(57)【要約】  本技術では、マイクロチップ内で目的の微小粒子を分取する技術において、微小粒子の分取性能を高めるために、吸引が行われるタイミングを最適化する。  これに対し、本技術では、微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップを用いて、前記主流路から前記分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定工程と、前記主流路上の所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における前記微小粒子の位置と前記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定工程と、を行う微小粒子の吸引条件の最適化方法などを提供する。
2018216279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップを用いて、
前記主流路から前記分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定工程と、
前記主流路上の所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における前記微小粒子の位置と前記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定工程と、
を行う微小粒子の吸引条件の最適化方法。
【請求項２】
前記距離を算出する距離算出工程を含み、
前記時間決定工程は、
前記時間ＴＸを変更して前記距離算出工程を複数回行い、前記距離が最短となる場合の時間を前記Ｔ１とする、請求項１に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
【請求項３】
前記所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から前記時間Ｔ１が経過した時点で、吸引力ＤＸにより前記微小粒子を吸引して前記微小粒子吸引流路内に前記微小粒子を分取する吸引工程と、
前記吸引力ＤＸをより小さい吸引力に変更して、前記微小粒子吸引流路内に前記微小粒子が分取されなくなるまで前記吸引工程を繰り返し、繰り返し終了時点の吸引力Ｄ１を特定する吸引力特定工程と、
前記Ｄ１から所定の割合で増加させた吸引力Ｄ２を、微小粒子の吸引に適用されるべき吸引力とする吸引力決定工程と、
を含む、請求項１に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
【請求項４】
前記分岐点特定工程は、
連続発光により、前記主流路及び前記分岐流路を通流する微小粒子の軌跡を示す蛍光画像を取得する軌跡画像取得工程と、
前記蛍光画像を複数のブロックに分割して二値化し、前記軌跡の画像を含むブロックを抽出する画像抽出工程と、
前記軌跡の画像を含むブロックから前記主流路の終端部に対応する終端ブロックを特定し、前記終端ブロックの画像の重心位置を前記分岐点とする分岐点取得工程と、
を含む、請求項１に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
【請求項５】
パルス発光により、前記時間ＴＸにおける微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程と、
前記微小粒子のストロボ画像の重心位置を前記微小粒子の位置とする位置取得工程と、
を含み、
前記距離算出工程において、前記位置取得工程により得られた前記微小粒子の位置を用いる、請求項２に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
【請求項６】
パルス発光により、前記時間Ｔ１における微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程と、
前記微小粒子のストロボ画像の重心位置を前記微小粒子の位置とする位置取得工程と、
を含み、
前記吸引力特定工程において、前記位置取得工程により得られた前記微小粒子の位置に基づいて前記微小粒子が分取されたか否かを判断する、請求項３に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
【請求項７】
前記主流路上の異なる位置に複数のビームスポットを形成する照射工程と、
任意のビームスポット間の距離と、該距離を前記微小粒子が通過する時間と、に基づいて前記微小粒子の速度を算出する速度算出工程と、
前記所定の位置からの距離と、前記速度と、に基づいて算出された時間を前記時間ＴＸとする時間算出工程と、
を含む、請求項１に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
【請求項８】
微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップと、
前記主流路から前記分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定部と、
前記主流路上の所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における前記微小粒子の位置と前記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定部と、
を備える微小粒子分取装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、微小粒子の吸引条件の最適化方法及び微小粒子分取装置に関する。より詳細には、微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路とを有するマイクロチップを用いた微小粒子の吸引条件の最適化方法及び当該マイクロチップ内で微小粒子分取を行う微小粒子分取装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
