(57)【要約】  本発明は、癌の治療に使用するための組成物であって、エリスロポエチンを含み、対象への前記組成物の投与後に抗癌剤が投与される、組成物に関する。
2019083023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に使用するための組成物であって、
エリスロポエチンを含み、
対象への前記組成物の投与後に抗癌剤が投与される、
組成物。
【請求項２】
対象に前記組成物を投与してから少なくとも１時間後に抗癌剤が投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記癌が、前記抗癌剤に対して耐性を有する癌である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記癌が、前記抗癌剤で治療されたことのない同一の組織由来の癌と比較して、抗癌剤排出トランスポーターの発現量が増大している癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物を投与することによって、対象中の癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現が抑制される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗癌剤排出トランスポーターがＡＢＣトランスポーターである、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＡＢＣトランスポーターが、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２及びＡＢＣＣ５から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物を投与することによって、対象中の癌細胞からの抗癌剤の排出が抑制される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物を投与しない対象と比較して、前記組成物を投与した対象において、抗癌剤の効果が増強される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
癌の治療に使用するための組成物であって、
抗癌剤を含み、
対象へのエリスロポエチンの投与後に前記組成物が投与される、
組成物。
【請求項１１】
対象にエリスロポエチンを投与してから少なくとも１時間後に前記組成物が投与される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記癌が、前記抗癌剤に対して耐性を有する癌である、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記癌が、前記抗癌剤で治療されたことのない同一の組織由来の癌と比較して、抗癌剤排出トランスポーターの発現量が増大している癌である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
エリスロポエチンを投与することによって、対象中の癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現が抑制される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗癌剤排出トランスポーターがＡＢＣトランスポーターである、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＡＢＣトランスポーターが、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２及びＡＢＣＣ５から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
エリスロポエチンを投与することによって、対象中の癌細胞からの抗癌剤の排出が抑制される、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
エリスロポエチンを投与しない対象と比較して、エリスロポエチンを投与した対象において、抗癌剤の効果が増強される、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
エリスロポエチンを含む、癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制するための組成物。
【請求項２０】
エリスロポエチンを含む、癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制するための組成物。
【請求項２１】
エリスロポエチンを含む、抗癌剤の効果を増強するための組成物。
【請求項２２】
癌の治療方法であって、
エリスロポエチンが投与された対象へ抗癌剤を投与する工程
を含む、治療方法。
【請求項２３】
癌を有する対象へのエリスロポエチンの投与方法であって、
対象への抗癌剤の投与前にエリスロポエチンを投与する工程
を含む、投与方法。
【請求項２４】
癌を有する対象への抗癌剤の投与方法であって、
エリスロポエチンが投与された対象へ抗癌剤を投与する工程
を含む、投与方法。
【請求項２５】
癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現抑制方法であって、
対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
癌細胞からの抗癌剤の排出抑制方法であって、
抗癌剤の投与前に対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
【請求項２７】
抗癌剤の効果増強方法であって、
抗癌剤の投与前に対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療に使用するための組成物、癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制するための組成物、癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制するための組成物、抗癌剤の効果を増強するための組成物、及び癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜薬剤耐性について＞
抗癌剤を用いた化学療法の問題点の１つとして、化学療法を継続することによって癌細胞が抗癌剤に対して耐性を獲得することがある。薬剤耐性となった癌細胞において、抗癌剤の蓄積が減少すること、そして抗癌剤を能動的に細胞外に排出するトランスポーター（例えばＡＢＣトランスポーター）の発現が上昇していることが知られている。当該トランスポーターの阻害剤や、当該トランスポーターの発現抑制剤を用いて薬剤耐性を克服し、抗癌剤の効果を回復させる試みがなされている（特許文献１）。【０００３】
＜エリスロポエチンについて＞
