(57)【要約】【課題】  本発明は、化合物スクリーニングなどの細胞ベースの実験に有用な不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞を取得することを目的とするものである。【解決手段】  本発明は、腫瘍血管内皮細胞を含む腫瘍組織由来の細胞懸濁液に対して磁気ビーズを用いた細胞分離、及び任意選択のフローサイトメトリーによる細胞分離を行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を分離し、さらに分離した細胞群の継代培養とフローサイトメトリーとを組み合わせてＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を再分離し、ＳＶ４０Ｔ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に有するウイルスベクターで形質転換し、継代培養とフローサイトメトリーを組み合わせて形質転換細胞を選抜することを含む、不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法に関する。本発明によれば、腫瘍血管内皮細胞に特異的な薬剤のスクリーニング又は医薬の開発に有用な腫瘍血管内皮細胞を安定的かつ大量に提供することが可能となる。【選択図】図１
2018169094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍血管内皮細胞を含む腫瘍組織由来の細胞懸濁液に対して磁気ビーズを用いた細胞分離、及び任意選択のフローサイトメトリーによる細胞分離を行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を分離する分離工程、
分離されたＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を継代培養する培養工程、
継代培養後の細胞群に対して、フローサイトメトリーを行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を再分離することを１〜２回繰り返す、任意選択の再分離工程、
培養工程又は再分離工程後の細胞群に、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔをコードする遺伝子、ヒトテロメア逆転写タンパク質をコードする遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に有するウイルスベクターを感染させる感染工程、及び
感染した細胞群を継代培養し、次いで前記蛍光タンパク質を発現しているＣＤ３１陽性細胞群をフローサイトメトリーにより分離する細胞選抜工程
を含む、不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
【請求項２】
培養工程において継代培養が１〜７回行われる、請求項１に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
【請求項３】
培養工程において継代時の培養基材からの細胞の剥離が複数回に分けて行われる、請求項１又は２に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
【請求項４】
感染工程においてウイルスベクターを３００〜１２００のＭＯＩで感染させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
【請求項５】
細胞選抜工程において継代培養が２〜３回行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
【請求項６】
Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔをコードする遺伝子及びヒトテロメア逆転写タンパク質をコードする遺伝子を組換え遺伝子として有し、少なくとも５０回以上の継代培養が可能な、不死化腫瘍血管内皮細胞株。
【請求項７】
ペリオスチン（Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）の発現が、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔをコードする遺伝子及びヒトテロメア逆転写タンパク質をコードする遺伝子を組換え遺伝子として有する不死化正常血管内皮細胞における発現と比較して亢進している、請求項６に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株。
【請求項８】
さらにバイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）及び／又はリジルオキシダーゼ（Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）の発現が、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔをコードする遺伝子及びヒトテロメア逆転写タンパク質をコードする遺伝子を組換え遺伝子として有する不死化正常血管内皮細胞における発現と比較して亢進している、請求項７に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株。
【請求項９】
ヒト腎癌組織由来である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株。
【請求項１０】
国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２４として寄託されている不死化ヒト腫瘍血管内皮細胞株。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株及び正常な血管内皮細胞に試験物質を接触させて各細胞の応答を比較する工程を含む、腫瘍血管内皮細胞に特異的に作用する物質をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
正常血管内皮細胞が不死化された細胞株である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
不死化腫瘍血管内皮細胞株が国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２４として寄託されている不死化ヒト腫瘍血管内皮細胞株であり、不死化された正常な血管内皮細胞が国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２５として寄託されている不死化ヒト正常血管内皮細胞株である、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞の樹立方法及び不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の治療法として現在広く用いられているものの多くは、がん細胞が他の正常細胞に比べて分裂や増殖が活発であるという性質を利用してがん細胞の増殖を抑制するものである。しかし、これらの治療法は正常組織でも分裂が活発な組織（毛根や骨髄など）にも作用するため、脱毛や骨髄抑制といった副作用が問題となっている。【０００３】
一方、腫瘍組織内のがん細胞等の増殖に不可欠な新生血管を標的とする血管新生阻害療法が近年では広く行われている。悪性腫瘍が増殖する際には、がん細胞の増殖に必要な栄養や酸素を得るために、がん細胞が自ら血管新生因子を分泌して、血管新生を誘導する。また、腫瘍組織内の血管は、悪性腫瘍が他の臓器や部位へ転移する場合にも使われるため、血管を標的とした治療法は、増殖抑制のみならず転移の抑制にもつながる。【０００４】
近年、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  （ＶＥＧＦ）中和抗体に代表される血管新生阻害療法が様々な腫瘍の治療に用いられており、生存率が向上している。しかし、ＶＥＧＦは正常組織における生理的な血管新生にも重要な分子であることから、ＶＥＧＦ阻害による高血圧や創傷治癒遅延等の他、ときに消化管出血や喀血など重篤な副作用が問題となり得る。その背景として、現存の血管新生阻害剤が開発された当時は、腫瘍血管は正常組織の血管と同じ性質であると考えられてきたことが挙げられる。【０００５】
しかし、現在では腫瘍血管が正常血管とは形態的及び機能的に異なること、さらにその内側を構成する血管内皮細胞のレベルにおいても、腫瘍血管内皮細胞（Ｔｕｍｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）は正常血管内皮細胞（Ｎｏｒｍａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）とは様々な点で異なることが知られている（非特許文献１及び２）。血管新生阻害療法の副作用を最小限にし、より腫瘍血管に特異的な新しい血管新生阻害療法を開発するためには、腫瘍血管内皮細胞の特異性を利用した薬剤開発の必要性が認識されるようになってきた（例えば特許文献１、特許文献２）。【０００６】
