(57)【要約】  ５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡと５’末端に水酸基を有する第３の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法。
2019189591.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡと５’末端に水酸基を有する第３の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域、Ｗ１領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｚ２領域、Ｌｚリンカー領域、Ｚ１領域及びＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｃ）前記第３の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域及びＹ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｄ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｅ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｆ）前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｇ）前記Ｗ１領域及び前記Ｗ２領域が、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含み、
ｈ）前記Ｌｚリンカー領域及び前記Ｌｗリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
ｉ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
製造方法。
【請求項２】
前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、請求項１に記載の製造方法。
【化１】
2019189591.tif 000024
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ１１とは結合していな他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項３】
前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｗリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、請求項２に記載の製造方法。
【化２】
2019189591.tif 000025
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【化３】
2019189591.tif 000026
（式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ１領域および前記Ｗ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ２領域および前記Ｗ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表される二価の基が、下記式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項２又は３に記載の製造方法。
【化４】
2019189591.tif 000027
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項５】
前記式（Ｉ’）で表される二価の基が、下記式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項３又は４に記載の製造方法。
【化５】
2019189591.tif 000028
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項６】
前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域及び前記Ｗ１領域からなる領域、並びに前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域及び前記Ｚ２領域からなる領域の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第３のＲＮＡと反応させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記第２の一本鎖ＲＮＡと前記第３のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域及び前記Ｙ１領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第１のＲＮＡと反応させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｙ２ａ領域、Ｌｚリンカー領域、Ｙ１ａ領域、Ｘ１ａ領域、Ｗ１ａ領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、Ｘ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｃ）前記Ｘ１ａ領域と前記Ｘ２ａ領域とが、互いに相補的な、４以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｄ）前記Ｙ１ａ領域と前記Ｙ２ａ領域とが、互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｅ）前記Ｗ１ａ領域及びＷ前記２ａ領域が、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含み、
ｆ）前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｌｚリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２ａ領域、前記Ｙ２ａ領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｙ１ａ領域、前記Ｘ１ａ領域、前記Ｗ１ａ領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２ａ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
製造方法。
【請求項１０】
前記Ｌｚリンカー領域が下記式（Ｉ）で表される二価の基である、請求項９に記載の製造方法。
【化６】
2019189591.tif 000029
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域及び前記Ｙ２ａ領域のいずれかの一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域及び前記Ｙ２ａ領域のＹ１１とは結合していない他方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項１１】
前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｗリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、請求項９に記載の製造方法。
【化７】
2019189591.tif 000030
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域および前記Ｙ２ａ領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２ａ領域および前記Ｙ１ａ領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【化８】
2019189591.tif 000031
（式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ１ａ領域および前記Ｗ２ａ領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ２ａ領域および前記Ｗ１ａ領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項１２】
前記式（Ｉ）で表される二価の基が、式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【化９】
2019189591.tif 000032
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項１３】
前記式（Ｉ’）で表される二価の基が、式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【化１０】
2019189591.tif 000033
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項１４】
前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、前記Ｙ１ａ領域、前記Ｘ１ａ領域及び前記Ｗ１ａ領域からなる領域、並びに前記Ｘ２ａ領域、前記Ｙ２ａ領域からなる領域の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａｔａｒｅｎｔｏｌａｅ  ＲＮＡリガーゼである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号１０、１１、または１２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記リガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ  ２である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖ＲＮＡの製造方法に関する。
本願は、２０１８年３月３０日に、日本に出願された特願２０１８−０６９５６０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制可能な核酸分子として、特許文献１では、核酸化合物が報告されている。かかる核酸としては、核酸化合物のリンカー部分にアミノ酸構造を有するものも知られている。また、これらの核酸化合物は、生体内で分解され難く高い生体安定性を有しており、免疫応答を回避できるという特性を持っている。【０００３】
かかる優れた特性を有する核酸化合物は、約５０塩基程度の長い鎖長のため、合成方法においてより簡便な方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０１７９１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、一本鎖ＲＮＡの簡便な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、２０塩基長程度の３つのＲＮＡを合成した後に、ある種のＲＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行うことで、５０塩基長以上の一本鎖ＲＮＡを容易に製造することができるという知見を得た。
さらに、前記３本の一本鎖ＲＮＡのうちの第一と第二の２本からなる一本鎖のＲＮＡと第三のＲＮＡとをある種のＲＮＡリガーゼを用いてライゲーションを行うことにより、目的とする５０塩基長以上の一本鎖ＲＮＡを容易に製造することができることを見出した。【０００７】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の一本鎖ＲＮＡの製造方法を提供するものである。【０００８】
［１］５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡと５’末端に水酸基を有する第３の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域、Ｗ１領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｚ２領域、Ｌｚリンカー領域、Ｚ１領域及びＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｃ）前記第３の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域及びＹ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｄ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｅ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｆ）前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｇ）前記Ｗ１領域及び前記Ｗ２領域が、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含み、
