(57)【要約】  本発明の課題は、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加した多孔性微粒子、その製造方法、それを用いたクロマトグラフィー用充填剤及びクロマトグラフィー用カラムを提供することである。  本発明の多孔性微粒子は、粒子表面が化学修飾剤によって修飾された多孔性微粒子であって、当該多孔性微粒子に存在する孔の内部まで化学修飾されていることを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子表面が化学修飾剤によって修飾された多孔性微粒子であって、当該多孔性微粒子に存在する孔の内部まで化学修飾されていることを特徴とする多孔性微粒子。
【請求項２】
前記化学修飾剤が、５員又は６員の芳香族ヘテロ環、若しくはそれぞれの縮合環を構造として含む修飾基を有することを特徴とする請求項１に記載の多孔性微粒子。
【請求項３】
前記多孔性微粒子が、金属酸化物を含有する微粒子であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の多孔性微粒子。
【請求項４】
前記多孔性微粒子が、二酸化ケイ素を含有する微粒子であることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれか一項に記載の多孔性微粒子。
【請求項５】
請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の多孔性微粒子を含むことを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載の多孔性微粒子を含むことを特徴とするクロマトグラフィー用カラム。
【請求項７】
請求項１から請求項３までの多孔性微粒子を製造する多孔性微粒子の製造方法であって、
前記多孔性微粒子を含む系を減圧後に乾燥ガスで置換する工程と、
当該多孔性微粒子を超臨界流体中で前記化学修飾剤と反応させて修飾を行う工程と、
を少なくとも含むことを特徴とする多孔性微粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔性微粒子、その製造方法、それを用いたクロマトグラフィー用充填剤及びクロマトグラフィー用カラムに関し、より詳しくは、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加した多孔性微粒子、その製造方法、それを用いたクロマトグラフィー用充填剤及びクロマトグラフィー用カラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の混合物を分離し、分析・精製の両方において優れた性能を発揮する技術として高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が知られている。ＨＰＬＣではカラムと呼ばれる筒に充填剤（固定相又は担体ともいう。）を充填し、その中に溶媒（移動相ともいう。）と試料を注入し、試料中の成分を分離する。一般的に用いられる充填剤（固定相）としてはシリカゲルを初めとした多孔性の微粒子が多いが、有機高分子材料を用いるものもあり、その種類は多岐にわたる。また、表面が化学修飾されているバリエーションも多く存在する。一方、移動相は水や有機溶媒などの液体の中から種々選択することができる。ＨＰＬＣはその優れた化合物の分離特性と操作の簡便性、対象化合物の幅広さなどから非常に広範な技術分野で活用されている。【０００３】
近年、有機エレクトロニクス材料や医薬原薬の精製においては、材料に求められる純度が非常に厳しいため、目的物と混在している化合物の量によってはクロマトグラフィーの有する分離能力のさらなる向上が必要不可欠となる。【０００４】
前記有機エレクトロニクス材料や医薬原薬のように極高純度が要求される精製技術分野においては、溶媒使用量を低減すること、大量の成分を注入しても分離不良を起こさない充填剤（固定相）を開発することが、クロマトグラフィーの有する優れた分離特性を産業的スケールでの精製操作に適用する上で、求められている。【０００５】
一方、ＨＰＬＣの発展的技術として、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）が知られている。ＳＦＣにおいては主たる溶媒（移動相）として超臨界流体を用いることが特徴であり、ほとんどの場合は二酸化炭素の超臨界流体が利用される。このシステムでは、カラムを通過し終えた溶媒（移動相）は超臨界状態ではなくなる。そのため、主たる溶媒として利用されていた超臨界状態二酸化炭素は気体に戻り、溶媒乾燥の負荷を減らすことができる。【０００６】
超臨界流体は気体と液体の中間的性質を備えており、通常の溶媒よりも拡散が非常に速い。また、粘度も低く、充填剤を密に詰められるため、概してＨＰＬＣよりも優れた分離能を発揮することが知られている。一方で、産業的スケールへの応用に関してはＨＰＬＣと同様の課題を抱えており、注入量が増加することにより分離不良を引き起こす。したがって、ＨＰＬＣの場合と同様に大量の成分を注入しても分離不良を起こさない充填剤（固定相）を開発することが、ＳＦＣの有する優れた分離特性を産業的スケールでの精製操作に適用する上で、求められている。【０００７】
上記要求に沿って、クロマトグラフィー用の充填剤（固定相）を有機構造で化学修飾する際、修飾率を増加させることによって分離特性を改善する技術が開示されており、超臨界流体中でクロマトグラフィー用のシリカゲルを化学修飾する製造方法が開示されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照。）。しかしながら、液相法での修飾に比べると修飾率に優れるもののその修飾率は十分ではなく、上述の超臨界流体クロマトグラフィ
ー（ＳＦＣ）においては分離能が十分ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６２−１９４４５７号公報
【特許文献２】特許第２８１８８５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記問題・状況に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加した多孔性微粒子、その製造方法、それを用いたクロマトグラフィー用充填剤及びクロマトグラフィー用カラムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく、上記問題の原因等について検討する過程において、粒子表面が化学修飾剤によって修飾された多孔性微粒子であって、当該多孔性微粒子に存在する孔の内部まで化学修飾されている多孔性微粒子によって、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加した多孔性微粒子が得られることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。【００１２】
１．粒子表面が化学修飾剤によって修飾された多孔性微粒子であって、当該多孔性微粒子に存在する孔の内部まで化学修飾されていることを特徴とする多孔性微粒子。【００１３】
２．前記化学修飾剤が、５員又は６員の芳香族ヘテロ環、若しくはそれぞれの縮合環を構造として含む修飾基を有することを特徴とする第１項に記載の多孔性微粒子。【００１４】
３．前記多孔性微粒子が、金属酸化物を含有する微粒子であることを特徴とする第１項又は第２項に記載の多孔性微粒子。【００１５】
４．前記多孔性微粒子が、二酸化ケイ素を含有する微粒子であることを特徴とする第１項から第３項までのいずれか一項に記載の多孔性微粒子。【００１６】
５．第１項から第４項までのいずれか一項に記載の多孔性微粒子を含むことを特徴とするクロマトグラフィー用充填剤。【００１７】
６．第１項から第４項までのいずれか一項に記載の多孔性微粒子を含むことを特徴とするクロマトグラフィー用カラム。【００１８】
７．第１項から第４項までの多孔性微粒子を製造する多孔性微粒子の製造方法であって、
前記多孔性微粒子を含む系を減圧後に乾燥ガスで置換する工程と、
当該多孔性微粒子を超臨界流体中で前記化学修飾剤と反応させて修飾を行う工程と、
を少なくとも含むことを特徴とする多孔性微粒子の製造方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の上記手段により、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加した多孔性微粒子、その製造方法、それを用いたクロマトグラフィー用充填剤及びクロマトグラフィー用カラムを提供することができる。【００２０】
本発明の効果の発現機構又は作用機構については、明確にはなっていないが、以下のように推察している。【００２１】
化学物質の混合物を分離する方法として、再結晶・濾過・蒸留・昇華・クロマトグラフィーなどが知られている。再結晶・濾過・蒸留・昇華等はコスト面に優れており、産業的スケールの精製に実用されている。このような操作は混合物の分離には必ずしも適しているとは言えないが、試料側の状態を、最初から不純物の混入が少ない状態にしておく、又は、非常に分離しやすいものしか混入していないといった状態にしておくことで精製を達成可能としている。しかしながら、有機エレクトロニクス材料や医薬原薬の精製においては、材料に求められる純度要求が非常に厳しいため、再結晶・濾過・蒸留・昇華等では要求純度に満たないことが問題となる。【００２２】
一方で、クロマトグラフィー法は試料を高温条件下におかなくても高純度に分離することが可能であり、医薬、食品、電子デバイス材料などの広範な有機化合物の分析、精製などにおいて広く利用されている。クロマトグラフィー法において、カラムに充填されている充填剤（固定相）と化合物の相互作用等により吸脱着が繰り返され、再結晶・濾過・蒸留・昇華等よりも理論段数が高いため、高純度の分離が可能となる。したがって、クロマトグラフィー法による化合物の分離能は、充填剤（固定相）の性能が化合物の分離に大きく影響している。それゆえ、充填剤（固定相）の性能を向上させることは、有機化合物全般の分析・精製に貢献することになる。【００２３】
化学物質の混合物を分離し、分析・精製の両方において優れた性能を発揮する技術として前述の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。【００２４】
ＨＰＬＣは分析・精製の両面において優れており、実験室的スケールでは非常に重用されるものであるが、産業的スケールにおいて特に精製面についての利用は限定的である。【００２５】
これには大きく二つの問題が存在している。一つは乾燥工程の負荷であり、分離した成分を分取した後、使用した大量の溶媒を揮発させて目的成分を濃縮しなくてはならないことに由来する。もう一つは大スケールでの分離精度の問題であり、一般にＨＰＬＣは固定相の充填材料量に対して大量の混合物を分離しようとすると、成分がうまく分離されなくなってしまうという問題がある。これを単純に装置サイズの拡張で解決しようとしてしまうと、運用にさらに大量の溶媒を消費し、乾燥負荷とコストの増大を招いてしまう。【００２６】
