(57)【要約】  腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターからなる、腎尿細管細胞特異的に前記遺伝子を発現させるためのベクター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターからなる、腎尿細管細胞特異的に前記遺伝子を発現させるためのベクター。
【請求項２】
前記プロモーターが、ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｔｙｐｅ  ２ａ（ＮＰＴ２ａ）、ｓｏｄｉｕｍ−ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−２−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＮＫＣＣ２）、ａｑｕａｐｏｒｉｎ２（ＡＱＰ２）、ｓｏｄｉｕｍ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＮＣＣ）及びｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ（ＥＮａＣ）からなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記遺伝子が、ＮＰＴ２ａ、ＮＫＣＣ２、ＡＱＰ２、ＮＣＣ及びＥＮａＣからなる群より選択される遺伝子である、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
血流を遮断した腎臓の腎動脈へのボーラス注入により投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
遺伝性尿細管疾患の遺伝子治療用である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎尿細管細胞特異的発現ベクターに関する。本願は、２０１７年９月１日に、日本に出願された特願２０１７−１６８９２４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
腎尿細管は、腎臓における糸球体から集合管に至るまでの組織である。腎尿細管を原尿が通る過程で再吸収・分泌等を受ける。腎尿細管には、糸球体側から順に、近位尿細管、ヘンレループ、太いヘンレ係蹄脚、遠位尿細管、集合管等と呼ばれる部位が存在し、個々の部位ごとに形状・機能が異なっている。【０００３】
遺伝性尿細管疾患には、バーター症候群、ギテルマン症候群、リドル症候群等が知られている。例えば、バーター症候群は、太いヘンレ係蹄脚の機能不全を特徴とする疾患であり、主に小児が発症する。バーター症候群の症状としては、低カリウム血症、代謝性アルカローシス、血圧低下等が挙げられる。バーター症候群の原因の１つとして、カルシウム感知受容体（ｃａｌｃｉｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣａＳＲ）の遺伝子変異による機能亢進が知られている。【０００４】
現在、バーター症候群を始めとする遺伝性尿細管疾患には、根本的な遺伝子治療はなされておらず、対症療法を行っているに過ぎない。このため、患者のＱＯＬは著しく低く、合併症による腎及び全身に及ぼす影響は多大であり、早急な解決が求められている。このため、腎尿細管細胞特異的に遺伝子を発現させる技術の開発が必要である。【０００５】
例えば、非特許文献１には、腎尿細管の太いヘンレ係蹄脚特異的に発現するｓｏｄｉｕｍ−ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−２−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（Ｎｋｃｃ２）遺伝子のプロモーターをクローニングして解析したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Igarashi P., et al., Cloning and kidney cell-specific activity of the promoter of the murine renal Na-K-C1 cotransporter gene., J. Biol. Chem., 271 (16), 9666-9674, 1996.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腎尿細管細胞特異的に遺伝子を発現させるためのベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターからなる、腎尿細管細胞特異的に前記遺伝子を発現させるためのベクター。
