(57)【要約】  短期間で効率よくドパミン神経細胞を調製する方法を提供することを課題とする。（１）多能性幹細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養するステップ、（２）ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させるステップ、及び（３）ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へ分化誘導するステップ、によってドパミン神経細胞を調製する。
2018193949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）〜（３）を含む、ドパミン神経細胞の調製方法：
（１）多能性幹細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養するステップ、
（２）ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させるステップ、
（３）ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へ分化誘導するステップ。
【請求項２】
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
多能性幹細胞がヒト細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
TGF-βファミリー阻害剤が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項５】
GSK3β阻害剤が６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項６】
BMP阻害剤が６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項７】
ヘッジホッグシグナルアゴニストが９−シクロヘキシル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−（１−ナフタレニルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−アミンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項８】
ステップ（２）における、通常の酸素分圧下で浮遊培養によって、グリア細胞などの不要な細胞への分化誘導が抑制される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項９】
ステップ（２）における継代の回数が０回又は１回である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１０】
継代の回数が少ないことにより、意図しない分化誘導の促進が回避される、請求項９に記載の調製方法。
【請求項１１】
ステップ（１）の培養期間が４日以上である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１２】
ステップ（１）〜（３）の全てが通常の酸素分圧下で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１３】
通常の酸素分圧下が、酸素濃度が18％〜22％の条件である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１４】
ステップ（２）の培養が、LIF、bFGF及びROCK阻害剤が更に存在する条件下で行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１５】
ステップ（２）の培養期間が７日間〜２１日間である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１６】
ステップ（３）が、γ−セクレターゼ阻害剤、神経栄養因子、アスコルビン酸、TGF-β3、及びcAMP又はcAMPアナログの存在下での接着培養を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の調製方法。
【請求項１７】
γ−セクレターゼ阻害剤がＮ−［Ｎ−（３，５‐ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルであり、神経栄養因子が脳由来神経栄養因子（BDNF）とグリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）であり、cAMPアナログがジプチリルcAMPである、請求項１６に記載の調製方法。
【請求項１８】
ステップ（３）の培養期間が５日間〜２１日間である、請求項１６又は１７に記載の調製方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項の調製方法で得られたドパミン神経細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載のドパミン神経細胞を用いた、in vitroアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はドパミン神経細胞（ドパミン作動性ニューロン）の調製方法及びその用途に関する。本出願は、２０１７年４月１９日に出願された日本国特許出願第２０１７−０８２６００号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
誘導多能性幹細胞（iPS細胞）に代表される多能性幹細胞には医薬品の開発、再生医療、基礎研究など、様々な分野での応用が期待されている。多能性幹細胞を適切な条件で培養すると特定の細胞系譜に沿って分化する。神経系を構築する細胞に関しても、この特性を活かして各種神経細胞の作製が試みられている。例えば、多能性幹細胞を低酸素分圧下で培養し、種々の神経細胞やグリア細胞へと分化誘導する方法が提案されている（特許文献１、非特許文献１、２）。また、cAMP及びMEK阻害剤を含有する培地を使用することにより高品質なドパミン神経細胞を誘導できるという報告もある（特許文献２）。これら以外にも、ドパミン神経細胞又はその前駆細胞の分化誘導法については数多くの報告がある（例えば非特許文献３〜６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１８７４１６  Ａ１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１５／０２０２３４  Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Stem Cell Reports 2016 Mar8;6(3):422-35
【非特許文献２】Molecular Brain (2016)9:88
【非特許文献３】PLoS One. 2014 Feb 21;9(2):e87388
【非特許文献４】Biochim Biophys Acta. 2015 Sep;1850(9):1669-75.
【非特許文献５】Biochim Biophys Acta. 2015 Sep;1850(1):22-32.
【非特許文献６】Nat Commun. 2016 Oct 14;7:13097
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多能性幹細胞からの神経細胞（特にドパミン神経細胞）の調製を目指した様々な試みがあるものの、依然として克服すべき課題は多い。例えば、上掲の特許文献１に開示された方法では、低酸素分圧下という特殊な酸素条件を使用することが大きな障害となる。また、ドパミン神経細胞への誘導効率（分化特異性）には改善の余地がある。更には、ドパミン神経細胞が得られるまでの期間が長い。臨床応用を前進させるためには、短期間で効率よくドパミン神経細胞が得られる方法ないし条件の創出が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく本発明者らは、ドパミン神経細胞の新規調製方法の創出を目指して研究を進めた。特に、低酸素分圧下で培養するためには専用の装置が必要になり、実用化を進める上で大きな障害になる点に配慮しつつ検討を重ねた。その結果、低酸素分圧下という特殊な酸素条件を用いなくとも、効率的に且つ短期間で多能性幹細胞をドパミン神経細胞へと分化誘導できる新たな方法（プロトコル）の確立に成功した。また、当該方法で調製したドパミン神経細胞が各種アッセイに有用であることが実証された。即ち、汎用性且つ実用性に優れたドパミン神経細胞の調製方法を確立できた。低酸素分圧下という特殊な酸素条件を採用しなくとも特異的／効率的に、しかも短期間で多能性幹細胞をドパミン神経細胞へと分化誘導できることは、多能性幹細胞を利用した移植医療や医薬品開発を大きく前進させるものであり、その意義は極めて大きい。
