(57)【要約】  本発明は、ヌクレオシドのリボースまたはデオキシリボース骨格に代わり、２−エチルグリセロールまたはメトキシメチル−１，３−プロパンジオール骨格などの特定の骨格を有する修飾核酸モノマー化合物および該モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体を提供する。  本発明の核酸モノマー化合物を含むオリゴ核酸類縁体は、生物学的安定性および／または標的遺伝子発現抑制活性に優れたオリゴ核酸類縁体を得ることを可能にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩。
【化９５】
2018230624.tif 000105
［式中、
Ａ１は、水酸基の保護基を示し；
Ａ２は、リン官能基、水酸基の保護基、または−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを示し；
Ｂは核酸塩基を示し；
Ｌは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＯＣＨ２−を示す。］
【請求項２】
Ｂが、
下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）：
【化９６】
2018230624.tif 000106
［式中、
Ｒ１は、水素原子またはメチルを示し；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す。］
から選択される核酸塩基である、請求項１に記載の化合物もしくはその塩。
【請求項３】
Ｌが、−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１または２に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
Ａ１が、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
Ａ２が、リン官能基である、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
Ａ２が、−Ｐ（−ＯＲ７）−ＮＲ８Ｒ９であり、
Ｒ７はＣ１−６アルキルまたは２−シアノエチルを示し、
Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキルであるか、または−ＮＲ８Ｒ９が一体となって
【化９７】
2018230624.tif 000107
［式中、Ｒ１０はＣ１−３アルキルを示し、ｍは０から４の整数を示し、ｎは１から３の整数を示す］
を形成する、
請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項７】
Ａ２が、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項８】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
Ｒ４における保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、請求項２に記載の化合物またはその塩。
【請求項９】
下記式（ＶＩ）で表される、請求項２に記載の化合物またはその塩。
【化９８】
2018230624.tif 000108
［式中、Ｂは、前記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）から選択される核酸塩基である。］
【請求項１０】
下記式（ＶＩＩ）で表される、請求項２に記載の化合物またはその塩。
【化９９】
2018230624.tif 000109
［式中、Ｂは、前記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）から選択される核酸塩基である。］
【請求項１１】
下記式（ＶＩＩＩ）で表される、修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物。
【化１００】
2018230624.tif 000110
［式中、
Ａ３は、水素原子、または、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基であり；
Ｂは核酸塩基を示し；
Ｌは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＯＣＨ２−を示す。］
【請求項１２】
Ｂが、下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）：
【化１０１】
2018230624.tif 000111
［式中、
Ｒ１は、水素原子またはメチルを示し；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す］
から選択される核酸塩基である、請求項１１に記載の修飾核酸モノマー担持物。
【請求項１３】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
Ｒ４における保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、請求項１２に記載の修飾核酸モノマー担持物。
【請求項１４】
下記式（ＩＸ）で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、該部分構造を２以上含有する場合は、該部分構造間でＢ３およびＬはそれぞれ同一であっても異なってもよい。）
【化１０２】
2018230624.tif 000112
［式中、
Ｂ３は、核酸塩基を示し；
Ｌは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＯＣＨ２−を示す。］
【請求項１５】
Ｂ３が、下記式（ＩＩ）’、（ＩＩＩ）’、（ＩＶ）’および（Ｖ）’：
【化１０３】
2018230624.tif 000113
［式中、
Ｒ１は、水素原子またはメチルを示し；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６-アルコキシ、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す。］
から選択される核酸塩基である、請求項１４に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【請求項１６】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
Ｒ４における保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、請求項１５に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【請求項１７】
Ｂ３は、下記式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）から選択される、請求項１５に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【化１０４】
2018230624.tif 000114
［式中、Ｒ１は前記の定義と同じである。］
【請求項１８】
Ｌが、−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、請求項１５から１７のいずれか一項に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【請求項１９】
一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が４〜１００である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【請求項２０】
一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が４〜３０である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾核酸モノマー化合物および該モノマー化合物を含むオリゴ核酸類縁体に関する。更に詳細には、本発明は、ヌクレオシドのリボースまたはデオキシリボース骨格の代わりに２−エチルグリセロール、またはメトキシメチル−１，３−プロパンジオール骨格などの特定の骨格を有する修飾核酸モノマー化合物および該モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中で示される核酸モノマー糖部の原子付番に関しては、天然型のリボヌクレオシド（アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジンなど）を基準にして慣用的に用いられる原子付番に従うものとする（下記化学構造式参照）。
【化１】
2018230624.tif 000002
【０００３】
核酸医薬は、ＤＮＡやＲＮＡといった核酸（オリゴヌクレオチド）からなる医薬品で、特定の塩基配列や特定のタンパク質を認識して遺伝子発現を抑制したり、タンパク質の機能を阻害したりすることにより、これまで治療が困難であった疾病の治療への利用が期待されている。
具体的なオリゴ核酸としては、アンチセンスや核酸アプタマー等のほか、近年はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）を利用した治療法の開発が注目されている。【０００４】
ＲＮＡ干渉とは、二本鎖ＲＮＡが遺伝子の発現を抑制する現象である。標的とする遺伝子と塩基配列が同じ二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入すると、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる細胞質内に存在する酵素の働きにより２０から２５塩基対程度の二本鎖ＲＮＡとなる。この二本鎖ＲＮＡが細胞内の複数のタンパク質とＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ） というタンパク質−ＲＮＡ複合体を形成し、標的遺伝子から合成されたｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）の相同配列に結合してｍＲＮＡを特異的に切断し、タンパク質への翻訳反応を抑制するものである（非特許文献１）。その後、２１塩基の短い二本鎖ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）を用いてもＲＮＡｉを誘起させることが報告され、ＲＮＡｉ法は、目的の遺伝子のみの発現を効果的に抑制する技術として注目されている。【０００５】
一方、アンチセンス法やＲＮＡｉ法においては、天然型のオリゴ核酸は、生体内に存在する各種のヌクレアーゼによる加水分解を容易に受けるため生物学的安定性に課題がある。この課題を解決するために、２’−ＯＭｅあるいは２’−Ｆ修飾核酸モノマーの導入、およびリン酸結合部位のホスホロチオエート結合への変換などの化学修飾によるヌクレアーゼ耐性の向上を図っている。
また、ＲＮＡのリボース部分を修飾した核酸として、下記式
【化２】
2018230624.tif 000003
［式中、Ｂは核酸塩基を表わす］
で示されるＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：２’，３’−ｓｅｃｏ−ＲＮＡ）モノマーをｓｉＲＮＡに導入することにより、そのエキソヌクレアーゼ抵抗性が高まるとともに、オフ−ターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）効果を抑制し、標的遺伝子サイレンシング効果の特異性を向上しうることが報告されている（非特許文献２）。また、特許文献１には、下記式
【化３】
2018230624.tif 000004
［式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＣＨ２−、Ｊは、−Ｐ−または−Ｓ−、Ｚは、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ３、Ｃ２−２２アルキル鎖、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルなどを表わす］
で示されるＵＮＡモノマーをｓｉＲＮＡに導入することが提案されている。
また、非特許文献３には、リボース部分を下記式
【化４】
2018230624.tif 000005
で示される、２−アミノ−１’，３’−プロパンジオール（セリノール）骨格に変換した修飾ヌクレオシド（セリノール核酸；ＳＮＡ）のオリゴマーについて、安定した二本鎖構造体が得られることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１３９７１０号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ， ３９１，８０６−８１１ （１９９８）
【非特許文献２】Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ９，３５９１−３５９７， ２０１１
【非特許文献３】Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１，５０，１２８５−１２８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまで多くの修飾核酸が提案されているが、現状において、生物学的安定性（例えば、血中安定性）の改善、標的遺伝子発現抑制活性の増強について、十分に満足し得るものは未だに見出されていない。
したがって、本発明の課題は、医薬への応用に際して有用で、優れた生物学的安定性または標的遺伝子発現抑制活性の少なくとも一つを可能にする新規修飾核酸モノマー化合物、および該モノマー化合物を構成ユニットとして含むオリゴ核酸類縁体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような課題を解決するために本発明者らは鋭意研究した。その結果、ヌクレオシドのリボースまたはデオキシリボース骨格に代わり、２−エチルグリセロール、またはメトキシメチル−１，３−プロパンジオール骨格などの特定の骨格を有する修飾ヌクレオシドを修飾核酸モノマー化合物として用いて、該修飾核酸モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体を、例えばｓｉＲＮＡとして用いた場合に、標的遺伝子発現抑制活性の維持もしくは増強または生物学的安定性の改善の少なくとも一つを可能とするｓｉＲＮＡが得られることを見出し、本発明を完成させたものである。【００１０】
本発明は、例えば、以下の通りである。
［１］．下記式（Ｉ）
【化５】
2018230624.tif 000006
［式中、Ａ１は、水酸基の保護基を示し；
Ａ２は、リン官能基、水酸基の保護基、または−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを示し；
Ｂは核酸塩基を示し；
Ｌは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＯＣＨ２−を示す］
で表される化合物もしくはその塩、
［２］．Ｂが、
下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）：
【化６】
2018230624.tif 000007
［式中、Ｒ１は、水素原子またはメチルを示し；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す］；
から選択される核酸塩基である、［１］に記載の化合物もしくはその塩、
［３］．Ｌが、−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、［１］または［２］に記載の化合物またはその塩、
［４］．Ａ１が、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基である、［１］から［３］のいずれか一に記載の化合物もしくはその塩、
［５］．Ａ２が、リン官能基である、［１］から［４］のいずれか一に記載の化合物もしくはその塩、
［６］．Ａ２が、−Ｐ（−ＯＲ７）−ＮＲ８Ｒ９であり、
Ｒ７はＣ１−６アルキルまたは２−シアノエチルを示し、
Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立してＣ１−６アルキルであるか、または、−ＮＲ８Ｒ９が一体となって
【化７】
2018230624.tif 000008
［式中、Ｒ１０はＣ１−３アルキルを示し、ｍは０から４の整数を示し、ｎは１から３の整数を示す］
を形成する、
［１］から［５］のいずれか一に記載の化合物またはその塩。
［７］．Ａ２が、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである、［１］から［４］のいずれか一に記載の化合物またはその塩、
［８］．Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
Ｒ４における保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、［２］から［７］のいずれか一に記載の化合物またはその塩、
［９］．下記式（ＶＩ）で表される、［２］に記載の化合物またはその塩。
【化８】
2018230624.tif 000009
［式中、Ｂは、前記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）から選択される核酸塩基である。］
［１０］．下記式（ＶＩＩ）で表される、［２］に記載の化合物またはその塩。
【化９】
2018230624.tif 000010
［式中、Ｂは、前記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）から選択される核酸塩基である。］
［１１］．下記（ＶＩＩＩ）で表される、修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物。
【化１０】
2018230624.tif 000011
［式中、
Ａ３は、水素原子、または、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基であり；
Ｂは核酸塩基を示し；
Ｌは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＯＣＨ２−を示す］
で表される修飾核酸モノマー担持物、
［１２］．Ｂが、下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）：
【化１１】
2018230624.tif 000012
［式中、
Ｒ１は、水素原子またはメチルを示し；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す］
から選択される核酸塩基である、［１１］に記載の修飾核酸モノマー担持物、
［１３］．  Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
Ｒ４における水酸基の保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、［１２］に記載の修飾核酸モノマー担持物、
［１４］．下記式（ＩＸ）で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、該部分構造を２以上含有する場合は、該部分構造間でＢ３およびＬはそれぞれ同一であっても異なってもよい。）
【化１２】
2018230624.tif 000013
［式中、
Ｂは核酸塩基を示し；
Ｌは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＯＣＨ２−を示す］、
［１５］．Ｂ３が、
下記式（ＩＩ）’、（ＩＩＩ）’、（ＩＶ）’および（Ｖ）’：
【化１３】
2018230624.tif 000014
（式中、
Ｒ１は、水素原子またはメチルを示し；
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す］、
から選択される核酸塩基である、［１４］に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
［１６］．  Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６における保護基はそれぞれ独立して、カーバメート系保護基、アシル系保護基、イミド系保護基、およびベンジル系保護基から選択され、
Ｒ４における水酸基の保護基は、シリル系保護基、トリチル系保護基、複素環系保護基、ベンジル系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基、エーテル系保護基、カルバモイル系保護基、およびアルコキシカルボニル系保護基から選択される、［１５］に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
［１７］．Ｂ３は、下記式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）から選択され；
【化１４】
2018230624.tif 000015
［式中、Ｒ１は前記の定義と同じである。］
から選択される置換基である［１６］に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
［１８］．Ｌが、−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、［１５］から［１７］のいずれか一に記載のオリゴ核酸類縁体またはその塩、
［１９］．一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が４〜１００である、［１５］から［１８］のいずれか一に記載のオリゴ核酸類縁体もしくはその塩、
［２０］．一鎖あたり含有する核酸塩基単位の総数が４〜３０である、［１５］から［１８］のいずれか一に記載オリゴ核酸類縁体もしくはその塩、
に関するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、優れた生物学的安定性（例えば、血中安定性）および／または標的遺伝子発現抑制活性を有するオリゴ核酸類縁体が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】修飾したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｉＲＮＡによるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性阻害試験の結果を示す図である。
【図２】修飾したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｉＲＮＡによるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性阻害試験の結果を示す図である。
【図３】修飾したＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｓｉＲＮＡによるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性阻害試験の結果を示す図である。
【図４】実施形態のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ修飾ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ安定性試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本明細書において記載する用語等の意義を説明し、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本明細書において、ハロゲン原子は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を示す。
Ｃ１−６アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、１−メチル−２−エチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２−エチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチルを示す。一つの態様としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルである。
【００１５】
Ｃ２−６アルケニル基は、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテン−１−イル、１−ブテン−２−イル、１−ブテン−３−イル、２−ブテン−１−イル、２−ブテン−２−イルを示す。Ｃ３−６アルケニル基は、Ｃ２−６アルケニル基からビニルを除いた基である。
Ｃ２−６アルキニル基は、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニルを示す。Ｃ３−６アルキニル基は、Ｃ２−６アルキニル基からエチニルを除いた基である。
Ｃ１−６アルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、イソペントキシ、ｓｅｃ−ペントキシ、ｔ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、イソヘキソキシ、１，２−ジメチルプロポキシ、２−エチルプロポキシ、１−メチル−２−エチルプロポキシ、１−エチル−２−メチルプロポキシ、１，１，２−トリメチルプロポキシ、１−ジメチルブトキシ、２，２−ジメチルブトキシ、２−エチルブトキシ、１，３−ジメチルブトキシ、２−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、ヘキシルオキシを示す。一つの態様としては、メトキシである。
