(57)【要約】  本発明は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないタンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法の提供を目的とする。目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ前記夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、前記無機塩水混濁液を前記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と前記夾雑物とに分離する分離工程と、を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ前記夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、前記無機塩水混濁液を前記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と前記夾雑物とに分離する分離工程と、を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記無機塩水混濁液がさらにアルコールを含む請求項１に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項３】
前記無機塩水混濁液のｐＨを下げる工程をさらに含む請求項１又は２に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項４】
目的タンパク質抽出工程が、加熱することをさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項５】
前記無機塩がアルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩から選ばれる少なくともーつである請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項６】
前記無機塩が無機塩化物、及び硝酸塩から選ばれる少なくともーつである請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項７】
前記無機塩水混濁液における無機塩の濃度が２ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、構造タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項９】
前記構造タンパク質が、フィブロインである、請求項８に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１０】
前記構造タンパク質が、クモ糸フィブロインである、請求項８又は９に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１１】
分離工程で得られた前記無機塩水溶液に貧溶媒を添加し、タンパク質を自然沈降させる工程をさらに含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質の精製方法。
【請求項１２】
タンパク質を発現した宿主細胞と無機塩と水とを接触させて、該タンパク質が溶解した無機塩水溶液を得る工程を含むことを特徴とするタンパク質溶液の製造方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が溶解した無機塩水溶液が前記宿主細胞由来の夾雑物を分離除去する工程を経たものである請求項１２に記載のタンパク質溶液の製造方法。
【請求項１４】
タンパク質を含む成形体を製造するに際して、請求項１２又は１３に記載のタンパク質が溶解した無機塩水溶液を成形体原料として用いることを特徴とするタンパク質成形体の製造方法。
【請求項１５】
前記タンパク質成形体が繊維又はフィルムである請求項１４に記載のタンパク質成形体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質等のタンパク質の製造は、組換えタンパク質として宿主細胞に発現させ、抽出及び精製することによって行われることがある。抽出に際して、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒は、クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質等のタンパク質の溶媒として使用されている。また、これら極性溶媒に、溶解促進剤として無機塩を添加することが知られている（例えば、特許文献１〜３）。また、塩化カルシウム／エタノール水溶液が絹フィブロイン（シルクフィブロイン）を溶解することが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５４２７３２２号公報
【特許文献２】特許第６０７７５６９号公報
【特許文献３】特許第６０７７５７０号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】AKIYOSHI AJISAW, “Dissolution of silk fibroin with calciumchloride/ethanol aqueous solution” The Journal of Sericultural Science of Japan Vol.67 No.2, 91-94(1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＤＭＳＯに無機塩（例えば、塩化リチウム）を添加した溶媒は、タンパク質を溶解させる溶媒として極めて優れている。一方、工業的な利用という観点からは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しない若しくは使用量の少ない溶媒が求められている。【０００６】
本発明は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないタンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法、及びタンパク質成形体の製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得てから、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離することによって、有機溶媒を使用せず、タンパク質を抽出及び精製できることを見出し、本発明の完成に至った。【０００８】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、無機塩水混濁液を前記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離する分離工程と、を含むことを特徴とするタンパク質の精製方法。
［２］無機塩水混濁液がさらにアルコールを含む［１］のタンパク質の精製方法。
［３］前記無機塩混濁溶液のｐＨを下げる工程が含まれる［１］又は［２］のタンパク質の精製方法。
