(57)【要約】  ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリン又はその塩を生成するように、前記ピロロキノリンキノン又はその塩を含む測定対象物と前記グリシンとを混合し、測定サンプルを調製するサンプル調製工程と、クロマトグラフィー法による前記測定サンプルに含まれる前記イミダゾピロロキノリン及びその塩のクロマトグラムに基づいて、前記測定対象物に含有される前記ピロロキノリンキノン及びその塩の量を定量する定量分析工程と、を有する分析方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリン又はその塩を生成するように、前記ピロロキノリンキノン又はその塩を含む測定対象物と前記グリシンとを混合し、測定サンプルを調製するサンプル調製工程と、
クロマトグラフィー法による前記測定サンプルに含まれる前記イミダゾピロロキノリン及びその塩のクロマトグラムに基づいて、前記測定対象物に含有される前記ピロロキノリンキノン及びその塩の量を定量する定量分析工程と、を有する
分析方法。
【請求項２】
前記サンプル調製工程において、水と相溶しない有機溶剤をさらに混合し、前記測定対象物中の油溶性成分を前記有機溶剤に溶解させた後、前記有機溶剤を取り除くことにより、前記測定対象物中の油溶性成分が除去された測定サンプルを調製する、
請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記グリシンとの反応の前または反応中において、前記ピロロキノリンキノンを酸化型にする酸化工程をさらに含む、
請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記測定対象物に含まれる前記ピロロキノリンキノン又はその塩の含有量が、０．０００１質量％以上１００質量％未満である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項５】
前記測定サンプルに含まれる前記グリシンの含有量が、１〜４０質量％である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記測定サンプルに含まれる前記グリシンの含有量は、ピロロキノリンキノン又はその塩の含有量に対して、１００〜１００００００倍重量である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項７】
前記ピロロキノリンキノンを含む前記測定対象物と前記グリシンとを混合した後、希釈剤を加える希釈工程をさらに含む、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項８】
前記クロマトグラフィー法による定量分析の方法が、標準添加法である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項９】
前記測定対象物が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、テアニン、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アセチルシステイン、コラーゲン、野菜抽出物、グルコース、及びフルクトースからなるA群より選ばれる少なくとも１種を含むものである、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項１０】
前記測定対象物が、食用油脂、リポ酸、ＤＨＡ，ＥＰＡ，レシチン、ビタミンＥ，グリセリルホスホリルコリン、ステアリン酸マグネシウム、シリカ、コメ粉、セルロース、デキストリン、マンニトール、キシリトール、乳糖、及びシクロデキストリンからなるＢ群より選ばれる少なくとも一種を含むものである、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロキノリンキノン又はその塩の定量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ  ｑｕｉｎｏｎｅ以下、単にＰＱＱということがある）は、ピロール環とキノリン環が縮合したものがｏ−キノン構造をとる物質である。ＰＱＱは電子伝達体としての機能が知られており、必須アミノ酸リジンの代謝に関与するアミノアジピン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｍｉｎｏａｄｉｐａｔｅ  ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＡＡＳＤＨ）中に取り込まれることで、ＡＡＳＤＨが酸化還元反応できるようになる。すなわち、ＡＡＳＤＨの補酵素と考えられており、このことから、ニコチンアミド（ピリジンヌクレオチド）とフラビンに次ぐ３番目の酸化還元補酵素とされ、新規のビタミンとなる可能性を有する。【０００３】
またＰＱＱは、細胞の増殖促進作用、抗白内障作用、肝臓疾患予防・治療作用、創傷治癒促進作用、抗アレルギー作用、逆転写酵素阻害作用、グリオキシラーゼＩ阻害作用および制癌作用などの多くの重要な生理活性を有するとされ、ＰＱＱ利用の産業上の重要性が高まっている。【０００４】
ＰＱＱは、細菌並びにカビおよび酵母など真菌に広く存在していることが知られていたが、近年、細菌だけでなく、イネなどの植物や哺乳類に至るまで広く存在することが報告されている。哺乳動物でも様々な組織、器官からその検出が報告されているものの、哺乳動物はＰＱＱの合成経路をもたないため、ＰＱＱを食物から摂取しているとされる。【０００５】
機能性を利用する機能性表示食品制度では食品中のＰＱＱの正確な測定データを算出する必要が求められている。多くの食品では単独での製品はなく、色々な物質と混合して提供される。一方でＰＱＱは多くの食品成分と反応しやすく、分析時に妨害を受けやすい。また、分析スケールはカプセルや錠剤に含まれるｍｇオーダーの含有量の分析である。【０００６】
これまでにＰＱＱの分析方法として、ガスクロマトグラフィー／質量分析（特許文献１）、液体クロマトグラフィー／タンデム型質量分析計（特許文献２）が報告されている。しかしながら、これらの分析方法はｎｇオーダーやｎｍｏｌ／Ｌオーダーといった微量分析に最適化されたものであり、ｍｇオーダーの分析には適していない。また、誘導体化を含む前処理が複雑で作業効率が上がらない。さらには、定量分析のために主に１３Cを利用した特殊な内部標準物質が要求されることから一般的な方法にならない。そのため、従来の方法ではカプセル等を初めとする機能性食品の分析に適していない。また、これら方法では、ＰＱＱが多くの食品成分と反応しやすく分析時に妨害を受けその定量性が脅かされ得るという点について、何ら対策はとられていない。【０００７】
