(57)【要約】【課題】高リスクな骨髄異形成症候群の治療薬として臨床使用されている注射剤（「ビダーザ(登録商標）」や「ダコジェン(登録商標）」）に代わり、加水分解的代謝酵素シチジンデアミナーゼに対して高い安定性を有し、且つ、経口投与でも体内に吸収され、核酸生合成ルートに取り込まれてＤＮＡメチル基転移酵素ＤＮＭＴを阻害する作用を有する薬剤を様々な進行性固形がんの治療薬もしくは予防薬として提供すること。【解決手段】  式（Ｉ）：2018199049.tif 000014  （式中、Ｒは水酸基又は水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ置換基を有していてもよいベンジル基）で表される新規化合物が上記課題を解決した。【選択図】なし
2018199049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
2018199049.tif 000013
（式中、Ｒは水酸基又は水素原子であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ同一又は異なって、置換基を有していてもよいベンジル基である。）で表される化合物又は其の塩を含有する固形がんの予防・治療剤。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ置換基としてアルキル又はハロゲン原子を有していてもよいベンジル基である、請求項１に記載の固形がんの予防・治療剤。
【請求項３】
アルキルがC1〜C6アルキル基である、請求項２に記載の固形がんの予防・治療剤。
【請求項４】
アルキルがメチル基又はエチル基である、請求項２に記載の固形がんの予防・治療剤。
【請求項５】
ハロゲン原子がフッ素原子、塩素原子又は臭素原子である、請求項２に記載の固形がんの予防・治療剤。
【請求項６】
Ｒ１及びＲ２がベンジル基である、請求項１に記載の固形がんの予防・治療剤。
【請求項７】
固形がんが、ＤＮＭＴによって惹起される進行性固形がんである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の固形がんの予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解的代謝酵素シチジンデアミナーゼに対する高い安定性を有し、且つ、５−アザシチジンや其の２’−デオキシ体に代わり得る経口投与可能な新規ＤＮＭＴ阻害剤の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＭＴsとは、ＤＮＡメチル基転移酵素群（ＤＮＡ-methyltransferases）の略称であり、ＤＮＡ鎖中のアデニン環６位アミノ基のメチル化（Adenine N6-specific DNA-methyltransferase: EC 2.1.1.72）またはシトシン環４位アミノ基のメチル化（Cytosine N4-specific DNA-methyltransferase: EC 2.1.1.113）、シトシン環５位へのメチル化（Cytosine C5-specific DNA-methyltransferase: EC 2.1.1.37）を触媒する酵素群である。特に、発現遺伝子のプロモーター領域によく認められるCpG アイランドと称される配列部分においてシトシン環５位へのメチル化を触媒する酵素群（維持メチル基転移酵素：ＤＮＭＴ１やde novo メチル基転移酵素：ＤＮＭＴ３  ｆａｍｉｌｙ）は、高等生物の正常な発生と細胞の分化を調節する際に極めて重要な役割を果たしている（非特許文献１と非特許文献２）。【０００３】
また、ＤＮＭＴは、がんの発達においても深く関係している。即ち、全てのCpGアイランドの６０−９０％はシトシン環５位がメチル化されていると考えられているが、異常なレベルのＤＮＡメチル化は発現遺伝子のサイレンシングと深く関連しており、プロモーター領域（CpGアイランド）が高レベルにシトシン環５位メチル化されている遺伝子は、その転写・発現がサイレンシングしていることが明らかにされている。なお、この異常ＤＮＡメチル化様式は、正常組織と比較して過剰メチル化と低メチル化の２つの異なる形があり、過剰メチル化は、がん抑制遺伝子のサイレンシングと深く関連している一方、広範囲な低メチル化もまた、異なる機構でがんの発達及び悪性化と関連している。このような発現遺伝子のサイレンシングは、例えば、がん抑制遺伝子ｐ５３の場合は大腸がんや乳がん等非組織的に見られ、がん抑制遺伝子Rbの場合は網膜芽細胞腫や骨肉腫等で、がん抑制遺伝子BRCA1の場合は家族性乳がんや子宮がん等で認められている（非特許文献３〜非特許文献５）。【０００４】
一方、細胞には、新しく作られるＤＮＡ鎖においても同じ位置のシトシン環５位へメチル基を導入するしくみが備わっており、この「ＤＮＡメチル化の複製」を可能にしているのもＤＮＭＴである。それ故、がん化した細胞では、がん抑制遺伝子の多くが転写・発現抑制されてサイレンシング状態になり、増殖しやすい状態になっている。【０００５】
なお、このシトシン環５位のメチル化に関しては、ＤＮＭＴの触媒活性中心にあるシステイン残基のSH基がＤＮＡ配列中のシトシン環６位を攻撃することによりシトシン環５位が活性化され、メチル基供与体S−アデノシル−L−メチオニンからのメチル基転移を促すという反応機構が提案されている。【０００６】
このような背景を持つＤＮＭＴに対する選択的な酵素阻害剤として、５−アザシチジンや其の２’−デオキシ体（デシタビン）が見いだされ、「ビダーザ(登録商標）」や「ダコジェン(登録商標）」という薬剤名で、高リスクな骨髄異形成症候群や急性骨髄白血病治療薬として臨床使用されている。なお、これらの薬剤はシトシンヌクレオシド類と化学構造（シトシン環５位炭素原子が窒素原子に置換された構造）が酷似しており、核酸生合成ルートを経て、２’−デオキシシチジンの代わりにＤＮＡ中へ入り込むことにより、がん抑制遺伝子プロモーター領域（CpGアイランド）におけるＤＮＭＴによるシトシン環５位のメチル化反応を自殺的に阻害し、がん抑制遺伝子の正常な発現を可能にして治療効果を現わすとされている。 
