(57)【要約】  リンパ行性薬剤送達法において用いられる、医薬、細胞、核酸等の薬剤を含有する最適なリンパ節内投与製剤を提供する。  リンパ行性薬剤送達法によって薬剤を標的リンパ節に送達するための薬剤含有液体製剤であって、液体の浸透圧が７００〜２７００ｋＰａであるリンパ節内投与製剤。
2019045005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ行性薬剤送達法によって薬剤を標的リンパ節に送達するための薬剤含有液体製剤であって、液体の浸透圧が７００〜２７００ｋＰａである、リンパ節内投与製剤。
【請求項２】
液体の浸透圧が、９００ｋＰａ以上である、請求項１記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項３】
液体の浸透圧が、２４００ｋＰａ以下である、請求項１記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項４】
液体の浸透圧が、９５０〜２０００ｋＰａである、請求項１記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項５】
液体の粘度が０．５〜２０ｍＰａ・ｓである、請求項１〜４のいずれか１項記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項６】
液体の粘度が１．０〜１５ｍＰａ・ｓである、請求項１〜４のいずれか１項記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤を含有する、請求項１〜６のいずれか１項記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項７記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項９】
ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルがオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである請求項８記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項１０】
薬剤が、医薬活性物質、核酸分子収容体又は培養細胞である請求項１〜９のいずれか１項記載のリンパ節内投与製剤。
【請求項１１】
薬剤が、抗がん剤である請求項１〜９のいずれか１項記載のリンパ節内投与製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリンパ行性薬剤送達法に有効な薬剤を含む溶液の浸透圧に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは日本人の二人に一人が罹患する病気であり、がん患者の死因９割が転移に起因する。乳がんや頭頸部がんをはじめとするがんの多くは、リンパ管を介して所属リンパ節に転移を来す。【０００３】
現在の転移リンパ節に対する化学療法として、血管を介した静脈内投与が一般的である。静脈に投与された薬剤は末梢組織で毛細血管より間質へ漏出し、ふたたび血管及びリンパ管に再吸収される。【０００４】
リンパ系は粒径の大きな物質及び高分子物質を優先的に取り込むという特徴をもつ。粒子の大きさが１０−１００ｎｍの場合にはリンパ系へ再吸収されやすく、１０ｎｍ以下の粒子は主に血管に再吸収される。また、リンパ系への再吸収の効率は分子量と正の相関を示し、特に分子量が１６，０００を超える物質は主にリンパ系に取り込まれる。したがって、一般的に低分子である抗がん剤は、リンパ系へのアクセスは困難であり、標的リンパ節への薬剤送達効率は低いと考えられる。【０００５】
現在のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）における重要な原理はＥＰＲ効果(Enhanced Permeability Retention effect)である。がん組織が構築する未成熟な腫瘍血管は正常な血管内皮とは異なり、血管内皮細胞間に２００ｎｍ程度の広い隙間が開口している。
そのため５０−１００ｎｍ程に粒径が制御された微粒子製剤や高分子製剤は受動的にがん組織に集積される。現在、このＥＰＲ効果を利用してリポソームやミセル化した薬剤が開発されており、固形腫瘍についてはその治療効果が数多く報告されている。【０００６】
しかしながら、リンパ節転移の治療に関する研究報告は、固形腫瘍の治療に関する研究に比べ、相対的に少なく、この理由として、リンパ節転移研究に有益な疾患モデルが開発されていないことがあった。斯かる状況の下、本発明者らは、ヒトのリンパ節の大きさと同等のリンパ節を有するＭＸＨ１０／Ｍｏ−ｌｐｒ／ｌｐｒリンパ節腫脹マウスを樹立することに成功し（図１、非特許文献１)、このマウスを用いて、ＥＰＲ効果に基づく薬剤送達法では早期の転移リンパ節に対して治療効果が期待されないことを報告した(非特許文献２)。これは、リンパ節に侵入し生着した腫瘍細胞が増殖するために必要な酸素や栄養を供給するための血管が、正常なリンパ節において十分に存在するため、リンパ節転移早期における腫瘍形成で血管新生が発生しにくいためだと考えられる。【０００７】
本発明者らは、従来の血行性全身投与あるは経口投与に依存しない、転移リンパ節に対する新たな治療法として、リンパ行性薬剤送達法を提案してきた(非特許文献３、非特許文献４)。この概念は、原発巣周囲の所属リンパ節に局注し、所属リンパ節とその下流のリンパ節転移を治療あるいは予防する方法、あるいは転移リンパ節の上流に位置するリンパ節に薬剤を投与し、リンパ管経由で薬剤を下流の転移リンパ節に送達させる方法である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Shao L, Mori S, Yagishita Y, Okuno T, Hatakeyama Y, Sato T, Kodama T. Lymphatic mapping of mice with systemic lymphoproliferative disorder: usefulness as an inter-lymph node metastasis model of cancer. J Immunol Methods 2013; 389:69-78.
【非特許文献２】Mikada M, Sukhbaatar A, Miura Y, Horie S, Sakamoto M, Mori S, Kodama T. Evaluation of the enhanced permeability and retention effect in the early stages of lymph node metastasis. Cancer Sci 2017.
【非特許文献３】Kodama T, Hatakeyama Y, Kato S, Mori S. Visualization of fluid drainage pathways in lymphatic vessels and lymph nodes using a mouse model to test a lymphatic drug delivery system. Biomedical optics express 2015; 6:124-34.
