(57)【要約】多能性幹細胞をFGF2、レチノイン酸およびBMP4を含む培養液中で培養することにより神経堤細胞を製造し、神経堤細胞をサイトカインおよびBMP4を含む培養液中で培養することにより交感神経前駆細胞を製造し、さらに、交感神経前駆細胞を神経栄養因子を含む培養液中で培養することにより交感神経細胞を製造する。
2018199142.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞をFGF（Fibroblast growth factor）2、レチノイン酸およびBMP（Bone morphogenetic protein）4を含む培養液中で培養する工程を含む、神経堤細胞の製造方法。
【請求項２】
FGF2の濃度が1ng／ml〜100ng／mlであり、レチノイン酸の濃度が10nM〜10μMであり、BMP4の濃度が5 ng/ml〜150 ng/mlである、請求項１に記載の神経堤細胞の製造方法。
【請求項３】
多能性幹細胞をGSK（Glycogen synthase kinase）3β阻害剤およびTGF（Transforming growth factor）β阻害剤を含む培養液中で培養し、その後、FGF2、レチノイン酸およびBMP4を含む培養液中で培養する、請求項１または２に記載の神経堤細胞の製造方法。
【請求項４】
前記培養は浮遊培養で行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の神経堤細胞の製造方法。
【請求項５】
CD49dによる選別工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の神経堤細胞の製造方法。
【請求項６】
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の神経堤細胞の製造方法。
【請求項７】
神経堤細胞をサイトカインおよびBMP4を含む培養液中で培養し、交感神経前駆細胞を誘導する工程を含む、交感神経前駆細胞の製造方法。
【請求項８】
サイトカインがEGF（Epidermal growth factor）およびFGF2である、請求項７に記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
【請求項９】
BMP4の濃度が5 ng/ml〜150 ng/mlであり、EGFの濃度が1ng／ml〜100ng／mlであり、FGF2の濃度が1ng／ml〜100ng／mlである、請求項８に記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記培養は浮遊培養で行われる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
【請求項１１】
神経堤細胞が請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって得られた、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって神経堤細胞を製造し、得られた神経堤細胞を用いて請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法によって交感神経前駆細胞を製造する、交感神経前駆細胞の製造方法。
【請求項１３】
請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法により交感神経前駆細胞を製造する工程、および得られた交感神経前駆細胞を神経栄養因子を含有する培養液中で培養して交感神経前駆細胞を交感神経細胞に成熟させる工程を含む、交感神経細胞の製造方法。
【請求項１４】
前記神経栄養因子は、NGF（Nerve growth factor）、BDNF（Brain-derived neurotrophic factor）およびGDNF（Glial cell line-derived neurotrophic factor）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法によって得られた交感神経細胞。
【請求項１６】
請求項１３または１４に記載の方法によって得られた交感神経細胞を含む交感神経障害治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から神経堤細胞を製造する方法、および神経堤細胞から交感神経前駆細胞さらには交感神経細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
交感神経は末梢自律神経であり、循環、呼吸、消化、発汗・体温調節、内分泌機能、生殖機能、および代謝といった不随意な機能を制御する。発生学的には交感神経細胞は体幹部神経堤細胞に由来することが知られており、動物モデルにおいて分化誘導に関与する様々な因子が同定されている。多能性幹細胞より交感神経細胞を誘導する方法についてこれまでに幾つかの報告があるが、分化効率は十分ではない（非特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Huang, M. et al. Generating trunk neural crest from human pluripotent stem cells. Sci. Rep. 6, 19727 (2016).
【非特許文献２】Oh, Y. et al. Functional coupling with cardiac muscle promotes maturation of hPSC-derived sympathetic neurons. Cell Stem Cell 19, 95-106 (2016).
【非特許文献３】Zeltner, N. et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC based model of familial dysautonomia. Nat. Med. 22, 1421-1427 (2016).
【非特許文献４】Denham, M. et al. Multipotent caudal neural progenitors derived from human pluripotent stem cells that give rise to lineages of the central and peripheral nervous system. Stem Cells 33, 1759-1770 (2015).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の通り、交感神経分化プロトコルについて幾つかの報告があるが、分化効率は十分ではない。特異的な細胞表面マーカーが知られていないこと、および体幹部神経堤細胞の分化誘導法に関する報告が少ないことが、ヒト多能性幹細胞から交感神経への分化誘導系構築を妨げていると考えられる。
そこで、本発明は、多能性幹細胞から交感神経細胞を効率良く製造することを一つの課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らはまずＰＨＯＸ２Ｂ−ｅＧＦＰレポーター発現多能性幹細胞を使用して各分化ステージを詳細に検討することにより神経堤細胞（ＮＣＣ）を経て機能的交感神経細胞を得るための効率的なプロトコルを確立した。そしてこのプロトコルによって多能性幹細胞から高純度で交感神経細胞を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
［１］多能性幹細胞をFGF（Fibroblast growth factor）2、レチノイン酸およびBMP（Bone morphogenetic protein）4を含む培養液中で培養する工程を含む、神経堤細胞の製造方法。
［２］FGF2の濃度が1ng／ml〜100ng／mlであり、レチノイン酸の濃度が10nM〜10μMであり、BMP4の濃度が5 ng/ml〜150 ng/mlである、［１］に記載の神経堤細胞の製造方法。
［３］多能性幹細胞をGSK（Glycogen synthase kinase）3β阻害剤およびTGF（Transforming growth factor）β阻害剤を含む培養液中で培養し、その後、FGF2、レチノイン酸およびBMP4を含む培養液中で培養する、［１］または［２］に記載の神経堤細胞の製造方法。
［４］前記培養は浮遊培養で行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の神経堤細胞の製造方法。
［５］CD49dによる選別工程を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の神経堤細胞の製造方法。
［６］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］〜［５］のいずれかに記載の神経堤細胞の製造方法。
［７］神経堤細胞をサイトカインおよびBMP4を含む培養液中で培養し、交感神経前駆細胞を誘導する工程を含む、交感神経前駆細胞の製造方法。
［８］サイトカインがEGF（Epidermal growth factor）およびFGF2である、［７］に記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
［９］BMP4の濃度が5 ng/ml〜150 ng/mlであり、EGFの濃度が1ng／ml〜100ng／mlであり、FGF2の濃度が1ng／ml〜100ng／mlである、［８］に記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