ｈ）前記Ｌｚリンカー領域及び前記Ｌｗリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
ｉ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
製造方法。
［２］前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、［１］に記載の製造方法。【０００９】
【化１】
2019189591.tif 000003
【００１０】
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域及び前記Ｚ２領域のいずれか一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域又は前記Ｚ１領域の前記Ｙ１１とは結合していない他方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
［３］前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｗリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、［２］に記載の製造方法。【００１１】
【化２】
2019189591.tif 000004
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）【００１２】
【化３】
2019189591.tif 000005
【００１３】
（式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ１領域及び前記Ｗ２領域の何れか一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ２領域又は前記Ｗ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
［４］前記式（Ｉ）で表される二価の基が、下記式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、［２］又は［３］に記載の製造方法。【００１４】
【化４】
2019189591.tif 000006
【００１５】
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
［５］前記式（Ｉ’）で表される二価の基が、下記式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、［３］又は［４］に記載の製造方法。【００１６】
【化５】
2019189591.tif 000007
【００１７】
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
［６］前記Ｗ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｙ１領域及び前記Ｚ１領域からなる領域、並びに前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域及び前記Ｚ２領域からなる領域の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、［１］〜［５］のいずれか一つに記載の製造方法。
［７］前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第３のＲＮＡと反応させる、［１］］〜［６］のいずれか一つに記載の製造方法。
［８］前記第２の一本鎖ＲＮＡと前記第３のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域及び前記Ｙ１領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第１のＲＮＡと反応させる、［１］］〜［６］のいずれか一つに記載の製造方法。
［９］５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｙ２ａ領域、Ｌｚリンカー領域、Ｙ１ａ領域、Ｘ１ａ領域、Ｗ１ａ領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、Ｘ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｃ）前記Ｘ１ａ領域と前記Ｘ２ａ領域とが、互いに相補的な、４以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｄ）前記Ｙ１ａ領域と前記Ｙ２ａ領域とが、互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｅ）前記Ｗ１ａ領域及びＷ前記２ａ領域が、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含み、
ｆ）前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｌｚリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２ａ領域、前記Ｙ２ａ領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｙ１ａ領域、前記Ｘ１ａ領域、前記Ｗ１ａ領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２ａ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
製造方法。
［１０］前記Ｌｚリンカー領域が下記式（Ｉ）で表される二価の基である、［９］に記載の製造方法。【００１８】
【化６】
2019189591.tif 000008
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域及び前記Ｙ２ａ領域のいずれかの一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域及び前記Ｙ２ａ領域のＹ１１とは結合していない他方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
［１１］前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｗリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、［９］に記載の製造方法。【００１９】
【化７】
2019189591.tif 000009
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域および前記Ｙ２ａ領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２ａ領域および前記Ｙ１ａ領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）【００２０】
【化８】
2019189591.tif 000010
（式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ１ａ領域および前記Ｗ２ａ領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ２ａ領域および前記Ｗ１ａ領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
［１２］前記式（Ｉ）で表される二価の基が、式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、［１０］又は［１１］に記載の製造方法。【００２１】
【化９】
2019189591.tif 000011
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
［１３］前記式（Ｉ’）で表される二価の基が、式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、［１１］又は［１２］に記載の製造方法。【００２２】
【化１０】
2019189591.tif 000012
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
［１４］前記Ｙ１ａ領域、前記Ｘ１ａ領域及び前記Ｗ１ａ領域からなる領域、並びに前記Ｘ２ａ領域、前記Ｙ２ａ領域からなる領域の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、［９］〜［１３］のいずれか一つに記載の製造方法。
［１５］前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａｔａｒｅｎｔｏｌａｅ  ＲＮＡリガーゼである、［１］〜［１４］のいずれか一つに記載の製造方法。
［１６］前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号２１、２２、または２３に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の製造方法。
［１７］前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の製造方法。［１８］前記リガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ  ２である、［１］〜［１７］のいずれか一つに記載の製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の方法によれば、一本鎖ＲＮＡの簡便な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態にかかる第１〜第３の一本鎖ＲＮＡの一例を示す模式図である。
【図２】本発明の一実施形態にかかる第１〜第３の一本鎖ＲＮＡの一例を示す模式図である。
【図３】実施例１及び２で使用した配列を示す図である。
【図４】実施例１で合成した連結一本鎖ＲＮＡを示す図である。
【図５】実施例１の液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図６】実施例２で合成した連結一本鎖ＲＮＡを示す図である。
【図７】実施例２の液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。
【図８】本発明の一実施形態にかかる第１〜第２の一本鎖ＲＮＡの一例を示す模式図である。
【図９】本発明の一実施形態にかかる第１〜第２の一本鎖ＲＮＡの一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２６】
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００２７】
本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ（センス鎖又はアンチセンス鎖）、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００２８】
本明細書において、ヌクレオチド数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４ヌクレオチド」との記載は、「１ヌクレオチド」、「２ヌクレオチド」、「３ヌクレオチド」、および「４ヌクレオチド」の全ての開示を意味する。また、「１〜４塩基」との記載は、「１塩基」、「２塩基」、「３塩基」、および「４塩基」の全ての開示を意味する。本明細書において、「ヌクレオチド数」及び「塩基数」は、相互に互換的に、ヌクレオチド配列の長さを表す。
【００２９】
［第一の態様］
