(57)【要約】本発明は、ＬＣ−ＭＳを用いて生体試料に含まれるバイオマーカーとしてのペプチドの量を測定し、その結果に基づき、特定の疾患を検出する方法であり、ＬＣ−ＭＳを用いた測定の前に行われる前処理工程が、生体試料に、ペプチドを安定同位体で標識した安定同位体試薬と、トリフルオロ酢酸とを添加して混合試料液を調製する工程、混合試料液を煮沸する工程、煮沸した混合試料液を固相抽出カラムに注入し、ペプチドを該固相抽出カラムに保持させる工程、固相抽出カラムに水溶性有機溶媒を流して該固相抽出カラムに保持されたペプチドを溶出する工程を備える。
2019013341.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフ質量分析装置を用いて生体試料に含まれるバイオマーカーとしてのペプチドの量を測定し、その結果に基づき、特定の疾患を検出する方法であって、
前記クロマトグラフ質量分析装置を用いた測定の前に行われる前処理工程が、
a)前記生体試料に、前記ペプチドを安定同位体で標識した安定同位体試薬と、トリフルオロ酢酸とを添加して混合試料液を調製する工程と、
b)前記混合試料液を煮沸する工程と、
c)前記煮沸した混合試料液を固相抽出カラムに注入し、前記ペプチドを該固相抽出カラムに保持させる工程と、
d)前記固相抽出カラムに水溶性有機溶媒を流して該固相抽出カラムに保持された前記ペプチドを溶出して溶出液を採取する工程と
を備える、疾患検出方法。
【請求項２】
前記水溶性有機溶媒が50％−100％のメタノールであるときは、前記溶出する工程の後に、さらに、
前記溶出液に含まれる前記水溶性有機溶媒を蒸発させて前記ペプチドを乾固させる工程と、
前記乾固した前記ペプチドを、0.1％−１％のトリフルオロ酢酸と5％−50％のアセトニトリルを含む水溶液に溶解させて質量分析用試料液を調製する工程とを備える請求項１に記載の疾患検出方法。
【請求項３】
前記水溶性有機溶媒が0.1％−１％のトリフルオロ酢酸と５％−99.9％のアセトニトリルを含み、
前記アセトニトリルの濃度が50％−99.9％であるときは、前記溶出する工程の後に、さらに、
前記溶出液に含まれる前記アセトニトリルの濃度が50％よりも低くなるように希釈して質量分析用試料液を調製する工程を備える請求項１に記載の疾患検出方法。
【請求項４】
前記クロマトグラフ質量分析装置が、液体クロマトグラフ部とＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定が可能である質量分析部とを備え、
前記クロマトグラフ質量分析装置を用いた測定が、
前記質量分析用試料液を前記液体クロマトグラフ部において時間的に分離する工程と、
前記液体クロマトグラフ部において時間的に分離された、前記質量分析用試料液に含まれる前記ペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のプロダクトイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を前記質量分析部において実行する工程と
を備える、請求項２に記載の疾患検出方法。
【請求項５】
前記クロマトグラフ質量分析装置が、液体クロマトグラフ部とＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定が可能である質量分析部とを備え、
前記クロマトグラフ質量分析装置を用いた測定が、
前記質量分析用試料液を前記液体クロマトグラフ部において時間的に分離する工程と、
前記液体クロマトグラフ部において時間的に分離された、前記質量分析用試料液に含まれる前記ペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のプロダクトイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を前記質量分析部において実行する工程と
を備える、請求項３に記載の疾患検出方法。
【請求項６】
前記特定の疾患が、認知機能障害疾患であり、
