(57)【要約】  癌の診断、特に大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断に有用であることが期待される、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、及び当該Ｆａｂフラグメントを含む複合体を用いた診断手段の提供。  配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント、及び当該Ｆａｂフラグメントを含む複合体。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項２】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、請求項１に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項２に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項４】
標識部と請求項１から３のいずれか１項に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体。
【請求項５】
標識部が（ｉ）配位子及びリンカー、（ｉｉ）配位子、（ｉｉｉ）蛍光色素及びリンカー、又は（ｉｖ）蛍光色素である、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
標識部が（ｉ）配位子及びリンカー、又は（ｉｉ）配位子である、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
配位子が下式（Ａ）で示される配位子である、請求項６に記載の複合体：
【化１】
2019009388.tif 000015
式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント又はリンカーへの結合を表す。
【請求項８】
標識部が（ｉ）配位子及びリンカーであって、当該配位子及びリンカーが下式（Ａ’）で示される基である、請求項６に記載の複合体：
【化２】
2019009388.tif 000016
式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表す。
【請求項９】
抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントが、当該Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）基の炭素原子と結合している、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
下式（I）で示される、請求項６に記載の複合体：
（Ｌ−Ｘ）ｐ−Ａｂ      （I）
式中、Ａｂは抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントであり、
Ｌは、配位子であり、
Ｘは、リンカー又は結合であり、及び
ｐは、１〜２５の自然数である。
【請求項１１】
Ｌが下式（Ａ）で示される配位子である、請求項１０に記載の複合体：
【化３】
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式中、波線はＸ（但し、Ｘが結合の場合はＡｂ）への結合を表す。
【請求項１２】
下式（II）で示される、請求項８又は１１のいずれか１項に記載の複合体：
【化４】
2019009388.tif 000018
式中、Ａｂは抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントであり、
ｐは、１〜２５の自然数であり、
ここで、Ａｂは当該Ａｂ中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している。
【請求項１３】
ｐが、１〜１６の自然数である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
ｐが、４〜１６の自然数である、請求項１０から１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
更に金属を含む、請求項５から１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
金属が金属放射性同位元素である、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１７】
金属が８９Ｚｒである、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１８】
ＰＥＴトレーサーとして用いるための、請求項１６又は１７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１９】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２０】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）請求項３に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２１】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２２】
以下の（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２３】
以下の（ａ）から（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ａ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２４】
以下の（ａ）から（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ａ）請求項３に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項３に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）請求項３に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を含む、抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法：
（ａ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むボリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、請求項１（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。       
【請求項２６】
以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法：
（ａ）請求項３に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び請求項３に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）請求項３に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、請求項３に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法により抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを調製する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを標識部と共有結合させる工程を含む、標識部と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する方法。
【請求項２８】
請求項２５又は２６に記載の方法により抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを調製する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを配位子と、リンカーを介して又は直接、共有結合させる工程を含む、配位子と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法により配位子と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する工程、及び、当該複合体の配位子に金属放射性同位元素を配位結合させる工程を含む、金属放射性同位元素で標識された標識部と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する方法。
【請求項３０】
請求項１５から１８のいずれか１項に記載の複合体及び薬学的に許容される担体を含む診断用組成物。
【請求項３１】
病期診断薬である、請求項３０に記載の診断用組成物。
【請求項３２】
大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断に用いる、請求項３０又は３１に記載の診断用組成物。
【請求項３３】
大腸癌又は大腸癌が転移した癌の診断に用いる、請求項３２に記載の診断用組成物。
【請求項３４】
大腸癌が転移した癌が転移性肝癌である、請求項３３に記載の診断用組成物。
【請求項３５】
大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断用組成物の生産のための、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項３６】
大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断において使用するための、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３７】
請求項１５から１８のいずれか１項に記載の複合体を対象に投与することを含む、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントに関する。本発明はまた、当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む診断用組成物、及び、当該Ｆａｂフラグメントを用いて癌を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）又はＣＥＡＣＡＭ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）は１９６５年に発見された腫瘍マーカーであり（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；１９６５；１２１：４３９−４６２、ＰＮＡＳ；１９６９；６４：１６１−１６７）、現在までに２３個のＣＥＡ関連分子が明らかとなっている（ＢｉｏＭｅｄＣｅｎｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；２０１０；８：１２−３３）。そのうち、ＣＥＡＣＡＭ５は正常組織でほとんど発現が認められないが、胎児の消化管や大腸癌で発現している（ＢＢＡ；１９９０；１０３２：１７７−１８９、Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．；１９９９；５２：１７４−１７８）。また、ＣＥＡＣＡＭ５は乳癌、肺癌、甲状腺癌でも発現していることが知られている（Ｄｉａｇｎ．Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌ．；１９９３；９：３７７−３８２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．；１９９０；５０：６９８７−６９９４、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ；２０００；３７：５３０−５３５）。【０００３】
