酔により麻酔を導入した［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社製）］。
〔２〕維持麻酔下（濃度は適宜調整）にて動物を仰臥位に固定し、綿棒を用いて動物の頬袋を引き出し、片手で引き出した頬袋を軽くつまんだ。
〔３〕生理食塩液及び綿棒で頬袋粘膜に付着した飼料等の異物を取り除き、清潔にした後頬袋を元に戻した。
〔４〕１ｍＬシリンジ及び経口投与用ゾンデを用いて、右頬袋には被験物質１ｍＬを適用し、左頬袋には１ｍＬシリンジに取り付けた空の経口投与用ゾンデを挿入・抜去した。
〔５〕適用３０秒後、被験物質が気道内へ逆流しないように動物を腹臥位に反転させ排出した。口腔内の余分な被験物質は綿棒を用いて全て除去した。
〔６〕適用部位の頬粘膜の色調等を観察・記録し、動物の頚部にハムスター用カラーを装着した後、動物をケージに戻した。
〔７〕上記の操作を１日２回（朝・夕）、１４日間繰り返した。【００９０】
４−３−２  検査及び観察【００９１】
（１）一般状態の観察
各群の全例について、適用期間中は、試験物質の適用前及び適用終了時に一般状態観察を行った（Ｄａｙ１〜Ｄａｙ１４）。また、適用期間終了日の翌日にも観察を行った（Ｄａｙ１５）。【００９２】
（２）体重測定
各群の全例において、適用期間中は、試験物質の適用前に体重を測定した（Ｄａｙ１〜Ｄａｙ１４）。また、適用期間終了日の翌日にも測定を行った（Ｄａｙ１５）。ただし、体重計の故障のためＤａｙ１３、１４は体重を測定しなかった。【００９３】
（３）適用部位の肉眼的観察方法
各群の全例の頬袋について、適用期間中は、試験物質の適用前及び適用終了時に頬袋粘膜の状態を観察し、評点化を記録した（Ｄａｙ１〜Ｄａｙ１４）。また、適用期間終了日の翌日（２４±２時間）にも観察を行った（Ｄａｙ１５）。観察部位は各試験物質の接触部位頬粘膜とした。なお、肉眼的観察の評価法は以下の表３（ISO 10993-10, Annex B.3「Table B.2 Grading system for oral and penile reactions」）に記載されている観察基準及び評価点に従って、紅斑及び痂皮形成の程度に評価点（口内炎ｇｒａｄｅ）をつけた。また、その他に見られた所見についても記録した。得られた観察結果をもとに、各群について試験物質ごとに、各動物の粘膜における評価点を合計し、観察数及び動物数で除して平均値（小数第一位四捨五入）を求め、総合評価の参考資料とした。【００９４】
【表３】
2018193904.tif 000005
【００９５】
（４）病理学的検査
各動物について、適用期間終了日の翌日の肉眼的観察の終了後、イソフルラン麻酔下で放血致死させ、左右頬袋を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。常法に従いＨＥ染色の標本を作製し、病理学的検査を実施した。なお、肉眼的観察の評価法はISO 10993-10, Annex B.3 「Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction」に記載されている基準に従って、上皮、白血球浸潤、血管充血及び浮腫の各項目について所見又はグレードを記録した。また、その他に認められた所見についても記録した。【００９６】
（５）総合評価
観察期間中の一般状態及び体重推移を参考にし、頬粘膜の肉眼的観察結果及び病理学的観察結果から得られた各試験物質の反応程度をもとにして、各試験物質の口腔粘膜への影響を総合的に評価した。【００９７】
４−４  結果【００９８】
４−４−１  一般状態
いずれの動物にも異常は認められなかった。【００９９】
４−４−２  体重
結果を図７に示した。０．１％ＯＰＢ−５群は体重がほとんど変化しなかった。他の群は平均値が徐々に増加した。【０１００】
４−４−３  適用部位の肉眼的観察
結果を図８に示し、最終日の各群の頬袋を図９のＰｈｏｔｏ１〜８に示した。全ての製剤で紅斑等の刺激性がほとんど認められなかった。しかし、０．１％ＯＰＢ−１、−２、−６、−７及び−８では、白板様症状（角化亢進、肥厚）が認められた。一方、０．１％ＯＰＢ−３、−４及び−５では全く異常が認められなかった。【０１０１】
４−４−４  病理組織学的検査
結果を図１０に示した。ISO 10993-10、Annex B.3「Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction」に記載されている評価基準に従って、上皮（細胞変性、化生及びびらん）、白血球浸潤、血管充血及び浮腫のグレード付けにより、個体毎の炎症指数及び群毎の炎症指数の平均を算出した。また、評価基準以外の所見についても記録した。その結果、平均値は０．１％ＯＰＢ−３群では変化は認められなかった。０．１％ＯＰＢ−１群を含む他の群では、上皮の細胞変性及び極小〜中等度の白血球浸潤が認められ、炎症指数は１〜３の極小と評価された。これらの群では、評価基準以外の所見として、軽微な細胞間浮腫及び軽微から軽度の過角化が認められた。【０１０２】
以上の結果から、０．１％ＯＰＢ−３で使用した基剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３は、オラネキシジングルコン酸塩の口腔粘膜適用製剤の基剤として特に有用であることが示唆された。また、肉眼的観察で全く異常が見られなかった０．１％ＯＰＢ−４及び−５で使用したＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７も、オラネキシジングルコン酸塩の口腔粘膜適用製剤の基剤として使用しうることが示唆された。
【実施例５】
【０１０３】
５．ハムスターを用いた口腔粘膜刺激性試験２
実施例４の刺激性試験において、基剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３が、オラネキシジングルコン酸塩の口腔粘膜適用製剤の基剤として有用であることが示唆された。そこで、本試験では、刺激のない製剤を作製するための基剤としてＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３を採用し、引き続きＯＰＢ濃度及び基剤濃度の検討を行った。試験系は、ハムスター頬袋への反復投与とし、期間を２週間から４週間に延ばし実施した。【０１０４】
５−１  被験物質【０１０５】
５−１−１  被験物質１
名称      ：０．１％ＯＰＢ−１
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      ０．５０ｗ／ｖ％【０１０６】
５−１−２  被験物質２
名称      ：０．１％ＯＰＢ−２
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      １．０  ｗ／ｖ％【０１０７】
５−１−３  被験物質３
名称      ：０．１％ＯＰＢ−３
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      ０．５０ｗ／ｖ％
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）      １．０  ｗ／ｖ％【０１０８】
５−１−４  被験物質４
名称      ：０．１％ＯＰＢ−４
