(57)【要約】  ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体を用いて、無細胞タンパク質合成系により、ポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法であって、該無細胞タンパク質合成系が、タンパク質合成に関与する因子によって再構成された系であり、該方法は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体として、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を用い、該方法は、さらに、終止コドンが導入されたテンプレート核酸、該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ、及び該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いる、方法。
2019098291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体を用いて、無細胞タンパク質合成系により、ポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法であって、
該無細胞タンパク質合成系が、タンパク質合成に関与する因子によって再構成された系であり、
該方法は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体として、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を用い、
該方法は、さらに、終止コドンが導入されたテンプレート核酸、
該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ、及び
該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いる、方法。
【請求項２】
標識に用いるポジトロン放出核種が１１Ｃ、１８Ｆ、又は１２４Ｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸がＯ−［（１８Ｆ）フルオロメチル］チロシン、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロエチル］チロシン、又は４−ボロノ−２−（１８Ｆ）フルオロフェニルアラニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
テンプレート核酸が、天然のタンパク質をコードする核酸配列のオープンリーディングフレームのフレームシフトを起こさない任意の位置へ終止コドンが挿入されている、又はオープンリーディングフレーム上のチロシン残基またはフェニルアラニン残基を指定するコドンと終止コドンとが置換されている核酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
終止コドンが、アンバーコドンである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
以下の構成要素を含む、ポジトロン放出核種標識タンパク質を無細胞タンパク質合成系で合成するためのキット：
１）ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸
２）終止コドンが導入されたテンプレート核酸
３）該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ
４）該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素。
【請求項７】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸、終止コドンが導入されたテンプレートＤＮＡ、該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ及び該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い、無細胞タンパク質合成系によりポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する手段を有する、ポジトロン放出核種標識タンパク質合成装置。
【請求項８】
標識に用いるポジトロン放出核種が１１Ｃ、１８Ｆ、又は１２４Ｉである、請求項６に記載のキット、請求項６に記載のキット又は請求項７に記載の装置。
【請求項９】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸がＯ−［（１８Ｆ）フルオロメチル］チロシン、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロエチル］チロシン、又は４−ボロノ−２−（１８Ｆ）フルオロフェニルアラニンである、請求項６に記載のキット、請求項７に記載の装置又は請求項８に記載のキットもしくは装置。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法を利用したＰＥＴ診断用薬剤あるいは試験用薬剤の製造方法。
【請求項１１】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を１以上含む、ポジトロン放出核種標識タンパク質。
【請求項１２】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸が、天然のタンパク質のアミノ酸配列における任意の位置への挿入、または天然のタンパク質のアミノ酸配列におけるチロシン残基又はフェニルアラニン残基の位置での置換によって導入されている、請求項１１に記載のポジトロン放出核種標識タンパク質。
【請求項１３】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸が、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロメチル］チロシン、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロエチル］チロシン、又は４−ボロノ−２−（１８Ｆ）フルオロフェニルアラニンである請求項１１に記載のポジトロン放出核種標識タンパク質。
【請求項１４】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸の製造方法であって、
以下の工程により、ポジトロン放出核種イオンとアミノ酸由来の反応前駆体との標識反応を行うための混合物を得ることを特徴とする方法：
（１）ポジトロン放出核種イオンを含む水溶液を陰イオン交換カラムに供し、ポジトロン放出核種イオンを該陰イオン交換カラムに吸着させる工程、
（２）クリプタンドを含む溶液を該陰イオン交換カラムに供しポジトロン放出核種イオンを脱着させ、ポジトロン放出核種イオン及びクリプタンドを含む混合溶液を回収する工程、
（３）該混合溶液を陽イオン交換カラムに供してクリプタンドを該陽イオン交換カラムに吸着させ、ポジトロン放出核種イオンが濃縮された濃縮混合溶液を回収する工程、
（４）上記濃縮混合溶液またはその留去後の残渣に反応前駆体を添加し、ポジトロン放出核種イオン、クリプタンド及び反応前駆体を含む混合物を得る工程。
【請求項１５】
前記（３）の工程で回収した濃縮混合液に、該濃縮混合溶液の溶媒より沸点の高い溶媒を高沸点溶媒として添加し、該高沸点溶媒を添加した濃縮混合溶液の留去後の残渣を前記工程（４）に記載の留去後の残渣とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標識に用いるポジトロン放出核種が１１Ｃ、１８Ｆ、又は１２４Ｉである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
クリプタンドがカリウムイオンと錯形成している請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年１１月１５日に出願された、日本国特許出願第２０１７−２１９７９８号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明はポジトロン放出核種によるタンパク質標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポジトロン放出核種は、分子イメージングに極めて有用な因子であり、Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＰＥＴ）を用いた診断、薬物導体への利用について研究が進められている。ここで、ポジトロン放出核種で標識する対象として、ペプチド、タンパク質等が注目されている。かかる状況の下、本発明者らは、ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体を用い、細胞から抽出精製されたタンパク質合成に関与する因子によって再構成された無細胞タンパク質合成系により、ポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法を開発しており、当該方法については特許も取得されている（特許文献１）。特許文献１にかかる方法は、２０種類の天然アミノ酸から１種類の天然アミノ酸を除き、その代わりにポジ卜ロン標識アミノ酸を加え、無細胞タンパク質合成系によってポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法に関する（図１）。しかし、この方法は目的のタンパク質のアミノ酸配列中に含まれる特定のアミノ酸を置換するため、ポジトロン放出核種標識アミノ酸の種類によっては、これを導入できるタンパク置のアミノ酸配列の種類が限定され得ること、天然のアミノアシル合成酵素／ｔＲＮＡペアを用いて１８Ｆ標識アミノ酸１等の標識アミノ酸を導入しているため導入効率が必ずしも高くない等の問題点がある。【０００３】
