(57)【要約】  細胞を利用せず、簡易にマイコプラズマを集菌する方法の提供。  検体に、蛋白質、好ましくはさらに水不溶性担体を添加し、得られた凝集体を回収することによる、マイコプラズマの集菌方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に、蛋白質を添加し、得られた凝集体を回収することを特徴とする、検体中のマイコプラズマの集菌方法。
【請求項２】
蛋白質が、アルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質およびゼラチンからなる群より選択される１以上である請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルブミンが、動物血清アルブミンである請求項２記載の方法。
【請求項４】
蛋白質の使用量が検体１ｍＬに対して０．１〜５００ｍｇである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
検体が、滅菌水、生理食塩水、液体培地、生体試料、培養上清、緩衝液およびリンゲル液からなる群より選択される液体検体である請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
マイコプラズマが、アコレプラズマ・レイドロウィ、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・オリニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・シノビエ、マイコプラズマ・ガリセプチカムおよびスピロプラズマ・シトリからなる群より選択される１以上である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
回収手段が３，０００〜３０，０００Ｇで１分間〜６０分間の遠心分離である請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載の方法によって集菌されたマイコプラズマをポリメラーゼ連鎖反応に付すことを特徴とする、マイコプラズマの測定方法。
【請求項９】
検体に、さらに水不溶性担体を添加する請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
水不溶性担体が、ラテックス粒子、シリカ粒子または金コロイド粒子である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ラテックス粒子が、有機高分子ラテックス粒子である請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ラテックス粒子の粒子径が、１０〜２，０００ｎｍである請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１３】
水不溶性担体の使用量が検体１ｍＬに対して０．０００５〜１０ｍｇである請求項９〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
蛋白質を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法に使用されるキット。
【請求項１５】
さらに水不溶性担体を含む、請求項９〜１３のいずれか１項記載の方法に使用されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を利用しない、マイコプラズマ集菌方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマとは、モリキューティス網に属する、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、スピロプラズマ属、アコレプラズマ属等の細菌をいう。マイコプラズマは、自己増殖能を持つ最小の微生物で、細菌の１０分の１ほどの大きさ（３００〜１０００ｎｍ）である（非特許文献１）。マイコプラズマは、真核細胞の細胞表面に結合し、培養細胞を汚染する微生物として知られており、医薬品の製造においてマイコプラズマ汚染は、重大な問題となる。【０００３】
特に再生医療分野では、被検体から採取した細胞を培養し、培養後の細胞を被検体自身に戻す、または第三者の生体内に移す治療を行うことから、これに用いる培地の無菌性を担保することは不可欠である。この際使用される培地には、事前に熱を加えるオートクレーブ滅菌またはフィルター滅菌が一般的に実施されているが、熱に弱い成分を含有する細胞を培養するための培地の場合は、２００ｎｍ径などのフィルターを用いて滅菌することが一般的である。しかし、マイコプラズマは、その小ささと細胞壁を欠くことから、かなりの柔軟性を有しており、殆どの細胞が４５０ｎｍ径のフィルターを通過し、１００〜２００ｎｍ径のフィルターさえも通過するため、これらのフィルター滅菌ではマイコプラズマを完全に排除できない（非特許文献２）ことがある。そのため、フィルター滅菌はマイコプラズマを除去するには必ずしも十分とはいえず、マイコプラズマが滅菌後の被検体に存在しないことを検証する別の方法が求められている。【０００４】
