(57)【要約】  配列番号１のアミノ酸配列又はその類似配列において、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から１４番目、３７番目、２９０番目、２９３番目及び３１９番目のアミノ酸残基のうち少なくとも１つに特定のアミノ酸変異を有するポリペプチド、前記ポリペプチドが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、及び形質転換体、前記ポリペプチドの製造方法、並びに２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｅ）のうち少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド。
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列
（Ａ２）グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列であって、且つ、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から１４番目のアスパラギン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がトレオニンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から３７番目のチロシン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から２９０番目のアラニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がトレオニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から２９３番目のトリプトファン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から３１９番目のヒスチジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がアルギニンに置換されるアミノ酸変異
【請求項２】
前記（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、前記（ｄ）及び前記（ｅ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、
前記（ｄ）のアミノ酸変異と、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸変異を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のポリペプチドが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーター配列、及び前記ポリヌクレオチドの下流に連結されたターミネーター配列を含む発現カセット。
【請求項６】
請求項５に記載の発現カセットを含有するベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養することを含む、グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物をグルコース又はグルコース−６−リン酸と接触させることにより、グルコース又はグルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへ変換することを含む、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、例えば、改変２−デオキシ−シロ−イノソース（以下、「ＤＯＩ」という。）合成酵素、該改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いた改変ＤＯＩ合成酵素の製造方法、及びＤＯＩの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスチックや洗剤など私達の日常生活において身近な製品の多くは、化石資源を原料として製造されている。これらの化成品原料となる炭素６員環化合物は、石油化学工業により、原油から生産されている。しかし、石油から化学製品原料を製造する従来からの石油化学プロセスを用いた場合には、有限な資源である石油の枯渇とそれに伴う価格の高騰、多量の二酸化炭素の排出による地球温暖化など、地球的規模の問題が生じる懸念がある。【０００３】
炭素６員環骨格を持つキラルな化合物であるＤＯＩは、医薬、農薬、酸化抑制剤や香料等の各種有用化学品の合成のための非常に重要な中間原料である。ＤＯＩはカテコールやドロキノンなどの２価フェノールやヒドロキシヒドロキノンに合成変換することができる。例えば、Kakinuma等, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935は、ＤＯＩをカテコールに合成変換することを開示している。カテコールは神経系医薬品などの原料、食品香料原料、ヘアケア商品などの酸化防止剤などに使用され、ヒドロキノンは止血剤、鎮痛剤等の原料、美白剤等の化粧品に使用され、世界的に需要の高い物質である。ＤＯＩは、さらには、擬似糖であるカルバグルコースにも変換ができ、用途の広い中間原料である。例えば、特開２００５−０５３８９９号公報は、ＤＯＩを原料としてカルバグルコースを合成することを開示している。【０００４】
多数の臨床医学的に重要な化学療法剤である２−デオキシストレプタミン含有アミノグリコシド系抗生物質の生合成過程に関与する酵素の１つに、初発の糖質を炭素環化する酵素が見出された。ブチロシン生産菌バチルス・サーキュランスに属する微生物より精製されたこの酵素は、グルコース−６−リン酸を基質、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）を補酵素として、多段階の反応を触媒し、最終的にＤＯＩを生合成した。Kudo等, J.Antibiot., 1999, vol.52, p.559及び特開２０００−２３６８８１号公報は、バチルス・サーキュランスに属する微生物よりそのＤＯＩ合成酵素遺伝子（グルコース−６−リン酸をＤＯＩに変換する反応を触媒する酵素をコードするｂｔｒＣ）をクローニングし、大腸菌内でその遺伝子を発現、精製することで組換えＤＯＩ合成酵素を大量に得たことを記載している。さらに、特開２０１４−０６４５１３号公報は、グルコースにヘキソキナーゼ又はポリリン酸グルコキナーゼとＤＯＩ合成酵素を作用させる二段階の酵素反応か、グルコース−６−リン酸にＤＯＩ合成酵素を作用させる一段階の酵素反応でＤＯＩが合成できることを開示している。さらにこの他にもHirayama等, J.Antibiot., 2005, vol.58, p.766はストレプトマイセス・フラジアエ由来のＤＯＩ合成酵素を開示しており、Subba等, Mol.Cells, 2005, vol.20, p.90はストレプトマイセス・リボシジフィカス由来のＤＯＩ合成酵素を開示しており、Kharel等, Arch.Biochem.Biophys., 2004, vol.429, p.204はストレプトマイセス・カナマイセティカス由来のＤＯＩ合成酵素を開示しており、Unwin等, J.Antibiot., 2004, vol.57, p.436はミクロモノスポラ・エキノスポラ由来のＤＯＩ合成酵素を開示しており、Kharel等, FEMS Microbiol.Lett., 2004, vol.230, p.185はストレプトマイセス・テネブラリウス由来のＤＯＩ合成酵素を開示しており、Hirayama等, J.Antibiot., 2006, vol.59, p.358はストレプトアロテイカス・ヒンダスタヌス由来のＤＯＩ合成酵素を開示している。【０００５】
そのほか、特開２０１３−１３５６９７号公報は特定のアミノ酸配列を有する耐熱性ＤＯＩ合成酵素を開示しており、Tamegai等, Biosci.Biotechnol.Biochem., 2010, vol.74, p.1215はバチルス・サーキュランスのＤＯＩ合成酵素に付随するＢｔｒＣ２タンパク質の役割を記載している。国際公開第２００６／１０９４７９号及びKogure等, J.Biotechnol., 2007, vol.129, p.502は、ＤＯＩ合成酵素の遺伝子からなる発現カセットを開示しており、細胞内の糖代謝の工学的改変による生産量の増強も試みられている。国際公開第２０１０／０５３０５２号は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群の中で少なくともスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子を有すると共に、２−デオキシ−シロ−イノソース（ＤＯＩ）生産系が付与又は強化され、好ましくは糖取り込み能力強化系を更に有するＤＯＩ生産大腸菌が開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の特許文献及び非特許文献に記載された技術は、ＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列を改変することにより、ＤＯＩ合成酵素活性を増強することを試みたものではない。ＤＯＩ合成酵素を用いてＤＯＩを高効率で生産できるシステムを構築するためには、酵素の改変による酵素活性の増強も有効な手段である。ＤＯＩの生産効率を向上できれば、ＤＯＩをより安価で、短時間に多量に生産することが可能になる。酵素の活性を高める手法として、酵素の基質と結合する活性中心のアミノ酸を改変し、高活性の酵素を選択する方法がある。また、目的の酵素をコードする遺伝子に試験管内で迅速に人工的に変異を誘発し、多数の変異遺伝子群の中から、目的の活性に改変された酵素をコードする遺伝子を選抜する進化工学的手法もある。後者の方法は、洗剤用酵素、生分解性プラスチック生産用酵素等の改変に適用されているが、ＤＯＩ合成酵素の改変への応用は知られていない。【０００７】
本発明者等は、ＤＯＩ合成酵素の活性に着目し、向上したＤＯＩ合成活性を有するＤＯＩ合成酵素を用いてグルコース−６−リン酸を効率よくＤＯＩに変換することにより、短時間で大量のＤＯＩが製造できる可能性があるとの着想を得た。本開示に係る一実施形態は、上記状況に鑑み、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ＤＯＩ合成酵素よりも高いＤＯＩ合成活性を有する改変ＤＯＩ合成酵素、該改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いた改変ＤＯＩ合成酵素の製造方法、及びＤＯＩの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、進化工学的手法を用いることにより、ＤＯＩ合成酵素をよりＤＯＩ合成活性が高い酵素へと改変することに成功した。また、該手法で得られた改変酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を用いて、従来よりも効率的にＤＯＩを製造することに成功した。【０００９】
本開示によれば、以下の（１）〜（９）が提供される。
（１）下記（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｅ）のうち少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチド。
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列
（Ａ２）グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列であって、且つ、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から１４番目のアスパラギン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がトレオニンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から３７番目のチロシン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から２９０番目のアラニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がトレオニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から２９３番目のトリプトファン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から３１９番目のヒスチジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がアルギニンに置換されるアミノ酸変異【００１０】
（２）前記（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、前記（ｄ）及び前記（ｅ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有する、前記（１）に記載のポリペプチド。
（３）前記（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、前記（ｄ）のアミノ酸変異と、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸変異を有する、前記（１）に記載のポリペプチド。【００１１】
（４）前記（１）〜前記（３）のいずれか１つに記載のポリペプチドが有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する、ポリヌクレオチド。
（５）前記（４）に記載のポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの上流に連結されたプロモーター配列、及び前記ポリヌクレオチドの下流に連結されたターミネーター配列を含む発現カセット。
（６）前記（５）に記載の発現カセットを含有するベクター。【００１２】
（７）前記（６）に記載のベクターによって形質転換された形質転換体。
（８）前記（７）に記載の形質転換体を培養することを含む、グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素活性を有するポリペプチドの製造方法。
（９）前記（１）〜前記（３）のいずれか１つに記載のポリペプチド、前記（７）に記載の形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物をグルコース又はグルコース−６−リン酸と接触させることにより、グルコース又はグルコース−６−リン酸を２−デオキシ−シロ−イノソースへ変換することを含む、２−デオキシ−シロ−イノソースの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本開示によれば、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ＤＯＩ合成酵素よりも高いＤＯＩ合成活性を有する改変ＤＯＩ合成酵素、該改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いた改変ＤＯＩ合成酵素の製造方法、及びＤＯＩの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＤＯＩから合成変換可能な芳香族化合物を示す図である。
【図２】解糖系のホスホグルコースイソメラーゼ遺伝子（ｐｇｉ）、ペントースリン酸経路のグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｚｗｆ）、及びグリコーゲン生合成経路に向かうホスホグルコムターゼ遺伝子（ｐｇｍ）を遺伝子破壊し、グルコース−６−リン酸を優先的にＤＯＩ合成酵素（ｂｔｒＣ遺伝子にコードされるタンパク質）が利用するように代謝工学的改変をしたΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株を示す図である。
【図３Ａ】エラープローンＰＣＲを用いた変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーの作製からＤＯＩ高生産ＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離（１，２，３次選抜）までの工程における変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーの作製を示す図である。