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      １．０  ｗ／ｖ％
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）      １．０  ｗ／ｖ％【０１０９】
５−１−５  被験物質５
名称      ：０．３％ＯＰＢ−１
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．３０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．２２ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      １．５０ｗ／ｖ％【０１１０】
５−１−６  被験物質６
名称      ：０．３％ＯＰＢ−２
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．３０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．２２ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      ３．０  ｗ／ｖ％【０１１１】
５−１−７  被験物質７
名称      ：０．３％ＯＰＢ−３
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．３０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．２２ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５        １．５０ｗ／ｖ％【０１１２】
５−１−８  被験物質８
名称      ：０．３％ＯＰＢ−４
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．３０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．２２ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−８５        ３．０  ｗ／ｖ％【０１１３】
５−１−９  被験物質９
名称      ：０．５％ＯＰＢ−１
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．５０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．３６ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      ２．５０ｗ／ｖ％【０１１４】
５−１−１０  被験物質１０
名称      ：０．５％ＯＰＢ−２
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．５０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．３６ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      ５．０  ｗ／ｖ％【０１１５】
５−１−１１  被験物質１１
名称      ：０．５％ＯＰＢ−３
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．５０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．３６ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      ２．５０ｗ／ｖ％
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）      １．０  ｗ／ｖ％【０１１６】
５−１−１２  被験物質１２
名称      ：０．５％ＯＰＢ−４
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩        ０．５０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４        ０．３６ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３      ５．０  ｗ／ｖ％
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）      １．０  ｗ／ｖ％【０１１７】
５−２  使用動物
入荷時８週齢のハムスター、Slc:Syrian、雄を用い、各群３匹で試験を行った。【０１１８】
５−３  試験方法【０１１９】
５−３−１  被験物質適用方法【０１２０】
（１）適用量
左頬袋に被験物質１ｍＬを適用した。【０１２１】
（２）適用方法
〔１〕ガス麻酔により麻酔を導入した［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社製）］。
〔２〕維持麻酔下（濃度は適宜調整）にて動物を仰臥位に固定し、綿棒を用いて動物の頬袋を引き出し、片手で引き出した頬袋を軽くつまんだ。
〔３〕生理食塩液及び綿棒で頬袋粘膜に付着した飼料等の異物を取り除き、清潔にした後頬袋を元に戻した。
〔４〕１ｍＬシリンジ及び経口投与用ゾンデを用いて、左頬袋には被験物質１ｍＬを適用し、右頬袋には１ｍＬシリンジに取り付けた空の経口投与用ゾンデを挿入・抜去した。
〔５〕適用３０秒後、被験物質が気道内へ逆流しないように動物を腹臥位に反転させ排出した。口腔内の余分な被験物質は綿棒を用いて全て除去した。
〔６〕適用部位の頬粘膜の色調等を観察・記録し、動物をケージに戻した。
〔７〕上記の操作を１日２回（朝・夕）、２８日間繰り返した。【０１２２】
５−３−２  検査及び観察【０１２３】
（１）一般状態の観察
各群の全例について、適用期間中は、試験物質の適用前及び適用終了時に一般状態観察を行った（Ｄａｙ１〜Ｄａｙ２８）。また、適用期間終了日の翌日にも観察を行った（Ｄａｙ２９）。【０１２４】
（２）体重測定
各群の全例において、適用期間中は、試験物質の適用前に体重を測定した（Ｄａｙ１〜Ｄａｙ２８）。また、適用期間終了日の翌日にも測定を行った（Ｄａｙ２９）。【０１２５】
（３）適用部位の肉眼的観察方法
各群の全例の頬袋について、適用期間中は、試験物質の適用前に頬袋粘膜の状態を観察し、評点化を記録した（Ｄａｙ１〜Ｄａｙ２８）。また、適用期間終了日の翌日（２４±２時間）にも観察を行った（Ｄａｙ２９）。観察部位は各試験物質の接触部位頬粘膜とした。なお、肉眼的観察の評価法は前記の表３（ISO 10993-10, Annex B.3「Table B.2 Grading system for oral and penile reactions」）に記載されている観察基準及び評価点に従って、紅斑及び痂皮形成の程度に評価点（口内炎ｇｒａｄｅ）をつけた。また、その他に見られた所見についても記録した。得られた観察結果をもとに、各群について試験物質ごとに、各動物の粘膜における評価点を合計し、観察数及び動物数で除して平均値（小数第一位四捨五入）を求め、総合評価の参考資料とした。【０１２６】
（４）病理学的検査
