(57)【要約】  死細胞が生じにくく、品質良く凍結保存することを可能にする。本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、脂肪酸を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、
脂肪酸を含むことを特徴とする凍結保存用組成物。
【請求項２】
前記細胞は、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の凍結保存用組成物。
【請求項３】
前記間葉系幹細胞は、３次元構造であり、スキャフォールドフリーの細胞塊を形成しているものであり、当該細胞塊を凍結保存するためのものであることを特徴とする請求項２に記載の凍結保存用組成物。
【請求項４】
細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、
前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、当該細胞塊を凍結保存するためのものであり、
脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含むことを特徴とする凍結保存用組成物。
【請求項５】
前記細胞は、間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項４に記載の凍結保存用組成物。
【請求項６】
前記間葉系幹細胞は、スキャフォールドフリーの細胞塊を形成しているものである、請求項５に記載の凍結保存用組成物。
【請求項７】
前記間葉系幹細胞は無血清培養されたものであることを特徴とする請求項２、３及び５のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
【請求項８】
前記成分は脂肪酸エステルであり、界面活性剤をさらに含む、請求項４に記載の凍結保存用組成物。
【請求項９】
前記脂肪酸はリノール酸及びリノレン酸のうち少なくとも１種である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
【請求項１０】
前記脂肪酸エステルはリン脂質である、請求項８に記載の凍結保存用組成物。
【請求項１１】
前記リン脂質はフォスファチジン酸である、請求項１０に記載の凍結保存用組成物。
【請求項１２】
前記脂肪酸エステルはフォスファチジン酸であり、前記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８である、請求項８に記載の凍結保存用組成物。
【請求項１３】
−８０℃以下で凍結保存するためのものであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の凍結保存用組成物。
【請求項１４】
細胞を凍結保存した凍結保存物の製造方法であって、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする凍結保存物の製造方法、
（ａ）前記細胞を、脂肪酸を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【請求項１５】
細胞を凍結保存した凍結保存物の製造方法であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする凍結保存物の製造方法、
（ａ）前記細胞を、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【請求項１６】
前記（ａ）工程の後に、（ｂ）前記凍結保存液に前記細胞が浸漬された状態から、前記細胞に対する前記凍結保存液の量を減らす工程を含み、
前記（ｃ）工程では、前記（ｂ）工程後の前記細胞を凍結する、請求項１４又は１５に記載の凍結保存物の製造方法。
【請求項１７】
前記（ｂ）工程では、前記細胞が、前記凍結保存液に浸漬されていない状態にする、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の凍結保存物の製造方法。
【請求項１８】
前記（ｃ）工程において、−８０℃以下で凍結することを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の凍結保存物の製造方法。
【請求項１９】
細胞と、
脂肪酸を含む凍結保存用組成物と、を含み、
凍結保存されていることを特徴とする細胞製剤。
【請求項２０】
細胞と、
脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存用組成物と、を含み、
前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、
凍結保存されていることを特徴とする細胞製剤。
【請求項２１】
細胞を含む細胞製剤の製造方法であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする細胞製剤の製造方法、
（ａ）前記細胞を、脂肪酸を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【請求項２２】
細胞を含む細胞製剤の製造方法であって、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする細胞製剤の製造方法、
（ａ）前記細胞を、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【請求項２３】
前記（ａ）工程の後に、（ｂ）前記凍結保存液に前記細胞が浸漬された状態から、前記細胞に対する前記凍結保存液の量を減らす工程を含み、
前記（ｃ）工程では、前記（ｂ）工程後の前記細胞を凍結する、請求項２２に記載の細胞製剤の製造方法。
【請求項２４】
前記（ｂ）工程では、前記細胞が、前記凍結保存液に浸漬されていない状態にする、請求項２３に記載の細胞製剤の製造方法。
【請求項２５】
細胞を凍結保存するための凍結保存用キットであって、
脂肪酸を備えることを特徴とする凍結保存用キット。
【請求項２６】
細胞を凍結保存するための凍結保存用キットであって、３次元構造である細胞塊を形成した前記細胞を凍結保存するためのキットであり、
脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を備えることを特徴とする凍結保存用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は凍結保存用組成物、凍結保存物の製造方法、細胞製剤、細胞製剤の製造方法及び凍結保存用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、スキャフォールドとして用いるナノファイバーやコラーゲンシートの組成や形態を工夫することでスキャフォールド型の細胞製剤を凍結可能であることが記載されている。【０００３】
また、特許文献２には、凍結保存液に自己血清とＤＭＳＯを加えた凍結保存形態で提供される細胞懸濁液型の細胞治療薬が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２０１５−１９８６０４号公報」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００９−１０７９２９号公報」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
再生医療製品の製造に用いる培地及び薬剤等において、成分既知であること、生物的汚染及び免疫原性のある物質の混在等のリスクを最小限度にすること、体内に存在しない物質を最小限度にすることが要求される。出願人らはこのような要求に応えて無血清でかつ化学的に規定されたＳＴＫ（登録商標）培地を開発した。【０００６】
ところで、再生医療製品の産業化においては、工場において一元集中的に培養、製剤化しドナーとは異なる患者に投与するセントラル型の他家同種再生医療が重要であるが、凍結保存が出来ないと作り貯めが出来ないのでコスト面及び生産管理面で著しく不利である。そのため、解凍後に死細胞の発生がより生じにくく、品質良く凍結保存する技術が求められている。【０００７】
本発明の一態様はこのような事情に基づいて成されたものであり、死細胞が生じにくく、品質良く凍結保存することを可能とするための凍結保存用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、脂肪酸を含む。【０００９】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであってよく、当該細胞塊を凍結保存するためのものであってよく、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む。【００１０】
また、本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法は、細胞を凍結保存した凍結保存物の製造方法であって、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする凍結保存物の製造方法である。【００１１】
（ａ）前記細胞を、脂肪酸を含む凍結保存液に浸漬する工程、（ｃ）前記細胞を凍結する工程。【００１２】
また、本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法は、細胞を凍結保存した凍結保存物の製造方法であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする凍結保存物の製造方法である。【００１３】
（ａ）前記細胞を、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存液に浸漬する工程、（ｃ）前記細胞を凍結する工程。【００１４】
また、本発明の一態様に係る細胞製剤は、細胞と、脂肪酸を含む凍結保存用組成物と、を含み、凍結保存されている。【００１５】
また、本発明の一態様に係る細胞製剤は、細胞と、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存用組成物と、を含み、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成してよく、凍結保存されている。【００１６】
また、本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法は、細胞を含む細胞製剤の製造方法であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであってもよく、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする製造方法である。【００１７】
（ａ）前記細胞を、脂肪酸を含む凍結保存液に浸漬する工程、（ｃ）前記細胞を凍結する工程。【００１８】
また、本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法は、細胞を含む細胞製剤の製造方法であって、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする細胞製剤の製造方法である。【００１９】
（ａ）前記細胞を、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。【００２０】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用キットは、細胞を凍結保存するための凍結保存用キットであって、脂肪酸を備える。【００２１】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用キットは、細胞を凍結保存するための凍結保存用キットであって、３次元構造である細胞塊を形成した前記細胞を凍結保存するためのキットであり、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を備えることを特徴とする凍結保存用キットである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の一態様によれば、解凍後に死細胞の発生がより生じにくく、品質良く凍結保存することを可能にするという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】細胞懸濁液状の間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下「ＭＳＣ」ともいう。）の凍結保存実験の結果を示す図であり、図１の（ａ）は各凍結保存液の成分比較を簡単に説明するための図であり、図１の（ｂ）は凍結保存実験の結果を示す図である。
【図２】細胞懸濁液状のＭＳＣの凍結保存実験の結果を示す図である。
【図３】細胞懸濁液状のＭＳＣの凍結保存実験の結果を示す図である。
【図４】細胞懸濁液状のＭＳＣの凍結保存実験の結果を示す図である。
【図５】ｇＭＳＣ（登録商標）１を用いた凍結保存実験の結果を示す図である。
【図６】ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存・解凍後の細胞の骨・脂肪分化能の確認実験の結果を示す図であり、図６の（ａ）は骨分化能の確認結果を示し、図６の（ｂ）は脂肪分化能の確認結果を示す図である。
【図７】凍結保存・解凍後、ｇＭＳＣ（登録商標）１を細切した後、細胞の軟骨分化能の確認実験を行った結果を示す図であり、図７の（ａ）は軟骨分化能の確認実験を行なったサンプルを撮影した結果を示し、図７の（ｂ）は硫酸化グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ：ＧＡＧ）ａｓｓａｙの結果を示す図である。
【図８】凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１から分離した細胞の表面抗原マーカーの発現確認実験の結果を示す図である。
【図９】実施例３の結果（ｇＭＳＣ（登録商標）１を）を示す図である。
【図１０】ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。
【図１１】ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。
【図１２】ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。
【図１３】ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。
【図１４】ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。
【図１５】ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」であることを示す。
【００２５】
〔凍結保存用組成物〕
