(57)【要約】  ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分として含有する組成物は、IV型アレルギーの予防又は改善に有効であり、特に、接触性皮膚炎の予防もしくは改善のための飲食品、医薬品、飼料、化粧品として使用することができる。
2019208151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするIV型アレルギーの予防又は改善のための組成物。
【請求項２】
接触性皮膚炎の予防又は改善のための請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
乳酸菌がイチジク由来の乳酸菌である請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
組成物が飲食品組成物である請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が医薬組成物である請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
組成物が飼料組成物である請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が化粧品組成物である請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はIV型アレルギー用組成物に関する。さらに詳細には、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするIV型アレルギー、特に接触性皮膚炎の予防又は改善のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の変化、大気汚染の悪化、アレルゲン物質、金属性装飾物への曝露などの様々な原因により、花粉症やアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などのアレルギーの著しい増加が指摘されている。アレルギーは免疫反応に基づく生体に対する全身的又は局所的な障害とされている。そして、アレルギーには、血中抗体による液性免疫反応に基づくI、II及びIII型アレルギーと、感作リンパ球による細胞性免疫反応に基づくIV型アレルギーに大別される。IV型アレルギーは、遅延型アレルギー、細胞性免疫、ツベルクリン型とも呼ばれ、抗原と特異的に反応する感作T細胞によって起こるとされている。IV型アレルギーでは、抗原と反応した感作T細胞から、マクロファージを活性化する因子などの様々な生理活性物質が遊離し、周囲の組織傷害を起こすとされている。IV型アレルギーには、ツベルクリン反応、接触性皮膚炎などがあり、この種のアレルギーの皮内反応は、通常、抗原皮内注射24〜48時間後、発赤、硬結となって現れる。【０００３】
このようなアレルギーに対して用いられる薬物としては、抗ヒスタミン剤、ステロイド薬などがある。しかしながら、これらの薬物は種々の副作用を示すことが指摘されていて、必ずしも安全とはいえない。【０００４】
こうした状況のなか、近年では、免疫反応に関与し抗アレルギー作用を有する乳酸菌が安全性の高い抗アレルギー素材として注目されている。例えば、ラクトバチルス・ブレビスなどのIgE抗体産生を抑制する乳酸菌（特許文献１）、ヒスタミン遊離抑制効果を有するラクトバチルス・ロイテリ（AD0002株）の乳酸菌（特許文献２）、腸管免疫又はI型ヘルパーT細胞を賦活するエンテロコッカス・フェシウム乳酸菌（特許文献３及び４）、Th1免疫増強作用とTh2免疫抑制作用を有するラクトバチルス・パラカゼイKW3110株の乳酸菌（非特許文献１）などが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平０９−２９５９号公報
【特許文献２】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献３】特開２００６−６７８８１号公報
【特許文献４】特開２００６−１０４１０７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】International archives of allergy and immunology 2004;  135:    205-215
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような背景技術下においては、乳酸菌を有効成分とする新たなアレルギー用組成物の開発が望まれている。したがって、本発明は、IV型アレルギー、特に接触性皮膚炎の予防もしくは改善に有効な、乳酸菌を有効成分とする新たな組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、本発明は、IV型アレルギー、特に接触性皮膚炎の予防もしくは改善のための新たな組成物を開発することを目的として鋭意検討した結果、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌及びそれが産生する多糖類が、マウス接触性皮膚炎モデルに対する抑制作用を有し、IV型アレルギー、特に接触性皮膚炎を予防もしくは改善する作用があることを見出し、この知見に基づき更に研究を重ねて本発明を完成した。【０００９】
本発明の一つの局面では、本発明は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするIV型アレルギーの予防又は改善のための組成物に関する。
本発明の組成物は、接触性皮膚炎の予防又は改善のために好ましく使用することができる。
本発明の組成物においては、乳酸菌はイチジク由来の乳酸菌であるのが好ましく、特に、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌が好ましい。
本発明の組成物においては、乳酸菌の培養物若しくは発酵物は、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物が好ましい。
本発明の組成物においては、乳酸菌が産生する多糖類としては、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体、あるいは、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体が挙げられる。
本発明の組成物は飲食品組成物が好ましく、飲食品としては、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントが好ましく挙げられる。
また、本発明の組成物は、医薬組成物が好ましい。
さらには、本発明の組成物は、飼料組成物及び化粧品組成物が好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の組成物は、マウス接触性皮膚炎モデルに対する抑制作用を有し、IV型アレルギーの予防又は改善に有効であり、特に接触性皮膚炎の予防又は改善のために使用することができる。本発明の組成物は、接触性皮膚炎などのIV型アレルギーの予防又は改善のための飲食品、医薬品、飼料、化粧品として使用することができる。そして、本発明の組成物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするため、安全性が高く、長期適用が可能であり、また、安価に大量供給が可能であり、その有用性及び実用性は極めて高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の顕微鏡写真である。図１の（Ａ）がグラム染色顕微鏡写真、（Ｂ）が走査型電子顕微鏡（SEM）写真である。
【図２】図２は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の多糖類の陰イオン交換クロマトグラフィー（TOYOPEARL DEAE−650M樹脂 (東ソ−株式会社)）による分離プロファイルである。0 mM〜500 mM の勾配濃度のNaCl（破線）で多糖類を溶出させ、各画分中の多糖類をフェノール硫酸法により490 nmでモニターした（直線）。
【図３】図３は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の多糖類を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製して得られた中性多糖体を、プロトン-NMR及びカーボン-NMRに付して得られたそれぞれのNMRプロファイルを示す。図３の（Ａ）がプロトン-NMRのNMRプロファイルであり、（Ｂ）がカーボン-NMRのNMRプロファイルである。
【図４】図４は、NMRプロファイルからの中性多糖体の構造解析結果を示す。この構造解析結果から、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の中性多糖体は、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかとなった。
