(57)【要約】  本発明は、ペプチド結合を有する高分子を高収率かつ短時間で製造する方法を提供することを目的とする。本発明によれば、ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、（Ａ）未保護のシステイン残基を有する高分子断片１と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片２とを、ＮＣＬ法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２を得る工程、および（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法が提供される。工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返すことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、
（Ａ）未保護のシステイン残基を有する高分子断片１：
【化１】
2019035478.tif 000023
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表す。）
と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片２：
【化２】
2019035478.tif 000024
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表し、Ｘはカルボキシル基の活性化基を表す。）
とを、ネイティブケミカルライゲーション法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２：
【化３】
2019035478.tif 000025
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表す。）
を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２：
【化４】
2019035478.tif 000026
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表す。）
を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法。
【請求項２】
工程（Ｂ）の後に、（Ｃ）脱保護剤を不活性化させる工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
不活性化剤を脱保護剤の添加量を上回る量で存在させる、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返す、請求項２または３に記載の製造方法。
【請求項５】
工程（Ｃ）の後に、得られた高分子断片を精製する工程を実施せずに、次の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施する、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を４回または５回繰り返して実施した場合に、ペプチド結合を有する高分子の収率が２５〜３５％である、請求項４または５に記載の製造方法。
【請求項７】
ペプチド結合を有する高分子が、ペプチドであり、
高分子断片１が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１であり、
高分子断片２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２であり、
保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２であり、
未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
脱保護剤が、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
保護基が、請求項８に記載の脱保護剤により脱保護される基である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
不活性化剤が、チオール系化合物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
反応系において、工程（Ａ）で得られた高分子断片に対する脱保護剤の１回当たりの添加量の比率（モル比）が、１〜３０である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国出願である特願２０１７−１５７７５１（出願日：２０１７年８月１８日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ネイティブケミカルライゲーション法による高分子の製造方法に関し、さらに詳細には、ネイティブケミカルライゲーション法によるペプチドおよびタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチドを合成する手法としては固相法と液相法が知られている。固相法ではＣ末端からＮ末端に向かって１アミノ酸ずつ鎖長を延長するため、固相法により合成されるペプチド鎖は１００アミノ酸程度が上限である。このため長鎖のペプチドを合成する場合には、生合成やペプチド鎖を連結する手法が用いられている。【０００４】
ペプチド鎖連結手法としては、これまでにネイティブケミカルライゲーション法（Native Chemical Ligation、ＮＣＬ法）が広く用いられている。ＮＣＬ法は、Ｃ末端にαカルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチドと、Ｎ末端にシステイン残基を有するペプチドとの化学選択反応であり、無保護のペプチド断片を用いて緩衝溶液中で混合するのみで、ペプチド結合を介して二つのペプチド断片を連結することができる。このためＮＣＬ法は、複数のペプチド断片を連結させて人工タンパク質を創製する手法として利用されている。【０００５】
このようにＮＣＬ法によれば、液相で比較的長鎖のタンパク質を調製することができるが、ＮＣＬ法では、ペプチド断片を連結させるたびに連結したペプチド断片を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などの精製手段により精製する必要があった。このためＮＣＬ法により比較的長鎖のタンパク質を調製する場合には、ペプチド断片の連結工程が多ければ多いほど、時間がかかり、しかも収率が低くなるという課題があった。【０００６】
これまでに複数のペプチド断片をワンポットで連結させる手法が報告されている（非特許文献１）。しかしこの手法は、脱保護工程を強塩基条件下（ｐＨ１１以上）で実施するため、ペプチド鎖が分解されたりすることなど課題があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tang S. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 54:5713-5717(2015)
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ペプチド結合を有する高分子（特に、ペプチドおよびタンパク質）を高収率かつ短時間で製造する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明者らは、今般、脱保護剤として使用可能なパラジウム錯体をＮＣＬ法の促進剤である４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）によって不活性化できること、ＮＣＬ法によるペプチド断片の連結反応において、脱保護剤であるパラジウム錯体の添加とパラジウム錯体の不活性化をワンポットで連続的に実施できること、５つのペプチド断片をＮＣＬ法により順次連結させる際にパラジウム錯体の添加とＭＰＡＡによる不活性化を連続的に行うことで、約３０％の収率で１日以内に目的ペプチドを製造できることを見出した。本発明者らはまた、本発明が１００アミノ酸残基を超えるタンパク質の合成にも適用可能であることを確認した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１０】
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］ペプチド結合を有する高分子の製造方法であって、
（Ａ）未保護のシステイン残基を有する高分子断片１：
【化１】
2019035478.tif 000002
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表す。）
