(57)【要約】  本発明は、生産効率に優れたニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法を提供することを課題とする。本発明（第一の発明群）に係るＮＭＮの製造方法は、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）、ポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の各酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、ＡＴＰ、およびポリリン酸を含む混合物と接触させる工程を含む。
2019065876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
【請求項２】
リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、請求項１に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項３】
実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、請求項１または２に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項４】
前記Ｎａｍｐｔがバクテリア由来のものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項５】
前記Ｐｐｋが、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項６】
前記形質転換体の宿主が、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、または酵母である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項７】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体。
【請求項８】
リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体。
【請求項９】
ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）の存在下で、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
【請求項１０】
実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、請求項９に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項１１】
前記処理物が精製酵素である、請求項９または１０に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項１２】
（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させる工程を含む、ＮＭＮの製造方法。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
【請求項１３】
反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
【請求項１４】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）およびホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびＡＴＰと接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法であって、反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、ＮＭＮの製造方法。
【請求項１５】
リボキナーゼ（Ｒｂｋ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボースおよびＡＴＰと接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、請求項１４に記載のＮＭＮの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチンアミドモノヌクレオチド等の核酸系化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の合成中間体である。近年、ＮＭＮはＮＡＤ＋への変換を通じて長寿遺伝子「サーチュイン」の活性をコントロールすること、ＮＭＮをマウスに投与すると抗老化作用が示されることが明らかにされた。さらに、ＮＭＮは糖尿病、アルツハイマー病、心不全などの疾患の予防や症状の改善に効果があることも報告されている。このようなＮＭＮには、機能性食品、医薬品、化粧品等の成分としての用途が期待されており、生産性の向上を目指して、効率的な製造方法の研究開発が進められている。【０００３】
特許文献１には、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）を過剰発現させた細胞（酵母、細菌等）を単離し、その細胞をニコチンアミド（ＮＡＭ）の存在化で培養する、ＮＭＮの製造方法が記載されている（請求項１，１３，１５等）。Ｎａｍｐｔは、ＮＡＭと細胞内で生合成されるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）とからＮＭＮを生成する酵素である。特許文献１には、ＰＲＰＰの生合成を促進するため、前記細胞にさらにホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）を過剰発現させることも記載されている（請求項３等）。Ｐｒｓは、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）およびＡＴＰから、ＰＲＰＰおよびＡＭＰを生成する酵素である。特許文献１では、特定の酵素を過剰発現する細胞を生かした状態で、炭素源、窒素源等を含有する培地で培養させながら、生体内での酵素反応によりＮＭＮ等の目的化合物を生成させている。【０００４】
特許文献２には、反応生成物に対する感受性が弱められた（つまり、Ｐｒｓにより生成するＰＲＰＰによる負のフィードバックを受けにくいため、系内へのＰＲＰＰの供給量を増加させることができる）Ｐｒｓ変異体を用いた、ＮＡＤ前駆体の合成システムが記載されている（請求項１、段落００６８等）。このＰｒｓ変異体は、組換え体において生成され、単離、精製されたものであってもよいことも記載されている（請求項６等）。特許文献２には、システムがさらにＮａｍｐｔ、ＡＴＰ、Ｒ５Ｐ、ＰＲＰＰを含んでいてもよいことも記載されている（請求項１０、２０、２１、２３等）。【０００５】
一方、非特許文献１には、リボキナーゼ（Ｒｂｋ、当該文献ではＲＫと表記されている）、Ｐｒｓ（同じくＰＰＳと表記されている）およびヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（８Ｂ３）の３つの酵素を用いて、リボースからイノシン一リン酸（ＩＭＰ）を合成する方法が記載されている。Ｒｂｋは、リボースおよびＡＴＰからＲ５ＰおよびＡＤＰを生成する反応（i）に関与し、Ｐｒｓは、Ｒ５ＰおよびＡＴＰからＰＲＰＰおよびＡＭＰを生成する反応（ii）に関与し、８Ｂ３は（iii）ＰＲＰＰおよびイノシン酸からＩＭＰおよびピロリン酸（ＰＰｉ）を生成する反応に関与する。上記の非特許文献１に記載の方法では、反応（ii）で生成するＡＭＰから、アデニル酸キナーゼによりＡＤＰが再生される。また、その再生されたＡＤＰおよび反応（i）で生成するＡＤＰから、ホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼにより、ＡＴＰが再生される。【０００６】
特許文献３には、単独でＡＭＰからＡＴＰを合成可能な酵素であるポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）２型を、ポリリン酸およびＡＭＰと反応させる、ＡＴＰの製造方法が記載されている。そのようなポリリン酸キナーゼ２型として、好熱菌（Thermosynechococcus elongatus等）に由来する、特定のアミノ酸配列を有するポリリン酸キナーゼが開示されている。特許文献３にはさらに、ＡＴＰを利用して物質（目的化合物）を製造する方法において、上記のＡＴＰの製造方法を同時に実施することにより、目的化合物の合成反応とＡＴＰの再生反応を共役させ、ＡＭＰから再生されたＡＴＰが目的化合物の合成に利用されるようにすることも記載されている。【０００７】
特許文献４には、７０℃、１０分間の熱処理でも失活しない好熱菌由来のＰｐｋの遺伝子を含む大腸菌を、大腸菌の通常の酵素が活性を失い、かつポリリン酸の細胞透過性が得られる、６０〜８０℃で加熱して、大腸菌の細胞膜が破壊された状態で、ＡＴＰの再生反応を行う方法が記載されている。【０００８】
特許文献５には、ＮＡＭ、ＡＴＰおよびリボースを原料とし、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、リボースリン酸ピロリン酸キナーゼおよびリボースキナーゼの触媒作用下で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法が記載されている。【０００９】
非特許文献２には、好熱菌由来のＰｐｋおよびそれによるＡＴＰ再生系を利用した、グリセロール三リン酸の合成方法が記載されている。その方法では、グリセロール、ＡＤＰ、ポリリン酸、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、Ｐｐｋ等を含む緩衝液を初発反応液として用い、逐次ポリリン酸を添加しながら、反応を進行させている。【００１０】
非特許文献３には、Streptococcus sanguinis由来のグルタチオンシンターゼ（ＧｓｈＦ）と、特許文献３に記載されているものと同様の活性を有する、好熱菌Thermosynechococcus elongates BP-1由来のＰｐｋによるＡＴＰ再生系とを共役させた、カスケード反応によるグルタチオンの製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開２０１５／０６９８６０号
【特許文献２】国際公開２０１６／１９８９４８号
【特許文献３】特開２０１３−０２１９６７号
【特許文献４】特開２００７−１４３４６３号
【特許文献５】国際公開２０１７／１８５５４９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Scism, Robert A. and Bachmann, Brian O. "Five‐component cascade synthesis of nucleotide analogues in an engineeredself‐immobilized enzymeaggregate." ChemBioChem 11.1 (2010): 67-70.
【非特許文献２】Restiawaty, Elvi et al. "Feasibility ofthermophilic adenosine triphosphate-regeneration system using Thermusthermophilus polyphosphate kinase." Process Biochemistry 46.9 (2011):1747-1752.
【非特許文献３】Zhang, Xing et al. "One-pot synthesis ofglutathione by a two-enzyme cascade using a thermophilic ATP regenerationsystem." Journal of Biotechnology 241 (2017): 163-169.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献１〜５および非特許文献１〜３に開示された方法は、ＮＭＮを効率的に製造するうえで問題があり、優れた方法とは言えない。具体的には、特許文献１では、特定の酵素を過剰発現する細胞を生かした状態で、炭素源、窒素源等を含有する培地で培養させながら、生体内での酵素反応によりＮＭＮを生成させているが、その生成量は３００ｎｍｏｌ−ＮＭＮ／ｇ−酵母湿菌体重量（実施例１）である。仮に、酵母乾燥菌体重量／酵母湿菌体重量の比が０．２と仮定すると、約０．５ｇ−ＮＭＮ／ｋｇ―酵母乾燥菌体重量となり、生成量が低いという問題がある。【００１４】
特許文献２には、反応生成物に対する感受性が弱められたＰｒｓ変異体を用いた、ＮＡＤ前駆体の合成システムが記載されている。しかし、ＮＭＮの生成を示す実施例は記載されておらず、具体的なＮＭＮの製造方法や生成量は示されていない。【００１５】
特許文献３には、単独でＡＭＰからＡＴＰを合成可能な酵素であるポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）２型をポリリン酸およびＡＭＰと反応させるＡＴＰの製造方法と、目的化合物の合成反応とを共役させる、物質の製造方法が記載されている。しかし、具体的なＮＭＮの製造方法や生成量は示されていない。【００１６】
特許文献４には、好熱菌由来のＰｐｋの遺伝子を含む大腸菌を加熱して、大腸菌の細胞膜が破壊された状態で、ＡＴＰの再生反応を行う方法が記載されているが、具体的なＮＭＮの製造方法や生成量は示されていない。【００１７】
特許文献５には、ニコチンアミド、ＡＴＰおよびリボースを原料とし、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、リボースリン酸ピロリン酸キナーゼおよびリボースキナーゼの触媒作用下で反応させるニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法が記載されている。しかし、特許文献５では、ＮＭＮの製造に多量のＡＴＰを使用している。具体的には、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰのモル数が、生成するＮＭＮのモル数の２倍以上となっている。ＡＴＰは高価な原料であるため、コスト的に効率的な製造方法とは言えない。【００１８】
従って、これまでにも多くのＮＭＮの製造法は示されているが、ＮＭＮの生成量およびＮＭＮの製造ために必要となるＡＴＰの量の観点から、いずれも十分なものではなかった。【００１９】
本発明は、生産効率に優れたニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて酵素反応を進行させた場合（図１参照）、従来の方法よりも効率的に、また安価にＮＭＮを生産することができることを見出した。さらに、前記Ｒ５Ｐを、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて製造する場合は、一層効率的かつ安価にＮＭＮを生産することができることを見出し、第一の発明群を完成させるに至った。【００２１】
また、本発明者らは、ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）の存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させて酵素反応を進行させた場合、従来の方法よりも効率的にＮＭＮを生産することができることを見出し、第二の発明群を完成させるに至った。【００２２】
さらに、本発明者らは、（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させることで、ＮＭＮの分解を顕著に抑制しながら、効率的にＮＭＮを生産することができることを見出し、第三の発明群を完成させるに至った。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14【００２３】
さらに、本発明者らは、単独または複数の手段の組み合わせにより、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にすることができることを見出し、第四の発明群を完成させるに至った。【００２４】
すなわち、本発明は下記［項１］〜［項１７］に関する。
［項１］
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
［項２］
リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、項１に記載のＮＭＮの製造方法。
［項３］
実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、項１または２に記載のＮＭＮの製造方法。
［項４］
前記Ｎａｍｐｔがバクテリア由来のものである、項１〜３のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項５］
前記Ｐｐｋが、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーである、項１〜４のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項６］
前記Ｐｐｋが、ポリリン酸キナーゼ２型ファミリーのクラス３サブファミリー（Ｐｐｋ２クラス３）である、項１〜５のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項７］
前記形質転換体の宿主が、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、または酵母である、項１〜６のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項８］
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の３酵素の発現が強化された形質転換体。
［項９］
リボキナーゼ（Ｒｂｋ）およびポリリン酸キナーゼ（Ｐｐｋ）の２酵素の発現が強化された形質転換体。
［項１０］
ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）の存在下で、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）と接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法。
［項１１］
実質的に形質転換体が増殖しない条件で行う、項１０に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１２］
前記処理物が精製酵素である、項１０または１１に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１３］
前記Ｎａｍｐｔがバクテリア由来のものである、項１０〜１２のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１４］
