(57)【要約】  蛍光光子を検知する光学系システムの小型化を図る。励起光源（５０）の照射動作のタイミングを基準として、光子検知部（２１）の光子検知動作を制御し、マイクロ流路（１０）に照射された励起光の消光後に、マイクロ流路（１０）中を流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知する。
2019026413.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォトダイオードを含む光子検知部が内蔵された集積回路チップと、
上記集積回路チップの表面側に形成されたマイクロ流路と、
上記マイクロ流路に励起光を照射する励起光源と、
上記光子検知部の光子検知動作、および上記励起光源の照射動作を同期的に制御する制御回路と、を備え、
上記制御回路は、上記励起光源の照射動作のタイミングを基準として、上記光子検知部の光子検知動作を制御し、
上記光子検知部は、上記マイクロ流路に照射された励起光の消光後に、上記マイクロ流路中を流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知する
ことを特徴とする液体中微粒子分析システム。
【請求項２】
上記マイクロ流路に沿って少なくとも二つの上記光子検知部が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の液体中微粒子分析システム。
【請求項３】
少なくとも二つの上記マイクロ流路を備え、上記マイクロ流路のそれぞれに上記光子検知部が備えられていることを特徴とする請求項１または２に記載の液体中微粒子分析システム。
【請求項４】
上記励起光源は、それぞれ波長の異なる複数のレーザー光源を備え、照射動作を行う上記レーザー光源を切り替えることで波長を替えてパルス発光を行うことを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載の液体中微粒子分析システム。
【請求項５】
上記励起光源の照射動作のタイミングを基準として、上記光子検知部が光子を検知したタイミングを計測するＴＤＣ回路と、
上記ＴＤＣ回路の計測結果に応じて、上記光子検知部が検知した光子の蛍光寿命を計算する蛍光寿命計算部と、を備えた
ことを特徴とする請求項１から４の何れか１項に記載の液体中微粒子分析システム。
【請求項６】
請求項１に記載の液体中微粒子分析システムを用いて液体中の微粒子を分析する液体中微粒子分析方法において、
励起光を照射し、上記励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作を周期的に繰り返して行い、上記マイクロ流路中を流れる単一対象物が、上記光子検知部を通過するに要する時間内に行われた上記光子検知動作の結果を合算することで、上記単一対象物からの蛍光光子を検知することを特徴とする液体中微粒子分析方法。
【請求項７】
請求項２に記載の液体中微粒子分析システムを用いて液体中の微粒子を分析する液体中微粒子分析方法において、
励起光を照射し、上記励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作を周期的に繰り返して行い、上記マイクロ流路中を流れる単一対象物が、複数の上記光子検知部を順次通過するに要する時間内に行われたそれぞれの上記光子検知動作の結果を合算することで、上記単一対象物からの蛍光光子を検知することを特徴とする液体中微粒子分析方法。
【請求項８】
請求項３に記載の液体中微粒子分析システムを用いて液体中の微粒子を分析する液体中微粒子分析方法において
複数の上記マイクロ流路のそれぞれに設けられた上記光子検知部は、同時並行的に動作し、それぞれの流路を流れる対象物からの蛍光光子を検知することを特徴とする液体中微粒子分析方法。
【請求項９】
請求項４に記載の液体中微粒子分析システムを用いて液体中の微粒子を分析する液体中微粒子分析方法において、
複数の波長の上記レーザー光源のそれぞれにより照射された励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作における検知結果を、上記レーザー光源の波長毎に合算することで、励起波長と蛍光強度との関係を推定し、あるいはさらに蛍光分子の種別の推定を行うことを特徴とする液体中微粒子分析方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の液体中微粒子分析システムを用いて液体中の微粒子を分析する液体中微粒子分析方法において、
上記励起光源により照射された励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作を繰り返し、各光子検知動作において得られた光子検知タイミングの分布情報から蛍光分子の蛍光寿命を推定し、あるいは、さらに蛍光分子の種別の推定を行うことを特徴とする液体中微粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体中の微粒子を光学的に分析するための液体中微粒子分析システム及び液体中微粒子分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、微小な生体または非生体の粒子を含む液体を流路に流し、流体中の微粒子を光学的に分析するフローサイトメータが知られている。これらのフローサイトメータでは、流体にレーザー光源から励起光を照射し、励起光の照射によって分析対象の微粒子から発生した散乱光および蛍光を検出することで、対象の微粒子の分析を行っている（例えば、特許文献１参照）。【０００３】
ところで、これらのフローサイトメータでは、分析対象に照射する励起光の波長と、励起光の照射によって分析対象の微粒子から発生した蛍光の波長と、が異なることを利用して、光学的なフィルタにより両者を分離して、蛍光のみを検知している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１８１３４９号公報（２０１０年８月１９日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、光学的なフィルタにより励起光と蛍光とを分離し、光検出器で検出する従来の技術では、光学系が大きく複雑になるという問題があった。【０００６】
