(57)【要約】  優れた抗腫瘍効果を発揮し且つ副作用の少ない、腫瘍溶解性ウイルスを用いた抗腫瘍療法を提供する。  腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。
2018182014.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。
【請求項２】
腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項１記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である請求項２記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ−３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる請求項１〜３のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
代謝拮抗剤が、５−ＦＵ又はその塩である請求項１〜３のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項６】
腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含む抗腫瘍剤。
【請求項７】
腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項６記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である請求項７記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】
植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ−３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる請求項６〜８のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１０】
代謝拮抗剤が、５−ＦＵ又はその塩である請求項６〜８のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１１】
腫瘍溶解性ウイルスを含有してなる薬剤と、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有してなる薬剤からなるキットである請求項１〜５のいずれか１項記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】
オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１３】
腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである請求項１２記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項１４】
オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と、腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによる腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進方法。
【請求項１５】
オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする癌細胞のウイルス受容体発現増強剤。
【請求項１６】
ウイルス受容体が、ＤＡＦ及び／又はＩＣＡＭ−１である請求項１５記載のウイルス受容体発現増強剤。
【請求項１７】
抗腫瘍剤を製造するための、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の使用。
【請求項１８】
抗腫瘍療法に使用される、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせ。
【請求項１９】
腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を患者に投与する、抗腫瘍療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスを用いた新たな抗腫瘍療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、日本人の死因の第１番目であり、統計上は国民の３人に１人が悪性腫瘍を原因として死亡している。長年の努力により、悪性腫瘍に対する手術療法、放射線療法、分子標的薬を含む化学療法の進歩は著しく、治療成績は向上している。しかし、悪性腫瘍による死亡率は依然として高く、悪性腫瘍に有効な新たな治療方法が望まれている。【０００３】
新たな治療方法として、腫瘍溶解性ウイルス療法が直接的な殺細胞効果を有する点で注目されてきている。例えば、ＤＮＡウイルスである腫瘍溶解性アデノウイルスや単純ヘルペスウイルスを用いた臨床研究が脳腫瘍や乳癌を対象として実施されており、安全性と有効性を示唆する結果が報告されている。【０００４】
また、ＲＮＡウイルスであるピコルナウイルス科のエンテロウイルスは、感染後に宿主細胞のゲノムへの組み込みがなく遺伝子変異による癌化リスクが低いことに加え、癌遺伝子を有していないため安全性が高く、また、細胞内での増殖速度が速いため、迅速かつ高い抗腫瘍効果が期待できる。例えば、エンテロウイルスであるコクサッキーウイルス（ＣＶ）Ａ２１型、エコーウイルス（ＥＶ）６型、ＥＶ７型、ＥＶ１１型、ＥＶ１２型、ＥＶ１３型、ＥＶ２９型を用いた腫瘍溶解性ウイルス療法（特許文献１）、ＣＶＡ１３型、ＣＶＡ１５型、ＣＶＡ１８型、ＣＶＡ２１型、ＥＶ１型、ＥＶ７型、ＥＶ８型、ＥＶ２２型を用いた腫瘍溶解性ウイルス療法（特許文献２）等が報告されている。【０００５】
さらに、本発明者らは、近年、コクサッキーウイルスＡ１１型（「ＣＶＡ１１型」と称する）とエコーウイルス４型（ＥＶ４型）が腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を示すと共に、ヒトに対する病原性が低く安全性が高いウイルスであることを見出している（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５２７７１９号公報
【特許文献２】特開２０１２−４６４８９号公報
【特許文献３】国際特許公開第２０１３／１５７６４８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、優れた抗腫瘍効果を発揮し且つ副作用の少ない、腫瘍溶解性ウイルスを用いた抗腫瘍療法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、腫瘍溶解性ウイルス療法について研究を重ねた結果、特定の抗がん剤をコクサッキーウイルス等と併用することにより当該ウイルスの増殖が促進され、副作用を増強することなく当該ウイルスによる抗腫瘍効果が顕著に増強されることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の１）〜１８）を包含する。
