(57)【要約】  ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子を有し、前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及び前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子のそれぞれが菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物、並びに前記組換え微生物を用いてピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を生産する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子を有し、
前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及び前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子のそれぞれが菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物。
【請求項２】
前記ピリドキサミン合成酵素が、ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼである、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記ピリドキシンオキシダーゼが酵素番号ＥＣ１．１．３．１２で表される、請求項１又は請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｏｌｕｍに由来する、請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号５のヌクレオチド配列を有するか、
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記ピリドキサミン合成酵素が、下記の部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有する、請求項１〜請求項５のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
（ｃ）  Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号３９）
（Ｘ８は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ９は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＡを表す）
（ｄ）  Ｘ１４Ｘ１５ＴＰＳＧＴＸ１６Ｘ１７（配列番号４０）
（Ｘ１４は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１５は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ１６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１７は、Ｎ又はＴを表す）
（ｅ）  Ｘ１８ＤＸ１９ＶＳＸ２０Ｘ２１（配列番号４１）
（Ｘ１８は、Ｖ、Ｉ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ａ、Ｔ又はＳを表し、
Ｘ２０は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｗ、又はＶを表す）
（ｆ）  Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４ＫＣＸ２５ＧＸ２６Ｘ２７Ｐ（配列番号４２）
（Ｘ２２は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ２３は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ２４は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ａ又はＱを表し、
Ｘ２５は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ２７は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表す）
（ｇ）  Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＳＸ３２ＧＸ３３Ｘ３４（配列番号４３）
（Ｘ２８は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ２９は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３０は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ３１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ３２は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ３３は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ３４は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す）
（ｈ）  Ｘ３５Ｘ３６ＲＸ３７Ｘ３８ＨＭＧＸ３９Ｘ４０Ａ（配列番号４４）
（Ｘ３５は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３６は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３７は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３８は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ３９は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ４０は、Ｔ、Ｖ又はＳを表す）
【請求項７】
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３０で表される、請求項１〜請求項６のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉに由来する、請求項１〜請求項７のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
（ｂ）配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域若しくは配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、
（ｃ）配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４のうちいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４のアミノ酸配列のうち少なくとも１つに対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
請求項１〜請求項８のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３１又はＥＣ２．６．１．１で表される、請求項１〜請求項５のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する、請求項１〜請求項５及び請求項１０のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号８のヌクレオチド配列を有するか、
（ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
請求項１〜請求項５及び請求項１０〜請求項１１のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
過酸化水素から酸素を生成する酵素活性を有する過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子をさらに有する、請求項１〜請求項１１のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子が、菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、請求項１３に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記過酸化水素分解酵素が酵素番号ＥＣ１．１１．１．６で表される、請求項１３又は１４に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号７のヌクレオチド配列を有するか、
（ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ過酸化水素から酸素を生成する酵素活性を有するか、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ過酸化水素から酸素を生成する酵素活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
請求項１３〜請求項１５のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
組換え大腸菌である、請求項１〜請求項１６のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
請求項１〜請求項１７のうちいずれか一項に記載の組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを接触させ、酸素存在下においてピリドキサミン又はその塩を生成させる、ピリドキサミン又はその塩の製造方法。
【請求項１９】
前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、前記ピリドキシンオキシダーゼ及び前記ピリドキサミン合成酵素を含む、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、さらに過酸化水素分解酵素を含む、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理による処理物である、請求項１８〜請求項２０のうちいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２２】
以下の（Ａ）及び（Ｂ）のいずれか又は両方を含む、請求項１８〜請求項２１のうちいずれか一項に記載の製造方法：
（Ａ）前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に、ピリドキシン又はその塩を連続的に添加又は複数回に分けて添加すること、
（Ｂ）前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液中において、前記ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸のモル濃度がピリドキシン又はその塩のモル濃度に対して１倍以上となるように制御すること。
【請求項２３】
前記ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸がＬ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸又はＤ−グルタミン酸である、請求項２２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ピリドキサミン又はその塩を生産可能な組換え微生物、及び該組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピリドキサミン及びその塩はビタミンＢ６の一種であり、糖化反応阻害作用を有することが知られている。ピリドキサミン及びその塩は例えば、種々の老化反応に関与する最終糖化産物（Advanced Glycation End Products; AGE）の体内への蓄積を阻害する。ＡＧＥはタンパク質の糖化によって生成する物質の総称であり、ＡＧＥの蓄積は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、慢性腎不全、アルツハイマー型認知症等の疾患を悪化させるとされている。このため、ピリドキサミン及びその塩はＡＧＥの蓄積を防ぐことでこれらの疾患の予防や治療を可能にすると期待される有望な物質である。【０００３】
また、ピリドキサミン及びその塩は統合失調症薬としての活性も有することが知られており、その実用化に向けての研究が種々なされている。その他、ピリドキサミン及びその塩の有する種々の生理活性を利用した健康食品や化粧品の開発も進められている。
ピリドキサミン及びその塩は化学的に合成することが可能である。例えば国際公開第２００６／０６６８０６号は、アラニンとギ酸を出発物質としてピリドキサミン二塩酸塩を化学的に合成する方法を開示している。また、国際公開第２００５／０７７９０２号は、ピリドキシンからピリドキサミンを化学的に合成する方法を開示している。【０００４】
一方、ピリドキサミンを生物学的に合成することも検討されている。国際公開第２００７／１４２２２２号はアクロモバクター属等の特定の微生物を用いてピリドキサールからピリドキサミンを得る方法を開示している。また、国際公開第２００７／１４２２２２号はピリドキシン存在下でアクレモニウム  フシジオイデスを培養することにより、一定量がピリドキサールに変換された実験も開示している。
特開平９−１０７９８５号公報はリゾビウム属に属しビタミンＢ６生産能を有する微生物を、好気的条件下、培地中で培養し、生成したビタミンＢ６を培養液から得るビタミンＢ６の製造方法を開示している。【０００５】
ビタミンＢ６合成に関する研究としては、国際公開第２００４／０３５０１０号はバチルス  サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｙａａＤ及びｙａａＥのうち少なくとも一方の活性が親生物よりも増強した生物を培養してビタミンＢ６を製造する方法を開示している。Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110は配列改変によりＬ−グルタミン酸を利用可能となるように改変されたピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ)を開示している。この改変配列を有するＰＰＡＴを発現する大腸菌を、飽和量のピリドキサール存在下でインキュベートすることにより、ピリドキサミンを生産することができたことが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、化学的合成によるピリドキサミン合成によっては高い反応収率が得られていない。例えば、国際公開第２００６／０６６８０６号に記載の方法では、多くの化学反応を経てピリドキサミン二塩酸塩が合成されるため、反応収率は低くなってしまう。また、国際公開第２００５／０７７９０２号に記載の方法ではピリドキサミンの二量体と三量体が生成し、反応収率もさほど高いものではない。
一方、特定の種の微生物を用いた方法である国際公開第２００７／１４２２２２号に記載の方法では、ピリドキサールからピリドキサミンへの変換効率が微生物種によって大きくばらついており、また全体としてはさほど高いものではなかった。また、国際公開第２００７／１４２２２２号に記載のピリドキシン存在下でのアクレモニウム  フシジオイデスの培養実験では、生成物の大部分がピリドキサミンではなくピリドキサールであった。さらに、特開平９−１０７９８５号公報の記載においては、生成したビタミンＢ６は、そのほとんどがピリドキソール（ピリドキシン）であり、ピリドキサミンの生成はわずかであった。【０００７】
国際公開第２００４／０３５０１０号では、ｙａａＤやｙａａＥの遺伝子を高発現させた微生物を培地で培養させることにより、ビタミンＢ６が得られたことを記載しているものの、生成物はピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキサミンリン酸などの混合物であって、ピリドキサミンを選択的に得ることはできなかった。
上記のように、ピリドキサミン又はその塩の化学的合成（例えば国際公開第２００６／０６６８０６号や国際公開第２００５／０７７９０２号）は、多くの反応及び精製工程を経るものであって、高い収率が得られていない。また、微生物の中にはピリドキサミン合成能を有するものもいるものの（例えば国際公開第２００７／１４２２２２号や特開平９−１０７９８５号公報）、そうした微生物を新たに発見することは手間がかかり、また、ビタミンＢ６群の中でピリドキサミン又はその塩を選択的に合成することができておらず、高いピリドキサミン生産効率も得られていない。また、このように天然に存在する微生物種から特定の微生物種をスクリーニングするというアプローチからは、ビタミンＢ６を高生産するためにはどの酵素あるいは遺伝子が重要であるかという分子生物学的な情報は得られない。【０００８】
さらにビタミンＢ６の生産に対して遺伝子組み換え技術を用いて作製した組換え微生物を用いた例もあるが（国際公開第２００４／０３５０１０号及びJournal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110）、物質生産の際には通常の培地を用いてビタミンＢ６が非選択的に得られたか（国際公開第２００４／０３５０１０号）、あるいは高価な原料であるピリドキサールを飽和量で用いてピリドキサミンが得られており（Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110）、ピリドキサミン又はその塩を安価に且つ選択性よく生産することは達成できていない。【０００９】
以上のような状況に鑑みて、本開示は、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で安価に生産できる組換え微生物、及び該組換え微生物を用いてピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で安価に生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は以下の態様を含む。
＜１＞
ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子を有し、
前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及び前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子のそれぞれが菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物。
＜２＞
前記ピリドキサミン合成酵素が、ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼである、＜１＞に記載の組換え微生物。
＜３＞
前記ピリドキシンオキシダーゼが酵素番号ＥＣ１．１．３．１２で表される、＜１＞又は＜２＞に記載の組換え微生物。
＜４＞
前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｏｌｕｍに由来する、＜１＞〜＜３＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜５＞
前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号５のヌクレオチド配列を有するか、
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号１のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
＜１＞〜＜４＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜６＞
前記ピリドキサミン合成酵素が、下記の部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有する、＜１＞〜＜５＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
（ｃ）  Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号３９）
（Ｘ８は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ９は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＡを表す）
（ｄ）  Ｘ１４Ｘ１５ＴＰＳＧＴＸ１６Ｘ１７（配列番号４０）
（Ｘ１４は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１５は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ１６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１７は、Ｎ又はＴを表す）
（ｅ）  Ｘ１８ＤＸ１９ＶＳＸ２０Ｘ２１（配列番号４１）
（Ｘ１８は、Ｖ、Ｉ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ａ、Ｔ又はＳを表し、
Ｘ２０は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｗ、又はＶを表す）
（ｆ）  Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４ＫＣＸ２５ＧＸ２６Ｘ２７Ｐ（配列番号４２）
（Ｘ２２は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ２３は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ２４は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ａ又はＱを表し、
Ｘ２５は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ２７は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表す）
（ｇ）  Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＳＸ３２ＧＸ３３Ｘ３４（配列番号４３）
（Ｘ２８は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ２９は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３０は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ３１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ３２は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ３３は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ３４は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す）
