(57)【要約】本発明は、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞の集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理することを含む、Ｋｉ６７陽性細胞が低減されたインスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、
を含む方法。
【請求項２】
さらに、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
製造された細胞集団が、Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＦＧＦＲ１阻害剤が１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア又はその塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程が、動物に移植することにより行われる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞の集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、
を含む方法。
【請求項８】
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の減少又は増殖を抑制する方法であって、
該細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理することを含む、方法。
【請求項９】
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団がインスリン産生細胞集団である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
ＦＧＦＲ１阻害剤が１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア又はその塩である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含む、膵前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
【請求項１３】
インスリン産生細胞集団である、請求項１２に記載の細胞集団。
【請求項１４】
移植用に使用される、請求項１２又は１３に記載の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団中に存在する高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去する方法に関する。
［発明の背景］【０００２】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、インスリン産生細胞や膵β細胞といったインスリン分泌細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。【０００３】
これまでに、多能性幹細胞からインスリン分泌細胞へと分化誘導するために様々な手法が、開発・報告されている。非特許文献１には、ヒトｉＰＳ細胞に由来する内分泌前駆細胞を線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１阻害剤であるＣＡＳ１９２７０５−７９−６（１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア）を用いて処理することにより、当該細胞の分化を促進できることが記載されている。【０００４】
また、タンパク質チロシンキナーゼの阻害に有効なピリド（２，３−ｄ）ピリミジンおよびナフチリジン化合物が公知であり、当該化合物はアテローム性動脈硬化症、再狭窄、ガンの細胞増殖疾患の治療に有用であることが報告されている（特許文献１）。【０００５】
さらに、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６について、ラット筋芽細胞におけるｂＦＧＦ刺激による細胞増殖を抑制し、ＰＤＧＥ刺激による細胞増殖は抑制しないこと、また、ヒト胎盤血管における微小血管伸長を抑制することが確認され、腫瘍増殖や動脈硬化性プラークの新血管形成を標的とし抗増殖剤／抗血管形成剤としての利用可能性が示唆されている（非特許文献２）。【０００６】
一方、これまでに多能性幹細胞由来の内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をさらに分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団中に高い増殖性を有する細胞が混在していることは知られておらず、また、そのような細胞を除去することについて検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ９６／１５１２８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ６，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３５９０８（２０１６）
【非特許文献２】Ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｊｕｌｙ  １９９８，Ｖｏｌ．２８６（１），ｐ．５６９−５７７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願発明者らは、多能性幹細胞からインスリン産生細胞又は膵β細胞へと分化誘導した細胞集団中に、これらインスリン分泌細胞（インスリン産生細胞や膵β細胞）と共に、Ｋｉ６７マーカー陽性によって特徴付けられる増殖性の高い細胞（以下、「Ｋｉ６７陽性細胞」と記載する）が存在することを見出した。【００１０】
分化誘導したインスリン分泌細胞を糖尿病の治療等に応用しようとした場合、インスリン分泌細胞以外の細胞を厳密に制御することは、安全性の観点から極めて重要である。また、高い増殖性を有する細胞の混入・残存は、レシピエントへの悪影響や移植されたインスリン分泌細胞の長期の生着に影響を及ぼす虞があり、好ましくない。【００１１】
そこで本発明は、分化誘導したインスリン分泌細胞と共存する高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去する手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理することによって、Ｋｉ６７陽性細胞の増殖が抑制され、Ｋｉ６７陽性細胞の含有量が低減されたインスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団を得ることが可能であることを見出した。【００１３】
本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］  インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、
を含む方法。
［２］  さらに、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、を含む、［１］の方法。
［３］  インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する、［１］又は［２］の方法。
［４］  製造された細胞集団が、Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含む、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］  ＦＧＦＲ１阻害剤が１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア又はその塩である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［５−１］  ＦＧＦＲ１阻害剤が、ＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１μＭ以下である物質である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［５−２］  ＦＧＦＲ１阻害剤が、１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１９２７０５−７９−６）、Ｅ−３８１０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０５８１３７−２３−７）、ＰＤ−１７３０７４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１９５８０−１１−７）、ＦＧＦＲ４−ＩＮ−１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１７０８９７１−７２−５）、ＦＧＦＲ−ＩＮ−１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１４４８１６９−７１−８）、ＦＩＩＮ−２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１６３３０４４−５６−０）、ＡＺＤ４５４７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０３５２７０−３９−３）、ＦＩＩＮ−３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１６３７７３５−８４−２）、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３１０７４６−１０−１）、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８７２５１１−３４−７）、ＣＨ５１８３２８４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２６５２２９−２５−１）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２３４３５６−６９−４）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ  Ｒａｃｅｍａｔｅ、Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１３５−２４−６）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８４８３１８−２５−２）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ  ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８４８４６３−１３−８）、Ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３４６２４２−８１−６）、ＢＬＵ９９３１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１５３８６０４−６８−０）、ＰＲＮ１３７１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１８０２９２９−４３−６）、Ｓ４９０７６（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２６５９６５−２２−７）、ＬＹ２８７４４５５（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２５４４７３−６４−７）、Ｌｉｎｓｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７１６０−７１−２）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４０５１６９−１６−６）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０５８１５６−９０−３）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６４９７３５−４６−６）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２３４３５６−６９−４）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ  Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３６０４６０−８２−７）、ＡＣＴＢ−１００３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９３９８０５−３０−８）、ＢＬＵ−５５４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１７０７２８９−２１−１）、Ｒｏｇａｒａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１４４３５３０−０５−９）、ＢＩＢＦ  １１２０  ｅｓｙｌａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６５６２４７−１８−６）、ＴＧ  １００５７２  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７３３１−６４−４）、ＥＮＭＤ−２０７６（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９３４３５３−７６−１）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ  ａｌａｎｉｎａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６４９７３５−６３−７）、ＴＧ  １００５７２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７３３４−０５−２）、ＢＩＢＦ  １１２０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６５６２４７−１７−５）、ＥＮＭＤ−２０７６  Ｔａｒｔｒａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２９１０７４−８７−７）、ＴＳＵ−６８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２５２９１６−２９−３）、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９４３３１９−７０−８）、Ｓｕｌｆａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３０８６７２−７４−３）、Ｌ��２７８４５４４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２２９２３６−８６−５）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ  ｌａｃｔａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６９２７３７−８０−７）、ＳＵ  ５４０２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１５５４３−９２−３）、ＦＧＦ−４０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１７０８９７１−５５−４）、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ＩＮ−１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７０５９４６−２７−６）、ＰＰ５８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１２３９１−５８−７）、ＴＧ  １００８０１  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０１８０６９−８１−２）、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６７０２２０−８８−９）、ＴＧ  １００８０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７３３１−８２−６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６３５７０２−６４−６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４４４７３１−５２−６）、ＰＤ１６８３９３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１９４４２３−１５−９）、Ａｐａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２１８７７９−７５−９）、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ  ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８２７０２２−３３−３）、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８４９２１７−６４−７）、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４１７７１６−９２−８）、Ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３８７８６７−１３−２）、又はそれらの塩である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］  ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程が、動物に移植することにより行われる、［２］〜［５］のいずれかの方法。