１）腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を組み合わせてなる抗腫瘍剤。
２）腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである１）記載の抗腫瘍剤。
３）コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である２）記載の抗腫瘍剤。
４）植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ−３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる１）〜３）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
５）代謝拮抗剤が、５−ＦＵ又はその塩である１）〜３）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
６）腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含む抗腫瘍剤。
７）腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである６）記載の抗腫瘍剤。
８）コクサッキーウイルスが、Ａ１１型又はＢ３型である７）記載の抗腫瘍剤。
９）植物アルカロイド系抗がん剤が、ＳＮ−３８、イリノテカン及びそれらの塩から選ばれる１以上からなる６）〜８）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
１０）代謝拮抗剤が、５−ＦＵ又はその塩である６）〜８）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
１１）腫瘍溶解性ウイルスを含有してなる薬剤と、オキサリプラチン及び植物アルカロイド系抗がん剤から選ばれる抗がん剤を含有してなる薬剤からなるキットである１）〜５）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
１２）オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤。
１３）腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルス又はアデノウイルスである１２）記載の抗腫瘍効果増強剤。
１４）オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と、腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによる腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進方法。
１５）オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を有効成分とする癌細胞のウイルス受容体発現増強剤。
１６）ウイルス受容体が、ＤＡＦ及び／又はＩＣＡＭ−１である１５）記載のウイルス受容体発現増強剤。
１７）抗腫瘍剤を製造するための、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の使用。
１８）抗腫瘍療法に使用される、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせ。
１９）腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を患者に投与する、抗腫瘍療法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、優れた抗腫瘍効果を発揮し、ヒトに対する安全性が高い抗腫瘍療法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）に対する細胞傷害性を示す図。Ａ：オキサリプラチン、ＣＶＡ１１型ともに不添加，Ｂ：オキサリプラチンのみ添加（５０μＭ），Ｃ：オキサリプラチン添加（５０μＭ）後、ＣＶＡ１１型添加（ＭＯＩ（感染力価）＝０．０１），Ｄ：ＣＶＡ１１型のみ添加（ＭＯＩ＝０．０１）。
【図２】オキサリプラチンによりＣＶＡ１１型の増殖が促進されることを示す図。
【図３】オキサリプラチンによるウイルス受容体の発現増加効果を示す図。
【図４】ヒト大腸癌担癌マウスにおける抗腫瘍効果（腫瘍体積の増加抑制）を示す図。
【図５】ヒト大腸癌担癌マウスにおける有害事象の発現（体重減少抑制）を示す図。
【図６】ヒト大腸癌担癌マウスにおける抗腫瘍効果（生存率）を示す図。
【図７】ヒト大腸癌担癌マウスにおける抗腫瘍効果を示す図（腫瘍組織像）。矢印は、死細胞を示す。
【図８】オキサリプラチンとＣＶＢ３型の併用によるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）に対する細胞傷害性を示す図。
【図９】オキサリプラチンによりＣＶＢ３型の増殖が促進されることを示す図。１：オキサリプラチン不添加、２：オキサリプラチン  ０．５μＭ添加、３：オキサリプラチン  １．０μＭ添加。
【図１０】オキサリプラチンによりＡＡＶの増殖が促進されることを示す図。
【図１１】ＳＮ−３８によりＣＶＡ１１型の増殖が促進されることを示す図。１：ＳＮ−３８不添加、２：ＳＮ−３８  １．０μＭ添加、３：ＳＮ−３８  ５．０μＭ添加、４：ＳＮ−３８  ５０μＭ添加。
【図１２】５−ＦＵによりＣＶＡ１１型の増殖が促進されることを示す図。１：５−ＦＵ不添加、２：５−ＦＵ  ５０μＭ添加。
【図１３】脳腫瘍細胞Ｕ−８７に対する細胞傷害性を示す図。
【図１４】オキサリプラチンとシスプラチンのＣＶＡ１１併用時の細胞傷害性を比較した図。（ａ）オキサリプラチンとＣＶＡ１１併用時の図。（ｂ）シスプラチンとＣＶＡ１１併用時の図。
【図１５】シスプラチンの添加ではＣＶＢ３型の増殖が促進されないことを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に感染して癌細胞を溶解、細胞死させるウイルスである。本発明の腫瘍溶解性ウイルスとしては、癌細胞を溶解させて細胞死を起こさせるウイルスであれば特に限定されないが、エンテロウイルスであるＣＶＡ１１型、ＣＶＢ３型（コクサッキーウイルス）やＥＶ４型（エコーウイルス）、アデノウイルスであるＡＡＶ、単純ペルペスウイルスの変異種であるＨＦ１０等が挙げられ、特にＣＶＡ１１型、ＣＶＢ３型及びＡＡＶが好ましい。ＣＶＡ１１型及びＣＶＢ３型は、ピコルナウイルス科に属する腸管系ウイルス（エンテロウイルス）の一種であるコクサッキーウイルス（Coxsackie virus）である。コクサッキーウイルスはＡ、Ｂの２群に分けられ、Ａ群はさらに２４型に，Ｂ群は６型に分けられる。本発明のＣＶＡ１１型はＡ群１１型のコクサッキーウイルスであり、ＣＶＢ３型はＢ群３型のコクサッキーウイルスである。