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、脂肪酸を含む。また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであってよく、当該細胞塊を凍結保存するためのものであり、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む。以下、単に「凍結保存用組成物」という場合、「細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物」と、「細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、当該細胞塊を凍結保存するための凍結保存用組成物」と、のいずれをも指すものとする。例えば、「本発明の一態様に係る凍結保存用組成物」という場合、懸濁液状に懸濁された細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物の一態様でもあり得、３次元構造である細胞塊を形成している細胞を凍結保存するための凍結保存用組成物の一態様でもあり得る。なお、後述する通り、ここでは間葉系幹細胞を一例に説明しているが、凍結保存対象となる細胞は、間葉系細胞に限定されない。
【００２６】
本発明者らは、脂肪酸を含む凍結保存用組成物を用いることによって、例えば間葉系幹細胞等の細胞が、良好な回収率及び生存率で良好に凍結され、凍結保存・解凍後に得られる細胞数も良好であることを見出した。また、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存用組成物を用いることによって、３次元構造である細胞塊を形成している細胞が、良好な回収率及び生存率で良好に凍結され、凍結保存・解凍後の回収率及び生存率も良好であることを見出した。なお、「回収率」とは、凍結保存・解凍前の細胞数に対する、全細胞数（生死は問わない）の比である。ここで、全細胞数とは、凍結保存・解凍によって破砕・流出等無く回収された細胞の数のことである。また、「生存率」とは、凍結保存・解凍後に回収できた全細胞数に対する、生存していた細胞数の割合である。
【００２７】
また、解凍後の細胞の品質（３方向分化能、マーカー等）も正常であり、凍結保存及び解凍によっても細胞の性質が変化していないことも確認した。また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、トリハロース、ポリエチレングリコール、ポリリジン等の動物細胞には存在しない成分を用いなくても、また、生物汚染のリスクがあるロット間差が著しい血清を用いなくても好適に凍結保存できるため、安全性も品質も優れている。
【００２８】
本明細書において「凍結保存」とは、細胞を凍結して保存することをいうが、好ましくは−８０℃以下等の超低温環境で凍結保存することをいう。
【００２９】
（細胞）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物で凍結する対象の細胞は、例えば、間葉系幹細胞、ＣＤ３４細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ｉＰＳ（induced pluripotent stem cells）細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、表皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肝細胞、膵細胞、筋細胞、神経細胞、神経幹細胞、造血幹細胞又はこれらの前駆細胞等が挙げられる。また、所望のマーカーに対して陽性を示す細胞であってもよい。細胞が由来する生物種も特に限定されず、生物種は、例えば微生物、非ヒト哺乳類またはヒト等が挙げられる。
【００３０】
上記細胞は従来公知の方法で培養されたものを用いればよい。また、上記細胞を培養する培地は、培養する細胞に応じて適宜選択される。さらに、細胞の増殖に適した培養容器も、培養する細胞に応じて適宜選択される。また、後述する本発明の別の態様（凍結保存物の製造方法、細胞製剤、細胞製剤の製造方法、凍結保存用キット）における「細胞」についてもここの説明に準拠する。
【００３１】
（間葉系幹細胞）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物で凍結する対象の一例である間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下「ＭＳＣ」ともいう。）について説明する。間葉系幹細胞は間葉系に属する細胞への分化能を有し、免疫抑制作用も併せ持つこと等といった利点により、再生医療において最も有望な細胞の一つと考えられている。
【００３２】
本明細書において「間葉系幹細胞」は、間葉系に属する組織に分化する体性幹細胞を意味する。また、間葉系幹細胞から、さらに特定の性質を有するものを単離したもの、間葉系幹細胞に対して、サイトカイン刺激等何らかの刺激を与えたもの、遺伝子導入したものも包含される。例えば、ＭＵＳＥ細胞、ＭＡＰＣ細胞、ＳＰ−１細胞なども包含される。間葉系幹細胞は、増殖能と、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞、脂肪細胞等への分化能とを有する。例えば、骨髄、脂肪細胞、滑膜細胞、歯槽骨、歯根膜等の成人の組織からだけでなく、胎盤、臍帯、臍帯血、胎児の種々の細胞等から単離されるものも含む。ヒト間葉系幹細胞であることが好ましいが、ラット、マウス等の非ヒト動物由来間葉系幹細胞であってもよい。
【００３３】
間葉系幹細胞は従来公知の方法で培養されたものを用いればよく、無血清培養又は低血清培養されたものであることが好ましく、無血清培養されたものであることがより好ましい。無血清培養であれば、培養成分が既知である。つまり、血清は天然成分由来であるためロット毎に成分の差が生じるが無血清培地ではこのような差が生じない。よって、無血清培養された間葉系幹細胞は安全性も品質も優れる。また、生物的汚染や免疫原性のある物質の混在等のリスクを最小限度にすること、体内に存在しない物質を最小限度することができる。また、含有される生物原料も明確であるため、品質の管理が容易である。
【００３４】
また、ＳＴＫ（登録商標）培地等の一部の無血清培地で無血清培養される間葉系幹細胞は増殖率に優れている。本発明の凍結保存方法や細胞製剤の一態様によれば、前記のような無血清培養で培養した細胞を凍結に供する。従って、ある程度継代を重ねた後であっても、仮足の発生や扁平形状への変化といった老化が生じていない若々しい状態であり、このような性質の良い状態の間葉系幹細胞を凍結に供することで、凍結保存、及び解凍後も優れた増殖率で間葉系幹細胞を培養、使用することができる。
【００３５】
本明細書において「無血清培養」とは、血清を用いない培養であることが意図される。例えば、血清を含まない培地である無血清培地を用いて培養することが意図される。また、「低血清培養」とは、一般的な血清含有培地（例えば、１０％ＦＢＳ含有培地）よりも、含有する血清量が少ない培地を用いた培養、及び一般的な血清含有培地を用いた培養よりも、血清含有培地を用いた培養期間が短い培養であることが意図される。
【００３６】
（無血清培養の一例）
まず、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物で凍結する対象となる細胞を無血清培養するために用いる無血清培地の一例について説明する。無血清培地を構成するための基礎培地は、当該分野において周知の動物細胞用培地であれば特に限定されず、好ましい基礎培地としては、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＣＤＢ培地などが挙げられる。これらの基礎培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。一実施形態において、無血清培地を構成するための基礎培地は、ＭＣＤＢとＤＭＥＭとを１：１の比率で混合した培地が好ましい。
【００３７】
一実施形態において、上記の基礎培地に、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β、ＨＧＦ、ＥＧＦ、少なくとも１つのリン脂質、及び少なくとも１つの脂肪酸を添加した無血清培地を増殖工程に用いればよい。基礎培地に対するＦＧＦの含有量は、終濃度で、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは３ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＰＤＧＦの含有量は、終濃度で、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＴＧＦ−βの含有量は、終濃度で、０．５〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌである。
【００３８】
基礎培地に対するＨＧＦの含有量は、終濃度で、０．１〜５０ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するＥＧＦの含有量は、終濃度で、０．５〜２００ｎｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは２０ｎｇ／ｍｌである。基礎培地に対するリン脂質の総含有量は、終濃度で、０．１〜３０μｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌである。基礎培地に対する脂肪酸の総含有量は、基礎培地の１／１０００〜１／１０であることが好ましく、さらに好ましくは１／１００である。
【００３９】
このような無血清培地を使用することによって、異種タンパク質の混入を防ぎつつ、血清含有培地と同等以上の増殖促進効果が得られ、間葉系幹細胞を所望の通り増殖させることができる。
【００４０】
無血清培地はリン脂質を含んでもよい。リン脂質としては、例えば、フォスファチジン酸、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン及びフォスファチジルグリセロールなどが挙げられ、これらのリン脂質を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。一実施形態において、無血清培地は、フォスファチジン酸とフォスファチジルコリンとを組み合わせて含有していてもよく、これらのリン脂質は、動物由来であっても、植物由来であってもよい。
【００４１】
無血清培地は脂肪酸を含んでもよい。脂肪酸としては、例えば、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸及びステアリン酸等が挙げられ、本実施形態に係る培地用添加剤はこれらの脂肪酸を単独で含有しても組み合わせて含有してもよい。また、本実施形態に係る無血清培地は、上記脂肪酸以外にさらにコレステロールを含有していてもよい。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、ＦＧＦは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）であることが好ましいが、ＦＧＦ−１など他のＦＧＦファミリーから選択されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、ＰＤＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はＰＤＧＦ−ＡＢであることが好ましい。さらに、本明細書中で使用される場合、ＴＧＦ−βは、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＴＧＦ−β１であることが好ましいが、他のＴＧＦ−βファミリーから選択されてもよい。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、ＨＧＦは、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図され、ＥＧＦは、上皮増殖因子（ＥＧＦ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーから選択される増殖因子が意図される。
【００４４】
また、一実施形態において、無血清培地は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及びアスコルビン酸化合物からなる群より選択される少なくとも２つの因子をさらに含有していてもよい。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、アスコルビン酸化合物は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）もしくはアスコルビン酸２リン酸、又はこれらに類似する化合物が意図される。
【００４６】
なお、無血清培地に含有されている上述した増殖因子は、天然のものであっても、遺伝子組換えによって製造されたものであってもよい。
【００４７】
１つの局面において、無血清培地は、脂質酸化防止剤を含有していることが好ましい。一実施形態において、無血清培地に含有される脂質酸化防止剤は、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート（ビタミンＥ）であり得る。無血清培地はまた、界面活性剤をさらに含有していてもよい。一実施形態において、無血清培地に含有される界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であり得る。
【００４８】
無血清培地は、インスリン、トランスフェリン及びセレネートをさらに含有していてもよい。本明細書中で使用される場合、インスリンは、インスリン様増殖因子であってもよく、天然の細胞由来であっても、遺伝子組換えによって製造されたものでもよい。本発明に係る培地用添加剤はさらに、デキサメタゾン、あるいは他のグルココルチコイドを含有していてもよい。
【００４９】
無血清培養をするときは、上述した無血清培地に、ヒト等の動物組織又は細胞から従来公知の方法により単離された間葉系幹細胞を播種し、所望の数に増殖するまで培養する。培養条件として、培地１ｍｌに対して１〜２×１０４個の間葉系幹細胞を播種することが好ましく、培養温度は３７℃±１℃、培養時間は４８〜９６時間、かつ５％ＣＯ２下であることが好ましい。このように培養することによって、免疫抑制能を維持又は向上した間葉系幹細胞を効率よく大量に得ることができる。
【００５０】
培養に用いる培養容器は、間葉系幹細胞が増殖し得るものであれば特に限定されない。例えば、ファルコン製７５ｃｍ２フラスコ、住友ベークライト製７５ｃｍ２フラスコ等を好適に用いることができる。但し、細胞によっては、用いる培養容器の種類によって細胞の増殖が影響を受ける場合がある。このため、間葉系幹細胞をより効率よく増殖させるために、増殖工程において増殖させる対象となる間葉系幹細胞（以下、「増殖対象細胞」ともいう）毎に、増殖に適した培養容器を用いて増殖工程を行うことが好ましい。
【００５１】