と、保護されたシステイン残基を有し、かつ、活性化された任意のアミノ酸残基を有する高分子断片２：
【化２】
2019035478.tif 000003
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表し、Ｘはカルボキシル基の活性化基を表す。）
とを、ＮＣＬ法により連結させて保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２：
【化３】
2019035478.tif 000004
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表し、Ｐｒはアミノ基の保護基を表す。）
を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２：
【化４】
2019035478.tif 000005
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、ＡＡは任意のアミノ酸残基を表す。）
を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法。
［２］工程（Ｂ）の後に、（Ｃ）脱保護剤を不活性化させる工程をさらに含む、上記［１］に記載の製造方法。
［３］不活性化剤を脱保護剤の添加量を上回る量で存在させる、上記［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返す、上記［２］または［３］に記載の製造方法。
［５］工程（Ｃ）の後に、得られた高分子断片を精製する工程を実施せずに、次の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施する、上記［４］に記載の製造方法。
［６］工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を４回または５回繰り返して実施した場合に、ペプチド結合を有する高分子の収率が２５〜３５％である、上記［４］または［５］に記載の製造方法。
［７］ペプチド結合を有する高分子が、ペプチドであり、
高分子断片１が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１であり、
高分子断片２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２であり、
保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２であり、
未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２が、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２である、
上記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法。
［８］脱保護剤が、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の製造方法。
［９］保護基が、上記［８］に記載の脱保護剤により脱保護される基である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の製造方法。
［１０］不活性化剤が、チオール系化合物である、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］反応系において、工程（Ａ）で得られた高分子断片に対する脱保護剤の１回当たりの添加量の比率（モル比）が、１〜３０である、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。
【００１１】
本発明の製造方法によれば、ＮＣＬ法において、複数のペプチド断片を連続してワンポットで連結させることができ、しかも目的産物を高い収率で得ることができる。本発明の製造方法はまた、反応系を極端なｐＨ値に調整せずに反応を実施することができることから、副反応産物の生成が低い点でも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明によりｎ個の高分子断片を連結させてｎ−１個のペプチド結合を有する高分子を製造する手順の模式図である。
【図２】図２は、本発明によりｎ個のペプチド断片を連結させてペプチドを製造する手順の模式図である。
【発明の具体的説明】
【００１３】
本発明の製造方法は、２種またはそれ以上の高分子断片を連結させてペプチド結合を有する高分子、すなわち、高分子断片がペプチド結合で連結されてなる高分子を製造する方法である。ペプチド結合を有する高分子としては、例えば、ペプチド、ペプチド結合を有する炭化水素分子、ペプチド結合を有するポリヌクレオチド分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド結合を有する樹脂が挙げられるが、典型的には、ペプチドである。なお、本発明においてペプチドとは、アミノ酸がペプチド結合により結合したものを意味し、ポリペプチドおよびタンパク質を含む意味で用いられるものとする。
【００１４】
高分子断片１および高分子断片２は、最終生産物であるペプチド結合を有する高分子を構成する高分子断片であり、かつ、システイン残基および場合によっては任意のアミノ酸残基を有する限り特に限定されるものではない。高分子断片としては、所定のアミノ酸残基を有するペプチド断片、炭化水素断片、ポリヌクレオチド断片、樹脂断片が挙げられるが、典型的には、ペプチド断片である。
【００１５】
工程（Ａ）の連結工程を効率的に実施するためには、高分子断片１および高分子断片２の分子量並びに繰り返し工程で新たに添加される高分子断片の分子量（数平均分子量）は、１０００〜１００００Ｄａとすることができる。また、最終産物として得られる高分子の分子量（数平均分子量）は、４０００〜５００００Ｄａ（好ましくは、５０００〜４００００Ｄａ）とすることができる。さらに、ペプチド断片を連結させてペプチドを製造する場合、工程（Ａ）の連結工程を効率的に実施するためには、ペプチド断片１およびペプチド断片２のアミノ酸数並びに繰り返し工程で新たに添加されるペプチド断片のアミノ酸数は、５〜１００個（好ましくは２０〜６０個）とすることができる。また、最終産物として得られるペプチドのアミノ酸数は、２０〜７００個、２５〜５００個または２５〜４００個とすることができる。
【００１６】
工程（Ａ）は、２種類の高分子断片を連結させる工程（連結工程）である。工程（Ａ）はネイティブケミカルライゲーション法（ＮＣＬ法）に基づいて実施するため、連結させる２種類の高分子断片のうち一方は、システイン残基（但し、そのＣ末端側（カルボキシル基）が高分子断片に結合し、そのＮ末端側（アミノ基）が未保護である）を有するもの（高分子断片１）である。また他方は、保護基により保護されたシステイン残基（但し、そのＣ末端側（カルボキシル基）が高分子断片に結合し、そのＮ末端側（アミノ基）が保護基により保護されている）と、任意のアミノ酸残基（但し、そのＮ末端側（アミノ基）が高分子断片に結合し、そのＣ末端側（カルボキシル基）が活性化基により活性化されている）とを有するもの（高分子断片２）である。高分子断片へのシステイン残基および任意のアミノ酸残基の導入方法並びに保護基および活性化基の導入方法は公知であり、当業者であれば市販の試薬および装置や適切な方法を選択して実施することができる。
【００１７】
ＮＣＬ法により高分子断片同士を連結させると、高分子断片１のシステイン残基（Ｎ末端）と、高分子断片２の活性化された任意のアミノ酸残基（Ｃ末端）とがペプチド結合した高分子断片１−２が得られる。この高分子断片１−２は、高分子断片２由来の保護されたシステイン残基を有しており、後述の通り、工程（Ｂ）によりこの保護基を脱保護することができる。
【００１８】
高分子断片がペプチド断片である場合には、Ｎ末端にシステイン残基を有するペプチド断片１と、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化基により活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２とをＮＣＬ法により連結させることができ、両者がペプチド結合したペプチド断片１−２が得られる。このペプチド断片１−２は、ペプチド断片２由来の保護されたシステイン残基をＮ末端に有しており、後述の通り、工程（Ｂ）によりこの保護基を脱保護することができる。ペプチド断片の合成方法並びにペプチド断片への保護基および活性化基の導入方法は公知であり、当業者であれば市販の試薬および装置や適切な方法を選択して実施することができる。
【００１９】
