(57)【要約】  溶液が高塩濃度であっても、高感度に核酸等が検出できる汎用性のある方法を提供することを目的とする。  この目的は、ＥＩＳ法によるインピーダンスを測定することによって、溶液中に存在する対象物質を検出する方法であって、該溶液中には、少なくとも対象物質、インピーダンス観測物質Ａ、該インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる物質Ｂが存在し、該電荷移動性を変動させる物質Ｂが、該対象物質に取り込まれる性質を有するものである、ＥＩＳ法による溶液中に存在する対象物質の検出方法によって達成された。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＩＳ法による、インピーダンスを測定することによって、溶液中に存在する対象物質を検出する方法であって、該溶液中には、少なくとも対象物質、インピーダンス観測物質Ａ、該インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させるインピーダンス変動物質Ｂが存在し、該インピーダンス変動物質Ｂが、該対象物質に取り込まれる性質を有するものである、ＥＩＳ法による溶液中に存在する対象物質の検出方法。
【請求項２】
前記ＥＩＳ法の作用電極には、前記インピーダンス変動物質Ｂと親和性を有する物質Ｃが配置されている請求項１記載の対象物質の検出方法。
【請求項３】
前記対象物質が核酸である請求項１または２記載の対象物質の検出方法。
【請求項４】
前記対象物質を増幅する工程を有する請求項１〜３いずれかに記載の対象物質の検出方法。
【請求項５】
インピーダンス観測物質Ａ，該インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させるインピーダンス変動物質Ｂおよび作用電極を有する、溶液中に存在する対象物質検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中に存在する対象物質の検出方法および検出するためのシステムであって、特に、ＰＣＲ法によって増幅された核酸を対象物質とする場合に好適な検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、特定の塩基配列を有する核酸の有無を調べる技術が、例えば、遺伝病の診断、細菌およびウイルス等による食品の汚染検査、細菌およびウイルス等の人体への感染検査などにおいて利用されている。【０００３】
そしてその検出感度を上げるため、ＰＣＲ法により核酸が増幅され、その核酸の検出は蛍光物質を利用した光学的な方法でされていた。【０００４】
この光学的方法は、光源、レンズ等の光学検出システムが必要となり、高価で小型化も難しいという課題を有していた。光学的手段ではなく、電界効果トランジスタ（以下ＦＥＴと呼ぶ）を用いた検出方法が提案されている（非特許文献１）。【０００５】
ＰＣＲ法で使用される溶液は、高塩濃度であり静電遮蔽距離が小さいことから電気的な感度が低く、大幅な感度を向上させる技術が求められていた。
ＥＩＳ法による検出も提案されているが、検出対象物質毎に特定のプローブを作用電極に配することが必要であったことから、汎用性に乏しかった（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５０３０９５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂ．Ｖｅｉｇａｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｎｓｏｒｓ，２０１５、１５，１５、ｐｐ１０３８０−１０３９８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、溶液が高塩濃度であっても、高感度に核酸等が検出できる汎用性のある方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の目的は、下記によって達成された。
（１）  ＥＩＳ法による、インピーダンスを測定することによって、溶液中に存在する対象物質を検出する方法であって、該溶液中には、少なくとも対象物質、インピーダンス観測物質Ａ、該インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させるインピーダンス変動物質Ｂが存在し、該インピーダンス変動物質Ｂが、該対象物質に取り込まれる性質を有するものである、ＥＩＳ法による溶液中に存在する対象物質の検出方法。【００１０】
