(57)【要約】  植物用抵抗性誘導作用を有する成分を有する成分を提供すること。  緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤；緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、植物用抵抗性誘導剤；緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、植物病害予防・改善剤；緑色の光合成色素を有する単細胞藻類を、好気的条件下において培養して、細胞外多糖体を含む培養物を得る、植物用抵抗性誘導成分の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤。
【請求項２】
前記藻類が、Trebouxiophyceae（トレボキシア藻綱）藻類及び／又はChlorophyceae（緑藻綱）藻類である、請求項１記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
【請求項３】
前記藻類が、ジェミネラ、ウロネマ、クロロコッカム及びクロロイディウムから選択される１種又は２種以上である、請求項１又は２記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
【請求項４】
前記培養物中の細胞外多糖体が、ウロン酸を少なくとも含むものである、請求項１〜３のいずれか記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
【請求項５】
前記培養物中の細胞外多糖体が、ウロン酸５〜４０質量％と中性単糖とを少なくとも含み、当該中性単糖がマンノース、ガラクトース及びラムノースから選択される１種又は２種以上のものである、請求項１〜４のいずれか記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
【請求項６】
前記藻体が、［１］Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)藻株；［２］Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)藻株；［３］Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株；［４］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA (NBRC 113207)藻株；［５］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)藻株から選択される１種又は２種以上のものである、請求項１〜５のいずれか記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
【請求項７】
緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、植物用抵抗性誘導剤。
【請求項８】
緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、植物病害予防・改善剤。
【請求項９】
緑色の光合成色素を有する単細胞藻類を、好気的条件下で培養をし、細胞外多糖体を含む培養物を得る、植物用抵抗性誘導成分の製造方法。
【請求項１０】
植物用抵抗性誘導成分を製造するための、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤、植物用抵抗性誘導剤、及び植物病害予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
農作物及び園芸用植物等の農業関連分野において、病原菌による病害を低減し、生育又は収穫を向上させるために、農薬が多用されている。しかし、農薬使用による被爆、環境負荷及び残留の懸念から、農薬の使用量の低減が求められている。
また、近年では、遺伝子組換えによる害虫抵抗性(Bt)と除草剤耐性の品種も普及しつつあるが、このような品種は限定的な品種に限られている。また、遺伝子組換えでない農作物や園芸用植物等が好まれる傾向にある。【０００３】
このような要請に応える農薬を得るために植物用抵抗性誘導剤の開発が進められている。植物用抵抗性誘導作用は、病原体を死滅させる作用ではなく、植物が本来有する防御機構を活性化させる作用である。この活性化により植物自体が病原体を退けることができる。この植物用抵抗性誘導作用を有する化合物は、殺虫・殺菌活性に頼らないため、耐性菌の出現率が低い、使用量が少量でよい、効果が持続する、防除目的以外の生物に対する影響がない等の利点があると一般的に云われている。また、この植物用抵抗性誘導化合物は、品種改良や遺伝子組換え作物とは異なり、必要なときに必要な場所で必要な植物（例えば、農作物、園芸用植物等）に使用でき、汎用性も高いという利点があると一般的に云われている。【０００４】
植物用抵抗性誘導化合物として、サリチル酸、プロベナゾール、バリダマイシンＡ等が知られており、これら化合物は既に実用化され、植物用抵抗性誘導剤として市場で流通されている。この植物用抵抗性誘導剤を使用した植物は、植物の全身獲得抵抗病原体の攻撃を感知すると、植物体中のサリチル酸濃度を高め、次いで転写制御因子であるＮＰＲ１を介してＰＲ遺伝子群を発現し、病原体に対する抵抗性が高まると一般的に云われている。すなわち、植物用抵抗性誘導剤が、植物体のＰＲ遺伝子群のスイッチをオンにし、病原体に対する抵抗性を植物体全体に獲得させている。【０００５】
また、新たな植物用抵抗性誘導剤を探索するために、ＳＡＲモデルに基づいて、ＰＲ−1α遺伝子の発現モニタリング系を利用したスクリーニング方法の開発が進められている。
例えば、特許文献１には、ハロゲン及びオキソ基を有する複素環系化合物等にＰＲ−１α遺伝子の発現増強作用があることを見出したこと、この発現増強作用により広い抗菌スペクトルを有するＰＲタンパク質の発現が誘導又は促進できること及び植物用抵抗性誘導ができることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−１２４２４１号公報
【特許文献２】特開２０１７−１９７４５６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1α Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System, Biosci. Biotechnol. Biochem., 75(9), 1796-1800 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、植物用抵抗性誘導剤の研究開発の知見はいまだ十分とは云えない。このため、植物用抵抗性誘導作用を有する成分について種々検討がなされている。このような成分は、植物の抵抗性を高める方向に誘導するための成分であるので、植物の生育阻害等を引き起こすデメリットが少ないと本発明者らは考えた。
そこで、本技術は、植物用抵抗性誘導作用を有する成分を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そして、本発明者らは、ＰＲ−１α遺伝子発現誘導活性試験を用いて、植物用抵抗性誘導に関与するＰＲ１遺伝子発現誘導活性作用を有する化合物を見出した。
本発明者らは、鋭意検討した結果、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物であり、当該培養物には細胞外多糖体が含まれていること、当該培養物が、ＰＲ−１α遺伝子発現誘導活性作用及び植物用抵抗性誘導作用を有することを見出し、本発明を完成させた。本発明は以下のとおりである。【００１０】
（１）  緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤。
（２）  前記藻類が、Trebouxiophyceae（トレボキシア藻綱）藻類及び／又はChlorophyceae（緑藻綱）藻類である、前記〔１〕記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
（３）  前記藻類が、ジェミネラ、ウロネマ、クロロコッカム及びクロロイディウムから選択される１種又は２種以上である、前記（１）又は（２）記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
（４）  前記培養物中の細胞外多糖体が、ウロン酸を少なくとも含むものである、前記（１）〜（３）のいずれか記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
（５）  前記培養物中の細胞外多糖体が、ウロン酸５〜４０質量％と中性単糖とを少なくとも含み、当該中性単糖がマンノース、ガラクトース及びラムノースから選択される１種又は２種以上のものである、前記（１）〜（４）のいずれか記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
（６）  前記藻体が、［１］Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)藻株；［２］Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)藻株；［３］Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株；［４］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA (NBRC 113207)藻株；［５］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)藻株から選択される１種又は２種以上のものである、前記（１）〜（５）のいずれか記載のＰＲ１遺伝子活性化剤。
（７）  緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、植物用抵抗性誘導剤。
（８）  緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、植物病害予防・改善剤。
（９）  緑色の光合成色素を有する単細胞藻類を、好気的条件下で培養をし、細胞外多糖体を含む培養物を得る、植物用抵抗性誘導成分の製造方法。
（１０）  植物用抵抗性誘導成分を製造するための、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の使用。
【発明の効果】
【００１１】
本技術によれば、植物用抵抗性誘導作用を有する成分を提供することができる。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各藻類の培養物、ラミナリン（ポジティブコントロール）、コントロール（Ｈ２Ｏ）の活性強度の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
