(57)【要約】  細胞増殖に係わるペプチドの付着が抑制された細胞培養容器を提供すること。  表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティング、特に、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含むコーティングを備える、細胞培養容器を提供する。2019093442.tif 000024（式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕａ３、Ｕｂ１、Ｕｂ２、Ｕｂ３及びＡｎ−は、本明細書及び特許請求の範囲に記載のとおりである。）
2019093442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを備える、細胞培養容器。
【請求項２】
前記細胞増殖に係わるペプチドが、受容体やシグナルを介した細胞増殖に係わるペプチド又は栄養輸送に係わるペプチドである、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記受容体やシグナルを介した細胞増殖に係わるペプチドが、細胞増殖因子、造血因子、神経栄養因子、インターロイキン及びホルモンからなる群から選ばれる、請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記コーティングが、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
【化１】
2019093442.tif 000022
（式中、
Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す）
を含む、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記共重合体が、さらに下記式（ｃ）：
【化２】
2019093442.tif 000023
［式中、
Ｒｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表す］
で表される基を含む繰り返し単位を含む、請求項４に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記細胞増殖因子が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）からなる群から選ばれる、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記造血因子が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球走化性因子（ＭＣＰ−１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）からなる群から選ばれる、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記インターロイキンが、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８及び白血病阻害因子（ＬＩＦ）からなる群から選ばれる、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記神経栄養因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３及びニューロトロフィン４／５からなる群から選ばれる、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記ホルモンが、インスリン、グルカゴン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、濾胞刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、プロラクチン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記栄養輸送に係わるペプチドが、トランスフェリン又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことで、該容器で培養される細胞の増殖率を増加させる方法。
【請求項１３】
細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことで、細胞培養容器内への細胞増殖に係わるペプチドの添加量を低減する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを備える、細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖又は維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖又は維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化又は維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化又は維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等の様々な分野で利用されている。【０００３】
細胞の培養には、通常、シャーレ、ディッシュ、フラスコ、バッグ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ボトル等の細胞培養容器が用いられ、細胞種、培養方法、培養スケール等の諸条件に応じて適宜選択されている。細胞培養容器の材質は、専ら、ガラス又は樹脂であるが、例えば、細胞培養容器が樹脂製であり、且つその表面が疎水性である場合には、細胞や、細胞増殖因子等の細胞培養に必須な成分の容器表面への付着が生じ、それにより細胞の増殖性や機能発現が損なわれるという問題があった。【０００４】
このような問題を解決するために、従来、プラズマ処理又はコロナ放電処理により、あるいは親水性化合物のコーティング処理により、その表面を親水性に改質した細胞培養容器が提案されている。しかしながら親水性化合物のコーティング処理では、容器に付されたコーティングから親水性化合物が培養液へ溶出し、細胞や細胞培養に必須な成分の付着抑制能の低下を招くのみならず、培養液を汚染し、細胞や細胞培養に必須な成分へ悪影響を及ぼす恐れや、再生医療／細胞医療における最終製品に不純物として残留するという問題がある。また、細胞培養容器の表面の改質ではなく、ポリビニルアルコールやポリエチレングリコール等の水溶性の合成ポリマーを添加した細胞培養液が提案されている（例えば、特許文献１参照）。細胞培養液に添加された水溶性の合成ポリマーは、細胞培養容器の表面に物理的に吸着され、容器表面への細胞の接着や、細胞増殖因子等の細胞培養に必須な成分の吸着が抑制されると報告されている。しかしながら、培養液への合成ポリマーの添加は、同様に、培養液を汚染し、細胞や細胞培養に必須な成分へ悪影響を及ぼす恐れや、再生医療／細胞医療における最終製品に不純物として残留する等の問題がある。【０００５】
本発明者らは、様々な生体物質の付着抑制能を有するコーティング材料として期待されているリン酸エステル基を有するポリマーに注目し、検討を重ねた。その結果、特定のアニオン性基とカチオン性基を含む共重合体を含むコーティング剤が、基体の種類を選ばず強固に固着することができ、また固着後は水系溶媒への耐性に優れたコーティング膜となり、且つ優れた生体物質（例えば、血小板やフィブリノゲン等）の付着抑制能を示すことを報告した（例えば、特許文献２、３参照）。また、同コーティング剤でコーティングされていることを特徴とする細胞培養容器が、細胞の付着抑制能に優れると共に、溶媒や放射線への耐性にも優れることを報告した（例えば、特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−１２４９８２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１９６６５０号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０９３２９３号
【特許文献４】国際公開第２０１４／１９６６５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞培養容器に付されるコーティングには、細胞の付着抑制能や、水系溶媒や放射線への耐性だけでなく、細胞増殖因子等の細胞増殖に係わるペプチドの付着抑制能を有することが、細胞の増殖性や機能発現の点から望ましい。しかしながら、これらを併せ持つコーティングを備える細胞培養容器は報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定のアニオン構造と、特定のカチオン構造と、場合により特定の疎水性構造とを含む共重合体を含むコーティングを、容器の表面の少なくとも一部に備える細胞培養容器が、優れた細胞の付着抑制能や、水系溶媒や放射線への耐性だけでなく、優れた細胞増殖因子等の細胞増殖に係わるペプチドの付着抑制能を有することを見出し、本発明を完成させた。
本発明は以下のとおりである。【０００９】
［１］  表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを備える、細胞培養容器。【００１０】
［２］  前記細胞増殖に係わるペプチドが、受容体やシグナルを介した細胞増殖に係わるペプチド又は栄養輸送に係わるペプチドである、上記［１］に記載の細胞培養容器。【００１１】
［３］  前記受容体やシグナルを介した細胞増殖に係わるペプチドが、細胞増殖因子、造血因子、神経栄養因子、インターロイキン及びホルモンからなる群から選ばれる、上記［２］に記載の細胞培養容器。【００１２】
［４］  前記コーティングが、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
【化１】
2019093442.tif 000003
（式中、
Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す）
を含む、上記［１］に記載の細胞培養容器。【００１３】
［５］  前記共重合体が、さらに下記式（ｃ）：
【化２】
2019093442.tif 000004
［式中、
Ｒｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表す］
で表される基を含む繰り返し単位を含む、上記［４］に記載の細胞培養容器。【００１４】
［６］  前記細胞増殖因子が、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）からなる群から選ばれる、上記［３］に記載の細胞培養容器。【００１５】
［７］  前記造血因子が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球走化性因子（ＭＣＰ−１）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）からなる群から選ばれる、上記［３］に記載の細胞培養容器。【００１６】
［８］  前記インターロイキンが、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８及び白血病阻害因子（ＬＩＦ）からなる群から選ばれる、上記［３］に記載の細胞培養容器。【００１７】
［９］  前記神経栄養因子が、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３及びニューロトロフィン４／５からなる群から選ばれる、上記［３］に記載の細胞培養容器。【００１８】
［１０］  前記ホルモンが、インスリン、グルカゴン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、濾胞刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、プロラクチン及びフィブロネクチンからなる群から選ばれる、上記［３］に記載の細胞培養容器。【００１９】
［１１］  前記栄養輸送に係わるペプチドが、トランスフェリン又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、上記［２］に記載の細胞培養容器。【００２０】