（２）前記ＥＩＳ法の作用電極には、前記インピーダンス変動物質Ｂと親和性を有する物質Ｃが配置されている前記１記載の対象物質の検出方法。
（３）前記対象物質が核酸である前記１または２記載の対象物質の検出方法。
（４）前記対象物質を増幅する工程を有する前記１〜３いずれかに記載の対象物質の検出方法。
（５）インピーダンス観測物質Ａ，該インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させるインピーダンス変動物質Ｂおよび作用電極を有する、溶液中に存在する対象物質検出システム。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高塩濃度であっても高感度で核酸等を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明を、ＰＣＲ法に適用した場合の効果発現機構を示す図である。
【図２】本発明のインピーダンス変化を示した図である。
【図３】本発明を、実際にＰＣＲ法に適用した場合のデータを示す図である。
【図４】本発明のリアルタイムＰＣＲの、１温度サイクルの温度設定とＥＩＳ測定タイミングを示す図である。
【図５】本発明をリアルタイムＰＣＲ法に応用した場合の、ＰＣＲ温度サイクル１１-４０回目のＥＩＳ測定結果ナイキストプロット例である。
【図６】本発明をリアルタイムＰＣＲ法に応用した場合の、ＰＣＲ温度サイクル１１-４０回目のＥＩＳ結果より計算で得られた電荷移動抵抗Ｒｃｔの変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
＜本発明の検出方法＞
本発明の検出方法は、ＥＩＳ法による、インピーダンスを測定することによって溶液中に存在する対象物質を検出する方法であって、該溶液中には、少なくとも対象物質、インピーダンス観測物質Ａ、該インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる物質Ｂが存在し、該電荷移動性を変動させる物質Ｂが、該対象物質に取り込まれる性質を有するものである、ＥＩＳ法による溶液中に存在する対象物質を検出することを特徴とする。
【００１４】
本発明においては、検出対象物質は溶液中、特に水溶液中に存在し、そこにはインピーダンス観測物質Ａ、このインピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる物質Ｂが共存しており、この物質Ｂ(以下インピーダンス変動物質Ｂと呼ぶ)が対象物質に取り込まれる性質を有している。
【００１５】
例えば対象物質が初期値から増加すると、当初存在していたインピーダンス変動物質Ｂが対象物質に取り込まれることから減少し、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させる。変動は、電荷移動性が増加、減少するいずれでも良いが、本発明では、この電荷移動性の変動をインピーダンス応答という形で検出することにより、対象物質の増加を検出することができる。
【００１６】
≪対象物質≫
本発明は、対象物質が核酸、核酸構造を分子内に有する化合物に好適に用いることができる。特にＰＣＲ法による核酸の増幅物である、二本鎖ＤＮＡの増加をモニタリングするのに適している。
本発明では、例えばＰＣＲ増幅において対象物質である二本鎖ＤＮＡの初期値が１ｎｇ／ｍｌであれば高感度で検出することが可能である。
【００１７】
≪インピーダンス観測物質Ａ≫
本発明のインピーダンス観測物質Ａは、作用電極に対し電荷を発現するものであり、溶液中でのその移動度の変動が、作用電極に対してインピーダンスの変動として認識される。対象物質、その複製物等、後述するインピーダンス変動物質Ｂ以外とは相互作用を起こさないもの、起こしても極めて小さいものであることが好ましい。具体的には、フェリシアン化物イオン、フェロシアン化物イオン、フェロセン等の酸化還元性電解質を形成する金属錯体が挙げられる。
本発明では、インピーダンス観測物質Ａの濃度が０．１〜１０ｍＭであることが好ましい。
【００１８】
≪インピーダンス変動物質Ｂ≫
本発明のインピーダンス変動物質Ｂは、溶液中、電極界面に存在することでインピーダンス観測物質Ａと近接場に存在する時に、インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を増加させる作用、減少させる作用を発生させるものをいい、いずれでも好ましく使用することができる。感度の点から増加させることが好ましい。
【００１９】
