(57)【要約】  びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法。
2019065901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、
前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、
前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量の測定である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量が、ＲＯＣ解析により決定したカットオフ値以上であることが、前記治療による予後が良好であることを示す工程である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化学療法が、抗ＣＤ２０抗体併用化学療法である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞のマーカーが、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９６、ＦＡＳ、ＩＬ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＫ、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＲＡＦ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞が、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ細胞）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔｆｈ細胞のマーカーが、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ）及びＮＯＤ２からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記間質細胞のマーカーが、ＢＭＰ２Ｋ、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＧＦＲ１及びＯＢＳＣＮからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットであって、
Ｔ細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬を含むキット。
【請求項１１】
前記マーカーの発現を測定する試薬が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量を測定する試薬である、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記化学療法が、抗ＣＤ２０抗体併用化学療法である、請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞のマーカーが、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９６、ＦＡＳ、ＩＬ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＫ、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＲＡＦ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ細胞）である請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
前記Ｔｆｈ細胞のマーカーが、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ）及びＮＯＤ２からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記間質細胞のマーカーが、ＢＭＰ２Ｋ、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＧＦＲ１及びＯＢＳＣＮからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法、及びキットに関する。
本願は、２０１７年９月２９日に出願された米国特許仮出願６２／５６５，１２３に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
全リンパ腫の３割強を占める最大病型であるびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ；以下、ＤＬＢＣＬともいう）の標準治療であるＲ−ＣＨＯＰに対する反応性は多様であり、初発時に予後良好又は治療抵抗症例を精確に予測する層別化システムの構築が重要である。現在、予後層別化方法として、腫瘍Ｂ細胞の分化段階（ＣＯＯ；Ｃｅｌｌ−ｏｆ−ｏｒｉｇｉｎ）に基づく分類（以下、ＣＯＯ分類ともいう）が主流である（非特許文献１）。【０００３】
しかしながら、最近の大規模臨床試験の結果では、ＣＯＯ分類に基づく層別化が必ずしも予後を反映していなかった（例えば、非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Nature 403, 503-511 (2000)
【非特許文献２】J. Clin. Oncol. 35(22), 2515-2526 (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｒ−ＣＨＯＰ療法の予後層別化において、従来の腫瘍Ｂ細胞のＣＯＯ分類に基づく層別化が必ずしも予後を反映していないため、ＣＯＯ分類による層別化では、ＤＬＢＣＬ患者に対するＲ−ＣＨＯＰ等の化学療法の治療効果を予測できないという問題がある。
本発明は、リンパ腫微小環境特性に基づく、ＤＬＢＣ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）細胞由来の遺伝子の発現により層別化でき、前記化学療法の効果を予測することができることを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、
前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、
前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、
を含む方法。
［２］前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量の測定である、［１］に記載の方法。
［３］前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量が、ＲＯＣ解析により決定したカットオフ値以上であることが、前記治療による予後が良好であることを示す工程である、［２］に記載の方法。
