(57)【要約】より高分子量のPHAを産生するPHA産生微生物、及び、それを用いたPHAの製造方法を提供する。Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有し、PHA分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより該遺伝子がコードするPHA分解酵素の活性が低下又は失われており、さらに、グリセロールキナーゼ活性が強化されている、PHA産生微生物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有し、PHA分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより該遺伝子がコードするPHA分解酵素の活性が低下又は失われており、さらに、グリセロールキナーゼ活性が強化されている、PHA産生微生物。
【請求項２】
PHA合成酵素をコードする遺伝子がAeromonas caviae由来である、請求項１に記載のPHA産生微生物。
【請求項３】
グリセロールキナーゼ活性の強化が、外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入することによって行われている、請求項１又は２に記載のPHA産生微生物。
【請求項４】
外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子が、Escherichia属由来である、請求項３に記載のPHA産生微生物。
【請求項５】
外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子が、Escherichia coli由来である、請求項４に記載のPHA産生微生物。
【請求項６】
グリセロールキナーゼ活性の強化が、PHA産生微生物の宿主が本来有する内生のグリセロールキナーゼ活性の強化によって行われている、請求項１又は２に記載のPHA産生微生物。
【請求項７】
細胞内へのグリセロール取り込み活性は強化されていない、請求項１〜６のいずれか１項に記載のPHA産生微生物。
【請求項８】
PHA産生微生物が、Cupriavidus属に属する微生物を宿主とする形質転換体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のPHA産生微生物。
【請求項９】
前記Cupriavidus属に属する微生物が、Cupriavidus necatorである、請求項８に記載のPHA産生微生物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のPHA産生微生物を培養する工程を含む、PHAの製造方法。
【請求項１１】
前記培養において、グリセロール及び／又はグリセロール骨格含有化合物を含む炭素源が使用される、請求項１０に記載のPHAの製造方法。
【請求項１２】
前記PHAが、3−ヒドロキシ酪酸に由来する構成単位を含む共重合PHAである、請求項１０又は１１に記載のPHAの製造方法。
【請求項１３】
前記共重合PHAが、少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸に由来する構成単位を含む、請求項１２に記載のPHAの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリセロールキナーゼ活性を強化したPHA産生微生物とそれを用いたPHAの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（以下、PHAと記載する）は、広範な微生物の細胞内に生産される熱可塑性ポリエステルである。PHAは生分解性を有し、再生可能資源から生産されうることから、環境調和型素材又は生体適合型素材として、多様な産業に利用する試みがなされている。【０００３】
PHAの構成成分はヒドロキシアルカン酸であり、具体的には、３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、あるいは、よりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸や、４−ヒドロキシ酪酸などが挙げられる。これらのヒドロキシアルカン酸が、単重合もしくは共重合することによってPHAが形成される。【０００４】
このようなPHAの例として、３−ヒドロキシ酪酸（以下、3HBと記載する場合がある）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、P(3HB)と記載する場合がある）が挙げられる。また、3HBと３−ヒドロキシ吉草酸（以下、3HVと記載する場合がある）の共重合体（以下、P(3HB-co-3HV)と記載する場合がある）や、3HBと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、3HHと記載する場合がある）の共重合体（以下、P(3HB-co-3HH)と記載する場合がある）が挙げられる。ほかにも、3HBと４−ヒドロキシ酪酸（以下、4HBと記載する場合がある）の共重合体（以下、P(3HB-co-4HB)と記載する場合がある）が挙げられる。【０００５】
PHAは、その分子量によって物性が変化するが、例えば繊維などに加工する際にはできるだけ高分子量であることが望ましい。一方で、PHAの精製工程や加工工程においては、熱や酸・アルカリ等の処理により分子量の低下が起こる。よって、PHA製品においてPHAの分子量を、所望の物性を発揮可能な分子量に保つためには、発酵生産工程におけるPHAの分子量制御技術、特に分子量をより高めるための技術の開発が必須であり、産業利用において重要な位置づけとなる。【０００６】
PHAの分子量制御技術として、特許文献１では、PHA産生微生物Cupriavidus necatorのPHA分解酵素遺伝子を破壊することにより、より高分子量のPHAを生産する方法が報告されている。この技術では、微生物内で生産されたPHAの分解を抑制することで、PHAの分子量低下を防ぎ、より高分子量のPHAを得ることが可能となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第04/065253号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、発酵生産工程においてより高い分子量のPHAを得ることが望まれているという観点から、特許文献１に開示されている技術はまだ改善の余地がある。【０００９】
本発明は、より高分子量のPHAを産生するPHA産生微生物、及び、それを用いたPHAの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、高分子量のPHAを生産する微生物を育種するための検討を鋭意行った。その結果、PHA分解酵素の活性が低下又は失われているPHA産生微生物、特にはCupriavidus necatorにおいて、グリセロールキナーゼ活性を強化することにより、高分子量のPHAを生産できることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち本発明は、下記［１］〜［１３］に関する。
［１］Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有し、PHA分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより該遺伝子がコードするPHA分解酵素の活性が低下又は失われており、さらに、グリセロールキナーゼ活性が強化されている、PHA産生微生物。
［２］PHA合成酵素をコードする遺伝子がAeromonas caviae由来である［１］に記載のPHA産生微生物。
［３］グリセロールキナーゼ活性の強化が、外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入することによって行われている、［１］又は［２］に記載のPHA産生微生物。
［４］外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子が、Escherichia属由来である、［３］に記載のPHA産生微生物。
［５］外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子が、Escherichia coli由来である、［４］に記載のPHA産生微生物。
［６］グリセロールキナーゼ活性の強化が、PHA産生微生物の宿主が本来有する内生のグリセロールキナーゼ活性の強化によって行われている、［１］又は［２］に記載のPHA産生微生物。
［７］細胞内へのグリセロール取り込み活性は強化されていない、［１］〜［６］のいずれか１項に記載のPHA産生微生物。
［８］PHA産生微生物が、Cupriavidus属に属する微生物を宿主とする形質転換体である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載のPHA産生微生物。
［９］前記Cupriavidus属に属する微生物が、Cupriavidus necatorである、［８］に記載のPHA産生微生物。
［１０］［１］〜［９］のいずれか１項に記載のPHA産生微生物を培養する工程を含む、PHAの製造方法。
