(57)【要約】【課題】血液検体中のヒト由来のＡＴＰを最小化することを可能とし、且つ起炎菌を生菌の状態で血液検体から直接回収できる前処理方法の提供を目的とする。【解決手段】血液中の起炎菌をＡＴＰ測定するための血液検体の前処理方法であって、血液検体から血小板と起炎菌のペレットを作成するステップと、前記血小板と起炎菌のペレットを、下記（Ａ）〜（Ｃ）のステップを任意の順であるいは、複数のステップを同時に処理するステップとを、有することを特徴とする。但し、血液培養検体の前処理においては、下記（Ａ）のステップを行わず、（Ｂ）と（Ｃ）とのステップのみを同時に処理する簡易ステップであることを特徴とする。  （Ａ）血小板の細胞膜蛋白をプロテアーゼ分解処理する。  （Ｂ）血小板を低張液にて膨化処理する。  （Ｃ）起炎菌への影響を抑えた条件下で、血小板の細胞膜を界面活性剤溶液にて破壊処理する。【選択図】  図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の起炎菌をＡＴＰ測定するための血液検体の前処理方法であって、
血液検体から血小板と起炎菌のペレットを作成するステップと、
前記血小板と起炎菌のペレットを、下記（Ａ）〜（Ｃ）のステップを任意の順であるいは、
複数のステップを同時に処理するステップとを、
有することを特徴とする血液検体の前処理方法。
（Ａ）血小板の細胞膜蛋白をプロテアーゼ分解処理する。
（Ｂ）血小板を低張液にて膨化処理する。
（Ｃ）起炎菌への影響を抑えた条件下で、血小板の細胞膜を界面活性剤溶液にて破壊処理する。
【請求項２】
前記血小板と起炎菌のペレットは、抗凝固剤入り採血管で採血した血液検体から遠心操作又は分離剤により、赤血球及び白血球を除いた上清を遠心操作にてペレット化したものである請求項１記載の血液検体の前処理方法。
【請求項３】
前記ステップ（Ａ）のプロテアーゼ分解処理に用いるプロテアーゼは、微生物起源のプロテアーゼである請求項１又は２記載の血液検体の前処理方法。
【請求項４】
前記ステップ（Ｂ）に用いる低張液は、浸透圧が、血液浸透圧より低い液である請求項１〜３のいずれかに記載の血液検体の前処理方法。
【請求項５】
前記ステップ（Ｃ）に用いる界面活性剤溶液は、疎水性部分に鎖状炭化水素を有する陰イオン性界面活性剤（Ｄ１）、疎水性部分に環状炭化水素を有する界面活性剤（Ｄ２）のうち１種以上である請求項１〜４のいずれかに記載の血液検体の前処理方法。
【請求項６】
血液培養検体の前処理においては、請求項１に記載の前処理において（Ａ）のステップを行わず、（Ｂ）と（Ｃ）とのステップのみを同時に処理する簡易ステップであることを特徴とする血液培養検体の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば敗血症等の感染症の起炎菌を検体から生菌の状態で直接回収したり、血液培養ボトル（血液培養検体）から起炎菌を直接回収したりする時に、ヒト由来のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を最小化して、起炎菌のＡＴＰを測定するための血液検体の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての生物は生命活動を行うためにＡＴＰ（アデノシン三リン酸）をエネルギーとして用いており、血液中のヒト由来のＡＴＰを取り除き最小化し、敗血症等の起炎菌を生菌の状態で回収できれば、ＡＴＰ測定により生菌（起炎菌）の有無や薬剤感受性試験を行うことができる。
現行の薬剤感受性試験は菌の濁度で判定するため、先ず起炎菌を分離培養し、次に薬剤感受性試験にて菌の十分な増殖を待たなければならず、通常、採血から２〜３日を要する。
それに対し、菌が産生するＡＴＰを測定することによって、細菌コロニーからスタートする薬剤感受性試験の迅速化が報告されている。（非特許文献１）
同報告によれば従来法が細菌コロニーのスタートから１８〜２４時間要するのに対して、ＡＴＰ測定ではおよそ６時間で可能とされている。
