(57)【要約】  本発明は、高比重リポタンパク質の修飾状態に関わらず、また標識コレステロールを取り込んでいるか否かに関わらず、高比重リポタンパク質に結合可能な抗体を取得することを課題とする。  配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目のアミノ酸配列からなるペプチド又は２０１〜２６７番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、且つ下記（１）〜（３）の高比重リポタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント；  （１）酸化修飾された高比重リポタンパク質、  （２）酸化修飾されていない高比重リポタンパク質、及び  （３）標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質を提供する。
2018181935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記特徴を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目のアミノ酸配列からなるペプチド又は２０１〜２６７番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、且つ
下記（１）〜（３）の高比重リポタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント；
（１）酸化修飾された高比重リポタンパク質、
（２）酸化修飾されていない高比重リポタンパク質、及び
（３）下記式（Ｉ）に表される標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質：
【化１】
2018181935.tif 000015
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の９１〜１１０番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１０１〜１６０番目の範囲には結合しないことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
非変性条件の試料中に存在する非変性高比重リポタンパク質と結合する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫から産生されるモノクローナル抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列とそれぞれ同じアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ＨＣＤＲは、重鎖相性鎖決定領域を表し、ＬＣＤＲは軽鎖相補性決定領域を表す、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫から産生されるモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列とそれぞれ同じアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫から産生されるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫から産生されるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、標識物質を含む標識コレステロールと高比重リポタンパク質とを混合することにより、前記標識コレステロールを取り込んだ前記高比重リポタンパク質と前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとを含む複合体を形成する工程、及び
前記複合体中の標識物質に起因するシグナルを検出する工程
を含む、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法。
【請求項１０】
前記標識コレステロールが、下記式（Ｉ）に表される標識コレステロールである、請求項９に記載の方法：
【化２】
2018181935.tif 000016
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント、及び標識コレステロールを含む、
高比重リポタンパク質の機能評価用試薬キット。
【請求項１２】
標識コレステロールに結合可能な抗体をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記標識コレステロールが、下記式（Ｉ）に表される標識コレステロールである、請求項１１又は１２に記載のキット：
【化３】
2018181935.tif 000017
【請求項１４】
高比重リポタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体とを混合し、複合体を形成する工程、及び
前記複合体を定量する工程
を含み、
前記捕捉抗体及び前記検出抗体のそれぞれが、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント及び配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントよりなる群から選択される一種である、
高比重リポタンパク質の定量方法。
【請求項１５】
前記捕捉抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントであり、
前記検出抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、
請求項１４に記載の定量方法。
【請求項１６】
前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、同一のエピトープに結合する抗体である、請求項１４に記載の定量方法。
【請求項１７】
前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項１４に記載の定量方法。 
【請求項１８】
前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、酸化修飾された高比重リポタンパク質及び酸化修飾されていない高比重リポタンパク質の何れにも結合する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の定量方法。 
【請求項１９】
前記捕捉抗体及び前記検出抗体が、下記式（Ｉ）に表される標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質に結合する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の定量方法：
【化４】
2018181935.tif 000018
【請求項２０】
前記検出抗体が標識物質を含み、
前記定量工程において、前記複合体に含まれる前記標識物質由来のシグナルが検出される、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の定量方法。 
【請求項２１】
前記捕捉抗体が固相に固定化されている、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の定量方法。
【請求項２２】
被検体から取得された第１試料中の高比重リポタンパク質と、標識コレステロールとを混合し、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質を形成する工程、
第１の捕捉抗体と、前記標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質とを混合することにより、前記標識コレステロールを取り込んだ前記高比重リポタンパク質と前記捕捉抗体との第１の複合体を形成する工程、及び
前記第１の複合体中の標識物質に起因する第１の測定値を取得する工程；並びに
前記被検体と同一の被検体から取得された第２試料中の高比重リポタンパク質と、第２の捕捉抗体と、検出抗体とを混合し、第２の複合体を形成する工程、
前記第２の複合体に起因する第２の測定値を取得する工程、及び
前記第１の測定値および前記第２の測定値に基づき、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を算出する工程；
を含み、
前記第１の捕捉抗体は、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであり、
前記第２の捕捉抗体及び前記検出抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、
高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定方法。
【請求項２３】
前記算出工程の後、算出結果を出力する工程をさらに含む、請求項２２に記載の高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定方法。
【請求項２４】
前記算出工程において、（ｉ）第１の測定値を第２の測定値で除した値、及び／又は（ｉｉ）前記（ｉ）で得られる値の逆数が算出される、請求項２３に記載の高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、アポリポプロテインＡ−１（本明細書では「ＡｐｏＡ１」と称する）に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが開示される。また、本明細書には、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを使用した高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法、及び高比重リポタンパク質の定量方法が開示される。さらに、本明細書には、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを含む高比重リポタンパク質の機能評価用試薬キット、及び高比重リポタンパク質の定量用キットが開示される。
【背景技術】
【０００２】
近年、リポタンパク質の機能が、疾患の存在や疾患リスクを評価する指標として注目されている。例えば、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）はリポタンパク質の一つであり、ＨＤＬによる末梢組織からのコレステロールの排出機能が心血管疾患のリスクに対する負の予後因子であることが知られている。【０００３】
このような臨床的な評価を正しく行うためには、リポタンパク質の機能を定量的に、精度良く評価することが重要である。好ましくは、生体内からリポタンパク質を捕捉した後、Ｂ／Ｆ分離により夾雑物を除き、高いＳ／Ｎにて機能を評価することが望まれる。一方で、リポタンパク質は生体内で酸化修飾反応を受けることが知られており、酸化の程度は個人差やその時々の状況により変動すると考えられる。リポタンパク質の機能評価を正しく行うためには、リポタンパク質の酸化状態に関わらずリポタンパク質を捕捉した上で、機能を解析することが望まれる。【０００４】
非特許文献１には、ＨＤＬの酸化状態に関わらず一様にＨＤＬに結合する抗ＡｐｏＡ１抗体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１６／０１０９４６９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】DiDonato JA et al., Circulation. 2013 Oct 8; 128(15) : p1644-1655
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
高比重リポタンパク質の機能を測定する上で、しばしば標識コレステロールが使用され、標識コレステロールを取り込んだリポタンパク質を捕捉することが求められる（例えば、特許文献１）。【０００８】
本発明は、酸化の有無にかかわらず高比重リポタンパク質に結合可能であって、且つ標識コレステロールを取り込んでいない高比重リポタンパク質だけでなく、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質にも結合可能な抗体及びその抗原結合フラグメントを提供することを一課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねたところ、高比重リポタンパク質の酸化修飾の有無に関わらず、高比重リポタンパク質、及び標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質に結合可能なモノクローナル抗体を取得し、当該抗体を使用することで高比重リポタンパク質の機能評価を行うことができることを確認した。【００１０】