本発明のインピーダンス変動物質Ｂは、対象物質に取り込まれる性質を有する。ここで対象物質に取り込まれるとは、対象物質とインピーダンス変動物質Ｂが化学的または物理的相互作用を有することからインピーダンス観測物質Ａに対しての影響が小さくなることをいう。例えば、二本鎖ＤＮＡのらせん構造内に選択的に結合する化合物、いわゆるインターカレートされる化合物が含まれる。
【００２０】
溶液中の対象物質が増加すると、インピーダンス変動物質Ｂは対象物質と相互作用しインピーダンス観測物質Ａへの作用が小さくなり、インピーダンスが変動することとなる。
インピーダンス変動物質Ｂは、その単なる近接による効果だけでインピーダンス観測物質Ａへの影響を及ぼすだけでなく、インピーダンス観測物質Ａと酸化還元作用をすることにより、電荷移動性の変動を起こすものであってもよい。
【００２１】
インピーダンス変動物質Ｂは、電気化学的検出だけでなく、光学的検出にも使えるようにするため、蛍光を発する化合物であってもよい。具体的には、メチレンブルー、ナイルブルー、アントラキノン誘導体、ナフタレン誘導体、金属アンミン錯体、有機配位子としてビピリジン誘導体、フェナントロリン誘導体、ジピリドフェナジン誘導体等を含む金属錯体のような酸化還元作用を有する化合物が好ましく使用される。
本発明では、インピーダンス変動物質Ｂの濃度が０．０１〜１００μＭであることが好ましく、ＰＣＲ法の反応進捗をシミュレーションするような場合は、当初０．１〜１０μＭであることが好ましい。
【００２２】
≪ＥＩＳ法≫
本発明は電気的検出にＥＩＳ法を利用するものであり、検出は、例えばインピーダンスアナライザーを使用する。溶液中のインピーダンス観測物質Ａの電荷移動特性の変動は、電場印加による電極界面あるいは溶液中でのインピーダンス応答、例えば、レジスタンス成分（実数成分）、リアクタンス成分（虚数成分）、インピーダンス絶対値、位相差、あるいはEISスペクトルのナイキストプロットから導かれる溶液抵抗、電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）、ワールブルグインピーダンス、電気二重層容量の変動という形で表される。特に電荷移動抵抗ＲｃｔはＥＩＳスペクトルの半円状ナイキストプロットの直径がほぼＲｃｔとなり、直感的にもわかりやすく、よく使われる。
【００２３】
本発明の作用電極は、インピーダンス変動物質Ｂの電荷移動変動をより強く発現させるため、その溶液側表面を、インピーダンス変動物質Ｂと親和性を有する化合物Ｃを配することが好ましい。この親和性を有する化合物Ｃは、電極表面を修飾するように配され、例えば、薄膜層として存在することが好ましい。インピーダンス変動物質Ｂが化合物Ｃの薄膜層内に留まるような構造をとることができる場合は、薄膜層内に存在していたインピーダンス変動物質Ｂの量が変動することにより、膜抵抗も変動することとなり、急激なインピーダンスの変動として検出することができる。
なお、インピーダンス変動物質Ｂは、薄膜層内に留まっているだけでなく、薄膜層を通過して電極に到達している場合においても、その量の変動がインピーダンスの変動として検出することができる。
【００２４】
本発明において、電極に印加される直流電圧は、通常、−１〜１Ｖの範囲である。測定において酸化還元種が使用される場合、通常はｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｐｏｔｅｎｔ−ｉａｌあるいは酸化還元種の式量電位が使用される。電極に印加される交流電圧は、特に限定されず、通常１ｍＶ〜１Ｖの範囲であり、１〜１００ｍＶであることが感度の点で好ましい。系において酸化還元種を用いる場合、酸化種及び還元種の両方が存在し、これにより、通常、１００ｍＶ未満の振幅が使用される。より好ましくは、電極間に印加される交流電圧の振幅は、約１〜１０ｍＶである。
【００２５】
親和性を有する化合物Ｃとしては、ＰＣＲ反応液成分、増幅成分、生体由来物質等に対する相互作用の小さい化合物であることが好ましく、例えば、ポリマー、ＳＡＭ膜が挙げられる。構造表面は、例えば水酸基、エーテル基、アルデヒド基、カルボニル基、カルボキシル基、ニトロ基、リン酸基、スルホン酸基等の官能基が配置される。ポリマー材料である場合、その主鎖あるいは、側鎖、あるいはその両方に官能基が配置される。具体的には、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、多糖類等が挙げられる。
【００２６】
電極に配する方法は公知の方法を適用することができる。公知の手法を用いて、電極上に電解重合、光重合、熱重合、ラジカル重合等を適用して物質Ｃを形成させることも可能である。薄膜層は、物質Ａが出入り可能で、物質Ｂが吸脱着可能なポーラス構造を有する材料であることが望ましく、０．００１〜１０μｍの厚さであることが好ましい。