［１０］前記培養は浮遊培養で行われる、［７］〜［９］のいずれかに記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
［１１］神経堤細胞が［１］〜［６］のいずれかに記載の方法によって得られた、［７］〜［１０］のいずれかに記載の交感神経前駆細胞の製造方法。
［１２］［１］〜［６］のいずれかに記載の方法によって神経堤細胞を製造し、得られた神経堤細胞を用いて［７］〜［１０］のいずれかに記載の方法によって交感神経前駆細胞を製造する、交感神経前駆細胞の製造方法。
［１３］［７］〜［１２］のいずれかに記載の方法により交感神経前駆細胞を製造する工程、および得られた交感神経前駆細胞を神経栄養因子を含有する培養液中で培養して交感神経前駆細胞を交感神経細胞に成熟させる工程を含む、交感神経細胞の製造方法。
［１４］前記神経栄養因子は、NGF（Nerve growth factor）、BDNF（Brain-derived neurotrophic factor）およびGDNF（Glial cell line-derived neurotrophic factor）である、［１３］に記載の方法。
［１５］［１３］または［１４］に記載の方法によって得られた交感神経細胞。
［１６］［１３］または［１４］に記載の方法によって得られた交感神経細胞を含む交感神経障害治療用組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、従来採取困難であったヒト交感神経細胞をヒト多能性幹細胞から作り出すことで、多くの研究に利用することが可能である。近年、多種多様な神経細胞がヒト多能性幹細胞から分化誘導され、それらを用いた再生医療・疾患モデルの作成・創薬スクリーニング・神経毒性評価などに用いられている。本発明で分化誘導された交感神経細胞も上記と同様に、再生医療や疾患モデルの作成、創薬などに応用可能であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ導入ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化条件と細胞プロファイル等についての解析結果を示す図。（ａ）ｈＰＳＣの前後軸と背腹軸の決定を調節するための培養条件の図。（ｂ）様々な条件下で分化させたＫｈＥＳ１  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ株の分化１０日目におけるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すヒートマップ像。（ｃ）ｂの条件（ｉ）〜（ｉｖ）の下の１０日目のＫｈＥＳ１  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ株由来凝集体の代表的なＦＣＭプロット。（ｄ）条件（ｉ）〜（ｉｖ）の下の１０日目の凝集体のＰＨＯＸ２Ｂ、ＳＯＸ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＦＯＸＤ３、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ８およびＨＯＸＣ９についてのＲＴ−ＰＣＲ解析。右の図はロンボメア（ｒ１〜８）および脊髄（頸髄および胸髄）領域におけるＨＯＸ遺伝子の発現パターンを示している。ＳＢ＝ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＲＡ＝レチノイン酸、Ｐｕｒ＝プルモルファミン、ＢＭＰ＝ＢＭＰ４、ＮＴ＝神経管、ＮＣＣ＝神経堤細胞、ＨＢ＝後脳、ＳＣ＝脊髄。
【図２】ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ導入ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化条件とマーカー発現プロファイル等についての解析結果を示す図。（ａ）交感神経系ＮＣＣ分化のための培養条件の図。（ｂ）ＫｈＥＳ１対照およびＫｈＥＳ１  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ株に由来する１０日目の凝集体の代表的な画像（スケールバー＝１００μｍ）。（ｃ）無選別およびＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋選別済みの１０日目の分化細胞のＰＨＯＸ２ＢおよびＳＯＸ１０についての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。白線の囲みは右のパネルにおいて拡大されている領域を示す。白色の矢頭はＰＨＯＸ２Ｂ＋ＳＯＸ１０−細胞を示している。（ｄ）ｃにおけるＰＨＯＸ２Ｂ＋細胞とＳＯＸ１０＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｅ）分化の０日目および１０日目（ＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋選別済み）におけるＨＯＸＢ７についての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。（ｆ）ｅにおけるＨＯＸＢ７＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。ＳＢ＝ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＲＡ＝レチノイン酸。
【図３】ＮＣＣから交感神経細胞への分化についての解析結果を示す図。（ａ）ＦＡＣＳ精製後の交感神経系ＮＣＣ培養のための培養条件の図。（ｂ）ＥＦ条件およびＥＦＢ条件の下の選別後３日目のニューロスフィアの代表的な画像（スケールバー＝１００μｍ）。（ｃ）ＥＦ条件およびＥＦＢ条件の下の選別後７日目のニューロスフィア中でのｅＧＦＰ＋細胞のＦＣＭ分析による定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）。（ｄ）選別後のＥＦＢ条件下で２８日間の培養中の細胞数、ｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージおよびＳＯＸ１０＋細胞のパーセンテージの変化（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。細胞数が０日目における数に対する変化倍率として記載されている。（ｅ）ＦＡＣＳ精製後の交感神経細胞分化のための培養条件の図。（ｆ）選別後２９日目におけるｅＧＦＰ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＴＨ、ＰＲＰＨおよびＤＢＨについての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。（ｇ）ｆにおけるＰＲＰＨ＋細胞、ＴＨ＋細胞およびＤＢＨ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｈ）選別後３０日目の培養神経細胞から放出されたノルアドレナリンの定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。ＥＦ＝ＥＧＦ＋ＦＧＦ２、ＥＦＢ＝ＥＧＦ＋ＦＧＦ２＋ＢＭＰ４。
【図４】細胞選別を行わない高純度交感神経細胞の誘導についての解析結果を示す図。（ａ）細胞選別を行わない交感神経細胞分化のための培養条件の図。（ｂ）ａに示されている分化の１０日目、１７日目および３１日目におけるｅＧＦＰ＋細胞のＦＣＭ分析。（ｃ）ｂにおけるｅＧＦＰ＋細胞の定量。３回の独立した実験のデータが各グラフに示されている。（ｄ）分化の３２日目におけるｅＧＦＰ、ＴＨ、ＰＲＰＨおよびＤＢＨについての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。（ｅ）ｄにおけるＰＲＰＨ＋細胞、ＴＨ＋細胞およびＤＢＨ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｆ）１０日目と１７日目におけるＰＨＯＸ２ＢおよびＳＯＸ１０についてと３２日目におけるＴＨ、ＤＢＨおよびＰＲＰＨについての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。１０日目の画像の中の白線の囲みは同じパネルの左側において拡大されている領域を示す。（ｇ）ｆの１０日目と１７日目におけるＰＨＯＸ２Ｂ＋細胞とＳＯＸ１０＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｈ）ｆの３２日目におけるＰＨＯＸ２Ｂ＋細胞、ＴＨ＋細胞、ＤＢＨ＋細胞およびＰＲＰＨ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。ＳＢ＝ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＲＡ＝レチノイン酸。
