(57)【要約】【課題】  被験者におけるＤＮＡの突然変異を同定することによって腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法を提供すること。【解決手段】  被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程とを有する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、
被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、
前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程と
を有する、方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡが血液由来のセルフリーＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記同定した突然変異が、体細胞突然変異として前記データベースに２例またはそれ以上集積されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍が膵臓癌である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記同定した突然変異がＴＰ５３遺伝子の変異であり、体細胞突然変異として前記データベースに１０例またはそれ以上集積されている、方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、前記正常細胞は膵管内乳頭粘液性腫瘍細胞を含む、方法。
【請求項７】
前記血液が血漿成分である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する突然変異識別システムであって、
被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する手段と、
前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する手段であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する手段と
を有する、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法、特に、被験者におけるＤＮＡの突然変異を同定することによって腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）は、アポトーシスや免疫によって破壊された癌細胞のゲノムＤＮＡが血中に漏出されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）であり、腫瘍特異的突然変異の情報と組み合わせることによって癌のバイオマーカーとしての利用や、薬剤耐性の早期検出およびモニタリングなどの幅広い用途が期待されている。また、ｃｔＤＮＡは被験者の血液から取得することができるため、非侵襲的な診断が可能となる。そのため、ｃｔＤＮＡの癌への診断適用が望まれているものの、１ミリリットルの血液中に平均して１７０塩基対に断片化された１から数千のゲノム由来のｃｆＤＮＡが含まれるため、正常細胞由来の膨大な量のＤＮＡの中から癌細胞で生じた突然変異を検出し定量することは極めて困難である。【０００３】
このような突然変異を検出するための技術としてデジタルＰＣＲや次世代シークエンシング（ＮＧＳ）が用いられている。しかし、癌細胞で生じた突然変異はわずかな量しか血中に存在しないため、ＮＧＳによるシーケンシングエラー率は大きな問題となる。そこで本発明者らはこの問題を解決するため、シーケンシング配列に分子バーコード配列を導入している（特許文献１）。この分子バーコード技術によれば、多くの場合１０から１５塩基のランダムな配列でＤＮＡ断片をラベルし、個々の分子由来のリードを見分け、各分子由来のリードのグループ化を可能にする。つまり、リードのコンセンサスを作ることにより、高品質のＤＮＡシーケンシングを提供し、配列決定した分子を計数することができるようになる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第６１２５７３１号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Schmitt MW, Kennedy SR, Salk JJ, Fox EJ, Hiatt JB, Loeb LA. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc Natl Acad Sci USA 2012;109:14508-13.
【非特許文献２】Newman AM, Lovejoy AF, Klass DM, Kurtz DM, Chabon JJ, Scherer F, et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nat Biotechnol 2016;34:547-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、このような分子バーコード技術によって配列を正確に読み取ることができたとしても、サンプル調製の際のＤＮＡ損傷によるゲノムＤＮＡ中の塩基置換のような、ＰＣＲ前に生じた塩基の相違については検出することができない。また正常組織あるいは血中セルフリーＤＮＡで低頻度に存在する体細胞突然変異についても、正常細胞由来のＤＮＡなのか、ごく少数存在する腫瘍細胞由来のＤＮＡなのかを区別することを困難とさせている。【０００７】