【非特許文献４】Kodama T, Matsuki D, Tada A, Takeda K, Mori S. New concept for the prevention and treatment of metastatic lymph nodes using chemotherapy administered via the lymphatic network. Scientific reports 2016; 6:32506
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、リンパ行性薬剤送達法において用いられる、医薬化合物、細胞、核酸等の薬剤を含有する最適なリンパ節内投与製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、リンパ行性薬剤送達法において用いられる、リンパ節内投与製剤について種々検討した結果、特定の浸透圧域を有する液体製剤が、標的リンパ節における薬剤貯留性が高く、また、下流リンパ節への送達性が高く、良好な薬剤効果を有することを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）〜１１）に係るものである。
１）リンパ行性薬剤送達法によって薬剤を標的リンパ節に送達するための薬剤含有液体製剤であって、液体の浸透圧が７００〜２７００ｋＰａである、リンパ節内投与製剤。
２）液体の浸透圧が９００ｋＰａ以上である、１）のリンパ節内投与製剤。
３）液体の浸透圧が、２４００ｋＰａ以下である、１）のリンパ節内投与製剤。
４）液体の浸透圧が９５０〜２０００ｋＰａである、１）のリンパ節内投与製剤。
５）液体の粘度が０．５〜２０ｍＰａ・ｓである、１）〜４）のいずれかのリンパ節内投与製剤。
６）液体の粘度が１．０〜１５ｍＰａ・ｓである、１）〜４）のいずれかのリンパ節内投与製剤。
７）非イオン性界面活性剤を含有する、１）〜６）のいずれかのリンパ節内投与製剤。
８）非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、７）のリンパ節内投与製剤。
９）ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルがオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンである８）のリンパ節内投与製剤。
１０）薬剤が、医薬活性物質、核酸分子収容体又は培養細胞である１）〜９）のいずれかのリンパ節内投与製剤。
１１）薬剤が、抗がん剤である１）〜９）のいずれかのリンパ節内投与製剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、リンパ行性薬剤送達法において、目的薬剤の効果を標的リンパ節において効果的に発揮させるためのリンパ節内投与製剤が提供される。すなわち、リンパ行性薬剤送達法において、低分子化合物、ポリペプチド、抗体、核酸等の医薬活性物質や免疫療法、遺伝子治療又は再生医療において使用される各種培養細胞等の薬剤の、リンパ節からネットワーク下流に位置するリンパ節への送達率及び貯留時間を調節でき、投与された薬剤のリンパ節及び下流リンパ節における治療又は予防的治療効果の最適化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウス実験におけるリンパネットワーク図。腋窩部には固有腋窩リンパ節（proper axillary lymph node：ＰＡＬＮ）と副腋窩リンパ節（accessory axillary lymph node：ＡＡＬＮ）が存在する。副腋窩リンパ節及び腸骨下リンパ節（subiliac lymph node：ＳｉＬＮ）は、固有腋窩リンパ節に対して、リンパネットワークの上流に位置する。すなわち副腋窩リンパ節→固有腋窩リンパ節、腸骨下リンパ節→固有腋窩リンパ節のリンパ流れが存在する。
【図２】ポリソルベート８０体積パーセントと粘度の関係。
【図３】リンパ行性薬剤送達法による腸骨下リンパ節から固有腋窩リンパ節への溶液の動態。
【図４】腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節に貯留性する各溶液の貯留特性。
【図５】各溶液に対する体重変化。
【図６】注射日からＤａｙ６目での腸骨下リンパ節及び固有腋窩リンパ節の病理像。
【図７】Ａ：Ｄａｙ０Ｔにおける腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）から内側腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）に流れ出る溶液の動態。Ｂ：Ｄａｙ６Ｔにおける抗腫瘍効果（ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング画像）。
【図８】Ｄａｙ６Ｔにおける各浸透圧に対する抗腫瘍効果。
【図９】Ｄａｙ６Ｔにおける各粘度に対する抗腫瘍効果。
【図１０】各溶液に対する治療開始後Ｄａｙ３Ｔ及びＤａｙ６Ｔでのマウス画像。
【図１１】実験日における高周波超音波で得られた固有腋窩リンパ節のＢモード画像。
【図１２】Ｄａｙ６Ｔでの腸骨下リンパ節及び固有腋窩リンパ節の病理像。
【図１３】各溶液に対するマウスの体重変化。
【図１４】グルコース体積パーセントと粘度との関係。
【図１５】エピルビシン実験の概念図。
【図１６】腫瘍細胞接種後１６日目における病理像。
【図１７】ニムスチン実験の概念図。
【図１８】腫瘍細胞接種後１６日目における病理像。
【図１９】メトトレキサート実験の概念図。
【図２０】腫瘍細胞接種後１６日目における病理像。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、「リンパ行性薬剤送達法」とは、転移リンパ節の上流に位置するリンパ節に薬剤を投与し、リンパ管経由で当該薬剤を下流のリンパ節に送達させる方法である。
本発明において、「リンパ節内投与製剤」とは、リンパ行性薬剤送達法によって目的薬剤を標的リンパ節に送達するための、リンパ節内に投与される液体製剤である。
【００１４】
本発明において、「薬剤」とは、疾病の治療又は予防的治療を目的として人を含む動物の体内に投与される各種物質を意味し、医薬活性物質（例えば、低分子化合物、特に低分子有機化合物；タンパク質又はポリペプチド（細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、神経栄養因子、酵素、ホルモン、サイトカイン等）；多糖類；脂質；抗体；核酸（ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、アプタマー等）；ウイルス等）の他、遺伝子治療のための核酸分子を収容する構造体（ウイルス、ウイルス様粒子、ミニサークル、プラスミド又はベクター（ネイキッドＤＮＡ）、リポソーム及び／又はナノ粒子）、免疫療法、遺伝子治療又は再生医療において使用される各種培養細胞（例えば、多能性幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）、組織幹細胞、間葉系幹細胞等）等が包含される。
なお、本明細書において、「治療」とは、疾病を有する対象の治療（即時治療）のことを指し、その状態、又はその状態によって生じる1つ若しくは複数の症状を、改善、軽減又は消失させることを意味する。「予防的治療」とは、疾病になるリスクはあるが、現時点ではその状態や症状を有しない対象の治療を意味する。
【００１５】
上記医薬活性物質の種類は、特に限定されず、中枢神経用薬、末梢神経系用薬、感覚器官用薬、循環器官用薬、呼吸器官用薬、消化器官用薬、泌尿生殖器官用薬、ホルモン剤、腫瘍用薬、放射性医薬品等の何れでも良いが、腫瘍用薬（抗がん剤）が好適である。
【００１６】
また、上記医薬活性物質の製剤形態は、組成物の形態でもよく、高分子ポリマーミセル医薬品等のミセル製剤、リポゾーム製剤であってもよい。
【００１７】
以下に、好適な薬剤の一例を示す。
（１）分子標的薬（イブリツモマブチウキセタン、イマチニブ、エベロリムス、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、スニチニブ、セツキシマブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、パニツムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ラパチニブ、リツキシマブ）から選ばれる１種以上。
（２）アルキル化剤（イホスファミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、ラニムスチン）から選ばれる１種以上。
（３）代謝拮抗剤（エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート）から選ばれる１種以上。
（４）植物アルカロイド（イリノテカン、エトポシド、エリブリン、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、パクリタキセル注射剤、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン）から選ばれる１種以上。
（５）抗がん性抗生物質（アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ぺプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン）から選ばれる１種以上。