しかし上記方法はコロニーからのスタートであり、このコロニーを得るまでの分離培養に１〜２日間は必要であるため、採血からの時間としては迅速であるとは言いがたい。【０００３】
特許文献１には例えば、０．１，０．２重量％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）と２重量％のサポニンからなる界面活性剤処理液にて、血球が破壊されたことが記載されている。
しかし、ＳＤＳの濃度が０．１％，０．２％のように高濃度であると、例えば敗血症の起炎菌として度々検出される［Streptococcus agalactiae］の場合に殆どが死滅して生菌として回収できなかった。
一方、ＳＤＳの濃度を０．０５％まで下げると、上記菌の生菌回収率が向上したが、血液中の血小板は殆ど破壊されないため、ヒト由来のＡＴＰを最小化することができず生菌をＡＴＰ測定できなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−２３５０７６号公報
【０００５】
【非特許文献１】Hattori N. et al. Novel antibiotic susceptibility tests by the ATP-bioluminescence method using filamentous cell treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy: 42,1406-1411,1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血液検体中（血液培養検体を含む）のヒト由来のＡＴＰを最小化することを可能とし、且つ起炎菌を生菌の状態で血液検体から直接回収できる前処理方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、血液中の起炎菌をＡＴＰ測定するための血液検体の前処理方法であって、血液検体から血小板と起炎菌のペレットを作成するステップと、前記血小板と起炎菌のペレットを、下記（Ａ）〜（Ｃ）のステップを任意の順であるいは、複数のステップを同時に処理するステップとを、有することを特徴とする。
（Ａ）血小板の細胞膜蛋白をプロテアーゼ分解処理する。
（Ｂ）血小板を低張液にて膨化処理する。
（Ｃ）起炎菌への影響を抑えた条件下で、血小板の細胞膜を界面活性剤溶液にて破壊処理する。
本発明にて起炎菌への影響を抑えるとは、生菌としての回収率が敗血症起炎菌の主要１９菌属の平均で５０％以上であることをいう。【０００８】
ここで、前記血小板と起炎菌のペレットは、抗凝固剤入り採血管で採血した血液検体から遠心操作又は分離剤により、赤血球及び白血球を除いた上清を遠心操作にてペレット化したものである。
抗凝固剤としては、例えばＥＤＴＡなどが挙げられる。【０００９】
本発明において、前記ステップ（Ａ）のプロテアーゼ分解処理に用いるプロテアーゼは、動物性蛋白質の分解に用いられる細菌、真菌などの微生物起源のプロテアーゼ（至適ｐＨにより酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼと区分される）である。
具体的には、細菌のバシラス属起源のプロテアーゼ（例えば、アロアーゼの商品名で市販されているもの）、真菌のアスペルギルス属起源のプロテアーゼ（例えば、パンチダーゼの商品名で市販されているもの）などが挙げられる。【００１０】
本発明において、前記ステップ（Ｂ）の膨化処理に用いる低張液は、浸透圧が、血液浸透圧より低い液であり、細菌には無毒・無害でヒト血液細胞のみを膨化・破壊するものであれば、特に限定されないが、例えば、4-(2-HydroxyEthyl)-1-Piperazine Ethane Sulfonic acid（HEPES）、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムを構成成分とする低張緩衝液などが挙げられる。【００１１】