高分子断片２およびペプチド断片２のシステイン残基のアミノ基の保護基Ｐｒは、工程（Ｂ）で使用する脱保護剤により脱保護される限り特に限定されるものではないが、例えば、アリルオキシカルボニル基（以下、単に「Ａｌｏｃ基」ということがある）、トリアルキルシリルエチルオキシカルボニル基、アルキルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、プロパルギルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基、イソプロピルアリルオキシカルボニル基およびトリクロロエトキシカルボニル基が挙げられ、好ましくはＡｌｏｃ基である。
【００２０】
高分子断片２およびペプチド断片２の任意のアミノ酸残基のカルボキシル基の活性化基Ｘは、ＮＣＬ法によるペプチド結合の形成反応が進行する限り特に限定されるものではないが、例えば、チオエステル基（−ＳＲａ）、Ｎ−アシル−ベンズイミダゾリノン基（Ｎｂｚ基）が挙げられ、好ましくはチオエステル基、より好ましくはアルキルチオエステル基である。ここで、チオエステル基の基Ｒａは、ＮＣＬ法におけるチオエステル交換反応を阻害せず、カルボニル炭素上での置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されない。Ｒａは、例えば、置換または非置換のベンジル基、置換または非置換のアリール基および置換または非置換のアルキル基から選択することができ、好ましくは置換または非置換のベンジル基、置換または非置換のＣ６−１０アリール基（より好ましくは置換または非置換のフェニル基またはナフチル基）および置換または非置換のＣ１−８アルキル基（より好ましくはＣ１−６アルキル基）から選択することができる。
【００２１】
工程（Ａ）における高分子断片１と高分子断片２との連結並びにペプチド断片１とペプチド断片２との連結は、ＮＣＬ法によるペプチドの連結反応に基づいて実施することができる。ＮＣＬ法によるペプチドの連結反応は、チオエステル交換反応により進行するが、反応を促進するためにチオール系化合物（チオール触媒）を添加してもよい。このようなチオール系触媒としては、チオフェニル／ベンジルメルカプタン混合物、２−メルカプトエタンスルホナート（ＭＥＳＮａ）、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、ヒドロキシチオフェノールが挙げられる。チオール系触媒以外には、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）などの還元剤をＮＣＬ法の反応促進に用いてもよい。
【００２２】
工程（Ｂ）は、工程（Ａ）において得られた高分子断片１−２およびペプチド断片１−２上のシステイン残基のアミノ基の保護基を脱保護する工程（脱保護工程）である。脱保護された高分子断片１−２およびペプチド断片１−２は、次回以降の連結工程において、アミノ基が未保護のシステインを有する高分子断片およびＮ末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片として使用することができる。
【００２３】
脱保護は脱保護剤の添加により実施することができる。本発明において使用できる脱保護剤としては、リン系配位子、窒素系配位子、酸素系配位子または硫黄系配位子が配位結合した金属錯体が挙げられる。このような金属錯体としては、パラジウム錯体、プラチナ錯体、ニッケル錯体、ロジウム錯体、ルテニウム錯体、銅錯体および鉄錯体が挙げられる。また、リン系配位子としては、トリフェニルホスフィントリホスホン酸（ＴＰＰＴＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＭＰ）、トリフェニルホスフィンモノ（３−スルホン酸ナトリウム）（ＴＰＰＭＳ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）が挙げられる。リン系配位子が配位結合した金属錯体の好ましい例としては、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ、Ｐｄ／ＴＨＭＰ、Ｐｄ／ＴＰＰＭＳ、Ｐｄ／ＴＣＥＰが挙げられる。
【００２４】
システイン保護基の脱保護に使用可能な脱保護剤を例示すると以下の通りである。
アリルオキシカルボニル基：Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ
トリアルキルシリルエチルオキシカルボニル基：ＨＦ
アルキルオキシカルボニル基：Ｐｄ／Ｃ／水素
ベンジルオキシカルボニル基：Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ
プロパルギルオキシカルボニル基：トリフルオロメタンスルホン酸
アダマンチルオキシカルボニル基：Ｐｄ／ジベンジリデンアセトン（ｄｂａ）
イソプロピルアリルオキシカルボニル基：Ｚｎ／Ｈ＋
トリクロロエトキシカルボニル基：Ｚｎ／酢酸
【００２５】
高分子断片１−２およびペプチド断片１−２に対する脱保護剤１回添加量の比率（モル比）は、脱保護効果が得られる限り特に限定されるものではないが、例えば、１〜３０とすることができ、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜２である。
【００２６】
本発明において、工程（Ａ）および（Ｂ）並びに工程（Ｃ）は、脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施することができる。工程（Ｂ）で添加された脱保護剤は脱保護作用が完了した後、その場で不活性化することができる。このため、本発明においては、脱保護工程の後に、脱保護された高分子断片１−２またはペプチド断片１−２を精製する手順や、脱保護剤を分離する手順が不要になる。
【００２７】
本発明に使用できる不活性化剤は、反応系において脱保護剤を不活性化状態にできるものであれば特に限定されないが、脱保護剤が金属錯体である場合には、金属錯体の配位子として機能しうる物質を用いることができる。金属錯体の配位子として機能しうる物質としては、例えば、チオール系化合物が挙げられ、チオール系化合物としては、アルキルチオール系化合物（例えば、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ））、芳香族チオール系化合物（例えば、４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、ヒドロキシチオフェノール）が挙げられる。なお、本発明においては高分子断片やペプチド断片の連結をＮＣＬ法により実施することから、ＮＣＬ法による反応を阻害しないか、あるいは、ＮＣＬ法による反応をむしろ促進する物質を不活性化剤として用いることが望ましい。このような物質としては、チオール系化合物が挙げられ、好ましくはＭＰＡＡ、ヒドロキシチオフェノールである。
【００２８】
工程（Ｂ）で脱保護剤を添加することによって高分子断片１−２およびペプチド断片１−２が脱保護されるが、その後、添加した脱保護剤を不活性化させる工程（工程（Ｃ））を実施することができる。工程（Ｃ）では、例えば、反応系を撹拌することにより、添加した脱保護剤を、反応系に存在する不活性化剤により不活性化することができる。本発明においては、脱保護剤を添加した後に反応系を撹拌して高分子断片１−２およびペプチド断片１−２を脱保護し、撹拌を継続することによって添加した脱保護剤を不活性化させてもよい。すなわち、本発明においては、高分子断片１−２およびペプチド断片１−２の脱保護と、脱保護剤の不活性化を連続的に実施することができる。ここで、「撹拌」とは、反応溶液を混合により溶媒および溶質を均一化させるあらゆる手段を含む意味で用いられる。
【００２９】
不活性化剤は、反応系において脱保護剤の添加量を上回る量で存在させることができる。後述のように工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返す場合には、反応系の不活性化剤の量は、脱保護剤の添加量の合計量を上回る量とすることができる。脱保護剤１回添加量に対する反応系中の不活性化剤の比率（モル比）は、２〜５００とすることができ、好ましくは５〜１００、より好ましくは１０〜５０とすることができる。
【００３０】
本発明においては、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をさらに１回以上繰り返して３個以上の高分子断片またはペプチド断片を連結させることができる。以下、図１および２に従って、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）をｎ−１回繰り返してｎ個の高分子断片またはペプチド断片を連結した高分子を製造する態様について説明する。
【００３１】