大腸癌患者では健常人に比べ血中ＣＥＡＣＡＭ５の濃度が高く（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；１９６５；１２１：４３９−４６２）、ＣＥＡＣＡＭ５は腫瘍マーカーとして使用されている。大腸癌患者の組織学的な検討では９０％以上の組織でＣＥＡＣＡＭ５が高発現している（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ；２０１３；１０８：６６２−６６７）。【０００４】
大腸癌の早期の転移は肝臓に限局しているため、早期に肝転移を発見し治療できれば、再発率を低下させることができる（Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．；２０１７；３：１６３−１７３）。肝転移の診断にはＣＴ（コンピュータ断層撮影）やＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）、ＦＤＧ−ＰＥＴ（Ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ−ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）が使用されている。ＣＴやＭＲＩ、ＦＤＧ−ＰＥＴの検出感度はそれぞれ７４．４、８０．３、８１．４％で、１ｃｍ以下の腫瘍では検出感度はＣＴで４７．３％、ＭＲＩで６０．２％に低下する（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ；２０１０；２５７：６７４−６８４）。肝特異性造影剤ＭＲＩも使用されているが、１ｃｍ以下の腫瘍ではその検出感度は２９〜３８％である（Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ；２００５；２３７：８９−９８）。【０００５】
癌を診断、治療するために、抗癌剤や金属放射性同位元素を結合させた抗体が用いられている。抗体を用いたターゲッティングは腫瘍細胞に対する特異性が高く、副作用が少ない。現在までにいくつかの金属放射性同位元素で標識されたモノクローナル抗体が診断及び治療に臨床応用されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ；２０１２；１９：１９６−２０３）。【０００６】
一方で、一般に抗体は血中半減期が長く、体内に投与後、癌を可視化するのに十分なシグナル対バックグラウンド比を与える腫瘍対血液比に達するのに４日〜５日の長い期間を必要とする（Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．；２０１０；８７：５８６−５９２）。また抗体のＦｃ領域は、抗体依存性細胞障害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）の薬理作用を引き起こす（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．；２０１３；３０：２２７−２３６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；２００２；１３：６０９−６１４）。また抗体は肝臓で代謝されるため標的に関わらず肝臓に高集積するが、大腸癌の早期の転移は肝臓に限局しているため、抗体で肝転移の病巣を検出することは難しい（Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．；２０１０；８７：５８６−５９２）。【０００７】
Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ダイアボディのような低分子化された組み換え抗体フラグメントは、組織浸透性が高いため病巣に届きやすく、大腸菌や酵母での発現系を用いた低コストでの生産が期待できることから治療用抗体として利用される一方、血中半減期が短く、腎排泄される特徴を有することから、診断薬としての利用も報告されている（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；２００５；２３：１１２６−１１３６）。【０００８】
診断薬として応用されている抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体としては、マウスモノクローナル抗体Ｔ８４．６６のヒト化抗体であるＭ５Ａ（特許文献１）が知られている。６４Ｃｕで標識したＭ５Ａは、皮下に癌細胞を移植したマウスを用いた試験で、良好なＰＥＴイメージを得るには投与後２２時間以上経過する必要があること（非特許文献１）、また、肝転移のモデルマウスを用いた試験において、肝臓の正常組織と肝臓の病巣部位への取り込みは投与後３時間では同程度であり、２４時間経過後には有意差があること（非特許文献２）が報告されている。【０００９】
抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体のフラグメントでは、マウスモノクローナル抗体のＮＰ−４のＦａｂ’を９９ｍＴｃで標識したＣＥＡ−Ｓｃａｎが大腸癌の診断に利用できることが報告されている（非特許文献３）。しかしながら、ＣＥＡ−Ｓｃａｎの病巣部位への取り込みは正常な肝臓への取り込みを上回らず、また、肝転移の検出感度はＦＤＧ−ＰＥＴより低い（非特許文献４）。ＣＥＡ−Ｓｃａｎは、１９９９年にＦＤＡに大腸癌の診断薬として認可されたが、もはや販売されていない（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８６８７５号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．；２００８；１９：８９−９６
【非特許文献２】ＰＬＯＳ  ＯＮＥ；２０１４；９（９）：ｅ１０６９２１
【非特許文献３】Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．；１９９７；２２６：６２１−６３１
【非特許文献４】Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．；２０００；４１：１６５７−１６６３
【非特許文献５】Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｔ．Ｃｈｅｎｇ、“９９ｍＴｃ−Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ”、［ｏｎｌｉｎｅ］、Ｕｐｄａｔｅ：Ｍａｒｃｈ  １７，２００８．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ、［平成２９年５月１７日検索］、インターネット＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ２３６７６／＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
一価のＦａｂフラグメントは、分子量約５０ｋＤａであり、分子量約１５０ｋＤａの抗体より小さく、腎排泄され、血中半減期も短い。そのため、肝転移を検出でき、投与後２〜３２時間以内に癌を可視化するのに十分なシグナル対バックグラウンド比を与える腫瘍対血液比に達する。Ｆｃ領域がないためＡＤＣＣやＣＤＣを引き起こすこともない。このような特長から、抗体と比べ、Ｆａｂフラグメントは、診断薬としてより有効であることが期待できる。【００１３】
しかしながら、Ｆａｂフラグメントでは、低分子化によりその結合活性が減弱することが多い。さらに抗体を体内診断薬として利用するためには、ＰＥＴトレーサー又は蛍光色素等の検出される物質で標識しなければならないが、Ｆａｂフラグメントでは、そのような物質で標識されることにより、その結合活性が減弱するとの課題がある。【００１４】
本発明の課題は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を検出するのに有用であり、かつ投与後短時間（例えば、４時間）の間に癌病巣に集積することが期待される抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを提供することにある。また、本発明の課題は、投与した当日に診断が可能であることが期待される当該Ｆａｂフラグメントを含む診断用組成物及びそれを利用した診断方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を検出するのに有用な抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの作製において相当の鋭意検討を重ねた結果、配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを作製し（実施例１）、当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは標識部の結合によってヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する結合活性が減弱しないこと（実施例３）、並びに当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体は投与４時間後において皮下移植モデル及び肝移植モデルにおいてヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性癌細胞に集積し、ヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性癌細胞を検出できることを見出した（実施例５及び６）。即ち、本発明は、癌に集積する抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント及び当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を提供する。【００１６】
本発明は、医学上又は産業上有用な物質・方法として以下の発明を含むものである。【００１７】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
（１）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から３８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４から６０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９３から１０１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
（２）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、上記（１）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
（３）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、上記（２）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント；並びに
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（３）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
（５）標識部と上記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体。
（６）標識部が（ｉ）配位子及びリンカー、（ｉｉ）配位子、（ｉｉｉ）蛍光色素及びリンカー、又は（ｉｖ）蛍光色素である、上記（５）に記載の複合体。
（７）標識部が（ｉ）配位子及びリンカー、又は（ｉｉ）配位子である、上記（６）に記載の複合体。
（８）配位子が下式（Ａ）で示される配位子である、上記（７）に記載の複合体：
【化１】
2019009388.tif 000003
式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント又はリンカーへの結合を表す。
（９）標識部が（ｉ）配位子及びリンカーであって、当該配位子及びリンカーが下式（Ａ’）で示される基である、上記（７）に記載の複合体：
【化２】
2019009388.tif 000004