本発明の第一の態様に係る製造方法は、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡと５’末端に水酸基を有する第３の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域、Ｗ１領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｂ）第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｚ２領域、Ｌｚリンカー領域、Ｚ１領域及びＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｃ）第３の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域及びＹ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｄ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｅ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが、互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｆ）前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが、互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｇ）前記Ｗ１領域及び前記Ｗ２領域が、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含み、
ｈ）前記Ｌｚリンカー領域及び前記Ｌｗリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
ｉ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする。
【００３０】
この態様は、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第３のＲＮＡと反応させる形態あるいは、前記第２の一本鎖ＲＮＡと前記第３のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第１のＲＮＡと反応させる形態で実施することができる。
【００３１】
本態様にかかる製造方法により生成される連結一本鎖ＲＮＡについては、国際公開第２０１２／００５３６８号、国際公開第２０１２／０１７９１９号、国際公開第２０１３／１０３１４６号などを参照することができる。
【００３２】
本態様にかかる製造方法で用いる第１の一本鎖ＲＮＡの塩基数（Ｌｗリンカー領域は除く）は、特に制限されず、下限は、例えば４塩基であり、好ましくは８塩基であり、上限は、例えば１６０塩基であり、好ましくは３０塩基である。第１の一本鎖ＲＮＡの塩基数の範囲としては、例えば、４〜１６０塩基が挙げられ、好ましくは８〜３０塩基が例示される。
【００３３】
本態様にかかる製造方法で用いる第２の一本鎖ＲＮＡの塩基数（Ｌｚリンカー領域は除く）は、特に制限されず、下限は、例えば６塩基であり、好ましくは８塩基であり、上限は、例えば１５０塩基であり、好ましくは３０塩基である。第２の一本鎖ＲＮＡの塩基数の範囲としては、例えば、６〜１５０塩基が挙げられ、好ましくは８〜３０塩基が例示される。
【００３４】
本態様にかかる製造方法で用いる第３の一本鎖ＲＮＡの塩基数は、特に制限されず、下限は、例えば４塩基であり、好ましくは８塩基であり、上限は、例えば１６０塩基であり、好ましくは３０塩基である。第３の一本鎖ＲＮＡの塩基数の範囲としては、例えば、４〜１６０塩基が挙げられ、好ましくは８〜３０塩基が例示される。
【００３５】
Ｘ１領域とＸ２領域とは、互いに相補的なヌクレオチド配列を含む。当該相補的なヌクレオチド配列の塩基数は、下限は２塩基であり、好ましくは４塩基であり、上限は、例えば１５０塩基であり、好ましくは２４塩基である。当該相補的なヌクレオチド配列の塩基数の範囲としては、例えば、２〜１５０塩基が挙げられ、好ましくは４〜２４塩基が例示される。
【００３６】
Ｙ１領域とＹ２領域とは、互いに相補的なヌクレオチド配列を含む。当該相補的なヌクレオチド配列の塩基数は、下限は２塩基であり、好ましくは４塩基であり、上限は、例えば１００塩基であり、好ましくは３０塩基である。当該相補的なヌクレオチド配列の塩基数の範囲としては、例えば、２〜１００塩基が挙げられ、好ましくは４〜３０塩基が例示される。
【００３７】
Ｚ１領域とＺ２領域とは、互いに相補的なヌクレオチド配列を含む。当該相補的なヌクレオチド配列の塩基数は、下限は１塩基、好ましくは２塩基、より好ましくは４塩基であり、上限は、例えば１００塩基であり、好ましくは３０塩基である。当該相補的なヌクレオチド配列の塩基数の範囲としては、例えば、１〜１００塩基が挙げられ、好ましくは２〜３０塩基が例示され、より好ましくは４〜３０塩基が例示される。
【００３８】
Ｗ１領域及びＷ２領域のそれぞれが含むヌクレオチド配列の塩基数は、特に制限されず、下限は、例えば１塩基であり、好ましくは４塩基であり、上限は、例えば１００塩基であり、好ましくは１０塩基である。前記ヌクレオチド配列の塩基数の範囲としては、例えば、１〜１００塩基が挙げられ、好ましくは４〜１０塩基が例示される。
【００３９】
本態様にかかる製造方法により製造される一本鎖ＲＮＡの塩基数(リンカー領域は除く)は、特に制限されず、下限は、例えば３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、上限は、例えば３００塩基であり、好ましくは８０塩基である。前記一本鎖ＲＮＡの塩基数の範囲としては、例えば、３８〜３００塩基が挙げられ、好ましくは４２〜８０塩基が例示される。
【００４０】
本態様にかかる製造方法により製造される一本鎖ＲＮＡは、Ｚ１領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域及びＷ１領域からなる領域（Ａ１領域）、並びにＸ２領域、Ｙ２領域及びＺ２領域からなる領域（Ｂ１領域）の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含むことが望ましい。遺伝子の発現を抑制する方法としては、特に制限されず、好ましくはＲＮＡ干渉法である。
【００４１】
ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡ及びこれと相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入することにより、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解され、その結果タンパク質への翻訳阻害を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象をいう。ＲＮＡ干渉の機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、ＤＩＣＥＲといわれる酵素（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖ＲＮＡと接触し、二本鎖ＲＮＡがｓｉＲＮＡと呼ばれる小さな断片に分解されるのが主な機構と考えられている。
【００４２】
標的となる遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を適宜選択することができる。標的となる遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列は、遺伝子発現を抑制可能な配列である限り特に制限されず、公知のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋなど）等に登録されている標的遺伝子の配列情報を基に常法により設計することが可能である。当該ヌクレオチド配列は、標的となる遺伝子の所定の領域に対して、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
【００４３】
ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列としては、例えば、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡを用いることができる。ＲＮＡ干渉により、標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列の塩基数は、特に制限されず、例えば１９〜３０塩基であり、好ましくは１９〜２１塩基である。
【００４４】
Ａ１領域およびＢ１領域のいずれか一方または両者は、同じ標的遺伝子に対する同一の発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。Ａ１領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、Ｘ１領域、Ｙ１領域およびＺ１領域のいずれか一領域または二領域以上でもよいし、二領域以上に架かる領域であってもよい。Ｂ１領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、Ｘ２領域、Ｙ２領域およびＺ２領域のいずれか一領域または二領域以上でもよいし、二領域以上に架かる領域であってもよい。発現抑制配列は、標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。
【００４５】
かかる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡと５’末端に水酸基を有する第３の一本鎖ＲＮＡにリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖と前記第３の一本鎖とを連結する工程で製造される（図１参照）。
【００４６】
連結一本鎖ＲＮＡは、分子内において相補性のある配列部分が並び、分子内で部分的に二重鎖を形成しうる。連結一本鎖ＲＮＡ分子は、図１に示すように、Ｘ１領域とＸ２領域とが互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、さらにＹ１領域とＹ２領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、さらにＺ１領域とＺ２領域とが互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これらの相補性を有する配列との間で、二重鎖が形成され、ＬｗおよびＬｚのリンカー領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖部を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域（ＬｗおよびＬｚ）の形状等は、これらに限定されない。
【００４７】
Ｚ１領域、Ｙ１領域、Ｘ１領域及びＷ１領域からなるＡ１領域およびＸ２領域とＹ２領域とからなるＢ領域の少なくとも一方が、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制する配列を少なくとも一つ含んでいてもよい。例えば、Ａ１領域に標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡ配列を含み、Ｂ１領域に前記センスＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡ配列を含んでいてもよい。あるいは、例えば、Ｂ１領域に標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と同一の配列からなるセンスＲＮＡ配列を含み、Ａ１領域に前記センスＲＮＡと相補的なアンチセンスＲＮＡ配列を含んでいてもよい。
【００４８】
本態様にかかる製造方法により製造される一本鎖ＲＮＡは、リボヌクレオチドのみからなるものであってもよく、デオキシヌクレオチド、非ヌクレオチドなどを含むものであってもよく、さらには、リボヌクレオチド中のホスホロジエステル結合の酸素原子が一部硫黄原子に置換されたホスホロチオエステル結合を含むものであってもよい。本態様にかかる製造方法により製造される一本鎖ＲＮＡは、好ましくはリボヌクレオチドのみから構成されるものである。
【００４９】
Ｌｚリンカー領域及びＬｗリンカー領域は、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、ここでのアミノ酸は天然アミノ酸及び人工アミノ酸のいずれであってもよく、また、置換基又は保護基を有するものであってもよい。
【００５０】
Ｌｚリンカー領域としては、例えば、下記式（Ｉ）で表される二価の基が挙げられる。
【００５１】
【化１１】
2019189591.tif 000013
【００５２】
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ１領域及びＺ２領域のいずれか一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、Ｚ２領域及びＺ１領域のＹ１１とは結合していない他方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【００５３】
また、Ｌｗリンカー領域としては、下記式（Ｉ’）で表される二価の基が挙げられる。