［７］  インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞の集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、
を含む方法。
［８］  内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の減少又は増殖を抑制する方法であって、
該細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理することを含む、方法。
［８−１］  内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制する方法であって、
該細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理することを含む、方法。
［８−２］  前記細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の絶対数を減少させる、［８］の方法。
［８−３］  前記細胞集団中に存在する内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞で、且つＫｉ６７陽性細胞でない細胞の数を減少させない、［８］、［８−１］、［８−２］のいずれか方法。
［９］  内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団がインスリン産生細胞集団である、［８］〜［８−３］のいずれかの方法。
［１０］  内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する、［８］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］  ＦＧＦＲ１阻害剤が１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア又はその塩である、［８］〜［１０］のいずれかの方法。
［１２］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含む、膵前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
［１２−１］  Ｋｉ６７陽性細胞を２％未満の割合で含む、膵前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
［１２−２］  Ｋｉ６７陽性細胞を１％未満の割合で含む、膵前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
［１２Ａ］  Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含む、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
［１２Ａ−１］  Ｋｉ６７陽性細胞を２％未満の割合で含む、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
［１２Ａ−２］  Ｋｉ６７陽性細胞を１％未満の割合で含む、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
［１３］  インスリン産生細胞集団である、［１２］〜［１２−２］のいずれかの細胞集団。
［１４］  移植用に使用される、［１２］〜［１３］の細胞集団。
［１４−１］  ［１２］〜［１３］の細胞集団を含む医薬。
［１４−２］  ［１２］〜［１３］の細胞集団を含むプロドラッグ。
［１５］  インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
（０）本明細書中に記載されているいずれかの方法（例えば、段落[００５８]から[０１０６]のいずれかの方法）を含む工程、
（１）インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、および
（２）ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
［１６］  インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団の製造方法であって、
（１）インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、ならびに（２）アルギン酸を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、
を含む方法。
［１７］  インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
（０）標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度を少なくとも７０％以上にする工程、
（１）インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、および
（２）ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
［１８］ＦＧＦＲ１阻害剤で処理した細胞集団を移植する工程を含む、糖尿病の治療方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１８−０８２６０６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、分化誘導したインスリン分泌細胞と共存する高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去する手法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理して（又は処理せず）得られたインスリン産生細胞集団を移植して、５週間後に摘出した移植片の剖検所見及び免疫組織染色の結果を示す。黒矢頭：移植片を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．用語
以下、本明細書において記載される用語について説明する。
【００１７】
本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。
【００１８】
本明細書において、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
【００１９】
本明細書において、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）  ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。
【００２０】
本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。
【００２１】
なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。
【００２２】
本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。
【００２３】
本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。培養には２次元培養（平面培養）や、３次元培養（浮遊培養）が含まれる。
【００２４】
本明細書において、「富化する（ｅｎｒｉｃｈ）」及び「富化すること（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％富化される。
【００２５】
本明細書において、「枯渇する（ｄｅｐｌｅｔｅ）」及び「枯渇すること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、細胞もしくは細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％減少（枯渇）している。
【００２６】
本明細書において、「純化する（ｐｕｒｉｆｙ）」及び「純化すること（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。
【００２７】
本明細書において、「細胞の数を減少させない」とは、本発明方法の実施に起因して細胞数が顕著に減少しないことを意味し、当該方法の実施前の細胞数と当該方法の実施後の細胞数との間に顕著な差がないことを意味する。ただし、本発明方法の実施を原因とするものではない細胞数の減少（例えば、従来公知の細胞培養及び分化の工程において通常生じ得る細胞の自然死等）は生じ得る。したがって、「細胞の数を減少させない」とは、本発明方法の実施前と比べた実施後の細胞の減少率が、３０％以下、２０％以下、１０％以下、または５％以下である場合も含まれる。
本明細書において、「増殖を抑制」とは、本発明方法の実施に起因して細胞数が顕著に増加しないことを意味し、当該方法の実施前の細胞数と当該方法の実施後の細胞数との間に顕著な増加がないことを意味する。本発明方法の実施前と比べた実施後の細胞の増加率が、３０％以下、２０％以下、１０％以下、または５％以下である場合も含まれる。
【００２８】
本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
【００２９】
マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書中において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ−ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。
【００３０】
本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
【００３１】
本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は上記で述べたように類似しており、ＣＤＫ８阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。
【００３２】
「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ−２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１８）、種々のコロニー−刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。
【００３３】
本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ  ＩとＲＯＣＫ  ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ−（４−ピリジニル）−４β−［（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（本明細書中、Ｙ−２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン（Ｈ−１１５２）、４β−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−（４−ピリジル）ベンゼン−１ゼンカルボアミド（Ｗｆ−５３６）、Ｎ−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−４−イル）−４ＰＥＲ（Ｒ）−１−アミノエチル］シクロヘキサン−１α−カルボアミド（Ｙ−３０１４１）、Ｎ−（３−｛［２−（４−アミノ−１，２，５−オキサジアゾール−３−イル）−１−エチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−イル］オキシ｝フェニル）−４−｛［２−（４−モルホリニル）エチル］−オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【００３４】
本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
【００３５】
ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２−［［２−［（５−ニトロ−６−アミノピリジン−２−イル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ−８（４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＴＷＳ−１１９（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１−アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）  及びＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ピリドカルバゾール−シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ−４−ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３βはこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【００３６】
本明細書において「血清代替物」とは、例えば、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２−サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ−Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ−２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ−Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。
【００３７】
２．Ｋｉ６７陽性細胞の増殖が抑制された内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団
本発明は、Ｋｉ６７陽性細胞の増殖が抑制された内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団に関するものであり、これらの細胞集団はＦＧＦＲ１阻害剤で処理することにより得ることができる。
【００３８】
本明細書において「Ｋｉ６７陽性細胞」とは、多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程において、多能性幹細胞から分化誘導された少なくとも内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞と共存し、マーカーとしてＫｉ６７の発現によって特徴付けられる細胞を意味する。
「Ｋｉ６７」は細胞周期関連核タンパク質として公知であり、増殖中の細胞のＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期において発現が認められ、増殖を休止しているＧ０期においては発現が認められないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとしても知られている。
【００３９】
多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程においては、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている（ＷＯ２００９／０１２４２８、ＷＯ２０１６／０２１７３４）。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、膵β細胞に大きく分類することができる。
【００４０】
本明細書において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。
【００４１】
本明細書において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。
【００４２】
本明細書において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。
【００４３】
「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理研等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、ＮＩＨ、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ−１〜ＣＨＢ−１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１〜ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉｓＣｅｌｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ−１株、ＫｈＥＳ−２株、ＫｈＥＳ−３株、ＫｈＥＳ−４株、ＫｈＥＳ−５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。
【００４４】
「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３−６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１−８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ−ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ  ４４８，３１３−３１７．）、ｃ−Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１−１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１  Ｍａｙ；８（５）：４０９−１２，Ｏｋｉｔａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８−６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ  Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７−１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ  ＩＨ，Ｄａｌｅｙ  ＧＱ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１−１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８−３０７００７号）等も用いることができる。
