(57)【要約】  ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）〜（３）：（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、（２）前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含んでなり、ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてループ構造またはフラップ構造を形成し、かつ、前記領域（２）および（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、核酸アプタマー。
2019035485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）〜（３）：
（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、
（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および
（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域
を含んでなり、
ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてフラップ構造を形成し、または、前記領域（１）が、前記第一のネックオリゴヌクレオチドおよび前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されたループ構造であって、前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが前記第二のネックオリゴヌクレオチドに隣接している、ループ構造を形成し、かつ、
前記領域（２）および前記領域（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、
核酸アプタマー。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼがCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼである、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項３】
前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸のPAM配列に隣接する2〜30塩基長の配列からなる、請求項１または２に記載の核酸アプタマー。
【請求項４】
前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸のPAM配列に隣接する3〜22塩基長の配列からなる、請求項３に記載の核酸アプタマー。
【請求項５】
前記領域（１）が6〜50塩基長である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項６】
前記領域（１）が架橋型核酸を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項７】
前記領域（２）がミスマッチまたはバルジを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項８】
前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドが5’-NGG-3’であり、前記複合体がCrispr-Cas9である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項９】
前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドが5’-TTTN-3’であり、前記複合体がCRISPR-Cpf1である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項１０】
前記領域（３）が4塩基対長以上である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項１１】
ホスホロチオエート修飾を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸アプタマー。
【請求項１２】
ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーを製造する方法であって、
（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを決定するステップと、
（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記第一のネックオリゴヌクレオチドに対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを決定するステップと、
（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを決定するステップと、
（４）前記第一のネックオリゴヌクレオチドに、前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、
（５）前記第二のネックオリゴヌクレオチドに、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、
（６）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、第二のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップと、
（７）前記ステップ（１）〜（６）により設計された配列を含む核酸を合成するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
（５’）前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを連結するステップ
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（６’）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、直接またはリンカーオリゴヌクレオチドを介して第一のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップ
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、
（１）前記複合体と前記標的核酸とを含む反応液を調製するステップと、
（２）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを前記反応液に添加するステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
細胞内において、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、
（１）標的核酸を含む細胞に前記複合体を導入するステップと、
（２）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
（１）ガイドRNAとCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼとを含む複合体を細胞に導入するステップと、
（２）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップと
を含む、ゲノム編集方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム編集酵素の活性を阻害する核酸アプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム編集法として、Zinc finger、TALEN、Crispr-Cas9を利用した方法が知られており、中でもCrispr-Cas9を用いたゲノム編集法が、その効率の高さと簡便性から、広範な細胞または生物種を対象として多くの研究において採用されている。Crispr-Cas9は、ガイドRNAとともに複合体を形成し、ガイドRNAの一部と相補的な配列およびそれに隣接するPAM配列を持つDNAを認識して切断する。DNAの切断部位が修復される過程で生じる塩基の挿入または欠失などにより、遺伝子を改変(例えば、ノックアウト)することができる。【０００３】
また、Crispr-Cas9によるDNAの切断がDNA修復機構を促進することを利用した、相同組換えまたは非相同末端結合(NHEJ)による外来遺伝子の導入方法も開発されている。さらに、dCas9(切断活性のないCas9変異体)とデアミナーゼを用いた一塩基編集技術や、dCas9とDNA(脱)メチル化酵素を用いたエピゲノム編集技術なども報告されている。例えば、特許文献１は、dCas9と異種機能ドメイン(例えば、転写活性化ドメイン)との融合タンパク質を開示している。【０００４】
Crispr-Cas9を特異的に阻害する方法を確立できれば、ゲノム編集を時間的・空間的に制御することが可能となり、上記のような種々の手法を、さらに様々な用途に適用することが可能となる。また、Cas9は、標的以外の部位を切断してしまうオフターゲット作用を有することが知られるが、Crispr-Cas9の阻害剤を用いて酵素反応時間を限定できれば、ゲノム編集におけるオフターゲット作用を軽減できることが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１６−５１２２６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ゲノム編集酵素の標的配列への結合を阻害することにより、ゲノム編集酵素の標的配列への作用を阻害することができる核酸アプタマーを提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ゲノム編集酵素に特異的に結合し、その活性を阻害できる核酸アプタマーを得ることに成功した。【０００８】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）〜（３）：（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含んでなり、ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてフラップ構造を形成し、または、前記領域（１）が、前記第一のネックオリゴヌクレオチドおよび前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されたループ構造であって、前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが前記第二のネックオリゴヌクレオチドに隣接している、ループ構造を形成し、かつ、前記領域（２）および前記領域（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、核酸アプタマーを提供するものである。【０００９】
前記ヌクレアーゼはCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼであることが好ましい。【００１０】
前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸のPAM配列に隣接する2〜30塩基長の配列からなることが好ましい。【００１１】
前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、前記標的核酸のPAM配列に隣接する3〜22塩基長の配列からなることがより好ましい。【００１２】
前記領域（１）は、6〜50塩基長であることが好ましい。【００１３】
前記領域（１）は、架橋型核酸を含むことが好ましい。【００１４】
前記領域（２）は、ミスマッチまたはバルジを含んでもよい。【００１５】
前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドは5’-NGG-3’であり、前記複合体はCrispr-Cas9であることが好ましい。【００１６】
前記領域（２）における前記第一のネックオリゴヌクレオチドは5’-TTTN-3’であり、前記複合体はCRISPR-Cpf1であることが好ましい。【００１７】
前記領域（３）は、4塩基対長以上であることが好ましい。【００１８】
上記核酸アプタマーは、ホスホロチオエート修飾を含んでもよい。【００１９】
また、本発明は、一実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーを製造する方法であって、（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを決定するステップと、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記第一のネックオリゴヌクレオチドに対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（４）前記第一のネックオリゴヌクレオチドに、前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（５）前記第二のネックオリゴヌクレオチドに、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（６）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、第二のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップと、（７）前記ステップ（１）〜（６）により設計された配列を含む核酸を合成するステップとを含む、方法を提供するものである。【００２０】
上記方法は、（５’）前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを連結するステップをさらに含むことが好ましい。【００２１】
あるいは、上記方法は、（６’）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、直接またはリンカーオリゴヌクレオチドを介して第一のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップをさらに含むことが好ましい。【００２２】
また、本発明は、一実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）前記複合体と前記標的核酸とを含む反応液を調製するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記反応液に添加するステップとを含む、方法を提供するものである。【００２３】