エリスロポエチンは、赤芽球の分化及び増殖に関わるサイトカインである。ある種の癌細胞は細胞表面にエリスロポエチン受容体を発現しており、エリスロポエチンの投与によって癌細胞の増殖が加速することが報告されている（非特許文献１）。また、エリスロポエチン受容体をコードする遺伝子の発現を阻害する物質を用いることで、抗癌剤の治療効果を増強できることが知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００９／１２２６３９号
【特許文献２】特開２０１２−１６２５００号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Joachim F, The Oncologist;13(suppl 3):16-20, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、抗癌剤に対して耐性となった癌に対しても当該抗癌剤を有効に作用させることができ、かつ抗癌剤の効果を増強することができる手段の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、エリスロポエチンを投与することによって癌細胞に存在する抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制することができること、それにより癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制することができ、抗癌剤の効果を増強できることを見出し、本発明に至った。【０００８】
本発明は、以下の＜１＞〜＜３３＞を包含する。
＜１＞
癌の治療に使用するための組成物であって、
エリスロポエチンを含み、
対象への前記組成物の投与後に抗癌剤が投与される、
組成物。
＜２＞
対象に前記組成物を投与してから少なくとも１時間後に抗癌剤が投与される、＜１＞に記載の組成物。
＜３＞
前記癌が、前記抗癌剤に対して耐性を有する癌である、＜１＞又は＜２＞に記載の組成物。
＜４＞
前記癌が、前記抗癌剤で治療されたことのない同一の組織由来の癌と比較して、抗癌剤排出トランスポーターの発現量が増大している癌である、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜５＞
前記組成物を投与することによって、対象中の癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現が抑制される、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜６＞
前記抗癌剤排出トランスポーターがＡＢＣトランスポーターである、＜４＞又は＜５＞に記載の組成物。
＜７＞
前記ＡＢＣトランスポーターが、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２及びＡＢＣＣ５から成る群から選択される少なくとも１つである、＜６＞に記載の組成物。
＜８＞
前記組成物を投与することによって、対象中の癌細胞からの抗癌剤の排出が抑制される、＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜９＞
前記組成物を投与しない対象と比較して、前記組成物を投与した対象において、抗癌剤の効果が増強される、＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１０＞
癌の治療に使用するための組成物であって、
抗癌剤を含み、
対象へのエリスロポエチンの投与後に前記組成物が投与される、
組成物。
＜１１＞
対象にエリスロポエチンを投与してから少なくとも１時間後に前記組成物が投与される、＜１０＞に記載の組成物。
＜１２＞
前記癌が、前記抗癌剤に対して耐性を有する癌である、＜１０＞又は＜１１＞に記載の組成物。
＜１３＞
前記癌が、前記抗癌剤で治療されたことのない同一の組織由来の癌と比較して、抗癌剤排出トランスポーターの発現量が増大している癌である、＜１０＞〜＜１２＞のいずれか１項に記載の組成物。
＜１４＞
エリスロポエチンを投与することによって、対象中の癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現が抑制される、＜１０＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１５＞
前記抗癌剤排出トランスポーターがＡＢＣトランスポーターである、＜１３＞又は＜１４＞に記載の組成物。
＜１６＞
前記ＡＢＣトランスポーターが、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２及びＡＢＣＣ５から成る群から選択される少なくとも１つである、＜１５＞に記載の組成物。
＜１７＞
エリスロポエチンを投与することによって、対象中の癌細胞からの抗癌剤の排出が抑制される、＜１０＞〜＜１６＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１８＞
エリスロポエチンを投与しない対象と比較して、エリスロポエチンを投与した対象において、抗癌剤の効果が増強される、＜１０＞〜＜１７＞のいずれか１つに記載の組成物。
＜１９＞
エリスロポエチンを含む、癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制するための組成物。
＜２０＞
エリスロポエチンを含む、癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制するための組成物。
＜２１＞
エリスロポエチンを含む、抗癌剤の効果を増強するための組成物。
＜２２＞
癌の治療方法であって、
エリスロポエチンが投与された対象へ抗癌剤を投与する工程
を含む、治療方法。
＜２３＞
癌を有する対象へのエリスロポエチンの投与方法であって、
対象への抗癌剤の投与前にエリスロポエチンを投与する工程
を含む、投与方法。
＜２４＞
癌を有する対象への抗癌剤の投与方法であって、
エリスロポエチンが投与された対象へ抗癌剤を投与する工程
を含む、投与方法。
＜２５＞
癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現抑制方法であって、
対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
＜２６＞
癌細胞からの抗癌剤の排出抑制方法であって、
抗癌剤の投与前に対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
＜２７＞
抗癌剤の効果増強方法であって、
抗癌剤の投与前に対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
＜２８＞
癌の治療に使用するための、エリスロポエチンと抗癌剤との組み合わせ剤であって、
対象にエリスロポエチンを投与後に抗癌剤が投与される、
組み合わせ剤。
＜２９＞
癌の治療における使用のためのエリスロポエチンであって、
対象にエリスロポエチンを投与後に抗癌剤が投与される、エリスロポエチン。
＜３０＞
癌の治療における使用のための抗癌剤であって、
対象にエリスロポエチンを投与後に抗癌剤が投与される、抗癌剤。
＜３１＞
癌の治療における使用のためのエリスロポエチンであって、
対象にエリスロポエチンを投与後に抗癌剤が投与される、エリスロポエチン。