前記ペプチドが、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ４Ａ、及び補体Ｃ３から選ばれる１ないし複数のタンパク質の一部分であるペプチドを含む、請求項１に記載の疾患検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液や尿等の生体試料に含まれる特定成分の量の測定値に基づき特定の疾患を検出する方法に関し、特に認知機能障害疾患の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の疾患に罹患している人から採取した血液や尿等の生体試料に存在し、それ以外の人から採取した生体試料には全く、又はほとんど存在しない物質は、その疾患に罹患していることを示すバイオマーカーとなり得る。そこで、生体試料に含まれるバイオマーカーとなる物質の量を測定し、その結果から種々の疾患を診断することが行われている。従来、生体試料中のバイオマーカーの測定には、体外診断薬が用いられてきた。【０００３】
体外診断薬を用いたバイオマーカーの測定方法の一つに、生体試料をそのまま、又は予め希釈しておき、そこに含まれる特定のタンパク質又はペプチドを抗原抗体反応を利用して測定する方法がある。例えば酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）及び化学発光測定法（CLIA）は、試料中の特定のタンパク質又はペプチドを、基質と反応すると発色する酵素によって標識された１次抗体または２次抗体と結合させ、タンパク質又はペプチドと結合した抗体の発色量でその量を測定する。また、放射性免疫測定法（RIA）では、１次抗体または２次抗体をラジオアイソトープで標識し、特定のタンパク質又はペプチドと結合した抗体の放射線量でその量を測定する。さらに、特定のタンパク質等が酵素の場合は、該タンパク質と基質を反応させ、それによって生じる生成物の量を測定する酵素活性測定法が用いられる。【０００４】
近年、生体が正常状態にあるときは該生体内に完全な状態で存在するタンパク質（以下「インタクトなタンパク質」という）が、特定の疾患に罹患した状態（疾患状態）にある生体では消化分解され種々の消化分解産物ペプチド（又は消化分解産物タンパク質）である部分ペプチド（又は部分タンパク質）を生成すること、或いは、タンパク質の翻訳合成におけるスプライシング異常等により部分タンパク質又は部分ペプチドとして翻訳合成されることが明らかになりつつある。また、疾患状態において、その疾患の進行とともに消化分解、又は翻訳合成される部分タンパク質や部分ペプチドの種類や量が変動することが明らかになりつつある。そこで、生体試料中のインタクトなタンパク質の量だけでなく、該インタクトなタンパク質とその部分タンパク質や部分ペプチドの量や種類から疾患やその進行度を診断する方法が模索されている。ところが、上記した抗原抗体反応や酵素と基質の反応を利用した従来の測定方法はいずれもタンパク質やペプチドを単独で測定するものであるため、インタクトなタンパク質とその部分タンパク質、部分ペプチドをそれぞれ測定するには時間や手間がかかる。また、測定対象が多くなるとその分、被検者（疾患に罹患している者）から多くの生体試料を採取する必要がある。【０００５】
これに対して、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて、生体試料中の複数のタンパク質及びその部分タンパク質、部分ペプチドの量を網羅的に測定し、該タンパク質、部分タンパク質、部分ペプチドの存在パターンやプロファイルに基づき疾患を診断する方法が提案されている。例えば特許文献１には、健常人と非アルコール性脂肪性肝疾患患者又は脂肪肝と非アルコール性脂肪性肝炎患者において存在の有無、存在量が異なるタンパク質及びその部分ペプチドを質量分析装置を用いて測定した結果から非アルコール性脂肪性肝炎を含む非アルコール性肝疾患を検出する方法が記載されている。また、特許文献２、３には、健常人と肝がん患者において存在の有無、存在量が異なるタンパク質及びその部分ペプチドを質量分析装置を用いて測定した結果から肝がんを検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2010-071900号公報
【特許文献２】特開2006-308533号公報