【００５４】
【化１２】
2019189591.tif 000014
【００５５】
（式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
リンカーＬｗ領域のＹ’１１に結合している末端の酸素原子は、Ｗ１領域及びＷ２領域の何れか一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、Ｗ２領域及びＷ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【００５６】
前記炭素数１〜２０のアルキレン基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数４〜６のアルキレン基である。前記アルキレン基としては、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、イソプロピレン基、ｎ−ブチレン基、イソブチレン基、ｔｅｒｔ−ブチレン基、ｎ−ペンチレン基、イソペンチレン基、及びヘキシレン基等が挙げられる。
【００５７】
前記アミノ基で置換されていてもよいアルキル基におけるアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状のいずれでもよく、好ましくは炭素数１〜１０のアルキル基、より好ましくは炭素数１〜５のアルキル基である。前記アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロビル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、及びヘキシル基等が挙げられる。前記アミノ基で置換されていてもよいアルキル基としては、前記例示したアルキル基の水素原子の一部がアミノ基で置換されたものもまた例示される。
【００５８】
前記アミノ基で置換されていてもよいアルキル基が有し得るアミノ基の数は特に制限されず、好ましくは１である。また、前記アミノ基で置換されていてもよいアルキル基におけるアミノ基の置換位置も特に制限されず、いずれの位置であってもよい。アミノ基で置換されたアルキル基としては、例えば、４−アミノブチル基が挙げられる。
【００５９】
上記式（Ｉ）及び（Ｉ’）のいずれかで表される二価の基の好ましい具体例としては、下記式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基が挙げられる。
【００６０】
【化１３】
2019189591.tif 000015
【００６１】
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【００６２】
ｎ及びｍは、好ましくは４〜６であり、ｎとｍは同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００６３】
本態様にかかる製造方法で用いる第１〜第３の一本鎖ＲＮＡの一例を図１及び図２に示す。図１の上の模式図では第１〜第３の一本鎖ＲＮＡを示し、図１の下の模式図ではリガーゼで結合させて一本鎖ＲＮＡとした状態を示している。図２では第１〜第３の一本鎖ＲＮＡを直線状に並べた状態を示している。
【００６４】
本明細書及び図面において示す配列においては、「ｐ」の略号は、５’末端の水酸基がリン酸基で修飾されていることを示す。また、配列中の「Ｐ」の略号は、下記構造式（ＩＩＩ−Ａ）で表されるアミダイトを用いて導入される構造であって、下記式で表される構造を示す。
【００６５】
【化１４】
2019189591.tif 000016
【００６６】
本態様にかかる製造方法で用いる第１〜第３の一本鎖ＲＮＡの製造方法は、特に制限されず、公知の固相合成法、液相合成法等や、公知の核酸合成装置等を用いて化学的に合成することができる。そのような合成方法としては、例えば、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法などが挙げられる。
【００６７】
一本鎖ＲＮＡの５’位のリン酸化には、５’末端のリン酸化用のアミダイトを固相合成にて使用してもよい。５’リン酸化アミダイトは市販のアミダイトを使用することができる。また、固相合成にて、５’末端が水酸基であるＲＮＡ分子を合成しておき、脱保護を行った後に、市販のリン酸化剤にてリン酸化することで５’末端にリン酸基を有する一本鎖ＲＮＡを調製することができる。リン酸化剤としては、たとえば下記構造式（ＩＩＩ−ａ）で示される市販のＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ(Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ)などが知られている（欧州特許出願公開第０８１６３６８号明細書）。
【００６８】
【化１５】
2019189591.tif 000017
【００６９】
また、Ｌｚ及びＬｗのリンカー領域については、以下に示すようなアミダイトを使用して、同様に核酸合成機にて調製することができる。リンカー領域のアミダイトとしては、例えば、下記構造式（ＩＩＩ−ｂ）に示されるプロリン骨格を有するアミダイトは国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ４に記載の方法にて調製でき、下記構造式（ＩＩＩ−ｃ）、（ＩＩＩ−ｄ）及び（ＩＩＩ−ｅ）のそれぞれで表される下記のアミダイトは国際公開第２０１３／１０３１４６号の実施例Ａ１〜Ａ３に記載の方法にて調製することができる。
【００７０】
【化１６】
2019189591.tif 000018
【００７１】
【化１７】
2019189591.tif 000019
【００７２】
【化１８】
2019189591.tif 000020
【００７３】
【化１９】
2019189591.tif 000021
【００７４】
本態様にかかる製造方法において使用するＲＮＡリガーゼは、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有する。当該ＲＮＡリガーゼとは、ATP + (ribonucleotide)n-3'-hydroxyl + 5'-phospho-(ribonucleotide)m <=> (ribonucleotide)n+m + AMP + diphosphateの反応を触媒する酵素であって、二本鎖核酸におけるニックを修復する活性を有するものである。
【００７５】
かかるＲＮＡリガーゼとしては、たとえば、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２が例示される。このＲＮＡリガーゼ２は、例えば、（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）から購入できる。さらに、ＲＮＡリガーゼとしては、ビブリオファージ（ｖｉｂｒｉｏｐｈａｇｅ）ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼ、若しくはＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ  ＲＮＡリガーゼが例示される。かかるＲＮＡリガーゼは、たとえば、非特許文献（Structure and Mechanism of RNA Ligase, Structure, Vol.12, PP.327-339.）に記載の方法で各生物から抽出および精製することで得られたものを用いることもできる。
【００７６】
Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼも使用可能である。かかるＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号１０に記載のアミノ酸配列の酵素のほかに、その変異体であるＴ３９Ａ，Ｆ６５Ａ，Ｆ６６Ａ（RNA ligase structures reveal the basis for RNA specificity and conformational changes that drive ligation forward, Cell. Vol.127,pp.71-84.参照）などを例示することができる。かかるＲＮＡリガーゼ２は、例えば、前記文献の記載に基づき、ＡＴＣＣ（登録商標）１１３０３としてＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４を用いる方法やＰＣＲ等の方法で得ることが可能である。
【００７７】
ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２は、非特許文献（Characterization ofbacteriophage KVP40 and T4 RNA ligase 2, Virology, vol. 319, PP.141-151.）に記載の方法で取得することができる。具体的には、例えば、以下のような方法で取得できる。すなわち、バクテリオファージＫＶＰ４０（例えば、寄託番号Ｇｏ００８１９９としてＪＧＩに寄託されている）から抽出したＤＮＡのうち、オープンリーディングフレーム２９３を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩによって制限酵素消化したのちに、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅させる。得られたＤＮＡをプラスミドベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込む。または、当該のＤＮＡ配列をＰＣＲによって人工合成することもできる。ここで、ＤＮＡ配列解析により、所望の変異体を得ることができる。続いて、得られたベクターＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に組み込み、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地中にて培養する。イソプロピル−β−チオガラクトシドを０．５ｍＭになるように添加し、３７℃で３時間培養する。その後の操作はすべて４℃で行うことが好ましい。まず、遠心操作により菌体を沈殿させ、沈殿物を−８０℃にて保管する。凍った菌体にバッファーＡ［５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．２Ｍ  ＮａＣｌ，１０％スクロース］を加える。そして、リゾチームとＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加え、超音波によって菌体を破砕し、目的物を溶出させる。その後、アフィニティクロマトグラフィやサイズ排除クロマトグラフィなどを利用して目的物を単離する。そして、得られた水溶液を遠心ろ過し、溶離液をバッファーに置換することによりリガーゼとして使用することができる。
このようにして、ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２を得ることができる。ＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２としては、配列番号１１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼが使用可能である。
【００７８】
Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼは非特許文献（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）に記載の方法で取得することができる。例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−８１６としてＡＴＣＣに寄託されている生物学的な材料から、前記リガーゼを得ることも可能である。Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼとしては、配列番号１２のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、二本鎖ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを使用可能である。かかるリガーゼとしては、具体的には、配列番号１２のアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼに加えて、配列番号１２のＲＮＡリガーゼにおいて、Ｋ１６５ＡあるいはＥ２７８Ａの変異を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼが例示される（An RNA Ligase from Deinococcus radiodurans, J Biol Chem., Vol. 279, No.49, PP. 50654-61.）。
【００７９】