（ｈ）  Ｘ３５Ｘ３６ＲＸ３７Ｘ３８ＨＭＧＸ３９Ｘ４０Ａ（配列番号４４）
（Ｘ３５は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３６は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３７は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３８は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ３９は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ４０は、Ｔ、Ｖ又はＳを表す）
＜７＞
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３０で表される、＜１＞〜＜６＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜８＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉに由来する、＜１＞〜＜７＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜９＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
（ｂ）配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域若しくは配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、
（ｃ）配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４のうちいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４のアミノ酸配列のうち少なくとも１つに対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
＜１＞〜＜８＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１０＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号６のヌクレオチド配列を有するか、
（ｂ）配列番号６のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
＜１＞〜＜９＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１１＞
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３１又はＥＣ２．６．１．１で表される、＜１＞〜＜５＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１２＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する、＜１＞〜＜５＞及び＜１１＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１３＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号８のヌクレオチド配列を有するか、
（ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
＜１＞〜＜５＞及び＜１１＞〜＜１２＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１４＞
過酸化水素から酸素を生成する酵素活性を有する過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子をさらに有する、＜１＞〜＜１３＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１５＞
前記過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子が、菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、＜１４＞に記載の組換え微生物。
＜１６＞
前記過酸化水素分解酵素が酵素番号ＥＣ１．１１．１．６で表される、＜１４＞又は＜１５＞に記載の組換え微生物。
＜１７＞
前記過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子が、
（ａ）配列番号７のヌクレオチド配列を有するか、
（ｂ）配列番号７のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つ過酸化水素から酸素を生成する酵素活性を有するか、
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するか、又は
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ過酸化水素から酸素を生成する酵素活性を有するタンパク質、をコードするヌクレオチド配列を有する、
＜１４＞〜＜１６＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１８＞
組換え大腸菌である、＜１＞〜＜１７＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１９＞
＜１＞〜＜１８＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを接触させ、酸素存在下においてピリドキサミン又はその塩を生成させる、ピリドキサミン又はその塩の製造方法。
＜２０＞
前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、前記ピリドキシンオキシダーゼ及び前記ピリドキサミン合成酵素を含む、＜１９＞に記載の製造方法。
＜２１＞
前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、さらに過酸化水素分解酵素を含む、＜２０＞に記載の製造方法。
＜２２＞
前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理による処理物である、＜１９＞〜＜２１＞のうちいずれか１つに記載の製造方法。
＜２３＞
以下の（Ａ）及び（Ｂ）のいずれか又は両方を含む、＜１９＞〜＜２２＞のうちいずれか１つに記載の製造方法：
（Ａ）前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に、ピリドキシン又はその塩を連続的に添加又は複数回に分けて添加すること、
（Ｂ）前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液中において、前記ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸のモル濃度がピリドキシン又はその塩のモル濃度に対して１倍以上となるように制御すること。
＜２４＞
前記ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸がＬ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸又はＤ−グルタミン酸である、＜２３＞に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産できる組換え微生物、及び該組換え微生物を用いてピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験７におけるピリドキシン塩酸塩濃度、ピリドキサール塩酸塩濃度及びピリドキサミン二塩酸塩濃度の測定結果を示す。
【図２】試験８におけるピリドキシン塩酸塩濃度、ピリドキサール塩酸塩濃度及びピリドキサミン二塩酸塩濃度の測定結果を示す。
【図３】試験９におけるピリドキシン塩酸塩濃度、ピリドキサール塩酸塩濃度及びピリドキサミン二塩酸塩濃度の測定結果を示す。
【図４−１】配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４の配列のアラインメントを示す。
【図４−２】配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４の配列のアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子を有し、
前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及び前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子のそれぞれが菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物（以下、本開示に係る組換え微生物という）を提供する。なお、本開示において導入とは、菌体内で発現可能となるように導入することをいう。
【００１４】
これまで、化学的方法によっても生物学的方法によっても、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産する方法は知られていなかった。ピリドキサミンの構造を以下に示す。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
しかし、驚くべきことに、上記のような構成を有する組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いることにより、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産できることを本発明者は見いだした。その理由は必ずしも明らかではないが、上記２種類の酵素が、それぞれ、菌体外から導入されているか又は菌体に内在するがその発現が強化されていることによって、導入又は強化された遺伝子から酵素を高い発現量で発現することが可能となり、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を生成する過程における各反応の平衡及びこの過程で生み出される副産物等や消費される原料等の量が、上記２種類の酵素の協働的な働きによって、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩の生成に有利となるためではないかと推測される。
さらに、本開示に係る組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いた場合には、中間生成物としてピリドキサールをいったん生成していると推測される。しかし、ピリドキサールはアルデヒドであるために反応性が高く、そのため中性付近のｐＨ条件では酵素等の触媒が存在しなくてもアラニン等のアミノ基供与体と自発的に反応して、ピリドキサミン及び副生成物を生成する。このように、ピリドキサールの自発的な反応においては、副生成物が生成し、ピリドキサミン生成の選択性が高くないため、ピリドキサミンの生産効率は高くはならないと考えられる。対照的に、本開示に係る組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いた場合には、中間体であるピリドキサールはピリドキサミン合成酵素により速やかにピリドキサミンに変換され、ピリドキサールの蓄積が抑制され、副生成物の生産も抑制される。これにより、高いピリドキサミン生産効率が達成できる。
【００１７】
このような上記２種類の酵素の協働作用は、これまで見いだされていなかったものであり、これによってピリドキシン又はその塩を用いることにより、化学的合成方法のように多ステップの反応をいちいち行う必要なく、高い生産効率でピリドキサミン又はその塩を製造することが可能となった。しかも、本開示に係る組換え微生物を用いることで、ビタミンＢ６群に含まれる他の物質を大量に副生することを避けることができる。また、ピリドキシンはピリドキサールと比較して工業的に安価に入手可能な原料であり、ピリドキシンを出発物質にできることで、ピリドキサミン又はその塩を安価に製造することが可能となった。
【００１８】
＜ピリドキシンオキシダーゼ＞
ピリドキシンオキシダーゼは、ピリドキシン−４−オキシダーゼとも呼ばれる酵素である。ピリドキシンオキシダーゼは、酵素番号ＥＣ１．１．３．１２で表される酵素であってもよい。ピリドキシンオキシダーゼは、ピリドキシンを酸素で酸化することにより、ピリドキサールに変換する反応を触媒する酵素活性を有する酵素である。なお、ピリドキサールやピリドキシンは周囲の環境により塩としても存在しうるが、表記の簡略化のため、本開示においては酵素の活性の記載については塩への言及は省略して表記する。ピリドキシンオキシダーゼは、ピリドキシンを酸化する際には、酸素を消費して過酸化水素を生成する。生物に有害な過酸化水素の生成のため、ピリドキシンオキシダーゼをピリドキシンから別の物質を生産するために用いても高い収率は達成できないと考えられてきた。しかし、本開示に係る組換え微生物を用いると、ピリドキシン又はその塩を原料としたピリドキサミン又はその塩の生産が高い生産効率で達成できるという予想外の効果が得られた。
【００１９】
前記ＥＣ１．１．３．１２のピリドキシンオキシダーゼは、例えばエンテロバクター  クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、メゾリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、ミクロバクテリウム  ルテオーラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｏｌｕｍ）、オクロバクテリウム  アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）ｓｐ．ＭＡ−１などに由来するピリドキシンオキシダーゼであってもよい。なお、ミクロバクテリウム  ルテオーラムのピリドキシンオキシダーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
＜ピリドキサミン合成酵素＞
本開示で用いられるピリドキサミン合成酵素とは、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有する任意の酵素を指す。なお、ピリドキサールやピリドキサミンは周囲の環境により塩としても存在しうるが、表記の簡略化のため、本開示においては酵素の活性の記載については塩への言及は省略して表記する。ピリドキサミン合成酵素の例としては、例えば、酵素番号ＥＣ２．６．１．３０で表されるピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ＥＣ２．６．１．３１で表されるピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、ＥＣ２．６．１．１で表されるアスパラギン酸トランスアミナーゼ、及びＥＣ２．６．１．５４で表されるピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼが挙げられる。
なおＥＣ２．６．１．１で表されるアスパラギン酸トランスアミナーゼは、ピリドキサールリン酸を補酵素とするホロ酵素であり、アスパラギン酸のアミノ基を２−オキソグルタル酸に転移し、グルタミン酸とオキサロ酢酸を生成する酵素活性を有する。当該アスパラギン酸トランスアミナーゼはピリドキサールリン酸と結合していないアポ酵素の状態では、グルタミン酸又はアスパラギン酸のアミノ基をピリドキサールに転移しピリドキサミンを合成することが知られている（JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1962年1月, Vol.237, No.1, p.127-132）。つまりＥＣ２．６．１．１で表されるアスパラギン酸トランスアミナーゼのアポ酵素の形態がＥＣ２．６．１．３１のピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼである。このため、アスパラギン酸トランスアミナーゼは、補酵素であるピリドキサールリン酸が存在しない又は量が少ない場合にはアポ酵素として存在し、ピリドキサミンを合成する。
ピリドキサミン合成酵素は、ピリドキサール又はその塩からピリドキサミン又はその塩を合成する際に、特定のアミノ酸のアミノ基部分を（＝Ｏ）に酸化し、当該アミノ基を転移させてピリドキサミン又はその塩を生成する酵素活性を有する。例えば、ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼはＬ−アラニン及びＤ−アラニンのいずれも利用可能であり、ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ及びアポ酵素の状態のアスパラギン酸トランスアミナーゼはＤ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、及び、Ｌ−グルタミン酸のいずれも利用可能であり、ピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼはＤ−グルタミン酸を利用可能である。
【００２１】
前記ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは、例えば、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、スピロヘータ門又はフィルミクテス門に属する微生物に由来するものであってもよい。ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは、例えば、メゾリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、オクロバクテリウム  アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＭＡ−１）などに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼであってもよい。なお、例えば、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは、その他、例えば、メソリゾビウム  ｓｐ．ＹＲ５７７（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号１８のアミノ酸配列を有する）、シュードアミノバクター  サリシラトキシダンス（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓ）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号１９のアミノ酸配列を有する）、Ｂａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号２０のアミノ酸配列を有する）、Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号２１のアミノ酸配列を有する）、リゾビウム  ｓｐ．ＡＣ４４／９６（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号２２のアミノ酸配列を有する）、エルウィニア  トレタナ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａ）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号２３のアミノ酸配列を有する）、Ｈｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号２４のアミノ酸配列を有する）であってもよい。
【００２３】
前記ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼは、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）やドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）などに由来するピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼであってもよい。なお、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼは配列番号４のアミノ酸配列を有する。前記アスパラギン酸トランスアミナーゼは、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）などに由来するアスパラギン酸トランスアミナーゼであってもよい。また、前記ピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼは、例えばクロストリジウム  ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）由来のピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼであってもよい。
【００２４】
＜過酸化水素分解酵素＞
本開示に係る組換え微生物は、過酸化水素を分解する酵素活性を有する過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子をさらに有していてもよい。本開示で用いられる過酸化水素分解酵素とは、前記ピリドキシンオキシダーゼがピリドキシンを酸化する際に生成する過酸化水素を分解する酵素活性を有する任意の酵素を指す。過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子をさらに有することにより、生物及び酵素活性に対して有害な過酸化水素の蓄積をより低減でき、ピリドキサミン又はその塩の生産効率のさらなる向上や、反応の継続可能時間の延長の点で有利である。また、過酸化水素分解酵素は酸素を再生する酵素活性を有していてもよい。酸素を再生する酵素活性の存在は、特に低酸素環境下においてピリドキサミン又はその塩の生産を行う場合に、反応系中の酸素の濃度を高めることができ、ピリドキサミン又はその塩の生産効率のさらなる向上の点で有利である。
このような過酸化水素分解酵素の例としては、酵素番号（ＥＣ）１．１１．１．１、１．１１．１．２、１．１１．１．３、１．１１．１．５、１．１１．１．６、１．１１．１．７、１．１１．１．８、１．１１．１．９、１．１１．１．１０、１．１１．１．１１、１．１１．１．１３、１．１１．１．１４、１．１１．１．１６、１．１１．１．１７、１．１１．１．１８、１．１１．１．１９、１．１１．１．２１又は１．１１．１．２３で表される酵素が挙げられる。この中でも酵素番号ＥＣ１．１１．１．６で表されるカタラーゼ及びＥＣ１．１１．１．２１で表されるカタラーゼペルオキシダーゼが、酸素再生能力という点から好ましく、酵素番号ＥＣ１．１１．１．６で表されるカタラーゼがさらに好ましい。
【００２５】
前記過酸化水素分解酵素は、例えばリステリア  ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サッカロミセス  セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などに由来するカタラーゼであってもよい。あるいは、前記過酸化水素分解酵素は、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などに由来するカタラーゼペルオキシダーゼであってもよい。なお、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉのカタラーゼは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
