(57)【要約】  本発明は、カテーテル等でより容易にデリバリーでき、物質透過性に優れるインジェクタブルなハイドロゲルを提供することを目的とする。本発明の一実施形態に係るハイドロゲルは、スルホン基を０．１〜７ミリモル／ｇで備えるスルホン化セルロースのナノファイバーと、ゼラチン、キトサン、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン及びその誘導体からなる群より選ばれる第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーの少なくとも一種を、重量比１：９９〜７０：３０で含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スルホン基を０．１〜７ミリモル／ｇで備えるスルホン化セルロースのナノファイバーと、ゼラチン、キトサン、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン及びその誘導体からなる群より選ばれる第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーの少なくとも一種を、重量比１：９９〜７０：３０で含むハイドロゲル。
【請求項２】
該第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーが、ゼラチン又はその誘導体である、請求項１記載のハイドロゲル。
【請求項３】
該スルホン化セルロースのナノファイバーがスルホン基を０．１〜２ミリモル／ｇで備える、請求項１又は２記載のハイドロゲル。
【請求項４】
該ゼラチンもしくはその誘導体がアルカリ処理された動物由来もしくは魚由来である、請求項２又は３記載のハイドロゲル。
【請求項５】
該ゼラチンもしくはその誘導体が低エンドトキシン化ゼラチンである、請求項２〜４のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項６】
該ゼラチン誘導体が、下記式（３）で示される構造：
ＧｌｔｎＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２                （３）
（上式において、Ｇｌｔｎはゼラチン残基であり、Ｒ１は炭素数１〜１１のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜１１のアルキル基である）
を含むゼラチン誘導体である、請求項２〜５のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項７】
該スルホン化セルロースのナノファイバーを含む第１剤と、該第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーを含む第２剤からなる２剤型の形態で供される請求項１〜６のいずれか１項記載のハイドロゲル。
【請求項８】
該第１剤が該スルホン化セルロースのナノファイバーの分散液であり、該第２剤が第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーの水溶液である、請求項７記載のハイドロゲル。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項記載のハイドロゲルを含む、医療用インジェクタブルハイドロゲル。
【請求項１０】
血管塞栓材である、請求項９記載の医療用インジェクタブルハイドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生分解性のハイドロゲルに関し、詳細にはスルホン化セルロースナノファイバーと第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーを含む、インジェクタブルなハイドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
カテーテル治療は、低侵襲な治療法として脳動脈瘤治療など広く医療現場で用いられている。脳動脈瘤は、脳の血管の一部が膨らんだものであり、破裂するとくも膜下出血を引き起こす疾患である。現在、カテーテルを用いて塞栓物質で動脈瘤を閉鎖する治療法が普及しており、開頭する必要のない低侵襲な治療法として重要となっている。【０００３】
塞栓物質としては、これまでにコイルが広く用いられてきており、ポリグリコール酸・乳酸共重合体をコートしたＭａｔｒｉｘ２  ｃｏｉｌｓ（Ｓｔｒｙｋｅｒ，ΜＳＡ）や非分解性高分子をコートしたＨｙｄｒｏｃｏｉｌ  ｅｍｂｏｌｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｃｒｏｖｅｎｔｉｏｎ／Ｔｅｒｕｍｏ，Ｊａｐａｎ）などが使用されている。しかしながら、操作中に動脈瘤を破裂させてしまう危険性や低い充填率、充填後の内皮化が不十分であること、非分解性であることなどに課題があった。また液体塞栓物質は、動脈瘤の中を完全に充填させることができる一方、シアノアクリレート（ＮＢＣＡ）やエチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）コポリマー（Ｏｎｙｘ，Ｃｏｖｉｄｉｅｎ）などの非分解性の高分子を用いるため、高い細胞毒性及びそれらの漏出による他臓器での塞栓が起きるリスクがある。そのため、カテーテル等によってデリバリーが可能な、インジェクタブルな塞栓物質の開発が求められている。【０００４】
インジェクタブルな塞栓物質として、ポリマーにセルロースナノクリスタル又はウィスカーを添加して弾性率を高めたハイドロゲルが提案されている。例えば、アジピン酸ジヒドラジド等で修飾されたヒアルロン酸とアルデヒド化セルロースナノファイバーを含むハイドロゲル（非特許文献１）、カルボキシルメチルセルロースとデキストランとアルデヒド化セルロースナノファイバーを含むハイドロゲル（非特許文献２）、ゼラチンとアルデヒド化セルロースナノウィスカーを含むハイドロゲル（非特許文献３）等が提案されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｕｉ  Ｍ．Ａ．Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，１５７１−１５８１