また、ｍｇオーダーの分析が可能でありかつ簡便な方法としては、ジアミン類によりＰＱＱを誘導体化して吸光度分析をする方法が非特許文献１に記載されている。しかしながら、当該方法は試料中にＰＱＱ以外に特定の吸光度を示すものが存在しないことが前提となるものであり、そもそもＰＱＱとその他の多数の共存成分を含む機能性食品を測定対象とすることは想定されていない。つまり、吸光度分析では食品成分の妨害に対して対応できず、ＰＱＱの誘導体化分析について安価で安全な分析方法は知られていない。【０００８】
また、分析時の妨害を抑制する方法については非特許文献２に報告されているが、この方法はアスコルビン酸による妨害を抑制するために、測定前にアスコルビン酸を除去する工程を経た後にＨＰＬＣ分析をする方法である。したがって、アスコルビン酸以外の成分については特段の考慮はされておらず、複雑かつ多種多様な共存成分を含む機能性食品等の定量分析を考慮した場合には、十分に対応できるものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平４−１４５３６０号公報
【特許文献２】特開２０１７−１８７３２１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】水津智樹ら著、分析化学Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．７，ｐｐ．５９９−６０２（２０１１）
【非特許文献２】池本一人ら著、分析化学Ｖｏｌ．６５，Ｎｏ．６，ｐｐ．３３９−３４２（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記の方法の中で、複雑かつ多種多様な共存成分を含む機能性食品等の定量分析を考慮した場合、ＨＰＬＣを用いた方法は比較的簡便であるが、一方で、妨害物質による影響を受けやすく、定量性が損なわれるという課題がある。このような課題を解消するため、ＰＱＱを誘導体化することが考えられる。一般に誘導体化はエステル化、アシル化、シリル化反応を使用して行われるが、これらの誘導体化試薬は高価であり、また、反応性が高く、安全性や取り扱いについて注意を払う必要が生じる。【００１２】
さらに、カプセル等に含まれるｍｇオーダーのＰＱＱ誘導体には大量の誘導体化試薬が必要であるため、より汎用性がありかつ簡便な定量分析方法の提供ということを前提とした場合に、このような誘導体化試薬を用いることは適さない。【００１３】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、機能性食品等のようなｍｇオーダーのＰＱＱとその他の多数の共存成分を含む測定対象物を測定対象とした際に、共存成分による影響を受けることなく、当該測定対象物に含まれるＰＱＱを迅速かつ簡便に定量できる分析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、共存成分による影響を排除すべくＰＱＱを誘導体化する際に、安全かつ簡便で、取り扱い性にも優れる誘導体化工程を含む分析方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、グリシンを用いてピロロキノリンキノンをより安定なイミダゾピロロキノリンへ変換し、イミダゾピロロキノリンを定量することでイミダゾピロロキノリンを定量分析でき、これにより、上記課題を解決し得ることを見出して、本発明を完成するに至った。【００１５】
その過程において、ＰＱＱはキノンを有するために還元、アルドール、イミノ化反応を生じやすく、還元性物質、アミノ化合物、アルデヒト化合物によって妨害されやすいという点においては、本発明者らは妨害物質による反応より早く、誘導体化を完了し、その誘導体化物質が妨害物質によって変化しない方法を検討し、その結果として、さらに安全で、安価な試薬によって達成することを検討し、適切な方法を見出した。【００１６】
また、本発明者らは、測定対象物の剤型に応じたより適切な方法として、例えば、カプセルや錠剤に含まれるＰＱＱを分析するために有機溶媒抽出方法により脂溶性夾雑物を除去すること、誘導体化反応条件を調整することについても検討し、適切な方法を見出した。具体的には、有機溶媒で脂溶性成分を除去し、水溶性妨害物質よりも速い反応、酸化工程によるより完全な誘導体化で定量性の一層の向上を図ることや、また、標準添加法により定量精度を高めること等を見出した。但し、これら個別具体的方法については、本発明の分析方法が幅広い態様の測定対象物を対象とすることに由来するより最適化された具体的手段の一つであり、本発明の分析方法の利用者に対してより適した具体的方法を提示するものであるが、本発明はこれら具体的手段が必須のものとして限定解釈されるべきものではない。【００１７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕
ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリン又はその塩を生成するように、前記ピロロキノリンキノン又はその塩を含む測定対象物と前記グリシンとを混合し、測定サンプルを調製するサンプル調製工程と、
クロマトグラフィー法による前記測定サンプルに含まれる前記イミダゾピロロキノリン及びその塩のクロマトグラムに基づいて、前記測定対象物に含有される前記ピロロキノリンキノン及びその塩の量を定量する定量分析工程と、を有する
分析方法。
〔２〕
前記サンプル調製工程において、水と相溶しない有機溶剤をさらに混合し、前記測定対象物中の油溶性成分を前記有機溶剤に溶解させた後、前記有機溶剤を取り除くことにより、前記測定対象物中の油溶性成分が除去された測定サンプルを調製する、
〔１〕に記載の分析方法。
〔３〕
前記グリシンとの反応の前または反応中において、前記ピロロキノリンキノンを酸化型にする酸化工程をさらに含む、
〔１〕又は〔２〕に記載の分析方法。
〔４〕
前記測定対象物に含まれる前記ピロロキノリンキノン又はその塩の含有量が、０．０００１質量％以上１００質量％未満である、
〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の分析方法。
〔５〕
前記測定サンプルに含まれる前記グリシンの含有量が、１〜４０質量％である、
〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の分析方法。
〔６〕
前記測定サンプルに含まれる前記グリシンの含有量は、ピロロキノリンキノン又はその塩の含有量に対して、１００〜１００００００倍重量である、
〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の分析方法。
〔７〕
前記ピロロキノリンキノンを含む前記測定対象物と前記グリシンとを混合した後、希釈剤を加える希釈工程をさらに含む、
〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の分析方法。
〔８〕
前記クロマトグラフィー法による定量分析の方法が、標準添加法である、
〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の分析方法。
〔９〕