【図５】図５は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の菌体又は多糖類をマウス接触性皮膚炎モデルに経口投与した場合の、接触性皮膚炎に対する抑制作用を示すグラフ(Tukey検定)である。
【図６】図６は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の菌体又は多糖類をマウス接触性皮膚炎モデルに経口投与した場合の、接触性皮膚炎に対する抑制作用を示すグラフ(Welchの方法によるt検定)である。
【図７】図７は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の菌体又は多糖類をマウス接触性皮膚炎モデルに塗布した場合の、接触性皮膚炎に対する抑制作用を示すグラフ(Tukey検定)である。
【図８】図８は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の菌体又は多糖類をマウス接触性皮膚炎モデルに塗布した場合の、接触性皮膚炎に対する抑制作用を示すグラフ(Welchの方法によるt検定)である。
【図９】図９は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株による発酵パイナップル果汁をマウス接触性皮膚炎モデルに経口投与した場合の、接触性皮膚炎に対する改善作用を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株が産生する酸性多糖体及び中性多糖体をマウス接触性皮膚炎モデルに経口投与した場合の、接触性皮膚炎に対する改善作用を示すグラフである。
【図１１】図１１は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株が産生する酸性多糖体及び中性多糖体をマウス接触性皮膚炎モデルに経口投与した場合の、マウス接触性皮膚炎モデルにおける炎症性サイトカインIL-4の発現に対する抑制作用を示すグラフである。
【図１２】図１２は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株が産生する酸性多糖体及び中性多糖体をマウス接触性皮膚炎モデルに経口投与した場合の、マウス接触性皮膚炎モデルにおける血清中のIgEレベルの上昇に対する抑制作用を示すグラフである。
【図１３】図１３は、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株が産生する酸性多糖体及び中性多糖体をマウス接触性皮膚炎モデルに経口投与した場合の、マウス接触性皮膚炎モデルの耳介での炎症の様子について顕鏡観察を行った結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明で提供される、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするIV型アレルギーの予防又は改善のための組成物について詳細に説明する。
１．本発明で対象とする乳酸菌
本発明で対象とする乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌であり、イチジク由来の乳酸菌が好ましい。具体的には、本発明により、イチジクの葉から単離同定されたLactobacillus paracasei IJH-SONE68株が挙げられる。この菌株は、2016年4月19日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-02242として国内寄託され、その後にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、2017年5月26日にNITE BP-02242として国際寄託の受託番号が付与されている。
【００１３】
Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株は、図１の写真に示すように、カタラーゼ陰性のグラム陽性桿菌で、かつ、白色コロニー形成性を有し、条件的ヘテロ乳酸発酵の特性を持つという菌学的性質を有する。さらには、多糖類を産生する能力を有している。
【００１４】
本発明では、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株と同等の乳酸菌も対象とする。ここで、同等の乳酸菌とは、Lactobacillus paracasei に属する乳酸菌であって、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株と同様に、IV型アレルギー、特に接触性皮膚炎を改善する作用を有する乳酸菌を指す。これらの同等の乳酸菌は、例えば、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株に対して突然変異、遺伝子組換え等の通常の変異処理技術を行うことによって得ることができ、また、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
【００１５】
２．本発明の有効成分
本発明の組成物は、上記した乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分として含む。
乳酸菌は、通常用いられるMRS培地やその修正培地等を用いて、液体静置培養等の通常用いられる培養方法により培養することができる。乳酸菌は、パイナップル属植物の果汁又はその抽出物の存在下で培養することにより、その増殖を促進することができ（国際公開第WO2011/046194号）、また、酒粕、酒粕抽出物又は酒粕の酵素分解物の存在下で培養することによっても、その増殖を促進することができる（特開平3-172171号公報、特開平5-15366号公報及び特許第2835548号公報）。乳酸菌を培養後、得られた培養物をそのまま有効成分として用いてもよく、得られた培養液を希釈又は濃縮して用いてもよく、培養物から回収した菌体を用いてもよい。また、本発明の効果を損なわない限り、培養後に加熱、及び凍結乾燥等の種々の追加操作を行うこともできる。また、乳酸菌の菌体は、その細胞表層に多糖類を付着している生菌体であっても死菌体であってもよく、生菌体及び死菌体の両方であってもよい。死菌体は、破砕物であってもよいが多糖類をその表層に付着していることが望ましい。また、乳酸菌の発酵物は、通常、栄養源としてグルコースなどを用い、必要に応じて、酵母エキス、パイナップル属植物の果汁、酒粕、焼酎粕等の植物乳酸菌の増殖促進物質を更に添加して、発酵させて得ることができる。
【００１６】
乳酸菌が産生する多糖類は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の培養物から、通常の方法により分離精製して得ることができる。具体的には、例えば、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の培養物から遠心分離により菌体を除去し、得られた培養物から、エタノールやアセトン等を用いて多糖類を沈殿させて得ることができる。また、イオン交換クロマトグラフィーによって、さらに分離精製して得ることもできる。このようにして得られる乳酸菌が産生する多糖類には、中性多糖体及び酸性多糖体がある。
【００１７】
本発明においては、乳酸菌が産生する多糖類としては、具体的には、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体、あるいは、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体が挙げられる。この中性多糖体は、後述する実施例２に記載するように、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株の培養物から得られる多糖類を陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離精製することにより得ることができる。この中性多糖体は、図３に示すプロトン-NMR及びカーボン-NMRのNMRプロファイルから、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかとなった。また、Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株は、主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体を菌体外に分泌する。より具体的には、この酸性多糖体は、グルコース、マンノース、ガラクトース及びラムノースから構成され、それらの組成比は、おおよそ10:170:2:1である。
【００１８】
３．本発明の組成物
本発明の組成物は、飲食品組成物、医薬組成物、飼料組成物、化粧品組成物などの各種の形態で用いることができる。
【００１９】
