(57)【要約】  ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有し、下記のポリヌクレオチドの近傍に発現対象の外来遺伝子を含むトランスジェニック植物。ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有し、下記のポリヌクレオチドの近傍に発現対象の外来遺伝子を含むトランスジェニック植物。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが外来のものである請求項１に記載のトランスジェニック植物。
【請求項３】
前記ＶＡＮＣ遺伝子が外来のものである請求項１又は２に記載のトランスジェニック植物。
【請求項４】
染色体上に前記ポリヌクレオチドが２個以上集合し、前記ポリヌクレオチドの染色体上の塩基対［ｂｐ］数あたりの存在個数が、２個／１０００ｂｐ〜３０個／１０００ｂｐである前記ポリヌクレオチドのクラスターを有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項５】
前記ＶＡＮＣタンパク質が、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのタンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
（ＩＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
【請求項６】
アブラナ科植物である請求項１〜５のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７】
ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有する植物の、下記のポリヌクレオチドの近傍に、発現対象の遺伝子を導入することを含むトランスジェニック植物の製造方法。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【請求項８】
ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有する植物に、下記のポリヌクレオチド及び発現対象の遺伝子を導入することを含み、前記発現対象の遺伝子は、前記ポリヌクレオチドの近傍に位置する、トランスジェニック植物の製造方法。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【請求項９】
植物に、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子、下記のポリヌクレオチド、及び発現対象の遺伝子を導入することを含み、前記発現対象の遺伝子は、前記ポリヌクレオチドの近傍に位置するトランスジェニック植物の製造方法。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１０】
染色体上に前記ポリヌクレオチドが２個以上集合し、前記ポリヌクレオチドの染色体上の塩基対（ｂｐ）数あたりの存在個数が、２個／１０００ｂｐ〜３０個／１０００ｂｐである前記ポリヌクレオチドのクラスターを有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物の製造方法。
【請求項１１】
前記ＶＡＮＣタンパク質が、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのタンパク質である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物の製造方法。
（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
（ＩＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
【請求項１２】
アブラナ科植物である請求項７〜１１のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物の製造方法。
【請求項１３】
ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
染色体上に下記のポリヌクレオチドが２個以上集合し、前記ポリヌクレオチドの染色体上の塩基対（ｂｐ）数あたりの存在個数が、２個／１０００ｂｐ〜３０個／１０００ｂｐである、前記ポリヌクレオチドのクラスター。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１４に記載のポリヌクレオチドのクラスターを含み、発現対象の遺伝子及び前記ポリヌクレオチドの、植物への導入に用いられるベクター。
【請求項１６】
さらにＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を含む請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を含み、前記ＶＡＮＣ遺伝子の植物への導入に用いられるベクターと、請求項１５に記載のベクターと、を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物の製造方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドのクラスター、ベクター、及びキットに関する。
本願は、２０１７年９月１３日に、日本に出願された特願２０１７−１７６００９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
植物や動物のゲノムに導入した外来配列は、しばしばＤＮＡのメチル化を受け、転写が抑制される。特に遺伝子組み換え（ＧＭ）植物の作出においては、この転写の抑制現象が、導入遺伝子の安定した発現の障害となる場合がある。
ＤＮＡのメチル化を伴う転写抑制を解除する方法として、ＤＮＡメチル化酵素をはじめとしたＤＮＡメチル化に必要な因子の機能を阻害する方法が知られている。例えば、生物を当該因子の阻害剤で処理する方法や、生物の本来有する当該因子に変異を導入することが挙げられる。
