(57)【要約】収束光を利用した従来の手法の問題点を解決し、観察対象物の高精度かつ高感度な強度像及び微分位相像を簡便に取得することができる顕微鏡観察方法及び透過型顕微鏡装置を提供する。例えば、開口絞りを最小にしたケーラー照明法により光源からの光を観察対象物に平行照射する工程、観察対象物を透過した光をマイクロレンズアレイに結像投影する工程、マイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する工程と、マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像からマイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する工程、該４次元データを、２次元周波数空間座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程を行う。
2019111440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の光軸上に配置された点光源例えば開口絞りを最小にしたケーラー照明法により光源から出射された光を観察対象物に平行照射する工程と、
前記観察対象物を透過した光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する工程と、
前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する工程と、
前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する工程と、
前記４次元データを、前記２次元周波数空間座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程と、
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項２】
前記絞り面と前記光軸との交点にビームストッパーを配置して非散乱成分を遮蔽する顕微鏡観察方法。
【請求項３】
面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する工程と、
前記観察対象物を透過した光を集光して検出面に実像を結像させる工程と、
前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得して互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する工程と、
前記複数の実画像から３次元データを生成する工程と、
前記３次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程と、
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項４】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、
前記点光源を２次元走査しながら前記照明工程と前記結像工程を行い、光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する工程と、
前記４次元データを、前記光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程と
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項５】
前記絞りにおいて非散乱成分の集光する点にビームストッパーを配置し、非散乱成分を遮蔽する請求項３に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項６】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、
前記絞りを２次元走査しながら前記照明工程と前記結像工程を行い、走査２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する工程と、
前記４次元データを、前記走査２次元座標と点対称の光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程と
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項７】
前記絞りにおいて非散乱成分の集光する点にビームストッパーを配置し、非散乱成分を遮蔽する請求項６に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項８】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置されたＨ状スリットを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、
前記Ｈ状スリットの架橋部に光源像が位置するように調整し、該架橋部において前記点光源からの光又は前記Ｈ状スリットの走査を１次元で行い、３次元データを生成する工程と、
前記３次元データを、検出面２次元座標の各点における１次元データの重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程と
を有し、
非散乱成分は前記Ｈ状スリットの架橋部分に集光するので、架橋がビームストッパーの役割を果たし、非散乱成分を遮蔽する顕微鏡観察方法。
【請求項９】
顕微鏡の光軸上に配置された点光源例えば開口絞りを最小にしたケーラー照明法により光源から出射された光を観察対象物に平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物を透過した光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する結像光学系と、
前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する撮像部と、
前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データの、前記２次元周波数空間座標における面積積分及び／又は重心積分を計算するデータ処理部と、を有し、
前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を得る透過型顕微鏡装置。
【請求項１０】
面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物を透過した光を集光して、検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得し、互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する撮像部と、
前記複数の実像画像から３次元データを生成する３次元データ生成部と、
前記３次元データから前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を生成するデータ処理部と、を有し、
前記データ処理部は、前記３次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を得る透過型顕微鏡装置。
【請求項１１】
前記照明光学系は、１枚又は１群のレンズ及び１枚又は１群の絞りにより構成されている請求項９又は１０に記載の透過型顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記結像光学系は、少なくとも２枚のレンズの間に絞り面が配置された構成を有する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の透過型顕微鏡装置。
【請求項１３】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記点光源を２次元走査しながら前記平行照射と前記結像を行い、光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データを、前記光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有する透過型顕微鏡装置。
【請求項１４】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記絞りを２次元走査しながら前記平行照射と前記結像を行い、走査２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データを、前記走査２次元座標と点対称の光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有する透過型顕微鏡装置。
【請求項１５】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置されたＨ状スリットを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記Ｈ状スリットの架橋部に光源像が位置するように調整し、該架橋部において前記点光源からの光又は前記Ｈ状スリットの走査を１次元で行い、３次元データを生成する３次元データ生成部と、
前記３次元データを、検出面２次元座標の各点における１次元データの重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有し、
非散乱成分は前記Ｈ状スリットの架橋部分に集光するので、架橋がビームストッパーの役割を果たし、非散乱成分を遮蔽する透過型顕微鏡装置。
【請求項１６】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する結像光学系と、
前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する検出系と、
前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データを、前記２次元周波数空間座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有し、
絞り面と光軸との交点にビームストッパーを配置して非散乱成分を遮蔽する透過型顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質を通過する際の光や電子の偏向を利用して観察対象物の強度像及び微分位相像を取得する顕微鏡観察方法及び透過型顕微鏡装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡による位相情報の取得には、主に干渉効果を利用した方法が用いられてきた。例えば、光学顕微鏡では、シュリーレン法、ゼルニケ位相差顕微鏡法及びノマルスキー微分干渉顕微鏡法などが知られている。また、電子顕微鏡では、焦点はずしを用いるデフォーカス法や位相板を用いる位相差電子顕微鏡などが知られている。【０００３】
これらの手法はいずれも、位相の異なる２つの波の位相差を、波の干渉に伴う強度変調に変換し、強度像から位相差を類推するものであり、信号波の他に位相基準を与える参照用の波、参照波を用意する必要がある。参照波として、信号波の一部を利用する簡便法については、「弱位相物体近似」を成立させるために観測可能な位相の大きさが制限され、その限界を克服できるホログラフィー法などでは、信号波とは別に独立した参照波が必要となるため、装置の工夫や複雑化が避けられない。【０００４】
また、近年、干渉効果を用いず、物質による光の偏向を利用して観察対象物の微分位相を求める手法が提案されている（非特許文献１〜８参照）。非特許文献１〜８に記載の手法では、光、電子又はＸ線の収束ビーム（以下、これらをまとめて「収束光」という。）を、走査しながら観察対象物に照射し、その照射位置で生じる屈折率変化に起因する光の偏向を検出して画像化している。【０００５】
屈折率変化は、位相変化、即ち微分位相の大きさに対応するため、特許文献１〜８に記載の技術では、収束光の偏向度合いを定量的に取り出すことで、観察対象物の微分位相走査像を観察している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】E. M. Waddell and J. N. Chapman、”Linear imaging of strong phase objects using asymmetrical detection in STEM”、Optik、第54巻、1979年、p.83-96