新規薬剤の開発には、標的とする細胞を用いて化合物ライブラリを評価するＣｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇが一般的に行われている。数千、数十万に及ぶ多くの化合物を用いた網羅的な解析により、目的の細胞への阻害作用をもたらす物質を探し出す方法であるが、そのためには適切な細胞種と十分な細胞数の確保が必要である。特に、細胞の選択は非常に重要で、スクリーニングの成功に大きく影響を及ぼす。そのため、治療標的としている疾患の病態を可能な限りｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現している細胞の確保が重要である。【０００７】
腫瘍血管内皮細胞に特異的な薬剤の開発のための、血管新生阻害活性をもつ化合物を同定するためには、腫瘍血管内皮細胞又はその形質を再現した細胞を用いてのスクリーニングが必要となる。しかし、腫瘍組織から分離できる腫瘍血管内皮細胞の収量は、腫瘍組織を単細胞化した集団のなかでわずかに２％足らずであり、初代培養である血管内皮細胞の大量培養には様々な限界がある。例えば、ヒトの手術摘出組織検体では、腫瘍の大きさにより、腫瘍血管内皮細胞の分取に用いることが可能な組織の量が限られている。また、組織からの分離の煩雑さ、培養にかかる高価な培地のコストなども問題となる。さらに、ヒト由来細胞の場合は、セネッセンス（老化）による増殖停止の課題があり、十分な細胞数の確保が困難となっている。一方、腫瘍血管由来の内皮細胞の特徴を備えながら不死化した細胞を取得したという報告は、これまでなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１６４６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１１／１９０６５号パンフレット
【非特許文献１】Br J Cancer. 106, 1214-23, 2012
【非特許文献２】Br J Cancer. 109, 2237-2247, 2013
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、化合物スクリーニングなどの細胞ベースの実験に有用な不死化したヒト由来腫瘍血管内皮細胞株を取得することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、所定の条件下でヒト由来腫瘍血管内皮細胞の分離、培養を行い、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔをコードする遺伝子（以下、ＳＶ４０Ｔ遺伝子と表す）及びヒトテロメア逆転写タンパク質をコードする遺伝子（以下、ｈＴＥＲＴ遺伝子と表す）を導入することで、ヒト腫瘍血管内皮細胞を効率的に不死化させることができることを見出し、以下の発明を完成させた。【００１１】
（１）腫瘍血管内皮細胞を含む腫瘍組織由来の細胞懸濁液に対して磁気ビーズを用いた細胞分離、及び任意選択のフローサイトメトリーによる細胞分離を行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を分離する分離工程、
分離されたＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を継代培養する培養工程、
継代培養後の細胞群に対して、フローサイトメトリーを行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を再分離することを１〜２回繰り返す、任意選択の再分離工程、
培養工程又は再分離工程後の細胞群に、ＳＶ４０Ｔ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に有するウイルスベクターを感染させる感染工程、及び
感染した細胞群を継代培養し、次いで前記蛍光タンパク質を発現しているＣＤ３１陽性細胞群をフローサイトメトリーにより分離する細胞選抜工程
を含む、不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
（２）培養工程において継代培養が１〜７回行われる、（１）に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
（３）培養工程において継代時の培養基材からの細胞の剥離が複数回に分けて行われる、（１）又は（２）に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
（４）感染工程においてウイルスベクターを３００〜１２００のＭＯＩで感染させる、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
（５）細胞選抜工程において継代培養が２〜３回行われる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法。
（６）ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を組換え遺伝子として有し、少なくとも５０回以上の継代培養が可能な、不死化腫瘍血管内皮細胞株。
（７）ペリオスチン（Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）の発現が、ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を組換え遺伝子として有する不死化正常血管内皮細胞における発現と比較して亢進している、（６）に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株。
（８）さらにバイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）及び／又はリジルオキシダーゼ（Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）の発現が、ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を組換え遺伝子として有する不死化正常血管内皮細胞における発現と比較して亢進している、（７）に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株。
（９）ヒト腎癌組織由来である、（６）〜（８）のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株。
（１０）国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２４として寄託されている不死化ヒト腫瘍血管内皮細胞株。
（１１）（６）〜（１０）のいずれか一項に記載の不死化腫瘍血管内皮細胞株及び正常な血管内皮細胞に試験物質を接触させて各細胞の応答を比較する工程を含む、腫瘍血管内皮細胞に特異的に作用する物質をスクリーニングする方法。
（１２）正常血管内皮細胞が不死化された細胞株である、（１１）に記載のスクリーニング方法。
（１３）不死化腫瘍血管内皮細胞株が国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２４として寄託されている不死化ヒト腫瘍血管内皮細胞株であり、不死化された正常な血管内皮細胞が国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２５として寄託されている不死化ヒト正常血管内皮細胞株である、（１２）に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、腫瘍組織由来の腫瘍血管内皮細胞から少なくとも５０回以上の継代培養が可能な不死化細胞株を樹立することができ、腫瘍血管内皮細胞に特異的な薬剤のスクリーニング又は医薬の開発に対して、必要量の腫瘍血管内皮細胞を安定的かつ大量に提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を有するウイルスベクターが導入された腫瘍血管内皮細胞（ｈ−ｉｍＴＥＣ）及び正常腎組織由来血管内皮細胞（ｈ−ｉｍＮＥＣ）におけるＶｅｎｕｓ及びｍＣｈｅｒｒｙの発現を示すフローサイトメトリーのヒストグラムである。ヒト皮膚微小血管内皮細胞株（ｉｍＨＭＶＥＣ）はＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子の導入により不死化したヒト皮膚微小血管内皮細胞である。
【図２】ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣにおけるＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子の発現をＰＣＲで確認した結果を示すゲル写真である。ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）はネガティブコントロール、ｉｍＨＭＶＥＣ及びマウス膵島血管内皮細胞（ＭＳ−１）はポジティブコントロールである。
