(57)【要約】  本発明は、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高い分離基材ならびにそれを用いた細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法を提供することを課題とする。本発明の分離基材は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための不織布からなる分離基材であって、分離基材の平均孔径が、２．０μｍ以上１５．０μｍ以下であり、分離基材の厚みが、１０μｍ以上５００μｍ以下である、分離基材である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための不織布からなる分離基材であって、
前記分離基材の平均孔径が、２．０μｍ以上１５．０μｍ以下であり、
前記分離基材の厚みが、１０μｍ以上５００μｍ以下である、分離基材。
【請求項２】
前記分離基材の通気度が、２ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以上４０ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以下である、請求項１に記載の分離基材。
【請求項３】
前記不織布を構成する繊維の平均繊維径が、８００ｎｍ以上１９００ｎｍ以下である、請求項１または２に記載の分離基材。
【請求項４】
前記分離基材の空隙率が、４０％以上９０％以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離基材。
【請求項５】
前記分離基材が、セルロース樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリスルホン樹脂、フッ素樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリアミド樹脂、および、ポリオレフィン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分離基材。
【請求項６】
前記分離基材が、セルロース樹脂およびポリオレフィン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の分離基材。
【請求項７】
前記セルロース樹脂が、セルロースアシレートまたはセルロースである、請求項６に記載の分離基材。
【請求項８】
前記ポリオレフィン樹脂が、ポリプロピレンである、請求項６に記載の分離基材。
【請求項９】
第１通液口および第２通液口が配置された容器と、前記第１通液口および前記第２通液口の間に充填されたろ材を備えた細胞分離フィルターであって、
前記ろ材が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離基材である、細胞分離フィルター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離基材に、少なくとも巨核球を含む培養液を接触させる接触工程と、
前記接触工程の前および後の少なくとも一方において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程と、
前記接触工程および前記培養工程の後に、産生した血小板を含む培養液を回収する回収工程とを有する、血小板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離基材、細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は血栓の形成に中心的な役割を果たし、生体内において止血機能を示す細胞であるため、出血の際や抗がん剤を使用した際に血小板が減少すると、重篤な場合には死に至ることがある。
そして、血小板の減少に対する唯一の確立された治療法は、血小板製剤を輸血することである。現行の血小板製剤は、ボランティアからの献血に依存しており、保存有効期間が４日という極めて短い日数であるのにも関わらず、少子化による献血可能年齢層の人口減少および献血需要の高い高齢者の人口増加に伴い、医療現場における需要と供給のバランスを保つことが困難になると予想されている。
そのため、献血に代替される血小板ソースの開発が着目されている。【０００３】
近年、多能性幹細胞、造血前駆細胞、間葉系細胞などをソースとして、巨核球を培養することによって血小板を体外で大量に生産する技術が報告されている。
この技術では、巨核球の細胞質が千切れることによって血小板が生産されるため、血小板生産後の培養液には、多数の巨核球が含まれることになる。
そのため、免疫原性を抑制する観点から、巨核球と巨核球から生産された血小板を分離する技術開発が必要となる。【０００４】
