(57)【要約】  強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるための宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ヘパラン硫酸を発現しておらず、かつ、霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を過剰発現している、宿主細胞を提供する。また、安定的に増殖させた強毒性の手足口病病因ウイルスを用いた抗手足口病病因ウイルスワクチンまたは抗手足口病病因ウイルス薬のスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるための宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ヘパラン硫酸を発現しておらず、かつ、霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を過剰発現している、宿主細胞。
【請求項２】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、ヒトエンテロウイルスＡ群に分類されるウイルスである、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ１６、コクサッキーウイルスＡ１４またはコクサッキーウイルスＡ７である、請求項１または２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
ＥＸＴ１遺伝子および／またはＥＸＴ２遺伝子を発現していない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記霊長類のＳＣＡＲＢ２がヒトＳＣＡＲＢ２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞がＲＤ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
（１）強毒性の手足口病病因ウイルスを産生する細胞を得るために、請求項１〜６のいずれか１項に記載の宿主細胞に、強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡを導入するステップと、
（２）強毒性の手足口病病因ウイルスを増殖させるために、前記ステップ（１）により得られた細胞を培養するステップと、
（３）前記ステップ（２）により増殖させた強毒性の手足口病病因ウイルスを回収するステップと
を含む、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に生産する方法。
【請求項８】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、ヒトエンテロウイルスＡ群に分類されるウイルスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスが、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ１６、コクサッキーウイルスＡ１４またはコクサッキーウイルスＡ７である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法により調製された、強毒性の手足口病病因ウイルス株。
【請求項１１】
（１）霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を発現しているトランスジェニックマウスを準備するステップと、
（２）前記トランスジェニックマウスに、候補ワクチンを接種するステップと、
（３）前記ステップ（２）のトランスジェニックマウスを、請求項１０に記載の強毒性の手足口病病因ウイルス株で攻撃するステップと、
（４）前記ステップ（３）のトランスジェニックマウスを解析するステップと
を含む、抗手足口病病因ウイルスワクチンのスクリーニング方法。
【請求項１２】
（１）霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を発現しているトランスジェニックマウスを準備するステップと、
（２）前記トランスジェニックマウスを、請求項１０に記載の強毒性の手足口病病因ウイルス株に感染させるステップと、
（３）前記ステップ（２）のトランスジェニックマウスに、抗手足口病病因ウイルス薬の候補化合物を投与するステップと、
（４）前記ステップ（３）のトランスジェニックマウスを解析するステップと
を含む、抗手足口病病因ウイルス薬のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記霊長類のＳＣＡＲＢ２がヒトＳＣＡＲＢ２である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスジェニックマウスが４週齢以上である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強毒性の手足口病病因ウイルスの安定的な生産、および、強毒性の手足口病病因ウイルスを用いたワクチンまたは抗ウイルス薬のスクリーニングに関する。
【背景技術】
【０００２】
手足口病は、ピコルナウイルス科エンテロウイルス属内の、主としてヒトエンテロウイルスＡ群（ＨＥＶ−Ａ）に分類されるウイルスが原因となって起こるウイルス性疾患である。手足口病は、口腔粘膜および四肢末端に現われる水疱性の発疹を主症状とし、幼児を中心に夏季に流行するが、一般的には軽症であり、特別な治療を行わなくても数日のうちに自然治癒する。しかし、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）は、無菌性髄膜炎や脳炎などの重篤な中枢神経系の合併症を稀に引き起こすことが報告されており、東アジアにおいては、１９９０年代後半から、ＥＶ７１の大規模流行による多数の死亡例が報告されている。これは、ＥＶ７１をはじめとするエンテロウイルスはＲＮＡウイルスであり、他のＲＮＡウイルス（例えばインフルエンザウイルスなど）と同様に変異頻度が極めて高く、ウイルスの大規模流行の間に強毒性変異株が生じることが一因と考えられている。そのため、エンテロウイルスは公衆衛生上危険なウイルスであると考えられており、ワクチンや抗ウイルス薬の開発が望まれている。【０００３】
エンテロウイルスに対するワクチンや抗ウイルス薬の開発のためには、エンテロウイルスの感染動物モデルが必要となる。本発明者らは、細胞表面受容体であるスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）がＥＶ７１の感染に必須の分子であることをすでに明らかにしており、ＥＶ７１感染モデルマウスとして、ヒトＳＣＡＲＢ２を発現するトランスジェニックマウスを作製している（非特許文献１）。一方、上記モデルマウスに感染させるためのＥＶ７１は、ＲＤ細胞などのウイルス感受性細胞を用いて増殖させて調製する。しかし、ウイルス感受性細胞を用いて増殖させたＥＶ７１では、その病原性が著しく低下してしまうことが度々確認されており、このことは、ＥＶ７１のワクチンや抗ウイルス薬の開発を行う上で大きな障害となっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Fujii, K., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＥＶ７１をはじめとするＨＥＶ−Ａに分類されるエンテロウイルスが結合する細胞膜表面受容体には、ＳＣＡＲＢ２の他にも、ヘパラン硫酸やＰＳＧＬ−１など、いくつかの分子が存在することが知られている。しかし、これらの細胞膜表面受容体の機能的な相違や、エンテロウイルスの病原性との相関、変異エンテロウイルスに対する選択圧などについては明らかにされていない。【０００６】
本発明は、ＥＶ７１をはじめとするＨＥＶ−Ａに分類されるエンテロウイルスの感染機構を明らかにするとともに、強毒性の手足口病病因ウイルスの安定的な生産を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ヘパラン硫酸を介して取り込まれた弱毒性ＥＶ７１が、ＳＣＡＲＢ２を介して感染した強毒性ＥＶ７１を上回って増殖することにより、ＥＶ７１の弱毒化が起こることを明らかにした。本発明者らは、この新規な発見に基づき、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるための宿主細胞および方法を確立した。【０００８】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるための宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ヘパラン硫酸を発現しておらず、かつ、霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を過剰発現している、宿主細胞を提供するものである。【０００９】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスは、ヒトエンテロウイルスＡ群に分類されるウイルスであることが好ましい。【００１０】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスは、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ１６、コクサッキーウイルスＡ１４またはコクサッキーウイルスＡ７であることが好ましい。【００１１】
