(57)【要約】  下記式（１）（式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。）で表される化合物を有効成分として含有する、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌用抗癌剤。    【化１】2018230556.tif 000016
2018230556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌用抗癌剤。
【化１】
2018230556.tif 000009
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【請求項２】
請求項１に記載の抗癌剤と薬学的に許容できる担体とを含有する、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌用医薬組成物。
【請求項３】
下記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、
前記癌由来の細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の存在量を測定することを含み、
測定されたサイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多いことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
【化２】
2018230556.tif 000010
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【請求項４】
下記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、
前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、
前記細胞における核内から細胞質内へのサイクリンＤ１タンパク質の移行を測定することと、を含み、
サイクリンＤ１タンパク質が核内から細胞質内へ移行したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
【化３】
2018230556.tif 000011
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【請求項５】
下記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、
前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、
前記細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の核内存在量を測定することと、を含み、
サイクリンＤ１タンパク質の核内存在量が減少したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
【化４】
2018230556.tif 000012
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【請求項６】
下記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、
前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、
前記細胞におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量を測定することと、を含み、
リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量が減少したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
【化５】
2018230556.tif 000013
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【請求項７】
サイクリンＤ１タンパク質に対する特異的結合物質を含む、下記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測するためのキット。
【化６】
2018230556.tif 000014
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【請求項８】
リン酸化Ａｋｔタンパク質に対する特異的結合物質を含む、下記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測するためのキット。
【化７】
2018230556.tif 000015
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌剤及びその使用に関する。より具体的には、抗癌剤、３−Ｏ−（２’Ｅ，４’Ｚ−ｄｅｃａｄｉｅｎｏｙｌ）−２０−Ｏ−ａｃｅｔｙｌｉｎｇｅｎｏｌ（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール）又はその誘導体の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法及びキットに関する。本願は、２０１７年６月１２日に、日本に出願された特願２０１７−１１５３８８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの合成及び修復にはトポイソメラーゼが必要である。トポイソメラーゼはＤＮＡのよじれを解消する酵素であり、ＤＮＡの一本鎖又は二本鎖を切断し、ＤＮＡの複製で生じるよじれを解消する。【０００３】
トポイソメラーゼは、ＤＮＡの切断が一本鎖であるトポイソメラーゼＩと、ＤＮＡの切断が二本鎖であるトポイソメラーゼＩＩとに分類される。【０００４】
トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼの活性を阻害する化合物である。トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡの切断段階でトポイソメラーゼの活性を阻害するＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤と、ＤＮＡ切断段階以外の段階でトポイソメラーゼの活性を阻害する酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤とに分類される。【０００５】
癌細胞は盛んにＤＮＡ合成を行っているため、トポイソメラーゼ阻害剤が抗癌剤として利用されている。ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ損傷監視機構（ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）により癌細胞のアポトーシスを誘導する。一方、酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡよじれ解消監視機構（ｄｅｃａｔｅｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）により細胞分裂阻害を誘導する。現在、抗癌剤に用いられているトポイソメラーゼ阻害剤はＤＮＡ切断型である。【０００６】
ところで、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、トウダイグサ科の多年草であるカンスイ（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ  ｋａｎｓｕｉ）から抽出されるジテルペン類である。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、トポイソメラーゼ阻害剤であり、ＤＮＡ切断を起こさないこと、ニワトリＢ細胞由来ＤＴ４０細胞の細胞増殖をＧ２／Ｍ期で停止させたことが報告されている（例えば、非特許文献１を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yasuaki Fukuda, et al., 3EZ, 20Ac-ingenol, a catalytic inhibitor of topoisomerases, downregulates p-Akt and induces DSBs and apoptosis of DT40 cells, Arch. Pharm. Res., 36, 1029-1038, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤が抗癌剤として働く作用機構は、ＤＮＡ損傷により誘導される監視機構を利用したものであり、多くの副作用の原因となっている。例えば、ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤処理により発生するＤＮＡ切断は、２〜３年後に二次癌を発生させる場合がある。【０００９】
また、トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ合成が速い細胞にアポトーシスを誘導させる傾向にある。このため、増殖が速い正常な骨髄造血幹細胞、未分化細胞が減少し、骨髄抑制、白血球減少等が発生する場合がある。【００１０】
また、心臓ではトポイソメラーゼＩＩ活性が高いことが知られている。このため、トポイソメラーゼＩＩを阻害するトポイソメラーゼ阻害剤を投与すると、心臓でアポトーシスを起こす細胞が多く発生し、心臓障害が発生する場合がある。【００１１】
一方、従来の酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤は、細胞増殖阻害活性が低く（ＩＣ５０＝５〜５０μＭ）、細胞周期停止後に多核細胞が発生する場合があり、また、これらの多核細胞が二次癌を発生させる場合がある。【００１２】
このような背景のもと、二次癌の発生等の副作用が低減された抗癌剤が求められている。そこで、本発明は、ＤＮＡ切断を起こさずに、特定の癌に特異的に作用する抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は以下の態様を含む。
［１］下記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌用抗癌剤。
【化１】
2018230556.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
［２］［１］に記載の抗癌剤と薬学的に許容できる担体とを含有する、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌用医薬組成物。
［３］上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記癌由来の細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の存在量を測定することを含み、測定されたサイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多いことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
［４］上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、前記細胞における核内から細胞質内へのサイクリンＤ１タンパク質の移行を測定することと、を含み、サイクリンＤ１タンパク質が核内から細胞質内へ移行したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
［５］上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、前記細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の核内存在量を測定することと、を含み、サイクリンＤ１タンパク質の核内存在量が減少したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
［６］上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、前記細胞におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質の核内存在量を測定することと、を含み、リン酸化Ａｋｔタンパク質の核内存在量が減少したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す、方法。
［７］サイクリンＤ１タンパク質に対する特異的結合物質を含む、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測するためのキット。
［８］リン酸化Ａｋｔタンパク質に対する特異的結合物質を含む、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測するためのキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＤＮＡ切断を起こさずに、特定の癌に特異的に作用する抗癌剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実験例１におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図２】実験例２におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）〜（ｅ）は、実験例３におけるフローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
【図４】実験例４においてアポトーシスの誘導を測定した結果を示すグラフである。
【図５】実験例５においてアポトーシスの誘導を測定した結果を示すグラフである。