前記ピリドキシンオキシダーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及び過酸化水素分解酵素は、いずれも、当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、例えば上記例示した微生物等の天然の微生物が有する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）を未改変のまま有するタンパク質であってもよいし、このようなアミノ酸配列に対してその酵素活性（上述の酵素活性）を失わない範囲で配列の改変を加えたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。このような改変としては、アミノ酸残基の挿入、欠失、置換及びアミノ酸配列Ｎ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加が挙げられる。アミノ酸残基の挿入、欠失及び置換のうち１つ以上がある場合は、挿入、欠失及び置換の各々は、存在する場合は、例えば１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜２０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよく、アミノ酸残基の挿入、欠失及び置換の総数は例えば１〜５０アミノ酸残基、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよい。また、末端に付加されるアミノ酸残基の数としては、存在する場合は一末端当たり例えば１〜５０アミノ酸残基、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよい。このような追加のアミノ酸残基は、細胞外への分泌等のためのシグナル配列を形成していてもよい。シグナル配列の例としては、大腸菌のＯｍｐＡシグナル配列などが挙げられる。
【００２７】
あるいは、各酵素は、当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）そのものを有するタンパク質、又は当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）に対して８０％以上、あるいは８５％以上、あるいは９０％以上、あるいは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、所望の酵素活性（上述の酵素活性）を有するタンパク質であってもよい。ここで、配列同一性は例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで評価することができる。
【００２８】
例えば、ピリドキシンオキシダーゼは、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンオキシダーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号１のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号１のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はピリドキシンオキシダーゼとしての活性を有しているべきである。ピリドキシンオキシダーゼ活性は、例えば、酸素存在下で基質としてのピリドキシンの水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサールを高速液体クロマトグラフィーで定量するか、あるいは生成したピリドキサールとトリスヒドロキシメチルアミノメタンのようなアミンとの間でシッフ塩基を形成させ４１５ｎｍ等での吸光度測定などで該シッフ塩基を定量することにより測定できる。
【００２９】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４のうちいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号２のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号１９のアミノ酸配列、配列番号２０のアミノ酸配列、配列番号２１のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列、及び配列番号２４のアミノ酸配列のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。該タンパク質も、ピリドキサミン合成酵素としての活性を有しているべきである。この場合、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性は、例えば、基質としてのピリドキサール及びＬ−アラニンを含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
【００３０】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、下記の部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素であってもよい。この場合、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性は、例えば、基質としてのピリドキサール及びＬ−アラニンを含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
（ｃ）  Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号３９）
（Ｘ８は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ９は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＡを表す）
（ｄ）  Ｘ１４Ｘ１５ＴＰＳＧＴＸ１６Ｘ１７（配列番号４０）
（Ｘ１４は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１５は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ１６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１７は、Ｎ又はＴを表す）
（ｅ）  Ｘ１８ＤＸ１９ＶＳＸ２０Ｘ２１（配列番号４１）
（Ｘ１８は、Ｖ、Ｉ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ａ、Ｔ又はＳを表し、
Ｘ２０は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｗ、又はＶを表す）
（ｆ）  Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４ＫＣＸ２５ＧＸ２６Ｘ２７Ｐ（配列番号４２）
（Ｘ２２は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ２３は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ２４は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ａ又はＱを表し、
Ｘ２５は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ２７は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表す）
（ｇ）  Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＳＸ３２ＧＸ３３Ｘ３４（配列番号４３）
（Ｘ２８は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ２９は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３０は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ３１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ３２は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ３３は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ３４は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す）
（ｈ）  Ｘ３５Ｘ３６ＲＸ３７Ｘ３８ＨＭＧＸ３９Ｘ４０Ａ（配列番号４４）
（Ｘ３５は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３６は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３７は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３８は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ３９は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ４０は、Ｔ、Ｖ又はＳを表す）
【００３１】
図４−１及び図４−２には、配列番号２及び配列番号１８〜配列番号２４の配列のアラインメントを示す。図４−１及び図４−２中、ＭｌＰＰＡＴはＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＭｓＰＰＡＴはＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＰｓＰＰＡＴはＰｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＢｌＰＰＡＴはＢａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＳｓＰＰＡＴはＳｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＲｓＰＰＡＴはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＥｔＰＰＡＴはＥｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＨｇＰＰＡＴはＨｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを表す。部分アミノ酸配列（ｃ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６５番目〜７０番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｄ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１４４番目〜１５２番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｅ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１７０番目〜１７６番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｆ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１９４番目〜２０３番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｇ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３２９番目〜３３７番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｈ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３４３番目〜３５３番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｃ）は、タンパク質のＮ末端から５５番目〜８０番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から５６番目〜７５番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｄ）は、タンパク質のＮ末端から１３４番目〜１６２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１３９番目〜１５７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｅ）は、タンパク質のＮ末端から１６０番目〜１８６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１６５番���〜１８１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｆ）は、タンパク質のＮ末端から１８４番目〜２１３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１８９番目〜２０８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｇ）は、タンパク質のＮ末端から３１９番目〜３４７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３２４番目〜３４２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｈ）は、タンパク質のＮ末端から３３３番目〜３６３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３３８番目〜３５８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。本開示において配列同士のアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで行うことができる。
【００３２】
本開示において、酵素Ｂのアミノ酸配列における「酵素ＡのＮ末端からＸ番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基」とは、前記酵素Ａのアミノ酸配列を酵素Ｂのアミノ酸配列に対してアラインメントしたときに、酵素Ａのアミノ酸配列のＮ末端からＸ番目のアミノ酸残基と対応する酵素Ｂのアミノ酸配列上のアミノ酸残基を指す。
【００３３】
図４−１及び図４−２から分かるように、部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）は、一群のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼの間で高度に保存された領域である。したがって、部分アミノ酸配列（ｃ）〜部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含むピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのバリエーションは、本開示におけるピリドキサミン合成酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１９７番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はピリドキサールとの結合に重要であり、Ｎ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は触媒活性に重要であり、Ｎ末端から１７１番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基及びＮ末端から１４６番目のトレオニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はピリドキサールとの結合を補助し、Ｎ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基及びＮ末端から３４５番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はアミノ酸認識に重要であると考えられており（Journal of Biological Chemistry, 2008, vol. 283, No.2 pp1120-1127）、ピリドキシン合成酵素の機能上、重要な残基である。これらの残基が保存されていれば、本開示におけるピリドキシン合成酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。ただし、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は、グルタミン酸以外にアスパラギン酸であってもよい。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は、アルギニン以外にメチオニン又はグルタミンであってもよい。
【００３４】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｃ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｃ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｃ−１）を含んでいてもよい。
（ｃ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９（配列番号４５）
Ｘ１が、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭを表し、
Ｘ２は、Ｉ、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ４は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ５は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ６は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ７は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ａ又はＬを表し、
Ｘ９は、Ｌ、Ｍ、Ｐ又はＶを表し、
Ｘ１０は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｌ又はＩを表し、
Ｘ１２は、Ｅ又はＱを表し、
Ｘ１３は、Ａ又はＧを表し、
Ｘ１４は、Ａ又はＶを表し、
Ｘ１５は、Ａ又はＬを表し、
Ｘ１６は、Ａ、Ｌ、Ｈ又はＹを表し、
Ｘ１７は、Ｓ、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ１８は、Ｌ、Ｆ、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ｉ、Ｆ、Ｖ又はＬを表す。
部分アミノ酸配列（ｃ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６３番目〜８１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｃ−１）は、タンパク質のＮ末端から５３番目〜９１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から５８番目〜８６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３５】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１４６番目のトレオニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｄ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｄ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｄ−１）を含んでいてもよい。
（ｄ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＴＰＳＧＴＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４  Ｘ１５Ｘ１６（配列番号４６）
Ｘ１は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３は、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｃ又はＦを表し、
Ｘ４は、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｌ又はＴを表し、
Ｘ５は、Ｃ又はＶを表し、
Ｘ６は、Ｈ、Ｎ又はＡを表し、
Ｘ７は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ８は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ９は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１０は、Ｎ又はＴを表し、
Ｘ１１は、Ｐ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｉ、Ｖ、Ｌ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｖ、Ｒ又はＰを表し、
Ｘ１４は、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＤを表し、
Ｘ１５は、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ１６は、Ｇ又はＡを表す。
部分アミノ酸配列（ｄ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１３８番目〜１５８番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｄ−１）は、タンパク質のＮ末端から１２８番目〜１６８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１３３番目〜１６３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３６】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１７１番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｅ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｅ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｅ−１）を含んでいてもよい。
（ｅ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＸ７ＶＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号４７）
