(57)【要約】  本発明の課題は、簡便な工程による、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法、および間葉系幹細胞を提供すること、さらに、上記した間葉系幹細胞の製造方法を利用した、分化誘導された細胞の製造方法、分化誘導された細胞、および脂肪細胞への分化抑制剤を提供することである。本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項２】
リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンが細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞接着シグナルがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで示されるアミノ酸配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項７】
リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項８】
リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
間葉系幹細胞が、骨髄由来細胞または軟骨由来細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地が、未分化維持用の液体培地である、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、０．０１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、０．０２μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬである、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか一項に記載の方法により脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造する工程、および分化誘導培地において、前記の脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を培養する工程を含む、分化誘導された細胞の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか一項に記載の方法により製造される間葉系幹細胞。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法により製造される分化誘導された細胞。
【請求項１６】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、脂肪細胞への分化抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便な工程による、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法に関する。本発明は、分化誘導培地において、上記の脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を培養する工程を含む、分化誘導された細胞の製造方法に関する。本発明は、上記の方法により製造される間葉系幹細胞および分化誘導された細胞に関する。本発明はさらに、脂肪細胞への分化抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における脂肪細胞蓄積に伴う肥満およびメタボリック症候群の発症の基盤は、蓄積した脂肪細胞に存在するマクロファージによる炎症反応である。脂肪細胞の起源は、間葉系幹細胞であり、間葉系幹細胞から骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞および脂肪細胞などが誘導される。間葉系幹細胞の分化を抑制する方法が検討されている。【０００３】
特許文献１には、剛性が１５０〜７５０ｋＰａの範囲にあるゲルおよびマトリックスを用いて間葉系幹細胞集団を保存する方法が記載されている。特許文献２には、ＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢの受容体アクティベーター）のシステインリッチドメインの一つに類似した配列を有する環状ペプチドを有効成分として含む脂肪分化抑制剤が記載されている。特許文献３には、特定されたアミノ酸配列を有し、ヒト骨髄幹細胞の増殖・分化の抑制を誘導する活性をもつペプチドが記載されている。特許文献４には、ヒトＤｅｌｔａ１の配列より得られたポリペプチドを原核生物細胞内において最少単位で発現させ、変性剤および還元剤を用いて精製することにより得られる、幹細胞分化抑制活性を有するポリペプチドが記載されている。【０００４】
一方、再生医療における代表的な足場材料として、ゼラチンが知られている。ゼラチンは生体適合性が高く、安全性の高い材料として知られ、医療用途での応用の実績が高い。特許文献５には、遺伝子組み換えゼラチン（リコンビナントゼラチン）から構成され、所定の特性を有する多孔質体から構成される細胞支持体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１５−４３７８０号公報
【特許文献２】特開２０１４−１９８６８６号公報
【特許文献３】特開平３−２２８６８３号公報
【特許文献４】特開２００７−３２６８３４号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５３７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１においては、アクリルアミドとビスアクリルアミドを所定の範囲内の比率で混合し、ゲル化することにより所定の剛性を有するゲルを作製しているが、操作が煩雑である。特許文献２〜４には、ペプチドまたはポリペプチドを用いて脂肪への分化を抑制することが記載されているが、更に簡便な工程により、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化を抑制する手法が望まれている。【０００７】