本発明において、前記ステップ（Ｃ）に用いる界面活性剤溶液は、疎水性部分に長鎖アルキル基等の鎖状炭化水素を有する陰イオン性界面活性剤（Ｄ１）、疎水性部分に構造中にステロイド核などの環状炭化水素を有する界面活性剤（Ｄ２）のうち１種以上を含有する溶液である。【００１２】
長鎖アルキル基などの鎖状炭化水素を有する陰イオン性界面活性剤（Ｄ１）としては、カルボン酸型、スルホン酸型および硫酸エステル型のいずれの界面活性剤でもよく、具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムなどが挙げられる。
それらは、１種あるいは２種以上の使用が好ましい。
また、陰イオン性界面活性剤（Ｄ１）の全溶液中の濃度は、０．０５重量％以下であることが好ましい。【００１３】
前記界面活性剤（Ｄ２）は構造中にステロイド核などの環状炭化水素を有する化合物であり、具体的には、サポニン、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）などを挙げることができる。
界面活性剤（Ｄ２）は使用しなくてもよいが、１種あるいは２種以上の使用が好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る血液検体の前処理方法にあっては、細菌がペプチドグリカン壁を有していることから、プロテアーゼで分解されることがなく、低張液では膨化しない。
また、界面活性剤溶液による処理においては、細菌へのダメージを抑えている。
これらにより、血小板及び極小量含まれている赤血球や白血球が、プロテアーゼによる細胞膜蛋白の分解、低張液による内圧の上昇と膨化、界面活性剤溶液によるリン脂質の乳化、の３つの作用の組み合わせにて細胞膜が破壊され、ヒト由来のＡＴＰが細胞外に放出され、洗浄工程などを経て、ヒト由来のＡＴＰを最小化し起炎菌のみのペレットを生菌の状態で回収することができる。【００１５】
上記処理より常法に基づいて、例えば、ルシフェラーゼ発光法などによるＡＴＰ測定が可能になる。
本発明においてヒト由来のＡＴＰを最小化するとは、起炎菌のＡＴＰ測定に影響を与えない程度にヒト由来のＡＴＰを除去することをいう。
本発明においては、ヒト由来のＡＴＰを約１／２，５００，０００以下に抑えることができる。
また、起炎菌を生菌として回収できるので、検体中の生菌の有無判定や薬剤感受性試験に供することができる。
本発明により、採血から僅か約６時間程度の短時間で薬剤感受性試験の判定結果が得られるようになり、予後を大きく左右する敗血症早期の治療に役立つことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】血液検体から血小板と起炎菌のペレットを作る操作を示す。
【図２】プロテアーゼ処理の操作及び作用の説明図を示す。
【図３】低張液処理操作及び細胞膨化写真を示す。
【図４】界面活性剤（Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）処理操作及びその作用の説明図を示す。
【図５】ペレットの洗浄操作を示す。
【図６】回収した起炎菌の培養操作を示す。
【図７】ＡＴＰ測定及び薬剤感受性の判定例を示す。
【図８】ヒト由来ＡＴＰの除去結果を示す。（ａ）は顕微鏡写真、（ｂ）はＡＴＰ測定結果を示す。
【図９】菌回収能の評価結果を示す。
【図１０】（ａ），（ｂ）は臨床検体の生菌の有無の判定例を示す。
【図１１】（ｃ），（ｄ），（ｅ）は臨床検体の薬剤感受性の判定例を示す。
【図１２】検体前処理方法（BAMB Procedure）とＡＴＰ測定の手順を示す。
【図１３】血液培養検体での簡易前処理プロトコールの血球破壊ステップの相違による、ＡＴＰバックグラウンドの測定結果を示す。
【図１４】血液培養検体の薬剤感受性の判定例を示す。
【図１５】血液培養検体の薬剤感受性の判定例を示す。
【図１６】血液培養検体の薬剤感受性の判定例を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
次に採血からＡＴＰ測定及び薬剤感受性の判定までを実施例で説明する。
