(57)【要約】  本発明は、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）植物の異数体の検出方法であって、被検ブラシカ・オレラセア植物由来のサンプルから抽出したＤＮＡを鋳型とし、ブラシカ・オレラセア植物の２以上の染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、得られたＤＮＡマーカー間の増幅量の相対差から染色体の異数性を検出することを含んでなる方法に関する。本発明によれば、ブラシカ・オレラセア品種において生ずることのある異型（染色体異数体）を、種子の品質管理や、育種研究の過程で、一般的な分子生物学的手法を有する実験室等において、簡便で、正確且つ迅速に検定することが可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）植物の異数体の検出方法であって、
被検ブラシカ・オレラセア植物由来のサンプルから抽出したＤＮＡを鋳型とし、ブラシカ・オレラセア植物の２以上の染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、得られたＤＮＡマーカー間の増幅量の相対差から染色体の異数性を検出することを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡマーカーとして、ブラシカ・オレラセア植物の第１染色体から第９染色体の全染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーを使用し、
被検植物が、全染色体の内のいずれの染色体についての異数体であるかを判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡマーカーとして、ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能なプライマーを使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡマーカーとして、
(i)   ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能なプライマーと
(ii)  前記(i)のいずれか一つの染色体ＤＮＡと同じ染色体ＤＮＡに特異的であって、前記(i)のプライマーに基づくＰＣＲ反応による増幅産物を検出可能なプローブと
を使用する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発するインターカレータを使用するか、または、ＰＣＲ伸長反応により蛍光を発するように蛍光色素により修飾されたプローブを使用する、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
染色体の異数体を検出する指標として、リアルタイムＰＣＲより得られる蛍光シグナルの増加を用いる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡマーカーとして、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーを１種以上使用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡマーカーとして、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーの１種以上と、配列番号１９〜２７に示される塩基配列を有するプローブの１種以上と
を使用する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーを少なくとも１種以上含む、ブラシカ・オレラセア植物の異数体検出用プライマーセット。
【請求項１０】
配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーの少なくとも１種以上と、
配列番号１９〜２７に示される塩基配列を有する、蛍光色素により修飾されたプローブの少なくとも１種以上と
を含む、ブラシカ・オレラセア植物の異数体検出用のプライマー及びプローブのセット。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の異数体の検出方法を用いて、ブラシカ・オレラセア植物の系統毎にその各染色体の異数体発生頻度を評価することによって、異数体発生率の少ない系統を選抜する工程を含む、ブラシカ・オレラセア作物の育種方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の異数体の検出方法を用いて、ブラシカ・オレラセア植物の種子に含まれる異数体の混入率を検定することを含む、ブラシカ・オレラセア種子の品質管理方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の異数体の検出方法を用いて、ブラシカ・オレラセア植物に含まれる異数体の混入率を検定することを含む、ブラシカ・オレラセア植物の品質管理方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１７−１５７３８４号（出願日：２０１７年８月１７日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）作物の異型（染色体異数体（aneuploid））の検出方法に関する。詳しくは、本発明は、ブラシカ・オレラセア（以下、「B. oleracea」と略することがある）作物において、異数体を原因として様々な異常形態を示す個体に対し、これらを如何なる生育ステージにおいても、分子生物学的手法により正確かつ迅速に分類し検出することを可能にする方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アブラナ科植物は、中近東や地中海沿岸を起源とする植物種であり、ブラシカ（Brassica）属植物には農業上極めて重要な作物が含まれる。なかでもブラシカ・オレラセア種は、B. oleracea var. capitata (キャベツ)、B. oleracea var. italica (ブロッコリー)、B. oleracea var. botrytis (カリフラワー)、B. oleracea var. gemmifera (メキャベツ)、B. oleracea var. gongyloides (コールラビー)、B. oleracea var. acephara (ハボタン、ケール)、およびB. oleracea var. albograbra (カイラン)等を含む極めて重要な植物種である。【０００４】
一般的にブラシカ・オレラセア作物においては、自家不和合性（self incompatibility, ＳＩ）または、細胞質雄性不稔性（cytoplasmic male sterility, ＣＭＳ）の性質を利用した雑種第一代交配（Ｆ１）植物が育種されてきた。Ｆ１品種は、在来品種や固定種に比べて、環境に適応した優れた能力や品種内の高い均一性を示すため、商業的利用価値が高く、多くの国で利用されている。【０００５】
一方で、両親の遺伝子を引き継いだＦ１品種であるにもかかわらず、通常とは異なる形態を示す個体も一定の頻度で出現することが報告されてきた（文献V. Ruffio-Chable et al., (2000)（非特許文献１））。このような異型個体は、通常、農産物としての価値が極めて低く、通常は青果物としての出荷対象には成り得ない。また、このような異型を示す個体が商品種子の中に大量に発生した場合には、商業上大きな問題に発展しかねないため、種苗会社はそのｌｏｔを廃棄する等の対応が必要になることもある。【０００６】
このような異型発生原因については、長い間解明されることがなく、採種時もしくは青果栽培における環境が影響を及ぼしているとか、突然変異、エピジェネティック変異などが影響しているのではないかといった、様々な憶測がなされるに止まっていた。【０００７】