＜３２＞
癌の治療に使用するための組成物の製造における、エリスロポエチンの使用であって、
対象への前記組成物の投与後に抗癌剤が投与される、
使用。
＜３３＞
癌の治療に使用するための組成物の製造における、抗癌剤の使用であって、
対象へのエリスロポエチンの投与後に前記組成物が投与される、
使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、抗癌剤に対して耐性となった癌に対しても当該抗癌剤を有効に作用させることができる。また、抗癌剤の効果を増強することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）による細胞傷害効果を示す。左がＲＧＫ３６を用いた結果であり、右がＲＧＫ４５を用いた結果である。細胞はＥＰＯ不含または含有培地で２４時間培養した後、各種濃度のＤＯＸで２４時間培養した。ＥＰＯを添加した場合、ＲＧＫ３６では０．５および１μＭで、ＲＧＫ４５は０．５μＭのＤＯＸにおいて細胞生存率が有意に減少した。ｎ＝４，＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１。
【図２】図２は、ＲＧＫ３６におけるＡＧＣＧ２の発現をウェスタンブロッティングで評価した結果を示す。ＥＰＯの濃度依存的にＡＢＣＧ２の発現が減少した。
【図３】図３は、図２のウェスタンブロッティングにおけるバンドをβ−アクチンで規格化したグラフを示す。ＥＰＯの濃度依存的にＡＢＣＧ２の発現が減少した。
【図４】図４は、ＲＧＫ４５を用いた場合における、パクリタキセル（ＰＴＸ）による細胞傷害効果を示す。細胞はＥＰＯ不含または含有培地で２４時間培養した後、各種濃度のＰＴＸで２４時間培養した。ＥＰＯを添加した場合、ＲＧＫ４５は１００および１０００ｎＭのＰＴＸにおいて細胞生存率が有意に減少した。ｎ＝４，＊：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１。
【図５】図５は、１時間のＥＰＯ曝露後、さらに培養されたＲＧＫ４５中のＡＧＣＧ２の発現の経時変化をウェスタンブロッティングで評価した結果を示す。曝露２４時間後までＡＢＣＧ２の発現が徐々に低下した。
【図６】図６は、図５のウェスタンブロッティングにおけるバンドをβ-アクチンで規格化したグラフを示す。
【図７】図７は、各種抗癌剤による細胞傷害効果を示す。細胞はEPO不含又は含有培地で24時間培養した後、各種濃度の抗癌剤で24時間培養した。すべての抗癌剤においてEPOを添加した場合、細胞生存率が有意に減少した。n = 4, *: p<0.05, **: p<0.01。
【図８】図８は、ＲＧＫ４５におけるＡＢＣＢ１及びＡＢＣＣ５の発現をウェスタンブロッティングで評価した結果を示す。ＥＰＯの濃度依存的にＡＢＣＢ１及びＡＢＣＣ５の発現が減少した。
【図９】図９は、ＭＫＮ４５におけるＡＢＣＧ２及びＡＢＣＢ１の発現をウェスタンブロッティングで評価した結果を示す。ＥＰＯ曝露により、ＡＢＣＧ２及びＡＢＣＢ１の発現が減少した。（−）はＥＰＯを曝露していない場合の結果を示し、（＋）は曝露した場合の結果を示す。
【図１０】図１０は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）による細胞傷害効果を示す。左が癌細胞であるＲＧＫ４５を用いた結果であり、右が正常細胞であるＲＧＭ１を用いた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜エリスロポエチン＞
本発明で使用されるエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、どのようなＥＰＯでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＥＰＯであり、より具体的には、哺乳動物ＥＰＯ、特にヒトＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。
【００１２】
本発明で使用されるＥＰＯは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト由来の抽出物から精製して得られた天然のヒトＥＰＯや、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せ、種々の方法で抽出し、分離及び精製したヒトＥＰＯを使用することができる。本発明において使用されるエリスロポエチンは、遺伝子工学的手法により製造されたＥＰＯが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＥＰＯが好ましい。
【００１３】
遺伝子組換え法により得られるＥＰＯには、天然由来のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは当該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加したものであって、天然由来のＥＰＯと同様の生物学的活性を有するものであってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法を用いて、ＥＰＯのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ＥＰＯと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。
【００１４】
本発明で使用されるＥＰＯは、ＥＰＯと他のタンパク質との融合タンパク質であってもよい。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＥＰＯをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＥＰＯとの融合に付される他のタンパク質は、特に限定されない。
【００１５】
本発明で使用されるＥＰＯは、化学修飾したＥＰＯであってもよい。化学修飾したＥＰＯの例として、例えば、ポリエチレングリコールなどにより化学修飾されたＥＰＯ、糖鎖のついていないＥＰＯをポリエチレングリコールなどにより化学修飾したもの、その他、ビタミンＢ１２など、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＥＰＯなどを挙げることができる。
【００１６】
さらに、本発明で使用されるＥＰＯは、ＥＰＯ誘導体であってもよい。ここでＥＰＯ誘導体とは、ＥＰＯ分子中のアミノ酸を修飾したＥＰＯ又はＥＰＯ分子中の糖鎖を修飾したＥＰＯのことをいう。ＥＰＯ分子中の糖鎖の修飾としては、糖鎖の付加、置換、欠失などが含まれる。ＥＰＯ分子中のアミノ酸の修飾としては、カルバミル化、ビオチン化、アミジン化、アセチル化、グアニジン化などを挙げることができる。修飾されるアミノ酸残基は特に限定されず、例えば、リジン、アルギニン、グルタミン酸、トリプトファンなどを挙げることができる。
【００１７】
＜抗癌剤排出トランスポーター＞
