(57)【要約】  本発明の目的は、線維芽細胞増殖促進用組成物、及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用組成物を提供することである。  本発明は、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有する線維芽細胞増殖促進用組成物、及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用組成物を提供する。
2019045037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有する線維芽細胞増殖促進用組成物。
【請求項２】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有するヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用組成物。
【請求項３】
ヒアルロン酸産生促進のために用いられる請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
皮膚疾患、又は関節炎の予防、改善又は治療のために用いられる請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
（１）（ａ）ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７、及び（ｂ）免疫細胞又は免疫細胞産生成分と、（２）線維芽細胞とを接触させる工程を有するヒアルロン酸含有組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の製造方法により製造されたヒアルロン酸含有組成物。
【請求項７】
飲食品である請求項１〜４、及び請求項６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
飲食品が食品添加物又はサプリメントである請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の有効量を摂取者に投与する工程を含む、線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進する方法。
【請求項１０】
線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進のために使用するための、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７。
【請求項１１】
線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用医薬製造のためのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の使用。
【請求項１２】
線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進するためのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸産生促進用組成物に関するものであり、より詳細には、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有するヒアルロン酸産生促進用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７について、風邪予防等の様々な機能を有することが知られているが（特許文献１〜６及び非特許文献１〜１０）、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の線維芽細胞増殖促進作用及びヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進作用については一切知られておらず、示唆さえされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−９５４６５号公報
【特許文献２】特開平１０−１６７９７２号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１４／１９９４４８号パンフレット
【特許文献４】ＷＯ２００８／０１８１４３号パンフレット
【特許文献５】ＷＯ２００４／０８４９２３号パンフレット
【特許文献６】ＷＯ２００４／０８４９２２号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｉｗａｓａｋｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｏｒａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｅｖ  Ｄｅｎｔ．，２０１６；１４（３）：２０７−１４．
【非特許文献２】Ｈａｔａｎｏ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１５；Ａｐｒ；２５（２）：３２１−３１
【非特許文献３】Ｈｉｒｏｓｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｓｃｉ．，２０１３  Ｄｅｃ  ６；２：ｅ３９
【非特許文献４】Ｆｕｊｉｋｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１２；７６（５）：９１８−２２．
【非特許文献５】Ａｒｉｍｏｒｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．  ２０１２  Ｄｅｃ；３４（６）：９３７−４３
【非特許文献６】Ｈｉｒｏｓｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１０  Ｍａｒ；５４（３）：１４３−５１．
【非特許文献７】Ｍａｅｄａ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００９  Ａｕｇ；９（９）：１１２２−５．
【非特許文献８】Ｈｉｒｏｓｅ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎｕｔｒ．  ２００６  Ｄｅｃ；１３６（１２）：３０６９−７３．
【非特許文献９】Ｍｕｒｏｓａｋｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０００  Ｊｕｎ；４９（３）：１５７−６４．