【図３】ｈ−ｉｍＴＥＣ、ｈ−ｉｍＮＥＣ及びＨＭＶＥＣの細胞集団倍加数（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ）を示すグラフである。
【図４】ｈ−ｉｍＴＥＣ（Ｐ５７）、ｈ−ｉｍＮＥＣ（Ｐ５８）、ｉｍＨＭＶＥＣ（Ｐ５７）及びＨＭＶＥＣ（Ｐ１３）を老化関連酸性β−ガラクトシダーゼで染色したときの顕微鏡写真である（スケールバー＝１００μｍ）。ＨＭＶＥＣはポジティブコントロールである。
【図５】腫瘍血管内皮細胞（ｈ−ＴＥＣ）、ｈ−ｉｍＴＥＣ、正常血管内皮細胞（ｈ−ＮＥＣ）、ｈ−ｉｍＮＥＣ、ｉｍＨＭＶＥＣ及びＨＭＶＥＣの外観を示す顕微鏡写真である（スケールバー＝１００μｍ）。
【図６】ｈ−ｉｍＴＥＣ、ｈ−ｉｍＮＥＣ、ｉｍＨＭＶＥＣ及びＨＭＶＥＣにおけるＣＤ３１及びＣＤ１４４の発現をＲｅｇｕｌａｒ−ＰＣＲで確認した結果を示すゲル写真である。ＨＭＶＥＣはポジティブコントロールである。
【図７】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を用いたＴｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙによるｈ−ｉｍＴＥＣ、ｈ−ｉｍＮＥＣ、ｉｍＨＭＶＥＣ及びＨＭＶＥＣの管腔形成能を示す顕微鏡写真である（スケールバー＝１００μｍ）。ＨＭＶＥＣはポジティブコントロールである。
【図８】Ｓｏｆｔ  ａｇａｒ  ａｓｓａｙによるｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣの足場依存性を示す顕微鏡写真である（スケールバー＝１００μｍ）。ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５ＳＭはポジティブコントロールである。
【図９】ｈ−ｉｍＴＥＣ、ｈ−ｉｍＮＥＣ及びｉｍＨＭＶＥＣにおけるＢｉｇｌｙｃａｎ（パネルＡ）及びＬｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ（パネルＢ）の発現をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定した結果を示すグラフである。
【図１０】ＭＴＳ  ａｓｓａｙによるｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣの細胞増殖能の比較を示すグラフである。
【図１１】Ｓｃｒａｔｃｈ  ａｓｓａｙによるｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣの細胞遊走能を示す顕微鏡写真である（スケールバー＝１００μｍ）。
【図１２】ｈ−ｉｍＴＥＣ、ｈ−ｉｍＮＥＣ及びｉｍＨＭＶＥＣにおけるＰｅｒｉｏｓｔｉｎの発現をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の態様は、腫瘍血管内皮細胞を含む腫瘍組織由来の細胞懸濁液に対して磁気ビーズを用いた細胞分離、及び任意選択のフローサイトメトリーによる細胞分離を行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を分離する分離工程、
分離されたＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を継代培養する培養工程、
継代培養後の細胞群に対して、フローサイトメトリーを行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を再分離することを１〜２回繰り返す、任意選択の再分離工程、
培養工程又は再分離工程後の細胞群に、ＳＶ４０Ｔ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に有するウイルスベクターを感染させる感染工程、
感染した細胞群を継代培養し、次いで前記蛍光タンパク質を発現しているＣＤ３１陽性細胞群をフローサイトメトリーにより分離する細胞選抜工程
を含む不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法に関する。
【００１５】
本発明の第１の態様は、腫瘍血管内皮細胞を含む腫瘍組織由来の細胞懸濁液に対して磁気ビーズを用いた細胞分離、及び任意選択のフローサイトメトリーによる細胞分離を行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を分離する分離工程を含む。本工程における腫瘍血管内皮細胞を含む腫瘍組織由来の細胞懸濁液は、Ｈｉｄａら（Ｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００４，６４，ｐｐ．８２４９−８２５５；本文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の方法に準拠して行うことができる。具体的には、臨床的にがんと診断された患者から採取された腫瘍組織を細切し、コラゲナーゼ処理を行って単細胞化することで細胞懸濁液を調製することができる。細胞懸濁液は、溶血剤で処理することで赤血球その他の血液細胞の混入を防止しておくことが好ましい。
【００１６】
本発明の第１の態様では、ＣＤ３１陰性細胞の混入を抑制するために、コラゲナーゼ処理等を行って得られた細胞懸濁液に対して抗ＣＤ３１抗体を担持させた磁気ビーズを用いたＣＤ３１陽性細胞の分離が行われる。ＣＤ３１抗原は、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１（ＰＥＣＡＭ−１）とも呼ばれ、分子量１４０ｋＤａの単鎖膜糖タンパクで、血管内皮細胞において発現している細胞表面抗原の一つである。磁気ビーズを用いた細胞分離操作は、当業者に広く知られ、又は汎用されている方法にしたがって行えばよく、またＭｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣＤ３１マクロビーズキット（http://www.miltenyibiotec.co.jp/ja-jp/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-reagents/endothelial-cells/cd31-microbead-kit-human.aspx）等の市販のキットを利用するときは、製造業者のプロトコールに従って行えばよい。
【００１７】
分離工程におけるフローサイトメトリーは、前記細胞懸濁液に対して、ＣＤ３１陽性を指標として、任意選択として行われる。本分離工程におけるフローサイトメトリーは、市販のフローサイトメーターを利用して行うことができるが、その際の操作条件は、処理される細胞群の細胞数を５００個／秒以下、好ましくは１００〜３００個／秒とし、流速を１〜２ｍＬ／時とすることが好ましい。この操作条件によって、フローサイトメトリー内でＣＤ３１陽性細胞が分離されるポイントを流れる細胞数を低くし、分離時の血管内皮細胞以外の細胞の混入を抑制することができる。本工程におけるフローサイトメトリーは、磁気ビーズを用いた細胞分離後の細胞群におけるＣＤ３１陽性細胞の含有率が８０％以上である場合には行わなくともよい。また、分離工程で磁気ビーズ及びフローサイトメトリーによる分離を繰り返すと細胞生存率が著しく低下し培養可能な細胞を得ることが困難となるため、分離工程でのこれらの操作は１回ずつとすることが好ましい。
【００１８】
本発明の第１の態様は、前記分離工程で分離されたＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を継代培養する培養工程を含む。培養は、適当な培養基材、例えばゼラチン及びフィブロネクチンでコーティングした培養皿を用い、ＥＧＭ−２ＭＶ培地等の適当な培地中で行えばよい。培養工程における継代培養の回数は、その後の再分離工程及び感染工程においてフローサイトメトリーによる細胞分離及び感染を適切に行うことができる程度まで細胞数を増加させることができ、かつ細胞老化を生じさせない範囲で適宜設定され、例えば１〜１０回、好ましくは１〜７回行われる。
【００１９】
本発明の第１の態様においては、各継代において細胞密度が８〜９割に達したところで細胞を培養基材から剥離回収して、次の継代に移行させることが好ましい。また、培養基材からの細胞剥離は、５分間程度のトリプシン処理と浮遊した細胞の回収を行った後、剥離された細胞数及びその状態を確認して、剥離が不十分であった場合には前記トリプシン処理及び細胞回収を繰り返して行うことが好ましい。かかる工夫も、腫瘍血管内皮細胞以外の細胞の増殖を抑制し、また腫瘍血管内皮細胞へのダメージを低減するために有効である。
【００２０】