本明細書には課題解決手段の第１の態様として、下記特徴を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであって、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目のアミノ酸配列からなるペプチド又は２０１〜２６７番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、且つ下記（１）〜（３）の高比重リポタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが、開示される：
（１）酸化修飾された高比重リポタンパク質、
（２）酸化修飾されていない高比重リポタンパク質、及び
（３）下記式（Ｉ）に表される標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質：【００１１】
【化１】
2018181935.tif 000003
本態様のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントによれば、高比重リポタンパク質の酸化修飾状態、標識コレステロールの取り込みの有無に関わらず、リポタンパク質と結合できるため、当該高比重リポタンパク質及び標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質の捕捉が可能となる。
本明細書には課題解決手段の第２の態様として、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを産生するハイブリドーマが開示される。【００１２】
本明細書には課題解決手段の第３の態様として、上記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと、標識物質を含む標識コレステロールと高比重リポタンパク質とを混合することにより、前記標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質と前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとを含む複合体を形成する工程、及び前記複合体中の標識物質に起因するシグナルを検出する工程を含む、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法が開示される。本態様によれば、高比重リポタンパク質について、その酸化修飾状態に関わらず、標識コレステロール取り込み能を測定することができる。【００１３】
本明細書には課題解決手段の第４の態様として、高比重リポタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体とを混合し、複合体を形成する工程、及び前記複合体を定量する工程を含む、高比重リポタンパク質の定量方法が開示される。前記捕捉抗体及び前記検出抗体のそれぞれが、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント及び配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントよりなる群から選択される一種である。本態様によれば、高比重リポタンパク質を再現性良く測定することができる。【００１４】
本明細書には課題解決手段の第５の態様として、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定方法が開示される。本態様は、被検体から取得された第１試料中の高比重リポタンパク質と、標識コレステロールとを混合し、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質を形成する工程、第１の捕捉抗体と、前記標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質とを混合することにより、前記標識コレステロールを取り込んだ前記高比重リポタンパク質と前記捕捉抗体との第１の複合体を形成する工程、及び前記第１の複合体中の標識物質に起因する第１の測定値を取得する工程；並びに前記被検体と同一の被検体から取得された第２試料中の高比重リポタンパク質と、第２の捕捉抗体と、検出抗体とを混合し、第２の複合体を形成する工程、前記第２の複合体の第２の測定値を取得する工程、及び
前記第１の測定値および前記第２の測定値に基づき、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を算出する工程；を含む。本態様において前記第１の捕捉抗体は、請求項１〜７のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントであり、前記第２の捕捉抗体及び前記検出抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。本態様によれば、再現性よく標識コレステロール取り込み能を測定することができる。【００１５】
本発明の方法にかかる態様はインビトロで行われる。
【発明の効果】
【００１６】
本明細書に開示されるモノクローナル抗体及び抗原結合フラグメントによれば、高比重リポタンパク質の酸化修飾状態に関わらず、高比重リポタンパク質、及び標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Aは、未処理リコンビナントApoA1又は酸化リコンビナントApoA1に対する各クローンの反応性を示す。図１Bは、未処理HDL又は酸化HDLに対する各クローンの反応性を示す。横軸は、クローン名を示す。
【図２】図２は、図１とは異なるクローンにおける未処理HDL又は酸化HDLに対する反応性を示す。横軸は、クローン名を示す。
【図３】図３Aは、1C5抗体、8E10抗体、P1A5抗体、及びP1A7抗体の標識コレステロール−HDLに対する捕捉能を示す。図３Bは、1C5抗体、8E10抗体、P1A5抗体、及びP1A7抗体のHDLに対する捕捉能を示す。図３中、High TG mix.は、高トリグリセリドプール血清を示し、Normal mix.は、正常プール血清を示す。
【図４】図４Aは、1C5抗体の標識コレステロール−HDLに対する捕捉能を、酸化未処理（-）のHDLと酸化処理（+）したHDLとで比較した結果を示す。図４Bは、1C5抗体のHDLの捕捉能を、酸化未処理（-）のHDLと酸化処理（+）したHDLとで比較した結果を示す。図４において(-)は、陰性コントロールを示す。oxidation (-)は酸化未処理を示し、oxidation (+)は酸化処理を受けたことを示す。
【図５】図５は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に含まれる部分配列に対する8E10抗体、P1-A5抗体、P1-A7抗体、及び1C5抗体の結合性を示す。
【図６】図６は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の51〜110番目の範囲内に含まれる各種部分配列に対する8E10抗体及び抗Hisタグ抗体の結合性を示す。
【図７】図７は、高比重リポタンパク質の機能評価用試薬キットの一例を示した概略図である。
【図８】図８は、高比重リポタンパク質の定量用試薬キットの一例を示した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント］
第１の態様は、ＡｐｏＡ１に結合するモノクローナル抗体又はその結合フラグメントに関する。
【００１９】
ＡｐｏＡ１は、アポリポプロテインＡ−１を意味し、好ましくはヒト由来のＡｐｏＡ１である。さらに好ましくは配列番号１に示されるタンパク質である。生体内では、ＡｐｏＡ１遺伝子から配列番号１のＡｐｏＡ１が転写及び翻訳され、その後Ｎ末端側が切断される。ＨＤＬにおいては配列番号２で示される成熟型ＡｐｏＡ１として存在する。本態様において、ＡｐｏＡ１のアミノ酸配列上の特定の領域について言及する場合は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に基づく。また、本態様において、ＡｐｏＡ１は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質を含むものである。これらの相同性については、National Center for Biotechnology Information (NCBI)に掲載されているblastp (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&DBSEARCH=true&QUERY=&SUBJECTS=)等を使用して求めることができる。
【００２０】
モノクローナル抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目の範囲又は２０１〜２６７番目の範囲に結合する。好ましくは、モノクローナル抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の９１〜１１０番目の範囲に結合する。また本態様のモノクローナル抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１０１〜１６０番目の範囲には結合しないことが好ましい。さらに、本態様のモノクローナル抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２〜６０番目及び１５１〜２１０番目の範囲にも結合しないことが好ましい。
さらにモノクローナル抗体は、
（１）酸化修飾された高比重リポタンパク質、
（２）酸化修飾された高比重リポタンパク質、及び
（３）下記式（Ｉ）に表される標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質：
【００２１】
【化２】
2018181935.tif 000004
に結合することができる。
【００２２】
ここで、高比重リポタンパク質は、ＨＤＬとも称される。高比重リポタンパク質は、１．０６３ｇ／ｍＬ以上の密度を有するリポタンパク質である。
【００２３】
高比重リポタンパク質の酸化修飾は、少なくとも当該高比重リポタンパク質に含まれるＡｐｏＡ１タンパク質又は脂質の酸化を意味し、この限りにおいて特に制限されない。ＡｐｏＡ１の酸化修飾としては、例えば、マロンジアルデヒド修飾；成熟型ＡｐｏＡ１の１９２番目のチロシン残基のクロロ化、１８番目のチロシン残基のニトロ化（J Biol Chem. 2012 Feb 24;287(9):6375-86.）、７２番目のトリプトファン残基のヒドロキシル化(Nat Med. 2014 Feb;20(2):193-203.)を挙げることができる。脂質の酸化修飾としては、酸化ホスファチジルコリン修飾（J. Biol. Chem.2, 69, 15274-15279, 1994）等を挙げることができる。インビトロで酸化修飾を行う方法としては、例えば、非特許文献１に記載されているように、過酸化水素等を使用して高比重リポタンパク質を酸化する方法を挙げることができる。
【００２４】
高比重リポタンパク質に結合するとは、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントが抗原抗体反応により高比重リポタンパク中に含まれるＡｐｏＡ１の少なくとも一部と結合する限り制限されない。結合とは、好ましくは高比重リポタンパク質を捕捉できることを意味する。より好ましくは、結合は、ウシ血清アルブミンを含まないＰＢＳ又はウシ血清アルブミンを含まないStartingBlock (PBS) Blocking buffer (Thermo Fisher SCIENTIFIC/製品番号37538)の中で起こる結合をいう。結合するとは、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを捕捉抗体としてＥＬＩＳＡ法で高比重リポタンパク質又は配列番号１に示される前記アミノ酸配列を有するペプチドを検出したときに、高比重リポタンパク質又は前記アミノ酸配列を有するペプチドを含むウェルのシグナルがＰＢＳ等の陰性対照を含むウェルのシグナルよりも高いことをいう。結合しないとは、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントを捕捉抗体としてＥＬＩＳＡ法で高比重リポタンパク質又は配列番号１に示される前記アミノ酸配列を有するペプチドを検出したときに、高比重リポタンパク質又は前記アミノ酸配列を有するペプチドを含むウェルのシグナルがＰＢＳ等の陰性対照を含むウェルのシグナルと同等であるかそれよりも低いことをいう。当該結合は、非変性の高比重リポタンパク質に対して生じるものに限らず、変性された高比重リポタンパク質に対して生じるものであってもよい。好ましくは、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントは、非変性条件下の試料中に非変性の状態で存在する高比重リポタンパク質と結合する。非変性状態の高比重リポタンパク質とは、例えば、タンパク質及び脂質の複合体が維持されていることをいう。変性は、例えば、タンパク質及び脂質の複合体が維持されていないことをいう。また、変性には、タンパク質の二次構造以上の高次構造の全部又は一部が可逆的又は不可逆的に破壊された状態を含んでいてもよい。具体的には、変性は、例えば高比重リポタンパク質の荷電の全部又は一部が変化している状態、及び／又は高比重リポタンパク質に含まれるタンパク質のジスルフィド結合の全部又は一部が切断されている状態を含む。