［１２］  細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことで、該容器で培養される細胞の増殖率を増加させる方法。【００２１】
［１３］  細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことで、細胞培養容器内への細胞増殖に係わるペプチドの添加量を低減する方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の細胞培養容器は、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティング、特には、式（ａ）で表されるアニオン性基と、式（ｂ）で表されるカチオン性基と、場合により式（ｃ）で表される疎水性基とを含む共重合体を含むコーティングを、容器の表面の少なくとも一部に備えることにより、細胞のみならず、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制することができる。また、コーティング中の該カチオン性基及びアニオン性基がイオン結合（イオンコンプレックス）を形成することで、ガラス、繊維、無機粒子又は樹脂（合成樹脂及び天然樹脂）等、容器の基材の種類を選ばず固着することができ、さらに固着後は水系溶媒（水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、アルコール等）への耐性に優れたコーティングとなる。すなわち、本発明により、細胞に加え、細胞増殖に係わるペプチドの容器表面への付着を抑制すると共に、培養液をはじめとする溶媒への耐性にも優れた細胞培養容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例１に従いｂＦＧＦの存在下又は非存在下（０、０．０１、０．１、１、１０及び１００ng/mL）でＳＫＮ細胞の培養を行い、その増殖率を測定した結果を示したグラフである。
【図２】図１の結果を基に算出した、実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートにおける細胞増殖率に対するｂＦＧＦ濃度のＥＤ５０値を示したグラフである。
【図３】実施例２でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例２に従いｂＦＧＦの存在下又は非存在下（０、０．０１、０．１、１、１０及び１００ng/mL）でＳＫＮ細胞の培養を行い、その増殖率を測定した結果を示したグラフである。
【図４】図３の結果を基に算出した、実施例２でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートにおける細胞増殖率に対するｂＦＧＦ濃度のＥＤ５０値を示したグラフである。
【図５】実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例３に従いＩＬ３の存在下又は非存在下（０、０．００１、０．０１、０．１、１及び１０ng/mL）でＴＦ１細胞の培養を行い、その増殖率を測定した結果を示したグラフである。
【図６】図５の結果を基に算出した、実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートにおける細胞増殖率に対するＩＬ３濃度のＥＤ５０値を示したグラフである。
【図７】実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例４に従い、プレートに吸着せず培地中に残存するｂＦＧＦ量を測定した結果を示したグラフである。
【図８】実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例５に従い、プレートに吸着せず培地中に残存するＩＬ３量を測定した結果を示したグラフである。
【図９】実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例６に従い、プレートに吸着せず培地中に残存するインスリン量を測定した結果を示したグラフである。
【図１０】実施例１でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例６に従い、プレートに吸着せず培地中に残存するトランスフェリン量を測定した結果を示したグラフである。
【図１１】実施例３でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例７に従いＴＰＯの存在下又は非存在下（０、０．０１、０．１、１、１０及び１００ng/mL）でＢＭ−ＣＤ３４＋細胞の培養を行い、その増殖率を測定した結果を示したグラフである。
【図１２】図１１の結果を基に算出した、実施例３でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートにおける細胞増殖率に対するＴＰＯ濃度のＥＤ５０値を示したグラフである。
【図１３】実施例３でコーティングされたマイクロプレート及び非コーティングマイクロプレートを用い、試験例８に従い、プレートに吸着せず培地中に残存するＩＬ６量を測定した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
≪用語の説明≫
本発明において用いられる用語は、他に特に断りのない限り、以下の定義を有する。
【００２５】
本発明において、「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
【００２６】
本発明において、「アルキル基」は、直鎖若しくは分岐の、飽和脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、t−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基又は１−エチルプロピル基が挙げられる。「炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基の例に加え、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基又はオクタデシル基、あるいはそれらの異性体が挙げられる。同様に「炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキル基」としては、「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」の例に加え、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、あるいはそれらの異性体が挙げられる。
【００２７】
本発明において、「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」は、上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を意味するか、あるいは１以上の上記ハロゲン原子で置換された上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を意味する。「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」の例は、上記のとおりである。一方「１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」は、上記炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基の１以上の任意の水素原子が、ハロゲン原子で置き換えられているものを意味し、例としては、フルオロメチル基、ジフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロメチル基、ジクロロメチル基、トリクロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ペルフルオロエチル基、ペルフルオロブチル基、又はペルフルオロペンチル基等が挙げられる。
【００２８】
本発明において、「エステル結合」は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−を意味し、「アミド結合」は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−若しくは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を意味し、「エーテル結合」は、−Ｏ−を意味する。
【００２９】
本発明において、「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基」は、炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基、あるいは１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基を意味する。ここで、「アルキレン基」は、上記アルキル基に対応する２価の有機基を意味する。「炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基」の例としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１−メチルプロピレン基、２−メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１−メチル−テトラメチレン基、２−メチル−テトラメチレン基、１，１−ジメチル−トリメチレン基、１，２−ジメチル−トリメチレン基、２，２−ジメチル−トリメチレン基、１−エチル−トリメチレン基、ヘキサメチレン基、オクタメチレン基及びデカメチレン基等が挙げられ、これらの中で、エチレン基、プロピレン基、オクタメチレン基及びデカメチレン基が好ましく、例えば、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基等の炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基がより好ましく、特にエチレン基又はプロピレン基が好ましい。「１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基」は、上記アルキレン基の１以上の任意の水素原子が、ハロゲン原子で置き換えられているものを意味し、特に、エチレン基又はプロピレン基の水素原子の一部又は全部がハロゲン原子で置き換えられているものが好ましい。
【００３０】
本発明において、「炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基」は、炭素原子数３乃至１０の、単環式若しくは多環式の、飽和若しくは部分不飽和の、脂肪族炭化水素の１価の基を意味する。この中でも、炭素原子数３乃至１０の、単環式若しくは二環式の、飽和脂肪族炭化水素の１価の基が好ましく、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基又はシクロヘキシル基等の炭素原子数３乃至１０のシクロアルキル基、あるいはビシクロ［３．２．１］オクチル基、ボルニル基、イソボルニル基等の炭素原子数４乃至１０のビシクロアルキル基が挙げられる。
【００３１】
本発明において、「炭素原子数６乃至１０のアリール基」は、炭素原子数６乃至１０の、単環式若しくは多環式の、芳香族炭化水素の１価の基を意味し、例えば、フェニル基、ナフチル基又はアントリル基等が挙げられる。「炭素原子数６乃至１０のアリール基」は、１以上の上記「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」で置換されていてもよい。
【００３２】
本発明において、「炭素原子数７乃至１５のアラルキル基」は、基−Ｒ−Ｒ’（ここで、Ｒは、上記「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基」を表し、Ｒ’は、上記「炭素原子数６乃至１０のアリール基」を表す）を意味し、例えば、ベンジル基、フェネチル基、又はα−メチルベンジル基等が挙げられる。「炭素原子数７乃至１５のアラルキル基」のアリール部分は、１以上の上記「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」で置換されていてもよい。