（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させる工程を含む、ＮＭＮの製造方法。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
［項１５］
反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、項１〜１４のいずれか一項に記載のＮＭＮの製造方法。
［項１６］
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）およびホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（Ｐｒｓ）の２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース−５−リン酸（Ｒ５Ｐ）、ニコチンアミド（ＮＡＭ）およびＡＴＰと接触させる工程を含む、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）の製造方法であって、反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下である、ＮＭＮの製造方法。
［項１７］
リボキナーゼ（Ｒｂｋ）の発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボースおよびＡＴＰと接触させて前記Ｒ５Ｐを製造する工程をさらに含む、項１６に記載のＮＭＮの製造方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の第一の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、ＮＭＮの生産量を従来よりも飛躍的に向上させる（例えば、特許文献１に記載された生産量の１０倍以上にする）ことが可能となる。また、ＡＴＰ再生反応を利用する本発明の製造方法により、ＰＲＰＰのように高価な中間体やＡＴＰを多量に投入せずとも、より安価なＲ５Ｐまたはリボースを原料としてＮＭＮを生産することができるため、生産コストの抑制も可能となる。【００２６】
本発明の第二の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、第３反応を効率的に進行させることができる。これにより、ＮＭＮの生産量や生成速度を向上させることが可能になり、ＮＭＮの生産コストを抑制することができる。【００２７】
本発明の第三の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物を用いてＮＭＮの生成反応を行う際、生成物であるＮＭＮの分解を抑制することができる。これにより、安価な触媒形態である菌体や無細胞抽出物などを用いて、高い収率でＮＭＮを生産することが可能になり、ＮＭＮの生産コストを抑制することができる。【００２８】
本発明の第四の発明群によるＮＭＮの製造方法を利用することにより、ＮＭＮの製造のために添加するＡＴＰの量を削減することができる。ＡＴＰは高価であるため、これにより、ＮＭＮの生産コストを抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、本発明のＮＭＮの製造方法において進行する反応を示した概略図である。
【図２】図２は、実施例１および比較例２におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。
【図３】図３は、実施例３におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。
【図４】図４は、実施例４におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。
【図５】図５は、実施例５におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。
【図６】図６は、実施例６および比較例２におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。
【図７】図７は、実施例７におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。
【図８】図８は、実施例８におけるＮＭＮの生成濃度を表すグラフである。
【図９】図９は、ＮＭＮの分解経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書で用いられる略語の定義はそれぞれ次の通りである。
Ｎａｍｐｔ（Nicotinamide phosphoribosyltransferase）：ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ
Ｐｒｓ（Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase）：ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ
Ｒｂｋ（Ribokinase）：リボキナーゼ
Ｐｐｋ（Polyphosphate kinase）：ポリリン酸キナーゼ
ＰＰａｓｅ（Pyrophosphatase）：ピロホスファターゼ
ＮＭＮ（Nicotinamide mononucleotide）：ニコチンアミドモノヌクレオチド
ＰＲＰＰ（Phosphoribosyl pyrophosphate）：ホスホリボシルピロリン酸
ＮＡＭ（Nicotinamide）：ニコチンアミド
Ｒ５Ｐ（Ribose-5-phosphate）：リボース−５−リン酸
ＮＲ（Nicotinamide riboside）：ニコチンアミドリボシド
ＮａＭＮ（Nicotinic acid mononucleotide）：ニコチン酸モノヌクレオチド
ＮＡＤ（Nicotinamide adenine dinucleotide）：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＰＰｉ（Pyrophosphate）：ピロリン酸
ＰｏｌｙＰ（Polyphosphate）：ポリリン酸
【００３１】
−第一の発明群−
本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第一の発明群は、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させる工程を含む。好ましくは、本発明のＮＭＮの製造方法は、前記Ｒ５Ｐの製造工程として、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸を含む混合物と接触させる工程をさらに含む。つまり、本発明では、ＡＴＰ再生反応を利用しながら、所定の酵素反応を進行させることによりＮＭＮを製造する。
【００３２】
このような第一の発明群のＮＭＮの製造方法は、典型的には、下記（１）〜（３）の工程（本明細書において、それぞれ第１工程、第２工程および第３工程と称する）を順次行うことにより実施される。これらの工程は、同一の者が実施してもよいし、異なる者が実施してもよい。また、これらの工程は、連続的に行ってもよいし、各工程の間に所定の期間をおいて段階的に行ってもよい。
（１）Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋの各酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる工程（第１工程）；
（２）必要に応じ、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液から、処理物を調製する工程（第２工程）；および
（３）第１、第２工程を経た形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、各基質化合物と接触させる工程（第３工程、図１参照）。
【００３３】
以下、本発明のＮＭＮの製造方法について、第１工程、第２工程および第３工程を行う実施形態に沿って、さらに詳細に説明する。ただし、本発明のＮＭＮの製造方法は、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、以下に具体的に記載する第１工程、第２工程および第３工程を適宜改変した実施形態で行うことも可能である。
【００３４】
［第１工程］
第１工程は、Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋの各酵素をコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる工程である。
【００３５】
（酵素）
本発明では、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋと、必要によりさらにＲｂｋの４酵素を利用する。Ｎａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＰｐｋおよびＲｂｋはいずれも既知の酵素であり、そのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列は当業者であれば容易に入手可能である。上記所定の４酵素は、それぞれの目的反応を触媒することができるものであれば、天然型の酵素であってもよいし、天然型の酵素のアミノ酸配列を改変することにより作製された、好ましくは発現量や酵素活性が向上した、変異型の酵素であってもよい。また、精製の簡略化や可溶性発現の促進、抗体による検出等を目的として、各酵素には種々のタグ（タンパク質またはペプチド）が付加されていてもよい。タグの種類としては、Ｈｉｓタグ（ヒスチジンタグ）、Ｓｔｒｅｐ（ＩＩ）−ｔａｇ、ＧＳＴタグ（グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼタグ）、ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質タグ）、ＧＦＰタグ（緑色蛍光タンパク質タグ）、ＳＵＭＯタグ（Ｓｍａｌｌ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ（ｌｉｋｅ）  Ｍｏｄｉｆｉｅｒタグ）ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ等が挙げられる。さらに、４酵素は、互いに融合タンパク質として発現されていてもよい。
【００３６】
・Ｎａｍｐｔ
Ｎａｍｐｔ（EC number: 2.4.2.12）は、一般的にＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）サルベージ経路に関与することが知られており、本発明において、ＰＲＰＰおよびＮＡＭからＮＭＮを生成させる反応（第３反応）のために利用される酵素である。ＮａｍｐｔによるＰＲＰＰとＮＡＭからのＮＭＮ合成反応において、本来、ＡＴＰは必須ではない。しかし、ＮａｍｐｔにはＡＴＰ加水分解活性があり、ＡＴＰの加水分解によってＮａｍｐｔが自己リン酸化されることで、ＮＭＮ生成に有利な方向に酵素学的パラメータや化学平衡が変化することが報告されている（Biochemistry 2008, 47, 11086-11096）。
【００３７】
Ｎａｍｐｔとしては、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_005737）、マウス（Mus musculus）由来のもの（NP_067499）、ラット（Rattus norvegicus）由来のもの（NP_808789）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）由来のもの（NP_997833）、Haemophilus ducreyi（AAR87771）、Deinococcus radiodurans（AE001890）、Oenococcus oeni（KZD13878）、Shewanella oneidensis（NP_717588）等バクテリア由来のものが挙げられる。本発明では、第３反応における酵素活性に優れることから、バクテリア由来のものを用いることが好ましい。ここで、バクテリアとは、核膜を有さない原核生物の一群であり、大腸菌、枯草菌、シアノバクテリアなどを含む生物群である。
【００３８】
・Ｐｒｓ
Ｐｒｓ（EC number: 2.4.2.17）は、本発明において、Ｒ５ＰおよびＡＴＰからＰＲＰＰおよびＡＭＰを生成させる反応（第２反応）のために利用される酵素である。
【００３９】
Ｐｒｓとしては、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（BAA05286）、Bacillus caldolyticus由来のもの（CAA58682）、Arabidopsis thaliana由来のもの（Q680A5）、Methanocaldococcus jannaschii由来のもの（Q58761）が挙げられる。長時間にわたって、特に製造系内の基質濃度が高い場合に、第２反応によるＰＲＰＰの生成およびそれに続く第３反応によるＮＭＮの生成を継続させる（つまり最終産物であるＮＭＮの製造系内の濃度を上昇させ続ける）ことができるよう、特許文献２に記載されているような変異型Ｐｒｓを用いることもできる。変異型Ｐｒｓとしては、例えば、ヒト由来のＰｒｓについての、Ａｓｐ５１Ｈｉｓ（５１位のＡＳＰのＨｉｓへの置換、以下同様）、Ａｓｎ１１３Ｓｅｒ、Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅ、Ａｓｐｌ８２Ｈｉｓ、Ａｌａ１８９Ｖａｌ、およびＨｉｓｌ９２Ｇｌｎなどの変異型、ならびにそれらに対応する他の生物由来のＰｒｓにおける変異型、例えば、枯草菌由来のＰｒｓについて、Ａｓｎ１２０Ｓｅｒ（上記Ａｓｎ１１３Ｓｅｒに対応）、Ｌｅｕ１３５Ｉｌｅ（上記Ｌｅｕ１２８Ｉｌｅに対応）などの変異型が挙げられる。
【００４０】
・Ｒｂｋ
Ｒｂｋ（EC number: 2.7.1.15）は、本発明において、リボースおよびＡＴＰからＲ５ＰおよびＡＤＰを生成させる反応（第１反応）のために利用される酵素である。Ｒｂｋとしては、各種の生物に由来する天然型Ｒｂｋ、またはそのアミノ酸配列を改変して作製された変異型Ｒｂｋを用いることができ、例えば、ヒト（Homo sapiens）由来のもの（NP_002755）、酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のもの（P25332）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のもの（P36945）、大腸菌（Escherichia coli）由来のもの（AAA51476）、Haemophilus influenzae由来のもの（P44331）が挙げられる。
【００４１】
・Ｐｐｋ
Ｐｐｋ（EC number: 2.7.4.1）は、本発明において、第１反応で生成するＡＤＰまたは第２反応で生成するＡＭＰと、ポリリン酸とから、ＡＴＰを再生する反応（ＡＴＰ再生反応）のために利用される酵素である。
【００４２】
Ｐｐｋはアミノ酸配列およびキネティクスの違いにより２つのファミリー、ポリリン酸キナーゼ１型ファミリー（Ｐｐｋ１）およびポリリン酸キナーゼ２型ファミリー（Ｐｐｋ２）に分類することができる。ポリリン酸を基質としてＡＴＰを再生する活性としては、Ｐｐｋ１よりもＰｐｋ２のほうが高い。従って、本発明におけるＰｐｋとしては、Ｐｐｋ２を用いることが好ましい。
【００４３】
Ｐｐｋ２はさらに、３つのサブファミリー、クラス１、クラス２およびクラス３に分類することができる。クラス１およびクラス２のＰｐｋ２はそれぞれ、ＡＤＰをリン酸化してＡＴＰを生成する反応、およびＡＭＰをリン酸化してＡＤＰを生成する反応を触媒する。これに対してクラス３のＰｐｋ２は、ＡＭＰのリン酸化反応およびＡＤＰのリン酸化反応の両方を触媒することができるため、単独でＡＭＰからＡＴＰを生成することができる。
【００４４】
本発明におけるＰｐｋとしては、ＡＤＰからＡＴＰを再生するためのＰｐｋ２クラス１と、ＡＭＰからのＡＤＰを再生するためのＰｐｋ２クラス２の組み合わせを用いることができる。または、ＡＭＰからのＡＤＰを再生するためにアデニル酸キナーゼ（ＡＭＰ＋ＡＴＰ→２ＡＤＰという反応を触媒する）を併用する場合は、ＡＤＰからＡＴＰを再生するためのＰｐｋ２クラス１またはＰｐｋ１のみを本発明におけるＰｐｋとして用いることも可能である。しかし、ＡＤＰからのＡＴＰの再生と、ＡＭＰからのＡＴＰの再生の、両方の反応を単独で触媒することができるという効率性の良さから、Ｐｐｋ２クラス３を用いることが好ましい。このようなＰｐＫを用いる場合は、第１反応のＰｐｋと第２反応のＰｐｋを共通化することができる。
【００４５】
Ｐｐｋ２クラス３としては、例えば、Deinococcus radiodurans由来のもの（NP_293858）、Paenarthrobacter aurescens由来のもの（ABM08865）、Meiothermus rube由来のもの（ADD29239）、Deinococcus geothermalis由来のもの（WP_011531362）、Thermosynechococcus elongatus由来のもの（NP_682498）が挙げられる。一方、Ｐｐｋ２クラス１としては、例えばRhodobacter sphaeroides由来のもの（CS253628）、Sinorhizobium meliloti由来のもの（NP_384613）、Pseudomonas aeruginosa由来のPA0141（NP_248831）、Pseudomonas aeruginosa由来のPA2428（NP_251118）、Francisella tularensis由来のもの（AJI69883）が挙げられる。Ｐｐｋ２クラス２としては、例えばPseudomonas aeruginosa由来のPA3455（NP_252145）が挙げられる。また、アデニル酸キナーゼとしては、例えばBacillus cereus由来のもの（AAP07232）が挙げられる。
【００４６】
（形質転換体）
本発明で用いられる形質転換体は、形質転換を行う前の（野生型の）細胞ないし菌体と比較して、所定の各酵素の発現が強化されたものである。「発現が強化された」とは、各酵素の発現量がどの程度強化されたかを意味するかは一概に決定されるものではなく、後述するように各酵素の反応溶媒中（製造系内）の濃度が適切な範囲となるよう、形質転換体における発現量は調節することができるが、少なくとも、人為的な操作によって、形質転換を行う前の（野生型の）細胞ないし菌体よりも発現が強化されていればよい。人為的な操作としては、特に限定されず、次に述べるように発現ベクターを利用する、ゲノム上に所定の酵素をコードする遺伝子発現ユニットを多コピー導入する、元々ゲノム上に存在する所定の酵素をコードする遺伝子のプロモーターを強力なものに置き換える等の操作が挙げられる。
【００４７】
本発明で用いられる形質転換体は、（i）所定の各酵素をコードする遺伝子の全てを含む形質転換体のみから構成されていてもよいし、（ii）所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士の組み合わせとして、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓの発現が強化された形質転換体およびＰｐｋの発現が強化された形質転換体からなる組み合わせによって、構成されていてもよい。
