(57)【要約】  本発明は、下記一般式（I）で示される化合物、またはその塩を含む、細胞接着を促進するための組成物を提供する：2019117262.tif 000051 ｛式中、各記号は明細書中で定義される通りである。｝。
2019117262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）で示される化合物、またはその塩を含む、細胞接着を促進するための組成物：
【化１】
2019117262.tif 000041
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基である。｝。
【請求項２】
Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
Ｒ２が、置換基を有していてもよいメチル基またはエチル基であり、Ｒ３が水素原子である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１が、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基もしくはメチル基で置換されていてもよいフェニル基である、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
Ｙが、メチレン基、エチリデン基またはプロピリデン基である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【化２】
2019117262.tif 000042
【化３】
2019117262.tif 000043
【化４】
2019117262.tif 000044
【化５】
2019117262.tif 000045
【化６】
2019117262.tif 000046
および、
【化７】
2019117262.tif 000047
【請求項８】
化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【化８】
2019117262.tif 000048
【化９】
2019117262.tif 000049
および、
【化１０】
2019117262.tif 000050
【請求項９】
細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
正常細胞株が、ＨＵＶＥＣ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＨＥＫ２９３である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
がん細胞株が、ＨｅＬａ細胞、Ａ４３１、ＨＣＴ１１６、またはＭＣＦ７である、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、請求項９記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞を培養するための培地。
【請求項１４】
細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項１３記載の培地。
【請求項１５】
正常細胞株が、ＨＵＶＥＣ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＨＥＫ２９３である、請求項１４記載の培地。
【請求項１６】
がん細胞株が、ＨｅＬａ細胞、Ａ４３１、ＨＣＴ１１６、またはＭＣＦ７である、請求項１４記載の培地。
【請求項１７】
幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、請求項１４記載の培地。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物を培地に添加することを含む、細胞の培養容器への接着を促進するための方法。
【請求項１９】
細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
正常細胞株が、ＨＵＶＥＣ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＨＥＫ２９３である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
がん細胞株が、ＨｅＬａ細胞、Ａ４３１、ＨＣＴ１１６、またはＭＣＦ７である、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着性細胞の細胞接着を促進するための組成物等に関し、詳細には、細胞接着を促進するための組成物、および当該組成物を用いることを特徴とする細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物体内の様々な細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持させるための技術が発展してきている。本技術は、細胞の機能及び構造を詳細に研究するため、医薬品等の薬効及び毒性を評価するため、また、再生医療を実施するために不可欠なものとなっている。動物由来の細胞は、その性状から浮遊性細胞と接着性細胞に大きく二分される。浮遊性細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着性細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着性細胞である。ここで、接着性細胞は培養する際に容器に接着させることがまず必要となるが、細胞の接着の割合が低い、或いは細胞の接着までに時間がかかるなどの問題が生じることがある。このような問題が生じた場合、細胞を用いた研究を迅速かつ効率的に実施できない。そのため、細胞の培養容器への接着を促進する手法が求められており、例えば、細胞外マトリックスを利用して細胞接着を促進する方法が報告されている（非特許文献１）。また、化学合成された低分子化合物やポリマーを用いて、細胞の接着を促進する方法が報告されている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００９／１５４２０１号
【特許文献２】特開平１１−３２２６１４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Somaiah C et al, PLOS ONE. 2015, Dec 14;10(12):e0145068
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、接着細胞の培養容器への接着を促進させ得る培地添加用組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定の化合物を培地に添加することにより、接着性細胞の培養容器への接着を極めて良好に促進し得ることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。【０００７】
［１］下記一般式（I）で示される化合物、またはその塩を含む、細胞接着を促進するための組成物：【０００８】
【化１】
2019117262.tif 000003
【０００９】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基である。｝。
［２］Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、［１］記載の組成物。
［３］Ｒ２が、置換基を有していてもよいメチル基またはエチル基であり、Ｒ３が水素原子である、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］Ｒ１が、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒである、［１］〜［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基もしくはメチル基で置換されていてもよいフェニル基である、［４］記載の組成物。
［６］Ｙが、メチレン基、エチリデン基またはプロピリデン基である、［４］または［５］に記載の組成物。
［７］化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、［１］〜［６］のいずれかに記載の組成物。【００１０】
【化２】
2019117262.tif 000004
【００１１】
【化３】
2019117262.tif 000005
【００１２】
【化４】
2019117262.tif 000006
【００１３】
【化５】
2019117262.tif 000007
【００１４】
【化６】
2019117262.tif 000008
【００１５】
および、【００１６】
【化７】
2019117262.tif 000009
【００１７】
［８］化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物。【００１８】
【化８】
2019117262.tif 000010
【００１９】
【化９】
2019117262.tif 000011
【００２０】
および、【００２１】
【化１０】
2019117262.tif 000012
【００２２】
