(57)【要約】  細胞表面マーカーＣＤ３１およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団、細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団、細胞表面マーカーＣＤ３１が陽性、ＣＤ１５７およびＣＤ２００の少なくとも一方が陽性、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞、ならびに、当該細胞集団または当該血管内皮幹細胞を有効成分とする血管再生用医薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面マーカーＣＤ３１およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団。
【請求項２】
細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団。
【請求項３】
血管内皮幹細胞を含む請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞が導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項５】
哺乳動物がヒトである請求項１〜４のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項６】
細胞表面マーカーＣＤ３１が陽性、ＣＤ１５７およびＣＤ２００の少なくとも一方が陽性、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞。
【請求項７】
導入遺伝子を発現する請求項６に記載の血管内皮幹細胞。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである請求項６または７に記載の血管内皮幹細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の細胞集団または請求項６〜８のいずれかに記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬。
【請求項１０】
血管再生用、虚血改善用、低栄養改善用、血管奇形治療用、血管奇形に起因する血流不全改善用、臓器再生促進用、または血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の予防および／または治療用である請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である請求項１０に記載の医薬。
【請求項１２】
請求項４に記載の細胞集団または請求項７に記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする導入遺伝子産物により改善される疾患の予防および／または治療用医薬。
【請求項１３】
導入遺伝子産物により改善される疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、がん、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、リウマチ、認知症、糖尿病、高血圧症、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肥満または感染症である請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
被験物質の血管に対する毒性を評価する方法であって、
（１）被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて請求項１〜５のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
（２）培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
（３）被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする毒性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陽性の哺乳動物細胞からなる細胞集団、および当該細胞集団を有効成分とする医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨髄に存在する造血幹細胞は、未分化な状態で分裂する能力（自己複製能）と成熟した血液細胞である赤血球や白血球、血小板を産生する前駆細胞に分化する能力によって、長期にわたり骨髄造血を維持することが知られている。一方、血管の内腔を形成する血管内皮細胞は、胎児期に発生すると、成熟した血管内皮細胞として緩徐な分裂により生涯にわたって血管を維持していると考えられてきた。つまり、血管システムには、血管を長期にわたって支持する幹細胞が存在するとは考えられていなかった。【０００３】
本発明者らは、既存の血管の中にも大量の血管内皮細胞を産生し得る血管内皮幹細胞のような細胞が存在するのではないかと考え、組織幹細胞の単離法として知られているヘキスト法を用いて、血管内皮細胞に異種性があるかどうかを検討した。ヘキスト法とは、組織幹細胞は、他の分化細胞に比べて薬剤（異物）排出能が高いことを利用する方法である。ＤＮＡ染色色素であるヘキスト３３３４２を細胞に取り込ませるとヘキスト３３３４２の排出能が高い細胞の一部が幹細胞性を示す。発明者らは、マウスの下肢の筋肉を実験材料として既存の血管を観察したところ、全体の血管内皮細胞中に１％程度ヘキスト３３３４２の排出能が高い、ｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞（以下、「ＳＰ細胞集団」と記す）が存在することを見出した。ヘキストを排出できないｍａｉｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞（以下、「ＭＰ細胞集団」と記す）とＳＰ細胞集団を比較すると、ＳＰ細胞集団には一個の細胞から大量の血管内皮細胞を産生する細胞が約１０％の割合で含まれており、ＭＰ細胞集団にはそのような能力を有する細胞はほぼ存在しないことが判明した。また、マウスの大腿動脈を結紮して虚血を誘導したマウスの大腿筋の中にこれらの血管内皮細胞を移植すると、ＳＰ細胞集団は、自身が分化した血管内皮細胞により完全な血管を形成することができるが、ＭＰ細胞集団にはその能力がほぼないことが判明した。移植されたＳＰ細胞集団はＭＰ細胞集団として血管に貢献しており、ＳＰ細胞集団の中に血管内皮幹細胞様の細胞が存在して、この細胞が、新たな血管を再生できる能力を有すると考えられた（非特許文献１）。従来、骨髄中には血管内皮前駆細胞が存在することが報告され、この細胞を用いた血管再生治療が行われている。しかし、この細胞は一過性に血管内皮細胞様の細胞に分化するが継続的に血管内皮細胞として貢献できないことが判明している。また、発明者らは、筋肉の血管内皮細胞中に見出した血管内皮幹細胞様の細胞は骨髄に由来する細胞でないことを確認している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Naito H, Kidoya H, Sakimoto S, Wakabayashi T, Takakura N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 2012 Feb 15;31(4):842-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、血管内皮幹細胞および血管内皮幹細胞集団を細胞表面マーカーにより特定し、当該血管内皮幹細胞および血管内皮幹細胞集団を有効成分とする医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］細胞表面マーカーＣＤ３１およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団。
［２］細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団。
［３］血管内皮幹細胞を含む前記［１］または［２］に記載の細胞集団。
［４］前記哺乳動物細胞が導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む前記［１］または［２］に記載の細胞集団。
［５］哺乳動物がヒトである前記［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞集団。
［６］細胞表面マーカーＣＤ３１が陽性、ＣＤ１５７およびＣＤ２００の少なくとも一方が陽性、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞。
［７］導入遺伝子を発現する前記［６］に記載の血管内皮幹細胞。
［８］哺乳動物がヒトである前記［６］または［７］に記載の血管内皮幹細胞。
［９］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞集団または前記［６］〜［８］のいずれかに記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬。
［１０］血管再生用、虚血改善用、低栄養改善用、血管奇形治療用、血管奇形に起因する血流不全改善用、臓器再生促進用、または血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の予防および／または治療用である前記［９］に記載の医薬。
［１１］血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である前記［１０］に記載の医薬。
［１２］前記［４］に記載の細胞集団または前記［７］に記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする導入遺伝子産物により改善される疾患の予防および／または治療用医薬。
［１３］導入遺伝子産物により改善される疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、がん、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、リウマチ、認知症、糖尿病、高血圧症、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肥満または感染症である前記［１２］に記載の医薬。
［１４］被験物質の血管に対する毒性を評価する方法であって、
（１）被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
（２）培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
（３）被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする毒性評価方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、血管内皮幹細胞集団および血管内皮幹細胞を提供することができる。本発明の細胞集団または血管内皮幹細胞を用いて、血管再生用、虚血改善用、低栄養改善用、血管奇形治療用、血管奇形に起因する血流不全改善用、臓器再生促進用、または血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の治療用の医薬を提供することができる。また、導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を用いることにより、導入遺伝子産物により改善される疾患治療用の医薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】マウスの肝臓を消化・分散して調製した細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図であり、（Ａ）は抗ＣＤ３１抗体と抗ＣＤ４５抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を抗ＣＤ１５７抗体と抗ＣＤ２００抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果である。