本発明の第１の態様は、継代培養後の細胞群に対して、フローサイトメトリーを行ってＣＤ３１陽性細胞を含む細胞群を再分離することを１〜２回繰り返す、任意選択の再分離工程を含む。繰り返しとは、継代培養後の細胞群に対してフローサイトメトリーを行って回収されたＣＤ３１陽性細胞群に対して、再びＣＤ３１陽性細胞を回収するためのフローサイトメトリーを１〜２回行うことをいう。再分離工程は、分離工程後の細胞群のＣＤ３１陽性細胞の含有率が８０％に満たない場合に行うことが好ましく、再分離によってＣＤ３１陽性細胞群の含有率を８０％以上に高めることができる。フローサイトメトリーにおける操作条件は前記分離工程における操作条件と同じである。再分離工程においてフローサイトメトリーを１回行った後に得られた細胞数が少ない場合には、任意選択で１〜５回の継代培養を行ってから、さらなるフローサイトメトリーを行ってもよい。なお、分離工程後のＣＤ３１陽性細胞の含有率が８０％以上である場合には再分離工程は行わなくともよい。
【００２１】
分離工程後の細胞群のＣＤ３１陽性細胞の含有率は５０％に満たないことが多く、ウイルスベクターを感染させても、形質転換された腫瘍血管内皮細胞を取得することが事実上できないことが、本発明者らによって確認された。推測ではあるが、腫瘍血管内皮細胞の増殖能は細胞懸濁液に混在する他の細胞のそれと比較すると低いことから、細胞群に含まれる腫瘍血管内皮細胞の割合が低いとウイルスベクターに感染した腫瘍血管内皮細胞の増殖が、混在する他の細胞の増殖によって駆逐されてしまうことが原因であると推察される。本発明の第１の態様における方法は、磁気ビーズによる細胞分離、フローサイトメトリーによる細胞分離、継代培養、及びフローサイトメトリーによる再分離を適宜組み合わせることによって、ウイルスベクターを感染させる細胞群におけるＣＤ３１陽性細胞の含有率を８０％以上に高めることで、上記の問題を解消することを特徴の一つとする。
【００２２】
また、かかるＣＤ３１陽性細胞の含有率が高い細胞群に対して、老化が起こる前にウイルスベクターを感染させることにより、老化が生じていないＣＤ３１陽性細胞を多く含有する細胞群を得ることができる。この細胞群に対して後述の細胞選抜工程を行うことにより、ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子が導入されて形質転換したＣＤ３１陽性細胞の含有率が８０％以上である、老化が生じていない細胞群の取得を可能にすることも、本発明の特徴である。
【００２３】
本発明の第１の態様は、ＣＤ３１陽性細胞の含有率が８０％以上である培養工程又は再分離工程後の細胞群に、ＳＶ４０Ｔ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に有するウイルスベクターを感染させる感染工程を含む。ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子はいずれも、生体から分離された非増殖性の初代細胞に遺伝子導入されることで、当該細胞にインビトロで実質上無限に増殖する能力を与える、すなわち当該細胞を不死化する遺伝子として、当業者に広く知られ、利用されている遺伝子である。また、蛍光タンパク質は、哺乳動物細胞内で発現することができ、その蛍光を指標としたフローサイトメトリーによって蛍光タンパク質が発現している細胞を分離することを可能にするものであれば、特に制限はない。蛍光タンパク質の例としては、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＶｅｎｕｓ等を挙げることができる。これら蛍光タンパク質をコードする遺伝子は、市販の蛍光タンパク質発現ベクターから適宜組み換えて使用することができる。
【００２４】
ウイルスベクターは、ＳＶ４０Ｔ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子を発現可能に導入することのできるものであれば、その種類に特に制限はない。本発明で使用できるウイルスベクターとしては、組換え型レトロウイルスベクター、組換え型アデノウイルスベクター、組換え型アデノ随伴ウイルスベクターなどを挙げることができる。上記の中でも好ましくは組換え型レトロウイルスベクターであり、特に好ましくは組換え型レンチウイルスベクターである。
【００２５】
組み換えウイルスベクターの作製は、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを欠損している組換えウイルスベクタープラスミドと、該欠損するタンパク質を補給できる任意のパッケージング細胞とを用いることで、調製することができる。例えばヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３等が、パッケージング細胞として利用される。
【００２６】
パッケージング細胞へのウイルスベクタープラスミドの導入法は特に限定されず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法又はエレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入法で行うことができる。本発明におけるウイルスベクターの作製は、組換え型ウイルスベクターの構築、パッケージング及び遺伝子導入操作を含め、当業者の通常の実施能力の範囲で行うことができる。
【００２７】
本発明の第１の態様において好ましいウイルスベクターは、例えばＲＰＬｓｉｎ−ＳＶ４０  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（ａｄｄｇｅｎｅ）及びＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈＴＥＲＴ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）等のような、ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲ遺伝子並びに蛍光タンパク質をコードする遺伝子を有する組換え型レンチウイルスベクターである。
【００２８】
本発明の第１の態様にかかる感染工程では、ウイルスベクターを３００〜１２００の、好ましくは５００〜１０００のＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染させることが好ましい。上記以外のＭＯＩでは、細胞傷害を起こしたり、感染効率が低下したりする傾向が認められる。また感染時間については、６時間だと導入効率が低くなる傾向が、また２４時間だと細胞傷害が大きくなる傾向が認められることから、概ね１０〜１４時間、特に１２時間とすることが好ましい。
【００２９】
本発明の第１の態様は、感染した細胞群を継代培養し、次いで前記蛍光タンパク質を発現しているＣＤ３１陽性細胞群をフローサイトメトリーにより分離する細胞選抜工程を含む。本工程における継代培養の培地、細胞密度の調節、トリプシン処理による細胞剥離操作は、前記培養工程と同様にして行うことが好ましく、フローサイトメトリーにおける操作条件も、前記分離工程における操作条件と同様にして行うことが好ましい。本工程における継代培養の回数は、フローサイトメトリーによる細胞分離を適切に行うことができる程度まで細胞数を増加させることができる範囲で適宜設定され、例えば１〜５回、好ましくは２〜３回行われる。この細胞選抜工程によって、ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子が導入されて形質転換したＣＤ３１陽性細胞の含有率が８０％以上である細胞群を得ることができる。
【００３０】
以上の工程を経ることによって調製される形質転換細胞について、適当な培地中での細胞の増殖能の確認、及び細胞の形態学的特徴、特徴的な遺伝子の発現、その他細胞生物学的な特徴を確認することで不死化した腫瘍血管内皮細胞株の樹立を確認することができる。
【００３１】
本態様にかかる方法で樹立される細胞株は、ＥＧＭ−２ＭＶ培地中で増殖し、少なくとも５０代、又は適切な培養条件下ではそれ以上継代培養が可能な能力を有し、その間において細胞の老化は実質的に観察されないという性質を有する。
【００３２】
また前記細胞株は、血管内皮細胞のマーカーとされているＣＤ３１及びＣＤ１４４を安定的に発現し、血管内皮細胞が一般的に有する管腔形成能も有しているとともに、別に樹立した正常組織由来の正常血管内皮細胞を不死化した細胞と比較して、増殖速度及び遊走能がいずれも高く、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）やＬｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  の発現が亢進しているなどの、腫瘍血管内皮細胞としての特徴（非特許文献１及び２）も併せ持っている細胞である。
【００３３】
以上のように、本発明の第１の態様である方法で樹立される細胞株は、不死化腫瘍血管内皮細胞と結論付けることができる。本発明の第１の態様は、前記各工程を含む、不死化腫瘍血管内皮細胞の製造方法と表すこともできる。
【００３４】
