(57)【要約】  樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患を治療、処置、または予防するための医薬組成物であって、糖鎖修飾酵素を有効成分として含む、記医薬組成物および樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患を治療、処置、または予防する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患を治療、処置、または予防するための医薬組成物であって、糖鎖修飾酵素を有効成分として含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記糖鎖修飾酵素がノイラミニダーゼである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記疾患が骨代謝疾患、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記疾患が骨粗しょう症、関節リウマチまたは多発性硬化症である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記疾患を有する対象に、前記糖鎖修飾酵素が治療上、処置上、または予防上有効量となる用量及び間隔で投与される、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患の治療、処置、または予防を必要とする対象に、有効量の糖鎖修飾酵素を投与することを含む、前記疾患を治療、処置、または予防する方法。
【請求項７】
前記糖鎖修飾酵素がノイラミニダーゼである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が骨代謝疾患、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患が骨粗しょう症、関節リウマチまたは多発性硬化症である、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患を有する対象に、前記糖鎖修飾酵素が治療上、処置上、または予防上有効量となる用量及び間隔で投与することを含む、請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与が経口投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、点眼、点耳、経鼻投与、吸入投与、経皮投与、経直腸投与、髄腔内投与、または静脈内投与である、請求項６〜請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、糖鎖修飾酵素を含む医薬組成物及び前記医薬組成物を用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞免疫受容体（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下ＤＣＩＲとも称する）は、主要な抗原提示細胞である樹状細胞、骨吸収細胞である破骨細胞等の細胞に発現する膜タンパク質であり、細胞外領域に糖鎖を認識するドメイン（ＣＲＤ）を、細胞質内領域に免疫抑制性シグナル伝達モチーフ（ＩＴＩＭ）をもつ。本開示者らは先にＤＣＩＲの遺伝子を欠損したマウス（Ｄｃｉｒ−／−マウス）の作製に成功し、当該マウスが加齢に伴いシェーグレン症候群や付着部炎といった自己免疫疾患を自然発症することを報告した（例えば、特開２００８−２９３１９号公報及び特開２００９−１９０４４号公報参照）。また、Ｄｃｉｒ−／−マウスは自己免疫疾患モデルであるコラーゲン誘導関節炎において高い感受性を示すが、これは樹状細胞が過剰に増殖分化する為であることを報告した（例えば、Ｆｕｊｉｋａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ.  Ｍｅｄ.，２００８参照）。【０００３】