【非特許文献１０】Ｍｕｒｏｓａｋｉ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９８  Ｊｕｌ；１０２（１）：５７−６４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、線維芽細胞増殖促進用組成物、及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有する組成物が、線維芽細胞増殖促進作用、及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進作用を有することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有する線維芽細胞増殖促進用組成物。
［２］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有するヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用組成物。
［３］ヒアルロン酸産生促進のために用いられる前記［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］皮膚疾患、又は関節炎の予防、改善又は治療のために用いられる前記［１］又は［２］に記載の組成物。
［５］（１）（ａ）ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７、及び（ｂ）免疫細胞又は免疫細胞産生成分と、（２）線維芽細胞とを接触させる工程を有するヒアルロン酸含有組成物の製造方法。
［６］前記［５］の製造方法により製造されたヒアルロン酸含有組成物。
［７］飲食品である前記［１］〜［４］、及び［６］のいずれかに記載の組成物。
［８］飲食品が食品添加物又はサプリメントである前記［７］に記載の組成物。
［９］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の有効量を摂取者に投与する工程を含む、線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進する方法。
［９−２］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、ヒアルロン酸産生を促進する、前記［９］に記載の方法。
［９−３］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、皮膚疾患又は関節炎を予防、改善又は治療する、前記［９］又は［９−２］に記載の方法。
［９−４］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、飲食品に含まれている、前記［９］〜［９−３］のいずれかに記載の方法。
［９−５］飲食品が食品添加物又はサプリメントである前記［９−４］に記載の方法。
［１０］線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進のために使用するための、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７。
［１０−２］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、ヒアルロン酸産生を促進する、前記［１０］に記載の、使用するための、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７。
［１０−３］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、皮膚疾患又は関節炎を予防、改善又は治療する、前記［１０］又は［１０−２］に記載の、使用するための、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７。
［１０−４］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、飲食品に含まれている、前記［１０］〜［１０−３］のいずれかに記載の、使用するための、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７。
［１０−５］飲食品が食品添加物又はサプリメントである前記［１０−４］に記載の、使用するための、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７。
［１１］線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用医薬製造のためのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の使用。
［１１−２］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、ヒアルロン酸産生を促進する、前記［１１］に記載の使用。
［１１−３］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、皮膚疾患又は関節炎を予防、改善又は治療する、前記［１１］又は［１１−２］に記載の使用。
［１１−４］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、飲食品に含まれている、前記［１１］〜［１１−３］のいずれかに記載の使用。
［１１−５］飲食品が食品添加物又はサプリメントである前記［１１−４］に記載の使用。
［１２］線維芽細胞増殖及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進するためのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の使用。
［１２−２］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、ヒアルロン酸産生を促進する、前記［１２］に記載の使用。
［１２−３］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、皮膚疾患又は関節炎を予防、改善又は治療する、前記［１２］又は［１２−２］に記載の使用。
［１２−４］ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、飲食品に含まれている、前記［１２］〜［１２−３］のいずれかに記載の使用。
［１２−５］飲食品が食品添加物又はサプリメントである前記［１２−４］に記載の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物は、好ましくは、（１）線維芽細胞増殖を促進する効果、（２）例えば、ＨＡＳ１若しくはＨＡＳ２等のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進する効果、（３）ヒアルロン酸産生を促進する効果、（４）例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬等の皮膚疾患の予防、改善又は治療効果、（５）例えば、膝の痛み、軟骨障害、変形性膝関節症、軟骨の欠損、軟骨の損傷、若しくは半月板損傷等の関節炎の予防、改善又は治療する効果から選択される１つ以上の効果を奏することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ヒアルロン酸合成酵素１（ＨＡＳ１）遺伝子発現量を示すグラフである（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．比較例１、平均値±標準偏差）。