そこで、日本薬局方参考情報では、バイオ医薬品の製造に用いる細胞機材について、適切な方法でマイコプラズマ否定試験を実施することが推奨されている。そのマイコプラズマの存在を否定するための方法とは、培養法、指標細胞を用いたＤＮＡ染色法、核酸増幅法の３つの検出法が挙げられる（非特許文献３）。特に、核酸増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による検出法として収載されている。本マイコプラズマ否定試験を実施する際に、マイコプラズマが細胞に付着して増殖することを利用して、マイコプラズマが感染している可能性がある培養上清から、アフリカミドリザルの腎臓上皮細胞由来のベロ細胞を共沈剤として用いて、マイコプラズマを集める方法が報告されている（非特許文献４）。この際、ベロ細胞を添加しないと、マイコプラズマの集菌がうまくいかないことが報告されており、細胞に限らず菌体を共沈させるものを添加して、マイコプラズマの回収率を上げることができる可能性が報告されている。また、マイコプラズマ汚染は、細胞懸濁液を検体とすることを前提としているが、貴重な培養細胞を利用することができない場合もあり、培養上清から遊離しているマイコプラズマを検出する方法も検討されている。細胞培養時に上清に遊離してくるマイコプラズマは、通常５％未満であることから、マイコプラズマの存在を否定するための試験を行うにあたり大量の培養上清の濃縮物を測定に供することで、検出感度を高めることが報告されている（非特許文献５）。【０００５】
細胞を簡便かつ高効率に収集する方法としては、細胞表面の糖に結合するＭＤＰ１という蛋白質を凝集促進剤として用いることが知られており、遠心分離を行うことなく細胞を沈殿させることができることが知られている。加えて、固体支持体を加える方法が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−１０４２５０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】小原有弘他、ＴＩＳＳＵＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ、第２６巻、Ｐ１５９−１６３（２００７）
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂ．Ｗｈｉｔｍａｎ、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ＳＥＣＯＮＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｆｏｕｒ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｐ５７５
【非特許文献３】第十七改正日本薬局方参考情報
【非特許文献４】菊池裕、厚生労働科学研究費補助金（医薬品等規制緩和・評価研究事業）平成２６年度分担研究報告書、ウイルス等感染性因子安全性評価に関する研究  無菌試験法の研究−細胞・組織加工製品における無菌試験方法のあり方について−、Ｐ２５５−２７２
【非特許文献５】内田恵理子他、バイオサイエンスとインダストリー、Ｖｏｌ．３３、Ｎｏ．９、Ｐ４−１４（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記のマイコプラズマ否定試験として核酸増殖法を実施するにあたり、従来知られている、共沈剤として細胞を用いたマイコプラズマの集菌方法では、検体となる培養液にマイコプラズマが存在するか否かを確認するために、対象となる培養液の試験日に合わせて細胞を調製する必要がある。さらに、使用する細胞および培養液中にマイコプラズマ（や他の細菌）が混入していないことを事前に確認する必要がある。この調製および確認はきわめて煩雑であり、試験を簡便に行うことを妨げるものである。共沈剤としてベロ細胞を用いることも知られているが、その場合にはベロ細胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、その他の蛋白質が混入することになり、マイコプラズマ集菌後に実施する核酸増幅反応の障害となる可能性がある。
したがって、本発明の課題は、共沈剤として細胞を使用することなく、簡便な手段により、検体中のマイコプラズマを確実に集菌する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる実情に鑑み、本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、検体に蛋白質、好ましくはさらに水不溶性担体を検体中に加えれば、マイコプラズマが確実に凝集体として集菌できることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１５］を提供するものである。
［１］  検体に、蛋白質を添加し、得られた凝集体を回収することを特徴とする、検体中のマイコプラズマの集菌方法。
［２］  蛋白質が、アルブミン、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質およびゼラチンからなる群より選択される１以上である前項［１］記載の方法。
［３］  アルブミンが、動物血清アルブミンである前項［２］記載の方法。
［４］  蛋白質の使用量が検体１ｍＬに対して０．１〜５００ｍｇである前項［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法。
［５］  検体が、滅菌水、生理食塩水、液体培地、生体試料、培養上清、緩衝液およびリンゲル液からなる群より選択される液体検体である前項［１］〜［４］のいずれか１項記載の方法。