【非特許文献２】G. R. Morrison and J. N. Chapman、”A comparison of three differential phase contrast systems suitable for use in STEM”、Optik、第64巻、1983年、p.1-12
【非特許文献３】J. Palmer and G. Morrison、”Differential phase contrast imaging in the scanning transmission x-ray microscope”、Proc. Short-Wavelength Coherent Radiation、第11巻、1991年、、p.141-145
【非特許文献４】A. Gianoncelli, G. R. Morrison, B. Kaulich, D. Bacescu and J.Kovac、”Scanning transmission x-ray microscopy with a configurable detector”、Appl. Phys. Lett.、第89巻、2006年、p.251117-1〜3
【非特許文献５】B. Hornberger, M. Feser, C. Jacobsen、”Quantitative amplitude and phase contrast imaging in a scanning transmission X-ray microscope”、Ultramicroscopy、第107巻、2007年、p.644-655
【非特許文献６】P. Thibault, M. Dierolf, A. Menzel, O. Bunk, C. David, and F. Pfeiffer、”High-Resolution Scanning X-ray Diffraction Microscopy”、Science、第321巻、2008年、p.379-382
【非特許文献７】A. Lubk and J. Zweck、”Differential phase contrast: An integral perspective”、Phys. Rev.、第A91巻、2015年、p.23805-1〜6
【非特許文献８】I. Lazic, E. G. T. Bosch and S. Lazar、”Phase contrast STEM for thin samples: Integrated differential phase contrast”、Ultramicroscopy、第160巻、2016年、p.265-280
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、収束光を用いた従来の走査型微分位相法には、以下に示す問題点がある。第１の問題点は、従来法は、検出面で観測される像が回折像で、観察時には観察対象物の画像を直接観察できないため、各種光学調整を行うための操作が必要な場合に速やかに対応することができないことである。【０００８】
第２の問題点は、観測データが膨大になることである。走査型微分位相法により取得される画像は、光源（source）面における２次元走査座標ｒｓと、検出（detection）面における２次元観測座標ｓｄの組み合わせ、即ち４次元座標（ｒｓ,ｓｄ）により記述される。ここで、ｒは実空間座標を、ｓは周波数空間（波数空間）座標を、下付きのｓは光源面を、下付きのｄは検出面を表す。光源面２次元走査座標の精度は画像の解像度に関係し、検出面２次元観測座標の精度は微分位相の観測精度に関係する。両者の精度を上げようとすると、それぞれのデータ解像度、即ちデジタル精度を上げる必要がある。例えば、それぞれ１メガバイトのデジタル精度であれば、４次元データは１テラバイトという膨大な記録量が要求されることとなる。【０００９】
第３の問題点は、記録量の膨大化に伴う観測時間の長大化である。従来の走査型微分位相法では、走査により得られる画像の１点ｒｓに対して２次元回折像を観測するため、例えば４次元データを記憶するには、画像を構成する点毎に２次元データを転送しなければならない。高速コンピュータよる高速転送を用い、例えば画像１点につき１メガバイトの２次元回折像を１ミリ秒で転送したとしても、１メガバイトの画像点を観測するには１０００秒を要する。【００１０】
収束光の走査と偏向により観察対象物の微分位相像を観察する手法の原理そのものは、４０年以上前に提案されていたが、前述した問題点から一般の顕微鏡法では普及せず、レンズ作製の困難さのため回折法に依拠せざるを得ないＸ線回折法（非特許文献３〜６参照）や、走査型が標準の電子顕微鏡法（非特許文献２，８参照）などにしか応用されてこなかった。【００１１】
そこで、本発明は、前述した収束光を利用した従来の手法の問題点を解決し、観察対象物の高精度かつ高感度な強度像及び微分位相像を簡便に取得することができる顕微鏡観察方法及び透過型顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る顕微鏡観察方法は、開口絞りを最小にしたケーラー照明法により光源から出射された光を観察対象物に平行照射する工程と、前記観察対象物を透過した光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する工程と、前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する工程と、前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する工程と、該４次元データを、前記２次元周波数空間座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程とを行う。
本発明に係る他の顕微鏡観察方法は、面光源を用いるケーラー照明法により前記面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する工程と、前記観察対象物を透過した光を集光して検出面に実像を結像させる工程と、前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得して互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する工程と、前記複数の実画像から三次元データを生成する工程と、該３次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程と、
を行う。
本発明に係る他の顕微鏡観察方法は、暗視野法であり、点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、前記点光源を２次元走査しながら前記照明工程と前記結像工程を行い、光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する工程と、前記４次元データを、前記光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程とを有し、前記絞りに形成される共役点にビームストッパーを配置し、非散乱成分を遮蔽する。
本発明に係る他の顕微鏡観察方法は、暗視野法であり、点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、前記絞りを２次元走査しながら前記照明工程と前記結像工程を行い、走査２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する工程と、前記４次元データを、前記走査２次元座標と点対称の光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程とを有し、前記絞りに形成される共役点にビームストッパーを配置し、非散乱成分を遮蔽する。
本発明に係る他の顕微鏡観察方法は、暗視野法であり、点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置されたＨ状スリットを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、前記Ｈ状スリットの架橋部に光源像が位置するように調整し、該架橋部において前記点光源からの光又は前記Ｈ状スリットの走査を１次元で行い、３次元データ生成する工程と、前記３次元データを、検出面２次元座標の各点における１次元データの重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程とを有し、前記Ｈ状スリットに形成される共役点にビームストッパーを配置し、非散乱成分を遮蔽する。
本発明に係る他の顕微鏡観察方法は、暗視野法であり、点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する工程と、前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する工程と、前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する工程と、前記４次元データを、前記２次元周波数空間座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程とを有し、絞り面と光軸との交点にビームストッパーを配置して非散乱成分を遮蔽する。【００１３】
本発明に係る透過型顕微鏡装置は、開口絞りを最小にしたケーラー照明法により光源から出射された光を観察対象物に平行照射する照明光学系と、前記観察対象物を透過した光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する結像光学系と、前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する撮像部と、前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する４次元データ生成部と、該４次元データの、前記２次元周波数空間座標における面積積分及び／又は重心積分を計算するデータ処理部とを有し、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を得るものである。
本発明に係る他の透過型顕微鏡装置は、面光源を用いるケーラー照明法により前記面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する照明光学系と、前記観察対象物を透過した光を集光して、検出面に実像を結像させる結像光学系と、前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得し、互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する撮像部と、前記複数の実像画像から三次元データを生成する三次元データ生成部と、該３次元データから前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を生成するデータ処理部とを有し、前記データ処理部は、前記三次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を得るものである。
本発明の透過型顕微鏡装置は、前記照明光学系が、１枚又は１群のレンズ及び１枚又は１群の絞りにより構成されていてもよい。
また、本発明の透過型顕微鏡装置は、前記結像光学系を、少なくとも２枚のレンズの間に絞り面が配置された構成とすることができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、収束光に代えて平行光を照射し、検出面又は検出面よりも手前の任意の位置に実像を結像させているため、４次元という高次元の次元減縮を実現でき、実像観察を通じて観察対象物の高精度かつ高感度な強度像及び微分位相像を簡便に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】従来の臨界照明による収束光走査回折像観察４次元顕微鏡の結像過程の概略を示す図である。
【図２】３レンズ・４光学面の光学系の構成例を示す概略図である。
【図３】Ａは図２に示す光学系に収束照明光を適用した従来型の走査型４次元法の結像図であり、Ｂは平行照明光を適用した本発明の平行光照射型４次元法の結像図である。
【図４】本発明の第１の実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程の光線図である。
【図５】本発明の第１の実施形態の透過型顕微鏡装置の構成例を示すブロック図である。
【図６】Ａ〜Ｃはライトフィールドカメラを利用した本発明の第２の実施形態の４次元顕微鏡観察方法の結像過程を示す図である。