微小粒子を分取するために、これまで種々の装置が開発されてきている。例えばフローサイトメータにおいて用いられる微小粒子分取系において、フローセル又はマイクロチップに形成されたオリフィスから、細胞を含むサンプル液とシース液とから構成される層流が吐出される。吐出される際に所定の振動が当該層流に与えられて、液滴が形成される。当該形成された液滴の移動方向が、目的の微小粒子を含むか含まないかによって、電気的に制御されて、目的の微小粒子が分取されうる。【０００３】
上記のように液滴を形成せずに、マイクロチップ内で目的の微小粒子を分取する技術も開発されている。【０００４】
例えば、下記特許文献１には、「微小粒子を含むサンプル液が通流するサンプル液導入流路と、該サンプル液導入流路にその両側から合流し、前記サンプル液の周囲にシース液を導入する少なくとも１対のシース液導入流路と、前記サンプル液導入流路及びシース液導入流路に連通し、これらの流路を通流する液体が合流して通流する合流流路と、該合流流路に連通し、回収対象の微小粒子を吸引して引き込む負圧吸引部と、該負圧吸引部の両側に設けられ、前記合流流路に連通する少なくとも１対の廃棄用流路と、を有するマイクロチップ。」（請求項１）が記載されている。当該マイクロチップにおいて、目的の微小粒子は吸引によって負圧吸引部へと回収される。【０００５】
また、下記特許文献２には、「主流路を通流する液体中の微小粒子を、前記主流路に連通する分岐流路内に負圧を発生させることにより該分岐流路内に取り込む手順を含み、該手順において、前記主流路と前記分岐流路との連通口に、前記分岐流路側から前記主流路側へ向かう液体の流れを形成させておく微小粒子分取方法。」（請求項１）が記載されている。当該分取方法において、当該主流路側へ向かう液体の流れによって、非分取動作時において非目的粒子又はこれを含むサンプル液及びシース液が分取流路に進入するのを抑制する。また、下記特許文献２には、当該微小粒子分取方法を実施可能な微小粒子分取用マイクロチップも記載されている（請求項９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−１２７９２２号公報
【特許文献２】特開２０１４−３６６０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
マイクロチップ内で目的の微小粒子を分取する技術において、例えば負圧によって目的の微小粒子が上記粒子分取流路内に吸引されうる。液体が目的の微小粒子を含まない場合は、吸引は行われない。そこで、微小粒子の分取性能を高める為には、吸引が行われるタイミングが最適化される必要がある。【０００８】
本技術は、マイクロチップ内で目的の微小粒子を分取する技術において、微小粒子の分取性能を高めるために、吸引が行われるタイミングを最適化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特定の方法によって上記の課題を解決できることを見出した。
すなわち、本技術は、
微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップを用いて、
前記主流路から前記分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定工程と、
前記主流路上の所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における前記微小粒子の位置と前記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定工程と、
を行う微小粒子の吸引条件の最適化方法を提供する。
前記方法は、
前記距離を算出する距離算出工程を含み、
前記時間決定工程は、
前記時間ＴＸを変更して前記距離算出工程を複数回行い、前記距離が最短となる場合の時間を前記Ｔ１としてもよい。
前記方法は、
前記所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から前記時間Ｔ１が経過した時点で、吸引力ＤＸにより前記微小粒子を吸引して前記微小粒子吸引流路内に前記微小粒子を分取する吸引工程と、
前記吸引力ＤＸをより小さい吸引力に変更して、前記微小粒子吸引流路内に前記微小粒子が分取されなくなるまで前記吸引工程を繰り返し、繰り返し終了時点の吸引力Ｄ１を特定する吸引力特定工程と、
前記Ｄ１から所定の割合で増加させた吸引力Ｄ２を、微小粒子の吸引に適用されるべき吸引力とする吸引力決定工程と、を含んでもよい。
前記分岐点特定工程は、
連続発光により、前記主流路及び前記分岐流路を通流する微小粒子の軌跡を示す蛍光画像を取得する軌跡画像取得工程と、
前記蛍光画像を複数のブロックに分割して二値化し、前記軌跡の画像を含むブロックを抽出する画像抽出工程と、
前記軌跡の画像を含むブロックから前記主流路の終端部に対応する終端ブロックを特定し、前記終端ブロックの画像の重心位置を前記分岐点とする分岐点取得工程と、を含んでもよい。
前記方法は、
パルス発光により、前記時間ＴＸにおける微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程と、
前記微小粒子のストロボ画像の重心位置を前記微小粒子の位置とする位置取得工程と、
を含み、
前記距離算出工程において、前記位置取得工程により得られた前記微小粒子の位置を用いてもよい。
前記方法は、
パルス発光により、前記時間Ｔ１における微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程と、
前記微小粒子のストロボ画像の重心位置を前記微小粒子の位置とする位置取得工程と、
を含み、