【００４５】
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ  Ｙ．，Ｄｉｎｇ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ  ５，５６８−５７４；、Ｋｉｍ  ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ  ＨＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６−６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ  ７，７９５−７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８−３０７００７号、特開２００８−２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
【００４６】
人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−２Ａ株、ＨｉＰＳ−ＲＩＫＥＮ−１２Ａ株、Ｎｉｐｓ−Ｂ２株、京都大学のＦｆ−ＷＪ−１８株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ−Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌ  ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。
【００４７】
本明細書において「膵前駆細胞集団」とは、膵前駆細胞により特徴付けられる細胞集団を意味する。本明細書において、膵前駆細胞は、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６−１、ＰＴＦ−１α、ＧＡＴＡ４およびＳＯＸ９の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。
【００４８】
膵前駆細胞集団は、膵前駆細胞を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の割合で含む細胞集団である。膵前駆細胞集団には、膵前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞等）が含まれていてもよい。
【００４９】
本明細書において「内分泌前駆細胞集団」とは、内分泌前駆細胞により特徴付けられる細胞集団を意味する。
【００５０】
本明細書において、内分泌前駆細胞は、Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＧＮ３の少なくとも一つのマーカーの発現、および膵関連のホルモン系（例えば、インスリン等）のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。内分泌前駆細胞は、ＰＡＸ−４、ＮＫＸ２−２、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＰＴＦ−１αなどのマーカーが発現していてもよい。
【００５１】
内分泌前駆細胞集団は、内分泌前駆細胞を３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の割合で含む細胞集団である。内分泌前駆細胞集団には、内分泌前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、膵前駆細胞、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞等）が含まれていてもよい。
【００５２】
細胞集団中の特定の細胞の割合は、フローサイトメトリーのような細胞数を算出可能な公知の手法に基づいて求めることができる。
【００５３】
「それ以降の分化段階にある細胞集団」とは、内分泌前駆細胞よりも膵β細胞へと分化段階が進んだ細胞により特徴付けられる細胞集団を意味する。内分泌前駆細胞よりも膵β細胞へと分化段階が進んだ細胞としては、好ましくは、インスリン産生細胞、又は膵β細胞である。
【００５４】
本明細書において「インスリン産生細胞」は、インスリンのマーカーの発現が認められ、かつＮＧＮ３発現量が内分泌前駆細胞にて確認される最大発現時の３分の１未満の割合であることによって特徴付けられる細胞を意味する。「インスリン産生細胞」は、ＮＫＸ６．１のマーカーを発現していてもよく、好ましくは、インスリン及びＮＫＸ６．１の両方のマーカーが発現していて、かつＮＧＮ３発現量が内分泌前駆細胞にて確認される最大発現時の３分の１未満の割合である細胞である。
ＮＧＮ３発現量は、定量的ＲＴ−ＰＣＲで測定することができる。所定の段階にある細胞よりＣｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴ  ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で作製したｃＤＮＡを用いＮＧＮ３およびＧＡＰＤＨに対するＴａｑＭａｎプローブ／プライマー配列セットを用い測定した後、ＧＡＰＤＨに対する相対的発現量をＮＧＮ３の遺伝子発現量とする。
【００５５】
「インスリン産生細胞集団」は、インスリン産生細胞を５％以上、好ましくは１５％以上、より好ましくは３０％以上の割合で含む細胞集団である。当該細胞集団には、インスリン産生細胞に加えて、その他の細胞（例えば、内分泌前駆細胞；グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一つのマーカーを発現する他の膵ホルモン産生細胞；Ｋｉ６７陽性細胞等）が含まれていてもよい。
インスリン産生細胞集団はさらに、内分泌前駆細胞からの分化工程において初期の段階に現れる「前期インスリン産生細胞集団」と、さらに分化が進んだ段階に現れる「後期インスリン産生細胞集団」に分けることができ、後期インスリン産生細胞集団は特に、インスリン陽性／ＮＫＸ６．１陽性細胞（ＩＮＳ／ＮＫＸ６．１両陽性細胞）が２０％以上の割合で含まれることにより特徴付けることができる。
【００５６】
本明細書において「膵β細胞」は、「インスリン産生細胞」より成熟した細胞を意味しており、具体的には、膵β細胞の成熟マーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現する、あるいはグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によって特徴付けられる細胞を意味する。
【００５７】
「膵β細胞集団」は、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を分化・成熟させることによって、好ましくは生体内で分化・成熟させることによって、得ることができる、膵β細胞を含む細胞集団である。当該細胞集団には、膵β細胞に加えて、その他の細胞（例えば、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞等）が含まれていてもよい。
【００５８】
内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、多能性幹細胞を膵β細胞へと分化誘導する公知の手法を用いて得ることができる。すなわち、以下の分化誘導工程を利用して各目的の細胞集団を得ることができる：
工程１）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する；
工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
工程３）原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する；
工程４）後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
工程５）膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
工程６）内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する。
以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。
【００５９】
工程１）胚体内胚葉細胞への分化
多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地、より好ましくはアクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、２２０００〜１５００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、好ましくは２２０００〜１０００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、より好ましくは２２０００〜８００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２である。培養期間は１日〜４日、好ましくは１日〜３日、特に好ましくは３日である。
【００６０】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００６１】
本工程で用いる培地としては、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ３／ＦＡＦ−ＢＳＡ／ＩＴＳ−Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。
【００６２】
アクチビンＡの培地中の濃度は、通常３０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは７０〜１２０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
別の態様として、アクチビンＡは培地中に低用量にて、例えば、５〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５〜５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１０ｎｇ／ｍＬの量にて含めることができる。
別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３〜１０ｎｇ／ｍｌである。
【００６３】
ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２〜５μＭ、好ましくは２〜４μＭ、特に好ましくは約３μＭである。
【００６４】
ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５〜２０μＭ、好ましくは５〜１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭである。
培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に０．０１〜２０μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭ、より好ましくは０．５〜５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ−２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。
【００６５】
具体的には、アクチビンＡ、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で１日培養した後、アクチビンＡのみを含む培地で１日毎に培地を交換しながらさらに２日培養する。あるいは、低用量のアクチビンＡの存在下、多能性幹細胞を、インスリンを０．０１〜２０μＭ含む培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンを含まない培地中で第２の培養を行うことにより製造することができる。
【００６６】
工程２）原腸管細胞への分化
工程１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜８日、好ましくは約４日である。
【００６７】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
【００６８】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００６９】
増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
【００７０】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００７１】
工程３）後方前腸細胞への分化
工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日〜５日、好ましくは約２日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
【００７２】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００７３】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００７４】
増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
【００７５】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
【００７６】
シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５〜１．５μＭ、好ましくは０．３〜１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。
【００７７】
ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００７８】
工程４）膵前駆細胞への分化
工程３）で得られた後方前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜１０日、好ましくは約５日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
【００７９】
２次元培養の場合には、工程３）で得られた後方前腸細胞を、既報（Ｔｏｙｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５−１９７）に従い、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを遠心分離して懸濁した後、工程４の新しい培地に再播種する。
【００８０】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００８１】
ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ−５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ−１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。
【００８２】
増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。
【００８３】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜３２０ｎＭ）、好ましくは約５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．８〜１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約１．６〜１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５〜２０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．３〜１１６ｎＭ）、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）、より好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ（すなわち、約０．６〜５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＥＧＦは通常通常５〜１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０〜１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＫＧＦは通常１０〜２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
【００８４】
工程４）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
【００８５】
また、培地にはＰＫＣ活性化剤を含めても良い。ＰＫＣ活性化剤としては、ＰｄＢＵ（ＰＫＣ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＩＩ）、ＴＰＢ（ＰＫＣ  ａｃｔｏｖａｔｏｒ  Ｖ）などを使用するが、その限りでない。ＰＫＣ活性化剤の濃度は約０．１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約３〜１０ｎｇ／ｍｌで添加する。
また、培地にはジメチルスルホキシド、アクチビン（１〜５０ｎｇ／ｍｌ）を添加してもよい。
いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、Ｂ−２７サプリメント、ＩＴＳ−Ｇ）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（本明細書中、ＡＡと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
【００８６】