このような分離技術として、例えば、特許文献１には、「巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための多孔質体からなる分離基材であって、多孔質体は、流入側における平均孔径が１０μｍ以上２０μｍ以下であり、流入側から流出側に向かって平均孔径が連続的または段階的に減少するとともに、流出側の平均孔径が３μｍ以上８μｍ以下である血小板分離基材。」が記載されている（［請求項１］）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−１９２９６０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、特許文献１に記載された血小板分離基材について検討したところ、巨核球の阻止率（除去率）は高いことが分かったが、血小板の透過率（回収率）が低く、巨核球と血小板との分離性能に改善の余地があることを明らかとした。【０００７】
そこで、本発明は、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高い分離基材ならびにそれを用いた細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、不織布からなる分離基材について、平均孔径が２．０μｍ以上１５．０μｍ以下であり、厚みが１０μｍ以上５００μｍ以下であると、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高くなることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。【０００９】
［１］  巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための不織布からなる分離基材であって、
分離基材の平均孔径が、２．０μｍ以上１５．０μｍ以下であり、
分離基材の厚みが、１０μｍ以上５００μｍ以下である、分離基材。
［２］  分離基材の通気度が、２ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以上４０ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以下である、［１］に記載の分離基材。
［３］  不織布を構成する繊維の平均繊維径が、８００ｎｍ以上１９００ｎｍ以下である、［１］または［２］に記載の分離基材。
［４］  分離基材の空隙率が、４０％以上９０％以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離基材。
［５］  分離基材が、セルロース樹脂、ポリアクリロニトリル樹脂、ポリスルホン樹脂、フッ素樹脂、ポリエーテルスルホン樹脂、ポリアミド樹脂、および、ポリオレフィン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離基材。
［６］  分離基材が、セルロース樹脂およびポリオレフィン樹脂からなる群から選択される少なくとも１種の樹脂で構成されている、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離基材。
［７］  セルロース樹脂が、セルロースアシレートまたはセルロースである、［６］に記載の分離基材。
［８］  ポリオレフィン樹脂が、ポリプロピレンである、［６］に記載の分離基材。【００１０】
［９］  第１通液口および第２通液口が配置された容器と、第１通液口および第２通液口の間に充填されたろ材を備えた細胞分離フィルターであって、
ろ材が、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離基材である、細胞分離フィルター。
［１０］  ［１］〜［８］のいずれかに記載の分離基材に、少なくとも巨核球を含む培養液を接触させる接触工程と、
接触工程の前および後の少なくとも一方において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程と、
接触工程および培養工程の後に、産生した血小板を含む培養液を回収する回収工程とを有する、血小板の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高い分離基材ならびにそれを用いた細胞分離フィルターおよび血小板の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。
なお、本明細書において、「〜」を用いて表される数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
【００１３】
一般に、分離基材とは、小さな空隙を多数内部に有する構造体であり、例えば、繊維構造体、多孔膜、ビーズ充填カラムおよびこれらの積層体から構成されるものが挙げられる。
ここで、繊維構造体とは、繊維が絡み合って１つの構造をなしているものであり、例えば、織物（メッシュ）、編物、組紐、不織布、および、繊維をカラムに充填したものなどが挙げられ、中でも、広い孔径分布、複雑な流路、作製の容易性の点から特に不織布が好ましい。また、不織布の製法としては、例えば、乾式法、湿式法、スパンボンド法、メルトブロー法、エレクトロスピニング法、ニードルパンチ法などが挙げられ、中でも、生産性と汎用性の点から、湿式法とメルトブロー法、エレクトロスピニング法が好ましい。
