(57)【要約】  例えば、高密度培養時においても、巨核球の血小板産生能および産生された血小板の生理活性の少なくとも一方を向上可能な血小板の製造方法を提供する。  本発明の血小板の製造方法は、巨核球から血小板を産生する血小板産生工程を含み、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することを特徴とする。
2019059234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球から血小板を産生する血小板産生工程を含み、
グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することを特徴とする、血小板の製造方法。
【請求項２】
前記グリシンの濃度が、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１記載の血小板の製造方法。
【請求項３】
前記グリシンの濃度が、６ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１または２記載の血小板の製造方法。
【請求項４】
前記グリシンの濃度が、１１〜２１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１から３のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
【請求項５】
前記システインの濃度が、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１から４のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
【請求項６】
前記システインの濃度が、２〜１１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１から５のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
【請求項７】
前記血小板の産生開始時の巨核球の細胞密度が、３×１０５細胞／ｍＬ以上である、請求項１から６のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
【請求項８】
前記巨核球は、不死化巨核球である、請求項１から７のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
【請求項９】
前記巨核球は、多能性細胞に由来する、請求項１から８のいずれか一項に記載の血小板の製造方法。
【請求項１０】
前記多能性細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項９記載の血小板の製造方法。
【請求項１１】
前記巨核球は、ヒト由来である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
血小板から血小板製剤を製造する製剤工程を含み、
前記血小板は、請求項１から１１のいずれか一項に記載の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする、血小板製剤の製造方法。
【請求項１３】
血小板と他の成分とを混合することにより、血液製剤を製造する血液製剤工程を含み、
前記血小板は、請求項１から１１のいずれか一項に記載の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする、血液製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板の製造方法、血小板製剤の製造方法、および血液製剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板製剤は、手術、傷害等の出血時、その他血小板の減少を伴う患者に対して投与される。血小板製剤は、献血で得られた血液から現在製造されている。しかしながら、人口構成の変化から、献血量が低減し、血小板製剤が不足することが懸念されている。【０００３】
また、献血の提供者が細菌等の感染症に罹患している場合、血液が細菌汚染されている可能性があるため、細菌汚染された血小板製剤の投与による感染症のリスクがある。このため、in vitroで血小板を製造する方法が開発されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Takayama N et.al, “Generation of functional platelets from human embryonic stem cells in vitro via ES-sacs, VEGF-promoted structures that concentrate hematopoietic progenitors.”, 2008, Blood, Vol. 111, No.11, pages 5298-5306
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血小板の大量製造のためには、高い細胞密度で巨核球の培養（以下、「高密度培養」ともいう）を実施し、血小板を高い密度で得ることが望ましい。このため、本発明者らは、高密度培養を試みた。しかしながら、前記高密度培養では、前記巨核球の血小板産生能が低下する、または前記巨核球から産生された血小板の生理活性が低下するという問題が生じることを見出した。【０００６】
そこで、本発明は、例えば、高密度培養においても、巨核球の血小板産生能および産生された血小板の生理活性の少なくとも一方を向上可能な血小板の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の血小板の製造方法は、巨核球から血小板を産生する血小板産生工程を含み、
グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することを特徴とする。【０００８】
本発明の血小板製剤の製造方法は、血小板から血小板製剤を製造する製剤工程を含み、
前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。【０００９】
本発明の血液製剤の製造方法は、血小板と他の成分とを混合することにより、血液製剤を製造する血液製剤工程を含み、
前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、例えば、高密度培養においても、巨核球の血小板産生能および産生された血小板の生理活性上の少なくとも一方を向上可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１における血小板の数を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例１におけるＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩの増加割合を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例１における血小板の数およびアネキシンＶ陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例２におけるＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩの増加割合を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例３における巨核球の数に対する血小板の数の比および血小板の濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、実施例３における血小板の濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の血小板の製造方法において、前記グリシンの濃度は、例えば、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。前記グリシンの濃度は、好ましくは、６ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは、１１〜２１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１３】
本発明の血小板の製造方法において、前記システインの濃度は、例えば、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。前記システインの濃度は、好ましくは、２〜１１ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１４】
本発明の血小板の製造方法において、前記血小板の産生開始時の巨核球の細胞密度は、例えば、３×１０５細胞／ｍＬ以上である。
【００１５】
本発明の血小板の製造方法において、前記巨核球は、例えば、不死化巨核球である。
【００１６】
本発明の血小板の製造方法において、前記巨核球は、例えば、多能性細胞に由来する。前記多能性細胞は、例えば、人工多能性幹細胞である。
【００１７】
本発明の血小板の製造方法において、前記巨核球は、例えば、ヒト由来である。
【００１８】
＜血小板の製造方法＞
本発明の血小板の製造方法は、巨核球から血小板を産生する血小板産生工程（以下、「産生工程」ともいう）を含み、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することを特徴とする。本発明の血小板の製造方法は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、前記血小板産生工程を実施することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板の製造方法は、例えば、後述の本発明の血小板製剤の製造方法、血液製剤の製造方法、血小板製剤、および血液製剤の説明を援用できる。