以上のように、ＤＣＩＲは破骨細胞の形成、樹状細胞分化・増殖や炎症性サイトカインの産生を負に制御する役割を果たしていると考えられる。従って、ＤＣＩＲ特異的に作用するリガンドが発見されれば、骨代謝疾患や自己免疫疾患の症状の抑制や緩和の有効な手段となると考えられる。また、樹状細胞は免疫系の中枢を担うことから、アレルギーなどの疾患においても治療効果が期待できる。本開示者らは上記知見に基づき、ケラタン硫酸−ＩＩ（ＫＳ−ＩＩ）がＤＣＩＲ特異的に結合する内在性リガンドとして破骨細胞内へＳＨＰ−１を介してシグナル伝達することを見出した（例えば、国際公開第２０１１／１０５４２４号参照）。本開示者らはさらに、特定の化学構造を有するアシアロ二本鎖Ｎ型糖鎖がＤＣＩＲに特異的に作用するリガンドであることを見出した（国際公開第２０１６／００６７００号参照）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＤＣＩＲ特異的に作用する物質を数多く見出すことは、ＤＣＩＲによって制御されている生体機構の調節が有効となりうる疾病の治療方法の選択の幅を広げる上で有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示者らは上記状況に鑑み、以下を提供する。
＜１＞樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患を治療、処置、または予防するための医薬組成物であって、糖鎖修飾酵素を有効成分として含む、前記医薬組成物。
＜２＞前記糖鎖修飾酵素がノイラミニダーゼである、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞前記疾患が骨代謝疾患、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である、＜１＞または＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞前記疾患が関節リウマチまたは多発性硬化症である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の医薬組成物。
＜５＞前記疾患を有する対象に、前記糖鎖修飾酵素が治療上、処置上、または予防上有効量となる用量及び間隔で投与される、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の医薬組成物。
＜６＞樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患の治療、処置、または予防を必要とする対象に、有効量の糖鎖修飾酵素を投与することを含む、前記疾患を治療、処置、または予防する方法。
＜７＞前記糖鎖修飾酵素がノイラミニダーゼである、＜６＞に記載の方法。
＜８＞前記疾患が骨代謝疾患、自己免疫疾患またはアレルギー疾患である、＜６＞または＜７＞に記載の方法。
＜９＞前記疾患が関節リウマチまたは多発性硬化症である、＜６＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の方法。
＜１０＞前記疾患を有する対象に、前記糖鎖修飾酵素が治療上、処置上、または予防上有効量となる用量及び間隔で投与することを含む、＜６＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の方法。
＜１１＞前記投与が経口投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、点眼、点耳、経鼻投与、吸入投与、経皮投与、経直腸投与、髄腔内投与または静脈内投与である、＜６＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の方法。3３ｎ
＜１２＞樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患を治療、処置、または予防する医薬組成物の製造のための、糖鎖修飾酵素の使用。
＜１３＞樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患を治療、処置、または予防する医薬組成物として使用するための糖鎖修飾酵素。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ノイラミニダーゼ投与後１８時間および４８時間におけるＤＣＩＲリガンドの量を示す。
【図２Ａ】ノイラミニダーゼ投与による血清カルシウム濃度の変化を示す。
【図２Ｂ】ノイラミニダーゼ投与による血清ＴＲＡＰ活性の変化を示す。
【図３】実験的自己免疫性脳脊髄炎を発症させた野生型およびＤＣＩＲノックアウトマウスにおけるノイラミニダーゼ投与の効果を示す。
【図４Ａ】コラーゲン誘導性関節炎を発症させたマウスにおけるノイラミニダーゼ投与による関節炎スコアへの効果を示す。
【図４Ｂ】コラーゲン誘導性関節炎の発症率を示す。
【図４Ｃ】コラーゲン誘導性関節炎を発症させたマウスにおけるノイラミニダーゼ投与による関節炎スコアへの効果を示す。