【特許文献３】特開2006-284389号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
疾患の診断に用いられる生体試料は、様々な病院や診療所等の医療機関において被検者から採取されたものであり、全ての機関において全く同じ手順、同じ条件、品質で生体試料を採取することは困難である。そのため、同じタンパク質由来のピークであっても、そうした生体試料の採取の手順や条件、品質等のばらつきによって、そのピークの信号強度に差異が生じる場合がある。【０００８】
疾患やその進行度の診断は、例えばインタクトなタンパク質とその部分タンパク質及び部分ペプチドそれぞれの量や存在比（量比）等を解析した結果に基づき行われる。従って、各成分のピークの信号強度に差異が生じると、タンパク質や部分タンパク質、部分ペプチドのそれぞれの量だけでなく、これらタンパク質と部分タンパク質、部分ペプチドの量比に差異が生じることになり、正確な診断を行うことができない。
なお、上記説明では、便宜上、インタクトなタンパク質の一部分を「部分タンパク質」、「部分ペプチド」と呼んだが、一般的には、タンパク質の一部分は「ペプチド」と呼ばれる。【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、特定の疾患のバイオマーカーとなるペプチドを質量分析装置を用いて正確に測定するための技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために成された本発明に係る疾患検出方法は、クロマトグラフ質量分析装置を用いて生体試料に含まれるバイオマーカーとしてのペプチドの量を測定し、その結果に基づき、特定の疾患を検出する方法であって、
前記クロマトグラフ質量分析装置を用いた測定の前に行われる前処理工程が、
a)前記生体試料に、前記ペプチドを安定同位体で標識した安定同位体試薬と、トリフルオロ酢酸とを添加して混合試料液を調製する工程と、
b)前記混合試料液を煮沸する工程と、
c)前記煮沸した混合試料液を固相抽出カラムに注入し、前記ペプチドを該固相抽出カラムに保持させる工程と、
d)前記固相抽出カラムに水溶性有機溶媒を流して該固相抽出カラムに保持された前記ペプチドを溶出して溶出液を採取する工程と
を備えることを特徴とする。【００１１】
ここで、生体試料とは、血液、血漿、血清、脳髄液、尿等をいう。
また、バイオマーカーとしてのペプチドとは、特定の疾患に罹患している人から採取された生体試料液中における存在量と、該特定の疾患に罹患していない人から採取された生体試料液中における存在量との間に差があるペプチドをいう。例えば特定の疾患に罹患していない状態の生体ではインタクトなタンパク質として存在し、特定の疾患に罹患している状態の生体では該インタクトなタンパク質の一部分であるペプチドとして生成又は合成される場合、該ペプチドがバイオマーカーに相当する。【００１２】
さらに、前記ペプチドを安定同位体で標識した安定同位体試薬とは、前記ペプチドを構成するいくつかの原子をその原子の安定同位体元素で置き換えたものをいう。【００１３】
前処理工程において生体試料に添加されるトリフルオロ酢酸は、生体試料中でフィブリノーゲンやアルブミン等のマトリックスに絡まった状態のペプチドを該マトリックスから分離する作用を有する。また、混合試料液を煮沸する工程は、ペプチドがかたまり状にあるときにそのペプチドをほぐす作用を有する。混合試料液を煮沸する時間は１分から３０分が好ましいが、これに限定されない。例えば生体試料の種類や質量分析による測定対象となるバイオマーカー（ペプチド）の種類により適切な煮沸時間を設定すると良い。【００１４】
生体試料に添加される安定同位体試薬は、それに対応するペプチドと質量電荷比の値がほぼ同じであり、また、物理的／化学的性質が類似している。従って、生体試料をクロマトグラム質量分析装置で測定したときに、安定同位体試薬とそれに対応するペプチドの挙動が類似する。クロマトグラム質量分析の結果、得られるマススペクトル上には、安定同位体試薬のピークと、それに対応するペプチドのピークが近くに現れる。前処理時の回収率にバラツキがあった場合にその影響は、安定同位体試薬のピークと、それに対応するペプチドのピークに及ぶが、安定同位体試薬の添加量は既知であるため、両者のピーク強度の対比から、或るペプチドの量を正確に求めることができる。【００１５】