飲食品組成物の飲食品としては、特に制限されず、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料、これらの飲料の濃縮原液、調製用粉末等；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、グミ、シリアル、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、及び焼き菓子等の菓子類；加工乳、乳飲料、発酵乳、ドリンクヨーグルト、バター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；ピューレなどの食品；その他機能性食品等が例示される。また、飲食品は、サプリメントであってもよく、例えば、顆粒状、粉末状、タブレット状のサプリメントであってもよい。
【００２０】
上記のような飲食品は、飲食品の原料に乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を添加することにより製造することができ、あるいは通常の飲食品と同様にして製造することができる。乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類の添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行ってもよい。添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飲食品が製造されてもよい。そのような飲食品としては、乳酸菌飲料、発酵乳などの発酵食品等が挙げられる。
【００２１】
飲食品組成物における乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、飲食品の態様によって適宜設定されるが、通常、飲食品組成物中に、1×106〜１×1012cfu/g又は1×106〜１×1012cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×107〜１×1011cfu/g又は1×107〜１×1011cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/gまたはcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、飲食品組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、さらには0.01重量％以上含まれるのが好ましい。
【００２２】
医薬組成物は、通常、乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を、通常使用される生理的に許容される液体又は固体の製剤担体に配合し製剤化して使用される。医薬組成物の剤形は特に制限されず、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。
【００２３】
本発明の医薬組成物の製剤における乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、剤形、用法、対象の年齢、性別、疾患の種類、疾患の程度、及びその他の条件等により適宜設定されるが、通常、1×106〜１×1012cfu/g又は1×106〜１×1012cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×107〜１×1011cfu/g又は1×107〜１×1011cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/gまたはcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、医薬組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、0.01重量％以上含まれるのが好ましい。
【００２４】
本発明の医薬組成物の投与時期は特に限定されず、適用対象に応じて、適宜投与時期を選択することができる。また、予防的に投与してもよく、維持療法に用いてもよい。投与形態は製剤形態、投与対象の年齢、性別、その他の条件、投与対象の症状の程度等に応じて適宜決定されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、いずれの場合も1日1回又は複数回に分けて投与することができ、また、数日又は数週間に1回の投与としてもよい。
【００２５】
飼料組成物の飼料としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。このような飼料は、一般的な飼料、例えば、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、乳清（ホエイ）、にがり、鉱物質飼料、酵母類等に乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を混合することにより製造することができる。また、例えば、サイレージの場合のように、添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飼料が製造されてもよい。製造された飼料は、一般的な哺乳動物、家畜類、養魚類、愛玩動物等に経口的に投与することができる。また、養魚類の場合には、乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を添加した発酵物を養魚場に撒く方法を採用することもできる。
【００２６】
飼料組成物における乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、飼料の態様や適用対象によって適宜設定されるが、1×106〜１×1012cfu/g又は1×106〜1×1012cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×107〜1×1011cfu/g又は1×107〜1×1011cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/gまたはcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、飼料組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、さらには0.01重量％以上含まれるのが好ましい。
【００２７】
本発明の化粧品組成物の化粧品としては、例えば、石けん、ボデイーシャンプー、クレンジングクリーム、洗顔料等の洗浄料；化粧水（ローション）、バニシングクリーム、コールドクリーム、エモリエントクリーム、マッサージクリーム等のクリーム；乳液、美容液等が挙げられる。これらの化粧品に通常使用される材料に、本発明の乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を添加することにより、本発明の化粧品組成物を得ることができる。
【００２８】
本発明の化粧品組成物においては、例えば、鶏等の鳥類の卵を割卵し卵黄を分離して得た液状の卵白に本発明の乳酸菌を添加して発酵させることにより得られる乳酸菌の発酵卵白を用いるのが好ましい。このような乳酸菌の発酵は、一般的に栄養源としてグルコースなどを用い、かつ、必要に応じて、酵母エキス、パイナップル果汁、酒粕、焼酎粕等の植物乳酸菌の増殖促進物質を添加して、発酵させるのがよい。乳酸菌の発酵卵白の形態は、配合する化粧品に応じて、例えば、液状、粉末状、クリーム状、ペースト状、ゼリー状等が挙げられる。
【００２９】
本発明の化粧品組成物に用いる乳酸菌の菌体又はその培養物若しくは発酵物の含有量は、化粧品の態様や適用対象によって適宜設定されるが、1×106〜1×1012cfu/g又は1×106〜1×1012cfu/mlの範囲内で菌体が含まれるような含有量が好ましく、1×107〜1×1011cfu/g又は1×107〜1×1011cfu/mlの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌体の場合、cfu/g又はcfu/mlは、個細胞/g又は個細胞/mlと置き換えることができる。例えば、乳酸菌の発酵卵白の場合には、発酵卵白の含有量は、乳酸発酵卵白の乾物換算で通常0.001重量％以上、更には0.01重量％以上とするのが好ましい。乳酸菌が産生する多糖類の場合には、化粧品組成物中に、多糖類の重量換算で通常0.001重量％以上、0.01重量％以上含まれるのが好ましい。
【００３０】
４．本発明の組成物の用途