【００２５】
前記試料は、哺乳動物等の被検体から取得される検体由来の高比重リポタンパク質、好ましくはヒトの高比重リポタンパク質を含む限り、特に限定されない。検体としては、例えば、血液、血清及び血漿といった血液試料が挙げられる。試料は、例えば検体そのものであってもよく、検体を生理食塩水、PBS等で希釈したものであってもよく、あるいは検体から特許文献１に記載のポリエチレングリコール法で回収した高比重リポタンパク質の浮遊液等であってもよい。前記試料は、コレステロールとエステルを形成する脂肪酸を含んでいることが好ましい。
【００２６】
また、第１の態様のモノクローナル抗体としては、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫（継代物を含む）から産生されるモノクローナル抗体を挙げることができる。受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３で特定されるハイブリドーマは、それぞれ識別の表示「８Ｅ１０」及び「Ｐ１Ａ５」として、２０１７年３月８日に、日本国千葉県木更津かずさ鎌足２−５−８  １２２号室に所在する独立行政法人製品評価技術基盤機構の微生物寄託センターに国際寄託されている。本明細書ではこれらのハイブリドーマから産生される抗体を、それぞれ８Ｅ１０抗体及びＰ１Ａ５抗体と称する場合がある。当該モノクローナル抗体は、前記特徴（１）〜（３）のすべての高比重リポタンパク質を結合することができる。
【００２７】
また第１の態様のモノクローナル抗体には、上記特徴を備えることを限度として、前記ハイブリドーマ又はその子孫からそれぞれ産生されるモノクローナル抗体の全部又は一部と同じアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体が含まれる。
【００２８】
また前記モノクローナル抗体には、それらの重鎖相性鎖決定領域（ＨＣＤＲ）及び軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）のアミノ酸配列が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫から産生される各モノクローナル抗体のＨＣＤＲ及びＬＣＤＲのアミノ配列と同一であるモノクローナル抗体が含まれる。具体的には受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫から産生される各モノクローナル抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を有するモノクローナル抗体が含まれる。
【００２９】
一般に抗原結合フラグメントは、抗原への結合能及び／又は抗原の認識能を保持した抗体の一部分を意味する。本態様において抗原結合フラグメントは、前述するモノクローナル抗体の一部分であって、当該モノクローナル抗体と同様にその抗原であるＡｐｏＡ１への結合能及び／又は抗原の認識能を保持することで、下記の特徴を備えているものである。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目のアミノ酸配列、好ましくは９１〜１１０番目のアミノ酸配列からなるペプチド、又は（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する。
好ましくは、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の９１〜１１０番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する。
より好ましくは、（ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の１０１〜１６０番目の範囲には結合しない。
さらに好ましくは、（ｅ）配列番号１に示されるアミノ酸配列の２〜６０番目及び１５１〜２１０番目のアミノ酸配列からなるペプチドに結合しない。
さらに、前記抗原結合フラグメントは、上記（ａ）から（ｅ）の特徴に加えて、
（１）酸化修飾された高比重リポタンパク質、
（２）酸化修飾された高比重リポタンパク質、及び
（３）式（Ｉ）に表される標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質に結合することができる：
【化３】
2018181935.tif 000005
【００３０】
本態様が対象とする抗原結合フラグメントは、かかる特徴を有するものであればよく、制限されるものではないが、例えば前述のモノクローナル抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチド等であってもよい。これらの抗原結合フラグメントの調製方法は公知であり、例えば米国特許出願公開第２０１６／０１５９８９５号明細書に記載の方法で調製することができる。
【００３１】
［ハイブリドーマ］
第２の態様は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３で特定されるハイブリドーマ又はその子孫に関する。当該子孫には、寄託したハイブリドーマそのもの、寄託されたハイブリドーマを培養したもの、寄託したハイブリドーマから分譲されたもの、これらのさらなる継代培養細胞等が含まれる。当該ハイブリドーマは前述するように、２０１７年３月８日付けで国際寄託機関に国際寄託されている。ハイブリドーマの作製方法の例を後述する実施例１に示す。
【００３２】
［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法１］
第３の態様は、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法（以下、単に測定方法ということがある）に関する。
【００３３】
＜複合体の形成＞
第３の態様では、上記［モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント］の欄で述べたモノクローナル又は抗原結合フラグメントと標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質とを混合することにより、前記標識コレステロールを取り込んだ前記高比重リポタンパク質と前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントとの複合体（第１の複合体ともいう）を形成する。前記標識コレステロールを取り込んだ前記高比重リポタンパク質と複合体を形成する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの１つは、好ましくは前記標識コレステロールを取り込んだ前記高比重リポタンパク質を後述する固相等に捕捉するための捕捉抗体（第１の捕捉抗体ともいう）であり得る。
前記高比重リポタンパク質は、好ましくは試料中に含まれるものである。試料については、上記［モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント］の欄における説明をここに援用する。
【００３４】
モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントと標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質とを混合する条件は、モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントが前記標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質に結合できる限り制限されない。
【００３５】
捕捉抗体は、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質と混合される際に、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、プレートなどの固相に結合した状態であってもよい。モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントの固相化は、公知の方法にしたがって行うことができる。
【００３６】
捕捉抗体を固相に固定する場合、捕捉抗体の固相への固定の態様は、特に限定されない。例えば、捕捉抗体と固相とを直接結合させてもよいし、捕捉抗体と固相との間を別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、アビジン類との組合せを介した結合が挙げられる。この場合、捕捉抗体を予めビオチンで修飾し、固相にアビジン類を予め結合させておくことにより、ビオチンとアビジン類との結合を介して、捕捉抗体と固相とを間接的に結合させることができる。本実施態様においては、捕捉抗体と固相との結合は、ビオチンとアビジン類を介した間接的な結合であることが好ましい。
【００３７】
固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体（酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど）、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
【００３８】
標識コレステロールは、コレステロール分子の一部に、標識となる分子（標識物質）が結合した物質である。ここで、標識コレステロールにおけるコレステロール部分は、天然に存在するコレステロールの構造を有してもよいし、又は、天然に存在するコレステロールのＣ１７位に結合しているアルキル鎖から１つ以上のメチレン基及び／又はメチル基が除かれたコレステロール（ノルコレステロールとも呼ばれる）の構造を有してもよい。
【００３９】
リポタンパク質はコレステロールをエステル化して取り込むので、リポタンパク質によりエステル化される標識コレステロールを用いることがより好ましい。なお、本実施形態の方法において、標識コレステロールは、高比重リポタンパク質と混合した際に、高比重リポタンパク質に含まれるレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性により試料に含まれる脂肪酸とエステル化され得る。リポタンパク質による標識コレステロールのエステル化を確認する方法自体は当該技術において公知であり、当業者にとってルーチンに行うことができる。
【００４０】
標識物質は、検出可能なシグナルが生じる限り、特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質（以下、「シグナル発生物質」ともいう）であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、発光物質、発色物質、放射性同位元素などが挙げられる。
抗体への標識物質の標識は、免疫測定技術分野において公知の標識方法により行うことができる。また、市販のラベリングキットなどを用いて標識してもよい。
【００４１】
蛍光物質は、有極性構造を有する蛍光団を含むことが好ましい。当該技術分野において、蛍光標識コレステロール及び有極性構造を有する蛍光団を含む標識コレステロール自体は公知である。
そのような有極性構造を有する蛍光団を含む蛍光標識コレステロールとしては、例えば、下記式（ＩＩ）：
【００４２】
【化４】
2018181935.tif 000006
で表されるボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標））骨格構造、又は
下記式（ＩＩＩ）：
【００４３】
【化５】
2018181935.tif 000007
で表されるベンゾオキサジアゾール骨格構造を有する蛍光団を含む蛍光標識コレステロール等が挙げられる。
【００４４】
標識コレステロールとして、好ましくは下記式（Ｉ）で表される化合物：
【化６】
2018181935.tif 000008
【００４５】
（（２３−（ジピロメテンボロンジフルオリド）−２４−ノルコレステロール、商品名ＴｏｐＦｌｕｏｒ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＣＡＳ  Ｎｏ：８７８５５７−１９−８、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社より入手できる）、又は、
下記式（ＩＶ）で表される化合物：
【００４６】
【化７】
2018181935.tif 000009
【００４７】