前記宿主細胞は、ＥＸＴ１遺伝子および／またはＥＸＴ２遺伝子を発現していないことが好ましい。【００１２】
前記ＳＣＡＲＢ２はヒトＳＣＡＲＢ２であることが好ましい。【００１３】
前記細胞はＲＤ細胞であるであることが好ましい。【００１４】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）強毒性の手足口病病因ウイルスを産生する細胞を得るために、上記記載の宿主細胞に、強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡを導入するステップと、（２）強毒性の手足口病病因ウイルスを増殖させるために、前記ステップ（１）により得られた細胞を培養するステップと、（３）前記ステップ（２）により増殖させた強毒性の手足口病病因ウイルスを回収するステップとを含む、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に生産する方法を提供するものである。【００１５】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスは、ヒトエンテロウイルスＡ群に分類されるウイルスであることが好ましい。【００１６】
前記強毒性の手足口病病因ウイルスは、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ１６、コクサッキーウイルスＡ１４またはコクサッキーウイルスＡ７であることが好ましい。【００１７】
また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により調製された、強毒性の手足口病病因ウイルス株を提供するものである。【００１８】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を発現しているトランスジェニックマウスを準備するステップと、（２）前記トランスジェニックマウスに、候補ワクチンを接種するステップと、（３）前記ステップ（２）のトランスジェニックマウスを、上記記載の強毒性の手足口病病因ウイルス株で攻撃するステップと、（４）前記ステップ（３）のトランスジェニックマウスを解析するステップとを含む、抗手足口病病因ウイルスワクチンのスクリーニング方法を提供するものである。【００１９】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を発現しているトランスジェニックマウスを準備するステップと、（２）前記トランスジェニックマウスを、上記記載の強毒性の手足口病病因ウイルス株に感染させるステップと、（３）前記ステップ（２）のトランスジェニックマウスに、抗手足口病病因ウイルス薬の候補化合物を投与するステップと、（４）前記ステップ（３）のトランスジェニックマウスを解析するステップとを含む、抗手足口病病因ウイルス薬のスクリーニング方法を提供するものである。【００２０】
前記ＳＣＡＲＢ２はヒトＳＣＡＲＢ２であることが好ましい。【００２１】
前記トランスジェニックマウスは４週齢以上であるであることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に係る強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるための宿主細胞および方法は、手足口病病因ウイルスを弱毒化させることなく増殖させることができるため、強毒性の手足口病病因ウイルス株を安定的かつ効率的に提供することが可能となる。【００２３】
また、本発明に係る強毒性の手足口病病因ウイルス株およびそれを用いた抗手足口病病因ウイルスワクチンまたは抗手足口病病因ウイルス薬のスクリーニング方法は、安定して高い再現性を有する。そのため、ワクチンおよび抗ウイルス薬の開発ならびに品質管理のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＥＸＴ１遺伝子またはＥＸＴ２遺伝子をノックアウトしたＲＤ細胞のヘパラン硫酸発現量を確認した図である。
【図２】ヘパラン硫酸またはＳＣＡＲＢ２を介したＥＶ７１の感染機構を示す模式図である。
【図３】強毒性ＥＶ７１（Ｎ７７２株）により攻撃したマウス（ワクチン接種（−）または（＋））の体重変化を示すグラフである。
【図４】強毒性ＥＶ７１（Ｎ７７２株）により攻撃したマウス（ワクチン接種（−）または（＋））の中和抗体価および生死を示す図である。
【図５】強毒性ＥＶ７１（Ｎ７７２株）により攻撃したマウス（ワクチン接種（−）または（＋））の脊髄におけるウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２６】
本発明は、第一の実施形態によれば、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるための宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ヘパラン硫酸を発現しておらず、かつ、霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を過剰発現している、宿主細胞である。
【００２７】
「手足口病病因ウイルス」とは、エンテロウイルスのうち、ヒトに感染し、手足口病を引き起こすものを意味する。また、本実施形態における「強毒性の手足口病病因ウイルス」とは、手足口病病因ウイルスのうち、神経病原性を有し、致死的感染を起こすものをいう。
【００２８】
エンテロウイルスは、ピコルナウイルス科（ｆａｍｉｌｙ  Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）エンテロウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）に分類されるウイルスであり、エンベロープを持たず、ＶＰ１〜ＶＰ４の４種類のタンパク質から構成された正十二面体のカプシドの中に一本鎖プラス鎖ＲＮＡを含む。エンテロウイルス属には、ポリオウイルス、コクサッキーＡ群ウイルス（ＣＡＶ）、コクサッキーＢ群ウイルス（ＣＢＶ）、エコーウイルス、エンテロウイルスが含まれる。このうち、ヒトに感染するエンテロウイルスは、分子系統解析に基づき、４つの種（ｓｐｅｃｉｅｓ）：ヒトエンテロウイルスＡ群（ＨＥＶ−Ａ）、ヒトエンテロウイルスＢ群（ＨＥＶ−Ｂ）、ヒトエンテロウイルスＣ群（ＨＥＶ−Ｃ）、およびヒトエンテロウイルスＤ群（ＨＥＶ−Ｄ）に分類され、さらに、抗体による中和反応性の違いから、多くの血清型に分類される。
【００２９】
本実施形態における手足口病病因ウイルスには、強毒性のものであれば、任意の血清型のエンテロウイルスを用いることができる。手足口病病因ウイルスの毒性の重篤化を決定する遺伝子変異は、現時点では十分には特定されていない。しかし、本発明は、ＥＶ７１感染患者から単離されたＥＶ７１では、ほとんどの場合において、ＶＰ１カプシドタンパク質の第１４５番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）（ＶＰ１−１４５Ｅ）であるのに対し、培養細胞で継代を重ねたＥＶ７１では同アミノ酸がグリシン（Ｇ）（ＶＰ１−１４５Ｇ）またはグルタミン（Ｑ）（ＶＰ１−１４５Ｑ）であり、これらのＥＶ７１は弱毒性であるという発見に一部基づいている。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＶＰ１カプシドタンパク質の第１４５番目のアミノ酸の上記変異がウイルス粒子表面の電荷分布を変化させ、その結果、ＥＶ７１のヘパラン硫酸への結合親和性が変化することがＥＶ７１の毒性変化をもたらすと推測される。したがって、ＶＰ１−１４５Ｅと同様にヘパラン硫酸に対する結合親和性を示さず、ＳＣＡＲＢ２を介して感染する手足口病病因ウイルスであれば、ＶＰ１−１４５Ｅと同様に強毒性である可能性が高い。ここで、「感染」とは、ウイルス粒子が宿主細胞の表面に結合し、宿主細胞内に取り込まれ、脱殻され、子孫ウイルスが増殖するまでの一連の過程を意味する。
【００３０】