［６］  マイコプラズマが、アコレプラズマ・レイドロウィ、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・オリニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・サリバリウム、マイコプラズマ・シノビエ、マイコプラズマ・ガリセプチカムおよびスピロプラズマ・シトリからなる群より選択される１以上である前項［１］〜［５］のいずれか１項記載の方法。
［７］  回収手段が３，０００〜３０，０００Ｇで１分間〜６０分間の遠心分離である前項［１］〜［６］のいずれか１項記載の方法。
［８］  前項［１］〜［７］のいずれか１項記載の方法によって集菌されたマイコプラズマをポリメラーゼ連鎖反応に付すことを特徴とする、マイコプラズマの測定方法。
［９］  検体に、さらに水不溶性担体を添加する前項［１］〜［８］のいずれか１項記載の方法。
［１０］  水不溶性担体が、ラテックス粒子、シリカ粒子または金コロイド粒子である前項［９］記載の方法。
［１１］  ラテックス粒子が、有機高分子ラテックス粒子である前項［１０］記載の方法。
［１２］  ラテックス粒子の粒子径が、１０〜２，０００ｎｍである前項［１０］又は［１１］記載の方法。
［１３］  水不溶性担体の使用量が検体１ｍＬに対して０．０００５〜１０ｍｇである前項［９］〜［１２］のいずれか１項記載の方法。
［１４］  蛋白質を含む、前項［１］〜［８］のいずれか１項記載の方法に使用されるキット。
［１５］  さらに水不溶性担体を含む、前項［９］〜［１３］のいずれか１項記載の方法に使用されるキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法は、従来知られている、細胞を共沈剤として用いる方法に比して、マイコプラズマの集菌効率が極めて高いことが確認された。また、本発明の方法では検査日に合わせて細胞を調製する必要がないうえに、細胞および培地中にマイコプラズマが混入していないことを確認する必要がないため、利便性が高い。さらに、ラテックス粒子等の水不溶性担体を用いることにより、分離後の凝集体が拡散しにくくなると同時に目視で確認しやすくなることで、マイコプラズマ集菌後の培地除去が容易となる。加えて、細胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、その他の蛋白質が混入することがなくなるため、マイコプラズマ集菌後の核酸増幅反応操作が容易となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について好ましい形態を中心に具体的に説明する。なお、本発明はこれら実施態様に何ら制約されるものではない。
【００１３】
本発明において、「マイコプラズマの集菌」とは、検体中に含まれるマイコプラズマを分離・濃縮することである。マイコプラズマを集菌することによって、その後に行われるマイコプラズマ検出試験を容易に行うことができる。
【００１４】
本明細書中でマイコプラズマとは、一般に呼称されるマイコプラズマを指し、学術名ではマイコプラズマタレス目に属する微生物群を指し、さらに具体的には第十七改定日本薬局方参考情報に従い、モリキューティス網の、マイコプラズマ属、ウレアプラズマ属、スピロプラズマ属、アコレプラズマ属等の細菌をいう。第十七改定日本薬局方参考情報では、アコレプラズマ・レイドロウィ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、マイコプラズマ・アルギニニ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、マイコプラズマ・オリニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・オラーレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｏｒａｌｅ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびマイコプラズマ・サリバリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）の７菌種７株がバリデーション菌株として用いられており、マイコプラズマ否定試験においてこれらの株が１０ｃｆｕ／ｍＬ以下であることを確認する必要がある。また、欧米の局方では、マイコプラズマ・シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、スピロプラズマ・シトリ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｉｔｒｉ）の菌種も対象となる（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ３９−ＮＦ３４））。
【００１５】
本発明において、検体とは、マイコプラズマの感染の有無を試験するための試料をいい、液状であることが好ましい。例えば、検体としては、滅菌水、生理食塩水、液体培地（例えば、真核細胞などの細胞を培養するために用いられるもの）、生体試料、培養上清、緩衝液、リンゲル液などがある。
【００１６】