【００１６】
Ｃ１−６アルキルチオ基は、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ネオペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、１−メチルプロピルチオを示す。
Ｃ１−６アルキルスルホニル基は、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、イソブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニル、ｎ−ペンチルスルホニル、イソペンチルスルホニル、ネオペンチルスルホニル、ｎ−ヘキシルスルホニル、１−メチルプロピルスルホニルを示す。
【００１７】
Ｃ１−６アルキル−カルボニル基は、例えば、アセチル、プロピオニル、ブチリルを示す。
Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基は、例えば、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニルを示す。
Ｃ６−１４アリール−カルボニル基は、例えば、ベンゾイル、ナフトイルを示す。一つの態様としては、ベンゾイルである。
Ｃ６−１４アリールスルホニル基は、例えば、ベンゼンスルホニル、ナフチルスルホニルを示す。
【００１８】
モノＣ１−６アルキルアミノ基は、例えば、モノメチルアミノ、モノエチルアミノ、モノｎ−プロピルアミノ、モノイソプロピルアミノ、モノｎ−ブチルアミノ、モノイソブチルアミノ、モノｔ−ブチルアミノ、モノｎ−ペンチルアミノ、モノイソペンチルアミノ、モノネオペンチルアミノを示す。
ジＣ１−６アルキルアミノ基は、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジｔ−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジネオペンチルアミノを示す。
【００１９】
「核酸塩基」は、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、（ｉ）天然型のヌクレオシドの核酸塩基（シトシル基、ウラシル基、チミニル基、アデニル基、グアニル基）、（ｉｉ）修飾核酸塩基または塩基アナログ（例えば、塩基部分が、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、ニトロ基、水酸基、シアノ基、カルボキシ基などで置換されたもの）、および（ｉｉｉ）保護されていてもよい核酸塩基（上記（ｉ）（ｉｉ）の核酸塩基におけるアミノ基または水酸基が保護基で保護されたもの）を包含して定義される。塩基アナログは、その構造が天然型のヌクレオシドの塩基の構造に類似する化学物質である。
【００２０】
「ヌクレオシド」は、本明細書においてペントース糖（リボース、デオキシリボース、またはそれらの改変物）に共有結合した核酸塩基からなる化合物を示す。
「ヌクレオチド」は、モノマー単位としての、または核酸中の、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。
「ヌクレオチド類縁体」は、ペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオシドの１個もしくは複数のリン酸エステルが、そのそれぞれの類縁体で任意に置換された化合物を指す。
「オリゴ核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、一般に一分子内に少数の核酸塩基を有する核酸分子またはその類縁体を指す。一方、多数の核酸塩基を有する核酸分子またはその類縁体についてはポリ核酸またはポリヌクレオチドと称するが、これらとオリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドとの重合数の境界は明確には定まっていない。本明細書中においてオリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドは、一分子内に４〜１００（さらには４〜５０）の核酸塩基を有する核酸分子またはその類縁体を指す。オリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であるモノマーユニット（ヌクレオチドサブユニット）の直線状オリゴマーである。
オリゴ核酸またはオリゴヌクレオチドに関する「類縁体」は、たとえば、修飾もしくは置換された糖部分、修飾もしくは置換された塩基部分、または修飾もしくは置換された糖結合部分から選択される少なくとも一つの改変部分またはこれらの組合せを有し得る。
【００２１】
本明細書中においては、化合物の化学構造式が異性体を表すことがあるが、本発明の化合物は特にいずれかの異性体に限定する旨の記載、例えば化合物名上の表記や、異性体の分離工程に関する記載がある場合を除き、化学構造式の記載に限定されるものではなく、化合物の構造上生ずる総ての幾何異性体、不斉炭素に基づく光学異性体、立体異性体、または互変異性体等の異性体及びこれらの異性体混合物を含む。したがって、分子内に不斉炭素原子を有し光学活性体およびラセミ体が存在することがあり得るが、特に一方の異性体に限定する旨の記載がある場合を除き、光学活性体およびラセミ体のいずれもが含まれる。
【００２２】
本発明の一形態は、ヌクレオシドのリボースまたはデオキシリボース骨格に代わり、２−エチルグリセロール、またはメトキシメチル−１，３−プロパンジオール骨格などの特定の骨格を有する修飾核酸モノマー化合物を提供する。
以下、本発明の修飾核酸モノマー化合物およびそれを少なくとも構成ユニットの一として含むオリゴ核酸類縁体について詳細に説明する。
【００２３】
１．修飾核酸モノマー化合物
本発明の修飾核酸モノマー化合物は、下記式（Ｉ）
【化１５】
2018230624.tif 000016
で表わされる。式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物は、その−Ｏ−Ａ１と−Ｏ−Ａ２とが、それぞれリボースまたはデオキシリボースの５’位と３’位に代替してオリゴ核酸類縁体を構成するヌクレオチドとの結合に関与し、オリゴ核酸誘導体を製造するのに用いることができる。
ここで、式（Ｉ）において、プロパン骨格炭素原子の番号はＩＵＰＡＣの命名法では、Ａ１、Ａ２の種類により変動しうるが、本発明の説明上、下記式のとおりの番号を用いるものとする。
【化１６】
2018230624.tif 000017
【００２４】
式（Ｉ）において、Ｂは核酸塩基である。
Ｂの一つの態様としては、下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）から選択される核酸塩基である。
【化１７】
2018230624.tif 000018
式（ＩＩ）〜（Ｖ）中、Ｒ１は、水素原子またはメチルを示す。
Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示し；
Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ同一であっても異なっていてもよい。
【００２５】
上記保護基は、後述するヌクレオチドオリゴマー（オリゴ核酸類縁体）製造時にアミノ基の保護基または水酸基の保護基として機能する。すなわち、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はアミノ基の保護基であり、Ｒ４は水酸基の保護基である。該保護基としてはヌクレオチドオリゴマー製造時に安定であり、オリゴマー形成後に脱保護できるものであれば、特に限定されない。例として、以下のものが挙げられる。
【００２６】
アミノ基の保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、アリルオキシカルボニルなどのカーバメート系保護基；アセチル、クロロアセチル、フルオロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、イソブチリル、ベンゾイル、２−ニトロベンゾイルなどのアシル系保護基；フタロイルなどのイミド系保護基；ベンジル、４−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジルなどのベンジル系保護基等が挙げられる。
【００２７】
水酸基の保護基としては、スルホニル系保護基を除き、後述するＡ１の水酸基の保護基と同様の保護基を挙げることができる。
【００２８】
核酸合成法で用いる縮合反応での安定性や、脱保護の容易性の点から、Ｂにおける、Ｒ２およびＲ６の一つの態様としては、アセチル、イソブチリル、ベンゾイルなどのアシル系保護基である。Ｒ３およびＲ５の一つの態様としては、同様の点から、アセチル、イソブチリル、２−メチルプロパノイルなどのアシル系保護基である。Ｒ４の一つの態様としては、同様の点から、ジメチルカルバモイル、ジフェニルカルバモイルなどのカルバモイル系保護基である。
【００２９】
式（Ｉ）において、Ａ１は、水酸基の保護基を示す。−Ｏ−Ａ１はリボースまたはデオキシリボースの５’位に代替してヌクレオチドとの結合に関与し、ヌクレオチドオリゴマー（オリゴ核酸類縁体）を形成し得る。
水酸基の保護基としては、特に制限されず、例えば、核酸の水酸基の保護基として通常使用されているものであればいずれの保護基も使用し得る。このような保護基としては、例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、（トリフェニルメチル）ジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリフェニルシリルなどのシリル系保護基；トリチル、４−モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチルなどのトリチル系保護基；テトラヒドロピラニル、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニルなどの複素環系保護基；ベンジル、４−メトキシベンジル、２−ニトロベンジル、４−ニトロベンジル、４−シアノベンジルなどのベンジル系保護基；アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ブチリル、プロピオニル、ピバロイル、レブリニル、ペンタノイル、バレリルなど脂肪族アシル系保護基；ベンゾイル、２，６−ジクロロベンゾイル、２−トルオイル、４−メトキシベンゾイル、２，４，６−トリメチルベンゾイルなどの芳香族アシル系保護基；ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエトキシエチル（ＳＥＭ）、２−（シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）、２−ナフチルメトキシメチル（ＮＡＰＯＭ）、ジフェニルメチル、などのエーテル系保護基；ジメチルカルバモイル、ジフェニルカルバモイルなどのカルバモイル系保護基；メシル、トシル、トリフルオロメタンスルホニルなどのスルホニル系保護基；９−フルオレニルメトキシカルボニルなどのアルコキシカルボニル系保護基が挙げられる。
【００３０】
これらの水酸基の保護基については、Ｂｅａｕｃａｇｅｅｔ ａｌ., Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ, Ｖｏｌ.４８, ｐｐ.２２２３−２３１１， １９９２；Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ，３ｒｄＥｄ. ， ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ， ＮｅｗＹｏｒｋ，１９９９（以下「Ｇｒｅｅｎｅらの文献」ともいう）などの文献を参照することができる。
【００３１】
式（Ｉ）におけるＡ１としては、核酸合成法で用いる縮合反応での安定性や、脱保護の容易性の点から、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４−モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）などのトリチル系保護基、シリル系保護基がより好ましく、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）がさらに好ましい。
【００３２】
式（Ｉ）において、Ａ２は、リン官能基、水酸基の保護基、または−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを示す。−Ｏ−Ａ２はリボースまたはデオキシリボースの３’位に代替してヌクレオチドとの結合に関与し、ヌクレオチドオリゴマー（オリゴ核酸類縁体）を形成し得る。
【００３３】
該水酸基の保護基としては、前記したＡ１の水酸基の保護基を同様に挙げることができる。Ａ１の水酸基の保護基と異なる条件で脱保護できる保護基が好ましい。例えば、Ａ１の水酸基の保護基がトリチル系保護基の場合にはシリル系保護基が好ましく、中でも、脱保護の容易性および選択性の点からトリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）がより好ましく、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）がさらに好ましい。また、Ａ１の水酸基の保護基がシリル系保護基の場合には、水酸基の保護基Ａ２は、複素環系保護基、脂肪族アシル系保護基、芳香族アシル系保護基が好ましい。
【００３４】
リン官能基としては、式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物を用いて、式（ＶＩＩ）のオリゴ核酸類縁体を、核酸合成法として知られているホスホロアミダイト法（Ｓ．  Ｌ．  Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｍ．  Ｈ．  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２２，  １８５９  （１９８１））、トリエステル法（Ｒ．  Ｌ．  Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，  Ｋ．  Ｋ．  Ｏｇｉｌｖｉｅ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８９，  ４８０１  （１９６７））、Ｈ−ホスホネート法（Ｐ．  Ｊ．  Ｇａｒｅｇｇ，  Ｉ．  Ｌｉｎｄｈ，  Ｔ．  Ｒｅｇｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ，  Ｒ．  Ｓｔｒｏｎｂｅｒｇ，  Ｃ．  Ｈｅｎｒｉｃｈｓｏｎ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２７，  ４０５１  （１９８６））などにより製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基を挙げることができる。
【００３５】
例えば、ホスホロアミダイト法により製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基としては、下記式（ｉ）で表されるリン官能基が挙げられる。
【化１８】
2018230624.tif 000019
［式中、Ｙ１はリン酸の保護基を示し、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ独立してＣ１−６アルキルを示すか、またはＺ１およびＺ２が一緒になって、それらが結合する窒素原子と共に、更に１〜３個のヘテロ原子を含んでいてもよい５ないし７員含窒素複素環を形成する。］
Ｙ１のリン酸の保護基としては、例えば、２−シアノエチル、２−（フェニルスルホニル）エチル、２，２，２−トリクロロエチル（ＴＣＥ）、２，２，２−トリブロモエチルなどのβ脱離により除去できる保護基；２−トリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル（ＤＰＳＥ）などのフッ化物イオンで除去できる保護基；４−［Ｎ−メチル−Ｎ−（トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル（ＴＦＡＢ）、２−［（１−ナフチル）カルバモイルオキシ］エチル（ＮＣＥ）、４−オキソペンチルなどの環化反応により除去できる保護基；メチルなどのアルキル（例えばＣ１−６アルキル）、２，４−ジニトロベンジルなどの炭素原子上での求核置換反応により除去できる保護基；ベンジルなどの加水素化分解により除去できる保護基；アリルなどのパラジウム触媒による置換反応で除去できる保護基が挙げられる。これらの中でも、メチルなどのＣ１−６アルキル、２−シアノエチル、２−トリメチルシリルエチルなどがホスホロアミダイト法で汎用されている。Ｙ１の一つの態様としては、脱離条件に優れる点で、２−シアノエチルである。また、Ｙ１の他の一つの態様としては、脱離性の点で、メチルである。
式（ｉ）の−ＮＺ１Ｚ２としては、例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジｎ−プロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ（−Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２）、ジｎ−ブチルアミノ、ジイソブチルアミノ、ジｔ−ブチルアミノ、ジｎ−ペンチルアミノ、ジイソペンチルアミノ、ジネオペンチルアミノなどを挙げることができる。Ｚ１およびＺ２が一緒になってそれらが結合する窒素原子と共に形成する更に複素原子を含んでいてもよい５ないし７員含窒素複素環としては、例えば、モルホリン−１−イル、ピペリジン−１−イルなどを挙げることができる。ここで、複素原子としては、窒素原子、酸素原子、硫黄原子などが挙げられる。これらの中でも、ジイソプロピルアミノ、ジメチルアミノなどがホスホロアミダイト法で汎用されている。−ＮＺ１Ｚ２の一つの態様としては、ジイソプロピルアミノである。また、−ＮＺ１Ｚ２の他の一つの態様としては、ジメチルアミノである。
【００３６】
例えば、トリエステル法により製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基としては、下記式（ｉｉ）で表されるリン官能基が挙げられる。
【化１９】
2018230624.tif 000020
［式中、Ｙ１はリン酸の保護基を示し、Ｙ２は水素原子またはリン酸の保護基を示す］
式（ｉｉ）におけるＹ１およびＹ２としてのリン酸の保護基としては、式（ｉ）のＹ１として前記したリン酸の保護基と同様に挙げることができる。
【００３７】
例えば、Ｈ−ホスホネート法により製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基としては、下記式（ｉｉｉ）で表されるリン官能基が挙げられる。
【化２０】
2018230624.tif 000021
［式中、Ｚ＋はカチオンを示す］
式（ｉｉｉ）におけるＺ＋のカチオンとしては、例えば、メチルアンモニウムイオン、エチルアンモニウムイオン、イソブチルアンモニウムイオンなどのモノＣ１−６アルキルアンモニウムイオン；ジメチルアンモニウムイオン、ジエチルアンモニウムイオン、ジイソブチルアンモニウムイオンなどのジＣ１−６アルキルアンモニウムイオン；カリウムイオン、リチウムイオンなどの金属イオンを挙げることができる。
【００３８】
式（Ｉ）におけるＡ２の一つの態様としては、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである。
【００３９】
Ａ２の他の一つの態様は、Ａ２が、−Ｐ（−ＯＲ７）−ＮＲ８Ｒ９である。
ここで、Ｒ７はＣ１−６アルキルまたは２−シアノエチルを示す。好ましくは、選択的な脱離条件の点で、メチル、２−シアノエチルであり、より好ましくは２−シアノエチルである。
Ｒ８およびＲ９はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキルであるか、または−ＮＲ８Ｒ９が一体となって
【化２１】
2018230624.tif 000022
［式中、Ｒ１０はＣ１−３アルキルを示し、ｍは０から４の整数を示し、ｎは１から３の整数を示す］
を形成する。
例えば、Ｒ８およびＲ９は独立して、Ｃ１−３アルキルであるか、または−ＮＲ８Ｒ９が一体としてモルホリン−１−イルもしくはピペリジン−１−イルから選択される基を形成する。
Ａ２の他の一つの態様としては、−Ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）Ｎ（ｉ−Ｐｒ）２である。
【００４０】
式（Ｉ）において、Ｌは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−または−ＣＨ２ＯＣＨ２−を示す。なお、式（Ｉ）において、Ｌが、−ＯＣＨ２ＣＨ２−である場合、Ｌ中の酸素原子が化合物骨格の炭素原子と結合し、かつＬ中の炭素原子がＢと結合していてもよいし、または、Ｌ中の酸素原子はＢと結合し、かつＬ中の炭素原子が化合物骨格の炭素原子と結合していてもよい。好ましくは、−ＯＣＨ２ＣＨ２−の酸素原子が化合物骨格の炭素原子と結合し、−ＯＣＨ２ＣＨ２−の炭素原子がＢと結合している。
【００４１】
本発明の一実施形態は、下記式（ＶＩ）で表される化合物またはその塩である。かかる化合物はホスホロアミダイト法により修飾核酸モノマーとして天然の核酸モノマーの代わりに用いて、３’末端を除く任意の位置に修飾核酸を導入したオリゴ核酸類縁体の製造を行うことができる。
【化２２】
2018230624.tif 000023
［式中、Ｂは、前記の定義と同じである。］
【００４２】
本発明の他の一実施形態は、下記式（ＶＩＩ）で表される化合物またはその塩である。かかる化合物はアミノ基を官能基として有する固相担体と結合させ、オリゴ核酸類縁体の固相合成において修飾核酸を３’末端に導入したオリゴ核酸類縁体の製造を行うことができる。
【化２３】
2018230624.tif 000024
［式中、Ｂは、前記の定義と同じである。］
【００４３】
本発明の式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物は、塩の形態であってもよい。そのような塩としては、例えば、硫酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、塩酸塩などの無機酸塩；酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩などの有機カルボン酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などの有機スルホン酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などのアミノ酸塩；四級アミン塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩が挙げられる。
【００４４】
２．修飾核酸モノマー化合物の製造
以下に、本発明の式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物の製造方法について説明する。
以下の反応における、原料または製造中間体は、それぞれ塩であってもよい。そのような塩としては、本発明の式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物の塩として例示したものが挙げられる。
以下の反応において、最終工程を除き、生成物は反応液のまま、または粗生成物として次反応に用いてもよい。あるいは、公知の分離手段（例えば、再結晶、蒸留、クロマトグラフィー）を用いて、反応混合物から単離して、次反応に用いてもよい。最終工程の生成物の単離および精製は、同様に公知の分離手段を用いて、さらに必要に応じてこれら手段を種々組み合わせることにより、行うことができる。
【００４５】
２．１  Ｌが−ＯＣＨ２ＣＨ２−である化合物
式（Ｉ）の化合物（以下、化合物（Ｉ）と言うこともある）において、Ｌが−ＯＣＨ２ＣＨ２−の場合は、例えば、以下の反応スキーム１に示す工程により製造することできる。
【化２４】
2018230624.tif 000025
［式中、Ｂは、前記の定義と同じであり、ＰＧ１およびＰＧ２はそれぞれ独立して水酸基の保護基であり、Ｐ２はリン官能基または−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを示す。］
【００４６】
工程１について：
工程１において、式（ａ）で表される、ＰＧ１およびＰＧ２で表される１位および３位を保護したグリセロール化合物（以下、化合物（ａ）という）の２位水酸基をヒドロキシエチル化し、式（ｂ）で表される２−ヒドロキシエチルエーテル化合物（以下、化合物（ｂ）という）を製造する。
化合物（ａ）は、例えばグリセロールの２つの１級水酸基を同時にまたは別々に保護基で保護することにより得ることができる。ＰＧ１とＰＧ２は同一または異なってもよい水酸基の保護基であり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。ここで、ＰＧ１とＰＧ２が異なる置換基の場合には、例えば光学分割やキラルカラムなどの公知の手段によって、所望の２位炭素原子の立体配置を有する異性体を得ることもできる。
また、公知の光学活性１位または３位−Ｏ−モノ置換グリセロール誘導体から、それぞれ他方の３位または１位の１級水酸基を保護基で保護することにより化合物（ａ）を光学活性体として得ることもできる。
さらに、本明細書中の実施例などに記載の方法、すなわち公知の光学活性１、２位または２、３位−Ｏ−ジ置換グリセロール誘導体から、それぞれ３位または１位の１級水酸基を順に保護基で保護した後、２位水酸基の保護基を除去し、必要な場合、例えば脱保護の際にそれぞれ１位または３位の保護基が併せて除去される場合にはそれぞれ１位または３位を再保護することにより、化合物（ａ）を光学活性体として得ることもできる。
