(57)【要約】本発明の目的は、優れた腫瘍組織形成能を有する癌幹細胞、及び当該癌幹細胞の樹立方法を提供することである。癌幹細胞を含む癌細胞群から、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を分離して濃縮することによって、２００個以下の細胞数でも生体内で腫瘍組織を形成可能な癌幹細胞が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２００個以下の細胞数で生体内で腫瘍組織を形成できる、癌幹細胞。
【請求項２】
１個の細胞数で生体内で腫瘍組織を形成できる、請求項１に記載の癌幹細胞。
【請求項３】
CD44v9を高発現している、請求項１又は２に記載の癌幹細胞。
【請求項４】
Panc-1 3-4 CST001株（受託番号：NITE BP-02449）である、請求項１〜３のいずれかに記載の癌幹細胞。
【請求項５】
癌幹細胞を含む癌細胞群から、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を分離して濃縮する工程を含む、癌幹細胞の分離方法。
【請求項６】
前記細胞群に、標識化した標識したオルニチンデカルボキシラーゼデグロンを軽質導入することにより、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞の分離及び濃縮を行う、請求項５に記載の癌幹細胞の分離方法。
【請求項７】
濃縮された２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞から、更にCD44v9を高発現している細胞を分離する、請求項５又は６に記載の癌幹細胞の分離方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに示す癌幹細胞を用いて、癌治療薬をスクリーニングする、癌治療薬のスクリーニング方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに示す癌幹細胞を用いて、癌治療薬の効能を評価する、癌治療薬の効能評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた腫瘍組織形成能を有し、少ない細胞数であっても腫瘍組織を形成できる癌幹細胞に関する。また、本発明は、当該癌幹細胞の樹立方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞には、自己増殖能があり、周辺組織への湿潤や離れた組織への転移が可能であるという特性がある。しかしながら、癌組織を形成している癌細胞の全てにおいて、これらの特性を備わっているのではなく、癌を発症させたり、癌を進行させる癌細胞は、癌細胞の中でもごく僅かにしか存在しない癌幹細胞であることが分かっている。癌幹細胞は、正常幹細胞と同様に未分化な表面形質を示し、自己複製能と分化能を有し、癌組織を構成する多様な分化段階にあるあらゆる癌細胞を生みだす特性を有している。即ち、癌幹細胞は、癌組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しつつ、分化によって大多数の癌細胞を生み出すもとになっていると考えられている。【０００３】
癌の制圧には、癌幹細胞の性状を明らかにし、癌幹細胞を制圧することが重要である。そのため、癌幹細胞は、創薬、診断薬の開発ツールとして有用であり、その標品の確立が望まれている。従来、癌幹細胞の樹立は、幹細胞表面マーカー、サイド・ポピュレーション、スフェアー形成能等を指標にして行われている。しかしながら、癌幹細胞は、癌組織を構成する癌細胞の中で、寡少にしか存在しておらず、しかも、従来の手法で樹立される癌幹細胞では、腫瘍組織の形成能が高くないため、細胞数が少ないと、モデル動物において腫瘍組織を形成できないため、多数の癌幹細胞を準備しなければ、腫瘍動物モデルを作成できないという欠点がある。【０００４】
このような従来技術を背景として、少ない細胞数であっても腫瘍組織を形成でき、医療産業を満足させる癌幹細胞の標品を製造する技術の開発が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の主な目的は、優れた腫瘍組織形成能を有する癌幹細胞、及び当該癌幹細胞の樹立方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、癌幹細胞を含む癌細胞群から、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を分離して濃縮することによって、２００個以下の細胞数でも生体内で腫瘍組織を形成可能な癌幹細胞が得られることを見出した。更に、本発明者等は、濃縮された２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞（癌幹細胞）から、更にCD44v9を高発現している癌幹細胞を分離することによって、格段に優れた腫瘍組織形成能を有する癌幹細胞が得られることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【０００７】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  ５０個以下の細胞数で腫瘍組織を形成できる、癌幹細胞。
項２．  １個の細胞数で腫瘍組織を形成できる、項１に記載の癌幹細胞。
項３．  CD44v9を高発現している、項１又は２に記載の癌幹細胞。
項４．  Panc-1 3-4 CST001株（受領番号：NITE BP-02449）である、項１〜３のいずれかに記載の癌幹細胞。
項５．  癌幹細胞を含む癌細胞群から、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を分離して濃縮する工程を含む、癌幹細胞の分離方法。
項６．  前記細胞群に、標識化した標識したオルニチンデカルボキシラーゼデグロンを軽質導入することにより、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞の分離及び濃縮を行う、項５に記載の癌幹細胞の分離方法。
項７．  濃縮された２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞から、更にCD44v9を高発現している細胞を分離する、項６に記載の癌幹細胞の分離方法。
項８．  項１〜４のいずれかに示す癌幹細胞を用いて、癌治療薬をスクリーニングする、癌治療薬のスクリーニング方法。
項９．  項１〜４のいずれかに示す癌幹細胞を用いて、癌治療薬の効能を評価する、癌治療薬の効能評価方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の癌幹細胞によれば、２００個以下（特に好ましい態様では、1個）の細胞数であっても、モデル動物内で腫瘍組織を形成でき、腫瘍動物モデルをより簡便に作成することが可能になる。また、本発明の癌幹細胞は、癌の治療薬のスクリーニングや癌治療薬の薬効評価等に利用することができ、癌の治療技術の向上に寄与することが可能になる。また、本発明の癌幹細胞の特性を明らかにすることにより、癌の発生、進行、転移等の機序の解明ができ、ひいては癌の根本治療に繋がる革新的な創薬及び治療法の開発に寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ａは、膵臓癌細胞株Panc-1にODC（ornithine decarboxylase）-degronシステムを導入し、癌幹細胞株（約0.06％）を可視化したことを、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す図である。ｂは、癌幹細胞株を濃縮し、濃縮前後で癌幹細胞株を観察した結果を示す図である。ｂにおける上図は濃縮前の細胞集団、下図は濃縮後の細胞集団を観察した結果である。
