(57)【要約】  濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高く、濾過滅菌前の培地への添加により適した、より実用的なステロール添加剤等を提供すること。シクロデキストリンのトリメチル化体とステロールとを用いて包接化合物を作製することにより、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高く、濾過滅菌前の培地への添加により適した、より実用的なステロール添加剤を提供することができる。かかるステロール添加剤は、所望のステロール濃度となるように培地に添加した後に濾過滅菌することに適しており、滅菌性がより高度に保証された培地を簡便かつ効率的に作製することができる。
2019138566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロデキストリンのトリメチル化体によって包接されたステロールを含有する細胞培養培地用添加剤であって、前記シクロデキストリンのトリメチル化体が、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、及びトリメチル−γ−シクロデキストリンからなる群より選択される１又は２以上である、前記添加剤。
【請求項２】
細胞培養培地が血清を含まない細胞培養培地である、請求項１に記載の添加剤。
【請求項３】
シクロデキストリンのトリメチル化体がトリメチル−β−シクロデキストリンである、請求項１又は２に記載の添加剤。
【請求項４】
ステロールが、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、エルゴステロール、フコステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、及びメチルコレステロールからなる群より選択される１又は２以上である、請求項１〜３のいずれかに記載の添加剤。
【請求項５】
ステロールがコレステロールである、請求項１〜４のいずれかに記載の添加剤。
【請求項６】
シクロデキストリンのトリメチル化体とステロールの重量比が、シクロデキストリンのトリメチル化体１０００重量部に対して、ステロール１〜８０重量部である、請求項１〜５のいずれかに記載の添加剤。
【請求項７】
細胞が、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物である、請求項１〜６のいずれかに記載の添加剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の添加剤と基本培地とを含む、細胞培養培地。
【請求項９】
血清を含まない、請求項８に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
０．０１〜５０ｍｇ／Ｌの濃度でステロールを含有する、請求項８又は９に記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、細胞培養培地の作製方法。
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の添加剤を基本培地に添加する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の後に、添加剤を含む基本培地を濾過滅菌し、細胞培養培地を調製する工程；
【請求項１２】
血清を基本培地に添加する工程を含まない、請求項１１に記載の作製方法。
【請求項１３】
細胞培養培地におけるステロールの濃度が０．０１〜５０ｍｇ／Ｌとなるように、工程（ａ）において、基本培地に添加剤を添加する、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）において、孔径が０．０１μｍ〜２０μｍのフィルターを用いて濾過滅菌を行う、請求項１１〜１３のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロールがシクロデキストリンのトリメチル化体（以下、「ＴＯＭＣＤ」と記載する場合がある）によって包接されたステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物を含有する細胞培養培地用添加剤に関する。また、本発明は、上記添加剤を含む細胞培養培地や、上記添加剤を用いる細胞培養培地の作製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、動物細胞をインビトロで培養する際には、ウシ胎仔血清等の動物由来の血清を５〜２０％の割合で含む培地（以下、「血清培地」と称する場合がある）が使用される。培地中の血清は、培養細胞の成長及び／又は増殖を促進するための栄養源、又はホルモン等の生理活性物質の供給源として重要であり、血清を全く含まない培地（以下、「無血清培地」と称する場合がある）中では動物細胞は全く増殖できないか、増殖が不十分なことが多い。しかし、血清は非常に高価であること、天然由来製品であるためにロット毎に成分の違いがあること、成分の不明なタンパク質性の物質が多量に含まれること等の問題がある。特に、細胞培養によって医薬品として使用するための組換えタンパク質／ペプチド（例えば、抗体等）を製造する場合には、血清培地を用いると血清由来の不純物の除去に関する煩雑な工程や試験が安全性評価のために必要となるため、実用的な無血清培地の開発が望まれている。【０００３】
現在、組換えタンパク質の作製においては、チャイニーズ ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が最も広く利用されている。これまでに、血液凝固第VIII因子産生ＣＨＯ細胞用の無血清培地として、特許文献１にＡＳＦ−１０４培地にプルロニックＦ６８及びジメチル−α−シクロデキストリンを添加した培地が開示されている。しかし、この培地を使用する場合は「まず、１０％血清を含んだ培地で対象となる細胞を８〜２４時間培養し、（第３頁右欄第２行〜３行）」と記載されているとおり、１０％血清含有培地で細胞を前培養する必要があり、完全に無血清条件下での培養とはならない。また、カルチャーディッシュ上のスモールスケールのしかも静置培養での例が記載されているのみで、工業的物質生産には程遠い培養法である。一方、よりラージスケールの組換え型哺乳類タンパク質の作製においては、マウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞が利用されることが多い。非特許文献１には、コレステロール又は植物ステロールがメチル−β−シクロデキストリン（以下、「ＭＯＭβＣＤ」又は「ＭＯＭ−β−ＣＤ」と記載する場合がある）によって包接された、「コレステロール又は植物ステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物」を、グルタミンを含むＣＤハイブリドーマ培地に添加することが開示されている。非特許文献１においては、「ＬＴＩ第１世代コレステロール添加物」及び「第２世代コレステロール添加物」と呼ばれる、ＭＯＭβＣＤとステロールの構成比の異なる２種類の包接化合物が作製され、これらの添加物を含有する無血清培地を使用することによってＮＳ０細胞の１週間の培養が可能であることを開示している（非特許文献１のFigure ２及び４）。しかし、非特許文献１には、第１世代（1st Generation）コレステロール添加物を加えた後に濾過滅菌した培地（Pre-filtration）においては、添加したコレステロールの殆どが濾過滅菌用フィルターによって取り除かれてしまうことが明らかにされている（非特許文献１のFigure ３）。また、同様の実験を、第２世代（2nd Generation）コレステロール添加物を用いて行った場合でも、濾過滅菌用フィルターにより１５％程度のコレステロールが除去されてしまうことが示されている（非特許文献１のFigure ３）。このように、コレステロールがＭＯＭβＣＤによって包接された、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物には、濾過滅菌用フィルター透過性（すなわち、濾過性能）が低いという課題があった。【０００４】
さらに、マウスハイブリドーマ培養用の無血清培地として、特許文献２及び３には、ＩＴＥＳ（インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム）中のトランスフェリンの代わりに無機鉄化合物を加えた培地が開示されているが、これらの場合においても、ティシュカルチャーフラスコでのスモールスケールの静置培養での例が記載されているに過ぎず、また、これらの培地が遺伝子組換え用の宿主として汎用されるＣＨＯ細胞の培養に適用できるか否かは不明である。以上のように、動物細胞による生理活性ペプチド／タンパク質の工業的生産に有用な、安価かつ生産性の高い工業用無血清培地は未だ提供されていないのが実情である。【０００５】