前記測定対象物が、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、テアニン、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アセチルシステイン、コラーゲン、野菜抽出物、グルコース、及びフルクトースからなるA群より選ばれる少なくとも１種を含むものである、
〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の分析方法。
〔１０〕
前記測定対象物が、食用油脂、リポ酸、ＤＨＡ，ＥＰＡ，レシチン、ビタミンＥ，グリセリルホスホリルコリン、ステアリン酸マグネシウム、シリカ、コメ粉、セルロース、デキストリン、マンニトール、キシリトール、乳糖、及びシクロデキストリンからなるＢ群より選ばれる少なくとも一種を含むものである、
〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の分析方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、機能性食品等のような相当量のＰＱＱとその他の多数の共存成分を含む測定対象物を測定対象とした際に、共存成分による影響を受けることなく、当該測定対象物に含まれるＰＱＱを迅速かつ簡便に定量できる分析方法を提供することができる。また、本発明によれば、共存成分による影響を排除すべくＰＱＱを誘導体化する際に、安全かつ簡便で、取り扱い性にも優れる誘導体化工程を含む分析方法を提供することもできる。これにより、食品をはじめとして様々な製品におけるＰＱＱの定量が広い濃度範囲で確立され、ＰＱＱ類に関連した健康食品や医薬品等の開発に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１において測定用サンプルをＨＰＬＣ分析にて得られたクロマトグラフである。
【図２】実施例１におけるＩＰＱの各ピークエリアの値のプロットとそれに基づいて作成された直線ａ及び検量線ｂを示すグラフである。
【図３】実施例５におけるＩＰＱの各ピークエリアの値のプロットとそれに基づいて作成された直線ｃを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。
【００２１】
〔分析方法〕
本実施形態の分析方法は、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリン又はその塩を生成するように、前記ピロロキノリンキノンを含む測定対象物と前記グリシンとを混合し、測定サンプルを調製するサンプル調製工程と、クロマトグラフィー法による前記測定サンプルに含まれる前記イミダゾピロロキノリン及びその塩のクロマトグラムに基づいて、前記測定対象物に含有される前記ピロロキノリンキノンの量を定量する定量分析工程と、を有する。
【００２２】
〔サンプル調製工程〕
サンプル調製工程は、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリン又はその塩を生成するように、ピロロキノリンキノンを含む測定対象物とグリシンとを混合し、測定サンプルを調製する工程である。ここで、「イミダゾピロロキノリン又はその塩を生成するように」とは、ピロロキノリンキノンを含む測定対象物とグリシンとの混合において、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応する態様であれば特に制限されない。
【００２３】
（分析対象）
本実施形態の分析方法における分析対象となるピロロキノリンキノンを以下に示す。ＰＱＱには、下記式（１）で表される酸化型ＰＱＱと、下記式（２）で表される還元型ＰＱＱがあり、環境に応じて酸化型ＰＱＱが相対的に多い状態から還元型ＰＱＱが相対的に多い状態まで様々取りうる。例えば、溶液中では、還元が進みやすく還元型ＰＱＱが相対的に多く存在し、酸化環境下では酸化型ＰＱＱが相対的に多く存在する。この点、本実施形態の分析方法によれば、酸化型ＰＱＱ及び還元型ＰＱＱの総量を定量することができる。
【化１】
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【００２４】
また、分析対象となる上記ピロロキノリンキノンの塩としては、特に制限されないが、例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属などの金属との塩；アンモニウムカチオン等の非金属との塩が挙げられる。特に、アルカリ金属塩の一種であるジナトリウム塩は、食品として多用されており、分析対象としては重要である。
【００２５】
（測定対象物）
ピロロキノリンキノンを含む測定対象物としては、特に制限されないが、例えば、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などの経口投与用の薬剤及びサプリメント；飲料；ゼリー；グミ；レトルト食品などその他食品が挙げられる。測定対象物については、上記の他、飲食品ではない化粧料、洗浄料、その他外用剤なども対象とすることができ、ＰＱＱを含む製品全般を対象とすることができる。これら測定対象物には、ピロロキノリンキノン以外の成分が任意に含まれる。任意成分には、ピロロキノリンキノンの定量分析に特段の影響を与えない物の他、従来法では、ピロロキノリンキノンの定量分析を妨害するもの（以下、「妨害物質」ともいう。）も含まれる。ピロロキノリンキノンと共存し得る妨害物質としては、以下のＡ群及びＢ群が想定される。
【００２６】
Ａ群は、サンプル調製工程においてＰＱＱと反応し、不特定の類縁体を形成することにより分析の妨害を起こす可能性のある化合物群である。このようなＡ群に属する化合物としては、具体的には、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の必須アミノ酸；テアニン、アセチルシステイン等の必須アミノ酸の誘導体；必須アミノ酸以外のアミノ酸；アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム等のビタミン類及びその誘導体；コラーゲン等のタンパク質；グルコース、及びフルクトース等の糖類；その他、野菜類、果実類、種子類、香辛料類、ハーブ類、海産物類、及び畜肉類等の食材抽出物が挙げられる。このなかでも、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム等のビタミン類及びその誘導体、並びにアセチルシステイン等の必須アミノ酸の誘導体は妨害効果が高く、定量化の妨げになりやすい。これに対して、本実施形態の分析方法によればこれらＡ群の化合物による妨害の影響を受けずに定量分析をすることができる。なお、本願明細書において、「妨害の影響を受けずに」には、妨害の影響があったとしても分析としては誤差範囲内である場合も含まれるものとする。
【００２７】