【００４８】
形質転換体の宿主は、発現ベクター等を利用したタンパク質発現システムによって所定の酵素を発現することができる細胞であれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、放線菌（例えばロドコッカス属（Rhodococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium））などの細菌；酵母（例えばサッカロマイセス属（Saccharomyces）、キャンディダ属（Candida）、ピキア属（Pichia））；糸状菌；植物細胞；昆虫細胞、哺乳類細胞などの動物細胞が挙げられる。これらの中でも、大腸菌、コリネバクテリウム属細菌およびロドコッカス属細菌、ならびにサッカロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母およびピキア属酵母が好ましく、大腸菌がより好ましい。
【００４９】
大腸菌としては、例えば、大腸菌Ｋ１２株およびＢ株、ならびにそれらの野生株由来の派生株であるＷ３１１０株、ＪＭ１０９株、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株（例えば、ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ'）、Ｋ８０２株、Ｃ６００株、ＢＬ２１株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株等が挙げられる。
【００５０】
発現ベクターを用いる場合は、本発明で用いる所定の各酵素の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。発現ベクターの構成の詳細については後述する。
【００５１】
宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法が挙げられる。
【００５２】
発現ベクターが導入された形質転換体は、宿主として用いた細胞（菌体）に適した方法で培養して、所定の各酵素を発現させればよい。前述したように、所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士を組み合わせる場合、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓの発現が強化された形質転換体とＰｐｋの発現が強化された形質転換体を作製して組みあわせる場合は、それぞれの形質転換体を同一の培地で培養してもよいし、別々の培地で培養した後に混合してもよい。
【００５３】
形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物（詳細は後記第２工程に関する事項を参照）を用いてＮＭＮの生成反応を行う場合、反応物（基質）であるリボースやＮＡＭ、生成物であるＮＭＮの分解または副反応が起き、ＮＭＮが効率的に製造できないことがある。その場合、分解や副反応の原因となる遺伝子を破壊または欠失させた宿主を用いることができる。具体的には、以下の（ａ）〜（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子が、欠損または破壊されている宿主を用いることができる。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｂ）EC 3.5.1.19
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｄ）EC 3.5.1.42
（ｅ）EC 1.17.2.1
（ｆ）EC 1.17.1.5
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
【００５４】
（ａ）EC 3.1.3.5に分類される酵素は、5'-nucleotidaseであり、ＮＭＮを加水分解してニコチンアミドリボシド（ＮＲ）とリン酸を生成する反応を触媒する酵素を含む。5'-nucleotidaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｕｓｈＡ、ｓｕｒＥ、ｙｒｆＧ、ｙｊｊＧ等が挙げられる。例えば、Enzyme and Microbial Technology, 58-59(2014), 75-79には、大腸菌におけるＮＡＤ分解の主要な役割を担う酵素として、5'-nucleotidaseであるＵｓｈＡが報告されており、同酵素がＮＭＮ分解活性を有することが開示されている。本発明において破壊または欠失させる5'-nucleotidaseとしては、特にｕｓｈＡまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
【００５５】
（ｂ）EC 3.5.1.19に分類される酵素は、nicotinamidaseであり、ＮＡＭの分解に関与する。nicotinamidaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｐｎｃＡが挙げられる。
【００５６】
（ｃ）EC 2.4.2.1に分類される酵素は、purine-nucleoside phosphorylaseであり、ＮＲを加リン酸分解して、ＮＡＭとリボース−１−リン酸（Ｒ１Ｐ）とを生成する反応を触媒する酵素を含む。purine-nucleoside phosphorylaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｄｅｏＤが挙げられる。Molecular and General Genetics, 104(1969), 351-359には、ヌクレオシドの代謝に関する遺伝子群の一つとして、ｄｅｏＤが開示されている。本発明において破壊または欠失させるpurine-nucleoside phosphorylaseとしては、ｄｅｏＤまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
【００５７】
（ｄ）EC 3.5.1.42に分類される酵素は、nicotinamide mononucleotide
deamidaseであり、ＮＭＮを加水分解して、ＮａＭＮとアンモニアを生成する酵素である。nicotinamide mononucleotide deamidaseをコードする遺伝子としては、例えば、大腸菌のｐｎｃＣが挙げられる。THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 286(2011), 40365-40375には、Shewanella oneidensisおよび大腸菌のｐｎｃＣに関する知見が開示されている。本発明において破壊または欠失させるnicotinamide mononucleotide deamidaseとしては、ｐｎｃＣまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
【００５８】
（ｅ）EC 1.17.2.1および（ｆ）EC 1.17.1.5に分類される酵素は、nicotinate dehydrogenaseであり、ＮＡＭからのヒドロキシニコチン酸の副生に関与する可能性が考えられる。
【００５９】
（ｇ）EC 3.2.2.1に分類される酵素は、purine nucleosidaseであり、ＮＲを加水分解して、ＮＡＭとリボースを生成する反応を触媒する酵素を含む。purine nucleosidaseをコードする遺伝子としては、例えば、Ochrobactrum anthropiのＰｕ−Ｎが挙げられる（Applied and Environmental Microbiology, 67(2001), 1783-1787）。本発明において破壊または欠失させるpurine nucleosidaseとしては、Ｐｕ−Ｎまたはそのホモログ遺伝子が好ましい。
【００６０】
（ｈ）EC 3.2.2.3に分類される酵素は、uridine nucleosidaseであり、ＮＲを加水分解して、ＮＡＭとリボースを生成する反応を触媒しうる酵素を含む。uridine nucleosidaseをコードする遺伝子としては、例えば、Arabidopsis thalianaのＵＲＨ１が挙げられる（Plant Cell, 21(2009), 876-91）。本発明において破壊または欠失させるuridine nucleosidaseとしては、ＵＲＨ１またはそのホモログ遺伝子が好ましい。
【００６１】
（ｉ）EC 3.2.2.14に分類される酵素は、NMN nucleosidaseであり、ＮＭＮを加水分解して、ＮＡＭとＲ５Ｐを生成する反応を触媒する酵素である。Biochem. Biophys. Res. Commun., 49(1972), 264-9には、大腸菌のNMN nucleosidase活性が開示されている。本発明においては、NMN nucleosidase活性を有する酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させることが好ましい。
【００６２】
欠損または破壊されるのは、（ｄ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とであることが好ましく、（ｄ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、（ａ）に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とであることがより好ましい。詳細は、後述する第三の発明群の説明に記載する。
遺伝子を破壊または欠失させる方法は、特段限定されるものではなく、公知の遺伝子破壊または欠失方法で行うことができる。例えば、線状にした遺伝子破壊または欠失用断片を用いる方法、複製起点を含まない環状の遺伝子破壊または欠失プラスミドを用いる方法、グループIIイントロンを用いる方法、Ｒｅｄ−ＥＴ相同組換え法、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のゲノム編集を用いる方法などが挙げられる。
【００６３】
（発現ベクター）
本発明で用いられる、所定の各酵素をコードする遺伝子は、典型的には、発現ベクターに含まれた状態で形質転換体の宿主に導入される。一つの形質転換体において２つ以上の酵素を発現させる場合、１つの発現ベクターに、発現させる各酵素をコードする遺伝子の全てが含まれていてもよいし、宿主内で共存可能な２以上の発現ベクターに、発現させる各酵素をコードする遺伝子が適宜振り分けられて含まれていてもよい。例えば、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの発現が強化された形質転換体を作製する場合、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋをコードする遺伝子全てが含まれる１つの発現ベクターを用いてもよいし、ＮａｍｐｔとＰｒｓをコードする遺伝子を含む発現ベクターとＰｐｋをコードする遺伝子を含む発現ベクターの２つのベクターの組み合わせによって構成されていてもよい。
【００６４】
本発明で用いられる発現ベクターは、公知の手法により作製することができる。一般的には、所定の酵素をコードする遺伝子の上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入すればよい。あるいは、発現ベクターに転写プロモーターおよび／またはターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、そのベクターの転写プロモーターおよび／またはターミネーターを利用して、その間に所定の酵素をコードする遺伝子を挿入すればよい。上述したように、１つの発現ベクターに２つ以上の酵素をコードする遺伝子を含める場合、それらの遺伝子は全て同一のプロモーター下に挿入されていてもよいし、異なるプロモーター下に挿入されていてもよい。プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌宿主において利用できるのものとしては、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来ＰＬプロモーター及びＰＲプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターが挙げられる。
【００６５】
所定の各酵素をコードする遺伝子（核酸）は、例えば、（i）塩基配列情報に従い、プライマーを作製し、ゲノム等を鋳型として増幅することによって得ることもできるし、（ii）酵素のアミノ酸配列情報に従い、有機合成的にＤＮＡを合成することによって得ることもできる。形質転換体の宿主となる細胞に応じて、遺伝子は最適化されていてもよい。
【００６６】
発現ベクターに所定の酵素をコードする遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入してもよい。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。また、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含めることが好ましい。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、例えばアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【００６７】
発現ベクターは、宿主に応じて、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどから選ばれる適切なものを用いればよい。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス）、ｐＡＣＹＣ１８４（ニッポンジーン）、ｐＭＷ１１８（ニッポンジーン）、ｐＥＴシリーズベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）などを挙げることができる。また２以上の挿入箇所を有するベクターとしてはｐＥＴＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）等を挙げることができる。必要に応じて、これらのベクターを改変したものを用いることもできる。
【００６８】
所定の酵素の発現を強化する方法としては、上述のような発現ベクターを用いる方法が典型的であるが、それ以外の方法を利用することもできる。例えば、所定の酵素をコードする遺伝子に、適切なプロモーターやターミネーター、マーカー遺伝子等を連結させた発現カセットを宿主のゲノム上に挿入することで、所定の酵素の発現を強化することができる。発現カセットがゲノム上に挿入された形質転換体を取得する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、相同組換えにより発現カセットをゲノム上に挿入する場合は、所定の酵素の発現カセットと任意のゲノム領域の配列を有し、宿主内で複製不可能なプラスミドを用いて形質転換を行うことで、当該プラスミド全体または発現カセットが挿入された形質転換体を得ることができる。その際、ＳａｃＢ遺伝子（レバンスクラーゼをコード）等のネガティブ選択マーカーを搭載したプラスミドや、複製機構が温度感受性（ｔｓ）のプラスミドを用いることで、２回の相同組換えにより発現カセットのみがゲノム上にされた形質転換体を効率的に取得することもできる。また、発現カセットのみから成るＤＮＡ断片を用いて形質転換を行うことで、ゲノム上のランダムな位置に発現カセットが挿入された形質転換体を得ることもできる。
【００６９】
また、所定の酵素として宿主がゲノム上に元々有する酵素（内因性酵素）を利用する場合は、ゲノム上の当該酵素遺伝子のプロモーターを強力なものに置換することで、その発現を強化することもできる。プロモーターとしては、上述した発現ベクターにおいて用いるプロモーターを同様に利用することができる。
【００７０】
（無細胞タンパク質合成反応液）
無細胞タンパク質合成系は、生きた微生物や細胞等ではなく、種々の生物から抽出した無細胞抽出物に、アミノ酸、ＡＴＰ等のエネルギー分子、エネルギー再生系、マグネシウムイオン等の塩類、そして、発現させたいタンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を添加した無細胞タンパク質合成反応液により、タンパク質を試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で合成するシステムである。無細胞抽出物には、リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル化ｔＲＮＡ合成酵素、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子などの翻訳成分が含まれる。本明細書中では、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成反応を行うための溶液を、反応の前後を含めて、無細胞タンパク質合成反応液と呼ぶ。
【００７１】
本発明で用いる無細胞タンパク質合成系としては、所定の各酵素が本来の機能を有する状態で発現することができるものであればいかなる系でもよいが、例えば、コムギ胚芽由来合成系、大腸菌由来合成系、ウサギ網状赤血球由来系、昆虫細胞由来合成系、ヒト細胞由来合成系を用いることができる。また、必要な可溶性タンパク質因子を組換えタンパク質として調製するＰＵＲＥ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）  Ｓｙｓｔｅｍ等を用いてもよい。無細胞系でのタンパク質合成反応プロセスとしては、バッチ法、ＣＦＣＦ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ）法、ＣＥＣＦ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ）法、重層法等を用いることができる。また、発現させる酵素遺伝子の鋳型としては、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。鋳型としてＲＮＡを用いる場合は、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物などを用いることができる。
【００７２】
［第２工程］
第２工程は、必要に応じ、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液から処理物を調製する工程である。形質転換体の処理物としては、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体等が挙げられる。また、破砕菌体から調製した無細胞抽出物および精製酵素も本発明の処理物に含まれる。無細胞タンパク質合成反応液の処理物としては、無細胞タンパク質合成反応液から調製した精製酵素が挙げられる。さらには、形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液およびこれら処理物に対して安定化処理を行った安定化処理物も、本発明の処理物に含まれる。
【００７３】