［１１］前記培養において、グリセロール及び／又はグリセロール骨格含有化合物を含む炭素源が使用される、［１０］に記載のPHAの製造方法。
［１２］前記PHAが、3−ヒドロキシ酪酸に由来する構成単位を含む共重合PHAである、［１０］又は［１１］に記載のPHAの製造方法。
［１３］前記共重合PHAが、少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸に由来する構成単位を含む、［１２］に記載のPHAの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、より高分子量のPHAを生産することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の好適な実施形態を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
本発明に用いるPHA産生微生物の特徴の１つは、Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有している点である。Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子としては、特に限定されないが、モノマーユニットとして少なくとも3HBを含む共重合PHAを合成できるPHA合成酵素をコードする遺伝子が好ましく、モノマーユニットとして少なくとも3HBと3HHを含む共重合PHAを合成できるPHA合成酵素をコードする遺伝子がより好ましく、3HBと3HHの共重合PHAであるP(3HB-co-3HH)を合成できるPHA合成酵素をコードする遺伝子であることがさらに好ましい。
【００１５】
そのようなPHA合成酵素をコードする遺伝子として、例えば、Aeromonas caviaeやAeromonas hydrophilaに由来するPHA合成酵素をコードする遺伝子が好ましく、Aeromonas caviaeに由来するPHA合成酵素をコードする遺伝子がより好ましい。Aeromonas caviaeに由来するPHA合成酵素をコードする遺伝子としては、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の配列相同性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。なお、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、配列番号2記載の遺伝子が挙げられる。また、配列番号1で表されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有し、且つPHA合成酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の具体例としては、例えば、配列番号3記載の遺伝子が挙げられる。
【００１６】
なお、PHA産生微生物は、Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子に加えて、Aeromonas属とは異なる属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有していてもよい。
【００１７】
本発明に用いるPHA産生微生物がAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する形態の一つとして、もともとAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有しない微生物にAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を導入する形態が挙げられる。導入する方法は特に限定されず、宿主の染色体上に直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に導入する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に配置して導入する方法のいずれを選択しても良いし、これらの方法のうち２以上を併用しても良い。ただし、プラスミドは培養中に脱落する可能性があることから、Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子が宿主の染色体上に挿入または置換されていることが好ましい。前記導入、挿入、置換、または配置の方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主の染色体上にAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を置換または挿入するには、相同組換え法等が利用できる。
【００１８】
また、導入するAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子は、その上流に、その発現に関わる「発現調節配列」を有していることが好ましい。本願において、「発現調節配列」とは、具体的には、遺伝子の開始コドンの上流に位置し、その遺伝子の転写量を制御するDNA配列、または、その遺伝子から転写された伝令RNAの翻訳量を調節するDNA配列（例えばSD配列（Shine Dalgarno配列））、あるいはその両方を含むDNA配列である。Aeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子の上流に連結する発現調節配列としては、宿主が元々有する発現調節配列を利用することもできるし、自然界に存在する任意の発現調節配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された発現調節配列を利用しても良い。
【００１９】
本発明の微生物においてAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子に対して使用される発現調節配列は特に限定されず、導入するAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子の上流に位置する発現調節配列をそのまま一緒に導入しても良いし、適切な発現調節配列を選択して前記遺伝子に連結させて、宿主に導入しても良い。また、宿主の染色体上にAeromonas属由来のPHA合成酵素をコードする遺伝子を挿入する際に、宿主の染色体上にもともと存在する発現調節配列に前記遺伝子が連結されるように挿入しても良い。
【００２０】
選択する発現調節配列としては、天然由来や改変体を問わず使用でき、特に限定されない。具体的には、遺伝子の転写量を制御するプロモーターとして、大腸菌由来のプロモーターである配列番号4記載のlacプロモーター、配列番号5記載のtrpプロモーターや、それらの改変体である配列番号6記載のlacUV5プロモーター、配列番号7記載のlacN15プロモーター、配列番号8記載のlacN16プロモーター、配列番号9記載のlacN17プロモーター、配列番号10記載のlacN19プロモーター、配列番号11記載のlacN20プロモーター、配列番号12記載のlacN21プロモーター、配列番号13記載のtacIプロモーター、配列番号14記載のtacIIプロモーター、配列番号15記載のticプロモーター、配列番号16記載のtrcプロモーターの他、Cupriavidus necator由来のphaCABオペロンのプロモーターである配列番号17記載のREPプロモーターや、その改変体である配列番号18記載のREPN17プロモーター、Cupriavidus necator由来のphasinをコードするphaP1遺伝子のプロモーターである配列番号19記載のphaP1プロモーターなどを使用することができる。これらのプロモーターは、Cupriavidus necator由来のphaC1遺伝子のSD配列である配列番号20記載の配列REP-SDや、その改変体である配列番号21記載の配列REP-SDM、その他公知のSD配列やそれに準じた配列を連結することにより、発現調節配列として利用することができる。また、Cupriavidus necator由来のA1067、A1068、A1069、 phaJ4aの４遺伝子を含むオペロンのプロモーターおよびA1067のSD配列からなる配列番号22記載の発現調節配列PJ4aや、Aeromonas caviae由来のphaPCJオぺロンのプロモーターおよびphaPのSD配列からなる配列番号23記載の発現調節配列Pacなど、その他任意の公知の発現調節配列を利用することもできる。さらに、上記の発現調節配列に対し、塩基の欠失、置換、及び／又は挿入により改変を加えた発現調節配列も使用することもできる。
【００２１】