本発明において、前記水溶性有機溶媒が50％−100％メタノールであるときは、前記溶出する工程の後に、さらに、
前記溶出液に含まれる前記水溶性有機溶媒を蒸発させて前記ペプチドを乾固させる工程と、
前記乾固した前記ペプチドを、0.1％−１％のトリフルオロ酢酸と５％−50％のアセトニトリルを含む水溶液に溶解させて質量分析用試料液を調製する工程とを備えることが好ましい。【００１６】
また、好ましくは、本発明において、前記水溶性有機溶媒が0.1％−１％のトリフルオロ酢酸と10％−99.9％のアセトニトリルを含み、
前記アセトニトリルの濃度が50％−99.9％であるときは、前記溶出する工程の後に、さらに、
前記溶出液に含まれる前記アセトニトリルの濃度が50％よりも低くなるように希釈して質量分析用試料液を調製する工程を備える。
なお、本明細書中において各種物質の濃度を表す「％」は「v/v％」を意味する。【００１７】
固相抽出カラムからメタノールを用いて前記ペプチドを溶出した場合にその溶出液をそのままクロマトグラム質量分析装置に供すると、前記メタノールによって生体試料の分離が妨げられる可能性があるため、前記メタノールを蒸発させる必要があるが、0.1％−１％のトリフルオロ酢酸と10％−99.9％のアセトニトリルを含む水溶性有機溶媒を用いて溶出した場合は、該水溶性有機溶媒を蒸発させる処理を省くことができる。ただし、アセトニトリルの濃度が50％−99.9％であるときは、該アセトニトリルによって分離が妨げられるため、アセトニトリルの濃度が50％よりも低くなるように溶出液を希釈して質量分析用試料液とすると良い。【００１８】
さらに、前記クロマトグラフ質量分析装置が、液体クロマトグラフ部とＭＲＭ（多重反応モニタリング）測定が可能である質量分析部とを備え、
前記クロマトグラフ質量分析装置を用いた測定が、
前記質量分析用試料液を前記液体クロマトグラフ部において時間的に分離する工程と、
前記液体クロマトグラフ部において時間的に分離された、前記質量分析用試料液に含まれる前記ペプチドがイオン化して生じるプリカーサイオン、該プリカーサイオンが異なる箇所でアミノ酸が開裂して形成される複数種のプロダクトイオンに応じた複数のＭＲＭトランジションを測定条件としたＭＲＭ測定を前記質量分析部において実行する工程と
を備えることが好ましい。【００１９】
本発明に係る疾患検出方法の対象となる疾患の一つとして、正常状態ではインタクトなタンパク質が、特定の疾患状態において該インタクトなタンパク質の一部分であるペプチドとして生成又は合成されるような疾患がある。そのような疾患の例として認知機能障害疾患、肝疾患（非アルコール性脂肪性肝疾患、脂肪肝、肝がん）が挙げられる。前記特定の疾患が認知機能障害疾患である場合の前記インタクトなタンパク質として、プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ４Ａ、及び補体Ｃ３が挙げられる。また、これらのタンパク質以外にも、転写因子AP-2 γ、オキシトシン受容体、E3ユビキチンリガーゼHERC2、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリ―メンバー16、ニューレキシン-2-βプリカーサー、ニューレキシン 1-β、プロトカドヘリンγ A-10が、前記インタクトなタンパク質に含まれる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、生体試料にトリフルオロ酢酸を添加して混合試料液を調製した後、煮沸するため、生体試料中のマトリックス（フィブリノーゲンやアルブミンなど）からペプチドを分離し、かたまり状のペプチドをほぐすことができる。このため、混合試料液を固相抽出カラムに注入したときに生体試料中のペプチドを安定的に該固相抽出カラムに保持させることができる。このため、その後、固相抽出カラムに水溶性有機溶媒を流して該固相抽出カラムに保持されていたペプチドを溶出することができる。