［４］目的タンパク質抽出工程が、加熱することをさらに含む［１］〜［３］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［５］無機塩がアルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩から選ばれる少なくともーつである［１］〜［４］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［６］無機塩が無機塩化物、及び硝酸塩から選ばれる少なくともーつである［１］〜［５］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［７］無機塩の濃度が２ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌである［１］〜［６］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［８］目的タンパク質が、構造タンパク質である、［１］〜［７］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［９］構造タンパク質が、フィブロインである、［８］のタンパク質の精製方法。
［１０］構造タンパク質が、クモ糸フィブロインである、［８］又は［９］のタンパク質の精製方法。
［１１］精製されたタンパク質水溶液に貧溶媒を添加し、タンパク質を自然沈降させる工程を含む［１］〜［１０］のいずれかのタンパク質の精製方法。
［１２］タンパク質を発現した宿主細胞と無機塩と水とを接触させて、該タンパク質が溶解した無機塩水溶液を得る工程を含むことを特徴とするタンパク質溶液の製造方法。
［１３］タンパク質が溶解した無機塩水溶液は、宿主細胞由来の夾雑物を分離除去する工程を経たものである［１２］のタンパク質溶液の製造方法。
［１４］タンパク質を含む成形体を製造するに際して、［１２］又は［１３］のタンパク質が溶解した無機塩水溶液を成形体原料として用いることを特徴とするタンパク質成形体の製造方法。
［１５］タンパク質成形体が繊維又はフィルムである［１４］のタンパク質成形体の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないこと若しくは、使用量の低減が可能なタンパク質の精製方法、タンパク質溶液の製造方法及びタンパク質成形体の製造方法の提供が可能となる。本発明の方法はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の極性溶媒を使用しないこと若しくは、使用量の低減が可能なため、工業的な利用を容易にすることができる。また、本発明のタンパク質の精製方法によれば、夾雑物（例えば菌体）から、有機溶媒を使用することなく目的タンパク質を選択的に抽出及び精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１及び２のタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】実施例３の無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３】実施例４のｐＨ調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】実施例５のｐＨ調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】実施例６の無機塩濃度及び液量の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図６】実施例７の無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図７】実施例８の無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
｛タンパク質の精製方法｝
本実施形態に係るタンパク質の精製方法は、目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させて、該目的タンパク質を溶解し、かつ夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を得る目的タンパク質抽出工程と、無機塩水混濁液を目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離する分離工程と、を含む。
【００１３】
〔１．目的タンパク質抽出工程〕
＜目的タンパク質＞
溶解させるタンパク質（以下、「目的タンパク質」ということもある。）としては、工業規模での製造が好ましい任意のタンパク質を挙げることができる。目的タンパク質としては、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、クモ糸タンパク質（クモ糸フィブロイン）及びシルクタンパク質（シルクフィブロイン）などのフィブロイン、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン、及びケラチン、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
【００１４】
フィブロイン様タンパク質であるクモ糸タンパク質及びシルクタンパク質、並びにこれら由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、ｎは２〜２０、好ましくは４〜２０、より好ましくは８〜２０、更に好ましくは１０〜２０、更により好ましくは４〜１６、更によりまた好ましくは８〜１６、特に好ましくは１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが更に好ましく、９０％以上であることが更により好ましく、１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは２〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質、並びにこれら由来のタンパク質の具体的としては、配列番号１（ＰＲＴ４１０）、配列番号２（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
【００１５】
クモ糸タンパク質の一種である横糸タンパク質、及びこれに由来するタンパク質としては、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、式２中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。横糸タンパク質、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｌａｇ＿９２＿ｓｈｏｒｔ２）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００１６】