休止菌体の調製は、公知の方法を用いて行うことができる。休止菌体とは、その増殖が実質的に停止した状態に置かれた菌体を意味する。具体的には、培養により増殖させた形質転換体を培地から回収した後、形質転換体が容易に利用可能な炭素源等を含まない緩衝液等に懸濁したり、回収した形質転換体を凍結させたり、乾燥させて粉末化したりすることにより調製することができる。形質転換体を培地から回収する方法は如何なる方法でもよく、例えば、遠心分離を用いた方法、膜ろ過を用いた方法等が挙げられる。遠心分離は、形質転換体を沈降させる遠心力が供給できるものであれば特に限定されることはなく、円筒型や分離板型などを利用することができる。遠心力としては、例えば、５００Ｇ〜２０，０００Ｇ程度で行うことができる。膜ろ過は、形質転換体を培地から回収することができれば、精密ろ過（ＭＦ）膜、限外ろ過（ＵＦ）膜いずれを用いて行ってもよい。形質転換体を懸濁する緩衝液としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれるものであれば如何なるものでもよく、例えば、リン酸緩衝液、アクリル酸緩衝液、トリス（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン）‐塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（２−（４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）やその他グッドの緩衝液（Ｇｏｏｄ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒｓ）等を用いることができる。形質転換体を凍結する場合は、上記の遠心分離等の操作により大半の水分を除去した状態、または適当な緩衝液に懸濁された状態で凍結すればよい。凍結する温度は、形質転換体を懸濁する緩衝液の成分によっても異なるが、実質的に形質転換体が凍結する温度であれば如何なる温度でもよく、例えば、−２１０℃〜０℃等の範囲で行えばよい。また、形質転換体を乾燥する場合、その乾燥方法としては、形質転換体の増殖が実質的に停止し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれる方法であれば如何なる方法でもよく、凍結乾燥法や噴霧乾燥法等が挙げられる。
【００７４】
膜透過性向上菌体の調製は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、有機溶媒や界面活性剤で形質転換体を処理することにより、基質や生成物が、形質転換体の細胞膜や細胞壁を通過しやすくなる。使用する有機溶媒や界面活性剤の種類としては、膜透過性が向上し、かつ、所定の各酵素の機能が保たれるものであれば特段限定されることはなく、有機溶媒であればトルエンやメタノール等、界面活性剤であればＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ  １００や塩化ベンゼトニウム等が挙げられる。
【００７５】
不活化菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば薬剤処理や加熱処理により行うことができる。薬剤による処理は、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤、塩酸アルキルジアミノエチルグリシンなどの両性イオン系界面活性剤などを用いることができる。また、エタノール等のアルコール類、２−メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン、シトルリン等のアミノ酸類なども挙げられる。加熱による処理は、目的の酵素が失活しない温度と時間で熱処理を行えばよい。
【００７６】
破砕菌体の調製は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ビーズミルによる磨砕処理、衝撃破砕装置による衝突処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等が挙げられ、いずれかの方法を単独または必要に応じ組み合わせて利用することができる。工業的規模で細胞の破砕を行う場合は、操作性、回収率、コスト等を勘案し、例えば、高圧処理や磨砕処理、衝突処理あるいはこれら処理に酵素処理等を組み合わせた処理を行うことが好ましい。
【００７７】
ビーズミルによる磨砕処理を行う場合、用いられるビーズは、例えば、密度２．５〜６．０ｇ／ｃｍ３、サイズ０．１〜１．０ｍｍのものを通常８０〜８５％程度充填することにより破砕を行うことができ、運転方式としては回分式、連続式いずれをも採用することができる。
【００７８】
高圧処理を行う場合、処理圧力は、細胞からの目的タンパク質回収率が十分高いものであれば特段限定されないが、例えば、４０〜２００ＭＰａ程度、好ましくは６０〜１５０ＭＰａ程度、より好ましくは８０〜１２０ＭＰａ程度の圧力で破砕を行うことができる。必要に応じて、装置を直列に配置したり、複数ステージ構造の装置を用いたりすることにより、多段階処理を行い、破砕および操作効率を向上させることも可能である。通常、処理圧力１０ＭＰａあたり２〜３℃の温度上昇が生じることから、必要に応じて冷却処理を行うことが好ましい。
【００７９】
衝突処理の場合、例えば、細胞スラリーを予め噴霧急速凍結処理（凍結速度：例えば１分間当たり数千℃）等によって凍結微細粒子（例えば５０μｍ以下）にしておき、これを高速（例えば約３００ｍ／ｓ）の搬送ガスによって衝突板に衝突させることで効率的に細胞を破砕することができる。
【００８０】
無細胞抽出物は、破砕菌体から破砕残渣（細胞膜や細胞壁等を含む不溶性画分）を除去することによって調製することができる。破砕残渣の除去は、公知の手法により行うことができ、例えば、遠心分離や膜ろ過、ろ布ろ過等を利用することができる。遠心分離操作は、上述したように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細であり、容易に沈降し難い場合は、必要に応じて凝集剤等を使用して残渣沈殿効率を上げることもできる。膜ろ過も、上述のように行うことができるが、形質転換体の破砕残渣が微細である場合には、特に限外ろ過（ＵＦ）膜を使用することができる。ろ布ろ過を行う場合には、ろ過助剤や凝集剤を併用して行うことができる。ろ過助剤としては、珪藻土やセルロースパウダー、活性炭などが挙げられる。凝集剤としては、カチオン系凝集剤、アニオン系凝集剤、両性系凝集剤、ノニオン系凝集剤等が挙げられる。上記いずれかの操作により、菌体が存在しない上清を回収し、無細胞化する（セルフリーにする）ことで、所定の各酵素を含む無細胞抽出物を調製することができる。
【００８１】
精製酵素の調製は、一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム等）、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ等）、アフィニティークロマトグラフィー（ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ等）、疎水性クロマトグラフィー（ｂｕｔｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ等）、陰イオンクロマトグラフィー（ＭｏｎｏＱカラム等））、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動等を、単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより行うことができる。
【００８２】
本発明においては、上述した形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、およびそれらの処理物に対して、安定化処理を行ったもの（安定化処理物）を用いることもできる。安定化処理は、未処理の状態よりも、環境因子（温度、ｐＨ、化学物質濃度等）に対する所定の各酵素の安定性、あるいは保存時の安定性が向上する処理であればいかなる処理でもよい。例えばアクリルアミド等のゲルへの包含、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類による処理（ＣＬＥＡ：Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅを含む）、無機担体（アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等）への担持処理等が挙げられる。
【００８３】
本発明で用いる基質や生成物は、極性が比較的高く、細胞膜や細胞壁が物質移動の律速となる可能性がある。従って、基質や生成物の透過性の観点から、本発明では、特に、破砕菌体、無細胞抽出物、精製酵素、またはそれらの安定化処理物を用いることが好ましい。
【００８４】
上述した形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物は、その酵素活性が保持される限り、如何なる条件で保存することもできる。所望により適切な条件下で（例えば−８０℃〜−２０℃、１日〜１年）それらの溶液を凍結し、使用時（第３工程の実施時）まで保存するようにしてもよい。
【００８５】
前述したように、所定の各酵素をコードする遺伝子を別個に含む形質転換体同士を組み合わせる場合、例えば、ＮａｍｐｔとＰｒｓの発現が強化された形質転換体およびＰｐｋの発現が強化された形質転換体を作製して組み合わせる場合は、（i）それぞれの形質転換体について別々に各処理を行ったのち、それらの処理物を混合するようにしてもよいし、（ii）それらの形質転換体を混合した後、一括して当該各処理を行ってもよい。
【００８６】
［第３工程］
第３工程は、第１工程を経た形質転換体または無細胞タンパク質合成反応液、または必要に応じてさらに第２工程を経たそれらの処理物を、酵素反応の各種原料となる基質と接触させる工程である。この工程においては、Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応がＰｐｋによるＡＴＰ再生反応と共役して行われる。Ｐｒｓによる第２反応では、ＡＴＰをリン酸源として基質がリン酸化されるため、また、Ｎａｍｐｔによる第３反応では、Ｎａｍｐｔ自身が有するＡＴＰ加水分解活性により自己リン酸化されるため、ＡＴＰが消費される。従って、両反応をＡＴＰ再生反応と共役して行うことで、消費されたＡＴＰを補いながら効率的に反応を進行させることができる。また、Ｐｒｓによる第２反応の生成物であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）は比較的不安定な化合物であるため、第２反応と第３反応を同一系内で行うことで、ＰＲＰＰ生成後、速やかにＮａｍｐｔによる第３反応を行うことができる。本発明においては、ＡＴＰ再生反応によりＡＤＰおよび／またはＡＭＰからＡＴＰが再生されるので、ＡＴＰは枯渇することはないが、反応中に維持したいＡＴＰ濃度に応じて、適度な量のＡＴＰを反応溶媒中に添加することが必要となる。この際、必要に応じて、ＡＴＰの代わりに、ＡＤＰまたはＡＭＰを反応溶媒中に添加してもよい。添加したＡＤＰやＡＭＰは、ＡＴＰ再生系によって系内ですぐにＡＴＰに再生されるため、実質的に、適度な量のＡＴＰを添加したのと同じ状態になるためである。また、これらを任意の割合で含有する混合物を添加してもよい。
【００８７】
第２反応および第３反応は、必要に応じて、ＰｐｋによるＡＴＰ再生反応を共役させたＲｂｋによる第１反応と組み合わせてもよい。両者を組み合わせる場合、Ｒｂｋによる第１反応をまず行い、その反応液を原料として、Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応を行ってもよいし、Ｒｂｋによる第１反応と、Ｐｒｓによる第２反応およびＮａｍｐｔによる第３反応を同じ反応系で行ってもよい。
【００８８】
Ｐｒｓによる第２反応とＮａｍｐｔによる第３反応は、Ｎａｍｐｔ、ＰｒｓおよびＰｐｋの３酵素の発現が強化された形質転換体、前記３酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させることにより行われる。
【００８９】
Ｒｂｋによる第１反応は、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボース、ＡＴＰ、およびポリリン酸と接触させることにより行われる。
【００９０】
第３工程で用いる上記原料は、一般的な供給業者から購入したものを用いることもできるし、自ら反応を行って合成したものを用いることもできる。例えば、Ｒ５Ｐは、市販品を用いることもできるが、原料コストの観点から、Ｒｂｋによる第１反応、すなわち、ＲｂｋおよびＰｐｋの２酵素の発現が強化された形質転換体、前記２酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、リボースおよびポリリン酸と接触させることにより合成したものを用いることが好ましい。
【００９１】
上記原料の一つであるポリリン酸は、種々の鎖長のものが知られている。本発明において使用するポリリン酸の鎖長は、ＡＴＰ再生反応が効率的に行えるものであれば如何なる鎖長のものでもよいが、溶解した際の溶液の粘度やコストの観点から、鎖長は３〜１００程度が好ましく、３〜３０程度がさらに好ましい。
【００９２】
第３工程では、必要に応じて、上記原料以外の化合物を、所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物と接触させ、あるいは反応溶媒中（製造系内）に含めるようにしてもよい。例えば、各酵素が機能を発揮するための成分として、マグネシウムイオン等の金属イオンを含めることが適切である。また、バッファー成分を含めることも好ましい。
【００９３】
用いる形質転換体が実質的に生きている場合、すなわち、細胞増殖能を維持している場合、実質的に形質転換体が増殖しない条件で反応を行うことが好ましい。そのような条件で反応を行うことにより、本反応における基質や生成物が、形質転換体の増殖に利用されたり、分解されたりすることなく、高い収率で目的生成物として生産されることが期待できる。実質的に形質転換体が増殖しない条件とは、実質的に反応系内の形質転換体の数が増加しない条件であれば如何なる条件でもよい。例えば、形質転換体が容易に利用可能な炭素源（グルコース等）を含まない溶液中で反応を行うことが挙げられる。
【００９４】
反応溶媒中（製造系内）に含まれる、所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物の量、すなわち、より具体的にはＮａｍｐｔ、Ｐｒｓ、ＲｂｋおよびＰｐｋそれぞれの量は、適宜調節することができる。同様に、反応媒体中に含まれる、Ｒ５Ｐ、ＮＡＭ、ＡＴＰ、ポリリン酸、リボース、さらに必要に応じて用いられるその他の原料の量も、適宜調節することができる。反応溶媒中（製造系内）の上記各物質の濃度は次の通りである。
【００９５】
Ｎａｍｐｔの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。Ｐｒｓの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。Ｒｂｋの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。Ｐｐｋの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。所定の各酵素の発現が強化された形質転換体、所定の各酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物の反応溶媒への添加量を適宜調整することにより、各酵素の反応溶媒中の濃度を上記の範囲に調節することが可能である。
【００９６】
Ｒ５Ｐの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。リボースの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。ＮＡＭの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌである。ＡＴＰの濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌである。ポリリン酸の濃度は、例えば１μｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである。これらの原料の反応溶媒への添加量などの調整により、各原料の反応溶媒中の濃度を上記範囲に調節することが可能である。反応溶媒への添加は、原料に応じて、第３工程の最初に一括で所定量を仕込むようにしてもよいし、第３工程の最初および／または途中の適切な段階で、順次所定量を添加するようにしてもよい。
【００９７】
上述したような各物質の濃度以外の、酵素反応を進行させるための条件、例えば温度、時間なども、適宜調節することができる。反応温度は、各酵素の触媒効率が最適となる範囲で調節することが好ましい。反応時間は、目的化合物であるＮＭＮの生成量が所定の量に到達するまでとすることができる。
【００９８】
生成したＮＭＮは、常法に従い、製造系から回収し、適宜濃縮、精製することができる。回収・精製の方法は、ＮＭＮの純度を向上させることができ、かつ効率的にＮＭＮを回収することができる方法であれば、如何なる方法を用いることもできるが、例えば、以下のような方法が挙げられる。ＮＭＮ合成反応後、菌体を用いて反応を行った場合は、遠心分離や膜ろ過等の手段により、菌体を除去することができる。あるいは、無細胞抽出物や精製酵素を用いて反応を行った場合は、限外ろ過膜によるろ過や、過塩素酸等を添加して沈殿させた後に遠心分離を行うこと等によってタンパク質等を除去することができる。過塩素酸による処理を行った場合は、水酸化カリウムなどによりpHを弱酸性に戻し、生じた過塩素酸カリウムの沈殿を再度遠心分離により除去する。菌体またはタンパク質を除去した後、必要に応じて、活性炭吸着による洗浄処理を行うことができる。ＮＭＮを含む水溶液を活性炭と接触させ、ＮＭＮを吸着させる。ろ紙等を用いてＮＭＮが吸着した活性炭をろ過した後、イソアミルアルコール等の溶媒で洗浄することで、一定の不純物を除去することができる。続いて、陰イオン交換樹脂により処理することで、さらに精製を行うことができる。ＮＭＮを含む溶液をＤｏｗｅｘ等の陰イオン交換樹脂に通し、吸着されたＮＭＮを水で溶出することができる。さらに、得られたＮＭＮ水溶液のｐＨを酸性にし、大量のアセトンを加えることで、ＮＭＮを沈殿として得ることができる。この沈殿を乾燥することで、精製されたＮＭＮを得ることができる。
【００９９】
本発明は、反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和が、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下となるように行うことができる。これを行うための手段としては、結果として、ＮＭＮ製造のために添加するＡＴＰ等の使用量を削減することができれば、如何なる方法を用いることもできるが、例えば、以下に示す手段を単独でまたは適宜組み合わせて、実施することができる。これら手段の詳細は、後述する第四の発明群の説明に記載する。
（１）ＡＴＰ再生系の共役
（２）ＰＰａｓｅの共存