次に、本技術の好ましい実施形態について説明する。ただし、本技術は以下の好ましい実施形態に限定されず、本技術の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１４】
１．緑色藻類の培養物及びこの製造方法
本技術は、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤、植物用抵抗性誘導剤、又は植物病害予防剤である。
本技術の培養物は、後述するように、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性作用、植物用抵抗性誘導作用、又は植物病害予防作用を有するものである。当該培養物には、細胞外産生の多糖体が含まれることが好適である。
【００１５】
本技術の緑色の光合成色素を有する単細胞藻類（以下、「緑色単細胞藻類」ともいう）の培養物は、当該緑色藻類を用いて以下のようにして製造することができるが、この製造方法に限定されることはない。
【００１６】
本明細書における「緑色の光合成色素を有する藻類」は、外観上緑色を有する藻類という広義の意味であり、光合成色素として、クロロフィルａ及びｂを含むものであるが、これ以外のクロロフィルや色素を有していてもよい。また、当該単細胞藻類は、単細胞の状態に限定されず、培養中に群生体の状態になってもよい。
【００１７】
本技術で使用される緑色単細胞藻類は、特に限定されず、例えば、Chlorophyceae（緑藻綱）藻類及び／又はTrebouxiophyceae（トレボキシア藻綱）藻類等が挙げられる。
また、本技術で使用される緑色単細胞藻類は、特に限定されず、例えば、ユーグレナ、クロレラ、ウロネマ、クロロコッカム、ジェミネラ及びクロロイディウムから選択される１種又は２種以上である。このうち、ジェミネラ、ウロネマ、クロロコッカム及びクロロイディウムから選択される１種又は２種以上のものが好ましい。また、これら各種藻株は、市販の製品に含まれる藻株、微生物保存機関でカルチャー・コレクション（例えば、ＮＢＲＣ（NITE Biological Resource Center） Culture Collection、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）等）として保存されている藻株、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関（例えば、NITE (National Institute of Technology and Evaluation)等）で受託株として保存されている藻株、将来見出される藻株等が挙げられ、本技術の目的とする効果であるＰＲ１遺伝子活性化作用を奏する培養物を産生する藻株を選択することができる。
【００１８】
例えば、ＮＢＲＣ（NITE Biological Resource Center）のカルチャー・コレクションより、以下の〜［１］〜［５］の藻株を入手でき、これらから１種又は２種以上のものを使用できる。
［１］Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)藻株は、NBRC 113204 Uronema sp.（http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113204）／公開2018/03/29；
［２］Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)藻株は、NBRC 113205 Geminella sp.（http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113205）／公開2018/03/29；
［３］Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株は、NBRC 113206 Chlorococcum sp.（http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113206）／公開2018/03/29；
［４］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA (NBRC 113207) （YAMA-Mizu-03-3）藻株は、NBRC 113207 Chloroidium saccharophilum（http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113207）／公開2018/03/29；
［５］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)（KAMI-04（3））藻株は、NBRC 113807 Chloroidium saccharophilum（http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113807）／公開2019/02/25。
なお、ＮＢＲＣ（NITE Biological Resource Center）のホームページアドレスは、２０１９年３月に、「http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT==00******（*はNBRC No.です）から、「https://www.nite.go.jp/nbrc/catalogue/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00******」に変更される。
【００１９】
前記Chlorophyceae（緑藻綱）藻類として、例えば、Chlorophyceae Uronema（ウロネマ）藻類、Chlorophyceae Chlorococcum（クロロコッカム）藻類等が挙げられる。
前記Trebouxiophyceae（トレボキシア藻綱）藻類として、例えば、Trebouxiophyceae Geminella（ジェミネラ）藻類、Trebouxiophyceae Chloroidium（クロロイディウム）藻類等が挙げられる。
【００２０】
クロロイディウムとして、本技術の効能を良好に発揮し得る観点から、クロロイディウム属（Chloroidium）藻が好ましい。クロロイディウムとして、Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum （NBRC 113207）等が好ましい。
【００２１】
ユーグレナとして、本技術の効能を良好に発揮し得る観点から、ユーグレナ属（Euglena）藻が好ましい。ユーグレナとして、例えばユーグレナ・グラシリス等が好ましい。
【００２２】
クロレラとして、本技術の効能を良好に発揮し得る観点から、クロレラ属（Chlorella）藻が好ましい。クロレラとして、例えば、クロレラ・ブルガリス等が挙げられ、さらに、Chlorella vulgaris Chikugo株（チクゴ株：クロレラ工業）等が好ましい。
【００２３】
ウロネマとして、本技術の効能を良好に発揮し得る観点から、ウロネマ属（Uronema）藻が好ましい。ウロネマとして、Chlorophyceae Uronema sp.（NBRC 113204）等が好ましい。
【００２４】
クロロコッカムとして、本技術の効能を良好に発揮し得る観点から、クロロコッカム（Chlorococcum）藻が好ましい。クロロコッカムとして、Chlorophyceae Chlorococcum sp.(NBRC 113206)等が好ましい。
【００２５】
ジェミネラとして、本技術の効能を良好に発揮し得る観点から、ジェミネラ属（Geminella）藻が好ましい。ジェミネラとして、Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)等が好ましい。
【００２６】
クロロイディウムとして、本技術の効能を良好に発揮し得る観点から、クロロイディウム属（Chloroidium）藻が好ましい。クロロイディウムとして、Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA (NBRC 113207)（YAMA-Mizu-03-3）（以下、YAMAともいう）及び／又はTrebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)(KAMI-04-(3))（以下、KAMIともいう）等が好ましく、より好ましくは、生産性の観点から、Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)である。
【００２７】
本技術において、上述した藻株と実質的に同質の藻株であればよい。実質的に同質の藻株とは、その１８ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１〜５）が、それぞれ９９．５％以上（好適には９９．８％以上、さらに好適には１００％）一致し、、かつ好ましくは上述した藻株と同一の藻類学的性質（形態観察及び細胞外多糖体産生）を有する。さらに本技術の藻株は、本技術の効果（特にＰＲ１遺伝子活性化作用成分の産生能）が損なわれない限り、上述した藻株又はそれと実質的に同質の藻株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された藻株であってもよい。
【００２８】
本技術の緑色単細胞藻類を培養して培養物を製造させる際に用いる培地として、一般的な単細胞藻類が培養可能な基礎培地が好適である。
一般的な単細胞藻類が培養可能な基礎培地中には、例えば、無機塩としてＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４等の微量無機成分が挙げられ、窒素源として硫酸アンモニウム、尿素等が含まれている。当該基礎培地中の各成分の含有量は±１０％の範囲であることが好ましい。
前記基礎培地として、より具体的には、例えば、後記〔実施例〕に示すような、ＡＦ６培地、ＢＧ１１培地、ＫＯ２培地等が挙げられる。このうち、ＡＦ６培地を使用する場合、クロレラ、クロロコッカム、ジェミネラ、クロロイディウム、ユーグレナ等が好適である。ＢＧ１１培地を使用する場合、ウロネマ、クロロイディウム等が好適である。ＫＯ２培地の場合、ユーグレナ等が好適である。
【００２９】
本技術の培養物を製造するための培養に際し、好気的な条件下で培養することが、上記多糖体を含む培養物を安定的に生産させることができるので好適である。通気培養することが、多糖体の生産性を向上させる点で、好ましい。通気手段として、例えば、撹拌、振盪、通気及びバブリング等が挙げられる。これらを単独で又は２種以上組み合わせて行うことが可能である。これにより、培養培地中に適度な気体が混合されるようになる。
【００３０】