【図２】図１（Ｂ）の画分Ａ（ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性）、画分Ｂ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性）および画分Ｃ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性）の各細胞について、それぞれコロニー形成アッセイを行った結果である。
【図３】肝血管障害モデルマウスの肝臓に、図１（Ｂ）の画分Ａ（ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性）、画分Ｂ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性）および画分Ｃ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性）の各細胞を移植し、肝臓の血管再生について検討した結果を示す図である。
【図４】ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスの肝臓の凍結切片を抗ＥＧＦＰ抗体および抗ＣＤ３１抗体で染色した結果を示す図である。
【図５】野生型マウス、凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子ヘテロ欠損マウス、血友病モデルマウス（凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子欠損マウス）、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病ＡモデルマウスおよびＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスにおける、血漿中凝固第ＶＩＩＩ因子を測定した結果を示す図である。
【図６】ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスと細胞を移植していない血友病Ａモデルマウスの出血時間を測定した結果を示す図である。
【図７】７０％部分肝切除術を行ったマウスの肝臓に、ＳＰ細胞集団の細胞またはＭＰ細胞集団の細胞を移植し、７日後の肝臓を蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）はＳＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓、（Ｂ）はＭＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓である。
【図８】７０％部分肝切除術を行ったマウスの肝臓に、ＳＰ細胞集団の細胞またはＭＰ細胞集団の細胞を移植し、７日後の肝臓の重量を測定した結果を示す図である。
【図９】７０％部分肝切除術を行ったマウスの肝臓にＳＰ細胞集団の細胞を移植し、７日後の肝臓から調製したＧＦＰ陽性血管内皮細胞（ＧＦＰ陽性ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）（Ｐｏｓｔ）と、移植前のＳＰ細胞集団の細胞（Ｐｒｅ）におけるＷｎｔ２およびＨＧＦのｍＲＮＡ発現量を測定した結果を示す図であり、（Ａ）はＷｎｔ２の結果、（Ｂ）はＨＧＦの結果である。
【図１０】マウスの網膜、脳、心臓、皮膚、筋組織および肺を消化・分散して調製した細胞に免疫蛍光染色を行い、各ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞を回収してコロニー形成アッセイを行った結果を示す図である。
【図１１】Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスの肝臓から調製した１個のＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を肝臓に移植し、１か月後のレシピエントマウスの肝臓を実体蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図１２】図１１のレシピエントマウスの肝臓を免疫蛍光染色し共焦点顕微鏡で観察した結果を示す図であり、（Ａ）が抗ＧＦＰ抗体で染色した結果、（Ｂ）が抗ＣＤ３１抗体結果、下段は上段の点線枠内（類洞周囲）の拡大画像である。
【図１３】図１１のレシピエントマウスの肝臓から細胞懸濁液を調製し、（Ａ）は抗ＧＦＰ抗体染色と前方散乱光（ＦＳＣ）でフローサイトメトリー解析を行った結果であり、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の細胞（ＧＦＰ陽性細胞）を抗ＣＤ１５７抗体と抗ＣＤ２００抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果である。
【図１４】ヒトの肝臓を消化・分散して調製した細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図であり、（Ａ）は抗ＣＤ３１抗体と抗ＣＤ４５抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を抗ＣＤ１５７抗体と抗ＣＤ２００抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果である。
【図１５】図１４（Ｂ）のＣＤ２００陽性画分（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陽性）およびＣＤ２００陰性画分（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陰性）の各細胞について、それぞれコロニー形成アッセイを行った結果である。
【図１６】ヒト腎臓組織を消化・分散して調製した細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図であり、（Ａ）は抗ＣＤ３１抗体と抗ＣＤ４５抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を抗ＣＤ１５７抗体と抗ＣＤ３１抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果である。
【図１７】ヒト胎盤組織を消化・分散して調製した細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った結果を示す図であり、（Ａ）は抗ＣＤ３１抗体と抗ＣＤ４５抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を抗ＣＤ１５７抗体と抗ＣＤ３１抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果である。
【図１８】ヒト皮膚組織を消化・分散して調製した細胞に免疫蛍光染色およびヘキスト染色を行い、ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性回収した後フローサイトメーターでヘキスト解析を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔血管内皮幹細胞および血管内皮幹細胞を含む細胞集団〕
本発明者らは、筋肉組織の血管から取得した血管内皮細胞中に、薬剤（異物）排出能が高い細胞（ＳＰ細胞集団）が１％程度存在し、この中に血管内皮幹細胞様の細胞が存在すること、薬剤（異物）排出能が低い大多数の血管内皮細胞（ＭＰ細胞集団）には、血管内皮幹細胞様の細胞はほぼ存在しないことを見出した（非特許文献１）。その後本発明者らは、肝臓の血管から取得した血管内皮細胞も同様に、薬剤（異物）排出能が高いＳＰ細胞集団画分と低いＭＰ細胞集団画分に分けることができ、ＳＰ細胞集団中に血管内皮幹細胞様の細胞が１０％程度存在し、ＭＰ細胞集団中にはほぼ存在しないことを確認した。今回、本発明者らは、血管内皮幹細胞様の細胞を他の血管内皮細胞と効率よく区別できるマーカー分子を見出すために、肝臓のＳＰ細胞集団とＭＰ細胞集団を用いて、ＭＰ細胞集団と比べＳＰ細胞集団で発現が高い遺伝子を網羅的に解析し、１００を超えるＳＰ細胞集団高発現遺伝子の中から、血管内皮幹細胞様の細胞（以下、「血管内皮幹細胞」と記す）を特定できる細胞表面マーカーを見出した。
【００１０】
本発明は、哺乳動物の血管内皮幹細胞を含む細胞集団を提供する。本明細書において、血管内皮幹細胞は未分化な状態で分裂する能力（自己複製能）と血管内皮細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。本発明の第１の細胞集団は、細胞表面マーカーＣＤ３１およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団である。本発明の第１の細胞集団には、通常の操作によって排除することが困難な程度の割合で不純細胞（ＣＤ３１陽性／ＣＤ２００陽性／ＣＤ４５陰性細胞以外の細胞）が含まれていてもよい。
【００１１】
ＣＤ３１は、免疫グロブリン・スーパーファミリーに属する分子量１４０ｋＤａの単鎖膜糖タンパクで、ＰＥＣＡＭ−１とも呼ばれ、内皮細胞の細胞表面マーカーとして使用されている。ＣＤ４５は、白血球共通抗原（LCA: Leukocyte common antigen）として知られている単鎖膜貫通タンパクで、少なくとも５つのアイソフォームが存在する。本発明において、ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性は血管内皮細胞の細胞表面マーカーと位置づけられる。したがって、本明細書において、ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞は血管内皮細胞と同義に使用される。
【００１２】
ＣＤ２００は、二つの免疫グロブリン様ドメイン（Ｖ、Ｃ）と単一の膜貫通および短い細胞質ドメインを含有する免疫グロブリン・スーパーファミリーに属する高度に保存された膜糖タンパクであり、胸腺、Ｂ細胞、活性化ＴおよびＢ細胞、樹状細胞、ニューロン、内皮細胞等、多様な細胞がＣＤ２００を細胞表面に発現している。本発明者らは、ＣＤ２００陽性の血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）に、血管内皮幹細胞が存在することを見出した。本発明の第１の細胞集団に含まれる血管内皮幹細胞は約２％であってもよく、約３％であってもよく、約４％であってもよく、約５％であってもよく、約６％であってもよく、約７％であってもよく、約８％であってもよく、約９％であってもよく、約１０％であってもよい。本発明の第１の細胞集団に含まれる血管内皮幹細胞は、１〜３％であってもよく、２〜４％であってもよく、３〜５％であってもよく、４〜６％であってもよく、５〜７％であってもよく、６〜８％であってもよく、７〜９％であってもよく、８〜１０％であってもよい。
【００１３】
本発明の第２の細胞集団は、細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になる細胞集団である。本発明の第２の細胞集団には、通常の操作によって排除することが困難な程度の割合で不純細胞（ＣＤ３１陽性／ＣＤ１５７陽性／ＣＤ２００陽性／ＣＤ４５陰性細胞以外の細胞）が含まれていてもよい。
【００１４】
