(57)【要約】  細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、
細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、
第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、
前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、
前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である、
細胞培養装置。
【請求項２】
前記第１培養液を貯留する第１導入用培養液貯留室と、前記第１導入用培養液貯留室に貯留された前記第１培養液を前記内面側空間に導く第１培養液導入流路と、前記内面側空間に貯留された前記第１培養液を排出する第１培養液排出流路と、前記第１培養液排出流路を経た前記第１培養液が導入される第１排出用培養液貯留室と、をさらに有し、
前記内面側空間は、前記第１培養液導入流路から導入された前記第１培養液が前記第１培養液排出流路に向けて流通可能である、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記第１排出用培養液貯留室に貯留された前記第１培養液を前記第１導入用培養液貯留室に送る第１培養液返送流路をさらに有する、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記第１導入用培養液貯留室から前記内面側空間および前記第１排出用培養液貯留室を経て前記第１導入用培養液貯留室に戻る循環流れとは逆の方向の前記第１培養液の流れを規制する逆流防止機構をさらに備えている、請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記逆流防止機構は、前記循環流れとは逆の方向の気体の流れを阻止するラプラス弁である、請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記第２培養液貯留室に貯留された前記第２培養液を前記外面側空間に導く第２培養液導入流路と、前記外面側空間に貯留された前記第２培養液を排出する第２培養液排出流路と、前記第２培養液排出流路を経た前記第２培養液が導入される第２排出用培養液貯留室と、を有する、請求項２〜５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記第１導入用培養液貯留室と、前記第１排出用培養液貯留室と、前記第２培養液貯留室である第２導入用培養液貯留室と、前記第２排出用培養液貯留室とのうち少なくともいずれか１つに、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記培養室のうち少なくとも２つ、または、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記第２培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに接続されている、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記隔膜は、親水性を有する高分子を主成分とし、２価以上の架橋点を有する架橋剤で架橋されたハイドロゲルで構成されている、請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記架橋剤は、ポリエチレングリコールを主鎖とする、請求項９に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記隔膜における前記細胞が接着可能な前記第１面は、細胞接着性を有するタンパク質によってコーティングされている、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記高分子は、ゼラチンである、請求項９または１０に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記ハイドロゲルは、ジベンゾシクロオクチンとアジド基との反応によって得られるゲルである、請求項９または１０に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記隔膜は、保管時には乾燥状態であり、培養時には前記第１培養液および前記第２培養液に触れることで膨潤する、請求項９または１０に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記隔膜の厚みは、０．１〜１００μｍである、請求項１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記内面側空間と前記外面側空間のうち少なくともいずれか一方の圧力を調整する圧力調整部をさらに備えている、請求項１〜１５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
細胞培養方法であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である細胞培養装置を準備し、
前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記内面側空間と前記外面側空間とのうち少なくともいずれか一方の圧力を調整することによって、前記隔膜を伸縮により厚さ方向に変位させる、
細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置および細胞培養方法に関する。
本願は、２０１７年９月１３日に日本に出願された特願２０１７−１７６１３８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品や化成品の薬効や毒性、および吸収、分布、代謝、排泄といった体内動態を、培養細胞を用いて評価するため、隔膜を用いた細胞培養装置が用いられている（例えば、特許文献１〜３および非特許文献１を参照）。特許文献１には、隔膜上で細胞を培養し、隔膜上の流路と隔膜下の流路に隣接する動作チャネルへの加減圧によって隔膜を伸縮させて培養する装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】日本国特開２０１４−７３１２５号公報
【特許文献２】米国特許第８６４７８６１号明細書
【特許文献３】日本国特開２０１４−５０６８０１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】D. Huh, B. D. Matthews, A. Mammoto, M. Montoya-Zavala, H. Y. Hsin and D. E. Ingber, Science, 2010, 328, 1662-1668.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載の細胞培養装置では、隔膜上および隔膜下の流路の壁の加工が複雑となる。また、この装置では、１つの隔膜を動作するためには、隔膜上の流路と、隔膜下の流路と、動作チャネルとの少なくとも３つの流路を必要とする。そのため、多くの隔膜を同時に駆動するためには多数の動作チャネルと動作チャネルを駆動するための圧力ラインが必要となる。
一般的に医薬品や化成品の薬効や毒性の評価のためには多数の候補化合物の影響を広い濃度範囲で検討する必要があるため、同時に評価可能なアッセイ条件数（アッセイスループット）が多い事が好ましい。このため、一般的な二次元培養においては９６ウェルプレートや３８４ウェルプレートが使用される事が多い。従って特許文献１に記載の細胞培養装置においても、多くの隔膜を同時に駆動し、多数のアッセイ条件を同時に評価することが好ましいが、特許文献１ではそれを実現できていない。【０００６】
本発明は、簡略な構造であって、操作の容易でスループットの向上が容易な細胞培養装置および細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様に係る細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である。【０００８】
前記第１培養液を貯留する第１導入用培養液貯留室と、前記第１導入用培養液貯留室に貯留された前記第１培養液を前記内面側空間に導く第１培養液導入流路と、前記内面側空間に貯留された前記第１培養液を排出する第１培養液排出流路と、前記第１培養液排出流路を経た前記第１培養液が導入される第１排出用培養液貯留室と、をさらに有し、前記内面側空間は、前記第１培養液導入流路から導入された前記第１培養液が前記第１培養液排出流路に向けて流通可能であってよい。
前記第１排出用培養液貯留室に貯留された前記第１培養液を前記第１導入用培養液貯留室に送る第１培養液返送流路をさらに有していてもよい。