また、前述の異型問題は、農家に種子を販売する種苗会社の品質管理の現場においても極めて厄介な問題である。Ｆ１種子を生産・販売する種苗会社は、商品種子の純度検定を目的としてＤＮＡマーカーやアイソザイムを利用した検定を実施する。しかしながら、これらの異型個体は、遺伝子型としてはＦ１型を示すため、通常は検出することができない。このため、検査現場においては、長い間検定手法の開発が望まれていた。【０００８】
さらに、育種研究においても、このような異型個体が多発しないように品種特性を改良する必要がある。しかしながら、このような異型は、幼苗期では外観から判断することは難しい。このため、異型の発生率を正確にカウントするためには、圃場にて大規模に展開し、熟練したブリーダーが丁寧に個々体の特性を調査する必要があった。しかし、このようなグローアウト検定は主観に頼る側面があり、判定する人間によって結果が変動してしまう懸念があった。さらに、植物の生育ステージや栽培環境によっては、たとえ熟練したブリーダーであっても正確に判断することは難しく、このような背景から、種苗会社では長い間、幼苗での簡易検定法の開発が望まれていた。【０００９】
例えば、文献V. Chable et al., (2009)（非特許文献２）では、カリフラワーＦ１品種において出現する異常形態が、異数体に起因する可能性が述べられている。このような異数体を検出する一般的な方法として、フローサイトメーターを使用した実験例がいくつか報告されている。【００１０】
しかしながら、フローサイトメーターを使用した手法は、染色体１本の差を正確に検出することは容易ではなく、内在性コントロールを置いたとしても、文献N. Roux et al., (2003)（非特許文献３）で示されたデータのように、判断が難しくなる場合が起こり得る。また、染色体の大きさには差があり、最大の染色体と最小の染色体のゲノム量比は、２倍近くに達することがある。比較的小さな染色体が付加した場合は、正常個体と異数体が示すピークの差が極めて小さいことから判断がつきにくく、検出感度が結果の信頼性に与える影響は大きい。
このため、フローサイトメーターを使用した手法は、通常の実験室で大規模な検定を実施することができない等の問題があった。【００１１】
また、フローサイトメーターを使用した手法において、仮に信頼度の高い実験系を組めたとしても、複数の染色体に異数性を生じた植物の場合、例えば、第１染色体トリソミー（Ｔｒｉｓｏｍｙ）と第２染色体モノソミー（Ｍｏｎｏｓｏｍｙ）が組み合わされた異数体の場合、結果的に１８本の染色体が核に含まれるために正常個体と判定してしまう等の問題があった。【００１２】
さらに、フローサイトメーターを用いた簡易検定では、どの染色体に異数性が生じたのかを同定することは困難である。トリソミーとなった染色体によっては、ブロッコリーの第２、第７染色体トリソミーや、カリフラワーの第１、第２、第７染色体トリソミーのように、熟期は多少ずれるが青果物を問題なく収穫できるタイプもあり、異数体であることが直ちに商品価値の減退に結びつかない場合もある。このため、現場では、トリソミーのタイプを個別に判別できることが重要となる。また、育種を進める観点からは、どの染色体がトリソミー化しやすいかということも重要な情報となるため、簡便且つ染色体ごとの詳細な異数性を解析できる検定手法の開発が望まれていた。【００１３】
植物においては、ＰＣＲを利用した、ＤＮＡマーカーを用いた遺伝子型の判別方法がこれまでにも報告されている。例えば、特許第３８３６４５１号（特許文献１）にはトウガラシ属植物の辛味成分の生産に関与する遺伝子型の判定法が開示されている。しかしながら、アブラナ科植物の異型の検定法への適用は、本発明者等の知る限り、これまで報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】日本国  特許第３８３６４５１号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】V. Ruffio-Chable et al., ISHS Acta Horticulturae 539 (2000) p89, Developmentally “Aberrant” plants in F1 hybrids of Brassica oleracea.
【非特許文献２】V. Chable et al., Euphytica 170 (2009) p275, “Aberrant” plants in cauliflower: 2. Aneuploidy and global DNA methylation.
【非特許文献３】N. Roux et al., Plant Cell Report 21 (2003) p483, Rapid detection of aneuploidy in Musa using flow cytometry.
【非特許文献４】I. Parkin et al., Genetics 171 (2005) p765, Segmental structure of the Brassica napus genome based on comparative analysis with Arabidopsis thaliana.
【非特許文献５】X. Cheng et al., Theoretical Applied Genetics 118 (2009) p1121, Development and genetic mapping of microsatellite markers from genome survey sequences in Brassica napus
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、上述のような従来の問題点、即ち、ブラシカ・オレラセア品種において生ずることのある異型（染色体異数体）を、種子の品質管理や、育種研究の過程で、正確且つ迅速に検定することを可能とする方法を提供することにある。またこのような方法は、一般的な分子生物学的手法を有する実験室等において、簡易に実施可能なものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは今般、種子の品質管理、及び育種研究の両サイドからの高い要求に応えるべく鋭意検討した結果、ブラシカ・オレラセア種において、リアルタイムＰＣＲを用いることによって、全染色体の異数体を、正確且つ迅速に検定することに成功した。この方法によれば、リアルタイムＰＣＲを有する研究室であれば容易に実施可能であり、簡易的に異型を検出することが可能であった。またこの方法は、異数体を原因として様々な異常形態を示す個体に対し、これらを如何なる生育ステージにおいても、分子生物学的手法により正確かつ迅速に分類し検出することを可能であった。【００１８】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。【００１９】
＜１＞  ブラシカ・オレラセア植物の異数体の検出方法であって、
被検ブラシカ・オレラセア植物由来のサンプルから抽出したＤＮＡを鋳型とし、ブラシカ・オレラセア植物の２以上の染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、得られたＤＮＡマーカー間の増幅量の相対差から染色体の異数性を検出することを含んでなる、方法。【００２０】
＜２＞  前記ＤＮＡマーカーとして、ブラシカ・オレラセア植物の第１染色体から第９染色体の全染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーを使用し、
被検植物が、全染色体の内のいずれの染色体についての異数体であるかを判定することを含む、前記＜１＞の方法。【００２１】