【図３Ｂ】エラープローンＰＣＲを用いた変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーの作製からＤＯＩ高生産ＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離までの工程における１次選抜を示す図である。
【図３Ｃ】エラープローンＰＣＲを用いた変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーの作製からＤＯＩ高生産ＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離までの工程における２次選抜を示す図である。
【図３Ｄ】エラープローンＰＣＲを用いた変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーの作製からＤＯＩ高生産ＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離までの工程における３次選抜を示す図である。
【図４】ｐＧＡＤＰの構造を示す図である。
【図５】ｐＧＡＤＰ−ｍｂｔｒＣの構造を示す図である。
【図６】ｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（◆）とｐＧＡＤＰ−ｍｂｔｒＣの１つ（後にｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）と判明）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）の培養（２×ＹＴ＋２％グルコース＋２％マンニトール、５０ｍｌ、３０℃）に伴う培地中のＤＯＩ生産量のタイムコースを示す図である。
【図７】（左）野生型ＤＯＩ合成酵素（ＷＴ）、（右）変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ）のＤＯＩ合成酵素活性を示す図である。
【図８】ｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（◆）、ｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）、ｐＧＡＤＰ−ｍｂｔｒＣ（後にｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）と判明）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）、ｐＧＡＤＰ−ｍｂｔｒＣ（後にｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｙ３７Ｆ）と判明）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（×）、ｐＧＡＤＰ−ｍｂｔｒＣ（後にｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ａ２９０Ｔ）と判明）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（＋）、ｐＧＡＤＰ−ｍｂｔｒＣ（後にｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）と判明）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（●）の培養（２×ＹＴ＋２％グルコース＋２％マンニトール、５０ｍｌ、３０℃）に伴う培地中のＤＯＩ生産量のタイムコースを示す図である。
【図９】左から野生型ＤＯＩ合成酵素（ＷＴ）、変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ）、変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）、変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ｙ３７Ｆ）、変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ａ２９０Ｔ）、変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）のＤＯＩ合成酵素活性を示す図である。
【図１０】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）の構造を示す図である。
【図１１】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣの構造を示す図である。
【図１２Ａ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋５％グルコース＋５％マンニトール、５０ｍｌ、３０℃）に伴う培地の濁度のタイムコースを示す図である。
【図１２Ｂ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋５％グルコース＋５％マンニトール、５０ｍｌ、３０℃）に伴う培地中のグルコース濃度のタイムコースを示す図である。
【図１２Ｃ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋５％グルコース＋５％マンニトール、５０ｍｌ、３０℃）に伴う培地中のマンニトール濃度のタイムコースを示す図である。
【図１２Ｄ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋５％グルコース＋５％マンニトール、５０ｍｌ、３０℃）に伴うＤＯＩ生産量のタイムコースを示す図である。
【図１３】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）の構造を示す図である。
【図１４Ａ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋３％グルコース＋４％マンニトール、３０ｍｌ、３０℃）に伴う培地の濁度のタイムコースを示す図である。
【図１４Ｂ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋３％グルコース＋４％マンニトール、３０ｍｌ、３０℃）に伴う培地中のグルコース濃度のタイムコースを示す図である。
【図１４Ｃ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋３％グルコース＋４％マンニトール、３０ｍｌ、３０℃）に伴う培地中のマンニトール濃度のタイムコースを示す図である。
【図１４Ｄ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（■）とｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（▲）の培養（２×ＹＴ＋３％グルコース＋４％マンニトール、３０ｍｌ、３０℃）に伴うＤＯＩ生産量のタイムコースを示す図である。
【図１５】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆの構造を示す図である。
【図１６】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆの構造を示す図である。
【図１７】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆの構造を示す図である。
【図１８Ａ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株でのＤＯＩ生産量（▲）、グルコース濃度（●）、フルクトース濃度（◆）、キシロース濃度（■）のタイムコースを示す図である。
【図１８Ｂ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株でのＤＯＩ生産量（▲）、グルコース濃度（●）、フルクトース濃度（◆）、キシロース濃度（■）のタイムコースを示す図である。
【図１８Ｃ】ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株でのＤＯＩ生産量（▲）、グルコース濃度（●）、フルクトース濃度（◆）、キシロース濃度（■）のタイムコースを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示によれば、配列番号１のアミノ酸配列からなる野生型ＤＯＩ合成酵素よりも高いＤＯＩ合成活性を有する改変ＤＯＩ合成酵素、該改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現カセット、該発現カセットを含むベクター、該ベクターを含む形質転換体、該形質転換体を用いた改変ＤＯＩ合成酵素の製造方法、及びＤＯＩの製造方法を提供することができる。
【００１６】
本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素によれば、高いＤＯＩ合成活性によりＤＯＩ生産速度を向上することが可能であり、短時間で効率よくグルコース−６−リン酸をＤＯＩへ変換することができる。本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素の製造方法によれば、改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子を宿主細胞で発現させることにより、ＤＯＩ合成活性が高い改変合成酵素を製造することができる。また、本開示に係るＤＯＩの製造方法によれば、該改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子を利用して、高い効率でグルコースからＤＯＩを製造することができる。
【００１７】
前述のとおり、ＤＯＩはカテコールやヒドロキノンなどの２価フェノールやヒドロキシヒドロキノンに合成変換することができる（図１参照）。本開示における一実施形態によれば、医薬品、工業品の製造原料として広く普及することが期待されているＤＯＩを、簡便かつ大量に効率よく製造することが可能である。このようにして製造したＤＯＩから、例えば、医薬品、工業品の製造原料として広く普及することが期待されている１，２，４−トリヒドロキシベンゼンを、製造することも可能である。
【００１８】
＜改変ＤＯＩ合成酵素＞
本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素は、下記（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、以下の（ａ）〜（ｅ）のうち少なくとも１つのアミノ酸変異を有するポリペプチドである。
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列
（Ａ２）グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列であって、且つ、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から１４番目のアスパラギン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がトレオニンに置換されるアミノ酸変異
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から３７番目のチロシン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換されるアミノ酸変異
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から２９０番目のアラニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がトレオニンに置換されるアミノ酸変異
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から２９３番目のトリプトファン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がアルギニンに置換されるアミノ酸変異
（ｅ）配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端から３１９番目のヒスチジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基がアルギニンに置換されるアミノ酸変異
このような、特定のアミノ酸残基の置換を有する改変ＤＯＩ合成酵素は、当該アミノ酸残基置換により向上したＤＯＩ合成活性を有する。本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素は、（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列に対して、下記（ａ）〜（ｅ）のうち少なくとも１つのアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列を有するポリペプチドと言うこともできるが、この表現において「（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列に対して、下記（ａ）〜（ｅ）のうち少なくとも１つのアミノ酸変異を導入した」とは最終的なアミノ酸配列を特定するためだけに用いられているものであって、スタートポイントとなるアミノ酸配列及び実際の配列改変操作の過程を限定するものではない。
【００１９】
配列番号１のアミノ酸配列は、バチルス・サーキュランス由来のＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列であり、ｂｔｒＣ遺伝子によってコードされている。改変ＤＯＩ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有しており、本開示においては変異型ＤＯＩ合成酵素とも呼ばれる。配列番号１のアミノ酸配列を以下の表１に示す。
【表１】
2018180568.tif 000002
【００２０】
グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素活性は、５０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７）、５ｍＭ  グルコース−６−リン酸、５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋、０．２ｍＭ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、及び測定対象のＤＯＩ合成酵素１０μｇからなる溶液を４６℃で５分間反応させ、反応後に反応溶液をフェノール／クロロホルム処理をして、除蛋白を行い、遠心後の水層画分１０μｌをサンプルとして、ＨＰＬＣでＤＯＩを定量し、活性を算出することにより測定できる。また、ＤＯＩ合成酵素１ｍｇが１分間あたりに合成するＤＯＩの量を比活性とする。ＨＰＬＣの条件は、
カラム    ：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ＸＢ−Ｃ１８  １００Å（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
溶離液    ：Ｈ２Ｏ／メタノール（８０／２０）
流量      ：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出      ：ＵＶ２６２ｎｍ
注入量    ：２μｌ
とする。
【００２１】
また、アミノ酸配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで評価することができる。
【００２２】
また、（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列における特定の位置のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基とは、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラム（デフォールトパラメータ）によって配列番号１のアミノ酸配列と（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列とをアラインメントした場合に、配列番号１中の特定位置のアミノ酸残基と対応することが見いだされた、（Ａ１）又は（Ａ２）のアミノ酸配列中のアミノ酸残基のことを指す。
【００２３】