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【０００７】
このような作用機序を有する薬剤は、本来ならば広範囲な抗がん剤としての利用が可能であるが、いずれの化合物も血中もしくは肝臓内に存在する代謝酵素シチジンデアミナーゼにより容易に加水分解されるという欠点があるために、高リスクな骨髄異形成症候群や急性骨髄白血病治療薬としての臨床使用に留まり、また、化学的な不安定性を有するが故に、注射剤としての剤形に留まっている。それ故、シチジンデアミナーゼに対して高い安定性を有し、且つ、５−アザシチジンや其の２’−デオキシ体に代わり得る経口投与可能な薬剤の出現が望まれている。【０００８】
なお、最近、加水分解的代謝酵素シチジンデアミナーゼに対して高い安定性を有する化合物SGI-110（グアデシタビン）（特許文献１〜２）が見出され、５−アザ−２’−デオキシシチジンのプロドラッグとして臨床開発が進められているが、この化合物はジヌクレオチド構造を有するために非常に極性が高く細胞膜の透過が容易でなく、経口投与剤としては不向きである（非特許文献６〜７）。
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【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国公開２００７０７２７９６号公報（日本特許５０３０９５８号明細書）．
【特許文献２】国際公開２０１３０３３１７６号公報（日本特許６０３８９２１号明細書）．
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ケミカル  レビューズ（Chemical Reviews），２０１５年，第１１５巻,  第６号, ｐ．２２４０−２２５４．
【非特許文献２】バイオモレキュールス（Biomolecules），２０１７年, 第７巻，第１号，３．
【非特許文献３】単行本「エピジェネティックス：ア  レファレンス  マヌアル」（Epigenetics: A Reference Manual），２０１１年，クレイグＪＭ，ワングＮＣ著，カイスターアカデミックプレス.
【非特許文献４】セル  アンド  バイオサイエンス（Cell & Bioscience），２０１４年 , 第４巻, ４６.
【非特許文献５】モレキュラー  キャンサー（Molecular Cancer）,２０１７年，第１６巻，２９．
【非特許文献６】オンコターゲット（Oncotarget），２０１７年, 第８巻, 第２号，ｐ．２９４９−２９５９．
【非特許文献７】エピジェネティックス（Epigenetics）, ２０１６年, 第１１巻，第１０号，ｐ．７０９−７２０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、加水分解的代謝酵素シチジンデアミナーゼに対して高い安定性を有し、且つ、５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体に代わり得る経口投与可能な化合物を創製し、高リスクな骨髄異形成症候群や急性骨髄白血病の治療薬としてのみならず、様々な固形癌（例えば、大腸がんや乳がん、子宮がん、胃がん、肺がん等）の治療薬もしくは予防薬として提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、高リスクな骨髄異形成症候群を含む様々な骨髄腫瘍の治療薬として５−アザシチジン（「ビダーザ(登録商標）」）や其の２’−デオキシ体（「ダコジェン(登録商標）」）よりも有用な医薬品を提供するため、加水分解的代謝酵素シチジンデアミナーゼに対する高い安定性を有し、且つ、生体内で核酸生合成ルートへ容易に入り込むことができる優れた薬理作用と物理化学的性質を兼ね備えた新たな化合物を見出すべく鋭意研究を行ってきた。その中で、５−アザシチジンや其の２’−デオキシ体の様々な５’位モノ燐酸ジアルキルエステル誘導体を合成し、それらの化学的反応性と生物活性を調べた結果、対応する５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体が、シチジンデアミナーゼに対する優れた安定性を有し、且つ、抗骨髄腫瘍活性を示すことを見出し、これらの知見を下に、更に詳細な検討を重ね、本発明を完成するに到った。【００１３】
すなわち、最近、開発した簡便なＤＮＭＴ阻害活性スクリーニング評価系（Epigenetics, 2016, Dec 9:0: Establishment of a high-throughput detection system for DNA demethylating agents, E. Okochi-Takada, N. Hattori et al.）を用いて、５−アザシチジンや其の２’−デオキシ体の様々な５’位モノ燐酸ジアルキルエステル誘導体につき評価したところ、5−アザ−２’−デオキシシチジンの５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体はいずれも非常に高いＤＮＭＴ阻害活性を有していることが確認できた。このＤＮＭＴ阻害活性は、これらの化合物が、ターゲットとする細胞内で酵素的もしくは非酵素的に活性化され、核酸生合成ルートを経てＤＮＡ中に取り込まれた結果であると解釈された。加えて、これら5−アザ−２’−デオキシシチジンの５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体は脂溶性が高く、経口投与が可能な物理化学的性質を有していることから、これらの化合物はいずれも、ＤＮＭＴが関連している様々な固形がんの経口投与可能な治療薬として利用できると推測された。加えて、その作用機序の考察（ＤＮＭＴ阻害によるがん抑制遺伝子の復活）から、ＤＮＭＴが関連している様々な固形がんの予防薬としての利用も可能であると推測された（Gastric Cancer, 2017, 20, 136-145 や Cancer Prevention Research, 2013, 6(4), 263-270 を参照）。【００１４】