【００４７】
工程１は例えば、化合物（ａ）と各種２−置換エチル化試薬（例えば、２−ブロモエタノール、エチレンオキシド、ブロモアセトアルデヒドジアルキルアセタール、２−ハロ酢酸エステルなど）とを塩基の存在下で反応させ、その後必要な場合には２−置換エチル基を２−ヒドロキシエチル基に変換する工程を行うことにより実施することができる。
【００４８】
あるいは、工程１を本明細書中の実施例などに記載の方法により実施する場合、アリル化試薬と反応させ、炭素−炭素２重結合を酸化開裂後、還元処理することにより実施することもできる。
具体的には、まず、化合物（ａ）の２位水酸基のアリル化を行う。アリル化工程は、化合物（ａ）、アリル化試薬、塩基を溶媒中で攪拌することにより実施できる。アリル化試薬としては、例えばアリルブロミド、メタンスルホン酸アリル、ｐ−トルエンスルホン酸アリルなどを用いることができる。塩基としては、例えばトリエチルアミンなどの３級アミン、水素化ナトリウムなどを用いることができる。溶媒としては、化合物（ａ）または使用されるアルキル化試薬に対して非反応性であり、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，４−ジオキサン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、アセトニトリル、ベンゼン、トルエンまたはそれらの混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、−８０℃〜８０℃、より好ましくは室温〜５０℃の範囲となる。
【００４９】
化合物（ｂ）を得るため、アリル化を行った後、炭素−炭素２重結合を酸化開裂し、次いで還元処理を行う。
炭素−炭素２重結合の酸化開裂には、四酸化オスミウムおよび過ヨウ素酸塩、四酸化オスミウムおよび四酢酸鉛、四酸化ルテニウムおよび過ヨウ素酸塩などの触媒を用いることができる。反応後の触媒を再酸化するために、触媒とともにＮ−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド（ＮＭＯ）などの再酸化剤を用いてもよい。
溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、四塩化炭素もしくはそれらの混合物、またはそれらとｔｅｒｔ−ブタノールおよび水との混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、−３０℃〜８０℃、より好ましくは−１０℃〜５０℃の範囲となる。
還元処理は生じたＯ−置換グルタルアルデヒドから化合物（ｂ）を製造する工程で、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ジボラン（Ｂ２Ｈ６）、水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ）、水素化トリエチルホウ素リチウム（ＬｉＢＨ（Ｃ２Ｈ５）３）などの金属水素化物もしくはその他の水素化物またはそれらの錯化合物を還元剤として用いる方法により実施することができる。これらの方法は、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、トルエンなどの反応を阻害しない有機溶媒中、または前記還元剤によってはこれら有機溶媒と水との混合溶媒中で、還元剤の存在下、０℃〜４０℃で５分間から２４時間攪拌することにより実施できる。
【００５０】
工程２について：
工程２では、化合物（ｂ）で形成された水酸基を式Ｂで表される核酸塩基に変換した式（ｃ）で表される２−ヘテロアリールエチルエーテル化合物（以下、化合物（ｃ）という）を製造する。
工程２は、例えば、化合物（ｂ）の２位に導入された２−ヒドロキシエチル基の水酸基を脱離基、例えば、ハロゲン、アルキルスルホン酸エステル、アリールスルホン酸エステルなどに変換し、塩基、例えば水素化ナトリウムの存在下、式ＢＨ［式中、Ｂは前記の定義と同じである。］で表される複素環化合物と反応させることにより実施することができる。
【００５１】
また、本明細書中の実施例などに記載の方法、すなわち化合物（ｂ）と、式ＢＨ［式中、Ｂは前記の定義と同じである。］から選択される複素環化合物と、を、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）などのアゾジカルボン酸ジエステル、トリフェニルホスフィンなどのトリアリールホスフィンで処理することにより実施することもできる。
工程２を本明細書中の実施例などに記載の方法により実施する場合、溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、トルエン、四塩化炭素もしくはそれらの混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、０℃〜１００℃、より好ましくは１０℃〜８０℃の範囲となる。反応雰囲気は特に制限されないが、窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気下などの不活性雰囲気下で行うことが好ましい。
【００５２】
なお、式ＢＨの複素環化合物における、保護基（Ｒ２〜Ｒ６）は、化合物（ｂ）との反応後に脱保護および／または保護を行うことで、保護基（Ｒ２〜Ｒ６）を所望の保護基または水素原子へと変換することができる。例えば後述する実施例６のように、保護基（Ｒ２〜Ｒ６）がＢｏｃであるＢＨと化合物（ｂ）とを反応させた後、Ｂｏｃ基を脱保護し、その後、Ｂｚなどの異なる保護基（Ｒ２〜Ｒ６）で保護することができる。
【００５３】
また、式ＢＨの複素環化合物において、Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニルであってよく、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニルでありうる。これらの化合物は、市販の材料を用いてもよいし、当業者に公知の方法により製造することができる。例えば、Ｒ２〜Ｒ６で修飾された核酸塩基の一例が、１）Ｅｎｇｌｉｓｃｈ，Ｕ． ａｎｄＧａｕｓｓ， Ｄ．Ｈ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９１，３０，６１３−６２２；２）Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ． ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ， ２９，１５６５−１５７３， ２００１などの文献に記載されている。例えば、当該文献１）の６２３頁には様々な修飾塩基が開示され；当該文献２）の１５６９頁には複数の修飾塩基および製造方法が開示されている。当業者であれば、これらの文献に記載された修飾塩基を参照および／または改変することにより、上記Ｒ２〜Ｒ６を有するＢＨを得ることが可能である。
【００５４】
反応の過程で、例えばＰＧ１および／またはＰＧ２の保護基が脱保護される場合もある。この場合、所定の反応後に再度ＰＧ１および／またはＰＧ２の保護を行えばよい。
【００５５】
工程３について：
工程３では、化合物（ｃ）の３位水酸基を保護するＰＧ２の脱保護を行い、式（ｄ）で表される化合物（以下、化合物（ｄ）という）を製造する。保護基を除去する反応条件は保護基ＰＧ２の種類により異なり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
一例をあげると、例えば、ＰＧ２がＴＢＤＭＳなどのシリル系保護基の場合にはフッ化物の塩またはフッ化水素の付加体により脱保護することができる。例えば、溶媒中でフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を作用させる手法が挙げられる。溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンまたはそれらの混合物などである。
【００５６】
工程４について（１）：
工程４では、化合物（ｄ）の３位水酸基をリン官能基または−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨであるＰ２へ変換し、式（ｅ）で表される化合物（以下、化合物（ｅ）という）を製造する。
Ｐ２がリン官能基である場合、リン官能基としては、式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物を用いて、式（ＶＩＩ）のオリゴ核酸類縁体を、核酸合成法として知られているトリエステル法、ホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、Ｈ−ホスホネート法などにより製造する際のリン酸反応性基であるリン官能基を挙げることができる。
工程４においてリン酸反応性基を本明細書中の実施例などに記載のホスホロアミダイトに変換する場合について詳細に説明する。
リン官能基への変換反応は、Ｐ２のリン官能基として、前記した式（ｉ）のリン官能基へ変換するには、例えば、対応する下記式（ｉ’）、
【化２５】
2018230624.tif 000026
［各式中、Ｈａｌはハロゲン原子を示し、Ｙ１、Ｚ１およびＺ２は前記の定義と同じである］
で表わされるリン酸化試薬と、化合物（ｄ）とを反応させることにより製造することができる。これらの反応は、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、クロロホルム、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンなどの反応を阻害しない溶媒に溶解し、必要に応じて、例えば、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、コリジン、２，６−ルチジン等の存在下、室温で５分間から２４時間攪拌することにより実施することができる。
【００５７】
工程４について（２）：
Ｐ２が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである場合、工程４は化合物（ｄ）の３位水酸基をコハク酸のモノエステル化合物（ｅ）とする工程である。例えば、化合物（ｄ）を、塩基の存在下、無水コハク酸と反応させることにより製造することができる。また、化合物（ｄ）とコハク酸の一方のカルボン酸を保護した誘導体、例えばコハク酸モノエステルとを、活性化剤または縮合剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−［３―（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、トリフェニルホスフィン−アゾジカルボン酸ジエチルなどの存在下で縮合した後、保護基を除去して製造することができる。コハク酸上の保護基を除去する反応条件は保護基の種類により異なり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
【００５８】
以上に説明した方法により、化合物（ｅ）を製造することができる。
化合物（ｅ）は同位元素（例、３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３５Ｓ、１２５Ｉ等）等で標識されていてもよく、このような同位元素等で標識された化合物も化合物（ｅ）に包含される。
さらに、化合物（ｅ）において、１Ｈは２Ｈ（Ｄ）に変換されていてもよく、このような変換をされた重水素変換体も化合物（ｅ）に包含される。
また、化合物（ｅ）は、溶媒和物（例えば、水和物など）であっても、無溶媒和物であってもよく、いずれも化合物（ｅ）に包含される。
【００５９】
２．２  Ｌが−ＣＨ２ＯＣＨ２−である化合物
化合物（Ｉ）において、Ｌが−ＣＨ２ＯＣＨ２−の場合は、例えば、以下の反応スキーム２に示す工程により製造することができる。
【化２６】
2018230624.tif 000027
［式中、ＢおよびＰＧ１は、前記の定義と同じであり、ＰＧ３は水酸基の保護基を示す。］
【００６０】
工程１について：
工程１においては、式（ｆ）で表される、１つの水酸基がＰＧ３で表される保護基で保護された２−（保護）ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（以下、化合物（ｆ）という）の非保護の２つの水酸基をメチレン基を介して脱水閉環させ、式（ｇ）で表される１，３−ジオキサン化合物（以下、化合物（ｇ）という）を製造する。
化合物（ｆ）は、例えば２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの３つの１級水酸基のうち１つを保護基ＰＧ３で保護することにより得ることができる。ＰＧ３は、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
【００６１】
工程１は例えば、化合物（ｆ）とホルムアルデヒド誘導体（例えば、パラホルムアルデヒド、トリオキサン、ホルムアルデヒドジアルキルアセタールなど）とを酸の存在下反応させることにより実施することができる。酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸などの有機酸、塩化スズ（ＩＩ）、塩化亜鉛などのルイス酸を用いることができる。反応選択性を向上させるために臭化リチウムを用いることもできる。溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンまたはそれらの混合物などである。
【００６２】
上記工程１の別法として、例えば実施例に記載されるように、以下の工程により化合物（ｇ）を得ることができる。
【化２７】
2018230624.tif 000028
工程１’について：
工程１ａにおいては、２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（以下、化合物（ｑ）という）の２つの水酸基をメチレン基を介して脱水閉環させ、式（ｒ）で表される１，３−ジオキサン化合物（以下、化合物（ｒ）という）を製造する。例えば、化合物（ｑ）とホルムアルデヒド誘導体（例えば、パラホルムアルデヒド、トリオキサン、ホルムアルデヒドジアルキルアセタールなど）とを酸の存在下反応させることにより実施することができる。酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸などの有機酸、塩化スズ（ＩＩ）、塩化亜鉛などのルイス酸を用いることができる。反応選択性を向上させるために臭化リチウムを用いることもできる。溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンまたはそれらの混合物などである。
【００６３】
工程１ｂでは、化合物（ｒ）の残る水酸基を保護基ＰＧ３で保護した、式（ｇ）で表される化合物（以下、化合物（ｇ）という）を製造する。水酸基を保護する反応条件は保護基ＰＧ３の種類により異なり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
【００６４】
工程２について：
工程２においては、化合物（ｇ）と核酸塩基またはその誘導体とを酸の存在下反応させることにより式（ｈ）で表される化合物（以下、化合物（ｈ）という）を製造する。酸としては、塩酸、硫酸などの無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸などの有機酸、塩化スズ（ＩＩ）、塩化亜鉛、トリフルオロメタンスルホン酸トリアルキルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルトリフラートなどのルイス酸を用いることができる。核酸塩基は、そのまま用いることもできるが、化合物（ｈ）と反応させる前にあらかじめシリル化剤とトリアルキルシリル化反応を行うか、かかるシリル化剤の共存下で化合物（ｈ）と反応させることもできる。シリル化剤としては、クロロトリメチルシラン、Ｎ，Ｏ−ビス(トリメチルシリル)アセトアミドなどを用いることができる。溶媒としては、用いられる反応条件下で、それ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、１，２−ジクロロエタンまたはそれらの混合物などである。
【００６５】
工程３について：
工程３では、化合物（ｈ）の１位水酸基を保護基ＰＧ１で保護した、式（ｉ）で表される化合物（以下、化合物（ｉ）という）を製造する。水酸基を保護する反応条件は保護基ＰＧ１の種類により異なり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
【００６６】
工程４について：
工程４では、化合物（ｉ）の３位水酸基を保護するＰＧ３の脱保護を行い、式（ｊ）で表される化合物（以下、化合物（ｊ）という）を製造する。保護基を除去する反応条件は保護基ＰＧ３の種類により異なり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
【００６７】
工程５について
工程５では、化合物（ｊ）の３位水酸基をリン官能基または−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨであるＰ２へ変換し、式（ｋ）で表される化合物（以下、化合物（ｋ）という）を製造する。
本工程は出発物質を化合物（ｊ）として、スキーム１の工程４と同様にして行うことができる。
【００６８】
化合物（Ｉ）において、Ｌが−ＣＨ２ＯＣＨ２−の場合は、別法として例えば、以下の反応スキーム３に示す工程により製造することができる。
【化２８】
2018230624.tif 000029
［式中、Ｂ、ＰＧ１、およびＰＧ３は、前記の定義と同じであり、Ｌ１はアルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ）または脱離基であり、ＰＧ４は水酸基の保護基を示す。］
【００６９】
工程１について：
工程１においては、式（ｌ）で表される、１位および３位水酸基をそれぞれＰＧ４およびＰＧ３で表される保護基で保護した２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（以下、化合物（ｌ）という）の残る水酸基の水素原子を、Ｌ１で置換されたメチルで置換し、式（ｍ）で表される化合物（以下、化合物（ｍ）という）を製造する。
ＰＧ３とＰＧ４は同一または異なってもよい水酸基の保護基であり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
Ｌ１はアルコキシ（例えばメトキシ、エトキシ）、アシルオキシ（例えばアセトキシ）または脱離基である。脱離基としては、特に限定されず、例えば、ハロゲン原子、トシル基などが挙げられる。
出発物質となる化合物（ｌ）は、例えば２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの３つの１級水酸基のうち２つを同時にまたは別々に保護基で保護することにより得ることができる。ここで、ＰＧ３とＰＧ４が異なる置換基の場合には、例えば光学分割やキラルカラムなどの自体公知の手段によって、所望の２位炭素原子の立体配置を有する異性体を得ることもできる。
また、例えば、酵素による不斉加水分解を用いて２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールの３つの１級水酸基のうち２つを異なる保護基で保護した光学活性な化合物（ｌ’）を得ることもできる。（Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．  Ｃｈｅｍ．  １９９０，  ３７９  −  ３８８，Ｏｒｇ．  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．  Ｄｅｖ．  ２０１２，  １６，  １５２７−１５３７）化合物（ｌ’）は、以降の工程の反応条件により、光学活性な化合物（ｌ）としてそのまま使用可能な場合もあり、また、公知の保護・脱保護手段を用いて所望の保護基に変換した光学活性な化合物（ｌ）を得ることもできる。
【００７０】
工程１は、化合物（ｌ）とホルムアルデヒド誘導体、例えば、パラホルムアルデヒド、トリオキサンなどとを酸の存在下反応させることにより実施することができ、Ｌ１が脱離基である化合物（ｍ）を得ることができる。酸としては、塩化水素などを用いることができる。
工程１に用いる溶媒としては、化合物（ｌ）、ホルムアルデヒド誘導体および使用される酸に対して非反応性であり、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、ベンゼン、トルエン、１，４−ジオキサン、ジクロロメタンなどである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、−３０℃〜５０℃、より好ましくは−１０℃〜３０℃の範囲となる。
また、工程１は、化合物（ｌ）とＭＯＭＣｌを、トリアルキルアミンとヨウ化ナトリウム存在下反応させることにより実施することができ、Ｌ１がメトキシ基である化合物（ｍ）を得ることができる。溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンまたはそれらの混合物などである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、０℃〜還流温度、より好ましくは室温〜１００℃の範囲となる。
【００７１】
工程２について：
工程２は、化合物（ｍ）と核酸塩基ＢＨとを反応させ、式（ｎ）で表される化合物（以下、化合物（ｎ）という）を製造する。化合物（ｍ）においてＬ１が脱離基である場合、化合物（ｍ）と核酸塩基ＢＨとを塩基の存在下反応させ、化合物（ｎ）を製造する。塩基としては、炭酸ナトリウムなどの無機塩基、トリエチルアミンなどの有機塩基を用いることができる。
工程２に用いる溶媒としては、化合物（ｍ）、および使用される塩基に対して非反応性であり、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、例えば、テトラヒドロフラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトン、クロロホルム、１，４−ジオキサン、ベンゼン、トルエン、ジクロロメタンなどである。反応の温度は、用いる試薬、溶媒に応じて調整することができるが、好ましくは、−３０℃〜８０℃、より好ましくは−１０℃〜５０℃の範囲となる。
また、工程２は、化合物（ｍ）においてＬ１がメトキシ基である場合には、先述の化合物（ｈ）を合成する場合、すなわちスキーム２の工程２と同じ方法により実施することが出来る。
【００７２】
工程３について：
工程３では、化合物（ｎ）の１位水酸基ＰＧ４を脱保護し、式（ｏ）で表される１位アルコール体（以下化合物（ｏ）という）を製造する。保護基を除去する反応条件は保護基ＰＧ４の種類により異なり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
【００７３】
工程４について：
工程４では、化合物（ｏ）の１位水酸基を保護基ＰＧ１で保護した、式（ｐ）で表される化合物（以下、化合物（ｐ）という）を製造する。水酸基を保護する反応条件は保護基ＰＧ１の種類により異なり、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。
【００７４】
工程４で製造した化合物（ｐ）から、反応スキーム２の工程４以下の工程を経て、目的物（ｋ）を得ることができる。
【００７５】
３．修飾核酸モノマー化合物担持体
本発明の一形態は、式（Ｉ）で表される修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物を提供する。
【００７６】
一実施形態は、下記式（ＶＩＩＩ）で表される、修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物を提供する。
【化２９】
2018230624.tif 000030
式（ＶＩＩＩ）中、ＬおよびＢは、前記の定義と同じである。
式（ＶＩＩＩ）中、Ａ３は、水素原子または水酸基の保護基である。Ａ３は、水素原子であってよいことを除き、上述したＡ１の定義と同一であり、Ａ１について上述した具体的態様を同様に適用することができる。一つの態様では、Ａ３は、トリチル、４−メトキシトリチル、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４，４’，４’’−トリメトキシトリチルから選択される水酸基の保護基である。
【００７７】
固相担体として、例えば、ＣＰＧ（コントロールドポアグラス；ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）、シリカゲルのような無機担体；ＨＣＰ（ｈｉｇｈｌｙｃｒｏｓｓ-ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）などの高分子担体などが用いられる。
【００７８】
上記式（ＶＩＩＩ）で表される一価の基は、式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物のＡ２が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである化合物に由来するものである。当該Ａ２のカルボキシル基と固相担体上のアミノ基との結合反応を介して式（ＶＩＩＩ）の一価の基がアミノ基を介して固相担体に保持されうる。
【００７９】
例えば、式（Ｉ）においてＡ２が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである修飾核酸モノマー化合物が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物は、以下の反応スキーム４に示す工程により製造することできる。
【化３０】
2018230624.tif 000031
［式中、ＢおよびＬは、前記の定義と同じであり、ＰＧ１は水酸基の保護基であり、Ｐ２は−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨであり、Ｓは担体を示す。］
【００８０】