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類は、マウス接触性皮膚炎に対する抑制作用を有し、IV型アレルギー、特に接触性皮膚炎を抑制する作用を有する。また、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類は、炎症性サイトカインIL-4の発現及び血清IgEレベルの上昇を抑制し、炎症症状を抑制することができる。したがって、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類は、接触性皮膚炎、アレルギー性脳炎、アトピー性皮膚炎、過敏性肺炎、結核性空洞、癩やサルコイドーシスの類上皮細胞性肉芽腫病変、天然痘・麻疹の発疹などのIV型アレルギーの予防又は改善に用いることができる。特に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類は、接触性皮膚炎に対する抑制作用を有するため、薬品などの皮膚接触によるアレルギー性接触性皮膚炎等の予防又は改善に用いることができる。また、本発明の組成物は、IV型アレルギーの予防又は改善に有効であることから、特に、健康維持や健康増進用の飲食品の素材として利用することができる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。【００３２】
実施例１
乳酸菌の分離及び同定
１． 乳酸菌サンプルの分離
イチジク(品種「とよみつ姫」)の葉、茎、および果実を選択し、殺菌済みピンセットとハサミを用いて2〜3 mmに細断片化した後、滅菌済のMRS液体培地入りの試験管に5〜6個ずつの細片を入れ、28℃および37℃にて、乳酸菌の標準培地であるMRS培地が濁る (増殖する) まで静置培養した。ちなみに、乳酸菌候補株の増殖が目視できるまでに2〜4日間を要した。
上記乳酸菌候補株の各培養液の一部をMRS寒天培地上にディスポーザブルループで線画塗菌後、静置培養を行った。寒天培地上に形成されたコロニーのうち、「色、つや、形状の異なるもの」を全てピックアップし、フレッシュなMRS寒天培地上に線画塗菌を行い、コロニーを純化した。
純化された各コロニーに対し、カタラーゼ酵素の産生の有無を検証するため、H2O2テストを行った。これは、10%のH2O2溶液に菌体を曝した際に起こる、カタラーゼが存在すれば生成する酸素の発生の有無を観察する試験法である。ちなみに、乳酸菌はカタラーゼを産生しない。
イチジクからの探索分離を試みた結果、イチジクの葉を分離源としたものから、カタラーゼ陰性を示す乳酸菌候補株を1株得ることができた。【００３３】
２． 分離株の同定
上記乳酸菌候補株をMRS液体培地で改めて培養し、遠心により菌体を取得した。細胞壁溶解酵素で処理した後, DNAzol試薬を使用し、ゲノムDNAを抽出した。
Lane, D. J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics、pp.115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester : Wileyに記載された方法にしたがって、ゲノムDNAを鋳型として、27fプライマーおよび1525rプライマーを用いたPCR反応により16S rDNA部分を増幅させ、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit（マッハライ・ナーゲル社製）により、アガロースゲルより目的断片を回収した。塩基配列決定のためのダイターミネーター法によるシークエンス反応は, Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3.1（ThermoFisher Scientific社製）にて行い、ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer（ThermoFisher Scientific社製）にて解析した。解析した16S rDNAの塩基配列に対してBLAST programによる相同性検索を行い、DNA data bank（DDBJ/EMBL/GenBank）のデータベースと比較することで、分離株の分類学的同定を行った。【００３４】
イチジクの葉より分離された乳酸菌候補株を、IJH-SONE68株と命名し、DNA data bank（DDBJ/EMBL/GenBank）に既に登録されている「Lactobacillus paracasei R094」の菌株で塩基配列のaccession番号が「NR_025880」である塩基配列と100%一致したため、Lactobacillus paracaseiと同定した。
この菌株は、2016年4月19日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物センター（〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に受託番号NITE P-02242として国際寄託され、その後にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管されて、2017年5月26日にNITE BP-02242として国際寄託の受託番号が付与されている。【００３５】
３．分離同定された乳酸菌の菌学的性質
分離同定された上記乳酸菌IJH-SONE68株は、図１の写真に示すように, カタラーゼ陰性のグラム陽性桿菌で、かつ、白色コロニー形成性を有し、条件的ヘテロ乳酸発酵の特性を有するとともに、多糖類を産生する能力を有していた。【００３６】
４．分離同定された乳酸菌の糖類の資化能力
（１）資化能力の試験方法
IJH-SONE68株の49種類の糖類に対する資化能力について以下の試験方法により調べた。
IJH-SONE68株をMRS液体培地で増殖の定常期まで静置培養した。遠心して得られた菌体を適量のsuspension medium (ビオメリュー社製) で洗浄した後、最終的に2 mLのsuspension mediumに懸濁した。この一部を、5 mLのsuspension mediumに加えてマクファーランド濁度が2になる量 (n) を求めた。続いて, API 50 CHL培地 (ビオメリュー社製) に2nの菌液を添加し、これをAPI 50 CHLキット (ビオメリュー社製、各ウェルの底にはそれぞれ49種類の糖が塗り付けられている) の各ウェルへ分注した。最後にミネラルオイルを重層し、滅菌水を入れたトレイにセットした。37℃で48時間培養した後に、各ウェルにおける色調の変化を観察することで、資化能の有無の判定を行った。【００３７】
５．資化能力の試験結果
IJH-SONE68株の49種類の糖類に対する資化能力を調べた結果は、表１に示したとおりである。【００３８】
【表１】
2019208151.tif 000003
【００３９】
実施例２
１． IJH−SONE68株が産生する多糖類の分離精製
IJH−SONE68株が産生する多糖類を以下の方法で分離精製した。
IJH−SONE68株をMRS液体培地で増殖の定常期まで静置培養した。この培養液5 mLを種培養液とし、5 Lの多糖類産生用半合成培地 (その組成は後述する) に植菌した後、37℃で120時間静置培養した。培養液を4℃に冷却した後、培養液上清中に含まれるタンパク質を変性させて、後のステップで沈殿として除去するために、202.5 mLの100%トリクロロ酢酸水溶液を加え、混和した後に30分間静置した。遠心によって沈殿を取り除き、回収した上清に等量のアセトンを加えて混和した後、4℃で一晩静置させることによって、IJH−SONE68株が産生する多糖体を沈殿させた。沈殿物を遠心によって回収した後、250 mLの70%エタノールで沈殿物の洗浄を行った。沈殿物を風乾させた後、75 mLの50 mM Tris−HCl buffer (pH 8.0) を加えて1時間混和することで、沈殿物を溶解させた。遠心によって不溶性の夾雑物を取り除いた後、回収した上清に対し、それぞれ750 μLの1 mg/mL DNase溶液 (Worthington社) および1 mg/mL RNase溶液 (ナカライテスク社) を加え、37℃で8時間反応させた。続いて750 μLの2 mg/mL proteinase K溶液 (和光純薬工業社製) を加え、37℃で16時間反応させた。反応後の溶液を4℃に冷却した後、添加した各酵素を変性させ、次の遠心で沈殿として除去するために、8.75 mLの100%トリクロロ酢酸水溶液を加えて混和し、4℃で1時間静置した。遠心によって沈殿物を取り除き、得られた上清に対し262.5 mLの100%エタノールを加え、しっかりと混和した後、遠心によってIJH−SONE68株が産生する多糖類を沈殿物として回収した。50 mLの70%エタノールで沈殿物を洗浄した後に風乾させ、適量 (約25 mL) の精製水を加えて4℃で一晩静置することで、多糖類を溶解させた。溶解後の多糖類サンプルは、10,000 MWCOの限外濾過ユニット (メルク社) を用い、溶媒を精製水に置換しながら、回収したサンプル中の単糖類などの小分子を取り除いて、精製された多糖類サンプルを得た。【００４０】