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼは非特許文献（Assiciation of Two Novel Proteins TbMP52 and TbMP48 with the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex, Vol.21, No.2, PP.380-389.）に記載の方法で取得することができる。
【００８０】
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ  ＲＮＡリガーゼは非特許文献（The Mitochondrial RNA Ligase from Leishmania tarentolae Can Join RNA Molecules Bridged by a Complementary RNA, Vol. 274, No.34, PP.24289-24296）に記載の方法で取得することができる。
【００８１】
中でも、ＲＮＡリガーゼとしては、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ  ２が好ましい。
【００８２】
本態様にかかる製造方法おいて、第１〜第３の一本鎖ＲＮＡにＲＮＡリガーゼを作用させる反応条件は、ＲＮＡリガーゼが機能し所望の一本鎖ＲＮＡを製造できる条件である限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【００８３】
ＲＮＡリガーゼの使用量は、連結する第１〜第３の一本鎖ＲＮＡの量、反応温度及び反応時間に応じて、適切な使用量を適宜設定することができる。ＲＮＡリガーゼの反応時間は、例えば、０．５〜１４４時間の範囲から選択される。ＲＮＡリガーゼ処理のｐＨは、使用酵素の至適ｐＨに対応して適宜設定することができ、例えば、ｐＨ４〜９の範囲から選択される。ＲＮＡリガーゼ処理の温度は、使用酵素の至適温度に対応して適宜設定することができ、例えば、０〜５０℃の範囲から選択される。
【００８４】
第１〜第３の一本鎖ＲＮＡにＲＮＡリガーゼを作用させる反応液には、これらの他に、緩衝液、金属塩、ＡＴＰ等が含まれていてもよい。緩衝液としては、例えばトリス−塩酸緩衝液、ＡＴＰ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。金属塩としては、例えば、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
【００８５】
ＲＮＡリガーゼを作用させて製造した一本鎖ＲＮＡを含む粗生成物は、ＲＮＡを沈殿、抽出及び精製する方法を用いることで通常、単離することができる。具体的には、反応後の溶液にエタノール、イソプロピルアルコールなどのＲＮＡに対して溶解性の低い溶媒を加えることでＲＮＡを沈殿させる方法や、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(例えば、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５／２４／１)の溶液を反応溶液に加え、ＲＮＡを水層に抽出させる方法が採用される。その後、逆相カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー等の公知の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の手法などにより単離、精製することができる。
【００８６】
［第二の態様］
次いで本発明の第二の態様について説明する。
本発明の第二の態様は、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法である。前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡとのを連結により生成する一本鎖ＲＮＡは、５’末端側から順に、Ｘ２ａ領域、Ｙ２ａ領域、Ｌｚリンカー領域、Ｙ１ａ領域、Ｘ１ａ領域、Ｗ１ａ領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２ａ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである（図９参照）。本態様にかかる製造方法は、以下のａ）〜ｇ）により規定される。
ａ）第１の一本鎖ＲＮＡは、５’末端側から順に、Ｙ２ａ領域、Ｌｚリンカー領域、Ｙ１ａ領域、Ｘ１ａ領域、Ｗ１ａ領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡである。
ｂ）第２の一本鎖ＲＮＡは、Ｘ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡである。
ｃ）Ｘ１ａ領域とＸ２ａ領域とは、互いに相補的な、４以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む。
ｄ）Ｙ１ａ領域とＹ２ａ領域は、互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含む。
ｅ）Ｗ１ａ領域及びＷ２ａ領域は、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含む。
ｆ）Ｌｗリンカー領域及びＬｚリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域である。Ｌｗリンカー領域およびＬｚリンカー領域は、前記第一の態様において説明したとおりである。
【００８７】
前記連結一本鎖ＲＮＡは、Ｙ１ａ領域とＸ１ａ領域とＷ１ａ領域とからなるＡ領域、および、Ｘ２ａ領域とＹ２ａ領域とからなるＢ領域の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含んでいてもよい。そのようなヌクレオチド配列として、ＲＮＡ干渉法により標的遺伝子の発現を抑制する配列を含んでいてもよい。
【００８８】
Ａ領域およびＢ領域のいずれか一方または両者は、同じ標的遺伝子に対する同一の発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。Ａ領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、Ｘ１ａ領域およびＹ１ａ領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。Ｂ領域が、２つ以上の発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、Ｘ２ａ領域およびＹ２ａ領域のいずれか一領域または両者でもよいし、両者に架かる領域であってもよい。発現抑制配列は、標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。
【００８９】
かかる連結一本鎖ＲＮＡは、５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡと３’末端に水酸基を有する第２の一本鎖ＲＮＡとにリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖とを連結する工程で製造される（図９参照）。
【００９０】
連結一本鎖ＲＮＡは、分子内において相補性のある配列部分が並び、分子内で部分的に二重鎖を形成しうる。連結一本鎖ＲＮＡ分子は、図９に示すように、Ｘ１ａ領域とＸ２ａ領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、さらにＹ１ａ領域とＹ２ａ領域が互いに相補性を有するヌクレオチド配列を含み、これらの相補性を有する配列との間で、二重鎖が形成され、ＬｗおよびＬｚのリンカー領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図９は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖部を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域（ＬｗおよびＬｚ）の形状等は、これらに限定されない。
【００９１】
Ｙ１ａ領域とＸ１ａ領域とＷ１ａ領域とからなるＡ領域およびＸ２ａ領域とＹ２ａ領域とからなるＢ領域の少なくとも一方が、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制する配列を少なくとも一つ含んでいてもよい。連結一本鎖ＲＮＡにおいて、Ａ領域とＢ領域とは、完全に相補的でもよいし、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１若しくは数個のヌクレオチドは、例えば、１〜３個のヌクレオチド、好ましくは１または２個のヌクレオチドである。Ｙ１ａ領域は、Ｙ２ａ領域の全領域に対して相補的なヌクレオチド配列を有している。Ｙ１ａ領域とＹ２ａ領域とは、互いに完全に相補的なヌクレオチド配列であり、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。Ｘ１ａ領域は、Ｘ２ａ領域の全領域に対して相補的なヌクレオチド配列を有している。Ｘ１ａ領域とＸ２ａ領域とは、互いに完全に相補的なヌクレオチド配列であり、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列である。本実施形態の製造方法では、Ｗ１ａ領域およびＷ２ａ領域は、任意の数のヌクレオチド配列を含む領域であり、必須の配列ではなく、ヌクレオチドの数が０の態様であってもよく、１以上のヌクレオチドを含む態様であってもよい。
【００９２】
以下に各領域の長さを例示するが、これに限定されない。
【００９３】
連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｗ２ａ領域のヌクレオチド数（Ｗ２ａｎ）と、Ｘ２ａ領域のヌクレオチド数（Ｘ２ａｎ）およびＹ２領域のヌクレオチド数（Ｙ２ａｎ）との関係は、例えば、下記式（１）の条件を満たす。Ｗ１a領域のヌクレオチド数（Ｗ１ａｎ）と、Ｘ１a領域のヌクレオチド数（Ｘ１ａｎ）およびＹ１ａ領域のヌクレオチド数（Ｙ１ａｎ）との関係は、例えば、下記式（２）の条件を満たす。
Ｗ２ａｎ≦Ｘ２ａｎ＋Ｙ２ａｎ    ・・・（１）
Ｗ１ａｎ≦Ｘ１ａｎ＋Ｙ１ａｎ    ・・・（２）
【００９４】
連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１領域のヌクレオチド数（Ｘ１ａｎ）とＹ１ａ領域のヌクレオチド数（Ｙ１ａｎ）との関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれかの条件を満たす。
Ｘ１ａｎ＝Ｙ１ａｎ    ・・・（３）
Ｘ１ａｎ＜Ｙ１ａｎ    ・・・（４）
Ｘ１ａｎ＞Ｙ１ａｎ    ・・・（５）
【００９５】
本実施形態の方法において、Ｘ１ａ領域のヌクレオチド数（Ｘ１ａｎ）、即ちＸ２ａ領域のヌクレオチド数（Ｘ２ａｎ）は、２以上であり、好ましくは４以上であり、より好ましくは１０以上である。
Ｙ１ａ領域のヌクレオチド数（Ｙ１ａｎ）、即ちＹ２ａ領域のヌクレオチド数（Ｙ２ａｎ）は、１以上であり、好ましくは２以上であり、より好ましくは４以上である。
【００９６】
Ｗ１ａ領域は、好ましくは、Ｗ２ａ領域の全領域またはＷ２ａ領域の部分領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含む。Ｗ１ａ領域とＷ２ａ領域とは、１もしくは数ヌクレオチドが非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。
【００９７】
より詳しくは、Ｗ２ａ領域は、Ｗ１ａ領域よりも、１ヌクレオチド以上短いヌクレオチド配列からなることが好ましい。この場合、Ｗ２ａ領域のヌクレオチド配列全体が、Ｗ１ａ領域の任意の部分領域の全てのヌクレオチドと相補的となる。Ｗ２ａ領域の５’末端から３’末端までのヌクレオチド配列は、Ｗ１ａ領域の３’末端のヌクレオチドから始まり５’末端に向かってのヌクレオチド配列と相補性のある配列であることがより好ましい。
【００９８】
連結一本鎖ＲＮＡ分子において、Ｘ１ａ領域のヌクレオチド数（Ｘ１ａｎ）とＸ２ａ領域の塩基数（Ｘ２ａｎ）との関係、Ｙ１ａ領域のヌクレオチド数（Ｙ１ａｎ）とＹ２ａ領域のヌクレオチド数（Ｙ２ａｎ）との関係、並びにＷ１ａ領域のヌクレオチド数（Ｗ１ａｎ）とＷ２ａ領域のヌクレオチド数（Ｗ２ａｎ）との関係は、下記式（６）、（７）および（８）の条件をそれぞれ満たす。
Ｘ１ａｎ＝Ｘ２ａｎ    ・・・（６）
Ｙ１ａｎ＝Ｙ２ａｎ    ・・・（７）
Ｗ１ａｎ≧Ｗ２ａｎ    ・・・（８）
【００９９】
連結一本鎖ＲＮＡにおいて、リンカー領域（Ｌｗ、Ｌｚ）を除くヌクレオチド数の合計は、下限が、典型的には、３８であり、好ましくは４２であり、より好ましくは５０であり、さらに好ましくは５１であり、特に好ましくは５２であり、上限が、典型的には、３００であり、好ましくは２００であり、より好ましくは１５０であり、さらに好ましくは１００であり、特に好ましくは８０である。
