(57)【要約】  本発明は、単離された多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞からインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法であって、(1) 始原生殖細胞様細胞を生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び(2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程を含む、方法；及び  当該方法により得られる精子幹細胞様の細胞を再構成精巣から解離し、精子幹細胞から生殖系列幹細胞を誘導し得る条件下で培養することを含む、生殖系列幹細胞様細胞の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された多能性幹細胞（PSC）由来の始原生殖細胞様細胞（PGCLC）からインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法であって、
(1) PGCLCを生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び
(2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により得られる精子幹細胞様の細胞を再構成精巣から解離し、精子幹細胞から生殖系列幹細胞（GSC）を誘導し得る条件下で培養することを含む、GSC様細胞（GSCLC）の製造方法。
【請求項３】
以下の性質を有することを特徴とする、単離されたGSCLC。
(a) 単離されたPSC由来である
(b) (i) Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4及びId4からなる群より選択される遺伝子、
(ii) CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1からなる群より選択される表面マーカー、並びに
(iii) PLZF及びID4からなる群より選択される転写因子
の発現レベルが、GSCと同等である
(c) GSCと同等の増殖速度で維持・増幅可能である
(d) 該GSCLCを成体精巣内に移植した場合、
(i) 移植細胞が定着した精細管に占めるGFRα1陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれと同等である、及び
(ii) 移植細胞が定着した精細管に占めるSCP3陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれよりも低い
(e) 該GSCLCを成体精巣内に移植して得られる精細胞を顕微授精した場合、正常な子孫を生じる
【請求項４】
請求項２に記載の方法により得られるGSCLC又は請求項３に記載のGSCLCを哺乳動物の精巣内に移植することを含む、稔性のある精細胞の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法により得られる精細胞と卵細胞とを受精させることを含む、単離されたPSCが全身に寄与した子孫の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から、エピブラスト様細胞、始原生殖細胞様細胞を介して、インビトロで生殖系列幹細胞様細胞を誘導する方法、及び該生殖系列幹細胞様細胞から成体動物の精巣内で正常な精子を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生生物学における主要な課題は、必須の発生経路をインビトロで再構成することであり、これは、新たな実験の機会を提供するだけでなく医学的応用の基礎としても役立つものである。多細胞生物において、生殖細胞系列には新たな生物の創出を確保する必須の機能が与えられており、それにより世代を超えて遺伝情報及びエピジェネティック情報が継承される。従って、生殖細胞系列の発生をインビトロで再構成することは、通常、ライフサイエンスにおける本来的意義である。マウス及びヒトの胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹細胞（「ES細胞」、「ESC」と略記する場合がある）から、インビトロで配偶子又はその前駆細胞（始原生殖細胞;「PGC」と略記する場合がある）を作り出す試みがいくつかなされてきたが、これらの試みは全て、化学的に定義されていない条件下、胚様体としてESCのランダムな分化を伴い、1種以上のマーカー遺伝子の自発的な発現に依存していた。結果として、これらの試みは目的の細胞を得るには非効率的であった。さらに、作製された細胞が健常な子孫の創出に寄与することは何ら実証されていなかった。【０００３】
本発明者らは以前、アクチビンA及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むサイトカインを用いて、ES細胞/人工多能性幹細胞(「iPS細胞」、「iPSC」と略記する場合がある)をエピブラスト様細胞(「EpiLC」と略記する場合がある)へ誘導し、その後、BMP4を含むサイトカインを用いて、始原生殖細胞様細胞（「PGC様細胞」、「PGCLC」と略記する場合がある)へと誘導する培養系を確立した(特許文献１、非特許文献１及び２)。さらに、該PGCLCを新生仔マウスの精巣内又は卵嚢下に移植して、精子又は卵子に分化させ、そこから正常な子孫を得ることに成功した(特許文献１、非特許文献１及び２)。また、多能性幹細胞（「PSC」と略記する場合がある）からPGCLCを経て卵子をインビトロで誘導することにも成功している。【０００４】
一方オスについては、多能性幹細胞からPGCを経て、精子の前段階の細胞である、精子幹細胞を誘導することが目標の一つとされてきた。精子幹細胞は、生涯にわたり精子を産出する細胞で、成体の精巣内にわずかしか存在せず、生殖細胞系列で唯一の幹細胞といわれている。これまで、精子幹細胞の長期培養株（生殖系列幹細胞；GSC）の樹立方法は研究されていたが、精子幹細胞がPGCから分化誘導されるメカニズムには不明な点が多く、多能性幹細胞からPGCLCを経て、GSC様の細胞をインビトロで誘導する培養系の確立が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2012/020687号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S. & Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell146, 519-532 (2011).
【非特許文献２】Hayashi, K.et al. Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice. Science 338, 971-975 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、多能性幹細胞由来のPGCLCからインビトロでGSC様の細胞を誘導する方法を提供することであり、このGSC様の細胞を精子に分化させ、効率よくPSCが寄与する子孫を作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
マウスの場合、PGCは胎齢12.5日齢（E12.5）までに将来精巣の元となる生殖巣体細胞に囲まれ、前精原細胞と呼ばれるようになり、その後、出生5日齢頃に、精原細胞及び精子幹細胞へと分化する。そこで、本発明者らは、PGCが前精原細胞となる時点の細胞環境に注目し、マウスESCから誘導したPGCLCを、マウス胎仔（E12.5）の生殖巣体細胞とともに浮遊培養して凝集させて「再構成精巣」を作製し、精子幹細胞への分化が誘導される培養条件を検討した。その結果、PGCLCが、精子幹細胞と同等の特性を示す細胞に分化する培養条件を決定することができた。この細胞をさらに培養したところ、生体由来のGS細胞と同様に増殖し、4ヶ月以上の長期培養が可能であることが確認された。本発明者らは、この細胞株を生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）と命名した。さらに、本発明者らは、GSCLCを生殖細胞欠損マウスの新生仔（生後7日齢）及び成体（生後8週齢）の精巣に移植した結果、一部が精子まで分化し、得られた精子を卵子と顕微授精させると健常な産仔が得られることを確認し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下に関する：
［1］単離された多能性幹細胞（PSC）由来の始原生殖細胞様細胞（PGCLC）からインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法であって、
(1) PGCLCを生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び
(2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程
を含む、方法。
［2］［1］に記載の方法により得られる精子幹細胞様の細胞を再構成精巣から解離し、精子幹細胞から生殖系列幹細胞（GSC）を誘導し得る条件下で培養することを含む、GSC様細胞（GSCLC）の製造方法。
［3］以下の性質を有することを特徴とする、単離されたGSCLC。
(a) 単離されたPSC由来である
(b) (i) Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4及びId4からなる群より選択される遺伝子、
(ii) CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1からなる群より選択される表面マーカー、並びに
(iii) PLZF及びID4からなる群より選択される転写因子
の発現レベルが、GSCと同等である
(c) GSCと同等の増殖速度で維持・増幅可能である
(d) 該GSCLCを成体精巣内に移植した場合、
(i) 移植細胞が定着した精細管に占めるGFRα1陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれと同等である、及び
(ii) 移植細胞が定着した精細管に占めるSCP3陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれよりも低い
(e) 該GSCLCを成体精巣内に移植して得られる精細胞を顕微授精した場合、正常な子孫を生じる
［4］［2］に記載の方法により得られるGSCLC又は［3］に記載のGSCLCを哺乳動物の精巣内に移植することを含む、稔性のある精細胞の製造方法。
［5］［4］に記載の方法により得られる精細胞と卵細胞とを受精させることを含む、単離されたPSCが全身に寄与した子孫の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来のPGCLCが抱える2つの課題、即ち、(1) 長期維持培養ができないこと、及び(2) 新生児精巣内でしか精子に分化しないこと、を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、インビトロでの再構成精巣の発展を示す。（A）2つの条件下での再構成精巣の作製および培養のためのスキーム。（B）3週間にわたる再構成精巣の発展の代表的な画像（条件2）。明視野画像（BF）、AAG蛍光、およびそれらのマージを示す。バー：200μm。（C）d14およびd21での再構成精巣（条件2）またはE13.5およびP3の精巣におけるGATA4およびSOX9（左）またはDDX4およびPLZF（右）の発現。バー：50μm。PGCLC由来の細胞および内在性の生殖細胞は、それぞれGFPおよびDDX4（第2列）によって同定する。DAPI染色およびマージも示す。（D）再構成精巣におけるd4 PGCLCまたはE12.5 PGCのDDX4（+）/ PLZF（-）およびDDX4（+）/ PLZF（+）細胞への分化の割合。（E）再構成精巣の長期培養（条件1）。（左）28日間培養した再構成精巣の形態。バー：200μm。（右）30日間培養した再構成精巣の切片におけるDDX4（ii）、SCP3（iii）、およびGFP（iv）の発現。（i）はDAPI。バー：10μm。図２も参照のこと。
【図２】図２は、インビトロでの再構成精巣を示し、図１に関連する。（A）条件1下で3週間の再構成精巣の発展の代表的な画像。明視野画像（BF、上）、AAGによるGFP蛍光（中）、およびそれらのマージ（下）を示す。バー：200μm。（B）d14およびd21での再構成精巣（条件１）、またはE13.5および出生後日数（P）3での再構成精巣における、GATA4およびSOX9（左）もしくはDDX4およびPLZF（右）の発現のIF分析。バー：50μm。PGCLC由来の細胞および内在性の生殖細胞は、それぞれGFPおよびDDX4によって同定した（第2列）。DAPI染色およびマージを、それぞれ上および下の列に示す。（C）d21での再構成精巣（条件1（左）および2（右））におけるDDX4およびPLZFの発現のIF分析。内在性の生殖細胞を、GFP（-）/ DDX4（+）細胞として同定した。DAPI染色およびマージを、それぞれ上および下の列に示す。バー：50μm。（D）インビボでAAG（+）PGCを有する再構成精巣の長期培養（条件1）。（左）49日間培養した再構成精巣の形態。明視野画像（BF）、AAGによるGFP蛍光、およびそれらのマージ（下）を示す。バー：200μm。（右）54日間培養した再構成精巣の切片におけるDDX4（ii）、SCP3（iii）、およびGFP（iv）の発現のIF分析を（i）DAPIと共に示す。バー：10μm。
【図３】図３は、再構成精巣から生殖系列幹細胞様細胞への誘導を示す。（A）再構成精巣からのGSCLC誘導のスキーム。（B）（上）GSCLCの誘導中のAAG（+）細胞のコロニーの代表的な画像。BF画像、AAG蛍光、およびそれらのマージを示す。（下）9継代でのGSCLC細胞株（GSCLC1）の画像。バー：100 μm。（C）GSCLC（GSCLC1,2）およびGSC（GSC1）の増殖。2 x 105のGSCLC/GSCを播種し、その増殖を6日または7日ごとに評価した。（D）GSCLC（GSCLC1,4）およびGSC（GSC1,2）における、qPCRにより測定することで示した遺伝子の発現レベル。各遺伝子について、2つのハウスキーピング遺伝子ArbpおよびPpiaの平均Ct値（0と設定）からのDCt（閾値サイクル[Ct]値の差）をプロットした。赤い点線は、GSCの平均CtsのCt値±1を示す。（E）GSCLC（GSCLC1,4）およびGSC（GSC1）におけるFACS分析により測定することで示した表面マーカーの発現レベル（赤色プロット）。青色のプロットは、アイソタイプが適合した対照の抗体による蛍光強度を示す。（F）GSCLC（GSCLC1）およびGSC（GSC1）のコロニーにおける、GFP、ID4、およびPLZFの発現（DAPIと共に示す）ならびにそれらのマージ。バー：50μm。図４も参照のこと。
【図４】図４は、再構成精巣由来の生殖系列幹細胞様細胞(GSCLC)を示し、図３に関連する。（A）GSC1、GSCLC1、およびGSCLC4の核型分析。（B）（左）GSC誘導条件下で直接d4 PGCLCを培養するためのスキーム。 （中）1,2及び4日間GSC誘導条件下でのd4 PGCLC培養の明視野（上）またはGFP（AAG）蛍光（下）の画像。バー：100μm。代表的な24ウェルのアルカリホスファターゼ（AP）染色の画像を右側に示す。バー：1 mm。（右）GSC誘導条件下で培養したd4またはd6 PGCLCから、AP陽性コロニーを誘導する効率。平均値はバーとして示す。各ウェルに1,000個〜3,000個ののPGCLCを播種し、d7でAP陽性コロニーの数を数えた。