［４］前記化学療法が、抗ＣＤ２０抗体併用化学療法である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記Ｔ細胞のマーカーが、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９６、ＦＡＳ、ＩＬ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＫ、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＲＡＦ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記Ｔ細胞が、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ細胞）である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］前記Ｔｆｈ細胞のマーカーが、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［６］に記載の方法。
［８］前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ）及びＮＯＤ２からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］前記間質細胞のマーカーが、ＢＭＰ２Ｋ、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＧＦＲ１及びＯＢＳＣＮからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットであって、
Ｔ細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬を含むキット。
［１１］前記マーカーの発現を測定する試薬が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量を測定する試薬である、［１０］に記載のキット。
［１２］前記化学療法が、抗ＣＤ２０抗体併用化学療法である、［１０］又は［１１］に記載のキット。
［１３］前記Ｔ細胞のマーカーが、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９６、ＦＡＳ、ＩＬ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＫ、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＲＡＦ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［１０］〜［１２］のいずれか一項に記載のキット。
［１４］前記Ｔ細胞が、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ細胞）である［１０］〜［１３］のいずれか一項に記載のキット。
［１５］前記Ｔｆｈ細胞のマーカーが、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１及びＴＮＦＲＳＦ４からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［１４］に記載のキット。
［１６］前記マクロファージ又は樹状細胞のマーカーが、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ）及びＮＯＤ２からなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［１０］〜［１５］のいずれか一項に記載のキット。
［１７］前記間質細胞のマーカーが、ＢＭＰ２Ｋ、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＧＦＲ１及びＯＢＳＣＮからなる群から選ばれる少なくとも一つのマーカーである、［１０］〜［１６］のいずれか一項に記載のキット。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＤＬＢＬＣ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法、及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】ＤＬＢＣＬ患者からのＦＦＰＥサンプルの４８の代表的な遺伝子の発現レベルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）システムを用いて解析した図である。
【図１Ｂ】Ｒ−ＣＨＯＰ療法後、予後良好、又は、予後不良となったそれぞれ１５名のＤＬＢＣＬ患者の生存曲線を示した図である。
【図１Ｃ】ＤＬＢＣＬ患者からのＦＦＰＥ組織における、予後良好と予後不良を示す症例間で発現が異なる免疫系、ガン経路系、及び、キナーゼ系に関連する遺伝子を示した図である。図中の「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」の欄において、「ｕｐ」は予後不良患者で発現が上昇した遺伝子、「ｄｏｗｎ」は予後不良患者で発現が減少した遺伝子をそれぞれ示す。
【図１Ｄ】ＤＬＢＣＬ患者からのＦＦＰＥ組織における、予後良好と予後不良を示す症例間で発現が異なる免疫系、ガン経路系、及び、キナーゼ系に関連する遺伝子の数を示した図である。
【図１Ｅ】本発明におけるｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを用いた場合のＤＬＢＣＬ患者の遺伝子発現解析の全体像を示した図である。
【図１Ｆ】トランスクリプトーム解析により抽出された予後因子候補の遺伝子を示した図である。
【図１Ｇ】予後因子候補の遺伝子の遺伝子オントロジー分析の結果を示した図である。
【図２Ａ】統計学的有意性（マン−ホウィットニーＵ検定からの−ｌｏｇ１０  ｐ値）と、予後良好症例と予後不良症例との間の遺伝子発現レベルのフォールド変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）の大きさとのボルケーノプロットを示した図である。
【図２Ｂ】ＭＹＣ、ＰＡＩＣＳ、ＦＫＢＰ４、ＰＤＸＰ、ＧＡＲＳの各遺伝子の高発現又は低発現患者の生存曲線を示した図である。
【図２Ｃ】ＤＬＢＣＬ患者における、ＰＡＩＣＳの発現とＰＤＸＰの発現との相関性、ＦＫＢＰ４の発現とＭＹＣの発現との相関性を示した図である。
【図２Ｄ】ＭＹＣ、ＰＡＩＣＳ、ＦＫＢＰ４、ＰＤＸＰ、ＧＡＲＳの各遺伝子の正常リンパ節（ＬＮ）サンプル、ＤＬＢＣＬサンプル、及びＤＬＢＣＬ細胞株での発現を示した図である。
【図２Ｅ】予後良好因子候補の遺伝子の遺伝子オントロジー分析の結果を示した図である。
【図３Ａ】ＩＬ−２１、ＢＣＬ６、及びＰＤ−１のＣＤ４＋Ｔ細胞の各画分における発現を示した図である。
【図３Ｂ】ＩＬ−２１のＣＤ８＋Ｔ細胞における発現を示した図である。
【図３Ｃ】ＩＬ−２１の発現と、標準的なＴｆｈマーカーの発現との間の相関係数を示した図である。
【図３Ｄ】ＤＬＢＣＬ組織における、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＩＣＯＳの各遺伝子の多重蛍光免疫染色の結果を示した図である。
