(57)【要約】  本発明は、被験細胞を包埋させた培地層を含む多層の培地を形成する必要や、培養後に細胞を沈降させる必要がなく、簡便かつ高精度で被験細胞の造腫瘍性を評価できる方法を提供するものであり、低粘性の液状であって、細胞及びコロニー（スフェア）を分散させる性質を有するが、細胞増殖において足場とはならない性質を有する培地組成物、好ましくは低分子量の寒天を含有する培地組成物中に被験細胞を分散した状態で培養して、形成されたコロニー（スフェア）を検出することを特徴とする。
2019009425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低粘性の液状であり、細胞及びコロニー(スフェア）を分散させるが、細胞増殖における足場とはならない性質を有する培地組成物で被験細胞を培養し、形成されたコロニー（スフェア）を検出することを含む、造腫瘍性の評価方法。
【請求項２】
前記培地組成物が低分子量の寒天を含有し、該寒天の重量平均分子量が１０，０００〜６０，０００である、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
低分子量の寒天の含有量が、培地組成物の全量に対し、０．００５（ｗ／ｖ）％以上２（ｗ／ｖ）％未満である、請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
低分子量の寒天を０．１（ｗ／ｖ）％含有する培地組成物の３７℃における粘度が２．０ｍＰａ・ｓ以下である、請求項２に記載の評価方法。
【請求項５】
被験細胞が動物由来の正常細胞、幹細胞または前駆細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項６】
検出するコロニー（スフェア）が、足場非依存的増殖性を有する細胞のコロニー（スフェア）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
足場非依存的増殖性を有する細胞が形質転換細胞、多能性幹細胞またはがん細胞である、請求項６に記載の評価方法。
【請求項８】
コロニー（スフェア）の検出が顕微鏡観察により行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項９】
コロニー（スフェア）の検出が細胞イメージング装置を用いて行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１０】
コロニー（スフェア）の検出が細胞検出試薬を用いて行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療等製品、特にヒト細胞加工製品の造腫瘍性の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療等製品（特に細胞加工製品）の実用化においては課題が多いが、幹細胞を利用した、特に人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用した細胞加工製品の造腫瘍性が、非臨床安全性試験におけるひとつの検討事項になっている（非特許文献１）。造腫瘍性を評価する方法として、遺伝子やタンパク質の発現で未分化細胞を検出するｑＲＴ−ＰＣＲやフローサイトメトリー、足場非依存的増殖細胞（悪性形質転換細胞）を検出する軟寒天コロニー形成試験、及び直接的なインビボ特性を評価する免疫不全マウスを用いた移植モデル試験が検討されている。ｑＲＴ−ＰＣＲやフローサイトメトリーは１日での評価が可能であるが、ターゲットが限定されることや検出感度が低いことが課題である。
一方、軟寒天コロニー形成試験や移植モデル試験では、造腫瘍性を示すターゲットの網羅的な検出や高感度検出が可能である。ごくわずかに存在する悪性形質転換細胞の検出を可能としたデジタル軟寒天コロニー形成試験法も提案されている（非特許文献２）。
しかし、軟寒天コロニー形成試験や移植モデル試験は、煩雑な操作を含むことや時間を要することが課題である。
特に、軟寒天コロニー形成試験は、悪性形質転換細胞を単離し、特性を解析できるという利点があるが、底部寒天培地層上に軟寒天培地を重層し、さらにその上に栄養培地を重層して、軟寒天培地層中で細胞を培養し、培養後は、悪性形質転換細胞を検出するために、寒天を溶解させる必要があり、非常に煩雑な操作を要する。
それゆえ、より簡便な操作で細胞加工製品の造腫瘍性を評価できる方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ヒト（自己）体性幹細胞加工医薬品等の品質及び安全性の確保に関する指針；薬食発０９０７第２号、平成２４年９月７日
【非特許文献２】S. Kusakawa et al., Scientific Reports 5 17892 (2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、被験細胞を包埋させた培地層を含む多層の培地を形成する必要や、培養後に細胞を沈降させる必要がなく、簡便かつ高精度で被験細胞の造腫瘍性を評価できる方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、本発明者は、低粘性の液状であって、細胞及びコロニー（スフェア）を分散させる性質を有するが、細胞増殖において足場とはならない性質を有する培地組成物、好ましくは低分子量の寒天を含有する培地組成物中に被験細胞を分散した状態で培養すると、造腫瘍性を有しない正常細胞（足場非依存的増殖性を有しない細胞）は増殖しないが、造腫瘍性の細胞（足場非依存的増殖性を有する細胞）は増殖してコロニー（スフェア）を形成し、形成された造腫瘍性細胞のコロニー(スフェア）を容易に検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］低粘性の液状であり、細胞及びコロニー(スフェア）を分散させるが、細胞増殖における足場とはならない性質を有する培地組成物で被験細胞を培養し、形成されたコロニー（スフェア）を検出することを含む、造腫瘍性の評価方法。
