(57)【要約】  開示の技術に係る産生物の製造方法は、培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とし、培養容器内における細胞単体の平均径をＡとした場合、培養容器内において、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合を５％以下とし、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とすることを含む。
2019049843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器に収容された細胞によって産生される産生物の製造方法であって、
前記培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とし、
前記培養容器内における細胞単体の平均径をＡとした場合、前記培養容器内において、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合を５％以下とし、
前記培養容器内において、細胞単体の径がＡ±Ａ／７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とする
製造方法。
【請求項２】
前記培養容器に収容された細胞に外力を与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減する
請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記培養容器内における細胞単体の径の標準偏差σをＡ／４以下とする
請求項１または請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記培養容器からポンプを用いて抜き出した細胞懸濁液を、細胞が濃縮された細胞濃縮液と、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体とに分離する分離処理を行う工程と、
前記細胞濃縮液を前記培養容器に戻す工程と、
前記培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、
を含み、
前記ポンプが、細胞懸濁液中に浮遊させた回転羽根を磁力によって回転させる磁気浮上型のポンプであり、前記ポンプが発生させる液流による外力を細胞に与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減する
請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記回転羽根の径をＤメートル、前記回転羽根の先端と前記回転羽根の周囲を囲う内壁との距離をＬメートル、前記回転羽根の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒、前記ポンプの送液圧力をＰパスカル、Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌとした場合、
２０００≦１００００Ｙ＋Ｐ≦８００００
３≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５．６
を満たす請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記回転羽根の径をＤメートル、前記回転羽根の先端と前記回転羽根の周囲を囲う内壁との距離をＬメートル、前記回転羽根の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒、Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌとした場合、
０．１≦Ｙ≦３
を満たす請求項４または請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ポンプの送液圧力をＰパスカルとした場合、
５００≦Ｐ≦８００００
を満たす請求項４から請求項６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記分離処理が中空糸膜による膜分離処理である
請求項４から請求項７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記中空糸膜が、精密濾過膜である
請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記膜分離処理がタンジェンシャルフローフィルトレーション方式である
請求項８に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記中空糸膜を透過した液を回収する回収工程を含む
請求項８から請求項１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記回収工程において回収された液を精製する工程を含む
請求項１１に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記培養容器に収容される細胞がＣＨＯ細胞である
請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記産生物が抗体である