【００１９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、前記高密度培養をグリシン存在下で実施することにより、前記巨核球の血小板産生能を向上できることを見出した。また、前記血小板産生能の向上は、グリシンが、前記巨核球に発現するグリシン受容体を活性化し、前記巨核球内に塩素イオン（Ｃｌ−）が流入することにより生じると推定された。なお、前記推定は、本発明を何ら制限しない。さらに、本発明者らは、鋭意研究の結果、メカニズムは不明であるが、前記高密度培養をシステイン存在下で実施することにより、産生された血小板の生理活性を向上できることを見出した。したがって、本発明によれば、例えば、前記高密度培養においても、巨核球の血小板産生能および産生された血小板の生理活性の少なくとも一方を向上可能であるため、前記高密度培養時に効率（収率）よく血小板の製造および機能性の高い血小板の製造の少なくとも一方を達成することできる。
【００２０】
本発明において、「巨核球」は、生体内においては骨髄中に存在する最大の細胞であり、血小板を放出する細胞および同等の機能を有する細胞を意味する。前記同等の機能を有する細胞は、血小板産生能を有する細胞を意味する。本発明において、巨核球は、多核化（多倍体化）前の巨核球、すなわち、未成熟な巨核球または増殖期の巨核球でもよいし、多核化後の巨核球（多核化巨核球）でもよい。具体例として、前記巨核球は、例えば、前巨核芽球、巨核芽球、前巨核球、および成熟巨核球のいずれでもよい。前記多核化後の巨核球が有する染色体のセット数は、２セットを超えればよく、具体例として、１６〜３２セットである。
【００２１】
前記巨核球の由来は、特に制限されないが、例えば、ヒトおよび非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、サル、ゴリラ、チンパンジー、マーモセット等の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ヒツジ、ウマ、モルモット等があげられる。
【００２２】
本発明において、前記巨核球は、細胞表面マーカーにより特定できる。前記巨核球がヒト由来の場合、前記細胞表面マーカーは、CD41a、CD42aおよびCD42bがあげられる。すなわち、前記巨核球は、CD41a、CD42aおよびCD42bが陽性の細胞である。前記巨核球がヒト由来の場合、前記細胞表面マーカーは、例えば、CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、およびCD203cからなる群から選択された少なくとも１つであってもよい。
【００２３】
本発明において、前記巨核球の血小板産生能は、例えば、前記血小板の産生開始時の巨核球の数（Ｍ）に対する前記血小板産生工程後における血小板の数（Ｐ）の比（Ｐ／Ｍ比）として表すことができる。また、前記巨核球の血小板産生能の低下の抑制または前記巨核球の血小板産生能の向上は、例えば、グリシンおよびシステイン非存在下で高密度培養した際のＰ／Ｍ比として、有意にＰ／Ｍ比が高いことを意味する。
【００２４】
本発明において、「血小板」は、血液中の細胞成分の一つであり、CD41aおよびCD42bが陽性である細胞成分を意味する。前記血小板は、例えば、細胞核を有さず、また、前記巨核球と比較して、大きさが小さい。このため、前記血小板と前記巨核球とは、例えば、細胞核の有無および／または大きさにより区別できる。前記血小板は、血栓形成と止血において重要な役割を果たすとともに、損傷後の組織再生や炎症の病態生理にも関与することが知られている。また、前記血小板は、出血等により血小板が活性化されると、その膜上にIntegrin αIIBβ3（glycoprotein IIb/IIIa; CD41aとCD61の複合体）等の細胞接着因子の受容体が発現することが知られている。また、前記血小板が活性化されると、血小板同士が凝集し、血小板から放出される各種の血液凝固因子によってフィブリンが凝固することにより、血栓が形成され、止血が進む。本発明において、前記血小板の由来は、前記巨核球の由来と同じである。
【００２５】
本発明において、前記血小板の生理活性は、公知の方法により評価することができる。前記血小板の生理活性は、例えば、活性化した血小板膜上のIntegrin αIIBβ3に特異的に結合するPAC-1に対する抗体を用いて、活性化した血小板量を評価することができる。また、前記血小板の生理活性は、例えば、血小板の活性化マーカーであるCD62p（P-selectin）を抗体で検出し、活性化した血小板量を評価してもよい。前記血小板の生理活性は、例えば、フローサイトメトリーを用い、活性化非依存性の血小板マーカーCD61またはCD41に対する抗体でゲーティングを行い、その後、抗PAC-1抗体や抗CD62p抗体の結合を検出することにより実施してもよい。これらの血小板の生理活性の評価は、アデノシン二リン酸（ADP）存在下で実施してもよい。
【００２６】
本発明において、前記血小板の生理活性の評価は、例えば、ADP存在下でフィブリノーゲンと結合するか否かを見て評価してもよい。前記血小板がフィブリノーゲンと結合することにより、血栓形成の初期に必要なインテグリンの活性化が生じる。さらに、前記血小板の生理活性は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号の図６に示されるように、in vivoでの血栓形成能を可視化して観察する方法で実施してもよい。
【００２７】
本発明において、「機能性が高い（生理活性が高い）」は、例えば、従来の方法で得られた血小板、すなわち、グリシンおよびシステイン非存在下で産生された血小板と比較して、前述のいずれかの方法で測定した血小板の生理活性が有意に高い、高い傾向がある、または生体から単離された血小板と生理活性が同等であることを意味する。また、前記「機能性が高い」は、例えば、前述のいずれかの方法で測定した血小板の生理活性が、生体から単離された血小板の生理活性と比較して、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であることを意味してもよい。
【００２８】
前記血小板は、例えば、前記血小板のCD42bの発現率が低い場合、またはアネキシンV陽性率が低い場合、劣化している、または異常である（以下、あわせて「劣化」ともいう）と評価できる、すなわち、前記血小板の生理活性は低いと評価できる。このため、産生された血小板における劣化している血小板の割合が低いほど、例えば、前記産生された血小板は、生理活性が高いと評価できる。また、劣化している血小板は、例えば、血栓形成機能（血液凝固機能）および止血機能を十分に有さず、臨床的な有用性が低い。
【００２９】
本発明において、前記「血小板の劣化」は、例えば、前記血小板表面のCD42b（GPIbα）が減少することをいう。すなわち、劣化している血小板は、例えば、CD42bの発現が低下した血小板およびシェディング反応によってCD42bの細胞外領域が切断された血小板を含む。前記血小板表面のCD42bがなくなると、前記血小板は、例えば、フォン・ウィルブランド因子（von Willebrand factor：VWF）との会合ができなくなり、結果的に、前記血小板の血液凝固機能が失われる。前記血小板の劣化は、例えば、前記血小板分画中のCD42b陽性率（またはCD42b陽性粒子数）に対するCD42b陰性率（またはCD42b陰性粒子数）を指標として評価することができる。具体例として、CD42b陽性率に対するCD42b陰性率が高いほど、または、CD42b陽性粒子数に対するCD42b陰性粒子数が多いほど、前記血小板は、劣化していると評価できる。前記CD42b陽性率は、前記血小板分画に含まれる血小板のうち、抗CD42b抗体が結合できる血小板の割合を意味する。また、前記CD42b陰性率は、血小板分画に含まれる血小板のうち、抗CD42b抗体が結合しない血小板の割合を意味する。
【００３０】
本発明において「異常な血小板」は、例えば、陰性電荷リン脂質であるホスファチジルセリンが脂質二重層の内側から外側に露出した血小板をいう。生体内においては、ホスファチジルセリンは血小板の活性化に伴って表面に露出し、そこに多くの血液凝固因子が結合することによって、血液凝固カスケード反応が増幅されることが知られている。一方、前記異常な血小板では、例えば、常に多くのホスファチジルセリンが表面に露出しているため、前記異常な血小板が患者に投与されると、例えば、過剰な血液凝固反応を引き起こし、播種性血管内凝固症候群等の重篤な病態が惹起される可能性がある。ホスファチジルセリンにはアネキシンＶが結合することが知られているため、前記血小板表面上のホスファチジルセリンは、例えば、蛍光標識したアネキシンＶの結合量を指標とし、フローサイトメータを用いて検出できる。このため、前記異常な血小板の量は、例えば、前記血小板分画中のアネキシンV陽性率、すなわち、アネキシンが結合する血小板の割合または数で評価することができる。具体例として、アネキシンＶ陽性率が高いほど、またはアネキシンＶ粒子数が多いほど、対象の血小板には、異常な血小板が多いと評価できる。
【００３１】
本発明の血小板の製造方法において、前記血小板産生工程（以下、「産生工程」ともいう）は、前述のように、巨核球から血小板を産生する。前記産生工程は、例えば、培地の存在下、前記巨核球を培養することにより実施できる。前記巨核球の培養は、例えば、フィーダ細胞上で実施してもよいし、フィーダ細胞なしで実施してもよい。前記巨核球は、例えば、浮遊培養できるため、前記フィーダ細胞なしで培養できる。前記フィーダ細胞は、増殖または分化させるようとする目的の細胞（目的細胞）の培養に必要な環境を整えるために、前記目的細胞と共培養される細胞を意味する。前記フィーダ細胞は、前記目的細胞と識別可能な細胞であればよく、前記目的細胞と同種由来の細胞でもよいし、異種由来の細胞でもよい。前記フィーダ細胞は、例えば、抗生物質、抗癌剤、γ線照射等により増殖しないように処理された細胞であってもよい。
【００３２】
