(57)【要約】本発明は、角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、（ａ)トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させ、該候補化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程と、（ｂ）工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、（ｃ）工程（ａ）において選択された該化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価する工程と、（ｄ）工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、工程（ｃ）において該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程とを含む。本発明の方法により、角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングすることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ)トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させ、該候補化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｃ）必要に応じて、該工程（ａ）において選択された該化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価する工程と、
（ｄ）該工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ａ）または（ｃ）において該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性は、前記ＴＧＦ−βシグナルに起因する前記細胞のアポトーシスを阻害する活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）および（ｃ）は、カスパーゼ活性を測定することを含み、前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性が、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、前記工程（ａ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数よりも多い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝４〜６であり、前記工程（ａ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝１〜３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）において、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する化合物として選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）は、細胞生存率を測定することを含み、該細胞生存率が実質的に減少していない場合、前記毒性が低いと評価される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｄ）において、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（ｄ）において、前記細胞生存率が約９０％以上を示し、かつ、該細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記角膜内皮における症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｅ)小胞体関連ストレス誘導物質の存在下で前記工程（ｄ）において選択された化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させて、前記工程（ｄ）において選択された化合物の該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価する工程と、
（ｆ）前記工程（ｄ）において選択された化合物の該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）において該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、工程（ｅ）において該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性は、前記小胞体関連ストレス誘導物質に起因する前記不死化ヒト角膜内皮細胞のアポトーシスを阻害する活性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｅ）は、カスパーゼ活性を測定することを含み、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性が、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｇ）において、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物として選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｆ）は、細胞生存率を測定することを含み、該細胞生存率が実質的に減少していない場合、前記毒性が低いと評価される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｇ）において、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ｇ）において、前記細胞生存率が約９０％以上を示し、かつ、該細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記角膜内皮における症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンからなる群から選択される、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ)トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させ、該候補化合物のカスパーゼ活性を評価し、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性を有する化合物を選択する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）において選択された該化合物の該フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｃ）該工程（ａ）において選択された該化合物のカスパーゼ活性を評価する工程と、
（ｄ）該工程（ｂ）において該フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ｃ）において実質的に低下したカスパーゼ活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
（ｅ)ＭＧ−１３２の存在下で該工程（ｄ）において選択された化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させて、該工程（ｄ）において選択された化合物の該候補化合物のカスパーゼ活性を評価する工程と、
（ｆ）該工程（ｅ）において選択された化合物の該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｇ）該工程（ｆ）において該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ｅ）において該実質的に低下したカスパーゼ活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
を含む、方法。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法を使用して、角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、
ＴＧＦ−βと、
フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞と、
該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、
細胞毒性を測定するための試薬または手段と
を備える、キット。
【請求項２５】
前記ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β２である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴが導入されたフックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞に由来する、請求項２４または２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドおよび４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養されたフックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞に由来する、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段は、カスパーゼ活性を測定するための試薬または手段である、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記細胞毒性を測定するための試薬または手段は、細胞生存率を測定するための試薬または手段である、請求項２４〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記細胞毒性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ)小胞体関連ストレス誘導物質の存在下で候補化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させ、該候補化合物の該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｃ）必要に応じて、該工程（ａ）において選択された該化合物の該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価する工程と、
（ｄ）該工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ａ）または（ｃ）において該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
を含む、方法。
【請求項３４】
前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性は、前記小胞体関連ストレス誘導物質に起因する前記細胞のアポトーシスを阻害する活性である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記工程（ａ）および（ｃ）は、カスパーゼ活性を測定することを含み、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性が、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記工程（ｃ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、前記工程（ａ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数よりも多い、請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記工程（ｃ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝４〜６であり、前記工程（ａ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝１〜３である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記工程（ａ）において、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物として選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記工程（ｂ）は、細胞生存率を測定することを含み、該細胞生存率が実質的に減少していない場合、前記毒性が低いと評価される、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記工程（ｄ）において、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記工程（ｄ）において、前記細胞生存率が９０％以上を示し、かつ、該細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記角膜内皮における疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである、請求項３３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンからなる群から選択される、請求項３３〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３３〜４５のいずれか一項に記載の方法を使用して、角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、
小胞体関連ストレス誘導物質と、
不死化ヒト角膜内皮細胞と、
該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、
細胞毒性を測定するための試薬または手段と
を備える、キット。
【請求項４７】
前記不死化ヒト角膜内皮細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴが導入された正常角膜内皮細胞に由来する、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記不死化ヒト角膜内皮細胞は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドおよび４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養された正常角膜内皮細胞に由来する、請求項４６または４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬は、カスパーゼ活性を測定するための試薬である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５０】
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
前記細胞毒性を測定するための試薬は、細胞生存率を測定するための試薬である、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンからなる群から選択される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２である、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
前記細胞毒性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系を用いた角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法およびキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。【０００３】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力を持たない。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来して角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因の詳細は不明である。フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着し、グッテー（Corneal  guttae）を形成したりデスメ膜の肥厚を生じ、羞明、霧視の原因となる。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。【０００４】