増殖対象細胞の増殖に適した培養容器の選択方法としては、例えば、最適な培養容器を増殖対象細胞に選択させる方法を挙げることができる。具体的に説明すると、複数種類の培養容器を準備し、培養容器の種類が異なる以外は同一の培養条件で増殖対象細胞を増殖させ、培養開始から２週間後の細胞数を公知の方法によって計測し、細胞数が多いものから順に増殖対象細胞の増殖に適した培養容器であると判断することができる。また、増殖対象細胞の増殖速度が速い場合は、培養開始から２週間経過する前であっても、コンフルエント状態の８０〜９０％の細胞数に達する期間が短いものから順に増殖対象細胞の増殖に適した培養容器であると判断することができる。
【００５２】
なお、間葉系幹細胞の増殖には、細胞が培養容器に接着することが必須条件であるので、培養容器に対する増殖対象細胞の接着が弱い場合は、無血清培養する工程において、無血清培地に、細胞接着分子をさらに含有させることが好ましい。細胞接着分子としては、例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン等を挙げることができる。これらの細胞接着分子は、一種類を単独で用いてもよく、複数種類を組み合わせて用いてもよい。
【００５３】
無血清培地に対する細胞接着分子の含有量は、終濃度で、１〜５０μｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは５μｇ／ｍｌである。一実施形態において、細胞接着分子としてフィブロネクチン用いる場合は、無血清培地に対するフィブロネクチンの終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように添加することによって、培養容器に対する増殖対象細胞の接着効率を向上させることができる。
【００５４】
また、無血清培養では、間葉系幹細胞を少なくとも１回継代してもよい。間葉系幹細胞は足場依存的に増殖するので、間葉系幹細胞が局所的に偏って増殖している等の場合に、増殖工程の途中で間葉系幹細胞を継代することによって培養条件を改善することができる。
【００５５】
間葉系幹細胞の継代方法としては特に限定されず、従来公知の間葉系幹細胞の継代方法を用いて継代することできる。継代後の間葉系幹細胞の状態が良好であることから、上記増殖工程では、継代を行う場合に哺乳類及び微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することが好ましい。上記「哺乳類及び微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤」としては、例えば、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）等を挙げることができる。
【００５６】
（凍結保存対象の形態）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物で凍結する対象の細胞の加工物は、どのような形態のものであってもよく、例えば、細胞の懸濁液、シート状に培養したもの、３次元構造の細胞塊等が挙げられる。中でも３次元構造の細胞塊を形成している間葉系幹細胞がより好ましく、スキャフォールドフリーの細胞塊を形成している間葉系幹細胞がさらに好ましい。
【００５７】
細胞塊は間葉系幹細胞のみから構成されることが好ましいが、コラーゲンやヒアルロン酸などの多糖体が入っていてもよい。コラーゲンやヒアルロン酸などの多糖体が入る場合は細胞塊の０．１〜５０％（ｖ／ｖ）であることが好ましい。
【００５８】
また、細胞塊は、凍結させる前に、本発明の凍結保存用組成物の一態様である凍結保存液を該細胞塊へ浸透させる処理（平衡化）を行ってもよく、行わなくてもよいが、特に後述（表５参照）の液抜き凍結を行う場合には、平衡化の工程を行うことが望ましい。
【００５９】
（３次元構造）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物によれば、３次元構造の細胞塊も好適に凍結することができる。細胞懸濁液を患部に投与する場合、投与される細胞が免疫特権を持つと言われる間葉系幹細胞ですら患部から遊走するという報告、及び、ホストの免疫細胞により攻撃される等の理由で患部に留まらないという報告がある。しかし、３次元構造の細胞塊を用いれば、細胞が患部から遊走、脱落することを防ぐことができ、長時間治療効果を発揮させる。
【００６０】
また、３次元構造体状に加工した形態の細胞製剤は、細胞懸濁液型の細胞製剤に対して凍結保存が格段に困難である。また、３次元構造体のように凍結させる細胞塊のサイズや厚みが大きくなると、熱伝導の観点から内部まで均一に凍結させることが困難になる。しかし、本発明の一態様によれば、このような３次元構造の細胞塊であっても、解凍後の死細胞が生じにくく、凍結保存・解凍後にも細胞の性質を変えることなく凍結保存することができる。また、３次元構造の細胞塊は、従来公知の方法で細胞塊を３次元構造に加工したものを用いればよい。本明細書において細胞塊に対して「３次元構造」という場合、マトリクスが３次元的に配向され、また、細胞が３次元に配列しており、細胞間の結合及び配向を保持している細胞を含む３次元方向に広がる物体を指す。
【００６１】
３次元構造の形状としては、例えば、治療の目的に応じて定めればよい。例えば、移植を目的とする部分に応じて、面積、厚み、強度を適宜設定すればよく、当業者は適宜、その大きさを設定することができる。この大きさは、移植される環境に応じて設定することができる。サイズの小さな細胞塊では、注射針で体腔内に注入するといったことも可能であるといったメリットがある。また、サイズの大きな細胞塊では、例えば手術時にピンセントで把持し易いなど、ハンドリングが容易であることなどから、充分な細胞数を投与しやすいというメリットがある。
【００６２】
移植される場合は少なくとも一定の大きさを有することが好ましく、そのような大きさは、例えば、面積について１ｃｍ２以上であり、好ましくは２ｃｍ２以上であり、より好ましくは３ｃｍ２以上である。さらに好ましくは４ｃｍ２以上であり、５ｃｍ２以上であり、６ｃｍ２以上であり、７ｃｍ２以上であり、８ｃｍ２以上であり、９ｃｍ２以上であり、１０ｃｍ２以上であり、１５ｃｍ２以上であり、あるいは２０ｃｍ２以上であり、また、例えば、４０ｃｍ２以下、３０ｃｍ２以下、２０ｃｍ２以下であり得るが、それらに限定されず、面積は、用途に応じて１ｃｍ２以下、又は、４０ｃｍ２以上であり得る。
【００６３】
容積で表す場合は、上記大きさは、好ましくは２ｍｍ３以上であり、より好ましくは４０ｍｍ３以上であり、また、例えば、４０ｃｍ３以下、又は、２０ｃｍ３以下であり得るがそれに限定されず、２ｍｍ３以下でもあり得る。
【００６４】
移植可能な人工組織において十分な厚みは、移植を目的とする部分に依存して変動するが、当業者は適宜、その厚みを設定することができる。この厚みは、移植される環境に応じて設定することができる。５ｍｍを超えてもよい。心臓へ移植する場合は、この最低限の厚みさえ有していればよいが、他の用途が意図される場合、厚みはより厚い方がよい場合があり得、そのような場合、例えば、２ｍｍ以上、より好ましくは３ｍｍ以上、さらに好ましくは５ｍｍ以上であることが意図される。例えば、骨、軟骨、靭帯、腱等に適用される場合、心臓と同様に、例えば１ｍｍ以上であり得、好ましくは２ｍｍ以上、より好ましくは３ｍｍ以上、さらに好ましくは５ｍｍ以上であり得る。また、いずれの場合も１ｍｍ以下であってもよく、１０ｍｍ以下であっても、５ｍｍ以下であってもよい。
【００６５】
細胞塊を構成する細胞の数は、適宜選択すればよいが、例えば、５０〜２００個の塊であってもよく、１００万個〜１億個の塊であってもよい。またその塊は、小さな塊であってもよく、大きな塊であってもよい。上述のように、細胞塊が大きくなると熱伝導の観点から内部まで均一に凍結させることが難しいため、従来法では良好な凍結保存が著しく困難になるが、本発明の一態様によれば、このように大きな細胞塊であっても、解凍後の死細胞が生じにくく、凍結保存・解凍後にも細胞の性質が変わることもなく凍結保存することができる。
【００６６】
以上に例示した大きさの３次元構造の細胞塊を用いれば、細胞が患部から遊走することをより効果的に防ぐことができ、より長時間治療効果を発揮させる。また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物を用いれば、このような大きさの細胞塊であっても、解凍後に死細胞がより生じにくく、凍結保存・解凍後にも細胞の性質が変わることもなく凍結保存を可能にする。
【００６７】
（細胞塊自体に対する軟骨分化誘導試験）
間葉系幹細胞の細胞塊は分化誘導を行わない未分化な状態で移植するのが好ましい。細胞塊を移植した後の軟骨分化能をin vitroで評価する試験する場合には、凍結保存しない状態の細胞塊であっても、凍結保存・解凍後の細胞塊であっても、細かく切断することが好ましい。細胞塊を細かく切断した方が、分化誘導培地が組織内部までより浸透し易いためである。細胞塊を切断するために用いられる手法としては、特に限定されず、例えば、滅菌済みメスあるいはハサミ等が用いられる。また、切断する際、細胞塊の大きさは、概ね１０ｍｇ〜２０ｍｇにすることがより好ましい。
【００６８】
（スキャフォールドフリー）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物で凍結する対象の細胞塊は、スキャフォールドフリーの３次元構造体であることがより好ましい。本明細書において「スキャフォールドフリー（足場フリー、基盤材料なし；ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ）」とは、人工組織を生産するときに従来使用されている材料（基盤材料＝スキャフォールド）を実質的に含まないことをいう。
【００６９】
従来、細胞を付着又は保持させて、その生育を可能とするための、細胞及び組織の足場となる材料、即ちスキャフォールドを人為的に加えることで３次元構造体状に加工した「スキャフォールド型」の細胞製剤が主流である。しかし、最近では人為的に素材を加えるリスクを懸念し、スキャフォールドを人為的に加えずに、例えば細胞自身を刺激して自らの足場となるような環境を自ら産生させる等といった方法で製造される「スキャフォールドフリー型」の細胞製剤の開発が進められている。スキャフォールドフリーの３次元構造体であることにより、細胞製剤に含まれる間葉系幹細胞以外の素材を少なくすることができる。また、スキャフォールドフリーの３次元構造体であることにより、成分が既知であること、生物的汚染及び免疫原性のある物質の混在等のリスクを最小限度にすること、体内に存在しない物質を最小限度にすることを実現できる。例えば、スキャフォールドとしてコラーゲン等の天然物が用いられることがある。このような天然物は、成分がロット毎に異なる。しかし、スキャフォールドフリーの３次元構造体であることにより、成分が既知となるため、安全性及び品質安定性に優れる。また、前記のような天然物は、生物的汚染及び免疫原性のある物質が含まれるリスクがある。スキャフォールドフリーの３次元構造体であることにより、このようなリスクを低減できる。ところで近年、３次元形態の細胞塊であっても凍結保存する方法が開発されつつある。しかしながら、これらの方法はスキャフォールドとして用いるナノファイバー又はコラーゲンシートの組成及び形態を工夫したものである。従って「スキャフォールドフリー型」の細胞製剤には原理的に用いることができない。本発明の一態様においては、このようなスキャフォールドフリーの３次元構造の細胞塊も、解凍後の死細胞が生じにくく、凍結・解凍によって細胞の性質が変わることもなく凍結保存をすることができる。
【００７０】
本発明における凍結対象の一例である間葉系幹細胞を含むスキャフォールドフリーの３次元構造体の細胞塊を得る方法としては、例えば、従来公知の低接着プレート、マイクロパターン表面プレート等を用いる方法、及び、ハンギングドロップ法を採用できる。また、日本国特許第４５２２９９４号公報に記載の方法を用いて作製してもよい。また、市販の物を用いてもよく、例えば、ｇＭＳＣ（登録商標）１（株式会社ツーセル製）を好適に用いることができる。
【００７１】
（脂肪酸）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は脂肪酸を含む。脂肪酸を含むことによって、凍結保存用組成物は、細胞を生存率よく凍結することができ、解凍後の細胞の性質の変化も生じない。
【００７２】
脂肪酸としては、リノール酸、オレイン酸、リノレン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸及びステアリン酸等が挙げられる。中でも、脂肪酸としてはリノール酸及びリノレン酸のうち少なくとも１種が凍結保存用組成物に含まれていることが好ましい。リノール酸及びリノレン酸のうち少なくとも１種が凍結保存用組成物に含まれていることにより、該凍結保存用組成物は、間葉系幹細胞をより生存率よく凍結するができる。また、短鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸でも良い。さらに高度不飽和脂肪酸でもよい。これらは単独でもよく複数種が混合されていてもよい。中でも複数の脂肪酸の混合物が好ましく、含有される脂肪酸の種類と量とが特定されている混合物がより好ましい。例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．製、品番１１９０５−０３１）（以下、「ＣＤ  ｌｉｐｉｄ（登録商標）」という。）がより好ましい。なお、ＣＤ  ｌｉｐｉｄ（登録商標）の原液の組成は次の通りである。Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  ２．０μｇ／ｍｌ，  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ２２０．００μｇ／ｍｌ，  ＤＬ−α−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ−Ａｃｅｔａｔｅ  ７０．００μｇ／ｍｌ，  Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ５４０．００μｇ／ｍｌ，  Ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  Ａｃｉｄ  １０.００μｇ／ｍｌ，
Ｍｙｒｉｓｔｉｃ  Ａｃｉｄ  １０．００μｇ／ｍｌ，  Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  １０．００μｇ／ｍｌ，  Ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  １０．００μｇ／ｍｌ，  Ｐａｌｍｉｔｉｃ  Ａｃｉｄ  １０．００μｇ／ｍｌ，  Ｓｔｅａｒｉｃ  Ａｃｉｄ  １０．００μｇ／ｍｌ，  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８  １００ｍｇ／ｍｌ，  Ｔｗｅｅｎ  ８０  ２．２ｍｇ／ｍｌ。
【００７３】
以上に例示した脂肪酸は前述のように、単独で用いてもよく、複数種を混ぜてもよいが、複数種を混合して用いることがより好ましい。凍結保存用組成物中により多くの種類の脂肪酸の混合物が含まれることにより、生存率をよりよく、間葉系幹細胞を凍結することができ、解凍後の細胞の性質の変化も生じない。
【００７４】