また、生体試料にバイオマーカーとしてのペプチドの安定同位体試薬を添加したため、生体試料に対してクロマトグラフ質量分析を行うことにより得られるデータからペプチドの正確な量を求めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る疾患検出方法を実施するために用いられる質量分析装置の一実施形態の概略構成図。
【図２】前処理の手順を説明するための図。
【図３】液体クロマトグラフ部の分析のグラジエントプロファイルを示す図。
【図４】１４種の認知機能障害疾患のバイオマーカーペプチドのＭＲＭトラジションを示す図。
【図５】本実施形態に係る液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて、或る生体試料の測定を行った結果、得られたＭＲＭクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明に係る疾患検出方法の一実施形態について図面を参照して説明する。
【００２３】
図１は本発明に係る疾患検出方法を実施するために用いられる液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の概略構成図である。
液体クロマトグラフ質量分析装置は、液体クロマトグラフ部（ＬＣ部）１０と質量分析部（ＭＳ／ＭＳ部）２０とを含む。
【００２４】
ＬＣ部１０は、移動相が貯留された移動相容器１１と、移動相を吸引して一定流量で送給するポンプ１２と、移動相中に予め用意された試料を所定量ずつ注入するインジェクタ１３と、試料に含まれる各種化合物を時間方向に分離するカラム１４と、を含む。なお、ＬＣ部１０が複数の移動相の組成を連続的に変化させながら試料に含まれる化合物を分離する、いわゆるグラジエント分離を行う場合は、移動相容器１１及びポンプ１２はそれぞれ２個以上設けられる。
【００２５】
ＭＳ／ＭＳ部２０は、タンデム四重極型質量分析装置から成り、大気圧であるイオン化室２１と図示しない高性能の真空ポンプにより真空排気される高真空の分析室２４との間に、段階的に真空度が高められた第１、第２中間真空室２２、２３を備えた多段差動排気系の構成である。イオン化室２１には、試料溶液に電荷を付与しながら噴霧するエレクトロスプレーイオン化用プローブ２５が設置され、イオン化室２１と次段の第１中間真空室２２との間は細径の加熱キャピラリ２６を通して連通している。第１中間真空室２２と第２中間真空室２３との間は頂部に小孔を有するスキマー２８で隔てられ、第１中間真空室２２と第２中間真空室２３にはそれぞれ、イオンを収束させつつ後段へ輸送するためのイオンガイド２７、２９が設置されている。分析室２４には、多重極イオンガイド３２が内部に設置されたコリジョンセル３１を挟み、イオンを質量電荷比に応じて分離する前段四重極マスフィルタ３０と、同じくイオンを質量電荷比に応じて分離する後段四重極マスフィルタ３３、さらにはイオン検出器３４が設置されている。ＣＩＤガス供給部３５はコリジョンセル３１の内部にアルゴン、窒素などのＣＩＤガスを供給するものである。また電源部３６は、エレクトロスプレイイオン化用プローブ２５、イオンガイド２７、２９、３２、四重極マスフィルタ３０、３３などにそれぞれ所定の電圧を印加する。
【００２６】
データ処理部４０は、機能ブロックとして、データ収集部４１、データ記憶部４２、グラフ作成部４３、定量分析部４４等を備える。入力部５２や表示部５３が付設された制御部５０は、処理条件パラメータ記憶部５１を備え、該記憶部５１に予め記憶されている処理条件パラメータに基づき液体クロマトグラフ部１０のポンプ１２やインジェクタ１３、質量分析部２０の電源部３６やＣＩＤガス供給部３５などの各部の動作をそれぞれ制御する。なお、制御部５０及びデータ処理部４０の機能の少なくとも一部は、パーソナルコンピュータをハードウエア資源とし、該コンピュータに予めインストールされた専用の制御・処理ソフトウエアをコンピュータ上で実行することにより実現することができる。
【００２７】
本実施形態に係るＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける基本的なＭＳ／ＭＳ測定動作は次の通りである。