腫瘍溶解性ウイルスは、細胞表面のウイルス受容体に結合することによって、当該細胞に感染することができる。ウイルス受容体としては、例えば、崩壊促進因子（ＤＡＦ又はＣＤ５５）、細胞間接着分子‐１（ＩＣＡＭ‐１又はＣＤ５４）、インテグリンα２β１（ＣＤ４９ｂ）等が挙げられる。腫瘍溶解性ウイルスがウイルス受容体と相互作用することでカプシドが脱安定化され、これにより腫瘍溶解性ウイルスの脱外皮が誘導される。
【００１３】
腫瘍溶解性ウイルスは、検体等から、遠心分離法や培養細胞によるウイルス増殖法等の既知のウイルス単離方法によって単離できる。また、本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞への高い感染性を獲得するよう、天然に存在しているウイルスを、多数回の継代にわたって細胞株において培養することによって生物選抜してもよい。生物選抜に好適な細胞株は、ＤＡＦ、ＩＣＡＭ‐１、インテグリンα２β１等のウイルス受容体を有するものが好ましく、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈ１２９９細胞、Ａ５４９細胞、ＬＫ−８７細胞、ＰＣ−９細胞、Ｈ４６０細胞等が挙げられる。
【００１４】
本発明の腫瘍溶解性ウイルスは、天然に存在するものであってもよく、改変されたもの、一部変異したものであってもよい。また、通常のウイルス以外にもベクター型ウイルスであってもよい。例えば、ＣＶＡ１１型の改変体としては、そのカプシドが除去されたものが挙げられる。カプシドは、例えば、キモトリプシン又はトリプシン等のプロテアーゼによる処理によって除去できる。具体的には、例えば、ＣＶＡ１１型を、アルキル硫酸塩等の界面活性剤の存在下においてキモトリプシンで処理することで、カプシドを除去できる。ＣＶＡ１１型のカプシドを除去することで、ウイルスの癌細胞への感染性を増大させることができる。また、カプシドに存在するタンパク質は宿主の体液性免疫及び細胞性免疫の主要な活性化因子であるので、ＣＶＡ１１型のカプシドを除去することで、宿主の免疫応答を低下させることができる。この結果、ＣＶＡ１１型の癌細胞に対する感染性、ひいては医薬組成物の癌細胞に対する細胞傷害性を向上させることができる。
【００１５】
また、本発明において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に感染する腫瘍溶解性ウイルスに由来する核酸を含む。腫瘍溶解性ウイルスに由来する核酸は、腫瘍溶解性ウイルスから直接単離されたウイルスＲＮＡ、合成ＲＮＡ、単離されたウイルスＲＮＡの塩基配列に対応するｃＤＮＡを包含する。
ウイルスＲＮＡを単離するには、フェノール／クロロホルム抽出法や磁気ビーズによる単離等の任意の方法を使用することができる。
また、上記核酸は、ウイルスを生じさせるための核酸を組み込んだウイルスプラスミドや発現ベクターであってもよい。発現ベクターには、例えば、ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするＤＮＡを発現することができるプラスミドが含まれる。発現ベクターには、挿入された核酸が機能的に連結された転写調節制御配列が含まれてもよい。ここでの転写調節制御配列は、例えば、転写を開始させるためのプロモーター、転写されたｍＲＮＡに対するリボソームの結合を可能にするための発現制御エレメント等である。
【００１６】
コクサッキーウイルスのうち、ＣＶＡ１１型に由来する核酸としては、具体的には配列番号１に示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。ＣＶＢ３型に由来する核酸としては、具体的には配列番号２に示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ−ＰＧｋ．ｐｕｒｏ 、ｐＴｋ２、非複製アデノウイルスシャトルベクター、サイトメガロウイルスプロモーター等を用いることができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はそのフラグメントを逆転写することによって調製することができる。
【００１７】
アデノウイルスのうち、ＡＡＶに由来する核酸としては、具体的には配列番号３に示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。発現ベクターとしては、発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＥＦ−ＰＧｋ．ｐｕｒｏ 、ｐＴｋ２、非複製アデノウイルスシャトルベクター、サイトメガロウイルスプロモーター等を用いることができる。ウイルスを生じさせるために必要なウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はそのフラグメントを逆転写することによって調製することができる。
【００１８】
本発明において、抗がん剤は、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれるものであり、植物アルカロイド系抗がん剤としては、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、エトポシド、イリノテカン若しくはその活性代謝物又はそれらの塩、ノギテカン、ソブゾキサン、ドセタキセル、パクリタキセル、パクリタキセル注射剤、エリブリン等が挙げられ、イリノテカン、ＳＮ−３８及びそれらの塩が好ましい。また、代謝拮抗剤としては、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−ＦＵのプロドラッグ（例えばテガフール又はその塩）、カペシタビン又はその塩、ＴＳ−１（Ｓ−１ともいう。テガフールにモジュレーターを併用した配合剤）、カルモフール、ドキシフルリジン等のフッ化ピリミジン系抗がん剤の他、ゲムシタビン、シタラビン、エノシタビン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ヒドロキシカルバミド、ネララビン、ペントスタチンやこれらのプロドラッグ等が挙げられ、生体内で５‐フルオロウラシルを存在させるフッ化ピリミジン系抗がん剤がより好ましく、特に５‐ＦＵ又はその塩が好ましい。
オキサリプラチンは、Ｌ−ＯＨＰとしても知られる第三世代の白金錯体系抗がん剤である。本発明において、「オキサリプラチン」は、ｃｉｓ−オキサロト（ｔｒａｎｓ−ｌ−１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）、その光学エナンチオマーであるｃｉｓ−オキサロト（ｔｒａｎｓ−ｄ−１，２−ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）及びこれらの混合物が包含される。
イリノテカンは、カンレンボク由来の抗腫瘍性アルカロイドであるカンプトテシンの誘導体で、トポイソメラーゼＩ阻害作用を有する。ＳＮ−３８（７−ｅｔｈｙｌ−１０−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）は、イリノテカンの活性代謝物であり、イリノテカンに比べ強い抗腫瘍活性を有する。
イリノテカン及びＳＮ−３８の塩としては、無機酸又は有機酸との塩が挙げられるが、好ましくは塩酸塩である。