＜３＞  前記ＤＮＡマーカーとして、ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能なプライマーを使用する、前記＜１＞または＜２＞の方法。【００２２】
＜４＞  前記ＤＮＡマーカーとして、
(i)   ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能なプライマーと
(ii)  前記(i)のいずれか一つの染色体ＤＮＡと同じ染色体ＤＮＡに特異的であって、前記(i)のプライマーに基づくＰＣＲ反応による増幅産物を検出可能なプローブと
を使用する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。【００２３】
＜５＞  ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発するインターカレータを使用するか、または、ＰＣＲ伸長反応により蛍光を発するように蛍光色素により修飾されたプローブを使用する、前記＜３＞または＜４＞の方法。【００２４】
＜６＞  染色体の異数体を検出する指標として、リアルタイムＰＣＲより得られる蛍光シグナルの増加を用いる、前記＜１＞〜＜５＞のいずれかの方法。【００２５】
＜７＞  前記ＤＮＡマーカーとして、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーを１種以上使用する、前記＜１＞〜＜６＞のいずれかの方法。【００２６】
＜８＞  前記ＤＮＡマーカーとして、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーの１種以上と、配列番号１９〜２７に示される塩基配列を有するプローブの１種以上とを使用する、前記＜１＞〜＜７＞のいずれかの方法。【００２７】
＜９＞  配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーを少なくとも１種以上含む、ブラシカ・オレラセア植物の異数体検出用プライマーセット。【００２８】
＜１０＞  配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーの少なくとも１種以上と、
配列番号１９〜２７に示される塩基配列を有する、蛍光色素により修飾されたプローブの少なくとも１種以上と
を含む、ブラシカ・オレラセア植物の異数体検出用のプライマー及びプローブのセット。【００２９】
＜１１＞  前記＜１＞〜＜８＞のいずれかの検出方法を用いて、ブラシカ・オレラセア植物の系統毎にその各染色体の異数体発生頻度を評価することによって、異数体発生率の少ない系統を選抜する工程を含む、ブラシカ・オレラセア作物の育種方法。【００３０】
＜１２＞  前記＜１＞〜＜８＞のいずれかの検出方法を用いて、ブラシカ・オレラセア植物の種子に含まれる異数体の混入率を検定することを含む、ブラシカ・オレラセア種子の品質管理方法。【００３１】
＜１３＞  前記＜１＞〜＜８＞のいずれかの検出方法を用いて、ブラシカ・オレラセア植物に含まれる異数体の混入率を検定することを含む、ブラシカ・オレラセア植物の品質管理方法。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の検定方法によれば、異型発生率及び各異型の将来的な形態を簡便かつ正確に特定することができ、商品種子の純度検定、及び各育種系統の異型発生頻度を検定することが可能となる。その結果、品質の良い種子の安定供給、及び、性質の良い系統を育成する手段を、効率的かつ迅速、早期に提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ブロッコリーの品種から発生した異数体（aneuploid）の表現型を示す。図中、それぞれ、（Ａ）は正常な個体（Normal）、（Ｂ）は第１染色体トリソミー（Trisomy）（+C1）、（Ｃ）は第２染色体トリソミー（+C2）、（Ｄ）は第３染色体トリソミー（+C3）、（Ｅ）は第４染色体トリソミー（+C4）、（Ｆ）は第５染色体トリソミー（+C5）、（Ｇ）は第６染色体トリソミー（+C6）、（Ｈ）は第７染色体トリソミー（+C7）、（Ｉ）は第８染色体トリソミー（+C8）、および（Ｊ）は第９染色体トリソミー（+C9）を示す。
【図２】リアルタイムＰＣＲによる定量解析を行う場合の増幅曲線のイメージ図を示す。図は、第６染色トリソミー場合を例にしている。ＰＣＲの反応液に加える鋳型のＤＮＡ量が一定であれば、例えば第６染色体トリソミー（Trisomy）の場合、第６染色体に座乗するマーカーの増幅曲線は、正常個体（Normal）よりも早く立ち上がることがわかる。
【図３】異数体の検出例を示す。すなわち、リアルタイムＰＣＲを実施することにより得られた染色体マーカーの増幅に基づく相対定量の計算結果の一例を示す。図のように、ブロッコリーＦ１品種９６個体を材料として、第４染色体マーカー、及び第６染色体マーカーによるｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを行って試験を実施したところ、第４染色体上のマーカーを基準として、第６染色体上のマーカーを相対定量した結果、第６染色体トリソミー及び第４染色体トリソミーを同定することができた。
【図４】トリソミー植物の花粉母細胞で観察された染色体の顕微鏡写真を示す。図のように、花粉母細胞減数分裂第一分裂中期の細胞を顕微鏡で観察した結果、正常型（Normal）の染色体（２ｎ＝１８）は９本の二価染色体が観察されたのに対し、トリソミー植物の染色体（２ｎ＋１）は９本の二価染色体プラス１本の染色体（矢印）が観察された。
【図５】カリフラワーの品種から発生した異数体の表現型を示す。図中、それぞれ、（Ａ）は正常な個体（Normal）、（Ｂ）は第１染色体トリソミー（+C1）、（Ｃ）は第２染色体トリソミー（+C2）、（Ｄ）は第４染色体トリソミー（+C4）、（Ｅ）は第６染色体トリソミー（+C6）、（Ｆ）は第７染色体トリソミー（+C7）、および（Ｇ）は第９染色体トリソミー（+C9）を示す。
【図６】キャベツの品種から発生した異型を示す。図中、それぞれ、（Ａ）は正常な個体（Normal）、（Ｂ）は第１染色体トリソミー（+C1）、（Ｃ）は第２染色体トリソミー（+C2）、（Ｄ）は第４染色体トリソミー（+C4）、（Ｅ）は第５染色体トリソミー（+C5）、（Ｆ）は第６染色体トリソミー（+C6）、（Ｇ）は第７染色体トリソミー（+C7）、（Ｈ）は第８染色体トリソミー（+C8）、および（Ｉ）は第９染色体トリソミー（+C9）を示す。また、（Ｊ）は第１染色体および第２染色体に異数性が生じた個体（+C1,+C2）、（Ｋ）は第１染色体および第８染色体に異数性が生じた個体（+C1,+C8）、および（Ｌ）は第５染色体および第８染色体に異数性が生じた個体（+C5,+C8）を示す。
【図７】ブロッコリー、カリフラワー、およびキャベツの各品種から発生した異数体の表現型の特徴を示す。ただし、これらの特徴は、ここで採用した各品種についての今回の実施例の試験において観察された表現型の特徴の一部に関するものであり、植物種や異数体のそれぞれについて、かならずしも一般化して特徴づけることはできないものである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００３５】
本発明は、前記したように、ブラシカ・オレラセア植物の異数体の検出方法であって、被検ブラシカ・オレラセア植物由来のサンプルから抽出したＤＮＡを鋳型とし、ブラシカ・オレラセア植物の２以上の染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、得られたＤＮＡマーカー間の増幅量の相対差から染色体の異数性を検出することを含んでなる方法に関する。本発明の好ましい態様によれば、検出方法に使用する染色体数は、３以上であり、より好ましいといえる順に、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上であり、最も好ましくは、９つの全染色体についてのマーカーを使用する。