前記吸引力特定工程において、前記位置取得工程により得られた前記微小粒子の位置に基づいて前記微小粒子が分取されたか否かを判断してもよい。
前記方法は、
前記主流路上の異なる位置に複数のビームスポットを形成する照射工程と、
任意のビームスポット間の距離と、該距離を前記微小粒子が通過する時間と、に基づいて前記微小粒子の速度を算出する速度算出工程と、
前記所定の位置からの距離と、前記速度と、に基づいて算出された時間を前記時間ＴＸとする時間算出工程と、を含んでもよい。【００１０】
また、本技術は、
微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップと、
前記主流路から前記分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定部と、
前記主流路上の所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における前記微小粒子の位置と前記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定部と、を備える微小粒子分取装置を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本技術によれば、上記マイクロチップ内で目的の微小粒子を分取する技術において、吸引が行われるタイミングが最適化される。その結果、微小粒子の分取性能が高められる。
なお、本技術により奏される効果は、ここに記載された効果に必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】微小粒子分取装置の物理構成の一例を示す図である。
【図２】マイクロチップの構成例を示す模式図である。
【図３】分取部を拡大した図である。
【図４】微小粒子分取装置の機能構成の一例を示す図である。
【図５】微小粒子分取装置が実行する処理の一例を示すフローチャートである。
【図６】微小粒子分取装置が実行する処理の一例を示すフローチャートである。
【図７】分岐点特定工程における処理の一例を示すフローチャートである。
【図８】微小粒子の軌跡を示す蛍光画像の一例を示す図である。
【図９】時間ＴＸを算出する処理の一例を示すフローチャートである。
【図１０】微小粒子の位置を特定する処理の一例を示すフローチャートである。
【図１１】微小粒子のストロボ画像の一例を示す図である。
【図１２】微小粒子分取装置が実行する処理の一例を示すフローチャートである。
【図１３】微小粒子の位置を特定する処理の一例を示すフローチャートである。
【図１４】微小粒子のストロボ画像の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。
１．微小粒子分取装置の構成
（１）物理構成
（２）機能構成
２．微小粒子分取装置の動作
（１）吸引タイミングの最適化
（２）吸引力の最適化
【００１４】
１．微小粒子分取装置の構成
（１）物理構成
図１は、微小粒子分取装置１０の物理構成の一例を示す図である。微小粒子装置１０は、光学系装置５０と制御系装置６０とを備える。光学系装置５０は、例えば、マイクロチップ１００、励起光照射部５１、蛍光検出部５４、前方散乱光検出部５５、流路観察部５６、透過照明部５７などを備えうる。制御系装置６０は、例えば、演算装置６１、記憶装置６２などを備えうる。
【００１５】
マイクロチップ１００は、微小粒子を含む液体が通流する主流路と、主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、上記主流路から分岐する分岐流路と、を有する。回収されるべき微小粒子が主流路を通流すると、当該微小粒子は微小粒子吸引流路に吸引される。その他の微小粒子は、分岐流路へと流れる。マイクロチップ１００の詳細については後述する。
【００１６】
励起光照射部５１は、マイクロチップの主流路を通流する微小粒子に励起光を照射する光源を備える。光源は、例えば、レーザーダイオードなどによって構成される。光源から照射され、ダイクロイックミラー５２や対物レンズ５３などを通過した励起光は、マイクロチップ１００の主流路上にビームスポットを形成する。
【００１７】
蛍光検出部５４は、励起光を照射された微小粒子から発生する蛍光を検出する。蛍光検出部５４は、例えば、光電子倍増管（ＰＭＴ）、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ素子などのエリア撮像素子などによって構成される。前方散乱光検出部５５は、励起光を照射された微小粒子から発生する前方散乱光を検出する。前方散乱光検出部５５は、例えば、フォトダイオードなどの光検出器などによって構成される。
【００１８】
流路観察部５６は、マイクロチップ１００上の主流路、微小粒子吸引流路及び分岐流路が交差する部分を含む一定の領域（分取部）を撮像するカメラを備える。透過照明部５７は、対物レンズの視野全体に光を照射する。
【００１９】
次に、図２を参照しながらマイクロチップ１００について説明する。図２は、マイクロチップ１００の構成例を示す模式図である。
【００２０】
マイクロチップ１００には、サンプル液インレット１０１及びシース液インレット１０３が設けられている。これらインレットからサンプル液及びシース液が、それぞれサンプル液流路１０２及びシース液流路１０４に導入される。当該サンプル液に微小粒子が含まれている。
【００２１】
シース液流路１０４を流れるシース液は、サンプル液流路１０２を流れるサンプル液と合流して、サンプル液の周囲がシース液で囲まれた層流を形成する。当該層流は、主流路１０５を、分取部１０７に向かって流れる。
【００２２】
分取部１０７において、主流路１０５を流れてきた上記層流は、主流路１０５から分岐する分岐流路１０８へと流れる。また、分取部１０７において、回収されるべき微小粒子が流れてきた場合にのみ、主流路１０５と同軸上にある微小粒子吸引流路１０９への流れが形成されて、当該微小粒子が回収される。当該微小粒子が微小粒子吸引流路１０９へと吸い込まれる際には、上記層流を構成するサンプル液及び／又はシース液も、微小粒子吸引流路１０９へと流れうる。