ＣＤ１５７は、グリコシル−ホスファチジルイノシトール結合型膜タンパクであり、単球、好中球、全てのリンパ系および骨髄系の前駆細胞に発現している。本発明者らは、ＣＤ２００陽性の血管内皮細胞（第１の細胞集団）にはＣＤ１５７陽性とＣＤ１５７陰性の２つの細胞集団が存在することを見出し、ＣＤ１５７陽性細胞集団に血管内皮幹細胞が多く含まれ、ＣＤ１５７陰性細胞集団に血管内皮幹細胞より分化のステージが進んだ血管内皮前駆細胞が多く含まれることを見出した。本発明の第２の細胞集団に含まれる血管内皮幹細胞は約２０％であってもよく、約３０％であってもよく、約４０％であってもよく、約５０％であってもよく、約６０％であってもよく、約７０％であってもよく、約８０％であってもよく、約９０％であってもよく、約９５％であってもよい。本発明の第２の細胞集団に含まれる血管内皮幹細胞は、２０〜４０％であってもよく、３０〜５０％であってもよく、４０〜６０％であってもよく、５０〜７０％であってもよく、６０〜８０％であってもよく、７０〜９０％であってもよく、８０〜９５％であってもよく、９０〜９９％であってもよい。
【００１５】
本発明の細胞集団は、哺乳動物細胞からなる細胞集団であればよい。哺乳動物は特に限定されないが、例えばヒト、サル、ウシ、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられる。本発明の細胞集団がヒトの細胞集団である場合、ヒトに対して安全に移植することができる。
【００１６】
本発明は、細胞集団を形成しない血管内皮幹細胞であってもよい。すなわち、本発明には血管内皮幹細胞が含まれる。本発明の血管内皮幹細胞は、細胞表面マーカーＣＤ３１およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞であってもよく、細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞であってもよい。哺乳動物は特に限定されないが、例えばヒト、サル、ウシ、ブタ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられる。本発明の血管内皮幹細胞がヒトの血管内皮幹細胞である場合、ヒトに対して安全に移植することができる。
【００１７】
本発明の細胞集団および本発明の血管内皮幹細胞は、任意の臓器から調製することができる。例えば、肝臓、網膜、脳、心臓、皮膚、筋肉（骨格筋）、肺、腎臓、胎盤などから調製できることが確認されている（実施例１、４、６、７参照）。本発明の細胞集団の調製方法は特に限定されないが、例えば、単離した臓器を市販の細胞分散用試薬で消化・分散して細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液を抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ２００抗体で染色した後、フローサイトメトリー技術を用いてＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陽性細胞（第１の細胞集団）を回収する方法を用いることができる。あるいは、上記細胞懸濁液を抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１５７抗体、抗ＣＤ２００抗体で染色した後、フローサイトメトリー技術を用いてＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞（第２の細胞集団）を回収する方法を用いることができる（実施例１参照）。
【００１８】
血管内皮幹細胞は、導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞であってもよい。導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞、および導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む細胞集団も本発明に含まれる。導入遺伝子は特に限定されず、生体に有利な効果を奏する遺伝子産物をコードする遺伝子であってもよい。また、導入遺伝子は、細胞外に分泌される遺伝子産物をコードする遺伝子であってもよい。このような導入遺伝子としては、特定の抗原を認識する抗体をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、特定の核酸配列にハイブリダイズする核酸をコードする遺伝子などが挙げられる。
【００１９】
導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞は、公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができる。例えば、上記のように調製したＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陽性細胞またはＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞に、所望の遺伝子が組み込まれた発現ベクターをトランスフェクションすることにより作製することができる。
【００２０】
〔医薬〕
本発明は、上記本発明の細胞集団を有効成分とする医薬を提供する。本発明者らは、肝血管障害モデルマウスの肝臓に本発明の細胞集団を移植すると、本発明の細胞集団に含まれる血管内皮幹細胞によって血管が再生されることを確認している（実施例１参照）。また、本発明は、上記本発明の血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬を提供する。本発明者らは、本発明の血管内皮幹細胞を１個、レシピエントマウスの肝臓に移植すると血管を構成する血管内皮細胞として定着、増殖し長期間維持されることを確認している（実施例５参照）。
【００２１】
本発明の医薬は、血管再生用の医薬として好適に用いることができる。本発明の医薬は血管を再生することができるので、血管機能の低下に起因する虚血および低栄養を改善するために用いることができる。それゆえ、本発明の医薬は、脳梗塞、心筋梗塞、バージャー病などの虚血性疾患の治療に有効である。これらの虚血性疾患は、動脈硬化症、血栓症、動脈炎などの動脈性疾患に起因するものであってもよく、高脂血症、糖尿病、高血圧、痛風、老化などの生活習慣病に起因するものであってもよい。また、本発明の医薬は、血管奇形の治療または血管奇形に起因する血流不全の治療に好適に用いることができる。血管奇形としては、動静脈瘻、もやもや病などが挙げられる。さらに、本発明の医薬は創傷治癒にも用いることができる。
【００２２】
本発明の医薬は、臓器の再生促進に用いることができる。本発明者らは、７０％部分肝切除したマウスの肝臓に本発明の細胞集団を移植すると、肝臓の再生が促進されることを確認している（実施例３参照）。対象の臓器は特に限定されず、本発明の医薬により血管を再生できる臓器であればいずれの臓器であっても再生を促進することができる。あらゆる臓器において臓器特有の細胞（幹細胞を含む）は、血管内皮細胞が分泌する液性因子や接着因子により、長期の細胞生存や細胞増殖が誘導されていることが明らかになっている。そのため、臓器の血管が再生されることに伴い、当該臓器の再生が促進される。したがって、本発明の医薬は、臓器再生により改善される疾患を治療することができる。例えば肝臓の再生が促進されると、肝硬変、肝線維症、肝炎、脂肪肝、肝不全等の予防または治療が可能になる。他の臓器についても同様である。
【００２３】
本発明の医薬は、血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の治療に用いることができる。例えば、遺伝子異常により分子が分泌されない、または分子の分泌量が減少することが原因の疾患患者に、正常な遺伝子を有する血管内皮幹細胞を含む本発明の医薬を適用すれば、再生血管の血管内皮細胞から必要な量の分子が分泌されるようになり、疾患を効率よく治療することができる。本発明者らは、血友病Ａモデルマウスの肝臓に、正常な凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子を有するマウスの肝臓から調製した本発明の細胞集団を投与した結果、出血から止血までの時間が顕著に短くなることを確認している（実施例２参照）。
【００２４】
血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患としては、例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドローム、骨粗鬆症などが挙げられる。これらの疾患と分泌される分子の対応を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2019098264.tif 000002
【００２６】
本発明の医薬は、血管を再生させる対象の臓器に適した本発明の細胞集団または本発明の血管内皮幹細胞を選択して使用することができる。血管を再生させる対象の臓器に適した本発明の細胞集団としては、発生段階の３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、外肺葉）の中の、同じ胚葉由来の臓器から調製した本発明の細胞集団であってもよい。内胚葉由来の臓器は、胃、腸、肺、肝臓、膵臓などであり、中胚葉由来の臓器は、筋肉、骨、血管、心臓、腎臓、脾臓、精巣、子宮などであり、外肺葉由来の臓器は、脳、神経、皮膚、水晶体などである。好ましくは、当該対象臓器と同じ臓器から調製した本発明の細胞集団を使用する。
【００２７】
本発明は、導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む細胞集団または導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬を提供する。導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞は移植した臓器または組織の血管に血管内皮細胞として定着すると共に、導入遺伝子産物を継続的かつ持続的に発現して血液中に分泌し、血流を介して疾患部位に導入遺伝子産物を送達することができるので、導入遺伝子産物の作用により改善される疾患の予防および／または治療に好適に用いることができる。
【００２８】
導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む細胞集団または導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬は、導入遺伝子産物が治療に有効な全ての疾患を治療対象とすることができる。例えば、凝固第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む血友病治療用医薬、凝固第ＩＸ因子をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む血友病治療用医薬、抗凝固第ＶＩＩＩ因子抗体をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む血友病治療用医薬、フォンビルブランド因子をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む出血性疾患用医薬（フォン・ヴィレブランド病など）、抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＶＥＧＦ受容体抗体をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む血管増殖性疾患（がん、加齢黄斑変性症など）治療用医薬、抗炎症性サイトカイン（ＩＬ６など）抗体をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む自己免疫疾患（リウマチなど）治療用医薬、抗アミロイドβ抗体をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む認知症治療用医薬、インシュリンをコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む糖尿病治療用医薬、サイトメガロウイルス遺伝子のＩＥ２のｍＲＮＡのアンチセンス核酸をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）治療用医薬、Ｔｉｅ２のアゴニストであるアンジオポエチン−１をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む血管透過性疾患（高血圧症、糖尿病性腎症など）治療用医薬、Ｎｏｇｇｉｎをコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む骨粗鬆症治療用医薬、肥満遺伝子産物（レプチンなど）をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む肥満抑制用医薬、がん抗原をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含むがんワクチン療法用医薬、ウイルス抗原をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を含む感染症予防および治療用医薬などが挙げられる。