【００３６】
よって、好ましくは、本発明の方法は、前記ＤＮＡマーカーとして、ブラシカ・オレラセア植物の第１染色体から第９染色体の全染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーを使用し、被検植物が、全染色体の内のいずれの染色体についての異数体であるかを判定することを含む。
【００３７】
本発明において、ブラシカ・オレラセア（Brassica oleracea）植物とは、ブラシカ属植物のブラシカ・オレラセア種の植物を意味し、ここには、B. oleracea var. capitata (キャベツ)、B. oleracea var. italica (ブロッコリー)、B. oleracea var. botrytis (カリフラワー)、B. oleracea var. gemmifera (メキャベツ)、B. oleracea var. gongyloides (コールラビー)、B. oleracea var. acephara (ハボタン、ケール)、およびB. oleracea var. albograbra (カイラン)等が包含される。好ましくは本発明において、Brassica oleracea植物は、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツである。
【００３８】
ここで「異数体」または「異型」とは、ブラシカ・オレラセア植物におけるいずれかの染色体数に異常があるもの、すなわち染色体数的異常（aneuploidy）、を意味する。ブラシカ・オレラセア植物の染色体は２ｎ＝１８であるから、正常な植物の場合、１細胞中に９種の染色体が２本ずつ存在する。一方で、異数体、すなわち異数性植物、例えば第１染色体トリソミー(trisomy)の場合は、第１染色体が３本に増加しており、第１染色体に異常があるということになる。異数体の個体によっては、植物種や生育状況等により、農産物や青果物として許容されうる場合もあり得るが、通常、異型個体は、農産物としての価値が極めて低いことが多く、青果物としての出荷対象には成り得ないことが多い。このため、異数体の検出を迅速かつ簡便に実施できる方法が重要となる。
【００３９】
本発明の検出方法においては、まず、異数体であるか否かを判断したい被検ブラシカ・オレラセア植物を用意し、この被検ブラシカ・オレラセア植物由来のサンプルからＤＮＡを抽出し、これをＰＣＲにおける鋳型として使用する。
【００４０】
ここでＤＮＡの抽出方法は、核酸抽出法として当業者に公知の方法であればいずれの方法であっても利用可能である。本発明では、抽出されたcrudeなＤＮＡをそのままＰＣＲの鋳型として使用することができるが、例えば、フェノール／クロロホルム法、界面活性剤による細胞溶解やプロテアーゼ酵素による細胞溶解、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結溶融を繰り返す処理方法、及びこれらの組合せを用いてＤＮＡの抽出を行ってもよい。また、試薬メーカーより販売されている各種ＤＮＡ抽出キット、例えば、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ社製）等を用いても良い。これらの方法により抽出したＤＮＡは、ＰＣＲの鋳型として用いるのに適した状態で保持することが好ましく、例えば適切な緩衝液に溶解させて低温下で保管することが好ましい。得られたＤＮＡの純度は、分光光度計を用いて２３０、２６０、及び２８０ｎｍの吸光度を測定することにより検定することができる。ＰＣＲを行う上で、２６０／２３０ｎｍの吸光度比が２．０以上、２６０／２８０ｎｍの吸光度比が１．８〜２．０であることが好ましい。また、得られたＤＮＡ溶液について、植物が共通に持つ内在性遺伝子に対するプライマー対（プライマーペア）を用いてＰＣＲを行い、増幅が起こることを確認してもよい。
【００４１】
本発明の検出方法においては、被検ブラシカ・オレラセア植物由来のサンプルから抽出したＤＮＡを鋳型として、ブラシカ・オレラセア植物の各染色体の一部を増幅することができるＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを実施する。詳しくは、ＤＮＡマーカーとしては、ブラシカ・オレラセア植物の２以上の染色体のそれぞれに特異的な２種以上のＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを実施する。より詳しくは、ＤＮＡマーカーとして、ブラシカ・オレラセア植物の第１染色体から第９染色体の全染色体のうち２以上の染色体のそれぞれに特異的な２種以上のＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを実施する。
【００４２】
ここで使用するＤＮＡマーカーとしては、ブラシカ・オレラセア植物のいずれかの染色体に座乗するものであって、染色体ゲノム内にシングルコピーとして存在し、他の染色体上に存在する配列の影響を受けないマーカーであれば特に制限はない。本発明では、このようなマーカーを使用することで、リアルタイムＰＣＲによる相対定量を実施し、ブラシカ・オレラセアの各種作物に対し、異数体の検定を実施可能とするものである。
【００４３】
したがって、すなわち、該マーカーは、ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能なプライマーが望ましい。ここで、ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であるとは、９種ある染色体のいずれか一つの染色体にのみ特異的であって、他の染色体には特異的で無いことを意味し、その特異的である染色体ＤＮＡが存在するときに、プライマーはＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能である。例えば、使用するＤＮＡマーカーには、第１染色体のＤＮＡにのみ特異的であって、その第１染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応により増幅産物を生成することができるプライマーが含まれうる。
【００４４】
ここで使用するプライマーの設計については、ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能であるように、当業者であれば適宜、作成することができる。具体例を挙げれば、後述する実施例１の記載を参照することで、当業者は適宜、所望のプライマーを作製することができる。
【００４５】
本発明においては、上記のような性質を有するプライマーを用い、リアルタイムＰＣＲを実施することで異数体検定を可能とするものであるが、一つの好ましい態様として、インターカレータ法が挙げられる。インターカレータ法においては、ＰＣＲ反応液に加えられたインターカレータは、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発することから、プライマーによる伸長反応が起こり、増幅産物が生成されると、蛍光を発する。これを検出することで、ＤＮＡマーカー間での増幅量の相対差を測定することができる。
インターカレータとしては、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを使用することができる。
【００４６】
インターカレータ法の具体的な態様として、
(i)  ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能なプライマーと
(ii)  インターカレータと
をＰＣＲ反応液に加え、ＰＣＲにおける伸長反応のステップで発せられる蛍光シグナルを毎サイクル測定し、相対定量の計算を行う。これにより、ＤＮＡマーカー間での増幅量の相対差を測定することができる。
【００４７】