【００２３】
回収されるべきでない微小粒子が微小粒子吸引流路１０９へと入ることを防ぐために、ゲート流インレット１１０が備えられていてもよい。当該ゲート流インレット１１０からシース液が導入され、微小粒子吸引流路１０９から主流路１０５への方向の流れが形成されることで、回収されるべきでない微小粒子が微小粒子吸引流路１０９へと入ることが防がれる。
【００２４】
分取部１０７は、検出領域１０６を有する。検出領域１０６において、主流路１０５を流れる微小粒子に対して励起光照射部から光が照射され、照射された結果生じた散乱光及び／又は蛍光によって、微小粒子が回収されるべきであるかどうかが判定されうる。
【００２５】
分取部１０７を拡大した図を図３に示す。図３に示されるとおり、主流路１０５と微小粒子吸引流路１０９とは、主流路１０５と同軸上にあるオリフィス部２０１を介して連通されている。回収されるべき微小粒子は、オリフィス部２０１を通って、微小粒子吸引流路１０９へと流れる。また、回収されるべきでない微小粒子がオリフィス部２０１を通って微小粒子吸引流路１０９へと入ることを防ぐために、オリフィス部２０１にはゲート流インレット１１０が備えられている。当該ゲート流インレット１１０からシース液が導入され、オリフィス部２０１から主流路１０５へ向かう流れが形成されることで、回収されるべきでない微小粒子が微小粒子吸引流路１０９へと入ることが防がれる。
【００２６】
このような流路構造を有するマイクロチップにおいて、微小粒子が回収される場合に、主流路１０５からオリフィス部２０１を通って微小粒子吸引流路１０９へと進む流れ（以下、「微小粒子回収時の流れ」）が形成される。微小粒子が回収される場合以外においては、当該流れは形成されない。微小粒子が回収される場合以外においては、例えば前記ゲート流インレット１１０から導入されたシース液によってオリフィス部２０１から主流路１０５へ向かう流れが形成されうる。
【００２７】
微小粒子回収時の流れは、微小粒子吸引流路１０９を負圧にすることで形成されうる。すなわち、微小粒子吸引流路１０９を負圧にすることで、微小粒子が微小粒子吸引流路１０９内に吸引される。
【００２８】
本技術の微小粒子分取装置は、微小粒子吸引流路内に負圧を発生させるため、アクチュエータを備えうる（図示せず）。アクチュエータは、例えば、ピエゾ素子などの圧電素子とすればよい。アクチュエータは、マイクロチップの表面に接触しており、微小粒子吸引流路に対応する位置に配置される。アクチュエータは、印加される電圧の変化に伴って伸縮し、マイクロチップの表面を介して微小粒子吸引流路内に圧力の変化を生じさせる。アクチュエータは、電圧を印加されて伸長した状態においては、微小粒子吸引流路を押圧して微小粒子吸引流路内の体積を小さく維持している。印加される電圧が低下すると、アクチュエータは収縮する方向へ力を発生するため、微小粒子吸引流路への押圧が弱まり、微小粒子吸引流路内に負圧が発生する。
【００２９】
再び図１を参照して、物理構成について更に説明する。微小粒子分取装置１０は、制御系装置６０を備える。制御系装置６０は、１台又は２台以上のコンピュータにより構成される。コンピュータは、演算装置６１、記憶装置６２などのハードウェアを備える。演算装置６１は、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭなどから構成される。ＣＰＵは、記憶装置６２、ＲＯＭなどからプログラムやデータをＲＡＭ上に呼び出して処理を実行することで、微小粒子分取装置１０全体の制御や機能を実現する。ＲＯＭは不揮発性メモリであり、ＢＩＯＳ、ＯＳ設定及び各種設定等のプログラムやデータが格納されている。ＲＡＭは揮発性メモリであり、プログラムやデータを一時的に保持する。記憶装置６２は、例えばハードディスクドライブであり、演算装置６１が実行するプログラムや、プログラム実行に必要なデータが格納されている。本技術の微小粒子分取装置１０は、上記物理構成により、後述する各種処理を実現する。
【００３０】
（２）機能構成
次に、図４を参照して、微小粒子分取装置の機能構成について説明する。図４は、微小粒子分取装置１０の機能構成の一例を示す図である。微小粒子分取装置１０は、分岐点特定部１１、時間決定部１３を備える。分岐点特定部１１は、光学系装置５０、制御系装置６０などにより実現される。時間決定部１３は、制御系装置６０などにより実現される。
【００３１】
分岐点特定部１１は、軌跡画像取得部１１１、画像抽出部１１２、分岐点取得部１１３を備えてもよい。軌跡画像取得部１１１は、光学系装置５０などにより実現される。画像抽出部１１２及び分岐点取得部１１３は、制御系装置６０などにより実現される。
【００３２】
微小粒子分取装置１０は、距離算出部１２、照明部１４、速度算出部１５、時間算出部１６を備えてもよい。照明部１４は、光学系装置５０の励起光照射部５１などにより実現される。距離算出部１２、速度算出部１５及び時間算出部１６は、制御系装置６０などにより実現される。
【００３３】
微小粒子分取装置１０は、微小粒子画像取得部１７、位置取得部１８を備えてもよい。微小粒子画像取得部１７は、光学系装置５０などにより実現される。位置取得部１８は、制御系装置６０などにより実現される。
【００３４】
微小粒子分取装置１０は、吸引部１９、吸引力特定部２０、吸引力決定部２１を備えてもよい。吸引部１９は、アクチュエータ、制御系装置６０などにより実現される。吸引力特定部２０及び吸引力決定部２１は、制御系装置６０などにより実現される。
【００３５】
２．微小粒子分取装置の動作
（１）吸引タイミングの最適化