二本鎖シーケンシング技術は、ＤＮＡの二本の鎖に存在する変異（突然変異）と、一本の鎖にのみ存在する変異（ＤＮＡ損傷）とを区別することができる（非特許文献１）。そのため、二重鎖シーケンシング技術を用いた癌患者由来ｃｆＤＮＡの包括的な分析は変異の原因を解明する上で非常に有益であるものの、二重鎖シーケンシング技術には膨大な量のＤＮＡを必要とするため、診断用途としては適していない（非特許文献２）。そこで、被験者のｃｆＤＮＡの突然変異について、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを区別するために、診断用途で用いることのできるより高精度な方法の開発が望まれている。  
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、被験者におけるＤＮＡの突然変異を同定することによって腫瘍細胞で生じた突然変異を高精度に識別する方法を提供することを目的とする。【０００９】
本発明者らは、このような課題を解決するために、癌体細胞突然変異カタログ（ＣＯＳＭＩＣ）に集積された突然変異の特徴に着目した結果、健常人被験者で観察された突然変異の多くが、ＣＯＳＭＩＣに登録されていないか、または数エントリーしか登録されていないことがわかった。そこで鋭意研究を重ねた結果、癌組織における体細胞突然変異である可能性の低い変異体を除外できるフィルターを開発し、このフィルターを用いて被験者のＤＮＡにおける突然変異を解析することにより、腫瘍細胞で生じた突然変異なのか正常細胞で生じた突然変異なのかを見分けることができることを見出した。【００１０】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程とを有する、方法が提供される。【００１１】
このような構成によれば、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定するだけで、その突然変異が腫瘍細胞で生じた突然変異なのか、正常細胞で生じた突然変異なのかを見分ける方法を提供することができる。また、このような構成によれば、非侵襲的かつ簡便に被験者における突然変異の存在を同定することを介して、被験者における腫瘍細胞の存在の有無を確認することができ、これを通して、被験者に適した治療法を選択するための材料として資することができる。【００１２】
また、本発明の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記ＤＮＡを血液由来のセルフリーＤＮＡとすることができる。【００１３】
さらに、本発明の他の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記同定した突然変異が、体細胞突然変異として前記データベースに２例またはそれ以上集積されていることができる。【００１４】
また、本発明の別の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記腫瘍を膵臓癌とすることができる。この場合、前記突然変異がＴＰ５３遺伝子の変異であり、体細胞突然変異として前記データベースに１０例またはそれ以上集積されていることが好ましい。またこの場合、前記正常細胞は膵管内乳頭粘液性腫瘍細胞を含むこともできる。【００１５】
また、本発明のさらに別の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記血液を血漿成分とすることもできる。【００１６】
本発明の第二の主要な観点によれば、上述の第一の主要な観点に係る方法を実行するシステムが提供され、具体的には、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する突然変異識別システムであって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する手段と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する手段であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する手段とを有する、システムが提供される。【００１７】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本願発明の一実施形態において、バーコードシーケンスのためのバーコードタグの結合を示す反応スキームである。
【図２】図２は、本発明の一実施形態において、サンプルデータにおけるフィルター処理された変異体数とフィルター処理によって除外された変異体数の分布を示すスキャッタープロットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。  