本発明における、もう一つの好ましい態様として、上記のような性質を有するプライマーに基づくＰＣＲ反応により生じる増幅産物を検出できるプローブを使用する、プローブ法が挙げられる。使用可能なプローブとしては、目的とする増幅産物の検出が可能であれば特に制限はないが、好ましくはＰＣＲ伸長反応により蛍光を発するように蛍光色素により修飾された標識プローブを使用する。相対定量の計算法については、ＰＣＲの伸長反応時に発せられる蛍光を測定することで、インターカレータ法と同様な原理で行うことができる。また、インターカレータ法と比較して、プローブ法では、非特異的なＰＣＲ産物を検出してしまうリスクを下げることができる。
【００４８】
プローブ法の具体的な態様として、
(i)  ブラシカ・オレラセア植物のいずれか一つの染色体ＤＮＡにのみ特異的であって、その染色体ＤＮＡが存在するときにＰＣＲ反応による増幅産物を生成可能なプライマーと
(ii)  前記(i)のいずれか一つの染色体ＤＮＡと同じ染色体ＤＮＡに特異的であって、前記(i)のプライマーに基づくＰＣＲ反応による増幅産物を検出可能なプローブと
を使用し、ＰＣＲにおける伸長反応のステップで発せられる蛍光シグナルを毎サイクル測定し、相対定量の計算を行う。これにより、ＤＮＡマーカー間での増幅量の相対差を測定することができる。
【００４９】
蛍光標識プローブとしては、蛍光物質と消光物質で二重標識したＴａｑＭａｎプローブが好ましい。ＴａｑＭａｎプローブは、通常、核酸プローブの５’末端を蛍光物質（レポーター蛍光色素）で修飾し、３’末端を消光物質（クエンチャー蛍光色素）で修飾する。レポーター蛍光色素の例としてはＣｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン）等のフルオレッセイン系蛍光色素が挙げられる。クエンチャー蛍光色素の例としては、６‐カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）等のローダミン系蛍光色素が使われることもあるが、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを実施する場合には、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、Ｅｃｌｉｐｓｅ等のダーククエンチャーを選択する方が好ましい。本発明においては、例えば、５’末端にＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ５の３種類の蛍光色素、３’末端にはＢＨＱ−１、ＢＨＱ−３の２種類のクエンチャーで標識した加水分解プローブを好適に使用することができる。
【００５０】
したがって、本発明の検出方法においては、ＰＣＲ反応により合成される二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発するインターカレータを使用するか、または、ＰＣＲ伸長反応により蛍光を発するように蛍光色素により修飾されたプローブを使用することが好ましい。
【００５１】
蛍光色素により修飾されたプローブを使用する場合、異なる種類の蛍光色素をラベルしたプローブを利用し、数種類のマーカーを混合してｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを実施することができる。前述の方法と同様に、各蛍光プローブが発する蛍光シグナルから、被験サンプル各個体及び各マーカーについて、ＤＮＡマーカー間での増幅量の相対差を測定することができるが、その際、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲの場合は同じ反応液中の１つのマーカーを内在性コントロールに設定した相対定量の計算が可能となり、実験誤差を減らすことで結果の信頼性を向上させることができることができる。
【００５２】
したがって、本発明のさらに好ましい態様によれば、プローブ法によるｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを実施する。
【００５３】
よって本発明の一つの好ましい態様によれば、本発明の検出方法では、染色体の異数体を検出する指標として、リアルタイムＰＣＲより得られる蛍光シグナルの増加を用いる。
【００５４】
なお、プライマーまたはプローブとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるＤＮＡ自動合成装置を利用して合成することが可能である。
【００５５】
本発明のより好ましい態様によれば、ＤＮＡマーカーとして、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーの一種以上を用いることができ、さらに好ましくは、後述する表１に記載したプライマーの一種以上を用いることができる。また本発明の別のより好ましい態様によれば、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーの一種以上と、配列番号１９〜２７に示される塩基配列を有するプローブの一種以上とを用いることができ、さらに好ましくは、表１に記載したプライマーの一種以上と、表２に記載したプローブの一種以上とを用いることができる。これらマーカーは、第１〜第９の９種類の染色体に対応するマーカーである。
【００５６】
ここで、ＤＮＡマーカーが塩基配列を「有する」とは、該マーカーがその塩基配列を有していることをいう。本発明においては、ＤＮＡマーカーは前記したように、所定の染色体のＤＮＡに特異的であることから、そのマーカーとしての性質を有する限り、ＤＮＡマーカーは、対応する塩基配列内の塩基のいずれかの１又は数個（例えば、１、２もしくは３個、好ましくは１又は２個、より好ましくは１個）が置換、欠失、付加もしくは削除されていてもよいことを意味し、あるいは、対応する塩基配列を一部として含みかつ所定の性質を保持する配列であってもよい。このような場合、「有する」という語は、「含む」に言い換えてもよい。また、１個の塩基の置換、欠失、付加もしくは削除が許容される場合については、「有する」を「から実質的になる」と言い換えても良い。
【００５７】
本発明の別のより好ましい態様によれば、ＤＮＡマーカーとして、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマー対の一種以上を用いることができ、さらに好ましくは、後述する表１に記載したプライマー対の一種以上を用いることができる。また本発明の別のより好ましい態様によれば、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマー対の一種以上と、それに対応する配列番号１９〜２７に示される塩基配列を有するプローブとを用いることができ、さらに好ましくは、表１に記載したプライマー対の一種以上と、表２に記載したプローブの一種以上とを用いることができる。
【００５８】
本発明のさらにより好ましい態様によれば、ＤＮＡマーカーは、以下の３つの組に分けて使用することで、より正確且つ安定的な検定が実施できる。
・第６染色体マーカー、第４染色体マーカー、及び第２染色体マーカー、
・第９染色体マーカー、第３染色体マーカー、及び第８染色体マーカー、並びに、
・第１染色体マーカー、第５染色体マーカー、及び第７染色体マーカー。
【００５９】
本発明において、リアルタイムＰＣＲ法は、上記のプライマー対とプローブを用いる以外は、例えば、実験医学別冊  原理からよくわかるリアルタイムＰＣＲ実験ガイド（羊土社）、Saiki RK, et al., Science, 230:1350-1354(1985)や植物細胞工学別冊、植物のＰＣＲ実験プロトコル、島本功・佐々木卓治監修（１９９５年）等に記載されている通常の方法に基づいて、市販のリアルタイムＰＣＲキットやリアルタイムＰＣＲ装置を用い、それらに添付の操作説明書に従って行なえばよい。