多孔膜とは、プラスチック体の全体に無数の連通孔を有するものであり、製法としては相分離法、発泡法、放射線やレーザー光などを照射するエッチング法、ポロジェン法、凍結乾燥法、プラスチック焼結法などが挙げられるが、広い孔径分布、複雑な流路、作製の容易性の点から特に相分離法を用いた多孔膜が好ましい。
ビーズ充填カラムとは、カラム内にビーズを充填させることでビーズ間に空隙を形成したものである。ビーズの粒径は均一であるものが望ましく、ビーズの粒径によってビーズ間の空隙を孔径として制御し易い。
【００１４】
［分離基材］
本発明の分離基材は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液から血小板を分離するための不織布からなる分離基材である。
また、本発明の分離基材の平均孔径は、２．０μｍ以上１５．０μｍ以下である。
また、本発明の分離基材の厚みは、１０μｍ以上５００μｍ以下である。
【００１５】
ここで、本明細書において、「平均孔径」とは、パームポロメータ（西華産業製 ＣＦＥ−１２００ＡＥＸ）を用いた細孔径分布測定試験において、ＧＡＬＷＩＣＫ（Porous Materials，Inc社製）に完全に濡らしたサンプルに対して空気圧を２ｃｃ／ｍｉｎで増大させて評価した値をいう。
具体的には、ＧＡＬＷＩＣＫに完全に濡らした膜状サンプルに対して、膜の片側に２ｃｃ／ｍｉｎで空気を一定量送り込み、その圧力を測りながら、膜の反対側へ透過してくる空気の流量を測定する。
この方法で、まず、ＧＡＬＷＩＣＫに濡れた膜状サンプルについて、圧力と透過空気流量とのデータ（以下、「ウェットカーブ」ともいう。）を得る。次いで、濡れていない、乾燥状態の膜状サンプルでも同様のデータ（以下、「ドライカーブ」ともいう。）を測定し、ドライカーブの流量の半分に相当する曲線（ハーフドライカーブ）とウェットカーブとの交点の圧力を求める。その後、ＧＡＬＷＩＣＫの表面張力（γ）、基材との接触角（θ）および空気圧（Ｐ）とを下記式（Ｉ）に導入し、平均孔径を算出することができる。
平均孔径＝４γｃｏｓθ／Ｐ  ・・・（Ｉ）
【００１６】
また、本明細書において、「厚み」とは、マイクロメータ（ミツトヨ製）を用いて分離基材の膜厚を１０か所で測定し、各測定値を平均した値をいう。
【００１７】
本発明の分離基材は、上述した通り、平均孔径が２．０μｍ以上１５．０μｍ以下であり、厚みが１０μｍ以上５００μｍ以下であるため、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高くなる。
このような効果を奏する理由は詳細には明らかではないが、本発明者らは以下のように推測している。
すなわち、後述する実施例と比較例との対比から、分離基材の平均孔径が１５．０μｍ以下であることにより、巨核球の透過を阻止することが可能となり、分離基材の平均孔径が２．０μｍ以上であり、かつ、分離基材の厚みが１０μｍ以上５００μｍ以下であることにより、血小板を透過させることが可能となったと考えられる。
【００１８】
本発明の分離基材の平均孔径は、３．０〜１１．０μｍであることが好ましく、４．０〜９．０μｍであることがより好ましい。
また、本発明の分離基材の厚みは、２０〜３００μｍであることが好ましく、２０〜１９０μｍであることがより好ましい。
【００１９】
本発明においては、巨核球と血小板との分離性能がより向上する理由から、分離基材の通気度が、２ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以上４０ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以下であることが好ましく、５ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以上３０ｃｍ３／ｃｍ２／ｓ以下であることがより好ましい。
ここで、本明細書において、「通気度」とは、ＪＩＳ Ｌ １９１３の「一般不織布試験方法」に記載されたフラジール形法により測定した値をいう。
【００２０】
また、本発明においては、巨核球と血小板との分離性能がより向上する理由から、分離基材の空隙率が、４０％以上９０％以下であることが好ましく、５０％超８５％未満であることがより好ましい。
ここで、本明細書において、「空隙率」とは、下記式により算出される値をいう。
空隙率（％）＝［１−｛ｍ／ρ／（Ｓ×ｄ）｝］×１００
ｍ：シート重量（ｇ）
ρ：樹脂密度（ｇ／ｃｍ３）
Ｓ：シート面積（ｃｍ２）
ｄ：シート膜厚（ｃｍ）
【００２１】
本発明の分離基材の構造は、上述した通り、不織布である。
不織布の製造方法としては、例えば、電界紡糸法、複合溶融紡糸法、メルトブロー法、ＣＶＤ（chemical vapor deposition）法が挙げられ、なかでも、電界紡糸法が好ましい。