コラーゲン、及びこれに由来するタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、式３中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。コラーゲン、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号４（Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｔｙｐｅ４−Ｋａｉ）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００１７】
レシリン、及びこれに由来するタンパク質として、例えば、式４：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。ここで、式４中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。レシリン、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号５（Ｒｅｓｉｌｉｎ−Ｋａｉ）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００１８】
エラスチン、及びこれに由来するタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。エラスチン、及びこれに由来するタンパク質の具体的としては、配列番号６（ｅｌａｓｔｉｎ  ｓｈｏｒｔ）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。ケラチンの組換えポリペプチドの具体例としては、配列番号７で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００１９】
目的タンパク質としては、溶解性がより優れるという観点から、クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質、並びにこれら由来のタンパク質等のフィブロイン様タンパク質が好ましく、クモ糸タンパク質、及びこれに由来するタンパク質がより好ましい。目的タンパク質は、例えば、遺伝子工学的手法を用いた一般的な方法により取得できる。具体的には、例えば、目的タンパク質（例えば、組換えクモ糸タンパク質）は、組換えの対象となる天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法としては、特に制限さないが、例えば、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等で増幅してクローニングする方法、及び化学的に合成する方法が挙げられる。
【００２０】
遺伝子の化学的な合成方法としては、特に制限されないが、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベース等より入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等で自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲ等で連結して合成する方法が挙げられる。目的タンパク質には、タンパク質の精製及び確認を容易にするため、アミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加してもよい。発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ又はウイルス等の発現ベクターを用いることができる。プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。具体的には、例えば、宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクター等を用いることができる。プラスミド型発現ベクターとしては、タンパク質の生産性に優れるという観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。宿主としては、例えば、動物細胞、植物細胞、微生物等を用いることができる。
【００２１】
目的タンパク質を発現した宿主細胞から当該目的タンパク質を溶解するために添加する本発明に係る無機塩及び水の添加量は特に制限されるものではないが、目的タンパク質の溶解性を高める観点から、例えば、宿主細胞の重量（ｇ）に対するタンパク質溶解用溶媒の体積（ｍＬ）の比（体積（ｍＬ）／重量（ｇ））として、５倍以上であることが好ましく、７倍以上であることがより好ましく、１０倍以上であることが更に好ましい。タンパク質溶解用溶媒を添加する際の宿主細胞は、乾燥した状態でもよく、湿った状態でもよい。
【００２２】
＜目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物＞
目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物は、例えば目的タンパク質を発現した宿主細胞若しくは、目的タンパク質を発現した宿主細胞の破砕物と目的タンパク質が分散したもの等のことをいう。
【００２３】
夾雑物は、特に限定されず目的タンパク質以外の物質であり、例えば、目的タンパク質を発現した宿主細胞由来のタンパク質等のことをいう。
【００２４】
非溶物は、特に限定されず、前記無機塩水溶液に溶解していない目的タンパク質を発現した宿主細胞由来のタンパク質等のことをいう。
【００２５】
＜無機塩＞
無機塩としては、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩が挙げられる。より具体的には、無機塩は、例えば、リン酸アルミニウム、炭酸リチウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、フッ化アルミニウム、酢酸第二鉄、酢酸アルミニウム、水酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化マンガン、水酸化クロム、水酸化第二鉄、水酸化アルミニウム、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化第一鉄、塩化マンガン、塩化クロム、塩化第二鉄、塩化アルミニウム、硝酸リチウム、硝酸ストロンチウム、硝酸ニッケル、硝酸カルシウム、硝酸コバルト、硝酸亜鉛、硝酸マグネシウム、硝酸第一鉄、硝酸マンガン、硝酸クロム、硝酸第二鉄、硝酸アルミニウム、臭化リチウム、臭化バリウム、臭化ストロンチウム、臭化ニッケル、臭化カルシウム、臭化コバルト、臭化亜鉛、臭化マグネシウム、臭化第一鉄、臭化マンガン、臭化クロム、臭化第二鉄、臭化アルミニウム、塩素酸バリウム、塩素酸ストロンチウム、塩素酸ニッケル、塩素酸カルシウム、塩素酸コバルト、塩素酸亜鉛、塩素酸マグネシウム、塩素酸第一鉄、塩素酸マンガン、塩素酸クロム、塩素酸第二鉄、塩素酸アルミニウム、ヨウ化ルビジウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化銅、ヨウ化リチウム、ヨウ化バリウム、ヨウ化ストロンチウム、ヨウ化ニッケル、ヨウ化カルシウム、ヨウ化コバルト、ヨウ化亜鉛、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化第一鉄、ヨウ化マンガン、ヨウ化クロム、ヨウ化第二鉄、ヨウ化アルミニウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸鉛、過塩素酸銅、過塩素酸リチウム、過塩素酸バリウム、過塩素酸ストロンチウム、過塩素酸ニッケル、過塩素酸カルシウム、過塩素酸コバルト、過塩素酸亜鉛、過塩素酸マグネシウム、過塩素酸第一鉄、過塩素酸マンガン、過塩素酸クロム、過塩素酸第二鉄、過塩素酸アルミニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸鉛、チオシアン酸銅、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸ストロンチウム、チオシアン酸ニッケル、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸コバルト、チオシアン酸亜鉛、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸第一鉄、チオシアン酸マンガン、チオシアン酸クロム、チオシアン酸第二鉄、チオシアン酸アルミニウム、シアン酸アンモニウム、シアン酸セシウム、シアン酸ルビジウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸鉛、シアン酸銅、シアン酸リチウム、シアン酸バリウム、シアン酸ストロンチウム、シアン酸ニッケル、シアン酸カルシウム、シアン酸コバルト、シアン酸亜鉛、シアン酸マグネシウム、シアン酸第一鉄、シアン酸マンガン、シアン酸クロム、シアン酸第二鉄、及びシアン酸アルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。
【００２６】
無機塩としては、無機塩化物及び硝酸塩から選ばれる少なくともーつであることが好ましい。無機塩化物としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は塩化マグネシウム等が挙げられる。硝酸塩としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸カルシウム、又は硝酸マグネシウム等が挙げられる。
【００２７】
目的タンパク質の抽出性向上の観点及び粉末の溶解性向上の観点から、さらに好ましくは、無機塩が塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、又は硝酸カルシウムから選ばれる少なくとも一つである。
【００２８】
本実施形態に係る無機塩水溶液は、溶解性に優れているため、無機塩の濃度は特に限定されないが溶解性向上の観点から１ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、２ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、３ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、４ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよく、５ｍｏｌ／Ｌ以上であってもよい。
【００２９】
無機塩の添加によるコスト低減の観点から１０ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、９ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、８ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、７ｍｏｌ／Ｌ以下であってもよく、６ｍｏｌ／Ｌ以下でであってもよい。
【００３０】
無機塩の濃度を上記の範囲内、例えば、１ｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌ、２ｍｏｌ／Ｌ〜８ｍｏｌ／Ｌ、２ｍｏｌ／Ｌ〜６ｍｏｌ／Ｌ、３ｍｏｌ／Ｌ〜８ｍｏｌ／Ｌ、又は３ｍｏｌ／Ｌ〜７ｍｏｌ／Ｌに調整することにより、上述したコスト低減の効果をより一層顕著に発揮することができる。無機塩濃度の下限は、２ｍｏｌ／Ｌ以上であれば、充分に優れたタンパク質の溶解性を示すことができる。塩化カルシウム濃度の上限は、タンパク質の溶解性に加えて、コスト低減の観点から、６ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００３１】
水は、特に限定されないが、タンパク質溶液中の夾雑物を低減するという観点から、例えば純水、蒸留水、又は超純水であってもよい。
【００３２】
アルコールを使用することにより、抽出に必要な無機塩の添加量を低減することができる。水と組み合わせるアルコールは、炭素数１〜６の低級アルコール、特にエタノールであってもよい。
【００３３】
アルコールの割合は、水とアルコールが相分離しない範囲で設定すればよいが、例えば、抽出溶媒、又は得られるタンパク質溶液の質量を基準として、１０質量％以上、又は２０質量％以上であってもよく、５０質量％以下、４０質量％以下又は３０質量％以下であってもよい。
【００３４】
目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させる方法に関しては、特に限定されず、混在物に無機塩及び水を添加してもよく、水に無機塩及び混在物を添加してもよく、また添加の順番を問わない。目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩と水とを接触させた水溶液のｐＨを低下さることによって、水溶液中に抽出される目的タンパク質量が増加する。
【００３５】
水溶液のｐＨを低下させる方法は、特に限定されない。例えば、前記水溶液に酸性化合物、水、ｐＨ緩衝剤、又はその他のｐＨ調整剤を加える方法によって、ｐＨを低下させることができる。
【００３６】
前記水溶液のｐＨを低下させる幅は、目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩と水とを接触させた水溶液から目的タンパク質が抽出されるように、調整される。水溶液のｐＨの低下幅は、特に限定されず、３．０以下、２．７以下、２．５以下、２．０以下、１．５以下、及び１．０以下であってもよい。
【００３７】
ｐＨを低下させるためにタンパク質水溶液に添加され得る酸性化合物の種類は、特に限定されない。酸性化合物は、例えば、硝酸、ＥＤＴＡからなる群より選ばれる少なくとも１種であってもよい。
【００３８】
目的タンパク質と夾雑物とが混在する混在物を無機塩及び水と接触させてから、加熱してもよい。加熱方法は特に限定されず、目的タンパク質の抽出時に所定の温度を保持できればよい。また更に撹拌することが含まれていてもよい。
【００３９】
加熱温度は特に限定されず、目的とするタンパク質の種類に応じて、たとえば加熱温度は６０℃以上、好ましくは７０℃以上、さらに好ましくは８０℃以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、目的タンパク質の純度向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１３０℃以下、好ましくは１１０℃以下、さらに好ましくは９０℃以下である。
【００４０】