［２］前記培地組成物が低分子量の寒天を含有し、該寒天の重量平均分子量が１０，０００〜６０，０００である、［１］に記載の評価方法。
［３］低分子量の寒天の含有量が、培地組成物の全量に対し、０．００５（ｗ／ｖ）％以上２（ｗ／ｖ）％未満である、［２］に記載の評価方法。
［４］低分子量の寒天を０．１（ｗ／ｖ）％含有する培地組成物の３７℃における粘度が２．０ｍＰａ・ｓ以下である、［２］に記載の評価方法。
［５］被験細胞が動物由来の正常細胞、幹細胞または前駆細胞である、［１］〜［４］のいずれかに記載の評価方法。
［６］検出するコロニー（スフェア）が、足場非依存的増殖性を有する細胞のコロニー（スフェア）である、［１］〜［５］のいずれかに記載の評価方法。
［７］足場非依存的増殖性を有する細胞が形質転換細胞、多能性幹細胞またはがん細胞である、［６］に記載の評価方法。
［８］コロニー（スフェア）の検出が顕微鏡観察により行われる、［１］〜［７］のいずれかに記載の評価方法。
［９］コロニー（スフェア）の検出が細胞イメージング装置を用いて行われる、［１］〜［７］のいずれかに記載の評価方法。
［１０］コロニー（スフェア）の検出が細胞検出試薬を用いて行われる、［１］〜［７］のいずれかに記載の評価方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、被験細胞を包埋させた培地層を含む多層の培地を形成する必要や、培養後に細胞を沈降させる必要がなく、煩雑な操作が不要で、培養物中におけるコロニー（スフェア）の形成を容易に検出することができ、簡便かつ高精度で被験細胞の造腫瘍性を評価できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、試験例１において、検出されたコロニー（スフェア）の例を示す図である。図中のスケールバーは５００μｍを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、被験細胞の造腫瘍性を評価する方法（以下、本明細書にて「本発明の評価方法」とも称する）を提供する。
本発明の評価方法は、下記に詳述する培地組成物中で被験細胞を培養し、形成されたコロニー（スフェア）を検出することを含む。
【００１０】
本発明の目的には、被験細胞の培養に用いる培地組成物は、低粘性の液状であって、細胞及びコロニー（スフェア）を分散させる性質を有するが、細胞増殖において足場とはならない性質を有するものであることが好ましい。
上記の性質を有する培地組成物としては、低分子量の寒天を含有する培地組成物が好ましい。
【００１１】
本発明において好ましく用いられる培地組成物に含有される寒天は、アガロースと、アガロースが部分的に硫酸エステル化され、又はメトキシ基、ピルビン酸基、カルボキシル基により置換されたアガロペクチンとにより構成されるが、これらの構成成分の比率に関して制限はなく、アガロースのみにて構成されてもよい。また、アガロースがヒドロキシエチル化された低融点アガロースや、原料となる海藻の選択により、又はヒドロキシエチル化を施す等により調製された低融点寒天、さらに温湯に対しても高い溶解性を示す即溶性寒天等も、用いることができる。
本発明では、寒天として、工業的に製造される粉末状、フレーク状又は固形状の寒天が、高純度で品質も均一であるため、好ましく用いられる。また、医薬品、食品等の分野で、一般的に使用される種々の性状、物性を有するものを用いることができる。
本発明の目的には、重量平均分子量が１０，０００〜６０，０００であり、一般的な寒天よりも低分子量の寒天（以下、本明細書において「低分子寒天」と称することがある）を用いることが好ましい。
【００１２】
本発明において、培地組成物に用いられる低分子寒天の重量平均分子量は、上記の通り１０，０００〜６０，０００であり、２０，０００〜６０，０００であることがより好ましく、３０，０００〜６０，０００であることがさらに好ましく、４０，０００〜６０，０００であることがさらにより好ましく、４３，０００〜６０，０００であることがより一層好ましく、４３，０００〜５０，０００であることが特に好ましい。
重量平均分子量が１０，０００未満である寒天を用いた場合には、細胞を分散する効果を得ることが困難な場合がある。一方、重量平均分子量が６０，０００を超える寒天を用いた場合には、細胞の培地中における分散が不均一となる場合がある。
【００１３】
さらに、本発明で用いる低分子寒天としては、分子量分布が狭いものであることが好ましく、寒天の重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値として得られる分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜８．０であることが好ましく、１．５〜７．０であることがより好ましく、２．０〜６．０であることがさらに好ましく、２．５〜５．５であることがより一層好ましく、３．５〜５．０であることが特に好ましい。
【００１４】
なお、低分子寒天の上記重量平均分子量及び数平均分子量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるゲル浸透クロマトグラフィー法により測定することができる。
具体的には、たとえば次のような測定機器、条件等により測定することができる。
（１）測定用試料：低分子寒天をたとえば０．１５（ｗ／ｖ）％程度の濃度となるように、精製水に９５℃〜９７℃で溶解した後、５０℃まで冷却し、試料とする。
なお、「（ｗ／ｖ）％」は「重量／体積％」を示す（以下同様）。
（２）測定機器：株式会社島津製作所製液体クロマトグラフＬＣ−１０ＡＴ  ＶＰ、ＲＩＤ−１０Ａ等