例えば、特許文献１は、ゼブラリン（Ｚｅｂｕｌａｒｉｎｅ）およびその関連化合物を用いた、ＤＮＡメチル化の阻害について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−２４８２２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ＤＮＡメチル化に必要な因子の阻害剤で処理する方法や、ＤＮＡメチル化に必要な因子に変異を導入する方法では、ゲノムの多くの領域でメチル化の脱抑制が起こるため、生物が不健全な状態となったり、発生致死などが生じたりするなど、多くの副作用の懸念がある。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、所望の領域について、ＤＮＡメチル化に伴う転写抑制の脱抑制が可能な、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物の製造方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドのクラスター、ベクター、及びキットの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＶＡＮＣタンパク質と、ＶＡＮＣタンパク質の標的となるポリヌクレオチド配列と、を用いることにより、所望の領域について、ＤＮＡメチル化に伴う転写抑制の脱抑制が可能となることを見出し、本発明を完成させた。【０００６】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するトランスジェニック植物、トランスジェニック植物の製造方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドのクラスター、ベクター、及びキットを提供するものである。
（１）ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有し、下記のポリヌクレオチドの近傍に発現対象の外来遺伝子を含むトランスジェニック植物。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（２）前記ポリヌクレオチドが外来のものである前記（１）に記載のトランスジェニック植物。
（３）前記ＶＡＮＣ遺伝子が外来のものである前記（１）又は（２）に記載のトランスジェニック植物。
（４）染色体上に前記ポリヌクレオチドが２個以上集合し、前記ポリヌクレオチドの染色体上の塩基対（ｂｐ）数あたりの存在個数が、２個／３００ｂｐ〜３０個／３００ｂｐである前記ポリヌクレオチドのクラスターを有する、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載のトランスジェニック植物。
（５）前記ＶＡＮＣタンパク質が、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのタンパク質である、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のトランスジェニック植物。
（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
（ＩＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
（６）アブラナ科植物である前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のトランスジェニック植物。
（７）ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子及び下記のポリヌクレオチドを有する植物の、前記下記のポリヌクレオチドの近傍に、発現対象の遺伝子を導入することを含むトランスジェニック植物の製造方法。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（８）ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有する植物に、下記のポリヌクレオチド及び発現対象の遺伝子を導入することを含み、前記発現対象の遺伝子は、前記ポリヌクレオチドの近傍に位置する、トランスジェニック植物の製造方法。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（９）植物に、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子、下記のポリヌクレオチド、及び発現対象の遺伝子を導入することを含み、前記発現対象の遺伝子は、前記ポリヌクレオチドの近傍に位置する、トランスジェニック植物の製造方法。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（１０）染色体上に前記ポリヌクレオチドが２個以上集合し、前記ポリヌクレオチドの染色体上の塩基対（ｂｐ）数あたりの存在個数が、２個／３００ｂｐ〜３０個／３００ｂｐである前記ポリヌクレオチドのクラスターを有する、前記（７）〜（９）のいずれか一つに記載のトランスジェニック植物の製造方法。
（１１）前記ＶＡＮＣタンパク質が、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかのタンパク質である、前記（７）〜（１０）のいずれか一つに記載のトランスジェニック植物の製造方法。
（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
（ＩＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質
（１２）前記植物がアブラナ科植物である前記（７）〜（１１）のいずれか一つに記載のトランスジェニック植物の製造方法。
（１３）ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（１４）染色体上に下記のポリヌクレオチドが２個以上集合し、前記ポリヌクレオチドの染色体上の塩基対（ｂｐ）数あたりの存在個数が、２個／３００ｂｐ〜３０個／３００ｂｐである、前記ポリヌクレオチドのクラスター。
ポリヌクレオチド：ａｇｔａｔｔａｔ（配列番号１１）、ａｇｔａｔｔａｃ（配列番号１２）、ａｇｔａｃｔａｔ（配列番号１３）、及びａｇｔａｃｔａｃ（配列番号１４）からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（１５）前記（１３）に記載のポリヌクレオチド、又は前記（１４）に記載のポリヌクレオチドのクラスターを含み、発現対象の遺伝子及び前記ポリヌクレオチドの、植物への導入に用いられるベクター。
