(57)【要約】  ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システム。
2018220929.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、
ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、
前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システム。
【請求項２】
前記ターミネーターが２個連結されている、請求項１に記載の発現システム。
【請求項３】
前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、請求項１又は２に記載の発現システム。
【請求項４】
遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に備える、請求項１〜３のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項５】
前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、請求項４に記載の発現システム。
【請求項６】
前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、単一のベクターに含まれている、請求項４又は５に記載の発現システム。
【請求項７】
Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ−ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、請求項６に記載の発現システム。
【請求項８】
前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項９】
目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現システムを導入する工程を備える、製造方法。
【請求項１０】
ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された発現カセットとを含む第１の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクター。
【請求項１１】
前記ターミネーターが２個連結されている、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、請求項１０又は１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片を更に含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に含む、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ−ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現システム及びその使用に関する。より具体的には、発現システム、目的タンパク質の製造方法及び発現ベクターに関する。本願は、２０１７年５月３１日に、日本に出願された特願２０１７−１０７９６５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の製造や、植物におけるタンパク質の局在の解析を目的として、トランスジェニック植物が用いられる場合がある。しかしながら、トランスジェニック植物を作出するためには長期間を要する。また、トランスジェニック植物によるタンパク質の発現量は比較的低い傾向にある。【０００３】
一方、ウイルスベースのベクターを用いた一過性の発現システムでは、短時間に組換えタンパク質の高い発現を得ることができる場合がある。例えば、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムと呼ばれる発現システムは、タバコモザイクウイルスをベースとしたウイルスシステムであり、タバコの葉における組換えタンパク質の高レベルの蓄積を達成するために開発されたものである（例えば非特許文献１を参照。）。【０００４】
また、ジェミニウイルスは、一本鎖の環状ＤＮＡゲノムを有しており、ローリングサークル型ＤＮＡ複製機構によりそのゲノムを非常に高いコピー数で複製することが知られている。この機構は、トランスジェニック植物におけるタンパク質の発現を増加させたり、一過性の発現システムにおける組換えタンパク質の発現量を増加させるために利用されてきた（例えば非特許文献２を参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Marillonnet S., et al., Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants., Nat. Biotechnol., 23 (6), 718-723, 2005.
【非特許文献２】Moon K. B., et al., Overexpression and self-assembly of virus-like particles in Nicotiana benthamiana by a single-vector DNA replicon system., Appl. Microbiol. Biotechnol., 98 (19), 8281-8290, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１に記載されたシステムは、宿主がタバコ属の植物に限られており、他の植物に適用することが困難な場合がある。一方、非特許文献２に記載されたシステムは、タンパク質の発現量が十分でない場合がある。そこで、本発明は、タバコ属以外の植物にも適用することができ、タンパク質の発現量が高い発現システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システム。
［２］前記ターミネーターが２個連結されている、請求項１に記載の発現システム。
［３］前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、請求項１又は２に記載の発現システム。
［４］遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に備える、［１］〜［３］のいずれかに記載の発現システム。
［５］前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、［４］に記載の発現システム。
［６］前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、単一のベクターに含まれている、［４］又は［５］に記載の発現システム。
［７］Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ−ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、［６］に記載の発現システム。
［８］前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、［１］〜［７］のいずれかに記載の発現システム。
［９］目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に［１］〜［８］のいずれかに記載の発現システムを導入する工程を備える、製造方法。
［１０］ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された発現カセットとを含む第１の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクター。
［１１］前記ターミネーターが２個連結されている、［１０］に記載の発現ベクター。
［１２］前記ターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターである、［１０］又は［１１］に記載の発現ベクター。
［１３］ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片を更に含む、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１４］遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に含む、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の発現ベクター。
［１５］前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、［１４］に記載の発現ベクター。
［１６］Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ−ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、［１０］〜［１５］のいずれか一項に記載の発現ベクター。
［１７］前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、［１０］〜［１６］のいずれかに記載の発現ベクター。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、タバコ属以外の植物にも適用することができ、タンパク質の発現量が高い発現システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】（ａ）アグロインフィルトレーションを行うにあたり、約１．２Ｌのアグロバクテリウム懸濁液を２Ｌのグラスビーカーに入れ、バキュームデシケーター内に設置した状態を示す写真である。（ｂ）レタスをアグロバクテリウム懸濁液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力に設定した状態を示す写真である。（ｃ）アグロインフィルトレーション後のレタスをボウルに入れた状態を示す写真である。（ｄ）アグロインフィルトレーション後のレタスをインキュベートしている状態を示す写真である。
【図２】（ａ）はｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｂ）はｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｃ）はｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｄ）はｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｅ）はｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｆ）はｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｇ）はｐＢＹＲ２Ｔ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｈ）はｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。（ｉ）はｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。