以下の発明は、主として上記の成果及び考察に基づく。
［１］以下のステップ（１）〜（３）を含む、ドパミン神経細胞の調製方法：
（１）多能性幹細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養するステップ、
（２）ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させるステップ、
（３）ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へ分化誘導するステップ。
［２］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］に記載の調製方法。
［３］多能性幹細胞がヒト細胞である、［１］又は［２］に記載の調製方法。
［４］TGF-βファミリー阻害剤が４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の調製方法。
［５］GSK3β阻害剤が６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリルである、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の調製方法。
［６］BMP阻害剤が６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンである、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の調製方法。
［７］ヘッジホッグシグナルアゴニストが９−シクロヘキシル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−（１−ナフタレニルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−アミンである、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の調製方法。
［８］ステップ（２）における、通常の酸素分圧下で浮遊培養によって、グリア細胞などの不要な細胞への分化誘導が抑制される、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の調製方法。
［９］ステップ（２）における継代の回数が０回又は１回である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１０］継代の回数が少ないことにより、意図しない分化誘導の促進が回避される、［９］に記載の調製方法。
［１１］ステップ（１）の培養期間が４日以上である、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１２］ステップ（１）〜（３）の全てが通常の酸素分圧下で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調製方法。
［１３］通常の酸素分圧下が、酸素濃度が18％〜22％の条件である、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１４］ステップ（２）の培養が、LIF、bFGF及びROCK阻害剤が更に存在する条件下で行われる、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１５］ステップ（２）の培養期間が７日間〜２１日間である、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１６］ステップ（３）が、γ−セクレターゼ阻害剤、神経栄養因子、アスコルビン酸、TGF-β3、及びcAMP又はcAMPアナログの存在下での接着培養を含む、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１７］γ−セクレターゼ阻害剤がＮ−［Ｎ−（３，５‐ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルであり、神経栄養因子が脳由来神経栄養因子（BDNF）とグリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）であり、cAMPアナログがジプチリルcAMPである、［１６］に記載の調製方法。
［１８］ステップ（３）の培養期間が５日以上である、［１６］又は［１７］に記載の調製方法。
［１９］［１］〜［１８］のいずれか一項の調製方法で得られたドパミン神経細胞。
［２０］［１９］に記載のドパミン神経細胞を用いた、in vitroアッセイ。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１−１】RELN欠失iPS細胞の樹立。（A）RELN欠失iPS細胞を用いたNANOGとTRA-1-60免疫染色像。（B）in vitroにおける三胚葉分化能の確認。（C）RELN欠失iPS細胞ゲノムにおけるRELN欠失の確認（血液ゲノムとiPS細胞ゲノムの比較）。
【図１−２】図１の続き。（D）使用したCRISPR-sgRNAの標的サイト。
【図１−３】図１の続き。（E）T7EIアッセイによるCRISPR/sgRNA活性の評価。
【図１−４】図１の続き。（F）CRISPR-sgRNA#4を用いて得られたRELN欠失アイソジェニック株一覧。
【図１−５】図１の続き。（G）RELN欠失アイソジェニック株の三胚葉分化能の確認。201B7由来＃4−1（+/-ヘテロ欠失）。
【図２】RELN欠失を有する神経細胞ではreelin発現が低下する。（A）健常対照iPS細胞由来ニューロスフィア（21日目）及びドパミン神経細胞（28日目）を用いたRELN mRNAの発現解析。（B）ニューロスフィア（21日目）におけるRELN mRNAの発現比較。（C）ドパミン神経細胞（28日目）におけるRELN mRNAの発現比較。（D）201B7、ヘテロ欠失Ig201B7(+/-)、ホモ欠失Ig201B7(-/-)のドパミン神経細胞（21日目）におけるTHとReelinの免疫染色結果。
【図３−１】先天性RELN欠失親子iPS細胞由来ドパミン神経細胞におけるドパミン産生の異常。（A）早期ドパミン神経細胞（23日目）におけるTHとTuj1の免疫染色像。（B）各群のTuj1陽性細胞におけるTH陽性率。（C）健常対照とRELN欠失親子でのニューロスフィアを用いた網羅的遺伝子発現比較解析。
【図３−２】図３の続き。（D）定量PCRを用いたCOMTの発現解析。（E）28日目の培養上清を用いたドパミン濃度の測定。
【図４−１】RELN欠失による神経細胞の遊走方向異常。（A）神経遊走のリアルタイムイメージング解析。左：位相差顕微鏡像、右：細胞トラッキング（cell tracking）の結果。
【図４−２】図４の続き。（B）4時間の総移動距離(a)。（C）撮影開始点と終了点の2点間の距離(b)。（D）比率（b/a）×100。
【図４−３】図４の続き。（E）細胞移動角度解析の模式図。（F）左：ひとつの代表細胞について、細胞角度解析をした結果。右：10個の細胞の角度解析結果のまとめ。（G）移動角度による分布比較。
【図５】新規プロトコルで調製したドパミン神経細胞のドパミン産生能。健常者iPS細胞をドパミン神経細胞へ誘導し、培養28日目と42日目の培養上清中のドパミン濃度を測定した。28日目：ニューロスフィアからの分化誘導を開始してから7日後、42日目：ニューロスフィアからの分化誘導を開始してから21日後、NTC：培地そのもの（細胞なし）の値。経時的なドパミン量増加が確認できる。
【図６】新規プロトコルで調製したドパミン神経細胞の確認。健常者iPS細胞をドパミン神経細胞へ誘導し、28日目に固定・染色した。左：中脳マーカー（FOXA2）、中央：ドパミン神経細胞マーカー（TH）、右：合成。共陽性を示す細胞が見られることから、中脳ドパミン神経細胞へ誘導されていることがわかる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
１．ドパミン神経細胞を調製する方法
本発明は多能性幹細胞からドパミン神経細胞を調製する方法（以下、「本発明の調製方法」とも呼ぶ。）に関する。本発明によれば、生体の中枢神経を構成するドパミン神経細胞と類似の特性を示す細胞が得られる。ドパミン神経細胞は神経疾患（例えば精神疾患、神経変性疾患）に対する治療薬ないし移植材料（移植医療用の細胞又は組織）として有用である。また、神経疾患に対する薬剤（治療薬、予防薬）の開発や神経疾患の発症・進展メカニズムの研究などのツールとして有用である。汎用性に優れた本発明の調製方法は、このように有用性の高いドパミン神経細胞を簡便且つ安価に調製することを可能にする。また、本発明の調製方法によれば、短期間で効率よくドパミン神経細胞を得ることができる。
【０００９】