従来、医薬品の安全性や有効性に関する試験研究には主として動物が用いられていたが、動物愛護の観点から動物を使用する代わりに、培養細胞等を用いてインビトロで医薬品の有効性や安全性を試験研究する技術の実用化レベルでの研究が行われている。例えば、生体組織から採取した初代培養細胞や無限増殖する不死化細胞（樹立細胞）系を用いる方法で予め試験した後に動物試験が行われている。しかし、初代細胞は初期段階ではよく増殖するが、継代培養とともに次第に増殖が停止（細胞老化）したり、形質転換をきたす。さらに、初代細胞は、その特性が生体組織から採取する度に異なるという不均質性の問題に加え、継代とともに変化することが指摘されている。特に、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合には、試験に供するに足る初代細胞を得ることは非常に困難であるとされる。【０００５】
特許文献１は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を作製するための方法を開示する。特許文献２では、細胞傷害抑制効果を確認するために、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞が用いられている。しかしながら、角膜内皮における疾患に有効で安全性の高い化合物をスクリーニングするための、迅速かつ簡便で、信頼性の高いスクリーニング方法はこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０１５６５５号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０１５６５４号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＴＧＦ−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させた際のＴＧＦ−β阻害活性を指標とすることで、角膜内皮における疾患に有効な化合物を選択することが可能であることを見出し、また、毒性評価を行うことでさらに安全性の高い化合物の選択を達成した。さらに、ＴＧＦ−β阻害活性のスコアおよび毒性のスコアを処理しランク付けすることで、より信頼性の高い候補化合物の選択を可能とした。このようなスクリーニングをハイスループットで行う方法も見出した。【０００８】
したがって、本願発明は以下のような発明を提供する。
（項目１）
角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ)トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させ、該候補化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｃ）必要に応じて、該工程（ａ）において選択された該化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価する工程と、
（ｄ）該工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ａ）または（ｃ）において該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
を含む、方法。
（項目２）
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性は、前記ＴＧＦ−βシグナルに起因する前記細胞のアポトーシスを阻害する活性である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記工程（ａ）および（ｃ）は、カスパーゼ活性を測定することを含み、前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性が、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記工程（ｃ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、前記工程（ａ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数よりも多い、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記工程（ｃ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝４〜６であり、前記工程（ａ）における前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝１〜３である、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、項目３〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記工程（ａ）において、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する化合物として選択される、項目３〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記工程（ｂ）は、細胞生存率を測定することを含み、該細胞生存率が実質的に減少していない場合、前記毒性が低いと評価される、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記工程（ｄ）において、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択される、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記工程（ｄ）において、前記細胞生存率が約９０％以上を示し、かつ、該細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記角膜内皮における症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
（ｅ)小胞体関連ストレス誘導物質の存在下で前記工程（ｄ）において選択された化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させて、前記工程（ｄ）において選択された化合物の該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価する工程と、
（ｆ）前記工程（ｄ）において選択された化合物の該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｇ）工程（ｆ）において該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、工程（ｅ）において該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
をさらに含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性は、前記小胞体関連ストレス誘導物質に起因する前記不死化ヒト角膜内皮細胞のアポトーシスを阻害する活性である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記工程（ｅ）は、カスパーゼ活性を測定することを含み、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性が、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性である、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記工程（ｇ）において、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物として選択される項目１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記工程（ｆ）は、細胞生存率を測定することを含み、該細胞生存率が実質的に減少していない場合、前記毒性が低いと評価される、項目１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記工程（ｇ）において、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択される、項目１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記工程（ｇ）において、前記細胞生存率が約９０％以上を示し、かつ、該細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択される、項目１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記角膜内皮における症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである、項目１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンからなる群から選択される、項目１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２である、項目１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ)トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させ、該候補化合物のカスパーゼ活性を評価し、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性を有する化合物を選択する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）において選択された該化合物の該フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｃ）該工程（ａ）において選択された該化合物のカスパーゼ活性を評価する工程と、
（ｄ）該工程（ｂ）において該フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ｃ）において実質的に低下したカスパーゼ活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
（ｅ)ＭＧ−１３２の存在下で該工程（ｄ）において選択された化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させて、該工程（ｄ）において選択された化合物の該候補化合物のカスパーゼ活性を評価する工程と、
（ｆ）該工程（ｅ）において選択された化合物の該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｇ）該工程（ｆ）において該不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ｅ）において実質的に低下したカスパーゼ活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
を含む、方法。
（項目２４）
項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法を使用して、角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、
ＴＧＦ−βと、
フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞と、
該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、
細胞毒性を測定するための試薬または手段と
を備える、キット。
（項目２５）
前記ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β２である、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
前記フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴが導入されたフックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞に由来する、項目２４または２５に記載のキット。
（項目２７）
前記フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドおよび４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養されたフックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞に由来する、項目２４〜２６のいずれか一項に記載のキット。
（項目２８）
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段は、カスパーゼ活性を測定するための試薬または手段である、項目２４〜２７のいずれか一項に記載のキット。
（項目２９）
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、項目２４〜２８のいずれか一項に記載のキット。
（項目３０）
前記細胞毒性を測定するための試薬または手段は、細胞生存率を測定するための試薬または手段である、項目２４〜２９のいずれか一項のいずれか一項に記載のキット。
（項目３１）
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、項目２４〜３０のいずれか一項のいずれか一項に記載のキット。
（項目３２）
前記細胞毒性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、項目２４〜３１のいずれか一項に記載のキット。
（項目３３）
角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、
（ａ)小胞体関連ストレス誘導物質の存在下で候補化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させ、該候補化合物の該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、
（ｃ）必要に応じて、該工程（ａ）において選択された該化合物の該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価する工程と、
（ｄ）該工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、該工程（ａ）または（ｃ）において該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程と
を含む、方法。
（項目３４）
前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性は、前記小胞体関連ストレス誘導物質に起因する前記細胞のアポトーシスを阻害する活性である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記工程（ａ）および（ｃ）は、カスパーゼ活性を測定することを含み、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性が、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性である、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）
前記工程（ｃ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、前記工程（ａ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数よりも多い、項目３３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記工程（ｃ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝４〜６であり、前記工程（ａ）における前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝１〜３である、項目３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、項目３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記工程（ａ）において、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物として選択される、項目３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記工程（ｂ）は、細胞生存率を測定することを含み、該細胞生存率が実質的に減少していない場合、前記毒性が低いと評価される、項目３３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記工程（ｄ）において、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択される、項目３３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記工程（ｄ）において、前記細胞生存率が９０％以上を示し、かつ、該細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択される、項目３３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記角膜内皮における疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである、項目３３〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンからなる群から選択される、項目３３〜４３のいずれか一項のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２である、項目３３〜４４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