本発明において用いられる蛋白質は、特に限定されないが、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、霊長類血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、齧歯類血清アルブミン、ウマ類血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、モルモット血清アルブミン、ニワトリ血清アルブミン、ブタ血清アルブミンなどの動物アルブミン）、カゼイン、加水分解カゼイン、乳蛋白質（例えば、商品名：ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル））、ゼラチンなどが挙げられる。マイコプラズマを集菌後ＰＣＲに付した際の菌の混入を避ける観点から、無菌の蛋白質が好ましい。これらの蛋白質は、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１７】
蛋白質の使用量は、マイコプラズマを完全に凝集できる量であれば特に限定されないが、例えば、検体１ｍＬに対して０．１〜５００ｍｇが好ましく、より好ましくは０．２〜１００ｍｇ、さらに好ましくは２〜２０ｍｇである。
【００１８】
本発明において用いられる水不溶性担体は、蛋白質と併用することで、マイコプラズマを凝集することができるものであれば特に限定されるものではないが、ポリスチレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどのラテックス粒子（例えば有機高分子ラテックス粒子）、物理吸着用やカルボキシル基を介した化学結合用といった処理加工を施したラテックス粒子、着色セルロース粒子、シリカ粒子、金コロイド粒子などが挙げられる。これらのうち、ラテックス粒子、特に有機高分子ラテックス粒子が、マイコプラズマの凝集性の点で好ましい。
【００１９】
水不溶性担体の形状は、特に限定されないが、球状または略球状であることが、マイコプラズマの凝集の観点から好ましい。
【００２０】
水不溶性担体の粒子径は、特に限定されるものではないが、視認性および実験の簡便性から、平均粒子径が１０〜２，０００ｎｍが好ましく、より好ましくは５０〜１，５００ｎｍ、さらに好ましくは１００〜１，０００ｎｍである。水不溶性担体の粒子径は、例えば、電子顕微鏡（ＴＥＭ）法を用いて測定することができる。
【００２１】
水不溶性担体の使用量は、マイコプラズマを完全に凝集できる量であれば特に限定されないが、例えば、検体１ｍＬに対して０．０００５〜１０ｍｇ、好ましくは０．００１〜１ｍｇ、更に好ましくは０．００２〜０．１ｍｇである。
【００２２】
蛋白質と水不溶性担体の重量比は、マイコプラズマの凝集性の点から、蛋白質：水不溶性担体＝１：１〜５００００：１が好ましく、より好ましくは１０：１〜１００００：１であり、さらに好ましくは２００：１〜１０００：１である。
【００２３】
検体に蛋白質を添加することにより、検体中のマイコプラズマとの凝集体を形成する。この際、水不溶性担体を添加すると、より効率的に凝集体を形成することができる。得られた凝集体を回収することによりマイコプラズマを集菌することができる。
【００２４】
具体的には、まず、遠心チューブに検体および蛋白質を加える。この際、水不溶性担体を加えることが好ましい。検体は液体であることが好ましく、水、生理食塩水、緩衝液（例えば、所定のｐＨに調整したＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＰＳバッファー、ＴＡＰＳバッファー、リン酸バッファー（ＰＢＳ）等）、液体培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、α―ＭＥＭ、ＨＡＮＫＳ等）、細胞懸濁上清または細胞を培養した後の培養上清でもよい。凝集を確実にするために、任意の時間（例えば、１秒間〜６０分間）攪拌または放置してもよい。得られた凝集体の回収は、例えば、遠心分離により行うことができる。遠心分離において遠心力は、特に限定されないが、例えば、３，０００〜３０，０００Ｇであり、好ましくは５，０００〜２８，０００Ｇ、より好ましくは１４，０００〜２５，０００Ｇである。遠心分離時間は、特に限定されないが、例えば、１０秒間〜１２０分間、好ましくは１分間〜６０分間、より好ましくは１０分間〜３０分間である。遠心分離時の温度は、特に限定されないが、例えば、４〜３５℃、好ましくは７〜３０℃、より好ましくは１０〜２０℃である。遠心分離を行うことで、遠心チューブ下部に、マイコプラズマが溜まるので、上清を除去する。必要に応じてこの遠心分離および上清を除去する工程を２回以上繰り返し、濃縮されたマイコプラズマを残渣として得ることもできる。
【００２５】
なお、前記凝集体を得るために、検体には任意に物理的処理および／または化学的処理を施してもよい。物理的処理としては、加熱処理、超音波照射処理、凍結、溶融処理などが挙げられる。化学的処理としては、化学試薬処理、例えば、消化酵素、界面活性剤、溶菌剤などを用いる変性処理等が挙げられる。
【００２６】
本発明はまた、前記の方法によって集菌されたマイコプラズマを含む残渣をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に付すことによってマイコプラズマを測定する方法に関する。
【００２７】
