(57)【要約】  本発明の課題は、ＧＰＲ２０の検出に用いることができる抗ＧＰＲ２０抗体、該抗体を含むことからなるＧＰＲ２０検出用試薬、ＧＰＲ２０の発現と関連する疾患の診断用試薬又は検査用組成物等を提供することである。  配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体又は当該抗体の抗原結合性断片、当該抗体のキメラ化抗体、ウサギ化抗体等の提供、当該抗体を含むことからなる組成物等の提供。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２】
ＧＰＲ２０への結合に対して、配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体と競合阻害活性を有する抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項３】
ＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤ（配列番号３１）に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合することを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片。
【請求項４】
重鎖配列が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６または９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、並びに、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み；
軽鎖配列が配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する可変領域を含む、請求項１乃至３のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項５】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び、配列番号１２に示される軽鎖可変領域を含むことからなる、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項６】
配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖、及び、配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項７】
キメラ抗体であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項８】
定常領域がウサギ抗体由来であることを特徴とする、請求項７に記載のキメラ抗体。
【請求項９】
配列番号１９のアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２１のアミノ酸番号２１乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む請求項１乃至５、７及び８のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１０】
ウサギ化されていることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の機能性断片。
【請求項１１】
ヒト化されていることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の機能性断片。
【請求項１２】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載の重鎖、及び（ｃ）に記載の軽鎖を含む、請求項１乃至５及び１０のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片：
（ａ）配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｂ）配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｃ）配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖。
【請求項１３】
配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、請求項１乃至５及び１０のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１４】
配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、請求項１乃至５及び１０のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１５】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦｖからなる群から選択される、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片。
【請求項１６】
ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ＧＰＲ２０の検出または測定方法が、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されたか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されなかったか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＧＰＲ２０陽性疾患の検査または診断方法に使用される、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
ＧＰＲ２０陽性疾患の検査または診断方法が、ＧＰＲ２０の検出または測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防方法には適していないと判定することを含む、請求項１７乃至２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＧＰＲ２０陽性疾患がＧＰＲ２０陽性癌である、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＧＰＲ２０陽性疾患が消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載の被験者に投与される、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を含む医薬組成物：
（ａ）請求項１７乃至１９及び２１のいずれか１項に記載の組成物を用いてＧＰＲ２０が検出または測定された被検標本の由来する被験者；
（ｂ）請求項２０記載の組成物を用いたＧＰＲ２０の検出または測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者；
（ｃ）請求項２２または２４記載の組成物を用いて、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防に適していると判定された被験者。
【請求項２６】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療方法：
（ａ）請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片、請求項１７乃至１９、２１に記載の組成物を用いて検体のＧＰＲ２０を検出または測定する工程；
（ｂ）（ａ）においてＧＰＲ２０の発現が検出または測定された検体に由来する被験者に抗ＧＰＲ２０抗体又は該抗体の抗原結合性断片を投与する工程。
【請求項２７】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７記載のポリヌクレオチドまたは請求項２８記載のベクターを含む細胞、
【請求項３０】
下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片の製造方法：
（ａ）請求項２９記載の細胞を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養物からモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合性断片を回収する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ＧＰＲ２０抗体、該抗体の機能断片、該抗体の修飾体、該抗体の有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むヌクレオチド、該ヌクレオチドが挿入されたベクター、該ヌクレオチドまたはベクターが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含む該抗体の製造方法、医薬組成物、診断用または検査用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＰＲ２０（Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２０）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーのクラスＡに属する、３５８アミノ酸からなる７回膜貫通型のタンパク質であり、Ｎ末端側を細胞外、Ｃ末端側を細胞内に持つ。ＧＰＲ２０は、ヌクレオチドまたは脂質を認識するＧＰＣＲと類似したアミノ酸配列を有するが、その生理的機能や生体内におけるリガンドは同定されていない。ＧＰＲ２０をＨＥＫ２９３細胞に発現させた実験から、ＧＰＲ２０は、リガンドによる刺激が無い条件下でＧｉ型の３量体Ｇ蛋白質を恒常的に活性化していることが報告されている（非特許文献１）。【０００３】
ＧＰＲ２０は心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、直腸、白血球でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現が確認されており、とりわけ小腸での高発現が報告されていた（非特許文献１）。脳内においては、視床、被殻、尾状核での発現が報告されていた（非特許文献２）。また、ＧＰＲ２０は消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（非特許文献３）や、消化管筋層内の神経叢などに存在し腸管の蠕動運動に関与するカハール介在細胞（ＩＣＣｓ）の一部においてｍＲＮＡ発現が報告されていた。ＩＣＣｓはＧＩＳＴの起源細胞であり、これらの細胞ではＧＩＳＴの主要な転写制御因子であるｅｔｓ  ｖａｒｉａｎｔ  １（ＥＴＶ１）によってＧＰＲ２０の発現が調節されていることが報告されている（非特許文献４）。【０００４】
ＧＰＲ２０欠損マウスは、オープンフィールドテストにおいて総移動距離の増加を特徴とする多動性障害の表現型を示すことから、ＧＰＲ２０が中枢神経系における自発的活動性に関連することが示唆されている（特許文献１）。【０００５】
これらこのことから、ＧＰＲ２０の発現を検出できる方法の提供は、ＧＩＳＴなどの腫瘍細胞や、消化管に存在する正常カハール介在細胞、脳内に存在する細胞などをＧＰＲ２０陽性細胞として検出することによって成し得る検査または診断に有用である。【０００６】
従来、ホルマリン固定された組織中のヒトＧＰＲ２０を検出できるとされるポリクローナル抗体は知られているが、検出感度や反応特異性が充分ではなく、均一な品質の抗体を提供するには問題があった。また、ＧＰＲ２０の免疫組織化学染色に有用なモノクローナル抗体は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】公開特許公報ＵＳ２００３／００１８９８９  Ａ１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｓｅ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  （２００８）  ２８３，  １２７４７−１２７５５
【非特許文献２】Ｏ’Ｄｏｗｄ  Ｂ．  Ｆ．，  Ｇｅｎｅ  １８７  （１９９７）  ７５−８１
【非特許文献３】Ａｌｌａｎｄｅｒ  Ｓ．  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．  ＣＡＮＣＥＲ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  （２００１）  ６１，  ８６２４−８６２８
【非特許文献４】Ｃｈｉ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  （２０１０）  ４６７（７３１７）：８４９−８５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の一つの課題は、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体を提供することである。【００１０】
本発明の他の一つの課題は抗ＧＰＲ２０抗体を含むことからなるＧＰＲ２０検出用試薬を提供することである。本発明の他の一つの課題は、抗ＧＰＲ２０抗体を含むことからなる、ＧＰＲ２０の発現と関連する疾患の診断用試薬または検査用組成物等を提供することである。【００１１】
また、本発明の課題には、該抗体が有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、該ヌクレオチドが挿入されたベクター、該ヌクレオチドまたはベクターが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含む該抗体の製造方法等が含まれる。【００１２】
さらに、本発明の他の一つの課題は、当該抗ＧＰＲ２０抗体を含有する医薬組成物、及び該医薬組成物を用いたＧＰＲ２０の発現が関与する疾患の治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者は上記課題を解決するために鋭意、検討を行い、新規な抗ＧＰＲ２０抗体を創出し、該抗体を用いてＧＰＲ２０を検出できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（２）ＧＰＲ２０への結合に対して、配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体と競合阻害活性を有する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（３）ＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤ（配列番号３１）に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合することを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗体又は当該抗体の機能性断片、
（４）重鎖配列が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６または９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、並びに、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み；
軽鎖配列が配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する可変領域を含む、（１）乃至（３）のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（５）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び、配列番号１２に示される軽鎖可変領域を含むことからなる、（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（６）配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖、及び、配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（７）キメラ抗体であることを特徴とする（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（８）定常領域がウサギ抗体由来であることを特徴とする、（７）に記載のキメラ抗体、
（９）配列番号１９のアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２１のアミノ酸番号２１乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む（１）乃至（５）、（７）及び（８）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（１０）ウサギ化されていることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の機能性断片、【００１４】
（１１）ヒト化されていることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の機能性断片、
（１２）以下の（ａ）または（ｂ）に記載の重鎖、及び（ｃ）に記載の軽鎖を含む、（１）乃至（５）及び（１０）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片：
（ａ）配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｂ）配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｃ）配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、
（１３）配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、（１）乃至（５）及び（１０）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（１４）配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、（１）乃至（５）及び（１０）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（１５）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦｖからなる群から選択される、（１）乃至（１４）のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片、
（１６）ｓｃＦｖであることを特徴とする、（１）乃至（１４）のいずれか１項に記載の抗体、
（１７）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含む組成物、
（１８）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、（１７）に記載の組成物、
（１９）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、（１７）または（１８）に記載の組成物、
（２０）ＧＰＲ２０の検出または測定方法が、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されたか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されなかったか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、（１８）または（１９）に記載の組成物、【００１５】
（２１）ＧＰＲ２０陽性疾患の検査または診断方法に使用される、（１７）乃至（２０）のいずれか１項に記載の組成物、
（２２）ＧＰＲ２０陽性疾患の検査または診断方法が、ＧＰＲ２０の検出または測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防方法には適していないと判定することを含む、（１７）乃至（２１）のいずれか１項に記載の組成物、
（２３）ＧＰＲ２０陽性疾患がＧＰＲ２０陽性癌である、（２１）または（２２）に記載の組成物、
（２４）ＧＰＲ２０陽性疾患が消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である、（２１）乃至（２３）のいずれか１項に記載の組成物、
（２５）下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載の被験者に投与される、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を含む医薬組成物：
（ａ）（１７）乃至（１９）及び（２１）のいずれか１項に記載の組成物を用いてＧＰＲ２０が検出または測定された被検標本の由来する被験者；