式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表す。
（１０）抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントが、当該Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）基の炭素原子と結合している、上記（９）に記載の複合体。
（１１）下式（I）で示される、上記（７）に記載の複合体：
（Ｌ−Ｘ）ｐ−Ａｂ      （I）
式中、Ａｂは抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントであり、
Ｌは、配位子であり、
Ｘは、リンカー又は結合であり、及び
ｐは、１〜２５の自然数である。
（１２）Ｌが下式（Ａ）で示される配位子である、上記（１１）に記載の複合体：
【化３】
2019009388.tif 000005
式中、波線はＸ（但し、Ｘが結合の場合はＡｂ）への結合を表す。
（１３）下式（II）で示される、上記（９）又は（１２）のいずれかに記載の複合体：
【化４】
2019009388.tif 000006
式中、Ａｂは抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントであり、
ｐは、１〜２５の自然数であり、
ここで、Ａｂは当該Ａｂ中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している。
（１４）ｐが、１〜１６の自然数である、上記（１１）から（１３）のいずれかに記載の複合体。
（１５）ｐが、４〜１６の自然数である、上記（１１）から（１３）のいずれかに記載の複合体。
（１６）更に金属を含む、上記（６）から（１５）のいずれかに記載の複合体。
（１７）金属が金属放射性同位元素である、上記（１６）に記載の複合体。
（１８）金属が８９Ｚｒである、上記（１６）に記載の複合体。
（１９）ＰＥＴトレーサーとして用いるための、上記（１７）又は（１８）に記載の複合体。
（２０）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２１）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）上記（４）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２２）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２３）以下の（ａ）及び／又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（２４）以下の（ａ）から（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ａ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２５）以下の（ａ）から（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ａ）上記（４）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）上記（４）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）上記（４）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２６）以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を含む、抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法：
（ａ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むボリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、上記（２）（ａ）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２７）以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法：
（ａ）上記（４）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び上記（４）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）上記（４）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、上記（４）に記載の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２８）上記（２６）又は（２７）に記載の方法により抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを調製する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを標識部と共有結合させる工程を含む、標識部と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する方法。
（２９）上記（２６）又は（２７）に記載の方法により抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを調製する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを配位子と、リンカーを介して又は直接、共有結合させる工程を含む、配位子と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する方法。
（３０）上記（２９）に記載の方法により配位子と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する工程、及び、当該複合体の配位子に金属放射性同位元素を配位結合させる工程を含む、金属放射性同位元素で標識された標識部と抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体を生産する方法。
（３１）上記（１６）から（１９）のいずれかに記載の複合体及び薬学的に許容される担体を含む診断用組成物。
（３２）病期診断薬である、上記（３１）に記載の診断用組成物。
（３３）大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断に用いる、上記（３１）又は（３２）に記載の診断用組成物。
（３４）大腸癌又は大腸癌が転移した癌の診断に用いる、上記（３３）に記載の診断用組成物。
（３５）大腸癌が転移した癌が転移性肝癌である、上記（３４）に記載の診断用組成物。
（３６）大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断用組成物の生産のための、上記（１６）から（１９）のいずれかに記載の複合体の使用。
（３７）大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断において使用するための、上記（１６）から（１９）のいずれかに記載の複合体。
（３８）上記（１６）から（１９）のいずれかに記載の複合体を対象に投与することを含む、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌の診断方法。
（３９）標識部を含む複合体として使用するための、上記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
（４０）標識部を含む複合体の生産のための、上記（１）から（４）のいずれかに記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの使用。
（４１）標識部を含む複合体が上記（５）から（１８）のいずれかに記載の複合体である、上記（３９）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
（４２）標識部を含む複合体が上記（５）から（１８）のいずれかに記載の複合体である、上記（４０）に記載の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの使用。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を検出するのに有用であり、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌又はこれらが転移した癌等の癌の診断に有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒト大腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞）を右肩の皮下に、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１５細胞（ヒトＣＥＡＣＡＭ５陰性細胞）を左肩の皮下に移植したマウスにＰＢ００９−０３を投与し、投与４時間後にＰＥＴで撮像した代表的な画像である。うつ伏せのマウスを撮像したので、右側の丸がＬＳ１７４Ｔ細胞を移植したマウスの右肩を、左側の丸がＨＣＴ−１５細胞を移植したマウスの左肩を示す。右のバーは、腫瘍への放射線集積量（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｖａｌｕｅ；ＳＵＶ−Ｍａｘ）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒト大腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞）を右肩の皮下に、ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１５細胞（ヒトＣＥＡＣＡＭ５陰性細胞）を左肩の皮下に移植したマウスにＰＢ００９−０３を投与し、投与４時間後、２４時間後及び４８時間後にＰＥＴで撮像し、画像解析を行った結果を示したグラフである。縦軸は腫瘍部に集積したＰＢ００９−０３のＳＵＶ−Ｍａｘ値を示す。また、グラフ中のエラーバーは平均値±標準誤差（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ルシフェラーゼ発現ＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞）を肝臓に移植したマウスにＰＢ００９−０３を投与し、投与４時間後にＰＥＴで撮像した代表的な画像である。矢印は細胞を移植した部分を、右のバーはＳＵＶ−Ｍａｘ値を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ルシフェラーゼ発現ＬＳ１７４Ｔ細胞（ヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞）を肝臓に移植したマウスにＰＢ００９−０３を投与し、投与４時間後及び２４時間後にＰＥＴで撮像し、画像解析を行った結果を示したグラフである。縦軸は肝臓と腫瘍部に集積したＰＢ００９−０３のＳＵＶ−Ｍａｘ値の比（腫瘍／肝臓  比）を示す。また、グラフ中のエラーバーは平均値±標準誤差（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２１】
本発明者らは、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体又はその抗原結合フラグメントの作製において相当の創意検討を重ねた結果、ヒトＣＥＡＣＡＭ５を検出するのに有用な抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを作製することに成功した。
【００２２】
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２３】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端側に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される。