なお、本発明に係る検体前処理方法をＢＡＭＢ（Bacterial ＡＴＰ Measurement in Blood）Procedureと表現した。
全体のステップの流れを図１２に示す。
ここで、ステップ２〜４の順序は問わない。
血液検体は、富山大学病院と流杉老人病院において、敗血症が疑われる患者から採取した全血であり、以下の実施例のすべての手技は、富山大学倫理委員会および流杉老人病院倫理委員会の承認並びにすべての患者から文書による同意を得てられ行われ、また実施例の方法は、承認されたガイドラインに従って実施された。
【実施例１】
【００１８】
血液検体の前処理を（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の順で行った場合。
＜ステップ１：全血からの血小板および細菌のペレット化＞
血液検体から赤血球・白血球を取り除き、「血小板（極少量の赤血球や白血球を含む）と起炎菌のペレット」を作る。
図１に示すように、例えば分離剤入りＥＤＴＡ採血管で採血し、軽度の遠心操作にて上清を得る。
この上清をチューブに移し、強い遠心操作を行うことで血小板と起炎菌のペレットを得る。
具体的には、血漿分離ＥＤＴＡチューブ（Vacutainer（登録商標）PPTTM Plasma Preparation Tube、BD Biosciences、CA、USA）に合計５ｍＬの静脈血を採取した。
その後、血液サンプルを１１００×ｇで１０分間遠心分離して血球を遠心分離し、得られた血漿および細菌である上清画分（２ｍＬ）を使用した。
上清を等分して２つの部分（それぞれ１ｍＬ）に分け、２０００×ｇで１０分間再度遠心分離し、次いで上清画分９００μＬを慎重に取り出してペレットを乱さないようにした。【００１９】
＜ステップ２：プロテアーゼ処理（血小板細胞膜のタンパク質分解）＞
血小板（および極少量の赤血球や白血球）の細胞膜蛋白の分解を行う。
細菌はプロテオグリカン壁を持つため、プロテアーゼでは分解されない。
図２に示すように例えば、プロテアーゼを加え、インキュベートする。
具体的には、分子生物学研究グレードの蒸留水（UltraPureTM DNase / RNase-Free蒸留水、Thermo Fisher Scientific、Massachusetts、USA、以下、蒸留水）で溶解したプロテアーゼ（Aroase NP-10：ヤクルト製薬工業、東京、日本）１ｍＬ（１０％ｗ／ｖ）をペレットに添加し、１０回ピペッティングした後、３７℃で１０分間インキュベートした。
インキュベーション後、混合物を２０００×ｇで５分間遠心分離し、次いでペレットを乱さないように上清画分１ｍＬを注意深く除去した。【００２０】
＜ステップ３：低張液による処理（血小板の膨化）＞
血小板（および極少量の赤血球や白血球）の内圧を高め、膨化させ壊れ易くする。
細菌はペプチドグリカン壁を持つため、膨化されない。
図３に示すように低浸透圧の低張液にて処理する。
具体的には、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（pH7.9．DOJINDO Molecular Technologies、Tokyo、Japan）、１．５ｍＭ  ＫＣｌ（和光純薬工業（株）、東京）および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏとなるように蒸留水で溶解した後、オートクレーブしてｐＨ７．９の低張液を作成する。
そして、低張液８００μＬをペレットに加えて１０回ピペッティングした後、室温で５分間インキュベートした。【００２１】
＜ステップ４：Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ処理＞
血小板（および極少量の赤血球や白血球）の細胞膜を破壊する。
低張液処理後、菌をペレット化するために遠心操作を行うが、遠心前に低張液にＤｅｔｅｒｇｅｎｔ（界面活性剤）溶液を加える工程が細菌の回収にとって必要である。