【図３】（ａ）〜（ｉ）は、実験例１において、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。
【図４】（ａ）は、実験例２において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。
【図５】（ａ）は、実験例２において、レタスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。
【図６】（ａ）は、実験例２において、ナスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。
【図７】（ａ）は、実験例２において、トマトの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。（ｂ）はトウガラシの葉及びバラの花弁から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。
【図８】（ａ）〜（ｅ）は、実験例３において、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。
【図９】（ａ）は、実験例４において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。
【図１０】（ａ）は、実験例５において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。
【図１１】ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターの構造を示す模式図である。
【図１２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例６において、発現したＥＧＦＰ又はＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。
【図１３】（ａ）は、実験例６において、ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）におけるＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［発現システム］
１実施形態において、本発明は、ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現システムを提供する。
【００１１】
本実施形態の発現システムが植物に導入されると、第２の核酸断片から、ジェミニウイルスの複製開始タンパク質であるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質が発現される。すると、ジェミニウイルスのローリングサークル型ＤＮＡ複製機構により、第１の核酸断片上のＬＩＲとＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットが高いコピー数で複製される。続いて、高いコピー数で複製された目的タンパク質の発現カセットから、高い発現量で目的タンパク質が発現される。
【００１２】
実施例において後述するように、本実施形態の発現システムは、目的タンパク質の発現カセットが、２個以上連結されたターミネーターを含んでいることにより、非常に高い目的タンパク質の発現量を達成することができる。
【００１３】
ターミネーターとは、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を終結する塩基配列である。ターミネーターとしては、特に限定されないが、例えば、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーター、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーター、ＣａＭＶのＮＯＳターミネーター等が挙げられる。本実施形態の発現システムにおいて、２個以上連結されたターミネーターは、それぞれ同じ塩基配列のターミネーターであってもよいし、異なる塩基配列のターミネーターであってもよい。
【００１４】
配列番号１９にシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターの塩基配列を示す。また、配列番号２０にタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターの塩基配列を示す。また、配列番号２１にＣａＭＶの３５Ｓターミネーターの塩基配列を示す。また、配列番号２２にＣａＭＶのＮＯＳターミネーターの塩基配列を示す。
【００１５】
これらのターミネーターの塩基配列は、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を終結させる機能を有する限り、それぞれ、配列番号１９〜２２の塩基配列に対して変異を有していてもよく、配列番号１９〜２２の塩基配列の一部を欠失していてもよい。
【００１６】
ターミネーターの塩基配列が、それぞれ配列番号１９〜２２の塩基配列に対して変異や欠失を有している場合、各塩基配列は、それぞれ、配列番号１９〜２２の塩基配列に対して、例えば７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することが更に好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。
【００１７】
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００  （１）
【００１８】
本実施形態の発現システムは、目的タンパク質の発現カセットが、２個のターミネーターを含んでいることが好ましい。実施例において後述するように、目的タンパク質の発現カセットが３個以上のターミネーターを含んでいる場合よりも、２個のターミネーターを含んでいる場合のほうが、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
【００１９】
また、本実施形態の発現システムにおいて、目的タンパク質の発現カセットが含むターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターであることが好ましい。
【００２０】
実施例において後述するように、ターミネーターとしてシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターを含む発現システムは、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
【００２１】
実施例において後述するように、本実施形態の発現システムにより、植物体１ｇ新鮮重量あたり３ｍｇ程度以上の目的タンパク質を発現させることができる。この発現量は、現在商用で用いられているｍａｇｎＩＣＯＮシステムと同等である。
【００２２】
また、実施例において後述するように、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムは宿主がタバコ属の植物に限られているのに対し、本実施形態の発現システムは、タバコ属の植物だけでなく、タバコ属以外の植物においても目的タンパク質の高い発現量を達成することができる。ここで、タバコ属以外の植物としては、例えば、トマト、ナス、トウガラシ等のナス科植物、レタス等のキク科植物、メロン等のウリ科植物、コチョウラン等のラン科植物等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
本実施形態の発現システムにおいて、第１の核酸断片は、プロモーターと、目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む。
【００２４】
プロモーターとしては、宿主の植物細胞中でその下流に連結されたＤＮＡの転写活性を示すものであれば特に制限されず用いることができる。具体的には、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ユビキチンプロモーター、キャッサバベインモザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター等が挙げられる。
【００２５】
目的タンパク質としては、特に制限されず、任意のタンパク質を発現することができる。本実施形態の発現システムによれば、動物細胞を用いたタンパク質発現と比較して低コストでタンパク質を発現させることができる。また、本実施形態の発現システムは、大腸菌等の発現系で発現させることが難しい花粉アレルゲン等の発現に利用することができる。このため、目的タンパク質は、例えば花粉アレルゲン等であってもよい。
【００２６】
ターミネーターは、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関与する塩基配列からなる。ターミネーターとしては、１種のターミネーターを２個以上連結して用いてもよいし、２種以上のターミネーターを組み合わせて用いてもよい。実施例において後述するように、本実施形態の発現システムは、２個以上連結されたターミネーターを有することにより、目的タンパク質の高い発現量を達成することができる。
【００２７】
また、ターミネーターのうち少なくとも１つがシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターであると、目的タンパク質の発現量を更に増加させることができる傾向にある。
【００２８】
第１の核酸断片は、プロモーター、目的タンパク質をコードする核酸断片、ターミネーターのほかにも、例えば５’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ（ＵＴＲ）、ポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。
【００２９】
５’−ＵＴＲを有することにより、目的タンパク質の発現効率がさらに上昇する場合がある。５’−ＵＴＲとしては、例えばタバコモザイクウイルスの５’−ＵＴＲ、シロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲ、シロイヌナズナ伸長因子１α−Ａ３遺伝子の５’−ＵＴＲ、イネアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲ等が挙げられる。
【００３０】