本発明の一態様は、上記従来の問題点を鑑みてなされたものであって、蛍光光子を検知する光学系システムの小型化を図ることができる液体中微粒子分析システムおよび分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る液体中微粒子分析システムは、フォトダイオードを含む光子検知部が内蔵された集積回路チップと、上記集積回路チップの表面側に形成されたマイクロ流路と、上記マイクロ流路に励起光を照射する励起光源と、上記光子検知部の光子検知動作、および上記励起光源の照射動作を同期的に制御する制御回路と、を備え、上記制御回路は、上記励起光源の照射動作のタイミングを基準として、上記光子検知部の光子検知動作を制御し、上記マイクロ流路に照射した励起光の消光後に、上記マイクロ流路中を流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知する構成である。【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る液体中微粒子分析方法は、上記の液体中微粒子分析システムを用いて液体中の微粒子を分析する液体中微粒子分析方法において、励起光を照射し、上記励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作を周期的に繰り返して行い、上記マイクロ流路中を流れる単一対象物が、上記光子検知部を通過するに要する時間内に行われた上記光子検知動作の結果を合算することで、上記単一対象物からの蛍光光子を検知する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の一態様によれば、蛍光光子を検知する光学系システムの小型化を図ることができる効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施形態１に係る液体中微粒子分析システム１０１の概略構成を示す模式図である。
【図２】集積回路チップ１２１の概略構成を示す模式図である。
【図３】励起光源５０の照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、の制御のタイミングを示すタイミングチャートである。
【図４】１０ｕｓｅｃの光子検知動作を１０００回繰り返した時の蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【図５】実施形態２に係る液体中微粒子分析システム１０２の概略構成を示す模式図である。
【図６】集積回路チップ１２２の概略構成を示す模式図である。
【図７】光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃから出力される蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【図８】実施形態３に係る液体中微粒子分析システム１０３の概略構成を示す模式図である。
【図９】集積回路チップ１２３の概略構成を示す模式図である。
【図１０】光子検知部２１Ａ，２１Ｂから出力される蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【図１１】実施形態４に係る液体中微粒子分析システム１０４の概略構成を示す模式図である。
【図１２】（ａ），（ｂ）は、蛍光分子ＦＭ１と、蛍光分子ＦＭ２との、レーザー光源５０Ａおよびレーザー光源５０Ｂの波長に対する励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図である。
【図１３】（ａ），（ｂ）は、レーザー光源５０Ａおよびレーザー光源５０Ｂの照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、の制御のタイミングを示すタイミングチャートである。
【図１４】実施形態５に係る液体中微粒子分析システム１０５の概略構成を示す模式図である。
【図１５】集積回路チップ１２５の概略構成を示す模式図である。
【図１６】励起光源５０の照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、受光回路２２の蛍光光子検知パルスの出力のタイミングを示すタイミングチャートである。
【図１７】蛍光光子検知パルスの発生数を示すヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔実施形態１〕
以下、本発明の実施形態１について、詳細に説明する。
【００１２】
〔液体中微粒子分析システム１０１の構成〕
図１は、本発明の実施形態１に係る液体中微粒子分析システム１０１の概略構成を示す模式図であり、液体中微粒子分析システム１０１を側面側から示す図である。図２は、集積回路チップ１２１の概略構成を模式的に示す図であり、集積回路チップ１２１を上面側から視た平面図である。
【００１３】
図１、および図２に示すように、液体中微粒子分析システム１０１は、制御回路３０と、集積回路チップ１２１と、光源駆動回路４０と、を備えている。制御回路３０は、液体中微粒子分析システム１０１の各部を統括的に制御する機能を備えている演算装置である。制御回路３０は、例えば１つ以上のプロセッサ（例えばＣＰＵなど）が、１つ以上のメモリ（例えばＲＡＭやＲＯＭなど）に記憶されているプログラムを実行することで液体中微粒子分析システム１０１の各構成要素を制御する。
【００１４】
集積回路チップ１２１は、マイクロ流路１０と、光子検知部２１と、を備えている。集積回路チップ１２１は、液体を流す流体回路部であるマイクロ流路１０と、電子回路部である光子検知部２１とが、ＣＭＯＳ等のシリコンを用いた半導体集積回路に内蔵されている構成であってもよい。例えば、集積回路チップ１２１は、所謂ＭＥＭＳ技術を用いてマイクロ流路１０と、光子検知部２１とが、一体に形成されている構成とすることができる。
【００１５】