該方法は、マイコプラズマを含む残渣を用いて、市販のキット（例えば、キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ）で公知の方法によりＤＮＡ抽出を行い、マイコプラズマ遺伝子検出キット（Ｍｙｃｏ  Ｆｉｎｄｅｒ、日水製薬株式会社（東京都、日本））を用いてマイコプラズマの検出試験を行うことができる。この検出試験において、公知のＰＣＲ法やその変法（例えば、リアルタイムＰＣＲ）が用いられる。
【００２８】
本発明の測定は、検体に対して蛋白質、好ましくはさらに水不溶性担体を含む、マイコプラズマ集菌用キットを使用して行うことができる。該キットに含まれる蛋白質および水不溶性担体は前記の通りである。該キットには、適宜上記のような操作を説明したマニュアルが添付されていてもよい。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。【００３０】
実施例１−１、実施例１−２、および比較例１〜５  細胞、ラテックス、蛋白質による効果比較試験
（１）試薬および細胞
（１−１）水不溶性担体
粒径３１５ｎｍのポリスチレン系ラテックス粒子（ＩＭＭＵＴＥＸ（登録商標、ＪＳＲライフサイエンス株式会社製）濃度１０ｗ／ｖ％、表面修飾：ＣＯＯＨ、平均粒子径の測定方法：ＴＥＭ法）を用いた。
（１−２）蛋白質
ＢＳＡ溶液（３０ｗ／ｖ％アルブミン溶液、ウシ血清由来（ＢＳＡ溶液）脂肪酸フリー、和光純薬工業株式会社製）を用いた。希釈には、カルシウムイオン及びマグネシウムイオン不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））を用いた。
（１−３）細胞培養
比較対照用として、ヒトコーカサス人赤白血病由来のＨＥＬ９２．１．７細胞を用いた。
（１−４）検体
検体としては、指定量のマイコプラズマを含んだＰＢＳ（−）を用いた。【００３１】
（２）マイコプラズマの集菌方法
実施例１−１  ＢＳＡおよびラテックスの両者を使用
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（２．５μＬ）およびＢＳＡ溶液（３５０μＬ、ＢＳＡ換算で１０５ｍｇ）を添加し、混合物を攪拌した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。【００３２】
比較例１  従来の細胞を使用
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、ヒトコーカサス人赤白血病由来のＨＥＬ９２．１．７細胞（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１００μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。
さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。なお、試験に使用したＨＥＬ９２．１．７細胞はマイコプラズマに感染していないことを予め確認している。【００３３】
実施例１−２  ＢＳＡを使用
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、ＰＢＳ（−）（２．５μＬ）およびＢＳＡ溶液（３５０μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。【００３４】
比較例２  ラテックスを使用
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（２．５μＬ）およびＰＢＳ（−）（３５０μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。【００３５】
比較例３  添加なし
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、ＰＢＳ（−）（２．８５μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。【００３６】
比較例４  理論値（濃縮工程なし）
マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）をＰＢＳ（−）（２００μＬ）に２５０ｃｆｕとなるように添加し、濃縮工程を経ずに調製した。【００３７】
（３）マイコプラズマ確認試験
試験例  マイコプラズマ確認試験
前記（２）で得たマイコプラズマ菌体濃縮液（２００μＬ、実施例１−１、実施例１−２および比較例１〜５）より、抽出キット（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用）を用いて、ＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いて、日水製薬株式会社（東京都、日本）のＭｙｃｏ  Ｆｉｎｄｅｒを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｑ値（サイクル数）を求めた（試験は２回行い、Ｃｑ値の平均値も求めた）。これにより、サンプル中のマイコプラズマ遺伝子の有無を判定した。【００３８】
（４）結果
（４−１）
結果を表１に示す。【００３９】
【表１】
2018199113.tif 000002
【００４０】
ＢＳＡおよびラテックスを添加した場合（実施例１−１）のＣｑ値が、細胞を添加した場合（比較例１）のＣｑ値よりも約２低いことから、実施例１−１の方が比較例１よりも約２サイクル早く増幅されていた。よって、ＢＳＡおよびラテックスを用いるマイコプラズマの回収方法は、細胞を用いる場合と比較して、４倍量のＰＣＲテンプレートを回収することができることとなる。【００４１】