（ｂ）（２０）記載の組成物を用いたＧＰＲ２０の検出または測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者；
（ｃ）（２２）または（２４）記載の組成物を用いて、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防に適していると判定された被験者、
（２６）以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療方法：
（ａ）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片、（１７）乃至（１９）、（２１）に記載の組成物を用いて検体のＧＰＲ２０を検出または測定する工程；
（ｂ）（ａ）においてＧＰＲ２０の発現が検出または測定された検体に由来する被験者に抗ＧＰＲ２０抗体又は該抗体の抗原結合性断片を投与する工程、
（２７）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド、
（２８）（２７）記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
（２９）（２７）記載のポリヌクレオチドまたは（２８）記載のベクターを含む細胞、
（３０）下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む、（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片の製造方法：
（ａ）（２９）記載の細胞を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養物からモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合性断片を回収する工程。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３の重鎖のアミノ酸配列（配列番号３）及びヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２】ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１１）及びヌクレオチド配列（配列番号１０）を示す。
【図３】ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３のＣＤＲＨ１〜３（配列番号５〜９）、ＣＤＲＬ１〜３のアミノ酸配列（配列番号１３〜１５）を示す。
【図４】ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図５】ウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図６】ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。
【図７】ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図８】ウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１のアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。
【図９】ヒトＧＰＲ２０一過性発現細胞株と抗ヒトＧＰＲ２０抗体を産生するハイブリドーマの培養上清を反応させた際のフローサイトメトリー解析結果を示す。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）の相対値を示す。
【図１０】ヒトＧＰＲ２０のＮ末端４８アミノ酸からなる合成ペプチドに対する抗ヒトＧＰＲ２０抗体の結合性を示す。
【００１７】
【図１１−１】ヒトＧＰＲ２０一過性発現細胞に対する抗ＧＰＲ２０抗体の免疫染色像を示す。図１１−１はラット抗ＧＰＲ２０モノクローナル抗体の染色像を示している。
【図１１−２】ヒトＧＰＲ２０一過性発現細胞に対する抗ＧＰＲ２０抗体の免疫染色像を示す。図１１−２は市販のウサギ抗ＧＰＲ２０ポリクローナル抗体の染色像を示している。
【図１１−３】ヒトＧＰＲ２０一過性発現細胞に対する抗ＧＰＲ２０抗体の免疫染色像を示す。図１１−３は市販のウサギ抗ＧＰＲ２０ポリクローナル抗体の染色像を示している。
【図１２−１】消化管間質腫瘍ＧＩＳＴのラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体及び市販のウサギ抗ＧＰＲ２０抗体による染色像を示す。図１２−１は胃由来ＧＩＳＴの染色像を示している。
【図１２−２】消化管間質腫瘍ＧＩＳＴのラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体及び市販のウサギ抗ＧＰＲ２０抗体による染色像を示す。図１２−２は小腸由来ＧＩＳＴの染色像を示している。
【図１２−３】消化管間質腫瘍ＧＩＳＴのラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体及び市販のウサギ抗ＧＰＲ２０抗体による染色像を示す。図１２−３は大腸由来ＧＩＳＴの染色像を示している。
【図１３】ＰＣ−３，ＧＩＳＴ４３０、ＧＩＳＴ４３０／６５４皮下移植マウスモデル由来腫瘍組織に対するラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体のＧＰＲ２０染色像を示す。
【図１４−１】消化管間質腫瘍ＧＩＳＴのラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体による染色像を示す。図１４−１は胃由来ＧＩＳＴの染色像を示している。
【図１４−２】消化管間質腫瘍ＧＩＳＴのラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体による染色像を示す。図１４−２は小腸由来ＧＩＳＴの染色像を示している。
【図１４−３】消化管間質腫瘍ＧＩＳＴのラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体による染色像を示す。図１４−３は大腸由来ＧＩＳＴの染色像を示している。
【図１５】ヒトＧＰＲ２０のＮ末端１から４８アミノ酸からなる合成ペプチド並びに３０−４８アミノ酸からなる合成ペプチドに対するラット抗ＧＰＲ２０モノクローナル抗体の結合活性を示している。横軸はクローン番号、縦軸は化学発光量（ＣＰＳ）による抗体結合量を示す。
【図１６】０４−０９３抗体のエピトープ  （配列番号３１：ヒトＧＰＲ２０の３０から４２番目のアミノ酸配列）を示す。
【図１７】ＯｃＨ１Ｌ１、ＯｃＨ２Ｌ１、ＯｃＣｈｉｍｅｒａ、ＲａｂｂｉｔＩｇＧ、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ、ａｎｔｉ-β  ａｃｔｉｎを用いたウエスタンブロット法による検出結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するものおよびそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「ＧＰＲ２０遺伝子」としては、例えば、ＧＰＲ２０蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等を挙げることができる。
【００１９】
本発明において、「ヌクレオチド」と「核酸」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。かかるヌクレオチドは一本鎖、二本鎖または三本以上の鎖からなるヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するものおよびそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本以上の鎖の会合体も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。
【００２０】
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は同義である。
【００２１】
本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。
【００２２】
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞および微生物等も含まれる。
【００２３】
本発明においては、ＧＰＲ２０を認識する抗体を、それぞれ「抗ＧＰＲ２０抗体」と表記することがある。かかる抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ化抗体、ウサギ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が含まれる。
【００２４】
本発明における「抗体の機能断片」とは、元の抗体が奏する機能の少なくとも一部を奏する抗体断片を意味する。「抗体の機能断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、一本鎖免疫グロブリン等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の機能断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
【００２５】
本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合または認識する抗原上の部分ペプチドまたは部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。本発明の抗ＧＰＲ２０抗体が結合または認識するＧＰＲ２０蛋白質上の部位としては、ＧＰＲ２０蛋白質上の部分ペプチドまたは部分高次構造等を例示することができる。
【００２６】
抗体分子の重鎖および軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖および軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
【００２７】
本発明において、「抗体変異体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つ本発明のＧＰＲ２０蛋白質に結合するポリペプチドを意味する。かかる抗体変異体における変異アミノ酸の数は、１乃至２個、１乃至３個、１乃至４個、１乃至５個、１乃至６個、１乃至７個、１乃至８個、１乃至９個、１乃至１０個、１乃至１２個、１乃至１５個、１乃至２０個、１乃至２５個、１乃至３０個、１乃至４０個または１乃至５０個である。かかる抗体変異体も本発明の「抗体」に包含される。
【００２８】
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。
【００２９】
本発明の抗体が奏する活性・性質としては、例えば、生物的活性、理化学的性質等を挙げることができ、具体的には、各種生物活性、抗原やエピトープに対する結合活性、製造や保存時における安定性、熱安定性等を挙げることができる。
【００３０】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、ならびに、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件またはそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭＮａＣｌ−１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
【００３１】
本発明において「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことを指し、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を意味する。
【００３２】
本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。本発明において「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性」を指し、ＮＫ細胞が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を傷害する作用活性を意味する。
【００３３】
本発明において「癌」と「腫瘍」は同じ意味で用いられる。
【００３４】
本発明において「免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）」とは組織標本中の抗原を検出する組織学的（組織化学的）手法を意味し、「免疫抗体法」と同義であり、「免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）」も同じ意味に用いられる。
【００３５】
本発明において「変性型ＧＰＲ２０」とは、ホルマリンで固定した標本中のＧＰＲ２０分子を意味する。ホルマリンで固定した後にパラフィン処理および脱パラフィン処理した標本中のＧＰＲ２０分子も「変性型ＧＰＲ２０」という。
【００３６】
本発明において「非変性型ＧＰＲ２０」とは、ホルマリンで固定していないサンプル中のＧＰＲ２０を意味する。ホルマリンで固定していない標本中のＧＰＲ２０分子も「非変性型ＧＰＲ２０」という。
【００３７】
２．ＧＰＲ２０
本発明で用いるＧＰＲ２０は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）あるいはニワトリのＴ細胞あるいは肥満細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、ＧＰＲ２０をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、ＧＰＲ２０  ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質およびエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、または真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＧＰＲ２０を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
【００３８】
ヒトＧＰＲ２０のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿００５２９３で登録されている。また、ヒトＧＰＲ２０のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＰ＿００５２８４で登録されている。
【００３９】
ＧＰＲ２０のｃＤＮＡは例えば、ＧＰＲ２０のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーまたはヒト細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＰＲ２０のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７−４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【００４０】
なお、ヒトＧＰＲ２０をコードするヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、ＧＰＲ２０と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＧＰＲ２０のｃＤＮＡに含まれる。さらに、ヒトＧＰＲ２０遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントまたはこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、ＧＰＲ２０と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＧＰＲ２０のｃＤＮＡに含まれる。
【００４１】
また、ヒトＧＰＲ２０のアミノ酸配列において、１個、２もしくは３個または４もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなり、ＧＰＲ２０と同等の生物活性を有する蛋白質もＧＰＲ２０に含まれる。さらに、ヒトＧＰＲ２０遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１個、２もしくは３個または４もしくは５個のアミノ酸が置換、欠失、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＰＲ２０と同等の生物活性を有する蛋白質もＧＰＲ２０に含まれる。
【００４２】
本明細書で使用された、ヒトＧＰＲ２０のアミノ酸配列は配列表の配列番号１に記載されている。
【００４３】
３．抗ＧＰＲ２０抗体の製造
本発明のＧＰＲ２０に対する抗体は、常法を用いて、ＧＰＲ２０またはＧＰＲ２０のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＧＰＲ２０の生物種はヒトに限定されず、サル、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＧＰＲ２０を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種ＧＰＲ２０に結合する抗体とヒトＧＰＲ２０との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。なお、抗原となるＧＰＲ２０はＧＰＲ２０遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。具体的には、ＧＰＲ２０遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＧＰＲ２０を精製すればよい。
【００４４】
本発明のＧＰＲ２０に対する抗体は、ＤＮＡ免疫法を使用して得ることもできる。ＤＮＡ免疫法とは、抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する手法である。遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、リポソームやポリエチレンイミンなどの導入試薬を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をＧｅｎｅ  Ｇｕｎにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するＨｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ法などが存在する。発現プラスミドの筋注による遺伝子導入法に関して、発現量を向上させる手法として、プラスミドを筋注後、同部位にエレクトロポレーションを加えるｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎという技術が知られている（Ａｉｈａｒａ  Ｈ，  Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｊ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９８  Ｓｅｐ；１６（９）：８６７−７０またはＭｉｒ  ＬＭ，  Ｂｕｒｅａｕ  ＭＦ，  Ｇｅｈｌ  Ｊ，  Ｒａｎｇａｒａ  Ｒ，  Ｒｏｕｙ  Ｄ，  Ｃａｉｌｌａｕｄ  ＪＭ，  Ｄｅｌａｅｒｅ  Ｐ，  Ｂｒａｎｅｌｌｅｃ  Ｄ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｂ，  Ｓｃｈｅｒｍａｎ  Ｄ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９９  Ａｐｒ  １３；９６（８）：４２６２−７．）。本手法はプラスミドの筋注前にヒアルロニダーゼで筋肉を処理することにより、さらに発現量が向上する（ＭｃＭａｈｏｎ  ＪＭ１，  Ｓｉｇｎｏｒｉ  Ｅ，  Ｗｅｌｌｓ  ＫＥ，  Ｆａｚｉｏ  ＶＭ，  Ｗｅｌｌｓ  ＤＪ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００１  Ａｕｇ；８（１６）：１２６４−７０）。
【００４５】
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＧＰＲ２０に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。このような方法の具体的な例は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット（２００９年４月１６日公開）および第ＷＯ１０／１１７０１１号（２０１０年１０月１４日公開）パンフレットに記載されている。
【００４６】