一方、ポジトロン放出核種標識アミノ酸をタンパク質の無細胞標識合成の原料として使用するためには、当該ポジトロン放出核種標識アミノ酸は、微量の水溶液（緩衝液）に溶解した状態で得る必要がある。非特許文献４には、サイクロトロンを用いて製造される１８Ｆ−フッ素イオンを標識反応に用いるために、１８Ｆ−フッ素イオンをＫｒｙｐｔｏｆｉｘ  ２．２．２（Ｋ．２２２）（登録商標）とカリウムイオン（Ｋ＋）のコンプレックス（クリプタンド、Ｋ．２２２／Ｋ＋）と一緒に無水の有機溶媒に溶かして活性化し、これをそのまま２０μＬ以下に濃縮する方法が開示されている。この方法ではＫ．２２２／Ｋ＋の濃度が必要以上に高くなり標識反応が阻害される。また従来の方法では、水溶液で得られた１８Ｆ−フッ素イオンをアセトニトリルとの共沸乾固操作を繰り返して無水化する時間と手間がかかる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特許５５９０５４０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Young DD et al., Biochemistry (2011) 50, 1894-1900
【非特許文献２】Young TS et al., J. Mol. Biol. (2010) 395, 361-374
【非特許文献３】Tolmachev V et al., Bioconjugate Chem (2010), 21, 2013-2022
【非特許文献４】Iwata R, et al., Appl. Radiat. Isot. (2017) 125, 113-118
【非特許文献５】Shimizu Y et al., Nature Biotechnology (2001) 19, 751-755
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、２０種類の天然アミノ酸のうち１種類を、対応するポジ卜ロン標識アミノ酸に入れ替える方法等の従来法とは異なる、新たなポジトロン放出核種標識タンパク質合成方法を提供することを課題とする。【０００７】
本発明は、こうしたポジトロン放出核種標識タンパク質合成の原料であるポジトロン放出核種標識アミノ酸の合成における問題点を解決する新たな方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意研究した結果、２０種類の天然アミノ酸のうち１種類に代えて、対応するポジ卜ロン標識アミノ酸を用いるのではなく、目的とするタンパク質をコードする標的テンプレート核酸に終止コドンを挿入し、当該終止コドンの位置にポジトロン放出核種標識アミノ酸を導入することによって、ポジトロン放出核種標識タンパク質を合成できることを見出した。また本発明は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸の合成において、サイクロトロンで得られたポジトロン放出核種イオン水溶液を陰イオン交換カラムで吸着し、クリプタンドを含む溶液で脱着した後陽イオン交換カラムで大部分のクリプタンドを除去して、ポジトロン放出核種イオンと微量のクリプタンドの溶液として回収し、非天然アミノ酸を含む反応前駆体と混合することにより、クリプタンドの必要以上の濃縮による標識反応阻害を回避し、時間や工程数を削減して合成できることを見出した。本発明はかかる新規の知見に基づくものである。従って、本発明は以下の項にかかる発明を提供する：
項１．ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体を用いて、無細胞タンパク質合成系により、ポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法であって、
該無細胞タンパク質合成系が、タンパク質合成に関与する因子によって再構成された系であり、
該方法は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体として、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を用い、
該方法は、さらに、終止コドンが導入されたテンプレート核酸、
該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ、及び
該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いる、方法。【０００９】
項２．標識に用いるポジトロン放出核種が１１Ｃ、１８Ｆ、又は１２４Ｉである、項１に記載の方法。【００１０】
項３．ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸がＯ−［（１８Ｆ）フルオロメチル］チロシン、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロエチル］チロシン、又は４−ボロノ−２−（１８Ｆ）フルオロフェニルアラニンである、項１又は２に記載の方法。【００１１】
項４．テンプレート核酸が、天然のタンパク質をコードする核酸配列のオープンリーディングフレームのフレームシフトを起こさない任意の位置へ終止コドンが挿入されている、又はオープンリーディングフレーム上のチロシン残基またはフェニルアラニン残基を指定するコドンと終止コドンとが置換されている核酸配列を含む、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。【００１２】
項５．終止コドンが、アンバーコドンである項１〜４のいずれか１項に記載の方法。【００１３】
項６．以下の構成要素を含む、ポジトロン放出核種標識タンパク質を無細胞タンパク質合成系で合成するためのキット：
１）ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸
２）終止コドンが導入されたテンプレート核酸
３）該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ
４）該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素。【００１４】
項７．ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸、終止コドンが導入されたテンプレートＤＮＡ、該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ及び該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い、無細胞タンパク質合成系によりポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する手段を有する、ポジトロン放出核種標識タンパク質合成装置。【００１５】
項８．標識に用いるポジトロン放出核種が１１Ｃ、１８Ｆ、又は１２４Ｉである、項６に記載のキット又は項７に記載の装置。【００１６】
項９．ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸がＯ−［（１８Ｆ）フルオロメチル］チロシン、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロエチル］チロシン、又は４−ボロノ−２−（１８Ｆ）フルオロフェニルアラニンである、項６に記載のキット、項７に記載の装置又は項８に記載のキットもしくは装置。【００１７】
項１０．項１〜５のいずれか１項に記載の方法を利用したＰＥＴ診断用薬剤あるいは試験用薬剤の製造方法。【００１８】
項１１．ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を１以上含む、ポジトロン放出核種標識タンパク質。【００１９】
項１２．ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸が、天然のタンパク質のアミノ酸配列における任意の位置への挿入、または天然のタンパク質のアミノ酸配列におけるチロシン残基又はフェニルアラニン残基の位置での置換によって導入されている、項１１に記載のポジトロン放出核種標識タンパク質。【００２０】
項１３．ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸が、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロメチル］チロシン、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロエチル］チロシン、又は４−ボロノ−２−（１８Ｆ）フルオロフェニルアラニンである項１１又は１２に記載のポジトロン放出核種標識タンパク質。【００２１】
項１４．ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸の製造方法であって、
以下の工程により、ポジトロン放出核種イオンとアミノ酸由来の反応前駆体との標識反応を行うための混合物を得ることを特徴とする方法：
（１）ポジトロン放出核種イオンを含む水溶液を陰イオン交換カラムに供し、ポジトロン放出核種イオンを該陰イオン交換カラムに吸着させる工程、
（２）クリプタンドを含む溶液を該陰イオン交換カラムに供しポジトロン放出核種イオンを脱着させ、ポジトロン放出核種イオン及びクリプタンドを含む混合溶液を回収する工程、
（３）該混合溶液を陽イオン交換カラムに供してクリプタンドを該陽イオン交換カラムに吸着させ、ポジトロン放出核種イオンが濃縮された濃縮混合溶液を回収する工程、
（４）上記濃縮混合溶液またはその留去後の残渣に反応前駆体を添加し、ポジトロン放出核種イオン、クリプタンド及び反応前駆体を含む混合物を得る工程。【００２２】
項１５．前記（３）の工程で回収した濃縮混合液に、該濃縮混合溶液の溶媒より沸点の高い溶媒を高沸点溶媒として添加し、該高沸点溶媒を添加した濃縮混合溶液の留去後の残渣を前記工程（４）に記載の留去後の残渣とする、項１４に記載の方法。【００２３】
項１６．標識に用いるポジトロン放出核種が１１Ｃ、１８Ｆ、又は１２４Ｉである、項１４又は１５に記載の方法。【００２４】