［２］前記プロモーターが、ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｔｙｐｅ  ２ａ（ＮＰＴ２ａ）、ｓｏｄｉｕｍ−ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−２−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＮＫＣＣ２）、ａｑｕａｐｏｒｉｎ２（ＡＱＰ２）、ｓｏｄｉｕｍ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（ＮＣＣ）、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｏｄｉｕｍ−ｃｈａｎｎｅｌ（ＥＮａＣ）等からなる群より選択される遺伝子のプロモーターである、［１］に記載のベクター。
［３］前記遺伝子が、ＮＰＴ２ａ、ＮＫＣＣ２、ＡＱＰ２、ＮＣＣ、及びＥＮａＣからなる群より選択される遺伝子である、［１］又は［２］に記載のベクター。
［４］血流を遮断した腎臓の腎動脈へのボーラス注入により投与される、［１］〜［３］のいずれかに記載のベクター。
［５］遺伝性尿細管疾患の遺伝子治療用である、［１］〜［４］のいずれかに記載のベクター。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、腎尿細管細胞特異的に遺伝子を発現させるためのベクターを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４において、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓の免疫組織化学解析の結果を示す写真である。（ｃ）及び（ｄ）は、実験例４において、ＮＫＣＣ２ｐｖｕ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓の免疫組織化学解析の結果を示す写真である。（ｅ）及び（ｆ）は、実験例４において、ＮＫＣＣ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓の免疫組織化学解析の結果を示す写真である。
【図２】（ａ）〜（ｄ）は、実験例４において、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓を免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、実験例５において、ＮＰＴ２ａ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓の免疫組織化学解析の結果を示す写真である。
【図４】（ａ）〜（ｄ）は、実験例５において、ＮＰＴ２ａ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓を免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（ａ）は、核を検出した結果を示す写真であり、（ｂ）は、ＥＧＦＰを検出した結果を示す写真であり、（ｃ）は、内在性のＮＨＥ３タンパク質を検出した結果を示す写真であり、（ｄ）は、（ａ）〜（ｃ）を合成した写真である。
【図５】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６において、ＡＱＰ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓の免疫組織化学解析の結果を示す写真である。
【図６】（ａ）〜（ｄ）は、実験例６において、ＡＱＰ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入したラットの腎臓を免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。（ａ）は、核を検出した結果を示す写真であり、（ｂ）は、ＥＧＦＰを検出した結果を示す写真であり、（ｃ）は、内在性のＡＱＰ２タンパク質を検出した結果を示す写真であり、（ｄ）は、（ａ）〜（ｃ）を合成した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［腎尿細管細胞特異的発現ベクター］
１実施形態において、本発明は、腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターからなる、腎尿細管細胞特異的に前記遺伝子を発現させるためのベクターを提供する。
【００１２】
実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態のベクターを用いることにより、インビボで腎尿細管細胞特異的に所望の遺伝子を発現させることに成功した。これは、腎尿細管細胞特異的に所望の遺伝子を発現させることに成功した初めての例である。
【００１３】
したがって、本実施形態のベクターは、ヒト又は動物において、腎尿細管細胞特異的に所望の遺伝子を発現させる用途に好適に用いることができる。
【００１４】
本実施形態のベクターにおいて、腎尿細管細胞特異的プロモーターとしては、例えば、ＮＰＴ２ａ、ＮＫＣＣ２、ＡＱＰ２、ＮＣＣ、ＥＮａＣ等の遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００１５】