請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の技術は、細胞から産生される産生物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞から産生される抗体を含むバイオ医薬品等の製造において、抗体の生産性を向上するため、培養容器から抗体を含む培地を連続的に抜き出す一方、新鮮な培地を連続的に培養容器に供給する灌流培養が知られている。【０００３】
灌流培養に関する技術として、例えば、特表２０１４−５０７９５９号公報には、平均細胞直径が増大したことに関連して、不十分な細胞増殖が観察されることが記載されている。【０００４】
また、Characterization and comparison of ATF and TFF in stirred bioreactors for continuous mammalian cell culture processes (Biochemical Engineering Journal 110(2016)17-26)には、磁気浮上型ポンプを使用した培養において、ＡＴＦ（Alternating Tangential Flow Filtration）ダイアフラム式往復ポンプと同等の培養結果が得られることが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
灌流培養によれば細胞の高濃度培養が可能となり、細胞から産生される抗体等の産生物の生産性が向上する。しかしながら、培養容器内における細胞の濃度が高まると、細胞のバイアビリティが低下したり、細胞から産生される産生物の品質が低下したりするといった問題がある。【０００６】
本発明の一つの実施形態は、細胞の高濃度培養による産生物の生産性を維持しつつ、産生物の品質を高める。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
開示の技術に係る産生物の製造方法は、培養容器に収容された細胞によって産生される産生物の製造方法であって、培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とし、培養容器内における細胞単体の平均径をＡとした場合、前記培養容器内において、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合を５％以下とし、培養容器内において、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とすることを含む。【０００８】
培養容器に収容された細胞に外力を与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減してもよい。培養容器内における細胞単体の径の標準偏差をＡ/４以下とすることが好ましい。【０００９】
開示の技術に係る産生物の製造方法は、培養容器からポンプを用いて抜き出した細胞懸濁液を、細胞が濃縮された細胞濃縮液と前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体とに分離する分離処理を行う工程と、前記細胞濃縮液を培養容器に戻す工程と、培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、を含み得る。上記のポンプが、細胞懸濁液中に浮遊させた回転羽根を磁力によって回転させる磁気浮上型のポンプであってもよく、ポンプが発生させる液流による外力を細胞に与えることにより、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を選択的に削減してもよい。【００１０】
ポンプの回転羽根の径をＤメートル、回転羽根の先端と回転羽根の周囲を囲う内壁との距離をＬメートル、回転羽根の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒、前記ポンプの送液圧力をＰパスカル、Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌとした場合、２０００≦１００００Ｙ＋Ｐ≦８００００且つ３≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５．６を満たすことが好ましい。Ｙは、ポンプの回転羽根の回転によって細胞懸濁液に作用するせん断応力に相当する。また、０．１≦Ｙ≦３を満たすことが好ましく、５００≦Ｐ≦８００００を満たすことが好ましい。【００１１】
分離処理は公知の方法により、細胞と産生物を分離することができる。例えば分離処理は、中空糸膜による膜分離処理であってもよく、中空糸膜が、精密濾過膜であってもよい。膜分離方処理は、タンジェンシャルフローフィルトレーション方式であってもよい。【００１２】
開示の技術に係る産生物の製造方法は、中空糸膜を透過した液を回収する回収工程を含み得る。更に、回収工程において回収された液を精製する工程を含み得る。培養容器に収容される細胞がＣＨＯ細胞であってもよく、細胞から産生される産生物が抗体であってもよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の一つの実施形態によれば、細胞の高濃度培養による産生物の生産性を維持しつつ、産生物の品質を高めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な磁気浮上型のポンプの構成の一例を示す図である。