【図２】図２は、ヒアルロン酸合成酵素２（ＨＡＳ２）遺伝子発現量を示すグラフである（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．比較例１、平均値±標準偏差）。
【図３】図３は、線維芽細胞増殖活性を示すグラフである（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．比較例２、平均値±標準偏差）。
【図４】図４は、ヒアルロン酸産生量を示すグラフである（ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０１ ｖｓ．比較例２、平均値±標準偏差）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、（１）ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有する線維芽細胞増殖促進用組成物、及び／又は（２）ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有するヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進用組成物（以下、本発明の組成物ともいう。）を提供する。
【００１１】
本発明の組成物は、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を含有する。ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７は独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（住所：郵便番号２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６０７号（平成７年１１月３０日に寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−１５３１７号より移管）として寄託されている。なお、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の変異株であっても、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の特徴を備えるものはラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の範疇である。
【００１２】
本発明の組成物は、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７に加えて、それ以外の成分を含有していてもよい。すなわち、本発明の組成物は、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７、及び必要に応じて所望の他の成分を、混合、撹拌等することにより製造され得る。
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７以外の成分は、本発明の効果を失しない限り、特に限定されず、例えば、医薬、薬学又は食品等の分野で知られる任意の成分を用いることができる。ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７以外の成分として、具体的には、免疫細胞、免疫細胞産生成分、又は公知の添加剤等が挙げられる。本発明の組成物は、免疫細胞及び／又は免疫細胞産生成分を含有することにより、より優れた線維芽細胞増殖促進活性及び／又はヒアルロン酸産生促進活性を有し得る。
本開示において、免疫細胞として、Ｂ細胞若しくはＴ細胞等のリンパ球、又はマクロファージ等が挙げられる。これらの細胞は、哺乳類又は鳥類等の血液、又は脾臓等から公知の方法により得ることができ、また市販品を購入して得ることもできる。免疫細胞産生成分は、免疫細胞が産生する成分であれば特に限定されないが、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７と免疫細胞との接触により免疫細胞における産生が促進される物質が好ましい。免疫細胞が産生する物質（成分）としては、例えば、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどのサイトカインや各種増殖因子があげられる。
【００１３】
本発明の組成物中のラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の含有量は、本発明の効果が発揮されれば、特に限定されないが、組成物１００質量％中、例えば、約０．００１質量％〜１００質量％の範囲であってもよく、１〜５０質量％の範囲であってもよい。
本発明の組成物における免疫細胞の数は、本発明の効果が発揮されれば、特に限定されず、１〜１×１０７細胞／ｍＬであってもよい。
【００１４】
（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の取得方法）
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の培養は、公知方法、自体公知の方法又はそれらに準じる方法に従って行われてよい。ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７は、例えば、天然培地、合成培地、又は半合成培地等の培地に培養することにより得ることができる。培地としては、窒素源及び／又は炭素源を含有するものが好ましく用いられる。前記窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等が挙げられる。前記炭素源としては、例えば、グルコース、キシロース、フラクトース、イノシトール、マルトース、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリン等が挙げられる。これらは１種で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００１５】
前記培地には、前記窒素源及び／又は炭素源に加えて、さらに、無機質として、例えば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン、又は各種ビタミン類等を１種で、又は２種以上を組み合わせて添加することができる。
【００１６】
本発明のひとつの態様において、前記ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の培養温度は、例えば、通常約２５〜４０℃程度、好ましくは約２７〜３５℃程度である。