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物における脂肪酸の含有量は特に限定されないが、例えば、凍結保存用組成物の全量に対して、最終濃度で０．０１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌであることが好ましい。例えば、凍結保存用組成物の全量に対して１／１０００〜１／１０（ｖ／ｖ）がより好ましい。
【００７５】
また、例えば、ＣＤ  ｌｉｐｉｄ（登録商標）を用いる場合、凍結保存用組成物の全量に対して１／１０００〜１／１０（ｖ／ｖ）（ＰＡ：０．５〜１００μｇ／ｍｌ，ＰＣ：０．５〜１００μｇ／ｍｌ）がより好ましい。脂肪酸の含有量は、前記の範囲のうち、より多い方が好ましい。つまり、凍結保存用組成物中に豊富に脂肪酸が含まれることがより好ましく、また、多様な脂肪酸を豊富に含むことがより好ましい。これにより、生存率をよりよく、間葉系幹細胞を凍結することができ、解凍後の細胞の性質の変化も生じない。
【００７６】
（脂肪酸エステル）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、脂肪酸エステルを含む。脂肪酸エステルを含むことによって、凍結保存用組成物は、細胞を生存率よく凍結することができる。
【００７７】
脂肪酸エステルとしては、リン脂質、中性脂肪等が挙げられる。中でも、リン脂質が凍結保存用組成物に含まれていることが好ましい。
【００７８】
リン脂質としては、例えば、フォスファチジン酸（以下、フォスファチジン酸のナトリウム塩をＰＡという。また、単に「フォスファチジン酸」という場合、その塩も含む。）、リゾフォスファチジン酸、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン（以下、ＰＣという。）、フォスファチジルグリセロールが挙げられる。
【００７９】
リン脂質等の脂肪酸エステルを用いる場合、その含有量は使用時の凍結保存組成物における最終濃度が、凍結保存用組成物の全量に対して０．０１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌとなるようにすることが好ましい。
【００８０】
（界面活性剤等）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、界面活性剤のような、脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの水溶（乳化）を補助する物質をさらに含有していてもよい。界面活性剤としては、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８又はＴｗｅｅｎ  ８０であり得る。
【００８１】
なお、脂肪酸、あるいは脂肪酸エステルの少なくともいずれかと、界面活性剤との両方が、さらに含まれている凍結保存用組成物用いることが好ましい。該組成物の例として、例えば、フォスファチジン酸とＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８とが含まれる凍結保存用組成物であることが好ましい。該凍結保存用組成物を用いることで、細胞を生存率よく凍結することができる。
【００８２】
（ＤＭＳＯ等の凍結保護剤）
上述した本発明の一態様に係る凍結保存用組成物の成分には、凍結・解凍過程で細胞内に氷結晶が成長することを抑制する、凍結保護剤が含まれていてもよい。凍結保護剤としてはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）等が挙げられる。本発明の一態様に係る凍結保存用組成物が凍結保護剤を含む場合、その量は、凍結保存用組成物の全量に対して０．５％〜５０％（ｖ/ｖ）がより好ましい。
【００８３】
（その他の成分）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は脂肪酸以外の成分を含んでもよく、例えば、基礎培地、増粘剤、ｐＨ調整剤、凍結保護剤等が挙げられる。
【００８４】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物はインスリン、アルブミン、トランスフェリンを含むことがより好ましい。インスリン、アルブミン、トランスフェリンは脂肪酸の作用を増強することができる。これらを加える場合の濃度は、使用時の凍結保存液における最終濃度が０．５μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌとなるようにすることが好ましい。
【００８５】
（凍結保存用組成物の製造方法）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、脂肪酸等の上述した各成分を適宜混合すればよい。
【００８６】
（提供形態）
本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は様々な形態で提供され得る。例えば、液体であってもよく、粉末、錠剤等の固体等であってもよい。固体で提供する場合は、使用者が適宜溶媒で溶解して凍結保存液にして使用すればよいが、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、好適な溶媒を指定する説明書と共に提供されてもよい。
【００８７】
〔凍結保存物の製造方法〕
本発明の一態様に係る凍結保存方法は、細胞を凍結保存した凍結保存物の製造方法であって、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含む。
【００８８】
（ａ）前記細胞を、脂肪酸を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【００８９】
また、本発明の一態様に係る凍結保存方法は、細胞を凍結保存した凍結保存物の製造方法であって、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含む。
【００９０】
（ａ）前記細胞を、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【００９１】
なお、本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法については、本発明の一態様に係る凍結保存組成物について説明したことが準用され、ここでは異なる点について主に説明する。また、「凍結保存物」とは、凍結保存された物のことを言う。
【００９２】
（凍結保存液）
本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法で用いる凍結保存液は脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より少なくとも１種の成分を含む。凍結保存液は、前述の本発明の一態様における凍結保存用組成物のうち液体の形態であるものを用いてもよく、本発明の一態様における凍結保存用組成物のうち固体の形態であるものについては、溶媒に当該固体を溶解して得られる溶液を用いてもよい。
【００９３】
（（ａ）工程）
（ａ）工程では、凍結対象の細胞を、脂肪酸を含む凍結保存液に浸漬する。浸漬する方法としては、例えば、凍結保存可能な容器に凍結保存液を入れ、当該凍結保存液中に細胞を入れることが好ましい。そのまま後述の（ｃ）工程の凍結を行なうことができるからである。
【００９４】
浸漬するときの凍結保存液と凍結対象の細胞との量比は、凍結保存可能な量であれば特に限定されないが、例えば、細胞容積に対して１：１〜１：１０００程度（５０個／ｍｌ〜１億個／ｍｌ程度）である。このような量であれば、細胞中に十分に凍結保存液を浸透させることができる。また、上述の３次元構造の細胞塊を用いる際に、細胞塊中に十分に凍結保存液を浸透させることができる。
【００９５】
（（ｂ）工程）
本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法では、（ａ）工程の後に、（ｂ）前記凍結保存液に前記細胞が浸漬された状態から、前記細胞に対する前記凍結保存液の量を減らす工程を含み、後述する（ｃ）工程では、前記（ｂ）工程後の前記細胞を凍結することがより好ましい。保存後の融解時間を短時間にすることができ、これにより、凍結保存による細胞の回収率、全細胞数、生存率をより向上させることができる。
【００９６】
（ｂ）工程の具体的な方法としては、間葉系幹細胞が含まれる凍結保存液から、凍結保存液を除去してもよく、間葉系幹細胞を取り出してもよい。また、（ｂ）工程では、間葉系幹細胞が、前記凍結保存液に浸漬されていない状態にすることがより好ましい。これにより、融解時間をより短時間にすることができ、凍結保存による細胞の回収率、全細胞数、生存率をより向上させることができる。ただし、浸漬されていない状態にする形態においても、完全に凍結保存液を間葉系幹細胞と分離することは必須の要件とはされず、間葉系幹細胞が格納されている容器に凍結保存液が残存してもよい。また、例えば、間葉系幹細胞が凍結保存液に浸漬した状態で格納されている容器から、凍結保存液を吸引してもよく、間葉系幹細胞を取り出してもよい。凍結保存液を吸引する場合には、ピペット等の従来公知の吸引器具を用いればよい。
【００９７】
（（ｃ）工程）
（ｃ）工程では、間葉系幹細胞を凍結する。（ｂ）工程を行なった場合には、（ｂ）工程によって浸漬されていない状態とした間葉系幹細胞を凍結する。凍結温度は凍結対象の間葉系幹細胞が凍結する温度に適宜設定すればよいが、例えば−８０℃以下、又は−１９６℃以下が挙げられる。−８０℃以下で凍結する場合は、例えば、従来公知の例等を用いればよく、−１９６℃以下で凍結する場合は、液体窒素を用いればよい。
【００９８】
（凍結保存容器）
凍結保存に用いる容器は、凍結温度に耐え得るものであればよい。例えば、−８０℃に耐え得るものであることが好ましく、−１９６℃に耐え得るものであることがより好ましい。具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリエチレンテレフタレート等の合成樹脂製の容器がより好ましい。該容器は、例えば、市販のクライオバイアル（凍結ベッセル）を使えば良い。
【００９９】
（細胞回収方法）
凍結保存後に細胞を回収する方法は特に限定されず、例えば、凍結保存されたものを融解すればよい。融解させる方法としては、細胞が損傷しない温度で融解させればよく、公知の方法が用いられる。該方法としては例えば、ウォーターバスによる融解法、ヒートブロック法、室温融解法等の一般的な方法が挙げられる。ウォーターバスによる融解法、ヒートブロック法が好ましく、中でも融解温度および融解時間等の観点から、ウォーターバスによる融解法がさらに好ましい。
【０１００】
融解温度は１０℃以上、４５℃以下が好ましく、２０℃以上、４０℃以下がより好ましく、３５℃以上、４０℃以下がより好ましい。例えば、室温（２５℃）に静置してもよいが、実施例で示すように３５〜３８℃の湯浴（ウォーターバス）を用いて融解することがより好ましい。迅速且つ、細胞の回収率、生存率がより高いからである。
【０１０１】
〔細胞製剤〕
本発明の一態様に係る細胞製剤は、細胞を含み、脂肪酸を含む凍結保存用組成物と、を含み、凍結保存されている。また、本発明の一態様に係る細胞製剤は、細胞を含み、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存用組成物と、を含み、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、凍結保存されている。なお、本発明の一態様に係る細胞製剤については、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物について説明したことが準用される。
【０１０２】
本明細書中において、「細胞製剤」は、再生医療用材料として再生医療等に用いられる、細胞を製剤化した治療薬であり、細胞を元の状態のまま機能を変化させることなく製剤化したもののみならず、特定の条件の下で培養及び増殖させることによって、分化能、免疫抑制能等の機能を向上させた細胞を製剤化したものも含む。
【０１０３】
本発明の一態様に係る細胞製剤は、後述の本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法によって好適に得られる。なお、本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法において（ｂ）工程を行なった場合にも、細胞中には凍結保存用組成物の成分が浸透している。
【０１０４】
〔細胞製剤の製造方法〕
本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法は、細胞を含む細胞製剤の製造方法であって、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含む。
【０１０５】
（ａ）前記細胞を、脂肪酸を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【０１０６】
間葉系幹細胞を含む細胞製剤の製造方法であって、以下の（ａ）、（ｃ）の工程をこの順に含むことを特徴とする細胞製剤の製造方法、
（ａ）前記細胞を、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を含む凍結保存液に浸漬する工程、
（ｃ）前記細胞を凍結する工程。
【０１０７】
なお、本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法については、本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法について説明したことが準用される。
【０１０８】
本発明の一態様に係る細胞製剤の製造方法は、本発明の凍結保存物の製造方法の一態様であり得る。
【０１０９】
〔凍結細胞用キット〕
本発明の一態様に係る凍結細胞用キットは、細胞を凍結保存するための凍結保存用キットであって、脂肪酸を備える。また、本発明の一態様に係る凍結細胞用キットは、細胞を凍結保存するための凍結保存用キットであって、３次元構造である細胞塊を形成した前記細胞を凍結保存するためのキットであり、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群より選ばれる少なくとも１種の成分を備える。以下、単に「凍結細胞用キット」という場合、「間葉系幹細胞を凍結保存するための凍結保存用キット」と、「細胞を凍結保存するための凍結保存用キットであり、前記細胞は、３次元構造である細胞塊を形成しているものであり、当該細胞塊を凍結保存するための凍結保存用キット」と、のいずれをも指すものとする。例えば、「本発明の一態様に係る凍結細胞用キット」という場合、細胞を凍結保存するための凍結保存用キットの一態様でもあり得、３次元構造である細胞塊を形成している細胞を凍結保存するための凍結保存用キットの一態様でもあり得る。
【０１１０】
本発明の一態様に係る凍結細胞用キットによれば、上述した本発明の一態様に係る凍結保存用組成物及び細胞製剤を好適に得ることができ、また、上述した本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法及び細胞製剤を製造する方法を好適に実施できる。なお、本発明の一態様に係る凍結保存用キットについては、本発明の一態様に係る凍結保存組成物について説明したことが準用され、ここでは異なる点について主に説明する。
