(57)【要約】  脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる、人工脂肪組織を開示する。
2019093477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる、人工脂肪組織。
【請求項２】
前記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、請求項１に記載の人工脂肪組織。
【請求項３】
厚さが１ｍｍ〜１０ｍｍである、請求項１又は２に記載の人工脂肪組織。
【請求項４】
前記断片化された細胞外マトリックスの平均長が１００ｎｍ〜２００μｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の人工脂肪組織。
【請求項５】
第１の層及び第２の層を含み、第１の層が請求項１〜４のいずれか一項に記載の人工脂肪組織からなる、人工皮膚。
【請求項６】
前記第２の層が、線維芽細胞を含む、請求項５に記載の人工皮膚。
【請求項７】
さらに第３の層を含み、前記第３の層が、角化細胞を含む、請求項５又は６に記載の人工皮膚。
【請求項８】
厚さが２００μｍ〜１０ｍｍである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の人工皮膚。
【請求項９】
（１）水性媒体中において、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを接触させる工程、及び
（２）前記断片化された細胞外マトリックスが接触した前記細胞を培養する工程、を含む、人工脂肪組織の製造方法。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記断片化された細胞外マトリックスの平均長が１００ｎｍ〜２００μｍである、請求項９又は１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
（１）水性媒体中において、脂肪細胞を含む第１の細胞と、第１の断片化された細胞外マトリックスとを接触させること、及び
（２）前記第１の断片化された細胞外マトリックスが接触した前記第１の細胞を培養すること、を含む第１の層を形成する工程と、
（３）前記第１の層にさらに第２の細胞を接触させ、前記第２の細胞を培養させることを含む、第２の層を形成する工程と
を含む、人工皮膚の製造方法。
【請求項１３】
前記第１の断片化された細胞外マトリックスの平均長が１００ｎｍ〜２００μｍである、請求項１２に記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項１４】
工程（３）が、前記第１の層上で、水性媒体中において、前記第２の細胞と断片化された第２の細胞外マトリックスとを接触させ、前記第２の細胞を培養することを含む工程であり、前記第２の細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、請求項１２又は１３に記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項１５】
前記第２の細胞が、線維芽細胞を含む、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項１６】
前記第２の層にさらに第３の細胞を接触させ、前記第３の細胞を培養させることを含む、第３の層を形成する工程
をさらに含み、前記第３の細胞が、角化細胞を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の人工皮膚の製造方法。
【請求項１７】
断片化された細胞外マトリックスを含む、脂肪細胞の培養剤。
【請求項１８】
前記断片化された細胞外マトリックスが、平均長が１００ｎｍ〜２００μｍのコラーゲンである、請求項１７に記載の培養剤。
【請求項１９】
化合物の皮膚透過性を評価する方法であって、
請求項５〜８のいずれか一項に記載の人工皮膚を準備する工程と、
被験化合物を人工皮膚に接触させる工程と、
前記被験化合物を接触させた人工皮膚を用いて前記被験化合物の皮膚透過性を測定する工程と、
前記被験化合物の皮膚透過性を基準値と比較する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工脂肪組織及びその製造方法、人工皮膚の製造方法並びに脂肪細胞の培養剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成熟脂肪細胞のインビトロにおける長期培養維持は、特に化粧品／医薬品アッセイ又は造形手術の分野において重要な課題の一つである。平皿上での従来の二次元培養は培養時間が短く、脂肪細胞は主に１週間後に脱分化してしまう。既存の報告では、単眼成熟脂肪細胞は１週間以上維持することができない（非特許文献１）。また、ある程度以上成熟した脂肪細胞では、その細胞内の脂肪滴の影響で培養皿から浮遊してしまう傾向にあるため、培地の交換が困難であった。【０００３】
それらの課題を解決するために、三次元細胞培養技術は注目されている。ＷＡＱＡＲ  ＨＡＳＳＡＮらはＰＥＧをベースにした共重合体とヒアルロン酸で構成されるヒドロゲルに細胞をカプセル化し、培養を行っている（非特許文献２）。しかし、この方法は細胞を単離培養してしまうため、細胞同士のコンタクトが物理的に難しく、分化効率は悪い。【０００４】
ＤＡＱＵＩＮＡＧらは、磁気ナノ粒子を基盤とする三次元立体構造カルチャーシステムによりマウス３Ｔ３-Ｌ１前脂肪細胞及びＧＦＰ発現マウス内皮細胞を用いて血管新生と脂質生成を同時にシミュレートすることを実証している。脂肪細胞と内皮細胞との共培養は、免疫染色によりきれいに見えるが、１４日後の脂肪小胞は非常に小さく、成熟度が低い（非特許文献３）。【０００５】
一方、脂肪細胞を含む皮膚モデルに関して、ウシI型コラーゲンヒドロゲル（３ｍｇ/ｍＬ）を用いて線維芽細胞及び脂肪幹細胞の２層構造の皮膚モデルの報告があるが、皮膚モデル構築のための培養に５６日から６３日と非常に長期間必要である。また、厚みもヒトの皮膚構造よりも薄い（非特許文献４）。【０００６】
また、ヒト凍結血漿ヒドロゲル（１ｍｇ／ｍＬフィブリノーゲン）に再懸濁した線維芽細胞、あるいは間葉系幹細胞と脂肪細胞の３層構造による皮膚モデルの報告もあるが、モデル構築に３５日と長い培養プロセスが必要である上に、形態的にもヒトの皮膚構造を模倣できておらず、非常に薄い（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Toda S, Uchihashi K, Aoki S, et al., Organogenesis. 2009 5(2):50-56
【非特許文献２】WAQAR HASSAN ET AL., STEM CELL RESEARCH & THERAPY 2013, 21;4(2):32
【非特許文献３】DAQUINAG, ET AL., TISSUE ENGINEERING. PART C, METHODS, 2013 May;19(5):336-44.