また、ＢＳＡを添加した場合（実施例１−２）は、細胞を添加した場合（比較例１）と比較して、Ｃｑ値が約１低いことから、実施例１−２の方が、比較例１よりも１サイクル早く増幅されていた。よって、ＢＳＡを用いるマイコプラズマの回収方法は、細胞を用いる場合と比較して、２倍量のＰＣＲテンプレートを回収することができることとなる。【００４２】
ＢＳＡおよびラテックスを添加した場合（実施例１−１）のＣｑ値が、ラテックスを添加した場合（比較例２）のＣｑ値よりも約６低いことから、実施例１−１の方が比較例２よりも６サイクル早く増幅されていた。よって、ＢＳＡおよびラテックスを用いるマイコプラズマの回収方法は、ラテックスのみを用いる場合と比較して、６４倍量のＰＣＲテンプレートを回収することができることとなる。【００４３】
また、添加成分を何ら加えなかった場合（比較例３）は、ＰＣＲによる増幅が得られなかった。さらに、実施例１−１のＣｑ値は、濃縮工程を行わない理論値のＣｑ値（比較例４）と近い値を示したことから、ＢＳＡおよびラテックスを用いた濃縮工程によるロスは、従来法である細胞を利用した場合と比較して極めて少なかった。【００４４】
また、実施例１−２のＣｑ値も、濃縮工程を行わない理論値のＣｑ値（比較例４）と従来法である細胞を利用した場合と比較して近い値を示したことから、ＢＳＡを用いた濃縮工程によるロスは、従来法である細胞を利用した場合と比較して少なかった。【００４５】
実施例２  ラテックス濃度の検討
（２−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（前記と同じ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（前記と同じ、３５０μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。この際、１０ｗ／ｖ％ラテックスの添加量が０．５μＬ、１μＬ、２．５μＬ、または２５μＬとなるように調整した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。【００４６】
（２−２）結果
結果を表２に示す。【００４７】
【表２】
2018199113.tif 000003
【００４８】
表２より、ラテックスの添加量によって、Ｃｑ値には影響が殆どないことが分かった。したがって、ラテックスの添加量はＰＣＲテンプレートの回収量には影響を殆ど及ぼさないと考えられる。【００４９】
実施例３  水不溶性担体の検討（シリカ粒子、金コロイド粒子）
（３−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、水不溶性担体および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（前記と同じ、３５０μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。この際、水不溶性担体には１０ｗ／ｖ％のラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）、５０ｍｇ／ｍＬのシリカ粒子（Ｓｉｃａｓｔａｒ  ３００ｎｍ（マイクロモッド社製）、均粒子径３００ｎｍ、表面修飾：ＣＯＯＨ、平均粒子径の測定方法：動的光散乱法、５．０μＬ）、０．１２４ｍｇ／ｍＬの金コロイド粒子（３００ｎｍ  スタンダード金ナノ粒子（サイトダイアグノスティクス社製）、平均粒子径３００ｎｍ、表面処理：なし、平均粒子径の測定方法：動的光散乱法、２ｍＬ）を用いた。なお、金コロイド粒子は添加量が多いため検体量を２３ｍＬとした。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＱＩＡａｍｐ  ＵＣＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。
また、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（２．５μＬ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（３５０μＬ）の代わりにＨＥＬ９２．１．７細胞（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１００μＬ）を、それぞれ添加した比較対象を測定した。【００５０】
（３−２）結果
結果を表３に示す。【００５１】
【表３】
2018199113.tif 000004
【００５２】
固形成分の含有量は、以下の通りである（計算値）。
ラテックス粒子：０．２５ｍｇ
シリカ粒子：０．２５ｍｇ
金コロイド粒子：０．２４８ｍｇ
表３より、ラテックス粒子以外にも、シリカ粒子や金コロイド粒子を用いてもマイコプラズマの検出が可能であることが分かった。【００５３】
実施例４  ＢＳＡ濃度の検討