【非特許文献２】Ｘｕａｎ  Ｙａｎｇら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｕｌｅｓ，２０１３，１４，４４４７−４４５５
【非特許文献３】Ｒａｊａｌａｘｍｉ  Ｄａｓｈら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９１，２，１６  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１３，６３８−６４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記セルロースナノクリスタル又はウィスカーを含むハイドロゲルは、ダブルバレルシリンジを用いてナノクリスタル又はウィスカーと、ヒアルロン酸等を別々に注入しなければならず、コイルや液体塞栓物質等の単一物のデリバリーに比べて煩瑣である。これは、ナノクリスタル又はウィスカーとヒアルロン酸等は、混合されると直ちに化学反応して共有結合からなる架橋構造を形成してゲル化してしまい、デリバリーができなくなるか、大きな力を要し、無理に注入しようとするとゲル構造を損傷し得るからである。また、該架橋構造によりゲル内のポアサイズが制限され、物質透過を阻害する場合がある。【０００７】
そこで、本発明はカテーテル等で、より容易にデリバリーすることができ、物質透過性に優れるインジェクタブルハイドロゲルを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は下記のものである：
スルホン基を０．１〜７ミリモル／ｇで備えるスルホン化セルロースのナノファイバーと、ゼラチン、キトサン、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン及びその誘導体からなる群より選ばれる、第一級アミノ基を有する生分解性ポリマーの少なくとも一種を、重量比１：９９〜７０：３０で含むハイドロゲル。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のハイドロゲルはチキソトロピー性を有し、剪断力下で粘度が低下するので、ダブルバレルシリンジを用いずともデリバリーすることができる。また、架橋構造の少なくとも一部に、スルホン基を介した静電的な結合等の、応力により可逆的にゾルに戻る緩い結合を備え、共有結合のみによって緻密に架橋されたハイドロゲルに比べて、ポアサイズが大きく物質透過性に優れる。更に、セルロースナノファイバーが生分解性であるので、ハイドロゲルも生分解性である。加えて該ハイドロゲルは高い細胞接着性を有し、生体適合性及び親和性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、アルデヒド化セルロースのＸ線回折チャート（左）と結晶化度を示すグラフ（右）である。
【図２】図２は、ピロ亜硫酸ナトリウムの仕込み量と得られたスルホン化セルロースのナノファイバーのスルホン基量の関係を示すグラフである。
【図３】図３は、スルホン化セルロースのナノファイバーの電子顕微鏡写真である。
【図４】図４は、生分解性試験におけるスルホン化セルロースのナノファイバーの重量減少（％）を示すグラフである。
【図５】図５は、スルホン化セルロースのナノファイバーとゼラチン溶液を混合して得られた本発明のハイドロゲルの写真である。
【図６】図６は、ハイドロゲルの断面の電子顕微鏡写真である。
【図７】図７は、ハイドロゲルのせん断弾性率の温度による変化を示すグラフである。
【図８】図８は、スルホン化セルロースのナノファイバー及びゼラチンの濃度とせん断弾性率の関係を示すグラフである。
【図９】図９は、ゼラチン溶液のｐＨとハイドロゲルのせん断弾性率の関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ハイドロゲルのチキソトロピー性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、スルホン化セルロースのナノファイバーに代えて、ペンタエリスリトール−ポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジル グルタレートでゼラチンを架橋して得られるＰＥＧゲルの粘弾性試験の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ハイドロゲルと、ＰＥＧゲルの透過性を比較して示すグラフである。
【図１３】図１３は、スルホン化セルロースのナノファイバーを含む培地で培養した細胞の電子顕微鏡写真（上段）と、細胞数を示すグラフ（下段）である。
【図１４】図１４は、スルホン化セルロースのナノファイバーを含む培地で培養した細胞の位相差顕微鏡写真（左）と、スルホン化セルロースのナノファイバーの濃度に対する細胞のアスペクト比を示すグラフ（右）である。
【図１５】図１５は、本発明のハイドロゲル表面に接着した細胞（左：内皮細胞、右：繊維芽細胞）の位相差顕微鏡写真である。
【図１６】図１６は、本発明のハイドロゲルに内包された線維芽細胞の位相差顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、ハイドロゲルに含まれるｓＣＮＦの単位重量当たりのスルホン基の量（ｍｍｏｌ／ｇ）と、アルブミンの吸着量との関係を表すグラフである。
【図１８】図１８は、埋植から１４日後のハイドロゲルを埋植していない組織（コントロール）とハイドロゲルを埋植した組織の組織切片のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の画像である。
【図１９】図１９は、各ハイドロゲルを埋植してから各日数後のＨＥ染色画像である。
【図２０】図２０は、ハイドロゲル内に浸潤した細胞の分布を定量してプロットしたグラフである。０は組織とハイドロゲルの境界、１はゲルの中央部分を表している。
【図２１】図２１は、各ハイドロゲルに浸潤した細胞の深さを定量してプロットしたグラフである。
【図２２】図２２は、埋植から１４日後のビメンチン抗体及びＣＤ３１抗体を用いた免疫染色画像である。
【図２３】図２３は、埋植から１４日後のビメンチン抗体及びＣＤ３１抗体を用いた免疫染色画像である。
【図２４】図２４は、ビメンチン染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
【図２５】図２５は、ＣＤ３１染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
