(57)【要約】  ビーズをウェル中に配置済みのマイクロウェルプレートを製品として製造販売することを可能にする新規な手段、及びビーズによる核酸キャプチャ効率をより一層高めることができる新規な手段が開示されている。本発明のマイクロウェルプレートは、ビーズを反応ウェル内に配置済みの可搬式マイクロウェルプレートであり、ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルがゲル化剤を含む溶液のゲルで覆われてなる。本発明の細胞溶解液は、ゲル化剤を含有する細胞溶解液である。ゲル化剤は、例えば、４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有する。
2020013133.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルがゲル化剤を含む溶液のゲルで覆われてなる、マイクロウェルプレート。
【請求項２】
前記ゲル化剤は、４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有する、請求項１記載のマイクロウェルプレート。
【請求項３】
前記ゲル化剤がゼラチンである、請求項１又は２記載のマイクロウェルプレート。
【請求項４】
前記ビーズは、核酸を捕捉するための複数のオリゴヌクレオチド分子が固定化されたビーズである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレート。
【請求項５】
プレート上の反応ウェルの80％以上が、ビーズを１個のみ含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレート。
【請求項６】
反応ウェルの内面が親水化処理されたマイクロウェルプレートがゲルで覆われてなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレート。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレートの作製方法であって、
ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルを有するマイクロウェルプレートを準備する工程；及び
前記複数の反応ウェルが存在するプレート表面領域に、ゲル化剤を含む溶液を添加し、該溶液をゲル化させる工程
を含む、方法。
【請求項８】
請求項６記載のマイクロウェルプレートの作製方法であって、
複数の反応ウェルを有するマイクロウェルプレートを準備する工程；
反応ウェルの内面を親水化処理する工程；
親水化処理されたプレートの反応ウェルのうちの少なくとも一部の複数の反応ウェルに、ビーズを１個ずつ配置する工程；及び
ビーズが配置された反応ウェルが存在するプレート表面領域に、ゲル化剤を含む溶液を添加し、該溶液をゲル化させる工程
を含む、方法。
【請求項９】
ゲル化剤を含有する細胞溶解液。
【請求項１０】
ゲル化濃度未満の濃度でゲル化剤を含有する、請求項９記載の細胞溶解液。
【請求項１１】
前記ゲル化剤は、４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有する、請求項９又は１０記載の細胞溶解液。
【請求項１２】
前記ゲル化剤がゼラチンである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の細胞溶解液。
【請求項１３】
１個のビーズと１個の細胞を含む区画内で、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の細胞溶解液にて細胞を溶解させることを含む、核酸の解析方法。
【請求項１４】
前記区画がマイクロウェルプレートの反応ウェルである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ビーズは、核酸を捕捉するための複数のオリゴヌクレオチド分子が固定化されたビーズである、請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲル化剤がゲル化した状態の細胞溶解液を細胞と接触させ、該ゲル化剤が融解する温度下で細胞溶解反応を進行させる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一細胞解析のための技術に関する。より具体的には、単一細胞解析のための可搬式マイクロウェルプレート、及び、核酸キャプチャ効率を高めることができる細胞溶解液に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は生物の機能上、構造上の最小単位である。異なる種類の細胞が混在している組織・臓器、あるいは分化状態や応答状態の異なる細胞が混在している細胞集団において、個々の細胞がどのような物質を産生し相互作用しているのか等を正確に解明することは、複雑な生物系における細胞の多様性への理解を劇的に変化させる。この複合体の中での真の細胞状態の理解が進むことで、疾病における細胞間相互作用、癌の進展機構、薬物治療抵抗性の制御機構の解明、特異的マーカー遺伝子の発見につながり、循環腫瘍細胞分析、免疫障害、感染症、免疫療法、予防接種、治療開発モニタリングの診断等の新たな臨床応用にも役立つと期待されるため、画期的な1細胞遺伝子発現解析法の開発が望まれている。【０００３】