本実施形態の発現システムにおいて、第２の核酸断片は、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む。Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットは、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質を宿主植物細胞内で発現することができる限り特に制限されず、プロモーター、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする核酸断片、ターミネーター、５’−ＵＴＲ、ポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。ここで、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質のプロモーターとしては、第１の核酸断片に用いることができるものとして上述したもののほか、例えばジェミニウイルス由来のＬＩＲにもプロモーター活性があるためこれを利用してもよい。
【００３１】
本明細書において、「発現システム」とは、第１の核酸断片及び第２の核酸断片を組み合わせて植物細胞に導入することにより、目的タンパク質を発現させることができる系のことを意味する。発現システムは、本発明の効果が得られる限り、１個の核酸断片により構成されていてもよいし、２個以上の核酸断片の組み合わせにより構成されていてもよい。ここで、核酸断片はベクターであってもよい。
【００３２】
すなわち、本実施形態の発現システムにおいて、第１の核酸断片及び第２の核酸断片は、それぞれ独立した核酸断片として別個に存在していてもよいし、連結して１本の核酸断片を構成していてもよい。
【００３３】
また、第１の核酸断片及び第２の核酸断片が連結している場合、その連結の順序は特に限定されず、５’側に第１の核酸断片が存在していてもよいし、５’側に第２の核酸断片が存在していてもよい。
【００３４】
本実施形態の発現システムにおいて、ＬＩＲ、ＳＩＲ、Ｒｅｐ／ＲｅｐＡは、ジェミニウイルス由来のものを用いる。ジェミニウイルスとしては、ローリングサークル型ＤＮＡ複製機構を有するものであれば特に限定されず、例えば、ジェミニウイルス科マストレウイルス属のインゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）、トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）、アフリカキャッサバモザイクウイルス（ＡＣＭＶ）、バラ葉巻ウイルス（ＲＬＣＶ）等が挙げられる。
【００３５】
配列番号２３にジェミニウイルス由来のＬＩＲの塩基配列を示す。また、配列番号２４にジェミニウイルス由来のＳＩＲの塩基配列を示す。また、配列番号２５にジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質（ＢｅＹＤＶの複製開始タンパク質であるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームＣ１及びＣ２）の塩基配列を示す。
【００３６】
ＬＩＲの塩基配列、ＳＩＲの塩基配列及びＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする塩基配列は、前記塩基配列にコードされるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質により、ＬＩＲとＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットが高いコピー数で複製される機能を有する限り、それぞれ、配列番号２３、２４、２５の塩基配列に対して変異を有していてもよく、配列番号２３、２４、２５の塩基配列の一部を欠失していてもよい。
【００３７】
ＬＩＲの塩基配列、ＳＩＲの塩基配列及びＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードする塩基配列が、それぞれ配列番号２３、２４、２５の塩基配列に対して変異や欠失を有している場合、各塩基配列は、それぞれ、配列番号２３、２４、２５の塩基配列に対して、例えば７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することが更に好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。
【００３８】
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば、上述した式（１）にしたがって求めることができる。
【００３９】
本実施形態の発現システムは、遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に備えていてもよい。これにより、目的タンパク質の発現量を更に増加させることができる。遺伝子サイレンシング阻害因子としては、例えば、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９、タバコラットルウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子１６Ｋ等が挙げられる。
【００４０】
第３の核酸断片は、上述した第１の核酸断片、第２の核酸断片とは独立した核酸断片として別個に存在していてもよいし、第１の核酸断片又は第２の核酸断片と任意の順序で連結していてもよいし、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が任意の順序で連結していてもよい。すなわち、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、単一のベクターに含まれていてもよい。
【００４１】
本実施形態の発現システムにおいて、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が単一のベクターに含まれており、当該ベクターはＴ−ＤＮＡのＲＢ及びＬＢを更に備えており、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が、Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとの間に存在していてもよい。
【００４２】
Ｔ−ＤＮＡとは、双子葉植物の腫瘍であるクラウンゴールの病原細菌であるアグロバクテリウムの病原性株に見出されるＴｉプラスミドやＲｉプラスミドが有する特定領域である。Ｔ−ＤＮＡを有するアグロバクテリウムを植物細胞と共存させると、ＲＢとＬＢとの間に存在する核酸断片を宿主植物細胞内に移行させる。
【００４３】
したがって、ＲＢとＬＢとの間に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が存在するベクターをアグロバクテリウムに導入し、当該アグロバクテリウムを宿主植物に導入することにより、宿主植物細胞内に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片を容易に導入することができる。
【００４４】
ＲＢとＬＢとの間に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が存在するベクターは、バイナリーベクター法に用いることができるベクターであることが好ましい。
【００４５】
バイナリーベクター法とは、Ｔｉプラスミドの本来のＴ−ＤＮＡを除去したｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドと、人工のＴ−ＤＮＡを有する小型のシャトルベクターを利用する植物への遺伝子導入法である。ここで、シャトルベクターは大腸菌とアグロバクテリウムの双方で維持できるものが好ましい。
【００４６】
ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドは、本来のＴ−ＤＮＡを有しないため、植物にクラウンゴールを形成することができない。しかしながら、ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡを宿主植物細胞内に導入するために必要なｖｉｒ領域を有している。
【００４７】
このため、ｖｉｒヘルパーＴｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに、所望の核酸断片を有するＴ−ＤＮＡを導入し、当該アグロバクテリウムを宿主植物に導入することにより、所望の核酸断片を容易に宿主植物細胞内に導入することができる。
【００４８】
すなわち、ＲＢとＬＢとの間に第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が存在するベクターは、大腸菌用の複製起点と、アグロバクテリウム用の複製起点を有しており、大腸菌とアグロバクテリウムの双方で維持することができるシャトルベクターであってもよい。
【００４９】
配列番号２６にＴ−ＤＮＡのＲＢの塩基配列を示す。また、配列番号２７にＴ−ＤＮＡのＬＢの塩基配列を示す。
【００５０】
ＲＢ及びＬＢの塩基配列は、ＲＢとＬＢとの間に存在する核酸断片を宿主植物細胞内に移行させる機能を有する限り、それぞれ、配列番号２６及び２７の塩基配列に対して変異を有していてもよく、配列番号２６及び２７の塩基配列の一部を欠失していてもよい。
【００５１】
ＲＢ及びＬＢの塩基配列が、それぞれ配列番号２６及び２７の塩基配列に対して変異や欠失を有している場合、各塩基配列は、それぞれ、配列番号２６及び２７の塩基配列に対して、例えば７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、８０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９０％以上の配列同一性を有することが更に好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが特に好ましい。
【００５２】
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば、上述した式（１）にしたがって求めることができる。
【００５３】
［発現ベクター］
１実施形態において、本発明は、ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された発現カセットとを含む第１の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、２個以上連結されたターミネーターとをこの順に含む、発現ベクターを提供する。
【００５４】
本実施形態の発現ベクターは、上述した発現システムの作製に好適に用いることができる。実施例において後述するように、本実施形態の発現ベクターは、発現カセットのマルチクローニングサイトに目的タンパク質をコードする遺伝子断片を導入することにより、非常に高い目的タンパク質の発現量を達成することができる。これは、発現カセットが２個以上連結されたターミネーターを含んでいることによる。