本発明に用いるPHA産生微生物の特徴の２つ目は、PHA分解酵素遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されることにより、該遺伝子がコードするPHA分解酵素の活性が低下又は失われている点である。PHA分解酵素をコードする遺伝子はphaZ遺伝子とも呼ばれ、例えばCupriavidus属は複数のphaZ遺伝子を保持している。一例としては、配列番号24に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号25に記載のPHA分解酵素遺伝子であり、phaZd遺伝子又はphaZ6遺伝子とも呼ばれている。その他にも、例えば、配列番号26に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号27に記載の塩基配列を有するphaZ1遺伝子や、配列番号28に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号29に記載の塩基配列を有するphaZ2遺伝子を含め、Steinbuchelらが挙げているPHA分解酵素（Microbiology., 156:2136-2152 (2010)）等を挙げることができる。さらに、前記遺伝子以外であっても、同等の生理学的機能を有している遺伝子であれば良く、例えば、配列番号24、配列番号26又は配列番号28に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有し、且つPHA分解酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。配列番号24、配列番号26又は配列番号28に記載のアミノ酸配列に対する配列相同性は、当該アミノ酸配列を有するタンパク質がPHA分解酵素活性を有する蓋然性が高くなるため、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９７％以上であることがさらに好ましい。
【００２２】
遺伝子の少なくとも一部の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、当業者に周知の方法により行うことができる。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ohman et al., J. Bacteriol., 162:1068-1074 (1985)）や、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Noti et al., Methods Enzymol., 154:197-217 (1987)）などがある。また、Bacillus subtilis由来のsacB遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をスクロース耐性株として容易に単離する方法（Schweizer, Mol. Microbiol., 6:1195-1204 (1992)、Lenz et al., J. Bacteriol., 176:4385-4393 (1994)）も利用することができる。染色体上のPHA分解酵素遺伝子を部位特異的に破壊、又は不活性化できれば、置換、欠失、挿入及び／又は付加の方法は特に制限されない。具体的には、例えば、染色体上のPHA分解酵素遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失させる方法、開始コドンから終始コドンまでの遺伝子配列の一部を欠失させる方法、遺伝子配列内に終始コドンを導入する方法、開始コドンを欠失させる方法、欠失又は挿入によりフレームシフトを起こさせる方法が挙げられる。さらに当該PHA分解酵素遺伝子のプロモーター配列を破壊することでもPHA分解酵素の発現を抑えることができる。
【００２３】
本発明において、PHA分解酵素の活性が低下又は失われているとは、遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたPHA分解酵素遺伝子のコードするPHA分解酵素の活性が、上記置換、欠失、挿入及び／又は付加される前のPHA分解酵素の活性よりも低下するか、又は、完全に失われることである。具体的には、遺伝子の少なくとも一部が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたPHA分解酵素遺伝子のコードするPHA分解酵素の活性が、上記置換、欠失、挿入及び／又は付加される前のPHA分解酵素の活性の２０％以下に低下していることが好ましく、１５％以下に低下していることがより好ましく、１０％以下に低下していることがさらに好ましく、完全に失われていることが最も好ましい。なお、ここでいうPHA分解酵素の活性の低下の割合は、当該PHA分解酵素の活性そのものを測定することでも求められるが、例えば、製造されるPHAの分子量の低下抑制の程度から推定することも可能である。
【００２４】
一例として、PHA産生微生物の宿主としてCupriavidus necatorを用いる場合、phaZ6遺伝子のコードするPHA分解酵素の活性が低下又は失われていることが好ましく、phaZ6遺伝子と、phaZ1遺伝子又はphaZ2遺伝子のコードするPHA分解酵素の活性が低下又は失われていることがより好ましく、phaZ6遺伝子、phaZ1遺伝子、及びphaZ2遺伝子それぞれのコードするPHA分解酵素の活性が低下又は失われていることがさらに好ましい。これらの態様によると、より高分子量のPHAを生産することができる。
【００２５】
本発明に用いるPHA産生微生物の特徴の３つ目は、グリセロールキナーゼ活性が強化されている点である。グリセロールは、グリセロール取り込みタンパク質によって微生物の細胞内に取り込まれる。細胞内に取り込まれたグリセロールは、グリセロールキナーゼによってグリセロール−３−リン酸に変換される。グリセロール−３−リン酸は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸に変換され、解糖系を介して資化される。本発明におけるグリセロールキナーゼ活性の強化とは、もともとグリセロールキナーゼ活性を有しない宿主に、後述するような方法で新たにグリセロールキナーゼ活性を付与する場合や、もともとグリセロールキナーゼ活性を有する宿主のグリセロールキナーゼ活性を強化して、強化する前に比べてグリセロールキナーゼ活性が増大している場合を指し、本発明の目的であるPHAの高分子量化が達成できる限り、その具体的な手段は特に限定されない。もともとグリセロールキナーゼ活性を有する宿主のグリセロールキナーゼ活性を強化した場合、具体的には、グリセロールキナーゼ活性が、強化する前に比べて１．２倍以上になっていることが好ましく、１．５倍以上になっていることがより好ましい。なお、ここでいうグリセロールキナーゼ活性の強化の割合は、グリセロールキナーゼ活性そのものを測定することでも求められるが、例えば、製造されるPHAの分子量の低下抑制の程度から推定することも可能である。
【００２６】
グリセロールキナーゼ活性を強化する方法としては、外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入する方法と、PHA産生微生物の宿主が本来有する内生のグリセロールキナーゼ活性を強化する方法が挙げられる。
【００２７】
外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を導入する方法は特に限定されず、宿主の染色体上に直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に導入する方法、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に配置して導入する方法のいずれを選択しても良いし、これらの方法のうち２以上を併用しても良い。ただし、プラスミドは培養中に脱落する可能性があることから、外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子が宿主の染色体上に挿入または置換されていることが好ましい。前記導入、挿入、置換、または配置の方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主の染色体上に外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を置換または挿入するには、相同組換え法等が利用できる。
【００２８】
本発明で、PHA産生微生物に導入する外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子としては特に限定されないが、例えば、Escherichia属、Salmonella属、Yersinia属、Serratia属、Pectobacterium属、Shigella属、Enterobacter属、Cronobacter属、Klebsiella属、Erwinia属、Haemophilus属、Pasteurella属、Mannheimia属、Xylella属、Xanthomonas属、Vibrio属、Pseudomonas属、Francisella属、Aeromonas属、Ralstonia属、Rhodopseudomonas属、Chromobacterium属、Burkholderia属、Bacillus属、Staphylococcus属、Listeria属、Lactococcus属、Streptococcus属、Lactobacillus属、Entericoccus属、Clostridium属、Thermoanaerobacter属、Mycoplasma属、Mycobacterium属、Corynebacterium属、Streptomyces属、Borrelia属、Leptospira属、Cupriavidus属に由来するグリセロールキナーゼをコードする遺伝子や、その改変体をコードする遺伝子等を用いることができる。本発明においては、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子として、Escherichia属由来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子がより好ましく、Escherichia coli由来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子がさらに好ましく、配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、または前記アミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の配列相同性を有し、且つグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が特に好ましい。配列番号30に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、Escherichia coliに由来する配列番号31に記載の遺伝子が挙げられる。