前記第１導入用培養液貯留室から前記内面側空間および前記第１排出用培養液貯留室を経て前記第１導入用培養液貯留室に戻る循環流れとは逆の方向の前記第１培養液の流れを規制する逆流防止機構をさらに備えていてもよい。
前記逆流防止機構は、前記循環流れとは逆の方向の気体の流れを阻止するラプラス弁であってもよい。
前記第２培養液貯留室に貯留された前記第２培養液を前記外面側空間に導く第２培養液導入流路と、前記外面側空間に貯留された前記第２培養液を排出する第２培養液排出流路と、前記第２培養液排出流路を経た前記第２培養液が導入される第２排出用培養液貯留室と、を有していてもよい。
前記第１導入用培養液貯留室と、前記第１排出用培養液貯留室と、前記第２培養液貯留室である第２導入用培養液貯留室と、前記第２排出用培養液貯留室とのうち少なくともいずれか１つに、播種された細胞が保持される細胞保持部を有していてもよい。
前記複数の前記細胞培養ユニットを有し、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記培養室のうち少なくとも２つ、または、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記第２培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに接続されていてもよい。
前記隔膜は、親水性を有する高分子を主成分とし、２価以上の架橋点を有する架橋剤で架橋されたハイドロゲルで構成されていてもよい。
前記架橋剤は、ポリエチレングリコールを主鎖としてもよい。
前記隔膜における前記細胞が接着可能な前記第１面は、細胞接着性を有するタンパク質によってコーティングされていてもよい。
前記高分子は、ゼラチンであってもよい。
前記ハイドロゲルは、ジベンゾシクロオクチンとアジド基との反応によって得られるゲルであってもよい。
前記隔膜は、保管時には乾燥状態であり、培養時には前記第１培養液および前記第２培養液に触れることで膨潤してもよい。
前記隔膜の厚みは、０．１〜１００μｍであってもよい。
前記内面側空間と前記外面側空間のうち少なくともいずれか一方の圧力を調整する圧力調整部をさらに備えていてもよい。【０００９】
本発明の第二態様に係る細胞培養方法は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である細胞培養装置を準備し、前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記内面側空間と前記外面側空間とのうち少なくともいずれか一方の圧力を調整することによって、前記隔膜を伸縮により厚さ方向に変位させる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の上記態様によれば、内面側空間と外面側空間との圧力差に応じて変位可能な隔膜を有するため、伸縮刺激を与えつつ細胞の培養を行うことができる。そのため、例えば、医薬品候補物質などの被検体を評価するにあたって、例えば腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞を生体内に近い環境下で培養できる。よって、被検体を正確に評価することができる。
本発明の上記態様によれば、隔膜を伸縮動作させるための流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第１実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図２】（Ａ）図１の細胞培養装置の一部を拡大して示す概略図である。（Ｂ）隔膜の動作を示す説明図である。（Ｃ）隔膜の動作を示す説明図である。
【図３】図１の細胞培養装置の一部を模式的に示す斜視図である。
【図４】図１の細胞培養装置の変形例を示す概略図である。
【図５】第２実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図６】第３実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図７】第４実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図８】第５実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図９】第６実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図１０】第７実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図１１】ラプラス弁の説明図である。（Ａ）ラプラス弁が設けられた液体貯留室の部分拡大図である。（Ｂ）ラプラス弁を介して下流口から連絡流路に培地が流入する場合の模式図である。（Ｃ）下流口に空気が流入した際に、ラプラス弁が機能している際の模式図を示す。
【図１２】隔膜の一例を模式的に示す断面図である。
【図１３】隔膜の作製方法を示す工程図である。
【図１４】隔膜の作製方法を示す工程図である。
【図１５】隔膜の作製方法を示す工程図である。
【図１６】隔膜の動作を示す写真である。
【図１７】隔膜の動作を示す写真である。
【図１８】隔膜の動作を示す写真である。
【図１９】（Ａ）細胞を示す写真である。（Ｂ）生細胞を示す写真である。（Ｃ）死細胞を示す写真である。（Ｄ）生細胞と死細胞とを合わせて示す写真である。
【図２０】ゲル薄膜（隔膜）および細胞の写真である。
【図２１】試験結果を示すグラフである。
【図２２】ゲル薄膜（隔膜）を構成する物質の一例であって、クリック架橋型架橋剤ＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧおよびアジド修飾ゼラチンの分子構造の模式図である。なお、図２２においてＲ２がゼラチン分子の主鎖を示す。
【図２３】ゲル薄膜（隔膜）を構成する物質の一例であるＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧとアジド修飾ゼラチンとの間のクリック反応による架橋形成を示す図である。なお、図２３において、Ｒ１がＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧの主鎖側の部位を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（第１実施形態）
［細胞培養装置］
本発明の第一実施形態に係る細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である。
第１実施形態に係る細胞培養装置１０について、図面を参照して説明する。
図１は、細胞培養装置１０を模式的に示す概略図である。図２（Ａ）は、細胞培養装置１０の一部を拡大して示す概略図である。図２（Ｂ）および図２（Ｃ）は、隔膜の動作を示す説明図である。図３は、細胞培養装置１０の一部を模式的に示す斜視図である。
図１に示すように、細胞培養装置１０は、貯留槽１１を備えている。貯留槽１１は、容器状の槽本体１２と、蓋部１３とによって構成されており、１つの細胞培養ユニット９を形成する。
【００１３】
図１および図３に示すように、細胞培養ユニット９は、培養室１と、隔膜２と、培養液貯留室３（第２培養液貯留室）と、培養液流路４（第２培養液流路）と、を有する。
培養室１および培養液貯留室３は、貯留槽１１の槽本体１２に形成された凹部によって確保された空間であり、培養液（液体）を貯留可能である。
【００１４】
図１に示すように、培養室１は、主室１ｃと、主室１ｃの底面１ｅに形成された凹部１ｄと、を有する。主室１ｃの内部空間は内面側空間１ａである。凹部１ｄの内部であって隔膜２で区画される空間は外面側空間１ｂである。外面側空間１ｂは隔膜２の下方に位置している。培養室１は、内面側空間１ａに第１培養液Ｃ１を貯留可能である。
【００１５】
隔膜２は、培養室１内において、内面側空間１ａと外面側空間１ｂとを隔てている。隔膜２は、培養室１内において、凹部１ｄの底面より高い位置にあり、主室１ｃの底面１ｅに沿って、凹部１ｄの上部開口を塞ぐように設置することができる。隔膜２の内面２ａ（一方の面、第１面）は内面側空間１ａに面しており、外面２ｂ（他方の面、第２面）は外面側空間１ｂに面している。
【００１６】
隔膜２は、親水性を有する高分子を主成分とするハイドロゲルで構成されていることが好ましい。前記高分子としては、ゼラチンが好適である。ハイドロゲルは、例えば、ジベンゾシクロオクチンとアジド基の反応によって得られる。
隔膜２を構成するハイドロゲルは、２価以上の架橋点を有する架橋剤によって架橋されていることが好ましい。前記架橋剤は、例えば、ポリエチレングリコールを主鎖とする。
ポリエチレングリコールを主鎖とする架橋剤の使用により、生体適合性、親水性、吸水性、伸縮性に優れた隔膜２が得られる。