本明細書において、抗癌剤排出トランスポーターとは、細胞内に存在する抗癌剤を細胞外へ能動的に排出することができる、膜タンパク質である。薬剤耐性となった癌細胞において、抗癌剤排出トランスポーターの発現が上昇していることが知られている。本発明は、エリスロポエチンを投与することによって癌細胞中の抗癌剤排出トランスポーターの発現量が低下するという発見に基づく。抗癌剤排出トランスポーターとしては、例えば、ＡＢＣトランスポーター（例えば、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＢ４、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＣ１０、ＡＢＣＣ５、ＡＢＣＧ２）、及びアミノ酸トランスポーターを挙げることができる。好ましくは、ＡＢＣトランスポーターであり、より好ましくは、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＧ２及びＡＢＣＣ５から選択される少なくとも１つである。
【００１８】
＜抗癌剤＞
本発明で使用される抗癌剤は、癌細胞中の抗癌剤排出トランスポーターによって排出されるものである限り、特に限定されない。例えば、以下のものを使用することができる。
アルキル化剤：カルボコン、ブスルファン、ニムスチン、シクロフォスファミドなど
代謝拮抗剤：メトトレキサート、メルカプトプリン、シタラビン、フルオロウラシル、テガフール、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など
抗生物質：アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシンなど
微小管阻害剤：ドセタキセル、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチンなど
トポイソメラーゼ阻害剤：イリノテカン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシドなど
血管新生阻害剤：ベバシズマブ、ソラフェニブ、スニチニブなど
金属錯体：シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、オキサリプラチンなど
【００１９】
＜エリスロポエチンを含む本発明の組成物＞
一態様において、本発明は、癌の治療に使用するための組成物であって、エリスロポエチンを含み、対象への前記組成物の投与後に抗癌剤が投与される組成物である。また別の態様において、本発明は、エリスロポエチンを含む、癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制するための組成物である。また別の態様において、本発明は、エリスロポエチンを含む、癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制するための組成物である。また別の態様において、本発明は、エリスロポエチンを含む、抗癌剤の効果を増強するための組成物である。これらを合わせて、以下で「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」とも呼ぶ。
【００２０】
エリスロポエチンを含む本発明の組成物の投与により、対象中の癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現が抑制される。当該トランスポーターの発現の抑制によって、対象中の癌細胞からの抗癌剤の排出が抑制され、癌細胞中に抗癌剤が蓄積される。その結果、エリスロポエチンを含む本発明の組成物を投与しない対象と比較して、前記組成物を投与した対象において、抗癌剤の効果が増強される。
【００２１】
本明細書において、「抗癌剤の効果の増強」とは、抗癌剤の治療効果である癌の縮小率又は癌細胞の減少率が、抗癌剤単独で使用した場合と比較して少なくとも５％以上、好ましくは少なくとも１０％以上であることを意味する。
【００２２】
（投与対象）
エリスロポエチンを含む本発明の組成物の投与対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としては具体的には、マウス、ラット、イヌ、サル、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられる。好ましくは、投与対象はヒトである。本発明の、癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制するための組成物、癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制するための組成物及び抗癌剤の効果を増強するための組成物は、インビトロでヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞に対して使用することもできる。したがって、これらの組成物の投与対象はヒト細胞又は非ヒト哺乳動物細胞であってもよい。
【００２３】
（治療されるべき癌の種類）
本明細書において、「癌」とは、上皮性細胞からなる悪性腫瘍（癌腫）、非上皮性細胞からなる悪性腫瘍（肉腫）、及び造血器腫瘍を意味する。一般に、造血器腫瘍以外のほとんどの癌は腫瘍塊を形成するので固形腫瘍とも呼ばれる。エリスロポエチンを含む本発明の組成物を用いて治療されるべき癌の種類は特に限定されず、癌腫として、脳腫瘍、皮膚癌、頸頭部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、結腸癌、膀胱癌、および卵巣癌などが例示される。また、肉腫としては、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、および血管肉腫などが例示される。さらに、造血器腫瘍として、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む悪性リンパ腫；急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病及び慢性リンパ性白血病を含む白血病；ならびに多発性骨髄腫が例示される。
【００２４】
また、エリスロポエチンを含む本発明の組成物を用いて治療されるべき癌は、当該組成物の投与後に投与される抗癌剤に対して耐性を有さない癌であってもよいし、耐性を有する癌であってもよい。好ましくは、当該抗癌剤に対して耐性を有する癌である。本明細書において、ある抗癌剤に対する「耐性」は、自然耐性（すなわち、癌が当該抗癌剤に対して最初から応答しないこと）及び獲得耐性（すなわち、癌が以前に応答していた当該抗癌剤に対して応答しなくなること）を含む。また、ある抗癌剤に対する薬剤耐性癌が、当該抗癌剤と構造的及び／又は機能的に関連する、これまで曝露されたことのない別の抗癌剤に対して耐性を示す現象（多剤耐性）を含む。ある抗癌剤に対して耐性であるか否かは、例えば当該抗癌剤に対する癌細胞の生存率（例えばＩＣ50）に基づいて決定することができる。抗癌剤に対して良好な応答を示す対象に対して本発明の組成物を使用することで、当該抗癌剤に対して不応となるまでの時期を延長することができる。また、抗癌剤に対して不応となった対象に対して本発明の組成物を使用することで、当該抗癌剤に対する応答性を回復し、予後を改善することができる。
【００２５】