（１６）さらにＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を含む前記（１５）に記載のベクター。
（１７）ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を含み、前記ＶＡＮＣ遺伝子の植物への導入に用いられるベクターと、前記（１５）に記載のベクターと、を備えるキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、所望の領域について、ＤＮＡメチル化に伴う転写抑制の脱抑制が可能な、トランスジェニック植物、トランスジェニック植物の製造方法、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドのクラスター、ベクター、及びキットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例で得られた、抗ＶＡＮＣ抗体によるクロマチン免疫沈降シークエンス（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）のマッピング結果を示す図である。
【図２】抗ＶＡＮＣ抗体によるＩＰ産物のリードについて、１コピーあたりのＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）値の分布を表示したグラフである。
【図３】ＶＡＮＣタンパク質の集積と、ＶＡＮＣ遺伝子導入によるＤＮＡの低メチル化状態とを解析した結果を示すグラフである。
【図４】ＶＡＮＣタンパク質が集積している領域で見出されたＡＧＴＡＹＴＡＹ配列である。
【図５】ＶＡＮＣタンパク質が集積している領域で見出されたＡＧＴＡＹＴＡＹ配列の、各トランスポゾンにおける出現回数を示すグラフである。
【図６】Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑの結果、ＡＧＴＡＴＴＡＹ配列の存在領域、及びＶＡＮＣ遺伝子導入系統でのＣｈＩＰ−ｓｅｑの結果を統合して示した図である。
【図７】ＶＡＮＤＡＬ２１配列を含むベクターのコンストラクトを示す図である。
【図８】図７に示すベクターを導入した４系統の種子をカナマイシン培地に播種後１日４℃で保存した後、２２℃長日条件で１２日間栽培し、根長を測定した結果を示す箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
≪ポリヌクレオチド≫
本発明のポリヌクレオチドは、下記表１に示す配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなる。当該ポリヌクレオチド配列は、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑにより明らかにされたＶＡＮＣタンパク質が集積する領域から共通に見出された配列であり、ＶＡＮＣタンパク質が特異的に結合する領域であると考えられる。配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、ＶＡＮＣタンパク質の結合の標的となるため、以下、配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを「標的ポリヌクレオチド」ということがある。
【００１０】
【表１】
2019054445.tif 000002
【００１１】
また、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。ここで、付加されていてもよいヌクレオチドの数としては、１〜１０個を挙げることができる。付加されていてもよいヌクレオチドの数としては、１〜５個が好ましく、１〜３個がより好ましく、１〜２個がさらに好ましく、１個が特に好ましい。
ヌクレオチドの付加は、５’側及び３’側のいずれであってもよい。配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列の、５’側にヌクレオチドが付加されていてもよく、３’側にヌクレオチドが付加されていてもよく、５’側と３’側の両方にヌクレオチドが付加されていてもよい。
配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列に付加されているヌクレオチドの種類は特に限定されず、アデニン、シトシン、グアニン、及びチミンから選択される任意のヌクレオチドであってよい。また、複数個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が付加される場合、当該ヌクレオチド配列も任意のものであってよい。
本発明者らは、ＶＡＮＣタンパク質が特異的に結合する領域において、配列番号１１〜１４で表されるポリヌクレオチド配列の５’側に、チミン又はシトシンが隣接することが多いことを見出している。したがって、「配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド」の好適な例としては、「配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列の５’側に、チミン又はシトシンが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド」が挙げられる。当該ポリヌクレオチド配列を、下記表２の配列番号１５〜２２に示す。以下、「標的ポリヌクレオチド」には、「配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド」も含まれる場合がある。
【００１２】
【表２】
2019054445.tif 000003
【００１３】
本発明に係るＶＡＮＣタンパク質は、ＶＡＮＤＡＬファミリーに属するトランスポゾンが有する遺伝子がコードするタンパク質の一つである。本発明に係るＶＡＮＣタンパク質は、前記標的ポリヌクレオチドに結合可能である。タンパク質が標的ポリヌクレオチドに結合可能であるかどうかは、公知の手法により調べることが可能である。例えば、後述の実施例に示すように、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑを行うことで、標的ポリヌクレオチドに対するタンパク質の結合を確認できる。ＶＡＮＣタンパク質と標的ポリヌクレオチドは直接結合してもよく、他の因子を介して間接的に結合してもよい。