【図５】コラーゲン誘導性関節炎を発症させたマウスにおけるノイラミニダーゼ投与による炎症性サイトカインの減少を示す。
【図６】コラーゲン誘導性関節炎を発症させたマウスにおけるノイラミニダーゼ投与による足首関節の組織像を示す。
【図７】コラーゲン誘導性関節炎を発症させたマウスにおけるノイラミニダーゼ投与による足首関節の組織像を、スコア化して評価した結果を示す。
【図８】コラーゲン誘導性関節炎を発症させたマウスにおけるノイラミニダーゼ投与による抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ１抗体、抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ２ａ抗体、抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧ２ｂ抗体の力価を示す。
【図９】ＤＣＩＲ−／−マウスと野生型マウスとの関節炎スコアの経時的変化の比較を示す。
【図１０Ａ】ＤＣＩＲ?／?マウスと野生型マウスとの関節炎スコアの累積スコアの比較を示す。
【図１０Ｂ】ＤＣＩＲ−／−マウスと野生型マウスとの関節炎スコアの最大スコアの比較を示す。
【図１０Ｃ】ＤＣＩＲ−／−マウスと野生型マウスとの疾患発症日の比較を示す。
【図１１】ＤＣＩＲ−／−マウスと野生型マウスの足首関節のＨ＆Ｅ染色像を示す。
【図１２】ＤＣＩＲ−／−マウスと野生型マウスの炎症、パンヌス形成、軟骨破壊、及び骨破壊の比較を示す。
【０００７】
本発明者は、多発性硬化症のモデル動物である実験的自己免疫疾患を発症させた野生型マウスに、糖鎖修飾酵素として、シアル酸のグリコシド結合を切断するグリコシダーゼであるノイラミニダーゼ（Ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ、ＥＣ  ３．２．１．１８）を投与すると、前記疾患の症状が低減すること、またノイラミニダーゼの投与により血中のカルシウム濃度および破骨細胞マーカーであるＴＲＡＰの活性が低下することを見出した。このノイラミニダーゼ投与効果はＣ型レクチン受容体ＤＣＩＲ欠損マウスでは認められないことから、ノイラミニダーゼはＤＣＩＲ特異的に作用していると考えられる。
例えば、以下のような実験からも裏付けられる：ノイラミニダーゼを生体内投与し、１８時間および４８時間後に骨髄細胞を回収した。ＤＣＩＲの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ２のＦｃ領域からなるＤＣＩＲ−Ｆｃキメラタンパクを骨髄細胞に結合させＤＣＩＲリガンドの発現状態をＦＡＣＳにて解析した。その結果、骨髄細胞に対するＤＣＩＲ−Ｆｃタンパクの結合が増加した。
このことにより、ノイラミニダーゼの投与によりＤＣＩＲの生体内リガンドが露出したことが示された。【０００８】
別の自己免疫疾患である関節リウマチのモデル動物である、コラーゲン誘導性関節炎を誘発したマウスにノイラミニダーゼを投与したところ、臨床スコアの改善、組織学的な重篤度の改善及び血清中の炎症性サイトカインが低下することがわかった。
また、ノイラミニダーゼの投与によって血清カルシウム濃度が上昇し、破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の活性が低下することを見出した。【０００９】
これらの結果から、ノイラミニダーゼは樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患または状態を治療、処置、または予防する目的に有効に使用しうることが明らかとなった。
特に、関節リウマチ、多発性硬化症および骨粗しょう症の治療に好適に使用されうる。【００１０】
＜医薬組成物＞
本開示の医薬組成物は、糖鎖修飾酵素を有効成分として含む。糖鎖修飾酵素としては、シアル酸のグリコシド結合を切断するグリコシダーゼであるノイラミニダーゼが挙げられる。ノイラミニダーゼがＤＣＩＲに特異的に作用するという知見は、従来報告されていない。【００１１】
ノイラミニダーゼは糖鎖の末端のシアル酸のα−２，３、α−２，６およびα−２，８−グリコシド結合を加水分解する作用を有する。α−２，３グルコシダーゼ活性、α−２，６グルコシダーゼ活性およびα−２，８グルコシダーゼ活性それぞれの強さはノイラミニダーゼの由来によって異なるが、いずれのノイラミニダーゼを用いてもよい。当業者は用いるノイラミニダーゼに応じて適切な投与量を見出すことができる。【００１２】