【００１７】
ポリエチレングリコールを主鎖とする架橋剤としては、直鎖型のポリエチレングリコールを主鎖とする２価の架橋剤を用いてもよいし、分岐型のポリエチレングリコールを主鎖とする４価や８価の架橋剤（多官能の架橋剤）を用いてもよい。主鎖となるポリエチレングリコールの分子量は５００〜５００万の範囲で選択可能であるが、隔膜２の物質透過性を確保するためには分子量５０００以上のポリエチレングリコールの使用が好ましい。
親水的な高分子であるポリエチレングリコールを主鎖とする架橋剤を用いてハイドロゲルを形成することで、乾燥させたハイドロゲルに培養液を添加した際に容易に膨潤させることができる。
【００１８】
具体的に、本実施形態に係る隔膜２は、例えば、以下に示すようなシクロオクチンとアジド基の反応によって得られるハイドロゲルで構成されていてもよい。
【００１９】
例えば、隔膜２として、ジベンゾシクロオクチンとポリエチレングリコールとを含む架橋剤（クリック架橋型架橋剤）として、ｄｉｂｅｎｚｏｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ  ｔｅｔｒａａｒｍ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  （ＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧ）と、アジド修飾ゼラチンと、を反応させることにより、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基とアジド基の間で生じるクリック反応により、一段階の反応で得られた細胞接着性のハイドロゲルを用いてもよい。
【００２０】
上記ＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧの分子構造を図２２に示す。
図２２に示したＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧは以下の性質を有する。
（１）基本骨格として多官能型ポリエチレングリコール（４ａｒｍＰＥＧ；分子量１０，０００前後）を有している。これにより、比較的水になじみやすい。
（２）分子末端にアジド基とクリック反応が可能なジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）基を４つ有している。
前記ＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧをアジド基で修飾された高分子と混合すると、ＤＢＣＯ基とアジド基がクリック架橋反応することで、複数の高分子がＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧを介して架橋し、ゲル化する（図２３）。
したがって、「クリック架橋型架橋剤の水溶液」と「アジド基を有する高分子の水溶液」とを混ぜるだけでゲルを形成することができる。
【００２１】
本実施形態に係る隔膜２の調製に用いるクリック架橋型架橋剤（後述する、ハイドロゲルを構成する化合物Ａ）は、上述のＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧに限られるものではない。
本実施形態に係るクリック架橋型架橋剤は、上述の(１)水溶性の基本骨格、(２)複数の「アジド基とクリック架橋反応する基」という２つの特性を有していてもよい。
ここで、（１）基本骨格の水溶性とは、常温から０度の温度において水又は中性近傍の緩衝液に１０質量％以上溶解し得ることを指す。
具体的な水溶性は、基本骨格となる化合物又は基本骨格を含む化合物Ａを１−１００ｍｇ／ｍＬ程度の濃度でＨＥＰＥＳバッファー等の緩衝液（ｐＨ７．０−７．６）中に分散させ、溶解し得るかを目視で検討する等で判断することができる。
また、具体的に水溶性である基本骨格の構造としては、基本骨格の一部が水溶性基に置換されている等であってもよい。
（２）アジド基とクリック架橋反応するとは、アジド基と容易かつ特異的に架橋する反応を起こし得る基である。特にアジド基とアルキンの縮合が挙げられる。本実施形態では、具体的には、シクロアルキン又はアザシクロアルキン等がこのような性質を有し、本実施形態では、シクロオクチン環又はアザシクロオクチン環を有する構造が好ましく挙げられる。
【００２２】
例えば、直鎖型ないし３分岐以上の分岐型のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の両末端ないし分岐末端に配置されたジベンゾシクロオクチン基などの基と、を含む架橋剤であれば、本実施形態に係るクリック架橋型架橋剤として、使用可能である。
主鎖の分岐数は、４分岐又は８分岐であってもよい。また、主鎖はネオペンチル骨格を有していてもよい。
このような化合物としては、具体的には、例えば、以下の一般式(１)の化合物が挙げられる。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子、−Ｌ１−Ｚ１基、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｌ１−Ｚ１基、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。
複数のＡ１は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキレン基を表し、前記アルキレン基中の１個又は非隣接の２個以上の−ＣＨ２−はそれぞれ独立して−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はシクロヘキシレン基によって置換されていてもよい。前記−ＣＨ２−の数は２〜５０であってもよい。
ｐは０又は１以上の整数を表し、複数存在するＲ２及びＲ４は同一でも異なってもよい。ｐは０〜５０であってもよい。
Ｒ１〜Ｒ４のうちの少なくとも２つ、好ましくは３つ以上のＲが−Ｌ１−Ｚ１基を含み、２つ以上のＲが−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｌ１−Ｚ１基であることが好ましい。Ｒが−Ｌ１−Ｚ１基を３つ以上含むことで、架橋剤と高分子化合物との間に形成される架橋剤１分子当たりの架橋点が十分に多くなり、形成したハイドロゲルの強度を高めることができる。
エチレングリコールの平均繰返し数ｎは、２０から５００の範囲にあってよく、３０から２５０の範囲にあってよく、４０から１２５の範囲にあってもよい。
エチレングリコールの上記平均繰り返し数は、ゲル濾過クロマトグラフィーや質量分析によって分子量を測定し、ＮＭＲによってＲ１〜Ｒ４基の数を推定することで推定することができる。
Ｌ１は、単結合又はエチレングリコール若しくはＡ１を結合させる反応形式に応じて導入されるリンカーを表す。Ｌ１の例としては、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、カルボニル基、チオエステル結合、またはカルバメート結合、アルキル基等、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
Ｚ1は、シクロオクチン環若しくはアザシクロオクチン環を有する基を表す。シクロオクチン環およびアゾシクロオクチン環中のアルキン基はアジド基に対する反応性が高く、銅触媒等の触媒を用いることなく、アジド基とクリック反応することができる。このようなシクロオクチン環若しくはアザシクロオクチン環を有する基としては、下記一般式（４）〜（７）で表される基を用いてもよい。
【００２５】
【化２】
2019054287.tif 000004
【００２６】
前記一般式（４）〜（７）中、＊はリンカー基Ｌ１との結合位置を表す。又、式中のＦはフッ素原子を、Ｍｅはメチル基を指す。
Ｌ1は、Ｚ１基とＡ１基を連結するリンカーである。例えば、本願実施例で用いられるＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧにおいては、以下の式（８）で示される部分がＬ1に相当する。
【００２７】
【化３】
2019054287.tif 000005
【００２８】
上記式（８）の構造は、Ｚ１基とＡ１基を連結する際に用いた、それぞれＺ１基の構造とＡ１基の構造を有する原料化合物およびこれらの原料化合物を連結させる反応形式により定まったものである。
例えば、式（８）のＣＯ−側がＺ１基の＊に、Ｏ−側がＡ１基の＊に結合してもよいが、又は、式（８）のＣＯ−側がＺ１基の＊に、Ｏ−側がＡ１基の＊に結合してもよい。