（２５−［Ｎ−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアザオール−４−イル）メチル］アミノ］−２７−ノルコレステロール、商品名２５−ＮＢＤ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ、ＣＡＳ  Ｎｏ：１０５５３９−２７−３、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社より入手できる）
であり、より好ましくは上記式（Ｉ）で表される化合物である。
【００４８】
上記の他、蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）などの蛍光色素、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）などの蛍光タンパク質などを用いることができる。
【００４９】
放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐなどを用いることができる。
【００５０】
他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。
【００５１】
標識コレステロールは、標識物質としてタグを有していてもよい。タグを標識されたコレステロールは、タグ付加コレステロールとも呼ばれる。タグ付加コレステロールを用いる場合は、後述のシグナル検出の工程において、タグに特異的に結合する物質（以下、「捕捉体」）を用いてシグナルが検出され得る。タグは、天然由来の物質及び合成された物質のいずれであってもよく、例えば、化合物、ペプチド、タンパク質、核酸及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。化合物は、これと特異的に結合できる物質が存在するか又は得られるかぎり、当該技術において公知の標識化合物であってもよく、例えば、色素化合物などが挙げられる。
【００５２】
当該技術において、コレステロールはエステル化されることで脂溶性が増大して、リポタンパク質による取り込みが促進することが知られている。コレステロールに付加されるタグは、脂溶性又は疎水性の物質であってもよい。
【００５３】
タグと該タグに特異的に結合できる物質との組み合わせとしては、例えば、抗原と該抗原を認識する抗体、ハプテンと抗ハプテン抗体、ペプチド又はタンパク質とそれらを認識するアプタマー、リガンドとその受容体、オリゴヌクレオチドとその相補鎖を有するオリゴヌクレオチド、ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）、ヒスチジンタグ（６〜１０残基のヒスチジンを含むペプチド）とニッケル、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とグルタチオンなどが挙げられる。タグとしての抗原は、当該技術において公知のペプチドタグ及びプロテインタグであってもよく、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、Ｍｙｃタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などが挙げられる。タグとしてのハプテンは、例えば、２，  ４−ジニトロフェノールなどが挙げられる。
【００５４】
捕捉体として用いられる抗体は、標識物質又はその一部を抗原としてヒト以外の動物に免疫して得られたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等）であり得る。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。
【００５５】
タグの例として、上記の式（ＩＩ）で表される構造、又は、下記の式（Ｖ）：
【００５６】
【化８】
2018181935.tif 000010
で表される構造を有するタグが挙げられる。
【００５７】
式（ＩＩ）で表される構造は、ボロンジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標））骨格であり、式（Ｖ）で表される構造は、ビオチンの一部分を示す。式（ＩＩ）又は（Ｖ）で表される構造を含むタグ付加コレステロールは、これらのタグに対する捕捉体が一般に入手可能であるので、好ましい。
【００５８】
また、２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）基を有するタグを付加したコレステロールも、抗ＤＮＰ抗体が市販されているので、好ましい。
【００５９】
タグ付加コレステロールとしては、例えば、下記の式（ＶＩ）：
【００６０】
【化９】
2018181935.tif 000011
（式中、Ｒ１は、メチル基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、
Ｘ及びＹは、同一又は異なって、−Ｒ２−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｒ２−、−Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２−、−Ｒ２−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ２−、−Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ２−、−Ｒ２−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ２−、−Ｒ２−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ２−、−Ｒ２−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−Ｒ２−、−Ｒ２−ＮＨ−（Ｃ＝Ｓ）−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｓ）−Ｒ２−、−Ｒ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｒ２−、−Ｒ２−Ｓ−、又は−Ｓ−Ｒ２−で表され、ここで、Ｒ２は、それぞれ独立して、結合手、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキレン基、置換基を有していてもよい炭素数６〜１２のアリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、又は、置換基を有していてもよい炭素数３〜８のシクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であり、
Ｌは、−（ＣＨ２）ｄ−［Ｒ３−（ＣＨ２）ｅ］ｆ−、又は−［（ＣＨ２）ｅ−Ｒ３］ｆ−（ＣＨ２）ｄ−で表わされ、ここで、Ｒ３は、酸素原子、硫黄原子、−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−又は−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−であり、
ＴＡＧは、タグであり、
ａ及びｃは、同一又は異なって、０〜６の整数であり、
ｂは、０又は１であり、
ｄ及びｅは、同一又は異なって、０〜１２の整数であり、
ｆは、０〜２４の整数である。）
で表されるタグ付加コレステロールが挙げられる。
【００６１】
式（ＶＩ）においてａ、ｂ及びｃがいずれも０であるとき、この式で表されるタグ付加コレステロールはリンカーを有さず、タグとコレステロール部分とが直接結合している。式（ＶＩ）においてａ、ｂ及びｃのいずれかが０でないとき、この式で表されるタグ付加コレステロールは、タグとコレステロール部分との間にリンカー（−［Ｘ］ａ−［Ｌ］ｂ−［Ｙ］ｃ−）を有する。リンカーにより、リポタンパク質の外表面に露出したタグと捕捉体とがより結合しやすくなると考えられる。以下に、式（ＶＩ）の各置換基について説明する。
【００６２】
Ｒ１は、炭素数１〜６のアルキレン基を主鎖とし、いずれかの位置にメチル基を有しいてもよい。Ｒ１は、天然に存在するコレステロールのＣ１７位に結合したアルキル鎖に相当する。本実施形態では、Ｒ１は、炭素数が１〜５の場合、天然に存在するコレステロールにおけるＣ２０の位置にメチル基を有することが好ましい。Ｒ１は、炭素数が６の場合、天然に存在するコレステロールのＣ２０位〜Ｃ２７位のアルキル鎖と同じ構造であることが好ましい。
【００６３】
［Ｘ］ａは、Ｒ１と、Ｌ、［Ｙ］ｃ又はタグとの連結部分に相当する。［Ｙ］ｃは、Ｒ１、［Ｘ］ａ又はＬと、タグとの連結部分に相当する。Ｘ及びＹは、コレステロール部分とリンカーとを結合させる反応及びリンカーとタグとを結合させる反応の種類に応じて決定される。
【００６４】
Ｒ２に関して、結合手とは、間に他の原子を介さずに直接結合することをいう。Ｒ２が、炭素数１〜１０のアルキレン基であるとき、そのようなアルキレン基としては、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、ペンチレン、ネオペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、２−エチルヘキシレン、ノニレン及びデシレンなどの基が挙げられる。それらの中でも、炭素数１〜４のアルキレン基が好ましい。Ｒ２が、置換基を有するアルキレン基であるとき、上記の炭素数には、置換基の炭素数は含まれない。
【００６５】
Ｒ２が、アリーレン基若しくはヘテロアリーレン基であるとき、そのような基は、Ｎ、Ｓ、Ｏ及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数６〜１２の芳香環であればよい。例えば、フェニレン、ナフチレン、ビフェニリレン、フラニレン、ピローレン、チオフェニレン、トリアゾーレン、オキサジアゾーレン、ピリジレン、ピリミジレンなどの基が挙げられる。Ｒ２が、置換基を有するアリーレン基又はヘテロアリーレン基であるとき、上記の炭素数には、置換基の炭素数は含まれない。
【００６６】
Ｒ２が、シクロアルキレン基若しくはヘテロシクロアルキレン基であるとき、そのような基は、Ｎ、Ｓ、Ｏ及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３〜８の非芳香環であればよい。例えば、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレン、ピロリジニレン、ピペリジニレン、モルホリニレンなどの基が挙げられる。Ｒ２が、置換基を有するシクロアルキレン基又はヘテロシクロアルキレン基であるとき、上記の炭素数には、置換基の炭素数は含まれない。
【００６７】
Ｒ２における置換基としては、例えば、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ２、−ＳＨ、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、カルボキシアルキル、アミン、アミド、及びチオエーテルなどの基挙げられる。Ｒ２は、置換基を複数有していてもよい。ここで、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素を表す。アルコキシは、−Ｏ−アルキル基を示し、このアルキル基は、炭素数１〜５、好ましくは炭素数１又は２の直鎖状又は分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素基である。
【００６８】
好ましくは、ａ及びｃが共に１であり、Ｘ及びＹが、同一又は異なって、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−、又は−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−である。
【００６９】
Ｌは、スペーサーに相当し、リンカーに所定の長さを付与するポリマー構造を有する。このポリマー構造部分は、リポタンパク質によるコレステロールの取り込みを阻害せず、且つ、リンカー部分がリポタンパク質に取り込まれにくい性質であることが好ましい。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーが挙げられる。好ましい実施形態において、Ｌは、−（ＣＨ２）ｄ−［Ｏ−（ＣＨ２）ｅ］ｆ−、又は−［（ＣＨ２）ｅ−Ｏ］ｆ−（ＣＨ２）ｄ−で表わされる構造である。ここで、ｄ及びｅは、同一又は異なって、０〜１２の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは共に２である。ｆは、０〜２４の整数、好ましくは２〜１１の整数、より好ましくは４〜１１の整数である。
【００７０】
リンカーを有さないタグ付加コレステロールとしては、例えば、上記式（Ｉ）で表される蛍光標識コレステロール（２３−（ジピロメテンボロンジフルオリド）−２４−ノルコレステロール）が挙げられる。このタグ付加コレステロールは、タグ（ＢＯＤＩＰＹ骨格構造を有する蛍光部分）がコレステロールのＣ２３位に直接結合している。上記のＢＯＤＩＰＹ骨格構造を有する蛍光部分に特異的に結合する捕捉体として、抗ＢＯＤＩＰＹ抗体（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ、Ａ−５７７０、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が市販されている。