本発明の第２の態様は、ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を組換え遺伝子として有し、少なくとも５０回以上の継代培養が可能な、不死化腫瘍血管内皮細胞株に関する。
【００３５】
かかる細胞株は、前記第１の態様にかかる本発明の方法によって製造することができる。本態様にかかる細胞は、適当な培地中で増殖し、少なくとも５０回、又は適切な培養条件下ではそれ以上の継代培養が可能な能力を有し、その間において細胞の老化は事実上観察されないという性質を有する他、血管内皮細胞のマーカーとされているＣＤ３１及びＣＤ１４４を安定的に発現し、血管内皮細胞が一般的に有する管腔形成能も有しており、さらに増殖速度及び遊走能が高い等の血管内皮細胞としての性質を備えている。さらに、好ましくはＰｅｒｉｏｓｔｉｎの発現が不死化正常血管内皮細胞よりも亢進している、より好ましくはＰｅｒｉｏｓｔｉｎに加えてＢｉｇｌｙｃａｎ又はＬｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅの発現が不死化正常血管内皮細胞よりも亢進している、さらにより好ましくはＰｅｒｉｏｓｔｉｎ、Ｂｉｇｌｙｃａｎ及びＬｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅの発現が不死化正常血管内皮細胞よりも亢進しているなどの特徴を有する。
【００３６】
本態様の不死化腫瘍血管内皮細胞株は、以下の（１）〜（６）の特徴を有する不死化腫瘍血管内皮細胞株と表すことができる。
（１）ＳＶ４０Ｔ遺伝子及びｈＴＥＲＴ遺伝子を組換え遺伝子として有する
（２）少なくとも５０回以上の継代培養が可能である
（３）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を用いたｔｕｂｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙにおいて管腔形成能を示す
（４）Ｂｉｇｌｙｃａｎの発現が亢進している
（５）Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅの発現が亢進している
（６）Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎの発現が亢進している
【００３７】
Ｂｉｇｌｙｃａｎ、Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、又はＰｅｒｉｏｓｔｉｎの発現が亢進しているとは、当該不死化腫瘍血管内皮細胞株におけるこれらの遺伝子又はタンパク質の発現量が、不死化正常血管内皮細胞におけるこれらの遺伝子又はタンパク質の発現量と比較して多いことを意味する。
【００３８】
発現量の比較対象として用いられる不死化正常血管内皮細胞は、不死化腫瘍血管内皮細胞株と同じ組織に由来するものであることが好ましいが市販の不死化正常血管内皮細胞（ｉｍＨＭＶＥＣ）でもよい。また、不死化正常血管内皮細胞は過度の継代により遺伝子発現等の性質が変化することがあるため、比較対象として用いられる不死化正常血管内皮細胞は、継代回数の少ないものであることが好ましい。
【００３９】
Ｂｉｇｌｙｃａｎ、Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ又はＰｅｒｉｏｓｔｉｎの遺伝子又はタンパク質の発現量の測定は、塩基配列又はアミノ酸配列が公知である遺伝子又はタンパク質の発現量を測定することが可能な、当業者に公知の各種方法を採用して行うことができる。典型的な方法は、Ｂｉｇｌｙｃａｎ、Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ又はＰｅｒｉｏｓｔｉｎの遺伝子の公知の塩基配列を元にして設計した塩基配列からなる核酸をプライマーとして用いるＰＣＲ法、特にリアルタイムＰＣＲ法、ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ法、及び上記因子タンパク質に特異的な抗体を用いる免疫学的方法、特にＥＬＩＳＡである。
【００４０】
本発明者らは、事前同意を得た腎癌患者から摘出された腎臓の腫瘍部位から腫瘍血管内皮細胞を、同じ腎臓の正常部位から正常な血管内皮細胞を、それぞれ分離し、前述の第１の態様にかかる方法を適用して、不死化腫瘍血管内皮細胞株及び不死化正常血管内皮細胞株を樹立した。さらに各細胞株を、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、２０１７年２月１６日付で、不死化腫瘍血管内皮細胞株を受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４２４（識別の表示：ｈ−ｉｍＴＥＣ＿ＲＣＣ０１）として、正常血管内皮細胞株を受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２４２５（識別の表示：ｈ−ｉｍＮＥＣ＿ＲＣＣ０１）として、それぞれ国内寄託した。また、上記各細胞株を、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターを国際寄託機関として、２０１８年１月３０日付けで国際寄託への移管請求を行い、不死化腫瘍血管内皮細胞株を受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２４（識別の表示：ｈ−ｉｍＴＥＣ＿ＲＣＣ０１）として、正常血管内皮細胞株を受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２５（識別の表示：ｈ−ｉｍＮＥＣ＿ＲＣＣ０１）として、それぞれ国際寄託した。
【００４１】
本発明の第３の態様は、前記国際受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２４２４（識別の表示：ｈ−ｉｍＴＥＣ＿ＲＣＣ０１）として、国際寄託機関である独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに国際寄託された不死化腫瘍血管内皮細胞株に関する。
【００４２】
不死化腫瘍血管内皮細胞株は、インビトロで事実上無限に増殖することができることから、腫瘍血管に特異的な新しい血管新生阻害療法の開発、特に腫瘍血管内皮細胞に対する特異的な薬剤開発において必要となる腫瘍血管内皮細胞を、安定的にかつ大量に供給することを可能にするものであり、同細胞株を用いたＣｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇに利用することができる。例えば、不死化腫瘍血管内皮細胞株と、正常な血管内皮細胞、特に不死化された正常血管内皮細胞とに試験物質を接触させたときの細胞の応答、典型的には試験物質を含む適当な培地中で各細胞を培養したときの細胞の形態変化、増殖能の変化、生化学反応、アポトーシスの誘導、遺伝子発現等の変動等を比較することで、腫瘍血管内皮細胞に特異的に作用する物質をスクリーニングすることが可能となる。
【００４３】
特に、同一個体すなわち一患者の同一の臓器から分離された腫瘍血管内皮細胞と正常な血管内皮細胞それぞれから樹立される不死化細胞株は、同一の遺伝子背景を有する株化細胞の組み合わせとして、血管新生阻害療法の開発又は腫瘍血管内皮細胞に対する特異的な薬剤のスクリーニング又は開発において有用な研究材料となり得る。本発明は、不死化腫瘍血管内皮細胞株及び正常な血管内皮細胞に試験物質を接触させて各細胞の応答を比較する工程を含む、腫瘍血管内皮細胞に特異的に作用する物質をスクリーニングする方法を、第４の態様として提供するものである。特に正常な血管内皮細胞は不死化された細胞株であることが好ましく、したがって前記２種の寄託細胞株の組み合わせは、本発明に係るスクリーニング方法において有用な細胞株として利用することができる。
【００４４】
例えば、適当な培地で増殖中の前記２種の寄託細胞株に対して試験物質を添加したときの両細胞の応答を比較することで、不死化腫瘍血管内皮細胞株に特異的に作用してその増殖を抑制したり、アポトーシスを引き起こしたりすることができる物質を効率的に探索することが、またかかる探索をいわゆるハイスループット化することが可能となる。特に、不死化腫瘍血管内皮細胞株の増殖を特異的に抑制したり、アポトーシスを引き起こしたりすることのできる物質は、抗腫瘍剤又は腫瘍転移抑制剤として利用することができると期待される。
【００４５】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４６】
１）血管内皮細胞の分離と培養
北海道大学の自主臨床研究に関する承認及びヒトを対象とする医学系研究に関する倫理指針の下、臨床的に腎癌と診断された患者から、術前の文書同意を得て、手術切除組織から腎癌組織及び正常腎組織を採取した。【００４７】