本工程は、Ｐ２が−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである、化合物（ｅ）または化合物（ｋ）とアミノ基を官能基として有する固相担体との結合反応により、オリゴ固相合成法の出発原料である修飾核酸モノマー担持物を製造する。
具体的には、化合物（ｅ）または化合物（ｋ）を、溶媒中、縮合剤及び塩基の存在下、アミノ基を官能基として有する固相担体と反応させることにより、修飾核酸モノマー化合物（上記式（ＶＩＩＩ）においてＡ３が水酸基の保護基（ＰＧ１）である化合物）由来の一価の基が担体に固定された担持物を得る。この担持物は、核酸オリゴマー原料としてそのまま核酸自動合成機に導入することができる。
また、ＰＧ１を脱保護反応に付することにより、上記式（ＶＩＩＩ）においてＡ３が水素原子である化合物が担体に固定された担持物を得ることもできる。
【００８１】
アミノ基を官能基として有する固相担体としては、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製のＡｍｉｎｏ  ＬＣＡＡ  ＣＰＧサポート、ＴｅｎｔａＧｅｌＴＭ(R)  Ｎ  ＮＨ２等の市販品を利用することができる。
【００８２】
溶媒としては、用いられる反応条件下でそれ自体が非反応性である溶媒（非反応性溶媒）を用いる。そのような非反応性溶媒の例としては、限定されないが、例えば、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、アセトニトリル、トルエン、塩化メチレンまたはそれらの混合物などである。
【００８３】
縮合剤としては、例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）およびその塩酸塩などが挙げられる。
【００８４】
塩基としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール、これらの混合物等が挙げられる。
【００８５】
得られた修飾核酸モノマー担持物は、必要により、公知の方法によりキャッピング処理を行ってもよい。例えば、未反応のカルボキシ基は、前記溶媒中、前記縮合剤、前記塩基の存在下、メタノール、エタノールなどのアルコール類とエステル化することによりキャッピングすることができる。また、未反応の−ＯＨ基又は−ＮＨ２基は、前記溶媒中、前記塩基の存在下、無水酢酸と反応させてアセチル化することによりキャッピングすることができる。
【００８６】
４．オリゴ核酸類縁体
本発明の一形態は、該モノマー化合物を構成ユニットの少なくとも一つとして含むオリゴ核酸類縁体を提供する。
【００８７】
一実施形態のオリゴ核酸類縁体は、下記式（ＩＸ）
【化３１】
2018230624.tif 000032
で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体またはその塩（ただし、上記部分構造を２以上含有する場合は、当該部分構造間でＢ３、およびＬはそれぞれ同一であっても、異なってもよい。）である。
式（ＩＸ）中、Ｌは、前記定義と同じである。
【００８８】
式（ＩＸ）において、Ｂ３は核酸塩基である。
Ｂ３の一つの態様としては、下記式（ＩＩ）’、（ＩＩＩ）’、（ＩＶ）’および（Ｖ）’から選択される核酸塩基である。
【化３２】
2018230624.tif 000033
式（ＩＩ）’〜（Ｖ）’中、Ｒ１は、水素原子またはメチルを示す。
式（ＩＩ）’〜（Ｖ）’中、Ｒ２およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す。
式（ＩＩ）’〜（Ｖ）’中、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立して水素原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ１−６アルキル−カルボニル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル、Ｃ６−１４アリール−カルボニル、Ｃ６−１４アリールスルホニル、または保護基を示す。
上記Ｂ３は、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６がそれぞれ独立して水素原子であってよいことを除き、上述したＢの定義と同一である。Ｂについて上述した具体的態様、さらには当該具体的態様においてＲ３、Ｒ５およびＲ６が水素原子へと置換された態様を同様に適用することができる。Ｒ３、Ｒ５およびＲ６が水素原子へと置換された部分構造を有するオリゴ核酸類縁体は、例えば、後述する固相法において、モノマー化合物を順次組み込んだオリゴマーを形成後、固相担体からの切り出しの前または後に、公知の脱保護手段を用いて保護基を除去することにより得られる。
【００８９】
一実施形態において、Ｂ３は、下記式（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）から選択される。
【化３３】
2018230624.tif 000034
［式中、Ｒ１は前記の定義と同じである。］
【００９０】
実施形態のオリゴ核酸類縁体は、式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物に対応する式（ＩＸ）の部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体である。ただし、上記の通り、実施形態のオリゴ核酸類縁体は、式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物と異なり、式（Ｉ）におけるＲ３、Ｒ５およびＲ６の少なくとも一つが水素原子であってもよい。
【００９１】
一つの態様としては、本発明のオリゴ核酸類縁体は、一の上記式（ＩＸ）の部分構造を含有するものである。他の一つの態様としては、本発明のオリゴ核酸類縁体は、Ｌが−ＯＣＨ２ＣＨ２−である一の上記部分構造を含有するものである。さらに一つの態様としては、それぞれＬが−ＯＣＨ２ＣＨ２−である、２以上の上記部分構造を含有するオリゴ核酸類縁体である。また、別の一つの態様としては、それぞれＬが−ＯＣＨ２ＣＨ２−であり、かつ２位炭素の絶対配置が同一の２以上の上記部分構造を含有するオリゴ核酸類縁体である。
【００９２】
本発明のオリゴ核酸類縁体は、式（ＩＸ）の部分構造を１以上含有し、式（ＩＸ）以外のヌクレオシドサブユニット（核酸塩基単位）をさらに含有してもよい。
式（ＩＸ）の部分構造以外のヌクレオシドサブユニットとしては、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシドのいずれでもよい。なお、本明細書において、「ヌクレオシドサブユニット」との語は、式（ＩＸ）の部分構造を有する構成ユニットを包含する。
サブユニットがリボヌクレオシドの場合にはリボース部分は公知の誘導体、例えば２’−Ｏ−メチルリボース、２’−フルオロリボースなどであってもよい。
ヌクレオシドサブユニットの塩基部分は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンのいずれでもよく、また、それらの修飾体であってよい。塩基部分の修飾体としては、例えば、塩基部分が、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基、アミノ基、モノＣ１−６アルキルアミノ基、ジＣ１−６アルキルアミノ基、ニトロ基、水酸基、シアノ基、カルボキシ基などで置換された当業者に公知の修飾体などが挙げられる。
【００９３】
本発明のオリゴ核酸類縁体を構成するヌクレオシドサブユニットの総数（核酸塩基単位の総数）としては、一つの態様としては、一鎖あたり４から１００個である。他の一つの態様としては、一鎖あたり４から３０個である。
例えば、オリゴ核酸類縁体がＤＮＡである場合には、一つの態様としては、一鎖あたり４から１００個であり、他の一つの態様としては一鎖あたり４から３０個である。
また、ＲＮＡである場合には、一つの態様としては、一鎖あたり４から５０個であり、他の一つの態様としては一鎖あたり４から３０個である。サブユニットとして式（ＩＸ）の部分構造は、一つの態様としてはオリゴ核酸類縁体中の核酸サブユニット総数に対して１％から１００％の範囲に相当する整数個、他の一つの態様としてはサブユニット総数に対して２％から８０％の範囲に相当する整数個、さらに他の一つの態様としては、２％から５０％の範囲に相当する整数個、また別の一つの態様としては、２％から２５％に相当する整数個、含有される。一つの態様としては、一鎖あたり４から３０個（より好ましくは４から２５個、さらに好ましくは４から２１個）のサブユニット総数に対して、１〜１０個（より好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜４個）の式（ＩＸ）の部分構造を含有する。また、そのオリゴ核酸類縁体中での含有位置は、いずれでもよく、使用目的に応じて、任意に決めることができる。
【００９４】
天然のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド中の各ヌクレオシドは下記（ＸＩＶ）に示す、ホスホジエステル結合により結合している。本発明のオリゴ核酸類縁体において、各ヌクレオシドサブユニットは、各ヌクレオシド間でホスホジエステル結合（式（ＸＩＶ））またはホスホロチオエート結合（式（ＸＶ））のいずれかにより結合している。なお、ホスホロチオエートは溶媒中では溶媒によって（ａ）および（ｂ）の互変異性体として存在しうる
【化３４】
2018230624.tif 000035
［各式中、Ｎｕ１およびＮｕ２はヌクレオシドサブユニットを示す］
【００９５】
本発明のオリゴ核酸類縁体は、その塩の形態にあってもよく、そのような塩としては、前記した本発明の式（Ｉ）の修飾核酸モノマー化合物の塩と同様の塩を挙げることができる。
【００９６】
実施形態のオリゴ核酸類縁体は、より具体的には、例えば、下記式（ＸＶＩ）
【化３５】
2018230624.tif 000036
［式中、ＹはＨ、ＯＨ、ＯＭｅまたはＦを示し、Ｂ３は前記と同様であり、ａは３から９９の整数を示し、ＴはＯＨまたはＳＨを示す。但し、Ｙ、Ｂ３、およびＴは各構成ユニットにおいてそれぞれ同じでも異なっていてもよい。］
で表わされるオリゴ核酸類縁体において、その任意の位置における１つ以上の構造ユニットに代わって、下記式（ＩＸ）
【化３６】
2018230624.tif 000037
（式中、ＬおよびＢ３は、前記定義と同じである。）
で表される部分構造を含む構造（すなわち、下記式（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）から選ばれる部分構造）を１つ以上含有するオリゴ核酸類縁体である。
ａは、一つの態様としては３から４９、他の一つの態様としては、３から２９の整数である。
【００９７】
【化３７】
2018230624.tif 000038
（式中、Ｔ、Ｂ３およびＬは、前記定義と同じである。ただし、上記部分構造を２以上含有する場合は、当該部分構造間でＢ３、およびＬはそれぞれ同一であっても、異なってもよい。）
【００９８】
本発明のオリゴ核酸類縁体は、例えばｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ、または、ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡなどとして使用することができる。
したがって、本発明のオリゴ核酸類縁体は、これらの使用用途に応じて、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド等であってもよく、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ体、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド体であってもよい。
本発明のオリゴ核酸類縁体を、例えば、ｓｉＲＮＡとして使用する場合には、標的遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖あるいはそれらの改変体からなる二本鎖ＲＮＡが好ましく、本発明の式（Ｉ）の部分構造は、センス鎖またはアンチセンス鎖あるいはそれらの改変体のいずれか一方に、または両者に含有させることができる。ここで改変体とは、前記したヌクレオシドの塩基部分の修飾体、糖部分の修飾体、天然体以外の各種ホスホジエステル結合を含むものが挙げられる。ｓｉＲＮＡは、そのセンス鎖とアンチセンス鎖とが、両３’末端の２から５程度のリボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドあるいは公知の修飾ヌクレオチドからなるダングリングエンドを持つようにハイブリダイズして二本鎖を形成しているものであってもよい。
【００９９】
５．オリゴ核酸類縁体の製造
本発明のオリゴ核酸類縁体は、式（ＶＩ）または式（ＶＩＩ）の修飾核酸モノマー化合物を用いて、核酸合成法として公知のトリエステル法、ホスホロアミダイト法、ジクロロホスフィン誘導体を用いる方法、Ｈ−ホスホネート法などにより固相法または液相法で製造することができる。また、これらの製造は核酸自動合成機器によって行うこともできる。（Ｎ. Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ., Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ.， １０９（２５），  ７８４５−７８５４ （１９８７）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２５（７），７１３−７１６（１９８４））
【０１００】
例えばホスホロアミダイト法を用いた固相法は以下のように行うことができる。
【化３８】
2018230624.tif 000039
［式中、ＹはＨ、ＯＨ、ＯＭｅまたはＦを示し、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ上記Ｂの定義と同義であり、Ｂ３は前記と同様であり、Ｔ’はＯまたはＳを示す。但し、Ｙ、およびＴは各構成ユニットにおいてそれぞれ同じでも異なっていてもよい。］
【０１０１】
なお、上記固相法において、Ｙの水酸基（ＯＨ）を公知の保護・脱保護手段を用いて所望の保護基に変換し、オリゴ核酸類縁体を製造してもよい。
【０１０２】
上記固相法の鎖延長用原料として例えば、本発明の式（ＶＩ）の修飾核酸モノマー化合物、および／または３’末端−ポリマーサポートとして式（ＶＩＩＩ）の修飾核酸モノマー担持物を用いることにより、任意の位置に式（ＩＸ）で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体を製造することができる。鎖延長用原料としては、式（ＶＩ）の修飾核酸モノマー化合物のほか、式（Ｉ）においてＡ２が、リン官能基（好ましくは−Ｐ（−ＯＲ７）−ＮＲ８Ｒ９である）化合物を使用することができる。
【０１０３】
得られた粗オリゴヌクレオチド生成物は、逆相もしくはイオン交換クロマトグラフィーなど公知の方法によって、単離・精製が可能であり、脱保護および精製とも、必要に応じて公知の方法を更に組み合わせて同様に行うこともできる。
【０１０４】
固相合成を行う場合、オリゴヌクレオチドブロックが結合する固相担体としては、例えば、ＣＰＧ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）、シリカゲルのような無機担体；ＨＣＰ（ｈｉｇｈｌｙｃｒｏｓｓ-ｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）などの高分子担体が用いられる。また、固相担体として、上記高分子担体にリンカー（例、末端アミンリンカー、コハク酸エステルリンカー）が結合した担体を用いることもできる。
【０１０５】
例えば、上述した式（ＶＩＩＩ）で表される、修飾核酸モノマー化合物由来の一価の基が、担体上のアミノ基を介して固相担体に保持されている修飾核酸モノマー担持物をオリゴ核酸類縁体の製造に用いることができる（例示スキーム１、２を参照）。
【化３９】
2018230624.tif 000040
［式中、ＰＧ１、Ｙ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｔ’、Ｌは、前記定義と同じである。］
【０１０６】
上記例示スキーム１に記載されるように、式（ＶＩＩＩ）で表される修飾核酸モノマー化合物を鎖延長用原料モノマーと縮合反応させ、次いで酸化又は硫化工程を行うことで、ヌクレオシドサブユニット間がホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合される。これを、さらに鎖延長工程（上記例示スキーム１のｓｔｅｐ２〜５または下記例示スキーム２のｓｔｅｐ２〜５）を繰り返すことにより、複数のヌクレオシドサブユニットが連結されたオリゴヌクレオチドブロックを得ることが可能である。オリゴヌクレオチドブロックの製造後には、サポートからの切り出し、および、脱保護反応を行うことにより、実施形態のオリゴ核酸類縁体を得ることができる。鎖延長工程の反復回数中任意の回数において、式（ＶＩ）で表される修飾核酸モノマー化合物を鎖延長用原料モノマーとして用いることで、３’末端および３’末端を除く任意の位置、任意の個数の式（ＩＸ）で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体を得ることができる。
【０１０７】
【化４０】
2018230624.tif 000041
［式中、Ｙ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｔ’、Ｌは、前記定義と同じである。］
【０１０８】
上記例示スキーム２に記載されるように、３’末端−固相担体と、鎖延長用原料モノマーとして、式（Ｉ）においてＡ２が、リン官能基（好ましくは−Ｐ（−ＯＲ７）−ＮＲ８Ｒ９である）修飾核酸モノマー化合物（例えば、式（ＶＩ）で表される修飾核酸モノマー化合物）とを縮合反応させ、次いで酸化又は硫化工程を行うことで、ヌクレオシドサブユニット間がホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合により結合される。これを、さらに鎖延長工程（上記例示スキーム１のｓｔｅｐ２〜５または例示スキーム２のｓｔｅｐ２〜５）を繰り返すことにより、複数のヌクレオシドサブユニットが連結されたオリゴヌクレオチドブロックを得ることが可能である。オリゴヌクレオチドブロックの製造後には、サポートからの切り出し、および、脱保護反応を行うことにより、実施形態のオリゴ核酸類縁体を得ることができる。鎖延長工程の反復回数中任意の回数において、式（ＶＩ）で表される修飾核酸モノマー化合物を鎖延長用原料モノマーとして用いることで、３’末端を除く任意の位置、任意の個数の式（ＩＸ）で表される部分構造を１以上含有するオリゴ核酸類縁体を得ることができる。
【０１０９】
また、３’末端への導入用に特別のモノマーの調製を要しないユニバーサルリンカーを担持した固相合成用担体（ユニバーサルサポート、例えばＡｎｄｒｅｉ  Ｐ．Ｇｕｚａｅｖ  ａｎｄ  Ｍｕｔｈｉａｈ  Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，２３８０−２３８１）を用いれば、以下に示すように式（ＶＩ）で表される修飾核酸モノマー化合物により、式（ＩＸ）で表される部分構造を任意の位置に、１以上の任意の個数含有するオリゴ核酸類縁体を得ることができる。
【化４１】
2018230624.tif 000042
【０１１０】
ホスホロチオエート結合を有するオリゴ核酸類縁体はリン原子の酸化工程に代えて、硫化工程を行うことで調製できる。硫化工程は、ホスホロチオエート結合を持つ修飾核酸の合成に通常使用されている硫化反応を採用することができる。硫化反応においては、例えば、硫黄の２，６−ルチジン懸濁液、硫黄の二硫化炭素溶液、ローソン試薬に加え、Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシド）（Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｗ．Ｅｇａｎ， Ｊ．Ｂ．Ｒｅｇａｎ，ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９０，１１２，１２５３−１２５４）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）（Ｈ. Ｖｕ ｅｔ ａｌ., Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ.， ３２，  ３００５−３００８（１９９１）、（３−（（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン）（ＤＤＴＴ）（Ｍ．Ｏｖｅｒｈｏｆｆ ａｎｄＧ．Ｓｃｚａｋｉｅｌ，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ，２００５，６，１１７６−８１）、などの試薬を用いることができる。リン原子の酸化剤に加え、予め硫化反応試薬をセットしておくことで、オリゴ核酸類縁体の任意の位置にホスホロチオエート結合を導入することができる核酸自動合成機器が利用されている。
【０１１１】
目的とするオリゴ核酸類縁体を得るために、また、例えば、各オリゴヌクレオチドブロックの製造後などに、脱保護反応に付することができる。脱保護反応としては、先述のＧｒｅｅｎｅらの文献を参照して選択することができる。また、最終的に製造されたオリゴ核酸類縁体を、例えば、脱保護反応と同様に、濃アンモニア水、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液等で処理することによって固相担体から切り出すことができる。脱保護反応および固相担体からの切り出しについても核酸自動合成機器が利用されている。
【０１１２】
他にも、式（ＸＶ）に示されるホスホロジチオエート構造の構築法としてはＭａｒｓｈａｌｌらの文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：  １５６４−１５７０，  １９９３）やＣａｒｕｔｈｅｒｓおよびＮｉｅｌｓｅｎの文献（ＷＯ１９８９/０１１４８６）を参考にすることができる。
【０１１３】
以上の工程により、式（ＩＸ）の部分構造の１つまたは２つ以上をオリゴ核酸類縁体の任意の位置にサブユニット（核酸塩基単位）として組み込むことができる。
【０１１４】
かくして得られる一本鎖のオリゴ核酸類縁体を、更に二本鎖のオリゴ核酸類縁体とすることもできる。すなわち、例えば、先ず、得られた一本鎖のオリゴ核酸類縁体と相補的な配列を有する他の一本鎖オリゴ核酸類縁体を製造する。この他の一本鎖オリゴ核酸類縁体は、天然型のオリゴヌクレオチドであってもよく、本発明の式（ＩＸ）の部分構造を１つ以上含有するオリゴヌクレオチドであってもよく、また、各ヌクレオシドの塩基部分や糖部分が、それらの修飾体であるヌクレオシドを構成ユニットとして含むオリゴヌクレオチドであってもよい。例えば、これらの一本鎖オリゴ類縁体のそれぞれを、当業者に公知の通常のアニーリング用緩衝液に溶解させ、それらを混合して、加温処理後に、冷却させ、二本鎖のオリゴ核酸類縁体を製造することができる。
【０１１５】
本発明の修飾核酸モノマー化合物を少なくとも構成ユニットの一つとして含むオリゴ核酸類縁体は生物学的安定性（例えば、血中安定性、より具体的には、血清中のオリゴ核酸類縁体残存量など）および／または標的遺伝子発現抑制活性に優れている。したがって、上記オリゴ核酸類縁体を、例えばｓｉＲＮＡとして用いた場合には、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、「遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品」としての有用性が期待される。本発明の修飾核酸モノマー化合物を少なくとも構成ユニットの一つとして含むオリゴ核酸類縁体は、例えば緩衝剤及び／又は安定剤等の慣用の助剤を配合して注射剤などの非経口投与用製剤とすることができる。さらに、脂質からなるリポソームに内包させ、または機能性高分子膜などで被覆することにより血中安定性を向上させた製剤を調製することができる。
【実施例】
【０１１６】
以下、実施例および参考例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、以下において使用される略語は当業者に周知の慣用的な略語であり、いくつかの略語は以下に示す。
Ｂｚ：ベンゾイル
ＣＰＧ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＡＤ：アゾジカルボン酸 ジイソプロピル
ＤＭＡＰ：４−（ジメチルアミノ）ピリジン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＴｒ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＤＳＰＣ：１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
Ｅｔ：エチル
ＨＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＬＣＡＡ：Ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ａｌｋｙｌａｍｉｎｅ
ｎ−：ノルマル
ＮＭＯ：Ｎ−メチルモルホリン  Ｎ−オキシド
ＮａＢＨ４：水素化ホウ素ナトリウム
Ｐｈ：フェニル
Ｐｒ：プロピル
ｉＰｒ：イソプロピル
ｔｅｒｔ−：ターシャリー
ＴＢＡＦ：テトラｎ−ブチルアンモニウム  フルオリド
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＢＤＰＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル
１Ｈ−ＮＭＲ：プロトン核磁気共鳴スペクトルメトリー【０１１７】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルの化学シフトは、テトラメチルシランに対するδ単位（ｐｐｍ）で、カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）で記録されている。パターンは、ｓ；シングレット、ｄ；ダブレット、ｂｒ；ブロード、ｍ；マルチプレットを意味する。
１Ｈ−ＮＭＲは、Ｖａｒｉａｎ／Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ４００ＭＨｚ  ｓｙｓｔｅｍ（４００ＭＨｚ）を使用して測定した。
クロマトグラフィーに関しては、ＹＡＭＡＺＥＮ社製パラレルプレップ｛カラム：ＹＡＭＡＺＥＮ社製  Ｈｉ−ＦｌａｓｈＴＭ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ）、サイズ；Ｓ（１６×６０ｍｍ）、Ｍ（２０×７５ｍｍ）、Ｌ（２６×１００ｍｍ）、２Ｌ（２６×１５０ｍｍ）｝あるいはメルク社製シリカゲル（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０，７０−２３０  ｍｅｓｈ）、富士シリシア製シリカゲル（ＢＷ−Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ，２００−４００  ｍｅｓｈ）を用いた。
超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）による分取はＷａｔｅｒｓ社製Ｐｒｅｐ１００ｑを用いて行った。
ｓｉＲＮＡ合成のために用いる固相担体の合成においては、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製のＡｍｉｎｏ  ＬＣＡＡ  ＣＰＧサポート  １０００Å（ローディング量：１０３μｍｏｌ／ｇ）を用いた。【０１１８】
以下の実施例中、「室温」は通常約１０℃から約３５℃を示す。％は特記しない限り重量パーセントを示す。
本明細書中の化合物名の標記において、（±）−および（ＲＳ）−はラセミ体を、（＋）−、（−）−、（Ｒ）−および（Ｓ）−はそれぞれエナンチオマーの（＋）型、（−）型、（Ｒ）−体および（Ｓ）−体であることを示す。また、立体配置中の「＊」は、相対配置を表し、特に記載がない場合にはいずれか１のエナンチオマーを示す。【０１１９】
実施例１
（Ｒ）−２−［２−（３−ベンゾイル−５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロピル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
【化４２】
2018230624.tif 000043
【０１２０】
（１）（Ｒ）−ｔｅｒｔ−ブチル［（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］ジフェニルシラン（化合物２）の合成
【化４３】
2018230624.tif 000044
【０１２１】
（Ｓ）−（＋）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（化合物１，ＣＡＳ番号２２３２３−８２−６，１０．０ｇ，７５．６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．６９ｇ，５．６８ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１５．７ｍｌ，１１２．７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２５０ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（２６．２ｍｌ，１００．６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え６０時間攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ｎ−ヘプタンで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル）にて精製し、標記化合物２（２７．０ｇ，７２．９ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０５（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，３Ｈ），３．６５（ｄｄ，Ｊ＝６．４，１０．４Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ＝４．５，１０．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９１（ｄｄ，Ｊ＝６．１，８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０７（ｄｄ，Ｊ＝６．４，８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄｄｄ，Ｊ＝４．５，６．１，６．４，６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３３−７．４８（ｍ，６Ｈ），７．６２−７．７１（ｍ，４Ｈ）．【０１２２】
（２）（Ｒ）−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−１，２−ジオール（化合物３）の合成
【化４４】
2018230624.tif 000045
【０１２３】
実施例１−（１）で得た化合物２（２７．０ｇ，７２．９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２６０ｍＬ）とＭｅＯＨ（６０ｍＬ）に溶解し、室温で濃塩酸（１２ｍＬ）とＭｅＯＨ（２００ｍＬ）の混合液を加え、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を氷水バスで冷却し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えｐＨを中性にしたのち、少量の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でアルカリ性とし、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル）にて精製し、標記化合物３（１７．６ｇ，５３．３ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０７（ｓ，９Ｈ），１．９９（ｄｄ，Ｊ＝５．３，７．０Ｈｚ，１Ｈ），２．５９（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），３．５７−３．９０（ｍ，５Ｈ），７．３５−７．４９（ｍ，６Ｈ），７．６２−７．７０（ｍ，４Ｈ）．【０１２４】
（３）（Ｒ）−１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−２−オール（化合物４）の合成
【化４５】
2018230624.tif 000046
【０１２５】
実施例１−（２）で得た化合物３（９．０ｇ，２７．２ｍｍｏｌ）をピリジン（２２５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、ＤＭＡＰ（０．２３ｇ，１．９ｍｍｏｌ）と４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１１．１ｇ，３２．８ｍｍｏｌ）を加え、室温で３６時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣を塩化メチレン（１５０ｍＬ）で溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水の順で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物４（１４．３ｇ，２２．６ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９９（ｓ，９Ｈ），２．４４（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１３−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．８３−３．９３（ｍ，１Ｈ），６．７４−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．０９−７．４９（ｍ，１５Ｈ），７．５６−７．６７（ｍ，４Ｈ）．【０１２６】
（４）（Ｒ）−｛２−（アリルオキシ）−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロポキシ｝（ｔｅｒｔ−ブチル）ジフェニルシラン（化合物５）の合成
【化４６】
2018230624.tif 000047
【０１２７】
実施例１−（３）で得た化合物４（１１．６ｇ，１８．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（９０ｍＬ）に溶解し、水浴で冷やしながら６０％水素化ナトリウム（２．２ｇ，５５．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加えたのち、室温で１０分間攪拌した。水浴で冷やしながらアリルブロミド（７．８ｍＬ，９１．６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１時間半攪拌したのち、６０％水素化ナトリウム（１．５ｇ，３６．７ｍｍｏｌ）とアリルブロミド（７．８ｍＬ，９１．６ｍｍｏｌ）を追加した。１時間後および２時間後にアリルブロミド（７．８ｍＬ，９１．６ｍｍｏｌ）を２回追加した。反応混合物を氷水バスで冷却し、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物５（９．７ｇ，１４．４ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９６（ｓ，９Ｈ），３．１５−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．５９−３．６７（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．７７（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），４．０６−４．１８（ｍ，２Ｈ），５．１０−５．１８（ｍ，１Ｈ），５．２２−５．３１（ｍ，１Ｈ），５．８４−５．９７（ｍ，１Ｈ），６．７３−６．８４（ｍ，４Ｈ），７．１３−７．４９（ｍ，１５Ｈ），７．５６−７．６７（ｍ，４Ｈ）．【０１２８】
（５）（Ｒ）−２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−２−イル｝オキシ）エタノール（化合物６）の合成
【化４７】
2018230624.tif 000048
【０１２９】
実施例１−（４）で得た化合物５（９．０ｇ，１３．４ｍｍｏｌ）とＮＭＯ（２．４ｇ，２０．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４５ｍＬ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（１５ｍＬ）および水（７．５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、２．５％四酸化オスミウム／ｔｅｒｔ−ブタノール溶液（１．８ｍＬ，０．１４４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪拌した。反応液に５％亜硫酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）を加え１０分間攪拌したのち、塩化メチレン（９０ｍＬ）および水（９０ｍＬ）を加え分離したのち、塩化メチレンで２回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。
得られた残渣をＴＨＦ（４５ｍＬ）に溶解し、四酢酸鉛（６．２ｇ，１３．４ｍｍｏｌ）を内温が１０℃以下になるように少しずつ加え、氷冷下２０分間、室温で４０分間攪拌した。不溶物を濾別したのち、ＴＨＦ（２７ｍＬ）で洗浄した。
ろ液に、氷冷下、ＮａＢＨ４（０．９４ｇ，２４．９ｍｍｏｌ）を１Ｎ水酸化ナトリウム（４５ｍＬ）に溶解した溶液を、内温が１０℃以下になるように加え、氷冷下１５分間、室温で２時間攪拌した。反応液にｐＨ＝８まで飽和塩化アンモニウム水溶液を加え５分間攪拌した。酢酸エチル（５４ｍＬ）を加え分離したのち、酢酸エチルで１回抽出した。有機相を０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（４５ｍＬ）と飽和食塩水（３６ｍＬ）の混合液で洗浄したのち、飽和食塩水で再度洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物６（７．６ｇ，１１．２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９９（ｓ，９Ｈ），２．５９−２．７４（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．７６（ｍ，６Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），６．７４−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１４−７．４９（ｍ，１５Ｈ），７．５６−７．６８（ｍ，４Ｈ）．【０１３０】
（６）（Ｓ）−３−ベンゾイル−１−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物７）の合成
【化４８】
2018230624.tif 000049
【０１３１】
実施例１−（５）で得た化合物６（１．０ｇ，１．４８ｍｍｏｌ）、３−ベンゾイルチミン（０．６８ｇ，３．０ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．９７ｇ，３．７０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に懸濁させし、氷冷下、ＤＩＡＤ（０．７３ｍＬ，３．６９ｍｍｏｌ）を滴下し、窒素雰囲気下、室温で１９時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、３−ベンゾイルチミン置換体（１．２８ｇ）を得た。
得られた粗置換体をＴＨＦ（１．４ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（６．５ｍＬ，６．５ｍｍｏｌ）を加え、同温で２時間半攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液（１：１）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物７（７７２ｍｇ，１．１９ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．８６（ｓ，３Ｈ），１．９５−２．０３（ｍ，１Ｈ），３．１８−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．４７−３．９２（ｍ，６Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．９４−４．０６（ｍ，１Ｈ），６．７９−６．８６（ｍ，４Ｈ），７．１８−７．３４（ｍ，９Ｈ），７．３６−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．５５−７．６５（ｍ，１Ｈ），７．８３−７．９４（ｍ，２Ｈ）．【０１３２】
（７）（Ｒ）−２−［２−（３−ベンゾイル−５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロピル  （２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物８）の合成
【化４９】
2018230624.tif 000050
【０１３３】
実施例１−（６）で得た化合物７（２９４ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．３９ｍＬ，２．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．６ｍＬ）に溶解し、氷冷下、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．２５ｍＬ，１．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％Ｅｔ３Ｎ）にて精製し、標記化合物８（２００ｍｇ，０．２３５ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０７−１．２１（ｍ，１２Ｈ），１．７８−１．８４（ｍ，３Ｈ），２．４８−２．６２（ｍ，２Ｈ），３．１３−３．２７（ｍ，２Ｈ），３．４３−４．０１（ｍ，１１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），６．７７−６．８６（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．３４（ｍ，８Ｈ），７．３５−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．５４−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．８３−７．９２（ｍ，２Ｈ）．【０１３４】
実施例２
（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロピル  （２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
【化５０】
2018230624.tif 000051
【０１３５】
（１）（Ｓ）−ｔｅｒｔ−ブチル［（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］ジフェニルシラン（化合物１０）の合成
【化５１】
2018230624.tif 000052
【０１３６】
（Ｒ）−（−）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール（化合物９，ＣＡＳ番号１４３４７−７８−５，１．０ｇ，７．５６ｍｍｏｌ）とイミダゾール（１．０８ｇ，１５．９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７．６ｍＬ）に溶解し、０℃でｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（２．１ｍｌ，７．９５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えたのち、室温で１６時間攪拌した。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（１５ｍＬ）と水（１５ｍＬ）を加え分離した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去し、標記化合物１０の粗生成物（２．８ｇ）を得た。【０１３７】
（２）（Ｓ）−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−１，２−ジオール（化合物１１）の合成
【化５２】
2018230624.tif 000053
【０１３８】
実施例２−（１）で得た化合物１０の粗生成物（２．８ｇ）を塩化メチレン（２８ｍＬ）とＭｅＯＨ（１４ｍＬ）に溶解し、室温で濃塩酸（１．３ｍＬ，１５．１ｍｍｏｌ）を加え３０分間攪拌した。反応混合物を氷水バスで冷却し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えｐＨを中性にしたのち、少量の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えアルカリ性とし、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去し、標記化合物１１の粗生成物（２．４８ｇ）を得た。【０１３９】
（３）（Ｓ）−１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−２−オール（化合物１２）の合成
【化５３】
2018230624.tif 000054
【０１４０】
実施例２−（２）で得た化合物１１の粗生成物（２．４８ｇ）をピリジン（３０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２．１ｇ，６．０５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（０．１３ｇ，０．３８ｍｍｏｌ）を追加し、室温で１時間攪拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、得られた残渣をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルに懸濁させ、ろ過し不溶物を除去した。ろ液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水の順で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物１２（２．６８ｇ，４．２３ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９９（ｓ，９Ｈ），２．４４（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），３．１３−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．７０−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．８３−３．９３（ｍ，１Ｈ），６．７４−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．０９−７．４９（ｍ，１５Ｈ），７．５６−７．６７（ｍ，４Ｈ）．【０１４１】
（４）（Ｓ）−｛２−（アリルオキシ）−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロポキシ｝（ｔｅｒｔ−ブチル）ジフェニルシラン（化合物１３）の合成
【化５４】
2018230624.tif 000055
【０１４２】
実施例２−（３）で得た化合物１２（１．０ｇ，１．５８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．３ｍＬ）に溶解し、水浴で冷やしながら６０％水素化ナトリウム（０．１１ｇ，２．８４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えたのち、室温で４５分間攪拌した。水浴で冷やしながらアリルブロミド（０．１５ｍＬ，１．８２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２時間攪拌したのち、６０％水素化ナトリウム（０．２４ｇ，６．２０ｍｍｏｌ）とアリルブロミド（０．４５ｍＬ，５．４５ｍｍｏｌ）を追加し、２時間攪拌した。反応混合物を氷水バスで冷却し、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物１３（０．７３ｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９６（ｓ，９Ｈ），３．１５−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．５９−３．６７（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．７７（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），４．０６−４．１８（ｍ，２Ｈ），５．１０−５．１８（ｍ，１Ｈ），５．２２−５．３１（ｍ，１Ｈ），５．８４−５．９７（ｍ，１Ｈ），６．７３−６．８４（ｍ，４Ｈ），７．１３−７．４９（ｍ，１５Ｈ），７．５６−７．６７（ｍ，４Ｈ）．【０１４３】
（５）（Ｓ）−２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−２−イル｝オキシ）エタノール（化合物１４）の合成
【化５５】
2018230624.tif 000056
【０１４４】
実施例２−（４）で得た化合物１３（０．５３ｇ，０．７８８ｍｍｏｌ）およびＮＭＯ（０．１４ｇ，１．２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．６ｍＬ）、ｔｅｒｔ−ブタノール（０．９０ｍＬ）および水（０．４５ｍＬ）に溶解し、氷冷下、２．５％四酸化オスミウム／ｔｅｒｔ−ブタノール溶液（０．１０ｍＬ，７．８μｍｏｌ）を加え、室温で１８時間攪拌した。反応液に５％亜硫酸水素ナトリウム水溶液（２．６ｍＬ）を加え３０分間攪拌したのち、水を加え塩化メチレンで３回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。
得られた残渣をＴＨＦ（２．６ｍＬ）に溶解し、氷冷下、四酢酸鉛（０．３９ｇ，０．７８８ｍｍｏｌ）を内温が１０℃以下になるように少しずつ加え、氷冷下２０分間、室温で３０分間攪拌した。反応液を濾過し不溶物を除去したのち、ＴＨＦで洗浄した。