ＮＰＴ２ａは、ＳＬＣ３４Ａ１とも呼ばれる遺伝子であり、近位尿細管特異的に発現する遺伝子である。また、ＮＫＣＣ２は、ＳＬＣ１２Ａ１とも呼ばれる遺伝子であり、太いヘンレ係蹄脚特異的に発現する遺伝子である。また、ＡＱＰ２は、集合管又は遠位尿細管に特異的に発現する遺伝子である。
【００１６】
腎尿細管細胞特異的プロモーターは、本実施形態のベクターを導入する対象の種由来のプロモーターであることが好ましい。しかしながら、異なる種由来のプロモーターを使用しても所望の遺伝子を発現させることは可能である。
【００１７】
実施例において後述するように、腎尿細管細胞特異的プロモーターの塩基配列は長いことが好ましい。また、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）にできるだけ近接した塩基を含むか、翻訳開始コドンを含むことが好ましい。腎尿細管細胞特異的プロモーターの長さは、例えば２ｋｂｐ以上であってもよく、例えば３ｋｂｐ以上であってもよく、例えば４ｋｂｐ以上であってもよく、例えば５ｋｂｐ以上であってもよく、例えば６ｋｂｐ以上であってもよい。
【００１８】
本実施形態のベクターにおいて、所望の遺伝子は、上記の腎尿細管細胞特異的プロモーターにより転写制御されている遺伝子が挙げられる。具体的には、ＮＰＴ２ａ、ＮＫＣＣ２、ＡＱＰ２、ＮＣＣ、ＥＮａＣ等の遺伝子であってもよい。所望の遺伝子は、本実施形態のベクターを導入する対象の種由来の遺伝子であることが好ましい。
【００１９】
所望の遺伝子は、疾患の原因となる変異を有しない遺伝子であることが好ましい。これにより、本実施形態のベクターを遺伝性尿細管疾患の遺伝子治療に用いることが可能になる。すなわち、本実施形態のベクターは、遺伝性尿細管疾患の遺伝子治療用であってもよい。
【００２０】
所望の遺伝子は、本来の腎尿細管細胞特異的プロモーターにより転写制御されている遺伝子であることが好ましい。しかしながら、腎尿細管細胞特異的プロモーターと、所望の遺伝子の組み合わせは、本来の組み合わせと異なっていてもよい。
【００２１】
ウイルスベクターとしては、一般に遺伝子導入に用いられるものであれば特に限定されず使用することができ、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターは市販されているものであってもよい。
【００２２】
ウイルスベクターとしては、なかでも、アデノウイルスベクターを好適に用いることができる。ウイルスベクターは、ウイルス増殖の観点から自己複製できないものを使用することが好ましい。
【００２３】
自己複製できないアデノウイルスベクターとしては、例えば人為的にＥ１Ａ及びＥ３領域を欠失させたもの、アデノキメラウイルス、改良型アデノウイルスベクター等が挙げられる。
【００２４】
自己複製ができないアデノウイルスベクターを使用する場合、相当する欠失領域を有するパッケージング細胞を用いて相同組換えを行なう必要がある。パッケージング細胞としては、Ｅ１ＡおよびＥ３領域を有するＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。
【００２５】
本実施形態のベクターは、血流を遮断した腎臓の腎動脈へのボーラス注入により投与されるものであることが好ましい。ボーラス注入とは急速注入のことである。ボーラス注入は、患者の腎組織に傷害を与えない程度の圧力となるように行えば特に限定されず、例えば、ウイルスベクター液１ｍＬあたり２〜３分程度で注入することが挙げられる。
【００２６】
実施例において後述するように、発明者らが様々な投与ルートを検討した結果、血流を遮断した腎臓の腎動脈へのボーラス注入により本実施形態のベクターを投与することが、腎組織への傷害も少なく、所望の遺伝子の発現効率も高いことが明らかとなった。
【００２７】
血流の遮断はクリップで血管をクランプすることにより行うことができる。腎動脈を遮断後、ウイルスベクターをボーラス注入する。また、腎動脈を遮断後、生理食塩水等の等張液を注入して腎臓内の血液を洗い流すとより感染効率が高まり好ましい。更に、ウイルスベクターを注入後、腎静脈を遮断して数分間維持することにより、ウイルスベクターの感染効率を更に向上させることができる。ここで、腎静脈を遮断する時間としては、例えば、５〜１０分程度が挙げられる。
【００２８】
本実施形態のベクターは、上述したウイルスベクターと、薬学的に許容される溶媒とを含む医薬組成物の形態に製剤化されていてもよい。薬学的に許容される溶媒としては、一般的な医薬組成物の製造に用いられるものを適宜使用することができる。
【００２９】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む遺伝性尿細管疾患の治療方法を提供する。
【００３０】
１実施形態において、本発明は、遺伝性尿細管疾患の治療のためのベクターであって、腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターを提供する。