また、本発明は、一実施形態によれば、細胞内において、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）標的核酸を含む細胞に前記複合体を導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、方法を提供するものである。【００２４】
また、本発明は、一実施形態によれば、（１）ガイドRNAとCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼとを含む複合体を細胞に導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、ゲノム編集方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の核酸アプタマーは、Crispr-Casシステムに基づくゲノム編集酵素の標的配列への結合を阻害することにより、ゲノム編集酵素の標的配列への作用を時間的・空間的に制御することができる。また、核酸を原料としているため、抗体と比較して、細胞への導入も容易である。そのため、本発明の核酸アプタマーは、以下のような優れた効果を奏し、有用である。
（１）本発明の核酸アプタマーを用いることにより、インビトロまたはインビボ(細胞内または動物個体内)においてゲノム編集のタイミングや精度を制御でき、ゲノム編集酵素複合体の標的配列への不必要かつ不本意な作用を低減または回避することができる。
（２）インビトロまたはインビボ(細胞内または動物個体内)においてゲノム編集酵素複合体を用いて核酸を切断する際、本発明の核酸アプタマーを低濃度で用いる、または、結合特異性を弱めた核酸アプタマーを用いることにより、ゲノム編集酵素複合体の活性を部分的に抑制できる。その結果としてゲノム編集酵素複合体が標的配列のみに正確に作用でき、オフターゲット効果を最小化することができる。
（３）異なる配列を標的とする複数のCas9/sgRNA複合体を細胞に同時に導入されている場合に、特定のCas9/sgRNA複合体の活性のみを阻害できる。
（４）本発明のアプタマーに、他の物質を認識する機能性核酸を連結することにより、前記他の物質を用いてゲノム編集酵素複合体に対する阻害活性を自在に制御することが可能となる。
（５）ファージ療法において、標的の病原菌がCrispr-Casシステムを有する場合、病原菌がファージに対する免疫を獲得するため、ファージが感染できなくなるが、本発明の核酸アプタマーを用いることにより、この問題を回避できる。本発明の核酸アプタマーを用いて病原菌のCrispr-Casシステムを抑制することにより、ファージの病原菌に対する感染能を持続させることができ、ファージ療法の効果を高めることができる。
（６）RNAを基質とするCrispr-Casシステムを用いたウイルス感染の診断キットと本発明の核酸アプタマーを併用することにより、疑陽性検出を低減でき、診断の精度を高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、SELEXで得られたCas9に対する候補アプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。s21、s36およびs40が高い阻害活性を有することが示された。
【図２】図２は、候補アプタマーs21、s36およびs40の、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害活性の濃度依存性を、in vitroでのアッセイにより確認した結果を示す図である。
【図３】図３は、s21の二次構造を示す模式図である。
【図４】図４は、s21のガイドRNA認識領域を短くした変異体(truncation mutant)の、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図５】図５は、s21およびs36のガイドRNA認識領域に変異を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図６】図６は、s21-2のガイドRNA認識領域に点突然変異を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図７】図７は、s21-2の構造安定化領域の長さを変更したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図８】図８は、s21-2の構造安定化領域の配列を変更したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図９】図９は、s21-2のネック領域に変異を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、s21-2にホスホロチオエート修飾を導入したアプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、s21ベースのアプタマーとCas9との相互作用を、ゲルシフトアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、s21ベースのアプタマーとCas9との相互作用を、表面プラズモン共鳴アッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、s21-2(ステムループ型アプタマー)およびs21-sf(ステムフラップ型アプタマー)の二次構造を示す模式図である。
【図１４】図１４は、s21ベースのステムフラップ型アプタマーの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１５】図１５は、s21-2の、異なる配列を標的とするCas9/crRNAに対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１６】図１６は、sgRNA中のガイド配列に対するアンチセンスDNAおよびアンチセンスRNAの、Cas9/sgRNA(GFPg1)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１７】図１７は、アプタマーによるCas9/sgRNAに対する阻害メカニズムの模式図である。
【図１８】図１８は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GFP373)に対するステムループ型アプタマーおよびステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図１９】図１９は、ステムループ型アプタマーのループ構造の長さが阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２０】図２０は、ステムフラップ型アプタマーのCas9/crRNAに対する阻害効果の、crRNA配列特異性を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２１】図２１は、ステムフラップ型アプタマーのフラップ構造の長さが阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２２】図２２は、ステムフラップ型アプタマーのフラップ構造と反対側の末端に対する塩基の付加が阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２３】図２３は、EGFR遺伝子を標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２４】図２４は、フラップ構造の長さがステムフラップ型アプタマーの阻害効果に与える影響を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２５】図２５は、EpCAM遺伝子を標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２６】図２６は、ステムフラップ型アプタマーによるCpf1/crRNAに対する阻害メカニズムの模式図である。
【図２７】図２７は、ステムフラップ型アプタマーの、Cpf1/crRNA(GFPa)による標的部位切断に対する阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２８】図２８は、EGFR遺伝子を標的とするCpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの阻害効果を、in vitroでのアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図２９】図２９は、細胞内ゲノムに導入された標的配列-mScarletレポーターカセットを標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による標的ゲノム編集に対する、ステムフラップ型アプタマーの阻害効果を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図３０】図３０は、細胞内ゲノムに導入された標的配列-mScarletレポーターカセットを標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による標的ゲノム編集に対する、フラップ構造部分にLNA修飾を導入したアプタマーの阻害効果を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図３１】図３１は、図３０に示す細胞を回収し、FACSにより定量化した結果を示すグラフである。
【図３２】図３２は、ゲノムに導入された標的配列-mScarletレポーターカセットを標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による、細胞内における標的ゲノム編集に対する、フラップ構造部分にLNA修飾を導入したアプタマーの阻害効果の濃度依存性を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図３３】図３３は、図３２に示す細胞を回収し、FACSにより定量化した結果を示すグラフである。
【図３４】図３４は、内在遺伝子を標的とするCas9/crRNA:tracrRNA複合体による、細胞内における標的ゲノム編集に対するアプタマーの阻害効果を、インデルの検出に基づき評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２８】
本発明は、第一の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーであって、以下の領域（１）〜（３）：（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域、および（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含んでなり、ここで、前記領域（１）が、前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されてフラップ構造を形成し、または、前記領域（１）が、前記第一のネックオリゴヌクレオチドおよび前記第二のネックオリゴヌクレオチドに連結されたループ構造であって、前記領域（１）における前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが前記第二のネックオリゴヌクレオチドに隣接している、ループ構造を形成し、かつ、前記領域（２）および前記領域（３）が連結されて一緒にステム構造を形成する、核酸アプタマーである。
【００２９】
本発明において、「核酸アプタマー」とは、高い親和性で標的分子(本発明においては、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体)と特異的に結合できる核酸分子を意味する。核酸アプタマーは、標的分子に特異的に結合することにより、標的分子の活性を阻害する作用を有し得る。核酸アプタマーを構成する核酸は、特に限定されず、例えば、DNA、RNA、修飾核酸などであってよく、これらの１種のみまたは２種以上を組み合わせて核酸アプタマーを構成することができる。よって、本発明における核酸アプタマーは、DNAアプタマー、RNAアプタマー、DNA/RNAキメラ型核酸アプタマー、およびそれらの一部に修飾核酸を含むアプタマーなどであってよい。好ましくは、本発明における核酸アプタマーは、DNAアプタマーである。
【００３０】
本明細書において、修飾核酸とは、非天然ヌクレオチドにより構成される核酸、または非天然核酸をいう。ここで、「非天然ヌクレオチド」とは、天然には存在しない人工的な化学修飾を塩基または糖を含むヌクレオチドであって、天然のヌクレオチドと同様の性質／構造を有するものをいう。種々の非天然ヌクレオチドが公知であり、例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2’-デオキシウリジン、α-デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾(例えば、置換五単糖(2’-O-メチルリボース、2’-デオキシ-2’-フルオロリボース、3’-O-メチルリボース、1’, 2’-デオキシリボース)、アラビノース、置換アラビノース糖、置換六単糖、α−アノマー糖など)を有するヌクレオシドを含む非天然ヌクレオチドなどが挙げられる。また、本明細書における非天然ヌクレオチドは、塩基アナログまたは修飾塩基を含むヌクレオチドであってもよい。塩基アナログには、例えば、2-オキソ(1H)-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ(1H)-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-(2-チアゾリル)プリン-9-イル基、2-アミノ-6-(2-チアゾリル)プリン-9-イル基、2-アミノ-6-(2-オキサゾリル)プリン-9-イル基などが挙げられる。修飾塩基には、例えば、修飾ピリミジン(例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル)、修飾プリン(例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン)、およびその他の複素環塩基などが挙げられる。また、本明細書において、「非天然核酸」とは、その骨格に天然には存在しない人工的な化学修飾が導入された核酸アナログであって、天然の核酸と同様の性質／構造を有するものをいう。非天然核酸には、例えば、ペプチド核酸(PNA：Peptide Nucleic Acid)、ホスフェート基を有するペプチド核酸(PHONA)、架橋化核酸、モルホリノ核酸、トリアゾール連結核酸などが挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2’-O-メチル型DNA/RNAなどが挙げられる。