【００２９】
本発明の医薬は、本発明の細胞集団または本発明の血管内皮幹細胞を、生体に投与可能な適当な溶液に懸濁した細胞懸濁液の形態で生体に投与することができる。生体に投与可能な溶液としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、その他の生理的塩類溶液が挙げられる。細胞集団または血管内皮幹細胞の調製は、通常投与直前に行うが、凍結保存した細胞集団または血管内皮幹細胞を用いて用時調製してもよい。本発明の医薬は、本発明の細胞集団または血管内皮幹細胞の細胞懸濁液を、血管を再生させる対象の臓器に直接、または、血管を再生させる対象の臓器の上流の静脈内に投与することができる。投与量は、血管を再生させる対象の臓器、患者年齢、体重などにより異なるので一義的には言えないが、医師が前記状況を考慮して判断することにより、適宜適当な投与量を決定することができる。例えば、１回あたり１個〜１×１０９個の細胞を投与してもよい。投与の頻度は、１回／日〜１回／週の範囲で適宜選択することができる。投与量および投与頻度は、患者に応じて適宜増減することができる。
【００３０】
〔血管毒性の評価方法〕
本発明は、上記本発明の細胞集団を用いる血管毒性の評価方法を提供する。本発明の血管毒性評価方法は、被験物質を上記本発明の細胞集団に接触させ、細胞増殖レベルを測定することにより実施することができる。具体的には、例えば、以下の工程を含む方法が挙げられる。
（１）被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて前記［１］〜［３］のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
（２）培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
（３）被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
【００３１】
被験物質は特に限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。ただし、これらに限定されない。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩であってもよい。
【００３２】
本発明の細胞集団の培養に用いる培地は、血管内皮細胞の培養に使用できる公知の培地から適宜選択することができる。培養方法も、公知の血管内皮細胞の培養方法を適宜選択して用いることができる。培養期間は特に限定されず、使用する被験物質に応じて、適宜設定することが好ましい。
【００３３】
細胞増殖レベルを測定する方法は特に限定されず、公知の方法から適宜選択して使用することができる。具体的には、例えば、目視またはセルカウンターを用いて細胞数を計数する方法、クリスタルバイオレット法、ＭＴＴ法、その他の各種細胞増殖測定キットを用いる方法などが挙げられる。
【００３４】
被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルが、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルより低下している場合、すなわち、被験物質が血管内皮幹細胞の増殖を抑制する物質である場合、当該被験物質は血管に対して毒性を有すると評価することができる。例えば、被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルが、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下である場合に、当該被験物質は血管に対して毒性を有すると評価してもよい。
【００３５】
また、被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルが、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルより大幅に上昇している場合、すなわち、被験物質が血管内皮幹細胞の増殖を異常に促進する物質である場合も、当該被験物質は血管に対して毒性を有すると評価することができる。例えば、被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルが、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルの２００％以上、２５０％以上、３００％以上である場合に、当該被験物質は血管に対して毒性を有すると評価してもよい。
【００３６】
哺乳動物の成体から回収した血管内皮細胞はインビトロでほとんど増殖しないので、細胞増殖を指標としたインビトロの血管毒性評価に用いることが難しい。一方、本発明の細胞集団はインビトロで増殖できるので、細胞増殖を指標としたインビトロの血管毒性評価に用いることができる。したがって、本発明の血管毒性評価方法は、簡便かつ迅速に被験物質の血管毒性を評価できる点で非常に有用である。本発明の血管毒性評価方法は、特に血管内皮細胞に対する毒性を評価したい場合に有用である。さらに、患者自身から本発明の細胞集団を調製することにより、患者等自身の血管に対する被検物質の影響を評価することができる点で非常に有用である。
【００３７】
本発明には、以下の各発明も含まれる。
［Ａ］前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞集団または前記［６］〜［８］のいずれかに記載の血管内皮幹細胞を投与する工程を含む血管再生方法。
［Ｂ］虚血および低栄養を改善する［Ａ］に記載の方法。
［Ｃ］血管奇形または血管奇形に起因する血流不全を治療する［Ａ］に記載の方法。
［Ｄ］臓器の再生を促進する［Ａ］に記載の方法。
［Ｅ］血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患を治療する［Ａ］に記載の方法。
［Ｆ］血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である［Ｅ］に記載の方法。
［Ｇ］血管の再生に使用するための前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞集団または前記［６］〜［８］のいずれかに記載の血管内皮幹細胞。
［Ｈ］虚血および低栄養を改善する［Ｇ］に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
［Ｉ］血管奇形または血管奇形に起因する血流不全を治療する［Ｇ］に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
［Ｊ］臓器の再生を促進する［Ｇ］に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
［Ｋ］血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患を治療する［Ｇ］に記載の使用するための細胞集団または血管内皮幹細胞。
［Ｌ］血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である［Ｋ］に記載の細胞集団または血管内皮幹細胞。
［Ｍ］血管再生用医薬を製造するための前記［１］〜［５］のいずれかに記載の細胞集団または前記［６］〜［８］のいずれかに記載の血管内皮幹細胞の使用。
［Ｎ］血管再生用医薬が、虚血および低栄養を改善する［Ｍ］に記載の使用。
［Ｏ］血管再生用医薬が、血管奇形または血管奇形に起因する血流不全を治療する［Ｍ］に記載の使用。
［Ｐ］血管再生用医薬が、臓器再生を促進する［Ｍ］に記載の使用。
［Ｑ］血管再生用医薬が、血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患を治療する［Ｍ］に記載の使用。
［Ｒ］血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である［Ｑ］に記載の使用。
［Ｓ］前記［４］に記載の細胞集団または前記［７］に記載の血管内皮幹細胞を投与する工程を含む導入遺伝子産物により改善される疾患の治療方法。
［Ｔ］導入遺伝子産物により改善される疾患の治療に使用するための前記［４］に記載の細胞集団または前記［７］に記載の血管内皮幹細胞。
［Ｕ］導入遺伝子産物により改善される疾患の治療用医薬を製造するための、前記［４］に記載の細胞集団または前記［７］に記載の血管内皮幹細胞の使用。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３９】
〔実施例１：細胞表面マーカーによるマウス肝臓血管内皮幹細胞の特定〕
マウス肝臓の血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）から取得したＳＰ細胞集団およびＭＰ細胞集団を用いて、ＭＰ細胞集団と比べＳＰ細胞集団で発現が高い遺伝子を網羅的に解析し、１００を超える遺伝子を見出した。これらの遺伝子の中から、ＳＰ細胞集団中に１０％程度存在する血管内皮幹細胞の細胞表面マーカーの特定を試みた。【００４０】
１−１  マウス肝臓血管内皮細胞の表面マーカー解析
（１）使用動物および細胞調製
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウス（通称グリーンマウス）を日本エスエルシーから購入した。８〜１２週齢のマウスを実験に使用した。麻酔下でマウスを開腹し、肝臓を摘出した。肝臓を細切した後、Ｄｉｓｐａｓｅ ＩＩ（Roche Applied Science社製）、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Wako社製）およびｔｙｐｅＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ（Worthington Biochemical Corp.社製）の混合溶液に浸漬し、３７℃で振盪して細胞外マトリックスを消化した。消化後の肝臓を孔径４０μｍのフィルターに通し、分散した細胞懸濁液を得た。ＡＣＫ（Ammonium-Chloride-Potassium）溶液（0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, and 0.1mM Na2-EDTA)で赤血球を溶血させ、残りの細胞を以下の実験に供した。【００４１】