精製した多糖類サンプルを、予め50 mM Tris−HCl buffer (pH 8.0) で平衡化したTOYOPEARL DEAE−650M樹脂 (東ソ−株式会社) を充填したオープンカラム (2.5 × 22 cm) にアプライし、中性多糖画分と酸性多糖画分に分離精製するためのカラムワークを行った。溶液は同bufferを用い、流速は1 mL/minで固定した。また、溶出液は6 mLごとに異なる試験管に回収した。まず、開始から240分までの間は同bufferで溶出させた (試験管番号1-40)。次に、240分の時点から600分の時点までは、同bufferを用いた0-500 mM NaClの濃度勾配を作り、溶出を続けた (試験管番号41-100)。カラム分離スぺクトルを図２に示す。試験管に溶出させた全てのサンプルに対し、フェノール硫酸法 (後述する) によって多糖類の存在を確認した後、該当する試験管内の溶液をそれぞれ中性多糖画分、酸性多糖画分として取りまとめた。それぞれの画分は10,000 MWCOの限外濾過ユニットを用い、溶媒を精製水に置換しながら、回収したサンプル中の単糖類などの小分子を取り除いた。
以上により、IJH−SONE68株が産生する多糖類として中性多糖画分および 酸性多糖画分が分離精製された。【００４１】
多糖類産生用半合成培地はKimmel SA、Roberts RF. Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR. Int. J. Food Microbiol.、40、87-92 (1998) に記載された培地を以下のように改変した。【００４２】
多糖類産生用半合成培地  [g/L]
Glucose                  20
Tween 80                 1.0
Ammonium citrate         2.0
Sodium acetate           5.0
MgSO4・7H2O               0.1
MnSO4・5H2O               0.05
K2HPO4                    2.0
Bacto casitone           10.0
Vitamine Soln.                2 mL
Trace element Soln.           1 mL【００４３】
Vitamine Soln.           [g/L]
4−aminobenzoic acid      0.05
Biotin                    0.001
Folic acid                0.025
Lipoic acid               0.025
Nicotinic acid            0.1
Pantothenic acid          0.05
Pyridoxamin−HCl          0.25
Vitamine B12              0.05
Pyridoxine                0.025
Riboflavin                0.05
Thiamine                  0.1【００４４】
Trace element Soln.は、Kets EPW, Galinski EA, de Bont JAM. Carnitine: a novel compatible solute in Lactobacillus plantarum. Arch. Microbiol., 192, 243-248 (1994) に記載されており、その組成は以下のとおりである。【００４５】
Trace element Soln.        [g/L]
25% HCl                        10 mL
FeCl2・4H2O                 1.5
CoCl2・6H2O                 0.19
MnCl2・4H2O                 0.1
ZnCl2                        0.07
H3BO3                        0.006
Na2MoO4・2H2O               0.036
NiCl2・6H2O                 0.024
CuCl2・2H2O                 0.002【００４６】
フェノ−ル硫酸法（DuBois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F., Colorimetric method for determination of sugars and related substances., Anal. Chem., 28, 350-356 (1956)）【００４７】
30 μLの対象サンプルと等量の5 w/v %フェノール水溶液を混和した後、150 μLの濃硫酸を加えて混和させ、反応を開始させる。10分後に直ちに氷冷し、反応を停止させる。反応液の490 nmにおける吸光度を測定することで、糖類の濃度を測定した。なお、濃度の決定には、グルコースを標品として同実験を行うことで作製した検量線を用いた。【００４８】
２．菌体外中性多糖体の構造解析
上記した陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（TOYOPEARL DEAE−650M樹脂 (東ソ−株式会社)）によって精製された中性多糖体を、プロトン-NMRおよびカーボン-NMRに付し、得られたそれぞれのNMRプロファイルを図３に示した。これらのNMRプロファイルからの中性多糖体の構造解析結果を図４に示した。
この構造解析結果から、IJH−SONE68株が産生する菌体外中性多糖体は、N−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有することが明らかになった。【００４９】
３．菌体外酸性多糖の糖組成分析
上記した陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製された酸性多糖体の糖組成分析を高速液体クロマトグラフ（HPLC）法で測定することにより行った。
精製された酸性多糖体(7.3 mg/mL)10μLと水60μLを混合して7倍希釈試料溶液を調製し、試験管に調製した希釈試料溶液20μLを採取し、減圧乾固し、2 mo1/Lトリフルオロ酢酸100μLを添加して溶解し、窒素置換、減圧封管、100℃で6時間加水分解し、次いで減圧乾固した。得られた残澄に水200μLを添加して溶解し、0.22μmのフィルターでろ過して測定用試料溶液を得、測定用試料溶液を水で10倍希釈して希釈測定用試料溶液を得た。これらの測定用試料溶液および希釈測定用試料溶液50μLを分析した。分析機器として、HPLCシステム:LC-20Aシステム(株式会社島津製作所)および分光蛍光光度計M-10AxL(株式会社島津製作所)を用いた。分析条件は以下の通りであった。
カラム:TSK-gel Sugar AXG 4.6 mmI.D.×15 cm(東ソー株式会社)
カラム温度:70℃
移動相:0.5 mo1/Lホウ酸カリウム緩衝液、pH 8.7
移動相流速:0.4 mL/min
ポストカラム標識:反応試薬:l w/v %アルギニン・3  w/v %ホウ酸
反応試薬流速:0.5 mL/min
反応温度:150℃
検出波長:Ex.320 nm  Em.430 nm【００５０】
菌体外酸性多糖体より調製した試料のクロマトグラムおよび各単糖類の検量線データを求め、検量線より菌体外酸性多糖の構成糖の試料中濃度を求めた。得られた結果を表２に示した。【００５１】
【表２】
2019208151.tif 000004
【００５２】
実施例３
IJH-SONE68株の経口投与によるマウス接触性皮膚炎モデルに対する抑制作用
実施例１で得られたIJH−SONE68株の乳酸菌菌体、並びにIJH−SONE68株の乳酸菌が産生する実施例２で得られた多糖類を経口投与した場合の、マウス接触性皮膚炎に対する抑制作用を以下に記載する方法で調べた。【００５３】
１．試験方法
（１）マウス試験用サンプルの調製
IJH-SONE68株を、MRS培地で48時間培養し、得られた培養液から遠心により菌体を回収し、精製水に再懸濁したものをマウス試験用のサンプルとした(約1×1012 cfu/mL相当)。この状態のものを生菌体用のサンプルとして、また121℃、20分の条件で加熱殺菌処理したものを死菌体用のサンプルとして用いた。
一方, 本株をmodified-SDM培地で培養した際に得られる培養液上清から、本株の産生する細胞外多糖体を実施例２に記載の方法で精製したもの（実施例２の中性多糖画分と酸性多糖画分の混合物）を細胞外多糖類投与群へ供した (濃度：1 mg/mL)。【００５４】
（２）試験で用いた試薬
ピクリルクロライドは東京化成工業株式会社のものを購入して使用した。【００５５】
（３）方法
動物は雄性BALB/cA Jcl系マウス (7週齢、日本クレア：入荷時) を用いた。マウスは、飼育ケージで5匹飼いとし、温度：20〜26℃、湿度：40〜60％、照明時間：12時間 (8：00〜20：00) の環境に調節された動物飼育室で飼育し、餌は固型飼料MF (オリエンタル酵母株式会社) を自由摂取させた。また飲水に関しては、精製水を自由に摂取させた。