これらの原料化合物及び反応形式は、原料化合物の入手しやすさ、及び、反応の容易さの観点から選択されたものであり、Ｌ１の構造は、このような観点からＺ１基とＡ１基を連結するのに適した構造であればよく、上記式（８）の構造に限られるものではない。  前記一般式（１）で表される化合物として、より具体的には、以下の一般式（９）〜（１１）の化合物が、好ましい化合物として挙げられる。以下の一般式（９）〜（１１）においては、各種パラメータは上述した一般式（１）の例と同様である。
【００２９】
【化４】
2019054287.tif 000006
【００３０】
【化５】
2019054287.tif 000007
【００３１】
【化６】
2019054287.tif 000008
【００３２】
本実施形態に係る隔膜２の調製に用いるハイドロゲルは、上述のクリック架橋型架橋剤（化合物Ａ）が、アジド修飾高分子、アジド修飾タンパク質（化合物Ｂ）によって、化合物Ｂが有するアジド基を介して修飾されていてもよい。
具体的には、下記化合物Ａのシクロオクチン環又はアザシクロオクチン環に含まれるアルキン基が下記化合物Ｂによって、前記化合物Ｂが有するアジド基を介して修飾されていてもよい。
アルキン基全体に対する修飾率は、１０〜１００％であってもよい。
このようなハイドロゲルは、例としては、クリック架橋型架橋剤の有する前記アルキン基と、下記アジド修飾タンパク質のアジド基とが縮合する反応によって得られる。
ハイドロゲル中のモル濃度として化合物Ａは０.６〜２．５ｍＭであってよく、化合物Ｂは１２．５〜２５.０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００３３】
アジド修飾タンパク質は、タンパク質を主鎖とし、前記主鎖のリジンおよびアルギニン側鎖に存在するアミノ基および主鎖末端に存在するアミノ基の少なくとも一部がアジド基で修飾されている化合物である。
このタンパク質は、細胞接着性を有するタンパク質であることが好ましい。
細胞接着性を有するとは、タンパク質が細胞外マトリックスとして細胞が付着しやすい性質、すなわち細胞接着活性部位であるアルギニンーグリシンーアスパラギン酸（ＲＧＤ）を多く含むことをいう。
このようなタンパク質の具体例としては、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン又はマトリゲル等が挙げられる。
本実施形態では、タンパク質としてゼラチンが好ましく挙げられる。
本実施形態に係るアジド修飾タンパク質は、ゼラチンがアジドで修飾されたアジド修飾ゼラチンが好ましい。
アジド修飾タンパク質の分子量は特に限定されず、適宜選択してよいが、目安として１０４〜１０５のものを用いることができる。
【００３４】
アジド修飾ゼラチン（以下、Ａｚｉｄｅ−ｇｅｌａｔｉｎと表記することもある）の分子構造の模式図を図１Ａに示す。Ａｚｉｄｅ−ｇｅｌａｔｉｎ  は、主鎖であるゼラチンの末端、リジンおよびアルギニン由来のアミノ基にアジド基が導入されている。
本実施形態に用い得るアジド修飾高分子は、上記Ａｚｉｄｅ−ｇｅｌａｔｉｎに限られるものではなく、分子内にアジド基を導入する基を複数有する高分子であれば、本実施形態に係る隔膜２に使用可能である。このような高分子としては、ゼラチン、コラーゲン、ラミニンなどの細胞接着性のタンパク質およびこれらのタンパク質を主成分とするマトリゲルなどの細胞培養基材を用いてもよい。
【００３５】
このようなジベンゾシクロオクチンとアジド基との反応によって得られるハイドロゲルを用いた隔膜２によれば、生体適合性、親水性、吸水性、伸縮性に優れ、隔膜２の面内方向における伸縮性、隔膜２の上下方向における弾性伸び変形性に優れる。
【００３６】
隔膜２は、内面側空間１ａと外面側空間１ｂとの圧力差により流体が透過可能である。
細胞２０は隔膜２を透過できない。
隔膜２は多孔質膜であってもよい。隔膜２の平均細孔径は例えば０．１μｍ〜１０μｍである。隔膜２の細孔の大きさは、液体は通過するが、細胞２０が通過できない大きさである。
【００３７】
図２（Ａ）に示すように、隔膜２は、隔膜２の面内方向に伸縮性を有する。換言すれば、隔膜２は、隔膜２の面内において、例えば、縦方向、横方向、斜め方向などに伸縮性を有する。含水時の隔膜２の伸び率（例えばＪＩＳ  Ｋ  ６２５１準拠）は、例えば１１０〜１０００％である。
隔膜２は、内面側空間１ａと外面側空間１ｂとの圧力差に応じて変形し、少なくとも一部が伸縮により隔膜２の厚さ方向に変位可能である。隔膜２は、周縁部が培養室１の底面１ｅまたは凹部１ｄ内面に固定されている。
【００３８】
隔膜２の中央部を含む部分は厚さ方向（図２（Ａ）における上下方向）に変位可能である。図２（Ａ）に示すように平坦な形状では隔膜２は伸び変形していないが、図２（Ｂ）および図２（Ｃ）に示すように、隔膜２が上方または下方に膨出することにより、中央部を含む部分が上方または下方に変位したときには、隔膜２は弾性的に伸び変形している。
図２（Ａ）で示すように、隔膜２が変形していないときの隔膜２の位置を通常位置Ｐ１という。図２（Ｂ）で示すように、中央部を含む部分が下方に変位したときの隔膜２の位置を下方変位位置Ｐ２という。図２（Ｃ）で示すように、中央部を含む部分が上方に変位したときの隔膜２の位置を上方変位位置Ｐ３という。
【００３９】
図２（Ａ）に示すように、隔膜２は、内面２ａが細胞接着性材料でコーティングされていることが好ましい。細胞接着性材料としては、例えば、細胞接着性を有するタンパク質が使用できる。細胞接着性材料としては、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、マトリゲル、およびポリリジンなどが使用できる。
【００４０】
隔膜２は乾燥させた状態としてもよい。ハイドロゲルから形成される隔膜２は乾燥によって劣化しにくくなるため保管が容易となる。また、ハイドロゲルから形成される隔膜２は乾燥によって強度が高くなるため、搬送の際に破損が起こりにくくなる。よって、隔膜２は、保管時には乾燥状態とするのが好ましい。隔膜２は、培養時には第１培養液Ｃ１および第２培養液Ｃ２に触れることで膨潤することが好ましい。
隔膜２の厚みは０．１〜１００μｍが好ましい。隔膜２は、乾燥後の厚みが０．１〜１００μｍであることが好ましい。
【００４１】
図１に示すように、培養液流路４は、一端（第１端）が培養液貯留室３の底部に接続され、他端（第２端）が培養室１の凹部１ｄの底部に接続されている。培養液流路４によって、培養液貯留室３と外面側空間１ｂとは連通している。培養液流路４は、第２培養液Ｃ２を外面側空間１ｂに導くことができる。
培養液流路４は、第２培養液導入流路と第２培養液排出流路とを兼ねる流路である。
【００４２】
蓋部１３は、槽本体１２の開口を開閉自在かつ気密に閉止する。詳しくは、蓋部１３は、培養室１および培養液貯留室３の上部開口をそれぞれ気密に閉止可能である。
【００４３】
第１圧力調整部１４Ａは、第１圧力調整経路１５Ａを通して培養室１の主室１ｃに第１培養液Ｃ１を供給することによって、内面側空間１ａの圧力を高めることができる。第２圧力調整部１４Ｂは、第２圧力調整経路１５Ｂを通して培養液貯留室３に第２培養液Ｃ２を供給することによって、培養液貯留室３の圧力を高めることができる。第１圧力調整部１４Ａおよび第２圧力調整部１４Ｂとしては、例えば、水頭圧によって培養室１および培養液貯留室３に培養液を供給する構成を採用できる。
【００４４】
図１の細胞培養装置１０では、第１圧力調整部１４Ａおよび第２圧力調整部１４Ｂによって、第１培養液Ｃ１および第２培養液Ｃ２をそれぞれ培養室１および培養液貯留室３に供給し、それぞれ培養室１（内面側空間１ａ）および培養液貯留室３の圧力を高めることができるが、培養室１（内面側空間１ａ）および培養液貯留室３の圧力を調整する構造は第１圧力調整部１４Ａおよび第２圧力調整部１４Ｂに限らない。例えば、培養室１または培養液貯留室３から培養液の一部を排出することによって培養室１（内面側空間１ａ）および培養液貯留室３の圧力を低下させてもよい。また、空気などの気体の供給によって培養室１および培養液貯留室３の圧力を変化させる構造を採用してもよい。また、培養室１および培養液貯留室３の容積の変化によって、培養室１および培養液貯留室３の圧力を変化させる構造を採用してもよい。
【００４５】
［細胞培養方法］
本実施形態に係る細胞培養方法は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である細胞培養装置を準備し、前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記内面側空間と前記外面側空間とのうち少なくともいずれか一方の圧力を調整することによって、前記隔膜を伸縮により厚さ方向に変位させる。
次に、細胞培養装置１０を用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
細胞２０は、例えば、腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞である。
【００４６】