項目３３〜４５のいずれか一項に記載の方法を使用して、角膜内皮における症状、障害または疾患に有効な化合物をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、
小胞体関連ストレス誘導物質と、
不死化ヒト角膜内皮細胞と、
該小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、
細胞毒性を測定するための試薬または手段と
を備える、キット。
（項目４７）
前記不死化ヒト角膜内皮細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴが導入された正常角膜内皮細胞に由来する、項目４６に記載のキット。
（項目４８）
前記不死化ヒト角膜内皮細胞は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミドおよび４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養された正常角膜内皮細胞に由来する、項目４６または４７に記載のキット。
（項目４９）
前記ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬は、カスパーゼ活性を測定するための試薬である、項目４６〜４８のいずれか一項に記載のキット。
（項目５０）
前記カスパーゼ活性は、カスパーゼ３／７活性である、項目４６〜４９のいずれか一項に記載のキット。
（項目５１）
前記細胞毒性を測定するための試薬は、細胞生存率を測定するための試薬である、項目４６〜５０のいずれか一項に記載のキット。
（項目５２）
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンからなる群から選択される、項目４６〜５１のいずれか一項に記載のキット。
（項目５３）
前記小胞体関連ストレス誘導物質は、ＭＧ−１３２である、項目４６〜５２のいずれか一項に記載のキット。
（項目５４）
前記小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、項目４６〜５３のいずれか一項に記載のキット。
（項目５５）
前記細胞毒性を測定するための試薬または手段は発光試薬を含む、項目４６〜５４のいずれか一項に記載のキット。【０００９】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系が提供され、フックス角膜内皮ジストロフィ治療や予防の薬のためのスクリーニング等の技術に関する産業（細胞培養産業、製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞（ｉＦＥＣＤ）を用いたスクリーニング方法および不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）を用いたスクリーニング方法の代表的な概念図を示す。
【図２】図２は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞（ｉＦＥＣＤ）を用いたスクリーニングの概要を示す。
【図３】図３は、１次スクリーニングにおけるＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙにより測定されたカスパーゼ３／７活性の代表的な結果を示す。縦軸は、候補化合物非接触群（ＴＧＦ−β２添加群）に対するカスパーゼ活性（％）を示す。横軸は、左から、コントロール群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）添加群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤添加群（１０μＭ）のプレート位置を示す。
【図４】図４は、コントロールを０％、ＴＧＦ−β２反応後を１００％とした場合と、ＴＧＦ−β２反応後を１００％、陽性対照のＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ反応後を０％とした場合の指標（ＣＶ値、Ｓ／Ｂ比、Ｓ／Ｎ比およびＺ’−ｆａｃｔｏｒ）を計算した結果を示す。
【図５】図５は、２次スクリーニングにおける細胞生存率の測定の代表的な結果を示す。縦軸は、候補化合物非接触群に対する細胞生存率（％）を示す。横軸は、左から、コントロール群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）添加群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤添加群（１０μＭ）のプレート位置を示す。
【図６】図６は、２次スクリーニングにおけるカスパーゼ３／７活性の測定の代表的な結果を示す。縦軸は、候補化合物非接触群に対するカスパーゼ３／７活性（％）を示す。横軸は、左から、コントロール群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）添加群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤添加群（１０μＭ）のプレート位置を示す。
【図７−１】図７は、ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤の薬剤名、ＴＧＦ−β２刺激におけるカスパーゼ３／７活性の２次スクリーニングの結果、細胞の生存率の結果、及びＴＧＦ−β２刺激における２次スクリーニングの結果を示す。図７は、（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％）の値が１〜２５位にランク付けられた薬剤を示している。
【図７−２】図７は、ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤の薬剤名、ＴＧＦ−β２刺激におけるカスパーゼ３／７活性の２次スクリーニングの結果、細胞の生存率の結果、及びＴＧＦ−β２刺激における２次スクリーニングの結果を示す。図７は、（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％）の値が１〜２５位にランク付けられた薬剤を示している。
【図８−１】図８は、ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤の薬剤名、ＴＧＦ−β２刺激におけるカスパーゼ３／７活性の２次スクリーニングの結果、細胞の生存率の結果、及びＴＧＦ−β２刺激における２次スクリーニングの結果を示す。図８は、（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％）の値が２６〜４７位にランク付けられた薬剤を示している。
【図８−２】図８は、ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤の薬剤名、ＴＧＦ−β２刺激におけるカスパーゼ３／７活性の２次スクリーニングの結果、細胞の生存率の結果、及びＴＧＦ−β２刺激における２次スクリーニングの結果を示す。図８は、（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％）の値が２６〜４７位にランク付けられた薬剤を示している。
【図９】図９は、不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）を用いたスクリーニングの概要を示す。
【図１０】図１０は、各薬剤名、ＭＧ−１３２（０．１μＭ）刺激におけるカスパーゼ３／７活性のスクリーニングの結果、ＭＧ−１３２（０．１μＭ）刺激での細胞の生存率の結果、及びＭＧ−１３２（０．１μＭ）刺激におけるスクリーニングの結果を細胞生存率で割った値（（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％））を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１３】
（定義）
本明細書において、数値の前の「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
【００１４】
本明細書において「眼細胞」とは、広義に用いられ、眼に存在する任意の細胞を意味し、眼瞼、強膜、角膜、ぶどう膜、水晶体、硝子体、網膜、視神経に存在する任意の細胞が包含される。
【００１５】
本明細書において「角膜内皮細胞」は、当該分野で用いられる通常の意味で用いられる。角膜とは、眼を構成する層状の組織の一つであり透明であり、最も外界に近い部分に位置する。角膜は、ヒトでは外側（体表面）から順に5層でできているとされ、外側から角膜上皮、ボーマン膜（外境界線）、固有層、デスメ膜（内境界線）、および角膜内皮で構成される。特に、特定しない限り、上皮および内皮以外の部分は「角膜実質」とまとめて称することがあり、本明細書でもそのように称する。
【００１６】
本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（immortalized  Fuchs’  endothelial  corneal  dystrophy）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。ｉＦＥＣＤの製造方法は、特許文献１に詳述されており、その内容全体は本明細書において参考として援用する。
【００１７】
本明細書において「ＨＣＥＣ」（human  corneal  endothelial  cells）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（immortalized）ヒト角膜内皮細胞の略称である。
【００１８】
本明細書において「角膜組織」とは、通常の意味で使用され、角膜を構成する組織自体をいう。角膜組織というときは、角膜を構成する角膜上皮、ボーマン膜、実質層、デスメ膜、および角膜内皮の全部（ヒトの場合。それ以外の動物の場合は、それに対応する区分に応じてその全部）を含んでいてもよく一部欠損していてもよく、あるいは、角膜のほか他の組織（強膜）を含んでいてもよく、その場合は特に強角膜ということがある。
【００１９】
本明細書において「未分化細胞」とは、分化能がある任意の細胞をいう。従って、未分化細胞には、幹細胞のほか、一定程度分化しているが、さらになお分化しうる細胞を包含する。
【００２０】
本明細書において「不死化細胞」とは、その決定的な特徴として、ここでは培養中見かけ上無限の寿命を示す（無限数の分裂を通じて増殖する能力を有する）細胞株（系統）を指す。このような不死化細胞は、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得させることができ、あるいは、特定の遺伝子を目的とする細胞に導入することで不死化能力を付与することもできる。
【００２１】
本明細書において、「樹立された」または「確立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。通常不死化された細胞は、所望の特徴を備えることが多いことから、樹立された細胞に該当することが多い。
【００２２】
本明細書において「形質転換（細胞）」とは、制御できない増殖状態へ自然発症的に変換されたこと（細胞）をいう。形質転換細胞は培養器において無限の分裂回数を通じて増殖する能力を獲得する。形質転換細胞は、それらの増殖制御の欠損に関し、腫瘍性、未分化性及び／又は過形成性のような用語を用いて呼称してもよい。
【００２３】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。従って、単離された細胞、組織などとは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸など）を実質的に含まない細胞をいう。
【００２４】
本明細書において「細胞外マトリクス層の肥厚」とは、ある細胞について言及するとき、その細胞の正常形態における細胞外マトリクス層よりも厚い細胞外マトリクス層を有することをいう。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常が約３μｍ程度であるため、細胞外マトリクス層の肥厚とは、約３μｍより厚いことであり、好ましくは、その厚さは約５μｍ以上であり、より好ましくは約６μｍ以上でありうる。
【００２５】
本明細書において「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）」とは、「細胞外基質」とも呼ばれ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、通常細胞が産生し、従って生体物質の一つである。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構成に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞自身からも分泌される。線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。ここで、代表的な細胞外マトリクスを構成する物質としては、例えば、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンVIII、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディン、プロテオグリカン類（例えば、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、ヒアルロン酸、アグリカンなど）などを挙げることができるがそれらに限定されず、細胞接着を担う細胞外マトリクスであれば、種々のものが本発明において関連し得る。
【００２６】
本明細書では、「細胞外マトリクスタンパク質」とは、細胞外マトリクスを構成するタンパク質をいう。このようなタンパク質としては、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンVIII、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＶ、エラスチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンディンを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明では、特にコラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンVIIIおよびフィブロネクチンの少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３つなおさらに好ましくは４つを指標として、フックス角膜内皮ジストロフィの性状を維持しているかどうかを判定することができる。
【００２７】
本明細書において「細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生」とは、ある細胞について言及するとき、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンVIII、およびフィブロネクチン等の細胞外マトリクスタンパク質が、正常形態における細胞外マトリクスにおいて産生されている量よりも多く産生されていることをいう。産生状況は刺激なしのものに加え、必要に応じてトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βに対する応答により発現量が増加することも含む。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常における細胞外マトリクスの量の約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上でありうる。正常に対する相違は有意であることが好ましいが必ずしも有意でなくともよい。
【００２８】
本明細書において「上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー」とは、上皮間葉移行（ＥＭＴ）において指標となるマーカーをいい、ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１等を挙げることができる。
【００２９】