【００２９】
また、導入する外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子は、その上流に、その発現に関わる発現調節配列を有していることが好ましい。外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の上流に連結する発現調節配列としては、宿主が元々有する発現調節配列を利用することもできるし、自然界に存在する任意の発現調節配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された発現調節配列を利用しても良い。
【００３０】
本発明において外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子に対して使用される発現調節配列は特に限定されず、導入する外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の上流に位置する発現調節配列をそのまま一緒に導入しても良いし、適切な発現調節配列を選択して前記遺伝子に連結させて、宿主に導入しても良い。また、宿主の染色体上に外来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を挿入する際に、宿主の染色体上にもともと存在する発現調節配列に前記遺伝子が連結されるように挿入しても良い。ここで選択する発現調節配列としては、PHA合成酵素をコードする遺伝子に関して上述したような発現調節配列を利用することができる。
【００３１】
PHA産生微生物の宿主が本来有する内生のグリセロールキナーゼ活性を強化する方法としては、特に限定されないが、染色体上の内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の上流に上述の発現調節配列を挿入したり、内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子のコピーを本来存在する位置とは異なる位置に導入したりすることによって、発現量を増大させても良いし、内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子に変異を導入することによって該遺伝子によるグリセロールキナーゼ活性を上昇させても良い。また、それらを組み合わせても良いし、併用しても良い。
【００３２】
本発明における、内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子とは、宿主のゲノム情報中でグリセロールキナーゼをコードしていると同定されている遺伝子や、グリセロールキナーゼ活性を有すると知られているタンパク質をコードする遺伝子である。例えば、PHA産生微生物の宿主としてCupriavidus necator H16株を用いる場合、配列番号32に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号33に記載の塩基配列を有するh16_A2507遺伝子や、配列番号34に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号35に記載の塩基配列を有するh16_B1199遺伝子が挙げられる。
【００３３】
染色体上の内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の上流に発現調節配列を挿入する場合、公知の方法を用いることができ、例えば、相同組換え法等が利用できる。また、発現調節配列としては、PHA合成酵素をコードする遺伝子に関して上述した発現調節配列を利用することができる。
【００３４】
内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子のコピーを本来存在する位置とは異なる位置に導入する場合、該導入の方法は特に限定されないが、宿主の染色体上に直接挿入または置換する方法、宿主が保有するメガプラスミド上に導入する形式、あるいはプラスミド、ファージ、ファージミドなどのベクター上に配置して導入する形式のいずれを選択しても良いし、これらの方法のうち２以上を併用しても良い。ただし、プラスミドは培養中に脱落する可能性があることから、宿主の染色体上に内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子のコピーが挿入または置換されていることが好ましい。前記導入、挿入、置換、または配置の方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、宿主の染色体上に内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を置換または挿入するには、相同組換え法等が利用できる。
【００３５】
また、導入する内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子のコピーは、その上流に、その発現に関わる発現調節配列を有していることが好ましい。内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の上流に連結する発現調節配列としては、宿主が元々有する発現調節配列を利用することもできるし、自然界に存在する任意の発現調節配列を利用することもできるし、人工的に構築または改変された発現調節配列を利用しても良い。
【００３６】
本発明において内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子に対して使用される発現調節配列は特に限定されず、内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の上流に位置する発現調節配列をそのまま一緒に導入しても良いし、適切な発現調節配列を選択して前記遺伝子に連結させて、宿主に導入しても良い。また、宿主の染色体上に内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子のコピーを挿入する際に、宿主の染色体上にもともと存在する発現調節配列に前記遺伝子が連結されるように挿入しても良い。ここで選択する発現調節配列としては、PHA合成酵素をコードする遺伝子に関して上述したような発現調節配列を利用することができる。
【００３７】
内生のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子に変異を導入する場合、公知の方法を用いることができる。例えば、グリセロールキナーゼをコードする遺伝子を鋳型とし、エラープローンＰＣＲや、変異を導入したプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、変異が導入されたグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を得ることができる。
【００３８】
本発明のPHA産生微生物は、細胞内へのグリセロール取り込み活性が強化されていないことが好ましい。このような態様によると、より高分子量のPHAを生産することができる。グリセロール取り込みタンパク質をコードする遺伝子の一例としてglpFと呼ばれる遺伝子があり、配列番号36で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号37で表される塩基配列で示される遺伝子や、配列番号38で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする配列番号39で表される塩基配列で示される遺伝子が挙げられる。PHA産生微生物がゲノム上に、細胞内へのグリセロール取り込みタンパク質をコードする遺伝子としてglpFに相当する遺伝子を有している場合、遺伝子操作によりグリセロール取り込み活性を強化しないことが好ましい。また、細胞内へのグリセロール取り込みタンパク質をコードする外来の遺伝子や、その改変体をコードする遺伝子を遺伝子操作によりPHA産生微生物に導入しないことが好ましい。
【００３９】
本発明のPHA産生微生物の宿主としては、PHA分解酵素遺伝子を有するPHA産生微生物を使用しうる。そのような宿主であるPHA産生微生物としては、例えばCupriavidus属に属する微生物が挙げられ、Cupriavidus necatorが好ましく、Cupriavidus necator H16株がより好ましい。勿論、前記微生物を人工的に突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された菌株も使用できる。