前記巨核球は、例えば、巨核球より未分化な細胞から誘導することができる。このため、本発明の血小板の製造方法は、例えば、前記産生工程に先立ち、巨核球より未分化な細胞から前記巨核球を誘導する巨核球誘導工程を含んでもよい。前記巨核球誘導工程において使用する培地、培養条件等は、例えば、後述の産生工程の説明を援用できる。
【００３３】
前記「巨核球より未分化な細胞」は、前記巨核球への分化能を有する細胞を意味する。具体例として、前記巨核球より未分化な細胞は、例えば、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４陽性細胞、巨核球・赤芽球前駆細胞（megakaryocyte-erythroid progenitor：MEP）、巨核球前駆細胞等があげられる。前記巨核球より未分化な細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血等から単離してもよいし、ＥＳ細胞（胚性幹細胞、embryonic stem cells）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells、iPS細胞）、核移植ＥＳ細胞（ntES細胞）、生殖性幹細胞、体性幹細胞、胚性腫瘍細胞等の多能性細胞から誘導してもよい。
【００３４】
前記巨核球の誘導方法は、特に制限されず、公知の誘導方法により実施できる。具体例として、前記巨核球の誘導方法は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号、国際公開２０１２／１５７５８６号等に記載された方法があげられる。具体例として、前記巨核球誘導工程では、例えば、前記巨核球より未分化な細胞に、癌遺伝子およびポリコーム遺伝子を強制発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、例えば、無限に増殖する不死化巨核球を得ることができる。さらに、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球を多核化巨核球に誘導し、血小板を産生させることができる。また、前記巨核球誘導工程では、例えば、前記巨核球前駆細胞にアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、前記不死化巨核球を得ることができる。さらに、後述の産生工程において、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球から多核化巨核球が誘導され、前記血小板が産生される。
【００３５】
前記巨核球誘導工程では、例えば、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよい。この場合、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行なってもよいし、別個に行なってもよい。具体例として、前記巨核球誘導工程では、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現後、前記強制発現を解除し、つぎに、前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよいし、前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させてもよいし、前記癌遺伝子および前記ポリコーム遺伝子を強制発現させ、さらに、前記アポトーシス抑制遺伝子を発現させてもよい。これにより、前記巨核球誘導工程では、前記不死化巨核球を得ることができる。さらに、後述の産生工程において、例えば、前記不死化巨核球の前記強制発現を解除することにより、前記不死化巨核球から多核化巨核球が誘導され、前記血小板が産生される。
【００３６】
前記巨核球誘導工程は、例えば、各遺伝子の導入効率を向上できることから、前記巨核球より未分化な細胞に、癌遺伝子およびポリコーム遺伝子を強制発現させる第１の発現工程と、前記未分化な細胞において、Ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子等のアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させる第２の発現工程と、前記強制発現を全て解除する解除工程とを含むことが好ましい。前述のように、前記強制発現を解除することにより、例えば、前記不死化巨核球から多核化巨核球が誘導され、前記血小板が産生される。このため、前記解除工程は、前記産生工程ということもできる。
【００３７】
各遺伝子の強制発現および強制発現の解除は、例えば、国際公開第２０１１／０３４０７３号、国際公開第２０１２／１５７５８６号、国際公開第２０１４／１２３２４２号または下記参考文献１に記載された方法等の公知の方法、またはそれに準ずる方法で実施できる。具体例として、各遺伝子の強制発現および強制発現の解除は、例えば、薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いて実施できる。前記遺伝子発現誘導システムは、例えば、Ｔｅｔ−ｏｎ（登録商標）システム、Ｔｅｔ−ｏｆｆ（登録商標）システム等があげられる。前記Ｔｅｔ−ｏｎシステムを用いる場合、例えば、前記強制発現する工程では、テトラサイクリン、ドキシサイクリン等の遺伝子発現を誘導する薬剤の存在下、培養を実施し、前記強制発現を解除する工程では、前記薬剤の非存在下で、前記培養を実施する。
参考文献１：Nakamura S et al, “Expandable megakaryocyte cell lines enable clinically applicable generation of platelets from human induced pluripotent stem cells.”, Cell Stem Cell, 2014, vol.14, No.4, pages 535-548
【００３８】
本発明において、「癌遺伝子」は、生体内で細胞の癌化を誘導可能な遺伝子を意味し、例えば、ｃ−ＭＹＣ、Ｎ−ＭＹＣ、Ｌ−ＭＹＣ等のＭＹＣファミリー遺伝子、ＳＲＣファミリー遺伝子、ＲＡＳファミリー遺伝子、ＲＡＦファミリー遺伝子、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＰＤＧＦＲ（血小板成長因子受容体）、Ａｂｌ（Abelson murine leukemia viral oncogene homolog）等のプロテインキナーゼファミリー遺伝子等があげられる。
【００３９】
本発明において、「ポリコーム遺伝子」は、ＣＤＫＮ２ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害２Ａ、ＩＮＫ４ａ／ＡＲＦ）を負に制御し、細胞老化を回避するために機能すると知られている遺伝子を意味する（下記参考文献２〜４）。具体例として、前記ポリコーム遺伝子は、例えば、BMI1（Polycomb complex protein BMI-1、polycomb group RING finger protein 4 (PCGF4)、RING finger protein 51 (RNF51)）、Mel18（Polycomb group RING finger protein 2）、Ring（Ring Finger Protein）1a/b、Phc（Polyhomeotic Homolog）1/2/3、Cbx（Chromobox）2/4/6/7/8、Ezh2（Enhancer Of Zeste 2 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit）、Eed（Embryonic Ectoderm Development）、Suz12（SUZ12 Polycomb Repressive Complex 2 Subunit）、HADC（Histone deacetylases）、Dnmt（DNA (cytosine-5)-methyltransferase）1/3a/3b等があげられる。
参考文献２：小黒秀行ら、「ポリコーム群蛋白複合体による幹細胞の老化制御」、再生医療、２００７年、第６巻、第４号、２６−３２頁
参考文献３：Jesus Gil et.al, “ Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2007, vol.7, pages 667-677
参考文献４：Soo-Hyun Kim et.al., “ Absence of p16INK4a and truncation of ARF tumor suppressors in chickens”, PNAS, 2003, vol.100, No.1, pages 211-216
【００４０】
本発明において、「アポトーシス抑制遺伝子」は、細胞のアポトーシスを抑制可能な機能を有する遺伝子を意味し、例えば、BCL2（B-cell lymphoma 2）、Bcl-xL（B-cell lymphoma-extra large）、Survivin（Baculoviral IAP Repeat Containing 5）、MCL1（BCL2 Family Apoptosis Regulator）等があげられる。
【００４１】
つぎに、前記産生工程は、前述のように、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下、実施する。具体的には、前記産生工程は、例えば、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含む培地の存在下、巨核球から血小板を産生する。前記産生工程は、例えば、グリシンまたはシステインの存在下、実施してもよいし、グリシンおよびシステインの存在下、実施してもよい。前記産生工程は、例えば、前記巨核球を含む培地を、例えば、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含む培地に交換する、または前記巨核球を含む培地に、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を添加することで実施できる。