マウス搬入後、7日間馴化した。馴化飼育後、次のように群分けを行った (群A: コントロール群; 群B: IJH-SONE68株生菌体懸濁液投与群; 群C: IJH-SONE68株死菌体懸濁液投与群; 群D: IJH-SONE68株由来細胞外多糖体投与群)。この時点をDay 0とし、マウスにはサンプルをDay 0から1回/日の頻度で14日間連続経口投与を行った。なお、1日あたりの投与容量は0.20 mL/匹とした。【００５６】
Day 6に、全てのマウスに対し、両手足 (20 μL)、胸腹部 (100 μL)および背部 (100 μL) にそれぞれ7 w/v %ピクリルクロライド溶液を塗布することによってマウスに抗原情報を記憶させた。Day 14に、マウス右耳介の厚さを予めノギスによって測定しておき、その後、右耳介の裏表に1 w/v %ピクリルクロライド溶液を20 μLずつ塗布することによって、アレルギー反応を惹起させた。24時間後 (Day 15)、耳介の厚さを測定し、惹起前後での違い (Δ耳介厚 [mm]) を各群間で比較した。データは平均値±標準誤差で示し、群間の有意差検定にはTukey検定、若しくはWelchの方法によるt検定を用い、危険率 (p値) が0.05未満で有意差有りと判定した。
以上の方法により、マウス接触性皮膚炎モデルに対する各サンプルの抑制作用の有無を評価した。【００５７】
２．試験結果
各群におけるΔ耳介厚を表３に示した。【００５８】
【表３】
2019208151.tif 000005
【００５９】
また、図５(Tukey検定)および図６（Welchの方法によるt検定)にも示した。図５から、コントロール群と比較して、群Cおよび群Dで炎症に起因する耳介厚の増加が有意に抑制される (p＜0.05) ことが確認された。また、図６から、コントロール群と群Bのみを比較した場合、耳介厚の増加が抑制される傾向にある (p＜0.1) ことが確認された。
以上の結果から、IJH-SONE68株菌体ならびに本株によって産生される細胞外多糖体を抗原感作前後で反復経口投与した場合、ピクリルクロライドにより誘導される接触性皮膚炎モデルの症状を改善することが示された。【００６０】
実施例４
IJH-SONE68株が産生する多糖類の塗布によるマウス接触性皮膚炎モデルに対する抑制作用
実施例１で得られたIJH−SONE68株の乳酸菌が産生する実施例２で得られた多糖類を塗布した場合の、マウス接触性皮膚炎に対する抑制作用を以下に記載する方法で調べた。【００６１】
１．試験方法
（１）マウス試験用サンプルの調製
IJH-SONE68株をmodified-SDM培地で培養した際に得られる培養液上清から、本株の産生する細胞外多糖体を実施例２の方法で精製したものを実験に供した (1 mg/mL)。なお, 既存の抗炎症薬の比較対照として用いたグリチルリチン酸二カリウム水溶液も同濃度とした。【００６２】
（２）試験で用いた試薬
ピクリルクロライドは東京化成工業株式会社のものを購入して使用した。【００６３】
（３）方法
動物は雄性BALB/cA Jcl系マウス (7週齢、日本クレア：入荷時) を用いた。マウスは、飼育ケージで5匹飼いとし、温度：20〜26℃、湿度：40〜60％、照明時間：12時間 (8：00〜20：00) の環境に調節された動物飼育室で飼育し、餌は固型飼料MF (オリエンタル酵母株式会社) を自由摂取させた。また飲水に関しては、精製水を自由に摂取させた。
マウス搬入後、7日間馴化した。馴化飼育後、次のように群分けを行った (群A: コントロール群; 群B: グリチルリチン酸二カリウム塗布群; 群C: 未分割EPS（実施例２で得られた中性多糖画分と酸性多糖画分の混合物）塗布群; 群D: 中性EPS（実施例２で得られた中性多糖画分）塗布群; 群E: 酸性EPS（実施例２で得られた酸性多糖画分）塗布群)。この時点をDay 0とし、全てのマウスに対し、両手足 (20 μL) および 胸部 (150 μL) にそれぞれ7 (w/v) %ピクリルクロライド溶液を塗布することによってマウスに抗原情報を記憶させた。【００６４】
Day 6に、マウス右耳介の厚さを予めノギスによって測定しておき、その後、右耳介の裏表に1 (w/v) %ピクリルクロライド溶液を20 μLずつ塗布することによって、 アレルギー反応を惹起させた。塗布より2時間後、各群のマウス右耳介の裏表両面に対し、各サンプルを20μLずつ塗布した。更に18時間後 (Day 7)、耳介の厚さを測定し、惹起前後での違い (Δ耳介厚 [mm]) を各群間で比較した。データは平均値±標準誤差で示し、群間の有意差検定にはTukey検定、若しくはWelchの方法によるt検定を用い、危険率 (p値) が0.05未満で有意差有りと判定した。
以上の方法により、マウス接触性皮膚炎モデルに対する各サンプルの抑制作用の有無を評価した。【００６５】
２．試験結果
各群におけるΔ耳介厚を表４に示した。【００６６】
【表４】
2019208151.tif 000006
【００６７】
また、図７(Tukey検定)および図８（Welchの方法によるt検定)にも示した。図７から、コントロール群と比較して、B群およびD群で炎症に起因する耳介厚の増加が抑制される傾向にある (p＜0.1) ことが確認された。また、図８から、コントロール群と各群とを個別に比較した場合, 耳介厚の増加が有意に抑制される (p＜0.05) ことが確認された。
以上の結果から、IJH-SONE68株によって産生される細胞外多糖類の炎症部位への塗布により、ピクリルクロライドにより誘導される接触性皮膚炎モデルの症状を改善することが示された。【００６８】
実施例５
IJH-SONE68株の発酵液によるマウス接触性皮膚炎モデルに対する改善作用
実施例１で得られたIJH−SONE68株の発酵パイナップル果汁を経口投与した場合の、マウス接触性皮膚炎に対する改善作用を以下に記載する方法で調べた。【００６９】
１．試験方法
動物は雄性BALB/cA Jcl系マウス (7週齢、日本クレア：入荷時) を用いた。マウスは、飼育ケージで5匹飼いとし、温度：20〜26℃、湿度：40〜60％、照明時間：12時間 (8：00〜20：00) の環境に調節された動物飼育室で飼育し、餌は固形飼料MF (オリエンタル酵母株式会社) を自由摂取させた。また、飲水に関しては、精製水を自由に摂取させた。マウス搬入後、7日間馴化した。馴化飼育後、次のように群分けを行った。【００７０】
群A: 陽性コントロール群 (滅菌蒸留水投与群)
群B: 未発酵パイナップル果汁投与群
群C: IJH-SONE68株による発酵パイナップル果汁原液投与群
群D: IJH-SONE68株による発酵パイナップル果汁原液の10倍希釈液投与群
群E: IJH-SONE68株による発酵パイナップル果汁原液の100倍希釈液投与群【００７１】
ここで、発酵パイナップル果汁原液とは、IJH-SONE68株を100%パイナップル果汁 (1 w/v %の焼酎蒸留残渣を含む) で48時間培養して得られた発酵液のことを指す。この原液を滅菌蒸留水で10倍に希釈したものを10倍希釈液とし、100倍に希釈したものを100倍希釈液とした。【００７２】
上記の群分けを行った時点をDay 0とし、マウスには上記の各サンプルをDay 0から1回/日の頻度で14日間連続経口投与を行った。なお、1日あたりの投与容量は0.20 mL/匹とした。Day 6に、全てのマウスに対し、両手足 (20 μL)、胸腹部 (100 μL)および背部 (100 μL) にそれぞれ7 w/v %ピクリルクロライド溶液を塗布することによって、マウスに抗原情報を記憶させた。Day 13に、マウス右耳介の厚さを予めノギスによって測定しておき、その後、右耳介の裏表に1 w/v %ピクリルクロライド溶液を20 μLずつ塗布することによって、アレルギー反応を惹起させた。その24時間後 (Day 14に該当)に、耳介の厚さを測定し、惹起前後での違い (Δ耳介厚（mm）) を各群間で比較した。データは平均値±標準誤差で示し、群間の有意差検定にはTukey-Kramer法を用い、危険率 (p値) が0.05未満で有意差有りと判定した。
以上の方法により、マウス接触性皮膚炎モデルに対する各サンプルの改善作用の有無を評価した。【００７３】
２．試験結果
各群におけるΔ耳介厚を表５および図９に示した。【００７４】
【表５】
2019208151.tif 000007
【００７５】
表５および図９から分かるように、陽性コントロール群 (群A) と比較して、発酵果汁投与群 (群C) で炎症に起因する耳介厚の増加が有意に抑制される (p＜0.05) ことが確認された。また、発酵果汁の希釈サンプルである群Dおよび群Eではコントロール群と比較して増加の値は低かった。また、未発酵のパイナップル果汁投与群である群Bでは、全く改善効果は認められなかった。以上の結果から、IJH-SONE68株で発酵させたパイナップル果汁の反復経口投与によって、ピクリルクロライドにより誘導される接触性皮膚炎モデルの症状が予防・改善されることが示された。【００７６】