【図２６】図２６は、ＣＤ３１染色画像から管腔構造の数を定量した結果である。
【図２７】図２７は、埋植から１４日後のＣＤ１６３抗体及びＣＤ６８抗体を用いた免疫染色画像である。
【図２８】図２８は、ＣＤ１６３染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
【図２９】図２９は、ＣＤ６８染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
【図３０】図３０は、ＣＤ１６３染色画像から得られた陽性細胞の面積とＣＤ６８染色画像から得られた陽性細胞の面積の比を表したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜スルホン化セルロースのナノファイバー＞
スルホン化セルロースは、下記式（１）に示すグルコース単位の３位と４位の間が開環されて、スルホン化された構造を含むセルロースである。
【化１】
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上式は、水中等においてスルホン基（−ＳＯ３Ｈ）が解離された状態を示し、対カチオンはＮａ＋に限定されずプロトン、Ｋ＋等であってよい。
【００１２】
スルホン化セルロースは、例えばＨｅｎｒｉｋｋｉ  Ｌｉｉｍａｔａｉｎｅｎら，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（２０１３）２０：７４１-７４９に記載された下記式に示す経路で合成することができる。
【化２】
2019181294.tif 000004
先ず、原料セルロースを水に分散させる。該分散液に、セルロース中のグルコース単位の量（ｋ）を１００モル％としたときに５０〜２００モル％の過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を添加し、遮光しながら、４０〜６０℃で２〜６時間撹拌することによって、アルデヒド化セルロースを生成する。減圧濾過によって未反応物を含む水溶液を除去し、超純水で洗浄する操作を数回繰り返した後に凍結乾燥することで、アルデヒド化セルロースの乾燥粉末を得る。上記式において、ｋの初期値を１００モル％としたときに、ｍは１〜８０モル％、好ましくは１０〜５０モル％である。ｍが前記下限値未満では生分解性を確保することが難しい。一方、ｍが前記上限値を超えると加水分解し易くなり、ナノファイバーの調製が困難になる。アルデヒド基の量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いた導電率測定による中和滴定により求めることができ、０．５〜８ミリモル／ｇ、好ましくは１〜７ミリモル／ｇ、より好ましくは１〜５ミリモル／ｇである。
【００１３】
原料セルロースとしては、例えば、針葉樹系パルプ、広葉樹系パルプ、綿系パルプ等の植物、動物等から得られたセルロース、これらを用いた紙、古紙等を用いることができる。
【００１４】
次いで、アルデヒド化セルロースを超純水に分散させ、ピロ亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）を、アルデヒド基量を１００モル％として２０〜２００モル％、好ましくは５０〜１５０モル％で添加して、室温で１２〜２４時間、撹拌しながら反応させる。生成物を遠心分離により回収し、超純水等で洗浄して未反応物を除去して精製した後、超音波ホモジナイザーによって１０〜３０分間程度ホモジナイズすることによって、スルホン化セルロースのナノファイバー（「ｓＣＮＦ」と略す場合がある）を得ることができる。収率は、約８０〜９０％である。
【００１５】
図３は実施例で調製したｓＣＮＦの電子顕微鏡写真である。ｓＣＮＦは電子顕微鏡で観察される繊維の直径が数ｎｍ〜１００ｎｍであり、好ましくは３〜２０ｎｍである。アスペクト比（繊維長／繊維径）については、約３０〜１０００である。
【００１６】
ｓＣＮＦは生分解性である。本発明において「生分解性」は３７℃のｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で、ｓＣＮＦの重量が１日で１％以上減少したことにより確認した。この生分解性は、原料セルロースのグルコース単位の量（ｋ）の初期値を１００モル％としたとき、ｍ＋ｎ、即ち開環された単位が、少なくとも１モル％、好ましくは１０〜５０モル％であることによるものと考えられる。また、ｓＣＮＦは開環単位を有することによって、Ｘ線回折測定による結晶化度が２０〜７０％であり、９０％程度の結晶化度を有する原料セルロースに比べて低い。
【００１７】
スルホン化セルロースのナノファイバーはスルホン基を０．１〜７ミリモル／ｇで備える。スルホン基の量は水酸化ナトリウム水溶液を用いた導電率測定による中和滴定により求めることができる。スルホン基が前記下限値未満のセルロースでは、ファイバー間の静電的な反発が弱いためか、ナノファイバーを形成し難い。スルホン基の上限については特に限定はないが、実際上、上記値より多いものを調製するのは困難である。好ましくは、ナノファイバーが遠心分離で容易に回収できる点で、ｓＣＮＦはスルホン基量が０．１〜２．５ミリモル／ｇ、より好ましくは０．１〜２ミリモル／ｇである。すなわち、ｓＣＮＦは下記式（２）で表されるものが好ましく使用される。
【化３】
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式（２）中、ｋ、ｍ、及び、ｎは、各繰り返し単位のモル％を表し、特に制限されないが、ｋは２５〜９５モル％が好ましく、４０〜９０モル％がより好ましい。ｍは４〜７０モル％が好ましく、７〜６０モル％がより好ましい。ｎは１〜７０モル％が好ましく、１０〜３０モル％がより好ましい。
【００１８】
なお、ｓＣＮＦは、上記以外の繰り返し単位を有していてもよい。上記以外の繰り返し単位としては特に制限されないが、例えば、以下に掲げる繰り返し単位が挙げられる。
【００１９】
【化４】
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【００２０】
＜第一級アミノ基を有する生分解性ポリマー＞