（２）免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー解析
上記（１）で調製した細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。モノクローナル抗体として、抗ＣＤ３１抗体（clone MEC13.3, BD Biosciences社製）、抗ＣＤ４５抗体（Clone 30-F11, BD Biosciences社製)、抗ＣＤ１５７抗体（clone BP3, Biolegend社製）、抗ＣＤ２００抗体（clone OX90, Biolegend社製）を使用した。フローサイトメトリー解析において死細胞を除去するために、染色した細胞にＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（PI, 2μg/mL, Sigma-Aldrich社製）を加え死細胞の核を染色した。フローサイトメトリー解析には、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ＳＯＲＰ（BD Bioscience社製）およびＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Treestar Software社製）を使用した。【００４２】
（３）結果
結果を図１に示した。（Ａ）のドットプロットの枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を肝臓の血管内皮細胞として回収した。続いて回収した細胞におけるＣＤ１５７発現量（Ｘ軸）とＣＤ２００発現量（Ｙ軸）を解析した結果を（Ｂ）のドットプロットに示した。その結果、肝臓の血管内皮細胞は、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性の画分Ａ、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性の画分ＢおよびＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性の画分Ｃの３つの画分に分かれることが明らかになった。そこで、各画分をそれぞれ回収し、以下の実験を行った。【００４３】
１−２  ＣＤ１５７およびＣＤ２００で分画した細胞のコロニー形成アッセイ
（１）実験方法
画分Ａ（ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性）、画分Ｂ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性）および画分Ｃ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性）の細胞を２４ウェル培養プレートに播種した。ＯＰ９ストローマ細胞（RIKEN cell bank）をフィーダー細胞とし、それぞれ５０００個／ウェルを播種した。培地には、１０％ＦＣＳおよびＶＥＧＦ（10 ng/mL; PeproTech社製）を含むＲＰＭＩ培地（Sigma-Aldrich Japan）を用いた。１０日間培養後、ウェルの細胞を固定して、抗ＣＤ３１抗体（BD Biosciences社製）で染色した。なお、画分Ａの細胞集団が本発明の第２の細胞集団であり、画分Ａと画分Ｂの混合細胞集団が本発明の第１の細胞集団である。【００４４】
（２）結果
結果を図２に示した。左は画分Ｃ、中央は画分Ｂ、右は画分Ａの結果である。画分ＡのＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞は、ＣＤ３１陽性の大型のコロニーを多数形成した。画分ＢのＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性細胞は、コロニー形成能を有しているが、コロニーの大きさや数は、画分Ａの細胞に及ばなかった。画分ＣのＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性細胞は、ＣＤ３１陽性細胞として生存していたが、コロニー形成能はほぼ消失していた。これらの結果から、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞（画分Ａ）が血管内皮細胞幹細胞画分であり、この細胞からスタートして、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性（画分Ｂ）の幹細胞機能を一部残した血管内皮前駆細胞へ分化し、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性の成熟血管内皮細胞に終末分化すると考えられた。すなわち、本発明の第２の細胞集団は血管内皮細胞幹細胞を主とする細胞集団、本発明の第１の細胞集団は血管内皮細胞幹細胞と、幹細胞機能を一部残した血管内皮前駆細胞との混合細胞集団であると考えられた。【００４５】
１−３  肝血管障害モデルマウスを用いた幹細胞能の確認
（１）肝血管障害モデルマウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにモノクロタリン（Sigma-Aldrich 社製）を３００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与し、同日に３０ｒａｄｓ／ｇの放射線を全身照射して、肝血管障害モデルマウスを作製した。【００４６】
（２）実験方法
Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスの肝臓から回収した画分Ａ（ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性）、画分Ｂ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性）および画分Ｃ（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性）の細胞を使用した。各画分の細胞２×１０４個を、それぞれ肝血管障害モデルマウスの脾静脈から肝臓に移植した。移植後４週間目に、麻酔下でマウスを開腹し、肝臓を蛍光実体顕微鏡（Leica社製）で観察した。さらに、肝臓を摘出して上記１−１（１）に記載の方法で細胞懸濁液を調製し、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ１５７抗体および抗ＣＤ２００抗体で免疫蛍光染色して、フローサイトメトリー解析を行った。【００４７】
（３）結果
結果を図３に示した。左側は肝臓の蛍光実体顕微鏡観察像である。画分ＡのＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞を移植した肝臓（上段）では、ＧＦＰ陽性領域が非常に広く、ＧＦＰ陽性の移植細胞が無数の血管領域を構築していることが明らかになった。画分ＢのＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性細胞を移植した肝臓（中段）のＧＦＰ陽性領域は、画分Ａの細胞を移植した場合より小さかった。すなわち、画分Ｂの細胞は、血管領域を構築する能力を維持しているが、その能力は画分Ａの細胞より劣っていることが明らかになった。画分ＣのＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性細胞を移植した肝臓（下段）では、移植した細胞がＧＦＰ陽性細胞として生存していることのみが観察され、画分Ｃの細胞には新たな血管領域を構築する能力はないことが明らかになった。【００４８】
各画分の細胞を移植した肝臓からＧＦＰ陽性ＣＤ３１陽性細胞（移植した細胞由来の細胞）を回収し（中央）、回収した細胞におけるＣＤ１５７発現量（Ｘ軸）とＣＤ２００発現量（Ｙ軸）のドットプロットを右側に示した。画分ＡのＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞を移植した肝臓（上段）では、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞から、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性細胞、さらにＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性細胞に分化が進行していることが明らかになった。画分ＢのＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性細胞を移植した肝臓（中段）では、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性細胞に分化が進行していることが明らかになった。画分ＣのＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性細胞を移植した肝臓（下段）では、移植した細胞がＧＦＰ陽性細胞として生存していることが明らかになった。【００４９】
１−４  小括
以上の解析結果から、血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）をＣＤ１５７とＣＤ２００によって分画すると、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性の血管内皮細胞が、幹細胞として血管形成に大いに貢献できる細胞であることが判明した。当該ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性の血管内皮幹細胞が分化して、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陽性になった細胞は、幹細胞には及ばないが、未だ増殖能を保有した細胞（一部幹細胞機能を残した、いわゆる血管内皮前駆細胞）であり、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性となった細胞は、増殖活性が極めて減弱している終末分化した血管内皮細胞であると考えられた。この研究成果により、本発明者らは、血管内皮細胞の中に階層性が存在し、血管内皮幹細胞から血管内皮前駆細胞、さらに終末分化した血管内皮細胞への分化系譜を血管システムが有していることを、世界で初めて発見した。
なお、データを示していないが、本発明者らは、移植したＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞により形成された血管は、移植後１年を経過したマウスでも減少することなく残存していることを確認している。【００５０】
〔実施例２：ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞移植による血友病の治療〕
幹細胞は、未分化性を維持しつつ、終末分化した体細胞を継続的に産生していくことから、血管内皮幹細胞と考えられるＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞を移植すれば、長期的に血管内皮細胞として貢献し続けることが期待できる。それゆえ、血管内皮細胞の機能不全に起因する疾患患者にこの細胞を移植すれば、当該疾患を完治できる可能性があると考えられる。そこで、血友病Ａモデルマウスの肝臓に正常なＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞を移植し、血友病Ａモデルマウスの出血傾向を抑制できるかについて検討した。【００５１】
（１）実験方法