すなわち、本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルスは、好ましくは、ＨＥＶ−Ａに分類されるウイルスであり、特に好ましくは、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、コクサッキーウイルスＡ１６（ＣＶＡ１６）、コクサッキーウイルスＡ１４（ＣＶＡ１４）またはコクサッキーウイルスＡ７（ＣＶＡ７）であり、最も好ましくは、ＥＶ７１である。
【００３１】
エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）は、ＶＰ１遺伝子の分子系統解析に基づき、Ａ、Ｂ１〜Ｂ５、およびＣ１〜Ｃ５の遺伝子型（ｓｕｂｇｅｎｏｇｒｏｕｐ）にさらに分類される。本実施形態におけるＥＶ７１は、いずれの遺伝子型のＥＶ７１であってよく、例えば、以下に限定されないが、Ｙ９０−３８９６株（Ｃ１型）、Ｉｓｅｈａｒａ株（Ｃ２型）、Ｎ７７２−Ｓｅｎｄａｉ．Ｈ−０６株（Ｃ４型）、２７１６−Ｙａｍａｇａｔａ−０３株（Ｂ５型）などが挙げられる。なお、ＥＶ７１感染患者から単離された上記株はいずれもＶＰ１−１４５Ｅである。各遺伝子型のＥＶ７１の塩基配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。
【００３２】
また、本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルスは、ヒトＳＣＡＲＢ２を発現するエンテロウイルス感染モデルマウス（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758）における５０％致死量（ＬＤ５０）により定義することができる。本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルスは、上記ＬＤ５０が、好ましくは１０６  ＴＣＩＤ５０以下であり、特に好ましくは１０５  ＴＣＩＤ５０以下である。
【００３３】
本実施形態における「宿主細胞」とは、手足口病病因ウイルスが感染する標的細胞をいう。「感染」とは、上で定義した通りである。本実施形態における宿主細胞は、ウイルスの増殖のために一般的に用いられる任意の哺乳動物細胞を用いて調製することができる。本実施形態における宿主細胞を調製するために用いることができる細胞には、例えば、ＲＤ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態における宿主細胞を調製するために用いることができる細胞は、好ましくは、ＲＤ細胞である。
【００３４】
本実施形態における宿主細胞は、ヘパラン硫酸を発現していない。「ヘパラン硫酸」とは、グルコサミンおよびウロン酸を構成成分とする糖鎖であり、コアタンパク質に結合したプロテオグリカンの形態で、細胞表面や細胞外マトリックスに広く存在している。また、「発現していない」とは、通常行われる検出手段（例えば免疫化学的手法など）によって、ヘパラン硫酸を検出することができない程度に、その産生量が欠損または低下していることを意味する。
【００３５】
本実施形態における宿主細胞は、ヘパラン硫酸の生合成に関与する酵素が変異により不活性化されている、または、当該酵素をコードする遺伝子が発現されないことにより、ヘパラン硫酸を発現しない。本実施形態における宿主細胞は、好ましくは、ヘパラン硫酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を発現しないことにより、ヘパラン硫酸を発現しない。ヘパラン硫酸の生合成には、ＥＸＴ遺伝子ファミリーが関与することが知られており、このファミリーには、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＸＴＬ１、ＥＸＴＬ２およびＥＸＴＬ３が含まれる。ＥＸＴ１およびＥＸＴ２はそれぞれ、α１，４−ＧｌｃＮＡｃ転移酵素およびβ１，４−ＧｌｃＡ転移酵素の両活性を有する酵素をコードし、ＥＸＴＬ１、ＥＸＴＬ２およびＥＸＴＬ３もまた、それぞれＧｌｃＮＡｃ転移酵素をコードする。すなわち、本実施形態における宿主細胞は、好ましくは、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＸＴＬ１、ＥＸＴＬ２および／またはＥＸＴＬ３を発現しておらず、特に好ましくは、ＥＸＴ１およびＥＸＴ２のいずれか一方または両方を発現していない。
【００３６】
ヘパラン硫酸の生合成に関与する遺伝子の発現は、当分野において周知の方法により消失させることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などを用いたゲノム編集技術により、遺伝子自体を破壊（ノックアウト）してもよいし、ｓｉＲＮＡなどを用いた遺伝子サイレンシングにより、遺伝子の発現を抑制（ノックダウン）してもよい。また、ヘパラン硫酸の生合成に関与する上記遺伝子はすでにクローニングされており、その塩基配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトＥＸＴ１については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１２７、ヒトＥＸＴ２については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４０１、ＮＭ＿２０７１２２、ＮＭ＿１１７８０８３が利用可能である。
【００３７】
本実施形態における宿主細胞は、さらに、霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を過剰発現している。「スカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）」（以下、単に「ＳＣＡＲＢ２」と記載する）とは、２つの膜貫通領域を有する細胞表面受容体タンパク質であり、ＨＥＶ−Ａに分類される一部のウイルスの感染に必須の分子である。また、ＳＣＡＲＢ２を「過剰発現している」とは、ＳＣＡＲＢ２をコードする外来遺伝子を導入していない宿主細胞が本来発現する量を超えて、ＳＣＡＲＢ２を発現している状態をいう。
【００３８】
本実施形態において、ＳＣＡＲＢ２は、ＳＣＡＲＢ２をコードする外来遺伝子を宿主細胞に導入することにより過剰発現させることができる。本実施形態において使用できるＳＣＡＲＢ２をコードする遺伝子は、任意の霊長類由来のものであってよいが、好ましくはヒト由来である。ＳＣＡＲＢ２をコードする遺伝子はすでにクローニングされており、その塩基配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトＳＣＡＲＢ２については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２１８９２．１が利用可能である。
【００３９】
ＳＣＡＲＢ２をコードする外来遺伝子の宿主細胞への導入は、当分野において周知の方法により行うことができる。例えば、ＳＣＡＲＢ２をコードする外来遺伝子を組み込んだ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換することによって、ＳＣＡＲＢ２をコードする外来遺伝子を宿主細胞へと導入することができる。発現ベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）などのプラスミドや、レトロウイルスベクターなどを用いることができる。形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などの周知の方法により行うことができる。
【００４０】
本実施形態の宿主細胞は、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させるために有用である。ここで、「安定的」とは、増殖させて得られたウイルス株において、増殖させる前の種ウイルスが有していた毒性が維持されていることを意味する。手足口病病因ウイルスは、他のＲＮＡウイルスと同様、増殖における変異頻度が極めて高い。そのため、当分野で一般的に用いられている宿主細胞に手足口病病因ウイルスを感染させた場合には、培養日数や継代回数を重ねるにしたがって、変異により弱毒性の手足口病病因ウイルスが生じ、それが宿主細胞に優位に感染を繰り返すことにより、手足口病病因ウイルス株が弱毒化してしまう。これに対し、本実施形態における宿主細胞では、変異により生じた弱毒性の手足口病病因ウイルスの選択的な感染が最小限に抑えられているため、増殖させる前と同様の毒性を維持した強毒性の手足口病病因ウイルス株を得ることができる。
【００４１】
本発明は、第二の実施形態によれば、（１）強毒性の手足口病病因ウイルスを産生する細胞を得るために、上記記載の宿主細胞に、強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡを導入するステップと、（２）強毒性の手足口病病因ウイルスを増殖させるために、前記ステップ（１）により得られた細胞を培養するステップと、（３）前記ステップ（２）により増殖させた強毒性の手足口病病因ウイルスを回収するステップとを含む、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に生産する方法である。