本発明の課題は、簡便な工程による、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法、および上記方法により製造される間葉系幹細胞を提供することである。本発明の別の課題は、上記した間葉系幹細胞の製造方法を利用した、分化誘導された細胞の製造方法、および上記方法により製造される分化誘導された細胞を提供することである。本発明のさらに別の課題は、脂肪細胞への分化抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養することによって、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法。
＜２＞  リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞  リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンが細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞  細胞接着シグナルがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで示されるアミノ酸配列である、＜４＞に記載の方法。
＜６＞  リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
＜７＞  リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
＜８＞  リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞  間葉系幹細胞が、骨髄由来細胞または軟骨由来細胞である、＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。
＜１０＞  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地が、未分化維持用の液体培地である、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、０．０１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法。
＜１２＞  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、０．０２μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬである、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法。【００１０】
＜１３＞  ＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法により脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造する工程、および分化誘導培地において、上記の脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を培養する工程を含む、分化誘導された細胞の製造方法。
＜１４＞  ＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法により製造される間葉系幹細胞。
＜１５＞  ＜１３＞に記載の方法により製造される分化誘導された細胞。
＜１６＞  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、脂肪細胞への分化抑制剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明による間葉系幹細胞の製造方法によれば、簡便な工程により、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造することができる。上記した間葉系幹細胞の製造方法を利用した、分化誘導された細胞の製造方法によれば、簡便な工程により、所望の細胞を製造することができる。本発明の方法により製造される間葉系幹細胞および分化誘導された細胞は、再生医療などにおいて有用である。また、本発明による脂肪細胞への分化抑制剤によれば、簡便な工程により、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、細胞がＵＤＥ  ＢＭであり、培地がＭｅｓｅｎＰｒｏである場合について、細胞をオイルレッドで染色して脂肪細胞への分化を確認した結果を示す。
【図２】図２は、細胞がＵＤＥ  ＢＭであり、培地がＤＭＥＭである場合について、細胞をオイルレッドで染色して脂肪細胞への分化を確認した結果を示す。
【図３】図３は、細胞がＵＤＥ  ＢＭであり、培地がＰＲＩＭＥ−ＸＶである場合について、細胞をオイルレッドで染色して脂肪細胞への分化を確認した結果を示す。
【図４】図４は、細胞がＹｕｂ２５０５であり、培地がＰＲＩＭＥ−ＸＶである場合について、細胞をオイルレッドで染色して脂肪細胞への分化を確認した結果を示す。
【図５】図５は、細胞がＢＭＳＣ(Ｌｏｎｚａ：ＰＴ-２５０１)であり、 培地がＭｅｓｅｎＰｒｏである場合についてリコンビナントゼラチン添加量を変えて培養した後、 Ｌｏｎｚａ（図５の上段のＡ）あるいはＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（図５の下段のＢ）の脂肪分化誘導培地を用いて脂肪分化させた細胞を、ナイルレッドで染色して脂肪細胞への分化を確認した結果を示す。
【図６】図６は、図５の顕微鏡写真について、脂肪へ分化した細胞数をカウントした結果を示す。図６の上段のＡは、Ｌｏｎｚａの脂肪分化誘導培地を用いて脂肪分化させた場合であり、図６の下段のＢは、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌの脂肪分化誘導培地を用いて脂肪分化させた場合である。
【図７】図７は、細胞がＢＭＳＣ(Ｌｏｎｚａ：ＰＴ-２５０１)であり、 培地がＭｅｓｅｎＰｒｏである場合について、リコンビナントゼラチン添加量を変えて培養し、細胞数を計測した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法に関するものであり、特に、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む方法である。
【００１４】
本発明によれば、間葉系幹細胞が脂肪細胞に分化することを抑制することができる。