これらの知見を踏まえて、本発明は、下記記載の発明を提供することにより上記課題を解決したものである。
〔１〕
式（Ｉ）：
2018199049.tif 000005
（式中、Ｒは水酸基又は水素原子であり、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ同一又は異なって、置換基を有していてもよいベンジル基である。）で表される化合物又は其の塩を含有する固形がんの予防・治療剤。
〔２〕
Ｒ１及びＲ２がそれぞれ置換基としてアルキル又はハロゲン原子を有していてもよいベンジル基である、〔１〕に記載の固形がんの予防・治療剤。
〔３〕
アルキルがC1〜C6アルキル基である、〔２〕に記載の固形がんの予防・治療剤。
〔４〕
アルキルがメチル基又はエチル基である、〔２〕に記載の固形がんの予防・治療剤。
〔５〕
ハロゲン原子がフッ素原子、塩素原子又は臭素原子である、〔２〕に記載の固形がんの予防・治療剤。
〔６〕
Ｒ１及びＲ２がベンジル基である、〔１〕に記載の固形がんの予防・治療剤。
〔７〕
固形がんが、ＤＮＭＴによって惹起される進行性固形がんである、〔１〕ないし〔６〕のいずれか１項に記載の固形がんの予防・治療剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体は、対応する５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体よりも脂溶性が高くなるので、経口投与が可能となり、腸部で吸収された後、血中もしくは肝臓内で加水分解的代謝酵素シチジンデアミナーゼの影響を受けることなく、固形がん細胞の細胞膜を通過して、細胞膜内又は細胞内で非酵素的・酵素的に加水分解されて活性化され、核酸生合成ルートを経てＤＮＡに組み込まれることによりＤＮＭＴ阻害活性を示すと推測されることから、様々な固形癌、特に、ＤＮＭＴによって惹起される進行性固形がんの治療薬もしくは予防薬として機能することが期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特に言及しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で用いた用語は以下に述べる意味を有する。
【００１７】
本発明の化合物又は其の塩
本発明の化合物は、下記の式（Ｉ）で表される化合物である。
2018199049.tif 000006
（式中、Ｒは水酸基又は水素原子であり、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ置換基を有していてもよいベンジル基である。Ｒ１、Ｒ２は同一であってもよく、異なってもよい。）
式（Ｉ）の具体的な例としては、下記の式（Ｉa）及び式（Ｉb）が挙げられる。
2018199049.tif 000007
【００１８】
「置換基を有していてもよいベンジル基」とは、置換基を有していてもよく、また有していなくてもよい。置換基は、ベンジル基の置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１〜３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合は各置換基が同一又は異なっていてもよい。置換基としては、アルキル基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基等が挙げられるが、好ましい置換基の例は、アルキル基及びハロゲン原子である。
【００１９】
「アルキル基」とは、特に限定しない限り、飽和脂肪族炭化水素基、例えば炭素数が１〜２０の直鎖または分岐鎖状のアルキル基あるいは環状のアルキル基を示す。直鎖または分岐鎖状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等のＣ１〜Ｃ６アルキル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、５−メチルヘキシル基、１，１−ジメチルペンチル基、２，２−ジメチルペンチル基、４，４−ジメチルペンチル基、１−エチルペンチル基、２−エチルペンチル基、１，１，３−トリメチルブチル基、１，２，２−トリメチルブチル基、１，３，３−トリメチルブチル基、２，２，３−トリメチルブチル基、２，３，３−トリメチルブチル基、１−プロピルブチル基、１，１，２，２−テトラメチルプロピル基、オクチル基、１−メチルヘプチル基、３−メチルヘプチル基、６−メチルヘプチル基、２−エチルヘキシル基、５，５−ジメチルヘキシル基、２，４，４−トリメチルペンチル基、１−エチル−１−メチルペンチル基、ノニル基、１−メチルオクチル基、２−メチルオクチル基、３−メチルオクチル基、７−メチルオクチル基、１−エチルヘプチル基、１，１−ジメチルヘプチル基、６，６−ジメチルヘプチル基、デシル基、１−メチルノニル基、２−メチルノニル基、６−メチルノニル基、１−エチルオクチル基、１−プロピルヘプチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル等の置換基を挙げることができるが、Ｃ１〜Ｃ６アルキルの基が好ましい。Ｃ１〜Ｃ６アルキルの基の好ましい例は、メチル基及びエチル基である。環状のアルキル基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等の基を挙げることができる。また、環状のアルキル基の好ましい例は、シクロペンチル基及びシクロヘキシル基である。
【００２０】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等を示し、好ましい例は、フッ素原子及び塩素原子及び臭素原子である。
【００２１】