【００４２】
本実施形態における「宿主細胞」、「強毒性の手足口病病因ウイルス」および「安定的」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。
【００４３】
本実施形態の方法では、第一の実施形態における宿主細胞に強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡを導入することにより、強毒性の手足口病病因ウイルスを産生する細胞（以下、単に「ウイルス産生細胞」と表記する）を調製する。強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡの宿主細胞への導入は、強毒性の手足口病病因ウイルスを感染させることにより行ってもよいし、強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡを調製してトランスフェクションすることにより行ってもよい。
【００４４】
強毒性の手足口病病因ウイルスの宿主細胞への感染は、従来公知の条件にしたがって行うことができる。例えば、宿主細胞を１０４〜１０５／ｃｍ２の濃度で播種した後、強毒性の手足口病病因ウイルスをＭＯＩ＝０．０１〜１０で添加することにより感染させることができる。宿主細胞に感染させるための強毒性の手足口病病因ウイルスは、中枢神経疾患を発症した手足口病病因ウイルス感染動物や、手足口病患者の咽頭拭い液、直腸拭い液、便などから分離することができ、または、国立感染症研究所もしくは日本全国の地方衛生研究所から入手することができる。
【００４５】
強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡの調製は、強毒性の手足口病病因ウイルスのｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写することにより行うことができる。また、強毒性の手足口病病因ウイルスのゲノムＲＮＡの宿主細胞へのトランスフェクションは、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法などの周知の方法により行うことができる。強毒性の手足口病病因ウイルスのｃＤＮＡは、上記と同様に分離または入手した強毒性の手足口病病因ウイルスから、公知の方法により調製することができる。
【００４６】
次いで、上記により得られたウイルス産生細胞を培養し、強毒性の手足口病病因ウイルスを増殖させる。ウイルス産生細胞の培養条件は、従来公知の条件にしたがって行うことができる。例えば、３〜７日間程度、細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察されるまでウイルス産生細胞を培養することができる。ＣＰＥとは、増殖したウイルスが細胞内に蓄積することによって起こるウイルス産生細胞の形態変化であり、光学顕微鏡で観察することにより容易に確認することができる。
【００４７】
次いで、増殖させた強毒性の手足口病病因ウイルスを回収する。増殖した強毒性の手足口病病因ウイルスは、培養液中に放出または産生細胞の内部に蓄積されており、従来公知の方法により回収することができる。例えば、ウイルス産生細胞を含む培養液について超音波破砕または凍結融解の繰り返し処理を行い、ウイルス産生細胞を破壊した後、遠心分離により細胞残渣を除去することにより、増殖した強毒性の手足口病病因ウイルスを回収することができる。必要に応じて、ポリエチレングリコール沈殿や密度勾配超遠心などにより、回収された強毒性の手足口病病因ウイルスをさらに精製してもよい。
【００４８】
本実施形態の方法は、強毒性の手足口病病因ウイルスを安定的に増殖させることができる宿主細胞を用いることにより、弱毒性の手足口病病因ウイルスの増殖を最小限に抑え、強毒性の手足口病病因ウイルスを容易かつ安定的に生産することができる。そのため、本実施形態の方法によれば、強毒性の手足口病病因ウイルス株を容易に調製することが可能となる。
【００４９】
すなわち、本発明は、第三の実施形態によれば、上記方法により調製された、強毒性の手足口病病因ウイルス株である。
【００５０】
本実施形態において、「強毒性の手足口病病因ウイルス株」とは、複数の手足口病病因ウイルス粒子の集まりであって、集まり全体として強毒性を示すものをいう。本実施形態における「強毒性」とは、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルス株は、単一の血清型または遺伝子型の強毒性の手足口病病因ウイルスから実質的に構成されてもよいし、複数の血清型または遺伝子型の強毒性の手足口病病因ウイルスから実質的に構成されてもよい。ここで、「実質的に構成される」とは、変異により弱毒化した手足口病病因ウイルスの混入が、調製された手足口病病因ウイルス株の神経病原性に影響しない程度であることを意味する。本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルス株は、ＥＶ７１のＶＰ１−１４５Ｅ変異株、またはそれと同様のＳＣＡＲＢ２に対する結合親和性を有し、ＳＣＡＲＢ２を介して感染するＥＶ７１、ＣＶＡ１６、ＣＶＡ１４もしくはＣＶＡ７の変異株から実質的に構成されることが好ましい。
【００５１】
本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルス株は、神経病原性を有し、致死的感染を起こすことができる。そのため、強毒性の手足口病病因ウイルス株のワクチンや抗ウイルス薬の開発のために有用である。
【００５２】
本発明は、第四の実施形態によれば、（１）霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を発現しているトランスジェニックマウスを準備するステップと、（２）前記トランスジェニックマウスに、候補ワクチンを接種するステップと、（３）前記ステップ（２）のトランスジェニックマウスを、上記記載の強毒性の手足口病病因ウイルス株で攻撃するステップと、（４）前記ステップ（３）のトランスジェニックマウスを解析するステップとを含む、抗手足口病病因ウイルスワクチンのスクリーニング方法である。
【００５３】
本実施形態における「ＳＣＡＲＢ２」および「強毒性の手足口病病因ウイルス」は、第一の実施形態において定義したものと、「強毒性の手足口病病因ウイルス株」は、第三の実施形態において定義したものと、それぞれ同様である。
【００５４】
本実施形態の方法では、霊長類のＳＣＡＲＢ２を発現しているトランスジェニックマウスを使用する。本実施形態におけるトランスジェニックマウスは、当分野において周知の方法により作製することができる。例えば、マウスの受精卵に、霊長類のＳＣＡＲＢ２をコードする遺伝子を適切なプロモーター配列の下流に配置した発現ベクターをマイクロインジェクションなどにより導入することにより、霊長類のＳＣＡＲＢ２を発現しているトランスジェニックマウスを作製することができる。本実施形態におけるトランスジェニックマウスは、転写調節領域を含めた完全長の霊長類のＳＣＡＲＢ２遺伝子座をクローニングしたＢＡＣなどの人工染色体を導入して作製されることが好ましい。本実施形態において使用できるＳＣＡＲＢ２をコードする遺伝子は、任意の霊長類の由来のものであってよいが、好ましくはヒト由来である。霊長類のＳＣＡＲＢ２をコードする遺伝子の塩基配列情報は、第一の実施形態において記載したとおり、所定のデータベースから入手することができる。
【００５５】
また、霊長類のＳＣＡＲＢ２を発現しているトランスジェニックマウスとして、すでに存在する系統を用いてもよく、例えば、ヒトＳＣＡＲＢ２を発現しているトランスジェニックマウスであるｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758）などを用いることができる。
【００５６】
本実施形態において使用するトランスジェニックマウスは、免疫応答が確立した成体マウスであることが好ましい。４週齢未満の仔マウスでは、免疫応答が発達途上であるため、ワクチンの効果を十分に評価できない場合がある。したがって、本実施形態において使用するトランスジェニックマウスは、好ましくは４週齢以上であり、特に好ましくは４〜１２週齢である。
【００５７】
次いで、上記トランスジェニックマウスに候補ワクチンを接種する。候補ワクチンには、開発段階のワクチンの他、出荷前に品質管理のために検定される製品化されたワクチンが含まれる。候補ワクチンには、例えば、不活化ワクチン、ウイルス様中空粒子ワクチン、生（弱毒化）ワクチン、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチンなどが挙げられる。候補ワクチンの接種量は、候補ワクチンの種類により異なるが、例えば、０．０１〜１０μｇ／体重ｋｇの範囲で適宜選択することができる。