【図６】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例７におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図８】（ａ）〜（ｄ）は、実験例８におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図９】（ａ）及び（ｂ）は、実験例９におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１０】実験例１０におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図１１】実験例１１におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１２】実験例１２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１３】（ａ）〜（ｆ）は、実験例１３におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１４におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１５】（ａ）〜（ｆ）は、実験例１５におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１６】実験例１６におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１７】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１６におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１８】実験例１７におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１９】実験例１８におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２０】実験例１９におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２１】（ａ）〜（ｆ）は、実験例２０におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２１におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例２２におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２４】実験例２３におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図２５】実験例２４におけるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［抗癌剤］
１実施形態において、本発明は、下記式（１）で表される化合物を有効成分として含有する、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌用抗癌剤を提供する。本実施形態の抗癌剤は、サイクリンＤ１タンパク質の核内存在量が対照よりも多い癌用であってもよい。
【化２】
2018230556.tif 000004
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【００１７】
式（１）において、脂肪族基は、本実施形態の抗癌剤の効果が得られる限り特に限定されず、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、飽和していてもよく、不飽和であってもよく、置換されていてもよく、未置換であってもよい。また、脂肪族基の炭素数は、例えば１〜２０であってもよく、例えば１〜１６であってもよい。脂肪族基の置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、エーテル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基等が挙げられる。
【００１８】
式（１）において、式ＲＣＯ−で表される基のうち、Ｒが脂肪族基であるものとしては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、２，３−ジメチルブタン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸等の炭素原子数１〜１６の飽和脂肪酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基；２，４−デカジエン酸等の炭素原子数１〜１６の不飽和脂肪酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基等が挙げられる。
【００１９】
また、式（１）において、芳香族基及びヘテロ芳香族基は、置換されていてもよく、未置換であってもよい。また、芳香族基及びヘテロ芳香族基の炭素数は、例えば１〜８であってもよく、例えば１〜６であってもよい。芳香族基及びヘテロ芳香族基の置換基としては、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、エーテル基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基等が挙げられる。
【００２０】
式（１）において、式ＲＣＯ−で表される基のうち、Ｒが芳香族基であるものとしては、安息香酸、フタル酸、サリチル酸、アントラニル酸等の芳香族カルボン酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基等が挙げられる。
【００２１】
また、式（１）において、式ＲＣＯ−で表される基のうち、Ｒがヘテロ芳香族基であるものとしては、フランカルボン酸、チオフェンカルボン酸、ピリジンカルボン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸等のヘテロ芳香族カルボン酸のカルボキシル基から水酸基を除いた基等が挙げられる。
【００２２】
上記式（１）で表される化合物は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９が水素原子であり、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１がメチル基であり、Ｒ１が下記式（２）若しくは（３）で表される基又は水素原子であり、Ｒ４がアセチル基であってもよい。下記式（２）及び（３）において、Ｒ１２は炭素数１〜１０のアルキル基を表す。
【００２３】
【化３】
2018230556.tif 000005
【００２４】
上記式（１）で表される化合物は、下記式（４）で表される３−Ｏ−（２’Ｅ，４’Ｚ−ｄｅｃａｄｉｅｎｏｙｌ）−２０−Ｏ−ａｃｅｔｙｌｉｎｇｅｎｏｌ（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール）であってもよく、下記式（５）で表される３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノールであってもよく、下記式（６）で表される２０Ａｃ−インゲノールであってもよい。
【００２５】
【化４】
2018230556.tif 000006
【００２６】
実施例において後述するように、発明者らは、上記式（１）で表される化合物を、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌細胞に投与すると、アポトーシスを誘導することを明らかにした。したがって、本実施形態の抗癌剤は、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌の治療に利用することができる。
【００２７】
実施例において後述するように、上記式（１）で表される化合物を、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌細胞に投与すると、Ｈ２ＡＸのリン酸化が上昇し、またｐ２１の発現が上昇し、ＤＮＡ損傷反応が増強される。その結果、ＡＴＭ／ＡＴＲが活性化し、ｐ５３がリン酸化されて安定化され、アポトーシスが誘導される。更に、ＰＴＥＮの発現が上昇しｐ−Ａｋｔが抑制され、ＧＳＫ−３βが活性化され、サイクリンＤ１が分解されて増殖阻害が起こり、アポトーシスが誘導される。
【００２８】
本明細書において、治療対象とする癌としては、ヒトの癌又は非ヒト動物の癌が挙げられるが、ヒトの癌であることが好ましい。また、癌は血液癌、固形癌等であってよい。
【００２９】
サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多いとは、対照細胞と比較して、細胞内におけるサイクリンＤ１タンパク質の存在量が多いことを意味する。ここで、対照としては、正常細胞が挙げられる。正常細胞は、正常な血液細胞、正常な組織由来の細胞等であってよい。正常細胞はサイクリンＤ１を過剰発現しない。すなわち、上記式（１）で表される化合物は、対照細胞と比較して、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が多い癌細胞に有効な抗癌剤である。あるいは、上記式（１）で表される化合物は、対照細胞と比較して、サイクリンＤ１タンパク質の核内存在量が多い癌細胞に有効な抗癌剤であるということもできる。あるいは、上記式（１）で表される化合物は、対照細胞と比較してサイクリンＤ１遺伝子の発現量が高い癌細胞に有効な抗癌剤であるということもできる。
【００３０】
非特許文献１に記載されているように、上記式（１）で表される化合物は、ＤＮＡ切断を起こさないことが明らかにされている。したがって、本実施形態の抗癌剤は、ＤＮＡ切断を起こさず、長期間使用しても二次癌の発生を起こしにくい。
【００３１】
また、従来のトポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡ合成が速い細胞にアポトーシスを誘導させる傾向にあり、ヒト又は非ヒト動物に投与すると、増殖が速い正常な骨髄造血幹細胞、未分化細胞が減少し、骨髄抑制、白血球減少等が発生する場合がある。
【００３２】
これに対し、上記式（１）で表される化合物は、酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤であり、ＤＮＡ切断を起こさず、ＤＮＡよじれ解消監視機構を誘導するものと考えられる。そして、幹細胞、未分化細胞等ではＤＮＡよじれ解消監視機構が欠損していることが知られている。したがって、本実施形態の抗癌剤は、正常細胞、サイクリンＤ１の過剰発現のなく、ＤＮＡよじれ解消監視機構が欠損している幹細胞、未分化細胞等のアポトーシスを誘導せず、ヒト又は非ヒト動物に投与しても、骨髄抑制、白血球減少が発生しにくい。
【００３３】
また、上記式（１）で表される化合物は、心臓で活性が高いトポイソメラーゼＩＩではなく、トポイソメラーゼＩを主な標的とする。したがって、本実施形態の抗癌剤は、ヒト又は非ヒト動物に投与した場合においても、心臓への副作用が少ない。
【００３４】
以上のことから、本実施形態の抗癌剤は、増殖が速い正常細胞であっても、サイクリンＤ１の過剰発現がなければアポトーシスは誘導されず、副作用が少ない抗癌剤として有用である。本実施形態の抗癌剤が治療対象とする癌としては、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌が挙げられる。また、サイクリンＤ１が顆粒膜細胞成分を含む細胞質画分に存在している場合にも有用である。あるいは、本実施形態の抗癌剤が治療対象とする癌は、対照細胞と比較してサイクリンＤ１遺伝子の発現量が高い癌であるということもできる。
【００３５】
これらの癌において、サイクリンＤ１タンパク質の細胞内存在量が正常細胞よりも増加する原因は様々である。例えば、染色体の転座が原因でサイクリンＤ１タンパク質の核内存在量が増加する場合もある。また、Ｗｎｔβカテニン遺伝子の突然変異、Ｋ−ｒａｓの突然変異、カテニン／ＡＰＣ系遺伝子の変異からサイクリンＤ１が過剰発現される場合もある。本実施形態の抗癌剤は、サイクリンＤ１タンパク質の細胞内存在量が増加する原因に関わらず、これらの癌のアポトーシスを誘導することができる。
【００３６】
サイクリンＤ１の過剰発現の原因は、癌遺伝子、癌抑制遺伝子を含む情報伝達系遺伝子の変異によりＰＩ３Ｋ／Ａｋｔが活性化されたためにサイクリンＤ１の分解（サイクリンＤ１の細胞質への移行）が阻害され、細胞内にサイクリンＤ１が蓄積される場合もある。このような癌は、Ａｋｔタンパク質のリン酸化が上昇した癌（リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞内濃度が上昇した癌）であり、本実施形態の抗癌剤はこのような癌にも有効である。
【００３７】
本実施形態の抗癌剤が治療対象とする癌は、更に、ＰＩ３（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ３−ｋｉｎａｓｅ）キナーゼ／Ａｋｔ経路が活性化し、Ａｋｔタンパク質のリン酸化が上昇した（リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞内濃度が上昇した）癌であることが好ましい。実施例において後述するように、本実施形態の抗癌剤は、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多く、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞内濃度が上昇した癌に特に有効である。
【００３８】
本実施形態の抗癌剤が治療対象とするより具体的な癌としては、マントル細胞リンパ腫、膵臓癌、脳腫瘍、脳下垂体腫瘍、食道癌、乳癌等が挙げられる。これらの癌では、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が正常細胞よりも増加している場合がある。
【００３９】
これらの癌において、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が正常細胞よりも増加する原因は様々である。例えば、染色体の転座が原因でサイクリンＤ１タンパク質の存在量が増加する場合もあるし、癌化により増殖シグナルが活性化された結果、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が増加する場合もある。本実施形態の抗癌剤は、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が増加する原因に関わらず、これらの癌のアポトーシスを誘導することができる。