【００３３】
本発明において、「炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基」は、基−Ｒ−Ｏ−Ｒ’（ここで、Ｒは、上記「炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基」を表し、Ｒ’は、上記「炭素原子数６乃至１０のアリール基」を表す）を意味し、例えば、フェノキシメチル基、フェノキシエチル基、又はフェノキシプロピル基等が挙げられる。「炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基」のアリール部分は、１以上の上記「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基」で置換されていてもよい。
【００３４】
本発明において、「ハロゲン化物イオン」とは、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン又はヨウ化物イオンを意味する。
本発明において、「無機酸イオン」とは、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン又はホウ酸イオンを意味する。
上記Ａｎ−として好ましいのは、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンであり、特に好ましいのはハロゲン化物イオンである。
【００３５】
本発明において、（メタ）アクリレート化合物とは、アクリレート化合物とメタクリレート化合物の両方を意味する。例えば（メタ）アクリル酸は、アクリル酸とメタクリル酸を意味する。
また、本発明において、「アニオン」又は「アニオン性基」とは、陰イオン又は陰イオン性基を意味し、水中で解離して陰イオン又は陰イオン性基になり得るものも含む。同様に、本発明において、「カチオン」又は「カチオン性基」とは、陽イオン又は陽イオン性基を意味し、水中で解離して陽イオン又は陽イオン性基になり得るものも含む。
【００３６】
≪本発明の説明≫
本発明の細胞培養容器は、細胞増殖に係わるペプチドの付着抑制能を有するポリマーを含むコーティングを、容器の表面の少なくとも一部に備えるものであれば特に制限されない。
【００３７】
＜細胞＞
本発明における細胞は、後述する細胞増殖に係わるペプチドに依存的に増殖を行う細胞であれば、特に制限されない。細胞とは、動物又は植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変がなされた細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血又は骨髄由来のＣＤ３４陽性前駆細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、がん幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＢＳＹ−２、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ  ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト子宮平滑筋肉腫細胞株としてＳＫＮ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ−２、ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、���ＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＫＭ−１２、ＳＷ−６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＦ−２６８、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、ＳＮＢ−１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫ−ＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ−１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ−３１、ＳＮ−１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＲＸＦ−３９３Ｌ、７８６−０、ＴＫ−１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ−４、ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７、ＭＫＮ−７４、皮膚がん細胞株としてＬＯＸ−ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ−ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０ＴＢ、ＲＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＦ１等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。肝細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）、ＪＨＨ７、ＨＬＦ、ＨＬＥ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＷＲＬ６８、ＨＢ６１１、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨｕＨ−４、ＨｕＨ−７等が挙げられる。
【００３８】
植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
【００３９】
＜細胞増殖に係わるペプチド＞
本発明における細胞増殖に係わるペプチドは、特定の細胞の数、重量及び／又は体積などを増加させる作用を有するペプチドであれば、特に制限されない。ペプチドとは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合したものを意味し、アミノ酸数が１０以下のオリゴペプチドや、アミノ酸数が１１以上のポリペプチドを含む。本発明における細胞増殖に係わるペプチドとしては、好ましくはアミノ酸数が２００以下、より好ましくはアミノ酸数が１１以上１５０以下のポリペプチドが挙げられる。なおペプチドは、非アミノ酸部分を含んでいてもよく、鎖状又は環状であってもよい。本発明における細胞増殖に係わるペプチドは、好ましくは、受容体やシグナルを介した細胞増殖に係わるペプチド又は栄養輸送に係わるペプチドである。
【００４０】
受容体やシグナルを介した細胞増殖に係わるペプチドは、好ましくは、細胞増殖因子（成長因子ともいう）、造血因子、神経栄養因子、サイトカイン及びホルモンからなる群から選ばれる。細胞増殖因子の例としては、以下に限定されるものではないが、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）等が挙げられ、好適な例としては、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の各種幹細胞の培養に使用されるｂＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−βが挙げられる。造血因子の例としては、以下に限定されるものではないが、顆粒コロニー球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、単球走化性因子（ＭＣＰ−１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、幹細胞成長因子−α（ＳＣＧＦ−α）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）等が挙げられる。神経栄養因子の例としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３及びニューロトロフィン４／５等が挙げられる。サイトカインの例としては、インターロイキン、コロニー刺激因子等が挙げられ、好適な例としては、インターロイキンが挙げられる。特にインターロイキンの例としては、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１５、インターロイキン−１６、インターロイキン−１７、インターロイキン−１８、白血病阻害因子（ＬＩＦ）等が挙げられ、特に好適な例としては、インターロイキン−３、インターロイキン−６が挙げられる。さらにホルモンの例としては、以下に限定されるものではないが、インスリン、グルカゴン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、濾胞刺激ホルモン、黄体刺激ホルモン、プロラクチン、フィブロネクチン等が挙げられる。
【００４１】
栄養輸送に係わるペプチドの例としては、以下に限定されるものではないが、トランスフェリン又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。
【００４２】
本発明において、「細胞増殖に係わるペプチドの付着が抑制された」（又は「細胞増殖に係わるペプチドの付着抑制能を有する」）とは、後述する実施例（例えば、試験例６）に記載された方法にて行う付着試験にて、コーティング膜を形成した細胞培養容器の培養液の比色定量の結果とコーティング膜を形成していない細胞培養容器の培養液の比色定量の結果とを比較した場合の相対付着量（％）（（コーティング容器の培養液の比色定量の結果）／（非コーティング容器の培養液の比色定量の結果）×１００）が５０％以下、好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下であることを意味する。
【００４３】
＜コーティング＞
本明細書において、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングは、エチレン性不飽和モノマーの重合体、又は多糖類若しくはその誘導体などのポリマーを含む。エチレン性不飽和モノマーの重合体の例としては、（メタ）アクリル酸及びそのエステル；酢酸ビニル；ビニルピロリドン；エチレン；ビニルアルコール；並びにそれらの親水性の官能性誘導体からなる群より選択される１種又は２種以上のエチレン性不飽和モノマーの重合体を挙げることができる。多糖類又はその誘導体の例としては、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロース）等のセルロース系高分子、デンプン、デキストラン、カードランを挙げることができる。
【００４４】
親水性の官能性誘導体の親水性官能性基の例としては、リン酸、ホスホン酸及びそれらのエステル構造；ベタイン構造；アミド構造；アルキレングリコール残基；アミノ基；並びにスルフィニル基等が挙げられる。
【００４５】
ここで、リン酸及びそのエステル構造は、下記式：
【化３】
2019093442.tif 000005
［ここで、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］
で表される基を意味し、ホスホン酸及びそのエステル構造は、下記式：
【化４】
2019093442.tif 000006
［ここで、Ｒ１４及びＲ１５は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、アシッドホスホオキシエチル（メタ）アクリレート、ビニルホスホン酸等を挙げることができる。
【００４６】
ベタイン構造は、第４級アンモニウム型の陽イオン構造と、酸性の陰イオン構造との両性中心を持つ化合物の一価又は二価の基を意味し、例えば、ホスホリルコリン基：
【化５】
2019093442.tif 000007
を挙げることができる。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）等を挙げることができる。