実施例６
IJH-SONE68株が産生する酸性多糖体および中性多糖体のマウス接触性皮膚炎モデルに対する改善作用
IJH−SONE68株が産生する酸性多糖体および中性多糖体のマウス接触性皮膚炎モデルに対する改善作用を、以下に記載するマウス接触性皮膚炎モデルにおける耳介厚変化の測定、炎症サイトカインIL-4および血清IgEレベルの測定、並びに耳介の炎症観察により調べた。【００７７】
１．耳介厚変化の測定
（１）試験方法
動物は雄性BALB/cA Jcl系マウス (7週齢、日本クレア：入荷時) を用いた。マウスは、飼育ケージで5匹飼いとし、温度：20〜26℃、湿度：40〜60％、照明時間：12時間 (8：00〜20：00) の環境に調節された動物飼育室で飼育し、餌は固形飼料MF (オリエンタル酵母株式会社) を自由摂取させた。また、飲水に関しては、精製水を自由に摂取させた。
マウス搬入後, 7日間馴化した。馴化飼育後、次のように群分けを行った。【００７８】
群A: 陰性コントロール群（通常飼料のみで飼育した群）
群B: 陽性コントロール群 (滅菌蒸留水投与群)
群C: 精製した酸性EPS溶液 (1 mg/mL) 投与群
群D: 精製した酸性EPS溶液 (0.1 mg/mL) 投与群
群E: 精製した中性EPS溶液 (1 mg/mL) 投与群
群F: 精製した中性EPS溶液 (0.1 mg/mL) 投与群【００７９】
ここで、群Cの酸性EPS溶液および群Eの中性EPS溶液は、それぞれ実施例２で得られた酸性多糖画分および中性多糖画分であり、それらを滅菌蒸留水で希釈したものが、それぞれ群Dの酸性EPS溶液および群Fの中性EPS溶液である。【００８０】
上記の群分けを行った時点をDay 0とし、マウスにはサンプルをDay 0から1回/日の頻度で14日間連続経口投与を行った。なお、1日あたりの投与容量は0.20 mL/匹とした。Day 6に、全てのマウスに対し、両手足 (20 μL)、胸腹部 (100 μL)および背部 (100 μL) にそれぞれ7 w/v %ピクリルクロライド溶液を塗布することによってマウスに抗原情報を記憶させた。Day 13に、マウス右耳介の厚さを予めノギスによって測定しておき、その後、右耳介の裏表に1 w/v %ピクリルクロライド溶液を20 μLずつ塗布することによって、アレルギー反応を惹起させた。その24時間後 (Day 14に該当)、耳介の厚さを測定し、惹起前後での違い (Δ耳介厚（mm）) を各群間で比較した。データは平均値±標準誤差で示し、群間の有意差検定にはTukey-Kramer法を用い、危険率 (p値) が0.05未満で有意差有りと判定した。
以上の方法により, マウス接触性皮膚炎モデルに対する各サンプルの抑制作用の有無を評価した。【００８１】
（２）試験結果
群B〜FにおけるΔ耳介厚を表６および図１０に示した。【００８２】
【表６】
2019208151.tif 000008
【００８３】
表６および図１０から分かるように、陽性コントロール群 (群B) と比較して, 酸性EPS溶液投与群では1 mg/mL (群C) および0.1 mg/mL (群D) のいずれの濃度でも炎症に起因する耳介厚の増加が有意に抑制される (それぞれp＜0.01およびp＜0.05) ことが確認された。また, 中性EPS溶液投与群では、1 mg/mLの濃度 (群E、p＜0.05) では有意な抑制が認められ、0.1 mg/mLの濃度 (群F) でも炎症に起因する耳介厚の増加が抑制された。以上の結果から、IJH-SONE68株によって産生される酸性多糖体および中性多糖体の反復経口投与によって、ピクリルクロライドにより誘導される接触性皮膚炎モデルの症状が予防・改善されることが示され、特にその効果は酸性多糖体で高い可能性が示唆された。【００８４】
２．炎症サイトカインIL-4および血清IgEレベルの測定
（１）試験方法
上記の１の試験方法に記載した耳介厚の測定後に、マウスを安楽死させ、安楽死後に各群のマウスより炎症を惹起させた右耳介を切除、回収し、NucleoSpin RNA Plusキット (MACHEREY-NAGEL社製) によりmRNAを抽出した。抽出したmRNAサンプルからReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerキット (TOYOBO社製) によってcDNAを合成した。cDNAを鋳型とし、定量RT-PCR法によって炎症惹起部位における炎症性サイトカインIL-4のmRNA発現量を比較した。なお、定量RT-PCRはKAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (日本ジェネティクス社製) を用い、PikoReal Real-Time PCR System装置 (Thermo Fisher Scientific社製) により行った。【００８５】
また、安楽死後に回収した血液より血清を回収し、血清中のIgE濃度をMouse IgE ELISA development kit (HRP) (Mabtech社製) を用いたELISA法により測定した。
それぞれデータは平均値±標準誤差で示し、群間の有意差検定にはTukey-Kramer法を用い、危険率 (p値) が0.05未満で有意差有りと判定した (以下に記載する図１１および１２中には陽性コントロール群との有意差のみについて記す)。【００８６】
（２）試験結果
群A〜FにおけるIL-4のmRNAの発現量（IL-4 mRNAの群Aに対する相対発現量）について、表７および図１１に示した。【００８７】
【表７】
2019208151.tif 000009
【００８８】
表７および図１１から分かるように、炎症性サイトカインIL-4のｍRNAの転写が炎症惹起によって陽性コントロール群（群B）では有意に上昇し (p＜0.01)、多糖体各摂取群においては、陽性コントロール群（群B）と比べて有意な低下(群Dおよび群E, それぞれp＜0.01およびp＜0.05) あるいは低下傾向 (群C, p＜0.1) が認められた。【００８９】
群A〜Fにおける血清中のIgE濃度（ng/mL）を表８に、群A〜Fにおける血清中のIgE濃度の群Aに対する相対値を表９に示し、その相対値をグラフ化したものを図１２に示した。【００９０】
【表８】
2019208151.tif 000010
【００９１】
【表９】
2019208151.tif 000011
【００９２】
表８および９並びに図１２から分かるように、IL-4の場合と同様に陽性コントロール群（群B）では血清中のIgE濃度が有意に上昇し、多糖体各摂取群（特に、群C〜E）においては、陽性コントロール群と比べて有意な低下が認められた。【００９３】
以上の結果から、IJH-SONE68株によって産生される酸性多糖体および中性多糖体の反復経口投与によって、ピクリルクロライドにより誘導される接触性皮膚炎モデルマウスにおける炎症性サイトカインIL-4の発現および血清IgEレベルの上昇が抑制されることが示された。【００９４】
３．耳介の炎症観察
（１）試験方法
上記の１の試験方法に記載した耳介厚の測定後に、マウスを安楽死させ、安楽死後に群A〜Fのマウスより炎症を惹起させた右耳介を切除、回収し、10%ホルマリン液にて固定後、パラフィンに包埋し、組織切片を作製した。切片はhematoxylin-eosin (HE) 染色をし、炎症の様子について顕鏡下にて観察を行った。【００９５】
結果を図１３に示す。図１３から分かるように、陰性コントロール（群A）と比べ、陽性コントロール（群B）では表皮層 (EP) が薄くなる一方、炎症によって真皮層 (DM) では厚さが明らかに増加している様子が認められた。その炎症症状は、各多糖体サンプルの投与による耳介厚の減少と比例するように抑えられているように考えられた。【００９６】
以上の詳細な説明から明らかなとおり、本発明によれば、以下の発明が提供される。
[1]  Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株とラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするIV型アレルギーの予防又は改善のための組成物。
[2]  接触性皮膚炎の予防又は改善のための上記[1]に記載の組成物。
[3]  乳酸菌がイチジク由来の乳酸菌である上記[1]又は[2]に記載の組成物。
[4]  乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌である上記[1]〜[3]のいずれかに記載の組成物。
[5]  培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[6]  多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[7]  多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である上記[1]〜[4]のいずれかに記載の組成物。