５−ＦＵは、フッ化ピリミジン系の代謝拮抗剤で、核酸の合成を阻害することにより抗腫瘍効果を発揮する抗がん剤である。
【００１９】
上記抗がん剤のうち、好ましくはオキサリプラチンである。オキサリプラチンやＳＮ−３８、５−ＦＵは、それ自体で抗腫瘍効果を有するが、後述する実施例に示すとおり、オキサリプラチンは腫瘍溶解性ウイルス、特にコクサッキーウイルスの増殖を促進する作用を有し、また、癌細胞のウイルス受容体（ＤＡＦ、ＩＣＡＭ‐１）の発現促進作用を有する。そして、オキサリプラチンやＳＮ−３８等の植物アルカロイド系抗がん剤及び５−ＦＵ等の代謝拮抗剤は、コクサッキーウイルスとオキサリプラチンを併用した場合、オキサリプラチン抵抗性の癌細胞に対して、コクサッキーウイルスを単剤で適用した場合よりも遥かに強い細胞傷害性を発揮する。これは、オキサリプラチンやＳＮ−３８、５−ＦＵによってコクサッキーウイルスが有する抗腫瘍効果が増強されたものと考えられる。
すなわち、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤又は代謝拮抗剤と、腫瘍溶解性ウイルスの併用において、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進剤、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果増強剤となり得、腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせは抗腫瘍剤となり得る（以下、これらを纏めて本発明の「抗腫瘍療法」とも称する）。また、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は癌細胞のウイルス受容体の発現増強剤となり得る。
【００２０】
ここで、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤による腫瘍溶解性ウイルスの増殖促進効果は、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤と腫瘍溶解性ウイルスを共に培養することによって得られる。培養は、培養細胞によるウイルス増殖法等の既知の方法を用いることができる。増殖促進効果は、ウイルスの感染力価（ＭＯＩ）を算出する既知の方法を用いることで評価することができる。
【００２１】
本発明の腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤による抗腫瘍効果（癌細胞に対する細胞傷害性）は、抗がん剤の存在下で腫瘍溶解性ウイルスに暴露された癌細胞の細胞株の生存を試験することで確認することができる。細胞株の生存を試験する方法には、例えば、固定した細胞を染色液で染色して、染色された生細胞の数を定量する方法、クリスタルバイオレット法、アポトーシス特異的なマーカーを定量する方法等がある。これらの方法を用いて、抗がん剤存在下で腫瘍溶解性ウイルスとインキュベーションされた癌細胞の細胞株について、所定時間後に生存している癌細胞を定量することで、結果的に、腫瘍溶解性ウイルスと抗がん剤による細胞傷害性によって、死滅した癌細胞を定量することができる。
【００２２】
本発明の抗腫瘍療法が対象とする癌種は、腫瘍溶解性ウイルス、特に腫瘍溶解性ウイルスが癌細胞に感染し細胞傷害性を発揮するものであれば特に限定されず、固形癌及び液性癌を含む。
固形癌において特に強い細胞傷害性が誘導される癌細胞としては、例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、下咽頭癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌等の癌細胞が挙げられる。したがって、本発明の抗腫瘍療法では、前記固形癌に加え、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病、ヒトＢリンパ腫等の癌細胞を対象に用いられるのが好ましく、大腸癌、結腸直腸癌の癌細胞が特に好ましい。
【００２３】
また、本発明の抗腫瘍療法は、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤又は代謝拮抗剤に抵抗性の癌、いわゆる難治性癌の治療に対しても使用することができる。例えばオキサリプラチン抵抗性の癌は、例えば、臨床上効果が得られる用量のオキサリプラチンを投与しても、腫瘍体積の減少、増大の抑制又は当該癌に関連する状態の改善等が見られない癌であり、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、悪性中皮腫、大腸癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌、下咽頭癌、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病、ヒトＢリンパ腫等の癌で見られる。
【００２４】
本発明の抗腫瘍療法では、腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を、それぞれの有効量を適当な配合比で含み、一の剤型に製剤化した配合剤（１剤型形態）でも、同時に又は間隔を空けて別々に使用できるように腫瘍溶解性ウイルスと抗がん剤のそれぞれの有効量を含有する薬剤を単独に製剤化して組み合わせたもの（２剤型形態。キットと称する）であってもよい。配合剤には、腫瘍溶解性ウイルスとオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤に加えて、キャリア、希釈剤、補助剤、担体を含むようにしてもよい。キャリアとしては、例えば、リポソーム、ミセル等が好ましい。リポソームは、脂質と膜安定性に寄与するステロイド又はステロイド前駆体との組み合わせを含む。この場合、脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。リポソーム又はミセルで覆われた腫瘍溶解性ウイルスは宿主の免疫応答を低下させることができる。希釈剤としては、例えば、脱塩水、蒸留水及び生理的食塩水等が挙げられる、また、補助剤としては、植物系オイル、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及び脂肪酸エステル等が挙げられる。担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。また、配合剤は、配合剤以外の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
また、キットは、腫瘍溶解性ウイルスを含有する薬剤とオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有する薬剤以外に、さらに他の薬剤を組み合わせて投与することができる。
【００２５】