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ又はＡ
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｒ又はＥを表し、
Ｘ３は、Ｙ、Ｎ、Ｌ又はＦを表し、
Ｘ４は、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＶを表し、
Ｘ５は、Ｉ、Ｌ又はＹを表し、
Ｘ６は、Ｖ、Ａ又はＩを表し、
Ｘ７は、Ａ、Ｓ又はＴを表し、
Ｘ８は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ９は、Ｆ、Ｗ又はＶを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ａ又はＬを表し、
Ｘ１１は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ１２は、Ｍ、Ｖ又はＬを表す。
部分アミノ酸配列（ｅ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１６５番目〜１７９番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｅ−１）は、タンパク質のＮ末端から１５５番目〜１８９番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１６０番目〜１８４番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３７】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１９７番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｆ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｆ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｆ−１）を含んでいてもよい。
（ｆ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＣＸ１０ＧＸ１１Ｘ１２ＰＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｓ（配列番号４８）
Ｘ１は、Ａ、Ｓ、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ２は、Ｄ、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ又はＭを表し、
Ｘ４は、Ｙ、Ｆ、Ｌ又はＣを表し、
Ｘ５は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ６は、Ｔ又はＡを表し、
Ｘ７は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ８は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ９は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｑ又はＡを表し、
Ｘ１０は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ１１は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ１２は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｇ、Ａ又はＳを表し、
Ｘ１４は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ１５は、Ｔ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ１６は、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＦを表し、
Ｘ１７は、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ａ又はＩを表し、
Ｘ１８は、Ｇ、Ａ、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１９は、Ｖ、Ｉ又はＡを表す。
部分アミノ酸配列（ｆ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１８８番目〜２１１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｆ−１）は、タンパク質のＮ末端から１７８番目〜２２１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１８３番目〜２１６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３８】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｇ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｇ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｇ−１）を含んでいてもよい。
（ｇ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＳＸ６ＧＸ７Ｘ８（配列番号４９）
Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ2は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ3は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ4は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ5は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ6は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ7は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ8は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す。
部分アミノ酸配列（ｇ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３２８番目〜３３７番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｇ−１）は、タンパク質のＮ末端から３１８番目〜３４７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３２３番目〜３４２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３９】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３４５番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｈ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｈ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｈ−１）を含んでいてもよい。
（ｈ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＲＸ６Ｘ７ＨＭＧＸ８Ｘ９ＡＸ１０Ｘ１１（配列番号５０）
Ｘ１は、Ｌ、Ｑ、Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｙ又はＷを表し、
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｈ又はＤを表し、
Ｘ３は、Ｋ、Ｒ又はＮを表し、
Ｘ４は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ５は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ７は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ８は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ９は、Ｔ、Ｖ又はＳを表し、
Ｘ１０は、Ｑ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｙ又はＧを表し、
Ｘ１１は、Ｐ又はＧを表す。
部分アミノ酸配列（ｈ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３４０番目〜３５５番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｈ−１）は、タンパク質のＮ末端から３３０番目〜３６５番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３３５番目〜３６０番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４０】
また、ピリドキサミン合成酵素は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号２のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号２のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はピリドキサミン合成酵素としての活性（ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性、本開示においてはピリドキサミン合成酵素活性ともいう）を有しているべきである。ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性（ピリドキサミン合成酵素活性）は、例えば、基質としてのピリドキサール及び必要なアミノ酸（配列番号２のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質の場合は例えばＬ−アラニン）を含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号４のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号４のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号４のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はピリドキサミン合成酵素としての活性（ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性、本開示においてはピリドキサミン合成酵素活性ともいう）を有しているべきである。ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素（ピリドキサミン合成酵素活性）は、例えば、基質としてのピリドキサール及び必要なアミノ酸（配列番号４のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質の場合は例えばＬ−グルタミン酸若しくはＬ−アスパラギン酸又はその塩）を含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
【００４１】
また、過酸化水素分解酵素は、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号３のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、過酸化水素分解酵素は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号３のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号３のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質は過酸化水素分解酵素としての活性を有しているべきである。過酸化水素分解酵素活性は、例えば、基質としての過酸化水素の水溶液に試験対象のタンパク質を加え、過酸化水素量の減少を２４０ｎｍでの吸光度の減少などを指標として定量することにより測定できる。
【００４２】
＜ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子＞
ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、上述のピリドキシンオキシダーゼをコードする任意の遺伝子であってよい。ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、上述のピリドキサミン合成酵素をコードする任意の遺伝子であってよい。過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子は、上述の過酸化水素分解酵素をコードする任意の遺伝子であってよい。これらの遺伝子がコードする酵素は、当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）に限られず、前記既知のアミノ酸配列とは異なる改変されたアミノ酸配列を有する酵素であってもよい。
【００４３】
このような遺伝子は、各酵素を有する微生物として上に例示された微生物（由来となる微生物）が天然に有する遺伝子等の、既知の遺伝子であってもよいし、所望の酵素活性が得られる範囲内において、上述のように当該酵素の既知のアミノ酸配列から改変された改変アミノ酸配列をコードするようにヌクレオチド配列を改変させた遺伝子であってもよい。そのような改変アミノ酸配列の例としては、上記のような、配列番号１〜４のアミノ酸配列のいずれかに類似するアミノ酸配列が挙げられる。また、特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、コドンの縮重の範囲内で変化させることができる。この場合、組換え微生物の宿主となる微生物において使用頻度が高いコドンを使用した方が、遺伝子の発現効率の点からは好ましい。
【００４４】
なお、遺伝子のヌクレオチド配列は、コードすべきアミノ酸配列からコドン表を元に設計することもできる。設計したヌクレオチド配列は、既知のヌクレオチド配列を遺伝子組み換え技術を利用して改変することで得てもよいし、ヌクレオチド配列を化学的に合成することで得てもよい。
ヌクレオチド配列を改変する方法としては、例えば、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、又は、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法、市販の突然変異導入キットを使用する方法などが挙げられる。
【００４５】
例えば、前記ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子、前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子は、いずれも、当該酵素活性を有するポリヌクレオチドをコードする既知のヌクレオチド配列（例えば、上記例示した微生物等の生物中に天然に存在する遺伝子が有するヌクレオチド配列）を未改変のまま有するＤＮＡであってもよいし、このようなヌクレオチド配列に対して、コードされる酵素がその酵素活性（上述の酵素活性）を失わない範囲で配列の改変を加えたヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。このような改変としては、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換及びヌクレオチド配列５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加が挙げられる。ヌクレオチドの挿入、欠失及び置換のうち１つ以上がある場合は、挿入、欠失及び置換の各々は、存在する場合は、例えば１〜９０ヌクレオチド、あるいは１〜６０ヌクレオチド、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜２０アミノ酸残基、あるいは１〜１５ヌクレオチド、あるいは１〜１０ヌクレオチド、あるいは１〜５ヌクレオチドであってもよく、ヌクレオチドの挿入、欠失及び置換の総数は例えば１〜１００ヌクレオチド、あるいは１〜５０ヌクレオチド、あるいは１〜３０ヌクレオチド、あるいは１〜１０ヌクレオチド、あるいは１〜５ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの挿入や欠失は局所的には存在していてもよいが、ヌクレオチド配列全体としては大規模なフレームシフトを生じていないことが好ましい。また、末端に付加されるヌクレオチドの数としては、存在する場合は一末端当たり例えば１〜１５０ヌクレオチド、あるいは１〜１００ヌクレオチド、あるいは１〜５０ヌクレオチド、あるいは１〜３０ヌクレオチド、あるいは１〜１０ヌクレオチド、あるいは１〜５ヌクレオチドであってもよい。このような追加のヌクレオチドは、細胞外への分泌等のためのシグナル配列をコードしていてもよい。
【００４６】
あるいは、各酵素をコードする遺伝子は、当該酵素活性を有するポリヌクレオチドをコードする既知のヌクレオチド配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列）そのものを有するＤＮＡ、又は前記既知のヌクレオチド配列に対して８０％以上、あるいは８５％以上、あるいは９０％以上、あるいは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、所望の酵素活性（上述の酵素活性）を有する酵素をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、配列同一性は例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで評価することができる。
【００４７】
あるいは、各酵素をコードする遺伝子は、当該酵素活性を有するポリヌクレオチドをコードする既知のヌクレオチド配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列）そのものを有するＤＮＡ、又は前記既知のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、所望の酵素活性（上述の酵素活性）を有する酵素をコードするＤＮＡであってもよい。また、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションとは以下のようにして行うことができる。
ハイブリダイゼーションでは、基準となるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列からなるＤＮＡをプローブとして、対象とするＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した２０ヌクレオチド以上、好ましくは５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２００ヌクレオチド以上を用いることができる。基準となるヌクレオチド配列と同じヌクレオチド長を有し、全長に渡って相補的なＤＮＡをプローブとして用いることも好ましい。ハイブリダイゼーションのための条件とは、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般的に用いている条件を例示できる。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件を意味する。例えば、６×ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中でプローブとともに５５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。ついでフィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄するなどを例示することができる。ストリンジェントな条件としては、フィルターの洗浄工程における０．１×ＳＳＣ、５０℃の条件であり、更にストリンジェントな条件としては、同工程における０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を挙げることができる。
【００４８】
例えば、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列（ミクロバクテリウム  ルテオーラムのピリドキシンオキシダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号５のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号５のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンオキシダーゼは、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号５のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００４９】
ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号６のヌクレオチド配列（メゾリゾビウム  ロティのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）又は配列番号８のヌクレオチド配列（大腸菌のピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号６又は８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号６又は８のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号６又は８のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
【００５０】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号６又は８のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号６又は８のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００５１】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号６及び配列番号２５〜配列番号３１のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号２５（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号２６（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号２７（Ｂａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号２８（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号２９（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号３０（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、及び配列番号３１（Ｈｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００５２】