ろ液に、氷冷下、ＮａＢＨ４（５５ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）を１Ｎ水酸化ナトリウム（２．６ｍＬ）に溶解した溶液を、内温が１０℃以下になるように加え、氷冷下２０分間、室温で１時間攪拌した。反応液にｐＨ＝８まで飽和塩化アンモニウム水溶液を加え５分間攪拌した。酢酸エチルを加え分離したのち、水層を酢酸エチルで１回抽出した。有機相を１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄したのち、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物１４（０．４３ｇ，０．６３５ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９９（ｓ，９Ｈ），２．５９−２．７４（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．６０−３．７６（ｍ，６Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），６．７４−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１４−７．４９（ｍ，１５Ｈ），７．５６−７．６８（ｍ，４Ｈ）．【０１４５】
（６）（Ｒ）−３−ベンゾイル−１−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物１５）の合成
【化５６】
2018230624.tif 000057
【０１４６】
実施例２−（５）で得た化合物１４（４３０ｍｇ，０．６３５ｍｍｏｌ）、３−ベンゾイルチミン（２６３ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（４１７ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（６．４ｍＬ）に懸濁させ、氷冷下、ＤＩＡＤ（０．３１ｍＬ，１．５９ｍｍｏｌ）を滴下し、窒素雰囲気下、室温で１９時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、３−ベンゾイルチミン置換体（８３０ｍｇ）を得た。
得られた粗置換体をＴＨＦ（１．７ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（２．５ｍＬ，２．５４ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下２０分間、室温で１時間半攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物１５（２０６ｍｇ，０．３２０ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．８６（ｓ，３Ｈ），１．９５−２．０３（ｍ，１Ｈ），３．１８−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．４７−３．９２（ｍ，６Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．９４−４．０６（ｍ，１Ｈ），６．７９−６．８６（ｍ，４Ｈ），７．１８−７．３４（ｍ，９Ｈ），７．３６−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．５５−７．６５（ｍ，１Ｈ），７．８３−７．９４（ｍ，２Ｈ）．【０１４７】
（７）（Ｓ）−２−［２−（３−ベンゾイル−５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロピル  （２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物１６）の合成
【化５７】
2018230624.tif 000058
【０１４８】
実施例１−（７）の方法に準じ、実施例２−（６）で得た化合物１５（２０５ｍｇ，０．３１５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．２７ｍＬ，１．５８ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１４ｍＬ，０．５０６ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（２．０ｍＬ）から、標記化合物１６（１６２ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０７−１．２１（ｍ，１２Ｈ），１．７８−１．８４（ｍ，３Ｈ），２．４８−２．６２（ｍ，２Ｈ），３．１３−３．２７（ｍ，２Ｈ），３．４３−４．０１（ｍ，１１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），６．７７−６．８６（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．３４（ｍ，８Ｈ），７．３５−７．４６（ｍ，４Ｈ），７．５４−７．６４（ｍ，１Ｈ），７．８３−７．９２（ｍ，２Ｈ）．【０１４９】
実施例３  
（Ｒ）−２−［２−（３−ベンゾイル−５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロピル  （２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
【化５８】
2018230624.tif 000059
【０１５０】
（１）（Ｓ）−３−ベンゾイル−１−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物１７）の合成
【化５９】
2018230624.tif 000060
【０１５１】
実施例１−（５）で得た化合物６（１．７７ｇ，２．６２ｍｍｏｌ）、３−ベンゾイルウラシル（１．１３ｇ，５．２３ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．７２ｇ，６．５４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２６ｍＬ）に懸濁させ、氷冷下、ＤＩＡＤ（１．３ｍＬ，６．５４ｍｍｏｌ）を滴下し、窒素雰囲気下、室温で１９時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、３−ベンゾイルウラシル置換体（３．７ｇ）を得た。
得られた粗置換体をＴＨＦ（２．６ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（１３．１ｍＬ，１３．１ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、２時間半攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液（１：１）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物１７（１．４０ｇ，２．２０ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．８９−２．０３（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．３３（ｍ，２Ｈ），３．４８−３．５８（ｍ，１Ｈ），３．５８−３．９３（ｍ，５Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），３．９４−４．０６（ｍ，１Ｈ），５．６９（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７７−６．８９（ｍ，４Ｈ），７．１８−７．３４（ｍ，９Ｈ），７．３６−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５５−７．６５（ｍ，１Ｈ），７．８３−７．９４（ｍ，２Ｈ）．【０１５２】
（２）（Ｒ）−２−［２−（３−ベンゾイル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］プロピル  （２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物１８）の合成
【化６０】
2018230624.tif 000061
【０１５３】
実施例１−（７）の方法に準じ、実施例３−（１）で得た化合物１７（４００ｍｇ，０．６３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｍＬ，３．７７ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．２０ｍＬ，０．７２ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（６．０ｍＬ）から、標記化合物１８（２７０ｍｇ，０．３２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０５−１．２４（ｍ，１２Ｈ），２．４８−２．６３（ｍ，２Ｈ），３．１２−３．３０（ｍ，２Ｈ），３．４３−４．０４（ｍ，１１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），５．５８−５．６９（ｍ，１Ｈ），６．７５−６．８８（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．３４（ｍ，８Ｈ），７．３５−７．４６（ｍ，３Ｈ），７．４７−７．５５（ｍ，１Ｈ），７．５５−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．８３−７．９３（ｍ，２Ｈ）．【０１５４】
実施例４
（Ｒ）−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−［２−（４−イソブチルアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］プロピル  （２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイトの合成
【化６１】
2018230624.tif 000062
【０１５５】
（１）（Ｓ）−Ｎ−｛１−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝イソブチルアミド（化合物１９）の合成
【化６２】
2018230624.tif 000063
【０１５６】
実施例１−（５）で得た化合物６（１．１ｇ，１．６３ｍｍｏｌ）、Ｎ４−イソブチリルシトシン（０．５９ｇ，３．２５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．０７ｇ，６．５４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１６ｍＬ）に懸濁させ、氷冷下、ＤＩＡＤ（０．８０ｍＬ，４．０６ｍｍｏｌ）を滴下し、窒素雰囲気下、室温で１９時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、Ｎ４−イソブチリルシトシン置換体（１．６ｇ）を得た。
得られた粗置換体をＴＨＦ（１．６ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（７．３ｍＬ，７．３ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、２時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液（１：１）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物１９（４８９ｍｇ，０．８１ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２０−１．２６（ｍ，６Ｈ），１．８８−１．９８（ｍ，１Ｈ），２．４５−２．４９（ｍ，１Ｈ），３．１１−３．２６（ｍ，２Ｈ），３．４３−３．５３（ｍ，１Ｈ），３．５４−３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７７−３．９１（ｍ，２Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．９２−４．０３（ｍ，１Ｈ），４．０７−４．１８（ｍ，１Ｈ），６．７９−６．８６（ｍ，４Ｈ），７．１８−７．３４（ｍ，８Ｈ），７．３５−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．６６−７．７２（ｍ，１Ｈ），７．８７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０１５７】
（２）（Ｒ）−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−［２−（４−イソブチルアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］プロピル  （２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物２０）の合成
【化６３】
2018230624.tif 000064
【０１５８】
実施例１−（７）の方法に準じ、実施例４−（１）で得た化合物１９（４５０ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．５８ｍＬ，３．３８ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．２５ｍＬ，１．１２ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（７．５ｍＬ）から、標記化合物２０（２８８ｍｇ，０．３６ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０５−１．１９（ｍ，１２Ｈ），１．１９−１．２５（ｍ，６Ｈ），２．４４−２．６６（ｍ，３Ｈ），３．０５−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．４１−４．１８（ｍ，１１Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），６．７７−６．８７（ｍ，４Ｈ），７．１６−７．３３（ｍ，８Ｈ），７．３４−７．４３（ｍ，２Ｈ），７．７２−７．８１（ｍ，１Ｈ），７．８７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０１５９】
実施例５
９−｛２−［（（２Ｒ）−１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミド）フォスフィノ］オキシ｝プロパン−２−イル）オキシ］エチル｝−２−イソブチルアミド−９Ｈ−プリン−６−イル  ジフェニルカーバメートの合成
【化６４】
2018230624.tif 000065
【０１６０】
（１）（Ｓ）−９−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］−２−ジイソプロピルアミド−９Ｈ−プリン−６−イル  ジフェニルカーバメート（化合物２１）の合成
【化６５】
2018230624.tif 000066
【０１６１】
実施例１−（５）で得た化合物６（０．８６ｇ，１．２７ｍｍｏｌ）、Ｎ２−イソブチリル−Ｏ６−ジフェニルカルバモイルグアニン（０．９０ｇ，２．１６ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．７３ｇ，２．８０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１３ｍＬ）に懸濁させ、氷冷下、ＤＩＡＤ（０．５５ｍＬ，２．８０ｍｍｏｌ）を滴下し、窒素雰囲気下、室温で２時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、Ｎ２−イソブチリル−Ｏ６−ジフェニルカルバモイルグアニン置換体（１．３ｇ）を得た。
得られた粗置換体をＴＨＦ（１．２ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（４．８ｍＬ，４．８ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、２時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水の混合液（１：１）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物２１（６８０ｍｇ，０．８１ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２１−１．３０（ｍ，６Ｈ），２．３９−２．４９（ｍ，１Ｈ），２．７５−２．９８（ｍ，１Ｈ），３．１１−３．２２（ｍ，２Ｈ），３．４６−３．７１（ｍ，３Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．８２−３．９２（ｍ，１Ｈ），３．９２−４．０３（ｍ，１Ｈ），４．２５−４．３６（ｍ，１Ｈ），４．３８−４．５１（ｍ，１Ｈ），６．７６−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．５２（ｍ，１９Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ）．【０１６２】
（２）９−｛２−［（（２Ｒ）−１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−｛［（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミド）フォスフィノ］オキシ｝プロパン−２−イル）オキシ］エチル｝−２−イソブチルアミド−９Ｈ−プリン−６−イル  ジフェニルカーバメート（化合物２２）の合成
【化６６】
2018230624.tif 000067
【０１６３】
実施例５−（１）で得た化合物２１（４００ｍｇ，０．４７８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．４５ｍＬ，２．６３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．８ｍＬ）に溶解し、氷冷下、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．１３ｍＬ，０．５７４ｍｍｏｌ）を加え２時間攪拌した。氷冷下、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．０６４ｍＬ，０．２８７ｍｍｏｌ）を追加し１０分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物２２（２６０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０４−１．１８（ｍ，１２Ｈ），１．２２−１．３０（ｍ，６Ｈ），２．４４−２．５５（ｍ，２Ｈ），２．８３−３．０２（ｍ，１Ｈ），３．１１−３．２６（ｍ，２Ｈ），３．４０−３．８２（ｍ，７Ｈ），３．７６（ｓ，６Ｈ），３．８２−４．０１（ｍ，２Ｈ），４．２４−４．４７（ｍ，２Ｈ），６．７６−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．５２（ｍ，１９Ｈ），７．９９（ｓ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ）．【０１６４】
実施例６
（Ｒ）−２−（２−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）エトキシ）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロピル  （２−シアノエチル）  ジイソプロピルホスホロアミドの合成
【化６７】
2018230624.tif 000068
【０１６５】
（１）（Ｒ）−２−［２−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エトキシ］−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−１−オール（化合物２３）の合成
【化６８】
2018230624.tif 000069
【０１６６】
実施例１−（５）で得た化合物６（２．５ｇ，３．６９ｍｍｏｌ）、Ｎ６，Ｎ６−ジ−Ｂｏｃ−アデニン（２．４８ｇ，７．３９ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（２．２３ｇ，８．４９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３７ｍＬ）に溶解し、氷冷下、ＤＩＡＤ（１．７ｍＬ，８．４９ｍｍｏｌ）を滴下し、窒素雰囲気下、室温で３時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、Ｎ６，Ｎ６−ジ−Ｂｏｃ−アデニン置換体（５．０６ｇ）を得た。得られた粗置換体を塩化メチレン（３７ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｍ  ＴＦＡ（１０ｍＬ，１３０．７ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で４時間攪拌した。氷冷下、反応混合物に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２６ｍＬ）を加え、室温で１５分間攪拌したのち、飽和食塩水を加えた。得られた混合物をクロロホルムで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／酢酸エチル）にて精製し、標記化合物２３（１．４５ｇ，２．９４ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０３（ｓ，９Ｈ），３．４６−３．７４（ｍ，５Ｈ），３．７６−４．００（ｍ，３Ｈ），４．１４−４．２６（ｍ，１Ｈ），４．３８−４．５２（ｍ，１Ｈ），５．５９（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），７．３３−７．４７（ｍ，６Ｈ），７．５８−７．６７（ｍ，４Ｈ），７．８３（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，１Ｈ）．【０１６７】
（２）（Ｒ）−Ｎ−｛９−［２−（｛１−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］−９Ｈ−プリン−６−イル｝ベンズアミド（化合物２４）の合成
【化６９】
2018230624.tif 000070
【０１６８】
実施例６−（１）で得た化合物２３（１．４５ｇ，２．９５ｍｍｏｌ）をピリジン（１４．８ｍＬ）に溶解し、氷冷下、ベンゾイルクロリド（２．７ｍＬ，２３．６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１６時間攪拌した。ＭｅＯＨ（８．３ｍＬ）を加えたのち反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣に水を加え酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去し粗生成物（３．３ｇ）を得た。
得られた粗生成物をＴＨＦ（２８ｍＬ）とＥｔＯＨ（１３ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（５．９ｍＬ，５．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間半攪拌した。反応混合物に飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／酢酸エチル）にて精製し、標記化合物２４（９００ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０３（ｓ，９Ｈ），２．９１−３．０３（ｍ，１Ｈ），３．４２−３．７７（ｍ，６Ｈ），３．７８−４．０１（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．３８（ｍ，１Ｈ），４．４３−４．５７（ｍ，１Ｈ），７．３２−７．４８（ｍ，６Ｈ），７．４９−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．５８−７．６７（ｍ，５Ｈ），７．９９−８．０６（ｍ，２Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），８．９９（ｓ，１Ｈ）．【０１６９】
（３）（Ｒ）−Ｎ−｛９−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］プロパン−２−イル｝オキシ）エチル］−９Ｈ−プリン−６−イル｝ベンズアミド（化合物２５）の合成
【化７０】
2018230624.tif 000071
【０１７０】
実施例６−（２）で得た化合物２４（９００ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ）をピリジン（９ｍＬ）に溶解し、氷冷下、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（７６８ｍｇ，２．２６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４時間攪拌したのち、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１１３ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）を追加し、室温で２時間攪拌した。氷冷下、反応混合物に氷水を加えた、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物２５（１．１７ｇ，１．３０ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９４（ｓ，９Ｈ），２．９１−３．０３（ｍ，１Ｈ），３．４２−３．７７（ｍ，６Ｈ），３．７８−４．０１（ｍ，２Ｈ），４．２５−４．３８（ｍ，１Ｈ），４．４３−４．５７（ｍ，１Ｈ），６．７１−６．８１（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．２７（ｍ，７Ｈ），７．２８−７．４５（ｍ，８Ｈ），７．４７−７．６７（ｍ，７Ｈ），７．９９−８．０５（ｍ，２Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），８．９９（ｓ，１Ｈ）．【０１７１】