［９］細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、［１］〜［８］のいずれかに記載の組成物。
［１０］正常細胞株が、ＨＵＶＥＣ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＨＥＫ２９３である、［９］記載の組成物。
［１１］がん細胞株が、ＨｅＬａ細胞、Ａ４３１、ＨＣＴ１１６、またはＭＣＦ７である、［９］記載の組成物。
［１２］幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、［９］記載の組成物。
［１３］［１］〜［８］のいずれかに記載の組成物を含む、細胞を培養するための培地。
［１４］細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、［１３］記載の培地。
［１５］正常細胞株が、ＨＵＶＥＣ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＨＥＫ２９３である、［１４］記載の培地。
［１６］がん細胞株が、ＨｅＬａ細胞、Ａ４３１、ＨＣＴ１１６、またはＭＣＦ７である、［１４］記載の培地。
［１７］幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、［１４］記載の培地。
［１８］［１］〜［８］のいずれかに記載の組成物を培地に添加することを含む、細胞の培養容器への接着を促進するための方法。
［１９］細胞が、正常細胞株、がん細胞株および幹細胞からなる群から選択される、［１８］記載の方法。
［２０］正常細胞株が、ＨＵＶＥＣ、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＨＥＫ２９３である、［１９］記載の方法。
［２１］がん細胞株が、ＨｅＬａ細胞、Ａ４３１、ＨＣＴ１１６、またはＭＣＦ７である、［１９］記載の方法。
［２２］幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である、［１９］記載の方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、細胞増殖において基板などへの接着が必須である接着性細胞の培養容器への接着を促進することができる。これにより、当該細胞を効率的に接着させることが可能となり、当該細胞を用いた研究を従来よりも迅速かつ効率的に実施することが可能となる。なお、本発明を用いて培養される接着性細胞が幹細胞（例、人工多能性幹細胞）の場合、本発明は該幹細胞の培養容器への接着を促進させつつも、当該培養の間、該幹細胞の未分化状態を好適に保つことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明組成物を段階的な濃度で培地に添加した場合に、ＨＥＫ２９３細胞株の培養容器への細胞接着が濃度依存的に促進することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において使用する用語を以下に定義する。
【００２６】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子である。「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。
【００２７】
「アルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等の基が挙げられる。
【００２８】
「アリール基」とは、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。特に、アリール基は、Ｃ６−１０の芳香族のフェニル、インデニル、ナフチルであり得る。
【００２９】
「アルキレン基」とは、直鎖または分岐状のアルキレン基を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、プロピリデン、ｎ−ブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔｅｒｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、ｓｅｃ−ペンチレン、ｔｅｒｔ−ペンチレン、ｎ−ヘキシレン、ｓｅｃ−ヘキシレン、ｔｅｒｔ−ヘキシレン等の基が挙げられる。
【００３０】
「アルキル基」、「アリール基」及び「アルキレン基」は、置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば以下が挙げられる。
(1)ハロゲノ基、
(2)ヒドロキシ基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ２−１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ２−１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル）、
(10)アリール基（例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル）、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル）、
(12)アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、３−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ−ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２−ペンチルチオ、３−ペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、２−ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)ヒドロキシ基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
ここで、「アルキル基」とは、Ｃ１−６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子若しくはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
ここで、「アシル基」とは、Ｃ１−６アルキル基、またはＣ６−１０アリール基を有するアシル基である。ここで、「Ｃ１−６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１〜６のものであり、「Ｃ6−１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６〜１０のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、等が挙げられる。
置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００３１】
式（I）に示される化合物は、塩の形態であってもよい。前記式（I）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸及び臭化水素酸等の無機酸との塩ならびに酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸及び安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００３２】
［ケトンおよびヒドラジドの組合せからなる化合物の合成］
一般的には、下記式で表されるように、ケトンとヒドラジド、それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４−ジオキサン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から３日間反応を行なうのが好ましい。
【００３３】
［反応式１］
【００３４】
【化１１】
2019117262.tif 000013
【００３５】
反応終了後の反応混合物は、蒸留水を加えて析出させる、又は析出しない場合は、有機溶媒抽出後濃縮といった通常の後処理を行ない、目的の本発明化合物を得ることができる。また、精製の必要が生じたときには、再結晶、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、液体クロマトグラフ分取等の任意の精製方法によって分離、精製することができる。
【００３６】
［ｋ−１誘導体の合成］
一般的に、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン(ｋ−１)と、所望の一級アミン、あるいはその塩を用いて、それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４−ジオキサン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から２４時間反応を行なうのが好ましい。アミンの塩としては、塩酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等を用いることが出来る。