細胞２０を隔膜２の内面２ａに播種して接着させるとともに、第１培養液Ｃ１を培養室１に導入する。培養液貯留室３には第２培養液Ｃ２を導入する。隔膜２は通常位置Ｐ１にある。
【００４７】
（１）工程１
図１に示すように、第１圧力調整部１４Ａを稼働させ、培養室１の主室１ｃに第１培養液Ｃ１を供給することによって、内面側空間１ａを加圧する。内面側空間１ａの圧力が外面側空間１ｂの圧力より高くなると、隔膜２は、図２（Ａ）に示す通常位置Ｐ１（平坦な形態）から、図２（Ｂ）に示す下方変位位置Ｐ２（下方に膨出した形態）に変位する。この際、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
内面側空間１ａの第１培養液Ｃ１の一部は隔膜２を透過して外面側空間１ｂに移行してもよい。細胞２０は隔膜２を透過しない。
【００４８】
（２）工程２
図１に示すように、第２圧力調整部１４Ｂを稼働させ、培養液貯留室３に第２培養液Ｃ２を供給することによって、培養液貯留室３を加圧する。培養液貯留室３は培養液流路４を通して外面側空間１ｂと連通しているため、培養液貯留室３の圧力上昇によって外面側空間１ｂの圧力は上昇し、内面側空間１ａの圧力より高くなる。そのため、隔膜２は、下方変位位置Ｐ２から通常位置Ｐ１（平坦な形態）を経て、図２（Ｃ）に示す上方変位位置Ｐ３（上方に膨出した形態）に変位する。
下方変位位置Ｐ２から通常位置Ｐ１に変位するとき、隔膜２は弾性的に縮み変形し、通常位置Ｐ１から上方変位位置Ｐ３に変位するとき、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
外面側空間１ｂの第１培養液Ｃ１の一部は隔膜２を透過して内面側空間１ａに移行してもよい。
【００４９】
工程１および工程２を繰り返すことによって、隔膜２が伸縮する環境下で、伸縮刺激を与えつつ細胞２０の培養を行うことができる。
【００５０】
本実施形態に係る細胞培養方法は、具体的には、例えば次のような試験への適用が考えられる。
被検体となる物質を系内（例えば培養室１の内面側空間１ａ）に添加することによって、被検体となる物質の、細胞２０に対する影響を評価することができる。被検体となる物質としては医薬品候補物質、その他の化成品（食品添加物、化粧品原料、塗料、農薬など）に用いられる化学物質が挙げられる。
【００５１】
細胞培養装置１０は、内面側空間１ａと外面側空間１ｂとの圧力差に応じて変位可能な隔膜２を有するため、伸縮刺激を与えつつ細胞２０の培養を行うことができる。そのため、例えば、医薬品候補物質などの被検体を評価するにあたって、例えば腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞２０を生体内に近い環境下で培養できる。よって、被検体を正確に評価することができる。
【００５２】
細胞培養装置１０は、隔膜２を伸縮動作させるための流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００５３】
（第１実施形態の変形例）
第１実施形態に係る細胞培養装置１０の変形例について、図４を参照して説明する。図４は、細胞培養装置１０の変形例である細胞培養装置１０ａを示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
【００５４】
［細胞培養装置］
図４に示すように、細胞培養装置１０ａは、貯留槽１１を備えている。貯留槽１１は、容器状の槽本体１２と、蓋部１３とによって構成されており、細胞培養ユニット９を形成する。
蓋部１３は、培養室１、培養液貯留室３の上部開口１ｇ，３ｇをそれぞれ気密に閉止可能である。蓋部１３が上部開口１ｇ，３ｇを気密に閉止する構造としては、例えば、蓋部１３が、上部開口１ｇ，３ｇのそれぞれを包囲するパッキン１６，１６を介して槽本体１２の上面に当接する構造を例示できる。なお、図４では、蓋部１３は、槽本体１２から離間して示されている。
【００５５】
蓋部１３は、培養室１および培養液貯留室３に相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ，３ｈを有する。通気孔１ｈ，３ｈは、それぞれ培養室１および培養液貯留室３に対して気体（例えば空気）を供給、および、培養室１および培養液貯留室３から気体（例えば空気）を排出することができる。通気孔１ｈ，３ｈにはそれぞれエアフィルタ１７が設けられることが好ましい。エアフィルタ１７によって、培養室１および培養液貯留室３に異物が混入するのを防ぐことができる。
【００５６】
培養室１の主室１ｃには、コンプレッサなどの加圧ポンプ１４Ｃ（第１圧力調整部）を用いて、通気孔１ｈを通して気体（例えば空気）を供給できる。培養液貯留室３には、コンプレッサなどの加圧ポンプ１４Ｄ（第２圧力調整部）を用いて、通気孔３ｈを通して気体（例えば空気）を供給できる。
【００５７】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０ａを用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
（１）工程１
通気孔１ｈを通して培養室１に気体（例えば空気）を供給して内面側空間１ａを加圧する。この際、培養液貯留室３は通気孔３ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
内面側空間１ａの圧力が外面側空間１ｂの圧力より高くなると、隔膜２は、通常位置から下方変位位置に変位する。この際、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
【００５８】
（２）工程２
通気孔３ｈを通して培養液貯留室３に気体（例えば空気）を供給して培養液貯留室３を加圧する。この際、培養室１は通気孔１ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
培養液貯留室３の圧力上昇によって外面側空間１ｂの圧力は上昇し、内面側空間１ａの圧力より高くなる。そのため、隔膜２は、下方変位位置から通常位置を経て上方変位位置に変位する。下方変位位置から通常位置に変位するとき、隔膜２は弾性的に縮み変形し、通常位置から上方変位位置に変位するとき、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
【００５９】
工程１および工程２を繰り返すことによって、隔膜２が伸縮する環境下で、伸縮刺激を与えつつ細胞２０の培養を行うことができる。
【００６０】
細胞培養装置１０ａは、内面側空間１ａと外面側空間１ｂとの圧力差に応じて変位可能な隔膜２を有するため、伸縮刺激を与えつつ細胞２０の培養を行うことができる。そのため、例えば、医薬品候補物質などの被検体を評価するにあたって、例えば腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞２０を生体内に近い環境下で培養できる。よって、被検体を正確に評価することができる。
【００６１】
細胞培養装置１０ａは、隔膜２を伸縮動作させるための流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００６２】
（第２実施形態）
［細胞培養装置］
第２実施形態に係る細胞培養装置１０Ａについて、図５を参照して説明する。図５は、細胞培養装置１０Ａを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図５に示すように、細胞培養装置１０Ａは、貯留槽１１Ａを備えている。貯留槽１１Ａは、槽本体１２Ａと、蓋部１３Ａとによって構成されており、細胞培養ユニット９Ａを形成する。
【００６３】
細胞培養ユニット９Ａは、培養室２１と、隔膜２と、培養液貯留室３と、培養液流路４と、第１導入用培養液貯留室２２と、第１排出用培養液貯留室２３と、第１培養液導入流路２４と、第１培養液排出流路２５とを備えている。
【００６４】
培養室２１、第１導入用培養液貯留室２２、および第１排出用培養液貯留室２３は、第１培養液Ｃ１を貯留できる。
培養室２１は、主室２１ｃと、主室２１ｃの底面に形成された凹部１ｄとを有する。主室２１ｃの内部空間は内面側空間２１ａである。内面側空間２１ａは、第１培養液導入流路２４を通して導入された第１培養液Ｃ１が流通可能である。
第１培養液導入流路２４は、一端（第１端）が第１導入用培養液貯留室２２に接続され、他端（第２端）が培養室２１の一端部（図５において左端部、第１端部）に接続されている。第１培養液導入流路２４は、第１導入用培養液貯留室２２の第１培養液Ｃ１を培養室２１に導くことができる。
第１培養液排出流路２５は、一端（第１端）が培養室２１に接続され、他端（第２端）が第１排出用培養液貯留室２３に接続されている。第１培養液排出流路２５の一端（第１端）は、培養室２１の他端部（図５において右端部、第２端部）に接続されている。第１培養液排出流路２５は、培養室２１の第１培養液Ｃ１を第１排出用培養液貯留室２３に導くことができる。