【００４２】
グリシンおよびシステインは、例えば、その誘導体でもよい。前記誘導体は、特に制限されず、例えば、その異性体もしくは塩、またはそれらの溶媒和物もしくは水和物等があげられる。前記異性体は、例えば、光学異性体等があげられる。
【００４３】
前記産生工程において、前記グリシンの濃度は、特に制限されず、血小板の産生能の向上効果を示す範囲で有ればよい。前記グリシンの濃度の下限は、特に制限されず、例えば、２ｍｍｏｌ／Ｌであり、特に機能性の高い血小板が得られることから、好ましくは、６ｍｍｏｌ／Ｌ、１１ｍｍｏｌ／Ｌである。前記グリシンの濃度の上限は、特に制限されず、例えば、４１ｍｍｏｌ／Ｌ、４０ｍｍｏｌ／Ｌ、３１ｍｍｏｌ／Ｌ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ、２１ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記グリシンの濃度の範囲は、例えば、２〜４１ｍｍｏｌ／Ｌ、２〜４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、例えば、前記血小板の産生能がより向上し、かつ特に機能性の高い血小板が得られることから、より好ましくは、６〜３１ｍｍｏｌ／Ｌ、６〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、１１〜３１ｍｍｏｌ／Ｌ、１１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、１１〜２１ｍｍｏｌ／Ｌ、１１〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記グリシンを含む培地の存在下、前記産生工程を実施する場合、前記グリシンの濃度は、前記培地へのグリシン添加時またはグリシンを含む培地への交換時において、前記培地が含むグリシンの濃度である。このため、前記培地にグリシンを添加する場合、前記グリシンの濃度は、グリシン添加後の培地におけるグリシンの濃度を意味する。また、グリシンを含む培地に交換する場合、前記グリシンの濃度は、前記交換する培地におけるグリシンの濃度を意味する。
【００４４】
前記産生工程において、前記システインの濃度は、特に制限されず、血小板の産生能の向上効果を示す範囲で有ればよい。前記システインの濃度の下限は、特に制限されず、例えば、２ｍｍｏｌ／Ｌである。前記システイン濃度の上限は、特に制限されず、例えば、１１ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌである。前記システイン濃度の範囲は、例えば、特に機能性の高い血小板が得られることから、好ましくは、２〜１１ｍｍｏｌ／Ｌ、２〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００４５】
前記グリシンの濃度および前記システインの濃度の測定方法は、公知の方法があげられ、具体例として、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いた測定方法、液体クロマトグラフィー−質量分析法等があげられる。
【００４６】
前記産生工程において、前記巨核球から血小板を産生させる期間は、特に制限されず、例えば、１〜１０日、３〜６日である。また、前記産生工程において、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の存在下で培養する期間は、特に制限されず、例えば、産生された血小板の数、生理活性等に応じて、適宜決定できる。グリシンおよびシステインは、例えば、前記産生工程の全期間または一部の期間存在する。
【００４７】
前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つの強制発現により前記巨核球を誘導する場合、前述のように、前記強制発現を解除することにより、前記巨核球は、前記血小板を産生する。このため、この場合、前記強制発現の解除時または解除後に、前記巨核球を含む培地を、例えば、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含む培地に交換する、または前記巨核球を含む培地に、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を添加することで実施できる。グリシンおよびシステインの少なくとも一方の添加または交換は、例えば、１回実施してもよいし、２回以上実施してもよい。
【００４８】
前記産生工程は、例えば、産生された血小板の生理活性を向上できることから、芳香族炭化水素受容体（ＡｈＲ）阻害剤の存在下、実施してもよい。具体的には、前記産生工程は、例えば、ＡｈＲ阻害剤を含む培地の存在下、実施する。前記産生工程は、例えば、前記巨核球を含む培地を、例えば、ＡｈＲ阻害剤を含む培地に交換する、または前記巨核球を含む培地に、ＡｈＲ阻害剤を添加することで実施できる。
【００４９】
前記ＡｈＲは、Per/ARNT/SIM (PAS)ファミリーに属する転写因子である。ＡｈＲは、例えば、リガンドが結合していない状態では不活性であり、芳香族炭化水素化合物がリガンドとして結合すると、核内に移行する。そして、前記核内移行後、前記ＡｈＲは、例えば、ARNT (Ahr Nuclear Translocator)とヘテロ二量体を形成し、異物応答配列（Xenobiotic Responsive Element (XRE)、DREともいう）と結合し、転写を活性化する。
【００５０】
前記ＡｈＲ阻害剤は、特に制限されず、例えば、ＡｈＲアンタゴニスト、ＡｈＲの発現を抑制可能な発現抑制核酸分子等があげられる。前記ＡｈＲアンタゴニストは、特に制限されず、例えば、4-(2-(2-(Benzo[b]thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-ylamino)ethyl)phenol (SR1)、α-ナフトフラボン (CAS 604-59-1)、1,4-ジヒドロシアントラキノン、1,5-ジヒドロシアントラキノン、1,8-ジヒドロシアントラキノン、galangin (CAS 548-83-4)、レスベラトロール、2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid (2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide (CH-223191)、N-(2-(3H-Indol-3-yl)ethyl)-9-isopropyl-2-(5-methyl-3-pyridyl)-7H-purin-6-amine (GNF351)、2-(29- amino-39-methoxyphenyl)-oxanaphthalen-4-one (PD98059)、(Z)-3-[(2,4-dimethylpyrrol-5-yl)methylidenyl]-2-indolinone (TSU-16)、6, 2', 4’-trimethoxyflavone (TMF)、3’, 4’-dimethoxyflavone (DMF)等があげられる。また、前記ＡｈＲアンタゴニストは、例えば、国際公開第2012/015914号にＡｈＲアンタゴニストとして記載された化合物であってもよい。
【００５１】
前記ＡｈＲ阻害剤の存在下で培養する期間は、特に制限されず、例えば、産生された血小板の数、生理活性等に応じて、適宜決定できる。前記ＡｈＲ阻害剤は、例えば、前記産生工程の全期間または一部の期間存在する。前記強制発現の解除後に前記ＡｈＲ阻害剤を培地に添加する場合、例えば、前記ＡｈＲ阻害剤の添加後３日頃から、機能的な血小板の放出が開始され、機能的な血小板の数は、培養日数が増加するにつれて増加する。前記ＡｈＲ阻害剤がＳＲ１の場合、特に機能性の高い血小板を得られることから、前記培養期間は、好ましくは、約５日である。
【００５２】
前記産生工程において、前記ＡｈＲ阻害剤の濃度は、特に制限されず、化合物の種類およびその有効濃度に応じて、適宜決定できる。前記ＡｈＲアンタゴニストの濃度は、例えば、産生された血小板の生理活性をより向上できることから、一例として、以下の濃度があげられる。
SR1：200nmmol/L以上1000mmol/L未満
CH-223191：0.2μmol/L以上4μmol/L未満
GNF351：20nmol/L以上300nmol/L未満
TMF：2.5μmol/L以上40μmol/L未満
DMF：2.5μmol/L以上40μmol/L未満
【００５３】
前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つの強制発現により前記巨核球を誘導する場合、前記産生工程は、例えば、前記強制発現の解除時または解除後に、前記巨核球を含む培地を、前記ＡｈＲ阻害剤を含む培地に交換する、または前記巨核球を含む培地に、前記ＡｈＲ阻害剤を添加することで実施できる。前記強制発現の解除後に前記ＡｈＲ阻害剤を添加等する場合、前記産生工程は、例えば、前記強制発現の解除後、１、２または３日以内に、前記ＡｈＲ阻害剤を添加等することが好ましい。前記ＡｈＲ阻害剤の添加または交換は、例えば、１回実施してもよいし、２回以上実施してもよい。
【００５４】
前記産生工程は、例えば、産生された血小板の生理活性を向上できることから、ROCK阻害剤の存在下、実施してもよい。具体的には、前記産生工程は、例えば、ROCK阻害剤を含む培地の存在下、実施する。前記産生工程は、例えば、機能性が高められた血小板をより得られることから、前記ROCK阻害剤と前記ＡｈＲ阻害剤とを併用することが好ましい。前記産生工程は、例えば、前記巨核球を含む培地を、例えば、ROCK阻害剤を含む培地に交換する、または前記巨核球を含む培地に、ROCK阻害剤を添加することで実施できる。前記ROCK阻害剤と前記ＡｈＲ阻害剤とを併用する場合、前記ROCK阻害剤と前記ＡｈＲ阻害剤とは、例えば、同時に添加または交換してもよいし、別個に添加または交換してもよい。
【００５５】