（６）プラチナ製剤（オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン）から選ばれる１種以上。
（７）ホルモン剤（アナストロゾール、エキセメスタン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、デキサメタゾン、トレミフェン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタン、リュープロレリン、レトロゾール）から選ばれる１種以上。
（８）インターフェロン・α、インターフェロン・β、インターフェロン・γ、インターロイキン２、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ、レンチナン）から選ばれる１種以上。
（９）上記（１）〜（８）のミセル製剤。
（１０）上記（１）〜（８）のリポゾーム製剤。
（１１）免疫療法、遺伝子治療、再生医療などにおいて使用される各種細胞懸濁液。
【００１８】
本発明のリンパ節内投与製剤は、リンパ節内に注射可能な剤型、すなわち注射用組成物であるのが好ましい。注射用組成物の形態は、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、ゲル、或いは用事調製のための固体組成物の何れでも良い。
【００１９】
本発明のリンパ節内投与製剤は、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）等の水性の希釈剤、又は例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油；エタノールなどのアルコール類、ポリソルベート２０、６０，８０等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等の非水性の希釈剤を用いて、上記薬剤の溶液、懸濁液、乳濁液が調製されるが、その場合において、当該液体の浸透圧が７００ｋＰａ〜２７００ｋＰａであるように調製される。
【００２０】
リンパ節内投与製剤の浸透圧は、７００〜２７００ｋＰａの範囲で調整されるが、下流に位置するリンパ節への薬剤の送達率及び貯留性並びに組織障害性の点から、好ましくは７００ｋＰａ以上、より好ましくは８００ｋＰａ以上、より好ましくは９００ｋＰａ以上、より好ましくは９５０ｋＰａ以上であり、より好ましくは１０００ｋＰａ以上であり、且つ２７００ｋＰａ以下、好ましくは２４００ｋＰａ以下、より好ましくは２０００ｋＰａ以下である。例えば、７００〜２７００ｋＰａ、好ましくは９００〜２７００ｋＰａ、より好ましくは９００〜２４００ｋＰａ、より好ましくは９５０〜２４００ｋＰａ、より好ましくは９５０〜２０００ｋＰａである。
【００２１】
本発明において、浸透圧Πは、Π＝ＣＲＴで定められたファントホッフの式より算出される。なお、式中、Ｃはモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、Ｒは気体定数（Ｒ＝８．３１×１０３Ｐａ・Ｌ／Ｋ・ｍｏｌ）、Ｔは絶対温度（Ｋ）をそれぞれ示す。
例えば、後述の表１に示す溶液の浸透圧Π（Ｐａ）は、（ポリソルベート８０のモル濃度＋エタノールのモル濃度）×８．３１×１０３×（２７３＋摂氏温度）で求められる。
【００２２】
併せて、本発明のリンパ節内投与製剤は、薬剤効果及び製剤上の取り扱いの点から、その粘度が、２５ｍＰａ・ｓ以下であるのが好ましく、より好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは１５ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは１３ｍＰａ・ｓ以下であり、且つ好ましくは０・５ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１ｍＰａ・ｓ以上である。
例えば、０．５〜２５ｍＰａ・ｓ、好ましくは１．０〜１５ｍＰａ・ｓ、より好ましくは１．０〜１３ｍＰａ・ｓである。
粘度は後述の実施例で示すように、２０℃において振動粘度計（例えば、音叉振動式粘度計＜ＳＶ−１Ａ、エー・アンド・デイ株式会社製＞）を使用して測定することが可能である。
【００２３】
浸透圧の調整は、グルコース、マンニトール、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、ラフィノース、マルトース等の糖類や、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の塩類、糖アルコール若しくは多価アルコール又はそのエーテル、非イオン性界面活性剤等を用いて行うことができる。また、粘度の調整は、一般に注射製剤において、増粘剤として用いられる各種の親水性ポリマーを用いて行うことができる。具体的には、例えば、セルロース、アミロース、ペクチン、ゼラチン、デキストリン、アルギン酸塩等の直鎖状の多糖類；セルロース誘導体（メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等のヒドロキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、並びにカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含むこれらの塩等）；グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸及びその塩等の非硫酸化グリコサミノグリカン、脱硫酸化ヘパリン、脱硫酸化コンドロイチン硫酸、及び脱硫酸化デルマタン硫酸等）；ガラクトマンナン（グアーガム、フェヌグリークガム、タラガム、ローカストビーンガム、及びイナゴマメガム等）；カルボマー；ポリアクリル酸；ポリカルボフィル；ポリビニルピロリドン；ポリアクリルアミド；ポリビニルアルコール；ポリ酢酸ビニルの誘導体及び混合物が挙げられる。
【００２４】
このうち、浸透圧及び粘度を共に調整可能な非イオン性賦形剤を用いるのが好ましく、例えば、グルコース、マンニトール、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、ラフィノース、マルトース等の糖類、非イオン性界面活性剤が好ましく、非イオン性界面活性剤がより好ましい。非イオン性界面活性剤としては、高級アルコールエチレンオキシド付加物、アルキルフェノールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、油脂のエチレノキサイド付加物、グリセリン脂肪酸エステル、ペンタエリスリトールの脂肪酸エステル、多価アルコールのアルキルエーテル、アルカノールアミン類の脂肪酸アミドなどが挙げられるが、中でも、例えば、ソルビトール及びソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油（polyethoxylated castor oil）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（polyethoxylated hydrogenated castor oil）、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール共重合体、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステルなどが好ましく用いられる。
【００２５】
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、特に、モノステアリン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタンなどが好適である。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、特に、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート６０、Ｔｗｅｅｎ６０）、トリステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート６５、Ｔｗｅｅｎ６５）、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）などが好適である。ポリエチレングリコール脂肪酸エステルとしては、特に、モノラウリン酸ポリエチレングリコール（10E．O.）などが好適である。ショ糖脂肪酸エステルとしては、特に、ショ糖パルミチン酸エステル類）、ショ糖ステアリン酸エステル類などが好適である。ポリオキシエチレンヒマシ油（polyethoxylated castor oil）としては、特に、ポリオキシエチレングリセロールトリリシノレート３５などが好適である。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（polyethoxylated hydrogenated castor oil）としては、特に、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０などが好適である。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール共重合体としては、特に、ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコールなどが好適である。グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノステアリン酸グリセリルなどが好適である。ポリグリセリン脂肪酸エステルとしては、特に、テトラグリセリンモノステアリン酸、デカグリセリンモノラウリン酸などが好適である。