【図７】Ａ〜Ｄは本発明の第３の実施形態の実像型４次元顕微鏡観察方法におけるマルチフォーカスを実現する方法の例を示す概略図であり、Ａは対物レンズの焦点をずらす焦点ずらし法、Ｂは検出面ずらし法、Ｃ及びＤは物面ずらし法である。
【図８】本発明の第４の実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程を示す図であり、Ａは光学顕微鏡に適用した場合の構成例であり、Ｂは電子顕微鏡に適用した場合の構成例である。
【図９】本発明の第４の実施形態の第１変形例の４次元顕微鏡観察方法で用いるＨ状スリットを示す図である。
【図１０】本発明の第５の実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程を示す図である。
【図１１】マイクロレンズアレイを装着したライトフィールド顕微鏡を用いて光軸上点光源ケーラー照明下で撮影した腎組織切片の微小検出器上の回折像の等高線プロットである。
【図１２】本発明の第６の実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程を示す図である。
【図１３】本発明の第６の実施形態の第１変形例の４次元顕微鏡観察方法で用いるＨ状スリットを示す図である。
【図１４】本発明の実施例で用いたデータ処理方法を示すフローチャートである。
【図１５】マウスの腎臓組織切片の顕微鏡像であり、Ａは点光源微分位相ライトフィールド顕微鏡像、Ｂは面光源微分位相ライトフィールド顕微鏡像、Ｃは通常微分干渉顕微鏡の粗視化像、Ｄは通常微分干渉顕微鏡の高画素数オリジナル像である。
【図１６】マウスの腎臓組織切片の顕微鏡像であり、Ａは点光源明視野ライトフィールド顕微鏡像であり、Ｂは通常明視野法の粗視化像である。
【図１７】マウスの腎臓組織切片の顕微鏡像であり、Ａは点光源明視野ライトフィールド顕微鏡像であり、Ｂは通常明視野法の粗視化像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態について、添付の図面を参照して、詳細に説明する。なお、本発明は、以下に説明する実施形態に限定されるものではない。また、説明は以下順に行う。
１．従来法における微分位相量の観測原理
２．第１の実施形態
：収束光照射の代わりに平行光照射と点光源の２次元走査を用いた微分位相像観察法
３．第２の実施形態
：点光源平行光照射とマイクロレンズの組み合わせによる走査不要の微分位相像観察法
４．第３の実施形態
：面光源平行光照射とピント位置を変えてフォーカスの異なる複数の像を撮影するマルチフォーカス操作の組み合わせによる走査次元を縮減した微分位相像観察法
５．第４の実施形態
：点光源から出射される平行光の対物レンズ後焦点面の集光位置にビームストッパーを配置して暗視野像を観察する微分位相像観察法
６．第４の実施形態の第１変形例
：光源走査又は斜光走査にＨ状スリットを用いることで走査の次元を１次元方向に限定して暗視野像を観察する微分位相像観察法
７．第５の実施形態
：第２の実施形態における点光源を光軸に配置すると共に対物レンズ後焦点面の光軸にストッパーを配置して暗視野像を観察する微分位相像観察法
８．第６の実施形態
：第４の実施形態における光源−ストッパー共役走査又は斜光−ストッパー共役走査に代えて固定ストッパーを用いて暗視野像を観察する微分位相像観察法
９．第６の実施形態の第１変形例
：絞り走査においてＨ状スリットを用いることで走査の次元を１次元方向に限定して暗視野像を観察する微分位相像観察法
【００１７】
（従来法における微分位相量の観測原理）
［収束光の偏向と微分位相］
図１は前述した収束光の偏向を用いた従来の臨界照明による収束ビーム走査回折像観察４次元顕微鏡の結像過程の概略を示す図である。なお、４次元顕微鏡における「４次元」は、後述するように、光源面２次元座標と検出面２次元座標を独立に扱う本発明の基本理念の表現である。図１に示す結像光学系は、４つの光学面を備えており、第１光学面が光源面、第２光学面が絞り面、第３光学面が物面、第４光学面が検出面となる。この光学系１００では、第１レンズ１０１の前焦点面にある光源面１１１上の点から出射した光が第１レンズ１０１、絞り１１２、第２レンズ１０２を通過し、収束光として観察対象物（物面１１３）に照射される。
【００１８】
観察対象物により偏向した収束光は、第３レンズ１０３を通過し、後焦点面に設置された検出面１１４上に絞りの像である回折光円を形成する。この回折光円の移動が微分位相を与え、光源位置を走査すれば微分位相走査像が得られる。光による物の結像過程は、４つの光学面をつなぐ３つのレンズ１０１〜１０３によるフーリエ変換過程でもあり、この事情は、図１の下段に示すように、連続するフーリエ変換（ＦＴ）又は逆フーリエ変換（ＦＴ−１）として表される。
【００１９】
具体的には、第１レンズ１０１の前焦点面にある光源面１１１上の１点ｒｓから出射された光δ（ｒ）は、第１レンズ１０１を通過する際に逆フーリエ変換ＦＴ−１で表される作用を受け、絞りにおいて絞り関数Ｐ（ｓ）で表される作用を受け、第２レンズ１０２を通過する際にフーリエ変換ＦＴで表される作用を受け、プローブ関数ｐ（ｒｓ−ｒ）で表される収束光としてｔ（ｒ）で表される物面１１３に照射される。そして、物で偏向した収束光は、第３レンズ１０３を通過する際にフーリエ変換ＦＴで表される作用を受け、後焦点面に置かれた検出面１１４上に下記数式１で表される回折光円を形成する。
【００２０】
【数１】
2019111440.tif 000003
【００２１】
この回折光円の移動が微分位相を与え、光源位置を走査すれば、臨界照明で収束する光は観察対象物を走査するので、微分走査像が得られる。このように光による物の結像過程は、４つの光学面をつなぐ３つのレンズによるフーリエ変換過程でもある。ちなみに、絞り関数Ｐ（ｓ）とプローブ関数ｐ（ｒ）はフーリエ変換でむすばれている。
【００２２】
ところで、回折光円移動を定量するのに必要な検出器が円の大きさは、回折光円の移動幅を考慮して、最大移動幅を付加した回折光円直径の大きさが下限となる。回折光円自体は、絞り面１１２に配置された絞りの像なので、その大きさは絞りの大きさに比例し、空間分解能をよくするため収束光を小さく収束すればするほど逆比例関係にある絞りは大きくなり、対応する検出器も大きくなる。一方、微分位相の観測精度は、検出器の空間解像度に比例する。検出器の要求仕様は、このように求めたい画像空間分解能と微分位相観測精度の両者に依存する。
【００２３】
一般に、観察対象物を透過する光波や電子波（搬送波）は、屈折率に依存した位相変化を受ける。屈折率は空間的に分布するので、対応する位相も空間的に分布する。その際、位相と屈折率の関係は下記数式２により表される。
【００２４】
【数２】
2019111440.tif 000004
【００２５】
なお、上記数式２において、θ（ｒ）は位相分布、ｎ（ｒ）は屈折率分布、ｌ（ｒ）は厚さの分布、ｒは２次元空間座標、λは搬送波の波長を表す。また、（ｎ（ｒ）−１）の「１」は空気（正確には真空）の屈折率であり、物がある時とない時のその場所の屈折率の変化が、位相変化に対応している。そして、（ｎ（ｒ）−１）ｌ（ｒ）が光学距離に相当する。
【００２６】
屈折率の分布は、微小範囲で見れば小さなプリズムの分布と近似できる。微小プリズムは、微小部分の屈折率の空間変化であり、上記数式１の関係から、位相の空間変化に対応することになり、結局位相空間分布の勾配（２次元１次微分＝ｄθ（ｒ）／ｄｒ）に比例する。一方、観察対象物を微小プリズムの集まりと考えた場合、収束光で狭い部分を照明すると、光は微小プリズムにより入射方向とは異なる方向に曲げられる。これが収束光を観察対象物に照射したときに起こる光線偏向の物理過程である。
【００２７】
従って、収束光の偏向を定量できれば、微分位相量を観測することができる。そして、偏向量の最も簡単な方法は、観察対象物に照射された収束光により、検出面に作出される回折像（回折光円）の偏向に伴う空間移動を定量することである。
【００２８】
［収束光照射とその走査による従来の微分位相像観察法］
最も簡略化した顕微鏡光学系は、対物レンズと接眼レンズとで構成される２レンズ系であるが、本実施形態の顕微鏡観察方法では、光源面と検出面でそれぞれ独立に定義された光源面２次元座標と検出面２次元座標を用いて表される４次元座標に基づいて４次元的観察を行うため、光源面を明示的に定義する必要がある。そこで、本実施形態の顕微鏡観察方法では、光源面と集光レンズ（コレクターレンズ）を含めた３レンズ系を採用する。
【００２９】
図２は３レンズ・４光学面の光学系の構成例を示す概略図である。図２に示す光学系１０では、３つのレンズ１１〜１３が、それぞれ光源面２１、物面２２、絞り面２３、検出面２４の４つの光学面の間に配置されている。図２は、光源面２１からの光を検出面２４に集める顕微鏡光学系の最も簡略化した最小モデルであり、実際の顕微鏡では第１レンズ１１、第２レンズ１２及び第３レンズ１３の全てにおいて、絞りなどの他の光学部品を含むより複雑な構成を採る。しかしながら、数理的に見た場合、その機能は、図２に示す最小モデルで表現できる。
【００３０】
図２に示す３レンズ・４光学面系の扱いをさらに単純化するため、本実施形態の顕微鏡観察方法では、３つのレンズ１１〜１３は同じ焦点距離ｆを持ち、これら７つの要素が同じ焦点距離間隔で結合される３レンズ・４光学面・６焦点系とする。ここでは、顕微鏡の拡大機能は考えないので、結像倍率は１倍として扱う。また、本実施形態においては、レンズ作用を、物理的に扱うときは光の収束効果、数理的に扱うときはフーリエ変換作用として扱う。
【００３１】
図２に示す３レンズ・４光学面系の光学系により、収束光を走査しながら照射する従来の微分位相像観察法を図示したのが図１である。ここで、検出面の光場を、光源面の実空間座標ｒｓと検出面の周波数空間座標ｓｄを用いてＵＣ（ｒｓ，ｓｄ）と表記する。４次元関数の変数である２つの２次元座標の順序は、光源面座標を最初に、検出面座標を２番目に置いた。微分位相は、収束光の偏向に伴う回折光円の移動で表されるので、具体的な計算は、光場により形成される強度像（２乗検出像）｜ＵＣ（ｒｓ，ｓｄ）｜２の検出面における重心計算を用いて行われる。これを、検出面におけるｓｄ重心という。
【００３２】
一般に、顕微鏡においては、観察対象物に収束光を照射し、その収束光を２次元走査することで、操作的に２次元面像を取得する走査法と、観察対象物に平行光を照射し、走査なしで１回の照射により２次元実像を取得する平行光照射法がある。前述したように、収束光照射の場合、照明光は観察対象物の狭い領域に当たるので、局所的に偏向度合いを特定することができる。一方、平行光照射の場合、照明光が観察対象物の広い領域に照射されて四方八方に偏向されるため、観察対象物上で局所的に偏向度合いが特定され、場所依存的には微分位相を抽出することはできないと考えられてきた。
【００３３】
（第１の実施形態）
先ず、本発明の第１の実施形態に係る４次元顕微鏡観察方法について説明する。本発明者は、光の逆進の性質を用い、かつ、通常の２次元的観察ではなく、４次元的観察を行えば、平行光照射法でも微分位相の観察が可能であることを見出し、本発明に至った。図３Ａは図２に示す光学系１０に収束照明光を適用した従来型の走査型４次元法の結像図であり、図３Ｂは光学系１０に平行照明光を適用した本発明の平行光照射型４次元法の結像図である。図３Ａと図３Ｂは鏡映対象であり、電子顕微鏡ですでに見出されている収束照明光を用いる走査透過型電子顕微鏡（STEM）と平行照明光を用いる透過型電子顕微鏡（TEM）の間に成立するTEM-STEM相反定理の４次元法への拡張である。
【００３４】
図３Ａに示すように、収束照明光を適用した走査型４次元法では、光源面１１１上の１つの光源点ｒｓから例えば３つの光線が射出される。そして、各光線は、レンズ１０１及びレンズ１０２により物面１１３上の１点に収束され、観察対象物により散乱された後、レンズ１０３により回折されて、検出面１１４の２次元座標上に広がる回折光として観察される。図３Ａに示す実線は光線が観察対象物によって局所的に偏向する様子を示し、波線は観察対象物がない時に直進する様子を示している。即ち、図３Ａには、観察対象物による収束光の偏向に伴い、検出面１１４上で回折光パターンが移動する様子が明示されている。この移動量が微分位相量に対応する。
【００３５】
光の逆進を利用し、図３Ａに示す結像図を鏡映反転しても光線図は成立する。図３Ｂは、図３Ａの光逆進光線図であり、光源面の多数の点からそれぞれ光軸に対して傾きをもった平行照明光が観察対象物に照射される構成の図である。図３Ｂは、図３Ａの光源面と検出面とを置換した上で、左右逆転させた結像図であり、検出面２４上の１つの像点に集光する光線が、光源面２１上の３つの異なる点光源から出射される様子を示している。この場合の光線図は、物面２２上における観察対象物の有無で異なり、図３Ｂではそれぞれ実線と破線で示す。これは、収束光照射における検出面１１４上の回折光パターンの移動に対応し、平行光照射における検出面２４上の１点に収束する多数の点光源からなる光源面の領域（以下、光源円という。）の移動を表し、この移動を定量できれば微分位相量が観察対象物上の各点で求まる。