本発明においては、１回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第１サイクル）の後、反応系においては脱保護剤が不活性化されている。従って、工程（Ｃ）の後に高分子断片１−２またはペプチド断片１−２を精製する工程を実施せずに（すなわち、ワンポットで連続的に）、次の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第２サイクル）を実施することができる。第２サイクル以降についても同様にして実施することができる。
【００３２】
図１の１回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）により得られた高分子断片１−２は、システイン残基（但し、Ｃ末端側が高分子断片に結合し、Ｎ末端側が未保護である）を有するものである。第２サイクルでは、高分子断片１−２と、保護基により保護されたシステイン残基（但し、Ｃ末端側が高分子断片に結合し、Ｎ末端側が保護基により保護されている）と、任意のアミノ酸残基（但し、Ｎ末端側が高分子断片に結合し、Ｃ末端側が活性化基により活性化されている）とを有する高分子断片３とを、工程（Ａ）に従ってＮＣＬ法により連結させて、保護基により保護されたアミノ基を有する高分子断片１−２−３を得ることができる。この高分子断片１−２−３はアミノ基が保護基により保護されたシステイン残基を有していることから、工程（Ｂ）に従って脱保護剤を添加することによって、高分子断片１−２−３上のシステイン残基のアミノ基の保護基を脱保護し、アミノ基が未保護のシステインを有する高分子断片１−２−３を得ることができる。そして、反応系に存在する脱保護剤は工程（Ｃ）に従って不活性化することができる。このようにして２回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第２サイクル）を完了させることができる。３回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第３サイクル）並びにそれ以降のサイクルは、上記の第２サイクルの記載に従って実施することができる。
【００３３】
また、図２の１回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）により得られたペプチド断片１−２は、Ｎ末端に未保護のシステイン残基を有するものである。第２サイクルでは、ペプチド断片１−２と、アミノ基が保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片３とを、工程（Ａ）に従ってＮＣＬ法により連結させて、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２−３を得ることができる。このペプチド断片１−２−３は、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有していることから、工程（Ｂ）に従って脱保護剤を添加することによって、ペプチド断片１−２−３上のシステイン残基のアミノ基の保護基を脱保護し、Ｎ末端に未保護のシステインを有する高分子断片１−２−３を得ることができる。そして、反応系に存在する脱保護剤は工程（Ｃ）に従って不活性化することができる。このようにして２回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第２サイクル）を完了させることができる。３回目の工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）（第３サイクル）並びにそれ以降のサイクルは、上記の第２サイクルの記載に従って実施することができる。
【００３４】
本発明においては、連結する高分子断片およびペプチド断片の個数に応じて、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を繰り返すことができる。すなわち、本発明において連結する高分子断片およびペプチド断片がｎ個（ｎは整数である）である場合、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）はｎ−１回実施することとなる。
【００３５】
但し、本発明の高分子の製造方法の最後の第ｎ−１サイクルにおいては、高分子断片ｎは、任意のアミノ酸残基（但し、Ｎ末端側が高分子断片に結合し、Ｃ末端側が活性化基により活性化されている）を有していればよく、システイン残基を有していないものを使用することができる。このような断片を最終サイクルに用いた場合には、第ｎ−１サイクルにおいて工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を省略することができる。もちろん、システイン残基（但し、Ｃ末端側が高分子断片に結合し、Ｎ末端側が保護基により保護されている）を有する高分子断片ｎを第ｎ−１サイクルで用いることもできるが、その場合には、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施できることはいうまでもない。
【００３６】
また、本発明のペプチドの製造方法の最後の第ｎ−１サイクルにおいては、ペプチド断片ｎは、Ｃ末端のカルボキシル基が活性化基により活性化されていればよく、システイン残基をＮ末端に有していないものを使用することができる。このような断片を最終サイクルに用いた場合には、第ｎ−１サイクルにおいて工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を省略することができる。もちろん、保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片ｎを第ｎ−１サイクルで用いることもできるが、その場合には、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施できることはいうまでもない。
【００３７】
本発明において連結できる高分子断片およびペプチド断片の個数ｎは、ＮＣＬ法による連結工程が進行する限り特に制限はないが、例えば、ｎの下限は２または３とすることができ、ｎの上限は１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５とすることができる。すなわち、本発明における工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の実施回数は、例えば、下限を１回または２回とすることができ、上限を１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４回とすることができる。
【００３８】
本発明においては、最終サイクル（第ｎ−１サイクル）の工程完了後に、得られた最終産物を精製する精製工程を実施することができる。最終産物の精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などの精製手段により実施することができる。
【００３９】
本発明においては、第１サイクルを実施した後、得られた中間産物（すなわち、高分子断片およびペプチド断片）を精製せずに、第２サイクル以降の工程を実施することができる。第２サイクル以降も同様に、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を実施した後、得られた中間産物を精製せずに、次のサイクルを実施することができる。中間産物の精製を行うと必然的に収率が低下するとともに、最終産物を得るまでに長期間を要することになるが、本発明では中間産物の精製を行わずに、ワンポットで連続的に高分子断片およびペプチド断片の連結を行うことができる。すなわち、本発明によれば、精製工程は、すべての高分子断片またはペプチド断片の連結の後に１回実施すればよい。従って、本発明によれば、結果として高収率かつ短時間で最終産物を製造することができる。例えば、３５〜４５アミノ酸のペプチドを本発明により４回の連結工程（４サイクル）で製造する場合には、最終産物のペプチドを収率２５〜３５％で１日以内に得ることができる。
【００４０】
本発明においては、ペプチド合成化学（特に、ＮＣＬ法によるペプチド合成方法）で使用される一般的な方法を特に制限なく採用することができる。例えば、本発明においては、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の後、あるいは、工程（Ａ）、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の繰り返し工程の後に、得られた産物を脱硫処理に付すことができる。脱硫処理によって、得られた産物のシステイン残基をアラニン残基に転換することができる。例えば、ペプチド結合を有する高分子がペプチドである場合には、目的とする最終産物のアミノ酸配列を考慮して、適宜脱硫処理を施すことができる。また、脱硫処理にあたっては、アラニン残基への転換を望まないシステイン残基をアセトアミドメチル基（Ａｃｍ基）等の保護基によりあらかじめ保護しておき、脱硫処理後に該保護基を脱保護することにより、所定の位置にシステイン残基を有するペプチドを得ることができる。