さらに、有機エレクトロニクス材料や医薬原薬の精製においては、材料に求められる純度要求が非常に厳しいため、ＨＰＬＣによる分離精製では前述のように負荷が大きく、産業的スケールに適さないという問題がある。【００２７】
したがって、有機エレクトロニクス材料や医薬原薬のように極高純度が要求される精製操作においては、溶媒使用量を低減すること、大量の成分を注入しても分離不良を起こさない充填剤（固定相）を開発することが、クロマトグラフィーの有する優れた分離特性を産業的スケールでの精製操作に適用する上で、求められている。【００２８】
近年、ＨＰＬＣの発展的技術として、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）が知られている。ＳＦＣにおいては主たる溶媒（移動相）として超臨界流体を用いることが特徴であり、ほとんどの場合は二酸化炭素の超臨界流体が利用される。このシステムでは、カラムを通過し終えた移動相は超臨界状態ではなくなる。そのため、主たる溶媒として利用されていた超臨界状態二酸化炭素は気体に戻り、溶媒乾燥の負荷を減らすことができる。【００２９】
超臨界流体は気体と液体の中間的性質を備えており、通常の溶媒よりも拡散速度が非常
に速い。また、粘度も低く、充填剤（固定相）を密に詰められるため、概してＨＰＬＣよりも優れた分離能を発揮することが知られている。一方で、産業的スケールへの応用に関してはＨＰＬＣと同様の課題を抱えており、注入量が増加することにより分離不良を引き起こす。したがって、ＨＰＬＣの場合と同様に大量の成分を注入しても分離不良を起こさない充填剤（固定相）を開発することが、ＳＦＣの有する優れた分離特性を産業的スケールでの精製操作に適用するために求められている。【００３０】
本発明の多孔性微粒子は、シリカゲル等の多孔性微粒子の細孔の深部まで密に化学修飾された多孔性微粒子であり、例えば、ＨＰＬＣのみならず、ＳＦＣ用の充填剤（固定相）として用いることによって、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加するものである。【００３１】
本発明では、多孔性微粒子を化学修飾する前に減圧条件下に曝露した後、乾燥したガスによって系内を満たす（パージする）ことによって多孔性微粒子の細孔内部に水分等が吸着していない状態を作り出す。しかる後に超臨界条件下での化学修飾反応に供することにより、媒質となる超臨界流体の拡散性が十分に活かされ、反応試薬の輸送性が向上し、多孔性微粒子の細孔深部まで密に化学修飾された多孔性微粒子を与えることができる。【００３２】
ここで前述のカラムに保持されるということについて改めて説明する。カラムクロマトグラフィーにおいて、充填剤（固定相）が化合物に吸着されることを保持と呼ぶ。カラムクロマトグラフィーにおいて化合物は、充填剤（固定相）への吸着と、溶媒（移動相）への溶出を繰り返しながらカラムの出口へと向かっていく。充填剤（固定相）へ吸着している間、化合物はカラムの内部を進行せず、溶媒（移動相）へ溶出した際にカラム先端へと進行する。このため、相互作用が強い化合物、すなわち、充填剤（固定相）に吸着している時間が長い化合物ほどカラムを通過するのに時間を要する。【００３３】
図１において、化合物がカラムを通過するまでの時間ｔ1を保持時間と呼び、全く、充填剤（固定相）と相互作用しない化合物がカラムを通過するまでの時間はホールドアップタイムと呼ばれる。この時、保持時間からホールドアップタイムを差し引いたものｔ1′は空間補正保持時間と呼ばれ、この化合物がカラムの、充填剤（固定相）に吸着され、カラム内を進行しない状態にあった正味の時間となる。また、この空間補正保持時間とホールドアップタイムの比率ｋを保持係数と呼び、化合物がどの程度、充填剤（固定相）に保持されやすいかを示す指標となる。【００３４】
さらに保持係数ｋが有する意味について説明する。固定相による化合物の保持については単独の化合物をＡ、充填剤（固定相）の保持サイトをＢとすると図２のように表すことができる。これは正に化学平衡であり、この平衡の平衡定数Ｋは［Ａ＋Ｂ］／［Ａ］＋［Ｂ］と表せる。図１に対応させて考えるとｔ0は化合物と、充填剤（固定相）が［Ａ］＋［Ｂ］の関係で存在する時間を表しており、ｔ1′（すなわち、図１では、ｔ1′＝ｔ1−ｔ0を表す。)は［Ａ＋Ｂ］の関係で存在する時間を表している。したがって、ｋ＝ｔ1′／ｔ0＝［Ａ＋Ｂ］／［Ａ］＋［Ｂ］と置き換えることができ、これは平衡定数Ｋと同一であることが分かる。すなわち、ＨＰＬＣにおいて保持係数ｋとは、充填剤（固定相）と化合物間の相互作用の強さ（親和性）を平衡定数という形で与えるものである。【００３５】
実際の測定系においては化合物量［Ａ］も、充填剤（固定相）の保持サイト量［Ｂ］も有限であり、正しく分離を行うためには両者ともに平衡定数の比率に落ち着くことができる適度な量であることが必要である。例えば、平衡定数が１００００の関係にある化合物と、充填剤（固定相）の場合、化合物１０００１個と１０００１個の保持サイトがあれば平衡関係を正しく実現可能である。しかし、保持サイト１０００１に対して化合物が１０００００個存在していた場合、保持サイト１００００個が化合物と結合してなお、９００
００個の余剰な化合物が残り１個の保持サイトに吸着しようとする状態が発生し、平衡が成立しなくなる。このことにより、吸脱着のバランスが崩れ、リーディングやテーリング、ピーク幅のブロード化を招き、結果、分離に支障をきたすものと推察される。【００３６】
したがって、オーバーロードによるピークのテーリング、リーディング、又はブロード化などの形状崩れにおいては、充填剤（固定相）上の吸着サイトをより多く用意することで解消するものと考えられる。【００３７】
本発明者らは、吸着サイトとなる修飾基をより多く、充填剤（固定相）上に付与する方法として、超臨界流体中での化学修飾に着目した。また、検討の結果、従来技術に開示されている方法よりもさらに多くの修飾基を導入する方法として、多孔性微粒子を含む系を減圧後、乾燥ガスによる多孔性微粒子中の水分の置換が有効であることを見出した。【００３８】
これによって修飾率が向上する理由は様々に考えられるが、以下のように考えられる。【００３９】
まず、多孔性微粒子の細孔内部に僅かに残存する水分などが減圧条件下で完全に取り除かれ、次いで乾燥ガスによって置換されることによって細孔内部は完全に水分のない乾燥状態となる。続けて、超臨界流体に曝露されることによって超臨界流体の拡散及びこれによる反応試薬の輸送が速やかに進むことによって、細孔内部まで効率よく化学修飾を行うことができたものと推察される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】化合物がカラムを通過するまでの時間を示した模式図
【図２】送液された化合物が充填剤（固定相）に吸着する様子を示した概念図
【図３】シンメトリー係数を表す模式図
【図４】超臨界又は亜臨界クロマトグラフィー法における充填カラムを用いた装置の概略図
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明の多孔性微粒子は、粒子表面が化学修飾剤によって修飾された多孔性微粒子であって、当該多孔性微粒子に存在する孔の内部まで化学修飾されていることを特徴とする。この特徴は、各実施態様に共通する又は対応する技術的特徴である。
【００４２】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記化学修飾剤が、５員又は６員の芳香族ヘテロ環、若しくはそれぞれの縮合環を構造として含む修飾基を有することが好ましい。
【００４３】
また、本発明の効果発現の観点から、前記多孔性微粒子が、金属酸化物を含有すること、さらに二酸化ケイ素を含有する微粒子であることが、好ましい。
【００４４】
本発明のクロマトグラフィー用充填剤及びクロマトグラフィー用カラムは、本発明の多孔性微粒子を含むことを特徴とし、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加する。
【００４５】
本発明の多孔性微粒子の製造方法は、前記多孔性微粒子を含む系を減圧後に乾燥ガスで置換する工程と、当該多孔性微粒子を超臨界流体中で前記化学修飾剤と反応させて修飾を行う工程と、を少なくとも含むことを特徴とする。
【００４６】
以下、本発明とその構成要素、及び本発明を実施するための形態・態様について詳細な説明をする。なお、本願において、「〜」は、その前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用する。
【００４７】
≪本発明の多孔性微粒子の概要≫
本発明の多孔性微粒子は、粒子表面が化学修飾剤によって修飾された多孔性微粒子であって、当該多孔性微粒子に存在する孔の内部まで化学修飾されていることを特徴とする。
【００４８】
本発明でいう「多孔性微粒子」とは、微粒子内部に多数の孔を有し、ガス分子や溶液中の化学物質を当該微粒子表面及び細孔によって吸着できる微粒子と定義する。「孔の内部」とは、前記細孔の表面部位をいう。
【００４９】
本発明でいう「化学修飾」とは、多孔性微粒子の表面（外部表面と内部表面）に化合物を吸着させることをいう。
【００５０】
ここで吸着とは、化学吸着（化学結合を伴う吸着）でも物理吸着（物理的相互作用による吸着）でもよく、これらの組み合わせであってもよい。化学吸着の場合、化学結合としては、水素結合、共有結合、配位結合、イオン結合等、更にはこれら２種以上の組み合わせが挙げられるが、いずれであってもよい。物理吸着の場合、物理的相互作用としては、イオン間相互作用、双極子相互作用、ファンデルワールス（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）等、更にはこれらの２種以上の組み合わせが挙げられるが、いずれであってもよい。
【００５１】
〔１〕多孔性微粒子
本発明の多孔性微粒子は、粒子表面が化学修飾剤によって修飾された多孔性微粒子であって、当該多孔性微粒子に存在する孔の内部まで化学修飾されていることを特徴とする。
【００５２】
本発明の多孔性微粒子が、孔の内部まで化学修飾されていることは、例えば、多孔性微粒子試料を減圧乾燥を行った後に、ＳＥＭ・ＥＤＳ（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ  Ｘ−ｒａｙ  Ｓｐｅｃｔｏｒｏｓｃｏｐｙ：エネルギー分散型Ｘ線分析装置）や炭素・水素・窒素同時定量装置ＣＨＮ元素分析装置（ＣＨＮコーダー）等を用いて、元素分析を行い、炭素濃度を測定して比較することによって推定することができる。
【００５３】