また、集積回路チップ１２１は、マイクロ流路１０と、光子検知部２１とが重畳され一体化されている構成であってもよい。例えば、集積回路チップ１２１は、ガラス基板およびシリコン樹脂等の光透過性部材に形成された微小流路であるマイクロ流路１０が、光子検知部２１が内蔵されたシリコン集積回路上に載置されている構成とすることができる。
【００１６】
集積回路チップ１２１は、後述する励起光源５０に対向する表面側にマイクロ流路１０を備え、マイクロ流路１０の下層に光子検知部２１が設けられている。マイクロ流路１０には、注入孔１１と、排出孔１２と、が設けられている。マイクロ流路１０は、注入孔１１から排出孔１２に向かって流れる微粒子を含む液体の流路として用いられる。
【００１７】
光子検知部２１は、フォトダイオード２３と、受光回路２２と、有している。フォトダイオード２３は、例えば、シングル・フォトン・アバランシェ・ダイオード（ＳＰＡＤ）を用いて構成されていてもよい。受光回路２２は、制御回路３０から供給される制御信号に応じて、フォトダイオード２３を制御し、フォトダイオード２３の出力信号を処理する。
【００１８】
光子検知部２１は、フォトダイオード２３に光子が入射することにより発生した電気信号を受光回路２２により増幅して、受光回路２２から蛍光光子検知パルスを発生させる受光動作を行う。また、光子検知部２１は、受光回路２２により発生した蛍光光子検知パルスの数を計測する機能を有している。なお、光子検知部２１は、液体中微粒子分析システム１０１における光学システムである。
【００１９】
光源駆動回路４０は、制御回路３０から供給される制御信号に応じて、励起光源５０の励起源の発光駆動を制御して、励起光源５０の励起光を照射対象に照射する照射動作を行う。励起光源５０には、例えば気体レーザーおよび半導体レーザー等のレーザー光源を用いることが出来る。なお、図１では、制御回路３０、および光源駆動回路４０は、集積回路チップ１２１とは別体である例を示しているが、制御回路３０、および光源駆動回路４０は、集積回路チップ１２１の中に形成されている構成であってもよい。
【００２０】
液体中微粒子分析システム１０１では、マイクロ流路１０内に液体を流すとともに、光源駆動回路４０により励起光源５０の励起源をパルス発光させ、励起光を照射する。励起光源５０の照射範囲では、励起光源５０からの励起光の照射により、マイクロ流路１０内の液体中の蛍光分子ＦＭが励起する。光子検知部２１は、蛍光分子ＦＭが励起したことにより発生した蛍光光子を検知する光子検知動作を行う。
【００２１】
光源駆動回路４０による励起光源５０の照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作とは、制御回路３０によって同期的に制御される。図３は、制御回路３０の制御に基づく励起光源５０の照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、の制御のタイミングを示すタイミングチャートである。
【００２２】
〔液体中微粒子分析システム１０１による液体中微粒子分析方法〕
図３に示すように、光源駆動回路４０は、制御回路３０の制御に応じた駆動パルス信号により、励起光源５０の励起源を、発光と消灯とを繰り返すパルス発光させる。制御回路３０は、光源駆動回路４０が励起光源５０の励起源を発光させる駆動パルス信号を出している照射動作期間中は、光子検知部２１の受光動作を停止する。励起光源５０の照射範囲では、励起光源５０からの励起光が照射されることにより、マイクロ流路１０中の蛍光分子ＦＭが励起し蛍光光子が発生する。
【００２３】
光源駆動回路４０から励起光源５０に入力される駆動パルス信号が立ち下がると、励起光源５０の励起源が消光する。その後、制御回路３０は、光子検知部２１の受光動作を開始する。
【００２４】
光子検知部２１の受光動作期間中にフォトダイオード２３に蛍光光子が入射すると電気信号が発生し、受光回路２２により増幅されて蛍光光子検知パルスが発生する。なお、励起光源５０からの励起光により励起された蛍光分子ＦＭは、励起光源５０の励起源の消光後も減衰しながら蛍光光子を発生する。これにより、光子検知部２１は、励起光源５０の励起源の消光後の受光動作期間中に、蛍光光子を検知することができる。なお、励起光源５０の発光中は、励起光源５０の励起光による光子がフォトダイオード２３に入射する。しかしながら、本実施形態では、励起光源５０の励起源の発光中は、光子検知部２１の受光動作を停止するため、励起光源５０の励起源の発光によって光子検知部２１の光子検知に影響が生じることがない。
【００２５】
制御回路３０は、このように、一回の駆動パルス周期Ｔにおいて、駆動パルス信号によって励起光源５０の励起源を発光させ照射動作を行い、励起源の消光後に光子検知部２１による光子検知動作を行う。そして、制御回路３０は、この駆動パルス周期Ｔを駆動パルス周期Ｔ１，Ｔ２，Ｔ３，・・・と周期的に繰り返して行う。駆動パルス周期Ｔにおける、励起光源５０の照射動作と、光子検知部２１による光子検知動作との具体的なタイミングは、例えば、励起光源５０の駆動パルスが５００ｐｓの幅を持ち、一回の駆動パルス周期が１０ｎｓｅｃであるとすることができる。励起光源５０の駆動パルスが立ち上がってから１ｎｓ後に受光回路２２が受光動作を開始し、励起光源５０の駆動パルスが立ち上がってから９ｎｓｅｃ  後に受光動作が終了する。
【００２６】
図４は、マイクロ流路１０中を流れる単一対象物（例えば細胞Ｘ２）が、光子検知部２１を通過するに要する時間内に１０ｎｓｅｃの光子検知動作を１０００回繰り返した時の蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。１０ｎｓｅｃの光子検知動作を１０００回繰り返すと１０ｕｓｅｃかかるので、１０ｕｓｅｃ毎に蛍光光子検知パルス数をプロットしたことになる。
【００２７】
例えば、蛍光分子ＦＭが微弱であり、励起光源５０からの励起光により蛍光分子ＦＭが励起して発生した蛍光光子の個数が少なければ、一回の駆動パルス周期Ｔで受光回路２２から蛍光光子検知パルスが発生するとは限らない。しかしながら、本実施形態では、マイクロ流路１０中を流れる単一対象物が、光子検知部２１を通過するに要する時間内に駆動パルス周期Ｔを周期的に繰り返して、フォトダイオード２３に入射した蛍光光子より引き起こされた受光回路２２の蛍光光子検知パルスの数を計測するため、蛍光分子ＦＭが微弱であっても、光子を検知することが出来る。