【図５】ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰノックインｈＰＳＣクローンの構築についての結果を示す図。（ａ）ＴＡＬＥＮ介在性ゲノム編集を用いるＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子ターゲティングの模式図。（ｂ）ＰＨＯＸ２Ｂの３’ＵＴＲ領域での標的化組込みを示すゲノムＰＣＲ。（ｃ）ｅＧＦＰ＋細胞におけるＰＨＯＸ２Ｂ＋細胞（ＰＨＯＸ２Ｂ／ｅＧＦＰ）の定量とＰＨＯＸ２Ｂ＋細胞におけるｅＧＦＰ＋細胞（ｅＧＦＰ／ＰＨＯＸ２Ｂ）の定量。左の画像はＣＨＩＲ２．０μMＢＭＰ４  ＲＡ１００nM条件下で１０日目におけるｅＧＦＰとＰＨＯＸ２Ｂについての免疫細胞化学の発見を示している（スケールバー＝５０μｍ）。右のグラフは定量的データを示している（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。ＤＳＢ＝二重鎖切断、ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＲＡ＝レチノイン酸。
【図６】ｈＰＳＣからのＮＭＰ様細胞とそれらの派生物の誘導についての結果を示す図。（ａ）様々な濃度のＣＨＩＲ９９０２１を使用した３日目の凝集体におけるＳＯＸ２、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＴＢＸ６、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ４およびＨＯＸＢ６についてのＲＴ−ＰＣＲ分析。（ｂ）様々な条件下で４０９Ｂ２  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ株を使用する分化の１０日目におけるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示すヒートマップ像。（ｃ）ＣＨＩＲ１．５μMＰｕｒ  ＲＡ１０００nM条件下で１０日目におけるｅＧＦＰ＋細胞とＣＤ４９ｄ＋細胞のＦＣＭ分析による定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｄ）ｅＧＦＰ＋ＣＤ４９ｄ−細胞由来の神経細胞におけるｅＧＦＰ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＣｈＡＴおよびＴＵＢＢＩＩＩについての免疫細胞化学分析（２８日目、スケールバー＝５０μｍ）。（ｅ）ｄにおけるｅＧＦＰ＋細胞とＣｈＡＴ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＲＡ＝レチノイン酸、Ｐｕｒ＝プルモルファミン。
【図７】ＰＨＯＸ２Ｂ発現性ＮＣＣの誘導におけるＲＡの効果を示す図。（ａ）ＣＨＩＲ２．０μMＢＭＰ  ＲＡ０nM条件およびＣＨＩＲ２．０μMＢＭＰ  ＲＡ１００nM条件の下の１０日目のＫｈＥＳ１  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ株由来の凝集体の代表的なＦＣＭプロット。（ｂ）ＣＨＩＲ２．０μMＢＭＰ４  ＲＡ０nM条件およびＣＨＩＲ２．０μMＢＭＰ４  ＲＡ１００nM条件の下の分化の１０日目におけるＰＨＯＸ２ＢおよびＳＯＸ１０についての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。（ｃ）ｂにおけるＳＯＸ１０＋細胞とＰＨＯＸ２Ｂ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＭＰ＝ＢＭＰ４、ＲＡ＝レチノイン酸。
【図８】ＣＨＩＲ２．０μMＢＭＰ４  ＲＡ１００nM条件下の凝集体中の細胞の解析結果を示す図。（ａ）ｅＧＦＰ発現とＣＤ４９発現のタイムコースＦＣＭ分析。（ｂ）ａのタイムコース分析におけるＧＦＰ＋細胞とＣＤ４９ｄ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｃ）１０日目の凝集体におけるｅＧＦＰ、ＣＤ４９ｄおよびＴＵＢＢＩＩＩのＦＣＭ分析。ＣＤ４９ｄの細胞外染色、固定、および透過処理の後に細胞内のｅＧＦＰとＴＵＢＢＩＩＩが染色された。（ｄ）ｃのＦＣＭ分析におけるＣＤ４９ｄ＋細胞、微弱なＴＵＢＢＩＩＩの細胞、ＴＵＢＢＩＩＩ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｅ）無選別およびＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋選別済みの１０日目の分化細胞のＰＨＯＸ２ＢおよびＳＯＸ１０についての免疫細胞化学分析（４０９Ｂ２  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ株、スケールバー＝５０μｍ）。白線の囲みは右のパネルにおいて拡大されている領域を示す。白色の矢頭はＰＨＯＸ２Ｂ＋ＳＯＸ１０−細胞を示している。（ｆ）分化の１０日目（ＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋選別済み）におけるＨＯＸＢ７についての免疫細胞化学分析（４０９Ｂ２  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ株、スケールバー＝５０μｍ）。
【図９】ＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋細胞からのニューロスフィア培養による交感神経細胞の誘導についての結果を示す図。（ａ）ＢＭＰ４を使用した、または使用しない選別後７日目のニューロスフィア細胞のｅＧＦＰ発現のＦＣＭ分析（灰色）。ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰレポーターを含まない親クローンを陰性対照に使用した（白色）。（ｂ）選別後７日目、１４日目および２８日目におけるＳＯＸ１０についての免疫細胞化学分析。（ｃ）選別後７日目、１４日目、２１日目および２８日目のニューロスフィア細胞のＴＵＢＢＩＩＩ発現のＦＣＭ分析（灰色）。アイソタイプ対照を使用して陰性集団を定量した（白色）。（ｄ）ｃのＦＣＭ分析におけるＴＵＢＢＩＩＩ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｅ）ＢＭＰ４を使用して接着培養されている選別後１４日目の細胞のｅＧＦＰとＳＭＡについての免疫細胞化学分析。（ｆ）ＮＦ処理を用いた、または用いないニューロスフィア細胞の形態。（ｇ）４０９Ｂ２  ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ  ｈｉＰＳＣ株由来の神経細胞のｅＧＦＰ、ＴＨ、ＰＲＰＨおよびＤＢＨについての免疫細胞化学分析（選別後２９日目、スケールバー＝５０μｍ）。ＥＦ＝ＥＧＦ＋ＦＧＦ２、ＥＦＢ＝ＥＧＦ＋ＦＧＦ２＋ＢＭＰ４、ＳＭＡ＝平滑筋アクチン。
【図１０】ニューロスフィア培養の手順とマーカー発現解析等の結果を示す図。（ａ）ニューロスフィア培養の神経細胞誘導のための培養条件の図。（ｂ）ａの様々な神経細胞誘導条件下でのｅＧＦＰ、ＴＨ、ＰＲＰＨおよびＤＢＨについての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。（ｃ）ｂにおけるＰＲＰＨ＋細胞、ＴＨ＋細胞およびＤＢＨ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｄ）ニューロスフィア細胞の貯蔵と融解後の培養の図。（ｅ）融解日における数に対する変化倍率として記載されている融解から７日後のニューロスフィア細胞の細胞数（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。（ｆ）貯蔵されたニューロスフィア細胞の神経細胞誘導培養後のｅＧＦＰ、ＴＨ、ＰＲＰＨおよびＤＢＨについての免疫細胞化学分析（スケールバー＝５０μｍ）。（ｇ）ｆにおけるＰＲＰＨ＋細胞、ＴＨ＋細胞およびＤＢＨ＋細胞の定量（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝３）。ＥＦＢ＝ＥＧＦ＋ＦＧＦ２＋ＢＭＰ４、ＮＦｓ＝神経栄養因子；ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、多能性幹細胞から交感神経細胞を製造する方法を提供する。当該製造方法は、（１）多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する工程、
（２）神経堤細胞から交感神経前駆細胞を誘導する工程、および
（３）交感神経前駆細胞から交感神経細胞を誘導する工程、を含む。
以下、説明する。
【００１０】
多能性幹細胞
多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、少なくとも本発明で使用される造血前駆細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や臍帯血由来の多能性幹細胞、骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
【００１１】
iPS細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotechnol., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
【００１２】
体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【００１３】
多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する工程
神経堤(neural crest)とは、脊椎動物の発生における神経管形成時、神経外胚葉と表皮外胚葉との境界に現れる一過的組織のことをいい、ここから脱上皮化して遊走する細胞群のことを神経堤由来細胞neural crest cellsという（J Cell Biochem 107, 1046-52 (2009)）。