本発明の多孔性微粒子の製造方法は、孔の内部まで化学修飾するために、前記多孔性微粒子を含む系を減圧後に乾燥ガスで置換する工程と、当該多孔性微粒子を超臨界流体中で前記化学修飾剤と反応させて修飾を行う工程と、を少なくとも含むことを特徴とする。
【００５４】
これは、多孔性微粒子の細孔内部に僅かに残存する水分などが減圧条件下で取り除かれ、次いで乾燥ガスによって置換されることによって細孔内部は完全に水分のない乾燥状態となる。続けて、超臨界流体に曝露されることによって超臨界流体の拡散及びこれによる反応試薬の輸送が速やかに進むことによって、細孔内部まで効率よく化学修飾を行うことができたものと推察される。
【００５５】
本発明の多孔性微粒子の出発物質である、多孔性微粒子は多孔性の微粒子であれば特に限定はないが、金属酸化物であることが好ましく、例示として二酸化ケイ素（シリカゲル）やアルミナ、ゼオライトに代表される無機金属酸化物が挙げられる。また、ポリマー材料でもよく、又はこれらの複合材料を担体として利用してもよい。
【００５６】
また、多孔性微粒子を化学修飾してその表面にあらかじめ修飾基を化学結合させたもの、さらには化学修飾した多孔性微粒子にさらにエンドキャッピング処理を施したものを用いることもできる。
【００５７】
好ましい多孔性微粒子の一例として、一般にクロマトグラフィー用充填剤として使用されている前記シリカゲルを例示すると、好ましい比表面積は、１〜１５００ｍ2／ｇ程度
であり、粒子径は１〜１０００μｍの範囲、より好ましくは１〜５０μｍの範囲、さらに好ましくは１〜１０μｍの範囲である。細孔径は、１〜１００ｎｍの範囲であり、深さは、２０〜１０００ｎｍの範囲、より好ましい深さの範囲は５０〜５００ｎｍであり、最も好ましい深さの範囲は５０〜１５０ｎｍである。また、細孔のピッチを細孔の中心間の距離と定義すると、好ましいピッチは２〜５００ｎｍの範囲であり、より好ましいピッチの範囲は２〜１００ｎｍであり、最も好ましいピッチの範囲は２〜５０ｎｍである。
【００５８】
本発明は、多孔性微粒子の孔の中の水分について、その深部まで乾燥ガスで置換するところに特徴を有する。多孔性微粒子は、含有する水分や酸素は減圧条件下におくことで完全に取り除かれる。減圧条件としては真空であることが好ましい。
【００５９】
次に、乾燥ガスによって置換されることによって細孔内部は完全に水分のない乾燥状態となる。乾燥ガスとして好ましく用いられるものは反応試薬や固定相担体、又は反応媒体となる溶媒や超臨界流体に対して不活性なものが好ましく、窒素、二酸化炭素、アルゴンなどが好ましく用いられるが、これらに限定されるものではない。中でも窒素であることが、取り扱い性の観点から好ましい。
【００６０】
続けて、超臨界流体に曝露されることによって超臨界流体の拡散及びこれによる反応試薬の輸送が速やかに進むことによって、細孔内部まで効率よく化学修飾を行うことができる。用いられる超臨界流体としては超臨界状態を取るものであれば特に限定されないが、有機物を用いて化学修飾を行うという性質上、反応性に乏しいものが好ましい。例えば、二酸化炭素、エタン、プロパン、ブタン、ベンゼン、ジエチルエーテル等が挙げられ、特に臨界点の圧力、温度が低いことから二酸化炭素が好適である。これらの超臨界流体は各々単独で利用してもよく、また、モディファイヤとして種々の溶媒を混合した状態で使用してもよい。
【００６１】
本発明で使用できる超臨界流体としては、臨界温度が４００℃以下であれば使用可能であるが、副反応を回避するには３００℃以下、より好ましくは２００℃以下、最も好ましくは１００℃以下がよく、かつ臨界圧力が３００ｋｇ／ｃｍ2以下、より好ましくは２００ｋｇ／ｃｍ2以下、最も好ましくは１００ｋｇ／ｃｍ2以下のものが好適である。これらの条件に適合する、本発明に好ましい超臨界流体を例示すると二酸化炭素、一酸化二窒素、エタン、プロパン、ブタン、ベンゼン、ジエチルエーテル等が挙げられ、特に二酸化炭素（臨界温度３１．３℃、臨界圧力７２．９ａｔｍ（７５．３ｋｇ／ｃｍ2）が好適である。これらの超臨界流体は各々単独で使用できる他、化学修飾剤の溶解度を向上させるためにメタノールやトルエンのようなモディファイヤとの混合流体として使用することも可能である。
【００６２】
〔２〕化学修飾剤
本発明に係る化学修飾剤における修飾基の構造は特に限定されないが、オクタデシル基等のアルキル基、アミノプロピル基等のヘテロアルキル基を含む構造や、芳香族炭化水素基、芳香族複素環基を含む構造等が挙げられ、特に有機電子材料を分離する際には共役π電子を有する芳香族炭化水素基、又は芳香族複素環基を含むものが好ましい。例えば、カルバゾリル基、アザカルバゾリル基、フェナントレニル基、フェナントロリニル基、ベンゾフラニル基、ジベンゾフラニル基、アザジベンゾフラニル基、チオフェニル基、ベンゾチオフェニル基、アザジベンゾチオフェニル基、ジベンゾチオフェニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、トリアジニル基、インドリル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、ベンゾチアゾリル基等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
本発明に係る化学修飾剤は、５員又は６員の芳香族ヘテロ環、若しくはそれぞれの縮合
環を構造として含む修飾基を有することが好ましい。また、化学修飾剤が、縮合芳香族ヘテロ環を複数有することが好ましく、さらに、芳香族ヘテロ環を複数有していてもよい。
【００６４】
中でも、当該化学修飾剤が、下記一般式（ａ−１）〜（ａ−１６）で表される構造を含む修飾基を有することが好ましい。
【００６５】
【化１】
2019117063.tif 000002
【００６６】
式中、Ｘはそれぞれ独立して炭素原子又はヘテロ原子を表し、少なくとも一つはヘテロ原子であることが好ましく、ヘテロ原子としては特に酸素原子、窒素原子、硫黄原子が好ましく用いられる。Ｍは金属原子を表し、特にＩｒ、Ｐｔが好ましく用いられる。ｎは１〜３の整数を表す。それぞれのＸは独立に置換基を有していてよいし、互いに環を形成していてもよい。また、Ｘの置換基同士で環を形成していてもよい。
【００６７】
上記一般式（ａ−１）〜（ａ−１６）で表される構造を含む修飾基として、さらに好ましい修飾基は、下記一般式（ｂ−１）〜（ｂ−２４）で表される構造を含む修飾基が挙げられる。
【００６８】
【化２】
2019117063.tif 000003
【００６９】
式中、Ｙは各々独立して炭素原子、窒素原子のいずれかを表し、Ｗは各々独立してヘテロ原子を表し、ヘテロ原子としては特に窒素原子、硫黄原子、酸素原子のいずれかが好ましく用いられる。Ｍは金属原子を表し、特にＩｒ、Ｐｔが好ましく用いられる。ｎは１〜３の整数を表す。一般式（ｂ−２４）において、Ｙのうちの少なくとも一つはヘテロ原子を表す。それぞれのＹは独立に置換基を有していてもよいし、互いに環を形成していてもよい。また、Ｙの置換基同士で環を形成していてもよい。Ｒは置換基を表し、置換基同士で環を形成していてもよい。
【００７０】
Ｒで表される置換基としては、例えば、水素原子、アルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、（ｔ）ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基等）、シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）、アルケニル基（例えば、ビニル基、アリル基等）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基等）、芳香族炭化水素環基（アリール基ともいい、例えば、フェニル基、ｐ−クロロフェニル基、メシチル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基、アントリル基、アズレニル基、アセナフテニル基、フルオレニル基、フェナントリル基、インデニル基、ピレニル基、ビフェニリル基等）、複素環基（例えば、エポキシ環、アジリジン環、チイラン環、オキセタン環、アゼチジン環、チエタン環、テトラヒドロフラン環、ジオキソラン環、ピロリジン環、ピラゾリジン環、イミダゾリジン環、オキサゾリジン環、テトラヒドロチオフェン環、スルホラン環、チアゾリジン環、ε−カプロラクトン環、ε−カプロラクタム環、ピペリジン環、ヘキサヒドロピリダジン環、ヘキサヒドロピリミジン環、ピペラジン環、モルホリン環、テトラヒドロピラン環、１，３−ジオキサン環、１，４−ジオキサン環、トリオキサン環、テトラヒドロチオピラン環、チオモルホリン環、チオモルホリン−１，１−ジオキシド環、ピラノース環、ジアザビシクロ［２，２，２］−オクタン環等）、芳香族複素環基（ピリジル基、ピリミジニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、ピラジニル基、トリアゾリル基（例えば、１，２，４−トリアゾール−１−イル基、１，２，３−トリアゾール−１−イル基等）、オキサゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、チアゾリル基、イソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、フラザニル基、チエニル基、キノリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、インドリル基、インドロインドリル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、ジアザカルバゾリル基（前記カルボリニル基のカルボリン環を構成する炭素原子の一つが窒素原子で置き換わったものを示す）、キノキサリニル基、ピリダジニル基、トリアジニル基、キナゾリニル基、フタラジニル基等）、ハロゲン原子（例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、フッ素原子等）、アルコキシル基（例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、オクチルオキシ基、ドデシルオキシ基等）、シクロアルコキシル基（例えば、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等）、アリールオキシ基（例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等）、アルキルチオ基（例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、オクチルチオ基、ドデシルチオ基等）、シクロアルキルチオ基（例えば、シクロペンチルチオ基、シクロヘキシルチオ基等）、アリールチオ基（例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基等）、アルコキシカルボニル基（例えば、メチルオキシカルボニル基、エチルオキシカルボニル基、ブチルオキシカルボニル基、オクチルオキシカルボニル基、ド��シルオキシカルボニル基等）、アリールオキシカルボニル基（例えば、フェニルオキシカルボニル基、ナフチルオキシカルボニル基等）、スルファモイル基（例えば、アミノスルホニル基、メチルアミノスルホニル基、ジメチルアミノスルホニル基、ブチルアミノスルホニル基、ヘキシルアミノスルホニル基、シクロヘキシルアミノスルホニル基、オクチルアミノスルホニル基、ドデシルアミノスルホニル基、フェニルアミノスルホニル基、ナフチルアミノスルホニル基、２−ピリジルアミノスルホニル基等）、ウレイド基（例えば、メチルウレイド基、エチルウレイド基、ペンチルウレイド基、シクロヘキシルウレイド基、オクチルウレイド基、ドデシルウレイド基、フェニルウレイド基、ナフチルウレイド基、２−ピリジルアミノウレイド基等）、アシル基（例えば、アセチル基、エチルカルボニル基、プロピルカルボニル基、ペンチルカルボニル基、シクロヘキシルカルボニル基、オクチルカルボニル基、２−エチルヘキシルカルボニル基、ドデシルカルボニル基、フェニルカルボニル基、ナフチルカルボニル基、ピリジルカルボニル基等）、アシルオキシ基（例えば、アセチルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基、ブチルカルボニルオキシ基、オクチルカルボニルオキシ基、ドデシルカルボニルオキシ基、フェニルカルボニルオキシ基等）、アミド基（例えば、メチルカルボニルアミノ基、エチルカルボニルアミノ基、ジメチルカルボニルアミノ基、プロピルカルボニルアミノ基、ペンチルカルボニルアミノ基、シクロヘキシルカルボニルアミノ基、２−エチルヘキシルカルボニルアミノ基、オクチルカルボニルアミノ基、ドデシルカルボニルアミノ基、フェニルカルボニルアミノ基、ナフチルカルボニルアミノ基等）、カルバモイル基（例えば、アミノカルボニル基、メチルアミノカルボニル基、ジメチルアミノカルボニル基、プロピルアミノカルボニル基、ペンチルアミノカルボニル基、シクロヘキシルアミノカルボニル基、オクチルアミノカルボニル基、２−エチルヘキシルアミノカルボニル基、ドデシルアミノカルボニル基、フェニルアミノカルボニル基、ナフチルアミノカルボニル基、２−ピリジルアミノカルボニル基等）、スルフィニル基（例えば、メチルスルフィニル基、エチルスルフィニル基、ブチルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、２−エチルヘキシルスルフィニル基、ドデシルスルフィニル基、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、２−ピリジルスルフィニル基等）、アルキルスルホニル基又はアリールスルホニル基（例えば、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、ブチルスルホニル基、シクロヘキシルスルホニル基、２−エチルヘキシルスルホニル基、ドデシルスルホニル基、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、２−ピリジルスルホニル基等）、アミノ基（例えば、アミノ基、エチルアミノ基、ジメチルアミノ基、ブチルアミノ基、シクロペンチルアミノ基、２−エチルヘキシルアミノ基、ドデシルアミノ基）、アニリノ基、ジアリールアミノ基（例えば、ジフェニルアミノ基、ジナフチルアミノ基、フェニルナフチルアミノ基等）、ナフチルアミノ基、２−ピリジルアミノ基等）、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、アルキ��シリル基又はアリールシリル基（例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、（ｔ）ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、（ｔ）ブチルジフェニルシリル基、トリフェニルシリル基、トリナフチルシリル基、２−ピリジルシリル基等）、アルキルホスフィノ基又はアリールホスフィノ基（ジメチルホスフィノ基、ジエチルホスフィノ基、ジシクロヘキシルホスフィノ基、メチルフェニルホスフィノ基、ジフェニルホスフィノ基、ジナフチルホスフィノ基、ジ（２−ピリジル）ホスホスフィノ基）、アルキルホスホリル基又はアリールホスホリル基（ジメチルホスホリル基、ジエチルホスホリル基、ジシクロヘキシルホスホリル基、メチルフェニルホスホリル基、ジフェニルホスホリル基、ジナフチルホスホリル基、ジ（２−ピリジル）ホスホリル基）、アルキルチオホスホリル基又はアリールチオホスホリル基（ジメチルチオホスホリル基、ジエチルチオホスホリル基、ジシクロヘキシルチオホスホリル基、メチルフェニルチオホスホリル基、ジフェニルチオホスホリル基、ジナフチルチオホスホリル基、ジ（２−ピリジル）チオホスホリル基）から選ばれるいずれかの基を表す。なお、これらの置換基はさらに上記の置換基によって置換されていてもよいし、また、それらが互いに縮合してさらに環を形成してもよい。
【００７１】
さらに、好ましくはアルキル基、芳香族炭化水素環基、芳香族複素環基、複素環基、及びシクロアルキル基である。
【００７２】
以下、一般式（ａ−１）〜（ａ−１６）及び一般式（ｂ−１）〜（ｂ−２４）で表される構造を含む修飾基の具体例を例示する。なお、（ｃ−１）〜（ｃ−１１５）において、−＊は後述するリンカー部との連結箇所を表す。
【００７３】
【化３】
2019117063.tif 000004
【００７４】
【化４】
2019117063.tif 000005
【００７５】
【化５】
2019117063.tif 000006
【００７６】
【化６】
2019117063.tif 000007
【００７７】
【化７】
2019117063.tif 000008
【００７８】
【化８】
2019117063.tif 000009
【００７９】
【化９】
2019117063.tif 000010
【００８０】
【化１０】
2019117063.tif 000011
【００８１】
【化１１】
2019117063.tif 000012
【００８２】
なお、本発明に係る修飾基としてはヘテロアリール基を含む構造が好適である。本発明においては、このようなヘテロアリールを含む環と金属原子で錯体を形成した構造も、縮合した芳香族複素環とみなす。このような構造について例を挙げて示せば、例えば、トリス（２−フェニルピリジナト）イリジウムのような構造は三つのフェニルピリジン配位子が金属と錯体を形成しているため、全体としては一つのヘテロアリール環としてみなす。このような構造は他に、トリス（８−キノリノラト）アルミニウム、８−ヒドロキシキノリノラトリチウム、トリス（２，２′−ビピリジル）ルテニウムジクロリド、トリス［１−フェニルイソキノリン−Ｃ2，Ｎ］イリジウムといった錯体化合物にも見られるものであるが、上に例示した構造に限定されるものではない。
【００８３】
これらの化学修飾剤又は修飾基は公知の方法で合成することができる。
【００８４】
多孔性微粒子は、あらかじめ表面修飾されていることも好ましい。すなわち２段階で化学修飾してもよい。
【００８５】
具体的には、前記修飾基が、表面修飾基によりあらかじめ表面修飾された多孔性微粒子と化学結合していることが好ましい。また、表面修飾基を用いて化学修飾した多孔性微粒子にさらにエンドキャッピング処理を施したものを用いることもできる。
【００８６】
エンドキャッピング剤としては、ヘキサメチルジシラザンなどのジシラザン化合物、ジエチルメチルシランやトリエチルシランなどのハイドロジェンシラン化合物、トリメチルメトキシシランなどのアルコキシシラン化合物、ペンタメチルジシロキサンやヘキサメチルシクロトリシロキサン、１，１，３，３−テトラメチルジシロキサンなどのシロキサン化合物、トリメチルクロロシランなどのクロロシラン化合物などを好適に用いることができる。
【００８７】
また、前記多孔性微粒子が、前記化学修飾剤とは化学構造の異なる化学修飾剤であらかじめ表面修飾されることも好ましい。これにより、例えば、試験材料をシリカゲルの残存シラノール基から遠ざけることで、試験材料が想定していないシラノール基との相互作用を抑え、修飾基との相互作用を促進させる効果が得られる。
【００８８】
さらに、前記した修飾基と表面修飾された多孔性微粒子とが二価の連結基を介して結合した構造であることも好ましい態様である。
【００８９】
このような、多孔性微粒子を表面修飾する基が、二価の連結基を介して、又は単結合を介して、本発明に係る修飾基と結合するものとして、下記一般式（ｄ−１）又は一般式（ｅ−１）で表される構造を有することが好ましい。
【００９０】
一般式（ｄ−１）において、Ｌ1、Ｌ2は単結合又は二価の連結基を表し、ｍ、ｏはそれぞれ０〜５の整数を表す。Ａｒは芳香族炭化水素であり二価の連結基を表す。
【００９１】
Ｌ1、Ｌ2で表される二価の連結基としては、置換若しくは無置換のアルキレン基、アリーレン基若しくはヘテロアリーレン基、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）2−、−Ｎ（Ｒ）−、カルボキシルエステル基、ケトンカルボニル基、スルホニキシル基、カルバモイル基、スルファモイル基又は、アミド基等が挙げられる。
【００９２】
一般式（ｅ−１）において、Ｌ1は単結合又は二価の連結基を表し、ｍ、ｏはそれぞれ０〜５の整数を表す。Ａｒは芳香族炭化水素である二価の連結基を表す。
【００９３】
一般式（ｅ−１）において、Ｌ1は、一般式（ｄ−１）におけるＬ1と同義である。
【００９４】
Ａｒで表される芳香族炭化水素である二価の連結基としては、オルト、パラ又はメタフェニレン、ナフチレン、ビフェニレン、アントラセニレン又はターフェニレン等を挙げることができる。
【００９５】
Ｒ1はそれぞれ独立に多孔性微粒子と連結する元素を表し、特に炭素、酸素、又は窒素が好ましく用いられる。
【００９６】
【化１２】
2019117063.tif 000013
【００９７】
本発明において好ましく用いられる二価の連結基を有するあらかじめ表面修飾された多孔性質微粒子の具体的な構造を以下（ｆ−１）〜（ｆ−１５）に例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。（ｆ−１）〜（ｆ−１５）において、＊は前記修飾基との連結部を表し、構造式左側の波線部分は、Ｓｉが多孔性質微粒子と結合している接続部を表す模式図である。
【００９８】
【化１３】
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【００９９】
本発明における化学修飾剤の超臨界流体に対する濃度は適宜選定でき、特に限定されるものではないが、０．０１〜２０％（容量比）が好ましく、特に０．１〜１０％（容量比）が好適である。
【０１００】