【図２】癌幹細胞集団（ZsGreen+）及び非癌幹細胞集団（ZsGreen-、ネガティブコントロール）について、癌幹細胞の特性の有無を確認した結果を示す図である。ａにはスフェアー形成能を評価した結果、ｂには抗癌剤耐性を評価した結果、ｃには幹細胞マーカーの発現能を評価した結果、ｄには非対称性分裂能を評価した結果を示す。
【図３】癌幹細胞集団（ZsGreen+）及び非癌幹細胞集団（ZsGreen -）をマウスの皮下にそれぞれ150cells移植し、６週間後に移植部位を観察した結果である。
【図４】CD44v9を高発現する癌幹細胞集団（ZsGreen -/CD44v9high）及びCD44v9を高発現する非癌幹細胞集団（ZsGreen -/CD44v9high）をマウスの皮下にそれぞれ150 cells移植し、６週間後に移植部位を観察した結果である。
【図５】CD44v9を高発現する株化された癌幹細胞（super Panc-1 CSC）をマウスの皮下に1 cellだけ移植し、経時的に移植部位を観察した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１．癌幹細胞の特性等
本発明の癌幹細胞は、２００個以下の細胞数で腫瘍組織を形成できることを特徴とする。従来樹立されている癌幹細胞は、このように少数の細胞数では、モデル動物内で腫瘍組織を形成できなかったが、本発明の癌幹細胞では、２００個以下という少ない細胞数であっても、モデル動物内で腫瘍組織を形成することが可能になっている。以下、本発明の癌幹細胞について詳述する。
【００１１】
本発明において、癌幹細胞とは、未分化の状態を維持し、自己複製能と分化能を有しており、分化によって癌細胞を生み出すことができる細胞を意味する。
【００１２】
本発明の癌幹細胞の特徴の一つは、２００個以下の細胞数で腫瘍組織を形成できる点にある。本発明の癌幹細胞の好適な態様として、１５０個以下、好ましくは１００個以下、７５個以下、５０個以下、４０個以下、又は３０個以下、より好ましくは１〜２０個、更に好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個、１〜４個、又は１〜３個、最も好ましくは１又は２個、或は１個の細胞数で、腫瘍組織を形成できるものが挙げられる。
【００１３】
本発明において、「生体内で腫瘍組織を形成できる」ことについては、モデル動物に所定数の癌幹細胞を投与した後に、当該投与部位において腫瘍組織が形成されているか否かを確認することによって、判定することができる。より簡便には、マウスの皮下に所定数の癌幹細胞を投与し、６週間経過後に当該投与皮膚部位において直径１０ｍｍ以上の腫瘍組織が形成されているか否かを目視にて確認することによって判定することができる。
【００１４】
また、本発明の癌幹細胞の好適な一態様として、CD44v9を高発現していることが挙げられる。CD44v9は癌幹細胞の表面マーカーとして知られているが、前記癌幹細胞の中でも、CD44v9の発現量が多いものを選択することによって、腫瘍組織形成能が格段位優れ、細胞数が１０個以下（特に、１個）であっても、生体内で腫瘍組織を形成できる癌幹細胞を提供することが可能になる。
【００１５】
本発明において、「CD44v9を高発現している」とは、蛍光物質等の標識物質で標識化された抗CD44v9抗体を用いて癌幹細胞の集団をFACS解析した際に、標識物質の検出量が検出閾値の細胞に比べて、標識物質の検出量（CD44v9発現量）が、５倍以上、好ましくは５〜１００倍、更に好ましくは１０〜１００倍のCD44v9発現量が認められることを指す。ここで、「検出閾値」とは、同じ幹細胞について抗CD44v9抗体を使用せずに標識物質の検出を行った場合（ネガティブコントロール）で認められる標識物質の検出量を指す。なお、腫瘍組織形成能が劣る通常の癌幹細胞では、同じ分離源の癌非幹細胞（幹細胞ではない癌細胞）に比して、平均のCD44v9の発現量が５倍未満である。
【００１６】
また、本発明の癌幹細胞（特に、CD44v9を高発現している癌幹細胞）の好適な一態様として、腫瘍組織の増殖・進行、及び／又は腫瘍細胞の転移・分化・増殖に関わるpathwayの活性化されていることが挙げられる。このようなpathwayの活性化の指標としては、具体的には、以下に示す(1)〜(28)の機能に関連している遺伝子の内、少なくとも１つ以上の遺伝子の発現が増加又は低下していることが挙げられる：(1)腫瘍増殖（growth of tumor）、(2)内皮細胞株の細胞移動（cell movement of endothelial cell lines）、(3)内皮細胞株の転移（migration of endothelial cell lines）、(4)炭水化物の合成（synthesis of carbohydrate）、(5)多糖の合成（synthesis of polysaccharide）、(6)タンパク質の合成（synthesis of protein）、(7)グリコサミノグリカンの合成（synthesis of glycosaminoglycan）、(8)脂質濃度（concentration of lipid）、(9)細胞寿命（cell survival）、(10)細胞走化性（chemotaxis of cells）、(11)細胞生存性（cell viability）、(12)血管組織の透過性（permeability of vascular tissue）、(13)走化性（chemotaxis）、(14)エイコサノイドの放出（release of eicosanoid）、(15)炭水化物の代謝（metabolism of carbohydrate）、(16)脂肪酸の放出（release of fatty acid）、(17)DNAの合成（synthesis of DNA）、(18)腫瘍細胞株の転移（migration of tumor cell lines）、(19)腫瘍細胞株の分化（differentiation of tumor cell lines）、(20)腫瘍細胞の増殖（proliferation of tumor cells）、(21)チロシンリン酸化（tyrosine phosphorylation）、(22)胚腹側発生(development of abdomen）、(23)細胞転移（metastasis of cells）、(24)細胞移動（cell movement）、(25)血管内皮細胞の移動（movement of vascular endothelial cells）、(26)腫瘍進行（progression of tumor）、(27)細胞骨格の組織化（organization of cytoskeleton）、(28)細胞活性化（activation of calls）。
【００１７】
本発明の癌幹細胞の好適な態様として、前記(1)〜(29)の機能に関連している遺伝子の内、少なくとも１個以上の遺伝子の発現が増加又は低下していればよいが、前記(1)〜(29)の機能の内、好ましくは５個以上、より好ましくは１０個以上、更に好ましくは１５個以上、特に好ましくは２０個以上、より一層好ましくは２５個以上、最も好ましくは２９個（全て）の機能に関連している遺伝子の発現が増加又は低下していることが挙げられる。ここで、「遺伝子の発現が増加又は低下」とは、前記機能の亢進に関連している遺伝子の場合には、その発現が増加していることが必要であり、前記機能の抑制に関連している遺伝子の場合には、その発現が抑制していることが必要である。
【００１８】