【００２６】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルがより好ましく、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５又はポリソルベート８０が好ましく、ポリソルベート８０（オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）がより好ましい。
浸透圧の調製に、非イオン性賦形剤を用いた場合の、製剤中の非イオン性界面活性剤の体積パーセントは、例えば０〜２５％（ｖ／ｖ）であるのが好ましく、より好ましくは８〜２５％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは１０〜２３％（ｖ／ｖ）であり、さらに好ましくは１５〜２０％（ｖ／ｖ）である。
【００２７】
本発明のリンパ節内投与製剤は、上記の薬剤と浸透圧調製剤に、本発明の効果を阻害しない範囲で、適宜、界面活性剤、保存剤（安定化剤）、無痛化剤、局所麻酔剤及びｐＨ調整剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤のような補助剤（賦形剤）を配合し、公知の注射剤と同様に常法に従い調製することができる。
【００２８】
保存剤としては例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のアルキルパラベン等が挙げられ、無痛化剤としては例えば、ベンジルアルコール等が挙げられ、局所麻酔剤としては例えば、塩酸キシロカイン、クロロブタノール等が挙げられ、ｐＨ調整剤としては例えば、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウムあるいは各種緩衝剤等が挙げられる。
【００２９】
また、界面活性剤、分散剤、乳化剤としては、上述した非イオン性界面活性剤やポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３０】
また、可溶化剤としては、例えばサリチル酸ナトリウム、ポロキサマー、酢酸ナトリウム等が挙げられ、防腐剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、安息香酸ナトリウム、フェノール等が挙げられ、安定剤としては、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン等のアルブミンが挙げられる。
【００３１】
斯くして調製された本発明のリンパ節内投与製剤は、患者のリンパ節内に局所投与される。ここで、投与対象となるリンパ節は、治療又は予防的治療を目的とするリンパ節（標的リンパ節）自体であってもよく、又は当該リンパ節が属するリンパ管ネットワーク上流に位置するリンパ節であってもよい。具体的には、例えば、腫瘍細胞が原発巣から移動して最初に転移を発症するセンチネルリンパ節や、センチネルリンパ節の下流に位置するリンパ節(二次リンパ節)、原発巣周囲の所属リンパ節の上流に位置するリンパ節、所属リンパ節が属するリンパ管ネットワークの上流に位置するリンパ節等が挙げられる。ここで、標的リンパ節は、がんを有しているか否かは問われない。例えば、リンパ節郭清する前に、郭清域内のリンパ節（上流側リンパ節）にリンパ節内投与製剤を投与し、リンパ管ネットワークを介して郭清域外のリンパ節（下流側リンパ節）に抗がん剤を送達させて、郭清を実施することにより、下流側リンパ節の予防的治療が可能である。
【００３２】
本発明のリンパ節内投与製剤のリンパ節への投与は、リンパ節内に本発明のリンパ節内投与製剤が注入できればその手法は限定されず、患者の皮膚を切開して露わになったリンパ節に注入投与してもよいし、患者の皮膚の上からリンパ節の位置として見当をつけた部位に注射投与してもよい。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３４】
参考例１  インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を含む溶液の粘性の測定
１．材料・方法
１）溶液の準備
ポリソルベート８０（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０、日油株式会社）、蒸留水、インドシアニングリーン溶液（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ：ＩＣＧ、第一三共株式会社）を混合し、粘度の異なる組成の溶液を調製した（表１）。
表１の溶液の粘度は音叉振動式粘度計（ＳＶ−１Ａ：粘度測定域：０．３〜１０、０００ｍＰａ・ｓ、ＳＶ−１Ｈ：粘度測定域：０．３〜１０００ｍＰａ・ｓ、エー・アンド・デイ株式会社）で、室温下（２０℃）で測定した。
表１中、血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００３５】
２．結果
１）ポリソルベート８０体積パーセントと粘度との関係
図２にポリソルベート８０体積パーセントと粘度との関係を示す。ポリソルベート８０含有率が高くなるほど、粘度が指数関数的に増加する傾向にあった。
ポリソルベート８０体積パーセント（ｘ）、 粘度（ｙ）とすると、以下の関係式（式１）を得た。【００３６】
【数１】
2019045005.tif 000003
【００３７】
表１中における浸透圧は、 以下の浸透圧は以下のファントホッフの式（式２）より求めた。【００３８】
【数２】
2019045005.tif 000004
【００３９】
【表１】
2019045005.tif 000005
【００４０】
実施例１  溶液の浸透圧を変えた場合のリンパ行性薬剤送達による薬剤動態
１．材料・方法
１）溶液の調整
表１で示した４つの溶液（ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）を準備した。各溶液の浸透圧及び粘度は、以下のとおりである。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ：浸透圧＝０ｋＰａ、粘度＝１．０１ｍＰａ・ｓ）
ＳｏｌｕｔｉｏｎＢ：浸透圧＝１７４０ｋＰａ、粘度＝６．０１ｍＰａ・ｓ）
ＳｏｌｕｔｉｏｎＣ：浸透圧＝３４８１ｋＰａ、粘度＝４２７ｍＰａ・ｓ）
ＳｏｌｕｔｉｏｎＤ：浸透圧＝５２２１ｋＰａ、粘度＝８０２０ｍＰａ・ｓ）【００４１】
２）溶液の浸透圧の変化にともなうリンパ行性薬剤送達法で送達される溶液の可視化
溶液を腸骨下リンパ節(ＳｉＬＮ)に投与速度１０μＬ／ｍｉｎで２００μＬ注射し、リンパ管経由で固有腋窩リンパ節(ＰＡＬＮ) への送達性と貯留性を生物発光イメージングシステム（ＩＶＩＳ，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）の蛍光モードで観察した（Excitation filter: 745 ｎｍ, Emission filter: ICG）。
観察日は、インドシアニングリーン溶液を腸骨下リンパ節に注射する直前、直後、６時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、３５日後、４２日後、４９日後とした。【００４２】
３）腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節に貯留する溶液の貯留特性
前述の２）の測定日に得られた腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節の蛍光値と測定時間との関係をプロットした。【００４３】
４）リンパ行性薬剤送達法によるインドシアニングリーン溶液注入にともなう体重変化
体重測定日は，インドシアニングリーン溶液を腸骨下リンパ節に注射する直前、１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、１４日後、２１日後、２８日後、３５日後とした。各回の体重測定値は平均値±標準誤差（ｍｅａｎ±ＳＥ）として表記した。【００４４】
２．実験結果
１）リンパ行性薬剤送達法による腸骨下リンパ節から固有腋窩リンパ節への溶液の動態
図３にリンパ行性薬剤送達法による腸骨下リンパ節から固有腋窩リンパ節への溶液の動態を示す。
投与直後において、すべての溶液において、腸骨下リンパ節から固有腋窩リンパ節への流れが確認された（０ｈｒ）。
注射後１日目で、固有腋窩リンパ節への貯留効果はＳｏｌｕｔｉｏｎＢ、Ｃ、Ｄで確認されたが（○で囲まれた箇所）、ＳｏｌｕｔｉｏｎＡでは確認されなかった。
注射後７日目で、腸骨下リンパ節にＳｏｌｕｔｉｏｎＢ、Ｃ、Ｄの貯留が確認されたが（○で囲まれた箇所）、ＳｏｌｕｔｉｏｎＡは確認されなかった。
注射後１４日目で、腸骨下リンパ節にＳｏｌｕｔｉｏｎＣ、Ｄの貯留が確認されたが（○で囲まれた箇所）、ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ及びＢでは確認されなかった。