【００７１】
タグがリンカーを介して結合しているタグ付加コレステロールとしては、下記の式（ＶＩＩ）：
【００７２】
【化１０】
2018181935.tif 000012
（式中、ｎは、０〜２４の整数、好ましくは２〜１１の整数、より好ましくは４〜１１の整数である。）
で表されるビオチン付加コレステロールが挙げられる。このタグ付加コレステロールにおいては、タグ（式（Ｖ）で表されるビオチン部分）がリンカー（ポリエチレングリコール）を介してコレステロール部分と結合している。ビオチン部分に特異的に結合する捕捉体としては、アビジン又はストレプトアビジンが適している。また、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）などの標識物質が結合したアビジン又はストレプトアビジンも市販されている。
【００７３】
また、下記の式（ＶＩＩＩ）：
【００７４】
【化１１】
2018181935.tif 000013
で表されるＤＮＰ付加コレステロールが挙げられる。このタグ付加コレステロールにおいては、ＤＮＰがリンカー（−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−）を介してコレステロール部分と結合している。
【００７５】
ＤＮＰに特異的に結合する捕捉体としては、抗ＤＮＰ抗体が適している。また、ＨＲＰ、ＡＬＰなどの標識物質が結合した抗ＤＮＰ抗体も市販されている。
【００７６】
コレステロール部分とタグとの結合様式は特に限定されないが、コレステロール部分とタグとを結合させてもよいし、コレステロール部分とタグとをリンカーを介して結合させてもよい。結合手段は特に限定されないが、例えば、官能基を利用したクロスリンクが簡便で好ましい。官能基は特に限定されないが、アミノ基、カルボキシル基及びスルフヒドリル基は、市販のクロスリンカーを利用できるので好ましい。
【００７７】
コレステロールは、Ｃ１７位に結合しているアルキル鎖に官能基がないので、タグの付加においては、該アルキル鎖に官能基を有するコレステロール誘導体を用いることが好ましい。そのようなコレステロール誘導体としては、例えば、胆汁酸の前駆体、ステロイドの前駆体などが挙げられる。具体的には、３β−ヒドロキシ−Δ５−コレン酸、２４−アミノ−５−コレン−３β−オルなどが好ましい。タグの官能基はタグの種類に応じて異なる。例えば、ペプチド又はタンパク質をタグに用いる場合は、アミノ基、カルボキシル基及びスルフヒドリル基（ＳＨ基）が利用でき、ビオチンをタグに用いる場合は、側鎖のカルボキシル基が利用できる。リンカーは、両端に官能基を有するポリマー化合物が好ましい。なお、ビオチンをタグとして付加させる場合、市販のビオチン標識試薬を用いてもよい。この試薬は、末端にアミノ基などの官能基を有する様々な長さのスペーサーアーム（ＰＥＧなど）を結合させたビオチンが含まれている。
【００７８】
複合体の形成後、好ましくは複合体形成後であって標識物質の検出前に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するＢｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ（Ｂ／Ｆ）分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、試料中の高比重リポタンパク質以外の成分などが挙げられる。Ｂ／Ｆ分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した固相だけを回収することによりＢ／Ｆ分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりＢ／Ｆ分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりＢ／Ｆ分離ができる。前記方法は、自動化の観点で好ましい。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの適切な水性溶媒で洗浄してもよい。
【００７９】
本実施形態に係る測定方法では、上記のようにして形成した複合体に、上記のタグに特異的に結合する捕捉体と、標識物質とを結合させることにより、該複合体を標識する。
【００８０】
タグに特異的に結合する捕捉体は、上記のタグ付加コレステロールのタグの種類に応じて適宜決定すればよい。例えば、上述したタグと該タグに特異的に結合できる物質との組み合わせを参照して、抗体、リガンド受容体、オリゴヌクレオチド、ビオチン、アビジン(若しくはストレプトアビジン)、ヒスチジンタグ又はニッケル、GST又はグルタチオンなどから選択できる。それらの中でも、捕捉体としては、タグに特異的に結合する抗体が好ましい。そのような抗体は、市販の抗体であってもよいし、当該技術において公知の方法により作製した抗体であってもよい。抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。抗体の由来及びアイソタイプは特に限定されない。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いてもよく、例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメントなどが挙げられる。
【００８１】
標識物質は、シグナル発生物質、他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質等を用いることができる。シグナル発生物質としては、蛍光物質、放射性同位元素などが例示される。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、酵素が例示される。酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましい。
【００８２】
好ましい実施形態においては、標識物質を、タグに特異的に結合する捕捉体を介して、間接的に複合体と結合させることにより、該複合体を標識する。例えば、複合体に、標識物質と結合した捕捉体を結合させるか、又は、複合体と結合した捕捉体に、標識物質を結合させることが挙げられる。標識物質をあらかじめ結合させた捕捉体を用いてもよいし、捕捉体に特異的に結合できる標識物質を用いてもよい。
【００８３】
標識物質をあらかじめ結合させた捕捉体は、例えば、タグに特異的に結合する捕捉体を、上記の標識物質で標識することにより得ることができる。なお、物質の標識方法自体は、当該技術において公知である。捕捉体が抗体の場合は、市販のラベリングキットなどを用いて標識してもよい。捕捉体に特異的に結合できる標識物質としては、例えば、捕捉体を特異的に認識する標識抗体(二次抗体)などが挙げられる。
【００８４】
この標識工程における温度及び時間の条件は特に限定されないが、例えば、複合体と、タグに特異的に結合する捕捉体と、標識物質との混合物を４〜60℃、好ましくは25〜42℃にて、１秒間〜24時間、好ましくは１〜２時間インキュベーションすることができる。インキュベーションの間、混合物は静置してもよいし、攪拌又は振とうしてもよい。
【００８５】
本実施形態においては、複合体と捕捉体と標識物質との混合の後且つシグナル検出の前に、未反応の遊離成分を除去するＢ／Ｆ分離を行ってもよい。未反応の遊離成分としては、例えば、タグに結合しなかった遊離の捕捉体、捕捉体と結合しなかった遊離の標識物質などが挙げられる。
【００８６】
＜シグナル検出＞
シグナルを検出する方法自体は、免疫測定技術分野において公知である。本実施態様では、標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。
【００８７】
例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、ルミノメーター、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００８８】
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてＡＬＰを用いる場合、基質として、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）などの化学発光基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。特に好ましくは、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）である。前記基質の発光は、ルミノメーターで検出することが好ましい。
【００８９】
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。ＥＬＩＳＡ法は、全自動免疫測定装置ＨＩＳＣＬ（シスメックス株式会社）を使用して複合体の形成とその検出を行ってもよい。
【００９０】
ここで、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。
【００９１】
試料の希釈に用いられる水性溶媒やＢ／Ｆ分離を行うための洗浄用の水性溶媒は、標識コレステロールがチューブ等に付着することを防ぐために添加される添加剤（例えば、ＬＩＰＩＤＵＲＥ（登録商標）−ＢＬ８０２等）を含んでいることが好ましい。
【００９２】
検出されたシグナルは、リポタンパク質に取り込まれたコレステロールの量を示し、リポタンパク質のコレステロール取り込み能の指標となる。この指標は、蛍光強度、発光強度などの光学的情報で表されてもよいし、取り込まれたコレステロールの量（分子数など）で表されてもよい。前記検出されたシグナルは、第１の複合体中のコレステロールに結合した標識物質に起因する測定値（第１の測定値ともいう）として使用することができる。
【００９３】
高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能の測定は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１０９４６９号又は米国特許出願公開第２０１７／０３１５１１２号に記載の方法にしたがって行うことができる。米国特許出願公開第２０１６／０１０９４６９号又は米国特許出願公開第２０１７／０３１５１１２号は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
［高比重リポタンパク質の定量方法］
第４の態様は、高比重リポタンパク質を定量する方法（以下、単に定量方法ということがある）に関する。
【００９５】
上記［モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント］の欄で述べたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質のみならず、標識コレステロールを取り込んでいない高比重リポタンパク質にも結合可能である。
【００９６】
高比重リポタンパク質と複合体を形成する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの１つは、好ましくは高比重リポタンパク質を固相等に捕捉するための捕捉抗体（第２の捕捉抗体ともいう）であり得る。また、高比重リポタンパク質と複合体を形成する前記モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントの１つは、高比重リポタンパク質を検出するための検出抗体であり得る。
【００９７】
モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントを捕捉抗体及び／又は検出抗体として用いることにより、高比重リポタンパク質を定量することができる。高比重リポタンパク質の定量は、公知の免疫学的測定法により行うことができる。たとえば、［モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント］の欄で述べたモノクローナル又は抗原結合フラグメントを捕捉抗体および検出抗体として用い、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定することができる。
捕捉抗体のエピトープと検出抗体のエピトープとは、同じであり得る。また、高比重リポタンパク質は通常ＡｐｏＡ１分子を複数有するため、捕捉抗体のエピトープと検出抗体のエピトープとは少なくとも部分的に重複していてもよいし、異なっていてもよい。
【００９８】
好ましくは、高比重リポタンパクを定量するために使用される捕捉抗体及び検出抗体は、それぞれ配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント及び配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントよりなる群から選択される一種である。