また細胞培養は、２次元培養の場合は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｔｙｐｅ  Ｉ−ｃｏｌｌａｇｅｎ、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ−Ｄ−リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ−Ｄ−リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
【００８７】
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００８８】
工程４）で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
【００８９】
工程５）内分泌前駆細胞への分化
工程４）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程４）で得られた膵前駆細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散し、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを遠心分離して懸濁した後、工程５）の新しい培地に再播種する。培養期間は２日〜３日、好ましくは約２日である。
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００９０】
工程６）インスリン産生細胞への分化
工程５）で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してインスリン産生細胞に分化誘導する。培養期間は１０日〜３０日、好ましくは約１０〜２０日である。
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ−システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ４、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。
培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
培養温度は、特に限定されないが、３０〜４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
【００９１】
膵β細胞への分化
上記工程で得られた細胞は、膵β細胞に分化誘導することができる。膵β細胞集団へと分化させる工程は、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団、好ましくはインスリン産生細胞集団、を動物生体内に移植することによって行うことができる。
【００９２】
「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。
【００９３】
移植は、細胞集団を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。移植される細胞数は、移植される細胞の分化段階や、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、１０×１０４細胞〜１０×１０１１個程度とすることができる。移植された細胞集団は、生体内環境において分化誘導され、目的の細胞集団、好ましくは膵β細胞集団へと分化することができ、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。
【００９４】
移植に際して、細胞集団は、アルギン酸を含むゲル中に包埋して移植してもよく、例えば、アルギン酸を含むゲル中に包埋された細胞集団をカプセル、バッグ、チャンバーなどのデバイスに封入して生体内に移植することもできる。
【００９５】
「アルギン酸を含むゲル」は、公知の手法（ＷＯ２０１０／０３２２４２、ＷＯ２０１１／１５４９４１）に準じて作製することができ、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液に架橋剤を添加してゲル化させることにより得ることができる。
【００９６】
アルギン酸塩は水溶性の塩であればよく、金属塩、アンモニウム塩等を利用することができる。例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウム等を好適に用いることができる。
【００９７】
アルギン酸エステル（アルギン酸プロピレングリコールとも称される）はアルギン酸のカルボキシル基にプロピレングルコールがエステル結合した誘導体である。
【００９８】
アルギン酸塩に含まれるマンヌロン酸とグルロン酸の割合（Ｍ／Ｇ比）は任意であり、一般的に、Ｍ＞Ｇである場合には柔軟性に富んだゲルを形成することができ、Ｍ＜Ｇである場合には強固なゲルを形成することができる。本発明においては、グルロン酸を１０〜９０％、２０〜８０％、３０〜７０％、又は、４０〜６０％の割合で含むものを利用することができる。
【００９９】
アルギン酸塩又はアルギン酸エステルは溶媒中に、０．０５〜１０重量％、好ましくは、０．１〜５重量％、より好ましくは０．５〜３重量％の量で含めることができる。溶媒はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルを溶解可能なものであればよく、水、生理食塩水等を利用することができる。
【０１００】
架橋剤はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液をゲル化できるものであればよく、特に限定されないが、多価の金属カチオンを利用することができる。多価の金属カチオンとしては、２価の金属カチオンが好ましく、より好ましくは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンである。架橋剤は塩の形態で利用することができ、本発明においては、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウムから選択される少なくとも一つを架橋剤として利用することができる。
【０１０１】
アルギン酸を含むゲルにはナノファイバーを含めることができる。ナノファイバーは、ナノメートル領域の直径を有する天然又は合成ファイバーである。天然ナノファイバーとしては、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、キトサンなどの多糖類の一又は複数を含むものが挙げられる。合成ナノファイバーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）などが挙げられる。ナノファイバーはアルギン酸を含むゲル中に１重量％未満、例えば、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、又はそれ未満の量にて含めることができる。アルギン酸を含むゲル中に含めるナノファイバーの量の下限は特に限定されないが、０．０５重量％以上、好ましくは０．１重量％以上とすることができる。
【０１０２】
本発明において「包埋」とは、アルギン酸を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、散在させ収容することを意味する。
【０１０３】
アルギン酸を含むゲルへの細胞集団の包埋は、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に細胞集団を混合し、ゲル化させることにより行うことができる。
【０１０４】
細胞集団はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に１×１０４細胞〜１×１０９細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０７細胞〜１×１０８細胞／ｍＬから選択される量にて含めることができる。
【０１０５】
細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液のゲル化は、当該溶液に架橋剤を添加して行うことができる。添加する架橋剤の量は、当該溶液に対し０．１〜５重量％、例えば、０．１〜１重量％、から選択される量とすることができる。ゲル化は、細胞培養や細胞移植に用いられる所定の構成及び／又は形状を有する容器内にて、あるいは当該容器に適合するゲルが得られるように設計された鋳型内で行うことができる。
【０１０６】
あるいは、公知の手法（ＷＯ２０１０／０１０９０２）に準じてアルギン酸を含むゲルカプセルを形成することにより行われてもよい。すなわち、架橋剤の溶液に対し、細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液を滴下して行ってもよい。滴下する際のノズルの形状や滴下方法に応じて、液滴のサイズを調整することができ、ひいてはアルギン酸を含むゲルカプセルの大きさを規定することができる。滴下方法は特に限定されないが、エアスプレー法、エアレススプレー方式、静電スプレー法等の手法により行うことができる。アルギン酸を含むゲルカプセルの大きさは特に限定されないが、直径が５ｍｍ以下、１ｍｍ以下、５００μｍ以下とすることができる。
架橋剤溶液には、０．１〜１０重量％、例えば、０．１〜５重量％、から選択される量の架橋剤を含めることができる。
【０１０７】
本発明において「ＦＧＦＲ１阻害剤」とは、少なくとも線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１に対する阻害活性を有する物質である。ＦＧＦＲ１は、成長因子であるＦＧＦ１〜ＦＧＦ１７に対して高い親和性を有する受容体として、４回膜貫通型チロシンキナーゼのファミリー（ＦＧＦＲ１，２，３，４）のメンバーである。ＦＧＦＲ１は、中胚葉の誘導やパターン形成、細胞の増殖や遊走、器官形成、骨成長などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。本発明で用いられるＦＧＦＲ１阻害剤は、ＦＧＦＲ１阻害活性を有すれば特に限定されず、ＦＧＦＲ１阻害活性と合わせてその他のＦＧＦＲの阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。本発明において「ＦＧＦＲ１阻害剤」とは、ＦＧＦＲ１阻害活性を少しでも有している物質が含まれるが、好ましくは、ＦＧＦＲ１を５０％以上阻害する物質を指し、より好ましくはＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１μＭ以下、さらに好ましくは１００ｎＭ以下である物質を指す。ＦＧＦＲ１阻害活性の判定方法としては、公知の方法から選択すればよく、例えばＥｎｚｙＣｈｒｏｍ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使った判定方法などが挙げられる。本発明において「ＦＧＦＲ１阻害剤」は従来公知のものを利用することが可能であり、特許文献又は非特許文献から見つけることができる。また、本発明において「ＦＧＦＲ１阻害剤」とは、少なくともＦＧＦＲ１阻害活性を有していればよく、他のＦＧＦＲに対する阻害活性を有していてもよい。例えば、本発明の「ＦＧＦＲ１阻害剤」はＦＧＦＲ１阻害活性を有する限り、ＦＧＦＲ２阻害剤、ＦＧＦＲ３阻害剤、ＦＧＦＲ４阻害剤等であってもよい。
【０１０８】
例えば、本発明において「ＦＧＦＲ１阻害剤」としては、下記に示した化合物（化合物群Ｄ）に加えて、以下一般式で示される構造式を有する化合物のうち、ＦＧＦＲ１に阻害活性を有する化合物（又はその塩）が挙げられ、好ましくは、以下一般式で示される構造式を有する化合物Ｉ及び化合物ＩＩのうち、ＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１μＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下である化合物（又はその塩）である。
【０１０９】
（化合物Ｉ）
化合物Ｉは下記式１：
【化１】
2019208505.tif 000002
〔式中、環ＡＢは、１以上の置換基を有する２環式複素環を示す（環ＡＢは、１以上の置換基を有する３環式複素環であってもよい）〕で表される化合物またはその塩が挙げられる。
好ましくは、式中、環ＡＢは、３個の置換基を有する２環式含窒素複素環を示す。
置換基としては、以下で示した置換基もしくは化合物群Ｄが有している置換基が挙げられ、好ましくは化合物群Ｄが有している置換基を示す。
【０１１０】
（化合物ＩＩ）
化合物ＩＩは下記式２：
【化２】
2019208505.tif 000003
〔式中、環Ｄは、置換基を有していてもよい５ないし６員単環式含窒素複素環を示し；
環Ｄ以外に１以上の含窒素複素環を含むことを示す。〕で表される化合物またはその塩が挙げられる。
好ましくは、式中、環Ｄは、置換基を有していてもよい、窒素を１または２含む芳香環を示す。
また、好ましくは、環Ｄ以外の１以上の含窒素複素環としては、置換基を有していてもよいピペラジンが挙げられる。
置換基としては、以下で示した置換基もしくは化合物群Ｄが有している置換基が挙げられ、好ましくは化合物群Ｄが有している置換基を示す。
【０１１１】
本明細書中、「複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、芳香族複素環および非芳香族複素環が挙げられる。
【０１１２】
本明細書中、「芳香族複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環が挙げられる。該「芳香族複素環」の好適な例としては、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、１，２，４−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、トリアゾール、テトラゾール、トリアジンなどの５ないし６員単環式芳香族複素環；
ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾトリアゾール、イミダゾピリジン、チエノピリジン、フロピリジン、ピロロピリジン、ピラゾロピリジン、オキサゾロピリジン、チアゾロピリジン、イミダゾピラジン、イミダゾピリミジン、チエノピリミジン、フロピリミジン、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、チアゾロピリミジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロトリアジン、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フェノキサチイン、インド−ル、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジンなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環が挙げられる。
【０１１３】
本明細書中、「非芳香族複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する３ないし１４員（好ましくは４ないし１０員）の非芳香族複素環が挙げられる。該「非芳香族複素環」の好適な例としては、アジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピロリン、ピロリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾリン、チアゾリジン、テトラヒドロイソチアゾール、テトラヒドロオキサゾール、テトラヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、テトラヒドロピリジン、ジヒドロピリジン、ジヒドロチオピラン、テトラヒドロピリミジン、テトラヒドロピリダジン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパニン、ジアゼパン、アゼピン、アゾカン、ジアゾカン、オキセパンなどの３ないし８員単環式非芳香族複素環；
ジヒドロベンゾフラン、ジヒドロベンゾイミダゾール、ジヒドロベンゾオキサゾール、ジヒドロベンゾチアゾール、ジヒドロベンゾイソチアゾール、ジヒドロナフト［２，３−ｂ］チオフェン、テトラヒドロイソキノリン、テトラヒドロキノリン、４Ｈ−キノリジン、インドリン、イソインドリン、テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノキサリン、テトラヒドロフェナントリジン、ヘキサヒドロフェノチアジン、ヘキサヒドロフェノキサジン、テトラヒドロフタラジン、テトラヒドロナフチリジン、テトラヒドロキナゾリン、テトラヒドロシンノリン、テトラヒドロカルバゾール、テトラヒドロ−β−カルボリン、テトラヒドロアクリジン、テトラヒドロフェナジン、テトラヒドロチオキサンテン、オクタヒドロイソキノリンなどの９ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）非芳香族複素環が挙げられる。
【０１１４】
本明細書中、「含窒素複素環」としては、「複素環」のうち、環構成原子として少なくとも１個以上の窒素原子を含有するものが挙げられる。
【０１１５】
以下、本明細書中で用いられる各置換基の定義について詳述する。特記しない限り各置換基は以下の定義を有する。
【０１１６】
本明細書中、「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【０１１７】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルが挙げられる。
【０１１８】
本明細書中、「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基」としては、例えば、１ないし７個、好ましくは１ないし５個のハロゲン原子を有していてもよいＣ１−６アルキル基が挙げられる。具体例としては、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、テトラフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、２，２―ジフルオロプロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシルが挙げられる。
【０１１９】
本明細書中、「Ｃ２−６アルケニル基」としては、例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、５−ヘキセニルが挙げられる。