1細胞遺伝子発現解析法の開発は近年大きな進歩を遂げている。2009年に次世代シーケンサーを用いた最初の1細胞遺伝子発現解析法が報告され（非特許文献１）、現在までに数十の方法が開発され（例えば、特許文献１、３、４、及び非特許文献２、４、５）、1回の解析で数万個の細胞を同時に解析でき、1万種類を超える遺伝子の発現をとらえることができるようになってきている。しかしながら、各方法はそれぞれいくつかの問題も含んでいるのが現状である。解析する細胞の性状によるばらつき、mRNAのキャプチャ効率、PCR増幅で生じる非特異的な副産物、PCRバイアス、高額な実験機器、実験手技の煩雑さ等が挙げられている。【０００４】
本願発明者らは、単一細胞の核酸を効率よく回収することのできる手段および当該回収した核酸を解析する手段（以下「Nx1-seq」とも称する）を開発している（特許文献１、非特許文献２）。Nx1-seqは、3’末端にmRNAをキャプチャするためのdT配列を有し、細胞を識別するためのバーコード配列、mRNAを識別するためのUMI配列を含んだオリゴヌクレオチドを結合させたマイクロビーズを、数十万個のマイクロウェル中に1個ずつ配置し、そこに単離した細胞1個を入れ、ウェル内で1細胞中のmRNAをキャプチャし、cDNA合成を行い、次世代シーケンサーで解析を行う方法である。既存の単一細胞解析技術と比較して、Nx1-seqは細胞中のmRNAのキャプチャ効率が非常に高い手法であることが示されている（非特許文献２）。つまり、Nx1-seqは1細胞中のごく微量な分子ももれなくキャプチャでき、1細胞内の遺伝子発現を正確に示すことができる方法であると言える。この非常に高いキャプチャ効率がNx1-seqの最大の特徴である。さらにNx1-seqは高額な実験機器を必要とせず、操作も簡便なことから既存の方法や製品化された方法よりも優位性がある方法である。【０００５】
Nx1-seqを用いて、新しい知見が得られている。ヒト子宮体がん組織における細胞の多様性をがん細胞、間質細胞の観点から解析した研究では、詳細なサブタイプ分類が可能になったことで、個々の細胞の多様性を証明し、発がん、浸潤、予後等の悪性化に関与する分子やサブクローンを同定している（非特許文献３）。また、HBV陽性のHepatocellular carcinomaから樹立された細胞株の１細胞遺伝子発現解析を行い、約3,000細胞のうちたった１つの細胞がHBV mRNAを高発現していることを見いだし、そのHBV RNA維持細胞とそれ以外の細胞の比較によりHBVを細胞に維持する為の遺伝子の同定に成功している（特許文献２）。これらの点からもNx1-seqは非常に有効な方法と言える。【０００６】
Nx1-seqを製品化する際、いくつか問題点も含んでいた。mRNAキャプチャビーズをマイクロウェルに配置する際には、疎水性のマイクロウェルプレート表面をその都度プラズマ処理して親水化させる必要があり、疎水性に戻る前にすぐに次の工程に進む必要があった。また、１つの反応ウェルに１個のmRNAキャプチャビーズを配置済みの状態で販売される製品は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2015/166768号
【特許文献２】国際公開第2017/082202号
【特許文献３】国際公開第2015/031691号
【特許文献４】国際公開第2012/048341号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tang F, Barbacioru C, Wang Y, et al mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat. Methods 2009;6: 377-382.
【非特許文献２】橋本真一、「Nx1-seqマイクロウェルプレートを用いた1細胞遺伝子発現解析」、実験医学別冊  シングルセル解析プロトコール（菅野純夫編）、2017年09月27日発行、羊土社、p.171〜175
【非特許文献３】Hashimoto S, Tabuchi Y, Yurino H, et al. Comprehensive single-cell transcriptome analysis reveals heterogeneity in endometrioid adenocarcinoma tissues. Sci Rep 2017; 7: 14225
【非特許文献４】Han X et al. Mapping the Mouse Cell Atlas by Microwell-Seq. Cell vol.172, p.1091-1107, February 22, 2018
【非特許文献５】Seq-Well Master Protocol, Version 1.0, 2/13/2017, Shalek Lab <http://shaleklab.com/wp-content/uploads/2017/09/Seq-Well-Protocol-V1.pdf>
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記したように、Nx1-seqには、親水化処理後、プレートが疎水性に戻る前に速やかにビーズの充填から細胞溶解までを完了させる必要があり、製品化においてこの点は問題となっていた。また、実験目的別のカスタムmRNAキャプチャビーズが作製済みでかつマイクロウェルに配置済みのキットを開発できれば、実験者の作業工程は格段に少なくなり、手技にかかる負担やバラツキは飛躍的に改善され、製品化へ大きくつながると考えられるが、そのようなキットを開発、製品化できた例は未だ存在しない。ビーズをマイクロウェルに配置済みのプレートを製造販売する際には、輸送等による衝撃でウェル内のビーズ配置が崩れてしまうという問題も解決しなければならない。【００１０】
また、ウェルや液滴などの区画内で1細胞由来の核酸を1個のビーズにより捕捉するという1細胞遺伝子発現解析技術においては、区画内でビーズから離れた位置にある核酸を捕捉できないという問題が本質的に存在する。Nx1-seqよりもキャプチャ効率が低い従来技術は言うに及ばず、非常に高いキャプチャ効率を誇るNx1-seqですらも、ビーズ上に捕捉できなかったmRNAがウェル内に残存する可能性は否定できない。【００１１】
本発明は、上記した問題を解決し、ビーズをウェル中に配置済みのマイクロウェルプレートを製品として製造販売することを可能にする新規な手段を提供することを目的とする。また、本発明は、ビーズによる核酸キャプチャ効率をより一層高めることができる新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ビーズをウェル内に配置済みのマイクロウェルプレートの表面をゲルで保護することにより上記の問題を解決できることを見出すとともに、ゲル化剤を低濃度で添加した細胞溶解液を使用し、ゲル化剤がゲル化する低温状態から細胞溶解反応を開始して該反応を緩徐に進行させることにより、ビーズによる核酸キャプチャ効率が高まることを見出し、以下の発明を完成した。【００１３】
(１)  ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルがゲル化剤を含む溶液のゲルで覆われてなる、マイクロウェルプレート。
(２)  前記ゲル化剤は、４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有する、(１)記載のマイクロウェルプレート。
(３)  前記ゲル化剤がゼラチンである、(１)又は(２)記載のマイクロウェルプレート。
(４)  前記ビーズは、核酸を捕捉するための複数のオリゴヌクレオチド分子が固定化されたビーズである、(１)〜(３)のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレート。
(５)  プレート上の反応ウェルの80％以上が、ビーズを１個のみ含む、(１)〜(４)のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレート。
(６)  反応ウェルの内面が親水化処理されたマイクロウェルプレートがゲルで覆われてなる、(１)〜(５)のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレート。
(７)  (１)〜(５)のいずれか１項に記載のマイクロウェルプレートの作製方法であって、
ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルを有するマイクロウェルプレートを準備する工程；及び
前記複数の反応ウェルが存在するプレート表面領域に、ゲル化剤を含む溶液を添加し、該溶液をゲル化させる工程
を含む、方法。
(８)  (６)記載のマイクロウェルプレートの作製方法であって、
複数の反応ウェルを有するマイクロウェルプレートを準備する工程；
反応ウェルの内面を親水化処理する工程；
親水化処理されたプレートの反応ウェルのうちの少なくとも一部の複数の反応ウェルに、ビーズを１個ずつ配置する工程；及び
ビーズが配置された反応ウェルが存在するプレート表面領域に、ゲル化剤を含む溶液を添加し、該溶液をゲル化させる工程
を含む、方法。
(９)  ゲル化剤を含有する細胞溶解液。
(１０)  ゲル化濃度未満の濃度でゲル化剤を含有する、(９)記載の細胞溶解液。
(１１)  前記ゲル化剤は、４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有する、(９)又は(１０)記載の細胞溶解液。
(１２)  前記ゲル化剤がゼラチンである、(９)〜(１１)のいずれか１項に記載の細胞溶解液。
(１３)  １個のビーズと１個の細胞を含む区画内で、(９)〜(１２)のいずれか１項に記載の細胞溶解液にて細胞を溶解させることを含む、核酸の解析方法。
(１４)  前記区画がマイクロウェルプレートの反応ウェルである、(１３)記載の方法。
(１５)  前記ビーズは、核酸を捕捉するための複数のオリゴヌクレオチド分子が固定化されたビーズである、(１３)又は(１４)記載の方法。
(１６)  前記ゲル化剤がゲル化した状態の細胞溶解液を細胞と接触させ、該ゲル化剤が融解する温度下で細胞溶解反応を進行させる、(１３)〜(１５)のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ビーズをウェル内に配置済みのマイクロウェルプレートの製品化を実現可能にする手段が提供される。ビーズ配置済みのマイクロウェルプレートの表面をゲルで保護することにより、(1)ビーズがウェルに固定され、輸送等の衝撃に耐えられるようになる、(2)疎水性材料で製造されたマイクロウェルプレートを親水化処理して用いる場合でも、親水化処理された表面と空気との接触がゲルによって防止され、プレート表面の親水性を長期間維持できる、という効果が達成される。特に、室温条件で融解可能なゾル−ゲル転移特性を有するゲル化剤を用いてゲル被膜を形成することで、室温でのゲル被膜の融解、洗浄が可能となり、操作性に優れた製品を提供できる。【００１５】