前記（Ａ２）のアミノ酸配列が有する、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性は、８５％以上、あるいは９０％以上、あるいは９５％以上の配列同一性であってもよい。
ここで、前記（Ａ２）のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列においてＤＯＩ合成酵素活性を失わない範囲での配列の改変を有するアミノ酸配列であってもよい。つまり、配列番号１のアミノ酸配列に対してＤＯＩ合成酵素活性を失わない範囲で配列の改変を加えたアミノ酸配列であってもよい。このような改変としては、アミノ酸残基の挿入、欠失、置換及びアミノ酸配列Ｎ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加が挙げられる。アミノ酸残基の挿入、欠失及び置換のうち１つ以上がある場合は、挿入、欠失及び置換の各々は、存在する場合は、例えば１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜２０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよく、アミノ酸残基の挿入、欠失及び置換の総数は例えば１〜５０アミノ酸残基、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよい。また、末端に付加されるアミノ酸残基の数としては、存在する場合は一末端当たり例えば１〜５０アミノ酸残基、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよい。このような追加のアミノ酸残基は、細胞外への分泌等のためのシグナル配列を形成していてもよい。シグナル配列の例としては、大腸菌のＯｍｐＡシグナル配列などが挙げられる。
【００２４】
前記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸変異は、いずれも、ＤＯＩ合成酵素活性を上昇させるアミノ酸変異である。本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素は、前記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸変異のうちいずれか１つのみを有していてもよく、２つ以上を有していてもよい。例えば、改変ＤＯＩ合成酵素は、前記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸変異のうち２つを有していてもよく、３つを有していてもよく、４つを有していてもよく、５つを有していてもよい。一実施形態においては、改変ＤＯＩ合成酵素は、（ｄ）及び（ｅ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有し、この場合さらに（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有していてもよい。別の実施形態においては、改変ＤＯＩ合成酵素は、（ｄ）のアミノ酸変異を有し、さらに（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有する。さらに別の実施形態においては、改変ＤＯＩ合成酵素は、（ｄ）のアミノ酸変異を有し、さらに（ａ）、（ｂ）、及び（ｅ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有する。この場合はさらに（ｃ）のアミノ酸変異を有してもよい。さらに別の実施形態においては、改変ＤＯＩ合成酵素は、（ｄ）のアミノ酸変異を有し、さらに（ａ）及び（ｅ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有する。この場合はさらに（ｂ）及び（ｃ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有してもよい。さらに別の実施形態においては、改変ＤＯＩ合成酵素は、（ｄ）のアミノ酸変異及び（ｅ）のアミノ酸変異を有する。この場合はさらに（ａ）〜（ｃ）のアミノ酸変異のうち少なくとも１つを有してもよい。
また、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、グルコース−６−リン酸から２−デオキシ−シロ−イノソースを生成する酵素活性を有するポリペプチドは、酵素の機能に関係する構造について配列番号１のアミノ酸と高度に類似する構造を有するため、このようなポリペプチドに対しても上記の（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸変異はそれぞれＤＯＩ合成酵素活性を上昇させる効果を奏する。
【００２５】
上記のように、（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸変異のうち１つ以上を有することにより、向上したＤＯＩ合成酵素活性を有する改変ＤＯＩ合成酵素が得られる。改変ＤＯＩ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＤＯＩ合成酵素（本開示においては、野生型ＤＯＩ合成酵素ともいう）よりも高いＤＯＩ合成活性を有することが好ましい。改変ＤＯＩ合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＤＯＩ合成酵素に対し、好ましくは１．１倍以上高いＤＯＩ合成活性を有し、より好ましくは１．２倍以上高いＤＯＩ合成活性を有し、より好ましくは１．３倍以上高いＤＯＩ合成活性を有し、より好ましくは１．４倍以上高いＤＯＩ合成活性を有し、より好ましくは１．５倍以上高いＤＯＩ合成活性を有し、より好ましくは１．６倍以上高いＤＯＩ合成活性を有し、より好ましくは１．７倍以上高いＤＯＩ合成活性を有し、一層好ましくは１．８倍以上高いＤＯＩ合成活性を有する。
【００２６】
上記（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸変異は、ＤＯＩ合成酵素の進化工学的改変により得られたものである。
【００２７】
＜ＤＯＩ合成酵素の進化工学的改変＞
進化工学的改変とは、目的のタンパク質をコードする遺伝子に対して、試験管内で人工的に突然変異を誘発させて、所望の性質に改変されたタンパク質を選抜し、該目的タンパク質分子を改変する技術をいう。
【００２８】
目的酵素遺伝子へのランダムな変異の導入は、目的の酵素遺伝子を保有する微生物に対して、アルキル化試薬（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等）処理、核酸塩基の酸化的脱アミノ化試薬（亜硝酸等）処理、放射線（紫外線、Ｘ線等）照射、又はＰＣＲを利用したランダムな変異導入、を行うことによって行うことができる。
【００２９】
ＰＣＲを利用したランダムな変異の導入は、目的酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型として、該遺伝子の増幅過程において、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の正確性を低める条件下でＰＣＲ反応を行い、増幅したＤＮＡ配列中にエラーを蓄積させるエラープローンＰＣＲを行うことでできる。エラープローンＰＣＲにおいては、反応溶液中にマンガンイオンを添加したり、４種類のデオキシリボ核酸（ｄＮＴＰ）の各濃度のバランスを崩したりすることによって、ＤＮＡポリメラーゼの正確性を低下させ、変異を導入することができる。
【００３０】
例えば、バチルス・サーキュランス由来のＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）をエラープローンＰＣＲで変異させる場合には、当該遺伝子を有するプラスミド（例えば、国際公開第２００６／１０９４７９号に記載のｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ）やＤＮＡ断片を鋳型として、当該遺伝子増幅用のプライマーを利用して、ＤＮＡポリメラーゼの正確性を低下させる条件下において、ＰＣＲを実施すればよい。ＤＮＡポリメラーゼの正確性を低下させる条件としては、後述の実施例１に記載の条件などが挙げられる。
【００３１】
また、ランダムな変異導入により得られた改変酵素遺伝子群は、所望の性質について向上した機能を有するかどうかを指標にしてスクリーニングすることができる。例えば、改変酵素遺伝子群が発現する改変酵素群のＤＯＩ合成活性を測定して、変異導入前よりもＤＯＩ合成活性が向上した改変酵素を選抜することができる。このようにして、所望の性質について向上した活性を有する改変酵素を得ることができる。得られた改変酵素をコードする遺伝子に対してさらにランダムな変異導入を行い、上記と同様にスクリーニングをすることにより、所望の性質について一層向上した活性を有する改変酵素を得ることができる。
【００３２】
進化工学的改変により、酵素中における活性中心の位置が分からなくても、向上した性質を有する改変酵素を得ることが可能となる。また、このような向上は、進化工学的改変によれば、機能との関係が事前には知られていないアミノ酸残基位置におけるアミノ酸変異あるいはその組み合わせにより、累積的に達成することができる。このことから、本開示に係るＤＯＩ合成酵素が有する改変及びそれによるＤＯＩ合成活性の向上は、当業者が予想することができないものである。
【００３３】
＜改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子＞
本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子は、前記改変ＤＯＩ合成酵素をコードする任意の核酸であってよい。特定のアミノ酸配列をコードする核酸のヌクレオチド配列は、コドンの縮重の範囲内で変化させることができる。この場合、組換え微生物の宿主となる微生物において使用頻度が高いコドンを使用した方が、遺伝子の発現効率の点からは好ましい。本開示によれば、改変ＤＯＩ合成酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００３４】
なお、遺伝子のヌクレオチド配列は、コードすべきアミノ酸配列からコドン表を元に設計することもできる。設計したヌクレオチド配列は、既知のヌクレオチド配列を遺伝子組み換え技術を利用して改変することで得てもよいし、ヌクレオチド配列を化学的に合成することで得てもよい。
ヌクレオチド配列を改変する方法としては、例えば、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ Ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、又は、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法、市販の突然変異導入キットを使用する方法などが挙げられる。
【００３５】
目的の遺伝子にランダムに変異を有する遺伝子の発現を行うため、種々の宿主・ベクター系を利用することができる。宿主・ベクター系として細菌、酵母等の系を利用することができるが、ランダムに変異を有する遺伝子を効率よく発現、製造できれば特に制限されない。得られた変異導入されたＰＣＲ断片を、発現に必要なプロモーター、ターミネーターを有し、かつ宿主内で発現できる発現ベクターに連結し、宿主に導入する。
【００３６】
＜改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現カセット＞
本開示に係る遺伝子発現カセットは、前述の改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子を、後述の宿主細胞内で発現させ得るものであれば特に限定されない。遺伝子発現カセットは、改変ＤＯＩ合成酵素をコードする核酸配列に加えて、例えば、プロモーター、エンハンサー、ＲＢＳ （リボソーム結合配列）、ターミネーター等のうち１つ以上を含んでいてもよい。遺伝子発現カセットは、改変ＤＯＩ合成酵素をコードする核酸配列に加えて、該核酸配列の上流にプロモーター及び該核酸配列の下流にターミネーターを含むことが好ましい。例えば、大腸菌を宿主細胞とするタンパク質の大量発現系においては、改変ＤＯＩ合成酵素をコードするＤＮＡ配列の上流側（５’末端側）にプロモーター、エンハンサー、及びＲＢＳ （リボソーム結合部位）等のＤＮＡ配列を連結し、改変ＤＯＩ合成酵素をコードするＤＮＡ配列の下流側（３’末端側）に、例えばターミネーターのＤＮＡ配列を連結した構成を採用できる。これら各要素は、大腸菌内で所望の機能を発揮する配列であれば特に限定されない。プロモーターには構成的に発現を行うプロモーター及び誘導的に発現を行うプロモーターがある。本開示に係るＤＯＩ遺伝子発現カセットにおいては、いずれのタイプのプロモーターを用いてもよい。また、大腸菌を宿主細胞とする場合には、ＩＰＴＧ （イソプロピルチオガラクトピラノシド）等の誘導物質により発現を誘導できるプロモーターを用いてもよい。 
【００３７】
一例として大腸菌を利用する場合、前記プロモーターの例としては、ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、前２種類の融合プロモーター、λファージのプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、グルタメートデカルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、ｇａｄＡプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター等が挙げられる。ターミネーターは特に限定されず、例えばｒｒｎターミネーター、ＡｓｐＡターミネーターなどを利用可能である。
【００３８】
また、リボソーム結合部位の例としては、シャインダルガノ（ＳＤ）配列のＡＧＧＡＧなどが挙げられる。エンハンサーとしては、公知のエンハンサーが使用可能である。
【００３９】
＜改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現ベクター＞
本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現ベクターは、前述の改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子を有し、後述の宿主細胞内で発現させ得るものであれば特に限定されない。改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現ベクターは好ましくは前記改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現カセットを含む。
【００４０】
一例として大腸菌を利用する場合、効率よく遺伝子発現を行なうために種々の発現ベクターが構築されている。ラクトースオペロンのプロモーター、トリプトファンオペロンのプロモーター、前２種類の融合プロモーター、λファージのプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、グルタメートデカルボキシラーゼ遺伝子プロモーター、ｇａｄＡプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター等の下流に変異処理遺伝子を接続し、該遺伝子の下流にターミネーターを接続した改変ＤＯＩ合成酵素発現ベクターを構築することができる。ターミネーターにはｒｒｎターミネーター、ＡｓｐＡターミネーターなどが利用されうるが、特に制限されるものではない。
【００４１】
ベクターとしては、宿主細胞内で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主細胞とする場合にはＬａｍｂｄａ  ｇｔ１０、Ｌａｍｂｄａ  ｇｔ１１などを例示することができる。また、プラスミドとしては、例えばＥｓｃｈｅｎｃｈｉａ  ｃｏｌｉを宿主細胞とする場合には、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＱＥ８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＢＲ３２２等を例示することができる。
【００４２】