【００４１】
本発明はまた、ペプチドの液相合成法に適用されるものである。ここで、「ペプチドの液相合成法」とは、固相合成法とは区別されることを意味し、全ての試薬が溶媒に溶解している場合のほか、試薬の一部または全部が溶媒に溶解せず、懸濁、分散等しているいわゆる不均一反応も本発明に含まれるものとする。
【００４２】
本発明の好ましい態様においては、ペプチド結合を有する高分子は、ペプチドである。この場合、
・高分子断片１は、Ｎ末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片であり、
・高分子断片２は、アミノ基が保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片であり、
・保護されたシステイン残基を有する高分子断片１−２は、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２であり、
・未保護のシステイン残基を有する高分子断片１−２は、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２である。
【００４３】
すなわち、本発明の好ましい態様によれば、ペプチドの製造方法であって、
（Ａ）Ｎ末端に未保護のシステイン残基を有するペプチド断片１：
【化５】
2019035478.tif 000006
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片１の一部である。）
と、アミノ基が保護されたシステイン残基をＮ末端に有し、かつ、カルボキシル基が活性化された任意のアミノ酸残基をＣ末端に有するペプチド断片２：
【化６】
2019035478.tif 000007
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片２の一部であり、Ｐｒはアミノ基の保護基を表し、Ｘはカルボキシル基の活性化基を表す。）
とを、ＮＣＬ法により連結させて、アミノ基が保護基により保護されたシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２：
【化７】
2019035478.tif 000008
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片１−２の一部であり、Ｐｒはアミノ基の保護基を表す。）
を得る工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）の後に、脱保護剤を添加して、アミノ基が未保護のシステイン残基をＮ末端に有するペプチド断片１−２：
【化８】
2019035478.tif 000009
（上記式中、Ｃｙｓはシステイン残基を表し、Ｃｙｓはペプチド断片１−２の一部である。）
を得る工程を含んでなり、工程（Ａ）および（Ｂ）を脱保護剤の不活性化剤が存在する反応系で実施する、製造方法が提供される。
【００４４】
本発明のペプチドの製造方法は、本発明の高分子の製造方法についての記載に従って実施することができる。なお、本明細書および図面においてペプチドおよびペプチド断片の化学式および模式図は、特に断りがない限り、向かって左側がＮ末端であり、右側がＣ末端である。
【実施例】
【００４５】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。【００４６】
例１：４−メルカプトフェニル酢酸によるＰｄ／ＴＰＰＴＳの不活性化
ワンポットにおけるペプチド連結法を確立するため、Ａｌｏｃ基の脱保護剤として機能するパラジウム／トリフェニルホスフィン（Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ）を不活性化する方法について検討した。【００４７】
（１）ＮＣＬ緩衝溶液におけるＰｄ／ＴＰＰＴＳ活性の検討
２ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（６Ｍ  塩酸グアニジン、０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、４０ｍＭ  トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）２００μＬに、Ｎ末端がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドを２ｍＭとなるように溶解した。次いで、６Ｎ  塩酸で反応溶液のｐＨを６．０に低下させ、アルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ（４ｍＭ）を添加し、反応溶液を室温で２時間攪拌して、Ａｌｏｃ基の脱保護反応を行った。【００４８】
Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加してから３分後、１時間後および２時間後における反応溶液中のＡｌｏｃ基が脱保護されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより分析したところ、それぞれの変換収率（原料ペプチドの消費効率に基づく値、以下同様）（conversion yield）は２６％、４８％および４８％であった。この結果は、Ａｌｏｃ基の脱保護反応がＰｄ／ＴＰＰＴＳ添加後直ちに進行し、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ添加から１〜２時間後においては脱保護反応は進行していないことを示している。これは、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加後、反応溶液の撹拌を継続することにより、Ｐｄの配位子であるＴＰＰＴＳがＭＰＡＡによって置き換えられ、Ｐｄが不活性化されたためと考えられた。なお、実施例を通してＲＰ−ＨＰＬＣは以下の条件で実施した。【００４９】
＜ＲＰ−ＨＰＬＣ＞
カラム：ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク社製）
カラム温度：室温
流速：１．０ｍＬ／分
試料導入量：２０μＬ
溶離液：水、アセトニトリル
グラジエント：５〜４０％（３５分間）
検出器：ＰＤＡ検出器【００５０】
（２）Ｐｄ／ＴＰＰＴＳの不活性化条件の検討
ＭＰＡＡによるＰｄ／ＴＰＰＴＳの不活性化の条件を検討した。具体的には、０．６ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（６Ｍ  塩酸グアニジン、０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、４０ｍＭ  トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．０）２５μＬに、４ｍＭ、８ｍＭまたは１２ｍＭとなるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加した。Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化するため、反応溶液を室温で１時間撹拌した。次いで、各反応溶液にＮ末端がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドを２ｍＭとなるように添加し、室温で１０分間撹拌した。【００５１】
Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加した各反応溶液中のＡｌｏｃ基が脱保護されたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで分析したところ、それぞれの変換収率は０％、０％および０％であった。この結果は、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ添加量が増えてもＡｌｏｃ基の脱保護反応は進行していないことを示している。すなわち、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを含む反応溶液の不活性化は、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ添加量によらず、Ｐｄ／ＴＰＰＴＳを添加したＮＣＬ緩衝溶液を室温で１時間攪拌することにより達成されることが確認された。【００５２】
例２：ワンポットにおけるペプチド断片のＮＣＬ
（１）ペプチド断片の合成