【非特許文献４】TROTTIER ET AL., STEM CELLS, 2008 Oct;26 (10): 2713-23
【非特許文献５】MONFORT ET AL., J Tissue Eng Regen Med., 2013 Jun;7(6):479-90
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一実施態様は、長期間維持が可能な人工脂肪組織を提供すること及び短時間で当該人工脂肪組織を製造可能な製造方法を提供することを目的とする。本発明の一実施態様は、さらに、長期間維持が可能な人工脂肪組織を含む人工皮膚を提供すること及び短時間で当該人工皮膚を製造可能な製造方法を提供することを目的とする。本発明の一実施態様は、さらに、脂肪細胞の培養剤を提供すること及び上記人工皮膚を用いて化合物の皮膚透過性を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、浮遊細胞である脂肪細胞を、断片化された細胞外マトリックスとともに培養して三次元組織体を形成することにより、短時間で脂肪細胞が分化し、且つ形成された三次元組織体からなる人工脂肪組織の長期間維持が可能であることを見出した。さらに、当該人工脂肪組織を用いることにより、ヒトの皮膚の厚みに近い厚さの人工皮膚を製造することが可能であることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は、例えば以下の［１］〜［２９］を提供する。
［１］
脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる、人工脂肪組織。
［２］
上記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、［１］に記載の人工脂肪組織。
［３］
上記細胞外マトリックスの含有率が、上記人工脂肪組織を基準として１０重量％〜３０重量％である、［１］又は［２］に記載の人工脂肪組織。
［４］
厚さが１ｍｍ〜１０ｍｍである、［１］〜［３］のいずれかに記載の人工脂肪組織。
［５］
培養中の収縮率が２０％以下である、［１］〜［４］のいずれかに記載の人工脂肪組織。
［６］
上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が１００ｎｍ〜２００μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の人工脂肪組織。
［７］
上記脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値が、２０μｍ〜１８０μｍである、［１］〜［６］のいずれかに記載の人工脂肪組織。
［８］
第１の層及び第２の層を含み、第１の層が［１］〜［７］のいずれかに記載の人工脂肪組織からなる、人工皮膚。
［９］
上記第２の層が、線維芽細胞を含む、［８］に記載の人工皮膚。
［１０］
さらに第３の層を含む、［８］又は［９］に記載の人工皮膚。
［１１］
上記第３の層が、角化細胞を含む、［１０］に記載の人工皮膚。
［１２］
厚さが０．２ｍｍ〜１０ｍｍである、［８］〜［１１］のいずれかに記載の人工皮膚。
［１３］
（１）水性媒体中において、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを接触させる工程、及び
（２）上記断片化された細胞外マトリックスが接触した上記細胞を培養する工程、を含む、人工脂肪組織の製造方法。
［１４］
工程（２）における培養時間が１０日〜３０日である、［１３］に記載の製造方法。
［１５］
工程（１）及び工程（２）の間に、水性媒体中における上記断片化された細胞外マトリックスと、上記細胞とを共に沈降させる工程をさらに含む、［１３］又は［１４］に記載の製造方法。
［１６］
上記細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法。
［１７］
上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が１００ｎｍ〜２００μｍである、［１３］〜［１６］のいずれかに記載の製造方法。
［１８］
（１）水性媒体中において、脂肪細胞を含む第１の細胞と、第１の断片化された細胞外マトリックスとを接触させること、及び
（２）上記第１の断片化された細胞外マトリックスが接触した上記第１の細胞を培養すること、を含む第１の層を形成する工程と、
（３）上記第１の層にさらに第２の細胞を接触させ、上記第２の細胞を培養させることを含む、第２の層を形成する工程と
を含む、人工皮膚の製造方法。
［１９］
上記第１の断片化された細胞外マトリックスの平均長が１００ｎｍ〜２００μｍである、［１８］に記載の人工皮膚の製造方法。
［２０］
工程（２）における培養時間が１０日〜６０日である、［１８］又は［１９］に記載の製造方法。
［２１］
工程（３）が、上記第１の層上で、水性媒体中において、上記第２の細胞と断片化された第２の細胞外マトリックスとを接触させ、上記第２の細胞を培養することを含む工程である、［１８］〜［２０］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［２２］
上記第２の細胞外マトリックスがコラーゲンを含む、［２１］に記載の人工皮膚の製造方法。
［２３］
上記第２の細胞が、線維芽細胞を含む、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［２４］
上記第２の層にさらに第３の細胞を接触させ、上記第３の細胞を培養させることを含む、第３の層を形成する工程
をさらに含む、［１８］〜［２３］のいずれかに記載の人工皮膚の製造方法。
［２５］
上記第３の細胞が、角化細胞を含む、［２４］に記載の人工皮膚の製造方法。
［２６］
断片化された細胞外マトリックスを含む、脂肪細胞の培養剤。
［２７］
上記断片化された細胞外マトリックスが、平均長が１００ｎｍ〜２００μｍのコラーゲンである、［２６］に記載の培養剤。
［２８］
分化促進剤である、［２６］又は［２７］に記載の培養剤。
［２９］
化合物の皮膚透過性を評価する方法であって、
［８］〜［１２］のいずれかに記載の人工皮膚を準備する工程と、
被験化合物を人工皮膚に接触させる工程と、
上記被験化合物を接触させた人工皮膚を用いて上記被験化合物の皮膚透過性を測定する工程と、
上記被験化合物の皮膚透過性を基準値と比較する工程と
を含む、方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、長期間維持が可能な人工脂肪組織を提供すること及び短時間で当該人工脂肪組織を製造可能な製造方法を提供することが可能になる。また、本発明によれば、長期間維持が可能な人工脂肪組織を含む人工皮膚を提供すること及び短時間で当該人工皮膚を製造可能な製造方法を提供することが可能になる。また、本発明によれば、脂肪細胞の培養剤を提供すること及び上記人工皮膚を用いて化合物の皮膚透過性を評価する方法を提供することが可能になる。【００１２】
さらに、本発明によれば、ヒトの皮膚の厚みに近い厚さの人工皮膚及びその製造方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】断片化コラーゲン、及び成熟脂肪細胞又は脂肪幹細胞を含む三次元組織体からなる人工脂肪組織の製造工程を示す模式図である。
【図２】培養１４日目の実施例１の人工脂肪組織を評価した結果を示す写真である。Ａは、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の結果を示す。矢印は断片化コラーゲンが存在している箇所の一例を示す。点線は成熟脂肪細胞の一例を示す。Ｂは、ナイルレッドの脂質染色の結果を示す。白色の部分は核を示す。Ｃは、ライブ／デッドキットを用いた結果を示す。グレーが生存した細胞、白色が死亡した細胞を示す。
【図３】実施例１の人工脂肪組織及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の抗ペリリピン抗体による免疫染色の結果を示す写真である。白色の部分は核を示す。写真中、３Ｄは実施例１の人工脂肪組織、２Ｄは従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の結果を示す。
【図４】培養７日目及び１４日目における、実施例１の人工脂肪組織及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪小胞の大きさを比較した結果を示すグラフである（＊ｐ＜０．００１）。グラフ中、３Ｄは実施例１の人工脂肪組織、２Ｄは従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の結果を示す。グラフ中、３Ｄは実施例１の人工脂肪組織、２Ｄは従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の結果を示す。
【図５】分化１７日目の実施例２の人工脂肪組織をＨＥ染色した結果を示す写真である。上の写真は下の写真の一部を拡大した写真であり、点線は成熟脂肪細胞の一例、矢印は断片化コラーゲンが存在している箇所の一例を示す。
【図６】分化３７日目及び７２日目における、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織を電子顕微鏡により観察した写真である。上の写真は分化３７日目の人工脂肪組織、下の写真は分化７２日目の人工脂肪組織を示す。矢印は成熟脂肪細胞の一例を示す。
【図７】実施例２の人工脂肪組織及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の抗ペリリピン抗体による免疫染色の結果を示す写真である。白色の部分は核を示す。写真中、３Ｄは実施例２の人工脂肪組織、２Ｄは従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の結果を示す。
【図８】培養７日目及び１４日目における、実施例２の人工脂肪組織及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪小胞の大きさを比較した結果を示すグラフである（＊ｐ＜０．００１）。グラフ中、３Ｄは実施例２の人工脂肪組織、２Ｄは従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の結果を示す。