まず、ポンプ１２は移動相容器１１から移動相を吸引して一定流量で以てカラム１４に送給する。インジェクタ１３から一定量の試料液が移動相中に導入されると、移動相の流れに乗って試料はカラム１４に導入され、カラム１４を通過する間に試料中の各種化合物は時間方向に分離されてカラム１４出口から溶出し、ＭＳ／ＭＳ部２０に導入される。
【００２８】
ＭＳ／ＭＳ部２０において、エレクトロスプレイイオン化用プローブ２５にカラム１４からの溶出液が到達すると、該プローブ２５の先端において電荷が付与されながら溶出液が噴霧される。噴霧により形成された帯電液滴は付与された電荷による静電気力の作用によって分裂しながら微細化され、その過程で溶媒は気化し化合物由来のイオンが飛び出す。
【００２９】
こうして生成されたイオンは加熱キャピラリ２６を通して第１中間真空室２２に送られ、イオンガイド２７で収束されてスキマー２８頂部の小孔を経て第２中間真空室２３に送られる。そして、化合物由来のイオンはイオンガイド２９で収束されて分析室２４に送られ、前段四重極マスフィルタ３０の長軸方向の空間に導入される。なお、イオン化法はエレクトロスプレイイオン化法に限らず、大気圧化学イオン化法や大気圧光イオン化法などを用いてもよいことは当然である。
【００３０】
ＭＳ／ＭＳ部２０においてＭＳ／ＭＳ分析を行う際には、前段四重極マスフィルタ３０及び後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に電源部３６からそれぞれ所定の電圧（高周波電圧と直流電圧とが重畳された電圧）が印加され、コリジョンセル３１内にはＣＩＤガス供給部３５から連続的に又は間欠的にＣＩＤガスが供給される。これにより、前段四重極マスフィルタ３０に送り込まれた各種イオンの中で、前段四重極マスフィルタ３０の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するイオンのみが該フィルタ３０を通過し、プリカーサイオンとしてコリジョンセル３１に導入される。コリジョンセル３１内でプリカーサイオンはＣＩＤガスに衝突して開裂し、各種のプロダクトイオンが生成される。生成された各種プロダクトイオンが後段四重極マスフィルタ３３に導入されると、後段四重極マスフィルタ３３の各ロッド電極に印加されている電圧に応じた特定の質量電荷比を有するプロダクトイオンのみが該フィルタ３３を通過し、イオン検出器３４に到達して検出される。イオン検出器３４はパルスカウント型検出器を用いることができ、この場合、入射したイオンの数に応じた個数のパルス信号を検出信号として出力する。
イオン検出器３４の検出信号はデータ処理部４０に入力され、マススペクトルやマスクロマトグラムが作成されるとともに、それらマススペクトルやマスクロマトグラムの解析処理が実行される。そして、その解析結果に基づき、該生体試料の提供者である被検者が特定の疾患に罹患しているか否かの診断、あるいは、特定の疾患に罹患している場合はその進行度の判定が行われる。
【００３１】
一般的なＬＣ−ＭＳ／ＭＳと同様、本実施形態でも、ＭＳ／ＭＳ測定のモードとして、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）測定、プロダクトイオンスキャン測定、プリカーサーイオンスキャン測定、ニュートラルロススキャン測定が用意されている。
ＭＲＭ測定では、前段四重極マスフィルタ３０及び後段四重極マスフィルタ３３でそれぞれ所定の質量電荷比のイオンのみを通過させてＭＳ／ＭＳ測定が行われ、これにより、目的化合物由来の特定のプリカーサイオンに対する特定のプロダクトイオンが検出される。ＭＲＭ測定では、プリカーサイオンの質量電荷比（m/z）とプロダクトイオンの質量電荷比（m/z）とを１組とするチャンネルを複数設定した測定を行うことができ、プリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組を「ＭＲＭトランジション」という。以下に説明する疾患検出処理では、ＭＳ／ＭＳ測定としてＭＲＭ測定が使用される。
【００３２】
次に、特定の疾患の検出のために上記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて実施される測定処理について説明する。ここでは、認知機能障害疾患の検出のために実施される測定処理を例に挙げて説明する。
＜１．試薬・用具等の準備＞