間葉系幹細胞を用いた細胞治療を行う場合、生体内において周囲の微小環境に影響を受けやすい間葉系幹細胞の意図しない方向(例えば、脂肪細胞)への組織分化を避けることが、治療効果を担保する意味で重要である。本発明の方法により得られる細胞は、例えば再生医療における骨組織修復または軟骨組織修復などに利用することができる。
【００１５】
本発明においては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する。リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養するタイミングとしては、特に限定されず、間葉系幹細胞の維持または拡大培養時、間葉系幹細胞の分化誘導培養時の何れか一方でもよいし、上記の両方でもよい。
【００１６】
好ましくは、間葉系幹細胞の維持または拡大培養時において、リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養することができる。上記の好ましい態様によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地は、未分化維持用の液体培地である。上記の好ましい態様によれば、間葉系幹細胞の維持または拡大培養時においてのみ培地中にリコンビナントゼラチンを添加するという簡便な操作(分化誘導培地へのリコンビナントゼラチンの添加は不要)により、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化を抑制することができる。
【００１７】
＜リコンビナントゼラチン＞
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。リコンビナントゼラチンとしては、ヒトコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、ＵＳ特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のゼラチンである。
【００１８】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。リコンビナントゼラチンは動物由来成分を含まないため、血清不使用(Serum free)および動物由来成分不使用(Xeno free) の条件下で間葉系幹細胞を培養することができる。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、精密に設計することが可能である。
【００１９】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００２０】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹはそれぞれ独立に、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸にはイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００２１】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１種のアミノ酸、好ましくは２種以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００２２】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを１分子中に２以上有することが好ましい。
【００２３】
具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００２４】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００２５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。ゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。ペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、少なくとも０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明におけるゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明におけるゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００２６】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００２７】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列は、式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００２８】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列は、式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００２９】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型コラーゲンである。より好ましくは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、公知の等電点を測定できる方法であれば限定されないが、例えば、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に従って、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００３１】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００３２】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する。
【００３３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００３４】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標が、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００３５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを得ることができる。