【００３７】
また、上記の手法を使用しない場合には、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン(ｋ−１)を、アンモニアのメタノール溶液に溶解させ、アンモニアガスを注入しながら撹拌することで、イミン（ｋ−１’）を合成し、その後、対応するイソシアネートと反応させることでも、合成できる。  
【００３８】
反応終了後の反応混合物は、蒸留水を加えた後に、溶媒抽出後濃縮といった通常の後処理を行ない、目的の本発明化合物を得ることができる。また、精製の必要が生じたときには、再結晶、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、液体クロマトグラフ分取等の任意の精製方法によって分離、精製することができる。
【００３９】
１．細胞接着を促進するための組成物
本発明は、以下の化合物を含む、細胞接着を促進するための組成物（以下、「本発明の組成物」と称することがある）を提供する。本発明の組成物は、細胞培養用の培地に添加することにより、細胞（特に接着細胞）の培養容器への細胞接着を促進することができる。
【００４０】
本発明の組成物に含まれる化合物は、一般式（I）：
【００４１】
【化１２】
2019117262.tif 000014
【００４２】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基である。｝で表される化合物、またはその塩である（以下、式（I）で示される化合物またはその塩を総称して、単に「本発明の組成物に含まれる化合物」または「本発明の組成物中の上記化合物」等と称する場合がある）。
【００４３】
一態様において、前記一般式（I）中のＸが単結合である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜１０のアルキル基、特に好ましくは、オクチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子である。
【００４４】
また、Ｘが−ＣＨ２ＣＯＯ−である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基（好ましくは、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子であるか、あるいは、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基（より好ましくは、置換基を有している炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、ベンジル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子である。
【００４５】
また、Ｘが−ＣＯＮＨ−である場合は、Ｒ１は、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、フェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子である。
【００４６】
また、Ｘが−ＮＨＣＯ−である場合は、Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり、ここで、Ｙが、単結合である場合は、Ｚは、単結合または置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、単結合または置換基を有していないアルキレン基、特に好ましくは、単結合またはメチレン基）であり、Ａｒは置換基（より好ましくは、ハロゲン原子、メチル基、水酸基、またはメトキシ基）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基または置換基を有していないアリール基、特に好ましくはフェニル基または水酸基を有するフェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、Ｒ３は、水素原子である。
【００４７】
また、Ｘが−ＮＨＣＯ−、かつ、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキレン基、特に好ましくはメチレン基、エチリデン基またはプロピリデン基）である場合は、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有しているアリール基、特に好ましくは、ハロゲノ基、メチル基、水酸基もしくはエトキシ基を有するフェニル基、またはナフチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基である。
【００４８】
本発明の組成物中の上記化合物の配合量は、本発明の組成物を培地に添加した際に、当該培地が、本発明の所望の効果を発揮できる濃度となるものであれば特に限定されない。なお、本発明の所望の効果を発揮できる濃度としては、上記化合物の培地中の濃度の下限値は、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上であり得る。また、その濃度の上限値は、通常１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、特に好ましくは２０μＭ以下であり得るが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の組成物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や担体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。
【００５０】
本発明の組成物の使用が好適である細胞種としては、接着性細胞の細胞であり得る。そのような細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が好ましい。また、細胞が由来する組織または臓器も、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられる。また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。
【００５１】
本発明において、正常細胞株の例としては、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（マウス胚線維芽細胞）、ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＢＫ（ウシ腎臓由来細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓尿細管上皮細胞）、Ｖｅｒｏ、ＮＩＨ３Ｔ３（マウス胎児線維芽細胞）、ＨｅｐａＲＧ（肝細胞、登録商標）、ヒト初代培養肝細胞等が挙げられる。これらの中では、特にＣ３Ｈ１０Ｔ１／２、ＨＵＶＥＣまたはＨＥＫ２９３が好ましい。
【００５２】
また、がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＢＳＹ−２、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ  ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ−２、ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＫＭ−１２、ＳＷ−６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＦ−２６８、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、ＳＮＢ−１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫＯＶ３、ＩＧＲＯＶ−１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ−３１、ＳＮ−１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＲＸＦ−３９３Ｌ、７８６−０、ＴＫ−１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ−４、ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７、ＭＫＮ−７４、皮膚がん細胞株としてＡ４３１、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ−ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０ＴＢ、ＲＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ等が挙げられる。これらの中では、ＨｅＬａ、Ａ４３１、ＨＣＴ１１６およびＭＣＦ７が特に好ましい。
【００５３】
また、本明細書において「幹細胞」とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞を意味し、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。本発明において、幹細胞としては、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）等が特に好ましい。