【００３１】
１実施形態において、本発明は、遺伝性尿細管疾患の治療薬を製造するためのベクターの使用であって、前記ベクターは、腎尿細管細胞特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に連結された所望の遺伝子とを有するウイルスベクターである、使用を提供する。
【００３２】
上記各実施形態において、上記のプロモーターは、ＮＰＴ２ａ、ＮＫＣＣ２、ＡＱＰ２、ＮＣＣ及びＥＮａＣからなる群より選択される遺伝子のプロモーターであってもよい。
【００３３】
また、上記の遺伝子は、ＮＰＴ２ａ、ＮＫＣＣ２、ＡＱＰ２、ＮＣＣ及びＥＮａＣからなる群より選択される遺伝子であってもよい。ここで、これらの遺伝子は、疾患の原因となる変異を有しない遺伝子であることが好ましい。
【００３４】
また、上記のベクターは、血流を遮断した腎臓の腎動脈へのボーラス注入により投与するものであることが好ましい。
【実施例】
【００３５】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３６】
［実験例１］（プロモーターのクローニング）
ウイスターラットのゲノムＤＮＡから、Ｎｐｔ２ａ遺伝子、Ｎｋｃｃ２遺伝子及びＡｑｐ２遺伝子のプロモーターをクローニングして使用した。クローニングするプロモーター領域としては、ヒト、マウス、ラットの塩基配列データを比較し、相同性の高い領域を選択した。【００３７】
Ｎｐｔ２ａ遺伝子の５’側上流の塩基配列データとして、アクセッション番号ＥＮＳＭＵＳＧ００００００２７２０２の塩基配列データを使用した。また、Ｎｋｃｃ２遺伝子の５’側上流の塩基配列データとして、アクセッション番号ＥＮＳＲＮＯＧ００００００１５２６２の塩基配列データを使用した。また、Ａｑｐ２遺伝子の５’側上流の塩基配列データとして、アクセッション番号ＥＮＳＲＮＯＧ００００００００２９７の塩基配列データを使用した。【００３８】
《Ｎｐｔ２ａ遺伝子のプロモーター》
ウイスターラットの血液からラットゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＮｐｔ２ａ遺伝子のプロモーターをクローニングした。クローニングするプロモーター領域ができるだけ長くなるように、翻訳開始コドンにできるだけ近接した領域を含む領域を取得した。クローニングしたプロモーターは−３３７９〜＋６３０の領域であった。ここで、−１がＮｐｔ２ａ遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の直前の塩基に対応し、以下同様である。【００３９】
《Ｎｋｃｃ２遺伝子のプロモーター》
下記表１に記載の各プロモーターを使用した。表１中、ｐＮＫＣＣ２ＤＩプロモーター及びｐＮＫＣＣ２ｐｖｕプロモーターはテキサス大学南西医療センターのピーター・イガラシ博士より分与された。ｐＮＫＣＣ２プロモーターはラットゲノムＤＮＡのＰＣＲにより調製した。【００４０】
【表１】
2019045049.tif 000002
【００４１】
《Ａｑｐ２遺伝子のプロモーター》
ウイスターラットの血液からラットゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＡｑｐ２遺伝子のプロモーターをクローニングした。クローニングしたプロモーターは−５３３８〜＋９３０の領域であった。【００４２】
［実験例２］（アデノウイルスベクターの調製）
実験例１でクローニングした各プロモーターは、緑色蛍光タンパク質発現ベクターであるｐＥＧＦＰＮ１（クロンテック社）にサブクローニングし、各プロモーターの下流に緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を連結した。続いて、各プロモーター及びその下流に連結されたＥＧＦＰ遺伝子をアデノウイルスベクターであるｐＡｘＣｗｉｔ（理化学研究所バイオリソースセンター）にそれぞれサブクローニングした。下記表２に、調製したアデノウイルスベクター名及びその内容を記載した。【００４３】
【表２】
2019045049.tif 000003
【００４４】
調製した各アデノウイルスベクターは、正確に単一クローンを選択して使用した。また、各アデノウイルスベクターの塩基配列は、制限酵素による切断及び塩基配列のシークエンス解析により確認した。【００４５】
各アデノウイルスベクターを、ヒト胎児腎細胞由来の細胞株であるＨＥＫ２９３細胞に感染させ、アデノウイルスを調製した。得られたアデノウイルスの力価は１０１３ｐｆｕ／ｍＬ以上であった。【００４６】
［実験例３］（投与ルートの検討）
アデノウイルスベクターを静脈投与により生体に投与した場合、９５％以上が肝臓にトラップされてしまう。そこで、アデノウイルスベクターを腎臓に特異的に感染させるための投与ルートの検討を行った。具体的には、８〜１０週齢のラットを用いて、以下の投与ルートによりアデノウイルスベクターを投与し検討した。実験は、動物実験委員会の承認を得て行い、４３匹のラットを本実験に使用した。【００４７】