【００２４】
抗体と抗原との結合の特異性は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域によって構成される部分のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２５】
抗体の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ−Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ−Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。Ｆａｂフラグメントは可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
【００２６】
＜本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント＞
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントには、以下の特徴を有するＦａｂフラグメントが含まれる：
配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【００２７】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域としては、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４等のいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域は、ヒトＩｇγ１定常領域である。
【００２８】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域である。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、以下のＦａｂフラグメントである：
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３０】
Ｆａｂフラグメントを含め、抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，２００８；９７：２４２６−２４４７）。
【００３１】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントには、翻訳後修飾により生じたＦａｂフラグメントも含まれ得る。翻訳後修飾により生じ得る本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、重鎖Ｎ末端がピログルタミル化された抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化による翻訳後修飾は、抗体の活性に顕著な影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；２００６；３４８：２４−３９）。
【００３２】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３４】
本発明には、以下の特徴を有する抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントも含まれる：
配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から３８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５４から６０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９３から１０１までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３５】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合する。得られた抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体ＦａｂフラグメントのヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する結合活性を測定する方法としては、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＳＰＲ）法による解析やＥＬＩＳＡ等の方法がある。例えば、ＳＰＲ法による解析を用いる場合、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて、センサーチップにＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）とビオチン化したヒトＣＥＡＣＡＭ５を固相化し、段階希釈したＦａｂフラグメントを添加することで結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を測定できる。
【００３６】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、本明細書に開示される、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法＞に記載の方法に従い生産することができる。
【００３７】
＜本発明の複合体＞
本発明の複合体は、標識部と本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体である。
【００３８】
「標識部」とは、（ｉ）配位子及びリンカー、（ｉｉ）配位子、（ｉｉｉ）蛍光色素及びリンカー、又は（ｉｖ）蛍光色素、である。ある態様としては、（ｉ）配位子及びリンカー、又は金属を含む（ｉｉ）配位子が挙げられる。ある態様としては、（ｉｉｉ）蛍光色素及びリンカーが挙げられる。ある態様としては、（ｉ）配位子及びリンカーが挙げられる。「標識部」の配位子は更に金属を含んでいてもよく、ある態様としては、金属を含む（ｉ）配位子及びリンカー、又は（ｉｉ）配位子であり、別の態様としては、（ｉ）金属とキレート錯体を形成した配位子及びリンカー、又は、（ｉｉ）金属とキレート錯体を形成した配位子である。
【００３９】
金属、蛍光色素又は非金属放射性同位元素を含む本発明の複合体は、各種造影剤等に用いることができ、例えば、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴトレーサー、蛍光標識された分子イメージング剤等に用いられる。
【００４０】
本明細書において、「金属」は、常磁性金属イオン又は金属放射性同位元素を意味する。金属としては、各配位子に配位結合する金属であれば特に制限はない。複合体の使用目的に応じて、公知の適切な配位子と金属の組合せが選択される。
【００４１】
常磁性金属イオンは、ＭＲＩ造影剤に好適に用いられる。常磁性金属イオンの態様としては、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｒｈ２＋、Ｃｏ２＋、Ｇｄ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｔｂ３＋、Ｐｍ３＋、Ｎｄ３＋、Ｔｍ３＋、Ｃｅ３＋、Ｙ３＋、Ｈｏ３＋、Ｅｒ３＋、Ｌａ３＋、Ｙｂ３＋、Ｍｎ３＋、又はＭｎ２＋が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様としては、Ｇｄ３＋、Ｍｎ３＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、又はＦｅ３＋が挙げられる。ある態様としては、Ｍｎ３＋又はＭｎ２＋が挙げられる。この場合、複合体にはカウンターアニオンとしてハロゲン等を用いることができる。また、カウンターアニオンは配位子のＣ（＝Ｏ）Ｏ−であってもよく、さらに複合体は、Ｎａ＋などのカウンターカチオンを有していてもよい。
【００４２】
金属放射性同位元素は、例えば、ＰＥＴトレーサー等に用いられる。金属放射性同位元素の態様としては、８９Ｚｒ、５１Ｍｎ、５２Ｆｅ、６０Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様としては、８９Ｚｒ、６０Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、又は１１１Ｉｎが挙げられる。ある態様としては、ジルコニウムの放射性同位体が挙げられる。ある態様としては８９Ｚｒが挙げられる。
【００４３】
「配位子」とは、本複合体において、金属とキレート錯体を形成しうる部分であり、ある態様としては、キレート剤から構成される基を意味する。構成される基とは、キレート剤からプロトンが除かれて、結合手を有する基である。
【００４４】
「キレート剤」とは、金属と配位結合できる化合物である。
【００４５】
「キレート剤」としては、シデロホアと、非シデロホアが挙げられる。さらにある態様としては、ＭＡＧ３（メルカプトアセチル−グリシル−グリシル−グリシン、ＣＡＳ番号：６６５１６−０９−４）、及びその公知の反応性誘導体が挙げられる。シデロホアとしては、ヒドロキサム酸型、カテコール型、又は、混合配位子型が挙げられる。ヒドロキサム酸型シデロホアとしては、例えば、フェリクローム、下式：
【００４６】
【化５】
2019009388.tif 000007
で示されるデフェロキサミン（ＤＦＯ）、フサリニンＣ、オルニバクチン、ロドトルル酸、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。カテコール型シデロホアとしては、例えば、エンテロバクチン、バチリバクチン、ビブリオバクチン、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。混合配位子型シデロホアとしては、例えば、アゾトバクチン、ピオベルジン、エルシニアバクチン、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。なお、上記シデロホアの場合、ＤＦＯはその反応性官能基である−ＮＨ２を介してリンカー又はＦａｂフラグメントと反応させることができ、ＤＦＯ以外のシデロホアの場合には、カルボキシ基、水酸基、アミノ基等の反応性官能基を介して、当業者が通常用いる方法でリンカー又はＦａｂフラグメントと反応させることもできる。
【００４７】
非シデロホアとしては、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸、ＣＡＳ番号：６７−４３−６）、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ（１，７−ビス（メチルカルバモイルメチル）−１，４，７−トリアザヘプタン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：１１９８９５−９５−３）、ＥＯＢ−ＤＴＰＡ（エトキシベンジルＤＴＰＡ、２−［［（２Ｓ）−２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−３−（４−エトキシフェニル）プロピル］−［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］アミノ］酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸、ＣＡＳ番号：８６９−５２−３）、ＤＯ３Ａ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：２１７９７３−０３−０）、ＨＰ−ＤＯ３Ａ（１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：１２００４１−０８−９）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸、ＣＡＳ番号：６０２３９−１８−１）、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。
【００４８】