本明細書において「ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進」とは、ある細胞について言及するとき、正常形態におけるＺＥＢ１またはＳｎａｉｌ１において産生されている量よりも多く産生されていることをいう。産生状況は刺激なしのものに加え、必要に応じてトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βに対する応答により発現量が増加することも含む。たとえば、ヒト角膜内皮細胞についていえば、正常におけるＺＥＢ１またはＳｎａｉｌ１の産生量の約１．１倍以上、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、約１．９倍以上、約２．０倍以上でありうる。正常に対する相違は有意であることが好ましいが必ずしも有意でなくともよい。
【００３０】
本明細書において「非線維芽形態」とは、細胞の形態についていい、線維芽細胞を有していないことをいう。具体的には、正常細胞同様に多角形の形態を維持して、著しい重層化を生じず、ポンプ機能およびバリア機能を有するもののような形態をいうがこれらに限定されない。線維芽細胞は、正常組織ではめだった機能を有しないが、損傷が加わると損傷部に遊走し、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの産生を始める結合組織の固有細胞であり、細胞外マトリックスを更新する。
【００３１】
本明細書において細胞の「正常細胞機能」とは、角膜内皮細胞等の具体的細胞について言う場合、その細胞が本来有している機能をいう。角膜内皮細胞についていえば、そのような機能としては、ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、角膜移植への適応能（Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  the  corneal  endothelium  in  the  monkey:  a  morphometric  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1982,  26:264-273；Matsubara  M,  Tanishima  T:  Wound-healing  of  corneal  endothelium  in  monkey:  an  autoradiographic  study,  Jpn  J  Ophthalmol  1983,  27:444-450；Van  Horn  DL,  Hyndiuk  RA:  Endothelial  wound  repair  in  primate  cornea,  Exp  Eye  Res  1975,  21:113-124およびVanHorn  DL,  Sendele  DD,  Seideman  S,  Buco  PJ:  Regenerative  capacity  of  the  corneal  endothelium  in  rabbit  and  cat,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  1977,  16:597-613）等が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３２】
ＺＯ−１およびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅは、遺伝子の発現を免疫的な手段またはＲＴ−ＰＣＲ等の核酸レベルでの発現をみることによって評価することができる。Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能していることを確認することによって、対象の細胞が正常の機能を有しているかどうかを確認することができる。
【００３３】
角膜移植への適応能は、通常ウサギ等の実験動物においても水疱性角膜症モデルとして角膜内皮を機械的に掻爬して、培養細胞の移植試験を行うことができる。しかしながら、ウサギの角膜内皮細胞は生体内で増殖するため、ホストの角膜内皮細胞の増殖による自然治癒の可能性を否定できない（Matsubara  M,  et  al.,  Jpn  J  Ophthalmol  1982,  26:264-273；Matsubara  M,et  al.,  Jpn  J  Ophthalmol  1983,  27:444-450；Van  Horn  DL,  et  al.,  Exp  Eye  Res  1975,  21:113-124およびVan  Horn  DL,  et  al.,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  1977,16:597-613）。したがって、より正確な移植適応能を評価するためには、霊長類への生着を評価することが好ましい。ヒトへの移植適応能を評価する場合は、霊長類であるカニクイザルなどにおいて、例えば、少なくとも１ヶ月、好ましくは少なくとも２ヶ月、より好ましくは少なくとも３ヶ月、さらに好ましくは少なくとも６ヶ月、さらにより好ましくは少なくとも１２ヶ月経過させた後の適応性を評価する。サル等の霊長類での移植適応能を確認することは特にヒトへの適用において重要である。
【００３４】
本明細書において「被験体」とは、本発明の診断または検出等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した器官（眼）あるいは細胞等）をいう。
【００３５】
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、眼の細胞等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
【００３６】
本明細書において「ＳＶ４０」とは、サル液胞性ウイルス（simian  （vacuolating）  virus）４０の略称であり、ポリオーマウイルスの一種でヒトを含む霊長類において見出される、腫瘍ウイルスの一種であり、高等動物細胞用のベクターや発癌機構の研究に利用される。詳細な情報は、http://www.nlm.nih.gov/cgi/mesh/2013/MB_cgi?field=uid&term=D027601に見出すことができ、Taxonomy  ID:  10633である。本発明において、そのラージＴ抗原（ＳＶ４０ラージＴ抗原）の遺伝子（核酸配列）を形質転換において使用する。
【００３７】
本明細書において「マーカー（物質、タンパク質または遺伝子（核酸））」とは、ある状態（例えば、正常細胞状態、形質転換状態、疾患状態、障害状態、あるいは増殖能、分化状態のレベル、有無等）にあるかまたはその危険性があるかどうかを追跡する示標となる物質をいう。このようなマーカーとしては、遺伝子（核酸＝ＤＮＡレベル）、遺伝子産物（ｍＲＮＡ、タンパク質など）、代謝物質、酵素などを挙げることができる。本発明において、ある状態（例えば、分化障害などの疾患）についての検出、診断、予備的検出、予測または事前診断は、その状態に関連するマーカーに特異的な薬剤、剤、因子または手段、あるいはそれらを含む組成物、キットまたはシステム等を用いて実現することができる。本明細書において、「遺伝子産物」とは、遺伝子によってコードされるタンパク質またはｍＲＮＡをいう。本明細書では、眼細胞、特に角膜内皮細胞への関連が示されていない遺伝子産物（すなわち、ＣＤ９８等の分子など）が眼細胞、特に角膜内皮細胞の正常かどうか（形質転換したかどうか）の指標として使用可能であることが見出された。
【００３８】
本明細書において「テロメラーゼ逆転写酵素（Telomerase  Reverse  Transcriptase：TERT）」（ヒトの場合hTERT）は、テロメラーゼ逆転写酵素の一種であり、テロメラーゼ酵素の触媒サブユニットであり、テロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）とともに、テロメラーゼ複合体の重要な成分を構成する。CMM9;  DKCA2;  DKCB4;  EST2;  PFBMFT1;  TCS1;  TP2;  TRT;  hEST2;  hTRTとも呼ばれる。そのIDは、Entrez  Gene  ID:7015であり、NM_001193376（ヒトｍRNA）、NP_001180305（ヒトタンパク質）である。ｈTERTとしては、特定のアクセッション番号（および本明細書に具体的に記載する場合の配列番号）に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００３９】
本明細書において「Snail1」は転写を制御するC2H2タイプのジンクフィンガーファミリーのタンパク質であり、上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカーのひとつである。SLUGH2;  SNA;  SNAH;  SNAIL;  SNAIL1;  dJ710H13.1とも称される。そのIDは、Entrez  Gene  ID:6615であり、NM_005985（ヒトｍRNA）、NP_005976（ヒトタンパク質）である。Snail1としては、特定のアクセッション番号（および本明細書に具体的に記載する場合の配列番号）に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００４０】
本明細書において「ZEB１」とは、ジンクフィンガーEボックス結合ホメオボックス１（Zinc  finger  E-box-binding  homeobox  1）をさし、上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカーのひとつである。AREB6;  BZP;  DELTAEF1;  FECD6;  NIL2A;  PPCD3;  TCF8;  ZFHEP;  ZFHX1Aとも称される。そのIDは、Entrez  Gene  ID:6035  であり、NM_001128128（ヒトｍRNA）、NP_001121600（ヒトタンパク質）である。ZEB１としては、特定のアクセッション番号（および本明細書に具体的に記載する場合の配列番号）に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質（あるいはそれをコードする核酸）のみならず、機能的に活性なその誘導体、または機能的に活性なそのフラグメント、またはその相同体、または高ストリンジェンシー条件または低ストリンジェンシー条件下で、このタンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸にコードされる変異体もまた、意味することが理解される。
【００４１】
本明細書で使用される「誘導体」または「類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、構成要素タンパク質に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、天然存在タンパク質を修飾した所産であり、その誘導体がなお天然存在タンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本発明では、ヒトについて主に論じられるが、他の種例えば霊長類内の他の種あるいはこのほかの属の動物の種のものにも当てはまることが理解され、これらの哺乳動物についても、本発明の範囲内に入ることが理解される。
【００４２】
本明細書で使用される「機能的に活性な」は、本明細書において、本発明のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、テロメラーゼ活性等の生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有する、ポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体を指す。
【００４３】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（saline−sodium  citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular  Cloning  2nd  ed.,Current  Protocols  in  Molecular  Biology,Supplement  1〜38、DNA  Cloning  1:Core  Techniques,  A  Prac1tical  Approach,Second  Edition,Oxford  University  Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、トランスサイレチンなど）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。これらの低ストリンジェンシー条件は、３５％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭ  Tris−HCl（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  EDTA、０．０２％  ポリビニルピロリドン（PVP）、０．０２％ＢＳＡ、100μｇ／ｍｌ変性サケ精子DNA、および１０％（重量／体積）デキストラン硫酸を含む緩衝液中、４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイゼーションし、２ｘＳＳＣ、２５ｍＭ  Tris−HCl（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  EDTA、および０．１％ＳＤＳからなる緩衝液中、５５℃で１〜５時間洗浄し、そして２ｘSSC、２５ｍＭ  Tris−HCl（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  EDTA、および０．１％SDSからなる緩衝液中、６０℃で１．５時間洗浄することを含む。
【００４４】
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリヌクレオチド配列または分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、マウス、ラットのＴＥＲＴ等の分子は、それぞれ、ヒトにおいて、対応するＴＥＲＴ等の分子を見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。従って、例えば、ある動物（例えば、マウス、ラット）における対応する遺伝子は、対応する遺伝子（例えば、ヒトのもの）の基準となる遺伝子として遺伝子アクセッション番号に見出される配列をクエリ配列として用いてその動物の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００４５】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたもの（本明細書にいう誘導体）であり得る。
【００４６】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子β（トランスフォーミング成長因子β；略称ＴＧＦ−βとも表示される）」とは、当該分野で用いられるものと同様の意味で用いられ、様々な硬化性疾患や、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症の病態形成を担い、脱毛に深く関与し、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防ぎ、癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。「ＴＧＦ−βシグナル」とは、ＴＧＦ−βによって媒介されるシグナルであって、ＴＧＦ−βによって惹起されるものをいう。ＴＧＦ−βシグナルには例えば、ＴＧＦ−β２によって媒介されるシグナルが含まれ、このほか、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３等によって媒介されるシグナルも例示される。ＴＧＦ−βについて、ヒトでは、ＴＧＦ−β１〜β３までの相同性約７０％の３つのアイソフォームが存在し、その作用は類似している。ＴＧＦ−βはレセプターに結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されてレセプターに結合できる活性型となり、その作用を発揮する。
【００４７】
本明細書において、「ＴＧＦ−βに対する阻害活性」または「小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性」とは、ＴＧＦ−β／小胞体関連ストレス誘導物質に起因する細胞のアポトーシスを阻害する活性を指す。「ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する」または「小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する」とは、細胞（ｉＦＥＣＤまたはｉＨＣＥＣ等）と候補化合物とを接触させていない群（候補化合物非接触群）に対して実質的に低下したカスパーゼ活性を有することを指し、「実質的に低下したカスパーゼ活性」とは、候補化合物非接触群に対して統計学的に有意に低下したカスパーゼ活性を指す。