【００５４】
本明細書において「本発明の組成物」との語は、「本発明の剤」または「本発明の細胞接着促進剤」との語に置き換えることができる。
【００５５】
２．培地
本発明は、本発明の組成物を含む細胞培養用の培地（以下、「本発明の培地」と称することがある）を提供する。本発明の培地を用いることにより、細胞（特に接着細胞）の培養容器への細胞接着を促進することができる。
【００５６】
本発明の培地に有効成分として含まれる上記化合物の濃度は、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、その濃度の下限値は、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上、さらに好ましくは１μＭ以上、特に好ましくは１０μＭ以上であり得る。また、その濃度の上限値は、通常１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、特に好ましくは２０μＭ以下であり得る。
【００５７】
本発明の培地は、本発明の組成物が配合されている以外は、公知の培地の組成と同様とすることができる。
【００５８】
一態様において、本発明の培地は、市販される培地に、本発明の組成物を添加することにより調製することができる。本発明の組成物を添加することにより本発明の培地とし得る市販の培地としては、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ＭｉｘｔｕｒｅＦ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地（味の素社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）等の培地が挙げられる。
【００５９】
また、上記の培地に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、細胞外マトリックス、生理活性物質等を目的に応じて添加してもよい。
【００６０】
本発明の培地における細胞の培養は、細胞培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。一態様において、培養容器として、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているものを用いてもよい。このような容器の例としては、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、セレクチン、ヒアルロン酸、フィブリン等をコーティングした容器が挙げられるが、これに限定されない。
【００６１】
本発明の培地により細胞接着を促進させることができる細胞は、「１．細胞接着を促進するための組成物」において説明した細胞と同様である。
【００６２】
３．細胞接着を促進するための方法
本発明は、本発明の組成物を培地に添加することを含む、細胞接着を促進するための方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する。本発明の方法は、細胞（特に接着細胞）の培養容器への細胞接着を促進することができる。
【００６３】
本発明の方法において用いられる培地は、所望の効果を得られる限り特に限定されない。また、本発明の方法における細胞培養条件（例えば、温度、二酸化炭素濃度、培養期間等）は自体公知の方法を用いればよく、あるいは、目的に応じて、適宜改変してもよい。例えば、細胞を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５℃〜３９℃、好ましくは３３℃〜３９℃（例、３７℃）である。二酸化炭素濃度は、通常、培養の雰囲気中、４体積％〜１０体積％であり、４体積％〜６体積％が好ましい。培養期間は、通常１乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
【００６４】
本発明の方法において用いられる培地は、本発明の培地を用いればよい。
【００６５】
本発明の方法における、上述した有効成分となる化合物の濃度および好適な細胞種等は、「１．細胞接着を促進するための組成物」において説明したものと同様である。
【００６６】
以下に、本発明の細胞接着促進用組成物の有用性について、以下の実施例において具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。また、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。また、（ｗ／ｖ）は、１体積あたりの重量を表わす。
【実施例】
【００６７】
[参考例１]化合物の合成
本明細書において２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（「ｋ−１」とも称することがある）および２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルアセトフェノン(「ｋ−２」とも称することがある)の２種のケトンについては自体公知の方法により合成が可能である（Sum TH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1;71(26-27): 4557-4564.）。また、２−（フェニルアミノ)アセトヒドラジド（「Ｈ−１」とも称することがある）および４−フェニルセミカルバジド（「Ｈ−１０」とも称することがある）の２種のヒドラジンも、自体公知の方法により合成が可能である（Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun;81(6):715-29.）。【００６８】
[ｋ−１：Ｈ−１]
２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン(ｋ−１)（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ)、２−（フェニルアミノ)アセトヒドラジド(Ｈ−１)（１１０ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加え、再度１００℃で撹拌後、熱時ろ過してｋ−１：Ｈ−１（７０．１ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ、収率３９％)を薄黄色固体として得た。【００６９】
【化１３】
2019117262.tif 000015
【００７０】
[ｋ−１：Ｈ−７]
Ｎ−ブロモ酪酸メチル（８．０ｇ、４４ｍｍｏｌ)、アニリン(８．０ｍＬ、８８ｍｍｏｌ)をトルエン(１０ｍＬ)に溶解させ、５時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を水(３０ｍＬ)、２Ｍ塩酸（２５ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で順次洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜１０／９０)で精製し、中間化合物（化合物番号１０５）（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、収率６０％)を黄色液体として得た。【００７１】
上記のようにして得られた中間化合物（化合物番号１０５）（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ)をメタノール(２６ｍＬ)に溶解させ、ヒドラジン・１水和物（１２．８ｍＬ、２６４ｍｍｏｌ）を加えて室温で４．５時間撹拌した。水（１５０ｍＬ）を加えて、塩化メチレン（３０ｍＬｘ５）で抽出した。有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで懸濁洗浄し、Ｈ−７（４．６０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、収率９０％)を無色固体として得た。【００７２】
【化１４】
2019117262.tif 000016
【００７３】
２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン(ｋ−１)（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、２−（フェニルアミノ）ブタンヒドラジド（Ｈ−７）（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（０．５ｍＬ）に溶解させた。ヘキサン（０．５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ−１：Ｈ−７（５６．８ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、収率５７％)を無色固体として得た。【００７４】
【化１５】
2019117262.tif 000017
【００７５】
[ｋ−１：Ｈ−１０]