本発明のひとつの態様において、前記ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の培養時間は約１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。また、本発明のひとつの態様において、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の培養は、通気振盪により実施してもよい。また、培地のｐＨは、特に限定されないが、通常約ｐＨ３〜６、好ましくは約ｐＨ４〜６である。
【００１７】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の菌体は、生菌体であってもよく、死菌体であってもよいが、安定性及び取扱いの容易性等の観点から、死菌体を用いることが好ましい。
培養終了後、菌体を採取した後、加熱死菌体を調製してもよいし、または菌体を培養液から一旦分離することなく、培養液中の菌体を加熱死菌体にし、その加熱死菌体を採取してもよい。菌体を採取する方法としては、例えば培養液に蒸留水を加え、遠心分離などの手段により上清を除き、必要によりその操作を繰り返し、遠心分離や濾過などにより菌体を採取する方法がある。
【００１８】
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の加熱死菌体は、採取された生菌あるいは生菌を含んだ培養液ごと、加熱処理により不活性化させ、噴霧乾燥、凍結乾燥などの適当な手段によって乾燥することにより得られる。加熱温度は通常約６０〜１００℃、好ましくは約７０〜９０℃である。加熱手段としては、ヒーターを用いる公知の手段であってよい。加熱時間は所望の温度に達した後、通常約５〜４０分、好ましくは約１０〜３０分である。
【００１９】
上記の様にして得られた前記死菌体は、さらに摩砕、破砕又は凍結乾燥処理等を行い、死菌体処理物としてもよい。本発明においては、前記死菌体処理物も死菌体として好適に用いることができる。
【００２０】
（使用方法）
本発明の組成物の投与経路は、特に限定されず、例えば、経口又は非経口のいずれかの経路で哺乳動物等に投与してもよい。本発明の組成物を経口的に投与した場合は生体内の免疫細胞と、非経口的に投与した場合は皮膚等に常在する免疫細胞とそれぞれ接触して効果を発揮する。
ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の投与量又は摂取量は、経口又は注射投与の場合は、摂取者の年齢及び体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、成人１人（約６０ｋｇ）１日当たり、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を乾燥死菌体として、好ましくは約０．５〜２００ｍｇ、より好ましくは約１〜１００ｍｇ、更に好ましくは約２〜５０ｍｇ摂取されるように設定するのが好ましい。または、成人１人（約６０ｋｇ）１日当たり、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を生菌換算で、好ましくは約（５×１０８）〜（２×１０１１）ｃｆｕ（Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ；コロニー形成単位）、より好ましくは約（１×１０９）〜（１×１０１１）ｃｆｕ摂取されるように設定するのが好ましい。摂取回数は、１日１回又は複数回に分けて行うことができる。
または外用塗布の場合は、適用する皮膚面積に応じて、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７の塗布量を適宜選択することができるが、通常、当該塗布量は、適用部位の面積約１０ｃｍ２に対して、１日につき、好ましくは約０．０１〜２．５ｍｇ、より好ましくは約０．０２〜１ｍｇである。前記の投与用量を、１日あたり、１回又は数回に分けて投与ないし適用するとよい。
【００２１】
本発明の組成物を経口投与する場合は、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤であってもよく、シロップ剤等の液剤であってもよい。これらの製剤を製造する場合には、その製剤形態に応じた担体もしくは添加剤を使用することができる。担体もしくは添加剤としては、例えば、賦形剤（ポリアクリル酸ナトリウム、ポリアクリル酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース、乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロース、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、ケイ酸、リン酸カリウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、精製タルク、ポリエチレングリコール等）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、無水リン酸水素カルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、アラビアゴム液、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、溶解補助剤（アラビアゴム、ポリソルベート８０等）、吸収促進剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等）、増粘剤（プロピレングリコール、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）を挙げることができる。必要に応じて、コーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。
【００２２】
本発明の組成物は、特に限定されないが、例えば、飲食品、飼料、医薬品、医薬部外品又は化粧品等であってよく、好ましくは、飲食品等である。
【００２３】
本発明の組成物を含有する飲食品は、一般的に飲食品に用いられる食品添加剤、例えば甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色料、漂白料、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。なお、飲食品には、機能性表示食品、特定保健用食品、健康食品、病者用食品が含まれる。
【００２４】