【００４８】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βシグナルに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患」とは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βに誘導される任意の角膜内皮の症状、障害または疾患を指す。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、ＴＧＦ−βに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００４９】
本明細書において、「細胞生存率（％）」とは、候補化合物の非存在下でｉＦＣＥＤまたはｉＨＣＥＣを培養した場合の細胞数に対する、当該候補化合物の存在下でｉＦＣＥＤまたはｉＨＣＥＣを培養した場合の細胞数の割合をいう。
【００５０】
本明細書において、「カスパーゼ活性」とは、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β２）添加群（候補化合物なし）または小胞体関連ストレス誘導物質添加群（候補化合物なし）におけるカスパーゼ活性に対する、ＴＧＦ−β（例えば、ＴＧＦ−β２）または小胞体関連ストレス誘導物質存在下で、本発明で使用される化合物とｉＦＣＥＤまたはｉＨＣＥＣとを接触させた場合のカスパーゼ活性の割合をいう。
【００５１】
本明細書において、「毒性が低い」とは、ＴＧＦ−βおよび小胞体関連ストレス誘導物質の非存在下で細胞の生存率が実質的に減少していないことを指し、「実質的に減少していない細胞生存率」とは、細胞（ｉＦＣＥＤまたはｉＨＣＥＣ等）と候補化合物とを接触させていない群（候補化合物非接触群）比較して、細胞生存率が有意に減少していないことを指す。例えば、目安となる数値として、１０％未満の減少、５％未満の減少などを挙げることができる。
【００５２】
本明細書において、「候補化合物」とは、スクリーニングの対象となる任意の化合物を指す。候補化合物としては、小分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、細胞などが挙げられるが、これらに限定されず、角膜内皮における症状、障害または疾患の予防または治療を達成し得るあらゆる物質の候補を包含する。
【００５３】
本明細書において、「小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質」とは、変性タンパク質を誘導し得る物質を指す。小胞体ストレスは、変性タンパク質の蓄積により生じ、過剰に変性タンパク質が蓄積すると、アポトーシスが誘導される。小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質としては、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンが挙げられる。
【００５４】
本明細書において、「小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患」とは、小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものを指し、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、および角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、血管新生等のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５５】
本発明で用いられるＴＥＲＴ等の分子の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul  et  al.,  J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson  &  Lipman,  Proc.Natl.Acad.Sci.,USA  85:2444-2448(1988)）、Smith  and  Waterman法（Smith  and  Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman  and  Wunsch法（Needleman  and  Wunsch,  J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、PCRおよびin  situハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【００５６】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。
【００５７】
（フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞）
本発明のスクリーニング法では、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を使用する。このフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、特許文献１、２などに概説されており、必要に応じて本明細書において参考として援用される。
【００５８】
本発明で使用されるフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、（１）細胞外マトリクス層の肥厚、（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンVIIIおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生、（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進、（４）非線維芽形態、（５）正常細胞機能（たとえば、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同程度に発現および／または機能している）からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を含み、好ましくは、これらの特徴の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、あるいはすべての特徴を有していてもよい。より好ましくは、本発明の細胞は、これらの特徴をすべて有する。１つの実施形態では、前記細胞外マトリクスタンパク質および／またはＥＭＴ関連マーカー発現亢進は、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βに対する応答性を含む。別の実施形態では、前記正常細胞機能は、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１の発現を含む。フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞のモデル細胞として従来達成できなかった特徴を備えるものであり、フックス角膜内皮ジストロフィの処置または予防のための薬剤をスクリーニングするために適切な細胞が提供されるからである。
【００５９】
各々の特徴は以下のように評価することができる
（１）細胞外マトリクス層の肥厚
正常細胞（通常２〜４μｍ）より厚くなっていることを確認する。好ましくは正常細胞の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍の厚さであることを観察することにより対象となる細胞がフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞であるかどうか判断することができる。
（２）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンVIIIおよびフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１つの細胞外マトリクスタンパク質の過剰産生
正常細胞の発現量より多くなっていることを確認する。好ましくは正常細胞の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍の発現量であることを観察することにより対象となる細胞がフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞であるかどうか判断することができる。あるいは、ＴＧＦ−βに対して応答して細胞外マトリクスタンパク質の発現が亢進しているかどうかをも判断の基礎とすることができる。
（３）ＺＥＢ１およびＳｎａｉｌ１からなる群より選択される少なくとも１つの上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連マーカー発現亢進
正常細胞の発現量より多くなっていることを確認する。好ましくは正常細胞の少なくとも１．５倍、より好ましくは少なくとも２倍の発現量であることを観察することにより対象となる細胞がフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞であるかどうか判断することができる。あるいは、ＴＧＦ−βに対して応答してＥＭＴ関連マーカーの発現が亢進しているかどうかをも判断の基礎とすることができる。
（４）非線維芽形態
細胞の形状から判断する。正常細胞同様に多角形の形態を維持して、著しい重層化を生じず一層の上皮細胞様形態を示すことを確認することにより判断することができる。
（５）正常細胞機能
Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびＺＯ−１が正常細胞と同様に免疫染色などにより発現が確認でき、正常細胞と同程度の発現により判断することができる。
【００６０】
別の局面において、本発明は、本発明のフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を用いるフックス角膜内皮ジストロフィの処置または予防のための薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００６１】
（フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の調製方法）
本発明において使用されるフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴをフックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞に導入することにより生産される。このフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の調製方法は、特許文献１、２などに概説されており、必要に応じて本明細書において参考として援用される。
【００６２】
従来、不死化細胞は、初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得させることができ、あるいは、特定の遺伝子を目的とする細胞に導入することで不死化能力を付与することもできる。ただし、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失するため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいといわれており、所望の特徴を維持する不死化細胞を提供することは難しかった。しかしながら、本発明は、上記特定の遺伝子導入技術を用いることによって、所望の特徴、すなわち、フックス角膜内皮ジストロフィが有する特徴を維持し、正常細胞と同様の機能を保持する（すなわち、形質転換していない）細胞を提供することができた。
【００６３】
初代培養の継代を重ねるなかで、細胞老化を免れて無限増殖する能力を獲得した不死化細胞では、安定して均一の特性を有することになるが、このような不死化細胞の多くは、その細胞が生体において本来有していた形態や機能の一部又はその全てを喪失することが多い。そのため、このような不死化細胞株を用いた試験では、その細胞株の由来する組織での本来の特性を正確に反映することは難しいとされていた。フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養(Zaniolo  K,  et  al.  Exp  Eye  Res.;94(1):22-31.  2012)や不死化の報告(Azizi  B,  et  al.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci.  2;52(13):9291-7.2011)があるが、細胞外マトリックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はない。一方、本発明ではフックス角膜内皮ジストロフィ患者の角膜内皮細胞の特徴である細胞外マトリックスの過剰産生という特性を維持している。これまでは、初代細胞にｒａｓ遺伝子やｃ−ｍｙｃ遺伝子などの発癌遺伝子、アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原遺伝子、ヒトパピローマウイルスのＨＰＶ１６遺伝子等を導入して細胞を形質転換し、初代細胞の有する活発な増殖能を継続的に保持し、さらに継代することによってその細胞固有の特性を喪失しない不死化細胞を樹立する試みがなされている。ところが、このような不死化細胞においても、対象とする臓器によっては、その初代細胞を調製し、これらの癌遺伝子やラージＴ抗原遺伝子を導入する時点で、すでに幾つかの機能を喪失するため、本来の機能を保持する厳密な意味での不死化細胞の取得は困難であることがある。特に、特殊な疾患の細胞や、増殖速度が非常に遅い場合や微小器官に由来する場合の初代細胞を調製して株化することは極めて困難であり、フックス角膜内皮ジストロフィについても同様な困難性があった。特に、フックス角膜内皮ジストロフィについては、そもそも角膜内皮では正常細胞の維持も困難な中、病態モデルの作出、および培養細胞として維持することはより困難であり、正常機能を保った病態モデルの作製は不可能と思われていた。
【００６４】
そこで、ＳＶ４０ラージＴ抗原を用いることに加えて、導入遺伝子として、テロメラーゼ逆転写酵素（Telomerase  Reverse  Transcriptase  :  TERT）を導入することによって、フックス角膜内皮ジストロフィの特徴を維持しつつ、不死化することに成功した。このようなフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞は、フックス角膜内皮ジストロフィを標的とした医薬品等の有用物質のスクリーニングにも耐え得る。
【００６５】
ＳＶ４０ラージＴ抗原およびhTERTの導入方法としては、当該分野で公知の遺伝子（核酸分子）の導入技術（形質転換、形質導入、トランスフェクション等）または遺伝子産物（タンパク質）の導入手法であればどのような技術であっても利用することができ、通常核酸分子の導入によりこれらの遺伝子の導入を実現することができる。本明細書では「遺伝子導入」とは、外来性の遺伝子、好ましくは機能遺伝子を適宜の導入技術により、その遺伝子を、例えば染色体ゲノム等に導入することをいう。また、当該分野で公知の標的遺伝子組換え法を利用すれば、内在性の機能遺伝子と置換させることによって外来性の機能遺伝子を導入することもできる。なお、外来性の機能遺伝子は、その生物の染色体ゲノムに元来存在しない遺伝子であり、他の生物種由来の遺伝子やＰＣＲ等で作製した合成遺伝子等でありうる。例えば、このような遺伝子の導入の手法としては、トランスフェクション手法が挙げられる。このようなトランスフェクションとしては、目的の遺伝子（本発明では、ＳＶ４０ラージT抗原およびhTERT遺伝子等）を適宜のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターであるがこれに限定されない）に導入する。ここでは、必要に応じてヘルパープラスミドを用いて（例えば、pLP1、pLP2、pLP/VSVG等）、適切な細胞（例えば、293T細胞）に感染させる。適宜の条件で培養した後、感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、目的とする細胞（本発明では、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞）の培養液にこの培養上清を、適宜の試薬（ここでは、ポリブレンであるがこれに限定されない）とともに添加してフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（iFECD）を生産することができる。あるいは、別の例としては、形質転換遺伝子をコードするDNAを含む外来性DNAは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルスベクター）への形質移入の技術を用いて目的の細胞に導入され得る。例えば、組換えレトロウイルスは、パッケージング細胞株中に産生されて、高力価のウイルス粒子を有する（一般に、105〜106  pfu/mlであるがこれに限定されない）培養物上清を産生する。組換えウイルス粒子は、目的とする細胞の培養物に、細胞培養物をウイルス粒子と適宜の濃度（例えば、５〜10μg/mlであるがこれに限定されない）のポリブレン等の試薬とを含む培地と共に適宜の時間（例えば、１〜12時間程度であるがこれに限定されない）インキュベートすることによって感染させるために使用される。レトロウイルスへの感染後、細胞は、リンスされて標準培地中で培養される。次いで、感染細胞は、外来性DNAの取り込み及び発現について分析される。細胞は、選択的マーカー遺伝子を取り込み且つ発現した細胞について選択する選択的条件に供されてもよい。あるいは、外来性DNAは、リン酸カルシウム媒介型形質移入の技術を用いて導入されてもよい。目的の遺伝子、例えば形質転換遺伝子をコードするDNAを含むリン酸カルシウム沈殿物は、Wigler  et  al.  (1979)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  76:1373-1376の技術を用いて調製されてもよい。形質移入後、細胞は、外来性DNAの取り込み及び発現について分析される。細胞は、選択的マーカー遺伝子を取り込み且つ発現した細胞について選択する選択的条件に供されてもよい。このような技術は、実施例において具体的に開示した例のほか、特表2013-509179、特開2004-254509に例示されているがこれらに限定されない。