本発明の式（Ｉ）で表わす化合物の塩は、薬理学的に許容される塩であれば如何なる塩であってもよい。其の塩としては、例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、硫酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩等）、有機酸塩（例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、蓚酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等）等の酸付加塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
本発明の式（Ｉ）で表わす化合物は、結晶であってもよく、結晶形が単一であっても、複数の結晶形の混合物であってもよい。結晶は、自体公知の結晶化法を適用して、結晶化することによって製造することができる。
【００２３】
また、本発明の式（Ｉ）で表わす化合物は、溶媒和物（例えば、水和物など）であってもよく、溶媒和物及び無溶媒和物（例えば、非水和物など）のいずれも式（Ｉ）で表わす化合物に包含される。
【００２４】
本発明の５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体は、５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体のプロドラッグもしくは５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸エステルのプロドラッグとなり得る。
【００２５】
５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体は、シチジンデアミナーゼに対して非常に安定であることから、消化管より吸収されたこれらの誘導体は血中や肝臓にある酵素シチジンデアミナーゼによる加水分解的代謝を受けにくい性質を有していることが期待される。
【００２６】
上記の加水分解的代謝酵素に対する高い安定性が期待され、本発明に係る５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体は、ＤＮＭＴによって惹起される疾病の治療薬もしくは予防薬となり得る。
【００２７】
５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体のために用いたＤＮＭＴ阻害活性評価スクリーニング系とは、最近、我々が開発した評価系（Epigenetics, 2016, Dec 9:0: Establishment of a high-throughput detection system for DNA demethylating agents, E. Okochi-Takada, N. Hattori et al.）であり、ＤＮＡメチル基転移酵素（ＤＮＭＴ）を阻害することにより発現遺伝子プロモーター領域のシトシン環５位メチル化が抑制されると蛍光発光性蛋白質ルシフェラーゼが発現できるように遺伝子改変した大腸がん細胞を用いる簡便なＤＮＭＴ阻害活性評価スクリーニング系である。
本発明の式（Ｉ）で表わす化合物の製造法
【００２８】
本発明の化合物は、例えば、以下に示す方法又はこれに準じた方法などによって製造することができる。
【００２９】
Ａ法
式（Ｉ）で表わす化合物又は其の塩は、自体公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造することができる（Bulletin of the Chemical Society, 1969, 42(12), 3505-8、Nucleic Acids Research, 1984, 12, 5025-36、Chemical &  Pharmaceutical Bulletin,1995, 43(2), 210-215、WO-2011113173などを参照）。例えば、市販の５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体を適切な溶媒中、オキシ塩化リンにより活性化した後、置換基を有していてもよいベンジルアルコールと脱ハロゲン化水素剤存在下で反応させることにより、目的とする５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル（式（I）を参照）を得ることができる。
【００３０】
Ｂ法
式（Ｉ）で表わす化合物又は其の塩は、例えば、市販の５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体を適切な溶媒中、脱ハロゲン化水素剤の存在下、クロロ燐酸ジベンジルエステル誘導体と反応させることにより、目的とする５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジル燐酸エステル（式（I）を参照）を得ることができる。
【００３１】
（脱ハロゲン化水素剤）  使用する脱ハロゲン化水素剤としては、有機塩基及び無機塩基が挙げられ、有機塩基としては、これらに限られないが、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン（DMAP)、n-ブチルリチウム、カリウム-tert-ブトキシドが挙げられ、無機塩基としては、これらに限られないが、水素化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム又は炭酸セシウムが挙げられる。塩基の使用量としては、原料化合物の２当量以上が好ましい。更には、原料化合物１モルに対して通常２．０〜５０．０当量の範囲を例示できるが、好ましくは５．０〜２０．０当量の範囲が良く、より好ましくは５．０〜１０．０当量の範囲であることが良い。
【００３２】
（溶媒）
反応の円滑な進行等の観点から、本発明の反応は溶媒の存在下で実施することが好ましい。本発明の反応における溶媒は、反応が進行する限りは、いずれの溶媒でもよい。
溶媒としては、例えば、製造法Ａの場合は、リン酸トリメチル、リン酸トリエチル、リン酸トリブチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリクレシル等のリン酸エステルが挙げられ、製造法Ｂの場合はピリジンが挙げられる。溶媒の使用量は、反応が進行する限りは、いずれの量でもよい。本発明の反応における溶媒の使用量は当業者により適切に調整されることができる。