このようにして樹立されたラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体の実例としては、０４−０９３抗体を挙げることができる。０４−０９３抗体重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号３に、これをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号２に、それぞれ示されている。０４−０９３抗体軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号１１に、これをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０に、それぞれ示されている。０４−０９３抗体は、配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する。また、０４−０９３抗体は配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドの中のＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤ（配列番号３１）に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合する。
【００４７】
本発明の抗体は、０４−０９３抗体に由来する６種全てのＣＤＲ配列を保持し、ＧＰＲ２０に結合する活性を有している抗体であればよい。すなわち、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＮＮＹＷＭＴ（Ａｂｍの定義による）またはＮＹＷＭＴ（Ｋａｂａｔの定義による））、配列番号６または９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＩＴＮＩＤＧＳＳＹ（Ａｂｍの定義による）またはＳＩＴＮＩＤＧＳＳＹＹＰＤＳＶＫＧ（Ｋａｂａｔの定義による））、および配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＧＳＦＤＹ）を保有している。また、前記の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＮＶＮＫＹＬＮ）、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＮＴＮＮＬＱＴ）、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＦＱＨＶＳＷＬＴ）を保有している。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は、図３にも記載されている。
【００４８】
本発明の抗体はＧＰＲ２０蛋白質を特異的に認識する。言い換えれば、本発明の好適な抗体はＧＰＲ２０蛋白質に特異的に結合する。
ある態様において、好適な抗体は、非変性型のヒトＧＰＲ２０、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ヒトＧＰＲ２０の両方に特異的に結合する。また、より好適な抗体は、非変性型のヒトＧＰＲ２０、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ヒトＧＰＲ２０の両方に特異的に結合し、かつ他のＧＰＲファミリーに特異的に結合しない抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の抗体には、上記のＧＰＲ２０に対するモノクローナル抗体に加え、異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、またはウサギ化（Ｒａｂｂｉｔ  ｔｙｐｅ）抗体、マウス化抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００５０】
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウスまたはラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５，（１９８４）参照）。また、他の例としてはマウスまたはラット由来の抗体の可変領域をウサギ由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる。
【００５１】
ウサギキメラ化抗体の更に具体的な例としては０４−０９３抗体由来の重鎖可変領域とウサギ重鎖の定常領域を含むことからなる重鎖（ＯｃＨｃｈ）、並びに、０４−０９３抗体由来の軽鎖可変領域とウサギ軽鎖の定常領域を含むことからなる軽鎖（ＯｃＬｃｈ）、を含むことからなる抗体を挙げることができる。ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列は配列表の配列番号１９のアミノ酸番号２０乃至４５６に示されている。ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列は配列表の配列番号２１のアミノ酸番号２１乃至２３２に示されている。
【００５２】
本発明の抗体には、前記ヒト化抗体やウサギ化抗体のＣＤＲを改変した抗体が含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００５３】
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット）を挙げることができる。ウサギ化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをウサギ由来の抗体に組み込んだ抗体、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もウサギ抗体に移植した抗体を挙げることができる。ＣＤＲのアミノ酸配列は、カバト（Ｋａｂａｔ）の定義、コシア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の定義、Ａｂｍの定義等公知の方法によって決めることができるが、本発明におけるＣＤＲはいずれの方法によって定義されたものでもよい。
【００５４】
ウサギ化抗体の更に具体的な例としては、０４−０９３抗体のウサギ化抗体を挙げることができ、より具体的な例としては、配列表の配列番号２３のアミノ酸番号２０乃至４５６に示される示すアミノ酸配列からなる重鎖（ＯｃＨ０１）または配列番号２５のアミノ酸番号２０乃至４５６に示される示すアミノ酸配列からなる重鎖（ＯｃＨ０２）、及び配列番号２７のアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖（ＯｃＬ０１）、を含むことからなるウサギ化抗体を挙げることができる。
【００５５】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，７０５：１２９−１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５−８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失および修飾は、抗体の抗原結合能およびエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）には影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１または２つのアミノ酸が欠失した欠失体、およびアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等を挙げることができる。但し、抗原結合能およびエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長および上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類および培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
【００５６】
以上の方法によって得られた抗体は、抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ  Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ．  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５−２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、および水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、最も適した抗体を選抜する必要がある。
【００５７】
また、抗体の重鎖および軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ−Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１−７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１−４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダまたはラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ  Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９−３５，Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６−８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合性断片の一種と解釈することも可能である。
【００５８】
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、および軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
【００５９】
本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２を挙げることができる。
【００６０】
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合性断片またはその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全てまたは一部を保持している断片を抗体の抗原結合性断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害活性、補体依存性細胞傷害活性および補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合性断片が保持する機能は、ＧＰＲ２０に対する結合活性である。
【００６１】
例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または重鎖および軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、および抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
【００６２】
さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
【００６３】
本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７−５３９）。
【００６４】
本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６−１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
【００６５】
一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【００６６】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖または重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および軽鎖または軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
【００６７】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
【００６８】
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン−へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
【００６９】
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＧＰＲ２０抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
【００７０】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
【００７１】
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７−１１４６）。
【００７２】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
【００７３】
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。また、抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
【００７４】
４．医薬組成物
本発明は抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む医薬組成物を提供する。
【００７５】
本発明の医薬組成物はＧＰＲ２０もしくはそのリガンドの過剰発現またはＧＰＲ２０の変異もしくは遺伝子増幅によるＧＰＲ２０シグナル異常または亢進、または、ＧＰＲ２０のアイソフォームのスイッチングにより惹起されるかまたは増悪化される各種疾患（以下、「ＧＰＲ２０に関わる疾患」という）、とりわけ各種癌の治療または予防に有用である。
【００７６】
かかる治療または予防の対象となる癌の惹起または増悪化の原因としては、ＧＰＲ２０遺伝子内の一塩基置換（ＳＮＰ）、ＧＰＲ２０の高発現、ＧＰＲ２０を恒常的に活性化するミスセンス変異、ＧＰＲ２０遺伝子の増幅または過剰発現、ＧＰＲ２０アイソフォームのスイッチング等を例示することができる。
【００７７】
かかる癌種としては、例えば、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を挙げることができ、好適にはＧＰＲ２０蛋白質を発現している消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を挙げることができる。
【００７８】
本発明において、疾患の治療または予防には、かかる疾患、好適にはＧＰＲ２０蛋白質を発現している個体におけるかかる疾患の発症の予防、増悪化または進行の抑制または阻害、かかる疾患に罹患した個体が呈する一つまたは二つ以上の症状の軽減、増悪化もしくは進行の抑制または寛解、二次性疾患の治療または予防等が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００７９】
本発明の医薬組成物には、治療または予防に有効な量の抗ＧＰＲ２０抗体または該抗体の機能断片と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤を含有せしめることができる。
【００８０】
「治療または予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態および投与経路につき治療または予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
【００８１】
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物またはそれに含まれる抗体の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性または低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
【００８２】
製剤用の物質として、例えば、アミノ酸類、抗菌剤、抗酸化剤、緩衝剤、充填剤、キレート剤、錯化剤、増量剤、単糖類、二糖類、炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、親水ポリマー、の防腐剤、溶媒、糖アルコール、懸濁剤、界面活性剤、安定化増強剤、弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、および／または薬学上の補助剤等を挙げることができ、それらの物質の添加量は、抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体の重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
【００８３】
抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体をリポソーム中に含有せしめたイムノリポソーム、抗体とリポソームとが結合してなる抗体修飾体（米国特許第６２１４３８８号等）を含有する医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
【００８４】
賦形剤や担体は、通常液体または固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与または非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等を挙げることができる。
【００８５】
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。凍結乾燥製剤を挙げることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
【００８７】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、経腸投与、局所投与および非経口投与のいずれでもよく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等を挙げることができる。
【００８８】
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、抗体のＧＰＲ２０蛋白質結合親和性等に応じて決定することができる。本発明の抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体のＧＰＲ２０蛋白質に対する親和性が高いほど（ＫＤ値が低いほど）、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。
【００８９】
本発明の抗ＧＰＲ２０抗体の投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該抗体のＧＰＲ２０蛋白質結合親和性またはその生物活性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、または１日２回もしくは３回以上投与することができる。
【００９０】
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
【００９１】
抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を有効成分として含む医薬組成物は他の医薬と同時にあるいは個々に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後に抗ＧＰＲ２０抗体または該抗体の機能断片を有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、または、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。他の医薬としては、化学療法剤、放射線療法など各種抗癌剤等を挙げることができる。それらをまとめて本発明の抗体と「他の薬剤との併用」と呼び、本発明の抗体、その機能断片またはその修飾体に加えてさらなる薬剤を含む医薬組成物も本発明に含まれる。
【００９２】
本発明は癌などＧＰＲ２０に関わる疾患の治療方法または予防方法、該疾患の治療用または予防用医薬組成物を調製するための本発明の抗体の使用、該疾患の治療または予防のための本発明の抗体の使用、をも提供する。本発明の抗体を含む治療用または予防用キットも本発明に含まれる。
【００９３】
５．診断用組成物
本発明は抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む検査用または診断用組成物（以下、まとめて「診断用組成物」という）をも提供する。
【００９４】
本発明の診断用組成物は、癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）などＧＰＲ２０に関わる疾患、ＧＰＲ２０発現の検査または診断に有用である。本発明において検査または診断には、例えば、罹患リスクの判定または測定、罹患の有無の判定、進行や増悪化の程度の測定、抗ＧＰＲ２０抗体等の医薬組成物による薬物治療の効果の測定または判定、薬物治療以外の治療の効果の測定または判定、再発リスクの測定、再発の有無の判定等が含まれるが、検査または診断であればそれらに限定されるものではない。