【００３１】
本発明の核酸アプタマーにおいて用いられる修飾核酸は、好ましくは、架橋化核酸および／またはホスホロチオエート修飾核酸である。また、修飾核酸は、本発明の核酸アプタマーのいずれの領域において含まれてもよいが、以下に詳述するように、核酸アプタマーのガイドRNA認識領域において架橋化核酸が含まれることが、特に好ましい。
【００３２】
本発明において、「ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体」とは、ガイドRNAにより認識される部位特異的にヌクレアーゼが誘導され、核酸と相互作用することができる複合体を意味する。以降、本明細書では、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体を「gRNA／ヌクレアーゼ複合体」と記載する。本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体は、元来、原核生物が有するCrispr-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat and CRISPR-associated proteins)と呼ばれる獲得免疫機構に由来する。Crispr-Casシステムは、Casの種類に基づいて、現在のところ、2つのクラスに大別され、さらにI〜VI型の6種類に分類されているが(クラス1はI型、III型、IV型；クラス2はII型、V型、VI型)、本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体は、そのいずれのCrispr-Casシステムに由来するものであってもよい。
【００３３】
したがって、本発明における「ヌクレアーゼ」は、Crispr-Casファミリーの任意のヌクレアーゼであってよい。Crispr-Casファミリーのヌクレアーゼの非限定的な例としては、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(以前はCsn1またはCsx12とも呼ばれていた)、Cas10、Cas12、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、またはこれらのホモログなどが挙げられる。
【００３４】
また、本発明におけるヌクレアーゼは、Casヌクレアーゼ以外のRNA誘導型ヌクレアーゼ(RNA-guided nuclease：RGN)であってもよく、ガイドRNAにより誘導されて核酸の標的部位に対して相互作用することができるものであれば、任意の生物種に由来する任意のヌクレアーゼであってよい。また、本発明におけるヌクレアーゼは、ガイドRNAにより誘導されて核酸の標的部位に対して相互作用する機能を維持している限り、人工的な修飾または変異を有するものであってよい。
【００３５】
本発明におけるヌクレアーゼは、DNAヌクレアーゼまたはRNAヌクレアーゼのいずれであってもよいが、ゲノム編集技術において遺伝子改変のために用いられるものが特に好ましい。すなわち、本発明におけるヌクレアーゼは、好ましくはCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼであり、特に好ましくはCas9およびCpf1(Cas12aとも呼ばれる)(Takashi Yamano et al., "Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA", Cell, doi：10.1016/j.cell.2016.04.003)である。また、本発明における好ましいRNAヌクレアーゼとしては、例えばCas13aなどが挙げられる。
【００３６】
さらに、本発明におけるヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであってもよいし、ニッカーゼであってもよい。さらに、本発明におけるヌクレアーゼは、変異により切断活性が失われたものであってもよい。すなわち、Cas9を例とすれば、本発明におけるヌクレアーゼには、エンドヌクレアーゼである野生型Cas9、ニッカーゼであるCas9(D10A)、切断活性を有しないdCas9のいずれもが含まれてよい。さらに、そのような変異ヌクレアーゼと追加の機能ドメイン(例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制化ドメイン、シチジンデアミナーゼなど)との融合タンパク質も、本発明におけるヌクレアーゼに含まれてよい。
【００３７】
本発明において、「ガイドRNA」とは、標的核酸に対して相補的なガイド配列を含み、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を標的核酸へとガイドして特異的に結合させる機能を有するRNAを意味する。ガイドRNAの構造は、ガイド配列を含みさえすれば、上記機能を有する限りにおいて特に限定されない。例えば、本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体がI型のCrispr-Casシステムである場合には、ガイドRNAはCRISPR RNA(crRNA)であってよく、II型のCrispr-Casシステムである場合には、ガイドRNAはcrRNAとtrans-activating crRNA(tracrRNA)とのデュアルRNAであってよい。また、本発明におけるガイドRNAは、crRNAとtracrRNAとがリンカーにより連結された一本鎖ガイドRNA(sgRNA)であってもよい。例えば、Crispr-Casシステムにおいては、crRNAは、標的核酸に対して相補的な約16塩基〜24塩基長のガイド配列とリピート領域とを有し、tracrRNAは、当該リピート領域に相補的なアンチリピート領域を有し、crRNAとtracrRNAとが二本鎖を形成する。
【００３８】
本発明の核酸アプタマーは、第1の領域として、gRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれるガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む、一本鎖のガイドRNA認識領域を含む。本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNA認識領域」とは、核酸アプタマーが、対象となるgRNA／ヌクレアーゼ複合体含まれるガイドRNAに相互作用するための機能構造単位を意味する。
【００３９】
本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識領域は、gRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれるガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを含む。ここで、「ガイドRNAを認識する配列」とは、当該配列が、ガイドRNAの少なくとも一部に対して塩基対を形成することを意味する。なお、塩基対には、G:CおよびA:Tのみならず、G:TまたはG:Uなどのゆらぎ塩基対も含まれてよい。また、ここで、ガイドRNAの「少なくとも一部」とは、ガイドRNAのうちの2塩基長〜全長を意味する。したがって、本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNAを認識する配列」は、ガイドRNAのうちの2塩基長〜全長に対して相補性を有する。この際、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、ガイドRNAのうちの2塩基長〜全長に対して完璧または完全な(すなわち100%の)相補性を有している必要はなく、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドがガイドRNAの少なくとも一部に対して相互作用できる程度の相補性を有していればよい。
【００４０】
したがって、本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド」は、ガイドRNAのうちの2塩基長〜全長に対して、少なくとも80%、90%、95%、99%、または100%の配列相補性を有していればよい。言い換えれば、本発明の核酸アプタマーにおける「ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド」は、ガイドRNAの2塩基長〜全長に対して完全に相補的な配列において、数個(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ)の塩基が挿入、欠失または置換されたものであってよい。なお、配列相補性は、当分野における慣用の計算アルゴリズム(NCBI BLASTなど)を用いて計算することができる。
【００４１】
本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが、ガイドRNAの部分配列に対して相補性を有する配列からなる場合、前記部分配列は、ガイドRNAの任意の部分から選択されてよいが、ガイドRNA中のガイド配列から選択されることが好ましい。また、この際、ガイド配列から選択される部分配列は、gRNA／ヌクレアーゼ複合体の標的核酸におけるPAM配列に隣接する部分に相補的であることが好ましい。すなわち、本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドは、例えば、標的核酸のPAM配列に隣接する2塩基以上、3塩基以上、4塩基以上の配列からなってよく、好ましくは標的核酸のPAM配列に隣接する2〜30塩基長、特に好ましくは標的核酸のPAM配列に隣接する3〜22塩基長、最も好ましくは標的核酸のPAM配列に隣接する4〜15塩基長の配列からなる。
【００４２】
本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識領域は、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドのみから構成されてもよいし、リンカーオリゴヌクレオチドを含んでもよい。リンカーオリゴヌクレオチドは任意の配列であってよいが、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドとの間で塩基対を形成しない配列であることが好ましく、かつ、ATリッチな配列であることが好ましい。リンカーオリゴヌクレオチドは、ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドのいずれか一方の末端または両方の末端に連結されてよいが、好ましくは、以下に述べる第二のネックオリゴヌクレオチドに、リンカー配列を介さずに直接連結されることが好ましい。リンカーオリゴヌクレオチドの長さは、ガイドRNA認識領域の機能が維持されることを限度として、任意であってよい。したがって、ガイドRNA認識領域の全体としての長さは、例えば、6〜50塩基長であってよく、好ましくは7〜25塩基長であってよく、特に好ましくは7〜15塩基長であってよい。
【００４３】
本発明の核酸アプタマーは、上述の通り、DNA、RNA、修飾核酸などの任意の核酸により構成されてよいが、ガイドRNA認識領域において架橋型核酸を含むことが特に好ましい。ガイドRNA認識領域に架橋型核酸を含めることにより、核酸アプタマーの複合体に対する阻害活性をさらに向上させることができる。架橋型核酸としては、BNA(Bridged Nucleic Acid)および2’,4’-BNA(別名LNA(Locked Nucleic Acid))ならびにそれらのアナログ(例えば、amino-LNA、thio-LNA、α-L-oxy-LNA、ENA(2’-O,4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acid)、AmNA(Amido-bridged Nucleic Acid)、GuNA(Guanidine-bridged Nucleic Acid)、scpBNA(2’-O,4’-C-spirocyclopropylene-bridged Nucleic Acid)、cEt-BNA(constrained ethy-bridged Nucleic Acid)、3’-amino-2’,4’-BNA、5’-amino-2’,4’-BNA、PrNA(2’-O,4’-C-Propylene-bridged Nucleic Acid)、2’,4’-BNANC(2’-O,4’-C-aminomethylene-bridged Nucleic Acid)、2’,4’-BNACOC(2’-O,4’-C-methyleneoxymethylene-bridged Nucleic Acid)など)を用いることができる。ガイドRNA認識領域に含まれる架橋型核酸の割合は、特に限定されないが、例えば50%以上、70%以上、80%以上、90%以上、または100%であってよい。
【００４４】
本発明の核酸アプタマーは、第2の領域として、前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列を片鎖に含む二本鎖のネック領域であって、前記ネック領域が、前記PAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記PAM配列に対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを含む、ネック領域を含む。
【００４５】
本発明の核酸アプタマーにおける第一のネックオリゴヌクレオチドは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体中のヌクレアーゼにより認識されるPAM配列からなる。「PAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)」とは、ヌクレアーゼが標的核酸の標的部位に対して相互作用するために必要な2〜8塩基長の配列であり、標的核酸中において、ガイドRNAにより標的化された配列に隣接して存在する(標的化するガイドRNAには存在しない)。PAM配列は、ヌクレアーゼが由来する細菌種やヌクレアーゼの型／亜型によって異なる。以下の表１に、Cas9が認識するPAM配列の例を示す。例えば、S. pyogenes由来のCas9が認識するPAM配列は、5’-NGGであることが知られている。
【００４６】
【表１】
2019035485.tif 000003
【００４７】