例えば、緑膿菌はチューブ内壁に付着しやすいため、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ無しで遠心すると、内壁に付着したままで殆ど回収できない。
但し、他の殆どの菌種ではそのような問題は生じない。
疎水性部分に環状炭化水素を有する界面活性剤の１種であるサポニンはヒト細胞膜のコレステロールに作用して楔を打つように入り込み、細胞膜の構造を緩める（破壊する）。
一方、細菌の細胞壁はペプチドグリカン層であるため、サポニンは作用しない。
疎水性部分に鎖状炭化水素を有する陰イオン性界面活性剤の１種であるＳＤＳは脂質二重層であるヒト細胞膜のリン脂質を乳化して細胞膜を破壊する。
ＳＤＳは細菌の細胞壁をも障害するが、例えばＳＤＳ濃度を０．０５％まで薄めれば、Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ処理で死滅し易いStreptococcus agalactiaeでさえ殆ど死滅しない。
０．０５％の低濃度で処理することで、細菌への影響を最小化してヒト細胞膜の破壊を主とした作用をもたらす。
その操作の流れを図４に示す。
具体的には、ステップ３のインキュベーション後、２％サポニン（SERVA Electrophoresis GmbH、Heidelberg、Germany）および０．０５％ＳＤＳ（和光純薬工業（株）製）をｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（PBS：Thermo Fisher Scientific）で溶解したＤｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ａ  ２００μＬを低張液・ペレット混合液に加え、混合物を１０回ピペッティングした後、２，０００×ｇで５分間遠心分離し、ペレットを乱さないように注意深く１ｍＬの上清画分を除去した。
次に、１ｍＬのＤｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ａをペレットに再度加え、混合物を２０回ピペッティングし、続いて室温で１５分間インキュベートした。【００２２】
＜ステップ５：ペレットの洗浄（ヒト由来ＡＴＰのバックグラウンドを最小化して生菌をペレット化する）＞
血小板（および極少量の赤血球や白血球）由来のＡＴＰや細胞小器官をＤｅｔｅｒｇｅｎｔ成分と共に洗い流し、起炎菌のみを生菌の状態で回収する。
その操作の流れを図５に示す。
具体的には、ステップ４のインキュベーション後、混合物を２０００×ｇで５分間遠心分離し、ペレットを乱さないように上清画分１ｍＬを注意深く除去した。
次に、ペレットにＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地（Muller-Hinton IIブロス、Cation-adjusted、BD Biosciences）１ｍＬを加え、数回穏やかに転倒混和した後、再び２０００×ｇで５分間遠心分離した。
遠心分離後、ペレットを乱さないように、１ｍＬの上清画分を注意深く除去した。
その後、このペレット洗浄工程を再度繰り返した。
すなわち、ペレットに１ｍＬのＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地を加え、穏やかに転倒混和した後、再び２，０００×ｇで５分間遠心分離した。
遠心分離後、ペレットを乱さないように、１ｍＬの上清画分を注意深く除去した。
これらは、ヒト由来のＡＴＰバックグラウンドを最小化した敗血症起炎菌の細菌ペレットである。【００２３】
＜ステップ６：起炎菌の培養（抗菌薬±）＞
血液検体より回収された起炎菌（生菌）を抗菌薬存在下、および非存在下で振盪培養する。
その操作例を図６に示す。
具体的には、ＢＡＭＢ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅの後、１ｍＬのＭｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地をペレットに添加した。