大腸菌などの原核生物を宿主とした組換え微生物において発現させる場合、発現を容易とするためにコドンを最適化してもよい。例えば、宿主となる原核生物において各アミノ酸をコードするコドンのうち最も使用頻度が高いものを当該アミノ酸のコドンとして高い頻度で使用するようにヌクレオチド配列を改変してもよい。このような観点からは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡとして、例えば、配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡを用いてもよいし、配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを用いてもよい。配列番号１０のヌクレオチド配列は、その５’末端から１７ヌクレオチドは上流領域となっており、１８番目のヌクレオチド〜２０番目のヌクレオチドに開始コドンがある。このため、これのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域をピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子領域として用いてもよい。同様に、配列番号３２〜配列番号３８のヌクレオチド配列は、いずれも、その５’末端から１７ヌクレオチドは上流領域となっており、１８番目のヌクレオチド〜２０番目のヌクレオチドに開始コドンがある。このため、これらのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域をピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子領域として用いてもよい。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
【００５３】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号１０のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域若しくは配列番号３２〜配列番号３８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡ、又は配列番号１０のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号３２のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号３３のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号３４のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｂａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号３５のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号３６のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号３７のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、及び配列番号３８のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｈｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００５４】
過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列（リステリア  ゼーリゲリのカタラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号７のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ過酸化水素分解酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号７のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、過酸化水素分解酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、過酸化水素分解酵素は、配列番号７のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号７のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、過酸化水素分解酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００５５】
＜ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子を有する組換え微生物＞
本開示に係る組換え微生物内において、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、それぞれ、菌体に内在するがその発現を強化した遺伝子であってもよいし、菌体外から菌体内へと導入された遺伝子であってもよい。また、菌体に内在するがその発現を強化した遺伝子と、菌体外から菌体内へと導入された遺伝子の両方が組換え微生物内に存在していてもよい。また、本開示に係る組換え微生物内において、菌体に内在するがその発現が強化されたピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子、及び／又は菌体外から菌体内へと導入されたピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子に加えて、さらに、菌体内に内在する発現強化されていない（例えばプロモータ未改変の）ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子が存在していてもよい。同様に、菌体に内在するがその発現が強化されたピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び／又は菌体外から菌体内へと導入されたピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、に加えて、さらに、菌体内に内在する発現強化されていない（例えばプロモータ未改変の）ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が存在していてもよい。本開示においては、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子のそれぞれについて、菌体に内在する遺伝子の発現の強化及び菌体外から菌体内への遺伝子の導入のうち１つ以上を行っているため、たとえ菌体内に発現強化されていない遺伝子が元々存在していたとしても、当該発現強化されていない元々の遺伝子による発現量よりも顕著に高い発現量が得られ、これにより高いピリドキサミン生産効率が達成できる。
本開示に係る組換え微生物が過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子をさらに有する場合には、該過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子は、菌体に内在する遺伝子であってもよいし、菌体に内在するがその発現を強化した遺伝子であってもよいし、菌体外から菌体内へと導入された遺伝子であってもよい。ただし、反応速度が大きくなると過酸化水素の生成量も増大するため、過酸化水素分解酵素の発現量を増やすために、菌体に内在する過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子の発現を強化すること、及び過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子を菌体外から菌体内に導入すること、のうち少なくとも１つを行うことが好ましい。
【００５６】
言い換えると、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子の各々は、宿主微生物のゲノムに内在するがプロモーターの置換等の操作を行うことによってその発現を強化した遺伝子であってもよいし、プラスミド等のベクターを用いて菌体外から菌体内へと導入された遺伝子であってもよい。これに加えて、組換え前の宿主微生物のゲノムに内在する発現強化されていない遺伝子がさらに存在してもよい。本開示においては、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子のそれぞれを宿主微生物の細胞外から導入するか、あるいはプロモーターの置換等によって宿主微生物の細胞に内在する当該遺伝子の発現を強化することによって、当該遺伝子の発現を上昇させ、前記２種類の酵素の組み合わせによるピリドキサミン生産能力を付与している。ここで、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子の各々については、導入又は発現強化を行う場合には、宿主微生物の細胞外からの導入と、プロモーターの置換等による当該遺伝子発現の強化のうち、一方のみを行ってもよいし、両方を行ってもよい。
【００５７】
本開示に係る組換え微生物は、過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子を有しても有しなくてもよい。本開示に係る組換え微生物が過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子をさらに有する場合には、過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子は、組換え前の宿主微生物のゲノムに内在する遺伝子であってもよいし、宿主微生物のゲノムに内在するがプロモーターの置換等の操作を行うことによってその発現を強化した遺伝子であってもよいし、プラスミド等のベクターを用いて菌体外から菌体内へと導入された遺伝子であってもよい。過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子について、導入又は発現強化を行う場合には、宿主微生物の細胞外からの導入と、プロモーターの置換等による当該遺伝子発現の強化のうち、一方のみを行ってもよいし、両方を行ってもよい。
【００５８】
ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子について、上記のような遺伝子発現の上昇を行わなければ、ピリドキサミン又はその塩の高生産のための十分な生産能力は得られない。このため、本開示に係る組換え微生物においては、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子の両方について、それぞれ、菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化の少なくとも一方を行っている。なお、菌体外からの酵素遺伝子の導入は、必ずしも、宿主微生物に存在しない酵素遺伝子を補うための導入に限られず、宿主微生物に内在する酵素遺伝子についても発現を増大させることを目的に行ってもよい。宿主微生物に存在しない酵素遺伝子については、例えばＫＥＧＧやＢＲＥＮＤＡといった酵素データベースを用いて容易に確認することができる。
【００５９】
宿主微生物に内在する遺伝子のプロモーターを別のプロモーターで置換することによって当該遺伝子の発現を強化する場合、そのような別のプロモーター（新たに導入するプロモーター）としては宿主微生物中で遺伝子の発現を強化できる（プロモーター置換前よりも強化することができる）ものであれば特に制限はなく、構成型プロモーターでも誘導型プロモーターでもよい。プロモーターの置換は、一般的な遺伝子組み換え技術を用いて行うことができる。なお、宿主微生物に内在するプロモーターの配列は、新たに導入したプロモーターによる発現に実用上問題となる悪影響を与えなければ、部分的にまたは完全に残しておいても構わない。
宿主微生物が例えば原核生物である場合には、新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例としては、大腸菌由来のｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変又は設計されたプロモーター配列も利用できる。
【００６０】
宿主微生物が例えば糸状菌である場合には、新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例としては、セロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ）プロモーター、エンドグルカナーゼ（ｅｇｌ）プロモーター、キシラナーゼＩＩＩ（ｘｙｎ３）プロモーター、Ｕ６プロモーター、α−アミラーゼ（ａｍｙ）プロモーター、などが挙げられる。
【００６１】
宿主微生物が例えば酵母である場合には、新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ペプチド鎖伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターなどが挙げられる。なお、上記プロモーターの配列の由来は宿主微生物となる酵母に限定されない。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのように、外来のプロモーターを用いてもよい。
【００６２】
宿主微生物の菌体外から遺伝子（外来（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子）を導入する場合には、その方法としては、菌体内（細胞内）に遺伝子を導入し、該遺伝子にコードされる酵素を発現させることができれば、特に制限はなく、酵素遺伝子を保有するプラスミドによる形質転換、酵素遺伝子のゲノムへの導入、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。遺伝子を導入する際には、該遺伝子を組み込んだ発現ベクターを菌体内に導入してもよい。該発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列を組み込んだものであれば特に限定されるものではないが、形質転換効率や翻訳効率を向上させるなどの観点より、以下に示すような構成を示すプラスミドベクターやファージベクターであることがより好ましい。
【００６３】
発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記宿主微生物を形質転換しうるものであれば特に限定されない。必要に応じて、該ヌクレオチド配列の他に、他の領域を構成するヌクレオチド配列（以下、単に「他の領域」とも言う。）を含んでいてもよい。他の領域としては、例えば、形質転換によって得られる組換え微生物が、所望の酵素を産生するために必要とする制御領域や、自律複製に必要な領域などが挙げられる。
また、前記組換え微生物の選択を容易にするという観点より、選択マーカーとなりうる選択遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。
所望の酵素を産生するために必要となる制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。
【００６４】
酵母を宿主微生物とした場合に使用可能な発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列の他に、前記遺伝子の発現効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、酵母を宿主微生物とする形質転換体中で前記遺伝子を発現できるものであればいずれを用いてもよい。例としては、宿主微生物が酵母である場合に新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例として上に記載したプロモーターが挙げられる。
【００６５】
また、前記発現ベクターは、分泌シグナルを含んでいてもよい。これにより、組換え微生物が所望の酵素を産生した場合、細胞外に該酵素を分泌することが可能となる。
分泌シグナルとしては、宿主微生物となる酵母から所望の酵素を分泌できるものであれば、特に限定されない。分泌効率の観点より、αファクターシグナル配列、インベルターゼシグナル配列、酸ホスファターシグナル配列、グルコアミラーゼシグナル配列などを用いることが好ましい。
【００６６】
以上のようなプロモーター配列や分泌シグナルを有する発現ベクターとしては、具体的にはｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ＹＥｐｌａｃ１９５等が挙げられる。
【００６７】
糸状菌を宿主微生物とした場合に使用可能な発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列の他に、前記遺伝子の発現効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、糸状菌を宿主微生物とする形質転換体中で前記遺伝子を発現できるものであればいずれを用いてもよい。例としては、宿主微生物が糸状菌である場合に新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例として上に記載したプロモーターが挙げられる。
【００６８】
糸状菌に対して適切な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，  Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６−４２８に記載されている。
また、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１００、ｐＳＬ１１８０（ファルマシア  インク社製）、ｐＦＢ６及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｐＲＡＸ、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｐＴＥＸ等のような一般的に用いられる他の発現ベクターを用いることもできる。
【００６９】
大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物を宿主微生物とする場合に使用可能な発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列の他に、前記遺伝子の発現効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。また、プロモーター配列の他にリボゾーム結合配列や転写終結配列等を含んでいてもよい。
【００７０】
プロモーター配列の例としては、宿主微生物が原核生物である場合に新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例として上に記載したプロモーターが挙げられる。
【００７１】
リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来又は枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主微生物内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。
前記リボゾーム結合配列としては、例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列のうち、４ヌクレオチド以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列などが挙げられる。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、特に制限されるものではないが、転写効率を考慮すると５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、目的酵素をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【００７２】
宿主微生物が原核生物である場合に使用可能な発現ベクターの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等が挙げられる。
また、２種類以上の宿主微生物内での自律複製が可能な発現ベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を発現ベクターとして利用することができる。
【００７３】
なお、宿主微生物の菌体外から遺伝子を導入する場合には、当該遺伝子は宿主微生物のゲノム中には存在しないヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよいが、宿主微生物のゲノム中に存在するヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもかまわない。たとえ、宿主微生物のゲノム中に元々同じ遺伝子が存在していたとしても、菌体外からの遺伝子の導入によりより強い遺伝子発現が得られ、増強された酵素活性によって、ピリドキサミン又はその塩の生産効率をさらに向上することができる。
【００７４】
菌体外（細胞外）から菌体内（細胞内）へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）などに記載されている。例えば、コンピテントセルを用いる方法や、エレクトロポレーションを用いる方法が挙げられる。
【００７５】
宿主微生物としては、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が存在する場合にこれらを発現可能な微生物であれば、特に限定されない。宿主微生物の例としては、酵母、糸状菌、及び原核生物が挙げられる。酵母の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母、が挙げられる。糸状菌の例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ若しくはｖｉｒｉｄｅ等のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属糸状菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ若しくはｏｒｙｚａｅ等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ等のフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属糸状菌、及びＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ若しくはｆｕｓｉｄｉｏｉｄｅｓ等のアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属の糸状菌、が挙げられる。また、原核生物の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．ＡＣ１０等のシェワネラ（Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ）属細菌、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ等のメゾリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ等のリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属枯草菌等の枯草菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ等のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌等の放線菌が挙げられる。