（４−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（８ｃｆｕ／ｍＬ）のＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％のラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（前記と同じ）を添加し、混合物を攪拌した。この際、ＢＳＡ溶液の添加量が０μＬ（０ｇ／２５ｍＬ）、１７５μＬ（０．０５ｇ／２５ｍＬ）、３５０μＬ（０．１ｇ／２５ｍＬ）、または１，５００μＬ（０．５ｇ／２５ｍＬ）となるように調整した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。【００５４】
（４−２）結果
結果を表４に示す。【００５５】
【表４】
2018199113.tif 000005
【００５６】
表４より、ラテックスのみを用いた場合と比較して、０．０５ｇ／２５ｍＬ以上のＢＳＡ濃度では、遠心分離後のペレットは強固なものであり、Ｃｑ値に大きな違いは見られなかった。【００５７】
実施例５  ＢＳＡ低濃度の検討
（５−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（前記と同じ）を添加し、混合物を攪拌した。この際、ＢＳＡ溶液の添加量が１７．５μＬ（０．００５ｇ／２５ｍＬ）、３５μＬ（０．０１ｇ／２５ｍＬ）、または３５０μＬ（０．１ｇ／２５ｍＬ）となるように調整した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＱＩＡａｍｐ  ＵＣＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。【００５８】
（５−２）結果
結果を表５に示す。【００５９】
【表５】
2018199113.tif 000006
【００６０】
表５より、ラテックスのみを用いた場合と比較して、ＢＳＡを添加した場合は、０．０１ｇ／２５ｍＬおよび０．００５ｇ／ｍＬの濃度でＣｑ値にばらつきが見られ、遠心分離後のペレットに緩みが見られるものの、マイコプラズマの集菌は可能であると判断された。【００６１】
実施例６  蛋白質の検討（ブロックエース）
（６−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（８ｃｆｕ／ｍＬ）２５ｍＬのＰＢＳ（−）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）および乳蛋白質であるブロックエース（ＤＳバイオメディカル社製）を添加し、混合物を攪拌した。この際、ブロックエースの添加量が０ｇ／ｍＬ、１ｇ／２５ｍＬ、または０．１ｇ／２５ｍＬとなるように調整した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。【００６２】
（６−２）結果
結果を表６に示す。【００６３】
【表６】
2018199113.tif 000007
【００６４】
表６より、ラテックスのみを用いた場合と比較して、さらにブロックエースを添加した場合は、ブロックエースの濃度にかかわらず、Ｃｑ値が約２低かった。【００６５】
実施例７  蛋白質の検討（ゼラチン）
（７−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）および１０％ゼラチン（冷水魚皮由来のゼラチン（ｆｒｏｍ  ｃｏｌｄ  ｗａｔｅｒ  ｆｉｓｈ  ｓｋｉｎ，４０〜５０％  ｉｎ  Ｈ２Ｏ、シグマアルドリッチ社製）溶液を添加し、混合物を攪拌した。この際、１０％ゼラチン溶液の添加量が５２５μＬ（０．０５ｇ／２５ｍＬ）、１，０５０μＬ（０．１ｇ／２５ｍＬ）、５，２５０μＬ（０．５ｇ／２５ｍＬ）となるように調整した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＱＩＡａｍｐ  ＵＣＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。【００６６】
（７−２）結果
結果を表７に示す。【００６７】
【表７】
2018199113.tif 000008
【００６８】
表７より、蛋白質としてＢＳＡの代わりにゼラチンを用いると、濃度依存的にマイコプラズマの集菌が可能であることが分かった。０．１ｇ／ｍＬのＢＳＡのみを用いた場合と比較して、０．５ｇ／２５ｍＬのゼラチンを添加した場合が、同等のＣｑ値となった。【００６９】
実施例８  多菌種を用いた検討
（８−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、アコレプラズマ・レイドロウィ（ＡＴＣＣ２３２０６−ＴＴＲ）、マイコプラズマ・アルギニニ（ＡＴＣＣ２３８３８−ＴＴＲ）、マイコプラズマ・ファーメンタンス（ＡＴＣＣ１９９８９−ＴＴＲ）、マイコプラズマ・オリニス（ＡＴＣＣ１７９８１−ＴＴＲ）、マイコプラズマ・オラーレ（ＡＴＣＣ２３７１４−ＴＴＲ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ１５５３１−ＴＴＲ）をそれぞれ含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＰＢＳ（−）（２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（前記と同じ、３５０μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＱＩＡａｍｐ  ＵＣＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Gで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。また、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（２．５μＬ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（３５０μＬ）の代わりにＨＥＬ９２．１．７細胞（５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１００μＬ）を、それぞれ添加した比較対象を測定した。【００７０】