【００３６】
光の逆進で重要なのは、全ての光学面が入れ代わることであり、例えば光源面と検出面が入れ代わることである。この場合、光学面の物理的意味は変わるが、各光学面に付与された座標系の数理的性質、即ち、実空間座標系か周波数空間座標系かの性質は保持される。その結果、検出面の周波数空間座標ｓｄはｓｓに、光源面の実空間座標ｒｓはｒｄに、それぞれ変更される。前述した収束光照射４次元法の検出面光場の標記法ＵＣ（ｒｓ，ｓｄ）に従うと、平行光（parallel light）を用いる平行光照射４次元法の検出面光場はＵｐ（ｓｓ，ｒｄ）と表記される。ここで、ｒｓ及びｒｄは結像座標を表し、ｓｄは回折光の光線方向を表し、ｓｓは光源光の光線方向を表す。
【００３７】
平行光照射４次元法の場合、収束光照射４次元法とは異なり、収束光の偏向は前述したように光源円の移動として現れるので、微分位相量は、検出面光場の２乗｜Ｕｐ（ｓｓ，ｒｄ）｜２の光源面におけるｓｓ重心を計算することで求まる。
【００３８】
図４は本発明の第１の実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程の光線図であり、図１に示す光線図の方式に従い、図３Ｂを書き換えたものである。通常の平行光照射法では、点光源が光軸上に置かれるが、平行光照射４次元法では、収束光照射４次元法と同様に、光軸から離れた点から発せられる光を２次元走査する。
【００３９】
この場合、光軸から離れた点から観察物対象物を照明すること、即ち、通常の光軸に平行な光の照射に代えて、光軸に対して傾きをもつ光を照射すること（以下、「斜光照明」という。）により、検出面で観察される実像を記録する。そして、光源点を２次元的に走査し、その都度観察像を、例えば顕微鏡装置に設けられたデータ記憶部に蓄積する。こうしてデータは、光源面の２次元座標と実像検出面の２次元座標の合成である４次元座標上に展開する。
【００４０】
３レンズ・４光学面の７要素で構成される光学系を用いて、収束光照射と平行光照射を比較すると、図３Ａに示すように、収束光照射では、光源面１１１−検出面１１４結像過程の数理はＦＴ−１、ＦＴ及びＦＴの順となる。一方、図３Ｂに示すように、光の逆進に対応し、平行光照射では、光源面２１−検出面２４結像過程の数理はＦＴ、ＦＴ及びＦＴ−１の順となる。
【００４１】
そして、臨界照明で得られる４次元像は、下記数式３で表される照射光のプローブ関数ｐ（ｒ）と、下記数式４で表される対象物透過関数ｔ（ｒ）を用いて、下記数式５で表される。なお、プローブ関数ｐ（ｒ）と対象物透過関数ｔ（ｒ）は、共に複素数である。
【００４２】
【数３】
2019111440.tif 000005
【００４３】
【数４】
2019111440.tif 000006
【００４４】
【数５】
2019111440.tif 000007
【００４５】
一方、ケーラー照明で得られる４次元像は、下記数式６で表される。
【００４６】
【数６】
2019111440.tif 000008
【００４７】
ここで、上記数式６における絞り関数Ｐ（ｓ）は下記数式７で表され、照射光プローブ関数とフーリエ変換ＦＴで結ばれる。また、Ｔ（ｓ）は、下記数式８で表される対象物透過関数のＦＴである。なお、Ｐ（ｓ）とＴ（ｓ）は、共に複素数である。
【００４８】
【数７】
2019111440.tif 000009
【００４９】
【数８】
2019111440.tif 000010
【００５０】
臨界照明による４次元法とケーラー照明による４次元法での微分位相量は、上記数式２〜８を用いて、それぞれ数式９及び数式１０で表される。
【００５１】
【数９】
2019111440.tif 000011
【００５２】
【数１０】
2019111440.tif 000012
【００５３】
上記数式９及び数式１０において、分子は１次モーメントを表し、分母は信号強度に対応する面積分を表す。また、割り算は重心に対応し、こうした演算を重心積分という。
【００５４】
ｓｄ重心に対する上記数式９は、透過係数の位相成分の微分θ’ｔ（ｒ）とプローブ関数の位相成分の微分θ’ｐ（ｒ）の双方を含んでいる。これは、微分符号などは若干異なるが、Waddellらにより世界で最初に導出された数式と同じである（非特許文献１参照）。一方、上記数式１０に示すｓｓ重心の表式は、本発明者が発見したものであり、本出願が世界初出である。そして、上記数式９及び数式１０を比較すると、光源面における実座標ｒｓを変数とするか、検出面における実座標ｒｄを変数とするかの違いを除けば、透過係数とプローブ関数の位相成分の微分表現が同じ表式を与えていることがわかる。
【００５５】
この結果は、図３Ａ，３Ｂに示す２つの４次元法の光場が光の逆進から考え等価であることを解析的に示していると共に、Waddellらにより提案された収束光の観察対象物上走査４次元法が、平行光照射を用いた光源面上点光源走査４次元法に代替できることを意味している。ここで、プローブ関数ｐ（ｒ）について考えると、顕微鏡のプローブ関数は、ほとんどのケースで中心対称なので、位相微分θ'p（０）は０となり、ｓｄ重心及びｓｓ重心は、共にｔ（ｒ）の位相成分θ（r）の微分のみを用いて表される。ただし、本発明の平行光照射４次元顕微鏡観察方法で用いられる微分は、２次元１次微分、即ち下記数式１１に示す勾配を意味し、θ’（r）は下記数式１２で表される。
【００５６】
【数１１】
2019111440.tif 000013
【００５７】
【数１２】
2019111440.tif 000014
【００５８】
そして、プローブ関数ｐ（ｒ）がδ関数的に絞った収束光であれば、上記数式９及び数式１０は、それぞれ下記数式１３及び数式１４に帰着される。
【００５９】
【数１３】
2019111440.tif 000015
【００６０】
【数１４】
2019111440.tif 000016
【００６１】
以上から、臨界照明による４次元顕微鏡データ及びケーラー照明による４次元顕微鏡データの両方について数式９及び数式１０に示すｓ重心計算を行えば、観察対象物の微分位相が求まることが分かる。実験で得られたθ'（r）（２次元）からθ（r）（１次元）を得るには、勾配からポテンシャルを求める定法に従い、下記数式１５に示す線積分操作を行えばよい。
【００６２】
【数１５】
2019111440.tif 000017
【００６３】
上記数式１５において、積分路Ｃは、例えばある起点ｒｉ＝（ｘｉ，ｙｉ）からｘ軸に平行な直線（ｘ，ｙｉ）、その直線端点（ｘｆ，ｙｉ）でｙ軸に平行な直線（ｘｆ，ｙ）で、終点が求めたいｒｆ＝（ｘｆ，ｙｆ）点となるような道筋である。
【００６４】
また、上記数式９及び数式１０で周波数空間の重心（ｓ重心）を計算するとき、下記数式１６に示すｔ（ｒ）の強度情報は、分母に現れる光場２乗検出の全積分値として得られているので、観察対象物とプローブの双方の光学情報、位相と強度の両方が得られたことになる。
【００６５】
【数１６】
2019111440.tif 000018
【００６６】
［装置構成］
図５は本実施形態の透過型顕微鏡装置の構成例を示すブロック図である。前述した顕微鏡観察方法は、例えば、図５に示すように、光学系２と、結像した２次元像を検出する撮像部３と、光源走査などを制御する制御部４と、４次元画像データの蓄積、保管、計算処理を行うデータ処理部５を備える透過型顕微鏡装置１により実施することができる。光学系２には、光源と、例えば図１〜図４に示す光学系を実現する複数のレンズを用いた結像系が設けられている。
【００６７】
図１に示すWaddellらが提案した収束光照射４次元法と、図４に示す本発明の平行光照射４次元法とでは、絞りと観察対象物の配置が異なるが、本実施形態の透過型顕微鏡装置１の光学系２の基本構成は、Waddellらが提案した収束光照射４次元法によるものと同じである。また、撮像部３には、２次元検出器を用いることができる。
【００６８】
現行顕微鏡を４次元観察用に改変する場合、収束光照射４次元法は、共焦点顕微鏡装置において検出面で回折円を検出し、その２次元データを対象物上の２次元走査と組み合わせ４次元データ化することで実現できる。一方、本実施形態の平行光照射による４次元顕微鏡観察方法は、通常透過型顕微鏡装置において検出面で実像を検出し、その２次元データを光源面上の点光源２次元走査と組み合わせ４次元データ化することで実現できる。
【００６９】
以上詳述したように、本実施形態の顕微鏡観察方法は、平行光照明４次元法であり、実像を第一義的観察対象としているため、観察対象物の強度像及び微分位相像を、高精度かつ高感度で簡便に取得することができる。また、本実施形態の透過型顕微鏡装置は、通常透過型顕微鏡装置を改変することで実現できるため、顕微鏡操作が容易である。
【００７０】
（第２の実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態に係る４次元顕微鏡観察方法について説明する。前述した第１の実施形態の平行光照射による４次元顕微鏡観察方法は、収束光照射による４次元法と同様に、４次元データ取得には、極めて大きなデータ容量と長時間観測が必要となる。この問題を根本的に解決するには、観察法の次元を下げる次元縮減技法が必要となる。そこで、本実施形態の４次元顕微鏡観察方法では、以下に示す３種の次元縮減技法を適用する。
【００７１】
４次元データを２次元に埋め込む方法としては、数年前にスタンフォード大で開発されたライトフィールドカメラ（Ren Ng, Marc Levoy, Mathieu Bredif, Gene Duval, Mark Horowitz, Pat Hanrahan、“Light Field Photography with a Hand-held Plenoptic Camera”、Stanford Tech Report CTSR 2005-02、p.1-11）を利用する方法が挙げられる。ライトフィールドカメラは、結像面にマイクロレンズアレイが配置され、その後方に微小検出器アレイが配置されており、各マイクロレンズの回折光を対応する微小検出器で検出する。これにより、ライトフィールドカメラでは、異なる視線方向を微小検出器上の異なる点にマッピングすることができる。
【００７２】
ライトフィールドカメラでは、この視線方向分解をピント合わせの事後的再調整に利用し、リフォーカシングという３次元イメージングを実現しているが、視線方向分解は４次元法から見れば光源光方向分解に対応するため、ライトフィールドカメラ像は平行光照射４次元法情報を含んでいることになる。このため、観察条件次第では、微小検出器で構成される検出器全体のデータから、微分位相像を計算できる。
【００７３】
図６Ａ〜Ｃはライトフィールドカメラを利用した本実施形態の平行光照射４次元顕微鏡観察方法の結像過程を示す図である。図６Ａは、図４の光線図に対応するものであり、観察対象物（物面２２）による光線偏向が、検出面２４の後方に位置する回折面２５上で、どのような変化をもたらすかを図示したものである。図６Ａでは、無偏向の場合の光の様子を破線で示し、偏向が生じた場合の光の様子を実線で示している。この図６Ａからは、検出面２４の後方に位置する回折面２５上の光点移動が確認できる。
【００７４】
この移動量は、すでに述べたように観察対象物の光線通過点での微分位相に比例する。しかしながら、このままでは、観察対象物全体が平行照射されるため、隣接部分を通過する多数の光線は、回折面２５上ではそれぞれ異なる方向に偏向した状態で重なり、個別の光点移動を取り出せない。この重なりを回避するには、検出面２４にライトフィールドカメラで使われているマイクロレンズアレイを配置すればよい。
【００７５】
そこで、顕微鏡光軸上に配置した点光源（以下、「光軸上点光源」という）を用いて平行照射する構成を図６Ｂに示す。図６Ｂでは、ライトフィールドカメラの主レンズ３１が、対物レンズ１３を代置するように配置されており、マイクロレンズアレイ３４の後方に微小検出器アレイ３５が配置されている。そして、マイクロレンズアレイ３４上に像が形成され、各マイクロレンズに対応する微小検出器アレイ３５の各微小検出器上に回折像が形成される。なお、図６Ｂでは、点光源からの光束が、観察対象物により偏向される場合を実線で示し、偏向されない場合を破線で示しており、それぞれマイクロレンズアレイ３４によって、どのようにして微小検出器アレイ３５上の異なる位置に収束されるかを示している。
【００７６】