【図２】開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置の構成の一例を示す図である。
【図３】開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法を実施した結果を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
開示の技術の実施形態に係る細胞によって産生される産生物の製造方法において、産生物を産生する細胞として用いられる細胞は、特に限定されないが、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。また本開示における細胞によって産生される産生物は、上記の細胞が培養液中に生産する物質であれば、特に限定されず、例えば、アルコール、酵素、抗生物質、組換えタンパク質、抗体などの物質が挙げられる。中でも産生物として、好ましくは、組み換えタンパク質、抗体であり、より好ましくは抗体である。
【００１６】
動物細胞に産生させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体及び抗VLA4抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ及びサル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体及びbispecific抗体など人為的に改変した抗体も含む。
【００１７】
得られた抗体又はその断片は、略均一にまで精製することができる。抗体又はその断片の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等
を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。
【００１８】
開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法において、細胞は、培地と共に培養容器に収容され、灌流培養方式によって培養される。すなわち、本実施形態に係る抗体の製造方法は、培養容器からポンプを用いて連続的に抜き出した細胞懸濁液を、細胞が濃縮された細胞濃縮液と、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体とに分離する分離処理を行う工程と、分離処理によって得られた細胞濃縮液を培養容器に戻す工程と、培養容器内に新鮮培地を供給する工程と、分離処理において分離された、前記細胞懸濁液よりも低い細胞濃度を有する液体を回収する工程と、回収された該液体に含まれる抗体を精製する工程と、を含む。
【００１９】
本発明者らは、上記の各工程を含む灌流培養において、培養容器内の細胞の濃度を所定範囲に維持すると共に、培養容器内の過剰に成長した細胞（以下、過剰成長細胞という）の個数割合を所定値以下にすることで、培養細胞において高い生存率を維持して高濃度培養による抗体の生産性を維持しつつ、抗体の品質を向上できることを見出した。
【００２０】
過剰成長細胞は、老化した細胞であり、正常細胞と比較して、抗体を産生する能力が低く、また、低品質の抗体を産生しやすい。従って、過剰成長細胞を選択的に除去して過剰成長細胞の個数割合を所定値以下にすることで、灌流培養による高い抗体生産能力を維持しつつ、抗体の品質を高めることができる。
【００２１】
また、培養容器に収容される細胞の濃度が高くなる程、細胞分裂が阻害され、過剰成長細胞が発生しやすくなり、また、細胞のバイアビリティの低下を招く。一方、培養容器に収容される細胞の濃度を低くすると、抗体の生産性が低下する。従って、培養容器に収容される細胞の濃度は、培養期間中、過剰成長細胞の増加及び細胞のバイアビリティの低下を抑制しつつ抗体の生産性を確保できる範囲にコントロールすることが好ましい。
【００２２】
具体的には、培養期間中、培養容器内における細胞の濃度を、３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上３×１０８ｃｅｌｌｓ/ｍｌ以下の範囲に維持することが好ましく、４×１０７
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下がより好ましく、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下が更に好ましく、６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上１．２×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下が最も好ましい。
【００２３】
培養容器内における細胞の濃度を３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上とすることで、抗体の生産性を確保することができる。また、細胞径の推移の観察が容易となる。一方、培養容器内における細胞の濃度を３×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下とすることで、細胞の濃度過多による細胞のバイアビリティの低下及び細胞から産生される抗体の品質低下を抑制することができる。培養容器内における細胞の濃度は、例えば、培養期間中における適切なタイミングで培養容器１０内の細胞の一部を抜き取るセルブリード処理によって調整することが可能である。細胞の濃度については、公知の方法、例えば、オートアナライザーを用いて取得することもでき、光学顕微鏡を用いて取得することもできる。