神経堤由来細胞は、例えば、神経堤マーカーであるＳＯＸ１０とＦＯＸＤ３などの存在により定義付けられる。
【００１４】
多能性幹細胞から神経堤細胞を誘導する工程は好ましくは下記の工程を含む。
（i）多能性幹細胞をTGFβ阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
（ii）得られた細胞をFGF2、レチノイン酸およびBMP4を含む培地で培養する工程。
【００１５】
神経堤細胞の製造のための多能性幹細胞の培養に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へTGFβ阻害剤、GSK3β阻害剤またはFGF2、レチノイン酸およびBMP4等を添加して調製することができる。基礎培地には、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Essential 6培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、ROCK阻害剤、Purmorphamine、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、ヘパリンなどの1つ以上の物質も含有し得る。
【００１６】
工程（i）で使用されるTGFβ阻害剤は、TGFβファミリーのシグナル伝達に干渉する低分子阻害剤であり、例えばSB431542、SB202190(R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer 2:20(2003))、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)などが包含され、例えば、TGFβ阻害剤がSB431542である場合、培地中の濃度は、好ましくは0.5μM〜100μM、より好ましくは5μM〜30μMである。
【００１７】
工程（i）で使用されるGSK3β阻害剤は、GSK(glycogen synthase kinase)-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、β-カテニンをリン酸化する能力）を阻害する物質として定義され、多くの阻害剤がすでに知られている。その具体例として、BIO (別称: GSK-3βインヒビターIX; 6-ブロモインジルビン-3'-オキシム)などのインジルビン(indirubin)誘導体、SB216763 (3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)などのマレイイミド誘導体、GSK-3βインヒビターVII (4-ジブロモ-アセトフェノン)などのα-ブロモメチルケトン化合物、CHIR99021（6-[(2-{[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチルイミダゾール-2-イル)ピリミジン-2-イル]アミノ}エチル)アミノ]ピリジン-3-カルボニトリル）(WO1999/65897; CAS番号 252917-06-9)、L803-mtsなどの細胞膜透過性リン酸化ペプチド、およびそれらの誘導体が挙げられる。例えば、GSK3β阻害剤がCHIR99021である場合、培地中の濃度は、好ましくは0.5μM〜100μM、より好ましくは1μM〜10μMである。
【００１８】
工程（ii）で使用される培地におけるレチノイン酸の濃度は、通常、10nM〜10μM、好ましくは、50nM〜5μMである。
【００１９】
工程（ii）で使用される培地におけるBMP4 (Bone morphogenetic protein 4)の濃度は、通常、5 ng/mlから150 ng/mlであり、好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlであり、より好ましくは、20 ng/mlから80 ng/mlである。
【００２０】
工程（ii）で使用される培地におけるFGF2（fibroblast growth factor 2: 別名bFGF）の濃度は、例えば、1ng／ml〜100ng／ml、好ましくは5ng／ml〜50ng／ml、より好ましくは10ng／ml〜30ng／mlである。
【００２１】
神経堤細胞の製造において、多能性幹細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、浮遊培養が好ましい。例えば、多能性幹細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを分離し、単細胞に解離させたのちに、浮遊培養に供することができる。多能性幹細胞の分離方法としては、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase(商標)およびAccumax(商標)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。
浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させるための人工的処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）がされていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）または非イオン性の界面活性ポリオール（Pluronic F-127等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。浮遊培養の際には、胚様体（EB）を形成させて培養することが好ましい。
【００２２】
本発明において、神経堤細胞を製造するための培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度、約37℃〜約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、神経堤細胞が得られる限り日数は特に限定されないが、例えば、工程（i）の培養期間が１〜４日であり、工程（ii）の培養期間は例えば３〜１０日である。
【００２３】
本発明において、得られた神経堤細胞は精製して次の工程に使用されることが好ましい。精製（選別）する場合、例えば、CD49ｄ（インテグリンα４）を用いることができ、当該精製の方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、抗CD49ｄ抗体を用いたフローサイトメトリーによる精製する方法等を用いて精製する方法が挙げられる。
【００２４】
神経堤細胞から交感神経前駆細胞を誘導する工程
本発明において、交感神経前駆細胞とは、神経栄養因子を添加して培養することにより交感神経に分化しうる細胞を意味し、例えば、PHOX2B（Nature 399, 366-370 (1999)）およびCD49dが陽性であることによって認識することができる。
【００２５】
交感神経前駆細胞は神経堤細胞をサイトカインおよびＢＭＰ４を含む培養液中で培養することによって得ることができる。
【００２６】
本発明において交感神経前駆細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地とし、これにサイトカインおよびＢＭＰ４を添加して調製することができる。
基礎培地には、上記と同様の培地が使用できる。
【００２７】
BMP4の濃度は、例えば、5 ng/ml〜150 ng/mlであり、好ましくは10 ng/ml〜100 ng/mlであり、より好ましくは20 ng/ml〜80 ng/mlである。
【００２８】
サイトカインとしてはEGF（Epidermal growth factor）とFGF2が好ましい。
EGFの濃度は、例えば、1ng／ml〜100ng／ml、好ましくは5ng／ml〜50ng／ml、より好ましくは10ng／ml〜30ng／mlである。
FGF2の濃度は、例えば、1ng／ml〜100ng／ml、好ましくは5ng／ml〜50ng／ml、より好ましくは10ng／ml〜30ng／mlである。
【００２９】
交感神経前駆細胞の製造において、細胞非接着性の培養器を使用して浮遊培養を行うことが好ましく、上記のように多能性幹細胞を胚様体（EB）を形成させて培養し、神経堤細胞を得た後、得られたEBを解離してサイトカインおよびBMP4を添加した培養液中で培養することによってニューロスフェアを形成させて培養することが好ましい。
【００３０】
交感神経前駆細胞を製造するために神経堤細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度、約37℃〜約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、交感神経前駆細胞が得られる限り日数は特に限定されないが、例えば、10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、または24日以上であり、30日以下、または48日以下である。
【００３１】
交感神経前駆細胞から交感神経細胞を誘導する工程
交感神経細胞は、例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）および／またはドーパミンβヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）の陽性細胞として特定され、好ましくはさらにペリフェリン（ＰＲＰＨ）陽性である。
【００３２】
本発明において、交感神経細胞は、上記の交感神経前駆細胞を神経栄養因子を添加した培養液中で培養する工程を含む方法によって製造することができる。