２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン(ｋ−１)（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、４−フェニルセミカルバジド(Ｈ−１０)（１０９ｍｇ，０．７２１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０)で精製した。得られた固体をＩＰＥで懸濁洗浄してｋ−１：Ｈ−１０（１９．１ｍｇ、０．０６１０ｍｍｏｌ、収率１１％）を無色固体として得た。【００７６】
【化１６】
2019117262.tif 000018
【００７７】
[ｋ−２：Ｈ−７]
２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルアセトフェノン(ｋ−２)（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ)、２−（フェニルアミノ)ブタンヒドラジド(Ｈ−７)（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜５０／５０）で精製してｋ−２：Ｈ−７（１０９ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ、収率６６％)を薄黄色固体として得た。【００７８】
【化１７】
2019117262.tif 000019
【００７９】
[ｋ−２：Ｈ−１]
２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルアセトフェノン(ｋ−２)（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ)、２−（フェニルアミノ)アセトヒドラジド(Ｈ−１)（９５．４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで懸濁洗浄してｋ−２：Ｈ−１（８０．４ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ、収率５３％)を黄色固体として得た。【００８０】
【化１８】
2019117262.tif 000020
【００８１】
［ｋ−１：I−１］
ヒドラジン一水和物（０．２６ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ベンジルイソシアネート（１０１）（０．３２４  ｍＬ、２．６３  ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３時間撹拌し、析出した固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１０２（３５２  ｍｇ、２．１３  ｍｍｏｌ、収率８２％）を無色固体として得た。【００８２】
【化１９】
2019117262.tif 000021
【００８３】
上記のようにして得られた１０２（１５５ｍｇ、０．９３８ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（ｋ−１）（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５５／４５）にて精製した。得られた固体を塩化メチレンで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：I−１（５５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、収率２４％）を無色固体として得た。【００８４】
【化２０】
2019117262.tif 000022
【００８５】
［ｋ−１：Ｂ−１］
２−ブロモプロピオン酸メチル（１０９）（５００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．３６ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．５４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１５／８５）で精製し、１１０（３４３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ、収率６４％）を薄黄色液体として得た。【００８６】
【化２１】
2019117262.tif 000023
【００８７】
上記のようにして得られた１１０（３４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２４時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．３６ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜２０／８０）で精製し、１１１（３２１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、収率９４％）を無色固体として得た。【００８８】
【化２２】
2019117262.tif 000024
【００８９】
上記のようにして得られた１１１（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（ｋ−１）（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、乾燥して得られた黄色固体を塩化メチレンで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−１（１７３ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、収率７０％）を薄黄色固体として得た。【００９０】
【化２３】
2019117262.tif 000025
【００９１】
［ｋ−１：Ｄ−１］
３−ベンジルオキシアニリン（１２９）（２．４４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２４ｍＬ）に溶解させ、酢酸ナトリウム（１．１０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（１．４９ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（３００ｍＬ）、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１０／９０）にて精製し、１３０（２．８２ｇ、９．８８ｍｍｏｌ、収率８１％）を薄黄色固体として得た。【００９２】
【化２４】
2019117262.tif 000026
【００９３】
上記のようにして得られた１３０（１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１８ｍＬ）に懸濁させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７〜３５／６５）にて精製し、１３１（２９５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率４３％）を薄黄色液体として得た。【００９４】
【化２５】
2019117262.tif 000027
【００９５】
上記のようにして得られた１３１（０．２９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をエタノール（３．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．３２ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜１０／９０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、１３２（２３９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、収率８８％）を薄黄色固体として得た。【００９６】
【化２６】
2019117262.tif 000028
【００９７】
上記のようにして得られた１３２（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（ｋ−１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２１時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５〜５０／５０）にて精製した。得られた固体を水、およびＩＰＥで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｄ−１（９５．９ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ、収率５１％）を無色固体として得た。【００９８】
【化２７】
2019117262.tif 000029
【００９９】
［ｋ−１：Ｊ−１］