具体的には、例えば、特開２０１６−０５３２３２号公報の図１に示すナノファイバー製造装置１１０により、不織布１２０を製造することができる。
【００２２】
本発明においては、十分な繊維強度と良好な分離性能を両立できる理由から、不織布を構成する繊維の平均繊維径は、８００ｎｍ以上１９００ｎｍ以下であることが好ましい。
また、分離基材の使用時（例えば、濾過中など）に繊維の剥がれを防止できる理由から、不織布を構成する繊維の平均繊維長は、１ｍｍ以上１ｍ以下であることが好ましい。
なお、平均繊維径および平均繊維長は、不織布を作製する際の原料（例えば、酢酸セルロースなど）溶液の濃度を調節することで調整することができる。
【００２３】
ここで、平均繊維径とは、以下のように測定した値をいう。
繊維からなる不織布の表面を、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope：ＴＥＭ）像、または、走査型電子顕微鏡（Scanning Electron Microscope：ＳＥＭ）像を観察する。
構成する繊維の大きさに応じて１０００〜５０００倍から選択される倍率で電子顕微鏡画像による観察を行う。ただし、試料、観察条件や倍率は下記の条件を満たすように調整する。
（１）観察画像内の任意箇所に一本の直線Ｘを引き、この直線Ｘに対し、２０本以上の繊維が交差する。
（２）同じ画像内で直線Ｘと垂直に交差する直線Ｙを引き、直線Ｙに対し、２０本以上の繊維が交差する。
上記のような電子顕微鏡観察画像に対して、直線Ｘに交錯する繊維、直線Ｙに交錯する繊維の各々について少なくとも２０本（すなわち、合計が少なくとも４０本）の幅（繊維の短径）を読み取る。こうして上記のような電子顕微鏡画像を少なくとも３組以上観察し、少なくとも４０本×３組（すなわち、少なくとも１２０本）の繊維径を読み取る。
このように読み取った繊維径を平均して平均繊維径を求める。
【００２４】
また、平均繊維長とは、以下のように測定した値をいう。
すなわち、繊維の繊維長は、上述した平均繊維径を測定する際に使用した電子顕微鏡観察画像を解析することにより求めることができる。
具体的には、上記のような電子顕微鏡観察画像に対して、直線Ｘに交錯する繊維、直線Ｙに交錯する繊維の各々について少なくとも２０本（すなわち、合計が少なくとも４０本）の繊維長を読み取る。
こうして上記のような電子顕微鏡画像を少なくとも３組以上観察し、少なくとも４０本×３組（すなわち、少なくとも１２０本）の繊維長を読み取る。
このように読み取った繊維長を平均して平均繊維長を求める。
【００２５】
本発明の分離基材は、樹脂材料で構成されていることが好ましい。
樹脂材料としては、具体的には、例えば、セルロースアシレート、セルロースなどのセルロース樹脂；ポリアクリロニトリル樹脂；ポリスルホン樹脂；フッ素樹脂；ポリエーテルスルホン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリプロピレンなどのポリオレフィン樹脂；等が挙げられ、これらを１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
これらのうち、セルロース樹脂およびポリオレフィン樹脂の少なくとも一方で構成されていることが好ましく、セルロース樹脂で構成されていることがより好ましく、セルロースアシレートまたはセルロースで構成されていることが更に好ましい。また、ポリオレフィン樹脂としては、ポリプロピレンであることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、セルロースから構成される分離基材は、セルロースアシレートから構成される分離基材を鹸化することにより得ることもできる。
ここで、セルロースアシレートが有するアシル基としては、具体的には、例えば、アセチル基、プロピオニル基およびブチリル基など挙げられる。なお、置換するアシル基は、１種類のみ（例えば、アセチル基のみ）であってもよく、２種以上であってもよい。
【００２７】
また、本発明においては、分離基材への血小板の吸着を抑制し、血小板の透過率をより向上させる観点から、分離基材の表面に親水化処理を施し、血小板低吸着材を化学的または物理的に修飾してもよい。
血小板低吸着材としては、側鎖に親水性基を有する重合体であることが好ましく、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、エチレングリコール、メタクリル酸メチル、ハイドロキシエチルメタクリレート、ビニルアルコール、Ｎ―ビニル―２―ピロリドン、スルホベタインモノマーの重合体等が挙げられる。
親水性基としては、具体的には、例えば、水酸基、エーテル基、ニトロ基、イミノ基、カルボニル基、リン酸基、メトキシジエチレングリコール基、メトキシトリエチレングリコール基、エトキシジエチレングリコール基、エトキシトリエチレングリコール基、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、カルボキシル基、ホスホリル基、ホスホリルコリン基、スルホン基、または、これらの塩などが挙げられる。
