(57)【要約】  本発明の課題は、飲食品として使用できる環状ホスファチジン酸ナトリウムを簡便に製造する方法を提供することである。本発明によれば、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿または上層液を回収する工程を含む、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿または上層液を回収する工程を含む、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項２】
リゾ型リン脂質が、大豆由来のリゾ型リン脂質である、請求項１に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項３】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとを酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液中において反応させる工程である、請求項１又は２に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項４】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとを、キレート剤を含有する酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液中において反応させる工程である、請求項１から３の何れか一項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項５】
キレート剤がＥＤＴＡである、請求項４に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項６】
反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿を回収する、請求項３から５の何れか一項に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項７】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをクエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液中において反応させる工程である、請求項１又は２に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【請求項８】
反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる上層液を回収する、請求項７に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ホスファチジン酸（以下、ｃＰＡと略すこともある）は、がん細胞の転移および浸潤を阻害する等の生理活性を有することが知られ（非特許文献１）、抗腫瘍剤を含む医薬品や機能性表示食品及び食品としての用途が期待されており、また、生体内のヒアルロン酸合成促進作用を有することから、化粧品に添加されている。【０００３】
従来、このような環状ホスファチジン酸の製造方法としては、化学的に合成する方法（特許文献１及び２）や、リゾ型リン脂質にホスフォリパーゼＤを作用させることによる酵素反応を利用した方法（特許文献３及び４）が知られている。環状ホスファチジン酸は脂質であり水に不溶であるため、ナトリウム塩などの水溶性の塩とすることが必要であり、化学的に合成した環状ホスファチジン酸を、水素化ナトリウムや水酸化ナトリウムなどの強塩基で処理し、ナトリウム塩に変換する方法で環状ホスファチジン酸ナトリウムが調製されている。【０００４】
また、有機溶媒及び／又は水を含む系においてリゾ型リン脂質（但し、水素添加物を除く）にホスホリパーゼＤを作用させて得られる反応物に、ナトリウム塩を添加した後、反応物から溶媒を除去することを含む環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法が知られている（特許文献５）。【０００５】
さらにリゾホスファチジルコリンと放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ属）由来のホスホリパーゼＤとをナトリウム原子の含有量が０．２質量％以下、およびカルシウム原子の含有量が０．０２質量％以下である水溶液中で５０〜６５℃にて４〜１０時間酵素反応させる工程と、  酵素反応の後処理として、エタノールを添加し、０〜８℃で１５〜３０時間静置保存し、反応液をろ過する工程と、ろ過して得られたろ液をＮａ型の強酸性陽イオン交換樹脂により処理する工程とを含むことを特徴とする、１−アシル−２，３−環状ホスファチジン酸またはその塩の製造方法が知られている（特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２２８１６９号公報
【特許文献２】特開平７−２５８２７８号公報
【特許文献３】特開２００１−１７８４８９号公報
【特許文献４】特開２００８−２２２６４３号公報
【特許文献５】特許５９３３３３８号公報
【特許文献６】特開２０１４−９３９５３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Biochemica et Biophysica Acta 15288(2002),p.1-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献５の実施例に記載の方法は、環状ホスファチジン酸ナトリウムをクロロホルム層に集めた後に、クロロホルムを留去することにより環状ホスファチジン酸ナトリウムを得ることが記載されているが、食品用途と考慮した場合には、クロロホルムを使用しない方法であることが望ましい。また、特許文献６に記載の方法は、ろ液をＮａ型の強酸性陽イオン交換樹脂により処理する工程を含むことから操作が煩雑であった。【０００９】
本発明は、飲食品として使用できる環状ホスファチジン酸ナトリウムを簡便に製造する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法について鋭意検討した結果、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させた後に、得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿または上層液を回収することによって、環状ホスファチジン酸ナトリウムを簡便に得ることができることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。【００１１】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）  リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿または上層液を回収する工程を含む、環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（２）  リゾ型リン脂質が、大豆由来のリゾ型リン脂質である、（１）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（３）  リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとを酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液中において反応させる工程である、（１）又は（２）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（４）  リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとを、キレート剤を含有する酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液中において反応させる工程である、（１）から（３）の何れか一に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（５）  