ノイラミニダーゼの作製方法は特に制限されず、生体からの採取、遺伝子工学的方法による作製、有機合成化学的方法による作製等を挙げることができる。特に、遺伝子工学的方法により作製することは、工業的な生産に有利である。ノイラミニダーゼを産生する生物からノイラミニダーゼをコードする遺伝子を単離し、大腸菌等の宿主に遺伝子を組み換えることによって容易に目的のノイラミニダーゼを生産することができる。ノイラミニダーゼを産生する生物としては、限定はされないが例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎs、インフルエンザウィルスなどが挙げられる。
ヒトも４種類のノイラミニダーゼ（即ち、ｈＮＥＵｓ１〜４）を産生することが知られている。ヒト由来のノイラミニダーゼを用いることは、ヒトに投与する場合に免疫原性が低くなるという観点から好ましい。【００１３】
＜治療方法＞
本開示の治療、処置、または予防方法（以下、単に「治療方法」とも称する）は、樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患または状態の治療、処置、または予防を必要とする対象（例えば、ヒトである患者）に、治療上、処置上、または予防上有効量の糖鎖修飾酵素を投与することを含む。【００１４】
本開示の治療方法において患者に投与される糖鎖修飾酵素及び有効成分として含まれる糖鎖修飾酵素の具体的な態様は、本開示の医薬組成物及び有効成分として含まれる糖鎖修飾酵素の具体的な態様として上述したものと同様とすることができる。【００１５】
本開示の治療方法において糖鎖修飾酵素を対象に投与すると、糖鎖修飾酵素によって発現したＤＣＩＲリガンドが対象生体内のＤＣＩＲに選択的に作用する。その結果、ＤＣＩＲによって制御される生体機構を意図的に調節することができる。このような生体機構としては破骨細胞の形成、樹状細胞の増殖、サイトカインの産生等が挙げられる。従って、本開示の方法は、過剰な骨吸収が関係している各種の骨代謝疾患、及び炎症性サイトカインの産生による過剰な免疫反応や炎症を伴う各種の自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療方法として有効である。さらに、前記糖鎖修飾酵素はＤＣＩＲ特異的に作用して樹状細胞、破骨細胞等の機能を抑制するため、薬効の作用点が限局でき、副作用の少ない治療方法を提供することができる。【００１６】
上記の骨代謝疾患としては骨関節炎、脊椎関節症、骨粗しょう症、骨パジェット病、変形性骨炎、大理石骨病、歯周病等を挙げることができる。自己免疫疾患としては関節リウマチ、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、グッドパスチャー症候群、Ｉ型糖尿病、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群等を挙げることができる。アレルギー疾患としては気管支喘息、アトピー性皮膚炎、結膜炎、食物アレルギー、アナフィラキシー、接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、慢性糸球体腎炎等を挙げることができる。【００１７】
本開示の治療方法において、本開示の糖鎖修飾酵素を対象に投与する方法は特に制限されず、経口投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、点眼、点耳、経鼻投与、吸入投与、経皮投与、経直腸投与、髄腔内投与、静脈内投与、留置等の外科的処置などを挙げることができる。対象に投与する糖鎖修飾酵素の量及び投与の間隔は特に制限されず、症状の種類や状態、対象の年齢や体格、ＤＣＩＲの活性の状態、意図するＤＣＩＲ活性化の度合、糖鎖修飾酵素とともに使用する他の成分の種類や量等に応じて選択できる。典型的には、糖鎖修飾酵素は、治療上、処置上、または予防上有効量となる用量及び間隔で対象に投与される。【００１８】
＜実施例１：ノイラミニダーゼの用量の検討＞