図６Ｂに示す構成では、図６Ａに示す構成の問題点、即ち、隣接点間を通る光線が作る検出面上光点の重なりは、マイクロレンズによる隣接点分離観測により解消されている。図６Ｂに示す構成では、光源面２１と微小検出器アレイ３５が置かれた回折面は共役であり、点光源は微小検出器の１点に収束している。この収束点の移動量が微分位相を与える。この構成は、マイクロレンズの座標が実像座標に、微小検出器上の座標が周波数座標に対応するので、４次元データ化は容易である。
【００７７】
図６Ｃは、図３Ｂに対応するものであり、対物レンズを代置する形でライトフィールドカメラが配置され、微小検出器に回折光が投影される構成を示している。リフォーカシングを実現する本来のライトフィールド顕微鏡は、面光源を用いるこの方式である。面発光により微小検出器上の回折像は回折光円を形成するが、面発光中の異なる光源からの光は、特定の観察対象物点を通るとき同じ光線偏光を受けるので、回折光円の移動が起こる。
【００７８】
この移動量を求めれば、図６Ｂに示す光点移動と同様に微分位相が取り出せることができる。図６Ｂの光点移動も図６Ｃの回折光円移動もその移動量は、微小検出器上の回折像の重心座標を計算すれば求まるので、光源の大きさにかかわらず、同一演算で微分位相量が求められる。以上から、ライトフィールドカメラを利用することにより、光源の大きさを気にせず４次元データを１回の撮像で同時悉皆的に微分位相量を取得できることが分かる。
【００７９】
なお、図６Ｂに示す光軸上点光源を用いたライトフィールドカメラ４次元顕微鏡法（以下、「微分位相ライトフィールド顕微鏡法」という。）も、図６Ｃに示す面光源を用いた微分位相ライトフィールド顕微鏡法も、吸収成分を持たない透明観察対象物については、同一微分位相像を与える。特に、吸収成分を持ちかつ厚い観察対象物については、マイクロレンズアレイ３４上にできる実像が投影像となるため、投影方向に依存した吸収成分由来の強度変動が生じ、その強度ムラが回折光円の重心計算に付加的重心移動を与える。
【００８０】
この問題を回避するには、図６Ｂに示すような観察対象物の投影方向が１つに定まる点光源を用いればよい。開口絞りの調節機能利用する場合、面光源を点光源に絞る点光源照明を用いると自動的に図６Ｂに示す光軸上点光源微分位相ライトフィールド顕微鏡法となる。そして、現在普及しているケーラー照明法では、開口絞りを調節することにより面光源の光源面積を最小（点光源対応）から最大（広い面光源対応）に自由に変えられる。
【００８１】
従って、顕微鏡装置にマイクロレンズが積層された微小検出器アレイを用いることにより、走査しなくても、異なる斜光照明に対応する複数の像で構成される４次元的データを、同時に悉皆撮像できるため、４次元観測から２次元観測への次元縮減を実現できる。ただし、この方法では、１回の２次元検出で４次元的データを取得するため、データ量不足となり、視野の広さ、画像分解能及び微分位相分解能の間でトレードオフの関係が生じ、これらの全てを同時に最適化することはできない。
【００８２】
ライトフィールド顕微鏡に関して、例えばRobert Prevedelらは、一辺が１５０μｍのマイクロレンズを使用し、４０倍主レンズで、平面方向の分解能３．７５μｍ、画素数１５×１５の微小検出器により、奥行き方向の分解能約７μｍを実現している（Robert Prevedelほか、“Simultaneous whole-animal 3Dimaging of neuronal activity using light-field microscopy”、Nature Methods、第１１巻、２０１４年、ｐ．７２７−７３０  参照）。Robert Prevedelらのライトフィールド顕微鏡においては、例えば１００倍の主レンズを用いれば平面方向の分解能を２.５倍にすることができるが、そうすると視野は２．５分の１になる。このように、微分位相ライトフィールド顕微鏡では、本来のライトフィールド顕微鏡の奥行き情報が微分位相情報に対応するので、視野の広さ、画像分解能及び微分位相分解能はそれぞれトレードオフの関係となる。
【００８３】
［装置構成］
前述した悉皆型４次元顕微鏡観察方法を実現する装置、即ち、本実施形態の透過型顕微鏡装置は、図５に示す制御部４から走査制御系をなくし、光源面積を制御できる光源制御系を設置し、通常透過型顕微鏡の光学系及びライトフィールドカメラからなる撮像部と、４次元画像データの保管及び計算処理を行うデータ処理部を備える構成とすることができる。ライトフィールドカメラから出力される２次元データは、データ処理部において、以下の処理が行われる。
【００８４】
＜ステップ１：４次元データ化＞
マイクロレンズの位置を実座標ｒｄに対応させ、各マイクロレンズ後方の微小検出器の画素の位置を周波数座標ｓｓに対応させ、実像型４次元データＵＫ（ｓｓ，ｒｄ）を構成する。
【００８５】
＜ステップ２：積分操作＞
ステップ１で得られた実像型４次元データを、ｓｓ座標に対して面積積分を行い、強度像を得る。又は、ステップ１で得られた実像型４次元データを、ｓｓ座標に対し重心積分を行い、即ちｓｓ座標に対し１次モーメントを計算しそれを強度像で除し、微分位相像を得る。
【００８６】
以上詳述したように、本実施形態の顕微鏡観察方法及び透過型顕微鏡装置は、第一義的観察対象としてマイクロアレイ上に現出する実像を観察するため、データ量を大幅に縮減することができると共に顕微鏡操作が容易となり、更に、同時並行的に面積分や重心積分の高速演算を行うため、観察対象物の強度像及び微分位相像を、リアルタイムで取得することができる。なお、本実施形態における上記以外の構成及び効果は、前述した第１の実施形態と同様である。
【００８７】
（第３の実施形態）
次に、本発明の第３の実施形態に係る４次元顕微鏡観察方法について説明する。前述したライトフィールドカメラを用いる４次元顕微鏡観察方法は、一度の２次元検出により４次元画像を取得するため、取得データ量にある程度の制限が課される。そこで、本実施形態の顕微鏡観察方法では、第１の実施形態の走査型４次元法の長所である「高解像度性」と、第２の実施形態のマイクロレンズアレイ利用４次元法の長所である「低次元性」の両者を持つ走査次元の縮減法を適用した。
【００８８】
前述したようにライトフィールドカメラの本来の機能は、奥行き情報を取得して、撮像後にピント合わせ（再焦点合わせ：refocusing）できることである。撮像後にピント合わせをする機能は、マルチフォーカス設定撮影を行うこと、即ち、ピントを変えた複数枚の写真を撮り、その画像データを３次元データとして外部の記憶装置に保存することでも可能である。この場合のデータは、観察対象物の異なる奥行きにピントを合わせた複数枚の写真なので３次元データを構成する。
【００８９】
情報的には、ライトフィールドカメラの４次元データもマルチフォーカス３次元データも同じ内容を持っている。従って、ライトフィールドカメラにより取得される４次元データと、マルチフォーカス３次元データは、何らかの方法で数理変換することが可能である。数理的には両者は等価だが、ピントが異なる写真１枚１枚は、マイクロレンズを介さずに通常の２次元デジタル受光器で撮像されるため、技術的にはマルチフォーカス３次元データの方がデータ量に制限がない点で優れている。
【００９０】
上述した３次元−４次元変換に関しては、例えば、コンピュータトモグラフィーの基盤である投影−断面定理を用いて、同一観察対象物に対し、ライトフィールドカメラ撮像による４次元データとマルチフォーカス設定により撮像された３次元データの変換方法が既に提案されている（Kazuya Kodama and Akira Kubota、”Efficient Reconstruction of All-in-Focus Images Through Shifted Pinholes from Multi-Focus Images for Dense Light Field Synthesis and Rendering”、IEEE Trans. Image Processing、第22巻、2013年、p.4407-4421）。この変換方法を用いれば、本実施形態の顕微鏡観察方法は、データ量制限のない第１の実施形態の走査型４次元顕微鏡法と等価な手法となる。
【００９１】
具体的には、本実施形態の透過型顕微鏡装置では、開口絞りつきコレクターレンズ系を備える公知の透過型顕微鏡に、面光源と電動制御ピント合わせ機構を持つ撮像部を付加し、焦点の異なる複数の２次元画像からなるマルチフォーカス３次元データを取得する。本実施形態の透過型顕微鏡装置は、４次元データでなく３次元データを取得するため、データ収集に必要な撮像時間及び画像記憶容量を、大幅に低減することができる。
【００９２】
ライトフィールドカメラが想定する対象物のピント合わせ範囲と、小さな物を観察する顕微鏡の想定するピント合わせ範囲では大きな違い（前者の奥行範囲が広い）があるため、そこを考察する必要がある。ここで、マルチフォーカス３次元データ取得の基本に関し、図２に示す３レンズ４光学面６焦点光学系を用いて考える。図７Ａ〜Ｄは本実施形態の実像型４次元顕微鏡観察方法（以下、「微分位相マルチフォーカス顕微鏡法」という。）におけるマルチフォーカスを実現する例を示す概略図であり、図２をもとに描いている。そして、図７Ａは対物レンズの焦点をずらしてマルチフォーカスを実現する焦点ずらし法、図７Ｂは検出面をずらすことでマルチフォーカスを実現する検出面ずらし法、図７Ｃは第１レンズと物面の間隔を固定しつつ物面をずらすことでマルチフォーカスを設定する物面ずらし法、図７Ｄは第１レンズと第２レンズの間隔を固定しつつ物面のみをずらすことでマルチフォーカスを実現する物面ずらし法である。
【００９３】
面光源を用いた微分位相マルチフォーカス顕微鏡法におけるマルチフォーカス設定の方法には、図７Ａに示す対物レンズの焦点距離を変動させる方式がある。この方式は電磁レンズを用いる電子顕微鏡で採用されており、焦点の異なる複数枚の画像を撮り、３次元のマルチフォーカス画像群とする。通常カメラのようにガラスレンズを用いる場合には、個々のレンズの焦点距離が固定なので、この方式は採用できない。その場合、図７Ｂに示す第３レンズ１３と検出面２４の距離を変えることで実現できる。具体的には、焦点ずらしΔｚを正負の方向に変え、複数枚の画像を撮り、３次元のマルチフォーカス画像群とする。
【００９４】
顕微鏡では、カメラと違い、観察対象物の位置を自由に変えられるので、焦点ずらしを物側で実現しても良い。その場合は、図７Ｃのように物と第２レンズ１２の距離を変えることで焦点ずらしを実現できる。更に、図７Ｄに示す焦点ずらしΔｚを正負の方向に変え、複数枚の画像を撮り、３次元のマルチフォーカス画像群とする。図７Ｃの例では、観察対象物（物面２２）と第１レンズ１１間の距離は焦点距離に固定されているが、図７Ｄのように、７要素全て固定し、観察対象物（物面２２）だけを動かし焦点ずらしΔｚを正負の方向に変え、複数枚の画像を撮り、３次元のマルチフォーカス画像群とすることもできる。
【００９５】
簡単かつ抽象的に示された図７Ｂ〜Ｄのマルチフォーカス設定を実際の顕微鏡装置に組み込むには、対象機器毎にそれぞれ実験的工夫が必要となる。ただし、現在のデジタル顕微鏡は、光学系の各要素の移動がコンピュータ制御されているので、図７Ｂ〜Ｄに示すいずれの場合も、マルチフォーカス設定と連動する画像の撮像は、ピント合わせ機構を持つ撮像部を付加するまでもなく、デジタル顕微鏡固有のピント合わせ機構の制御プログラムを改変することで、全自動化することができる。
【００９６】
本実施形態の面光源微分位相マルチフォーカス顕微鏡法で得られた３次元データは、例えば透過型顕微鏡装置に設けられたデータ処理部において、４次元データ化を経て強度像又は微分位相像に数値変換される。データ処理部における変換処理は、例えば、以下に示す工程を実行するプログラムにより実施することができる。
【００９７】
＜ステップ１：フーリエ変換＞
マルチフォーカス３次元実画像を、３次元フーリエ変換し、３次元周波数画像化する。
【００９８】
＜ステップ２：４次元データ化＞
３次元周波数画像から面光源からの絞り方向に垂直な多数の周波数空間断面を切りだし、２次元逆フーリエ変換を行い、斜光照明対応の２次元実像を得る。斜光照明方向の垂直断面は光源座標と１対１対応するので、２次元逆フーリエ変換データの集合は、実像型４次元データＵＫ（ｓｓ，ｒｄ）を構成する。
【００９９】
＜ステップ３＞
ステップ２で得られた実像型４次元データを、ｓｓ座標に対して面積積分を行い、強度像を得る。又は、ステップ２で得られた実像型４次元データを、ｓｓ座標に対し重心積分を行い、即ちｓｓ座標に対し１次モーメントを計算し、それを強度像で除し、微分位相像を得る。
【０１００】