シクロデキストリン（ＣＤ）とは、通常、５分子以上のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合によって結合し、環状構造をとった環状オリゴ糖の一種である。一般的に用いられるシクロデキストリンは、６〜８分子のグルコースが結合したものであり、６分子のグルコースが結合したものがα−ＣＤ、７分子のグルコースが結合したものがβ−ＣＤ、８分子のグルコースが結合したものがγ−ＣＤと呼ばれている。ＣＤは、その環状構造の内部の空孔に他の分子（ゲスト分子）を取り込んでゲスト分子を包接する作用を有することが知られている。シクロデキストリンの環状構造の外側は親水性であるのに対し、環状構造の内側の空孔は疎水性である。このようなシクロデキストリンの包接作用を利用して、ゲスト分子の匂いをマスキングしたり、ゲスト分子を安定化したり、疎水性のゲスト分子を可溶化するために用いられることがある。しかし、ＣＤ、特にメチル−β−シクロデキストリンは、細胞に接触させると細胞膜の脂質を除去する性質があり、細胞の生存率が低下することが、動物細胞を用いた実験により明らかとなっていた（非特許文献２及び３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平４−３１６４８４号公報
【特許文献２】特開平４−５１８９１号公報
【特許文献３】特開平３−１８０１７５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gorfien et al., Biotechnol. Prog. 2000, 16, 682-687
【非特許文献２】Joel et.al., Neurotoxicology. 2007, 28(3): 613-621
【非特許文献３】Laura et. al., Journal of Controlled Release 2008, 126: 10-16
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の通り、これまでの研究から、無血清培地にコレステロールを安定的に添加するために、コレステロールがＭＯＭβＣＤによって包接された、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を使用できることが知られていた（非特許文献１）。しかし、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物は濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）が低く、特に、培養培地中のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物が培養培地として通常用いられる程度の低い濃度であると、濾過滅菌用フィルターで濾過する際にそのほとんどが除去されてしまう場合があることから、所望のコレステロール濃度を含有する培地を作製するためには、基本培地と、高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物とを、それぞれ別々に濾過滅菌用フィルターで濾過滅菌し、その高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物の一部をその基本培地に無菌条件下で添加することが行われていた（いわゆる「後添加法」又は「濾過後添加法」）。この後添加法では、基本培地と、高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物とをそれぞれ別々に濾過滅菌した後の工程（例えば、その高濃度のコレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物の一部をその基本培地に添加する工程等）で無菌性を保証することが難しく、無菌性を保証するためには最終製品を一つ毎に検査する必要があるという課題があった。また、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物は、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）が低く、濾過滅菌用フィルターに目詰まりを生じさせ易いため、後添加法であっても他の添加法であっても、濾過滅菌用フィルターを多く消費し、コストがかさむという課題もあった。【０００９】
本発明の課題の１つは、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適した、より実用的なステロール添加剤を提供すること、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適したステロール添加剤を提供することにある。また、本発明の他の課題は、濾過滅菌により適した、より実用的なステロール含有培地を提供すること、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、濾過滅菌により適しており、したがって、より簡便かつより効率的に、滅菌性をより高度に保証することができる又は保証されたステロール含有培地を提供することにある。また、本発明の他の課題は、濾過滅菌に必要なフィルター量がより少なくて済むため、より低コストで濾過滅菌が可能なステロール添加剤やステロール含有培地を提供すること等にもある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく試行錯誤を行い、トリメチル−β−シクロデキストリン（以下、「ＴＯＭβＣＤ」又は「ＴＯＭ−β−ＣＤ」と記載する場合がある）とコレステロールとを用いて、コレステロールがＴＯＭβＣＤに包接された包接化合物（以下、かかる化合物を「コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物」と記載する場合がある）を作製した（実施例１）。そして、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地と、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地とで、濾過用フィルターで濾過した際の濾過性能（フィルター透過性）を比較したところ、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地は、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地と比較して濾過滅菌用フィルターの目詰まりが生じにくく、２倍以上の量（ｍＬ）の培地を同一の濾過用フィルターで濾過できることが明らかとなった（実施例５、６）。背景技術でも述べたように、ＣＤ、特にメチル−β−シクロデキストリンは、細胞に接触させると細胞膜の脂質を除去する性質があり、細胞の生存率が低下することが、動物細胞を用いた実験により明らかとなっていたこと（非特許文献２及び３）等を考慮すると、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地がこのように優れた濾過性能を有することは、当業者にとって非常に意外な結果であった。【００１１】
また、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した後に濾過滅菌した培地と（濾過前添加培地）、濾過滅菌後にコレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地（濾過後添加培地）とを作製し、これらの培地を用いてＳＮＴ−８細胞の無血清培養を行い、細胞増殖能の変化を調べた（実施例７）。その結果、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は、濾過前添加培地では濾過後添加培地と比較して、細胞数が１６％以上低下したが、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は濾過性能が高く、驚くべきことに、濾過前添加培地において、濾過後添加培地とほぼ同程度以上の細胞増殖能が維持されることが明らかとなった（実施例７）。【００１２】
また、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物又はコレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を添加した培地をフィルターで濾過し、培地１Ｌ毎に採取して、それぞれの培地での細胞増殖能を調べたところ、コレステロール・ＭＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は、濾過して１Ｌ目又は３Ｌ目で細胞増殖能の低下が認められたが、コレステロール・ＴＯＭβＣＤ包接化合物を用いた場合は４Ｌ目でも細胞増殖能の低下は認められなかった。【００１３】
以上のように、本発明者は、ＣＤのトリメチル化体とステロールとから形成される錯体化合物が、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適しており、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していること等を見いだし、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、
（１）シクロデキストリンのトリメチル化体によって包接されたステロールを含有する細胞培養培地用添加剤であって、前記シクロデキストリンのトリメチル化体が、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、及びトリメチル−γ−シクロデキストリンからなる群より選択される１又は２以上である、前記添加剤や、