【００６６】
不死化させる際に、追加的にあれば有用な詳細な条件としては以下をあげることができる。たとえば、好ましい実施形態では、前記フックス角膜内皮ジストロフィの患者由来の角膜内皮細胞を、SB431542（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）およびSB203580（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）を含む培地中で培養することで、好ましい細胞を得ることができる。この培地は、好ましくは実施例中で使用したＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地であってもよいが、これに限定されない。
【００６７】
（フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を用いたスクリーニング方法）
１つの局面において、本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞（ｉＦＥＣＤ）を使用した、角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する化合物を選択する１次スクリーニングと、細胞に対する毒性が低く、かつ、ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する化合物を選択する２次スクリーニングを含む。本発明は、１次スクリーニングおよび２次スクリーニングの両方を行うことにより、信頼性の高いスクリーニング方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の方法は、（ａ)トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させ、該候補化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程と、（ｂ）工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、必要に応じて（ｃ）工程（ａ）において選択された該化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価する工程と、（ｄ）工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、工程（ｃ）において該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程とを含み得る。
【００６８】
なお、１次スクリーニングは、（ａ)トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βの存在下で候補化合物とフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞とを接触させ、該候補化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程に該当し、２次スクリーニングは、（ｂ）工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、必要に応じて（ｃ）工程（ａ）において選択された該化合物の該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を評価する工程と、（ｄ）工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、工程（ａ）または（ｃ）において該ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程に該当する。工程（ｃ）は必須の工程ではないが、スクリーニングの精度を向上させるために工程（ｃ）を含めることが好ましい。驚くべきことに、予想外にも、工程（ｃ）を行うことによって、スクリーニングの精度が、有意に上昇したからである。これは、単なる試験者の習熟や他の要因を考慮しても、有意に上昇していることから、工程（ｃ）を含ませることが有利であることが理解される。このような工程（ｃ）の包含による効果は、従来のスクリーニング技術からは予想し得なかったことである。
【００６９】
１つの実施形態では、工程（ｃ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、工程（ａ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数よりも多くてもよい。２次スクリーニングにおける工程（ｃ）において試行回数を増やすことによって、より高い信頼度で有用化合物を選択するためである。また、１次スクリーニングの試行回数を少なめに設定することによって、大量の候補化合物を処理することを可能にするという利点もある。試行回数が少ないことに起因して、１次スクリーニングでは信頼度が低くなる可能性があるが、２次スクリーニングにより信頼度が担保されている。実際、１次スクリーニングにおいて有用であると考えられたいくつかの化合物が、２次スクリーニングで除外された。表１は、１次スクリーニングでは、７５％以下のカスパーゼ活性を示していたにもかかわらず、試行回数を増やした２次スクリーニングでは、ほとんどカスパーゼ活性の低下が見られなかった例を示している。表１において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号：Ｇ７５７０）によって測定された細胞生存率が９０％以上であったものを「〇」で示し、細胞生存率が９０％未満であったものを「×」で示す。
【００７０】
【表１】
2018230712.tif 000002
いくつかの実施形態では、工程（ａ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数であり得、工程（ｃ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、工程（ａ）における試行回数よりも多くなるように、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上の回数であり得る。特定の実施形態では、工程（ｃ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝４〜６であり得、工程（ａ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝１〜３であり得る。好ましい実施形態では、工程（ｃ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝５であり得、工程（ａ）におけるＴＧＦ−βに対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝２であり得る。当業者であれば、候補化合物の数を考慮して、適宜試行回数を設定することが可能である。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βに対する阻害活性は、ＴＧＦ−βシグナルに起因する細胞のアポトーシスを阻害する活性に基づいて評価され得る。アポトーシスを阻害する活性は、例えば、カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）、細胞膜外部表面におけるホスファチジルセリンの露出、Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）の切断または染色体ＤＮＡの断片化を指標として評価され得る。特定の実施形態では、ＴＧＦ−βに対する阻害活性は、カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）を測定することにより評価されてもよく、例えば、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性を有する化合物をＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する化合物として選択され得る。候補化合物非接触群は、候補化合物を添加していない群（ＴＧＦ−β添加群）である。候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）とは、候補化合物非接触群に対して統計学的に有意に低下したカスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）であって、例えば、候補化合物非接触群に対して、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、または約５５％以下のカスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）であり得る。ある実施形態では、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する化合物として選択され得る。
【００７２】
２次スクリーニングにおいて、候補化合物のフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞に対する毒性が評価され得る。毒性を評価することによって、医薬として有用な化合物を選択することを可能にする。毒性は、細胞生存率を評価することによって行われ得る。
【００７３】
１つの実施形態において、工程（ｂ）は、細胞生存率を測定することを含み、細胞生存率が実質的に減少していない場合、毒性が低いと評価され得る。細胞生存率の測定はＴＧＦ−β非存在下で行われる。実質的に減少していない細胞生存率とは、候補化合物非接触群と比較して、細胞生存率が有意に減少していないことを指し、例えば、候補化合物非接触群に対して約９０％以上の細胞生存率であり得る。細胞生存率の閾値は、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、約１００％であってもよい。細胞数の減少に起因してカスパーゼ活性も低下してしまうため、一見カスパーゼ活性を抑制しているようにみえたとしても、毒性が強く細胞数が著しく減少している場合があることが明らかになった。そのため、カスパーゼ活性の測定に加え、細胞数を測定することにより正確に薬物を選別することができる。表２に示されるような化合物は、一見カスパーゼ活性を抑制しているように見えたが、細胞生存率が９０％を下回り毒性が強いため、２次スクリーニングにおいて除外された。表２において、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号：Ｇ７５７０）によって測定された細胞生存率が９０％以上であったものを「〇」で示し、細胞生存率が９０％未満であったもの「×」で示す。
【００７４】
【表２】
2018230712.tif 000003
２次スクリーニングでは、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択され得る。そのような化合物は、細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．９以下、約０．８以下、約０．７５以下、約０．７以下、約０．６５以下、約０．６以下、約０．５５以下、約０．５以下、約０．４５以下、約０．４以下、約０．３５以下、約０．３以下、約０．２５以下、または約０．２以下を示す化合物であり得る。特定の実施形態では、工程（ｄ）において、細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択され得る。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法において、候補化合物の濃度は任意の濃度であり得る。候補化合物の濃度はすべて同じ濃度を使用してもよく、候補化合物毎に異なる濃度を使用してもよいことが理解される。当業者であれば、細胞に対して毒性を示す濃度（例えば、５０％阻害濃度：ＩＣ５０）が知られている場合は、これを考慮して候補化合物の濃度を設定することが可能である。使用される候補化合物の濃度としては、例えば、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約１ｍＭ、約１０ｍＭ、約１００ｍＭが挙げられるがこれらに限定されない。また、これらの濃度の間の任意の数値（例えば、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８または約９×１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７または１０８ｎＭ）も使用することができる。これらの値の任意の点の範囲もまた、本発明において好ましい濃度の範囲として採用することができる。特定の実施形態では、候補化合物の濃度は約１０μＭである。別の実施形態では、候補化合物の濃度は約１μＭである。
【００７６】
本発明のスクリーニング方法は、ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有する化合物が選択されるため、本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物は、ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患を予防または治療し得る。ＴＧＦ−βに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ（ＰＰＤ）、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ（ＣＨＥＤ）、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎からなる群より選択され得る。本発明のスクリーニング方法では、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を使用しているため、本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物は、特にフックス角膜内皮ジストロフィを予防または治療し得る。
【００７７】
さらなる実施形態においては、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を用いたスクリーニング方法によって選択された化合物をさらに、以下で詳述する不死化ヒト角膜内皮細胞を用いたスクリーニング方法に供してもよい。あるいは、不死化ヒト角膜内皮細胞を用いたスクリーニング方法によって選択された化合物を、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を用いたスクリーニング方法に供してもよい。これらの２種類のスクリーニング系を使用する場合は、２つめのスクリーニング系では、必要に応じて１次スクリーニングを省略してもよい。１つめのスクリーニングによりある程度候補化合物の数が限定されているからである。不死化ヒト角膜内皮細胞を用いたスクリーニング方法では、小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物が選択されるため、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞および不死化ヒト角膜内皮細胞の両方を用いたスクリーニング方法により選択された化合物は、ＴＧＦ−βおよび小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有し得る。フックス角膜内皮ジストロフィは、小胞体関連ストレスもまた原因の１つとして考えられているため、ＴＧＦ−βおよび小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物は、フックス角膜内皮ジストロフィに対して特に有効であると考えられる。また、ＴＧＦ−βに対する阻害活性を有することが示された化合物であっても、小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性をまったく示さない化合物が存在することが明らかになった。これは、２つのスクリーニングを組み合わせて使用することにより、ＴＧＦ−βおよび小胞体関連ストレスの両方に起因する角膜内皮の障害等（例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ）に有効な化合物をスクリーニングすることが可能であることを示している。フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞および不死化ヒト角膜内皮細胞の両方を用いたスクリーニング方法の代表的な概念図を図１に示す。