【図９】断片化コラーゲン及び成熟脂肪細胞を含む人工脂肪組織からなる第１層、線維芽細胞を含む第２層、角化細胞を含む第３層を含む人工皮膚の製造工程を示す模式図である。
【図１０】培養９日目（角化細胞の分化７日目）における、脂肪細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ及び断片化コラーゲンを１０ｍｇ用いて製造した実施例３の人工皮膚（左）と、マウスの皮下組織の皮膚（右）とをＨＥ染色した結果を示す写真である。
【図１１】培養９日目（角化細胞の分化７日目）における、脂肪細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ及び断片化コラーゲンを１０ｍｇ用いて製造した実施例３の人工皮膚をＨＥ染色した結果を示す写真である。Ａは角化細胞を含む層、Ｂは線維芽細胞を含む層、Ｃは脂肪細胞を含む層を拡大した写真である。
【図１２】培養９日目（角化細胞の分化７日目）における、脂肪細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ及び断片化コラーゲンを１０ｍｇ用いて製造した実施例３の人工皮膚をＨＥ染色した結果を示す写真である。Ａは角化細胞を含む層、Ｂは線維芽細胞を含む層、Ｃは脂肪細胞を含む層を拡大した写真である。
【図１３】培養９日目（角化細胞の分化７日目）における、脂肪細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ及び断片化コラーゲンを１５ｍｇ用いて製造した実施例３の人工皮膚をＨＥ染色した結果を示す写真である。Ａは角化細胞を含む層、Ｂは線維芽細胞を含む層、Ｃは脂肪細胞を含む層を拡大した写真である。
【図１４】実施例３で製造した３層構造の人工皮膚における、角化細胞の分化時間と人工皮膚の厚さの関係示すグラフである。黒四角は、脂肪細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ及び断片化コラーゲンを１０ｍｇ用いて製造した実施例３の人工皮膚、黒丸は、脂肪細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ及び断片化コラーゲンを１０ｍｇ用いて製造した実施例３の人工皮膚、白丸は、脂肪細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓ及び断片化コラーゲンを１５ｍｇ用いて製造した実施例３の人工皮膚の結果を示す。
【図１５】三次元ヒト脂肪幹細胞組織（３Ｄ）及び従来の二次元培養により製造された人工脂肪組織（２Ｄ）における分化２１日までの、脂肪形成遺伝子であるＰＰＡＲγ２、ＦＡＢＰ４及びＧＬＵＴ４の発現をＲＴ−ｑＰＣＲを用い、ハウスキーピング遺伝子ＲＰＩＩ発現レベルにより正規化して評価した結果を示す。アスタリスクは、二次元組織に対する有意差を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（人工脂肪組織）
本実施形態に係る人工脂肪組織は、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを含む三次元組織体からなる。上記細胞の少なくとも一部は断片化された細胞外マトリックスに接着している。本実施形態に係る人工脂肪組織は、平皿上での従来の二次元培養により製造される人工脂肪組織と比較して、分化が促進されており、且つ長期間維持が可能である。
【００１５】
本実施形態に係る人工脂肪組織は、人工的に作られた脂肪組織であり、生体組織から単離しただけの脂肪組織そのものは含まれない。
【００１６】
「三次元組織体」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、本実施形態の人工脂肪組織は、断片化された細胞外マトリックスを含む三次元組織体からなるため、断片化された細胞外マトリックスの有無により、生体組織及び断片化された細胞外マトリックスを用いない他の方法により製造された三次元組織体と区別することが可能である。
【００１７】
本実施形態において「脂肪細胞」には、成熟脂肪細胞のように分化した細胞だけでなく、脂肪幹細胞のように未分化の細胞も含まれる。脂肪細胞は、例えば、皮下脂肪組織、心外膜由来脂肪組織等から採取した細胞を用いてもよく、採取した細胞を分化誘導して用いてもよい。脂肪細胞は、特に限定されないが、脂肪細胞から構築した脂肪組織を、最終的に生体の特定箇所の組織に見立てて利用する場合には、当該箇所の組織に対応する組織由来のものを用いることが好ましい。脂肪細胞の由来となる動物種としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ブタ等が挙げられる。好ましい脂肪細胞としては、成熟脂肪細胞又は脂肪幹細胞が挙げられる。
【００１８】
「細胞外マトリックス」とは、生物において細胞の外に存在する物質を意味し、具体的には、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸等が挙げられる。本実施形態における細胞外マトリックスは、動物細胞の外に存在する物質、すなわち動物の細胞外マトリックスであることが好ましく、コラーゲン又はエラスチンを含むことがより好ましく、コラーゲン又はエラスチンであることがさらに好ましく、コラーゲンであることが特に好ましい。
【００１９】
コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン又は非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
【００２０】
従来の三次元組織体は、コラーゲン等の細胞外マトリックスの濃度が低く、且つ細胞密度が高いものであった。そのため、培養中又は培養後に細胞のけん引力によって三次元組織体が収縮したり、培養中又は培養後に細胞が産生する酵素によって三次元組織体が容易に分解される等の問題があった。また、例えば、多孔性の高密度コラーゲンなども市販されているがこれらは、コラーゲンと細胞を均一接着させることが出来ない上に、その後の細胞特性評価のために細胞を回収することが困難であった。本実施形態に係る三次元組織体からなる脂肪組織は、細胞外マトリックスの含有率が従来の三次元組織体の含有率より高く、収縮が起きにくく安定である。
【００２１】
三次元組織体における細胞外マトリックスの含有率は、上記三次元組織体を基準として０．０１〜９０重量％であってよく、１０〜９０重量％であることが好ましく、１〜５０重量％であることが好ましく、１０〜３０重量％であることがより好ましく、２０〜３０重量％であることが特に好ましい。ここで、「三次元組織体における細胞外マトリックス」とは、三次元組織体を構成する細胞外マトリックスを意味し、内因性の細胞外マトリックスであってもよいし、外因性の細胞外マトリックスであってもよい。また「三次元組織体における細胞外マトリックス」には後述する断片化された細胞外マトリックスも含まれる。すなわち、三次元組織体が内因性の細胞外マトリックスを含む場合、上記三次元組織体を構成する細胞外マトリックスの濃度は、内因性の細胞外マトリックス及び上記断片化された細胞外マトリックスを合わせた濃度を意味する。上記細胞外マトリックスの濃度は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。
【００２２】
「内因性の細胞外マトリックス」とは、細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックスを意味し、「内因性コラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲン産生細胞が産生するコラーゲンを意味する。内因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであってもよいし、非線維性コラーゲンであってもよい。
【００２３】
「外因性の細胞外マトリックス」とは、外部から供給される細胞外マトリックスを意味する。本実施形態に係る人工脂肪組織は三次元組織体からなり、当該三次元組織体は、断片化された細胞外マトリックスを含む。外因性の細胞外マトリックスは、由来となる動物種が内因性の細胞外マトリックスと同じであっても異なっていてもよい。由来となる動物種としては、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられる。また、外因性の細胞外マトリックスは、人工の細胞外マトリックスであってもよい。断片化された細胞外マトリックスは外因性の細胞外マトリックスである。細胞外マトリックスがコラーゲンである場合には、「外因性コラーゲン」とも称され、外部から供給されるコラーゲンを意味し、具体的には、線維性コラーゲン、非線維性コラーゲン等が挙げられる。外因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであることが好ましい。上記線維性コラーゲンとしては、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンが挙げられ、好ましくはＩ型コラーゲンである。上記線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体が挙げられる。外因性の非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
【００２４】
外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞とは異なっていてよい。また、細胞が、細胞外マトリックス産生細胞を含む場合、外因性の細胞外マトリックスにおいて、由来する動物種は、細胞外マトリックス産生細胞とは異なっていてよい。つまり、外因性の細胞外マトリックスは、異種細胞外マトリックスであってよい。
【００２５】