採取された各組織を外科用剪刀を用いてハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ：Ｇｉｂｃｏ（登録商標）  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で細切後、５０ｍＬのコニカルチューブに移し、ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ：Ｇｉｂｃｏ（登録商標）  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）を加え、３７℃で１時間撹拌して細胞懸濁液を調製した。【００４８】
氷上にチューブを立て、非働化済みの牛胎仔血清（ＦＢＳ：Ｈｙｃｌｏｎｅ（登録商標）  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を該細胞懸濁液と等量入れ、コラゲナーゼの作用を止めた。【００４９】
細胞懸濁液を別の新しい５０ｍＬチューブに１００μｍメッシュサイズのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して移動させた後、１，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して細胞を沈殿させた。２．５％ＦＢＳ含有ＨＢＳＳで細胞を２回洗浄し、１，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心後、上清を除去した。２．５％ＦＢＳ含有ＨＢＳＳで懸濁後、別の新しい５０ｍＬチューブに７０μｍメッシュサイズのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して移動させた後、１，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して細胞を沈殿させた。【００５０】
上清を除去後、溶血剤（Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を２０ｍＬ加えて懸濁し、室温で１５分間反応させた。１，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心後、ＭＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒ（脱気した０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ含有緩衝液：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で細胞を２回洗浄した。ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁後、ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、４℃で１０分間反応させた。【００５１】
抗ヒトＣＤ３１磁気ビーズ（Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、４℃で３０分間反応後、ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで細胞を洗浄し、１，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。ＬＳ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をＭＡＣＳマニュアル細胞分離装置のマグネットに設置し、ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒを３回加えてキャリブレーションした後、１５ｍＬチューブをカラムの下に設置した。【００５２】
ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁した細胞懸濁液５００μＬをカラムに加え、ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３ｍＬで３回洗浄してＣＤ３１陰性細胞として回収した。カラムをマグネットから外し、５ｍＬのＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒを加えてカラム内に残った磁気標識されたＣＤ３１陽性細胞を、付随しているシリンジによって物理的に別の１５ｍＬチューブに押し出して回収した。【００５３】
回収した細胞群のＣＤ３１陽性率が８０％未満である場合にはさらにフローサイトメトリーによる分離を行った。フローサイトメトリーによる分離操作において、溶液中の細胞数を３００個 ／秒以下とし、さらに流速を下限（１ｍＬ／時）に設定することで、フローサイトメトリー内でＣＤ３１陽性細胞が分離されるポイントを流れる細胞数を下げ、血管内皮細胞以外の細胞の混入を回避しながら、ＣＤ３１陽性細胞を分離した。【００５４】
このようにして回収した腎癌組織由来及び非癌部正常腎組織由来のＣＤ３１陽性細胞を、１．５％ゼラチン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）、１０μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした培養皿を用い、１５％ＦＢＳを含むＥＧＭ−２  ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ）中で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで１〜２回継代培養し、感染工程へとすすんだ。【００５５】
分離工程終了後のＣＤ３１陽性細胞の含有率が８０％未満であった場合は前述の条件で１〜７回継代培養した後に上記の条件で再度フローサイトメトリーによる再分離を行い、８０％以上の純度のＣＤ３１陽性細胞である血管内皮細胞を分離した。【００５６】
上記の継代培養において、混入しているがん細胞や線維芽細胞などの他の細胞に血管内皮細胞が駆逐されないように、細胞密度が８〜９割のところで継代した。また、細胞を培養皿から剥離するためのトリプシン処理について、トリプシン処理開始後５分でトリプシンをクエンチして剥がれた細胞を回収し、剥がれていない細胞が多く残存している場合には追加のトリプシン処理を行うなどして、剥離状態を観察しながら行った。【００５７】
２）ウイルス液の調製
レンチウイルス発現ベクターとして、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ｈＴＥＲＴ−ＩＲＥＳ２−Ｖｅｎｕｓ（国立がんセンター研究所  増富健吉博士及び石井源一郎博士より供与）及びＲＰＬｓｉｎ−ＳＶ４０  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃５８９９３）を使用した。レンチウイルス調製には、パッケージング用プラスミドとしてｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ（理化学研究所バイオリソースセンター  ＃ＲＤＢ４３９４）及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ（理化学研究所バイオリソースセンター  ＃ＲＤＢ４３９３）を、上記プラスミドと合わせて使用した。【００５８】
サブコンフルエント状態のＨＥＫ２９３Ｔ細胞（理化学研究所  ＃ＲＣＢ２２０２）を直径６０ｍｍのＴｙｐｅ  Ｉコラーゲンコートディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に１×１０６／４ｍＬ  １０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／ｄｉｓｈ程度播種して約２４時間培養し、サブコンフルエントにした。マイクロチューブにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２００μＬ、ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ  ２μｇ、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ  ２μｇ、上記発現ベクター４μｇ、トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）２４μＬを混和し、１５分間室温で静置してＤＮＡ溶液を調製した。【００５９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＤＮＡ溶液を加えて１２時間培養後、培養上清を吸引除去し、新鮮な１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに交換してさらに４８時間培養した。ウイルス含有培養上清を回収し、０．４５μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を通して浮遊細胞等を除去後、６，０００×ｇ、４℃で１６時間遠心した。上清を除去し、ＥＧＭ−２ＭＶ培地で懸濁して−８０℃に保存した。ウイルスのタイター（力価）は、ｑＰＣＲ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ａｂｍ）を用いて測定した。【００６０】