なお、本明細書中の化合物及び複合体は、特に記載がない限りフリー体及びその塩も包含する。ここで「その塩」とは、その化合物及び複合体の置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合があり、その化合物及び複合体が形成しうる塩である。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基や、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。例えば、ＤＦＯは、デフェロキサミンメタンスルホン酸塩としても存在し、他の塩としても存在する。ＤＴＰＡは、フリー体とともにナトリウム塩としても存在する。
【００４９】
ＭＲＩ造影剤に用いる場合の「キレート剤」のある態様としては、上記のシデロホア及び非シデロホアキレート剤である。
【００５０】
ＰＥＴトレーサーに用いる場合の「キレート剤」のある態様としては、上記のシデロホア及び非シデロホアキレート剤であり、更に、ある態様としては、ＭＡＧ３である。ある態様としては、ＤＦＯである。
【００５１】
本発明の複合体に含まれる配位子を形成する「キレート剤」のある態様としては、ＤＦＯ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＥＯＢ−ＤＴＰＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡが挙げられる。ある態様としては、ＤＦＯ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡが挙げられる。ある態様としては、ＤＦＯが挙げられる。
【００５２】
「リンカー」とは、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントと配位子の間に距離をつくる基である。複合体における「リンカー」のある態様としては、
下式：
【００５３】
【化６】
2019009388.tif 000008
（以下−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−と表記する）、−ＣＨ２−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ１−２０  アルキレン）−Ｃ（＝Ｏ）−、が挙げられる。ここで「Ｃ１−２０  アルキレン」とは、直鎖又は分岐の炭素数１〜２０のアルキレンである。Ｃ１−２０  アルキレンのある態様としては、Ｃ１−１０  アルキレン、Ｃ１−２アルキレンが挙げられる。Ｃ１−２０  アルキレンのある態様としては、エチレンが挙げられる。ある態様としては、−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−が挙げられる。ある態様としては、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｃ２Ｈ４−Ｃ（＝Ｏ）−が挙げられる。リンカーを形成するために用いることができる試薬としては、ＨＯ−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ１−２０  アルキレン）−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＨ、コハク酸、ｐ-フェニレンジイソチオシアナート等が挙げられる。
【００５４】
蛍光色素を含む本発明の複合体は蛍光標識された分子イメージング剤として用いることができる。
【００５５】
本発明の複合体に用いる蛍光色素としては、光イメージングに通常用いられる近赤外波長(６５０〜１０００ｎｍ）に吸収極大及び発光極大がある色素を用いることができる。蛍光色素のある態様としては、シアニン又はインドシアニン化合物が挙げられる。ある態様としては、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＬＩ−ＣＯＲ社）、Ｃｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、ＢＯＤＩＰＹ、及びＤｙＬｉｇｈｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＣＦ７９０（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）、ＤＹ（ＤＹＯＭＩＣＳ  ＧＭＢＨ社）、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ６８０、及びＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ７５０（Ａｎａｓｐｅｃ社）、ＰＵＬＳＡＲ６５０、及びＱＵＡＳＡＲ６７０（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等が挙げられる。ある態様としては、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷが挙げられる。なお、蛍光色素は、そのカルボキシ基、水酸基、アミノ基等を介して、あるいは当業者が通常用いる方法で活性化基を導入し、Ｆａｂフラグメントあるいはリンカーと反応させることができる。活性化基が導入された蛍光色素のある態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基でエステル化された蛍光色素が挙げられる。例えば、上述のＩＲＤｙｅ８００ＣＷのＮＨＳエステルは市販されており、それらを利用可能である。
【００５６】
非金属放射性同位元素を含む本発明の複合体は、ＰＥＴトレーサーとして用いることができる。
【００５７】
本発明の複合体に用いる非金属放射性同位元素としては、１８Ｆ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎが挙げられる。ある態様としては、１８Ｆが挙げられる。非金属放射性同位元素を含む化合物の結合には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル４−［１８Ｆ］フルオロ安息香酸（［１８Ｆ］ＳＦＢ）を用いることができる。
【００５８】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントと標識部との結合は、公知の手法により、当業者が適宜行うことができる。例えば、標識部を本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基やアミノ酸側鎖のアミノ基）、１以上のチオール基（例えば、アミノ酸側鎖のチオール基）、又は１以上のカルボキシル基（例えば、Ｃ末端やアミノ酸の側鎖のカルボキシル基）に結合させることができる。ある態様として、本発明の複合体は、標識部が本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基に結合した、複合体である。
【００５９】
本発明の複合体は、標識部が配位子及びリンカーである場合、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントとリンカーを反応させて得られた物質に配位子を形成するキレート剤を反応させて生産することもできる。配位子を形成するキレート剤にリンカーを反応させて得られた物質に本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを反応させて生産することもできる。反応例としては、キレート剤のアミノ基とリンカーとを反応させて得られた物質を、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基やリジン側鎖のアミノ基）と反応させることが挙げられる。標識部が配位子である場合、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントと配位子を形成するキレート剤を反応させて生産することもできる。反応例としては、キレート剤を、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基やリジン側鎖のアミノ基）と反応させることが挙げられる。本発明の複合体の生産には、アミンにイソチオシアネートを加えてチオウレアを合成する反応や、アミンにカルボン酸を加えてアミドを合成する反応等を用いることができる。当該反応は、当業者に公知の方法を適用することにより行うことができる。なお、原料としてあらかじめ配位子とリンカーが結合した化合物を用いることもできる。配位子とリンカーが結合した化合物の例としては、以下の式で示されるｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ（ｐ−イソチオシアノフェニルアミノチオカルボニル基置換ＤＦＯ、ＣＡＳ番号：１２２２４６８−９０−７）、
【００６０】
【化７】
2019009388.tif 000009
ｐ−イソチオシアノベンジル基置換ＤＴＰＡ（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ、ＣＡＳ番号：１０２６５０−３０−６）、ｐ−イソチオシアノベンジル基置換ＤＯＴＡ（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ、ＣＡＳ番号：１２７９８５−７４−４）、及び、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ（［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアナートフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸、ＣＡＳ番号：１５７３８０−４５−５）が挙げられる。
【００６１】
例えば、本発明の複合体は、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの１以上のアミノ基（例えば、Ｎ末端アミノ基やアミノ酸の側鎖のアミノ基）と、イソチオシアン酸基を有する標識部とを反応させて、アミノ基を介して１以上の標識部が結合したＦａｂフラグメントである複合体として生産することができる。
【００６２】
上記生産方法により生産した、１以上の標識部が結合した本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントに金属（常磁性金属イオン又は金属放射性同位元素）を添加し、金属を含む本発明の複合体を得ることができる。
【００６３】
本発明の複合体は、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントに１以上の標識部が結合した複合体である。本発明の複合体は、ある態様としては、１〜２５の標識部と結合した、ある態様としては、１〜２３の標識部と結合した、ある態様としては１〜１６の標識部と結合した、ある態様としては１〜１１の標識部と結合した、ある態様としては１〜１０の標識部と結合した、ある態様としては１〜９の標識部と結合した、ある態様としては４〜２３の標識部と結合した、ある態様としては４〜１６の標識部と結合した、ある態様としては４〜１０の標識部と結合した、ある態様としては４〜９の標識部と結合した、ある態様としては３〜２３の標識部と結合した、ある態様としては３〜１６の標識部と結合した、ある態様としては、３〜１０の標識部と結合した、更に、ある態様としては３〜９の標識部と結合した、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである。本発明の複合体は、ある態様としては、更に金属を含む、１つ以上の標識部と結合した抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである。本発明の複合体のある態様としては、結合した標識部の数が異なる複合体の混合物であってもよい。
【００６４】
１つの実施形態として、本発明の複合体は、標識部と本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体である。
【００６５】
ある実施形態として、本発明の複合体は、標識部が（ｉ）配位子及びリンカー、又は（ｉｉ）配位子である、複合体である。
【００６６】
ある実施形態として、本発明の複合体は、標識部が（ｉ）配位子及びリンカー、又は（ｉｉ）配位子であり、当該配位子が下式（Ａ）で示される配位子である、複合体である：
【００６７】
【化８】