本発明の調製方法では、以下のステップ（１）〜（３）を行う。
（１）多能性幹細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養するステップ
（２）ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させるステップ
（３）ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へ分化誘導するステップ
【００１０】
ステップ（１）
ステップ（１）では多能性幹細胞を使用する。「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
【００１１】
多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはES細胞又はiPS細胞を用いる。更に好ましくはiPS細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞が用いられる。
【００１２】
ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期座として、単為発生胚を用いてもよい(（Kim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
【００１３】
ES細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3）、WiCell Research Institute、ESI BIOなどから入手可能である。
【００１４】
EG細胞は、始原生殖細胞を、LIF、bFGF、SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609， （2003））。
【００１５】
「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞、リンパ球等）をリプログラミングすることによって作製される、分化多能性と自己複製能を有する細胞である。iPS細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。iPS細胞の作製に利用可能な細胞、即ち、iPS細胞の由来である細胞の例として、リンパ球（T細胞、B細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、粘膜上皮細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪幹細胞、歯髄幹細胞、神経幹細胞を挙げることができる。
【００１６】
iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
【００１７】
iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。
【００１８】
iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
【００１９】
多能性幹細胞は公知の方法により、生体外（in vitro）で維持することができる。臨床応用を視野に入れた場合等、安全性の高い細胞を提供することが望まれる場合には、多能性幹細胞を、血清代替物を用いた無血清培養や、無フィーダー細胞培養により維持することが好ましい。血清を使用（又は併用）するのであれば、自己血清（即ちレシピエントの血清）を使用するとよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを含有し得る。公知の方法（例えば、Ｗ０  ９８／３０６７９を参照）により血清代替物を調製することができる。市販の血清代替物を用いることもできる。市販の血清代替物の例として、KSR（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated （Gibco社製）、Glutamax （Gibco社製）が挙げられる。
【００２０】
ステップ（１）では、以上のようにして用意した多能性幹細胞を、TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤の存在下で培養する。即ち、TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤が添加された培地を用いて多能性幹細胞を培養する。尚、ステップ（１）は多能性幹細胞の神経分化能の亢進を目的とする。
【００２１】
培地は、哺乳動物細胞の培養に用いる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地、及びこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝O.8〜1.2：1.2〜0.8である。
【００２２】
培地にはTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤及びBMP阻害剤が添加される。TGF-βファミリー阻害剤とは、TGF-βとTGF-β受容体との結合を介するTGF-βシグナル伝達を阻害する物質である。TGF-β阻害剤にはタンパク質性阻害剤及び低分子阻害剤がある。タンパク質性阻害剤の例は、抗TGF-β中和抗体、抗TGF-β受容体中和抗体である。低分子阻害剤の例は、SB431542（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド又はその水和物）、SB202190(４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール)、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)である。好ましくは、SB431542を用いる。TGF-βファミリー阻害剤の濃度（培地への添加量）は、多能性幹細胞の神経分化能の亢進という目的が達成される限り特に限定されないが、SB431542を例としてその濃度を示すと、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。全培養期間を通してTGF-βファミリー阻害剤濃度を一定にするのではなく、例えば段階的にTGF-βファミリー阻害剤濃度を増加させるなど、TGF-βファミリー阻害剤濃度に変化を設けても良い。
【００２３】
GSK3β阻害剤としては、CHIR99021（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、SB-415286（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、SB-2167、indirubin-3’-Monoxime、Kenpaullone、BIO（６−ブロモインジルビン−３'−オキシム）等を用いることができる。好ましくは、CHIR99021を用いる。GSK3β阻害剤の濃度（培地への添加量）は、多能性幹細胞の神経分化能の亢進という目的が達成される限り特に限定されないが、CHIR99021を例としてその濃度を示すと、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。全培養期間を通してGSK3β阻害剤濃度を一定にするのではなく、例えば段階的にGSK3β阻害剤濃度を増加させるなど、GSK3β阻害剤濃度に変化を設けても良い。
【００２４】
BMP阻害剤とは、BMP(bone morphogenetic protein)とBMP受容体（I型又はII型）との結合を介するBMPシグナル伝達（BMP signaling）を阻害する物質である。BMP阻害剤にはタンパク質性阻害剤と低分子阻害剤がある。タンパク質性阻害剤の例は、天然の阻害剤であるNoggin、chordin、follistatin等である。低分子阻害剤の例は、Dorsomorphin（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）及びその誘導体、LDN-193189（4-(6-(4-piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl）quinoline）及びその誘導体である。これらの化合物は市販されており（例えばSigma-AldrichやStemgent社から入手できる）、容易に入手可能である。好ましくは、Dorsomorphinを用いる。BMP阻害剤の濃度（培地への添加量）は、多能性幹細胞の神経分化能の亢進という目的が達成される限り特に限定されないが、Dorsomorphinを例としてその濃度を示すと、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。全培養期間を通してBMP阻害剤濃度を一定にするのではなく、例えば段階的にBMP阻害剤濃度を増加させるなど、BMP阻害剤濃度に変化を設けても良い。