氷冷したＴＨＦ（１０ｍＬ）に水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、３−シアノフェノール（１４８）（０．６３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間、６０℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を追加して６０℃で更に１６時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、水（１．５ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液  （１．５ｍＬ）、水（４．５ｍＬ）を順次加えて室温で３時間撹拌した。懸濁溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜８／９２）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、１４９（４７７ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ、収率７３％）を無色固体として得た。【０１００】
【化２８】
2019117262.tif 000030
【０１０１】
上記のようにして得られた１４９（２００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．２７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．２２ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２０時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜３５／６５）にて精製し１５０（３６９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、収率９５％）を無色液体として得た。【０１０２】
【化２９】
2019117262.tif 000031
【０１０３】
上記のようにして得られた１５０（３６５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．８ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を追加して５５℃で更に２０時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（３／１）で懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、１５１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、収率８６％）を無色固体として得た。【０１０４】
【化３０】
2019117262.tif 000032
【０１０５】
上記のようにして得られた１５１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（ｋ−１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜５５／４５）にて精製した。得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｊ−１（１０２ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、収率５４％）を無色固体として得た。【０１０６】
【化３１】
2019117262.tif 000033
【０１０７】
[実施例１]間葉系幹細胞に対する作用
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を、間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いて７乃至１０日間前培養した。得られたｈＭＳＣを同培地に２．０×１０５ cells／ｍＬとなるように懸濁した。引き続き、終濃度１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｈ−１０、ｋ−１：I−１、ｋ−１：Ｂ−１、またはｋ−１：Ｊ−１溶液を添加し、２４ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１１４）に０．５ｍＬ／ウェルずつ播種した。対照としては、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。本プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて２０分間培養した。その後、培地を除いた後５００μＬのＰＢＳで３回洗浄してＰＢＳを除去後、０．２５ ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）をＰＢＳで５倍希釈した溶液を４００μＬ添加して３７℃にて２〜５分間インキュベートして細胞を剥離させた。更に同容量の培地を添加して別の容器へと移し、４００ｇで４分間遠心して上清を除去した。その後、２００μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁した後、２００μＬのＡＴＰ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、１５分間室温で静置した後、１００μＬの懸濁液を９６ウェル平底プレートに分注し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定した。ここで培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。化合物無添加（対照）のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を表１に示す。【０１０８】
【表１】
2019117262.tif 000034
【０１０９】
表１に示される通り、化合物ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｈ−１０、ｋ−１：I−１、ｋ−１：Ｂ−１及びｋ−１：Ｊ−１は、細胞接着促進作用を有することが明らかになった。【０１１０】
[実施例２]各種細胞株に対する作用
各種ヒト由来細胞を、次に示す各々の培地を用いて培養した。ヒト子宮頸がん由来細胞株ＨｅＬａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）社製、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ（和光純薬工業社製））、ヒト上皮様細胞がん由来細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ社製、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＮＥＡＡ、和光純薬工業社製）含有Ｅａｇｌｅ'ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ（和光純薬工業社製））、ヒト結腸腺がん由来細胞株ＨＣＴ１１６（ＤＳファーマバイオメディカル社製、１０％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ Ｍｅｄｉｕｍ（シグマアルドリッチ社製））、ヒト乳腺がん由来細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ社製、１０％ ＦＢＳ及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ、和光純薬工業社製）含有ＥＭＥＭ（和光純薬工業社製））、ヒト胎児腎細胞由来細胞株ＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ社製、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（和光純薬工業社製））。対数増殖期にある細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて１〜５分間インキュベートして剥離し、各々の培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントした。【０１１１】
ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｈ−１０、ｋ−２：Ｈ−７、ｋ−２：Ｈ−１、ｋ−１：I−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、又はｋ−１：Ｊ−１溶液を、終濃度１０μＭとなるように前述の各種細胞が懸濁された各培地に添加し、８０００ｃｅｌｌｓ／１００ μＬ／ウェルずつ９６穴接着プレート（コーニング社製、＃３５８５）に播種した。対照としてはＤＭＳＯを添加した細胞懸濁液を播種した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。本プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３０分から２時間静置培養後、培養液をアスピレートし、各々の培地を用いて２回洗浄を行うことにより培養プレートに接着していない細胞を取り除いた後、各々の培地を１００μＬ／ウェル添加した。続いて、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加・懸濁し、１０分間室温で静置した。さらに、ＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことでプレートに接着する細胞数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％とした際に、１００％以下の値を示すものを「−」、１０３％以上の値を示すものを「△」、１２０％以上の値を示すものを「○」、２００％以上の値を示すものを「◎」として表２に示す。なお、空欄は試験未実施を示す。【０１１２】