【０１１１】
本発明の一態様に係る凍結細胞用キットの構成は、態様によっては脂肪酸、態様によっては脂肪酸及び脂肪酸エステルのうち少なくとも１種の成分を備える限り、特に限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、上述した本発明の一態様に係る凍結保存用組成物の脂肪酸及び脂肪酸エステル以外の成分を備えていてもよい。また、間葉系幹細胞を安定的に保持するための試薬、バッファー等を備えていてもよく、間葉系幹細胞を無血清培養するための無血清培地を備えていてもよく、培養した間葉系幹細胞からスキャフォールドフリーで３次元構造に加工された細胞塊を得るための試薬、器具を備えていてもよい。また、本発明の一態様に係る凍結細胞用キットは、複数の異なる試薬を、適切な容量及び／又は形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。
【０１１２】
また、本発明の一態様に係る凍結細胞用キットには、凍結保存用組成物を得るための手順等を記載した指示書を含んでもよい。紙若しくはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、又は磁気テープ、コンピューター等の読み取り可能なディスク又はＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。
【０１１３】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、実施形態中にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１４】
〔付記事項〕
以上のように、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、細胞は、間葉系幹細胞であることがより好ましい。
【０１１５】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記細胞は、３次元構造であり、スキャフォールドフリーの細胞塊を形成しているものであり、当該細胞塊を凍結保存するためのものであることがより好ましい。
【０１１６】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記細胞は、スキャフォールドフリーの細胞塊を形成しているものであることがより好ましい。
【０１１７】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記細胞は無血清培養されたものであることがより好ましい。
【０１１８】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記成分は脂肪酸エステルであり、界面活性剤をさらに含むことがより好ましい。
【０１１９】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記脂肪酸はリノール酸及びリノレン酸のうち少なくとも１種であることがより好ましい。
【０１２０】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記脂肪酸エステルはリン脂質であることがより好ましい。
【０１２１】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記リン脂質はフォスファチジン酸であることがより好ましい。
【０１２２】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物では、前記脂肪酸エステルはフォスファチジン酸であり、前記界面活性剤はＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８であることがより好ましい。
【０１２３】
また、本発明の一態様に係る凍結保存用組成物は、−８０℃以下で凍結保存するためのものであることがより好ましい。
【０１２４】
また、本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法では、前記（ａ）工程の後に、（ｂ）前記凍結保存液に前記細胞が浸漬された状態から、前記細胞に対する前記凍結保存液の量を減らす工程を含み、前記（ｃ）工程では、前記（ｂ）工程後の前記細胞を凍結することがより好ましい。
【０１２５】
また、本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法では、前記（ｂ）工程では、前記細胞が、前記凍結保存液に浸漬されていない状態にすることがより好ましい。
【０１２６】
また、本発明の一態様に係る凍結保存物の製造方法では、前記（ｃ）工程において、−８０℃以下で凍結することがより好ましい。
【０１２７】
また、本発明の一態様に係る細胞を含む細胞製剤の製造方法では、前記（ａ）工程の後に、（ｂ）前記凍結保存液に前記細胞が浸漬された状態から、前記細胞に対する前記凍結保存液の量を減らす工程を含み、前記（ｃ）工程では、前記（ｂ）工程後の前記細胞を凍結することがより好ましい。
【０１２８】
また、本発明の一態様に係る細胞を含む細胞製剤の製造方法では、前記（ｂ）工程では、前記細胞が、前記凍結保存液に浸漬されていない状態にすることがより好ましい。
【実施例】
【０１２９】
＜実施例１：細胞懸濁液の凍結保存に対する有効成分特定試験：細胞生存率への影響検討のための凍結保存実験＞
細胞懸濁液の凍結保存に対する有効成分を特定するために、細胞凍結保存液の組成を振って、試験細胞懸濁液状のＭＳＣに対する凍結保存効果を評価した。本実施例では特に断りの無い限り、以下のプロトコールに従った。【０１３０】
〔プロトコール〕
「細胞培養」
ヒト滑膜由来ＭＳＣの初代細胞は、以下の（１）から（４）の手順、もしくは、組織を細断して培養容器中で培養液（ＳＴＫ（登録商標）１）中に浸漬し、組織片から細胞をＯｕｔｇｒｏｗｔｈさせることで得た。【０１３１】
（１）ヒトから滑膜を採取した。【０１３２】
（２）得られた滑膜組織をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、カルシウム及びマグネシウムフリー、ＰＢＳ（−）、株式会社細胞科学研究所）で洗浄後、組織を０．４％コラゲナーゼ溶液１０ｍｌ中に加えて混和し、３７℃で１〜４時間反応させた。【０１３３】
（３）フィルタリング後、遠心分離した。【０１３４】
（４）メーカーの指示に従い、ＳＴＫ（登録商標）１（ＭＳＣの初代培養用無血清培地、ツーセル株式会社/ＤＳファーマバイオメディカル株式会社から販売、以下の説明において同じ。）中で初代培養を行った。【０１３５】
上記の方法で得られた初代細胞を継代し、ＳＴＫ（登録商標）２（ＭＳＣ増殖培養用無血清培地、株式会社ＤＳファーマバイオメディカルより発売。以下の説明において同じ。）にて、メーカーの指示に従って継代培養を繰り返すことで、増殖させた。【０１３６】
「細胞凍結」
継代培養を繰り返すことで増殖されたＭＳＣを、ＳＴＫ（登録商標）２培地中でさらに平面培養し、サブコンフルエントになった状態で、ＰＢＳで１回洗浄した。【０１３７】
その後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で剥離・シングルセル化し、遠心分離用のチューブ中に回収し、洗浄培地（ＤＭＥＭ，  Ｓｉｇｍａ）を用いて希釈した。【０１３８】
その後、室温で５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離することで、ペレットダウンした。【０１３９】
上記のペレットダウンされたＭＳＣを再び洗浄培地中に懸濁し、この細胞懸濁液とトリパンブルー溶液とを１０μＬずつ混合し、ワンセルカウンター（登録商標）を用いて細胞数をカウントした。【０１４０】
その結果に基づき、細胞懸濁液を「遠心分離用のチューブ１本あたり１００万ｃｅｌｌｓ」となるように小分けし、再び、同上の方法でペレットダウンした。【０１４１】
それぞれの遠心チューブ中から懸濁用の培地（上澄）を除去した後、それぞれの条件で用いる各凍結保存液をそれぞれの遠心チューブに１．０ｍｌ分注し、懸濁した。各凍結保存液の組成は、以下の表１、表２及び表３に記載の通りである。【０１４２】
上記の、凍結保存液中に懸濁されたＭＳＣを凍結バイアル中に収容した。ここで、凍結バイアルはｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｖｉａｌ（２ｍｌ、ＷＨＥＡＴＯＮ社）を用いた。【０１４３】
その後、前記の凍結バイアルを−８０℃フリーザー（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）に移動し、凍結保存した。【０１４４】
「細胞融解」
１．−８０℃フリーザー中で１週間凍結保存したＭＳＣ（凍結バイアル中に保存）を取り出した。
２．前記の凍結バイアルを３７℃湯浴（ウォーターバス）にて２．５分間温めた。
３．目視で氷の塊が完全に融解したことを確認し、前記の凍結バイアルをウォーターバスから取り出した。【０１４５】
「細胞数測定」
１．融解した細胞を洗浄培地（ＤＭＥＭ，  Ｓｉｇｍａ）で１回洗浄した後、再び洗浄培地にて懸濁した。
２．マイクロチューブ内で細胞懸濁液とトリパンブルー溶液を１０μＬずつ混合し、ワンセルカウンター（登録商標）を用いて細胞数をカウントし、生存率を算出した。【０１４６】
〔結果１〕
まず、次の３つの凍結保存液それぞれを用いて、細胞懸濁液状のＭＳＣの凍結保存実験を行なった。以下の凍結保存液において、基礎培地は、「ＭＣＤＢとＤＭＥＭとを１：１の比率で混合したもの」を用いた。以降、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）の凍結保存液を、必要に応じ、それぞれ凍結保存液（ｉ）、凍結保存液（ｉｉ）、凍結保存液（ｉｉｉ）等と略記することがある。【０１４７】
（ｉ）基礎培地を用いた保存液：
基礎培地
＋Ａｌｂｕｍｉｎ（１．２５ｍｇ／ｍｌ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＣｅｌｌＰｒｉｍｅ  ｒＡｌｂｕｍｉｎ：ＡＦ−Ｓ）＋１０％ＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ  ０３１−２４０５１）
（ｉｉ）ＳＴＫ２（サイトカインフリー）を用いた保存液：
基礎培地
＋Albumin（1.25 mg/ml, Millipore, CellPrime rAlbumin AF-S）
+ Insulin（10 μg/ml, Wako, 090-06481）
+ Transferrin（5.5 μg/ml, Wako, 201-18081）
+ Ascorbic acid 2-phosphate(VC)（50μg/ml, SIGMA, A8960）
+ Dexamethasone (Dex)（10-8M, SIGMA(Fluka), 31375）
+ Na2SeO3（6.7 ng/ml, Wako, 194-10842）
＋CD lipid(登録商標)(原液の1/100, Thermo Fisher Scientific Inc., 11905-031）
＋Phosphatidic acid sodium salt (PA)(10μg/ml, Sigma, P9511）
＋Phosphatidylcholine(PC)(10 μg/ml, Sigma P3556）
＋L-Glutathione (reduced) （2μg/ml, メルクミリポア, 104090）
＋Lithium chloride(LiCl)(1mM, メルクミリポア, 105679）
（ｉｉｉ）ＳＴＫ（登録商標）２を用いた保存液：
ＳＴＫ（登録商標）２＋１０％ＤＭＳＯ（Ｗａｋｏ  ０３１−２４０５１）
結果を図１に示す。図１（ａ）は各凍結保存液の成分比較を簡単に説明するための図であり、図１（ｂ）は凍結保存実験の結果を示す図である。この棒グラフのそれぞれの項目において、「Ｌｉｖｅ」は「凍結バイアル（ｖｉａｌ）一本あたりの生細胞数」を示し、「Ｔｏｔａｌ」は「凍結バイアル一本あたりの全細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「凍結バイアル一本あたりの全細胞数」に対する「凍結バイアル一本あたりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結保存・解凍を行った結果である。【０１４８】
図１（ｂ）に示すように、凍結保存液（ｉ）と比較して、凍結保存液（ｉｉ）及び凍結保存液（ｉｉｉ）で保存した場合、凍結保存・解凍後におけるＭＳＣの細胞数は有意に多く（Ｐ＜０．００１）、細胞生存率も高かった。また、凍結保存液（ｉｉ）で保存したＭＳＣと、凍結保存液（ｉｉｉ）で保存したＭＳＣとの間で、凍結保存・解凍後の細胞数及び細胞生存率の差は認められなかった。ＭＳＣの凍結保存を行なう際に、本発明の一態様によれば良好に凍結保存できることに加え、サイトカインが必須ではないことが示された。【０１４９】
〔結果２〕
表１の凍結保存液それぞれを用いて細胞懸濁液状のＭＳＣの凍結保存実験を行なった結果を図２に示す。図２はＭＳＣの凍結保存実験の結果を示す図である。この棒グラフのそれぞれの項目において、「全細胞数」は「凍結バイアル一本あたりの凍結保存・解凍後の全細胞数」を示し、「生細胞」は「凍結バイアル一本あたりの凍結保存・解凍後の生細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「凍結バイアル一本あたりの全細胞数」に対する「凍結バイアル一本あたりの生細胞数」の比を示している。【０１５０】
なお、本実施形態以降に示す各表等に記載の「基礎培地」は、基礎培地であるＭＣＤＢとＤＭＥＭとを１：１の比率で混合したものを意図する。また、ＳＴＫ２（サイトカインフリー）及びＳＴＫ（登録商標）２は、それぞれ、上記〔結果１〕の凍結保存液（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の凍結保存液の（ＤＭＳＯ以外の部分の）ことである（図１（ａ）参照）。以降、ＳＴＫ２（サイトカインフリー）のことを、ＳＴＫ２（−）等と略記することもある。ＳＴＫ２（サイトカインフリー）に含まれる組成は、サイトカインを含まない以外は、前記ＳＴＫ（登録商標）２培地と同一の組成である。【０１５１】
【表１】
2019026910.tif 000002
図２に示すように脂肪酸及びＰＡ、ＰＣを添加した凍結保存液を用いた条件（１−４、１−６）では、そうでない条件（前記以外）に比べ、凍結保存・解凍後の細胞数が多く、生存率が高かった。従って、脂肪酸およびＰＡ、ＰＣは、ＭＳＣの凍結保存に効果があると認められた。また、Ｎａ２ＳｅＯ３の単独添加又は抗酸化剤「Ｌ−Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  （ｒｅｄｕｃｅｄ）＋Ｌｉｔｈｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＬｉＣｌ）」の添加では効果がなかった。【０１５２】