培養温度は、特に限定されないが、５〜４０℃の常温程度であればよい。
また、培養培地中のｐＨ（２０℃）は、使用する培地組成のｐＨの±２が好ましく、より好ましくはｐＨ±１である。また、培養培地中のｐＨは、好ましくは１．５〜９．５である。培養培地中のｐＨは、ウロネマ、クロロコッカム、ジェミネラ、クロロイディウム及びクロレラの場合、より好ましくは６〜９である。
培養期間は、特に限定されないが、４日〜３週間程度を１サイクルとするのが、多糖体を産出させるのに好適である。より好ましくは、７日〜２週間程度であればよい。
培養の照度は、特に限定されないが、多糖体を含む培養物を得やすい観点から、１５００〜１００００ｌｕｘが好適である。
また、独立栄養培養条件下にて藻体数を多くする場合、太陽光；植物栽培用ランプ、ＬＥＤ等の人工光源等の光を用いることが可能であり、炭酸ガスの補給と撹拌をすることが好ましい。
【００３１】
なお、本技術の緑色単細胞藻類（好適には、クロレラ、クロロコッカム、ジェミネラ、ユーグレナ、ウロネマ、クロロイディウム）を用いて多糖体を含む培養物を産生させる場合、独立栄養培養が可能であり、このことは本技術の利点でもある。
また、本技術は独立栄養培養での培養物の生産方法に限定されず、一般的な単細胞藻類が培養可能な基礎培地に、グルコース等の炭素源を含有させて、多糖体を含む培養物を産生させもよい。また、培地は炭素源、窒素源、リンが含まれていればよく、本技術に用いる培地として下水やメタン発酵槽で生じる消化液（液肥）を用いてもよい。
【００３２】
また、本技術の培養物の生産方法は、バッチ式、連続式の何れでもよいが、連続式が生産性向上のため好ましい。また、開放系培養及び閉鎖系培養の何れでもよく、例えば、培養タンク内の密閉培養及び開放系の露天培養等が挙げられる。培養条件管理の点で、閉鎖系培養が好ましい。
【００３３】
本技術の培養物を前記単細胞緑藻類に産生させた後に、水溶液洗浄、超音波、遠心分離、ろ過等の物理的手段及び化学的手段にて、藻体から多糖体を含む培養物を分離し、多糖体が含まれる上清液を得るのが好適である。
本技術では、藻体外の代謝産物が、本技術の効果に何らか寄与していると推測されるため、当該培養物には、多糖体以外に、種々の藻類の代謝産物（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、有機酸、脂質等）が種々含まれていてもよい。
また、本技術の培養物として、藻体外の代謝産物を使用することができるので、培養後の藻体表面から多糖体を分離しながら、連続的に培養物を得ることが可能であり、連続培養できる観点で本技術の藻類は優れているといえる。連続的に培養物を得る方法として、例えば、遠心分離（好適には、５０００〜９０００ｒｐｍ、５分間程度）及びろ過（例えば、濾過助剤及びろ過フィルター等）を単独で又は組み合わせて用いることができる。
得られた培養物は、希釈液、濃縮液又は乾燥物等の状態に適宜調整してもよい。乾燥手段として凍結乾燥が好ましい。
【００３４】
本技術の培養物には、少なくとも多糖体が含まれることが好適であり、当該多糖体に、糖質以外の物質（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸、有機酸、脂質等）が本技術の効果を損なわない範囲において結合していてもよく、このような多糖体として、例えば、糖タンパク質、ペプチドグリカン、糖脂質等が挙げられる。
【００３５】
本技術の多糖体の収量は、培養液中に、２０ｍｇ／Ｌ以上得ることができ、より好適には５０ｍｇ／Ｌ以上、さらに好適には１００ｍｇ／Ｌ以上である。本技術は３００〜５００ｍｇ／Ｌまで収量を高めることが可能である。
多糖体の生産性が高い藻類として、クロロコッカム及びクロロイディウムが好適である。また、効能の高い多糖体を生産する藻類として、クロロコッカム及びウロネマが好適である。
【００３６】
本技術において、藻類の培養物中に多糖体が、乾燥物換算で２０質量％以上含まれることが好ましく、中性単糖が２０質量％以上含まれることがより好ましい。
また、藻類の培養物中の多糖体は、ウロン酸が好適には５質量％以上、より好適には１０質量％以上含まれることが好ましく、その上限値として好適には４０質量％以下、より好適には３５質量％以下、さらに好適には３０質量％以下、よりさらに好適には２５質量％以下含まれることが好ましく、当該数値範囲として５〜３０質量％含まれることがより好ましい。当該多糖体は、細胞外多糖体が、回収容易等の高い生産効率及び高い収量が望めるので、より好ましい。
【００３７】
本技術の緑色単細胞藻類（好適には、Chlorophyceae藻類及び／又はTrebouxiophyceae藻類）が産生する多糖体は、特に限定されないが、本技術の多糖体の構成単糖として少なくともウロン酸を含むことが望ましく、当該ウロン酸はグルクロン酸が好ましいがこれに限定されない。これにより、後述するＰＲ１遺伝子活性化等の本技術の効能を期待できる。
また、本技術の多糖体に含まれる中性単糖として六単糖（好適にはアルドヘキソース）を含むことが好適である。当該中性単糖として、より具体的には、マンノース、ガラクトース及びラムノースのいずれか１又は２以上を少なくとも主な構成単糖とすることが、本技術の効能の観点から、望ましい。さらに、当該中性単糖のうち、少なくともマンノース又はラムノースを含むことが、本技術の効能の観点から望ましい。
【００３８】
本技術の培養物中の細胞外多糖体は、ウロン酸を少なくとも含むことが好適であり、さらに、ウロン酸及び中性単糖を本技術の多糖体の構成単糖として本技術の多糖体に含まれることがより望ましい。これにより、後述するＰＲ１遺伝子活性化等の本技術の効能を期待できる。このときの中性単糖は、マンノース、ガラクトース及びラムノースから選択される１種又は２種以上のものがよりさらに好適である。
さらに、上述した、ウロネマ、クロロコッカム、ジェミネラ及びクロロイディウムから選択される１種又は２種以上である藻類が生産する培養物に含まれる多糖体が、本技術の良好な効能を奏する観点から、好ましい。
【００３９】
前記ウロネマの産生する多糖体の収量として、培養液中に、２０ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
ウロネマ産生物中の細胞外多糖体（以下、「ウロネマ多糖体」ともいう）は、ウロン酸が含まれることが好適であり、その下限値として好ましくは５質量％以上であり、より好ましくは１０質量％以上、さらに好ましくは１５質量％以上であり、また、その上限値として好ましくは３５質量％以下であり、より好ましくは３０質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは１０〜３０質量％である。当該ウロネマ多糖体に、グルクロン酸が含まれることがより好適であり、下限値として好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、また、上限値として好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは５〜１５質量％、さらに好ましくは１０〜１５質量％含まれることが好適である。
【００４０】
ウロネマ産生物中の多糖体は、中性単糖として好適には２０質量％以上含まれ、その他成分として好適には７０質量％以下が含まれるものである。
さらに好ましくは、ウロネマの培養物中に、マンノース０〜４質量％、アラビノース０〜１．５質量％、ガラクトース０〜１．５質量％、キシロース０〜２質量％、グルコース０〜６質量％、ラムノース５〜２０質量％（より好適には５〜１５質量％）、リボース０〜１質量％、フコース０〜１質量％であり、またウロン酸が１５〜３０質量％である。これらからいずれか又は複数を組み合わせでもよい。
【００４１】
ウロネマ産生物中の細胞外多糖体は、中性糖のうちで、マンノース及び／又はラムノースを少なくとも含むことが好適であり、さらにラムノースを主な成分とすることが好ましい。
ウロネマ多糖体中の中性糖の主な構成単糖比は、マンノース（Ｍａｎ）：ラムノース（Ｒｈａ）：グルコース（Ｇｌｃ）＝１〜１０：５〜２０：１〜１０が好ましく、Ｍａｎ：Ｒｈａ：Ｇｌｃ＝０〜１：１〜３：０〜１がより好ましい。また、ウロネマ多糖体中の中性糖の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ｒｈａ＝１〜１／３：１がより好ましい。
また、ウロネマ多糖体中の主な構成単糖比は、ラムノース（Ｒｈａ）：ウロン酸（ＵＡ）＝１〜４：１〜６が好ましく、Ｒｈａ：ＵＡ＝１〜２：１〜３がより好ましい。
【００４２】
前記クロロコッカムの産生する多糖体の収量として、培養液中に、５０ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
クロロコッカム産生物中の細胞外多糖体（以下、「クロロコッカム多糖体」ともいう）は、ウロン酸が含まれることが好適であり、その下限値として好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、また、その上限値として好ましくは２５質量％以下、より好ましくは２０質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは１０〜２０質量％である。当該クロロコッカム多糖体に、グルクロン酸が含まれることがより好適であり、下限値として好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、また、上限値として好ましくは２５質量％以下、より好ましくは２０質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは１０〜２０質量％含まれることが好適である。
【００４３】
クロロコッカム産生物中の多糖体は、中性単糖として好適には６０質量％（より好適には７０質量％）以上含まれ、その他成分として好適には３０質量％以下が含まれるものである。
さらに好ましくは、クロロコッカムの培養物中に、マンノース１０〜３０質量％（より好適には１４〜２５質量％）、アラビノース１０〜３０質量％（より好適には２０〜３０質量％）、ガラクトース１０〜３０質量％（より好適には１７〜３０質量％）、キシロース０〜５質量％、グルコース０〜１質量％、ラムノース０〜２質量％、リボース０〜１質量％、フコース０〜１質量％であり、またウロン酸は、１０〜２０質量％である。これらからいずれか又は複数を組み合わせでもよい。
【００４４】
クロロコッカム産生物中の細胞外多糖体は、中性糖のうちで、マンノース、アラビノース、及びガラクトースを含むことが好適であり、さらにマンノース、アラビノース、及びガラクトースを主な成分とすることが好ましい。
クロロコッカム多糖体中の中性糖の主な構成単糖比は、マンノース（Ｍａｎ）：アラビノース（Ａｒａ）：ガラクトース（Ｇａｌ）＝１〜３：１〜３：１〜３が好ましく、Ｍａｎ：Ａｒａ：Ｇａｌ＝１〜２：１〜２：１〜２がより好ましい。また、クロロコッカム多糖体中の中性糖の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ａｒａ：Ｇａｌ＝１：１〜２：１〜２がより好ましい。