また化学修飾反応における反応温度は、多孔性微粒子及び化学修飾剤の種類によって適宜選定でき、超臨界流体の臨界温度以上であれば特に限定されないが、温度が高くなりすぎると既に化学結合されている化学修飾基が存在する場合はその脱離が多くなる可能性があるので、その上限は４００℃とすることが好ましい。より好ましい反応温度の上限は３００℃、最も好ましい反応温度上限は２５０℃である。
【０１０１】
化学修飾反応における超臨界流体の圧力は、臨界圧力以上であれば問題はなく、化学修飾剤の種類や濃度に応じて適宜選定できる。臨界圧力〜１００ｋｇ／ｃｍ2が通常である。また反応時間は３０分〜１２０時間、より好ましくは２〜２４時間とすることが望ましい。反応槽中の流体の流速は特に限定されるものではないが、超臨界流体状態で毎分５ｍＬ以下が好ましい。
【０１０２】
〔３〕充填剤
本発明によって得られるクロマトグラフィー用充填剤については、本発明を以てしても反応させきることができていない残存活性基を異なる修飾構造でエンドキャッピングして利用してもよい。また、エンドキャッピングの際に乾燥ガスで微粒子を置換する操作を行ってもよい。エンドキャッピングの構造は粒子上の残存活性基と反応しうるものであればよく、例示すると排除体積の小さなアルキルシリル基、アシル基、アルコキシル基、アルキルアミノ基などが特に好適であるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
本発明によって得られる充填剤は、カラムクロマトグラフィー用の充填剤、特に高速液体クロマトグラフィー用充填剤又は超臨界流体クロマトグラフィー用の充填剤として好ましく用いられるが、これに限定されるものではない。例えば、薄層クロマトグラフィーの担体や吸着材として用いてもよいし、濾過補助剤やフィルターのような形態で用いてもよい。
【０１０４】
〔４〕カラム
本発明のクロマトグラフィー用カラムは、本発明の多孔性微粒子を含むことを特徴とし、カラムクロマトグラフィーに供される。
【０１０５】
本発明のカラムは、いわゆるリーディングやテーリング、ピーク幅のブロード化を減少させる効果を有する。
【０１０６】
通常リーディングやテーリングに関して、クロマトグラフィーにおけるカラムの性能を表す指標として、シンメトリー係数が挙げられる。シンメトリー係数（ｓｙｍｍｅｔｙ  ｆａｃｔｏｒ、テーリング係数）はピークの対称性の度合いを表す指標であり、図３において下記式で表される。
【０１０７】
（シンメトリー係数：Ｓ）
Ｓ＝Ｗ（０．０５ｈ）／２ｆ
Ｗ（０．０５ｈ）：ピークのベースラインからピーク高さｈの１／２０の高さにおけるピーク幅）
ｆ：Ｗ（０．０５ｈ）のピーク幅をピーク頂点から横軸へ下した垂線で２分したピーク立ち上がり側の距離
Ｓ＝１であれば左右対称となり、ピークとして理想的な形状を示している。Ｓ＞１のとき、ピークは右側に膨らんだ形、すなわちテーリングしている形状となる。Ｓ＜１のとき、ピークは左側に膨らんだ形、すなわちリーディングしている形状となる。したがって、Ｓは１に近いほどカラムとして優れた性能を持っていることとなる。本発明のカラムのシンメトリー係数は、０．７０＜Ｓ＜１．３０であることが好ましく、０．８０＜Ｓ＜１．２０であることがより好ましく、０．８５＜Ｓ＜１．１５であることがさらに好ましい。  
【０１０８】
〔４．１〕カラムクロマトグラフィー（以下、「クロマト法」ともいう。）
本発明に係るカラムクロマトグラフィーの最も典型的なところは、充填剤（固定相）に本発明の多孔性微粒子を用い、そこに化合物Ａを吸着させ、それを溶媒又は溶離液と呼ばれる移動相（Ｂ）で徐々に溶出させて行くというものである。
【０１０９】
このとき、多孔性微粒子表面及び細孔内部に存在する修飾基と化合物Ａとの相互作用（吸着）に対して、移動相（Ｂ）との相互作用が拮抗する場合、Ａは多孔性微粒子と移動相Ｂとの間で、吸着−脱着の平衡を繰り返し、多孔性微粒子との相互作用が小さい場合は速く、相互作用が大きい場合には遅く、溶出して行く。
【０１１０】
このときに、吸着−脱着平衡の往復回数が大きいほど理論段数（すなわち精製効率）が増大することから、クロマト法による精製効率は、充填剤（固定相）の長さに比例し、移動相の通過速度にも比例し、充填剤（固定相）の表面積にも比例することになる。
【０１１１】
これを実現させたのが、高速液体クロマトグラフィーであり、これが、有機化合物の成分分析や品質保証に幅広く使われているのも、この理論に裏打ちされた高度の理論段数を実現できる希な手法であることに起因している。
【０１１２】
このクロマト法が再結晶に比べ秀でる理由は、移動相Ｂの極性を任意に変更できる点である。例えば、移動相を最初から良溶媒と貧溶媒の混合溶媒にしておくことはもとより、精製の際に徐々に良溶媒比率を増やしていくグラジエント法を用い、さらに理論段数を増やせることが挙げられる。
【０１１３】
また、温度も任意に変えることが可能であるため、精製可能となる溶質の適用範囲が極めて広く、ほぼ汎用的な精製法として活用できることが最大の特徴である。
【０１１４】
一方、クロマト法の欠点もある。前述のように、理論段数を大きくするための根本的な原理が、吸着−脱着平衡を活用しているところにある。
【０１１５】
例えば、移動相に化合物Ａと相互作用が強い溶媒Ｂ′（すなわち良溶媒）だけを用いてクロマト法を行った場合、Ａと多孔性微粒子との相互作用よりも、Ａと移動相Ｂ′との相互作用が強ければ、吸着−脱着平衡の往復回数が激減し、精製効果が低くなってしまう。
【０１１６】
つまり、精製効果を高めるためには、良溶媒Ｂ′の他に、大過剰の貧溶媒Ｃを混合し、吸着−脱着平衡の往復回数を増やす必要がある。ただしこの場合、精製されて分取した化合物Ａの溶液には、大過剰のＣが含まれており、これを濃縮しなければならないことが最大の問題である。
【０１１７】
例えば、１ｇのＡを得るためには、良溶媒Ｂ′と貧溶媒Ｃの混合比率を１：９９〜１０：９０くらいにする必要があり、一般的にはおおよそ１０Ｌから１００Ｌの貧溶媒Ｃが必要となってしまう。そのため、ＨＰＬＣ分取は研究開発には適用されているものの、大量生産には使われていないのが実情である。
【０１１８】
貧溶媒濃縮の問題を解決する手段が、超臨界二酸化炭素を用いたＨＰＬＣである超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）である。
【０１１９】
超臨界二酸化炭素は、二酸化炭素を高温高圧で超臨界流体にしたものであり、その他の物質もこのような超臨界流体にすることは可能であるが、比較的低い圧力と温度で超臨界状態を実現できることから、クロマトや抽出では専ら二酸化炭素が使われている。
【０１２０】
この超臨界二酸化炭素には、普通の流体や液体とは異なった特徴がある。それは、温度と圧力を変化させることで、溶解したいものの極性に合わせて、連続的に極性を変化させることができることである。
【０１２１】
例えば、魚の頭に含まれているドコサヘキサエン酸を選択抽出する際にも、この超臨界二酸化炭素が使われているし、接着剤を用いている特殊な衣類のクリーニングにも、皮脂は溶かして接着剤は溶かさない超臨界二酸化炭素が使われている。
【０１２２】
このように様々な極性を持たせることができる超臨界二酸化炭素であるが、比較的低い温度と圧力の領域で形成される超臨界二酸化炭素の極性は、シクロヘキサンやヘプタン程度である。現在市販されている超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）では、この程度の極性の超臨界二酸化炭素が、装置内で作られ、それが良溶媒と混合されてカラム内に入り、通常のＨＰＬＣと同様の機構で化合物の精製が行われる。
【０１２３】
超臨界二酸化炭素を用いたカラムクロマトグラフィーのシステムでは、カラムを通過した後に検出器に入るが、通常はその段階までは高温高圧状態が保たれ、二酸化炭素も超臨界流体として存在している。その後常温常圧で分取されるまでの間に二酸化炭素はガスとなり、分取時には自ら溶液から抜けていくために、貧溶媒の濃縮が不要となる。この時、参考文献（生物工学会誌８８巻、１０号、５２５〜５２８ページ、２０１０年）に記載の気液分離機構等を備えた二酸化炭素回収装置によって二酸化炭素を回収することが可能であり、再び超臨界流体としての利用も可能である。
【０１２４】
そのため、高純度の新規合成化合物を数多く合成する必要のある創薬の業界では、最近この超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）を積極的に活用するようになってきており、その影響で分析用、分取用ともに販売価格が下がり、かなり一般的に使われるようになってきた。
【０１２５】
〔４．２〕超臨界又は亜臨界クロマトグラフィー法
超臨界クロマトグラフィー法は超臨界流体を用いるばかりではなく、亜臨界流体を用いることもできる。超臨界又は亜臨界クロマトグラフィー法に用いるカラムとしては、充填カラム、オープンカラム、キャピラリカラムを用いることができる。
【０１２６】
〈クロマトグラフィー用カラム〉
本発明のクロマトグラフィー用カラムは、移動相に注入された試料中の目的の物質を分離することができる本発明の充填剤を有するカラムである。
【０１２７】
充填剤は、本発明の多孔性微粒子が用いられる。カラムに収容される一体型の充填剤に担持されている状態でカラムに収容されていてもよいし、充填剤からなる一体型の成形物としてカラムに収容されていてもよい。
【０１２８】
本発明のクロマトグラフィー用カラムでは、図４に示すように、例えば、有機溶媒（二酸化炭素を含む）を含有する超臨界流体１１、ポンプ１２、モディファイヤ１３、分離する有機化合物を注入するインジェクター１４、分離用のカラム１５、検出器１７、圧力調整弁１８等を備えた装置を用いることができる。
【０１２９】
カラム１５は、カラムオーブン１６内で温度調整される。充填剤としては本発明の多孔性微粒子が用いられる。
【０１３０】
本発明において、超臨界流体とは、超臨界状態にある物質のことである。
【０１３１】
ここで、超臨界状態について説明する。物質は、温度、圧力（又は体積）等の環境条件の変化により気体、液体及び固体の三つの状態の間を移り変わるが、これは分子間力と運動エネルギーとのバランスで決定される。横軸に温度を、縦軸に圧力をとって気液固三態の移り変わりを表したものを状態図（相図）というが、その中で気体、液体及び固体の三相が共存し、平衡にある点を三重点という。三重点より温度が高い場合は、液体とその蒸気が平衡になる。この時の圧力は飽和蒸気圧であり、蒸発曲線（蒸気圧線）で表される。この曲線で表される圧力よりも低い圧力では液体は全部気化し、またこれよりも高い圧力を加えれば蒸気は全部液化する。圧力を一定にして温度も変化させてもこの曲線を超えると液体が蒸気に、また蒸気が液体になる。この蒸発曲線には、高温、高圧側に終点があり、これを臨界点（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐｏｉｎｔ）と呼ぶ。臨界点は物質を特徴づける重要な点であり、液体と蒸気との区別がつかなくなる状態で、気液の境界面も消失する。
【０１３２】
臨界点より高温の状態では、気液共存状態を生じることなく液体と気体の間を移り変わることができる。