【００９５】
本発明の診断用組成物は、抗ＧＰＲ２０抗体抗体もしくはその機能断片またはその修飾体、それらを含む組成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
【００９６】
かかる診断用組成物には、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有せしめることができる。
【００９７】
本発明は癌などＧＰＲ２０に関わる疾患の検査方法または診断方法、該疾患の診断用組成物を調製するための本発明の抗体の使用、該疾患の検査または診断のための本発明の抗体の使用、をも提供する。本発明の抗体を含む検査または診断用キットも本発明に含まれる。
【００９８】
本発明の診断用組成物を用いた検査または診断の方法としてはサンドウィッチＥＬＩＳＡが望ましいが、通常のＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）などの抗体を利用した検出方法が利用可能である。抗体の標識法としてはビオチンのほか、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣやＡＬＥＸＡなどの発蛍光団、放射性同位元素などのラベルなど生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ρ−ＮＰＰ（ρ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３−Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）などの発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕ（登録商標）  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒトまたは非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、組織ホモジネート上清、組織切片等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００９９】
本発明の抗体を含む検査または診断用のサンドウィッチＥＬＩＳＡキットには、コントロール（ＧＰＲ２０由来ペプチドの標準液）、発色試薬、希釈用緩衝液、固相用抗体、検出用抗体、ならびに洗浄液等が含まれてよい。抗原に結合した抗体量を測定する方法としては、吸光法、蛍光法、発光法、ＲＩ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）法等が好適に適用され、測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等が好適に使用される。
【０１００】
前記の免疫組織学的試験だけでなく、試料中の細胞、組織または臓器もしくはその一部から、常法に従って可溶化した蛋白を調製し、当該可溶化蛋白に標識化抗体を反応させることにより可溶化蛋白中のＧＰＲ２０の存否を確認するウエスタンブロッティング法やドットブロット法においても用いることができる。対象となる被検試料としては、血液等の体液中に含まれる、細胞、血中循環腫瘍細胞、がん細胞を含む様々な細胞が分泌するエクソソームなどから調製した可溶化蛋白質が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０１０１】
本発明は免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）の分析に有用な抗体、その機能断片およびその修飾体、ならびにそれらを含む組成物を提供する。かかる組成物も本発明の「診断用組成物」に包含される。
【０１０２】
免疫組織化学は、組織切片を抗原に結合する抗体（一次抗体）と反応させ、抗原に結合した一次抗体を検出する手法であれば特に限定されない。
組織切片は、好適にはホルマリン固定後にパラフィン包埋処理する。パラフィン包埋後、薄切した組織切片を脱パラフィン処理した後、抗原賦活処理および非特異的反応抑制処理を行う。抗原賦活処理の方法としては、加熱処理、プロテアーゼ等による酵素処理を例示することができ、好適には加熱処理である。加熱処理の条件としては、通常、温度９０乃至１１０℃、ｐＨ８乃至１０、処理時間２０乃至６０分の範囲が好適である。ｐＨの調整にはＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（例えば、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス緩衝液）等を使用することができる。非特異的反応抑制処理としては、発色に使用する酵素と同様または類似の触媒活性を有する内因性の酵素を不活性化する方法が通常用いられる。ペルオキシダーゼ反応により発色させる場合、予め組織中に存在する内因性のペルオキシダーゼをＨ２Ｏ２等で阻害することが好ましい。Ｈ２Ｏ２の溶媒は水、メタノール等を使用することができ、Ｈ２Ｏ２の濃度は０．１乃至３％、好適には０．３乃至３％である。Ｈ２Ｏ２溶液にはアジ化ナトリウムを添加することができる。また、血清やカゼインによりブロッキングする方法も非特異的反応抑制処理として使用することができる。血清やカゼインは、一次抗体反応の前に組織を処理することができるが、１次抗体を希釈する溶媒に含有せしめることもできる。
【０１０３】
一次抗体の反応条件は特に限定されないが、温度４乃至５０℃、好適には２０乃至３７℃、より好適には２４℃である。反応時間は５分乃至一昼夜、好適には１０分乃至４時間、より好適には３０分乃至１時間である。
【０１０４】
一次抗体の検出には、好適には、可視化することができ且つ一次抗体に結合する抗体（二次抗体）を用いることができる。二次抗体自体に結合する抗体（三次抗体）を用いて３回以上の反応を行う場合もある。二次抗体または三次抗体の可視化法としては、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素をそれらの抗体に結合させるか、またはそれらの抗体にビオチン等を付加して前記酵素を結合させたストレプトアビジン等と結合させ、それらの酵素に対応する発色基質を反応させる方法を好適に使用することができる。酵素を二次抗体または三次抗体に結合させる方法としては、デキストリンポリマーやアミノ酸ポリマーに前記酵素と二次抗体を多数結合させた試薬を用いる方法（ポリマー法）を例示することができる。ビオチン化二次抗体およびペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンを反応させる方法（ＬＳＡＢ法）では、発色基質としてＤＡＢ等を用いることができる。また、蛍光色素などで標識された二次抗体を使用することもできる。蛍光標識二次抗体で処理した場合、処理後に蛍光顕微鏡を用いて陽性細胞を検出する。
【０１０５】
スメア法では、摘出細胞をガラスに塗布または遠心分離機で分離し、細胞成分と液性成分に分け、細胞成分について免疫染色を行う。すなわち、細胞成分をスライドガラス上に塗布し、エタノール液または１０％ホルマリン液などで固定した後、組織切片と同様の免疫染色を行うことができる。
【０１０６】
凍結包埋法では、摘出組織をＯＣＴコンパウンド等での包埋後に液体窒素等で急速凍結し、クリオスタットで薄切することでスライド標本を作製する。この標本を１０％ホルマリンやエタノール液などで固定した後、組織切片と同様の免疫染色を行うことができる。
【０１０７】
免疫組織化学に係る操作は、反応液、反応条件、洗浄回数等をプログラムして免疫装置に組み込み、自動化して行なうことができる。
【０１０８】
画像診断の場合は、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を抗体にラベルし、被験者に該抗体を投与し、PET/CTなどの画像診断技術を使用して画像を取り、ＧＰＲ２０の存在を判定または検査することができる。
【０１０９】
本発明の診断用組成物に含まれる抗体、その機能断片またはその修飾体は、好適にはＧＰＲ２０に結合する抗体、すなわちＧＰＲ２０選択性を有する抗体、その機能断片またはその修飾体である。
【０１１０】
ヒトＧＰＲ２０選択性を有する抗体としては、ラット０４−０９３抗体の重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含んでなる抗体、ラット０４−０９３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでなる抗体、ラット０４−０９３抗体の重鎖および軽鎖を含んでなる抗体等を例示することができる。かかる抗体としては、ラット０４−０９３抗体、０４−０９３抗体由来のキメラ抗体、０４−０９３抗体由来のウサギ化抗体、０４−０９３抗体由来のヒト化抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【０１１１】
本発明の一つの好適な態様において、診断用組成物は、ＧＰＲ２０検出用または測定用である。
【０１１２】
本発明は被検サンプル中のヒトＧＰＲ２０を検出または測定する方法を提供する。
【０１１３】
これらの検出または測定方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。かかる測定方法および診断用組成物は、ヒトＧＰＲ２０陽性癌、好ましくは、消化管間質腫瘍の診断用または検査用としても本発明に含まれる。
【０１１４】
本発明には、ＧＰＲ２０を標的とする医薬組成物が投与される個体（患者）を同定する方法も包含される。かかる同定方法においては、該個体由来サンプル中のヒトＧＰＲ２０を測定し、該サンプル中に、ヒトＧＰＲ２０が検出されたか、または、健常個体由来サンプル中に検出されたヒトＧＰＲ２０の量と比較してより多くのヒトＧＰＲ２０が検出された場合に、該個体を陽性と判定し、ＧＰＲ２０を標的とする医薬組成物が投与される個体と同定することができる。
【０１１５】
また、ＧＰＲ２０を標的とする医薬組成物が投与される個体を同定するためには、被験者由来のサンプル中でＧＰＲ２０の発現が確認された場合のほかに、更に発現量や免疫染色による染色割合や染色の強さを指標とすることができる。一例としては、抗ＧＰＲ２０抗体で免疫染色した際の染色度合いに応じて表１に示す０乃至３のスコアを設定し、スコア１以上、２以上または３以上の被験者を、ＧＰＲ２０を標的とする医薬組成物が投与される患者と同定する方法を挙げることができる。
【０１１６】
【表１】
2018181656.tif 000002
【０１１７】
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
【０１１８】
また、かかる同定方法の好適な一態様において、該個体は癌、好ましくは消化管間質腫瘍に罹患しているかまたはそのリスクがあるとの判定に用いることができる。
【０１１９】
さらに、本発明の医薬組成物は、その一態様において、かかる同定方法において陽性と判定された個体に投与され得る。
【０１２０】
６．試薬
本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片またはその修飾体は、試薬としても有用である。かかる試薬は、上述の検査または診断用、研究用およびその他の用途で使用される。
【実施例】
【０１２１】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源から容易に入手可能である。【０１２２】
実施例１：ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体の作製
１）−１  ヒトＧＰＲ２０発現ベクターの構築
ヒトＧＰＲ２０タンパク質（ＮＰ＿００５２８４）をコードするｃＤＮＡは、当業者に公知な方法に従いヒト脳由来ｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法により増幅され、哺乳動物発現用ベクターに組み込むことによってヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０が作製された。ヒトＧＰＲ２０のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０プラスミドＤＮＡの大量調製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。【０１２３】
１）−２  ラット免疫
免疫には６週齢のＷＫＹ／Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）が使用された。まずラット両足下腿部をＨｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社）にて前処理後、同部位にヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０が筋肉内注射された。続けて、ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ社）を使用し、２ニードル電極を用いて、同部位にインビボ  エレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボ  エレクトロポレーションを繰り返した後、７９日目にラットのリンパ節を採取しハイブリドーマ作製に用いた。【０１２４】
１）−３  ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞とマウスミエローマＳＰ２／０−ａｇ１４細胞とをＨｙｂｒｉｍｕｎｅ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて電気細胞融合した後、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁し、希釈して３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で培養した。出現した各々のハイブリドーマコロニーは、モノクローンとして回収され、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に懸濁して３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で培養した。適度に細胞が増殖した後、各々のハイブリドーマ細胞の凍結ストックを作製すると共に、培養上清が回収され、抗ＧＰＲ２０抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングに用いられた。【０１２５】
１）−４  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
１）−４−１  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ用抗原遺伝子発現細胞の調製
２９３α細胞（インテグリンαｖ及びインテグリンβ３を発現するＨＥＫ２９３由来の安定発現細胞株）を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０６細胞／１０ｍＬになるよう調製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社）を用いた形質移入手順に従って、この２９３α細胞に対して、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０もしくは陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１のＤＮＡを導入し、９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ分注後、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で２４から２７時間培養した。得られた形質移入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに使用した。【０１２６】
１）−４−２  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
実施例１）−４−１で調製した発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０またはｐｃＤＮＡ３．１導入２９３α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で１回洗浄後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳ（＋）で３回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５  Ｍ  クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ  リン酸水素２ナトリウム・１２水  ｐＨ４．５）にｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ  ＨＣｌを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのｐｃＤＮＡ３．１導入２９３α細胞と比較し、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０発現ベクター導入２９３α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトＧＰＲ２０抗体産生陽性として選択した。【０１２７】
１）−５  フローサイトメトリーによるヒトＧＰＲ２０結合抗体のスクリーニング
１）−５−１  フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
２９３Ｔ細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２になるよう２２５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社製）に播種し、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０および陰性コントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて導入し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。【０１２８】
１）−５−２  フローサイトメトリー解析
実施例１）−４−２のＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトＧＰＲ２０に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）−５−１で調製した一過性発現２９３Ｔ細胞の懸濁液を遠心し、上清を除去した後、各々に対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ  ７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含む５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ３．１導入２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０導入２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている抗体を産生するハイブリドーマをヒトＧＰＲ２０に結合する抗体産生ハイブリドーマとして１７８クローン選択した。図９にヒトＧＰＲ２０に特異的に結合した抗体の例としてクローン番号０４−０９３、１３−００１、１３−００６、１３−０１０、１３−０４０及び１３−０４６、並びに1次抗体を添加していない陰性コントロール（ｗ／ｏ  １ｓｔＡｂ）の結果を示す。図９の横軸はクローン番号、縦軸はＭＦＩ（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による抗体結合量を示す。【０１２９】
１）−６  ペプチド−ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