キレート剤がＥＤＴＡである、（４）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（６）  反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿を回収する、（３）から（５）の何れか一に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（７）  リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程が、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをクエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液中において反応させる工程である、（１）又は（２）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
（８）  反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる上層液を回収する、（７）に記載の環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法によれば、飲食品として使用できる環状ホスファチジン酸ナトリウムを簡便に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、薄層クロマトグラフィーにより環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを検出した結果を示す。
【図２】図２は、薄層クロマトグラフィーにより環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを検出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明による環状ホスファチジン酸ナトリウムの製造方法は、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる工程、及び得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿または上層液（上清）を回収する工程を含むことを特徴とする。本発明の方法は、クロロホルム、メチレンクロライド、トルエン、エチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶（エチルアルコール以外の有機溶媒）を使用することなく実施できる。
【００１５】
リゾ型リン脂質としては、脂肪酸種が異なるもの、エーテル又はビニルエーテル結合をもった分子種などが知られているが、これらは市販品として入手可能である。
【００１６】
リゾ型リン脂質としては、大豆由来のリゾ型リン脂質、卵黄由来のリゾ型リン脂質、あるいはトウモロコシ由来のリゾ型リン脂質など使用することができるが、大豆由来のリゾ型リン脂質を使用することが好ましい。
【００１７】
リゾ型リン脂質としては、例えば、レシチンを原料に用い、レシチン、分画レシチン等をホスホリパーゼＡ２で処理することにより部分加水分解したリゾレシチンを用いることができる。例えば、大豆リゾレシチンを使用することができる。大豆リゾレシチンは市販品を購入することができる。
【００１８】
本発明においては、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させる。例えば、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとを酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液中又はクエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液中において反応させることができる。ナトリウム塩を存在させることにより、環状ホスファチジン酸ナトリウムを製造することができる。
【００１９】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応は、キレート剤の存在下において行ってもよい。本発明において用いられるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、クエン酸、酒石酸、フィチン酸等であるが、好ましくはエチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、最も好ましくはＥＤＴＡである。
【００２０】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応においては、カルシウムイオンが存在しないことが好ましく、カルシウムイオンが存在する場合には微量であることが好ましい。
【００２１】
本発明において用いられるホスホリパーゼＤは、リゾ型リン脂質に作用させた場合に、ｃPAを生成するものであれば特に限定されるものではないが、ストレプトマイセス  エスピー（Streptomyces sp.）またはアクチノマヂュラ  エスピー（Actinomadula sp.）に由来するホスホリパーゼDが特に好ましく用いられる。
【００２２】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応は、例えば、２５℃〜５０℃、好ましくは３０℃〜４５℃に加温し連続的に攪拌しながら５〜３０時間程度反応させることにより行なうことができる。
【００２３】
リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとの反応は、より具体的には以下の手順で行うことができる。
（方法１）酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液あるいはクエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ５．０〜６．０）にリゾ型リン脂質（大豆リゾレシチンなど）、を添加して分散溶解する。この溶液にホスホリパーゼＤを、所望により少量の精製水に分散した後に、添加する。得られた混合液を２５℃〜５０℃で５〜３０時間撹拌する。
（方法２）ＥＤＴＡを含有する酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ４．０〜７．０、好ましくはｐＨ５．０〜６．０）にリゾ型リン脂質（大豆リゾレシチンなど）を添加して分散溶解する。この溶液にホスホリパーゼＤを、所望により少量の精製水に分散した後に、添加する。得られた混合液を２５℃〜５０℃で５〜３０時間撹拌する。
【００２４】
本発明においては、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをナトリウム塩の存在下において水性媒体中において反応させた後に得られた反応液にエチルアルコールを添加することにより生じる沈殿又は上層液を回収する。本発明においては、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとを酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液の存在下において水性媒体中において反応させることにより生成した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムが、エチルアルコールを添加することにより沈殿することを見出し、この沈殿を回収することにより環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを簡便に（即ち、有機溶媒を使用することなく、かつ強酸性陽イオン交換樹脂による処理等を行うことなく）回収することに成功した。さらに本発明においては、リゾ型リン脂質とホスホリパーゼＤとをクエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液の存在下において水性媒体中において反応させることにより生成した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムが、反応液にエチルアルコールを添加して攪拌及び静置することにより生じる上層液と下層液のうちの上層液に存在することを見出し、この上層液を回収することにより環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを簡便に（即ち、有機溶媒を使用することなく、かつ強酸性陽イオン交換樹脂による処理等を行うことなく）回収することに成功した。