【図５】図５は、GSCLC由来の精子形成と繁殖力のある子孫を示す。（AおよびB）GSC（GSC1）、d4 PGCLC（Aのみ）およびGSCLC（GSCLC1, 4）の移植10週間後のW/Wv マウスの精巣（A）または単離した精細管（B）の代表的なBFおよびAAG-蛍光画像。囲んだ領域を拡大し、AAG（+）細胞が精細管の基底領域にのみ定着したことが明らかになった。d4 PGCLC移植で認められるドットの蛍光（左から二番目、下）は、自己蛍光である。H＆Eにより染色した組織学的切片を（B）に示す。（A）のバー；1mm、（B）のバー：100 μm（左）、50 μm（右）。（C）GSCLC（GSCLC1）またはGSC（GSC1）の移植後10週目のW / Wvマウスの精細管切片における、GFP、GFRa1およびPLZF（左）またはGFP、SCPおよびPLZF（右）の発現（DAPIと共に示す）。バー：50μm。（下）GSC（GSC1）またはGSCLC（GSCLC1, 4）を移植することにより定着された細管の間における、GFRa1（+）（左）またはSCP3（+）（右）細胞を有する精細管の代表的な割合。（D）GSCLC1（i-iv）またはGSCLC3 (v, vi)由来の精子（I、ii、v、vi）および精細胞（iii、iv）のBF（i、iii、v）およびAAG-蛍光（ii、iv、vi）の画像。（ii、vi）のバー：10 μm。（iv）のバー：50 μm。（E）GSCLC由来精子のICSIによって産生された、前核段階での接合子（i）、2細胞胚（ii）、子孫（iii、iv）、および胎盤（iii）。（F）GSCLC1由来の精子由来の繁殖力のあるオスの子孫（アグーチ）。（G）GSCLCおよびGSC由来の精子を注入した卵母細胞の発生。図６も参照のこと。
【図６】図６は、GSCLC由来の精子形成と子孫を示し、図５に関連する。（A）条件1及び2下での再構成精巣に由来するGSCLCの15株の生体精巣への移植及び精子形成。（B）GSCLC1,2および3を移植した精巣における精子形成を伴うまたは伴わないコロニーの数。（C、D）GSCLC1およびGSC1由来の子孫の体重（C）および胎盤重量（D）。スチューデントt検定によりp値を得た。（E）GSCLC1および3由来の精子由来の子孫のインプリントの複合重亜硫酸制限分析(Combined bisulfite restriction analysis；COBRA）。以前に報告されたように（Lee et al.、 2009）、H19、Peg10、Igf2r、Meg3IG、およびSnrpnの主要なCpGのメチル化状態を分析した。 U：消化されていない。 D：それぞれの酵素で消化した。消化されていない（黒い三角形）および消化された（白い三角形）断片の長さを示す。GSCLC1および3由来の精子由来の子孫はすべて、明らかに正常なインプリンティングパターンを示した。
【図７】図７は、実施例２の、培養PGCLCから精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣を得るまでの培養スキームを示す。
【図８】図８は、気液界面培養による再構成精巣における各種PGCマーカーの発現の経時的変化を示す。
【図９】図９は、気液界面培養14日目の再構成精巣からのGSCLCの樹立を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［Ｉ］始原生殖細胞様細胞（PGCLC）から精子幹細胞様の細胞を製造する方法
本発明は、単離された多能性幹細胞由来のPGCLCからインビトロで精子幹細胞様の細胞を製造する方法を提供する。当該方法は、
(1) PGCLCを生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る工程、及び
(2) 得られた再構成精巣を気液界面培養して、該再構成精巣中でDDX4陽性かつPLZF陽性細胞を誘導する工程
を含む。
【００１３】
１．多能性幹細胞からの始原生殖細胞様細胞（PGCLC）の製造
本発明で用いられるPGCLCは、単離された多能性幹細胞からインビトロで誘導され、かつPGCと同等の特性を有するものであればいかなるものであってもよいが、例えば、前記特許文献１及び非特許文献１に記載されるPGCLCが挙げられる。該PGCLCは、単離されたPSCから、以下に示す方法により、エピブラスト様細胞（EpiLC）を経由して製造することができる。
【００１４】
PGCLC製造の出発材料として使用する多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と、三つの一次胚葉すべてに分化できる「分化多能性」とを有する、単離された未分化細胞であればいずれでもよい。ここで「単離された」とは、生体内（インビボ）から生体外（インビトロ）の状態におかれたことを意味し、必ずしも純化されている必要はない。例えば、単離された多能性幹細胞として、iPS細胞、ES細胞、胚性生殖（EG）細胞、胚性癌（EC）細胞などが挙げられるが、好ましくはiPS細胞又はES細胞である。
【００１５】
本発明の方法は、いずれかのPSCが樹立されているか、樹立可能である、任意の哺乳動物種において適用することができる。このような哺乳動物の例として、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、好ましくはヒト、マウス、ラット、サル、イヌ等、より好ましくはヒト又はマウスである。
【００１６】
（1）多能性幹細胞の作製
（i）ES細胞
多能性幹細胞は自体公知の方法により取得することができる。例えば、ES細胞の作製方法としては、哺乳動物の胚盤胞ステージにおける内部細胞塊を培養する方法（例えば、Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）を参照）、体細胞核移植によって作製された初期胚を培養する方法（Wilmut et al., Nature， 385, 810（1997）；Cibelli et al.,Science, 280, 1256（1998）；入谷明ら, 蛋白質核酸酵素, 44, 892（1999）；Baguisi et al., Nature Biotechnology， 17, 456（1999）；Wakayama et al., Nature, 394, 369（1998）；Wakayama et al., Nature Genetics, 22, 127（1999）；Wakayama et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984（1999）；RideoutIII et al., Nature Genetics, 24,109（2000））などが挙げられるが、これらに限定されない。また、ES細胞は、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞株であるH1及びH9は、ウィスコンシン大学のWiCell Instituteより入手可能であり、KhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。ES細胞を体細胞核移植により作製する場合、体細胞の種類や体細胞を採取するソースは下記iPS細胞作製の場合に準ずる。
【００１７】
（ii）iPS細胞
iPS細胞は、体細胞に核初期化物質を導入することにより作製することができる。
【００１８】
（a）体細胞ソース
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、マウス又はヒト）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよい。例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば、脂肪由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００１９】
体細胞を採取するソースとなる哺乳動物個体の選択は特に制限されないが、最終産物としてGSCLCがヒト不妊などの疾患の治療に使用される場合には、移植片拒絶及び／又はGvHDを予防するという観点から、患者本人の細胞であるか、又は患者のHLA型と同一若しくは実質的に同一であるHLA型を有する他人から体細胞を採取することが好ましい。ここで「実質的に同一であるHLA型」とは、免疫抑制剤などの使用により、ドナー体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。例えば、主たるHLA（HLA−A、HLA−B及びHLA−DRの主要な3遺伝子座、又はさらにHLA−Cwを含む4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる（以下同じ）。PGC様細胞をヒトに投与（移植）しないが、例えば、患者の薬剤感受性や副作用の有無を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとして使用する場合には、同様に患者本人又は薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。
【００２０】
哺乳動物から分離した体細胞は、細胞の種類に応じて、その培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5〜20％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質及びiPS細胞の樹立効率改善物質と細胞との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、予め無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
【００２１】
（b）核初期化物質
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
（1）Oct3／4、Klf4、c-Myc
（2）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2（ここで、Sox2はSox1、Sox3、Sox15、Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1、Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）、N-Myc又はL-Mycで置換可能である。）
（3）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、Fbx15、Nanog、Eras、ECAT15-2、TclI、β-catenin（活性型変異体S33Y）
（4）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
（5）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6
（6）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16 E7
（7）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV6 E6、HPV16 E7
（8）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、Bmil
（上記因子のさらなる情報については、WO2007／069666を参照（但し、上記（2）の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1若しくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101−106（2008）を参照）。「Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663-676（2006）、Cell, 131, 861-872（2007）等も参照。「Oct3／4、Klf2（又はKlf5）、c-Myc、Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197−203（2009）も参照。「Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、hTERT、SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141−146（2008）も参照）
（9）Oct3／4、Klf4、Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106（2008）を参照）
（10）Oct3／4、Sox2、Nanog、Lin28（Science, 318, 1917-1920（2007）を参照）
（11）Oct3／4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005（2008）を参照）
（12）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28（Cell Research（2008）600-603を参照）
（13）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005（2008）も参照）
（14）Oct3／4、Klf4（Nature 454:646-650（2008）、Cell Stem Cell, 2:525-528（2008）を参照）
（15）Oct3／4、c-Myc（Nature 454:646-650（2008）を参照）
（16）Oct3／4、Sox2（Nature, 451, 141-146（2008）、WO2008／118820を参照）
（17）Oct3／4、Sox2、Nanog（WO2008／118820を参照）
（18）Oct3／4、Sox2、Lin28（WO2008／118820を参照）
（19）Oct3／4、Sox2、c-Myc、Esrrb（ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203（2009）を参照）
（20）Oct3／4、Sox2、Esrrb（Nat. Cell Biol., 11, 197-203（2009）を参照）
（21）Oct3／4、Klf4、L-Myc
（22）Oct3／4、Nanog
（23）Oct3／4
（24）Oct3／4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT（Science, 324：797-801（2009）を参照）
【００２２】
上記（1）〜（24）において、Oct3／4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（又はSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。さらにLin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28bなどを用いることもできる。
【００２３】
また、上記（1）〜（24）には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記（1）〜（24）のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
【００２４】
これらの組み合わせの中で、Oct3／4、Sox2、Klf4、c−Myc、Nanog、Lin28及びSV40LTから選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質である。
【００２５】
とりわけ、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3／4、Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせ（即ち、上記（9））が好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など）は、Oct3／4、Sox2、Klf4及びc−Mycの4因子のほか、Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2及びLin28の5因子か、それにNanogを加えた6因子（即ち、上記（12））、さらにSV40 Large T加えた7因子（即ち、上記（24））が好ましい。
【００２６】