【００２４】
上記のように、過剰成長細胞を選択的に除去し、培養期間中、培養容器に含まれる過剰成長細胞の個数割合を所定値以下にすることが好ましい。本開示の技術では、培養容器に収容された細胞単体の径の平均値をＡとした場合、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞を過剰成長細胞とする。培養期間中、培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合を５％以下とすることが好ましく、４％以下がより好ましく、３％以下が更に好ましく、０．０１％以上２．５％以下が最も好ましい。培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合が５％以下であることは、過剰成長細胞の除去が適切に行われていることを意味し、これにより抗体の生産能力を高めるとともに、抗体の品質を高めることができる。細胞単体の径や過剰成長細胞の個数割合については、例えば、オートアナライザーを用いて取得することもでき、光学顕微鏡を用いて取得した画像を処理することによって得ることもできる。
細胞単体の径の平均値Ａは、例えば、以下の式で求められる。
細胞単体の径の平均値Ａ＝細胞の径の和÷細胞の数
また培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合は以下の式で求められる。
培養容器内における径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数割合％＝（径が１．４×Ａ以上である過剰成長細胞の個数）÷（細胞の全個数）×１００
【００２５】
また、培養期間中、培養容器内における細胞単体の径の標準偏差σをＡ/４以下とすることが好ましく、Ａ／１００以上Ａ／５以下が更に好ましい。培養容器内における細胞単体の径の標準偏差σがＡ/４以下であることは、過剰成長細胞の排除が適切に行われていることを意味し、これにより、抗体の生産能力を高めるとともに、抗体の品質を高めることができる。
【００２６】
また、培養期間中、培養容器内において、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を５０％以上とすることが好ましく、５５％以上がより好ましく、６０％以上９５％以下が更に好ましい。細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合が５
０％以上であることは、培養容器内において正常な細胞が多く含まれ且つ細胞の均質性が高いことを意味し、これにより、抗体の品質を安定化させることができる。
培養容器内における細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合は以下の式で求められる。
培養容器内における細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合％＝（細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数）÷（細胞の全個数）×１００
【００２７】
また、培養期間中の少なくともいずれかの時点における培養容器内にける細胞の生存率は９０％以上であることが好ましく、９２％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９７％以上が最も好ましい。細胞の生存率とは、ある時点における培養容器内の全細胞のうち、生存している細胞の個数割合である。細胞の生存率を９０％以上とすることで、抗体の生産能力を高めることができる。
細胞の生存率は、公知の方法、例えば、オートアナライザーを用いて取得することもでき、光学顕微鏡を用いて取得することもできる。
【００２８】
上記の分離工程において行われる分離処理は、中空糸膜を用いた膜分離処理であってもよい。この場合、中空糸膜として精密濾過膜（ＭＦ膜）を用いることができる。膜分離処理の方式は、タンジェンシャルフロー方式であってもよい。タンジェンシャルフロー方式は、膜分離処理の対象となる液体を濾過膜の膜面に沿って流しながら、サイズの小さい成分を透過側に送る方式である。また、膜分離以外の分離処理方式として、例えば音波凝集法を用いることも可能である。音波凝集法を用いた細胞懸濁液の分離処理では、細胞懸濁液に音波を照射して細胞を凝集及び沈殿させることで、細胞懸濁液が細胞と上澄み液とに分離する。
【００２９】
過剰成長細胞は、正常な細胞よりも脆弱である。従って、細胞に適当な大きさの外力を与えることによって過剰成長細胞を選択的に破壊し、削減することができる。細胞に外力を与える手段として、細胞培養装置に設置されたポンプを用いることもできるし、超音波によって与えることもできる。細胞に外力を与えるためのポンプは、例えば、細胞懸濁液を培養容器から分離処理部に移送するためのポンプであってもよい。細胞に外力を与えるためのポンプは、例えば、磁気浮上型のポンプを好適に用いることができる。
またこれらの外力により、過剰成長した細胞に加え、細胞の凝集体をほぐし単一細胞にしたり、死細胞を破壊し、削減することもできる。これによっても細胞の増殖性やバイアビリティ、抗体品質の一定の改良効果も得られる。
【００３０】