腫瘍溶解性ウイルスを含有する上記の製剤は、腫瘍溶解性ウイルスに加えて、キャリア、希釈剤又は補助剤等を含むようにしてもよい。キャリアとしては、例えば、リポソーム、ミセル等が好ましい。リポソームは、脂質と膜安定性に寄与するステロイド又はステロイド前駆体との組み合わせを含む。この場合、脂質としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セレブロシド、ガングリオシド等のホスファチジル化合物が挙げられる。リポソーム又はミセルで覆われた腫瘍溶解性ウイルスは宿主の免疫応答を低下させることができる。
希釈剤としては、例えば、脱塩水、蒸留水及び生理的食塩水等が挙げられる、また、補助剤としては、植物系オイル、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール及び脂肪酸エステル等が挙げられる。
【００２６】
また、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を含有する製剤は、薬理学的に許容される担体を用いて、通常公知の方法により調製することができる。斯かる担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を例示できる。
【００２７】
尚、上記製剤中における腫瘍溶解性ウイルスの配合量は、例えば液剤１ｍＬに１×１０２〜１×１０１０プラーク形成ユニットとすることが挙げられ、１×１０５プラーク形成ユニット以上とするのが好ましい。また、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の配合量は、例えば製剤中に１〜１０００ｍｇであるのが好ましい。
【００２８】
本発明の抗腫瘍療法では、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤を種々の方法、すなわち経口、筋肉、皮下、直腸、膣、鼻腔等を介してがん患者に投与することができるが、癌種に応じて腫瘍内投与、静脈投与、腹腔内投与することが好ましい。特に、食道癌、大腸癌等の消化器癌の多くは、内視鏡等で腫瘍組織を視認しながら、上記の製剤組成物を腫瘍組織に直接注射できる。この場合、内視鏡等で注射した部位を確認できるため、出血しても対処しやすいという利点もある。
【００２９】
また、腫瘍溶解性ウイルス、並びにオキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤は、癌を治療するのに十分な量となるように投与されればよく、投与量は、患者の体重、年齢、性別、腫瘍組織の大きさ等に基づいて決定される。例えば、成人一日あたり、腫瘍溶解性ウイルスは、１×１０２〜１×１０１０プラーク形成ユニットが例示でき、抗がん剤は、１〜１０００ｍｇが例示できる。
投与方法は、単回投与でも複数回投与でもよく、徐放製剤として持続的に投与してもよい。また、投与順序や投与間隔は、腫瘍溶解性ウイルスと、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の組み合わせの効果が得られる範囲であれば特に制限されないが、オキサリプラチン、植物アルカロイド系抗がん剤及び代謝拮抗剤から選ばれる抗がん剤の投与後に腫瘍溶解性ウイルスを投与することがより好ましい。また、キットとする場合は、それぞれ単独の製剤を、同時に或いは間隔を空けて投与してもよい。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１  オキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用による抗腫瘍効果
（１）方法
（ａ）ＣＶＡ１１型の調製
ＣＶＡ１１型は、国立感染症研究所から入手した。ＣＶＡ１１型は、ＨＥＬＡ細胞（ＡＴＣＣから購入）を用いて増殖した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を１０ｍＬ用いて継代培養したＨＥＬＡ細胞（約２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）にＣＶＡ１１型（播種量：ＭＯＩ＝０．１〜１．０）を１時間孵置した後、培地をＤＭＥＭに置換し、細胞変性効果が始まるまで静置した。培地を除去後、培養用シャーレにＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ １ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離回収した。なお、ＣＶＡ１１型及びＨＥＬＡ細胞は、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。液体窒素を用いて、回収したＨＥＬＡ細胞の凍結、融解を３回繰り返した後、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清（ウイルス溶液）は、−８０℃で保存した。【００３１】
（ｂ）ＭＯＩの算出
ＭＯＩは、特許文献３に記載の以下の方法で算出した。
オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）（ＡＴＣＣから入手）を９６穴のプレートに５×１０３ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で５時間維持した。ウイルスは、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉで１００倍又は１０００倍希釈して、これをＭＯＩ測定用のウイルス原液とした（ここでの希釈倍率の常用対数をＬとする）。ウイルス原液を１０倍ずつ段階希釈し（ここでの希釈倍率の常用対数をｄとする）、希釈系列液を調製した。次に、各ウェルに希釈系列液を０．０５ｍＬずつ添加した（添加した希釈系列液の体積をｖとする）。１２０時間後に５０％以上の細胞変性効果が認められたウェル数の合計を８で除算した値Ｓを算出し、ＭＯＩを以下の式で算出した。
（数１）
ｌｏｇ１０（ＭＯＩ）＝Ｌ＋ｄ（Ｓ−０．５）＋ｌｏｇ１０（１／ｖ）【００３２】
（ｃ）ＣＶＡ１１型のクリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の検討
クリスタルバイオレット法により、ＣＶＡ１１型による抗腫瘍効果（細胞傷害性）を評価した。
オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を７２時間後にコンフルエントになる密度（３×１０４ｃｅｌｌｓ/ウェル）で２４穴のプレートに播種した。適切な感染力価（ＭＯＩ＝０．００１、０．０１、０．１）になるように、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ ＩでＣＶＡ１１型を希釈し、ＣＶＡ１１型の希釈液を調製した。約６時間後、プレートから培地を除去し、ＣＶＡ１１型の希釈液を各ウェルに２００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを１時間維持した。次に、ＣＶＡ１１型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに１ｍＬ加え、７２時間培養した。７２時間後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で緩やかに洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを各ウェルに３００μＬ添加した後、１５分間室温に静置することで生存接着細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを除去し、ＰＢＳで洗浄後、２％エタノール及び０．１％クリスタルバイオレットを含有する滅菌水を、各ウェルに３００μＬ添加し、室温で１０分間静置することで生細胞を染色した。染色後のプレートの各ウェルを滅菌水５００μＬで２回洗浄し、スキャナを用いて染色を記録することで、抗腫瘍効果を確認した。【００３３】