さらに、上記におけるc-MycをL-Mycに変更した組み合わせも、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
【００２７】
上記の各核初期化物質のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO2007／069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg及びL−Mycのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
【００２８】
遺伝子名   マウス          ヒト
Lin28      NM_145833       NM_024674
Lin28b     NM_001031772    NM_001004317
Esrrb      NM_011934       NM_004452
Esrrg      NM_011935       NM_001438
L-Myc      NM_008506       NM_001033081
【００２９】
核初期化物質としてタンパク性因子を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該培養細胞又はその馴化培地から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００３０】
（c）核初期化物質の体細胞への導入方法
核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。ヒトへの臨床応用を念頭におく場合、その出発材料たるiPS細胞も遺伝子操作なしに作製されたものであることが好ましい。
【００３１】
そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）若しくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro−JectTMProtein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect−1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrainPeptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で約5〜15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
【００３２】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT（Frankel, A. et al, Cell55, 1189-93（1988）；Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88（1988））、Penetratin（Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50（1994））、Buforin II（Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245−50（2000））、Transportan（Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67−77（1998））、MAP（model amphipathic peptide）（Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39（1998））、K−FGF（Lin, Y. Z. etal. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258（1995））、Ku70（Sawada, M. et al. Nature CellBiol. 5, 352-7（2003））、Prion（Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90（2002））、pVEC（Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44（2001））、Pep-1（Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6（2001））、Pep-7（Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65（2002））、SynBl（Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679-86（2000））、HN-I（Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6（2000））、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R（Cell Stem Cell, 4:381-384（2009））や9R（Cell Stem Cell, 4:472-476（2009））等のポリアルギニンが挙げられる。
【００３３】
核初期化物質のcDNAとPTD若しくはCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して、ベクターを用いて組換え発現させる。融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
【００３４】
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【００３５】
iPS細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化物質を、タンパク性因子自体としてではなく、それをコードする核酸の形態で用いることも好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよく、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
【００３６】
核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1−11、pXT1、pRc／CMV、pRc／RSV、pcDNAI／Neo）などが用いられ得る。
【００３７】
用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エピソーマルベクターなどが使用され得る。
【００３８】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えば、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV−TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
【００３９】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４０】
核初期化物質である核酸（初期化遺伝子）は、各々別個の発現ベクター上に組み込んでもよいし、1つの発現ベクターに2種類以上、好ましくは2〜3種類の遺伝子を組み込んでもよい。遺伝子導入効率の高いレトロウイルスやレンチウイルスベクターを用いる場合は前者が、プラスミド、アデノウイルス、エピソーマルベクターなどを用いる場合は後者を選択することが好ましい。さらに、2種類以上の遺伝子を組み込んだ発現ベクターと、1遺伝子のみを組み込んだ別の発現ベクターとを併用することもできる。
【００４１】
上記において複数の初期化遺伝子を1つの発現ベクターに組み込む場合、これら複数の遺伝子は、好ましくはポリシストロニック発現を可能にする配列を介して発現ベクターに組み込むことができる。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S. Patent No. 4,937,190）など、好ましくは2A配列を用いることができる。
【００４２】
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat−E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段がWO2007／69666、Cell, 126, 663−676（2006）及び Cell, 131, 861−872（2007）に開示されている。ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917−1920（2007）に開示がある。iPS細胞から誘導されるPGC様細胞を不妊治療や生殖細胞の遺伝子治療などの再生医療として利用する場合、初期化遺伝子の発現（再活性化）は、iPS細胞由来のPGC様細胞から再生された生殖細胞又は生殖組織における発癌リスクを高める可能性があるので、核初期化物質をコードする核酸は細胞の染色体に組み込まれず、一過的に発現することが好ましい。かかる観点からは、染色体への取込みが稀なアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段は、Science, 322, 945−949（2008）に開示されている。また、アデノ随伴ウイルスベクターも染色体への取込み頻度が低く、アデノウイルスベクターと比べて細胞毒性や炎症惹起作用が低いので、別の好ましいベクターとして挙げられる。センダイウイルスベクターは染色体外で安定に存在することができ、必要に応じてsiRNAにより分解除去することができるので、同様に好ましく利用され得る。センダイウイルスベクターについては、J. Biol. Chem., 282, 27383−27391（2007）や特許第3602058号に記載のものを用いることができる。
【００４３】
レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre／loxPシステムを用いて、不要となった時点で核初期化物質をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後で、プラスミドベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー−プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、若しくはSV40などのポリアデニル化配列で置換した3’−自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre-loxPシステム及びSIN LTRを用いる具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27：1042-1049（2009）に開示されている。
【００４４】
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949−953（2008）等に記載されている。
【００４５】
プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回又は4回）繰り返して行うことができる。
【００４６】
尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre−loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature, 458：771−775（2009）、Woltjen et al., Nature, 458：766−770（2009）に開示されている。
【００４７】
別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピソーマルベクターが挙げられる。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797−801（2009）に開示されている。必要に応じて、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターに初期化遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、これを体細胞に導入することもできる。
【００４８】
該エピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA−1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。
【００４９】
また、エピソーマル発現ベクターは、初期化遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピソーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５０】
エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797−801 (2009)に記載される方法を用いることができる。
【００５１】
iPS細胞から初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクターの一部をプローブ又はプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析又はPCR分析を行い、バンドの有無又は検出バンドの長さを調べることにより実施することができる。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法を用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797−801 (2009)に記載される方法を用いることができる。
【００５２】
核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への導入は、該物質を適当な濃度で水性若しくは非水性溶媒に溶解し、ヒト又はマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5〜20％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1 nM〜約100 nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
【００５３】
（d）iPS細胞の樹立効率改善物質
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
【００５４】
iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸（VPA）（Nat. Biotechnol., 26（7）：795-797（2008））、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）（Millipore）、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1（OriGene）等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’−azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26（7）：795-797（2008））、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294（Cell Stem Cell,2：525-528（2008））等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNA及びshRNA（例、G9a siRNA（human）（Santa Cruz Biotechnology）等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist（例えばBayk8644）（Cell Stem Cell, 3, 568-574（2008））、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNA及びshRNA（Cell Stem Cell, 3, 475-479（2008））、UTF1（Cell Stem Cell, 3, 475-479（2008））、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135（2008））、2i／LIF（2iはmitogen-activated protein kinase signalling及びglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6（10）, 2237-2247（2008））等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNA又はshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