注射後２１日目で、腸骨下リンパ節にＳｏｌｕｔｉｏｎＤの貯留が確認されたが（○で囲まれた箇所）、ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、Ｂ、Ｃは確認されなかった。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＤでは、ＳｏｌｕｔｉｏｎＤを、注射容器に入れ、注射針から押し出すには相当の力が必要であり、実用に適した溶液ではなかった。
ＳｏｌｕｔｉｏｎＣ及びＤでは腸骨下リンパ節に浮腫が確認された（矢印部分）。【００４５】
２）腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節に貯留する溶液の貯留特性
図４に図３で得られた腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節に貯留する各溶液の貯留特性を示す。投与直後では、固有腋窩リンパ節ではｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂの貯留性が高く、腸骨下リンパ節ではｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄの貯留性が高くなることが確認された。 【００４６】
３）各溶液に対する体重変化
図５に各溶液に対するマウスの体重変化を示す。エラーバーは平均±標準誤差として表記されている。ＳｏｌｕｔｉｏｎＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを腸骨下リンパ節に注射しても、副作用としての顕著な体重減少は確認されなかった。【００４７】
４）浸透圧及び粘度の適正域
以上から、浸透圧、粘度の適正な範囲は、浸透圧上限値は３４８１ｋＰａ以下、粘度上限値は４２７ｍＰａ×ｓ以下であると判断できる。【００４８】
実施例２  浸透圧の変化に対する病理解析
１．材料・方法
１）溶液の調整
表２に示された溶液、Π７５８、Π４０８、Π５１５、Π５５６、Π２６１０、Π２７７３を使用した。Π７５８の粘度に関しては, 生理食塩水の粘度が水と同等と判断し参考文献（理科年表、国立天文台編、１９９７、丸善株式会社）から得た。溶液Π７５８、Π４０８、Π５１５、Π５５６、Π２６１０、Π２７７３の粘度に関しては、音叉振動式粘度計（ＳＶ−１Ａ：粘度測定域：０．３〜１０、０００ｍＰａ・ｓ、ＳＶ−１Ｈ：粘度測定域：０．３〜１０００ｍＰａ・ｓ、エー・アンド・デイ株式会社）で、室温下（２０℃）で測定した。
浸透圧は前記と同様に前記（式２）より求めた。
表２中、 血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から、各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００４９】
【表２】
2019045005.tif 000006
【００５０】
２）マウス
マウスとしては図１に示すＭＸＨ１０／Ｍｏ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（１４−１８週齢）（前記非特許文献１）を使用した。【００５１】
３）溶液の注射
溶液を腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）に投与速度１０μＬ／ｍｉｎで２００μＬ注射し、リンパ管経由で固有腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）に送達させた。注射日をｄａｙ０とした。【００５２】
４）病理解析
注射日から６日目（Ｄａｙ６）に腸骨下リンパ節と固有腋窩リンパ節を摘出し取り出し、１０％ホルマリン溶液に浸漬して４日間放置したのちパラフィンで包埋し、ブロックを作製した。パラフィンブロックはミクロトーム（ＲＥＭ−７００，Ｙａｍａｔｏ  Ｋｏｈｋｉ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）を使用し厚さ３μｍに薄切し、スライドグラス（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ，Ｍａｔｓｕｎａｍｉ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）に貼付した。その後、パラフィン伸展器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に一晩置き、十分伸展させた。作製した切片は、ＨＥ全自動染色システム（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，  Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，  Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）を用いてヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色をおこなった。
観察には光学顕微鏡（ＢＸ５１，オリンパス社製）を用いて明視野観察法で観察した。【００５３】
２．結果
１）病理解析
図６に注射日から６日目（Ｄａｙ６）での腸骨下リンパ節及び固有腋窩リンパ節の病理像を示す。溶液はΠ７５６、Π４０８ 、Π５１５、Π５５６、Π２６１０およびにΠ２７７３である。倍率は２倍および１０倍である。２倍画像上で□で囲んだ部位を拡大したものが１０倍像である。画像においてＴは腫瘍領域、Ｎは壊死領域を示す。
（Ａ）Π７５８
ＳｉＬＮ
リンパ節に特記すべき病的変化は認められなかった。
ＰＡＬＮ
リンパ節に特記すべき病的変化は認められなかった。
（Ｂ）Π４０８
ＳｉＬＮ
リンパ節髄洞に軽度の拡張がみられ、リンパ節髄質に軽度の浮腫を認めるが、リンパ節に明らかな器質的変化が認められなかった。
ＰＡＬＮ
リンパ節全体のリンパ節髄洞に拡張がみられ、リンパ節外に浮腫を認められた。しかし、壊死巣や線維化は観られず可逆的変化と思われる。
（Ｃ）Π５１５
ＳｉＬＮ  
リンパ節髄洞に軽度の拡張がみられ、リンパ節髄質に軽度の浮腫を認められたが、リンパ節に明らかな器質的変化が認められなかった。
ＰＡＬＮ
リンパ節髄洞に軽度の拡張がみられ、リンパ節髄質に軽度の浮腫を認められたが、リンパ節に明らかな器質的変化が認められなかった。
（Ｄ）Π５５６
ＳｉＬＮ  
リンパ節髄洞に軽度の拡張がみられ、リンパ節髄質に浮腫を認めるが、リンパ節に明らかな器質的変化が認められない。
ＰＡＬＮ
リンパ節全体のリンパ節髄洞に拡張がみられ、リンパ節外に浮腫を認められた。しかし、壊死巣や線維化は観られず可逆的変化と思われる。
（Ｅ）Π２６１０
ＳｉＬＮ  
リンパ節髄洞に軽度の拡張がみられた。
ＰＡＬＮ
リンパ節全体のリンパ節髄洞に拡張がみられ、リンパ節外に浮腫を認められた。しかし、壊死巣や線維化は観られず可逆的変化と思われる。
（Ｆ）Π２７７３
ＳｉＬＮ  
リンパ節の大部分に及ぶ広範な壊死を認め、輸出リンパ管基部も壊死に陥っていたことから、輸出リンパ管を介した薬剤送達は困難な所見を呈している。
ＰＡＬＮ
リンパ節髄洞に軽度の拡張がみられ、リンパ節髄質に軽度の浮腫を認められたが、リンパ節に明らかな器質的変化が認められなかった。【００５４】
以上の結果から、浸透圧２７７３ｋＰａ、粘度１８．９ｍＰ・ｓの溶液は、下流リンパ節への薬剤送達を達成できず、リンパ行性薬剤送達の製剤としては適さないと考えられる。【００５５】
実施例３  シスプラチンを含む溶液を用いた浸透圧域の検討
１．材料・方法
１）溶液の調製
表３にシスプラチンを含む溶液の組成を示す。
溶液はｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ，ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖである。シスプラチンのworking solution はsalineで準備する。 マウスにはマウス体重あたり、５ｍｇ／ｋｇを投与するように調整した。【００５６】
表３に示された粘度は前記（式１）から算出した。
表３に示された浸透圧は前記（式２）より求めた。
表３中、 血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から、各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００５７】
【表３】
2019045005.tif 000007
【００５８】
２）腫瘍細胞
ルシフェラーゼ遺伝子を発現するＫＭ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ悪性線維性組織球腫様細胞を使用した（Li L, Mori S, Sakamoto M, Takahashi S, Kodama T. Mouse model of lymph node metastasis via afferent lymphatic vessels for development of imaging modalities. PLoS One 2013; 8:e55797）。細胞の培養には、培地として１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）、１％Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．５％Ｇ４１８  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。【００５９】