（４）（Ｓ）−Ｎ−｛９−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］−９Ｈ−プリン−６−イル｝ベンズアミド（化合物２６）の合成
【化７１】
2018230624.tif 000072
【０１７２】
実施例６−（３）で得た化合物２５（１．１７ｇ，１．３０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．３ｍＬ）に溶解し、氷冷下、１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（６．５ｍＬ，６．５ｍｍｏｌ）を滴下し、同温で４時間攪拌した。反応混合物に水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物２６（８１０ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．９５−３．０４（ｍ，１Ｈ），３．１０−３．２０（ｍ，２Ｈ），３．４８−３．７１（ｍ，３Ｈ），３．８８（ｓ，６Ｈ），３．８６−３．９７（ｍ，１Ｈ），３．９８−４．０９（ｍ，１Ｈ），４．３２−４．４３（ｍ，１Ｈ），４．４８−４．６０（ｍ，１Ｈ），６．７６−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．３２（ｍ，７Ｈ），７．３３−７．４１（ｍ，２Ｈ），７．４９−７．５７（ｍ，２Ｈ），７．５８−７．６６（ｍ，１Ｈ），７．９９−８．０７（ｍ，２Ｈ），８．１１（ｓ，１Ｈ），８．８０（ｓ，１Ｈ），９．０１（ｓ，１Ｈ）．【０１７３】
（５）（Ｒ）−２−（２−（６−ベンズアミド−９Ｈ−プリン−９−イル）エトキシ）−３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロピル  （２−シアノエチル）  ジイソプロピルホスホロアミド（化合物２７）の合成
【化７２】
2018230624.tif 000073
【０１７４】
実施例１−（７）の方法に準じ、実施例６−（４）で得た化合物２６（４５０ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．７０ｍＬ，４．１ｍｍｏｌ）、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．２３ｍＬ，１．０ｍｍｏｌ）、塩化メチレン（６．８ｍＬ）から標記化合物２７（２４２ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０２−１．２０（ｍ，１２Ｈ），２．５０−２．６５（ｍ，２Ｈ），３．０８−３．２６（ｍ，２Ｈ），３．４３−３．７７（ｍ，７Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．９０−４．０５（ｍ，２Ｈ），４．３９−４．５０（ｍ，２Ｈ），６．７５−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．３３（ｍ，７Ｈ），７．３３−７．４２（ｍ，２Ｈ），７．４８−７．５８（ｍ，２Ｈ），７．５８−７．６６（ｍ，１Ｈ），７．９９−８．０８（ｍ，２Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），８．８１（ｓ，１Ｈ），９．０５（ｓ，１Ｈ）．【０１７５】
実施例７
（Ｒ）−４−｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−［２−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］プロポキシ｝−４−オキソブタノエート−ＣＰＧ  サポートの合成
【化７３】
2018230624.tif 000074
【０１７６】
（１）（Ｓ）−１−［２−（｛１−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−３−ヒドロキシプロパン−２−イル｝オキシ）エチル］ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物２８）の合成
【化７４】
2018230624.tif 000075
【０１７７】
実施例３−（１）で得た化合物１７（１００ｍｇ，０．１５７ｍｍｏｌ）を、室温で２Ｍ  ジメチルアミン／ＴＨＦ溶液（２．０ｍＬ，２．０ｍｍｏｌ）で溶解し１時間攪拌した。反応液を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物２８（８３ｍｇ，０．１５６ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．９３−２．００（ｍ，１Ｈ），３．１３−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．４６−３．５５（ｍ，１Ｈ），３．５７−４．００（ｍ，６Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），５．５４−５．６０（ｍ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，４Ｈ），７．１８−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，４Ｈ），７．３５−７．４２（ｍ，２Ｈ），８．０３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０１７８】
（２）トリエチルアミン  （Ｒ）−４−｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−［２−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］プロポキシ｝−４−オキソブタノエート（化合物２９）の合成
【化７５】
2018230624.tif 000076
【０１７９】
実施例７−（１）で得た化合物２８（４０ｍｇ，０．０７５ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（２７．５ｍｇ，０．２２５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（０．８０ｍＬ）に溶解し、室温で無水コハク酸（１５ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を加え１６時間攪拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物２９（３８ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，９Ｈ），２．５８（ｓ，４Ｈ），３．００（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，６Ｈ）３．１０−３．２１（ｍ，２Ｈ），３．５６−３．６８（ｍ，１Ｈ），３．７０−３．８５（ｍ，２Ｈ），３．８０（ｓ，６Ｈ），３．８９−４．０１（ｍ，１Ｈ），４．０５−４．１８（ｍ，２Ｈ），４．２２−４．３３（ｍ，１Ｈ），５．５４−５．６０（ｍ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，４Ｈ），７．１８−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，４Ｈ），７．３５−７．４２（ｍ，２Ｈ）．【０１８０】
（３）（Ｒ）−４−｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−［２−（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）エトキシ］プロポキシ｝−４−オキソブタノエート−ＣＰＧ  サポート（ＣＰＧサポート３０）の合成
【化７６】
2018230624.tif 000077
【０１８１】
実施例７−（２）で得た化合物２９（１５ｍｇ，０．０２０ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１１μＬ，０．０６１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．５ｍＬ）に溶解し、室温でＨＢＴＵ（１５．５ｍｇ，０．０４１ｍｍｏｌ）を加え、５分間静かに攪拌した。室温で、ＣＰＧサポート（３３０ｍｇ，１０．３ｍｍｏｌ）を素早く加え、１６時間静かに振とうした。振とうを止め、グラスフィルターで濾過した。残渣を塩化メチレン、２０％メタノール／塩化メチレン、塩化メチレン、ジエチルエーテルの順に洗浄し、得られたＣＰＧサポートを減圧下乾燥した。ピリジン（１．１ｍＬ）に懸濁させ、ＴＥＡ（１５μＬ）と無水酢酸（０．３５ｍＬ）を加え、室温で１時間静かに振とうした。懸濁液に塩化メチレンを加えろ過し、塩化メチレン、２０％メタノール／塩化メチレン、塩化メチレン、ジエチルエーテルの順に洗浄し、得られたＣＰＧサポートを減圧下乾燥し標記のＣＰＧサポート３０（３１０ｍｇ）を得た。５％ジクロロ酢酸／１，２−ジクロロエタンで処理した吸光度から計算されたローディング量は、６１．６μｍｏｌ／ｇであった。【０１８２】
合成例８（Ｒ＊）−１−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−（ヒドロキシメチル）プロポキシ｝メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンおよび（Ｓ＊）−１−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−（ヒドロキシメチル）プロポキシ｝メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンの合成
【化７７】
2018230624.tif 000078
【０１８３】
（１）（１，３−ジオキサン−５−イル）メタノール（化合物３２）の合成
【化７８】
2018230624.tif 000079
【０１８４】
２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール（化合物３１，ＣＡＳ番号４７０４-９４-３，３．０ｇ，２８．３ｍｍｏｌ），ホルムアルデヒド  ジメチルアセタール（８．７ｍｌ，９８．９ｍｍｏｌ）およびリチウムブロミド（０．４９ｇ，５．７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１４．１ｍＬ）に懸濁させ、室温でｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．５４ｇ，２．８３ｍｍｏｌ）を加え４０時間攪拌した。反応液にＴＥＡ（３ｍＬ）を加え、減圧下濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル）にて精製し、標記化合物３２（１．４８ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．５３（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），１．９６（ｄｄｄｄｄ，Ｊ＝３．９，５．９，６．６，１１．３，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｄｄ，Ｊ＝５．１，６．６Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｄｄ，Ｊ＝５．９，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｄｄ，Ｊ＝３．９，１１．３Ｈｚ，２Ｈ），４．８１（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ）．【０１８５】
（２）［（１，３−ジオキサン−５−イル）メトキシ］（ｔｅｒｔ−ブチル）ジフェニルシラン（化合物３３）の合成
【化７９】
2018230624.tif 000080
【０１８６】
合成例８−（１）で得た化合物３２（１．４８ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）とイミダゾール（１．７１ｇ，２５．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解し、室温でｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド（３．９ｍｌ，１５．０ｍｍｏｌ）をゆっくり加えたのち、１５時間攪拌した。反応液に水を加えジエチルエーテルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル）にて精製し、標記化合物３３（３．９ｇ，１０．９ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．０７（ｄｄｄｄｄ，Ｊ＝４．１，６．６，７．４，１１．３，１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．６５（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１１．３Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｄｄ，Ｊ＝４．１，１１．５Ｈｚ，１Ｈ），４．８１（ｄ、Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３４−７．４７（ｍ，６Ｈ），７．６０−７．６８（ｍ，４Ｈ）．【０１８７】
（３）（ＲＳ）−１−（｛３−［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］−２−（ヒドロキシメチル）プロポキシ｝メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物３４）の合成
【化８０】
2018230624.tif 000081
【０１８８】
ウラシル（１．８９ｇ，１６．８ｍｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン（２８ｍＬ）に懸濁させ、室温で、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（８．２ｍｌ，３３．７ｍｍｏｌ）を加えたのち１時間加熱還流した。室温まで放冷したのち減圧下濃縮した。得られた残渣を１，２−ジクロロエタン（４２ｍＬ）に溶解し、合成例８−（２）で得た化合物３３（２．０ｇ，５．６１ｍｍｏｌ）に加えた。室温で、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルトリフラート（２．６ｍｌ，１１．２ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で１時間攪拌した。反応液を室温まで放冷し、氷冷下、氷を含む飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注いだ。酢酸エチルで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル）にて精製し、標記化合物３４（１．９ｇ，４．０５ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０５（ｓ，９Ｈ），１．９６−２．０９（ｍ，１Ｈ），２．１１−２．２０（ｍ，１Ｈ），３．５７−３．８４（ｍ，６Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），５．７２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３６−７．４９（ｍ，６Ｈ），７．６０−７．６７（ｍ，４Ｈ），８．３７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０１８９】
（４）（ＲＳ）−１−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）オキシ］メチル｝プロポキシ｝メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物３５）の合成
【化８１】
2018230624.tif 000082
【０１９０】
実施例１−（７）の方法に準じ、合成例８−（３）で得た化合物３４（１．９ｇ，４．０５ｍｍｏｌ）、ピリジン（２５ｍＬ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（１．７９ｇ，５．２７ｍｍｏｌ）から標記化合物３５（２．９ｇ，３．７６ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：０．９５（ｓ，９Ｈ），２．０７−２．２１（ｍ，１Ｈ），３．０６−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．５７−３．６６（ｍ，２Ｈ），３．６９−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．７８（ｓ，６Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），５．６１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７５−６．８４（ｍ，４Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１５−７．４７（ｍ，１５Ｈ），７．５４−７．６３（ｍ，４Ｈ），７．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
【０１９１】
（５）（Ｒ＊）−１−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−（ヒドロキシメチル）プロポキシ｝メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物３６ａ）および（Ｓ＊）−１−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−（ヒドロキシメチル）プロポキシ｝メチル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン（化合物３６ｂ）の合成
【化８２】
2018230624.tif 000083
【０１９２】
実施例６−（４）の方法に準じ、合成例８−（４）で得た化合物３５（２．９ｇ，３．７６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（３．８ｍＬ）および１Ｍ  ＴＢＡＦ／ＴＨＦ溶液（２０．７ｍＬ，２０．７ｍｍｏｌ）から標記化合物のエナンチオマー混合物（１．６５ｇ，３．１０ｍｍｏｌ）を得た。
得られた混合物（２６０ｍｇ）をダイセル製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＤ−Ｈ（２ｃｍｘ２５ｃｍ）を用いた超臨界流体クロマトグラフィー（移動相  ＣＯ２：２−プロパノール：アセトニトリル（７０：１５：１５）、１２０ｂａｒ、４０℃、流速：１００ｍＬ／分）にて一回あたり１２ｍｇずつ分取し、ダイセル製ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ（登録商標）ＡＤ−Ｈ（４．６ｍｍｘ１５０ｍｍ、移動相  ２−プロパノール：ｎ−ヘキサン（５０：５０）、流速：１ｍＬ／分）での分析結果の保持時間４．４分の標記化合物（３６ａ：１１３ｍｇ、＞９９％ｅｅ）および保持時間４．９分の標記化合物（３６ｂ：１２３ｍｇ、＞９９％ｅｅ）を得た。
３６ａ：
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．０２−２．１５（ｍ，１Ｈ），３．１３−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．６２−３．７６（ｍ，４Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８−６．８８（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．４３（ｍ，９Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．
３６ｂ：
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：２．０２−２．１５（ｍ，１Ｈ），３．１３−３．２８（ｍ，２Ｈ），３．６２−３．７６（ｍ，４Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８−６．８８（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．４３（ｍ，９Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０１９３】
実施例９
（Ｓ＊）−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロピル  （２−シアノエチル）  ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物３７）の合成
【化８３】
2018230624.tif 000084
【０１９４】
合成例８−（５）で得た化合物３６ａ（１２０ｍｇ，０．２２５ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２３ｍＬ，１．３５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２．０ｍＬ）に溶解し、氷冷下、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．０７５ｍＬ，０．２７０ｍｍｏｌ）を加え１時間攪拌した。氷冷下、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．０１３ｍＬ，０．０４５ｍｍｏｌ）を追加し３０分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物３７（９０ｍｇ，０．１２３ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０４−１．２０（ｍ，１２Ｈ），２．１２−２．２７（ｍ，１Ｈ），２．５０−２．６１（ｍ，２Ｈ），３．０２−３．２３（ｍ，２Ｈ），３．４２−３．８４（ｍ，８Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），５．６９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７７−６．８６（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．４４（ｍ，９Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０１９５】
実施例１０
（Ｒ＊）−３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロピル  （２−シアノエチル）  ジイソプロピルホスホロアミダイト（化合物３８）の合成
【化８４】
2018230624.tif 000085
【０１９６】
合成例８−（５）で得た化合物３６ｂ（１３５ｍｇ，０．２５３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（０．２６ｍＬ，１．５２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２．２ｍＬ）に溶解し、氷冷下、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．０８５ｍＬ，０．３０４ｍｍｏｌ）を加え１時間攪拌した。氷冷下、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．０１１ｍＬ，０．０５１ｍｍｏｌ）を追加し３０分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘプタン／酢酸エチル／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物３８（７５ｍｇ，０．１０２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．０４−１．２０（ｍ，１２Ｈ），２．１２−２．２７（ｍ，１Ｈ），２．５０−２．６１（ｍ，２Ｈ），３．０２−３．２３（ｍ，２Ｈ），３．４２−３．８４（ｍ，８Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），５．６９（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７７−６．８６（ｍ，４Ｈ），７．１５−７．４４（ｍ，９Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０１９７】
実施例１１
（Ｓ＊）−４−（３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロポキシ）−４−オキソブタノエート−ＣＰＧ  サポートの合成
【化８５】
2018230624.tif 000086
【０１９８】