【００５８】
また、本実施形態において、候補ワクチンは、アジュバントと混合して投与されてもよい。アジュバントとは、宿主動物の免疫応答を非特異的に増強する物質であり、種々のアジュバントが当技術分野で公知である。本実施形態において使用できるアジュバントとしては、以下に限定されないが、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマーなどが挙げられる。
【００５９】
本実施形態において、候補ワクチンの接種は、単回または複数回繰り返して行うことができるが、複数回繰り返して行うことが好ましい。候補ワクチンを複数回繰り返して接種する場合には、２〜４週間の間隔で接種を繰り返すことが好ましい。候補ワクチンの投与経路は、特に限定されないが、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与などが挙げられる。
【００６０】
次いで、候補ワクチンを接種した上記トランスジェニックマウスを、上記強毒性の手足口病病因ウイルス株で攻撃する。攻撃は、候補ワクチンを投与していない上記トランスジェニックマウスに投与した場合に９０％以上のマウスが死亡する量の強毒性の手足口病病因ウイルス株を投与することにより行うことができる。すなわち、本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルス株の攻撃投与量は、候補ワクチンを投与していない上記トランスジェニックマウスにおけるＬＤ５０の１０〜１００倍量であることが好ましい。本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルス株の投与経路は、特に限定されないが、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与などが挙げられる。
【００６１】
本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルス株による攻撃は、上記候補ワクチンの接種の１〜２０週間後に行うことが好ましい。また、攻撃の時期を決定するために、候補ワクチンを接種した上記トランスジェニックマウスから血清を採取し、血清中の抗体価を予め確認してもよい。
【００６２】
次いで、上記攻撃後のトランスジェニックマウスを解析することにより、候補ワクチンの有効性を評価する。トランスジェニックマウスの解析は、当分野において周知の方法により、例えば、生死状態や麻痺症状の有無などについて観察することにより行うことができる。
【００６３】
本実施形態のスクリーニング方法において、候補ワクチンの投与により、候補ワクチンを投与しなかったトランスジェニックマウスと比較して、死亡率および麻痺症状が有意に減少した場合には、当該候補ワクチンは、抗手足口病病因ウイルスワクチンとして有望であると評価することができる。一方、候補ワクチンの投与により、候補ワクチンを投与しなかったトランスジェニックマウスと比較して、死亡率および麻痺症状に変化が見られないまたは増加した場合には、当該候補ワクチンは、抗手足口病病因ウイルスワクチンとして有望または有効ではないと評価することができる。
【００６４】
本発明は、第五の実施形態によれば、（１）霊長類のスカベンジャー受容体クラスＢメンバー２（ＳＣＡＲＢ２）を発現しているトランスジェニックマウスを準備するステップと、（２）前記トランスジェニックマウスを、上記記載の強毒性の手足口病病因ウイルス株に感染させるステップと、（３）前記ステップ（２）のトランスジェニックマウスに、抗手足口病病因ウイルス薬の候補化合物を投与するステップと、（４）前記ステップ（３）のトランスジェニックマウスを解析するステップとを含む、抗手足口病病因ウイルス薬のスクリーニング方法である。
【００６５】
本実施形態における「ＳＣＡＲＢ２」、「強毒性の手足口病病因ウイルス」および「感染」は、第一の実施形態において定義したものと、「強毒性の手足口病病因ウイルス株」は、第三の実施形態において定義したものと、それぞれ同様である。
【００６６】
本実施形態の方法では、霊長類のＳＣＡＲＢ２を発現しているトランスジェニックマウスを使用する。本実施形態におけるトランスジェニックマウスは、第四の実施形態におけるものと同様である。本実施形態において使用するトランスジェニックマウスは、好ましくは４週齢以上であり、特に好ましくは４〜１２週齢である。
【００６７】
次いで、上記トランスジェニックマウスに強毒性の手足口病病因ウイルス株を投与し、感染させる。強毒性の手足口病病因ウイルス株の投与量は、当該トランスジェニックマウスにおけるＬＤ５０の１０〜１００倍量であることが好ましい。本実施形態における強毒性の手足口病病因ウイルス株の投与経路は、特に限定されないが、例えば、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与などが挙げられる。
【００６８】
次いで、強毒性の手足口病病因ウイルスに感染させた上記トランスジェニックマウスに、抗手足口病病因ウイルス薬の候補化合物を投与する。候補化合物には、合成化合物、ペプチド性化合物、核酸、抗体などが挙げられ、これらの候補化合物は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。投与される候補化合物の濃度は、化合物の種類により異なるが、例えば、１ｎＭ〜１０μＭの範囲で適宜選択することができる。また、候補化合物の投与は、例えば１日間〜２週間にわたって行うことができる。候補化合物の投与経路は、特に限定されないが、例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与などが挙げられる。
【００６９】
次いで、候補化合物を投与された上記トランスジェニックマウスを解析し、候補化合物の抗手足口病病因ウイルス薬としての有効性を評価する。トランスジェニックマウスの解析は、第四の実施形態におけるものと同様に、当分野において周知の方法により行うことができる。
【００７０】
本実施形態のスクリーニング方法において、候補化合物の投与により、候補化合物を投与しなかったトランスジェニックマウスと比較して、死亡率および麻痺症状が有意に減少した場合には、当該候補化合物は、抗手足口病病因ウイルス薬として有望であると評価することができる。一方、候補化合物の投与により、候補化合物を投与しなかったトランスジェニックマウスと比較して、死亡率および麻痺症状に変化が見られないまたは増加した場合には、当該候補化合物は、抗手足口病病因ウイルス薬として有望ではないと評価することができる。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００７２】
＜１．ヘパラン硫酸（ＨＳ）欠失細胞の作製＞
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたゲノム編集により、ヘパラン硫酸（ＨＳ）を発現しないＲＤ細胞を作製した。ＥＸＴ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００１２７）およびＥＸＴ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００４０１、ＮＭ＿２０７１２２、ＮＭ＿１１７８０８３）のそれぞれを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の配列を設計し、ｓｇＲＮＡをコードする以下のＤＮＡ断片をｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰプラスミド（ａｄｄｇｅｎｅ社製）のＢｂｓＩ切断部位に挿入した。【００７３】
（ｉ）ＥＸＴ１−ｓｇＲＮＡのためのＤＮＡ配列
【化１】
2018181298.tif 000002
【００７４】
（ｉｉ）ＥＸＴ２−ｓｇＲＮＡのためのＤＮＡ配列
【化２】
2018181298.tif 000003
【００７５】
得られたプラスミドをＲＤ細胞にトランスフェクションし、３日間培養した。その後、細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ（ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、ＧＦＰ陽性細胞を分取した。分取した細胞について限界希釈法によるクローニングを実施し、単一クローンを得た。【００７６】