【００１４】
本発明に係るＶＡＮＣタンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合可能であり、且つポリヌクレオチドのメチル化を抑制する機能を有することが好ましい。ポリヌクレオチドのメチル化を抑制する機能は「脱メチル化作用」とも呼べるものである。ＶＡＮＣタンパク質は、標的ポリヌクレオチドを含むＤＮＡにおいて、標的ポリヌクレオチドの、近傍のポリヌクレオチドのメチル化を抑制可能である。
ここで「近傍」とは、ＶＡＮＣタンパク質による脱メチル化作用の及ぶ範囲をいい、標的ポリヌクレオチドを含んでもよい。
本発明に係るＶＡＮＣタンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合し、近傍のポリヌクレオチドのメチル化を抑制するものと考えられる。したがって、ＶＡＮＣタンパク質による脱メチル化作用の及ぶ範囲は、標的ポリヌクレオチドのＤＮＡの周辺の領域について調べればよい。当該範囲は、公知の手法により確認することが可能である。例えば、後述の実施例に示すように、Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行うことで、標的ポリヌクレオチドのＤＮＡの周辺の領域の、ＤＮＡメチル化の状態を確認できる。例えば、ＶＡＮＣタンパク質の発現を亢進させた植物体Ａと、前記植物体ＡよりもＶＡＮＣタンパク質の発現が低い植物体Ｂとを比較する。そして、標的ポリヌクレオチドのＤＮＡの周辺の領域について、植物体Ｂよりも植物体Ａのほうで、ＤＮＡのメチル化の度合いが低下していた範囲を、ＶＡＮＣタンパク質による脱メチル化作用の及ぶ範囲とすることができる。
後述の実施例に示される結果によれば、ＶＡＮＣタンパク質は、標的ポリヌクレオチドの末端の位置を起点として、その周囲数キロｂｐの範囲のＤＮＡのメチル化を抑制可能であることが示唆されている。よって、ＶＡＮＣタンパク質がポリヌクレオチドのメチル化を抑制可能な、前記近傍の範囲の具体例としては、例えば、標的ポリヌクレオチドの末端の位置を起点として１ｂｐ〜５０００ｂｐの範囲であってもよく、１ｂｐ〜３０００ｂｐの範囲であってもよく、１ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲であってもよく、１ｂｐ〜５００ｂｐの範囲であってもよい。
【００１５】
本発明に係るＶＡＮＣタンパク質としては、上記に挙げたものであってよいが、例えば、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＶＡＮＤＡＬ２１に含まれるＶＡＮＣ遺伝子（Ａｔ２ｇ２３４８０）がコードするタンパク質である。
シロイヌナズナのＶＡＮＤＡＬ２１は、トランスポゾンとして機能することが知られており、ＶＡＮＡ、ＶＡＮＢ、ＶＡＮＣの３つの遺伝子を含む。ＶＡＮＡ遺伝子（Ａｔ２ｇ２３５００）がコードするＶＡＮＡタンパク質は、ＭＵＲＡ−ｔｙｐｅのトランスポゼースとして機能するとされる。ＶＡＮＢ遺伝子（Ａｔ２ｇ２３４９０）の機能は未知である。ＶＡＮＣ遺伝子（Ａｔ２ｇ２３４８０）がコードするＶＡＮＣタンパク質は、ＤＮＡの脱メチル化作用を有する。
【００１６】
ＶＡＮＣ遺伝子（Ａｔ２ｇ２３４８０）、又はＶＡＮＣ遺伝子のホモログ、バリアント、若しくは変異体がコードするタンパク質としては、例えば、以下の（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のタンパク質が挙げられる。
（Ｉ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、（ＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されているアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質、（ＩＩＩ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、脱メチル化作用を有するタンパク質。
【００１７】
ここで、上記（ＩＩ）のアミノ酸配列において、欠失、置換、又は付加されていてもよいアミノ酸の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
ここで、上記（ＩＩＩ）のアミノ酸配列との同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。アミノ酸配列の同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（参照ＵＲＬ：ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により求めることができる。パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００１８】
上記（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のタンパク質は、標的ポリヌクレオチドに結合可能で、標的ポリヌクレオチドの、近傍のポリヌクレオチドのメチル化を抑制可能である。
【００１９】
標的ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドが２個以上集合した前記ポリヌクレオチドのクラスターを形成してもよい。
当該クラスターは、標的ポリヌクレオチドの染色体上の領域の塩基対［ｂｐ］数あたりの存在個数が、２個／１０００ｂｐ〜３０個／１０００ｂｐであってもよく、２個／５００ｂｐ〜２０個／５００ｂｐであってもよく、２個／５００ｂｐ〜４個／５００ｂｐであってもよい。なお、標的ポリヌクレオチドは、正鎖（５’→３’）にあってもよく、相補鎖（３’→５’）にあってもよい。
【００２０】
標的ポリヌクレオチドが、上記の割合で前記ポリヌクレオチドのクラスターを形成していることにより、より効果的にＶＡＮＣタンパク質によるメチル化抑制効果が発揮される。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドには、ＶＡＮＣタンパク質が結合でき、ＶＡＮＣタンパク質の作用により、本発明のポリヌクレオチドの近傍のＤＮＡの脱メチル化を起こすことができるので、本発明のポリヌクレオチドの近傍の遺伝子の転写が抑制されることが防止される。