【００４０】
本発明においては、本発明のPHA産生微生物を培養することによって、該微生物にPHAを生産させることができる。本発明のPHA産生微生物を培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、培地に適切な炭素源を添加して培養を行なえばよい。
【００４１】
培養時の炭素源としては、本発明のPHA生産微生物が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が好ましい。本発明においては、グリセロールキナーゼ活性の強化によりPHAの分子量向上効果が得られるため、グリセロール及び／又はグリセロール骨格含有化合物を含む炭素源を使用することがより好ましく、グリセロール及び／又は油脂やその分画油類を用いるのがさらに好ましく、グリセロール；グリセロールと他の炭素源の混合物；パーム油、パーム核油などの植物油脂；パーム油やパーム核油を分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレインやパーム核油オレインを用いるのが特に好ましい。
【００４２】
本発明におけるPHAの製造では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００４３】
培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、使用する微生物において通常使用されるような培養条件でよい。
【００４４】
本発明において製造されるPHAは、微生物が生産するPHAであれば特に限定されないが、炭素数4〜16の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される１つの３−ヒドロキシアルカン酸の単重合PHAや、炭素数4〜16の３−ヒドロキシアルカン酸から選択される１つ以上の３−ヒドロキシアルカン酸が共重合した共重合PHAが好ましい。例えば、P(3HB)、P(3HB-co-3HV)、P(3HB-co-3HH)、P(3HB-co-4HB)などが挙げられる。好ましくは、３−ヒドロキシ酪酸に由来する構成単位を含む共重合PHAであり、より好ましくは、少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸に由来する構成単位を含む共重合PHAである。
【００４５】
本発明において、菌体からのPHAの回収方法は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてPHAを抽出する。このPHAを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、その濾液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてPHAを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてPHAを回収する。
【００４６】
本発明で製造されるPHAの分子量を測定する方法は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。PHAの分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー法により分析する。精製したPHA 10 mgを10 mlのクロロホルムに溶解し、0.2 mmのフィルターで濾過して測定用サンプルを調製し、そのうち0.05 mlを用いて分析する。測定システムはSCL-10A（島津製作所社製）、カラムはShodex GPC K-806L（昭和電工社製）を２本直列に接続し、40℃で測定する。移動層は1.0 ml/分のクロロホルムとし、RI検出器（RID-10A、島津製作所社製）を用いる。標準品としては、同様に処理したポリスチレン（昭和電工社製、重量平均分子量：711万、192万、66.8万、19.7万、3.14万、0.295万）を用い、検量線によりPHAの重量平均分子量を算出する。
【００４７】
本発明において製造されるPHAの分子量は特に限定されないが、培養終了時の分子量が重量平均分子量で30万〜400万であることが好ましく、50万〜350万であることがより好ましく、70〜330万であることがさらに好ましく、100〜300万であることが特に好ましい。
【００４８】
本発明において製造されるPHAには、添加剤、例えば結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、染料・顔料などの着色剤、可塑剤、滑剤、無機充填剤、帯電防止剤、防カビ剤、抗菌剤、発泡剤、難燃剤等を必要に応じて添加することができる。
【００４９】
本発明により製造されるPHAを含む樹脂組成物を成形加工することにより成形体を製造することができる。成形加工方法としては従来公知の方法で良く、例えば射出成形、フィルム成形、ブロー成形、繊維の紡糸、押出発泡、ビーズ発泡などが挙げられる。
【００５０】
前記成形体は、例えば各種容器、包装材、農園芸用のフィルム、医療材料等に用いることができる。
【実施例】
【００５１】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。本実施例における遺伝子操作は、Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている方法で行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主などは市場の供給者から購入し、その取扱説明書にしたがって使用することができる。なお、本実施例に用いられる酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００５２】
（製造例１）グリセロールキナーゼ活性強化用プラスミドpCUP2-PlacN17-glpKEcの作製
グリセロールキナーゼ活性強化用プラスミドpCUP2-PlacN17-glpKEcを作製した。【００５３】
まず、pCR(R)2.1-TOPO(R)（Invitrogen社製）を鋳型とし、配列番号40および配列番号41で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。同様に配列番号42および配列番号43で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。次に、Escherichia coli HB101株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号44および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに、上記PCRで得られた3種のDNA断片を鋳型とし、配列番号40および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。得られたDNA断片を、特開2007-259708号公報記載のpCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-Fusion(R) HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて連結し、lacN17プロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびglpKEc構造遺伝子配列を有するグリセロールキナーゼ強化用プラスミドpCUP2-PlacN17-glpKEcを作製した。【００５４】
（製造例２）KNK-005 ΔphaZ1,2,6株を親株とする、グリセロールキナーゼ活性強化用プラスミド導入株の作製
グリセロールキナーゼ活性を強化した菌株の作製を目的とし、KNK-005 ΔphaZ1,2,6株（国際公開第2015/146195号参照）を親株として、製造例１記載のプラスミドを導入した菌株を作製した。KNK-005 ΔphaZ1,2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。【００５５】
まず、KNK-005 ΔphaZ1,2,6株をNutrient Broth培地（DIFCO社製）で一晩培養した。得られた培養液0.5 mlをNutrient Broth培地50 mlに接種し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を氷上で速やかに冷却し、菌体を回収して氷冷した蒸留水で良く洗浄した後、得られた菌体を2 mlの蒸留水に懸濁した。菌体液をプラスミド溶液と混合し、キュベットに注入してエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、MicroPulserエレクトロポレーター（バイオ・ラッド社製）を使用し、電圧1.5 kV、抵抗800 Ω、電流25 μFの条件で行った。エレクトロポレーション後、菌体溶液を回収して5 mlのNutrient Broth培地を添加し、30℃で3時間培養した。得られた培養液を、100 mg/lのカナマイシン硫酸塩を含むNutrient Agar培地（DIFCO社製）に塗布した。30℃で3日間培養し、得られたコロニーからプラスミドが導入された菌株を取得した。得られた菌株をKNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株と命名した。【００５６】