【００５５】
本実施形態の発現ベクターは、発現カセットが、２個のターミネーターを含んでいることが好ましい。実施例において後述するように、発現カセットが３個以上のターミネーターを含んでいる場合よりも、２個のターミネーターを含んでいる場合のほうが、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
【００５６】
また、本実施形態の発現ベクターにおいて、発現カセットが含むターミネーターの少なくとも１つが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターであることが好ましい。
【００５７】
実施例において後述するように、ターミネーターとしてシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターを含む発現ベクターは、目的タンパク質の発現量が高い傾向にある。
【００５８】
本実施形態の発現ベクターにおいて、ＬＩＲ、ＳＩＲ、プロモーター、ターミネーターについては上述したものと同様である。すなわち、本実施形態の発現ベクターにおいて、ジェミニウイルスは、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）であってもよい。
【００５９】
本明細書において、マルチクローニングサイトとは、制限酵素に認識される１種又は複数の塩基配列が並んだ領域である。すなわち、本実施形態の発現ベクターのマルチクローニングサイトにおいて、制限酵素部位は１個であってもよいし、複数であってもよい。本実施形態のベクターは、マルチクローニングサイトを有することから、目的タンパク質をコードする核酸断片を容易にクローニングすることができる。
【００６０】
本実施形態の発現ベクターは、目的タンパク質をコードする核酸断片を含んでいなくてもよいし、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入されていてもよい。すなわち、目的タンパク質をコードする核酸断片が導入されたベクターも本実施形態の発現ベクターに含まれる。
【００６１】
本実施形態のベクターは、ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片を更に含んでいてもよい。Ｒｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質については上述したものと同様である。
【００６２】
本実施形態のベクターは、遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に含んでいてもよい。遺伝子サイレンシング阻害因子については、上述したものと同様であり、例えば、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９であってもよい。
【００６３】
本実施形態のベクターは、Ｔ−ＤＮＡのＲＢ及びＬＢを更に備えており、第１の核酸断片、第２の核酸断片及び第３の核酸断片が、Ｔ−ＤＮＡのＲＢとＬＢとの間に存在していてもよい。ＲＢとＬＢは上述したものと同様である。また、本実施形態のベクターは、バイナリーベクター法に用いることができるベクターであることが好ましい。
【００６４】
［目的タンパク質の製造方法］
１実施形態において、本発明は、目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に上述した発現システムを導入する工程を備える、製造方法を提供する。ここで、発現システムは、上述したベクターのマルチクローニングサイトに目的タンパク質をコードする遺伝子断片が導入されたものであってもよい。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、タバコ属植物及びタバコ属以外の植物を宿主として、高い発現量で目的タンパク質を製造することができる。
【実施例】
【００６５】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６６】
［材料及び方法］
（レタスにおける一過性発現）
まず、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株を、抗生物質（１００ｍｇ／Ｌカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、３０ｍｇ／Ｌリファンピシン）を添加したＹＥＢ培地（６ｇ／Ｌイーストエキストラクト、５ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌスクロース、２ｍＭ硫酸マグネシウム）中、２８℃で２日間培養した。【００６７】
続いて、２日間培養した培養物を上記と同じ培地で１００倍希釈し、ＭＥＳを終濃度１０ｍＭとなるように添加してｐＨを５．６に調製し、更にアセトシリンゴンを終濃度２０μＭとなるように添加して、１４０ｒｐｍに設定したロータリーシェーカーを用いて２８℃で１８〜２４時間培養してスケールアップした。【００６８】
続いて、ＯＤ５９５が約２．４に達した後、スクロースを終濃度５５ｇ／Ｌとなるように添加し、更にアセトシリンゴンを終濃度２００μＭとなるように添加し、２２℃で１時間インキュベートした。【００６９】
その後、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸を終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、更にＴｗｅｅｎ−２０を終濃度０．００５％となるように添加し、バキュームインフィルトレーションに用いた。【００７０】
続いて、市販のレッドリーフレタスを蒸留水で洗浄し、ペーパータオルで水を除去した。続いて、洗浄したレタスの基部を湿ったペーパータオルに乗せた。続いて、レタスをプラスチックラップで覆い、２４度で１日静置した。続いて、バキュームインフィルトレーションの前に、レタスに青色ＬＥＤライトを３０分間以上照射した。【００７１】
続いて、図１（ａ）に示すように、約１．２Ｌのアグロバクテリウム懸濁液を２Ｌのグラスビーカーに入れ、バキュームデシケーター内に設置した。続いて、図１（ｂ）に示すように、レタスをアグロバクテリウム懸濁液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力に設定して２０分間静置した。続いて、圧力を大気圧に戻し、レタスを水で洗浄した。【００７２】
続いて、ペーパータオルで水を除去した。続いて、洗浄したレタスの基部を湿ったペーパータオルで覆い、図１（ｃ）に示すようにレタスをボウルに入れた。続いて、図１（ｄ）に示すように、レタスをプラスチックラップで不完全に覆い、穴が開いた状態にした。レタスは、２４℃で１６時間明期及び８時間暗期の条件下で３〜５日間静置した。【００７３】
（ベンサミアナタバコ、トマト、ナス、トウガラシ、メロン、バラ及びコチョウランにおける一過性発現）
まず、バイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株を、１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、２０μＭアセトシリンゴン、１００ｍｇ／Ｌカナマイシン、３０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、３０ｍｇ／Ｌリファンピシンを添加したＬ−ブロス培地中、２８℃で静止期まで培養した。【００７４】
続いて、培養物を遠心分離してアグロバクテリウム・ツメファシエンスを回収した後、インフィルトレーションバッファー（１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）、１００μＭアセトシリンゴン）を用いてＯＤ６００が約１となるように懸濁した。続いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンスをこの液体中に２〜３時間放置した。【００７５】
その後、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの懸濁液を、ニードルを付けていない１ｍＬのシリンジを用いて４週齢のベンサミアナタバコの葉の裏側にインフィルトレーションした。あるいは、場合により、ベンサミアナタバコをアグロバクテリウム懸濁液に浸し、７３６ｍｍＨｇの圧力下で２０分間静置した後、圧力を大気圧に戻すことによりインフィルトレーションした。また、同じ懸濁液を、４週齢のトマトの葉、４週齢のナスの葉、４週齢のトウガラシの葉、３週齢のメロンの葉、市販のバラの花弁、市販のコチョウランの花弁に同様にインフィルトレーションした。また、同じ懸濁液を、ニードルを付けた１ｍＬのシリンジを用いてトマトの果実にインフィルトレーションした。【００７６】
（ベクターの作製）
《ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ａ）はｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクター（米国アリゾナ州立大学Ｍａｓｏｎ博士より分与された。）のＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。既知のベクターであるｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、インゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）由来の複製システムを有している。また、ｐＢＹＲ２ｆｐベクターは、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９の発現カセットを有している。【００７７】
まず、プライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰ−Ｆ、配列番号１）及びプライマー（ＥＧＦＰ−ｐＢＹＲ２ｆｐ−Ｒ、配列番号２）を用いてｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ｆｐベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターを作製した。【００７８】
《ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｂ）はｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。ｐＢＹＲ２ｆｐベクターに、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲ及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを有するＥＧＦＰ遺伝子断片を導入した。【００７９】