従来、ＤＮＡメチル化に必要な因子の阻害剤で処理する方法や、ＤＮＡメチル化に必要な因子に変異を導入する方法で、ＤＮＡの脱メチル化を試みた場合、ゲノムの多くの領域でメチル化の抑制が起こるため、生物が不健全な状態となったり、発生致死などが生じたりするなどの副作用の懸念があった。
一方、本発明のポリヌクレオチドによれば、当該ポリヌクレオチドの近傍の領域で特異的にＤＮＡの脱メチル化を起こすことができる。したがって、上記の副作用が回避され、生物を健全な状態に保ちながら、目的の遺伝子を安定して発現させることができる。
【００２２】
≪トランスジェニック植物≫
本発明のトランスジェニック植物は、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有し、下記のポリヌクレオチドの近傍に発現対象の外来遺伝子を含む。
ポリヌクレオチド：配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【００２３】
ここで、前記ＶＡＮＣタンパク質、前記ポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドの「近傍」としては、前記≪ポリヌクレオチド≫で説明したものが挙げられる。
【００２４】
トランスジェニック植物における植物としては、特に制限されず、陸上植物が好ましく、種子植物がより好ましく、被子植物がさらに好ましい。被子植物としては、例えば、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）等のイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）植物；シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  
ｎａｐｕｓ）等のアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）植物；ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）等のナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）植物；ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）等のマメ科（Ｆａｂａｓｅａｅ）植物；タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ  ｃｅｐａ）等のネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）植物が挙げられ、上記のなかでもアブラナ科植物が好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
トランスジェニック植物は、外来遺伝子の導入操作が行われた初代トランスジェニック植物及びその子孫若しくはクローンを含む。
【００２５】
前記ＶＡＮＣ遺伝子、標的ポリヌクレオチド、及び前記外来遺伝子は、トランスジェニック植物のゲノム上に存在することが好ましい。また、本明細書において「ゲノム」とは、トランスジェニック植物の染色体に含まれる、全てのＤＮＡを包含する意味で用いている。
発現対象の外来遺伝子としては、特に制限されず、任意の遺伝子を採用できる。
標的ポリヌクレオチドの近傍に位置するものが外来遺伝子かどうかは、トランスジェニック植物に遺伝子導入されていない、野生型等のコントロールの植物のＤＮＡの配列情報と比較して、新たに遺伝子が導入されているかを調べることで判断できる。
【００２６】
本発明のトランスジェニック植物において、標的ポリヌクレオチドは、植物が本来有する内在のポリヌクレオチドであってもよいが、植物に導入された外来のポリヌクレオチドであることが好ましい。
標的ポリヌクレオチドが新たに導入された部分では、ＶＡＮＣタンパク質の作用により、標的ポリヌクレオチドの近傍において新たにポリヌクレオチドの脱メチル化を起こすことができる。
標的ポリヌクレオチドが外来のポリヌクレオチドかどうかは、トランスジェニック植物に遺伝子導入されていない、野生型等のコントロールの植物のＤＮＡの配列情報と比較して、新たに標的ポリヌクレオチドが導入されているかを調べることで判断できる。
【００２７】
本発明のトランスジェニック植物において、前記ＶＡＮＣ遺伝子は、植物が本来有する内在のＶＡＮＣ遺伝子であってもよいが、植物に導入された外来のＶＡＮＣ遺伝子であることが好ましい。
ＶＡＮＣ遺伝子が外来のＶＡＮＣ遺伝子かどうかは、トランスジェニック植物に遺伝子導入されていない、野生型等のコントロールの植物のＤＮＡの配列情報と比較して、新たにＶＡＮＣ遺伝子が導入されているかを調べることで判断できる。
【００２８】
野生型のシロイヌナズナにおいては、標的ポリヌクレオチドは、ＶＡＮＤＡＬファミリーに属するトランスポゾンの一部として存在する。一方、例えば、標的ポリヌクレオチドが、外来のポリヌクレオチドである場合、当該標的ポリヌクレオチドは、ＶＡＮＤＡＬファミリーに属するトランスポゾンの一部として導入されなくともよい。同様に、前記ＶＡＮＣ遺伝子が、外来のＶＡＮＣ遺伝子である場合、当該ＶＡＮＣ遺伝子は、ＶＡＮＤＡＬファミリーに属するトランスポゾンの一部として導入されなくともよい。
具体的には、外来の標的ポリヌクレオチドの近傍にＶＡＮＡ遺伝子及び／又はＶＡＮＢ遺伝子を有さないことが好ましく、外来の標的ポリヌクレオチドの近傍にＶＡＮＡ遺伝子を有さないことがより好ましい。ＶＡＮＡ遺伝子は、ＭＵＲＡ−ｔｙｐｅのトランスポゼースとして機能すると推定されるので、外来の標的ポリヌクレオチドの近傍にＶＡＮＡ遺伝子を有さないことで、意図せずトランスポゾンが活性化することを回避できる。
【００２９】
本発明のトランスジェニック植物は、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有し、ＶＡＮＣタンパク質を発現していることが好ましい。
前記ＶＡＮＣ遺伝子が外来のＶＡＮＣ遺伝子である場合、ＶＡＮＣ遺伝子のゲノム上の導入位置は特に限定されず、ＶＡＮＣタンパク質を発現可能に導入されていることが好ましい。
【００３０】
本発明のトランスジェニック植物は、ＶＡＮＣ遺伝子又はＶＡＮＣタンパク質の発現が亢進されていることが好ましい。ＶＡＮＣ遺伝子又はＶＡＮＣタンパク質の発現が亢進されているとは、トランスジェニック植物の野生型等の遺伝子導入されていないコントロールの植物と比較して、ＶＡＮＣ遺伝子又はＶＡＮＣタンパク質の発現が増加している状態である。