これら２チューブの混合物を１つに戻し、再び２等分に分割して菌数を揃えた。
その後、Ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ（ＬＶＦＸ）（Sigma-Aldrich、USA）２．０μｇ／ｍｌ存在下、非存在下の各々の条件で、３７℃、０，２，４，６，１２，２４時間の振盪培養を行った。【００２４】
＜ステップ７：起炎菌培養後の生菌ＡＴＰの測定と薬剤感受性の判定＞
培養後の各タイムポイントで生菌ＡＴＰを測定し、薬剤感受性を判定する。
通常、培養後４時間程度、すなわち採血後６時間程度（前処理工程の２時間含む）の迅速さで薬剤感受性が判定可能。
その操作例を図７に示す。
具体的には、ＡＴＰバイオルミネッセンスによる生菌のＡＴＰ測定を以下の手順で行った。
なお、ＡＴＰの測定にはＡＴＰバイオルミノメーター自動測定装置を使用した。
ＡＴＰバイオルミノメーター自動測定装置は日立製作所が開発したプロトタイプモデルであり、単菌を検出するためのａｔｔｏｍｏｌｅレベルでのＡＴＰ測定を可能とする。【００２５】
生菌ＡＴＰの測定試薬は、CheckLiteTM HSセット（Kikkoman Biochemifa、Tokyo、Japan）およびＡＴＰ標準サンプル（Kikkoman Biochemifa）を使用した。
CheckLiteTM HSセットには、ＡＴＰ除去試薬、ＡＴＰ抽出試薬、および生物発光試薬が含まれている。
洗浄液と希釈用緩衝液として、蒸留水（UltraPureTM DNase / RNase-Free蒸留水、Thermo Fisher Scientific）を用いて、それぞれ細菌試料とATP標準サンプルの希釈系列を作成した。【００２６】
ＡＴＰ検量線作成は、ＡＴＰ標準サンプル（Kikkoman Biochemifa）を用い、高濃度測定用と低濃度測定用の２つの希釈系列を調製した。
高濃度測定用には１００〜２×１０９ａｍｏｌ／ｍＬのＡＴＰ標準サンプルを滅菌水で希釈することによって調製した。
低濃度測定用には１００〜５００ａｍｏｌ／ｍＬのＡＴＰ標準サンプルを滅菌水またはＡＴＰ抽出試薬で希釈することにより調製した。
ブランクサンプルとして滅菌水またはＡＴＰ抽出試薬を使用した。
ＡＴＰ生物発光は以下のステップで測定した。
まず、反応チューブ内に滅菌水またはＡＴＰ抽出試薬で希釈したＡＴＰ標準サンプル１０μＬを、試薬チューブ内に生物発光試薬１ｍＬを、それぞれＡＴＰバイオルミノメーター自動測定装置にセットした。
そして、ＡＴＰバイオルミノメーター自動測定装置により５０μＬの生物発光試薬をサンプルに添加した。【００２７】
＜細菌の細胞内ＡＴＰ測定の手順＞
まずＡＴＰ除去試薬をＰＢＳで２０％（ｖ／ｖ）に希釈した。
次に振盪培養後の細菌試料１２．５μＬに２０％（ｖ／ｖ）ＡＴＰ除去試薬１２．５μＬを添加した。
そして細胞外ＡＴＰおよび死菌ＡＴＰを除去するために３０分間インキュベートした。
インキュベーション後、２５μＬのＡＴＰ抽出試薬を細菌試料またはブランク試料に添加した。
生菌の細胞内ＡＴＰを抽出するために、試料を１分間インキュベートした。
細胞内ＡＴＰ抽出後の試料１０μＬを反応チューブに加え、ＡＴＰバイオルミノメーター自動測定装置にセットした。
試料中の生菌細胞内ＡＴＰを生物発光試薬と混合し、３０秒間測定した。
相対光強度（ＲＬＵ）は、試料と生物発光試薬を混合した後３０秒以内にその最大強度から５秒間の平均値として計算した。
サンプルのＡＴＰ生物発光（ＲＬＵ）をＡＴＰ検量線（ＲＬＵ／ａｍｏｌ）で比較定量することにより、全細菌細胞内ＡＴＰ（ａｍｏｌ）を決定した。【００２８】
図８に、ヒト由来ＡＴＰ除去能の評価結果を示す。
図８（ａ）は、本発明に係るプロセス（BAMB procedure）の処理前と処理後の血漿ペレットの顕微鏡写真を示す。
処理後には、血球のすべてが破壊され、除去されているのが分かる。
図８（ｂ）は、健常人５人から採血した血液の処理前後における血漿ペレットのＡＴＰ測定結果を示す。
このグラフから、ヒト由来のＡＴＰが約１／２，５００，０００に低下しているのが分かる。【００２９】