【００２７】
本発明の作用電極は、電気化学計測の電極であれば材料は特に限定されないが、電極表面に化合物Ｃを配する場合は、グラファイト、カーボンナノチューブ、カーボンブラック等から構成されるカーボン電極、金電極、ＩＴＯ等の導電性酸化物電極であることが好ましい。
本発明では、作用電極と、参照電極および対電極のいずれか１電極の少なくとも２電極で測定することが好ましく、その電極間の周波数は０．１〜１ＭＨｚであることが好ましい。
【００２８】
≪その他の添加物≫
本発明の対象物質を含む溶液中には、例えばＰＣＲ法の進捗モニターの検出であれば、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ターゲットＤＮＡ、バッファー用電解質等、通常のキットで使用される素材が含まれる。
【００２９】
以下実施例において本発明の実施態様を示すが、これに限られるものではない。
【実施例】
【００３０】
＜実施例１＞
作用電極であるカーボン電極上に、インピーダンス変動物質Ｂとして使用するメチレンブルー（以下ＭＢと記することもある）と親和性のある化合物Ｃからなる薄膜層として、ポリビニルアルコールからなる薄膜層を形成し、そのカーボン電極を試験水溶液内に配置した。試験水溶液は、最終濃度トリスバッファーを１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭ、インピーダンス観測物質Ａとしてフェリシアン化物イオン−フェロシアン化物イオン各1ｍＭとなるように調製した。ＥＩＳ測定は、作用電極、参照電極にＡｇ/ＡｇＣｌ、対電極に白金線として水溶液内に配置した３電極式により測定を行った。【００３１】
室温で試験水溶液のＥＩＳ測定を行い、インピーダンスを初期値として測定した。測定条件は、直流電圧をｏｐｅｎ  ｃｉｒｃｕｉｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ、交流電圧を５ｍＶ、周波数を１００ｋ〜０．１Ｈｚとし、測定器はインピーダンスアナライザーを使用した。この時、ＥＩＳスペクトルのナイキストプロットから導かれたＲｃｔは１１．８キロΩであった。【００３２】
ついで、インピーダンス変動物質Ｂとして１μＭのメチレンブルー（ＭＢ）を添加し、インピーダンス観測物質Ａ試験水溶液が均一となるように十分撹拌し、その後、Ｒｃｔを測定した。ＭＢ濃度がフェリシアン化物イオン−フェロシアン化物イオン濃度の１／１０００程度であるが、Ｒｃｔは１１．６キロΩから８．６キロΩの大幅低下を示し３キロΩとなり、ＭＢがフェリシアン化物イオン−フェロシアン化物イオンの電荷移動特性を大きく増強することが示された。【００３３】
ここにＰＣＲ増幅物の代替として４０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を１μＭ添加した。その結果Ｒｃｔが１．０８キロΩ、約３６％上昇し、ＭＢが二本鎖ＤＮＡにインターカレート、すなわち取り込まれ電荷移動特性効果が低減することが示された。【００３４】
よって、インピーダンス観測物質Ａのフェリシアン化物イオン−フェロシアン化物イオンが、インピーダンス変動物質ＢのＭＢによりその電荷移動特性が増強され、また二本鎖ＤＮＡがＭＢを取り込むことで、その電荷移動特性を変動させることから、二本鎖ＤＮＡをＥＩＳ測定で検出できる。
＜実施例２＞【００３５】
上記メチレンブルーの代わりに、ビピリジン、ジピリドフェナジンを配位子としたルテニウム錯体、ビス（２，２’−ビピリジン）ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジンルテニウム（ＩＩ）(以下Ｒｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体と記す)をインピーダンス変動物質Ｂとして同様の試験を行ったところ、そのＲｃｔの変動に対する寄与はメチレンブルーよりさらに増強され、４０ｂｐの１μＭの二本鎖ＤＮＡによるＲｃｔの増加は８４％となった。【００３６】
よって、インピーダンス観測物質Ａのフェリシアン化物イオン−フェロシアン化物イオンが、インピーダンス変動物質ＢのＲｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体によりその電荷移動特性が増強され、また二本鎖ＤＮＡがＲｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体を取り込むことで、その電荷移動特性を変動させることから、二本鎖ＤＮＡをＥＩＳ測定で検出できる。
＜実施例３＞【００３７】