図１は、本実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な磁気浮上型のポンプ２００の構成の一例を示す図である。ポンプ２００は、細胞懸濁液を吸入する吸入口２１１及び細胞懸濁液を排出する排出口２１２を有するケース２１０と、ケース２１０内に収容された回転羽根２２０と、回転羽根２２０の底部に設けられたロータ磁石２２１と、ロータ磁石２２１を回転させるステータ２３０と、ステータ２３０に巻回されたコイル２４０と、を含んで構成されている。コイル２４０に電流を流すことで、ステータ２３０に磁力が発生する。ケース２１０内において細胞懸濁液中に浮遊した回転羽根２２０は、ステータ２３０が発生させる磁力によって回転する。ステータ２３０が回転することで、細胞懸濁液は吸入口２１１から吸入され、排出口２１２から排出される。ポンプ２００は、回転羽根２２０を回転駆動させるための回転軸を有していないため、洗浄処理及び滅菌処理を行う際の作業負担を軽減できる。
【００３１】
ここで、回転羽根２２０の径をＤメートル（図１参照）、回転羽根２２０の先端と回転羽根２２０の周囲を囲うケース２１０の内壁との距離をＬメートル（図１参照）、回転羽根２２０の１秒間あたりの回転数をＲ、円周率をπ、細胞懸濁液の粘度をＸパスカル秒とすると、回転羽根２２０の回転によって細胞懸濁液に作用するせん断応力Ｙは、下記の（１）式によって概算することができる。なお、回転数とは、回転羽根の装置において設定された回転数を意味する。粘度については、液体の粘度測定方法 JIS Z 8803の方法に基づいて測定することができる。
Ｙ＝Ｘ×Ｄ×π×Ｒ／Ｌ  ・・・（１）
【００３２】
ポンプ２００の送液圧力をＰパスカルとすると、本開示の技術では、せん断応力Ｙと送液圧力Ｐとを重み付け加算した値を、ポンプ２００が発生させる液流によって細胞に加わる外力の指標値Ｆとして用いている。指標値Ｆは、下記の（２）式によって表わされる。Ｆ＝１００００Ｙ＋Ｐ  ・・・（２）
【００３３】
せん断応力Ｙに１００００倍の重み付けを行っているのは、過剰成長細胞の選択的な除去において、せん断応力Ｙの影響が、送液圧力Ｐの影響よりも大きいからである。過剰成長細胞は、正常な細胞と比較して、外力の印加によって破壊されやすく、（２）式によって示される指標値Ｆをコントロールすることで、正常な細胞へのダメージを抑制しつつ過剰成長細胞を破壊することができる。
【００３４】
過剰成長細胞の選択的な除去を行うためには、指標値Ｆについて、２０００≦Ｆ≦８００００を満たすことが好ましく、４０００≦Ｆ≦６００００がより好ましく、６０００≦Ｆ≦４００００が更に好ましく、７０００≦Ｆ≦３００００が最も好ましい。指標値Ｆを２０００以上とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。指標値Ｆを８００００以下とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。
【００３５】
また、指標値Ｆが上記の範囲内にある場合でも、せん断応力Ｙが過大である場合には、正常な細胞にダメージを与えるおそれがあり、また、ポンプの送液圧力Ｐを大きくするだけでは、過剰成長細胞の破壊が促進されないおそれがある。従って、指標値Ｆのみならず、せん断応力Ｙと送液圧力Ｐとの比率も併せてコントロールすることが好ましい。具体的には、３≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５．６を満たすことが好ましく、３．７≦ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）≦５が更に好ましい。ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）を３以上とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。ｌｏｇ１０（Ｐ／Ｙ）を５．６以下とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。
【００３６】
また、過剰成長細胞の選択的な除去を行うためには、せん断応力Ｙについて、０．１≦Ｙ≦３を満たすことが好ましく、０．２≦Ｙ≦２．５がより好ましく、０．２５≦Ｙ≦２が更に好ましい。せん断応力Ｙを０．１以上とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。せん断応力Ｙを３以下とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。
【００３７】
また、過剰成長細胞の選択的な除去を行うためには、送液圧力Ｐについて、５００≦Ｐ≦８００００を満たすことが好ましく、１５００≦Ｐ≦５００００がより好ましく、３０００≦Ｐ≦３００００が更に好ましい。送液圧力Ｐを５００以上とすることで、過剰成長細胞を効率的に破壊することができる。送液圧力Ｐを８００００以下とすることで、正常な細胞へのダメージを抑制することができる。
【００３８】
図２は、開示の技術の実施形態に係る抗体の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置１００の構成の一例を示す図である。
【００３９】
細胞培養装置１００は、細胞を培地とともに収容する培養容器１０と、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施すフィルタ膜２４を有するフィルタ部２０と、フィルタ膜２４によって阻止された成分を培養容器１０に戻す流路５２と、フィルタ膜２４を透過した成分が通過する流路５３と、流路５３に接続された回収タンク４０とを有する。