【図３Ｅ】増悪患者又は無増悪患者のＤＬＢＣＬ患者組織における、ＩＣＯＳ遺伝子の発現の頻度を示した図である。
【図３Ｆ】ＤＬＢＣＬ組織における、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃの各遺伝子の多重蛍光免疫染色の結果を示した図である。
【図３Ｇ】増悪患者又は無増悪患者のＤＬＢＣＬ患者組織における、ＣＤ１１ｃ＋マクロファージの発現の頻度を示した図である。
【図４Ａ】ＤＬＢＣＬ組織における、ＦＧＦＲ１、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＣＤ３の各遺伝子の多重蛍光免疫染色の結果を示した図である。
【図４Ｂ】ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１の各遺伝子の、ＤＬＢＣＬ細胞株、ＤＬＢＣＬ組織、及び正常リンパ節での発現を示した図である。
【図５Ａ】良性リンパ節腫脹と診断された患者から得られた反応性リンパ節中の、ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１の存在を示した図である。
【図５Ｂ】正常リンパ節及び反応性リンパ節中の、ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１の存在を示した図である。
【図５Ｃ】反応性リンパ節のＧＣ領域、及び正常リンパ節の濾胞中の、ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１の発現の頻度を示した図である。
【図５Ｄ】ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、又はＦＧＦＲ１の発現の有無による生存曲線を示した図である。
【図６Ａ】ＤＭＳスコアの計算方法と計算されたＤＭＳスコアによる生存曲線を示した図である。図中、「ｐｔ」は「ポイント」を表す。
【図６Ｂ】ＤＭＳスコアと予後不良関連微小環境遺伝子の発現との関係を示した図である。
【図６Ｃ】ＤＬＢＣＬ患者のＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、ＦＧＦＲ１の各遺伝子の発現を示した図である。
【図６Ｄ】ＤＭＳスコアによる生存曲線を示した図である。
【図６Ｅ】ＤＭＳの各グループ（ＤＭＳスコア０〜３の各グループ）の、Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘによる分類、及びハンス基準（Ｈａｎｓ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）による分類を示した図である。
【図６Ｆ】ＤＭＳの各グループ（ＤＭＳスコア０〜３の各グループ）の、ＩＰＩリスクスコアによる分類を示した図である。
【図６Ｇ】ハンス基準（Ｈａｎｓ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）による分類、及びＬｙｍｐｈ２Ｃｘによる分類での生存曲線を示した図である。
【図７Ａ】ＤＭＳの各グループのハンス基準に基づくグループでの生存曲線を示した図である。
【図７Ｂ】ＤＭＳの各グループのＬｙｍｐｈ２Ｃｘ分類に基づくグループでの生存曲線を示した図である。
【図７Ｃ】ＤＭＳの各グループのＩＰＩ分類に基づくグループでの生存曲線を示した図である。
【図７Ｄ】性別、バイオプシー領域、ハンス基準による分類、Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘによる分類、ＩＰＩリスクスコア、及びＤＭＳスコアの多変量解析の結果を示した図である。
【図７Ｅ】ＤＭＳスコアのランダム再サンプリング技術によるパーミューテンションテストの結果を示した図である。
【図８Ａ】免疫関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルの教師なし（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）階層的クラスター解析の結果を示した図である。
【図８Ｂ】ＤＭＳスコア、ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１の発現の程度と、コピー数改変（ＣＮＡ）を伴う遺伝子数との相関を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法］
１実施形態において、本発明は、ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法を提供する。
【００１１】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記患者から得た検体は、本発明の方法に用いることができる検体であれば特に制限はないが、例えば、リンパ腫組織、末梢血などの血液、及びリンパ液等が挙げられる。前記患者から得たリンパ腫組織は、本発明の方法に用いることができるリンパ腫組織であれば特に制限はないが、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ：ＦＦＰＥ）組織等が挙げられる。
【００１２】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記マーカーの発現を測定する工程は、前記マーカーの発現を測定することができる工程であれば特に制限はない。例えば、前記マーカーの発現の測定には、前記マーカーのｍＲＮＡの発現量の測定及び前記マーカーのタンパク質の発現量の測定等が挙げられるが、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量の測定であることが好ましい。前記マーカーのｍＲＮＡ発現量の測定方法としては、トランスクリプトーム解析法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）等が挙げられるが、リンパ腫組織として、前記ＦＦＰＥ組織を用いる場合、ＦＦＰＥ組織に含まれるｍＲＮＡは断片化、又は変性している程度が高いため、前記ＦＦＰＥ組織を用いる場合は、トランスクリプトーム解析法のひとつである、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）システムが好ましい。ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムは、顕微鏡によって識別可能なバーコード配列を有するプローブ対を標的ＲＮＡ分子に結合させ、顕微鏡によってバーコードの数を直接数えることで、増幅や逆転写することなく、多数の遺伝子を高感度、且つ高精度で解析するシステムであり、ｍＲＮＡが断片化、又は変性している場合であっても、その感度及び精度を保つことができる。ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムで用いるプローブとして、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ社が提供しているプローブを用いてもよい。あるいは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ社のカスタム合成サービスによりプローブを合成してもよい。前記マーカーのタンパク質の発現量の測定方法としては、ウェスタンブロッティングや免疫組織化学等が挙げられる。前記マーカーの発現の測定は、検体（例えば、リンパ腫組織）中にＴ細胞、マクロファージ又は樹状細胞、あるいは間質細胞が含まれたままの状態で行ってもよく、検体（例えば、末梢血）からこれらの細胞を単離した後に行ってもよい。