改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現ベクターは、改変ＤＯＩ合成酵素をコードするＤＮＡを転写させるためのプロモーターを有していてもよい。プロモーターの例としては、上述のプロモータが挙げられる。また、改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現ベクターは、リボソーム結合配列を含んでいてもよい。リボソーム結合配列の例としては、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列が挙げられ、ＳＤ配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８ヌクレオチド）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
転写及び翻訳を効率的に行うため、目的のタンパク質のＮ末端は発現ベクターのコードする別のタンパク質のＮ末端部分に融合されていてもよい。
【００４３】
目的とするタンパク質の発現にはターミネーターは必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下にターミネーターを配置することが望ましい。
クローニングの際、前記のようなベクターを、挿入されるＤＮＡの切り出しに使用した制限酵素で切断してベクターＤＮＡ断片を得ることができるが、必ずしも挿入されるＤＮＡの切り出しに使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。挿入されるＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、例えば挿入されるＤＮＡ断片の付着末端とベクターＤＮＡ断片の付着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により挿入されるＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えＤＮＡを作製する。必要に応じて、アニーリングの後、微生物等の宿主細胞に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えＤＮＡを作製することもできる。
【００４４】
本開示に係る組換えＤＮＡを宿主細胞に導入するには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ．ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（２００１）等に記載されている分子生物学、生物工学及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法を利用することができる。例えばコンピテントセルを用いる方法や、エレクトロポレーションを用いる方法が挙げられる。
【００４５】
このようにして作製された発現ベクターを複製、維持することができる宿主内に導入することにより改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子を発現する形質転換体を得ることができる。次いで得られた形質転換体の発現するＤＯＩ合成酵素の性質を検証することにより該酵素の改変を検証する。
【００４６】
＜形質転換体＞
本開示に係る形質転換体は、本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素遺伝子発現ベクターを含む形質転換体である。
形質転換体作製に使用する宿主細胞としては、組換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよい。宿主細胞は、微生物の細胞であることが好ましい。前記微生物の細胞は、真核生物（例えば酵母）の細胞であっても、原核生物の細胞であってもよい。宿主細胞の例として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の細胞が挙げられるが、特に大腸菌の細胞に限定されるものではなく、エシェリヒア属細菌の細胞、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバチルス属細菌の細胞、シュードモナス属細菌などの細菌類の細胞、サッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属などの酵母類の細胞、アスペルギルス属などの糸状菌類の細胞などが使用できる。
【００４７】
宿主細胞は、ＤＯＩ合成酵素の基質となるグルコース−６−リン酸を多量に蓄積する宿主細胞であることが好ましい。このような宿主細胞としては、例えば、大腸菌においてグルコースリン酸イソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子を破壊した株（例えば、国際公開第２００６／１０９４７９号に記載の大腸菌ＧＩ７２４Δｐｇｉ株）、大腸菌においてｐｇｉ遺伝子及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子を破壊した株（例えば、国際公開第２０１０／０５３０５２号に記載の大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株）、並びに大腸菌においてｐｇｉ遺伝子、ｚｗｆ遺伝子及びホスホグルコムターゼをコードするｐｇｍ遺伝子を破壊した株（図２参照）（例えば、国際公開第２００６／１０９４７９号に記載の大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株）がある。
【００４８】
宿主細胞はグルコースからグルコース−６−リン酸を生成する酵素をコードする遺伝子、例えばｇｌｋ、を有する細胞であることが好ましい。
また、宿主細胞には、細胞外のグルコースをそのまま細胞内に取り込む能力をさらに付与してもよく、このために例えばグルコース輸送促進タンパク質遺伝子をさらに導入してもよい。グルコース輸送促進タンパク質遺伝子としては、例えば、ザイモモナス・モビリス由来のｇｌｆなどがある。また、宿主細胞には、フルクトース及びスクロースの向上した利用能をさらに付与してもよく、このために例えばスクロース加水分解酵素遺伝子をさらに導入してもよい。スクロース加水分解酵素遺伝子としては、例えば、大腸菌Ｏ−１５７由来のｃｓｃＡなどがある。このような遺伝子を有するベクターの例として、国際公開第２０１０／０５３０５２号に記載されているプラスミドベクターｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆなどがある。
【００４９】
宿主細胞に組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば宿主細胞が大腸菌の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。コンピテントセルとしては、大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセルなどが利用できる。このようにして得られた形質転換体は、培養されることにより、改変ＤＯＩ合成酵素を安定に生産することができる。前記形質転換体の培養の条件は、元々の宿主微生物の培養条件と同様であり、公知の条件を用いることができる。
【００５０】
該形質転換体の培養には、種々の炭素源、窒素源、無機塩類及び有機栄養源を任意に用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース、ショ糖、糖蜜、油脂などが利用できる。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００５１】
炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。培地の例として、例えば、ＬＢ液体培地、ＲＭ液体培地、２×ＹＴ液体培地、Ｌ寒天培地、ＲＭＭ液体培地などが挙げられる。あるいはＬＢ寒天プレートなどであってもよい。なお、選択マーカーを含む発現ベクターにより形質転換した形質転換体の培養においては、例えば、前記選択マーカーが薬剤耐性である場合には、それに対応する薬剤を含む培地を使用し、前記選択マーカーが栄養要求性である場合には、それに対応する栄養素を含まない培地を使用する。
培養条件は、培地の種類、培養方法により適宜選択すればよく、形質転換体が生育する条件であれば特に制限はない。
【００５２】
培養温度は、該形質転換体が生育可能な温度であればよい。培養の際のｐＨは、該形質転換体が生育可能なｐＨであればよい。培養時間はＤＯＩ合成酵素を効率よく生産できる時間であれば特に制限はない。
培養温度は例えば２０℃〜４５℃の範囲内の温度であってもよく、２５℃〜３５℃の範囲内の温度であってもよく、２４℃〜３７℃の範囲内の温度であってもよい。培地のｐＨは、例えば４〜８の範囲で選べばよく、５〜８の範囲であってもよく、６．５〜８の範囲であってもよい。培養は、微生物の種類に応じて、好気的に行ってもよいし、嫌気的に行ってもよい。
【００５３】
培養期間は例えば１時間〜７日間であってもよく、６時間〜６０時間であってもよく、１２時間〜３０時間であってもよい。培養期間は、改変ＤＯＩ合成酵素の産生量が最大になるように設定してもよい。例えば、好気条件下でｐＨは６以上８以下のｐＨ、温度は２５℃以上４０℃以下の範囲内の温度で、ｐＨと温度を適切に制御しながら培養した場合、培養に必要な時間は４８時間以内としてもよい。培養時間は０．５時間〜３０時間の範囲内であってもよい。
培養は前記培養成分を含有する液体培地中で、振とう培養、通気攪拌培養、連続培養又は流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
【００５４】
得られた形質転換体を、ＤＯＩが生産可能な条件下で培養し、培養液中のＤＯＩの生産量状況を調べる。例えば、ＤＯＩの生産量状況は、ガスクロマトグラフ質量分析計や高速液体クロマトグラフ分析計で調べることができる。このような生産量分析は、Kogure等, J.Biotechnol., 2007, vol.129, p.502を参照して行うことができる。
【００５５】
上記において、ＤＯＩの生産量状況に変化が認められた形質転換体については、該形質転換体が有する発現ベクターを抽出し、該酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定する。次いで、該酵素の推定アミノ酸配列を野生型酵素のアミノ酸配列と比較し、どのアミノ酸が該酵素の性質の改変に寄与しているかを特定することができる。
【００５６】
性質が改変された酵素の推定アミノ酸配列上に複数のアミノ酸置換が見出された場合には、それぞれのアミノ酸の置換が酵素の性質の改変にどの程度寄与しているかを、部位特異的変異導入法で任意の１つのアミノ酸を他のアミノ酸へ置換し、調べることができる。
【００５７】
上記で得られた変異型酵素の酵素学的性質は、各変異型酵素を分離・精製後、比活性、基質特異性、至適温度、至適ｐＨ等を調べ、野生型酵素と比較することにより、酵素の性質の変化を検証することができる。
【００５８】
形質転換体が産生した改変ＤＯＩ合成酵素は、培養物中の形質転換体を含む培養液をそのまま採取して利用することもできる。また、得られた培養物から濾過又は遠心分離などの手段により形質転換体を採取して利用することもできる。採取した形質転換体を機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）等のキレート剤及び又は界面活性剤を添加してポリペプチドを可溶化し、溶液として分離採取することができる。
【００５９】
＜改変ＤＯＩ合成酵素の製造方法＞
本開示に係るＤＯＩ合成活性を有するポリペプチド（改変ＤＯＩ合成酵素）の製造方法は、本開示に係る形質転換体を培養することを含む。形質転換体の培養に用いる培地及び培養条件、培養方法等については、本開示に係る形質転換体の説明で述べた通りである。培養条件は、宿主細胞が生育しＤＯＩ合成活性を有するタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。
本開示に係る形質転換体を培養することにより、本開示に係るベクター上の改変ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子が発現し、改変ＤＯＩ合成酵素が生成する。例えば、適切な培地中、好気条件下、ｐＨ６〜８の範囲内のｐＨ、温度２５℃〜４０℃の範囲内の温度において、４８時間以内の培養により改変ＤＯＩ合成酵素を得ることができる。
【００６０】
生成した改変ＤＯＩ合成酵素は、形質転換体の細胞（例えば大腸菌の菌体）内及び培地のうち少なくとも１つに含まれた状態にある。この形質転換体の細胞及び培地を精製せずにそのままＤＯＩ合成反応に用いてもよく、あるいは培地から改変ＤＯＩ合成酵素を精製してもよい。この際には、細胞を破砕あるいは溶解することで、細胞内の改変ＤＯＩ合成酵素も回収することができる。あるいは、遠心分離等によって培地から細胞を分離し、この分離した細胞をＤＯＩ合成反応に用いてもよく、あるいはこの細胞を乾燥、凍結又は凍結乾燥して保存してもよい。あるいは分離した細胞を破砕又は溶解して、放出されたＤＯＩ合成酵素をそのままＤＯＩ合成反応に用いてもよく、あるいは放出されたＤＯＩ合成酵素を精製してもよい。酵素の精製には、遠心分離、塩析、脱塩、クロマトグラフィー、電気泳動、限外ろ過等の、一般的な精製法を、適切に調節した条件下で用いることができる。例えば、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いた細胞の溶解、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースへのＤＯＩ合成酵素の固定、及び溶出ｂｕｆｆｅｒによる溶出によりＤＯＩ合成酵素を精製することもできる。
【００６１】
＜ＤＯＩの製造方法＞
本開示に係るＤＯＩ製造方法は、本開示に係る改変ＤＯＩ合成酵素、本開示に係る形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物をグルコース又はグルコース−６−リン酸と接触させることにより、グルコース又はグルコース−６−リン酸をＤＯＩへ変換することを含む、ＤＯＩの製造方法である。  
【００６２】
形質転換体の培養物とは、形質転換体を培養して得られる、細胞と周囲の培地等からなる産物を指す。培養物は使用しなくともよく、例えば、予め調製された乾燥若しくは凍結させた形質転換体の細胞を、直接反応系に添加してもよい。
【００６３】
形質転換体の培養物を得るための培地、培養条件、培養方法等は、上記の形質転換体の培養に用いることができる培地、培養条件、培養方法等と同様である。培養条件は、宿主細胞が生育しＤＯＩ合成活性を有するタンパク質を産生できる条件であれば特に制限はない。
【００６４】
また、前記形質転換体の処理物とは、形質転換体が産生する改変ＤＯＩ合成酵素の活性を失わない範囲で、形質転換体に対して任意の処理を行った産物を指す。このような処理としては、例えば、加熱処理、冷却処理、機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、自己消化、界面活性剤処理及び酵素処理（例えば細胞溶解処理）からなる群から選択される１つ以上を含む処理などが挙げられる。たとえ、このような処理によって形質転換体自体が死滅したとしても、当該形質転換体が産生した酵素の活性が残存していれば、反応に用いることが可能である。
【００６５】
前記培養物の処理物とは、形質転換体が産生する改変ＤＯＩ合成酵素の活性を失わない範囲で、形質転換体の培養物に対して任意の処理を行った産物を指す。このような処理としては、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理（例えば細胞破壊処理）、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理が挙げられる。例えば、形質転換体の細胞を培地等から分離して、分離された細胞を反応系に添加してもよい。このような分離には、濾過又は遠心分離などの手段が使用可能である。あるいは、改変ＤＯＩ合成酵素を夾雑物から分離するための精製処理を行い、該精製処理により得られた酵素を含む溶液を反応系に添加してもよい。あるいは、培養物を、メタノールやアセトニトリル等の有機溶媒又は有機溶媒と水との混合溶媒を用いて抽出した抽出物を反応系に添加してもよい。このような精製物又は抽出物は、形質転換体の細胞を含まないものであってもよい。当該形質転換体の細胞が存在しなくても、酵素の活性が残存していれば、反応に用いることが可能である。
【００６６】
上記のような細胞の破砕あるいは溶解処理は、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い形質転換体の細胞膜を破壊することにより、行うことができる。
【００６７】