Ａ：オキサリプラチン、ＣＶＡ１１型ともに不添加、Ｂ：オキサリプラチンのみ添加（５０μＭ）、Ｃ：オキサリプラチン添加（５０μＭ）後、ＣＶＡ１１型添加（ＭＯＩ＝０．０１）、Ｄ：ＣＶＡ１１型のみ添加（ＭＯＩ＝０．０１）の４群に分けて比較した。【００３４】
（２）結果
図１にクリスタルバイオレット法の結果を示す。Ｂ：オキサリプラチンのみを添加したもの、Ｄ：ＣＶＡ１１型のみを添加したＷｉＤｒでは抗腫瘍効果は認められなかった。一方、Ｃ：オキサリプラチン添加後ＣＶＡ１１型を添加（ＭＯＩ＝０．０１）した群で強い抗腫瘍効果が認められた。【００３５】
実施例２  オキサリプラチンによるＣＶＡ１１型の増殖促進作用
（１）方法
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＡ１１型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。Ａ：オキサリプラチン、ＣＶＡ１１型ともに不添加、Ｂ：オキサリプラチンを添加せず、ＣＶＡ１１型のみを添加、Ｃ：オキサリプラチン添加（５０μＭ）後、ＣＶＡ１１型添加（ＭＯＩ＝０．０１）の３群に分けて比較をした。検定はt検定を用いた。【００３６】
（２）結果
図２にＣＶＡ１１型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、有意なＣＶＡ１１型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチンがＣＶＡ１１型の増殖を促進することが確認された。【００３７】
実施例３  オキサリプラチンによるウイルス受容体発現促進作用
（１）方法
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ２下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２下にプレートを約４２時間静置した後、ｍＲＮＡを採取しｃＤＮＡを作成した。細胞播種後、約２０時間後にＣＶＡ１１型を添加したものと比較した。ＤＡＦ（ｄｅｃａｙ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）の発現をｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより比較した。検定はt検定を用いた。【００３８】
（２）結果
図３にｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲの結果を示す。
オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）において、オキサリプラチン添加により、ウイルス受容体あるＤＡＦとＩＣＡＭ−１の発現が有意に増加した。一方、ＣＶＡ１１型ウイルスを添加したものは、ＤＡＦとＩＣＡＭ−１の発現は増加しなかった。受容体の中にはウイルスの増殖に影響するものも知られており、この結果より、ＣＶＡ１１型によるＷｉＤｒに対する抗腫瘍効果がオキサリプラチンによる前処理によって増加したのは、ＤＡＦやＩＣＡＭ−１がウイルスの増殖に関与し、ＣＶＡ１１型ウイルスが増殖したためと考えられた。【００３９】
実施例４  オキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用によるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果１
（１）方法
実施例１で確認したＣＶＡ１１型の癌細胞に対する抗腫瘍効果を、オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株ＷｉＤｒによる担癌ヌードマウスを用いて検討した。ＷｉＤｒをＰＢＳ で洗浄し、５.０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉに懸濁した。 ６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹部にＷｉＤｒを含む懸濁液を、１００μＬずつ２７Ｇ針を用いて皮下注射した。マウスは、１）非投与群、２）オキサリプラチン単独投与群、３）ＣＶＡ１１型単独投与群、４）オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与した群の４つに分けた。オキサリプラチン１００μｇは、ｄａｙ１に腹腔内投与された。ＣＶＡ１１型は５×１０７プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）をｄａｙ２，４，６，８，１０に皮下腫瘍内に局所注射された。非投与群に対しては、右側腹部にＣＶＡ１１型を含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを、ＣＶＡ１１型投与群と同量投与した。ＣＶＡ１１型投与後、各群の腫瘍体積及び体重を測定した。なお、腫瘍体積は、長径×短径×短径×０．５で算出した。また、試験は各群５匹のマウスを用いて行い、検定はt検定を用いた。【００４０】
（２）結果
図４は、非投与群の腫瘍体積およびオキサリプラチン単独投与群、ＣＶＡ１１型単独投与群、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与した群（併用群）の腫瘍体積を示す。オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスでは、非投与群と比較して、腫瘍体積の増加が有意に抑制された。また、併用群は、オキサリプラチン単独投与群、ＣＶＡ１１型単独投与群と比較しても腫瘍体積の増加が抑制されており、高い抗腫瘍効果を有していることが確認された。
また、図５は、これら４群の体重の変化を示す。この結果、非投与群と比べて、オキサリプラチン単独投与したマウス、ＣＶＡ１１型を単独投与したマウス、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスにおいて有意な体重減少を認めなかった。この時点での体重減少は、有害事象を示唆するため、体重減少を認めないことは、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスにおいても有害事象を認めなかったといえ、本発明の抗腫瘍療法は安全性が高いといえる。【００４１】
実施例５  オキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用によるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果２
（１）方法