【００５５】
尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質及びiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
【００５６】
iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が（a）タンパク性因子である場合、（b）該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは（c）低分子化合物である場合に応じて、それぞれ上記したように実施することができる。
【００５７】
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
【００５８】
（e）培養条件による樹立効率の改善
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5〜10％ CO2／95〜90％大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18％以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15％以下（例、14％以下、13％以下、12％以下、11％以下など）、10％以下（例、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下など）、又は5％以下（例、4％以下、3％以下、2％以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1％以上（例、0.2％以上、0.3％以上、0.4％以上など）、0.5％以上（例、0.6％以上、0.7％以上、0.8％以上、0.9％以上など）、又は1％以上（例、1.1％以上、1.2％以上、1.3％以上、1.4％以上など）である。
【００５９】
細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
【００６０】
低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されない。開始時期は、体細胞への核初期化物質の接触より前であっても、後であってもよく、該接触と同時であってもよい。例えば、体細胞に核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2、3、4、5、6、7、8又は9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
【００６１】
低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上又は10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下又は30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
【００６２】
さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期及び好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
【００６３】
核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（LIF）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）及び／又は幹細胞因子（SCF）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（MEF）の共存下で培養される。MEFとしては、通常STO細胞等がよく使われるが、iPS細胞の誘導には、SNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073−1085（1990））等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、核初期化物質の接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後（例えば1〜10日後）から開始してもよい。
【００６４】
iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3／4など、好ましくはNanog又はOct3／4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β−ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676（2006））、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita et al., Nature, 448, 313-317（2007））等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872（2007）に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3／4、Klf4及びSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
【００６５】
選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（若しくはOct3／4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）及び目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確性を期すために、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
【００６６】
（iii）ナイーヴヒトES及びiPS細胞
胚盤胞期胚から誘導される従来のヒトES細胞は、マウスES細胞と非常に異なる生物学的（形態的、分子的及び機能的）特性を有する。マウス多能性幹細胞は、2つの機能的に区別される状態、即ちLIF依存的なES細胞と、bFGF依存的なエピブラスト幹細胞（EpiSC）とで存在し得る。分子学的解析から、ヒトES細胞の多能性状態は、マウスES細胞のそれではなく、むしろマウスEpiSCのそれに類似していることが示唆されている。最近、LIFの存在下にOct3／4、Sox2、Klf4、c−Myc及びNanogを異所的に誘導するか（Cell Stem Cells, 6：535−546, 2010参照）、LIF並びにGSK3β及びERK1／2経路阻害剤と組み合わせて、Oct3／4、Klf4及びKlf2を異所的に誘導する（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, オンライン公開doi／10.1073／pnas.1004584107参照）ことにより、マウスES細胞様の多能性状態にあるヒトES及びiPS細胞（ナイーヴヒトES及びiPS細胞とも呼ばれる）が樹立されている。これらのナイーヴヒトES及びiPS細胞は、それらの多能性が従来のヒトES及びiPS細胞に比べてより未熟であるため、本発明のための出発材料として好適であり得る。
【００６７】
（2）多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導
分化誘導用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS-A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地（MEM）、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM／F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。無血清培地（SFM）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、従って、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する培地が挙げられ得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0〜20％、好ましくは0〜5％、より好ましくは0〜2％、最も好ましくは0％（すなわち、無血清）であり得る。SFMは任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2−メルカプトエタノール、3’−チオグリセロールあるいはこれらの均等物などを適宜含有する物質が挙げられ得る。かかる血清代替物は、例えば、WO 98／30679に記載の方法により調製できる。また、より簡便にするため、市販のものを利用できる。かかる市販の物質としては、Knockout（商標）Serum Replacement（KSR）、Chemically−defined Lipid concentrated、及びGlutamax（Invitorogen）が挙げられる。
【００６９】
培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。本発明の方法により、原腸陥入前のエピブラスト細胞と同等のEpiLCが製造される限り、添加物は特に限定されないが、例えば、成長因子（例えば、インスリンなど）、ポリアミン類（例えば、プトレシンなど）、ミネラル（例えば、セレン酸ナトリウムなど）、糖類（例えば、グルコースなど）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸など）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（NEAA）、L−グルタミンなど）、還元剤（例えば、2−メルカプトエタノールなど）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、d−ビオチンなど）、ステロイド（例えば、［ベータ］−エストラジオール、プロゲステロンなど）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、緩衝剤（例えば、HEPESなど）、栄養添加物（例えば、B27 supplement、N2 supplement、StemPro−Nutrient Supplementなど）を挙げることができる。各添加物は自体公知の濃度範囲で含まれることが好ましい。
【００７０】
本発明のEpiLCの製造方法において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の存在下又は不在下にて培養されてよい。フィーダー細胞は、本発明の方法によりEpiLCが製造され得る限り、特に限定されない；ESC、iPSCなどの多能性幹細胞の培養に使用するために自体公知のフィーダー細胞を使用することができる；例えば、線維芽細胞（マウス胚性線維芽細胞、マウス線維芽細胞株STOなど）が挙げられ得る。フィーダー細胞は、自体公知の方法、例えば、放射線（ガンマ線など）、抗癌剤（マイトマイシンCなど）での処理などにより不活性化されていることが好ましい。しかし、本発明の好ましい実施態様において、多能性幹細胞は、無フィーダー条件下で培養される。
【００７１】
多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導用培地（培地A）は、基本培地にアクチビンAを必須の添加物として含有する。アクチビンAの濃度は、例えば、約5 ng／ml以上、好ましくは約10 ng／ml以上、より好ましくは約15 ng／ml以上、また、例えば、約40ng／ml以下、好ましくは約30 ng／ml以下、より好ましくは25 ng／ml以下である。
【００７２】
培地Aには、bFGF及び／又はKSRがさらに含有されていることが好ましい。塩基性FGF及びKSRは、有効濃度範囲で存在する場合にEpiLCの誘導効率を顕著に増大させる。bFGFの濃度は、例えば、約5 ng／ml以上、好ましくは約7.5 ng／ml以上、より好ましくは約10 ng／ml以上であり、また、例えば、約30 ng／ml以下、好ましくは約20 ng／ml以下、より好ましくは約15 ng／ml以下である。KSRの濃度は、例えば、約0.1 w／w％以上、好ましくは約0.3 w／w％以上、より好ましくは約0.5 w／w％以上であり、また、例えば、約5 w／w％以下、好ましくは約3 w／w％以下、より好ましくは約2 w／w％以下である。
【００７３】
特に好ましい態様においては、培地Aは基本培地に加えて、アクチビンA、bFGF及びKSRを含有する。これらの成分の適切な濃度は、アクチビンAについては約10〜約30 ng／ml、好ましくは約15〜約25 ng／ml、bFGFについては約7.5〜約20 ng／ml、好ましくは約10〜約15 ng／ml、KSRについては約0.3〜約3 w／w％、好ましくは約0.5〜約2 w／w％の範囲に亘って選択することができる。
【００７４】
培地Aに含まれるアクチビンA及びbFGFは、そのソースに関して限定を受けず、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌなど）の細胞から単離及び精製されてよい。培養に供する多能性幹細胞と同種のアクチビンA及びbFGFを使用することが好ましい。アクチビンA及びbFGFは、化学的に合成されてもよく、無細胞翻訳系を用いて生化学的に合成されてもよく、或いは各タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体から製造されてもよい。アクチビンA及びbFGFの組換え産物は市販されている。
【００７５】
多能性幹細胞をEpiLCに誘導するために使用される培養器は、特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、培養器表面の細胞への接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。細胞接着用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−L−リジン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-オルニチン、ラミニン、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物（lysed cell membrane preparations）が挙げられる（Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365：p1636-1641）。
【００７６】
この培養において、多能性幹細胞を上記培養器上に播き、例えば、約104〜105細胞／cm2、好ましくは約2〜8×104細胞／cm2の細胞密度とし、1〜10％ CO2／99〜90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、3日未満、好ましくは約2日間（例えば、48±12時間、好ましくは48±6時間）培養する。培養の結果、扁平なエピブラスト様構造を有する細胞が一様に現れる。