【０１２０】
本明細書中、「Ｃ２−６アルキニル基」としては、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、４−メチル−２−ペンチニルが挙げられる。
【０１２１】
本明細書中、「Ｃ３−１０シクロアルキル基」としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、アダマンチルが挙げられる。
【０１２２】
本明細書中、「ハロゲン化されていてもよいＣ３−１０シクロアルキル基」としては、例えば、１ないし７個、好ましくは１ないし５個のハロゲン原子を有していてもよいＣ３−１０シクロアルキル基が挙げられる。具体例としては、シクロプロピル、２，２−ジフルオロシクロプロピル、２，３−ジフルオロシクロプロピル、シクロブチル、ジフルオロシクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルが挙げられる。
【０１２３】
本明細書中、「Ｃ３−１０シクロアルケニル基」としては、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニルが挙げられる。
【０１２４】
本明細書中、「Ｃ６−１４アリール基」としては、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリルが挙げられる。
【０１２５】
本明細書中、「Ｃ７−１６アラルキル基」としては、例えば、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル、フェニルプロピルが挙げられる。
【０１２６】
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ基」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシが挙げられる。
【０１２７】
本明細書中、「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルコキシ基」としては、例えば、１ないし７個、好ましくは１ないし５個のハロゲン原子を有していてもよいＣ１−６アルコキシ基が挙げられる。具体例としては、メトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、エトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、４，４，４−トリフルオロブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシが挙げられる。
【０１２８】
本明細書中、「Ｃ３−１０シクロアルキルオキシ基」としては、例えば、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロヘプチルオキシ、シクロオクチルオキシが挙げられる。
【０１２９】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキルチオ基」としては、例えば、メチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオが挙げられる。
【０１３０】
本明細書中、「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ基」としては、例えば、１ないし７個、好ましくは１ないし５個のハロゲン原子を有していてもよいＣ１−６アルキルチオ基が挙げられる。具体例としては、メチルチオ、ジフルオロメチルチオ、トリフルオロメチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、４，４，４−トリフルオロブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオが挙げられる。
【０１３１】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」としては、例えば、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、２−メチルプロパノイル、ペンタノイル、３−メチルブタノイル、２−メチルブタノイル、２，２−ジメチルプロパノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイルが挙げられる。
【０１３２】
本明細書中、「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基」としては、例えば、１ないし７個、好ましくは１ないし５個のハロゲン原子を有していてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基が挙げられる。具体例としては、アセチル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイルが挙げられる。
【０１３３】
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基」としては、例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ペンチルオキシカルボニル、ヘキシルオキシカルボニルが挙げられる。
【０１３４】
本明細書中、「Ｃ６−１４アリール−カルボニル基」としては、例えば、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイルが挙げられる。
【０１３５】
本明細書中、「Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基」としては、例えば、フェニルアセチル、フェニルプロピオニルが挙げられる。
【０１３６】
本明細書中、「５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基」としては、例えば、ニコチノイル、イソニコチノイル、テノイル、フロイルが挙げられる。
【０１３７】
本明細書中、「３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基」としては、例えば、モルホリニルカルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピロリジニルカルボニルが挙げられる。
【０１３８】
本明細書中、「モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基」としては、例えば、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルカルバモイルが挙げられる。
【０１３９】
本明細書中、「モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基」としては、例えば、ベンジルカルバモイル、フェネチルカルバモイルが挙げられる。
【０１４０】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキルスルホニル基」としては、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、ｓｅｃ−ブチルスルホニル、ｔｅｒｔ−ブチルスルホニルが挙げられる。
【０１４１】
本明細書中、「ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルホニル基」としては、例えば、１ないし７個、好ましくは１ないし５個のハロゲン原子を有していてもよいＣ１−６アルキルスルホニル基が挙げられる。具体例としては、メチルスルホニル、ジフルオロメチルスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、イソプロピルスルホニル、ブチルスルホニル、４，４，４−トリフルオロブチルスルホニル、ペンチルスルホニル、ヘキシルスルホニルが挙げられる。
【０１４２】
本明細書中、「Ｃ６−１４アリールスルホニル基」としては、例えば、フェニルスルホニル、１−ナフチルスルホニル、２−ナフチルスルホニルが挙げられる。
【０１４３】
本明細書中、「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよい複素環基、アシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいカルバモイル基、置換されていてもよいチオカルバモイル基、置換されていてもよいスルファモイル基、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいスルファニル（ＳＨ）基、置換されていてもよいシリル基が挙げられる。
【０１４４】
本明細書中、「炭化水素基」（「置換されていてもよい炭化水素基」における「炭化水素基」を含む）としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基が挙げられる。
【０１４５】
本明細書中、「置換されていてもよい炭化水素基」としては、例えば、下記の置換基群Ａから選ばれる置換基を有していてもよい炭化水素基が挙げられる。
［置換基群Ａ］
（１）ハロゲン原子、
（２）ニトロ基、
（３）シアノ基、
（４）オキソ基、
（５）ヒドロキシ基、
（６）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、
（７）Ｃ６−１４アリールオキシ基（例、フェノキシ、ナフトキシ）、
（８）Ｃ７−１６アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、
（９）５ないし１４員芳香族複素環オキシ基（例、ピリジルオキシ）、
（１０）３ないし１４員非芳香族複素環オキシ基（例、モルホリニルオキシ、ピペリジニルオキシ）、
（１１）Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ基（例、アセトキシ、プロパノイルオキシ）、
（１２）Ｃ６−１４アリール−カルボニルオキシ基（例、ベンゾイルオキシ、１−ナフトイルオキシ、２−ナフトイルオキシ）、
（１３）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルオキシ基（例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシ）、
（１４）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ基（例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシ、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシ）、
（１５）Ｃ６−１４アリール−カルバモイルオキシ基（例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシ）、
（１６）５ないし１４員芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、ニコチノイルオキシ）、
（１７）３ないし１４員非芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、モルホリニルカルボニルオキシ、ピペリジニルカルボニルオキシ）、
（１８）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルホニルオキシ基（例、メチルスルホニルオキシ、トリフルオロメチルスルホニルオキシ）、
（１９）Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１４アリールスルホニルオキシ基（例、フェニルスルホニルオキシ、トルエンスルホニルオキシ）、
（２０）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ基、
（２１）５ないし１４員芳香族複素環基、
（２２）３ないし１４員非芳香族複素環基、
（２３）ホルミル基、
（２４）カルボキシ基、
（２５）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基、
（２６）Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、
（２７）５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、
（２８）３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、
（２９）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、
（３０）Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基（例、フェニルオキシカルボニル、１−ナフチルオキシカルボニル、２−ナフチルオキシカルボニル）、
（３１）Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、
（３２）カルバモイル基、
（３３）チオカルバモイル基、
（３４）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、
（３５）Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、
（３６）５ないし１４員芳香族複素環カルバモイル基（例、ピリジルカルバモイル、チエニルカルバモイル）、
（３７）３ないし１４員非芳香族複素環カルバモイル基（例、モルホリニルカルバモイル、ピペリジニルカルバモイル）、
（３８）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルホニル基、
（３９）Ｃ６−１４アリールスルホニル基、
（４０）５ないし１４員芳香族複素環スルホニル基（例、ピリジルスルホニル、チエニルスルホニル）、
（４１）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル基、
（４２）Ｃ６−１４アリールスルフィニル基（例、フェニルスルフィニル、１−ナフチルスルフィニル、２−ナフチルスルフィニル）、
（４３）５ないし１４員芳香族複素環スルフィニル基（例、ピリジルスルフィニル、チエニルスルフィニル）、
（４４）アミノ基、
（４５）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基（例、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）、
（４６）モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリールアミノ基（例、フェニルアミノ）、
（４７）５ないし１４員芳香族複素環アミノ基（例、ピリジルアミノ）、
（４８）Ｃ７−１６アラルキルアミノ基（例、ベンジルアミノ）、
（４９）ホルミルアミノ基、
（５０）Ｃ１−６アルキル−カルボニルアミノ基（例、アセチルアミノ、プロパノイルアミノ、ブタノイルアミノ）、
（５１）（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル−カルボニル）アミノ基（例、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ）、
（５２）Ｃ６−１４アリール−カルボニルアミノ基（例、フェニルカルボニルアミノ、ナフチルカルボニルアミノ）、
（５３）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ基（例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）、
（５４）Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニルアミノ基（例、ベンジルオキシカルボニルアミノ）、
（５５）Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ基（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ）、
（５６）Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１４アリールスルホニルアミノ基（例、フェニルスルホニルアミノ、トルエンスルホニルアミノ）、
（５７）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基、
（５８）Ｃ２−６アルケニル基、
（５９）Ｃ２−６アルキニル基、
（６０）Ｃ３−１０シクロアルキル基、
（６１）Ｃ３−１０シクロアルケニル基、及び
（６２）Ｃ６−１４アリール基。
【０１４６】
「置換されていてもよい炭化水素基」における上記置換基の数は、例えば、１ないし５個、好ましくは１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【０１４７】
本明細書中、「複素環基」（「置換されていてもよい複素環基」における「複素環基」を含む）としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、(i)芳香族複素環基、(ii)非芳香族複素環基および(iii)７ないし１０員複素架橋環基が挙げられる。
【０１４８】
本明細書中、「芳香族複素環基」（「５ないし１４員芳香族複素環基」を含む）としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環基が挙げられる。
該「芳香族複素環基」の好適な例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの５ないし６員単環式芳香族複素環基；
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環基が挙げられる。
【０１４９】
本明細書中、「非芳香族複素環基」（「３ないし１４員非芳香族複素環基」を含む）としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する３ないし１４員（好ましくは４ないし１０員）の非芳香族複素環基が挙げられる。