上記三次元組織体は、断片化された細胞外マトリックスを含む。「断片化された細胞外マトリックス」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを断片化したものを意味する。断片化された細胞外マトリックスの由来となる細胞外マトリックスは、一種類であってもよいし、複数種の細胞外マトリックスを併用してもよい。従来、コラーゲン等の細胞外マトリックスは酸性の水溶液等に溶かしていたが、濃度は０．１〜０．３重量％程度であり多く溶かすことはできなかった。そのため従来の方法では三次元組織体におけるコラーゲン等の細胞外マトリックスの量を多くすることが困難であった。本実施形態に係る断片化された細胞外マトリックスは水にほとんど溶解しないが、後述する水性媒体に分散することにより、水性媒体中で脂肪細胞を含む細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進すると推測される。断片化された細胞外マトリックスの平均長は、１００ｎｍ〜２００μｍであることが好ましく、２２μｍ〜２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化された細胞外マトリックスの平均径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、４μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。
【００２６】
細胞外マトリックスがコラーゲンである場合、断片化された細胞外マトリックスは「断片化コラーゲン」とも称される。「断片化コラーゲン」とは、線維性コラーゲン等のコラーゲンを断片化したものであって、三重らせん構造を維持しているものを意味する。断片化コラーゲンの平均長は、１００ｎｍ〜２００μｍであることが好ましく、２２μｍ〜２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化コラーゲンの平均径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、４μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。
【００２７】
コラーゲン等の細胞外マトリックスを断片化する方法は、特に制限はなく、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等のホモジナイザーを用いて細胞外マトリックスを断片化してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックスをそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの断片化された細胞外マトリックスを得ることも可能である。
【００２８】
断片化された細胞外マトリックスの直径及び長さは、電子顕微鏡によって個々の断片化された細胞外マトリックスを解析することによって求めることが可能である。
【００２９】
本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体からなる人工脂肪組織を製造できる。
【００３０】
上記三次元組織体からなる人工脂肪組織は、厚さが１０μｍ〜２０ｍｍであることが好ましく、１００μｍ〜１５ｍｍであることがより好ましく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることが特に好ましい。厚さの下限は特に制限されないが、例えば、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、３ｍｍ、又は５ｍｍであってよい。厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１．５ｍｍ又は１ｍｍであってもよい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。
【００３１】
ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
【００３２】
上記三次元組織体からなる人工脂肪組織は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の三次元組織体からなる人工脂肪組織のもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の三次元組織体からなる人工脂肪組織における対応する部分の長さを示す。
収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００
上記の例では収縮率を、培養後１日目の人工脂肪組織と培養３日目の人工脂肪組織から算出しているが、例えば、培養後１日目の人工脂肪組織と培養２日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後１日目の人工脂肪組織と培養５日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後１日目の人工脂肪組織と培養８日目の人工脂肪組織から算出してもよい。
【００３３】
培養した脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪滴の大きさを用いることができる。脂肪滴とは、トリグリセリド（中性脂肪）、コレストロール等の脂質を貯蔵する細胞内小器官であり、上記脂質類がリン脂質の１重膜で覆われることで液滴様の形状を有している。また上記リン脂質の表面には脂肪組織特有のタンパク質（ペリリピン等）の発現が見られる。成熟した脂肪細胞の脂肪滴の大きさにはばらつきがあるが、例えば、脂肪滴の大きさの平均値が２０μｍ以上である場合には、脂肪細胞がある程度成熟している、すなわち、成熟脂肪細胞であるとすることができる。
【００３４】
本実施形態の人工脂肪組織において、脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値は、２０μｍ〜１８０μｍであることが好ましく、１００μｍ〜１８０μｍであることがより好ましい。上記脂肪滴の大きさは、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１８０μｍ以下又は１５０μｍ以下であってよい。また、上記脂肪滴の大きさは、１５μｍ以上、３０μｍ以上、５０μｍ以上又は８０μｍ以上であってよい。また上記の脂肪滴の大きさは、培養７日目、培養１０日目、培養１４日目、又は培養２１日目における数値であってよい。
【００３５】
また、培養した脂肪細胞の成熟度を示す指標として、脂肪形成マーカー及び脂肪分解マーカー等の遺伝子マーカーの発現プロファイルを用いることができる。脂肪形成マーカーとしては、例えば、Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ２（ＰＰＡＲγ２）、Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４（ＦＡＢＰ４）及びＧｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｔｙｐｅ  ４（ＧＬＵＴ−４）等が挙げられる。ＰＰＡＲγ２及びＦＡＢＰ４は脂肪形成の初期マーカーとして、ＧＬＵＴ−４は脂肪形成の後期マーカーとして利用することができる。脂肪分解マーカーとしては、例えば、ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ（ＨＳＬ）及びＡｄｉｐｏｃｙｔｅ  Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  Ｌｉｐａｓｅ（ＡＴＧＬ）等が挙げられる。
【００３６】
ＰＰＡＲγ２は、脂肪細胞の分化で最も重要な転写因子の一つである。脂肪形成の間、ＰＰＡＲγ２発現は増加し、続いて一定又は減少することが報告されている（B. Galateanu et al., Int. J. Mol. Sci. 2012 (13) 15881-15900及びA. Soukas et al., J. Biol. Chem. 2001 (276) 34167-34174）。したがって、例えば、ＰＰＡＲγ２が増加する段階にある組織体と比較して、ＰＰＡＲγ２が一定に発現する段階にある組織体において脂肪形成はより進行していると考えられる。ＦＡＢＰ４は、脂肪酸を流出させるための膜への輸送に必要とされる、もう一つの初期マーカーである。したがって、例えば、より典型的な直線的な増加のＦＡＢＰ４発現プロファイルを示す組織体の方が、より脂肪形成の初期段階にあると考えられる。典型的な直線的な増加のＦＡＢＰ４発現プロファイルについては、例えば、E.C.M. Mariman et al., Cell. Mol. Life Sci. 2010 (67) 1277-1292を参照することができる。
【００３７】
インスリン刺激性ＧＬＵＴ−４は、脂肪細胞における主要なグルコース輸送体である。脂肪形成の分化が初期段階にある組織体では、ＧＬＵＴ−４の発現は弱い（S.-W. Qian et al., BMC Dev. Biol. 2010 (10) 47）。したがって、例えば、より早くＧＬＵＴ−４の発現が増加している組織体は、脂肪形成の分化がより進行していると考えられる。
【００３８】
本実施形態の人工脂肪組織は、脂肪細胞以外の細胞を含んでいてもよく、細胞外マトリックス産生細胞を含んでいてもよい。「細胞外マトリックス産生細胞」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを分泌する細胞を意味する。つまり、当該人工脂肪組織は、内生の細胞外マトリックスを含んでもよい。細胞外マトリックス産生細胞としては、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。その他の脂肪細胞以外の細胞としては、例えば、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ−ＳＭＣ））、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。
【００３９】
上記三次元組織体からなる脂肪組織は、実験動物の代替品、移植材料等として適用することができる。具体的には、例えば、セルライト、肥満等に対する化粧品のアッセイスクリーニング、糖尿病、肥満等に対する医薬品のスクリーニング、脂肪組織に関連する炎症性疾患等の他の病理学的なインビトロモデル、外傷や腫瘍摘出により生じた軟部組織欠損や乳房切除等の後の組織再構築に適用することができる。
【００４０】
（人工皮膚）