実施例４におけるオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株ＷｉＤｒを皮下移植された担癌ヌードマウスにおける生存率を比較し、皮下移植後ｄａｙ  ４０の腫瘍の病理組織をＨ．Ｅ．（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ｅｏｓｉｎ）染色にて評価した。【００４２】
（２）結果
図６に担癌ヌードマウスにおける生存率を比較したデータを示す。オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスの生存率は、未治療群のマウス、オキサリプラチン単独投与群のマウス、ＣＶＡ１１型単独投与群のマウスと比べて改善が見られた。また、図７に腫瘍組織の病理組織（Ｈ．Ｅ．染色）を示す。Ｈ．Ｅ．染色された腫瘍の病理組織においては、オキサリプラチン投与後にＣＶＡ１１型を投与したマウスの腫瘍の病理組織において、より広範囲に細胞死をみとめた。これにより、生存率や病理組織の観察からも本発明が高い抗腫瘍効果を有することが確認された。【００４３】
実施例６  オキサリプラチンとＣＶＢ３型の併用による抗腫瘍効果
（１）方法
（ａ）ＣＶＢ３型の調製
ＣＶＢ３型は、国立感染症研究所から入手した。ＣＶＢ３型は、ＨＥＬＡ細胞（ＡＴＣＣから購入）を用いて増殖した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を１０ｍＬ用いて継代培養したＨＥＬＡ細胞（約２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）にＣＶＡ１１型（播種量：ＭＯＩ＝０．１〜１．０）を１時間孵置した後、培地をＤＭＥＭに置換し、細胞変性効果が始まるまで静置した。培地を除去後、培養用シャーレにＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ １ｍＬを添加し、セルスクレーパーを用いて細胞を剥離回収した。なお、ＣＶＢ３型及びＨＥＬＡ細胞は、インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。液体窒素を用いて、回収したＨＥＬＡ細胞の凍結、融解を３回繰り返した後、４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心を行い、上清を回収した。回収した上清（ウイルス溶液）は、−８０℃で保存した。【００４４】
（ｂ）ＭＯＩの算出
ＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。【００４５】
（ｃ）ＣＶＢ３型のクリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の検討
ウイルスとしてＣＶＢ３型を使用した。また、ＣＶＢ３型の感染力価（ＭＯＩ）を０（不添加）、０．００１、０．０１、０．１とし、オキサリプラチンの添加量を０μＭ（不添加）、０．５μＭ、１μＭ、５μＭとした以外は、実施例１（１）（ｃ）と同様の方法で行った。【００４６】
（２）結果
図８にクリスタルバイオレット法の結果を示す。オキサリプラチンのみを添加したもの（図８のＣＶＢ３型のＭＯＩが０の横一列）、ＣＶＢ３型のみを添加したもの（図８のＯＸＡが０の縦一列）では抗腫瘍効果は認められなかった。一方、オキサリプラチン添加後ＣＶＡ１１型を添加した群（枠内の群）では、ＭＯＩ及びオキサリプラチン添加量の量に依存して強い抗腫瘍効果が認められた。【００４７】
実施例７  オキサリプラチンによるＣＶＢ３型の増殖促進作用
（１）方法
ＣＶＢ３型の調製は、実施例６（１）（ａ）と同様の方法で行った。また、ＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度が０（不添加）、０．５、１．０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＢ３型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。１：オキサリプラチン不添加、２：オキサリプラチン  ０．５μＭ添加、３：オキサリプラチン  １．０μＭ添加の３群に分けて比較した。試験は６回試験とし、検定はt検定を用いた。【００４８】
（２）結果
図９にＣＶＢ３型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、ＣＶＢ３型ウイルス量の増加がみとめられた。特にオキサリプラチン１μＭ添加時には有意な増加がみとめられた。これにより、オキサリプラチンがＣＶＡ１１型だけでなく、ＣＶＢ３型の増殖も促進することが確認された。【００４９】
実施例８  オキサリプラチンによるＡＡＶの増殖促進作用
（１）方法
（ａ）ＡＡＶの調製
ＡＡＶとしてｐＡＡＶ−ＣＭＶ  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ（株）製）を使用した。ｐＡＡＶ−ＣＭＶ  Ｖｅｃｔｏｒは、ＡＡＶｐｒｏ(R)  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ（株）製）を用いて調製を行った。回収した上清（ウイルス溶液）は、−８０℃で保存した。【００５０】
（ｂ）ＭＯＩの算出
ＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。【００５１】
（ｃ）オキサリプラチンの添加
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、オキサリプラチンを最終濃度が０（無添加）、０．２５、０．５、１．０、２．５μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約２４時間静置した後、ＡＡＶをＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、ＡＡＶｐｒｏ(R)  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）Ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いてウイルスのコピー数を測定した。検定はt検定を用いた。【００５２】
（２）結果
図１０にＡＡＶのコピー数の結果を示す。オキサリプラチン添加を行ったもので、有意なＡＡＶのコピー数の増加がみとめられた。特に、オキサリプラチンの添加量が０．２５〜１．０μＭの間で顕著な増加が見られた。これにより、オキサリプラチンがＡＡＶの増殖を促進することが確認された。【００５３】
実施例９  ＳＮ−３８によるＣＶＡ１１型の増殖促進作用
（１）方法
ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ａ）及び（ｂ）と同様の方法で行った。
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、ＳＮ−３８を最終濃度が０（不添加）、１．０、５．０、５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＡ１１型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。１：ＳＮ−３８不添加、２：ＳＮ−３８  １．０μＭ添加、３：ＳＮ−３８  ５．０μＭ添加、４：ＳＮ−３８  ５０μＭ添加の４群に分けて比較をした。試験は６回試験とし、検定はt検定を用いた。【００５４】