上記のとおり、本願発明は、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とを高精度に識別する方法であって、被験者のＤＮＡにおける突然変異を同定する工程と、前記同定した突然変異を癌特異的突然変異が集積されたデータベースに照合する工程であって、前記同定した突然変異が、前記腫瘍に特異的な突然変異として前記データベースに所定の閾値症例数またはそれ以上集積されている場合に、前記腫瘍細胞由来の突然変異であると判定する、前記照合する工程とを有するものである。【００２０】
本願明細書において、「腫瘍細胞で生じた突然変異」とは、被験者の血液中に浮遊している腫瘍由来の遊離ＤＮＡである循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における突然変異を指す。特定の癌に特有の突然変異を有するｃｔＤＮＡに基づくリキッドバイオプシーを用いることにより、画像診断などの方法で癌と診断されるよりも前に癌を発見することができ、また治療の奏功の判断が可能となる。なお、一般的に、血液中に存在するＤＮＡのうち、ｃｔＤＮＡは、正常細胞ＤＮＡに比べて非常に微量でしか存在しないことが知られている。【００２１】
本願明細書において、「正常細胞で生じた突然変異」とは、被験者の正常細胞の死滅によって細胞から血漿中に放出されたセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）における突然変異を指す。【００２２】
本願発明の一実施形態において、「癌特異的突然変異が集積されたデータベース」とは、種々の癌組織に存在する固有の突然変異を塩基単位で捉えた癌組織由来の塩基配列から得られるものであり、１塩基多型、コピー数変異、構造多型などの癌に関連する体細胞変異の情報を網羅的に集積したデータベースであればよい。例えば、「癌特異的突然変異が集積されたデータベース」としては、Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer (COSMIC)、The Cancer Genome Atlas（TCGA）、International Cancer Genome Consortium（ICGC）等を用いることができるが、これに限られるものではない。【００２３】
また、本願明細書において、「所定の閾値症例数」とは、同定した突然変異が腫瘍細胞由来の突然変異なのか正常細胞由来の突然変異なのかを上記のデータベースを用いて判定する際に、その判定の閾値となる症例数を指す。例えば、閾値症例数を２例、３例、４例、５例、６例、７例、８例、９例、１０例またはそれ以上などのように、突然変異が生じる癌または腫瘍または遺伝子に応じて適宜設定可能である。【００２４】
例えば、腫瘍が膵臓癌の場合、同定した突然変異が、癌組織突然変異としてデータベースに２例またはそれ以上集積されている場合に、腫瘍細胞由来の突然変異であると判定することもでき、この症例数はその突然変異や突然変異が生じる遺伝子によって変更することができる。ＴＰ５３遺伝子の場合は登録変異数が多く正常細胞の変異あるいは塩基配列決定時の誤りが多いため、同定した突然変異がＴＰ５３遺伝子の場合には閾値症例数を変更することもでき、例えば体細胞突然変異として前記データベースに１０例またはそれ以上集積されている場合に、腫瘍細胞由来の突然変異であると判定することもできる。このように、本願明細書において、「所定の閾値症例数」とは、癌の種類、同定した突然変異の種類、突然変異が生じた遺伝子の種類等によって適宜変更することも可能である。【００２５】
本願発明の一実施形態において、このような腫瘍細胞由来の突然変異であると判定するための所定の閾値症例数をＣＶ７８フィルターと呼ぶこともできる。このフィルターによって処理することにより、設定した閾値を超える症例数を有する変異体が選択され、腫瘍組織に特異的な体細胞突然変異とみなすことができ、一方でその症例数に満たない他の変異体は除外することができる。例えば、ＣＶ７８フィルターにおいて、ＴＰ５３遺伝子の変異の場合には閾値症例数を１０とし、その他の遺伝子の変異の場合には２とするなど、同一のフィルター内において、突然変異が生じた遺伝子の種類毎に閾値症例数を設定することもできる。【００２６】
また、本願発明の一実施形態において、腫瘍が膵臓癌の場合、正常細胞として膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）細胞を含むこともできる。このようにすることで、同定した突然変異が膵臓癌細胞由来の突然変異なのかＩＰＭＮ細胞由来の突然変異なのかを通じて、ＩＰＭＮと膵臓癌とを区別することもできる。【００２７】
本願明細書において、「被験者のＤＮＡ」とは被験者から得られたＤＮＡであればよく、その由来細胞または由来組織は特に限られない。本願発明の一実施形態において、「被験者のＤＮＡ」を被験者の血液由来のセルフリーＤＮＡとすることができ、この場合には被験者の血漿成分を用いることが好ましい。【００２８】
なお、上述のような突然変異の識別方法は、癌特異的突然変異が集積されたデータベースの蓄積サンプル数が多ければ多いほど好ましく、本発明に係る識別方法の精度も高くなると考えられる。また、本願発明においては、このような蓄積サンプルに係るデータを、任意のデータベースに格納できる構成を取り得る。すなわち、本願発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置またはシステムをも提供することができる。このような解析装置またはシステムによれば、対象となる被験者毎に、識別の対象となる突然変異に係る情報を蓄積し、必要に応じてその蓄積した情報を取り出し、癌特異的突然変異が集積されたデータベースと照合することにより、被験者から検出された突然変異のうち、腫瘍細胞で生じた突然変異と正常細胞で生じた突然変異とをいつでも高精度に識別することができる。【００２９】