【００６０】
リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば、LightCycler 480 System II（Ｒｏｃｈｅ社製）等を用いることができる。またこのとき、反応試薬としては、例えば、「Premix Ex Taq (Perfect Real Time)」（タカラバイオ社製）等を使用することができるが、特にこれに限定されない。
【００６１】
まず、上記の操作で得られたＤＮＡ試料を鋳型とし、本発明における所定のプライマーまたはプライマー対を用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲ増幅は前記のプライマーまたはプライマー対を用いる以外は特に制限はなく、常法に従って行うことができる。ＰＣＲ条件（変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度および時間、ならびにサイクル数等）、ＰＣＲ反応液の組成（鋳型ＤＮＡ量、緩衝液の種類、プライマー濃度、ＤＮＡポリメラーゼの種類や濃度、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等）は、前記のプライマーまたはプライマー対を用いたＰＣＲにおいて所望する高感度でＰＣＲ増幅産物が得られるような条件を予備実験等により当業者であれば適切に選択及び設定することができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ濃度、塩化マグネシウム濃度等がほぼ最適化されたリアルタイムＰＣＲ用マスターミックスが市販されているので、適宜、これらを利用してもよい。
【００６２】
前記したように、ブラシカ・オレラセアの染色体は２ｎ＝１８であるから、正常な植物の場合、１細胞中に９種の染色体が２本ずつ存在する。一方で異数性植物、例えば第１染色体トリソミーの場合は、第１染色体が３本に増加している。これらの植物から抽出したＤＮＡを鋳型とし、表１、もしくは表１と表２に記載したＤＮＡマーカーを用いてリアルタイムＰＣＲを実施すると、反応液に加えるＤＮＡ量を正確に統一した場合、第１染色体トリソミーでは、正常個体に対して第１染色体に座乗したマーカーの増幅曲線は早いサイクルで立ち上がる、つまり低いThreshold cycle値（Ｃｔ値、蛍光強度から得られるマーカーの増幅曲線と、ある一定の基準で設定したThreshold lineとの交点）となる。
【００６３】
具体例を示すと、図２にも示されているように、ＰＣＲの反応液に加える鋳型のＤＮＡ量が一定であれば、例えば第６染色体トリソミー（Trisomy）の場合、第６染色体に座乗するマーカーの増幅曲線は、正常個体（Normal）よりも早く立ち上がる。
【００６４】
しかしながら、実際の検定現場では、多数の被験サンプルのＤＮＡ量を正確に揃えることは困難である。このため、ＤＮＡ量を揃えるのではなく、各染色体のマーカーの増幅を相対定量し、それらの相対差から、各染色体の数を推定することができ、トリソミー等の異数性を判定することが可能となる。
【００６５】
この手法をブラシカ・オレラセア種に幅広く適用するためには、ブラシカ・オレラセア種内でＳＮＰｓが存在しない共通領域にＰＣＲ用のプライマー等を設計する必要があるが、本発明者らが鋭意検討した結果、ブラシカ・オレラセア種に幅広く応用が可能で、且つｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲによる効率的な検定を実施可能とし得るＤＮＡマーカーを設計することに成功したのである。これによって本発明の検出方法を発明することに至ったのである。
【００６６】
したがって、本発明の検出方法では、前記したように、染色体に特異的なＤＮＡマーカーを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、得られたＤＮＡマーカー間の増幅量の相対差から染色体の異数性を検出する。
【００６７】
ここで、得られるＤＮＡマーカー間の増幅量の相対差は、被検ブラシカ・オレラセア植物の２以上の染色体のそれぞれに特異的なＤＮＡマーカーについて、リアルタイムＰＣＲを行った結果、染色体マーカー毎の相対的な増幅量を比較することにより、確認することができる。すなわち、複数の染色体マーカーについての増幅量について相対定量することによって、そのいずれかの染色体について異常があった場合、その染色体によるマーカーの増幅量と、それ以外の正常な染色体によるマーカーの増幅量との間で、明らかな差異が生じることになり、これから、異数体の存在を検出することが可能となるのである。
【００６８】
マーカーの増幅量については、マーカーの増幅曲線を利用して確認することができる。マーカーの増幅曲線は、ＰＣＲ反応により測定される蛍光強度に基づき、容易に作成可能である。
【００６９】
増幅量の相対差の測定、すなわち相対定量を行う場合は、マーカーについて得られる増殖曲線を利用することが好ましい。例えば、増殖曲線と、ある一定の基準で設定したＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅとの交点をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ値（Ｃｔ値）として、他の染色体のマーカーが示すＣｔ値と比較することにより、目的の染色体の数を推定することができる。またより安定した結果を求める観点からは、増殖曲線を２回微分し、最大値となった部分のサイクル値を採用し、これを他の染色体のマーカーが示す値と比較することにより、目的の染色体の数を推定してもよい（２次微分法）。
【００７０】
本発明において、被験サンプル各個体及び各マーカーが示すＣｔ値については、上記のようにして２次微分法により算出された値を採用し、△△Ｃｔ法による相対定量に基づいて対象としたゲノム領域のコピー数比を推定することができる。
【００７１】
本発明による検出方法の好ましい態様の一部を、換言すると、具体的には以下のような（ａ）法および（ｂ）法として表現することもできる。
(a)  ＰＣＲ反応液にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の蛍光色素を混合し、各染色体のマーカーを別個にＰＣＲで増幅する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の蛍光色素が発するシグナルから、被験サンプル各個体及び各マーカーのＣｔ値を検出し、△△Ｃｔ法等による相対定量に基づいて対象としたゲノム領域のコピー数比を推定する方法。
(b)  異なる種類の蛍光色素をラベルしたプローブを利用し、数種類のマーカーを混合してｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを実施する。蛍光プローブが発する蛍光シグナルから、被験サンプル各個体及び各マーカーのＣｔ値を検出し、△△Ｃｔ法等による相対定量に基づいて対象としたゲノム領域のコピー数比を推定する方法。
【００７２】
なおここで前記（ａ）法は、比較的に安価な試薬で実施することができる一方で、全染色体のＰＣＲを別個に実施するため、試験回数が増加する傾向にある。前記（ｂ）法は、蛍光プローブを合成する必要がある一方、内在性コントロールを基準として相対定量を実施することが可能となり、実験回数も減らすことができる。
【００７３】
上記したプライマー、プライマー対、およびプローブはキット化することもできる。本発明のキットは、上記プライマーもしくはプライマー対、またはプライマーもしくはプライマー対とプローブとを少なくとも含むものであればよく、必要に応じて、ＰＣＲの陽性コントロールとなる標的配列を含むＤＮＡ分子、ＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液やＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、標識物質、説明書などを含んでいてもよい。