《腎動脈へのボーラス投与》
まず、ラットの腹部大動脈と左腎動脈の間をクリップでクランプして血流を遮断した。続いて、１ｍＬの生理食塩水を２分間かけて左腎動脈に注入した。これにより、腎臓内の血液が洗い流された。続いて、１ｍＬのアデノウイルスベクター液を２分間かけて左腎動脈に注入した。続いて、腎静脈をクリップでクランプして血流を遮断し１０分間維持した。これにより、アデノウイルスベクターが腎臓内に留まり、腎細胞に効率よく感染した。その後、クリップをはずし、血流を再開させた。【００４８】
《腎動脈への緩徐な投与》
ラットの腎動脈にアデノウイルスベクター液１ｍＬを１６時間かけて緩徐に注入した。【００４９】
《膀胱への投与》
ラットの膀胱にアデノウイルスベクター液１ｍＬを注入した。その結果、アデノウイルスベクターは尿管を逆流して腎細胞に感染することが期待された。【００５０】
《腎実質への投与》
ラットの腎臓にアデノウイルスベクター液１ｍＬを直接注射した。注射は１０回に分けて行い、あらゆる方向に向けて注射した。【００５１】
《免疫組織化学解析》
アデノウイルスベクターの投与から４日後に各ラットから腎臓を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで２日間固定した。続いて、各腎臓標本をパラフィン包埋して薄切切片を作製した。【００５２】
続いて、各組織切片を抗ＥＧＦＰ抗体、抗ＮＫＣＣ２抗体、抗ＡＱＰ２抗体、抗ｓｏｄｉｕｍ−ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ３（ＮＨＥ３；ＳＬＣ９Ａ３Ｐ２）抗体で染色した。抗ＮＨＥ３抗体は、抗ＮＰＴ２ａ抗体が入手できなかったため、抗ＮＰＴ２ａ抗体の代わりに使用した。【００５３】
その結果、腎動脈への緩徐な投与では、ＥＧＦＰの発現が検出できなかった。この投与方法では、血液の存在により、アデノウイルスの感染率が低かったものと考えられた。【００５４】
また、膀胱への投与では、鮮明なＥＧＦＰの発現が検出された。しかしながら、近位尿細管の微絨毛が消失していた。これはアデノウイルスベクターの尿細管への逆流の圧力が高すぎたためであると考えられた。膀胱への投与では、腎臓の構造を破壊しただけでなく、尿管へのアデノウイルスの感染のリスクも考えられた。【００５５】
また、腎実質への投与では、ＥＧＦＰが発現した領域は、アデノウイルスベクターを注射した部位に限定されていた。また、繰り返された穿刺及び液注入により腎実質の構造が傷害を受けていた。【００５６】
これに対し、顕微鏡観察の結果、アデノウイルスベクターの腎動脈へのボーラス投与による腎組織構造への目立った傷害は認められなかった。また、血清及び尿の解析結果から、アデノウイルスベクターの腎動脈へのボーラス投与による、腎臓及び肝臓の機能の変化も認められなかった。【００５７】
また、後述するように、アデノウイルスベクターの腎動脈へのボーラス投与により、最も高い遺伝子発現効率が得られることが明らかとなった。そこで、以降の実験では、腎動脈へのボーラス投与によりアデノウイルスベクターを投与した。【００５８】
［実験例４］（ＮＫＣＣ２プロモーターの検討）
発明者らは、実験例２で調製した、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰ、ＮＫＣＣ２ｐｖｕ−ＥＧＦＰ及びＮＫＣＣ２−ＥＧＦＰの３種類のアデノウイルスベクターを腎動脈へのボーラス投与によりラットに投与した。続いて、アデノウイルスベクターの投与から４日後に各ラットから腎臓を摘出し、実験例３と同様にして組織切片を作製した。【００５９】
《免疫組織化学解析》
続いて、作製した各組織切片を免疫組織化学解析により解析した。図１（ａ）及び（ｂ）は、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図１（ａ）は抗ＥＧＦＰ抗体で染色した結果を示す写真であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）の組織切片に隣接する別の組織切片を抗ＮＫＣＣ２抗体で染色し、内在性のＮＫＣＣ２タンパク質を検出した結果を示す写真である。スケールバーは、いずれも１ｃｍを示す。【００６０】
また、図１（ｃ）及び（ｄ）は、ＮＫＣＣ２ｐｖｕ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図１（ｃ）は抗ＥＧＦＰ抗体で染色した結果を示す写真であり、図１（ｄ）は、図１（ｃ）の組織切片に隣接する別の組織切片を抗ＮＫＣＣ２抗体で染色し、内在性のＮＫＣＣ２タンパク質を検出した結果を示す写真である。スケールバーは、いずれも１ｃｍを示す。【００６１】
また、図１（ｅ）及び（ｆ）は、ＮＫＣＣ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図１（ｅ）は抗ＥＧＦＰ抗体で染色した結果を示す写真であり、図１（ｆ）は、図１（ｅ）の組織切片に隣接する別の組織切片を抗ＮＫＣＣ２抗体で染色し、内在性のＮＫＣＣ２タンパク質を検出した結果を示す写真である。スケールバーは、いずれも１ｃｍを示す。【００６２】