2019009388.tif 000010
式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント又はリンカーへの結合を表す。
【００６８】
ある実施形態として、本発明の複合体は、標識部が（ｉ）配位子及びリンカーであって、当該配位子及びリンカーが下式（Ａ’）で示される基である、複合体である：
【００６９】
【化９】
2019009388.tif 000011
式中、波線は抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントへの結合を表す。
【００７０】
ある実施形態として、本発明の複合体は、標識部が式（Ａ’）で示される基であり、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントが、当該Ｆａｂフラグメント中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）基の炭素原子と結合している、複合体である。
【００７１】
ある実施形態として、本発明の複合体は、下式(I)で示される、複合体である： 
（Ｌ−Ｘ）ｐ−Ａｂ      （I）
式中、Ａｂは、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントであり、
Ｌは配位子であり、
Ｘはリンカー又は結合であり、
ｐは１〜２５の自然数であり、ｐのある態様としては１〜２３の自然数であり、ある態様としては１〜１６の自然数であり、ある態様としては１〜１１の自然数であり、ある態様としては１〜１０の自然数であり、ある態様としては１〜９の自然数であり、ある態様としては４〜２３の自然数であり、ある態様としては４〜１６の自然数であり、ある態様としては４〜１０の自然数であり、ある態様としては４〜９の自然数であり、ある態様としては３〜２３の自然数であり、ある態様としては３〜１６の自然数であり、ある態様としては３〜１０の自然数であり、更に、ある態様としては３〜９の自然数である。
【００７２】
ある実施形態として、本発明の複合体は、
Ｌが下式（Ａ）で示される配位子である、式(I)の複合体である：
【００７３】
【化１０】
2019009388.tif 000012
式中、波線はＸ（但し、Ｘが結合の場合はＡｂ）への結合を表す。
【００７４】
式(I)の複合体のある実施形態としては、下式（II）で示される複合体である：
【００７５】
【化１１】
2019009388.tif 000013
式中、Ａｂは、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントであり、
ｐは１〜２５の自然数であり、ｐのある態様としては１〜２３の自然数であり、ある態様としては１〜１６の自然数であり、ある態様としては１〜１１の自然数であり、ある態様としては１〜１０の自然数であり、ある態様としては１〜９の自然数であり、ある態様としては４〜２３の自然数であり、ある態様としては４〜１６の自然数であり、ある態様としては４〜１０の自然数であり、ある態様としては４〜９の自然数であり、ある態様としては３〜２３の自然数であり、ある態様としては３〜１６の自然数であり、ある態様としては３〜１０の自然数であり、更に、ある態様としては３〜９の自然数であり、
Ａｂは当該Ａｂ中のアミノ基を介して、標識部末端のＣ（＝Ｓ）の炭素原子と結合している。
【００７６】
ある実施形態として、本発明の複合体は、式（Ｉ）の複合体であって、更に金属を含む複合体である。金属のある態様としては、金属放射性同位元素が挙げられる。金属放射性同位元素のある態様としては、８９Ｚｒが挙げられる。
【００７７】
ある実施形態として、本発明の複合体は、式（II）の複合体であって、更に金属を含む複合体である。金属のある態様としては、金属放射性同位元素が挙げられる。金属放射性同位元素のある態様としては、８９Ｚｒが挙げられる。
【００７８】
本発明の複合体には、複数種の複合体の混合物である複合体も含まれる。例えば、標識部と翻訳後修飾を受けていない本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体、及び、標識部と前記抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの翻訳後修飾により生じた本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体、の混合物である複合体も、本発明の複合体に含まれる。
【００７９】
複数種の本発明の複合体の混合物である本発明の複合体のある実施形態を以下に示す：
（１）標識部が式（Ａ’）で示される配位子及びリンカーであり、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである複合体、並びに、標識部が式（Ａ’）で示される配位子及びリンカーであり、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントである複合体、の混合物である複合体。
（２）更に金属を含む、（１）の複合体。
（３）更に金属を含む（１）の複合体及び金属を含まない（１）の複合体の混合物である複合体。
（４）金属が金属放射性同位元素である、（２）〜（３）の複合体。
（５）金属放射性同位元素が８９Ｚｒである、（４）の複合体。
【００８０】
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００８１】
１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００８２】
配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基番号１から３６３までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８３】
配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基番号１から３３６までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８４】
好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００８５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８６】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該技術分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開第９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００８８】
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００８９】
好ましい本発明の発現ベクターには、配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００９０】
好ましい本発明の発現ベクターには、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００９１】
本発明の発現ベクターは、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。
【００９２】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドの重鎖フラグメント及び／又は軽鎖をコードする遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。宿主細胞中で本発明のＦａｂフラグメントを発現させるためのプロモーターとしては、宿主細胞がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００９３】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞又は昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の重鎖フラグメント及び／又は軽鎖をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００９４】
＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００９５】
１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００９６】
１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００９７】
好ましい本発明の形質転換された宿主細胞としては、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００９８】
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、Ｆａｂフラグメントを発現しうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞）が例示される。形質転換自体は、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法など、公知の方法により行われ得る。
【００９９】
＜本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法＞
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を包含する。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法において培養する本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される： 
（ａ）本発明の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、本発明の抗ヒ卜ＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【０１０１】
ある態様としては、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法において培養する本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される： 
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【０１０２】
ある態様としては、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法において培養する本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）から（ｃ）からなる群より選択される： 
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【０１０３】
好ましくは、使用される本発明の形質転換された宿主細胞は、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、又は、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
【０１０４】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法において、形質転換された宿主細胞は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【０１０５】