【００７７】
EpiLCへの分化の事実は、例えば、EpiLC及び／又は多能性幹細胞のマーカー遺伝子の発現レベルをRT−PCRにより分析することにより確認できる。本発明のEpiLCは、E5.5〜E6.0のエピブラスト様（原腸陥入前エピブラスト様）状態にある細胞を意味する。より詳細には、EpiLCは、以下の特性のいずれか又は両方を有する細胞として定義される：
（1）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇、
（2）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下。
従って、EpiLCへの分化の事実は、培養により得られた細胞中、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bから選択される少なくとも1つ、並びに／又はGata4、Gata6、Sox17及びBlimp1から選択される少なくとも1つの発現レベルを測定し、分化誘導前の多能性幹細胞のものと発現レベルを比較することにより確認できる。
【００７８】
より好ましくは、本発明のEpiLCは、以下の特性を有する：
（1）Oct3／4の持続的な遺伝子発現;
（2）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Sox2及びNanogの遺伝子発現の低下;
（3）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Fgf5、Wnt3及びDnmt3bの遺伝子発現の上昇;及び
（4）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、Gata4、Gata6、Sox17及びBlimp1の遺伝子発現の低下。
【００７９】
上述のとおり、好ましい態様において、本発明の培地Aは、アクチビンA、bFGF及びKSRを含有する。従って、本発明はまた、アクチビンA、bFGF及びKSRを含む、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導用試薬キットも提供する。これらの成分は、水又は適当な緩衝液中に溶解した形態で提供されてもよく、凍結乾燥粉末として提供され、用時適当な溶媒に溶解して用いることもできる。また、これらの成分はそれぞれ単独の試薬としてキット化されていてもよいし、互いに悪影響を与えない限り、2種以上を混合して1つの試薬として提供することもできる。
【００８０】
本発明者らは、一過性ではあるが、原腸陥入前エピブラスト細胞と同等の特性を有するEpiLCを製造することに初めて成功した。エピブラストは、生殖細胞系列以外の体細胞系列の前駆細胞でもあるので、このようにして得られたEpiLCは、生殖細胞系列だけでなく、他の種々の細胞系列を誘導するための出発細胞物質して使用できる。それらは、多能性細胞生物学において、重要であるが殆ど理解されていない主題である、ICMのエピブラスト分化の基礎となる遺伝的及びエピジェネティックなメカニズムの調査にも有用であり得る。特定の系統のための中間体として、ESC又はiPSCからのEpiLCの派生（derivation）は、非常に直接的なプロセスであり、系統の分化決定（lineage specification）をin vitroで再構成するための新規ストラテジーを提供する。
【００８１】
（3）EpiLCからPGC様細胞への分化誘導
このようにして得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養することにより、PGC様細胞へと分化誘導することができる（Cell, 137, 571−584（2009））。従って、本発明の第二の側面は、上記（2）の方法により得られたEpiLCを介して、多能性幹細胞からPGC様細胞を製造する方法に関する。すなわち、該方法は、
I）上記（2）に記載のいずれかの方法に従って多能性幹細胞からEpiLCを製造する工程；及び
II）工程I）で得られたEpiLCをBMP4及びLIFの存在下で培養する工程
を含む。
【００８２】
工程II）での分化誘導用基本培地としては、工程I）で使用するために例示した基本培地が同様に好ましく使用される。正常な精子形成に貢献できるPGC様細胞が本発明の方法により製造できる限り、培地は、工程I）で使用するために例示した添加物と同じ添加物を含有してよい。
【００８３】
培地は、血清含有培地又は無血清培地（SFM）であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0〜20％、好ましくは0〜5％、より好ましくは0〜2％、最も好ましくは0％（すなわち無血清）であり得る。SFMは、KSRなど任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくともよい。
【００８４】
EpiLCからPGC様細胞への分化誘導用培地（培地B）は、基本培地の必須添加物として、骨形成タンパク質4（bone morphogenetic protein 4）（BMP4）及び白血病阻止因子（leukemia inhibitory factor）（LIF）を含有する。BMP4の濃度は、例えば、約100 ng／ml以上、好ましくは約200 ng／ml以上、より好ましくは約300 ng／ml以上である。また、BMP4の濃度は、例えば、約1,000 ng／ml以下、好ましくは約800 ng／ml以下、より好ましくは600 ng／ml以下である。LIFの濃度は、例えば、約300 U／ml以上、好ましくは約500 U／ml以上、より好ましくは約800 U／ml以上である。また、LIFの濃度は、例えば、約2,000 U／ml以下、好ましくは約1,500 U／ml以下、より好ましくは1,200 U／ml以下である。
【００８５】
培地Bは、幹細胞因子（SCF）、骨形成タンパク質8b（BMP8b）及び上皮成長因子（EGF）から選択される少なくとも1つの添加物をさらに含有することが好ましい。SCF、BMP8b及びEGFは、有効濃度範囲で存在した場合に、PGC様細胞がBlimp1−及びStella−陽性状態で維持される期間を著しく延長する。SCFの濃度は、例えば、約30 ng／ml以上、好ましくは約50 ng／ml以上、より好ましくは約80 ng／ml以上である。また、SCFの濃度は、例えば、約200 ng／ml以下、好ましくは約150 ng／ml以下、より好ましくは約120 ng／ml以下である。BMP8bの濃度は、例えば、約100 ng／ml以上、好ましくは約200 ng／ml以上、より好ましくは約300 ng／ml以上である。また、BMP8bの濃度は、例えば、約1,000 ng／ml以下、好ましくは約800 ng／ml以下、より好ましくは600 ng／ml以下である。EGFの濃度は、例えば、約10 ng／ml以上、好ましくは約20 ng／ml以上、より好ましくは約30 ng／ml以上である。また、EGFの濃度は、例えば、約100 ng／ml以下、好ましくは約80 ng／ml以下、より好ましくは約60 ng／ml以下である。
【００８６】
特に好ましい実施態様において、培地Bは、基本培地に加えてBMP、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを含有する。これら成分の濃度は、BMP4については約200〜800 ng／ml、好ましくは約300〜600 ng／ml、LIFについては約500〜1500 U／ml、好ましくは約800〜1,200 U／ml、SCFについては約50〜150 ng／ml、好ましくは約80〜120 ng／ml、BMP8bについては約200〜800 ng／ml、好ましくは約300〜600 ng／ml、EGFについては約20〜80 ng／ml、好ましくは約30〜60 ng／mlの範囲に亘って適宜選択され得る。
【００８７】
培地Bに含有されるBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFは、そのソースに関して特に限定されず、任意の哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット、イヌなど）の細胞から単離及び精製されてよい。培養に供するEpiLCと同種のBMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFを使用することが好ましい。BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFは、化学的に合成されてもよく、無細胞翻訳系を用いて生化学的に合成されてもよく、或いは各タンパク質をコードする核酸を有する形質転換体から製造されてもよい。BMP4、LIF、SCF、BMP8b及びEGFの組換え産物は市販されている。
【００８８】
この培養において、自体公知の細胞非接着性又は低接着性培養器にEpiLCを播種し、例えば、約3〜10×104細胞／mL、好ましくは約4〜8×104細胞／mLの細胞密度とし、1〜10％CO2／99〜90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、約4〜10日間、好ましくは約4〜8日間、より好ましくは約4〜6日間、さらに好ましくは約4日間培養する。
【００８９】
PGC様細胞への分化の事実は、例えば、RT−PCRなどによりBlimp1の発現を分析することによって確認できる。さらに必要に応じて、他の遺伝子や細胞表面抗原の発現を調べることもできる。他の遺伝子の例にはStellaが挙げられる。Blimp1-及び／又はStella-プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質遺伝子を有する多能性幹細胞を出発物質として使用する場合には、PGC様細胞への分化の事実はFACS分析により確認できる。ヒト又は他の非マウス哺乳動物に由来するESC又はiPSCなど、多能性幹細胞が適切なトランスジェニックレポーターを有さない場合には、PGC様細胞の分化の事実は、PGC様細胞に特異的に発現する1種以上の細胞表面抗原を用いて、FACS分析などにより確認することが好ましい。細胞表面抗原として、好ましくはSSEA-1及びインテグリン-β3が例示される。
【００９０】
前記工程I）及びII）により製造される、多能性幹細胞に由来するPGC様細胞を含む細胞集団は、PGC様細胞の精製された集団であってよく、PGC様細胞以外に1種以上の細胞が共存してもよい。ここで、「PGC様細胞」は、分化誘導前のEpiLCに比してBlimp1及び／又はStellaの発現の上昇を示し、正常な精子形成に貢献でき、免疫不全マウスに移植された場合にテラトーマを形成しない細胞として定義される。上述のとおり、Blimp1-及び／又はStella-プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質遺伝子を有する多能性幹細胞を出発物質として使用してPGC様細胞を誘導する場合、セルソーターを用いて、前記工程II）で得られた細胞集団をソーティングすることにより、Blimp1-及び／又はStella-陽性PGC様細胞を容易に単離し精製できる。PGC様細胞は、マーカーとして、Blimp1及びStellaとともに発現が増加する遺伝子（例、Nanog）の制御下にあるレポーターを用いてFACSにより単離し精製することもできる。
【００９１】
２．PGC様細胞の維持増幅
上記のようにして得られるPGC様細胞は、精子幹細胞様の細胞への分化に先立って、増幅させることができる。PGCの増幅を支持する薬剤として、フォルスコリンやレチノイン酸（RA）シグナリングアゴニストが知られている。フォルスコリンは、アデニル酸シクラーゼを活性化し、細胞内cAMPレベルを上昇させる。本発明者らは以前、ホスホジエステラーゼ4（PDE4）阻害薬がPGC様細胞の増幅を支持することを見出した。PDE4阻害薬はフォルスコリンとは異なる機序（cAMPの加水分解を阻害すること）で細胞内cAMPレベルを上昇させる。そこで、本発明者らは、PDE4阻害薬とフォルスコリンとを併用することにより、相乗的に（約50倍まで）PGC様細胞の増幅を促進させることに成功した（EMBO J., 36(13): 1888-1907 (2017)）。
【００９２】
従って、PGC様細胞の維持増幅は、例えば、EpiLCからの分化誘導開始日をd0として、d4〜d10、好ましくはd4〜d8、より好ましくはd4〜d6、さらに好ましくは約d4のPGC様細胞を、PDE4阻害薬の存在下、好ましくは、さらにフォルスコリンの存在下で培養することにより実施することができる。基本培地としては、PSCからEpiLCへの分化誘導に関して例示した培地を、同様に使用することができる。培地には、血清又は血清代替物を添加することが好ましい。ここで用いられる血清又は血清代替物の種類及び添加濃度は、PSCからEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。また、培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。そのような添加物としては、PGC様細胞の維持増幅を支持し得る限り、特に制限されず、PSCからEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。例えば、本工程に使用される培地として、10% Knockout Serum Replacement（KSR）、2.5% 胎仔ウシ血清（FCS）、0.1 mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、100 U/ml ペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシン、2mM L-グルタミンを含むGMEM培地等が挙げられるが、これに限定されない。
【００９３】
上記培地に添加されるPDE4阻害薬としては、PDE4の酵素活性、即ち、cAMPの加水分解活性を阻害し得る物質であれば特に制限はないが、好ましくはPDE4の選択的阻害薬（ホスホジエステラーゼ（PDE）以外の酵素だけでなく、PDE4以外のPDEsも阻害しない）である。例えば、イブジラスト、S-(+)-ロリプラム、ロリプラム、GSK256066、シロミラスト等が挙げられるがこれに限定されない。
【００９４】
PDE4阻害薬の濃度は、例えば、約0.1 μM以上、好ましくは約0.5 μM以上、より好ましくは約1 μM以上である。また、PDE4阻害薬の濃度は、例えば、約100 μM以下、好ましくは約50 μM以下、より好ましくは30 μM以下である。好ましい実施態様において、PDE4阻害薬の濃度は、約0.5〜50 μM、好ましくは約1〜30 μM範囲内で適宜選択され得る。
【００９５】
上記培地に添加されるフォルスコリンの濃度は、例えば、約0.1 μM以上、好ましくは約0.5 μM以上、より好ましくは約1 μM以上である、また、フォルスコリンの濃度は、例えば、約100 μM以下、好ましくは約50 μM以下、より好ましくは30 μM以下である。好ましい実施態様において、フォルスコリンの濃度は、約0.5〜50 μM、好ましくは約1〜30 μM範囲内で適宜選択され得る。
【００９６】
PGC様細胞の維持増幅用培地には、SCFがさらに含有されていることが好ましい。SCFの濃度は、例えば、約30 ng／ml以上、好ましくは約50 ng／ml以上、より好ましくは約80 ng／ml以上である。また、SCFの濃度は、例えば、約200 ng／ml以下、好ましくは約150 ng／ml以下、より好ましくは約120 ng／ml以下である。好ましい実施態様において、SCFの濃度は、約50〜150 ng／ml、好ましくは約80〜120 ng／mlの範囲内で適宜選択され得る。
【００９７】
特に好ましい実施態様においては、PGC様細胞の維持増幅用培地は、10 μM PDE4阻害薬、10 μM フォルスコリン及び100 ng/ml SCFを含有する。尚、他のPGC増殖刺激因子と併用するとPGC様細胞のEGCへの脱分化を促進する可能性があるため、PGC様細胞の維持増幅用培地にはLIFを添加しないことが好ましい場合がある。
【００９８】