【００３３】
（反応温度）
本発明の反応温度は、特に制限されない。一つの態様においては、収率の向上、副生成物の抑制、及び経済効率等の観点から、−２０℃〜５０℃（すなわち、マイナス２０℃〜プラス５０℃）、好ましくは−１０℃〜３０℃（すなわち、マイナス１０℃〜プラス３０℃）、より好ましくは−１０℃〜２０℃（すなわち、マイナス１０℃〜プラス２０℃）、さらに好ましくは−５℃〜１５℃（すなわち、マイナス５℃〜プラス１５℃）、
特に好ましくは−５℃〜１０℃（すなわち、マイナス５℃〜プラス１０℃）の範囲を例示できる。
【００３４】
（反応時間）
本発明の反応時間は、特に制限されない。一つの態様においては、収率の向上、副生成物の抑制、及び経済効率等の観点から、０．５時間〜１２０時間、好ましくは１時間〜７２時間、より好ましくは１時間〜４８時間、さらに好ましくは１時間〜２４時間の範囲を例示できる。しかしながら、本発明の反応時間は、当業者により適切に調整されることができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物
本発明の式（Ｉ）で表わす化合物は、そのまま、あるいは自体公知の方法により薬理学的に許容される担体と混合して医薬組成物とすることにより、哺乳動物（例、ヒト、サル、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ウサギなど）に対して安全な医薬として用いることができる。
【００３６】
ここにおいて、薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤などが挙げられ、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤及び緩衝剤などが挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００３７】
医薬組成物の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、顆粒剤、散剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、徐放剤などの経口剤などが挙げられ、これらは経口的に安全に投与できる。但し、液剤投与も可能であるので、この限りではない。
【００３８】
医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、日本薬局方に記載の方法などにより製造することができる。
【００３９】
本発明の式（Ｉ）で表わす化合物の用途
本発明の式（Ｉ）で表わす化合物は多くの治療的及び予防的用途を有する。好ましい実施態様では、本発明の化合物は、シチジン類（例えば、デシタビン又はアザシチジン）による治療に感受性を有する極めて多様な疾患の治療に用いられる。本発明の化合物を用いて治療することができる好ましい適応症には、望ましくない又は無制御の細胞分裂を伴うものが含まれる。そのような適応症には様々な固形癌が含まれるが、より好ましくは、ＤＮＭＴによって惹起される進行性固形がんが適応対象である。
【００４０】
前記がんが、乳がん、皮膚がん、骨がん、前立腺がん、肝がん、肺がん、脳がん、喉頭がん、胆嚢がん、膵臓がん、直腸がん、傍甲状腺がん、腺組織がん、神経組織がん、頭部及び頸部のがん、結腸がん、胃がん、気管支がん、腎臓がん、基底細胞がん、扁平上皮がん（潰瘍型及び乳頭状型の両型）、転移性皮膚がん、骨肉腫、ユーイング肉腫、ベンティキュラム細胞肉腫、ミエローマ、巨細胞腫瘍、小細胞肺がん、胆がん、小島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性及び慢性リンパ球性及び顆粒球性腫瘍、毛様細胞腫瘍、アデノーマ、クロム親和性細胞腫、粘膜神経腫、腸神経節神経腫、過形成角膜神経腫、マルファン症候群様体質腫瘍、ウィルム腫瘍、セミノーマ、卵巣腫瘍、平滑筋腫瘍、子宮頸部形成異常及び前記部位に発生するがん、神経芽腫、網膜芽腫、軟組織肉腫、悪性類癌腫、局所性皮膚病巣、菌状息肉腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性及び他の肉腫、腎細胞腫、腺癌、多発性グリア芽細胞腫、悪性メラノーマ及び類表皮がんから成る群から選択される。
【００４１】
本発明で使用される適切な医薬組成物には、活性成分が有効な量で、すなわち治療される症状で、治療的及び/又は予防的目的を達成するために有効な量で存在する組成物が含まれる。
【００４２】
本発明で使用される医薬組成物は、経口投与用剤形として提供される。本明細書において提供される医薬組成物は、経口投与のために、固形、半固形、又は液状投与剤形で提供され得る。本明細書で用いられる場合、経口投与には、頬、舌及び舌下投与も含まれる。適切な経口投与剤形には、錠剤、カプセル、丸剤、トローチ、薬用キャンディー、芳香製剤、カシェ剤、ペレット剤、薬物添加チューインガム、顆粒剤、原末、発泡製剤、又は非発泡粉末若しくは顆粒剤、溶液、エマルション、懸濁液、溶液、ウェハ、スプリンクル（sprinkles）、エリキシル剤、及びシロップ剤が含まれるが、これらに限定されない。活性成分に加え、医薬組成物は、結合剤、充填材、希釈剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、流動促進剤、着色剤、色素遊走阻止剤、甘味剤及び 香味料を含むが、これらに限定されない１種以上の医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含んでもよい。
【００４３】
医薬組成物又は剤形内の本発明の式（Ｉ）で表わす化合物の量は、例えば、約1mg〜約2,000mg、約10mg〜約2,000mg、約20mg〜約2,000mg、約50mg〜約1,000mg、約100mg〜約500mg、約150mg〜約500mg、又は約150mg〜約250mgの範囲であってもよい。