具体的には、まず、プライマー（ｐＲＩ２０１−ＥＧＦＰ−Ｆ、配列番号３）及びプライマー（ＥＧＦＰ−ｐＲＩ２０１−Ｒ、配列番号４）を用いてＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。【００８０】
続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＳａｌＩで切断したｐＲＩ２０１−ＡＮ（タカラバイオ社）にクローニングし、ｐＲＩ２０１−ＥＧＦＰベクターを作製した。【００８１】
続いて、ｐＲＩ２０１−ＥＧＦＰベクターを鋳型として、プライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＡｔＡＤＨ−Ｆ、配列番号５）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＨＳＰｔｅｒ−Ｒ、配列番号６）を用いて、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲ及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを有するＥＧＦＰ遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。【００８２】
続いて、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｈｏＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ｆｐベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを作製した。配列番号２８にｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターの全長の塩基配列を示す。【００８３】
《ｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｃ）はｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを鋳型として、プライマー（ｐＢＹＲ２ＥＥ−Ｅｘｔ３−Ｆ、配列番号７）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＥＥ−Ｅｘｔ３−Ｒ、配列番号８）を用いて、タバコエクステンシン遺伝子ターミネーターをＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターが２個連結したものであった。【００８４】
《ｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｄ）はｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターをプライマー（ｐＢＹＲ２Ｈ−ＨＳＰｔｅｒ−Ｆ、配列番号９）及びｐＢＹＲ２Ｈ−ＨＳＰｔｅｒ−Ｒ、配列番号１０）を用いて、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを鋳型としてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターが２個連結したものであった。【００８５】
《ｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｅ）はｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰからタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを除去するため、制限酵素ＸｍａＩ及びＣｌａＩで切断した。ＳＩＲ−Ｃ２をプライマー（ＨＳＰｔｅｒ−ＳＩＲ−Ｆ、配列番号１１）及びプライマー（Ｃ１−ＣｌａＩ−Ｃ２−Ｒ、配列番号１２）を用いて、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。上記ＸｍａＩ及びＣｌａＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰにクローニングし、ｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを１個有するものであった。【００８６】
《ｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｆ）はｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２Ｔ−３５Ｓｔｅｒ−Ｆ、配列番号１３）及びプライマー（３５Ｓｔｅｒ−ＮＯＳｔｅｒ−Ｒ、配列番号１４）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚ（Ｍａｒｋｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）を鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＮＯＳターミネーターはプライマー（３５Ｓｔｅｒ−ＮＯＳｔｅｒ−Ｆ、配列番号１５）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＴＮ−ＮＯＳｔｅｒ−Ｒ、配列番号１６）を用いて、ｐＲＩ２０１−ＡＮ（タカラバイオ社）を鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰを作製した。ｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーター及びＮＯＳターミネーターが、それぞれ１個ずつ連結したものであった。【００８７】
《ｐＢＹＲ２Ｔ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｇ）はｐＢＹＲ２Ｔ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２Ｔ−３５Ｓｔｅｒ−Ｆ、配列番号１３）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ−３５Ｓｔｅｒ−Ｒ、配列番号１７）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２Ｔ−ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２Ｔ−ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを１個有するものであった。【００８８】
《ｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｈ）はｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ−３５Ｓｔｅｒ−Ｆ、配列番号１８）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ−３５Ｓｔｅｒ−Ｒ、配列番号１７）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーター及びカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターが、それぞれ１個ずつ連結したものであった。【００８９】
《ｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターの作製》
図２（ｉ）はｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターのＴ−ＤＮＡ領域の模式図である。カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターはプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ−３５Ｓｔｅｒ−Ｆ、配列番号１８）及びプライマー（ｐＢＹＲ２ＨＳ−３５Ｓｔｅｒ−Ｒ、配列番号１７）を用いて、ｐＣａｍｂｉａ１３９１Ｚを鋳型として、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を、制限酵素ＸｂａＩで切断したｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターにクローニングし、ｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターを作製した。ｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターのターミネーターは、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーター及び、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターが、それぞれ１個ずつ連結したものであった。【００９０】
図２（ａ）〜（ｉ）中、「３５Ｓ−ｐ×２」はエンハンスエレメントを２つ有するカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーターを意味し、「ＴＭＶΩ」はタバコモザイクウイルスの５’−ＵＴＲを意味し、「ＡｔＡＤＨ５’」はシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲを意味し、「ＥＧＦＰ」はｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎを意味し、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味し、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「３５Ｓｔｅｒ」はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを意味し、「Ｎｏｓ−ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味し、「ＬＩＲ」はインゲン黄斑萎縮ウイルス（ＢｅＹＤＶ）ゲノムのＬｏｎｇ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎを意味し、「ＳＩＲ」はＢｅＹＤＶゲノムのＳｈｏｒｔ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎを意味し、「Ｃ１」及び「Ｃ２」はＢｅＹＤＶの複製開始タンパク質であるＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームＣ１及びＣ２を意味し、「ＬＢ」及び「ＲＢ」はそれぞれＴ−ＤＮＡの左側ボーダー配列及び右側ボーダー配列を意味し、「Ｎｏｓ−ｐ」はＮＯＳプロモーターを意味し、「ｐ１９」はトマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９をコードする遺伝子を意味する。【００９１】