【００６５】
蓋部１３Ａは、第１導入用培養液貯留室２２、第１排出用培養液貯留室２３、および培養液貯留室３に相当する位置に、それぞれ通気孔２２ｈ，２３ｈ，３ｈを有する。
【００６６】
第１培養液導入流路２４および第１培養液排出流路２５は、流路断面積（第１培養液Ｃ１の流れ方向に直交する断面の面積）が他の部位より小さい抵抗流路部位２４ａ，２５ａを有していてもよい。抵抗流路部位２４ａ，２５ａの流路断面積は、例えば他の部位の１／１０以下であってよい。抵抗流路部位２４ａ，２５ａの断面積が他の部位の断面積の１／１０となると、流路抵抗は他の部位に比べて１００倍となる。抵抗流路部位２４ａ，２５ａによって、液の流量の調節が可能である。
【００６７】
抵抗流路部位２４ａ，２５ａについて説明する。
断面が矩形のマイクロ流路を流れる液体の流量（Ｑ）と圧力損失（ΔＰ）には以下の関係がある（F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006を参照）。
【００６８】
【数１】
2019054287.tif 000009
【００６９】
【数２】
2019054287.tif 000010
【００７０】
式（１）および式（２）において、ΔＰはマイクロ流路の入口と出口の圧力差、Ｒは流路抵抗、μは流体の粘度、ｌはマイクロ流路の長さ、ｗはマイクロ流路の幅、ｈはマイクロ流路の深さである。当該式（１）および式（２）はｗ＞ｈの条件で成立する。
【００７１】
第１培養液導入流路２４および第１培養液排出流路２５において、抵抗流路部位と、抵抗流路部位以外の部分の部位と、の長さが等しい場合を考える。抵抗流路の断面積が他の部位の断面積の１／１０となると、幅ｗ、深さｈが１／１００．５となり、式（２）の抵抗流路の流路抵抗Ｒが、抵抗流路以外の部位の流路抵抗Ｒの１００倍となる。式（１）より、圧力損失についても抵抗流路の圧力損失が、抵抗流路以外の部位の圧力損失の１００倍となる。
流路の一部に、流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位が形成された場合には、抵抗流路の圧力損失のみを考慮して流路設計をすることで流路網の設計が容易になるという利点がある。
【００７２】
隔膜２の上流側の流路である第１培養液導入流路２４と、下流側の流路である第１培養液排出流路２５とが、それぞれ抵抗流路部位２４ａ，２５ａを有することで、隔膜２の上流側と下流側との圧力損失を調節し、隔膜２にかかる圧力を調節することができる。
【００７３】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０Ａを用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
（１）工程１
通気孔２２ｈを通して第１導入用培養液貯留室２２に気体（例えば空気）を供給する。
第１導入用培養液貯留室２２の圧力上昇によって、第１導入用培養液貯留室２２の第１培養液Ｃ１の一部は第１培養液導入流路２４に流入する。第１培養液導入流路２４の第１培養液Ｃ１の一部が培養室２１（詳しくは内面側空間２１ａ）に流入することによって、内面側空間２１ａは加圧される。この際、培養液貯留室３は通気孔３ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。第１排出用培養液貯留室２３も通気孔２３ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
内面側空間２１ａの圧力が外面側空間１ｂの圧力より高くなると、隔膜２は、通常位置から下方変位位置に変位する。この際、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
【００７４】
第１培養液導入流路２４は培養室２１の一端部（図５において左端部、第１端部）に接続され、第１培養液排出流路２５は培養室２１の他端部（図５において右端部、第２端部）に接続されている。
そのため、培養室２１（詳しくは内面側空間２１ａ）には、培養室２１の一端部（第１端部）から他端部（第２端部）に向けた第１培養液Ｃ１の流れが生じる。その過程で、第１培養液Ｃ１は、隔膜２の内面２ａ（図２（Ａ）参照）に対面して内面２ａに沿って流れ、その過程で細胞２０にせん断力を加える。
内面側空間２１ａの第１培養液Ｃ１は、第１培養液排出流路２５を通って第１排出用培養液貯留室２３に向かって流れる。
【００７５】
（２）工程２
通気孔３ｈを通して培養液貯留室３に気体（例えば空気）を供給して培養液貯留室３を加圧する。培養液貯留室３の圧力上昇によって外面側空間１ｂの圧力は上昇し、内面側空間２１ａの圧力より高くなる。そのため、隔膜２は、下方変位位置から通常位置を経て上方変位位置に変位する。下方変位位置から通常位置に変位するとき、隔膜２は弾性的に縮み変形し、通常位置から上方変位位置に変位するとき、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
工程２においては、第１導入用培養液貯留室２２から培養室２１（詳しくは内面側空間２１ａ）を経て第１排出用培養液貯留室２３に向かう第１培養液Ｃ１の流れを継続させてもよいし、停止させてもよい。
【００７６】
工程１および工程２を繰り返すことによって、隔膜２を伸縮させつつ、せん断力が加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。
【００７７】
細胞培養装置１０Ａは、内面側空間２１ａと外面側空間１ｂとの圧力差に応じて変位可能な隔膜２を有するため、伸縮刺激を与えつつ、せん断力が加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。そのため、例えば、医薬品候補物質などの被検体を評価するにあたって、例えば腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞２０を生体内に近い環境下で培養できる。よって、被検体を正確に評価することができる。
【００７８】
細胞培養装置１０Ａは、隔膜２の伸縮動作、および培養室２１に第１培養液Ｃ１の流れを生じさせるための流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００７９】
（第３実施形態）
【００８０】
［細胞培養装置］
第３実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂについて、図６を参照して説明する。図６は、細胞培養装置１０Ｂを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図６に示すように、細胞培養装置１０Ｂでは、貯留槽１１Ｂの細胞培養ユニット９Ｂは、培養室２１と、隔膜２と、培養液貯留室３と、培養液流路４と、第１導入用培養液貯留室２２と、第１排出用培養液貯留室２３と、第１培養液導入流路２４と、第１培養液排出流路２５と、第１培養液返送流路２６とを有する。貯留槽１１Ｂは、容器状の槽本体１２Ｂと、蓋部１３Ａとによって構成されている。
細胞培養ユニット９Ｂは、第１培養液返送流路２６を有する点で、第２実施形態における細胞培養ユニット９Ａ（図５参照）と異なる。
【００８１】
第１培養液返送流路２６は、一端（第１端）が第１排出用培養液貯留室２３に接続され、他端（第２端）が第１導入用培養液貯留室２２に接続されている。第１培養液返送流路２６は、第１排出用培養液貯留室２３の第１培養液Ｃ１を第１導入用培養液貯留室２２に送ることができる。そのため、第１導入用培養液貯留室２２から培養室２１を経て第１排出用培養液貯留室２３に送られ、再び第１導入用培養液貯留室２２に戻される第１培養液Ｃ１の流れ（循環流れ）を生じさせることができる。
【００８２】
第１導入用培養液貯留室２２には、第１培養液返送流路２６の他端（第２端）に、逆止弁５１が設けられている。逆止弁５１は、第１培養液返送流路２６から第１導入用培養液貯留室２２へ向かう第１培養液Ｃ１の流れを許容し、かつその逆の方向の流れ（第１導入用培養液貯留室２２から第１培養液返送流路２６へ向かう第１培養液Ｃ１の流れ）を阻止する。
第１排出用培養液貯留室２３には、第１培養液排出流路２５の他端（第２端）に、逆止弁５２が設けられている。逆止弁５２は、第１培養液排出流路２５から第１排出用培養液貯留室２３へ向かう第１培養液Ｃ１の流れを許容し、かつその逆の方向の流れ（第１排出用培養液貯留室２３から第１培養液排出流路２５へ向かう第１培養液Ｃ１の流れ）を阻止する。
【００８３】
逆止弁５１，５２としては、例えば弁孔を有する弁座と、弁体とを備えた構造の逆止弁を例示できる。この逆止弁は、液が順方向に流れる際には、弁体が弁座から離れることにより弁孔が開かれるため、液は弁孔を通過して順方向に流れる。液が逆方向に流れる際には、弁体が弁座に当接して弁孔が閉止されるため、当該方向の液の流れ（逆方向への液の流れ）は阻止される。