本発明に好適な飲食品は特に限定されない。具体的には、例えば、食品添加物又はいわゆる栄養補助食品（サプリメント）としての錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。これ以外には、例えば茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料、そば、うどん、中華麺、即席麺等の麺類、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子及びパン類、かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品、加工乳、発酵乳等の乳製品、サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品、ソース、たれ等の調味料、カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊等のレトルトパウチ食品、アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の冷菓等を挙げることができる。
【００２５】
本発明の組成物を含有する飼料としては、例えば、ウシ、ウマ、ブタ等の家畜用飼料、ニワトリ等の家禽用飼料、魚類等の養殖用飼料、イヌ、ネコ等のペット用飼料などが挙げられる。本発明の飼料は、飼料中に本発明の組成物を添加する以外、一般的な飼料の製造方法を用いて加工製造することができる。
【００２６】
また、本発明の組成物は医薬品に配合して使用することもできる。医薬品はラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７と公知の医薬品添加剤等を配合して製造され得る。
【００２７】
また、本発明の組成物は医薬部外品又は化粧品に配合して使用することもできる。化粧品としては、例えば、ボディ洗浄料、ハンド洗浄料、洗顔料等の洗浄料類や化粧水、乳液、クリーム等の基礎化粧料、ファンデーション、アンダーメークアップ、白粉等のメークアップ料等の化粧料剤形等が挙げられる。
【００２８】
本発明の組成物を飲食品、飼料、医薬品、医薬部外品又は化粧品の形態に調製した場合、当該飲食品、飼料、医薬品、医薬部外品若しくは化粧品、その添付説明書又はその包装箱等には、本発明の組成物の作用に鑑みて、（１）線維芽細胞増殖を促進する旨、（２）例えば、ＨＡＳ１若しくはＨＡＳ２等のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進する旨、（３）ヒアルロン酸産生を促進する旨、（４）例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬等の皮膚疾患の予防、改善又は治療効果がある旨、（５）例えば、膝の痛み、軟骨障害、変形性膝関節症、軟骨の欠損、軟骨の損傷、若しくは半月板損傷等の関節炎の予防、改善又は治療する効果がある旨から選択される１つ以上を表示することができる。
【００２９】
皮膚疾患及び関節炎は、それぞれ、線維芽細胞の増殖を促進すること、及び／又はヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進することにより、予防、改善又は治療され得る。
【００３０】
本発明の組成物は、好ましくは、（１）線維芽細胞増殖を促進する効果、（２）例えば、ＨＡＳ１若しくはＨＡＳ２等のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進する効果、（３）ヒアルロン酸産生を促進する効果、（４）例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬等の皮膚疾患の予防、改善又は治療効果、（５）例えば、膝の痛み、軟骨障害、変形性膝関節症、軟骨の欠損、軟骨の損傷、若しくは半月板損傷等の関節炎の予防、改善又は治療する効果から選択される１つ以上の効果を奏することができる。
【００３１】
線維芽細胞増殖促進効果の有無について、例えば試料無添加の対照の線維芽細胞増殖能を超えるときに、その試料には線維芽細胞増殖促進効果があると判断することができる。
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進効果の有無について、例えば試料無添加の対照のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現能を超えるときに、その試料にはヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進効果があると判断することができる。
ヒアルロン酸産生促進効果の有無について、例えば試料無添加の対照のヒアルロン酸産生能を超えるときに、その試料にはヒアルロン酸産生促進効果があると判断することができる。
皮膚疾患の改善又は治療効果の有無について、例えば試料投与前と投与後とで、アンケートの結果、検査項目「かゆみ」等において有意差が認められたときに、その試料には皮膚疾患の改善又は治療効果があると判断することができる。
関節炎の改善又は治療効果の有無について、例えば試料投与前と投与後とで、ＷＯＭＡＣ（Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis Index）評価、ＳＦ−３６(MOS 36-Item Short-Form Health Survey)、ＪＫＯＭ(Japanese Knee Osteoarthiritis Measure)評価等において、有意差が認められたときに、その試料には関節炎の改善又は治療効果があると判断することができる。
【００３２】
本発明は、（１）（ａ）ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７、及び（ｂ）免疫細胞又は免疫細胞産生成分と、（２）線維芽細胞とを接触させる工程を有するヒアルロン酸含有組成物の製造方法を提供する。
線維芽細胞はヒトを含む哺乳類等の体内にあるものであってもよく、体外にあるものであってもよいが、体内であることが好ましい。上記成分（１）と（２）の接触は、成分（１）の経口摂取又は皮膚への塗布により生じるものであってもよく、成分（２）の培養培地に成分（１）を添加することにより生じるものであってもよい。
【００３３】
本発明は、上記製造方法により製造されたヒアルロン酸含有組成物（以下、本発明のヒアルロン酸含有組成物ともいう。）を提供する。
本発明のヒアルロン酸含有組成物は、上記成分（１）、上記成分（２）、又は医薬、薬学若しくは食品等の分野で知られる任意の成分を含有していてもよい。
本発明のヒアルロン酸含有組成物は、好ましくは、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬等の皮膚疾患の予防、改善又は治療効果；例えば、膝の痛み、軟骨障害、変形性膝関節症、軟骨の欠損、軟骨の損傷、若しくは半月板損傷等の関節炎の予防、改善又は治療する効果；から選択される１つ以上の効果を奏することができる。
本発明のヒアルロン酸含有組成物は、飲食品、化粧品又は医薬部外品等であってもよいが、飲食品であることが好ましい。本発明のヒアルロン酸含有組成物が飲食品である場合、具体的には、例えば、食品添加物又はいわゆる栄養補助食品（サプリメント）としての錠剤、顆粒剤、散剤、ドリンク剤等を挙げることができる。