〔結果３〕
表２に記載の凍結保存液それぞれを用いて細胞懸濁液状のＭＳＣの凍結保存実験を行なった結果を図３に示す。図３はＭＳＣの凍結保存実験の結果を示す図である。この棒グラフのそれぞれの項目において、「全細胞数」は「凍結バイアル一本あたりの凍結保存・解凍後の全細胞数」を示し、「生細胞」は「凍結バイアル一本あたりの凍結保存・解凍後の生細胞数」を示している。（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）また、「生存率」とは、「凍結バイアル一本あたりの全細胞数」に対する「凍結バイアル一本あたりの生細胞数」の比を示している。【０１５３】
【表２】
2019026910.tif 000003
図３に示すように脂肪酸を添加した凍結保存液を用いた条件（２−７、２−１０、２−１１）では、そうでない条件（前記以外）に比べ、凍結保存・解凍後の全細胞数及び生存率が高く、ＭＳＣの凍結保存に効果があると認められた。【０１５４】
〔結果４〕
表３に記載のそれぞれの凍結保存液を用いて細胞懸濁液状のＭＳＣの凍結保存実験を行なった結果を図４に示す。図４はＭＳＣの凍結保存実験の結果を示す図である。この棒グラフのそれぞれの項目において、「全細胞数」は「凍結バイアル一本あたりの凍結保存・解凍後の全細胞数」を示し、「生細胞」は「凍結バイアル一本あたりの凍結保存・解凍後の生細胞数」を示している。（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）また、「生存率」とは、「凍結バイアル一本あたりの全細胞数」に対する「凍結バイアル一本あたりの生細胞数」の比を示している。【０１５５】
【表３】
2019026910.tif 000004
図４に示すように脂肪酸を添加した凍結保存液を用いた条件（（３−２）から（３−５）、（３−７））では、そうでない条件（前記以外）に比べ、凍結保存・解凍後の細胞数が多く、生存率が高かった。従って、脂肪酸は、ＭＳＣの凍結保存に効果があると認められた。【０１５６】
＜実施例２：スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊を用いた凍結保存実験＞
本発明の一形態における凍結保存液のスキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊に対する効果を評価する為、実施例１の〔結果１〕に記載の凍結保存液（ｉｉ）及び凍結保存液（ｉｉｉ）を用いて、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験を行なった。【０１５７】
〔プロトコール(ｇＭＳＣ（登録商標）１の作製、凍結・解凍、セルカウント)〕
「ｇＭＳＣ（登録商標）１の作製」
ヒト滑膜由来ＭＳＣの初代細胞は、以下の（１）から（４）の手順、もしくは、組織を細断して培養容器中で培養液（ＳＴＫ１）中に浸漬し、組織片から細胞をＯｕｔｇｒｏｗｔｈさせることで得た。【０１５８】
（１）ヒトから滑膜を採取した。【０１５９】
（２）得られた滑膜組織をＰＢＳで洗浄後、組織を０．４％コラゲナーゼ溶液１０ｍｌ中に加えて混和し、３７℃で１〜４時間反応させた。【０１６０】
（３）フィルタリング後、遠心分離した。 
（４）メーカーの指示に従い、ＳＴＫ（登録商標）１中で初代培養を行った。【０１６１】
上記の方法で得られた初代細胞を継代し、ＳＴＫ（登録商標）２にて、メーカーの指示に従って継代培養を繰り返すことで、増殖させた。【０１６２】
サブコンフルエントになったＭＳＣ（５継代目：Ｐ５）をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、カルシウム及びマグネシウムフリー、ＰＢＳ（−）、株式会社細胞科学研究所）で１回洗浄した後、細胞剥離剤ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＴＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で剥離、回収して洗浄培地（ＤＭＥＭ，  Ｓｉｇｍａ）にて懸濁した後、遠心分離用のチューブに移し、室温で５分、１５００ｒｐｍで遠心分離した。分離した単一細胞を再び洗浄培地にて懸濁し、トリパンブルー染色により細胞数をカウントした。ＳＴＫ（登録商標）２にて６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ（住友ベークライト株式会社）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の播種密度で細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７日間培養（高密度培養）した。培地交換は、播種から３日目、５日目に行った。【０１６３】
通常は、播種から７日目に機械的に培養皿から組織を剥離して、複数の間葉系幹細胞が集合し、たぐまった状態にすることで、スキャフォールドフリーの３次元構造体である、ｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞塊が得られる。【０１６４】
「ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存方法」
１．材料
（１）凍結保存液（自社製）：
凍結保存液は、実施例１の〔結果１〕に記載の（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の凍結保存液をそれぞれ用いた。これらの組成は前述の通り（図１（ａ）、等参照）である。【０１６５】
（２）凍結保存容器：ＷＨＥＡＴＯＮ  ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｖｉａｌ、型番：Ｗ９８５８６８
（３）保存液使用量：１．０ｍＬ／ｇＭＳＣ（登録商標）１／ｃｒｙｏｖｉａｌ
２．ｇＭＳＣ（登録商標）１の作製及び、凍結保存
ｇＭＳＣ（登録商標）１の作製は、前述の「ｇＭＳＣ（登録商標）１の作製」欄の記載に準拠して行う。より好適には、以下に記載するように凍結保存液を細胞塊へ浸透させるための動作（平衡化）を行うのが望ましい。【０１６６】
平衡化は、培養物を「ｇＭＳＣ（登録商標）１形状に加工する前」(以下の（２）参照）に行っても良く、「ｇＭＳＣ（登録商標）１形状に加工した後」(以下の（４）参照)に行っても良いが、本実施例では両方を行った場合の一例を説明する。特に、本実施例では「ｇＭＳＣ（登録商標）１形状に加工する前」の平衡化工程も説明する為、先に詳述したｇＭＳＣ（登録商標）１の作製の工程も併せて簡潔に記載する。【０１６７】
（１）６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ上に高密度培養されたＭＳＣ（ｄａｙ  ７）の培養上清を全てアスピレートした。【０１６８】
（２）前記の６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅをＰＢＳ（−）２ｍＬで２回洗浄した後、凍結保存液２ｍＬを加え、安全キャビネット内にて室温で１０分間静置した。【０１６９】
（３）前記の凍結保存液の入った６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅにおいて、チップをつけたＰ２００のピペットマン（登録商標）を用い、高密度培養されたＭＳＣを培養容器から物理的に剥離させ、たぐまった状態にすることで３次元形状のｇＭＳＣ（登録商標）１に加工した。【０１７０】
（４）その後、凍結保存液の入った同じ６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ上でさらに室温で１０分間静置した。【０１７１】
（５）予め１ｍＬの凍結保存液を入れた凍結保存容器にｇＭＳＣ（登録商標）１を移し、冷蔵庫（４℃）にて１０分間静置した。【０１７２】
（６）−８０℃フリーザーに移動し、凍結保存した。【０１７３】
「ｇＭＳＣ（登録商標）１の融解方法」
１．−８０℃フリーザーから凍結したｇＭＳＣ（登録商標）１（凍結バイアル中に収容されている）を取り出した。
２．前記の凍結バイアルを３７℃湯浴（ウォーターバス）にて２．５分間温めた。
３．目視で氷塊状のｇＭＳＣ(登録商標)１が完全に融解されたことを確認し、前記の凍結バイアルをウォーターバス中から取り出した。【０１７４】
「融解したｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数測定方法」
１．材料
（１）Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ａ  （Ａｎｉｍａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ  Ｆｒｅｅ）。Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、型番：ＬＳ００４１５４
（２）０．４％トリパンブルー溶液。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．  型番：１５２５０
（３）ＤＭＥＭにて調製した５６０Ｕ（ｕｎｉｔ）／ｍＬのコラゲナーゼ溶液を０．４５ｍｍフィルター（ミリポア  型番：ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）にて、フィルトレーションした。
２．方法
（１）ｇＭＳＣ（登録商標）１を１５ｍＬ遠沈管のコラゲナーゼ溶液１ｍＬへ入れた。【０１７５】
（２）３７℃のＣＯ２インキュベーター内で９０分間静置する。３０分毎に混和（ボルテックス）しながら加温した。【０１７６】
（３）反応時間終了時にｇＭＳＣ（登録商標）１がシングルセルサスペンジョン状態まで完全に分解されたことを確認し、よく混和した。【０１７７】
（４）マイクロチューブ内で細胞懸濁液とトリパンブルー溶液を１０μＬずつ混合し、ワンセルカウンターを用いて細胞数をカウントした。【０１７８】
〔実験の結果（上述のｇＭＳＣ（登録商標）１の作製、凍結保存・解凍後のセルカウント）〕
上記の実験の結果を図５に示す。即ち、図５はｇＭＳＣ（登録商標）１を用いた凍結保存実験の結果を示す図である。この棒グラフのそれぞれの項目において、「Ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し、「Ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している。（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」に対する「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結保存・解凍後の結果である。【０１７９】
前述の通り、凍結保存液は、実施例１の〔結果１〕欄に記載の（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の凍結保存液をそれぞれ用いた。これらの組成は前述の通り（図１（ａ）、等参照）であるが、いずれにおいてもＣＤ  ｌｉｐｉｄ（登録商標）、ＰＡ、ＰＣを前述の組成で含有させた。【０１８０】
図５に示すとおり、上記の（ｉｉ）、（ｉｉｉ）のいずれの凍結保存液を用いることで、三次元形態であるｇＭＳＣ（登録商標）１においても、凍結前の状態と同様に、全細胞数及び、生細胞数（細胞の生存率）が良好であることが示された。このことから、本発明の一態様の凍結保存液によって、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊を良好に凍結保存できることが示された。また、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の比較から、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊においても、サイトカインの有無によっては全細胞数及び細胞の生存率に有意な差は認められないことが判った。【０１８１】
〔凍結保存前後の細胞の骨・脂肪分化能の確認〕
次に、凍結保存前のｇＭＳＣ（登録商標）１、及び凍結保存液（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を用いて凍結保存・解凍した後のｇＭＳＣ（登録商標）１を用いて、骨・脂肪分化能の評価を行った。【０１８２】
（骨分化能評価の方法）
凍結保存前のｇＭＳＣ（登録商標）１、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１のいずれにおいても、以下の方法で骨分化能を評価した。即ち、ｇＭＳＣ（登録商標）１をコラゲナーゼ処理によりシングルセル状態にし、洗浄した後に、それぞれＳＴＫ（登録商標）２で培養し、コンフルエントになった時点で、培地交換を行い、用いる培地を骨分化用培地（ＳＴＫ（登録商標）３（株式会社ＤＳファーマバイオメディカル製））に切り替えて培養した。この後の培地交換は、概ね３日に１回行った。培養２１日後に、培養後のｇＭＳＣ（登録商標）１を、アリザリンレッドＳ（ナカライテスク：０１３０３−５２）で染色し、骨分化誘導されているか否かを確認した。【０１８３】
（脂肪分化能評価の方法）
凍結保存前のｇＭＳＣ（登録商標）１、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１のいずれにおいても、以下の方法で骨分化能を評価した。即ち、コラゲナーゼ処理によりシングルセル状態にし、洗浄した後にそれぞれＳＴＫ（登録商標）２を用いて６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅ中で培養し、コンフルエントになった時点で、培地交換を行い、用いる培地を脂肪分化用培地（ＤＭＥＭ（ｓｉｇｍａ：Ｄ５７９６）、ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ０７８１）、インスリン（Ｗａｋｏ：０９３−０６４７１）、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ：Ｄ１７５６）、インドメタシン（Ｗａｋｏ：０９７−０２４７１）、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ：４１０９５７））に切り替えて３日間培養した。その後、脂肪分化誘導培地と脂肪分化維持培地（ＭＥＭ（ｓｉｇｍａ：Ｄ５７９６）、ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ：Ｐ０７８１）、インスリン（Ｗａｋｏ：０９３−０６４７１））とを３日おきに交互に交換し分化培養を続けた。培養２１日後にオイルレッドＯ（ＷＡＫＯ：１５４−０２０７２）で染色し、脂肪分化誘導されているか否かを確認した。【０１８４】
（骨分化能・脂肪分化能評価の結果）
以上の実験を３株のｇＭＳＣ（登録商標）１について行なった。結果を図６に示す。図６は、凍結保存・解凍後の細胞の骨・脂肪分化能の確認実験の結果を示す図であり、図６の（ａ）は骨分化能の確認結果を示し、図６の（ｂ）は脂肪分化能の確認結果を示す図である。図６に示すとおり、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊においても、凍結保存液（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の何れを用いて凍結した場合にも、凍結保存・解凍後にも良好な骨分化能及び脂肪分化能を有することが確認できた。【０１８５】