（３）カラム：東ソー株式会社製ＴＯＳＯＨ  ＴＳＫ−ＧＥＬ  ｆｏｒ  ＨＰＬＣ、ＴＳＫ−ＧＥＬ  ＧＭＰＷＸＬ等
（４）溶媒：０．１Ｍ硝酸ナトリウム水溶液等
（５）検出器：示差屈折計
（６）測定温度：５０℃
（７）標準物質：分子量既知のプルラン（Ｓｈｏｄｅｘ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  Ｐ−８２等）
【００１５】
また、本発明で培地組成物に用いる低分子寒天は、１．５（ｗ／ｖ）％のゲルについて、２０℃で測定したゲル強度が２５ｇ／ｃｍ２以下であることが好ましく、１５ｇ／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１２ｇ／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。
上記「ゲル強度」とは、寒天の１．５（ｗ／ｖ）％水溶液を２０℃で１５時間静置し、凝固したゲルについて、その表面１ｃｍ２当たり２０秒間耐え得る最大荷重をいい、たとえば日寒水式測定装置を用い、日本工業規格（ＪＩＳ）  Ｋ  ８２６３：１９９４の規定に従って測定される。
【００１６】
さらに、本発明で培地組成物に好適に用いられる低分子寒天は、１．５（ｗ／ｖ）％ゲル押出荷重が１０ｇ〜１，４００ｇであることが好ましく、１０ｇ〜１，０００ｇであることがより好ましく、１０ｇ〜５００ｇであることがさらに好ましく、１００ｇ〜３００ｇであることがより一層好ましい。
上記押出荷重は、たとえば、テクスチャーアナライザー（英弘精機株式会社製）に付随する円柱容器（内径５０ｍｍ、高さ１１０ｍｍ、アクリル樹脂製）の底部中央部の穴（直径３ｍｍ）をテープで塞ぎ、寒天の１．５（ｗ／ｖ）％水溶液１００ｇを充填し、２０℃にて１８時間静置してゲル化させた後、底部のテープをはずし、直径４９ｍｍのプランジャーを用いてゲル上部から加圧し（２０℃、進入速度２０ｍｍ／分）、ゲルが壊れて下部の穴から流出した時の荷重を測定することにより求められる。
【００１７】
上記した低分子寒天は、通常の寒天の酸処理による低分子化、あるいは、テングサ、オゴノリ、オバクサ等の海藻からの抽出工程時に、又は前記抽出工程もしくはろ過工程のいずれかを経た寒天に対し、酸処理を行う等、公知の方法により製造することができるが、低分子寒天として市販されている製品、たとえば「ウルトラ寒天イーナ」（伊那食品工業株式会社製）等を用いることもできる。
【００１８】
本発明の評価方法に用いる培地組成物の調製に際し、低分子寒天は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法には特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌等が挙げられる。これらの滅菌処理は、寒天が固形でも溶液の状態でも施すことができる。
【００１９】
本発明の評価方法においては、上記した低分子寒天を、細胞培養に通常用いる培地成分とともに含有する培地組成物を用いる。
【００２０】
細胞培養に通常用いる培地成分としては、グルコース、フルクトース、ショ糖、マルトース等の炭水化物；アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸等のアミノ酸；アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質；トリペプチド（グリシルグリシルグリシン）、大豆ペプチド等のペプチド；血清；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド等）、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン；オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸等の脂肪酸；コレステロール等の脂質；塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等の無機塩；亜鉛、銅、セレン等の微量元素；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（Ｎ，Ｎ−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＢＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｎ−［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ）（Ｔｒｉｃｉｎｅ）等の緩衝試薬；アンホテリシンＢ、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質；Ｔｙｐｅ  Ｉ  コラーゲン、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  コラーゲン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン等の細胞接着因子及び細胞間マトリックス；インターロイキン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）等のサイトカイン及び増殖因子；デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、エストラジオール、プロゲステロン、グルカゴン、インスリン等のホルモン等が挙げられ、培養する細胞に応じて適切な成分を選択し、公知の組成に従って培地組成物を調製して用いることができる。
【００２１】
また、本発明においては、細胞培養用として汎用される培地を用いることもでき、かかる培地としては、肝細胞をはじめ哺乳動物細胞や、がん細胞、哺乳動物由来の細胞株の培養に用いられる培地を挙げることができる。
【００２２】