（製造例３）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株を親株とする、グリセロールキナーゼ活性強化用プラスミド導入株の作製
グリセロールキナーゼ活性を強化した菌株の作製を目的とし、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株（国際公開第2015/146195号参照）を親株とし、製造例２と同様の方法で、製造例１記載のプラスミドを導入した菌株を作製した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCReΔZ2,6株は、染色体上のphaZ1遺伝子およびphaZ6遺伝子を全長欠失し、phaZ2遺伝子の16番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、phaJ4b遺伝子の直上流にREPプロモーターおよびphaC1SD（REP-SD）配列からなる発現調節配列が挿入され、phaZ1遺伝子を欠失した領域にlacプロモーター、phaC1SD（REP-SD）配列、およびphaCRe構造遺伝子配列が挿入され、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。得られた菌株をKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株と命名した。【００５７】
（製造例４）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::Plac-glpKEcΔZ2株の作製
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株のphaZ6遺伝子を欠失した領域に、グリセロールキナーゼ活性強化用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、DNA挿入用プラスミドを作製した。【００５８】
まず、pCR(R)2.1-TOPO(R)を鋳型とし、配列番号40および配列番号43で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。次に、Escherichia coli HB101株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号44および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種のDNA断片を鋳型とし、配列番号40および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。得られたDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-Fusion(R) HD Cloning Kitを用いて連結し、lacプロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびglpKEc構造遺伝子配列を有するプラスミドpCUP2-Plac-glpKEcを作製した。【００５９】
次に、C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号46および配列番号47で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。同様に配列番号48および配列番号49で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた2種のDNA断片を鋳型とし、配列番号46および配列番号49で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をSmiIで消化した。このDNA断片を、特開2007-259708号公報に記載のベクターpNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ6構造遺伝子より上流のDNA配列、配列番号50記載のDNA配列、およびphaZ6構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ6ULを作製した。【００６０】
次に、pCUP2-Plac-glpKEcを鋳型とし、配列番号51および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をEcoRIとSpeIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacB-dZ6ULをMunIとSpeIで消化して得られるDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ6構造遺伝子より上流のDNA配列、lacプロモーターとphaC1SD（REP-SD）配列からなる発現調節配列、glpKEc構造遺伝子配列、およびphaZ6構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ6UL-Plac-glpKEcを作製した。【００６１】
次に、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株を親株として、pNS2X-sacB-dZ6UL-Plac-glpKEcを用いてphaZ6遺伝子を欠失した領域にグリセロールキナーゼ活性強化用の遺伝子発現カセットを挿入した株の作製を行った。pNS2X-sacB-dZ6UL-Plac-glpKEcを大腸菌S17-1株（ATCC47055）に導入し、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株とNutrient Agar培地上で混合培養して接合伝達を行った。【００６２】
上記接合伝達後の菌株から、250 mg/Lのカナマイシン硫酸塩を含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム2 g/L、塩化ナトリウム5 g/L、硫酸マグネシウム・7水和物0.2 g/L、リン酸二水素アンモニウム1 g/L、リン酸水素二カリウム1 g/L、寒天15 g/L、pH6.8）上で生育する菌株を選択し、前記プラスミドがKNK-005 REP-phaJ4bΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をNutrient Broth培地で2世代培養した後、20 %のショ糖を含むNutrient Agar培地で生育する菌株を選択した。得られた菌株からphaZ6遺伝子を欠失した領域にグリセロールキナーゼ活性強化用の遺伝子発現カセットが挿入されたものをPCRにより選別し、うち1株をKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::Plac-glpKEc ΔZ2株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::Plac-glpKEc ΔZ2株は、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株のphaZ6遺伝子を欠失した領域にlacプロモーター、phaC1SD（REP-SD）配列、およびglpKEc構造遺伝子配列が挿入されている菌株である。【００６３】
（製造例５）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacN17-glpKEc ΔZ2株の作製
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株のphaZ6遺伝子を欠失した領域に、グリセロールキナーゼ活性強化用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、DNA挿入用プラスミドを作製した。【００６４】
まず、製造例１で作製したpCUP2-PlacN17-glpKEcを鋳型とし、配列番号51および配列番号45で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をEcoRIとSpeIで消化した。このDNA断片を、製造例４で作製したpNS2X-sacB-dZ6ULをMunIとSpeIで消化して得られるDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ6構造遺伝子より上流のDNA配列、lacN17プロモーターとphaC1SD（REP-SD）配列からなる発現調節配列、glpKEc構造遺伝子配列、およびphaZ6構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ6UL-PlacN17-glpKEcを作製した。【００６５】