３）細胞接種
固有腋窩リンパ節に細胞溶液（４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を４０μＬ接種した。この日をｄａｙ−３Ｔとした。【００６０】
４）薬剤投与
細胞接種後３日目に、腸骨下リンパ節にシスプラチン溶液を速度１０μＬ／ｍｉｎで２００μＬ投与し固有腋窩リンパ節に送達させた。【００６１】
５）生物発光イメージングシステムを用いた腫瘍の成長の確認
固有腋窩リンパ節内の腫瘍成長を評価するために、生物発光イメージングシステム（ＩＶＩＳ，  ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を使用した。麻酔下において、１５ｍｇ／ｍＬに濃度調整したルシフェリンをマウスの体重に合わせて１０μＬ／ｇをマウスの腹腔内に注射した。ルシフェリン投与１０分後に、ＩＶＩＳを用いて生物発光強度を測定した。測定データは、専用の解析ソフトを使用して固有腋窩リンパ節における単位時間当たりの発光量を算出した。治療開始日（ｄａｙ０Ｔ）、治療開始後３日目（ｄａｙ３Ｔ）、治療開始後６日目（ｄａｙ６Ｔ）に１回、生物発光強度の測定を行った。【００６２】
６）固有腋窩リンパ節の超音波診断
小動物用高周波超音波診断装置（中心周波数２５ＭＨｚ、空間分解能７０μｍ、方位分解能１４０ｍｍ、ＶＥＶＯ７７０，ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ社）下で、固有腋窩リンパ節のＢモード像を得る。腫瘍接種日（ｄａｙ−３Ｔ）、治療開始日（ｄａｙ０Ｔ）、治療開始後３日目（ｄａｙ３Ｔ）、治療開始後６日目（ｄａｙ６Ｔ）に、計測した。【００６３】
７）リンパ節体積測定
腫瘍接種日（ｄａｙ−３Ｔ）、治療開始日（ｄａｙ０Ｔ）、治療開始後３日目（ｄａｙ３Ｔ）、治療開始後６日目（ｄａｙ６Ｔ）に、マウスの体重を測定した。
８）病理解析
治療開始後６日目（ｄａｙ６Ｔ）に腸骨下リンパ節及び固有腋窩リンパ節を摘出し、ヘマトキシリン・エオジン染色により、病理像を解析した。【００６４】
２．実験結果
１）溶液の動態
図７Ａにｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖのｄａｙ０Ｔにおける腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）から内側腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）に流れ出る溶液の動態のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング画像を示す。
図７Ｂにｄａｙ６Ｔにおける抗腫瘍効果として、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング画像を示す。血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から、各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００６５】
２）浸透圧対する抗腫瘍効果
図８にｄａｙ６Ｔにおける各浸透圧に対する抗腫瘍効果を示す。縦軸は無次元化されたルシフェラーゼ活性値を示す。 ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ(day 6T)／ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ(day 0T)という無次元量を導入した。結果、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ を指標とした抗腫瘍効果の評価では、浸透圧Π＝３２００ｋＰａまで固有腋窩リンパ節に対する抗腫瘍効果が確認された。 【００６６】
３）粘度に対する抗腫瘍効果
図９にｄａｙ６Ｔにおける各粘度に対する抗腫瘍効果を示す。
結果、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙを指標とした抗腫瘍効果の評価では、粘度μ＝１２０ｍＰａ・ｓまでは、固有腋窩リンパ節に対する抗腫瘍効果が確認できた。【００６７】
４）マクロ視野における浸透圧および粘度に対する浮腫の評価
図１０に、各溶液に対する治療開始後Ｄａｙ３Ｔ及びＤａｙ６Ｔでのマウス画像を示す。Ｄａｙ３Ｔにおいて、溶液ＩＶ（浸透圧Π＝２７６８ｋＰａ、粘度μ＝５５ｍＰａ・ｓ）及びＶ（浸透圧Π＝３６４１ｋＰａ、粘度μ＝２６１．５ｍＰａ・ｓ）で浮腫が確認された。【００６８】
５）高周波超音波イメージング法による浮腫の評価
図１１に、実験日における高周波超音波で得られた固有腋窩リンパ節のＢモード画像を示す。Ｄａｙ６Ｔにおいて、溶液ＩＶ（浸透圧Π＝２７６８ｋＰａ、粘度μ＝５５．０ｍＰａ・ｓ）及びにＶ（浸透圧Π＝３６４１ｋＰａ、粘度μ＝２６１．８ｍＰａ・ｓ）で浮腫が確認された。【００６９】
６）病理解析
図１２にｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ、 ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ'、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ’ 、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ’、  および Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ おけるｄａｙ６Ｔでの腸骨下リンパ節および固有腋窩リンパ節の病理像を示す。倍率は２倍および１０倍である。２倍画像上で□で囲んだ部位を拡大したものが１０倍像である。画像においてＴは腫瘍領域、Ｎは壊死領域、Ｅは浮腫領域を示す。
（Ａ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ
ＳｉＬＮ
既存のリンパ節の大部分が壊死に陥り、壊死の範囲は周囲組織にも及んでいる。抗がん剤の周囲組織への拡散が示唆される。輸出リンパ管からのPALNへの薬剤送達が殆ど期待できない所見である。
ＰＡＬＮ
リンパ節辺縁洞の場所により、腫瘍組織が壊死に陥った領域も認められるが、殆ど腫瘍増殖が抑制されていない領域も認められる。リンパ節実質の構造は保たれている。リンパ節辺縁洞の一部に抗がん剤が流入したものの、全域には到達しなかったものと思われる。
（Ｂ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ’
ＳｉＬＮ
リンパ節中央に抗がん剤の注入によると思われる広範な壊死巣の形成が認められ、リンパ節辺縁洞にも及んでいる。輸出リンパ管からのPALNへの薬剤送達が殆ど期待できない所見である。
ＰＡＬＮ
リンパ節辺縁洞を起点として増殖したと思われる腫瘍の浸潤・増殖が認められる。薬剤送達が殆ど為されなかったと思われる。
（Ｃ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ
ＳｉＬＮ  
リンパ節中央に抗がん剤の注入によると思われる壊死巣の形成が認められたが、リンパ節辺縁洞の組織は保存されており、輸出リンパ管からのＰＡＬＮへの薬剤送達が期待できる所見である。
ＰＡＬＮ
リンパ節辺縁洞相当部に腫瘍細胞の増殖がみられたが、腫瘍組織の広範な壊死を伴っていた。ＳｉＬＮからのリンパ行性の薬剤送達の効果が期待できる所見である。
（Ｄ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ’
ＳｉＬＮ  
リンパ節門部相当部に浮腫と限局した壊死を認められたものの、リンパ節の構造は保存されており、輸出リンパ管からのＰＡＬＮへの薬剤送達が期待できる所見である。
ＰＡＬＮ
リンパ節辺縁洞およびリンパ節実質相当部に腫瘍細胞の増殖がみられたが、腫瘍組織の広範な壊死もみられた。ＳｉＬＮからのリンパ行性の薬剤送達の効果と考えらえる。
（Ｅ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ
ＳｉＬＮ  
リンパ節の一部に限局した壊死病巣を認められたもののリンパ節の構造は保存されており、輸出リンパ管からのＰＡＬＮへの薬剤送達が期待できる所見である。
ＰＡＬＮ
リンパ節辺縁洞およびリンパ節実質相当部に腫瘍細胞が増殖し、壊死したことを示す広範な壊死病巣を認められた。腫瘍細胞の残存はみられなかった。ＳｉＬＮからのリンパ行性の薬剤送達による著明な抗腫瘍効果と考えられる。
（Ｆ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ’
ＳｉＬＮ
リンパ節に壊死組織がみられ、辺縁洞も一部壊死に陥っていた。
ＰＡＬＮ
リンパ節辺縁洞およびリンパ節実質に腫瘍細胞の増殖が認められ、一部腫瘍組織が壊死に陥っていた。限局的ではあるが、ＳｉＬＮからのリンパ行性の薬剤送達による抗腫瘍効果が認められた。リンパ行性薬剤送達を期待できる結果であるため、投与するシスプラチン濃度を高めることなどで、所望の抗腫瘍効果が得られると考えられる。
（Ｇ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ
ＳｉＬＮ
既存のリンパ節に広範な壊死像を認め、周囲組織には著明な浮腫を認める。輸出リンパ管からのPALNへの薬剤送達が期待できない所見である。