得られた単一クローンについて、細胞表面におけるＨＳの発現量を以下の手順により解析した。細胞をトリプシンで剥がして回収し、２％ウシ胎児血清含有ＰＢＳに懸濁した。２×１０５細胞を分取し、一次抗体としてマウス抗ＨＳモノクローナル抗体Ｆ５８−１０Ｅ４（ａｍｓｂｉｏ社製）（１：５０希釈）またはアイソタイプ・コントロール抗体マウスＩｇＭ  ＭＭ−３０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）（１：５０希釈）、二次抗体としてＣｙ３標識抗マウスＩｇＭ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）（１：２００希釈）を用い、それぞれ３０分、氷上で反応させた。その後、反応溶液から未反応の抗体を遠心分離により除去し、解析用サンプルとした。解析用サンプルをＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ベクトン・ディッキンソン社製）に供することにより、細胞表面のＣｙ３結合量を解析した。また、得られた単一クローンに代えて野生型ＲＤ細胞を用いた以外は同様の手順により調製したサンプルを陰性対照とした。【００７７】
結果を図１に示す。野生型ＲＤ細胞では、アイソタイプ・コントロール抗体と反応させた対照サンプルの蛍光強度ピークに比べ、抗ＨＳ抗体と反応させたサンプルの蛍光強度ピークが顕著にシフトしており、ＨＳが大量に発現していることが確認された（図１左）。一方、ＥＸＴ１遺伝子をノックアウトしたＲＤ細胞クローン（ＲＤ−ΔＥＸＴ１）およびＥＸＴ２遺伝子をノックアウトしたＲＤ細胞クローン（ＲＤ−ΔＥＸＴ２）では、抗ＨＳ抗体と反応させたサンプルの蛍光強度ピークは、アイソタイプ・コントロール抗体と反応させた対照サンプルの蛍光強度ピークとほぼ重なっており、ＨＳが実質的に発現していないことが確認された（図１中央、右）。【００７８】
＜２．ＨＳ欠失／ＳＣＡＲＢ２過剰発現細胞の作製＞
上記１で得られたＲＤ−ΔＥＸＴ１およびＲＤ−ΔＥＸＴ２について、以下の手順によりヒトＳＣＡＲＢ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１２０４２５５、ＮＭ＿００５５０６）を導入し、ヒトＳＣＡＲＢ２を過剰発現するＨＳ欠失ＲＤ細胞（ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２およびＲＤ−ΔＥＸＴ２−ＳＣＡＲＢ２）を作製した。ヒトＳＣＡＲＢ２遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクター（ｐＱＣＸＩＰ−ｈＳＣＡＲＢ２）とｐＶＳＶ−Ｇを、ＧＰ２−２９３パッケージング細胞にトランスフェクションし、２日後に上清を回収し、ヒトＳＣＡＲＢ２発現レトロウイルスを得た。得られたレトロウイルスをＲＤ−ΔＥＸＴ１およびＲＤ−ΔＥＸＴ２に感染させた後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン存在下で選択培養し、ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２およびＲＤ−ΔＥＸＴ２−ＳＣＡＲＢ２を得た。また、同様の手順により、野生型ＲＤ細胞にＳＣＡＲＢ２遺伝子を過剰発現させた細胞（ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２）を作製した。【００７９】
＜３．ＨＳ欠失／ＳＣＡＲＢ２過剰発現細胞を用いたＥＶ７１の増殖＞
最初に、以下の手順により、継代回数Ｐ０のＥＶ７１を調製した。ＥＶ７１  Ｉｓｅｈａｒａ株（国立感染症研究所より入手）からゲノムＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、ｃＤＮＡを調製した。以下のプライマーセットを用いたＰＣＲにより、全長ゲノムＲＮＡに対するｃＤＮＡ（配列番号７）を増幅した。【００８０】
５’プライマー（ＮｏｔＩ切断配列＋Ｔ７プロモーター配列＋ウイルスゲノム５’末端の２０塩基）
【化３】
2018181298.tif 000004
【００８１】
３’ プライマー（ＳａｌＩ切断配列＋ｐｏｌｙ（Ａ）配列（２５塩基）＋ウイルスゲノム３’末端の１０塩基）
【化４】
2018181298.tif 000005
【００８２】
表１．ＥＶ７１  Ｉｓｅｈａｒａ株  全長ｃＤＮＡ配列（配列番号７）
【表１Ａ】
2018181298.tif 000006
【表１Ｂ】
2018181298.tif 000007
【表１Ｃ】
2018181298.tif 000008
【００８３】
得られた全長ｃＤＮＡを、ｐＳＡＶ１４ベクターのＮｏｔＩ／ＳａｌＩ切断部位に挿入してクローニングした。これを鋳型とし、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｔ７  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてインビトロ転写を行い、全長ゲノムＲＮＡを得た。４μｇの全長ゲノムＲＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を用いて２×１０６のＲＤ−ＳＣＡＲＢ２細胞にトランスフェクションし、翌日または翌々日に、９０％以上の細胞について細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された時点で細胞を回収した。回収された細胞を３回凍結融解し、さらに超音波破砕機に供することにより細胞を完全に破砕し、ウイルスを遊離させた。その後、遠心分離により細胞残渣を除去し、上清をウイルス液として回収した。【００８４】
回収したウイルスをＭＯＩ＝０．０１でＲＤ−ＳＣＡＲＢ２細胞（１×１０６）に感染させ、５日間にわたり細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察し、顕著なＣＰＥが観察されたら細胞を回収した。上記と同様の手順により、増殖したウイルスを回収した。これを継代回数Ｐ０のＥＶ７１とした。上記と同様の手順により継代回数Ｐ０のＥＶ７１をＲＤ−ＳＣＡＲＢ２細胞に感染させ、継代回数Ｐ１のＥＶ７１を得た。継代回数Ｐ１のＥＶ７１を用いて同様の手順を繰り返し、継代回数Ｐ２のＥＶ７１（ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２））を得た。その後、ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２細胞に代えて、上記１および２で得られた各細胞を用いて、ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２）をさらに同様の手順により連続継代し、継代回数Ｐ３〜Ｐ５までのＥＶ７１を得た。【００８５】
得られた継代回数Ｐ２〜Ｐ５のＥＶ７１のカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列を以下の手順により解析した。継代回数Ｐ０〜Ｐ３のＥＶ７１からＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡを合成した。以下の配列のプライマーを用いて、ＶＰ１遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢ１７７８１６）の部分領域（ＰＶ１の第５８〜２９７番目のアミノ酸に対応）を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列をシークエンシングにより解析した。【００８６】
【化５】
2018181298.tif 000009
【００８７】
結果を表２に示す。野生型ＲＤ細胞により継代したＥＶ７１は、ＶＰ１の第１４５番目のグルタミン酸（Ｅ）が、１回の継代でグルタミン（Ｑ）に変異していた。これに対し、ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２およびＲＤ−ΔＥＸＴ２−ＳＣＡＲＢ２により継代したＥＶ７１は、３回の継代を繰り返しても、ＶＰ１の第１４５番目のグルタミン酸が変異せずに維持されていることが確認された。この結果から、ＨＳを発現しておらず、かつ、ＳＣＡＲＢ２を過剰発現している宿主細胞を用いることにより、ＶＰ１の第１４５番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）である強毒性ＥＶ７１を安定的に増殖させることができることが示された。【００８８】
表２．ＶＰ１の第１４５番目のアミノ酸
【表２】
2018181298.tif 000010
【００８９】
＜４．継代増殖によるＥＶ７１の毒性変化（１）＞