また、Ｂ群は、サンプル調製工程においてＰＱＱの抽出を阻害することにより分析の妨害を起こす可能性のある化合物群である。このようなＢ群に属する化合物としては、具体的には、脂溶性成分、粉末成分が挙げられる。より具体的には、Ｂ群に属する化合物として、食用油脂、非食用油脂、動物性油脂、及び植物性油脂等の油脂類；リポ酸；ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ），レシチン等の脂質；ビタミンＥ等の脂溶性ビタミン類及びその誘導体；グリセリルホスホリルコリン、ステアリン酸マグネシウム；セルロース、デキストリン、マンニトール、キシリトール、乳糖、シクロデキストリン等の糖類及び糖アルコール；シリカ等の無機粉体；コメ粉等の有機粉体が挙げられる。このなかでも、油脂は妨害効果が高く、定量化の妨げになりやすい。これに対して、本実施形態の分析方法によればこれらＢ群の化合物による妨害の影響を受けずに定量分析をすることができる。
【００２８】
測定対象物に含まれるピロロキノリンキノン又はその塩の含有量は、好ましくは０．０００１質量％以上１００質量％未満であり、より好ましくは０．０００５質量％以上１００質量％未満であり、さらに好ましくは０．００１質量％以上１００質量％未満である。本実施形態の分析方法によれば、比較的多量のピロロキノリンキノン又はその塩を含むものを測定対象物とした場合であっても、簡便に定量分析を行うことが可能である。
【００２９】
（測定対象）
本実施形態の分析方法における測定対象となるイミダゾピロロキノリン（以下、「ＩＰＱ」ともいう。）を以下に示す。イミダゾピロロキノリンは、ピロロキノリンキノンとグリシンとを反応させて得られるピロロキノリンキノンの誘導体であり、下記式（３）で表される。ＩＰＱはＰＱＱと異なり、更なるアミノ酸等の任意成分と反応をしないという点で、安定性に優れる。また、液体クロマトグラフィーの溶出時間がＰＱＱと異なり、クロマトグラムのピークの分離も容易になる。本実施形態の分析方法においてはＩＰＱを形成させて検出することにより、測定サンプル中に共存する任意成分の妨害を受けずに定量分析が可能となる。
【化２】
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【００３０】
（グリシン）
グリシンを用いることにより、ＩＰＱの生成が効率的及び優先的に進行し、上記妨害物質による影響を排することができる。添加するグリシンの態様は、特に制限されず、水溶液であっても、粉末状であってもよい。水溶液である場合には、溶媒として水を用いても緩衝液を用いてもよい。
【００３１】
（前処理）
サンプル調製工程において、ピロロキノリンキノンを含む測定対象物とグリシンとを混合するに際して、測定対象物の形態に応じた前処理を行ってもよい。例えば、測定対象物がカプセル剤であればカプセルを切断したり、錠剤であれば錠剤を粉砕したりするなど、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが混合されやすいよう適切に処理することができる。
【００３２】
（分液操作）
また、サンプル調製工程において、水と相溶しない有機溶剤をさらに混合し、測定対象物中の油溶性成分を有機溶剤に溶解させた後、有機溶剤を取り除くことにより、測定対象物中の油溶性成分が除去された測定サンプルを調製してもよい（分液操作）。特に、測定対象物が脂溶性成分を含む場合には、分液操作を行うことにより、有機層に脂溶性成分を抽出し、水層にＰＱＱ（若しくは反応後のＩＰＱ）を抽出することで、ＰＱＱ（若しくは反応後のＩＰＱ）の定量精度がより向上する傾向にある。なお、水槽に抽出されるのがＰＱＱであるかＩＰＱであるかという点については、分液操作をピロロキノリンキノンとグリシンとを反応させた後に行うか、前に行うかによって異なる。また、反応中である場合には、未反応のＰＱＱと反応済のＩＰＱがともに水層に抽出されるということもある。
【００３３】
分液処理において用い得る有機溶媒としては、特に制限されないが、例えば、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレン、シクロヘキサン、トルエン、ヘキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、アセトンが挙げられる。このなかでも、水溶性が低いという観点から、酢酸エチル、クロロホルム、塩化メチレンが好ましく、より好ましくは生分解性の高い酢酸エチルである。なお、分液操作は脂溶性成分を含まないと考えられる場合には、省略することも可能である。分液操作を行うことにより、ＰＱＱ（ＩＰＱ）の定量精度がより向上する傾向にある。
【００３４】
（遠心分離操作）
測定対象物が、難溶性成分等の粉末成分を含む場合には、遠心分離操作を行ってもよい。また、分液操作の過程で水層と有機層を分離させるために遠心分離操作を利用してもよい。
【００３５】
（混合方法）
ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリン又はその塩を生成するように、ピロロキノリンキノンを含む測定対象物と前記グリシンとを混合する方法としては、特に制限されないが、少なくとも、水又は緩衝液などの水溶液中で、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとを共存させる方法が挙げられる。
【００３６】
その条件としては、特に制限されない。例えば、イミダゾピロロキノリンを生成する反応の温度と時間はサンプル濃度、妨害物質濃度によって変更することができる。このなかでも、反応温度は、好ましくは０〜１２０℃であり、より好ましくは１０〜９０℃であり、さらに好ましくは、２０〜８０℃である。また、反応時間は、好ましくは５分〜２日であり、より好ましくは１０分〜２４時間であり、さらに好ましくは１０分〜１０時間である。さらに、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが共存する溶液（反応液）のｐＨは、好ましくは２〜１２であり、より好ましくは２〜１０であり、さらに好ましくは６〜８である。溶液内でのＩＰＱはｐＨにあわせてイオン化しており、塩が溶けた状態と同じである。
【００３７】
グリシンの使用量は、ピロロキノリンキノン又はその塩に対して大過剰で使用することが好ましく、好ましくは１００〜１００００００倍重量であり、より好ましくは２００〜５０００００倍重量であり、さらに好ましくは３００〜１０００００倍重量である。
【００３８】
（酸化工程）
上記混合方法の一態様として、イミダゾピロロキノリンを生成する反応をより効率的に進める観点からは、グリシンとの反応の前または反応中において、ピロロキノリンキノンを酸化型にする酸化工程を有することが好ましい。酸化工程において、一部の還元型となったＰＱＱを酸化型ＰＱＱとすることにより、ＩＰＱ化の反応がさらに進行し得る。なお、酸化工程における酸化方法、すなわち、還元型ＰＱＱを酸化型ＰＱＱにする方法としては、特に制限されないが、例えば、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが共存する液中に空気を吹き込む方法や、当該液を容器に入れ、十分に空気と接触させるために振る等の操作をする方法（容器中の空気とよくなじませること）が挙げられる。