前記(1)腫瘍増殖（growth of tumor）に関与している遺伝子としては、具体的には、ADM,AFAP1L2,AKR1B10,ALCAM,ANGPTL4,ATF3,BMP2,BMP4,CA9,CCDC88A,CCL5,CD82,CERS6,CLU,COL18A1,CST6,CTSB,CTSS,CTSV,CXCL8,DAPK1,DKK1,ERBB3,ERO1A,F3,FGF2,FGFR3,FN1,FST,GADD45A,GLDC,GRN,HDAC6,HRAS,ICAM2,IGFBP2,IL18,IL32,ITGB6,JAG1,KMT2A,LGALS7/LGALS7B,LMO2,LOX,LRIG1,LUM,MAOA,MCAM,MIF,mir-25,MKI67,MMP1,NOV,NR4A2,NRG1,NTS,PAK1,PFKFB3,PGF,PHLDA1,PLA2G4A,PPARGC1A,PPP2R2A,PTGS2,PTN,PTPN13,RORC,RRAD,S100A9,SEMA3B,SLC7A11,SNAI1,SNAI2,SOX2,SPARC,SRC,TP73,TRIM22,VCAN,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００１９】
前記(2)内皮細胞株の細胞移動（cell movement of endothelial cell lines）に関与している遺伝子としては、具体的には、ADM,ALCAM,ANGPTL4,COL18A1,CTSB,CX3CL1,CXCL8,FGF2,IL18,NRG1,PLPP3,SRC,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２０】
前記(3)内皮細胞株の転移（migration of endothelial cell lines）に関与している遺伝子としては、具体的には、ALCAM,ANGPTL4,COL18A1,CTSB,CX3CL1,CXCL8,FGF2,IL18,NRG1,PLPP3,SRC,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２１】
前記(4)炭水化物の合成（synthesis of carbohydrate）に関与している遺伝子としては、具体的には、AGPAT1,ALDH1A1,APLN,BMP2,CCL5,CHST15,CSGALNACT1,CX3CL1,CXCL8,DKK1,DPAGT1,FGF2,FOXA2,GALNT5,GOT1,GRB10,GRK5,HAS3,HRAS,IL18,LPL,MIF,NR4A2,NRG1,NTS,PPARGC1A,PPP1CB,PPP1R3C,PTGER4,RGS2,SNCA,ST6GALNAC1,SYK,TIRAP,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２２】
前記(5)多糖の合成（synthesis of polysaccharide）に関与している遺伝子としては、具体的には、APLN,BMP2,CCL5,CSGALNACT1,CX3CL1,DKK1,FGF2,FOXA2,GALNT5,GRB10,HAS3,HRAS,IL18,NRG1,PPARGC1A,PPP1CB,PPP1R3C,PTGER4,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２３】
前記(6)タンパク質の合成（synthesis of protein）に関与している遺伝子としては、具体的には、ADM,AFAP1L2,APLN,BMP2,BMP4,BMPR1B,C3,CBLB,CCDC88A,CCL5,CDK1,CHST15,CLN3,CNTN1,CSK,CX3CL1,CXCL8,DAB2,DAPK1,EDIL3,EPOR,FAM20C,FGF2,FGFR3,FN1,GRB10,GRK5,HDAC6,HRAS,IQGAP3,MAPK4,MIF,MMD,MMP1,NRG1,NTRK2,PAG1,PAK1,PDK1,PDK2,PELI2,PLPP3,PPARGC1A,PRR5L,PSEN2,PSKH1,PTGER4,PTN,RORC,SNCA,SRC,ST6GAL1,STK19,STK36,SYK,TF,UCN,VEGFC,及びZBED3よりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２４】
前記(7)グリコサミノグリカンの合成（synthesis of glycosaminoglycan）に関与している遺伝子としては、具体的には、BMP2,CCL5,CSGALNACT1,CX3CL1,DKK1,FGF2,GALNT5,HAS3,HRAS,IL18,NRG1,PTGER4,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２５】
前記(8)脂質濃度（concentration of lipid）に関与している遺伝子としては、具体的には、ABCC3,ACPP,ACSL4,ADM,ALDH1A1,AMH,ANGPTL4,ATF3,C3,CCDC80,CD14,CEL,CERS6,CFB,CLN3,CLU,COL18A1,CPE,CTSS,CX3CL1,CXCL8,CYP11A1,CYP27B1,DHRS3,DIO2,EDIL3,ELOVL3,EPHX2,FAAH,FMO3,FOXA2,GATA6,GBA,GRK5,HRAS,IL18,IL18BP,LPL,LTC4S,MIF,NEIL1,NMU,NTRK2,NTS,NXPH4,PDE10A,PDK2,PLA2G4A,PLIN2,PLPP3,PMCH,POR,PPARGC1A,PPP1R3C,PSEN2,PTGER4,PTGS2,RGCC,RILP,RRAD,S100A8,S100A9,SLC23A2,SLCO1B3,SNCA,SRC,TFPI,TH,TSC1,UCN,UCP2,及びUGT8よりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２６】
前記(9)細胞寿命（cell survival）に関与している遺伝子としては、具体的には、ABCC3,ADGRE2,AFAP1L2,ALCAM,AMH,APLN,ASS1,ATF3,ATG12,BCL6,BMP2,BMP4,C3,CA9,CADM1,CALB1,CBLB,CCL5,CD82,CDK1,CEL,CHP2,CLN3,CLU,COL17A1,COL18A1,CTSB,CX3CL1,CXCL8,DAB2,DKK1,DUSP5,EPOR,ERBB3,FGF2,FGFR3,FN1,GADD45A,GATA6,GRB10,HK2,HNRNPUL2,HRAS,IGFBP2,IL18,JAG1,KIFC2,KLF4,KLF5,KLK6,KSR1,L1CAM,LIMS1,LRIG1,MAGED1,MCAM,MFAP5,MICAL2,MIF,MMP1,MMP13,MVP,NCSTN,NEIL1,NFIL3,NOV,NR4A2,NRG1,NTRK2,NUPR1,OPN3,PAK1,PCDHGC3,PDK1,PFDN4,PGF,PLA2G4A,POR,PPARGC1A,PPP1CB,PPP2R2A,PRPF8,PSEN2,PTGS2,PTN,PTPN13,RNF4,RORC,S100A8,S100A9,SERPINB2,SERPINF1,SFR1,SLC6A8,SLCO1B3,SNAI1,SNAI2,SNCA,SOCS2,SOX2,SPARC,SPRY1,SRC,SYK,TCF7L1,TFPI,TP73,TSC1,TUBGCP6,UCP2,VBP1,VCAN,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２７】