（２）細胞培養培地が血清を含まない細胞培養培地である、上記（１）に記載の添加剤や、
（３）シクロデキストリンのトリメチル化体がトリメチル−β−シクロデキストリンである、上記（１）又は（２）に記載の添加剤や、
（４）ステロールが、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、エルゴステロール、フコステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、及びメチルコレステロールからなる群より選択される１又は２以上である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の添加剤や、
（５）ステロールがコレステロールである、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の添加剤や、
（６）シクロデキストリンのトリメチル化体とステロールの重量比が、シクロデキストリンのトリメチル化体１０００重量部に対して、ステロール１〜８０重量部である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の添加剤や、
（７）細胞が、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物である、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の添加剤に関する。【００１５】
また本発明は、
（８）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の添加剤と基本培地とを含む、細胞培養培地や、
（９）血清を含まない、上記（８）に記載の細胞培養培地や、
（１０）０．０１〜５０ｍｇ／Ｌの濃度でステロールを含有する、上記（８）又は（９）に記載の細胞培養培地に関する。【００１６】
さらに本発明は、
（１１）以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、細胞培養培地の作製方法；
（ａ）上記（１）〜（７）のいずれかに記載の添加剤を基本培地に添加する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の後に、添加剤を含む基本培地を濾過滅菌し、細胞培養培地を調製する工程；や、
（１２）血清を基本培地に添加する工程を含まない、上記（１１）に記載の作製方法や、
（１３）細胞培養培地におけるステロールの濃度が０．０１〜５０ｍｇ／Ｌとなるように、工程（ａ）において、基本培地に添加剤を添加する、上記（１１）又は（１２）に記載の製造方法や、
（１４）工程（ｂ）において、孔径が０．０１μｍ〜２０μｍのフィルターを用いて濾過滅菌を行う、上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適した、より実用的なステロール添加剤を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適したステロール添加剤を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌により適した、より実用的なステロール含有培地を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、濾過滅菌により適しており、したがって、より簡便かつより効率的に、滅菌性をより高度に保証することができる又は保証されたステロール含有培地を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌に必要なフィルター量がより少なくて済むため、より低コストで濾過滅菌が可能なステロール添加剤やステロール含有培地を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地を用いてＳＮＴ−８細胞を培養したときの細胞増殖の程度を示す図である。図中、ＭＯＭ ５ｍｇの×１０００は、実施例１のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを５ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を１，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇの×２０００は、実施例１のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇの×４０００は、実施例１のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇの×２０００は、実施例１のＴＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇの×２０００は、実施例１のＴＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表す。図の縦軸は、コントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準としたときの、各場合における細胞数の割合を示す。コントロールとしては、ＭＯＭ ４０ｍｇの×２０００の培地を用いた。
【図２】実施例１で作製したコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液が所定の希釈倍率となるように添加した培地を用いてＳＮＴ−８細胞を培養したときの細胞増殖能を示す図である。図中、横軸は希釈倍率を表し、縦軸はコントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準としたときの、各場合における細胞数の割合を示す。なお、コントロールとしては、ＭＯＭ ４０ｍｇの×２０００の培地を用いた。
【図３】コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地の濾過効率を示す図である。図の縦軸は、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった場合の総濾過量を１．０としたときの、総濾過量の割合を濾過効率として示した。図中、ＭＯＭ ５ｍｇは、実施例１のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを５ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を１，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＴＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表す。また、黒色の棒グラフは、培地としてＲＰＭＩ−１６４０培地を用いた場合の結果を表し、灰色の棒グラフは、培地としてＡｒｔｅｍｉｓ−１培地を用いた場合の結果を表す。
【図４】コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地を用いてＳＮＴ−８細胞を培養したときの細胞増殖の程度（培養４日目の細胞数）を示す図である。図中、黒色の棒グラフは、培地を濾過滅菌した後、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した培地を用いた場合（「濾過後添加」）の結果を表し、灰色の棒グラフは、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した後の培地をフィルター濾過した場合（「濾過前添加」）の結果を表す。また、図中、ＭＯＭ ５ｍｇは、実施例１のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを５ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を１，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＭＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表し、ＴＯＭ ４０ｍｇは、実施例１のＴＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ加えて作製したコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を４，０００倍希釈となるように培地に添加した場合の結果を表す。