【００３１】
シロイヌナズナのように、野生型のシロイヌナズナがＶＡＮＣ遺伝子を有している植物の場合であっても、外来のＶＡＮＣ遺伝子を新たに有することで、ＶＡＮＣタンパク質の発現量を向上させることができる。また、本来ＶＡＮＣ遺伝子を有していない植物が外来のＶＡＮＣ遺伝子を新たに有することで、新たにＶＡＮＣタンパク質の機能を備えることができる。
【００３２】
前記外来遺伝子、標的ポリヌクレオチド、及び前記ＶＡＮＣ遺伝子は、トランスジェニック植物とは別種の生物に由来するものであってもよく、人工的に製造されたものであってもよい。また、トランスジェニック植物の野生型の植物に由来するが、染色体上の本来の位置とは別の位置に新たに導入されたものであってもよい。
【００３３】
標的ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドが２個以上集合した前記ポリヌクレオチドのクラスターを形成してもよい。当該クラスターとしては、前記≪ポリヌクレオチド≫で説明したものが挙げられる。
標的ポリヌクレオチドが、上記の割合で前記ポリヌクレオチドのクラスターを形成していることにより、より効果的にＶＡＮＣタンパク質によるメチル化抑制効果が発揮される。
【００３４】
以上のように、トランスジェニック植物は、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有し、標的ポリヌクレオチドの近傍に発現対象の外来遺伝子を含むことで、ＶＡＮＣタンパク質の作用により、本発明のポリヌクレオチドの近傍の外来遺伝子のＤＮＡがメチル化されることが防止される。そのため、標的ポリヌクレオチドの近傍の外来遺伝子が、メチル化に伴い転写抑制されてしまうことを防止でき、外来遺伝子を安定して発現させることができる。また、標的ポリヌクレオチドの近傍の領域で特異的に脱メチル化が起きるため、トランスジェニック植物を健全な状態に保ちながら、外来遺伝子を安定して発現させることができる。
【００３５】
≪トランスジェニック植物の製造方法≫
一実施形態として、本発明のトランスジェニック植物の製造方法は、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子及び下記のポリヌクレオチドを有する植物の、前記下記のポリヌクレオチドの近傍に、発現対象の遺伝子を導入することを含む。
ポリヌクレオチド：配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【００３６】
一実施形態として、本発明のトランスジェニック植物の製造方法は、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を有する植物に、下記のポリヌクレオチド及び発現対象の遺伝子を導入することを含み、前記発現対象の遺伝子は、前記ポリヌクレオチドの近傍に位置する、製造方法である。
ポリヌクレオチド：配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【００３７】
標的ポリヌクレオチドと、発現対象の遺伝子とは、標的ポリヌクレオチド及び発現対象の遺伝子を含む構築物として導入してもよい。当該構築物において、発現対象の遺伝子は、標的ポリヌクレオチドの近傍に配置されることが好ましい。
【００３８】
一実施形態として、本発明のトランスジェニック植物の製造方法は、植物に、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子、下記のポリヌクレオチド、及び発現対象の遺伝子を導入することを含み、前記発現対象の遺伝子は、前記ポリヌクレオチドの近傍に位置する、製造方法である。
ポリヌクレオチド：配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【００３９】
ＶＡＮＣ遺伝子と、標的ポリヌクレオチドと、発現対象の遺伝子とは、ＶＡＮＣ遺伝子、標的ポリヌクレオチド及び発現対象の遺伝子を含む構築物として導入してもよい。当該構築物において、発現対象の遺伝子は、標的ポリヌクレオチドの近傍に配置されることが好ましい。
【００４０】
ここで、トランスジェニック植物における植物、前記ＶＡＮＣタンパク質、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドの「近傍」としては、前記≪ポリヌクレオチド≫で説明したものが挙げられる。
発現対象の遺伝子としては、特に制限されず、前記≪トランスジェニック植物≫で説明した外来遺伝子が挙げられる。
【００４１】
標的ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドが２個以上集合した前記ポリヌクレオチドのクラスターを形成してもよい。当該クラスターとしては、前記≪ポリヌクレオチド≫で説明したものが挙げられる。
標的ポリヌクレオチドが、上記の割合で前記ポリヌクレオチドのクラスターを形成していることにより、より効果的にＶＡＮＣタンパク質によるメチル化抑制効果が発揮される。
【００４２】
前記ＶＡＮＣ遺伝子、標的ポリヌクレオチド、及び発現対象の遺伝子の植物への導入方法としては、公知の方法を使用可能である。例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等が挙げられる。これらの前記ＶＡＮＣ遺伝子、標的ポリヌクレオチド、発現対象の遺伝子は、植物の細胞のゲノムＤＮＡに導入されることが好ましい。
【００４３】
製造されるトランスジェニック植物は、ＶＡＮＣタンパク質を発現していることが好ましい。
植物に前記ＶＡＮＣ遺伝子を導入する場合、ＶＡＮＣ遺伝子のゲノム上の導入位置は特に限定されず、ＶＡＮＣタンパク質を発現可能に導入することが好ましい。
【００４４】
製造されるトランスジェニック植物は、ＶＡＮＣ遺伝子又はＶＡＮＣタンパク質の発現が亢進されていることが好ましい。ＶＡＮＣ遺伝子又はＶＡＮＣタンパク質の発現が亢進されているとは、トランスジェニック植物の野生型等の遺伝子導入されていないコントロールの植物と比較して、ＶＡＮＣ遺伝子又はＶＡＮＣタンパク質の発現が増加している状態である。
ＶＡＮＣ遺伝子又はＶＡＮＣタンパク質の発現を増加させる方法としては、例えば、ＶＡＮＣ遺伝子に恒常発現プロモーターを連結して、該プロモーターの制御下にＶＡＮＣ遺伝子を発現させる方法が挙げられる。
【００４５】