【０１００】
連結一本鎖ＲＮＡにおいて、ＬｗおよびＬｚのリンカー領域の長さは、特に制限されない。これらのリンカー領域は、例えば、Ｘ１ａ領域とＸ２ａ領域とが二重鎖を形成可能な長さ、あるいはＹ１ａ領域とＹ２ａ領域とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。ＬｗおよびＬｚの各リンカー領域は、アミノ酸から誘導される原子団を有する領域である。これらのリンカー領域（Ｌｗ、Ｌｚ）は、通常、非ヌクレオチドのリンカー領域である。
【０１０１】
リンカー領域の主鎖を形成する原子の数は、その上限は、典型的には、１００であり、好ましくは８０であり、より好ましくは５０である。
【０１０２】
Ｌｗリンカー領域は、例えば、上記式（Ｉ）で表される二価の基であり、Ｌｚリンカーは、例えば、上記式（Ｉ’）で表される二価の基である。
【０１０３】
第二の態様において、第１および第２の一本鎖ＲＮＡにＲＮＡリガーゼを作用させる反応条件は、ＲＮＡリガーゼが機能し所望の一本鎖ＲＮＡを製造できる条件である限り特に制限されず、適宜設定することができる。
【０１０４】
ＲＮＡリガーゼとしては、前記第一の態様において例示したものと同じものが使用できる。ＲＮＡリガーゼの使用量は、連結する第１〜第３の一本鎖ＲＮＡの量、反応温度及び反応時間に応じて、適切な使用量を適宜設定することができる。ＲＮＡリガーゼの反応時間は、例えば、０．５〜１４４時間の範囲から選択される。ＲＮＡリガーゼ処理のｐＨは、使用酵素の至適ｐＨに対応して適宜設定することができ、例えば、ｐＨ４〜９の範囲から選択される。ＲＮＡリガーゼ処理の温度は、使用酵素の至適温度に対応して適宜設定することができ、例えば、０〜５０℃の範囲から選択される。
【０１０５】
第１および第２の一本鎖ＲＮＡにＲＮＡリガーゼを作用させる反応液には、これらの他に、緩衝液、金属塩、ＡＴＰ等が含まれていてもよい。緩衝液としては、例えばトリス−塩酸緩衝液、ＡＴＰ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。金属塩としては、例えば、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
【０１０６】
ＲＮＡリガーゼを作用させて製造した一本鎖ＲＮＡを含む粗生成物は、ＲＮＡを沈殿、抽出及び精製する方法を用いることで通常、単離することができる。具体的には、反応後の溶液にエタノール、イソプロピルアルコールなどのＲＮＡに対して溶解性の低い溶媒を加えることでＲＮＡを沈殿させる方法や、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（例えば、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール＝２５／２４／１）の溶液を反応溶液に加え、ＲＮＡを水層に抽出させる方法が採用される。その後、逆相カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティカラムクロマトグラフィー等の公知の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の手法などにより単離、精製することができる。
【０１０７】
本発明の方法により製造した一本鎖ＲＮＡの中で、標的となる遺伝子の発現を抑制できるものは、遺伝子が原因となる疾患の治療又は予防剤として使用することができる。
【０１０８】
２０塩基長程度の一本鎖ＲＮＡを化学合成する場合は、約５０塩基長あるいはそれ以上の一本鎖ＲＮＡを化学合成する場合と比べて収率及び収量の点で優れている。そのため、約５０塩基長程度又はそれ以上の一本鎖ＲＮＡを化学合成するより、２０塩基長程度の一本鎖ＲＮＡを化学合成しライゲーションして連結することで、高い収率及び収量が得られる上、ライゲーションされなかったＲＮＡ鎖は精製で容易に除去可能であるため品質においても優れている。
【０１０９】
それ故、本発明の製造方法によれば、約５０塩基長又はそれ以上の一本鎖ＲＮＡを高い収率、収量及び品質で製造することができる。また、ＲＮＡ干渉により標的遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含ませることにより、結果として、ＲＮＡ干渉法に利用できる一本鎖ＲＮＡを、効率的に製造可能となり、コストの低減が期待される。
【実施例】
【０１１０】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。【０１１１】
・実施例１
１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖Ｉ）を合成した。当該鎖は１１塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。【０１１２】
鎖Ｉ：pCUCUGCUUCPG  (5'-3')
当該一本鎖ＲＮＡは、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機(商品名ＮＴＳ  Ｍ−４ＭＸ−Ｅ、日本テクノサービス株式会社)を用いて３’側から５’側に向かって合成した。【０１１３】
当該合成には、ＲＮＡアミダイトとして、国際公開第２０１３／０２７８４３号の実施例２に記載のウリジンＥＭＭアミダイト、実施例３に記載のシチジンＥＭＭアミダイト、実施例４に記載のアデノシンＥＭＭアミダイト、実施例５に記載のグアノシンＥＭＭアミダイト、及び国際公開第２０１２／０１７９１９号の実施例Ａ３に記載のプロリンアミダイト（ＩＩＩｂ）を使用し、５’リン酸化にはＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、固相担体として多孔質ガラスを使用し、デブロッキング溶液として高純度トリクロロ酢酸トルエン溶液を使用し、縮合剤として５−ベンジルメルカプト−１Ｈ−テトラゾールを使用し、酸化剤としてヨウ素溶液を使用し、キャッピング溶液としてフェノキシ酢酸溶液とＮ−メチルイミダゾール溶液とを使用して行った。【０１１４】
固相合成後の固相担体からの切出しと脱保護は、国際公開第２０１３／０２７８４３号に記載の方法に従った。すなわち、アンモニア水溶液とエタノールとを加え、しばらく静置した後に固相担体をろ過し、その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドを用いて水酸基の脱保護を行った。得られたＲＮＡを注射用蒸留水によって用いて所望の濃度となるように溶解した。【０１１５】
２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１の鎖ＩＩ）を合成した。当該鎖は２６塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。【０１１６】
鎖ＩＩ：pCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUA  (5'-3')（配列番号１）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。【０１１７】
３．第３の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図１の鎖ＩＩＩ）を合成した。前記鎖は１６塩基長からなり、第３の一本鎖ＲＮＡに対応する。【０１１８】
鎖ＩＩＩ：AGCAGAGUACACACAG  (5'-3')（配列番号２）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。【０１１９】
４．ライゲーション
次に、ライゲーション反応を、１６．２μＭ  ＲＮＡ  二本鎖、５０ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ  ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭ  ＡＴＰの組成で、反応スケール０．２ｍＬで行った。【０１２０】
上記第１〜第３のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記及び図４に示す。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'（配列番号３、４）【０１２１】
具体的には、まず、第１のＲＮＡ鎖が５．８μＭ、第２のＲＮＡ鎖が５．８μＭ、第３の鎖が７．６μＭとなるよう、５００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、４０００μＭ  ＡＴＰ緩衝液（１０ｘ緩衝液）１２８μＬ及び注射用蒸留水を１．５ｍＬチューブ内に加え、３７℃水浴中に１０分静置した。その後、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ  ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を上記の組成と反応スケールになるように加え、３７℃で３時間インキュベートした。反応後、０．２Ｍ  エチレンジアミン四酢酸５μＬに反応液５０μＬを加え、この溶液を表１のＬＣ条件で分析した。【０１２２】
【表１】
2019189591.tif 000022
【０１２３】
ＨＰＬＣ分析の結果、反応後、第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ及び第３の一本鎖ＲＮＡが減少し、リテンションタイムが遅れた新たなピークが２本観察された（図５）。【０１２４】
この溶出ピークを質量分析測定によって分子量を確認したところ、リテンションタイムの小さいピークは、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡとが結合した第４の一本鎖ＲＮＡであることが確認できた。また、リテンションタイムの大きいピークは、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡとが結合した目的の連結一本鎖ＲＮＡであることが確認できた（測定値：１７０２５．４８３６、理論値１７０２５．４６７２）。【０１２５】
反応後の溶液をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムにおける原料及び生成物の面積値からそれぞれを定量した。【０１２６】
その定量値から、以下の式にて転化率を算出した結果、転化率は２２％であった。
転化率＝｛連結一本鎖ＲＮＡ量／（第２の一本鎖ＲＮＡ量＋第４の一本鎖ＲＮＡ量＋連結一本鎖ＲＮＡ量）｝【０１２７】
・実施例２
１．第１の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖ＩＶ）を合成した。当該鎖は１４塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡに対応する。【０１２８】
鎖ＩＶ：pGUACUCUGCUUCPG  (5'-3')（配列番号５）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。【０１２９】
２．第２の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖Ｖ）を合成した。当該鎖は１９塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。【０１３０】
鎖Ｖ：pUACCPGGUAUAUGCUGUGU  (5'-3') （配列番号６）【０１３１】
３．第３の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖ＶＩ）を合成した。当該鎖は２０塩基長からなり、第３の一本鎖ＲＮＡに対応する。【０１３２】
鎖ＶＩ：AGCAGAGUACACACAGCAUA  (5'-3')（配列番号７）【０１３３】
４．ライゲーション
上記第１〜第３のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記及び図６に示す。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'（配列番号３、４）【０１３４】
上記と同様にライゲーション及び分析を行った。【０１３５】
ＨＰＬＣ分析の結果、反応後、第１の一本鎖ＲＮＡ、第２の一本鎖ＲＮＡ及び第３の一本鎖ＲＮＡが減少し、リテンションタイムが遅れた新たなピークが２本観察された。【０１３６】
この溶出ピークを質量分析測定によって分子量を確認したところ、リテンションタイムの小さいピークは、第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖核ＲＮＡが結合した第４の一本鎖核酸であることが確認できた。また、リテンションタイムの大きいピークは、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡと第３の一本鎖ＲＮＡとが結合して目的の連結一本鎖ＲＮＡであることが確認できた（測定値：１７０２５．４７７９、理論値：１７０２５．４６７２）。【０１３７】