項１７．クリプタンドがカリウムイオンと錯形成している項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、２０種類の天然アミノ酸のうち１種類を、対応するポジ卜ロン標識アミノ酸に入れ替える方法等の従来法とは異なる、新たなポジトロン放出核種標識タンパク質合成方法を提供することができる。また本発明によれば、従来のポジトロン放出核種標識アミノ酸の合成法に比べ時間や工程数を減らし、回収率を向上できる新たな合成法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、従来の無細胞タンパク質合成試薬とポジトロン放出核種標識アミノ酸を用いてポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法を示す（日本国特許第５５９０５４０号）。Ａ：19種類の天然アミノ酸。Ｂ：通常のtRNAとその合成酵素(プロリン)。Ｃ：通常の無細胞タンパク質試薬及びリボソーム。Ｄ：ポジトロン標識タンパク質。１．18F標識アミノ酸（18F-フルオロプロリン）
【図２】本発明の方法を示す。Ａ：20種類の天然アミノ酸。Ｂ：通常の無細胞タンパク質試薬及びリボソーム。Ｃ：ポジトロン標識タンパク質。１．18F標識アミノ酸（18F-フルオロメチルチロシン）。２．フルオロチロシン-tRNA合成酵素。フルオロチロシンをtRNAに導入することが可能な改良型アミノアシルtRNA合成酵素。３．tRNA。フルオロチロシンtRNA合成酵素によりフルオロチオシンと結合するtRNA。４．終止コドンを導入した遺伝子（ATG-TAG-・・・）。非天然アミノ酸を導入したい位置に終止コドンを導入したDNA。
【図３】１８Ｆ−ＦＥＴを含むヒトＩＬ−８のアミノ酸配列を示す。
【図４】ゲルオートラジオグラフィーにおいて、１８Ｆ−ＦＥＴ−ＩＬ−８の合成結果を示す。
【図５】ゲルオートラジオグラフィーにおいて、変異型ｐＣＮＦ  ＲＳ、ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔの異なる濃度による１８Ｆ−ＦＥＴ−ＩＬ−８の合成結果を示す。
【図６】１８Ｆ−ＦＥＴを含むＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２のアミノ酸配列を示す。
【図７】ゲルオートラジオグラフィーにおいて、１８Ｆ−ＦＥＴ−ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の合成結果を示す。１８Ｆ−ＦＥＴを（Ａ）８．９  ＭＢｑ使用した場合と（Ｂ）４９２  ＭＢｑ使用した場合
【図８】ゲルオートラジオグラフィーにおいて、１８Ｆ−ＦＥＴ−  ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の放射化学純度を示す。
【図９】ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の細胞結合実験の結果を示す。
【図１０】ＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ−３移植ヌードマウスにおける１８Ｆ−ＦＥＴ−ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２  ＰＥＴ画像を示す。右側は非標識ＺＨＥＲ２：３４２投与によるＢｌｏｃｋｉｎｇ画像を示す。
【図１１】１８Ｆ−ＦＥＴのマイクロスケール標識合成操作の1例を示す。
【図１２】１８Ｆ−ＦＥＴの合成収率と反応溶媒量の関係を示す。（（Ａ）反応溶媒量と等量の１８Ｆ−フッ素イオンを含むメタノールを留去した後に前駆体溶液を添加して反応した場合。（Ｂ）３００μＬの１８Ｆ−フッ素イオンを含むメタノールを留去した後に前駆体溶液を添加して反応した場合。（Ｃ）３００μＬの１８Ｆ−フッ素イオンを含むメタノールにＤＭＳＯを添加して留去した後に前駆体溶液を添加して反応した場合（方法１）。（Ｄ）３００μＬの１８Ｆ−フッ素イオンを含むメタノールに前駆体溶液を添加して留去後反応して合成した場合（方法２）。
【図１３】分析ＨＰＬＣカラムによる１８Ｆ−ＦＥＴの迅速精製の例を示す。
【図１４】実施例７における結合性試験の結果を示す。
【図１５】１８Ｆ−ＦＥＴを含むZPD-L1のアミノ酸配列を示す。
【図１６】実施例８において合成したO-[18F]フルオロエチル-L-チロシン標識Affibody (HE-tag-ZＰＤ−Ｌ１＿１)のゲルオートラジオグラフィーの結果を示す。
【図１７】実施例９における結合性試験の結果を示す。
【図１８】実施例１０におけるＰＥＴイメージングの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法
本発明は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体を用いて、無細胞タンパク質合成系により、ポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する方法であって、
該無細胞タンパク質合成系が、タンパク質合成に関与する因子によって再構成された系であり、
該方法は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体として、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を用い、
該方法は、さらに、終止コドンが導入されたテンプレート核酸、
該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ、及び
該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いる、方法を提供する。
【００２８】
本明細書中において、「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」はいずれも「核酸」に包含される。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
【００２９】
本発明において、「タンパク質」及び「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いられる。また、本明細書において、「タンパク質」及び「ペプチド」は、特に言及しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。
【００３０】
本発明の方法は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸又はその誘導体として、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を原料として用いる。本発明において、「非天然アミノ酸」とは、アミノ酸又はその誘導体であって、２０種類の天然アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リシン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン）以外のものを意味し、典型的には、２０種類の天然アミノ酸に対応するｔＲＮＡに結合しないものを示す。本明細書において、ポジトロン放出核種で標識した非天然アミノ酸を、単に酸を単にポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸と示すことがある。ここで、ポジトロン（陽電子）とは、正の電荷を有する電子を示す。また、ポジトロン放出核種とは、ポジトロンを放出する能力を有する元素（放射性同位元素）を意味する。ポジトロン放出核種としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、１２４Ｉ等が挙げられ、１１Ｃ、１８Ｆ、１２４Ｉ等が好ましい。
【００３１】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸としては、特に限定されないが、例えば、ポジトロン放出核種標識された、メチルチロシン、エチルチロシン、フェニルアラニン等が挙げられる。より具体的には、例えば、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロメチル］チロシン、Ｏ−［（１８Ｆ）フルオロエチル］チロシン、又は４−ボロノ−２−（１８Ｆ）フルオロフェニルアラニンが挙げられる。
【００３２】
これらのポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸は、例えば、下記実施例に記載の方法に従い、製造することができる。また、下記実施例に具体的に示したもの以外のポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸についても、下記実施例の記載に基づき、同様の方法により製造することができる。ポジトロン放出核種の半減期が短いため、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸は使用現場で用事調製することが望ましい。
【００３３】
本発明の方法は、さらに、終止コドンが導入されたテンプレート核酸を用いる。テンプレート核酸に終止コドンを導入する方法としては、この分野において公知の方法（例えば、文献非特許文献５に記載の方法）に準じて適宜行うことができる。テンプレート核酸への終止コドンの導入の位置は特に限定されないが、典型的には、例えば、天然のタンパク質をコードする核酸配列のオープンリーディングフレームのフレームシフトを起こさない任意の位置へ終止コドンを挿入することができる。また、オープンリーディングフレーム上のチロシン残基を指定するコドンと終止コドンとを置換することもできる。かかる方法は、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸として、ポジトロン放出核種標識された、メチルチロシン、エチルチロシン等を用いる場合に好ましい。また、オープンリーディングフレーム上のフェニルアラニン残基を指定するコドンと終止コドンとを置換することもできる。かかる方法は、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸として、ポジトロン放出核種標識されたフェニルアラニン等を用いる場合に好ましい。終止コドンとしては、特に限定されないが、アンバー（ａｍｂｅｒ）コドン（ＵＡＧ）、オパール（ｏｐａｌ）コドン（ＵＧＡ）、オーカー（ｏｃｈｒｅ）コドン（ＵＡＡ）が挙げられ、アンバーコドン等が好ましい。テンプレート核酸に導入する終止コドンの数は特に限定されないが、例えば、テンプレート核酸の核酸配列１つに対し、1〜4個、好ましくは3個の終止コドンを導入することが好ましい。本発明の方法により得られる当該標識タンパク質は、タンパク質１分子に対し導入されるポジトロン放出核種標識アミノ酸の数が比較的少なくてもＰＥＴ等で検出できるため有用である。