【００９９】
より好ましくは、捕捉抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントであり、検出抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。あるいは、捕捉抗体及び前記検出抗体が、共に配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。
【０１００】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の５１〜１１０番目に結合するモノクローナル抗体として好ましくは、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４２又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫（継代物を含む）から産生されるモノクローナル抗体（例えば、８Ｅ１０抗体）を挙げることができる。配列番号１に示されるアミノ酸配列の２０１〜２６７番目に結合するモノクローナル抗体として好ましくは、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４４３のハイブリドーマ又はその子孫（継代物を含む）から産生されるモノクローナル抗体（例えばＰ１Ａ５抗体）を挙げることができる。
【０１０１】
上記［モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント］の欄で述べたモノクローナル又は抗原結合フラグメントについての説明は、この欄に援用される。
【０１０２】
高比重リポタンパク質の定量は、高比重リポタンパク質と、捕捉抗体と、検出抗体とを混合することにより、複合体（第２の複合体ともいう）を形成する工程と、前記複合体を定量する工程を含む。
【０１０３】
標識物質に起因するシグナルのデータは、高比重リポタンパク質の測定値（第２の測定値ともいう）として用いることができる。あるいは、標識物質に起因するシグナルのデータから、高比重リポタンパク質の測定値を生成してもよい。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度そのもの又は該シグナル強度から算出される値を、前記測定値として用いることができる。シグナル強度から算出される値としては、例えば、各検体のシグナル強度の値から陰性対照試料のシグナル強度の値を差し引いた値、各検体のシグナル強度を陽性対照試料のシグナル強度の値で除した値、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。陰性対照試料としては、高比重リポタンパク質を含まない試料等が挙げられる。陽性対照試料としては、既知量の高比重リポタンパク質を含む試料（キャリブレータともいう）等が挙げられる。
【０１０４】
また、高比重リポタンパク質の測定値は、キャリブレータのシグナル強度の値とキャリブレータの高比重リポタンパク質の量から検量線を作成し、その検量線に各検体の標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質に由来するシグナルの強度の値を当てはめることにより算出することができる。また、検量線を作成せず、キャリブレータのシグナル強度の値から回帰式を求め、その回帰式に各検体における標的物質に由来するシグナルの強度の値を当てはめることにより、高比重リポタンパク質の測定値を算出することができる。
【０１０５】
高比重リポタンパク質の測定値は、例えば試料一定量あたりの高比重リポタンパク質の量又は濃度を反映する値である。
【０１０６】
捕捉抗体及び検出抗体は、上記［モノクローナル抗体又はその結合フラグメント］で説明したモノクローナル抗体又はその結合フラグメント、及びそれらの断片（例えば、Fab、F(ab)2等）のいずれも用いることができる。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。
【０１０７】
上記免疫学的な測定を行う場合には、試料の希釈やB/F分離を行うための洗浄用の水性溶媒は、標識コレステロールがチューブ等に付着することを防ぐために添加される添加剤（例えば、LIPIDURE（登録商標）-BL802等）を含んでいることが好ましい。
【０１０８】
［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法２］
第５の態様は、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定するための第２の方法に関する。本態様では、上記［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法１］で述べた方法により取得されたコレステロールに結合した標識物質に起因する第１の測定値と、上記［高比重リポタンパク質の定量方法］で述べた方法により取得された高比重リポタンパク質の第２の測定値に基づいて、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を評価する。
【０１０９】
本態様の方法では、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定するために第１試料が用いられ、高比重リポタンパク質の定量のために第２試料が用いられる。第１試料および第２試料は、同一の被検体から採取された試料である。第１試料と、第２試料とは、異なる時刻において採取されたものであってよいが、好ましくは実質的に同時刻である。ここで、実質的に同時刻に採取する、とは、第１試料と第２試料とを同時刻に採取すること、同日に採取すること、数日内に採取することを含む。好ましくは、第１試料と第２試料とは同時刻に採取される。具体的には、同一の被検体から採取した試料を２分割し、第１の試料および第２の試料とし得る。
【０１１０】
被検体から取得された第１試料中の高比重リポタンパク質と標識コレステロールとを混合し、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質を形成する工程と、第１の捕捉抗体と、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質とを混合することにより、標識コレステロールを取り込んだ高比重リポタンパク質と捕捉抗体との第１の複合体を形成する工程と、第１の複合体中のコレステロールに結合した標識物質に起因する第１の測定値を取得する工程と、を含む測定工程Ａを含む。
【０１１１】
また、本態様の高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能の測定方法は、前記被検体と同一の被検体から取得された第２試料中の高比重リポタンパク質と、第２の捕捉抗体と、検出抗体とを混合し、第２の複合体を形成する工程と、第２の複合体に起因する第２の測定値を取得する工程と、を含む測定工程Ｂを含む。
【０１１２】
さらに、本態様における高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能の測定方法は、測定工程Ａで取得された第１の測定値及び測定工程Ｂで取得された第２の複合体の第２の測定値に基づき、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を算出する工程を含む。具体的には、測定工程Ａで取得された第１の測定値及び測定工程Ｂで取得された第２の複合体の第２の測定値から比活性を算出することができる。ここで、高比重リポタンパク質の「比活性」は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）に示すいずれかの値である：（ｉ）第１の測定値を第２の測定値で除した値、（ｉｉ）前記（ｉ）で得られる値の逆数。
【０１１３】
本態様の測定方法は、算出された値を出力する工程を含んでもよい。「出力」は、特に限定されず、例えば、測定結果の算出を行ったＣＰＵからメモリやモニタに出力すること、測定結果をモニタ等に表示すること、測定結果を他の端末へ送信すること、測定結果を紙にプリントアウトすること等を含む。
【０１１４】
高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能の測定方法は、上記［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法１］で説明した方法に従う。高比重リポタンパク質の量又は濃度の求め方は、上記［高比重リポタンパク質の定量方法］で説明した方法に従う。
【０１１５】
［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定試薬キット１］
第６の態様は、高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定用試薬キットに関する。
【０１１６】
当該キットは、上記［モノクローナル抗体又はその結合フラグメント］の欄で述べたモノクローナル又は抗原結合フラグメントと、標識コレステロールとを含む。標識コレステロールとして、タグ付加コレステロールを用いる場合は、標識物質を結合した捕捉体をさらに含み得る。
【０１１７】
キットの１例を図７に示す。キット１０ａには、上記［モノクローナル抗体又はその結合フラグメント］で述べたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメント、及び標識コレステロールが含まれる。標識コレステロールとしては、例えば上記［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能を測定する方法１］の項に記載の標識コレステロールを挙げることができる。これらは、例えば溶液又は粉末の状態で、容器などに収容された状態でキットを構成することができる。また、キット１０ａには生理食塩水、緩衝液（例えば、ＰＢＳ等）の溶媒が含まれていてもよい。また、溶媒は、標識コレステロールがチューブ等に付着することを防ぐために添加される添加剤（例えば、LIPIDURE（登録商標）-BL802等）を含んでいてもよい。図７には、キットの構成成分として、モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを収容した容器１１ａ、標識コレステロールを収容した容器１２ａ、及び溶媒を収容した容器１３ａを含むキット１０ａを示す。さらに、キット１０ａには、これらの容器を納めた箱１５ａが含まれていてもよい。さらにまた、キット１０ａには取扱説明書あるいは取扱説明書を閲覧できるＵＲＬを記載した用紙１４ａが含まれてもよい。前記モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、磁気ビーズ又はプラスチックビーズに固相化した状態であってもよい。また、前記モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、図７に記載する容器収容形態に代えて、例えば９６ウェルマイクロプレート上に固相化された状態でキットに組み込まれていてもよい。モノクローナル抗体又は結合フラグメントの固相化は、公知の方法にしたがって行うことができる。またモノクローナル抗体又は結合フラグメントを磁気ビーズ等に直接固相するのではなく、例えばビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）との結合を介して、磁気ビーズ等に結合させてもよい。
【０１１８】
［高比重リポタンパク質の定量用試薬キット］
第７の態様は、上記［モノクローナル抗体又はその結合フラグメント］の欄で述べたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを含む高比重リポタンパク質の定量用試薬キットに関する。
【０１１９】
キットの１例を図８に示す。キット１０ｂには、上記［モノクローナル抗体又はその結合フラグメント］で述べたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントが含まれる。例えばモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、溶液又は粉末の状態で、容器などに収容された状態でキットを構成することができる。また、キット１０ｂには生理食塩水、緩衝液（例えば、ＰＢＳ等）の溶媒が含まれていてもよい。また、溶媒は、標識コレステロールがチューブ等に付着することを防ぐために添加される添加剤（例えば、LIPIDURE（登録商標）-BL802等）を含んでいてもよい。図７には、キットの構成成分として、モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを収容した容器１１ｂ、及び溶媒を収容した容器１３ｂを含むキット１０ｂを示す。また、キット１０ｂには、コレステロールに結合した標識物質と結合可能な検出抗体等を収容した容器１２ｂが含まれていてもよい。さらに、キット１０ｂには、これらの容器を納めた箱１５ｂが含まれていてもよい。さらにまた、キット１０ｂには取扱説明書あるいは取扱説明書を閲覧できるＵＲＬを記載した用紙１４ｂが含まれてもよい。前記モノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、磁気ビーズ又はプラスチックビーズに固相化した状態であってもよい。また、前記モノクローナル又は抗原結合フラグメントは、図８に記載する容器収容形態に代えて、例えば９６ウェルマイクロプレート上に固相化された状態でキットに組み込まれていてもよい。モノクローナル抗体又は結合フラグメントの固相化は、公知の方法にしたがって行うことができる。またモノクローナル抗体又は結合フラグメントを磁気ビーズ等に直接固相するのではなく、例えばビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）との結合を介して、磁気ビーズ等に結合させてもよい。