本開示に係る形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物と、グルコース又はグルコース−６−リン酸との接触は、以下のような条件で行うことが好ましい。
接触は基質としてのグルコース又はグルコース−６−リン酸を含む溶液中で行うことが好ましい。もちろん、溶液はグルコースとグルコース−６−リン酸の両方を含んでいてもよい。反応は、反応の効率等から、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ等の補酵素の存在下で行うことが好ましい。
【００６８】
反応条件は、上記反応が進む限り、特に限定されない。例えば、溶液のｐＨは、改変ＤＯＩ合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、例えば、反応時のｐＨは、４．０〜９．０の範囲内のｐＨであることが好ましく、好ましくは５．０〜８．０の範囲内のｐＨであり、６．０〜８．０の範囲内のｐＨであることがより好ましい。溶液の温度も、改変ＤＯＩ合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、好ましくは１０℃〜５０℃の範囲内の温度、より好ましくは２０℃〜４５℃の範囲内の温度、更により好ましくは３０℃〜４２℃の範囲内の温度である。
【００６９】
溶液の媒体としては、水若しくは水性媒体、有機溶媒又は水若しくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えばアセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。あるいは溶液は液体培地であってもよい。
【００７０】
本開示に係る形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物と、グルコース又はグルコース−６−リン酸との接触は、振盪若しくは攪拌下で行うのが好ましい。例えば、このような接触は溶液中で行うことができる。例えば、前記形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に、グルコース又はグルコース−６−リン酸を基質溶液の形態であるいは固体の形態で添加してもよい。
反応開始時若しくは反応途中において、反応液のｐＨを適切な範囲に維持するため、酸やアルカリを添加してもよい。反応溶液に添加可能なアルカリの例としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物の他、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど水に溶解して、液性を塩基性とするものが挙げられる。反応溶液に添加可能な酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸などが挙げられる。
【００７１】
上記接触は、例えば、空気雰囲気下で行ってもよく、脱酸素雰囲気下で行ってもよい。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。
【００７２】
好ましい実施形態では、使用される、形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物は、前記改変ＤＯＩ合成酵素を含んでいる。このため、前記接触により、反応溶液中に共に存在している前記改変ＤＯＩ合成酵素が作用し、ＤＯＩを高い生産効率で生産する。なお、前記形質転換体の処理物若しくは前記培養物の処理物が生きた状態の前記形質転換体を含んでいることは必須ではないが、反応に関与する物質を代謝により継続的に供給することができるという観点からは、生きた状態の前記形質転換体を含むことが好ましい。
【００７３】
形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物の添加時期は、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。同様に、原料となるグルコース又はグルコース−６−リン酸も、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。
【００７４】
グルコース又はグルコース−６−リン酸の反応溶液中における濃度は、例えば０．１質量％〜２０質量％であり、あるいは０．５質量％〜１５質量％であり、あるいは２質量％〜１０質量％であってもよい。
【００７５】
前記形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物と、グルコース又はグルコース−６−リン酸とを接触させる方法としては、前記形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物をグルコース又はグルコース−６−リン酸を含む溶液に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物をグルコース又はグルコース−６−リン酸を含む溶液に加え、振とうしながら反応を進行させる方法、前記形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物とピリドキシン又はその塩とを溶液中で充分に混和の後、静置して反応を進行させる方法などが挙げられる。好ましくは、反応効率の観点より、前記形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物をグルコース又はグルコース−６−リン酸を含む溶液に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法が挙げられる。
【００７６】
反応に使用可能な反応容器としては特に制限はない。好ましくは、添加した前記形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物とピリドキシン又はその塩を含む溶液とが十分混和されるように攪拌できるとともに、改変ＤＯＩ合成酵素の最適温度範囲内に保てるように温度調節機能を有する反応容器であることが好ましい。
【００７７】
前記形質転換体、前記形質転換体の培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物と、グルコース又はグルコース−６−リン酸との接触時間（反応時間）は、改変ＤＯＩ合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、例えば３０分間〜１００時間であり、あるいは２時間〜５０時間であってもよい。また、反応はバッチ式で行ってもよく、反応途中で、基質及び前記微生物、前記培養物若しくは前記処理物のうち一方又は両方を逐次添加するセミバッチ式で行ってもよく、連続式で行ってもよい。セミバッチ式や連続式の場合は、新たな原料及び前記形質転換体、前記培養物若しくは前記処理物のうち一方又は両方が供給される等の操作が行われるため、反応時間の上限は特に限定はされない。例えば、グルコース又はグルコース−６−リン酸を連続的に添加してもよい。
【００７８】
一実施形態においては、ＤＯＩの製造方法は、本開示に係る形質転換体を培地中で培養することを含む。培地は好ましくは液体培地であり、また、好ましくはグルコース又はグルコース−６−リン酸を含む。ｃｓｃＡの導入等によりフルクトース利用能が向上している形質転換体の場合には、培地はさらにフルクトースを含んでいてもよい。使用できる培地及び培養条件、培養方法等については、上述の、形質転換体の培養に使用できる培地、培養条件、培養方法等を適用できる。例えば、２×ＹＴ液体培地等を用いることができる。このような培地に、グルコース又はグルコース−６−リン酸を添加して、所望の濃度のグルコース又はグルコース−６−リン酸を培地中に含むようにしてもよい。培養温度は例えば２５℃〜３５℃の範囲内の温度でもよく、培養時間は例えば５時間〜３０時間であってもよい。グルコース又はグルコース−６−リン酸の培地中における濃度は、例えば０．１質量％〜２０質量％であり、あるいは０．５質量％〜１５質量％であり、あるいは１．５質量％〜１０質量％であってもよい。このような培養によっても、形質転換体の存在によりＤＯＩが産生される。
【００７９】
ＤＯＩ生産のための培養（以下本培養とも呼ぶ）の前に、形質転換体に対し前培養を行ってもよい。前培養に用いる培地は、ＤＯＩ生産のための培養に用いる培地とは異なる培地であってもよい。培地の差異は、基本培地の差異であってもよいし、グルコース又はグルコース−６−リン酸の濃度における差異であってもよい。前培養に用いる培地、培養条件、培養方法等については、上述の、形質転換体の培養に使用できる培地、培養条件、培養方法等を適用できる。前培養に用いる培地は、グルコースもグルコース−６−リン酸も含まない培地であってもよい。前培養に用いる培地の例としては、ＲＭ液体培地やＲＭＭ液体培地が挙げられるが、２×ＹＴ液体培地であってもよい。前培養は形質転換体の状態が安定するまで行えばよいが、前培養時間は例えば３時間〜４８時間であり、あるいは８時間〜３０時間であってもよい。前培養後の形質転換体は、そのまま培地ごと本培養のための培地に添加してもよく、遠心処理等で前培養に用いた培地から分離してから本培養のための培地に添加してもよい。通常は、本培養の培養液量は、前培養の培養液量よりも大きな培養用量、例えば体積で１０倍以上、あるいは２０倍以上、とすることができる。
【００８０】
本培養は、バッチ式で行ってもよく、反応途中で、グルコース又はグルコース−６−リン酸を逐次添加するセミバッチ式で行ってもよく、グルコース又はグルコース−６−リン酸を連続的に添加する連続式で行ってもよい。セミバッチ式や連続式の場合は、新たな原料が供給される等の操作が行われるため、反応時間の上限は特に限定はされない。
【００８１】
上記の方法においては、グルコース又はグルコース−６−リン酸を原料として本開示に係る形質転換体若しくは前記培養物又は前記形質転換体若しくは前記培養物の処理物を用いることにより、ＤＯＩを高い生産効率で製造することができる。上記の方法により得られたＤＯＩは、例えばカテコールに変換して神経系医薬品などの原料、食品香料原料、ヘアケア商品などの酸化防止剤などに利用でき、ヒドロキノンに変換して止血剤、鎮痛剤等の原料、美白剤等の化粧品などに利用可能である。上記の方法で得られたＤＯＩを脱水することにより１，２，４−トリヒドロキシベンゼン（ＴＨＢ）を得ることができる。さらに上記の方法で得られたＴＨＢの水酸基をグリシジルエーテル化して１，２，４−トリグリシジルオキシベンゼン（ＴＧＢ）を得ることができる。ＴＧＢは耐熱性に優れ、かつ常温で低粘度の液状であり、電子部品の封止材、回路基材、接着剤、コーティング材、塗料、複合材料のマトリックス樹脂など広い範囲に渡って利用できる。
【００８２】
なお、本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により実施形態を具体的に説明するが、本開示は、これらの実施例によりその技術的範囲を限定されるものではない。なお、実施例において、特に断らない限り、物質の含有量又は添加量を表す「％」は「質量％」を意味する。【００８４】
（実施例１）
＜エラープローンＰＣＲによる変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーの構築＞
エラープローンＰＣＲを用いた変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーの作製からＤＯＩ高生産ＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離（１，２，３次選抜）までの工程を図３Ａ〜図３Ｄに示した。【００８５】
配列番号１に示すバチルス・サーキュランス由来のＤＯＩ合成酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子（ｂｔｒＣ）に、エラープローンＰＣＲでランダムに変異を導入した。ｂｔｒＣ遺伝子全長を含むプラスミドｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ（国際公開第２００６／１０９４７９号に記載されている、バチルス・サーキュランス由来のＤＯＩ合成酵素の４２ｋＤａサブユニットをコードするｂｔｒＣ遺伝子をベクターｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ部位に挿入したもの）を鋳型として、ｂｔｒＣ遺伝子の開始コドン上流にＳａｌＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号２に示すプライマー１（５’−acgcgtcgacatgacgactaaacaaatttg−３’）とｂｔｒＣ遺伝子の終止コドン上流にＰｓｔＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号３に示すプライマー２（５’−aaaactgcagttacagcccttcccgga−３’）を用い、ＤＮＡポリメラーゼの正確性を低下させる条件（表２）でＰＣＲを実施することで、変異箇所を限定することなくｂｔｒＣ遺伝子全領域へのランダムな変異の導入を実施した。【００８６】
【表２】
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【００８７】
ＰＣＲは、９４℃で２分３０秒保持後、９４℃で２０秒の熱変性、５０℃で２５秒のアニーリング、７２℃で１分１０秒のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、３０サイクル実施し、さらに７２℃で３分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。【００８８】
このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清をエタノール沈殿して、ＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩとＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって精製・単離し、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。【００８９】
次いで、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を宿主細胞（大腸菌）で発現させるための発現ベクターを構築した。ｐＬＥＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として、配列番号４に示すプライマー３（５’−atggtaccgagctcggatcc−３’）と５’側にＸｂａＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号５に示すプライマー４（５’−ctagtctagactaggagataatttatcaccgcag−３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒の熱変性、５２℃で３０秒のアニーリング、６８℃で１分のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、３０サイクル実施し、さらに６８℃で２分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清をエタノール沈殿して、ＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって精製・単離し、発現ベクターのＤＮＡ断片を取得した。【００９０】
次いで、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を宿主細胞（大腸菌）で発現させるためのプロモーターとして、ｇａｄＡプロモーターを取得した。ｇａｄＡプロモーターは、具体的には以下のようにして取得した。大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として、５’側にＸｂａＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号６に示すプライマー５（５’−ctagtctagagtcgtttttctgct−３’）と５’側にＳａｌＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号７に示すプライマー６（５’−acgcgtcgacttcgaactccttaaatttatttgaaggc−３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒の熱変性、５０℃で３０秒のアニーリング、６８℃で１分のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、３０サイクル実施し、さらに６８℃で２分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清をエタノール沈殿して、ＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＳａｌＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって精製・単離し、ｇａｄＡプロモーターのＤＮＡ断片を取得した。【００９１】