形質転換された宿主細胞の培養自体は、公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９５２；１２２：５０１）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９５９；８：３９６−３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．；１９６７；１９９：５１９−５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；１９５０；７３：１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜３３６時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（ＰＮＡＳ；１９８５；８２：８４０４−８４０８）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；１９７２：４３１）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（ＰＮＡＳ；１９８０；７７：４５０５−４５０８）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【０１０６】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程に加えて、発現させた抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを回収、好ましくは単離、精製する工程を含むことができる。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやハイドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【０１０７】
＜本発明の複合体を生産する方法＞
本発明の複合体を生産する方法は、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを標識部と共有結合させる工程を含む。本発明の複合体を生産する方法はまた、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントと標識部とを共有結合させる工程を含んでいてもよい。本発明の複合体を生産する方法はまた、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントと標識部とを共有結合させる工程を含んでいてもよい。使用されるリンカー、配位子、又は蛍光色素等、及び連結の方法は、＜本発明の複合体＞に記載のものを使用することができる。
【０１０８】
１つの実施形態において、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを標識部と共有結合させる工程を含む方法である。ある態様としては、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントを標識部と共有結合させる工程を含む方法である。
【０１０９】
ある態様としては、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントをｉ）配位子とリンカーを介して結合させる又はｉｉ）配位子と直接共有結合させる工程を含む方法である。ある態様としては、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントをｉ）配位子とリンカーを介して結合させる又はｉｉ）配位子と直接共有結合させる工程を含む方法である。
【０１１０】
ある態様としては、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、当該Ｆａｂフラグメントを配位子とリンカーを介して又は直接共有結合させる工程、及び、当該複合体の配位子に金属を配位結合させる（即ち、キレート錯体を形成させる）工程を含む方法である。ある態様としては、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、当該Ｆａｂフラグメントを配位子とリンカーを介して又は直接共有結合させる工程、及び、当該複合体の配位子に金属を配位結合させる工程を含む方法である。
【０１１１】
ある態様としては、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、当該Ｆａｂフラグメントを配位子とリンカーを介して又は直接共有結合させる工程、及び、当該複合体の配位子に金属放射性同位元素を配位結合させる工程（即ち、キレート錯体を形成させる）を含む方法である。ある態様としては、本発明の複合体を生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、当該Ｆａｂフラグメントを配位子とリンカーを介して又は直接共有結合させる工程、及び、当該複合体の配位子に金属放射性同位元素を配位結合させる工程を含む方法である。
【０１１２】
本発明の複合体を生産する方法は、上記で特定する２つ以上の工程を一連の工程として含む方法として実施することもできるし、上記で特定する少なくとも１つの工程を含む方法として実施することもできる。例えば、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを標識部と結合させる工程を含む方法、及び、標識部を結合させた本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントに金属で標識する工程を含む方法もまた、本発明の複合体を生産する方法に含まれる。また、本発明の複合体を生産する方法には、工程の順番が異なる方法も含まれる。例えば、配位子を金属放射性同位元素で標識した後に、当該配位子を本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントと共有結合させる方法も、本発明の複合体を生産する方法に含まれる。
【０１１３】
＜本発明の診断用組成物・診断方法＞
本発明は、蛍光色素、金属又は非金属放射性同位元素を含む本発明の複合体（以下、検出可能な本発明の複合体と称する。）を含む、診断用組成物に関する。検出可能な本発明の複合体は、常法に従って製剤化され、病期診断薬（特に癌の診断）として利用することができる。病期診断薬とは、病状がどの程度進行しているかを検査することが可能な診断薬を意味する。例えば、癌については、そのステージを検査することが可能な診断薬を意味する。本発明の診断用組成物により診断できることが期待される癌は、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌及びこれらが転移した癌からなる群より選択される。好ましくは、当該癌は大腸癌又は大腸癌が転移した癌である。より好ましくは、当該癌は大腸癌が転移した癌であり、そのような癌には転移性肝癌が含まれる。
【０１１４】
本発明の診断用組成物の製剤化にあたっての検出可能な本発明の複合体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいはＦａｂフラグメントの結合力価等により異なるが、例えば、患者の単位体重あたりＦａｂフラグメントの質量ベースで０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
【０１１５】
本発明の診断用組成物の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤を挙げることができ、静脈内注射、標的局所への筋肉内注射、皮下注射等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。薬学的に許容される担体や添加剤の種類は特に限定されず、当業者に周知の担体や添加剤を用いることができる。
【０１１６】
本発明はまた、癌の診断用組成物、ある態様としては、病期診断用組成物の生産のための、検出可能な本発明の複合体の使用に関する。本発明は、癌の診断において使用するための、ある態様としては、病期診断において使用するための、検出可能な本発明の複合体にも関する。
【０１１７】
そして、本発明は、検出可能な本発明の複合体を、手術前又は手術中に対象に投与することを含む癌の診断方法にも関する。ここにおいて、「対象」とは、その診断を受けることを必要とするヒト又はその他の哺乳動物であり、ある態様としては、その診断を受けることを必要とするヒトである。本発明の診断方法における検出可能な本発明の複合体の有効量は上記製剤化にあたっての検出可能な本発明の複合体の有効量と同様の量であってもよい。本発明の診断方法において、検出可能な本発明の複合体は、静脈内注射等により投与することが好ましい。ＰＥＴトレーサーとして用いるための本発明の複合体は、投与から１．５〜４８時間後、ある態様としては２〜４８時間後、ある態様としては４〜２４時間後、ある態様としては４〜６時間後、ある態様としては１．５〜６時間後にＰＥＴで撮像することができる。本発明の診断方法において、蛍光標識された本発明の複合体を術中診断に用いる場合、当該複合体は、例えば手術の２〜４８時間前、好ましくは４時間前、に患者に投与される。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明は、本発明の複合体の生産のための、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの使用にも関する。ある態様としては、本発明は、本発明の複合体を含む診断用組成物の生産のための、本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの使用にも関する。
【０１１９】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１：抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントの作製）
マウス由来の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体であるＴ８４．６６を文献（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．；２００４；１７：４８１−４８９）に記載の方法を参考にしてヒト化後、文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；２０１４；８２：１６２４−１６３５）に準じて構築したヒト化抗体の分子モデルを用いて、標識部を結合させても親和性が減弱しないことが期待される可変領域を有する抗体を設計した。【０１２１】
前記抗体の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；１９８７；１：４９９−５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇγ１のＦａｂ領域遺伝子（配列番号１の塩基番号３６４から６７８までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖フラグメント遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ社）に挿入した。また、抗体の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇκの定常領域遺伝子（配列番号３の塩基番号３３７から６５７までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）に挿入した。抗体の重鎖フラグメントと軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のｐＥＥベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ライゲーション用キットＴＡＫＡＲＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ２．１（Ｔａｋａｒａ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。【０１２２】