（１）トリエチルアミン  （Ｓ＊）−４−（３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロポキシ）−４−オキソブタノエート（化合物３９）の合成
【化８６】
2018230624.tif 000087
【０１９９】
合成例８−（５）で得た化合物３６ａ（３５ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（２４ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（０．６５ｍＬ）に溶解し、室温で無水コハク酸（１３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を加え１６時間攪拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物３９（３４ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，９Ｈ），２．１４−２．２８（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），２．９８（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，６Ｈ），３．０７−３．１７（ｍ，２Ｈ），３．５５−３．６４（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），４．０７−４．２７（ｍ，２Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１４−７．４４（ｍ，９Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０２００】
（２）（Ｓ＊）−４−（３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロポキシ）−４−オキソブタノエート−ＣＰＧ  サポート（ＣＰＧサポート４０）の合成
【化８７】
2018230624.tif 000088
【０２０１】
実施例１１−（１）で得た化合物３９（３３ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（０．０２３Ｌ，０．１３５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．３ｍＬ）に溶解し、室温でＨＢＴＵ（３４ｍｇ，０．０９０ｍｍｏｌ）を加え、５分間静かに攪拌した。室温で、ＣＰＧサポート（７４３ｍｇ，０．０７７ｍｍｏｌ）を素早く加え、１６時間静かに振とうした。振とうを止めグラスフィルターで濾過した。残渣を塩化メチレン、２０％メタノール／塩化メチレン、塩化メチレン、ジエチルエーテルの順に洗浄し得られたＣＰＧサポートを減圧下乾燥した。ピリジン（２．４ｍＬ）に懸濁させ、ＴＥＡ（３３μＬ）と無水酢酸（０．８０ｍＬ）を加え、室温で１時間静かに振とうした。懸濁液に塩化メチレンを加えろ過し、塩化メチレン、２０％メタノール／塩化メチレン、塩化メチレン、ジエチルエーテルの順に洗浄し、得られたＣＰＧサポートを減圧下乾燥し標記のＣＰＧサポート４０（４６０ｍｇ）を得た。５％ジクロロ酢酸／１，２−ジクロロエタンで処理した吸光度から計算されたローディング量は、６２．２μｍｏｌ／ｇであった。【０２０２】
実施例１２
（Ｒ＊）−４−（３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロポキシ）−４−オキソブタノエート−ＣＰＧ  サポートの合成
【化８８】
2018230624.tif 000089
【０２０３】
（１）トリエチルアミン  （Ｒ＊）−４−（３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロポキシ）−４−オキソブタノエート（化合物４１）の合成
【化８９】
2018230624.tif 000090
【０２０４】
合成例８−（５）で得た化合物３６ｂ（３５ｍｇ，０．０６６ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（２４ｍｇ，０．１９７ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（０．６５ｍＬ）に溶解し、室温で無水コハク酸（１３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を加え１６時間攪拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／０．５％ＴＥＡ）にて精製し、標記化合物４１（３８ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，９Ｈ），２．１４−２．２８（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），２．９８（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，６Ｈ），３．０７−３．１７（ｍ，２Ｈ），３．５５−３．６４（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），４．０７−４．２７（ｍ，２Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１４−７．４４（ｍ，９Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０２０５】
（２）（Ｒ＊）−４−（３−［ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ］−２−｛［（２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メトキシ］メチル｝プロポキシ）−４−オキソブタノエート−ＣＰＧ  サポート（ＣＰＧサポート４２）の合成
【化９０】
2018230624.tif 000091
実施例１１−（２）の方法に準じ、実施例１２−（１）で得た化合物４１（３７ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．０２６Ｌ，０．１５１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３８ｍｇ，０．１０１ｍｍｏｌ）、ＣＰＧサポート（８２５ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（３．７ｍＬ）およびピリジン（２．７ｍＬ）、ＴＥＡ（０．０３７ｍＬ）、無水酢酸（０．９０ｍＬ）から、標記化合物−ＣＰＧサポート４２（５５０ｍｇ）を得た。５％ジクロロ酢酸／１，２−ジクロロエタンで処理した吸光度から計算されたローディング量は、６０．５μｍｏｌ／ｇであった。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．２４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，９Ｈ），２．１４−２．２８（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），２．９８（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，６Ｈ），３．０７−３．１７（ｍ，２Ｈ），３．５５−３．６４（ｍ，２Ｈ），３．７９（ｓ，６Ｈ），４．０７−４．２７（ｍ，２Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），５．７１（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８−６．８５（ｍ，４Ｈ），７．１４−７．４４（ｍ，９Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２９（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）．【０２０６】
実施例１３、比較例
実施例１から１２で製造した修飾核酸モノマー化合物、非特許文献２記載の方法で製造した下記式
【化９１】
2018230624.tif 000092
で示されるＵＮＡモノマー化合物、非特許文献３（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）記載の方法で製造した下記式
【化９２】
2018230624.tif 000093
で示されるＳＮＡモノマー化合物、並びにリボースまたはデオキシリボースを有するヌクレオシドモノマーを用いて、β−シアノエチルホスホロアミダイトを用いた改良固相ホスホロアミダイト法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １８（１８），５４３３−５４４１，（１９９０））により下記表１に記載の各種ｓｉＲＮＡを合成した。
【表１】
2018230624.tif 000094
ここで、表中、大文字はリボヌクレオチド、小文字のｔはデオキシリボヌクレオチドを表し、Ｘｆ（ＸはＣまたはＵ）は２’−フルオロリボヌクレオチドを表し、下線で示した塩基は、上記実施例で製造した化合物番号（Ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｎｏ．）の修飾核酸モノマー化合物をオリゴマー中に組み込んだことを表す。例えば、Ｄｕｐｌｅｘ  ＩＤ  ＃１のセンス鎖は下線で示した先頭の塩基Ｇの位置に実施例５で製造されたモノマー化合物２２が組み込まれていることを示す。なお、本実施例において、オリゴマーへの組み込みに用いた修飾核酸モノマー化合物（すなわち、化合物８，１８，２０，２２，２７）は核酸塩基のアミノ基または水酸基の水素原子（Ｒ２〜Ｒ６）が保護基で保護されているが、オリゴマーへの組み込み後のｓｉＲＮＡにおいては、当該核酸塩基におけるアミノ基または水酸基の保護基がいずれも脱保護されており（すなわち、Ｒ２〜Ｒ６はいずれも水素原子である）、化合物８，１８，２０，２２，２７に由来する下記構造単位８’（（ａ）または（ｂ）），１８’（（ａ）または（ｂ）），２０’，２２’，２７’（（ａ）または（ｂ））がそれぞれ組み込まれている。具体的には、これらがオリゴマーの３’末端以外に相当する場合には構造単位８’（ａ）、１８’（ａ）、２０’、２２’、２７’（ａ）が組み込まれており、これらがオリゴマーの３’末端に相当する場合（具体的には、＃２、＃３、および＃５のセンス鎖の３’末端の化合物２７、＃６および＃８のセンス鎖の３’末端の化合物８、＃１０のアンチセンス鎖の３’末端の化合物１８）はリン酸基を含まない構造単位２７’（ｂ）、８’（ｂ）、１８’（ｂ）が組み込まれている。
【化９３】
2018230624.tif 000095
また、表中のＦｉｒｅｆｌｙ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎは、Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクター中の標的配列の位置を示し、試験例１で使用したベクターにおいては、Ａ：７０４、Ｂ：９２９である。
合成した各種ｓｉＲＮＡについて、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ―ＭＳ（Ｔａｎａｋａ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １９８８，  ２：  １５１−１５３）による分子量（［Ｍ―Ｈ］―）の測定を行った結果を表２に示す。
【表２】
2018230624.tif 000096
【０２０７】
比較例
対照ｓｉＲＮＡとして、実施例１から１２で製造した修飾核酸モノマーを用いずにほぼ同様にホスホロアミダイト法により、以下の表３に示すセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる対照ｓｉＲＮＡを合成した。
対照ｓｉＲＮＡ
【表３】
2018230624.tif 000097
ここで、表中、大文字はリボヌクレオチド、小文字のｔはデオキシリボヌクレオチドを表し、小文字のｕは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、Ｘｆ（ＸはＣまたはＵ）は２’−フルオロリボヌクレオチドを表し、＾はホスホロチオエート結合を表し、下線で示した塩基は、上記で製造した化合物番号（Ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｎｏ．）の修飾核酸モノマー化合物をオリゴマー中に組み込んだことを表す。なお、オリゴマーへの組み込み後のｓｉＲＮＡにおいては、当該核酸モノマー化合物におけるアミノ基または水酸基の保護基がいずれも脱保護されており、化合物４３，４４に由来する下記構造単位４３’，４４’がそれぞれ組み込まれている。
【化９４】
2018230624.tif 000098
合成した対照ｓｉＲＮＡについて、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ―ＭＳによる分子量（［Ｍ―Ｈ］―）の測定を行った。結果を表４に示す。
【表４】
2018230624.tif 000099
【０２０８】
試験例
次に、製造した各種ｓｉＲＮＡの評価を以下のようにして行った。
１）Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポータアッセイを用いた各種ｓｉＲＮＡのｉｎｖｉｔｒｏ活性評価
表１および表３に記載の各種ｓｉＲＮＡ（終濃度１−１０ｎＭ/ｗｅｌｌ）、Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクターｐＧＬ４．１３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ＲｅｎｉｌｌａＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクターｐＧＬ４．７３（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）４．０×１０４個／１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ ｗｅｌｌｐｌａｔｅにリバーストランスフェクションした。一晩培養後、Ｄｕａｌ−ＧｌｏＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて添付文書に従いＦｉｒｅｆｌｙＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性およびＲｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を測定した。ＣｏｎｔｒｏｌとしてｓｉＲＮＡを用いない細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性（Ｆｉｒｅｆｌｙ/Ｒｅｎｉｌｌａ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を１００％として、各種ｓｉＲＮＡ導入細胞のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性（相対値）（ｉ.ｅ., Ｒｅｌａｔｉｖｅ ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｃｔｉｖｉｔｙ）を計算した。結果を［表５］、［表６］、［表７］、［図１］、［図２］および［図３］に示す。【０２０９】
【表５】
2018230624.tif 000100
【表６】
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【表７】
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【０２１０】
２）ヌクレアーゼ耐性試験
糖がリボースである天然のヌクレオチドからなるｓｉＲＮＡと、一部を本願発明の修飾ヌクレオチドに置換したｓｉＲＮＡについて、ヌクレアーゼ耐性を検討した。
各種ｓｉＲＮＡ（終濃度 ０．５μＭ）および３’−エキソヌクレアーゼであるヘビ毒ホスホジエステラーゼＳＶＰＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＴｒｉｓ−ＨＣｌ（４０ｍＭ， ｐＨ８．５），ＮａＣｌ（１００ｍＭ），ＭｇＣｌ２（１５ ｍＭ）を含む溶液に混合した。３７℃で６０分間静置した後、等量のＥＤＴＡ（０．５Ｍ）を混合させることで反応をクエンチさせた。溶液をＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、ｎａｔｉｖｅゲルｅ−ＰＡＧＥＬ（ＡＴＴＯ社）を用いて電気泳動後、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＩＩＲＮＡ ｇｅｌｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて核酸を染色し、ＬＡＳ−４０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ社）にて画像解析をした。結果を［図４］に示す。
［図４］の結果に示す通り、通常のリボヌクレオチドから調製したｓｉＲＮＡに比較して本願発明のモノマーを用いたｓｉＲＮＡは、３’−エキソヌクレアーゼに対する耐性が認められ、生体内での分解の抑制が期待できる。【０２１１】
３）ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
ｉ）ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ調製
各種ｓｉＲＮＡを２５ ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ  ４．０に溶解し、濃度０．０５３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ希釈液とした。ＷＯ２０１１／１３９７１０号の（実施例１の）製法により製造したイオン化脂質、１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル  １−メチルピペリジン−４−カルボキシレート、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（日油株式会社）を、モル比６０／８．５／３０／１．５の割合でエタノールに溶解した。ｓｉＲＮＡと脂質の比を重量比０．０６とし、ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液をそれぞれ３ｍＬ/ｍｉｎ、１ ｍＬ/ｍｉｎの流速で混合することで、Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＮＰ）を得た。得られたＬＮＰ水溶液を１００ｋＤ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２ （ＳＰＥＣＴＲＵＭ社）を用いて透析により外液をＰＢＳ ｐＨ７．４に置換した。透析後、濾過滅菌を行い、実験に用いた。ｓｉＲＮＡ濃度および封入率は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡＲｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した（ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで希釈し測定したｓｉＲＮＡ濃度をＬＮＰ外液に存在するｓｉＲＮＡとし、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で希釈し測定したｓｉＲＮＡ濃度を製剤中の全ｓｉＲＮＡ濃度として封入率を算出した）。平均粒子径は、粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ ＺＳ）にて測定した。測定結果を［表８］に示す。
【表８】
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【０２１２】
ｉｉ）血液凝固第７因子Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩを対象としたｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｓｉＲＮＡを封入したＬＮＰをマウス（ｎ＝３  ｐｅｒ  ｇｒｏｕｐ）に尾静脈内投与し、投与から２４時間後に麻酔下で採血を実施した。遠心により血液から血漿を分離し、血漿中のＦａｃｔｏｒＶＩＩタンパク質濃度をＢＩＯＰＨＥＮ ＦＶＩＩ キット（Ａｎｉａｒａ社）により定量した。Ｃｏｎｔｒｏｌとして無処置のマウス血漿中のＦａｃｔｏｒＶＩＩタンパク質濃度を１００％とし、ＬＮＰ投与群のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩタンパク質濃度（相対値）（「Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｐｌａｓｍａ」）を算出した。結果を［表９］に示す。
【表９】
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［表９］の結果に示す通り、ＬＮＰ製剤をマウスへ静脈投与した際、本願発明のモノマーを用いたｓｉＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルリボースを含むリボヌクレオチドから調製したｓｉＲＮＡと同等以上の標的タンパク発現抑制作用が認められ、医薬品製剤への応用が期待できる。【０２１３】
本発明の範囲は以上の説明に拘束されることはなく、上記例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書に記載した全ての文献及び刊行物は、その目的にかかわらず参照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願2017-118572号(2017年6月16日出願)の特許請求の範囲、明細書の開示内容を包含する。
【産業上の利用可能性】
【０２１４】
本発明は、修飾核酸モノマー化合物および該モノマー化合物を構成ユニットとして含むオリゴ核酸類縁体を提供し、該オリゴ核酸類縁体は生物学的安定性および／または標的遺伝子発現抑制活性に優れるため、治療や診断等への有用性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月6日(2019.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１， ８０６−８１１ （１９９８）
【非特許文献２】Ｐａｓｔｅｒｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ９， ３５９１−３５９７， ２０１１
【非特許文献３】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１，５０，１２８５−１２８８
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
３）ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ活性評価
ｉ）ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ調製
各種ｓｉＲＮＡを２５ ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ  ４．０に溶解し、濃度０．０５３ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ希釈液とした。イオン化脂質、１−（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−８−イル  １−メチルピペリジン−４−カルボキシレート、ＤＳＰＣ（日本精化株式会社）、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（日本精化株式会社）、ＭＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（日油株式会社）を、モル比６０／８．５／３０／１．５の割合でエタノールに溶解した。ｓｉＲＮＡと脂質の比を重量比０．０６とし、ｓｉＲＮＡ希釈液と脂質溶液をそれぞれ３ ｍＬ/ｍｉｎ、１ ｍＬ/ｍｉｎの流速で混合することで、Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＮＰ）を得た。得られたＬＮＰ水溶液を１００ ｋＤ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｇ２ （ＳＰＥＣＴＲＵＭ社）を用いて透析により外液をＰＢＳ ｐＨ７．４に置換した。透析後、濾過滅菌を行い、実験に用いた。ｓｉＲＮＡ濃度および封入率は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した（ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒで希釈し測定したｓｉＲＮＡ濃度をＬＮＰ外液に存在するｓｉＲＮＡとし、１％  Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し測定したｓｉＲＮＡ濃度を製剤中の全ｓｉＲＮＡ濃度として封入率を算出した）。平均粒子径は、粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ）にて測定した。測定結果を［表８］に示す。
【表８】
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【国際調査報告】
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