上述の通り、マイクロチップの微小粒子吸引流路を負圧にすることで、微小粒子が微小粒子吸引流路内に吸引される。微小粒子の吸引は、所定の検出領域において微小粒子が回収されるべきであると判定された場合に、所定の検出領域を粒子が通過したときから所定の時間が経過した時点において行われる。より精度の高い微小粒子分取のためには、どの程度の時間が経過した時点において吸引が行われるべきかを最適化する必要がある。
【００３６】
当該吸引が行われるべき時間の調整方法として、例えば高速度カメラなどによって、微小粒子を分取する状況の動画を撮影し、当該動画に基づき当該吸引が行われるべき時間を調整することが考えられる。しかし、この方法は、高額な高速度カメラ及び当該方法を行うためのソフトウェアを必要とするので望ましくない。そこで、どの時点で吸引が行われるべきかを決定するための新たな方法を開発する必要がある。
【００３７】
また、本技術の微小粒子分取装置に搭載されるマイクロチップは実験毎に又は分析されるべき試料毎に交換されうる。マイクロチップを交換することによって、試料間での汚染が回避されうる。しかし、マイクロチップを交換することで、検出領域において微小粒子が検出される位置及び／又は流路の長さ等において変化が生じうる。そのため、新たにマイクロチップを搭載した場合、より精度の高い微小粒子分取のためには、微小粒子の吸引が行われるべき時点を最適化する必要がある。また、このような最適化は、自動で行われることが望ましい。
【００３８】
以上のとおり、マイクロチップ内で目的の微小粒子を分取する技術において、微小粒子を吸引するタイミングを自動で最適化する新たな方法が必要である。本技術は、微小粒子の吸引タイミングを自動で最適化する新たな方法を提供する。具体的には、本技術は、微小粒子を含む液体が通流する主流路と、当該主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、上記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップを用いた微小粒子の吸引条件の最適化方法を提供する。
【００３９】
以下、微小粒子の吸引タイミングを最適化する方法を説明する。当該方法は、上述した微小粒子分取装置１０により実行される。
【００４０】
図５は、微小粒子分取装置１０が実行する処理の一例を示すフローチャートである。まず、分岐点特定部１１は、主流路から分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定工程を実行する（ステップＳ１）。次に、時間決定部１３は、主流路上の所定の位置を微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における上記微小粒子の位置と上記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定工程を実行する（ステップＳ２）。
【００４１】
主流路を通流する微小粒子と分岐点との間の距離が短くなって微小粒子が分岐点により近づいたタイミングの方が、微小粒子の吸引に適している。上述した処理を行うことで、微小粒子の吸引に適したタイミングを選択して、微小粒子の吸引を行うことができる。
【００４２】
次に、微小粒子分取装置１０が実行する処理の他の一例を、図６を参照して説明する。図６は、微小粒子分取装置１０が実行する処理の一例を示すフローチャートである。
【００４３】
まず、分岐点特定部１１は、主流路から分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定工程を実行する（ステップＳ１１）。次に、距離算出部１２は、主流路上の所定の位置を微小粒子が通過した時刻から時間ＴＸが経過した時点における上記微小粒子の位置と上記分岐点との間の距離を算出する距離算出工程を実行する（ステップＳ１２）。距離算出工程は、時間ＴＸを変更して複数回実行される（ステップＳ１３）。時間決定部１３は、得られた距離が最短となる場合の時間Ｔ１を算出し、当該時間Ｔ１を微小粒子の吸引に適用されるべき時間とする時間決定工程を実行する（ステップＳ１４）。
【００４４】
上述の通り微小粒子分取装置１０は、距離算出工程を含むことができる。また、微小粒子分装置１０は、時間決定工程において、時間ＴＸを変更して距離算出工程を複数回行い、上記距離が最短となる場合の時間を前記Ｔ１とすることができる。このような処理により、主流路を通流する微小粒子が上記分岐点に最も近づいたタイミング、即ち微小粒子の吸引に最も適したタイミングで微小粒子の吸引を行うことができる。
【００４５】
次に、上記分岐点特定工程に含まれうる処理の一例を、図７を参照して説明する。図７は、分岐点特定工程における処理の一例を示すフローチャートである。
【００４６】
軌跡画像取得部１１１は、連続発光により、主流路及び分岐流路を通流する微小粒子の軌跡を示す蛍光画像を取得する軌跡画像取得工程を実行する（ステップＳ２１）。連続発光の光源は、光学系装置５０の透過照明部５７でありうる。微小粒子の軌跡を示す蛍光画像は、光学系装置５０の流路観察部５６によって取得されうる。次に、画像抽出部１１２は、上記蛍光画像を複数のブロックに分割して二値化し、上記軌跡の画像を含むブロックを抽出する画像抽出工程を実行する（ステップＳ２２）。分岐点取得部１１３は、軌跡の画像を含むブロックから主流路の終端部に対応する終端ブロックを特定し、当該終端ブロックの画像の重心位置を分岐点とする分岐点取得工程を実行する（ステップＳ２３）。
【００４７】
次に、軌跡画像取得部１１１、画像抽出部１１２及び分岐点取得部１１３における処理の一例を、図８を参照して更に説明する。図８は、微小粒子の軌跡を示す蛍光画像の一例を示す図である。
【００４８】
図８Ａは、主流路を通流する微小粒子の軌跡３０１を示す蛍光画像である。軌跡画像取得部１１１は、透過照明部５７から透過照明を連続発光（ＤＣ発光）し、流路観察部５６のカメラによって微小粒子の軌跡３０１を蛍光画像として取得する。微小粒子の軌跡３０１の交点が分岐点３０２である。
【００４９】