また、クロロコッカム多糖体中の主な構成単糖比は、マンノース（Ｍａｎ）：アラビノース（Ａｒａ）：ガラクトース（Ｇａｌ）：ウロン酸（ＵＡ）＝１〜３：１〜３：１〜３：１〜３が好ましく、Ｍａｎ：Ａｒａ：Ｇａｌ：ＵＡ＝１〜２：１〜２：１〜２：１〜２がより好ましい。
【００４５】
前記ジェミネラの産生する多糖体の収量として、培養液中に、２０ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
ジェミネラ産生物中の細胞外多糖体（以下、「ジェミネラ多糖体」ともいう）は、ウロン酸が含まれることが好適であり、その下限値として好ましくは５質量％以上であり、その上限値として好ましくは２０質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは５〜１５質量％である。当該ジェミネラ多糖体に、グルクロン酸が含まれることがより好適であり、下限値として好ましくは５質量％以上であり、また、上限値として好ましくは２０質量％以下、より好ましくは１５質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは５〜１５質量％含まれることが好適である。
ジェミネラ産生物中の多糖体は、中性単糖として好適には３５質量％（より好適には４０質量％）以上含まれ、その他成分として好適には６０質量％以下が含まれるものである。
【００４６】
さらに好ましくは、ジェミネラの培養物中に、マンノース０〜３０質量％（好適には９〜２５質量％）、アラビノース０〜８質量％、ガラクトース３〜２０質量％、キシロース０〜３量％、グルコース０〜１質量％、ラムノース２〜２０質量％、リボース０〜１質量％、フコース０〜４質量％であり、また、ウロン酸は５〜１５質量％である。これらからいずれか又は複数を組み合わせでもよい。
ジェミネラ産生物中の細胞外多糖体は、中性糖のうちでマンノース、ガラクトース及びラムノースを主な成分とすることが好ましい。
ジェミネラ多糖体中の中性糖の主な構成単糖比は、マンノース（Ｍａｎ）：アラビノース（Ａｒａ）：ガラクトース（Ｇａｌ）：ラムノース（Ｒｈａ）＝１〜６：０〜１：１〜３：１〜３が好ましく、Ｍａｎ：Ｇａｌ：Ｒｈａ＝１〜６：１〜２：１〜２がより好ましい。また、ジェミネラ多糖体中の中性糖の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ｇａｌ：Ｒｈａ＝１：０〜２／５：０〜３／１０が好ましく、実質的にＭａｎからなることがより好ましい。
ジェミネラ多糖体中の主な構成単糖比は、マンノース（Ｍａｎ）：ガラクトース（Ｇａｌ）：ラムノース（Ｒｈａ）：ウロン酸（ＵＡ）＝１〜６：０〜１：１〜３：１〜３：１〜４が好ましく、Ｍａｎ：ＵＡ＝１〜２：１〜２がより好ましい。
【００４７】
前記クロロイディウムの産生する多糖体の収量として、培養液中に、２５０ｍｇ／Ｌ以上が好ましい。
クロロイディウム産生物中の細胞外多糖体（以下、「クロロイディウム多糖体」ともいう）は、ウロン酸が含まれることが好適であり、その下限値として好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、また、その上限値として、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは２５質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは１０〜２５質量％である。当該クロロイディウム多糖体にグルクロン酸が含まれることがより好適であり、下限値として好ましくは５質量％以上、より好ましくは１０質量％以上であり、また上限値として好ましくは２５質量％以下、より好ましくは２０質量％以下であり、当該数値範囲として、より好ましくは５〜１５質量％、さらに好ましくは１０〜１５質量％含まれることが好適である。
【００４８】
クロロイディウム産生多糖体は、中性単糖として好適には３０質量％（より好適には３４質量％）以上含まれ、その他成分として好適には７０質量％以下が含まれるものである。
さらに好ましくは、クロロイディウムの培養物中に、マンノース３〜１８質量％、アラビノース３〜１２質量％、ガラクトース０〜２０質量％（より好適には５〜１５質量％）、キシロース０〜９質量％、グルコース０〜５質量％、ラムノース０〜５質量％、リボース０〜１質量％、フコース０〜１質量％であり、ウロン酸１０〜３０質量％（より好適には１５〜２５質量％）である。これらからいずれか又は複数を組み合わせでもよい。
【００４９】
クロロイディウム産生物中の細胞外多糖体は、中性糖のうちでマンノース、アラビノース、ガラクトース、グルコース及びキシロースを主な成分とすることが好ましい。
クロロイディウム多糖体の中性糖の主な構成単糖比は、マンノース（Ｍａｎ）：アラビノース（Ａｒａ）：ガラクトース（Ｇａｌ）：グルコース（Ｇｌｃ）：キシロース（Ｘｙｌ）＝１〜２：１〜２：１〜３：０〜１：０〜１が好ましい。
【００５０】
クロロイディウム多糖体の主な構成単糖比は、マンノース（Ｍａｎ）：アラビノース（Ａｒａ）：ガラクトース（Ｇａｌ）：キシロース（Ｘｙｌ）：グルコース（Ｇｌｃ）：ウロン酸（ＵＡ）＝１〜２：０〜２：１〜３：０〜１：０〜１：１〜４が好ましい。さらに、クロロイディウム多糖体の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ａｒａ：Ｇａｌ：Ｘｙｌ：ＵＡ＝１〜２：０〜１：１〜２：０〜１：１〜３がより好ましい。
【００５１】
クロロイディウムＫＡＭＩ藻体の多糖体（以下、「クロロイディウムＫＡＭＩ多糖体」ともいう）の中性糖の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ａｒａ：Ｇａｌ：Ｘｙｌ：Ｒｈａ＝１〜２：１〜２：１〜２：１〜２：０〜１が、さらにより好ましい。
また、クロロイディウムＫＡＭＩ多糖体中のウロン酸は好ましくは５〜３０質量％、１０〜３０質量％であることがより好ましく、また、グルクロン酸は５〜１５質量％であることがより好ましい。
また、クロロイディウムＫＡＭＩ多糖体の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ａｒａ：Ｇａｌ：Ｘｙｌ：Ｒｈａ：ＵＡ＝１〜４：１〜２：１〜２：１〜２：０〜１：１〜５がより好ましい。
【００５２】
クロロイディウムＹＡＭＡ藻体の多糖体（以下、「クロロイディウムＹＡＭＡ多糖体」ともいう）の中性糖の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ｇａｌ：Ｇｌｃ＝１〜２：１〜２：１が、さらにより好ましい。
また、クロロイディウムＹＡＭＡ多糖体の多糖体中のウロン酸は１０〜２０質量％であることが好ましい。
また、クロロイディウムＹＡＭＡ多糖体の主な構成単糖比は、Ｍａｎ：Ｇａｌ：Ｇｌｃ：ＵＡ＝１〜２：１〜２：０〜１：１〜３がより好ましく、Ｍａｎ：Ｇａｌ：ＵＡ＝１〜２：１〜２：１〜３がより好ましい。
【００５３】
本技術の培養物は、適宜公知の分離・精製技術、例えば液々分液、固液分液、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂等の方法によって不活性な不純物を除去し、更に精製してもよい。
本技術の培養物から多糖体をさらに回収してもよい。多糖体を回収する方法として、公知の多糖体の分離方法を用いればよい。水溶性多糖体を得る場合には、例えば、培養物を水溶液に溶解後、不溶性画分を除去し、水溶性画分を回収することが好適である。水に溶解の際に混合することが好ましい。処理する際の水温は、５〜４０℃であるのが好ましい。溶解後、低温（例えば１〜１０℃）に放置（例えば５〜１５時間）することが好ましい。不溶性画分の除去は、遠心分離及び限界ろ過膜等の物理的手段にて行うことが好ましい。これにより、より水溶性の高く、純度の高い多糖体を得ることができるので、種々の用途にも利用可能である。
【００５４】
２．本技術の培養物の用途
本技術の培養物は、後記〔実施例〕に示すように、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性作用を有するので、ＰＲタンパク質（pathogenesis-related proteins）等の発現を誘導又は促進することができる。ここで、ＰＲタンパク質は、それ自体が抗菌活性を有するタンパク質、及び他の抗菌性物質を生成し得るタンパク質の総称である。一般に、植物が生成するＰＲタンパク質は非常に広い抗菌スペクトラムを有するので、本技術の培養物は、病原性の微生物（例えば、糸状菌（例えば、Colletotrichum属等）、細菌（例えば、Pseudomonas属等）、ウイルス）等に対しても有効であると考えられる。
【００５５】
本技術の培養物は、ストレス耐性遺伝子の１種であるＰＲ−１ａ遺伝子を人為的にＯＮにすることで植物用抵抗性誘導を起こす。これにより、本技術の培養物は、植物が本来持っているストレス耐性を引き出すことができる。当該ストレスの原因として、病気（炎症、感染等）、環境（寒暖、干ばつ、光、栄養成分、塩濃度、薬物等）等が挙げられる。当該ストレス耐性として、より具体的には、例えば、（１）過敏感細胞死の促進、抗菌物質生成の促進、細胞壁の効果の向上といった病気に対する耐性、（２）気孔開閉の制御、根伸長の促進等といった環境に対する耐久性等が挙げられる。
【００５６】
ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導において、サリチル酸等の二次刺激を加えた場合に迅速で強い誘導活性が見られることがある。これは、ＰＲ−１α遺伝子発現を誘導するサリチル酸（ＳＡ）シグナル伝達経路等が二次刺激により誘導されることに起因するものとされている。本技術の培養物は、二次刺激がなくとも発現していることから、あらかじめ防御応答遺伝子を強く発現誘導し、植物の抵抗性を高めておくことができると考える。このようにして植物の抵抗性を高めることができるので、本技術の培養物は病原体感染又は発症を防ぐといった病気又はその発症の予防にも使用できると考えられる。
また、本技術の培養物はＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導作用を有することから、用法用量（例えば、添加時期や添加濃度等）を適宜調整することによって、本技術は植物が感染を受けた場合でも迅速に応答できる準備状態を作り出すことも可能であり、また病気又は発症後の治療にも使用できると考える。
【００５７】
従って、本技術の培養物は、上述のようにＰＲ１遺伝子発現誘導活性作用を有するので、植物用抵抗性誘導作用及び植物病害予防作用を発揮することができる。