【００４０】
［医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、上述した抗癌剤と薬学的に許容できる担体とを含有する、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌に対する医薬組成物を提供する。
【００４１】
医薬組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。
【００４２】
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。
【００４３】
医薬組成物は添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤；界面活性剤；乳化剤；等が挙げられる。
【００４４】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００４５】
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００４６】
化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇであると考えられる。
【００４７】
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えられる。
【００４８】
［上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記癌由来の細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の存在量を測定することを含み、測定されたサイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多いことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す方法を提供する。
【００４９】
本実施形態の方法において、サイクリンＤ１タンパク質の存在量の測定方法は特に限定されず、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、免疫組織染色等により測定することができる。後述するように、細胞質内のサイクリンＤ１はプロテアソームにより速やかに分解される。したがって、サイクリンＤ１遺伝子の発現量が高い細胞は、サイクリンＤ１タンパク質の核内存在量が高いといえる。
【００５０】
また、本実施形態の方法において、対照としては、上述したものと同様であり、正常細胞等が挙げられる。
【００５１】
また、治療対象とする癌由来の細胞としては、例えば生検試料由来の血液細胞、外科手術により摘出した癌組織由来の細胞等を用いることができる。
【００５２】
本実施形態の方法によれば、治療対象とする癌由来の細胞のサイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い場合に、上記式（１）で表される化合物の投与が治療に有効であると判断することができる。
【００５３】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、前記細胞における核内から細胞質内へのサイクリンＤ１タンパク質の移行を測定することと、を含み、サイクリンＤ１タンパク質が核内から細胞質内へ移行したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す方法を提供する。
【００５４】
実施例において後述するように、上記式（１）で表される化合物の投与により、細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導が認められた癌細胞では、上記式（１）で表される化合物の投与により、核内に存在していたサイクリンＤ１が細胞質内に移行したことが観察された。
【００５５】
したがって、治療対象とする癌由来の細胞を上記式（１）で表される化合物の存在下で培養した結果、サイクリンＤ１が核内から細胞質内に移行した場合には、当該癌の治療に上記式（１）で表される化合物の投与が有効であると判断することができる。
【００５６】
第２実施形態の方法において、細胞の培地に添加する上記式（１）で表される化合物の濃度は終濃度０．５〜１０μＭ程度であってよい。また、細胞の核内から細胞質内へのサイクリンＤ１の移行は、上記式（１）で表される化合物の投与後、例えば、２４〜４８時間程度の間に確認することができる。
【００５７】
また、核内から細胞質内へのサイクリンＤ１の移行は、細胞を核画分と細胞質画分に分画して、抗サイクリンＤ１抗体を用いたウエスタンブロッティングを行うこと等により確認することができる。あるいは、細胞を固定し、抗サイクリンＤ１抗体を用いて免疫染色することにより、サイクリンＤ１の細胞内局在を確認してもよい。
【００５８】
《第２実施形態の変形例》
第２実施形態の方法において、サイクリンＤ１が細胞の核内から細胞質内へ移行すると、核内のサイクリンＤ１の存在量が減少する。したがって、核内のサイクリンＤ１の存在量が減少することを指標として、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測することもできる。
【００５９】
また、サイクリンＤ１が細胞の核内から細胞質内へ移行すると、細胞質内のサイクリンＤ１の存在量が増加する。したがって、細胞質内のサイクリンＤ１の存在量が増加することを指標として、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測することもできる。しかしながら、細胞質内のサイクリンＤ１はプロテアソームにより分解されるため、細胞質内のサイクリンＤ１の存在量の増加は一時的である。
【００６０】
すなわち、サイクリンＤ１タンパク質は核内から細胞質に移行し、更に細胞質内で分解される。したがって、細胞質内のサイクリンＤ１の存在量が一時的に増加し、更に減少することを指標として、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測することもできる。
【００６１】
（第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する方法であって、前記化合物の存在下で前記癌由来の細胞を培養することと、前記細胞におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量を測定することと、を含み、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量が減少したことが、前記化合物の投与が前記癌の治療に有効であることを示す方法を提供する。
【００６２】
リン酸化Ａｋｔタンパク質とは、活性化されたＡｋｔタンパク質のことである。リン酸化Ａｋｔタンパク質としては、Ａｋｔタンパク質の第４７３番目のセリン残基がリン酸化されたＡｋｔタンパク質が挙げられる。細胞質内又は核内に存在するリン酸化Ａｋｔタンパク質は、サイクリンＤ１の分解反応をコントロールする。
【００６３】
実施例において後述するように、上記式（１）で表される化合物の投与により、細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導が認められた癌細胞では、上記式（１）で表される化合物の投与により、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内における存在量が顕著に減少した。
【００６４】
したがって、治療対象とする癌由来の細胞を上記式（１）で表される化合物の存在下で培養した結果、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内における存在量が減少した場合には、当該癌の治療に上記式（１）で表される化合物の投与が有効であると判断することができる。
【００６５】
第３実施形態の方法において、細胞の培地に添加する上記式（１）で表される化合物の濃度は終濃度０．５〜１０μＭ程度であってよい。また、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内における存在量の減少は、上記式（１）で表される化合物の投与後、例えば、２４〜４８時間程度の間に確認することができる。
【００６６】
また、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量の減少は、細胞を核画分と細胞質画分に分画して、抗ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体を用いたウエスタンブロッティングを行うこと等により確認することができる。あるいは、細胞を固定し、抗ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体を用いて免疫染色することにより、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量を確認してもよい。
【００６７】
［キット］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、サイクリンＤ１タンパク質に対する特異的結合物質を含む、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測するためのキットを提供する。
【００６８】
本実施形態のキットにより、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する、上述した第２実施形態の方法を実施することができる。
【００６９】
ここで、サイクリンＤ１タンパク質は、治療対象とする動物種のサイクリンＤ１であることが好ましい。治療対象とする癌がヒトの癌である場合には、ヒトのサイクリンＤ１タンパク質であることが好ましい。
【００７０】
特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に標的物質又はその断片を抗原として免疫することによって作製することができる。あるいは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体であってもよい。
【００７１】
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的物質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的物質に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００７２】
本実施形態のキットは、上記式（１）で表される化合物を更に備えていてもよい。また、本実施形態のキットは、後述する、リン酸化Ａｋｔタンパク質に対する特異的結合物質を更に備えていてもよい。
【００７３】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、リン酸化Ａｋｔタンパク質に対する特異的結合物質を含む、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測するためのキットを提供する。
【００７４】
本実施形態のキットにより、上記式（１）で表される化合物の投与が癌の治療に有効であるか否かを予測する、上述した第３実施形態の方法を実施することができる。リン酸化Ａｋｔタンパク質とは、活性化されたＡｋｔタンパク質のことである。リン酸化Ａｋｔタンパク質としては、Ａｋｔタンパク質の第４７３番目のセリン残基がリン酸化されたＡｋｔタンパク質が挙げられる。
【００７５】
ここで、リン酸化Ａｋｔタンパク質は、治療対象とする動物種のリン酸化Ａｋｔタンパク質であることが好ましい。治療対象とする癌がヒトの癌である場合には、ヒトのリン酸化Ａｋｔタンパク質であることが好ましい。
【００７６】
第２実施形態のキットにおいて、特異的結合物質としては、上述したものと同様であり、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。また、第２実施形態のキットは、上記式（１）で表される化合物を更に備えていてもよい。また、第２実施形態のキットは、上述したサイクリンＤ１タンパク質に対する特異的結合物質を更に備えていてもよい。
【００７７】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の癌細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の存在量を測定することと、測定されたサイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い場合に、前記癌患者に下記式（１）で表される化合物の有効量を投与することと、を含む、癌の治療方法を提供する。
【００７８】
【化５】
2018230556.tif 000007
［式（１）中、Ｒ１〜Ｒ１１は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜３０の脂肪族基又は式ＲＣＯ−（ここで、Ｒは、炭素数１〜３０の脂肪族基又は炭素数１〜１０の芳香族基若しくはヘテロ芳香族基を表す。）で表される基を表す。］
【００７９】
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の癌細胞を上記式（１）で表される化合物の存在下で培養することと、前記細胞における核内から細胞質内へのサイクリンＤ１タンパク質の移行を測定することと、サイクリンＤ１タンパク質が核内から細胞質内へ移行した場合に、前記癌患者に上記式（１）で表される化合物の有効量を投与することと、を含む、癌の治療方法を提供する。
【００８０】
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の癌細胞を上記式（１）で表される化合物の存在下で培養することと、前記細胞におけるサイクリンＤ１タンパク質の核内存在量を測定することと、サイクリンＤ１タンパク質の核内存在量が減少した場合に、前記癌患者に上記式（１）で表される化合物の有効量を投与することと、を含む、癌の治療方法を提供する。