【００７４】
よって本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーを少なくとも１種以上含む、ブラシカ・オレラセア植物の異数体検出用プライマーセットが提供される。また、本発明のさらに別の好ましい態様によれば、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーの少なくとも１種以上と、配列番号１９〜２７に示される塩基配列を有する、蛍光色素により修飾されたプローブの少なくとも１種以上とを含む、ブラシカ・オレラセア植物の異数体検出用のプライマー及びプローブのセットが提供される。
【００７５】
本発明の異数体の検出方法を使用することで、ブラシカ・オレラセア植物の系統毎にその各染色体の異数体発生頻度を評価することができる。このことを利用することで、さらに本発明により、異数体発生率の少ない系統を選抜する工程を含む、ブラシカ・オレラセア作物の育種方法を提供することができる。
【００７６】
また本発明による異数体の検出方法を使用することで、ブラシカ・オレラセア植物の種子に含まれる異数体の混入率を検定することを含む、ブラシカ・オレラセア種子の品質管理方法を提供することができる。
従来は、グローアウト検定により種子に含まれる異数体率を検定していたため、栽培の為の大規模な圃場面積と数ヶ月の生育期間を要していた。更に、熟練した検定者でなければ正確な結果を導き出すことが出来なかった。本発明による種子の品質管理方法によれば、異数体率の検定を、省スペースで実施することででき、迅速且つ正確な結果を得ることができる。
【００７７】
本発明による異数体の検出方法を使用することで、ブラシカ・オレラセア植物に含まれる異数体の混入率を検定することを含む、ブラシカ・オレラセア植物の品質管理方法を提供することができる。
本発明によるブラシカ・オレラセア植物の品質管理方法によれば、発芽したばかりの子葉を材料として検定することも可能である。さらに、定植ステージまでに異数体検定を実施すれば、正常個体だけを選定して栽培することが可能となり、その結果、ほぼ全ての植物体から正常な青果物を収穫することができる。
【実施例】
【００７８】
下記の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。例えば、ＤＮＡを抽出する被験サンプルは、どのような生育段階でもよく、種子、子葉、本葉、根、何れの組織を用いても構わない。ＤＮＡの抽出法についても特別な方法は必要とせず、ＰＣＲが問題なく実施できる程度に精製されていればよい。蛍光色素については、リアルタイムＰＣＲ法で使用される一般的な色素であれば、どのような蛍光色素を用いても構わない。【００７９】
なお、本発明の方法は、以下の実施例にて示す通り、異なる作物であるブロッコリー、カリフラワー、およびキャベツにおいても共通のマーカーで異数体の検出が可能であることを示し、汎用性の高いマーカーであることを証明したものである。また、本発明者らは、これら実施例以外にも多数の系統において本法が実施可能であることを確認しており、本法は、以下の実施例で使用した系統に何ら限定されるものではない。【００８０】
実施例１：  マーカーの作製
ＯＰＥＲＯＮ社のＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）プライマー（１０ｍｅｒ）、及び本発明者らが設計したＳＲＡＰ（Sequence Related Amplified polymorphism）プライマーを用い、ブロッコリーＦ２集団のＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施することによりブラシカ・オレラセアの連鎖地図を構築した。【００８１】
次に、本発明者らが構築した連鎖地図と、文献I. Parkin et al., Genetics 171 (2005) p765（非特許文献４）、文献X. Cheng et al., Theoretical Applied Genetics 118 (2009) p1121（非特許文献５）、及びＮＣＢＩに登録されている公的情報とを比較することで、各Linkage Groupに座乗するマーカーと公的な連鎖地図との関係を解析した。【００８２】
さらに、各染色体に座乗するマーカーは、あらゆるブラシカ・オレラセア種に対しても利用できるよう改変する必要があったため、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワーの幅広い遺伝資源から特徴的な系統を選定し、それらのＤＮＡを鋳型としてＳＮＰｓの存在しない領域を同定し、プライマーを再設計した。【００８３】
これらのマーカーを用い、マーカー作製の過程で同定した第１染色体〜第９染色体の各染色体がトリソミーとなった９種のトリソミック植物（図１）を鋳型としてＰＣＲを実施し、判定に影響を及ぼすような他の染色体からの非特異的増幅がないことを確認した後、各染色体に特異的なマーカーとして扱った。【００８４】
更に、より簡便且つ安定的なｍｕｌｔｉｐｌｅｘ蛍光プローブ法を実施するために、ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ５の３種類の蛍光色素でラベルした加水分解プローブを設計し、３種のマーカーを１つの反応液に混合、つまり６種類のプライマーと３種類のプローブを混合しても互いに干渉せずに安定的な結果が出せるようなプライマー及びプローブの設計を目指した。一般的には、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを実施すると、プライマーダイマーの形成や、増幅ＤＮＡ断片への別のプライマーのアニーリングなど複雑な反応が起き、ｃｒｕｄｅな鋳型ＤＮＡに対して、染色体数が２本と３本の違い（１．５倍量の差）を安定的に検出するシステムを構築することは難しい。しかしながら、本発明者らは、マーカー配列の改良を重ね、鋭意検討した結果、表１及び表２に示すマーカーを設計することに成功した。
さらに、得られた９種類の染色体のマーカーを３種類３組に分けることによって、より正確且つ安定的な検定が実施できた（後述する実施例４参照）。【００８５】
【表１】
2019035480.tif 000002
【００８６】
【表２】
2019035480.tif 000003
【００８７】
図２は、リアルタイムＰＣＲを利用した相対定量に関する基本的原理を示す。
ＰＣＲの反応液に加える鋳型のＤＮＡ量が一定であれば、例えば第６染色体トリソミーの場合、第６染色体に座乗するマーカーの増幅曲線は、正常個体よりも早く立ち上がる。相対定量を行う場合は、この増幅曲線と、ある一定の基準で設定したＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｉｎｅとの交点をＣｔ値として、他の染色体のマーカーが示すＣｔ値と比較することにより、目的の染色体の数を推定することができる。【００８８】
図３は、リアルタイムＰＣＲを実施することにより得られた相対定量の計算結果の一例を示す。ここでの試験では、ブロッコリーＦ１品種９６個体を材料とし、第４染色体マーカー、及び第６染色体マーカーを用いて蛍光プローブ法によるｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲ機としてはＲｏｃｈｅ社の「LightCycler 480 System II」、反応試薬としてはタカラバイオ社の「Premix Ex Taq (Perfect Real Time)」を使用した。図中のＸ軸は個体番号を示し、Ｙ軸は第４染色体マーカーを基準として第６染色体マーカーの相対定量を△△Ｃｔ法により計算した値を示す。【００８９】