また、ある抗癌剤に対して癌細胞が耐性を獲得したことの指標として、癌細胞中に存在する抗癌剤排出トランスポーターの発現量の増大が挙げられる。好ましくは、エリスロポエチンを含む本発明の組成物を用いて治療されるべき癌は、当該組成物の投与後に投与される抗癌剤で治療されたことのない同一の組織由来の癌（対照癌）と比較して、抗癌剤排出トランスポーターの発現量が増大しており（好ましくは統計的に有意に増大しており）、例えば、抗癌剤排出トランスポーターの発現量が対照癌と比較して１.２倍以上、１．４倍以上、１．６倍以上、１．８倍以上、２倍以上、３倍以上、４倍以上又５倍以上増大しており、最大で１０倍又は２０倍増大している。抗癌剤排出トランスポーターの発現量の比較は、例えばウェスタンブロッティングによって行うことができる。
【００２６】
（エリスロポエチンを含む本発明の組成物と抗癌剤との投与間隔）
エリスロポエチンを含む本発明の組成物と抗癌剤の投与順序は、特に限定されるものではなく、エリスロポエチンを含む本発明の組成物の投与後又は投与前に抗癌剤が投与されてもよいし、エリスロポエチンを含む本発明の組成物と抗癌剤とが同時に投与されてもよい。好ましくは、エリスロポエチンを含む本発明の組成物を対象に投与してから少なくとも１時間後に抗癌剤が投与され、より好ましくは、本発明の組成物を治療対象に投与してから１〜７２時間後、１〜４８時間後、１〜３６時間後、１〜２４時間後、１〜１２時間後、６〜７２時間後、６〜４８時間後、６〜３６時間後、６〜２４時間後、６〜１２時間後、１２〜７２時間後、１２〜４８時間後、１２〜３６時間後、１２〜２４時間後、１８〜７２時間後、１８〜４８時間後、１８〜３６時間後、１８〜２４時間後、２４〜７２時間後、２４〜４８時間後、２４〜３６時間後、３６〜７２時間後、又は３６〜４８時間後に抗癌剤が投与される。このような投与間隔を採用することで、癌細胞中の抗癌剤排出トランスポーターの発現が十分に抑制され、その結果、癌細胞が抗癌剤に良好に応答するようになる。
【００２７】
（投与経路及び投与量）
本発明のエリスロポエチンを含む本発明の組成物の投与経路は、経口及び非経口投与のいずれでもよい。好ましくは非経口投与である。非経口投与としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などが挙げられる。例えば注射投与によって本発明の医薬組成物を全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲でエリスロポエチンの投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ〜１００，０００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲でエリスロポエチンの投与量が選択され得る。しかしながら、本発明の医薬組成物の投与量は、これらに制限されるものではない。
【００２８】
（製剤化）
本発明の組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤などが挙げられる。更にこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などを担体として挙げることができる。
【００２９】
＜抗癌剤を含む本発明の組成物＞
一態様において、本発明は、癌の治療に使用するための組成物であって、抗癌剤を含み、対象へのエリスロポエチンの投与後に抗癌剤が投与される組成物である。
【００３０】
抗癌剤を含む本発明の組成物の投与前に対象に投与されるエリスロポエチンは、上記の「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」の形態で使用されてもよい。したがって一実施形態において、本発明は、癌の治療に使用するための組成物であって、抗癌剤を含み、上記の「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」の対象への投与後に抗癌剤が投与される、組成物である。
【００３１】
抗癌剤を含む本発明の組成物の投与対象、治療されるべき癌の種類、投与経路及び製剤化については、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」について上記した投与対象、治療されるべき癌の種類、投与経路及び製剤化と同様である。
【００３２】
（抗癌剤を含む本発明の組成物とエリスロポエチンとの投与間隔）
抗癌剤を含む本発明の組成物とエリスロポエチンの投与順序は、特に限定されるものではなく、エリスロポエチンの投与後又は投与前に抗癌剤を含む本発明の組成物が投与されてもよいし、抗癌剤を含む本発明の組成物とエリスロポエチンとが同時に投与されてもよい。好ましくは、エリスロポエチンを対象に投与してから少なくとも１時間後に抗癌剤を含む本発明の組成物が投与され、より好ましくは、エリスロポエチンを治療対象に投与してから１〜７２時間後、１〜４８時間後、１〜３６時間後、１〜２４時間後、１〜１２時間後、６〜７２時間後、６〜４８時間後、６〜３６時間後、６〜２４時間後、６〜１２時間後、１２〜７２時間後、１２〜４８時間後、１２〜３６時間後、１２〜２４時間後、１８〜７２時間後、１８〜４８時間後、１８〜３６時間後、１８〜２４時間後、２４〜７２時間後、２４〜４８時間後、２４〜３６時間後、３６〜７２時間後、又は３６〜４８時間後に抗癌剤を含む本発明の組成物が投与される。
【００３３】
（投与量）
本発明の組成物の投与量としては、例えば、一回の投与につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲で抗癌剤の投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり０．００１ｍｇ／ｂｏｄｙ〜１００，０００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で抗癌剤の投与量が選択され得る。しかしながら、本発明の組成物の投与量は、これらに制限されるものではない。
【００３４】
＜治療方法及び投与方法＞
一態様において、本発明は、癌の治療方法であって、エリスロポエチンが投与された対象へ抗癌剤を投与する工程を含む、治療方法である。また別の態様において、本発明は、癌を有する対象への抗癌剤の投与方法であって、エリスロポエチンが投与された対象へ抗癌剤を投与する工程を含む、投与方法である。また別の態様において、本発明は、癌を有する対象への抗癌剤の投与方法であって、エリスロポエチンが投与された対象へ抗癌剤を投与する工程を含む、投与方法である。
【００３５】
本発明の治療方法及び投与方法で使用されるエリスロポエチン及び抗癌剤はそれぞれ、上記の「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」及び「抗癌剤を含む本発明の組成物」であってもよい。
【００３６】
本発明の治療方法及び投与方法における、投与対象、治療されるべき癌の種類、及び投与経路は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」について上記した投与対象、治療されるべき癌の種類及び投与経路と同様である。投与量は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」及び「抗癌剤を含む本発明の組成物」について上記した投与量と同様である。