【００２８】
〔付記事項〕
本実施形態１によれば、液体中微粒子分析システム１０１は、フォトダイオード２３を含む光子検知部２１が内蔵された集積回路チップ１２１と、集積回路チップ１２１の表面側に設けられたマイクロ流路１０と、マイクロ流路１０に励起光を照射する励起光源５０と、光子検知部２１の検知動作、および励起光源５０の照射動作を同期的に制御する制御回路３０と、を備えている。制御回路３０は、励起光源５０の照射動作のタイミングを基準として、光子検知部２１の光子検知動作を制御する。光子検知部２１は、マイクロ流路１０に照射された励起光の消光後に、マイクロ流路１０中を流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知する。
【００２９】
これらの構成によれば、光子検知部２１の検知動作、および励起光源５０の照射動作を制御することにより、マイクロ流路１０に照射した励起光の消光後に、マイクロ流路１０中を流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知する。これによって、光学的なフィルタにより励起光源５０からの励起光と、当該励起光によって励起した蛍光分子ＦＭから発生した蛍光光子とを分離する必要がなく、光学系システムの小型化を図ることができる。
【００３０】
また、実施形態１の液体中微粒子分析システム１０１を用いて液体中の微粒子を分析する液体中微粒子分析方法によれば、励起光を照射し、励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作を周期的に繰り返して行い、マイクロ流路１０中を流れる単一対象物が、光子検知部２１を通過するに要する時間内に行われた光子検知動作の結果を合算することで、上記単一対象物からの蛍光光子を検知する。
【００３１】
この構成によれば、蛍光分子ＦＭが微弱であっても、光子を検知することが出来る。
【００３２】
〔実施形態２〕
本発明の実施形態２について、図５〜図７に基づいて説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、上述の実施形態１にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００３３】
〔液体中微粒子分析システム１０２の構成〕
図５は、実施形態２に係る液体中微粒子分析システム１０２の概略構成を示す模式図であり、液体中微粒子分析システム１０２を側面側から示す図である。図６は、集積回路チップ１２２を上面側から視た平面図である。
【００３４】
上述の実施形態１では、集積回路チップ１２１は、マイクロ流路１０の下方に１つの光子検知部２１を備えていた。実施形態１と、実施形態２との違いは、図５および図６に示すように、実施形態２では、集積回路チップ１２２は、マイクロ流路１０の流れ方向に沿って少なくとも二つの光子検知部２１が設けられていることである。図５および図６では、集積回路チップ１２１に３個の光子検知部２１（２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃ）がマイクロ流路１０に沿って設けられている例を図示しているが、光子検知部２１の数は少なくとも二つであればよく、３個に限定されるものではない。なお、光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃを合わせて、液体中微粒子分析システム１０２の光学システムを構成している。
【００３５】
また、液体中微粒子分析システム１０２では、励起光源５０からの励起光パルス５５の照射範囲が、全ての光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃのフォトダイオード２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃの受光部を含むように調整されている。マイクロ流路１０内を流れる液体中の微粒子は、液体の流れに沿って、フォトダイオード２３Ａ、フォトダイオード２３Ｂ、フォトダイオード２３Ｃの上を順に通過する。マイクロ流路１０内を流れる液体中に蛍光分子ＦＭを持つ細胞Ｘ１，Ｘ２等の微粒子が含まれている場合には、フォトダイオード２３Ａ，２３Ｂ，２３Ｃの上を通過する際に、光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃにおいて順に蛍光分子ＦＭが検知される。
【００３６】
〔液体中微粒子分析システム１０２による液体中微粒子分析方法〕
図７は、蛍光分子ＦＭを持つ二つの細胞Ｘ１，Ｘ２がマイクロ流路１０内の流れた時に想定される、光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃからの出力の例を示している。この図７では、上述の図４と同様に、１０００回の光子検知動作ごとの蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【００３７】
例えば、マイクロ流路１０中を流れる単一対象物である細胞Ｘ２の蛍光分子ＦＭが、励起光源５０の励起光によって励起されて発生した蛍光光子を検知したことによって発生する蛍光光子検知パルスは、図７に示すように、光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃを順次通過するに要する時間に応じて、それぞれ異なる時間に観測される。光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃのそれぞれで検出された蛍光光子検知パルスは、同じ細胞Ｘ２の蛍光分子ＦＭから観測されたものである。このように、光子検知部２１が１つの場合には、１回しか観測されないものを、光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃのそれぞれで計３回観測したこととなる。そして、マイクロ流路１０中を流れる細胞Ｘ２が、光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃを順次通過するに要する時間内に行われた光子検知動作の結果は、合算される。