また、血小板低吸着材よびその修飾方法としては、ＷＯ８７／０５８１２、特開平４−１５２９５２、特開平５−１９４２４３、ＷＯ２０１０／１１３６３２等に記載の材料および方法を利用できる。
【００２８】
〔細胞懸濁液〕
本発明の分離基材を用いて血小板の分離に供する細胞懸濁液は、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液である。
ここで、巨核球および血小板は特に限定されず、例えば、成体組織から採取した巨核球および血小板；多能性幹細胞、造血前駆細胞および間葉系細胞等の分化能を有する細胞から分化させた巨核球および血小板；通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで作製された巨核球および血小板；これらを組み合わせた巨核球および血小板；などが挙げられる。
【００２９】
多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞〔ＥＳ（embryonic stem）細胞〕、核移植胚性幹細胞〔ｎｔ（nuclear transfer）ＥＳ細胞〕、および、人工多能性幹細胞〔ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞〕などが挙げられ、なかでも、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が好ましい。
造血前駆細胞としては、例えば、骨髄由来、臍帯血由来、動員〔Ｇ−ＣＳＦ（Granulocyte-colony stimulating factor）〕末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞および末梢血由来細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの造血前駆細胞としては、例えば、分化抗原群（cluster of differentiation：ＣＤ）３４陽性のもの（例えば、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞あるいはＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−およびＣＤ３４＋細胞のもの）が挙げられる（国際公開ＷＯ２００４／１１０１３９）。
間葉系細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、骨髄細胞、脂肪細胞および滑膜細胞などが挙げられ、なかでも、脂肪前駆細胞が好ましい。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞としては、例えば、繊維芽細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
［細胞分離フィルター］
本発明の細胞分離フィルターは、第１通液口および第２通液口が配置された容器と、第１通液口および第２通液口の間に充填されたろ材を備えた細胞分離フィルターであって、ろ材に上述した本発明の分離基材を用いた細胞分離フィルターである。
【００３１】
細胞分離フィルターに用いられる容器の形態、大きさ、材質は特に限定されない。
容器の形態としては、例えば、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態であってよい。
容器の型（タイプ）としては、クロスフロータイプおよびカラムタイプのいずれのタイプでも使用することができる。
【００３２】
［血小板の製造方法］
本発明の血小板の製造方法は、上述した本発明の分離基材に、少なくとも巨核球を含む培養液を接触させる接触工程と、
接触工程の前および／または後において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程と、
接触工程および培養工程の後に、産生した血小板を含む培養液を回収する回収工程とを有する、血小板の製造方法である。
ここで、接触工程における接触手段は、培養液の量および巨核球の濃度などに従って適宜選択することができるが、例えば、本発明の分離基材を充填した塔またはカラム等に細胞懸濁液を供給する方法などが挙げられる。
また、培養工程における血小板を産生させる手段は、例えば、流体によるシェアストレスを負荷させる方法が挙げられ、具体的には、巨核球を含む培養液を撹拌する方法などが挙げられる。なお、培養工程において培養する巨核球は、接触工程の後に培養工程を有する場合は、本発明の分離基材で補足された巨核球であってもよい。また、接触工程の後に培養工程を有する場合は、後述する実施例のように、巨核球と血小板とを含む細胞懸濁液を分離基材に接触させた際に、初期段階で補足された巨核球は、その後に接触する細胞懸濁液（すなわち流体）による負荷によっても血小板が産生していると考えられる。