PGC様細胞の維持増幅方法において、PGC様細胞は、フィーダー細胞の存在下又は非在下にて培養されてよい。フィーダー細胞の種類は特に限定されないが、自体公知のフィーダー細胞を使用することができる。例えば、線維芽細胞（マウス胚性線維芽細胞、マウス線維芽細胞株STOなど）が挙げられ得る。フィーダー細胞は、自体公知の方法、例えば、放射線（ガンマ線など）、抗癌剤（マイトマイシンCなど）での処理などにより不活性化されていることが好ましい。フィーダー細胞がPDE4阻害薬及び／又はフォルスコリンに対して脆弱である場合には、予めこれらの添加物の存在下で数世代フィーダー細胞を継代培養して、該添加物に馴化させておくことが望ましい。
【００９９】
PGC様細胞の維持増幅のために使用される培養器は特に限定されず、例えばPSCからEpiLCへの分化誘導において例示されたものが、同様に使用可能である。
【０１００】
この培養において、PGC様細胞を（フィーダー細胞が予め播種された）培養器上に播き、例えば、約104〜105細胞／cm2、好ましくは約2〜8×104細胞／cm2の細胞密度とし、1〜10％ CO2／99〜90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、3〜9日間、好ましくは4〜8日間、より好ましくは5〜7日間培養する。培養の結果、扁平なコロニーが形成され、Blimp1及びStellaを強発現し続け、糸状及び葉状仮足を伴う運動性細胞の特徴を示し、移動期のPGCの特性を維持する。
【０１０１】
３．始原生殖細胞様細胞（PGCLC）からの精子幹細胞様の細胞の製造
(1) 再構成精巣の形成（工程(1)）
本工程では、例えば、上記の方法により得られたPGCLCを、生殖巣体細胞と浮遊培養にて共培養し、再構成精巣を得る。用いるPGCLCが不均一な細胞集団である場合、例えば、FACSを用いて、SSEA-1陽性及びインテグリン-β3陽性の細胞分画を単離して用いることが好ましい。PGCLCとしては、EpiLCからの分化誘導開始日をd0として、d4〜d10、好ましくはd4〜d8、より好ましくはd4〜d6、さらに好ましくは約d4の細胞が用いられ得る。また、PGCLCとして、上記２．で詳述した方法により、3〜9日間、好ましくは4〜8日間、より好ましくは5〜7日間維持増幅したPGCLCを用いてもよい。
【０１０２】
ここで「生殖巣」とは、生殖細胞とそれらを支持する体細胞からなる構造体をいう。母胎で、胎児（仔）の始原生殖細胞（PGC）におけるオス、メスの性分化が始まる頃（マウスでは受精後12.5日齢（E12.5））までに形成される。PGCはオス、メス各々に特徴的な生殖巣の体細胞に包まれながら、配偶子（精子や卵子）へと分化する。本発明では、PGCが前精原細胞となる時点の細胞環境を模倣すべく、この時期の生殖巣（例えば、マウスの場合、E12.0〜E13.0、好ましくは約E12.5）が用いられる。生殖巣は、共培養するPGCLCと同種の哺乳動物から自体公知の方法により採取することができる。生殖巣から体細胞を単離する手法としては、例えば、生殖巣をトリプシン処理等により単一細胞に解離し、培地又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）等の等張緩衝液に再懸濁した後、FACSやMACSを用いて、PGCの細胞表面マーカー陽性細胞、例えば、SSEA-1陽性細胞を除去する方法等が挙げられるが、これに限定されない。
【０１０３】
次いで、PGCLCと生殖巣体細胞とを浮遊培養にて共培養する。ここで「浮遊培養」とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味し、細胞や細胞塊が底面に触れていても、培養液を軽く揺らすと細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態で培養することも、浮遊培養に包含される。浮遊培養の際は、培養容器として、例えば、底表面が未処理のプラスティックディッシュや、細胞の基質への接着を阻止するための接着阻止用コーティング剤（ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）等）でコートしたものを用いることが好ましい。例えば、1個の再構成精巣あたり、103〜105個、好ましくは約104個のPGCLCと、2×103〜1×106個、好ましくは2〜10×104個、さらに好ましくは約4×104個の生殖巣体細胞とを、例えばPGCLC:生殖巣体細胞=1:2〜1:15、1:2〜1:10、好ましくは1:3〜1:5、より好ましくは約1:4の割合で培地に添加し、静置培養することができる。本工程に使用される培地は、基本培地として、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導に関して例示した培地を、同様に使用することができる。培地には、血清又は血清代替物を添加することが好ましい。ここで用いられる血清又は血清代替物の種類及び添加濃度は、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。また、培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。そのような添加物としては、PGCLCと生殖巣体細胞とが自己組織化して精巣を模倣した凝集塊（再構成精巣）を形成し得る限り、特に制限されず、多能性幹細胞からEpiLCへの分化誘導に関して例示されたものが、同様に使用可能である。例えば、この再構成精巣形成工程（本工程(1)）に使用される培地として、10% Knockout Serum Replacement（KSR）を含むαMEM培地等が挙げられるが、これに限定されない。本工程に先立ってPGCLCの維持増幅培養を行った場合には、当該維持増幅培養に使用した培地と同一組成の培地を用いることもできる。
【０１０４】
本工程(1)の浮遊培養は、例えば、1〜10％CO2／99〜90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、約1〜5日間、好ましくは約1〜3日間、より好ましくは約2〜3日間、さらに好ましくは約2日間実施される。
【０１０５】
(2) 精子幹細胞様の細胞の誘導（工程(2)）
本工程では、工程(1)で得られた再構成精巣を気液界面培養することにより、該再構成精巣中に精子幹細胞様の細胞を誘導する。「気液界面培養」とは、セルカルチャーインサートの多孔膜上に細胞を播種し、上側を気相とし、下側から膜を介して培地を供給する培養法をいう。工程(1)で得られた再構成精巣を、培養容器（例、24ウェルプレート）に挿入したセルカルチャーインサートの多孔膜上に移し、膜の下側に培地を添加して気液界面培養を実施する。用いる培地は、工程(1)と同じものであってよい。培養は、1〜10％CO2／99〜90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約34〜37℃で、約1〜8週間、好ましくは約2〜8週間、より好ましくは約2〜4週間、さらに好ましくは約3週間実施される。精子幹細胞様の細胞の誘導に先立ってPGCLCの維持増幅を行った場合には、本工程の培養期間を、例えば約1〜2週間、好ましくは約10〜14日間とすることもできる。好ましい一実施態様においては、培養温度は本工程を通じて約34℃である。別の実施態様として、最初の2週間約37℃で培養した後、34℃で培養する方法も用いることができる。
【０１０６】
本工程の間、再構成精巣では、4日目頃から精細管様の構造が出現し始め、7日目頃にはそれらが集合してネットワークを形成するようになる。精細管様構造の外側のPGCLC由来細胞は消失し、大多数のPGCLC由来細胞は精細管様ネットワークの内側に局在するようになる。その後、再構成精巣は、精細管様ネットワークをさらに発達させながら安定に維持され、該ネットワークの内側のPGCLC由来細胞の数はさらに増加する。14日目には、ほとんどのPGCLC由来細胞は精細管の内腔区画内に存在し、21日目には、それらの多くは基底区画に見られるようになる。
【０１０７】
14日目には、PGCLC由来細胞の多くは、生殖腺PGCにおいて発現し始める生殖細胞マーカーであるDDX4（MVH）陽性となるが、前精原細胞において周産期に発現が始まる精子幹細胞マーカーであるPLZF（ZBTB16）は陰性である。21日目になると、PGCLC由来細胞の大部分がDDX4陽性となり、その一部はDDX4／PLZF二重陽性となる。さらに長期間培養を続けると、PGCLC由来細胞の一部は、減数分裂開始の重要なマーカーであるSCP3陽性となるが、本工程の条件下では、減数分裂を完了するまでには至らない。
【０１０８】
４．精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣からの生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）の製造
本発明はまた、上記のようにして得られる精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣から、精子幹細胞の長期培養細胞株である生殖系列幹細胞（GSC）と同等の特性を有する細胞、即ち、生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）の製造方法を提供する。当該方法は、上記工程(1)及び(2)により得られる精子幹細胞様の細胞を含む再構成精巣から、例えば、酵素処理（例、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ、トリプシン）及びピペッティング操作により精子幹細胞様の細胞を単一細胞に解離させ、精子幹細胞からGSCを誘導し得る条件下で培養することを含む。精子幹細胞様の細胞は、例えば、CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT、GFRα1等の細胞表面マーカーや、PGCLCがレポーター細胞の場合は、該レポーターを指標として、FACS等により生殖巣体細胞由来の細胞と分離することもできるが、体細胞と精子幹細胞様の細胞との培養容器への接着性の差を利用して数度の継代を行うことにより、簡便に富化することができる。例えば、ゼラチン、コラーゲン、マトリゲル、ラミニン等でコーティングした培養容器を用いて、解離した再構成精巣由来の細胞を播種し、例えば6〜24時間毎、好ましくは約12時間毎に、新しい培養容器に浮遊細胞を継代することにより、接着性の高い体細胞は培養容器表面に残存するため徐々に除去され、精子幹細胞様の細胞が富化される。
【０１０９】
本工程で使用される培地は、精子幹細胞からのGSCの誘導を支持し得るものであれば特に制限はないが、例えば、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）及び白血病抑制因子（LIF）、好ましくはさらに上皮細胞成長因子（EGF）及び／又は塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）を含有する培地が挙げられる。当該培地のより詳細な組成については、WO2004/092357やKanatsu-Shinohara, M. et al., Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003) の記載を参照することができる。より具体的には、好ましい一実施態様として、後述の実施例に記載されるGSC/GSCLC培地を挙げることができる。
【０１１０】
上記のようにして富化された精子幹細胞様の細胞は、好ましくは、本工程の培養は、フィーダー細胞の存在下で培養される。フィーダー細胞としては、例えば、例えばマウス胎児線維芽細胞（MEF）等が好適に用いられる。富化された精子幹細胞様の細胞を、予めフィーダー細胞を播種した培養容器に、PGCLC由来細胞として、約103細胞以上の細胞密度で播種すれば、最初の2週間の間にGSC様のコロニーが増幅する。コロニーの直径が約500μm以上になれば、新しい培養容器に継代することができる。
【０１１１】
富化された精子幹細胞様の細胞の培養は、例えば、1〜10％CO2／99〜90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、約2週間以上、好ましくは約2か月以上実施される。
【０１１２】
以上のようにして得られるGSC様の細胞（GSCLC）は、以下の性質を有することを特徴とする。
(a) 単離されたPSC由来である
(b) (i) Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4及びId4からなる群より選択される遺伝子、
(ii) CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1からなる群より選択される表面マーカー、並びに
(iii) PLZF及びID4からなる群より選択される転写因子
の発現レベルが、GSCと同等である
(c) GSCと同等の増殖速度で維持・増幅可能である
(d) 該GSCLCを成体精巣内に移植した場合、
(i) 移植細胞が定着した精細管に占めるGFRα1陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれと同等である、及び
(ii) 移植細胞が定着した精細管に占めるSCP3陽性細胞を有する精細管の割合が、GSCを移植した場合のそれよりも低い
(e) 該GSCLCを成体精巣内に移植して得られる精細胞を顕微授精した場合、正常な子孫を生じる
このように、本発明のGSCLCは、鍵遺伝子、細胞表面マーカー及び転写因子の発現レベル、細胞の増殖速度、成体精巣内に移植した場合の精原細胞／精子幹細胞マーカー（GFRα1）陽性の精細管の出現率、正常な子孫を生じる能力において、従来公知のGSCと同等であるが、単離されたPSC由来である点、及び成体精巣内に移植した場合の減数母細胞（SCP3陽性）の出現率がGSCと比較して低い点において、生体内から採取した精子幹細胞から誘導されるGSCと相違する。
【０１１３】
５．本発明のGSCLCの使用
このようにして樹立された、多能性幹細胞に由来するGSCLCは種々の目的で使用することができる。例えば、レシピエント動物の精巣に移植されたGSCLCは、精巣、特に成体精巣での精子形成及び健常な子孫の創出に確実に貢献できるので、不妊、又は生殖組織の遺伝性疾患の治療に使用できる。
【０１１４】
GSCLCの精巣への移植は、WO 2004/092357及びBiol. Reprod., 69：612-616（2003）に記載の方法において、GSCの代わりにGSCLCを使用することにより実施できる。移植の結果、GSCLCから分化した精細胞（精子又は円形精細胞）は、自体公知のICSI又はROSI法により卵細胞と受精させることができ、得られた胚（例、2細胞期胚）を偽妊娠させた仮親の子宮又は卵管に移植することにより子孫を得ることができる。
【０１１５】
本発明のGSCLC（GSCLCを含む細胞集団を含む；以下同じ）は、常套手段に従って医薬上許容される担体と混合するなどして、非経口製剤、好ましくは、注射剤、懸濁剤又は点滴剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合しても良い。
【０１１６】
本発明の剤を水性懸濁剤として調製する場合、上記水性液の1つにGSCLCを約1.0×106〜約1.0×107細胞／mLの細胞密度となるように懸濁させる。
【０１１７】
本発明の剤は、幹細胞の低温保存に通常使用される条件下で低温保存し、使用直前に融解することができる。
【０１１８】
このようにして得られる製剤は、安定で低毒性であるので、ヒトなどの哺乳動物に対して安全に投与することができる。投与方法は特に限定されないが、製剤は、精細管へと、注射又は点滴により投与されることが好ましい。男性不妊患者については、例えば、1回につきGSCLC量として約1.0×105〜約1×107細胞量の剤を、約1〜2週間隔で、1又は2〜10回投与するのが通常、好都合である。
【０１１９】
本発明は、内部細胞塊から精子幹細胞までの雄性生殖細胞分化決定経路のin vitroでの再構成を初めて実証する。発生過程を反映するこのようなin vitro系は、生殖細胞の詳細な発生メカニズムの解明を促進するだけでなく、不妊及び遺伝性疾患発症のメカニズムの解明も促進するであろう。