【００７８】
（不死化ヒト角膜内皮細胞を用いたスクリーニング方法）
１つの局面において、本発明は、不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）を使用した、角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物を選択する１次スクリーニングと、細胞に対する毒性が低く、かつ、小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物を選択する２次スクリーニングを含む。小胞体（ＥＲ）関連ストレスを誘導した不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）を使用することによって、ｉＦＥＣＤを使用するスクリーニング方法とは異なり、小胞体（ＥＲ）関連ストレスという観点で角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングすることが可能である。本発明は、１次スクリーニングおよび２次スクリーニングの両方を行うことにより、信頼性の高いスクリーニング方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の方法は、（ａ)小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質の存在下で候補化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させ、該候補化合物の該小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程と、（ｂ）工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、（ｃ）工程（ａ）において選択された該化合物の該小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価する工程と、（ｄ）工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、工程（ｃ）において該小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程とを含み得る。
【００７９】
小胞体関連ストレス誘導物質としては、ＭＧ−１３２、タプシガルギン、ツニカマイシンが挙げられる。ＭＧ−１３２は、小胞体関連ストレスの原因の１つであるタンパク質のフォールディングの異常（変性タンパク質の蓄積）を誘導し得る物質として知られている。特に、フックス角膜内皮ジストロフィでは、変性タンパク質の蓄積による小胞体関連ストレスが原因の１つであることが知られているため、ＭＧ−１３２により誘導される小胞体関連ストレスは、よりフックス角膜内皮ジストロフィの状態を反映するものであると考えられる。ｉＨＣＥＣにおけるＭＧ−１３２に対する阻害活性を評価するスクリーニング方法は、上記ｉＦＣＥＤを使用したスクリーニング方法では評価できないフックス角膜内皮ジストロフィの病態（変性タンパク質の蓄積などに起因する小胞体関連ストレス）を抑制する化合物をスクリーニングすることが可能となり有利である。理論に束縛されることを望まないが、ＭＧ−１３２での阻害活性を確認した化合物は、実際にフックス角膜内皮ジストロフィの病態を有利に抑制するものであることが、実際にスクリーニングされた化合物からも見て取ることができる。
【００８０】
なお、１次スクリーニングは、（ａ)小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質の存在下で候補化合物と不死化ヒト角膜内皮細胞とを接触させ、該候補化合物の該小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価し、該阻害活性を有する化合物を選択する工程に該当し、２次スクリーニングは、（ｂ）工程（ａ）において選択された該化合物の該細胞に対する毒性を評価する工程と、（ｃ）工程（ａ）において選択された該化合物の該小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を評価する工程と、（ｄ）工程（ｂ）において該細胞に対する毒性が低いと評価され、かつ、工程（ｃ）において該小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有すると評価された化合物を選択する工程に該当する。
【００８１】
１つの実施形態では、工程（ｃ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、工程（ａ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数よりも多くてもよい。２次スクリーニングにおける工程（ｃ）において試行回数を増やすことによって、より高い信頼度で有用化合物を選択するためである。また、１次スクリーニングの試行回数を少なめに設定することによって、大量の候補化合物を処理することを可能にするという利点もある。試行回数が少ないことに起因して、１次スクリーニングでは信頼度が低くなる可能性があるが、２次スクリーニングにより信頼度が担保されている。いくつかの実施形態では、工程（ａ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数であり得、工程（ｃ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、工程（ａ）における試行回数よりも多くなるように、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれ以上の回数であり得る。特定の実施形態では、工程（ｃ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝４〜６であり得、工程（ａ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝１〜３であり得る。好ましい実施形態では、工程（ｃ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝５であり得、工程（ａ）における小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性の評価の試行回数は、ｎ＝２であり得る。当業者であれば、候補化合物の数を考慮して、適宜試行回数を設定することが可能である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性は、小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に起因する細胞のアポトーシスを阻害する活性に基づいて評価され得る。アポトーシスを阻害する活性は、例えば、カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）、細胞膜外部表面におけるホスファチジルセリンの露出、Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＰＡＲＰ）の切断または染色体ＤＮＡの断片化を指標として評価され得る。特定の実施形態では、小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性は、カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）を測定することにより評価されてもよく、例えば、候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性を有する化合物を小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物として選択され得る。候補化合物非接触群は、候補化合物を添加していない群（小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質添加群）である。候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）とは、候補化合物非接触群に対して統計学的に有意に低下したカスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）であって、例えば、候補化合物非接触群に対して、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、または約５５％以下のカスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）であり得る。ある実施形態では、候補化合物非接触群に対して約７５％以下のカスパーゼ３／７活性を示す化合物が、小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物として選択され得る。
【００８３】
２次スクリーニングにおいて、候補化合物の不死化ヒト角膜内皮細胞に対する毒性が評価され得る。毒性を評価することによって、医薬として有用な化合物を選択することを可能にする。毒性は、細胞生存率を評価することによって行われ得る。
【００８４】
１つの実施形態において、工程（ｂ）は、細胞生存率を測定することを含み、細胞生存率が実質的に減少していない場合、毒性が低いと評価され得る。細胞生存率の測定は小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質非存在下で行われる。実質的に減少していない細胞生存率とは、候補化合物非接触群と比較して、細胞生存率が有意に減少していないことを指し、例えば、候補化合物非接触群に対して約９０％以上の細胞生存率であり得る。細胞生存率の閾値は、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、約１００％であってもよい。細胞数の減少に起因してカスパーゼ活性も低下してしまうため、一見カスパーゼ活性を抑制しているようにみえたとしても、毒性が強く細胞数が著しく減少している場合があることが明らかになった。そのため、カスパーゼ活性の測定に加え、細胞数を測定することにより正確に薬物を選別することができる。
【００８５】
２次スクリーニングでは、実質的に減少していない細胞生存率、および候補化合物非接触群に対して実質的に低下したカスパーゼ３／７活性を示す化合物が選択され得る。そのような化合物は、細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．９以下、約０．８５以下、約０．８以下、約０．７５以下、約０．７以下、約０．６５以下、約０．６以下、約０．５５以下、約０．５以下、約０．４５以下、約０．４以下、約０．３５以下、約０．３以下、約０．２５以下、または約０．２以下を示す化合物であり得る。特定の実施形態では、工程（ｄ）において、細胞生存率（％）に対するカスパーゼ３／７活性（％）の比が約０．８以下を示す化合物が選択され得る。
【００８６】
本発明のスクリーニング方法は、小胞体（ＥＲ）関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を有する化合物が選択されるため、本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物は、小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患を予防または治療し得る。小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患は、タンパク質のフォールディングの異常に起因し得る。特定の実施形態において、小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮における症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、および角膜実質の浮腫、角膜上皮びらんであり得る。フックス角膜内皮ジストロフィの原因の１つとして、小胞体（ＥＲ）関連ストレスが知られているため、本発明のスクリーニング方法によって選択された化合物は、特にフックス角膜内皮ジストロフィを予防または治療し得る。
【００８７】
（キット）
別の局面において、本発明は、上記スクリーニング方法を使用して、角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングするためのキットを提供する。
【００８８】
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、薬剤、抗体、標識、細胞、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、薬剤をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、薬剤、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【００８９】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明のスクリーニング方法および試薬の使用方法を指示する文言が記載されている。また、指示書には、使用方法（スクリーニング方法）を指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（FDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package  insert）であり、紙媒体で提供されてもよく、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明のキットは、ＴＧＦ−βと、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞と、ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、細胞毒性を測定するための試薬または手段とを備え得る。ＴＧＦ−βはＴＧＦ−β２であり得る。フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の作製方法は、上記で説明したとおりである。
【００９１】
別の実施形態において、本発明のキットは、小胞体関連ストレス誘導物質と、不死化ヒト角膜内皮細胞と、小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、細胞毒性を測定するための試薬または手段とを備え得る。小胞体関連ストレス誘導物質としては、例えば、ＭＧ−１３２、タプシガルギンおよびツニカマイシンが挙げられる。特定の実施形態では、小胞体関連ストレス誘導物質はＭＧ−１３２であり得る。不死化ヒト角膜内皮細胞は、正常者由来の研究用角膜（ＳｉｇｈｔＬｉｆｅ）を使用して、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞（ｉＦＥＣＤ）と同様の方法で作製した。
【００９２】
さらに別の実施形態において、本発明のキットは、ＴＧＦ−βと、小胞体関連ストレス誘導物質と、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞と、不死化ヒト角膜内皮細胞と、ＴＧＦ−βに対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段と、細胞毒性を測定するための試薬または手段とを備え得る。
【００９３】