【０１３３】
臨界温度以上でかつ臨界圧力以上の状態にある流体を超臨界流体といい、超臨界流体を与える温度・圧力領域を超臨界領域という。また、臨界温度以上又は臨界圧力以上のいずれかを満たした状態を亜臨界（膨張液体）状態といい、亜臨界状態にある流体を亜臨界流体という。超臨界流体及び亜臨界流体は、高い運動エネルギーを有する高密度流体であり、溶質を溶解するという点では液体的な挙動を示し、密度の可変性という点では気体的な特徴を示す。超臨界流体の溶媒特性はいろいろあるが、低粘性で高拡散性であり固体材料への浸透性が優れていることが重要な特性である。
【０１３４】
超臨界状態は、例えば、二酸化炭素であれば、臨界温度（以下、Ｔｃともいう）３１℃、臨界圧力（以下、Ｐｃともいう）は７．３８×１０6Ｐａ、プロパン（Ｔｃ＝９６．７℃、Ｐｃ＝４３．４×１０5Ｐａ）、エチレン（Ｔｃ＝９．９℃、Ｐｃ＝５２．２×１０5Ｐａ）等、この領域以上では流体は拡散係数が大きくかつ粘性が小さくなり物質移動、濃度平衡への到達が速く、かつ液体のように密度が高いため、効率のよい分離が可能となる。しかも、例えば二酸化炭素のような常圧、常温で気体となる物質を用いることにより回収が迅速になる。また、液体溶媒を用いる精製法で不可避の微量の溶媒の残留に起因する種々の障害はない。
【０１３５】
超臨界流体又は亜臨界流体として用いられる溶媒としては、二酸化炭素、一酸化二窒素、アンモニア、水、メタノール、エタノール、２−プロパノール、エタン、プロパン、ブタン、ヘキサン、ペンタン等が好ましく用いられるが、この中でも二酸化炭素を好ましく用いることができる。
【０１３６】
超臨界流体又は亜臨界流体として用いる溶媒は１種類を単独で用いることも可能であるし、極性を調整するためのいわゆるモディファイヤ（エントレーナ）と呼ばれる物質を添加することも可能である。
【０１３７】
モディファイヤとしては、例えば、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素系溶媒、塩化メチル、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール系溶媒、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、アセトアルデヒドジエチルアセタール等のアセタール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等のカルボン酸系溶媒、アセトニトリル、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の窒素化合物系溶媒、二硫化炭素、ジメチルスルホキシド等の硫黄化合物系溶媒、さらに水、硝酸、硫酸等が挙げられる。
【０１３８】
超臨界流体又は亜臨界流体の使用温度は、基本的に、本発明に係る溶質として用いる有機化合物が溶解する温度以上であれば特に限定はないが、温度が低過ぎると超臨界流体状態、又は亜臨界流体状態の維持が困難となり、また温度が高過ぎるとその有機化合物が分解する場合があるため、使用温度は２０〜６００℃の範囲内とするのが好ましい。
【０１３９】
超臨界流体又は亜臨界流体の使用圧力は、基本的に用いる物質の臨界圧力以上であれば特に限定はないが、圧力が低過ぎると、本発明に係る溶質として用いる有機化合物の超臨界流体又は亜臨界流体への溶解性が乏しくなる場合があり、また圧力が高過ぎると製造装置の耐久性、操作時の安全性等の面で問題が生じる場合があるため、使用圧力は１〜１００ＭＰａの範囲内とするのが好ましい。
【０１４０】
超臨界流体又は亜臨界流体を使用する装置は、溶質として用いる有機化合物が超臨界流体又は亜臨界流体と接触して超臨界流体又は亜臨界流体へ溶解する機能を有する装置であればなんら限定されることはなく、例えば、超臨界流体又は亜臨界流体を閉鎖系で使用するバッチ方式、超臨界流体又は亜臨界流体を循環させて使用する流通方式、バッチ方式と流通方式とを組み合わせた複合方式等の使用が可能である。
【０１４１】
本発明に係る超臨界又は亜臨界クロマトグラフィー法においては、移動相に試料を注入した後に、目的物質のうち、カラムからの溶出が最も遅い目的物質のピークのテーリングが減衰し終わる以前に次の試料注入を行うことが好ましい。
【０１４２】
このとき、移動相に試料を注入した後に、当該移動相の組成を変化させてもよいし、組成を一定としてもよい。特に大量の分離対象化合物の分取操作を行う場合には、移動相の組成を変化させることもできる。
【０１４３】
移動相の組成を変化させる工程は、超臨界又は亜臨界流体と溶媒を含有する移動相の組成を変化させるものである。この工程により移動相の組成を変化させることで、ピークのテーリングの減衰を速めることができる。カラム吸着超臨界又は亜臨界流体クロマトグラフィーでは、特に比較的大量の分離対象化合物をロードする分取操作を行う場合には、ピークが顕著なテーリングを示す。このテーリングが減衰する前に次の試料を注入すると、テーリングしている成分が次に注入した試料のピーク成分に混入することとなり、分離した化合物の純度が低下し、不都合が生じる。そのため、テーリングの完全な減衰を待ってから次の試料の注入を行わなければならない。したがって、テーリングの減衰を速めることで次の試料注入のタイミングを速めることができることとなるが、本発明においては移動相の組成を変化させることで、ピーク成分のカラムからの押し出しを促進させ、テーリングの減衰を速めることができる。
【０１４４】
移動相中の組成を変化させることは、液体クロマトグラフィーでいうステップグラジエント法と同様の効果を生じさせ、ピーク成分のカラムからの押し出しを促進させることで、テーリングの減衰を速めている。
【０１４５】
超臨界又は亜臨界クロマトグラフィーは、高拡散性・低粘度の超臨界又は亜臨界流体を用いていることから、移動相の流速が大きく、カラムの平衡化も早い。そのため、移動相中の組成が一時的に変化しても、移動相中の組成を元に戻すとカラムは迅速に変化前の環境に復元することから、テーリングを減衰させた後直ちに次の試料を注入することができる。結果として、試料の時間当たりの処理量を増やすことができ、効率性・生産性が向上する。
【０１４６】
移動相の組成を変化させる工程は、超臨界又は亜臨界クロマトグラフィー装置で行うことができる限り、どのような手法によるものでもよい。例えば、移動相中の溶媒比率を増加させることで、移動相の組成の変化を生じさせることができるし、圧力やカラム温度を有意に変化させることでも、移動相中のＣＯ2密度が変化し、これらを含めて移動相の組成変化とする。
【０１４７】
移動相中には既に溶媒が含まれているが、移動相中に含ませる溶媒とは別途、カラムの上流で移動相生成装置の下流に溶媒注入装置を設け、移動相中の溶媒比率を増加させることができる。溶媒注入装置は、例えば注入する溶媒を保持するためのループ配管と流路切替弁、溶媒注入ポンプで構成される溶媒注入装置とすることができる。
【０１４８】
溶媒注入装置に用いるループ配管は、所定の容積を有する管である。ループ配管を有すると、試料の注入の定量性が向上し、またより多量の試料を注入することが可能となり好ましい。本発明において、ループ配管の容積は、超臨界又は亜臨界クロマトグラフィー装置で用いられるカラムの種類やカラムの内径、目的の物質の種類、移動相の組成等の条件に応じて異なるが、一度に多量の溶媒を注入する必要があるため、溶媒注入装置が有するループ配管は試料注入装置が有するループ配管よりも大型で、多量の溶媒を保持できるものが適する。
【０１４９】
溶媒注入装置に用いる流路切替弁は、移動相の流路に設けられる開閉自在な弁やコックであれば特に限定されない。例えば、二方弁やバタフライ弁を組み合わせて用いたり、三方弁を用いて移動相の流路の切り替えを行う弁が挙げられる。上記溶媒注入装置に用いる溶媒注入ポンプは、超臨界又は亜臨界クロマトグラフィー装置の試料注入などで用いられる高圧ポンプを用いることができる。
【０１５０】
溶媒注入装置を用いた場合、溶媒の注入は、流路切替弁を切り替え溶媒注入ポンプによりカラムの移動相に溶媒を送りこむことで行われる。溶媒の注入は、試料の注入容積以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは５倍以上の溶媒を瞬時に注入することが好ましい。上限値としては、試料の注入容積の３０倍以下、好ましくは２０倍以下、より好ましくは１５倍以下の溶媒を注入することが好ましい。このような溶媒注入量とすることで、ピークのテーリングの減衰がさらに速まることとなる。
【０１５１】
溶媒注入装置から注入される溶媒は特に限定されるものではなく、例えば、移動相中に含有される溶媒と同一の溶媒であってもよいし、異なる溶媒であってもよい。また、注入される溶媒は１種でもよいし、２種以上でもよい。
【０１５２】
特に、テーリングの減衰をさらに速める点で、極性の高い溶媒が好ましい。また、移動相中に含有される溶媒と比較して、より極性の高い溶媒を使用することが好ましい。
【０１５３】
前記移動相の組成を変化させる工程及び移動相の組成を変化前に戻す工程の両工程は、瞬時に行うことが好ましい。ここでいう瞬時とは、移動相の変化を生じさせるのに十分な時間であればよい。
【０１５４】
ピーク検出の方法は、特段限定はされるものではないが、通常超臨界又は亜臨界クロマトグラフィーが有する検出器、例えば紫外吸光分光計により検出されたピークによりタイミングを計ることができる。
【実施例】
【０１５５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」又は「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」又は「質量％」を表す。【０１５６】
実施例１
〈多孔性微粒子１−１の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、比表面積３５０ｍ2／ｇ、アミノプロピル基修飾度１．４４ｍｍｏｌ／ｇの球状シリカゲル（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅａｒ−ＮＨ2、登録商標、メルク社製）２ｇをガラス容器に入れ、そこに３−（カルバゾール−９−イル）安息香酸（２．８７ｇ，１０ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．１０ｇ、２０ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）を加えた。この混合液を超音波発生器に浸漬し、超音波をかけながら４時間反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子１−１を得た。【０１５７】
〈多孔性微粒子１−２の作製〉
以下、本発明の多孔性微粒子の作製を具体的に説明する。なお、超臨界流体中における多孔性微粒子と化学修飾剤との反応は、日本ウォーターズ社製ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＣ２（登録商標）を用いて行った。【０１５８】