【００１３】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量の測定である場合、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程としては、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量が、受信者動作特性解析（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ；以下、ＲＯＣ解析という）により決定したカットオフ値以上であることが、前記治療による予後が良好であることを示す工程が挙げられる。あるいは、前記マーカーの発現を測定する工程が、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量の測定である場合、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程としては、前記マーカーのｍＲＮＡ発現量が、ＲＯＣ解析により決定したカットオフ値未満であることが、前記治療による予後が不良であることを示す工程が挙げられる。カットオフ値は、ＲＯＣ解析でのＲＯＣカーブの曲線下面積を求め、ヨーデンインデックス（Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｅｘ）を最大化することによって決定することができる。予後の例としては、例えば、無増悪生存率（ＰＦＳ）、無増悪生存期間、生存率（ＯＳ）、生存期間、無事象生存率（ＥＦＳ）、無事象生存期間等が挙げられる。
【００１４】
例えば、前記マーカーのｍＲＮＡのそれぞれの発現量が、ＲＯＣ解析により決定したカットオフ値以上である場合、スコアを１とし、カットオフ値未満である場合、スコアを０として計算したときに、スコアの合計が高い程、予後が良好であると示すことができる。本明細書において、前記マーカーのｍＲＮＡのそれぞれの発現量が、ＲＯＣ解析により決定したカットオフ値以上である場合、スコアを１とし、カットオフ値未満である場合、スコアを０として計算されるスコアを、ＤＭＳ（ＤＬＢＣＬ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）スコアと称する。
【００１５】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記化学療法としては、抗ＣＤ２０抗体単剤療法や抗ＣＤ２０抗体併用化学療法等が挙げられる。前記抗ＣＤ２０抗体併用化学療法とは、抗ＣＤ２０抗体と他の化学療法剤とを併用して用いる化学療法を意味し、Ｒ−ＣＨＯＰ療法、Ｇ−ＣＨＯＰ療法、ＣＨＡＳＥＲ療法、Ｒ−ＴＨＰ−ＣＯＰ療法、ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ療法等が挙げられる。
前記抗ＣＤ２０抗体併用化学療法に用いられる、抗ＣＤ２０抗体としては、リツキシマブ（製品名：リツキサン（登録商標））、オファツムマブ（製品名：アーゼラ（登録商標））、オビヌツズマブ（製品名：ガザイバ（登録商標））、イブリツモマブ チウキセタン（製品名：ゼヴァリン（登録商標））、オクレリズマブ、ヴェルツズマブ等が挙げられる。
前記抗ＣＤ２０抗体と併用して用いられる他の化学療法剤としては、シクロホスファミド（製品名：エンドキサン（登録商標））、シタラビン（製品名：キロサイド（登録商標））、エトポシド（製品名：ラステット（登録商標））、デキサメタゾン（製品名：デキサート（登録商標））、ドキソルビシン、ビンクリスチン（製品名：オンコビン（登録商標））、プレドニゾロン（製品名：プレドニン（登録商標））、ピラルビシン（製品名：テラルビシン（登録商標））、ベンダムスチン（トレアキシン（登録商標））等が挙げられる。
ＣＨＯＰ療法は、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンを用いる治療方法であり、Ｒ−ＣＨＯＰ療法は、ＣＨＯＰ療法にさらにリツキシマブを加えた治療方法である。Ｇ−ＣＨＯＰ療法は、ＣＨＯＰ療法にさらにオビヌツズマブを加えた治療方法である。ＣＨＡＳＥＲ療法は、シクロホスファミド、シタラビン、エトポシド、デキサメタゾン、及びリツキシマブを用いる治療方法である。Ｒ−ＴＨＰ−ＣＯＰ療法は、リツキシマブ、ピラルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンを用いる治療方法である。ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ療法は、エトポシド、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、プレドニゾン、及びリツキシマブを用いる治療方法である。
【００１６】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記Ｔ細胞のマーカーとしては、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９６、ＦＡＳ、ＩＬ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＫ、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＲＡＦ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１、ＴＮＦＲＳＦ４等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００１７】