以下に示す試薬及び用具等を準備する。
（１）検量線用標準溶液（ＳＴＤ溶液）：認知機能障害疾患のバイオマーカーとなるインタクトなタンパク質（プロトロンビン、ゲルソリン、補体Ｃ４Ａ、補体Ｃ３）のアミノ酸配列の一部からなるペプチド、具体的には、表１に挙げた１４種のペプチドから選ばれる１ないし複数のペプチドを、所定量ずつ含む試薬。標準血清中に、１４種のペプチドから選ばれる１ないし複数のペプチドを所定量ずつ含んだものでもよい。所定の希釈液を用いてＳＴＤ溶液を段階的に希釈することにより検量線上の各検量点用溶液（例えば６点の検量点用の溶液）を作製する。なお、表１には、１４種のペプチドの配列番号（Ｎｏ．１〜１４）、識別番号（ＩＤ）、該ペプチドの元となるタンパク質の名称、及び該ペプチドのアミノ酸配列を示している。
【００３３】
【表１】
2019013341.tif 000003
【００３４】
（２）精度管理用標準溶液（ＱＣ溶液）：ＳＴＤ溶液から作製した検量点用溶液を混合し作製したもの。例えば、６点検量点の場合、検量点１の溶液と検量点２の溶液を混合して作製したもの、検量点３の溶液と検量点４の溶液を混合して作製したもの、検量点５の溶液と検量点６の溶液を混合して作製したものを、それぞれＱＣ溶液として使用する。
（３）安定同位体試薬：上記１４種のペプチドの一部の原子を安定同位体で置換したものを所定量ずつ含む試薬。
【００３５】
（４）溶媒Ａ：0.1％−１％ＴＦＡ）及び５％−50％アセトニトリル（ＡＣＮ）を含む水溶性有機溶媒
（５）溶媒Ｂ：50％−100％メタノール
（６）溶媒Ｃ：0.1％−１％ＴＦＡを含む水溶液
（７）溶媒Ｄ：0.1％−１％ＴＦＡ及び5％−50％メタノールを含む水溶性有機溶媒
（８）アルミシール
（９）９６穴（ウェル）のサンプルプレート
（１０）蒸発防止用プレートマット
【００３６】
＜２．生体試料（血清）の準備＞
被検者から血液を採取し、これを所定時間放置した後、遠心分離し、上澄み（血清）を採取する。
【００３７】
＜３．試料の調製＞
図２に示す手順に従って、前処理を行う。
まず、９６穴のサンプルプレートの各ウェルに生体試料である血清を25μLずつ注入する。また、血清を注入したウェルとは別のウェルにＳＴＤ溶液、ＱＣ溶液をそれぞれ25μLずつ注入する。
【００３８】
次に、血清、ＳＴＤ溶液、ＱＣ溶液を注入したサンプルプレートの各ウェルに溶媒Ｃ（0.1％−１％ＴＦＡを含む水溶液)を475μLずつ添加し、さらに、安定同位体試薬を20μLずつ添加する。これにより、各ウェルには、520μLの液体（混合液）が注入された状態となる。
続いて、サンプルプレートの上面をアルミニウム製シールで封じ、これをプレートシェーカーで攪拌する。その後、サンプルプレートに対応した遠心機で第１回遠心分離（100g, 2min, 4℃）、熱処理（100℃, 15min）、氷中保管（10min）、第２回遠心分離（100g, 2min, 4℃）を行う。
【００３９】
＜４．固相抽出カラム（固相抽出プレート）による処理＞
まず、９６穴プレートに対応した固相抽出カラム（商品名 Oasis HLB μElution Plate、Water社製、以後、「固相抽出プレート」と称する）の各ウェルに、溶媒Ｂ（500μLの50%-100％メタノール）を流して不溶成分を除去し、続いて500μLの溶媒Ｃ（0.1％-1%ＴＦＡを含む水溶液）を流して前記固相抽出プレートを調整する。
【００４０】
次に、前処理の第２回遠心分離後のサンプルプレートの各ウェル中の上澄液500μLを固相抽出プレートの対応するウェルに流す。続いて、500μLの溶媒Ｄ（[0.1％−１％ＴＦＡ]＋[５％−50％メタノール]を含む水溶性有機溶媒）を該固相抽出プレートの各ウェルに流し、固相抽出プレートに非特異的に吸着しているマトリクス成分を洗浄排出する。その後、固相抽出プレートの各ウェルに50μLの溶媒Ａ（[0.1％−１％ＴＦＡ]＋[５％−50％ＡＣＮ]を含む水溶性有機溶媒）を添加して、固相抽出プレートに吸着しているペプチドを質量分析用の９６穴サンプルプレートの各ウェルに溶出する。以上により得られた、９６穴サンプルプレートの各ウェルに収容されている液体が質量分析用試料液となる。
【００４１】
＜５．クロマトグラフ質量分析装置による測定＞