第一級アミノ基を有する生分解性ポリマー（以下「生分解性ポリマー」と略する）は、ヒトの体内又は体表面において、加水分解、酵素分解、微生物分解等により分解可能なポリマーであり、第一級アミノ基を有するものである。但し、第一級アミノ基に加えて、スルホン基と反応し得る第二アミノ基、第三級アミノ基があってもよいことはいうまでもない。このような好ましい生分解性ポリマーの例としては、キトサン等の多糖類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン等のポリペプチド、フィブロネクチン等の糖タンパク、エラスチン等の繊維類、及びこれらの誘導体が包含され、これらの遺伝子組み換え体であってもよい。これらのうち、ポリペプチドが好ましく、中でもゼラチン又はその誘導体が最も好ましい。
【００２１】
ゼラチンは動物由来でも魚由来でもよい。また、ゼラチンは酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、又は、遺伝子組み換えゼラチンのいずれであってもよく、好ましくはアルカリ処理ゼラチンであり、より好ましくは低エンドトキシン化ゼラチンである。また、該ゼラチンの分子量の範囲は、重量平均分子量（Ｍｗ）が３０，０００〜１５０，０００が好ましく、５０，０００〜１２０，０００であることがより好ましい。該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により定法に従い測定することができる。
【００２２】
ゼラチン誘導体としては、下記式（３）で示される構造を含むものを用いることができる。
ＧｌｔｎＮＨ−ＣＨＲ１Ｒ２                （３）
上式において、「Ｇｌｔｎ」はゼラチン残基であり、Ｒ１は炭素数１〜１１のアルキル基であり、Ｒ２は水素原子又は炭素数１〜１１のアルキル基である。Ｎは、ゼラチン中の主としてリジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基由来である。好ましくは、Ｒ２が水素原子である。該誘導体は、アルキル基を有するので、組織への接着性に優れ、足場材料としても好適である。
【００２３】
Ｒ２が炭素数１〜５のアルキル基である場合、Ｒ１と同じでも互いに異なっていてもよい。該アルキル基は、分岐を有していてもよい。該アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等が挙げられる。好ましくは、Ｒ１が炭素数１〜３の直鎖アルキル基であり、Ｒ２が水素原子である。
【００２４】
該ゼラチン誘導体中の誘導化率は、疎水性基が結合されたイミノ基の、原料ゼラチン中のアミノ基量に対するモル％で、２０〜８０モル％、好ましくは３０〜７０モル％である。言い換えれば、得られたゼラチン誘導体におけるイミノ基／アミノ基（モル比）は、２０／８０〜８０／２０であり、好ましくは３０／７０〜７０／３０である。
【００２５】
該ゼラチン誘導体は、ゼラチン水溶液に、アルデヒドもしくはケトン、例えばドデカナール、テトラデカナール、デシルエチルケトンを添加し、３０〜８０℃、０．５〜１２時間、撹拌してシッフ塩基を形成した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）、２−ピコリンボラン、ピリジンボラン等を用いて還元することによって調製することができる。
【００２６】
＜ハイドロゲル＞
ハイドロゲルは、水を含むゲルを意味する。本発明のハイドロゲルは、ｓＣＮＦと生分解性ポリマーを重量比１：９９〜７０：３０、好ましくは１０：９０〜４０：６０、で含む。ここで、重量比は乾燥状態での重量の比である。ハイドロゲル中の水分量は、特に制限されないが、典型的には、該ハイドロゲルの重量の５０〜９９重量％で適宜調製されることが好ましい。特に、ハイドロゲルをカテーテルでデリバリーする場合、水分量が９０〜９９重量％であることが好ましい。
【００２７】
本発明の実施形態に係るハイドロゲルは、典型的には、ｓＣＮＦを０．５〜２．５重量％でｐＨ６〜８の超純水又は緩衝液に分散させた液と、生分解性ポリマーをｐＨ８〜１０の緩衝液に、１〜３０重量％で溶解した溶液を、３０〜４０ｏＣ程度に加温しながら、ミキサー等の公知の撹拌手段によって、上記の重量比範囲となる量比で混合することで調製することができる。混合直後から粘度が上昇してゲル化反応が始まる。但し、後述する実施例で示す通り、ゲル化が平衡に達して、弾性率が最高値に達するには時間がかかる場合があり、その溶液のｐＨに依存することが見出された。この傾向は生分解性ポリマーがゼラチンの場合に顕著である。
例えば、手術等において、短時間で硬い塞栓を形成したい場合には、ゼラチン水溶液のｐＨを９〜１０にすることが好ましい。
【００２８】
ハイドロゲルは、既に述べた生分解性に加えて、チキソトロピー性を有することを特徴とする。これは、本発明を限定する趣旨ではないが、ｓＣＮＦと生分解性ポリマーが、少なくとも部分的に、例えば静電相互作用、水素結合等の弱い物理的な相互作用に基づくネットワーク構造を形成していることによるものと考えられる。また、ナノクリスタルやウィスカーに比べてアスクペクト比が高いナノファイバーを使用していることも寄与していると考えられる。該ハイドロゲルは剪断力を与えることによって粘度が下がるので、カテーテル、注射器等によるインジェクションに好適である。
【００２９】
本発明のハイドロゲルの他の特徴として、ゲルの内部構造が挙げられる。ナノファイバーというコロイドからなる本発明のハイドロゲルはコロイドゲルとして考えることができ、一般的に用いられる分子同士が架橋してできる分子ゲルとはその構造が大きく異なる。分子ゲルの場合ポアサイズが５ｎｍ程度であるのに対し、コロイドゲルは数十ｎｍのポアを有していると考えられる。そのため、物質透過性が高く、栄養や増殖因子をより透過させることが期待される。
【００３０】
＜添加剤等＞
本発明のハイドロゲルにデリバリーしたい各種薬剤、タンパク質等を配合し、これらの局所デリバリー担体、又は徐放性デリバリー担体として使用してもよい。薬剤としては、例えばステロイド等の抗炎症薬、抗血栓薬、抗生物質、線維芽細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子等の成長因子が挙げられる。
【００３１】
＜用途＞