３）血管内皮細胞への遺伝子導入
１）で分離した血管内皮細胞をＥＧＭ−２ＭＶ培地を用いて３０％コンフルエント程度に培養した後、ＭＯＩ５００〜１０００に調製した２）のウイルス溶液を含むＥＧＭ−２ＭＶ培地に交換して１２時間感染させた。【００６１】
感染後、培養上清を吸引除去し、新鮮なＥＧＭ−２ＭＶ培地に交換して血管内皮細胞を増殖させた。２〜３回継代培養を行った後、Ｖｅｎｕｓ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光及びＣＤ３１を指標としたＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩによって陽性細胞のみを分離することで、ウイルスベクターが導入された血管内皮細胞（腎癌組織由来の細胞をｈ−ｉｍＴＥＣ、非癌部正常腎組織由来の細胞をｈ−ｉｍＮＥＣと表す）を選抜した。選抜後に２〜５回継代培養し培養後のＣＤ３１陽性率が８０％に満たない場合にはＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩによる再選抜を行った。ｍＣｈｅｒｒｙ及びＶｅｎｕｓの蛍光輝度を解析することで遺伝子導入された細胞の純度を確認した（図１）。【００６２】
４）ＳＶ４０、ｈＴＥＲＴの発現確認
ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣからｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。１μｇのＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ、ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｏＹｏＢｏ）、Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ（Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）及びｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。使用したプライマーの配列を以下に示す。【００６３】
ＳＶ４０：
forward  5’-GGTGGGTTAAAGGAGCATGA-3’      （配列番号１）
reverse  5’-CAACTCCAGCCATCCATTCT-3’         （配列番号２）
ｈＴＥＲＴ：
forward  5’-GCATCAGGGGCAAGTCCTAC-3’      （配列番号３）
reverse  5’-CCAACAAGAAATCATCCACCAA-3’   （配列番号４）
ｈｕｍａｎ  ＧＡＰＤＨ：
forward  5’-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’        （配列番号５）
reverse  5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’          （配列番号６）【００６４】
ＰＣＲは、ＧｏＴａｑ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、イニシャルインキュベーション（９５℃  ２分）、熱変性（９５℃  ３０秒）、アニーリング（５８℃  ２０秒）、伸長反応（７２℃  ６０秒）を行い、内部標準にはＧＡＰＤＨを用いた。２％アガロースゲル（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて増幅産物の電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を使用して紫外線光下で各バンドを確認した。その結果、ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣにおいてＳＶ４０Ｔ、ｈＴＥＲＴの発現が確認された（図２）。【００６５】
５）継代数の確認
ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣを５．０×１０３個／ウェルの密度になるようＥＧＭ−２ＭＶ培地で調整して、それぞれ２４ウェルプレートに播種した。２日間培養後に培地を交換し、さらに２日間培養した。Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）で細胞を回収し、細胞数をカウントした。Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇは、Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ＝ｌｏｇ（培養終了時の細胞数／培養開始時の細胞数）／ｌｏｇ２として算出した。【００６６】
４日ごとに細胞数を計測し、細胞集団倍加数を算出したところ、図３に示す通りｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣにおいて、継代数５０（Ｐ５０）を超えても細胞増殖の維持が確認された。遺伝子導入をしていない血管内皮細胞では、Ｐ１５前後で細胞が増殖しなくなった。【００６７】
６）細胞老化の回避
ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣをサブコンフルエントに培養後、培養上清を除去してＰＢＳで洗浄した。Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（老化関連酸性β−ガラクトシダーゼ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ＳＡ−β−Ｇａｌ）活性を可視化するためのキット、Ａｂｃａｍ）に付随しているＦｉｘａｔｉｖｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加して１５分間室温で固定した。ＰＢＳで２回洗浄後、Ｋｉｔに付随しているＳｔａｉｎｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｘ−Ｇａｌ含有）を用いて３７℃で染色し、倒立顕微鏡で観察した（図４）。【００６８】
ＨＭＶＥＣは継代数１３でβ−ガラクトシダーゼ染色が観察されたのに対し、ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣは継代数５８で染色されず、老化現象が回避されていることが示唆された。【００６９】
７）血管内皮細胞の形質維持
ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣの形態を顕微鏡で観察した写真を図５に示す。遺伝子導入前の形態と比較してやや細長くなったが、大きな変化は見られなかった。【００７０】
８）ＣＤ３１及びＣＤ１４４の発現
ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣに対して、下記のプライマーを用いたＰＣＲを前記４）と同じ条件で行い、血管内皮細胞のマーカーであるＣＤ３１及びＣＤ１４４の発現を解析した。【００７１】
ｈｕｍａｎ  ＣＤ３１：
forward  5’-GACCAGGTGAAAGACTGAACC-3’   （配列番号７）
reverse  5’-TGCAGATATACGTCCCACTGTC-3’    （配列番号８）
ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４４：
forward  5’-CGTGTTCGCCATTGAGAGGC-3’      （配列番号９）
reverse  5’-ACGGACGCATTGAACAACCG-3’       （配列番号１０）【００７２】
ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣいずれも、ＣＤ３１及びＣＤ１４４の発現が認められた（図６）。【００７３】
９）管腔形成能
９６ウェルプレートをＧｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングし、３７℃で３０分間インキュベートした後、５％ＦＢＳ含有ＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）で懸濁したｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣを１．０×１０４個／ウェルの密度で播種した。３７℃で９時間インキュベート後、管腔形成を倒立顕微鏡で観察した（図７）。【００７４】
ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣいずれも管腔形成が認められ、ＳＶ４０Ｔ抗原及びｈＴＥＲＴ遺伝子の導入は血管内皮細胞としての性質に影響を及ぼさないことが示唆された。【００７５】