焦点ずらしの最小ずれ幅とずれ領域範囲をどう設定するかは、多用されるフーリエ変換の基本的性質に立ち返り、以下のように考察される。実空間の最小ずれ幅は、周波数空間では、周波数範囲に対応するので、微分位相マルチフォーカス顕微鏡法の周波数対応である光源座標の範囲、即ち最大偏向視覚範囲を定める。実空間のずれ領域範囲は、周波数空間では、周波数精度に対応するので、微分位相マルチフォーカス顕微鏡法の周波数対応である光源座座標の観測精度、即ち観測位相精度を定める。従って、観察対象毎に得たい位相微分の範囲と観測精度とへの要求から、逆に焦点ずらしの最小ずれ幅とずれ領域範囲が決められる。
【０１０１】
［装置構成］
前述した顕微鏡観察方法を実現する装置、即ち、本実施形態の透過型顕微鏡装置の構成は、光学系２の点光源を面光源に代えて光源を走査する代わりに焦点ずらしを行い、データ処理部５において３次元−４次元変換を行う以外は、図５に示す顕微鏡装置１と同様である。本実施形態の透過型顕微鏡装置における光学系は、従来の透過型顕微鏡の光学系を踏襲することができ、撮像部には２次元検出器を用いることができる。また、データ処理部では、３次元データを４次元データに変換し、面積分や重心積分を算出する演算処理を行い、最終的に強度像や微分位相像を得る。
【０１０２】
以上詳述したように、図７Ａ〜Ｄに示す本実施形態の透過型顕微鏡装置は、マルチフォーカス３次元観察を基本とする微分位相マルチフォーカス顕微鏡であり、平行光照射を用いた透過型顕微鏡装置を拡張したもので、臨界照明による収束光を用いた走査型顕微鏡法とは異なり、走査を行わないため、装置を簡素化することができる。また、本実施形態の顕微鏡観察方法及び透過型顕微鏡は、第一義的観察対象が実像であるため、顕微鏡装置が簡易化され、かつ、顕微鏡操作が容易となる。
【０１０３】
更に、本実施形態の顕微鏡観察方法及び透過型顕微鏡は、マルチフォーカス機構に依拠した奥行き方向操作のみによる３次元的データ取得であるため、２次元点光源走査による４次元データ取得に比べて撮像が高速となりデータ量も圧縮される。その結果、本実施形態の顕微鏡観察方法及び透過型顕微鏡装置によれば、観察対象物の強度像及び微分位相像を、精度を保ちつつ高速かつ簡便に取得することができる。なお、本実施形態における上記以外の構成及び効果は、前述した第１又は第２の実施形態と同様である。
【０１０４】
（第４の実施形態）
次に、本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡観察方法について説明する。前述した第１〜第３の実施形態では明視野法による４次元顕微鏡観察方法について述べたが、本技術は暗視野法にも適用することが可能である。図８Ａ，Ｂは本実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程を示す図であり、図８Ａは光学顕微鏡に適用した場合の構成例であり、図８Ｂは電子顕微鏡に適用した場合の構成例である。
【０１０５】
光学顕微鏡の場合は、図８Ａに示すように、３つのレンズ１１〜１３が、それぞれ光源面２１、物面２２、絞り面２３、検出面２４の４つの光学面の間に配置されている。そして、光源面２１の任意の点から射出された光は第１レンズ１１を通り斜光平行光として観察対象物に当たる。光は物により散乱される成分（実線で表示）と散乱されない成分（破線で表示）に分かれる。
【０１０６】
散乱されない成分はいわゆる背景光として検出面２４に現出し、光源面と共役である絞り面２３の共役点に集光する。そこで、本実施形態の顕微鏡観察方法では、この光源共役点に成分全てを遮蔽するビームストッパー４０を配置して、背景光を除去する。なお、物質（観察対象物）により偏向された光は、絞り面２３の光源共役点からずれた位置を通過するため、ビームストッパー４０では遮蔽されない。これにより、検出面２４に散乱成分のみからなる暗視野像を結像させることができる。この場合の暗視野像は、散乱成分のうち特に偏向によりビームストッパー４０を迂回する成分であり、この暗視野像の実座標が光源面２１における光源座標にタグ付けされた形で記録される。
【０１０７】
そして、光源座標を２次元走査すれば４次元データが得られ、これを前述したアルゴリズム、即ち光源座標での重心座標を求める演算を行えば、暗視野像の実座標各点の微分位相が求まる。本実施形態の顕微鏡観察方法では、散乱成分のみが微分位相に関する情報を保持しており、背景光はノイズ源の役割しか持たないため、背景光を除去することで感度向上が図られる。ただし、この方法は、光源点の走査に共役して背景光の絞り面集光点が走査されるので、ビームストッパー４０の共役走査も必要となる。
【０１０８】
電子顕微鏡の場合は、点光源アレイの製作が困難であるため、図８Ｂに示すように、点光源を光軸に固定しかつ偏向コイル２６を用いて斜光照明を作出する方法を適用し、斜光照明を斜光方向走査することで点光源走査を代替する。背景光は偏向のない透過光であり、絞り面２３上の光源共役点ｐ２に強い共役点像を作るので、この光源共役点に適当な大きさのビームストッパー４０を配置すれば、背景光を除去することができる。この場合もビームストッパー４０の共役走査が必要である。
【０１０９】
［装置構成］
前述した顕微鏡観察方法は、例えば、図５に示す構成の透過型顕微鏡装置により実施することができる。その際、光学顕微鏡の場合は、光学系２に例えば点光源アレイを設け、制御部４に点光源アレイの点光源走査制御系と光源走査に共役したストッパー走査制御系を設ける。また、電子顕微鏡の場合は、光学系２に光軸上点光源からの平行光を斜光照明に変換し斜光方向走査するための偏向コイルを設け、制御部４に光軸上点光源を斜光走査する偏向コイル制御系と斜光走査に共役したストッパー走査制御系を設ける。そして、データ処理部５において、面積分や重心積分を算出する演算処理を行い、最終的に微分位相像を得る。
【０１１０】
本実施形態の顕微鏡観察方法は、点光源から出射される平行光の対物レンズ後焦点面の集光位置にビームストッパーを配置して背景光を除去しているため、高感度で暗視野像を観察することができる。なお、本実施形態における上記以外の構成は、前述した第１の実施形態と同様である。
【０１１１】
（第４の実施形態の第１変形例）
次に、本発明の第４の実施形態の第１変形例に係る顕微鏡観察方法について説明する。図９は本変形例の４次元顕微鏡観察方法で用いるＨ状スリットを示す図である。
【０１１２】
特に生体物質の電子顕微鏡観察においては、電子線破壊の問題で電子線の照射量にある限界が存在する。例えば生体分子の場合、１平方オングストロームあたり１００電子が限界照射量といわれている。４次元法では追加次元である周波数空間の解像のため、例えば６４×６４の周波数メッシュでデータを得るには、通常の２次元観察を４０９６回も実行する必要がある。そのため、１回ごとの電子線量（限界照射量÷実行観察数）は、例えば通常２次元観察の４０９６分の１となり、極めて小さくなる。その場合、像観察はほぼ不可能となるため、顕微鏡の操作性が悪化する。
【０１１３】
この問題を回避するには、周波数空間の解像度を低下させて、例えば１６×１６の周波数メッシュにし、観察回数を２５６回にしてデータ取得を行えば良いが、これは微分位相の観測分解能を４分の１に落とすことになる。このため、観測分解能を落とさず各観察実行時の電子線照射量を増大させる方法が求められる。
【０１１４】
そこで、本変形例の顕微鏡観察方法では、暗視野４次元観察方法である第４の実施形態に次元縮減法を組み合わせて、暗視野像の観察を行う。具体的には、本実施形態の顕微鏡観察方法では、図８Ｂに示す光学系の絞り面２３に、図９に示すようなＨ状スリット４１が形成された光学素子を配置し、光源像４２がＨ状スリット４１の架橋部４１ａに位置するよう調整し、架橋部４１ａを１次元で光源走査又は偏向コイルによる斜光走査する。
【０１１５】
ここで、Ｈ状スリット４１は、相互に平行な２本の直線板で形成されたスリットが、ストッパーの役割をする架橋部４１ａでつながれている形状のスリットであり、導電材料からなる光学素子（絞り）に形成されている。電子顕微鏡の場合、光源走査に伴い光源共役な強い背景電子線が架橋部４１ａを移動するが、その際、架橋部４１aの導電材料部分に電子が当たると、光学素子の外周を通ってグランドに流れるため、帯電が防止される。また先に述べたビームストッパーの共役走査が不要となる。
【０１１６】
上述した方法で得られた３次元データについて、実像上の各点において光源走査又は斜光走査で得た１次元データで重心計算を行う。この重心位置が電子線走査方向に対応する物質（観察対象物）の微分位相であり、各点でプロットした２次元像が、走査方向対応微分位相像となる。
【０１１７】
なお、本変形例の顕微鏡観察方法における光学系２の絞りをＨ状スリット４１に変更した点、及び微分位相を求める演算を２次元の重心積分から１次元に変更した点以外の構成は、前述した第４の実施形態と同様である。
なおＨ状スリットにおいて架橋部４１ａを除いた単純スリットを用いて同様の観察を行うと暗視野像の代わりに明視野像が得られる。
【０１１８】
（第５の実施形態）
次に、本発明の第５の実施形態に係る顕微鏡観察方法について説明する。前述した第４の実施形態の顕微鏡観察方法は、光源の２次元走査が必要なため、空間分解能と微分位相分解能を共に高めるには、極めて大きな４次元データ容量と長時間観測が必要となる。この問題は、前述した第２の実施形態の顕微鏡観察方法のように、分解能を犠牲にし、４次元データ取得をマイクロレンズアレイによる２次元データ検出で代替することで解決することができる。
【０１１９】
図１０は本実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程を示す図である。図１０に示すように、本実施形態の顕微鏡観察方法は、第２の実施形態と第４の実施形態を組み合わせたものであり、マイクロレンズアレイ３４により操作不要とした４次元顕微鏡観察方法において、点光源を光軸に配置すると共に対物レンズ後焦点面の光軸にビームストッパー４０を配置している。
【０１２０】
本実施形態の顕微鏡観察方法では、光軸上の光源を用いるため、ストッパー４０は常に光軸上に位置（固定）していればよく、走査は不要である。本実施形態の顕微鏡装置においても、物質（観察対象物）により偏向された光がストッパー４０を回避し、検出面２４に到達する点は、前述した第４の実施形態と同じである。
【０１２１】
図１１はマイクロレンズアレイを装着したライトフィールド顕微鏡を用いて光軸上点光源照明下で撮影した腎組織切片の微小検出器アレイ上の回折像の等高線プロットである。マイクロレンズアレイ３４の後方に配置された微小検出器アレイ３５上には、図１１の中央に広がる背景光由来の強い回折像（大きいピーク）と、物（観察対象物）による散乱光由来の移動回折像（小さいピーク）の重なりが見えている。このような場合でも、暗視野法を適用すれば、中央の背景光由来の回折像を除去できるため、散乱光由来の回折像の偏向度合いを評価する重心移動の見積もりが正確となり、権威強観察における感度を向上させることができる。
【０１２２】
本実施形態の顕微鏡観察方法は、例えば、光源とストッパーの走査にかかわる制御系をなくし、点光源を含めた光源面積を制御できる制御系を備え、絞り面２３の光軸上にストッパー４０を配置した構成とし、撮像部３にはライトフィールドカメラを用い、データ処理部５において４次元画像データの保管及び計算処理を行う透過型顕微鏡装置により実施することができる。この場合、ライトフィールドカメラから出力される２次元データは、データ処理部５において４次元データに変換され、第４の実施形態と同様の演算処理により微分位相像が得られる。
【０１２３】
本実施形態の顕微鏡観察方法は、光軸から外れた光源の共役点は絞り開口内でも光軸から外れ、この外れにさらに物（観察対象物）による偏向が加わると絞りに当たり光が遮蔽されるため、光源を光軸に固定し、絞りを２次元的に走査することで、光源共役点は光軸上に固定されストッパーも固定される。その結果、本実施形態の顕微鏡観察方法によれば、絞り面で２次元走査を１回実施するだけで、高感度な暗視野像が得られる。
【０１２４】
（第６の実施形態）
次に、本発明の第６の実施形態に係る顕微鏡観察方法について説明する。図１２は本実施形態の４次元顕微鏡観察方法における結像過程を示す図である。前述した第４の実施形態において暗視野法を実現する顕微鏡装置には、光源走査と光源走査に共役するストッパー走査の２つの機械系が不可欠であるが、これらの機構を顕微鏡に付加するには、大きな設計変更が必要となる。
【０１２５】
一方、前述した偏向利用４次元微分位相法の本質は偏向に伴う絞りによる遮蔽であるから、光源の走査は絞りの走査に代替可能である。そこで、図１２に示すように、本実施形態の顕微鏡観察方法では、絞りを２次元的に走査し、走査の各点で２次元の実像を記録する。具体的には、本実施形態の顕微鏡観察方法では、光源面２１と絞り面２３の点対称共役性から、絞りの走査点座標は、図８Ａに示す光源座標と点対称になり、走査２次元座標と実像２次元座標が４次元データを構成する。
【０１２６】