【００３４】
本発明の方法は、さらに、前記テンプレート核酸に導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ、及び該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いる。テンプレート核酸に導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡとしては、前述した終止コドン（アンバー（ａｍｂｅｒ）コドン（ＵＡＧ）、オパール（ｏｐａｌ）コドン（ＵＧＡ）、オーカー（ｏｃｈｒｅ）コドン（ＵＡＡ）等、好ましくはアンバーコドン）を認識するものが挙げられる。
【００３５】
当該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、この分野において公知の方法、例えば、非特許文献１に記載の方法に基づき製造することができる。また、前記テンプレート核酸に導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡもこの分野において公知の方法、例えば、非特許文献２に記載の方法に基づき製造することができる。本発明の方法は、テンプレート核酸に導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡとこれに対応するアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用いることによって、目的とするタンパク質のうち所望の位置に、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を挿入することができる。本発明の方法における、テンプレート核酸に導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡの使用量は特に限定されないが、例えば、該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル-tRNA合成酵素(11〜33 μM)に対し、該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するtRNAは5 μM〜15 μMとなるよう配合することが好ましく、アミノアシル-tRNA合成酵素(22 μM)に対して、tRNAを5 μMとなるよう配合することがより好ましい。
【００３６】
本発明においては、上記ｔＲＮＡ及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素は、直交系ｔＲＮＡ及び直交系アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素であることが好ましい。本発明において、あるｔＲＮＡ及びアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素について「直交系」とは、当該ｔＲＮＡが、当該アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素以外の酵素からはアミノ酸を受け取らないことを意味する。
【００３７】
本発明の方法によれば、上記原料を用い、無細胞タンパク質合成系によりタンパク質を合成することによって、所望の位置でポジトロン放出核種標識されたタンパク質を得ることができる。
【００３８】
無細胞タンパク質合成系とは、大腸菌等の細胞を直接用いずに、試験管内で転写、翻訳という一連のタンパク質合成の流れを行う合成系である。無細胞タンパク質合成系は、細胞にとって毒性となるタンパク質を生産できるという利点を有する。
【００３９】
無細胞タンパク質合成系としては、この分野において公知のものを適宜使用することができる。より具体的には、無細胞タンパク質合成系としては、例えば、細胞大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞を破砕し、膜成分を遠心分離で除いた細胞抽出液を使用したものが挙げられる。細胞抽出液を使用した無細胞タンパク質合成系としては、ＲＴＳ  １００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  Ｋｉｔ  （ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ）、RYTS Kit (Protein Express)、無細胞くん（太陽日酸）等が挙げられる。
【００４０】
無細胞タンパク質合成系は、当該系を構成する因子として、タンパク質合成に必要な、標識されていないアミノ酸（典型的には、天然アミノ酸等）を含む。また、無細胞タンパク質合成系を構成する因子としては、例えば、転写／翻訳のための因子、酵素、反応系においてエネルギーを再生するための酵素、転写、翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素等のタンパク質成分が挙げられる。これらの因子は、それぞれタグを付けて（ラベルして）別々に調製されることが好ましい。そして、これらのタンパク質成分は、相互に付着し合う関係にある物質の一方でラベルされていることが好ましい。かかる実施形態においては、相互に付着し合う関係にある物質のうち他方の物質を吸着体として用いることにより、翻訳終了後に当該タンパク質成分を捕捉できるため好ましい。これにより、目的とするポジトロン放出核種標識タンパク質合成後、無細胞タンパク質合成系を構成する因子であるタンパク質成分をアフィニティークロマトグラフィー等により除去することができる（日本国特開２００３−１０２４９５参照）。
【００４１】
相互に付着し合う関係にある物質としては、例えば、タンパク質と金属イオンとの組合せ、抗原と抗体との組合せ、タンパク質又はペプチド断片との組合せ、タンパク質と特定のアミノ酸、ＤＮＡ、色素、ビタミン、レクチン等の低分子化合物との組合せ、タンパク質と糖との組合せ、タンパク質とイオン交換樹脂との組合せを挙げることができる。タンパク質と金属イオンとの組合せとしては、例えば、ヒスチジンタグとニッケル錯体又はコバルト錯体を挙げることができる。また、相互に付着し合う関係にある物質は、磁力により付着し合う物質であってもよい。
【００４２】
転写／翻訳のための因子、酵素としては、開始因子、延長因子、終結因子、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ及びＲＮＡポリメラーゼ等を挙げることができる。また、反応系においてエネルギーを再生するための酵素としては、例えば、クレアチニンキナーゼ、ミヨキナーゼ及びヌクレオシドジフォスフェートキナーゼを挙げることができる。転写、翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素としては、例えば、無機ピロフォスファターゼを挙げることができる。
【００４３】
本発明において、無細胞タンパク質合成系は、リボソーム、ＡＴＰ、ＧＴＰ、非天然アミノ酸等、緩衝液を構成する酸及び塩基等、タンパク質合成の分野において公知の試薬等をさらに含んでいてもよい。
【００４４】
本発明においては、無細胞タンパク質合成系としては、タンパク質合成に関与する因子（細胞等が有する酵素を生成したもの等）によって再構築された系を用いてもよい。
【００４５】
「再構成された無細胞タンパク質合成系」としては、例えば、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）を挙げることができる。ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）は大腸菌の抽出精製されたリボソーム、アミノ酸、ＮＴＰ、転写／翻訳のための因子、酵素から再構成されている。ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）では、リボソームタンパク質以外のすべてのタンパク質成分がヒスチジンタグで別々にタグ付けされている。合成終了後、リボソームタンパク質は限外濾過により除去され、他のタンパク質成分はヒスチジンタグ付加因子を利用して、アフィニティークロマトグラフィーにより除去される。  再構成された無細胞タンパク質合成系は、大腸菌以外のこの分野において公知の細胞（例えば、昆虫細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球）を原料として、ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（登録商標）と同様にして構成してものであってもよい。
【００４６】
本発明の方法は、上記無細胞タンパク質合成系において、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸、終止コドンが導入されたテンプレート核酸、該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ、及び該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を混合することにより行うことができる。
【００４７】
本発明におけるタンパク質合成の反応における温度は特に限定されないが、好ましくは３０℃である。本発明におけるタンパク質合成の反応時間は、特に限定されないが、好ましくは３０分〜１２０分である。ポジトロンは半減期が比較的短いため、短時間で合成時間が短くて済む本発明の方法は、ポジトロン放出核種標識されたタンパク質の合成方法として非常に有用である。
【００４８】