ヒトＧＰＲ２０のＮ末端側４８アミノ酸に対する結合性をペプチド−ＥＬＩＳＡ法により評価した。９６−ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で１晩静置した。溶液を除去し、３００μＬ／ｗｅｌｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、Ｃ末端がビオチン化されたヒトＧＰＲ２０のＮ末端側１−４８アミノ酸（配列番号２９）からなる合成ペプチド１をＰＢＳで１０  ｎＭに溶解した溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間静置した。同様にＣ末端がビオチン化された、ＧＰＲ２０のアミノ酸配列とは異なる配列を有する合成ペプチドを添加したプレートを陰性コントロールとして用意し、以下同様に処理した。プレートから溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１晩静置した。溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２倍希釈した抗ヒトＧＰＲ２０抗体産生ハイブリドーマの培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間静置した。溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳで５００倍希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間静置した。溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１０分間静置した後、プレートリーダー（ＡＲＶＯ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で化学発光を測定した。図１０にヒトＧＰＲ２０のＮ末端側１−４８アミノ酸に特異的な結合を示した６種の抗体の典型的な反応例を示す。図１０の横軸はクローン番号、縦軸は化学発光量（ＣＰＳ）による抗体結合量を示す。【０１３０】
１）−７  ラットモノクローナル抗体のサブクラス、タイプの決定
ラット抗ヒトＧＰＲ２０モノクローナル抗体の重鎖のサブクラス、軽鎖のタイプは、ＲＡＴ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ  ＴＥＳＴ  ＫＩＴ（ＤＳファーマバイオメディカル社）により決定された。その結果、０４−０９３、１３−００１、１３−００６、１３−０１０、１３−０４０及び１３−０４６は、いずれもＩｇＧ２ｂ、κ鎖であることが確認された。また、実施例４に記載の方法と同様の方法により塩基配列を解析した結果、１３−００１、１３−００６、１３−０１０、１３−０４０の各抗体のアミノ酸配列は高い相同性を示す配列を有しており、同一のエピトープを認識することが推定された。【０１３１】
１）−８  ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体の調製
ラット抗ヒトＧＰＲ２０モノクローナル抗体０４−０９３、１３−００１及び１３−０４６は、ハイブリドーマ培養上清から精製された。【０１３２】
まず、各々の抗ＧＰＲ２０抗体産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅで十分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２０％添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に培地交換し、４−５日間培養した。本培養上清を回収し、０．８μｍのフィルターに通した後、さらに０．２μｍのフィルターに通して不溶物を除去した。【０１３３】
抗体は、上記のハイブリドーマ上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に抗体を吸着させ、ＰＢＳでカラムを洗浄後に０．１Ｍ  グリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出液に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０〜７．５に調整した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にてＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を０．７ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。【０１３４】
実施例２：ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体のＩＨＣ適性評価
２）−１  ＧＰＲ２０一過性発現２９３Ｔ細胞を用いたＧＰＲ２０染色性評価
２）−１−１  セルブロックの作製
２９３Ｔ細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０またはｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）でトランスフェクションされた（ＧＰＲ２０発現２９３Ｔ細胞）。このＧＰＲ２０発現２９３Ｔ細胞のペレットをホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。同様にｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞（コントロール２９３Ｔ細胞）についてもホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。【０１３５】
２）−１−２  ＧＰＲ２０一過性発現２９３Ｔ細胞の免疫染色
１）−８で調製したラットモノクローナル抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４−０９３、１３−００１及び１３−０４６と市販のウサギポリクローナル抗ヒトＧＰＲ２０抗体のＧＰＲ２０染色性を比較した。市販の抗体は、いずれもヒトＧＰＲ２０に由来する合成ペプチドを抗原として作製されており、ＬＳ  Ｂｉｏ社製のＬＳ−Ａ１０１（Ｃ末端）、ＬＳ−Ａ１０２（Ｎ末端）、ＬＳ−Ａ１０３（細胞質ドメイン）、ＬＳ−Ａ１０４（Ｃ末端）、ＬＳ−Ｂ７７２４（２９１〜３４０アミノ酸）、ａｂｃａｍ社製のａｂ７５５５９、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製のＮＬＳ１０１（Ｃ末端）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のｓｃ−８７１４１（Ｎ末端）が用いられた。なお、括弧内は各ウサギポリクローナル抗体作製時の免疫に使用された合成ペプチドのＧＰＲ２０内の部位を示している。【０１３６】
脱パラフィンおよび抗原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ  Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）を用いて、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ：ＤＡＫＯ社製）、９７℃で２０分間実施した。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて室温で実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で１回洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ３％  Ｈ２Ｏ２（ＤＡＫＯ社製）を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、１５分間インキュベートし、Ａｉｒ  ｂｌｏｗで液を除去した。抗ＧＰＲ２０抗体をＳｉｇｎａｌ  ｓｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で表２−１及び表２−２に記載の濃度に希釈し、３０分間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄後、１次抗体の種に応じてラット抗体にはＨｉｓｔｏｆｉｎｅ  ｓｉｍｐｌｅｓｔａｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ＭＡＸ  ＰＯ（Ｒａｔ）＃４１４３１１（ニチレイバイオサイエンス社製）、ウサギ抗体にはＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＃Ｋ４００３（ＤＡＫＯ社製）を加え３０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した。【０１３７】
ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水で計３回洗浄した。【０１３８】
各抗体の典型的な染色結果を図１１−１、図１１−２、及び図１１−３に示す。また、図１１−１、図１１−２、及び図１１−３における各抗体の染色強度をスコア化した結果を表２−１及び表２−２に示す。表中において、＋＋＋は強陽性、＋＋は陽性、＋は弱陽性、−は陰性を示している。ラットモノクローナル抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３、１３−００１、１３−０４６はウサギポリクローナル抗ＧＰＲ２０抗体に比べ、ＧＰＲ２０発現２９３Ｔ細胞（２９３−ＧＰＲ２０）に強い染色性を示した。一方、陰性コントロール２９３Ｔ細胞（２９３−ＥＶ）に対して、ラットモノクローナル抗ＧＰＲ２０抗体は染色性を示さなかったことから、ＧＰＲ２０特異的な染色性が確認された。【０１３９】
【表２−１】
2018181656.tif 000003
【０１４０】
【表２−２】
2018181656.tif 000004
【０１４１】
２）−２  臨床ＧＩＳＴ組織切片の免疫染色
２）−２−１  ＧＩＳＴ組織アレイの染色
臨床検体における抗ＧＰＲ２０抗体の染色性をＧＩＳＴ４８１，  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｒａｙ，  ２４  ｃａｓｅｓ／４８  ｃｏｒｅｓ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社製）を用いて検討した。【０１４２】
脱パラフィンおよび抗原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ  Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）を用いて、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ：ＤＡＫＯ社製）、９７℃で２０分間実施した。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて室温で実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で１回洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ３％  Ｈ２Ｏ２（ＤＡＫＯ社製）を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、１５分間インキュベートし、Ａｉｒ  ｂｌｏｗで液を除去した。ラットモノクローナル抗ＧＰＲ２０抗体あるいはウサギポリクローナル抗ＧＰＲ２０抗体をＳｉｇｎａｌ  ｓｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で１０μｇ／ｍＬまたは５μｇ／ｍＬに希釈し、３０分間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄後、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  ｓｉｍｐｌｅｓｔａｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ＭＡＸ  ＰＯ（Ｒａｔ）＃４１４３１１（ニチレイバイオサイエンス社製）を加え３０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した。【０１４３】
ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水で計３回洗浄した。【０１４４】
図１２において（図１２−１）胃ＧＩＳＴ、（図１２−２）小腸ＧＩＳＴ、（図１２−３）大腸ＧＩＳＴに対する各抗体のＧＰＲ２０染色性を比較した結果、ラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３が最も高感度であった。【０１４５】
実施例３：ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４−０９３の配列解析
３）−１  ０４−０９３産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
０４−０９３の重鎖及び軽鎖のシグナル配列と可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅するため、０４−０９３産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。【０１４６】
３）−２  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる０４−０９３の重鎖のシグナル配列と可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
０４−０９３の重鎖のシグナル配列と可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅は、実施例３）−１で調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの約１μｇとＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。０４−０９３の重鎖のシグナル配列と可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ  （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。【０１４７】
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した重鎖のシグナル配列と可変領域をコードするｃＤＮＡをプラスミドにクローニングし、次に重鎖のシグナル配列と可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。【０１４８】
３）−３  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる０４−０９３の軽鎖のシグナル配列と可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅とヌクレオチド配列の決定
実施例３）−２と同様の方法で実施した。ただし、０４−０９３の軽鎖のシグナル配列と可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ  （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。【０１４９】
０４−０９３抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列は、公知の定常領域の配列とつなぎ合わせることにより決定された。ラットの重鎖ＩｇＧ２ｂの定常領域の塩基配列とアミノ酸配列はＩＭＧＴ，  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）に掲載されているＡＡＢＲ０３０４８９０５（ＩＧＨＧ２Ｂ＊０１）の塩基配列とアミノ酸配列を参照した。また、ラットの軽鎖ＩｇＫの定常領域の塩基配列とアミノ酸配列は同システムに掲載されているＶ０１２４１（ＩＧＫＣ＊０１）の塩基配列とアミノ酸配列を参照した。【０１５０】
０４−０９３抗体の重鎖は、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号３に示される重鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１３４乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号３において、４５乃至５４番目のアミノ酸配列（ＧＦＴＦＮＮＹＷＭＴ）または５０乃至５４番目のアミノ酸配列（ＮＹＷＭＴ）からなるＣＤＲＨ１、６９乃至７８番目のアミノ酸配列（ＳＩＴＮＩＤＧＳＳＹ）または６９乃至８５番目のアミノ酸配列（ＳＩＴＮＩＤＧＳＳＹＹＰＤＳＶＫＧ）からなるＣＤＲＨ２、１１８乃至１２２に記載のアミノ酸配列（ＧＳＦＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を有する。０４−０９３抗体の重鎖可変領域は配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する。０４−０９３抗体のＣＤＲＨ１は配列表の配列番号５または８に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号６または９に示されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する。また、０４−０９３抗体の重鎖のアミノ酸配列は図１に記載されている。【０１５１】
０４−０９３抗体の軽鎖は、配列表の配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する。配列表の配列番号１１に示される軽鎖アミノ酸配列中で、１乃至１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、２０乃至１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、１２７乃至２３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。当該可変領域は、配列表の配列番号１１において、４３乃至５３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、６９乃至７５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、１０８乃至１１５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。０４−０９３抗体の軽鎖可変領域は配列表の配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。０４−０９３抗体のＣＤＲＬ１は配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列（ＫＡＳＱＮＶＮＫＹＬＮ）を有し、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列表の配列番号１４に示されるアミノ酸配列（ＮＴＮＮＬＱＴ）を有し、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列表の配列番号１５に示されるアミノ酸配列（ＦＱＨＶＳＷＬＴ）を有する。また、０４−０９３抗体の軽鎖のアミノ酸配列は図２に記載されている。【０１５２】
０４−０９３抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列中の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列である。配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４００乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番号１３３乃至１６２またはヌクレオチド番号１１８乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４または２０５乃至１８３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３６６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４−０９３抗体の重鎖のシグナル配列と可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１６にも示されている。配列表の配列番号１６に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、５８乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードしている。配列番号２の配列は図１にも記載されている。【０１５３】
０４−０９３抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列である。配列表の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３７９乃至６９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４−０９３抗体の軽鎖のシグナル配列と可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１７にも示されている。配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、５８乃至３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードしている。また、配列番号１０の配列は図２に記載されている。【０１５４】
実施例４：ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の作製