また、回収工程における回収手段としては、例えば、本発明の分離基材を充填した塔またはカラム等に、産生した血小板を含む培養液を通液させる方法などが挙げられる。
【実施例】
【００３３】
以下に実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。【００３４】
〔実施例１〕
＜酢酸セルロースの合成＞
セルロース（原料：綿花リンター）に、酢酸、無水酢酸および硫酸を混合し、反応温度を４０℃以下に保ちながらアセチル化した。原料となるセルロースが消失してアセチル化が完了した後、さらに４０℃以下で加熱を続けて、所望の重合度に調整した。
次いで、酢酸水溶液を添加して残存する酸無水物を加水分解した後、６０℃以下で加熱を行うことで部分加水分解を行い、所望の置換度に調整した。
残存する硫酸を過剰量の酢酸マグネシウムにより中和した。酢酸水溶液から再沈殿を行い、さらに、水での洗浄を繰り返すことにより、置換度２．９１の酢酸セルロースを合成した。【００３５】
＜酢酸プロピオン酸セルロースの合成＞
酢酸を酢酸とプロピオン酸の混合溶媒に変更し、無水酢酸を無水酢酸と無水プロピオン酸の混合物に変更した以外は、酢酸セルロースの合成と同様の方法で行い、アセチル置換度１．３％、プロピオニル置換度４８％の酢酸プロピオン酸セルロースを合成した。【００３６】
＜不織布の作製＞
合成した酢酸セルロースを、ジクロロメタン８７％およびメタノール１３％の混合溶媒に溶解させ、３．５ｇ／１００ｃｍ３の酢酸セルロース溶液を調製し、ナノファイバー製造装置の複数あるノズルの一部にセットした。
同様の方法で調製した酢酸プロピオン酸セルロース溶液を残りのノズルにセットし、目付量１０ｇ/ｍ２で２０×３０ｃｍの酢酸セルロース繊維および酢酸プロピオン酸セルロースからなる不織布を作製した。
次いで、作製した不織布を２００℃で５分間加熱処理を施し、分離基材を作製した。【００３７】
＜巨核球および血小板＞
培地：ＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）４５０ｍｌにウシ血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）５０ｍｌを添加したものを使用した。
巨核球：ＭＥＧ−０１（ＡＴＣＣ社）を巨核球として使用した。これを培地と混合することで、巨核球液（６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を調製した。
血小板懸濁液：ラット末梢血から単離したものを血小板として使用した。具体的には、クエン酸−デキロース溶液（ＡＣＤ）（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）が入った１５ｍｌ遠心分離用コニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ社）にラットから採血した全血１０ｍｌを回収した。３００×ｇ、室温で７分間遠心し、遠心後のＰｌａｓｍａ層およびＢｕｆｆｆｙ ｃｏａｔ層を回収した。回収液を同様に遠心分離し、Ｐｌａｓｍａ層のみを回収した後に、１８００×ｇ、室温で５分間遠心し、上清を回収することで血小板を得た。これを培地と混合することで、血小板懸濁液（６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を調製した。
巨核球液と血小板懸濁液とを等量混合することで、細胞懸濁液を調製した。【００３８】
＜細胞分離試験＞
濾過モジュール（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、ＫＳ−４７）の供給側の一方の流通口が細胞懸濁液を含む５０ｍｌシリンジ（テルモ社）にチューブ接続された濾過モジュールを用いて膜分離処理を行った。シリンジをシリンジポンプ（ＨＡＲＶＡＲＤ  ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ社、ＰＨＤ  ＵＬＴＲＡ  ４４００）に設置し、３ｍｌ／ｍｉｎ．の流量で細胞懸濁液３０ｍｌが濾過モジュール内に設置した分離基材に対して直行するデッドエンド方式で供給されるよう、シリンジポンプを運転した。濾過モジュールの透過側の排出口から排出された濾液を回収した。【００３９】
＜回収細胞数のカウント＞
濾過モジュールの透過側から採取した濾液１００μｌに核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えたダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline：ＤＰＢＳ）〔Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製〕１０μｌを添加し、遮光環境で１５分反応した。ＤＰＢＳを３００μｌを加え、ＢＤ Ｔｒｕｃｏｕｎｔ ｔｕｂｅｓ（日本ベクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ）により測定した。