前記ROCKは、Rho結合キナーゼ（Rho-associated coiled-coil forming kinase（ROCK））を意味する。前記ROCK阻害剤は、例えば、ROCKアンタゴニスト、ROCKの発現を抑制可能な発現抑制核酸分子等があげられる。前記ROCK阻害時は、例えば、(R)-(＋)- trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide (Y-27632)、4-[(1R)-1-aminoethyl]-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)benzamide (Y-39983)、ファスジル塩（Fasudil(HA1077)塩酸塩）、4-fluoro-5-[[(2S)-hexahydro-2-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl]sulfonyl]-isoquinoline (Ripasudil）、2-(3-(4-((1H-indazol-5-yl)amino)quinazolin-2-yl)phenoxy)-N-isopropylacetamide (SLx-2119)、N-[(3-Hydroxyphenyl)methyl]-N'-[4-(4-pyridinyl)-2-thiazolyl]urea dihydrochloride (RKI-1447)、6-Chloro-N4-[3,5-difluoro-4-[(3-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)oxy]phenyl]-2,4-pyrimidinediamine (TC-S 7001, Azaindole 1)、N-[2-[2-(Dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide (SR-3677)、Staurosporine、(S)-(+)-2-Methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]homopiperazine (H-1152)、rac-(2R)-2-(dimethylamino)-N-(1-oxo- 1,2-dihydroisoquinolin-6-yl)-2-(thiophen-3-yl)acetamide (AR-12286)、N-(1-{[4-(methylsulfanyl)phenyl]methyl}piperidin-3-yl)-1H-indazol-5-amine (INS-117548)等があげられる。前記産生工程において、前記ROCK阻害剤の濃度は、特に制限されず、化合物の種類およびその有効濃度に応じて、適宜決定できる。
【００５６】
前記癌遺伝子、前記ポリコーム遺伝子、および前記アポトーシス抑制遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つの強制発現により前記巨核球を誘導する場合、前記産生工程は、例えば、前記強制発現の解除時または解除後に、前記巨核球を含む培地を、前記ROCK阻害剤を含む培地に交換する、または前記巨核球を含む培地に、前記ROCK阻害剤を添加することで実施できる。前記強制発現の解除後に前記ROCK阻害剤を添加等する場合、前記産生工程は、例えば、前記強制発現の解除後、１、２または３日以内に、前記ROCK阻害剤を添加等することが好ましい。前記ＡｈＲ阻害剤の添加または交換は、例えば、１回実施してもよいし、２回以上実施してもよい。
【００５７】
前記産生工程において、前記血小板の産生開始時の巨核球の細胞密度は、特に制限されない。前記巨核球の細胞密度の下限は、例えば、１×１０５細胞／ｍＬ、２×１０５細胞／ｍＬ、３×１０５細胞／ｍＬ、４×１０５細胞／ｍＬである。前記巨核球の細胞密度の上限は、特に制限されず、例えば、４×１０５細胞／ｍＬ、６×１０５細胞／ｍＬ、８×１０５細胞／ｍＬである。前記細胞密度の範囲は、例えば、１×１０５細胞／ｍＬ〜８×１０５細胞／ｍＬ、２×１０５細胞／ｍＬ〜８×１０５細胞／ｍＬ、３×１０５細胞／ｍＬ〜６×１０５細胞／ｍＬ、４×１０５細胞／ｍＬ〜６×１０５細胞／ｍＬである。前記細胞密度は、例えば、前記巨核球の細胞数を、前記巨核球を懸濁する培地の体積で除することにより算出できる。
【００５８】
前記産生工程において、前記巨核球の培養条件は、特に制限されず、前記巨核球の通常の培養条件を採用できる。具体例として、培養温度は、例えば、約３５〜約４２℃、約３６〜約４０℃、約３７〜約３９℃である。ＣＯ２濃度は、例えば、約５〜約１５％である。Ｏ２濃度は、例えば、約１５〜約２５％、約２０％である。
【００５９】
前記培地は、特に制限されず、例えば、前記巨核球から血小板を産生するのに好適な公知の培地およびそれに準ずる培地があげられる。具体例として、前記培地は、例えば、動物細胞の培養に用いる培地を基礎培地として調製することができる。前記基礎培地は、例えば、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco’s modified Eagle’s Medium（DMEM）、Ham’s F12培地、RPMI1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal（登録商標） Medium（Thermo Fisher Scientific社製）等の単独培地またはこれらの混合培地があげられる。前記培地は、例えば、血清または血漿を含んでもよいし、これらを含まない無血清培地でもよい。前記血清および血漿の由来は、前記巨核球の由来と同じ由来であることが好ましい。具体例として、前記巨核球がヒト由来である場合、前記血清および血漿は、それぞれ、ヒト由来であることが好ましい。
【００６０】
前記培地は、例えば、他の成分を含んでもよい。前記他の成分は、特に制限されず、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（ＭＴＧ）、脂質、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカイン等があげられる。前記他の成分は、例えば、１種類でもよいし、２種類以上でもよい。前記サイトカインは、例えば、血球系細胞の分化を促進する物質であり、具体例として、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、各種ＴＰＯ様作用物質、Stem Cell Factor（SCF）、ITS（インスリン−トランスフェリン−セレナイト）サプリメント、ADAM阻害剤、FLT阻害剤、WNT阻害剤等があげられる。前記培地は、例えば、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、ＴＰＯを含むIMDM培地が好ましい。前記培地は、例えば、さらにSCFを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。前記他の成分の濃度は、特に制限されない。前記TPOの濃度は、例えば、約10ng/mL〜約200ng/mL、約50ng/mL〜約100ng/mLである。前記SCFの濃度は、例えば、約10ng/mL〜約200ng/mL、約50ng/mLである。前記ヘパリンの濃度は、例えば、約10U/mL〜約100U/mL、約25U/mLである。前記培地は、例えば、さらに、ホルボールエステル（例えば、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート；PMA）を含んでもよい。
【００６１】
このようにして、前記巨核球から血小板を産生できる。前記産生工程後の培地は、例えば、前記血小板を含む。
【００６２】
本発明の血小板の製造方法は、例えば、前記産生工程で得られた血小板を精製する精製工程を含んでもよい。前記血小板の精製方法は、特に制限されず、例えば、中空糸膜等の分離手段を用いた精製方法、遠心分離による精製方法等の公知の方法により実施できる。
【００６３】
＜血小板＞
本発明の血小板は、前記本発明の血小板の製造方法により得られたことを特徴とする。本発明の血小板は、前記本発明の血小板の製造方法により得られたことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【００６４】
＜血小板製剤の製造方法＞
本発明の血小板製剤の製造方法は、前述のように、血小板から血小板製剤を製造する製剤工程を含み、前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。本発明の血小板製剤の製造方法は、前記血小板が、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板製剤の製造方法は、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【００６５】
前記製剤工程では、例えば、他の成分を添加してもよい。前記他の成分は、例えば、前記血小板等の細胞の安定化剤等があげられる。
【００６６】
本発明の血小板製剤の製造方法は、前記製剤工程に先立ち、前記本発明の血小板の製造方法により、血小板を製造する血小板製造工程を含んでもよい。前記血小板製造工程は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【００６７】
＜血小板製剤＞
本発明の血小板製剤は、前記本発明の血小板製剤の製造方法により得られたことを特徴とする。本発明の血小板製剤は、前記本発明の血小板製剤の製造方法により得られたことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血小板製剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法および血小板製剤の製造方法の説明を援用できる。
【００６８】
＜血液製剤の製造方法＞