次いで、上記で増幅させた発現ベクターのＤＮＡ断片とｇａｄＡプロモーターのＤＮＡ断片を、２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘを用い、１６℃、３０分で反応させ、連結することでｇａｄＡプロモーターのＤＮＡ断片を発現ベクターのＤＮＡ断片に挿入し、発現ベクターｐＧＡＤＰ（図４）を取得した。【００９２】
上記操作によって得られた発現ベクターｐＧＡＤＰを制限酵素ＳａｌＩとＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって精製・単離し、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子のＤＮＡ断片を連結挿入することによって、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｍｂｔｒＣ）の分子集団を得た。【００９３】
上記操作によって取得した分子集団を大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル細胞に形質転換し、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーを構築した。【００９４】
（実施例２）
＜ＤＯＩ高生産ＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離＞
上記操作により取得された変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーから変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子ライブラリー（ｐＧＡＤＰ−ｍｂｔｒＣ、図５）を抽出し、ＤＯＩ合成酵素の基質であるグルコース−６−リン酸が高蓄積する大腸菌ＧＩ７２４Δｐｇｉ株（国際公開第２００６／１０９４７９号及びKakinuma等, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935に記載されている、大腸菌ＧＩ７２４株におけるｐｇｉ遺伝子を破壊した株）のコンピテントセルに形質転換した。形質転換細胞をＬ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２％寒天、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、生育したクローンをＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離の選抜対象とした。【００９５】
１次選抜では、まず、得られた選抜対象クローンをＲＭ液体培地（２％カザミノ酸、１％グリセロール、０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が１ｍｌずつ入ったディープウェルプレート９６Ｗｅｌｌ丸底に植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前培養を行った。次に、前培養液を１次選抜用２×ＹＴ液体培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が１ｍｌずつ入ったディープウェルプレート９６Ｗｅｌｌ丸底に１０μｌずつ植菌し、３０℃で１５時間振とうし、本培養を行った。本培養後の培養液を遠心分離して菌体を除いた上清１０μｌ、滅菌蒸留水９０μｌ、メタノール１００μｌ、オキシム化試薬ＮＢＨＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を混合し、６０℃で１時間オキシム化反応を行った。オキシム化反応後、減圧濃縮遠心機で乾固し、メタノール２００μｌで再溶解後、表３の条件でＨＰＬＣ分析を行い、ＤＯＩ濃度を決定し、野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を有するクローンよりもＤＯＩ生産量の多かった候補クローンを選抜した。【００９６】
【表３】
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【００９７】
１次選抜において得られた候補クローンを対象として、２次選抜を実施した。２次選抜では、１次選抜において得られた候補クローンをＲＭ液体培地が３ｍｌずつ入った試験管に植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前培養を行った。次に、前培養液を２次選抜用２×ＹＴ液体培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が５０ｍｌずつ入った５００ｍｌ三角フラスコに濁度ＯＤ６００＝０．１になるように植菌し、３０℃で３６時間振とうし、本培養を行った。本培養開始０、１２、２４、３６時間後の培養液を遠心分離して菌体を除いた上清１０μｌに対し、１次選抜におけるＤＯＩ濃度測定操作と同様の操作を行うことで、ＤＯＩ濃度をＨＰＬＣで決定し、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を有するクローンよりもＤＯＩ生産量の多かった候補クローンを選抜した。【００９８】
２次選抜において得られた候補クローンを対象として、３次選抜を実施した。２次選抜で得られたクローンから、プラスミドベクターを精製単離し、ＤＯＩ合成酵素の基質であるグルコース−６−リン酸が高蓄積する大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（国際公開第２００６／１０９４７９号及びKakinuma等, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935に記載されている、大腸菌ＧＩ７２４株におけるｐｇｉ遺伝子、ｚｗｆ遺伝子及びｐｇｍ遺伝子を破壊した株）のコンピテントセル細胞に形質転換した。形質転換細胞をＬ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２％寒天、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で培養し、生育したクローンを３次選抜に用いた。３次選抜では、まず、得られた選抜対象クローンをＲＭＭ液体培地（２％カザミノ酸、０．５％マンニトール、０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が３ｍｌずつ入った試験管に植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前培養を行った。次に、前培養液を３次選抜用２×ＹＴ液体培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、２％グルコース、２％マンニトール、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が５０ｍｌずつ入った５００ｍｌ三角バッフルフラスコに濁度ＯＤ６００＝０．１になるように植菌し、３０℃で３６時間振とうし、本培養を行った。本培養開始０、１２、２４、３６時間後の培養液を遠心分離して菌体を除いた上清１０μｌに対し、１次選抜におけるＤＯＩ濃度測定操作と同様の操作を行うことで、ＤＯＩ濃度をＨＰＬＣで決定し、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を有するクローンよりもＤＯＩ生産量の多かった候補クローンを選抜した（図６）。図６中、◆で表されるデータ系列は配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を有するクローンによるＤＯＩ生産量、■で表されるデータ系列は野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を有するクローンよりもＤＯＩ生産量の多かった候補クローンによるＤＯＩ生産量である。【００９９】
（実施例３）
＜変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列の解析＞
ＤＯＩ合成酵素遺伝子の変異点を決定するために、上記３次選抜において得られたクローンのＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列解析を行った。解析用プライマーは、配列番号８に示すプライマー７（５’−ggagccaaccgaagaacc−３’）、配列番号９に示すプライマー８（５’−ctagtctagagtcgtttttctgct−３’）、配列番号１０に示すプライマー９（５’−acctgatgcccgaacatg−３’）、配列番号１１に示すプライマー１０（５’−agatcgaatccgggtccg−３’）の計４種のプライマーを使用し、ベックマンコールター社製のＤＴＣＳ  Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｋｉｔを利用して、ＰＣＲ反応を行い、その反応サンプルをベックマンコールター社製のＣＥＱ８０００ジェネティックアナライザーにより解析した。解析の結果、ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから８７７番目のＴがＡに塩基置換されていた。すなわち、Ｎ末端から２９３番目のトリプトファンがアルギニンにアミノ酸置換されていた。このようにして、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素と比較して、ＤＯＩ生産性を向上させる変異型ＤＯＩ合成酵素をコードする遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ））を取得した。【０１００】
（実施例４）
＜野生型及び変異型ＤＯＩ合成酵素の生産及び精製＞
配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素を含むプラスミドベクターｐＬＥＸ−ｂｔｒＣ（国際公開第２００６／１０９４７９号に記載されている）をテンプレートとして、ｂｔｒＣ遺伝子の開始コドン上流にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号１２に示すプライマー１１（５’−cgcggatccatgacgactaaacaaattt−３’）、ｂｔｒＣ遺伝子の終止コドン上流にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号１３に示すプライマー１２（５’−cccaagcttttacagcccttccccgatc−３’）を用いてｂｔｒＣ遺伝子のヌクレオチド配列をＰＣＲ法により増幅し、大腸菌組換え蛋白質高発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ−ｂｔｒＣを得た。ｐＱＥ８０Ｌベクターに連結することによりヒスチジンタグ配列とＤＯＩ合成酵素が融合した組換えＤＯＩ合成酵素を生産することができる。組換え蛋白質としてＤＯＩ合成酵素を高発現させた大腸菌を遠心により回収後、Ｌｙｓｉｓ    ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２ｍＭ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）に懸濁した。懸濁液を超音波破砕機にかけ、大腸菌を破砕後、遠心をすることにより組換えＤＯＩ合成酵素を上清に回収した。上清液とヒスチジンタグ配列と特異的に結合するＮｉ−ＮＴＡアガロースを混合して、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースにＤＯＩ合成酵素を結合させた後、Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７）、３０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．２ｍＭ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を加えて、洗浄し、遠心して上清を捨てた。組換えＤＯＩ合成酵素が結合したＮｉ−ＮＴＡアガロースに溶出ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７）、２００ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．２ｍＭ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２０）を加えて、組換えＤＯＩ合成酵素を溶出させ、高純度の組換えＤＯＩ合成酵素を精製することができた。【０１０１】
同様に、変異型ＤＯＩ合成酵素（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ））についても、上記で取得した変異型ＤＯＩ合成酵素（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ））を含むプラスミドベクターをテンプレートとして、ｂｔｒＣ遺伝子の開始コドン上流にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号１２に示すプライマー１１（５’−cgcggatccatgacgactaaacaaattt−３’）、ｂｔｒＣ遺伝子の終止コドン上流にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイトを付加したヌクレオチド配列に相当する配列番号１３に示すプライマー１２（５’−cccaagcttttacagcccttccccgatc−３’）を用いてｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）遺伝子のヌクレオチド配列をＰＣＲ法により増幅し、大腸菌組換え蛋白質高発現ベクターｐＱＥ８０Ｌ（ＱＩＡＧＥＮ）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドｐＱＥ８０Ｌ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）を得た。同様な方法で組換え変異型ＤＯＩ合成酵素の生産、精製を行った。【０１０２】
（実施例５）
＜野生型及び変異型ＤＯＩ合成酵素の活性測定＞
実施例４で精製した野生型及び変異型ＤＯＩ合成酵素の酵素活性をグルコース−６−リン酸、ＮＡＤ＋を用いて測定した。アッセイの反応溶液の組成は、５０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７）、５ｍＭ  グルコース−６−リン酸、５ｍＭ  β−ＮＡＤ＋、０．２ｍＭ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、野生型又は変異型ＤＯＩ合成酵素  １０μｇとし、４６℃、５分間反応させた。反応後、反応溶液をフェノール／クロロホルム処理をして、除蛋白を行い、遠心後の水層画分１０μｌをサンプルとして、実施例２における１次選抜におけるＤＯＩ濃度測定に用いたＨＰＬＣを用いた方法でＤＯＩを定量し、活性を算出した。また、ＤＯＩ合成酵素１ｍｇが１分間あたりに合成するＤＯＩの量を比活性とした。変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ）のＤＯＩ合成酵素活性は、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素の活性よりも、１．５倍高活性であった（図７）。【０１０３】
（実施例６）  