また、様々な異なるPAM配列を認識するように変異させたヌクレアーゼも作製されている。このようなヌクレアーゼおよびPAM配列については多数報告されており(例えば、Cebrian-Serrano, A. & Davies, B., "Crispr-Cas orthologues and variants: optimizing the repertoire, specificity and delivery of genome engineering tools", Mamm. Genome (2017). doi:10.1007/s00335-017-9697-4、および、Murovec J, Pirc Z, Yang B., "New variants of CRISPR RNA-guided genome editing enzymes.", Plant Biotechnol. J. (2017) Apr 1. doi: 10.1111/pbi.12736参照)、本発明の核酸アプタマーは、上記いずれのヌクレアーゼおよびPAM配列を対象としたものであってもよく、標的とするgRNA／ヌクレアーゼ複合体に応じて適切なPAM配列を選択して第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用することができる。
【００４８】
また、標的とするgRNA／ヌクレアーゼ複合体が、例えばCas13aなどのRNAヌクレアーゼを含むものである場合には、第一のネックオリゴヌクレオチドとしてプロトスペーサー隣接部位(protospacer flanking site：PFS)の配列を用いることができる。PFS配列は、PAM配列と同様の機能を有する配列であり、標的RNA中の、ガイドRNAにより標的化された配列に隣接して存在する。したがって、本発明において第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用できるPAM配列には、PFS配列も含まれてよい。
【００４９】
すでに上で述べたように、本発明におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれる好ましいヌクレアーゼは、Cas9およびCpf1である。したがって、本発明の核酸アプタマーにおいては、それらに対応するPAM配列(それぞれ5’-NGGおよび5’-TTTN)を、第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用することが好ましい。
【００５０】
本発明の核酸アプタマーにおける第二のネックオリゴヌクレオチドは、第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用されるPAM配列に対して相補性を有する配列からなる。この際、第二のネックオリゴヌクレオチドは、第一のネックオリゴヌクレオチドとして使用されるPAM配列に対して、100%の相補性を有していることが好ましいが、第一のネックオリゴヌクレオチドと第二のネックオリゴヌクレオチドとが二本鎖を形成できることを限度として、1つまたは2つのミスマッチまたはバルジを含むことができる。
【００５１】
本発明の核酸アプタマーにおいて、一本鎖のガイドRNA認識領域は、少なくとも第二のネックオリゴヌクレオチドに連結される。一本鎖のガイドRNA認識領域が第二のネックオリゴヌクレオチドのみに連結される場合、一本鎖のガイドRNA認識領域はフラップ構造を形成する。一本鎖のガイドRNA認識領域が、第一のネックオリゴヌクレオチドおよび第二のネックオリゴヌクレオチドの両方に連結される場合、一本鎖のガイドRNA認識領域は、ループ構造を形成する。いずれの場合も、一本鎖のガイドRNA認識領域は、その中に含まれる前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドが第二のネックオリゴヌクレオチドに対して隣接するように連結される。
【００５２】
本発明の核酸アプタマーは、第3の領域として、第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを含む、二本鎖の構造安定化領域を含む。第一の構造安定化オリゴヌクレオチドは任意の核酸配列からなってよく、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドは、当該第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと二本鎖を形成できる配列であれば、任意の核酸配列であってよい。したがって、第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとは、少なくとも70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、または100%の相補性を有していればよく、二本鎖の構造安定化領域には、1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれ以上)のミスマッチまたはバルジが含まれていてもよい。
【００５３】
第一の構造安定化オリゴヌクレオチドは、第一のネックオリゴヌクレオチドに付加され、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドは、第二のネックオリゴヌクレオチドに付加され、互いにハイブリダイズして二本鎖の構造安定化領域を形成することにより、核酸アプタマー全体の構造を安定化する。したがって、二本鎖の構造安定化領域は、本発明の核酸アプタマーにおけるネック領域およびガイドRNA認識領域の構造および機能が維持されることを限度として、任意の長さであってよく、例えば4塩基対長以上、6塩基対長以上、8塩基対長以上であってよく、好ましくは6〜20塩基対長である。
【００５４】
第一の構造安定化オリゴヌクレオチドおよび第二の構造安定化オリゴヌクレオチドは、同じ長さであってもよいし、異なる長さであってもよい。したがって、構造安定化領域の自由末端(すなわち、ネック領域が連結されているのとは反対側の末端)は、平滑末端であってもよいし、粘着末端(5’突出または3’突出末端)であってもよい。あるいは、構造安定化領域の自由末端は、相互に連結されていてもよい。
【００５５】
本発明の核酸アプタマーは、上記にしたがって設計された一本鎖のガイドRNA認識領域、二本鎖のネック領域、および二本鎖の構造安定化領域を組み合わせることにより、製造することができる。
【００５６】
すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する核酸アプタマーを製造する方法であって、（１）前記ガイドRNAを認識する配列からなるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを決定するステップと、（２）前記ヌクレアーゼに対応するPAM配列からなる第一のネックオリゴヌクレオチドと、前記第一のネックオリゴヌクレオチドに対して相補性を有する配列からなる第二のネックオリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（３）第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを決定するステップと、（４）前記第一のネックオリゴヌクレオチドに、前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（５）前記第二のネックオリゴヌクレオチドに、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドを付加するステップと、（６）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、第二のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップと、（７）前記ステップ（１）〜（６）により設計された配列を含む核酸を合成するステップとを含む、方法である。
【００５７】
ここで、Crispr-Casシステムにおいて、標的遺伝子におけるPAM配列とガイドRNAにより標的化される配列(以下、「ガイドRNA標的配列」と記載する)の配置(位置関係)は、Casの種類によって異なる。例えば、Cas9の場合には、ガイドRNA標的配列の下流の(すなわち、ガイドRNA標的配列の3’末端に隣接する)PAM配列を認識し、Cpf1の場合には、ガイドRNA標的配列の上流の(すなわち、ガイドRNA標的配列の5’末端に隣接する)PAM配列を認識する。そのため、本発明の核酸アプタマーにおけるガイドRNA認識オリゴヌクレオチドと第一および／または第二のネックオリゴヌクレオチドの、5’→3’方向の並び順は、核酸アプタマーが対象とするgRNA／ヌクレアーゼ複合体に含まれるヌクレアーゼの種類によって適宜変更され得る。
【００５８】
したがって、例えば、一本鎖のガイドRNA認識領域が第一および第二のネックオリゴヌクレオチドの両方に連結された(すなわち、一本鎖のガイドRNA認識領域がループ構造を形成する)核酸アプタマーを製造する場合、
（ｉ）Cas9のような、ガイドRNA標的配列の下流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
第二の構造安定化オリゴヌクレオチド−第二のネックオリゴヌクレオチド−ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド−(リンカーオリゴヌクレオチド−)第一のネックオリゴヌクレオチド−第一の構造安定化オリゴヌクレオチド
の順に連結され；
（ｉｉ）Cpf1のような、ガイドRNA標的配列の上流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
第一の構造安定化オリゴヌクレオチド−第一のネックオリゴヌクレオチド−(リンカーオリゴヌクレオチド−) ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド−第二のネックオリゴヌクレオチド−第二の構造安定化オリゴヌクレオチド
の順に連結される。なお、上記において、「(リンカーオリゴヌクレオチド−)」は、任意のリンカーオリゴヌクレオチドを意味する。すなわち、本実施形態の方法は、（６’）前記ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを、直接またはリンカーオリゴヌクレオチドを介して第一のネックオリゴヌクレオチドに連結するステップをさらに含んでいてよい。
【００５９】
また、例えば、一本鎖のガイドRNA認識領域が第二のネックオリゴヌクレオチドのみに連結された(すなわち、一本鎖のガイドRNA認識領域がフラップ構造を形成する) 核酸アプタマーを製造する場合、
（ｉ）Cas9のような、ガイドRNA標的配列の下流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
第一のネックオリゴヌクレオチド−第一の構造安定化オリゴヌクレオチド(−)第二の構造安定化オリゴヌクレオチド−第二のネックオリゴヌクレオチド−ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドの順に連結され；
（ｉｉ）Cpf1のような、ガイドRNA標的配列の上流のPAM配列を認識するヌクレアーゼを含む複合体を対象とする核酸アプタマーは、5’→3’方向に：
ガイドRNA認識オリゴヌクレオチド−第二のネックオリゴヌクレオチド−第二の構造安定化オリゴヌクレオチド(−)第一の構造安定化オリゴヌクレオチド−第一のネックオリゴヌクレオチド
の順に連結される。なお、上記において、「(−)」は、構造安定化領域の自由末端における任意の連結を意味する。すなわち、本実施形態の方法は、（５’）前記第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと、前記第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを連結するステップをさらに含んでいてよい。
【００６０】
上記のように設計された核酸アプタマーは、当該技術分野において公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば、アミダイト法もしくはホスホアミダイト法などにより化学合成することができる。(例えば、Nucleic Acid(Vol.2)[1]Synthesis and Analysis of Nucleic Acid(Editor: Yukio Sugiura, Hirokawa Publishing Company)参照)。または、RNAポリメラーゼを用いる方法やDNAポリメラーゼを用いた遺伝子工学的手法により生合成してもよい。例えば、本発明の核酸アプタマーがRNAアプタマーである場合には、RNAポリメラーゼのプロモーター配列(例えば、T7プロモーター)を含む鋳型DNAを化学合成し、それをRNAポリメラーゼにより転写することによって作製することができる。例えば、本発明の核酸アプタマーがDNAアプタマーである場合には、鋳型DNAを化学合成し、それをPCRにより増幅することによって作製することができる。
【００６１】
一本鎖のガイドRNA認識領域が第二のネックオリゴヌクレオチドのみに連結された(すなわち、一本鎖のガイドRNA認識領域がフラップ構造を形成する) 核酸アプタマーを製造する場合、本発明の核酸アプタマーは、2本のアプタマー部分核酸を合成後にハイブリダイズさせて作製してもよいし、第一の構造安定化オリゴヌクレオチドと第二の構造安定化オリゴヌクレオチドとを、構造安定化領域の自由末端(すなわち、ネック領域が連結されているのとは反対側の末端)において連結させて1本の核酸として合成して作製してもよい。例えば、第一のネックオリゴヌクレオチド−第一の構造安定化オリゴヌクレオチドからなる第一のアプタマー部分核酸と、第二の構造安定化オリゴヌクレオチド−第二のネックオリゴヌクレオチド−ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドからなる第二のアプタマー部分核酸とを合成し、ハイブリダイズさせて作製してもよいし、第一のネックオリゴヌクレオチド−第一の構造安定化オリゴヌクレオチド−第二の構造安定化オリゴヌクレオチド−第二のネックオリゴヌクレオチド−ガイドRNA認識オリゴヌクレオチドを1本の核酸として合成して作製してもよい。
【００６２】
本発明の核酸アプタマーは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体に特異的に結合し、複合体の標的配列への作用を阻害できる。そのため、ゲノム編集をはじめとするCrispr-Casシステムに基づく既存の種々の方法と組み合わせて用いるのみにより、そのタイミングや精度を自在に制御することができ、有用である。
【００６３】
すなわち、本発明は、第三の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）前記複合体と前記標的核酸とを含む反応液を調製するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記反応液に添加するステップとを含む、方法である。
【００６４】