【図５】コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した後の培地をフィルター（「ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ  ＰＥＳ  ４３１１１８）」）で濾過して得られた４Ｌの培地を連続的に濾過滅菌して、濾過開始から１Ｌ毎に培地をそれぞれ別の容器に回収し、回収した各培地を用いてＳＮＴ−８細胞を培養したときの細胞増殖の程度（培養４日目の細胞数）を示す図である。図の縦軸は、コントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準としたときの、各場合における細胞数の割合を示す。コントロールとしては、Ａｒｔｅｍｉｓ−１培地にコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように後添加した培地を用いた。図中、「１Ｌ目」は、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した４Ｌの培地を連続的に濾過滅菌したときの濾過開始〜１Ｌまでの培地を、「２Ｌ目」はその次の２Ｌまでの培地を、「３Ｌ目」はその次の３Ｌまでの培地を、「４Ｌ目」はその次の４Ｌまでの培地をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の添加剤としては、シクロデキストリンのトリメチル化体（ＴＯＭＣＤ）によって包接されたステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物を含有する細胞培養培地用の添加剤であって、前記シクロデキストリンのトリメチル化体が、トリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、及びトリメチル−γ−シクロデキストリンからなる群より選択される１又は２以上である、前記添加剤であれば特に制限されない。ここで、上記「トリメチル−α−シクロデキストリン（ＴＯＭαＣＤ）」とは、６分子のグルコースが環状に結合したα−シクロデキストリンであって、それを構成するグルコースの１又は２分子以上（好ましくは３分子以上、より好ましくは４分子以上、さらに好ましくは５分子以上、より好ましくは６分子）の２位、３位及び６位の３つの水酸基がメチル基によって修飾された化合物及びその誘導体を意味し、上記「トリメチル−β−シクロデキストリン（ＴＯＭβＣＤ）」とは、７分子のグルコースが環状に結合したβ−シクロデキストリンであって、それを構成するグルコースの１又は２分子以上（好ましくは３分子以上、より好ましくは４分子以上、さらに好ましくは５分子以上、より好ましくは６分子以上、さらに好ましくは７分子）の２位、３位及び６位の３つの水酸基がメチル基によって修飾された化合物及びその誘導体を意味し、上記「トリメチル−γ−シクロデキストリン（ＴＯＭγＣＤ）」とは、８分子のグルコースが環状に結合したγ−シクロデキストリンであって、それを構成するグルコースの１又は２分子以上（好ましくは３分子以上、より好ましくは４分子以上、さらに好ましくは５分子以上、より好ましくは６分子以上、さらに好ましくは７分子以上、より好ましくは８分子）の２位、３位及び６位の３つの水酸基がメチル基によって修飾された化合物及びその誘導体を意味する。
【００２０】
上記「ステロールがシクロデキストリンのトリメチル化体によって包接されたステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物（ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物）」とは、ステロール（ゲスト分子）の全部又は一部が、ＣＤトリメチル化体（ホスト分子）の環状構造の内側の疎水性の空孔に取り込まれた構造を形成する、ＣＤトリメチル化体とステロールの錯体化合物を意味する。ステロールがＴＯＭＣＤに包接されているかどうかは、溶液状態においては円二色性スペクトルやＮＭＲスペクトルを用い、固体状態においては熱分析ＤＳＣ、粉末Ｘ線などで、ＴＯＭＣＤ単独、ゲスト分子単独、物理的混合物とＣＤ包接体を比較するなどして確認することができる。本発明においては、ホスト分子として、ＴＯＭαＣＤ、ＴＯＭβＣＤ、及びＴＯＭγＣＤのいずれか１つ、又は、これらのうちの２又は３つを併用してもよいが、ＴＯＭβＣＤと、ＴＯＭαＣＤ及び／又はＴＯＭγＣＤとを組み合わせることが好ましく、ＴＯＭβＣＤを単独で用いることがさらに好ましい。また、本発明においては、ゲスト分子として、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、エルゴステロール、フコステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、及びメチルコレステロールからなる群より選択される１又は２以上のステロール又はその誘導体を用いることができるが、コレステロールを用いることが好ましい。
【００２１】
本発明における「ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物」を調製する方法としては、特に制限されず、例えば混練法、飽和水溶液法、乳化法、混合粉砕法等の公知の方法を用いることができる。上記の混練法としては、ホスト分子に少量の水を添加してペースト状にし、そこに一定量のゲスト分子を添加して混練機等でよく練って、ゲスト分子がホスト分子に包接されたゲスト分子・ホスト分子包接化合物を得る方法が挙げられる。上記の飽和水溶液法としては、ホスト分子の飽和水溶液を作製し、その後一定量のゲスト分子を添加・混合し、３０分間〜数日間、攪拌混合して、ホスト分子に包接されたゲスト分子を沈殿させて得る方法が挙げられる。上記の乳化法としては、ホスト分子の２０〜５０％懸濁液を作製し、そこに一定量のゲスト分子を添加し、ホモジナイザーで乳化させて、ゲスト分子がホスト分子に包接されたゲスト分子・ホスト分子包接化合物を得る方法が挙げられる。上記の混合粉砕法としては、ホスト分子とゲスト分子を振動ミルに入れ、粉砕して、ゲスト分子がホスト分子に包接されたゲスト分子・ホスト分子包接化合物を得る方法が挙げられる。なお、上述の混練法、飽和水溶液法、乳化法において、固体状の「ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物」を得る場合は、それぞれの方法で得られるステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物を含む液体を乾燥（好ましくは凍結乾燥）すればよい。保存は、常温であってもよいが、より長期間の保存を可能にする観点から、４℃以下の温度で行うことが好ましい。
【００２２】
また、本発明における「ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物」中の、ＴＯＭＣＤとステロールの重量比としては、培養対象となる細胞を増殖し得る限り特に制限さないが、例えば、ＴＯＭＣＤ１０００重量部に対してステロールを１〜８０の範囲内、好ましくは５〜８０重量部の範囲内、より好ましくは５〜７０重量部の範囲内、さらに好ましくは１０〜６０重量部の範囲内、さらにより好ましくは２０〜５０重量部の範囲内、特に好ましくは３５〜４５重量部の範囲内とすることができる。
【００２３】
本発明の添加剤は、粉剤、顆粒剤、錠剤等の固体の剤型であってもよいし、水溶剤、懸濁剤、乳剤、油性剤等の液体の剤型であってもよいが、保存性に優れている観点から、固体の剤型であることが好ましい。
【００２４】
本発明の添加剤は、培地に添加する際に培地等で適当な倍率で希釈することができる。したがって、本発明の添加剤におけるステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物の濃度は特に制限されないが、本発明の添加剤が固体の場合は、例えば０．００１〜９９．９重量％、好ましくは０．１〜９０重量％、より好ましくは１〜６０重量％が挙げられ、本発明の添加剤が固体の場合は、例えば０．００１〜２５重量％、好ましくは０．１〜２０重量％、より好ましくは１〜１５重量％が挙げられる。
【００２５】
本発明の添加剤は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物のみから成っていてもよいし、他の任意成分を含んでいてもよい。かかる任意成分としては、固体の担体や液体の担体（例えば水）のほか、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、乳化剤、浸透圧調整剤などが挙げられる。本発明の添加剤は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物、又は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物と任意成分を用いて製造することができる。ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物と任意成分を含んでいる本発明の添加剤は、ステロール・ＴＯＭＣＤ包接化合物と任意成分を混合すること等によって作製することができる。
【００２６】
本発明の添加剤は、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物の培養において使用することができるが、特に動物由来細胞の培養に適用することが好ましい。ここで、上記「動物由来細胞」としては、特に制限されないが、例えば、哺乳動物由来細胞、昆虫細胞、線虫細胞等を挙げることができ、なかでも、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＥ−１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ＳＮＴ−８細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ハイブリドーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ−１２７細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞等の哺乳動物由来細胞を特に好適に例示しすることができる。また、上記動物由来細胞は、正常細胞、疾患細胞、形質転換細胞、変異細胞、体細胞、生殖細胞、発芽細胞、幹細胞、前駆細胞、及び胚細胞のいずれであってもよく、また、既に確立された細胞系であっても、天然源から採取されたものであってもよい。上記幹細胞としては、多能性幹細胞、体性幹細胞等が挙げられ、多能性幹細胞としては、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）等が挙げられ、体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、心臓幹細胞、肝臓幹細胞、小腸幹細胞等が挙げられる。本発明の添加剤は、上記動物由来細胞の浮遊（撹拌）培養にも、接着培養にも用いることができる。