【００８１】
１実施形態において、本発明は、癌患者由来の癌細胞を上記式（１）で表される化合物の存在下で培養することと、前記細胞におけるリン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量を測定することと、リン酸化Ａｋｔタンパク質の細胞質内又は核内存在量が減少した場合に、前記癌患者に上記式（１）で表される化合物の有効量を投与することと、を含む、癌の治療方法を提供する。
【００８２】
上記各実施形態の治療方法において、細胞の培地に添加する上記式（１）で表される化合物の濃度は終濃度０．５〜１０μＭ程度であってよい。また、細胞の核内から細胞質内へのサイクリンＤ１の移行、サイクリンＤ１タンパク質の核内存在量の減少、リン酸化Ａｋｔタンパク質の核内存在量が減少は、上記式（１）で表される化合物の存在下で細胞培養を開始した後、例えば、２４〜４８時間程度の間に確認することができる。また、対照としては、上述したものと同様であり、正常細胞等が挙げられる。
【００８３】
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌の治療方法を提供する。
【００８４】
１実施形態において、本発明は、上記式（１）で表される化合物の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、サイクリンＤ１遺伝子の発現量が対照よりも多い癌の治療方法を提供する。
【００８５】
１実施形態において、本発明は、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌の治療のための、上記式（１）で表される化合物を提供する。
【００８６】
１実施形態において、本発明は、サイクリンＤ１遺伝子の発現量が対照よりも多い癌の治療のための、上記式（１）で表される化合物を提供する。
【００８７】
１実施形態において、本発明は、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が対照よりも多い癌の治療薬を製造するための、上記式（１）で表される化合物の使用を提供する。
【００８８】
１実施形態において、本発明は、サイクリンＤ１遺伝子の発現量が対照よりも多い癌の治療薬を製造するための、上記式（１）で表される化合物の使用を提供する。
【００８９】
これらの各実施形態において、上記式（１）で表される化合物は、薬学的に許容される担体を含む組成物の形態であってもよい。薬学的に許容される担体としては、上述したものが挙げられる。
【００９０】
また、これらの各実施形態において、対照としては、上述したものと同様であり、正常細胞等が挙げられる。
【実施例】
【００９１】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。【００９２】
［実験例１］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はＢＡＬＬ−１細胞の増殖を抑制した）
ヒトマントル細胞リンパ腫由来の細胞株であるＢＡＬＬ−１細胞、ヒト骨髄性白血病細胞株ＴＫＧ０２１０細胞及びヒトＴ細胞急性白血病細胞株ＴＫＧ０３７７細胞を、２．５×１０４個／ウェル／１００μＬずつ９６ウェルプレートに播種し、終濃度０（対照）、０．５、１、５、１０μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養した。続いて、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（ロシュ  アプライド  サイエンス社）を用いたＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を検討した。【００９３】
図１は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、０〜１０μＭの範囲で濃度依存的に各癌細胞株の生存率を減少させたことが明らかとなった。【００９４】
特に、ＢＡＬＬ−１細胞は、１〜１０μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養した結果、７０〜７５％が死滅したことが明らかとなった。また、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞は、１〜１０μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養した結果、５〜２０％が死滅したことが明らかとなった。【００９５】
［実験例２］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の増殖を抑制した）
ヒトマントル細胞リンパ腫由来の細胞株であるＪｅＫｏ−１細胞を、１×１０４個／ウェル／１００μＬずつ９６ウェルプレートに播種した。また、ヒト膵臓癌由来細胞株であるＰａｎｃ−１細胞を、３×１０３個／ウェル／１００μＬずつ９６ウェルプレートに播種した。【００９６】
続いて、各細胞のウェルに、終濃度０（対照）、０．１、０．５、１、５、１０μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを添加し、４８時間培養した。続いて、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（ロシュ  アプライド  サイエンス社）を用いたＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を検討した。【００９７】
図２は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、０〜１０μＭの範囲で濃度依存的にＪｅＫｏ−１細胞及びＰａｎｃ−１細胞の増殖を抑制したことが明らかとなった。【００９８】
より詳細には、ＪｅＫｏ−１細胞を１〜１０μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養すると、ほとんど生育した細胞がなくなる程度の増殖阻害が認められた。また、Ｐａｎｃ−１細胞を１〜１０μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養すると、２０〜３０％しか生存していない程度に増殖阻害が認められた。【００９９】
［実験例３］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理は細胞増殖をＳ期で停止させた）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールによる癌細胞の増殖の阻害が、細胞周期の停止によるものか否かを検討した。【０１００】
具体的には、ＢＡＬＬ−１細胞を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで６、１２、２４及び４８時間処理した後、フローサイトメトリーを用いて細胞周期を解析した。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理を行わなかった細胞を対照とした。【０１０１】
図３（ａ）〜（ｅ）はフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。なお、本解析においては生細胞にゲートをかけた。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、Ｓ期の細胞の割合が、６時間後で６８％に、１２時間後及び２４時間後で７５％に増加したことが明らかとなった。一方、対照の細胞では、Ｓ期の細胞の割合が５３％に留まっていた。【０１０２】
また、Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合は、１２時間後及び２４時間の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、約３％に減少したことが明らかとなった。一方、対照の細胞では、Ｇ２／Ｍ期の細胞の割合は約９％であった。【０１０３】
同様に、Ｇ１期の細胞の割合は、２４時間の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、約１９％に減少したことが明らかとなった。一方、対照の細胞では、Ｇ１期の細胞の割合は約３８％であった。また、４８時間後の各細胞周期の細胞の割合は算出することができなかった。【０１０４】
以上の結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールで処理により、ＢＡＬＬ−１細胞の細胞増殖がＳ期で停止したことを示す。【０１０５】
［実験例４］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はＢＡＬＬ−１細胞のアポトーシスを誘導した）
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ロシュ  アプライド  サイエンス社）を用いて、細胞質におけるヒストン結合ＤＮＡ断片化を検出することにより、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によるアポトーシスの誘導を検討した。【０１０６】
具体的には、ＢＡＬＬ−１細胞、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞を、５×１０４個／ウェル／２００μＬずつチューブに入れ、終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、６、１２、２４、４８、７２時間インキュベートした。続いて、各細胞を溶解バッファーで溶解した。続いて、各細胞の細胞破砕物の上清を集めてＥＬＩＳＡプレートに移し、波長４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、アポトーシスの誘導を測定した。【０１０７】
図４は、アポトーシスの誘導を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＢＡＬＬ−１細胞を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で７２時間インキュベートすることにより、断片化したＤＮＡが顕著に増加したことが明らかとなった。一方、終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で７２時間インキュベートしても、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞では、断片化したＤＮＡはほとんど検出されなかった。【０１０８】
以上の結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＢＡＬＬ−１細胞のアポトーシスが誘導されることを示す。【０１０９】
［実験例５］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理はＰａｎｃ−１細胞のアポトーシスを誘導した）
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ロシュ  アプライド  サイエンス社）を用いて、細胞質におけるヒストン結合ＤＮＡ断片化を検出することにより、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によるアポトーシスの誘導を検討した。【０１１０】
具体的には、Ｐａｎｃ−１細胞を、５×１０３個／ウェル／１００μＬずつチューブに入れ、終濃度３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、６、１２、２４、４８、７２時間インキュベートした。続いて、各細胞を溶解バッファーで溶解した。続いて、各細胞の細胞破砕物の上清を集めてＥＬＩＳＡプレートに移し、波長４０５ｎｍの吸光度を測定することにより、アポトーシスの誘導を測定した。【０１１１】
図５は、アポトーシスの誘導を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｐａｎｃ−１細胞を終濃度３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下でインキュベートすると、２４時間後にＤＮＡの断片化が開始し、４８時間後、７２時間後に断片化したＤＮＡが更に増加したことが明らかとなった。【０１１２】
以上の結果は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、Ｐａｎｃ−１細胞のアポトーシスが誘導されることを示す。【０１１３】
［実験例６］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によるアポトーシスの誘導はカスパーゼ３の活性化を伴う）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＪｅＫｏ−１細胞及びＰａｎｃ−１細胞でアポトーシスが誘導されることを、カスパーゼ３の活性化反応を検出することにより確認した。【０１１４】
具体的には、ＪｅＫｏ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。続いて、各細胞におけるカスパーゼ３の活性化を、抗活性化カスパーゼ抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより検出した。また、ローディングコントロールとして、抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。【０１１５】
図６（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図６（ａ）はＪｅＫｏ−１細胞の結果を示し、図６（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞の結果を示す。その結果、ＪｅＫｏ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理４８時間後にカスパーゼ３の活性化が観察された。一方、Ｐａｎｃ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後からカスパーゼ３の活性化が観察された。【０１１６】