【００３９】
また、上記酸化方法の一態様として、ピロロキノリンキノンを含む測定対象物とグリシンとを混合した後、希釈剤を加える希釈化工程を有していてもよい。希釈剤としては特に制限されないが、水又は緩衝液を添加する方法が挙げられる。緩衝液としては、特に制限されないが、例えば、炭酸バッファーが好ましい。このような希釈化工程を経ることにより、ピロロキノリンキノンを酸化型にしやすくなるめ、イミダゾピロロキノリンを生成する反応をより効率的に進める傾向にある。
【００４０】
さらに、上記希釈化工程においては、ＨＰＬＣに導入するサンプル組成とＨＰＬＣ溶離液の組成との相違を少なくし、これにより、ショックピーク、ピーク形状の乱れ、溶出時間の変動が生じることを抑止する観点から、希釈剤として、ＨＰＬＣ溶離液を用いてもよい。上記還元型ＰＱＱを酸化型ＰＱＱにする目的において用いる希釈剤と、ショックピーク等による変動を抑止する目的において用いる希釈剤とは、同一であっても異なってもよい。また、これら異なる目的の希釈剤は、同時に添加しても別々に添加してもよく、好ましくは、グリシンによる誘導体化反応の進行の観点から、上記還元型ＰＱＱを酸化型ＰＱＱにする目的において用いる希釈剤を先に添加し、ショックピーク等による変動を抑止する目的において用いる希釈剤を後に添加するか、若しくは同時に添加することが好ましい。特に、ショックピーク等による変動を抑止する目的において用いる希釈剤を後に添加する場合、これを再希釈化工程ともいう。
【００４１】
（測定サンプル）
上記のようにして得られる測定サンプルは、ピロロキノリンキノン又はその塩とグリシンとが反応して得られたイミダゾピロロキノリン又はその塩と、未反応のグリシンと、測定対象物に含まれるその他の各成分が含まれ得る。
【００４２】
測定サンプルに含まれるグリシンの含有量は、好ましくは１〜４０質量％であり、より好ましくは３〜２０質量％であり、さらに好ましくは３〜１０質量％である。測定サンプルに含まれるグリシンの含有量は、未反応の測定サンプルに含まれるグリシンの残存量、すなわち、ピロロキノリンキノン又はその塩がイミダゾピロロキノリンに全て転化したあとのグリシンの残存量と考えることができる。グリシンの含有量が１質量％以上であることにより、ピロロキノリンキノン又はその塩がイミダゾピロロキノリンに十分に転化したものということができる。また、グリシンの含有量が４０質量％以下であることにより、測定サンプル内に含まれるグリシンが多すぎることによる定量測定に与える影響が抑えられる傾向にある。
【００４３】
〔定量分析工程〕
定量分析工程は、クロマトグラフィー法による測定サンプルに含まれるイミダゾピロロキノリン及びその塩のクロマトグラムに基づいて、測定対象物に含有されるピロロキノリンキノンの量を定量する工程である。ここで、クロマトグラムとは、溶出時間ごとに得られる各成分の信号を、X軸を時間、Y軸を信号強度としてプロットすることで得られるチャートである。
【００４４】
クロマトグラフィー法による測定サンプルに含まれるイミダゾピロロキノリン及びその塩の定量分析方法としては、常法を用いることができ、例えば、標準添加法、内部標準法、絶対検量線法が挙げられる。定量法は求める精度と補正を考慮して採用すればよいが、このなかでも、妨害の影響を最小限にして、分析精度を高める観点から、標準添加法が好ましい。
【００４５】
本実施形態において用い得る標準添加法は、常法と同様であり、例えば、イミダゾピロロキノリン及びその塩を検出可能な検出器を用いて、測定サンプルのクロマトグラムを得て、当該クロマトグラム中のイミダゾピロロキノリン及びその塩に由来するピークを特定し、かつ当該ピークの面積に基づき予め定めた検量線から、測定サンプルに含まれるイミダゾピロロキノリン及びその塩を定量する方法が挙げられる。検量線の作成にあっては、初めに、濃度が既知のイミダゾピロロキノリンの標準溶液を予め調製し、当該標準溶液を測定サンプルに添加して、検量線作成用のサンプル群を調製する。そして、当該サンプル群のクロマトグラムを得て、イミダゾピロロキノリン及びその塩に由来するピークの面積を測定し、測定されたピークの面積と、測定したサンプルに添加されたイミダゾピロロキノリンの量（標準溶液により添加されたイミダゾピロロキノリンの量）とをプロットしたグラフを作成する。当該プロットから最小二乗法等により、ピークの面積とイミダゾピロロキノリン及びその塩の濃度の関係を示す近似直線を得て、当該近似直線に基づいて検量線を作成する。
【００４６】
本実施形態において用い得るクロマトグラフィー法としては、求める精度と補正を考慮して採用すればよいが、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が挙げられる。当該方法におけるカラム及び溶離液の組み合わせは特に制限されない。ＨＰＬＣ装置は、分離カラム、および分離溶液を分離カラムに送り込むポンプを備える。ＨＰＬＣ装置は、それ以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器等備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や蛍光検出器、質量分析装置が挙げられる。
【００４７】
分離カラムとしては、逆相カラムを用いることができる。逆相カラムとしては、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（ＯＤＳカラム、Ｃ８カラム、Ｃ２カラム）、これらにイオン交換樹脂を配合したカラムが挙げられるが、特にＯＤＳカラムが好ましい。特に、ＨＰＬＣによる分析を行う場合には、粒径が５．０μｍ以下のオクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（ＯＤＳカラム）を使用することが好ましく、１．７〜５．０μｍのＯＤＳカラムが更に好ましい。
【００４８】
溶離液としては、特に制限されないが、例えば、燐酸バッファー、酢酸バッファー、ギ酸バッファー、炭酸バッファー、及びこれらの混合バッファーが挙げられる。また、必要に応じて有機溶媒を添加してもよい。このような有機溶媒としては、特に制限されないが、例えば、アセトニトリル、メタノールが挙げられる。また、分離度を上げることを目的として、イオンペア試薬を溶離液に添加するイオンペア法を用いてもよい。イオンペア試薬としては、特に制限されないが、例えば、アンモニウム塩、スルホン酸化合物等が挙げられる。
【００４９】
溶出法としては、特に制限されないが、例えば、送液中において移動相（溶離液）の組成を変化させないアイソクラティック溶出法、及び、送液中において移動相（溶離液）の組成を変化させるグラジエント溶出法が挙げられる。溶出法は、分離能に応じて適宜選択することができる。
【００５０】