本発明の化合物を抗がん剤として用いる場合、その有効投与量は、がんの性質、がんの進行程度、治療方針、転移の程度、腫瘍の量、体重、年齢、性別及び患者の（遺伝的）人種的背景等に依存して適宜選択できるが、薬学的有効量は一般に、臨床上観察される症状、がんの進行度合い等の要因に基づいて決定される。一日あたりの投与量は、例えば、ヒトに投与する場合は、約0.01mg/kg〜約10mg/kg（体重60kgの成人では、約0.5mg〜約500mg）、好ましくは約0.05mg/kg〜約5mg/kg、より好ましくは約0.1mg/kg〜約2mg/kgである。投与は、１回で投与しても複数回に分けて投与してもよい。
実施例
【００４４】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００４５】
以下の実施例において、室温は、約１５〜３０℃を意味する。１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲは、日本電子ＪＮＭ−ＥＣＺ  ４００Ｒを用いて測定し、ＣＤＣｌ３、ＤＭＳＯ−ｄ６、ＣＤ３ＯＤを溶媒として用い、内部標準のテトラメチルシランからのケミカルシフトδ（ｐｐｍ）を示した。その他の本明細書中の記号は、以下の意味を示す。ｓ  ：シングレットｄ  ：ダブレットｔ  ：トリプレットｍ  ：マルチプレットｂr ：ブロードｂr ｓ：ブロードシングレットＪ  ：結合定数  また、各化合物のMassは、Yamazen Smart Flash MS system装置を用いて測定した値である。
【実施例１】
【００４６】
５−アザシチジン類のオキシ塩化リンによる活性化及びそれに続くベンジルアルコール類との縮合【００４７】
５−アザシチジン  １２２ｍｇを室温にてトリエチル燐酸エステル約１mＬに懸濁させ、これにオキシ塩化リン  ９３μＬ（原料５−アザシチジンに対して約２倍モル）を０℃冷却下にて添加し、約１時間撹拌した。次いで、この溶液に対応するベンジルアルコール  約０．５mＬ（約１０倍モル）とピリジン  約０．４ｍＬ（約１０倍モル）を加えて、０℃冷却下にて更に１時間撹拌した。其の反応液を酢酸エチル−水混液に注ぎ、希炭酸水素ナトリウム溶液で中和した後、酢酸エチルで抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、不溶物を除いた抽出液を減圧乾固して得られた油状の残留物をシリカゲルパックカラム（Yamazen Smart Flash MS system装置）にて分離精製することにより、目的とする５−アザシチジンの５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体を得た。なお、以後は、これを合成法Ａと称する。
【実施例２】
【００４８】
５−アザシチジン類とクロロ燐酸ジベンジルエステル誘導体との縮合【００４９】
５−アザシチジン  １２２ｍｇを室温にて無水ピリジン  １．０ｍＬに懸濁させ、対応するクロロ燐酸ジベンジルエステル誘導体  約０．２５ｍＬ（約１．２倍モル）を０℃冷却下にて添加し、約１時間撹拌した。其の反応液を酢酸エチル−水混液に注ぎ、希炭酸水素ナトリウム溶液で中和した後、酢酸エチルにて抽出した。抽出液を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、不溶物を除いた抽出液を減圧乾固して得られた油状の残留物をシリカゲルパックカラム（Yamazen Smart Flash MS system装置）にて分離精製して、目的とする５−アザシチジンの５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体を得た。なお、以後は、これを合成法Ｂと称する。【００５０】
以下に、上記合成法Ａ又は合成法Ｂにより、合成した５−アザシチジン類の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル化合物（A）〜（E）に関するシリカゲルカラム分離系、単離収率、機器データ、分配係数を示す。
2018199049.tif 000008
化合物（A）５−アザシチジル酸  Ｏ，Ｏ’−ジベンジルエステル  （O,O’-Dibenzyl 5-Azacytidylate）（式（Ｉ）中、R= OH, R1= R2= Benzyl）：（合成法Ａ）、シリカゲルカラム展開系：クロロホルム−メタノール系、白色粉末：収率＝13％
Mass= 505.3 (M++1): calcd. for C22H25N4O8P (MW= 504.14). 
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.32 (1H, s), 8.04 (1H, br.), 7.24 (10H, br s), 7.07 (1H, br.), 5.75 (1H, br.), 4.98 and 4.96 (each 2H, each s), 4.83 (1H, br s), and 4.40-4.05 (5H, m) ppm.  13C-NMR (CDCl3) δ: 165.6, 155.7, 154.5, 137.9, 135.4, 128.6, 128.4, 128.2, 128.0, 127.3, 91.5, 82.2, 74.6, 69.7(J= 4.7Hz), 69.2, 67.4, and 66.6 ppm.
分配係数Log P= 0.83 (n-Octanol/PBS)
化合物（B）５−アザ−２’−デオキシシチジル酸  Ｏ，Ｏ’−ジベンジルエステル    （O,O’-Dibenzyl 5-Aza-2’-deoxycytidylate）（式（Ｉ）中、R= H, R1= R2= Benzyl）：（合成法Ａと合成法Ｂ）、シリカゲルカラム展開系：クロロホルム−メタノール系、白色粉末：収率＝26％（Ａ法）、60％（Ｂ法）
Mass= 489.3 (M++1): calcd. for C22H25N4O7P (MW= 488.15).