［実験例１］
（ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較１）
ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターは、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターのＴＭＶΩがシロイヌナズナアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲに置き換えられ、更にシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターが挿入された、ターミネーターを２つ有するベクターであった。【００９２】
下記表１にｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターの概要を示す。表１中、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味する。【００９３】
【表１】
2018220929.tif 000003
【００９４】
ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、ベンサミアナタバコの葉、レタスの葉、ナスの葉、トマトの果実、トマトの葉、トウガラシの葉、メロンの葉、バラの花弁及びコチョウランの花弁にそれぞれ導入した。【００９５】
ベクターの導入後、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、各植物に青色ＬＥＤを照射して、紫外線吸収フィルター（型式「ＳＣ−５２」、フジフイルム）を用いてＥＧＦＰの蛍光を観察した。【００９６】
図３（ａ）〜（ｉ）は、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。図３（ａ）〜（ｉ）において、スケールバーは１ｃｍを示す。図３（ａ）はベンサミアナタバコの葉の結果であり、図３（ｂ）はレタスの葉の結果であり、図３（ｃ）はナスの葉の結果であり、図３（ｄ）はトマトの果実の結果であり、図３（ｅ）はトマトの葉の結果であり、図３（ｆ）はトウガラシの葉の結果であり、図３（ｇ）はメロンの葉の結果であり、図３（ｈ）はバラの花弁の結果であり、図３（ｉ）はコチョウランの花弁の結果である。いずれの写真においても、左側がｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを導入した結果であり、右側がｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターを導入した結果である。【００９７】
その結果、バラを除いて、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターの導入により、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターの導入よりもＥＧＦＰの発現量が増加したことが明らかとなった。バラにおいてはいずれのベクターを導入した場合においてもＥＧＦＰの蛍光が認められなかった。【００９８】
また、特に、トマトの果実及びトマトの葉においては、ＥＧＦＰの蛍光はｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを導入した場合のみにおいて観察され、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターの導入では、ＥＧＦＰの蛍光はほとんど観察されなかった。【００９９】
この結果から、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを１個有するｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターよりも、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーター及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターの２個のターミネーターを有するｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターの方が、ＥＧＦＰの発現量が顕著に高いことが明らかとなった。【０１００】
［実験例２］
（ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較２）
ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉、レタスの葉、ナスの葉、トマトの葉、トウガラシの葉及びバラの花弁にそれぞれ導入した。続いて、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。【０１０１】
続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）、並びに、レタスの葉、ナスの葉、トマトの葉、トウガラシの葉及びバラの花弁それぞれ１ｍｇ新鮮重量から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。【０１０２】
続いて、調製したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。【０１０３】
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥしたゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いたイムノブロット解析により、ＥＧＦＰタンパク質を検出した。【０１０４】
図４（ａ）はベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図４（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、「ＧＦＰ」は、市販されている精製されたＧＦＰタンパク質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）を意味する。また、図４（ｂ）は、図４（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。また、図４（ｃ）は、図４（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図４（ｃ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。【０１０５】
また、図５（ａ）はレタスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図５（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないレタスの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図５（ｂ）は、図５（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。また、図５（ｃ）は、図５（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図５（ｃ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。【０１０６】
また、図６（ａ）はナスの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図６（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないナスの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図６（ｂ）は、図６（ａ）のゲルをＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。また、図６（ｃ）は、図６（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図６（ｃ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。【０１０７】
また、図７（ａ）はトマトの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。図７（ａ）中、「ＮＴ」はベクターを導入していないトマトの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図７（ｂ）はトウガラシの葉及びバラの花弁から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後にＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロット解析した結果を示す写真である。図７（ｂ）中、「ＮＴ」はベクターを導入していないトウガラシの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。【０１０８】
その結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションした植物では、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションした植物よりもＥＧＦＰの発現量が顕著に増加したことが明らかとなった。【０１０９】
具体的には、ＥＧＦＰの発現量を定量した結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコでは、１ｇ新鮮重量中に３．７ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。一方、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコでは、１ｇ新鮮重量中に１．５ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。【０１１０】
同様に、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたレタスでは、１ｇ新鮮重量中に０．３７ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。一方、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたレタスでは、１ｇ新鮮重量中に０．２０ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。【０１１１】