【００３７】
（エリスロポエチンと抗癌剤との投与間隔）
本発明の治療方法及び投与方法において、抗癌剤とエリスロポエチンの投与順序は、特に限定されるものではなく、抗癌剤の投与後又は投与前にエリスロポエチンが投与されてもよいし、抗癌剤とエリスロポエチンとが同時に投与されてもよい。好ましくは抗癌剤の投与前にエリスロポエチンが投与される。抗癌剤の投与前にエリスロポエチンが投与される場合、エリスロポエチンと抗癌剤との投与間隔は、好ましくは、少なくとも１時間であり、より好ましくは、１〜７２時間、１〜４８時間、１〜３６時間、１〜２４時間、１〜１２時間、６〜７２時間、６〜４８時間、６〜３６時間、６〜２４時間、６〜１２時間、１２〜７２時間、１２〜４８時間、１２〜３６時間、１２〜２４時間、１８〜７２時間、１８〜４８時間、１８〜３６時間、１８〜２４時間、２４〜７２時間、２４〜４８時間、２４〜３６時間、３６〜７２時間、又は３６〜４８時間である。
【００３８】
＜抗癌剤排出トランスポーターの発現抑制方法＞
一態様において、本発明は、癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現抑制方法であって、対象へエリスロポエチンを投与する工程を含む、方法である。当該方法で使用されるエリスロポエチンは、上記の「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」であってもよい。また、当該方法における対象、治療されるべき癌の種類、並びに投与経路は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」について上記した対象、治療されるべき癌の種類及び投与経路と同様である。エリスロポエチンの投与量は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」について上記した投与量と同様である。なお、本発明の抗癌剤排出トランスポーターの発現抑制方法は、インビトロでヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞に対して使用することもできる。したがって、投与対象はヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞であってもよい。
【００３９】
＜抗癌剤の排出抑制方法＞
一態様において、本発明は、癌細胞からの抗癌剤の排出抑制方法であって、抗癌剤の投与前に対象へエリスロポエチンを投与する工程を含む、方法である。当該方法で使用されるエリスロポエチン及び抗癌剤はそれぞれ、上記の「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」及び「抗癌剤を含む本発明の組成物」であってもよい。また、当該方法における対象、治療されるべき癌の種類、並びに投与経路は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」について上記した対象、治療されるべき癌の種類及び投与経路と同様である。エリスロポエチン及び抗癌剤の投与量は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」及び「抗癌剤を含む本発明の組成物」について上記した投与量と同様である。当該方法におけるエリスロポエチンと抗癌剤との投与間隔は、「本発明の治療方法及び投与方法」について上記した投与間隔と同様である。なお、本発明の抗癌剤の排出抑制方法は、インビトロでヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞に対して使用することもできる。したがって、投与対象はヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞であってもよい。
【００４０】
＜抗癌剤の効果増強方法＞
一態様において、本発明は、抗癌剤の効果増強方法であって、抗癌剤の投与前に対象へエリスロポエチンを投与する工程を含む、方法である。当該方法で使用されるエリスロポエチン及び抗癌剤はそれぞれ、上記の「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」及び「抗癌剤を含む本発明の組成物」であってもよい。また、当該方法における対象、治療されるべき癌の種類、並びに投与経路は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」について上記した対象、治療されるべき癌の種類及び投与経路と同様である。エリスロポエチン及び抗癌剤の投与量は、「エリスロポエチンを含む本発明の組成物」及び「抗癌剤を含む本発明の組成物」について上記した投与量と同様である。当該方法におけるエリスロポエチンと抗癌剤との投与間隔は、「本発明の治療方法及び投与方法」について上記した投与間隔と同様である。なお、本発明の抗癌剤の効果増強方法は、インビトロでヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞に対して使用することもできる。したがって、投与対象はヒト又は非ヒト哺乳動物の細胞であってもよい。
【００４１】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００４２】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００４３】
実施例１
エリスロポエチン（EPO）曝露後におけるドキソルビシン（DOX）の癌細胞傷害効果
（１）細胞培養
ラット正常胃粘膜細胞の癌様変異株であるRGK36及びRGK45を使用した。RGK36及びRGK45はいずれも、本発明者によって樹立された細胞株であり、国際公開第2007/018182号に開示されたRGK1細胞株からクローニングされたものである。RGK36及びRGK45を、10％FBS、ペニシリンとストレプトマイシン含有DMEM/F12（Sigma, D6421）を用い、37℃、5%CO2環境下で培養した。
（２）細胞増殖試験
RGK36とRGK45を、96 well plate (日本ジェネティクス、TrueLine)に103 cell/wellの濃度で播種し、一晩培養した。培養後、10 U/mLのEPO（R&D systems, 1306-RE-010）を添加し24時間培養した。24時間後、0, 0.25, 0.5および1 μMのDOX（Wako, 046-21523）含有培地で24時間培養した。培養後、PBSで細胞を2回洗浄し、Cell Counting Kit-8 (Dojindo, CK04)を用いて細胞増殖試験を行った。【００４４】
結果を図１に示す。RGK36とRGK45はどちらもDOXの濃度依存的に細胞生存率が低下した。またEPOを添加した場合、RGK36では0.5および1 μMで、RGK45は0.5 μMのDOXにおいて細胞生存率が有意に減少することが分かった。【００４５】
実施例２
ウェスタンブロッティングによるABCG2の発現量の評価