【０１２０】
［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定試薬キット２］
このキットは、高比重リポタンパク質の比活性を測定するための試薬キットである。このキットは、上で述べた［高比重リポタンパク質のコレステロール取り込み能測定試薬キット１］の構成と、［高比重リポタンパク質の定量用試薬キット］の構成を含む。
【０１２１】
また、第６の態様、及び第７の態様の別態様として上記［モノクローナル抗体又はその結合フラグメント］の欄で述べたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントについて、高比重リポタンパク質の機能評価用試薬キット又は高比重リポタンパク質の定量用キットの製造のための用途に関する。つまり、第１の態様のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントは、前述する高比重リポタンパク質の機能評価用試薬キット又は高比重リポタンパク質の定量用キットの製造に使用することができる。当該高比重リポタンパク質の機能評価用試薬キット又は高比重リポタンパク質の定量用キットは上述の通りである。
【実施例】
【０１２２】
以下に実施例を示して本発明の内容を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定して解釈されるものではない。【０１２３】
実施例１：モノクローナル抗体の作製
１．ハイブリドーマの取得
マウス腸骨リンパ節法（特許第4098796号）によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製した。具体的には、抗原の接種は、1 mg/mLの全長型ヒトApoA1リコンビナントタンパク（SIGMA-ALDRICH社、製品番号SRP4693-100UG；大腸菌由来；アミノ酸配列は配列番号１に示す。）とフロイントコンプリートアジュバントを容積比1:2で混合したエマルジョン（抗原濃度：0.33 mg/mL）を、0.1 mL/匹でマウス（C57Bl6）の尾根部に1回注射することにより行った。また抗原の初回接種から16日後に、上記エマルジョンを、再度0.06 mL/匹で同一のマウスの尾根部に1回注射することにより追加免疫を行った。更に、2回目の抗原接種の4日後、腸骨リンパ節よりリンパ球を単離し、ミエローマと細胞融合させハイブリドーマを得た。【０１２４】
２．一次スクリーニング
ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の一次スクリーニングは、サンプルとしてハイブリドーマの培養上清を用い、ハイブリドーマを作製する際に用いたヒトApoA1タンパク質と、正常ヒト血清からポリエチレングリコール沈殿により抽出したHDL含有画分との2種の陽性抗原固相した抗原固相ELISA法にて行った。固相する陰性対照には牛血清アルブミン（BSA）を使用した。一次スクリーニングを行い、上記2種の陽性抗原の両方に反応を示し、陰性対照への反応が少ない培養上清を含むウェルを選定した。抗原固相ELISA法は以下の手法で行った。ポリエチレングリコール沈殿は、特許文献１、又は国際公開第2016/194825号に記載の方法で行った。【０１２５】
＜手法＞
i. PBSにて1μg/mLに希釈した陽性抗原又は陰性対照を50μlずつ96穴プレートの各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベーションし、陽性抗原及び陰性対照をウェル内に固相化し抗原固相プレートを作製した。
ii. 各ウェルをPBS 200 μlで2回洗浄し、最後にPBSをできるだけ除去した。iii. 各ウェルに2 %BSA加PBSを200μlずつ添加し、25 ℃で１時間ブロッキングした。iv. モノクローナル抗体を含むハイブリドーマの培養上清をStartingBlock (PBS) Blocking buffer (Thermo Fisher SCIENTIFIC/製品番号37538)で10倍希釈し、50μlずつ抗原固相プレートの各ウェルに添加し、4 ℃で一晩インキュベーションした。
v. 各ウェルをPBS 200μlで3回洗浄し、最後にPBSをできるだけ除去した。vi. StartingBlock (PBS) Blocking bufferで10,000倍希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体（Dako/製品番号P0260）を50μlずつ抗原固相プレートの各ウェルに添加し、25 ℃で30分間インキュベーションした。
vii. 各ウェルをPBS 200 μlで5回洗浄し、最後にPBSをできるだけ除去した。viii. 化学発光基質溶液（SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社）を各ウェルに100μlずつ添加し、プレートを25℃にて600 rpmで２分間振盪し発光させた。ix. マイクロプレートリーダー（Infinite（登録商標）F200 Pro、TECAN社製）で各ウェルの発光強度を測定した。【０１２６】
３．二次スクリーニング
選定されたハイブリドーマの培養上清を用いて抗原固相ELISA法により二次スクリーニングを行った。二次スクリーニングには、陽性抗原として、上記２．一次スクリーニングで使用した２種類の陽性抗原（未処理のリコンビナントApoA1又は未処理のHDL；以下それぞれを「未処理リコンビナントApoA1」、「未処理HDL」と称する）と、これらの陽性抗原を酸化処理して得た酸化陽性抗原（酸化処理したリコンビナントApoA1又は酸化処理したHDL；以下それぞれを「酸化リコンビナントApoA1」又は「酸化HDL」と称する）の計４種類を陽性抗原として使用した。また陰性対照はBSAとした。上記4種類の陽性抗原に反応性を示し、酸化処理の有無で反応性に差が少なく、陰性対照への反応が少ない培養上清を含むウェルを選定した。抗原固相ELISA法及び抗原の酸化処理は以下の手法でおこなった。【０１２７】
＜手法＞
i. PBSにて1μg/mLに希釈した陽性抗原又は陰性対照を50μlずつ96穴プレートの各ウェルに添加し、37℃で１時間インキュベーションし、陽性抗原及び陰性対照をウェル内に固相化し抗原固相プレートを作製した。
ii. 各ウェルをPBS 200 μlで2回洗浄し、最後にPBSをできるだけ除去した。iii. 酸化処理した２種の陽性抗原を作製するため、それぞれの陽性抗原を固相したウェルに、酸化処理溶液（1 M 過酸化水素、200 μM 亜硝酸ナトリウム、100μM  diethylenetriaminepentaacetic acidを含むPBS）を添加した。酸化処理を行わない２種の陽性抗原を固相したウェルにはPBSを添加した。すべてのプレートを37℃で１時間インキュベーションした。
iv. 各ウェルをPBS 200 μlで2回洗浄し、最後にPBSをできるだけ除去した。v. 一次スクリーニングのiii〜ixにしたがって各ウェルの発光強度を測定した。【０１２８】
＜二次スクリーニング結果＞
得られた各クローンが産生する抗体と、未処理リコンビナントApoA1、未処理HDL、酸化リコンビナントApoA1又は酸化HDLとの反応性を、上記３．二次スクリーニングで確認した。
結果を図１A、図１B及び図２に示す。図１A、図１B及び図２の横軸はハイブリドーマのクローン名、縦軸は発光強度である。（なお、各ハイブリドーマの上清に含まれる抗体濃度は各クローンによって異なる。）【０１２９】
図１A及び図１Bに示されるように、8E10クローンが産生する抗体は、何れの陽性抗原にも高い反応性を示した。図２に示されるように、P1A5及びP1A7を含むいくつかの抗体は未処理HDL及び酸化HDLの何れにも高い反応性を示した（なお、図２に示す各クローンと、リコンビナントApoA1及び酸化リコンビナントApoA1との反応性の確認は省略した。図２に示す各クローンは、ApoA1を抗原として樹立されたクローンであり、HDLに結合することが確認されればApoA1とも当然に結合すると考えられた為である）。これら3種の抗体について、以下の通りクローニングを実施し、さらに反応性を検討した。【０１３０】
４．クローニング
上記３．二次スクリーニングで選定したウェルの細胞を限界希釈法により播種した。その培養上清を上記３．二次スクリーニングの方法にしたがって再度スクリーニングを行い、目的の単一クローンのハイブリドーマを３種（クローン名：8E10、P1A5、及びP1A7）取得した。なお、これらのハイブリドーマのうち、8E10及びP1A5について、それぞれ識別の表示「8E10」及び「P1A5」として2017年3月8日に、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8 122号室に所在する独立行政法人製品評価技術基盤機構の微生物寄託センターに国際寄託した（識別の表示「8E10」：受託番号NITE BP-02442、識別の表示「P1A5」：受託番号NITE BP-02443）。【０１３１】
実施例２：各抗体の捕捉能
次に、実施例１でクローニングされたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体に対するBODIPY標識コレステロール取り込みHDL（標識コレステロール−HDL）捕捉性を蛍光強度で評価した。評価したモノクローナル抗体は、クローン名8E10、P1A5、及びP1A7にそれぞれ由来する抗体（以下、それぞれ8E10抗体、P1A5抗体、及びP1A7抗体と称する）の３種と、市販の抗ApoA1抗体（Anti-Apolipoprotein AI/HDL2/HDL3, Mouse-Mono(1C5)、 SANBIO BV社、製品番号MON5030；以下、1C5抗体とする）である。【０１３２】
アッセイに供するHDLは、上述のポリエチレングリコール沈殿によりヒト血清より粗精製した。ヒト血清として、高トリグリセリドの血清2種（A15、A24）及び高トリグリセリドの血清（A16、A18、A19）のプール血清（高トリグリセリドプール血清：High TG mix）と、正常血清３種（N52、N60、N103）及び正常血清（N73、N83、N93）のプール血清（正常プール血清：Normal mix）を使用した。陰性対照として、LIPIDURE （登録商標）-BL802（日油株式会社）を含むPBSを使用した。【０１３３】
以下、標識コレステロールを取り込ませる実験に使用するバッファーには、LIPIDURE（登録商標）-BL802を添加した。また、マイクロプレート等のブロッキングには、ブロッキング試薬N101（日油株式会社）を使用した。【０１３４】
１．モノクローナル抗体の標識コレステロール−HDLの捕捉能の評価
96ウェルプレート（蛍光測定用黒色プレートＨ、住友ベークライト株式会社製）の各ウェルに10μg/mLの抗体濃度に調整した実施例１で得られた３種のモノクローナル抗体（8E10抗体、P1A5抗体、P1A7抗体）又は1C5抗体をそれぞれ添加し、抗体固相プレートを作製した。HDLへの標識コレステロールの取り込みは、特許文献１、又は国際公開第2016/194825号パンフレットに記載の方法に従って行った。具体的には、HDLをBODIPY標識コレステロール（BODIPY商品名TopFluor Cholesterol、CAS No: 878557-19-8、Avanti Polar Lipids社）と混合し、37℃で２時間振盪しながらインキュベーションし標識コレステロール−HDLを含む反応液を作製した。各モノクローナル抗体を固相した96ウェルプレートに前記反応液をそれぞれ添加し、25℃で１時間振盪しながらインキュベーションした。インキュベーション終了後、反応液を除去しプレートを洗浄した。プレートの洗浄は0.01% CHAPS加PBSで行った。10 mM  メチル-β-シクロデキストリン／PBS溶液を添加し、25 ℃で１時間振盪混和した。次いで、当該プレートについて、蛍光プレートリーダー（Infinite（登録商標）200 Pro、TECAN社製）を用い、485/535 nmの励起／蛍光波長で、BODIPYの蛍光強度を測定し、プレートに固定化されたモノクローナル抗体について標識コレステロール−HDLの捕捉量を評価した。【０１３５】