（８−２）結果
結果を表８に示す。【００７１】
【表８】
2018199113.tif 000009
【００７２】
日本薬局方では、前記の通り７菌種が問題となっているが、表８より、本発明の方法を用いることで、実施例１に示したマイコプラズマ・サリバリウムだけではなく、アコレプラズマ・レイドロウィ、マイコプラズマ・アルギニニ、マイコプラズマ・ファーメンタンス、マイコプラズマ・オリニス、マイコプラズマ・オラーレ、マイコプラズマ・ニューモニエについても、検出可能であることがわかった。【００７３】
実施例９  検体としてＡＩＭ−Ｖ培地またはＫＢＭ培地を用いた検討
（９−１）方法
５０ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・サリバリウム（ＡＴＣＣ２３０６４−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）ＡＩＭ−Ｖ培地（ＡＩＭ−Ｖ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＣＴＳＴＭ、ライフテクノロジーズ社製、２５ｍＬ）又はＫＢＭ培地（ＫＢＭ５５０、コージンバイオ社製、２５ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（前記と同じ、３５０μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、２４．５ｍＬの上清を除去後にペレットを再懸濁した。再懸濁液を１．５ｍＬポリプロピレンチューブに移し、ＰＢＳ（−）で全量を１，４００μＬとした。さらに、この液を２０，０００Ｇで１０分間遠心分離（２０℃）し、１，２００μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＱＩＡａｍｐ  ＵＣＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した。また、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（２．５μＬ）および３０ｗ／ｖ％のＢＳＡ溶液（３５０μＬ）の代わりにＨＥＬ９２．１．７細胞（５×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１００μＬ）を、それぞれ添加した比較対象を測定した。【００７４】
（９−２）結果
結果を表９に示す。【００７５】
【表９】
2018199113.tif 000010
【００７６】
表９より、検体がＡＩＭ−Ｖ培地やＫＢＭ培地であってもマイコプラズマの集菌が可能であることが確認された。【００７７】
実施例１０  小容量の検討
（１０−１）方法
５ｍＬポリプロピレンチューブに、マイコプラズマ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ１５５３１−ＴＴＲ）を含む（１０ｃｆｕ／ｍＬ）検体（１ｍＬ）、１０ｗ／ｖ％ラテックス溶液（前記と同じ、２．５μＬ）および３０ｗ／％のＢＳＡ溶液（前記と同じ、１４μＬ）を添加し、混合物を攪拌した。この際、検体としてＡＩＭ−Ｖ培地（前記と同じ）、ＫＢＭ培地（前記と同じ）、リンゲル液（ラクトリンゲル液「フソー」、扶桑薬品工業株式会社製）、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬株式会社製）、ＰＢＳ（−）を用いた。次に、攪拌したサンプルを２０，０００Ｇで３０分間遠心分離（１０℃）し、８１６．５μＬの上清を除去し、菌体濃縮液（２００μＬ）とした。その菌体濃縮液から、ＤＮＡを抽出（キアゲン社（ヒルデン、ドイツ）のＱＩＡａｍｐ  ＵＣＰ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔを使用）し、抽出したＤＮＡ溶液を２０，０００Ｇで１５分間遠心分離（２０℃）し、その上清（２５μＬ）を用いてリアルタイムＰＣＲ法によりＣｑ値を比較した（６重試験の平均）。【００７８】
（１０−２）結果
結果を表１０に示す。【００７９】
【表１０】
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【００８０】
表１０より、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＫＢＭ培地、リンゲル液、生理食塩水、ＰＢＳ（−）について、検体に含まれるマイコプラズマの量が少ない１ｍＬ検体であってもマイコプラズマの集菌が可能であることが確認された。
【国際調査報告】
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2018199113.tif 000013
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