本実施形態の分析方法は、ＰＱＱ定量分析において以下の利点、特徴を有する。第一に、誘導体化することで安定になり、経時的変化が小さくなる、第二に、ＰＱＱと反応する物質による妨害効果を小さくできる。また、その他に、誘導体化に使用するグリシン等のグリシンは安価で安全である。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。【００５２】
以下に分析に用いた各試料の調製方法を記載する。なお、実施例において用いた試薬は、特に記載がない限り和光特級の試薬を用いた。【００５３】
（１）１０％グリシン溶液：グリシン１００ｇを秤量し蒸留水９００ｇに溶解して、調製した。【００５４】
（２）標準添加溶液
（２−１）ＰＱＱ原液：１００ｍｇのピロロキノリンキノンニナトリウム塩（三菱瓦斯化学社製、Ｎａ／ピロロキノリンキノンモル比１．７０〜２．１０、水分量＜１２％、ＨＰＬＣ純度＞９９．０％）を１０％グリシン液で溶解し、総重量が２０ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱ原液中のＰＱＱの濃度は５ｇ／Ｌであった。
（２−２）０．１ｇ／Ｌ添加溶液：ＰＱＱ原液２ｇを１０％グリシン液で希釈し、総重量が１００ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱの濃度は０．１ｇ／Ｌであった。
（２−３）０．２ｇ／Ｌ添加溶液：ＰＱＱ原液４ｇを１０％グリシン液で希釈し、総重量が１００ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱの濃度は０．２ｇ／Ｌであった。
（２−４）０．３ｇ／Ｌ添加溶液：ＰＱＱ原液６ｇを１０％グリシン液で希釈し、総重量が１００ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱの濃度は０．３ｇ／Ｌであった。【００５５】
（３）炭酸緩衝液
（３−１）２５０ｍＭ炭酸緩衝液：１５．９５ｇのＮａ２ＣＯ３と８．４ｇのＮａＨＣＯ３を蒸留水で溶解し、総量が１Ｌとなるようにメスアップした。
（３−２）５０ｍＭ炭酸緩衝液：２５０ｍＭ炭酸緩衝液を水で５倍希釈して調製した。【００５６】
（４）比較用標準添加溶液
（４−１）ＰＱＱ比較用原液：１００ｍｇのピロロキノリンキノンニナトリウム塩（三菱瓦斯化学社製、Ｎａ／ピロロキノリンキノンモル比１．７０〜２．１０、水分量＜１２％、ＨＰＬＣ純度＞９９．０％）を５０ｍＭ炭酸緩衝液で溶解し、総重量が２０ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱ比較用原液中のＰＱＱの濃度は５ｇ／Ｌであった。
（４−２）０．１ｇ／Ｌ比較用添加溶液：ＰＱＱ比較用原液２ｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液で希釈し、総重量が１００ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱの濃度は０．１ｇ／Ｌであった。
（４−３）０．２ｇ／Ｌ比較用添加溶液：ＰＱＱ比較用原液４ｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液で希釈し、総重量が１００ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱの濃度は０．２ｇ／Ｌであった。
（４−４）０．３ｇ／Ｌ比較用添加溶液：ＰＱＱ比較用原液６ｇを５０ｍＭ炭酸緩衝液で希釈し、総重量が１００ｇとなるように、メスアップした。ＰＱＱの濃度は０．３ｇ／Ｌであった。【００５７】
（５）ＨＰＬＣ溶離液（１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ／１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４＝３０／７０（ｐＨ５．１））：
６．０ｇのＣＨ３ＣＯＯＨを蒸留水で溶解し、総量が１Ｌとなるようにメスアップして１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ（１液）を調製し、これとは別に、７．７１ｇのＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を蒸留水で溶解し、総量が１Ｌとなるようにメスアップして１００ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４（２液）を調製した。その後、３００ｍLの１液と７００ｍLの２液を混合して、ＨＰＬＣ溶離液及び炭酸緩衝液として用いる緩衝液を得た。なお、得られた緩衝液のｐＨが５．１±０．２であることを確認した。【００５８】
（６）サンプル希釈液：ＨＰＬＣ溶離液をサンプル希釈液とした。【００５９】
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
送液ユニット  ：ＬＣ−１０ＡＤ（島津製作所社製）
カラム        ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ
（ＹＭＣ社製、長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒子径５μｍ）
検出器        ：ＵＶ２５９ｎｍ
ＨＰＬＣ溶離液：上記のとおり
カラム温度    ：４０℃
溶離液流速    ：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、
導入量        ：３μＬ
分析時間      ：３０ｍｉｎ【００６０】
〔実施例１：ハードカプセル〕
（サンプル調製工程）
測定対象物として、市販のピロロキノリンキノン二ナトリウム塩５ｍｇ相当入りハードカプセル品を１粒使用した。当該ハードカプセル品の原材料名表記には、酵素処理アスパラガス抽出物、デキストリン、コエンザイムＱ１０、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩，ショ糖脂肪酸エステル、着色料（カラメル）、二酸化ケイ素、ゼラチンが記載されていた。【００６１】
上記ハードカプセル品の外皮カプセルを切断し、５０ｍＬの容器（遠心チューブ）に外皮カプセル及びそのカプセル内容物を全て入れた。その後、容器に酢酸エチル５ｍＬと、１０％グリシン液２５ｍＬを加え、振盪混和しつつ容器外から超音波を６０分当て、ピロロキノリンキノンとグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリンを生成するように混合した。そして、混合後の溶液を遠心分離器にて遠視分離を行い、水層と油層（酢酸エチル層）に分離し、そのうち水層のみを採取して、測定用サンプルした。【００６２】