血友病Ａモデルマウス（凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子欠損マウス）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞およびＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスの肝臓から、実施例１の１−１に記載の方法で調製した。血友病Ａモデルマウスの肝臓に、Ｃ５７ＢＬ／６−ＴｇマウスのＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞およびＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞をそれぞれ脾静脈から移植し、６週間後に採血し血漿を回収した。これら以外に、野生型マウス、凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子ヘテロ欠損マウス、細胞を移植していない凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子欠損マウスからも採血を行い、血漿を回収した。血漿中の凝固第ＶＩＩＩ因子の測定には、Ｔｈｒｏｍｂｏｃｈｅｃｋ ＦＶＩＩＩ ｋｉｔ（Sysmex Corporation社製）を使用した。【００５２】
ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病ＡモデルマウスおよびＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスについては、移植から６週間後に麻酔下で開腹し、肝臓を摘出した。摘出した肝臓は、定法に従い凍結切片を作製し、抗ＥＧＦＰ抗体および抗ＣＤ３１抗体で染色して、ＥＧＦＰ陽性ＣＤ３１陽性細胞の存在を蛍光顕微鏡で観察した。さらに、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスと細胞を移植していない血友病Ａモデルマウスの尾を切断し、１分毎に浸み出した血液を濾紙に吸着させ、止血するまでの時間を記録した。【００５３】
（２）結果
ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスの肝臓の凍結切片を抗ＥＧＦＰ抗体および抗ＣＤ３１抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を図４に示した。移植されたＥＧＦＰ陽性の血管内皮細胞によって血管が構築されており、類洞様血管網がＥＧＦＰ陽性の血管によって置き換わっていることが明らかになった。【００５４】
血漿中の凝固第ＶＩＩＩ因子の測定結果を図５に示した（N=4、Student T test）。各測定値は、標準血漿の凝固第ＶＩＩＩ因子の測定値を１００％とする相対値で示した。血友病Ａモデルマウスの血漿中に凝固第ＶＩＩＩ因子は検出されなかったが、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスでは、野生型マウスの約７０％レベルの凝固第ＶＩＩＩ因子が検出された。このレベルは、凝固第ＶＩＩＩ因子遺伝子ヘテロ欠損マウスの凝固第ＶＩＩＩ因子レベルより高いものであった。一方、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスでは、凝固第ＶＩＩＩ因子の発現はほとんど回復しなかった。【００５５】
ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスと細胞を移植していない血友病Ａモデルマウスの出血時間を測定した結果を図６に示した。（Ａ）が細胞を移植していない血友病Ａモデルマウスの結果、（Ｂ）がＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスの結果である。細胞を移植していない血友病Ａモデルマウスは、６０分経過後も止血しなかったのに対して、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植した血友病Ａモデルマウスは、５分弱で止血した。
これらの結果から、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞（血管内皮幹細胞）の移植は、血管内皮細胞の機能不全に起因する疾患の治療に有効であることが明らかになった。【００５６】
〔実施例３：ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞移植による肝再生〕
近年、血管内皮細胞から分泌される分子が、組織の恒常性維持や組織再構築に重要な機能を果たすことが報告されており、肝臓についても肝臓の類洞血管の血管内皮細胞による肝細胞の維持機構が明らかにされている。ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞は、肝臓の類洞血管の形成に大きく貢献することが明らかになったため、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞の移植により、肝臓の再生が促進するかどうかを検討した。【００５７】
３−１  肝再生実験１
（１）実験方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して定法に従い７０％部分肝切除術を行った。ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞およびＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスの肝臓から、実施例１の１−１に記載の方法で調製した。７０％部分肝切除したマウスの肝臓に、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞およびＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞を、それぞれ脾静脈を介して移植し、８日後に麻酔下でマウスから肝臓を取り出し、重量を測定した。【００５８】
（２）結果
データを示していないが、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を移植したマウスは、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞を移植したマウスに比べ肝臓の再生が促進されていることが明らかになった。したがって、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞（血管内皮幹細胞）の移植は、例えば肝線維症、肝硬変などの疾患の治療に有効であると考えられる。【００５９】
３−２  肝再生実験２
（１）実験方法
Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスの肝臓から、実施例１の１−１（１）に記載の方法で細胞懸濁液を調製した。得られた細胞にヘキスト染色と免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。ヘキスト染色は、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液に、ヘキスト染色液（2% FBS (Sigma-Aldrich), 1mM HEPES (Gibco), 5μg/mL Hoechst33342 (Sigma-Aldrich)含有DMEM (Sigma-Aldrich)）を添加して、３７℃で９０分間行った。免疫蛍光染色には、実施例１で使用した抗ＣＤ３１抗体および抗ＣＤ４５抗体と同じモノクローナル抗体を使用した。染色した細胞にＰＩ（2μg/mL, Sigma-Aldrich社製）を加え死細胞の除去を行った。ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＰＩ陰性細胞（死細胞を除去した血管内皮細胞）を回収し、ヘキスト解析をフローサイトメーターで行った。フローサイトメトリー解析には、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ＳＯＲＰ（BD Bioscience社製）およびＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Treestar Software社製）を使用した。ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性でヘキスト染色されない細胞をＳＰ細胞集団として回収し、ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性でヘキスト染色される細胞をＭＰ細胞集団として回収した。ＳＰ細胞集団の約７０％はＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性であり、ＭＰ細胞集団にはＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性はほとんど含まれないことが本発明者らにより確認されている。【００６０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して定法に従い７０％部分肝切除術を行った。ＳＰ細胞集団およびＭＰ細胞集団の細胞それぞれ２×１０４個を、７０％部分肝切除したマウスの肝臓に脾静脈を介して移植した。７日後に麻酔下でマウスから肝臓を摘出し、重量を測定し、蛍光顕微鏡で観察した。【００６１】
摘出した肝臓から実施例１の１−１に記載の方法で、ＧＦＰ陽性血管内皮細胞（ＧＦＰ陽性ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を調製した。この移植後のＧＦＰ陽性血管内皮細胞と、移植前のＳＰ細胞集団の細胞（各１×１０４個）から、ＲＮＡｅａｓｙ ｋｉｔ（Qiagen社）を用いてそれぞれトータルＲＮＡを調製し、ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られた移植前後のｃＤＮＡ（ＰｒｅおよびＰｏｓｔ）を試料として、Ｗｎｔ２とＨＧＦのｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法によって解析した。肝臓内の、血管内皮細胞は、肝臓に対してＷｎｔ２やＨＧＦなどのサイトカインを分泌して肝細胞の長期的な維持、あるいは肝臓の再生に関わることが知られているからである。対照として解糖系酵素であるＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のｍＲＮＡの発現量を測定した。リアルタイムＰＣＲには、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＭＸ３０００Ｐ（Stratagene社製）を用いた。リアルタイムＰＣＲに用いたプライマーは以下のとおりである。
Ｗｎｔ２
5'-AAGGACAGCAAAGGCACCTT-3'（配列番号１）
5'-GAGCCACTCACACCATGACA-3'（配列番号２）
ＨＧＦ
5'-ACCCTGGTGTTTCACAAGCA-3'（配列番号３）
5'-CAAGAACTTGTGCCGGTGTG-3'（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ
5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'（配列番号５）
5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3'（配列番号６）【００６２】
（２）結果