また、前記Ｔ細胞としては、本発明の方法に用いることができるＴ細胞であれば特に制限はないが、濾胞性ヘルパーＴ細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｈｅｌｐｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ；以下、Ｔｆｈ細胞という）が好ましい。Ｔｆｈ細胞のマーカーとしては、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１、ＴＮＦＲＳＦ４等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００１８】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーとしては、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＮＯＤ２等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００１９】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記間質細胞のマーカーとしては、ＢＭＰ２Ｋ、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＧＦＲ１、ＯＢＳＣＮ等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程、及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程は、いずれか1つの工程であってもよいし、２つ以上の工程を組み合せてもよいが、２つ以上の工程を組み合わせることが好ましく、３つの工程を全て組み合わせることがより好ましい。
【００２１】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、前記３つの工程、即ち、前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程、及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程の全てを組み合わせた方法としては、例えば、Ｔ細胞マーカーとしてＩＣＯＳ、樹状細胞マーカーとしてＣＤ１１ｃ、間質細胞マーカーとしてＦＧＦＲ１の発現を測定する工程を組み合わせた方法が挙げられる。
【００２２】
上記ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ及びＦＧＦＲ１のｍＲＮＡ発現量を測定する工程を組み合わせた、本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法の具体例としては、上記ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ及びＦＧＦＲ１の各ｍＲＮＡの発現量を測定し、ＲＯＣ解析により決定したカットオフ値、具体的には、ＩＣＯＳについては５４３．６５、ＣＤ１１ｃについては２４２８．８８、ＦＧＦＲ１については８８６．３７の各数値以上である場合、各マーカーのスコアを１とし、前記数値未満である場合、各マーカーのスコアを０として、前記ＤＭＳスコアを算出し、ＤＭＳスコアが０、１、２、３と上昇するにしたがって、前記治療による予後（例えば、ＰＦＳ又はＯＳ）が良好となると示す方法を挙げることができる。
【００２３】
［ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキット］
１実施形態において、本発明は、ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットであって、Ｔ細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬を含むキットを提供する。
【００２４】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記化学療法としては、抗ＣＤ２０抗体併用化学療法等が挙げられる。前記抗ＣＤ２０抗体併用化学療法としては、Ｒ−ＣＨＯＰ療法、Ｇ−ＣＨＯＰ療法、ＣＨＡＳＥＲ療法、Ｒ−ＴＨＰ−ＣＯＰ療法、ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ療法等が挙げられる。抗ＣＤ２０抗体、及び抗ＣＤ２０抗体と併用して用いられる他の化学療法剤としては、前記ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において挙げたものが用いられる。
【００２５】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記Ｔ細胞のマーカーの発現を測定する試薬としては、前記Ｔ細胞のマーカーの発現を測定する試薬であれば、特に制限はないが、例えば、前記Ｔ細胞のマーカーに結合するように設計されたプローブを、蛍光等で標識した蛍光標識プローブ等が挙げられる。プローブの例としては、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸プローブ、ならびに抗体や抗体断片等の結合分子が挙げられる。
前記キットに用いられるＴ細胞のマーカーとしては、ＣＣＲ４、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９６、ＦＡＳ、ＩＬ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ７Ｒ、ＩＴＫ、ＩＴＰＫＢ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＲＡＦ１、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１、ＴＮＦＲＳＦ４等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
また、前記Ｔ細胞としては、本発明のキットに用いることができるＴ細胞であれば特に制限はないが、Ｔｆｈ細胞が好ましい。Ｔｆｈ細胞のマーカーとしては、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＬ１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ２１、ＰＤＣＤ１、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＬＡＭＦ１、ＴＮＦＲＳＦ４等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬としては、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬であれば、特に制限はないが、例えば、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーに結合するように設計されたプローブを、蛍光等で標識した蛍光標識プローブ等が挙げられる。プローブの例としては、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸プローブ、ならびに抗体や抗体断片等の結合分子が挙げられる。
【００２８】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記マクロファージ又は前記樹状細胞のマーカーとしては、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＣＤ１１ｃ（ＩＴＧＡＸ）、ＮＯＤ２等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬としては、前記間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬であれば、特に制限はないが、例えば、前記間質細胞のマーカーに結合するように設計されたプローブを、蛍光等で標識した蛍光標識プローブ等が挙げられる。プローブの例としては、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸プローブ、ならびに抗体や抗体断片等の結合分子が挙げられる。