ペプチド１：ＬＥＮＶＷＲＤ（配列番号１）、ペプチド２：ＣＶＴＹＴＥＨ（配列番号２）、ペプチド３：ＣＫＲＫＴＶＴ（配列番号３）、ペプチド４：ＣＲＤＶＴＹ（配列番号４）、ペプチド５：ＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号５）をペプチド合成機ＲｅｓＰｅｐ ＳＬ（ＩＮＴＡＶＩＳ社製）を用いてＦｍｏｃ法による固相合成法により合成した。Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドは、Ａｌｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｃａｓ：９６８６５−７２−４、Ｌ０１８０７、渡辺化学工業社製）を用いて上記固相合成法を行うことにより調製した。Ｃ末端がチオエステル化されたペプチドは、上記固相合成法を行うことにより調製したペプチドに２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）を反応させ、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製することにより調製した。【００５３】
（２）ペプチド４とペプチド５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結
【化９】
2019035478.tif 000010
【００５４】
２ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（６Ｍ  塩酸グアニジン、０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ  ４−メルカプトフェニル酢酸（ＭＰＡＡ）、４０ｍＭ  トリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、６ｍＭ  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）２００μＬに、ペプチド５を２ｍＭとなるように溶解した。この緩衝溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド４を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ  水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド４とペプチド５とが連結されたペプチドＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号６）（以下、ペプチド４−５という）を得た。得られたペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９７％であることを確認した。なお、実施例を通してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは以下の条件で実施した。【００５５】
＜ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ＞
質量分析装置：ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（ＢＲＵＫＥＲ社製）
測定モード：リフレクター・ポジティブ
マトリックス：α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）【００５６】
ペプチドの脱保護
【化１０】
2019035478.tif 000011
【００５７】
次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ  塩酸で６．０に低下させ、アルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド４−５に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド４−５を得た。また、サンプルの一部を上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９９％であることを確認した。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。【００５８】
（３）ペプチド３とペプチド４−５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結
【化１１】
2019035478.tif 000012
【００５９】
ペプチド４−５を含む上記（２）の反応溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド３を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ  水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド３とペプチド４−５とが連結されたペプチドＣＫＲＫＴＶＴＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号７）（以下、ペプチド３−４−５という）を得た。得られたペプチドを上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が８２％であることを確認した。【００６０】
ペプチドの脱保護
【化１２】
2019035478.tif 000013
【００６１】
次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ  塩酸で６．０に低下させ、溶液をアルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド３−４−５に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド３−４−５を得た。また、サンプルの一部を上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９８％であることを確認した。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。【００６２】
（４）ペプチド２とペプチド３−４−５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結
【化１３】
2019035478.tif 000014
【００６３】
ペプチド３−４−５を含む上記（３）の反応溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド２を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ  水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド２とペプチド３−４−５とが連結されたペプチドＣＶＴＹＴＥＨＣＫＲＫＴＶＴＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号８）（以下、ペプチド２−３−４−５という）を得た。得られたペプチドを上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９６％であることを確認した。【００６４】
ペプチドの脱保護
【化１４】
2019035478.tif 000015
【００６５】
次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ  塩酸で６．０に低下させ、溶液をアルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド２−３−４−５に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド２−３−４−５を得た。また、サンプルの一部を上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９７％であることを確認した。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。【００６６】
（５）ペプチド１とペプチド２−３−４−５との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結
【化１５】
2019035478.tif 000016
【００６７】