【００３６】
本発明においては、リコンビナントゼラチンを、間葉系細胞培養時の液体培地中に添加する。リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地におけるリコンビナントゼラチンの含有量は本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、一般的には０．１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬであり、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬである。本発明における液体培地中のリコンビナントゼラチンの含有量は、先行技術文献に記載されているペプチドの含有量と比較して大幅に低く（約１／１００，０００倍量）、本発明によれば、より少量の添加量であっても優れた効果（脂肪細胞への分化の抑制）を達成することができる。なお、本発明においては、リコンビナントゼラチンを培養器材にコートすることは不要である。
【００３７】
リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地におけるリコンビナントゼラチン濃度は、特に限定されないが、脂肪細胞への分化を抑性能の点から０．０１μｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．０２μｍ／ｍＬ以上がより好ましく、０．０１μｇ／ｍＬ以上が更に好ましく、１μｇ／ｍＬ以上が最も好ましい。リコンビナントゼラチン濃度は、細胞増殖率の点から、５００μｇ／ｍＬ未満が好ましく、３００μｇ／ｍＬ未満がより好ましく、５０μｇ／ｍＬ未満が更に好ましく、１０μｇ／ｍＬ未満が最も好ましい。
リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地におけるリコンビナントゼラチン濃度は、０．０１μｇ／ｍＬ以上５００μｇ／ｍＬ未満が好ましく、０．０２μｇ／ｍＬ以上３００μｇ／ｍＬ未満が好ましく、１μｇ／ｍＬ以上５０μｇ／ｍＬ未満が更に好ましく、１μｇ／以上１０μＬ未満が最も好ましい。
【００３８】
＜培地＞
液体培地の種類は、間葉系幹細胞を維持培養または拡大培養できる培地であれば、その種類は特に限定されないが、例えば、ＭｅｓｅｎＰｒｏ（２％血清含有、ライフテクノロジーズ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（２０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）（Ｇｉｂｃｏ）含有、ライフテクノロジーズ）、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）含有、ＳＩＧＭＡ）、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  ＸＳＦＭ（無血清、ＪＸエネルギー）、ＭＳＣＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）（タカラバイオ）、Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＡＣＦ(動物由来成分不含)及びＭｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＳＦ(無血清、何れもベリタス)、ＭＳＣＧＭ ＢｕｌｌｒｔＫｉｔ(血清含有、Ｌｏｎｚａ)などを挙げることができる。
【００３９】
＜間葉系幹細胞＞
本発明で使用する間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、未分化細胞としての複製能力を有し、かつ骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞および脂肪細胞などへの分化能を有する細胞である。
間葉系幹細胞の起源は特に限定されず、ヒト間葉系幹細胞でもよいし、マウス、ラット、ネコ、またはイヌ等の非ヒト動物由来の間葉系幹細胞でもよい。
【００４０】
間葉系幹細胞は，骨髄、軟骨、脂肪組織，胎盤組織、臍帯組織、 歯髄等の種々の組織から取得できることが知られており、その由来は特に限定されないが、間葉系幹細胞は好ましくは、骨髄由来細胞、軟骨由来細胞または脂肪由来細胞である。
間葉系幹細胞は、投与する患者の自家細胞でもよいし、他家細胞でもよい。
【００４１】
各組織から間葉系幹細胞を単離する方法としては、従来公知の方法を採用することが可能であり、例えば、コラゲナーゼ法によって組織から間葉系幹細胞を好適に分離することができる。 例えば、間葉系幹細胞は、細胞表面マーカー(ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ９０など)を指標として回収することができる。
【００４２】
＜培養＞
リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する際の培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ2の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは３日から４日に１回）で培地を交換することが好ましい。培養期間は特に限定されず１日〜２０日間、好ましくは３日〜１５日間、より好ましくは３日〜１０日間培養することができる。
【００４３】
培養には、プレート、ディッシュ、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系または閉鎖系のどちらでも実施することができる。
【００４４】
＜脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞＞
本発明の方法により製造される脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞とは、リコンビナントゼラチンを含有しない液体培地において培養した間葉系幹細胞と比較して、脂肪細胞への分化能が抑制されている間葉系幹細胞のことを意味する。
【００４５】