さらにＤＯＩ生産性を向上させる変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を取得するために、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（Ｗ２９３Ｒ）を含むプラスミドをテンプレートとして、実施例１に示したエラープローンＰＣＲ法で、新たな変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子クローンライブラリーを構築した。次いで、実施例２のＤＯＩ合成酵素遺伝子変異クローンの単離に示した１、２、３次選抜を実施し、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（Ｗ２９３Ｒ）を含むクローンよりもさらにＤＯＩ生産性の向上したクローンを取得した（図８）。図８中、◆で表されるデータ系列はｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株によるＤＯＩ生産量を表し、■で表されるデータ系列はｐＧＡＤＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株によるＤＯＩ生産量を表し、▲で表されるデータ系列、×で表されるデータ系列、＋で表されるデータ系列、及び●で表されるデータ系列は、それぞれ異なる変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株によるＤＯＩ生産量を表す。【０１０４】
次に実施例３の変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子の塩基配列の解析と同様に塩基配列解析をした結果、表４に示すように、以下の４種の変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子が得られた。
ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから８７７番目のＴがＡに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から２９３番目のトリプトファンがアルギニンにアミノ酸置換され、且つＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから４１番目のＡがＣに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から１４番目のアスパラギンがトレオニンにアミノ酸置換された変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ））。
ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから８７７番目のＴがＡに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から２９３番目のトリプトファンがアルギニンにアミノ酸置換され、且つＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから１１０番目のＡがＴに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から３７番目のチロシンがフェニルアラニンにアミノ酸置換された変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｙ３７Ｆ））。
ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから８７７番目のＴがＡに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から２９３番目のトリプトファンがアルギニンにアミノ酸置換され、且つＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから８６８番目のＧがＡに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から２９０番目のアラニンがトレオニンにアミノ酸置換された変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ａ２９０Ｔ））。
ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから８７７番目のＴがＡに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から２９３番目のトリプトファンがアルギニンにアミノ酸置換され、且つＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）の開始コドンから９５６番目のＡがＧに塩基置換されたことにより、配列番号１におけるＮ末端から３１９番目のヒスチジンがアルギニンにアミノ酸置換された変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））。【０１０５】
【表４】
2018180568.tif 000005
【０１０６】
野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を含むクローン、Ｗ２９３Ｒ変異を有する変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子を含むクローン、及び表４に示した各クローンによるＤＯＩ生産（図８に示したもの）について、以下の表５に数値を示す。【０１０７】
【表５】
2018180568.tif 000006
【０１０８】
次に実施例４と同様に上記４種の（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ））、（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｙ３７Ｆ））、（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ａ２９０Ｔ））、（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））の変異型ＤＯＩ合成酵素を生産、精製した。その後、実施例５と同様に野生型ＤＯＩ合成酵素と各変異型ＤＯＩ合成酵素のアッセイを行い、活性を比較した結果、
変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）のＤＯＩ合成酵素活性は、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素の活性よりも、１．９２倍高活性（図９）、
変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ｙ３７Ｆ）のＤＯＩ合成酵素活性は、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素の活性よりも、１．５７倍高活性（図９）、
変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ａ２９０Ｔ）のＤＯＩ合成酵素活性は、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素の活性よりも、１．４５倍高活性（図９）、
変異型ＤＯＩ合成酵素（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）のＤＯＩ合成酵素活性は、配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素の活性よりも、１．８３倍高活性（図９）、
であり、以上４種の変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子は全て配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素よりも高活性であった。【０１０９】
（実施例７）
＜変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））を導入した形質転換体によるＤＯＩ発酵生産性＞
変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））のＤＮＡ断片を宿主細胞（大腸菌）で発現させるための発現ベクターを構築した。具体的には、ｐＬＥＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として、配列番号４に示すプライマー３（５’−atggtaccgagctcggatcc−３’）と５’側にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを有する配列番号１４に示すプライマー１３（５’−cgcggatccgagataatttatcaccgcag−３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒の熱変性、５０℃で３０秒のアニーリング、６８℃で１分のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、３０サイクル実施し、さらに６８℃で２分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清をエタノール沈殿して、ＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって精製・単離し、発現ベクターのＤＮＡ断片を取得した。【０１１０】
次いで、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））のＤＮＡ断片を宿主細胞（大腸菌）で発現させるためのプロモーターとして、ｇａｐＡプロモーターを取得した。ｇａｐＡプロモーターは、具体的には以下のようにして取得した。大腸菌の染色体ＤＮＡを鋳型として、５’側にＢａｍＨＩ制限酵素サイトを有する配列番号１５に示すプライマー１４（５’−cgcggatccgcgggaagagtgaggcgagtc−３’）と５’側にリン酸基を付加した配列番号１６に示すプライマー１５（５’−atattccaccacctatttg−３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒の熱変性、５０℃で３０秒のアニーリング、６８℃で１分のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、３０サイクル実施し、さらに６８℃で２分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清をエタノール沈殿して、ｇａｐＡプロモーターのＤＮＡ断片を回収した。【０１１１】
次いで、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））を含むプラスミドを鋳型として、５’側にリン酸基を付加した配列番号１７に示すプライマー１６（５’−atgacgactaaacaaatttgttttgcgg−３’）と５’側にＰｓｔＩ制限酵素サイトを有する配列番号１８に示すプライマー１７（５’−aaaactgcagttacagcccttcccggatc−３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒の熱変性、５０℃で３０秒のアニーリング、６８℃で１分のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、３０サイクル実施し、さらに６８℃で２分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清をエタノール沈殿して、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））のＤＮＡ断片を回収した。【０１１２】
次に、上記で増幅させたｇａｐＡプロモーターのＤＮＡ断片と、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））のＤＮＡ断片とを、２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｘを用い、１６℃、３０分で反応させた。このようにして得たＬｉｇａｔｉｏｎ産物を鋳型として、配列番号１５に示すプライマー１４と配列番号１８に示すプライマー１７とを用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分保持後、９４℃で３０秒の熱変性、５０℃で３０秒のアニーリング、６８℃で１分のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、３０サイクル実施し、さらに６８℃で２分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をフェノール／クロロホルムで処理し、遠心分離し、上清をエタノール沈殿して、ＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＰｓｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって精製・単離し、発現ベクターのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を、上記した発現ベクターのＤＮＡ断片に連結挿入し、プラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）を得た（図１０）。また、同様な方法で配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子が挿入されたｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣも得た（図１１）。【０１１３】
プラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）及びｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを精製単離し、ＤＯＩ合成酵素の基質であるグルコース−６−リン酸が高蓄積する大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（国際公開第２００６／１０９４７９号及びKakinuma等, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935に記載されている）のコンピテントセルに形質転換した。形質転換細胞を２×ＹＴ液体培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が３ｍｌ入った試験管に植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前培養を行った。次に、前培養液を評価培養用２×ＹＴ液体培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、５％グルコース、５％マンニトール、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が５０ｍｌずつ入った５００ｍｌ三角バッフルフラスコに濁度ＯＤ６００＝０．１になるように植菌し、３０℃で６０時間振とうし、本培養を行った。本培養開始０、１２、２４、３６、４８、６０時間後の培養液を遠心分離して菌体を除いた上清１０μｌに対し、実施例２における１次選抜におけるＤＯＩ濃度測定操作と同様の操作を行うことで、ＤＯＩ濃度をＨＰＬＣで決定した。また、菌体の濁度、培地中のグルコース濃度、マンニトール濃度もあわせて測定した。菌体濁度は分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定し、グルコース濃度は和光純薬工業（株）製のグルコースＣＩＩ−テストワコーに従い、マンニトール濃度は、Ｍａｇａｚｙｍｅ社製のＭａｎｎｉｔｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに従って測定した。【０１１４】
図１２Ａに培地の濁度のタイムコース、図１２Ｂに培地中のグルコース濃度のタイムコース、図１２Ｃに培地中のマンニトール濃度のタイムコース及び図１２ＤにＤＯＩ生産量のタイムコースを示す。ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（図１２Ａ〜図１２Ｄ中における▲で示されるデータ系列）は、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（図１２Ａ〜図１２Ｄ中における■で示されるデータ系列）の約２倍のＤＯＩ生産速度を示した。【０１１５】
（実施例８）
＜変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ））を導入した形質転換体によるＤＯＩ発酵生産性＞