２７１６−Ｙａｍａｇａｔａ−０３株（山形県衛生研究所より入手）をＲＤ−ＳＣＡＲＢ２細胞で１代継代増殖したものを継代回数Ｐ０のＥＶ７１とした以外は、上記３と同様の手順により、上記１および２で得られた各細胞を用いて連続継代することにより継代回数Ｐ１〜Ｐ３のＥＶ７１を調製し、それらの病原性を以下の手順により解析した。ヒトＳＣＡＲＢ２発現トランスジェニックマウスとしてｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０（Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 110, No. 36, pp. 14753-14758）を用いた。１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌの上記各種ＥＶ７１を０．５ｍｌ、６〜７週齢のｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０（各１０匹）に腹腔内投与した。投与後、２週間にわたり毎日、生死状態、麻痺症状、および体重変化を観察した。麻痺率は、２日以上にわたり四肢のいずれかに完全あるいは不完全麻痺の症状が確認されたマウスの割合を示す。体重変化率は、投与前の体重を１００％として算出した。【００９０】
結果を表３〜５に示す。ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２およびＲＤ−ΔＥＸＴ２−ＳＣＡＲＢ２により継代したＥＶ７１は、３回の継代を繰り返しても、Ｐ０と同等またはそれ以上の病原性を維持していることが示された。この結果から、ＨＳを発現しておらず、かつ、ＳＣＡＲＢ２を過剰発現している宿主細胞を用いることにより、強毒性ＥＶ７１を安定的に増殖させることができることが示された。【００９１】
表３．ＥＶ７１投与から２週間後における麻痺率（％）
【表３】
2018181298.tif 000011
【００９２】
表４．ＥＶ７１投与から２週間後における致死率（％）
【表４】
2018181298.tif 000012
【００９３】
表５．ＥＶ７１投与から６日後における体重変化（％）
【表５】
2018181298.tif 000013
【００９４】
以上の結果から想定されるＥＶ７１の弱毒化メカニズムを図２に示す。ＶＰ１カプシドタンパク質の第１４５番目のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）である強毒性ＥＶ７１（ＶＰ１−１４５Ｅ）と、同アミノ酸がグリシン（Ｇ）またはグルタミン（Ｑ）である弱毒性ＥＶ７１（ＶＰ１−１４５ＧまたはＶＰ１−１４５Ｑ）は、いずれもＳＣＡＲＢ２を介して宿主細胞に感染する（黒矢印）。しかし、細胞表面にＨＳが発現している場合には、弱毒性ＥＶ７１はＨＳに引き寄せられて細胞表面に接近し、強毒性ＥＶ７１よりもＳＣＡＲＢ２を介して宿主細胞に感染しやすくなり、さらに、ＨＳに結合して細胞内に取り込まれた弱毒性ＥＶ７１も、ＳＣＡＲＢ２を介した感染経路に合流して増殖する（白矢印）。その結果、弱毒性ＥＶ７１が優位に増殖し、継代を重ねるにつれてＥＶ７１の弱毒化が起こるものと考えられる。【００９５】
＜５．継代増殖によるＥＶ７１の毒性変化（２）＞
宿主細胞として、ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２に代えてＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２を用いた以外は、上記３と同様の手順により、全長ゲノムＲＮＡを細胞にトランスフェクションし、増殖したウイルスを回収した。回収したウイルスを１代継代増殖して得られたウイルス（ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１））と、上記３でＲＤ−ＳＣＡＲＢ２を用いて調製した継代回数Ｐ０のＥＶ７１（ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２））を、それぞれ１０週齢のｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０（各１０匹）に静脈内投与し、投与２週間後における生存率を比較した。【００９６】
結果を表６に示す。ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２）に比べ、ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１）は、１０００倍以上高い毒性を有していることが示された。【００９７】
表６．ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２）とＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１）の毒性比較
【表６】
2018181298.tif 000014
【００９８】
＜６．強毒性ＥＶ７１を用いたワクチン検定（１）＞
ＳＫ−ＥＶ００６（ＶＰ１−１４５Ｇ）株（国立感染症研究所より入手）をＥＶ７１の生ワクチンとして、ホルマリン固定した同株を不活化ワクチンとして用い、それぞれ以下の手順によりｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０トランスジェニックマウスを免疫した。【００９９】
（生ワクチンによる免疫）
４週齢のｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０トランスジェニックマウスに、１０６ＴＣＩＤ５０のＳＫ−ＥＶ００６（ＶＰ−１４５Ｇ）株を腹腔内投与した（初回免疫）。その後、８週齢時にも同様の投与を行った（追加免疫）。対照群には、ＰＢＳを投与した。【０１００】
（不活化ワクチンによる免疫）
１００μｌのホルマリン固定ＳＫ−ＥＶ００６（ＶＰ−１４５Ｇ）を、等量のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社製）と混合し、不活化ワクチン調製物とした。０．３μｇの不活化ワクチン調製物を、４週齢のｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０トランスジェニックマウスに皮下投与した（初回免疫）。その後、８週齢時にも同様の投与を行った（追加免疫）。対照群には、同量のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＰＢＳを投与した。【０１０１】
各マウスの１０週齢時に採血し、血清を得た。血清の中和抗体価を、標準的なプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により評価した。要すれば、得られた血清を段階希釈し、攻撃ウイルス（５００ｐｆｕ）と混合後、ＲＤ細胞およびＳＫ−ＥＶ００６（ＶＰ−１４５Ｇ）株を用いてプラークアッセイを行い、プラーク数の８０％減少を達成した血清の最大希釈の逆数を中和抗体価として記録した。【０１０２】
上記採血の翌日に、攻撃ウイルスを各マウスに静脈内投与した。攻撃ウイルスには、Ｉｓｅｈａｒａ株（上記３で調製したＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２））を使用した。攻撃ウイルスの投与量は、上記攻撃ウイルスを１０週齢マウスに感染させて予め決定したＬＤ５０の１０〜１００倍量とした。攻撃後、２週間にわたり毎日、生死状態および麻痺症状を観察した。麻痺率は、上記５に記載したのと同様に算出した。【０１０３】
結果を表７および８に示す。生ワクチンと不活化ワクチンのいずれを投与した場合にも、中和抗体価の上昇、死亡率および麻痺率の顕著な低下が認められ、強毒性ＥＶ７１による攻撃が防御されたことが示された。この結果から、ｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０の成体マウスを用いた抗ＥＶ７１ワクチンのスクリーニングが可能であることが確認された。【０１０４】
表７．生ワクチンによる防御効果（攻撃：Ｉｓｅｈａｒａ  ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２）  １０７ＴＣＩＤ５０）
【表７】
2018181298.tif 000015
【０１０５】
表８．不活化ワクチンによる防御効果（攻撃：Ｉｓｅｈａｒａ  ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２）  １０７ＴＣＩＤ５０）
【表８】
2018181298.tif 000016
【０１０６】
＜７．強毒性ＥＶ７１を用いたワクチン検定（２）＞
上記６と同様にして、不活化ワクチンによりｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０トランスジェニックマウスを免疫した。各マウスの２１週齢時に採血した以外は、上記６と同様の手順によりプラークアッセイを行った。上記採血の翌日に、攻撃ウイルスとして、上記３で調製したＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１）（ＬＤ５０＝１０３．５）を用いた以外は、上記６と同様の手順により攻撃感染を行い、死亡率および麻痺率を算出した。【０１０７】