［実験例７］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によるＨ２ＡＸのリン酸化及びｐ２１タンパク質の発現の検討）
ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤の投与により、細胞内でＤＮＡ損傷反応が誘導され、Ｈ２ＡＸのリン酸化が起きることはよく知られている。また、サイクリンＤ１タンパク質の存在量が多い細胞では、ＤＮＡ損傷に際し、Ｈ２ＡＸのリン酸化の上昇、ｐ２１タンパク質の発現増加、及びカスパーゼ３の活性化が認められ、この性質で、サイクリンＤ１タンパク質の細胞内存在量の多いＢＡＬＬ−１細胞、Ｊｅｋｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞でも３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により特異的増殖阻害からアポトーシスを誘導している可能性がある。【０１１７】
発明者らは、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼ阻害剤と同様に、一本鎖ＤＮＡ合成阻害によるＳ期合成阻害が誘導されることを明らかにした。このことから、サイクリンＤ１の存在量が多い細胞では、ＤＮＡ切断を起こさない３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＤＮＡ切断マーカーであるリン酸化Ｈ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）の存在量が増加し、ＤＮＡ損傷反応と同様な応答を誘導し、増殖阻害からアポトーシスを誘導しているのではないかと考えた。【０１１８】
そこで、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理による、Ｈ２ＡＸのリン酸化及びｐ２１タンパク質の発現量の変化をウエスタンブロッティングにより検討した。【０１１９】
具体的には、ＪｅＫｏ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。【０１２０】
続いて、各細胞におけるＨ２ＡＸのリン酸化を抗リン酸化Ｈ２ＡＸ抗体（ミリポア社）を用いて検出した。また、ｐ２１タンパク質を抗ｐ２１抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を用いて検出した。また、ローディングコントロールとして、抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。【０１２１】
図７（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図７（ａ）はＪｅＫｏ−１細胞の結果を示し、図７（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞の結果を示す。図７（ａ）及び（ｂ）中、「γＨ２ＡＸ」はリン酸化Ｈ２ＡＸの存在を検出した結果であることを表し、「ｐ２１」はｐ２１タンパク質の存在を検出した結果であることを表す。【０１２２】
その結果、ＪｅＫｏ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後にＨ２ＡＸのリン酸化が検出され、ＤＮＡ損傷反応が誘導されたことが確認された。一方、Ｐａｎｃ−１細胞ではＨ２ＡＸのリン酸化は検出されなかった。しかしながら、Ｐａｎｃ−１細胞においては、ＤＮＡ損傷反応後に、細胞増殖阻害又はアポトーシスのいずれを進行させるかを選択することが知られる、ｐ２１タンパク質の強い発現誘導が観察された。【０１２３】
後述するように、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞はサイクリンＤ１タンパク質の存在量が多い細胞であることが明らかとなった。このため、ＤＮＡ切断を起こさない３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの投与により、ＪｅＫｏ−１細胞ではＨ２ＡＸのリン酸化の上昇が起こり、Ｐａｎｃ−１細胞では３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後にｐ２１タンパク質の発現の増加を確認することができた。また、上述したように、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後にカスパーゼ３の活性化が認められた。すなわち、ｐ２１タンパク質の発現と同時期にカスパーゼ３の活性化も起こっていることが確認できた。その後、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理４８時間後にｐ２１タンパク質の急激な減少が認められた。【０１２４】
この結果から、抗癌剤に耐性を示す膵臓癌由来細胞であるＰａｎｃ−１細胞を３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理することにより、ｐ２１タンパク質の発現によるカスパーゼ３活性化が生じることが明らかとなった。また、活性化されたカスパーゼ３がｐ２１タンパク質を分解し、アポトーシス誘導の方向に働いたものと考えられた。これが、ＤＮＡ切断を起こさない３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの投与がＤＮＡ損傷反応を誘導し、細胞の増殖阻害及びアポトーシス誘導を起こす機構である。【０１２５】
また、正常細胞では、サイクリンＤ１タンパク質が過剰に存在するということがないため、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを投与しても増殖阻害やアポトーシス誘導を起こすことがない。【０１２６】
［実験例８］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によるＡＴＲ及びｐ５３タンパク質の発現の検討）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、従来の分類ではＤＮＡ切断損傷による損傷監視機構を発生しない化合物である。しかしながら、上述した実験例の結果から、ＢＡＬＬ−１細胞、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によりアポトーシスが誘導されることが明らかとなった。そこで、ＤＮＡ損傷反応により誘導される情報伝達に関するタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検討した。【０１２７】
具体的には、ＪｅＫｏ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。【０１２８】
続いて、各細胞におけるＡＴＲタンパク質、ｐ５３タンパク質、リン酸化ｐ５３（以下、「ｐ−ｐ５３」という場合がある。）タンパク質を、それぞれ抗ＡＴＲ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）、抗ｐ５３抗体（サンタクルーズ社）、抗ｐ−ｐ５３抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を用いて検出した。また、ローディングコントロールとして、抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。【０１２９】
図８（ａ）〜（ｄ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図８（ａ）はＪｅＫｏ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図８（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図８（ｃ）はＰａｎｃ−１細胞（核画分）の結果を示し、図８（ｄ）はＰａｎｃ−１細胞（細胞質画分）の結果を示す。【０１３０】
その結果、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞のいずれにおいても、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後にＡＴＲタンパク質の発現量の増加が認められ、２４時間後に更に増加が認められ、４８時間後には減少が認められた。【０１３１】
また、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞のいずれにおいても、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後にｐ５３タンパク質の発現量の増加が認められ、４８時間後まで発現量の増加が認められた。【０１３２】
また、ＪｅＫｏ−１細胞ではｐ５３のリン酸化が確認されなかったが、Ｐａｎｃ−１細胞では３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後にｐ５３のリン酸化が観察された。また、図８（ｃ）及び（ｄ）の結果から、Ｐａｎｃ−１細胞の核画分及び細胞質画分のいずれにおいてもリン酸化ｐ５３タンパク質が増加したことが明らかとなった。【０１３３】
以上の結果から、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＤＮＡ損傷反応が増強され、ＡＴＲタンパク質の発現が誘導され、ｐ５３タンパク質の細胞内濃度の上昇が認められたことが明らかとなった。更に、Ｐａｎｃ−１細胞ではｐ５３のリン酸化が起こり、強いアポトーシス誘導が生じたものと考えられた。【０１３４】
したがって、抗癌剤に耐性を示す膵臓癌由来細胞であるＰａｎｃ−１細胞を３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理することにより、上述した、ｐ２１タンパク質の発現によるカスパーゼ３活性化によるアポトーシス誘導だけでなく、ＡＴＲタンパク質によるｐ５３の活性化によるアポトーシス誘導も生じることが明らかとなった。【０１３５】
［実験例９］
（ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡの検討）
ＡＴＲの発現に対する３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理の影響を検討した。まず、ＢＡＬＬ−１細胞を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で１２、２４及び４８時間培養し、抗ＡＴＲ抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより、ＡＴＲタンパク質の発現量を解析した。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を対照に用いた。【０１３６】
図９（ａ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＢＡＬＬ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理の開始後１２時間からＡＴＲの発現が上昇し、４８時間後まで継続したことが明らかとなった。【０１３７】
続いて、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＡＴＲ（５４５）  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を終濃度５０ｎＭでＢＡＬＬ−１細胞に導入し、４８時間インキュベートした。続いて、細胞の培地を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを含む新しい培地に交換して１２、２４及び４８時間培養し、抗ＡＴＲ抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより、ＡＴＲタンパク質の発現量を解析した。【０１３８】
対照ｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を導入し、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を対照に用いた。【０１３９】
図９（ｂ）はｓｉＲＮＡの存在下におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡを導入したＢＡＬＬ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理を行っても、ＡＴＲの発現上昇が認められないことが確認された。【０１４０】
［実験例１０］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理による細胞増殖阻害におけるＡＴＲの影響の検討）
ＡＴＲ活性が細胞増殖阻害に与える影響を検討した。実験例９と同様にしてＢＡＬＬ−１細胞にＡＴＲに対するｓｉＲＮＡを導入し、４８時間インキュベートした。続いて、細胞の培地を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを含む培地に交換し、４８時間培養した。【０１４１】
比較のために、ｓｉＲＮＡを導入せず、終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを含む培地で４８時間培養したＢＡＬＬ−１細胞を用いた。また、対照として、対照ｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を導入し、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を用いた。【０１４２】
図１０は、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を測定した結果を示すグラフである。その結果、ＡＴＲのノックダウンにより、細胞増殖阻害が約２０％減少したことが明らかとなった。【０１４３】