４）−１  抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３のウサギキメラ化体のデザイン
ウサギキメラ化配列は、ウサギの重鎖定常領域ＩＧＨＧ＊０２とウサギの軽鎖定常領域ＩＧＫＣ２＊０１をＩＭＧＴ（登録商標），  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）から参照して、クローン０４−０９３のそれぞれの可変領域につなげることで設計した。【０１５５】
ウサギキメラ化抗体重鎖をＯｃＨｃｈと命名し、そのアミノ酸配列を配列番号１９に記した。配列番号１９においてアミノ酸番号１乃至１９番目のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、２０乃至１３３番目のアミノ酸配列は重鎖可変領域を示し、１３４乃至４５６番目のアミノ酸配列は重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。【０１５６】
ウサギキメラ化抗体軽鎖をＯｃＬｃｈ命名し、そのアミノ酸配列を配列番号２１に記した。配列番号２１においてアミノ酸番号１乃至２０番目のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、２１乃至１２７番目のアミノ酸配列は軽鎖可変領域を示し、１２８乃至２３２番目のアミノ酸配列は軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。【０１５７】
４）−２  抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３のウサギ化体のデザイン
ウサギ化抗体の可変領域のアミノ酸配列は、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって設計した。可変領域のアミノ酸配列の同一性とウサギｇｅｒｍｌｉｎｅ配列における中庸さに基づき、重鎖アクセプター配列はＩＧＨＶ１Ｓ７＊０１とＩＧＨＪ３＊０１を、軽鎖アクセプター配列はＩＧＫＶ１Ｓ３９＊０１とＩＧＫＪ１−２＊０１を選択した。タンパク質立体構造解析プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）で構築されたクローン０４−０９３のホモロジーモデルを分析し、アクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基をＱｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準などを参考に選択した。重鎖定常領域はウサギのＩＧＨＧ＊０２を、軽鎖定常領域はウサギのＩＧＫＣ１＊０１を選択した。【０１５８】
ウサギ化抗体重鎖は、ＯｃＨ０１およびＯｃＨ０２の二種類を設計し、各々のアミノ酸配列を配列番号２３および２５に記した。配列番号２３及び２５において、１乃至１９番目のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、２０乃至１３３番目のアミノ酸配列は可変領域を示し、１３４乃至４５６番目のアミノ酸配列は定常領域を示す。【０１５９】
ウサギ化抗体軽鎖は、ＯｃＬ０１の一種類を設計し、そのアミノ酸配列を配列番号２７に記した。配列番号２７において、１乃至２０番目のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、２１乃至１２７番目のアミノ酸配列は可変領域を示し、１２８乃至２３０番目のアミノ酸配列は定常領域を示す。【０１６０】
４）−２  リコンビナント抗体の作製
４）−２−１  ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の重鎖発現ベクターの構築
４）−２−１−１  抗体発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号２８に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。【０１６１】
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫからネオマイシン発現ユニットを除去することによりｐＣＭＡ−ＬＫを構築した。【０１６２】
４）−２−１−２  ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈ発現ベクターの構築
配列番号１８に示すウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号１８に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、８３乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、４２５乃至１３９３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。【０１６３】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、合成したＤＮＡ断片とｐＣＭＡ−ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片を結合することにより、ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈ発現ベクターを構築した。【０１６４】
４）−２−２  ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の軽鎖発現ベクターの構築
４）−２−２−１  ウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈ発現ベクターの構築
配列番号２０に示すウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２０に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、８６乃至４０６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードし、４０７乃至７２１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例４）−２−１−２と同様の方法でウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈの発現ベクターを構築した。【０１６５】
４）−２−３  ウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の重鎖発現ベクターの構築
４）−２−３−１  ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１の発現ベクターの構築
配列番号２２に示すウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２２に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、８３乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、４２５乃至１３９３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例４）−２−１−２と同様の方法でウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１発現ベクターを構築した。【０１６６】
４）−２−３−２  ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２の発現ベクターの構築
配列番号２４に示すウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２４に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、８３乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、４２５乃至１３９３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例４）−２−１−２と同様の方法でウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２発現ベクターを構築した。【０１６７】
４）−２−４  ウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の軽鎖発現ベクターの構築
４）−２−４−１  ウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１の発現ベクターの構築
配列番号２６に示すウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２６に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、８６乃至４０６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、４０７乃至７２１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例５）−２−１−２と同様の方法でウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１発現ベクターを構築した。【０１６８】
４）−２−５  リコンビナント抗体の調製
４）−２−５−１  リコンビナント抗体の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍＬに調製した。４０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に０．２４ｍｇの重鎖発現ベクターと０．３６ｍｇの軽鎖発現ベクターと１．８ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍＬのＥＸ−ＣＥＬＬ  ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  （Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過した。【０１６９】
リコンビナント抗体の発現において、ＯｃＨｃｈとＯｃＬｃｈの発現ベクターを組み合わせることによりＯｃＣｈｉｍｅｒａ、ＯｃＨ０１とＯｃＬ０１の発現ベクターを組み合わせることによりＯｃＨ１Ｌ１、ＯｃＨ０２とＯｃＬ０１の発現ベクターを組み合わせることによりＯｃＨ２Ｌ１抗体を生産した。【０１７０】
４）−２−５−２  リコンビナント抗体の精製
実施例４）−２−５−１で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーの１段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライしたのちに、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳへのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を２ｍｇ／ｍＬに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。【０１７１】
実施例５：ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体を用いた免疫染色
５）−１  ＧＩＳＴ細胞株の免疫染色
実施例４）−２−５で作製したウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の染色性を、ＧＩＳＴ細胞株（ＧＩＳＴ４３０、ＧＩＳＴ４３０／６５４）および陰性対照として前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）のパラフィン包埋標本を用いて検討した。脱パラフィンおよび抗原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ  Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）を用いて、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  ｐＨ：ＤＡＫＯ社製）、９７℃で４０分間実施した。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて室温で実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で１回洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ３％  Ｈ２Ｏ２（ＤＡＫＯ社製）を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、３０分間インキュベートし、Ａｉｒ  ｂｌｏｗで液を除去した。ラットモノクローナル抗ＧＰＲ２０抗体あるいはウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体をＲＥＡＬ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫＯ社製）で１．０μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬに希釈し、３０分間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄後、ラット抗体に対してはＨｉｓｔｏｆｉｎｅ  ｓｉｍｐｌｅｓｔａｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ＭＡＸ  ＰＯ（Ｒａｔ）＃４１４３１１（ニチレイバイオサイエンス社製）を、ウサギ抗体に対してはＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＃Ｋ４００３（ＤＡＫＯ社製）を加え、いずれも３０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した。【０１７２】
ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水で計３回洗浄した。【０１７３】
図１３に典型的な染色像を示す。ＧＩＳＴ細胞株に対してウサギキメラ化抗体ＯｃＣｈｉｍｅｒａ及びウサギ化抗体ＯｃＨ１Ｌ１、ＯｃＨ２Ｌ１は、ラット抗体０４−０９３に比べより高感度な染色性を示した。ＧＰＲ２０を発現していない前立腺癌細胞株に対しては染色性を示さなかった。【０１７４】
５）−２  臨床ＧＩＳＴの免疫染色
臨床検体におけるウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の染色性をＧＩＳＴ８０１，  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｒｒａｙ，  ８０  ｃａｓｅｓ／８０  ｃｏｒｅｓ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社製）を用いて検討した。染色は実施例５）−１と同様の方法で実施した。【０１７５】
図１４において（図１４−１）胃ＧＩＳＴ、（図１４−２）小腸ＧＩＳＴ、（図１４−３）大腸ＧＩＳＴに対する各抗体のＧＰＲ２０染色性を比較した結果、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体はいずれもラット抗ＧＰＲ２０抗体０４−０９３よりも高感度であった。【０１７６】
実施例６：エピトープの同定
６）−１  ペプチドＥＬＩＳＡによる結合能評価
以下の合成ペプチドに対するラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体０４−０９３の結合をペプチド−ＥＬＩＳＡ法により評価した。９６−ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）にＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で１晩静置した。溶液を除去し、３００μＬ／ｗｅｌｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下ＰＢＳＴ）で３回洗浄した後、Ｃ末端がビオチン化された、ヒトＧＰＲ２０のアミノ酸番号１から４８番目（配列番号２９）からなる合成ペプチド１、ヒトＧＰＲ２０のアミノ酸番号３０から４８番目（配列番号３０）からなる合成ペプチド２、ＧＰＲ２０のアミノ酸配列とは異なる配列を有する陰性コントロールの合成ペプチドを各々ＰＢＳで１０  ｎＭに溶解した溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間静置した。プレートから溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１晩静置した。溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈した０４−０９３抗体を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間静置した。溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＰＢＳで５００倍希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間静置した。溶液を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１０分間静置した後、プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で化学発光を測定した。図１５に各種抗体の反応例を示す。図１５の横軸はクローン番号、縦軸は化学発光量（ＣＰＳ）による抗体結合量を示す。０４−０９３抗体は、合成ペプチド１及び合成ペプチド２に対して同等の結合活性を示した。一方、他の抗ＧＰＲ２０抗体は、合成ペプチド２に対して結合性を示さなかった。本結果から、０４−０９３抗体はＧＰＲ２０のアミノ酸番号３０から４８番目からなるアミノ酸配列（配列番号３０：ＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤＥＥＬＨＧＴ）に結合することが示された。
６）−２  ＧＰＲ２０断片ペプチドを用いた結合能評価
エピトープを詳細に解析するため、ＧＰＲ２０のアミノ酸番号２９から４８番目からなるペプチド、並びに本ペプチドの末端のアミノ酸を一残基ずつ連続的に短縮したペプチドを合成し、Ｎ−末端をビオチン化、Ｃ−末端をアミド化したものをＧＰＲ２０断片ペプチドライブラリーとして作製した（シグマ アルドリッチ ジャパン社）。作製したＧＰＲ２０断片ペプチドと０４−０９３抗体の解離定数は、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４システム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を使用し、ＧＰＲ２０断片ペプチドをリガンドとしてセンサーチップに捕捉、０４−０９３抗体をアナライトとすることで測定した。緩衝液としてＰＢＳ−Ｔ、センサーチップとしてストレプトアビジンセンサーチップ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いた。各ＧＰＲ２０断片ペプチドについて、センサーチップを１μｇ／ｍＬのペプチド溶液に３００秒間浸した後、０４−０９３抗体の希釈系列溶液（０．２４７〜２０ｎＭの３倍希釈系列、５濃度）に９０秒間浸して結合相をモニターし、引き続き緩衝液に浸して２７０秒間の解離相をモニターした。各濃度の０４−０９３抗体を測定後は、センサーチップを再生するためにクエン酸緩衝液ｐＨ  ２．２に２０秒間浸し、さらに平衡化のため緩衝液に２０秒間浸した。データの解析には１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。
結果を表３に示す。【０１７７】
【表３】
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【０１７８】
ＧＰＲ２０断片ペプチド（ＧＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤ：配列番号２９のアミノ酸番号２９から４２）は０４−０９３抗体に強い結合を示したが、（ＧＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬ：配列番号２９のアミノ酸番号２９から４１）では結合の低下が認められた。また、ＧＰＲ２０断片ペプチド（ＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤＥＥＬ：配列番号２９のアミノ酸番号３０から４５）は０４−０９３抗体に強い結合を示したが、（ＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤＥＥＬ：配列番号２９のアミノ酸番号３１から４５）では結合の低下が認められた。これらの結果より、配列番号２９のアミノ酸番号３０から４２（ＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤ：配列番号３１）を０４−０９３抗体のエピトープとして同定した。【０１７９】