また、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたナスでは、１ｇ新鮮重量中に０．４６ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。一方、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたナスでは、１ｇ新鮮重量中に０．４２ｍｇのＥＧＦＰが発現したことが明らかとなった。【０１１２】
トマトの葉、トウガラシの葉、バラの花弁では、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色において、明確なＥＧＦＰのバンドが観察されなかった。このため、これらのサンプルではイムノブロット解析のみ行った。【０１１３】
その結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたトマトの葉及びトウガラシの葉では、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションした場合と比較してＥＧＦＰの発現量の顕著な増加が認められた。【０１１４】
また、バラの花弁においては、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしてイムノブロット解析した場合においてもＥＧＦＰの発現は検出されなかった。【０１１５】
以上の結果から、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを１個有するｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクターよりも、タバコエクステンシン遺伝子のターミネーター及びシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーターの２個のターミネーターを有するｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターの方が、ＥＧＦＰの発現量が顕著に高いことが明らかとなった。また、この発現システムがタバコだけでなくタバコ属以外の複数の種の植物においても機能することが明らかとなった。【０１１６】
［実験例３］
（様々なターミネーターを有するベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較１）
ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｔ−ＥＧＦＰベクター、ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクター、及び、ターミネーターを３個有する、ｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。【０１１７】
下記表２に各ベクターの概要を示す。表２中、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味し、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「３５Ｓｔｅｒ」はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを意味し、「Ｎｏｓ−ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味する。【０１１８】
【表２】
2018220929.tif 000004
【０１１９】
ベクターの導入後、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、各植物に励起光を照射して、紫外線吸収フィルター（型式「ＳＣ−５２」、フジフイルム）を用いてＥＧＦＰの蛍光を観察した。【０１２０】
図８（ａ）〜（ｅ）は、発現したＥＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。図８（ａ）〜（ｅ）の上部にそれぞれ導入したベクターを示す。【０１２１】
その結果、ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｔ−ＥＧＦＰベクターよりも、ターミネーターを２個以上有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターの方が、ＥＧＦＰの発現量が高い傾向が認められた。【０１２２】
［実験例４］
（様々なターミネーターを有するベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較２）
ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクター、及び、ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。続いて、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。【０１２３】
続いて、０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）に相当する調製したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。【０１２４】
図９（ａ）はベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図９（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図９（ｂ）は、図９（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図９（ｂ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。【０１２５】
その結果、ターミネーターを１個しか有していない、ｐＢＹＲ２ｆｐ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２Ｈ−ＥＧＦＰベクターよりも、ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターの方がＥＧＦＰの発現量が顕著に高いことが明らかとなった。また、ＥＧＦＰの発現量は、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターをアグロインフィルトレーションしたベンサミアナタバコにおいて、１ｇ新鮮重量中３．７ｍｇに達したことが明らかとなった。【０１２６】
［実験例５］
（様々なターミネーターを有するベクターによるＥＧＦＰの発現レベルの比較３）
ターミネーターを２個有する、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＨ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＥＥ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＴＮ−ＥＧＦＰベクター、ｐＢＹＲ２ＨＴ−ＥＧＦＰベクター、及び、ターミネーターを３個有するｐＢＹＲ２ＨＴＳ−ＥＧＦＰベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、アグロインフィルトレーションにより、ベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。続いて、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、ベクターを導入したベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。【０１２７】
続いて、０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）に相当する調製したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。【０１２８】
図１０（ａ）はベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図９（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰタンパク質を示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。また、図１０（ｂ）は、図１０（ａ）におけるＥＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図１０（ｂ）のグラフの数値は平均値±標準偏差で示す。【０１２９】
また、下記表３に、本実験例で使用した各ベクターの概要及びＥＧＦＰの発現量を示す。表３中、「Ｅｘｔ３’」はタバコエクステンシン遺伝子のターミネーターを意味し、「ＨＳＰｔｅｒ」はシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを意味し、「３５Ｓｔｅｒ」はカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓターミネーターを意味し、「Ｎｏｓ−ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味する。また、ＥＧＦＰの発現量は平均値±標準偏差で示す。【０１３０】
【表３】
2018220929.tif 000005
【０１３１】
その結果、いずれのベクターにおいても、高いＥＧＦＰの発現が認められた。具体的には、いずれのベクターにおいても、植物体１ｇ新鮮重量あたり３ｍｇ程度以上のＥＧＦＰの発現が認められた。また、ターミネーターを２個有するベクターの方が、ターミネーターを３個有するベクターよりも、ＥＧＦＰの発現量が高い傾向が認められた。また、ターミネーターにシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子のターミネーターを含むベクターは、ＥＧＦＰの発現量が特に高い傾向が認められた。特に、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターでは、植物体１ｇ新鮮重量あたり４ｍｇ程度のＥＧＦＰの発現が認められた。【０１３２】
［実験例６］
（ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びｍａｇｎＩＣＯＮシステムによるタンパク質の発現レベルの比較）
上述したように、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムは、現在商用で用いられている発現システムであり、植物体１ｇ新鮮重量あたり３ｍｇ程度以上の目的タンパク質を発現させることができることが知られている。そこで、上述したｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びｍａｇｎＩＣＯＮシステムによるタンパク質の発現レベルを比較した。【０１３３】