各動物について、適用期間終了日の翌日の肉眼的観察の終了後、イソフルラン麻酔下で放血致死させ、左右頬袋を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。常法に従いＨＥ染色の標本を作製し、病理学的検査を実施した。なお、肉眼的観察の評価法はISO 10993-10, Annex B.3 「Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction」に記載されている基準に従って、上皮、白血球浸潤、血管充血及び浮腫の各項目について所見又はグレードを記録した。また、その他に認められた所見についても記録した。【０１２７】
（５）総合評価
観察期間中の一般状態及び体重推移を参考にし、頬粘膜の肉眼的観察結果及び病理学的観察結果から得られた各試験物質の反応程度をもとにして、各試験物質の口腔粘膜への影響を総合的に評価した。【０１２８】
５−４  結果【０１２９】
５−４−１  一般状態
いずれの動物にも異常は認められなかった。【０１３０】
５−４−２  体重
すべての群で経時的に体重が増加し、群間による差はほとんど無かった。【０１３１】
５−４−３  適用部位の肉眼的観察
結果を図１１に示した。全ての製剤で紅斑等の刺激性が認められなかった（評価点０）。しかし、０．３％濃度以上のＯＰＢでは、白板様症状（角化亢進、肥厚）が認められた。一方、０．１％濃度のＯＰＢでは全く異常が認められなかった。【０１３２】
５−４−４  病理組織学的検査
結果を図１２に示した。ISO 10993-10、Annex B.3「Table B.3 Grading system for microscopic examination for oral, penile, rectal and vaginal tissue reaction」に記載されている評価基準に従って、上皮（細胞変性、化生及びびらん）、白血球浸潤、血管充血及び浮腫のグレード付けにより、個体毎の炎症指数及び群毎の炎症指数の平均を算出した。また、評価基準以外の所見についても記録した。その結果、０．１％ＯＰＢの各群では炎症性の反応は認められなかった。０．３％濃度以上のＯＰＢ各群では、上皮の変性及び白血球浸潤が認められ、炎症指数は１〜３でいずれも極小の反応であった。評価基準以外の所見として、０．１％ＯＰＢ群では一部の個体に軽微〜軽度の過角化が認められ、０．３％濃度以上のＯＰＢ各群では、軽微〜中程度の過角化及び軽微な棘細胞増生が認められた。その他コントロール群（右頬袋：Sham-ope側）で認められた表皮内微小膿瘍は自然発症性の病変と考えられた。
【実施例６】
【０１３３】
６．５−ＦＵ誘発ハムスター口内炎モデルにおける効力試験１
本試験では、５−ＦＵ誘発口内炎モデルにおけるＯＰＢ製剤の効力を試験した。具体的には、５−ＦＵ誘発口内炎モデルにおいて、０．１％ＯＰＢで口腔内を含嗽した際の口腔内細菌数の経時的な測定及び口内炎評価を行った。【０１３４】
６−１  試験物質
被験物質と対照物質を合わせて試験物質とした。【０１３５】
６−１−１  被験物質
名称：０．１％ＯＰＢ
組成：オラネキシジングルコン酸塩．．．０．１０ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール．．．０．１４ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール．．．０．１０ｗ／ｖ％【０１３６】
６−１−２  対照物質
名称：基剤
組成：ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール．．．０．０７ｗ／ｖ％
ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール．．．０．１０ｗ／ｖ％【０１３７】
６−２  使用動物
入荷時６週齢のハムスター、Slc:Syrian、雄を用い、各群５匹で試験を行った。【０１３８】
６−３  試験方法【０１３９】
６−３−１  麻酔
ガス麻酔［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社製）、持続麻酔は適宜濃度を調整］を実施した。【０１４０】
６−３−２  口内炎モデル作製
麻酔下にて、５−ＦＵを６０ｍｇ／ｋｇとなるようにハムスターの腹腔内に投与した。投与はｄａｙ０、ｄａｙ２の計２回とした。【０１４１】
Ｄａｙ４に麻酔下にて、ハムスターの頬袋を摘出した。頬袋に溜まっている餌・実験動物用床敷を取り除き、生理食塩液を含ませたカット綿で軽く拭き取った。精密ワイヤーブラシ（φ２．３４ｍｍ、サンフレックス株式会社製）で頬袋の表層（角質層）をブラッシングした。ブラッシング後、頬袋を口腔内に戻した。【０１４２】
６−３−３  試験物質投与
麻酔下にて、ハムスターを仰臥位に固定し、片頬袋に試験物質を１ｍＬずつ注入した。３０秒後、試験物質を排出し、余分な頬袋内の試験物質を滅菌綿棒で吸い取った。この含嗽操作による投与は１日２回とした。投与は口内炎の障害がピークに達した後は実施しなかった。【０１４３】
６−３−４  細菌採取
Ｄａｙ０、４、７、１０、１７において、１回目の試験物質投与前、０ｈｒ、６ｈｒ後の計４時点に、麻酔下で両頬袋内から滅菌綿棒を用いて細菌を採取した。但し、ｄａｙ１０、１７において試験物質適用しなかった場合は、１回のみの採取とした。採取後の綿棒は５ｍＬ  ＳＣＤＬＰ培地に浸漬後撹拌し、細菌計数用サンプルとした。【０１４４】
６−３−５  生残菌数の測定
新ＧＭＰ微生物試験法１）、食品衛生検査指針２）を参考にカンテン平板混釈法を実施した。
〔１〕細菌計数用サンプル５００μＬを採取し、４．５ｍＬの希釈液を用いて、１０１倍〜１０４倍の１０倍希釈系列を作製した。
〔２〕細菌計数用サンプル原液及び各希釈菌液１ｍＬずつ滅菌シャーレに分注した。
〔３〕上記のシャーレに、速やかに約４７℃に設定した恒温槽で保温した測定培地（ＴＳＡ＋）１５ｍＬを分注した。
〔４〕測定培地の固化後、混釈平板をインキュベーター内に倒置し、コロニーが計数できるまで３５℃で培養した（約２日間）。
〔５〕培養後、混釈平板で増殖したコロニーを目視にて計数した。コロニー数が多すぎてコロニー間の区別ができない混釈平板は、ＴＮＴＣ（too numerous to count）とし計数しなかった。【０１４５】
６−３−６  生残菌数の算出
６−３−５の項に基づいて採用したコロニー数に希釈倍数を乗じ生残菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を求めた。採用コロニー数は小数点以下第２位を四捨五入して表示した。下式により生残菌数（ＣＦＵ／ｓｗａｂ）を計算した。
Ａ：採用コロニー数
生残菌数（ＣＦＵ／ｓｗａｂ）＝Ａ×希釈倍数×サンプル液量（５ｍＬ）【０１４６】
さらに、生残菌数の対数値よりＬｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎを次式で求めた。Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎは小数点以下第３位を四捨五入して表示した。生残菌数１以下の対数値は０とした。
Ｂ：ベースラインの生菌数対数値
Ｃ：試験物質塗布後の生菌数対数値
Ｌｏｇ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ＝Ｂ−Ｃ【０１４７】
６−３−７  統計学的解析