【００７６】
これらの宿主微生物中に、例えば所望の遺伝子を含む発現ベクターを導入する（形質転換する）ことによって、所望の遺伝子を宿主微生物中に導入することができる。そして、導入された遺伝子は、例えば発現ベクター中に含まれたプロモーターの活性により、得られた組換え微生物中で高発現させることが可能である。
【００７７】
宿主微生物の細胞に発現ベクター等の組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば宿主微生物が大腸菌の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。このようにして得られた組換え微生物は、培養されることにより、導入された遺伝子がコードする酵素を高い発現量で安定に生産することができる。
また、これらの酵素をコードするＤＮＡは、組換え微生物から取り出すことができ、他の微生物に移入させることも可能である。また、このＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲにより酵素をコードするＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素等で処理した後、他のベクターＤＮＡ断片と結合させ、宿主微生物に新たに導入することも容易に実施できる。
【００７８】
＜ピリドキサミン又はその塩の製造方法＞
一実施形態においては、ピリドキサミン又はその塩の製造方法は、本開示に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを酸素存在下において接触させて、ピリドキサミン又はその塩を生産させることを含む。
ピリドキシンの塩の例としては、ピリドキシンと酸との塩が挙げられる。酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。ピリドキシンの塩は、例えばピリドキシン塩酸塩である。
ピリドキサミンの塩の例としては、ピリドキサミンと酸との塩が挙げられる。酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸、などが挙げられる。医薬としての使用の観点からは、ピリドキサミンの塩は、医薬用途への応用が最も進んでいるピリドキサミン二塩酸塩であることが好ましい。
なお、このような組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いるピリドキサミン又はその塩の製造方法のことを、単に「組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法」とも称する。
【００７９】
組換え微生物の培養物とは、組換え微生物を培養して得られる、菌体と周囲の培地等からなる産物を指す。酵素が細胞外に分泌される場合には、このような培養物を使用することで、基質と酵素とがより接触しやすくなり、ピリドキサミン又はその塩を生産する効率を向上させることができる。ただし、培養物は使用しなくともよく、例えば、予め調製された乾燥若しくは凍結させた組換え微生物の細胞を、直接反応系に添加してもよい。
【００８０】
組換え微生物の培養の際には、培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で、振とう培養、通気攪拌培養、連続培養又は流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
【００８１】
より具体的には、前記組換え微生物の培養の条件は、元々の宿主微生物の培養条件と同様であり、公知の条件を用いることができる。
培地に使用する成分としては、公知のものを用いることができる。例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン及びジャガイモ等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン及び有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム及び鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。
なお、前記選択マーカーを含む発現ベクターにより形質転換した組換え微生物の培養においては、例えば、前記選択マーカーが薬剤耐性である場合には、それに対応する薬剤を含む培地を使用し、前記選択マーカーが栄養要求性である場合には、それに対応する栄養素を含まない培地を使用する。
【００８２】
培養条件は、前記組換え微生物、培地、培養方法の種類により適宜選択すればよく、組換え微生物が生育し、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素を産生できる条件であれば特に制限はない。
培地のｐＨは、例えば４〜８の範囲で選べばよく、５〜８の範囲であってもよい。
培養温度は例えば２０℃〜４５℃であり、好ましくは２４℃〜３７℃である。培養は、微生物の種類に応じて、好気的に行ってもよいし、嫌気的に行ってもよい。
培養期間は例えば１日間〜７日間である。培養期間は、目的の酵素の産生量が最大になるように設定してもよい。
【００８３】
また、前記組換え微生物の処理物とは、組換え微生物が産生するピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の活性を失わない範囲で、組換え微生物に対して任意の処理を行った産物を指す。このような処理としては、例えば、加熱処理、冷却処理、機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、自己消化、界面活性剤処理及び酵素処理（例えば細胞溶解処理）からなる群から選択される１つ以上を含む処理などが挙げられる。たとえ、このような処理によって組換え微生物自体が死滅したとしても、当該微生物が産生した酵素の活性が残存していれば、反応に用いることが可能である。
【００８４】
前記培養物の処理物とは、組換え微生物が産生するピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の活性を失わない範囲で、組換え微生物の培養物に対して任意の処理を行った産物を指す。このような処理としては、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理（例えば細胞破壊処理）、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理が挙げられる。例えば、組換え微生物の細胞を培地等から分離して、分離された細胞を反応系に添加してもよい。このような分離には、濾過又は遠心分離などの手段が使用可能である。あるいは、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素、並びに存在する場合には過酸化水素分解酵素を夾雑物から分離するための精製処理を行い、該精製処理により得られた酵素を含む溶液を反応系に添加してもよい。あるいは、培養物を、メタノールやアセトニトリル等の有機溶媒又は有機溶媒と水との混合溶媒を用いて抽出した抽出物を反応系に添加してもよい。このような精製物又は抽出物は、組換え微生物の細胞を含まないものであってもよい。当該微生物の細胞が存在しなくても、酵素の活性が残存していれば、反応に用いることが可能である。
【００８５】
上記のような細胞の破砕あるいは溶解処理は、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い組換え微生物の細胞膜を破壊することにより、行うことができる。
【００８６】
本開示に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触は、以下のような条件で行うことが好ましい。
接触は基質としてのピリドキシン又はその塩を含む溶液中で行うことが好ましい。溶液のｐＨは、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、６．０〜９．０であることが好ましく、７．０〜８．５であることがより好ましい。溶液の温度も、溶液のｐＨは、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、２０〜７０℃であることが好ましく、２５℃〜５０℃であることがより好ましい。
溶液の媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒又は水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えばアセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。
【００８７】
組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触は、酸素存在下で行われる。これは、ピリドキシンオキシダーゼがピリドキシン又はその塩を酸化する際に酸素を消費するためである。反応系における酸素濃度としては、例えば、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを含む溶液を、大気に開放して、つまり大気と接触させて反応を行う、あるいは、体積比で０．１〜２０％、０．５〜１０％、又は１〜５％の酸素を含む気体と接触させて反応を行うことができる。そのような溶液における溶存酸素量としては、０．１ｍｇ〜１３ｍｇ酸素／Ｌ、０．５ｍｇ〜１０ｍｇ酸素／Ｌ、あるいは１ｍｇ〜８ｍｇ酸素／Ｌであってもよい。
【００８８】
なお、前記組換え微生物が酸素を生成可能な過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子を有する場合には、酸素濃度を低減させても、あるいは酸素の供給を低減又は遮断した条件の下でも、反応を行うことができる。例えば、反応系を密閉した条件や反応系を窒素パージ（窒素置換）した条件で反応を行うことも可能である。
【００８９】
本開示に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触は、振盪もしくは攪拌下で行うのが好ましい。例えば、このような接触は溶液中で行うことができる。例えば、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に、ピリドキシン又はその塩を基質溶液の形態であるいは固体の形態で添加してもよい。また、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液には、ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸をさらに添加してもよい。前記アミノ酸は、ピリドキシン又はその塩を基質溶液に含まれていてピリドキシン又はその塩と共に、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に添加されてもよい。また、ピリドキシン又はその塩を基質溶液とは別の基質溶液に含まれて、あるいは固体の形態で、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に添加されてもよい。
反応開始時もしくは反応途中において、反応液のｐＨを適切な範囲に維持するため、酸やアルカリを添加してもよい。反応溶液に添加可能なアルカリの例としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物の他、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど水に溶解して、液性を塩基性とするものが挙げられる。反応溶液に添加可能な酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸などが挙げられる。
【００９０】
上記接触は、例えば、空気雰囲気下で行ってもよく、部分的な脱酸素雰囲気下で行ってもよい。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。ただし、ピリドキシンオキシダーゼがピリドキシンを酸化する際には酸素を消費するので、酸素は除去しない雰囲気の方が好ましい。
【００９１】
好ましい実施形態では、使用される、組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物は、前記ピリドキシンオキシダーゼ及び前記ピリドキサミン合成酵素を含んでいる。このため、前記接触により、反応溶液中に共に存在している前記ピリドキシンオキシダーゼ及び前記ピリドキサミン合成酵素が協働的に作用し、ピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で生産する。なお、前記組換え微生物の処理物若しくは前記培養物の処理物が生きた状態の前記組換え微生物を含んでいることは必須ではないが、反応に関与する物質を代謝により継続的に供給することができるという観点からは、生きた状態の前記組換え微生物を含むことが好ましい。
【００９２】
組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物の添加時期は、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。同様に、原料となるピリドキサミンも、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。
【００９３】
反応溶液は、ピリドキサミン合成酵素によりピリドキサミン又はその塩を生成する際に消費されるアミノ酸を含んでいてもよい。このアミノ酸も、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。例えば、ピリドキサミン合成酵素としてピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを用いる場合には、反応溶液はＬ−アラニン及びＤ−アラニンのうち１つ以上を含んでいてもよい。また、ピリドキサミン合成酵素としてピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ又はアスパラギン酸トランスアミナーゼを用いる場合には、反応溶液はＬ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、及びＤ−グルタミン酸のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。なお、アミノ酸は周囲の環境によって塩としても存在しうるが、本明細書においては、これらも含めてアミノ酸として記載している。例えばＬ−グルタミン酸との記載は塩を形成していないＬ−グルタミン酸だけでなく、塩を形成しているＬ−グルタミン酸（例えばＬ−グルタミン酸ナトリウム一水和物）をも包含している。塩を形成している場合の対イオンは、カチオンとしてはナトリウムイオン、カリウムイオンなどが挙げられ、アニオンとしては塩化物イオン、酢酸イオン、硝酸イオンなどが挙げられる。
【００９４】
ピリドキシン又はその塩の反応溶液中における濃度は、例えば０．１ｍＭ〜５００ｍＭであり、あるいは０．４ｍＭ〜２００ｍＭ、あるいは０．５ｍＭ〜１００ｍＭ、あるいは０．８ｍＭ〜５０ｍＭであってもよい。ピリドキシン又はその塩の濃度が高くなると、ピリドキシンオキシダーゼの酵素活性が阻害される傾向がある。このため、ピリドキシン又はその塩の反応溶液中における濃度は過剰に高くしすぎない方が好ましい。つまり、ピリドキシン又はその塩の反応溶液中における濃度を、例えば上記範囲内の濃度に維持するように制御してもよい。例えば、本開示に係るピリドキサミン又はその塩の製造方法は、以下の（Ａ）及び（Ｂ）のいずれか又は両方を含んでいてもよい：
（Ａ）前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に、ピリドキシン又はその塩を連続的に添加又は複数回に分けて添加すること、
（Ｂ）前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液中において、前記ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸のモル濃度がピリドキシン又はその塩のモル濃度に対して１倍以上となるように制御すること。
前記アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸等が挙げられる。
【００９５】
このような制御のために、例えば、ピリドキシン又はその塩は反応溶液中に全量を一括で添加するのではなく、複数回に分けて添加してもよい。反応が進行することによりピリドキシンの濃度は低減するため、時間間隔を置いてピリドキシン又はその塩を添加することにより、ピリドキシン又はその塩の濃度が過剰に高くなることを避けることができる。このような逐次添加としては、例えば、０．５時間〜１０時間の範囲内の時間間隔を置いて、ピリドキシン又はその塩を２回以上、好ましくは３回以上添加することが挙げられる。また、ピリドキシン又はその塩は、反応溶液中に連続的に添加してもよい。連続的な添加の場合にもその添加速度を調整することで、ピリドキシン又はその塩の濃度が過剰に高くなることを避けることができる。この調整のために、反応溶液中のピリドキシン又はその塩の濃度を特定のタイミングで測定してもよいし、連続的にモニターしてもよい。
【００９６】
また、前記アミノ酸（ピリドキサミン合成酵素によりピリドキサミン又はその塩を生成する際に消費されるアミノ酸）の濃度は、例えば０．１ｍＭ〜２０００ｍＭであり、あるいは０．２ｍＭ〜１０００ｍＭであり、あるいは０．４ｍＭ〜５００ｍＭ、あるいは０．５ｍＭ〜４００ｍＭ、あるいは１ｍＭ〜３００ｍＭ、あるいは２ｍＭ〜２５０ｍＭであってもよい。アミノ酸の添加の様式は特に制限されず、全量を一括して添加してもよいし、複数回に分けて添加してもよいし、連続的に添加してもよい。このような逐次添加としては、例えば、０．５時間〜１０時間の範囲内の時間間隔を置いて、アミノ酸を２回以上、好ましくは３回以上添加することが挙げられる。添加のタイミングは、ピリドキシン又はその塩を複数回に分けて添加する場合には、ピリドキシン又はその塩を添加するタイミングと同時でもよいし、別々に添加してもよい。
【００９７】
前記アミノ酸（ピリドキサミン合成酵素によりピリドキサミン又はその塩を生成する際に消費されるアミノ酸）の濃度（モル濃度）は、ピリドキシン又はその塩の濃度（モル濃度）よりも高く維持することが好ましい。前記アミノ酸の濃度をピリドキシン又はその塩の濃度よりも高く維持することで、反応の平衡をピリドキサミン又はその塩に有利な方向へとシフトさせることができ、ピリドキサミン又はその塩の生産効率をさらに向上することができる。前記アミノ酸のモル濃度は、ピリドキシン又はその塩のモル濃度よりも１．０倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましく、２．０倍以上であることがさらに好ましく、５．０倍以上であることがさらに好ましく、１０．０倍以上であってもかまわない。
【００９８】
前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを接触させる方法としては、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物をピリドキシン又はその塩を含む溶液に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物をピリドキシン又はその塩を含む溶液に加え、振とうしながら反応を進行させる方法、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物とピリドキシン又はその塩とを溶液中で充分に混和の後、静置して反応を進行させる方法などが挙げられる。好ましくは、反応効率の観点より、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物をピリドキシン又はその塩を含む溶液に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法が挙げられる。
【００９９】
反応に使用可能な反応容器としては特に制限はない。好ましくは、添加した前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物とピリドキシン又はその塩を含む溶液とが十分混和されるように攪拌できるとともに、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の最適温度範囲内に保てるように温度調節機能を有する反応容器であることが好ましい。
【０１００】
前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触時間（反応時間）は、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、例えば３０分〜１００時間であり、あるいは２時間〜５０時間であってもよい。また、反応はバッチ式で行ってもよく、反応途中で、基質及び前記微生物、前記培養物若しくは前記処理物のうち一方又は両方を複数回に分けて添加するセミバッチ式で行ってもよく、連続式で行ってもよい。セミバッチ式や連続式の場合は、新たな原料及び前記組換え微生物、前記培養物若しくは前記処理物のうち一方又は両方が供給される等の操作が行われるため、反応時間の上限は特に限定はされない。
【０１０１】
上記の方法においては、ピリドキシン又はその塩を原料として本開示に係る組換え微生物若しくは前記培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いることにより、化学的合成方法における場合のように煩雑なステップを経ることなく、安価に、ピリドキサミンその塩を高い生産効率で製造することができる。上記の方法により得られたピリドキサミン又はその塩は、例えばその生理活性を利用した製品の製造に用いることができる。例えば、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、慢性腎不全、アルツハイマー型認知症等のＡＧＥの蓄積に起因する疾患や統合失調症の予防や治療、健康食品、化粧品といった用途に利用可能である。
【０１０２】
なお、本開示において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本開示において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例により実施形態を更に説明するが、本開示は以下の実施例によって何等限定されるものではない。また、実施例の組成物における含有成分量を示す「％」は、特に断らない限り質量基準である。【０１０４】
<分析条件>
ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキサミン二塩酸塩は高速液体クロマトグラフィーにより定量した。これらの分析条件は次の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＯＤＰ−５０  ６Ｅ（昭和電工株式会社）
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＯＤＰ−５０Ｇ  ６Ａ（昭和電工株式会社）
カラム温度：３０℃
ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）
検出：ＵＶ２５４ｎｍ【０１０５】
比較例１  pno発現株の作成
Microbacterium luteolum由来ピリドキシン−４−オキシダーゼ遺伝子を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号９のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号１２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ製）のＢａｍＨＩ及びＳａｌＩによる処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１０６】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-pnoと命名した。ここで、pnoはピリドキシン−４−オキシダーゼの略称である。【０１０７】
実施例１  ppat-pno発現株の作成
Mesorhizobium loti MAFF303099由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号１４のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１５のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例１で作製したpUC18-pnoをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１０８】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１０に示すヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-pnoと命名した。ここで、ppatはピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの略称である。【０１０９】
実施例２  ppat-pno-kat発現株の作成
Listeria seeligeri由来カタラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１１のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、実施例１で作成したpUC18-ppat-pnoをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ここで、katはカタラーゼの略称である。【０１１０】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１１に示す塩基配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-pno-katと命名した。【０１１１】
実施例３  aspC-pno発現株の作成
Eschrichia coli W3110のゲノムDNAを 鋳型として用い配列番号１６のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲによりEscherichia coli W3110由来ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、実施例１で作製したpUC18-pnoをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１１２】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８に示すヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-aspC-pnoと命名した。ここで、aspCはピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼの略称である。【０１１３】
実施例４  aspC-pno-kat発現株の作成
Listeria seeligeri由来カタラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１１のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、実施例３で作成したpUC18-aspC-pnoをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。ここで、katはカタラーゼの略称である。【０１１４】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１１に示す塩基配列であることを確認した。得られたプラスミドをaspC-pno-katと命名した。【０１１５】
試験１  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
pUC18、比較例１、及び実施例１で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水８００μｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（２００ｍＭ）及びＬ−アラニン（８００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。基質液１００μｌと菌体懸濁液３００μｌを２．０ｍｌチューブで混合し、チューブは蓋を開けて３７℃で６時間、１，０００ｒｐｍで振とうすることで行った。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析した。この結果得られた反応収率を表１に示す。なお、表１に示す収率とは、基質液中のピリドキシン塩酸塩のモル量に対する得られたピリドキサミン二塩酸塩のモル量の比を表す。【０１１６】
【表１】
2018207930.tif 000003
【０１１７】
表１に示されたように、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子の両方が細胞外から導入された場合には、ピリドキサミン二塩酸塩が高い生産効率で生産された。また、比較例１で作成したプラスミドを含む形質転換体においては、ピリドキサールとアミノ基供与体との自発的な反応が起こったと推測される。上述のとおり、この自発的反応の場合は副生成物の生成のため、高いピリドキサミン生産効率は得られない。表１の結果においても、比較例１で作成したプラスミドを含む形質転換体を用いた場合は、高いピリドキサミン生産効率は得られていない。【０１１８】
試験２  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
ｐＵＣ１８及び実施例３で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水８００μｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−グルタミン酸ナトリウム一水和物を水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（２００ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸ナトリウム一水和物（８００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。基質液３００μｌと菌体懸濁液９００μｌを２．０ｍｌチューブで混合し、チューブは蓋を開けて３７℃で２４時間、１，０００ｒｐｍで振とうすることで行った。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析した。この結果得られた反応収率を表２に示す。なお、表２に示す収率とは、基質液中のピリドキシン塩酸塩のモル量に対する得られたピリドキサミン二塩酸塩のモル量の比を表す。【０１１９】
表２
【表２】
2018207930.tif 000004
【０１２０】
表２に示されたように、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が細胞外から導入された場合には、ピリドキサミン二塩酸塩が高い生産効率で生産された。【０１２１】
試験３  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（酸素濃度の検討）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-pno）で形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水８００μｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（２００ｍＭ）及びＬ−アラニン（８００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。基質液１００μｌと菌体懸濁液３００μｌを２．０ｍｌチューブで混合した。反応は、チューブの蓋を開けた条件、チューブの蓋を閉めた条件、及び窒素パージした後で蓋を閉めた条件で、３７℃で２４時間、１，０００ｒｐｍで振とうすることで行った。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析した。この結果得られた反応収率を表３に示す。なお、表３に示す収率とは、基質液中のピリドキシン塩酸塩のモル量に対する得られたピリドキサミン二塩酸塩のモル量の比を表す。【０１２２】
表３
【表３】
2018207930.tif 000005
【０１２３】
表３に示されたように、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が細胞外から導入された組換え微生物を用いてピリドキサミン又はその塩を生産する場合、酸素の供給が制限された条件下よりも酸素の供給が制限されていない条件の方がピリドキサミン又はその塩の収率が高かった。【０１２４】
試験４  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（過酸化水素分解酵素による効果の検討）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-pno）及び実施例２で作製したプラスミド（pUC18-ppat-pno-kat）のそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水８００μｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（２００ｍＭ）及びＬ−アラニン（８００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。基質液１００μｌと菌体懸濁液３００μｌを２．０ｍｌチューブで混合した。反応はチューブの蓋を閉めた条件で３７℃で２４時間、１，０００ｒｐｍで振とうすることで行った。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析した。pUC18-ppat-pnoで形質転換したＤＨ５αを用いた場合のピリドキサミン二塩酸塩の生成量を１．０とした場合の、pUC18-ppat-pno-katで形質転換したＤＨ５αを用いた場合のピリドキサミン二塩酸塩の生成量の相対値（ＰＭ生成速度比）を表４に示す。【０１２５】
表４
【表４】
2018207930.tif 000006
【０１２６】
表４に示されるように、本開示に係る組換え微生物がさらに過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子を有することで、酸素供給が制限された条件下におけるピリドキサミン又はその塩の生産効率がさらに向上することが分かる。【０１２７】
試験５  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（過酸化水素分解酵素による効果の検討）
実施例３で作製したプラスミド（pUC18-aspC-pno）及び実施例４で作製したプラスミド（pUC18-aspC-pno-kat）のそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水８００μｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−グルタミン酸ナトリウム一水和物を水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（２００ｍＭ）及びＬ−グルタミン酸ナトリウム一水和物（８００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。基質液１００μｌと菌体懸濁液３００μｌを２．０ｍｌチューブで混合した。反応はチューブの蓋を閉めた条件で３７℃で２４時間、１，０００ｒｐｍで振とうすることで行った。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析した。pUC18-aspC-pnoで形質転換したＤＨ５αを用いた場合のピリドキサミン二塩酸塩の生成量を１．０とした場合の、pUC18-aspC-pno-katで形質転換したＤＨ５αを用いた場合のピリドキサミン二塩酸塩の生成量の相対値（ＰＭ生成速度比）を表５に示す。【０１２８】
表５
【表５】
2018207930.tif 000007
【０１２９】
表５に示されるように、本開示に係る組換え微生物がさらに過酸化水素分解酵素をコードする遺伝子を有することで、酸素供給が制限された条件下におけるピリドキサミン又はその塩の生産効率がさらに向上することが分かる。【０１３０】
このように、本開示に係るピリドキサミン又はその塩の製造方法によれば、ピリドキシン又はその塩から高い生産効率で安価にピリドキサミン又はその塩を生産することができることが示された。【０１３１】
試験６（参考）：pnoのピリドキシン濃度の検討
比較例１で作製したプラスミド（pUC18-pno）で形質転換したＤＨ５αを５００ｍｌの試験管中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地２ｍｌに接種し、３７℃にて２４時間振盪培養した。培養液を１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水１，０００μｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩を水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。この基質液を、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整した。所定量の基質溶液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ）１００μｌ、菌体懸濁液１００μｌ及び水を混合して、ピリドキシン塩酸塩の濃度が表６に示す各濃度である１，０００μｌの反応液を２．０ｍｌチューブで調製した。反応は、チューブの蓋を閉めて３７℃で２４時間、１，０００ｒｐｍで振とうすることで行った。反応液を一部採取し、遠心分離を行い、４１５ｎｍで吸光度を測定することで、生成したピリドキサール塩酸塩を定量した。各ピリドキシン塩酸塩濃度におけるＰＬ生成量を、ピリドキシン塩酸塩濃度が０．８ｍＭの場合のピリドキサール塩酸塩に対する相対値（ＰＬ生成量比）を表６に示す。【０１３２】
表６
【表６】
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【０１３３】
表６に示されるように、反応溶液中のピリドキシン塩酸塩の濃度を一定値以上に増加させた場合は、ＰＬ生成量比はかえって減少した。つまり、ピリドキシンオキシダーゼの酵素活性に対する阻害が見られた。【０１３４】
試験７  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（原料を全て全量一括添加）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-pno）で形質転換したＤＨ５αを、２０００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水１０ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩を水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）を含む基質液（１）を調製した。Ｌ−アラニンを水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、Ｌ−アラニン（１，０００ｍＭ）を含む基質液（２）を調製した。１００ｍｌバッフル付き三角フラスコに菌体懸濁液４．０ｍｌ、基質液（１）４．０ｍｌ、基質液（２）２．０ｍｌを添加し、３７℃で２４時間、２００ｒｐｍで振とうして反応させた。反応液を一部採取し、ピリドキサミン二塩酸塩の濃度を上記に示す分析条件で分析した。結果を図１に示す。図１〜図３において、ＰＮはピリドキシン塩酸塩の濃度を、ＰＬはピリドキサール塩酸塩の濃度を、ＰＭはピリドキサミン二塩酸塩の濃度を表している。また、ｈｒは時間の単位「時間」を表している。【０１３５】
図１に示されるように、高濃度のピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを最初から全量添加しても、ピリドキサミン二塩酸塩の生産が進行した。【０１３６】
試験８  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニン共に複数回に分けて添加）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-pno）で形質転換したＤＨ５αを、２０００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水１０ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩を水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）を含む基質液（１）を調製した。Ｌ−アラニンを水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、Ｌ−アラニン（１，０００ｍＭ）を含む基質液（２）を調製した。１００ｍｌバッフル付き三角フラスコに菌体懸濁液４．０ｍｌ、基質液（１）０．５ｍｌ及び基質液（２）０．２５ｍｌ添加し、３７℃で２００ｒｐｍで振とうして反応させた。反応開始後１時間後に基質液（１）０．５ｍｌ及び基質液０．２５ｍｌをさらに添加した。反応開始後７時間後に基質液（１）０．５ｍｌ及び基質液（２）０．２５ｍｌをさらに添加した。反応は、反応開始後２４時間後まで継続させた。反応液を一部採取し、ピリドキサミン二塩酸塩の濃度を上記に示す分析条件で分析した。結果を図２に示す。この試験ではピリドキシン塩酸塩とＬ−アラニンとは各回とも等モル添加されている。【０１３７】
図２に示されるように、比較的多量のピリドキシン塩酸塩であっても、最初から全量は添加せずに複数回に分けて添加した場合には、ピリドキサミン二塩酸塩の生産効率はさらに向上した。これは、複数回に分割した添加により、ピリドキシンの濃度が比較的低濃度に保たれ、ピリドキシンオキシダーゼの活性がより発揮しやすくなるためと推測できる。【０１３８】
試験９  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（ピリドキシン塩酸塩を複数回に分けて添加且つＬ−アラニンを一括添加）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-pno）で形質転換したＤＨ５αを、２０００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水１０ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩を水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）を含む基質液（１）を調製した。Ｌ−アラニンを水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、Ｌ−アラニン（１，０００ｍＭ）を含む基質液（２）を調製した。１００ｍｌバッフル付き三角フラスコに菌体懸濁液４．０ｍｌ、基質液（１）を０．５ｍｌ及び基質液（２）２．０ｍｌ添加し、３７℃で２００ｒｐｍで振とうして反応させた。反応開始後１時間後に基質液（１）０．５ｍｌをさらに添加し、反応開始後７時間後に基質液（１）０．５ｍｌをさらに添加した。反応は、反応開始後２４時間後まで継続させた。反応液を一部採取し、ピリドキサミン二塩酸塩の濃度を上記に示す分析条件で分析した。結果を図３に示す。この試験ではピリドキシン塩酸塩のモル濃度よりもＬ−アラニンのモル濃度の方が常に高く維持されている。【０１３９】
図２と図３との比較から分かるように、Ｌ−アラニンの濃度がピリドキシン塩酸塩の濃度よりも高く維持される場合には、比較的多量のピリドキシン塩酸塩であっても、ピリドキサミン二塩酸塩の生産効率はさらに向上した。これは、ピリドキシン塩酸塩よりも高濃度のＬ−アラニンの存在により、反応の平衡がピリドキサミン生成にさらに有利になったからではないかと推測される。【０１４０】
参考例１  ppat発現株の作成
Mesorhizobium loti MAFF303099由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号５１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号５２のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによる処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１４１】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１０のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppatと命名した。ここで、ppatはピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の略称である。【０１４２】
参考例２．ppat-plr発現株の作成
Saccharomyces cerevisiae由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号５３のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号５４のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号５５のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例１で作製したpUC18-ppatをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１４３】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号５３のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-plrと命名した。ここで、plrはピリドキサールレダクターゼ遺伝子（ピリドキシンデヒドロゲナーゼに該当）の略称である。【０１４４】