本実施形態の顕微鏡観察方法により暗視野像を観察する際は、前述した第３の実施形態と同様に、光軸光源共役である絞り面２３の光軸上にビームストッパー４０が固定される。なお、図１２には、図８Ａに示す光源走査法に対応する絞り走査法の例を示しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、図８Ｂに示す斜光走査法に対応する絞り走査法でもよく、その場合でも同様の効果が得られる。
【０１２７】
本実施形態の顕微鏡観察方法に用いられる透過型顕微鏡装置の構成は、制御部４における光源又は斜光とストッパー４０の共役２次元走査制御を、絞りの２次元走査制御に変更する以外は前述した第４の実施形態で説明したものと同様である。また、本実施形態の顕微鏡観察方法において微分位相を求める演算方法も、前述した第４の実施形態と同じである。
【０１２８】
（第６の実施形態の第１変形例）
次に、本発明の第６の実施形態の第１変形例に係る顕微鏡観察方法について説明する。図１３は本変形例の４次元顕微鏡観察方法で用いるＨ状スリットを示す図である。本変形例の顕微鏡観察方法は、前述した第６の実施形態の顕微鏡観察方法と次元縮減法を組み合わせたものであり、図１３に示すＨ状スリット４１を絞り面２３に配置し、光源像４２がＨ状スリット４１の架橋部４１ａに位置するよう調整し、架橋部４１ａと平行な方向に絞り走査を１次元で行う。
【０１２９】
これらの３次元データの周波数に関する１次元重心積分が微分位相を与えるため、得られた３次元データについて、実像上の各点において光源走査又は斜光走査で得た１次元データで重心計算を行う。直交する次元方向での微分位相については、例えば、観察対象物を左右どちらかに９０度回転させて同様の１次元走査観察をすれば、直交方向の微分位相３次元データが取得できる。又は、直交する２つの３次元データを用いれば、周波数重心計算とその結果を組み合わせた積分計算から位相像が得られる。そして、この重心位置が絞り走査方向に対応する物質の微分位相であり、各点でプロットした２次元像が、絞り走査方向対応微分位相像となる。
【０１３０】
本実施形態の顕微鏡観察方法に用いる装置の構成は、光学系２の絞りをＨ状スリットに変更する以外は、前述した第６の実施形態と同様である。また、微分位相を求める演算は、２次元の重心積分を１次元に変更する以外は、前述した第４の実施形態と同じである。
【０１３１】
上述した各実施形態及びその変形例の４次元透過型顕微鏡法は、可視光や電子線を用いる顕微鏡だけでなく、レンズを用いるあらゆるタイプの透過型顕微鏡に応用可能である。応用可能な顕微鏡としては、Ｘ線顕微鏡、紫外顕微鏡、赤外顕微鏡、中性子顕微鏡、超音波顕微鏡などが挙げられる。また、本発明の顕微鏡観察方法は、位相板を使わないため、波の干渉作用を原理とする位相板を用いる現行の位相差顕微鏡法に比べて、以下に示す利点を有する。
【０１３２】
＜一般的利点＞
位相板を使わないので、光学構成が単純であり、位相版劣化による寿命問題や位相板自体の生み出すエラー問題から解放されている。さらに干渉法一般との比較では、干渉法が信号光と強い参照光の和についての観測なので、画像中には必ず信号よりはるかに強い背景光が含まれ、位相差像はその背景信号の差として検出される。本発明は、光であれ電子であれ、それらの物質透過時の偏向の定量化なので、信号光のみで画像が構成され干渉法に見られるような不要な背景光がない。このため干渉を利用する位相差法に比べ信号感度（Ｓ／Ｎ比)が各段に向上する。
【０１３３】
＜各顕微鏡における個別的な利点＞
可視、紫外、赤外などの光学顕微鏡：現行位相差法では、位相変化の大きい境界でハローなどのエラーが生じる。これを取り除く種々の方法が提案されているが、完全のものはない。本発明の微分位相ライトフィールド顕微鏡法、微分位相マルチフォーカス顕微鏡法は共にハローフリーである。また現行位相差法では、光学構成の異なる典型的な２種、位相差法と微分干渉法が用いられているが、本発明を利用すれば両者に対応する位相法が１度の実験で得られる。また１度の実験であらゆる方向の微分に対応した微分干渉像が得られる。
【０１３４】
電子顕微鏡、Ｘ線顕微鏡、中性子顕微鏡などにおける位相板を使う現行の手法の欠点、（ｉ）弱い位相物体にしか適用できない（ii）電子顕微鏡の場合、電子が誘起する位相板帯電のため、像の乱れが生じ位相板の短寿命化が避けられない、（iii）干渉を生起する弾性散乱電子・Ｘ線・中性子のみ結像に寄与し、非弾性散乱電子・Ｘ線・中性子は背景ノイズになる。厚い試料では非弾性散乱電子・Ｘ線・中性子が弾性散乱電子・Ｘ線・中性子を凌駕するため、位相差像はＳ／Ｎ比が低い。本発明はこうした欠点全てから解放されており、特に弾性散乱電子・Ｘ線・中性子、非弾性散乱電子・Ｘ線・中性子すべてが像形成に活用されるので厚い試料のＳ／Ｎ比が格段に向上する。
【実施例】
【０１３５】
以下、本発明の実施例として、市販のライトフィールド顕微鏡を用いて、前述した第２の実施形態の方法により、微分位相ライトフィールド顕微鏡の実証実験を行った。図１４は本発明の実施例で用いたデータ処理方法を示すフローチャートである。なお次元縮減した3次元データに対しても同様なデータ処理のフローチャートとなる。【０１３６】
実験に用いた装置は、オリンパス株式会社製  正立顕微鏡  ＢＸ６３に、ライトフィールド顕微鏡用アタッチメント（PhaseView社製３Ｄイメージングユニット  InSight）を装着して構成した。オリンパス株式会社製  正立顕微鏡  ＢＸ６３は、多機能で明視野像や微分干渉像などの切り替え撮影ができるものである。この正立顕微鏡のＣマウントに、PhaseView社製３Ｄイメージングユニット  InSightを装着し、InSightのマイクロレンズがオリンパス顕微鏡の中間像面に来るよう調整した。そして、そのマイクロレンズアレイ上に形成された中間像の回折像の総体を、InSightのリレーレンズにより浜松ホトニクス株式会社製デジタルカメラ  ＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０  Ｖ３（画素数  ２０４８×２０４８）のＣＭＯＳイメージセンサ上に転送し検出した。【０１３７】
マイクロレンズは、中間像面に出し入れ可能となっており、引き抜くと正立顕微鏡本来の機能が回復される。また、正立顕微鏡の明視野モードの状態でマイクロレンズを挿入してライトフィールド顕微鏡を構成し、観察は、４０倍の対物レンズ（Olympus UPlanSApo X40 NA0.95）を用いて行った。この４０倍の対物レンズは、明視野像及び微分干渉像の取得においても用いた。なお、これら像の解像度は画素数が２０４８×２０４８だが、低解像度のライトフィールド顕微鏡像との比較のため、画素数を１２８×１２８に粗視化した画像も作成した。【０１３８】
ここで、InSightが備えるマイクロレンズアレイは、直径６５μｍのマイクロレンズが縦横１２８個ずつ配列された構成であった。また、デジタルカメラのＣＭＯＳイメージセンサの画素数は２０４８×２０４８であり、画素サイズは６．５μｍ×６．５μｍであった。ライトフィールド顕微鏡では、マイクロレンズが１画素に対応するので、像分解能は、６５μｍ÷４０＝１．６３μｍとなる。マイクロレンズアレイで形成された像は、デジタルカメラのＣＭＯＳ上に投影されるので、各マイクロレンズが作る回折像は、マイクロレンズの直下にある１６×１６の正方形の画素に投影されるが、その中でも回折像の円形中心分の画素（画素数１０×１０）が使用された。【０１３９】
即ち、本発明における微小検出器は、ＣＭＯＳ上に縦１０個×横１０個の画素で構成され、その総数はマイクロレンズアレイの構成と同じ縦１２８個×横１２８個となる。このような構成のライトフィールド顕微鏡では、奥行き分解能は６μｍであった。この光学系の基本構成は、前述したRobert Prevedelらにより報告されたライトフィールド顕微鏡とほぼ同じであった。【０１４０】
観察対象物には、マウス腎臓の切片が３色で蛍光染色されている試料（ThermoFisher Scientific社製  FluoCells F24630）を用いた。切片の厚さは１６μｍであった。この試料に対して、図１４に示すデータ処理方法を用いて、明視野像と微分位相像の観察（低分機能）を行った。また、比較例として、正立顕微鏡本来の機能である明視野像と微分干渉像の観察（高分解能）及びライトフィールド顕微鏡での４次元観察を行った。【０１４１】
その結果を図１５〜１７に示す。なお、図１５〜１７に示す画像のうち、図１５Ａと図１６Ａは、多数あるＣＭＯＳ画素の受光強度ばらつきを補正するため、試料のないブランク状態での画像を用いて各画素の感度補正を行った後の較正画像である。【０１４２】
（１）微分位相ライトフィールド顕微鏡像と通常微分干渉像の比較
図１５Ａはマウスの腎臓組織切片の点光源微分位相ライトフィールド顕微鏡像、図１５Ｂは面光源微分位相ライトフィールド顕微鏡像、図１５Ｃは通常微分干渉顕微鏡の粗視化像、図１５Ｄは通常微分干渉顕微鏡の高画素数オリジナル像である。図１５Ａに示す点光源微分位相ライトフィールド顕微鏡像と、図１５Ｃに示す通常微分干渉顕微鏡の粗視化像はきわめて類似しており、本発明の観察方法の実現性と効果を実証している。【０１４３】
一方、図１５Ｂに示す面光源微分位相ライトフィールド顕微鏡像は、図１５Ａに示す点光源微分位相ライトフィールド顕微鏡像に比べて、画像がぼけて解像度が低下した。これは、図６Ｃに示すように、斜光成分が隣の画素に越境して入射するためと考えられる。この結果は、点光源が微分位相ライトフィールド顕微鏡用照明として優れていることを示している。図１５Ｄに示す通常微分干渉顕微鏡の高画素数オリジナル画像は、画素数を減らした効果を示すために参考として載せたものである。【０１４４】
（２）点光源明視野ライトフィールド顕微鏡像と通常明視野像（粗視化）の比較
図１６Ａはマウスの腎臓組織切片の点光源明視野ライトフィールド顕微鏡像であり、図１６Ｂはその通常明視野法の粗視化像である。前述したように、微分位相ライトフィールド顕微鏡像の計算過程で得られる各マイクロ受光器の画像強度の面積分は、明視野像を与える。図１６Ａに示す点光源明視野ライトフィールド顕微鏡像は、こうして得られた点光源対応の明視野像である。これを、図１６Ｂに示す粗視化された通常明視野像と比較すると、両観察では光源面積に差があるためか、図１６Ａ，Ｂの両画像には図１５Ａ〜Ｄの画像に見られるような並行性は見られなかった。【０１４５】
（３）面光源明視野ライトフィールド顕微鏡像と通常ライトフィールド顕微鏡像の比較
図１７Ａはマウスの腎臓組織切片の面光源明視野ライトフィールド顕微鏡像、図１７Ｂはその通常ライトフィールド顕微鏡像である。これらの実験はともにライトフィールド顕微鏡モードの観察だが、得られたデータの処理が異なる。具体的には、図１７Ａは本発明の手法を適用した各マイクロ受光器検出全域の強度の積分値の画像、図１７Ｂは本来の面光源利用ライトフィールド顕微鏡の全焦点画像、即ち、異なる奥行きの合焦点像１０枚を再生し、その全ての画像の総和をとったものである。各マイクロ受光器における検出全域のデータを等分に使用する意味では、両者は同一結果を与えると予想されるが、両画像の類似性は高い。【０１４６】
ライトフィールドカメラと焦点ずらしを用いたマルチフォーカスカメラの等価性は、すでに実験的に実証されており、図１５Ａ〜Ｄに示す微分位相ライトフィールド顕微鏡の実証は、微分位相マルチフォーカス顕微鏡法の実証を含意している。従って、光源面積を制御できるケーラー照明を用いる微分位相法の本発明は実証されたといえる。
【符号の説明】
【０１４７】
１  顕微鏡装置
２、１０、１００  光学系
３  撮像部
４  制御部
５  データ処理部
１１〜１３、３１、１０１〜１０３  レンズ
２１、１１１  光源面
２２、１１３  物面
２３、１１２  絞り面
２４、１１４  検出面
２５  回折面
２６  偏向コイル
３１  ライトフィールドカメラの主レンズ
３４  マイクロレンズアレイ
３５  微小検出器アレイ
４０  ビームストッパー
４１  Ｈ状スリット
４１ａ  架橋部
４２  光源像
ｆ  焦点距離
Ｚ  光軸
【図１】
2019111440.tif 000019
【図２】
2019111440.tif 000020
【図３】
2019111440.tif 000021
【図４】
2019111440.tif 000022
【図５】
2019111440.tif 000023
【図６】
2019111440.tif 000024
【図７】
2019111440.tif 000025
【図８】
2019111440.tif 000026
【図９】
2019111440.tif 000027
【図１０】
2019111440.tif 000028
【図１１】
2019111440.tif 000029
【図１２】
2019111440.tif 000030