図８Ｂは、蛍光画像から軌跡の画像を含むブロックを抽出した状態を示す図である。画像抽出部１１２は、蛍光画像を複数のブロックに分割して二値化し、当該複数のブロックの中から、微小粒子の軌跡３０１の画像を含むブロックを抽出する。蛍光画像において主流路と直交する方向をＸ軸、主流路と平行な方向をＹ軸とすると、蛍光画像上の任意の位置を座標（Ｘ，Ｙ）で特定することが可能である。
【００５０】
図８Ｃは、分岐点３０２を特定した状態を示す図である。分岐点取得部１１３は、画像抽出部１１２が抽出した微小粒子の軌跡３０１を含むブロックから、主流路の終端に対応する終端ブロック３０３を特定する。終端ブロック３０３は、微小粒子の軌跡３０１の画像を含み、且つＹ軸方向に連続するブロックの中で最も下流に位置するブロックとすることができる。分岐点取得部１１３は、終端ブロック３０３の画像の重心位置の座標（ＸＳ，ＹＳ）を分岐点３０２とすることができる。
【００５１】
次に、上記距離算出工程で用いられる、主流路上の所定の位置を微小粒子が通過した時刻からの経過時間ＴＸを算出する方法の一例を、図９を参照して説明する。図９は、時間ＴＸを算出する処理の一例を示すフローチャートである。
【００５２】
照明部１４は、主流路上の異なる位置に複数のビームスポットを形成する照射工程を実行する（ステップＳ３１）。速度算出部１５は、任意のビームスポット間の距離と、該距離を微小粒子が通過する時間と、に基づいて、微小粒子の速度を算出する速度算出工程を実行する（ステップＳ３２）。時間算出部１６は、主流路上の所定の位置からの距離と、上記速度と、に基づいて算出された時間を時間ＴＸとする時間算出工程を実行する（ステップＳ３３）。
【００５３】
上記主流路上の所定の位置は、励起光照射部５１からの光により主流路上に形成されたビームスポットの位置とすることができる。上記主流路上の所定の位置を、再び図３を参照して更に説明する。図３に示すように、検出領域１０６において、微小粒子の進行方向に対して垂直に、例えば２つのビームスポット４０１及び４０２が形成されうる。ビームスポットを形成する２つの励起光は、波長が同一でもよく異なってもよい。主流路１０５上の所定の位置は、例えば、当該２つのビームスポットのうち、微小粒子吸引流路１０９側のビームスポット４０２の位置であってよく、又は、他方のビームスポット４０１の位置であってもよい。ビームスポットを微小粒子が通過するときに、散乱光及び／又は蛍光が発生することで、微小粒子の通過が検出されうる。
【００５４】
次に、上記距離算出工程で用いられる、主流路上の所定の位置を微小粒子が通過した時刻から時間ＴＸが経過した時点における微小粒子の位置を特定する方法の一例を、図１０を参照して説明する。図１０は、微小粒子の位置を特定する処理の一例を示すフローチャートである。
【００５５】
微小粒子画像取得部１７は、パルス発光により、上記時間ＴＸにおける微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程を実行する（ステップＳ４１）。位置取得部１８は、上記微小粒子のストロボ画像の重心位置を微小粒子の位置とする位置取得工程を実行する（ステップＳ４２）。
【００５６】
位置取得部１８は、例えば、ストロボ画像において主流路と直交する方向をＸ軸、主流路と平行な方向をＹ軸として、ストロボ画像上の微小粒子の位置を座標（Ｘ，Ｙ）で特定することができる。
【００５７】
次に、上記距離算出工程及び時間決定工程における処理の一例を、図１１を参照して説明する。図１１は、微小粒子５０１のストロボ画像の一例を示す図である。
【００５８】
図１１Ａは、時間Ｔ０における微小粒子５０１のストロボ画像を示す図である。微小粒子画像取得部１７は、主流路１０５上の所定の位置４０１を微小粒子５０１が通過した時刻から時間Ｔ０が経過したタイミングで透過照明部５７から透過照明をパルス発光し、流路観察部５６のカメラによって時間Ｔ０における微小粒子５０１のストロボ画像を取得する。図１１Ａの例では、時間Ｔ０における微小粒子５０１は、主流路１０５上の所定の位置４０１と分岐点３０２との間に位置し、所定の位置４０１から距離Ｙ０離れた位置にある。距離算出部１２は、微小粒子５０１の位置と分岐点３０２との間の距離Ｚ０を算出する。距離算出部１２は、時間ＴＸを変更して、微小粒子５０１の位置と分岐点３０２との間の距離ＺＸを算出する距離算出工程を複数回行う。
【００５９】
図１１Ｂは、時間ＴＮにおける微小粒子５０１のストロボ画像を示す図である。図１１Ｂの例では、時間ＴＮにおける微小粒子５０１の位置は、分岐点３０２と重なっているため、時間ＴＮにおける微小粒子５０１の位置と分岐点３０２との間の距離ＺＮは０となる。時間決定部１３は、上記距離ＺＸが最短となる場合の時間ＴＸは時間ＴＮであると算出し、この時間ＴＮを微小粒子の吸引に適用されるべき時間と決定する。
【００６０】
本技術において、微小粒子は当業者により適宜選択されてよい。本技術において、微小粒子には、細胞、微生物、及びリポソームなどの生物学的微小粒子、並びに、ラテックス粒子、ゲル粒子、及び工業用粒子などの合成粒子などが包含されうる。生物学的微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれうる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれうる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれうる。さらに、生物学的微小粒子には、核酸、タンパク質、これらの複合体などの生物学的高分子も包含されうる。また、合成粒子は、例えば有機若しくは無機高分子材料又は金属などからなる粒子でありうる。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、及びポリメチルメタクリレートなどが含まれうる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、及び磁性体材料などが含まれうる。金属には、金コロイド及びアルミなどが含まれうる。微小粒子の形状は、一般には球形又は略球形であってよく、又は非球形であってもよい。微小粒子の大きさ及び質量は、マイクロチップの流路のサイズによって当業者により適宜選択されうる。他方で、マイクロチップの流路のサイズも、微小粒子の大きさ及び質量によって適宜選択されうる。本技術において、微小粒子には、必要に応じて化学的又は生物学的な標識、例えば蛍光色素など、が取り付けられうる。当該標識によって、当該微小粒子の検出がより容易になりうる。取り付けられるべき標識は、当業者により適宜選択されうる。