【００３８】
例えば、蛍光分子ＦＭが微弱であれば、蛍光光子検知パルス数は少なくなり、一回の観測では十分なＳＮ(signal to noise)比が取れない場合がある。この実施形態２では、光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃのそれぞれで蛍光光子検知パルスを観測することで、複数回の観測による蛍光光子検知パルス数を合算することができ、ＳＮ比を向上させることが可能である。
【００３９】
〔付記事項〕
本実施形態２によれば、マイクロ流路１０に沿って少なくとも二つの光子検知部２１（２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃ）が設けられている。
【００４０】
この構成によれば、複数回の観測による蛍光光子検知パルス数を合算することができ、蛍光分子ＦＭが微弱で蛍光光子検知パルス数は少ない場合であっても、ＳＮ比を向上させて、マイクロ流路１０中を流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知することができる。よって、対象物の流れる方向に並んだ少なくとも二つの光子検知部２１により、計測時間を増やすことができ、感度の向上を図ることができる。
【００４１】
〔実施形態３〕
本発明の実施形態３について、図８〜図１０に基づいて説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、上述の実施形態１にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００４２】
〔液体中微粒子分析システム１０３の構成〕
図８は、実施形態３に係る液体中微粒子分析システム１０３の概略構成を示す模式図であり、液体中微粒子分析システム１０３を側面側から示す図である。図９は、集積回路チップ１２３を上面側から視た平面図である。
【００４３】
上述の実施形態１では、集積回路チップ１２１は、一本のマイクロ流路１０と、マイクロ流路１０の下方に設けられた１つの光子検知部２１を備えていた。実施形態１と、実施形態３との違いは、図８および図９に示すように、実施形態３では、集積回路チップ１２３は、少なくとも二つのマイクロ流路１０（１０Ａ，１０Ｂ）を含んでいる。なお、図８および図９では、集積回路チップ１２３に、互いに略平行に設けられた二つのマイクロ流路１０Ａ，１０Ｂが設けられている例を図示しているが、マイクロ流路１０の数は、少なくとも二つであれば良く、３つや４つ等であってもよい。
【００４４】
また、集積回路チップ１２３は、各マイクロ流路１０Ａ，１０Ｂの下方に少なくとも１つの光子検知部２１Ａ，２１Ｂを備えている。また、液体中微粒子分析システム１０３では、励起光源５０からの励起光パルス５５の照射範囲が、全ての光子検知部２１Ａ，２１Ｂのフォトダイオード２３Ａ，２３Ｂの受光部を含むように調整されている。なお、光子検知部２１Ａ，２１Ｂを合わせて、液体中微粒子分析システム１０３の光学システムを構成している。
【００４５】
〔液体中微粒子分析システム１０３による液体中微粒子分析方法〕
各マイクロ流路１０Ａ，１０Ｂ内を流れる液体中の微粒子は、液体の流れに沿って、それぞれの流路の下方にある光子検知部２１Ａ，２１Ｂにより独立して観測される。図１０は、蛍光分子ＦＭを持つ細胞Ｘがマイクロ流路１０Ａ，１０Ｂ内をそれぞれ流れた時に想定される、光子検知部２１Ａ，２１Ｂからの出力の例を示している。この図１０は、上述の図４と同様に、１０００回の光子検知動作ごとの蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【００４６】
図９および図１０に示すように、マイクロ流路１０Ａ内を流れる液体中に蛍光分子ＦＭを持つ細胞Ｘ等の微粒子が含まれている場合には、フォトダイオード２３Ａ上を通過する際に、光子検知部２１Ａにおいて蛍光分子ＦＭが検知される。また、マイクロ流路１０Ｂ内を流れる液体中に蛍光分子ＦＭを持つ細胞Ｘ等の微粒子が含まれている場合には、フォトダイオード２３Ｂ上を通過する際に、光子検知部２１Ｂにおいて蛍光分子ＦＭが検知される。
【００４７】
このように、複数のマイクロ流路１０Ａ，１０Ｂのそれぞれに設けられた光子検知部２１Ａ，２１Ｂは、同時並行的に動作し、それぞれの流路を流れる対象物からの蛍光光子を検知する。これにより、各マイクロ流路１０Ａ，１０Ｂを流れる細胞Ｘの蛍光分子ＦＭが励起して発生した蛍光光子は、それぞれの流路の下部にある光子検知部２１Ａ，２１Ｂにより独立して観測される。よって、複数のマイクロ流路１０Ａ，１０Ｂのそれぞれを流れる液体中の微粒子の分析を同時並行して行うことが可能になり、分析のスループットを向上させることができる。
【００４８】
〔付記事項〕
本実施形態３によれば、少なくとも二つのマイクロ流路１０（１０Ａ，１０Ｂ）を備え、マイクロ流路１０のそれぞれに光子検知部２１（２１Ａ，２１Ｂ）が備えられている。
【００４９】
この構成によれば、少なくとも二つのマイクロ流路１０Ａ，１０Ｂのそれぞれを流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知することができ、複数流路で同時並行的に分析を行って、分析のスループットを向上させることができる。よって、複数の流路を流れる流体中の微粒子を同時並行的に計測しようとする場合であっても、レーザー光を高速走査したり、光検出器をアレー化したり、あるいは、流体システムをステッピングして位置を変えながら計測を繰り返したりする必要がなく、装置のさらなる複雑化、および大型化を防ぐことが出来る。また、少なくとも二つのマイクロ流路１０のそれぞれに対象物を流すことで、液体中の微粒子分析処理を並列的に行うことができ、スループットの増大を図ることが出来る。
【００５０】
〔実施形態４〕
本発明の実施形態４について、図１１〜図１３に基づいて説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００５１】
〔液体中微粒子分析システム１０４の構成〕
図１１は、実施形態４に係る液体中微粒子分析システム１０４の概略構成を示す模式図であり、液体中微粒子分析システム１０４を側面側から示す図である。