ここで、神経栄養因子は、運動ニューロンの生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、Nerve Growth Factor (NGF)、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)、Neurotrophin 3 (NT-3)、Neurotrophin 4/5 (NT-4/5)、Neurotrophin 6 (NT-6)、Glia cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF)、Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF)およびLIFなどが挙げられる。好ましい神経栄養因子は、NGF、BDNFおよびGDNFから成るグループより選択される因子である。
【００３３】
添加する神経栄養因子の濃度については、当業者がその効力により適宜選択して用いてよく、例えば、1ng/ml〜100ng/mlであり、好ましくは、5ng/ml〜50ng/mlである。
【００３４】
交感神経細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地へ神経栄養因子を添加して調製することができる。基礎培地には、上述したような培地が使用できる。
【００３５】
本発明において神経栄養因子を製造するために交感神経前駆細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度、約37℃〜約39℃程度が好ましい。また、培養期間については、交感神経細胞が得られる限り日数は特に限定されないが、例えば、例えば、10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、または24日以上であり、30日以下、または48日以下である。
【００３６】
＜交感神経障害治療剤のスクリーニングへの利用＞
本発明の方法によって得られた交感神経細胞は、交感神経障害治療用化合物（例えば医薬化合物、溶媒、小分子、ペプチド、またはポリヌクレオチド）のスクリーニングに用いることもできる。例えば、候補医薬化合物を、交感神経細胞に加え、当該細胞の形態または機能的な変化により、評価を行うことができる。機能的な変化の例として当該細胞から産生されるノルエピネフリンの量を計測することで評価することができる。ここで、交感神経細胞が由来する人工神経前駆細胞は、治療対象となる交感神経障害と同様の表現型を呈する細胞が好ましく、特に好ましくは、交感神経障害に侵された体細胞から作製された人工多能性幹細胞である。
【００３７】
＜再生医療への応用＞
本発明の方法によって得られた交感神経細胞は、損傷した交感神経系組織の正常化のために再生医療の分野で有効に使用し得る。それゆえ、この細胞は、あらゆる交感神経系細胞の障害に関係する疾患（交感神経の損傷や自律神経失調症など）の治療用細胞になり得る。
【００３８】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されない。
【実施例】
【００３９】
方法
研究承認
日本の文部科学省（ＭＥＸＴ）によってヒトＥＳＣの使用が承認された。京都大学の組換えＤＮＡ実験安全委員会によって組換えＤＮＡ研究の研究計画が承認された。【００４０】
細胞株
ＫｈＥＳ１とＫｈＥＳ３のｈＥＳＣ株は末盛博文博士（京都大学再生医科学研究所）から提供していただいた。４０９Ｂ２と６０４Ａ１のヒトｉＰＳ細胞株は山中伸弥博士（京都大学ｉＰＳ細胞研究所）から提供していただいた。これらの細胞株は、ｍＴｅＳＲ１培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むグロースファクター・リデューストＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）被覆細胞培養プレート上で維持された。【００４１】
プラスミド構築
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）プラスミドの構築のためにＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ  ２．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／）を使用してＴＡＬＥＮ反復可変二残基（ＲＶＤ）をデザインした。Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  ＴＡＬＥＮおよびＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  ２．０とＴＡＬＥＮコードプラスミドの組立てのためのそのプロトコル（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用してＴＡＬＥＮコードプラスミドを組み立てた。改変型ＦｏｋＩを含む哺乳類発現ベクターは広島大学の山本卓博士から頂戴した。
ターゲティングベクターの構築のためにｌｏｘＰ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセットベクターの３’側に１ｋｂｐのＰＣＲ増幅ホモロジーアームをクローン化した。次にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して１ｋｂｐの５’側ホモロジーアーム（ＰＣＲ増幅物）、Ｔ２Ａペプチド配列（オリゴヌクレオチド対をアニールした物）およびｅＧＦＰオープン・リーディング・フレーム（第１ＡＴＧを含まないＯＲＦ；ＰＣＲ増幅物）をｌｏｘＰ−ｎｅｏ−ｌｏｘＰカセットベクターの５’側に継目なくクローン化した。ＰＣＲ増幅にＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を使用し、ＰＣＲ増幅された全てのＤＮＡ断片をクローニングした後にそれらの配列を完全にシーケンス解析した。
Ｃｒｅ発現ベクターの構築のために核移行シグナルを含むＣｒｅ（ＮＬＳ−Ｃｒｅ）のＯＲＦをｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ＲＦＰ−Ｐｕｒｏベクター（ＢｉＯＳＥＴＴＩＡ社）のマルチクローニング部位にクローン化した。【００４２】
形質移入と安定株の生成
ＴＡＬＥＮによるゲノム編集のためにスーパーエレクトロポレーターＮＥＰＡ２１（ネッパジーン株式会社）を製造業者の指示に従って使用して形質移入を実施した。具体的にはＳｔｅｍＰｒｏアキュターゼ細胞解離試薬（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞を個々の細胞に解離させた。次に１つのキュベットの中で１００万個の細胞に２μｇの各ＴＡＮＥＮプラスミドと６μｇのターゲティングベクタープラスミドを形質移入し、そして５０μＭのＹ２７６３２（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）が添加されたｍＴｅＳＲ１培地を含むグロースファクター・リデューストＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス被覆６ｃｍ細胞培養ディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）にすぐに再播種した。形質移入から２４〜４８時間後にＹ２７６３２（１０μＭ）を使用して細胞生存を促進した。１００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（和光純薬工業株式会社）を使用する選択を形質移入から３日後に開始して細胞を選択した。薬剤選択から１０〜１４日後に生存クローンを単離し、その後の実験のために増殖させた。
Ｃｒｅ−ｌｏｘＰの欠失のために３．５ｃｍディッシュ内でｈＰＳＣを通常通りに継代処理した（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）。２日後、ＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を製造業者の指示に従って使用して３μｇのＣｒｅ発現プラスミドを形質移入した。５００ｎｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＩｎｖｉｏＧｅｎ社）を使用する選択を形質移入から２日後に開始して細胞を選択した。形質移入から４日後に生存細胞を解離させ、５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（和光純薬工業株式会社）および１０μＭのＹ２７６３２が添加された霊長類ＥＳ細胞用培地（株式会社リプロセル）を含む有糸分裂が不活性化されたＳＮＬフィーダー細胞上にそれらの生存細胞を継代処理した。次の日にＹ２７６３２を除去した。継代処理から１４日後に個々のコロニーを単離し、その後の実験のために増殖させた。【００４３】
ゲノムＰＣＲ
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を製造業者の指示に従って使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ＰｒｉｍＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して標的部位でのゲノムへの組込みを検出するためのゲノムＰＣＲを実施した。【００４４】
ｈＰＳＣの分化