（３）バクテリア由来Ｎａｍｐｔの利用
（４）不要遺伝子を破壊または欠失させた宿主の利用
（５）適切な基質濃度
【０１００】
−第二の発明群−
本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第二の発明群は、ＰＰａｓｅの存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させる工程を含む。
【０１０１】
第二の発明群によるＮＭＮの製造方法は、以下の点を除き、第一の発明群と同様に、第１工程、第２工程および第３工程を順次行うことにより実施される。すなわち、第１工程および第２工程は、少なくともＮａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、当該酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を調製するとともに、ＰＰａｓｅの発現が強化された形質転換体乃至は特段発現は強化されていないが内在性酵素としてＰＰａｓｅを発現している微生物等、当該酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を調製するための工程とし、第３工程において、そのような第１工程および第２工程を経た形質転換体、無細胞タンパク質合成反応液またはそれらの処理物を、少なくともＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させればよい点である。
【０１０２】
・ＰＰａｓｅ
ＰＰａｓｅ（EC number: 3.6.1.1）は、ピロリン酸を２分子のリン酸に加水分解する酵素である。本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第二の発明群では、ＰＰａｓｅの存在下で、第３反応を行うことにより、第３反応を極めて効率的に進行させることができる。
【０１０３】
Ｎａｍｐｔによる第３反応では、ＮＭＮとともにピロリン酸が副生する。一般的な酵素反応の見地からは、第３反応系にＰＰａｓｅを加えることで、副生物であるピロリン酸がリン酸に分解され、ＮＭＮ生成方向の反応が促進されることは予測される。しかし、Ｎａｍｐｔの場合、必ずしもそれは自明ではない。なぜならば、ピロリン酸を分解してしまうと、Ｎａｍｐｔ反応が継続的に進行しない可能性があるからである。Ｎａｍｐｔは、ＡＴＰを加水分解して、自己リン酸化によって活性化されることが知られている。Ｎａｍｐｔによる第３反応が継続するためには、反応毎に自己リン酸化されたＮａｍｐｔの脱リン酸化が必要であり、ピロリン酸は、その脱リン酸化のトリガー物質であるとされている（Biochemistry 47, 11086-11096(2008)）。従って、ＰＰａｓｅによりピロリン酸を除去してしまうと、Ｎａｍｐｔの脱リン酸化が起きず、反応が継続しない可能性が十分に考えられる。しかし、第二の発明群では、第３反応をＰＰａｓｅの存在下で行うことにより、顕著に第３反応を促進することができる。
【０１０４】
ＰＰａｓｅとしては、例えば、酵母由来のもの（P00817）、大腸菌由来のもの（NP_418647）、枯草菌由来のもの（P37487）、Thermus thermophilus由来のもの（P38576）、Streptococcus gordonii由来のもの（P95765）、Streptococcus mutans（O68579）などが挙げられる。
【０１０５】
ＰＰａｓｅは、第３反応系に加えることが可能であればいかなる形態でもよく、またいかなる方法で調製してもよい。具体的には、まず、第一の発明群における第１工程と同様に、ＰＰａｓｅをコードする遺伝子を含む形質転換体を作製して培養し、または当該各酵素をコードする遺伝子を含む無細胞タンパク質合成反応液でタンパク質合成反応を行い、当該各酵素を発現させる。また、ＰＰａｓｅは、通常の微生物等においては、生存に必要な酵素として一定量発現しているため、特段発現が強化されていない微生物等を培養して、そのまま用いることができる。続いて、第一の発明群における第２工程と同様に、第１工程を経た形質転換体、特段発現が強化されていない微生物等または無細胞タンパク質合成反応液から処理物を調製することができる。あるいは、処理物の一態様として市販のＰＰａｓｅ精製酵素を利用することもできる。市販のＰＰａｓｅ精製酵素としては、シグマ・アルドリッチ社の酵母由来ＰＰａｓｅ精製酵素（製品番号10108987001）などが挙げられる。
【０１０６】
上記のようにして得られたＰＰａｓｅの存在下で、Ｎａｍｐｔの発現が強化された形質転換体、前記酵素を発現させた無細胞タンパク質合成反応液、またはそれらの処理物を、ＮＡＭおよびＰＲＰＰと接触させることで、第二の発明群によるＮＭＮの製造方法を実施することができる。第二の発明群により、第３反応を極めて効率的に進行させることができ、ＮＭＮを効率的に製造することができる。第二の発明群による第３反応は、第３反応単独で行うこともできるが、第１反応、第２反応およびＡＴＰ再生反応の一つ以上の反応と組み合わせて、同一の反応系で行うこともできる。換言すれば、本発明の第一の発明群における第３反応の実施形態を、本発明の第二の発明群で規定する第３反応とすることにより、第一の発明群および第二の発明群を統合したＮＭＮの製造方法を実施することも可能である。
【０１０７】
用いる形質転換体が実質的に生きている場合、すなわち、細胞増殖能を維持している場合、実質的に形質転換体が増殖しない条件で反応を行うことが好ましい。そのような条件で反応を行うことにより、本反応における基質や生成物が、形質転換体の増殖に利用されたり、分解されたりすることなく、高い収率で目的生成物として生産されることが期待できる。実質的に形質転換体が増殖しない条件とは、実質的に反応系内の形質転換体の数が増加しない条件であれば如何なる条件でもよい。例えば、形質転換体が容易に利用可能な炭素源（グルコース等）を含まない溶液中で反応を行うことが挙げられる。
【０１０８】
本発明における第２工程の形態としては、特に処理物が精製酵素であることが好ましい。精製酵素を用いることで、反応物（基質）や生成物の分解または副反応が抑制できるため、本発明による第３反応の促進効果をより享受することができる。
【０１０９】
−第三の発明群−
本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第三の発明群は、（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子と、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子とが破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともニコチンアミド（ＮＡＭ）と接触させる工程を含む。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
【０１１０】
第三の発明群によるＮＭＮの製造方法は、以下の点を除き、第一の発明群と同様に、第１工程、第２工程および第３工程を順次行うことにより実施される。すなわち、第１工程および第２工程は、各種ＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子が破壊または欠失され、かつ、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｎａｍｐｔ）の発現が強化されている形質転換体またはそれらの処理物を調製するための工程とし、第３工程において、そのような第１工程および第２工程を経た形質転換体またはそれらの処理物を、少なくともＮＡＭと接触させればよい点である。
【０１１１】
各種ＥＣ番号に分類される酵素については、前述の通りである。大腸菌等の形質転換体またはそれらの処理物を用いてＮＭＮを合成する場合、これらの酵素は、生成したＮＭＮを分解し、結果としてＮＭＮの生産量を低下させる要因となる。宿主が有するＮＭＮの分解経路としては、ＮＡＭを生じる分解経路と、ニコチン酸モノヌクレオチド（ＮａＭＮ）を生じる分解経路の２つが知られている（図９）。本発明者らは、両方の経路を弱化する（経路上にある一つ以上の酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失する）ことで、片方の経路を弱化するよりも、ＮＭＮの分解を飛躍的に抑制できることを見出し、第三の発明群を完成させた。
【０１１２】
ＮＭＮからＮａＭＮを生じる分解経路を弱化するためには、図９に示すように、（ｄ）EC 3.5.1.42に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させればよい。
【０１１３】
ＮＭＮからＮＡＭを生じる分解経路を弱化するためには、図９に示すように、以下の（ａ）（ｃ）（ｇ）（ｈ）（ｉ）に示されるいずれか一つ以上のＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させればよい。
（ａ）EC 3.1.3.5
（ｃ）EC 2.4.2.1
（ｇ）EC 3.2.2.1
（ｈ）EC 3.2.2.3
（ｉ）EC 3.2.2.14
【０１１４】
ＮＭＮの分解に直接的に関わる酵素であることから、（ａ）EC 3.1.3.5または（ｉ）EC 3.2.2.14に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させることが好ましく、（ａ）EC 3.1.3.5に示されるＥＣ番号に分類される酵素をコードする遺伝子を破壊または欠失させることがより好ましい。
【０１１５】
遺伝子を破壊または欠失させる方法は、特段限定されるものではなく、第一の発明群の説明に記載した通りである。本発明の第三の発明群は、本発明の第一および第二の発明群の一方または両方に統合して、ＮＭＮの製造方法を実施することも可能である。
【０１１６】
−第四の発明群−
本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第四の発明群では、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にすることができる。
【０１１７】
これまで述べてきた第１反応、第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においてはＡＴＰが必要となる。すなわち、第１反応では、リボースからのＲ５Ｐの生成に伴い、ＡＴＰがＡＤＰに変換されるため、１モルのＲ５Ｐの生成につき、１モルのＡＴＰが使用される。第２反応では、Ｒ５ＰからのＰＲＰＰの生成に伴い、ＡＴＰがＡＭＰに変換されるため、１モルのＰＲＰＰの生成につき、１モルのＡＴＰが使用される。第３反応では、ＰＲＰＰからのＮＭＮの生成に際し、その反応自体にＡＴＰは必須ではない。しかし、先述のように、ＮａｍｐｔにはＡＴＰ加水分解活性があり、ＡＴＰの加水分解によってＮａｍｐｔが自己リン酸化され、ＮＭＮ生成に有利な方向に酵素学的パラメータや化学平衡が変化する。従って、第３反応系内にＡＴＰが十分に存在する場合は、ＰＲＰＰからのＮＭＮの生成に伴い、実質的に、１モルのＰＲＰＰの生成につき、１モル以上のＡＴＰが使用されることになる。すなわち、Ｒ５Ｐを原料とした第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においては、１モルのＮＭＮの生成につき、計２モル以上のＡＴＰが、リボースを原料とした第１反応、第２反応および第３反応によるＮＭＮの製造においては、１モルのＮＭＮの生成につき、計３モル以上のＡＴＰが使用されることになる。
【０１１８】
ＡＴＰは高価な化合物であるため、ＮＭＮを安価に製造しようとする場合、その使用量はできるだけ少ないほうが望ましい。本発明のＮＭＮの製造方法のうち、第四の発明群を利用することで、ＮＭＮの製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を、生成するＮＭＮのモル数の０．５当量以下にすることができる。
【０１１９】
第四の発明群によるＮＭＮの製造方法は、ＮＭＮ製造のために添加するＡＴＰ等の使用量を削減することができれば、如何なる方法を用いて行うこともできるが、例えば、以下に示す手段を、単独でまたは適宜組み合わせて、実施することができる。
【０１２０】
（１）ＡＴＰ再生系の共役
副生したＡＤＰまたはＡＭＰをＡＴＰに再生することができる系を、少なくとも、第２反応および第３反応を含むＮＭＮ生成反応系と共役させることで、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。ＡＴＰ再生系としては、ＡＭＰおよびＡＤＰからＡＴＰを再生できる系であればいかなる系でもよく、例えば、ポリリン酸をリン酸源としてＰｐｋを用いる系、ホスホエノールピルビン酸をリン酸源としてピルビン酸キナーゼを用いる系、クレアチンリン酸をリン酸源としてクレアチンリン酸キナーゼを用いる系等が挙げられるが、リン酸源のコストの観点からは、ポリリン酸をリン酸源としてＰｐｋを用いる系が好ましい。ポリリン酸とＰｐｋを用いたＡＴＰ再生系を共役させたＮＭＮ生成反応は、具体的には、第一の発明群における第３工程に記載されたように実施することができる。
【０１２１】
（２）ＰＰａｓｅの共存
ＮＭＮ生成反応系にＰＰａｓｅを共存させることにより、副生物であるピロリン酸がリン酸に分解され、ＮＭＮ生成方向の反応が促進されることで、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。ＰＰａｓｅを共存させたＮＭＮ生成反応は、具体的には、第二の発明群に記載されたように実施することができる。
【０１２２】
（３）バクテリア由来Ｎａｍｐｔの利用
第３反応を触媒する酵素Ｎａｍｐｔとして、バクテリア由来のＮａｍｐｔを用いることにより、ＮＭＮの生成が効率的に進行し、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。バクテリア由来のＮａｍｐｔとしては、第一の発明群における第１工程に記載されたものを利用することができる。
【０１２３】
（４）不要遺伝子を破壊または欠失させた宿主の利用
形質転換体、形質転換体から調製した休止菌体、膜透過性向上菌体、不活化菌体、破砕菌体、破砕菌体から調製した無細胞抽出物およびこれらに対して安定化処理を行った安定化処理物を用いてＮＭＮの生成反応を行う場合、反応物（基質）や生成物の分解、あるいは副反応の原因となる遺伝子を破壊または欠失させた宿主を用いることができる。具体的には、第一の発明群における第１工程に記載された遺伝子のいずれか一つ以上を、破壊または欠失させた宿主を用いることができる。好ましくは、第三の発明群に記載された遺伝子破壊または欠失させた宿主を用いることができる。
【０１２４】
（５）適切な基質濃度
化学平衡や酵素の基質親和性の観点から、反応系内のリボースやＮＡＭ濃度を高めることによって、ＮＭＮ生成速度や生成量の向上が期待でき、結果として、ＮＭＮ製造のために反応系に添加するＡＴＰ、ＡＤＰおよびＡＭＰ各モル数の総和を削減することができる。一方、ＡＴＰも、反応系内の濃度を高めることによって、同様の効果は期待できるが、必要以上にＡＴＰを添加しても、それに見合ったＮＭＮ生成量の増加がなければ、ＮＭＮを１モル生成させるために用いるＡＴＰのモル数は増加してしまう。すなわち、適切な量のＡＴＰを反応系に添加することで、効率的にＮＭＮを製造することができる。反応系に添加するＡＴＰのモル数は、生成するＮＭＮのモル数の１当量以下が好ましく、０．５当量以下がより好ましく、０．１当量以下がさらに好ましい。
【０１２５】
本発明の第四の発明群は、本発明の第一、第二および第三の発明群の一つまたは二つ以上に統合して、ＮＭＮの製造方法を実施することも可能である。
【実施例】
【０１２６】
［実施例１］＜ＡＴＰ再生系を利用したリボースからのＮＭＮ合成＞
本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）
Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）、Homo sapiens由来（NP_002755）
Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）
Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）【０１２７】
（１）発現プラスミドの作製
各酵素の発現プラスミドを以下のように作製した。表１の「由来」に記載された生物種由来の各酵素について、同表中の「アミノ酸配列」に記載された各配列番号で示されるアミノ酸配列から成る各酵素タンパク質をコードするＤＮＡ（表１の「塩基配列」に記載された各配列番号で示される塩基配列から成る）を合成し、それぞれ発現ベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（遺伝子合成はジェンスクリプトジャパンで実施、大腸菌発現用にコドンを最適化）。得られた各プラスミドを、表１の「発現プラスミド」に示されるように命名した。【０１２８】
【表１】
2019065876.tif 000003
【０１２９】
（２）各酵素の発現が強化された形質転換体の作製
大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテントセル（Ｚｉｐ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）、フナコシ）を氷上で融解し、（１）で作製した各プラスミドＤＮＡ溶液を混合して氷上で１０分間静置した。４２℃で４５秒間ヒートショックを加えた後、再度氷冷し、ＳＯＣ培地を添加した。３７℃で１時間振とう培養を行った後、ＬＢ寒天培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌ含有）に塗布し、３７℃で一晩静置培養を行った。得られたコロニーを各酵素の発現が強化された組換え体とした。【０１３０】
（３）組換え体の培養
各酵素の発現が強化された組換え体のコロニーを、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  １（Ｍｅｒｃｋ）を添付プロトコールに従って添加したＬＢ培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む）２ｍｌに植菌した。温度３７℃、振とう回転数２００ｒｐｍで３時間培養を行った後、温度１７℃、回転振とう数２００ｒｐｍに変更して、さらに１８時間培養を行った。【０１３１】
（４）無細胞抽出物の調製
（３）で得られた培養液を遠心分離（５，０００×ｇ、１０分間）し、上清を廃棄した。沈殿した菌体に、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ  ７．５）を添加し、波長６３０ｎｍの濁度が１０となるように調整した。ただし、Ｐｒｓ発現菌体については、５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて行った。バッファー菌体懸濁液０．５ｍｌをＢｉｏｒｕｐｔｏｒ（コスモバイオ）で１５分間破砕した。破砕液を遠心分離（５，０００×ｇ、１０分間）し、得られた上清を無細胞抽出物とした。無細胞抽出物のタンパク質濃度は、ＢＳＡ（牛血清アルブミン、バイオラッド）を標準タンパク質として、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（バイオラッド）を用いて測定した。【０１３２】