【００５２】
上述の実施形態１では、１つの励起光源５０からの励起光パルス５５を、マイクロ流路１０内を流れる液体に照射する構成であった。実施形態１と、この実施形態４との違いは、図１１に示すように、実施形態４では、励起光源５０として、波長の違う二つのレーザー光源５０Ａ，５０Ｂが備えられていることである。
【００５３】
蛍光をマーカーとして微粒子を分析する場合、異なるターゲットを識別するために、複数のマーカーを使うことが必要になることがある。例えば、蛍光分子ＦＭ１としてＦＩＴＣを使い、蛍光分子ＦＭ２としてＤＡＰＩを使う場合がある。図１２（ａ），（ｂ）は、それぞれの蛍光分子ＦＭ１（ＦＩＴＣ）と、蛍光分子ＦＭ２（ＤＡＰＩ）との、レーザー光源５０Ａおよびレーザー光源５０Ｂの波長に対する励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを示している。レーザー光源５０Ａの励起光の波長は４８８ｎｍ、レーザー光源５０Ｂの励起光の波長は３７５ｎｍに設定されている。この構成において、図１２（ａ），（ｂ）に示すように、レーザー光源５０Ａの励起光は蛍光分子ＦＭ１を励起するが、蛍光分子ＦＭ２を励起しない。また、レーザー光源５０Ｂの励起光は蛍光分子ＦＭ２を励起するが、蛍光分子ＦＭ１を励起しない。
【００５４】
〔液体中微粒子分析システム１０４による液体中微粒子分析方法〕
図１３は、レーザー光源５０Ａ、および、レーザー光源５０Ｂのそれぞれの励起光の照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、の制御のタイミングを示すタイミングチャートである。
【００５５】
図１３（ａ）は、レーザー光源５０Ａと、レーザー光源５０Ｂと、を交互に駆動するように制御する場合のタイミングを示すタイミングチャートである。この図１３（ａ）に示した制御タイミングでは、レーザー光源５０Ａの励起源を発光させた後の、光子検知部２１の受光動作（図１３のＴ１，Ｔ３，Ｔ５，Ｔ７の期間）により蛍光分子ＦＭ１による蛍光光子を検知する。また、レーザー光源５０Ｂを発光させた後の、光子検知部２１の受光動作（図１３のＴ２，Ｔ４，Ｔ６の期間）により蛍光分子ＦＭ２による蛍光光子を検知する。
【００５６】
また、図１３（ｂ）に示すように、レーザー光源５０Ａを複数回駆動した後に、レーザー光源５０Ｂを複数回駆動させるといったレーザー光源５０Ａ，５０Ｂの駆動パターンで励起光を照射する照射動作を制御してもよい。この図１３（ｂ）に示した制御タイミングでは、レーザー光源５０Ａの励起源を発光させた後の光子検知部２１受光動作（図１３のＴ１，Ｔ２，Ｔ３，Ｔ７の期間）により蛍光分子ＦＭ１による蛍光光子を検知する。また、レーザー光源５０Ｂを発光させた後の光子検知部２１の受光動作（図１３のＴ４，Ｔ５，Ｔ６の期間）により蛍光分子ＦＭ２による蛍光光子を検知する。
【００５７】
このように、液体中微粒子分析システム１０４では、複数の波長のレーザー光源５０Ａ，５０Ｂのそれぞれにより照射された励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作における検知結果を、レーザー光源５０Ａ，５０Ｂの波長毎に合算することで、励起波長と蛍光強度との関係を推定し、あるいはさらに蛍光分子の種別の推定を行う。
【００５８】
これらの構成によれば、光学的なフィルタによって、蛍光分子ＦＭ１から発生した蛍光光子と、蛍光分子ＦＭ２から発生した蛍光光子とを分離する必要がなく、光学系システムを大型化することなく、複数の蛍光マーカーを用いて異なるターゲットを識別することができる。
【００５９】
〔付記事項〕
本実施形態４によれば、励起光源５０は、それぞれ波長の異なる複数のレーザー光源５０Ａ，５０Ｂを備え、照射動作を行うレーザー光源５０Ａ，５０Ｂを切り替えることで波長を替えてパルス発光を行う。
【００６０】
この構成によれば、異なるターゲットを識別するために、励起スペクトルの異なる複数の蛍光マーカーを用いるとともに、照射タイミングずらして波長の異なるレーザー光源５０Ａ，５０Ｂから励起光を照射することが出来る。よって、光学系システムを、大型化および複雑化することなく、対象物から生じる蛍光スペクトルの異なる複数の蛍光光子を検知することができる。
【００６１】
〔実施形態５〕
本発明の実施形態５について、図１４〜図１７に基づいて説明すれば、以下のとおりである。なお、説明の便宜上、前記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を省略する。
【００６２】
〔液体中微粒子分析システム１０５の構成〕
図１４は、実施形態５に係る液体中微粒子分析システム１０５の概略構成を示す模式図であり、液体中微粒子分析システム１０５を側面側から示す図である。図１５は、集積回路チップ１２５を上面側から視た平面図である。
【００６３】
上述の実施形態１と、実施形態５との違いは、図１４および図１５に示すように、実施形態５は、集積回路チップ１２５の内部に、ＴＤＣ(ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ)回路６１および蛍光寿命計算部６２が組み込まれていることである。ＴＤＣ回路６１は、受光回路２２から蛍光光子を検知した時に出力される蛍光光子検知パルスを受けて、励起光源５０の駆動パルスの立ち上がりから、蛍光光子検知パルスの出力までに要した時間をデジタル値に変換して出力する。なお、光子検知部２１と、ＴＤＣ回路６１と、蛍光寿命計算部６２とを合わせて、液体中微粒子分析システム１０５の光学システムが構成されている。
【００６４】
〔液体中微粒子分析システム１０５による液体中微粒子分析方法〕
図１６は、励起光源５０の励起光の照射動作（駆動パルス）と、光子検知部２１の光子検知動作と、受光回路２２の蛍光光子検知パルスの出力のタイミングを例示すタイミングチャートである。
【００６５】