また、本発明によるゲル化剤含有細胞溶解液を用いれば、Nx1-seqのように非常に高いmRNAキャプチャ効率を有することが知られている技術においても、キャプチャ効率をより一層高めることができる。つまり、本発明によれば、既存の方法では捉えられなかったごく微量な分子についても解析可能な精度を達成できるため、臨床研究に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】マイクロウェルプレートを含む可搬式解析デバイスの構成例である。(A)斜視方向から見た図、(B)プレートカバーを外した状態、(C)プレートカバーを被せた状態。
【図２】プラズマクラスター処理（O2 100cc 75W）を1,200秒施したPDMSマイクロウェルプレート（プラズマ処理）とプラズマクラスター処理を施していないPDMSマイクロウェルプレート（未処理）の親水性を、接触角測定法によって比較した結果をまとめたグラフである。
【図３】ゾル−ゲル相転換Lysis buffer又は従来のLysis bufferを使用し、特許文献１記載の方法によりヒト大腸癌組織細胞の遺伝子発現解析を行い、1細胞中の観察遺伝子数とRead数をプロットした図である。解析デバイスは、実施例で作製した可搬式デバイスを洗浄して用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のマイクロウェルプレートは、ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルがゲル化剤を含む溶液のゲル（以下、「ゲル被膜」ということがある）で覆われていることを特徴とする。ゲル被膜でプレート表面が保護されることにより、反応ウェル内のビーズ配置を崩すことなく輸送できる、すなわち可搬式という性能が、ビーズ配置済みプレートに付与される。以下、本明細書において、ゲル化剤を含む溶液のゲルを「ゲル被膜」、ゲル化剤を含む溶液を「プレート被覆液」ということがある。
【００１８】
プレート被覆液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等の、水を主たる溶媒とする水性の溶液である。従って、本発明でプレートのゲル被膜に用いるゲル化剤は、親水性のゲル化剤である。
【００１９】
ゲル化剤としては、室温条件下での温和な処理でゲル融解が可能なものを好ましく用いることができ、中でも、４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有するものを特に好ましく用いることができる。また、ゲル化剤としては、熱可逆的にゾル−ゲル相転移するものが好ましい。本発明のマイクロウェルプレートを含む製品は、ゲル化剤がゲル化した状態を維持できる条件下で輸送、保管すればよく、例えば、ゲル化剤がゲル状態を維持する低温で輸送、保管すればよい。
【００２０】
室温条件とは、一般に１８℃〜２５℃程度の温度条件をいう。本発明で好ましく用いることができるゲル化剤は、例えば、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、又は２５℃の条件においた時にゲルが融解するゲル化剤である。「２５℃で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有するゲル化剤」という語には、ゲル融解温度が２５℃以下のゲル化剤が包含される。また、「４℃条件で固体」という語には、ゲル化温度が４℃以上のゲル化剤が包含される。「４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有する」ゲル化剤は、例えば、ゲル化温度が４℃以上１８℃未満の範囲内のいずれかの温度であり、ゲル融解温度が１８℃〜２５℃の範囲内のいずれかの温度であるゲル化剤であり得る。
【００２１】
ゲル化剤の具体例としては、第一にゼラチンを挙げることができるが、上記のようなゾル−ゲル相転移特性を有する限り、いかなるゲル化剤であっても本発明において好ましく用いることができる。また、ゲルの融解の為にゲルを融解させる試薬による処理が必要なタイプのゲル化剤であっても、室温条件下での試薬処理によりゲル被膜を融解可能であれば、プレート被覆液に使用可能である。ゼラチン以外のゲル化剤の具体例としては、アルギン酸及びその塩（アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸カルシウム等）、寒天（アガロース）、カラギーナン、ペクチン、ローカストビーンガム、並びに、これらに化学修飾、誘導体化、物理的処理等を加えて上記したゾル−ゲル相転移特性を付与したものを挙げることができる。複数のゲル化剤を混合する、又はゲル化剤に適当な増粘剤を添加することにより、ゾル−ゲル相転移特性を調整することも可能である。
【００２２】
プレート被覆液中のゲル化剤の濃度は、そのゲル化剤がゲル化可能な濃度（ゲル化濃度）である。ゲル化剤ごとにゲル化濃度も知られており、例えばゼラチンのゲル化濃度は1.5〜3.0％程度である。従って、ゼラチンを用いる場合には、プレート被覆液中のゼラチン濃度はこの濃度範囲内、あるいはこれよりもやや高め（＋1〜2％程度）の濃度であってよい。
【００２３】