野生型の８〜１２週齢のマウスに、ノイラミニダーゼ（０．２Ｕ／マウス）（ロッシュ社製、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来）又はＰＢＳを、尾静脈より静脈内投与し、投与から１８時間後及び４８時間後に骨髄細胞を回収した。ノイラミニダーゼ又はＰＢＳをそれぞれ２匹のマウスに投与し、各マウスをＮｅｕ１、Ｎｅｕ２、ＰＢＳ１及びＰＢＳ２とした。得られた骨髄細胞にＤＣＩＲ−Ｆｃを加えて結合させ、ＦＡＣＳにてＣＤ１１ｂ＋細胞又は樹状細胞であることを示すＣＤ１１ｂ＋かつＣＤ１１ｃ＋の細胞の全数に対するＦｃ陽性を示す細胞数の比率を求めた。ＤＣＩＲ−Ｆｃは、マウス由来のＤＣＩＲ細胞外ドメイン（アミノ酸残基の２０８〜６８９位）とヒトＩｇＧ２抗体のＦｃドメインからなるキメラタンパク質である。ネガティブコントロールとして、糖鎖結合に必須であるドメインに変異を挿入した変異型ＤＣＩＲ−Ｆｃ及びＦｃドメインのみのタンパク質をＤＣＩＲ−Ｆｃに代えて使用した。なお、ノイラミニダーゼ１Ｕは、反応溶液１０μＬ中で、５分間３７℃において、１ｎｍｏｌのＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ＡＭＣから末端のα−Ｎｅｕ５Ａｃの９５％以上を切断するために必要な酵素量として定義される。【００１９】
ノイラミニダーゼ投与後１８時間後においてはＤＣＩＲ−Ｆｃの樹状細胞への結合がネガティブコントロールと比較して顕著に増加していた。しかし、４８時間後においてはＤＣＩＲ−Ｆｃと変異型ＤＣＩＲ−ＦｃとでＦｃ陽性率に大きな差がなかった（図１）。ノイラミニダーゼの投与によってＤＣＩＲリガンドの細胞表面への発現が増加したと考えられ、その効果は４８時間後には減少していると考えられる。そこで、ノイラミニダーゼの投与は２日に１回行うこととした。【００２０】
＜実施例２：ノイラミニダーゼ投与後のカルシウム濃度及び酒石酸抵抗性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性の血清濃度＞
８〜１２週齢のオスのＣ５７ＢＬ/６Ｊ系統の野生型（ＷＴ）及びＤＣＩＲノックアウトマウス（Ｄｃｉｒ−／−）に、ノイラミニダーゼ（０．１Ｕ／マウス）（ロッシュ社製、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来）又はＰＢＳを、２日毎に５回静脈内投与した。最後の投与から２４時間後に麻酔下にて心臓穿刺により全採血した。次いで、血清を調製し、血清のカルシウムイオン濃度をカルシウムＥ−ＨＡテストワコー（富士フイルム和光純薬株式会社製）を用いて測定した。破骨細胞のマーカーである血清のＴＲＡＰ活性は、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、キットの使用説明書に従って波長４０５ｎｍの吸光度により測定した。【００２１】
野生型マウスの血清カルシウム濃度及びＴＲＡＰ活性は、ノイラミニダーゼの投与によって有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図２ＡおよびＢ）。この結果より、ノイラミニダーゼの投与によって破骨細胞の活性が抑制されたことがわかった。また、ＤＣＩＲノックアウトマウスではノイラミニダーゼの投与によって血清カルシウム濃度及びＴＲＡＰ活性は有意な減少を示さなかったことから、ノイラミニダーゼはＤＣＩＲに特異的に作用していると考えられる。【００２２】
＜実施例３：実験的自己免疫性脳脊髄炎マウスへのノイラミニダーゼの投与＞
実験的自己免疫性脳脊髄炎は多発性硬化症の動物モデルである。実験動物としては、Ｃ５７ＢＬ/６Ｊ野生型及びＤＣＩＲノックアウトマウス（Ｄｃｉｒ−／−）を用いた。
１００μｇのＭＯＧ３５−５５ペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）を、１００μＬのフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）と５００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（ディフコ社製）をＰＢＳに溶解した溶液１００μＬとに加えてエマルジョンを得た。得られたエマルジョンを０日目及び７日目に、野生型及びＤＣＩＲノックアウトマウス皮下注射して実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘発した。また、０日目及び２日目にＰＢＳに溶解したマウス１匹当たり２００nｇ／回の百日咳毒素を注射した。【００２３】
ＭＯＧによる免疫を行う日（即ち、０日）の７日前から２日毎に、マウス１匹当たり０．１ユニットの投与量となるように、１００μＬのノイラミニダーゼ（ロッシュ社製、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来）のＰＢＳ溶液（野生型マウス：ｎ＝６、ＤＣＩＲノックアウトマウス：ｎ＝７）又はＰＢＳ（野生型マウス：ｎ＝８、ＤＣＩＲノックアウトマウス：ｎ＝８）を４回静脈内投与した。０日の翌日、つまりＭＯＧによる免疫を行った日の翌日から、上記と同様にノイラミニダーゼ又はＰＢＳを２日毎に４回静脈内投与した。【００２４】