哺乳動物細胞の培養用培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン株式会社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン株式会社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１培地及びｍＴｅＳＲ２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ及びリプロＦＦ２（株式会社リプロセル製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（株式会社細胞科学研究所製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン株式会社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン株式会社製）等が挙げられる。
【００２３】
がん細胞の培養に用いられる培地としては、上記哺乳動物細胞の培養用培地及び、上記哺乳動物細胞の培養用培地に細胞接着因子を添加したものが挙げられる。細胞接着因子としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン等が挙げられる。これらの細胞接着因子は、１種を単独で、又は２種類以上を組み合わせて添加することができる。
【００２４】
肝細胞の培養に用いられる培地としては、上記哺乳動物細胞の培養用培地及び、ＨｅｐａｔｏＺＹＭＥ−ＳＦＭ（ライフテクノロジーズ社製）、ＨＣＭ（登録商標）−肝細胞培養培地ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標、ロンザ社製）、ＨＢＭ（登録商標）−肝細胞基本培地（ロンザ社製）、ＨＭＭ（登録商標）−肝細胞メンテナンス培地（ロンザ社製）、変法ランフォード培地（日水製薬株式会社製）、ＩＳＯＭ’ｓ培地、肝細胞増殖培地（タカラバイオ株式会社製）、肝細胞維持培地（タカラバイオ株式会社製）、肝細胞基本培地（タカラバイオ株式会社製）、活性維持スーパー培地（インビトロ  ＡＤＭＥＴ  ラボラトリーズ社製）などが挙げられる。これらの培地には、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン等の細胞接着因子を添加することが可能であり、前記細胞接着因子は、１種又は２種以上を選択して添加することができる。
【００２５】
本発明においては、被験細胞の種類等により、適切な培地を選択して用いることができる。上記した培地は、それらの組成に基いて調製して用いてもよいが、各社より提供されている市販の製品を用いることもできる。
【００２６】
本発明において、被験細胞の培養に用いる培地組成物における低分子寒天の含有量は、培地組成物の全量に対し、０．００５（ｗ／ｖ）％以上で２（ｗ／ｖ）％未満であることが好ましく、０．０３（ｗ／ｖ）％以上で２（ｗ／ｖ）％未満であることがより好ましく、０．０３（ｗ／ｖ）％〜１（ｗ／ｖ）％であることがさらに好ましく、０．０３（ｗ／ｖ）％〜０．１（ｗ／ｖ）％であることがさらにより好ましい。
培地組成物中の低分子寒天の含有量が０．００５（ｗ／ｖ）％以上であれば、細胞又は一つの細胞から形成されたコロニー（スフェア）は、過剰な大きさの凝集塊を形成することなく増殖し得る。また、培地組成物中の低分子寒天の含有量が０．０３（ｗ／ｖ）％以上であれば、細胞の均一な分散が得られるため、より好ましい。一方、培地組成物中の低分子寒天の含有量が２（ｗ／ｖ）％以上であると、室温でゲル化してしまう場合があるため、取扱いが困難となることがある。
また、培地組成物中の低分子寒天の含有量は、後述するように、被験細胞の種類や培養方法、検出方法等により、適切な濃度となるように選択することができる。
【００２７】
本発明で用いる培地組成物の粘度は、０．１（ｗ／ｖ）％の低分子寒天を含有する培地組成物において、Ｅ型粘度計を用い、３７℃で回転数１００ｒｐｍにて５分間測定した場合、２．０ｍＰａ・Ｓ以下であることが好ましく、１．５ｍＰａ・Ｓ以下であることがより好ましい。
【００２８】
本発明で用いる培地組成物は、公知の方法に準じて調製することができ、たとえば、培地成分及び低分子寒天を所定濃度となるように精製水に添加して、９０℃〜９７℃に加熱して溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌して調製することができる。
また、低分子寒天を０．６（ｗ／ｖ）％〜２（ｗ／ｖ）％の濃度となるように精製水に添加して９０℃〜９７℃に加熱、溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌して調製した低分子寒天水溶液と、任意の培地を所定量混合して調製することもできる。
さらにまた、低分子寒天を０．０１（ｗ／ｖ）％〜０．２（ｗ／ｖ）％の濃度となるように精製水に添加して９０℃〜９７℃に加熱、溶解し、１２１℃で２０分間オートクレーブ滅菌して調製した低分子寒天水溶液と、成分を２倍以上に濃縮した培地を所定量混合して調製することもできる。
低分子寒天水溶液と任意の培地を混合する際の該培地の温度は、２５℃〜８０℃であることが好ましく、より好ましくは３０℃〜５０℃、さらに好ましくは３２℃〜３７℃である。また、その際の寒天水溶液の温度は、３０℃〜８０℃であることが好ましく、より好ましくは４０℃〜７０℃、さらに好ましくは５０℃〜６０℃である。
【００２９】
本発明の評価方法においては、上記した低分子寒天を含有する培地組成物中で、被験細胞を培養する。被験細胞の培養は、上記した低分子寒天を含有する培地組成物のみを用いて、単層で行うことができる。すなわち、本発明の評価方法においては、軟寒天コロニー形成試験のように、複数の培地を重層することなく、被験細胞の培養を行うことができる。