各群の生菌数（ＣＦＵ／ｓｗａｂ）とその対数値の平均値及び標準偏差を求めた。生菌数は小数点以下第１位を四捨五入して整数で表示した。生菌数の対数値は小数点以下第３位を四捨五入して表示した。なお、生菌数が０の場合は生菌数の対数値は０とした。また、探索試験のため検定は行わなかった。【０１４８】
６−３−８  口内炎評価
以下の表４に基づき、口内炎ｇｒａｄｅを評価した。【０１４９】
【表４】
2018193904.tif 000006
【０１５０】
６−４  結果【０１５１】
６−４−１  細菌数
結果を表５及び図１３に示す。Ｄａｙ０、４、１０においては、０．１％ＯＰＢ群で投与後の細菌数減少が顕著であったが、口内炎の重症化が顕著であったｄａｙ７では、細菌数減少値が微量であった。【０１５２】
【表５】
2018193904.tif 000007
【０１５３】
６−４−２  口内炎ｇｒａｄｅ
結果を図１４に示した。０．１％ＯＰＢ群において、口内炎ｇｒａｄｅが顕著に低かった。【０１５４】
本試験において、０．１％ＯＰＢ群のｄａｙ７の細菌数減少値が低かった原因として、細菌採取方法若しくは浸出液過多による殺菌活性の低下が考えられた。本試験において、０．１％ＯＰＢを投与し口腔内を清潔に保つことが口内炎重症化を軽減させることが示唆された。
【実施例７】
【０１５５】
７．５−ＦＵ誘発ハムスター口内炎モデルにおける効力試験２
本試験では、５−ＦＵ誘発ハムスター口内炎モデルにおいて、０．１％オラネキシジングルコン酸塩と０．１％ＣＨＧの口内炎軽減効果を比較検討した。【０１５６】
７−１  試験物質
被験物質と対照物質を合わせて試験物質とした。【０１５７】
７−１−１  被験物質１
名称      ：０．１％ＯＰＢ
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％【０１５８】
７−１−２  被験物質２
名称      ：Ｐｅｒｉｄｅｘ（登録商標）／０．１％ＣＨＧ
製造元    ：3M ESPE Dental Products
組成      ：クロルヘキシジングルコン酸塩    ０．１２ｗ／ｖ％【０１５９】
７−１−３  対照物質
名称      ：基剤
組成      ：ポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレン（２０）グリコール．．．０．０７ｗ／ｖ％【０１６０】
７−２  使用細菌
本試験には、口腔内の常在菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcusaureus、ＡＴＣＣ番号：６５３８、Microbiologics, Inc.社製）を用いた。【０１６１】
７−３  使用動物
入荷時６週齢のハムスター、Slc:Syrian、雄を用い、各群５匹で試験を行った。【０１６２】
７−４  試験方法【０１６３】
７−４−１  試験菌液の調製
〔１〕保管されている細菌ペレットの入ったバイアルを取り出し室温に戻した。
〔２〕バイアルから細菌ペレットを１個取り出し、滅菌チューブに移した。
〔３〕０．５ｍＬの生理食塩液を加えた。
〔４〕滅菌綿棒で細菌ペレットを押しつぶし、菌懸濁液とした。
〔５〕ＴＳＡ平板に菌懸濁液を滅菌綿棒で直径約２ｃｍの円形エリアに接種し、白金耳を用いて接種エリアから画線接種した。
〔６〕画線接種されたＴＳＡ平板を倒置し、コロニーを形成するまで培養した。
〔７〕形成されたコロニーの中から単一のコロニーを選び、白金線で採取してカジトン培地に穿刺した。
〔８〕穿刺したカジトン培地を、菌の増殖が確認できるまで培養した。
〔９〕菌の増殖を確認後、冷蔵保管した（設定値２〜８℃）。
〔１０〕カジトン培地で冷蔵保管された試験菌の一部を白金線で採取し、ＭＨＢ培地５ｍＬを入れた１４ｍＬ滅菌チューブに移し、菌が増殖するまで静置培養した。
〔１１〕培養後、培養液１０μＬを滅菌チップで採取し、再度ＭＨＢ培地５ｍＬを入れた１４ｍＬ滅菌チューブに移し、菌が増殖するまで静置培養した。
〔１２〕培養後、ＭＨＢ培地で継代培養した試験菌培養液約５ｍＬを１５ｍＬコニカルチューブに回収し、生理食塩液を８ｍＬ添加した後、緩やかに攪拌した。
〔１３〕３０００ｒｐｍ、１０分間、２３℃で遠心（冷却遠心機５８００、ロータＲＳ−７２０、株式会社久保田製作所製）し、上清を廃棄した。
〔１４〕沈殿している試験菌に蒸留水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場製）１ｍＬを添加し、懸濁した。
〔１５〕菌懸濁液を１４ｍＬ滅菌チューブに移し、濁度をＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（品番７０９００、シスメックス・ビオメリュー株式会社製）を用いて判定した。ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ５となるように、生理食塩液を加え、菌液濃度を調節した。
〔１６〕ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ５とした菌懸濁液を、試験菌液とした。【０１６４】
７−４−２  麻酔
ガス麻酔［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社）、持続麻酔は適宜濃度を調整］を実施した。【０１６５】
７−４−３  口内炎モデル作製
麻酔下にて、５−ＦＵを６０ｍｇ／ｋｇとなるようにハムスターの腹腔内に投与した。投与はｄａｙ０、ｄａｙ２の計２回とした。Ｄａｙ４に麻酔下にて、ハムスターの頬袋を摘出した。頬袋に溜まっている餌・実験動物用床敷を取り除き、生理食塩液を含ませたカット綿で軽く拭き取った。精密ワイヤーブラシ（φ２．３４ｍｍ、サンフレックス株式会社製）で頬袋の表層（角質層）をブラッシングした。ブラッシング後、頬袋を口腔内に戻した。【０１６６】
７−４−４  試験物質投与
麻酔下にて、ハムスター頬袋に綿棒を用いて１日２回塗布（群分け日から４日間）した。ただし、４日目は午前のみの１回投与とした。【０１６７】
７−４−５  試験菌液塗布
麻酔下にて、７−４−１で調製した試験菌液を、午前の試験物質投与前にハムスター頬袋に白金耳を用いて１日１回塗布（群分け日から５日間）した。【０１６８】
７−４−６  口内炎評価
前記の表４に基づき、口内炎ｇｒａｄｅを評価した。【０１６９】
７−４−７  統計学的解析
各群のｇｒａｄｅの平均値及び標準偏差を求め、平均値のみでグラフを作成した。探索的な解析のため検定は行わなかった。【０１７０】
７−５  結果
結果を図１５に示した。０．１％ＯＰＢ群は基剤及び０．１％ＣＨＧ群と比較して口内炎重症化を軽減する傾向であった。基剤群と０．１％ＣＨＧ群はほとんど同じｇｒａｄｅであり差は無かった。口内炎の重症化軽減効果から、０．１％ＯＰＢの方が、０．１％ＣＨＧと比較して塗布した細菌若しくは頬袋粘膜の常在菌に対する殺菌効力が優れていることが考えられた。
【実施例８】
【０１７１】
８．５−ＦＵ・放射線照射併用により誘発されたハムスター口内炎モデルにおける効力試験
本試験では、５−ＦＵ・放射線照射併用により誘発されたハムスター口内炎モデルにおいて、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３を基剤とした０．１％ＯＰＢ製剤を含嗽法により適用し、口内炎軽減効果を比較検討した。【０１７２】
８−１  試験物質
被験物質と対照物質を合わせて試験物質とした。【０１７３】
８−１−１  被験物質