本実施形態の方法では、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と、前記複合体の標的核酸とを含む反応液を調製する。反応液の組成は、ヌクレアーゼの酵素活性のために適したものであれば、特に限定されず、すでに確立されたゲノム編集法において使用される反応液の組成に準じて適切に決定することができる。例えば、反応液は、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と前記複合体の標的核酸とを、バッファ(例えば、1〜100 mMのHEPES(pH 7.0〜pH8.0)、1〜100 mMのTris(pH 7.0〜pH8.0)など)および／または塩(例えば、50〜300 mMのNaCl、50〜300 mMのKCl、0〜100 mMのMgCl2など)を含む水性溶媒に添加することにより、調製することができる。反応液におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体の終濃度は、例えば、10〜300 nMの範囲であってよい。反応液における標的核酸の終濃度は、例えば、1〜1000 nMの範囲であってよい。gRNA／ヌクレアーゼ複合体と前記複合体の標的核酸との反応時間は、用いるヌクレアーゼの種類に応じて適宜決定することができ、例えば、5 分〜24時間行うことができる。
【００６５】
次いで、核酸アプタマーを、上記反応液に添加する。核酸アプタマーの添加量は、例えば、終濃度0.1〜1000 nMの範囲で適宜決定することができる。核酸アプタマーによる阻害反応は、好ましくは、5分〜24時間行うことができる。
【００６６】
なお、本実施形態の方法において、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と核酸アプタマーとは、順次または同時に反応液に添加されてよい。例えば、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と標的核酸とを反応させた後に核酸アプタマーを添加することができ、これにより、複合体の過剰な酵素反応を止めることができる。あるいは、核酸アプタマーは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と標的核酸とを含む反応液を調製する際に一緒に添加することもでき、これにより、複合体の酵素反応の程度や精度を制御することができる。すなわち、バッファおよび／または塩を含む水性溶媒に対して、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と、前記複合体の標的核酸と、核酸アプタマーとを、すべて同時に添加してもよい。
【００６７】
本発明は、第四の実施形態によれば、ガイドRNAとヌクレアーゼとを含む複合体の、前記複合体の基質である標的核酸に対する結合活性または酵素活性を阻害する方法であって、（１）標的核酸を含む細胞に前記複合体を導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、方法である。
【００６８】
本実施形態の方法では、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を、標的核酸を含む細胞に導入する。細胞は、目的の標的核酸を含むものであれば特に限定されず、大腸菌などの原核生物、酵母などの真菌、昆虫、植物、動物など、あらゆる生物種の細胞を用いることができる。本実施形態の方法における好ましい細胞は、植物または動物由来の細胞であり、特に好ましくはヒトなどの哺乳動物由来の細胞である。動物細胞の種類も特に限定されず、任意の組織から単離された細胞、受精卵、培養細胞などを用いることができる。また、細胞に含まれる標的核酸は、ゲノムDNAやミトコンドリアDNAなどの内在性の核酸であってもよいし、プラスミドベクターなどの外因性の核酸であってもよい。
【００６９】
gRNA／ヌクレアーゼ複合体の細胞への導入は、すでに確立されたゲノム編集法のプロトコールにしたがって行うことができる。例えば、予め調製したgRNAとヌクレアーゼとを、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより細胞に導入すればよい。あるいは、gRNAおよび／またはヌクレアーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを細胞に導入し、その後、細胞を培養することにより、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を細胞内で発現させてもよい。発現ベクターには、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を導入する細胞の種類に応じて、適切なウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを選択して用いることができる。
【００７０】
次いで、核酸アプタマーを、上記細胞に導入する。核酸アプタマーの細胞への導入は、細胞の種類に応じて、公知の方法により行うことができ、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどにより行うことができる。核酸アプタマーの導入後の細胞を、その種類に応じた適切な培養条件下で、１〜７日間培養することが好ましい。
【００７１】
なお、本実施形態の方法において、核酸アプタマーとgRNA／ヌクレアーゼ複合体は、順次または同時に細胞に導入されてよい。例えば、gRNA／ヌクレアーゼ複合体を細胞に導入した1〜6時間後に核酸アプタマーを導入することができ、これにより、複合体の過剰な酵素活性を抑制することができる。あるいは、核酸アプタマーは、gRNA／ヌクレアーゼ複合体と同時に細胞に導入することもでき、これにより、複合体の酵素反応の程度や精度を制御することができる。
【００７２】
本発明は、第五の実施形態によれば、（１）ガイドRNAとCrispr-Casファミリーのヌクレアーゼとを含む複合体を細胞に導入するステップと、（２）上記核酸アプタマーを前記細胞に導入するステップとを含む、ゲノム編集方法である。
【００７３】
本実施形態の方法は、第四の実施形態における標的核酸をゲノムDNAとして、かつ、第四の実施形態におけるgRNA／ヌクレアーゼ複合体としてgRNA／Casヌクレアーゼ複合体を用いることにより、ゲノム編集を行うものである。したがって、本実施形態の方法において用いることができる細胞は、第四の実施形態におけるものと同様である。また、gRNA／Casヌクレアーゼ複合体および／または核酸アプタマーの細胞への導入も、第四の実施形態の方法におけるものと同様の手順により行うことができる。
【００７４】
第三〜第五の実施形態の方法によれば、ゲノム編集をはじめとするCrispr-Casシステムに基づく既存の種々の方法において、そのタイミング、精度、程度などを自在に制御できるため、有用である。
【実施例】
【００７５】
以下に、具体的な実施例を示し、本発明についてさらに説明するが、本発明は以下の開示により限定されるものではない。また、本明細書中で引用する文献の内容は、参照により本明細書の一部をなすものとする。【００７６】
(実施例１．Cas9に対する核酸アプタマーの取得)
Cas9タンパク質に対する核酸アプタマーとして、大腸菌発現系により調製したHis-Cas9タンパク質に対する核酸アプタマーをSELEX法により取得した。詳細は以下の通りである。【００７７】
His-Cas9タンパク質(Streptococcus pyogenes Cas9)をHis-結合磁気ビーズ(Thermo Fisher Scientific社、10103D)に結合させ、結合バッファ(10 mM Tris/HCl  pH7.4、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、tRNA)で洗浄した。その後、化学合成した核酸ライブラリー(N17、N19、N21、N23)とHis-Cas9タンパク質を結合させた磁気ビーズとを、結合バッファ中、常温で一時間インキュベートした。その後、結合バッファで3回洗浄した後、98℃、3分間で溶出し、His-Cas9タンパク質と結合した核酸を回収した。5サイクルのセレクションを行い、増幅ステップのプライマーには、N-Rev、N-Fを用いた。セレクション後、増幅した配列をIllumina社のMiSeqにより解析した。得られた約10万リードの配列から、近似配列を有するクラスターの配列、および、数の多い配列から、任意の候補アプタマー配列をピックアップした。候補アプタマー配列を化学合成し、以下の実施例において、Cas9に対する候補アプタマーの阻害活性を調べた。なお、核酸ライブラリーの配列、プライマー配列を表２に示す。また、ピックアップした候補配列を表３Ａ〜３Ｃに示す。【００７８】
【表２】
2019035485.tif 000004
なお、NはG,A,TまたはCであり、Uはデオキシウリジンである。【００７９】
【表３Ａ】
2019035485.tif 000005
【表３Ｂ】
2019035485.tif 000006
【表３Ｃ】
2019035485.tif 000007
【００８０】
(実施例２−１．Cas9に対する阻害活性に基づく候補アプタマーの２次スクリーニング)
EGFP(GFP)配列を含むプラスミドの、Cas9およびGFP-targeting sgRNA(sgRNA(GFPg1): GFP-g1サイトを標的とするように設計したガイド配列を有するsgRNA)による切断が、候補アプタマーの存在下で阻害されるかどうかを試験した。候補アプタマーがCas9に対する阻害活性を有しない場合、Cas9とsgRNA(GFPg1)との複合体により、プラスミド中のGFP配列が切断される。一方、候補アプタマーがCas9に対する阻害活性を有する場合、上記切断が抑制される。プラスミドに含まれるGFPの配列は以下の通りである。【００８１】
GFP：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG(配列番号６７)【００８２】
0.5 pmol(終濃度50 nM)のCas9タンパク質、0.3 pmolのsgRNA(終濃度30 nM)、1 pmolの候補アプタマー(終濃度100 nM)、およびGFP配列を含むプラスミド(終濃度3 nM)を、10μlの反応バッファ(20 mM HEPES pH6.5、100 mM NaCl、5 mM MgCl2、0.1 mM EDTA)中で混合し、37℃、20分間インキュベートした。その後、0.65%アガロースゲル電気泳動により、プラスミドの切断を観察した。【００８３】
結果を図１に示す。図中、「Cas9(-)」はCas9を入れていないコントロールサンプルであり、すなわち、プラスミドが切断されなかった場合の結果を示す。一方、「Aptamer(-)」は候補アプタマーを添加せずに調製したサンプルであり、すなわち、プラスミドが切断された場合の結果を示す。プラスミドが切断されたことにより、高分子量の二本のバンド(Open circular DNAおよび一本鎖DNA)が確認できる。したがって、低分子量のバンドが強く検出されるほど、候補アプタマーのCas9に対する阻害活性が高いと評価することができる。【００８４】
図1の結果から、s1〜s55、C1、C2、C4、C6、およびC95の60個の候補アプタマーのうち、s21、s36およびs40が、高いCas9阻害活性を有することが示された。また、「Ep159」、「Ep84」および「GslG」は、無関係な核酸アプタマー配列を用いたネガティブコントロールであり、いずれもCas9阻害活性は確認されなかった。なお、「sgCCR5」は、候補アプタマーに代えて、他の配列(CCR5の配列)を標的とするように設計したガイド配列を有するsgRNA(sgRNA(CCR5))を加えた場合の結果であり、終濃度30nMおよび100nMのsgRNA(CCR5)による競合的な阻害効果は確認されなかった。【００８５】
GFP-targeting sgRNA(sgRNA(GFPg1))の配列(Nat. Biotechnol. 2015, 33(1):73-80. doi: 10.1038/nbt.3081.)、sgRNA(CCR5)の配列、無関係な核酸アプタマー配列(Ep159、Ep84、GslG)を以下に示す。【００８６】
【表４】
2019035485.tif 000008
なお、核酸の表記において、大文字はDNA、小文字はRNAを表すものとする。【００８７】
また、以下の実施例においては、特に断りがない限り、上記実施例２−１と同様の手順により、アプタマーの阻害活性を評価した。【００８８】
(実施例２−２．候補アプタマーの阻害活性の再評価)
高いCas9阻害活性が確認されたs21、s36およびs40について、アプタマーの濃度を変更して、阻害活性の再評価を行った。具体的には、各候補アプタマーの終濃度を3 nM、10 nM、または、30 nMとして、上記実施例２−１と同様の手順により、アプタマーの阻害活性を評価した。【００８９】
結果を図２に示す。この結果、s21およびs36の核酸アプタマーがCas9/sgRNA(GFP-g1)に対する高い阻害活性を有していることが示された。【００９０】
(実施例３．変異導入実験による核酸アプタマーの配列／構造と阻害活性との相関の解析)
Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対して高い阻害活性を示したs21は、5’末端および3’末端が互いに相補的な配列を有していることから、図３に示すような二次構造を形成しているものと考えられた。この推定された二次構造に基づき、核酸アプタマーを以下の3つの領域に分けて、変異導入解析を行った。
(1) 構造安定化領域：  二本鎖を形成している。PCRプライマーの結合配列を含み、アプタマーの由来するライブラリーごとに規定された固定の配列を有する。
(2) ネック領域：  二本鎖を形成している。ライブラリーにおいてランダムな配列を有する可変領域である。
(3) ガイドRNA認識領域：  一本鎖ループ構造を形成している。ライブラリーにおいてランダムな配列を有する可変領域である。【００９１】
（実施例３−１．ガイドRNA認識領域への変異導入）
まず、ガイドRNA認識領域の長さによる、核酸アプタマーの阻害活性に対する影響について調べた。s21とs36の間で共通性のある配列を残し、ガイドRNA認識領域の長さが異なる短縮型変異アプタマーを合成し(s21-1、s21-2、s21-3、s21-4、s21-5、s21-6、Tetra)、Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性を調べた。変異アプタマーの配列を表５に示す。なお、下線を付した配列(CGCC)は、本実施例の結果から、Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性に重要であることが示唆された配列である。【００９２】
【表５】
2019035485.tif 000009
【００９３】
さらに、候補アプタマーのスクリーニングにより得られた配列の中から、s21およびs36と共通の配列を含む核酸アプタマー(N19-M1、N19-M2、N19-13、N19-14：配列を表６に示す)を選択し、それらの阻害活性を評価した。【００９４】