【００２７】
また、本発明の細胞培養培地としては、上記本発明の添加剤と基本培地とを含むものであれば特に制限されない。上記「基本培地」としては、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物の培養が可能な培地であればどのようなものであってもよく、例えば、炭素源、窒素源を含む培地が挙げられ、好ましくはさらに無機塩類を含む培地が好ましく挙げられる。また、かかる「基本培地」としては、上記動物由来細胞の無血清培養が可能な培地であることが特に好ましい。具体的には、上記基本培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（G. E. Moore ら、ザ  ジャーナル  オブ  ザ  アメリカンメディカル  アソシエイション（J. A. M. A.）、第１９９巻、第５１９頁(１９６７)）、Ａｒｔｅｍｉｓ−１培地（日本テクノサービス株式会社製）、イーグルＭＥＭ培地（H.Eagle、サイエンス（Science）、第１３０巻、第４３２頁（１９５９））、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地（R.DulbeccoおよびG.Freeman、バイロロジー（Virology）、第８巻、第３９６頁（１９５９））、イスコフ培地（N. Iscove アンド F. Melchers、 ジャーナル  エクスペリメンタル  メソッズ（J. Exp. Med.）、第１４７巻、第９２３頁(１９７８)）、ハムＦ１２培地（R. G. Ham、 プロシーディングス  オブ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sci.、）、第５３巻、第２８８頁(１９６５)）、Ｌ−１５培地（A. Leibovitz、 アメリカン  ジャーナル  オブ  ハイジーン（Amer. J. Hyg.）、第７８巻、第１７３頁(１９６３)）、Ｅ−ＲＤＦ培地（極東製薬）、ＵＣ−１０２培地（日水製薬）、ＵＣ−２１２培地（日水製薬）、ダイゴＴ培地（日本製薬、特開昭６０−１４５０８８号）、ＴＬ−２培地（Y. Shintani ら、アプライド  マイクロバイオロジー  アンド  バイオテクノロジー（Appl. Microbiol. Biotechnol.）、第２７巻、第５３３頁(１９８８)）、又は、これらを適当な比率で混合した培地を好適に挙げることができ、なかでも、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡｒｔｅｍｉｓ−１培地を特に好適に挙げることができる。
【００２８】
本発明の細胞培養培地におけるステロールの濃度としては、培養対象となる生物細胞の生存及び／又は増殖を可能にし得る限り特に制限されないが、例えば、０．００１〜５００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．０３〜４０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．１２５〜３０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．１２５〜２５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．２５〜１６ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．５〜８ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．５〜５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．５〜２ｍｇ／Ｌの範囲内が挙げられ、また、コストの観点から、培地中のＴＯＭＣＤ包接ステロールの濃度の上限を、ステロール濃度換算で１００ｍｇ／Ｌ以下、７５ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、２５ｍｇ／Ｌ以下、１６ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、８ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、４ｍｇ／Ｌ以下又は２ｍｇ／Ｌ以下としてもよい。また、本発明の細胞培養培地は、血清を含まない無血清培地であっても、血清を含む血清含有培地であってもよいが、無血清培地であることが好ましい。
【００２９】
本発明の細胞培養培地は、本発明の添加剤及び上記基本培地の他に、培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分や、特定の選択マーカーに対応する選択薬剤等をさらに含むものであってもよい。上記「培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分」としては、例えば、ＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＮＧＦ、インターロイキン（例えばインターロイキン２、好ましくはヒト組み換え型インターロイキン２）、コロニー刺激因子、インターフェロン等のサイトカイン；ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等のアルブミン；インスリン、トランスフェリン、β−エストラジオール、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、亜セレン酸、プロスタグランジン等の生理活性物質；コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン等の細胞外マトリックス成分；ウシ血清（胎児ウシ、新生児ウシまたは正常ウシ血清）、ヒト血清、ウシ血清、ブタ血清、サル血清、尾なしサル血清、ラット血清、ネズミ血清、ウサギ血清、ヒツジ血清等の血清；を好適に挙げることができ、上記「特定の選択マーカーに対応する選択薬剤」としては、例えば、メソトレキセート、ミコフェノール酸またはネオマイシン誘導体であるＧ４１８等を好適に挙げることができる。なお、「培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分」を用いる場合、培地中のその成分の濃度は、当業者であれば適宜設定することができる。例えば、インターロイキン（好ましくはインターロイキン２、より好ましくはヒト組み換え型インターロイキン２）の培地中の濃度としては、好ましくは５０〜１２５０ＩＵ／ｍＬ、より好ましくは１２５〜５００ＩＵ／ｍＬ、さらに好ましくは２００〜３００ＩＵ／ｍＬが挙げられる。また、血清アルブミン（好ましくはヒト血清アルブミン）の培地中の濃度としては、好ましくは０．４〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．６〜６ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜３ｇ／Ｌが挙げられる。
【００３０】
本発明の細胞培養培地は、粉末、顆粒等の固体であってもよいし、水溶液等の液体であってもよい。固体の細胞培養培地は、保存性により優れているというメリットを有しており、液体の細胞培養培地は、簡便性により優れているというメリットを有している。液体の細胞培養培地は、そのまま使用する濃度の培地であってもよいし、何倍（例えば５倍、１０倍）かに希釈して使用するような濃度である濃縮タイプの培地であってもよい。そのまま使用する濃度である、液体の細胞培養培地は、滅菌を行っておくと、その細胞培養培地のユーザーは改めて滅菌することなくそのまま使用することができるため、簡便性の観点から非常に好ましい。
【００３１】
本発明の細胞培養培地は、本発明の添加剤と、基本培地と、必要に応じてさらに任意成分とを混合すること等によって作製することができる。かかる任意成分としては、固体の担体や液体の担体（例えば水）のほか、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、乳化剤、浸透圧調整剤などが挙げられる。
【００３２】
本発明の細胞培養培地のより具体的な作製方法としては、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むものであれば特に制限されない。