本発明のマイクロウェルプレートを遺伝子発現解析に用いる場合には、プレート被覆液がRNaseフリーとなるように調製する。市販のゲル化剤のうち、細胞培養や生体組織工学グレードのゲル化剤は、通常RNaseフリーであるので、そのままプレート被覆液の調製に用いることができる。
【００２４】
本発明のマイクロウェルプレートは、典型的には、単一細胞解析用のマイクロウェルプレートであり、反応ウェルに配置されるビーズは、核酸を捕捉するための複数のオリゴヌクレオチド分子が固定化されたビーズであり得る。ビーズ上のオリゴヌクレオチド分子に捕捉される核酸は、例えばRNAであり、RNAは、例えばmRNAである。そのような核酸捕捉ビーズ及びその製造方法は単一細胞解析の分野で広く知られており、例えば特許文献１、３、４に記載されている。本発明のゲル被膜による可搬化技術は、各種のマイクロプレート式単一細胞解析デバイスに適用することができる。ビーズのサイズは通常数十μm（例えば15〜30μm程度、又は18μm〜25μm程度）であり、ビーズの直径：反応ウェルの直径＝1:1.2〜1.75となるサイズとしてもよい。
【００２５】
ビーズの材質は特に限定されず、核酸解析キットの核酸捕捉担体やイムノアッセイキットの固相粒子担体に用いられる種々の材質を採用できる。ビーズの材質の例として、ポリスチレン、ポリプロピレン等の樹脂製のビーズ等の有機ポリマー製ビーズ、セレン化カドミウム（CdSe）、硫化亜鉛（ZnS）、硫化カドミウム（CdS）、セレン化亜鉛（ZnSe）、酸化亜鉛（ZnO）等の半導体材料でできた量子ドット（半導体ナノ粒子）等の半導体製ビーズ、金等の金属製ビーズ、シリカ製ビーズなどの重合体ビーズ等を挙げることができる。具体例として、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルおよびアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレン等（Merrifield Biochemistry 1964,3,1385-1390参照）、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、天然海綿、シリカゲル、ガラス、金属プラスチック、セルロース、架橋デキストラン（例えばSephadex(商品名)）およびアガロースゲル（Sepharose(商品名)）等の材質のビーズを挙げることができる。
【００２６】
本発明のマイクロウェルプレートにおける、プレート部分の材質も特に限定されず、マイクロプレート式単一細胞解析デバイスにおいて用いられる種々の材質を採用できる。成形の容易さとビーズ回収の便宜から、その材質としては、弾性のある高分子樹脂が好ましい。例えば、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリメチルメタアクリレート（PMMA）（アクリル樹脂）、ポリカーボネート（PC）、ポリスチレン（PS）、ポリプロピレン（PP）、ポリエチレン（PE）、ポリエチレンテレフタレート（PET）などが例示される。
【００２７】
反応ウェルのサイズは、通常、直径数十μm（例えば24〜70μm、又は24〜35μm）、深さ数十μm（例えば30〜90μm、30〜50μm、又は30〜40μm）である。プレート上の反応ウェルの個数は特に限定されず、解析の目的、プレートのサイズ等に応じて適宜選択できる。例えば、プレート上の反応ウェルの個数は100000個以上であり得る。
【００２８】
マイクロウェルを複数有するプレートの作製方法は公知であり、本発明のマイクロウェルプレートにおけるプレート部分はいかなる手法によって作製してもよい。例えば、マイクロプレートの母型を準備しておき、この母型に例えば熱硬化性樹脂を注いだのち、熱硬化性樹脂を減圧下でヒータ等によって加熱・硬化して成形することによって製造できる。あるいは、熱硬化性樹脂の代わりに、光硬化性樹脂を用いてもよい。光硬化性樹脂は紫外線等の光を照射して成形することによって硬化するものである。あるいはマイクロプレートは、抜き勾配を有する母型と離型剤を使用して、熱可塑性樹脂を減圧下で射出成形することによっても製造できる。また反応ウェルは、ナノインプリントや、切削加工等の方法により固相基板上に成形されてもよい。あるいはまた、市販のマイクロウェルプレートを本発明のプレート部分に用いることも可能である。
【００２９】
プレート部分が疎水性の材質からなる場合、少なくとも反応ウェルの内壁（底面も含む）は、親水化処理されることが好ましい。この場合、親水化処理の後にビーズを反応ウェル内に配置し、次いでゲル被膜を形成させる。親水化処理には、例えば親水性樹脂の塗布、光触媒作用を利用した表面処理、アルカリケイ酸塩等の無機系コート処理、エッチング処理、プラズマクラスター処理等の方法を用いることができる。
【００３０】
本発明のマイクロウェルプレートは、プレート上の反応ウェルのうちの50％以上、60％以上、70％以上、又は80％以上が、ビーズを１個のみ含んでいてよく、80％以上の反応ウェルがビーズを１個のみ含んでいることが好ましい。そのようなプレートを製造する方法は、例えば特許文献１に記載され公知であり、下記実施例にも記載されている。特許文献１に記載されるように、ビーズの直径に対する反応ウェルの直径の比率を約1.2〜1.75、ビーズの直径に対する反応ウェルの深さの比率を約1.5〜2.5に設定し、下記実施例でも行なった特許文献１記載の方法によりビーズを充填することで、プレート上の反応ウェルの80％以上にビーズを１個のみ配置することができる。