名称      ：ＯＰＢ
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３    １．０  ｗ／ｖ％【０１７４】
８−１−２  対照物質
名称／略称：基剤／Ｂａｓｅ
組成      ：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３    １．０  ｗ／ｖ％【０１７５】
８−２  使用動物
入荷時６週齢のハムスター、Slc:Syrian、雄を用い、各群８匹で試験を行った。【０１７６】
８−３  試験方法【０１７７】
８−３−１  麻酔【０１７８】
（１）  放射線照射時
ソムノペンチル（登録商標）（共立製薬株式会社製）を４０ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内に投与した。【０１７９】
（２）  口内炎評価及び試験物質投与時
ガス麻酔［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社製）、持続麻酔は適宜濃度を調整］を実施した。【０１８０】
８−３−２  口内炎モデル作製【０１８１】
（１）放射線照射
Ｄａｙ０にて、麻酔下でハムスターの頬袋を綿棒で摘出した。頬袋に溜まっている餌・実験動物用床敷を取り除き、生理食塩水を含ませたカット綿で軽く拭き取った。成型したアクリル板上に体、頬袋を共に固定し、照射部位の頬袋以外を鉛で覆い、［棚板距離：１２．５ｃｍ、管電圧：１６０  ｋＶ、管電流：６．２  ｍＡ］の条件で放射線を照射（４０Ｇｙ）した。但し、照射は１個体に付き片頬袋とし、各群左頬袋と右頬袋に４匹ずつとなるように振り分けた。【０１８２】
（２）５−ＦＵ投与
Ｄａｙ０、５、１０の計３回、５−ＦＵを６０ｍｇ／ｋｇとなるようにハムスターの腹腔内に投与した。【０１８３】
８−４−３  試験物質投与
麻酔下にて、ハムスターを仰臥位に固定し、片頬袋に試験物質を１ｍＬずつ注入した。３０秒後、試験物質を排出し、余分な頬袋内の試験物質を滅菌綿棒で吸い取った。この含嗽操作による投与は１日２回とした。投与は口内炎の障害がピークに達した後は実施しなかった。【０１８４】
８−４−４  口内炎評価
前記の表４に基づき、口内炎ｇｒａｄｅを評価した。【０１８５】
８−４−５  統計学的解析
各群の口内炎ｇｒａｄｅの平均値及び標準偏差を求めグラフを作成した。探索的な解析のため検定は行わなかった。【０１８６】
８−５  結果
結果を図１６に示した。口内炎ｇｒａｄｅの最大値はｂａｓｅ群が４．９、ＯＰＢ群が４．３であり、さらに立ち上がりもｂａｓｅ群の方が早かった。モデルの強度が強かった影響も有り、ｄａｙ４０においても潰瘍が治らない個体もいたため完全に全例治癒はしなかったが、ＯＰＢ群の方が明らかに治癒が早かった。
【実施例９】
【０１８７】
９．ラット歯肉炎モデルにおける効力試験
本試験では、ラット歯肉炎モデルにおいて、０．１％オラネキシジングルコン酸塩の歯肉炎に対する治療効果を検討した。【０１８８】
９−１  試験物質
被験物質と対照物質を合わせて試験物質とした。【０１８９】
９−１−１  被験物質
名称      ：ＯＰＢ
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３    １．０  ｗ／ｖ％【０１９０】
９−１−２  対照物質
名称／略称：基剤／Ｂａｓｅ
組成      ：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３    １．０  ｗ／ｖ％【０１９１】
９−２  使用細菌
本試験には、歯肉炎起因菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis、ＡＴＣＣ番号：３３２７７、Microbiologics, Inc.社製）を用いた。【０１９２】
９−３  使用動物
入荷時５週齢のラット、Jcl:Wistar、雄を用い、各群５匹で試験を行った。【０１９３】
９−４  試験方法【０１９４】
９−４−１  試験菌の調製（保存以外のすべての操作は嫌気チャンバー内で行った）
〔１〕保管されている細菌ペレットの入ったバイアルを取り出し嫌気チャンバーに入れた。
〔２〕バイアルから細菌ペレットを１個取り出し、滅菌チューブに移した。
〔３〕０．５ｍＬの調製ＴＳＢ培地を加えた。
〔４〕滅菌綿棒で細菌ペレットを押しつぶし、菌懸濁液とした。
〔５〕菌懸濁液をＣＤＣ嫌気性菌用ヒツジ血液寒天培地に接種した。
〔６〕嫌気条件下（３７℃）で３〜４日間培養した。
〔７〕形成されたコロニーの中から単一のコロニーを選び、再度同様にＣＤＣ嫌気性菌用ヒツジ血液寒天培地に接種した。
〔８〕菌の増殖を確認後、３ｍＬの調製ＴＳＢ培地を加えスプレッダーで懸濁し、グリセロールストックを作製した。
〔９〕上記ストックを冷凍保存した。
〔１０〕ストックからＣＤＣ嫌気性菌用ヒツジ血液寒天培地に接種し嫌気条件下で培養した。
〔１１〕菌の増殖を確認後、適量の調製ＴＳＢ培地で懸濁し、一部を取りだし濁度をＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄを用いてＭｃＦａｒｌａｎｄ５とした。希釈倍率を計算し、残存している懸濁液から１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬとなるように菌液濃度を調整した。
〔１２〕上記を試験菌液とした。【０１９５】
９−４−２  麻酔【０１９６】
（１）  カタン糸挿入、剖検時
ペントバルビタールナトリウム水溶液を腹腔内に４０ｍｇ／ｋｇ投与した。【０１９７】
（２）  細菌接種、試験物質投与
ガス麻酔［導入麻酔：空気１．０Ｌ／ｍｉｎに５％イソフルラン（マイラン製薬株式会社）、持続麻酔は適宜濃度を調整］を実施した。【０１９８】
９−４−３  カタン糸挿入
麻酔後、専用台に背位で固定し下額を持ち上げ、上顎右第一臼歯と第二臼歯の間にカタン糸を挿入した。【０１９９】
９−４−４  細菌接種
麻酔後、試験菌液０．２ｍＬをカタン糸挿入部位に接種した。この操作は２時間おきに実施した。【０２００】
９−４−５  試験物質投与
麻酔後、試験物質１ｍＬを口腔内に洗浄投与した。この操作は１日２回とした。【０２０１】
９−４−６  観察及び検査【０２０２】
（１）一般状態
カタン糸挿入日から剖検日まで１日１回実施した。【０２０３】
（２）体重測定
カタン糸挿入日から剖検時まで計２回実施した。【０２０４】
（３）剖検
麻酔下で、腹大動脈を切断し放血死させ、剖検を行った。【０２０５】
（４）病理組織学的検査
摘出した上顎を１０ｖ／ｖ％中性緩衝ホルマリン液で固定し、脱脂、脱灰後、ＨＥ染色標本を作製した。各標本につき炎症性変化について病理検査した。【０２０６】
９−４−７  統計学的解析
各群の体重の平均値及び標準偏差を算出する。検定は行わなかった。【０２０７】
９−５  結果
一般状態に異常は認められず、体重に群間の差は無かった。
病理学的検査結果を図１７に示した。また、ＨＥ染色標本の顕微鏡写真を図１８に示す。
ＯＰＢ投与群では、歯肉の重層扁平上皮における好中球の浸潤が８／１０例、細胞間水腫が１／１０例及び潰瘍が１／１０例で何れも軽微に認められた。歯肉の固有層における好中球の浸潤が８／１０例及び出血が１／１０例で何れも軽微に認められた。一方、ｂａｓｅ投与群では、歯肉の重層扁平上皮における好中球の浸潤が軽微８／１０例及び軽度２／１０例で認められた。細胞間水腫が２／１０例、過角化が２／１０例、表皮肥厚が２／１０例及び潰瘍が１／１０例で何れも軽微に認められた。歯肉の固有層における好中球の浸潤が軽微６／１０例及び軽度３／１０例で認められた。出血及び水腫が何れも１／１０例で軽微に認められた。【０２０８】