ＰＡＬＮ
リンパ節辺縁洞を起点として増殖したと思われる壊死を伴った腫瘍がみられる。十分な抗がん剤の薬剤送達が為されなかったものと思われる。
（Ｈ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ’
ＳｉＬＮ
リンパ節門部相当部に壊死組織がみられ、また、周囲組織に浮腫を伴っており、輸出リンパ管からのPALNへの十分な薬剤送達が期待できない所見である。
ＰＡＬＮ
リンパ節の広範な領域が腫瘍に置換されており、抗がん剤の薬剤送達が殆ど為されなかったものと思われる。
（Ｉ）ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖ
ＳｉＬＮ
リンパ節門部の領域が広範な壊死に陥っており、また、周囲組織には著明な浮腫を伴っており、輸出リンパ管からのPALNへの薬剤送達が殆ど期待できない所見である。
ＰＡＬＮ
既存のリンパ節全ての領域が腫瘍に置換された状態である。抗がん剤は殆ど送達されなかったと思われる。
以上から、ＣＤＤＰを含む溶液を使用した場合のリンパ行性薬剤送達法に、より有効な溶液はｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ〜ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ'であった。当該病理像の結果から、リンパ行性薬剤送達の製剤として、浸透圧５８８ｋＰａ以下、又は、２７６８ｋＰａ以上は適さないと考えられる。【００７０】
７）病理解析
図１３に各溶液に対するマウスの体重変化を示す。すべての溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ）において、明確な体重減少は確認されなかった。【００７１】
参考例２  グルコースを含む溶液の粘性の測定
１．材料・方法
１）溶液の準備
グルコース（Otsuka, 50% glucose）を希釈し、粘度の異なる溶液（０．１〜５０v/v％グルコース水溶液）を調製した（表４）。溶液の粘度は音叉振動式粘度計（ＳＶ−１Ａ：粘度測定域：０．３〜１０、０００ｍＰａ・ｓ、ＳＶ−１Ｈ：粘度測定域：０．３〜１０００ｍＰａ・ｓ、エー・アンド・デイ株式会社）で、室温下（２０℃）で測定した。【００７２】
１．結果
図１４はグルコース体積パーセントと粘度との関係である。グルコースの体積パーセントの増加とともに、 粘度は指数関数的に増加する。 
グルコース体積パーセント（ｘ）、 粘度（ｙ）とすると、以下の関係式（式３）を得た。【００７３】
【数３】
2019045005.tif 000008
表４中における浸透圧は、 ファントホッフの式前記（式２）より求めた。
血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００７４】
【表４】
2019045005.tif 000009
【００７５】
実施例４  エピルビシンを含む溶液を用いた粘度域及び浸透圧域の検討
１．材料・方法
１）溶液の調製
表５にエピルビシンを含む溶液の組成を示す。
溶液はｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ’、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｆである。
表５における粘度は 前記（式３）から求めた。各溶液の粘度はほぼ１ｍＰａ×ｓであった。 
表５中における浸透圧は, ファントホッフの式前記（式２）より求めた。
血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００７６】
【表５】
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【００７７】
２）腫瘍細胞
ルシフェラーゼ遺伝子を発現するFM3A−Ｌｕｃマウス乳がん細胞を使用した（Shao L, Mori S, Yagishita Y, Okuno T, Hatakeyama Y, Sato T, Kodama T.  Lymphatic mapping of mice with systemic lymphoproliferative disorder: Usefulness as an inter-lymph node metastasis model of cancer.  J Immunol Methods. 2013 Mar 29;389(1-2):69-78.）。細胞の培養には、培地として１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，ＵＳＡ）、１％Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、  及び０．５％Ｇ４１８  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むRPMI-1640 medium (Biological Industries, Haemek, Israel)を用いた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。【００７８】
３）細胞接種
腸骨下リンパ節（ＳｉＬＮ）に細胞溶液（３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を６０μＬ接種した。この日をｄａｙ０とした。実験の概要図を図１５に示す。 【００７９】
４）溶液投与
細胞接種後７日目（Ｄ７）に、腸骨下リンパ節にエピルビシン溶液をボーラス投与で２００μＬ投与し固有腋窩リンパ節（ＰＡＬＮ）に送達させた。薬剤濃度はマウスを３４ｇと仮定して、 ３ｍｇ/ｋｇ/ｍｏｕｓｅとした。 【００８０】
５）病理解析
腫瘍移植後１６日目（Ｄ１６）に腸骨下リンパ節及び固有腋窩リンパ節を摘出し、ヘマトキシリン・エオジン染色により、病理像を解析した。【００８１】
２．実験結果
１）ボーラス投与の場合
図１６は腫瘍移植後１６日目における病理像である。
（Ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ
ＳｉＬＮ  （Ｃ−１，  Ｃ−２）
リンパ節に腫瘍の浸潤・増殖は確認できない。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ（Ｃ−３，  Ｃ−４）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。
（Ｄ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄ
ＳｉＬＮ  （Ｄ−１，  Ｄ−２）
リンパ節辺縁洞を起点に浸潤・増殖したと思われる腫瘍細胞がわずかにみられるが、腫瘍組織の大部分は壊死組織に陥り、線維性組織に置換されている。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ（Ｄ−３，  Ｄ−４）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。
（Ｆ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｆ
ＳｉＬＮ（Ｆ−１，  Ｆ−２）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ（Ｆ−３，  Ｆ−４）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。
（Ｃ’）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ’，  Ｃｏｎｔｒｏｌ
ＳｉＬＮ（Ｃ’−１，  Ｃ’−２）
リンパ節辺縁洞を起点に浸潤・増殖したと思われる腫瘍細胞が、著明な増殖傾向を示し、リンパ節周囲に腫瘍塊を形成している。
ＰＡＬＮ（Ｃ’−３，  Ｃ’−４）
リンパ節辺縁洞に腫瘍細胞の浸潤、増殖が認められ、転移病巣を形成している。
以上から、 エピルビシンを含む溶液を使用した場合のリンパ行性薬剤送達法においても、浸透圧１６００ｋＰａ〜２３３５ｋＰａの範囲で、本発明の効果が発揮され、良好な薬剤効果が得られることが示された。【００８２】
実施例５  ニムスチンを含む溶液を用いた浸透圧域の検討
１．材料・方法
１）溶液の調製
表６にニムスチンを含む溶液の組成を示す。
溶液はｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ、およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄである。 
表６中の粘度は前記（式３）から求めた。 
粘度はほぼ１ｍＰａ×ｓであった。
表６中における浸透圧は、 ファントホッフの式前記（式２）より求めた。
血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００８３】
【表６】
2019045005.tif 000011
【００８４】
２）腫瘍細胞