実施例７：ウエスタンブロッティング法によるＧＰＲ２０タンパク質の検出
２９３Ｔ細胞に一過性に発現させたＧＰＲ２０タンパク質をウエスタンブロッティング法により検出した。２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０の発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＧＰＲ２０並びにｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）を各々導入した。各細胞よりＭｅｍ−ＰＥＲ  Ｐｌｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて膜画分のタンパク質溶解液を調製し、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク質濃度を測定した。濃度調整したタンパク質溶液にＮｕＰＡＧＥＴＭ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （４Ｘ）、ＮｕＰＡＧＥＴＭ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ  （１０Ｘ）  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１Ｘ濃度となるように添加し、７０℃で１０分間加熱した後、定法に従いＴｒｉｓ  ／Ｇｌｙｓｉｎ／ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで２０μｇ／ｌａｎｅのタンパク質を電気泳動した。泳動後のゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にタンパク質を転写した。このＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ社）で１時間ブロッキングした後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈したウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体またはウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の１次抗体反応液中で４℃、一晩振盪した。また、対照としてウサギIgG及びマウス抗FLAG抗体、マウス抗β actin抗体を同様に一次抗体反応液として用いた。ＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．  システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで３回洗浄した後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈した２次抗体液（１次抗体がウサギ抗体の場合はＩＲＤｙｅ  ６８０ＣＷ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、１次抗体がマウス抗体の場合はＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを使用した）で反応させた後、ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで２回、ＴＢＳで１回洗浄した。蛍光の検出にはＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社）を用いた。図１７において、ウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体ＯｃＨ１Ｌ１、ＯｃＨ２Ｌ１、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体ＯｃＣｈｉｍｅｒａは、ヒトＧＰＲ２０を発現する２９３Ｔ−ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＰＲ２０細胞またはＮ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０を発現する２９３Ｔ−ｐＦＬＡＧ−ＧＰＲ２０細胞に対して反応性を示し、複数のバンドが検出された。一方、陰性コントロールである２９３Ｔ−ｐｃＤＮＡ３．１細胞ではバンドが検出されなかった。また、マウス抗ＦＬＡＧ抗体は２９３Ｔ−ｐＦＬＡＧ−ＧＰＲ２０に対してのみ反応性を示し、複数のバンドが検出された。以上の結果より、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体はウエスタンブロッティング法によるＧＰＲ２０の検出に有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明の提供する抗ＧＰＲ２０抗体を用いることによりＧＰＲ２０を発現している各種癌の検査または診断が可能となり、本発明の抗ＧＰＲ２０抗体を含むＧＰＲ２０を発現している各種癌の検査または診断用キット等を提供することができる。また、本発明の抗ＧＰＲ２０抗体を有効成分として含む医薬組成物等を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１８１】
配列番号１８：ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号１９： ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列
配列番号２０：ウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２１： ウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列
配列番号２２：ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２３： ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１のアミノ酸配列
配列番号２４：ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２５： ウサギ化抗体重鎖Ｈ０２のアミノ酸配列
配列番号２６：ウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２７：ウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２９：合成ペプチド１  ヒトＧＰＲ２０の１から４８番目のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月26日(2019.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項２】
ＧＰＲ２０への結合に対して、配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体と競合阻害活性を有する抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項３】
ＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤ（配列番号３１）に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合することを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項４】
重鎖配列が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６または９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、並びに、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み；
軽鎖配列が配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する可変領域を含む、請求項１乃至３のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項５】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び、配列番号１２に示される軽鎖可変領域を含むことからなる、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項６】
配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖、及び、配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項７】
キメラ抗体であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項８】
定常領域がウサギ抗体由来であることを特徴とする、請求項７に記載のキメラ抗体。
【請求項９】
配列番号１９のアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２１のアミノ酸番号２１乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む請求項１乃至５、７及び８のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１０】
ウサギ化されていることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１１】
ヒト化されていることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１２】
以下の（ａ）または（ｂ）に記載の重鎖、及び（ｃ）に記載の軽鎖を含む、請求項１乃至５及び１０のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片：
（ａ）配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｂ）配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｃ）配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖。
【請求項１３】
配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、請求項１乃至５及び１０のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１４】
配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、請求項１乃至５及び１０のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片。
【請求項１５】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦｖからなる群から選択される、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片。
【請求項１６】
ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ＧＰＲ２０の検出または測定方法が、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されたか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されなかったか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＧＰＲ２０陽性疾患の検査または診断方法に使用される、請求項１７乃至２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
ＧＰＲ２０陽性疾患の検査または診断方法が、ＧＰＲ２０の検出または測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防方法には適していないと判定することを含む、請求項１７乃至２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
ＧＰＲ２０陽性疾患がＧＰＲ２０陽性癌である、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＧＰＲ２０陽性疾患が消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である、請求項２１乃至２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
下記（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載の被験者に投与される、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を含む医薬組成物：
（ａ）請求項１７乃至１９及び２１のいずれか１項に記載の組成物を用いてＧＰＲ２０が検出または測定された被検標本の由来する被験者；
（ｂ）請求項２０記載の組成物を用いたＧＰＲ２０の検出または測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者；
（ｃ）請求項２２または２４記載の組成物を用いて、ＧＰＲ２０に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合性断片を投与する工程を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療または予防に適していると判定された被験者。
【請求項２６】
以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含むＧＰＲ２０陽性疾患の治療方法：
（ａ）請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片、請求項１７乃至１９、２１に記載の組成物を用いて検体のＧＰＲ２０を検出または測定する工程；
（ｂ）（ａ）においてＧＰＲ２０の発現が検出または測定された検体に由来する被験者に抗ＧＰＲ２０抗体又は該抗体の抗原結合性断片を投与する工程。
【請求項２７】
請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７記載のポリヌクレオチドまたは請求項２８記載のベクターを含む細胞、
【請求項３０】
下記の工程（ａ）および（ｂ）を含む、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片の製造方法：
（ａ）請求項２９記載の細胞を培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養物からモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合性断片を回収する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意、検討を行い、新規な抗ＧＰＲ２０抗体を創出し、該抗体を用いてＧＰＲ２０を検出できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）配列番号１においてアミノ酸番号１乃至４８に示されるアミノ酸配列を含むことからなるペプチドに特異的に結合する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（２）ＧＰＲ２０への結合に対して、配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体と競合阻害活性を有する抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（３）ＬＥＶＰＬＦＨＬＦＡＲＬＤ（配列番号３１）に示されるアミノ酸配列からなるエピトープに結合することを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗体又は当該抗体の抗原結合性断片、
（４）重鎖配列が、配列番号５または８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６または９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、並びに、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する可変領域を含み；
軽鎖配列が配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する可変領域を含む、（１）乃至（３）のいずれか1項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（５）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び、配列番号１２に示される軽鎖可変領域を含むことからなる、（１）乃至（４）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（６）配列番号３のアミノ酸番号２０乃至４６６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖、及び、配列番号１１のアミノ酸番号２０乃至２３２に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（７）キメラ抗体であることを特徴とする（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（８）定常領域がウサギ抗体由来であることを特徴とする、（７）に記載のキメラ抗体、
（９）配列番号１９のアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２１のアミノ酸番号２１乃至２３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む（１）乃至（５）、（７）及び（８）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（１０）ウサギ化されていることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（１１）ヒト化されていることを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（１２）以下の（ａ）または（ｂ）に記載の重鎖、及び（ｃ）に記載の軽鎖を含む、（１）乃至（５）及び（１０）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片：
（ａ）配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に記載のアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｂ）配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、
（ｃ）配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖、
（１３）配列番号２３においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、（１）乃至（５）及び（１０）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（１４）配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列を含むことからなる重鎖及び、配列番号２７においてアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列を含むことからなる軽鎖からなる、（１）乃至（５）及び（１０）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片、
（１５）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’およびＦｖからなる群から選択される、（１）乃至（１４）のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片、
（１６）ｓｃＦｖであることを特徴とする、（１）乃至（１４）のいずれか１項に記載の抗体、
（１７）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含む組成物、