ペプチド２−３−４−５を含む上記（４）の反応溶液に、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド１を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ  水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド１とペプチド２−３−４−５とが連結されたペプチドＬＥＮＶＷＲＤＣＶＴＹＴＥＨＣＫＲＫＴＶＴＣＲＤＶＴＹＣＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号９）（以下、ペプチド１−２−３−４−５という）を得た。得られたペプチドを上記と同様の条件でＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析し、変換収率が９８％であることを確認した。【００６８】
（６）ＭＰＡＡ除去および脱硫処理
ペプチド１−２−３−４−５を含む上記（５）の反応溶液を、６Ｎ  塩酸を用いてｐＨ０．５〜１．０に調整した。次いで、脱硫反応を阻害するＭＰＡＡを除去するため、ジエチルエーテルを反応溶液に添加し１０秒間激しく攪拌した後、エーテル層を除去した。これらの操作を４回繰り返した後、加熱することによってエーテルを完全に除去した。【００６９】
ペプチド１−２−３−４−５を脱硫するため、反応溶液に６Ｎ  水酸化ナトリウム溶液を添加し、反応溶液のｐＨ値を中性に調整し、５００ｍＭ  ＴＣＥＰ、５％  ２−メチル−２−プロパンチオール（ｔＢｕＳＨ）および２０ｍＭ  ２、２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ−０４４、和光純薬工業社製）を添加し、３７℃で７時間撹拌した。生成物をＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ（測定モード：リニアー・ポジティブとした以外は上記（２）と同様の条件）により確認した。脱硫されたペプチドＬＥＮＷＩＲＤＡＶＴＹＴＥＨＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＴＹＡＬＫＲＱＧＲＴＬＹＧＦＧＧ（配列番号１０）が確認され、また、４回のＮＣＬ、３回のＡｌｏｃ基脱保護および脱硫処理実施後のペプチド（配列番号１０）の総収率（ペプチド５に対する配列番号１０のペプチドのモル比）（total yield）は約２９．５％であることを確認した。【００７０】
例３：ワンポットにおけるペプチド断片の連結によるヒストンＨ３の化学合成
（１）ヒストンＨ３のリジン残基のトリメチル化
ヒストンＨ３のＫ９位置のリジン残基（Ｋ）のトリメチル化（ｍｅ３）（以下、「Ｈ３Ｋ９ｍｅ３」ということがある。）は、最も有名なヒストン修飾の１つであり、遺伝子サイレンシングの重要な特徴である。この修飾は、ヘテロクロマチンの形成に寄与する。ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）は、π−カチオン相互作用によってそのクロモドメイン（ＣＤ）によってＨ３Ｋ９ｍｅ３を認識し、クロモシャドウドメイン（ＣＳＤ）を介して二量体化する。豊富なヒストンＨ３Ｋ９ｍｅ３マーカーが存在すると、ＨＰ１はそのＣＤおよびＣＳＤドメインを介してヘテロクロマチン形成を誘導する。【００７１】
最近、低温ＥＭ法によって決定されたＨＰ１−Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ダイヌクレオソーム複合体の構造が報告されている（Machida S. et al., Mol Cell. 69(3):385-397(2018)）。この報告によると、Ｋ９位置でリジン残基の代わりにシステイン残基を導入し、Ｋｍｅ３アナログを使用してこの複合体を再構成した。しかし、他のグループによると、このＫｍｅ３類似体が元のＫｍｅ３と同じ性質を有していないことが報告されている。化学的タンパク質合成は、突然変異なしにＫ９ｍｅ３を有するヒストンＨ３を合成する唯一の方法である。そこで、ワンポットライゲーション法によりＫ９ｍｅ３を有するヒストンＨ３を合成することにした。【００７２】
ヒストンＨ３の全配列は、３つのペプチド断片に分割され、ヒストンＨ３の元のシステイン残基はＡｃｍ（アセトアミドメチル）基によって保護される。ライゲーション部位のシステイン残基をアラニン残基に変換するための脱硫後、Ａｃｍ基は除去されるべきである。最も広く使用されている方法はヨウ素による酸化であるが、この反応条件はしばしばメチオニン（Ｍｅｔ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）の酸化を引き起こす。他の方法は、ＡｃＯＨ／水＝１：１の条件で酢酸銀を使用する。しかしながら、過剰の銀イオンは、反応中に容易にタンパク質の凝集を引き起こす。最近、変性バッファー中におけるパラジウム錯体によるＡｃｍ基の脱保護が報告されている（Maity SK et al., Angew Chem Int Ed Engl. 55(28):8108-12(2016)）。この脱保護反応は迅速に進行し、１時間以内に完了した。しかしながら、Ａｌｏｃ基の脱保護に用いられるＰｄ／ＴＰＰＴＳ複合体がシステイン（Ａｃｍ）の脱保護を誘導した可能性があった。【００７３】
（２）Ａｌｏｃ基およびＡｃｍ基の除去の検討
Ｎ末端システイン残基の保護のためのＡｌｏｃ基および内部システイン残基の保護のためのＡｃｍ基が選択的に除去できるかどうかを試験した。ＮＣＬ条件下で２当量のＰｄ／ＴＰＰＴＳ錯体でＡｌｏｃ基が除去されたことが確認された。一方、Ａｃｍ基は同じ条件下で全く脱保護されなかった。次に、ＰｄＣｌ２錯体を用いてＡｃｍ基を除去した。この保護基は１０当量のＰｄＣｌ２錯体で２０分以内に除去された。Ａｌｏｃ基も同じ条件下で除去されたが、反応速度はＡｃｍ基に比べて非常に遅かった。【００７４】
要約すると、Ａｌｏｃ基はＰｄ／ＴＰＰＴＳ錯体で除去され、Ａｃｍ基はＰｄＣｌ２錯体で選択的に除去された。Ｐｄ／ＴＰＰＴＳ錯体は電子が豊富であり、辻−トロスト反応を含むいくつかのクロスカップリング反応に適している。さらに、その非常に立体障害のある特性は、Ａｃｍ基のチオエーテルへの配位を妨げる。対照的に、ＰｄＣｌ２錯体は電子求引性分子によって取り囲まれ、ルイス酸として機能する。立体障害の少ない構造は、Ａｃｍ基の除去を誘発するチオエーテル基への配位を可能にする。したがって、Ａｌｏｃ基およびＡｃｍ基は、パラジウム錯体の電子および立体特性に依存して選択的に除去された。【００７５】
（３）バリン残基−システイン残基間連結の促進
通常、バリン残基−システイン残基間のＮＣＬ法による連結は、β−分枝形成の立体障害が原因でチオエステル交換が妨げられたため非常に遅かった。従前のヒストンＨ３の化学合成では、この連結を完了するのに約４８時間かかった。本発明では標準的なバリン残基の代わりにペニシラミンを導入した。側鎖のチオール基はＣ末端チオエステルを攻撃して４員環を形成することが確認された。この状態は、４員環上に２つのメチル基が存在することによるソープ・インゴールド効果（Thorpe-Ingold Effect）によって安定化される（Y. Wang et al., Chem. Sci., 9:1940-1946(2018）参照）。この歪んだチオエステル形成は、バリン残基とシステイン残基の間の連結を容易にした。【００７６】
（４）ペプチド断片の合成
下記のペプチド６、ペプチド７およびペプチド８をペプチド合成機ＲｅｓＰｅｐ ＳＬ（ＩＮＴＡＶＩＳ社製）を用いてＦｍｏｃ法による固相合成法により合成した。【００７７】
ペプチド６：ＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＸ（配列番号１１）
（９番目のアミノ酸残基はトリメチル化リジンである。４６番目のＸはペニシラミン（Ｄ−ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ、（２Ｓ）−２−アミノ−３−メチル−３−スルファニルブタン酸）を表す。）
ペプチド７：ＣＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳ（配列番号１２）
ペプチド８：ＣＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１３）
（９番目および２３番目のアミノ酸残基はＡｃｍ基で保護されたシステイン残基である。）【００７８】
Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基で保護されたペプチドは、Ａｌｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｃａｓ：９６８６５−７２−４、Ｌ０１８０７、渡辺化学工業社製）を用いて上記固相合成法を行うことにより調製した。Ｃ末端がチオエステル化されたペプチドは、上記固相合成法を行うことにより調製したペプチドに２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮａ）を反応させ、次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製することにより調製した。【００７９】