９−６  考察
歯肉の重層扁平上皮における好中球の浸潤、細胞間水腫、過角化、表皮肥厚及び固有層における好中球の浸潤及び水腫はいずれも炎症に関連した変化であり、処置に起因して生じたと考えられた。これらの何れの変化もｂａｓｅ投与群と比較してＯＰＢ投与群で頻度及び程度共に低い傾向にあったことから、ＯＰＢ投与による炎症軽減効果が認められた。
【実施例１０】
【０２０９】
１０．ラット肺炎モデルにおける効力試験
本試験では、ラットの誤嚥性肺炎モデルにおいて、０．１％オラネキシジングルコン酸塩の肺炎に対する治療効果を検討した。【０２１０】
１０−１  試験物質
被験物質と対照物質を合わせて試験物質とした。【０２１１】
１０−１−１  被験物質
名称      ：ＯＰＢ
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      ０．１０ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３    １．０  ｗ／ｖ％【０２１２】
１０−１−２  対照物質
名称／略称：基剤／Ｂａｓｅ
組成      ：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ−４４      ０．０７ｗ／ｖ％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ−１２３    １．０  ｗ／ｖ％【０２１３】
１０−２  使用動物
入荷時７週齢のラット、Crl:CD(SD)、雄を用いて試験を行った。【０２１４】
１０−３  群構成
気管内投与日の朝に体重を測定し、層別無作為化割付により以下の表６に示す４群（１〜４群）に割り付けた。割付から外れた６匹を層別無作為化割付により以下の表６に示す２群（５，６群）に割り付け、唾液採取用個体とした。【０２１５】
【表６】
2018193904.tif 000008
【０２１６】
１０−４  試験方法【０２１７】
１０−４−１  麻酔【０２１８】
（１）口腔内洗浄、唾液採取
ソムノペンチルを腹腔内に４０ｍｇ／ｋｇとなるように投与した。【０２１９】
（２）気管内投与時、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）採取時
ガス麻酔［導入麻酔：空気３．０Ｌ／ｍｉｎに３％イソフルラン（マイラン製薬株式会社）、持続麻酔は適宜濃度を調整］を実施した。【０２２０】
１０−４−２  口腔内洗浄
麻酔下で、試験物質を滅菌綿棒に含浸させ口腔内に十分量塗布した。【０２２１】
１０−４−３  唾液採取
麻酔下で、０．１％塩酸ピロカルピン（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。過剰分泌される唾液を回収した。回収した唾液は、中和剤入り栄養培地に加え静置した。その後、遠心（ｒ．ｔ．，３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ）し、沈渣を同量の生理食塩液で懸濁し、気管内投与液とした。【０２２２】
１０−４−４  気管内投与
唾液採取後、麻酔下で咽頭鏡を用い気管内に投与用チューブを留置し、唾液若しくは生理食塩液を０．１ｍＬ投与した。【０２２３】
１０−４−５  ＢＡＬＦ採取
気管内投与６，２４時間後、麻酔下で正中切開し、腹大動脈切開により放血し安楽死させた。その後、肺を露出させ、気管支起始部にカテーテルを挿入した。そのラインから０．１％ＢＳＡ、０．０５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有ＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳ）８ｍＬで３回洗浄し（各回２回注入回収を繰り返す）、洗浄液を採取した（ＢＡＬＦ）。ＢＡＬＦを遠心（２００ｇ，４℃，１０ｍｉｎ）し、上清は別の保存チューブに分取し、ＬＤＨ濃度測定、サイトカイン類測定（ＥＬＩＳＡ）用とした。沈渣はＰＢＳ  １ｍＬで懸濁し血液学的検査用とした。【０２２４】
１０−４−６  唾液採取用動物の取扱
気管内投与終了後、唾液採取用の動物は過麻酔下で放血させ安楽死させた。【０２２５】
１０−４−７  サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）濃度測定
キット添付のプロトコールに従い測定した。【０２２６】
１０−４−８  血液学的検査
懸濁した沈渣に対して、多項目自動血球計数装置を用いて血液学的解析を実施した。【０２２７】
１０−４−９  生化学的検査
採取したＢＡＬＦ上清に対して、自動分析装置７１８０（株式会社日立ハイテクノロジーズ）を用いＬＤＨ濃度を測定した。【０２２８】
１０−４−１０  統計学的解析
探索的な解析のため検定は行わなかった。【０２２９】
１０−５  結果
血液学的検査及び生化学的検査の結果を図１９に示した。
血液学的検査からは両群間に差が無かった。ＩＬ−６に関しては２４時間値においてＯＰＢ群で２．５倍ほど低い値となった。ＴＮＦ−αに関しては、両時点でＯＰＢ群の方が低い値となった。
したがって、ＯＰＢで口腔内を処理した方が、唾液の誤嚥による肺での炎症性反応は低いことが示唆された。
【実施例１１】
【０２３０】
１１．オラネキシジンのTLR Reporter Cell Lineを用いた抗炎症作用の検討
実施例６〜１０より、オラネキシジンには口内炎、歯肉炎、肺炎に対して抗炎症作用を有することが示された。炎症は、ＬＰＳやＬＴＡを認識する受容体であるToll-like receptor 4（ＴＬＲ−４）、Toll-like receptor 2（ＴＬＲ−２）を介した免疫応答と関連していることが明らかになっている（ChemMedChem. 2016 Jan 19;11(2):154-65、Biotechnol Adv. 2012 Jan-Feb;30(1):251-60、J Dent Res. 2016 Jul;95(7):725-33）。
オラネキシジンは、ＴＬＲ−４及びＴＬＲ−２に対するアンタゴニスト（様）作用によって炎症を抑えている可能性がある。そこで、本試験ではこのことを明らかにするため、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−２やレポーター遺伝子（ＳＥＡＰ）を安定発現したヒト由来細胞を用いたレポーターアッセイにより、オラネキシジンのＴＬＲ−４及びＴＬＲ−２に対するアンタゴニスト（様）作用を確認する。【０２３１】
１１−１  被験物質
名称      ：１．５％ＯＰＢ
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      １．５ｗ／ｖ％【０２３２】
１１−２  細胞
以下の表７に記載の細胞を用いた。【０２３３】
【表７】
2018193904.tif 000009
【０２３４】
１１−３  試験方法【０２３５】
１１−３−１  オラネキシジンのＴＬＲ−４に対するアンタゴニスト（様）作用の検討【０２３６】
−使用細胞：ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４発現細胞