ＮＭＰ様細胞誘導のためにＳｔｅｍＰｒｏアキュターゼ細胞解離試薬を使用して維持されていたｈＰＳＣを個々の細胞に解離させ、９６ウェル・ウルトラロウ・アタッチメント・マルチウォールプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を使用して１０μＭのＳＢ４３１５４２（シグマ・アルドリッチ社）、様々な濃度のＣＨＩＲ９９０２１（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）および１０μＭのＹ２７６３２が添加された１００μＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地（Ｇｉｂｃｏ）の中でそれらの細胞をすぐに再凝集させた（１００００細胞／ウェル）。１日目に１０μＭのＳＢ４３１５４２（シグマ・アルドリッチ社）および０日目と同じ濃度のＣＨＩＲ９９０２１が添加された５０μＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地をそれらの９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。
背腹軸の改変のために１．５μＭ、２．０μＭ、または３．０μＭのＣＨＩＲ９９０２１で処理された３日目の凝集体を２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２および／またはレチノイン酸（ＲＡ、全トランス型、シグマ・アルドリッチ社）が添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地の中で培養した。ＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）または１μＭのＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を表示されている条件に加えた。培地を一日おきに１０日目まで交換した。
頭蓋運動神経細胞分化のために１．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１で処理された３日目の凝集体を２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、１μＭのＲＡおよび１μＭのＰｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅが添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地の中で１０日目まで培養した。培地を一日おきに交換した。１０日目にＳｔｅｍＰｒｏアキュターゼ細胞解離試薬を使用してそれらの細胞を個々の細胞に解離させ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ、下記参照）によってｅＧＦＰ＋ＣＤ４９ｄ−細胞を選別した。１×Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２およびＢ２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、１００ｎＭのコンパウンドＥ（Ａｂｃａｍ社）、１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）を含むグロースファクター・リデューストＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス被覆培養プレート上で選別済みの細胞を培養し、２０μＭのＹ２７６３２を選別後の最初の２日の間に添加した。培地を一日おきに交換し、選別後の７〜１０日の時点でそれらの細胞を一度継代処理した。
交感神経系ＮＣＣおよびＳＮ（Sympathetic neurons）の分化のために２．０μＭのＣＨＩＲ９９０２１で処理された３日目の凝集体を２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、１００ｎＭのＲＡおよび５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４が添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地の中で１０日目まで培養した。培地を一日おきに交換した。１０日目にＳｔｅｍＰｒｏアキュターゼ細胞解離試薬を使用してそれらの細胞凝集体を個々の細胞に解離させ、ＦＡＣＳによってｅＧＦＰ＋ＣＤ４９ｄ＋細胞を選別した。ウルトラロウ・アタッチメント・ディッシュ（１０ｃｍ）またはマルチウォールプレート（６ウェル）（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の中の１×Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２およびＢ２７サプリメント、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４および２μｇ／ｍＬのヘパリン（シグマ・アルドリッチ社）が添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の中で選別済みの細胞を５０００００細胞／ｍＬの密度で培養した。培地を３〜４日毎に交換し、０．０５％のトリプシンと１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用し、続いて穏やかにピペッティングして細胞を解離させることにより細胞塊を７日毎に継代処理した。
神経細胞の成熟のために１×Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）、Ｎ２およびＢ２７サプリメント、神経栄養因子（ＮＦ）であるＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌずつ）が添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含むウルトラロウ・アタッチメント・ディッシュまたはマルチウォールプレート上に細胞塊を移した。培地を３〜４日毎に交換した。ＮＦ処理から１４日後に０．０５％トリプシンおよび１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩとそれに続く穏やかなピペッティングによってそれらの細胞塊を解離させた。グロースファクター・リデューストＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス被覆培養プレートまたはガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社）上の１０％（体積／体積）のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）、ＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬずつ）および２０μＭのＹ２７６３２が添加されたＤＭＥＭ（ナカライテスク株式会社）の中に解離済みの細胞を播種した。その後、Ｙ２７６３２を含まない培地で前記培地の半分を交換することにより２日毎にそれらの培養物に栄養供給した。
ＢＺ−Ｘ７００蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）を使用して培養細胞の画像を取得した。【００４５】
フローサイトメトリー分析とＦＡＣＳ
ＰＥ結合マウス抗ＣＤ４９ｄ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ラット抗ＧＦＰ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７マウス抗クラスＩＩＩベータチューブリン（ＴＵＢＢＩＩＩ）抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を製造業者のプロトコルに従って使用した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（ミルテニーバイオテク社）を使用してフローサイトメトリーを実施した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）によってＦＡＣＳを実施した。全ての実験において対照集団としてアイソタイプ対照を使用した。【００４６】
ＲＮＡ単離とＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して細胞からの全ＲＮＡ抽出を実施した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社）を使用する逆転写に全ＲＮＡ（１μｇ）を使用した。Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔバージョン（ＴａＫａＲａ社）またはＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。【００４７】
免疫細胞化学と顕微鏡観察