ペプチド６の９番目のアミノ酸残基は、トリメチルリジンのＦｍｏｃ体（α炭素に結合したアミノ基が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）により保護されたトリメチルリジン）を用いて上記固相合成法を行うことにより導入した。トリメチルリジンのＦｍｏｃ体は公知の方法（R Wieneke et al., Org. Biomol. Chem., 9: 5482-5486(2011)およびR. Baba et al., J. Am. Chem. Soc., 134 (35):14310-14313( 2012)参照、市販品を利用可能）に従って合成した。ペプチド６の４６番目のアミノ酸残基は、Ｓ−トリチル−Ｌ−ペニシラミンのＦｍｏｃ体（α炭素に結合したアミノ基がＦｍｏｃ基により保護されたＳ−トリチル−Ｌ−ペニシラミン）を用いて上記固相合成法を行うことにより導入した（Y. Wang et al., Chem. Sci., 9:1940-1946(2018）参照）。Ｓ−トリチル−Ｌ−ペニシラミンのＦｍｏｃ体は市販品（SIGMA-ALDRICH社製）を用いた。ペプチド８の９番目および２３番目のアミノ酸残基は、Ａｃｍ基で保護されたシステイン残基であり、チオール基がＡｃｍ基で保護されたシステインのＦｍｏｃ体（α炭素に結合したアミノ基がＦｍｏｃ基により保護されたＳ−アセトアミドメチル−Ｌ−システイン）を用いて上記固相合成法を行うことにより導入した。Ｓ−アセトアミドメチル−Ｌ−システインのＦｍｏｃ体は市販品（渡辺化学工業社製）を用いた。【００８０】
（５）ペプチド７とペプチド８との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結
【化１６】
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【００８１】
２ｍＬチューブにおいてＮＣＬ緩衝溶液（例２（２）と同様）２００μＬに、ペプチド８を２ｍＭとなるように溶解した。この緩衝溶液に、Ｎ末端のシステイン残基がＡｌｏｃ基により保護され、Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド７を２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ  水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド７とペプチド８とが連結されたペプチドＣＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＣＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１４）（以下、ペプチド７−８という。５０番目および６４番目のアミノ酸残基はＡｃｍ基で保護されたシステイン残基である。）を得た。なお、ＮＣＬ法による連結反応の開始から１時間後、２つの出発物質が完全に消失した。【００８２】
ペプチドのＡｌｏｃ基の脱保護
【化１７】
2019035478.tif 000018
【００８３】
次いで、反応溶液のｐＨを６Ｎ  塩酸で６．０に低下させ、アルゴンガスでバブリングして酸素を脱気し、ペプチド７−８に対して２当量となるようにＰｄ／ＴＰＰＴＳを添加し、反応溶液を室温で１０分間攪拌することにより、Ｎ末端が脱保護（Deprotection）されたペプチド７−８を得た。反応溶液を引き続いて室温で５０分間撹拌することにより、添加したＰｄ／ＴＰＰＴＳを不活性化した。【００８４】
（６）ペプチド６とペプチド７−８との連結
ＮＣＬ法によるペプチドの連結
【化１８】
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【００８５】
Ｃ末端がチオエステル化されたペプチド６は、ソープ・インゴールド効果（Y. Wang et al., Chem. Sci., 9:1940-1946(2018）参照）により、該ペプチドのＣ末端で４員環を安定的に形成した。【００８６】
【化１９】
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【００８７】
Ｃ末端で４員環を形成させたペプチド６をペプチド７−８を含む上記（５）の反応溶液に２ｍＭとなるように添加した。反応溶液を６Ｎ  水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整した後、３７℃で２時間攪拌することによりＮＣＬ法による連結反応を実施し、ペプチド６とペプチド７−８とが連結されたＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＸＣＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＣＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１５）（以下、ペプチド６−７−８という。９６番目および１１０番目のアミノ酸残基はＡｃｍ基で保護されたシステイン残基である。Ｘはペニシラミン残基を表す。）を得た。【００８８】
混合物を水−アセトニトリル混合物で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物を３９％の単離収率（ペプチド７−８に対する配列番号１５のペプチドのモル比）（isolated yield）で得た。ペプチドの純度はＲＰ−ＨＰＬＣで確認し、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（測定モード：リニアー・ポジティブとした以外は例２（２）と同様の条件）によって同定した。【００８９】
（７）脱硫処理
【化２０】
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【００９０】
粉末化したペプチド６−７−８に、５００ｍＭ  ＴＣＥＰ、ＧＳＨ（グルタチオン、ナカライテスク社製）および２０ｍＭ  ２、２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩（ＶＡ−０４４、和光純薬工業社製）を変性条件下で添加して、全てのシステイン変異をアラニン残基に、またペニシラミンをバリン残基に変換した。２．５時間後、反応が完了し、反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、脱硫（Desulfurization）されたペプチドＡＲＴＫＱＴＡＲＫＳＴＧＧＫＡＰＲＫＱＬＡＴＫＡＡＲＫＳＡＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＶＡＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＶＲＥＩＡＱＤＦＫＴＤＬＲＦＱＳＳＡＶＭＡＬＱＥＡＣＥＡＹＬＶＧＬＦＥＤＴＮＬＣＡＩＨＡＫＲＶＴＩＭＰＫＤＩＱＬＡＲＲＩＲＧＥＲＡ（配列番号１６）を得た。脱硫の収率（脱硫前のペプチドに対する脱硫後のペプチドのモル比）は６５％であった。ペプチドの純度をＲＰ−ＨＰＬＣで確認し、分子量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって同定した。【００９１】
（８）Ａｃｍ基の脱保護およびＭＰＡＡ除去
【化２１】
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【００９２】
粉末化したペプチド６−７−８に対して１０当量のＰｄＣｌ２錯体を、ｐＨ３．０の変性条件下で加えて、内部システイン残基のＡｃｍ保護基を除去した。１時間後、反応が完了し、中性ｐＨで反応混合物にＰｄＣｌ２錯体に対して５００当量のＤＴＴを添加して、全てのパラジウムをペプチド６−７−８から分離した。次いで、反応混合物を水−アセトニトリル混合物で希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製してＡｃｍ基が脱保護された配列番号１７のペプチドを得た。ＨＰＬＣによりペプチド６−７−８の純度を確認し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分子量を確認した。Ａｃｍ基の脱保護の収率（脱保護前のペプチドに対する脱保護後のペプチドのモル比）は８２％であった。また、２回のＮＣＬ、１回のＡｌｏｃ基脱保護、脱硫処理およびＡｃｍ基脱保護実施後のペプチド（配列番号１７）の総収率（ペプチド８に対する配列番号１７のペプチドのモル比）は約２１％であることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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