変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ））のＤＮＡ断片を宿主細胞（大腸菌）で発現させるための発現ベクターを構築した。配列番号１のアミノ酸配列の野生型ＤＯＩ合成酵素遺伝子が挿入されたｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（図１１）を鋳型として、配列番号１９に示すプライマー１８（５’−ttccattatttaatccgcgataacaagagg−３’）と配列番号２０に示すプライマー１９（５’−cctcttgttatcgcggattaaataatggaa−３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅には、ＫＯＤポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分保持後、９８℃で１５秒の熱変性、５５℃で３０秒のアニーリング、６８℃で６分のＤＮＡ伸長の反応を１サイクルとして、２０サイクル実施し、さらに６８℃で３分保持し、得られたＰＣＲ増幅産物を４℃で保持した。このようにＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＤｐｎＩで消化し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）を得た（図１３）。【０１１６】
プラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）及びｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを精製単離し、ＤＯＩ合成酵素の基質であるグルコース−６−リン酸が高蓄積する大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（国際公開第２００６／１０９４７９号及びKakinuma等, Tetrahedron Letters, 2000, vol.41, p.1935に記載されている）のコンピテントセルに形質転換した。形質転換細胞を２×ＹＴ液体培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が３ｍｌ入った試験管に植菌し、３０℃で２４時間振とうし、前培養を行った。次に、前培養液を評価培養用２×ＹＴ液体培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、３％グルコース、４％マンニトール、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）が３０ｍｌずつ入った２００ｍｌ三角バッフルフラスコに濁度ＯＤ６００＝０．１になるように植菌し、３０℃で４８時間振とうし、本培養を行った。本培養開始０、１２、２４、３６、４８時間後の培養液を遠心分離して菌体を除いた上清１０μｌに対し、実施例２における１次選抜におけるＤＯＩ濃度測定操作と同様の操作を行うことで、ＤＯＩ濃度をＨＰＬＣで決定した。また、菌体の濁度、培地中のグルコース濃度、マンニトール濃度もあわせて測定した。菌体濁度は分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定し、グルコース濃度は和光純薬工業（株）製のグルコースＣＩＩ−テストワコーに従い、マンニトール濃度は、Ｍａｇａｚｙｍｅ社製のＭａｎｎｉｔｏｌ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに従って測定した。【０１１７】
図１４Ａに培地の濁度のタイムコース、図１４Ｂに培地中のグルコース濃度のタイムコース、図１４Ｃに培地中のマンニトール濃度のタイムコース及び図１４ＤにＤＯＩ生産量のタイムコースを示す。ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｈ３１９Ｒ）を含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（図１４Ａ〜図１４Ｄ中における▲で表されるデータ系列）は、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣを含む大腸菌ＧＩ７２４ΔｐｇｉΔｚｗｆΔｐｇｍ株（図１４Ａ〜図１４Ｄ中における■で表されるデータ系列）の約１．２倍のＤＯＩ生産速度を示した。【０１１８】
（実施例９）
＜変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）、（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ））を導入した形質転換体によるジャーファーメンターでのＤＯＩ発酵生産性評価＞  
ジャーファーメンターの培養では実施例８とは異なる宿主と発現ベクターを用いた。宿主にはＤＯＩ合成酵素基質であるグルコース−６−リン酸が高蓄積する大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株（国際公開第２０１０／０５３０５２号に記載されている、大腸菌ＭＧ１６５５株におけるｐｇｉ遺伝子及びｚｗｆ遺伝子を破壊した株）を用いた。一方、発現ベクターについては以下のように作成した。【０１１９】
ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ）を含むプラスミドベクターｐＧＡＰ−ｂｔｒＣ−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ（国際公開第２０１０／０５３０５２号に記載されている、ＧＡＤＰＨプロモータ、バチルス・サーキュランスのＤＯＩ合成酵素遺伝子であるｂｔｒＣ、大腸菌Ｏ−１５７株由来のスクロース加水分解酵素遺伝子であるｃｓｃＡ及びザイモモナス・モビリス由来のグルコース輸送促進タンパク質遺伝子であるｇｌｆの発現ユニットをｐＢＲ３２２（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０１７４９）に組み込んだもの）を鋳型にして配列番号２１に示すプライマー２０（５’-cattacaggcttttaaataaaatcggg -３’）、配列番号２２に示すプライマー２１（５’- taaaagcctgtaatgggcggacacgtc  -３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は９８℃で１０秒間の熱変性、５５℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で４０秒間のＤＮＡ伸長反応を１サイクルとして３０サイクル実施した。このように増幅したＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ））を含むプラスミドベクターｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを得た。（図１５）【０１２０】
変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ））を含むプラスミドベクターｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを鋳型にして配列番号２３に示すプライマー２２（５’- tgttttacctttgcattcggcgaacat-３’）、配列番号２４に示すプライマー２３（５’-tgcaaaggtaaaacaccggtccgcaaa-３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は９８℃で１０秒間の熱変性、５８℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で４０秒間のＤＮＡ伸長反応を１サイクルとして３０サイクル実施した。このように増幅したＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ））を含むプラスミドベクターｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを得た。（図１６）【０１２１】
また、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ））を含むプラスミドベクターｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを鋳型にして配列番号２５に示すプライマー２４（５’- ttaatccgcgataacaagaggggctac-３’）、配列番号２６に示すプライマー２５（５’- ttatcgcggattaaataatggaagat-３’）を用い、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。ＰＣＲの反応条件は９８℃で１０秒間の熱変性、５４．４℃で１５秒間のアニーリング、７２℃で４０秒間のＤＮＡ伸長反応を１サイクルとして３０サイクル実施した。このように増幅したＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、変異型ＤＯＩ合成酵素遺伝子（ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）を含むプラスミドベクターｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを得た。（図１７）【０１２２】
プラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ及びプラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆをＭｏｎａｒｃｈ（登録商標）  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて精製単離し、ＤＯＩ合成酵素の基質であるグルコース−６−リン酸が高蓄積する大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株（国際公開第２０１０／０５３０５２号に記載されている）のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することによって３種類のプラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆをそれぞれ含む、３種類のＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株を得た。【０１２３】
３種類のプラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆをそれぞれ含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株について、ジャーファーメンターを用いたＤＯＩ生産性評価を行った。
前培養としてＬＢ培地（１％ハイポリペプトンＮ、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．０１％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）が１００ｇずつ入った５００ｍｌ三角バッフルフラスコにアンピシリン１００ｍｇ／ｍｌを０．１ｍｌ加え、３種類のプラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆをそれぞれ含む３種類のＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株を、０．１ｍｌ別々の上記三角バッフルフラスコに植菌し、一晩１２０ｒｐｍ、２８℃で撹拌培養を行った。【０１２４】
培地成分１（０．２％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、０．０１％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３％アデカノール）３５０ｇが入った１Ｌ培養槽（ＡＢＬＥ社製造培養槽  ＢＭＬ−０１ＫＰ３）を滅菌し、培地成分２（１０％（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．６％ＮＨ４Ｃｌ、４．６％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）を１５ｇ、５０％コーンスティープリカーを５ｇ 、５０％フィチン酸を７００μｌ加え、前培養液を１０ｇ植菌し培養を開始した。培養開始とともに試薬糖液（２１％Ｇｌｃ、２１％Ｆｒｕ、１％Ｘｙｌ）を０．１３ｇ／ｍｉｎの速度で３０時間流加した。試薬糖液はグルコース溶液、フルクトース溶液、キシロース溶液をそれぞれ別々に高圧蒸気滅菌し混合して作製した。【０１２５】
培養は大気圧下、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度８００ｒｐｍ、培養温度３０℃、ｐＨ６．０（１２．５％アンモニア溶液で調整）で３２時間行った。培養開始０、８、２４、２７、３２時間後の培養液を遠心分離して、菌体を取り除いた上清を滅菌蒸留水で１００倍希釈し、フィルター（マイレクス−ＧＶ、０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、４ｍｍ）を用いてろ過し、表７の条件に従ってＤＯＩ、グルコース、フルクトース、キシロース濃度の測定をＨＰＬＣを用いて行った。
図１８ＡにｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株でのＤＯＩ生産量（▲）、グルコース濃度（●）、フルクトース濃度（◆）、キシロース濃度（■）のタイムコースを示し、図１８ＢにｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株でのＤＯＩ生産量（▲）、グルコース濃度（●）、フルクトース濃度（◆）、キシロース濃度（■）のタイムコースを示し、図１８ＣにｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株でのＤＯＩ生産量（▲）、グルコース濃度（●）、フルクトース濃度（◆）、キシロース濃度（■）のタイムコースを示した。【０１２６】
表６に３種類のプラスミドｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆをそれぞれ含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株の３２時間目のＤＯＩ濃度を示した。つまり、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含む大腸菌ＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株それぞれの３２時間培養を行った後のＤＯＩ濃度を示した図である。【０１２７】
【表６】
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【０１２８】
３２時間目のＤＯＩ濃度はｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株で５６．６ｇ／Ｌ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｎ１４Ｔ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株で３０．６ｇ／Ｌ、ｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株で７０．５ｇ／Ｌとなった。
よってｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ／Ｈ３１９Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株でｐＧＡＰＰ−ｂｔｒＣ（Ｗ２９３Ｒ）−ｃｓｃＡ−ｇｌｆを含むＭＧ１６５５ΔｐｇｉΔｚｗｆ株の約１．２倍のＤＯＩ生産性を示した。【０１２９】
【表７】
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【０１３０】
２０１７年３月２７日に出願された日本国特許出願２０１７−０６１５７２の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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