次に、製造例４と同様の方法で、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株を親株として、pNS2X-sacB-dZ6UL-PlacN17-glpKEcを用いてphaZ6遺伝子を欠失した領域にグリセロールキナーゼ活性強化用の遺伝子発現カセットを挿入した株の作製を行った。得られた株をKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacN17-glpKEc ΔZ2株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacN17-glpKEc ΔZ2株は、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株のphaZ6遺伝子を欠失した領域にlacN17プロモーター、phaC1SD（REP-SD）配列、およびglpKEc構造遺伝子配列が挿入されている菌株である。【００６６】
（製造例６）KNK-005 REP-phaJ4b PlacUV5-A2507 ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株の作製
染色体上のh16_A2507遺伝子の上流にh16_A2507の発現を強化するための発現調節配列を挿入することを目的とし、発現調節配列挿入用プラスミドを作製した。【００６７】
まず、C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号52および配列番号53で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。同様に配列番号54および配列番号55で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに、製造例４で作製したpCUP2-Plac-glpKEcを鋳型とし、配列番号56および配列番号57で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。同様に配列番号58および配列番号59で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。上記PCRで得られた4種のDNA断片を鋳型とし、配列番号52および配列番号55で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をSmiIで消化した。このDNA断片を、pNS2X-sacBをSmiIで消化したDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、h16_A2507構造遺伝子より上流のDNA配列、lacUV5プロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびh16_A2507構造遺伝子配列の一部を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-A2507U-PlacUV5-A2507を作製した。【００６８】
次に、製造例４と同様の方法で、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株を親株として、pNS2X-sacB-A2507U-PlacUV5-A2507を用いてh16_A2507遺伝子の上流に発現調節配列を挿入した。得られた株をKNK-005 REP-phaJ4b PlacUV5-A2507 ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b PlacUV5-A2507 ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株は、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株のh16_A2507遺伝子の直上流にlacUV5プロモーターおよびphaC1SD配列からなる発現調節配列が挿入された菌株である。【００６９】
（製造例７）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacUV5-A2507 ΔZ2株の作製
KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株のphaZ6遺伝子を欠失した領域に、グリセロールキナーゼ活性強化用の遺伝子発現カセットを導入することを目的とし、DNA挿入用プラスミドを作製した。【００７０】
まず、製造例６で作製したpNS2X-sacB-A2507U-PlacUV5-A2507を鋳型とし、配列番号40および配列番号43で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。次に、C. necator H16株のゲノムDNAを鋳型とし、配列番号60および配列番号61で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。さらに、上記PCRで得られた2種のDNA断片を鋳型とし、配列番号40および配列番号61で示したDNAをプライマーとしてPCRを行った。得られたDNA断片を、pCUP2ベクターをMunIとSpeIで消化したDNA断片と、In-Fusion(R) HD Cloning Kitを用いて連結し、lacUV5プロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、およびh16_A2507構造遺伝子配列を有するプラスミドpCUP2-PlacUV5-A2507を作製した。【００７１】
次に、pCUP2-PlacUV5-A2507を鋳型とし、配列番号51および配列番号61で示したDNAをプライマーとしてPCRを行い、得られた断片をEcoRIとSpeIで消化した。このDNA断片を、製造例４で作製したpNS2X-sacB-dZ6ULをMunIとSpeIで消化して得られるDNA断片と、DNAリガーゼを用いて連結し、phaZ6構造遺伝子より上流のDNA配列、lacUV5プロモーターとphaC1SD配列からなる発現調節配列、h16_A2507構造遺伝子配列、およびphaZ6構造遺伝子より下流のDNA配列を有するDNA挿入用プラスミドpNS2X-sacB-dZ6UL-PlacUV5-A2507を作製した。【００７２】
次に、製造例４と同様の方法で、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株を親株として、pNS2X-sacB-dZ6UL-PlacUV5-A2507を用いてphaZ6遺伝子を欠失した領域にグリセロールキナーゼ活性強化用の遺伝子発現カセットを挿入した株の作製を行った。得られた株をKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacUV5-A2507 ΔZ2株と命名した。KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacUV5-A2507 ΔZ2株は、KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株のphaZ6遺伝子を欠失した領域にlacUV5プロモーター、phaC1SD（REP-SD）配列、およびh16_A2507構造遺伝子配列が挿入されている菌株である。【００７３】
（実施例１）KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株によるPHAの生産
製造例２で得られたKNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株を以下の条件で培養、精製し、PHA生産量を算出した。また、得られたPHAの重量平均分子量を測定した。PHA生産量は11.8 g/L、重量平均分子量は217×104であった。得られた結果を表1に示した。【００７４】
＜培養＞
菌株は以下のように培養した。【００７５】
種培地の組成は1 %(w/v) Meat extract、1 %(w/v) Bacto Trypton、0.2 %(w/v) Yeast extract、0.9 %(w/v) Na2HPO4・12H2O、0.15 %(w/v) KH2PO4(pH6.8)、5x10-6 %(w/v) カナマイシンとした。【００７６】
PHA生産培地の組成は、1.1 %(w/v) Na2HPO4・12H2O、0.19 %(w/v) KH2PO4、0.13 %(w/v) (NH4)2SO4、0.1 %(w/v) MgSO4・7H2O、0.1 %(v/v)微量金属塩溶液（0.1N塩酸に1.6 %(w/v) FeCl3・6H2O、1 %(w/v) CaCl2・2H2O、0.02 %(w/v) CoCl2・6H2O、0.016 %(w/v) CuSO4・5H2O、0.012 %(w/v) NiCl2・6H2Oを溶かしたもの）とした。炭素源には、オレイン酸とグリセロールをそれぞれ1.0 %(w/v)の濃度で用いた。【００７７】
菌株を種培地10 mlに接種し、培養温度30℃で17時間培養し、前培養液とした。【００７８】
次に、50 mlのPHA生産培地を入れた坂口フラスコに前培養液を1.0 %(v/v)接種し、培養温度30℃で72時間振とう培養を行った。【００７９】
＜精製＞
培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、エタノールで洗浄後真空乾燥し、乾燥菌体を取得した。【００８０】