また、このようなシステムは、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵにシステムバスを介してＲＡＭ、ＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスクなどの外部記憶装置及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）が接続されて構成されることができる。入出力Ｉ／Ｆには、キーボードやマウスなどの入力装置、ディスプレイなどの出力装置、及びモデムなどの通信デバイスが夫々接続されている。外部記憶装置は、ｃｔＤＮＡ量情報ＤＢ、画像診断情報ＤＢ、及びプログラム格納部とを備え、いずれも記憶装置内に確保された一定の記憶領域である。【００３０】
さらに、このようなシステムは、ＤＮＡ量を測定および解析するシステムおよび突然変異を同定するシステムを有することができ、このようなシステムは、被験者から分子診断用採血管等で採取された核酸を含む生体サンプルを元に核酸分析を行う核酸分析装置を含むことができ、それぞれ、専用回線や公衆回線等の通信ネットワークによって電子的に接続されることができる。
【実施例】
【００３１】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３２】
（実験手法および材料）
以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。【００３３】
被験者およびサンプル
大阪府立成人病センターにおいて、２０１２年１月から２０１６年２月までの間に、膵癌患者およびＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）患者の血液サンプリングを行った。血漿調製およびＤＮＡ抽出は従来周知の手段によって行った。また組織サンプルについては内視鏡、超音波誘導、及び細針吸引を用いて得た。すべての患者から書面による同意を得ており、この研究は大阪府立癌医療センターの倫理委員会で承認されている。【００３４】
標的領域を増幅するためのアダプターおよびプライマー
膵臓癌に関連する遺伝子の標的領域を表１に示した。イオントレントシーケンシングのためのプライマー配列を含む３０塩基長のアダプター配列を、固体の指標となる５塩基、分子の指標となる１２塩基、および３’側のスペーサーとなる２０塩基に結合した。【００３５】
【表１】
2019009431.tif 000002
【００３６】
バーコード鎖を用いたライブラリー構築
２つの遺伝子特異的プライマーで血漿サンプルあたり２つの別個の反応混合物を調製した。約１ｍｌの全血由来のセルフリーＤＮＡを、ｐＨ８．０の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、２．４ユニットのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Takara Bio, Kusatu, Japan）、７．５ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB, Ipswich, MA, USA）、及び０．５ユニットのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（Toyobo, Osaka, Japan）を含む１５μｌ溶液中で、２５℃で３０分間、次いで７５℃で２０分間インキュベートすることによって末端修復した。１２ヌクレオチドのバーコード配列でタグ付けされたアダプターのライゲーションを、２０μｌの末端修復溶液中で、０．５μＬの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、４０ｐｍｏｌのアダプター、及び２０００ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、２５℃で１５分間インキュベートすることによって行った。ライゲーション産物を１．２倍量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）で２回精製した。精製ビーズを、１×Ｑ５反応緩衝液（ＮＥＢ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、６μＭ遺伝子特異的プライマー混合物、及び０．４ユニットのＱ５ホットスタートＨｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を含む２０μｌの線形増幅溶液に混合した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを除去した後、以下のように増幅を行った。変性のための９８℃で３０秒、次に９８℃で１０秒、及び６５℃で２分を１５サイクル。続いて、１．２μＬの１００μＭ Ｔ＿ＰＣＲ＿Ａを反応混合物に加え、９８℃で１０秒、６５℃で３０秒、及び７２℃で３０秒を１５サイクルで増幅した。増幅産物を１．２倍量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰで１回精製し、２０μＬの０．