前記(10)細胞走化性（chemotaxis of cells）に関与している遺伝子としては、具体的には、APLN,BMP2,BMP4,C3,CCDC88A,CCL5,CLU,CSK,CX3CL1,CXCL6,CXCL8,ERBB3,FGF2,FN1,GRN,HDAC6,HRAS,IL18,KLRC4-KLRK1/KLRK1,LOX,LTB4R2,MIF,MYH10,MYLK,NOV,NRG1,PAK1,PGF,PTGS2,PTN,RTN4,S100A8,S100A9,SEMA3B,SEMA3D,SEMA3F,SERPINA1,SIRPA,SNAI2,SRC,SYK,TIRAP,TREM1,TSC1,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２８】
前記(11)細胞生存性（cell viability）に関与している遺伝子としては、具体的には、ABCC3,ADGRE2,AFAP1L2,AMH,APLN,ASS1,ATF3,ATG12,BCL6,BMP2,BMP4,C3,CA9,CADM1,CALB1,CCL5,CD82,CDK1,CEL,CHP2,CLN3,CLU,COL17A1,CTSB,CX3CL1,CXCL8,DAB2,DKK1,DUSP5,EPOR,ERBB3,FGF2,FGFR3,FN1,GADD45A,GATA6,HK2,HNRNPUL2,HRAS,IGFBP2,IL18,JAG1,KIFC2,KLF4,KLF5,KLK6,KSR1,L1CAM,LRIG1,MCAM,MFAP5,MICAL2,MIF,MMP1,MMP13,MVP,NCSTN,NEIL1,NFIL3,NOV,NR4A2,NRG1,NTRK2,NUPR1,PAK1,PCDHGC3,PDK1,PFDN4,PGF,PLA2G4A,POR,PPARGC1A,PPP1CB,PPP2R2A,PRPF8,PSEN2,PTGS2,PTN,PTPN13,RNF4,RORC,S100A8,S100A9,SERPINB2,SERPINF1,SFR1,SLC6A8,SLCO1B3,SNAI1,SNAI2,SNCA,SOCS2,SOX2,SPARC,SPRY1,SRC,SYK,TCF7L1,TFPI,TP73,TSC1,TUBGCP6,VBP1,VCAN,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００２９】
前記(12)血管組織の透過性（permeability of vascular tissue）に関与している遺伝子としては、具体的には、IL18,IL18BP,MIF,NTS,PAK1,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３０】
前記(13)走化性（chemotaxis）に関与している遺伝子としては、具体的には、AMOT,APLN,BMP2,BMP4,C3,CCDC88A,CCL5,CLU,CSK,CX3CL1,CXCL6,CXCL8,ERBB3,FGF2,FN1,GRN,HDAC6,HRAS,IL18,KLRC4-KLRK1/KLRK1,L1CAM,LOX,LTB4R2,MIF,MYH10,MYLK,NOV,NRG1,PAK1,PGF,PIK3C2G,PTGS2,PTN,RTN4,S100A8,S100A9,SEMA3B,SEMA3D,SEMA3F,SERPINA1,SIRPA,SNAI2,SRC,SYK,TIRAP,TREM1,TSC1,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３１】
前記(14)エイコサノイドの放出（release of eicosanoid）に関与している遺伝子としては、具体的には、BCL6,C3,CCL5,CTSB,CX3CL1,CXCL8,IL32,MIF,NMU,NRG1,NTS,PLA2G4A,PTGS2,SRC,SYK,TI及びCAM2よりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３２】
前記(15)炭水化物の代謝（metabolism of carbohydrate）に関与している遺伝子としては、具体的には、AGPAT1,ALDH1A1,ALDOC,APLN,BMP2,CBR3,CCL5,CHST15,CP,CS,CSGALNACT1,CTSB,CX3CL1,CXCL8,DIO2,DKK1,DPAGT1,FGF2,FOXA2,FUT2,GALNT5,GALT,GFPT2,GOT1,GRB10,GRK5,HAS3,HK2,HRAS,IL18,LPL,MIF,NR4A2,NRG1,NTS,PFKFB3,PPARGC1A,PPIP5K1,PPP1CB,PPP1R3C,PTGER4,RGS2,SIAE,SLC23A2,SLC5A3,SNCA,ST6GAL1,ST6GALNAC1,SYK,TIRAP,UGT1A6,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３３】
前記(16)脂肪酸の放出（release of fatty acid）に関与している遺伝子としては、具体的には、BCL6,C3,CCL5,CTSB,CX3CL1,CXCL8,IL32,MIF,NMU,NRG1,NTS,PLA2G4A,PPARGC1A,PTGS2,SRC,SYK,TICAM2,及びUCNよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３４】
前記(17)DNAの合成（synthesis of DNA）に関与している遺伝子としては、具体的に、ADM,AFAP1L2,ALDH3A1,AMH,ATF3,BMP2,BMP4,BMPR1B,CCDC88A,CCL5,CLU,CXCL8,ERBB3,FGF2,FN1,GRN,HRAS,IGFBP2,IGFBP4,IGFBP6,KIAA0101,KSR1,MIF,NCOA2,NOV,NRG1,NTS,PGF,PTGS2,PTN,RGS12,RRAD,SERPINA1,SNAI1,SPARC,SRC,及びTP73よりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３５】
前記(18)腫瘍細胞株の転移（migration of tumor cell lines）に関与している遺伝子としては、具体的には、ACSL4,ALCAM,ATF3,BMP2,CA9,CALML3,CCDC88A,CCL5,CD82,CHP2,CLU,COL18A1,CSK,CST6,CTSB,CX3CL1,CXCL8,DAB2,DDX58,DPAGT1,EPOR,ERBB3,F3,FGF2,FN1,FOXQ1,GRN,HAS3,HDAC6,HRAS,IGFBP2,IGFBP4,IGFBP6,IL32,ITGB6,KLF4,KLF5,KLK6,KLRC4-KLRK1/KLRK1,KRT8,L1CAM,LOX,MALAT1,MCAM,MIF,MMP1,MYH10,NOV,NR4A2,NRG1,NTRK2,PAK1,PDK1,PGF,PHLDA1,PTGER4,PTGS2,PTN,RAB21,RALGAPA2,S100A8,S100A9,SEMA3F,SERPINA1,SERPINF1,SIRPA,SNAI1,SNAI2,SPARC,SRC,ST6GAL1,SYK,TFPI,TP73,TSC1,VCAN,VEGFC,及びVSNL1よりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３６】