反応後の溶液をＨＰＬＣ（波長２６０ｎｍ）によって各成分に分離し、得られたクロマトグラムにおける原料及び生成物の面積値からそれぞれを定量した。【０１３８】
その定量値から、以下の式にて転化率を算出した結果、転化率は７１％であった。
転化率＝｛連結一本鎖ＲＮＡ量／（第２の一本鎖ＲＮＡ量＋第４の一本鎖ＲＮＡ量＋連結一本鎖ＲＮＡ量）｝【０１３９】
・実施例３
１．第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成する一本鎖ＲＮＡ合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖ＶＩＩ）を合成した。当該鎖は３７塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成するＲＮＡに対応する。【０１４０】
鎖ＶＩＩ：pCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG  (5'-3')（配列番号４）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。【０１４１】
２．ライゲーション
上記第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成するＲＮＡおよび第３の一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖ＩＩＩ）をライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記及び図６に示す。
5'-CAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'（配列番号３、４）【０１４２】
次に、ライゲーション反応を、１６．２μＭ  ＲＮＡ二本鎖、５０ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭ  ＡＴＰの組成で、反応スケール２１ｍＬで行った。【０１４３】
反応後、反応液を表２に記載の条件を用いて、カラムクロマトグラフィー精製した。得られた画分をＨＰＬＣにより分析し、純度９０％以上の画分（クロマトグラムにおいて検出されるピークの総面積に対して目的物のピーク面積が占める比率が、９０％以上の割合となる画分）を集めて混合した。その結果、純度９１％、総収率１１％で目的物を得ることができた。また、得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた（測定値：１７０２５．４７５２、理論値：１７０２５．４６７２）。ここで、総収率とは、仕込んだ固相担体の量に対する、ライゲーション反応後の生成物を精製して得られた一本鎖ＲＮＡの量の割合である。前記ＲＮＡの量は、波長２６０ｎｍの紫外線の吸光度に基づき求められる。吸光度が１を示す場合のＲＮＡの濃度を３３μｇ／ｍＬとして求めた値である。【０１４４】
【表２】
2019189591.tif 000023
【０１４５】
・実施例４
１．第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成する一本鎖ＲＮＡ合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖ＶＩＩＩ）を合成した。当該鎖は３３塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成するＲＮＡに対応する。【０１４６】
鎖ＶＩＩＩ：pUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG  (5'-3')（配列番号４）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。【０１４７】
２．ライゲーション
上記第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成するＲＮＡおよび第３のＲＮＡ（図３、鎖ＶＩ）をライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記及び図６に示す。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'（配列番号３、４）【０１４８】
次に、ライゲーション反応を、１６．２μＭ  ＲＮＡ二本鎖、５０ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭ  ＡＴＰの組成で、反応スケール１９ｍＬで行った。【０１４９】
反応後、反応液を表２に記載の条件を用いて、カラムクロマトグラフィー精製した。得られた画分をＨＰＬＣにより分析し、純度９０％以上の画分（クロマトグラムにおいて検出されるピークの総面積に対して目的物のピーク面積が占める比率が、９０％以上の割合となる画分）を集めて混合した。その結果、純度９４％、総収率１１％で目的物を得ることができた。また、得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた（測定値：１７０２５．４８３１、理論値：１７０２５．４６７２）。ここで、総収率とは、仕込んだ固相担体の量に対する、ライゲーション反応後の生成物を精製して得られた一本鎖ＲＮＡの量の割合である。前記ＲＮＡの量は、波長２６０ｎｍの紫外線の吸光度に基づき求められる。吸光度が１を示す場合のＲＮＡの濃度を３３μｇ／ｍＬとして求めた値である。【０１５０】
・実施例５
１．第１の一本鎖核酸と第２の一本鎖核酸から生成する一本鎖核酸合成
以下に示す一本鎖核酸（図３の鎖ＩＸ）を合成した。当該鎖は３１塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成するＲＮＡに対応する。【０１５１】
鎖ＩＸ：pCCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG  (5'-3')（配列番号４）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。【０１５２】
２．第３の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖Ｘ）を合成した。当該鎖は２２塩基長からなり、第２の一本鎖核酸に対応する。【０１５３】
鎖Ｘ：AGCAGAGUACACACAGCAUAUA  (5'-3')（配列番号８）【０１５４】
３．ライゲーション
上記第１〜第３のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記及び図６に示す。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'（配列番号３、４）【０１５５】
次に、ライゲーション反応を、１６．２μＭ  ＲＮＡ二本鎖、５０ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭ  ＡＴＰの組成で、反応スケール１７ｍＬで行った。【０１５６】
反応後、反応液を表２に記載の条件を用いて、カラムクロマトグラフィー精製した。得られた画分をＨＰＬＣにより分析し、純度９０％以上の画分（クロマトグラムにおいて検出されるピークの総面積に対して目的物のピーク面積が占める比率が、９０％以上の割合となる画分）を集めて混合した。その結果、純度９３％、総収率１２％で目的物を得ることができた。また、得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた（測定値：１７０２５．５００４、理論値：１７０２５．４６７２）。ここで、総収率とは、仕込んだ固相担体の量に対する、ライゲーション反応後の生成物を精製して得られた一本鎖ＲＮＡの量の割合である。前記ＲＮＡの量は、波長２６０ｎｍの紫外線の吸光度に基づき求められる。吸光度が１を示す場合のＲＮＡの濃度を３３μｇ／ｍＬとして求めた値である。【０１５７】
・実施例６
１．第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成する一本鎖ＲＮＡ合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖ＸＩ）を合成した。当該鎖は３０塩基長からなり、第１の一本鎖ＲＮＡと第２の一本鎖ＲＮＡから生成するＲＮＡに対応する。【０１５８】
鎖ＸＩ：pCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG  (5'-3')（配列番号４）
当該一本鎖ＲＮＡは、上記と同様の方法により合成した。【０１５９】
２．第３の一本鎖ＲＮＡの合成
以下に示す一本鎖ＲＮＡ（図３の鎖ＸＩＩ）を合成した。当該鎖は２３塩基長からなり、第２の一本鎖ＲＮＡに対応する。【０１６０】
鎖ＸＩＩ：AGCAGAGUACACACAGCAUAUAC  (5'-3')（配列番号９）【０１６１】
３．ライゲーション
上記第１〜第３のＲＮＡをライゲーションすることで得られる連結一本鎖ＲＮＡを下記及び図６に示す。
5'-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACCPGGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUCPG-3'（配列番号３、４）【０１６２】
次に、ライゲーション反応を、１６．２μＭ  ＲＮＡ二本鎖、５０ｕｎｉｔｓ／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、４００μＭ  ＡＴＰの組成で、反応スケール１８ｍＬで行った。【０１６３】
反応後、反応液を表２に記載の条件を用いて、カラムクロマトグラフィー精製した。得られた画分をＨＰＬＣにより分析し、純度９０％以上の画分（クロマトグラムにおいて検出されるピークの総面積に対して目的物のピーク面積が占める比率が、９０％以上の割合となる画分）を集めて混合した。その結果、純度９３％、総収率１７％で目的物を得ることができた。また、得られた試料を質量分析測定によって測定した結果、計算値と合致していることから、目的物が得られていることが確認できた（測定値：１７０２５．５０３１、理論値：１７０２５．４６７２）。ここで、総収率とは、仕込んだ固相担体の量に対する、ライゲーション反応後の生成物を精製して得られた一本鎖ＲＮＡの量の割合である。前記ＲＮＡの量は、波長２６０ｎｍの紫外線の吸光度に基づき求められる。吸光度が１を示す場合のＲＮＡの濃度を３３μｇ／ｍＬとして求めた値である。
【図１】
2019189591.tif 000034
【図２】
2019189591.tif 000035
【図３】
2019189591.tif 000036
【図４】
2019189591.tif 000037
【図５】
2019189591.tif 000038
【図６】
2019189591.tif 000039
【図７】
2019189591.tif 000040
【図８】
2019189591.tif 000041
【図９】
2019189591.tif 000042
【配列表】
2019189591000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月2日(2020.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡと５’末端に水酸基を有する第３の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ１領域、Ｗ１領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｚ２領域、Ｌｚリンカー領域、Ｚ１領域及びＹ１領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｃ）前記第３の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｘ２領域及びＹ２領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｄ）前記Ｘ１領域と前記Ｘ２領域とが互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｅ）前記Ｙ１領域と前記Ｙ２領域とが互いに相補的な、２以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｆ）前記Ｚ１領域と前記Ｚ２領域とが互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｇ）前記Ｗ１領域及び前記Ｗ２領域が、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含み、