被験細胞としては、哺乳動物由来の正常細胞、幹細胞および前駆細胞が挙げられる。
【００３０】
哺乳動物由来の正常細胞としては、精子、卵子等の生殖細胞や、生体を構成する体細胞が挙げられる。
生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞（たとえば、角化細胞（ケラチノサイト）、角質細胞等）、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト（希突起膠細胞）、マイクログリア（小膠細胞）、アストロサイト（星状膠細胞）、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞、骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞及び単核細胞等が挙げられる。
当該体細胞には、たとえば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。
【００３１】
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例として、以下に限定されるものではないが、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、毛包幹細胞等の成体幹細胞；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞等が挙げられる。
【００３２】
前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞であり、衛星細胞、膵前駆細胞、血管前駆細胞、血管内皮前駆細胞、造血前駆細胞（臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞等）が挙げられる。
【００３３】
本発明の一態様において、被験細胞は、本質的に足場非依存的増殖性を有しない細胞である。「足場非依存的増殖性を有しない細胞」には、足場依存的に増殖する細胞、及び足場依存性に関わらず増殖しない細胞が含まれる。「本質的に」とは、造腫瘍性の細胞（足場非依存的増殖性を有する細胞）が混入していなければ、細胞が足場非依存的には増殖しないことを意味する。
本発明の一態様において、被験細胞に含まれる「足場非依存的増殖性を有しない細胞」の割合は、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．９％以上、９９．９９％以上）である。
【００３４】
造腫瘍性の細胞、すなわち足場非依存的増殖性を有する細胞としては、がん細胞、形質転換細胞、多能性幹細胞等を挙げることができる。
【００３５】
がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞であり、胃がん、食道がん、大腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞がん、基底細胞がん、腺がん、骨髄がん、腎細胞がん、尿管がん、肝がん、胆管がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、頭蓋咽頭がん、喉頭がん、舌がん、線維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、がん患者由来の血液等のがん組織の細胞が挙げられる。
【００３６】
形質転換細胞とは、遺伝的性質の変化した細胞をいい、自然に発生したものの他、人為的に作成されたものも含まれる。
【００３７】
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を挙げることができる。多能性幹細胞は、生体内に移植されると奇形腫を形成し得る。
【００３８】
本発明の一態様において、被験細胞として、上記した多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）を適切な分化誘導培養に付して得られた多能性を有しない細胞（例えば、体細胞、成体幹細胞）が用いられる。
該細胞は、本質的に足場非依存的増殖性を有しない細胞であり得る。多能性幹細胞を分化誘導培養に付して得られた細胞には、分化していない多能性幹細胞が残存している可能性がある。そのため、このような細胞を被験細胞として、本発明の評価方法を適用すると、仮に多能性幹細胞が残存していた場合、該多能性幹細胞が増殖し、コロニー（スフェア）を形成するため、検出が可能である。
【００３９】
被験細胞の培養は、一般的に動物細胞の培養が可能な容器、たとえば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトル等を用いて行うことができる。被験細胞が表面に接着して足場依存的な増殖が生じないよう、表面が細胞非接着処理されたディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート等を用いて培養を行うことが好ましく、イージースフェア（ＥＺ ＳＰＨＥＲＥ）（旭硝子株式会社製）、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト株式会社製）等、検出しようとするコロニー（スフェア）と同一径の複数の凹みを導入した細胞非接着性培養容器を用いることもできる。
【００４０】
本発明の評価方法において、被験細胞の培養は、動物細胞の培養に際して通常用いられる条件および方法により行うことができるが、細胞の機能等に及ぼす損傷を回避するためには静置培養することが好ましい。
培養温度は、通常２５℃〜３９℃であり、好ましくは３３℃〜３９℃である。
また、二酸化炭素濃度は、通常４（ｖ／ｖ）％〜１０（ｖ／ｖ）％であり、好ましくは４（ｖ／ｖ）％〜６（ｖ／ｖ）％である。なお、「（ｖ／ｖ）％」は「体積／体積％」を示す（以下同様）。