【００２５】
必要に応じて、培地にその他の成分を添加してもよい。添加され得る成分の例として、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等を挙げることができる。
【００２６】
多能性幹細胞は、通常、接着培養に供される。接着培養は浮遊培養と対照をなす培養であり、典型的には接着条件下で二次元培養（平面培養）する。但し、マトリゲルTM（BD）などを使用し、三次元的に培養することにしてもよい。接着培養には、例えば、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ等を用いることができる。培養面への細胞の接着性を高めるために、マトリゲルTM（BD）、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、或いはこれらの中の二つ以上の組み合わせによってコーティング処理された培養器を用いるとよい。
【００２７】
フィーダー細胞の存在下/非存在下いずれの条件で多能性幹細胞の培養を行ってもよいが、臨床応用を視野に入れた場合等、安全性の高い細胞を提供することが望まれる場合には、フィーダー細胞の非存在下で培養（無フィーダー細胞培養）するとよい。尚、フィーダー細胞の例は、MEF（マウス胎仔線維芽細胞）、STO細胞（マウス胎仔線維芽細胞株）、SNL細胞（STO細胞のサブクローン）である。
【００２８】
培養温度、C02濃度、02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。また、通常の酸素分圧下で培養すればよい。尚、他の条件（湿度、CO2の濃度等）によって変動し得るが、「通常の酸素分圧下」の場合の酸素濃度は典型的には約18％〜約22％となる。尚、「通常の酸素分圧下」の詳細は後述する。
【００２９】
ステップ（１）の期間（培養期間）は４日以上とし、具体的には例えば４日間〜２０日間、好ましくは６日間〜１４日間である。培養期間が短すぎることはニューロスフェア形成能低下を引き起こす。他方、培養期間が過度に長くなれば、ドパミン神経細胞の効率的な調製という、本発明の効果の一つが損なわれ得る。
【００３０】
必要に応じて継代することにしてもよい。例えばサブコンフルエント又はコンフルエントの状態になった段階で細胞を回収し、一部の細胞を別の培養器に播種し、培養を継続する。細胞の回収には細胞解離液などを利用すればよい。細胞解離液としては、例えば、EDTA-トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。分散（離散）状態となるように、回収後の細胞をセルストレイナーなどで処理した後に継代培養に供するとよい。
【００３１】
ステップ（１）の結果、多能性幹細胞の神経分化能が亢進する。神経分化能が亢進したことは、ステップ（１）の開始前と比較して神経系マーカー（Sox2、nestin、Sox1等）の発現が上昇することを指標に確認できる。また、神経分化能が亢進したことの評価に未分化マーカーの発現を利用してもよい。
【００３２】
通常、ステップ（１）後の細胞を一旦回収し、次の培養（ステップ（２））へ進む。回収操作は、継代培養の際の回収操作と同様に行うことができる。
【００３３】
ステップ（２）
このステップでは、ステップ（１）で得られた細胞をTGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの存在下且つ通常の酸素分圧下で浮遊培養し、ニューロスフィアを形成させる。即ち、TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストが添加された培地を用い、且つ通常の酸素分圧下という条件を採用し、ステップ（１）後の細胞を培養する。ステップ（２）は、神経細胞系譜に沿った分化を誘導することを目的とする。尚、特に言及しない事項（使用可能な基礎培地、使用可能なTGF-βファミリー阻害剤やGSK3β阻害剤、培地に添加可能な他の成分等）はステップ（１）と同様であり、その説明を省略する。
【００３４】
浮遊培養には、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等を用いることができる。非接着性の条件下での培養を可能にするため、細胞非接着性の培養面を有する培養器を用いることが好ましい。該当する培養器としては、細胞非接着性になるようにその表面（培養面）を処理したもの、細胞の接着性向上のための処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）がその表面（培養面）に施されていないもの、を挙げることができる。浮遊培養では、細胞の培養器に対する非接着状態を維持できればよく、静置培養を採用しても、あるは、旋回培養や振とう培養を採用してもよい。
【００３５】
培地に添加する成分の内、TGF-βファミリー阻害剤とGSK3β阻害剤は上記の通りである。このステップにおいても、TGF-βファミリー阻害剤としてはSB431542を、GSK3β阻害剤としてはCHIR99021を用いることが好ましい。SB431542を用いた場合の培地中の濃度は、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。同様に、CHIR99021を用いた場合の培地中の濃度は、例えば0.5μM〜20μM、好ましくは1μM〜10μMである。
【００３６】
FGF8は線維芽細胞増殖因子ファミリーの一つである。FGF8は脊椎動物の脳形成の制御に関与し、中脳への領域化に必要である。本発明の目的を達成し得る限り、各種哺乳動物由来のFGF8を使用することが可能である。但し、使用する多能性幹細胞との間で由来（動物種）を合わせることが好ましい。従って、ヒト多能性幹細胞を用いる場合には、好ましくはヒトFGF8を採用する。ヒトFGF8とは、ヒトが生体内で天然に発現するFGF8のアミノ酸配列を有することを意味し、組換え体であってもよい。ヒトFGF8の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号でNP_006110.1（fibroblast growth factor 8 isoform B precursor [Homo sapiens].）を例示することができる。FGF8の濃度（培地への添加量）は、神経細胞系譜に沿った分化誘導という目的が達成される限り特に限定されないが、例えば1 ng/ml〜5μg/ml、好ましくは10〜500 ng/ml、更に好ましくは50〜400 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００３７】
ヘッジホッグシグナルアゴニストは、ソニックヘッジホッグ（SHH）シグナルを促進するものであれば特に限定されない。例えば、腹側化の誘導に有用なプルモルファミン（９−シクロヘキシル−Ｎ−［４−（４−モルホリニル）フェニル］−２−（１−ナフタレニルオキシ）−９Ｈ−プリン−６−アミン）を用いるとよい。プルモルファミンの濃度（培地への添加量）は、神経細胞系譜に沿った分化誘導という目的が達成される限り特に限定されないが、例えば1 ng/ml〜5μg/ml、好ましくは10〜500 ng/ml、更に好ましくは50〜400 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。ヘッジホッグシグナルアゴニストとして、SAG（Ｎ−メチル−Ｎ′−（３−ピリジニルベンジル）−Ｎ′−（３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボニル）−１，４−ジアミノシクロヘキサン）を用いることもできる。SAGを用いる場合の濃度（培地への添加量）は、神経細胞系譜に沿った分化誘導という目的が達成される限り特に限定されないが、例えば10 nM〜100μM、好ましくは100 nM〜10μM、更に好ましくは100 nM〜2μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００３８】
全培養期間を通して各成分（TGF-βファミリー阻害剤、GSK3β阻害剤、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニスト）の濃度が一定であることは必須ではなく、特定の成分（二以上の成分であってもよい）又は全ての成分の濃度が培養途中で変化するようにしてもよい。例えば、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの添加をステップ（２）の２日目〜６日目に開始する。当該条件によれば、細胞への急激な刺激を緩和することができる。好ましくは、FGF8及びヘッジホッグシグナルアゴニストの添加をステップ（２）の３日目〜５日目に開始する。
【００３９】