図１１は、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムを利用した発現ベクターである、ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクター（Ｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のＫｌｉｍｙｕｋ博士より分与された。）の構造を示す模式図である。【０１３４】
図１１中、「ＲＢ」及び「ＬＢ」はそれぞれＴ−ＤＮＡの右側ボーダー配列及び左側ボーダー配列を意味し、「Ａｃｔ２」はシロイヌナズナ由来のＡｃｔ２プロモーターを意味し、「Ω」はタバコモザイクウイルス由来の５’−ＵＴＲのΩ配列を意味し、「ＲｄＲｐ」は、トバモウイルス（ターニップベインクリアリングウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを意味し、「ＭＰ」はｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎを意味し、「ＧＦＰ」はｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎを意味し、「ＮＴＲ」はｃｒ−ＴＭＶ（アブラナ科植物感染性トバモウイルス）由来の３’−ＵＴＲを意味し、「Ｎｏｓ−ｔ」はＮＯＳターミネーターを意味する。また、「ＲｄＲｐ」及び「ＭＰ」のドットを付したボックスで示す領域はイントロンを意味する。【０１３５】
ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクター及びＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターを、それぞれアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１株に導入し、４週齢又は５週齢のベンサミアナタバコの葉にそれぞれ導入した。【０１３６】
ベクターの導入後、各植物を３日間インキュベートしてＥＧＦＰ又はＧＦＰを一過性に発現させた。続いて、各植物に青色ＬＥＤを照射して、紫外線吸収フィルター（型式「ＳＣ−５２」、フジフイルム）を用いてＥＧＦＰ又はＧＦＰの蛍光を観察した。【０１３７】
図１２（ａ）及び（ｂ）は、発現したＥＧＦＰ又はＧＦＰの蛍光を観察した結果を示す写真である。図１２（ａ）及び（ｂ）において、スケールバーは１ｃｍを示す。図１２（ａ）は４週齢のベンサミアナタバコの葉の結果であり、図１２（ｂ）は５週齢のベンサミアナタバコの葉の結果である。図１２（ａ）及び（ｂ）の上部にそれぞれ導入したベクターを示す。図１２（ａ）及び（ｂ）中、「４ｗｏ」は４週齢の結果であることを示し、「５ｗｏ」は５週齢の結果であることを示す。【０１３８】
その結果、４週齢及び５週齢のいずれのベンサミアナタバコの葉を用いた場合においても、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを導入した方が、ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターを導入するよりも、ＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量が高い傾向が認められた。【０１３９】
続いて、各ベンサミアナタバコの葉から、全可溶性タンパク質をそれぞれ調製した。続いて、０．２ｍｇ新鮮重量（ＦＷ）に相当する調製したタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、全可溶性タンパク質をクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により検出した。【０１４０】
図１３（ａ）は各ベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色した結果を示す写真である。図１３（ａ）の上部にそれぞれ導入したベクターを示す。また、図１３（ａ）中、矢頭はＥＧＦＰ又はＧＦＰタンパク質を示し、「４ｗｏ」は４週齢の結果であることを示し、「５ｗｏ」は５週齢の結果であることを示す。また、「ＮＴ」はベクターを導入していないベンサミアナタバコの葉から調製した全可溶性タンパク質を意味する。【０１４１】
また、図１３（ｂ）は、図１３（ａ）におけるＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量を数値化したグラフである。図１３（ｂ）のグラフの数値は４週齢及び５週齢のベンサミアナタバコにおけるＥＧＦＰ又はＧＦＰの発現量の平均値±標準偏差で示す。また、図１３（ｂ）中、「＊」は、スチューデントのｔ検定の結果、Ｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。【０１４２】
その結果、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターを導入した方が、ＧＦＰ＿ｐＩＣＨ１８７１１ベクターを導入するよりも、タンパク質の発現量が有意に高いことが明らかとなった。この結果は、ｐＢＹＲ２ＨＳ−ＥＧＦＰベクターによるタンパク質の発現量が、ｍａｇｎＩＣＯＮシステムによるタンパク質の発現量よりも高いことを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明によれば、タバコ属以外の植物にも適用することができ、タンパク質の発現量が高い発現システムを提供することができる。
【図１】
2018220929.tif 000006
【図２】
2018220929.tif 000007
【図３】
2018220929.tif 000008
【図４】
2018220929.tif 000009
【図５】
2018220929.tif 000010
【図６】
2018220929.tif 000011
【図７】
2018220929.tif 000012
【図８】
2018220929.tif 000013
【図９】
2018220929.tif 000014
【図１０】
2018220929.tif 000015
【図１１】
2018220929.tif 000016
【図１２】
2018220929.tif 000017
【図１３】
2018220929.tif 000018
【配列表】
2018220929000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月26日(2018.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジェミニウイルス由来のＬｏｎｇ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＬＩＲ）と、ジェミニウイルス由来のＳｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＳＩＲ）と、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された目的タンパク質の発現カセットとを含む第１の核酸断片と、
ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片と、を備え、
前記目的タンパク質の発現カセットが、プロモーターと、前記目的タンパク質をコードする核酸断片と、２個連結されたターミネーターとをこの順に含み、
前記ターミネーターが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーター又はタバコエクステンシン遺伝子由来のターミネーターである、発現システム。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に備える、請求項１に記載の発現システム。
【請求項５】
前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、請求項４に記載の発現システム。
【請求項６】
前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、単一のベクターに含まれている、請求項４又は５に記載の発現システム。
【請求項７】
Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ−ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、請求項６に記載の発現システム。
【請求項８】
前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項１、４〜７のいずれか一項に記載の発現システム。
【請求項９】
目的タンパク質の製造方法であって、植物細胞に請求項１、４〜８のいずれか一項に記載の発現システムを導入する工程を備える、製造方法。
【請求項１０】
ジェミニウイルス由来のＬＩＲと、ジェミニウイルス由来のＳＩＲと、前記ＬＩＲと前記ＳＩＲとの間に連結された発現カセットとを含む第１の核酸断片を含み、前記発現カセットが、プロモーターと、マルチクローニングサイトと、２個連結されたターミネーターとをこの順に含み、
前記ターミネーターが、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２遺伝子由来のターミネーター又はタバコエクステンシン遺伝子由来のターミネーターである、発現ベクター。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
ジェミニウイルス由来のＲｅｐ／ＲｅｐＡタンパク質の発現カセットを含む第２の核酸断片を更に含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
遺伝子サイレンシング阻害因子の発現カセットを含む第３の核酸断片を更に含む、請求項１０又は１３に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記遺伝子サイレンシング阻害因子が、トマトブッシースタントウイルスに由来する遺伝子サイレンシング阻害因子Ｐ１９である、請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
Ｔ−ＤＮＡ右側ボーダー配列（ＲＢ）及びＴ−ＤＮＡ左側ボーダー配列（ＬＢ）を更に備え、前記第１の核酸断片、前記第２の核酸断片及び前記第３の核酸断片が、前記ＲＢと前記ＬＢとの間に存在する、請求項１０、１３〜１５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記ジェミニウイルスが、インゲン黄斑萎縮ウイルスである、請求項１０、１３〜１６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【国際調査報告】
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