（２）結果
図１１にＳＮ−３８添加時のＣＶＡ１１型のウイルス力価の結果を示す。ＳＮ−３８添加を行ったもので、有意なＣＶＡ１１型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチンだけでなく、ＳＮ−３８においてもＣＶＡ１１型の増殖を促進することが確認された。【００５５】
実施例１０  ５−ＦＵによるＣＶＡ１１型の増殖促進作用
（１）方法
ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ａ）及び（ｂ）と同様の方法で行った。
培養したオキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）を３×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地に懸濁した。９６穴のプレートの各ウェルに、得られた細胞懸濁液を１００μＬずつ分注し、３×１０5ｃｅｌｌｓ/ウェルとなるように播種した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約８時間静置した後、５−ＦＵを最終濃度が０（不添加）、５０μＭとなるように添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約１２時間静置した後、ＣＶＡ１１型をＭＯＩ＝０．０１となるように添加した。３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを約３０時間静置した後、実施例１（１）（ｂ）に記載の方法でウイルスの感染力価を測定した。１：５−ＦＵ不添加、２：５−ＦＵ  ５０μＭ添加の２群に分けて比較をした。試験は６回試験とし、検定はt検定を用いた。【００５６】
（２）結果
図１２に５−ＦＵ添加時のＣＶＡ１１型のウイルス力価の結果を示す。５−ＦＵ添加を行ったもので、有意なＣＶＡ１１型ウイルス量の増加がみとめられた。オキサリプラチン、ＳＮ−３８だけでなく、５−ＦＵにおいてもＣＶＡ１１型の増殖を促進することが確認された。【００５７】
実施例１１  脳腫瘍細胞株Ｕ−８７を使用した際のオキサリプラチンとＣＶＡ１１型の併用による抗腫瘍効果
（１）方法
（ａ）ＣＶＡ１１型の調製
ＣＶＡ１１型の調製は、実施例１（１）（ａ）と同様の方法で行った。
（ｂ）ＭＯＩの算出
ＭＯＩの算出は、オキサリプラチン抵抗性大腸癌細胞株（ＷｉＤｒ）の代わりに脳腫瘍細胞株Ｕ−８７を使用したこと以外は実施例１（１）（ｂ）と同様の方法で行った。
（ｃ）ＣＶＡ１１型のクリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の検討
クリスタルバイオレット法により、脳腫瘍細胞株Ｕ−８７を使用した際のＣＶＡ１１型及びオキサリプラチンの併用による抗腫瘍効果（細胞傷害性）を評価した。
脳腫瘍細胞株Ｕ−８７を７２時間後にコンフルエントになる密度（３×１０４ ｃｅｌｌｓ/ウェル）で２４穴のプレートに播種した。その後、オキサリプラチンを０（不添加）又は５０μＭ添加した。感染力価がＭＯＩ＝０．００１になるように、ＯＰＴＩ-ＭＥＭ ＩでＣＶＡ１１型を希釈し、ＣＶＡ１１型の希釈液を調製した。約６時間後、プレートから培地を除去し、ＣＶＡ１１型の希釈液を各ウェルに２００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ2下にプレートを１時間維持した。次に、ＣＶＡ１１型の希釈液を除去し、各細胞用培地を各ウェルに１ｍＬ加え、７２時間培養した。７２時間後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で緩やかに洗浄し、０．５％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを各ウェルに３００μＬ添加した後、１５分間室温に静置することで生存接着細胞を固定した。その後、グルタルアルデヒド含有ＰＢＳを除去し、ＰＢＳで洗浄後、２％エタノール及び０．１％クリスタルバイオレットを含有する滅菌水を、各ウェルに３００μＬ添加し、室温で１０分間静置することで生細胞を染色した。染色後のプレートの各ウェルを滅菌水５００μＬで２回洗浄し、スキャナを用いて染色を記録することで、抗腫瘍効果を確認した。【００５８】
（２）結果
図１３にクリスタルバイオレット法の結果を示す。ＣＶＡ１１型のみにおいても抗腫瘍効果が確認されたが、オキサリプラチン５０μＭとの併用で抗腫瘍効果の増強が確認された。これにより大腸癌以外の癌種である脳腫瘍に対しても当該抗腫瘍療法が効果的であることが示された。【００５９】
比較例１  ＣＶＡ１１型とオキサリプラチン又はシスプラチン併用時における抗腫瘍効果の比較
（１）方法
（ａ）ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出
ＣＶＡ１１型の調製及びＭＯＩの算出は、実施例１（１）（ａ）及び（ｂ）と同様の方法で行った。【００６０】
（ｃ）クリスタルバイオレット法を用いた抗腫瘍効果の比較
ＣＶＡ１１型の感染力価（ＭＯＩ）を０（不添加）、０．００１、０．０１、０．１とし、オキサリプラチン又はシスプラチンの添加量を０μＭ（不添加）、０．５μＭ、１μＭ、５μＭとした。それ以外は、実施例１（１）（ｃ）と同様の方法で行った。【００６１】
（２）結果
図１４（ａ）にオキサリプラチン添加時、図１４（ｂ）にシスプラチン添加時のクリスタルバイオレット法の結果を示す。ＣＶＡ１１型とオキサリプラチンの併用は、ＣＶＡ１１型とシスプラチンの併用と比較して、強い抗腫瘍効果を示した。この結果より、腫瘍溶解性ウイルスであるＣＶＡ１１型とオキサリプラチンの組み合わせは、既報（国際公開第２０１３−１５７６４８号）のＣＶＡ１１型とシスプラチンとの組み合わせと比較して特に有用であることが示された。【００６２】
比較例２  シスプラチンによるＣＶＢ３型の増殖促進作用
（１）方法
オキサリプラチンの代わりにシスプラチンを使用した以外は、実施例７と同様の方法で行った。１：シスプラチン不添加、２：シスプラチン  ０．５μＭ添加、３：シスプラチン  １．０μＭ添加の３群に分けて比較をした。【００６３】
（２）結果
図１５にＣＶＢ３型のウイルス力価の結果を示す。オキサリプラチンを添加した場合（図９）と異なり、シスプラチンを添加してもＣＶＢ３型ウイルス量の増加はみとめられなかった。この結果より、オキサリプラチンはシスプラチンと比較して、腫瘍溶解性ウイルスとの併用において有用であることが示された。
【図１】
2018182014.tif 000003
【図２】
2018182014.tif 000004
【図３】
2018182014.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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