神経細胞系譜に沿った分化誘導を促進するため、好ましくは、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor (LIF)）も添加された培地を使用する。本発明の目的を達成し得る限り、各種哺乳動物由来のLIFを使用することが可能である。但し、使用する多能性幹細胞との間で由来（動物種）を合わせることが好ましい。従って、ヒト多能性幹細胞を用いる場合には、好ましくはヒトLIFを採用する。LIFの濃度は特に限定されないが、例えば0.25 ng/ml〜1μg/ml、好ましくは1 ng/ml〜50 ng/ml、更に好ましくは5 ng/ml〜20 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００４０】
神経細胞系譜に沿った分化誘導を促進するため、好ましくは、bFGF（塩基性線維芽細胞増殖因子）も添加された培地を使用する。bFGFはFGF2とも呼ばれる。本発明の目的を達成し得る限り、各種哺乳動物由来のbFGFを使用することが可能である。但し、使用する多能性幹細胞との間で由来（動物種）を合わせることが好ましい。従って、ヒト多能性幹細胞を用いる場合には、好ましくはヒトbFGFを採用する。ヒトFGF2とは、ヒトが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号でNP_001997.5（fibroblast growth factor 2 [Homo sapiens]）を例示することができる。bFGFの濃度は特に限定されないが、例えば0.25 ng/ml〜1μg/ml、好ましくは1 ng/ml〜50 ng/ml、更に好ましくは3 ng/ml〜30 ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００４１】
細胞死抑制のために、好ましくは、ROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）（例えばY-27632やFasudil(HA-1077)）も添加された培地を使用する。ROCK阻害剤としてY-27632を使用する場合の濃度は、例えば約1μM〜約50μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。
【００４２】
ROCK阻害剤は細胞が分散状態にあるときの細胞死を強力に抑止する。従って、ステップ（２）の全培養期間にわたってROCK阻害剤を使用するのではなく、細胞を播種する際（即ち、培養開始時）や、例えば継代培養のために細胞を回収して分散させる際にのみ、ROCK阻害剤を含有する培地で細胞を処理することにしてもよい。
【００４３】
好ましくは、神経細胞系譜に沿った分化誘導に有利となるように、毛様体神経栄養因子（CNTF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン３（NT-3）、ウシ胎児血清、N2サプリメント、B27サプリメント等を添加した培地を使用する。尚、N2サプリメントはGibco（製品名  N2 supplement(x100)）等から入手することができ、B27サプリメントはGibco（製品名  B27 supplement(x100)）等から入手することができる。
【００４４】
更に、必要に応じて、培地にその他の成分を添加してもよい。添加され得る成分の例として、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等を挙げることができる。
【００４５】
このステップ（２）ではニューロスフィアを形成させるため浮遊培養を行う。例えば、無血清凝集浮遊培養法（SFEB法／SFEBq法。Watanabeら， Nature Neuroscience 8，288-296 (2005)、WO 2005/123902）やニューロスフィア法（Reynolds BA and Weiss S.,Science,USA,1992 Mar 27;255(5052):1707-10）などを採用することができる。
【００４６】
本発明では、ステップ（２）を通常の酸素分圧下で実施する。細胞培養の際、生体内の環境を考慮して酸素濃度を低くした条件（低酸素分圧／低酸素濃度）が用いられることがあるが、本発明における「通常の酸素分圧下」はこのような特殊な条件と対照をなす。即ち、「通常の酸素分圧下」とは、酸素濃度を意図的に調整していない条件である。尚、他の条件（湿度、共存するCO2の濃度等）によって変動し得るが、「通常の酸素分圧下」の場合の酸素濃度は典型的には約18％〜約22％となる。
【００４７】
ステップ（２）を通常の酸素分圧下で実施することは全培養期間（ステップ（１）〜ステップ（３））を通して特殊な酸素条件（典型的には低酸素環境）の設定を不要とし（即ち、ステップ（１）〜（３）の全てを通常の酸素分圧下で実施することが可能になる）、さらにグリア細胞などの不要な細胞への分化誘導を抑制できることから、極めて実用性の高い調製方法となる。
【００４８】
その他の培養条件（培養温度、C02濃度等）は適宜設定できる。培養温度は例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。
【００４９】
ステップ（２）の期間（培養期間）は例えば７日間〜２１日間、好ましくは１０日間〜１６日間である。培養期間が短すぎたり或いは長すぎたりすると、分化効率の低下のおそれがある。また、培養期間が過度に長くなれば、ドパミン神経細胞の効率的な調製という、本発明の効果の一つが損なわれ得る。
【００５０】
形成されたニューロスフィアを回収して細胞を解離させた後、更なる浮遊培養に供することにしてもよい。即ち、継代培養を行ってもよい。但し、継代培養の回数は少ない方がよく、好ましくは継代培養の回数を１回又は０回（即ち、継代培養をしない）とする。継代培養の回数が少ないことは、短期間でのドパミン神経細胞の調製に有利であり、また、意図しない分化誘導（例えばグリア細胞への分化誘導）が促されることを回避するためにも有効と考えられる。その一方で、継代培養は細胞の純度向上に有効であるため、継代培養の回数は１回が最適といえる。継代培養を１回にする場合には、ステップ（２）の開始から６日目〜１０日目に継代するとよい。尚、継代培養に際してニューロスフィアを回収するときには、培養器表面に接着した細胞の混入を防ぐと良い。このような操作は、ドパミン神経細胞の調製効率や純度の向上に寄与し得る。
【００５１】
ステップ（３）
ステップ（２）によって形成されるニューロスフィアは神経系未分化細胞及び中脳系神経未分化細胞を含有する。ステップ（３）では、ニューロスフィアを構成する細胞を回収し、ドパミン神経細胞へと分化誘導する。ドパミン神経細胞への分化誘導に適した培地や培養条件は公知であり、また、基本的な培養方法や操作については、例えばThermoFisher社が提供するプロトコル（ThermoFisher社のウェブページで公開されている）等を参考にすることができる。具体的には、例えば、γ−セクレターゼ阻害剤、神経栄養因子、アスコルビン酸、TGF-β3、及びcAMP又はcAMPアナログを含有する培地で接着培養することにより、ドパミン神経細胞への分化を誘導する。好ましくは、γ−セクレターゼ阻害剤としてＮ−［Ｎ−（３，５‐ジフルオロフェナセチル−Ｌ−アラニル）］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルを、神経栄養因子として脳由来神経栄養因子（BDNF）とグリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）を、cAMPアナログとしてジプチリルcAMPを用いる。
【００５２】
典型的には、ステップ（２）で形成されたニューロスフィアを回収し、細胞を解離（単一細胞化）させ、培養器に播種して培養する。このような分散培養ではなく、回収したニューロスフィアを細胞塊のまま接着培養に供してもよい。この場合、通常は培養を継続するとニューロスフィアから周囲へと細胞が遊走し、遊走した細胞の中にドパミン神経細胞を認めることができる。
【００５３】
ここでの接着培養には、例えば、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ等を用いることができる。培養面への細胞の接着性を高めるために、マトリゲルTM（BD）、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、或いはこれらの中の二つ以上の組み合わせによってコーティング処理された培養器を用いるとよい。
【００５４】
培養温度、C02濃度、02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は例えば約30〜40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は例えば約1〜10%、好ましくは約5%である。また、通常の酸素分圧下で培養すればよい。
【００５５】