本発明の試薬または手段は目的となる分子または物質を他から識別するための「標識」を含みうる。「標識」としては、物質（蛍光物質、発光物質等）の他、エネルギー、電磁波、放射線等も含まれる。標識方法としては、RI（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。標識する場合、機能に影響を与えないものならば何れも用いることができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−βまたは小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段は、カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）を測定するための試薬または手段であり得る。ＴＧＦ−βまたは小胞体関連ストレス誘導物質に対する阻害活性を測定するための試薬または手段は、発光試薬を含みうる。発光試薬は、測定する対象（カスパーゼ活性の場合、カスパーゼ）を発光させるための試薬であり得る。カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）を測定するための試薬または手段としては、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙ、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔ（商標）  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ｇｒｅｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ＡＦＣ  Ｃａｓｐａｓｅ−３／７  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ等で使用される試薬または手段が挙げられるが、これに限定されない。当業者は、カスパーゼ活性（例えば、カスパーゼ３／７活性）を測定するための公知の技術、市販のキットまたは試薬もしくは手段を使用することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、細胞毒性を測定するための試薬または手段は、細胞生存率を測定するための試薬または手段であり得る。細胞毒性を測定するための試薬または手段は、発光試薬であり得る。発光試薬は、測定する対象（細胞生存率の場合、生細胞または死細胞、あるいは両方）を発光させるための試薬であり得る。細胞生存率を測定するための試薬または手段としては、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、ＲｅａｌＴｉｍｅ−Ｇｌｏ（商標）  ＭＴ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ等で使用される試薬または手段が挙げられるが、これに限定されない。当業者は、細胞生存率を測定するための公知の技術、市販のキットまたは試薬もしくは手段を使用することができる。
【００９６】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００９７】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９８】
以下に、本発明の例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイツ）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理委員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。【００９９】
（実施例１：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）および正常角膜内皮細胞の不死化細胞（ｉＨＣＥＣ）の作製）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来および健常者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤおよびｉＨＣＥＣ）を作製した。【０１００】
（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，    Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」という）で培養した。【０１０１】
（取得方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ；  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて２９３Ｔ細胞  （ＲＣＢ２２０２；  Ｒｉｋｅｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｂａｒａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５  μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。シアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）により維持培養を行った。【０１０２】
（実施例２：フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を用いたスクリーニング）
本実施例では、実施例１で作製したフックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を用いて、角膜内皮における疾患に有効な化合物のスクリーニングを行った。本実施例では、角膜内皮細胞の細胞障害を誘導する物質としてＴＧＦ−β２を使用した。【０１０３】
（材料および方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞を９６ウェルプレートに７×１０３個播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，２６２５２−９４）＋１０％  ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ／０４−００１−１Ａ）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ、２６２５２−９４）を使用した。次に、ＴＧＦ−β２（製造元：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、販売元：和光純薬工業株式会社／製造元コード３０２−Ｂ２−００２，３０２−Ｂ２−０１０、販売元コード：５５３−６２８８１，５５９−６２８８３）（５ｎｇ／ｍＬ）のみまたはＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）とＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎの各薬剤（１０μM）両方を添加し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて２８時間後に位相差顕微鏡を用いて細胞形態を観察した。その後Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ８０９１）を用いてカスパーゼ３／７活性の測定を行った。培地は、ＤＭＥＭ＋２％  ＦＢＳ＋１％  Ｐ／Ｓを使用した。本実施例におけるカスパーゼ３／７活性および細胞生存率の測定は、ＶｅｒｉｔａｓTM  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを使用した。このような装置であれば、多数の試料について同時に測定することが可能である。【０１０４】
コントロール群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ、１３４０８−６４）を添加した。また、陽性対照としてカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫ（異性体混合物）（和光純薬工業株式会社／２６２−０２０６１）（１０μＭ）を使用した。１次スクリーニングはｎ＝２でカスパーゼ３／７活性の測定を実施し、上位の薬剤について２次スクリーニングをｎ＝５で実施した。カスパーゼ活性は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）中２８時間培養後に測定した。本実施例におけるスクリーニングの概要を図２に示す。【０１０５】
（結果）
（１次スクリーニング）
図３は、１次スクリーニングにおけるＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙにより測定されたカスパーゼ３／７活性の代表的な結果を示す。第１次スクリーニングとしてｎ＝２で測定し、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）添加群を１００％とした。図３におけるグラフの横軸は、左から、コントロール群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）添加群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ各薬剤添加群（１０μＭ）を示す。図３に示されるコントロール群等の（１）（２）は、９６ウェルプレートの左端、右端に置いた結果をそれぞれ示しており、コントロール群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）添加群、ＴＧＦ−β２（５ｎｇ／ｍＬ）＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ添加群（１０μＭ）は（１）（２）合わせてｎ＝５である。【０１０６】
（アッセイ系の精度の確認）
一般的にスクリーニングで使われる代表的な指標を以下に示す。
・ＣＶ値（変動係数、ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）；ＣＶ（％）＝標準偏差（ＳＤ）／平均（Ａｖ）は、どれ位ばらつきがあるのかを示す指標である。スクリーニングでは概ね、ＣＶ値１０％以内が求められる。
・Ｓ／Ｂ比（Ｓｉｇｎａｌ／Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｒａｔｉｏ）；Ｓ／Ｂ＝Ａｖ１００％／Ａｖ０％は、反応前後におけるシグナル強度の比である。Ｓ／Ｂ比が大きいほど読み取り幅が大きくなるので活性有無を判定しやすくなる。Ｓ／Ｂ比は２以上が好ましい。
・Ｓ／Ｎ比（Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）；Ｓ／Ｎ＝（Ａｖ１００％−Ａｖ０％）／ＳＤ０％は、ベースのばらつきに対するシグナルの大きさの比である。
・Ｚ’−ｆａｃｔｏｒ；Ｚ’−ｆａｃｔｏｒ＝１−（３×ＳＤ１００％＋３×ＳＤ０％）／（Ａｖ１００％−Ａｖ０％）は、データのばらつきやシグナル強度から計算される、アッセイ系の質の目安となる数字である。アッセイ系の精度を表すもっとも重要な指標で、一般的に、Ｚ’値が０．５以上であればスクリーニングの系として合格とみなされる。【０１０７】
図４は、コントロールを０％、ＴＧＦ−β２反応後を１００％とした場合と、ＴＧＦ−β２反応後を１００％、陽性対照のＴＧＦ−β２＋Ｚ−ＶＤ−ＦＭＫ反応後を０％とした場合の各指標を計算した結果を示す。示されるように、スクリーニング系として一般的に求められる値を満たしている。【０１０８】
（２次スクリーニング：細胞生存率の測定）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号：Ｇ７５７０）で、ｎ＝２で毒性の指標として細胞生存率を算出した。細胞生存率は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）中２８時間培養後に測定した。細胞生存率の測定はＴＧＦ−β非存在下で行った。２次スクリーニングにおける細胞生存率の測定の代表的な結果を図５に示す。細胞生存率が９０％を切った場合、ランキングから除外した。【０１０９】
（２次スクリーニング：Ｃａｓｐａｓｅ３／７活性の測定）
２次スクリーニングにおいてＣａｓｐａｓｅ３／７活性の評価をｎ＝５で行った。代表的な結果を図６に示す。【０１１０】
（細胞生存率およびＣａｓｐａｓｅ３／７活性の評価）
図７および図８は、ＳＣＲＥＥＮ−ＷＥＬＬ（登録商標）  ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｖ２，  Ｊａｐａｎ  ｖｅｒｓｉｏｎでの各薬剤の薬剤名、ＴＧＦ−β２刺激におけるカスパーゼ３／７活性の２次スクリーニングの結果、細胞の生存率の結果、及びカスパーゼ３／７活性を細胞生存率で割った値（（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％））を示す。２次スクリーニングにおけるカスパーゼ３／７活性の値を細胞生存率の値（（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％））が低いほど有用な薬剤であることを示している。図７および図８に示される薬剤は、カスパーゼ３／７活性／細胞生存率（％）が８０％以下を示しており、ＴＧＦ−β２に対する阻害活性を有し、かつ、毒性が低く、角膜内皮における疾患等に有効であることが予測される。図７は、カスパーゼ３／７活性／細胞生存率（％）の値が１〜２５位にランク付けられた薬剤を示しており、図８は、カスパーゼ３／７活性／細胞生存率（％）の値が２６〜４７位にランク付けられた薬剤を示している。【０１１１】
（実施例３：不死化ヒト角膜内皮細胞を用いたスクリーニング）
本実施例では、実施例１で作製した不死化ヒト角膜内皮細胞を用いて、角膜内皮における疾患に有効な化合物のスクリーニングを行った。本実施例では、細胞障害を誘導する物質として小胞体（ＥＲ）関連ストレスを誘導する物質として知られるＭＧ−１３２を使用した。【０１１２】
（材料および方法）
不死化ヒト角膜内皮細胞（ｉＨＣＥＣ）を９６ウェルプレートに７×１０３個播種し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて２４時間培養した。培地はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，２６２５２−９４）＋１０％  ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ／０４−００１−１Ａ）＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ、２６２５２−９４）を使用した。次に、ＭＧ−１３２（ＳＩＧＭＡ、Ｍ７４４９）（０．１μＭ）のみまたはＭＧ−１３２（０．１μＭ）と実施例２において（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％）の値が８０％以下を示した上位４０種類の各薬剤（１０μM）両方を添加し、３７℃で５％ＣＯ２の条件下にて18時間後に位相差顕微鏡を用いて細胞形態を観察した。その後Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）  ３／７  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ８０９１）を用いてカスパーゼ３／７活性の測定を行った。ＭＧ−１３２は、フックス角膜内皮ジストロフィ患者で認められるのと同様に、折りたたまれなかったタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞内への蓄積を増加させる作用を有しており、小胞体ストレスを介した細胞死を誘導する。培地は、ＤＭＥＭ＋２％  ＦＢＳ＋１％  Ｐ／Ｓを使用した。なお、コントロール群には各試薬の溶媒であるＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ、１３４０８−６４）を添加した。また、陽性対照としてカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＤ−ＦＭＫ（異性体混合物）（和光純薬工業株式会社／２６２−０２０６１）（１０μＭ）を使用した。本実施例におけるスクリーニングの概要を図９に示す。実施例２と同様の手順で、カスパーゼ３／７活性および細胞生存率の測定を行った（それぞれｎ＝２）。カスパーゼ活性および細胞生存率は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋２％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）中１８時間培養後に測定した。【０１１３】
（結果）
図１０は、各薬剤名、ＭＧ−１３２（０．１μＭ）刺激におけるカスパーゼ３／７活性のスクリーニングの結果、ＭＧ−１３２（０．１μＭ）刺激での細胞の生存率の結果、及びカスパーゼ３／７活性を細胞生存率で割った値（（カスパーゼ３／７活性）／（細胞生存率）（％））を示す。図１０に示される薬剤は、カスパーゼ３／７活性／細胞生存率（％）が８０％以下を示しており、ＴＧＦ−β２に対する阻害活性を有し、かつ、毒性が低く、角膜内皮における疾患等に有効であることが予測される。【０１１４】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。【０１１５】
本願は日本国特許出願特願２０１７−１１８６２５（２０１７年６月１６日出願）に対して優先権主張を行うものであり、その内容全体が本明細書において参照として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
フックス角膜内皮ジストロフィのモデル系を用いた角膜内皮における疾患に有効な化合物をスクリーニングする方法が提供され、角膜内皮疾患治療に関する産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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