本発明によれば、反応系に、前記テンプレート核酸に予め終止コドンを認識するｔＲＮＡが存在するため、当該導入した終止コドンの位置でタンパク質合成反応は終了せず、当該位置に、当該ｔＲＮＡに結合したポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸が導入され、タンパク質合成がさらに進行する。そのため、所望の位置にポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸が導入された目的タンパク質を得ることができる。図２に、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸としてフルオロチロシンを用いた、本発明の典型的な実施形態の概略を示す。
【００４９】
本発明の方法を用いることによって種々のタンパク質を合成することができる。目的とするタンパク質の分子量は特に限定されないが、例えば、分子量が10 kDa〜100 kDaのタンパク質を製造することができる。本発明においては、比較的低分子のペプチド（例えば、分子量が7kDa〜10 kDa）を製造することもできる。
【００５０】
本発明は、目的とするタンパク質をコードする標的テンプレート核酸に終止コドンを挿入し、当該終止コドンの位置にポジトロン放出核種標識アミノ酸を導入するため、目的のタンパク質のアミノ酸配列に依存せず、任意のアミノ酸配列のタンパク質に対しポジトロン放出核種標識アミノ酸を導入することができる。また、本発明によれば、ポジトロン核種放出標識アミノ酸をごく微量しか用いなくても、ポジトロン放出核種標識アミノ酸を導入し、得られたポジトロン放出核種標識タンパク質を検出できるため有用である。本発明においては、前述した無細胞タンパク質合成系中の、ポジトロン核種放出標識アミノ酸の濃度は、０．５〜７ナノモル／Ｌであることが好ましく、１〜５ナノモル／Ｌであることがより好ましい。
【００５１】
ポジトロン放出核種標識タンパク質合成キット
本発明は、以下の構成要素を含む、ポジトロン放出核種標識タンパク質を無細胞タンパク質合成系で合成するためのキット：
１）ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸
２）終止コドンが導入されたテンプレート核酸
３）該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ
４）該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を提供する。
【００５２】
当該キットに含まれる、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸；終止コドンが導入されたテンプレートＤＮＡ；該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ；及び該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素としては、前述の通りである。
【００５３】
本発明のキットは、リポソーム、ＡＴＰ、ＧＴＰ、非天然アミノ酸等、緩衝液を構成する酸及び塩基等、タンパク質合成の分野において公知の試薬等をさらに含んでいてもよい。また、本発明のキットは、上記タンパク質合成方法を行うための手順を書き記した書面を含んでいてもよい。
【００５４】
ポジトロン放出核種標識タンパク質合成装置
本発明は、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸、終止コドンが導入されたテンプレートＤＮＡ、該導入された終止コドンを認識しかつ該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸に結合するｔＲＮＡ及び該ｔＲＮＡと該ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸とを結合させるアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を用い、無細胞タンパク質合成系によりポジトロン放出核種標識タンパク質を合成する手段を有する、ポジトロン放出核種標識タンパク質合成装置を提供する。また、本発明の装置も、上記タンパク質合成方法を行うための手順を書き記した書面を含んでいてもよい。
【００５５】
また、本発明は、上記本発明の方法を利用したＰＥＴ診断用薬剤あるいは試験用薬剤の製造方法も提供する。また、本発明は、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を１以上含む、ポジトロン放出核種標識タンパク質を提供する。かかるポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を含むポジトロン放出核種標識タンパク質は、前述した本発明の方法によりはじめて得ることができる。
【００５６】
ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸の製造方法
また、本発明は、ポジトロン放出核種標識アミノ酸の新たな合成方法も提供する。より具体的には、本発明は、非限定的な好ましい実施形態として、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸の製造方法であって、
以下の工程により、ポジトロン放出核種イオンと非天然アミノ酸由来の反応前駆体との標識反応を行うための混合物を得ることを特徴とする方法を提供する：
（１）ポジトロン放出核種イオンを含む水溶液を陰イオン交換カラムに供し、ポジトロン放出核種イオンを該陰イオン交換カラムに吸着させる工程、
（２）クリプタンドを含む溶液を該陰イオン交換カラムに供しポジトロン放出核種イオンを脱着させ、ポジトロン放出核種イオン及びクリプタンドを含む混合溶液を回収する工程、
（３）該混合溶液を陽イオン交換カラムに供してクリプタンドを該陰イオン交換カラムに吸着させ、ポジトロン放出核種イオンが濃縮された濃縮混合溶液を回収する工程、
（４）上記濃縮混合溶液またはその留去後の残渣に反応前駆体を添加し、ポジトロン放出核種イオン、クリプタンド及び反応前駆体を溶解する無水有機溶媒を、前記標識反応を行うための混合物として得る工程。
【００５７】
本発明の方法によれば、ポジトロン放出核種標識タンパク質の合成の原料となるポジトロン放出核種標識アミノ酸を合成する標識反応を２０μＬ以下といった微量な溶液で行うことができる。また本発明では、クリプタンドの必要以上の濃縮とその結果としての標識反応阻害を回避することができ、標識効率（標識体の取得率や量）を向上することができる。本発明は、特に留去の繰り返しとその結果としての標識効率（標識体の取得率や量）の低下に対し、留去工程数を少なくすることができ、標識効率の向上のほか、合成に要する時間を短くすることができる。
【００５８】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、まず、ポジトロン放出核種イオンの水溶液を陰イオン交換カラムに供する工程を含む。当該カラムへの吸着と後の工程における脱着とによって、ポジトロン放出核種イオンを濃縮でき、それにより当該イオンを含む水溶液（緩衝液）の容量を少量に抑えることが可能である。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、次に、クリプタンドを含む溶液を該陰イオン交換カラムに供して、ポジトロン放出核種イオンを脱着させ、ポジトロン放出核種イオン及びクリプタンドを含む混合溶液を回収する工程を行ってもよい。本発明においては、「クリプタンド」とは、特に明記しない限り、２つ以上の環からなる多座配位子と、多座配位子とイオンとが錯体形成したものとの総称を示す。クリプタンドとしては、例えば、クリプトフィックス２．２．２（登録商標）とカリウムイオンとが錯形成したものが使用例として挙げられる。陰イオン交換カラムに吸着されたポジトロン放出核種イオンの脱着に、クリプタンドを含む溶液を同カラムに供することで行うことから、クリプタンドの必要以上の濃度上昇を抑えることができる。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態においては、さらに、該混合溶液を陽イオン交換カラムに供してクリプタンドを該陽イオン交換カラムに吸着させ、ポジトロン放出核種イオンが濃縮された濃縮混合溶液を回収する工程を行ってもよい。当該濃縮混合溶液には、ポジトロン放出核種イオン、及び上記工程で該陽イオン交換カラムに吸着されなかったクリプタンドが含まれる。ポジトロン放出核種イオンとクリプタンドを含む画分としての陰イオン交換カラムからの回収物を、さらに陽イオン交換カラムに供して大部分のクリプタンドを除去し、ポジトロン放出核種が濃縮されたクリプタンドとの混合溶液を得ることで、過剰なクリプタンドの存在による様式反応阻害を防ぐことができる。また、本発明は、該混合溶液を陽イオン交換カラムに供する工程の後、当該工程で得られた濃縮混合溶液に反応前駆体を添加する工程の前に、当該濃縮混合溶液に、溶媒及び／又はクリプタンドを添加する工程を含んでいてもよい。本発明においては、適宜溶媒及び／またはクリプタンドを追添加することで、クリプタンドの濃度を標識反応に適したものに調整することができる。
【００６１】
本発明は、上記濃縮混合溶液またはその留去後の残渣に反応前駆体を添加する工程を含む。本発明においては、イオン交換カラムを使用して、ポジトロン放出核種イオンとクリプタンドとを含む画分が回収される。これに非天然アミノ酸由来の反応前駆体の添加を経て無水有機溶媒に溶解された状態とすることで、標識反応に供する混合物となる。反応前駆体はアセトニトリルに代表される無水の有機溶媒に溶けた溶液として調製することが好ましい。反応前駆体としては、メチルチロシン、エチルチロシン、フェニルアラニン等のアミノ酸（好ましくはエチルチロシン等）に対し、トシル基、トリチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基からなる群より選択される少なくとも一種（好ましくはこれらの全て）が置換した化合物等が挙げられる。反応前駆体は、ポジトロン放出核種イオンとクリプタンドを含む画分、またはその溶媒を留去して得られる残渣のいずれに添加してもよい。本発明によれば、上記濃縮混合溶液またはその留去後の残渣に反応前駆体を添加することによって、無水有機溶媒中に、ポジトロン放出核種イオン、クリプタンド及び反応前駆体を含む混合物を、標識反応を行うための原料として得ることができる。上記工程で得られるポジトロン放出核種イオン、クリプタンド及び反応前駆体を含む混合物において、クリプタンドの含有量は、１０〜８０ミリモル／Ｌであることが好ましく、２０〜４０ミリモル／Ｌであることがより好ましい。上記工程で得られる当該混合物におけるクリプタンドと反応前駆体との含有量比は特に限定されないが、例えば、クリプタンド１モルに対し、反応前駆体が０．１〜１．５モルであることが好ましく、０．２〜１モルであることがより好ましい。