この結果から、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールによる細胞増殖阻害がＡＴＲ依存性であることが明らかとなった。【０１４４】
［実験例１１］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＡｋｔタンパク質のリン酸化に与える影響の検討）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路に与える影響を検討した。具体的には、ＢＡＬＬ−１細胞、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞を、終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養し、抗ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を用いたウエスタンブロッティングにより、全細胞、核、細胞質の各画分におけるＡｋｔタンパク質の４７３番目のセリン残基のリン酸化を解析した。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を対照に用いた。【０１４５】
図１１は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＢＡＬＬ−１細胞の全細胞破砕物（レーン４）及びＴＫＧ０２１０細胞の全細胞破砕物（レーン５）において、リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（以下、「ｐ−Ａｋｔ」という場合がある。）の減少が認められた。【０１４６】
また、ＢＡＬＬ−１細胞の全細胞破砕物におけるｐ−Ａｋｔの減少はわずかであったが、ＢＡＬＬ−１細胞の核画分におけるｐ−Ａｋｔは顕著に減少したことが明らかとなった（レーン４）。これに対し、ＴＫＧ０２１０細胞の核画分におけるｐ−Ａｋｔの存在量は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理を行ってもほとんど変化しなかった。また、ＴＫＧ０３７７細胞の核画分におけるｐ−Ａｋｔの存在量は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により増加したことが明らかとなった。【０１４７】
また、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞の細胞質画分におけるｐ−Ａｋｔの存在量は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理を行ってもほとんど変化しなかった。これに対し、ＢＡＬＬ−１細胞の細胞質画分におけるｐ−Ａｋｔの存在量は、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によりわずかに減少した。【０１４８】
［実験例１２］
（ＢＡＬＬ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＰＴＥＮ、ｐ−ＰＴＥＮ及びｐ−Ａｋｔに与える影響の検討）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＢＡＬＬ−１細胞のＰＴＥＮ、ｐ−ＰＴＥＮ及びｐ−Ａｋｔに与える影響を検討した。まず、ＢＡＬＬ−１細胞を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で３、６、１２、２４、４８時間培養し、抗ＰＴＥＮ抗体（サンタクルーズ社）、抗ｐ−ＰＴＥＮ（Ｓｅｒ３８０／Ｔｈｒ３８２／３８３）抗体（サンタクルーズ社）、及び抗ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を用いたウエスタンブロッティングにより、全細胞画分におけるＰＴＥＮ、ｐ−ＰＴＥＮ及びｐ−Ａｋｔの存在量を解析した。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を対照に用いた。【０１４９】
図１２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＰＴＥＮの存在量の上昇が観察された。また、ｐ−ＰＴＥＮの存在量もＰＴＥＮの存在量の上昇に伴って上昇した。その結果、ｐ−Ａｋｔの存在量の下方制御が観察された。【０１５０】
［実験例１３］
（ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＰＴＥＮに与える影響の検討）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞におけるＰＴＥＮの発現に与える影響を検討した。【０１５１】
具体的には、まず、ＪｅＫｏ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。【０１５２】
続いて、抗ＰＴＥＮ抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞の、全細胞画分、核画分、細胞質画分におけるＰＴＥＮタンパク質の存在量を解析した。また、ローディングコントロールとして、抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。【０１５３】
図１３（ａ）〜（ｆ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１３（ａ）はＪｅＫｏ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図１３（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図１３（ｃ）はＪｅＫｏ−１細胞（核画分）の結果を示し、図１３（ｄ）はＪｅＫｏ−１細胞（細胞質画分）の結果を示し、図１３（ｅ）はＰａｎｃ−１細胞（核画分）の結果を示し、図１３（ｆ）はＰａｎｃ−１細胞（細胞質画分）の結果を示す。【０１５４】
その結果、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞のいずれにおいても、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後から全細胞画分でＰＴＥＮタンパク質の存在量が上昇し、４８時間後まで高い発現が観察された。また、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞のいずれにおいても、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後〜２４時間後に核画分におけるＰＴＥＮタンパク質の存在量の上昇が観察された。また、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞のいずれにおいても、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後〜２４時間後に細胞質画分におけるＰＴＥＮタンパク質の存在量の上昇が観察されたが、４８時間後にはＰＴＥＮタンパク質の存在量の低下が観察された。【０１５５】
細胞質のＰＴＥＮはｐ−Ａｋｔを抑制してアポトーシスの誘導に作用し、核内のＰＴＥＮはＥＲＫ、サイクリンＤ１のリン酸化を抑制し、細胞増殖の阻害に作用することが知られている。以上の結果から、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により上昇したＰＴＥＮタンパク質は、アポトーシスの誘導及び細胞増殖の阻害の双方に作用していることが明らかとなった。【０１５６】
［実験例１４］
（ＢＡＬＬ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がｐ−Ａｋｔに与える影響の検討）
ＢＡＬＬ−１細胞、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で２４、４８時間培養し、ウエスタンブロッティングにより、核画分及び細胞質画分におけるｐ−Ａｋｔの存在量を解析した。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した各細胞を対照に用いた。【０１５７】
図１４（ａ）はＢＡＬＬ−１細胞のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＢＡＬＬ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理４８時間後の細胞質画分において、ｐ−Ａｋｔのわずかな減少が観察された。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理２４時間後の核画分において、ｐ−Ａｋｔの中程度の減少が観察され、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理４８時間後の核画分において、ｐ−Ａｋｔの更なる減少が観察された。【０１５８】
一方、図１４（ｂ）はＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞のウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＢＡＬＬ−１細胞の結果とは異なり、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞の細胞質画分、核画分では、ｐ−Ａｋｔの減少が観察されなかった。【０１５９】
［実験例１５］
（ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がｐ−Ａｋｔに与える影響の検討）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞におけるｐ−Ａｋｔに与える影響を検討した。【０１６０】
具体的には、まず、ＪｅＫｏ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。【０１６１】
続いて、抗Ａｋｔ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）及び抗ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞の、全細胞画分、核画分、細胞質画分における全Ａｋｔタンパク質及びｐ−Ａｋｔの存在量を解析した。また、ローディングコントロールとして、抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。【０１６２】
図１５（ａ）〜（ｆ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１５（ａ）はＪｅＫｏ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図１５（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図１５（ｃ）はＪｅＫｏ−１細胞（核画分）の結果を示し、図１５（ｄ）はＪｅＫｏ−１細胞（細胞質画分）の結果を示し、図１５（ｅ）はＰａｎｃ−１細胞（核画分）の結果を示し、図１５（ｆ）はＰａｎｃ−１細胞（細胞質画分）の結果を示す。【０１６３】
その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＪｅＫｏ−１細胞の全細胞画分ではｐ−Ａｋｔのわずかな減少が観察され、全Ａｋｔにはほとんど変化が認められなかった。また、Ｐａｎｃ−１細胞の全細胞画分では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後及び２４時間後に、ｐ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ双方の一時的な上昇が認められたが、４８時間後には再び減少が観察された。また、ＪｅＫｏ−１細胞の核画分では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理を行ってもｐ−Ａｋｔの変化が認められなかった。一方、ＪｅＫｏ−１細胞の細胞質画分では３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２〜４８時間後にｐ−Ａｋｔの明らかな減少が認められた。また、Ｐａｎｃ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２〜２４時間後に核画分、細胞質画分共に、ｐ−Ａｋｔ、全Ａｋｔ双方の増加が認められたが、４８時間後には減少が観察された。【０１６４】
［実験例１６］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＰＴＥＮ及びｐ−Ａｋｔに与える影響の検討）
ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを用いて、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＰＴＥＮ及びｐ−Ａｋｔに与える影響を検討した。まず、ＢＡＬＬ−１細胞を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で１２、２４及び４８時間培養し、実験例１１と同様のウエスタンブロッティングにより、ｐ−Ａｋｔの存在量を解析した。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を対照に用いた。【０１６５】
図１６はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＢＡＬＬ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理の開始後２４時間でＢＡＬＬ−１細胞におけるｐ−Ａｋｔの存在量が減少したことが明らかとなった。【０１６６】