【図１３】
2019111440.tif 000031
【図１４】
2019111440.tif 000032
【図１５】
2019111440.tif 000033
【図１６】
2019111440.tif 000034
【図１７】
2019111440.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月18日(2020.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡の光軸上に配置された点光源例えば開口絞りを最小にしたケーラー照明法により光源から出射された光を観察対象物に平行照射する工程と、
前記観察対象物を透過した光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する工程と、
前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する工程と、
前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する工程と、
前記４次元データを、前記２次元周波数空間座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程と、
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項２】
前記絞り面と前記光軸との交点にビームストッパーを配置して非散乱成分を遮蔽する請求項１に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項３】
面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する工程と、
前記観察対象物を透過した光を集光して検出面に実像を結像させる工程と、
前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得して互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する工程と、
前記複数の実画像から３次元データを生成する工程と、
前記３次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程と、
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項４】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、
前記点光源を２次元走査しながら前記照明工程と前記結像工程を行い、光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する工程と、
前記４次元データを、前記光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程と
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項５】
前記絞りにおいて非散乱成分の集光する点にビームストッパーを配置し、非散乱成分を遮蔽する請求項４に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項６】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、
前記絞りを２次元走査しながら前記照明工程と前記結像工程を行い、走査２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する工程と、
前記４次元データを、前記走査２次元座標と点対称の光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程と
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項７】
前記絞りにおいて非散乱成分の集光する点にビームストッパーを配置し、非散乱成分を遮蔽する請求項６に記載の顕微鏡観察方法。
【請求項８】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明工程と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置されたＨ状スリットを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像工程と、
前記Ｈ状スリットの架橋部に光源像が位置するように調整し、該架橋部において前記点光源からの光又は前記Ｈ状スリットの走査を１次元で行い、３次元データを生成する工程と、
前記３次元データを、検出面２次元座標の各点における１次元データの重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得する工程と
を有し、
非散乱成分は前記Ｈ状スリットの架橋部分に集光するので、架橋がビームストッパーの役割を果たし、非散乱成分を遮蔽する顕微鏡観察方法。
【請求項９】
面光源を用いるケーラー照明法により前記面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する工程と、
前記観察対象物を透過した光を集光して検出面に実像を結像させる工程と、
前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得して互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する工程と、
前記複数の実画像から三次元データを生成する工程と、
該３次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を取得する工程と、
を有する顕微鏡観察方法。
【請求項１０】
顕微鏡の光軸上に配置された点光源例えば開口絞りを最小にしたケーラー照明法により光源から出射された光を観察対象物に平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物を透過した光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する結像光学系と、
前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する撮像部と、
前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データの、前記２次元周波数空間座標における面積積分及び／又は重心積分を計算するデータ処理部と、を有し、
前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を得る透過型顕微鏡装置。
【請求項１１】
面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物を透過した光を集光して、検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得し、互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する撮像部と、
前記複数の実像画像から３次元データを生成する３次元データ生成部と、
前記３次元データから前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を生成するデータ処理部と、を有し、
前記データ処理部は、前記３次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を得る透過型顕微鏡装置。
【請求項１２】
前記照明光学系は、１枚又は１群のレンズ及び１枚又は１群の絞りにより構成されている請求項１０または１１に記載の透過型顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記結像光学系は、少なくとも２枚のレンズの間に絞り面が配置された構成を有する請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の透過型顕微鏡装置。
【請求項１４】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記点光源を２次元走査しながら前記平行照射と前記結像を行い、光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データを、前記光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有する透過型顕微鏡装置。
【請求項１５】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記絞りを２次元走査しながら前記平行照射と前記結像を行い、走査２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データを、前記走査２次元座標と点対称の光源面２次元座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有する透過型顕微鏡装置。
【請求項１６】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置されたＨ状スリットを通過した散乱光を集光して検出面に実像を結像させる結像光学系と、
前記Ｈ状スリットの架橋部に光源像が位置するように調整し、該架橋部において前記点光源からの光又は前記Ｈ状スリットの走査を１次元で行い、３次元データを生成する３次元データ生成部と、
前記３次元データを、検出面２次元座標の各点における１次元データの重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有し、
非散乱成分は前記Ｈ状スリットの架橋部分に集光するので、架橋がビームストッパーの役割を果たし、非散乱成分を遮蔽する透過型顕微鏡装置。
【請求項１７】
点光源から出射された光を観察対象物に斜め方向から平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物で偏向され、前記点光源と共役な位置に配置された絞りを通過した散乱光を集光して像面上に配置されたマイクロレンズアレイに結像投影する結像光学系と、
前記マイクロレンズアレイ後方検出面に配置されたマイクロ光検出器アレイ上に形成された回折光場の強度分布を検出する検出系と、
前記マイクロ光検出器アレイ上の複数の回折画像から、マイクロレンズアレイ座標を２次元実空間座標、マイクロ光検出器アレイ上各検出座標を２次元周波数空間座標とする４次元データを生成する４次元データ生成部と、
前記４次元データを、前記２次元周波数空間座標における重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元微分位相像を取得するデータ処理部と
を有し、
絞り面と光軸との交点にビームストッパーを配置して非散乱成分を遮蔽する透過型顕微鏡装置。
【請求項１８】
面光源を用いるケーラー照明法により前記面光源を構成する各点光源から同時出射された光を観察対象物に平行照射する照明光学系と、
前記観察対象物を透過した光を集光して、検出面に実像を結像させる検出光学系と、
前記検出面に形成される光場の強度分布から実像を取得し、互いにピントが異なる複数の実画像を撮像する撮像部と、
前記複数の実像画像から三次元データを生成する三次元データ生成部と、
該３次元データから前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を生成するデータ処理部と、を有し、
前記データ処理部は、前記三次元データを３次元フーリエ変換した後、投影−断面定理を用いて光源面２次元座標と検出面２次元座標からなる４次元データを生成し、前記光源面２次元座標における面積積分及び／又は重心積分を計算して、前記観察対象物の２次元強度像及び／又は２次元微分位相像を得る透過型顕微鏡装置。
【国際調査報告】
2019111440.tif 000036
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2019111440.tif 000038
2019111440.tif 000039
2019111440.tif 000040
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2019111440.tif 000042
2019111440.tif 000043
2019111440.tif 000044
2019111440.tif 000045