４％のパラホルムアルデヒド中で細胞を室温で２０分間にわたって固定し、０．２％のトリトンＸ−１００中でそれらの細胞を室温で１０分間にわたって透過処理した。次にあらゆる非特異的な結合を防止するためにＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（ＤＳファーマバイオメディカル社）と共にそれらの細胞を定温放置した後にそれらの細胞を一次抗体と共に４℃で１２時間または室温で２時間にわたって定温放置した。ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ６４７、Ｃｙ−３（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社；１／２００）またはＡｌｅｘａ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１／１０００）のどれかに結合している適切な種特異的抗血清を使用して二次抗体との定温放置を１時間にわたって実施した。ＤＡＰＩ（シグマ・アルドリッチ社；１／１０００）で細胞核を染色した後にＦＶ１０００またはＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡（オリンパス株式会社）を使用して細胞像を取得した。全ての抗体がＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ中に希釈された。次の一次抗体を表示されている濃度で使用した：ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ社；１／５０００）、ヤギ抗ＰＨＯＸ２Ｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社；１／２００）、ヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；１／２００）、マウス抗ＴＵＢＢＩＩＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社；１／１０００）、ウサギ抗ＳＯＸ１０（Ａｂｃａｍ社；１／２００）、マウス抗ＨＯＸＢ７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社；１／５０）、ウサギ抗ＴＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社；１／１０００）、ウサギ抗ＤＢＨ（Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ社；１／４００）、ヤギ抗ＰＲＰＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社；１／２００）、マウス抗α平滑筋アクチン（Ａｂｃａｍ社；１：４００）。【００４８】
免疫細胞化学分析結果の定量
同一のゲインと露光の設定で試料の画像を取得した。ＤＡＰＩ＋細胞、ＰＨＯＸ２Ｂ＋細胞、ＳＯＸ１０＋細胞、ｅＧＦＰ＋細胞、ＨＯＸＢ７＋細胞、またはＴＨ＋細胞の平均数を算出するためにＩｍａｇｅＪソフトウェアプログラムを使用して調製物当たり９視野を自動計測した。ＣｈＡＴ＋細胞、ＰＲＰＨ＋細胞、またはＤＢＨ＋細胞の平均数を算出するために調製物当たり９視野を手動計測した。【００４９】
ノルエピネフリン定量
Cell Stem Cell 19, 95-106 (2016)に報告されたようにして培養上清中のノルエピネフリン濃度を測定した。培養されたＳＮをＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて１５分間培養した。対照としてその培地を収集した。それらの細胞を５０ｍＭのＫＣｌを含むＨＢＳＳ中でさらに１５分間にわたって培養し、その後で培地を収集した。培地収集後に培地を３００ｇで５分間にわたって遠心分離して細胞または細胞破片を排除した。ノルエピネフリンの分解を防止するために１ｍＭのＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）と４ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウム（ナカライテスク株式会社）をそれらの試料に添加し、分析までそれらの試料を−８０℃で貯蔵した。エピネフリン／ノルエピネフリンＥＬＩＳＡキット（Ａｂｎｏｖａ社）を製造業者の指示に従って使用して試料中の総ノルエピネフリンレベルを定量した。対照試料における計算されたエピネフリンレベルを５０ｍＭのＫＣｌで処理した試料のエピネフリンレベルから減算してノルエピネフリン放出レベルを決定した。【００５０】
統計分析
統計分析のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１３ソフトウェアプログラムを使用した。結果が平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。スチューデントのｔ検定を用いて統計的有意性を決定した。「ｎ」は独立した実験の数を表している。【００５１】
＜結果＞
レポーターを利用して分化中のＰＨＯＸ２Ｂ発現を追跡することにした。ＰＨＯＸ２Ｂはマウスにおける交感神経節、副交感神経節および腸管神経節などの自律神経系神経堤派生物の発生に必須の転写因子である。長期持続性のＰＨＯＸ２Ｂ発現（交感神経系ＮＣＣから成熟神経細胞まで）を考慮して、ＰＨＯＸ２Ｂ発現の追跡が分化プロトコルの最適化に有用であり得るとの仮説を立てた。ＰＨＯＸ２Ｂ座位の３’ＵＴＲ領域を標的とし、２種類のｈＰＳＣクローン、すなわちヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ、細胞株：ＫｈＥＳ１）およびヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ、細胞株：４０９Ｂ２）からＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰノックインレポーター株を生成した（図５ａ、ｂ）。【００５２】
ＳＮは体幹部ＮＣＣに由来し、体幹部ＮＣＣはＮＭＰに由来する。ＮＭＰは胚の体軸発生時に後部神経板および沿軸中胚葉について両能性である。ＮＭＰ誘導のためにはｈＰＳＣのＷＮＴ介在性後方化が重要である。凝集培養の最初の３日間におけるＷＮＴ活性化因子ＣＨＩＲ９９０２１の効果をまず評価した。Ｈｏｘ遺伝子の発現上昇には１．５μＭ以上のＣＨＩＲを用いる処理が有効であった。このことはこれらの条件下の細胞が３日間の初期分化の間に後方化を開始したことを示している（図６ａ）。ＮＭＰのマーカーであるＢＲＡＣＨＵＲＹとＳＯＸ２もそれらの条件下で発現し、３日目のＣＨＩＲ処理凝集体がＮＭＰの特徴を有していることを確認した。中胚葉特異的転写因子ＴＢＸ６の発現が上昇したので、より高い投与量のＣＨＩＲ（５μＭ）での処理がｈＰＳＣを中胚葉への発生運命に導く可能性が高い。【００５３】
身体の後方領域では様々なサブタイプの神経前駆細胞（ＮＰＣ）とＮＣＣが背腹軸決定を経てＮＭＰ由来の神経板から生成される。それ故、我々はこれらの３日目の凝集体の背腹軸を改変した。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナルとソニック・ヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナルがそれぞれ背方化および腹方化にとって重要であるので、ＢＭＰ４とＳＨＨアゴニストであるプルモルファミン（Ｐｕｒ）を１．５μＭ、２．０μＭ、または３．０μＭのＣＨＩＲで処理した３日目の凝集体に添加した（図１ａ）。加えて、レチノイン酸（ＲＡ）はＮＭＰを経たＮＰＣ誘導に有効であり、且つ、神経管外植物または胚性自律神経節からの初代神経堤幹細胞の神経細胞誘導がＲＡの存在下で実施されていたので、ＲＡをこの状況で使用した。幾つかの条件では４０％を超える純度でＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ＋細胞が検出された（図１ｂおよび図６ｂ）。それらのうち、次の（ｉ）ＣＨＩＲ１．５μＭＰｕｒ＋ＲＡ１０００ｎＭ、（ｉｉ）ＣＨＩＲ２．０μＭＰｕｒ＋ＲＡ１０００ｎＭ、（ｉｉｉ）ＣＨＩＲ１．５μＭＢＭＰ＋ＲＡ１００ｎＭおよび（ｉｖ）ＣＨＩＲ２．０μＭＢＭＰ＋ＲＡ１０００ｎＭという４条件に焦点を当てた。３．０μＭのＣＨＩＲ処理では１．５μＭまたは２．０μＭのＣＨＩＲ処理と比較して比較的に低い頻度（０％〜１０％）でｅＧＦＰ＋細胞が検出された（データを示さず）。【００５４】
ＰＨＯＸ２Ｂは自律神経堤派生物だけではなく後脳における中枢神経系（ＣＮＳ）神経細胞およびそれらの神経細胞の前駆細胞においても発現する。ＣＤ４９ｄ（インテグリンα４）は遊走性ＮＣＣおよびそれらの派生物において発現するので、ＣＮＳ中のＮＰＣなどの他の系譜からＮＣＣを区別するためにＣＤ４９ｄを使用した。Ｐｕｒ処理条件下（条件（ｉ）および（ｉｉ））よりもＢＭＰ処理条件下（条件（ｉｉｉ）および（ｉｖ））でより多くのＣＤ４９ｄ＋細胞が検出された（図１ｃ）。ＢＭＰ４処理細胞（条件（ｉｉｉ）および（ｉｖ））だけがＮＣＣマーカーであるＳＯＸ１０とＦＯＸＤ３を発現したが、一方でＰｕｒ処理細胞ではＮＰＣマーカーであるＳＯＸ１とＰＡＸ６がより強く発現している（図１ｄ）。興味深いことに我々の実験ではＰｕｒ処理条件下だけではなくＢＭＰ４処理条件下でもＰＨＯＸ２Ｂの発現上昇にＲＡが重要であった（図１ｂ、図６ｂおよび図７ａ）。ＲＡがあっても無くてもＳＯＸ１０＋細胞が検出されたがＳＯＸ１０＋とＰＨＯＸ２Ｂ＋の二重陽性細胞はＲＡを含む条件下でのみ見出された（図７ｂ、ｃ）。このことはＢＭＰ４がＮＣＣ誘導に関与し、ＲＡがＮＣＣの発生運命を自律系譜に向かうよう改変することを示している。