前記(19)腫瘍細胞株の分化（differentiation of tumor cell lines）に関与している遺伝子としては、具体的には、AJUBA, AKR1C3, BCL6, BMP2, BMP4, CD14, COL18A1, DAB2, EPOR, FEZ1, FGF2, FN1, FST, GCNT1, HRAS, JAG1, KLF4, KMT2A, MIF, mir-25, NOV, NRG1, NTRK2, PTGER4, PTGS2, SERPINB2, SIRPA, SNCA, SOX2, SPARC, SRC, SSBP2,TP73, 及びVCANよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３７】
前記(20)腫瘍細胞の増殖（proliferation of tumor cells）に関与している遺伝子としては、具体的には、AFAP1L2,ATF3,BMP2,BMP4,CA9,CD82,CST6,CTSB,CTSS,CTSV,CXCL8,DKK1,ERBB3,F3,FGF2,FGFR3,FST,GLDC,GRN,HDAC6,HRAS,IGFBP2,IL18,IL32,JAG1,KMT2A,LGALS7/LGALS7B,LOX,LUM,MCAM,MIF,mir-25,MKI67,NOV,NR4A2,NRG1,NTS,PFKFB3,PTGS2,PTN,PTPN13,RORC,S100A9,SEMA3B,SNAI1,SNAI2,SOX2,SRC,TP73,TRIM22,VCAN,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３８】
前記(21)チロシンリン酸化（tyrosine phosphorylation）に関与している遺伝子としては、具体的には、ADM,AFAP1L2,CADM1,CBLB,CCL5,CHST15,CNTN1,CSK,CX3CL1,EPOR,FGF2,FN1,MIF,MMP1,NRG1,PAG1,PSEN2,PTN,PTPN13,SRC,ST6GAL1,SYK,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３９】
前記(22)胚腹側発生(development of abdomen）に関与している遺伝子としては、具体的には、ADM,ALDH1A1,AMH,APLN,ARID5B,ATF3,BMP2,BMP4,CADM1,CD14,CLU,CTSS,CX3CL1,CYP11A1,CYP27B1,DKK1,DYNC2LI1,EPOR,ERBB3,FGF2,FOXA2,FOXD1,FST,GATA6,GCNT1,HDAC6,HRAS,IGFBP2,JAG1,KMT2A,KRT8,LIN7C,NFIL3,NRG4,NTRK2,PGF,PTGS2,RDH10,RORC,SCHIP1,SPRY1,SRC,STK36,TF,TP73,TSC1,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００４０】
前記(23)細胞転移（metastasis of cells）に関与している遺伝子としては、具体的には、AGR2,ALCAM,ANGPTL4,ATF3,BMP2,BMP4,CCDC88A,CD82,COL18A1,CTSB,CXCL6,CXCL8,DAPK1,F3,FGF2,FN1,IL18,LOX,LTB4R2,MALAT1,MBD2,MCAM,MMP1,MMP10,NBEAL2,NTRK2,PGF,PTGS2,SERPINA1,SNAI1,SNAI2,SRC,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００４１】
前記(24)細胞移動（cell movement）に関与している遺伝子としては、具体的には、ACSL4,ADARB1,ADM,AGR2,AJUBA,ALCAM,ALPP,AMOT,ANGPTL4,APLN,ARID5B,ATF3,ATG12,ATP2B4,BCAS3,BMP2,BMP4,C3,CA9,CADM1,CADPS2,CALML3,CBLB,CCDC88A,CCL5,CD14,CD58,CD82,CDK1,CFB,CHP2,CLU,CNTN1,COL17A1,COL18A1,CSK,CST6,CTSB,CTSS,CTSV,CX3CL1,CXCL6,CXCL8,DAB2,DDX58,DIO2,DKK1,DNAH11,DNAJB4,DPAGT1,DSG3,ECSCR,EDIL3,EMD,EPOR,EPS8,ERBB3,F3,FAAH,FGF13,FGF2,FGFR3,FN1,FOXA2,FOXQ1,FST,GADD45A,GALNT1,GATA6,GBA,GCNT1,GJB2,GRN,HAS3,HDAC6,HEY1,HRAS,ICAM2,IGFBP2,IGFBP4,IGFBP6,IL18,IL18BP,IL32,ITGB6,JAG1,KCNK2,KCNK5,KLF4,KLF5,KLK6,KLRC4-KLRK1/KLRK1,KMT2A,KRT10,KRT16,KRT8,L1CAM,LIMS1,LOX,LRIG1,LTB4R2,LTC4S,LUM,LYPD3,MALAT1,MCAM,MESP1,MIF,mir-25,MMP1,MMP10,MMP13,MYH10,MYLK,NFIL3,NMU,NOV,NR4A2,NRG1,NTRK2,NTS,PAK1,PAPPA,PARD6B,PCOLCE2,PDK1,PGF,PHLDA1,PIK3C2G,PLA2G4A,PLPP3,PMCH,PTGER4,PTGS2,PTN,PTPRR,RAB21,RALGAPA2,RAP2B,RGCC,RGS16,RORC,RTN4,S100A2,S100A8,S100A9,SCHIP1,SEMA3B,SEMA3D,SEMA3F,SEMA6D,SERPINA1,SERPINB2,SERPINE2,SERPINF1,SH3BP1,SIRPA,SNAI1,SNAI2,SNCA,SOCS2,SOX2,SPARC,SRC,ST6GAL1,SYK,TFPI,TIRAP,TNS3,TP73,TREM1,TSC1,TUBA1A,UCN,UCP2,UTRN,VCAN,VEGFC,VSNL1,WISP2,及びWLSよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００４２】
前記(25)血管内皮細胞の移動（movement of vascular endothelial cells）に関与している遺伝子としては、具体的には、ADM,BMP4,COL18A1,CXCL8,DIO2,DKK1,ECSCR,FGF13,FGF2,FN1,GATA6,KMT2A,LOX,NRG1,PLA2G4A,PTGS2,PTN,RTN4,SEMA3D,SNAI2,SPARC,SRC,及びVEGFCよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００４３】
前記(26)腫瘍進行（progression of tumor）に関与している遺伝子としては、具体的には、AGR2,ALCAM,CA9,CCL5,CLU,CXCL8,ERBB3,F3,FGF2,IGFBP2,IGFBP4,IGFBP6,IL18,MCAM,MIF,MMP1,PAK1,PTGS2,SERPINF1,SOX2,SRC,及びTSC1よりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００４４】