【実施例】
【００３４】
以下に実施例及び試験例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３５】
１．ＨＡＳ１およびＨＡＳ２遺伝子発現促進効果の評価
（ａ）試料の調製（１）
（実施例１）
免疫細胞であるＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓細胞２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌを５００ｎｇ／ｍｌのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７加熱死菌体（ＨＫ  Ｌ−１３７）を含有する１０質量％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社製）で、４８時間３７℃で培養し、培養後の培地を回収して脾臓細胞培養上清を得た。マウス線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１）を当該脾臓細胞培養上清が２５質量％含まれる２質量％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマ社製）で、３時間３７℃で培養した。
（比較例１）
「５００ｎｇ／ｍｌのＨＫ  Ｌ−１３７を含有する１０質量％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有ＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ社製）」を、「ＨＫ  Ｌ−１３７非添加の培地」に置換えた以外は上記実施例と同様の工程を経て脾臓細胞培養上清を得た。マウス線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１）を当該脾臓細胞培養上清が２５質量％含まれる２質量％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマ社製）で、３時間３７℃で培養した。
（陰性対照１）
マウス線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１）を、２質量％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマ社製）で、３時間３７℃で培養した。
（陽性対照１）
マウス線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１）を、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）を含む２質量％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマ社製）で、３時間３７℃で培養した。【００３６】
（ｂ）試験
培養後の細胞の中のＲＮＡをキット（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ法により、総ＲＮＡ中のＨＡＳ１およびＨＡＳ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量の相対定量を行った。ＨＡＳ１及びＨＡＳ２のｍＲＮＡ発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。測定に使用したプライマーの配列は表１に記載のとおりである。【００３７】
【表１】
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【００３８】
（ＨＡＳ１）
結果を図１に示す。陰性対照１の遺伝子発現量を１００％とすると、比較例１では７７％、実施例１では１９３％の発現量だった。比較例１と比べ、実施例１ではＨＡＳ１遺伝子発現量が有意に高値だった。【００３９】
（ＨＡＳ２）
結果を図２に示す。陰性対照１の遺伝子発現量を１００％とすると、比較例１では１３２％、実施例１では２４２％の発現量だった。比較例１と比べ、実施例１ではＨＡＳ２遺伝子発現量が有意に高値だった。【００４０】
２．線維芽細胞賦活化作用の評価
（ａ）試料の調製（２）
マウス線維芽細胞（ＢＡＬＢ／３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１）の培養時間を「３時間」から「７２時間」に変更した以外は上記試料の調製（１）と同様の工程を経て、実施例２、比較例２、陰性対照２、及び陽性対照２を得た。【００４１】
（ｂ）試験
細胞増殖（代謝）活性をＷＳＴ−１法により測定した。具体的には、５００μＭ  ＷＳＴ-1（ＷＡＫＯ社製）及び２０μＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ（ＷＡＫＯ社製）含有溶液を（ａ）の培養液に５質量％となるよう添加した。添加直後および２時間３７℃で培養後の培地の４５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度の増加量を細胞増殖活性とした。
結果を図３に示す。陰性対照の線維芽細胞増殖活性を１００％とすると、比較例２では１１０％、実施例２では１８０％だった。比較例２と比べ、実施例２では線維芽細胞増殖活性が有意に高値だった。【００４２】
３．ヒアルロン酸合成促進作用の評価
（ａ）試料
上記実施例２、比較例２、陰性対照２、及び陽性対照２を用いた。【００４３】
（ｂ）試験
回収した培地中のヒアルロン酸量をＥＬＩＳＡキット（ＢＴＰ-９６２００、Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ社）で測定した。
結果を図４に示す。陰性対照のヒアルロン酸産生量を１００％とすると、比較例２では１３３％、実施例２では２４４％のヒアルロン酸産生量だった。比較例２と比べ、実施例２ではヒアルロン酸産生量が有意に高値だった。【００４４】
これらの結果からラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が、線維芽細胞当たりのヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現を促進し、及び／又は線維芽細胞増殖を促進し、ヒアルロン酸産生を促進することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の組成物は、ヒアルロン酸産生促進を目的とした飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、飼料等として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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