本発明の血液製剤の製造方法は、前述のように、血小板と他の成分とを混合することにより、血液製剤を製造する血液製剤工程を含み、前記血小板は、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とする。本発明の血液製剤の製造方法は、前記血小板が、前記本発明の血小板の製造方法で得られたことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血液製剤の製造方法は、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【００６９】
前記他の成分は、特に制限されず、例えば、赤血球等の他の血球系細胞、前記血小板等の細胞の安定化剤等があげられる。
【００７０】
本発明の血液製剤の製造方法は、前記血液製剤工程に先立ち、前記本発明の血小板の製造方法により、血小板を製造する血小板製造工程を含んでもよい。前記血小板製造工程は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【００７１】
＜血液製剤＞
本発明の血液製剤は、前記本発明の血液製剤の製造方法により得られたことを特徴とする。本発明の血液製剤は、前記本発明の血液製剤の製造方法により得られたことが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の血液製剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法および血液製剤の製造方法の説明を援用できる。
【００７２】
＜血小板の産生能向上剤＞
本発明の血小板の産生能向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の血小板の産生能向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の血小板の産生能向上剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【００７３】
＜血小板の生理活性向上剤＞
本発明の血小板の生理活性向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の血小板の生理活性向上剤は、グリシンおよびシステインの少なくとも一方を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の血小板の生理活性向上剤は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【００７４】
＜グリシンまたはシステインの使用＞
本発明は、血小板の産生能向上のための、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の使用である。また、本発明は、血小板の生理活性向上のための、グリシンおよびシステインの少なくとも一方の使用である。本発明は、例えば、前記本発明の血小板の製造方法の説明を援用できる。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。【００７６】
［実施例１］
高密度培養時に、前記巨核球の血小板産生能の低下および産生された血小板の生理活性が低下すること、ならびに高密度培養をグリシン存在下で実施することにより、前記巨核球の血小板産生能を向上できることおよび産生された血小板の生理活性を向上できることを確認した。【００７７】
（１）不死化巨核球の作製
不死化巨核球は、以下の手順で作製した。【００７８】
（１−１）iPS細胞からの造血前駆細胞の調製
ヒトiPS細胞（TKDN SeV2：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞）から、下記参考文献５に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。具体的には、ヒトES/iPS細胞コロニーを20ng/mL VEGF（R&D SYSTEMS社製）存在下でC3H10T1/2フィーダ細胞と１４日間共培養して造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells；HPC）を作製した。培養条件は、３７℃、２０％Ｏ２、５％ＣＯ２で実施した（特に記載がない限り、以下同条件）。
参考文献５：Takayama N. et al., “Transient activation of c-MYC expression is critical for efficient platelet generation from human induced pluripotent stem cells”, J. Exp. Med., 2010, vo.13, pages 2817-2830【００７９】
（１−２）遺伝子導入システム
遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Tetracycline制御性のTet-on（登録商標）遺伝子発現誘導システムベクターである。LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G（下記参考文献６）のmOKSカセットをc-MYC、BMI1、またはBCL-xLに組み替えることで作製した。c-MYC、BMI1、またはBCL-xLが導入されたベクターを、それぞれ、LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、およびLV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2Gとした。c-MYC、BMI1、およびBCL-xLウイルスは、293T細胞へ前記レンチウイルスベクターで遺伝子導入することにより作製した。得られたウイルスを目的の細胞に感染させることによって、c-MYC、BMI1、およびBCL-xL遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン（clontech#631311）を加えることによって強制発現させることができる。
参考文献６：Kobayashi, T.et al., “Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells.”, Cell, 2010, vol.142, No.5, pages 787-799【００８０】
（１−３）造血前駆細胞へのc-MYCおよびBMI1ウイルスの感染
予めC3H10T1/2フィーダ細胞を播種した6 well plate上に、前記（１−１）の方法で得られたHPCを5×104cells/wellとなるように播種し、BMI1ウイルスおよびc-MYCウイルスを用いたレンチウイルス法にてc-MYCおよびBMI1を強制発現させた。このとき、細胞株１種類につき6 wellずつ使用した。具体的には、それぞれMOI（multiplicity of infection）20となるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃、900rpm、６０分間遠心）で感染させた。前記スピンインフェクションは、１２時間おきに２回実施した。培地は、基本培地（15% Fetal Bovine Serum (GIBCO)、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO)、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO)、0.45 mmol/L 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich)、50μg/mL L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich)を含有するIMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) (Sigma-Aldrich)）に、50 ng/mL Human thrombopoietin (TPO)(R&D SYSTEMS)、50 ng/mL Human Stem Cell Factor (SCF) (R&D SYSTEMS)および2μg/mL Doxycycline (Dox、clontech #631311)となるようにそれぞれを添加した培地（以下、分化培地）に、さらに、Protamineを最終濃度が10 μg/mLとなるように添加した培地を用いた。【００８１】
（１−４）巨核球自己増殖株の作製および維持培養
前記（１−３）の方法でc-MYCおよびBMI1ウイルスの感染を実施した日を感染0日目として、以下の通り、c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子が導入されたHPCを培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。c-MYC遺伝子およびBMI1遺伝子の強制発現は、培地に1μg/mL DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。【００８２】
・感染２日目〜感染１１日目
感染２日目に、ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、1200rpm、５分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。感染９日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。前記再播種時は、細胞数を計測後、1×105 cells/2mL/wellとなるようにC3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(6well plate)。【００８３】
・感染１２日目〜感染１３日目
感染２日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後3×105 cells/10mL/100mm dishとなるように、C3H10T1/2フィーダ細胞上に播種した(100mm dish)。【００８４】