目的タンパク質を溶解させる時間は特に限定されず、効率よく目的タンパク質を得る観点及び菌体死菌化の観点から、目的とする組換えタンパク質の種類に応じて、たとえば０．５時間以上、好ましくは１時間以上、さらに好ましくは２時間以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、作業効率向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１５時間以下、好ましくは１０時間以下、さらに好ましくは５時間以下である。
【００４１】
〔２．分離工程〕
目的タンパク質抽出工程で得られた目的タンパク質を溶解し、かつ夾雑物を非溶物として含む無機塩水混濁液を、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液と夾雑物とに分離する方法は、特に限定されず、適宜な分離手段、例えば、自然沈降（沈殿）、遠心分離又は濾過を用いて凝集体を分離することができる。遠心分離の条件は、特に限定されない。例えば、（８０±５℃）、１０００×ｇ〜１５０００×ｇで５〜３０分間行うことができる。不溶物の分離は２回以上行ってもよい。
【００４２】
＜貧溶媒＞
貧溶媒を無機塩水溶液に添加することで目的タンパク質の純度を向上することができる、貧溶媒は特に限定されず、目的タンパク質を析出されるように、調整される。貧溶媒は、例えば、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、アルコール（エタノール）等が挙げられる。
【００４３】
｛タンパク質溶液の製造方法｝
本実施形態に係るタンパク質溶液の製造方法は、タンパク質を発現した宿主細胞と無機塩と水とを接触させて、該タンパク質が溶解した無機塩水溶液を得る工程を含むことを特徴とする。ここのタンパク質は上記の目的タンパク質と同じである。また、タンパク質を発現した宿主細胞、無機塩及び水は、［１．目的タンパク質抽出工程］に記載されている通りである。
無機塩水溶液、［２．分離工程］に記載されている通りである。無機塩水溶液は、［２．分離工程］に記載の分離方法によって、宿主細胞由来の夾雑物を分離除去する工程を経たものであることが好ましい。
【００４４】
｛タンパク質成形体の製造方法｝
本実施形態に係るタンパク質成形体の製造方法は、上記目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（タンパク質溶液）を成形体原料として用いることを特徴とする。
＜タンパク質成形体＞
本実施形態に係るタンパク質溶液は、例えば、成形体原料として用いることができる。本実施形態に係る成形体原料は、紡糸に用いることができ、またキャストフィルム液等として有用である。本実施形態に係る成形体原料は、例えば、タンパク質溶液の粘度を、紡糸できる粘度に調整して製造される。タンパク質溶液の粘度は、例えば、１００〜１０，０００ｃＰ（センチポイズ）である。タンパク質溶液の粘度の調整は、例えば、溶液中のタンパク質の濃度を調整することで行うことができる。タンパク質溶液の粘度は、例えば、京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定することができる。
【００４５】
本実施形態のタンパク質成形体が繊維又はフィルムであることが好ましい。本実施形態に係るタンパク質繊維の製造方法は、本発明に係るタンパク質溶液を成形体原料とし、凝固液に押し出し、未延伸糸を得る工程（以下、「紡糸工程」ともいう。）を含む。本実施形態に係る製造方法は、未延伸糸を延伸する工程（以下、「延伸工程」ともいう。）を更に含むものであってもよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４７】
＜材料＞〔（１）改変フィブロイン発現株の作製〕
（プラスミド型発現株の作製）
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列を有し、さらにＮ末端に配列番号８で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されている。【００４８】
次に、ＰＲＴ４１０をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。【００４９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）についても同様にタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。【００５０】
（タンパク質の発現）
配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表１）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
【表１】
2018235958.tif 000002
【００５１】
当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表２）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
【表２】
2018235958.tif 000003
【００５２】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。【００５３】
実施例１  タンパク質の精製（１）
（無機塩によるタンパク質の精製）
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄し菌体を取得した。上記のようにして得られた、目的タンパク質（改変フィブロインＰＲＴ７９９）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、水（１００ｍＬ）、３Ｍ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含む水溶液を使用した。【００５４】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。【００５５】
分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物（ろ過残渣）と目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００５６】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、３倍量の８５％エタノール、又は１／２倍量の７Ｍ  酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。【００５７】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を行った。解析結果は図１のレーンＮｏ．１（３倍量の８５％エタノール）及びレーンＮｏ．２（１／２倍量の７Ｍ  酢酸カリウム）に示す。【００５８】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