【００３０】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットにおいて、前記間質細胞のマーカーとしては、ＢＭＰ２Ｋ、ＣＯＬ８Ａ２、ＦＧＦＲ１、ＯＢＳＣＮ等が挙げられ、これらのマーカーは単独で用いても、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットには、Ｔ細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬の他に、他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムで用いられる試薬、及び免疫組織化学やウェスタンブロッティング等で用いられる試薬（例えば、緩衝液、洗浄液、検出試薬等）が挙げられる。
【００３２】
また、本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットには、前記ＤＭＳスコアを計算するための指示書が含まれていてもよい。前記指示書には、各マーカーの前記カットオフ値等を記載してもよい。
また、本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットを用いて測定した各マーカーの発現量を、インターネットやイントラネット等のネットワークを介してコンピュータ等の装置に入力し、前記装置により、各マーカーの前記カットオフ値からＤＭＳスコアを計算し、このＤＭＳスコアの数値より、前記化学療法に対する治療効果を予測し、その予測結果を、前記ネットワークを介して他のコンピュータやタブレット等の装置に出力することもできる。
【００３３】
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットは、本発明のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法に用いることができる。
【００３４】
また、本発明は、前記ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、予後が良好と予測された場合には、前記ＤＬＢＣＬ患者に対し、前記化学療法を実施することを含むＤＬＢＣＬ患者の治療方法を提供する。
本実施形態のＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法において、予後が良好と予測された場合には、前記ＤＬＢＣＬ患者に対し、前記化学療法を実施してＤＬＢＣＬ患者を治療することにより、前記ＤＬＢＣＬ患者の予後を良好にすることができる。
【００３５】
本発明は、ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法における使用のための、検体中の、Ｔ細胞のマーカー、マクロファージ又は樹状細胞のマーカー、及び間質細胞のマーカーを提供する。
【００３６】
また、本発明は、ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットの製造のための、検体中の、Ｔ細胞のマーカー、マクロファージ又は樹状細胞のマーカー、及び間質細胞のマーカーの使用を提供する。さらに、本発明は、ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するためのキットの製造のための、Ｔ細胞のマーカーの発現を測定する試薬、マクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する試薬及び間質細胞のマーカーの発現を測定する試薬からなる群から選ばれる少なくとも一つの試薬の使用を提供する。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例等により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例等に限定されるものではない。【００３８】
（実施例１）予後因子候補遺伝子の遺伝子発現
ＤＬＢＣＬ患者からのＦＦＰＥサンプルの下記表１に示す、４８の代表的な遺伝子の発現レベルを、ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを用いて解析した。その結果を図１Ａに示す。図１Ａに示したように、レアな微小環境構成要素に由来すると考えられるかなり低発現な転写物が、非常に高い再現性をもって定量されることが確認された。【００３９】
【表１】
2019065901.tif 000003
【００４０】
次に、Ｒ−ＣＨＯＰ療法を実施し、予後良好、又は、予後不良となったそれぞれ１５名のＤＬＢＣＬ患者（図１Ｂ）を含む３０のＤＬＢＣＬ症例からのＦＦＰＥ組織を用いて、免疫系、ガン経路系、キナーゼ系に関連する１９００の遺伝子の発現量を、ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを用いて調べた。その結果を、図１Ｃに示す。図１Ｃに示したように、予後良好と予後不良を示す症例間で統計的に有意に発現が異なる遺伝子が同定された。
前記予後良好と予後不良を示す症例間で統計的に有意に発現が異なる遺伝子は、免疫系パネルで富化されていた（図１Ｄ）。これらのほとんどは腫瘍Ｂ細胞起源の遺伝子でなく、Ｔ細胞で発現される遺伝子、ＮＫ細胞で発現される遺伝子（ＫＬＲＢ１）、及びその他の微小環境細胞で発現される遺伝子（ＩＴＧＡＸ、ＡＩＲＥ）を含む微小環境関連遺伝子であった。その他の微小環境関連予後遺伝子は、ＦＧＦＲ１（線維芽細胞成長因子レセプター１）とＣＯＬ４Ａ４（コラーゲン・タイプＩＶアルファ４）であった。細胞周期、アポトーシス及び細胞形質転換で重要な役割を有するものとしてよく知られている、がん遺伝子ＭＹＣは、ガン経路系パネルでトップランクの予後因子として抽出された（図１Ｃ）。【００４１】
ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムにより解析される遺伝子の数は、１アッセイ当たり最大８００の遺伝子であるため、ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムによるスクリーニングで解析されなかった遺伝子を補完するために、ＲＮＡシークエンシングによるトランスクリプトーム解析を実施した（図１Ｅ）。その結果、予後良好群及び予後不良群について、発現が異なる５６の遺伝子が、予後因子候補として抽出された（図１Ｆ）。この５６遺伝子中、１２遺伝子は、ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムによるスクリーニングでも抽出された遺伝子であった。【００４２】