（１８）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または当該抗体の抗原結合性断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、（１７）に記載の組成物、
（１９）（１）乃至（１６）のいずれか１項に記載の抗体または該抗体の抗原結合性断片と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のＧＰＲ２０の検出または測定方法に使用される、（１７）または（１８）に記載の組成物、
（２０）ＧＰＲ２０の検出または測定方法が、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されたか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてＧＰＲ２０が検出もしくは測定されなかったか、または被検標本におけるＧＰＲ２０の発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、（１８）または（１９）に記載の組成物、
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するものおよびそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「ＧＰＲ２０遺伝子」としては、例えば、ＧＰＲ２０蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれるＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等を挙げることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ＧＰＲ２０のｃＤＮＡは例えば、ＧＰＲ２０のｍＲＮＡを発現している臓器のｃＤＮＡライブラリーまたはヒト細胞から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＧＰＲ２０のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７−４９１）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
ウサギ化抗体の更に具体的な例としては、０４−０９３抗体のウサギ化抗体を挙げることができ、より具体的な例としては、配列表の配列番号２３のアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖（ＯｃＨ０１）または配列番号２５のアミノ酸番号２０乃至４５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖（ＯｃＨ０２）、及び配列番号２７のアミノ酸番号２１乃至２３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖（ＯｃＬ０１）、を含むことからなるウサギ化抗体を挙げることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
製剤用の物質として、例えば、アミノ酸類、抗菌剤、抗酸化剤、緩衝剤、充填剤、キレート剤、錯化剤、増量剤、単糖類、二糖類、炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、親水ポリマー、防腐剤、溶媒、糖アルコール、懸濁剤、界面活性剤、安定化増強剤、弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、および／または薬学上の補助剤等を挙げることができ、それらの物質の添加量は、抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体の重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
本発明の診断用組成物は、抗ＧＰＲ２０抗体もしくはその機能断片またはその修飾体、それらを含む組成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
実施例２：ラット抗ヒトＧＰＲ２０抗体のＩＨＣ適性評価
２）−１  ＧＰＲ２０一過性発現２９３Ｔ細胞を用いたＧＰＲ２０染色性評価
２）−１−１  セルブロックの作製
２９３Ｔ細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０またはｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）でトランスフェクションされた。このＧＰＲ２０発現２９３Ｔ細胞のペレットをホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。同様にｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞（コントロール２９３Ｔ細胞）についてもホルマリン固定後にパラフィン包埋ブロックとした。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５２】
０４−０９３抗体の重鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列中の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列である。配列表の配列番号２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして、４００乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の重鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２において、ＣＤＲＨ１をコードするヌクレオチド番号１３３乃至１６２またはヌクレオチド番号１１８乃至１６２に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２３４または２０５乃至１８３に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＨ３をコードするヌクレオチド番号３５２乃至３６６に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４−０９３抗体の重鎖のシグナル配列と可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１６にも示されている。配列表の配列番号１６に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、５８乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードしている。配列番号２の配列は図１にも記載されている。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
０４−０９３抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列である。配列表の配列番号１０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして、３７９乃至６９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は０４−０９３抗体の軽鎖定常領域をコードしている。当該可変領域をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０において、ＣＤＲＬ１をコードするヌクレオチド番号１２７乃至１５９に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ２をコードするヌクレオチド番号２０５乃至２２５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ＣＤＲＬ３をコードするヌクレオチド番号３２２乃至３４５に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを有する。０４−０９３抗体の軽鎖のシグナル配列と可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１７にも示されている。配列表の配列番号１７に示されるヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、５８乃至３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードしている。また、配列番号１０の配列は図２に記載されている。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
４）−２−１−２  ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈ発現ベクターの構築
配列番号１８に示すウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号１８に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、８３乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、４２５乃至１３９３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、合成したＤＮＡ断片とｐＣＭＡ−ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードする部分を取り除いたＤＮＡ断片を結合することにより、ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈ発現ベクターを構築した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
４）−２−２  ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体の軽鎖発現ベクターの構築
４）−２−２−１  ウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈ発現ベクターの構築
配列番号２０に示すウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２０に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、８６乃至４０６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードし、４０７乃至７２１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例４）−２−１−２と同様の方法でウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈの発現ベクターを構築した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
４）−２−３  ウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の重鎖発現ベクターの構築
４）−２−３−１  ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１の発現ベクターの構築
配列番号２２に示すウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２２に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、８３乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、４２５乃至１３９３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例４）−２−１−２と同様の方法でウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１発現ベクターを構築した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
４）−２−３−２  ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２の発現ベクターの構築
配列番号２４に示すウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２４に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、８３乃至４２４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は重鎖可変領域をコードし、４２５乃至１３９３番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例４）−２−１−２と同様の方法でウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２発現ベクターを構築した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
４）−２−４  ウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の軽鎖発現ベクターの構築
４）−２−４−１  ウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１の発現ベクターの構築
配列番号２６に示すウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列表の配列番号２６に示されるヌクレオチド配列の２６乃至８５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列をコードし、８６乃至４０６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は軽鎖可変領域をコードし、４０７乃至７２１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域をコードしている。実施例５）−２−１−２と同様の方法でウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１発現ベクターを構築した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
実施例７：ウエスタンブロッティング法によるＧＰＲ２０タンパク質の検出
２９３Ｔ細胞に一過性に発現させたＧＰＲ２０タンパク質をウエスタンブロッティング法により検出した。２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ヒトＧＰＲ２０発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｈＧＰＲ２０、Ｎ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０の発現ベクターｐＦＬＡＧ−ＧＰＲ２０並びにｐｃＤＮＡ３．１（空ベクター）を各々導入した。各細胞よりＭｅｍ−ＰＥＲ  Ｐｌｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて膜画分のタンパク質溶解液を調製し、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてタンパク質濃度を測定した。濃度調整したタンパク質溶液にＮｕＰＡＧＥＴＭ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （４Ｘ）、ＮｕＰＡＧＥＴＭ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ  （１０Ｘ）  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１Ｘ濃度となるように添加し、７０℃で１０分間加熱した後、定法に従いＴｒｉｓ  ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ  ｂｕｆｆｅｒを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで２０μｇ／ｌａｎｅのタンパク質を電気泳動した。泳動後のゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）にタンパク質を転写した。このＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ社）で１時間ブロッキングした後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈したウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体またはウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体の１次抗体反応液中で４℃、一晩振盪した。また、対照としてウサギIgG及びマウス抗FLAG抗体、マウス抗β actin抗体を同様に一次抗体反応液として用いた。ＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．  システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで３回洗浄した後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈した２次抗体液（１次抗体がウサギ抗体の場合はＩＲＤｙｅ  ６８０ＣＷ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、１次抗体がマウス抗体の場合はＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧを使用した）で反応させた後、ＴＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０バッファーで２回、ＴＢＳで１回洗浄した。蛍光の検出にはＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社）を用いた。図１７において、ウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体ＯｃＨ１Ｌ１、ＯｃＨ２Ｌ１、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体ＯｃＣｈｉｍｅｒａは、ヒトＧＰＲ２０を発現する２９３Ｔ−ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＰＲ２０細胞またはＮ末端にＦＬＡＧタグを付加したヒトＧＰＲ２０を発現する２９３Ｔ−ｐＦＬＡＧ−ＧＰＲ２０細胞に対して反応性を示し、複数のバンドが検出された。一方、陰性コントロールである２９３Ｔ−ｐｃＤＮＡ３．１細胞ではバンドが検出されなかった。また、マウス抗ＦＬＡＧ抗体は２９３Ｔ−ｐＦＬＡＧ−ＧＰＲ２０に対してのみ反応性を示し、複数のバンドが検出された。以上の結果より、ウサギキメラ化抗ＧＰＲ２０抗体及びウサギ化抗ＧＰＲ２０抗体はウエスタンブロッティング法によるＧＰＲ２０の検出に有用であることが示された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
配列番号１８：ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号１９： ウサギキメラ化抗体重鎖ＯｃＨｃｈのアミノ酸配列
配列番号２０：ウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２１： ウサギキメラ化抗体軽鎖ＯｃＬｃｈのアミノ酸配列
配列番号２２：ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２３： ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０１のアミノ酸配列
配列番号２４：ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２５： ウサギ化抗体重鎖ＯｃＨ０２のアミノ酸配列
配列番号２６：ウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１のアミノ酸配列をコードする配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列
配列番号２７：ウサギ化抗体軽鎖ＯｃＬ０１のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２９：合成ペプチド１  ヒトＧＰＲ２０の１から４８番目のアミノ酸配列
【国際調査報告】
2018181656.tif 000029
2018181656.tif 000030
2018181656.tif 000031
2018181656.tif 000032