RGK36を60 mm dishで培養した。細胞を0, 5及び10 U/mLのEPO含有培地で24時間培養した。PBSで3回洗浄した後、1%プロテアーゼ阻害カクテル（Thermo Fisher Scientific, #78415）含有RIPA bufferで処理しタンパク質を回収した。タンパク質40 μLに対し、100 mM DTT（Wako, 040-29223）含有LDS sample buffer (Thermo Fisher Scientific, NP0007)を40 μL添加し、95℃で10分間処理した。サンプルをゲルにアプライした後、30 mAで95分間電気泳動した。泳動後、ろ紙（ATO, CB-09A）PVDFメンブレン（BioRad, 162-0177）、ゲル、ろ紙の順で重ね、90 mAで45分間転写した。転写後、5%スキムミルク（雪印メグミルク）を用い、シェイクしながら1時間ブロッキングした。ブロッキング後、0.1%ABCG2抗体（Sigma-aldrich, SAB4300689）含有Solution 1溶液（TOYOBO, NKB-201）にメンブレンを浸し、4℃で一晩静置した。その後TBSTで3回洗浄し、0.1%anti-rabbit IgG-HRP抗体（CST, 7074）含有Solution 2（TOYOBO, NKB-301）にメンブレンを浸し、シェイクした。1時間後、メンブレンをTBSTで3回洗浄した後ルミノイメージアナライザで撮影した。撮影後、stripping buffer (Thermo Fisher Scientific, #46430)で抗体を剥離し、blocking bufferで1時間ブロッキングした。ブロッキング後、0.1% β-actin抗体（CST, 4967）含有Solution 1溶液にメンブレンを浸し、4℃で一晩静置した。その後TBSTで3回洗浄し、0.1%anti-rabbit IgG-HRP抗体含有Solution 2にメンブレンを浸し、シェイクした。1時間後、メンブレンをTBSTで3回洗浄した後、ルミノイメージアナライザで撮影した。【００４６】
結果を図２及び３に示す。EPOの添加により濃度依存的にABCG2の発現が減少することが分かった。【００４７】
実施例３
エリスロポエチン（EPO）曝露後におけるパクリタキセル（PTX）の癌細胞傷害効果
（１）細胞培養
ラット正常胃粘膜細胞の癌様変異株であるRGK45を、10％FBS、ペニシリンとストレプトマイシン含有DMEM/F12（Sigma-aldrich, D6421）を用い、37℃、5%CO2環境下で培養した。
（２）細胞増殖試験
RGK45を96 well plate (日本ジェネティクス、TrueLine)に103 cell/wellの濃度で播種し、一晩培養した。培養後、10 U/mLのEPO（R&D systems, 1306-RE-010）を添加し24時間培養した。24時間後、0, 1, 10, 100および1000 nMのPTX（Wako, 169-18611）含有培地で24時間培養した。培養後、PBSで細胞を2回洗浄し、Cell Counting Kit-8 (Dojindo, CK04)を用いて細胞増殖試験を行った。【００４８】
結果を図４に示す。PTXの濃度依存的に細胞生存率が低下した。またEPOを添加した場合、RGK45は100および1000 nMのPTXにおいて細胞生存率が有意に減少することが分かった。【００４９】
実施例４
エリスロポエチン（EPO）曝露後におけるABCG2発現の経時変化
RGK45を100 ng/mLのEPO含有培地にて１時間培養した。その後、上清をアスピレーションで捨てた。得られた細胞に培地を加え、６時間、１２時間、２４時間、４８時間培養した（培地を加えずにその後の処理を行ったものを「０時間」とする）。その後、上清をアスピレーションで捨て、PBSで3回洗浄した後、1%プロテアーゼ阻害カクテル（Thermo Fisher Scientific, #78415）含有RIPA bufferで処理し、タンパク質を回収した。タンパク質40 μLに対し、100 mM DTT（Wako, 040-29223）含有LDS sample buffer (Thermo Fisher Scientific, NP0007)を40 μL添加し、95℃で10分間処理した。サンプルをゲルにアプライした後、30 mAで95分間電気泳動した。泳動後、ろ紙（ATO, CB-09A）PVDFメンブレン（BioRad, 162-0177）、ゲル、ろ紙の順で重ね、90 mAで45分間転写した。転写後、5%スキムミルク（雪印メグミルク）を用い、シェイクしながら1時間ブロッキングした。ブロッキング後、0.1%ABCG2抗体（Sigma, SAB4300689）含有Solution 1溶液（TOYOBO, NKB-201）にメンブレンを浸し、4℃で一晩静置した。その後TBSTで3回洗浄し、0.1%anti-rabbit IgG-HRP抗体（CST, 7074）含有Solution 2溶液（TOYOBO, NKB-301）にメンブレンを浸し、シェイクした。1時間後、メンブレンをTBSTで3回洗浄した後、ルミノイメージアナライザで撮影した。撮影後、stripping buffer (Thermo Fisher Scientific, #46430)で抗体を剥離し、blocking bufferで1時間ブロッキングした。ブロッキング後、0.1% β-actin抗体（CST, 4967）含有Solution 1溶液にメンブレンを浸し、4℃で一晩静置した。その後TBSTで3回洗浄し、0.1%anti-rabbit IgG-HRP抗体含有Solution 2にメンブレンを浸し、シェイクした。1時間後、メンブレンをTBSTで3回洗浄した後、ルミノイメージアナライザで撮影した。【００５０】
結果を図５及び６に示す。EPOに曝露後、ABCG2の発現が徐々に低下した。【００５１】
実施例５
エリスロポエチン（EPO）曝露後における抗癌剤の癌細胞傷害効果
（１）細胞培養
ヒト由来胃癌細胞MKN45 (RIKEN BRC、寄託番号RCB1001)を、10％FBS、ペニシリン、及びストレプトマイシン含有RPMI1640（Wako）を用い、37℃、5%CO2環境下で培養した。ラット正常胃粘膜細胞の癌様変異株であるRGK45を、10％FBS、ペニシリン、及びストレプトマイシン含有DMEM/F12（Sigma, D6421）を用い、37℃、5%CO2環境下で培養した。【００５２】
（２）細胞増殖試験
MKN45を、96 well plate（TrueLine, TR5003）に2 x 104 cell/wellの濃度で播種し、一晩培養した。培養後、10 U/mLのEPO（フナコシ, 287-TC-500）を添加し、24時間培養した。24時間後、各種抗癌剤含有培地で24時間培養した。抗癌剤とその濃度を表１に示す。培養後、Cell Counting Kit-8 (Dojindo, CK04)を用いて細胞増殖試験を行った。
【表１】
2019083023.tif 000003
【００５３】
結果を図７に示す。MKN45はいずれの抗癌剤も濃度依存的に細胞生存率が低下した。またEPOを添加した場合、すべての抗癌剤において細胞生存率が有意に減少した。【００５４】
（３）ウェスタンブロッティング