【００４７】
アミド構造は、下記式：
【化６】
2019093442.tif 000008
［ここで、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８は、互いに独立して、水素原子又は有機基（例えば、メチル基、ヒドロキシメチル基又はヒドロキシエチル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２０１０−１６９６０４号公報等に開示されている。
【００４８】
アルキレングリコール残基は、アルキレングリコール（ＨＯ−Ａｌｋ−ＯＨ；ここでＡｌｋは、炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基である）の片側端末又は両端末の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残るアルキレンオキシ基（−Ａｌｋ−Ｏ−）を意味し、アルキレンオキシ単位が繰り返されるポリ（アルキレンオキシ）基も包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等を挙げることができる。さらに、そのような構造を有するモノマー又はポリマーは、例えば、特開２００８−５３３４８９号公報等に開示されている。
【００４９】
アミノ基は、式：−ＮＨ２、−ＮＨＲ１９又は−ＮＲ２０Ｒ２１［ここで、Ｒ１９、Ｒ２０及びＲ２１は、互いに独立して、有機基（例えば、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基等）である］で表される基を意味する。本明細書におけるアミノ基には、４級化又は塩化されたアミノ基を包含する。そのような構造を有するエチレン性不飽和モノマーの例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド等を挙げることができる。
【００５０】
スルフィニル基は、下記式：
【化７】
2019093442.tif 000009
［ここで、Ｒ２２は、有機基（例えば、炭素原子数１乃至１０の有機基、好ましくは、１個以上のヒドロキシ基を有する炭素原子数１乃至１０のアルキル基等）である］
で表される基を意味する。そのような構造を有するポリマーとして、特開２０１４−４８２７８号公報等に開示された共重合体を挙げることができる。
【００５１】
その中でも、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングに含まれるポリマーとしては、下記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
【００５２】
【化８】
2019093442.tif 000010
【００５３】
［式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す］が好ましい。
【００５４】
また共重合体は、さらに下記式（ｃ）：
【化９】
2019093442.tif 000011
［式中、Ｒｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表す］
で表される基を含む繰り返し単位を含んでもよい。
【００５５】
本発明の細胞培養容器に係わる共重合体は、上記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位と、上記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位と、場合により上記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位を含む共重合体であれば特に制限は無い。なお、本発明において、上記式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位は、上記式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位及び上記式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位とは異なる。該共重合体は、上記式（ａ）で表される基を含むモノマーと、上記式（ｂ）で表される基を含むモノマーと、場合により上記式（ｃ）で表される基を含むモノマーとをラジカル重合して得られたものが望ましいが、重縮合、重付加反応させたものも使用できる。共重合体の例としては、オレフィンが反応したビニル重合ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン等が挙げられるが、これらの中でも特にオレフィンが反応したビニル重合ポリマー又は（メタ）アクリレート化合物を重合させた（メタ）アクリルポリマーが望ましい。
【００５６】
共重合体中における式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位の割合は、３モル％乃至８０モル％である。なお、共重合体は、２種以上の式（ａ）で表される基を含む繰り返し単位を含んでいてもよい。
【００５７】
共重合体中における式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位の割合は、３モル％乃至８０モル％である。なお、共重合体は、２種以上の式（ｂ）で表される基を含む繰り返し単位を含んでいてもよい。
【００５８】
共重合体中における式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位の割合は、全共重合体に対して上記式（ａ）及び（ｂ）を差し引いた残部であってもよいが、例えば０モル％乃至９０モル％である。なお、共重合体は、２種以上の式（ｃ）で表される基を含む繰り返し単位を含んでいてもよい。
【００５９】
本発明の細胞培養容器に係わる共重合体の好ましい一実施態様は、下記式（ａ１）及び（ｂ１）の繰り返し単位を含む共重合体である。
【００６０】
【化１０】
2019093442.tif 000012
【００６１】
式中、Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｑａ及びＱｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、ｍは、０乃至６の整数を表す。
【００６２】
共重合体は、さらに下記式（ｃ１）の繰り返し単位を含んでもよい。
【００６３】
【化１１】
2019093442.tif 000013
【００６４】
式中、Ｔｃは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｑｃは、単結合、エーテル結合又はエステル結合を表し、Ｒｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表す。
【００６５】
式（ａ１）において、ｍは０乃至６の整数を表すが、好ましくは１乃至６の整数を表し、より好ましくは１乃至５の整数を表し、特に好ましくは１である。
【００６６】
共重合体中に含まれる式（ａ１）で表される繰り返し単位の割合は、３モル％乃至８０モル％である。なお、共重合体は、２種以上の式（ａ１）で表される繰り返し単位を含んでいてもよい。
【００６７】
共重合体に含まれる式（ｂ１）で表される繰り返し単位の割合は、３モル％乃至８０モル％である。なお、共重合体は、２種以上の式（ｂ１）で表される繰り返し単位を含んでいてもよい。
【００６８】
共重合体に含まれる式（ｃ１）で表される繰り返し単位の割合は、全共重合体に対して上記式（ａ１）及び式（ｂ１）を差し引いた残部であってもよいが、例えば０モル％乃至９０モル％である。なお、共重合体は、２種以上の式（ｃ１）で表される繰り返し単位を含んでいてもよい。
【００６９】
本発明の細胞培養容器に係わる共重合体の好ましい別の実施態様は、下記式（Ａ）及び（Ｂ）：
【００７０】
【化１２】
2019093442.tif 000014
【００７１】
［式中、
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｑａ及びＱｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し；
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し；
Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し；
ｍは、０乃至６の整数を表す］
で表される化合物を含むモノマー混合物を、溶媒中にて反応（重合）させることにより得られる共重合体である。
【００７２】
共重合体は、さらに下記式（Ｃ）： 
【００７３】
【化１３】
2019093442.tif 000015
【００７４】
［式中、
Ｔｃは、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し；
Ｑｃは、単結合、エーテル結合又はエステル結合を表し；
Ｒｃは、炭素原子数１乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基、炭素原子数３乃至１０の脂環式炭化水素基、炭素原子数６乃至１０のアリール基、炭素原子数７乃至１５のアラルキル基又は炭素原子数７乃至１５のアリールオキシアルキル基（ここで、前記アリール部分は、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基で置換されていてもよい）を表す］
で表わされる化合物を含むモノマー混合物より得られる共重合体であってよい。
【００７５】
Ｔａ、Ｔｂ及びＴｃとしては、水素原子、メチル基又はエチル基が好ましく、水素原子又はメチル基がより好ましい。Ｑａ、Ｑｂ及びＱｃとしては、単結合又はエステル結合が好ましく、エステル結合がより好ましい。Ｒａ及びＲｂとしては、炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキレン基が好ましく、メチレン基、エチレン基又はプロピレン基がより好ましい。Ｒｃとしては、炭素原子数４乃至１８の直鎖若しくは分岐アルキル基又は炭素原子数３乃至１０のシクロアルキル基が好ましく、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基若しくはそれらの異性体、又はシクロヘキシル基がより好ましい。Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３としては、水素原子、メチル基、エチル基又はｔ−ブチル基が好ましく、式（ａ）のＵａ１及びＵａ２としては、水素原子がより好ましく、式（ｂ）のＵｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３としては、水素原子、メチル基、エチル基又はｔ−ブチル基がより好ましい。
【００７６】
上記式（Ａ）の具体例としては、ビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチル（メタ）アクリレート、３−クロロ−２−アシッドホスホオキシプロピル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシプロピル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシメチル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキポリオキシエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシポリオキシプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられるが、この中でもビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（＝リン酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル）又はアシッドホスホオキシポリオキシエチレングリコールモノメタクリレートが好ましく用いられ、最も好ましいのはアシッドホスホオキシエチルメタクリレート（＝リン酸２−（メタクリロイルオキシ）エチル）である。