【表６】
2019035485.tif 000010
【００９５】
結果を図４に示す。ガイドRNA認識領域の長さが7塩基以上のアプタマーでは、阻害活性の低下はあまり見られなかったが、ガイドRNA認識領域の長さが6塩基のアプタマー(s21-3)では、阻害活性が有意に低下した。一方、ガイドRNA認識領域を、安定的なループ構造を形成することが知られるテトラループ配列に置き換えたアプタマー(Tetra)では、阻害活性が著しく低下した。また、s21およびs36と共通の配列を含む核酸アプタマーでは、ネック領域を持ち、かつ、ガイドRNA認識領域の最初(5’末端)の4塩基の配列がCGCCであるN19-13のみが阻害活性を示したことから、ガイドRNA認識領域の最初のCGCCがCas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性に重要であることが推察された。【００９６】
ガイドRNA認識領域におけるCGCCの位置が阻害活性に及ぼす影響について、さらに解析するために、候補アプタマーのスクリーニングにより得られた配列の中から、ガイドRNA認識領域がCGCCで始まる候補アプタマー(N23-meme1、N23-meme2)、ガイドRNA認識領域のいずれかの位置にCGCCを含む候補アプタマー(N23-m1、N23-m2、N23-m3)、ならびに、s21およびs36のネック領域に変異を有する候補アプタマー(s21-mut1、s36-mut1)を選択し、Cas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性を調べた。これらの候補アプタマーの配列を表７に示す。【００９７】
【表７】
2019035485.tif 000011
【００９８】
結果を図５に示す。ガイドRNA認識領域がCGCCで始まる候補アプタマー(N23-meme1、N23-meme2)はどちらもs21と同レベルの阻害活性を示した。一方、ガイドRNA認識領域の他の位置にCGCCを含む候補アプタマー(N23-m1、N23-m2、N23-m3)や、s21およびs36のネック領域に変異を有する候補アプタマー(s21-mut1、s36-mut1)は、いずれもs21と比較して弱い阻害活性しか示さなかった。【００９９】
さらに、s21-2のガイドRNA認識領域に点変異を導入した核酸(s21-2lm1、s21-2lm2、s21-2lm3、s21-2lm4、s21-2lm5、s21-2lm6、s21-2lm7)を作製し、阻害活性を評価した。これらの核酸配列を表８に示す(変異部位を下線で示した)。【０１００】
【表８】
2019035485.tif 000012
【０１０１】
結果を図６に示す。ガイドRNA認識領域(7塩基長)のうち、1塩基目に点変異を導入(C→G)したアプタマー(s21-2lm1)および2塩基目に点変異を導入(G→C)したアプタマー(s21-2lm2)は、クリティカルに阻害活性を消失した。また、3塩基目に点変異を導入(C→G)したアプタマー(s21-2lm3)および4塩基目に点変異を導入(C→G)したアプタマー(s21-2lm4)も、有意に阻害活性が低下した。一方、5〜7塩基目における点変異導入は、阻害活性に大きな影響を与えなかった(s21-2lm5、s21-2lm6、s21-2lm7)。以上の結果から、ガイドRNA認識領域の最初のCGCC配列がCas9/sgRNA(GFP-g1)に対する阻害活性に重要であり、それ以外の配列は特に重要でないことが確認された。【０１０２】
(実施例３−２．構造安定化領域およびネック領域への変異導入)
次に、構造安定化領域の配列／構造とアプタマーの阻害活性との相関を調べた。まず、構造安定化領域の長さについての影響を調べるために、s21-2(構造安定化領域：12塩基対長)を元にして、構造安定化領域が11塩基対長(s21-2e)、10塩基対長(s21-2f)、9塩基対長(s21-2g)、8塩基対長(s21-2a)、6塩基対長(s21-2b)、3塩基対長(s21-2c)、0塩基対長(s21-2d)の核酸を調製し、Cas9/sgRNA(EGFP-g1)に対する阻害活性について調べた。これらの核酸配列を表９に示す。【０１０３】
【表９】
2019035485.tif 000013
【０１０４】
結果を図７に示す。構造安定化領域が8塩基対長までは、短くなるにしたがって阻害活性が徐々に減少したが、6塩基対長以下になると阻害活性が急激に失われることが示された。【０１０５】
次に、構造安定化領域およびネック領域の塩基配列の重要性について確認するため、s21-2を元にして、ステム構造を保持したまま、自由末端から2塩基対ごとに配列を置換した核酸(s21-2m1〜s21-2m7)を調製し、Cas9/sgRNA(EGFP-g1)に対する阻害活性について調べた。これらの核酸配列を表１０に示す(変異部位を下線で示した)。【０１０６】
【表１０】
2019035485.tif 000014
【０１０７】
結果を図８に示す。構造安定化領域に変異を導入した核酸(s21-2m1〜s21-2m6)はいずれもs21-2と同等の阻害活性を示し、アプタマーの阻害活性は構造安定化領域の配列には依存しないことが明らかになった。一方、ネック領域に変異を導入した核酸(s21-2m7)は、阻害活性を大きく損なっており、ネック領域の塩基配列はアプタマーの阻害活性に重要であることが示唆された。【０１０８】
(実施例３−３．ネック領域への変異導入)
次に、ネック領域について、様々な変異を導入した核酸配列(s21-2mm1〜s21-2mm11)を調製し、ネック領域の配列／構造とアプタマーの阻害活性との相関を詳細に調べた。これらの核酸配列を表１１に示す(変異部位を下線で示した)。【０１０９】
【表１１】
2019035485.tif 000015
【０１１０】
結果を図９に示す。ネック領域内の構造安定化領域に隣接した塩基対から3番目の塩基対は、塩基対が形成されていれば塩基の種類はアプタマーの阻害活性に影響しないこと、1番目と2番目の塩基対については、ガイドRNA認識領域の最初のCGCC配列に隣接するネック部分の配列(本実施例では「センス配列」と呼称する)がTC>CC>TTの順に阻害活性が高いこと、その相補鎖であるネック部分の配列(本実施例では「アンチセンス配列」と呼称する)がGGであることが必要であること、また、センス配列におけるバルジの挿入は許容される(s21-2mm11)ことが判明した。【０１１１】
(実施例３−４．ホスホロチオエート化核酸アプタマーの阻害活性)
生体内での核酸の使用のためには、安定性を上げるために、核酸のリン酸基の酸素原子を硫黄原子により置換(ホスホロチオエート修飾)することがしばしば行われる。そこで、ホスホロチオエート修飾(以下、「チオール化」と表記する)がアプタマーの阻害活性に影響を与えるか否かについて検討を行った。調製したチオール化核酸の配列を表１２に示す(チオール化塩基を^で示した)。【０１１２】
【表１２】
2019035485.tif 000016
【０１１３】
結果を図１０に示す。s21-2の構造安定化領域およびネック領域のセンス配列／アンチセンス配列の3塩基をチオール化した核酸(s21-ls2s1〜s21-ls2s5)、ガイドRNA認識領域の全塩基をチオール化した核酸(s21-ls2s6)はいずれも阻害活性を有し、s21-2と比較して阻害活性の減少はほとんどみられなかった。一方、s21-2の全領域の全塩基をチオール化した核酸(s21-ls2s all)の阻害活性は有意に減少した。【０１１４】
(実施例４．ゲルシフトアッセイによるCas9とアプタマーの相互作用の解析)
Cas9タンパク質と、阻害活性を有する核酸アプタマーとの間の相互作用を、ゲルシフトアッセイにより解析した。詳細な実験条件は以下の通りである。【０１１５】
2 pmolのCas9タンパク質と、20 pmolの核酸アプタマー(s21、s21-2、s21-mm2、tetra、St2-1SA(Streptavidinに対するアプタマー))を結合バッファ(20 mM Tris/HCl pH8.0、250 mM NaCl、1 mM MgCl2、2.5% glycerol、0.05% Tween-20、0.05 mg/ml tRNA)中で30分間常温にてインキュベートした。その後、8%アクリルアミドゲルで電気泳動し、SYBR Gold(Thermo Fisher Scientific社)によって染色後、Bio-Rad ChemiDoc XRS imageanalysis system(Bio-Rad社)により解析した。なお、St2-1SAの配列は以下の通りである(表１３)。【０１１６】
【表１３】
2019035485.tif 000017
【０１１７】
結果を図１１に示す。高いCas9阻害活性を有するs21およびs21-2を用いたサンプルにおいては、Cas9タンパク質との複合体を示すバンドがゲル上部にみられた。一方、Cas9阻害活性の低いs21-2mm2、Tetra、およびSt2-1SA(ネガティブコントロール) を用いたサンプルにおいては、Cas9タンパク質との複合体を示すバンドはみられなかった。【０１１８】
(実施例５．表面プラズモン共鳴分析によるCas9タンパク質と核酸アプタマーとの物理化学的相互作用の解析)
Cas9タンパク質と核酸アプタマーとの間の解離定数(Kd)を算出するために、表面プラズモン共鳴分析を行った。詳細な実験手法は以下の通りである。【０１１９】
5’ビオチン修飾したs21を調製し、ストレプトアビジンセンサーチップ(GEヘルスケア社)上に固定した。その後、ランニングバッファ(20 mM Tris/HCl pH8.0、150 mM NaCl、1 mM MgCl2、0.005% Tween-20)中に、異なる濃度(2.5 nM、5 nM、10n M、20 nM)のCas9タンパク質をロードすることにより、センサグラムを得た。KdはBiacore evaluation software package(GEヘルスケア社、Ver 2.0)により算出した。また、コントロールとして、Tetraを用いて同様の試験を行った。【０１２０】
結果を図１２に示す。s21とCas9タンパク質との間のKdは、0.57 nMであり、s21が非常に高いCas9結合能を持っていることが分かった。一方、阻害活性が弱かったTetraとCas9タンパク質との間のKdは、8.79 μMであった。【０１２１】
(実施例６．ステムフラップ型アプタマーの設計)
Cas9アプタマーの阻害活性にはガイドRNA認識領域の最初の4塩基が重要であることから、図１３で示すように、この最初の4塩基(CGCC)のみをガイドRNA認識領域としたステムフラップ型のアプタマー(s21-sf)を調製し、その阻害活性について調べた。s21-sfの配列を以下に示す(表１４)。【０１２２】
【表１４】
2019035485.tif 000018
【０１２３】
結果を図１４に示す。新たに設計したステムフラップ構造を形成するアプタマー(s21-sf)は、ステムループ構造を形成するアプタマー(s21-2)と、ほぼ同等の阻害活性を持つことが確認された。【０１２４】
(実施例７−１．Cas9アプタマーのsgRNA配列特異性)
s21-2は、Cas9/sgRNA(GFPg1)に対して高い阻害活性を示したので、GFP配列上の他の部位を標的とするCas9/sgRNA複合体に対してもs21-2が同様の阻害活性を有するかどうかについて検討した。以降の実験では、sgRNAに代えて、crRNAとtracrRNAとをアニーリングさせた複合体(crRNA:tracrRNA)を用いた。crRNAおよびtracrRNAは、ファスマック社またはIDT社から購入したものを用いた。crRNAの配列を表１５に示す(下線はcrRNAにおけるガイド配列を示す)。【０１２５】
【表１５】
2019035485.tif 000019
【０１２６】
GFPの異なる部位を標的化する3つのcrRNAを、それぞれtracrRNAとアニーリングさせてcrRNA:tracrRNA複合体とした後、s21-2とCas9タンパク質を同時に加え、s21-2の阻害活性について調べた。なお、使用したcrRNA:tracrRNAは終濃度30 nMであり、Cas9の終濃度は50 nMであり、実施例２−１と同じである。アプタマー濃度は図中に示した。【０１２７】
結果を図１５に示す。s21-2は、Cas9/sgRNA(GFPg1)と同じ部位を標的とするCas9/crRNA:tracrRNA (GFPg1)に対しては高い阻害活性を示したが、他の部位(GFP332、GFP373、GFP686)を標的とするCas9/crRNA:tracrRNAに対しては弱い阻害活性しか示さなかった。この結果は、すなわち、s21-2がcrRNA(GFPg1)と相互作用していることを示唆するものと考えられる。そこで、s21-2の配列をみてみると、阻害活性に重要であるガイドRNA認識領域の最初の4塩基CGCCと、crRNA(GFPg1)中のガイド配列の3’末端の４塩基GGCGが相補的であり、二本鎖を形成する可能性が考えられた。さらに、ネック領域のアンチセンス配列がPAM配列(NGG)と同じ配列であること、およびCas9/sgRNAの結晶構造に基づく考察から、s21-2およびs21-sfは、図１７に示す模式図のような様式でCas9/sgRNA複合体に結合していることが示唆された。【０１２８】
なお、既存の手法(アンチセンス法)により、sgRNA(GFPg1) 中のガイド配列に対するアンチセンスDNA(As(GFPg1))およびアンチセンスRNA(AsRNA(GFPg1))の阻害活性を評価したところ、阻害活性はほとんど見られなかった(図１６)。As(GFPg1)、AsRNA(GFPg1)の配列を表１６に示す。【０１２９】
【表１６】
2019035485.tif 000020
【０１３０】
(実施例７−２．特異性メカニズムに基づいたアプタマーの設計)
図１７に示す結合モデルに従って、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)に対して、ステムフラップ型アプタマー(sf(GFP332)、sf(GFP373))およびステムループ型アプタマー(s21-2(GFP332)、s21-2(GFP373))を設計し、その阻害活性を測定した。配列を表１７および１８に示す(crRNA中のガイド配列と二本鎖を組むと考えられる配列を下線で示す)。【０１３１】
【表１７】
2019035485.tif 000021
【０１３２】
【表１８】
2019035485.tif 000022
【０１３３】
結果を図１８に示す。ステムフラップ型アプタマー(sf(GFP332)およびsf(GFP373))は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)の両方に対して、高い阻害活性(Cas9/sgRNA(GFPg1)に対するs21アプタマーと同等) を示した。この結果は、本発明者らが想定する結合様式を強く示唆している。【０１３４】