１×ＴＥで回収した。３μｌの精製産物を、１×Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ緩衝液（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．５μＭ Ｔ＿ＰＣＲ＿Ａ、０．５μＭネステッドプライマーミックス、及び０．４ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Thermo Fisher Scientific）を含むＰＣＲ増幅溶液（各２０μＬ）の２本のチューブに添加した。熱サイクルは以下のように行った。変性を９５℃で２分、及び９５℃で１５秒、６３℃で１分を２５サイクルまたは３０サイクル。増幅産物を１．２倍容量のＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズで精製した。Qubit dsDNA HS Assay KitまたはQuant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて生成物濃度を測定した。【００３７】
シーケンシングおよびデータ解析
プロトコールに従って、Ion Torrent Protonシーケンサー（Thermo Fisher Scientific）を用いて、大規模並列シーケンシングを行った。Torrent Suite（Thermo Fisher Scientific）を使用して、ローシグナルをベースコールに変換し、シーケンスリードのＦＡＳＴＱファイルを抽出した。【００３８】
ＦＡＳＴＱ形式のリードは、個体の割り当てのための５塩基のインデックスを使用して分類した。５塩基インデックスとスペーサー配列との間の配列を分子バーコードタグとして使用した。スペーサーおよびそれに続く配列の全長が５０塩基よりも大きい場合、ＢＷＡ−ＭＥＭを用いてリードを標的領域に並べた。短いマッピング末端（４０塩基未満）のリードは破棄した。同じバーコード配列を持つリードはまとめてグループ化し、エラーバーコードタグの検出および除去を特許文献１に記載したとおりに行なった。同じバーコードを有するリードのコンセンサス配列はＶａｒＳｃａｎを用いて行った。リードの８５％以上があるポジションに同じ塩基を持っている場合、それをコンセンサス塩基とした。変異体の検出のため、シークエンシングエラーを計算するためのポアソン分布モデルを適用した。変異体の存在ごとに各標的領域を評価し、検出閾値としてＰ＝１０−４を設定した。ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２および１３の各塩基位置を特定の閾値で評価した。この分析では、一般的なＳＮＰ部位およびエラーが起こりやすい部位は考慮しなかった。ヒトリファレンスゲノムのバージョンはＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９である。【００３９】
結果
膵臓癌のシーケンシング
ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ４、ＣＴＮＮＢ１、ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、およびＮＲＡＳの膵臓癌関連遺伝子の標的領域を上述の方法によってシーケンシングした。標的領域の総サイズは２．８ｋｂであった。バーコードタグ付きアダプターは直接ｃｆＤＮＡの未消化末端に結合させた。ライブラリー構築のために、遺伝子特異的プライマーのみを用いた線形増幅工程の後、アダプターと遺伝子特異的プライマーの混合物とを用いて標的領域を増幅した。反応スキームを図１に示した。このライブラリーをイオントレントシーケンサーでシーケンスした。シーケンスリードは、分子バーコードを用いてグループ化した。エラー配列を除去した後、高品質の配列データを用いて各リード群についてコンセンサス配列を構築した。配列決定された分子の平均数は、標的領域あたり９００塩基であった。【００４０】
非腫瘍特異的変異体を除去するためのフィルターの構築
第１のデータセットは、健常人１２名および膵臓癌患者５７名のコホートから得た。変異体検出の結果を表２の上半分にまとめた。健常人サンプルにおいては１２の変異体が見出された（表３）。【００４１】
【表２】
2019009431.tif 000003
【００４２】
【表３】
2019009431.tif 000004
【００４３】
１％未満のリードに存在する変異体は全ゲノムまたはエキソームシーケンシングのような次世代シーケンサーの従来の適用での分析では影響しないが、ｃｔＤＮＡの検出においては重大な問題となる。この実施例では、１２人の健常人のうち５人が変異体陽性と判定された（表２）。つまり、健常人であっても癌特異的変異に陽性と判断された個人が５名いることとなり、シーケンシングの結果から直接的に癌特異的変異に陽性であると判断することは、膵臓癌の突然変異の診断として適切ではない。したがって、本発明者らは変異体フィルターを設定した。【００４４】