【０１２０】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【０１２１】
［実施例１］
（方法の概要）
ESCの培養とPGCLCの誘導
ポリ-L-オルニチンおよびラミニン（20 ng / mL）でコーティングしたウェル（Hayashi et al., 2011; Hayashi and Saitou, 2013; Ying et al., 2008）上で、2i （PD0325901：0.4μM [Stemgent]; CHIR99021：3 μM（Stemgent））及びLIF（1,000 U/ml）を含むN2B27培地を用いて、AAGトランスジーンを有する胚性幹細胞（ESC）（C57BL/6 x 129/SvJcl）（Ohta et al., 2000）を培養した。ヒト血漿フィブロネクチン（16.7g / mL）でコーティングした12ウェルプレートのウェル上で、エピブラスト様細胞（EpiLC）培地（アクチビンA [20ng / mL]、bFGF [12 ng/mL]及びknockout serum replacement [KSR] [1％] [Thermo Fisher Scientific]を含むN2B27）を用いて、EpiLCを1.0 x 105 ESCから誘導した。EpiLC培地を毎日交換した。PGCLCは、PGCLC培地（15％KSR、0.1mM NEAA、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2-メルカプトエタノール、100U / mLペニシリン、0.1mg / mLストレプトマイシン、及び2mM L-グルタミン[100ng / mL]を含むGMEM[Invitrogen]、、BMP4 [500ng / mL] [R＆D Systems]、LIF [1,000U / mL] [Invitrogen]、SCF[100 ng/mL] [R&D Systems]、及びEGF [50 ng/mL] [R&D Systems]を用いた(4〜6日間)）を用いて、低細胞結合U底96ウェルのリピジュア-コートプレート中、浮遊条件下で2.0 x 103 EpiLCから誘導した。【０１２２】
再構成精巣の作製と培養
10% KSRを含むα-最小必須培地（α-MEM）(Invitrogen)を用いて、低細胞結合U底96ウェルのリピジュア-コートプレート中、浮遊条件下で、FACSにより収集したd4 PGCLC (10,000 細胞/再構成精巣)と、MACS（磁気活性化細胞分取を参照）により収集したE12.5生殖腺（ICR）の体細胞（40,000細胞/再構成精巣）とを凝集させた（37℃、5%CO2）。2日間の浮遊培養の後、ガラス毛細管を用いて0.4 μm 透明PET膜（Corning）を有する24ウェルプレート用のファルコン透過性支持体のウェルに凝集物を移した。気液界面培養（Sato et al., 2011）のため、各ウェルに350μLのα-MEM-10％KSRを補充した（Satoら、2011）。培地を毎週交換した。【０１２３】
再構成精巣からのGSCLCの誘導及び新生仔精巣からのGSCの誘導
再構成精巣を、10分間、解離緩衝液（ディスパーゼ[1mg / mL] [Invitrogen]及びヒアルロニダーゼ [1 mg / mL] [Sigma、H3506]を含有するDMEM）に浸し、次いで周期的に（5分ごと）ピペッティングしながら、0.05％トリプシン-0.53 mM EDTAで15分間インキュベートし、これを10％FBSを含むDMEM中でクエンチし、続いて正確なピペッティングにより単一細胞に解離した。細胞懸濁液を1,200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。増殖因子（下記参照）を含むGSC/GSCLC培養培地に細胞ペレットを懸濁し、細胞を0.1％（w / v）ゼラチンでコーティングした培養プレート上に播種した（細胞/再構成精巣を24ウェルプレートに移した）。体細胞はより容易に培養プレートに結合するので、体細胞を12時間毎に繰り返し継代することによりできるだけ除去した。2回または3回の継代後、残りのAAG（+）細胞を、増殖因子を含むGSC / GSCLC培地（下記参照）中のMEFを有するプレート上に移した。約1 × 103個以上のAAG（+）細胞/ウェルが播種された場合、最初の2週間にGSCLCコロニーが拡大した。直径が約500μmを超えるGSCLCコロニーが発生すると、それらを新しいウェルに継代し、約2ヶ月後にGSCLC細胞株を樹立した。対照GSC細胞株は、本質的に同じ手順を用いることにより、P7での新生仔（AAGを有する129/Sv x C57BL/6）の精巣から誘導した。GSC / GSCLC培養のための培地は、Kanatsu-Shinohara et al. (2003)に記載されたものを一部改変した： StemPro-34 SFM（Invitrogen）に、Stem Pro サプリメント、1％FBS、1 x Gluta-MAX-1（Invitrogen）、1 x 最小必須培地（MEM）ビタミン溶液（Sigma）、5 mg/mL AlbuMAX-II（Invitrogen）、5 × 10-5 M 2-メルカプトエタノール、1 x MEM非必須アミノ酸溶液（Invitrogen）、30 μg / mLピルビン酸、1 x ITS-G（Invitrogen）、100U/mLのペニシリン、0.1 mg/mL ストレプトマイシン、および増殖因子（組換えラットGDNF [10ng / mL] [R＆D Systems]、ヒトbFGF [10 ng/mL] [Invitrogen]、LIF/ESGRO [103U / mL] [Invitrogen]、及びマウスEGF [20ng] [Invitrogen]）を補充した。【０１２４】
ACCESSION NUMBER
本明細書で報告したGSC1、2及びGSCLC1-4のRNA-seqデータ、GSC1、2、GSCLC1及び4のSC3-seqデータ、GSC1及びGSCLC1-3のWGBSデータ、並びにGSC2及びGSCLC4のWGBSデータのためのaccession numberは、それぞれNCBI GEO: GSE76245、GSE87341、 DDBJ: DRA004241 及びDRA005141である。【０１２５】
動物
すべての動物実験は、京都大学の倫理ガイドラインに基づいて行った。Acro/Act-EGFP（AAG）トランスジェニックマウス（M. Okabeの贈与）(Nakanishi et al., 1999; Okabe et al., 1997)は、C57BL/6のバックグラウンドを大きく維持していた。SLC（Hamamatsu、Japan）から、W/Wv（WB×C57BL/6）、BDF1（C57BL/6×DBA/2）、ICRおよび129/SvJclマウスを購入した。腟栓を確認した日の正午を胎生期（E）0.5とした。【０１２６】
蛍光標識細胞分取（FACS）
d4 PGCLCを含有する凝集物をPBSで洗浄し、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAで7分間処理することにより単細胞に解離させ、10％FBSを含むDMEMでクエンチし、続いてピペッティングした。細胞懸濁液をナイロンセルストレーナ（直径40μm）に通して細胞塊を除去した。フロースルー細胞を1200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）（Thermo Fisher Scientific、San Diego、CA）を含むPBSで懸濁し、それぞれPE及びAlexa Fluor 647をコンジュゲートした抗インテグリンβ3抗体（BioLegend）および抗SSEA1抗体（eBioscience）と氷上で15分間インキュベートした。PBS-0.1％BSAで洗浄した後、細胞を同じ緩衝液（1×106細胞/ ml）で懸濁し、フローサイトメーター（AriaIII：BD Biosciences）で選別した。
GSCLC/GSCの表面マーカーの発現解析のために、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAで4分間処理し、10％FBSを含むDMEMでクエンチし、その後ピペッティングすることにより、GSCLC/ GSCを単一細胞に解離させた。細胞懸濁液を1,200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを0.1％BSAを含むPBSに懸濁させた（約1×106細胞を200 μlのPBS-0.1％BSAに懸濁した）。半量の懸濁液を一次抗体(Antibodies)で氷上で15分間染色した。残りの半分は、染色されていない対照を確立するために用いた。PBS-0.1％BSAで洗浄した後、各懸濁液を二次抗体(Antibodies)で氷上で15分間染色した。次いで、細胞をPBS-0.1％BSAで懸濁し、フローサイトメーター（AriaIII; BD Biosciences）で分析した。すべての分析において、AAG（+）細胞を使用前に選別した。【０１２７】
磁気活性化細胞分取(MACS)
E12.5の雄性生殖腺を10％FBSを含むDMEM中で単離し、PBSで洗浄し、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAにより単一細胞に解離した。細胞懸濁液をナイロンセルストレーナ（直径70μm）（Falcon）に通して細胞塊を除去した。フロースルー細胞を1200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを0.5％BSAおよび2mM EDTAを含有するPBSに懸濁し、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec、Bergisch、Gladbach、Germany）(Antibodies)をコンジュゲートした抗SSEA1抗体と氷上で15分間インキュベートした。細胞懸濁液をPBS-0.5％BSA-0.2mM EDTAで洗浄し、次いでMSカラム（Miltenyi Biotec）にアプライした。大部分のSSEA-1陽性PGCが除去されたフロースルー細胞を、PBS-0.5％BSA-0.2mM EDTAで洗浄し、αMEM-10％KSRで懸濁し、再構成精巣の作製のためにPGCLCと凝集させた。【０１２８】
PGCLC及びGSCLCの精巣への移植
GSCおよびGSCLCを、0.05％トリプシン-0.53mM EDTAと4分間インキュベートすることにより単一細胞に解離させ、これを10％FBSを含むDMEMでクエンチした。細胞懸濁液をナイロンセルストレーナ（直径40μm）（Falcon）に通して細胞塊を除去し、フロースルー細胞を1,200rpmで5分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを2.5×107細胞/ mlの濃度で、増殖因子を含まないGSC / GSCLC培地に懸濁した。PGCLCの移植のために、FACSにより収集したd4 PGCLCの10,000細胞を、5μlのGSC/GSCLC培地に懸濁させた。以前に記載されているように(Brinster and Avarbock, 1994; Brinster and Zimmermann, 1994)、約5μlの各ドナー細胞懸濁液を、成体WBB6F1 W/Wv（8週齢）レシピエントの精巣網内にシリンジを備えたピペットでを注入した。移植後8-10週間で移植された精巣を分析した。【０１２９】
細胞質内の精子注入（ICSI）および円形精細胞注入（ROSI）
5IUのウマ絨毛性ゴナドトロピンを注入し、その後48時間後に5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）を2回注入することにより、BDF1メスで過剰排卵を誘導した。hCG注入の12時間後、卵管から卵丘 - 卵母細胞複合体を収集し、卵母細胞を0.1％ヒアルロニダーゼで処理することにより卵丘細胞から遊離させた。ICSIでは、ピエゾ駆動式マイクロマニピュレーター（Piezo-actuated micromanipulator）（Kimura and Yanagimachi、1995）を用いて精子をMII卵母細胞の細胞質に注入した。ROSIのために、丸い精細胞を受け取った卵母細胞を、5mMのSrCl2および2mMのEGTAを含むKSOM培地中で1時間培養した（Kishigami and Wakayama、2007）。ICSIまたはROSI後の2細胞期胚を、標準的な手順で0.5dpc偽妊娠ICRメスの卵管に移した。【０１３０】
組織学および免疫蛍光（IF）分析
組織学的分析のために、移植細胞を有する精巣をBouin固定液で48時間固定し、70％エタノールで3回洗浄し、連続濃度のエタノールで脱水し、パラフィンに包埋した。組織を7μmの厚さに切断した。キシレン（3回）および段階的な連続のエタノールで脱パラフィンした後、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
IF分析のために、再構成精巣を4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて氷上で2時間固定し、PBSで3回洗浄し、スクロース溶液の連続濃度（15％、30％）で置換し、OCT化合物(Sakura, Tokyo, Japan)中に埋め込み、凍結した後、-20℃で10μmの厚さに切断した。空気乾燥後、切片をPBSで3回洗浄し、ブロッキング緩衝液（5％BSAおよび0.1％Triton X-100を含有するPBS）中で30分間インキュベートし、次いで一次抗体(Antibodies)を含む染色緩衝液（1％BSAおよび0.1％Triton X-100を含有するPBS）で4℃、2時間反応させた。PBSで3回洗浄した後、サンプルを二次抗体(Antibodies)および1μg/ mlのDAPIを含有する染色緩衝液中で1時間インキュベートした。切片をPBSで3回洗浄し、Vectashieldマウンティング培地（Vector Laboratories）にマウントした。全ての試料を共焦点顕微鏡（Olympus FV1000）で分析した。
GSC/GSCLCのIF分析のために、カバースリップ上で培養したGSC/GSCLCを室温で10分間3％PFAで固定し、次いでPBSで3回洗浄し、続いてメタノールで-30℃で2分間浸透させた。次いで、サンプルをPBSで2回洗浄し、室温で30分間10％BSAを含むPBSでブロックし、一次抗体（抗体）の組合せを含有する溶液（0.1％BSA含有PBS）と共に室温で2時間インキュベートした。次いで、サンプルをPBSで3回洗浄し、1次抗体(Antibodies)と1μg/ mlのDAPIとの組み合わせを含む溶液（0.1％BSAを含むPBS）と共に1時間インキュベートした。切片をPBSで3回洗浄し、Vectashieldマウンティング培地（Vector Laboratories）にマウントした。全ての試料を共焦点顕微鏡（Zeiss LSM780）で分析した。本実験で用いた抗体を表１に示す。【０１３１】
【表１】
2018225802.tif 000002
【０１３２】
アルカリホスファターゼ（AP）染色
GSC培養条件下で直接培養したd4 PGCLCをPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで氷上で1時間固定した。0.1％Tween20（PBST）を含有するPBSで洗浄した後、d4 PGCLC由来のコロニーを室温でAP緩衝液中でインキュベートした。AP緩衝液は、N、N-ジメチルホルムアミド（Sigma）0.5mlにナフトールAS-MXリン酸二ナトリウム塩（Sigma）5mgとFast Red TR salt（Sigma）10mgを逐次溶解した後、濾過して調製した。適切な時点でPBSTにより反応を停止させた。【０１３３】
核型分析
GSCs / GSCLCを60ng/ mlのデメコルシン（Sigma）を含む培地で6時間培養し、0.05％トリプシン-0.53mM EDTA中で4分間インキュベートすることにより単細胞に解離させ、10％FBSを含むDMEMでクエンチした。次いで、細胞を低張溶液（75mM KCL）で膨潤させ、Carnoy固定液で繰り返し処理（3回）することにより固定した。次いで、固定した細胞をエタノールで洗浄したガラススライド(Matsunami)に広げ、DAPIで染色した。核型イメージは、共焦点顕微鏡（Olympus FV1000）で分析することで得られ、染色体の数を数えた。【０１３４】