そして、本技術の培養物は、当該培養物を含有するＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤、植物用抵抗性誘導剤又は植物病害予防剤等の有効成分として使用することができる。また、本技術の培養物は、上述したこれら作用を発揮させる目的で使用することができる。また、本技術の培養物は、これら製剤又は組成物に用いるための成分として使用することができ、またこれら製剤又は組成物を製造するために使用することができる。
【００５８】
さらに、本技術の培養物は、目的に応じて任意成分を併用することも可能であり、この任意成分として、本技術の効能を増強させる成分が好ましい。
本技術の増強成分として、例えば、海藻由来抽出物、微生物由来抽出物等が挙げられ、抽出物として多糖体を含むものが好適である。これらを得る際の培養方法や採取方法、抽出方法等は、特に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。
海藻として、褐藻類（例えば、ウミトラノオ、コンブ、ヒジキ、ヒバマタ、ホンダワラ、モズク、ラッパモク、ワカメ等）、紅藻類（例えば、アサクサノリ、テングサ等）、緑藻類（例えば、アオサ、アオノリ、カサノリ、サボテングサ、フサイワヅタ、ミル等）が挙げられる。
微生物として、例えば、キノコ等の菌、細菌、麹等のカビ等が挙げられる。
これらから１種又は２種以上を選択して使用してもよい。
【００５９】
このうち、コンブ由来の抽出物が好適であり、このなかでさらにラミナリンが、遅効性のＰＲ１遺伝子発現誘導活性作用を有するので、好適である。後記実施例に示すように、ラミナリンは遅効作用があるため、本技術の緑色単細胞藻類培養物と併用することで、効能の発現時期や持続性等を調整することができ、本技術の効能をより良好なものにすることができる。
なお、ラミナリンは、コンブ等の褐藻類に含まれており、β１−３結合とβ１−６結合のグルコース主鎖からなる直鎖の多糖であり、通常β１−３結合とβ１−６結合の比は約３：１である。また、ラミナリンは、ラミナン、β−グルカン、β１，３−グルカンとも呼ばれており、当該ラミナリンは市販品を用いてもよい。
また、ジェミネラ抽出物、ウロネマ抽出物、クロロコッカム抽出物及びクロロイディウム抽出物から選択される１種又は２種以上のものを、ラミナリンと比較して速効性を有する観点から、これらに、ラミナリンを含む褐藻類抽出物又はラミナリンを配合することが好適である。
【００６０】
本技術の培養物が対象とする病害の種類及び病原菌の種類は、特に制限されない。後述する実施例ではアブラナ科植物であるシロイヌナズナにおいて、植物の抵抗性獲得の指標となるＰＲ−１α遺伝子の発現が向上していた。よって、本技術にかかる植物病害の予防又は改善方法は、病原性糸状菌の感染による病害を予防又は改善する目的で行われることが好ましい。
【００６１】
前記病原性の糸状菌としては、例えば、青かび病、赤枯病、溝腐病、糸状菌性やさび病菌による赤衣病、赤星病、灰色かび病、赤焼病、イエローパッチ、萎黄病、萎凋病、うどんこ病、紫かび病、輪紋病、灰斑病、角斑病、糸状菌性による褐色腐敗病、褐色円斑病、褐色円星病、褐点病、褐斑病、せん孔褐斑病、褐変病、褐紋病、株腐病などを引き起こす糸状菌が好ましく、Colletotrichum属の糸状菌がより好ましく、Colletotrichum higginsianum（以下、C. higginsianumという。）がさらに好ましい。細菌病としては黒腐病、軟腐病、斑点細菌病などを引き起こす細菌が好ましい。
【００６２】
本技術の使用対象となる植物の種類は、特に制限されず、陸上植物であっても水生植物であってもよい。陸上植物としては、被子植物、裸子植物が好適であり、キク科、ラン科、ユリ科、マメ科、イネ科、アカネ科、トウダイグサ科、カヤツリグサ科、セリ科、シソ科、ウリ科、ナス科、及びアブラナ科がより好適であり、ナス科及びアブラナ科が更に好適である。このうち、上述したＳＡＲモデル（例えば、非特許文献１参照）により抵抗性を獲得できる植物が好適である。
【００６３】
前記ユリ科（広義）の植物としては、タマネギ（ネギ属）が例示できる。前記マメ科の植物としては、大豆が例示できる。
前記セリ科の植物としては、ニンジンが例示できる。前記イネ科の植物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、ムギ等が挙げられる。
前記ウリ科の植物としては、例えばメロン、スイカ、冬瓜、キュウリ、カボチャなどが挙げられる。前記ナス科の植物としては、例えばタバコ、トマト、ジャガイモ、ナス、ピーマンなどが挙げられる。
前記アブラナ科の植物としては、例えばナズナ、アブラナ、キャベツ、ケール、ハクサイ、カブ、ダイコン、ワサビ、カラシなどが挙げられる。
このうち、後記〔実施例〕に示すように、アブラナ科植物であるシロイヌナズナにおいて、病害に対する抵抗性の指標となるＰＲ−１α遺伝子の発現が向上していたので、アブラナ科植物に対して使用されることが好ましいと考える。
【００６４】
本技術における植物又は当該植物の病害及びこの原因となる病原菌に対する使用方法は、特に制限されない。
本技術は、植物に対して使用する部位は特に限定されず、例えば、地上部（葉や幹等）及び地下部（根、根茎等）に対して、使用することができる。。
本技術において、培養物中に多糖体を含むために堆肥利用及び効果維持の観点から、地下部への使用が好ましい。また、本技術において、使用量のコスト面の観点から地上部への使用が好ましい。
【００６５】
本技術の使用は、一般的な農薬使用で行えばよく、例えば、散布、注入、塗布又は埋設等が挙げられる。また、前記製剤又は組成物は、植物のための農薬用であってもよく、或いは農薬や堆肥等農業資材に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
【００６６】
本技術の使用方法として、例えば、対象となる植物に曝露させる方法等が挙げられる。当該方法によって、対象となる植物に対して、病害に対する抵抗性を誘導することができる。
本技術において対象となる植物に暴露する具体的な操作や手段は特に制限されない。例えば、有効成分となりうる濃度で溶解させた薬液を調製し、該薬液を霧吹き等で植物体に噴霧したり、該薬液を浸みこませたガーゼを植物体に密着させたり、該薬液を注射器によって植物体の茎に注入したり、点滴器具を用いて該薬液を植物体の根に点滴したりする操作が例示できる。
【００６７】
なお、本技術を使用する際の製剤又は組成物の調製（調剤）は、従来の植物抵抗性誘導剤等と同様に公知の方法で行うことができる。
当該調製に用いる溶媒は、本技術の培養物を有効成分となりうる濃度で溶解できるものであれば特に制限されず、公知の溶媒を用いることができる。前記溶媒は植物に対して害が無い又は害が少ないものが好ましい。本技術の培養物は水に懸濁又は溶解できると共に、水は容易に取得できかつ安全性も高いので、水を使用することがより好ましい。
【００６８】
本技術を有効成分となりうる濃度範囲として、特に限定されない。また、本技術の使用期間は、特に限定されない。本技術の培養物は、多糖体の炭水化物が主体であるので、大量に使用しても植物自身、環境、散布者及び動物に対しても影響が少なくまた自然に分解されて肥料として再利用される。
本技術の使用期間は、長期間継続的に使用することができ、また使用後効能発揮のピークが５〜８日程度であることから、好ましくは３日以上、より好ましくは５日以上継続的に使用することが望ましい。
本技術の濃度範囲は、例えば後述の実施例で説明する植物用抵抗性誘導方法により検討して決定することができる。当該濃度の下限値として、効能発揮の観点から、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは１ｍｇ／Ｌ以上である。また、当該濃度の上限値として、コストの観点から、好ましくは１０ｇ／Ｌ以下、より好ましくは５ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは１ｇ／Ｌ以下である。当該濃度範囲として、より好ましくは０．０２ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．２ｍｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌである。
【００６９】
本技術は、以下の構成を採用することができる。
〔１〕
緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤、植物用抵抗性誘導剤、又は植物病害予防・改善剤。
〔２〕
ＰＲ１遺伝子発現誘導活性のための、植物用抵抗性誘導のための、又は植物病害予防・改善のための、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物又はその使用。
〔３〕
緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物を有効成分とする、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性方法、植物用抵抗性誘導方法、又は植物病害予防・改善方法。
〔４〕
ＰＲ１遺伝子発現誘導活性剤、植物用抵抗性誘導剤、又は植物病害予防・改善剤を製造するための、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物の使用。
【００７０】
〔５〕  前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つにおいて、好適には、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物と、海藻類抽出物又はラミナリンとを、併用することである。
〔６〕  前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記培養物中の藻類多糖体が、ウロン酸を少なくとも含むものである。より好適には、当該培養物中の多糖体が、少なくともウロン酸を５〜４０質量％含むものである。
〔７〕  前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記培養物中の藻類多糖体が、ウロン酸と中性糖とを少なくとも含むことである。さらに好適には、当該中性糖が、マンノース、ガラクトース及びラムノースから選択される１種又は２種以上のものである。
〔８〕  前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記藻体が、Trebouxiophyceae（トレボキシア藻綱）藻類及び／又はChlorophyceae（緑藻綱）藻類である。
〔９〕  前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記藻類が、ユーグレナ、ウロネマ、クロロコッカム、ジェミネラ、クロロイディウム及びクロレラから選択される１種又は２種以上である。より好適には、ジェミネラ、ウロネマ、クロロコッカム及びクロロイディウムから選択される１種又は２種以上である。