（ａ）上記本発明の添加剤を上記基本培地に添加する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の後に、上記本発明の添加剤を含む上記基本培地を濾過滅菌し、細胞培養培地を調製する工程；
【００３３】
上記工程（ａ）においては、細胞培養培地におけるステロールの濃度が、例えば、０．００１〜５００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．０３〜４０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．１２５〜３０ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．１２５〜２５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．２５〜１６ｍｇ／Ｌの範囲内、さらに好ましくは０．５〜８ｍｇ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．５〜５ｍｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．５〜２ｍｇ／Ｌの範囲内となるように、上記基本培地に本発明の添加剤を添加することが好ましい。また、コストの観点から、培地中のＴＯＭＣＤ包接ステロールの濃度の上限が、ステロール濃度換算で１００ｍｇ／Ｌ以下、７５ｍｇ／Ｌ以下、５０ｍｇ／Ｌ以下、２５ｍｇ／Ｌ以下、１６ｍｇ／Ｌ以下、１０ｍｇ／Ｌ以下、８ｍｇ／Ｌ以下、５ｍｇ／Ｌ以下、４ｍｇ／Ｌ以下又は２ｍｇ／Ｌ以下となるように、上記基本培地に本発明の添加剤を添加してもよい。
【００３４】
さらに、上記工程（ｂ）における濾過滅菌は、培地から菌を除去することが可能なフィルターであればどのようなものを使用して行ってもよいが、かかる濾過滅菌用フィルターの孔径の上限として、例えば、２０μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、８μｍ以下、５μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１．５μｍ以下、１．２μｍ以下、１μｍ以下、０．８μｍ以下、０．６μｍ以下、０．４５μｍ以下、０．３５μｍ以下、０．３μｍ以下、０．２５μｍ以下が挙げられ、濾過滅菌用フィルターの孔径の下限として、０．０１μｍ以上、０．０３μｍ以上、０．０５μｍ以上、０．０８μｍ以上、０．１μｍ以上、０．１５μｍ以上、０．２μｍ以上が挙げられる。濾過滅菌用フィルターの孔径の範囲としては、先に挙げた上限と下限のすべての組合せを開示するが、例えば、０．０１〜２０μｍの範囲内、より好ましくは０．０３〜１５μｍの範囲内、さらに好ましくは０．０５〜１０μｍの範囲内、より好ましくは０．０８〜５μｍの範囲内、さらに好ましくは０．１〜１μｍの範囲内、より好ましくは０．１〜０．６μｍの範囲内、さらに好ましくは０．１〜０．４５μｍの範囲内、より好ましくは０．１〜０．３μｍの範囲内、特に好ましくは０．２〜０．２５μｍの範囲内が挙げられる。また、上記工程（ｂ）においては、上記濾過滅菌用フィルターと、プレフィルターとを組み合わせて使用してもよい。プレフィルターの孔径は、特に制限されないが、濾過滅菌用フィルターの孔径よりも大きい孔径が好ましく挙げられ、例えば、上記の濾過滅菌用フィルターの孔径の１．１〜１０倍の範囲内、１．１〜５倍の範囲内、１．２〜３倍の範囲内が挙げられる。
【００３５】
上記濾過滅菌用フィルター及びプレフィルターの材質は特に制限されず、例えば、セルロース系、ナイロン系、親水性ポリエーテルスルホン、親水性ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）等を好適に挙げることができる。また、上記工程（ｂ）における濾過滅菌は、上記濾過滅菌用フィルター（好ましくは、ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ  ＰＥＳ  ４３１１１８））を交換することなく（同一の上記濾過滅菌用フィルターを用いて）、１Ｌ以上、２Ｌ以上、３Ｌ以上、４Ｌ以上、５Ｌ以上、７Ｌ以上、又は１０Ｌ以上の培地を継続的に滅菌することが好ましい。より具体的には、基本培地としてＡｒｔｅｍｉｓ−１培地を用いた場合には、上記工程（ｂ）において、４Ｌ以上の培地を一つの濾過滅菌用フィルター（好ましくは、ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ  ＰＥＳ  ４３１１１８））を用いて継続的に滅菌することが好ましい。
【００３６】
また、本発明の細胞培養培地の作製方法は、上述のような「培養対象の生物細胞の生存及び／又は増殖を向上させるための成分」及び／又は「特定の選択マーカーに対応する選択薬剤」を添加する工程をさらに含むものであってもよく、かかる工程は、上記工程（ａ）の前、上記工程（ａ）における本発明の添加剤の添加と同時、上記工程（ａ）と上記（ｂ）の間、又は上記（ｂ）の後に実施することができる。また、本発明の細胞培養培地の作製方法は、血清を基本培地に添加する工程を含まないことが好ましい。
【００３７】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【実施例１】
【００３８】
[コレステロール・シクロデキストリン包接化合物の作製]
メチル−β−シクロデキストリン（ＭＯＭ−β−ＣＤ：和光純薬）を蒸留水に溶かして５ｍＬとし、２００ｍｇ／ｍＬのメチル−β−シクロデキストリン含有液を調製した。他方、トリメチル−β−シクロデキストリン（ＴＯＭ−β−ＣＤ：和光純薬）を蒸留水に溶かして１０ｍＬとし、１００ｍｇ／ｍＬのトリメチル−β−シクロデキストリン含有液を調製した。【００３９】
前述のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロール（シグマ、Ｃ３０４５）を５ｍｇ加え、時々激しく撹拌しながら５０℃で３０分間加温して、コレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物（「５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤ」又は「ＭＯＭ ５ｍｇ」とも表す。）を作製した。同様に、前述のＭＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロール（シグマ、Ｃ３０４５）を４０ｍｇ加えて、コレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物（「４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤ」又は「ＭＯＭ ４０ｍｇ」とも表す。）を作製した。同様にＴＯＭ−β−ＣＤ溶液に、コレステロールを４０ｍｇ（４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤ）加えてコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物（「４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤ」又は「ＴＯＭ ４０ｍｇ」とも表す。）を作製した。なお、５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤの溶液におけるコレステロール濃度は、１ｍｇ／ｍＬであり、ＭＯＭ−β−ＣＤ濃度は２００ｍｇ／ｍＬであり、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤの溶液におけるコレステロール濃度は、８ｍｇ／ｍＬであり、ＭＯＭ−β−ＣＤ濃度は２００ｍｇ／ｍＬであり、４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤにおけるコレステロール濃度は、４ｍｇ／ｍＬであり、ＴＯＭ−β−ＣＤ濃度は１００ｍｇ／ｍＬである。【００４０】
作製した３種類のコレステロール・シクロデキストリン包接化合物（すなわち、５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤ、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤ、４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤ）をそれぞれ、ミリポア社マイレクスＧＶフィルター（フィルター径３３ｍｍ、孔径０．２２μｍ）を用いて濾過滅菌した。
【実施例２】
【００４１】