逆止弁５１，５２は、培養液の流れを規制する逆流防止機構の例である。逆止弁５１，５２は、第１培養液Ｃ１の循環流れ（第１導入用培養液貯留室２２から、培養室２１、第１排出用培養液貯留室２３を経て第１導入用培養液貯留室２２に戻る流れ）の方向とは逆の方向の流れを阻止できる。
【００８４】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０Ｂを用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
（１）工程１
（１−１）サブ工程１−１
通気孔２２ｈを通して第１導入用培養液貯留室２２に気体（例えば空気）を供給する。
第１導入用培養液貯留室２２の圧力上昇によって、第１培養液導入流路２４の第１培養液Ｃ１の一部が培養室２１（詳しくは内面側空間２１ａ）に流入し、内面側空間２１ａは加圧される。この際、培養液貯留室３は通気孔３ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。第１排出用培養液貯留室２３も通気孔２３ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
内面側空間２１ａの圧力が外面側空間１ｂの圧力より高くなると、隔膜２は、通常位置から下方変位位置に変位する。この際、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
なお、第１導入用培養液貯留室２２は逆止弁５１を有するため、第１導入用培養液貯留室２２の第１培養液Ｃ１は第１培養液返送流路２６には流入しない。
【００８５】
培養室２１（詳しくは内面側空間２１ａ）には、培養室２１の一端部（第１端部）から他端部（第２端部）に向けた第１培養液Ｃ１の流れが生じる。内面側空間２１ａの第１培養液Ｃ１は、第１培養液排出流路２５を通って第１排出用培養液貯留室２３に向かって流れる。
【００８６】
（１−２）サブ工程１−２
通気孔２３ｈを通して第１排出用培養液貯留室２３に気体（例えば空気）を供給する。
この際、第１導入用培養液貯留室２２は通気孔２２を通して大気に開放しておくことが好ましい。
第１排出用培養液貯留室２３の圧力上昇によって、第１排出用培養液貯留室２３の第１培養液Ｃ１は、第１培養液返送流路２６を通って第１導入用培養液貯留室２２に向かって流れる。
なお、第１排出用培養液貯留室２３は逆止弁５２を有するため、第１排出用培養液貯留室２３の第１培養液Ｃ１は第１培養液排出流路２５には流入しない。
【００８７】
サブ工程１−１およびサブ工程１−２を繰り返すことによって、第１培養液Ｃ１を、第１導入用培養液貯留室２２から、培養室２１、第１排出用培養液貯留室２３を経て第１導入用培養液貯留室２２に戻すことができるため、第１培養液Ｃ１の循環使用が可能となる。
【００８８】
（２）工程２
第２実施形態における工程２と同様としてよい。
【００８９】
工程１および工程２を繰り返すことによって、隔膜２を伸縮させつつ、せん断力が加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。
【００９０】
細胞培養装置１０Ｂは、内面側空間２１ａと外面側空間１ｂとの圧力差に応じて変位可能な隔膜２を有するため、伸縮刺激を与えつつ、せん断力が加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。そのため、例えば、医薬品候補物質などの被検体を評価するにあたって、例えば腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞２０を生体内に近い環境下で培養できる。よって、被検体を正確に評価することができる。
【００９１】
細胞培養装置１０Ｂは、隔膜２の伸縮動作、および培養室２１に第１培養液Ｃ１の流れを生じさせるための流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００９２】
細胞培養装置１０Ｂでは、第１培養液Ｃ１の循環使用が可能となるため、被検体を連続的に細胞２０に曝露することができ、第１培養液Ｃ１の使用量を削減できる。また、蓋部１３Ａが開閉可能な構成となっているため、無菌的操作も容易になる。
【００９３】
（第４実施形態）
第４実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃについて、図７を参照して説明する。図７は、細胞培養装置１０Ｃを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図７に示すように、細胞培養装置１０Ｃでは、貯留槽１１Ｃの細胞培養ユニット９Ｃは、培養室２１と、隔膜２と、培養液貯留室３と、培養液流路４と、第１導入用培養液貯留室２２と、第１排出用培養液貯留室２３と、第１培養液導入流路２４と、第１培養液排出流路２５と、第１培養液返送流路２６とを有する。貯留槽１１Ｃは、容器状の槽本体１２Ｃと、蓋部１３Ａとによって構成されている。
【００９４】
第１培養液返送流路２６の一端（第１端）には、ラプラス弁５３が設けられている。ラプラス弁５３は、第１排出用培養液貯留室２３から第１培養液返送流路２６への第１培養液Ｃ１の流れを許容し、かつ気体（例えば空気）の流入を阻止する。
ラプラス弁５３は、第１培養液Ｃ１の循環流れ（第１導入用培養液貯留室２２から、培養室２１、第１排出用培養液貯留室２３を経て第１導入用培養液貯留室２２に戻る流れ）の方向とは逆の方向の流れを阻止できる。
【００９５】
第１培養液排出流路２５の一端（第１端）には、ラプラス弁５４が設けられている。ラプラス弁５４は、培養室２１から第１培養液排出流路２５への第１培養液Ｃ１の流れを許容し、かつ気体（例えば空気）の流入を阻止する。
ラプラス弁５４は、第１培養液Ｃ１の循環流れ（第１導入用培養液貯留室２２から、培養室２１、第１排出用培養液貯留室２３を経て第１導入用培養液貯留室２２に戻る流れ）の方向とは逆の方向の流れを阻止できる。
【００９６】
ラプラス弁５３，５４の構造と機能を、図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）を用いて説明する。図１１（Ａ）は、ラプラス弁１１７が設けられた液体貯留室の部分拡大図を示す。図１１（Ｂ）は、ラプラス弁１１７を介して下流口１１４から連絡流路１１５に培地１３１が流入する場合の模式図を示す。図１１（Ｃ）は、下流口１１４に空気が流入した際に、ラプラス弁１１７が機能している際の模式図を示す。図１１（Ｃ）に示すように、微細な流路内において、培地１３１と空気との間には界面張力による圧力差、すなわちラプラス圧が発生する。流路の表面が液体培地で濡れている場合は、ラプラス圧未満の空気圧条件下において液体が満たされた微細流路に空気は流入しえない。このような条件下で微細流路は受動的な空気流入防止機構として扱うことができる。
【００９７】
ラプラス弁の設計について、以下に説明する。
ラプラス弁に空気が流入してしまう圧力（ラプラス圧、限界圧力）（ΔＰＬａｐ）は界面張力（γ）およびラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅（ｗＬ）および深さ（ｈＬ）によって以下の式（３）で計算できる。
【００９８】
【数３】
2019054287.tif 000011
【００９９】
細胞培養装置を駆動するための現実的な圧力範囲は市販の圧力制御装置で調整可能な圧力範囲および細胞の耐圧性によって決定されると考えられる。
仮に細胞の耐圧性を生体内の血圧の上限程度（３０ｋＰａ＝２２５ｍｍＨｇ）とすると、実施形態に係る細胞培養装置を駆動するために現実的な圧力範囲は１ｋＰａ〜３０ｋＰａ程度となる。培養液の界面張力は６０ｍＮ／ｍ程度であり、ラプラス弁を構成するマイクロ流路の断面が正方形の場合、つまりｗＬ＝ｈＬの場合、３０ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法（長さ）は上記式（３）よりｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ程度、１ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法（長さ）はｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ程度と推算される。
ラプラス弁を構成するマイクロ流路の寸法（長さ）を上記寸法（３０ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ、１ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ）よりも小さくすることで、想定する圧力で運用した際にラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