ルシフェラーゼ遺伝子を発現するFM3A−Ｌｕｃマウス乳がん細胞を使用した（Shao L, Mori S, Yagishita Y, Okuno T, Hatakeyama Y, Sato T, Kodama T.  Lymphatic mapping of mice with systemic lymphoproliferative disorder: Usefulness as an inter-lymph node metastasis model of cancer.  J Immunol Methods. 2013 Mar 29;389(1-2):69-78.）。細胞の培養には、培地として１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）、１％Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、  及び０．５％Ｇ４１８  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むRPMI-1640 medium (Biological Industries, Haemek, Israel)を用いた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。【００８５】
３）細胞接種
腸骨下リンパ節に細胞溶液（３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を６０μＬ接種した。この日をｄａｙ０とした。図１７はニムスチンの実験の概念図である。 【００８６】
４）溶液投与
細胞接種後７日目（Ｄ７）に、腸骨下リンパ節にニムスチン溶液をボーラス投与で２００μＬ投与し固有腋窩リンパ節に送達させた。薬剤濃度はマウスを３４ｇと仮定して、５ｍｇ/ｋｇ/ｍｏｕｓｅとした。【００８７】
５）病理解析
腫瘍移植後１６日目（Ｄ１６）に腸骨下リンパ節及び固有腋窩リンパ節を摘出し、ヘマトキシリン・エオジン染色により、病理像を解析した。【００８８】
２．実験結果
図１８は腫瘍細胞接種後１６日目における病理像（ボーラス投与）の病理像である。 
（Ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ
ＳｉＬＮ （Ｉ, Ｊ）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ（Ｋ, Ｌ）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。
（Ｄ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄ
ＳｉＬＮ （Ｍ, Ｎ）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ（Ｏ, Ｐ）
リンパ節内に腫瘍細胞は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。
以上から、ニムスチンを含む溶液を使用した場合のリンパ行性薬剤送達法においても、浸透圧１６００ｋＰａ〜１９４３ｋＰａの範囲で、本発明の効果が発揮され、良好な薬剤効果が得られることが示された。【００８９】
実施例６  メトトレキサートを含む溶液を用いた浸透圧域の検討
１．材料・方法
１）溶液の調製
表７にメトトレキサートを含む溶液の組成を示す。
溶液はｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ、およびｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄである。
表７中の粘度は前記（式３）から求めた。
粘度はほぼ１ｍＰａ×ｓであった。
表７中における浸透圧は、 ファントホッフの式前記（式２）より求めた。
血液の浸透圧に対する比とは、１ｍＯｓｍ／Ｋｇ＝２２６９．６８Ｐａの関係から各溶液の浸透圧［ｋＰａ］をｍＯｓｍ／Ｋｇに単位換算し、これを血液の浸透圧２９０ｍＯｓｍ／ｋｇで除した値である。【００９０】
【表７】
2019045005.tif 000012
【００９１】
２）腫瘍細胞
ルシフェラーゼ遺伝子を発現するFM3A−Ｌｕｃマウス乳がん細胞を使用した（Shao L, Mori S, Yagishita Y, Okuno T, Hatakeyama Y, Sato T, Kodama T.  Lymphatic mapping of mice with systemic lymphoproliferative disorder: Usefulness as an inter-lymph node metastasis model of cancer.  J Immunol Methods. 2013 Mar 29;389(1-2):69-78.）。細胞の培養には、培地として１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）、１％Ｌ−グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、  及び０．５％Ｇ４１８  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むRPMI-1640 medium (Biological Industries, Haemek, Israel)を用いた。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とした。【００９２】
３）細胞接種
腸骨下リンパ節に細胞溶液（３．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を６０μＬ接種した。この日をｄａｙ０とした。図１９はメトトレキサート実験の概念図である。 【００９３】
４）溶液投与
細胞接種後７日目（Ｄ７）に、腸骨下リンパ節にメトトレキサート溶液をボーラス投与で２００μＬ投与し固有腋窩リンパ節に送達させた。薬剤濃度はマウスを３４ｇと仮定して、 ５ｍｇ/ｋｇ/ｍｏｕｓｅとした。【００９４】
５）病理解析
腫瘍移植後１６日目（Ｄ１６）に腸骨下リンパ節及び固有腋窩リンパ節を摘出し、ヘマトキシリン・エオジン染色により、病理像を解析した。【００９５】
２．実験結果
抗腫瘍効果の病理像を図２０に示す。 
（Ｂ）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ 
ＳｉＬＮ（ Ｅ, Ｆ）
リンパ節に明らかな腫瘍細胞の増殖は確認できない。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ  （Ｇ, Ｈ）
リンパ節に明らかな腫瘍細胞の増殖は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。
（Ｃ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ
ＳｉＬＮ （Ｉ, Ｊ）
リンパ節に明らかな腫瘍細胞の増殖は確認できない。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ（Ｋ, Ｌ）
リンパ節に明らかな腫瘍細胞の増殖は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。
（Ｄ）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄ
ＳｉＬＮ （Ｍ, Ｎ）
リンパ節に明らかな腫瘍細胞の増殖は確認できない。投与薬剤による増殖抑制効果と考えられる。
ＰＡＬＮ（Ｏ, Ｐ）
リンパ節に明らかな腫瘍細胞の増殖は確認できない。投与薬剤による転移抑制効果と考えられる。【００９６】
以上から、メトトレキサートを含む溶液を使用した場合のリンパ行性薬剤送達法においても、浸透圧１２０８〜1９４３ｋＰａの範囲で、本発明の効果が発揮され、良好な薬剤効果が得られることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明のリンパ節内投与製剤によれば、リンパ節に薬剤を投与して、投与したリンパ節より下流のリンパ節に効率よく薬剤を流し込むことができる。例えば、薬剤が抗がん剤である場合、標的のリンパ節で抗がん作用を発揮するだけでなく、微小ながんが転移している可能性がある他のリンパ節にも抗がん剤を効率よく流し込むことができ、微小ながんを殺すことで、再発を防止することができる。
また、例えば、手術で郭清できない領域のリンパ節にがんがある場合、外科的手術での治癒は不可能であるが、本発明のリンパ節内投与製剤を用いることで、上流のリンパ節から抗がん剤を流して郭清できない領域のリンパ節の治療を行うことが可能である。さらに、本発明のリンパ節内投与製剤においては、使用する薬剤の量は、従来の全身投与に用いる量よりも少ないため、副作用も少なく、安全性が高い。
【図１】
2019045005.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019045005.tif 000022
【図１１】
2019045005.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2019045005.tif 000029
【図１８】
2019045005.tif 000030
【図１９】
2019045005.tif 000031
【図２０】
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【国際調査報告】
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2019045005.tif 000034
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