実施例２で用いた試験水溶液条件でＰＣＲに必要な酵素、ｄＮＴＰ、プライマー、ＤＮＡテンプレート等を加えてＰＣＲを実施し、そのＰＣＲ前後の溶液を、実施例２と同じ作用電極と白金線対電極を用いて２電極式ＥＩＳ測定を行った。行ったＰＣＲは、ＤＮＡテンプレートとしてｐＵＣ１８を使用し、フォワードプライマーとしてＭ１３Ｍ４を、リバースプライマーとしてＭ１３Ｒｖを用い、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて、９５℃で２分間の変性ステップの後、９５℃、５５℃、７２℃の３ステップの温度設定を３０サイクル実施したものである。【００３８】
ＥＩＳスペクトルのボードプロットでは、ＰＣＲ増幅物により、周波数１００ｋ〜０．１Ｈｚ範囲でのインピーダンス虚数成分（−Ｚ’’）の極大が２２．８キロΩから、ＰＣＲ後に３５．８キロΩに増大した。すなわち、ＰＣＲ増幅物により虚数成分は５７％増加率した。またＲｃｔの変化としては５２キロΩから８０キロΩの約５４％増加した。このことからＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡ検出に本発明が有効であることが示された。
＜実施例４＞【００３９】
作用電極に平板電極を用いた２電極式を用い、インピーダンス観測物質Ａとしてフェリシアン化物イオン−フェロシアン化物イオン、インピーダンス変動物質ＢとしてＲｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体を用いてＰＣＲの温度サイクル実行中にＥＩＳ測定を行った。
テンプレートＤＮＡとして１ｎｇ／ｍｌのミトコンドリアＤＮＡを使用した。【００４０】
ＰＣＲ溶液は表１に記載の通り、トリスバッファーを１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２を１．５ｍＭ、ＫＣｌを５０ｍＭに、ＰＣＲに必要なＤＮＡ合成酵素、ｄＮＴＰを加え、フェリシアン化物イオン−フェロシアン化物イオンを各１ｍＭ、Ｒｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体を１μＭになるように添加した。【００４１】
この溶液をまず９８℃で２分間熱したのち、（９８℃１０秒→５７℃３０秒→６８℃３０秒）の温度サイクルを１０回行った後、６８℃保持時間を５０秒に伸ばし後半２５秒をＥＩＳ測定に充てた（図４）。このＥＩＳ測定込みの温度サイクル（９８℃１５秒→５５℃３０秒→６８℃５０秒）は３０回行った。また比較として、ＤＮＡテンプレートを加えないものでも全く同じ操作によるＥＩＳ測定を行った。【００４２】
【表１】
2019026517.tif 000003
【００４３】
ＤＮＡテンプレート１ｎｇ／ｍｌ含むＰＣＲ温度サイクル１１回目−４０回目のＥＩＳ測定結果のナイキストプロットの典型的な一例を図５に示した。各温度サイクルでＥＩＳ測定は典型的な半円を描き、温度サイクルごとに増加した。ＰＣＲ増幅産物である二本鎖ＤＮＡにＲｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体が取り込まれＲｃｔが大きくなっていることが示された。【００４４】
また温度サイクル２５―３０サイクル付近でＲｃｔの増加率が大きくなっており、これはＰＣＲプロセスで二本鎖ＤＮＡの増加が極大となることを示しており、これは光学的なＰＣＲモニタリングでのＤＮＡ増幅挙動と一致する。【００４５】
図６はＥＩＳ測定結果からＲｃｔを計算により得た測定例のグラフで、右目盛りはＲｃｔの増加量（ｄｅｌｔａ  Ｒｃｔ）を温度サイクルごとに描いたもので、ＤＮＡテンプレートを含まない場合（０ｎｇ／ｍＬＤＮＡ）と比較すると、ＤＮＡテンプレートを含む場合（１ｎｇ／ｍＬＤＮＡ）のグラフは２５−３０サイクル付近でＲｃｔが急激に増加し始める。この付近から二本鎖ＤＮＡが顕著に増加したことを示す。なお、（Ｒｃｔｎ−Ｒｃｔｉｎｉｔｉａｌ）／Ｒｃｔｉｎｉｔｉａｌは、（観測されたＲｃｔ−初期のＲｃｔ）を初期Ｒｃｔで割ったものである。このグラフからも２５−３０サイクル付近でＲｃｔが急激に増加し始めたことがわかる。【００４６】
対照実験であるターゲットＤＮＡを含まないものをＥＩＳ測定したものは、Ｒｃｔの急激な変化は観測されなかった。この様子はＲｃｔの増加分を温度サイクルごとにプロットすることでも見られる（図６右目盛り）。【００４７】
なお、時間短縮のために本実施例では、観測ステップを温度サイクル初期１０回分除いたが、この温度ステップのスキップ回数は適宜変更可能である。例えばテンプレートＤＮＡが低濃度である場合には１５−２０回程度までスキップすることもできる。また全温度サイクル数の変更、および全ＰＣＲサイクルにおける温度、保持時間の設定は観測対象に合わせて適宜設定変更することもできる。【００４８】