・感染１４日目
ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、および抗ヒトCD235ab-pacific blue（BioLegend）抗体を、それぞれ2μL、1μL、および1μLを用いて、前記血球細胞と抗体とを反応させた。前記反応後、FACS Verse（商標）（BD Biosciences）を用いて解析した。感染１４日目において、CD41a陽性率が５０%以上である細胞を、巨核球自己増殖株とした。【００８５】
（１−５）巨核球自己増殖株へのBCL-xLウイルス感染
前記感染１４日目の巨核球自己増殖株に、BCL-xLウイルスを用いたレンチウイルス法にてBCL-xLを遺伝子導入した。MOI 10になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃、900rpm、６０分間遠心）で感染させた。BCL-xL遺伝子の強制発現は、培地に1μg/mL DOXとなるようにDOXを添加することにより実施した。【００８６】
（１−６）巨核球不死化株の作成および維持培養
・感染１４日目〜感染１８日目
前記（１−５）の方法で得られたBCL-xL遺伝子を導入した巨核球自己増殖株を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行った。前記遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいC3H10T1/2フィーダ細胞上に2×105cells/2mL/wellとなるように播種した（6well plate）。【００８７】
・感染１８日目：継代
BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、3×105 cells/10mL/100mm dishとなるように播種した。【００８８】
・感染２４日目：継代
BCL-xL遺伝子を導入後の巨核球自己増殖株を回収し、細胞数を計測後、1×105 cells/10mL/100mm dishとなるように播種した。以後、４−７日毎に同様にして継代を行い、維持培養を行った。なお、継代時には、新たな分化培地に懸濁の上、播種した。【００８９】
感染２４日目にBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、および抗ヒトCD235ab-Pacific Blue（Anti-CD235ab-PB; BioLegend）抗体を、それぞれ、2μL、1μL、および1μLを用いて、免疫染色した後にFACS Verse（商標）を用いて解析した。そして、感染２４日目において、CD41a陽性率が50%以上である株を不死化巨核球細胞株とした。感染後２４日以上増殖することができたこれらの細胞を、不死化巨核球細胞株SeV2-MKCLとした。【００９０】
得られたSeV2-MKCLを、10cmディッシュ（10mL/ディッシュ）で静置培養した。培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。培養条件は、２７℃、５％ＣＯ２とした。
FBS（シグマ#172012 lot.12E261）15％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mmol/L
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/L
アスコルビン酸(sigma #A4544) 50μg/mL
Puromycin (sigma #P8833-100MG) 2μg/mL
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質200ng/mL【００９１】
（２）血小板の産生
DOXを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、前記（１）の方法で得た不死化巨核球細胞株（SeV2-MKCL）を、PBS(-)で2度洗浄し、下記血小板産生培地に懸濁した。細胞の播種密度は、4.0×105 cells/mL（×４）とした。また、前記血小板産生培地には、所定濃度分（１、５、もしくは１０、または１０、２０、もしくは４０ｍｍｏｌ／Ｌ）のグリシンを添加した。なお、前記血小板産生培地は、０．６〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌのグリシンを含む。したがって、グリシン添加後の前記血小板産生培地におけるグリシン濃度は、約２〜約４１ｍｍｏｌ／Ｌである。【００９２】
前記血小板産生培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は、終濃度）。
FBS 15％またはhuman plasma 5％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 4mmol/L
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μmol/L
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
SCF (和光純薬#193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質200ng/mL
ADAM阻害剤15μmol/L
芳香族炭化水素受容体（AhR）阻害剤（SR1） 750nmol/L、またはGNF351（Calbiochem #182707） 500nmol/L
ROCK阻害剤10μmol/LまたはY39983（Chemscene LLC #CS-0096）500nmol/L
Urokinase 5U/mL
Heparin 10U/mL、または低分子heparin（SANOFI、クレキサン）1U/mL【００９３】
そして、前記グリシン添加後の血小板生産培地存在下で６日間培養して、血小板を産生させ、産生された血小板の数をカウントした。また、コントロールは、前記細胞の播種密度を1.0×105 cells/mL（×１）または4.0×105 cells/mL（×４）とし、前記グリシン未添加の血小板産生培地を用いた以外は、同様にして血小板の数をカウントした。これらの結果を図１に示す。【００９４】
図１は、血小板の数を示すグラフである。図１において、（Ａ）は、コントロールおよび添加したグリシン濃度が、１、５、または１０ｍｍｏｌ／Ｌの場合の結果を示し、（Ｂ）は、コントロールおよび添加したグリシン濃度が、１０、２０、または４０ｍｍｏｌ／Ｌの場合の結果を示す。図１（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、細胞の播種密度およびグリシン濃度の条件を示し、縦軸は、血小板の数を示す。図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、グリシン未添加の血小板産生培地を用いた場合、通常の巨核球の培養密度（1.0×105 cells/mL（×１）、ＰＣ）と比較して、高密度培養（4.0×105 cells/mL（×４）、ＮＣ）で得られる血小板の数は、半減していた。すなわち、巨核球の血小板産生能が、１／８程度に低減していた。これに対し、グリシン添加後の血小板産生培地を用いた場合、いずれの濃度においても、グリシン未添加の血小板産生培地を用い、高密度培養した場合と比較して、血小板の数が増加していた。すなわち、グリシンの添加により、高密度培養時における巨核球の血小板産生能を向上できることが分かった。また、前記血小板の産生開始時のグリシン濃度が、１１〜３１ｍｍｏｌ／Ｌまたは１１〜２１ｍｍｏｌ／Ｌの場合、前記巨核球の血小板産生能がより向上することが分かった。【００９５】
（３）血小板の生理活性
前記実施例１（２）で得られた血小板について、血小板の生理活性を、フローサイトメータを用いて測定した。具体的には、1.5mLマイクロチューブに希釈液900μLを添加し、血小板産生後の培養液100μLを添加し、混合した。得られた溶液のうち200μLをFACSチューブに分注し、下記標識抗体を添加して染色し、フローサイトメータで血小板におけるＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩを分析した。また、前記ＮＣについても同様にフローサイトメータで分析後、ＮＣにおけるＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩを基準として、各サンプルにおけるＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩの増加割合を算出した。これらの結果を図２に示す。
・血小板の生理活性の測定
0.5μL 抗CD42a抗体PB標識（eBioscience 48-0428-42）
0.5μL 抗CD42b抗体PE標識（Bio Legend 303906）
0.5μL 抗CD62p抗体APC標識（Bio Legend 304910）
10μL 抗PAC-1抗体FITC標識（BD 303704）【００９６】
図２は、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩの増加割合を示すグラフである。図２において、（Ａ）は、コントロールおよび添加したグリシン濃度が、５または１０ｍｍｏｌ／Ｌの場合の結果を示し、（Ｂ）は、コントロールおよび添加したグリシン濃度が、１０、２０、または４０ｍｍｏｌ／Ｌの場合の結果を示す。図２（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、細胞の播種密度およびグリシン濃度の条件を示し、縦軸は、ＭＦＩの増加割合を示す。図２（Ａ）および（Ｂ）に示すように、いずれのグリシン濃度においても、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１の発現量が、グリシン未添加のコントロールと比較して、増加していた。また、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１の発現量は、グリシンの濃度依存的に増加していた。これらのことから、グリシンの添加により、前記高密度培養時における産生された血小板の生理活性を向上できることが分かった。【００９７】