固相抽出カラムによる処理によって得られた質量分析用試料液が収容された９６穴サンプルプレートを上述のＬＣ−ＭＳ／ＭＳのインジェクタ１３の試料載置部にセットして、クロマトグラフ質量分析を実施した。ＬＣ部１０、ＭＳ／ＭＳ部２０の具体的な装置名及び各部における処理条件等と、その分析結果を以下に示す。
＜５．１  ＬＣ部＞
・装置名：  グラジエント分析が可能な高速液体クロマトグラフ装置（商品名 Nexera XR（株式会社島津製作所製）を用いた。
・カラム：  ペプチドやタンパク質の分析用逆相カラム（商品名 Aeris（登録商標） peptide（Phenomenex社）、カラムサイズ；2.1×50mm, 2.6μm（ＭＡＸ Pressure: 1000bar(100MPa)）を用いた。
・分析方式：  以下の溶媒Ｅと溶媒Ｆの混合比を時間的に変化させながら、質量分析用試料液を時間的に分離する、グラジエント分析を採用した。図３にグラジエントプロファイルを示す。
溶媒Ｅ：  水：ＡＣＮ：ギ酸＝９８：２：０．１
溶媒Ｆ：  水：ＡＣＮ：ギ酸＝１０：９０：０．１
加熱温度；55℃
サンプラー温度；5℃
【００４２】
＜５．２  ＭＳ／ＭＳ部＞
・装置名：  ＭＲＭ分析が可能な質量分析装置であるトリプル四重極型質量分析装置（商品名ＬＣＭＳ−８０６０（株式会社島津製作所製））を用いた。分析時の各部の設定値は以下の通りである。
ＣＩＤガス圧：  ２７０ｋＰａ
インターフェイス電圧：    ３ｋＶ
ネブライザーガス流量：    ３Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量：  １０Ｌ／ｍｉｎ
インターフェイス温度：  ３００℃
DL温度              ：  ２５０℃
ヒートブロック温度  ：  ４００℃
ドライイングガス流量：  １０Ｌ／ｍｉｎ
【００４３】
また、１４種のペプチドのＭＲＭパラメータを図４に示す。ＭＲＭパラメータは、プリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比の組（ＭＲＭトランジション）、Ｑ１プリロッドのバイアス電圧、コリジョンエネルギー、Ｑ３プリロッドのバイアス電圧を含む。
【００４４】
＜５．３  測定結果＞
図５は、或る被検者から採取された生体試料について液体クロマトグラフ質量分析を行った結果、得られた１４種のペプチドのイオン強度に基づき作成されたベースピーククロマトグラムである。図５に示す各記号は表１に示す記号に対応している。図５に示すように、１４種のペプチド由来のピークがそれぞれ観測された。
【００４５】
なお、上記した実施形態は本発明の一例にすぎず、例えば液体クロマトグラフに代えてガスクロマトグラフを用いても良い。また、上記実施形態において、固相抽出プレートに吸着しているペプチドを溶出するために溶媒Ａ（[0.1％−１％ＴＦＡ]＋[５％−50％ＡＣＮ]を含む水溶性有機溶媒）を用いたが、これに代えて溶媒Ｂ（50％−100％メタノール）を用いても良い。溶媒Ｂを用いた場合は、前記ペプチドを溶出する工程の後に、さらに、前記溶出液に含まれる前記溶媒Ｂを蒸発させてペプチドを乾固させることが好ましい。
また、上記実施形態で用いた用具や装置は一例に過ぎず、それらに限定されない。例えば、液体クロマトグラフィの逆相カラムとして一般的なＣ１８カラムを用いて固相抽出プレートを構成しても良い。
その他、本発明の趣旨に沿った範囲で適宜変形や修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
【符号の説明】
【００４６】
１０…液体クロマトグラフ部
１４…カラム
２０…ＭＳ／ＭＳ部
３０…四重極マスフィルタ
３０…前段四重極マスフィルタ
３１…コリジョンセル
３２…多重極イオンガイド
３４…イオン検出器
３５…ＣＩＤガス供給部
３６…電源部
４０…データ処理部
４１…データ収集部
４２…データ記憶部
４３…グラフ作成部
４４…定量分析部
５０…制御部
５２…入力部
５３…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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