【００４０】
培養容器１０の内部には、撹拌翼１１を有する撹拌装置が設けられている。撹拌翼１１を回転させることで、培養容器１０の内部に収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。
【００４１】
流路５１は、一端が培養容器１０の底部に接続され、他端がフィルタ部２０の流入口２０ａに接続されている。流路５１の途中には、培養容器１０に収容されている細胞懸濁液を抜き出して、フィルタ部２０に送るポンプＰＵ１が設けられている。ポンプＰＵ１は、過剰成長細胞の選択的な除去を行うための、細胞への外力の印加手段として用いられる。すなわち、細胞懸濁液を培養容器１０からフィルタ部２０に移送する間に、ポンプＰＵ１が発生させる液流による外力が細胞に加わることで、過剰成長細胞が選択的に破壊される。ポンプＰＵ１として、図１に示す磁気浮上型のポンプ２００を用いることができる。この場合、細胞懸濁液に作用するせん断応力Ｙは、回転羽根２２０の径Ｄ、回転羽根２２０の先端と回転羽根２２０の周囲を囲うケース２１０の内壁との距離Ｌ、及び回転羽根２２０の１秒間あたりの回転数Ｒによって調整することが可能である。送液圧力ＰはポンプＰＵ１とフィルタ部２０との間に設置された圧力計６０によって測定することが可能である。ポンプＰＵ１の送液圧力Ｐは、流路５２上に設けられたピンチバルブＶの開度によって調整することが可能である。
【００４２】
フィルタ部２０は、容器２１と、容器２１内の空間を供給側２２と透過側２３とに隔て、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施すフィルタ膜２４と、を備える。また、フィルタ部２０は、供給側２２において、細胞懸濁液が流入する流入口２０ａと細胞懸濁液が流出する流出口２０ｂとを有する。培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液は、流入口２０ａから容器２１の内部に流入して流出口２０ｂから容器２１の外部に流出する間にフィルタ膜２４上を通過する。フィルタ部２０は、膜分離処理の対象となる液体をフィルタ膜２４の膜面に沿って（膜面と平行な方向に）流しながら、サイズの小さい成分を透過側２３に送るタンジェンシャルフロー方式による膜分離処理を行う。タンジェンシャルフロー方式による膜分離処理は、培養容器１０から抜き出された細胞懸濁液がフィルタ膜２４の膜面に沿って平行に一方向に循環する流れを形成するものであってもよいし、細胞懸濁液がフィルタ膜２４の膜面に沿って往復する流れを形成するものであってもよい。循環する流れを形成する場合、例えばスペクトラムラボラトリーズ社のKrosFlo灌流培養フローパス装置（KML-100、KPS-200、KPS-600）やＬｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖシリーズを好適に用いることができる。また往復する流れを形成する場合、REPLIGEN社のATFsystemを好適に用いることができる。
【００４３】
細胞懸濁液に含まれる細胞は、フィルタ膜２４を透過せず、流出口２０ｂから容器２１の外部に流出し、流路５２を介して培養容器１０の内部に戻される。一方、細胞懸濁液に含まれる抗体は、フィルタ膜２４を透過して、透過側２３に設けられた排出口２０ｃから容器２１の外部に排出される。透過側２３には、ポンプＰＵ２が設けられた流路５３が接続されており、透過側２３に透過した抗体を含む透過液は、流路５３を介して回収タンク４０に回収される。なお、ポンプＰＵ２は、図１に示す磁気浮上型のポンプ２００であってもよい。
【００４４】
フィルタ膜２４として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器１０内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができ、培養容器１０内における細胞の増殖性を高めることができる。
【００４５】
また、フィルタ膜２４として、中空糸膜を用いることができる。中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減できる。また、フィルタ膜２４に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減できる。これらにより、細胞のロスを低減できる。
【００４６】
フィルタ膜２４を透過し、回収タンク４０に回収された透過液に含まれる抗体は、流路５６を介して、抗体の精製を行う精製処理部（図示せず）に送られる。
【００４７】
細胞培養装置１００は、新鮮な培地を培養容器１０に供給するための流路５４と、流路５４の途中に設けられたポンプＰＵ３を有する。ポンプＰＵ３は、図１に示す磁気浮上型のポンプ２００であってもよい。
【００４８】
培養容器１０内の細胞の濃度が過度に高くなることを防止するために、培養期間中における適切なタイミングで培養容器１０内の細胞の一部を抜き取るセルブリード処理が行われる。セルブリード処理において、培養容器１０内の細胞は、流路５５を介して培養容器１０の外部に排出される。
【００４９】
なお、図２に示す細胞培養装置１００は、分離処理をフィルタ部２０による膜分離処理によって行うものであるが、フィルタ部２０を、音波凝集法による分離処理を行う処理部に置き換えることも可能である。