前記(27)細胞骨格の組織化（organization of cytoskeleton）に関与している遺伝子としては、具体的には、ABLIM3,ADM,AJUBA,AKAP2,AMOT,ANGPTL4,ATF3,BCAS3,BCL6,BICDL1,BMP2,BMP4,C2CD3,C3,CALML3,CAPN6,CCDC88A,CCL5,CD82,CDK1,CGN,CLN3,CLU,CNTN1,CSK,CTSS,CTSV,CUL7,CXCL8,DAPK1,DYNC2LI1,EPHX2,EPS8,F3,FEZ1,FGF13,FGF2,FHL3,FN1,GAS2L3,GRK5,GRN,HDAC6,HERC1,HRAS,IFT122,IGSF9,KLF5,KRT16,KRT4,L1CAM,LAMB2,LOX,LRRC4C,MAEA,MAOA,MICAL2,MNS1,MYH10,NRG1,NTRK2,NTS,PAK1,PARD6B,PKP1,PLXNA3,PSEN2,PTGS2,PTN,PVRL1,RAB21,RGS2,RRAD,RTN4,S100A8,S100A9,SEMA3D,SEMA3F,SERPINF1,SIPA1L1,SIRPA,SLITRK6,SNCA,SNX10,SPARC,SRC,STK36,SYK,TF,TSC1,TUBGCP6,UCN,UGT8,VEGFC,及びWISP2よりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００４５】
前記(29)細胞活性化（activation of calls）に関与している遺伝子としては、具体的には、APLN,ATF3,BLNK,BMP2,C3,CADM1,CBLB,CCL5,CD14,CD58,CPE,CSK,CTSS,CX3CL1,CXCL6,CXCL8,DDX58,DKK1,ENTPD2,F3,FGF2,FGFR3,FN1,FOXA2,FOXD1,FZD5,GADD45A,GRN,HAS3,HDAC6,HLA-DMA,HLA-DPA1,HNRNPD,ICA1,ICAM2,IL18,IL32,ITGB6,KLF4,KLRC1,KLRC2,KLRC4-KLRK1/KLRK1,KRT8,KSR1,LIN7C,MIF,MMP1,MMP13,NBEAL2,NFIL3,NMU,NOV,NRG1,NTS,PAG1,PLA2G4A,PSEN2,PTGER4,PTGS2,RAP2B,RGCC,RORC,S100A8,S100A9,SATB1,SERPINA1,SERPINE2,SERPINF1,SERPINF2,SIAE,SIRPA,SNCA,SOCS2,SRC,ST6GAL1,SYK,TF,TIRAP,TP73,TREM1,及びVCANよりなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００４６】
本発明において、前記機能に関連している遺伝子の発現が増加又は低下していることについては、前記機能の亢進に関連している遺伝子の場合であれば、同じ分離源の癌非幹細胞（幹細胞ではない癌細胞）における各遺伝子の発現量よりも、２倍以上、好ましくは４〜１０倍、更に好ましくは７〜１０倍であることを指し、前記機能の抑制に関連している遺伝子の場合であれば、同じ分離源の癌非幹細胞（幹細胞ではない癌細胞）における各遺伝子の発現量よりも、１／２倍以下、好ましくは１／４〜１／１０倍、更に好ましくは１／７〜１／１０倍であることを指す。
【００４７】
前記機能に関連している各遺伝子の発現量については、次世代シーケンサー等を使用した公知の遺伝子解析手法によって求めることができる。
【００４８】
本発明の癌幹細胞の由来については、特に制限されず、癌幹細胞の使用目的等に応じて、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル等の哺乳動物由来のものから適宜選択されるが、作製された癌幹細胞をヒトの癌に対する創薬ツールや診断薬の開発ツールとして使用する場合には、ヒト由来であることが好適である。
【００４９】
本発明の癌幹細胞の取得を容易にする寄託株の具体例として、Panc-1 3-4 CST001株が挙げられる。当該Panc-1 3-4 CST001株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に受託番号NITE BP-02449として国際寄託（日本国での国内寄託の受託日2017年3月22日、ブダペスト条約に基づく国際寄託への移管日2018年3月20日）されている。当該Panc-1 3-4 CST001株の中には、1個の細胞であっても腫瘍組織を形成でき、CD44v9を高発現し、前記(1)〜(29)の機能に関連している遺伝子の発現量が増加されているヒト由来の癌幹細胞（ZsGreen+/CD44v9high細胞）が含まれている。
【００５０】
２．癌幹細胞株の樹立方法
本発明の癌幹細胞は、癌幹細胞を含む癌細胞群から、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を分離して濃縮することによって得ることができる。
【００５１】
「癌幹細胞を含む癌細胞群」は、癌患者から摘出した癌組織から得られた細胞群であってもよく、また癌細胞としてストックされている細胞群であってもよい。通常、癌組織や癌細胞としてストックされている細胞群には、ごく僅かな割合で癌幹細胞が含まれている。
【００５２】
癌細胞群の癌種については、特に制限されず、あらゆる癌由来の癌細胞群を使用することができる。本発明で使用する癌細胞群の由来としては、具体的には、膵臓癌、結腸直腸癌、大腸癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆管癌、肺癌、皮膚癌等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは膵臓癌が挙げられる。
【００５３】
また、癌細胞群の由来については、特に制限されず、あらゆる哺乳動物由来のものを使用でき、その具体例や好適なもの等については、前記「１．癌幹細胞の特性等」の欄に示す通りである。
【００５４】
本発明において「２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞」とは、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低下しており、癌幹細胞としての特性を有している細胞である。「２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞」とは、例えば、後述する標識したオルニチンデカルボキシラーゼデグロンを形質導入して２〜３週間培養・セレクションした後に、標識物質が検出される細胞であり得る。
【００５５】
癌細胞群から２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を分離・濃縮する方法については、特に制限されないが、例えば、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を標識化して、標識化された細胞を濃縮する方法が挙げられる。
【００５６】
癌細胞群に含まれる２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を標識化する方法については、特に制限されないが、好ましくは、癌細胞群に対して、標識したオルニチンデカルボキシラーゼデグロン（Ornithine Decarboxylase-Degron；ODC-Degron）を形質導入する方法が挙げられる。２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞は、ODC-Degronを分解できないため、当該ODC-Degronに導入している標識物が細胞内で蓄積し、標識化することが可能になる。
【００５７】
ODC-Degronの標識化に使用される標識物質の種類については、特に制限されないが、例えば、GFP、YFP、ZsYellow、Dsred、Amcyan、mCherry、mOrange、mCerulean等の蛍光タンパク質が挙げられる。また、癌細胞群に対して標識化したODC-Degronの形質導入は、ベクターを使用する方法；リン酸カルシウム法；リポフェクション法；エレクトロポレーション法；マイクロインジェクション法等の公知の手法によって行うことができる。