蛍光顕微鏡による観察結果を図７に示した。（Ａ）がＳＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓の結果、（Ｂ）がＭＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓の結果である。ＳＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓ではＧＦＰ陽性細胞が血管を形成していることが観察されたが、ＭＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓ではＧＦＰ陽性細胞がほとんど観察されなかった。【００６３】
肝重量を測定した結果を図８に示した（N=6、Student T test）。ＳＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓の重量は、ＭＰ細胞集団の細胞を移植した肝臓の重量より重く、ＳＰ細胞集団の細胞の移植により肝臓の再生が促進していることが判明した。【００６４】
移植前のＳＰ細胞集団の細胞および移植後のＧＦＰ陽性ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性血管内皮細胞における、Ｗｎｔ２およびＨＧＦのｍＲＮＡ発現量の結果を図９に示した（N=3、Student T test）。（Ａ）がＷｎｔ２の結果、（Ｂ）がＨＧＦの結果である。Ｗｎｔ２およびＨＧＦとも、移植前（Ｐｒｅ）より移植後（Ｐｏｓｔ）の発現が上昇していることが判明した。【００６５】
これらの結果から、血管内皮幹細胞の肝臓への移植は、例えば肝線維症、肝硬変などの疾患の治療に有効であると考えられる。【００６６】
〔実施例４：肝臓以外の臓器におけるＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞〕
肝臓では、ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞を指標として、臓器内の血管内皮幹細胞を単離できることが判明した。そこで、肝臓以外の臓器においても、このような血管内皮幹細胞が存在するかどうかを検討した。【００６７】
（１）実験方法
８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから、網膜、脳、心臓、皮膚、筋肉、肺を採取した。実施例１の１−１（１）に記載の方法で細胞懸濁液をそれぞれ調製した。各細胞懸濁液を抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ１５７抗体および抗ＣＤ２００抗体で免疫蛍光染色して、ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性細胞（ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞）およびＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性細胞（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞）を回収した。これらの細胞を用いて、実施例１の１−２（１）に記載の方法で、コロニー形成アッセイを行った。【００６８】
（２）結果
結果を図１０に示した。（Ａ）は網膜、（Ｂ）は脳、（Ｃ）は心臓、（Ｄ）は皮膚（真皮）、（Ｅ）は筋組織、（Ｆ）は肺の結果である。いずれの臓器においても、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を回収することができ、この細胞はＣＤ３１陽性の大型のコロニーを多数形成した。一方、ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性血管内皮細胞のコロニー形成能は乏しいものであった。
血管は臓器において特徴的な構造を維持し、その臓器の機能を支持している。したがって、各臓器の血管内皮幹細胞は当該臓器の再生を誘導し得ると考えられる。【００６９】
〔実施例５：遺伝子導入された血管内皮幹細胞の移植〕
遺伝子導入された血管内皮幹細胞を移植することで、移植された血管内皮幹細胞およびそれから分化した血管内皮細胞が、導入された遺伝子産物を継続的かつ持続的に発現するかどうかを検討した。【００７０】
（１）実験方法
実施例１の１−１に記載の方法で、Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスの肝臓から、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を調製した。このＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞２００個を、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを添加した４０００μＬの４％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Sigma-Aldrich）含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ThermoFisher）に懸濁した。ピペットマン（商品名、GILSON）を用いて２０μＬの細胞懸濁液を９６ウェルプレート（ThermoFisher）に分注した。１個の細胞が入っているウェルを顕微鏡（DM IL LED、Leica）で肉眼的に選別して、さらに蛍光顕微鏡（DMi8、Leica）でＧＦＰが発現していることを確認した。【００７１】
レシピエントとしてＣ５７ＢＬ／６マウス（日本ＳＬＣ社）を用いた。ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞１個を含む２０μＬの溶液を注射針付注射筒を用いてレシピエントマウスの肝臓に経皮的に直接注入した。１か月後にレシピエントマウスを麻酔下で開腹して実体蛍光顕微鏡（MZ 16 FA、Leica）を用いて肝臓の観察を行い、その後安楽死させて肝臓を摘出した。ＧＦＰ陽性血管コロニーを含む部分を顕微鏡下で切除して、蛍光免疫染色およびフローサイトメーターを用いて解析した。蛍光免疫染色は、４％パラホルムアルデヒド（Wako）で固定した後、抗ＧＦＰ抗体（MBL）および抗ＣＤ３１抗体（Clone 30-F11, BD Biosciences社製）で染色し、ＳＹＴＯＸ ｏｒａｎｇｅ（ThermoFisher）で核染色を行い、共焦点顕微鏡（Leica）で観察した。細胞懸濁液の調製は実施例１の１−１（１）と同じ方法で行い、フローサイトメトリー解析は、実施例１の１−１（２）と同じ方法で行った。【００７２】
（２）結果
レシピエントマウスの肝臓の実体蛍光顕微鏡画像を図１１に示した。ＧＦＰの発現を維持している血管構造が観察された。【００７３】
レシピエントマウスの肝臓を免疫蛍光染色し共焦点顕微鏡で観察した結果を図１２に示した。（Ａ）が抗ＧＦＰ抗体で染色した結果、（Ｂ）が抗ＣＤ３１抗体結果、下段は上段の点線枠内（類洞周囲）の拡大画像である。ＧＦＰを発現しているＣＤ３１陽性細胞が観察された。【００７４】
フローサイトメトリー解析の結果を図１３に示した。ＧＦＰ陽性の血管内皮細胞（ＣＤ１５７陰性ＣＤ２００陰性）が多数存在することが示された。また、ＧＦＰ陽性の血管内皮幹細胞（ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性）も増殖していることが示された。【００７５】
これらの結果から、１個の血管内幹細胞であっても、定着すれば、長期的に血管内皮細胞および血管内皮幹細胞として生体内で維持することができること、その際に、移植する血管内皮幹細胞から目的分子が分泌されるように、目的分子をコードする遺伝子を導入した血管内皮幹細胞を移植することで、疾患の治療に有用な目的分子を生体で長期間発現し得ることが証明された。【００７６】
〔実施例６：ヒト肝臓における血管内皮幹細胞の確認〕
マウスの肝臓で確認された血管内皮幹細胞が、ヒトにも存在するかどうかを検討した。【００７７】
６−１  ヒト肝臓血管内皮細胞の表面マーカー解析
（１）実験方法
ヒト肝臓組織を用いて、実施例１の１−１（１）に記載の方法で細胞懸濁液を調製した。続いて実施例１の１−１（２）に記載の方法で、得られた細胞に免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。【００７８】
（２）結果
結果を図１４に示した。（Ａ）のドットプロットの枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を肝臓の血管内皮細胞として回収した。続いて回収した細胞におけるＣＤ１５７発現量（Ｘ軸）とＣＤ２００発現量（Ｙ軸）を解析した結果を（Ｂ）のドットプロットに示した。図１４（Ｂ）に示されたように、ヒト肝臓の血管内皮細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）は、ＣＤ２００の発現量により、ＣＤ２００陰性とＣＤ２００陽性の２つの画分に分かれることが示された。一方、ＣＤ１５７陽性細胞数は非常に少ないが存在することが確認された。【００７９】
６−２  ＣＤ２００で分画した血管内皮細胞のコロニー形成アッセイ
（１）実験方法
図１４（Ｂ）のＣＤ２００陽性画分（本発明の第１の細胞集団：ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陽性細胞）およびＣＤ２００陰性画分（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陰性細胞）をそれぞれ回収し、実施例１の１−２（１）に記載の方法で、コロニー形成アッセイを行った。【００８０】
（２）結果
結果を図１５に示した。（Ａ）がＣＤ２００陽性画分の結果、（Ｂ）がＣＤ２００陰性画分の結果である。（Ｂ）のＣＤ２００陰性画分には、ＣＤ３１陽性のコロニーを形成する細胞は存在しなかったが、（Ａ）のＣＤ２００陽性画分には、ＣＤ３１陽性のコロニーを形成する細胞が含まれることが示された。すなわち、ヒト肝臓のＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＣＤ２００陽性細胞には、血管内皮細胞コロニー形成能を有する血管内皮幹細胞が含まれることが明らかになった。なお、本実施例ではＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞（本発明の第２の細胞集団）の細胞数が少なかったため、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞を用いてコロニー形成アッセイを行わなかったが、ヒトの場合もマウスと同様に、ＣＤ１５７陽性ＣＤ２００陽性血管内皮細胞集団（本発明の第２の細胞集団）は血管内皮細胞幹細胞を主とする細胞集団であると考えられる。【００８１】
以上の結果から、血管内皮幹細胞は哺乳動物に共通して存在しており、種々の臓器の血管形成に大きく貢献し、ヒトの各種疾患においてもこの血管内皮幹細胞の移植による治療が有効であると考えられる。【００８２】
〔実施例７：ヒト血管内皮細胞におけるＣＤ１５７陽性の確認〕
マウスでは、いずれの臓器、器官、組織においても血管内皮幹細胞はＣＤ１５７を発現していることが明らかになった（実施例４）。ヒトの肝臓においては、ＣＤ２００陽性細胞中に血管内皮幹細胞の存在が確認されたが、ＣＤ１５７陽性細胞の存在は明確ではなかった。そこで、肝臓以外のヒト組織にＣＤ１５７陽性血管内皮細胞の存在を確認できるかどうか検討した。【００８３】
（１）実験方法
ヒト腎臓組織およびヒト胎盤組織から、実施例１の１−１（１）に記載の方法で、それぞれ細胞懸濁液を調製した。得られた細胞に、抗ＣＤ３１抗体（clone WM59, BioLegend社製）、抗ＣＤ４５抗体（Clone HI30, BioLegend社製)および抗ＣＤ１５７抗体（clone SY11B5, BD社製）を用いて免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。フローサイトメトリー解析には、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ＳＯＲＰ（BD Bioscience社製）およびＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Treestar Software社製）を使用した。【００８４】