植物に、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子、及び標的ポリヌクレオチドを導入する場合、外来の標的ポリヌクレオチドの近傍にＶＡＮＡ遺伝子及び／又はＶＡＮＢ遺伝子を導入しないことが好ましく、外来の標的ポリヌクレオチドの近傍にＶＡＮＡ遺伝子を導入しないことがより好ましい。ＶＡＮＡ遺伝子は、ＭＵＲＡ−ｔｙｐｅのトランスポゼースとして機能すると推定されるので、外来の標的ポリヌクレオチドの近傍にＶＡＮＡ遺伝子を導入しないことで、意図せずトランスポゾンが活性化することを回避できる。
【００４６】
これらの前記ＶＡＮＣ遺伝子、標的ポリヌクレオチド、及び発現対象の遺伝子のポリヌクレオチドの、導入対象の植物又は植物材料としては、植物体のいずれの部位であってもよく、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等が挙げられる。また、植物体ではなく、培養細胞等の細胞に対して、ポリヌクレオチドを導入してもよい。例えばカルスを形成させて、ポリヌクレオチドを導入し、それを再分化させて得られた不定胚や、不定芽等から、トランスジェニック植物を得てもよい。
【００４７】
前記ＶＡＮＣ遺伝子、標的ポリヌクレオチド、発現対象の遺伝子が植物へ導入されたか否かを確かめる方法としては、公知の方法を使用可能である。例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行ってもよく、選抜マーカー遺伝子を用いて行ってもよい。選抜マーカー遺伝子としては、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等が挙げられる。
【００４８】
本発明のトランスジェニック植物の製造方法によれば、本発明のトランスジェニック植物を製造できる。また、前記≪トランスジェニック植物≫において説明したように、前記発現対象の遺伝子を安定して発現させることができる。また、標的ポリヌクレオチドの近傍の領域で特異的に脱メチル化が起きるため、トランスジェニック植物を健全な状態に保ちながら、前記発現対象の遺伝子を安定して発現させることができる。
【００４９】
≪ベクター・キット≫
本発明のベクターは、下記のポリヌクレオチド、又は前記下記のポリヌクレオチドのクラスターを含み、発現対象の遺伝子及び前記ポリヌクレオチドの、植物への導入に用いられる。
ポリヌクレオチド：配列番号１１〜１４のいずれかで表されるポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は前記ポリヌクレオチド配列に１〜数個のヌクレオチドが付加されているポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
【００５０】
本発明のベクターは、形質転換後に発現対象の遺伝子が発現可能な、発現ベクターであってもよい。
発現対象の遺伝子の挿入サイトは、標的ポリヌクレオチドの近傍に配置されることが好ましい。
ベクターは、さらにＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を含んでもよい。
本発明のベクターにおいて、ＶＡＮＣ遺伝子は、標的ポリヌクレオチドの近傍に配置されることが好ましい。
【００５１】
本発明のベクターは、キット化して提供されてもよい。
本発明のキットは、ＶＡＮＣタンパク質をコードするＶＡＮＣ遺伝子を含み、前記ＶＡＮＣ遺伝子の植物への導入に用いられるベクターと、本発明のベクターと、を備える。
【００５２】
本発明のベクターによれば、本発明のポリヌクレオチドを含むため、発現対象の遺伝子がメチル化に伴い転写抑制されてしまうことを防止でき、前記発現対象の遺伝子を安定して発現させることができる。また、ＶＡＮＣタンパク質の作用による脱メチル化が特異的となるため、トランスジェニック植物を健全な状態に保ちながら、前記発現対象の遺伝子を安定して発現させることができる。
【実施例】
【００５３】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５４】
１．ＶＡＮＣ遺伝子導入系統に対するＣｈＩＰ−ｓｅｑ
野生型のシロイヌナズナに、ＶＡＮＣ遺伝子（Ａｔ２ｇ２３４８０）を常法により導入した。ＶＡＮＣ遺伝子の導入が確認されたＶＡＮＣ遺伝子導入系統から、クロマチン試料を得て、抗ＶＡＮＣ抗体と反応させて免疫沈降（ＩＰ）を行った後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ処理及びＲＮａｓｅ  Ａ処理を行ってＤＮＡを回収し、試料（ＶＡＮＣ＋ＩＰ）を調製した。また、抗ＶＡＮＣ抗体との反応を行わなかった以外は、上記試料（ＶＡＮＣ＋ＩＰ）の調製と同様にして、コントロールの試料（ＶＡＮＣ＋Ｉｎｐｕｔ）を調製した。
その後、両試料に対してシーケンスを行い、取得した配列を参照ゲノム上にマッピングした。【００５５】
結果を図１に示す。図１は、抗ＶＡＮＣ抗体によるＣｈＩＰ−ｓｅｑのマッピング結果を、シロイヌナズナの二番染色体の５００ｋｂの領域について表示したものである。グラフの縦軸は、マッピングされた配列のリード数を示してある。図１中に、２つのＶＡＮＤＡＬ２１の領域「ＡＴ２ＴＥ１９６１５＿ＶＡＮＤＡＬ２１」及び「ＡＴ２ＴＥ２０１４０＿ＶＡＮＤＡＬ２１」を示す。ＶＡＮＣ＋ＩＰの結果から、抗ＶＡＮＣ抗体によるＩＰ産物のリードはＶＡＮＣ領域のみにマップされていた。
図２は、抗ＶＡＮＣ抗体によるＩＰ産物のリードについて、１コピーあたりのＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）値の分布を、ＶＡＮＤＡＬファミリーごとに表示したグラフである。図２で示されるように、ＶＡＮＤＡＬ２１ファミリーでのみＲＰＭ値が高かった。
これらの結果から、ＶＡＮＣタンパク質は、ＶＡＮＤＡＬ２１ファミリーに属するトランスポゾンの領域部分に特異的に集積することが明らかとなった。【００５６】
次に、トランスポゾンごとにＶＡＮＣタンパク質の集積とＶＡＮＣ遺伝子導入によるＤＮＡの低メチル化の状態を解析した。
結果を図３（ａ）〜（ｃ）に示す。メチル化は、ＣＧサイト（ａ），ＣＨＧサイト（ｂ），ＣＨＨサイト（ｃ）のコンテクストごとに比較した。ＨはＧ以外の塩基を示す。縦軸は抗ＶＡＮＣ抗体によるＩＰ産物のＲＰＭ値を示し、横軸は野生型に対するＶＡＮＣ遺伝子導入系統の相対的な低メチル化量を示す。色の薄いドット（○）はＶＡＮＤＡＬ２１ファミリーのトランスポゾンを示し、色の濃いドット（●）はＶＡＮＤＡＬ２１ファミリー以外のＶＡＮＤＡＬ型トランスポゾンを示す。解析した全てのコンテクストで、ＶＡＮＣタンパク質の集積と相関して、ＤＮＡの低メチル化が引き起こされていることが明らかとなった。【００５７】