前後軸決定のレベルはＷＮＴシグナル量によって決定されることが幾つかのこれまでの報告に記載された。これと一致して我々の実験ではＣＨＩＲ濃度が高くなるほど細胞がより後方に規定された。１．５μＭでのＣＨＩＲ処理によって細胞が後脳および頸髄領域（ＨＯＸＢ４＋ＨＯＸＢ８＋ＨＯＸＣ９−）に割り当てられ、一方で２．０μＭのＣＨＩＲ処理によって細胞が頸髄から胸髄の領域（ＨＯＸＢ４−ＨＯＸＢ８＋ＨＯＸＣ９＋）に割り当てられた（図１ｄ）。【００５５】
Ｐｕｒ条件下ではｅＧＦＰ＋細胞の大半がＣＤ４９ｄを発現しなかった（図１ｃおよび図６ｃ）。ＳＨＨシグナルは神経上皮細胞を腹方化するので、条件（ｉ、ｉｉ）の下ではｅＧＦＰ＋細胞は腹方後脳内の頭蓋運動神経細胞の前駆細胞であると仮説を立てた。実際にこれらのＣＤ４９ｄ−ｅＧＦＰ＋細胞は、運動神経細胞マーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）を発現する神経細胞に分化した（図６ｄ、ｅ）。【００５６】
こうして、１）ＣＨＩＲで処理した３日目の凝集体はＣＮＳ神経前駆細胞とＮＣＣの両方を生じさせ得ること、２）ＢＭＰ処理とＲＡ処理がＰＨＯＸ２Ｂ発現性ＮＣＣの誘導に必須であること、および３）２．０μＭのＣＨＩＲ処理によってｈＰＳＣについて体幹部レベルの前後軸が決定されることが確認された。ｅＧＦＰ＋細胞は実際にこれらの条件下でＰＨＯＸ２Ｂタンパク質を発現し、このことによって我々のレポーター系の漏出の可能性が除外された（図５ｃ）。【００５７】
我々の培養における交感神経系ＮＣＣの誘導を確認するために次にＣＨＩＲ２．０μＭＢＭＰ＋ＲＡ１００ｎＭ条件下のＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋細胞の特徴を分析した（図２ａ、ｂ）。分化中にＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋細胞は８日目の後から出現し、ｅＧＦＰ＋細胞の中には１０日目の後にＣＤ４９ｄ発現を喪失する細胞もあった（図８ａ、ｂ）。このことは異なるステージの細胞が共存することを示唆している。予期された通り、ｅＧＦＰ＋細胞の中では大半のＣＤ４９ｄ＋細胞が神経細胞マーカーＴＵＢＢＩＩＩを弱く発現し、一方でＣＤ４９ｄ−細胞がＴＵＢＢＩＩＩを強く発現した（図８ｃ、ｄ）。このことはＣＤ４９ｄ−ｅＧＦＰ＋細胞が神経細胞分化系列決定の後期ステージにあることを示している。ＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋細胞の大半がＳＯＸ１０とＰＨＯＸ２Ｂについて二重陽性であった（図２ｃ、ｄおよび図８ｅ）。このことはこれらの細胞がマウス胚性交感神経節に局在するＳＯＸ１０とＰＨＯＸ２Ｂの二重陽性前駆細胞に対応することを示唆している。ＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋細胞の大半がＨＯＸＢ７を発現するので（図２ｅ、ｆおよび図８ｆ）、これらの細胞は体幹部レベルの前後軸に規定された。まとめると、ＣＨＩＲ２．０μＭＢＭＰ＋ＲＡ１００ｎＭ条件下のＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋細胞における必須転写因子の発現は生体内および生体外のマウス交感神経系ＮＣＣにおける必須転写因子の発現と同等であることが確認された。【００５８】
次にＳＮの誘導のためにＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋細胞の培養条件を最適化した。ＳＮは分化を通してＰＨＯＸ２Ｂの発現を維持しており、一方で交感神経系ＮＣＣ由来の非神経細胞はＰＨＯＸ２Ｂ発現を喪失しているので、ｅＧＦＰ発現を再度追跡した。ニューロスフィア培養法によってインビトロで胚性マウス交感神経節中の交感神経系ＮＣＣを選択的に増殖させることができるので、ＥＧＦおよびＦＧＦ２を使用して選別済みのＣＤ４９ｄ＋ｅＧＦＰ＋交感神経系ＮＣＣ富化細胞を懸濁培養して凝集体を形成した（図３ａ）。しかしながら、それらの細胞の約半数が選別後の培養の最初の７日の間にｅＧＦＰ発現を喪失した（図３ｂ、ｃ）。生体内および生体外での動物実験では交感神経系ＮＣＣの初期神経細胞分化系列決定にＢＭＰ４が必要である。それ故、ＢＭＰ４を添加し、そのＢＭＰ４によって細胞の大半（９０％超）においてｅＧＦＰの発現が維持された。さらに、より長く（選別後２８日まで）それらの細胞を培養すると、この条件によってｅＧＦＰ発現を喪失せずに細胞数が１０倍を超えて拡大した（図３ｄ）。
その延長された凝集培養の間にＳＯＸ１０の発現が急速に低下し、１４日後にＳＯＸ１０を発現する細胞はほとんど無かった（図３ｄおよび図９ｂ）。ＳＯＸ１０の喪失と共にＰＨＯＸ２Ｂの維持により交感神経系ＮＣＣが神経細胞分化系列決定に導かれることを考慮すると、ＢＭＰ４を使用するニューロスフィア培養は交感神経系ＮＣＣを選択的に増殖させるようであり、それらの交感神経系ＮＣＣの発生を神経細胞へと促す。実際にＢＭＰ４を使用するとＴＵＢＩＩＩＢ＋細胞の数が培養の最初の１４日の間に増加した（図９ｃ、ｄ）。接着培養ではＢＭＰ４の存在下でも大半の細胞がｅＧＦＰ発現を喪失し、ＮＣ由来筋線維芽細胞のマーカーであるα平滑筋アクチンを発現する細胞もあった（図９ｅ）。このことは神経細胞系譜への決定に凝集体の浮遊培養が重要であることを示している。まとめると、我々はＰＨＯＸ２Ｂ発現を維持しながら交感神経系譜細胞を増殖させる培養系の確立に成功した。【００５９】
次にニューロスフィア培養からＳＮを誘導し、それらのＳＮの純度を評価した。播種されたＢＭＰ４処理凝集体は神経細胞の形態を示さず（図９ｆ）、おそらくそれはそれらの凝集体が未熟であることによるものであった。神経前駆細胞の成熟のため、全てがＳＮの初期神経細胞分化系列決定に関与することが報告されているが、成熟型神経細胞の誘導にとって充分ではないＥＧＦ、ＦＧＦ２およびＢＭＰ４を除き、交感神経細胞発生を促進する神経栄養因子（ＮＦ）であるＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦを添加した（図３ｅ）。この改変プロトコルを用いた１４日の培養後にそれらの細胞は軸索形態を示した（図９ｆ）。この時点において、両方ともカテコールアミン合成の触媒酵素であり、したがってノルアドレナリン作動性神経細胞のマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）とドーパミンβヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）についてそれらの細胞の大半（８５％超）が陽性であった（図３ｆ、ｇ）。これらの細胞は末梢神経細胞特異的中間径フィラメントであるペリフェリン（ＰＲＰＨ）も発現した。したがって、これらの神経細胞は体幹部ＮＣＣに由来する末梢（ＰＲＰＨ＋）ノルアドレナリン作動性（ＴＨ＋ＤＢＨ＋）神経細胞であり、ＳＮに対応する。この成熟ステップは選別後の培養の様々な時点のニューロスフィア細胞に適用可能であった（図１０ａ〜ｃ）。それ故、大半のＰＨＯＸ２Ｂ発現性ニューロスフィア細胞は培養が延長された（２８日の）ときも最終的に分化した神経細胞を生じさせる。さらに、ニューロスフィア細胞は生存性または神経細胞分化能を失わずに一般的方法によって凍結保存され得る（図１０ｄ〜ｇ）。最後に、ＳＮの神経伝達物質であるノルエピネフリンの放出をこれらの神経細胞の機能上の態様として確認した（図３ｈ）。ｈＰＳＣ由来のＳＮから放出されたノルエピネフリンの量はこれまでの報告におけるものと同等であった。【００６０】
培養条件の改良によって段階的にｈＰＳＣをＳＮに分化させることに成功した。しかしながら、細胞選別ステップがＰＨＯＸ２Ｂ発現性ＮＣＣの精製に必要であるので、そのような分化はＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰレポーターｈＰＳＣ株を使用する場合にのみ可能であった。我々の最終的な目標は様々なｈＰＳＣ株に適用可能である堅固で普遍的な分化方法を開発することであるので、次にＰＨＯＸ２Ｂレポーターを含まないｈＰＳＣ株に我々の系を適用することを試みた。【００６１】
この目的のためにＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰ  ｈＰＳＣ株を使用する細胞選別を除いて上記と同じ方法を繰り返した（図４ａ）。驚くべきことにニューロスフィア培養に移した後にｅＧＦＰ＋細胞が高頻度（１７日目；７５％〜８５％）で精製され、神経細胞成熟ステップ後にニューロスフィア細胞として高頻度（３１日目；７５％〜９０％）で維持される（図４ｂ、ｃ）ことがタイムコース分析によって示された。免疫染色によってそれらの細胞の７５％〜８０％においてＰＨＯＸ２Ｂ＋ＴＨ＋ＤＢＨ＋ＰＲＰＨ＋末梢ノルアドレナリン作動性神経細胞の特徴が示された（図４ｄ、ｅ）。このことは細胞選別が無くても本プロトコルが交感神経系ＮＣＣおよびそれらの派生物を選択的に増殖させ得ることを示している。【００６２】
この原理のさらなる証拠として、ＰＨＯＸ２Ｂ：：ｅＧＦＰレポーターを含まない４種類の異なるｈＰＳＣ株（ｈＥＳＣ株としてのＫｈＥＳ１株とＫｈＥＳ３株、ｈｉＰＳＣ株としての４０９Ｂ２株と６０４Ａ１株）を使用して同じ方法を実施した。この実験シリーズではニューロスフィア培養での選択的増殖により７０％〜８０％の純度でＳＯＸ１０−ＰＨＯＸ２Ｂ＋交感神経前駆細胞とＳＮの両方がしっかりと生成された（図４ｆ〜ｈ）。これらのデータは様々なｈＰＳＣ株からのＳＮの生成についての我々のプロトコルの確実性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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