1H-NMR (CD3OD) δ: 8.33 (1H, s), 7.34 (10H, br s), 6.05 (1H, t, J= 6.4Hz), 5.06 and 5.03 (each 2H, each br s), 4.31-4.27 (1H, m), 4.21-4.17 (2H, m), 4.10-4.05 (1H, m), 2.41-2.36 (1H, m), and 2.15-2.06 (1H, m) ppm.  13C-NMR (CD3OD) δ: 167.7, 156.9, 156.0, 139.5, 137.0(d, J= 6.7Hz), 129.8, 129.3, 129.2, 128.7, 128.4, 88.2, 86.7(d, J= 7.7Hz), 71.6, 71.0(d, J= 5.8Hz), 68.3(d, J= 5.8Hz), and 41.7 ppm.
分配係数Log P= 1.15 (n-Octanol/PBS)
化合物（C）５−アザ−２’−デオキシシチジル酸  Ｏ，Ｏ’−ジ（４−メチル）ベンジルエステル  （O,O’-Di（4-methyl)benzyl 5-Aza-2’-deoxycytidylate）（式（Ｉ）中、R= H, R1= R2= 4-Methylbenzyl）：（合成法Ａ）、シリカゲルカラム展開系：クロロホルム−メタノール系、白色粉末：収率＝22％
Mass= 517.3 (M++1): calcd. for C24H29N4O7P (MW= 516.18).
1H-NMR (CD3OD) δ: 8.31 (1H, s), 7.24-7.15 (8H, m), 6.03 (1H, t, J= 6.0Hz), 5.04 and 4.99 (each 2H, each br s), 4.24-4.22 (1H, m), 4.16-4.10 (2H, m), 4.10-4.05 (1H, m), 2.36-2.32 (1H, m), 2.30 (6H, br s), and 2.06-1.99 (1H, m) ppm.  13C-NMR (CD3OD) δ: 167.3, 156.4, 155.6, 139.4, 138.0, 133.4 (d, J= 5.8Hz), 129.8, 129.4, 128.9, 128.1, 87.7, 86.3(d, J= 7.7Hz), 71.3, 70.5(d, J= 5.8Hz), 67.7(d, J= 5.8Hz), 41.2, and 20.7 ppm.
化合物（D）５−アザ−２’−デオキシシチジル酸  Ｏ，Ｏ’−ジ（４−フルオロ）ベンジルエステル  （O,O’-Di(4-fluoro)benzyl 5-Aza-2’-deoxycytidylate）（式（Ｉ）中、R= H, R1= R2= 4-Fluorobenzyl）：（合成法Ａ）、シリカゲルカラム展開系：クロロホルム−メタノール系、白色粉末：収率＝24％
Mass= 525.2 (M++1): calcd. for C22H23F2N4O7P (MW= 524.13). 
1H-NMR (CD3OD) δ: 8.35 (1H, s), 7.39-7.01 (8H, m), 6.07 (1H, t, J= 6.4Hz), 5.06 and 5.03 (each 2H, each br s), 4.33-4.29 (1H, m), 4.28-4.17 (2H, m), 4.10-4.05 (1H, m), 2.45-2.38 (1H，m), and 2.23-2.18 (1H, m) ppm.  13C-NMR (CD3OD) δ: 167.9, 157.1, 156.1, 133.1, 131.6(d, J= 7.7Hz), 130.5, 116.6, 116.4, 116.1, 116.0, 88.4, 86.8 (d, J= 6.8Hz), 71.6, 70.3(d, J= 5.8Hz), 68.4(d, J= 5.8Hz), 67.7, and 41.7 ppm.
分配係数Log P= 1.40 (n-Octanol/PBS)
化合物（E）５−アザ−２’−デオキシシチジル酸  Ｏ，Ｏ’−ジ（４−クロロ）ベンジルエステル  （O,O’-Di(4-chloro)benzyl 5-Aza-2’-deoxycytidylate）（式（Ｉ）中、R= H, R1= R2= 4-Chlorobenzyl）：（合成法Ａ）、シリカゲルカラム展開系：クロロホルム−メタノール系、白色粉末：収率＝20％
Mass= 557.1 (M++1): calcd. for C22H23Cl2N4O7P (MW= 556.07).
1H-NMR (CD3OD) δ: 8.34 (1H, s), 7.33 (8H, br.), 6.07 (1H, t, J= 6.4Hz), 5.06 and 5.04 (each 2H, each br s), 4.35-4.30 (1H, m), 4.28-4.17 (2H, m), 4.12-4.05 (1H, m), 2.45-2.34 (1H, m), and 2.25-2.15 (1H, m) ppm.  13C-NMR (CD3OD) δ: 166.5, 155.8, 154.8, 137.0(d, J= 7.7Hz), 134.4, 133.1, 129.5, 128.7, 128.6, 128.1, 87.1, 85.4(d, J= 6.8Hz), 70.2, 68.9(d, J= 5.8Hz), 67.2(d, J= 5.8Hz), 66.3, and 40.3 ppm.