〔凍結保存前後の細胞の軟骨分化能の確認〕
次に、凍結保存前のｇＭＳＣ（登録商標）１、及び凍結保存液（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を用いて凍結保存・解凍した後のｇＭＳＣ（登録商標）１を用いて、軟骨分化能の評価を行なった。なお、以下に記載のように、軟骨分化誘導を行う前に、凍結保存前のｇＭＳＣ（登録商標）１、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１のいずれにおいても、これを滅菌済みメスあるいはハサミで４等分(湿重量で概ね１０ｍｇ〜２０ｍｇ)した。【０１８６】
（軟骨分化能評価の方法）
凍結保存前のｇＭＳＣ（登録商標）１、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１のいずれにおいても、以下の方法で軟骨分化誘導を行う。即ち、ｇＭＳＣ（登録商標）１を４等分（湿重量で概ね１０ｍｇ〜２０ｍｇ）した後、軟骨分化用基礎培地で１回洗浄後、１個ずつを１５ｍＬコニカルチューブに移し、軟骨分化誘導培地（高グルコースα−ＭＥＭ中に、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β３、１００ｎＭのＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、５０μｇ／ｍｌのＬ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ２‐ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１００μｇ／ｍｌのＳｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、ＩＴＳ−プラス（６．２５μｇ／ｍｌのＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、６．２５μｇ／ｍｌのＩｎｓｕｌｉｎ、６．２５ｎｇ／ｍｌのｓｅｌｅｎａｔｅ、５．３５μｇ／ｍｌのｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、１．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。）を前記のコニカルチューブに分注（１．０〜１．８ｍｌ／本）し、５％炭酸ガス存在下にて３７℃で２８日間培養した。なお、２〜３日おきに同一の分化誘導培地と交換した。硫酸化グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ：ＧＡＧ）定量用キット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）を用いて培養後のｇＭＳＣ（登録商標）１の硫酸化グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ：ＧＡＧ）の量を定量した。なおＧＡＧの量は細胞のＤＮＡ含量によってノーマライズした。【０１８７】
（軟骨分化能評価の結果）
以上の手順を３株のｇＭＳＣ（登録商標）１について行なった。結果を図７に示す。図７は凍結保存・解凍後の細胞の軟骨分化能の確認実験の結果を示す図であり、図７の（ａ）は軟骨分化能の確認実験を行なったサンプルを撮影した結果を示し、図７の（ｂ）は硫酸化グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ：ＧＡＧ）ａｓｓａｙの結果を示す図である。図７に示すとおり、凍結保存液（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の何れを用いて凍結した場合にも、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊においても、凍結保存・解凍後にも良好な軟骨分化能を有することが確認できた。【０１８８】
〔凍結保存前後の細胞表面抗原マーカーの発現確認〕
次に、凍結保存前のｇＭＳＣ（登録商標）１、及び凍結保存液（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を用いて凍結保存・解凍した後のｇＭＳＣ（登録商標）１を用いて、細胞表面抗原マーカーの発現確認を行った。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ解析）によって細胞表面抗原マーカーの発現の確認を評価した。ＦＡＣＳ解析に用いたフローサイトメータは、ＢＤ社製ＦＡＣＳＶＥＲＳＥ（登録商標）を用いた。【０１８９】
（細胞サンプルの準備）
（１）上述の方法で凍結保存・解凍後に融解して得られた細胞懸濁液の細胞数と細胞濃度を確認して、洗浄工程後に５００万個の細胞を分取した。【０１９０】
（２）分取した細胞懸濁液を回転数１，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行い、遠心終了後、ほぼ全量の上清を除去した。【０１９１】
（３）５ｍＬのＤＭＥＭにて細胞ペレットを懸濁混和した。【０１９２】
（４）回転数１，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行い、遠心終了後、ほぼ全量の上清を除去した。【０１９３】
（５）０．５％ＨＳＡ（ヒトアルブミン）含有ＰＢＳ（−）、１．７ｍＬを用いて得られた細胞ペレットを懸濁混和してから、１００μＬずつ２．０ｍＬチューブ１６本に分注した。【０１９４】
（ＦＡＣＳ抗体反応）
（１）各抗体を薬用冷蔵ショーケース（４℃）より取り出して、前記の各チューブに添加した。各抗体の添加量は規定濃度（／１，０００，０００ｃｅｌｌｓ）より算出した。【０１９５】
（２）遮光（４℃）で一晩反応させた。【０１９６】
（３）反応終了後、回転数１，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行なった。【０１９７】
（４）遠心終了後、ほぼ全量の上清を除去した。【０１９８】
（５）各チューブに０．５％ＨＳＡ（ヒトアルブミン）／ＰＢＳを３００μＬずつ添加して、懸濁した。【０１９９】
（６）回転数１，５００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行い、遠心終了後、ほぼ全量の上清を除去した。【０２００】
（７）各チューブに０．５％ＨＳＡ（ヒトアルブミン）含有ＰＢＳ（−）を３００μＬずつ添加し、蛍光色素（7-Amino-ActinomycinD；Biolegend社製の420403）をメーカーの推奨通り加え懸濁した。【０２０１】
（８）各サンプルをそれぞれ、手動ピペット（１００−１０００μＬ）を用いてセルストレーナー付きチューブを通した。【０２０２】
（９）ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ社ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩセルソーター）で解析を行なった。【０２０３】
【表４】
2019026910.tif 000005
（凍結保存前後の細胞表面抗原マーカーの発現確認の結果）
以上の解析を３株のｇＭＳＣ（登録商標）１について行なった。結果を図８に示す。図８は凍結保存・解凍後の細胞表面抗原マーカーの発現確認実験の結果を示す図である。図８に示すように、凍結保存液（ｉｉ）、（ｉｉｉ）の何れを用いて凍結保存・解凍した場合にも、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊においても、細胞塊の分解後の凍結保存前後の細胞表面抗原マーカーの発現プロファイルに変化はなかった。【０２０４】
以上の骨分化能、脂肪分化能、軟骨分化能及び細胞表面抗原マーカーの発現確認実験の結果より、本発明の一態様によれば、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊においても、凍結解凍後に細胞の性質が変わらないことが示された。【０２０５】
＜実施例３：スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊を用いた凍結保存実験と融解時の凍結保存液の液量の影響＞
本発明の一態様の方法で凍結保存されたスキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊の凍結保存実験において、凍結（融解）時の凍結保存液の液量の影響を評価する為の実験を以下のように行った。【０２０６】
「ｇＭＳＣ（登録商標）１の作製」、「ｇＭＳＣ（登録商標）１の融解方法」及び「融解したｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数測定方法」については、特に断りの無い限り、実施例２と同じ操作を行なった。「ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存方法」については、表５に示す２通りの方法、即ち「液有り凍結」または「液抜き凍結」のいずれか、を行なった。【０２０７】
【表５】
2019026910.tif 000006
なお、表５の工程７ｂは、即ち、前述の「ｂ（工程）」の一形態である。【０２０８】
本実験の結果を図９に示す。図９は本実施例の結果を示す図である。この棒グラフのそれぞれの項目において、「Ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し、「ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結・解凍後の結果である。【０２０９】
いずれの保存方法であっても、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞を、良好な生存率で凍結保存できた。さらに、凍結保存前に凍結保存液を除去した方法（７ｂ）の方が、凍結保存液を除去しない方法（７ａ）に比べて、全細胞数及び生存率が有意に高かった。これにより、「（ｂ）工程」を行なう「液抜き凍結」の方が全細胞数及び生存率のより高い凍結保存が可能であることが示された。【０２１０】
＜実施例４：間葉系幹細胞、特にスキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊の凍結保存に対する有効成分特定試験：細胞生存率への影響検討のための凍結保存実験＞
本発明の一態様の方法で凍結保存された細胞の凍結保存効果に対する有効成分をさらに詳細に特定する為に、組成の異なる細胞凍結保存液をそれぞれ用いてｇＭＳＣ（登録商標）１を用いて凍結保存効果を評価した。【０２１１】
なお、本実施例において、「細胞培養」、「ｇＭＳＣ（登録商標）１の作製」、「ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存方法」及び「融解したｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数測定方法」は、実施例２と同じ操作であるが、評価した凍結保存液の組成は、以下の〔結果４−１〕〜〔結果４−６〕欄の各表に記載の通りである。【０２１２】
また、〔結果４−１〕〜〔結果４−６〕欄に記載の実験の結果は、後述のように、それぞれ、図１０〜図１５のグラフに記載されている。【０２１３】
〔結果４−１〕
表６の凍結保存液を用いて実施例２と同様の条件で凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１の解凍後の細胞数（生細胞数と全細胞数）を評価した。その結果を図１０に示す。この棒グラフのそれぞれの項目において、「ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し、「ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」に対する「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結・解凍後の結果である。【０２１４】
【表６】
2019026910.tif 000007
ベースとなる対照群である「１０％ＤＭＳＯ＋基礎培地＋アルブミンの凍結保存液」（６−２）と比較して、「１０％ＤＭＳＯ＋ＳＴＫ２（サイトカインフリー）を含む凍結保存液（実施例１結果（ｉｉ）の凍結保存液）」（６−１）で凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１の解凍後の細胞数は、対照群（６−２）に比べ有意に多かった（Ｐ＜０．０５）。また、前記（６−２）に（脂肪酸のミクスチャーである）ＣＤ  ｌｉｐｉｄ（登録商標）を加えた凍結保存液（６−３）においても、解凍後の細胞数は対照群（６−２）に比べ有意に多かった。【０２１５】
これらに加え、前記（６−２）にリノール酸（５０．０μｇ／ｍＬ）、ＰＡ（１０．０μｇ／ｍＬ）、ＰＡ（５０．０μｇ／ｍＬ）、リノレン酸（１０．０μｇ／ｍＬ）となるように、それぞれの溶液を添加することによって作製した凍結保存液（６−４）、（６−７）、（６−８）及び（６−１３）により凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１において、解凍後の細胞数は、対照群の（６−２）よりも多かった。【０２１６】
以上から、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊の凍結保存に、脂肪酸及び脂肪酸エステルからなる群の成分を複数種類含む（６−１）や（６−３）のような組成を加えた凍結保存液以外にも、リノール酸、ＰＡ、リノレン酸の溶液の添加が有効であることが示された。【０２１７】
〔結果４−２〕
表７の凍結保存液を用いて、実施例２と同様の条件で凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１の解凍後の細胞数（生細胞数と全細胞数）を評価した。その結果を図１１に示す。図１１はリノール酸、リノレン酸、及びＰＡがそれぞれ含まれている凍結保存液を用いた、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。この棒グラフのそれぞれの項目において、「ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し「ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」に対する「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結・解凍後の結果である。【０２１８】
【表７】
2019026910.tif 000008