【００５８】
癌細胞群の内、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞は、ほんの僅かな割合でしか存在していない。そのため、標識化した２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を濃縮する。
【００５９】
標識化した２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞を濃縮する方法については、特に制限されないが、腫瘍形成能が高い癌幹細胞を効率的に得るという観点から、好ましくは、標識物質の検出量が多い細胞をFACS等によって分画する方法が挙げられる。
【００６０】
また、２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞の濃縮は、濃縮された細胞の総数に対して２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞が６０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは７５％以上、特に好ましくは８０％以上になるように行えばよい。
【００６１】
このように濃縮された２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞は、癌幹細胞として、優れた腫瘍形成能を有しており、２００個以下という少ない細胞数であっても、腫瘍を形成することができる。
【００６２】
また、このようにして得られた癌幹細胞（２６ｓプロテオソームの代謝機能が低い細胞）から、更にCD44v9を高発現している癌幹細胞を分離することによって、腫瘍形成能が顕著に高い癌幹細胞を得ることもできる。
【００６３】
CD44v9を高発現している癌幹細胞の分離は、抗CD44v9抗体を使用したFACS解析によるセルソーティング等の公知の手法を用いて行うことができる。また、「CD44v9を高発現している」ことの指標については、前記「１．癌幹細胞の特性等」の欄に示す通りである。
【００６４】
３．癌幹細胞の利用
本発明の癌幹細胞は、その特性を分析することにより、癌の発生、進行、転移等の機序の解明に役立てることができ、更にはその分化誘導や増殖制御を行うことができる物質をスクリーニングすることが可能になる。具体的には、上記で得られる癌幹細胞に対して、被験物質（スクリーニングに供される候補物質）を接触させ、癌幹細胞の分化の有無を測定し、癌幹細胞を分化させた被験物質を選択することによって、癌幹細胞を分化誘導させる物質をスクリーニングすることが可能になる。また、上記で得られる癌幹細胞に対して、被験物質（スクリーニングに供される候補物質）を接触させ、癌幹細胞の増殖の程度を測定し、癌幹細胞の増殖を抑制させた被験物質、又は癌幹細胞の増殖を促進させた被験物質を選択することによって、癌幹細胞の増殖を抑制できる物質又は癌幹細胞の増殖を促進する物質をスクリーニングすることが可能になる。
【００６５】
また、癌幹細胞は、癌の発症、進行、転移を担っているので、本発明の癌幹細胞は、癌治療薬のスクリーニングや癌治療薬の薬効評価等に使用することもできる。具体的には、本発明の癌幹細胞に対して、被験物質（スクリーニングに供される候補物質）を接触させ、癌幹細胞の生育の有無を測定し、癌幹細胞の生育を阻害した被験物質を選択することによって、癌の治療薬をスクリーニングすることが可能になる。また、本発明の癌幹細胞に対して、癌の治療薬を接触させ、癌幹細胞の生育阻害の程度を測定することによって、癌幹細胞の生育阻害の程度が大きい程、癌の治療薬の薬効は高く、癌幹細胞の生育阻害の程度が小さい程、癌の治療薬の薬効は低いと評価することができる。なお、「癌幹細胞の生育阻」害とは、癌幹細胞の生育を止める又は生育能を減弱化させる場合のみならず、癌幹細胞を死滅させる場合も包含する。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。
実施例１：癌幹細胞の分離及び特性解析
１．癌幹細胞の分離
膵臓癌細胞株（Panc-1）に対して、GFPで蛍光標識されたODC (Ornithine Decarboxylase)-Degronシステムを、レトロウイルスベクターにて形質導入を行った。使用したODC-Degronをコードしている塩基配列は、配列番号１に示す通りである。形質導入後、２〜３週間培養・セレクションを行い、細胞の観察を行った。その結果を図１ａに示す。図１ａから分かるように、膵臓癌細胞株Panc-1にODC-degronシステムを導入しても、蛍光（緑）を発する細胞（癌幹細胞）は全体の約0.06％しか得られなかった。このような少数の癌幹細胞では、薬剤のスクリーニングをはじめとする一連の実験ができない。【００６７】
そこで、次に、セルソーター（SONY社SH800Z  purity sorting mode）を用いて、蛍光（緑）を発する細胞（癌幹細胞）をソーティングして、10ml DMEM(FBS10%, G418 1mg/ml)入りの10cm dish に入れて、２週間の培養によって、蛍光を発する細胞（癌幹細胞）を濃縮した。濃縮した細胞を観察した結果を図１ｂに示す。このように、蛍光を発する細胞（癌幹細胞）を濃縮することにより、蛍光の発色認められる細胞（即ち、癌幹細胞）が、全体の約81.18％を占める癌幹細胞集団が得られた。得られた癌幹細胞集団をZsGreen+とした。【００６８】
２．癌幹細胞の特性の解析
得られた癌幹細胞集団（ZsGreen+）について、癌幹細胞の特性を確認するために、スフェアーの形成能、抗癌剤耐性、幹細胞マーカーの発現能、及び非対称性分裂能の確認を行った。なお、比較のために、膵臓癌細胞株Panc-1にODC-degronシステムを導入し、蛍光を発しなかった非癌幹細胞集団（ZsGreen-）についても、同様に特性解析を行った。【００６９】
スフェアーの形成能については、（DMEM）培地に各細胞集団を96-well Ultra Low Cluster Plateを用いて100〜3000 cells/wellとなるように接種し、37℃で培養した後に、２週間に渡り細胞の状態を観察することにより確認した。【００７０】
抗癌剤耐性については、オキサリプラチン（L-OHP）を2又は5μMとなるように添加した培地（FBSを10容量％含むDMEM培地）に各細胞集団を96穴プレートにて5000〜10000 cells/wellとなるように接種し、37℃で2〜４日間培養した後に、生細胞数を計測し、細胞生存率（Cell viability、%）を求めた。【００７１】
幹細胞マーカーの発現については、幹細胞マーカーであるBmi1及びCD44v9、並びに癌幹細胞特異的マーカーであるDclk1の発現を（qPCR及びウエスタンブロッティング）により測定した。なお、Bmi1及びDclk1の発現量についてはハウスキーピング遺伝子（GAPDH）の発現量で補正し、CD44v9の発現量についてはハウスキーピング遺伝子（Actin）の発現量で補正した。【００７２】
非対称性分裂能については、ibidi 35mm Plateにて培地（FBSを10容量％含むDMEM培地）に各細胞集団を1000〜10000 cells/plateとなるように接種し、37℃で１日間培養した後に、１週間に渡り細胞の状態を継続的に観察することにより確認した。なお、癌幹細胞では、癌幹細胞では、非対称に分裂して異なる性質の娘細胞を産み、遺伝的に不均一な細胞分裂を行う特性がある。【００７３】