【００６２】
本発明では、反応前駆体を添加する前に、ポジトロン放出核種イオンとクリプタンドを含む画分に対し、同画分の溶媒の沸点よりも高い沸点を有する溶媒（これを本発明では高沸点溶媒と呼ぶ）を添加し、高沸点溶媒を添加した画分を留去して残渣を得、該残渣に反応前駆体を添加しても良い。高沸点溶媒を添加した留去工程を加えることで、高収量のポジトロン放出核種標識アミノ酸を得ることができる。本発明において、高沸点溶媒の添加量は当該画分と等量であることが好ましい。また本発明において高沸点溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ、Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に代表される非プロトン性極性溶媒から選択することが好ましい。
【００６３】
本発明においては、前述の工程において得られるポジトロン放出核種イオン、クリプタンド及び反応前駆体を含む混合物を原料として、クリプタンドの存在下で、ポジトロン放出核種イオンと反応前駆体とを反応させることにより、ポジトロン放出核種標識非天然アミノ酸を製造することができる。本発明により、標識反応を行うための混合物として、ポジトロン放出核種イオン、クリプタンド及び反応前駆体を溶解する無水有機溶媒を得て以降の工程は、非特許文献２に記載の内容を例に、同標識反応として当業者が通常行う処理を行って、最終的にポジトロン放出核種標識アミノ酸を得ればよい。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６５】
実施例１：Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識ＩＬ−８の合成
本実施例で合成したタンパク質はヒトＩＬ−８である。大腸菌由来の無細胞タンパク質合成試薬で合成するため、シグナル配列を除き開始コドンのメチオニンを追加した。これは、ポジトロン放出核種標識タンパク質の合成方法（日本国特許第５５９０５４０号）で使用されている。このオリジナルのＤＮＡテンプレートであるｐＥＴ−２８ａ  ＩＬ−８（Ｍｅｔ＋２８−９９）の開始コドン（ＡＴＧ）の後ろにアンバーコドン（ＴＡＧ）を導入したＤＮＡを作成し、本実施例のテンプレートＤＮＡ（ｐＥＴ−２８ａ  ＩＬ−８  ＴＡＧ）として用いた。合成されるアミノ酸配列を図３に示す。したがって、Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン（１８Ｆ−ＦＥＴ）はこのアンバーコドンでのみ組み込まれることによりＩＬ−８は選択的に標識される。【００６６】
１．  Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識ＩＬ−８の合成
方法及び材料
無細胞タンパク質合成試薬にはＲＴＳ  １００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  Ｋｉｔ  （ｂｉｏｔｅｃｈｒａｂｂｉｔ）を使用した。テンプレートＤＮＡは前述したアンバーコドンを含むｐＥＴ−２８ａ  ＩＬ−８  ＴＡＧを使用した。古細菌Ｍ．Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の変異型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｎ−Ｈｉｓ−ｐＣＮＦ  ＲＳ）は大腸菌により発現させ、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製により調製した（非特許文献１）。直交系ペアのｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔはＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．による委託ＲＮＡ合成により入手した（非特許文献２）。本実施例では、１．５  ｍＬチューブに以下の表１のように上記の試薬を混合し、３０℃で３０〜１２０分間反応させた。ネガティブコントロールとして、ｐＣＮＦ  ＲＳ，  ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔ，  ｐＥＴ−２８ａ  ＩＬ−８  ＴＡＧを含まない試料を同様に調製した。反応液１０μＬをＮｕＰＡＧＥＴＭ  ＬＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＮｕＰＡＧＥＴＭ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔを含む）と混合し、ＮｕＰＡＧＥＴＭ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌを用いて電気泳動を行い（２００  Ｖ，  ３０分）、ゲルをイメージングプレート（ＢＡＳ−ＩＰ  ＭＳ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に一晩コンタクトし、ＦＬＡ−９５００にてオートラジオグラフィー像を得ることで１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＩＬ−８の合成を確認した。【００６７】
【表１】
2019098291.tif 000003
【００６８】
結果
１．  Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識ＩＬ−８の合成
図４に示されるように、レーン１、２、３、４で、時間依存的なＯ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識ＩＬ−８のバンドの増加が認められた。一方、ネガティブコントロールのレーン５  （ｐＣＮＦ  ＲＳ，  ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔを除き、ｐＥＴ−２８ａ  ＩＬ−８  ＴＡＧの代わりにｐＥＴ−２８ａ  ＩＬ−８を加えた反応液）、レーン６  （ｐＣＮＦ  ＲＳを除いた反応液）、レーン７  （ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔを除いた反応液）、レーン８（ｐＣＮＦ  ＲＳ，  ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔを除いた反応液）では同位置にバンドは確認されなかった。以上のことから、ｐＣＮＦ  ＲＳ、ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｏｐｔ、ＴＡＧ（アンバーコドン）を含むテンプレートＤＮＡを用いることで１８Ｆ−ＦＥＴを選択的に導入した蛋白質が合成可能であることが示された。【００６９】
２．  変異型ｐＣＮＦ  ＲＳ、ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔの最適濃度の検討
方法及び材料
ｐＣＮＦ  ＲＳ  を０−３０μＭ、ｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔを０−１５μＭの濃度で表１の試薬を混合し、３０℃で１２０分間反応させた。反応液１０μＬをＮｕＰＡＧＥＴＭ  ＬＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＮｕＰＡＧＥＴＭ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔを含む）と混ぜ、ＮｕＰＡＧＥＴＭ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｅｌを用いて電気泳動を行い（２００  Ｖ，  ３０分）、ゲルをイメージングプレートに一晩コンタクトし、ＦＬＡ−９５００にてオートラジオグラフィー像を得た。【００７０】
結果
図５に示されるように、ｐＣＮＦ  ＲＳの濃度が２２μＭ（０．８  ｍｇ／ｍＬ）でｔＲＮＡ  ＣＵＡｏｐｔが５μＭで反応させた場合、合成量が最大になることが示された。【００７１】
実施例２：Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２）の合成
Ａｆｆｉｂｏｄｙは分子量６  −７ｋＤａでＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを母核として作成された小分子タンパク質リガンドであり、ＺＨＥＲ２：３４２は乳癌に高発現しているＨＥＲ２を標的として作成されたＡｆｆｉｂｏｄｙであり（図６）、小動物ＰＥＴイメージングが報告されている（非特許文献３）。精製を簡略化するために、肝臓への集積を低減化させたＨＥ−ｔａｇを導入したＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を本実施例で合成した。【００７２】
方法及び材料
Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔによる委託ＤＮＡ合成により、ｐＥＴ−２１ａ  ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を得た。このテンプレートＤＮＡの開始コドン（ＡＴＧ）の後ろにアンバーコドンＴＡＧを導入した、ｐＥＴ−２１ａ  ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２  ＴＡＧを実施例２のテンプレートＤＮＡとして使用した。実施例１で最適化した濃度で、以下の表２あるいは表３の組成に試薬を混合し、３０℃で３０〜１２０分間反応させ、ゲルオートラジオグラフィーを実施した。【００７３】