その結果、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した場合に、ＥＧＦＰの発現パターンが内在性のＮＫＣＣ２タンパク質の発現パターンに最も近くなることが明らかとなった。【００６３】
これに対し、ＮＫＣＣ２ｐｖｕ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した場合、及びＮＫＣＣ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した場合では、ＥＧＦＰが内在性のＮＫＣＣ２タンパク質よりも広範囲の領域で発現されていた。【００６４】
《共焦点レーザー顕微鏡》
続いて、共焦点レーザー顕微鏡を使用して、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した場合のＥＧＦＰ及び内在性のＮＫＣＣ２タンパク質の発現を、より高解像度で検討した。組織切片の免疫染色には、実験例３で用いたものと同じ抗体を使用し、ＥＧＦＰ及び内在性のＮＫＣＣ２タンパク質を二重染色した。また、ヘキスト３３３４２を用いて核を染色した。【００６５】
図２（ａ）〜（ｄ）は、同一視野をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図２（ａ）は核を検出した結果を示す写真であり、図２（ｂ）はＥＧＦＰを検出した結果を示す写真であり、図２（ｃ）は内在性のＮＫＣＣ２タンパク質を検出した結果を示す写真であり、図２（ｄ）は図２（ａ）〜（ｃ）を合成した写真である。スケールバーは、いずれも５０μｍを示す。【００６６】
その結果、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入により発現したＥＧＦＰ及びＮＫＣＣ２タンパク質は、いずれも太いヘンレ係蹄脚に発現していることが確認された。すなわち、太いヘンレ係蹄脚特異的に所望の遺伝子を発現させることができることが明らかとなった。【００６７】
以上の結果から、ＮＫＣＣ２ＤＩ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入により、内在性のＮＫＣＣ２タンパク質に近い発現パターンでＥＧＦＰを発現させることができることが明らかとなった。【００６８】
非特許文献１によれば、尿細管の初代培養細胞を使用したインビトロの検討において、ｐＮＫＣＣ２ｐｖｕプロモーターが最も高いプロモーター活性を示し、ｐＮＫＣＣ２ＤＩプロモーターが最も低いプロモーター活性を示したことが報告されている。【００６９】
これに対し、インビボにおいて、内在性のＮＫＣＣ２タンパク質に近い発現パターンで遺伝子を発現させるためには、ｐＮＫＣＣ２ＤＩプロモーターを用いることが最もよいことが明らかとなった。すなわち、プロモーターはできるだけ長いことが好ましいことが明らかとなった。【００７０】
［実験例５］（ＮＰＴ２ａプロモーターの検討）
発明者らは、実験例２で調製した、ＮＰＴ２ａ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを腎動脈へのボーラス投与によりラットに投与した。続いて、アデノウイルスベクターの投与から４日後に各ラットから腎臓を摘出し、実験例３と同様にして組織切片を作製した。【００７１】
《免疫組織化学解析》
続いて、作製した各組織切片を免疫組織化学解析により解析した。図３（ａ）及び（ｂ）は、ＮＰＴ２ａ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図３（ａ）は抗ＥＧＦＰ抗体で染色した結果を示す写真であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）の組織切片に隣接する別の組織切片を抗ＮＨＥ３抗体で染色し、内在性のＮＨＥ３タンパク質を検出した結果を示す写真である。上述したように、抗ＮＨＥ３抗体は、抗ＮＰＴ２ａ抗体が入手できなかったため、抗ＮＰＴ２ａ抗体の代わりに使用した。スケールバーは、いずれも１ｃｍを示す。【００７２】
その結果、ＮＰＴ２ａ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入によるＥＧＦＰの発現パターンと、内在性のＮＨＥ３タンパク質の発現パターンは近いことが明らかとなった。【００７３】
《共焦点レーザー顕微鏡》
続いて、共焦点レーザー顕微鏡を使用して、ＥＧＦＰ及び内在性のＮＫＣＣ２タンパク質の発現を、より高解像度で検討した。組織切片の免疫染色には、実験例３で用いたものと同じ抗体を使用し、ＥＧＦＰ及び内在性のＮＨＥ３タンパク質を二重染色した。また、ヘキスト３３３４２を用いて核を染色した。スケールバーは、いずれも５０μｍを示す。【００７４】