−使用培地
前培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度１０％）＋ペニシリン（終濃度１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）
サンプル投与、投与後培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度５％）
−活性測定：ＳＥＡＰ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Novus Biologicals社製）
−タンパク量定量：ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（フナコシ株式会社製）【０２３７】
〔１〕細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ／１００μＬになるよう、１０％ＦＢＳ
ＤＭＥＭで調整し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（コラーゲン処理）に撒いて、４０ｈ培養（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔２〕１．５％ＯＰＢを、以下の表８に示す濃度になるよう５％ＦＢＳを用いて希釈する。【０２３８】
【表８】
2018193904.tif 000010
【０２３９】
〔３〕ＬＰＳを２０ｎｇ／ｍＬ（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）になるよう５％ＦＢＳを用いて調製する。
〔４〕培地を除去後、ＯＰＢ培地５０μＬ、ＬＰＳ培地５０μＬの順番で培地を加え、８ｈ培養（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔５〕培養後、上清を５０μＬ別の９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、ＳＥＡＰ  ａｓｓａｙを行う。
〔６〕上清の残りを除去した９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに、０．１％ＳＤＳ−Ｏ．１Ｎ  ＮａＯＨを５０μＬ加えて、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔで凍結（−２０℃）させる。融解後、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙを行う。
〔７〕レポーター遺伝子であるＳＥＡＰの発現量をタンパク質濃度で較正し、ＯＰＢ濃度毎の阻害率を算出した。【０２４０】
１１−３−２  オラネキシジンのＴＬＲ−２に対するアンタゴニスト（様）作用の検討【０２４１】
−使用細胞：ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ２発現細胞
−使用培地
前培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度１０％）＋ペニシリン（終濃度１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）
サンプル投与、投与後培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度１％）
−活性測定：ＳＥＡＰ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Novus Biologicals社製）
−タンパク量定量：ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（フナコシ株式会社製）【０２４２】
〔１〕細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ／１００μＬになるよう、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭで調整し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（コラーゲン処理）に撒いて、３６ｈ培養（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔２〕１．５％ＯＰＢを、前記表８に示す濃度になるよう１％ＦＢＳを用いて希釈する。
〔３〕ＬＴＡを２μｇ／ｍＬ（終濃度１μｇ／ｍＬ）になるよう１％ＦＢＳを用いて調製する。
〔４〕培地を除去後、ＯＰＢ培地５０μＬ、ＬＴＡ培地５０μＬの順番で培地を加え、１２ｈ培養（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔５〕培養後、上清を５０μＬ別の９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、ＳＥＡＰ  ａｓｓａｙを行う。
〔６〕上清の残りを除去した９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに、０．１％ＳＤＳ−０．１Ｎ  ＮａＯＨを５０μＬ加えて、ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔで凍結（−２０℃）させる。融解後、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙを行う。
〔７〕レポーター遺伝子であるＳＥＡＰの発現量をタンパク質濃度で較正し、ＯＰＢ濃度毎の阻害率を算出した。【０２４３】
１１−４  結果
結果を図２０に示す。
ＯＰＢ濃度が上昇するにしたがい、ＳＥＡＰの阻害率が高まっており（ＩＣ５０：約１０μｇ／ｍＬ）、ＯＰＢが、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２に対するアンタゴニスト（様）作用を示すことが明らかになった。この結果より、ＯＰＢが、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２を介した免疫応答を阻害することにより、抗炎症作用を有することが示唆された。
【実施例１２】
【０２４４】
１２．マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７を用いたオラネキシジンの抗炎症作用の検討
マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７は、ＬＰＳやＬＴＡで刺激すると、それらを認識する受容体を介して免疫応答を開始し、炎症性メディエーターであるＮＯの産生を行う。そこで、オラネキシジンがＬＰＳ刺激による炎症に対する抗炎症作用を有するかどうかを、ＲＡＷ２６４．７細胞からのＮＯ産生を指標として確認する。【０２４５】
１２−１  被験物質
名称      ：１．５％ＯＰＢ
組成      ：オラネキシジングルコン酸塩      １．５ｗ／ｖ％【０２４６】
１２−２  細胞
以下の表９に記載の細胞を用いた。【０２４７】
【表９】
2018193904.tif 000011
【０２４８】
１２−３  試験方法【０２４９】
１２−３−１  オラネキシジンのＬＰＳ刺激に対する抗炎症作用の検討【０２５０】