【表２】
2019117262.tif 000035
【０１１３】
表２に示される通り、本発明組成物は、各種細胞株に対して細胞接着促進効果を有することが示された。【０１１４】
[実施例３]本発明組成物の正常細胞への作用
ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  Ｖｅｉｎ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ＨＵＶＥＣ）は、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  （Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）の培地にて培養を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−1ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントした。【０１１５】
ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：I−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、又はｋ−１：Ｊ−１溶液を、終濃度１０μＭとなるように前述の細胞が懸濁された各培地に添加し、８０００ｃｅｌｌｓ／１００ μＬ／ウェルずつ９６穴接着プレート（コーニング社製、＃３５８５）に播種した。対照としてはＤＭＳＯを添加した細胞懸濁液を播種した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。本プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３０分静置培養後、培養液をアスピレートし、各々の培地を用いて２回洗浄を行うことにより培養プレートに接着していない細胞を取り除いた後、培地を１００μＬ／ウェル添加した。続いて、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加・懸濁し、１０分間室温で静置した。さらに、ＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことでプレートに接着する細胞数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を表３に示す。【０１１６】
【表３】
2019117262.tif 000036
【０１１７】
表３に示される通り、ｋ−１：I−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、又はｋ−１：Ｊ−１を培地へ添加することにより、正常細胞であるＨＵＶＥＣの細胞接着が促進することが明らかとなった。【０１１８】
[実施例４]ＨＥＫ２９３細胞株に対する濃度依存的作用
ＤＭＳＯに溶解させたｋ−１：Ｊ−１溶液を、終濃度０．１、１、１０μＭとなるように培地へ添加し、更にＨＥＫ２９３細胞を各培地に８０００ｃｅｌｌｓ／１００ μＬ／ウェルの細胞濃度で播種できるよう添加後、９６穴接着プレート（コーニング社製、＃３５８５）に播種した。対照としてはＤＭＳＯを添加した細胞懸濁液を播種した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて１時間静置培養後、培養液をアスピレートし、培地を用いて２回洗浄を行い培養プレートに接着していない細胞を取り除いた後、培地を１００μＬ／ウェル添加した。続いて、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加・懸濁し、１０分間室温で静置した後、ＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことでプレートに接着する細胞数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１とした際の化合物添加時の相対的ＲＬＵ値を図１に示す。【０１１９】
図１に示される通り、ｋ−１：Ｊ−１は、濃度依存的にＨＥＫ２９３の細胞接着を促進した。【０１２０】
[実施例５]本発明組成物の線維芽細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２への作用
マウス胚線維芽細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）は、１０（ｖ／ｖ）％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）とＬ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン安定化溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＢＭＥ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて培養を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳにて洗浄後、０．２５ｗ／ｖ ％トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（和光純薬工業社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして剥離し、培地を添加、遠心して上清を除去した。その後、同培地で再懸濁した後、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントした。【０１２１】
ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：I−１、ｋ−１：Ｂ−１、又はｋ−１：Ｊ−１溶液を、終濃度１０μＭとなるように前述の細胞が懸濁された各培地に添加し、８０００ｃｅｌｌｓ／１００ μＬ／ウェルずつ９６穴培養プレート（コーニング社製、＃３５１１７２）に播種した。対照としてはＤＭＳＯを添加した細胞懸濁液を播種した（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。本プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて３０分静置培養後、培養液をアスピレートし、上記の培地を用いて２回洗浄を行うことにより培養プレートに接着していない細胞を取り除いた後、培地を１００μＬ／ウェル添加した。続いて、培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加・懸濁し、１０分間室温で静置した。さらに、ＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことでプレートに接着する細胞数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を表４に示す。【０１２２】
【表４】
2019117262.tif 000037
【０１２３】
表４に示される通り、ｋ−１：I−１、ｋ−１：Ｂ−１、又はｋ−１：Ｊ−１を培地へ添加することにより、正常細胞であるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２の細胞接着が促進することが明らかとなった。【０１２４】
[実施例６]本発明組成物のヒト人工多能性幹細胞への作用
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ、ｉＰＳアカデミアジャパン社製）２５３Ｇ１株を、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製）を用いて７乃至１４日間培養した。得られたｈｉＰＳＣを同培地に１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。引き続き、終濃度が１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｂ−１、またはｋ−１：Ｊ−１溶液を添加し、１２ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１１４３）に１．０ｍＬ／ウェルずつ播種した。対照としては、ＤＭＳＯを終濃度が０．１％となるよう添加した。本プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。培養後、培地を除き５００μＬの培地を新たに添加し、続いて同量のＡＴＰ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加・懸濁し、１０分間室温で静置した後、９６ウェル平底プレートに２００μＬ／ウェルで分注し、ＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことでプレートに接着する細胞数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を表５に示す。【０１２５】