また、Cas9/crRNA(GFP332)、Cas9/crRNA(GPF373)に対するステムループ型アプタマー(s21-2(GFP332)、s21-2(GFP373))は、対応するステムフラップ型アプタマーに比べて、やや低い阻害活性を示した。この原因としては、ループ長が短く(7塩基)、crRNA中のガイド鎖と十分に二本鎖を組めていない可能性が考えられた。【０１３５】
そこで、ループ長を17塩基まで伸ばし、ガイド配列と二本鎖を形成すると考えられる4塩基以外をAで構成したステムループ型アプタマー(s21-A(GFP332)、s21-A(GFP373))を設計し(配列は上の表１８に示す)、Cas9/crRNA(GFP332)、Cas9/crRNA(GPF373)に対する阻害活性を測定した。【０１３６】
結果を図１９に示す。s21-A(GFP332)および s21-A(GFP373)はいずれも、対応するステムフラップ型アプタマーと同等の阻害活性を示した。この結果から、ループ長を伸長することにより、阻害活性を回復できることが示された。なお、ガイド配列に対するアンチセンスDNA(As(GFP332)、As(GFP373))は、上記アプタマーと比較して低い阻害活性しか示さなかった。【０１３７】
(実施例８.ステムフラップ型アプタマーの構造的なパラメータに関する実験)
ステムフラップ型アプタマーのガイド配列に対する特異性を調べるために、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)のそれぞれに対する、GFPg1部位を標的とするアプタマー(s21-2、s21-sf)、フラップ構造のないネガティブコントロールアプタマー(sf-0)、GFP332部位を標的とするステムフラップ型アプタマー(sf(GFP332))、およびGFP373部位を標的とするステムフラップ型アプタマー(sf(GFP373))の阻害活性を評価した。sf-0の配列を表に示す。【０１３８】
【表１９】
2019035485.tif 000023
【０１３９】
結果を図２０に示す。sf(GFP332)はCas9/crRNA(GFP332)に対して、sf(GFP373)はCas9/crRNA(GPF373)に対して、非常に高い阻害活性を示した。これに対し、s21-sf(GFPg1部位を標的とするステムフラップ型アプタマー)は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)のいずれに対してもほとんど阻害活性を示さなかった。この結果から、ステムフラップ型アプタマーが高い配列特異性を有することが示された。その一方で、s21-2(GFPg1部位を標的とするステムループ型アプタマー)は、Cas9/crRNA(GFP332)およびCas9/crRNA(GPF373)のいずれに対しても若干の阻害活性を示しており、配列特異性がやや低いことが示唆された。【０１４０】
次に、ステムフラップ型アプタマーのフラップの長さと阻害活性との間の関係について調べた。s21-sfを元にして、フラップ構造の長さを変更したステムフラップ型アプタマー(sf-0、sf-2(GFPg1)、sf-3(GFPg1)、sf-4(GFPg1)、sf-5(GFPg1)、sf-6(GFPg1)；それぞれ0、2、3、4、5、6塩基長のフラップ構造を有する)、および、フラップ配列の相補配列をネック領域のアンチセンス配列に付加したアプタマー(sf-ds) を作製し、その阻害活性を調べた。また、標的DNAと同じガイド配列およびPAM配列を有する二本鎖デコイ(decoy：decoy-sとdecoy-asとの二本鎖)を対照として用いた。sf-2(GFPg1)、sf-3(GFPg1)、sf-4(GFPg1)、sf-5(GFPg1)、sf-6(GFPg1)、decoy-s、decoy-asの配列を表２０に示す。【０１４１】
【表２０】
2019035485.tif 000024
【０１４２】
結果を図２１に示す。sf-0(フラップ長:0)は100 nMでもほとんど阻害活性を示さないが、フラップ構造が2、3、4塩基長に伸びるにしたがって(sf-2(GFPg1)、sf-3(GFPg1)、sf-4(GFPg1))、アプタマーの阻害活性が上昇することが確認された。また、4塩基長以上のフラップ構造を有するアプタマー(sf-4(GFPg1)、sf-5(GFPg1)、sf-6(GFPg1))は、いずれも高い阻害活性を示した。一方、フラップ配列部分を二本鎖にしたsf-dsや二本鎖デコイは、ステムフラップ型アプタマーに比べて、弱い阻害活性しか示さなかった。この結果から、ステムフラップ型アプタマーにおけるフラップ部分は一本鎖であることが阻害活性に重要であることが示唆された。【０１４３】
さらに、フラップ部分と二本鎖を組まない1〜4塩基長の配列をネック領域のアンチセンス配列に付加したアプタマー(s21-sf-T1、s21-sf-T2、s21-sf-T3)についても阻害活性を評価したところ、いずれも高い阻害活性を有していた(図２２)。また、s21-sfの構造安定化領域を6塩基対長にまで短くしたアプタマー(s21-sf-ShortStem)は、s21-sf(構造安定化領域:12塩基対長)と変わらない阻害活性を示した(図２２)。この結果から、構造安定化領域が少なくとも6塩基対長を有していれば、構造安定化領域の構造は阻害活性に影響しないようであることが理解される。なお、s21-sf-T1、s21-sf-T2、s21-sf-T3、s21-sf-ShortStemの配列は以下の通りである(表２１)。【０１４４】
【表２１】
2019035485.tif 000025
【０１４５】
（実施例９．他の遺伝子の標的とするCas9/crRNAに対するアプタマーの阻害活性の検証実験）
EGF受容体(EGFR)遺伝子配列中の2つの部位(EGFR-bおよびEGFR-c)を標的とするCas9/crRNA(EGFR-b)およびCas9/crRNA(EGFR-c)に対するステムフラップ型アプタマー(sf(EGFR-b)、sf(EGFR-c))を設計し、阻害活性を調べた。標的プラスミドには、ヒトEGF受容体とGFPの融合タンパク質の遺伝子配列を含むプラスミドを用いた。EGF受容体の遺伝子配列は以下の通りである。【０１４６】
EGF receptor：
ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACAAGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTCAATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGCCCTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAATATGTACTACGAAAATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATAAAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGAAATCCTGCATGGCGCCGTGCGGTTCAGCAACAACCCTGCCCTGTGCAACGTGGAGAGCATCCAGTGGCGGGACATAGTCAGCAGTGACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCACCTGGGCAGCTGCCAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTGCAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCTCCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGCAGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGACGAAGCCACGTGCAAGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACGTACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGAAGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTGTGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTGCGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGACTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATCAGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATACTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCACAGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTTGAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTGCAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAGTGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATAAACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAACAGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCCCCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAGCCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAACCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGAGTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACTACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAAACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCATCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAATGGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGCTGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAAGCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGAGGGAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAACTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCGCAAAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTGCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTTTACACAGAATCTATACCCACCAGAGTGATGTCTGGAGCTACGGGGTGACCGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCCAAGCCATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATCTCCTCCATCCTGGAGAAAGGAGAACGCCTCCCTCAGCCACCCATATGTACCATCGATGTCTACATGATCATGGTCAAGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAAGTTCCGTGAGTTGATCATCGAATTCTCCAAAATGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGGGGATGAAAGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGACTCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATGAAGAAGACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCATCCCACAGCAGGGCTTCTTCAGCAGCCCCTCCACGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCAACCAGCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATAGAAATGGGCTGCAAAGCTGTCCCATCAAGGAAGACAGCTTCTTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACAGGCGCCTTGACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGTGCCTGAATACATAAACCAGTCCGTTCCCAAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAATCCTGTCTATCACAATCAGCCTCTGAACCCCGCGCCCAGCAGAGACCCACACTACCAGGACCCCCACAGCACTGCAGTGGGCAACCCCGAGTATCTCAACACTGTCCAGCCCACCTGTGTCAACAGCACATTCGACAGCCCTGCCCACTGGGCCCAGAAAGGCAGCCACCAAATTAGCCTGGACAACCCTGACTACCAGCAGGACTTCTTTCCCAAGGAAGCCAAGCCAAATGGCATCTTTAAGGGCTCCACAGCTGAAAATGCAGAATACCTAAGGGTCGCGCCACAAAGCAGTGAATTTATTGGAGCA(配列番号１５９)【０１４７】
EGF受容体(EGFR)遺伝子配列中の2つの部位(EGFR-bおよびEGFR-c)を標的とするcrRNAの配列、ならびに、ステムフラップ型アプタマーsf(EGFR-b)およびsf(EGFR-c) の配列は以下の通りである(表２２)。
【表２２】
2019035485.tif 000026
【０１４８】