続いて、ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＰＴＥＮ（５７２８）  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を終濃度５０ｎＭでＢＡＬＬ−１細胞に導入し、４８時間インキュベートした。続いて、細胞の培地を新しい培地に交換し、終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下又は非存在下で１２、２４及び４８時間培養し、抗ＰＴＥＮ抗体（サンタクルーズ社）及び抗ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を用いたウエスタンブロッティングにより、ＰＴＥＮタンパク質及びｐ−Ａｋｔの存在量を解析した。【０１６７】
また、対照ｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）を導入し、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を対照に用いた。【０１６８】
図１７（ａ）及び（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１７（ａ）は、ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入し、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞の結果である。また、図１７（ｂ）は、ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入し、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で培養した細胞の結果である。【０１６９】
ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、図１７（ａ）に示すように、ＢＡＬＬ−１細胞にＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入し、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞では、１２時間培養後以降にＰＴＥＮの発現の減少が観察された。この結果は、ｓｉＲＮＡの導入によりＰＴＥＮの発現が効果的に抑制されたことを示す。【０１７０】
また、図１７（ａ）に示すように、ｓｉＲＮＡの導入によりＰＴＥＮの発現が抑制されたＢＡＬＬ−１細胞では、ｐ−Ａｋｔの存在量が顕著に増加した。この結果は、ＰＴＥＮがＢＡＬＬ−１細胞におけるｐ−Ａｋｔの脱リン酸化を行っていることを示す。【０１７１】
一方、図１７（ｂ）に示すように、ＢＡＬＬ−１細胞にＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入し、終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で培養した細胞では、１２時間培養後にＰＴＥＮの発現の上昇が観察され、２４時間及び４８時間培養後にＰＴＥＮの発現は更に上昇した。【０１７２】
また、図１７（ｂ）に示すように、ｓｉＲＮＡの導入によりＰＴＥＮの発現を抑制し、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理を行ったＢＡＬＬ−１細胞では、１２時間後にｐ−Ａｋｔの存在量の上昇が観察された。しかしながら、２４時間後及び４８時間後にはｐ−Ａｋｔの存在量の減少が観察された。【０１７３】
以上の結果から、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは、ＰＴＥＮを上方制御することによりｐ−Ａｋｔの存在量を下方制御することが明らかとなった。【０１７４】
［実験例１７］
（ＢＡＬＬ−１細胞、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞におけるサイクリンＤ１の発現の検討）
ＢＡＬＬ−１細胞、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞におけるサイクリンＤ１の発現を検討した。具体的には、抗サイクリンＤ１抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞の全細胞画分におけるサイクリンＤ１の存在量を解析した。【０１７５】
図１８は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＢＡＬＬ−１細胞がサイクリンＤ１を過剰発現していることが明らかとなった。一方、ＴＫＧ０２１０細胞及びＴＫＧ０３７７細胞では、サイクリンＤ１の発現は認められなかった。【０１７６】
［実験例１８］
（ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞におけるサイクリンＤ１の発現の検討）
ＪｅＫｏ−１細胞及びＰａｎｃ−１細胞におけるサイクリンＤ１の発現を検討した。具体的には、抗サイクリンＤ１抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞の全細胞画分におけるサイクリンＤ１の存在量を解析した。【０１７７】
図１９は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、ＪｅＫｏ−１細胞ではサイクリンＤ１が過大に過剰発現しており、、Ｐａｎｃ−１細胞においてもサイクリンＤ１が過剰発現していることが明らかとなった。【０１７８】
［実験例１９］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＢＡＬＬ−１細胞におけるサイクリンＤ１の発現に与える影響の検討）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＢＡＬＬ−１細胞におけるサイクリンＤ１の発現に与える影響を検討した。【０１７９】
具体的には、ＢＡＬＬ−１細胞を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で１２、２４、４８時間培養し、ウエスタンブロッティングにより、核画分及び細胞質画分におけるサイクリンＤ１の存在量を解析した。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの非存在下で培養した細胞を対照に用いた。【０１８０】
図２０はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。その結果、対照のＢＡＬＬ−１細胞の核画分には、大量のサイクリンＤ１が存在していることが明らかとなった。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理２４時間後の核画分において、サイクリンＤ１の減少が観察された。【０１８１】
一方、対照のＢＡＬＬ−１細胞の細胞質画分には、サイクリンＤ１はわずかしか存在していないことが明らかとなった。更に、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後及び２４時間後に、細胞質画分におけるサイクリンＤ１の存在量が増加し、４８時間後に再び減少したことが明らかとなった。【０１８２】
この結果は、ＢＡＬＬ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、核に存在していたサイクリンＤ１が細胞質に移行し、細胞質で分解されたことを示す。【０１８３】
［実験例２０］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞におけるサイクリンＤ１の発現に与える影響の検討）
３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＪｅＫｏ−１細胞及びＰａｎｃ−１細胞におけるサイクリンＤ１の発現に与える影響を検討した。【０１８４】
具体的には、まず、ＪｅＫｏ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。【０１８５】
続いて、ウエスタンブロッティングにより、各細胞の、全細胞画分、核画分、細胞質画分におけるサイクリンＤ１の存在量を解析した。【０１８６】
図２１（ａ）〜（ｆ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図２１（ａ）はＪｅＫｏ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図２１（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図２１（ｃ）はＪｅＫｏ−１細胞（核画分）の結果を示し、図２１（ｄ）はＪｅＫｏ−１細胞（細胞質画分）の結果を示し、図２１（ｅ）はＰａｎｃ−１細胞（核画分）の結果を示し、図２１（ｆ）はＰａｎｃ−１細胞（細胞質画分）の結果を示す。【０１８７】
その結果、ＪｅＫｏ−１細胞の全細胞画分では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２〜４８時間後にサイクリンＤ１の発現量の減少が観察された。また、Ｐａｎｃ−１細胞の全細胞画分では３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２〜２４時間後に一時的にサイクリンＤ１の発現量が増加し、その後減少することが明らかとなった。【０１８８】
また、ＪｅＫｏ−１細胞の核画分では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２〜４８時間後にサイクリンＤ１の発現量のわずかな減少が観察された。また、対照のＪｅＫｏ−１細胞の細胞質画分では、サイクリンＤ１の存在は検出されなかったが、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２〜４８時間後にサイクリンＤ１の存在量の増加が認められ、その後減少が認められた。【０１８９】
また、Ｐａｎｃ−１細胞の核画分では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後に一時的にサイクリンＤ１の発現量が増加し、２４時間後から減少したことが観察された。また、対照のＰａｎｃ−１細胞の細胞質画分では、サイクリンＤ１が多く検出されたが、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２〜４８時間後にサイクリンＤ１の存在量が減少していくことが明らかとなった。【０１９０】
ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞のいずれにおいても、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、最終的には、核画分及び細胞質画分の双方において、サイクリンＤ１の存在量が減少又は消失することが明らかとなった。【０１９１】
以上の結果から、ｐ−Ａｋｔの減少に伴いＧＳＫ−３βが活性化されて核のサイクリンＤ１をリン酸化した結果、サイクリンＤ１が核から細胞質に移行し、細胞質でプロテアソームにより分解されたと考えられた。マントル細胞リンパ腫及び膵臓癌由来の細胞株は、いずれも、サイクリンＤ１遺伝子のノックダウンにより、増殖阻害及び細胞死が誘導されることが知られている。このため、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞においても、サイクリンＤ１の減少が増殖阻害及び細胞死に影響しているものと考えられた。【０１９２】
［実験例２１］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理がＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞におけるＧＳＫ−３βの活性化に与える影響の検討）【０１９３】
上述したように、ＪｅＫｏ−１細胞及びＰａｎｃ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によりｐ−Ａｋｔが抑制されることが明らかとなった。そこで、ｐ−Ａｋｔの下流で、サイクリンＤ１の分解反応の上流に位置する、サイクリンＤ１を核から細胞質に移行させるＧＳＫ−３βの活性化について検討した。【０１９４】
具体的には、まず、ＪｅＫｏ−１細胞を０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を３μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で、０（対照）、１２、２４及び４８時間培養した。【０１９５】
続いて、抗ＧＳＫ−３β抗体（セルシグナリングテクノロジー社）及び抗ｐ−ＧＳＫ−３β（Ｓｅｒ９）抗体（セルシグナリングテクノロジー社）を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞におけるＧＳＫ−３β及びｐ−ＧＳＫ−３βの存在量を解析した。また、ローディングコントロールとして、抗アクチン抗体（シグマ社）を用いてアクチンタンパク質を検出した。【０１９６】
図２２（ａ）及び（ｂ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図２２（ａ）はＪｅＫｏ−１細胞（全細胞）の結果を示し、図２２（ｂ）はＰａｎｃ−１細胞（全細胞）の結果を示す。【０１９７】
その結果、ＪｅＫｏ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理２４時間後からＧＳＫ−３βの増加が観察された。また、Ｐａｎｃ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理１２時間後からＧＳＫ−３βの増加が観察された。そして、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の双方において、ｐ−ＧＳＫ−３β（不活性型）の減少が観察され、ＧＳＫ−３β（活性型）の増加が観察された。【０１９８】
以上の結果から、ＢＡＬＬ−１細胞、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＰＴＥＮが活性化され、その結果ｐ−Ａｋｔが抑制され、その結果ＧＳＫ−３βが活性化され、その結果サイクリンＤ１をリン酸化し、サイクリンＤ１を核から細胞質に移行させ、サイクリンＤ１が分解されていることが明らかとなった。【０１９９】