以下の評価基準に従って、実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアを０日、２日及び７日〜３０日には毎日観察し臨床スコアを評価した。結果を図３及び表１に示す。
・実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコア
０：疾患が認められない
０．５：部分的な尻尾挙上不全
１：尻尾麻痺
１．５：一方の後肢の麻痺
２：両方の後肢の麻痺
２．５：一方の前肢の脱力
３：両方の前肢の脱力
４：両方の前肢の麻痺
５：瀕死【００２５】
ノイラミニダーゼ投与群及びＰＢＳ投与群のそれぞれの平均スコアは、各群のすべてのマウスのスコアの平均値から決定した。累積スコアは、各マウスの毎日の臨床スコアの合計であり、群毎に平均値を求めた。平均最大スコアは、各マウスの最大の臨床スコアの群毎の平均値として計算した。
ノイラミニダーゼを投与された野生型マウスではＥＡＥの臨床スコアが他の群と比較して有意に低かった（ｐ＜０．０５）。このことから、ノイラミニダーゼの投与によって、自己免疫性脳脊髄炎の臨床症状が改善されることがわかった。また、ＤＣＩＲノックアウトマウスでは、ＰＢＳ投与群と臨床スコアに差が認められなかったことから、ノイラミニダーゼの効果はＤＣＩＲに特異的に作用していると考えられる。【００２６】
【表１】
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【００２７】
＜実施例４：コラーゲン誘導性関節炎マウスへのノイラミニダーゼ投与の効果＞
コラーゲン誘導性関節炎は、関節リウマチの動物モデルである。コラーゲン誘導性関節炎マウス（ＣＩＡマウス）は既報の方法に従って用意した（Inglis J.J.,Nat.Protocol.,2008）。方法の概要を記載すると、ニワトリＩＩ型コラーゲン（ＩＩＣ）（シグマアルドリッチ社製）の粉末を１０ ｍＭ酢酸水溶液に溶解し４℃で一晩静置した。等量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（ディフコ社製）とニワトリＩＩ型コラーゲン酢酸水溶液（４ｍｇ／ｍＬ）とを混合してエマルジョンを調製した。８〜１２週齢のＤＢＡ／１Ｊマウスの尾根部近くの異なる３か所に、得られたエマルジョンを１００μＬずつ皮内投与して免疫した。最初の免疫後 ２１日目に、最初の投与部位の近くに同じ量のＩＩＣ／ＣＦＡエマルジョンをブーストとして皮内注射した。【００２８】
上記のＩＩＣ／ＣＦＡエマルジョンによる最初の免疫（即ち、０日）の７日前から２日毎に、マウス１匹当たり０．１ユニットの投与量となるように、１００μＬのノイラミニダーゼ（ロッシュ社、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ由来）のＰＢＳ溶液（ｎ＝１０）又はＰＢＳ（ｎ＝１０）を４回静脈内投与した。また、ブーストを行う７日前から上記と同様にノイラミニダーゼ又はＰＢＳを２日毎に４回静脈内投与した。【００２９】
以下の基準に従って各肢について関節炎スコアを評価した。１匹のマウスの関節炎スコアの最大値（即ち、最も重症であることを示すスコア）は１２である。
以下の評価基準に従って、関節炎スコアを０日及び２１日〜４５日には毎日観察し関節炎スコアを評価した。
・関節炎スコア
０：正常
１：わずかな腫脹及び／又は発赤
２：重度の腫脹及び／又は発赤
３：関節の強直【００３０】
ノイラミニダーゼ投与群及びＰＢＳ投与群のそれぞれの平均スコアは、各群のすべてのマウスのスコアの平均値から決定した。累積スコアは、各マウスの毎日の臨床スコアの合計であり、群毎に平均値を求めた。平均最大スコアは、各マウスの最大スコアの群毎の平均値として計算した。結果を図４に示す。また、１個体のスコアが１以上になった場合にその個体が関節炎を発症したと判断し、各群の全個体数に対する発症した個体数の比率を発症率とした。【００３１】
図４Ａはノイラミニダーゼ投与群及びＰＢＳ投与群それぞれの平均スコアの推移を示す。ノイラミニダーゼ投与群では、初回免疫後２６日以後は一貫してＰＢＳ投与群よりも低い関節炎スコアを示した。ノイラミニダーゼ投与によって、関節炎の臨床症状が抑制されたことを示す。
図４Ｂは関節炎の発症率を示す。初回免疫後から２６日にはノイラミニダーゼ投与群及びＰＢＳ投与群のいずれにおいても関節炎の発症率は１００％であった。