結果を図２３に示す。Cas9/crRNA(EGFR-b)およびCas9/crRNA(EGFR-c)に対するステムフラップ型アプタマーsf(EGFR-b) およびsf(EGFR-c)は、先の実施例において解析したGFPを標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーに比べると、やや低い阻害活性しか得られなかった。この原因としては、crRNAとアプタマーが二本鎖を組む配列がAT-richであり、両者の間で二本鎖が形成されにくいことが考えられた。そこで、二本鎖を形成しやすくするために、フラップ構造の長さを5塩基長または6塩基長に伸ばしたアプタマー(sf5(EGFR-b)、sf5(EGFR-c)、sf5(EGFR-c)、sf6(EGFR-c))を設計し、再度阻害活性を評価した。また、コントロールとして、アンチセンスDNA(As(EGFR-b)、As(EGFR-c))を用いた。これらの配列を表２３に示す。【０１４９】
【表２３】
2019035485.tif 000027
【０１５０】
結果を図２４に示す。予想通り、EGFRのどちらの標的部位に対するCas9/crRNAについても、フラップ長さを伸ばすことにより阻害活性が回復し、6塩基長のフラップ構造を持つステムフラップ型アプタマーsf6(EGFR-b) およびsf6(EGFR-c)は、GFPを標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーと同程度の阻害活性を示した。【０１５１】
さらに、EpCAM遺伝子を標的とするCas9/crRNA(EpCAM)に対するステムフラップ型アプタマー(sf(EpCAM))を設計し、阻害活性を調べた。標的プラスミドにはEpCAM遺伝子中の標的配列をクローニングしたプラスミドを用いた。配列を以下に示す。
EpCAM：GTGCACCAACTGAAGTACACCGG (配列番号１７０)【０１５２】
【表２４】
2019035485.tif 000028
【０１５３】
結果を図２５に示す。Cas9/crRNA(EpCAM)に対するステムフラップ型アプタマー(sf(EpCAM))も、他の遺伝子を標的とするCas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーと同様に高い阻害活性を示した。【０１５４】
(実施例１０．Cpf1(Cas9ホモログ)に対するアプタマーのデザインと阻害活性の検証実験)
Cas9には様々ホモログが存在し、それぞれ異なる配列からなるPAMを認識することが知られている。そこで、上記実施例において検討したCas9阻害アプタマーの設計方法が、他のPAM配列を認識するCas9ホモログに対しても適用可能なものであるかどうかについて検証した。【０１５５】
ここでは、Cas9ホモログとして、Cas9に次いでよく使用されているCrisprゲノム編集酵素であるCpf1を用いた。Cpf1は、標的遺伝子中のガイドRNA標的配列の上流の(すなわち、5’末端に隣接する)PAM配列(TTTN)を認識し、標的遺伝子の二本鎖DNAを切断する。そのため、Cpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの場合には、Cas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーの場合とは反対側の末端(すなわち、5’末端)にフラップ構造部分を配置することが必要であるはずである。そこで、図２６に示すように、Cpf1/crRNAを標的とするステムフラップ型アプタマー(sf-c(GFPa))およびGFPを標的とするcrRNA(GFPa)を設計し、アプタマーの阻害活性を評価した。さらに、Cas9阻害アプタマーでは、ネック領域におけるG:T塩基対が阻害活性の上昇に寄与したので、同様にT:G塩基対を導入した3種類のステムフラップ型アプタマー(sf-c1(GFPa)、sf-c2(GFPa)、sf-c3(GFPa))も作製した。また、GFP遺伝子を含むプラスミドは、実施例２で使用したものと同じものを使用した。Cpf1酵素、crRNAはIDT社から購入したものを使用した。【０１５６】
crRNA(GFPa)およびアプタマーの配列を表２５に示す。表中、下線は、crRNAと二本鎖を組むと考えられる配列を示す。
【表２５】
2019035485.tif 000029
【０１５７】
終濃度60 nMのCpf1、終濃度50 nMのcrRNA(GFPa)をバッファ(50 mM Tris/HCl pH7.9、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、100 ug/ml BSA)中で混合し、20 分間静置した。その後、終濃度 3 nMのプラスミドおよびアプタマーを加え、37℃で10分間インキュベートした。その後、0.65%アガロースゲル電気泳動により、プラスミドの切断を観察した。【０１５８】
結果を図２７に示す。Cpf1/crRNAに対して設計したステムフラップ型アプタマーも、Cas9/crRNAに対するステムフラップ型アプタマー同様、高い阻害活性を示した。また、ネック領域にT:Gミスマッチを挿入したアプタマーでは、いずれも阻害活性が減少した。【０１５９】
さらに、Cpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーのデザインの一般性を検証するために、EGFRの3箇所の標的配列(EGFR-1、EGFR-2、EGFR-3)に対するcrRNAおよび、それぞれに対応するステムフラップ型アプタマー(sf-c(EGFR-1)、sf-c(EGFR-2)、sf-c(EGFR-3))を設計し、アプタマーの阻害活性について調べた。EGFRの3箇所の標的配列およびそれぞれに対応するステムフラップ型アプタマーの配列を表２６に示す。表中、下線は、crRNAと二本鎖を組むと考えられる配列を示す。【０１６０】
【表２６】
2019035485.tif 000030
【０１６１】
結果を図２８に示す。いずれのCpf1/crRNAに対するステムフラップ型アプタマーも高い阻害活性を示した。【０１６２】
(実施例１１．細胞内におけるアプタマー阻害活性の検証実験)
本発明のアプタマーが、細胞内においてもCas9/crRNAを阻害できるかどうかを確認するために、ゲノム編集が生じると蛍光タンパク質(mScarlet)が発現するレポーター細胞株(293-mScarlet)を作製した。293-mScarlet細胞は、Thermo Fisher Scientific社のFlp-Inシステムにより、HEK293のゲノムに、終止コドンを有する標的配列がmScarletのコード配列の上流に挿入されたレポーターカセットを挿入することにより作製した。293-mScarlet細胞は、ゲノム編集される前の状態では、mScarletのコード配列の上流に終止コドンが存在することにより、mScarletを発現しない。しかし、標的配列に依存的なゲノム編集が起こると、切断された標的部位における塩基の挿入または欠失により終止コドンが消失し、さらに切断部位がmScarletのコード配列のフレームと一致するように正しく修復された場合に、mScarlet蛍光タンパク質が発現するようになる。【０１６３】
上記レポーターカセットの配列を以下に示す。小文字はmScarletの配列、大文字は終止コドンを含む標的配列を示す。また、下線はCas9/crRNAの標的配列を示し、標的配列の3’末端に位置するTAGが終止コドンである。
レポーターカセット(標的配列-mScarlet)：
ATGGCGTCTTCTTCTCATTTCACACCGAAGCAGAGTTTTTCGGATTCCCGAGTAGCAGATGACCATGACAAGTAGCGGCAGGACCAGCCCCAAGATGACTTGGAGATAACTACTAAGAAGAAAACGGTGAGCAAGGGCGAGGAGgtgagcaagggcgaggcagtgatcaaggagttcatgcggttcaaggtgcacatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttctcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccagggccttcatcaagcaccccgccgacatccccgactactataagcagtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgccgtgaccgtgacccaggacacctccctggaggacggcaccctgatctacaaggtgaagctccgcggcaccaacttccctcctgacggccccgtaatgcagaagaagacaatgggctgggaagcgtccaccgagcggttgtaccccgaggacggcgtgctgaagggcgacattaagatggccctgcgcctgaaggacggcggccgctacctggcggacttcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagatgcccggcgcctacaacgtcgaccgcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccgtggtggaacagtacgaacgctccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag(配列番号１８４)【０１６４】
24ウェルプレートに播種された293-mScarlet細胞株に、Cas9タンパク質(2μg)/crRNA:tracrRNA(0.5 μg)複合体を、Lipofectamine(商標) CRISPRMAX(商標) Cas9 Transfection Reagent (Thermo Fisher Scientific社)を用いて導入した。Cas9/crRNA:tracrRNAの導入と同時(すなわち、0時間後)または6時間後に、アプタマー(sf-Sca)(終濃度100 nM)またはネガティブコントロールアプタマー(ds-cont)(終濃度100 nM)を導入し、その後、3日間培養し、mScarletの発現の有無を顕微鏡観察した。なお、Cas9/crRNA:tracrRNAの導入6時間後におけるアプタマーの導入は、Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific社)を用いて行った。使用したcrRNAおよびアプタマーの配列を表２７に示す。^はチオール化塩基を示す。【０１６５】
【表２７】
2019035485.tif 000031
【０１６６】
結果を図２９に示す。アプタマーをCas9/crRNA:tracrRNAの導入と同時(Cas9/crRNA(Sca)+sf-Sca,0h)または6時間後(Cas9/crRNA(Sca)+sf-Sca,6h)に導入したいずれの場合も、sf-Scaにより細胞におけるゲノム編集が顕著に阻害された。【０１６７】
（実施例１２．LNAを含むアプタマーの細胞でのゲノム編集阻害実験）
細胞内におけるアプタマーのゲノム編集に対する阻害効果をさらに改善するために、フラップ構造部分をLNAに置換したアプタマー(sf-Sca-LNA)を合成し、実施例１１と同様の実験系および手順により、その阻害活性を評価した。アプタマー(終濃度100 nM)をCas9/sgRNAと同時に細胞に導入し、その後、3日間培養し、mScarletの発現の有無を顕微鏡観察した。さらに、アプタマーの阻害活性を定量的に評価するために、観察後の細胞を回収し、FACSを用いてゲノム編集が起きた細胞(mScarletを発現する細胞)の数をカウントした。sf-Sca-LNAの配列を表２８に示す。下線はLNAを示し(ただし、LNAのCは5メチルシトシンである)、^はチオール化塩基を示す。【０１６８】
【表２８】
2019035485.tif 000032
【０１６９】
その結果を図３０および図３１に示す。DNAアプタマー(sf-Sca)は、細胞内でのゲノム編集を約60〜70%阻害したのに対し、LNA/DNAアプタマー(sf-Sca-LNA)は、ほぼ完全に細胞内でのゲノム編集を阻害した。また、sf-Sca-LNAの濃度依存性を調べた結果を図３２および図３３に示す。sf-Sca-LNAは、終濃度50 nM以上でほぼ完全にゲノム編集を阻害できることが明らかになった。【０１７０】
（実施例１３．内在遺伝子のゲノム編集に対するLNA修飾アプタマーによる阻害実験）
次に、Cas9による内在遺伝子に対するゲノム編集をアプタマーにより阻害することができるかを調べた。標的とする内在遺伝子には、HPRT1とEMX1を選んだ。それぞれの遺伝子を標的とするcrRNAを合成し、Cas9/crRNA:tracrRNA複合体を調製した。得られた複合体を、実施例１１と同様の手順により、アプタマーと同時に293FT細胞(Thermo Fisher Scientific社)に導入し、3日間培養した。その後、細胞を回収し、Guide-it Mutation Detection kit(タカラバイオ社)を用いて、細胞からDNAを抽出し、ゲノム編集の標的部位をPCRで増幅し、PCR産物をT7E1 酵素により処理した後、2%アガロースゲル電気泳動することにより、ゲノム編集によって生じたインデル(insertion/deletion)を検出した。使用したcrRNA、アプタマー、およびプライマーの配列を表２９に示す。表中、大文字はDNA、小文字はRNA、下線はLNAを示し(ただし、LNAのCは5メチルシトシンである)、^はチオール化塩基を示す。【０１７１】
【表２９】
2019035485.tif 000033
【０１７２】
結果を図３４に示す。HPRT1とEMX1のどちらに対するゲノム編集も、本発明の方法により設計されたアプタマー(sf-HPRT1およびsf-EMX1)により、ほぼ完全に阻害できることが確認された。
【図１】
2019035485.tif 000034
【図２】
2019035485.tif 000035
【図３】
2019035485.tif 000036
【図４】
2019035485.tif 000037
【図５】
2019035485.tif 000038
【図６】
2019035485.tif 000039
【図７】
2019035485.tif 000040
【図８】
2019035485.tif 000041
【図９】
2019035485.tif 000042
【図１０】
2019035485.tif 000043
【図１１】
2019035485.tif 000044
【図１２】
2019035485.tif 000045
【図１３】
2019035485.tif 000046
【図１４】
2019035485.tif 000047
【図１５】
2019035485.tif 000048
【図１６】
2019035485.tif 000049
【図１７】
2019035485.tif 000050
【図１８】
2019035485.tif 000051
【図１９】
2019035485.tif 000052
【図２０】
2019035485.tif 000053
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
2019035485.tif 000062
【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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