（４）血小板の劣化
細胞の播種密度を、1.0×105 cells/mL（×１）、2.0×105 cells/mL（×２）、3.0×105 cells/mL（×３）、4.0×105 cells/mL（×４）、または8.0×105 cells/mL（×８）とし、ＳＲ１に代えて、０．５μmol/LのGNF-351を含む血小板産生培地を用い、前記血小板産生培地に、１０ｍｍｏｌ／Ｌ分のグリシンおよび２０Ｕ／ｍＬ分のヘパリンを添加した以外は、前記実施例１（２）と同様にして血小板を産生させ、血小板の数をカウントした。さらに、得られた血小板について、血小板の劣化状態を、アネキシンＶの陽性率に基づき、評価した。具体的には、血小板におけるアネキシンＶの陽性率の測定は、前記血小板産生後の培養液100μLをFACSチューブに分注し、下記標識抗体およびタンパク質を添加して染色を行い、フローサイトメータ分析直前にアネキシンV binding buffer（BD Biosciences）で５倍希釈し、分析した。また、コントロールは、細胞の播種密度を、1.0×105 cells/mL（×１）、3.0×105 cells/mL（×３）、または4.0×105 cells/mL（×４）とし、グリシンおよびヘパリンを添加しなかった以外は、同様にして、分析した。これらの結果を図３に示す。
・血小板のダメージの測定
1.0μL 抗CD41a抗体APC標識（Bio Legend 303710）
1.0μL 抗CD42b抗体PE標識（Bio Legend 303906）
5μL Annexin V FITC標識（BD Biosciences 556419）【００９８】
図３は、血小板の数およびアネキシンＶ陽性細胞の割合を示すグラフである。図３において、横軸は、細胞の播種密度およびグリシンの添加の有無を示し、縦軸は、血小板の数またはアネキシンＶ陽性細胞の割合を示す。図３に示すように、コントロールでは、血小板の産生開始時の巨核球の播種密度を増加させると、通常の３倍の細胞密度において、アネキシンＶ陽性細胞の割合の増加、すなわち、血小板の劣化が観察され、通常の４倍の細胞密度において、血小板の劣化および血小板数の減少が観察された。これに対し、グリシンを添加した実施例では、いずれの播種密度においても、コントロールと比較して、血小板の劣化が抑制され、また、血小板の数が増加した。劣化した血小板の割合が減少するということは、機能性を有する血小板の割合が増加したことを意味する。したがって、グリシンの添加により、巨核球の血小板産生能を向上でき、且つ産生された血小板の生理活性を向上でき、前記高密度培養時においてこれらの効果が特に顕著に表れることが分かった。【００９９】
［実施例２］
高密度培養をシステイン存在下で実施することにより、産生された血小板の生理活性を向上できることを確認した。【０１００】
グリシンに代えて、所定濃度（１、５、または１０ｍｍｏｌ／Ｌ）分のシステインを添加した血小板産生培地を用いて血小板を産生させた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩの増加割合を算出した。なお、前記血小板産生培地は、０．６〜０．８ｍｍｏｌ／Ｌのシステインを含む。したがって、システイン添加後の前記血小板産生培地におけるシステイン濃度は、約２〜約１１ｍｍｏｌ／Ｌである。コントロールは、システインを未添加とした以外は同様にして、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩの増加割合を算出した。これらの結果を図４に示す。【０１０１】
図４は、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１のＭＦＩの増加割合を示すグラフである。図４において、横軸は、細胞の播種密度およびシステイン濃度の条件を示し、縦軸は、ＭＦＩの増加割合を示す。図４に示すように、いずれのグリシン濃度においても、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１の発現量が、システイン未添加のコントロール（ＮＣ）と比較して、増加していた。また、ＣＤ６２ｐおよびＰＡＣ−１の発現量は、システインの濃度依存的に増加していた。これらのことから、システインの添加により、前記高密度培養時における産生された血小板の生理活性を向上できることが分かった。【０１０２】
［実施例３］
異なる多能性細胞から誘導した巨核球を用い、前記高密度培養時に、前記巨核球の血小板産生能が低下すること、および前記高密度培養をグリシン存在下で実施することにより、前記巨核球の血小板産生能を向上できることを確認した。【０１０３】
（１）ｉＰＳ細胞
前記実施例１（１−６）で得られた不死化巨核球細胞株（SeV2-MKCL）に、国際公開第２０１０／１３４５２６の方法に従って、センダイウイルスベクターにより、c-MYC、OCT3/4、SOX2、およびKLF4を導入することにより、iPS細胞を誘導した。つぎに、前記ヒトiPS細胞（TKDN SeV2）に代えて、誘導したiPS細胞を用いた以外は、前記実施例１（１−１）〜（１−６）と同様にして、不死化巨核球細胞株を誘導した。さらに、得られた不死化巨核球細胞株について、前記実施例１（２）と同様にして、血小板の数をカウントし、血小板の濃度を算出した。そして、前記血小板の産生開始時の巨核球の細胞密度（播種密度）と、前記血小板の濃度とに基づき、前記Ｐ／Ｍ比を算出した。コントロールは、前記細胞の播種密度を1.0×105 cells/mL（×１）または4.0×105 cells/mL（×４）とし、前記グリシン未添加の血小板産生培地を用いた以外は、同様にして、血小板の濃度およびＰ／Ｍ比を算出した。これらの結果を図５に示す。【０１０４】
図５は、Ｐ／Ｍ比および血小板の濃度を示すグラフである。図５（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、細胞の播種密度およびグリシン濃度の条件を示し、縦軸は、それぞれ、Ｐ／Ｍ比および血小板の濃度を示す。また、図５（Ａ）において、図中の数字は、Ｐ／Ｍ比を示す。図５（Ａ）に示すように、グリシン未添加のコントロールでは、前記高密度培養時（×４）において、前記巨核球の血小板産生能が低下していた。これに対し、図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、グリシンを添加した場合、いずれのグリシン濃度においても、前記高密度培養時のコントロールと比較して、前記巨核球の血小板産生能が向上し、血小板の濃度も上昇していた。これらのことから、グリシンの添加により、前記高密度培養時における巨核球の血小板産生能を向上できることが分かった。【０１０５】
（２）ｉＰＳ細胞株
前記ヒトiPS細胞（TKDN SeV2）に代えて、ヒトiPS細胞（NIH5およびNIH8）を用いた以外は、前記実施例１（１−１）〜（１−６）と同様にして、不死化巨核球細胞株を誘導した。そして、得られた不死化巨核球細胞株について、前記細胞の播種密度を4.0×105 cells/mL（×４）または6.0×105 cells/mL（×６）とし、培養日数を５日間とした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、血小板の数をカウントし、血小板の濃度を算出した。コントロールは、前記細胞の播種密度を1.0×105 cells/mL（×１）、4.0×105 cells/mL（×４）、または6.0×105 cells/mL（×６）とし、前記グリシン未添加の血小板産生培地を用いた以外は、同様にして血小板の濃度を算出した。これらの結果を図６に示す。【０１０６】
図６は、血小板の濃度を示すグラフである。図６において、（Ａ）は、NIH5の結果を示し、（Ｂ）は、NIH8の結果を示す。図６（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、細胞の播種密度およびグリシン濃度の条件を示し、縦軸は、血小板の濃度を示す。図６（Ａ）および（Ｂ）に示すように、いずれの播種密度においても、前記高密度培養時のコントロールと比較して、血小板の濃度が上昇していた。これらのことから、グリシンの添加により、前記高密度培養時における巨核球の血小板産生能を向上できることが分かった。【０１０７】
以上のことから、本発明の製造方法によれば、異なる細胞に由来する巨核球について、前記高密度培養時に、前記巨核球の血小板産生能が低下すること、および前記高密度培養をグリシン存在下で実施することにより、前記巨核球の血小板産生能を向上できることがわかった。【０１０８】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。【０１０９】
この出願は、２０１７年９月１９日に出願された日本出願特願２０１７−１７９１３７を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
以上のように、本発明によれば、例えば、前記高密度培養においても、巨核球の血小板産生能および産生された血小板の生理活性の少なくとも一方を向上可能であるため、前記高密度培養時に効率（収率）よく血小板の製造および機能性の高い血小板の製造の少なくとも一方を達成することできる。したがって、本発明は、例えば、血小板を使用する細胞医薬分野、医療分野等において極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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2019059234.tif 000010
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