１ｇのＴＯＭ−β−ＣＤを蒸留水に溶かして１０ｍＬとし、コレステロール（シグマ、Ｃ３０４５）をそれぞれ５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇおよび１６０ｍｇ加え、実施例１と同様にコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物を作製した。コレステロールを６０ｍｇ以下で添加した場合、溶液は完全に透明となり、コレステロールは溶解した。一方、コレステロールを７０ｍｇ以上添加した場合は、反応温度５０℃では白濁して完全には溶解しなかった。コレステロール添加量７０ｍｇ以上の白濁した溶液を室温に放置したところ、７０ｍｇのコレステロールを添加した溶液は透明になり、コレステロールは完全に溶解した。８０ｍｇのコレステロールを添加した溶液はほぼ透明になったが浮遊物が残存し、コレステロールは完全には溶解しなかった。１６０ｍｇのコレステロールを添加した溶液は室温でも白濁しており、コレステロールは完全には溶けきらなかった。７０ｍｇ以下のコレステロールを添加した溶液を、ミリポア社マイレクスＧＶフィルター（フィルター径３３ｍｍ、孔径０．２２μｍ）を用いて濾過滅菌し、４℃で保管したが、いずれも析出物は観察されず培地に添加可能であった。これらの結果から、ＴＯＭＣＤに対するステロール（好ましくはコレステロール）の好ましい使用量は、ＴＯＭＣＤ１０００重量部に対して、ステロール（好ましくはコレステロール）を８０重量部以下、より好ましくは７０重量部以下、さらに好ましくは６０重量部以下であることが示された。
【実施例３】
【００４２】
[コレステロール・シクロデキストリン包接化合物の好適な希釈倍率の決定]
実施例１で濾過滅菌して得られた各コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を、ヒト組み換え型ＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ−１培地（日本テクノサービス株式会社、茨城県牛久市）に添加した。５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤについては、１，０００倍希釈になるように培地に添加し、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤについては、２，０００倍と４，０００倍希釈になるようにそれぞれ培地に添加した。同様に、４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤについては、２，０００倍と４，０００倍（４０ｍｇ）希釈になるようにそれぞれ培地に添加した（Ａ１ｃ＋培地）。Ａ１ｃ＋培地を２４穴マイクロプレートのウェルにそれぞれ２ｍＬずつ加え、次いで、その各ウェルにＮＫ／Ｔ細胞株であるＳＮＴ−８細胞を１×１０５細胞（５×１０４細胞／ｍＬ）ずつ加え、３７℃のＣＯ２インキュベータ内で４日間培養し、細胞数を計測した。コントロールには、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤを２，０００倍希釈になるように添加したＡ１ｃ＋培地を用いた。コントロールにおけるこの希釈倍率は、実験を行う前に予め決定していた希釈倍率である。【００４３】
これらの実験の結果、５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤについては１，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤについては２，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤについては４，０００倍希釈の場合に、最も良い細胞増殖能が得られた（図１）。
【実施例４】
【００４４】
[コレステロール包接ＴＯＭ−β−ＣＤの使用可能な希釈倍率の検討]
実施例１で作製したコレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物を、ヒト組み換え型ＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ−１培地に２５０倍希釈から１２８，０００倍希釈まで添加し、ＳＮＴ−８細胞を用いて細胞増殖能を測定した。コントロールはコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物を２、０００倍希釈になるように添加したヒト組み換え型ＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２）を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ−１培地を用いた。コントロールを１とした時の各希釈倍率の細胞増殖能を図２に示した。２，０００倍から８，０００倍希釈では細胞増殖能はコントロールとほぼ同等であったが、それ以外の希釈倍率では細胞増殖能は低下したものの、１２８，０００倍希釈でも無添加に比べて細胞増殖能は高く、添加効果は認められた。これらの結果から、細胞培養培地におけるコレステロール濃度は０．０３ｍｇ／Ｌ（１２８，０００倍希釈のときのコレステロール濃度）〜１６ｍｇ／Ｌ（２５０倍希釈のときのコレステロール濃度）が好ましく、０．１２５ｍｇ／Ｌ（３２０００倍希釈のときのコレステロール濃度）〜１６ｍｇ／Ｌ（２５０倍希釈のときのコレステロール濃度）がより好ましく、０．２５ｍｇ／Ｌ（１６０００倍希釈のときのコレステロール濃度）〜１６ｍｇ／Ｌ（２５０倍希釈のときのコレステロール濃度）がさらに好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ（８０００倍希釈のときのコレステロール濃度）〜８ｍｇ／Ｌ（５００倍希釈のときのコレステロール濃度）がより好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ（８０００倍希釈のときのコレステロール濃度）〜４ｍｇ／Ｌ（１０００倍希釈のときのコレステロール濃度）がさらに好ましく、０．５ｍｇ／Ｌ（８０００倍希釈のときのコレステロール濃度）〜２ｍｇ／Ｌ（２０００倍希釈のときのコレステロール濃度）がより好ましい。
【実施例５】
【００４５】
［コレステロール・シクロデキストリン包接化合物添加培地の濾過性能 １（ＲＰＭＩ−１６４０培地）］
ＲＰＭＩ−１６４０培地にヒト血清アルブミン（２ｇ／Ｌ）を加えた培地に、実施例３で決定した濃度のコレステロール・シクロデキストリン包接化合物をそれぞれ添加し、濾過検討用培地を作製した。すなわち、５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤについては１，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤについては２，０００倍希釈、４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤについては４，０００倍希釈の濃度とした。また、コントロールとして、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった培地も作製した（「無添加」）。濾過鍾の上部にシリコンゴム栓を取り付け、シリコンゴム栓に１８Ｇの注射針を取り付けた。三方コックを介して５０ｍＬの注射筒の外筒にミリポア社マイレクスＧＶフィルター（フィルター径１３ｍｍ、孔径０．２２μｍ）を取り付け、該フィルターと前述の注射針を連結した。注射筒外筒に濾過検討用培地を分注し、濾過鍾の吸引口を介して−０．０５ＭＰａの圧力で注射筒の外筒中の濾過検討用培地をフィルターを介して濾過鍾中に吸引濾過した。フィルターが目詰まりするまでの各培地の総濾過量を表１に示した。なお、フィルターの目詰まりの判定は、１０滴滴下する時間が１０秒以上かかるようになった時点をフィルターが目詰まりした時点と判定した。また、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった場合の総濾過量を１．０としたときの、総濾過量の割合を濾過効率として表１に示すと共に、図３に黒い棒グラフで示した。【００４６】
【表１】
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【００４７】
表１や図３の結果から分かるように、コレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物は、コレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物と比較して、総濾過量が３倍以上に増加していた。このことから、コレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物は、コレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物よりも濾過性能（フィルター透過性）が高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
【実施例６】
【００４８】
［コレステロール・シクロデキストリン包接化合物添加培地の濾過性能 ２（Ａｒｔｅｍｉｓ−１培地）］
コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加する培地をＲＰＭＩ−１６４０培地からＡｒｔｅｍｉｓ−１培地に代えたこと以外は、実施例５に記載の方法と同様の方法で、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物の濾過性能を検討した。各培地の総濾過量を表２に示した。また、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加しなかった場合の総濾過量を１．０としたときの、総濾過量の割合を濾過効率として表２に示すと共に、図３に灰色の棒グラフで示した。【００４９】
【表２】
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【００５０】