ＣｈＩＰ−ｓｅｑにより得られたデータについて、Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ  ｄａｔａ  ２（ＭＡＣＳ２）によってピーク検出を行い、ＶＡＮＣタンパク質が集積している領域６１カ所を同定した。同定された各領域から、上下の各５ｋｂについて、５０ｂｐごとのＤＮＡメチル化の平均値をコンテクストごとに示した。
結果を図３（ｄ）〜（ｆ）に示す。ＶＡＮＣ遺伝子導入系統（ＶＡＮＣ  ＴＧ）と野生型（ＷＴ）とを比較した。ＣＧサイト（ｄ），ＣＨＧサイト（ｅ），ＣＨＨサイト（ｆ）の全てについて、ＶＡＮＣタンパク質が集積している領域での、ＶＡＮＣ遺伝子導入系統のＤＮＡメチル化の顕著な低下が確認された。【００５８】
上記で同定されたＶＡＮＣタンパク質が集積している領域６１カ所に、共通の配列が存在するか、ＤＲＥＭＥ（４．１１．０）スクリプトを用いて解析した。その結果、６１カ所中６０カ所で、ＡＧＴＡＹＴＡＹ配列（ＹはＴもしくはＣを表す。）が確認された（図４）。【００５９】
８塩基中２カ所にＹ塩基が存在するので８塩基の配列には４通りが考えられる。そこでＡＧＴＡＴＴＡＴ（ｂ），ＡＧＴＡＣＴＡＴ（ｃ），ＡＧＴＡＣＴＡＣ（ｄ），ＡＧＴＡＴＴＡＣ（ｅ）の４通りの配列について、ＶＡＮＤＡＬファミリーごと、及びＶＡＮＤＡＬ以外のトランスポゾンについて出現回数を解析した（図５）。
その結果、ＡＧＴＡＴＴＡＴおよびＡＧＴＡＴＴＡＣ配列は、ＶＡＮＤＡＬ２１ファミリーにのみ高頻度に、存在することが明らかになった（図５）。【００６０】
野生型および上記ＶＡＮＣ遺伝子導入系統について、常法によりＢｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑを行った。ＡＧＴＡＴＴＡＹ配列の存在する場所、またＶＡＮＣ遺伝子導入系統でのＣｈＩＰ−ｓｅｑの結果を統合し、三番染色体及び二番染色体の領域について、それらをゲノムブラウザで表示した（図６）。
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−ｓｅｑについて、ＣＧ，ＣＨＧ，ＣＨＨのコンテクストごとの野生型（ＷＴ）およびＶＡＮＣ遺伝子導入系統（ＴＧ＋）のＤＮＡメチル化を示した。
ＡＧＴＡＴＴＡＣおよびＡＧＴＡＴＴＡＴ配列について、当該配列が存在する場所をそれぞれ示した。正の値は配列が正鎖に存在し、負の値は相補鎖に存在することを示す。
ＣｈＩＰ−ｓｅｑについて、それぞれＩＮＰＵＴ  ＤＮＡリードがマップされた領域、及び抗ＶＡＮＣ抗体でのＩＰ産物のマップされた領域をそれぞれ示した。
図６中の黒矢印で示すＡＧＴＡＴＴＡＣ又はＡＧＴＡＴＴＡＴ配列が存在する領域では、ＶＡＮＣタンパク質が集積し、さらにＤＮＡの低メチル化が顕著に起きていた。
これらの結果からＶＡＮＣタンパク質はＡＧＴＡＴＴＡＣ配列又はＡＧＴＡＴＴＡＴ配列が存在する領域を認識して結合し、近傍のＤＮＡの低メチル化を引き起こすことが示唆された。【００６１】
２．ＶＡＮＤＡＬ２１配列を用いた外来遺伝子導入
シロイヌナズナへの導入ベクターとして、図７に示す４つのコンストラクトを作製した。まず、ｐＧｒｅｅｎＩＩ−０１７９（Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S. & Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 42, 819-32 (2000).）に、ＶＡＮＤＡＬ２１配列を組み込んで、ＶＡＮＤＡＬ２１配列を含むベクターを作製した（図７  Ｈｉｕｎ）。ｐＧｒｅｅｎＩＩ−０１７９に組み込んだＤＮＡ断片、及び当該ＤＮＡ断片に含まれるＶＡＮＤＡＬ２１配列の塩基配列を配列番号２及び４にそれぞれ示す。また、ＶＡＮＤＡＬ２１配列に含まれるＶＡＮＡ遺伝子、ＶＡＮＢ遺伝子、及びＶＡＮＣ遺伝子の塩基配列を配列番号５、６、及び７にそれぞれ示す。
次いで、ＶＡＮＢ遺伝子の配列を、カナマイシン耐性遺伝子であるＮＰＴＩＩの配列（ＮＯＳプロモーター−ＮＰＴＩＩ遺伝子−ＮＯＳターミネーター）と置き換えた（図７  Ｈｉｕｎ＿ＶＡＮＢ２１Δ：ＮＰＴＩＩ）。置換後のＤＮＡ断片の塩基配列を配列番号３に示す。ＮＰＴＩＩ遺伝子、並びにＮＯＳプロモーター及びＮＯＳターミネーターの塩基配列を配列番号１０、並びに配列番号８及び９にそれぞれ示す。植物体中でＮＰＴＩＩが発現すると、カナマイシン培地で根が伸長する。
次いで、ＶＡＮＣ遺伝子配列中に終止コドンを導入し、ＶＡＮＣ遺伝子の機能を損なわせた（図７  Ｈｉｕｎ＿ＶＡＮＢ２１Δ：ＮＰＴＩＩ＿ＶＡＮＣ２１−ｅｎｄｏ１．１及びＨｉｕｎ＿ＶＡＮＢ２１Δ：ＮＰＴＩＩ＿ＶＡＮＣ２１−ｅｎｄｏ２）。図７中、ドットパターンで表す構成はＶＡＮＣ遺伝子を示し、「＊」は、ＶＡＮＣ遺伝子配列中に導入した終止コドンを表す。【００６２】
図７に示す４種のベクターを、それぞれ、野生型のシロイヌナズナに、花にアグロバクテリウムを感染させるフローラルディップ法により導入し、４系統の形質転換体を作製した。前記４系統の種子をカナマイシン培地に播種後１日４℃で保存した後、２２℃長日条件で１２日間栽培し、根長を測定した。その結果を各系統１０個体ずつの箱ひげ図として図８に示した。【００６３】
図８に示すように、ＶＡＮＣ遺伝子が機能する系統（Ｈｉｕｎ＿ＶＡＮＢ２１Δ：ＮＰＴＩＩ）では、いずれのカナマイシン濃度でも根の伸長は阻害されなかった。一方、ＶＡＮＣ遺伝子が機能しない系統（Ｈｉｕｎ＿ＶＡＮＢ２１Δ：ＮＰＴＩＩ＿ＶＡＮＣ２１−ｅｎｄｏ１．１及びＨｉｕｎ＿ＶＡＮＢ２１Δ：ＮＰＴＩＩ＿ＶＡＮＣ２１−ｅｎｄｏ２）では、５０ｍｇ／ｍＬ以上のカナマイシン濃度で根の伸長が阻害された。この結果は、機能的なＶＡＮＣタンパク質の存在が、ＮＰＴＩＩの安定的な発現に寄与したことを示している。すなわち、ＮＰＴＩＩとともに導入された周辺領域に存在する標的ポリヌクレオチドに、ＶＡＮＣタンパク質が集積し、ＮＯＳプロモーターのメチル化が抑制されることにより、ＮＰＴＩＩが安定に発現したものと考えられる。【００６４】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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