ベースとなる対照群である「１０％ＤＭＳＯ＋基礎培地＋アルブミンの凍結保存液」（７−２）と比較して、「ＳＴＫ２（−）を含む凍結保存液（実施例１の凍結保存液（ｉｉ）」（７−１）、「（脂肪酸のミクスチャーである）ＣＤ  ｌｉｐｉｄ（登録商標）を含む凍結保存液」（７−３）、「リノール酸溶液を含む凍結保存液（リノール酸５０．０μｇ／ｍＬ含）」（７−４）、「リノレン酸溶液を含む凍結保存液（リノレン酸１０．０μｇ／ｍＬ含)」（７−５）、「ＰＡ溶液を含む凍結保存液（ＰＡ５０．０μｇ／ｍＬ含）」（７−６）のいずれも、全細胞数、生細胞数が多かった。【０２１９】
以上から、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞の細胞塊の凍結保存において、これらの成分の添加が有効であることが示された。【０２２０】
〔結果４−３〕
表８の組成の凍結保存液を用いて、実験２と同様の条件で凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１の解凍後の細胞数を評価した。その結果を図１２に示す。【０２２１】
図１２は、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。この棒グラフのそれぞれの項目において、「ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し、「ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」に対する「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結・解凍後の結果である。【０２２２】
【表８】
2019026910.tif 000009
本実験は、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存におけるリノール酸の効果を確認するためのものである。ここで、「リノール酸溶液を含む凍結保存液」である（８−４）及び（８−５）においては、リノール酸を可溶とするための溶解補助剤として、環状オリゴ糖の一種であるｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを予め添加した。即ち、１０μｇ／ｍＬ濃度のリノール酸溶液には、０．３４ｍｇ／ｍＬ濃度のｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを予め添加して、５０μｇ／ｍＬ濃度のリノール酸溶液には１．７ｍｇ／ｍＬ濃度のｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを予め添加した。【０２２３】
そのため、上記の（８−４）、（８−５）の条件に加え、これらの溶液中に添加された濃度に相当するｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎのみを（８−２）に加えた、（８−６）、（８−７）の条件も対照群として用意した。【０２２４】
さらに、（８−４）〜（８−７）に共通する成分のみからなる、ベースとなる対照群として、「１０％ＤＭＳＯ＋基礎培地＋アルブミンの凍結保存液」（この組成は（６−２）、（７−２)等と同一）も用意した。【０２２５】
（８−２）と比較して、（８−４）、（８−５）の各凍結保存液を用いた場合に、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数（全細胞数、総細胞数）は有意に多かった（それぞれ、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。【０２２６】
一方、（８−７）の、溶解補助剤（ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）を単独で比較的高濃度（１．７ｍｇ／ｍＬ）添加した凍結保存液を用いた場合において、全細胞数のみに限っては（８−２）の保存液を用いた場合より有意に多い（Ｐ＜０．０５）ものの、ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ単独では、（８−５）の、「リノール酸を含み、（８−７）と同濃度のｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎを含む条件」には平均値も有意水準も劣っている。【０２２７】
以上の結果から、リノール酸溶液を含む凍結保存液には、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞を良好な生存率で凍結保存する凍結保存効果があり、ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎの効果に比べて、リノール酸の凍結保存効果が高く、効果の主体はリノール酸のほうにあることが裏付けられた。【０２２８】
〔結果４−４〕
表９の組成の凍結保存液を用いて、実施例２と同様の条件で凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１の解凍後の細胞数（生細胞数と全細胞数）を評価した。その結果を図１３に示す。【０２２９】
図１３は、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。この棒グラフのそれぞれの項目において、「ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し、「ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」に対する「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結・解凍後の結果である。【０２３０】
【表９】
2019026910.tif 000010
本実験ではリノール酸とＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８と相乗効果の有無を調べた。なお、本実験で用いたリノール酸溶液には、〔結果４−３〕で用いられたリノール酸溶液と同様にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含めなかった。【０２３１】
ベースとなる対照群である「１０％ＤＭＳＯ＋基礎培地＋アルブミンの凍結保存液」（９−２）と比較して、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（０．９ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結保存液」（９−４）及び「リノール酸溶液を加えた凍結保存液（リノール酸５０．０μｇ／ｍＬ含）」（９−５）を用いた場合に、それぞれの凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数は有意に多かった（Ｐ＜０．０５、リノール酸は全細胞数のみ）。さらに、リノール酸とＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８との併用（９−６）により、さらに細胞数が多かったことが示された（Ｐ＜０．０１、全細胞数のみ）。【０２３２】
以上の結果から、リノール酸溶液及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含む凍結保存液には、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞を良好な生存率で凍結保存する凍結保存効果があり、これらを両方加えることで相乗効果が生じ、より高い凍結保存効果が発揮されることが判った。【０２３３】
〔結果４−５〕
表１０の組成の凍結保存液を用いて、表記の条件で凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１の解凍後の細胞数（生細胞数と全細胞数）を評価した。その結果を図１４に示す。図１４は、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。この棒グラフのそれぞれの項目において、「ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し、「ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」に対する「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結・解凍後の結果である。【０２３４】
【表１０】
2019026910.tif 000011
本実験は、ｇＭＳＣ（登録商標）１凍結保存におけるＰＡの効果を確認するためのものである。ここで、「ＰＡ溶液を含む凍結保存液」（１０−４）及び（１０−５）においては、ＰＡを乳化させ可溶とするための溶解補助剤として、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ  ８０を添加した。即ち、１０μｇ／ｍＬ濃度のＰＡ溶液には、１．０μｇ／ｍＬ濃度のＴｗｅｅｎ  ８０が予め添加して、５０μｇ／ｍＬ濃度のＰＡ溶液に、５．０μｇ／ｍＬ濃度のＴｗｅｅｎ  ８０が予め添加した。【０２３５】
そのため、（１０−４）、（１０−５）の条件に加え、これらの溶液中に添加された濃度に相当するＴｗｅｅｎ  ８０のみを（１０−２）に加えた、（１０−６）、（１０−７）の条件も対照群として用意した。【０２３６】
さらに、（１０−４）〜（１０−７）に共通する成分のみからなる対照群（ベースとなる条件）である「１０％ＤＭＳＯ＋基礎培地＋アルブミンの凍結保存液」（この組成は（６−２）、（７−２）等と同一）も用意した。【０２３７】
対照群の１つ（ベースとなる条件）である「１０％ＤＭＳＯ＋基礎培地＋アルブミンの凍結保存液」（１０−２）と比較して、「ＰＡ溶液を加えた凍結保存液（ＰＡ  １０．０μｇ／ｍＬ含）」（１０−４）及び「ＰＡ溶液を加えた凍結保存液（５０．０μｇ／ｍＬ含）」（１０−５）、それぞれの添加により、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数は有意に多かった（共に、Ｐ＜０．０５）。一方で、Ｔｗｅｅｎ  ８０のみを単独添加した場合（１０−６及び１０−７）では、効果が認められなかった。【０２３８】
以上の結果から、ＰＡ溶液を含む凍結保存液には、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞を良好な生存率で凍結保存する凍結保存効果があり、ＰＡの溶解を補助する溶解補助剤（Ｔｗｅｅｎ  ８０）単独の添加では凍結保存効果が認められないことが判る。従って、有効成分はＰＡのほうであることが裏付けられ、ＰＡには凍結保存効果があることが示された。【０２３９】
〔結果４−６〕
表１１の組成の凍結保存液で実施例２に記載した条件で凍結保存したｇＭＳＣ（登録商標）１の解凍後の細胞数（生細胞数と全細胞数）を評価した。その結果を図１５に示す。図１５は、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存実験の結果を示すグラフである。この棒グラフのそれぞれの項目において、「ｌｉｖｅ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」を示し、「ｔｏｔａｌ」は「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」を示している（ｎ＝３、結果は全て、「平均値±標準偏差」（ｍｅａｎ±ＳＤ）で示されている。）。また、「生存率」とは、「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの全細胞数」に対する「『ｇＭＳＣ（登録商標）１』一個当たりの生細胞数」の比を示している。また、「保存前」とは、ｇＭＳＣ（登録商標）１の凍結保存を行わずに細胞数を測定した場合の結果であり、それ以外は凍結・解凍後の結果である。【０２４０】
【表１１】
2019026910.tif 000012
本実験ではＰＡとＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８と相乗効果の有無を調べた。なお、本実験で用いたＰＡ溶液には、〔結果４−５〕で用いられたＰＡ溶液と同様にＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含めなかった。【０２４１】
まず、ＰＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８の単独の効果を、ベースとなる対照群である「１０％ＤＭＳＯ＋基礎培地＋アルブミンの凍結保存液」（１１−２）と比較した。その結果、「ＰＡ溶液を加えた凍結保存液（ＰＡ１０．０μｇ／ｍＬ含）」（１１−４）及び「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（０．９ｍｇ／ｍＬ）を加えた凍結保存液」（１１−５）において、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数は、（１１−２）に比べて多いことが判る。【０２４２】
さらに、ＰＡとＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を併用した（１１−６）が、それぞれを単独で加えた前記（１１−４）、（１１−５）よりも、凍結保存・解凍後のｇＭＳＣ（登録商標）１の細胞数が多いことも判り、さらに効果を高めたことが示された（Ｐ＜０．０１）。【０２４３】
以上の結果から、ＰＡ及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含む凍結保存液には、スキャフォールドフリーの３次元構造を有する間葉系幹細胞を良好な生存率で凍結保存する凍結保存効果があり、これらを両方加えることで相乗効果が生じ、より高い結保存効果が発揮されることが判った。
【産業上の利用可能性】
【０２４４】
本発明を用いれば、間葉系幹細胞を用いたより安全かつ利用価値の高い移植治療材料を提供することができるので、間葉系幹細胞を用いた移植治療等の再生医療に好適に利用可能である。
【図１】
2019026910.tif 000013
【図２】
2019026910.tif 000014
【図３】
2019026910.tif 000015
【図４】
2019026910.tif 000016
【図５】
2019026910.tif 000017
【図６】
2019026910.tif 000018
【図７】
2019026910.tif 000019
【図８】
2019026910.tif 000020
【図９】
2019026910.tif 000021
【図１０】
2019026910.tif 000022
【図１１】
2019026910.tif 000023
【図１２】
2019026910.tif 000024
【図１３】
2019026910.tif 000025
【図１４】
2019026910.tif 000026
【図１５】
2019026910.tif 000027
【国際調査報告】
2019026910.tif 000028
2019026910.tif 000029
2019026910.tif 000030
2019026910.tif 000031
2019026910.tif 000032
2019026910.tif 000033