また、ジェミネラ抽出物、ウロネマ抽出物、クロロコッカム抽出物及びクロロイディウム抽出物から選択される１種又は２種以上のものを、ラミナリンと比較して速効性を有する観点から、速効用として用いることが好適である。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つにおいて、好適には、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される１種又は２種以上である。
（ａ）ウロネマが、Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)である。
（ｂ）クロロコッカムが、Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)である。
（ｃ）ジェミネラが、Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)である。
（ｄ）クロロイディウムが、Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA(NBRC 113207)及び／又はTrebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)である。
〔１１〕  前記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記藻体が、［１］Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)藻株；［２］Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)藻株；［３］Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株；［４］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA (NBRC 113207)藻株；［５］Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)藻株から選択される１種又は２種以上のものである。
【００７１】
〔１２〕
緑色の光合成色素を有する単細胞藻類を、好気的条件下で培養をし、細胞外多糖体を含む培養物を得る、植物用抵抗性誘導成分、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性成分、又は植物病害予防・改善成分の製造方法。好適には、独立栄養培養培地である。
〔１３〕
植物用抵抗性誘導成分、ＰＲ１遺伝子発現誘導活性成分、又は植物病害予防・改善成分を製造するための、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類又はその使用。
【００７２】
〔１４〕  前記〔１２〕又は〔１３〕において、好適には、前記藻体が、Chlorophyceae（緑藻綱）藻類及び／又はTrebouxiophyceae（トレボキシア藻綱）藻類である。
〔１５〕  前記〔１２〕〜〔１４〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記藻類が、ユーグレナ、ウロネマ、クロロコッカム、ジェミネラ、クロロイディウム及びクロレラから選択される１種又は２種以上である。より好適には、ウロネマ、クロロコッカム、ジェミネラ及びクロロイディウムから選択される１種又は２種以上である。
〔１６〕  前記〔１２〕〜〔１５〕のいずれか１つにおいて、好適には、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択される１種又は２種以上である。
（ａ）ウロネマが、Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)である。
（ｂ）クロロコッカムが、Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)である。
（ｃ）ジェミネラが、Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)である。
（ｄ）クロロイディウムが、Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA(NBRC 113207)及び／又はTrebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)である。
〔１７〕  前記〔１２〕〜〔１５〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記藻体が、（１）Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)藻株；（２）Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)藻株；（３）Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株；（４）Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA (NBRC 113207)藻株；（５）Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)藻株から選択される１種又は２種以上のものである。
〔１８〕  前記〔１２〕〜〔１７〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記培養の温度が、５〜４０℃である。
〔１９〕  前記〔１２〕〜〔１８〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記培養のｐＨが、１．５〜１０である。
〔２０〕  前記〔１２〕〜〔１９〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記培養後、遠心分離及びろ過を単独で又は２種組み合わせて藻体を除去することである。
〔２１〕  前記〔１２〕〜〔２０〕のいずれか１つにおいて、好適には、前記藻体を除去した後に凍結乾燥し、さらに水溶液に溶解後、水溶性画分を回収することである。
〔２２〕  前記〔１２〕〜〔２１〕のいずれか１つにおいて、好適には、藻類培養物（好適には多糖体）の製造方法又は藻類の使用にて得られた藻類培養物（好適には多糖体）。
【実施例】
【００７３】
以下に実施例等を用いて本技術をさらに詳しく説明するが、本技術はこれら実施例に限定されるものではない。【００７４】
＜使用藻株＞【００７５】
使用するウロネマ藻株、クロロコッカム藻株、ジェミネラ藻株、クロロイディウムＹＡＭＡ藻株、クロロイディウムＫＡＭＩ藻株の各藻株は、NBRC Culture Collectionから入手した（表１参照）。また、それぞれの18srRNAについて、表２〜５（配列番号１〜４）及び表１２（配列番号５）に開示する。【００７６】
１）Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)：（公開日２０１８年３月２９日／ウェブサイトURL：http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113204、ウェブサイト印刷日２０１８年３月２９日）
２）Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)：（公開日２０１８年３月２９日／ウェブサイトURL:http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113206、ウェブサイト印刷日２０１８年３月２９日）
３）Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)：（公開日２０１８年３月２９日／ウェブサイトURL:http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113205、ウェブサイト印刷日２０１８年３月２９日）
４）Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum YAMA (NBRC 113207)：（公開日２０１８年３月２９日／ウェブサイトURL:http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113207、ウェブサイト印刷日２０１８年３月２９日）【００７７】
【表１】
2019188773.tif 000002
【００７８】
【表２】
2019188773.tif 000003
【００７９】
【表３】
2019188773.tif 000004
【００８０】
【表４】
2019188773.tif 000005
【００８１】
【表５】
2019188773.tif 000006
【００８２】
＜製造例１〜４：藻類由来の培養物（多糖体を含む培養物）の製造方法及び当該培養物の分析＞
＜藻類由来の培養物（多糖体を含む培養物）の製造方法＞
＜製造例１＞
表１及び６に示す「ウロネマ藻株」を含むスラント状培地（５０ｍＬ）を、表７又は８に示す基礎培地１００ｍＬ（３００ｍＬ容三角フラスコ）に添加し、独立栄養培養条件下で、照度１５００〜１００００ｌｕｘ、２３℃で、１２０ｒｐｍにて１２日間前培養した。なお、前培養前に、予備的に藻体数を増やしてもよい。
さらに、予備的培養後の培養液１Ｌを１０Ｌ容のジャーファメンターに移して１２日間本培養を行い、これを本培養後の培養液１とした。このときの培養条件は、照度１５００〜１００００ｌｕｘ、２３℃、２００ｒｐｍ、通気０．５６ｖｖｍの好気的な条件にし、独立栄養培養条件下で行った。【００８３】
＜製造例２〜４＞
表１及び６に示す、「クロロコッカム藻株」、「ジェミネラ藻株」、「クロロイディウム藻株」の各藻株（表１参照）について、上記「ウロネマ藻株」の多糖体の製造方法と同様にして、それぞれ培養を行い、本培養後の培養液２〜４を得た。【００８４】
クロロコッカム藻株、ジェミネラ藻株、クロレラ藻株、ユーグレナ藻株には、ＡＦ６培地を使用した（表７）。ウロネマ藻株、クロロイディウム藻株には、ＢＧ１１培地を使用した（表８）。【００８５】
＜製造例１〜４の藻類由来の培養物１〜４の回収＞
前記ウロネマ由来の培養液１を、遠心分離（７０００ｒｐｍ（６５００Ｇ）、２５℃）し、細胞外多糖体を含有する上清液と、藻体とに分離した。
さらに分画分子量５０００のＵＦ膜を用いて、培養液を４００ｍＬまで濃縮し、凍結乾燥して、ウロネマ由来の多糖体を含む培養物１を得た。
また、ウロネマ由来の培養物１の方法と同様にして、各藻株由来（クロロコッカム藻株、ジェミネラ藻株、クロロイディウム藻株由来）の培養液２〜４から、表６に示す各藻株由来の多糖体を含む培養物２〜４を得た。
また、各藻株における多糖体の生産量（ｍｇ／培養上清１Ｌ）は、藻体分離後の上清液についてフェノール硫酸発色法（標品：グルコース）にて行い、その結果を表６に示す。【００８６】