本発明のハイドロゲルは、医療用インジェクタブルハイドロゲルとして好適に使用される。例えば、脳動脈瘤治療、冠動脈塞栓療法、心筋梗塞治療に用いることができる。心筋梗塞は、血管の閉塞によって心筋組織が壊死する不可逆的な病態であり、梗塞後には心機能の低下や不整脈によって心不全に陥る可能性がある。生体活性を付与したハイドロゲルを足場として梗塞部位に注入することで、心室壁を厚く保ち、ネクローシスや炎症反応、心筋リモデリングを抑制するとともに、周囲からの細胞浸潤を誘導し、新生血管を形成させることで、組織の再生を促進させることができると期待される。更には、細胞や機能性タンパク質を内包してデリバリーすることで、膵島デリバリー治療や増殖因子のデリバリーなどの適用も期待される。その他、本発明のハイドロゲルを、ハイドロキシアパタイトやリン酸カルシウムなどの人工骨に混合することでインジェクタブルな人工骨として、創傷被覆材として、また生体組織用の接着剤としての用途も考えられる。
【００３２】
本発明のハイドロゲルは、ハイドロゲルの形態として供してもよいが、スルホン化セルロースのナノファイバーを含む第１剤と、生分解性ポリマーを含む第２剤からなる２剤型の形態で供されてよい。例えば、第１剤がスルホン化セルロースのナノファイバーの分散液であり、第２剤が生分解性ポリマーの水溶液であり、これらを施術の際に混合してインジェクトし、又は、ダブルバレルシリンジによりインジェクトしてもよい。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜スルホン化セルロースナノファイバー（ｓＣＮＦ）の調製＞
非特許文献１を参考にして、表１に示すスルホン化セルロース１〜８を合成し、スルホン化セルロースナノファイバー（ｓＣＮＦ１〜８）を得た。
第一段階として、セルロースを原料としてアルデヒド化セルロースを作製した。１ｇのろ紙粉末（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、メッシュ：４０−１００、繊維長：１５０−４００μｍ）を撹拌子で撹拌しながら１００ｍＬの超純水に分散させた。得られた分散物に、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）をセルロース中のグルコース単位のモル数に対して０．５〜２当量の割合で、それぞれ添加した。遮光しながら、オイルバス中５０ｏＣで４時間撹拌することによって、グルコース単位中の３位と４位の間で開環することによって、アルデヒド化セルロースを調製した。反応物を減圧濾過することによって未反応物を含む水溶液を除去し、超純水で洗浄した。この操作を３回繰り返すことで洗浄を行い、最後に凍結乾燥することで、アルデヒド化セルロースの乾燥粉末を得た。生成されたアルデヒド基量を、中和滴定法によって定量した。【００３４】
続いて、スルホン化処理によってスルホン化セルロースナノファイバーを合成した。上記のようにして得られた１ｇのアルデヒド化セルロースを１００ｍＬの超純水に分散させ、ピロ亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）をアルデヒド基に対して、０．０５〜２．５当量の割合で、それぞれ添加した。撹拌しながら室温で１２〜２４時間反応させ、スルホン化処理を行った。得られた生成物を、４０００ｒｐｍ、３０分の遠心分離によって回収し、超純水によって洗浄した。この操作を３回行うことで、未反応物を除去し精製した。最後に、超音波ホモジナイザー（１５０Ｗ、４０ｋＨｚ、６０％パワー、ＢＲＡＮＳＯＮ）によって１０〜３０分間ホモジナイズすることでスルホン化セルロースナノファイバーを得た。【００３５】
各アルデヒド化セルロースのグルコース単位の開環割合、アルデヒド基量を、滴定法により測定した。結果を表１に示す。同表から分かるように、グルコース単位に対する過ヨウ素酸ナトリウムの仕込み量を０．５〜２当量まで変化させることで、開環するグルコース単位及びそれによって生成するアルデヒド基の量を制御することができる。【００３６】
【表１】
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【００３７】
＜Ｘ線回折測定＞
過ヨウ素酸ナトリウムを用いた開環反応によって、セルロースの結晶性がどのように変化するかを評価するため、Ｘ線回折測定（ＸＲＤ）を行った（図１、左図）。ＸＲＤ測定の結果より、グルコース単位の開環割合の増大に伴ってセルロース由来のピーク（１４．６、１６．５、２２．８ｏ）が減少しており、結晶性が低下することが示された。アモルファス構造由来の１８ｏのピークと２２．８ｏの比から結晶化度を算出したところ、もともと９０％であった結晶化度が開環反応に伴って徐々に減少し、グルコース単位の７％を開環したｓＣＮＦ１では８３％の結晶化度、３０％を開環したｓＣＮＦ２では７０％の結晶化度、４０％を開環したｓＣＮＦ３では６８％の結晶化度であった（図１、右図）。開環割合が６２％のｓＣＮＦ４では２３％まで結晶化度が減少しており、分解性が向上していることが予測される。このように、開環反応を制御することで、セルロースの結晶性及び分解性が制御できることが示された。【００３８】
＜ピロ亜硫酸ナトリウム量とスルホン基量の関係＞
各スルホン化セルロースナノファイバーを超音波ホモジナイザーで処理した後、スルホン基量を滴定法により測定した（表１）。ピロ亜硫酸ナトリウムの量がアルデヒド基に対して、それぞれ、０．０５〜０．５当量であったときのスルホン化セルロースナノファイバーのスルホン基量を図２に示す。同図から分かるように、開環割合とアルデヒド基量が同じであってもピロ亜硫酸ナトリウムの量を変化させることでセルロースナノファイバー中のスルホン基量を制御することができた。【００３９】
＜電子顕微鏡観察＞
ピロ亜硫酸ナトリウムがアルデヒド基の５０モル％のｓＣＮＦ３、及び１５０モル％仕込みのスルホン化セルロースナノファイバーは、超音波処理によって機械的に細断することで図３の電子顕微鏡写真に示すようなｓＣＮＦを調製することができた。【００４０】
＜生分解性＞
ｓＣＮＦの生分解性を、グルコース単位の開環割合が７％のｓＣＮＦ１及び６２％のｓＣＮＦ４を用いて、３７℃において調べた。各ｓＣＮＦ１００ｍｇを、５ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に分散し、２４時間ごとに不溶解性物の重量を測って、重量減少を測定した。比較として、原料セルロース（ろ紙粉末、ＡＤＶＡＮＴＥＣ社）を用いた。図４に結果を示す。ｓＣＮＦ１は１日で約５％、ｓＣＮＦ４は約１５％減少した。このように生分解性は、グルコース単位の開環割合に依存するので、他のｓＣＮＦはｓＣＮＦ１と４の間の値となると予測される。これに対して、原料セルロースは１日ではほとんど重量が減少しなかった。【００４１】