測定用サンプルのうち０．２ｍＬを５０ｍＬの容器に分取し、２５０ｍＭ炭酸緩衝液２ｍＬを添加した。その後、７０℃で１時間放置し、さらに、室温で１時間振盪したのち、サンプル希釈液（ＨＰＬＣ溶離液）を用いて５倍に希釈した。得られた溶液をフィルターにてろ過し、上記条件にてＨＰＬＣ分析を行った。得られたクロマトグラフを図１に示す。クロマトグラフのリテンションタイム（Ｒｔ）１０〜１１分にかけてみられるピークがイミダゾピロロキノリンに由来するピークであった。次いで、イミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリア（ピークの面積）の値Ｂを算出した。なお、上記ピークエリアの算出までの操作は３回行い（測定対象物としてのハードカプセル品を合計３粒用い）、イミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリアの値Ｂを３点得た。【００６３】
（定量分析工程）
２５ｍＬの１０％グリシン液に代えて、０．１ｇ／Ｌ添加溶液、０．２ｇ／Ｌ添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ添加溶液を２５ｍＬずつ用いたこと以外は、上記と同様の方法により、０．１ｇ／Ｌ添加溶液、０．２ｇ／Ｌ添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ添加溶液を加えた場合毎のクロマトグラフを得て、イミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリア（ピーク面積）をそれぞれ算出した。なお、上記ピークエリアの算出までの操作は合計３回行い、０．１ｇ／Ｌ添加溶液、０．２ｇ／Ｌ添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ添加溶液を加えた場合におけるイミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリアの値をそれぞれ３つずつ、合計９点の値を得た。【００６４】
その後、ＰＱＱの濃度を横軸とし、ＨＰＬＣピークエリアを縦軸として、１０％グリシン液、０．１ｇ／Ｌ添加溶液、０．２ｇ／Ｌ添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ添加溶液を加えた場合におけるイミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリアの値（合計１２点）をそれぞれプロットし、そのプロットから最小二乗法により直線ａを作成し、当該直線ａの傾きＡ（ａｒｅａ／ｍｇ）を算出した。そして、標準添加法における検量線ｂを作成した。図２に、各ピークエリアの値のプロットとそれに基づいて作成された直線ａ及び検量線ｂを示す。【００６５】
ハードカプセルには未知の量αmg含まれる。この時に示されるピーク面積はＢである。ここにＰＱＱを添加したときのピーク面積＝Ａ（α＋添加量）として直線aをあわわしている。添加量を変えてプロットすることでＡを求めることで未知のα＝B/Aであらわされる。【００６６】
最後に、３点のピークエリアの値Ｂそれぞれに対して下記式を適用し、測定用サンプルのＰＱＱの含量を求めた。その結果を標準偏差及び相対標準偏差とともに表１に示す。
ＰＱＱの含量（ｍｇ／カプセル）＝Ｂ（ａｒｅａ）／Ａ（ａｒｅａ／ｍｇ）
【表１】
2019138817.tif 000005
【００６７】
表１からわかるように、本発明の分析方法によれば、ばらつきも少なく定量性に優れた分析が可能となることがわかる。なお、実施例１においてはばらつきの確認のため、ピークエリアの値Bを３点測定して比較しているが、本発明の分析方法はピークエリアの値Bを複数点測定することが必須となるものではない。【００６８】
〔比較例１：ハードカプセル〕
２５ｍＬの１０％グリシン液に代えて、５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いたこと、及び、酢酸エチルを用いた遠心分離（水層と油層の分離）を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の方法により、ピロロキノリンキノンに由来するピークのピークエリア（ピークの面積）の値Ｂを算出した。また、０．１ｇ／Ｌ添加溶液、０．２ｇ／Ｌ添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ添加溶液に代えて、０．１ｇ／Ｌ比較用添加溶液、０．２ｇ／Ｌ比較用添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ比較用添加溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様の方法により、傾きＡ（ａｒｅａ／ｍｇ）を算出した。得られた値Ｂ及び傾きＡに基づいて、上記式によりＰＱＱの含量（ｍｇ／カプセル）を算出したところ、平均値として４．５４ｍｇ／カプセルという値が得られた。【００６９】
４．５４ｍｇ／カプセルという値は、実施例１の５．０８ｍｇ／カプセルよりも小さい値である。このように比較例１において得られる値が実施例１よりも小さくなった理由としては、ハードカプセルに含まれる夾雑物（例えば、クロマトグラム上のＰＱＱ以外のピークで現れる夾雑物や、ＵＶ２５９ｎｍで検出されない夾雑物）が、ＰＱＱの検出を妨害しているためであると考えられる。特に、当該ハードカプセル品のラベル表記から考えれば、植物抽出物であるアスパラガス抽出物の影響も少なからずあるものと推察される。上記結果により、グリシンを用いることにより、正確な含量が定量できることがわかる。さらに、ＨＰＬＣに導入されたサンプル組成がＨＰＬＣ溶離液と大きく異なる場合、ショックピーク、ピーク形状の乱れ、溶出時間の変動が生じやすい傾向にあるところ、ＨＰＬＣ溶離液による再希釈によりこれらも効果的に防止されたものと考えられる。【００７０】
〔実施例２：ソフトカプセル〕
（サンプル調製工程）
測定対象物として、ＭＧＣアドバンストケミカル株式会社販売のＰＱＱ１０ｍｇ相当入りサプリ（ソフトカプセル）を使用した。該ＰＱＱサプリの原材料名表記には、食用オリーブ油、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩、ゼラチン、ビタミンＣ、グリセリン、ミツロウ、着色剤（カラメル）が記載されていた。【００７１】
ハードカプセルに代えて上記ソフトカプセルを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、イミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリア（ピークの面積）の値Ｂと、傾きＡ（ａｒｅａ／ｍｇ）を算出した。得られた値Ｂ及び傾きＡに基づいて、上記式によりＰＱＱの含量（ｍｇ／カプセル）を算出したところ、平均値として１０．０３ｍｇ／カプセルという値が得られた。【００７２】
〔比較例２：ソフトカプセル〕