【表６】
2019188773.tif 000007
【００８７】
【表７】
2019188773.tif 000008
【００８８】
【表８】
2019188773.tif 000009
【００８９】
＜製造例１〜４の各藻株由来の各培養物分析＞
各藻株由来の各培養物１〜４を凍結乾燥して粉末を得た。各培養物１〜４は、ウロネマ由来培養物１、クロロコッカム由来培養物２、ジェミネラ由来培養物３、クロロイディウム由来培養物４である。
各粉末を、酸加水分解法（例えば、加水分解条件：７２％硫酸水溶液、室温で１時間攪拌後、４％硫酸水溶液に調整した後、４％硫酸水溶液でオートクレーブ処理（１２１℃、１時間））ＨＰＬＣ分析、各種糖分析等にて、各培養物中の構成単糖（中性単糖：マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、グルコース、ラムノース、リボース、フコース）の測定を行った。その結果、各藻株の培養物に含まれる多糖体の中性糖構成は表９のとおりであった。【００９０】
１）Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)藻株：ウロネマ培養物中に測定された中性単糖が２５質量％含まれ、この培養物中の中性糖において主な構成糖はラムノース１３質量％、グルコース５．５質量％であった。
２）Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株：クロロコッカム培養物中に測定された中性単糖が７１質量％含まれ、この培養物中の中性糖において主な構成糖はマンノース２０質量％、アラビノース２３質量％、ガラクトース２４質量％であった。
３）Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)藻株：ジェミネラ培養物（第１回目）中に測定された中性単糖が４１質量％含まれ、この培養物中の中性糖において主な構成糖はアラビノース７質量％、ガラクトース１３質量％、ラムノース１５質量％であった。
ジェミネラ培養物（第２回目）中で測定された中性単糖が２５質量％含まれ、この培養物中の中性糖において主な構成糖はマンノース１０質量％、ガラクトース４質量％、ラムノース３質量％、フコース３質量％であった。
４）Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum (NBRC 113207)藻株：クロロイディウム培養物中に測定された中性単糖が３４質量％含まれ、この培養物中の中性糖において主な構成糖はマンノース８質量％、アラビノース７質量％、ガラクトース１１質量％であった。【００９１】
【表９】
2019188773.tif 000010
【００９２】
＜実施例１〜２：ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導試験＞
ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を連結したプラスミドコンストラクト（PR-1a::Fluc+）を導入したシロイヌナズナ種子を１００μＬの滅菌水とともに９６Ｗｅｌｌプレートに播種し、５日間の春化処理をした後に終濃度０．１ｍＭのルシフェリンを添加し、バイオトロン（明条件１２時間、暗条件１２時間、相対湿度１００％）に置いた。
なお、本実施例は、特許文献１及び２、非特許文献１を参照にして行うことが可能である。また、非特許文献１に示された内容に沿って、タバコ由来のPathogenesis-related gene 1a（PR-1a）遺伝子プロモーターの下流に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Firefly luciferase; F-luc）を連結させた融合遺伝子（PR-1a::F-luc）を有するプラスミドを得ることができる。当該プラスミドをアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens LBA4404）を介してシロイヌナズナに導入し、PR-1a::F-lucを有する形質転換シロイヌナズナ種子（PR-1a::F-luc）を得ることができる。【００９３】
ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導試験の試料として、上述した各藻体から得られた培養物１〜４を用いた。各培養物１〜４は、上述したウロネマ由来培養物１、クロロコッカム由来培養物２、ジェミネラ由来培養物３、クロロイディウム由来培養物４である。
発芽後に滅菌水で調整した各培養物１〜４の試料を、各Ｗｅｌｌに１／１０量添加し、最終濃度とした。各プレートにおける最終濃度は、プレート１（実施例１）：０．０２ｗｔ％（２００μｇ／ｍＬ）、プレート２（実施例２）：０．００２ｗｔ％（２０μｇ／ｍＬ）とした。なお、試料は、培養物粉末を滅菌水にて１％（１０ｍｇ／ｍＬ）溶液に調整し、−２０℃にて保管したものである。
各試料の各処理区につき、１２反復行い、ＰＲ−１ａプロモーター発現誘導はFluc発光活性を指標として評価した。処理による植物体の発光量を遺伝子発現誘導活性として、その強度を経時的にモニタリングした。
フォトカウンティング装置GaAsP IMAGE INTENSIFIER UNIT C8600（浜松フォトニクス株式会社）及び解析ソフトWasabiを使用して、各ウェル内の発光強度を測定してレポーターであるF-lucの発現量を測定することで、各試料のPR-1a遺伝子発現誘導活性についてそれぞれ評価した。
経時的モニタリングの解析タイムポイントは、０．２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６時間に設定した。０時間の発光量を１とした相対値を、相対発光量とし、１２０時間の結果を表１０及び１１に示した。【００９４】
表１０及び１１に示すように、各藻類の藻体外に生産された多糖体を含む培養物に、顕著なＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導活性を有することが示唆された。当該多糖体を含む培養物は、ウロネマ、クロロコッカム、ジェミネラ、クロロイディウム由来の産生物である。またこれらは、Chlorophyceae（緑藻綱）藻類及び／又はTrebouxiophyceae（トレボキシア藻綱）藻類でもある。
このことから、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類が藻体外に生産する多糖体を主な起因として、ＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導を活性化させていると考える。これら培養物には、中性糖としてマンノース、ラムノース及び／又はガラクトースのいずれか１又は２以上を構成単糖とすることで共通するので、これらが何らかの効能に関与していると考える。
また、ウロネマ由来の多糖体は、中性糖において、ラムノース、グルコースを主な構成単糖としている。この主な構成単糖を含む多糖体がＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導を活性化に関与していると考える。
また、クロロコッカム由来の多糖体は、中性糖において、ガラクトース、アラビノース、マンノースを主な構成単糖としている。この主な構成単糖を含む多糖体がＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導を活性化に関与していると考える。
ジェミネラ由来の多糖体は、中性糖において、マンノース、ラムノース、ガラクトースを主な構成単糖としている。この主な構成単糖を含む多糖体がＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導を活性化に関与していると考える。
クロロイディウム由来の多糖体は、中性糖において、ガラクトース、マンノース、アラビノース、キシロースを主な構成単糖としている。この主な構成単糖を含む多糖体がＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導を活性化に関与していると考える。【００９５】
【表１０】
2019188773.tif 000011
【００９６】
【表１１】
2019188773.tif 000012
【００９７】
＜実施例３〜４：生理活性試験＞
＜実施例３〜４で使用する藻株＞
実施例３では、Chlorophyceae Uronema sp. (NBRC 113204)藻株を、ウロネマ藻株として使用した。
実施例３では、Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株を、クロロコッカム藻株として使用した。
実施例３では、Trebouxiophyceae Geminella sp. (NBRC 113205)藻株を、ジェミネラ藻株として使用した。
実施例３では、NBRC Culture Collectionから、Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)藻株を入手し（表１参照）、この18srRNAについて、表１２（配列番号５）に開示し、クロロコッカムＫＡＭＩ藻株として使用した。
。
実施例３では、２００５年５月に、現在の日本国宮城県大崎市鳴子の潟沼（Katanuma）にて採取したユーグレナ藻株を使用した。
実施例３では、ポジティブコントロールとして、ラミナリン（ＳＩＧＭＡ社製）を使用した。【００９８】
実施例４では、Chlorophyceae Chlorococcum sp. (NBRC 113206)藻株を、クロロコッカム藻株として使用した。
実施例４では、Chlorella vulgaris Chikugo株（チクゴ株：クロレラ工業）を、クロレラ藻株として、使用した。【００９９】
５）Trebouxiophyceae Chloroidium saccharophilum KAMI (NBRC 113807)：（公開日２０１９年２月２５日／ウェブサイトURL:http://www.nbrc.nite.go.jp/NBRC2/NBRCCatalogueDetailServlet?ID=NBRC&CAT=00113807、ウェブサイト印刷日２０１９年２月２５日）
採取地（株の由来）  北海道斜里郡清里町神の子池）Kaminoko Pond, Shari-gun, Kiyosato-cho, Hokkaido）採集日：2012/5/7。【０１００】
【表１２】
2019188773.tif 000013
【０１０１】
＜実施例３〜４で使用する試料＞
上述した＜製造例１〜４：藻類由来の培養物（多糖体を含む培養物）の製造方法及び当該培養物の分析＞＜藻類由来の培養物（多糖体を含む培養物）の製造方法＞と同様にして、＜実施例３〜４で使用する藻株＞記載の各藻株から各培養物を得、これを各試料とした。