【００２５】
なお、エチルアルコールの添加による沈殿の回収は、複数回行ってもよい。
本発明の一例においては、エチルアルコールの添加（１回目の添加）により生じた沈殿物を、遠心操作（例えば、３０００回転、５分間）により回収し、これを精製水に溶解する。本発明の一例においては、得られた溶液にエチルアルコールを添加（２回目の添加）して生じた沈殿物を、遠心操作（例えば、３０００回転、５分間）により回収してもよい。
また本発明の別の例においては、エチルアルコールを添加して攪拌を行った後、静置し下層部を分液除去して上層液を得ることができる。この上層液を回収して減圧濃縮を行いエタノールを除去した後に、精製水に溶解後、凍結乾燥を行い環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末を得ることができる。
所望により、上記で回収された環状リゾホスファチジン酸ナトリウムは精製水に溶解後に凍結乾燥して環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末を得ることができる。
【００２６】
以下の実施例で本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例によって何ら限定されるものではない。なお、下記実施例で使用した大豆リゾレシチン（ＳＬＰホワイトリゾ）はカルシウム含量が少ないものである。
【実施例】
【００２７】
実施例１
１Ｍ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに大豆リゾレシチン（ＬＰＣ７０）１０ｇを添加して分散溶解した。この溶液にホスホリパーゼＤ（名糖産業社製；アクチノマジューラ由来）４００ｍｇを少量の精製水に分散した後に添加し、４０℃で１６時間攪拌した。反応後１００ｍｌのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を３０００回転、５分間遠心分離を行い回収して５０ｍｌの精製水に溶解した。これに５０ｍｌのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を３０００回転、５分間遠心分離を行って回収し３０ｍｌの精製水に溶解後凍結乾燥して環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する４．２ｇの粉末を得た。【００２８】
実施例２
１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する１Ｍ酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００ｍｌに大豆リゾレシチン（ＬＰＣ７０）１０ｇを添加して分散溶解した。この溶液にホスホリパーゼＤ（名糖産業社製；アクチノマジューラ由来）４００ｍｇを少量の精製水に分散した後に添加し、４０℃で１６時間攪拌した。反応後１００ｍｌのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を３０００回転、５分間遠心分離を行って５０ｍｌの精製水に溶解した。これに５０ｍｌのエチルアルコールを添加して生じた沈殿物を３０００回転、５分間遠心分離を行って回収し３５ｍｌの精製水に溶解後凍結乾燥して４．０ｇの粉末を得た。【００２９】
実施例３
１Ｍクエン酸ナトリウム・クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）１００ｍｌに１０ｇのホワイトリゾ（辻製油社製）を溶解させ、アクチノマジューラ由来ホスホリパーゼＤ（名糖産業社製）２００ｍｇを添加して４０℃で１６時間酵素反応を行った。反応液に１００ｍｌの９９％エタノールを添加して攪拌を行った後、室温に１時間静置し下層部を分液除去して上層液１３５ｍｌを得た。この上層液を回収してロータリーエバポレーターで減圧濃縮を行いエタノールを除去した後４０ｍｌの精製水に溶解後凍結乾燥を行い環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末５．２ｇを得た。【００３０】
実施例４
１Ｍクエン酸ナトリウム・クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）１００ｍｌに１０ｇの辻製油社製大豆リゾレシチン（ＬＰＣ７０）を溶解させ、アクチノマジューラ由来ホスホリパーゼＤ（名糖産業社製）２００ｍｇを添加して４０℃で１６時間酵素反応を行った。反応液に１００ｍｌの９９％エタノールを添加して攪拌を行った後、室温に１時間静置し下層部を分液除去して上層液１３５ｍｌを得た。この上層液を回収してロータリーエバポレーターで減圧濃縮を行いエタノールを除去した後４０ｍｌの精製水に溶解後凍結乾燥を行い環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末４．５ｇを得た。【００３１】
＜薄層クロマトグラフィーによる環状リゾホスファチジン酸ナトリウムの検出＞
実施例１、実施例３および実施例４で得られた環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを含有する粉末１０ｍｇを秤量し１ｍｌのクロロホルム：メタノール：水（６０：３０：５、Ｖ／Ｖ）に溶解した。得られた溶液をメルク社シリカゲル薄層プレートに５マイクロリットルをスポットして、クロロホルム：メタノール：酢酸：水（６０：３０：３：５、Ｖ／Ｖ）の混合溶媒で展開した。その後、プレートを乾燥し、３％酢酸銅を含有する８％リン酸、２％硫酸溶液を噴霧して１５０℃で３分間加温して環状リゾホスファチジン酸ナトリウムのスポットを確認した。特許第５９３３３８号記載の方法で調製した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムを対照にした。【００３２】
結果を図１及び図２に示す。【００３３】
図１のＡは、特許第５９３３３８号記載の方法で調製した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムの結果を示し、図１のＢは、実施例１で調製した試料の結果を示す。
図１に示したように実施例１で得た環状リゾホスファチジン酸ナトリウムは、対照の特許第５９３３３８号記載の方法で調製した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムとＲｆ値が同一であった。【００３４】
図２のＡは、特許第５９３３３８号記載の方法で調製した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムの結果を示し、図２のＢは、実施例４に示した方法で調製した試料の結果を示す。図２のＣは、実施例３に示した方法で調製した方法で調製した試料の結果を示す。図２に示したように実施例３及び４で得た環状リゾホスファチジン酸ナトリウムは、対照の特許第５９３３３８号記載の方法で調製した環状リゾホスファチジン酸ナトリウムとＲｆ値が同一であった。
【図１】
2019117187.tif 000002
【図２】
2019117187.tif 000003
【国際調査報告】
2019117187.tif 000004
2019117187.tif 000005
2019117187.tif 000006