図９（表１）に敗血症血液の血液培養から検出される頻度が高い１９菌属の回収結果を示す。
その平均回収率はＡＴＰ測定で９３．６％，ＣＦＵ測定にて７１．９％であった。【００３０】
図１０，図１１に臨床検体に本発明に係るＢＡＭＢ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを用いた例を示す。
検体（ａ），（ｂ）：敗血症疑い患者の血液検体で、血液培養陰性であった例を示す。
ＢＡＭＢ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ後の培養時間経過でＡＴＰの上昇は認められず、血液中に生菌がいないことが分かる。
検体（ｃ），（ｄ）：敗血症患者の血液検体で、血液培養陽性、抗菌薬のＬＶＦＸ（レボフロキサシン）に耐性のＥ．ｃｏｌｉ（ｃ）とＭＲＳＡ（ｄ）とが検出された例を示す。
ＢＡＭＢ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ後の培養４時間でＬＶＦＸ±に関わらずＡＴＰの上昇が認められた。
つまり、培養後４時間（採血後６時間）で「血液中に起炎菌（生菌）が存在し、それがＬＶＦＸ耐性菌である」ことがＡＴＰ測定で判定された。
検体（ｅ）：敗血症患者の血液検体で、血液培養陽性、抗菌薬のＬＶＦＸに感受性のあるProteus mirabilisとEnterococcus faecalisの２菌が検出された例を示す。
ＢＡＭＢ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ後の培養４時間でＬＶＦＸ無しでＡＴＰ上昇、ＬＶＦＸありでＡＴＰ抑制が認められた。
つまり、培養後４時間（採血後６時間）で、「血液中に起炎菌（生菌）が存在し、それがＬＶＦＸ感受性菌である」ことがＡＴＰ測定で判定された。
【実施例２】
【００３１】
実施例１のステップ２〜４の順序をステップ３、２、４と変更し、その他のステップなどは実施例１と同様にして３回実験した。
その結果、バックグラウンド（図１０において0時間のＣＰＳ値）の平均は４７６であった。
【実施例３】
【００３２】
実施例１のステップ２〜４の順序をステップ４、２、３と変更し、その他のステップなどは実施例１と同様にして３回実験した。
その結果、バックグラウンド（図１０において0時間のＣＰＳ値）の平均は５００であった。
【実施例４】
【００３３】
実施例１のステップ３おける界面活性剤をＳＤＳのみに変更し、その他のステップなどは実施例１と同様にして３回実験した。
その結果、バックグラウンド（図１０において0時間のＣＰＳ値）の平均は４７９であった。
【実施例５】
【００３４】
＜血液培養ボトルから生菌を回収し、ＡＴＰ測定による迅速薬剤感受性試験を行う手順＞
本実施例では、血液培養陽性となったボトルからＡＴＰバックグラウンドを最小化して起炎菌を生菌の状態で直接回収する方法を示す。
血液培養した後では血球の細胞膜が既に壊れ易くなっているため、実施例１のステップ２におけるプロテアーゼ処理を必要とせず、低張液とＤｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ａを混合した迅速・簡便な前処理方法のみで血球（血小板を含む）を破壊することができる。
その後、回収した生菌を培養してＡＴＰ測定による迅速薬剤感受性試験を行う。
以下、本実施例のプロトコールを記載する。
１．培養検体（血液培養陽性化から１時間後）１００μｌを１．５ｍｌのエッペンチューブに採る。
２．低張液８００μｌ＋Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ａ  ２００μｌを添加し、２０回ピペッティング。それから遠心（２０００×Ｇ，１０分間，室温）して菌のペレット化を行う。
３．上清１０００μｌを除去
４．ミューラーヒントン培地を用いて３０００倍希釈
５．１．５ｍｌのエッペンチューブ２本それぞれに希釈した産物を２７０μｌずつ添加
６．エッペンチューブ２本それぞれにＡＴＰ消去試薬３０μｌを添加