脂肪細胞への分化能は、脂肪細胞分化培地において間葉系幹細胞を培養することによって脂肪細胞への分化誘導を行った後に、脂肪細胞への分化を確認することにより、評価することができる。脂肪細胞は、例えば、細胞の形態的変化、脂肪細胞の特徴的性質、または特異的マーカーを利用して検出することができる。脂肪細胞は、細胞内に脂肪を蓄積する。従って、オイルレッドＯを用いた細胞内脂肪の染色によって脂肪細胞を検出することができる。また、（褐色）脂肪細胞の特異的マーカーとしては、ＵＣＰ１、ＥＶＯＬ３（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｒｙ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）、ＰＧＣ１Ａ（ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ１−ａｌｐｈａ）、ＰＲＤＭ１６（ＰＲＤ１−ＢＦ１−ＲＩＺ１  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １６）、ＣＩＤＥＡ（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＤＦＦＡ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ａ）等が挙げられ、これらを指標として脂肪細胞を検出することができる。なお、ＵＣＰ１は、脱共役タンパク質（Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の一種である。特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。
【００４６】
本発明によれば、本発明の製造方法により製造される間葉系幹細胞が提供される。本発明の方法により製造される間葉系幹細胞は、細胞移植のために使用することができる。具体的には、本発明の細胞は、疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。移植方法としては、切開または内視鏡などが使用可能である。
【００４７】
＜分化誘導された細胞の製造方法＞
本発明によれば、上記した本発明の方法により脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造する工程、および分化誘導培地において、上記の脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を培養する工程を含む、細胞の製造方法が提供される。上記の方法によれば、間葉系幹細胞から分化誘導することができる細胞である限り、所望の細胞を製造することができる。間葉系幹細胞から分化誘導することができる細胞としては、骨細胞、軟骨細胞、心筋細胞および脂肪細胞などを挙げることができるが特に限定されない。
【００４８】
分化誘導培地は、分化誘導すべき所望の細胞の種類に応じて適宜選択することができる。
骨細胞への分化誘導を行う場合には、Ｌｏｎｚａ：Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ等を使用することができる。
軟骨細胞への分化誘導を行う場合には、Ｌｏｎｚａ：Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ等を使用することができる。
【００４９】
心筋細胞への分化誘導を行う場合には、例えば特開２００９−１３６２０９に記載の方法等を使用することができる。
脂肪細胞への分化誘導を行う場合には、Ｌｏｎｚａ：Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ等を使用することができる。
【００５０】
分化誘導のための培養条件（培地以外の培養条件）は、リコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する際の培養条件と同様である。分化誘導のための培養期間も特に限定されないが、一般的には３日〜２１日であり、好ましくは７日〜１８日である。
【００５１】
本発明によればさらに、上記の細胞の製造方法により製造される分化誘導された細胞が提供される。上記した本発明の細胞は、細胞移植のために使用することができる。具体的には、本発明の分化誘導された細胞は、疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。移植方法としては、切開または内視鏡などが使用可能である。
【００５２】
＜脂肪細胞への分化抑制剤＞
本発明によれば、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、脂肪細胞への分化抑制剤が提供される。リコンビナントゼラチンの詳細は本明細書中に記載した通りである。リコンビナントゼラチンは、本明細書中に記載した通り、間葉系幹細胞の培養のための液体培地に溶解することによって、脂肪細胞への分化抑制剤として使用することができる。リコンビナントゼラチンを脂肪細胞への分化抑制剤として提供する場合の形態は特に限定されず、リコンビナントゼラチンを溶液または粉末として提供してもよいし、リコンビナントゼラチンを液体培地に溶解させた状態で提供してもよい。
【００５３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５４】
［参考例１］リコンビナントゼラチン
リコンビナントゼラチンとして以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：分子量：５１．６ｋＤ構造：  Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙアミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個イミノ酸含量：３３％ほぼ１００％のアミノ酸がＧｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。
ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００５５】
［実施例１］軟骨由来細胞Ｙｕｂ２５０５および骨髄由来細胞ＵＤＥ  ＢＭを用いた脂肪分化誘導実験
（１）実験１：ＣＢＥ３添加（添加量：２８ｎｇ／ｍＬ）
実験２：ＣＢＥ３無添加【００５６】
（２）材料
使用細胞：
Ｙｕｂ２５０５（国立成育医療研究センター（以降、成育研）で樹立された軟骨由来細胞）