分配係数Log P= 2.44 (n-Octanol/PBS)
【試験例１】
【００５１】
５−アザシチジル酸ジベンジルエステル誘導体のシチジンデアミナーゼに対する安定性
得られた５−アザシチジル酸類のジベンジルエステル誘導体（式（Ｉ）を参照）約１ｍｇをアセトニトリル１ｍＬに溶解し、其の１０μＬをＰＢＳ１ｍＬに添加し、この溶液にシチジンデアミナーゼのＰＢＳ溶液１０μＬを加えて、３７℃にて約３０分間〜１時間撹拌した。得られた反応液にアセトニトリル１ｍＬを加えて遠心分離し、其の上澄液をＨＰＬＣ分析した。例えば、Cytidine，DecitabineとO,O’-Di(4-fluoro)benzyl 5-Aza-2’-deoxycytidylate（化合物Ｄ）の分析結果を表１に示す。
シチジンデアミナーゼ：CDA(1-146aa), Human, His-tagged, Recombinant cytidine deaminase (ATGen社)
ＨＰＬＣ測定条件：
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＡＤＭＥ
４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ、粒子サイズ：３μｍ
溶出：  溶出液Ａ＝１０ｍＭ蟻酸アンモニウム含有精製水
溶出液Ｂ＝アセトニトリル
Ａ：Ｂ＝９９：１→５：９５、３０分間のグラジエントモード
流出速度：１．０ｍＬ/分        オーブン温度：４０℃
検出器：ＵＶ２４０ｎｍ
【００５２】
【表１】
2018199049.tif 000009
【００５３】
このように、本発明に係る５−アザシチジル酸類のジベンジルエステル誘導体は、シチジンデアミナーゼに対して非常に安定であることが確認できた。一方、シチジンや５−アザ−２’−デオキシシチジン（Decitabine）はいずれも、上記した反応条件下で不安定であり、完全に消失した。
【試験例２】
【００５４】
in vitro 評価
５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体のために用いたＤＮＭＴ阻害活性評価スクリーニング系とは、最近、我々が開発した評価系（Epigenetics, 2016, Dec 9:0: Establishment of a high-throughput detection system for DNA demethylating agents, E. Okochi-Takada, N. Hattori et al.）である。本評価系では、内在性プロモーターCpGアイランド領域の下流に、分泌型ルシフェラーゼ遺伝子を連結したベクターを大腸がん細胞へ導入した。ＤＮＡメチル基転移酵素（ＤＮＭＴ）の阻害、もしくは、その他のＤＮＡメチル化維持機構の阻害が起きると、プロモーターCpGアイランドのC-メチル化が減少し、分泌型ルシフェラーゼが発現する。ルシフェラーゼが分泌型であるため、細胞上清を回収し、基質ルシフェリンを加えることで簡便に評価できるＤＮＭＴ阻害活性スクリーニング系である。
即ち、試料添加の前日に遺伝子改変した大腸がん細胞HML58-3を96-well細胞培養プレートに播種し、それぞれに10 μMの各試料を加えて4日間培養した。5日目で細胞上清を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。また、各試料につき細胞数をWST-8法により測定した。
2018199049.tif 000010
その結果、５−アザ−２’−デオキシシチジンの５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体（上記の図において、Ｈは化合物（Ｂ)であり、Ｆは化合物(Ｄ)であり、Ｃｌは化合物（Ｅ）であり、Ｍｅは化合物（Ｃ）である。）はいずれも、非常に強いルシフェラーゼ活性が認められ、ＤＮＭＴ阻害を誘発していることが示され（上左図を参照）、且つ、それらの化合物の細胞毒性は低い（上右図を参照）ことが明らかとなった。
【試験例３】
【００５５】
in vivo 評価
５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体の５’位モノ燐酸ジベンジルエステル誘導体の抗腫瘍効果を検討するために、ヒト大腸がん由来HCT116細胞移植マウスモデルを用いた。ヌードマウス（雌、5週齢）を馴化飼育の後、右側側腹部皮下に5x106個の細胞を移植し、群分け日から週２回の頻度で計６回、各種濃度の試料（ＤＭＳＯ溶液）を腹腔内投与した。観察は群分け後２８日目まで行い、その間、週１回の頻度で体重及び腫瘍径を測定した。
その結果、腫瘍体積については媒体（ＤＭＳＯ）投与群と比較して試料濃度依存的な増加抑制を示した。なお、体重推移については、全ての群において体重減少が認められたが、その程度は軽度であった。
それ故、例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジンの５’位モノ燐酸ジ（４−フルオロ）ベンジルエステル誘導体（化合物Ｄ）（投与量：5.5mg/kg、11mg/kg、22mg/kg）は、移植した大腸がん細胞に対して投与量依存的な抗腫瘍活性を有し、且つ、安全性が高いことが明らかとなった（下記の図を参照）。
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【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、現在、臨床使用されている５−アザシチジンまたは其の２’−デオキシ体に代わり得る薬剤を、高リスクな骨髄異形成症候群や急性骨髄白血病治療薬として医療現場に提供することができ、且つ、ＤＮＭＴによって惹起される様々な固形がんの治療もしくは予防薬として医療現場に提供することができる。
【国際調査報告】
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