＜ハイドロゲルの調製＞
各ｓＣＮＦとゼラチンからなるハイドロゲル（ｓＣＮＦゲル）を合成した。２．５重量％のｓＣＮＦ３の分散液（超純水、ｐＨ＝７）と３７ｏＣに加温した２０重量％のブタ皮アルカリ処理ゼラチン（新田ゼラチン社）溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝８．５）を、ボルテックスミキサーを用いて、素早く等量混合することでｓＣＮＦゲル３を調製した。混合した瞬間からゲル化反応が始まり、数分以内には図５の写真に示すようにゲル化した。同様にして、ｓＣＮＦ１、２、４、７についてもｓＣＮＦゲルを得た。得られたｓＣＮＦゲル３を凍結乾燥して液体窒素に浸漬後粉砕して、ゲルの断面を電子顕微鏡で観察した。図６に電子顕微鏡写真を示す。同図から、ｓＣＮＦゲルが約１０〜８０μｍ径の孔を有することが分かる。図６において、高倍率の写真（左）は、孔の壁部分の拡大である。【００４２】
＜粘弾性評価＞
得られたハイドロゲルの力学特性を評価するために、粘弾性測定装置（Ｒｈｅｏｐｌｕｓ、アントンパール社）を用いてｓＣＮＦゲルの粘弾性評価を行った（図７）。５重量％のｓＣＮＦ３の分散液（超純水、ｐＨ＝７）と３７ｏＣに加温した２０重量％のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝８．５）を５０μＬずつ素早く混合して得られた溶液１００μＬを粘弾性測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定し、１０ｏＣから測定を開始し、１分に１ｏＣずつ昇温しながら５０ｏＣまで測定を行った。測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。ゼラチンは３０ｏＣ付近に相転移温度（ゲル化温度）を有しているため、低温ではゲル、３０ｏＣ以上では溶解し液状となる。これは温度上昇によって水素結合が開裂するためである。一方で、ｓＣＮＦゲル３においては、３０ｏＣ以上でも相転移は起こらず、生体組織の温度である３７ｏＣにおいても１ｋＰａという高いせん断弾性率を示しており、ゼラチンのみの場合と比較して１０００倍増加した。これは、ｓＣＮＦ３とゼラチンとの間で相互作用が働くことで、ネットワーク構造が形成されたためであると考えられる。このことより、ｓＣＮＦとゼラチンを組み合わせることで、ゲル化が起こり、３７ｏＣでも高い弾性率を有するゲルが作製できることが分かった。【００４３】
＜ｓＣＮＦとゼラチンの濃度の影響＞
ｓＣＮＦゲルの作製条件と力学特性の関係を明らかにするために、ｓＣＮＦ及びゼラチンの濃度の影響を調べた。０．５〜２．５重量％のｓＣＮＦ３の溶液（超純水、ｐＨ＝７）と、１〜３０重量％のゼラチン各溶液を５０μＬずつ素早く混合して得られた溶液１００μＬを粘弾測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定し、３７ｏＣにおける粘弾性特性を評価した（図８）。測定時の周波数は１Ｈｚ、ひずみは１％で実験を行った。図８に示すように、ｓＣＮＦ及びゼラチンの濃度を増加させるとせん断弾性率が増加した。ｓＣＮＦ及びゼラチンそれぞれの濃度を調整することで、数Ｐａから１０００Ｐａまで幅広く力学特性を変化させることができた。【００４４】
＜ゼラチン溶液のｐＨの影響＞
ｓＣＮＦ３の２．５重量％溶液（超純水、ｐＨ＝７）と、２０重量％のゼラチン溶液のｐＨを８〜１０に変えて、ゲル化速度への影響を調べた（図９）。ｐＨ＝８では５分でゲル化するものの、ハイドロゲルのせん断弾性率が平衡に達するまでに６時間必要とした。一方ｐＨ＝９及びｐＨ＝１０のゼラチン溶液を用いると即座にゲル化し、１０分以内にせん断弾性率が１ｋＰａに達した。【００４５】
＜ハイドロゲルの粘弾性試験＞
２．５重量％のｓＣＮＦ３の溶液（超純水、ｐＨ＝７）と、２０重量％のゼラチン溶液を５０μＬずつ素早く混合して得られた溶液１００μＬを粘弾測定装置のステージにのせ、直径１０ｍｍの円盤状の治具で固定し、３７ｏＣで５分ごとにひずみを１％と１０００％へ変化させることでチキソトロピー性を評価した。１０００％ひずみによってゲルがいったんは破壊され弾性率が低下したが、１％のひずみに戻すと、再び弾性率が回復していた（図１０）。これは、本発明のハイドロゲルの結合様式が可逆的なものであることを示す。これに対して比較対象として、末端Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドで修飾されたカルボキシル基を有する４分岐ポリエチレングリコール（ペンタエリスリトール−ポリ（エチレングリコール）エーテルテトラスクシンイミジル グルタレート、Ｍｗ＝２０，０００）でゼラチンを架橋したゲル（以下「ＰＥＧ−Ｇ」又は「ＰＥＧゲル」という）で同様の実験を行った（図１１）。その結果、３サイクル後には、貯蔵弾性率が元の２０％程度まで低下していた。一方で、本発明のハイドロゲル（ｓＣＮＦ−Ｇ）は３サイクル後も貯蔵弾性率が元の値まで回復しており、チキソトロピー性を有していることが示された。【００４６】
＜透過性試験＞
高い分子量を有するフルオロセイン（ＦＩＴＣ）で蛍光ラベル化されたデキストラン（Ｍｗ＝２，０００，０００Ｄａ）を用いて、ゲルの透過性試験を行った（図１２）。２．５重量％のｓＣＮＦ３の分散液（超純水、ｐＨ＝７）と３７ｏＣに加温した２０重量％のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝８．５）を素早く５０μＬずつ混合して得られた溶液１００μＬを２４ウェルトランスウェルインサート（コーニング社）内に添加し、１日ゲル化させた後、超純水２ｍＬを加えて１日かけて膨潤させた。比較として上記ＰＥＧ−Ｇを同様に処理した。その後、１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−デキストラン（Ｍｗ＝２，０００，０００Ｄａ，流体力学半径〜５０ｎｍ）を２００μＬ添加し、プレート側には１ｍＬのＰＢＳを添加した。所定時間ごとに５０μＬの溶液をインサート下側から取り出し、５０μＬのＰＢＳを補充した。得られた溶液の蛍光強度を、マイクロプレートリーダーを用いて測定し、検量線から透過率を評価した。その結果、分子ゲル（ＰＥＧ−Ｇ）と比較して、ｓＣＮＦゲル３は５０ｎｍという巨大な分子をより透過させることが明らかとなった。また、速度定数は、ｓＣＮＦゲルが６．４×１０−５ｈ−１、ＰＥＧ−Ｇが１．６×１０−５ｈ−１となっており、約４倍透過性に優れることが示された。【００４７】