７．エッペンチューブの１本にはレボフロキサシン（ＬＶＦＸ  ２０μｇ／ｍｌ）を３３．３μｌ添加、もう１本には超純水３３．３μｌを添加して、それぞれ３５℃で培養
８．測定ポイントは２時間，４時間，６時間，（２４時間）
９．培養後、１ポイントあたり１０μｌずつ３回サンプルを採取
１０．ＡＴＰ抽出試薬１０μｌを添加してボルテックス後にＡＴＰ量をそれぞれ測定
本プロトコールにおいてもＤｅｔｅｒｇｅｎｔ  Ａは必須である（図１３）。
表２に示すように、健常人血液を４時間血液培養してヒト由来ＡＴＰバックグラウンドを測定した結果、低張液＋０．０５％ＳＤＳ（サポニン無し）、或いは低張液のみでは血球を十分破壊することは出来ないことが分かる。【００３５】
図１４に本実施例の迅速薬剤感受性試験結果を示す。
菌ＡＴＰ量は抗菌薬有り・無しに関わらず培養時間が進むにつれて増加しており、抗菌薬（レボフロキサシン）耐性であることが培養４時間後には明らかである。
実際、従来の検査法ではレボフロキサシン耐性のEscherichia coli（大腸菌）が検出され、薬剤感受性結果は一致した。
以上により、血液培養陽性時より僅か４時間で正確な感受性結果を得ることが出来た。
【実施例６】
【００３６】
＜血液培養ボトルからのＡＴＰ測定による迅速薬剤感受性試験の症例２＞
実施例５と同じプロトコール（但し血液培養陽性化から４時間後の培養検体を使用）で、実施例５とは別な敗血症患者の血培ボトルから迅速薬剤感受性試験を行った。
図１５に本実施例の迅速薬剤感受性試験結果を示す。
培養時間が進むにつれ、抗菌薬無しでは菌ＡＴＰ量は増加、抗菌薬（レボフロキサシン）有りでは菌ＡＴＰ量は減少した。
つまり、抗菌薬（レボフロキサシン）感受性であることが培養４時間後には明らかである。
実際、従来の検査法ではレボフロキサシン感受性のStreptococcus anginosusが検出され、薬剤感受性結果は一致した。
以上により、血液培養陽性時より僅か４時間で正確な感受性結果を得ることが出来た。
【実施例７】
【００３７】
＜血液培養ボトルからのＡＴＰ測定による迅速薬剤感受性試験の症例３＞
実施例５と同じプロトコール（但し血液培養陽性化から５時間後の培養検体を使用）で、実施例５，６とは別な敗血症患者の血培ボトルから迅速薬剤感受性試験を行った。
図１６に本実施例の迅速薬剤感受性試験結果を示す。
菌ＡＴＰ量は抗菌薬有り・無しに関わらず培養時間が進むにつれて増加しており、抗菌薬（レボフロキサシン）耐性であることが培養４〜６時間後には明らかである。
但し抗菌薬有り・無しで菌ＡＴＰ量の増加に差があるため、抗菌薬耐性菌と感受性菌とが混合していた可能性がある。従来の検査法ではレボフロキサシン耐性のStaphylococcus capitis or Staphylococcus capraeが検出され、薬剤感受性結果は一致した。
以上、血液培養陽性時より僅か４〜６時間で正確な感受性結果を得ることが出来た。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
敗血症疑い患者の血液検体における、ＡＴＰ測定を用いた迅速薬剤感受性試験の実施に利用できる。
血液検体中の生菌の有無について、ＡＴＰ測定により迅速判定（遺伝子検査の弱点を補える）の実施に利用できる。
血液培養ボトルからの血液培養検体における、ＡＴＰ測定を用いた迅速薬剤感受性試験の実施に利用できる。
血液検体以外にも、脳脊髄液（細菌性髄膜炎）、心嚢水（心膜炎）、胸水（胸膜炎）、腹水（腹膜炎）、関節包液（整形外科の術後感染症）、眼房水（眼内炎）、肺胞洗浄液（肺炎）、尿（尿路感染症）、術後のドレーン排液（術後感染症）、ＣＶカテーテル先端（長期臥床患者のカテ先バイオフィルムによる敗血症）などで、生菌の有無の迅速判定、および迅速薬剤感受性試験等の実施に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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