該「非芳香族複素環基」の好適な例としては、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロイソチアゾリル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロピリダジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、アゼパニル、ジアゼパニル、アゼピニル、オキセパニル、アゾカニル、ジアゾカニルなどの３ないし８員単環式非芳香族複素環基；
ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソチアゾリル、ジヒドロナフト［２，３−ｂ］チエニル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル、４Ｈ−キノリジニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジニル、テトラヒドロベンゾアゼピニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロフェナントリジニル、ヘキサヒドロフェノチアジニル、ヘキサヒドロフェノキサジニル、テトラヒドロフタラジニル、テトラヒドロナフチリジニル、テトラヒドロキナゾリニル、テトラヒドロシンノリニル、テトラヒドロカルバゾリル、テトラヒドロ−β−カルボリニル、テトラヒドロアクリジニル、テトラヒドロフェナジニル、テトラヒドロチオキサンテニル、オクタヒドロイソキノリルなどの９ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）非芳香族複素環基が挙げられる。
【０１５０】
本明細書中、「７ないし１０員複素架橋環基」の好適な例としては、キヌクリジニル、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタニルが挙げられる。
【０１５１】
本明細書中、「含窒素複素環基」としては、「複素環基」のうち、環構成原子として少なくとも１個以上の窒素原子を含有するものが挙げられる。
【０１５２】
本明細書中、「置換されていてもよい複素環基」としては、例えば、前記した置換基群Ａから選ばれる置換基を有していてもよい複素環基が挙げられる。
【０１５３】
「置換されていてもよい複素環基」における置換基の数は、例えば、１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【０１５４】
本明細書中、「アシル基」としては、例えば、「ハロゲン原子、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、アミノ基およびカルバモイル基から選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、５ないし１４員芳香族複素環基および３ないし１４員非芳香族複素環基から選ばれる１または２個の置換基」をそれぞれ有していてもよい、ホルミル基、カルボキシ基、カルバモイル基、チオカルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、スルファモイル基、ホスホノ基が挙げられる。
【０１５５】
また、「アシル基」としては、炭化水素−スルホニル基、複素環−スルホニル基、炭化水素−スルフィニル基、複素環−スルフィニル基も挙げられる。
ここで、炭化水素−スルホニル基とは、炭化水素基が結合したスルホニル基を、複素環−スルホニル基とは、複素環基が結合したスルホニル基を、炭化水素−スルフィニル基とは、炭化水素基が結合したスルフィニル基を、複素環−スルフィニル基とは、複素環基が結合したスルフィニル基を、それぞれ意味する。
「アシル基」の好適な例としては、ホルミル基、カルボキシ基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ２−６アルケニル−カルボニル基（例、クロトノイル）、Ｃ３−１０シクロアルキル−カルボニル基（例、シクロブタンカルボニル、シクロペンタンカルボニル、シクロヘキサンカルボニル、シクロヘプタンカルボニル）、Ｃ３−１０シクロアルケニル−カルボニル基（例、２−シクロヘキセンカルボニル）、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基（例、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−カルバモイル基（例、ジアリルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−カルバモイル基（例、シクロプロピルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、５ないし１４員芳香族複素環カルバモイル基（例、ピリジルカルバモイル）、チオカルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−チオカルバモイル基（例、メチルチオカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−チオカルバモイル基（例、ジアリルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−チオカルバモイル基（例、シクロプロピルチオカルバモイル、シクロヘキシルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−チオカルバモイル基（例、フェニルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−チオカルバモイル基（例、ベンジルチオカルバモイル、フェネチルチオカルバモイル）、５ないし１４員芳香族複素環チオカルバモイル基（例、ピリジルチオカルバモイル）、スルフィノ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基（例、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル）、スルホ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基、ホスホノ基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルホスホノ基（例、ジメチルホスホノ、ジエチルホスホノ、ジイソプロピルホスホノ、ジブチルホスホノ）が挙げられる。
【０１５６】
本明細書中、「置換されていてもよいアミノ基」としては、例えば、置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基およびＣ６−１４アリールスルホニル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいアミノ基が挙げられる。
【０１５７】
置換されていてもよいアミノ基の好適な例としては、アミノ基、モノ−またはジ−（ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル）アミノ基（例、メチルアミノ、トリフルオロメチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、ジブチルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニルアミノ基（例、ジアリルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキルアミノ基（例、シクロプロピルアミノ、シクロヘキシルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリールアミノ基（例、フェニルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキルアミノ基（例、ベンジルアミノ、ジベンジルアミノ）、モノ−またはジ−（ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル）−カルボニルアミノ基（例、アセチルアミノ、プロピオニルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニルアミノ基（例、ベンゾイルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルボニルアミノ基（例、ベンジルカルボニルアミノ）、モノ−またはジ−５ないし１４員芳香族複素環カルボニルアミノ基（例、ニコチノイルアミノ、イソニコチノイルアミノ）、モノ−またはジ−３ないし１４員非芳香族複素環カルボニルアミノ基（例、ピペリジニルカルボニルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ基（例、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）、５ないし１４員芳香族複素環アミノ基（例、ピリジルアミノ）、カルバモイルアミノ基、（モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル）アミノ基（例、メチルカルバモイルアミノ）、（モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル）アミノ基（例、ベンジルカルバモイルアミノ）、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ基（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ）、Ｃ６−１４アリールスルホニルアミノ基（例、フェニルスルホニルアミノ）、（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル−カルボニル）アミノ基（例、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ）、（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ６−１４アリール−カルボニル）アミノ基（例、Ｎ−ベンゾイル−Ｎ−メチルアミノ）が挙げられる。
【０１５８】
本明細書中、「置換されていてもよいカルバモイル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基およびモノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいカルバモイル基が挙げられる。
【０１５９】
置換されていてもよいカルバモイル基の好適な例としては、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−カルバモイル基（例、ジアリルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−カルバモイル基（例、シクロプロピルカルバモイル、シクロヘキシルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル−カルバモイル基（例、アセチルカルバモイル、プロピオニルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニル−カルバモイル基（例、ベンゾイルカルバモイル）、５ないし１４員芳香族複素環カルバモイル基（例、ピリジルカルバモイル）が挙げられる。
【０１６０】
本明細書中、「置換されていてもよいチオカルバモイル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基およびモノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいチオカルバモイル基が挙げられる。
【０１６１】
置換されていてもよいチオカルバモイル基の好適な例としては、チオカルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−チオカルバモイル基（例、メチルチオカルバモイル、エチルチオカルバモイル、ジメチルチオカルバモイル、ジエチルチオカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−チオカルバモイル基（例、ジアリルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−チオカルバモイル基（例、シクロプロピルチオカルバモイル、シクロヘキシルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−チオカルバモイル基（例、フェニルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−チオカルバモイル基（例、ベンジルチオカルバモイル、フェネチルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル−チオカルバモイル基（例、アセチルチオカルバモイル、プロピオニルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニル−チオカルバモイル基（例、ベンゾイルチオカルバモイル）、５ないし１４員芳香族複素環チオカルバモイル基（例、ピリジルチオカルバモイル）が挙げられる。
【０１６２】
本明細書中、「置換されていてもよいスルファモイル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基およびモノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいスルファモイル基が挙げられる。
【０１６３】
置換されていてもよいスルファモイル基の好適な例としては、スルファモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−スルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−スルファモイル基（例、ジアリルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−スルファモイル基（例、シクロプロピルスルファモイル、シクロヘキシルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−スルファモイル基（例、フェニルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−スルファモイル基（例、ベンジルスルファモイル、フェネチルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル−スルファモイル基（例、アセチルスルファモイル、プロピオニルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニル−スルファモイル基（例、ベンゾイルスルファモイル）、５ないし１４員芳香族複素環スルファモイル基（例、ピリジルスルファモイル）が挙げられる。
【０１６４】
本明細書中、「置換されていてもよいヒドロキシ基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基およびＣ６−１４アリールスルホニル基から選ばれる置換基」を有していてもよいヒドロキシ基が挙げられる。
【０１６５】
置換されていてもよいヒドロキシ基の好適な例としては、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基（例、アリルオキシ、２−ブテニルオキシ、２−ペンテニルオキシ、３−ヘキセニルオキシ）、Ｃ３−１０シクロアルキルオキシ基（例、シクロヘキシルオキシ）、Ｃ６−１４アリールオキシ基（例、フェノキシ、ナフチルオキシ）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ）、Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ基（例、アセチルオキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルオキシ基（例、ベンゾイルオキシ）、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニルオキシ基（例、ベンジルカルボニルオキシ）、５ないし１４員芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、ニコチノイルオキシ）、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、ピペリジニルカルボニルオキシ）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルオキシ基（例、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）、５ないし１４員芳香族複素環オキシ基（例、ピリジルオキシ）、カルバモイルオキシ基、Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ基（例、メチルカルバモイルオキシ）、Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイルオキシ基（例、ベンジルカルバモイルオキシ）、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ基（例、メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ）、Ｃ６−１４アリールスルホニルオキシ基（例、フェニルスルホニルオキシ）が挙げられる。
【０１６６】
本明細書中、「置換されていてもよいスルファニル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基および５ないし１４員芳香族複素環基から選ばれる置換基」を有していてもよいスルファニル基、ハロゲン化されたスルファニル基が挙げられる。
【０１６７】
置換されていてもよいスルファニル基の好適な例としては、スルファニル（−ＳＨ）基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ２−６アルケニルチオ基（例、アリルチオ、２−ブテニルチオ、２−ペンテニルチオ、３−ヘキセニルチオ）、Ｃ３−１０シクロアルキルチオ基（例、シクロヘキシルチオ）、Ｃ６−１４アリールチオ基（例、フェニルチオ、ナフチルチオ）、Ｃ７−１６アラルキルチオ基（例、ベンジルチオ、フェネチルチオ）、Ｃ１−６アルキル−カルボニルチオ基（例、アセチルチオ、プロピオニルチオ、ブチリルチオ、イソブチリルチオ、ピバロイルチオ）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルチオ基（例、ベンゾイルチオ）、５ないし１４員芳香族複素環チオ基（例、ピリジルチオ）、ハロゲン化チオ基（例、ペンタフルオロチオ）が挙げられる。