【００７７】
ビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（＝リン酸２−（メタクリロイルオキシ)エチル）、アシッドホスホオキシポリオキシエチレングリコールモノメタクリレート及びアシッドホスホオキシポリオキシプロピレングリコールモノメタクリレートの構造式は、それぞれ下記式（Ａ−１）乃至式（Ａ−４）で表される。
【００７８】
【化１４】
2019093442.tif 000016
【００７９】
これらの化合物は、合成時において、後述する一般式（Ｄ）又は（Ｅ）で表されるような、２つの官能基を有する（メタ）アクリレート化合物を含む場合がある。
【００８０】
上記式（Ｂ）の具体例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド等が挙げられるが、この中でもジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、メタクリロイルコリンクロリド又は２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレートが好ましく用いられ、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレートが最も好ましく用いられる。
【００８１】
ジメチルアミノエチルアクリレート（＝アクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル）、ジエチルアミノエチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ジエチルアミノ）エチル）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル）、メタクリロイルコリンクロリド及び２−（ｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル）の構造式は、それぞれ下記式（Ｂ−１）乃至式（Ｂ−５）で表される。
【００８２】
【化１５】
2019093442.tif 000017
【００８３】
上記式（Ｃ）の具体例としては、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸の直鎖若しくは分岐アルキルエステル類；シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸の環状アルキルエステル類；ベンジル（メタ）アクリレート、フェネチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸のアラルキルエステル類；スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系モノマー；メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系モノマー；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系モノマーが挙げられる。この中でもブチル（メタ）アクリレート又はシクロヘキシル（メタ）アクリレートが好ましく用いられる。
【００８４】
ブチルメタクリレート（＝メタクリル酸ブチル）及びシクロヘキシルメタクリレート（＝メタクリル酸シクロヘキシル）の構造式は、それぞれ下記式（Ｃ−１）及び式（Ｃ−２）で表される。
【００８５】
【化１６】
2019093442.tif 000018
【００８６】
本発明に係わる共重合体の別の実施態様では、上記式（Ａ）、（Ｂ）及び場合により（Ｃ）で表される化合物に加えて、さらに任意の第４成分が共重合していてもよい。例えば、第４成分として２以上の官能基を有する（メタ）アクリレート化合物が共重合しており、ポリマーの一部が部分的に３次元架橋していてもよい。そのような第４成分として、例えば、下記式（Ｄ）又は（Ｅ）：
【００８７】
【化１７】
2019093442.tif 000019
【００８８】
［式中、Ｔｄ、Ｔｅ及びＵｅは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒｄ及びＲｅは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖若しくは分岐アルキレン基を表し；ｎは、１乃至６の整数を表す］で表される２官能性モノマーが挙げられる。すなわち本発明に係わる共重合体は、好ましくは、このような２官能性モノマーから誘導される架橋構造を含むものである。
【００８９】
式（Ｄ）及び（Ｅ）において、Ｔｄ及びＴｅは、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基である。
【００９０】
式（Ｅ）において、Ｕｅは、好ましくは、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、水素原子である。
【００９１】
式（Ｄ）において、Ｒｄは、好ましくは、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至３の直鎖若しくは分岐アルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、エチレン基若しくはプロピレン基であるか、あるいは１つの塩素原子で置換されたエチレン基若しくはプロピレン基であり、特に好ましくは、エチレン基若しくはプロピレン基である。また式（Ｄ）において、ｎは、好ましくは、１乃至５の整数を表し、特に好ましくは１である。
【００９２】
式（Ｅ）において、Ｒｅは、好ましくは、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至３の直鎖若しくは分岐アルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、エチレン基若しくはプロピレン基であるか、あるいは１つの塩素原子で置換されたエチレン基若しくはプロピレン基であり、特に好ましくは、エチレン基若しくはプロピレン基である。また式（Ｅ）において、ｎは、好ましくは、１乃至５の整数を表し、特に好ましくは１である。
【００９３】
式（Ｄ）で表される２官能性モノマーは、好ましくは、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレートが挙げられる。
式（Ｅ）で表される２官能性モノマーは、好ましくは、リン酸ビス（メタクリロイルオキシメチル）、リン酸ビス［（２−メタクリロイルオキシ）エチル］、リン酸ビス［３−（メタクリロイルオキシ）プロピル］、あるいは上記式（Ａ−３）又は（Ａ−４）由来の２官能性モノマーが挙げられる。
式（Ｄ）と式（Ｅ）の中では、式（Ｅ）で表される２官能性モノマーがより好ましく用いられる。
【００９４】
また、３官能（メタ）アクリレート化合物としては、トリアクリル酸ホスフィニリジントリス（オキシ−２，１−エタンジイル）が挙げられる。
【００９５】
これら第４成分の中でも、特に、エチレングリコールジメタクリレート、上記式（Ａ−３）及び（Ａ−４）由来の２官能性モノマーのうち、エチレングリコール及びプロピレングリコールの繰り返し単位を有するジメタクリレート、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］、並びに上記式（Ａ−３）及び（Ａ−４）由来の２官能性モノマーのうち、リン酸エステル基を介してエチレングリコール及びプロピレングリコールの繰り返し単位を有するジメタクリレートが好ましく、その構造式は、それぞれ、下記式（Ｄ−１）乃至（Ｄ−３）及び式（Ｅ−１）乃至（Ｅ−３）で表される。
【００９６】
【化１８】
2019093442.tif 000020
【００９７】
これらの中でも、式（Ｅ−１）乃至（Ｅ−３）が特に好ましい。
【００９８】
共重合体には、これらの第４成分の１種又は２種以上が含まれていてもよい。
上記共重合体中における第４成分、例えば、上記式（Ｄ）又は（Ｅ）で表される２官能性モノマーから誘導される架橋構造の割合は、０モル％乃至５０モル％であり、好ましくは５モル％乃至４５モル％であり、最も好ましくは１０モル％乃至４０モル％である。
【００９９】
式（Ａ）で表される化合物の、上記共重合体を形成するモノマー全体に対する割合は、３モル％乃至８０モル％である。また、式（Ａ）で表される化合物は、２種以上であってもよい。
式（Ｂ）で表される化合物の、上記共重合体を形成するモノマー全体に対する割合は、３モル％乃至８０モル％である。また、式（Ｂ）で表される化合物は、２種以上であってもよい。
【０１００】
式（Ｃ）で表される化合物の、上記共重合体を形成するモノマー全体に対する割合は、上記式（Ａ）及び（Ｂ）の割合を差し引いた残部であってもよいが、例えば０モル％乃至９０モル％である。また、式（Ｃ）で表される化合物は、２種以上であってもよい。
【０１０１】
本発明の実施態様に係わる共重合体は、一般的なアクリルポリマー又はメタクリルポリマー等の合成方法であるラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合等の方法により合成することができる。その形態は溶液重合、懸濁重合、乳化重合、塊状重合等、種々の方法が可能である。
【０１０２】
重合反応における溶媒としては、水、リン酸緩衝液又はエタノール等のアルコール又はこれらを組み合わせた混合溶媒でもよいが、水又はエタノールを含むことが望ましい。さらには水又はエタノールを１０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを５０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを８０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを９０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。好ましくは水とエタノールの合計が１００質量％である。
【０１０３】
反応濃度としては、例えば上記式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物の反応溶媒中の濃度を、０．０１質量％乃至４質量％とすることが好ましい。濃度が４質量％超であると、例えば式（Ａ）で表されるリン酸基の有する強い会合性により共重合体が反応溶媒中でゲル化してしまう場合がある。濃度０．０１質量％未満では、得られたワニスの濃度が低すぎるため、十分な膜厚のコーティング膜を得るためのコーティング剤の作成が困難である。濃度が、０．０１質量％乃至３質量％、例えば３質量％、２質量％又は１質量％であることがより好ましい。
【０１０４】
また本発明に係わる共重合体の合成においては、例えば下記式（１）に記載の塩とした後、場合により式（Ｃ）で表される化合物と共に重合して共重合体を作製してもよい。
【０１０５】
【化１９】
2019093442.tif 000021
【０１０６】
リン酸基含有モノマーは会合し易いモノマーのため、反応系中に滴下されたとき、速やかに分散できるように反応溶媒中に少量ずつ滴下してもよい。
【０１０７】
さらに、反応溶媒はモノマー及びポリマーの溶解性を上げるために加温（例えば４０℃乃至１００℃）してもよい。
【０１０８】
重合反応を効率的に進めるためには、重合開始剤を使用することが望ましい。重合開始剤の例としては、２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（和光純薬工業（株）製；ＶＡ−０６５、１０時間半減期温度；５１℃）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）、１−［（１−シアノ−１−メチルエチル）アゾ］ホルムアミド、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（和光純薬工業（株）製；ＶＡ−０８６、１０時間半減期温度；８６℃）、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ−水和物（和光純薬工業（株）製；ＶＡ−０５７、１０時間半減期温度；５７℃）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタノイックアシド）（和光純薬工業（株）製；Ｖ−５０１）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（和光純薬工業（株）製；ＶＡ−０４４、１０時間半減期温度；４４℃）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジスルファートジヒドレート（和光純薬工業（株）製；ＶＡ−０４６Ｂ、１０時間半減期温度；４６℃）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］（和光純薬工業（株）製；ＶＡ−０６１、１０時間半減期温度；６１℃）、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（和光純薬工業（株）製；Ｖ−５０、１０時間半減期温度；５６℃）、ペルオキソ二硫酸又はｔ−ブチルヒドロペルオキシド等が用いられる。