【表２】
2019098291.tif 000004
【００７４】
【表３】
2019098291.tif 000005
【００７５】
結果
１．  Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２）の合成
図７に示されるように、レーン１、２、３、４において時間依存的な１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２のバンドの増加が認められた。また、高放射能（４９２  ＭＢｑ）の１８Ｆ−ＦＥＴをＲｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ＲＴＳ  ｋｉｔ）に溶解させ、それを用いて固体の試料（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｌｙｓａｔｅ，  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ，  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＲＴＳ  ｋｉｔ））を溶解させ、反応させたところ３０分でも高い収率で１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を得ることに成功した。【００７６】
実施例３：Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２）の精製
ポジトロン放出各種は半減期が短い短半減期各種であるため、迅速な精製法が求められる。１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２は、ＨＥ−ｔａｇが含まれているため市販のＨｉｓ−ｔａｇ精製の原理でスピンカラムやカートリッジカラムなどを利用し、精製することができる。また、ｐＣＮＦ  ＲＳがＨｉｓ−ｔａｇを有しているが、低濃度のイミダゾールを用いることで１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２と分離することが可能である。最終的に、溶媒を動物などに投与可能な注射液にする必要があるため、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化されたＮＡＰ−５  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩することで高純度な１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２得ることができる。【００７７】
方法及び材料
反応液を６０℃で５分間反応させ、遠心分離（２０，０００  ｇ，  １０分）を行い、上清を回収した。その上清をＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＰＢＳ，  ｐＨ  ７．４）で０．６  ｍＬに希釈し、あらかじめ平衡しておいたＨｉｓ  ＳｐｉｎＴｒａｐ  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加え溶出し、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒでカラムを洗浄後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  （５０  ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含むＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で溶出した。溶出した試料をあらかじめＰＢＳであらかじめ平衡化しておいたＮＡＰ−５により脱塩を行い、１  ｍＬの１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を得た。得られた試料の放射能量をキュリーメーターで測定し、放射化学収率を計算した。また、得られた試料をＮｕＰＡＧＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）−オートラジオグラフィー（ＡＲＧ）で分析することにより放射化学純度を算出した。【００７８】
結果
ＮｕＰＡＧＥ−ＡＲＧの結果、シングルバンドで放射能のバンドが検出され、放射化学純度が＞９９％と算出された（図８）。【００７９】
実施例４：Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２）のＨＥＲ２陽性細胞（ＳＫＯＶ−３）への結合性試験
本発明により合成された１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の結合性を評価した。【００８０】
方法及び材料
１２ウェルプレートで培養したＳＫＯＶ−３細胞に０．２９６  ＭＢｑ／ｍＬの濃度に調製した１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を加え、３７℃で１時間反応させた。非特異的結合量は、非標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２（１５μｇ／ｍＬ）存在下で結合量を測定することで算出した。反応後、薬液を取り除き、培地で２回洗浄した。最後に、０．１Ｍ  ＮａＯＨを１  ｍＬ加え、細胞を溶解させ、エッペンチューブに回収し、その放射能量をγカウンター（Ａｌｏｋａ）で測定することで結合量を求めた。コントロール細胞としてＨＥＫ２９３を使用した。【００８１】
結果
図９に示されるように、コントロールのＨＥＫ２９３細胞と比べて、ＨＥＲ２陽性細胞のＳＫＯＶ−３で高い結合が認められ、非標識体でその結合が完全にブロッキングされたことから、この結合は特異的結合であることが示された。【００８２】
実施例５
Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２）のＨＥＲ２陽性細胞株（ＳＫＯＶ−３）を移植したヌードマウスにおけるＰＥＴイメージングにより、本発明により合成された１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２のＩｎ  ｖｉｖｏでの結合性を評価した。【００８３】
方法及び材料
ＨＥＲ２陽性細胞株（ＳＫＯＶ−３）細胞を１．１×１０８個／０．２  ｍＬをヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ／ｎｕ，  日本クレア，  ８週齢）の左腋窩に移植し、１〜２ヶ月後に使用した。ＰＢＳで製剤化した１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を３．３±０．２  ＭＢｑ静脈投与し、小動物ＰＥＴ（Ｃｌａｒｖｉｖｏ  ＰＥＴ／ＣＴ，  島津株式会社）を用いて１２０分間のダイナミック撮影を行った。また、Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特異的結合を評価するために、非標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２（２５０μｇ）を先に静脈投与し、その後１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を投与し、２時間後に３０分間のスタッティック撮影を行った。１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の腫瘍への集積は、ＡＭＩＤＥを用いて解析した。【００８４】
結果
図１０に示されるように、ＨＥＲ２陽性細胞株（ＳＫＯＶ−３）を移植した部位に顕著な１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の集積を認めた。また、非標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２投与前に処置することで１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の集積は有意に減少した。したがって、Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるトレーサーの集積は特異的結合であることが示され、本発明で合成したＯ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２）  Ｉｎ  ｖｉｖｏで機能することが示された。【００８５】
実施例６：O-[18F]フルオロエチル-L-チロシン（18F-FET）の標識合成方法（１）
図１１に示すように、サイクロトロンで製造された１８Ｆ−フッ素イオン水溶液（１．５〜２ｍＬ）を用いて以下に示す２０μＬスケールの手順にて１８Ｆ−ＦＥＴを合成した。
１．１８Ｆ−フッ素イオン水（１．５〜２ｍＬ）を連結したＯａｓｉｓ  ＭＡＸ＋ＭＣＸカートリッジに通し、その後ＭｅＯＨ（２ｍＬ）でカートリッジを洗った。
２．Ｋ．２２２／ＫＨＣＯ３−ＭｅＯＨ（２０ｍＭ、２００μＬ）およびＭｅＯＨ（１００μＬ）で１８Ｆ−フッ素イオンを反応バイアル（３００μＬ）に回収した。
３．回収したＭｅＯＨ溶液にＫ．２２２／ＫＨＣＯ３−ＭｅＯＨ（２０ｍＭ、５、１０、２０μＬ）と等容量のＤＭＳＯを添加し、８５℃のブロックヒータに入れてＨｅ（２００ｍＬ／ｍｉｎ）を１０分間流してＭｅＯＨを留去した。
４．等容量の前駆体（Ｌ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｏ−（２−ｔｏｓｙｌ−ｏｘｙｅｔｈｙｌ）−Ｎ−ｔｒｉｔｙｌ，ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ  ｅｓｔｅｒ、ＡＢＸ）のアセトニトリル溶液（１２ｍｇ／ｍＬ、１８ｍＭ）を反応バイアルに添加し、約２分間Ｈｅを流してＭｅＣＮを留去した。
５．次にキャップで完全に封をして加熱した（８５℃、５分）。
６．反応液にＨＣｌ（２Ｍ、３０μＬ）を加え、キャップで封をして脱保護反応を行った（１２０℃、１０分）。