図４（ａ）〜（ｄ）は、同一視野をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図４（ａ）は核を検出した結果を示す写真であり、図４（ｂ）はＥＧＦＰを検出した結果を示す写真であり、図４（ｃ）は内在性のＮＨＥ３タンパク質を検出した結果を示す写真であり、図４（ｄ）は図４（ａ）〜（ｃ）を合成した写真である。【００７５】
その結果、ＮＰＴ２ａ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入により発現したＥＧＦＰ及びＮＨＥ３タンパク質は、いずれも近位尿細管細胞に発現していることが確認された。すなわち、近位尿細管特異的に所望の遺伝子を発現させることができることが明らかとなった。しかしながら、ＥＧＦＰは細胞質に局在し、ＮＨＥ３タンパク質は同一の細胞の細胞膜に局在していることが明らかとなった。ＥＧＦＰとＮＨＥ３タンパク質の局在の違いは、膜局在シグナルの有無によるものと考えられた。【００７６】
以上の結果から、ＮＰＴ２ａ−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入により、内在性のＮＫＣＣ２タンパク質に近い発現パターンでＥＧＦＰを発現させることができることが明らかとなった。また、内在性のＮＨＥ３タンパク質を発現する細胞と同一の細胞にＥＧＦＰを発現させることができることが明らかとなった。【００７７】
［実験例６］（ＡＱＰ２プロモーターの検討）
発明者らは、実験例２で調製した、ＡＱＰ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを腎動脈へのボーラス投与によりラットに投与した。続いて、アデノウイルスベクターの投与から４日後に各ラットから腎臓を摘出し、実験例３と同様にして組織切片を作製した。【００７８】
《免疫組織化学解析》
続いて、作製した各組織切片を免疫組織化学解析により解析した。図５（ａ）及び（ｂ）は、ＡＱＰ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターを導入した結果を示す写真である。図５（ａ）は抗ＥＧＦＰ抗体で染色した結果を示す写真であり、図５（ｂ）は、図３（ａ）の組織切片に隣接する別の組織切片を抗ＡＱＰ２抗体で染色し、内在性のＡＱＰ２タンパク質を検出した結果を示す写真である。スケールバーは、いずれも１ｃｍを示す。【００７９】
その結果、ＡＱＰ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入によるＥＧＦＰの発現パターンと、内在性のＡＱＰ２タンパク質の発現パターンは近いことが明らかとなった。【００８０】
《共焦点レーザー顕微鏡》
続いて、共焦点レーザー顕微鏡を使用して、ＥＧＦＰ及び内在性のＡＱＰ２タンパク質の発現を、より高解像度で検討した。組織切片の免疫染色には、実験例３で用いたものと同じ抗体を使用し、ＥＧＦＰ及び内在性のＡＱＰ２タンパク質を二重染色した。また、ヘキスト３３３４２を用いて核を染色した。【００８１】
図６（ａ）〜（ｄ）は、同一視野をそれぞれ共焦点レーザー顕微鏡で観察した結果を示す写真である。図６（ａ）は核を検出した結果を示す写真であり、図６（ｂ）はＥＧＦＰを検出した結果を示す写真であり、図６（ｃ）は内在性のＡＱＰ２タンパク質を検出した結果を示す写真であり、図６（ｄ）は図６（ａ）〜（ｃ）を合成した写真である。スケールバーは、いずれも５０μｍを示す。【００８２】
その結果、ＡＱＰ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入により発現したＥＧＦＰ及びＡＱＰ２タンパク質は、いずれも集合管細胞に発現していることが確認された。すなわち、集合管特異的に所望の遺伝子を発現させることができることが明らかとなった。しかしながら、ＥＧＦＰは細胞質に局在し、ＡＱＰ２タンパク質は同一の細胞の細胞膜に局在していることが明らかとなった。ＥＧＦＰとＡＱＰ２タンパク質の局在の違いは、膜局在シグナルの有無によるものと考えられた。【００８３】
以上の結果から、ＡＱＰ２−ＥＧＦＰアデノウイルスベクターの導入により、内在性のＡＱＰ２タンパク質に近い発現パターンでＥＧＦＰを発現させることができることが明らかとなった。また、内在性のＡＱＰ２タンパク質を発現する細胞と同一の細胞にＥＧＦＰを発現させることができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明によれば、腎尿細管細胞特異的に遺伝子を発現させるためのベクターを提供することができる。
【図１】
2019045049.tif 000004
【図２】
2019045049.tif 000005
【図３】
2019045049.tif 000006
【図４】
2019045049.tif 000007
【図５】
2019045049.tif 000008
【図６】
2019045049.tif 000009
【国際調査報告】
2019045049.tif 000010
2019045049.tif 000011
2019045049.tif 000012
2019045049.tif 000013