上記予備的コフォートにおける２つのスクリーニングの結果に基づいて、２４８の予後因子候補の遺伝子を選択し、次のｎＣｏｕｎｔｅｒシステムによる評価コフォートのためのプローブセットをカスタム合成（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ社）により設計した。遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ；以下、ＧＯとも称する）分析の結果、これらの候補遺伝子の殆どが免疫系において富化されている遺伝子であることが明らかとなった（図１Ｇ）。このことは、免疫状態が、ＤＬＢＣＬ患者の臨床結果と密接に関連していることを示唆している。【００４３】
（実施例２）予後不良因子の同定
２００６〜２０１３年にＲ−ＣＨＯＰまたはＲ−ＣＨＯＰ様の化学療法で処置された１７０のＤＬＢＣＬサンプル（年齢、中央値７１歳［範囲、２３−８９歳］；ＩＰＩ（国際予後指標）：低リスクと低中間リスク  ５１．５％、高中間リスクと高リスク：４８．３％、観察期間、中央値３．３年）で、ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを用いて実施例１で同定された予後因子候補遺伝子の遺伝子発現を分析した。【００４４】
その結果、統計学的有意性（マン−ホウィットニーＵ検定からの−ｌｏｇ１０  ｐ値）と、予後良好症例と予後不良症例との間の遺伝子発現レベルのフォールド変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）の大きさとのボルケーノプロットでいくつかの予後因子が確認された（図２Ａ）。【００４５】
最も有意な予後不良因子の一つはＭＹＣであった。ＭＹＣの状態は、遺伝子再編成状態だけでなくタンパク質発現についても、臨床結果を予測することが報告されている。この報告と一致して、ＭＹＣ  ｍＲＮＡの高発現は、生存不良を強く予測した（図２Ｂ）。【００４６】
他の予後不良因子は、デノボのプリン生合成に重要な役割を果たすホスホリボシルアミノイミダゾールカルボキシラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、及びホスホリボシルイミダゾールスクシノカルボキシアミドシンターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅｓｕｃｃｉｎｏｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ（ＰＡＩＣＳ）、ビタミンＢ６代謝に関連する、グリシルｔＲＮＡ合成酵素（ＧＡＲＳ）とピリドキサール・ホスファターゼ（ＰＤＸＰ）であった（図２Ｂ）。これらの遺伝子の上方制御は同時に起こっており（図２Ｃ）、これらの遺伝子の上方制御がリンパ腫細胞の高活性化を示している。実際、これらの遺伝子の発現は、正常リンパ節サンプル、ＤＬＢＣＬサンプル、ＤＬＢＣＬ細胞株の順で上方制御されており（図２Ｄ）、潜在的な治療ターゲットとなる可能性がある。【００４７】
（実施例３）予後良好因子の同定
実施例２と同様にして、ｐ値とフォールド変化とに関して、予後良好臨床経過を伴う患者において上方制御されている、予後良好因子を同定した（図２Ａ）。これらの予後良好因子は、免疫関連ＧＯ階層、特に免疫反応階層で富化されていた（図２Ｅ）。予後良好因子の殆どはＴ細胞またはＮＫ細胞関連遺伝子、マクロファージまたは樹状細胞（以下、マクロファージ／ＤＣともいう）関連遺伝子、細胞外マトリックス（以下、ＥＣＭともいう）関連遺伝子であり、これらは、おそらく腫瘍微小環境構成要素により発現されていると思われる。【００４８】
この中で、Ｔｆｈ細胞の主要マーカーであるＩＣＯＳ、マクロファージ／ＤＣの主要マーカーであるＣＤ１１ｃ、及び間質性細胞の主要マーカーであるＦＧＦＲ１に注目し、これらの遺伝子が同一細胞によって共発現されているかを確認するために、Ｃ１システム（フリューダイム社製）とＢｉｏｍａｒｋ（登録商標）システム（フリューダイム社製）を使用して、浸入するＴ細胞の超高感度単一細胞ＧＥＰを実施した。【００４９】
その結果、Ｔｆｈ細胞の特異的マーカーであり、実施例１及び２において、予後因子の一つとして特定されたＩＬ−２１が、とＣＤ４＋Ｔ細胞のレアな画分に限定的に発現しており（図３Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞では発現しておらず（図３Ｂ）、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＢＣＬ−６、ＰＤ−１、ＣＸＣＲ５、ＩＣＯＳ、ＳＬＡＭＦ１のような標準的なＴｆｈマーカーと共発現されていた（図３Ｃ）。このことは、Ｔｆｈ細胞がＤＬＢＣＬ微小環境で予後良好を予測する主要な構成要素の１つであることを示唆している。【００５０】
さらに、Ｍａｎｔｒａ（登録商標）組織標本定量ワークステーション（パーキン−エルマー社製）を用いた、多重蛍光免疫染色によるＤＬＢＣＬ組織の視覚化を行い、ＩＣＯＳ＋Ｔｆｈ細胞が無増悪患者サンプルで顕著に侵入することを確認した（図３Ｄ、図３Ｅ）。【００５１】
ＤＬＢＣＬ組織の多重蛍光免疫染色像において、ＣＤ１１ｃ陽性細胞は、ＣＤ３＋細胞またはＣＤ２０＋細胞でなく、ＣＤ６８＋細胞と完全に一致した（図３Ｆ）。このことは、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ６８＋マクロファージ／ＤＣ由来のこの予後因子が、アポトーシス性Ｂ細胞スカベンジャーとして機能するＧＣ微小環境の主要な因子であることを示唆している。これらの細胞構成要素の定量的解析により、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ６８＋マクロファージ／ＤＣが富化されていることが、無増悪長期生存と関係していることが視覚的に確認された（図３Ｇ）。【００５２】
その他の微小環境関連の予後良好遺伝子であるＦＧＦＲ１（線維芽細胞成長因子１）陽性細胞は、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３のようなリンケージ特異的マーカーとは融合せず、細胞間隙に存在していた（図４Ａ）。このことから、ＦＧＦＲ１がＥＣＭ関連の遺伝子であることが確認された。【００５３】
これらの予後因子の遺伝子の発現は、ＤＬＢＣＬ細胞株で観察されなかった（図４Ｂ）。このことから、これらの予後因子はＤＬＢＣＬ組織の微小環境に由来すると考えられる。さらに正常リンパ節と比較してＤＬＢＣＬサンプルで低発現であることは、Ｔｆｈ細胞、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ６８＋マクロファージ／ＤＣ、ＦＧＦＲ１＋間質細胞のような特定の微小環境特性の損失がＤＢＬＣＬの発症と関係していることを示している。【００５４】
（実施例４）微小環境に基づく組織起源とＤＬＢＣＬ患者の臨床結果との関係
Ｍａｎｔｒａ（登録商標）組織標本定量ワークステーション（パーキン−エルマー社製）を使用して、良性リンパ節腫脹と診断された患者から得られた反応性リンパ節中の、微小環境由来予後因子の存在を解析した（図５Ａ）。その結果、ＩＣＯＳ＋Ｔｆｈ細胞、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ６８＋マクロファージ／ＤＣ、及びＦＧＦＲ１＋間質細胞は、ＧＣ領域に明瞭に存在した。これらの遺伝子は、ＧＣがない正常のリンパ節のＢ細胞濾胞で殆ど又は全く発現していなかった（図５Ｂ）。【００５５】