【００６１】
本技術のマイクロチップは、当技術分野で既知の方法により製造されうる。例えば、本技術のマイクロチップは、例えば、上記で述べたとおりの流路が形成された２枚の基板を貼り合わせることにより製造することができる。流路は、２枚の基板の両方に形成されていてもよく、又は、一方の基板にのみ形成されていてもよい。基板の貼り合わせ時の位置の調整をより容易にするために、流路は、一方の基板にのみ形成されていることが好ましい。
【００６２】
本技術のマイクロチップを形成する材料として、当技術分野で既知の材料が用いられうる。例えば、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ＰＤＭＳ（polydimethylsiloxane）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリエチレン、ポリスチレン、ガラス、及びシリコンが挙げられるがこれらに限定されない。特に、加工性に優れており且つ成形装置を使用して安価にマイクロチップを製造することができることから、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン等の高分子材料が特に好ましい。
【００６３】
（２）吸引力の最適化
微小粒子を微小粒子吸引流路内に吸引する場合に、微小粒子と一緒にサンプル液及び／又はシース液が微小粒子吸引流路内に吸引される。適用される吸引力が大きすぎる場合、微小粒子と一緒に微小粒子吸引流路内に吸引されるサンプル液及び／又はシース液の量が多くなり、回収された微小粒子の密度が下がるため、望ましくない。一方で、適用される吸引力が小さすぎる場合、微小粒子が回収されない可能性が高まる。そのため、適用される吸引力についても最適化することが望ましい。本技術に係る微小粒子の吸引条件の最適化方法は、吸引力を自動で最適化する方法も提供する。
【００６４】
以下、吸引力の最適化方法を説明する。当該吸引力の最適化方法は、上述した吸引タイミングの最適化方法と組み合わせて実行される。このため、吸引タイミングの最適化方法と重複する説明は省略する。
【００６５】
図１２は、微小粒子分取装置１０が実行する処理の一例を示すフローチャートである。まず、吸引部１９は、上記所定の位置を微小粒子が通過した時刻から上記時間Ｔ１が経過した時点で、吸引力ＤＸにより微小粒子を吸引して微小粒子吸引流路内に微小粒子を分取する吸引工程を実行する（ステップＳ５１）。次に、吸引力特定部２０は、上記吸引力ＤＸをより小さい吸引力に変更して、微小粒子吸引流路内に微小粒子が分取されなくなるまで上記吸引工程を繰り返し（ステップＳ５２）、繰り返し終了時点の吸引力Ｄ１を特定する吸引力特定工程を実行する（ステップＳ５３）。吸引力決定部２１は、上記Ｄ１から所定の割合で増加させた吸引力Ｄ２を、微小粒子の吸引に適用されるべき吸引力とする吸引力決定工程を実行する（ステップＳ５４）。
【００６６】
吸引力決定工程において、Ｄ１から所定の割合で増加させた吸引力をＤ２としている。当該所定の割合は、Ｄ２が微小粒子を分取しうる吸引力となるよう任意に設定されうる。例えば、ＤＸをより小さい吸引力に変更して吸引工程を繰り返し、微小粒子吸引流路内に微小粒子が分取されなくなるまで吸引工程をＮ回行ったとすると、Ｎ回目の吸引工程における吸引力ＤＮが繰り返し終了時点の吸引力Ｄ１となる。この場合における吸引力Ｄ２を、例えば、Ｎ−Ｍ回目の吸引力ＤＮ−Ｍとしてもよい。Ｍの値は、より好適な吸引力Ｄ２を算出するために大きすぎないことが好ましく、例えば１〜５程度の値とすることができる。
【００６７】
上記処理により、主流路を通流する微小粒子を吸引しつつ、微小粒子と一緒に吸引されるサンプル液及び／又はシース液の量を低減可能な、最適な吸引力で微小粒子を分取することができる。
【００６８】
次に、上記吸引力特定工程において、上記時間Ｔ１が経過した時点で微小粒子が分取されたか否かを判断する方法の一例を、図１３を参照して説明する。図１３は、微小粒子の位置を特定する処理の一例を示すフローチャートである。
【００６９】
微小粒子画像取得部１７は、パルス発光により、上記時間Ｔ１における微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程を実行する（ステップＳ６１）。位置取得部１８は、上記微小粒子のストロボ画像の重心位置を微小粒子の位置とする位置取得工程を実行する（ステップＳ６２）。
【００７０】
図１４は、微小粒子５０１のストロボ画像の一例を示す図である。図１４Ａは、微小粒子５０１が微小粒子吸引流路１０９に吸引された状態を示すストロボ画像である。図１４Ａに示す例の場合、吸引力特定部２０は微小粒子が分取されたと判断する。図１４Ｂは、微小粒子５０１が分岐流路１０８へ流れた状態を示すストロボ画像である。図１４Ｂに示す例の場合、吸引力特定部２０は微小粒子が分取されなかったと判断する。
【００７１】
本技術は以下のような構成も採ることができる。
〔１〕微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップを用いて、
前記主流路から前記分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定工程と、