【００３１】
本発明のマイクロウェルプレートは、スライドグラス等の支持基板に取り付けられた形態であってもよい。図１には、そのような形態で本発明のマイクロウェルプレートを含む、可搬式の単一細胞解析デバイスの一例を示す。
【００３２】
図１に示した構成例では、スライドグラス４０の上に、仕切り壁２０で周囲を囲まれたプレート設置部３０が２箇所設けられている。この設置部に装着されるマイクロウェルプレート６０は、一方のみがビーズ配置済みのマイクロウェルプレートで他方をビーズなしのマイクロウェルプレートとしてもよいし、両方ともビーズ配置済みのマイクロウェルプレートとしてもよい。図１には、２箇所ある設置部のうちの一方にのみマイクロウェルプレート６０を設置した状態を示す。このように、複数ある設置部のうちの一部にマイクロウェルプレートを設置した構成としても差し支えない。一般的なチャンバースライドと同様に、上部プレート７０をスライドグラス４０からはがすことで仕切り壁２０を取り払い、マイクロウェルプレート６０をスライドグラス４０の上に残すことができるように構成してもよい。ビーズなしのマイクロウェルプレートが疎水性の材質からなる時には、ビーズなしのマイクロウェルプレートも親水化処理し、親水性を維持するために表面をゲルで被覆することが好ましい。なお、図示した構成例ではプレート設置部は２箇所あるが、支持基板のサイズやマイクロウェルプレートのサイズに応じて、支持基板上のマイクロウェルプレートの設置数は適宜設定できる。
【００３３】
反応ウェルへのビーズの挿入は、プレート設置部３０にプレート６０を設置する前に行なってもよいし、プレート設置部３０にプレート６０を設置してからビーズの挿入を行なってもよい。プレート設置部３０にビーズ配置済みのプレート６０が置かれた状態で、プレート６０の表面にプレート被覆液を添加し、ゲル化させることにより、ゲル被膜によるプレート６０の被覆を行なうことができる。
【００３４】
本発明のマイクロウェルプレートを含む可搬式解析デバイスは、プレート設置部３０を覆うプレートカバー５０を含んでいてよい。プレートカバー５０は、プレート設置部３０に設置されたマイクロウェルプレート６０を物理的に保護するカバーとして使うほか、細胞分散液をプレート６０上（仕切り壁２０で囲まれた空間内）に添加して顕微鏡下で観察する際のカバーとしても使うことができる。
【００３５】
本発明のマイクロウェルプレートを使用する時は、まず、プレート表面を覆うゲルを融解させる。室温条件で融解可能なゲル化剤を用いた場合には、室温に放置してゆっくりとゲルを融解させる。プレートを加熱して急激に温度を上昇させると、溶解したプレート被覆液の対流が起こって反応ウェル内のビーズが舞い上がり、反応ウェルから脱落したり、他の反応ウェルに移動して複数のビーズが１ウェル内に入ってしまうおそれがある。
【００３６】
その後、室温の洗浄バッファー（PBSなど）でプレートを洗浄する。洗浄の際は、ビーズが舞い上がり反応ウェルから脱落することを防ぐため、反応ウェルに直接噴射しないようにする。例えば、図１に例示した形態で本発明のマイクロウェルプレートを含む解析デバイスを構成した場合には、プレート６０を囲む仕切り壁２０に向かって洗浄バッファーを噴射し、洗浄バッファーがゆるやかに反応ウェル内に流れ込むようにするとよい。
【００３７】
本発明のマイクロウェルプレートの製造方法を以下に説明する。
【００３８】
まず、ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルを有するマイクロウェルプレートを準備する。上述したように、市販のマイクロウェルプレート、又は公知の方法により作製したマイクロウェルプレートの反応ウェルに、特許文献１記載の方法等によりビーズを配置すればよい。プレート上の反応ウェルの全てに１個ずつビーズを配置する必要はなく、例えばプレート上の反応ウェルのうちの50％以上、60％以上、70％以上、又は80％以上のウェルがビーズを１個のみ含むように、ビーズを配置できればよい。図１に示した構成例の解析デバイス１０を作製する場合には、ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルを有するマイクロウェルプレート６０がプレート設置部３０に配置された状態（ビーズの挿入は、プレート設置部３０にプレート６０を設置する前でも後でもよい）のものを準備すればよい。
【００３９】
次いで、ビーズを１個のみ含む複数の反応ウェルが存在するプレート表面領域に、ゲル化剤を含む溶液（プレート被覆液）を添加し、該溶液をゲル化させる。プレート上で反応ウェルが設けられているウェル領域全体にプレート被覆液を添加してゲル化させ、ウェル領域全体をゲルで被覆してよい。本明細書において、「（マイクロウェル）プレート表面」といった場合には、反応ウェルの底面及び内壁も包含される。使用するゲル化剤の種類に応じて適当な方法によりゲル化させればよく、例えばゼラチンの場合には、該ゼラチンがゲル化する温度にて、プレート被覆液添加後のプレートを冷却すればよい。
【００４０】
プレート部分が疎水性の材質からなる場合、複数の反応ウェルを有するマイクロウェルプレートを準備し、反応ウェルの内面を親水化処理した後に、反応ウェルにビーズを配置する。全ての反応ウェルに１個ずつビーズを配置する必要はなく、プレート上の反応ウェルのうちの少なくとも一部の複数の反応ウェル（例えば、プレート上の反応ウェルのうちの50％以上、60％以上、70％以上、又は80％以上の反応ウェル）に、ビーズを１個ずつ配置できればよい。ビーズ配置後の工程は上記の通りである。