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、アミノプロピル基修飾度１．４４ｍｍｏｌ／ｇの球状シリカゲル（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅａｒ−ＮＨ2、登録商標、メルク社製）２ｇを１１０℃で真空乾燥した後、乾燥容器をグローブボックス内に移動し、乾燥された窒素で容器をパージした。グローブボックス内でこのシリカゲルを反応槽に移してから装置に設置した後、この反応槽に３−（カルバゾール−９−イル）安息香酸（２．８７ｇ，１０ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．１０ｇ，２０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた混合液をモディファイヤとして用い、供給する二酸化炭素に対して３．０％（容量比）となるようにして、反応温度６０℃、流体圧力２５０ｋｇ／ｃｍ2、流速毎分０．１５ｍＬの条件で反応槽に８時間供給して反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子１−２を得た。【０１５９】
〈多孔性微粒子１−３の作製〉
真空乾燥後のパージを大気で行い、また、前記グローブボックス中での操作を全て大気中で行った以外は全く同じようにして比較例のクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子１−３を得た。【０１６０】
多孔性微粒子１−１〜１−３として得られたシリカゲルについて、減圧乾燥を行った後に、元素分析を行った結果を、下記表Ｉに示す。【０１６１】
なお、元素分析は、炭素・水素・窒素同時定量装置ＣＨＮコーダーＭＴ−６（ヤナコテクニカルサイエンス社製）を用いた。表中、炭素含有量値は相対値を表し、多孔性微粒子１−１を１．００とした。【０１６２】
【表１】
2019117063.tif 000015
【０１６３】
表Ｉより、本発明の手法が最も炭素含有率が高く、修飾基の導入率が高いことが分かった。【０１６４】
実施例２
実施例１の多孔性微粒子１−１〜１−３でそれぞれ得られた充填剤を、イソプロピルアルコールを用いたスラリー充填法で内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール製カラムに充填した。このカラムを用い、超臨界流体クロマトグラフィーによるサンプルの分析を行った。分析装置には日本ウォーターズ社製ＵＰＣ２を用いた。移動相として４０％酢酸エチルをモディファイヤに使用した超臨界流体二酸化炭素を、流速毎分２．５ｍＬ、カラム温度５０℃、流体圧力７０ｋｇ／ｃｍ2の条件で送液し、有機エレクトロルミネッセンス（有機ＥＬ）材料の発光層のドーパントとして利用されるＩｒ（ｐｉｑ）3（０．１０ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液を１μＬ注入することにより、クロマトグラムを得た。【０１６５】
保持係数、実施例３の分離係数α、実施例５及び実施例６の分離度Ｒは、下記式により求めた。【０１６６】
保持係数ｋ：溶媒ショックをホールドアップタイムｔ0、成分の保持時間をｔとして、下記の式に当てはめて算出した。【０１６７】
ｋ＝（ｔ−ｔ0）／ｔ0
分離係数α：成分Ａと成分Ｂについて、それぞれの保持係数をｋA、ｋBとしたとき、以下の式に当てはめて算出した。ただし、遅れて溶出してくる成分の保持係数をｋBとする（ｋA＜ｋB）。【０１６８】
α＝ｋB／ｋA
分離度Ｒ：成分Ａのピーク幅と保持時間をそれぞれＷA、ｔAとし、成分Ｂのピーク幅と保持時間をそれぞれＷB、ｔBとする時、分離度Ｒは以下のように表される。ただし、遅れて溶出してくる成分の保持時間をｔBとする（ｔA＜ｔB） 。【０１６９】
Ｒ＝（ｔB−ｔA）／（（ＷA＋ＷB）×０．５）
表Ｉ中、保持係数値は相対値を表し、多孔性微粒子１−１を１．００とした。【０１７０】
【化１４】
2019117063.tif 000016
【０１７１】
【表２】
2019117063.tif 000017
【０１７２】
表IIの１−１〜１−３の結果から、カルバゾールを修飾基として用いた充填剤について、乾燥ガスで置換したシリカゲルを用いて超臨界流体中で反応を行った本発明の充填剤が最も化合物をよく保持することが分かった。すなわち、修飾基の量が多く、保持に有利な充填剤であることが分かる。【０１７３】
実施例３
多孔性微粒子１−２と１−３を用いた充填剤を、イソプロピルアルコールを用いたスラリー充填法で内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール製カラムに充填した。移動相として、４０％%酢酸エチルをモディファイヤに使用した超臨界流体二酸化炭素を、流速毎分２．５ｍＬ、流体圧力７５ｋｇ／ｃｍ2の条件で送液し、有機ＥＬ材料の発光層のホストとして利用されるｍＣＰ：１，３−ビス（Ｎ−カルバゾリル）ベンゼン（０．９０ｍｇ／ｍＬ）と、発光層のドーパントとして利用されるＩｒ（ｐｉｑ）3（０．１０ｍｇ／ｍＬ）とを含む混合液体を１μＬ注入することにより、クロマトグラムを得た。また、温度については３５〜７５℃までの３条件で分析を実施した。【０１７４】
表中、分離係数α値は相対値を表し、カラム３−２を１．００とした。【０１７５】
【表３】
2019117063.tif 000018
【０１７６】
表IIIから、本発明の多孔性微粒子１−２を充填剤として用いたカラムでは、分析温度による影響を受けやすいことが分かった。超臨界流体となった二酸化炭素は温度が高くなるほど粘度や拡散係数が大きくなることが知られている。これに伴い、二酸化炭素の粘度や拡散係数が高くなることで物質の輸送性が細孔の深部まで及ぶ可能性が高くなると考えられる。多孔性微粒子１−２を用いた充填剤は細孔深部まで化学修飾されており、物質の輸送が細孔の深部まで及ぶ影響が顕著だが、多孔性微粒子１−３の充填剤は細孔深部の化学修飾が不十分なため、温度の影響を受けにくいものと推察される。【０１７７】
実施例４
〈多孔性微粒子４−１の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、アミノプロピル基修飾度１．４４ｍｍｏｌ／ｇの球状シリカゲル（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅａｒ−ＮＨ2、登録商標、メルク社製）２ｇを１１０℃で真空乾燥した後、乾燥容器をグローブボックス内に移動し、乾燥された窒素で容器をパージした。グローブボックス内でこのシリカゲルを反応槽に移してから装置に設置した後、この反応槽に安息香酸（１．２２ｇ，１０ｍｍｏｌ）とＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．１０ｇ，２０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた混合液をモディファイヤとして用い、供給する二酸化炭素に対して２．５％（容量比）となるようにして、反応温度６５℃、流体圧力２５０ｋｇ／ｃｍ2、流速毎分０．１５ｍＬの条件で反応槽に８時間供給して反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子４−１を得た。【０１７８】
〈多孔性微粒子４−２〜４−２０の作製〉
酢酸を表IVに対応するカルボン酸に種々変更した以外は、多孔性微粒子４−１と同様にして多孔性微粒子４−２〜４−２０を作製した。【０１７９】
表IV中、多孔性微粒子４−２〜４−２０の修飾基構造は下記の構造を有するものとする。式中＊は対応する修飾基構造との接続部を表し、波線は残りのリンカー部との接続部を表す。【０１８０】
【化１５】
2019117063.tif 000019
【０１８１】
多孔性微粒子４−１〜４−２０でそれぞれ得られた充填剤を、イソプロピルアルコールを用いたスラリー充填法で内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール製カラムに充填した。このカラムを用い、移動相として、４０％酢酸エチルをモディファイヤに使用した超臨界流体二酸化炭素を、流速毎分３．０ｍＬ、カラム温度５０℃、流体圧力７０ｋｇ／ｃｍ2の条件で送液し、ｍＣＰ（０．９０ｍｇ／ｍＬ）とＩｒ（ｐｉｑ）3（０．１０ｍｇ／ｍＬ）とを含む混合液体を１μＬ注入することにより、クロマトグラムを得た。得られた結果を表IVに示す。【０１８２】
ただし、表中の分離度Ｒは、
０．５未満は分離しておらず×、
０．５以上１．５未満を△、
１．５以上３．０未満を○、
３．０以上を◎として記載した。【０１８３】
【表４】
2019117063.tif 000020
【０１８４】
表IVから、本発明の多孔性微粒子４−１〜４−２０を充填剤として用いたカラムは、分離が良好であることから、充填剤は細孔深部まで化学修飾されているものと推察される。また、ヘテロ原子を含む修飾基の場合に、より好ましい結果が得られることが分かった。【０１８５】
実施例５
〈多孔性微粒子５−１の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、アミノプロピル基修飾度１．４４ｍｍｏｌ／ｇの球状シリカゲル（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅａｒ−ＮＨ2、登録商標、メルク社製）２ｇをガラス容器に入れ、そこに３−（２−フェニル）ピリジル安息香酸（修飾基構造ｃ−１８、２．７５ｇ、１０ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．１０ｇ、２０ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）を加えた。この混合液を超音波発生器に浸漬し、超音波をかけながら４時間反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子５−１を得た。【０１８６】
〈多孔性微粒子５−２の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、アミノプロピル基修飾度１．４４ｍｍｏｌ／ｇの球状シリカゲル（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅａｒ−ＮＨ2、登録商標、メルク社製）２ｇを１１０℃で真空乾燥した後、乾燥容器をグローブボックス内に移動し、乾燥された窒素で容器をパージした。グローブボックス内でこのシリカゲルを反応槽に移してから装置に設置した後、この反応槽に３−（２−フェニル）ピリジル安息香酸（修飾基構造ｃ−１８、２．７５ｇ、１０ｍｍｏｌ）とＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．１０ｇ、２０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた混合液をモディファイヤとして用い、供給する二酸化炭素に対して２．０％（容量比）となるようにして、反応温度６０℃、流体圧力２００ｋｇ／ｃｍ2、流速毎分０．２０ｍＬの条件で反応槽に８時間供給して反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子５−２を得た。【０１８７】