水への溶解性、イオンバランス及びモノマーとの相互作用を考慮した場合、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ−水和物、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタノイックアシッド）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジスルファートジヒドレート、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド及びペルオキソ二硫酸から選ばれることが好ましい。
有機溶媒への溶解性、イオンバランス及びモノマーとの相互作用を考慮した場合、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）又は２，２’−アゾビス（イソブチロニトリル）を用いることが望ましい。
【０１０９】
重合開始剤の添加量としては、重合に用いられるモノマーの合計重量に対し、０．０５質量％乃至１０質量％である。
【０１１０】
反応条件は反応容器をオイルバス等で５０℃乃至２００℃に加熱し、1時間乃至４８時間、より好ましくは８０℃乃至１５０℃、５時間乃至３０時間攪拌を行うことで、重合反応が進み本発明の共重合体が得られる。反応雰囲気は窒素雰囲気が好ましい。
【０１１１】
反応手順としては、全反応物質を室温の反応溶媒に全て入れてから、上記温度に加熱して重合させてもよいし、あらかじめ加温した溶媒中に、反応物質の混合物全部又は一部を少々ずつ滴下してもよい。
【０１１２】
後者の反応手順によれば、本発明の共重合体は、上記式（Ａ）、（Ｂ）及び場合により（Ｃ）で表される化合物、溶媒及び重合開始剤を含む混合物を、重合開始剤の１０時間半減期温度より高い温度に保持した溶媒に滴下し、反応（重合）させる工程を含む製造方法により調製することができる。
【０１１３】
本発明に係わる共重合体の分子量は数千から数百万程度であれば良く、好ましくは５，０００乃至５，０００，０００である。さらに好ましくは、１０，０００乃至２，０００，０００、最も好ましくは５，０００乃至１，０００，０００である。また、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体のいずれでも良く、該共重合体を製造するための共重合反応それ自体には特別の制限はなく、ラジカル重合やイオン重合や光重合、乳化重合を利用した重合等の公知の溶液中で合成される方法を使用できる。これらは目的の用途によって、本発明の共重合体のうちいずれかを単独使用することもできるし、複数の共重合体を混合し、且つその比率は変えて使用することもできる。
【０１１４】
本発明に係わる細胞培養容器にコーティングを形成するために用いられるコーティング剤は、所望の共重合体を、場合により所望の溶媒にて所定の濃度に希釈することにより調製してもよい。
【０１１５】
そのような溶媒としては、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アルコールが挙げられる。アルコールとしては、炭素数２乃至６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール（＝ｔ−アミルアルコール）、３−メチル−１−ブタノール、３−メチル−３−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、２，３−ジメチル−２−ブタノール、３，３−ジメチル−１−ブタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ペンタノール、２−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−３−ペンタノール、３−メチル−１−ペンタノール、３−メチル−２−ペンタノール、３−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、４−メチル−３−ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独で又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよいが、共重合体の溶解の観点から、水、ＰＢＳ、エタノール、プロパノール、及びそれらの混合溶媒から選ばれるのが好ましく、水、エタノール、及びそれらの混合溶媒から選ばれるのがより好ましい。
【０１１６】
さらにコーティング剤は、共重合体含有ワニスから調製してもよい。共重合体含有ワニスは、例えば、上記式（Ａ）、（Ｂ）及び場合により（Ｃ）で表される化合物を、溶媒中で、化合物の合計濃度０．０１質量％乃至２０質量％にて反応（重合）させる工程を含む製造方法により調製することができる。
【０１１７】
コーティング剤中の固形分の濃度としては、均一にコーティング膜を形成させるために、０．０１乃至５０質量％が望ましい。また、コーティング剤中の共重合体の濃度としては、好ましくは０．０１乃至４質量％、より好ましくは０．０１乃至３質量％、特に好ましくは０．０１乃至２質量％、さらに好ましくは０．０１乃至１質量％である。共重合体の濃度が０．０１質量％未満であると、コーティング剤中の共重合体の濃度が低すぎて十分な膜厚のコーティング膜が形成できず、４質量％超であると、コーティング剤の保存安定性が悪くなり、溶解物の析出やゲル化が起こる可能性がある。
【０１１８】
さらにコーティング剤は、上記共重合体と溶媒の他に、必要に応じて得られるコーティング膜の性能を損ねない範囲で他の物質を添加することもできる。他の物質としては、防腐剤、界面活性剤、基材との密着性を高めるプライマー、防カビ剤及び糖類等が挙げられる。
【０１１９】
コーティング剤中の共重合体のイオンバランスを調節するために、さらにコーティング剤中のｐＨを予め調整する工程を含んでいてもよい。ｐＨ調整は、例えば上記共重合体と溶媒を含む組成物にｐＨ調整剤を添加し、該組成物のｐＨを３．０以上、好ましくは３．５乃至８．５、さらに好ましくは３．５乃至８．０とすることにより実施してもよい。使用しうるｐＨ調整剤の種類及びその量は、上記共重合体の濃度や、そのアニオンとカチオンの存在比等に応じて適宜選択される。
ｐＨ調整剤の例としては、アンモニア、ジエタノールアミン、ピリジン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の有機アミン；水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物；塩化カリウム、塩化ナトリウム等のアルカリ金属ハロゲン化物；硫酸、リン酸、塩酸、炭酸等の無機酸又はそのアルカリ金属塩；コリン等の４級アンモニウムカチオン、あるいはこれらの混合物（例えば、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液）を挙げることができる。これらの中でも、アンモニア、ジエタノールアミン、水酸化ナトリウム、コリン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが好ましく、特にアンモニア、ジエタノールアミン、水酸化ナトリウム及びコリンが好ましい。
【０１２０】
本発明の細胞培養容器は、上記コーティング剤より形成されたコーティングを、細胞培養容器の表面の少なくとも一部に有する。具体的には、細胞及び細胞増殖に係わるペプチドを含む培養液と接触し得る、容器の内部及び／又は外部の表面の少なくとも一部に有する。
【０１２１】
＜容器＞
本発明の細胞培養容器を構成する、共重合体がコーティングされる容器は、当技術分野で使用され得る任意の形態の容器類であればよく、例えば、細胞の培養に一般的に用いられるペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュなどのシャーレ又はディッシュ、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコなどのフラスコ、プラスチックバッグ、テフロン（登録商標）バッグ、培養バッグなどのバッグ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレートなどのプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ローラーボトルなどのボトル等が挙げられる。好ましくは、６〜１５３６穴のマルチウェルプレート及びシャーレが挙げられる。
【０１２２】
また、容器の材質は、例えば、ガラス、金属、金属含有化合物若しくは半金属含有化合物、活性炭又は樹脂を挙げることができる。金属は、典型金属：（アルカリ金属：Li、Na、K、Rb、Cs；アルカリ土類金属：Ca、Sr、Ba、Ra）、マグネシウム族元素：Be、Mg、Zn、Cd、Hg；アルミニウム族元素：Al、Ga、In；希土類元素：Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu；スズ族元素：Ti、Zr、Sn、Hf、Pb、Th；鉄族元素：Fe、Co、Ni；土酸元素：V、Nb、Ta、クロム族元素：Cr、Mo、W、U；マンガン族元素：Mn、Re；貴金属：Cu、Ag、Au；白金族元素：Ru、Rh、Pd、Os、Ir、Pt等が挙げられる。金属含有化合物若しくは半金属含有化合物は、例えば基本成分が金属酸化物で、高温での熱処理によって焼き固めた焼結体であるセラミックス、シリコンのような半導体、金属酸化物若しくは半金属酸化物（シリコン酸化物、アルミナ等）、金属炭化物若しくは半金属炭化物、金属窒化物若しくは半金属窒化物（シリコン窒化物等）、金属ホウ化物若しくは半金属ホウ化物等の無機化合物の成形体等の無機固体材料、アルミニウム、ニッケルチタン、ステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）が挙げられる。
【０１２３】
樹脂としては、天然樹脂若しくはその誘導体、又は合成樹脂いずれでもよく、天然樹脂若しくはその誘導体としては、セルロース、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、ニトロセルロース（ＮＣ）、デキストラン硫酸を固定化したセルロース等、合成樹脂としてはポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＰＥ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂（ＡＢＳ）又はテフロン（登録商標）が好ましく用いられる。本発明の細胞培養容器の製造では、共重合体を、該容器の表面の少なくとも一部に存在するようにコーティングする際に、高温での処理を要しないため、耐熱性が低い樹脂等も適用可能である。
【０１２４】
容器の材質は１種類であっても２種類以上の組み合わせであってもよい。これらの材質の中において、ガラス、シリコン、シリコン酸化物、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、テフロン（登録商標）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）若しくはステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）単独、又はこれらから選ばれる組み合わせであることが好ましく、ガラス、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ステンレス（ＳＵＳ３０４、ＳＵＳ３１６、ＳＵＳ３１６Ｌ等）であることが特に好ましい。