本実施形態に係る人工皮膚は、複数の層を含み、そのうちの一つの層が上述した人工脂肪組織からなる層である。すなわち、本実施形態に係る人工皮膚は、第１の層及び第２の層を含み、上述した人工脂肪組織を第１の層として含む。当該人工皮膚は、少なくとも第１の層及び第２の層を含んでいればよく、さらに第３の層、第４の層又は第５の層を含んでいてもよく、それ以上の層を含んでいてもよい。各層の順番は問わないが、第１の層、第２の層、第３の層の順番に積層されることが好ましい。ただし、この場合にも、第１の層、第２の層、第３の層がこの順番であればよく、例えば、第１の層の下、第１の層と第２の層の間、第２の層と第３の層の間、又は第３の層の上に別の層を含むことを制限するものではない。
【００４１】
本実施形態に係る人工皮膚の各層は、含まれる細胞の種類及び細胞の分布の違い等に基づき区別することができる。例えば、人工皮膚を細胞の種類ごとに異なる色に染色することで、各層が異なった色で示されるため、断面写真等により各層を区別することができる。また、例えば、人工皮膚に含まれるすべての細胞を染色し、断面写真等における染色された細胞の密度の違いから各層を区別することができる。
【００４２】
第１の層以外の層（第２の層、第３の層、第４の層及び第５の層等）は、細胞を含む。当該細胞は、上述した脂肪細胞を含んでもよく、脂肪細胞以外の細胞を含んでもよい。第２の層が、線維芽細胞又は角化細胞を含むことが好ましく、線維芽細胞を含むことがより好ましく、ヒト皮膚由来線維芽細胞又はヒト心臓線維芽細胞を含むことがさらに好ましい。第３の層が、線維芽細胞又は角化細胞を含むことが好ましく、角化細胞を含むことがより好ましく、ヒト表皮角化細胞を含むことがさらに好ましい。第１の層を最下層とする場合には、第２の層が線維芽細胞を含み、第３の層が角化細胞を含むことが好ましい。このように積層することで、よりヒトの生体内の皮膚構造に近い人工皮膚を得ることができるからである。
【００４３】
また、第１の層以外の層（第２の層、第３の層、第４の層及び第５の層等）は、細胞外マトリックスを含んでもよく、断片化された細胞外マトリックスを含んでもよい。第２の層が断片化された細胞外マトリックスを含むことが好ましい。細胞外マトリックス及び断片化された細胞外マトリックスについては上述したものと同じものを用いることができる。断片化された細胞外マトリックスを含めることで、細胞同士の間隔が適切な層を形成することができる。
【００４４】
本実施形態に係る人工皮膚は、厚さが１０μｍ〜２０ｍｍであることが好ましく、１００μｍ〜１５ｍｍであることがより好ましく、２００μｍ〜１０ｍｍであることがさらに好ましく、１ｍｍ〜１０ｍｍであることが特に好ましい。厚さの下限は特に制限されないが、例えば、１０μｍ、５０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、５００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、３ｍｍ、又は５ｍｍであってよい。厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、２０ｍｍ、１５ｍｍ、１０ｍｍ、５ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１．５ｍｍ又は１ｍｍであってもよい。このような人工皮膚は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。
【００４５】
「人工皮膚の厚さ」とは、最上層の組織表面から最下層の組織底面の距離を意味する。例えば、上皮組織、真皮組織、皮下組織を含む３層組織の場合は、上皮組織の表面から、最下層の皮下組織の底面までの距離（３層組織の全厚）を意味する。
【００４６】
本実施形態に係る人工皮膚を構成する細胞数は、１×１０６個以上であってよい。
【００４７】
本実施形態の人工皮膚の第１の層は、上述した人工脂肪組織からなる。人工脂肪組織において、脂肪細胞の脂肪滴の大きさの平均値は、２０μｍ〜１８０μｍであることが好ましく、１００μｍ〜１８０μｍであることがより好ましい。上記脂肪滴の大きさは、２５０μｍ以下、２００μｍ以下、１８０μｍ以下又は１５０μｍ以下であってよい。また、上記脂肪滴の大きさは、１５μｍ以上、３０μｍ以上、５０μｍ以上又は８０μｍ以上であってよい。また上記の脂肪滴の大きさは、培養７日目、培養１０日目、培養１４日目、又は培養２１日目における数値であってよい。
【００４８】
上記人工皮膚は、生体の皮膚の代用として、実験動物の代替品、移植材料等として適用することができる。具体的には、例えば、化合物の皮膚透過性、皮膚安全性、皮膚腐食性、及び皮膚刺激性等を評価する試験、化粧品のアッセイスクリーニング、医薬品のスクリーニング、病理学的なインビトロモデル、整形外科手術や火傷手術のための移植材料に適用することができる。
【００４９】
（人工脂肪組織の製造方法）
本実施形態に係る人工脂肪組織の製造方法は、
（１）水性媒体中において、脂肪細胞を含む細胞と、断片化された細胞外マトリックスとを接触させる工程（以下、工程（１）ともいう）、及び
（２）上記断片化された細胞外マトリックスが接触した上記細胞を培養する工程（以下、工程（２）ともいう）、を含む。
【００５０】
「脂肪細胞」、「断片化された細胞外マトリックス」等については、上述したとおりである。
【００５１】
本実施形態における工程（１）の「脂肪細胞を含む細胞」は、脂肪細胞以外の細胞を含んでいてもよく、細胞外マトリックス産生細胞を含んでいてもよい。「細胞外マトリックス産生細胞」とは、コラーゲン等の細胞外マトリックスを分泌する細胞を意味する。細胞外マトリックス産生細胞としては、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。その他の脂肪細胞以外の細胞としては、例えば、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｒｏｔａ−ＳＭＣ））、角化細胞（例えば、ヒト表皮角化細胞）等が挙げられる。
【００５２】
「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、断片化コラーゲン及び細胞が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられる。液体培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。細胞に対する負荷を軽減する観点から、水性媒体は液体培地であることが好ましい。
【００５３】
水性媒体中において、断片化された細胞外マトリックスと、脂肪細胞を含む細胞とを接触させる方法としては、特に制限はない。例えば、細胞を含む培養液に、断片化された細胞外マトリックスの分散液を加える方法、断片化された細胞外マトリックスの培地分散液に細胞を加える方法、又は予め用意した水性媒体に、断片化された細胞外マトリックス及び細胞をそれぞれ加える方法が挙げられる。
【００５４】
工程（１）における水性媒体中の断片化された細胞外マトリックスの濃度は、目的とする三次元組織体からなる人工脂肪組織の形状、厚さ、培養器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程（１）における水性媒体中の断片化された細胞外マトリックスの濃度は、０．１〜９０重量％であってよく、１〜３０重量％であってよい。
【００５５】
工程（１）における断片化された細胞外マトリックスの量は、１×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１〜１００ｍｇであってよく、１〜５０ｍｇであってよい。
【００５６】
工程（１）における断片化された細胞外マトリックスと、細胞との質量比が、１０００：１〜１：１で あることが好ましく、９００：１〜９：１であることがより好ましく、５００：１〜１０ ：１であることがさらにより好ましい。
【００５７】
脂肪細胞とその他の細胞とを共に用いる場合、工程（１）における脂肪細胞：その他の細胞の比率（細胞数）は、９９：１〜９：１であってもよいし、８ ０：２０〜５０：５０であってもよい。
【００５８】
工程（１）及び工程（２）の間に、脂肪細胞を含む細胞と、水性媒体中における断片化された細胞外マトリックスとを共に沈降させる工程をさらに含んでもよい。このような工程を行うことで、三次元組織体からなる人工脂肪組織における断片化された細胞外マトリックス及び細胞の分布が、より均一になる。具体的な方法としては、特に制限はないが、例えば、断片化された細胞外マトリックスと細胞とを含む培養液を遠心操作する方法が挙げられる。
【００５９】
工程（１）の工程が、水性媒体中で細胞の層を形成させた後、上記断片化された細胞外マトリックスを接触させることにより行われてもよい。細胞の層を断片化された細胞外マトリックスと接触させる前に形成することで、下層部の細胞密度が高い三次元組織体からなる人工脂肪組織を作製することができる。例えば、細胞外マトリックス産生細胞を含む細胞の層を断片化された細胞外マトリックスと接触させる前に形成することで、細胞外マトリックス産生細胞を含む細胞の下層部の細胞密度が高い三次元組織体からなる人工脂肪組織を作製することができる。用いる細胞の種類によっては、この方法により、より生体に近い人工脂肪組織を作製することができる。
【００６０】
本実施形態において、三次元組織体の製造方法は、工程（２）の後、工程（３）として、さらに細胞を接触させ、細胞を培養する工程を含んでもよい。上記細胞は、工程（１）で用いた細胞と同じであってよく、異なってもよい。例えば、工程（１）で用いる細胞が細胞外マトリックス産生細胞以外の細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞は細胞外マトリックス産生細胞を含んでもよい。また例えば、工程（１）で用いる細胞が細胞外マトリックス産生細胞を含む場合に、工程（３）で用いる細胞は細胞外マトリックス産生細胞以外の細胞を含んでもよい。工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方が細胞外マトリックス産生細胞を含んでもよく、工程（１）で用いる細胞及び工程（３）で用いる細胞の両方が細胞外マトリックス産生細胞以外の細胞を含んでもよい。上記工程（３）により、２層構造の三次元組織体からなる人工脂肪組織を作製することができる。同様の方法により複数の層を含む人工皮膚を製造することができる。当該人工皮膚の製造方法については後述する。
【００６１】