すべての癌特異的突然変異のデータは、癌体細胞突然変異カタログ（ＣＯＳＭＩＣ）と呼ばれる公開データベースに保存されている。国際癌ゲノムコンソーシアムおよび癌ゲノムアトラスなどの癌ゲノムを特徴付ける最近の大規模な努力により、原発腫瘍に起因するほとんどの変異を同定していると推定される。しかしながら、健常人で同定された１２の変異体のうち１０種はＣＯＳＭＩＣに登録されていなかった。本発明者らはこれに対処するために以下の２つのことを前提とした。（１）ＣＯＳＭＩＣは癌組織に存在するすべての体細胞突然変異をカバーする。（２）ＣＯＳＭＩＣにおける低頻度のエントリーはＤＮＡ損傷やＰＣＲ／シーケンシングエラーなどの人工的な要因から生じる可能性がある。したがって、ＴＰ５３の変異体を除き、ＣＯＳＭＩＣ（バージョン７８）でカタログ化されていない変異体とシングルエントリーの変異体を除外した。ＴＰ５３については、多くの体細胞突然変異がそのコード領域においてカタログ化されているため、より厳格な基準を適用し、１０未満のエントリーの変異体を除外した。このようなバイオインフォマティクスプロセスをＣＶ７８フィルターと命名した。ＣＶ７８フィルターによって変異体を検証すると、健常人に存在するすべての変異体を除外した（表２）。フィルター処理された変異体は、ＣＶ７８フィルターによって選択された変異体として定義した（表２）。本実施例の実験では挿入／欠損のエラーは稀であったため、解析から除外した（１つの欠損と１つの挿入）。【００４５】
膵臓癌患者１０例については、血漿および腫瘍の両方のサンプルを入手できた。シーケンシングで同定したその変異体を表４に示す。【００４６】
【表４】
2019009431.tif 000005
【００４７】
同定された３５の変異体のうち、６つは血漿サンプルでのみ検出された。これらの変異体をＣＶ７８フィルターで検証すると、６つの変異体のすべてが除外された。すなわち、ＣＶ７８フィルターは正常細胞に存在する変異体と腫瘍細胞に存在する変異体とを識別できることがわかる。【００４８】
管状乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）と膵臓癌との区別
最初のシーケンシングによる変異体の同定、その後の癌特異性のための変異体のフィルタリングの全プロセスを、独立した第２のサンプルセットで検証した。このサンプルセットにはＩＰＭＮ患者２０人と膵臓癌患者８６人の血漿サンプルが含まれる。第２のデータセットに含まれる膵臓癌患者由来の血漿サンプルは、組織サンプルとペアになった血漿サンプルを除いて、第１のデータセットに含まれる患者のものよりも後に得られた。ＣＶ７８フィルターの構築後にのみ、第２のセットのすべてのサンプルをアッセイし、分析した。【００４９】
ＩＰＭＮは膵管内で増殖する新生物であり、そのため、血流中にｃｆＤＮＡを放出する可能性は低い。ＫＲＡＳ突然変異は、良性新生物患者の血漿中ではほとんど検出されない。ＩＰＭＮ症例のかなりの割合が膵臓癌に進行するため、ＩＰＭＮと膵臓癌との区別は実質的な臨床的利益を有すると考えられる。【００５０】
ＩＰＭＮ患者２０人のうち１０人はＣＶ７８フィルター処理前には変異型陽性であったが、ＣＶ７８フィルター処理後には１人の患者のみが変異型陽性となった（表２）。一方、膵臓癌患者８６人のうち３２人は、ＣＶ７８フィルター処理後にも変異体陽性となった。【００５１】
バーコードシーケンスによって同定された変異の他の特徴
バーコードシーケンスによって同定された変異を、特定の遺伝子におけるそれらの存在に従って分類した（表５）。【００５２】
【表５】
2019009431.tif 000006
【００５３】
第１および第２のサンプルセットに共通して、ＣＶ７８フィルターで処理してもＫＲＡＳ突然変異の場合では突然変異とみなされるものが多い。これはコドン１２および１３に存在する突然変異ホットスポットに起因する。第１および第２のサンプルセット間のリカバリー率（変異体として選択された割合）に有意差はなかった。【００５４】
第１および第２のサンプルセットの結果に有意差がなかったため、その後の分析は両方のサンプルセット由来のデータを組み合わせて行った。フィルター処理した変異体では、Ｇ>Ｔ／Ｃ>Ａのトランスバージョン変異およびＣ>Ｔ／Ｇ>Ａのトランジション変異がそれぞれ２３．３％および６２．８％の割合で見出された（表６）。ＣＶ７８フィルターによって除外された変異体では、Ｇ>Ｔ／Ｃ>Ａのトランスバージョン変異およびＣ>Ｔ／Ｇ>Ａのトランジション変異が、それぞれ３２．２％および４０．６％の割合で見出された（表６）。これらのトランスバージョン変異およびトランジション変異は両方のデータセットの大部分の突然変異を占めた。【００５５】
【表６】
2019009431.tif 000007
【００５６】
すべてのサンプルを、ｘ軸をシーケンスされた分子数、ｙ軸を変異体分子数としてスキャッタープロット上にプロットした（図２）。フィルター処理された変異体（フィルター処理で残された変異体）と除外された変異体の分布は互いに異なっていた。フィルター処理された変異体分子は、シーケンスされた分子の１０％超から１％未満までのそれぞれの割合で広く分布していた。一方で、除外された変異体はシーケンスされた分子の１０％以上を占めることはほぼなく、その割合は１％前後であった。【００５７】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
2019009431.tif 000008
【図２】
2019009431.tif 000009
【国際調査報告】
2019009431.tif 000010
2019009431.tif 000011
2019009431.tif 000012
2019009431.tif 000013