（２）実験結果
ヒト腎臓組織の結果を図１６に、ヒト胎盤組織の結果を図１７にそれぞれ示した。図１６および１７とも、（Ａ）は抗ＣＤ３１抗体と抗ＣＤ４５抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果であり、（Ｂ）は（Ａ）の枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）中のＣＤ１５７陽性細胞のフローサイトメトリー解析を行った結果である。腎臓および胎盤共に、（Ａ）の枠内の細胞（ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性細胞）を抗ＣＤ１５７抗体で染色してフローサイトメトリー解析を行った結果、ＣＤ１５７陽性血管内皮幹細胞画分の存在が観察された。【００８５】
〔実施例８：ヒト血管内皮細胞におけるＳＰ細胞集団の確認〕
本発明者らは、マウス血管内皮細胞中にｓｉｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞（ＳＰ細胞集団）が存在することを確認している（非特許文献１）。しかし、ヒト組織においては、血管内皮細胞中にＳＰ細胞集団が存在することは未だ確認されていない。そこで、ヒト組織においても、血管内皮細胞中にＳＰ細胞集団の存在を確認できるかどうか検討した。【００８６】
（１）実験方法
ヒト皮膚組織から、実施例１の１−１（１）に記載の方法で細胞懸濁液を調製した。得られた細胞にヘキスト染色と免疫蛍光染色を行い、フローサイトメトリー解析を行った。ヘキスト染色は、１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液に、ヘキスト染色液（2% FBS (Sigma-Aldrich), 1mM HEPES (Gibco), 5μg/mL Hoechst33342 (Sigma-Aldrich)含有DMEM (Sigma-Aldrich)）を添加して、３７℃で９０分間行った。免疫蛍光染色には、抗ＣＤ３１抗体（clone WM59, BioLegend社製）および抗ＣＤ４５抗体（Clone HI30, BioLegend社製）を使用した。染色した細胞にＰＩ（2μg/mL, Sigma-Aldrich社製）を加え死細胞の除去を行った。ＣＤ３１陽性ＣＤ４５陰性ＰＩ陰性細胞（死細胞を除去した血管内皮細胞）を回収し、ヘキスト解析をフローサイトメーターで行った。フローサイトメトリー解析には、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ ＳＯＲＰ（BD Bioscience社製）およびＦｌｏｗＪｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Treestar Software社製）を使用した。【００８７】
（２）実験結果
結果を図１８に示した。ヒト皮膚組織にＳＰ細胞集団画分（破線枠内）が存在することを確認した。【００８８】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
2019098264.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年5月15日(2019.5.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面マーカーＣＤ３１およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になり、血管内皮幹細胞を８〜１０％含む細胞集団。
【請求項２】
細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になり、血管内皮幹細胞を２０〜４０％含む細胞集団。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞が導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである請求項１〜３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５】
細胞表面マーカーＣＤ３１が陽性、ＣＤ１５７およびＣＤ２００の少なくとも一方が陽性、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞。
【請求項６】
導入遺伝子を発現する請求項５に記載の血管内皮幹細胞。
【請求項７】
哺乳動物がヒトである請求項５または６に記載の血管内皮幹細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞集団または請求項５〜７のいずれかに記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬。
【請求項９】
血管再生用、虚血改善用、低栄養改善用、血管奇形治療用、血管奇形に起因する血流不全改善用、臓器再生促進用、または血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の予防および／または治療用である請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
請求項３に記載の細胞集団または請求項６に記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする導入遺伝子産物により改善される疾患の予防および／または治療用医薬。
【請求項１２】
導入遺伝子産物により改善される疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、がん、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、リウマチ、認知症、糖尿病、高血圧症、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肥満または感染症である請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
被験物質の血管に対する毒性を評価する方法であって、
（１）被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて請求項１〜４のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
（２）培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
（３）被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする毒性評価方法。
【請求項１４】
単離した臓器を消化・分散して細胞懸濁液を調製する工程（Ｉ）と、ＣＤ３１が陽性、ＣＤ１５７およびＣＤ２００の少なくとも一方が陽性、ＣＤ４５が陰性である細胞を回収する工程（ＩＩ）を含むことを特徴とする血管内皮幹細胞の調製方法。
【請求項１５】
前記工程（ＩＩ）において、ＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性、ＣＤ４５が陰性である細胞を回収することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面マーカーＣＤ３１およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になり、血管内皮幹細胞を８〜１０％含む細胞集団。
【請求項２】
細胞表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性であり、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物細胞から本質的になり、血管内皮幹細胞を２０〜４０％含む細胞集団。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞が導入遺伝子を発現する血管内皮幹細胞を含む請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項４】
哺乳動物がヒトである請求項１〜３のいずれかに記載の細胞集団。
【請求項５】
細胞表面マーカーＣＤ３１が陽性、ＣＤ１５７およびＣＤ２００の少なくとも一方が陽性、ＣＤ４５が陰性である哺乳動物の血管内皮幹細胞。
【請求項６】
導入遺伝子を発現する請求項５に記載の血管内皮幹細胞。
【請求項７】
哺乳動物がヒトである請求項５または６に記載の血管内皮幹細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の細胞集団または請求項５〜７のいずれかに記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする医薬。
【請求項９】
血管再生用、虚血改善用、低栄養改善用、血管奇形治療用、血管奇形に起因する血流不全改善用である請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
臓器再生促進用である請求項８に記載の医薬。
【請求項１１】
血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患の予防および／または治療用である請求項８に記載の医薬。
【請求項１２】
血管内皮細胞から分泌される分子の異常に起因する疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、高血圧、耐糖能異常症、脂質代謝異常症、メタボリックシンドロームまたは骨粗鬆症である請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
請求項３に記載の細胞集団または請求項６に記載の血管内皮幹細胞を有効成分とする導入遺伝子産物により改善される疾患の予防および／または治療用医薬。
【請求項１４】
導入遺伝子産物により改善される疾患が、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、がん、加齢黄斑変性症、自己免疫疾患、リウマチ、認知症、糖尿病、高血圧症、糖尿病性腎症、骨粗鬆症、肥満または感染症である請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
被験物質の血管に対する毒性を評価する方法であって、
（１）被験物質を含有する培地および被験物質を含有しない培地を用いて請求項１〜４のいずれかに記載の細胞集団を培養する工程と、
（２）培養後の細胞増殖レベルを測定する工程と、
（３）被験物質を含有する培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルを、被験物質を含有しない培地を用いて培養した場合の細胞増殖レベルと比較する工程
を含むことを特徴とする毒性評価方法。
【請求項１６】
単離した臓器を消化・分散して細胞懸濁液を調製する工程（Ｉ）と、ＣＤ３１が陽性、ＣＤ１５７およびＣＤ２００の少なくとも一方が陽性、ＣＤ４５が陰性である細胞を回収する工程（ＩＩ）を含むことを特徴とする血管内皮幹細胞の調製方法。
【請求項１７】
前記工程（ＩＩ）において、ＣＤ３１、ＣＤ１５７およびＣＤ２００が陽性、ＣＤ４５が陰性である細胞を回収することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【国際調査報告】
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