ｈ）前記Ｌｚリンカー領域及び前記Ｌｗリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
ｉ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
製造方法。
【請求項２】
前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基である、請求項１に記載の製造方法。
【化１】
2019189591.tif 000043
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ１１とは結合していな他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項３】
前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｗリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、請求項２に記載の製造方法。
【化２】
2019189591.tif 000044
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ１領域および前記Ｚ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｚ２領域および前記Ｚ１領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【化３】
2019189591.tif 000045
（式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子、又はアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ１領域および前記Ｗ２領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ２領域および前記Ｗ１領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表される二価の基が、下記式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項２又は３に記載の製造方法。
【化４】
2019189591.tif 000046
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項５】
前記式（Ｉ’）で表される二価の基が、下記式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項３又は４に記載の製造方法。
【化５】
2019189591.tif 000047
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項６】
前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡと、前記第３の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域及び前記Ｗ１領域からなる領域、並びに前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域及び前記Ｚ２領域からなる領域の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域、前記Ｙ１領域、前記Ｘ１領域、前記Ｗ１領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第３のＲＮＡと反応させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記第２の一本鎖ＲＮＡと前記第３のＲＮＡ鎖から生成する一本鎖ＲＮＡであって、５’末端側から順に、前記Ｘ２領域、前記Ｙ２領域、前記Ｚ２領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｚ１領域及び前記Ｙ１領域からなる一本鎖ＲＮＡを、前記第１のＲＮＡと反応させる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
５’末端にリン酸基を有する第１の一本鎖ＲＮＡ及び第２の一本鎖ＲＮＡに、国際生化学・分子生物学連合が酵素番号として定めるＥＣ６．５．１．３に分類され、ニック修復活性を有するＲＮＡリガーゼを作用させ、前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとを連結する工程を含む一本鎖ＲＮＡの製造方法であって、
ａ）前記第１の一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、Ｙ２ａ領域、Ｌｚリンカー領域、Ｙ１ａ領域、Ｘ１ａ領域、Ｗ１ａ領域、Ｌｗリンカー領域及びＷ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｂ）前記第２の一本鎖ＲＮＡが、Ｘ２ａ領域からなる一本鎖ＲＮＡであり、
ｃ）前記Ｘ１ａ領域と前記Ｘ２ａ領域とが、互いに相補的な、４以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｄ）前記Ｙ１ａ領域と前記Ｙ２ａ領域とが、互いに相補的な、１以上の同数のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、
ｅ）前記Ｗ１ａ領域及びＷ前記２ａ領域が、それぞれ独立に、任意の数のヌクレオチド配列を含み、
ｆ）前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｌｚリンカー領域が、それぞれ独立に、アミノ酸から誘導される原子団を有するリンカー領域であり、
ｇ）前記第１の一本鎖ＲＮＡと前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、５’末端側から順に、前記Ｘ２ａ領域、前記Ｙ２ａ領域、前記Ｌｚリンカー領域、前記Ｙ１ａ領域、前記Ｘ１ａ領域、前記Ｗ１ａ領域、前記Ｌｗリンカー領域及び前記Ｗ２ａ領域からなる連結一本鎖ＲＮＡである、
製造方法。
【請求項１０】
前記Ｌｚリンカー領域が下記式（Ｉ）で表される二価の基である、請求項９に記載の製造方法。
【化６】
2019189591.tif 000048
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域及び前記Ｙ２ａ領域のいずれかの一方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域及び前記Ｙ２ａ領域のＹ１１とは結合していない他方の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項１１】
前記Ｌｚリンカー領域が、下記式（Ｉ）で表される二価の基であり、前記Ｌｗリンカー領域が、下記式（Ｉ’）で表される二価の基である、請求項９に記載の製造方法。
【化７】
2019189591.tif 000049
（式中、Ｙ１１及びＹ２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ１２及びＹ２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ１２とＹ２２とがその末端で互いに結合して炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ１ａ領域および前記Ｙ２ａ領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｙ２ａ領域および前記Ｙ１ａ領域のＹ１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【化８】
2019189591.tif 000050
（式中、Ｙ’１１及びＹ’２１は、それぞれ独立して、炭素数１〜２０のアルキレン基を表し、Ｙ’１２及びＹ’２２は、それぞれ独立して、水素原子もしくはアミノ基で置換されていてもよいアルキル基を表すか、或いはＹ’１２とＹ’２２とがその末端で互いに結合し炭素数３〜４のアルキレン基を表し、
Ｙ’１１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ１ａ領域および前記Ｗ２ａ領域のいずれか一方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合しており、
Ｙ’２１に結合している末端の酸素原子は、前記Ｗ２ａ領域および前記Ｗ１ａ領域のＹ’１１とは結合していない他方の領域の末端ヌクレオチドのリン酸エステルのリン原子と結合している。）
【請求項１２】
前記式（Ｉ）で表される二価の基が、式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【化９】
2019189591.tif 000051
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項１３】
前記式（Ｉ’）で表される二価の基が、式（ＩＩ−Ａ）又は（ＩＩ−Ｂ）で表される二価の基である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【化１０】
2019189591.tif 000052
（式中、ｎ及びｍは、それぞれ独立して、１から２０の何れかの整数を表す。）
【請求項１４】
前記第１の一本鎖ＲＮＡと、前記第２の一本鎖ＲＮＡとの連結により生成する一本鎖ＲＮＡが、前記Ｙ１ａ領域、前記Ｘ１ａ領域及び前記Ｗ１ａ領域からなる領域、並びに前記Ｘ２ａ領域、前記Ｙ２ａ領域からなる領域の少なくとも一方に、遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２、ＫＶＰ４０由来のリガーゼ２、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ＲＮＡリガーゼ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＲＮＡリガーゼ、またはＬｅｉｓｈｍａｎｉａｔａｒｅｎｔｏｌａｅ  ＲＮＡリガーゼである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡリガーゼが、配列番号１０、１１、または１２に記載のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＲＮＡリガーゼである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡリガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ２またはＫＶＰ４０由来のＲＮＡリガーゼ２である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記リガーゼが、Ｔ４バクテリオファージ由来のＴ４  ＲＮＡリガーゼ  ２である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１９】
下記鎖ＩＩ、ＩＩＩ、及びＶ〜ＸＩＩからなる群より選択される配列からなる一本鎖ＲＮＡ。
鎖ＩＩ：ｐＣＡＵＡＵＡＣＣＰＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡ
鎖ＩＩＩ：ＡＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧ
鎖Ｖ：ｐＵＡＣＣＰＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵ
鎖ＶＩ：ＡＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡ
鎖ＶＩＩ：ｐＣＡＵＡＵＡＣＣＰＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＰＧ
鎖ＶＩＩＩ：ｐＵＡＣＣＰＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＰＧ
鎖ＩＸ：ｐＣＣＰＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＰＧ
鎖Ｘ：ＡＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡ
鎖ＸＩ：ｐＣＰＧＧＵＡＵＡＵＧＣＵＧＵＧＵＧＵＡＣＵＣＵＧＣＵＵＣＰＧ
鎖ＸＩＩ：ＡＧＣＡＧＡＧＵＡＣＡＣＡＣＡＧＣＡＵＡＵＡＣ
【国際調査報告】
2019189591.tif 000053
2019189591.tif 000054
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