図４Ｃは、関節炎スコアの累積スコア、発症日及び最大スコアについてのノイラミニダーゼ投与群とＰＢＳ投与群との比較である。累積スコアはノイラミニダーゼ投与群でＰＢＳ投与群より有意に低かったが（ｐ＜０．０５）、発症日はほとんど差がなかった。また、最大スコアには有意差は認められなかったが、ｐ値は０．０５４であり境界的な値を示した。【００３２】
＜ノイラミニダーゼ投与による炎症性サイトカインの減少＞
ＩＩＣ／ＣＦＡエマルジョンによる最初の免疫後から４５日に採血し、血清のＩＦＮγ、ＩＬ−１７及びＩＬ−６を測定した。
無希釈の血清を用いて、マウスＥＬＩＳＡセット（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）によってＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７の濃度、マウスＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（バイオレジェンド社製）によってＩＬ−６の濃度を測定した。
結果を図５に示す。ＩＦＮγ及びＩＬ−１７は、ノイラミニダーゼ投与群ではＰＢＳ投与群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）低値であった。一方、ＩＬ−６は２つの群の間で有意な差は認められなかった。【００３３】
＜関節炎の重篤度の組織学的評価＞
ＩＩＣ／ＣＦＡエマルジョンによる最初の免疫から４５日目に、ＣＩＡマウスの後肢の足首関節２つを麻酔下で切断した。関節を１０％の中性緩衝ホルマリンで固定し、続いて１０％ＥＤＴＡ中で脱灰化した。２つの関節をパラフィンブロックに包埋し、厚さ４μｍのパラフィン切片を作成し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。足首関節のＨ＆Ｅ染色組織像の代表例を図６に示す。図６中、Ｔａｌは距骨、Ｔｉｂは脛骨、Ｃａｌは踵骨、Ｎａｖは舟状骨を示す。ノイラミニダーゼ投与群およびＰＢＳ投与群において、重度（上段）または軽度（下段）の骨破壊を伴う足首関節部位の炎症像が認められたが、ノイラミニダーゼ投与群では炎症の状態はＰＢＳ投与群と比較して軽度であった。未処置のマウスでは骨破壊および炎症像は観察されなかった。【００３４】
関節炎の組織学的な重篤度は、炎症、パンヌス形成、軟骨破壊、及び骨破壊の４つのパラメーターをスコア化することによっても評価した。各パラメーターのスコアの評価基準は以下に示す通りである。
・炎症
０：正常
１：炎症細胞の局所的な浸潤が観察された
２：炎症細胞の広範囲に渡る関節領域への浸潤が観察された
３：炎症細胞の関節包への広範囲の浸潤が観察された
・パンヌス形成
０：正常
１：パンヌス形成が２か所未満で観察された
２：パンヌス形成が２か所以上４か所未満で観察された
３：パンヌス形成が４か所以上で観察された
ただし、１か所の広範囲のパンヌス形成が観察された場合には、２か所としてカウントし評価を行った。
・軟骨破壊
０：正常
１：関節における軟骨細胞の少量の減少
２：１領域での軟骨破壊
３：２領域以上での軟骨破壊
・骨破壊
０：正常
１：距骨の表面の粗さが観察された
２：距骨の浅い破壊が観察された
３：距骨の深い破壊が観察された【００３５】
各スコアの評価結果のノイラミニダーゼ投与群とＰＢＳ投与群との比較を図７に示す。ノイラミニダーゼ投与群では、炎症、パンヌス形成、軟骨破壊、及び骨破壊の４つのパラメーターのいずれについてもＰＢＳ投与群より有意に低い値を示した（ｐ＜０．０５）。【００３６】
＜抗コラーゲン抗体の力価測定＞
ＩＩＣ／ＣＦＡエマルジョンによる最初の免疫の日（即ち、０日）から４５日目にマウスから採血し血清を調製した。２０μg／ｍＬのニワトリＩＩ型コラーゲンのＰＢＳ溶液を９６穴プレートの各ウェルに分注し、４℃で一晩静置してコーティングを行った。続いて、ニワトリＩＩ型コラーゲン溶液を捨て、１０％ウシ胎児血清のＰＢＳ希釈液を各ウェルに分注し、室温で１時間静置してブロッキングを行った。血清をＰＢＳで希釈し、総ＩｇＧ測定用には５０００倍、ＩｇＧ１測定用には２５００倍、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ測定用には５００倍の希釈試料を調製した。これらの希釈試料を各ウェルに分注し、室温で２時間インキュベートした。続いて、０．８μｇ／ｍＬに調製したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ社製）、又は０．