２５ｍＬの１０％グリシン液に代えて、５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いたこと以外は、実施例２と同様の方法により、ピロロキノリンキノンに由来するピークのピークエリア（ピークの面積）の値Ｂを算出した。また、０．１ｇ／Ｌ添加溶液、０．２ｇ／Ｌ添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ添加溶液に代えて、０．１ｇ／Ｌ比較用添加溶液、０．２ｇ／Ｌ比較用添加溶液、又は０．３ｇ／Ｌ比較用添加溶液を用いたこと以外は、実施例２と同様の方法により、傾きＡ（ａｒｅａ／ｍｇ）を算出した。得られた値Ｂ及び傾きＡに基づいて、上記式によりＰＱＱの含量（ｍｇ／カプセル）を算出したところ、平均値として５．５ｍｇ／カプセルという値が得られた。【００７３】
５．５ｍｇ／カプセルという値は、実施例２の１０．０３ｍｇ／カプセルの約半分の値である。このように比較例２において得られる値が実施例２よりも小さくなった理由としては、ソフトカプセルに含まれる夾雑物（例えば、クロマトグラム上のＰＱＱ以外のピークで現れる夾雑物や、ＵＶ２５９ｎｍで検出されない夾雑物）が、ＰＱＱの検出を妨害しているためであると考えられる。特に、当該ソフトカプセル品のラベル表記から考えれば、妨害効果の高いアスコルビン酸（ビタミンＣ）の影響も少なからずあるものと推察される。上記結果により、アスコルビン酸共存下においても正確な含量が定量できることがわかる。また、炭酸バッファーを用いた希釈により還元型ＰＱＱが酸化型ＰＱＱとなり、ＩＰＱが進行しやすいため、比較的妨害効果の高いアスコルビン酸（ビタミンＣ）の影響を排して、正確性がより向上したものと推察される。さらに、ＨＰＬＣに導入されたサンプル組成がＨＰＬＣ溶離液と大きく異なる場合、ショックピーク、ピーク形状の乱れ、溶出時間の変動が生じやすい傾向にあるところ、ＨＰＬＣ溶離液による再希釈によりこれらも効果的に防止されたものと考えられる。【００７４】
〔実施例３：飲料〕
測定対象物として、キリンビバレッジ社製「生茶」５２５ｍＬに対し、ピロロキノリンキノンジナトリウムを２０ｍｇ添加し、一晩室温で静置させたものを使用した。さらに検量線作成用に生茶に対してピロロキノリンキノンジナトリウムを１５、２０、４０ｍｇになるように添加したものを準備した。なお、原材料名表記には、緑茶、生茶葉抽出物、ビタミンＣが記載されていた。【００７５】
５０ｍＬの容器に静置後の生茶２ｍＬを入れ、粉末のグリシンを０．３ｇ添加した。その後、容器外から超音波を１５分当て、粉末のグリシンを全て溶解させた。さらに４時間振盪させたあと、フィルターにてろ過し、上記条件にてＨＰＬＣ分析を行った。イミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリア（ピークの面積）の値Ｂと、傾きＡ（ａｒｅａ／ｍｇ）を算出し、得られた値Ｂ及び傾きＡに基づいて、上記式によりＰＱＱの含量（ｍｇ／カプセル）を算出したところ、平均値として２０ｍｇ／飲料という値が得られた。【００７６】
〔比較例３：飲料〕
粉末のグリシンを添加しなかったこと以外は、実施例３と同様の方法により、ＨＰＬＣ分析を行った。しかしながら、ＰＱＱ２０ｍｇ添加と４０ｍｇ添加のＰＱＱピーク面積はほぼ同じ値であった。このことからグリシンを添加しない場合には、ＰＱＱピーク面積からは飲料に含まれるＰＱＱの濃度依存性を確認することはできなかった。これは、アスコルビン酸と植物抽出物である緑茶が検出を妨害しているためと推察される。【００７７】
〔実施例４：共存物質の影響〕
ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩１ｇとデキストリン９ｇを粉末状態で混合した。この粉末５０ｍｇを５０ｍＬの容器に入れ、そこに、表２に示す物質１と物質２を５０ｍｇずつ添加して、粉末状態で混合した。次いで、酢酸エチル５ｍＬと、１０％グリシン液２５ｍＬを加え、振盪混和しつつ容器外から超音波を３０分当て、ピロロキノリンキノンとグリシンとが反応してイミダゾピロロキノリンを生成するように混合した。そして、混合後の溶液を遠心分離器にて遠心分離した、水層と油層（酢酸エチル層）に分離し、そのうち水層のみを採取して、測定用サンプルとした。【００７８】
測定用サンプル２ｍＬを１５ｍＬの容器に分取し、その後、７０℃で１時間放置し、さらに、室温で１時間振盪したのち、サンプル希釈液（ＨＰＬＣ溶離液）を用いて５倍に希釈した。得られた測定用サンプルに対してＨＰＬＣ分析を行い、ＰＱＱに由来するピークの消失とＩＰＱに由来するピークの生成を確認することにより、共存物質（物質１及び２）共存下におけるグリシンによるＰＱＱのＩＰＱへの誘導体化反応の進行を確認した。誘導体化反応が完全に進行したものをＡとし、共存物質による妨害が有意に認められるものをＢとした。なお、下記表２においては、物質１及び２を組み合わせて用いているが、物質１又は２の単独使用においても実質的に同様の傾向が見られた。
【表２】
2019138817.tif 000006
共存物質して妨害するアミノ酸が存在したとしてもグリシンを用いることによりＩＰＱへの誘導体化が選択的かつ優位に進行したことを確認できた。【００７９】
〔実施例５：分析範囲〕
０．１ｇ／Ｌ添加溶液等と同様にして、０．５ｇ／Ｌ添加溶液、１．０ｇ／Ｌ添加溶液、２．０ｇ／Ｌ添加溶液、３．０ｇ／Ｌ添加溶液、４．０ｇ／Ｌ添加溶液を調整した。測定対象物は特に使用せず、これら０．１〜４．０ｇ／Ｌ添加溶液を、サンプル希釈液（ＨＰＬＣ溶離液）を用いて５倍に希釈した。得られた溶液をフィルターにてろ過し、上記条件にてＨＰＬＣ分析を行った。【００８０】
イミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリア（ピーク面積）をそれぞれの添加溶液ごとに算出し、ＰＱＱの濃度を横軸とし、ＨＰＬＣピークエリアを縦軸として、イミダゾピロロキノリンに由来するピークのピークエリアの値をそれぞれプロットし、そのプロットから最小二乗法により直線ｃを作成した。図３に、各ピークエリアの値のプロットとそれに基づいて作成された直線ｃを示す。標準添加法において高濃度から低濃度まで直線ｃの直線性が保たれているということは、本発明の分析方法の正確性を担保するための一つの指標となる。図３に示されるとおり、本発明の分析方法によれば２．５ｍｇから１００ｍｇの範囲で直線性が確認された。このことからすると、打ち込み量の増加、希釈操作を組み合わせればさらに広い濃度範囲で分析が可能であることがわかる。【００８１】
本出願は、２０１８年１月１２日に日本国特許庁へ出願された日本特許出願（特願２０１８−００３６３６）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の分析方法は、食品等に含まれるＰＱＱの定量的な測定方法として、産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2019138817.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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