図１６に基づいて、ＴＤＣ回路６１の動作を説明する。この例では、光子検知動作周期のＴ２，Ｔ３，Ｔ４，Ｔ６，Ｔ７において受光回路２２が、蛍光光子検知パルスを出力している。例えばＴ２においては、ＴＤＣ回路６１はこの蛍光光子検知パルスを受けて、励起光源５０の駆動パルスの立ち上がりのタイミングから蛍光光子検知パルスの発生タイミングまでの時間ｔ２をデジタル値として出力する。このようにして、受光回路２２から出力される蛍光光子検知パルスはそれぞれ、そのパルスが発生した周期の、励起光源５０の駆動パルスの立ち上がりタイミングからの遅延時間が測定される。
【００６６】
蛍光寿命計算部６２は、ＴＤＣ回路６１から出力される、蛍光光子検知パルス毎の発生時間に関する情報（励起光源５０の駆動パルスの立ち上がりタイミングから蛍光光子検知パルスの発生タイミングまでの時間を計測した結果）を取得する。そして、蛍光光子検知パルス毎の発生時間に関する情報を幾つかのビン（小区間）に分け、図１７に示すように、ビン毎のパルス発生数の分布情報を示すヒストグラムを作る。蛍光寿命計算部６２は、このヒストグラムの減衰特性から、蛍光寿命τを推定する。
【００６７】
例えば、所定ターゲットを識別するために、予め蛍光寿命の判っている複数の蛍光マーカー（蛍光分子ＦＭ）を用いた場合に、ＴＤＣ回路６１と蛍光寿命計算部６２との共同により得られた蛍光寿命τに基づいて蛍光光子を検知することが出来る。蛍光寿命３ｎｓｅｃ  の蛍光分子ＦＭ１と、１５ｎｃｅｃの蛍光分子ＦＭ２を使った場合、受光回路２２から出力される蛍光光子検知パルスに基づいて計算した蛍光寿命τに基づいて、どちらの蛍光分子からの蛍光光子であるかを判定することができる。
【００６８】
このように、液体中微粒子分析システム１０５では、励起光源５０により照射された励起光の消光後に生ずる蛍光の光子を検知する光子検知動作を繰り返し、各光子検知動作において得られた光子検知タイミングの分布情報から蛍光分子の蛍光寿命を推定し、あるいは、さらに蛍光分子の種別の推定を行う。これにより、受光回路２２から出力される蛍光光子検知パルスに基づいて計算した蛍光寿命τに基づいて蛍光光子を検知することができるため、光学的なフィルタにより励起光源５０の励起光によって発生した蛍光光子と、励起光源５０の励起光によって励起された蛍光分子ＦＭから発生した蛍光光子とを分離する必要がなく、光学系システムの小型化を図ることができる。また、異なるターゲットを識別するために、複数の蛍光マーカーを用いた場合であっても、各蛍光光子を光学的なフィルタにより分離する必要がなく、光学系システムを、型化および複雑化することなく、対象物から生じる複数の蛍光光子を蛍光寿命τに基づいて検知することができる。
【００６９】
〔付記事項〕
本実施形態５によれば、励起光源５０の照射動作のタイミングを基準として、光子検知部２１が光子を検知したタイミングを計測するＴＤＣ回路と、ＴＤＣ回路の計測結果に応じて、光子検知部２１が検知した光子の蛍光寿命を計算する蛍光寿命計算部６２と、を備えた。
【００７０】
この構成よれば、所定のターゲットを識別するために用いた蛍光分子ＦＭから発生する蛍光光子を蛍光寿命τに基づいて検知することができるため、光学的なフィルタを用いる必要がなく、光学系システムの小型化を図ることができる。
【００７１】
〔まとめ〕
本発明の態様１に係る液体中微粒子分析システム１０１は、フォトダイオード２３を含む光子検知部２１が内蔵された集積回路チップ１２１と、上記集積回路チップ１２１の表面側に形成されたマイクロ流路１０と、上記マイクロ流路１０に励起光を照射する励起光源５０と、上記光子検知部２１の光子検知動作、および上記励起光源５０の照射動作を同期的に制御する制御回路３０と、を備え、上記制御回路３０は、上記励起光源５０の照射動作のタイミングを基準として、上記光子検知部２１の光子検知動作を制御し、上記光子検知部２１は、上記マイクロ流路１０に照射された励起光の消光後に、上記マイクロ流路１０中を流れている対象物から生じる蛍光の光子を検知する構成である。
【００７２】
上記の構成によれば、光学的なフィルタにより励起光源５０からの励起光と、当該励起光によって励起した対象物から生じる蛍光の光子と、を分離する必要がなく、光学系システムの小型化を図ることができる。
【００７３】
本発明の態様２に係る液体中微粒子分析システム１０２は、上記の態様１において、上記マイクロ流路１０に沿って少なくとも二つの上記光子検知部２１が設けられている構成としてもよい。
【００７４】
上記の構成によれば、対象物の流れる方向に並んだ少なくとも二つの光子検知部２１により、検知回数および、検知時間を増やすことができ、感度の向上を図ることができる。
【００７５】
本発明の態様３に係る液体中微粒子分析システム１０３は、上記の態様１または２において、少なくとも二つの上記マイクロ流路１０を備え、上記マイクロ流路１０のそれぞれに上記光子検知部２１が備えられている構成としてもよい。
【００７６】
上記の構成によれば、複数流路で同時並行的に分析を行うことができ、分析のスループットを向上させることができる。
【００７７】
本発明の態様４に係る液体中微粒子分析システム１０４は、上記の態様１から３の何れか１項において、上記励起光源５０は、それぞれ波長の異なる複数のレーザー光源５０Ａ，５０Ｂを備え、照射動作を行う上記レーザー光源５０Ａ，５０Ｂを切り替えることで波長を替えてパルス発光を行う構成としてもよい。
【００７８】
上記の構成によれば、異なるターゲットを識別するために、励起スペクトルの異なる複数の蛍光マーカーを用いて、対象物から生じる蛍光スペクトルの異なる複数の蛍光光子を検知することができる。
【００７９】
本発明の態様５に係る液体中微粒子分析システムは、上記の態様１から４の何れか１項において、上記励起光源の照射動作のタイミングを基準として、上記光子検知部が光子を検知したタイミングを計測するＴＤＣ回路と、上記ＴＤＣ回路の計測結果に応じて、上記光子検知部が検知した光子の蛍光寿命を計算する蛍光寿命計算部と、を備えた構成としてもよい。
【００８０】
上記の構成によれば、所定のターゲットを識別するために用いた蛍光分子ＦＭから発生する蛍光光子を蛍光寿命τに基づいて検知することができるため、光学的なフィルタを用いる必要がなく、光学系システムの小型化を図ることができる。
【００８１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【００８２】