＜ｓＣＮＦが細胞機能に与える影響＞
ｓＣＮＦを細胞培養液中に分散させ、培養細胞に与えることで、細胞機能に与える影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で評価した。Ｌ９２９マウス線維芽細胞（理研）は、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリンストレプトマイシン）を用いて３７ｏＣ、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。５×１０３個のＬ９２９細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。その後、ｓＣＮＦ３を１２．５μｇ／ｍＬの濃度で懸濁した培地をＬ９２９細胞に添加し、培養を継続した。ｓＣＮＦを添加した日を０日目として、１、２、３日後に細胞数カウンティングキット（ＷＳＴ−８、ＤＯＪＩＮＤＯ）を用いて細胞数を定量し、３日後のサンプルに関しては、固定と脱水処理を行った後に、ＳＥＭ観察を行った（図１３上段）。ｓＣＮＦは基板上に集積してフィルムのような構造を形成しており、細胞の足場として接着に関与していることが示唆された。
細胞数については、ｓＣＮＦを添加した細胞は未添加のサンプルと同様に増殖しており、有意な差はみられなかった（図１３下段）。【００４８】
一方で、細胞の形態を位相差顕微鏡で観察すると、ｓＣＮＦの濃度依存的な細胞の伸展が観察された（図１４左、×４０）。この画像観察から、細胞の長軸と短軸の長さの比（アスペクト比）を算出し比較すると、ｓＣＮＦ５０μｇ／ｍＬ以上の濃度で、未添加と比較して優位に細胞伸展が促進されていた（図１４右、×４０）。これは、ｓＣＮＦ上のスルホン基が培地中のたんぱく質（フィブロネクチンなど）を吸着し、細胞の足場としてのマトリックスを培養中に構築したためであると考えられる。このように、本発明のハイドロゲルは、再生医療に適用することも期待される。【００４９】
＜ハイドロゲルへの細胞接着試験＞
２．５重量％のｓＣＮＦ３の分散液（超純水、ｐＨ＝７）と３７ｏＣに加温した２０重量％のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝８．５）を１００μＬずつ素早く混合して得られた溶液２００μＬを４８ウェルプレートに添加し、１日ゲル化させた後、超純水２ｍＬを加えて１日かけて膨潤させた。得られたゲルを１時間のＵＶ照射によって滅菌処理した。１ｘ１０４個のヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｌｏｎｚａ社）又は２ｘ１０４個のヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ、Ｌｏｎｚａ社）をゲル上に播種し、ＨＵＶＥＣはＥＧＭ−２培地で、ＮＨＤＦはＦＧＭ培地（Ｌｏｎｚａ社）で、それぞれ、３７ｏＣ、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。その後、位相差顕微鏡によって観察を行った（図１５、×４０）。どちらの細胞もゲル表面に良好な接着・伸展が確認された。本発明のハイドロゲルは高い細胞接着性と親和性を有していることが示された。【００５０】
＜ハイドロゲルへの細胞の内包実験＞
３７ｏＣに加温した２０重量％のブタ皮アルカリ処理ゼラチン溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝８）に１ｘ１０５個のＮＨＤＦを混合したものと、２．５重量％のｓＣＮＦ３の分散液（超純水、ｐＨ＝７）を素早く１００μＬずつ混合して得られた溶液２００μＬを４８ウェルプレートに添加し、ゲル化させた。３分間静置後に、ＦＧＭ培地を１ｍＬ添加し３７ｏＣ、５％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。その後、位相差顕微鏡によって観察を行った（図１６、×４０）。ゲルに内包されたＮＨＤＦはゲル内部でも良好な接着及び伸展をしている様子が確認された。本発明のハイドロゲルは、細胞の内包が可能であることから、細胞デリバリーに応用できることが示された。【００５１】
＜ハイドロゲルへのタンパク質吸着実験＞
表１に「６」と記載したのと同様の方法により作製し、スルホン基量が０．５ｍｍｏｌ／ｇであるｓＣＮＦの２重量％の分散液（超純水、ｐＨ＝７）と３７ｏＣに加温した２０重量％のブタ皮アルカリ処理ゼラチン（新田ゼラチン社）溶液（０．１Ｍホウ酸バッファー、ｐＨ＝８．５）とを、ボルテックスミキサーを用いて、素早く等量混合し、厚さ１ｍｍのシリコンモールドへ入れ、４℃で２４時間インキュベートすることでｓＣＮＦハイドロゲルを調製した。上記ハイドロゲルをＰＢＳ中で２４時間洗浄した後に、１０ｍｍのパンチで打ち抜き、１ｍｇ／ｍＬのＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅでラベル化されたウシ血清アルブミン溶液に浸漬し、２４時間３７℃でインキュベートした。次に、ＰＢＳで３回洗浄後、１００μｇ／ｍＬのコラゲナーゼ溶液でゲルを溶解し、９６ウェルプレートに移し、蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した。ハイドロゲルに吸着したアルブミンの量は検量線から算出した。【００５２】
また、上記ｓＣＮＦに代えて、表１に「７」と記載したのと同様の方法で作製し、スルホン基量が１．２ｍｍｏｌ／ｇであるｓＣＮＦ、表１に「８」と記載したのと同様の方法で作製し、スルホン基量が１．７ｍｍｏｌ／ｇであるｓＣＮＦを用いて上記と同様の試験を行った。結果を図１７に示した。【００５３】
図１７に示した結果から、ハイドロゲルに含まれるｓＣＮＦの単位重量当たりのスルホン基の量（ｍｍｏｌ／ｇ）が増加するにつれて、アルブミンの吸着量が増加した。 
これは負に帯電したスルホン基とアルブミン中の正に帯電した部分が静電相互作用したためであると考えられる。このことから、本発明の実施形態に係るハイドロゲルは体内のサイトカインや増殖因子を吸着することで体内で機能を発現すると期待される。【００５４】