Ｙｕｂ２５０５は参考文献（Ｎａｓｕ  Ｍ，  Ｔａｋａｙａｍａ  Ｓ，  Ｕｍｅｚａｗａ  Ａ．  Ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ：  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１５；２３０：１３７６−１３８８）に記載の方法に準じて樹立した。【００５７】
ＵＤＥ  ＢＭ（成育研で樹立された骨髄由来細胞）
ＵＤＥ  ＢＭは以下の方法で樹立した。骨から骨髄液を取り出し、密度勾配遠心分離によって細胞を集めた。回収した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含有）培地中に播種して培養した。培養容器に接着した細胞を回収した。【００５８】
使用培地：
ＭｅｓｅｎＰｒｏ（２％血清含有、ライフテクノロジーズ）：Ｙｕｂ２５０５、ＵＤＥ  ＢＭ
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）含有、ライフテクノロジーズ）：Ｙｕｂ２５０５
ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）含有、ＳＩＧＭＡ）：ＵＤＥ  ＢＭ
ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  ＸＳＦＭ（無血清、ＪＸエネルギー）：Ｙｕｂ２５０５、ＵＤＥ  ＢＭ
脂肪分化誘導培地：Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）【００５９】
０．１質量％ＣＢＥ３水溶液：ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）  （富士フイルム）【００６０】
（３）方法
以下の細胞の培養は全て、３７℃５％ＣＯ2にて行った。
直径１０ｃｍの培養皿にＭｅｓｅｎＰｒｏ培地８ｍＬを分注して各細胞を維持培養した。細胞播種量は１×１０6ｃｅｌｌ／培養皿とし、培養期間は５〜７日間とした。【００６１】
ＭｅｓｅｎＰｒｏ（８ｍＬ）で培地交換した。その際、ＣＢＥ３を２８ｎｇ／ｍＬになるよう添加した。Ｃｏｎｔｒｏｌには、ＣＢＥ３の代わりにＰＢＳ（ナカライテスク）を添加した。培養期間は７日間とした。【００６２】
各培地（ＭｅｓｅｎＰｒｏ、ＤＭＥＭ、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  ＸＳＦＭ）２ｍＬへＣＢＥ３を２８ｎｇ／ｍＬになるよう添加したものを使用し（ＣｏｎｔｒｏｌはＣＢＥ３の代わりにＰＢＳ（ナカライテスク）を添加したものを使用）、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに継代して、前培養を実施した。細胞播種量は０．２×１０6ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとし、培養期間は３日間とした。【００６３】
脂肪分化誘導培地（２ｍＬ）に培地交換して、分化誘導を開始した。その際、３，４日毎に分化誘導し、培地と維持培地を交互に交換した。分化誘導期間は２週間とした。【００６４】
維持培地（２ｍＬ）に培地交換して、維持培養を行った。維持培養期間は７日間とした。【００６５】
細胞をオイルレッドで染色し、２５画面分を顕微鏡で撮影することにより、脂肪細胞への分化を確認した。【００６６】
（４）結果
脂肪への分化を確認した結果を図１〜図４に示す。
細胞がＵＤＥ  ＢＭであり、培地がＭｅｓｅｎＰｒｏである場合（図１）、細胞がＵＤＥ  ＢＭであり、培地がＤＭＥＭである場合（図２）、細胞がＵＤＥ  ＢＭであり、培地がＰＲＩＭＥ−ＸＶである場合（図３）、細胞がＹｕｂ２５０５であり、培地がＰＲＩＭＥ−ＸＶである場合（図４）の何れの組み合わせにおいても、実験２（ＣＢＥ３無添加）に比べて実験１（ＣＢＥ３添加）は脂肪への分化が抑制されていた。【００６７】
［実施例２］ヒト骨髄由来細胞ＢＭＳＣを用いた脂肪分化誘導実験
（１）実験：ＣＢＥ３添加（添加量：０、０．０２８、２.８、２８、２８０μｇ／ｍＬ）【００６８】
（２）材料
使用細胞：
ヒト骨髄由来細胞ＢＭＳＣ(Ｌｏｎｚａ：ＰＴ-２５０１)【００６９】
使用培地：
ＭｅｓｅｎＰｒｏ（２％血清含有、ライフテクノロジーズ）
脂肪分化誘導培地：Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ：Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ【００７０】
０．１質量％ＣＢＥ３水溶液：ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）（富士フイルム）【００７１】
（３）方法
以下の細胞の培養は全て、３７℃５％ＣＯ2にて行った。
直径１０ｃｍの培養皿にＭｅｓｅｎＰｒｏ培地８ｍＬを分注してＢＭＳＣ細胞を維持培養した。細胞播種量は５×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとし、培養期間は６日間とした。【００７２】
ＭｅｓｅｎＰｒｏ培地２ｍＬへＣＢＥ３を０〜２８０μｇ／ｍＬになるよう添加したものを使用し（ＣｏｎｔｒｏｌはＣＢＥ３の代わりにＰＢＳ（ナカライテスク）を添加したものを使用）、６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ(Ｆａｌｃｏｎ  ＴＣ)に継代して、前培養を実施した。細胞播種量は１．５×１０5ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌとし、培養期間は４日間とした。【００７３】
脂肪分化誘導培地（Ｌｏｎｚａ／ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）２ｍＬに培地交換して、分化誘導を開始した。Ｌｏｎｚａ培地では３、４日毎に分化誘導し、培地と維持培地を交互に交換した。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ培地では、３、４日毎に分化誘導培地を交換した。分化誘導期間は１７日間とした。【００７４】
維持培地（２ｍＬ）に培地交換して、維持培養を行った。維持培養期間は１日間とした。【００７５】
細胞をナイルレッドで染色し、２５画面分を顕微鏡(キーエンスＢＺ-Ｘ７００)で撮影することにより、脂肪細胞への分化を確認した。３００μｍ2以下の検出オブジェクトは脂肪細胞としてカウントせず、３００μｍ2を超えたものをカウントした。【００７６】
（４）結果