培養を行う期間は、通常３日間〜３５日間であるが、被験細胞および検出すべき細胞の種類等に合わせて適宜設定することができる。
【００４１】
本発明の評価方法においては、上記した被験細胞を培養し、培養物中に存在する可能性のある造腫瘍性の細胞、すなわち足場非依存的増殖性を有する細胞を検出することにより、被験細胞について造腫瘍性を評価する。
培養にあたっては、被験細胞を上記した低分子寒天を含有する培地組成物中に分散し、培養に付す。被験細胞が接着細胞やコロニー（スフェア）を形成した細胞である場合、必要に応じて、被験細胞を分散処理に付してもよい。かかる分散処理は、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素、及び／又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤を含む分散液により行うことができる。
本発明の一態様においては、単一細胞に分散された被験細胞を、上記した低分子寒天を含有する培地組成物中に懸濁し、培養に付す。
【００４２】
上述したように、低分子寒天は足場としては機能し難いので、被験細胞を上記した低分子寒天を含有する培地組成物中にて培養すると、足場非依存的増殖性を有しない細胞は増殖せず、コロニー（スフェア）を形成しないのに対し、造腫瘍性の細胞は、足場非依存的増殖性を有するため、増殖し、コロニー（スフェア）を形成する。
従って、かかるコロニー（スフェア）を検出することにより、被験細胞の造腫瘍性、すなわち被験細胞中に造腫瘍性の細胞が存在するか否かを評価することができる。
形成されたコロニー（スフェア）については、顕微鏡観察や細胞イメージング装置を用いた解析を行うことにより検出することができ、その大きさ、数、形態、構成細胞数などを解析することができる。
【００４３】
顕微鏡観察や細胞イメージング装置を用いた解析を行うには、被験細胞が培養組成物中に浮遊せずに培養容器底面に沈殿しているが、良好に分散した状態の培養物を得ることが好ましい。
かかる状態の培養物を得るためには、培地組成物中における低分子寒天の濃度は、被験細胞の種類等によって異なるが、０．００５（ｗ／ｖ）％以上０．０７（ｗ／ｖ）％未満であることが好ましく、０．０３（ｗ／ｖ）％以上０．０７（ｗ／ｖ）％未満であることがより好ましく、０．０３（ｗ／ｖ）％〜０．０５（ｗ／ｖ）％であることがさらに好ましい。
【００４４】
培地組成物中における低分子寒天の濃度が０．０３（ｗ／ｖ）％以上である場合、被験細胞の分散性がより向上し、被験細胞が均一に分散した培養物を得ることができる。被験細胞が培養組成物中に浮遊せずに培養容器底面に沈殿しているが、均一に分散した状態の培養物は、遠心分離等、被験細胞を沈降させる操作を繰り返し行うことなく、また培養物を希釈することなく、そのまま細胞イメージング装置により解析することができるため、細胞イメージ解析によるハイコンテントスクリーニング又はハイコンテントアナリシスに好適に用いることができる。
なお、細胞イメージング装置により解析する前に、被験細胞の培養物を遠心分離等により沈降させる操作を行ってもよいが、かかる操作は１回程度で十分である。
【００４５】
細胞イメージング装置の例としては、「Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ」（登録商標）（パーキンエルマー社製）、「Ｏｐｅｒｅｔｔａ」（登録商標）（パーキンエルマー社製）、「Ｃｙｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＥヘルスケア社製）、「ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００」（ＧＥヘルスケア社製）、「ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ  ６０００」（ＧＥヘルスケア社製）、「セルボイジャー（ＣｅｌｌＶｏｙａｇｅｒ）（登録商標）ＣＶ７０００（横河電気株式会社製）、「ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＶＴＩ ＨＣＳ Ｒｅａｄｅｒ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、「ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）ＸＴＩ ＨＣＡ Ｒｅａｄｅｒ」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、「ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（登録商標）」（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、「ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ」（モレキュラーデバイス社製）、「Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ」（スクリーンホールディングス社製）などが挙げられる。しかしながら、細胞イメージング装置は、これらに限定されることはなく、蛍光又は明視野画像データを利用して、評価対象とする細胞を個別かつ複数のパラメーターについて経時的かつ詳細に調べることができるものであればよい。
【００４６】
形成されたコロニー（スフェア）の検出は、細胞検出試薬を用いて行うこともできる。