【００４１】
本発明はまた、ゲル化剤を含有する細胞溶解液を提供する。細胞溶解液に添加するゲル化剤については、基本的には、プレート被覆液に用いるゲル化剤と同じことがいえるが、４℃条件で固体であり、室温条件で融解可能なゾル−ゲル相転移特性を有するゲル化剤が好ましく、ゾル−ゲル相転移が熱可逆的であるものが特に好ましい。
【００４２】
本発明の細胞溶解液中のゲル化剤は、当該ゲル化剤のゲル化濃度未満の低濃度でゲル化剤を含有することが望ましい。ゲル化剤濃度を低濃度とすることで、流動性のない完全な固体状態とならず、例えば、ゲル化温度以下に冷却した時に、低い流動性を有する柔らかいゲル状となる。ゲル化剤のゲル化濃度については上述した通りである。ゲル化剤としてゼラチンを用いる場合、細胞溶解液中のゼラチン濃度は1.5％未満であり、例えば1.0％以下、0.8％以下、又は0.5％以下とすることができる。
【００４３】
ゲル化剤含有細胞溶解液は、単一細胞核酸解析技術において好ましく用いることができる。該細胞溶解液を用いる核酸の解析方法は、１個のビーズと１個の細胞を含む区画内で、ゲル化剤含有細胞溶解液にて細胞を溶解させることを含む。単一細胞解析技術としては、マイクロウェルプレートの反応ウェル内で細胞溶解とビーズ上への核酸の捕捉を行なう技術の他、エマルジョン液滴中で細胞溶解とビーズ上への核酸の捕捉を行なう技術も知られている。ゲル化剤含有細胞溶解液は、特に、マイクロウェルプレートの反応ウェル内で細胞溶解と核酸捕捉を行なう技術において好ましく用いることができる。すなわち、上記した１個のビーズと１個の細胞を含む区画は、好ましくは、マイクロウェルプレートの反応ウェルである。
【００４４】
ゲル化剤含有細胞溶解液を用いて細胞の溶解反応を行なう際には、ゲル化剤がゲル化した状態（低い流動性を有する柔らかいゲル状）の細胞溶解液を細胞と接触させ、ゲル化剤が融解（ゾル化）する温度下で細胞溶解反応を進行させる。例えば、ゲル化剤としてゼラチンを含む細胞溶解液を用いる場合には、ゼラチンがゲル化する温度に冷却した細胞溶解液を室温環境下で細胞と接触させ（マイクロウェルプレートも、ゼラチンがゲル化する温度に冷却しておくことが好ましい）、そのまま室温に放置して細胞溶解反応を進行させればよい。流動性が低い状態で細胞溶解反応が開始することにより、細胞溶解成分の細胞への浸透速度が低下し、細胞が溶解する時間が長くなるとともに、反応ウェル内で細胞から抽出された核酸の拡散が抑制され、その結果、反応ウェル内で近接して存在するビーズによって効率的に核酸が捕捉され、核酸キャプチャ効率が向上するものと考えられる。
【００４５】
ゲル化剤含有細胞溶解液は、単独でも試薬として提供できるし、本発明のマイクロウェルプレートを含む可搬式解析デバイス、あるいは公知の単一細胞解析デバイスと組み合わせて提供することもできる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００４７】
１．単一細胞由来の核酸の構成を解析するためのPDMSマイクロウェルプレートのプラズマ処理とその親水化評価
１−１．PDMSマイクロウェルプレートのプラズマ処理
polydimethylsiloxane使用樹脂（モメンティブ社 TSE-3032）用いて、直径35〜40μm×深さ50μmの1.7×105〜2.3×105ウェルのマイクロプレートを作製し、oxygen plasma chamber (YSR-R, SAKIGAKE Semiconductor Co., Ltd)を用いてO2 100cc 75Wの条件で1,200秒間プラズマ照射を行った。以下、プラズマ処理後のPDMSマイクロウェルプレートを「プラズマプレート」、プラズマ処理を施していないPDMSマイクロウェルプレートを「未処理プレート」とも称する。また、PDMSマイクロウェルプレートにビーズを配置させたもの、あるいはビーズ配置済みのマイクロウェルプレートを含む解析器具を、「解析デバイス」又は単に「デバイス」とも称する。【００４８】
１−２．プラズマプレートの親水化の測定
上記方法にて処理されたプラズマプレート(照射直後、照射24時間後、照射48時間後、照射72時間後)に対してPBSを10μl添加し、液滴の接触角を測定し、プラズマ処理の効果とその持続時間を観察した。それぞれの接触角測定は3回行いその平均値を採用した。同様に、未処理プレートについても液滴の接触角を測定した。
結果を図２に示す。PBSの液滴の接触角が大きいことは親水性が低いことを意味し、接触角が小さいと親水性が高いことを意味する。プラズマクラスター処理をすることで、処理直後は親水性が大きく向上したことが示された。しかし、照射後は経時的に親水性が低下し、72時間後にはプラズマ未処理時と同程度まで戻ってしまうことがわかった。解析デバイスの製造工程においては、プラズマクラスター処理後速やかに次の工程（ビーズの充填とゼラチンによる固定）を行なうべきである。【００４９】
２．RNAキャプチャビーズ充填済みの可搬式デバイスの作製
RNAキャプチャービーズは、特許文献１の実施例３に記載される方法で作製した、ビーズごとに異なるバーコード配列を有するオリゴヌクレオチドを表面に結合させた架橋アガロースゲルビーズ（直径20μm）を用いた。特許文献１の実施例３に記載される方法に従い、ウェル数の約1.1〜1.3倍の個数のビーズをプレート上に載せ、透析膜（12,000〜14,000 MWCO 再生セルロース透析チューブ、25-mm flat width、Fisher Scientific）でプレートを覆い、ローラーもしくは定規を透析膜上より押し付けながら表面をならすように移動させることにより、1ウェルに1個のビーズが配置されるようにした。【００５０】