（５）ＮＭＮ合成反応
（４）で調製した無細胞抽出物を用いてＮＭＮ合成反応を行った。反応液量を１００μＬとし、表２（Ｎｏ．１−２、１−４）に示す組成で各反応液を調製し、３７℃で静置反応を行った。【０１３３】
【表２】
2019065876.tif 000004
【０１３４】
反応開始直後（０時間後）、３時間後および６時間後に、反応液１０μＬずつをサンプリングした。サンプリングした反応液を（６）に記載するＨＰＬＣ移動相９０μＬと混合し、すぐに氷冷することで反応を停止した。希釈液を限外ろ過膜（セントリカット超ミニ、分画分子量１０，０００、クラボウ）でろ過し（５，０００×ｇ、１０分間）、ろ液をＨＰＬＣで分析した。【０１３５】
（６）ＮＭＮの分析
ＮＭＮ合成反応サンプルの分析は、ＨＰＬＣにより以下の条件で行った。
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ  ＬＣ−１８−Ｔ（シグマ・アルドリッチ）
移動相：０．０５Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ  ７）
流速：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２６１ｎｍ
カラム温度：３０℃【０１３６】
（７）実験結果
実験結果を図２に示す。Ｐｐｋを添加したサンプルＮｏ．１−２とＮｏ．１−４では、それぞれ０．５ｍＭ、０．６ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０５μｍｏｌ、０．０６μｍｏｌ）のそれぞれ０．２当量、０．１７当量であった。また、Ｐｒｓは、Bacillus subtilis由来（ＢｓＰｒｓ）、Homo sapiens由来（ＨｓＰｒｓ）のいずれでもＮＭＮが生成することが確認された。以上の結果から、ＡＴＰ再生酵素であるＰｐｋを共存させることで、リボースから効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。【０１３７】
［比較例１］＜ＡＴＰ再生系を利用しないリボースからのＮＭＮ合成＞
（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
本比較例では、実施例１（２）〜（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。【０１３８】
（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。反応液量を１００μＬとし、表２（Ｎｏ．１−１、１−３）に示す組成で各反応液を調製すること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０１３９】
（３）実験結果
実験結果を図２に示す。Ｐｐｋを添加しなかったサンプルＮｏ．１−１およびＮｏ．１−３では、ＮＭＮの生成は検出限界以下であった。【０１４０】
［実施例２］＜冷凍保存した無細胞抽出物によるＮＭＮの合成＞
（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
本実施例では、ＰｒｓとしてBacillus subtilis由来（ＢｓＰｒｓ）のみを用いること以外は、実施例１（２）〜（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。調製直後に、（２）で後述するＮＭＮ合成反応を行った。また、得られた各無細胞抽出物を−２０℃で保存した。１か月間後、保存しておいた無細胞抽出物を用いて、再度ＮＭＮ合成反応を行った。【０１４１】
（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（１）で得られた調製直後および１か月間保存後（−２０℃保存）の無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表３に示す組成で調製すること、および反応開始後６時間でサンプリングすること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０１４２】
【表３】
2019065876.tif 000005
【０１４３】
（３）実験結果
無細胞抽出物を−２０℃で保存したＮｏ．２−２は、無細胞抽出物調製直後のサンプルＮｏ．２−１と同様、反応６時間後で０．５ｍＭのＮＭＮ生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０５μｍｏｌ）の０．２当量であった。従って、凍結保存することで、ＮＭＮ合成能を有した状態で、無細胞抽出物が保存可能であることが示された。【０１４４】
［実施例３］＜Ｐｒｓ変異体を利用したＮＭＮの合成＞
本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）
Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）Ａｓｎ１２０Ｓｅｒ変異体（ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ）およびＬｅｕ１３５Ｉｌｅ変異体（ＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉ）
Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）
Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）
ＢｓＰｒｓＮ１２０ＳおよびＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉは、１２０番目のアスパラギンがセリンに、１３５番目にロイシンがイソロイシンにそれぞれ置換されている。両変異体の生物種由来、アミノ酸配列を示す配列番号、ＤＮＡの塩基配列を示す配列番号、発現プラスミド名をそれぞれ表４に示す。【０１４５】
【表４】
2019065876.tif 000006
【０１４６】
（１）Ｐｒｓ変異体発現プラスミドの作製
Ｐｒｓ変異体を発現するプラスミドを以下のように作製した。表１に記載したpEBsPrsを鋳型として、変異導入ＰＣＲ反応を行った。変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Ｐｒｓ変異体名を表５に示す。【０１４７】
【表５】
2019065876.tif 000007
【０１４８】
変異導入ＰＣＲ反応は、表６に示す反応液組成および表７に示す反応条件にて行った。【０１４９】
【表６】
2019065876.tif 000008
【０１５０】
【表７】
2019065876.tif 000009
【０１５１】
ＰＣＲ反応終了後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、添付プロトコールに従ってＰＣＲ産物を精製した。生成したＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した反応液を用いて、大腸菌ＨＳＴ０８（タカラバイオ）を形質転換した。出現したコロニーからプラスミド抽出を行い、プライマーＴ７−ＰＰ（配列番号１９）およびＴ７−ＴＰ（配列番号２０）を用いて塩基配列の確認を行った。正しく変異が導入された各プラスミドを表４に記載した各変異体Ｐｒｓ発現プラスミドとした。【０１５２】
（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
Ｐｒｓとして、ＢｓＰｒｓＮ１２０ＳおよびＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉを用いること以外は、実施例１（２）〜（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。【０１５３】
（３）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表８に示す組成で調製すること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０１５４】
【表８】
2019065876.tif 000010
【０１５５】
（４）実験結果
実験結果を図３に示す。ＢｓＰｒｓＮ１２０ＳおよびＢｓＰｒｓＬ１３５Ｉを用いた場合、反応６時間後には野生型よりも高いＮＭＮ生成量を示した。Ｐｒｓを添加しない場合、ＮＭＮの生成は認められなかった。以上の結果から、Ｐｒｓ変異体を用いることで、効率的にＮＭＮを合成できることが示された。【０１５６】
［実施例４］＜基質濃度の検討＞
（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
本実施例では、Ｐｒｓとして、実施例３記載のＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓを用いること以外は、実施例１（２）〜（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。【０１５７】
（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表９に示す組成で調製すること、および反応開始後１８時間でサンプリングすること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０１５８】
【表９】
2019065876.tif 000011
【０１５９】
（３）実験結果
実験結果を図４に示す。ポリリン酸（Ｐｏｌｙ−Ｐ）濃度は１０ｍＭよりも５ｍＭとしたほうが、全体的にＮＭＮの生成量が多いことが確認された。ポリリン酸濃度が５ｍＭで、基質リボース濃度が３０ｍＭの場合、もう一つの基質であるニコチンアミド濃度は６ｍＭの場合（サンプルＮｏ．４−１、４−４）よりも２０ｍＭの場合（サンプルＮｏ．４−２、４−５）のほうが、ＮＭＮ生成量は１．７倍以上高くなることが確認された。ただし、マグネシウム濃度による影響はほとんど見られなかった。一方、両基質を同じ比率で２倍濃度とした場合（サンプルＮｏ．４−３、４−６）、マグネシウム濃度１０ｍＭ（サンプルＮｏ．４−３）ではＮＭＮ生成量は微増に留まったが、マグネシウム濃度２０ｍＭ（サンプルＮｏ．４−６）では、ＮＭＮ生成量が増加し、２．６ｍＭ生成した。サンプルＮｏ．４−６では、添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２６μｍｏｌ）の０．３８当量であった。以上の結果から、ＮＭＮの効率的な生成には、リボース、ニコチンアミド、ポリリン酸、マグネシウムの濃度を適切に設定することが重要であることが示された。【０１６０】
［実施例５］＜バクテリア由来およびヒト由来Ｎａｍｐｔ精製酵素を用いたＮＭＮ合成＞
本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＨｄＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）、Deinococcus radiodurans由来（AE001890）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＤｒＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）、Shewanella oneidensis由来（NP_717588）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＳｏＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）およびヒト（Homo sapiens）由来（NP_005737）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＨｓＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）
Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）ＰｒｓのＡｓｎ１２０Ｓｅｒ変異体（ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ）
Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）Ｐｐｋ
Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）Ｒｂｋ【０１６１】
（１）Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ発現プラスミドの作製
バクテリア由来の各種ＮａｍｐｔにＨｉｓタグが付加されたタンパク質を発現するプラスミドを以下のように作製した。まず、Deinococcus radiodurans由来（AE001890）およびShewanella oneidensis由来（NP_717588）の各酵素について、表１０中の「アミノ酸配列」に記載された各配列番号で示されるアミノ酸配列から成る各酵素タンパク質をコードするＤＮＡ（表１０の「塩基配列」に記載された各配列番号で示される塩基配列から成る）を合成し、それぞれ発現ベクターｐＥＴ−２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩサイトにクローニングした（遺伝子合成はジェンスクリプトジャパンで実施）。得られた各プラスミドを、表１０の「発現プラスミド」に示されるように命名した。【０１６２】
【表１０】
2019065876.tif 000012
【０１６３】
続いて、作成したpEDrNampt、pESoNamptおよびpEHdNampt（実施例１記載）を鋳型として、ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加するための変異導入ＰＣＲ反応を行った。鋳型プラスミド名、変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ発現プラスミド名を表１１に示す。【０１６４】
【表１１】
2019065876.tif 000013
【０１６５】
Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ発現プラスミドの作製は、表１１に示す各種鋳型プラスミドと変異導入プライマーを用いる以外は、実施例３（１）と同様の操作により、変異導入ＰＣＲ反応から塩基配列確認までを行った。正しくＨｉｓタグが付加されたプラスミドを表１１に記載した各プラスミドとした。【０１６６】
（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
実施例４（１）と同様の操作により、各酵素を発現する組換え体の作製、培養および無細胞抽出物の調製を行った。ただし、バクテリア由来Ｎａｍｐｔについては、（１）で作製したＨｉｓタグ付加発現プラスミドを用いて組換え体の作製および培養を行い、Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔを含む無細胞抽出物を調製した。その際、菌体を懸濁するバッファーとしては、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ  ８．０）を用いた。【０１６７】
（３）Ｎａｍｐｔ精製酵素の調製
（２）で調製したバクテリア由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔを含む無細胞抽出物を用いて、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔの精製を行った。ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（タカラバイオ）２００μＬを１．５ｍｌチューブに採取し、遠心分離（５０００ｇ、２分間）により樹脂を沈殿させた。上清を捨て、蒸留水１ｍｌを加えて懸濁した後、再度遠心分離を行った。この一連の洗浄操作を計２回行った後、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ  ８．０）を用いて同様に、２回洗浄を行った。洗浄後の樹脂に、各バクテリア由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔの無細胞抽出物１ｍｌを添加し、４℃で１時間穏やかに振とうした。遠心分離により無細胞抽出物を除いた後、Ｗａｓｈバッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）を用いて２回洗浄を行った。遠心分離によりＷａｓｈバッファーを除いた後、Ｅｌｕｔｉｏｎバッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  塩化ナトリウム、１５０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．０）を１００μＬ添加した。遠心分離により上清を回収した後、再度、Ｅｌｕｔｉｏｎバッファーを１００μＬ添加した。この一連の操作を３回行い、得られた溶出液を混合した。混合した溶出液を、煮沸洗浄した透析チューブ（三光純薬）に入れ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ  ７．５）を用いて透析を行った。透析後の溶液を回収し、各バクテリア由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔの精製酵素溶液とした。【０１６８】
（４）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（２）で得られたＮａｍｐｔ以外の各酵素の無細胞抽出物と、Ｎａｍｐｔ精製酵素を用いてＮＭＮ合成反応および分析を行った。バクテリア由来のＮａｍｐｔ精製酵素としては、（３）で調製した３種のＨｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ精製酵素を用いた。ヒト由来Ｎａｍｐｔ精製酵素（ＨｓＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）としては、市販されているヒト由来Ｈｉｓタグ付加Ｎａｍｐｔ精製酵素（ＣＹ−Ｅ１２５１、ＭＢＬ）を用いた。各反応液を表１２に示す組成で調製すること、反応開始後１２時間にサンプリングすること以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０１６９】
【表１２】
2019065876.tif 000014
【０１７０】
（５）実験結果