工程（２）において、断片化された細胞外マトリックスが接触した細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃〜４０℃で あってもよく、３０℃〜３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６〜８であってもよく、７．２〜７．４であってもよい。本実施形態に係る製造方法は、従来の二次元培養及び三次元組織の製造に用いられた複雑な組成の培養培地を必要とせず、ＤＭＥＭ等簡単に調製可能な培地を用いることができる。培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。培地は、二種類の培地を混合した混合培地であってもよい。また、本実施形態に係る製造方法によれば、従来の二次元培養と比較して、はるかに短い培養時間で十分に分化した人工脂肪組織を得ることができる。したがって、工程（２）における培養時間は、例えば、１０日〜６０日であってよく、１０日〜３０日であってよく、１３日〜２５日であってよく、１４日〜１７日であってよい。ただし、上記の培養時間はあくまでも十分に分化した脂肪組織を得るために必要とする時間を示すものであり、それ以上の培養を妨げるものではない。
【００６２】
工程（２）における培地中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ、培養 器のサイズ等に応じて適宜決定できる。例えば、工程（２）における培地中の細胞密度は、１〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよく、１０３〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであってよい。また、工程（２）における培地中の細胞密度は、工程（１）における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
【００６３】
本実施形態に係る製造方法により製造される三次元組織体からなる人工脂肪組織は、培養中の収縮率が２０％以下であることが好ましく、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。上記収縮率は、例えば、以下の式で算出できる。式中Ｌ１は、培養後１日目の三次元組織体のもっとも長い部分の長さを示し、Ｌ３は、培養後３日目の三次元組織体における対応する部分の長さを示す。
収縮率（％）＝｛（Ｌ１―Ｌ３）／Ｌ１｝×１００
上記の例では収縮率を、培養後１日目の人工脂肪組織と培養３日目の人工脂肪組織から算出しているが、培養の終了時点を含む培養期間の任意の時点での人工脂肪組織から算出してもよい。例えば、培養後１日目の人工脂肪組織と培養２日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後１日目の人工脂肪組織と培養５日目の人工脂肪組織から算出してもよく、培養後１日目の人工脂肪組織と培養８日目の人工脂肪組織から算出してもよい。
【００６４】
本実施形態に係る製造方法により製造される三次元組織体からなる人工脂肪組織は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらにより好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
【００６５】
本実施形態に係る製造方法により製造される三次元組織体からなる人工脂肪組織は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらにより好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
【００６６】
また、本実施形態に係る製造方法によれば、安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体からなる人工脂肪組織を製造できる。さらに、本実施形態に係る製造方法により製造した人工脂肪組織は、従来の二次元培養と比較して、成熟脂肪細胞が長期間維持される。また、本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、サイズが大きい三次元組織体からなる人工脂肪組織を製造できる。
【００６７】
（人工皮膚の製造方法）
本実施形態に係る人工皮膚の製造方法は、
（１）水性媒体中において、脂肪細胞を含む第１の細胞と、第１の断片化された細胞外マトリックスとを接触させること（以下、工程（１）’ともいう）、及び
（２）上記第１の断片化された細胞外マトリックスが接触した上記第１の細胞を培養すること、を含む第１の層を形成する工程（以下、工程（２）’ともいう）と、
（３）上記第１の層にさらに第２の細胞を接触させ、上記第２の細胞を培養させることを含む、第２の層を形成する工程（以下、工程（３）’ともいう）と
を含む。
【００６８】
工程（１）’及び（２）’については、上記（人工脂肪組織の製造方法）で述べた方法と同様の方法が挙げられる。水性媒体、脂肪細胞を含む第１の細胞、第２の細胞、第１の断片化された細胞外マトリックスについても、上述した水性媒体、脂肪細胞を含む細胞、断片化された細胞外マトリックスと同様のものが挙げられる。
【００６９】
工程（２）’における第１の層を形成する方法は、特に限定されないが、培養された細胞の厚さが所望の厚さになれば、層が形成されたとみなすことができる。工程（２）’において第１の層の形成が完了してから工程（３）’を開始する必要はなく、工程（２）’の培養中に工程（３）’を開始することができる。
【００７０】
第１の断片化された細胞外マトリックスの平均長は、１００ｎｍ〜２００μｍであることが好ましく、２２μｍ〜２００μｍであることがより好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがさらにより好ましい。断片化された細胞外マトリックスの平均径は、５０ｎｍ〜３０μｍであることが好ましく、４μｍ〜３０μｍであることがより好ましく、２０μｍ〜３０μｍであることがさらにより好ましい。
【００７１】
また、本実施形態に係る製造方法によれば、従来の二次元培養と比較して、はるかに短い培養時間で十分に分化した脂肪組織（第１の層）を得ることができる。したがって、工程（２）’における培養時間は、例えば、１０日〜６０日であってよく、１０日〜３０日であってよく、１３日〜２５日であってよく、１４日〜１７日であってよい。ただし、上記の培養時間はあくまでも十分に分化した脂肪組織を得るために必要とする時間を示すものであり、それ以上の培養を妨げるものではない。
【００７２】
第２の細胞は、第１の細胞と同じであってもよく、異なっていてもよい。また、細胞を接触させる方法及び培養方法についても、上記（人工脂肪組織の製造方法）で述べた方法と同様の方法が挙げられる。
【００７３】
第２の細胞として用いる細胞としては、上記（人工脂肪組織）で述べたものと同様のものが挙げられるが、第２の細胞が線維芽細胞を含むことが好ましい。第２の層を線維芽細胞が分化した層とすることで、より生体の皮膚に近い構造とすることができる。
【００７４】
また、工程（３）’が、上記第１の層上で、水性媒体中において、上記第２の細胞と断片化された第２の細胞外マトリックスとを接触させ、上記第２の細胞を培養することを含む工程であることが好ましい。第２の細胞外マトリックスとしては、上記（人工脂肪組織）で述べたものと同様のものが挙げられる。断片化された細胞外マトリックスを含めることで、細胞同士の間隔が適切な層を形成することができる。第２の細胞外マトリックスがコラーゲンを含むことが好ましく、第２の細胞外マトリックスがコラーゲンであることがより好ましい。
【００７５】
本実施形態に係る人工皮膚の製造方法は、上記第２の層にさらに第３の細胞を接触させ、上記第３の細胞を培養させることを含む、第３の層を形成する工程を、さらに含むことができる。
【００７６】
第３の細胞として用いる細胞としては、上記（人工脂肪組織）で述べたものと同様のものが挙げられるが、第３の細胞が角化細胞を含むことが好ましい。第３の層を角化細胞が分化した層とすることで、より生体の皮膚に近い構造とすることができる。
【００７７】
本実施形態に係る人工皮膚の製造方法によれば、上記（人工皮膚）において述べたものと同様に、生体の皮膚に近い厚さの人工皮膚を、従来の二次元培養と比較して、はるかに短い培養時間で得ることができる。
【００７８】
また、本実施形態に係る人工皮膚の製造方法によれば、安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体からなる人工脂肪組織を第１の層として含む、人工皮膚を製造することができる。さらに、本実施形態に係る製造方法により製造した人工皮膚における人工脂肪組織は、従来の二次元培養と比較して、成熟脂肪細胞が長期間維持される。また、本実施形態に係る製造方法によれば、比較的少ない細胞数で、厚さが１ｍｍ以上である、生体の皮膚に近い厚さの人工皮膚を製造できる。
【００７９】
（脂肪細胞の培養剤）
本実施形態に係る脂肪細胞の培養剤は、断片化された細胞外マトリックスを含む。本実施形態に係る脂肪細胞の培養剤は、上記断片化された細胞外マトリックスの平均長が１００ｎｍ〜２００μｍであってもよく、上記断片化された細胞外マトリックスの平均径が５０ｎｍ〜３０μｍであってもよい。また、断片化された細胞外マトリックスの長さについて、断片化された細胞外マトリックス全体のうち９５％が１００ｎｍ〜２００μｍの範囲にあってもよい。さらに、断片化された細胞外マトリックスの直径について、断片化された細胞外マトリックス全体のうち９５％が５０ｎｍ〜３０μｍの範囲にあってもよい。
【００８０】
「脂肪細胞の培養剤」とは、脂肪細胞を培養するための試薬を意味する。脂肪細胞の培養剤は、粉末の状態であってもよいし、水性媒体に断片化された細胞外マトリックスが分散した分散液の状態であってもよい。断片化された細胞外マトリックスの種類、大きさ、製造方法及び上記培養剤の使用方法としては、上記（人工脂肪組織）及び（人工脂肪組織の製造方法）において示されているものと同様のものが挙げられる。断片化された細胞外マトリックスを含むことで、脂肪細胞の分化が促進される。したがって、脂肪細胞の培養剤は、分化促進剤と捉えることもできる。また、断片化された細胞外マトリックスを含むことで、成熟脂肪細胞の脱分化が起こりにくくなる。したがって、脂肪細胞の培養剤は、成熟脂肪細胞の脱分化抑制剤（成熟脂肪細胞の維持剤）と捉えることもできる。さらに、本実施形態に係る培養剤によれば、例えば１ｍｍ以上の厚さを持つ組織を形成した場合にも、長期培養による組織収縮が少ない組織を形成可能であるため、分化促進効果および脱分化抑制効果を奏しつつ、長期間形態が安定した組織を形成することができる。