【００５０】
［実施例］
図２に示す細胞培養装置１００を用いて互いに異なる複数の条件下で灌流培養方式によって細胞培養を行うことで、抗体を製造する実験を行った。各条件の内容及び各条件に対応する細胞の生存率に関する評価結果、及び得られた抗体の品質に関する評価結果を図３に示す。なお、実施例１３では、フィルタ部２０による膜分離処理に代えて、音波凝集法による分離処理を行った。
【００５１】
＜実験方法＞
培養容器１０に新鮮な培地を１０Ｌ注入し、３７℃で１日間コンディショニングを行った。
培養容器１０内の細胞濃度が１．０×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように細胞を播種した。実施例１〜１５及び比較例１〜５においてＣＨＯ細胞を使用した。
ポンプＰＵ１を所定の条件で駆動し、分離処理部（フィルタ部２０または音波凝集による分離処理部）に細胞懸濁液を送り、分離処理によって得られた透過液または上澄み液を、１５Ｌ／ｄａｙの割合で連続的に引き抜くとともに、培養容器１０内の液量が１０Ｌを維持するように、新鮮な培地を連続的に供給した。
培養容器１０内の細胞の濃度が所定値に達するまで培養を継続し、その後、細胞の濃度が所定値を保つように培養容器１０から細胞懸濁液を連続的に抜き出した。
培養容器１０内の細胞の濃度が所定値に達してから１０日目に培養容器１０内の細胞懸濁液及び分離処理によって得られた透過液または上澄み液からサンプルを得て、細胞の生存率及び抗体品質に関する評価を行った。
【００５２】
＜各種条件＞
培養容器１０から細胞懸濁液を抜き出すためのポンプＰＵ１として、磁気浮上型ポンプ（実施例１〜１５、比較例１〜５）及びダイアフラム往復ＡＴＦポンプ（比較例１）を使用した。磁気浮上型ポンプは、Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖｉ３０ＳＵ、ｉ１００ＳＵ、６００ＳＵ、２０００ＳＵを用いた。回転羽根の径Ｄ、及び回転羽根の先端と回転羽根の周囲を囲う内壁との距離Ｌが、図３に示す各値となるように、回転羽根を適宜加工した。ポンプ［１］は、ｉ１００ＳＵである。ポンプ［２］は、ｉ１００ＳＵの回転羽根を加工したものである。ポンプ［３］はｉ３０ＳＵの回転羽根を加工したものである。ポンプ［４］は、６００ＳＵの回転羽根を加工したものである。ポンプ［５］は、２０００ＳＵの回転羽根を加工したものである。ダイアフラム往復ＡＴＦポンプは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製のＡＴＦ２を用いた。
磁気浮上型ポンプの回転羽根の１秒間あたりの回転数Ｒ、及び送液圧力Ｐが図３に示す各値となるように調整した。送液圧力Ｐは、ピンチバルブＶの開度によって調整した。せん断応力Ｙは、（１）式を用いて算出した。
分離処理は、中空糸型ＭＦ膜による膜分離法（実施例１〜１２、１４、１５、比較例１〜５）及び音波凝集法（実施例１３）により行った。
中空糸型ＭＦ膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社の０．２μｍ孔径の
ＰＥＳ（ポリエーテルスルフォン）フィルタＳ０６−Ｐ２０Ｕ−１０−Ｓを用いた。音波凝集はＡｐｌｉｋｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ社のＢｉｏｓｅｐ Ａｃｏｕｓｔｉｃ 
Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。
【００５３】
＜測定＞
培養容器１０内の細胞の濃度が所定値に達してから１０日目に培養容器１０内の細胞懸濁液を抜き取り、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＣｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａ
ｎａｌｙｚｅｒ Ｖｉ-ＣＥＬＬ ＸＲを用いて、細胞の濃度、細胞の生存率及び細胞の径
を測定した。なおＶｉ−ＣＥＬＬのソフトはＶｉ-ＣＥＬＬ ＸＲ２．０４を用い、測定時のパラメータは以下のように設定した。
Ｍｉｎ ｄｉａｍｅｔｅｒ：６μｍ
Ｍａｘ ｄｉａｍｅｔｅｒ：５０μｍ
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ：細胞濃度が１００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下ではサンプルは希釈せず、Ｄｉｌｕｔｉｏｎは１で測定。細胞濃度が１００×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上ではサンプルを１０倍希釈した上でＤｉｌｕｔｉｏｎは１０で測定。
Ｃｅｌｌ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：８５％
Ｃｅｌｌ ｓｈａｒｐｎｅｓｓ：１００
Ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｓｐоｔ ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ：７５％
Ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｓｐоｔ ａｒｅａ：５％
Ｍｉｎｉｍｕｍ ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ：０
Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒ ｄｅｇｒｅｅ：Ｍｅｄｉｕｍ
細胞単体の平均径ＡについてはＶｉ−ＣＥＬＬの出力値を用いた。細胞単体の径の標準偏差σ、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞の個数割合、細胞単体の径がＡ±Ａ／７の範囲にある細胞の個数割合についてはＶｉ−ＣＥＬＬから出力される細胞の径と、個数のデータから算出した。
細胞懸濁液の粘度については、細胞懸濁液を３７℃に保った状態で、エー・アンド・デイ社の音叉振動式粘度計ＳＶ−１０により測定した。
Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＫｒｏｓＦｌｏデジタル圧力モニタ
（ＡＣＰＭ−２０１−０１Ｎ）を、ポンプＰＵ１の排出口の直後に設置し、ポンプＰＵ１の送液圧力Ｐを測定した。
抗体品質として、サイズ排除クロマトグラフィーにより、抗体の分解・凝集状態を以下のような手順で評価した。
（１）分離処理によって得られた透過液または上澄み液７ｍｌにＡｂ Ｃａｐｃｈｅｒ Ｅｘｔｒａ（プロテノバ株式会社）１００μｌを加え３０ｍｉｎ静置した。
（２）得られた液を遠心分離し、上清液は廃却し、沈殿したゲルを回収した。
（３）２ｍｌのマイクロチューブにセットしたマイクロバイオスピンカラム６（バイオ・ラッド社）内に得られたゲルを入れ、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ２．８））４００μｌをカラムに加え遠心分離した。
（４）カラムを通過しチューブ内に溜まった液内に、中和バッファー（１．０Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ９．０）を３０μｌ添加し中和した。
（５）得られた中和液をアミコンウルトラ３０ｋＤａ（メルク株式会社）を用い、リン酸緩衝生理食塩水８０％と超純水２０％の混合液にバッファー交換し、抗体濃度が５ｍｇ／Ｌになるよう調製した。
（６）上記調製液を東ソー社製のＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって抗体のサイズ分布を測定し、メインピークの割合を算出した。メインピークの割合が大きい程、透過液または上澄み液に含まれる抗体が高品質であることを示す。
【００５４】
＜評価＞
細胞の生存率に関する評価判定基準は以下のとおりである。
Ａ：細胞の生存率が９７％以上である。
Ｂ：細胞の生存率が９５％以上であり、９７％未満である。
Ｃ：細胞の生存率が９２％以上であり、９５％未満である。
Ｄ：細胞の生存率が９０％以上であり、９２％未満である。
Ｅ：細胞の生存率が９０％未満である。
【００５５】
サイズ排除クロマトグラフィーによって得られたメインピークの割合に関する評価判定基準は以下のとおりである。
Ａ：メインピークの割合が９９％以上である
Ｂ：メインピークの割合が９７％以上であり、９９％未満である。
Ｃ：メインピークの割合が９５％以上であり、９７％未満である。
Ｄ：メインピークの割合が９５％未満である
【００５６】
培養容器１０内における細胞単体の平均径をＡとした場合、比較例１〜５は、細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合が５０％未満であり、細胞単体の径の標準偏差σがＡ/４よりも大である点が、実施例１〜実施例１５と異なる。比較例３及び５において、細胞の生存率に関する評価が、どちらもＥ判定（９０％未満）となった。比較例１〜５において、サイズ排除クロマトグラフィーによって得られたメインピークの割合に関する評価が、いずれもＤ判定（９５％未満）となった。比較例１〜５では、過剰成長細胞の選択的な除去が不十分であり、これに起因して、抗体の品質が低下したものと考えられる。
【００５７】
一方、実施例１〜１５において、細胞の生存率に関する評価が、Ａ判定、Ｂ判定、Ｃ判定及びＤ判定のいずれかとなり、サイズ排除クロマトグラフィーによって得られたメインピークの割合に関する評価が、Ａ判定、Ｂ判定及びＣ判定のいずれかとなった。実施例１〜１５では、過剰成長細胞の選択的な除去が適切に行われ、これによって細胞の生存率が高まり、また、抗体の品質が向上したものと考えられる。すなわち、実施例１〜１５において、細胞の高濃度培養による産生物（抗体）の生産性を維持しつつ、産生物（抗体）の品質を高めることができた。特に、過剰成長細胞の選択的な除去を行うことによって、細胞単体の径が１．４×Ａ以上の細胞（すなわち過剰成長細胞）の個数割合を２．５％以下とし、且つ細胞単体の径がＡ±Ａ/７の範囲にある細胞の個数割合を６０％以上とした実施例１〜実施例５及び実施例１４〜実施例１５では、細胞の生存率に関する評価及びメインピークの割合に関する評価がいずれもＡ判定となった。
【００５８】
本出願は、２０１７年９月６日出願の日本出願である特願２０１７−１７１３３１及び２０１７年１１月１０日出願の日本出願である特願２０１７−２１７３９５の優先権を主張するものであり、この出願の全内容は参照により本明細書に取り込まれる。また本明細書に記載された全ての文献、特許出願及び技術規格は、個々の文献、特許出願及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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