[8]  組成物が飲食品組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[9]  飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[8]に記載の組成物。
[10]  組成物が医薬組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[11]  組成物が飼料組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[12]  組成物が化粧品組成物である上記[1]〜[7]のいずれかに記載の組成物。
[13]  IV型アレルギーの予防又は改善のための組成物の有効成分としてのLactobacillus paracasei IJH-SONE68株とラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類の使用。
[14]   接触性皮膚炎の予防又は改善のための組成物である上記[13]に記載の使用。
[15]  乳酸菌がイチジク由来の乳酸菌である上記[13]又は[14]に記載の使用。
[16]  乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌である上記[13]〜[15]のいずれかに記載の使用。
[17]  培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、上記[13]〜[16]のいずれかに記載の使用。
[18]  多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である上記[13]〜[16]のいずれかに記載の使用。
[19]  多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である上記[13]〜[16]のいずれかに記載の使用。
[20]  組成物が飲食品組成物である上記[13]〜[19]のいずれかに記載の使用。
[21]  飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[20]に記載の使用。
[22]  組成物が医薬組成物である上記[13]〜[19]のいずれかに記載の使用。
[23]  組成物が飼料組成物である上記[13]〜[19]のいずれかに記載の使用。
[24]  組成物が化粧品組成物である上記[13]〜[19]のいずれかに記載の使用。
[25]  Lactobacillus paracasei IJH-SONE68株とラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分として含む組成物を、それを必要とする対象に適用することを含む方法であって、対象においてIV型アレルギーを予防又は改善する方法。
[26]   接触性皮膚炎を予防又は改善する上記[25]に記載の方法。
[27]  乳酸菌がイチジク由来の乳酸菌である上記[25]又は[26]に記載の方法。
[28]  乳酸菌がLactobacillus paracasei IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）又はそれと同等の乳酸菌である上記[25]〜[27]のいずれかに記載の方法。
[29]  培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、上記[25]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[30]  多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である上記[25]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[31]  多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である上記[25]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[32]  組成物が飲食品組成物である上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[33]  飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである上記[32]に記載の方法。
[34]  組成物が医薬組成物である上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[35]  組成物が飼料組成物である上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
[36]  組成物が化粧品組成物である上記[25]〜[31]のいずれかに記載の方法。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
以上に詳細に説明したとおり、本発明の組成物は、IV型アレルギーの予防又は改善に有効であり、特に接触性皮膚炎の予防又は改善のために使用することができる。本発明の組成物は、接触性皮膚炎などのIV型アレルギーの予防又は改善のための飲食品、医薬品、飼料、化粧品として使用することができる。そして、本発明の組成物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）に属する乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするため、安全性が高く、長期適用が可能であり、また、安価に大量供給が可能であり、その有用性及び実用性は極めて高い。
【図１】
2019208151.tif 000012
【図２】
2019208151.tif 000013
【図３】
2019208151.tif 000014
【図４】
2019208151.tif 000015
【図５】
2019208151.tif 000016
【図６】
2019208151.tif 000017
【図７】
2019208151.tif 000018
【図８】
2019208151.tif 000019
【図９】
2019208151.tif 000020
【図１０】
2019208151.tif 000021
【図１１】
2019208151.tif 000022
【図１２】
2019208151.tif 000023
【図１３】
2019208151.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月23日(2020.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei） IJH-SONE68株（受託番号NITE BP-02242）である乳酸菌の菌体、その培養物若しくは発酵物又はそれが産生する多糖類を有効成分とするIV型アレルギーの予防又は改善のための組成物。
【請求項２】
接触性皮膚炎の予防又は改善のための請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
培養物若しくは発酵物が、乳酸菌をパイナップル属植物の果汁の存在下で培養若しくは発酵して得られる培養物若しくは発酵物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
多糖類がN−アセチルグルコサミンがα-1,6結合により連結した構造を有する中性多糖体である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
多糖類が主としてグルコースとマンノースから構成される酸性多糖体である請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
組成物が飲食品組成物である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
飲食品が、飲料、機能性食品、発酵食品又はサプリメントである請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
組成物が医薬組成物である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
組成物が飼料組成物である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が化粧品組成物である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】
2019208151.tif 000025
2019208151.tif 000026
2019208151.tif 000027
2019208151.tif 000028
2019208151.tif 000029
2019208151.tif 000030