MKN45またはRGK45を、60 mm dishに106 cellの濃度で播種し、一晩培養した。培養後、MKN45を10 U/mLのEPOを添加し、24時間培養した。RGK45は0, 0.01, 0.1, 1, 10 U/mLのEPO含有培地で24時間培養した。24時間後、細胞はPBSで三回洗浄し1% Protease Inhibitor Cocktail（Thermo, 78415）含有RIPA bufferで細胞溶解液を調整した。その後15000 rpmで15分間遠心処理し、上清をサンプルとした。サンプルは2倍希釈したNuPAGE LDS Sample Buffer（Thermo, NP0007）に2-mercaptoethanolを5%含有させたバッファーと1:1で混合し、95度で5分間ボイルした。その後サンプルは氷上で静置し、4-12% NuPAGE Bis-Tris Precast Gel（Thermo, NP0323BOX）を用いて100 Vで70分間電気泳動した。電気泳動後、PVDFメンブレン（BioRad, 1620177）を用いて1.2 mA/cm2で1時間転写した。転写後、TBSTで洗浄し、PVDF Blocking Reagent（TOYOBO, NYPBR01）で1時間ブロッキングした。ブロッキング後15分間TBSTで3回洗浄した。その後、Solution 1（TOYOBO, NKB-101）を用いて一次抗体を1000倍希釈し、4℃の冷蔵庫で一晩静置した。一次抗体処理後、15分TBSTで3回洗浄した。その後Solution 2（TOYOBO, NKB-101）を用いて二次抗体を3000倍希釈し室温で1時間シェイクした。二次抗体処理後、15分TBSTで3回洗浄しHRPを用いてイメージングした。一次抗体、二次抗体のリストを表２に示す。
【表２】
2019083023.tif 000004
【００５５】
結果を図８及び９に示す。RGK45において、ABCG2、ABCB1及びABCC5の発現がEPOの濃度依存的に低下した（図８）。RGK45において、EPO曝露によりABCB1から排泄される抗癌剤であるPTXの細胞傷害性が増強されるが、この効果はEPO曝露によるトランスポーターの発現低下に起因すると考えられる。【００５６】
MKN45についても、EPO曝露によりABCG2及びABCB1の発現が低下した（図９）。DOXの排泄に関するABCG2とPTXの排泄に関するABCB1の発現が、EPO曝露により低下することから、EPO曝露による抗癌剤の増強効果は排泄トランスポーターの発現低下に起因していると考えられる。【００５７】
実施例６
エリスロポエチン（EPO）曝露後におけるDOXの癌細胞特異的傷害効果
（１）細胞培養
10％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシン含有DMEM/F12（Thermo、11330-032）を用いて、ラット正常胃粘膜細胞RGM1（RIKEN BRC、寄託番号RCB0876）を37℃、5%CO2環境下で培養した。また、10％FBS、ペニシリン及びストレプトマイシン含有DMEM/F12（Sigma-aldrich, D6421）を用いて、RGK45を37℃、5%CO2環境下で培養した。
（２）細胞増殖試験
RGM1及びRGK45を、96 well plate (日本ジェネティクス、TrueLine)に103 cell/wellの濃度で播種し、一晩培養した。培養後、10 U/mLのEPO（R&D systems, 1306-RE-010）を添加し、24時間培養した。24時間後、500nMのDOX（Wako, 169-18611）含有培地で24時間培養した。培養後、PBSで細胞を2回洗浄し、Cell Counting Kit-8 (Dojindo, CK04)を用いて細胞増殖試験を行った。【００５８】
結果を図１０に示す。EPO曝露によるDOXの細胞傷害効果は、癌細胞(RGK45)において有意に増強された。しかし、当該細胞傷害効果は正常細胞（RGM1）では生じないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明を利用することによって、抗癌剤に対して耐性となった癌に対しても抗癌剤を有効に作用させることができる。また、抗癌剤の効果を増強することができる。
【図１】
2019083023.tif 000005
【図２】
2019083023.tif 000006
【図３】
2019083023.tif 000007
【図４】
2019083023.tif 000008
【図５】
2019083023.tif 000009
【図６】
2019083023.tif 000010
【図７】
2019083023.tif 000011
【図８】
2019083023.tif 000012
【図９】
2019083023.tif 000013
【図１０】
2019083023.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月27日(2019.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
エリスロポエチンを含む、癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制するための組成物。
【請求項２０】
エリスロポエチンを含む、癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制するための組成物。
【請求項２１】
前記癌細胞が酸素欠乏状態になることで抗癌剤に対して抵抗性を示すことのできる細胞を除く癌細胞である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記癌細胞が酸素欠乏状態になることで抗癌剤に対して抵抗性を示すことのできる細胞を除く癌細胞である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現抑制方法であって、
対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
癌細胞からの抗癌剤の排出抑制方法であって、
抗癌剤の投与前に対象へエリスロポエチンを投与する工程
を含む、方法。
【請求項２７】
前記癌細胞が酸素欠乏状態になることで抗癌剤に対して抵抗性を示すことのできる細胞を除く癌細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌細胞が酸素欠乏状態になることで抗癌剤に対して抵抗性を示すことのできる細胞を除く癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
エリスロポエチンを含む、抗癌剤に対して不応となった獲得耐性癌を患う対象の癌細胞であって、酸素欠乏状態になることで当該抗癌剤に対して抵抗性を示すことのできる細胞を除く癌細胞における抗癌剤排出トランスポーターの発現を抑制するための組成物。
【請求項２０】
エリスロポエチンを含む、抗癌剤に対して不応となった獲得耐性癌を患う対象の癌細胞であって、酸素欠乏状態になることで当該抗癌剤に対して抵抗性を示すことのできる細胞を除く癌細胞からの抗癌剤の排出を抑制するための組成物。
【国際調査報告】
2019083023.tif 000015
2019083023.tif 000016
2019083023.tif 000017