【０１６８】
本明細書中、「置換されていてもよいシリル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基およびＣ７−１６アラルキル基から選ばれる１ないし３個の置換基」を有していてもよいシリル基が挙げられる。
【０１６９】
置換されていてもよいシリル基の好適な例としては、トリ−Ｃ１−６アルキルシリル基（例、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチル（ジメチル）シリル）が挙げられる。
【０１７０】
より具体的には、本発明において利用可能なＦＧＦＲ１阻害剤としては、ＰＤ−１６６８６６（１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア：ＣＡＳ  Ｎｏ．：１９２７０５−７９−６）（本明細書中、当該化合物を「ＣＡＳ１９２７０５−７９−６」と記載する場合がある）、Ｅ−３８１０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０５８１３７−２３−７）、ＰＤ−１７３０７４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１９５８０−１１−７）、ＦＧＦＲ４−ＩＮ−１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１７０８９７１−７２−５）、ＦＧＦＲ−ＩＮ−１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１４４８１６９−７１−８）、ＦＩＩＮ−２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１６３３０４４−５６−０）、ＡＺＤ４５４７（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０３５２７０−３９−３）、ＦＩＩＮ−３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１６３７７３５−８４−２）、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３１０７４６−１０−１）、ＮＶＰ−ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８７２５１１−３４−７）、ＣＨ５１８３２８４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２６５２２９−２５−１）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２３４３５６−６９−４）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ  Ｒａｃｅｍａｔｅ、Ｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１１３５−２４−６）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８４８３１８−２５−２）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ  ｆｒｅｅ  ａｃｉｄ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８４８４６３−１３−８）、Ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３４６２４２−８１−６）、ＢＬＵ９９３１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１５３８６０４−６８−０）、ＰＲＮ１３７１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１８０２９２９−４３−６）、Ｓ４９０７６（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２６５９６５−２２−７）、ＬＹ２８７４４５５（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２５４４７３−６４−７）、Ｌｉｎｓｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７１６０−７１−２）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４０５１６９−１６−６）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０５８１５６−９０−３）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６４９７３５−４６−６）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２３４３５６−６９−４）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ  Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３６０４６０−８２−７）、ＡＣＴＢ−１００３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９３９８０５−３０−８）、ＢＬＵ−５５４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１７０７２８９−２１−１）、Ｒｏｇａｒａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１４４３５３０−０５−９）、ＢＩＢＦ  １１２０  ｅｓｙｌａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６５６２４７−１８−６）、ＴＧ  １００５７２  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７３３１−６４−４）、ＥＮＭＤ−２０７６（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９３４３５３−７６−１）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ  ａｌａｎｉｎａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６４９７３５−６３−７）、ＴＧ  １００５７２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７３３４−０５−２）、ＢＩＢＦ  １１２０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６５６２４７−１７−５）、ＥＮＭＤ−２０７６  Ｔａｒｔｒａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２９１０７４−８７−７）、ＴＳＵ−６８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２５２９１６−２９−��）、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：９４３３１９−７０−８）、Ｓｕｌｆａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１３０８６７２−７４−３）、ＬＹ２７８４５４４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２２９２３６−８６−５）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ  ｌａｃｔａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６９２７３７−８０−７）、ＳＵ  ５４０２（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１５５４３−９２−３）、ＦＧＦ−４０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１７０８９７１−５５−４）、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ−ＩＮ−１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：７０５９４６−２７−６）、ＰＰ５８（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１２３９１−５８−７）、ＴＧ  １００８０１  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０１８０６９−８１−２）、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６７０２２０−８８−９）、ＴＧ  １００８０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８６７３３１−８２−６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：６３５７０２−６４−６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４４４７３１−５２−６）、ＰＤ１６８３９３（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１９４４２３−１５−９）、Ａｐａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１２１８７７９−７５−９）、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ  ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８２７０２２−３３−３）、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：８４９２１７−６４−７）、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：４１７７１６−９２−８）、Ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ  Ｎｏ．：３８７８６７−１３−２）、等又はその塩（これらの化合物を、化合物群Ｄとする）が例示される。また、これらの化合物は、ＦＧＦＲ１阻害活性を有する限り、好ましくはＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１００ｎＭ以下である限り、上記より選択される一又は複数の置換基を有していてもよい。
また、これらの化合物は、ＦＧＦＲ１阻害活性を有する限り、好ましくはＦＧＦＲ１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１００ｎＭ以下である限り、一部の部分構造（置換基、環等）が変換されていてもよい。
【０１７１】
好ましくは、本発明においてＦＧＦＲ１阻害剤は、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６（１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア：ＣＡＳ  Ｎｏ．：１９２７０５−７９−６）、Ｅ−３８１０（ＣＡＳ  Ｎｏ．：１０５８１３７−２３−７）、ＰＤ１７３０７４（ＣＡＳ  Ｎｏ．：２１９５８０−１１−７）である。
なお、以下試験によりＣＡＳ１９２７０５−７９−６はＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４について阻害活性を有することが分かっている。リコンビナントタンパク質として調製したＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４に結合する蛍光プローブを、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６の存在下又は非存在下で作用させ、蛍光シグナルをプレートリーダーで検出した。ＣＡＳ１９２７０５−７９−６の存在下又は非存在下における蛍光シグナルの変動から、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６の各タンパク質に対する阻害活性（ｐＩＣ５０）を算出した。
【０１７２】
ＦＧＦＲ１阻害剤は上記に示した化合物に限定されるものではなく、ＦＧＦＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＦＧＦＲ１に結合する抗体、ドミナントネガティブＦＧＦＲ１変異体等もＦＧＦＲ１阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【０１７３】
ＦＧＦＲ１阻害剤としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ〜１００μＭ、好ましくは０．０１μＭ〜１０μＭである。
【０１７４】
ＦＧＦＲ１阻害剤による、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の処理は、当該細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤と共存させることにより行うことができる。例えば、ＦＧＦＲ１阻害剤を添加した培地で当該細胞集団を培養することにより行うことができる。ＦＧＦＲ１阻害剤は培地に、ＦＧＦＲ１活性を阻害することが可能な任意の量にて含めることができ、例えば、１０μＭ以下、又は５μＭ以下の量にて、好ましくは５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満の量にて含めることができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の添加量の下限は、特に限定されないが、０．１μＭ以上、好ましくは０．５μＭ以上とすることができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の添加量は、好ましくは、５μＭ未満０．１μＭ以上であり、より好ましくは５μＭ未満０．５μＭ以上である。ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養は、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、２日以上、４日以上、８日以上、１０日以上、又は１５日以上行うことができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養は、４日以上行うことが好ましい。ＦＧＦＲ１阻害剤による処理期間中も培地の交換は可能であり、培養スケジュールにしたがって、ＦＧＦＲ１阻害剤が添加された交換前と同じ組成を有する培地又は異なる組成を有する培地と交換することができる。
本発明において、ＦＧＦＲ１阻害剤により処理される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるＫｉ６７陽性細胞の割合は特に限定されないが、１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上であってもよい。
本発明において、ＦＧＦＲ１阻害剤により処理される細胞（スターティングマテリアルの細胞）におけるアルカリフォスファターゼ陽性細胞の割合は特に限定されないが、１０％以下、５％以下、１％以下、０．５％以下であってもよい。
【０１７５】
内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理すると共に、目的の細胞集団（例えば、インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団）へとさらに分化させる工程に付すことができる。ここで「ＦＧＦＲ１阻害剤で処理すると共に」とは、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程と分化させる工程とを同時に行う場合、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理した後に分化させる工程に付す場合、ならびに、分化させる工程に付した後にＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程に付す場合も含む。したがって、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理するのに用いる培地と細胞集団を分化させるのに用いる培地とは別々のものであってもよいし、分化させる工程に用いる培地にＦＧＦＲ１阻害剤がさらに添加されてもよい。
【０１７６】
一態様において、ＦＧＦＲ１阻害剤は内分泌前駆細胞をインスリン産生細胞へと分化させる工程に用いられる培地中に含めることができ、より好ましくは、内分泌前駆細胞集団を分化誘導して得られた前期インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団のさらなる分化工程（例えば、上記工程６の最後の約４〜１５日、好ましくは最後の約４〜７日間）に用いられる培地中に含めることができる。内分泌前駆細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤を処理した場合には、目的細胞数が大幅に減少する場合があるが、前期インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理した場合は、そのような目的細胞数の大幅減少を回避することができる。すなわち、前期インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理した場合、内分泌前駆細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理した場合と比べて、得られるインスリン産生細胞の数を増大することができる。
【０１７７】