qPCR
AAG蛍光に対するFACSによって収集したGSC / GSCLCのRNAを抽出し、メーカーの指示に従い、RNeasy Micro Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を用いて精製した。精製した全RNAをSuperscriptIII（Invitrogen）により逆転写して、first-strand cDNAを生成し、これをPower SYBER Green（ABI、Foster City、CA）でqPCR分析に使用した。使用したプライマー配列を表２に示す。【０１３５】
【表２】
2018225802.tif 000003
【０１３６】
Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA)
COBRAは以前に報告されているように行った（Lee et al．，2009）。GSCs / GSCLCをAAG蛍光に対するFACSにより収集し、それらのゲノムDNAならびに野生型マウスのテールゲノムDNAを抽出し、各サンプルから精製した2μgのDNAを重亜硫酸塩処理に供した後、メーカーの指示に従い、Epitect Plus Bisulfite Kit（Qiagen）を用いて、精製した。ExTaq（TakaRa）を用いて、96℃30秒間、60℃1分間、72℃1分間の40サイクルのプロトコールで精製したDNAをPCRにより増幅した。使用したPCRプライマー配列は表２に示されている。増幅したDNAを、適切な制限酵素（New England BioLabs）-PhuI-HF（H19）、HhaI（Peg10）、TaqαI（Igf2r）、AciI（Meg3 IGおよびSnrpn）で消化し、消化した試料を2％または3％アガロースゲル中で電気泳動を通じて分離した。【０１３７】
（結果）
PGCLCは、再構成精巣(reconstituted testes)において、雄性の分化を受ける
生殖細胞と精巣の体細胞、特にセルトリ細胞との密接な相互作用は、雄性生殖細胞の分化に必須である（Svingen and Koopman、2013）。PGCLCがインビトロで精子形成の分化を受けるかどうかを調べるために、再構成精巣を用いた培養系の開発を試みた（図1A）。Acro/Act-EGFP（AAG）トランスジーンを有する胚性幹細胞（ESC）（129/SvJcl x C57BL/6バックグラウンド）（Ohtaら、2000）をPGCLCに誘導し、蛍光標識細胞分取（FACS）を用いて、高レベルのSSEA1およびINTEGRINβ3に基づいて、4日目(d4)または6日目(d6)にPGCLCを単離した。PGCLCと、磁気細胞分離(MACS)によりPGCを枯渇させた胎生期（E）12.5での胎生の精巣細胞との凝集体を作成した（図1A）。浮遊条件下で2日間培養した後、34℃で培養する条件（条件1）、または37℃で2週間培養し、次いで34℃で残りの期間培養する条件（条件２）のいずれかで、再構成精巣を気液界面培養用の透過性膜上（Steinberger et al, 1964）にプレイスした（図1A）。理由は不明だが、d6 PGCLCは再構成精巣に十分に組み込まれなかったため（データは示さず）、出発物質としてd4 PGCLCを使用した。条件1及び2のいずれの条件下でも同様の結果が得られたため、いずれかの条件からの代表的な結果を示す。
気液界面培養のd0では、再構成精巣は明瞭な基礎構造を持たない平らで丸い形を示した（図1B及び2A）。AAG陽性（+）細胞は、いくつかの凝集塊を形成する再構成精巣全体にランダムな分布を示した（図1Bおよび2A）。約d4から、精細管様構造が明らかになり始め、d7では広範な発展を示し、吻合ネットワークを構築した（図1B及び2A）。d7までに、精細管様構造の外側の、凝集塊を含むAAG（+）細胞は消失し、AAG（+）細胞の大部分は精細管様ネットワークの内側に存在した（図1B及び2A）。その後、精細管様ネットワークのさらなる発展と共に再構成精巣が安定に維持され、ネットワーク内のAAG（+）細胞の数の増加が見られた（図1B及び2A）。
d14およびd21における再構成精巣の免疫蛍光（IF）分析により、セルトリ細胞の重要な転写因子であるGATA4およびSOX9（Vidal et al., 2001; Viger et al., 1998）陽性細胞により描写された強固な精細管様構造が明らかとなったが、これは扁平上皮細胞、最も可能性が高いのは筋様細胞、の層の下にあった（図1Cおよび2B）。特徴的な核構造を有するAAG（+）細胞は、d14でほとんど独占的に細管の内腔区画内に存在し、それらの多くは、d21で基底区画に見られた（図1C及び2B）。d14では、多くのAAG(+)細胞が生殖腺のPGCにおいて発現し始める生殖細胞マーカーであるDDX4（Fujiwara et al., 1994）は陽性(+)となったが、前精原細胞(pro-spermatogonia)において、周産期に発現が始まるSSCマーカーであるPLZF（ZBTB16）（Buaas et al, 2004; Costoya et al, 2004）は陰性であった（図1C及び2B）。d21では、AAG（+）細胞のいくつかは、DDX4及びPLZFが両方（+）となった（図1C及び2B）。各条件下で、d21での再構成精巣全体の切片を試験した：AAG（+）細胞の大部分はDDX4（+）となり（条件1では〜92％、条件2では〜75％）、DDX4（+）細胞のわずか一部はPLZF(+)となった（条件1では〜6.3％、条件2では〜18％）（図1D）。興味深いことに、MACS（AAG（-）/DDX4（+））により枯渇したままの内在性のPGCsが、d4 PGCLCよりも高い頻度でPLZFを獲得した（条件1では〜56％、条件2では〜54％（図1D及び2C）。
再構成精巣のより長期間の培養を行った（d54まで）。少数のAAG（+）細胞または内在性の生殖細胞は、減数分裂の開始の重要なマーカーであるSCP3（Yuan et al., 2000）が陽性であったが（図1E及び2D）、本実験の条件下で減数分裂を完了した細胞は見出されなかった。まとめると、これらのデータは、再構成精巣がインビトロで精巣発生を再現し、再構成精巣内でPGCLCが分化して精原細胞様細胞を形成することを示している。このような細胞型へのPGCLCの分化の動態は、インビボでのPGCのものと比較して長引いた。【０１３８】
PGCLCからの精原細胞様の状態のインビトロ伝播
PGCではなく、周産期の前精原細胞、精原細胞又はSSCは、生殖細胞系幹細胞（GSC）と呼ばれる、自己再生能及び精子形成能を有する初代細胞株としてインビトロで増殖させることができ、生殖系列幹細胞（GSC）と呼ばれる(Kanatsu-Shinohara et al., 2003; Kubota et al., 2004)。新生仔の精巣は、GSCの誘導のための頑強な供給源である(Kanatsu-Shinohara et al., 2003)。従って、PGCLC由来の精原細胞様細胞を有し、新生仔精巣に類似し得るd21 再構成精巣からGSC様細胞（GSCLC）を得ることができるかどうかを試験した。d21 再構成精巣を単細胞に解離し、AAG（+）細胞を濃縮し、GSC誘導条件下で培養した（図3A）。培養のd3では、AAG（+）細胞を単一または対の細胞（単一の再構成精巣からの数千の細胞）としてマウス胚性フィーダー（MEF）上に散在させ、そのうちのいくつかは、d8で小さなコロニーを形成した（多くとも数十のコロニー）（図3B）。その後、このようなコロニーは緩徐な増殖を示し、数回の継代で、正常な核型を有し、GSCと区別できないブドウ房様コロニー形態を有する安定な細胞株として増殖し（条件1及び2からそれぞれ、9および6株）、凍結保存/再拡大とそれに続く解凍に対して高い効率を有した（図3B及び4A）。最初のコロニー数が10以上の場合に、一貫した様式でこのような細胞株を樹立することができ、GSCs（129/SvJcl x C57BL/6）と同様に増殖した（図3C）（Kanatsu-Shinohara et al., 2003）。
再構成精巣由来の細胞株における重要な遺伝子（Ddx4、Daz1、Gfra1、Ret、Piwil2、Itga6、Kit、Plzf、Piwil4、及びId4）、表面マーカー（CD9、SSEA1、INTEGRINβ1、INTEGRINα6、KIT及びGFRα1）並びに転写因子（PLZF及びID4）（Kanatsu-Shinohara and Shinohara、2013; Yang and Oatley、2014）の発現を、GSCにおけるそれらと比較することで、前記細胞株がGSCと同様の遺伝子発現を示すことを明らかにした（図3D-3F）。従って、これらの細胞株をGSCLCと命名した。再構成精巣の形成なしにPGCLCからGSCLCを得ることができるかどうかを調べるために、SSEA1及びINTEGRINβ3によりソートしたd4又はd6 PGCLCをGSC誘導条件下で直接培養した。しかし、これは、PGC由来の胚性生殖細胞（EGC）誘導の効率（〜5％）と同様の効率を有する、強くアルカリホスファターゼが陽性で、ドーム型ESC様コロニーの急速な拡大（数日以内）をもたらし（図4B）（Matsui et al., 1992; Resnick et al., 1992）、このような培養物からGSC様コロニーを単離/検出することができなかった。本発明者らは、PGCLCの雄性生殖細胞経路への分化は、GSCLCの誘導に必須であると結論付けた。【０１３９】
成体精巣における精子形成とGSCLC由来の繁殖力のある子孫
精原細胞/SSCは、精子形成のために成体精巣（約8週間超）に定着することができるが（Brinster and Zimmermann, 1994）、PGCは新生仔精巣（〜5-10日）においてのみ定着し、精子形成を受ける（Chuma et al., 2005; Ohta et al., 2004）。これは、これらの細胞型間の精子形成のためのホーミング能力又は本来備わっている/後成的な能力のいずれかの違いによるものであろう。
GSCLCが成熟した幹細胞の特性を獲得するかどうかを調べるために、それらをW/Wvマウスの成体精巣（8-10週）に移植した。GSC（AAG（+）; 129/SvJcl x C57BL/6）（GSC1）は、成体精巣に定着し、精子形成を受けた（図5A）。一方でPGCLCは、新生仔ではそのような活性を示したが(Hayashi et al., 2011)、成体では示さなかった（図5A）。注目すべきは、PGCLCとは異なり、すべてのGSCLC細胞株が成体精巣に定着したことである（図5A、6A、及び6B）。しかし、予期せぬことに、それらのうちの少数（GSCLC 1, 2, 3： 3/15）は、定着した細管の分画において精子形成を受けた（図5A、6A、および6B）。組織学的分析により、GSCLC由来のAAG（+）細胞が完全に占める細管において適切な精子形成が起こることを確認したが（図5B）、精原細胞又は初回の減数分裂期の細胞のみが、基底区画の周りにのみ整列したひと続きのAAG(+)細胞を保持する細管に存在した（図5B）。GSCLC細胞株は、移植後少なくとも16週間まで、移植された精巣で奇形腫を形成しなかった。
IF分析により、GFRα1（+）精原細胞/SSC様細胞は、GSC（〜33.9％）およびGSCLC（GSCLC1：〜36.6％; 4：〜32.4％）が定着した細管において同様の比率で存在することが明らかになった（図5C）。対照的に、GSCが定着したほとんどすべての細管はSCP3（+）減数母細胞（〜99.3％）を示したが、GSCLCが定着した細管では半分以下（GSCLC1：44.4％; 4：39.1％）であった（図5C）。従って、GSCLCは成体精細管に定着し、精原細胞/ SSCの特徴を示すが、それらは最初の減数分裂の前期の段階又は進入する段階付近で精子形成を停止させる傾向がある。
GSCLC由来の精子又は精細胞の機能を調べた。このような細胞（GSCLC1：精子; 3：円形精細胞）を、成功した精子形成（図5D）を有する精細管から一貫して単離することができ、細胞質内への精子注入（ICSI）又は円形精細胞注入（ROSI）をそれぞれ行い、正常な割合で外観的には正常な子孫が生み出された（図5E及び図5G）。このような子孫を、Combined Bisulfite Restriction Analysis（COBRA）により調べたところ、適切なインプリントを持ち、全体的に正常な発達を示し、繁殖力があった（図5F及び6C-6E）。従って、PGCLC及び再構成精巣における雄性の経路へのそれらの分化を介して、PSCは、成体精巣における精子形成のための即時の前駆体であるSSC能力を有する安定な細胞株に誘導され得る。【０１４０】
［実施例２］
（方法の概要）
ES細胞からPGCLCへの分化誘導とPGCLCの培養
実施例１と同様にして誘導した4日目（d4）のPGCLCをセルソーターにてソートし、初期PGCマーカーであるBlimp1陽性の細胞集団を回収した。該細胞をフィーダー細胞(m220細胞; Nature, 352: 809-811 (1991), J. Biol. Chem., 269: 1237-1242(1994))上に播種し、GMEM-10% KSR-2.5% FBS-Forskolin-Rolipram-SCF添加 (GK10FR) の培地条件下で5, 7, 9日間培養した（図７）。【０１４１】
培養PGCLCと雄性胎児生殖巣細胞の再構成精巣
培養PGCLCsと胎齢12.5日の雄性生殖巣体細胞を5,000細胞:70,000細胞の比率で混合し、GK10FR中で2日間浮遊凝集培養した（図７）。その後、凝集塊を培養膜 (culture insert) 上に移し、2週間気液界面培養を行った（図７）。培地はDMEM/F12-10% FBSを用いた。【０１４２】
再構成精巣から精原細胞様細胞株(GSCLC)の樹立
培養膜上で気液界面培養を開始後10日目、14日目の再構成精巣からGSCLCsを樹立した。再構成精巣は、0.05% Trypsin溶液中、37℃で10分間反応させ、ピペッティングにて単一細胞まで解離を行った。その後、セルソーターにて後期PGCマーカーであるDDX4（MVH）陽性の細胞集団をソートして、フィーダー細胞(MEF)上に播種し、実施例１と同様、StemPro34を基礎培地とし、GDNF、FGF2、EGF、LIFを添加した条件下で培養を行った。【０１４３】
（結果）
再構成精巣において培養PGCLCは後期PGCへと分化する
気液界面培養開始3日目まで培養PGCLCは増殖し、4〜5日目までに再構成精巣の菅構造が明確となった。また、その間、初期PGCマーカーであるBlimp1と、それに続いてStellaの発現が減弱し、後期PGCマーカーであるMVHの発現が上昇した（図８）。MVHの発現は気液界面培養10日目に向けて上昇していき、その後14日目にかけて少し減弱した。【０１４４】
10日目・14日目の再構成精巣からGSCLCを樹立することができる
10日間又は14日間培養した再構成精巣を単一細胞に解離し、セルソーターにて採取した後期PGCマーカーMVH陽性細胞を、精原幹細胞培養条件下で培養したところ、長期間継代可能な細胞株を誘導することが出来た。10日目再構成精巣から3株、14日目再構成精巣から1株（図９）の計4株を樹立し得た。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明の方法により得られる生殖系列幹細胞様細胞（GSCLC）は、長期間維持増幅培養が可能であり、かつ新生仔のみならず成体精巣に移植した場合でも稔性のある精子形成が可能であることから、生殖細胞の詳細な発生メカニズムの解明、不妊及び遺伝性疾患発症のメカニズムの解明の促進に大いに寄与し得る。【０１４６】
（関連出願の表示）
本出願は、2017年6月7日付で日本国に出願された特願2017-113054を基礎としており、ここで言及することによりそれらの内容は全て本明細書に包含される。
【図１】
2018225802.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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