また、Ｐａｎｃ−１細胞では、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理後、一時的にサイクリンＤ１レベルの増加が観察された。これは、Ｐａｎｃ−１細胞の核内にサイクリンＤ１が存在しているため、ＤＮＡ複製因子が分解されずに残り、サイクリンＤ１が再複製に利用され、ＤＮＡ損傷反応の増強が発生していることを示す。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理によるＤＮＡ損傷反応の誘導では、この再複製の間サイクリンＤ１が利用されているため、一時的に増加しているように観察されたものと考えられた。一方、ｐ−ＧＳＫ−３βの減少とＧＳＫ−３βの上昇は時間の経過とともに一貫して観察された。【０２００】
以上示したように、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、一時的なｐ−Ａｋｔの増加が誘導された。ｐ−Ａｋｔとｐ−ＧＳＫ−３β（不活性型）の増加は他の化合物の投与によるＤＮＡ損傷でも観察されている。ｐ−Ａｋｔが抑制されるためには、ＤＮＡ損傷反応の誘導においてｐ−Ａｋｔ抑制に働く、上流のＰＴＥＮの活性化が必要である。しかしながら、その発現調節とｐ−Ａｋｔ抑制機構には不明な点が多い。そのため、ＤＮＡ損傷反応において、ＰＴＥＮレベルが増加するという報告、減少するという報告、変化なしとの報告があり、またＰＴＥＮが上昇してもｐ−Ａｋｔが抑制されない場合も報告されている。【０２０１】
従来、酵素阻害型トポイソメラーゼ阻害剤の投与によりＰＴＥＮが増加するという報告はなく、またｐ−Ａｋｔを抑制するという報告もない。したがって、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＰＴＥＮが上昇しｐ−Ａｋｔは最終的には（４８時間後）減少するか、消滅するという本実験例の結果は、発明者らが初めて明らかにしたものである。また、サイクリンＤ１の分解に働くＧＳＫ−３βは連続的な活性化が観察された。【０２０２】
［実験例２２］
（ＡＴＲ及びＰＴＥＮのノックダウンがサイクリンＤ１の分解に与える影響の検討）
ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡ及びＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを用いて、サイクリンＤ１の核から細胞質への移行がＡＴＲ及びＰＴＥＮ依存的であるか否かを検討した。まず、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＡＴＲ（５４５）  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）、ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｈｕｍａｎ  ＰＴＥＮ（５７２８）  ｓｉＲＮＡ−ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）、及び対照ｓｉＲＮＡ（「ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ  Ｐｌｕｓ  Ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｏｌ」、ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）をそれぞれ終濃度５０ｎＭでＢＡＬＬ−１細胞に導入し、４８時間インキュベートした。【０２０３】
続いて、細胞の培地を終濃度０．５μＭの３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールを含む新しい培地に交換して２４及び４８時間培養した。続いて、抗サイクリンＤ１抗体（サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロッティングにより、核画分及び細胞質画分におけるサイクリンＤ１の存在量を解析した。【０２０４】
図２３（ａ）は、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡを導入したＢＡＬＬ−１細胞のウエスタンブロッティングによりサイクリンＤ１の存在を検出した結果である。また、図２３（ｂ）は、ＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入したＢＡＬＬ−１細胞のウエスタンブロッティングによりサイクリンＤ１の存在を検出した結果である。ローディングコントロールとしてアクチンタンパク質を検出した。【０２０５】
その結果、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡを導入し３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で２４及び４８時間培養した細胞、及びＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入し３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で２４及び４８時間培養した細胞の核画分においては、サイクリンＤ１の存在量が多いことが明らかとなった。【０２０６】
これに対し、対照細胞の細胞質画分ではサイクリンＤ１の存在量が少なく、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡを導入し３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で２４時間培養した細胞、及びＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入し３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で２４時間培養した細胞では細胞質画分におけるサイクリンＤ１の存在量が増加し、ＡＴＲに対するｓｉＲＮＡを導入し３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養した細胞、及びＰＴＥＮに対するｓｉＲＮＡを導入し３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下で４８時間培養した細胞では再び細胞質画分におけるサイクリンＤ１の存在量が少なくなったことが明らかとなった。【０２０７】
以上の結果から、ＡＴＲ又はＰＴＥＮをノックダウンするとサイクリンＤ１の核から細胞質への移行が阻害されることが明らかとなった。したがって、サイクリンＤ１の核から細胞質への移行はＡＴＲ及びＰＴＥＮ依存的であることが明らかとなった。また、細胞質におけるサイクリンＤ１の分解には、ＡＴＲ又はＰＴＥＮの影響はないものと考えられる。【０２０８】
［実験例２３］
（イリノテカンがＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の増殖に与える影響の検討）
ＤＮＡ切断型トポイソメラーゼＩ阻害剤であり、現在臨床で利用されているイリノテカンが、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞の増殖に与える影響を検討した。【０２０９】
まず、ＪｅＫｏ−１細胞を、１×１０４個／ウェル／１００μＬずつ９６ウェルプレートに播種した。続いて、細胞のウェルに、終濃度０（対照）、０．５、１、５、１０、２０、３０μＭのイリノテカンを添加し、４８時間培養した。また、Ｐａｎｃ−１細胞を、３×１０３個／ウェル／１００μＬずつ９６ウェルプレートに播種した。続いて、細胞のウェルに、終濃度０（対照）、０．５、１、５、１０、２０、３０、５０μＭのイリノテカンを添加し、４８時間培養した。続いて、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（ロシュ  アプライド  サイエンス社）を用いたＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を検討した。【０２１０】
図２４は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。その結果、ＪｅＫｏ−１細胞を１〜２０μＭのイリノテカンの存在下で培養すると、ほとんど生育した細胞がなくなる程度の増殖阻害が認められた。しかしながら、増殖阻害の程度は３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理よりも低かった。一方、Ｐａｎｃ−１細胞は０．５〜５０μＭのイリノテカンの存在下で抵抗性を示し、完全な増殖阻害は確認されなかった。増殖阻害の程度は３０〜３５％程度であった。【０２１１】
実験例２の結果から、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールのＪｅＫｏ−１細胞に対するＩＣ５０は０．５μＭであると算出された。また、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールのＰａｎｃ−１細胞に対するＩＣ５０は３μＭであると算出された。これに対し、本実験例の結果から、イリノテカンのＪｅＫｏ−１細胞に対するＩＣ５０は５μＭであると算出された。また、Ｐａｎｃ−１細胞はイリノテカンに対して抵抗性を示した。【０２１２】
細胞におけるサイクリンＤ１の異常な存在は、化学療法的抗癌剤、放射線療法に対する抗癌作用に抵抗性を示し、予後不良の原因とされている。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールはこのような性質をもった癌に特異的に作用し、その原因であるサイクリンＤ１を減少又は消滅させることができた。このことにより、Ｐａｎｃ−１細胞でも３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理に対し、抵抗性を示すこともなく増殖阻害及びアポトーシスを誘導したものと思われる。【０２１３】
また、サイクリンＤ１の細胞質における異常な存在は、癌の浸潤、転移にも関係していることが報告されている。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール処理により、ＪｅＫｏ−１細胞、Ｐａｎｃ−１細胞ともに細胞質でもＰＴＥＮレベルの上昇が確認され、サイクリンＤ１の減少も観察することができた。【０２１４】
イリノテカンは一種のプロドラッグであり、肝カルボキシルエステラーゼ等により、活性代謝物ＳＮ−３８に変換されて機能する。カルボキシルエステラーゼの活性には個人差があるが、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールは代謝を受けて活性化されるものではなく、臨床的に有用であると考えられる。【０２１５】
［実験例２４］
（３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノールに類似する化合物の検討）
ＢＡＬＬ−１細胞に、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール、３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノール、２０Ａｃ−インゲノール及びインゲノールを０．０１、０．０５、０．１、０．５、１μＭの濃度で４８時間暴露した後、ＭＴＴアッセイにより細胞の増殖を検討した。対照として薬剤に暴露しなかった細胞を用いた。３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール、３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノール、２０Ａｃ−インゲノールの化学式は上述した通りである。下記式（７）にインゲノールの化学式を示す。【０２１６】
【化６】
2018230556.tif 000008
【０２１７】
図２５は結果を示すグラフである。その結果、３ＥＺ，２０Ａｃ−インゲノール及び３ＥＥ，２０Ａｃ−インゲノールの存在下において、ＢＡＬＬ−１細胞の顕著な増殖抑制が認められた。また、２０Ａｃ−インゲノールの存在下においても、ＢＡＬＬ−１細胞の増殖抑制が認められた。一方、インゲノールはＢＡＬＬ−１細胞の増殖にあまり影響を及ぼさなかった。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
本発明によれば、ＤＮＡ切断を起こさずに、特定の癌に特異的に作用する抗癌剤を提供することができる。
【図１】
2018230556.tif 000017
【図２】
2018230556.tif 000018
【図３】
2018230556.tif 000019
【図４】
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【図５】
2018230556.tif 000021
【図６】
2018230556.tif 000022
【図７】
2018230556.tif 000023
【図８】
2018230556.tif 000024
【図９】
2018230556.tif 000025
【図１０】
2018230556.tif 000026
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2018230556.tif 000029
【図１４】
2018230556.tif 000030
【図１５】
2018230556.tif 000031
【図１６】
2018230556.tif 000032
【図１７】
2018230556.tif 000033
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2018230556.tif 000036
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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2018230556.tif 000043
2018230556.tif 000044
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