前記主流路上の所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における前記微小粒子の位置と前記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定工程と、
を行う微小粒子の吸引条件の最適化方法。
〔２〕前記距離を算出する距離算出工程を含み、
前記時間決定工程は、
前記時間ＴＸを変更して前記距離算出工程を複数回行い、前記距離が最短となる場合の時間を前記Ｔ１とする、〔１〕に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
〔３〕前記所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から前記時間Ｔ１が経過した時点で、吸引力ＤＸにより前記微小粒子を吸引して前記微小粒子吸引流路内に前記微小粒子を分取する吸引工程と、
前記吸引力ＤＸをより小さい吸引力に変更して、前記微小粒子吸引流路内に前記微小粒子が分取されなくなるまで前記吸引工程を繰り返し、繰り返し終了時点の吸引力Ｄ１を特定する吸引力特定工程と、
前記Ｄ１から所定の割合で増加させた吸引力Ｄ２を、微小粒子の吸引に適用されるべき吸引力とする吸引力決定工程と、
を含む、〔１〕又は〔２〕に記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
〔４〕前記分岐点特定工程は、
連続発光により、前記主流路及び前記分岐流路を通流する微小粒子の軌跡を示す蛍光画像を取得する軌跡画像取得工程と、
前記蛍光画像を複数のブロックに分割して二値化し、前記軌跡の画像を含むブロックを抽出する画像抽出工程と、
前記軌跡の画像を含むブロックから前記主流路の終端部に対応する終端ブロックを特定し、前記終端ブロックの画像の重心位置を前記分岐点とする分岐点取得工程と、
を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
〔５〕パルス発光により、前記時間ＴＸにおける微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程と、
前記微小粒子のストロボ画像の重心位置を前記微小粒子の位置とする位置取得工程と、
を含み、
前記距離算出工程において、前記位置取得工程により得られた前記微小粒子の位置を用いる、〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
〔６〕パルス発光により、前記時間Ｔ１における微小粒子のストロボ画像を取得する微小粒子画像取得工程と、
前記微小粒子のストロボ画像の重心位置を前記微小粒子の位置とする位置取得工程と、
を含み、
前記吸引力特定工程において、前記位置取得工程により得られた前記微小粒子の位置に基づいて前記微小粒子が分取されたか否かを判断する、〔３〕〜〔５〕のいずれかに記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
〔７〕前記主流路上の異なる位置に複数のビームスポットを形成する照射工程と、
任意のビームスポット間の距離と、該距離を前記微小粒子が通過する時間と、に基づいて前記微小粒子の速度を算出する速度算出工程と、
前記所定の位置からの距離と、前記速度と、に基づいて算出された時間を前記時間ＴＸとする時間算出工程と、
を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の微小粒子の吸引条件の最適化方法。
〔８〕微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記主流路と同軸上にある微小粒子吸引流路と、前記主流路から分岐する分岐流路と、を有するマイクロチップと、
前記主流路から前記分岐流路が分岐する分岐点を特定する分岐点特定部と、
前記主流路上の所定の位置を前記微小粒子が通過した時刻から所定の時間ＴＸが経過した時点における前記微小粒子の位置と前記分岐点との間の距離に基づいて、微小粒子の吸引に適用されるべき時間Ｔ１を決定する時間決定部と、
を備える微小粒子分取装置。
【符号の説明】
【００７２】
１０  微小粒子分取装置
１１  分岐点特定部
１１１  軌跡画像取得部
１１２  画像抽出部
１１３  分岐点取得部
１２  距離計算部
１３  時間決定部
１４  照明部
１５  速度算出部
１６  時間算出部
１７  微小粒子画像取得部
１８  位置取得部
１９  吸引部
２０  吸引力特定部
２１  吸引力決定部
５０  光学系装置
６０  制御系装置
１００  マイクロチップ
１０５  主流路
１０８  分岐流路
１０９  微小粒子吸引流路
３０１  微小粒子の軌跡
３０２  分岐点
３０３  終端ブロック
４０１，４０２  ビームスポット
５０１  微小粒子
【図１】
2018216279.tif 000003
【図２】
2018216279.tif 000004
【図３】
2018216279.tif 000005
【図４】
2018216279.tif 000006
【図５】
2018216279.tif 000007
【図６】
2018216279.tif 000008
【図７】
2018216279.tif 000009
【図８】
2018216279.tif 000010
【図９】
2018216279.tif 000011
【図１０】
2018216279.tif 000012
【図１１】
2018216279.tif 000013
【図１２】
2018216279.tif 000014
【図１３】
2018216279.tif 000015
【図１４】
2018216279.tif 000016
【国際調査報告】
2018216279.tif 000017
2018216279.tif 000018
2018216279.tif 000019
2018216279.tif 000020