具体的には、クロロコッカム藻株、ジェミネラ藻株、クロロイディウムＹＡＭＡ藻株、クロレラ藻株には、ＡＦ６培地を使用し（表７）、ウロネマ藻株、クロロイディウムＫＡＭＩ藻株には、ＢＧ１１培地を使用し（表８）、ユーグレナ藻株には、ＫＯ２培地を使用し上記製造例１〜４を参考にして各藻株に適した培養を行い、多糖体を含む培養物をそれぞれ得た。
このようにして、実施例３の試料として、ウロネマ由来培養物５、クロロコッカム由来培養物６、ジェミネラ由来培養物７、クロロイディウムＫＡＭＩ由来培養物８、ユーグレナ由来培養物９を得た。また、実施例４の試料として、クロロイディウムＹＡＭＡ由来培養物１０、クロレラ由来培養物１１を得た。
このときクロロイディウムＫＡＭＩ藻株における多糖体の生産量（ｍｇ／培養上清１Ｌ）は、藻体分離後の上清液についてフェノール硫酸発色法（標品：グルコース）にて行い、３００ｍｇ／Ｌであった。【０１０２】
〔ＫＯ２培地組成〕
硝酸ナトリウム  ８５ｍｇ：硫酸アンモニウム  ６６ｍｇ：リン酸二水素カリウム  ２７ｍｇ：リン酸マグネシウム七水和物  ２５ｍｇ：塩化カルシウム二水和物  １１ｍｇ：硫酸鉄七水和物   ２ｍｇ：ＥＤＴＡ−２Ｎａ  ３ｍｇ：Ｎ１  Ｍｅｔａｌｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ※１  ０．１ｍＬ：蒸留水  ９９ｍＬ：ｐＨ  ２：調製量  １００ｍＬ。
※１［Ｎ１  Ｍｅｔａｌｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ組成］
ホウ酸  ２．８６ｇ：塩化マンガン四水和物  １．８１ｇ：硫酸亜鉛七水和物  ０．２２ｇ：硫酸銅五水和物  ０．０８ｇ：三酸化モリブデン  １５ｍｇ：蒸留水  １０００ｍＬ：調製量  １０００ｍＬ。【０１０３】
＜実施例３〜４：ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導試験＞
実施例３〜４のＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導試験は、＜実施例１〜２：ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導試験＞と同様にして、各試料についての発現誘導を確認した。このときの使用した濃度は、０．０２ｍｇ／ｍＬであった。
経時的モニタリングの解析タイムポイントは、０．２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、１９２、２１６、２４０、２６４時間に設定した。０時間の発光量を１とした相対値を、相対発光量とした。
ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導試験における、実施例３の各試料の結果を表１３及び図１に示し、実施例４の各試料の結果を表１４に示した。【０１０４】
表１３及び１４に示すように、各藻類の藻体外に生産された多糖体を含む培養物に、顕著なＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導活性を有することが示唆された。当該多糖体を含む培養物は、ウロネマ由来、クロロコッカム由来、ジェミネラ由来、クロロイディウム（好適にはＫＡＭＩ）由来、ユーグレナ由来、クロレラ由来の産生物である。これら産生物は、ＰＲ−１ａ遺伝子プロモーター発現誘導を活性化させる作用があることが示された。【０１０５】
このうち、ウロネマ由来（１．３５倍）、クロロコッカム由来（１．１１倍）、ジェミネラ由来（１．３７倍）、クロロイディウムＫＡＭＩ由来（１．１２倍）、ユーグレナ由来（１．１０倍）の産生物は、ラミナリンよりも、Ｍａｘピーク（活性）値が高かった。また、これら産生物のＭａｘピーク値は、ラミナリンのＭａｘピーク値よりも前にシフトしており、この時間の差は、ラミナリンのＭａｘピーク時間の０．６７〜０．７８になっており、ラミナリンと比較して速効型といえる。これら藻類由来の培養物中の活性物質について検討中であるが、通常多糖体は高分子であるため遅効的であることが多い。しかし、これら藻類由来の培養物は、ラミナリンと同じ高分子の多糖体でありながら、速効的であることは、これらの優れた利点といえる。また、各産生物とラミナリンとの両者を併用することで、作用時期を調整することが容易である。【０１０６】
【表１３】
2019188773.tif 000014
【０１０７】
【表１４】
2019188773.tif 000015
【０１０８】
＜実施例３〜４の各藻株由来の各培養物分析＞
実施例３〜４の各藻株由来の各培養物分析を行った。具体的には、実施例３の試料として、ウロネマ由来培養物５、クロロコッカム由来培養物６、ジェミネラ由来培養物７、クロロイディウムＫＡＭＩ由来培養物８、また、実施例４の試料として、クロロイディウムＹＡＭＡ由来培養物１０を使用した。【０１０９】
これら藻株由来の各培養物について、以下のように、ＡＢＥＥ標識化法を用いて、各培養物中の構成単糖の分析を行った(Yasuno, S., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1944（1997）、Yasuno, S., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 1353（1999）)。
Man:マンノース、Ara:アラビノース、Gal:ガラクトース、Xyl:キシロース、Glc:グルコース、Rha:ラムノース、Rib:リボース、Fuc:フコース、NAc-GlcN：Nアセチルグルコサミン、NAc-GalN：Nアセチルガラクトサミン、NAc-ManN：Nアセチルマンノサミン、GalUA：ガラクツロン酸、GlcUA：グルクロン酸。
１）HPLC装置
ACQUITY UPLC H Classシステム（製造元Waters）  ACQUITY UPLC BEH C18 Column,1.7 μm, 2.1 x 100 mm（製造元：J-オイルミルズ）、カラム温度：５０℃、移動相：Ａ／Ｂ＝０．２ＭPotassium borate（ｐＨ  ８．９）／ＡＣＮ、流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ、検出：蛍光（Ｅｘ．３０５ｎｍ，Ｅｍ．３６０ｎｍ）。【０１１０】
試料にＭｉｌｌｉＱ水（ＭＱＷ）を添加して１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、当該溶液１０μＬを加水分解試料とした。具体的には、各試料を１０μＬずつチューブに分取し、分取した各チューブへＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加え、撹拌、遠心した後、１００℃で３時間加熱した。空冷した後、遠心処理し、ＳｐｅｅｄＶａｃにて乾固させた。２−プロパノールを加え、撹拌した後、ＳｐｅｅｄＶａｃにより乾固させた試料にピリジン／メタノール及び、無水酢酸を加え、室温で３０分反応させた。溶液をＳｐｅｅｄＶａｃにより乾固させ、ＡＢＥＥ標識化へと進めた。ＡＢＥＥ標識化試薬（ＡＢＥＥ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、酢酸、メタノール）を加え、８０℃、１時間反応させた。ＭＱＷ  ２００μＬ、クロロホルム２００μＬにて後処理を実施し、水層を回収し、ＨＰＬＣにインジェクトした。ピーク面積から各単糖の検量線を作成するとともに、サンプル中に含まれる単糖を定量した。【０１１１】
さらに、カルバゾール硫酸発色法（GalUA換算）を用いて、乾燥培養物１００μｇ／ｍＬに調整して各培養物中のウロン酸の分析を行った。各試料中のウロン酸含有量（GalUA換算）の結果を、表１６に示す。【０１１２】
【表１５】
2019188773.tif 000016
【０１１３】
【表１６】
2019188773.tif 000017
【０１１４】
表１５にＡＢＥＥ標識化法による糖分析の結果、表１６にウロン酸の結果を示す。
ジェミネラ、ウロネマ、クロロコッカム及びクロロイディウムの各藻株の培養物に含まれる各多糖体における単糖構成は表１５のとおりであった。
ウロネマ由来の多糖体は、ラムノース、マンノース、グルクロン酸を主な構成単糖としている。
クロロコッカム由来の多糖体は、マンノース、アラビノース、ガラクトース、グルクロン酸を主な構成単糖としている。
ジェミネラ由来の多糖体は、マンノース、グルクロン酸を主な構成単糖としている。
クロロイディウムＫＡＭＩ由来の多糖体は、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、ラムノース及びグルクロン酸を主な構成単糖としている。
クロロイディウムＹＡＭＡ由来の多糖体は、マンノース、ガラクトース、及びグルコースを主な構成単糖としている。【０１１５】
ジェミネラ、ウロネマ、クロロコッカム及びクロロイディウムの各藻株の培養物に含まれる各多糖体中には、ウロン酸が含まれており、当該ウロン酸（ＧａｌＵＡ換算）含有率は、表１６のとおりであった。このことから、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類が藻体外に生産する多糖体にはウロン酸が含まれていることで、ウロン酸を含まないラミナリンとは違うＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導作用（例えば、効能速度等）を有すると考える。
上述のように、上記各多糖体は、構成単糖として上述のようなウロン酸及び中性単糖を有することで、ＰＲ−１ａ遺伝子発現誘導を活性化に関与していると考える。【０１１６】
本技術の培養物は、緑色の光合成色素を有する単細胞藻類の培養物であるため、直接的な殺虫・殺菌性を示さないと考える。そして、本技術の培養物は、直接的な殺虫・殺菌性を示さないことから、耐性菌出現率が低く、施用量も少量で抑えることができ、効果も持続的であり、防除目的外の生物に対する影響も少ないと考える。
また、本技術の培養物は、多糖体の炭素源を豊富に含み、また、当該培養物中に種々の成分を含むことも可能であることから、植物の施肥的な効能も期待することができる。
本技術の培養物は、液体培養によって得られるものであるため、水溶性が高く農場等の灌漑水と混合させて簡便に使用することができる。また、本技術の培養物は、不溶性成分が含まれている場合でも散布等の施用後に次第に分解していくと考えるので、長期的な効能発揮が期待でき、一方で環境負荷が低いと考える。また、施用時に、化学農薬のような体内被爆のおそれも少ない利点がある。
また、本技術の培養物は、必要なときに必要な場所で必要な作物に使用でき、汎用性が高いと考える。
【図１】
2019188773.tif 000018
【配列表】
2019188773000001.app
【国際調査報告】
2019188773.tif 000019
2019188773.tif 000020
2019188773.tif 000021
2019188773.tif 000022