図２に、癌幹細胞集団（ZsGreen+）及び非癌幹細胞集団（ZsGreen-、ネガティブコントロール）について、癌幹細胞の特性の有無を確認した結果を示す。図２において、ａにはスフェアー形成能を評価した結果、ｂには抗癌剤耐性を評価した結果、ｃには幹細胞マーカーの発現能を評価した結果、ｄには非対称性分裂能を評価した結果を示す。この結果、癌幹細胞集団（ZsGreen+）には、スフェアー形成能、抗癌剤耐性、及び対称性分裂能があり、幹細胞マーカーと癌幹細胞特異的マーカーの発現が認められ、癌幹細胞としての特性を有していることが確認された。【００７４】
３．造腫瘍能の解析
得られた癌幹細胞集団（ZsGreen+）の造腫瘍能を確認するために、以下の試験を行った。先ず、６〜８週齢のSCID beigeマウス（n=3）に、癌幹細胞集団（ZsGreen+）をそれぞれ150cellsとなるように皮下移植を行なった。６週間後に、細胞を移植した部位を観察し、腫瘍の形成の有無を確認した。また、比較のために、非癌幹細胞集団（ZsGreen-）についても、同様に造腫瘍能の解析を行った。【００７５】
得られた結果を図３に示す。この結果、癌幹細胞集団（ZsGreen+）は、わずか150 cellsの移植で直径約10mm以上の腫瘍を形成できており、造腫瘍能が高いことが明らかとなった。一方、非癌幹細胞集団（ZsGreen-）では、150 cellsの移植では腫瘍を形成できていなかった。【００７６】
実施例２：CD44v9を高発現する癌幹細胞の分離及び特性解析
１．CD44v9を高発現する癌幹細胞の分離
前記実施例１で得られた癌幹細胞集団（ZsGreen+）及び非癌幹細胞集団（ZsGreen-）について、抗CD44v9抗体を用いたFACSによって、CD44v9の発現量に応じて、CD44v9を高発現している群と、CD44v9を高発現していない群に分けた。細胞集団の中でCD44v9発現量が最小（検出閾値）の細胞に比べて、CD44v9発現量が１０倍以上である細胞をCD44v9高発現、CD44v9発現量が５倍未満である細胞をCD44v9非高発現として群分けした。以下、癌幹細胞集団（ZsGreen+）の内、CD44v9高発現の細胞集団を「ZsGreen+/CD44v9high」、癌幹細胞集団（ZsGreen+）の内、CD44v9非高発現の細胞集団を「ZsGreen+/CD44v9-」、非癌幹細胞集団（ZsGreen-）の内、CD44v9高発現の細胞集団を「ZsGreen-/CD44v9high」、及び非癌幹細胞集団（ZsGreen-）の内、CD44v9高発現の細胞集団を「ZsGreen-/CD44v9-」と表記する。【００７７】
２．造腫瘍能の解析
実施例１に示す「３．造腫瘍能の解析」と同条件で、造腫瘍能の解析を行った。得られた結果を図４に示す。移植６週間後には、ZsGreen-/CD44v9highの細胞集団では150 cellsの移植による腫瘍形成は認められなかったが、ZsGreen+/CD44v9high及びZsGreen+/CD44v9-の細胞集団では、150 cellsの移植でいずれも直径約15mmの腫瘍の形成が認められた。【００７８】
３．次世代シークエンスによる遺伝子解析
ZsGreen+/CD44v9high、ZsGreen+/CD44v9-、及びZsGreen-/CD44v9-の細胞集団について、分子間分子間ネットワーク・パスウェイ解析を用いて、遺伝子的な相違を分析した。【００７９】
具体的には、TruSeq stranded mRNA sample prep kit (Illumina, San Diego, CA)を用いて、製造元の指示書に従ってmRNAライブラリーを準備した。シーケンス決定は、Illumina HiSeq 2500 platform（75-base single-end mode）を用いて行った。ベースコールは、Illumina Casava1.8.2 ソフトウェアを用いて行った。決定した配列は、Bowtie2 ver. 2.2.3 とSAMtools ver. 0.1.19TopHat v2.0.13を組み合わせたTopHat v2.0.13を用いて、マウス参照ゲノム配列（mm10）にマップした。100万個のリード配列をマッピングし、転写産物（フラグメント）の長さを1キロbaseとしたときの正規化された遺伝子発現量をCuffnorm version2.2.1を用いて算出した。【００８０】
次いで、Subio社製オミクス解析ソフトウエアSubio platform (ver. 1.19; Subio, Kagoshima, Japan)で主成分解析、ソフトウエアIPA(Ingenuity Pathway Analysis、IPA, QIAGENRedwood City)でpathway解析を行った。【００８１】
ZsGreen-/CD44v9-の細胞集団に比べて、ZsGreen+/CD44v9-の細胞集団おいて、Fold changeが±２, p<0.05の遺伝子群が約600個認められた。一方、ZsGreen-/CD44v9-の細胞集団に比べて、ZsGreen+/CD44v9highの細胞集団おいて、Fold changeが±２, p<0.05の遺伝子群が約760個認められた。ZsGreen+/CD44v9-及びZsGreen+/CD44v9highの細胞集団についてIPA解析をしたところ、表１に示すように、両者には明らかな差を認めた。即ち、ZsGreen+/CD44v9-の細胞集団(vs ZsGreen-/CD44v9-)に比べて、ZsGreen+/CD44v9highの細胞集団(vs ZsGreen-/CD44v9-)では、growth of tumor, migration of tumor cell lines, differentiation of tumor cell lines, proliferation of tumor cells, progression of tumorといった腫瘍組織の増殖・進行、腫瘍細胞の転移・分化・増殖に関わるpathwayの活性化（Activation z-scoreを2.0以上とした）が認められた。一方、ZsGreen+/CD44v9-の細胞集団(vs ZsGreen-/CD44v9-)では、活性化されたpathwayには腫瘍関連のものはなかった。以上の結果から、ZsGreen+/CD44v9highの細胞集団は、極めて活発な腫瘍細胞の集まりであることが分かった。【００８２】
【表１】
2018181878.tif 000002
【００８３】
実施例３：ZsGreen+/CD44v9highの細胞集団から癌幹細胞の株化及びその造腫瘍能の解析
１．癌幹細胞の株化
ZsGreen+/CD44v9highの細胞集団を抗生剤G418入りの培地で培養し、マウス由来細胞を除去し、株化を行った。株化された癌幹細胞を純粋培養し、細胞をストックした（1×106個/ml セルバンカー細胞凍結保存液）。株化された癌幹細胞の一つを株名「Panc-1 3-4 CST001株」とし、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託した（受託番号：NITE BP-02449）。【００８４】
２．造腫瘍能の解析
前記で株化した癌幹細胞の造腫瘍能の解析を行った。試験方法は、投与する細胞数を１個として基剤（DMEM:matrigel（容量比）=1:1 total 100μl）に包埋させた状態で細胞を移植したこと以外は、実施例１に示す「３．造腫瘍能の解析」と同条件を採用した。【００８５】
得られた結果を図５に示す。この結果、前記で株化した癌幹細胞は、細胞数１個を移植しただけであっても、移植４５日目に腫瘍形成が認められ、その後の２週間は劇的な腫瘍組織の増大が認められた。
【図１】
2018181878.tif 000003
【図２】
2018181878.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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