【００８１】
（化合物の皮膚透過性を評価する方法）
本実施形態に係る化合物の皮膚透過性を評価する方法は、
人工皮膚を準備する工程と、
被験化合物を人工皮膚に接触させる工程と、
上記被験化合物を接触させた人工皮膚を用いて上記被験化合物の皮膚透過性を測定する工程と、
上記被験化合物の皮膚透過性を基準値と比較する工程と
を含む。人工皮膚は、上記（人工皮膚）に記載した本実施形態に係る人工皮膚、又は上記（人工皮膚の製造方法）に記載した本実施形態に係る製造方法により製造した人工皮膚を用いる。上述したように、当該人工皮膚は、生体の皮膚と類似の構成及び厚さを有しているため、生体の皮膚の代用として化合物の皮膚透過性試験に用いることができる。
【００８２】
被験化合物としては、特に制限されず、通常皮膚透過性試験に用いられる化合物であれば何でも用いることができる。
【００８３】
被験化合物を人工皮膚に接触させる接触方法としては、特に制限されないが、被験化合物が液体である場合には、例えば、人工皮膚の表面に直接塗布又は散布することが挙げられ、被験化合物が個体である場合には、溶媒に溶解させた溶液を用いて、同様に人工皮膚の表面に塗布又は散布することが挙げられる。
【００８４】
被験化合物の皮膚透過性の測定は、当業者に周知の皮膚透過性試験法に基づき行うことができる。例えば、化粧品・医薬部外品を対象とした安全性評価については、薬生薬審発１１１５第１号（平成２８年１１月１５日）のガイダンスに従って試験することができる。
【００８５】
基準値は、被験化合物の種類及び濃度等に基づき適宜設定できる。例えば、基準値が一点である場合には、基準値と比較して高い場合には皮膚透過性が高いと評価することができ、基準値と比較して低い場合には皮膚透過性が低いと評価することができる。また、例えば、基準値は皮膚透過性を段階的に評価するための範囲として設定することもできる。
【００８６】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８７】
（実施例１：マウス成熟脂肪細胞を用いた人工脂肪組織の製造）
発明者らは、組織中のコラーゲン密度を増加させるために、コラーゲンマイクロファイバーを用いた三次元組織体の製造方法を開発した（図１）。成熟脂肪細胞を用いた人工脂肪組織は、図１に示す模式図のとおりに以下のように製造した。【００８８】
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０  ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて５分間ホモジナイズすることで、直径が約４．４μｍであり、長さが約２２．５μｍである断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。【００８９】
血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液１ｍＬ（断片化コラーゲン、約１０ｍｇ相当）と、ＤＭＥＭ中の１×１０６ｃｅｌｌｓの初代成熟マウス脂肪細胞とを２４ウェルプレートトランスウェル（ＩＷＡＫＩ社製）中で混合した。播種２４時間後、上記のトランスウェルを、６ｍＬの培地（ＤＭＥＭ培地、ナカライテスク社製）を含む６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）に入れた。成熟脂肪細胞は、４日ごとに培地交換、１４日まで培養した。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物が堆積しているだけで、遠心はしていないので、培養経過とともに自重方向の厚みは減少し、安定していき、１４日培養後には厚さ約２ｍｍの三次元組織体が得られた。得られた三次元組織体からなる人工脂肪組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色及び又は抗ペリリピン抗体による免疫染色で染色し、組織学的評価を行った。また、ナイルレッドを用いて脂質を染色した。生存率は、ライブ／デッドキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて評価し、脂肪小胞の生存/死亡及び分析の測定は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所製）を用いて行った。また、電子顕微鏡を用いて培養７日目及び１４日目における脂肪小胞１００個の脂肪小胞の直径を測定し、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪細胞と比較した。【００９０】
従来の二次元培養により人工脂肪組織を製造する方法は以下のように行った。６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）中に３×１０５（ｃｅｌｌｓ／ウェル）の初代成熟マウス脂肪細胞を播き、培養した。２ｍＬの培地（ＤＭＥＭ培地、ナカライテスク社製）で培養を続けた。培地は３日毎に交換した。なお、成熟脂肪細胞は脂肪滴の浮力の影響で容器底面に接着しないため、培地に市販のカバーガラスを浮かせ、その下に細胞を接着させて培養した。【００９１】
ＨＥ染色では、成熟脂肪細胞を取り囲む三次元組織体中に高密度の断片化されたコラーゲンが存在することが示された（図２Ａ  矢印）。成熟脂肪細胞は、小さな細胞質及び核を有する典型的な丸い単眼形状を示した（図２Ａ）。【００９２】
ナイルレッドの脂質染色では、細胞質内の脂肪滴が確認された。成熟脂肪細胞を示す単眼形状の脂肪滴が確認され、三次元組織体内の成熟脂肪細胞の均質で高い再分画が示された（図２Ｂ）。１４日以上の長時間の培養を行った場合であっても、人工脂肪組織は、２日目の９８．５％から１４日目の９４．６％（図２Ｃ  グレーが生存、白色が死亡した細胞を示す）の高い生存率で成熟脂肪細胞を良好に維持した。抗ペリリピン抗体による免疫染色の結果から、培養１４日目における三次元組織体の成熟した脂肪細胞は、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪細胞と比較して、大きな単眼形状（０日目に５４±８μｍの脂肪小胞）を維持したことが確認された（図３）。一方、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織において、成熟脂肪細胞は線維芽細胞様細胞形態に脱分化し、培養１４日目における三次元組織体内の成熟脂肪細胞と比較して有意に３．７倍小さい小胞を示した（図４、ｎ＞１００個の脂肪小胞をカウント、ｔ−検定）。また、断片化コラーゲンを含む三次元組織体からなる人工脂肪組織は、７日目から１４日目にかけて脂肪小胞の大きさが維持されていたが、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、７日目から１４日目にかけて脂肪小胞の大きさが減少した。このことは、断片化コラーゲンを含む三次元組織体は、従来の二次元培養により製造される人工脂肪組織と比較して、脱分化されるまでの時間が長いため、長期間の維持が可能であり、成熟脂肪細胞の培養時間を少なくとも１週間以上延長することができたことを示す。【００９３】
（実施例２：ヒト脂肪幹細胞を用いた人工脂肪組織の製造）
脂肪幹細胞を用いた人工脂肪組織は、図１に示す模式図のとおりに以下のように製造した。【００９４】
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０  ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて５分間ホモジナイズすることで、直径が約４．４μｍであり、長さが約２２．５μｍである断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。【００９５】
血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液３００μＬ（断片化コラーゲン、約３ｍｇ相当）と、ＤＭＥＭ中の５×１０５ｃｅｌｌｓのヒト脂肪幹細胞とを９６ウェルインサート（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）中で混合した。播種２４時間後、２００μＬの培地（ＤＭＥＭ培地、ナカライテスク社製）を加えた。培地は２日ごとに交換し、１９日間培養した。１９日間のうち、２日間が増殖期間に相当し、その後の１７日間が分化期間に相当する。培養開始と共に細胞及び断片化コラーゲンを含む混合物が堆積しているだけで、遠心はしていないので、培養経過とともに自重方向の厚みは減少し、安定していき、１４日培養後には厚さ約２ｍｍの三次元組織体が得られた。分化１７日目（培養１９日目）の三次元組織体からなる人工脂肪組織をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色及び又は抗ペリリピン抗体による免疫染色で染色し、組織学的評価を行った。【００９６】
ＨＥ染色では、三次元組織体中に高密度の断片化されたコラーゲンが存在することが示された（図５  矢印）。また、成熟脂肪細胞を示す大きな丸い単眼形状の脂肪滴が確認された（図５  拡大図）。中には、１００μｍを超える大きさの成熟脂肪細胞も確認された。【００９７】
従来の二次元培養により人工脂肪組織を製造する方法は以下のように行った。２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製）中に、１×１０４（ｃｅｌｌｓ／ウェル）のヒト脂肪幹細胞を播き、培養した。播種後２日間は５００μＬのＤ−ＭＥＭを用いて培養し、増殖をさせた後、分化促進用の培地に培地交換した。分化促進用の培地は、Ｄ−ＭＥＭにＰＧＭ−２  Ｓｉｎｇｌｅｑｕｏｔ  ＫｉｔＰＴ−９５０２（ＬＯＮＺＡ製）を加えたものであり、成長補助剤（Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリン）が含まれている。５００μＬで培養し、培地は週に１回交換した。【００９８】
従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、分化３７日目時点でも液滴の状態の脂肪小胞が散見された（図６）。また、ナイルレッドの脂質染色により確認したところ、小さい脂肪滴しか確認されず、断片化コラーゲンを含む三次元組織体のように、１００μｍを超える大きさの成熟脂肪細胞は確認されなかった。【００９９】