２．モノクローナル抗体のHDLの捕捉能の評価
上記１．において蛍光強度を測定したプレートを使用して、モノクローナル抗体に捕捉されている標識コレステロール−HDL量をELISA法で測定した。具体的には、上記１で蛍光強度を測定した後、10 mM  メチル-β-シクロデキストリンを除去するために洗浄した。ブロッキングバッファー（StartingBlock、Thermo Scientific社）でヤギ抗ApoAI抗血清（Nアッセイ ApoAI R2試薬：ニットーボー）を1,000倍希釈して各ウェルに添加した。25℃で 1 時間振盪しながらインキュベーションした後、PBSで 3 回洗浄した。HRP標識ウサギ抗ヤギ IgG抗体1,000倍希釈して各ウェルに添加した。 25 ℃で 1 時間振盪しながらインキュベーションした後、反応液を除去し、PBSで 5回洗浄した。化学発光基質溶液（SuperSignal ELISA Pico、37069、Thermo Scientific社）を各ウェルに100μlずつ添加し、プレートを25℃にて600 rpmで２分間振盪し発光させた。マイクロプレートリーダー（Infinite（登録商標）F200 Pro、TECAN社製）で各ウェルの発光強度を測定した。【０１３６】
３．HDLの酸化処理の有無による1C5抗体の捕捉能の評価
未処理のHDLと実施例１の二次スクリーニングの欄に記載の酸化処理を行ったHDLを用いて、1C5抗体の捕捉能をELISA法で検討した。【０１３７】
４．結果
結果を図３及び図４に示す。図３Aは、1C5抗体、8E10抗体、P1A5抗体、及びP1A7抗体の標識コレステロール−HDLに対する捕捉能を示す。また図３Bは、これらの抗体のHDLに対する捕捉能を示す。また図４Aは、1C5抗体の標識コレステロール−HDLに対する捕捉能を、酸化処理HDLと酸化未処理のHDLとで比較した結果を示す。図４Bは、1C5抗体のHDLの捕捉能を、酸化処理HDLと酸化未処理のHDLとで比較した結果を示す。
図３A及び図３Bに示すように、市販抗体である1C5抗体は、標識コレステロール−HDLの蛍光強度で評価した場合、A15、及び高トリグリセリドプール血清（High TG mix）以外の血清では、陰性対照（バッファー）と同程度の蛍光強度しか得られなかった。また、ELISA法で1C5抗体の捕捉能を評価した場合であっても、血清によっては捕捉が不充分であることが確認された。しかし、図４A及び図４Bに示すように、1C5抗体の標識コレステロール−HDL及びHDLの捕捉能はHDLを酸化処理することにより改善した。
この結果から、市販の1C5抗体は、酸化修飾を受けたHDLとの結合性が高く、酸化未処理のHDLとは結合性が低いことが明らかとなった。【０１３８】
図３Aに示すように、今回作製した8E10抗体及びP1A5抗体では、1C5抗体を用いた際に蛍光シグナルが得られなかった血清においても蛍光シグナルを得ることができた。また、図３B示すように、8E10抗体及びP1A5抗体は、使用した血清すべてから標識コレステロール−HDLをELISAでも検出することができ、1C5抗体よりも検出感度が高いと考えられた。【０１３９】
一方、P1A7抗体はすべての血清において標識コレステロール−HDLの捕捉が可能であり、8E10抗体と同程度に標識コレステロール−HDLの捕捉が可能であった（図３B）、しかしながら、P1A7抗体で捕捉した標識コレステロール−HDLに由来する蛍光シグナルは8E10抗体で捕捉した場合と比較して低くなった。本実施例において抗体が捕捉しているHDLには、BODIPY標識コレステロールを取り込んだ標識コレステロール−HDLと、BODIPY標識コレステロールを取り込んでいないHDLとの両方が含まれる。このため、ELISA法では前記２つのHDLのどちらを捕捉した場合であっても発光シグナルが検出される。P1A7抗体はBODIPY標識コレステロールを取り込んでいないHDLを選択的に捕捉したためにBODIPYの蛍光シグナルが得られなかったと考えられた。【０１４０】
以上の結果から、8E10抗体及びP1A5抗体は、標識コレステロールを取り込んでいないHDLだけでなく、標識コレステロール−HDLに対しても高い結合性を示すと考えられた。【０１４１】
実施例３：モノクローナル抗体が認識する結合部位の決定
以下の方法にしたがって、8E10抗体、P1-A5抗体、P1-A7抗体、及び1C5抗体の結合部位を決定した。
配列番号１で示される全長型ヒトApoA1リコンビナントタンパク（大腸菌由来）のアミノ酸配列に含まれる各種の部分配列にHisタグ配列を付加したペプチドを作製し、このペプチドを抗原として、以下に示す抗原固相ELISA法により抗体と抗原の結合の有無を観察した。部分配列を有するペプチドとして、配列番号１で示されるアミノ酸配列の2〜60番目、51〜110番目、101〜160番目、151〜210番目、及び201〜267番目のアミノ酸配列からなるペプチドの計5種を使用した。【０１４２】
＜手法＞
i. 96ウェルプレートの各ウェルに、1  ng/mLに調整した上記ペプチドをそれぞれ添加した。
ii.各ウェルを洗浄後、2%BSA加PBSでブロッキングした。
iii. 2%BSA加PBSで10倍希釈した8E10、P1A5、及びP1A7のハイブリドーマ培養上清、並びに2%BSA加PBSで１μg/mLに調製した1C5抗体をそれぞれ各ウェルに50μlずつ添加した。25 ℃で1時間インキュベーションした後、各ウェルを洗浄した。10,000倍希釈したHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体を1,000倍希釈して各ウェルに添加し、25 ℃で1時間インキュベーションした。各ウェルを洗浄後、実施例２と同様に、発光基質を添加し、マイクロプレートリーダーを用いて発光強度を測定した。【０１４３】
図５に示すように、8E10抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の51〜110番目からなるペプチドに結合し、その他のアミノ酸配列（2〜60番目、101〜160番目、151〜210番目、201〜267番目）からなるペプチドには結合しなかった。P1A5抗体は、前記アミノ酸配列の201〜267番目からなるペプチドに結合し、その他のアミノ酸配列（2〜60番目、51〜110番目、101〜160番目、151〜210番目）からなるペプチドには結合しなかった。P1A7抗体及び1C5抗体は、前記8E10抗体及びP1A5抗体が結合しなかった前記アミノ酸配列の101〜160番目からなるペプチドのみに結合した。【０１４４】
さらに、8E10抗体の結合部位をより詳細に検討するため、配列番号１で示されるアミノ酸配列の51〜110番目の範囲内に含まれる部分配列にHisタグ配列を付加したペプチドを作製し、このペプチドを抗原として、抗原固相ELISA法により抗体と抗原の結合の有無を観察した。これらの部分配列を有するペプチドとして、配列番号１で示されるアミノ酸配列の、51〜70番目、64〜83番目、77〜96番目、及び91〜110番目からなるペプチドの計5種を選択した。抗原固相ELISA法は、8E10抗体のみを用いた点を除き上記実施例３の＜手法＞i〜iiiにしたがった。また、8E10抗体にかえて、抗Hisタグ抗体を用いて同様に、上記ペプチドに対する結合有無の評価を行った。【０１４５】
図６に示すように、8E10抗体は配列番号１で示されるアミノ酸配列の91〜110番目からなるペプチドと強い結合性を示した。また抗Hisタグ抗体は、前記アミノ酸配列の91〜110番目からなるペプチドと強く結合すると共に、前記アミノ酸配列の77〜96番目からなるペプチドとも結合した。このことから、8E10抗体の結合部位は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の91〜110番目の範囲に含まれていると考えられた。また図６から、8E10抗体の結合部位は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の51〜70番目の範囲、64〜83番目の範囲、及び77〜96番目の範囲には含まれていないことがわかる。【０１４６】
実施例４．高比重リポタンパク質量を定量するための抗体の組み合わせの検討
高比重リポタンパク質（HDL）量をELISA法により定量するために最適な補足抗体と検出抗体の組み合わせを見つけるため、自社の全自動免疫測定装置HISCLを使って、P1A5抗体、8E10抗体、及びポリクローナル抗体（実施例２で使用したヤギ抗ApoAI抗血清）を捕捉抗体及び検出抗体として使用してELISA測定システムを構築し、結果の精度を比較した。【０１４７】
＜ELISA測定システムの構築＞
i. 各抗体について、捕捉抗体として用いる抗体には、公知の方法にしたがってビオチン標識を行った。検出抗体として使用する抗体には公知の方法にしたがってアルカリフォスファターゼ（ALP）を標識した。
i i. HISCL磁性ビーズのバッファーを除去し、除去したバッファーと同量の0.1%  pluronic F68含有PBSで３回洗浄した。
i ii. 0.1%  pluronic F68含有PBSで３回洗浄済みのHISCL磁性ビーズとビオチン標識捕捉抗体を反応させ、捕捉抗体固相HISCL磁性ビーズをそれぞれの抗体について調製した。捕捉抗体固相HISCL磁性ビーズは、0.1%  pluronic F68含有PBSで3回洗浄した後、同バッファーに懸濁した（HISCLのR2試薬として使用）。
iv. 検体から特許文献１に記載のポリエチレングリコール法にしたがってそれぞれHDL画分を得た（以下、「サンプル」という）。
v. HISCLのR１試薬として、1 mM  シクロデキストリン、 0.1% pluronic F68、 ×200 Liposome 、1/1000 LIPIDURE （登録商標）-BL802+ 2% Glycerolを含むPBSを準備した。
vi. HISCLのR3バッファーに、各検出用抗体と、アルカリホスファターゼ標識検出抗体を加えたR3試薬を準備した。
vii. HISCLに各試薬とサンプルをセットし、以下のプロトコールにしたがって、１５サンプルから各１回分注して（検体番号No. 1〜15）それぞれHDLの定量を行った：
［R1試薬90μlとサンプル10μlを混合］→［42℃, 742sec］→［R2試薬30μl添加］→［42℃, 742sec］→［B/F分離］→［42℃, 568sec］→［B/F分離］→［R4試薬50μl、［R5試薬100μl添加］→［42℃, 305sec］→発光強度検出。
捕捉抗体と検出抗体の組み合わせは表１に示す。
【表１】
2018181935.tif 000014
【０１４８】
＜結果＞
定量結果、平均値（Average）、標準偏差（SD）、分散（CV%）を表１に示す。【０１４９】
捕捉抗体としてP1A5抗体又は8E10抗体を用い、検出抗体としてポリクローナル抗体を使用した系では、CVがそれぞれ62％、99％となり、測定間のばらつきが大きく測定結果が安定しないことが明らかとなった。これに対して、捕捉抗体としてP1A5抗体を用い、検出抗体として8E10抗体を用いた場合のCVは17％となり、測定間のばらつきが小さいことが明らかとなった。捕捉抗体として8E10抗体を用い、検出抗体として8E10抗体又はP1A5抗体を用いた場合のCVは、それぞれ11％、13％となり、測定間のばらつきが小さいことが明らかとなった。【０１５０】
以上の結果から、HDLの定量を行う場合には、捕捉抗体及び検出抗体に8E10抗体及び／又はP1A5抗体を用いることが好ましいと考えられた。
【符号の説明】
【０１５１】
１０ａ  高比重リポタンパク質の機能評価用試薬キット
１１ａ  モノクローナル又は抗原結合フラグメントを収容した容器
１２ａ  標識コレステロールを収容した容器
１３ａ  溶媒を収容した容器
１４ａ  取扱説明書あるいは取扱説明書を閲覧できるＵＲＬを記載した用紙
１５ａ  上記容器を納めた箱
１０ｂ  高比重リポタンパク質の定量用試薬キット
１１ｂ  モノクローナル又は抗原結合フラグメントを収容した容器
１２ｂ  コレステロールに結合した標識物質を検出するための捕捉抗体を収容した容器
１３ｂ  溶媒を収容した容器
１４ｂ  取扱説明書あるいは取扱説明書を閲覧できるＵＲＬを記載した用紙
１５ｂ  上記容器を納めた箱
【図１】
2018181935.tif 000019
【図２】
2018181935.tif 000020
【図３】
2018181935.tif 000021
【図４】
2018181935.tif 000022
【図５】
2018181935.tif 000023
【図６】
2018181935.tif 000024
【図７】
2018181935.tif 000025
【図８】
2018181935.tif 000026
【配列表】
2018181935000001.app
【国際調査報告】
2018181935.tif 000027
2018181935.tif 000028
2018181935.tif 000029
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