脂肪への分化を確認した結果を図５、６に示す。(図５の脂肪細胞染色写真より、脂肪細胞に誘導された細胞数をカウントした結果が図６である)
細胞がＢＭＳＣであり、培地がＭｅｓｅｎＰｒｏである場合、脂肪分化誘導培地がＬｏｎｚａ，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌの何れの場合においても、ＣＢＥ３添加によって脂肪分化が抑制されていた。ＣＢＥ３添加量が２．８〜２８０μｇ／ｍＬである場合に顕著に脂肪分化抑制された。【００７７】
［実施例３］ヒト骨髄由来細胞ＢＭＳＣを用いた細胞増殖実験
（１）実験：ＣＢＥ３添加（添加量：０、０．０２８、２．８、２８μｇ／ｍＬ）【００７８】
（２）材料
使用細胞：
ヒト骨髄由来細胞ＢＭＳＣ(Ｌｏｎｚａ：ＰＴ-２５０１)
使用培地：ＭｅｓｅｎＰｒｏ（２％血清含有、ライフテクノロジーズ）
０．１質量％ＣＢＥ３水溶液：ｃｅｌｌｎｅｓｔ（登録商標）（富士フイルム）【００７９】
（３）方法
以下の細胞の培養は全て、３７℃５％ＣＯ2にて行った。
直径１０ｃｍの培養皿にＭｅｓｅｎＰｒｏ培地８ｍＬを分注して、ｐａｓｓａｇｅ５（第五継代細胞）まで維持培養した。細胞播種量は０．４〜１．０×１０6ｃｅｌｌ／培養皿とし、培養期間は各継代毎に７日間前後とした。【００８０】
ＭｅｓｅｎＰｒｏ培地２ｍＬへＣＢＥ３を０〜２８μｇ／ｍＬになるよう添加したものを使用し（ＣｏｎｔｒｏｌはＣＢＥ３の代わりにＰＢＳ（ナカライテスク）を添加したものを使用）、１０ｃｍ培養皿(住友ベークライト製)にｐａｓｓａｇｅ６（第六継代細胞）として継代した。細胞播種量は０．４×１０6ｃｅｌｌ／培養皿とし、培養期間は７日間とした。７日間経過後に細胞数をＶｉ-Ｃｅｌｌ(ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ)を用いて計測した。【００８１】
（４）結果
細胞数を計測した結果を図７に示す。各々のＣＢＥ３濃度においてＮ＝３で培養を行い、測定した結果の平均値を表す。ＣＢＥ３無添加に比べ、ＣＢＥ３の添加により７日間培養後の細胞数は増加した。細胞数の増加は２．８μｇ／ｍＬのときがピークであり、更に高濃度とすることで細胞数は、減少傾向を示した。
【図１】
2018207923.tif 000002
【図２】
2018207923.tif 000003
【図３】
2018207923.tif 000004
【図４】
2018207923.tif 000005
【図５】
2018207923.tif 000006
【図６】
2018207923.tif 000007
【図７】
2018207923.tif 000008
【配列表】
2018207923000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月10日(2018.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地において間葉系幹細胞を培養する工程を含む、脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項２】
リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンの分子量が１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
リコンビナントゼラチンが、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有し、ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、リコンビナントゼラチンが細胞接着シグナルを一分子中に２配列以上含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
細胞接着シグナルがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐで示されるアミノ酸配列である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項７】
リコンビナントゼラチンのアミノ酸配列が、下記式で示される、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）６３］３−Ｇｌｙ式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項８】
リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、細胞接着性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
間葉系幹細胞が、骨髄由来細胞または軟骨由来細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地が、未分化維持用の液体培地である、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、０．０１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンが溶解した液体培地中の濃度が、０．０２μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬである、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から１２の何れか一項に記載の方法により脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を製造する工程、および分化誘導培地において、前記の脂肪細胞への分化が抑制された間葉系幹細胞を培養する工程を含む、分化誘導された細胞の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から１２の何れか一項に記載の方法により製造される間葉系幹細胞。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法により製造される分化誘導された細胞。
【請求項１６】
ヒトコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを含む、脂肪細胞への分化抑制剤。
【国際調査報告】
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