４μｇ／ｍＬに調製した、アルカリフォスファターゼ標識マウス抗マウスＩｇＧ１抗体、アルカリフォスファターゼ標識マウス抗マウスＩｇＧ２ａ抗体若しくはアルカリフォスファターゼ標識マウス抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体（それぞれ、サンタクルズ社製）を加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ＩｇＧ抗体測定用には３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体及びＩｇＧ２ｂ抗体測定用には、ｐ−ニトロフェニルリン酸溶液を基質として加え、１Ｎ ＨＣｌ又は１Ｎ ＮａＯＨで発色反応を停止した。総ＩｇＧ抗体については波長４５０ｎｍでの吸光度、他の抗体については波長４０５ｎｍでの吸光度の測定によって各抗体の力価を求めた。【００３７】
測定結果を図８に示す。抗ＩＩ型コラーゲン抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗体の力価は、ノイラミニダーゼ投与群とＰＢＳ投与群との間に差が認められなかった。【００３８】
＜実施例５：ＤＣＩＲ−／−及び野生型マウスへのノイラミニダーゼ投与効果の比較＞
ノイラミニダーゼ投与の抑制作用がＤＣＩＲ依存的に発揮しているのか調べるためにＤＣＩＲ−／−マウスにＣＩＡを誘導した。その際、マウス１匹当たり２ユニットの投与量となるように、１００μＬのノイラミニダーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来）のＰＢＳ溶液（野生型マウス：ｎ＝２２、ＤＣＩＲノックアウトマウス：ｎ＝１１）又はＰＢＳ（野生型マウス：ｎ＝１９、ＤＣＩＲノックアウトマウス：ｎ＝１４）を静脈内投与した。ＩＩＣ／ＣＦＡエマルジョンによる最初の免疫（即ち、０日）の一日前に１回投与し、その後２日毎に６回投与した。【００３９】
実施例４に記載した方法の通り、関節炎スコアの評価、組織学的な重篤度の評価を行った。結果を図９〜１２に示す。
図９は関節炎スコアの経時的変化の比較を示す。図１０Ａは関節炎スコアの累積スコアの比較、図１０Ｂは最大スコアの比較、図１０Ｃは疾患発症日の比較を示す。
ノイラミニダーゼを投与された野生型マウスではＣＩＡの関節炎スコアが他の群と比較して有意に低かった（ｐ＜０．０５）。また、ノイラミニダーゼを投与した野生型マウスにおいて、累積スコアと最大スコアが有意に減少した（ｐ＜０．０５）。疾患発症日には有意差は認められなかった。一方、ＤＣＩＲノックアウトマウスでは、ＰＢＳ投与群は、ノイラミニダーゼ投与群と比較して累積スコアと最大スコアに差が認められなかった。
このことから、ノイラミニダーゼの投与によって、コラーゲン誘導性関節炎の臨床症状が改善されることがわかった。また、ＤＣＩＲノックアウトマウスでは、ＰＢＳ投与群と関節炎スコアに差が認められなかったことから、ノイラミニダーゼの効果はＤＣＩＲに特異的に作用していると考えられる。【００４０】
図１１は足首関節のＨ＆Ｅ染色像を示す。図１２は炎症、パンヌス形成、軟骨破壊、及び骨破壊の比較を示す。
野生型マウスにおいては、ノイラミニダーゼ投与群はＰＢＳ投与群と比較して、骨破壊を伴う足首関節部位の炎症像が軽減した。ＤＣＩＲノックアウトマウスでは、ノイラミニダーゼ投与群とＰＢＳ投与群において顕著な炎症像の差は認められなかった。未処置のマウスでは骨破壊および炎症像は観察されなかった。
組織学的解析により、ノイラミニダーゼ投与群では炎症、パンヌス形成のスコアが有意に軽減した。骨破壊スコアでは有意差は検出できなかったが顕著な減少が認められた。ＤＣＩＲノックアウトマウスではこれらの差が認められなかったことから、ノイラミニダーゼの効果はＤＣＩＲに特異的に作用していると考えられる。【００４１】
以上のように、ノイラミニダーゼなどの糖鎖修飾酵素が、樹状細胞免疫受容体によって制御される生体機構が関与する疾患を治療、処置、または予防することができることが示された。【００４２】
２０１７年５月１２日に出願された米国特許仮出願６２／５０５，２３８開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
また、この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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