得られた乾燥菌体1 gに100 mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣を濾別し、エバポレーターで総容量が30 mlになるまで濃縮後、90 mlのヘキサンを徐々に添加し、1時間穏やかに攪拌した。析出したPHAを濾別後、60℃で3時間真空乾燥し、乾燥PHAとして取得した。得られた乾燥PHAの重量を測定し、PHA生産量を算出した。【００８１】
＜重量平均分子量測定＞
PHAの重量平均分子量をゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー法により分析した。精製したPHA 10 mgを10 mlのクロロホルムに溶解し、0.2 mmのフィルターで濾過して測定用サンプルを調製し、そのうち0.05 mlを用いて分析した。測定システムはSCL-10A（島津製作所社製）、カラムはShodex GPC K-806L（昭和電工社製）を２本直列に接続し、40℃で測定した。移動層は1.0 ml/分のクロロホルムとし、RI検出器（RID-10A、島津製作所社製）を用いた。標準品としては、同様に処理したポリスチレン（昭和電工社製、重量平均分子量：711万、192万、66.8万、19.7万、3.14万、0.295万）を用い、検量線によりPHAの重量平均分子量を算出した。【００８２】
（比較例１）KNK-005株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えてKNK-005株（米国特許第7384766号明細書参照）を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。ただし、種培地にカナマイシンは添加しなかった。KNK-005株は、染色体上に配列番号3に記載のPHA合成酵素をコードする遺伝子を有する菌株である。PHA生産量は10.4 g/L、重量平均分子量は91×104であった。結果を表１に示した。【００８３】
（比較例２）KNK-005 ΔphaZ1,2,6株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えてKNK-005 ΔphaZ1,2,6株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。ただし、種培地にカナマイシンは添加しなかった。PHA生産量は10.7 g/L、重量平均分子量は136×104であった。結果を表１に示した。【００８４】
【表１】
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【００８５】
表１に示すように、実施例１では大腸菌由来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の導入によりグリセロールキナーゼ活性を強化することで、比較例２に対して重量平均分子量を約1.6倍に向上させることができた。実施例１の親株である比較例２のKNK-005 ΔphaZ1,2,6株は、PHA分解酵素であるphaZ遺伝子の破壊により、比較例１のKNK-005株に対して重量平均分子量が約1.5倍に向上しているが、実施例１に示すように、大腸菌由来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の導入によりグリセロールキナーゼ活性を強化することで、比較例２よりもさらに重量平均分子量を向上させる効果があった。【００８６】
（実施例２）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えて製造例３で得られたKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。PHA生産量は11.2 g/L、重量平均分子量は160×104であった。結果を表２に示した。【００８７】
（実施例３）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::Plac-glpKEc ΔZ2株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えて製造例４で得られたKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::Plac-glpKEc ΔZ2株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。ただし、種培地にカナマイシンは添加しなかった。PHA生産量は12.2 g/L、重量平均分子量は186×104であった。結果を表２に示した。【００８８】
（実施例４）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacN17-glpKEc ΔZ2株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えて製造例５で得られたKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacN17-glpKEc ΔZ2株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。ただし、種培地にカナマイシンは添加しなかった。PHA生産量は11.9 g/L、重量平均分子量は195×104であった。結果を表２に示した。【００８９】
（実施例５）KNK-005 REP-phaJ4b PlacUV5-A2507 ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えて製造例６で得られたKNK-005 REP-phaJ4b PlacUV5-A2507 ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。ただし、種培地にカナマイシンは添加しなかった。PHA生産量は7.6 g/L、重量平均分子量は186×104であった。結果を表２に示した。【００９０】
（実施例６）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacUV5-A2507 ΔZ2株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えて製造例７で得られたKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔphaZ6::PlacUV5-A2507 ΔZ2株を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。ただし、種培地にカナマイシンは添加しなかった。PHA生産量は10.8 g/L、重量平均分子量は177×104であった。結果を表２に示した。【００９１】
（比較例３）KNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株によるPHAの生産
KNK-005 ΔphaZ1,2,6 / pCUP2-PlacN17-glpKEc株に代えてKNK-005 REP-phaJ4b ΔphaZ1::Plac-phaCRe ΔZ2,6株（国際公開第2015/146195号参照）を用いて、実施例１と同様の方法でPHAを生産し、得られたPHAの生産量、及び、重量平均分子量を測定した。ただし、種培地にカナマイシンは添加しなかった。PHA生産量は10.0 g/L、重量平均分子量は117×104であった。結果を表２に示した。【００９２】
【表２】
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【００９３】
表２に示すように、実施例２ではプラスミドを用いた大腸菌由来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の導入によりグリセロールキナーゼ活性を強化することで、比較例３に対して重量平均分子量を約1.4倍に向上させることができた。実施例３、及び実施例４は宿主ゲノム中への大腸菌由来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の導入によりグリセロールキナーゼ活性を強化することで、比較例３に対して重量平均分子量をそれぞれ約1.6倍、約1.7倍に向上させることができた。実施例３と実施例４は大腸菌由来のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子上流の発現調節配列が異なるが、どちらも重量平均分子量の向上効果があった。実施例５では宿主ゲノム中に存在するグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の上流に発現調節配列を挿入することによりグリセロールキナーゼ活性を強化することで、比較例３に対して重量平均分子量を約1.6倍に向上させることができた。実施例６では宿主ゲノム中に存在するグリセロールキナーゼをコードする遺伝子のコピーをゲノム上の異なる領域に導入することによりグリセロールキナーゼ活性を強化することで、比較例３に対して重量平均分子量を約1.5倍に向上させることができた。
【配列表】
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【国際調査報告】
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