四方を仕切り壁で囲まれたプレート設置部を有するスライドグラスに、ビーズ配置済みのプラズマプレートを設置し（図１）、ビーマトリックスゼラチンLS-W（新田ゼラチン社製）（以下、単に「ゼラチン」とも称する）を3%（w/v）含むPBSを室温で1000μl、プレート上（仕切り壁内）に静かに添加した。その後、冷蔵庫で静置して冷却した。これによってゼラチン含有PBSはゲル化するため、プレート表面の酸素接触を長期間防ぐことができ、反応ウェル中のビーズも固定されているので輸送にも耐えられる。試作した可搬式デバイスを長期保存して性能を調べたところ、保存期間６か月の時点で親水性を維持できていることが確認できた。１年程度は性能を維持できると考えられる。【００５１】
３．ゾル−ゲル相転換Lysis buffer作製とそれによるRNAキャプチャ効率の改善に対する評価
３−１．ゾル−ゲル相転換Lysis bufferの作製
従来のLysis buffer(500mM LiCl in 100mM TRIS buffer (pH7.5) with 1% lithium dodecyl sulfate, 10mM EDTA and 5mM DTT)にビーマトリックスゼラチンLS-Wを0.4%（w/v）になる様に添加し、ゾル−ゲル相転換Lysis buffer（以下「ゼラチンLysis buffer」とも称する）を作製した。ビーマトリックスゼラチンLS-Wの低濃度での添加により、このゼラチンLysis bufferは、室温では流動性が高く（ゾル化）、10℃以下では流動性が低い（柔らかいゲル状）という特性を持つようになった。【００５２】
３−２．RNAキャプチャ効率の測定
ゼラチンLysis bufferのRNAキャプチャ効率を評価するために、３−１．にて作製したゼラチンLysis bufferを用いて、ヒト大腸癌組織について、特許文献１に示された方法により遺伝子発現解析を行った。従来のLysis bufferを用いた遺伝子発現解析も同様に行った。デバイスは、２．にて作製したビーズ充填済みの可搬式デバイスを洗浄して用いた。【００５３】
まず、可搬式デバイスを室温に放置し、プレート表面を保護するゼラチンゲルをゆるやかに融解させた。加熱等により急激に温度を上昇させると、溶けたゼラチン含有PBSの対流が起きてビーズが舞い上がり、ビーズ配置が崩れるため、ゲルをゆっくり融かすことが肝要である。次いで、室温のPBSでプレートを洗浄した。この際、プレートに直接PBSを噴射すると反応ウェル内のビーズが舞い上がり、ビーズ配置が崩れる恐れがあるので、仕切り壁（図１の２０）の壁面に対してPBSを噴射してプレートを洗浄した。【００５４】
ヒト大腸癌組織をコラゲナーゼ等で処理して得た細胞分散液を、細胞数がプレートのウェル数に対して20分の1以下の個数になるように調整し、プレート上（仕切り壁２０で囲まれた空間内）に添加した。4℃で10〜15分放置してウェルに細胞を入れた後、PBSでプレートを洗浄し、デバイスを再度４℃に冷却した。冷却後のデバイスのプレートに4℃のゼラチンLysis buffer（柔らかいゲル状）を添加し、室温で15分間静置することにより、細胞溶解を緩やかに進行させ、ビーズ上にmRNAを捕捉した。比較例では、ゼラチンLysis bufferに代えてゼラチン不含の従来のLysis bufferを使用し、上記と同様の手順でウェル内の細胞を溶解させ、ビーズ上にmRNAを捕捉した。【００５５】
2mlの冷Lysis bufferが入ったシャーレにプレートを逆さにして浸し、ビーズをLysis buffer中に落下させ、遠心してビーズを回収した。特許文献１の実施例と同様の方法により逆転写反応等を行い、HiSeq2500（イルミナ株式会社）にてシークエンスを解析した。【００５６】
観察された遺伝子数とRead数の関係をプロットした結果を図３に示す。大きい丸（ゼラチン入り）が、ゾル−ゲル相転換Lysis bufferを用いた場合の結果であり、小さい丸（ゼラチンなし）が、従来のLysis bufferを用いた場合の結果である。ゾル−ゲル相転換Lysis bufferを用いた場合には、従来のLysis bufferに比べて観察された遺伝子数が多いことが分かった。これは、Lysis bufferの流動性がゼラチンにより低くなった結果、細胞へのLysis bufferの透過および細胞を可溶化する際のRNA流出が抑えられ、1細胞中に含まれるRNAをロスなくバーコードビーズに結合することができたためと考えられる。ゼラチンLysis bufferをプレートに添加した後、室温下ではなく4℃のままで静置すると、細胞は10分経っても完全には融解せず、RNAの回収率が極めて低下した（データは図示せず）。
【符号の説明】
【００５７】
１０  解析デバイス
２０  仕切り壁
３０  プレート設置部
４０  スライドグラス
５０  プレートカバー
６０  マイクロウェルプレート
７０  上部プレート
【図１】
2020013133.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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