ステップ（３）の期間（培養期間）は特に限定されないが、例えば５日以上、好ましくは７日以上の培養を行う。過度に長い期間の培養は、細胞の疲弊ないし活性の低下、細胞死等を引き起こし得るが、一般に、培養期間が長いほど分化・成熟化が進む。従って、このステップの培養期間の上限は特に限定されないが、例えば培養期間を５日間〜２１日間とする。必要に応じて継代することにしてもよい。例えばサブコンフルエント又はコンフルエントの状態になった段階で細胞を回収し、一部の細胞を別の培養器に播種し、培養を継続する。
【００５６】
ステップ（３）によって、ドパミン神経細胞が得られる。ドパミン神経細胞はドパミンマーカー（チロシンヒドロキシラーゼ、ドパミントランスポーター）の発現、中脳マーカーとしてのFOXA2等を指標として、或いはドパミン産生能の評価（後述の実施例を参照）によって同定ないし確認することができる。
【００５７】
使用する細胞の種類や細胞の状態、及び各ステップの培養条件によって変動し得るが、本発明の調製方法によれば、２１日間〜３０日間程度で多能性幹細胞からドパミン神経細胞を得ることが可能である。
【００５８】
２．ドパミン神経細胞の用途
本発明の第２の局面は本発明の調製方法で得られたドパミン神経細胞の用途に関する。本発明のドパミン神経細胞はそれ自体、各種神経疾患に対する治療薬ないし移植材料として利用され得る。本発明のドパミン神経細胞の適用が想定されるのは、典型的には、ドパミン系薬剤がその治療に使用される中枢神経系疾患、例えば統合失調症、双極性障害、注意欠如多動症、自閉スペクトラム症、パーキンソン病である。移植医療などへの適用に先立って、調製した細胞を細胞表面マーカー、形態、分泌物質などを指標として精製ないし純化してもよい。
【００５９】
一方、本発明のドパミン神経細胞は実験ツールとしても有用であり、例えば、各種神経疾患に対する医薬（治療薬、予防薬）の開発における各種アッセイ（薬剤スクリーンニング系、薬効評価系、薬剤応答アッセイなど）、各種神経疾患の発症・進展メカニズムの解明／理解を目指した研究での各種アッセイ（遺伝子発現解析、プロテオミクス解析、形態解析、神経電気生理的解析など）、神経毒性の評価（毒性評価系）に適用可能である。また、非ヒト動物を用いたin vivoアッセイにも適用可能である。尚、本発明の調製方法で得られるドパミン神経細胞が各種アッセイに有用であることは、後述の実施例で実証されている。
【実施例】
【００６０】
＜ドパミン神経細胞の新規調製方法の確立とそれを利用した研究＞
統合失調症（SCZ）や自閉スペクトラム症(ASD)の病態仮説として、神経発達の障害が重要な役割を果たしていると考えられている。発達期から既に特性が顕在化するASDのみならず、SCZにおいても、明白な精神症状が現れていない発症前からいくつかの認知機能障害や神経生理学的或いは神経画像的変化があることや、SCZやASDの死後脳を用いた検討の結果、神経細胞による脳構築の障害が認められたことが報告されている。これらの報告からすると、胎児期から始まる神経発達の障害がSCZやASDの発症病因になることが推測されるが、SCZやASD患者の脳内病態の詳細は不明である。【００６１】
SCZやASDのゲノム解析研究により、両疾患ともに神経発達に関与する遺伝子上の変異が複数同定されており、そのひとつがRELNにおける変異である。RELNによってコードされるタンパク質reelinは巨大な分泌タンパク質であり、発達期の脳の層構造形成に必須とされている。ヒトではRELNのホモ欠失変異を有すると、発達遅延を伴う滑脳症を呈し、reelinの減少は神経発達障害の発症との関連性が報告されている。同様に、Reln変異マウスであるreelerマウスでは脳層構造の乱れや異常行動が見られ、また、ひとつひとつの神経細胞の遊走方向異常も報告されている。これらの報告から、ヒトにおいても、脳内のreelinが減少すると、不安定な神経遊走が起こる可能性が示唆され、SCZやASDに関与する神経発達の障害を来すことが予想される。【００６２】
Reelinを発現する神経細胞種は複数存在するが、その中でもチロシンヒドロキシラーゼ（tyrosin hydroxylase; TH）陽性のドパミン神経細胞は、出生前後の限定された時期にのみreelinを発現することがマウスを用いた研究で報告されている。Reelinは限定的な時期にしか発現しないにもかかわらず、Relnが変異したreelerマウスではドパミン神経細胞の異常が確認されている。一方、SCZやASDの病態にドパミン系が関与するとの報告が多数存在することから、ドパミン神経細胞とreelinの関係を調べることで、SCZやASDの発症メカニズム解明への手掛かりが得られる可能性が示唆される。【００６３】
そこで、本研究では、RELN欠失を伴うSCZ患者及びその健常な家族、計2名からのiPS細胞の樹立、およびゲノム編集によって人工的にRELN欠失iPS細胞（RELN欠失アイソジェニック株）を作製することを試みた。その際、今後の発展、応用を見据え、iPS細胞からドパミン神経細胞を調製（分化誘導）する方法に改良を加えることにした。【００６４】
以下に示すように、確立に成功した新規調製方法によって、全てのiPS細胞はTH陽性ドパミン神経細胞への分化が可能であった。ライブイメージング解析により、RELN欠失iPS細胞由来のドパミン神経細胞は遊走距離の異常ではなく、遊走方向の異常を呈することが明らかとなった。これらの知見は、発達期のヒト脳におけるreelin機能不全の影響の解明に寄与し、RELN変異がSCZに至る分子病態を反映していると考えられる。【００６５】
１．材料と方法
（１）iPS細胞樹立対象者
RELN欠失者2名（親子であり、子は統合失調症患者、母親は健常者）
健常対照（コントロール）2名（健常者男性2名、RELN欠失なし）【００６６】
（２）iPS細胞の樹立
健常者女性対照（201B7）は理化学研究所バイオリソースセンター（BRC）から入手した。RELN欠失を含め、ゲノム異常がないことを事前に確認した。その他のiPS細胞については、既報（Okita, K. et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature methods 8, 409-412 (2011)）に準じて末梢リンパ球からエピソーマルベクターを用いて樹立した。樹立したiPS細胞はフィーダー細胞（mitomycin-C処理したマウス胎児線維芽細胞：MEF）上でiPS細胞培地（20% KSR, 2mM L-グルタミン, 0.1 mM 非必須アミノ酸, 2-メルカプトエタノール, ペニシリン／ストレプトマイシン及びbFGFを含有するDMEM/F12）を用いて培養した。フィーダーフリー培養の際は、MatrigelTM（BD）コートをした培養皿上でiPS細胞を培養した。培地は一晩フィーダー細胞に暴露したiPS細胞培地（MEFコンディション培地）を使用した。【００６７】
（３）アレイCGH
ゲノムDNAは末梢血又はフィーダーフリー条件で培養したiPS細胞から分離した。アレイCGHについては既報（Kushima, I. et al. High-resolution copy number variation analysis of schizophrenia in Japan. Molecular psychiatry (2016)）に準じて実施した。【００６８】
（４）胚様体（EB）形成及びin vitroでの三胚葉分化能確認
iPS細胞をTrypLETM select（Thermo Fisher Scientific Inc.）によって分散させた後、DMEM/F12培地（5% KSR, 2mM L-グルタミン, 0.1 mM 非必須アミノ酸, 2-メルカプトエタノール, Y27632, ペニシリン／ストレプトマイシンを含む）にて7日間浮遊培養し、EBを形成させた。その後、EBを10%FBS DMEM培地下でゼラチンコート培養皿上に播種し、7日間かけて自発的に分化誘導させた。【００６９】
（５）CRISPR/Cas9システム
Cas9発現ベクターとsgRNA発現ベクターはAddgeneより入手した。【００７０】
（６）HEK293FTとヒトiPS細胞へのCRISPRの導入
HEK293FTは10％ DMEM培地にて培養した。Lipofectamine3000を用いてCas9発現ベクターとsgRNA発現ベクターをコトランスフェクションし、48時間後、ピューロマイシンによる選択を行った。ヒトiPS細胞の場合は、フィーダーフリー条件下で培養した201B7とNC779の健常対照株を用いた。10μMのY-27632にて前処理した後、TrypLETM select（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて分散させた。その後、FuGENE（登録商標） HD（プロメガ社）を用いてCas9発現ベクターとsgRNA発現ベクターをコトランスフェクションし、1 × 106個/ウェルにてMatrigelTM（BD）コーティングした6ウェルプレート上に播種した。24時間後、ピューロマイシンによる選択を行った。【００７１】