【表５】
2019117262.tif 000038
【０１２６】
表５に示される通り、ｋ−１：Ｂ−１、またはｋ−１：Ｊ−１溶液を培地へ添加することにより、ヒト人工多能性幹細胞である２５３Ｇ１細胞株の細胞接着が促進されることが明らかとなった。【０１２７】
[実施例７]本発明組成物のヒト人工多能性幹細胞への作用
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ、ｉＰＳアカデミアジャパン社製）２０１Ｂ７株を、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社製）を用いて７乃至１４日間培養した。得られたｈｉＰＳＣを同培地に１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。引き続き、終濃度が１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｂ−１、またはｋ−１：Ｊ−１溶液を添加し、１２ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１１４３）に１．０ｍＬ／ウェルずつ播種した。対照としては、ＤＭＳＯを終濃度が０．１％となるよう添加した。本プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。培養後、培地を除き５００μＬの培地を新たに添加し、続いて同量のＡＴＰ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加・懸濁し、１０分間室温で静置した後、９６ウェル平底プレートに２００μＬ／ウェルで分注し、ＥｎＳｐｉｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことでプレートに接着する細胞数を測定した。化合物無添加のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの、それぞれの化合物添加時の相対値を表６に示す。【０１２８】
【表６】
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【０１２９】
表６に示される通り、ｋ−１：Ｂ−１、またはｋ−１：Ｊ−１溶液を培地へ添加することにより、ヒト人工多能性幹細胞である２０１Ｂ７細胞株の細胞接着が促進されることが明らかとなった。【０１３０】
[実施例８]本発明組成物使用時のヒト人工多能性幹細胞の未分化性の評価
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ、ｉＰＳアカデミアジャパン社製）２５３Ｇ１株を、ＳｔｅｍＦｉｔ培地（味の素社製）を用いて７乃至１４日間培養した。得られたｈｉＰＳＣを同培地に２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。引き続き、終濃度が１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｂ−１、またはｋ−１：Ｊ−１溶液を添加し、６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１１４６）に１．５ｍＬ／ウェルずつ播種した。対照としては、ＤＭＳＯを終濃度が０．１％となるよう添加した。本プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて１２０時間培養した。培養中は、２４、７２時間後に上記化合物を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地を用いて培地交換を行った。培養後、培地を除き、１ｍＬ／ウェルのＰＢＳ（−）（富士フィルム和光純薬社製）を添加し洗浄した後、１ｍＬ／ウェルの０．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液（ナカライテスク社製）を添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて１０分間静置した。１０分後、剥離した細胞を１５ｍＬ遠沈管に回収し、２００ｇ、３分間の条件で遠心分離（多本架恒温遠心機 ＥＩＸ−１３６、トミー精工社製）を行った。その後、上清を除去し、２００μＬのＴｒｙｐＬＥ（登録商標） Ｓｅｌｅｃｔ（１×）（ギブコ社製）を添加し、３７℃の恒温槽中に２分間静置した。２分後、恒温槽中から１５ｍＬ遠沈管を取り出し、５ｍＬの１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）（富士フィルム和光純薬社製）を添加し、２００ｇ、３分間の条件で遠心分離を行った。遠心分離後上清を除去し、５ｍＬの２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（−）（富士フィルム和光純薬社製）を添加し、２００Ｇ、３分間の条件で遠心分離を行った。遠心分離後上清を除去し、１００μＬの２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（−）を添加し細胞を懸濁後、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに細胞懸濁液を分注した。分注後の細胞懸濁液に対し、細胞染色抗体である、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ-Ｈｕｍａｎ ＴＲＡ−１−６０ ＡｎｔｉｇｅｎとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−ＳＳＥＡ−４（共にＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を５μＬずつ添加し、室温下に３０分間静置した。また、Ｉｓｏｔｏｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ, κ Ｉｓｏｔｙｐｅ ＣｏｎｔｒｏｌとＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ３, κ Ｉｓｏｔｏｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（共にＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を５μＬずつ添加し、室温下に３０分間静置した。３０分後、各１．５ｍＬエッペンドルフチューブに１．０ｍＬの２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（−）を添加し、２０００ｇ、３分間の条件で遠心分離（微量高速冷却遠心機 ＭＸ−３０７、トミー精工社製）後、上清を除去した。この操作を計２回行った後、３００μＬの２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ（−）を添加し、測定用サンプルとした。測定は、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標） ＩＩＩ セルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行い、上記の抗体に対するダブルポジティブな割合を算出することで、未分化性維持の評価とした。ＤＭＳＯ、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｊ−１を添加して培養したｈｉＰＳＣにおける、���ＲＡ−１−６０とＳＳＥＡ−４のダブルポジティブの割合の結果を表７に示す。【０１３１】
【表７】
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【０１３２】
表７に示される通り、ｋ−１：Ｂ−１、またはｋ−１：Ｊ−１溶液を培地へ添加しても、ヒト人工多能性幹細胞の未分化性は維持されることが明らかとなった。即ち、本発明組成物を用いた幹細胞の培養は、その未分化性に対して影響を及ぼさないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明によれば、接着細胞の培養容器への接着を促進することができ、これにより接着細胞の培養を効率化することができる。従って、本発明は、接着細胞を用いる研究や医療の分野において有益である。【０１３４】
本出願は、日本で出願された特願２０１７−２３９１０３（出願日：２０１７年１２月１３日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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