さらに、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、分化７２日目時点でも液滴の状態の脂肪小胞が散見され、すべての脂肪細胞は分化していなかった（図６）。また、より脂肪が増えると、脂肪細胞は離れて培養液中に浮遊し、培養液を交換するのが困難になった。【０１００】
抗ペリリピン抗体による免疫染色の結果から、培養７日目における三次元組織体の脂肪幹細胞は、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織の脂肪幹細胞と比較して、大きな単眼形状（７日目に４μｍ±２μｍの脂肪小胞）を形成したことが確認された（図７）。一方、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織においては、培養７日目における三次元組織体内の脂肪細胞と比較して有意に２倍小さい小胞を示した（図８、ｎ＞１００個の脂肪小胞をカウント、ｔ−検定）。また、断片化コラーゲンを含む三次元組織体からなる人工脂肪組織は、７日目から１４日目にかけて脂肪小胞の大きさが２倍以上（１０μｍ±４μｍ）となっていたが、従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織は、７日目から１４日目にかけて脂肪小胞の大きさはほとんど変わらなかった。【０１０１】
以上により、断片化コラーゲンを含む三次元組織体からなる人工脂肪組織は、従来の二次元培養により製造される人工脂肪組織と比較して、分化が早く進むことが示された。【０１０２】
（実施例３：成熟脂肪細胞を用いた人工皮膚の製造）
成熟脂肪細胞を用いた人工皮膚は、図９に示す模式図のとおりに以下のように製造した。【０１０３】
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体を１０倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水（×１０  ＰＢＳ）に分散し、ホモジナイザーを用いて５分間ホモジナイズすることで、直径が約４．４μｍであり、長さが約２２．５μｍである断片化コラーゲンを得た。得られた断片化コラーゲンを無血清培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、断片化コラーゲンの培地分散液を得た。【０１０４】
血清を含む培地（ＤＭＥＭ）にて濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように断片化コラーゲンを分散した。得られた分散液１ｍＬ（断片化コラーゲン、約１０ｍｇ相当）と、ラットの皮下組織から採取した、ＤＭＥＭ中の１×１０６ｃｅｌｌｓの成熟ラット脂肪細胞とを２４ウェルプレートトランスウェル（ＩＷＡＫＩ社製）中で混合した。プレートをインキュベーターに入れ、２４時間培養した。【０１０５】
次に、２４ウェルのインサートを、ＰＢＳ（０．０４μＬ／インサート）中の０．０４ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン溶液（＃Ｆ２００６−５Ｇ、Ｓｉｇｍａ社製）でコートし、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、上記断片化コラーゲンの培地分散液１ｍＬ（断片化コラーゲン、約１０ｍｇ相当）と、５×１０５ｃｅｌｌｓのヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を混合し、１００μＬを２４ウェルのインサートに分配した。プレートをインキュベーターに入れ、２４時間培養した。【０１０６】
次に、上記ＮＨＤＦのコラーゲンゲル上で、インサート中の培地を吸引し、ＰＢＳ（０．０４μＬ／インサート）中の０．０４ｍｇ／ｍＬコラーゲンＩＶ溶液でコートし、３７℃で少なくとも２０分間インキュベートした。ＮＨＤＦのコラーゲンゲル上に加えたコラーゲンＩＶ溶液を吸引し、ＮＨＤＦのコラーゲンゲル上に、２×１０６ｃｅｌｌｓの正常ヒト表皮角化細胞（＃ＫＫ−４００９、１バイアル＝５０００００細胞、ＫＵＲＡＢＯ社製）を加えた。ＤＭＥＭ  ５％ＦＢＳ：ＥｐｉＬｉｆｅ（＃Ｃ−２５１７Ａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（１：１）培地をインサートの外側に１ｍＬ加え、１時間後にインサートの外側に１ｍＬを再度加えた。【０１０７】
内側と外側の培地を静かに吸引し、ＤＭＥＭ  ５％ＦＢＳ：ＥｐｉＬｉｆｅ（１：１）培地中でアスコルビン酸を１００倍に希釈し、インサートの外側に５００μＬの分化培地として加えた。インサートの内側には培地を加えなかった。分化７日目まで毎日インサートの外の培地を交換した。【０１０８】
上記方法によれば、脂肪組織の培養開始からわずか９日間（脂肪組織の培養２４時間＋線維芽細胞の培養２４時間＋角化細胞の分化７日間）で、下部に脂肪組織の層、中間に線維芽細胞の層、上部に角化細胞の層の３層構造の人工皮膚を製造することができる（図９）。【０１０９】
上記のように製造された角化細胞の分化７日目の人工皮膚をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色し、組織学的評価を行った。上記人工皮膚は、下部の脂肪細胞を含む層（皮下組織）、中間の線維芽細胞を含む層（真皮組織）、上部の角化細胞を含む層（表皮組織）のいずれの層においても細胞間の距離が適切であり、生体内の皮膚組織に近い構造であることが示された（図１０及び図１１）。角化細胞は上皮様層を形成しており、角化細胞の分化の形態的な指標の一つである脱核も観察された（図１１）。また、角化細胞の分化７日目の人工皮膚は、厚さ（上皮組織の表面から、最下層の皮下組織の底面までの距離）が約４．３ｍｍあり、厚さの点においても生体内の皮膚組織に近い厚さが再現できていることが示された。【０１１０】
脂肪組織の製造に用いる脂肪細胞を１×１０６ｃｅｌｌｓから５×１０５ｃｅｌｌｓに変更した場合、用いる断片化コラーゲンの量を１０ｍｇから１５ｍｇに変更した場合にも、上記と同様の結果が示された（図１２、図１３）。角化細胞の分化時間と３層構造の人工皮膚の厚さの関係を図１４に示す。角化細胞の分化３〜７日目にかけて、皮膚の厚みの減少が収束し、スタグネーションすることが示された。【０１１１】
（実施例４：三次元組織における脂肪幹細胞の脂肪形成促進）
実施例２と同様にヒト脂肪幹細胞を用いて製造した断片化コラーゲンを含む三次元組織体及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織体における、脂肪形成遺伝子の発現をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により確認した（図１５）。【０１１２】
ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡマイクロキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、キットのプロトコルに従って、上記三次元組織体及び従来の二次元培養により製造した人工脂肪組織体からトータルＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）Ｎ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、キットのプロトコルに従って、１μｇのＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲは、７０ｎｇのｃＤＮＡを０．３μＭのＦｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅプライマーとともにｉＴａｑ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲＡＤ社製）を用いて増幅した。使用した各プライマーの配列、ＲＴ−ＰＣＲの最適増幅サイクル数及び温度条件は表１に示す。ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ｑＰＣＲ反応は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。【０１１３】
【表１】
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【０１１４】
脂肪形成は、前脂肪細胞が未成熟脂肪細胞となる際に最初の初期脂肪形成遺伝子（例えば、ＦＡＢＰ４、ＰＰＡＲγ２）を発現し、その後脂肪小胞の脂質蓄積をしながら後期遺伝子（例えば、ＧＬＵＴ４）を発現するというように、増殖段階から分化段階へと切り替わる。初期マーカー及び後期マーカーの発現は、培養期間を通して徐々に増加していることが見いだされたが、三次元組織体と二次元培養により製造した人工脂肪組織体とでは、発現に違いが見られた。上記断片化コラーゲンを含む三次元組織体おけるｍＲＮＡ量は、二次元培養により製造した人工脂肪組織体と比較して多い傾向にあり、７日目における初期遺伝子ＦＡＢＰ４の発現は最大５．５倍であり、２１日目における後期遺伝子ＧＬＵＴ４の発現は８．３倍であった（図１５）。【０１１５】
ＰＰＡＲγ２遺伝子の発現は、二次元培養により製造した人工脂肪組織体においては増加し続けたが、上記三次元組織体においては、７日目から２１日目にかけてわずかに増強した発現プロファイルを示したものの、ほぼ一定であった。三次元組織においては、すでにＰＰＡＲγ２が一定に発現する段階あり、脂肪形成がより進行していると考えられる。もう一つの初期マーカーＦＡＢＰ４については、三次元組織体では７日目から２１日目にかけて概ね一定であった。一方で、二次元培養により製造した人工脂肪組織体では、７日目から２１日目にかけて発現の増加が見られた。後期マーカーであるインスリン刺激性ＧＬＵＴ−４の発現は、三次元組織体において１４日目から急激に増加した一方で、二次元培養により製造した人工脂肪組織体におけるＧＬＵＴ−４の発現は非常に弱く観察された。これらの結果より、上記三次元組織体は、二次元培養により製造した人工脂肪組織体と比較して、より分化状態に即した遺伝子発現を示すことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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