例えば、液体中微粒子分析システムが、少なくとも二つのマイクロ流路１０を有し、マイクロ流路１０のそれぞれに、各流路に沿って少なくとも二つの光子検知部２１が備えられている構成であってもよい。また、液体中微粒子分析システムが、少なくとも二つのマイクロ流路１０と、それぞれ波長の異なる複数の励起光源５０と、を備えている構成であってもよい。また、液体中微粒子分析システムが、複数のマイクロ流路１０、複数の光子検知部２１、および、それぞれ波長の異なる複数の励起光源５０を備えるとともに、ＴＤＣ回路６１と、蛍光寿命計算部６２とを備えている構成であってもよい。
【符号の説明】
【００８３】
１０、１０Ａ、１０Ｂ  マイクロ流路
１１  注入孔
１２  排出孔
２１、２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ  光子検知部
２２  受光回路
２３、２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ  フォトダイオード
３０  制御回路
４０  光源駆動回路
５０  励起光源
５０Ａ、５０Ｂ  レーザー光源
６１  ＴＤＣ回路
６２  蛍光寿命計算部
１０１、１０２、１０３、１０４、１０５  液体中微粒子分析システム
１２１、１２２、１２３、１２５  集積回路チップ
【図１】
2019026413.tif 000003
【図２】
2019026413.tif 000004
【図３】
2019026413.tif 000005
【図４】
2019026413.tif 000006
【図５】
2019026413.tif 000007
【図６】
2019026413.tif 000008
【図７】
2019026413.tif 000009
【図８】
2019026413.tif 000010
【図９】
2019026413.tif 000011
【図１０】
2019026413.tif 000012
【図１１】
2019026413.tif 000013
【図１２】
2019026413.tif 000014
【図１３】
2019026413.tif 000015
【図１４】
2019026413.tif 000016
【図１５】
2019026413.tif 000017
【図１６】
2019026413.tif 000018
【図１７】
2019026413.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月27日(2020.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１】本発明の実施形態１に係る液体中微粒子分析システム１０１の概略構成を示す模式図である。
【図２】集積回路チップ１２１の概略構成を示す模式図である。
【図３】励起光源５０の照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、の制御のタイミングを示すタイミングチャートである。
【図４】１０ｎｓeｃの光子検知動作を１０００回繰り返した時の蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【図５】実施形態２に係る液体中微粒子分析システム１０２の概略構成を示す模式図である。
【図６】集積回路チップ１２２の概略構成を示す模式図である。
【図７】光子検知部２１Ａ，２１Ｂ，２１Ｃから出力される蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【図８】実施形態３に係る液体中微粒子分析システム１０３の概略構成を示す模式図である。
【図９】集積回路チップ１２３の概略構成を示す模式図である。
【図１０】光子検知部２１Ａ，２１Ｂから出力される蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。
【図１１】実施形態４に係る液体中微粒子分析システム１０４の概略構成を示す模式図である。
【図１２】（ａ），（ｂ）は、蛍光分子ＦＭ１と、蛍光分子ＦＭ２との、レーザー光源５０Ａおよびレーザー光源５０Ｂの波長に対する励起スペクトルおよび蛍光スペクトルを示す図である。
【図１３】（ａ），（ｂ）は、レーザー光源５０Ａおよびレーザー光源５０Ｂの照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、の制御のタイミングを示すタイミングチャートである。
【図１４】実施形態５に係る液体中微粒子分析システム１０５の概略構成を示す模式図である。
【図１５】集積回路チップ１２５の概略構成を示す模式図である。
【図１６】励起光源５０の照射動作と、光子検知部２１の光子検知動作と、受光回路２２の蛍光光子検知パルスの出力のタイミングを示すタイミングチャートである。
【図１７】蛍光光子検知パルスの発生数を示すヒストグラムである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
図４は、マイクロ流路１０中を流れる単一対象物（例えば細胞Ｘ２）が、光子検知部２１を通過するに要する時間内に１０ｎｓｅｃの光子検知動作を１０００回繰り返した時の蛍光光子検知パルス数を、時間を横軸にプロットしたグラフである。１０ｎｓｅｃの光子検知動作を１０００回繰り返すと１０μｓｅｃかかるので、１０μｓｅｃ毎に蛍光光子検知パルス数をプロットしたことになる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
例えば、所定ターゲットを識別するために、予め蛍光寿命の判っている複数の蛍光マーカー（蛍光分子ＦＭ）を用いた場合に、ＴＤＣ回路６１と蛍光寿命計算部６２との共同により得られた蛍光寿命τに基づいて蛍光光子を検知することが出来る。蛍光寿命３ｎｓｅｃの蛍光分子ＦＭ１と、１５ｎｓｅｃの蛍光分子ＦＭ２を使った場合、受光回路２２から出力される蛍光光子検知パルスに基づいて計算した蛍光寿命τに基づいて、どちらの蛍光分子からの蛍光光子であるかを判定することができる。
【国際調査報告】
2019026413.tif 000020
2019026413.tif 000021
2019026413.tif 000022
2019026413.tif 000023