より詳細には、ハイドロゲルに含まれるｓＣＮＦのスルホン基量が、０．４ｍｍｏｌ／ｇ以上であると、ハイドロゲルは優れたアルブミン吸着性能を有し、スルホン基量が０．５ｍｍｏｌ／ｇを超えると、ハイドロゲルはより優れたタンパク質吸着性能を有し、スルホン基量が１．０ｍｍｏｌ／ｇ以上であると、ハイドロゲルは更に優れたタンパク質吸着性能を有し、スルホン基量が１．０ｍｍｏｌ／ｇを超えると、ハイドロゲルは特に優れたタンパク質吸着性能を有し、スルホン基量が１．７ｍｍｏｌ／ｇ以上であると、ハイドロゲルは最も優れたタンパク質吸着性能を有する。【００５５】
＜ハイドロゲルのラット皮下への埋植試験＞
本実験は、物質・材料研究機構の動物実験安全委員会に承認された実験計画に基づいて行われた。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、メス、６−８週齢）を２．５％イソフルランによる吸入麻酔下で、背部の毛を剃り７０％エタノールで消毒した後に、背部皮下に直径５ｍｍ厚さ１ｍｍのディスク状のハイドロゲルを埋入した。【００５６】
なお、上記ハイドロゲルは、２重量％のｓＣＮＦと２０％ゼラチン（タンパク質吸着実験と同様のもの）とを当量混合することにより作製したものである。なお、ｓＣＮＦは、表１に「６」、「７」、及び、「８」と記載したのと同様の方法により作製し、スルホン基量がそれぞれ０．５ｍｍｏｌ／ｇ、１．２ｍｍｏｌ／ｇ、１．７ｍｍｏｌ／ｇであるものを用いた。
表２には、使用したハイドロゲルの「試料名称」と、上記ハイドロゲルに含まれるｓＣＮＦの作製方法、スルホン基量をまとめて示した。
【表２】
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【００５７】
上記ハイドロゲルはＵＶ（紫外線）照射によって滅菌した。次に、ハイドロゲルを埋植した日を０日目として、３、７、及び、１４日後に、ソムノペンチルを過剰投与し、マウスを屠殺した。その後、周辺組織を取り出し、１０％ホルマリンで固定し、組織切片を作製し（材料の中心部分）、染色した。結果を図１８〜図２１に示した。
図１８は、埋植から１４日後のハイドロゲルを埋植していない組織（コントロール）とハイドロゲルを埋植した組織の組織切片のヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の画像である。なお、図１８中、黒色の破線で囲まれた範囲は、埋植したハイドロゲルを示している。なお、図１８中のスケールバーは１ｍｍに対応する。
図１９は、各ハイドロゲルを埋植してから各日数後のＨＥ染色画像である。なお、図１９中、白色の破線はホストの組織とハイドロゲルとの境界を示しており、破線で挟まれた範囲は、ハイドロゲルを示している。また、上記破線で挟まれた範囲において、黒色に見える部分は、ハイドロゲルであり、灰色に見える部分は、浸潤した細胞と細胞が産生した細胞外マトリックス成分である。なお、図１９中のスケールバーは、３００μｍに対応する。
図２０は、ハイドロゲル内に浸潤した細胞の分布を定量したものである。０は組織とハイドロゲルの境界、１はゲルの中央部分を表している。
図２１は、各ハイドロゲルに浸潤した細胞の深さを定量したものである。【００５８】
図１８〜図２１に示すように、埋植から３日後にはどのサンプルにおいても細胞浸潤は見られないが、７日後には浸潤が起きており、特に１．２−ｓＮＣ、及び、１．７−ｓＮＣにおいては、１４日後には完全にホストの細胞によって内部まで浸潤が起きていた。【００５９】
次に、どの細胞が浸潤しているかを調べるため、１４日後のサンプルに対してビメンチン及びＣＤ３１による免疫染色を行った。結果を、図２２〜図２６に示した。
図２２、及び、図２３は、埋植から１４日後のビメンチン抗体及びＣＤ３１抗体を用いた免疫染色画像である。図中、ビメンチン染色では黒色で見える部分が線維芽細胞、ＣＤ３１染色では黒色で見える部分が管腔構造を有するものが血管内皮細胞である。なお、図２２、及び、図２３中のスケールバーは、１００μｍに対応する。
図２４は、ビメンチン染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図２５は、ＣＤ３１染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図２６は、ＣＤ３１染色画像から管腔構造の数を定量した結果である。【００６０】
上記のビメンチン染色の結果から、多くの線維芽細胞がゲル内に浸潤していることが明らかとなった。また、１．２−ｓＮＣ、及び、１．７−ｓＮＣにおいては血管の数が他のサンプルと比較して多くなっていた。これらのことより、ハイドロゲルに含まれるｓＣＮＦのスルホン基量が、０．７ｍｍｏｌ／ｇ以上であると、細胞浸潤と血管新生をより促進することで、組織リモデリングをより誘導しやすいことが示唆された。上記観点からは、ｓＣＮＦのスルホン基量は１．０ｍｍｏｌ／ｇ以上が好ましく、１．２ｍｍｏｌ／ｇ以上がより好ましい。【００６１】
より詳細なメカニズム理解するために、マクロファージの染色を行った。結果を図２７〜図３０に示した。
図２７は、埋植から１４日後のＣＤ１６３抗体及びＣＤ６８抗体を用いた免疫染色画像である。なお、図２７中のスケールバーは１００μｍに対応する。
図２８は、ＣＤ１６３染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図２９は、ＣＤ６８染色画像から陽性細胞の面積を定量した結果である。
図３０は、ＣＤ１６３染色画像から得られた陽性細胞の面積とＣＤ６８染色画像から得られた陽性細胞の面積の比を表したものである。【００６２】
マクロファージには炎症に関わるＭ１型と組織再生に関わるＭ２型があり、ゲル内におけるＭ２型マクロファージの数を調べることで、組織再生との関連性が分かると考えた。ＣＤ１６３はＭ２型のマクロファージのマーカーである。図２７〜図３０の結果から、ハイドロゲルに含まれるｓＣＮＦのスルホン基量が、上記数値範囲であると、明らかにＣＤ１６３陽性の細胞がより増えており、Ｍ２型マクロファージがより多く存在することが分かった。この細胞が組織再生を促す液性因子を産生することで、組織再生がより誘導されたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明のハイドロゲルは、生分解性のチキソトロピー性材料であり、インジェクタブルハイドロゲルとして医療用途に大変有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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