以上の実施例から分る様に、本発明はＰＣＲ産物である二本鎖ＤＮＡ検出に有効であり、５５−９８℃の温度サイクルに耐性があり、従来のＥＩＳ測定では難しい短時間での測定が可能で、ＰＣＲ進行をリアルタイムに可能にするなどの特徴を持つことが示された。【００４９】
以上の実験結果より、本発明は、溶液中の核酸等種々の対象物質の検出に有用であり、リアルタイム計測に適用できることから定量性評価も可能で、汎用性もあることが明確となった。
【符号の説明】
【００５０】
Ａ      インピーダンス観測物質Ａ
Ｂ      インピーダンス変動物質Ｂ
ｅ-    電荷
【図１】
2019026517.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月13日(2019.8.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＩＳ法による、インピーダンスを測定することによって、溶液中に存在する対象物質を検出する方法であって、該溶液中には、少なくとも電極に固定されていない対象物質、インピーダンス観測物質Ａ、該インピーダンス観測物質Ａの電荷移動性を変動させるインピーダンス変動物質Ｂが存在し、該インピーダンス観測物質Ａが、作用電極に対し電荷を発現し、該インピーダンス変動物質Ｂ以外とは相互作用を起こさないものであり、該インピーダンス変動物質Ｂが、該対象物質に取り込まれる性質を有するものである、ＥＩＳ法による溶液中に存在する対象物質の検出方法。
【請求項２】
前記ＥＩＳ法の作用電極には、前記インピーダンス変動物質Ｂと親和性を有する物質Ｃが配置されている請求項１記載の対象物質の検出方法。
【請求項３】
前記対象物質が核酸である請求項１または２記載の対象物質の検出方法。
【請求項４】
前記対象物質を検出する溶液中に、ｄＮＴＰを有するものである請求項１〜３いずれかに記載の対象物質の検出方法。
【請求項５】
前記インピーダンス変動物質Ｂが、メチレンブルー、ナイルブルー、アントラキノン誘導体、ナフタレン誘導体、金属アンミン錯体、有機配位子としてビピリジン誘導体、フェナントロリン誘導体、ジピリドフェナジン誘導体等を含む金属錯体のような酸化還元作用を有する化合物から選択されるものである請求項１〜４いずれかに記載の対象物質の検出方法。
【請求項６】
前記対象物質を増幅する工程を有する請求項１〜５いずれかに記載の対象物質の検出方法。
【請求項７】
前記対象物質の検出が、インピーダンス変動物質Ｂのインピーダンス観測物質Ａへの作用が小さくなることを検出するものである請求項１〜６いずれかに記載の対象物質の検出方法。
【請求項８】
前記対象物質を増幅する工程とインピーダンスを測定する工程とが同一の溶液中である請求項１〜７いずれかに記載の対象物質の検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
、Ｒｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体を１μＭになるように添加した。
［００４１］
この溶液をまず９８℃で２分間熱したのち、（９８℃１０秒→５７℃３０秒→６８℃３０秒）の温度サイクルを１０回行った後、６８℃保持時間を５０秒に伸ばし後半２５秒をＥＩＳ測定に充てた（図４）。このＥＩＳ測定込みの温度サイクル（９８℃１５秒→５５℃３０秒→６８℃５０秒）は３０回行った。また比較として、ＤＮＡテンプレートを加えないものでも全く同じ操作によるＥＩＳ測定を行った。
［００４２］
［表１］
2019026517.tif 000010
［００４３］
ＤＮＡテンプレート１ｎｇ／ｍｌ含むＰＣＲ温度サイクル１１回目−４０回目のＥＩＳ測定結果のナイキストプロットの典型的な一例を図５に示した。各温度サイクルでＥＩＳ測定は典型的な半円を描き、温度サイクルごとに増加した。ＰＣＲ増幅産物である二本鎖ＤＮＡにＲｕ（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ錯体が取り込まれＲｃｔが大きくなっていることが示された。
［００４４］
また温度サイクル２５−３０サイクル付近でＲｃｔの増加率が大きくなっており、これはＰＣＲプロセスで二本鎖ＤＮＡの増加が極大となることを示しており、これは光学的なＰＣＲモニタリングでのＤＮＡ増幅挙動と一致する。
［００４５］
図６はＥＩＳ測定結果からＲｃｔを計算により得た測定例のグラフで、右
【国際調査報告】
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