【０１２５】
＜細胞培養容器の製法方法＞
本発明は、上述したようなコーティング剤を、容器の表面の少なくとも一部と接触させる工程を含む、容器の部表面の少なくとも一部にコーティングを備える細胞培養容器の製造方法に関する。コーティング剤と容器の表面との接触には特に制限は無いが、容器をコーティング剤に浸漬する、コーティング剤を容器に添加し、所定の時間静置する、又はコーティング剤を容器の表面に塗布する等の方法が用いられるが、コーティング剤を容器に添加し、所定の時間静置する方法が好ましい。添加は、例えば、容器の全容積の０．５乃至１倍量のコーティング剤を、シリンジ等を用いて添加することによって行うことができる。静置は、容器の材質やコーティング剤の種類に応じて、時間や温度を適宜選択して実施されるが、例えば、５分から２４時間、好ましくは３０分から３時間、１０乃至３５℃、好ましくは２０乃至３０℃、最も好ましくは２５℃で実施される。これにより、容器の表面の少なくとも一部に、好ましくは全体にわたって、コーティングを有する細胞培養容器を製造することができる。
【０１２６】
また、かかる方法により得られる容器の表面のコーティングは、上記容器の表面の少なくとも一部と接触させる工程後、好ましくはコーティング剤を添加し、所定の時間静置する工程後、乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等）を用いての洗浄後に、細胞培養容器として使用することができる。
すなわち、上記容器の表面の少なくとも一部と接触させる工程後、好ましくはコーティング剤を添加し、所定の時間静置する工程後、４８時間以内、好ましくは２４時間以内、さらに好ましくは１２時間以内、さらに好ましくは６時間以内、さらに好ましくは３時間以内、さらに好ましくは１時間以内に乾燥工程を経ずにそのまま、あるいは水又は細胞培養に付される試料の媒質（例えば、水、緩衝液、培地等、特に好ましくは培地（例えば、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地））を用いての洗浄後に、細胞培養容器として使用することができる。
【０１２７】
容器は、乾燥工程に付してもよい。乾燥工程は、大気下又は真空下にて、好ましくは、温度−２００℃乃至２００℃の範囲内で行なう。乾燥工程により、上記コーティング剤中の溶媒を取り除くと共に、本発明に係わる共重合体の式（ａ）及び式（ｂ）同士がイオン結合を形成して基体へ完全に固着する。
コーティングは、例えば室温（１０℃乃至３５℃、好ましくは２０℃乃至３０℃、例えば２５℃）での乾燥でも形成することができるが、より迅速にコーティングを形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて乾燥させてもよい。またフリーズドライ法による極低温乃至低温（−２００℃乃至−３０℃前後）での乾燥工程を用いてもよい。フリーズドライは真空凍結乾燥と呼ばれ、通常乾燥させたいものを冷媒で冷却し、真空状態にて溶媒を昇華により除く方法である。フリーズドライで用いられる一般的な冷媒は、ドライアイスとメタノールの混合媒体（−７８℃）、液体窒素（−１９６℃）等が挙げられる。
【０１２８】
乾燥温度が−２００℃未満であると、一般的ではない冷媒を使用しなければならず汎用性に欠けることと、溶媒昇華のために乾燥に長時間を要し効率が悪い。乾燥温度が２００℃超であると、コーティング表面のイオン結合反応が進みすぎて該表面が親水性を失い、細胞及び細胞増殖に係わるペプチドの付着抑制能が発揮されない。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２５℃乃至１５０℃である。
本願のコーティングは、以上の簡便な工程を経て製造される。
【０１２９】
また、コーティングに残存する不純物、未反応モノマー等を無くすため、さらにはコーティング中の共重合体のイオンバランスを調節するために、水及び電解質を含む水溶液から選ばれる少なくとも１種の溶媒で洗浄する工程を実施してもよい。洗浄は、流水洗浄又は超音波洗浄等が望ましい。上記水及び電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ、生理食塩水（塩化ナトリウムのみを含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。固着後は水、ＰＢＳ及びアルコール等で洗浄してもコーティング膜は溶出せずに基体に強固に固着したままである。形成されたコーティングは細胞又はタンパク質が付着してもその後水洗等にて容易に除去することができ、本発明のコーティングが形成された容器の表面は、細胞及び細胞増殖に係わるペプチドの付着抑制能を有する。
【０１３０】
本発明の容器の表面に付与されるコーティングの膜厚は、容器の形状や、試料の種類等に応じて適宜調整でき、また容器の表面全体にわたってほぼ均一であっても、部分的に不均一であってもよいが、特に限定はなく、好ましくは１０乃至１０００Åであり、さらに好ましくは１０乃至５００Åであり、最も好ましくは１０乃至３００Åである。
【０１３１】
＜その他の実施態様＞
本発明はまた、細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことで、該容器で培養される細胞の増殖率を増加させる方法に関する。細胞の増殖率を増加させるとは、例えば実施例の試験例１に記載の方法に準じて行う細胞増殖試験にて、コントロール（非コーティング）に比較し５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは５０％以上細胞の増殖率を増加させることを意味する。細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことにより、細胞増殖に係わるペプチドの付着が抑制され、培養期間中、細胞増殖に係わるペプチドが培養液中に十分に存在することができるため、該容器で培養される細胞の増殖率が有意に増加する。かかる方法における、細胞、細胞増殖に係わるペプチド、コーティング及び容器等の意味は、上述のとおりである。
【０１３２】
本発明はまた、細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことで、細胞培養容器内への細胞増殖に係わるペプチドの添加量を低減する方法に関する。ペプチドの添加量を低減するとは、例えば実施例の試験例１に準じた方法による、細胞増殖率に対するペプチド濃度のEffective dose 50（ＥＤ５０）値が、コントロール（非コーティング）に比較し５０％以下、好ましくは４０％以下であることを意味する。細胞培養容器の表面の少なくとも一部に、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティングを行うことにより、細胞増殖に係わるペプチドの付着が抑制されるため、その添加量の決定にあたり付着量を考慮する必要が無いため、細胞増殖に係わるペプチドの添加量を低減することができる。かかる方法における、細胞、細胞増殖に係わるペプチド、コーティング及び容器等の意味は、上述のとおりである。
【実施例】
【０１３３】
以下、合成例、実施例、試験例等に基づいて、本発明をさらに詳細に説明するが本発明はこれらに限定されない。【０１３４】
＜合成例１＞
アシッドホスホオキシエチルメタアクリレート（製品名；ホスマーＭ、ユニケミカル（株）社製、乾固法１００℃・１時間における不揮発分：９１．８％、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（４４．２質量％）、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（２８．６質量％）、その他の物質（２７．２質量％）の混合物）２５．００ｇを３５℃以下に冷却しながらコリン（４８−５０％水溶液：東京化成工業（株）社製）２９．９５ｇを加えて均一になるまで撹拌した。この混合液にメタクロイルコリンクロリド８０％水溶液（東京化成工業（株）社製）２０．９５ｇ、メタクリル酸ブチル（東京化成工業（株）社製）２８．６７ｇ、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（製品名；Ｖ−６５、和光純薬工業（株）社製）０．７０ｇ、エタノール１１０．８４ｇを３５℃以下に保ちながら順に加えた。さらに、２，２’−アゾビス（Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン）ｎ−水和物（和光純薬社製品名；ＶＡ−０５７、和光純薬工業（株）社製）０．７０ｇを純水２７．７１ｇに溶解させた水溶液を３５℃以下に保ちながら上記の溶液に加え、十分に攪拌して均一となった上記全てのものが入った混合液を、滴下ロートに導入した。一方で、別途純水５６．８１ｇとエタノール１３１．６２ｇを冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。この状態を維持しつつ、上記混合液を導入した滴下ロートを３つ口フラスコにセットし、１時間かけて混合液を純水とエタノールの沸騰液内に滴下した。滴下後、２４時間上記環境を維持した状態で加熱撹拌する。２４時間後に冷却することで固形分約１９．８６質量％の共重合体含有ワニス４３２．９７ｇを得た。得られたコロイド状液体のＧＦＣにおける重量平均分子量は約８，５００であった。【０１３５】
＜調製例１＞
上記合成実施例１で得られた共重合体含有ワニス１０．００ｇに、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１Ｎ）（関東化学（株）社製）１．１９ｇと純水２６．７８ｇ、エタノール６２．５４ｇを加えて十分に撹拌し、コーティング剤を調製した。ｐＨは３．６であった。【０１３６】
＜実施例１＞
調製例１で得られたコーティング剤を底部ガラス製９６ウェルマイクロプレート（旭硝子（株）製、Code 5866-096）に０．３mL／ウェル入れ、２５℃で１時間静置した。ウェルよりコーティング剤を除去後、２５℃で３時間乾燥させた。その後、ウェルを純水で十分に洗浄することで、コーティング膜が形成された底部ガラス製マイクロプレートを得た。【０１３７】
＜実施例２＞
調製例１で得られたコーティング剤をポリスチレン（ＰＳ）製３８４ウェルマイクロプレート（Greiner Bio-One社製）に０．１mL／ウェル入れ、２５℃で１時間静置した。ウェルよりコーティング剤を除去後、２５℃で３時間乾燥させた。その後、ウェルを純水で十分に洗浄することで、コーティング膜が形成されたＰＳ製マイクロプレートを得た。【０１３８】
＜試験例１＞
子宮平滑筋肉腫細胞株（ＳＫＮ細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）を、ＷＯ２０１４／０１７５１３の方法に従い、０．０１５％（w/v）の脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL  CG-LA、三昌（株）製）を添加したHam’s F-12培地（和光純薬工業（株）製）を用いて１０００cells／０．１mL／ウェルで、実施例１で得られたコーティング膜を形成した底部ガラス製マイクロプレートに播種した。対照として、コーティング膜を形成していない底部ガラス製マイクロプレートに対してもＳＫＮ細胞を同様に播種した。また、播種した細胞にヒトｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２：Human Recombinant, Basic fibroblast growth factor、（株）リプロセル製）を終濃度がそれぞれ０、０．０１、０．１、１、１０、１００ng／mLとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４日間培養を行った。培養後、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ（株）製）を用いて各ウェルの発光値をマルチモードマイクロプレートリーダー  FlexStation 3（Molecular  Devices社製）で測定することにより細胞数を算出した。結果を図１、図２に示す。図１はｂＦＧＦが０ng／mLのときの細胞数を１００％として各ｂＦＧＦ濃度の細胞増殖率を算出したものである。また図２は、図１の結果をもとに算出した細胞増殖率に対するｂＦＧＦ濃度のEffective dose 50（ＥＤ５０）値である。【０１３９】