１０）足場依存性の確認
２％Ａｇａｒ（ＢＤ）を予め温めておいたＥＧＭ−２ＭＶ培地で希釈して０．９％Ａｇａｒを作製し、６ウェルプレートに１．２ｍＬ添加し、室温でゲル化させてＳｏｆｔ  ａｇａｒを作製した。ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣをＥＧＭ−２ＭＶ培地で懸濁し、２％Ａｇａｒに混和して終濃度０．３６％になるよう調整し、Ｓｏｆｔ  ａｇａｒの上に播き、３７℃で２〜３週間インキュベート後、倒立顕微鏡で細胞を観察した（図８）。【００７６】
ポジティブコントロールであるがん細胞Ａ３７５ＳＭは、Ｓｏｆｔ  ａｇａｒ上でコロニーを形成するのに対し、ｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣはいずれもコロニーを形成せず、足場依存性を有することが確認された。【００７７】
１１）遺伝子発現プロファイル
継代回数９と１３のｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣに対して、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）を用いてＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを行い、腫瘍血管内皮細胞マーカーとして報告されているＢｉｇｌｙｃａｎ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２０１２，Ｍａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６）及びＬｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ（Ｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１３）の発現を確認した。使用したプライマーの配列を以下に示す。【００７８】
ｈｕｍａｎ  Ｂｉｇｌｙｃａｎ：
forward  5’-GGCCATCCATCCAGTTTGGCAACTAC-3’（配列番号１１）
reverse  5’-CTGGCTTAGCTTCCTGGCTCTG-3’   （配列番号１２）
ｈｕｍａｎ  Ｌｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅ  （ＬＯＸ）：
forward  5’-CGACCCTTACAACCCCTACA-3’       （配列番号１３）
reverse  5’-CAGGTCTGGGCCTTTCATAA-3’        （配列番号１４）【００７９】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、イニシャルインキュベーション（９５℃  ３０秒）、熱変性（９５℃  １秒）、アニーリング（５８℃  ５秒）、伸長反応（５８℃）を４０サイクル行い、ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で増幅産物を定量した。内部標準にはＧＡＰＤＨを用い、ΔＣｔ法により相対比を比較検討した（図９）。【００８０】
継代回数９のｈ−ｉｍＴＥＣのＢｉｇｌｙｃａｎ発現はｈ−ｉｍＮＥＣより約２０倍高かった。また、Ｌｙｓｙｌ  ｏｘｉｄａｓｅの発現もｈ−ｉｍＮＥＣよりもｈ−ｉｍＴＥＣにおいて有意に亢進していた。【００８１】
１２）ＭＴＳアッセイ
ＥＧＭ−２ＭＶ培地で懸濁したｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣを１．０×１０３個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。３７℃で０、２４、４８、７２時間インキュベート後、ＭＴＳ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ：Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェル２０μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベート後に吸光度を測定した（図１０）。その結果ｈ−ｉｍＴＥＣはｈ−ｉｍＮＥＣより増殖速度が速いことが確認された。【００８２】
１３）Ｓｃｒａｔｃｈアッセイ
ＥＧＭ−２ＭＶ培地で懸濁したｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣ（１．０×１０５個）を１２ウェルプレートに播種し、３７℃でインキュベートしてコンフルエントにした。ピペットチップの先で各ウェル中央の細胞層をスクラッチし、１２時間培養してスクラッチした部分に移動してきた細胞を倒立顕微鏡で観察した（図１１）。【００８３】
ｈ−ｉｍＴＥＣは、ｈ−ｉｍＮＥＣより間隙への遊走が速く、不死化されていない腫瘍血管内皮細胞と同様の性質を維持していることが示唆された。【００８４】
１４）  遺伝子発現プロファイルの解析
継代回数１８と１９のｈ−ｉｍＴＥＣ及びｈ−ｉｍＮＥＣから、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）及び下記の塩基配列からなるプライマーＤＮＡを用いて、Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎの発現をＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで測定した。内部標準はβ−ａｃｔｉｎ（ＡＣＴＢ）を選択した。【００８５】
β−ａｃｔｉｎ
forward  5’-TTACAGGAAGTCCCTTGCCATCC -3’（配列番号１５）
reverse  5’-AAGCAATGCTATCACCTCCCCTG -3’（配列番号１６）
Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ：
forward  5’-GCACCTTCAAAGAAATCCCCGT -3’（配列番号１７）
reverse  5’-AGTGTGGGTCCTTCAGTTTTGAT -3’（配列番号１８）【００８６】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、イニシャルインキュベーション（９５℃  ３０秒）、熱変性（９５℃  １秒）、アニーリング（５８℃  ５秒）、伸長反応（５８℃）を４０サイクル行い、ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で増幅産物を定量し、ΔＣｔ法により相対比を比較検討した（図１２）。【００８７】
継代回数１８のｈ−ｉｍＴＥＣにおけるＰｅｒｉｏｓｔｉｎの発現はｈ−ｉｍＮＥＣより６倍以上亢進していた。ｈ−ｉｍＴＥＣにおけるＰｅｒｉｏｓｔｉｎの発現は、ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ）を用いた遺伝子発現プロファイル解析においてもｈ−ｉｍＮＥＣの３０倍以上の亢進が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の不死化腫瘍血管内皮細胞株を樹立する方法、不死化腫瘍血管内皮細胞株及び腫瘍血管内皮細胞に特異的に作用する物質をスクリーニングする方法は、いずれも、腫瘍血管内皮細胞を標的とした腫瘍の治療剤の探索、開発等において利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１  ＳＶ４０フォワードプライマー
配列番号２  ＳＶ４０リバースプライマー
配列番号３  ｈＴＥＲＴフォワードプライマー
配列番号４  ｈＴＥＲＴリバースプライマー
配列番号５  ｈＧＡＰＤＨフォワードプライマー
配列番号６  ｈＧＡＰＤＨリバースプライマー
配列番号７  ｈＣＤ３１フォワードプライマー
配列番号８  ｈＣＤ３１リバースプライマー
配列番号９  ｈＣＤ１４４フォワードプライマー
配列番号１０  ｈＣＤ１４４リバースプライマー
配列番号１１  ｈＢｉｇｌｙｃａｎフォワードプライマー
配列番号１２  ｈＢｉｇｌｙｃａｎリバースプライマー
配列番号１３  ｈＬＯＸフォワードプライマー
配列番号１４  ｈＬＯＸリバースプライマー
配列番号１５  β−ａｃｔｉｎフォワードプライマー
配列番号１６  β−ａｃｔｉｎリバースプライマー
配列番号１７  Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎフォワードプライマー
配列番号１８  Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎリバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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