７．バイアルを氷水に浸け冷却後、反応液にＫＦ（１Ｍ、３０μＬ）およびメイロン（４０μＬ）を添加した。
８．反応液をＨＰＬＣ分析用ＯＤＳカラムに注入し、１８Ｆ−ＦＥＴを含むフラクションを集めた（例えばＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ、１５０ｘ４．６ｍｍ、溶離液：エタノール／５０ｍＭ酢酸、２．０ｍＬ／ｍｉｎ）。
ロータリエバポレータで溶離液を留去し、適当な溶媒に精製した１８Ｆ−ＦＥＴを溶解して無細胞合成に供した。【００８６】
方法（２）
上記方法（１）の操作３において、等量のＤＭＳＯに代わり等量の前駆体溶液を、操作４で前駆体溶液に代わり等量のアセトニトリルを用いる。その他の操作は方法（１）と同じである。【００８７】
１．  １８Ｆ−フッ素イオンのメタノール溶液の調製
Ｋ．２２２／Ｋ＋を捕捉する陽イオン交換カートリッジには入手が容易な市販のものを用いた。ポリマー系の容量の違う２つのＯａｓｉｓ  ＭＡＸカートリッジ（１０  ｍｇ、３０  ｍｇ）とシリカ系のＳｅｐ−Ｐａｋ  ＣＭ  Ｌｉｇｈｔ（１３０  ｍｇ）をＫ．２２２／Ｋ＋の漏出率と１８Ｆ−フッ素イオンの回収率の点から比較検討した。表４に示す結果から明らかなように、Ｏａｓｉｓ  ＭＡＸ（１０  ｍｇ）とＭＣＸ（３０  ｍｇ）の組合せが最適であった。【００８８】
【表４】
2019098291.tif 000006
【００８９】
２．１８Ｆ−ＦＥＴのマイクロスケール標識合成
図１２に示すように、通常のメタノール留去で得られた収率（（Ｂ）ので示される収率）に比べ、新たに開発した方法（１）と（２）のいずれにおいても１８Ｆ−ＦＥＴの合成収率は改善され、２つの方法で得られた合成収率には実質的な差はほとんど見られなかった。この結果から１０μＬスケールまでは十分な収量を与える実用的な方法であることが示された。これらのマイクロスケール合成法は１８Ｆ−ＦＥＴに限らず、他の多くの１８Ｆ−標識プローブ合成に応用可能である。表５は代表的な１８Ｆ−プローブの合成を２０μＬスケールで実施した例である。方法（２）は前駆体が不安定でメタノール留去中に分解する場合は収率が大幅に低下し適さないが、方法（１）は前駆体の安定性に左右されず高い収率を与え汎用的な方法である。【００９０】
【表５】
2019098291.tif 000007
【００９１】
３．分析カラムによる迅速精製
図１３に示すように、１０μＬスケールで合成された１８Ｆ−ＦＥＴは分析用のカラムでも十分に高い化学的、放射化学的純度で分離精製され、溶出に要した時間は６分以内であった。また、分取した液量は約１ｍＬと少なく、その後のロータリエバポレータによる乾固操作も迅速であった。出発した１８Ｆ−フッ素イオンに基づく１８Ｆ−ＦＥＴの放射化学的収率は４０〜５０％（減衰補正した値）であり、ＨＰＬＣ精製を含めた合成に要した時間は４０分であり、マイクロスケール合成の実用性を示すものであった。【００９２】
実施例７：[１８Ｆ]ＳＦＢ標識ＺＨＥＲ２：３４２との比較結合試験
１８Ｆの蛋白質標識法としてよく利用されている[１８Ｆ]ＳＦＢを用いてＺＨＥＲ２：３４２を標識し、ＨＥＲ２に対する結合性を本発明の方法で合成した１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２と比較した。【００９３】
方法及び材料
ＺＨＥＲ２：３４２ (2 mg/mL)０．１ｍＬ、 [１８Ｆ]ＳＦＢ（３４８ＭＢｑ）エタノール溶液０．１ｍＬ、４０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）０．５ｍＬを混合させ、５０℃で１０分間反応させた。反応後、実施例３と同様にＨｉｓＳｐｉｎＴｒａｐで精製し、溶出した試料をあらかじめＰＢＳであらかじめ平衡化しておいたＮＡＰ−５により脱塩を行い、１ｍＬの１８Ｆ−ＦＳＢ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２を（３ＭＢｑ）得た。既存のＳＦＢ標識したＺＨＥＲ２：３４２と本発明の標識法で標識したＺＨＥＲ２：３４２を比較するために、実施例４と同様にＨＥＲ２陽性細胞（ＳＫＯＶ−３）への結合性試験を行った。【００９４】
結果
標識されていないＺＨＥＲ２：３４２と標識されたＺＨＥＲ２：３４２の区別が困難なため正確な比放射能は算出不可だが、出発原料と回収された放射能量から比放射能を計算すると>0.259 GBq/μmolと推定された。本発明はこれと比較すると>18.5 GBq/μmolと極めて高い比放射能が実現できることを示唆している。また細胞結合試験の結果、図１４に示すように１８Ｆ−ＦＳＢ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の特異的結合量と比較して、１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の結合量は極めて高いことが示されている。【００９５】
実施例８：O-[18F]フルオロエチル-L-チロシン標識Affibody (HE-tag-ZＰＤ−Ｌ１＿１)の合成
Affibodyは分子量6 -7kDaでProtein Gを母核として作成された小分子タンパク質リガンドであり、現在様々な標的に対して作成されている。本実施例では、免疫チェックポイントのProgrammed cell Death ligand 1(PD-L1)を標的としたZPD-L1(WO2017072280A1)について合成した。また、N末端側のメチオニンの次にFETを導入したもの(M1_H3insFET)と、Y12をFETに置換したもの(Y12FET)を設計し、標識部位の異なる２つの[18F]FET- ZPD-L1について検討した(図１５)。【００９６】
方法及び材料
Genescriptによる委託DNA合成により鋳型DNAを得た。異なる部位にTAGを導入したpET-21a HE-tag-ZPD-L1を使用し、実施例2で最適化した濃度で試薬を混合し、30℃で30分間反応させた。精製は実施例2と同様に実施し、ゲルオートラジオグラフィーにより分析した。【００９７】
結果
ＮｕＰＡＧＥ−ＡＲＧの結果、精製後にいずれのFET導入部位においても[18F]FET-ZPD-L1のバンドが検出され（図１６）、任意の部位に[18F]FETを導入することが可能であることが示された。【００９８】
実施例９：Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２）のPD-L1陽性細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）への結合性試験
本発明により合成された１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２の結合性を評価した。【００９９】
方法及び材料
２４ウェルプレートで培養したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に０．２５０  ＭＢｑ／ｍＬの濃度に調製した１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺPD-L１_１M１_H３InsFETあるいは１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺPD-L１_１Y１２YETを加え、３７℃で１時間反応させた。非特異的結合量は、非標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２（２０μｇ／ｍＬ）存在下で結合量を測定することで算出した。反応後、薬液を取り除き、培地で２回洗浄した。最後に、０．１Ｍ  ＮａＯＨを１  ｍＬ加え、細胞を溶解させ、エッペンチューブに回収し、その放射能量をγカウンター（Ａｌｏｋａ）で測定することで結合量を求めた。【０１００】
結果
図１７に示されるように、いずれの部位にFETを導入した１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺPD-L１_１もMDA−MB−２３１細胞に対して特異的結合が認められ、その差はなかった。【０１０１】
実施例１０
Ｏ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺＰＤ−Ｌ１＿１）のMDA−MB−２３１細胞を移植したヌードマウスにおけるＰＥＴイメージングにより、本発明により合成された１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺPD−L1_1のＩｎ  ｖｉｖｏでの結合性を評価した。【０１０２】
方法及び材料
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を１．０×１０6個／０．２  ｍＬをヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１−ｎｕ／ｎｕ，  日本クレア，  ８週齢）の左腋窩に移植し、１ヶ月後に使用した。ＰＢＳで製剤化した１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺPD−L1_1を１．８  ＭＢｑ静脈投与し、小動物ＰＥＴ（Ｃｌａｒｖｉｖｏ  ＰＥＴ／ＣＴ，  島津株式会社）を用いて１２０分間のダイナミック撮影を行った。１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺPD−L1_1の腫瘍への集積は、ＡＭＩＤＥを用いて解析した。【０１０３】
結果
図１８に示されるように、MDA−MB−２３１を移植した部位に顕著な１８Ｆ−ＦＥＴ標識ＨＥ−ｔａｇ−ＺＰＤ−Ｌ１＿１の集積を認めた。したがって、本発明で合成したＯ−［１８Ｆ−フルオロエチル］−Ｌ−チロシン標識Ａｆｆｉｂｏｄｙ  （ＨＥ−ｔａｇ−ＺPD−L1_1）  もＨＥ−ｔａｇ−ＺＨＥＲ２：３４２同様Ｉｎ  ｖｉｖｏで機能することが示された。
【図１】
2019098291.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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