図１、図２より、コーティングを行うことでＳＫＮ細胞の細胞増殖率が高くなり、細胞増殖率に対するｂＦＧＦのＥＤ５０が有意に低下することが確認できた。【０１４０】
＜試験例２＞
子宮平滑筋肉腫細胞株（ＳＫＮ細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク）を、国際公開第２０１４／０１７５１３号の方法に従い、０．０１５％（w/v）の脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL  CG-LA、三昌（株）製）を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（和光純薬工業（株）製）を用いて４５０cells／０．０４５mL／ウェルで、実施例２で得られたコーティング膜を形成したＰＳ製マイクロプレートに播種した。対照として、コーティング膜を形成していないＰＳ製マイクロプレートに対してもＳＫＮ細胞を同様に播種した。また、播種した細胞にヒトｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２：Human Recombinant, Basic fibroblast growth factor、（株）リプロセル製）を終濃度がそれぞれ０、０．０１、０．１、１、１０、１００ng／mLとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４日間培養を行った。培養後、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ（株）製）を用いて各ウェルの発光値をマルチモードマイクロプレートリーダー  FlexStation 3（Molecular  Devices社製）で測定することにより細胞数を算出した。結果を図３、図４に示す。図３はｂＦＧＦが０ng／mLのときの細胞数を１００％として各ｂＦＧＦ濃度の細胞増殖率を算出したものである。また図４は、図３の結果をもとに算出した細胞増殖率に対するｂＦＧＦ濃度のEffective dose 50（ＥＤ５０）値である。【０１４１】
図３、図４より、コーティングを行うことでＳＫＮ細胞の細胞増殖率が高くなり、細胞増殖率に対するｂＦＧＦのＥＤ５０が有意に低下することが確認できた。【０１４２】
＜試験例３＞
ヒト骨髄由来赤白血病細胞（ＴＦ１細胞、住商ファーマインターナショナル社）をピルビン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業（株）製）を用いて１０００cells／０．１mL／ウェルで、実施例１で得られたコーティング膜を形成した底部ガラス製マイクロプレートに播種した。対照として、コーティング膜を形成していない底部ガラス製マイクロプレートに対してもＴＦ１細胞を同様に播種した。また、播種した細胞にインターロイキン−３（ＩＬ３、和光純薬工業（株）製）を終濃度がそれぞれ０、０．００１、０．０１、０．１、１、１０ng／mLとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４日間培養を行った。培養後、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ（株）製）を用いて各ウェルの発光値をマルチモードマイクロプレートリーダー  FlexStation 3（Molecular  Devices社製）で測定することにより細胞数を算出した。結果を図５、図６に示す。図５はＩＬ３が０ng／mLのときの細胞数を１００％として各ＩＬ３濃度の細胞増殖率を算出したものである。また図６は、図５の結果をもとに算出した細胞増殖率に対するＩＬ３濃度のEffective dose 50（ＥＤ５０）値である。【０１４３】
図５、図６より、コーティングを行うことでＴＦ１細胞の細胞増殖率が高くなり、細胞増殖率に対するＩＬ３のＥＤ５０が有意に低下することが確認できた。【０１４４】
＜試験例４＞
ｂＦＧＦ（和光純薬工業（株）製）を添加したHam’s F-12培地（和光純薬工業（株））を０．１mL／ウェルで、実施例１で得られたコーティング膜を形成した底部ガラス製マイクロプレートに入れた。対照としてコーティング膜を形成していない底部ガラス製マイクロプレートに対してもｂＦＧＦを添加したHam’s F-12培地を同様に入れた。３７℃で６時間インキュベーションしたのち、Ham’s F-12培地中のｂＦＧＦ量をｂＦＧＦエライザキット（Raybiotech社製）を用いてプロトコルに従って定量した。図７はインキュベーションしていない時のHam’s F-12培地中のｂＦＧＦ量を１００％とした時、インキュベーション後のHam’s F-12培地中のｂＦＧＦ量を表している。【０１４５】
図７より、コーティングを行うことでｂＦＧＦの吸着を抑えられることが示された。【０１４６】
＜試験例５＞
ＩＬ３（（株）リプロセル製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業（株））を０．１mL／ウェルで、実施例１で得られたコーティング膜を形成した底部ガラス製マイクロプレートに入れた。対照としてコーティング膜を形成していない底部ガラス製マイクロプレートに対してもＩＬ３を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を同様に入れた。３７℃で4日間インキュベーションしたのち、ＲＰＭＩ１６４０培地中のＩＬ３量をＩＬ３エライザキット（abcam社製）を用いてプロトコルに従って定量した。図８はインキュベーションしていない時のＲＰＭＩ１６４０培地中のＩＬ３量を１００％とした時、インキュベーション後のＲＰＭＩ１６４０培地中のＩＬ３量を表している。【０１４７】
図８より、コーティングを行うことでＩＬ３の吸着を抑えられることが示された。【０１４８】
＜試験例６＞
インスリン−トランスフェリン−セレニウム水溶液（ＩＴＳ水溶液、Thermo Fisher Scientific社製）を添加したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（ＤＭＥＭ、和光純薬工業（株）製）を０．１mL／ウェルで、実施例１で得られたコーティング膜を形成した底部ガラス製マイクロプレートに入れた。対照としてコーティング膜を形成していない底部ガラス製マイクロプレートに対してもＩＴＳ水溶液を添加したＤＭＥＭを同様に入れた。３７℃で３日間インキュベーションしたのち、ＤＭＥＭ中のインスリン量とトランスフェリン量をそれぞれインスリンエライザキット（Mercodia社製）及びトランスフェリンエライザキット（abcam社製）を用いてプロトコルに従って定量した。図９はインキュベーションしていない時のＤＭＥＭ中のインスリン量を１００％とした時、インキュベーション後のＤＭＥＭ中のインスリン量、図１０はインキュベーションしていない時のＤＭＥＭ中のトランスフェリン量を１００％とした時、インキュベーション後のトランスフェリン量をそれぞれ表している。【０１４９】
図９、図１０より、コーティングを行うことでインスリン、トランスフェリンの吸着を抑えられることが示された。【０１５０】
＜実施例３＞
調製例１で得られたコーティング剤をＰＳ製９６ウェルマイクロプレート（Corning社製、#3595）に０．３mL／ウェル入れ、２５℃、１時間静置した。コーティング剤を除去後、２５℃で３時間乾燥させた。その後、純水で十分に洗浄を行って、コーティング膜が形成されたＰＳ製９６ウェルマイクロプレートを得た。【０１５１】
＜試験例７＞
ヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性前駆細胞（Bone Marrow CD34+細胞（ＢＭ−ＣＤ３４＋）、LONZA社、Product Code 2M−101B）を、StemSpanTMSFEM培地（STEMCELL TECHNOLOGIES製、CATALOG #09650）を用いて２０００ cells／０．１mL／ウェルで、実施例３で得られたコーティング膜を形成したＰＳ製９６ウェルマイクロプレートに播種した。対照としてコーティング膜を形成していないＰＳ製９６ウェルマイクロプレートに対してもＢＭ−ＣＤ３４＋細胞を同様に播種した。また、播種した細胞にStem Cell Factor（ＳＣＦ、PEPROTECH社製、Catalog Number：300-07）を終濃度が１００ng／mLとなるように添加し、さらにThrombopoietin（ＴＰＯ、PEPROTECH社製、Catalog Number：300-18）を終濃度がそれぞれ０、０．０１、０．０１、０．１、１、１０、１００ng／mLとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間培養を行った。培養後、CellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ（株）製）を用いて各ウェルの発光値をマルチモードマイクロプレートリーダー FlexStation 3（Molecular Devices社）で測定することにより細胞数を算出した。結果を図１１、図１２に示す。図１１はＴＰＯが０ng／mLのときの細胞数を１００％として各ＴＰＯ濃度の細胞増殖率を算出したものである。また、図１２は図１１の結果をもとに算出した細胞増殖率に対するＴＰＯ濃度のEffective dose 50（ＥＤ５０）値である。【０１５２】
図１１、図１２より、コーティングを行うことでＢＭ−ＣＤ３４＋細胞の細胞増殖率が高くなり、細胞増殖率に対するＴＰＯのＥＤ５０が有意に低下することが確認できた。【０１５３】
＜試験例８＞
インターロイキン−６（ＩＬ６、（株）リプロセル製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業（株））を０．１mL／ウェルで、実施例１で得られたコーティング膜を形成したＰＳ製マイクロプレートに入れた。対照としてコーティング膜を形成していないＰＳ製マイクロプレートに対してもＩＬ６を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を同様に入れた。３７℃で４日間インキュベーションしたのち、ＲＰＭＩ１６４０培地中のＩＬ６量をＩＬ６エライザキット（abcam社製）を用いてプロトコルに従って定量した。図１３はインキュベーションしていない時のＲＰＭＩ１６４０培地中のＩＬ６量を１００％とした時、インキュベーション後のＲＰＭＩ１６４０培地中のＩＬ６量を表している。【０１５４】
図１３より、コーティングを行うことでＩＬ６の吸着を抑えられることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明の細胞培養容器は、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制するコーティング、特には、式（ａ）で表されるアニオン性基と、式（ｂ）で表されるカチオン性基と、場合により式（ｃ）で表される疎水性基とを含む共重合体を含むコーティングを、容器の表面の少なくとも一部に備えることにより、細胞のみならず、細胞増殖に係わるペプチドの付着を抑制することができる。そのため、細胞の増殖性や機能発現が損なわれることがなく、細胞培養における細胞の増殖率を増加させることができ、かつ細胞増殖に係わるペプチドの添加量を低減することができる。また、本発明の細胞培養容器が備えるコーティングは、プラスチック等の樹脂との密着性がよく、容器の表面の少なくとも一部に、容易に形成することができる。さらに、前記コーティングは、水系溶媒への耐性に優れることから、コーティングから共重合成分の培養液への溶出が抑制されるため、細胞や細胞増殖に係わるペプチドに悪影響を及ぼすことが無く、また最終製品への残留等の問題も解消され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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