実験結果を図５に示す。バクテリア由来Ｎａｍｐｔ（ＨｄＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ、ＤｒＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ、ＳｏＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）を用いた場合、１．４ｍＭから２．４ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．１４〜０．２４μｍｏｌ）の０．０４２〜０．０７１当量であった。一方、ヒト由来Ｎａｍｐｔ（ＨｓＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）を用いた場合、ＮＭＮの生成量は０．６ｍＭであった。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０６μｍｏｌ）の０．１７当量であった。以上の結果から、バクテリア由来、ヒト由来いずれのＮａｍｐｔでもＮＭＮの合成は可能であるが、特にバクテリア由来Ｎａｍｐｔを用いることで、効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。【０１７１】
［実施例６］＜ＡＴＰ再生系を利用したＲ５ＰからのＮＭＮ合成＞
（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
本実施例では、実施例１（２）〜（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。【０１７２】
（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。反応液量を１００μＬとし、表１３（Ｎｏ．６−２）に示す組成で各反応液を調製すること、およびサンプリングを反応開始直後（０時間後）と６時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０１７３】
【表１３】
2019065876.tif 000015
【０１７４】
（３）実験結果
実験結果を図６に示す。Ｐｐｋを添加したサンプルＮｏ．６−２では、２．４ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２４μｍｏｌ）の０．０４２当量であった。以上の結果から、ＡＴＰ再生酵素であるＰｐｋを共存させることで、Ｒ５Ｐから効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。【０１７５】
［比較例２］＜ＡＴＰ再生系を利用しないＲ５ＰからのＮＭＮ合成＞
（１）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
本比較例では、実施例１（２）〜（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。【０１７６】
（２）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。反応は、反応液量を１００μＬとし、表１３（Ｎｏ．６−１）に示す組成で各反応液を調製すること、およびサンプリングを反応開始直後（０時間後）と６時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０１７７】
（３）実験結果
実験結果を図６に示す。Ｐｐｋを添加しなかったサンプルＮｏ．６−１では、ＮＭＮの生成は検出限界以下であった。【０１７８】
［実施例７］＜不要遺伝子破壊宿主で調製した無細胞抽出液を用いたＮＭＮ合成＞
（１）不要遺伝子破壊宿主の作製
反応物（基質）であるＮＡＭ、および生成物であるＮＭＮの分解または副反応を抑制するため、分解や副反応の原因となる各酵素をコードする遺伝子を破壊した表１４の宿主を作製した。【０１７９】
【表１４】
2019065876.tif 000016
【０１８０】
不要遺伝子破壊宿主の作製は、ＴａｒｇｅＴｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（シグマ・アルドリッチ）を用い、基本的に添付プロトコールに従って行った。【０１８１】
・ＢＮ１株の作製
最初に、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主としてｕｓｈＡ遺伝子が破壊された、ＢＮ１株を以下のように作成した。まず、配列番号３１（ＩＢＳプライマー）、配列番号３２（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号３３（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。【０１８２】
【表１５】
2019065876.tif 000017
【０１８３】
【表１６】
2019065876.tif 000018
【０１８４】
ＰＣＲ反応終了後、反応液の３μＬを、４％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約３５０ｂｐＤＮＡ断片の増幅を確認した。残りのＰＣＲ反応液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。精製したＰＣＲ反応液８μＬに、１０３Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（キット添付）  ２μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ  １μＬ、ＢｓｒＧＩ  １μＬ、滅菌水８μＬを加えた。３７℃で３０分間、続いて６０℃で３０分間消化を行った後、８０℃で１０分間処理を行った。得られた消化産物３μＬを６０℃で３０秒間熱処理した後、氷上で１分間冷却した。ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（キット添付）１μＬ、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ）４μＬを加えて混合した後、１６℃で１時間、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液５μＬを、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）５０μＬと混合し、氷上で３０分間静置した。４２℃で４５秒間インキュベートした後、再び氷上で５分間静置した。ＳＯＣ培地を５００μＬ加え、３７℃で１時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った後、ＬＢ寒天培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に適量を塗布した。３７℃で一晩培養を行った後、生育したコロニーをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に植菌し、３７℃で１６時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。培養液を遠心して菌体を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従ってプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡとした。【０１８５】
続いて、カナマイシン耐性遺伝子を含まないｕｓｈＡ遺伝子破壊用プラスミドを作製するため、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡを鋳型として、配列番号３４（ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｄＫｍ−Ｆ２）および配列番号３５（ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｄＫｍ−Ｒ）に示すプライマーを用いて、表１７に示す反応液組成および表１８に示す反応条件にて、ＰＣＲ反応を行った。なお、配列番号３４に示すプライマーは、5’末端にリン酸化修飾がされたものを用いた。【０１８６】
【表１７】
2019065876.tif 000019
【０１８７】
【表１８】
2019065876.tif 000020
【０１８８】
ＰＣＲ反応終了後、反応液に１μＬのＤｐｎＩ（タカラバイオ）を添加し、３７℃で１時間反応を行った。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した反応液２μＬに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＜Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ＞（タカラバイオ）２μＬを加えて混合した後、１６℃で１時間、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液を、大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（タカラバイオ）４０μＬと混合し、氷上で３０分間静置した。４２℃で４５秒間インキュベートした後、再び氷上で５分間静置した。ＳＯＣ培地を５００μＬ加え、３７℃で１時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った後、ＬＢ寒天培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に適量を塗布した。３７℃で一晩培養を行った後、生育したコロニーをＬＢ液体培地（クロラムフェニコール２５μｇ／ｍＬ含有）に植菌し、３７℃で１６時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。培養液を遠心して菌体を回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、添付プロトコールに従ってプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＭｌｕＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約６．３ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡΔＫｍとした。【０１８９】
１μＬのｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡΔＫｍプラスミド溶液を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（バイオダイナミクス研究所）５０μＬに添加し、氷上で１０分間静置した。４２℃で４５秒間ヒートショックを行い、再び氷上で５分間静置した。室温にしたＳＯＣ培地４５０  μＬを添加し、３７℃で１時間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。振とう後の培養液１００μＬを、３ｍＬのＬＢ液体培地（１％グルコース、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有）に添加し、３７℃で一晩、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。得られた培養液４０μＬを、２ｍＬのＬＢ液体培地（１％グルコース、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有）に添加し、ＯＤ６００が約０．２になるまで３７℃で培養を継続した。ＯＤ６００が約０．２になった後、１０μＬの１００ｍＭ  ＩＰＴＧ溶液を培養液に添加し、３０℃で３０分間、２００ｒｐｍで振とう培養を行った。その後、マイクロ遠心機を用いて最大速度で１分間遠心分離を行い、菌体を１ｍＬのＬＢ液体培地（１％グルコース含有、クロラムフェニコール非含有）に再懸濁した。３０℃で１時間、２０ｒｐｍで振とう培養を行った後、１００μＬの培養液を、予め１００μＬの１００ｍＭ  ＩＰＴＧ溶液を塗布しておいたＬＢ寒天プレートに塗布し、３０℃で３日間、培養を行った。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号３６）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号３７）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約１．１ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約１．８ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子が破壊された宿主としてＢＮ１株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｍｉｘ  ＆  Ｇｏ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ１株のコンピテントセルを作製した。【０１９０】
【表１９】
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【０１９１】
・ＢＮ３株の作製
続いて、ＢＮ１株を宿主としてｐｎｃＡ遺伝子が破壊された、ＢＮ３株を以下のように作成した。配列番号３８（ＩＢＳプライマー）、配列番号３９（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号４０（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。ＢＮ１株作製時と同様に、ＰＣＲ反応液の精製、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｒＧＩによる制限酵素処理、ベクターｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃとのライゲーション反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換およびプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＡとした。【０１９２】
カナマイシン耐性遺伝子を含まないｐｎｃＡ遺伝子破壊用プラスミドを作製した。ＰＣＲ反応時のテンプレートとしてｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＡを用いること以外は、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡΔＫｍ作製時と同様の操作により行った。得られたプラスミドをｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＡΔＫｍとした。【０１９３】
ＢＮ１株を宿主として、ｐｎｃＡ遺伝子が破壊されたＢＮ３株を作製した。遺伝子破壊プラスミドとしてｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＡΔＫｍを用いること、およびコンピテントセルとしてＢＮ１株コンピテントセルを用いること以外は、上述のＢＮ１株の作製と同様の操作により作製した。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４１）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４２）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。【０１９４】
元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約２．２ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約２．９ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子とｐｎｃＡ遺伝子が破壊された宿主として、ＢＮ３株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｍｉｘ  ＆  Ｇｏ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ３株のコンピテントセルを作製した。【０１９５】
・ＢＮ６株の作製
続いて、ＢＮ３株を宿主としてｐｎｃＣ遺伝子が破壊された、ＢＮ６株を以下のように作成した。配列番号４３（ＩＢＳプライマー）、配列番号４４（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号４５（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。ＢＮ１株作製時と同様に、ＰＣＲ反応液の精製、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｒＧＩによる制限酵素処理、ベクターｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃとのライゲーション反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換およびプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＣとした。【０１９６】
カナマイシン耐性遺伝子を含まないｐｎｃＣ遺伝子破壊用プラスミドを作製した。ＰＣＲ反応時のテンプレートとしてｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＣを用いること以外は、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡΔＫｍ作製時と同様の操作により行った。得られたプラスミドをｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＣΔＫｍとした。【０１９７】
ＢＮ３株を宿主として、ｐｎｃＣ遺伝子が破壊されたＢＮ６株を作製した。遺伝子破壊プラスミドとしてｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｐｎｃＣΔＫｍを用いること以外は、上述のＢＮ１株の作製と同様の操作により作製した。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号４６）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号４７）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。【０１９８】
元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約０．５ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約１．２ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子、ｐｎｃＡ遺伝子およびｐｎｃＣ遺伝子が破壊された宿主として、ＢＮ６株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｍｉｘ  ＆  Ｇｏ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ６株のコンピテントセルを作製した。【０１９９】