細胞検出試薬としては、細胞の活性や増殖を指標として細胞を検出し得る試薬、細胞の染色を行う試薬等を用いることができ、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）測定試薬、チミジン取り込みアッセイに用いるトリメチル化チミジン、クリスタルバイオレット、トリパンブルー、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ））、ＷＳＴ−１（２−（４−アイオドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩（２−（４−Ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ））、ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，モノナトリウム塩（２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ））等の染色試薬、レサズリン等の還元されて蛍光を発する試薬が例示される。
【００４７】
被験細胞の培養と並行して、ネガティブコントロール及び／又はポジティブコントロールの細胞を、上記した低分子寒天を含有する培地組成物中で培養してもよい。
ネガティブコントロールの細胞としては、足場非依存的増殖性を有しない細胞からなる細胞集団（足場非依存的増殖性を有しないことが確認された細胞集団）を用いることができる。ポジティブコントロールの細胞としては、造腫瘍性の細胞（足場非依存的増殖性を有する細胞）を用いることができる。
ネガティブコントロール及びポジティブコントロールの培養条件は、細胞の種類が異なる点を除き、被験細胞の培養条件と同一とする。ネガティブコントロールではコロニー（スフェア）の形成が生じず、ポジティブコントロールでは顕著なコロニー（スフェア）の形成が生じることが期待される。そして、被験細胞を培養した際のコロニー（スフェア）形成を、ネガティブコントロール及び／又はポジティブコントロールにおけるコロニー（スフェア）形成と比較し、それに基づき被験細胞のコロニー（スフェア）形成が有意であるか否か、或いは被験細胞が造腫瘍性であるか否か（被験細胞が造腫瘍性細胞を含むか否か）を判断することができる。
【００４８】
上記した本発明の評価方法では、被験細胞を包埋させた培地層を含む多層の培地を形成する必要や、培養後に細胞を沈降させる必要がなく、煩雑な操作が不要で、培養物を直接観察してコロニー（スフェア）の形成を容易に検出することができる。
従って、本発明の評価方法は、簡便かつ高精度で被験細胞の造腫瘍性（すなわち、被験細胞が造腫瘍性細胞を含むか否か）を評価し得る方法を提供するものである。
【実施例】
【００４９】
以下に試験例により、本発明についてさらに詳細に説明する。【００５０】
［試験例１］間葉系幹細胞中のＨｅＬａ細胞の検出
（１）低分子寒天を含有する培地組成物の調製
低分子寒天（「ウルトラ寒天イーナ」、伊那食品工業株式会社製）を２．０（ｗ／ｖ）％となるように純水に懸濁させた後、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。本水溶液を攪拌し、さらに１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌して完全に溶解させた。室温まで放冷した後、ゲル化した低分子寒天水溶液を電子レンジで加熱し再溶解させた。本水溶液１５０μＬを１５ｍＬ遠沈管（アズワン株式会社製）に入れ、３７℃に加温した１０（ｖ／ｖ）％牛胎仔血清（ＦＢＳ）（バイオロジカルインダストリーズ社製）を含有するＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース）（和光純薬工業株式会社製）９．８５ｍＬを添加し、速やかに攪拌して、低分子寒天の終濃度が０．０３（ｗ／ｖ）％の培地組成物を調製した。
上記低分子寒天の物性については、下記の通りである。
（ｉ）重量平均分子量及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）
ＨＰＬＣによるゲル浸透クロマトグラフィー−示差屈折計法により、０．１５（ｗ／ｖ）％水溶液を試料として測定した重量平均分子量（Ｍｗ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、それぞれ４３，０００及び４．９であった。
（ｉｉ）１．５（ｗ／ｖ）％ゲルの強度
日寒水式測定装置を用い、ＪＩＳ  Ｋ  ８２６３：１９９４の規定に従って２０℃で測定した１．５（ｗ／ｖ）％ゲルのゲル強度は、１０ｇ／ｃｍ２であった。
（ｉｉｉ）１．５（ｗ／ｖ）％ゲル押出荷重
テクスチャーアナライザー（英弘精機株式会社製）にて、上記に記載した方法で測定した１．５（ｗ／ｖ）％ゲル押出荷重は、１７０ｇであった。なお、測定条件は下記の通りである。
・測定温度：２０℃
・プランジャーの直径：４９ｍｍ
・プランジャーの進入速度：２０ｍｍ／分【００５１】
（２）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の造腫瘍性の評価
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Human Mesenchymal Stem Cells（ｈＭＳＣ））（ロンザ社製）を（１）で調製した低分子寒天を含有する培地組成物に懸濁した後、さらにヒト子宮頸がん由来細胞株（ＨｅＬａ）（アメリカンタイプカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）社製）を懸濁した。前記懸濁液を、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに、播種密度が、ｈＭＳＣは２５，０００ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェル、ＨｅＬａは０．０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェル及び０．２５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェルとなるように、それぞれ３２ウェルに分注した。陰性対照として、ＨｅＬａを添加していないｈＭＳＣの懸濁液を、２５，０００ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェルの播種密度にて３２ウェルに分注した。
各プレートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５（ｖ／ｖ）％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。１５日間培養を継続した後、各プレートの培養物を顕微鏡下（「倒立型リサーチ顕微鏡ＩＸ７３」、オリンパス株式会社製、倍率：４倍）にて観察し、直径が２００μｍ以上のコロニーの数を計測した。検出されたＨｅＬａのコロニーの顕微鏡下の観察画像の例を図１に示し、コロニーの計測結果を表１に示した。【００５２】
【表１】
2019009425.tif 000003
【００５３】
表１に示されるように、コロニー数の実測値は、理論値（ＨｅＬａ細胞数）とよく合致しており、本発明の評価方法をｈＭＳＣの造腫瘍性の評価、すなわち、ｈＭＳＣに含まれる造腫瘍性細胞の検出に適用できることが示唆された。【００５４】
［試験例２］ヒト骨髄由来間葉系幹細胞中の造腫瘍性の細胞検出試薬を用いた評価
試験例１（１）と同様の方法で、低分子寒天の終濃度が０．０６（ｗ／ｖ）％の培地組成物を調製した。
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌs（ｈＭＳＣ））（プロモセル（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）社製）を前記培地組成物に懸濁した後、さらにヒト子宮頸がん由来細胞株（ＨｅＬａ）（アメリカンタイプカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）社製）を懸濁した。前記懸濁液を、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに、播種密度が、ｈＭＳＣは２５，０００ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ウェル、ＨｅＬａは０．５ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ウェルとなるように分注した。
各プレートを、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５（ｖ／ｖ）％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した。１７日間培養を継続した後、セルカウンティングキット−８（（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８）、発色基質としてＷＳＴ−８を含有）（株式会社同仁化学研究所製）またはアラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標））（レサズリン）（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製）を２０μＬずつ各ウェルに添加し、同インキュベーターで３時間反応させた。
セルカウンティングキット−８を添加したウェルについては、４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、生成されたホルマザンを検出した。また、アラマーブルーを添加したウェルについては、励起波長＝５４０ｎｍ、蛍光波長＝５９０ｎｍにて蛍光強度を測定して、レサズリンの還元により生成されたレゾルフィンを検出した。吸光度および蛍光強度の測定は、エンスパイアー（ＥｎＳｐｉｒｅ）（商標）マルチモードプレートリーダー（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）社製）を用いて行った。
直径が３００μｍ以上のＨｅＬａのコロニーが検出されたウェルと、検出されなかったウェルについて、４５０ｎｍにおける吸光度および蛍光強度の測定値をそれぞれ比較した結果を表２に示した。なお、ｔ検定は、ソフトウェア（「ＰｈａｒｍａｃｏＢａｓｉｃ」（株式会社サイエンティスト社））を用いて実施した。【００５５】
【表２】
2019009425.tif 000004
【００５６】
表２に示されるように、セルカウンティングキット−８およびアラマーブルーのどちらの試薬を使用した場合も、直径が３００μｍ以上のコロニーが検出されたウェルでは、前記コロニーが検出されなかったウェルと比較して、４５０ｎｍにおける吸光度および蛍光強度に有意な差が認められた。
試験例２の上記結果から、形成されたコロニー（スフェア）の検出を細胞検出試薬を用いて行うことによっても、本発明の評価方法をｈＭＳＣの造腫瘍性の評価、すなわち、ｈＭＳＣに含まれる造腫瘍性細胞の検出に適用できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
以上詳述したように、本発明により、被験細胞を包埋させた培地層を含む多層の培地を形成する必要や、培養後に細胞を沈降させる必要がなく、簡便かつ高精度で被験細胞の造腫瘍性を評価できる方法を提供することができる。【００５８】
本願は、日本国で出願された特願２０１７−１３４１７１を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
2019009425.tif 000005
【国際調査報告】
2019009425.tif 000006
2019009425.tif 000007
2019009425.tif 000008
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