デジタル定量分析で、これらの予後微小環境細胞がＧＣ領域で富化されることを確認した（図５Ｃ）。これらの結果から、これらの微小環境細胞の富化がＧＣ特性を反映し、リンパ腫細胞の起源ではなく、ＤＬＢＣＬ組織の起源、所謂、「組織起源」を定義することが示唆された。さらに、図５Ｄに示すように、これらのＧＣ微小環境細胞はそれぞれ、それ自体でＤＬＢＣＬ患者の予後の強力な予測因子であった。【００５６】
この「組織起源」の概念に基づき、リンパ腫微小環境を表す新たなスコアリングシステムである、ＤＭＳスコアを構築した。このシステムはＧＣ微小環境の３つの構成要素の存在によって定義される。このＤＭＳスコアの一例としては、図６Ａに示すように、ｎＣｏｕｎｔｅｒからＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１の発現状態によって計算されるものが挙げられ、このＤＭＳスコアは、ＤＬＢＣＬ患者を層別化し、明確に患者の予後を反映した。【００５７】
このように、ＤＭＳスコアが高いグループでは、これらのＴｆｈ関連マーカーの富化が確認されるのに対し、予後不良関連微小環境遺伝子である、ＩＬ−２１、ＰＤ−１、ＣＸＣＬ−１３、ＣＴＬＡ−４、及びＦＯＸＰ３は上方制御されないか、下方制御された（図６Ｂ）。【００５８】
更に、Ｒ−ＣＨＯＰ療法で処置されたＤＬＢＣＬ患者の７２の症例を追加し、上記と同様にして、臨床結果と、ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、ＦＧＦＲ１の各遺伝子の発現量の関係について調べた。その結果、無増悪患者において、ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１の遺伝子の発現が上昇していたのに対し、増悪患者においては、いずれの遺伝子も発現が上昇していなかった（図６Ｃ）。この結果からも、ＩＣＯＳ、ＣＤ１１ｃ、及びＦＧＦＲ１は、ＤＬＢＣＬ患者の予後の強力な予測因子であることが分かる。
また、これらの７２症例について、ＤＭＳスコアを算出し、カプラン・マイヤー法により生存率曲線を描画した（図６Ｄ）。図６Ｄから明らかなように、ＤＭＳスコアが高い程、無増悪生存率が高いことから、ＤＭＳスコアは、ＤＬＢＣＬ患者を層別化し、明確に患者の予後を反映することが確認された。【００５９】
ＤＭＳの各々のグループ（ＤＭＳスコア０〜３の各グループ）は、ハンス基準（Ｈａｎｓ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）による標準的なＣＯＯ分類によって一定の割合で分類されるＧＣＢタイプと非ＧＣタイプを含むが、調和した相関性は観察されなかった（図６Ｅ）。他方、改良されたＣＯＯ分類モデルであるＬｙｍｐｈ２Ｃｘスコアで分類されるＧＣＢ症例は、統計的有意性をもってＤＭＳスコアが高いグループで高かった。このことは、ＤＭＳスコアとＬｙｍｐｈ２Ｃｘスコアの両方が、各々微小環境とリンパ腫細胞特性の視点から、ＧＣ様特性を反映することを示唆している。【００６０】
ＩＰＩリスクとＤＭＳスコアによるサブグループ間の相関は見られた（図６Ｆ）が、ＤＭＳスコアは標準的なＣＯＯベースの層別化モデルよりも正確に患者の予後を予測することができた（図６Ａ、図６Ｄ、図６Ｇ）。そこで、ＤＭＳスコアが標準的な臨床予後指標の予後価値を増加することができるかどうかを検討した。
その結果、図７Ａ〜図７Ｃ示すように、ＤＭＳスコアは、ハンス基準の全てのサブグループ（ＧＣＢと非ＧＣ）、Ｌｙｍｐｈ２Ｃｘの全てのサブグループ（ＧＣＢとＡＢＣ）とＩＰＩ分類（高リスク（３−５）、低リスク（０−２））において、予後を予測することができた。さらに、多変量解析により、ＤＭＳスコアが独立した予後因子であることが確認された（図７Ｄ）。ランダム再サンプリング技術によるパーミューテンションテスト（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）では、ログランク検定からのｐ値の９９．５０％が０．０００６３未満であり、これは、予後モデルとしてＤＭＳスコアの検出力を表している（図７Ｅ）。このように、ＧＣ微小環境特性の量によって定義される「組織起源」分類は、標準的なＣＯＯ分類とＩＰＩとは独立して、デノボで無処置のＤＬＢＣＬの臨床結果を予測することができた。【００６１】
（実施例５）ＤＬＢＣＬのＧＣ微小環境特性と遺伝子変異状態の関係
４４７の免疫関連遺伝子の遺伝子発現プロファイルと、臨床的に確認されているシークエンスプラットホーム（ＯｎｃｏＰａｎｅｌ、ダナ−ファーバーキャンサーインスティテュート社製）を使用して、１０６のＤＬＢＣＬ症例のターゲット捕捉シークエンスから得られる体細胞変異状態との間の相関関係を調べた。その結果、遺伝子発現プロファイルの教師なし（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）階層的クラスター解析では、２つの主要な集団が特定され、主にＤＭＳスコアが高い患者と低い患者で構成された（図８Ａ）。レーザー捕獲顕微解剖した反応性リンパ節からのＧＣ組織の遺伝子発現パターンは、ＤＭＳスコアが高い人の遺伝子発現パターンに似ていた。このことから、ＤＭＳスコアがＧＣ微小環境組織を正確に評価することが確認された。【００６２】
また、ＤＭＳスコアが最も高い患者（ＧＣ微小環境特性が高い患者）は、ＤＭＳが最も低い患者と互いに相容れず、ＭＹＣ、ＣＤＫ４、Ｅ２Ｆ１のようなリンパ腫活動と細胞周期に関連した遺伝子の低発現によって特徴づけられ、予後良好であることを反映していた（図８Ａ）。【００６３】
ＡＢＣまたは非ＧＣサブタイプにおいて富化されていることが繰り返し報告されている、ＢＣＲシグナル経路は、ＤＭＳスコアが低い患者に顕著に集中しており、このことは、微小環境特性に基づくサブタイプが、変異に基づくサブタイプと相関することを示唆している。また、高いＤＭＳスコア、特に３つの微小環境因子の中でＩＣＯＳの高発現は、コピー数改変（ＣＮＡ）の減少数と顕著に相関していた（図８Ｂ）。このことから、ＤＬＢＣＬのＧＣ微小環境特性は、体細胞変異で定義されるＤＬＢＣＬサブタイプ、及びＣＮＡを伴う遺伝子数と相関し、おそらく発病または臨床予後を反映すると思われる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、ＤＬＢＣＬ患者における化学療法に対する治療効果を予測するための方法であって、前記患者から得た検体中のＴ細胞のマーカーの発現を測定する工程、前記患者から得た検体中のマクロファージ又は樹状細胞のマーカーの発現を測定する工程及び前記患者から得た検体中の間質細胞のマーカーの発現を測定する工程からなる群から選ばれる少なくとも一つの工程と、前記マーカーの発現に基づき、前記治療による予後を予測する工程と、を含む方法を提供する。本発明は、新規なＤＬＢＣＬの予後モデルの開発とＤＬＢＣＬの病態生理学における微小環境構成要素の役割の解明に貢献するものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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