改変フィブロイン抽出液（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）について、ＢＣＡ法による測定から得られた結果を基に、タンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製した。Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）  Ｔｅｔｒａ  ＳｙｓｔｅｍにＭｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）【００５９】
ＴＧＸ（登録商標）  Ｇｅｌｓをセットし、調製した各ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルをロードし、電気泳動を行った。電気泳動終了後、Ｇｅｌ  ＤＯＣ（登録商標）  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒで解析を行った。結果を図１に示す。【００６０】
図１の左の写真は、電気泳動後、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で染色したもの、図１の右の写真は、電気泳動後、ＰＲＴ７９９のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で染色したものである。ＰＲＴ７９９（理論分子量：２１１．４ｋＤａ）は、２５０ｋＤａの分子量マーカの付近にバンドとして検出された。【００６１】
実施例２  タンパク質の精製（２）
（無機塩及びエタノールによるタンパク質の精製）
上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ７９９（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、水（８０ｍＬ）、１Ｍ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、エタノール（２０ｍＬ）を含む水溶液を使用した。【００６２】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００６３】
分離した夾雑物に１／５倍量の１Ｍ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（８０ｍＬ）、エタノール（２０ｍＬ）を含む水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００６４】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、３倍量の８５％エタノール、又は１／２倍量の７Ｍ  酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。【００６５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図１レーンＮｏ．３（３倍量の８５％エタノール）及びレーンＮｏ．４（１／２倍量の７Ｍ  酢酸カリウム）に示す。エタノールの添加により、無機塩の添加量を低減できることが確認された。また、図１より抽出溶媒を１Ｍ  ＣａＣｌ２  ２０％エタノールとし、析出用貧溶媒をエタノールとすることで純度向上が確認された。【００６６】
実施例３  無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製（１）
上記のようにして得られた、目的タンパク質（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、水（１００ｍＬ）、０Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、又は６Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を含む水溶液を使用した。【００６７】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００６８】
分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００６９】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。【００７０】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。レーンＮｏ．１〜６はそれぞれ１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、又は６Ｍのサンプルに対応している。解析結果は図２に示す。無機塩の添加量により抽出効率が向上することが確認された。【００７１】
実施例４  ｐＨ調整によるタンパク質の精製（１）
（異なるｐＨの無機塩水溶液によるタンパク質の精製）
上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の乾燥菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム（Ｍｇ（ＮＯ３）２）を含む水溶液（ｐＨ４．２）、
（２）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む水溶液（ｐＨ４．０）、
（３）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、３０ｍＭのＥＤＴＡを含む水溶液（ｐＨ３．７）、又は
（４）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、０．３％の硝酸を含む水溶液（ｐＨ３．４）
を使用した。【００７２】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００７３】
分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００７４】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ  酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。【００７５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図３に示す。レーンＮｏ．１〜４はそれぞれ水溶液（１）〜（４）に対応している。ＰＲＴ４１０（理論分子量：５３．６ｋＤａ）は、５０〜６０ｋＤａの分子量マーカの付近にバンドとして検出された。ｐＨの調整により抽出効率が向上することが確認された。【００７６】
実施例５  ｐＨ調整によるタンパク質の精製（２）
上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）、を含む水溶液（ｐＨ５．４）、
（２）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、硝酸（１ｍＬ）を含む水溶液（ｐＨ３．８）、
（３）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、硝酸（２ｍＬ）を含む水溶液（ｐＨ３．５）、又は
（４）水（１００ｍＬ）、２Ｍの硝酸マグネシウム、硝酸（３ｍＬ）を含む水溶液（ｐＨ２．７）
を使用した。【００７７】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００７８】