（７）T7EIアッセイ
sgRNAの切断活性を調べるため、T7EIアッセイを行った。標的領域をPCRによって増幅し、熱変性（95℃で2分）、再アニーリング化（-0.1℃/秒で85℃から25℃に降温）させた。その後、T7EIによってDNA切断を行い、1.5％ゲルにて産物を電気泳動した。【００７２】
（８）神経分化
ドパミン神経細胞への分化は既報（Fujimori, K. et al. Modeling neurological diseases with induced pluripotent cells reprogrammed from immortalized lymphoblastoid cell lines. Molecular brain 9, 88 (2016)）に改良を加えて行った。まず、iPS細胞をSB431542（3μM）、CHIR99021（3μM）、dorsomorphin（3μM）を添加したiPS細胞培地にて7日間培養した（0日目〜7日目）。その後、TrypLETM select（Thermo Fisher Scientific Inc.）によって分散させ、セルストレイナーに通したものをニューロスフィア培地（DMEM/F12に1×N2サプリメント, 0.6% グルコース, ペニシリン／ストレプトマイシン, 5mM HEPESを添加した培地（MHM培地）に、1×B27サプリメント, 20 ng/ml bFGF, 10 ng/ml human LIF, 10μM Y27632, 3μM CHIR99021, 2μM SB431542, 100 ng/ml FGF8及び1μM プルモルファミンを添加したもの）にて2週間浮遊培養することでニューロスフィアを形成させた（7日目〜21日目）。FGF8とプルモルファミンは10日目から添加した。また、14日目にニューロスフィアを回収し、分散させて単一細胞化した後、再度浮遊培養し、ニューロスフィア（二次ニューロスフィア）を再形成させた。【００７３】
21日目にニューロスフィアをMatrigel TM（BD）コート又はポリ-L-オルニチン/ラミニンコートした培養皿に播種し、ドパミン神経細胞用培地（MHM培地にB27サプリメント, 10μM DAPT, 20 ng/ml BDNF, 20 ng/ml GDNF, 0.2 mM アスコルビン酸, 1 ng/ml TGF-β3及び0.5 mM dbcAMPを添加したもの）にて培養することでドパミン神経細胞へと分化誘導させた（21日目以降）。尚、全ての培養は、通常のCO2インキュベータ（5%CO2。酸素濃度は18.5%〜19.5%（調整していない））内で培養した。【００７４】
以上のプロトコルで健常者iPS細胞をドパミン神経細胞へ誘導し、28日目と42日目の培養上清中のドパミン濃度を測定した（図５）。また、28日目の細胞を固定し、中脳マーカー（FOXA2）とドパミン神経細胞マーカー（TH）で染色した（図６）に示す。経時的なドパミン量増加が認められ（図５）、ドパミン神経細胞への分化誘導が達成できていること、及び培養期間の長期化に伴って成熟化が進むことが確認された。また、共陽性を示す細胞が見られることから（図６）、中脳ドパミン神経細胞へ誘導されていることがわかる。【００７５】
（９）神経遊走試験
二次ニューロスフィア（21日目）を一つずつMatrigel M（BD）コート培養皿上へ播種し、ドパミン神経細胞用培地で培養した。動画はIncuCyte（登録商標）（ESSEN BIOSCIENCE）にて撮影した。細胞トラッキングのために、播種後48時間〜52時間の計4時間の間、15分おきに連続撮影し、ImageJを用いて解析した。遊走距離は各撮影点におけるXY座標によって計算した。【００７６】
細胞ひとつひとつの遊走角度の解析にはMATLAB（Mathworks, Natick）を用いた。各時点での細胞の位置をXY座標により獲得し、基準点からの移動角度を計測した。画像n枚目における細胞の位置をCellnと定義し、スタート地点（＝播種してから48時間後の細胞の位置）をCell0とした。4時間の細胞遊走方向の平均値を座標軸として定義した。細胞の各時点での遊走角度は座標軸からの角度とした。連続する2枚の画像間で細胞が移動していない場合は、解析対象外とした。【００７７】
（１０）免疫細胞染色
細胞を4％パラフォルムアルデヒドにて固定（15分間、室温）した。膜透過とブロッキングの処理のため、1 %BSAと0.3%TritonX-100を含むPBSに1時間、細胞を浸漬した。その後、一次抗体反応（4℃、一晩）を実施した。PBSで洗浄後、蛍光標識した二次抗体と反応させた（室温、1時間）。一次抗体にはTRA-1-60 (abcam)、NANOG (abcam)、SOX17 (R&D systems)、αSMA (R&D systems)、TUJ1 (SIGMA)、TH (Chemicon)及び Reelin (MBL)を使用した。写真観察にはBZ-9000（KEYENCE）又はLS780（Zeiss）を用いた。【００７８】
（１１）培地中のドパミン濃度測定
分化誘導して得られたドパミン神経細胞のドパミン産生能を調べるため、ELISAキット（DLD EA608-96）を用いて培養上清中のドパミン濃度を測定した。サンプルには28日目の培養上清を用いた。少なくとも3回の独立した実験（培養）で得られた培養上清を使用した。【００７９】
（１２）DNAマイクロアレイと定量的PCR
全RNAはRNeasy Plu Mini Kitを用いて抽出した。DNAマイクロアレイはSurePrint G3 Hmm GE 8x60K V2 Microarray Kit (Agilent Technology)を用いて実施し、GeneSpring GX software program (version 13; Aglilent Technology)によって解析した。逆転写反応にはHigh-Capacity cDNA Transcription Kit (Applied Biosystems)を用いた。定量的PCRによる遺伝子発現解析は7900HT (Applied Biosystems)にてKAPA SYBR Fast qPCR Kit (KAPA BIOSYSTEMS)を用いて実施した。【００８０】
（１３）統計解析
平均値の比較は、二群間の場合はStudentのt検定（両側検定）、三群間の場合はANOVA検定後Dunnett法を用いた。分布の比較は、ピアソンのカイの二乗検定を用いた。いずれもp<0.05を有意とした。【００８１】
２．結果
（１）RELN欠失iPS細胞の作製
健常対照2名（CON779とCON1004）及びRELN欠失2名（SCZ339とFAM258）の末梢リンパ球を用いてエピソーマルベクター法によってiPS細胞を樹立した。得られた各iPS細胞について、多能性マーカー（NANOGとTRA-1-60）の発現と、三胚葉への分化能（内胚葉：SOC17、中胚葉：αSMA、外胚葉：Tuj1）を確認した（FAM258の結果を図１ＡとＢに示す）。【００８２】
樹立したiPS細胞のゲノム整合性を評価するため、アレイCGHおよびTaqMan Copy Number assayによるゲノム解析を行った。RELN欠失iPS細胞ではRELN欠失が確認された（図１Ｃ）。iPS細胞における染色体の異数性（＝CNV）は樹立過程において起こりうる現象である。今後の解析への影響を懸念し、RELN欠失以外のCNVが見つかったiPS細胞ラインは解析から除外した。ただし、CON779については、20q11.21の重複が新たに見つかったが解析に使用した（このCNVはヒトES細胞においても頻繁に同定されるCNVだからである）。【００８３】
今回の研究では、RELN欠失を保有する人はNS339とNF258以外に同定できなかった。この２人は親子のため、この２人由来のiPS細胞で観察された表現型が、RELN欠失のためなのか、この親子に特異的なのかは判定が困難と考えられる。そこで、CRISPR/Cas9システムを用い、人工的にRELN欠失アイソジェニックiPS細胞株を作製した。４種類の一本鎖ガイドRNA(sgRNA)をRELN欠失領域に設計した（図１Ｄ）。T7EIアッセイの結果、sgRNA#4が最も切断効率が良いことがわかった（図１Ｅ）ため、sgRNA#4を用いてアイソジェニック株を作製することにした。結果の再現性とオフターゲットの可能性を除くため、２つの健常対照（201B7とCON779）からそれぞれアイソジェニック株を作製した。図１Ｆに示したとおり、複数のアイソジェニック株が作製できた。いずれも三胚葉分化能を保持したままであった（図１Ｇ）。さらに、CCTopを用いてオフターゲットの可能性を調べた。その結果、エクソン領域で予想される切断領域は目的とするRELNのみであった（データを示さず）。【００８４】
（２）ヒトiPS細胞由来ドパミン神経細胞はreelinを発現する