・ＢＮ８株の作製
続いて、ＢＮ６株を宿主としてｙｒｆＧ遺伝子が破壊された、ＢＮ８株を以下のように作成した。配列番号４８（ＩＢＳプライマー）、配列番号４９（ＥＢＳ１ｄプライマー）および配列番号５０（ＥＢＳ２プライマー）に示す各プライマー、およびＴａｒｇｅＴｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｙｓｔｅｍ添付のＥＢＳ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーを用い、表１５に示す反応液組成および表１６に示す反応条件にてＰＣＲを行った。ＢＮ１株作製時と同様に、ＰＣＲ反応液の精製、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｓｒＧＩによる制限酵素処理、ベクターｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃとのライゲーション反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換およびプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化後、１％アガロースゲルにて電気泳動を行い、約７．７ｋｂｐのバンドが確認されたプラスミドを、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｙｒｆＧとした。【０２００】
カナマイシン耐性遺伝子を含まないｙｒｆＧ遺伝子破壊用プラスミドを作製した。ＰＣＲ反応時のテンプレートとしてｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｙｒｆＧを用いること以外は、ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡΔＫｍ作製時と同様の操作により行った。得られたプラスミドをｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｙｒｆＧΔＫｍとした。【０２０１】
ＢＮ６株を宿主として、ｙｒｆＧ遺伝子が破壊されたＢＮ８株を作製した。遺伝子破壊プラスミドとしてｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｙｒｆＧΔＫｍを用いること、およびコンピテントセルとしてＢＮ６株コンピテントセルを用いること以外は、上述のＢＮ１株の作製と同様の操作により作製した。出現した複数のコロニーに対し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（配列番号５１）およびＲｅｖｅｒｓｅプライマー（配列番号５２）を用いて、コロニーＰＣＲを行った。反応液組成は表１９、反応条件は表１８とした。【０２０２】
元の宿主（ＢＬ２１（ＤＥ３））では約０．４ｋｂｐのバンドが増幅するのに対し、約１．１ｋｂｐのバンドが増幅したクローンが得られた。このクローンを、ｕｓｈＡ遺伝子、ｐｎｃＡ遺伝子、ｐｎｃＣ遺伝子およびｙｒｆＧ遺伝子が破壊された宿主として、ＢＮ８株とした。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  Ｍｉｘ  ＆  Ｇｏ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）を用い、添付プロトコールに従って、ＢＮ８株のコンピテントセルを作製した。【０２０３】
（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
本実施例では、Ｐｒｓとして、実施例３記載のＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓを用いること、および酵素発現の宿主として、本実施例（１）記載のＢＮ３株およびＢＮ８株を用いること以外は、実施例１（２）〜（４）と同様の操作により、各酵素の無細胞抽出物を調製した。【０２０４】
（３）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（１）で得られた無細胞抽出物を用いて、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表２０に示す組成で調製すること、およびサンプリングを反応開始直後（０時間後）、６時間後、および２４時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０２０５】
【表２０】
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【０２０６】
（４）実験結果
実験結果を図７に示す。反応６時間時点では、通常のＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７−１）、１．９ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．１９μｍｏｌ）の０．０５２当量であった。一方、ｕｓｈＡ遺伝子およびｐｎｃＡ遺伝子を破壊したＢＮ３株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７−２）、２．３ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２３μｍｏｌ）の０．０４３当量であった。ｕｓｈＡ遺伝子、ｐｎｃＡ遺伝子、ｐｎｃＣ遺伝子およびｙｒｆＧ遺伝子を破壊したＢＮ８株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合も（サンプルＮｏ．７−３）、同様に２．３ｍＭのＮＭＮの生成が認められた。添加したＡＴＰのモル数（０．０１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．２３μｍｏｌ）の０．０４３当量であった。すなわち、ＮＭＮの生成が進行する段階では、ＢＮ３株およびＢＮ８株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いる方が、ＢＬ２１（ＤＥ３）を宿主として調製した無細胞抽出液を用いるよりも、ＮＭＮの生産量が高くなることがわかった。【０２０７】
さらに、反応２４時間時点では、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＮ３株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７−１、Ｎｏ．７−２）、ＮＭＮが検出できなかった。ＢＮ８株を宿主として調製した無細胞抽出液を用いた場合（サンプルＮｏ．７−３）、２．０ｍＭのＮＭＮが残存していた。すなわち、ＮＭＮが一定量生成した後の段階では、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＮ３株を宿主として調製した無細胞抽出液よりも、ＢＮ８を宿主として調製した無細胞抽出液を用いる方が、生成したＮＭＮの分解が格段に抑えられることがわかった。ただし、ＮＭＮの分解が進行する前の時点（例えば６時間）で、生成したＮＭＮを適切に回収する工程を行えば、いずれの宿主由来の無細胞抽出液を用いた場合でも、生成したＮＭＮを適切に取得することができる。【０２０８】
［実施例８］＜ＰＰａｓｅを用いた精製酵素によるＮＭＮ合成＞
本実施例では、所定の各酵素として下記のものを用いた。
Ｎａｍｐｔ：Haemophilus ducreyi由来（AAR87771）ＮａｍｐｔにＨｉｓタグを付加したもの（ＨｄＮａｍｐｔ−Ｈｉｓ）
Ｐｒｓ：Bacillus subtilis由来（BAA05286）ＰｒｓのＡｓｎ１２０Ｓｅｒ変異体にＨｉｓタグを付加したもの（ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ−Ｈｉｓ）
Ｐｐｋ（Ｐｐｋ２クラス３）：Deinococcus radiodurans由来（NP_293858）ＰｐｋにＨｉｓタグを付加したもの（ＤｒＰｐｋ−Ｈｉｓ）
Ｒｂｋ：Saccharomyces cerevisiae由来（P25332）ＲｂｋにＨｉｓタグを付加したもの（ＳｃＲｂｋ−Ｈｉｓ）【０２０９】
（１）Ｈｉｓタグ付加Ｐｒｓ、ＰｐｋおよびＲｂｋ発現プラスミドの作製
Ｐｒｓ、ＰｐｋおよびＲｂｋにＨｉｓタグが付加されたタンパク質を発現するプラスミドを以下のように作製した。実施例３で作製したpEBsPrsN120S、実施例１で作製したpEDrPpkおよびpEScRbkを鋳型として、各酵素にＨｉｓタグを付加するための変異導入ＰＣＲ反応を行った。鋳型プラスミド名、変異導入用プライマー名およびその塩基配列を示す配列番号、Ｈｉｓタグ付加酵素発現プラスミド名を表２１に示す。【０２１０】
【表２１】
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【０２１１】
Ｈｉｓタグ付加酵素発現プラスミドの作製は、表２１に示す各種鋳型プラスミドと変異導入プライマーを用いる以外は、実施例３（１）と同様の操作により、変異導入ＰＣＲ反応から塩基配列確認までを行った。正しくＨｉｓタグが付加されたプラスミドを表２１に記載した各プラスミドとした。【０２１２】
（２）組換え体の作製・培養および無細胞抽出物の調製
上記（１）でＨｉｓタグ付加酵素発現プラスミドを用い、実施例４（１）と同様の操作により、組換え体の作製、培養および無細胞抽出物の調製を行った。その際、菌体を懸濁するバッファーとしては、ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ−Ｈｉｓ以外は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ  ８．０）を用いた。ただし、ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ−Ｈｉｓについては、５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて行った。【０２１３】
（３）精製酵素の調製
（２）で調製したＨｉｓタグ付加酵素を含む無細胞抽出物を用いて、実施例５（３）と同様に、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより、各Ｈｉｓタグ付加酵素の精製を行った。ただし、ＢｓＰｒｓＮ１２０Ｓ−Ｈｉｓについては、５０ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて用透析を行った。【０２１４】
（４）ＮＭＮ合成反応、ＮＭＮの分析
（３）で得られた各種精製酵素を用い、ＰＰａｓｅ（酵母由来、シグマ・アルドリッチ社、製品番号10108987001）の存在下または非存在下で、ＮＭＮ合成反応および分析を行った。各反応液を表２２に示す組成で調製すること、サンプリングを反応開始直後（０時間後）、６時間後、２４時間後および４８時間後に行うこと以外は、実施例１（５）および（６）と同様に行った。【０２１５】
【表２２】
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【０２１６】
（５）実験結果
実験結果を図８に示す。第３反応のみの場合、ＰＰａｓｅを添加した場合（サンプルＮｏ．８−１）では、反応４８時間で４．０ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．４０μｍｏｌ）の０．２５当量であった。一方、ＰＰａｓｅを添加しなかった場合（サンプルＮｏ．８−２）、０．５２ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０５２μｍｏｌ）の１．９当量であった。第２反応＋第３反応の場合、ＰＰａｓｅを添加した場合（サンプルＮｏ．８−３）では、反応４８時間で４．１ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．４１μｍｏｌ）の０．２４当量であった。一方、ＰＰａｓｅを添加しなかった場合（サンプルＮｏ．８−４）、０．３４ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０３４μｍｏｌ）の２．９当量であった。さらに、第１反応＋第２反応＋第３反応の場合、ＰＰａｓｅを添加した場合（サンプルＮｏ．８−５）では、反応４８時間で３．６ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．３６μｍｏｌ）の０．２８当量であった。一方、ＰＰａｓｅを添加しなかった場合（サンプルＮｏ．８−６）、０．２５ｍＭのＮＭＮが生成した。添加したＡＴＰのモル数（０．１μｍｏｌ）は、生成したＮＭＮのモル数（０．０２５μｍｏｌ）の４．０当量であった。以上の結果から、精製酵素反応系にＰＰａｓｅを添加することで、効率的にＮＭＮを合成することが可能であることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０２１７】
配列番号１５：Prs変異体BsPrsN120Sの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号１６：Prs変異体BsPrsN120Sの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号１７：Prs変異体BsPrsL135Iの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号１８：Prs変異体BsPrsL135Iの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号１９：プライマーＴ７−ＰＰ
配列番号２０：プライマーＴ７−ＴＰ
配列番号２５：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEHdNampt-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号２６：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEHdNampt-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号２７：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrNampt-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号２８：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrNampt-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号２９：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpESoNampt-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号３０：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpESoNampt-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号３１：ｕｓｈＡ用ＩＢＳプライマー
配列番号３２：ｕｓｈＡ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号３３：ｕｓｈＡ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号３４：ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡΔＫｍ調製用プライマー（フォワード）
配列番号３５：ｐＡＣＤ４Ｋ−Ｃ−ｕｓｈＡΔＫｍ調製用プライマー（リバース）
配列番号３６：ｕｓｈＡ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号３７：ｕｓｈＡ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号３８：ｐｎｃＡ用ＩＢＳプライマー
配列番号３９：ｐｎｃＡ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号４０：ｐｎｃＡ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号４１：ｐｎｃＡ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号４２：ｐｎｃＡ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号４３：ｐｎｃＣ用ＩＢＳプライマー
配列番号４４：ｐｎｃＣ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号４５：ｐｎｃＣ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号４６：ｐｎｃＣ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号４７：ｐｎｃＣ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号４８：ｙｒｆＧ用ＩＢＳプライマー
配列番号４９：ｙｒｆＧ用ＥＢＳ１ｄプライマー
配列番号５０：ｙｒｆＧ用ＥＢＳ２プライマー
配列番号５１：ｙｒｆＧ遺伝子破壊検出用プライマー（フォワード）
配列番号５２：ｙｒｆＧ遺伝子破壊検出用プライマー（リバース）
配列番号５３：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEBsPrsN120S-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号５４：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEBsPrsN120S-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号５５：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrPpk-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号５６：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEDrPpk-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
配列番号５７：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEScRbk-Hisの変異導入用プライマー（フォワード）
配列番号５８：Hisタグ付加Nampt発現プラスミドpEScRbk-Hisの変異導入用プライマー（リバース）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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