分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）を分離した。【００７９】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。【００８０】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液、及びろ過残渣について、上記「ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図４に示す。レーンＮｏ．１〜４はそれぞれ水溶液（１）〜（４）に対応している。ｐＨの調整により抽出効率が向上することが確認された。【００８１】
実施例６  無機塩濃度及び液量の調整によるタンパク質の精製
上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の湿菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、２．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（２）水（１００ｍＬ）、２．５Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
（３）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
（４）水（２００ｍＬ）、２．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（５）水（２００ｍＬ）、２．５Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、又は
（６）水（２００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
を使用した。【００８２】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液と）を分離した。【００８３】
分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液と）を分離した。【００８４】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。【００８５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液、及びろ過残渣について、上記「ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図５に示す。レーンＮｏ．１〜６はそれぞれ水溶液（１）〜（６）に対応している。無機塩の濃度、液量の違いにより抽出効率が向上することが確認された。【００８６】
実施例７  無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製（２）
上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の乾燥菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（２）水（１００ｍＬ）、１．０Ｍの塩化マグネシウム（MgCl2）を含む水溶液、
（３）水（１００ｍＬ）、２．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
（４）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、又は
（５）水（１００ｍＬ）、４．０Ｍの硝酸マグネシウムを含む水溶液、
を使用した。【００８７】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。【００８８】
分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。【００８９】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得し、粉末化した。【００９０】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液について、上記「ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図６に示す。レーンＮｏ．１〜５はそれぞれ水溶液（１）〜（５）に対応している。無機塩の種類、濃度の違いにより抽出効率が向上することが確認された。【００９１】
実施例８  無機塩濃度の調整によるタンパク質の精製（３）
上記のようにして得られた、目的タンパク質ＰＲＴ４１０（改変フィブロイン）を発現している組換え大腸菌の乾燥菌体を１０ｇ計りとり、溶媒を添加した。溶媒として、
（１）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの硝酸マグネシウム（Mg(NO3)2）を含む水溶液、
（２）水（１００ｍＬ）、１．０Ｍの塩化マグネシウム（MgCl2）を含む水溶液、
（３）水（１００ｍＬ）、１．０Ｍの塩化カルシウム（CaCl2）を含む水溶液、
（４）水（１００ｍＬ）、２．０Ｍの塩化カルシウムを含む水溶液、
（５）水（１００ｍＬ）、３．０Ｍの塩化カルシウムを含む水溶液、又は
（６）水（１００ｍＬ）、４．０Ｍの塩化カルシウムを含む水溶液、
を使用した。【００９２】
溶媒の添加後、８０℃で２時間撹拌しながら熱溶解させた。熱溶解終了後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。【００９３】
分離した夾雑物に１／５倍量の３Ｍ  塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）水溶液を添加し、遠心分離機により１１０００×ｇで１０分間遠心することで、夾雑物と、目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（２）（改変フィブロイン抽出液）とを分離した。【００９４】
目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液（１）と（２）とを統合し、１／２倍量の７Ｍ酢酸カリウムを目的タンパク質が溶解した無機塩水溶液に混和後、３０分間静置した。その後、遠心分離機により２５００×ｇで１０分間遠心することで、固形分を目的タンパク質として取得した。【００９５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析）
得られた改変フィブロイン抽出液ついて、上記「ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析」と同様の方法により解析を行った。解析結果は図７に示す。レーンＮｏ．１〜６はそれぞれ水溶液（１）〜（６）に対応している。無機塩の種類、濃度の違いにより抽出効率が向上することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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