iPS細胞由来神経系細胞がreelinを発現するかどうかを調べるため、まずニューロスフィア(21日目)とドパミン神経細胞（28日目）におけるRELN mRNAの発現レベルを定量的RT-PCRによって解析した。健常対照群において、ドパミン神経細胞におけるRELN発現はニューロスフィアでの発現よりも上昇していた（図２Ａ）。このことは、ドパミン神経細胞がreelinを発現している可能性を示唆する。一方で、RELN欠失iPS細胞由来の神経系、特にドパミン神経細胞では健常対照群に比べてRELN mRNA発現の低下が認められた。【００８５】
次に、免疫細胞染色を用いて、ドパミン神経細胞におけるreelinの発現を調べた。親株である201B7とアイソジェニック株（ヘテロ欠失、ホモ欠失）を使用した。201B7ではTH陽性神経細胞においてreelinの発現が確認され、ヘテロ欠失株201B7(+/-)では、ややシグナルが弱いもののreelinの発現が確認できた。しかし、ホモ欠失株201B7(-/-)ではreelinシグナルが検出されなかった（図２Ｄ）。以上の結果から、過去にマウスで報告されているように、ヒトにおいてもTH陽性ドパミン神経細胞でreelinが発現していることが明らかとなり、また、RELN欠失株ではreelinの発現異常が認められることが示された。【００８６】
（３）RELN欠失iPS細胞も健常対照iPS細胞と同様にTH陽性神経細胞へと分化する
既報（Hook, V. et al. Human iPSC neurons display activity-dependent neurotransmitter secretion: aberrant catecholamine levels in schizophrenia neurons. Stem cell reports 3, 531-538 (2014)、Robicsek, O. et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Molecular psychiatry 18, 1067-1076 (2013)）によると、統合失調症患者由来iPS細胞はドパミン神経細胞への分化異常を示す。そこで、健常コントールiPS細胞とRELN欠失iPS細胞の間でTH陽性細胞への分化能を比較した。図３ＡとＢに示したとおり、新たに確立したプロトコルでは、RELN欠失に関係なく全てのiPS細胞が高効率にTH陽性細胞へと分化した。図３Ｂはステップ（３）開始から48時間後の結果を示すが、培養を継続しステップ（３）開始から7日目の時点での201B7、CON779及びCON1004についてTH陽性率を測定したところ、いずれも85%以上であった。【００８７】
次に、ニューロスフィアを用いて、健常対照iPS細胞（CONT：201B7とCON779）と先天性RELN欠失親子（RELN-del：SCZ339とFAM258）の網羅的遺伝子発現比較解析をDNAマイクロアレイによって実施した。ドパミン代謝に関係する遺伝子のうち、COMTの発現がRELN-del群において顕著に高かった（20倍以上）（図３Ｃ）。COMTはcatechol-O-methyltransferaseという酵素をコードする遺伝子であり、この酵素は脳内におけるドパミン濃度の調整にも関与している。RELN欠失親子で認められたCOMTの高発現がRELN欠失によるものであるか否かを明らかにするため、RELN欠失アイソジェニック株も用い、定量PCRで解析した。その結果、COMTの高発現はRELN欠失親子（SCZ339とFAM258）のみで認められ、RELN欠失アイソジェニック株では認められなかった。【００８８】
ドパミン産生能を調べるため、ELISAキットを用いて培養上清中のドパミン濃度を測定した。その結果、先天性RELN欠失親子では健常対照群に比べて有意なドパミン量低下が認められた。一方、アイソジェニック株については、いずれも親株と同等のドパミン量を示した（図３Ｅ）。【００８９】
（４）RELN欠失iPS細胞由来神経細胞は遊走方向異常を示す
reelerマウスの発達期の脳において、ドパミン神経細胞は遊走方向の異常を呈すことが報告されている（Bodea, G.O. et al. Reelin and CXCL12 regulate distinct migratory behaviors during the development of the dopaminergic system. Development (Cambridge, England) 141, 661-673 (2014)）。ヒトでも同様の異常が起きているか否かを調べるため、RELN欠失神経細胞を用いた細胞トラッキングアッセイを実施した。健常対照（201B7, CON779, CON1004）由来ドパミン神経細胞は、ニューロスフィアの端から外側に向かって真っ直ぐに遊走するのに対し、RELN欠失神経細胞では遊走の方向性に異常が認められた（図４Ａ）。客観的評価のため、各群について定量解析を行った。4時間の総移動距離で比較したところ、RELN欠失親子は健常対照群に比べて有意な低値を示した（図４Ｂ）。一方で、ホモ欠失Ig201B7(-/-)を除くアイソジェニック株では差は認められなかった。4時間の開始点（48h）と終了点（52h）の2点間の距離を定量化したところ、RELN欠失親子群は最も距離が短く、アイソジェニック株においても親株と比べると短い距離を示した（図４Ｃ）。このことから、RELN欠失株は真っ直ぐ遊走していないことが予想される。実際、総移動距離と2点間の距離の比（2点間の距離／総移動距離）をとってみると、RELN欠失の全ての群で有意な低値が認められ、RELN欠失神経細胞は遊走の方向性を失っていることが明らかとなった。【００９０】
神経遊走方向についてさらに詳細に解析するため、細胞ひとつひとつの各点における遊走角度を計測した。測定メトリクスは図４Ｅに示した。Cellnの遊走角度（αCelln）は標準軸とCellnの位置ベクトルがなす角度と定義した。正の角度は反時計回りを示し、負の角度は時計回りを示す。図４ＦとＧに示したように、健常対照群では各点の角度はほとんどが-20°＜αCell n ＜20°（201B7:87%、CON779:83%、CON1004: 80%）であった。一方で、RELN欠失群では、SCZ339:50%、FAM258:47%、Ig201B7((+/-): 71%, Ig201B7(-/-): 65%, IgCON779(+/-): 73%、IgCON779(-/-): 70%となり、RELN欠失によって、通常の神経遊走方向の指向性を失っていた。角度による分布の比較でも、RELN欠失による有意な角度変化が認められた（図４Ｇ）。以上から、reelinの減少はヒト神経細胞のランダムな遊走を引き起こすことが明らかになった。【００９１】
３．まとめ
神経発達に関わるreelinの遺伝子（RELN）に生じる変異は、統合失調症や自閉スペクトラム症の発症に関わると考えられているが、発症に至る分子メカニズムの詳細は明らかになっていない。この課題に取り組むため、先天性にRELN欠失を保有する人からiPS細胞を樹立するとともに、ゲノム編集を利用してRELN欠失アイソジェニック株を作製した。新たに確立したプロトコルでTH陽性神経細胞に分化誘導させ、その特性を検討した。まず、樹立したiPS細胞をTH陽性神経細胞へと分化誘導させたところ、対照株に比べ、RELN欠失株ではreelinの発現低下が認められた。しかし、TH陽性神経細胞への分化効率についてはRELN欠失の有無は影響なく、全ての群で高効率に誘導が可能であった。つまり、確立したプロトコルを用いると、RELN欠失の有無にかかわらず、等質性の高いTH陽性細胞での解析が可能であった。RELN欠失TH陽性神経細胞の遊走性を解析したところ、対照神経細胞と比べた最大の特徴は神経遊走方向の統制がとれなくなることであった。リアルタイムライブイメージング観察の結果、対照神経細胞は方向性が一定の遊走が見られるのに対し、RELN欠失神経細胞は方向性が一定しない遊走が確認された。これは、遊走方向の角度を定量化する、極座標ヒストグラム解析によっても再確認された。本結果は、ヒト脳におけるreelinの機能の一端を解明したと考えられ、精神疾患発症の脆弱性現象を模倣していると予想される。RELN欠失iPS細胞はヒトにおける脳発達障害の解明ツールに新たな知見をもたらし、治療薬開発に役立つだろう。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明の調製方法によれば、特殊な装置を用いなくとも、特異的／効率的に、しかも短期間で多能性幹細胞からドパミン神経細胞を調製することが可能となる。本発明の調製方法で得られるドパミン神経細胞は、各種神経疾患に対する治療薬ないし移植材料として利用され得る。また、実験ツールとしても有用であり、各種アッセイに利用され得る。【００９３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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