〈多孔性微粒子５−３〜５−１５の作製〉
修飾基構造ｃ−１８を、表Ｖに対応するカルボン酸に種々変更した以外は多孔性微粒子５−１と同様にして多孔性微粒子５−２〜５−１５を作製した。【０１８８】
多孔性微粒子５−１〜５−１５でそれぞれ得られた充填剤を、イソプロピルアルコールを用いたスラリー充填法で内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール製カラムに充填した。このカラムを用い、移動相として、４０％酢酸エチルをモディファイヤに使用した超臨界流体二酸化炭素を、流速毎分３．０ｍＬ、カラム温度５０℃、流体圧力７０ｋｇ／ｃｍ2の条件で送液し、ｍＣＰ（９．００ｍｇ／ｍＬ）とＩｒ（ｐｉｑ）3（１．００ｍｇ／ｍＬ）とを含む混合液体を１μＬ注入することにより、クロマトグラムを得た。得られた結果を表Ｖに示す。【０１８９】
ただし、分離度Ｒは、
０．５未満は分離しておらず×、
０．５以上１．５未満を△、
１．５以上３．０未満を○、
３．０以上を◎として記載した。【０１９０】
【表５】
2019117063.tif 000021
【０１９１】
表Ｖの結果から本発明の充填剤を用いた場合は、大量のサンプルを注入した場合でも良好な分離が得られることが分かった。【０１９２】
実施例６
〈多孔性微粒子６−１の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、アミノプロピル基修飾度１．４４ｍｍｏｌ／ｇの球状シリカゲル（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅａｒ−ＮＨ2、Ｍｅｒｃｋ製）２ｇをガラス容器に入れ、そこに３−（９−フェニルカルバゾール−３−イル）安息香酸（３．６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）とＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．１０ｇ、２０ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）を加えた。この混合液を超音波発生器に浸漬し、超音波をかけながら４時間反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子６−１を得た。【０１９３】
〈多孔性微粒子６−２の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、アミノプロピル基修飾度１．４４ｍｍｏｌ／ｇの球状シリカゲル（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅａｒ−ＮＨ2、登録商標、メルク社製）２ｇを１１０℃で真空乾燥した後、乾燥容器をグローブボックス内に移動し、乾燥された窒素で容器をパージした。グローブボックス内でこのシリカゲルを反応槽に移してから装置に設置した後、この反応槽に３−（９−フェニルカルバゾール−３−イル）安息香酸（３．６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）とＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３．１０ｇ、２０ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた混合液をモディファイヤとして用い、供給する二酸化炭素に対して２．０％（容量比）となるようにして、反応温度６０℃、流体圧力２５０ｋｇ／ｃｍ2、流速毎分０．２０ｍＬの条件で反応槽に８時間供給して反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子６−２を得た。【０１９４】
多孔性微粒子６−１及び６−２でそれぞれ得られた充填剤を、イソプロピルアルコールを用いたスラリー充填法で内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール製カラムに充填した。このカラムを用い、移動相として、４０％酢酸エチルをモディファイヤに使用した超臨界流体二酸化炭素を、流速毎分３．０ｍＬ、カラム温度５０℃、流体圧力７０ｋｇ／ｃｍ2の条件で送液し、Ｉｒ（ｐｉｑ）3（０．１０ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液を１μＬ注入することにより、クロマトグラムを得た。また、これらのカラムを、ヘキサン：イソプロパノール＝９５：５（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を移動相として用いたＨＰＬＣに適用し、同様の分析を行った。それぞれの分析から得られた保持係数の相対値を表VIに示す。表中、保持係数値は、カラム６−１／ＨＰＬＣを相対値１．００とした。【０１９５】
【表６】
2019117063.tif 000022
【０１９６】
表VIより、各カラムについてＨＰＬＣ適用時とＳＦＣ適用時の保持係数を比較した場合、本発明の多孔性粒子を含む充填剤を用いたカラムの方が、ＳＦＣ適用時の保持係数の向上が著しいことが分かった。超臨界流体となった二酸化炭素は、液体に比べて粘度が低く、拡散係数も高いことが知られており、物質の輸送性が細孔の深部まで及ぶ可能性が高くなると考えられる。カラム（６−２）の充填剤は細孔深部まで修飾されており、物質の輸送が細孔の深部まで及ぶ影響が顕著だが、カラム（６−１）の充填剤は細孔深部の修飾が不十分なため、移動相が超臨界流体であることの特長が性能に反映されていないものと推察される。【０１９７】
実施例７
〈多孔性微粒子７−１の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍ、比表面積４５０ｍ2／ｇの球状シリカゲル（ダイソーゲルＳＰ−１００−５−Ｐ、ダイソー社製）２．０ｇをガラス容器に入れ、そこに９−（３−（７−クロロジメチルシリルヘプチル）フェニル）カルバゾール（４．３４ｇ、１０ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．１９ｇ、１５ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）を加えた。この混合液を超音波発生器に浸漬し、超音波をかけながら６時間反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子７−１を得た。【０１９８】
〈多孔性微粒子７−２の作製〉
細孔径約１００Å、平均粒子径約５μｍの球状シリカゲル（ダイソーゲルＳＰ−１００−５−Ｐ、ダイソー社製）２．０ｇを１１０℃で真空乾燥した後、乾燥容器をグローブボックス内に移動し、乾燥された窒素で容器をパージした。グローブボックス内でこのシリカゲルを反応槽に移してから装置に設置した後、この反応槽に９−（３−（７−クロロジメチルシリルヘプチル）フェニル）カルバゾール（４．３４ｇ、１０ｍｍｏｌ）、ピリジン（１．１９ｇ、１５ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのテトラヒドロフランに溶解させた混合液をモディファイヤとして用い、供給する二酸化炭素に対して２．０％（容量比）となるようにして、反応温度６０℃、流体圧力２５０ｋｇ／ｃｍ2、流速毎分０．２０ｍＬの条件で反応槽に６時間供給して反応を行った。このシリカゲルを、ガラスフィルター（Ｇ４）を用いて濾過し、テトラヒドロフラン３００ｍＬ、メタノール３００ｍＬ、アセトン３００ｍＬで順次洗浄濾過した。さらに、得られたシリカゲルを減圧乾燥し、化学修飾されたクロマトグラフィー用充填剤である多孔性微粒子７−２を得た。【０１９９】
〈多孔性微粒子７−３の作製〉
真空乾燥後のパージを大気で行い、また、グローブボックス中での操作をすべて大気中で行った以外は全く同じようにして比較例の充填剤７−３を得た。【０２００】
多孔性微粒子７−１〜７−３で得られたシリカゲルについて、減圧乾燥を行った後に、元素分析を行った結果を表VIIに示す。【０２０１】
【表７】
2019117063.tif 000023
【０２０２】
表VIIより、本発明の手法は、多孔性微粒子１−１〜１−３の合成法とは異なり、アミ
ド縮合を伴わない合成方法に対して適用しても、最も炭素含有率が高く、修飾基の導入率が高いことが分かった。【０２０３】
実施例８
多孔性微粒子７−１〜７−３でそれぞれ得られた充填剤を、イソプロピルアルコールを用いたスラリー充填法で内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール製カラムに充填した。このカラムを用い、移動相として、４０%酢酸エチルをモディファイヤに使用
した超臨界流体二酸化炭素を、流速毎分２．５ｍＬ、カラム温度５０℃、流体圧力７０ｋｇ／ｃｍ2の条件で送液し、Ｉｒ（ｐｉｑ）3（０．１０ｍｇ／ｍＬ）とを含む混合液体を１μＬ注入することにより、クロマトグラムを得た。それぞれの分析から得られた保持係数の相対値を表VIIIに示す。【０２０４】
【表８】
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【０２０５】
表VIIIのカラム７−１〜７−３の結果から、カルバゾールを修飾基として用いた充填剤について、乾燥ガスで置換したシリカゲルを用いて超臨界流体中で反応を行った本発明の充填剤が最も化合物をよく保持することが分かった。すなわち、修飾基の量が多く、保持に有利な充填剤であることが分かる。【０２０６】
また、本発明の手法は、多孔性微粒子１−１〜１−３の合成法とは異なり、アミド縮合を伴わない合成法に対して適用しても有効であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２０７】
本発明の多孔性微粒子は、優れた分離特性を与え、また保持容量が増加しているので、クロマトグラフィー用充填剤及びクロマトグラフィー用カラムに好適に利用される。
【符号の説明】
【０２０８】
１１  超臨界流体
１２  ポンプ
１３  モディファイヤ
１４  インジェクター
１５  分離用のカラム
１６  カラムオーブン
１７  検出器
１８  圧力調整弁
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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