供試した９６個体のうち、８８個体の正常型は１付近の値を示すが、５個体の第６染色体トリソミーは１．４付近、３個体の第４染色体トリソミーは０．７付近の値を示した。ＰＣＲの増幅効率を１サイクルあたり２倍とした場合の理論値は、第６染色体トリソミーが１．５、第４染色体トリソミーが０．６６であるから、実測値はそれに近い値となった。【００９０】
実施例２  ブロッコリーのトリソミー植物の染色体観察
リアルタイムＰＣＲでトリソミーと判定された植物のうち、第６染色体トリソミー、第７染色体トリソミー、および第２染色体トリソミーを材料として染色体を観察した。
長さが１〜２ｍｍのブロッコリーの蕾から葯を取り出し、１％酢酸オルセイン溶液にて染色し、花粉母細胞の減数分裂第一分裂中期（ＭＩ期）の染色体を観察した。【００９１】
結果は、図４で示したとおりであった。
図４に示されているように、正常個体の染色体（２ｎ＝１８）は９本の二価染色体が観察されたのに対し、トリソミー植物の染色体（２ｎ＋１）は９本の二価染色体プラス１本の染色体（矢印）が観察された。【００９２】
実施例３  ブロッコリーにおける異型検出例
株式会社サカタのタネが開発中のブロッコリーＦ１品種「ＳＢＲ−４８」の種子を育苗トレーに播種し、発芽した４４５個体の子葉からＤＮＡを抽出し、各染色体に特異的なマーカーを用いてＳＹＢＲ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。【００９３】
具体的には、各染色体に特異的なマーカーとして、配列番号１〜１８に示される塩基配列を有するプライマーを使用し、通常のＰＣＲ反応液に、インターカレータとしてＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ社より入手）が終濃度１／２００００となるよう加えてＰＣＲを実施した。リアルタイムＰＣＲにはＲｏｃｈｅ社の「LightCycler 480 System II」を使用し、ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間インキュベートした後９５℃１５秒、６０℃３０秒、７２℃３０秒の３ステップＰＣＲを４０サイクルとした。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのシグナル測定には、励起波長４６５ｎｍ、検出波長５１０ｎｍのフィルターを使用した。【００９４】
２次微分法により得られたＣｔ値をもとに、第９染色体のマーカーを基準として△△Ｃｔ法による相対定量の計算を行った。【００９５】
結果は、表３に示されたとおりであった。
次いで、これら表３の結果を染色体別に纏めた結果、表４のような比率で各異数体が含まれていることが明らかとなった。【００９６】
なお、本実施例において第３染色体トリソミーは出現しなかったが、図１で示したように、第３染色体トリソミーもまれに出現する（各染色体トリソミーの表現型の特徴については図７に示した通りであった）。なお本発明者らは、第３染色体トリソミーも含めて、設計したマーカーに問題がないことを既に別途、確認している。【００９７】
【表３−１】
2019035480.tif 000004
【００９８】
【表３−２】
2019035480.tif 000005
【００９９】
【表３−３】
2019035480.tif 000006
【０１００】
【表３−４】
2019035480.tif 000007
【０１０１】
【表３−５】
2019035480.tif 000008
【０１０２】
【表３−６】
2019035480.tif 000009
【０１０３】
【表３−７】
2019035480.tif 000010
【０１０４】
【表４】
2019035480.tif 000011
【０１０５】
実施例４  カリフラワーにおける異型検出例
株式会社サカタのタネが開発中のカリフラワーＦ１品種「ＳＣＦ−３０」の種子を育苗トレーに播種し、発芽した６５４個体の子葉からＤＮＡを抽出し、各染色体に特異的なマーカーを用いて蛍光プローブ法によるリアルタイムＰＣＲを実施した。【０１０６】
具体的には、以下の通りに行った。
カリフラワーの子葉からのＤＮＡの抽出は、前記した実施例３と同様にして行った。【０１０７】
染色体に特異的なマーカーとしては、以下の３つの組合せに分け、ＰＣＲ試験を実施した。
・第６染色体マーカー、第４染色体マーカー、及び第２染色体マーカーのｔｒｉｐｌｅｘ、
・第９染色体マーカー、第３染色体マーカー、及び第８染色体マーカーのｔｒｉｐｌｅｘ、並びに、
・第１染色体マーカー、第５染色体マーカー、及び第７染色体マーカーのｔｒｉｐｌｅｘ。【０１０８】
なおここで使用した染色体マーカーは、各染色体について表１および表２に示したプライマーおよびプローブを使用した。例えば、第１染色体マーカーは、配列番号１および２で示された配列を有するプライマーと、配列番号１９に示された配列を有するプローブを使用した。【０１０９】
リアルタイムＰＣＲについては、実施例３と同機種を使用し、ＰＣＲ条件は、９５℃で１分間インキュベートした後、９５℃１５秒、６０℃４５秒の２ステップＰＣＲを４０サイクルとした。ＦＡＭ、ＨＥＸ、Ｃｙ５のシグナル測定には、それぞれ励起波長４６５ｎｍ、５３３ｎｍ、６１８ｎｍ、検出波長５１０ｎｍ、５８０ｎｍ、６６０ｎｍのフィルターを使用した。【０１１０】
２次微分法により得られたＣｔ値をもとに、それぞれ第２染色体、第８染色体、第７染色体の各マーカーを内在性コントロールとして△△Ｃｔ法による相対定量の計算を行った【０１１１】
結果は、表５に示された通りであった。
次いで、これら表５を纏めた結果、表６のような比率で各異数体が含まれていることが明らかとなった。【０１１２】
さらに、この実験で異数体と推定された植物について、その後の表現型を調査するために圃場にて栽培した。その結果、ブロッコリーと同様に、各異数体がそれぞれ特徴的な外観を示した（図５）（各染色体トリソミーの表現型の特徴については図７に示した通りであった）。
以上の結果より、カリフラワーにおいてもブロッコリーと同様に異数体が出現し、当該手法が、これら異数体を検出するための有効な手段であることが明らかとなった。【０１１３】
【表５−１】
2019035480.tif 000012
【０１１４】
【表５−２】
2019035480.tif 000013
【０１１５】
【表５−３】
2019035480.tif 000014
【０１１６】
【表５−４】
2019035480.tif 000015
【０１１７】
【表５−５】
2019035480.tif 000016
【０１１８】
【表５−６】
2019035480.tif 000017
【０１１９】
【表５−７】
2019035480.tif 000018
【０１２０】
【表５−８】
2019035480.tif 000019
【０１２１】
【表６】
2019035480.tif 000020
【０１２２】
実施例５  キャベツにおける異型検出例
株式会社サカタのタネが開発中のキャベツＦ１品種「ＳＣＢ−８１」の栽培圃場から、収穫期における外観が正常とは異なる形態を示した個体を選抜し、成葉からＤＮＡを抽出して、前記実施例４と全く同様な方法で異数体の分析を行った。【０１２３】
結果は、表７に示された通りであった。
その結果、第３染色体以外のトリソミー植物は全て検出され、キャベツにおいても異型個体の大部分は染色体の異数性が原因であることが明らかとなった。
これらのことから、本発明による方法は、ブロッコリーやカリフラワーのみならず、キャベツの異型個体分析にも有効であることが証明された。【０１２４】
図６は、各種異数体の外観を撮影したものである（各染色体トリソミーの表現型の特徴については図７に示した通りであった）。図６や表７で示したように、代表的なトリソミー以外にも、複数の染色体に異数性が生じた個体も存在していた。【０１２５】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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