前方散乱光（Forward scatter：ＦＳＣ）および側方散乱光（Side scatter：ＳＳＣ）ゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。血小板分画における核染色陰性細胞を血小板とし、巨核球分画における核染色陽性細胞を巨核球とすることで、回収液中の血小板数及び巨核球数を算出した。
以下の式から得た血小板透過率および巨核球阻止率を表１に示す。
血小板透過率（％）＝（濾液中の血小板数／元液中の血小板数）×１００
巨核球阻止率（％）＝１００−（濾液中の巨核球数／元液中の巨核球数）×１００【００４０】
＜評価（分離の判定）＞
分離の総合判定として、以下基準で評価を行った。結果を下記表１に示す。
Ａ：血小板透過率が８０％以上、かつ、巨核球阻止率９５％以上
Ｂ：血小板透過率が８０％以上、かつ、巨核球阻止率９０％以上
または、血小板透過率が７０％以上、かつ、巨核球阻止率９５％以上
Ｃ：血小板透過率が７０％未満、または、巨核球阻止率９０％未満【００４１】
〔実施例２〜５および比較例１〕
ナノファイバー製造装置に導入する酢酸セルロースおよび酢酸プロピオン酸セルロース溶液の濃度を調節して不織布を作製した以外は、実施例１と同様の方法で分離基材を作製し、評価を行った。結果を表１に示す。【００４２】
〔実施例６〜７および比較例２〜３〕
ナノファイバー製造装置で不織布を作製する上での目付量を変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で分離基材を作製し、評価を行った。結果を表１に示す。【００４３】
〔実施例８〜９および比較例４〕
実施例８〜９ではポリプロピレン製不織布（スリーエム製）を用い、比較例４ではポリプロピレン製不織布（メルクミリポア製）を用いて、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を下記表１に示す。【００４４】
〔実施例１０〕
ジクロロメタン８７％およびメタノール１３％の混合溶媒に溶解したセルロース溶液を用いて不織布を作製した以外は、実施例１と同様の方法で分離基材を作製し、評価を行った。結果を表１に示す。【００４５】
〔実施例１１および比較例５〕
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したポリアクリロニトリル溶液を用いて不織布を作製した以外は、実施例１と同様の方法で分離基材を作製し、評価を行った。結果を表１に示す。【００４６】
〔比較例６〜８〕
比較例６ではポリエチレンテレフタラート製不織布（帝人製）を用い、比較例７ではＳＵＳ３１６製の綾畳織りメッシュを用い、比較例８では酢酸セルロース製多孔膜（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で評価を行った。結果を下記表１に示す。【００４７】
〔比較例９〕
比較例９は、先行例である特許文献１（特開２０１６−１９２９６０号公報）の実施例３のデータを引用し、当データを一部改変したものを使用した。【００４８】
ここで、各実施例において、濾過膜を表１のように相違させた。
具体的には、実施例１〜５および比較例１では、孔径および通気度の異なるセルロースアシレートからなる不織布を用いた。
実施例６〜７および比較例２〜３では、厚みの異なるセルロースアシレートからなる不織布を用いた。
実施例８〜９および比較例４では、平均孔径の異なるポリプロピレンからなる不織布を用いた。
実施例１０〜１１および比較例５〜６では、素材の異なる不織布を用いた。
比較例７では、メッシュ構造の分離基材を用い、比較例８では、多孔性構造の分離基材を用いた。【００４９】
【表１】
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【００５０】
表１に示す結果から、平均孔径が１５μｍより大きい不織布からなる分離基材を用いた場合には、巨核球の阻止率が低くなることが分かった（比較例１）。
また、平均孔径が２．０μｍより小さい不織布からなる分離基材を用いた場合には、血小板の透過率が低くなることが分かった（比較例４〜６）。
また、厚みが５００μｍより大きい不織布からなる分離基材を用いた場合には、血小板の透過率が低くなることが分かった（比較例２、３および９）。
また、平均孔径が２．０μｍ以上１５．０μｍ以下であり、厚みが１０μｍ以上５００μｍ以下であっても、不織布の形態ではない分離基材を用いた場合には、血小板の透過率および巨核球の阻止率のいずれかが低くなることが分かった（比較例７および８）。【００５１】
これに対し、平均孔径が２．０μｍ以上１５．０μｍ以下であり、厚みが１０μｍ以上５００μｍ以下である、不織布からなる分離基材を用いた場合には、巨核球の阻止率が高く、かつ、血小板の透過率が高くなることが分かった（実施例１〜１１）。
【国際調査報告】
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