前述の重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗体発現を行った。一過性発現については、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｎｔｉｆｉｃ社）で約３００万個／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対し、前述の重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクトし、５〜７日間培養した。培養上清をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いて精製し、Ｆａｂフラグメントを得た。恒常的発現については、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にＰｖｕＩで直鎖にした前述の重鎖フラグメントと軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターをＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いたエレクトロポレーション法にてトランスフェクトした。トランスフェクト翌日にメチオニンスルホキシミンを添加し、５〜７日間培養した。メチルセルロース含有半固形培地に細胞を播種し、コロニー形成後にＣｌｏｎｅＰｉｘ  ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いてＦａｂフラグメントの発現量が多い細胞を取得した。当該細胞の培養上清をＣａｐｔｏ  Ｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）、及び、ＢｉｏＰｒｏ  Ｓ７５（ワイエムシィ社）を用いて精製し、Ｆａｂフラグメントを得た。【０１２３】
作製した抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント（ＰＢ００９−０１と称する。）の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、ＰＢ００９−０１の軽鎖をコードする塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。ＰＢ００９−０１の重鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１１０までのアミノ酸配列からなる。ＰＢ００９−０１の軽鎖可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号１から１１２までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２４から３８、５４から６０、９３から１０１までのアミノ酸配列からなる。【０１２４】
なお、可変領域及びＣＤＲ配列はＫａｂａｔ番号付けに従って決定した（Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、 ５ｔｈ Ｅｄ．、 Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。【０１２５】
（実施例２：Ｆａｂフラグメント複合体の生産）
キレート剤であるＤＦＯのＦａｂフラグメントＰＢ００９−０１への結合には、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ（ｐ−イソチオシアノフェニルアミノチオカルボニル基置換ＤＦＯ）（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社）を使用した。リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）にて１ｍｇ／ｍＬに調製したＦａｂフラグメント溶液に、１／５量の０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）を添加した。これに終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるようにｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯを添加し、３７℃で１時間半反応させた。反応後、アミコンウルトラ３Ｋ−０．５ｍＬ遠心式フィルター（メルクミリポア社）を用いて、ＤＦＯがリンカー（−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−（１，４−フェニレン）−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−）を介して結合したＦａｂフラグメント（ＰＢ００９−０２と称する。）を精製した。【０１２６】
ＰＢ００９−０２について、質量分析でＤＦＯから構成される配位子の結合数を確認した。ＰＢ００９−０２を、ＭａｓｓＰＲＥＰ  Ｍｉｃｒｏ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて脱塩し、ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて測定を実施した。その結果、１個のＰＢ００９−０１にＤＦＯから構成される配位子が少なくとも３個から１０個結合した分子が確認された。【０１２７】
（実施例３：結合活性評価）
ＰＢ００９−０２の結合活性を詳細に測定するために、ＳＰＲ法による解析を行った。本実施例では、比較Ｆａｂフラグメントとして、Ｔ８４．６６のヒト化抗体であるＭ５ＡのＦａｂフラグメント（Ｍ５Ａ−Ｆａｂと称する。）を用いた。ＤＦＯをリンカーを介して結合させたＭ５Ａ−Ｆａｂ（Ｍ５Ａ−Ｆａｂ−ＤＦＯと称する。）は、実施例２に記載の方法を用いて作製した。【０１２８】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＳＰＲ法による解析を行った。センサーチップの表面にＢｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  Ｋｉｔ、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）とＢｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学研究所）でビオチン化した１０μｇ／ｍＬのヒトＣＥＡＣＡＭ５（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を流速５μＬ／ｍｉｎにて、２分間添加して固相化した。ＰＢ００９−０１、ＰＢ００９−０２、Ｍ５Ａ−Ｆａｂ及びＭ５Ａ−Ｆａｂ−ＤＦＯを、ＨＢＳ−ＥＰ＋溶液（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）で４００ｎＭから２倍公比で６段階希釈し、流速５０μＬ／ｍｉｎにて、１００μＬを流路にそれぞれ添加した。この測定系により、データ解析ソフトウェア（ＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ、ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＰＢ００９−０１、ＰＢ００９−０２、Ｍ５Ａ−Ｆａｂ又はＭ５Ａ−Ｆａｂ−ＤＦＯとヒトＣＥＡＣＡＭ５との解離定数（ＫＤ）をそれぞれ計算した。その結果、下表に示したようにＭ５Ａ−ＦａｂはＤＦＯの結合によって結合活性が減弱するのに対して、ＰＢ００９−０１はＤＦＯの結合によって結合活性が減弱しないことが確認された。【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
（実施例４：ＤＦＯが結合したＦａｂフラグメント複合体の８９Ｚｒ標識）
８９ＺｒはＺｒ−Ｏｘａｌａｔｅとして３Ｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＬＬＣ社より購入した。２０μＬのＺｒ−Ｏｘａｌａｔｅ（２．６ｍＣｉ）を２Ｍの炭酸ナトリウム１０μＬで中和した後５ｍｇ／ｍＬのゲンチジン酸２０μＬを加えた。さらに、０．０５％のポリソルベート８０を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を１１０μＬ添加した。１０ｍｇ／ｍＬのＰＢ００９−０２を４０μＬ添加し、室温で３０分間反応後、さらに３７℃で３０分間反応させた。反応後、アミコンウルトラ１０Ｋ−０．５ｍＬ遠心式フィルター（メルクミリポア社）を用いて、８９Ｚｒ標識したＰＢ００９−０２（ＰＢ００９−０３と称する。）を精製した。【０１３１】
（実施例５：複合体の皮下移植モデルにおける造影評価）
免疫不全マウス（ＮＯＧマウス；Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の右肩の皮下にヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞としてヒト大腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）；ＣＬ−１８８）を１×１０６細胞移植し、左肩の皮下にヒトＣＥＡＣＡＭ５陰性細胞としてヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ−１５細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）；ＣＣＬ−２２５）を５×１０６細胞移植した。本実施例はＮ＝３で実施した。腫瘍体積が約３００ｍｍ３になった後、ＰＢ００９−０３（約２０μｇ、約１２０μＣｉ）を静脈投与した。ＰＢ００９−０３投与４時間後、２４時間後及び４８時間後にＰＥＴで撮像し、腫瘍部分のＳＵＶ−Ｍａｘを測定した。その結果、図１Ａに示すようにＰＢ００９−０３は、投与４時間後において、ヒトＣＥＡＣＡＭ５陰性細胞であるＨＣＴ−１５細胞に比べて、ヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性細胞であるＬＳ１７４Ｔ細胞に多く集積することが示された。また、図１Ｂに示すようにＰＢ００９−０３は投与４時間後から４８時間後までヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性の癌細胞を検出できることが明らかになった。【０１３２】
（実施例６：複合体の肝移植モデルにおける造影評価）
麻酔下で免疫不全マウス（ＮＳＧマウス；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）の肝臓にルシフェラーゼ発現ＬＳ１７４Ｔ細胞を１×１０６細胞移植した。本実施例はＮ＝６で実施した。ＩＶＩＳ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（パーキンエルマー社）でルシフェラーゼの発現を指標に肝臓での細胞の生着を確認した後に、実施例４と同様の方法で作製したＰＢ００９−０３（約１４μｇ、約１００μＣｉ）を静脈投与した。ＰＢ００９−０３投与４時間後及び２４時間後にＰＥＴで撮像した。肝臓及びＬＳ１７４Ｔ腫瘍（移植したＬＳ１７４Ｔ細胞が肝臓に生着した状態を指す）のＳＵＶ−Ｍａｘをそれぞれ測定し、肝臓のＳＵＶ−Ｍａｘに対する腫瘍のＳＵＶ−Ｍａｘの比を算出した。その結果、図２Ａに示すようにＰＢ００９−０３は、投与４時間後において、肝臓に生着したＬＳ１７４Ｔ腫瘍に集積することが示された。また、投与４時間後及び２４時間後における肝臓に対する腫瘍のシグナルの比は図２Ｂに示す値であった。これらのことから、ＰＢ００９−０３は投与４時間後及び２４時間後において、肝臓に存在するヒトＣＥＡＣＡＭ５陽性の癌細胞を検出できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明の抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメント及び当該抗ヒトＣＥＡＣＡＭ５抗体Ｆａｂフラグメントを含む複合体は、大腸癌、乳癌、肺癌、甲状腺癌及びこれらが転移した癌からなる群より選択される癌の診断に有用であることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号１及び３で表される塩基配列は、それぞれＰＢ００９−０１の重鎖フラグメント及び軽鎖の塩基配列であり、配列番号２及び４で表されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び３によりコードされる重鎖フラグメント及び軽鎖のアミノ酸配列である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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