参考例３  ppat-adh発現株の作成
Shewanella sp. AC10由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号５７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号５８のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例１で作製したpUC18-ppatをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。この形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１４５】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号５６のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adhと命名した。ここで、adhはアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の略称である。【０１４６】
参考例４  ppat-adh-plr発現株の作成
Shewanella sp. AC10由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号５６のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号５７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号５８のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。この形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１４７】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号５６のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-plrと命名した。【０１４８】
参考例５  adh-plr発現プラスミドの作成
参考例２で作製したpUC18-ppat-plrをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、回収したピリドキサールレダクターゼ遺伝子（ｐｌｒ）断片と、参考例３で作製したpUC-ppat-adhをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、回収したアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）断片とpUC18のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、得られたプラスミドをpUC18-adh-plrと命名した。【０１４９】
参考例６  Msppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Mesorhizobium sp. YR577由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号３２のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例５で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号３２のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Msppat-adh-plrと命名した。【０１５０】
参考例７  Psppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Pseudaminobacter salicylatoxidans由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号３３のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例５で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号３３のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Psppat-adh-plrと命名した。【０１５１】
参考例８  Blppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Bauldia litoralis由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号３４のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例５で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号３４のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Blppat-adh-plrと命名した。【０１５２】
参考例９  Ssppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Skermanella stibiiresistens由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号３５のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例５で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号３５のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Ssppat-adh-plrと命名した。【０１５３】
参考例１０  Rsppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Rhizobium sp. AC44/96由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号３６のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例５で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号３６のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Rsppat-adh-plrと命名した。【０１５４】
参考例１１  Etppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Erwinia toletana由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号３７のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例５で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号３７のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Etppat-adh-plrと命名した。【０１５５】
参考例１２  Hgppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Herbiconiux ginsengi由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号３８のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、参考例５で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号３８のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Hgppat-adh-plrと命名した。【０１５６】
試験１０  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
参考例６〜参考例１２で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調整した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌと菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表７に示す。なお、表７に示すピリドキサミン生産量とは、参考例４で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。【０１５７】
【表７】
2018207930.tif 000009
【０１５８】
表７に示されたように、ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子として、参考例４にて使用したMesorhizobium loti MAFF303099由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子に代えて、Mesorhizobium sp. YR577由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Pseudaminobacter salicylatoxidans由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Bauldia litoralis 由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Skermanella stibiiresistens 由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Rhizobium sp. AC44/96由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Erwinia toletana由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、又はHerbiconiux ginsengi 由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入することによっても、ピリドキシン塩酸塩からピリドキサミン二塩酸塩を生産することができた。これらの参考例は、ピリドキシンデヒドロゲナーゼを用いる例であって、ピリドキシンオキシダーゼを用いるものではないが、これらのピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼが本開示におけるピリドキサミン合成酵素として機能可能であることを示すものである。【０１５９】
２０１７年５月１２日に出願された日本国特許出願２０１７−０９５５７２号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
2018207930.tif 000010
【図２】
2018207930.tif 000011
【図３】
2018207930.tif 000012
【図４−１】
2018207930.tif 000013
【図４−２】
2018207930.tif 000014
【配列表】
2018207930000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月8日(2019.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
前記ＥＣ１．１．３．１２のピリドキシンオキシダーゼは、例えばエンテロバクター  クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、メゾリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、ミクロバクテリウム  ルテオーラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｕｔｅｏｌｕｍ）、オクロバクテリウム  アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）ｓｐ．ＭＡ−１などに由来するピリドキシンオキシダーゼであってもよい。なお、ミクロバクテリウム  ルテオーラムのピリドキシンオキシダーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
図４−１及び図４−２から分かるように、部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）は、一群のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼの間で高度に保存された領域である。したがって、部分アミノ酸配列（ｃ）〜部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含むピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのバリエーションは、本開示におけるピリドキサミン合成酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１９７番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はピリドキサールとの結合に重要であり、Ｎ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は触媒活性に重要であり、Ｎ末端から１７１番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基及びＮ末端から１４６番目のトレオニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はピリドキサールとの結合を補助し、Ｎ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基及びＮ末端から３４５番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はアミノ酸認識に重要であると考えられており（Journal of Biological Chemistry, 2008, vol. 283, No.2 pp1120-1127）、ピリドキサミン合成酵素の機能上、重要な残基である。これらの残基が保存されていれば、本開示におけるピリドキサミン合成酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。ただし、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は、グルタミン酸以外にアスパラギン酸であってもよい。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は、アルギニン以外にメチオニン又はグルタミンであってもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
例えば、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列（ミクロバクテリウム  ルテオーラムのピリドキシンオキシダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号５のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号５のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンオキシダーゼをコードする遺伝子は、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号５のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキシンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、配列番号６又は８のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号６又は８のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本開示に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触は、以下のような条件で行うことが好ましい。
接触は基質としてのピリドキシン又はその塩を含む溶液中で行うことが好ましい。溶液のｐＨは、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、６．０〜９．０であることが好ましく、７．０〜８．５であることがより好ましい。溶液の温度も、ピリドキシンオキシダーゼ及びピリドキサミン合成酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、２０〜７０℃であることが好ましく、２５℃〜５０℃であることがより好ましい。
溶液の媒体としては、水もしくは水性媒体、有機溶媒又は水もしくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えばアセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本開示に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触は、振盪もしくは攪拌下で行うのが好ましい。例えば、このような接触は溶液中で行うことができる。例えば、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に、ピリドキシン又はその塩を基質溶液の形態であるいは固体の形態で添加してもよい。また、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液には、ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸をさらに添加してもよい。前記アミノ酸は、ピリドキシン又はその塩を含む基質溶液に含まれた状態で、ピリドキシン又はその塩と共に、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に添加されてもよい。また、前記アミノ酸は、ピリドキシン又はその塩を含む基質溶液とは別の基質溶液に含まれた状態で、あるいは固体の形態で、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に添加されてもよい。
反応開始時もしくは反応途中において、反応液のｐＨを適切な範囲に維持するため、酸やアルカリを添加してもよい。反応溶液に添加可能なアルカリの例としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物の他、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど水に溶解して、液性を塩基性とするものが挙げられる。反応溶液に添加可能な酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸などが挙げられる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
上記の方法においては、ピリドキシン又はその塩を原料として本開示に係る組換え微生物若しくは前記培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いることにより、化学的合成方法における場合のように煩雑なステップを経ることなく、安価に、ピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で製造することができる。上記の方法により得られたピリドキサミン又はその塩は、例えばその生理活性を利用した製品の製造に用いることができる。例えば、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、慢性腎不全、アルツハイマー型認知症等のＡＧＥの蓄積に起因する疾患や統合失調症の予防や治療、健康食品、化粧品といった用途に利用可能である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
試験８  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニン共に複数回に分けて添加）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-pno）で形質転換したＤＨ５αを、２０００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水１０ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩を水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）を含む基質液（１）を調製した。Ｌ−アラニンを水で溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ８．０に調整して、Ｌ−アラニン（１，０００ｍＭ）を含む基質液（２）を調製した。１００ｍｌバッフル付き三角フラスコに菌体懸濁液４．０ｍｌ、基質液（１）０．５ｍｌ及び基質液（２）０．２５ｍｌ添加し、３７℃で２００ｒｐｍで振とうして反応させた。反応開始後１時間後に基質液（１）０．５ｍｌ及び基質液（２）０．２５ｍｌをさらに添加した。反応開始後７時間後に基質液（１）０．５ｍｌ及び基質液（２）０．２５ｍｌをさらに添加した。反応は、反応開始後２４時間後まで継続させた。反応液を一部採取し、ピリドキサミン二塩酸塩の濃度を上記に示す分析条件で分析した。結果を図２に示す。この試験ではピリドキシン塩酸塩とＬ−アラニンとは各回とも等モル添加されている。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
試験１０  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
参考例６〜参考例１２で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌと菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表７に示す。なお、表７に示すピリドキサミン生産量とは、参考例４で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。
【国際調査報告】
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