−使用細胞：ＲＡＷ２６４．７
−使用培地
前培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度１０％）＋ペニシリン（終濃度１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）
サンプル投与、投与後培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度５％）−活性測定：Ｎｉｔｒａｔｅ／Ｎｉｔｒｉｔｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Griess Reagents社製）
−タンパク量定量：細胞を染色しにくく、値が不安定になるため測定せず。【０２５１】
〔１〕細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ／１００μＬになるよう、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭで調整し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（無処理）に撒いて、２４ｈ培養（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔２〕１．５％ＯＰＢを、前記表８に示した濃度になるよう５％ＦＢＳを用いて希釈する。
〔３〕ＬＰＳを２００ｎｇ／ｍＬ（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）になるよう５％ＦＢＳを用いて調製する。
〔４〕培地を除去後、ＯＰＢ培地５０μＬ、ＬＰＳ培地５０μＬの順番で培地を加え、８ｈ培養（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔５〕培養後、上清を５０μＬ別の９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、Ｎｉｔｒａｔｅ／Ｎｉｔｒｉｔｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙを行う。【０２５２】
１２−３−２  オラネキシジンの大腸菌（ＬＰＳ産生菌）刺激に対する抗炎症作用の検討【０２５３】
−使用細胞：ＲＡＷ２６４．７
−使用培地
前培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度１０％）＋ペニシリン（終濃度１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（終濃度１００μｇ／ｍＬ）
サンプル投与、投与後培養：ＤＭＥＭ＋ＦＢＳ（終濃度１％）
−活性測定：Ｎｉｔｒａｔｅ／Ｎｉｔｒｉｔｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Griess Reagents社製）
−タンパク量定量：細胞を染色しにくく、値が不安定になるため測定せず。【０２５４】
〔１〕細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ／１００μＬになるよう、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭで調整し、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（無処理）に撒いて、２４ｈ培養（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔２〕１．５％ＯＰＢを、前記表８に示した濃度になるよう１％ＦＢＳを用いて調製する。
〔３〕培地を除去後、ＯＰＢ培地５０μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２で静置する。
〔４〕ＭＨＢで一晩培養した大腸菌を、ＭｃＦ  １になるよう調製し、５％ＤＭＥＭで３００倍希釈する。更に、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎを終濃度５０μｇ／ｍＬになるよう添加する。
〔５〕ＯＰＢ培地を添加したプレートに、更に調製した菌培地５０μＬを加え、密閉して２４ｈ培養する（３７℃、５％ＣＯ２）。
〔６〕培養後上清を５０μＬ別の９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、Ｎｉｔｒａｔｅ／Ｎｉｔｒｉｔｅ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙを行う。【０２５５】
１２−４  結果
結果を図２１に示す。
ＯＰＢ濃度が上昇するにしたがい、ＮＯ産生が減少しており、ＯＰＢがＮＯ産生阻害作用を示すことが明らかになった（ＩＣ５０：約１０μｇ／ｍＬ）。この結果より、ＯＰＢが抗炎症作用を有することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０２５６】
本発明により、広範な炎症性疾患に適用可能な、炎症の改善用及び／又は予防用の組成物が提供される。また、本発明の組成物をがんの治療による口腔粘膜炎の改善用及び／又は予防用の組成物として用いることで、化学療法、放射線治療を受けている患者のコミュニケーション機能の阻害、睡眠障害、疼痛、嚥下障害（食事摂取量の減少）などのＱＯＬの低下や、化学療法、放射線治療のＤｏｓｅ遵守妨害を防ぐことができるため、産業上の有用性は高い。
【図１】
2018193904.tif 000012
【図２】
2018193904.tif 000013
【図３】
2018193904.tif 000014
【図４】
2018193904.tif 000015
【図５】
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【図６】
2018193904.tif 000017
【図７】
2018193904.tif 000018
【図８】
2018193904.tif 000019
【図９Ａ】
2018193904.tif 000020
【図９Ｂ】
2018193904.tif 000021
【図９Ｃ】
2018193904.tif 000022
【図９Ｄ】
2018193904.tif 000023
【図１０】
2018193904.tif 000024
【図１１】
2018193904.tif 000025
【図１２】
2018193904.tif 000026
【図１３】
2018193904.tif 000027
【図１４】
2018193904.tif 000028
【図１５】
2018193904.tif 000029
【図１６】
2018193904.tif 000030
【図１７】
2018193904.tif 000031
【図１８】
2018193904.tif 000032
【図１９】
2018193904.tif 000033
【図２０】
2018193904.tif 000034
【図２１】
2018193904.tif 000035
【国際調査報告】
2018193904.tif 000036
2018193904.tif 000037
2018193904.tif 000038
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