内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理することにより、当該細胞集団においてＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制することができる。
本手法は、テラトーマの増殖を抑制するのでなく、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少または抑制することができる。
本手法は、ｉＰＳ細胞の増殖を抑制するのでなく（例えば、アルカリフォスファターゼ陽性細胞の数を減少させなくてもよい）、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少または抑制することができる。
【０１７８】
本手法によれば、ＦＧＦＲ１阻害剤を用いた処理により、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中におけるＫｉ６７陽性細胞の絶対数を低減することが可能である。これにより、得られた細胞集団中におけるＫｉ６７陽性細胞を枯渇させることができる。
【０１７９】
すなわち、得られた細胞集団中におけるＫｉ６７陽性細胞の割合を、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理せずに培養及び／又は分化させた場合と比べて低減することが可能であり、その割合は１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満とすることができ、好ましくは３％未満、２％未満、又は１％未満とすることができる。
【０１８０】
また、本手法によれば、ＦＧＦＲ１阻害剤を用いて処理した内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、インスリン産生細胞又は膵β細胞へと分化させることによって、Ｋｉ６７陽性細胞の増殖が抑制され、インスリン産生細胞又は膵β細胞が富化された細胞集団を得ることができる。すなわち、分化誘導後に得られた細胞集団におけるインスリン産生細胞又は膵β細胞の割合を、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理することなく得られた場合と比べて増大させることが可能であり、その割合は４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上とすることができる。
【０１８１】
本手法により得られたインスリン産生細胞又は膵β細胞は、動物生体内に移植して、動物生体内で分化させた場合にはそのまま留置して、インスリン分泌細胞として利用することが可能である。本手法により得られたインスリン産生細胞又は膵β細胞によれば、Ｋｉ６７陽性細胞の増殖を回避して、安全、かつ移植細胞の長期の生着を達成し得る。
【０１８２】
本発明により、高い増殖性を有するＫｉ６７陽性細胞を除去したインスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団（本発明の細胞集団）は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、糖尿病、特にI型糖尿病を治療するための細胞医薬として有用である。
【０１８３】
また、本発明の細胞集団は、プロドラッグであってもよい。プロドラッグとは、生体内に移植した後に分化し、疾患を治療する機能を有する細胞に変化する細胞集団をいう。
【０１８４】
本発明の細胞集団は、毒性（例、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、癌原性）が低く、そのまま、または薬理学的に許容される担体等と混合して医薬組成物とすることにより、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）に対して、安全に投与することができる。
【０１８５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１８６】
多能性幹細胞から内分泌前駆細胞集団への分化誘導は、上記工程１）−５）、既報（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５−１９７）等に従い実施した。【０１８７】
実施例１：内分泌前駆細胞集団をＦＧＦ受容体１阻害剤で処理して得られた細胞集団における目的外細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）の減少
１．方法
（１）インスリン産生細胞集団の作製
内分泌前駆細胞集団からインスリン産生細胞集団への分化誘導は、上記工程６）や既報（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；３２：１１２１−１１３３）に従い実施した。
ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＣＡＳ１９２７０５−７９−６）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で１２日間培養して、インスリン産生細胞集団を得た。得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞数をフローサイトメトリーにより評価した。【０１８８】
（２）ＦＧＦ受容体１阻害剤処理細胞の生体内移植
以下マウスの準備や細胞の移植は公知の方法に準じて行った。
ストレプトゾトシンによりインスリン欠乏性の糖尿病を誘発させた免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを用いて、上記（１）で得られたＣＡＳ１９２７０５−７９−６を含む分化誘導培地、または比較例として含まない分化誘導培地で培養して得られたインスリン産生細胞集団を腎被膜下に移植した。移植後の経過観察は血中ヒトＣ−ペプチド濃度と血糖値を測定した。移植５週後の時点で移植片を摘出した。【０１８９】
（３）移植片中の目的外細胞の評価
摘出した移植片を固定、脱水後に凍結切片を作製し、目的外細胞について評価するために免疫組織染色を実施した。生体内において膵島細胞への成熟が期待できる目的細胞はインスリン陽性（かつＮＫＸ６．１陽性）又はグルカゴン陽性を、目的細胞の長期生着に悪影響を及ぼす可能性がある目的外細胞はＫｉ６７陽性を指標として評価した。【０１９０】
２．結果
（１）インスリン産生細胞集団の作製
ＣＡＳ１９２７０５−７９−６（１μＭ）を含む分化誘導培地で１２日間処理する実験を５回行い、得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞率±標準偏差の結果を表１に示す。内分泌前駆細胞集団をＣＡＳ１９２７０５−７９−６で１２日間処理した場合、得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞率は、対照と比べて顕著に少なかった。この結果は、内分泌前駆細胞集団をＣＡＳ１９２７０５−７９−６で処理することにより、Ｋｉ６７陽性細胞を減少させる、又はその増殖が抑制されることを示す。【０１９１】
【表１】
2019208505.tif 000004
【０１９２】
（２）ＦＧＦ受容体１阻害剤処理細胞の生体内移植
移植後の経過観察として測定した血中ヒトＣ−ペプチド濃度と血糖値の結果を表２に示す。ＣＡＳ１９２７０５−７９−６（１μＭ）を含む分化誘導培地で１２日間処理して得られたインスリン産生細胞集団は、移植４ヵ月後において血液中にヒトＣ−ペプチドを分泌し、高血糖改善作用を示し、それらのレベルはＣＡＳ１９２７０５−７９−６で処理せず得られたインスリン産生細胞集団を移植した場合と同等であった。【０１９３】
【表２】
2019208505.tif 000005
【０１９４】
（３）移植片中の目的外細胞の評価
移植後５週間で摘出した移植片の免疫組織染色の結果を図１に示す。
ＣＡＳ１９２７０５−７９−６（１μＭ）を含む分化誘導培地で１２日間処理して得られたインスリン産生細胞集団を腎被膜下に移植した場合、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６で処理せず得られたインスリン産生細胞集団を腎被膜下に移植した場合に比較して、移植片の肥大化の大幅な抑制が認められた。この結果は、内分泌前駆細胞集団をＣＡＳ１９２７０５−７９−６で処理することにより、目的外細胞であるＫｉ６７陽性細胞を減少させる、又はその増殖が抑制されることを示す。【０１９５】
実施例２：インスリン産生細胞集団をＦＧＦ受容体１阻害剤で処理して得られた細胞集団における目的外細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）の減少と目的細胞の維持（インスリン陽性（かつＮＫＸ６．１陽性）細胞）
１．方法
１）  ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＣＡＳ１９２７０５−７９−６）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で１１日間培養して、インスリン産生細胞集団を得た。
２）ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で４日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。次いで、分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）にＦＧＦ受容体１阻害剤（ＣＡＳ１９２７０５−７９−６、１μＭ）を添加して７日間培養した。
３）ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で７日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。次いで、分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）にＦＧＦ受容体１阻害剤（ＣＡＳ１９２７０５−７９−６、１μＭ）を添加して４日間培養した。
４）ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）を含み、かつＣＡＳ１９２７０５−７９−６を含まない分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で１１日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。【０１９６】
上記１）、２）、及び３）の各方法で得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞数をフローサイトメトリーにより計数し、各細胞集団中におけるＫｉ６７陽性細胞率を求めた。
また、上記１）、２）、及び３）の各方法で得られた細胞集団中のインスリン陽性（かつＮＫＸ６．１陽性）細胞数をフローサイトメトリーにより計数し、各方法におけるインスリン陽性（かつＮＫＸ６．１陽性）細胞率を、上記４）の方法で得られた対照細胞集団中におけるインスリン陽性（かつＮＫＸ６．１陽性）細胞数を１００％とする相対値にて算出した。【０１９７】
２．結果
各方法を用いてそれぞれ３回繰り返し、インスリン産生細胞製造工程においてＣＡＳ１９２７０５−７９−６で処理するタイミングの影響を評価した。各方法で得られたＫｉ６７陽性細胞率及びインスリン陽性（かつＮＫＸ６．１陽性）細胞率の平均値±標準偏差の結果を表３に示す。
得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞率はＣＡＳ１９２７０５−７９−６を用いて、分化誘導工程の開始時点から処理した場合、最後の７日間処理した場合、最後の４日間処理した場合の間で有意な差異は認められず、いずれの場合においても、対照と比べて顕著に少なかった。この結果は、インスリン産生細胞または膵β細胞製造過程でＣＡＳ１９２７０５−７９−６処理を行うことによって、細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞を減少させる、又はその増殖を抑制できることを示す。
一方、インスリン陽性（かつＮＫＸ６．１陽性）細胞率については、分化誘導工程の開始時点から処理した場合と、最後の７日間又は４日間処理した場合とで、顕著な差異が認められた。すなわち、分化誘導工程の開始時点で（内分泌前駆細胞集団を）ＣＡＳ１９２７０５−７９−６処理した場合には、目的細胞であるインスリン陽性（ＮＫＸ６．１陽性）細胞数の顕著な減少が認められるが、分化誘導開始から４日後、又は７日後の分化がある程度進んだ段階で（前期インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を）ＣＡＳ１９２７０５−７９−６処理した場合には、目的細胞であるインスリン陽性（ＮＫＸ６．１陽性）細胞数はほとんど減少しないことが確認された。【０１９８】
【表３】
2019208505.tif 000006
【０１９９】
実施例３：ＣＡＳ１９２７０５−７９−６以外のＦＧＦＲ１阻害剤で処理して得られた細胞集団における目的外細胞（Ｋｉ６７陽性細胞）の減少
１．方法
ｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を、分化因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）を含む分化誘導培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ／１％Ｂ２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で８日間培養し、次いで、分化因子（Ｔ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ４、ヘパリン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｒ４２８）を含む分化誘導培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ３／ＦＡＦ−ＢＳＡ／ＩＴＳ−Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６、Ｅ−３８１０、又はＰＤ１７３０７４を、それぞれ低、中、高の３つの濃度で添加した培地にて４日間培養した。得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞数をフローサイトメトリーにより評価した。【０２００】
２．結果
ＣＡＳ１９２７０５−７９−６又はＥ−３８１０で処理し、得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞率を表４に示す。また、又はＰＤ１７３０７４で処理し、得られた細胞集団中のＫｉ６７陽性細胞率を表５に示す。
この結果より、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６に限らず、他のＦＧＦＲ１阻害剤で処理して得られた細胞集団においても、Ｋｉ６７陽性細胞率は対照と比べて顕著に少なくなることが確認された。この結果は、ＣＡＳ１９２７０５−７９−６処理に限定されることなく、ＦＧＦＲ１の阻害処理によってＫｉ６７陽性細胞が減少、又はその増殖が抑制されることを示す。【０２０１】
【表４】
2019208505.tif 000007
【０２０２】
【表５】
2019208505.tif 000008
【０２０３】
以上の結果より、内分泌前駆細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理することによって、当該該細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞を減少させること又はその増殖を抑制することが可能であり、その結果、目的細胞が富化された細胞集団が得られることが明らかとなった。
【図１】
2019208505.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月27日(2020.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理する工程、
を含む方法。
【請求項２】
さらに、ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
製造された細胞集団が、Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＦＧＦＲ１阻害剤が１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア又はその塩である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＦＧＦＲ１阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程が、動物に移植することにより行われる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在するＫｉ６７陽性細胞の減少又は増殖を抑制する方法であって、
該細胞集団をＦＧＦＲ１阻害剤で処理することを含む、方法。
【請求項８】
インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団がインスリン産生細胞集団である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
インスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を５μＭ未満のＦＧＦＲ１阻害剤で処理する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＧＦＲ１阻害剤が１−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド（２，３−ｄ）ピリミジン−７−イル］−３−ｔｅｒｔ−ブチルウレア又はその塩である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｋｉ６７陽性細胞を３％未満の割合で含む、多能性幹細胞から分化誘導されたインスリン産生細胞又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
【請求項１２】
移植用に使用される、請求項１１に記載の細胞集団。
【国際調査報告】
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