結果を表９に示す。攻撃ウイルスとしてＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１）を用いた場合には、その高い毒性のために、ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ２）よりも少量のウイルスにより十分な攻撃が可能であることが確認された。この結果から、ＨＳを発現しておらず、かつ、ＳＣＡＲＢ２を過剰発現している宿主細胞で継代増殖させたＥＶ７１が、ワクチン検定のための攻撃ウイルスとして有用であることが示された。【０１０８】
表９．不活化ワクチンによる防御効果（攻撃：Ｉｓｅｈａｒａ  ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１）  ２×１０５ＴＣＩＤ５０）
【表９】
2018181298.tif 000017
【０１０９】
＜８．強毒性ＥＶ７１を用いたワクチン検定（３）＞
上記Ｉｓｅｈａｒａ株（Ｃ２型）に加え、遺伝子型の異なる強毒性ＥＶ７１（Ｙ９０−３８９６株（Ｃ１型）（仙台医療センターウイルスセンターより入手）、Ｎ７７２株（Ｃ４型）（仙台医療センターウイルスセンターより入手）、Ｃ７／Ｏｓａｋａ株（Ｂ４型）（国立感染症研究所より入手）、および２７１６−Ｙａｍａｇａｔａ−０３株（Ｂ５型）（山形県衛生研究所より入手））を、ワクチン検定のための攻撃ウイルスとして調製した。上記の強毒性ＥＶ７１の全長ｃＤＮＡ配列と、ｃＤＮＡの増幅のために使用したプライマーセットを以下に示す。【０１１０】
表１０．Ｙ９０−３８９６株（Ｃ１型）（配列番号１０）
【表１０Ａ】
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【表１０Ｂ】
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【表１０Ｃ】
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【０１１１】
表１１．Ｎ７７２株（Ｃ４型）（配列番号１１）
【表１１Ａ】
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【表１１Ｂ】
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【表１１Ｃ】
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【０１１２】
表１２．Ｃ７／Ｏｓａｋａ株（Ｂ４型）（配列番号１２）
【表１２Ａ】
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【表１２Ｂ】
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【表１２Ｃ】
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【０１１３】
表１３．２７１６−Ｙａｍａｇａｔａ−０３株（Ｂ５型）（配列番号１３）
【表１３Ａ】
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【表１３Ｂ】
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【表１３Ｃ】
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【０１１４】
表１４．ＰＣＲに使用したプライマーセット（配列番号１４〜２１）
【表１４】
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【０１１５】
ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２に代えてＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２を宿主細胞として用いた以外は、上記３と同様の手順により、継代回数Ｐ０のＥＶ７１を調製した。得られた継代回数Ｐ０のＥＶ７１を、ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２細胞に感染させ、継代回数Ｐ１のＥＶ７１を得た。得られた継代回数Ｐ１のＥＶ７１を攻撃ウイルスとして用いた（接種量：１×１０６ＴＣＩＤ５０）以外は、上記６と同様の手順により、不活化ワクチンにより免疫されたｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０トランスジェニックマウスを攻撃し、死亡率および麻痺率を算出した。【０１１６】
結果を表１５に示す。ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２細胞を用いて継代増殖させたＥＶ７１はいずれも高い毒性を有しており、攻撃ウイルスとして使用できるものであることが確認された。また、上記６で調製した不活化ワクチンは、Ｉｓｅｈａｒａ株に対してだけでなく、遺伝子型の異なる種々の強毒性ＥＶ７１株に対しても有効であることが示された。【０１１７】
表１５．強毒性ＥＶ７１（ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１））による攻撃感染に対する不活化ワクチンの防御効果
【表１５】
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【０１１８】
＜９．強毒性ＥＶ７１を用いたワクチン検定（４）＞
攻撃ウイルスとして上記８で調製したＮ７７２株（ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１）、１０６ＴＣＩＤ５０）を用いた以外は、上記６と同様の手順により、成体ｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０マウスを免疫および攻撃し、血清の中和抗体価、体重変化、死亡率および麻痺率を算出し、不活化ワクチンの有効性を評価した。【０１１９】
結果を図３および４、ならびに表１６に示す。不活化ワクチンを接種しなかったｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０マウスは著しく体重が減少し、死亡率および麻痺率ともに１００％であったが、不活化ワクチンの接種量の増加にしたがって、中和抗体価の上昇、死亡率および麻痺率の顕著な低下が認められ、強毒性ＥＶ７１による攻撃が防御されたことが確認された。この結果から、成体ｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０マウスと、ＨＳを欠失し、かつ、ＳＣＡＲＢ２を過剰発現している宿主細胞において継代増殖させたＥＶ７１株とを用いることにより、抗ＥＶ７１ワクチンの有効性を評価でき、抗ＥＶ７１ワクチンのスクリーニングが可能であることが示された。【０１２０】
表１６．Ｎ７７２株（ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１））による攻撃感染に対する不活化ワクチンの防御効果
【表１６】
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【０１２１】
さらに、不活化ワクチンの接種による強毒性ＥＶ７１の増殖抑制効果を、脊髄におけるＥＶ７１の力価を算出することにより評価した。上記６と同様の手順により、成体ｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０マウスを不活化ワクチンにより免疫し、上記８で調製したＮ７７２株（ＲＤ−ΔＥＸＴ１−ＳＣＡＲＢ２（Ｐ１）、１０６ＴＣＩＤ５０）により攻撃した。攻撃１日後、２日後、３日後のマウス（各６匹）から脊髄を摘出し（〜０．１ｇ）、１０倍量のＤＭＥＭ（日水製薬株式会社製）を加えてホモジナイズした。得られたホモジネートを１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清を回収した。上清のウイルス力価（ＴＣＩＤ５０）を、ＲＤ−ＳＣＡＲＢ２細胞を用いて測定した。【０１２２】
結果を図５に示す。不活化ワクチンを接種しなかったｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０マウスの脊髄ではＥＶ７１が増殖していたのに対し、不活化ワクチンを接種したｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０マウスの脊髄では、ＥＶ７１の増殖はほとんど見られなかった。この結果からも、成体ｈＳＣＡＲＢ２−Ｔｇ１０マウスと、ＨＳを欠失し、かつ、ＳＣＡＲＢ２を過剰発現している宿主細胞において継代増殖させたＥＶ７１株とを用いることにより、抗ＥＶ７１ワクチンの有効性を評価でき、抗ＥＶ７１ワクチンのスクリーニングが可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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