表２や図３の結果から分かるように、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加する培地がＡｒｔｅｍｉｓ−１培地であっても、コレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物は、コレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物と比較して、総濾過量が２倍以上に増加していた。このことから、コレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物は添加する培地の種類によらず、コレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物よりも高い濾過性能（フィルター透過性）を示すことが分かった。そのため、コレステロール・ＴＯＭ−β−ＣＤ包接化合物は、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
【実施例７】
【００５１】
［濾過滅菌したコレステロール含有培地の細胞増殖能 １］
上記実施例６の濾過滅菌により得られた各培地にｒｈＩＬ−２を２５０ＩＵ／ｍＬ添加し、実施例３と同様にＳＮＴ−８細胞を用いて細胞増殖能を測定した。その結果を図４に示す。なお、実施例６で得られた培地では、コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を培地に添加した後に濾過滅菌を行っており、すなわち、濾過前にコレステロール・シクロデキストリン包接化合物を培地に添加した（「濾過前添加」）。一方、コントロールの培地として、培地を濾過した後、その培地にコレステロール・シクロデキストリン包接化合物を添加した「濾過後添加」）。【００５２】
図４から、５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤを１，０００倍希釈して用いた場合は、濾過後添加に比べて濾過前添加は、細胞増殖能が１６％程度減少し、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤを２，０００倍希釈して用いた場合は、３４％程度減少したのに対し、４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤを４０００倍希釈して用いた場合は細胞増殖能がほぼ変わらず、むしろわずかに向上した。これらの結果は、ＭＯＭ−β−ＣＤは、ＴＯＭ−β−ＣＤと比較して濾過性能が低く、濾過滅菌用フィルターでろ過される割合が高いため、濾過前添加のときは培地中のＭＯＭ−β−ＣＤ濃度がより多く低下していると考えられる。このように、ＴＯＭ−β−ＣＤは濾過性能が高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
【実施例８】
【００５３】
［濾過滅菌したコレステロール含有培地の細胞増殖能 ２］
ｒｈＩＬ−２を２５０ＩＵ／ｍＬを含むＡｒｔｅｍｉｓ−１培地に各コレステロール・シクロデキストリン包接化合物を１，０００倍希釈（５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤ）、２，０００倍希釈（４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤ）、４，０００倍希釈（４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤ）になるように添加した培地を各４Ｌ作製し、ボトルトップフィルター（コーニング社、孔径０．２２μｍ  ＰＥＳ  ４３１１１８）を取り付けたストレージボトル（コーニング社、１Ｌ  ４３１４３３）で−０．０４ＭＰａの陰圧で吸引濾過した。５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地は、濾過速度は低下したものの４Ｌ全て濾過することができた。一方、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地は１．３Ｌで目詰まりを起こし４Ｌ全量の濾過は行えなかった。４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地は目詰まりすることなく４Ｌ全て濾過することができた。【００５４】
濾過した各培地での細胞増殖能を、実施例３と同様にＳＮＴ−８細胞を用いた方法で測定した。その結果を図５に示す。なお、コントロールとしては、Ａｒｔｅｍｉｓ−１培地にコレステロール・ＭＯＭ−β−ＣＤ包接化合物の溶液を２，０００倍希釈となるように後添加した培地を用い、コントロールの培地を用いた場合における細胞数を基準（「１」）とした。図５から分かるように、５ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地では３Ｌ目から細胞増殖能が低下し、４０ｍｇ／ＭＯＭ−β−ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地では１Ｌ目で細胞増殖能が低下した。一方、４０ｍｇ／ＴＯＭ−β−ＣＤを添加したＡ１ｃ＋培地では、４Ｌ目でも細胞増殖能の低下は認められなかった（図５）。これらの結果から、ＴＯＭ−β−ＣＤは、ＭＯＭ−β−ＣＤよりも濾過性能が高く、濾過滅菌用フィルターの目詰まりを起こしにくいことが示された。したがって、ＴＯＭ−β−ＣＤは、ＭＯＭ−β−ＣＤと比較して、濾過滅菌に必要なフィルター量が少なく、より低コストで濾過滅菌が可能であることが示された。このように、ＴＯＭ−β−ＣＤは濾過性能が高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、濾過滅菌前の培地への添加（すなわち、培地へ添加後の濾過滅菌）により適した、より実用的なステロール添加剤を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、培地へ添加後の濾過滅菌により適しており、したがって、滅菌性がより高度に保証されたステロール含有培地をより簡便かつより効率的に作製することにより適したステロール添加剤を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌により適した、より実用的なステロール含有培地を提供することができ、より詳細には、濾過滅菌用フィルター透過性（濾過性能）がより高いため、濾過滅菌により適しており、したがって、より簡便かつより効率的に、滅菌性をより高度に保証することができる又は保証されたステロール含有培地を提供することができる。また、本発明によれば、濾過滅菌に必要なフィルター量がより少なくて済むため、より低コストで濾過滅菌が可能なステロール添加剤やステロール含有培地を提供することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月21日(2018.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリメチル−β−シクロデキストリンによって包接されたステロールを含有する細胞培養培地用添加剤。
【請求項２】
細胞培養培地が血清を含まない細胞培養培地である、請求項１に記載の添加剤。
【請求項３】
ステロールが、コレステロール、カンペステロール、デスモステロール、エルゴステロール、フコステロール、β−シトステロール、スチグマステロール、及びメチルコレステロールからなる群より選択される１又は２以上である、請求項１又は２に記載の添加剤。
【請求項４】
ステロールがコレステロールである、請求項１〜３のいずれかに記載の添加剤。
【請求項５】
トリメチル−β−シクロデキストリンとステロールの重量比が、トリメチル−β−シクロデキストリン１０００重量部に対して、ステロール１〜８０重量部である、請求項１〜４のいずれかに記載の添加剤。
【請求項６】
細胞が、動物若しくは植物由来の細胞、又は微生物である、請求項１〜５のいずれかに記載の添加剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の添加剤と基本培地とを含む、細胞培養培地。
【請求項８】
血清を含まない、請求項７に記載の細胞培養培地。
【請求項９】
０．０１〜５０ｍｇ／Ｌの濃度でステロールを含有する、請求項７又は８に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含む、細胞培養培地の作製方法。
（ａ）請求項１〜６のいずれかに記載の添加剤を基本培地に添加する工程；
（ｂ）上記工程（ａ）の後に、添加剤を含む基本培地を濾過滅菌し、細胞培養培地を調製する工程；
【請求項１１】
血清を基本培地に添加する工程を含まない、請求項１０に記載の作製方法。
【請求項１２】
細胞培養培地におけるステロールの濃度が０．０１〜５０ｍｇ／Ｌとなるように、工程（ａ）において、基本培地に添加剤を添加する、請求項１０又は１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において、孔径が０．０１μｍ〜２０μｍのフィルターを用いて濾過滅菌を行う、請求項１０〜１２のいずれかに記載の製造方法。
【国際調査報告】
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