すなわち、ラプラス弁が機能するための限界の圧力であるラプラス圧ΔＰＬａｐが、実施形態に係る細胞培養装置で使用する圧力範囲よりも大きくなるように、ラプラス弁を構成するマイクロ流路を形成すれば、ラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
なお、ｗＬとｈＬの比率が１：１でない場合も同様に式（３）に基づいて流路の寸法を設計することが可能である。
ラプラス弁５３，５４は、培養液の流れを規制する逆流防止機構の例である。
【０１００】
第１培養液排出流路２５の一端（第１端）は培養室２１に接続され、他端（第２端）は第１排出用培養液貯留室２３に接続されている。第１排出用培養液貯留室２３内には、第１培養液排出流路２５の他端（第２端）に連設されて上方に延出する延長管路４１が設けられている。延長管路４１の上端開口４１ａは、延長管路４１の基端４１ｂより高い位置にある。
サブ工程１−２では、第１排出用培養液貯留室２３の圧力上昇に伴って延長管路４１および第１培養液排出流路２５の第１培養液Ｃ１は培養室２１に流入できるが、延長管路４１および第１培養液排出流路２５の第１培養液Ｃ１がなくなった時点で、ラプラス弁５４によって培養室２１への第１培養液Ｃ１の流入は停止する。そのため、第１培養液Ｃ１の循環流れ（第１導入用培養液貯留室２２から、培養室２１、第１排出用培養液貯留室２３を経て第１導入用培養液貯留室２２に戻る流れ）の方向とは逆の方向の流れを阻止できる。
サブ工程１−１では、第１培養液Ｃ１は、延長管路４１の上端開口４１ａから第１排出用培養液貯留室２３内に流れ込む。
【０１０１】
第１培養液返送流路２６の一端（第１端）は第１排出用培養液貯留室２３に接続され、他端（第２端）は第１導入用培養液貯留室２２に接続されている。第１導入用培養液貯留室２２内には、第１培養液返送流路２６の他端（第２端）に連設されて上方に延出する延長管路４２が設けられている。延長管路４２の上端開口４２ａは、延長管路４２の基端４２ｂより高い位置にある。
サブ工程１−１では、第１導入用培養液貯留室２２の圧力上昇に伴って延長管路４２および第１培養液返送流路２６の第１培養液Ｃ１は第１排出用培養液貯留室２３に流入できるが、延長管路４２および第１培養液返送流路２６の第１培養液Ｃ１がなくなった時点で、ラプラス弁５３によって第１排出用培養液貯留室２３への第１培養液Ｃ１の流入は停止する。そのため、第１培養液Ｃ１の循環流れの方向とは逆の方向の流れを阻止できる。
サブ工程１−２では、第１培養液Ｃ１は、延長管路４２の上端開口４２ａから第１導入用培養液貯留室２２内に流れ込む。
【０１０２】
細胞培養装置１０Ｃでは、内面側空間２１ａと外面側空間１ｂとの圧力差に応じて変位可能な隔膜２を有するため、伸縮刺激を与えつつ、せん断力が加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。そのため、例えば、医薬品候補物質などの被検体を評価するにあたって、例えば腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞２０を生体内に近い環境下で培養できる。よって、被検体を正確に評価することができる。
【０１０３】
細胞培養装置１０Ｃは、隔膜２の伸縮動作、および培養室２１に第１培養液Ｃ１の流れを生じさせるための流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【０１０４】
細胞培養装置１０Ｃでは、第１培養液Ｃ１の循環使用が可能となるため、第１培養液Ｃ１の使用量を削減できる。また、無菌的操作も容易になる。
【０１０５】
（第５実施形態）
［細胞培養装置］
第５実施形態に係る細胞培養装置１０Ｄについて、図８を参照して説明する。図８は、細胞培養装置１０Ｄを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図８に示すように、細胞培養装置１０Ｄでは、貯留槽１１Ｄの細胞培養ユニット９Ｄは、培養室２１と、隔膜２と、第１導入用培養液貯留室２２と、第１排出用培養液貯留室２３と、第１培養液導入流路２４と、第１培養液排出流路２５と、第１培養液返送流路２６と、第２導入用培養液貯留室２７（第２培養液貯留室）と、第２排出用培養液貯留室２８と、第２培養液導入流路２９と、第２培養液排出流路３０と、第２培養液返送流路３１とを備えている。貯留槽１１Ｄは、容器状の槽本体１２Ｄと、蓋部１３Ｄとによって構成されている。
【０１０６】
第２導入用培養液貯留室２７および第２排出用培養液貯留室２８は、第２培養液Ｃ２を貯留できる。
第２培養液導入流路２９は、一端（第１端）が第２導入用培養液貯留室２７に接続され、他端（第２端）が培養室２１の凹部１ｄの底部に接続されている。第２培養液導入流路２９は、第２導入用培養液貯留室２７の第２培養液Ｃ２を外面側空間１ｂに導くことができる。
第２培養液排出流路３０は、一端（第１端）が培養室２１の凹部１ｄの底部に接続され、他端（第２端）が第２排出用培養液貯留室２８に接続されている。第２培養液排出流路３０は、外面側空間１ｂの第２培養液Ｃ２を第２排出用培養液貯留室２８に導くことができる。
第２培養液返送流路３１は、一端（第１端）が第２排出用培養液貯留室２８に接続され、他端（第２端）が第２導入用培養液貯留室２７に接続されている。第２培養液返送流路３１は、第２排出用培養液貯留室２８の第２培養液Ｃ２を第２導入用培養液貯留室２７に送ることができる。
第１培養液返送流路２６には、抵抗流路部位２６ａが形成されている。
【０１０７】
第２導入用培養液貯留室２７内には、第２培養液返送流路３１の他端（第２端）に連設された延長管路４３が設けられている。延長管路４３の上端開口は、延長管路４３の基端より高い位置にある。
第２排出用培養液貯留室２８内には、第２培養液排出流路３０の他端（第２端）に連設された延長管路４４が設けられている。延長管路４４の上端開口は、延長管路４４の基端より高い位置にある。
【０１０８】
蓋部１３Ｄは、第１導入用培養液貯留室２２、第１排出用培養液貯留室２３、第２導入用培養液貯留室２７および第２排出用培養液貯留室２８に相当する位置に、それぞれ通気孔２２ｈ，２３ｈ，２７ｈ，２８ｈを有する。
【０１０９】
第２導入用培養液貯留室２７には、第２培養液導入流路２９の一端（第１端）に、第２導入用培養液貯留室２７から第２培養液導入流路２９への第２培養液Ｃ２の流れを許容し、かつ気体（例えば空気）の流入を阻止するラプラス弁５５が設けられている。
第２排出用培養液貯留室２８には、第２培養液返送流路３１の一端（第１端）に、第２排出用培養液貯留室２８から第２培養液返送流路３１への第２培養液Ｃ２の流れを許容し、かつ気体（例えば空気）の流入を阻止するラプラス弁５６が設けられている。
【０１１０】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０Ｄを用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
（１）工程１
第３実施形態における工程１と同様としてよい。
【０１１１】
（２）工程２
（２−１）サブ工程２−１
通気孔２７ｈを通して第２導入用培養液貯留室２７に気体（例えば空気）を供給して第２導入用培養液貯留室２７を加圧する。この際、第２排出用培養液貯留室２８は通気孔２８ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第２導入用培養液貯留室２７の圧力上昇によって外面側空間１ｂの圧力は上昇し、内面側空間２１ａの圧力より高くなる。そのため、隔膜２は、下方変位位置から通常位置を経て上方変位位置に変位する。下方変位位置から通常位置に変位するとき、隔膜２は弾性的に縮み変形し、通常位置から上方変位位置に変位するとき、隔膜２は弾性的に伸び変形する。
第２培養液返送流路３１はラプラス弁５６を有するため、第２培養液Ｃ２の逆流は規制される。
【０１１２】
（２−２）サブ工程２−２
通気孔２８ｈを通して第２排出用培養液貯留室２８に気体（例えば空気）を供給して第２排出用培養液貯留室２８を加圧する。この際、第２導入用培養液貯留室２７は通気孔２７ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
第２排出用培養液貯留室２８の圧力上昇によって、第２排出用培養液貯留室２８の第２培養液Ｃ２は、第２培養液返送流路３１を通って第２導入用培養液貯留室２７に向かって流れる。
第２培養液導入流路２９はラプラス弁５５を有するため、第２培養液Ｃ２の逆流は規制される。
【０１１３】
工程２では、サブ工程２−１およびサブ工程２−２を繰り返すことによって、第２培養液Ｃ２を、第２導入用培養液貯留室２７から、外面側空間１ｂ、第２排出用培養液貯留室２８を経て第２導入用培養液貯留室２７に戻すことができるため、第２培養液Ｃ２の循環使用が可能となる。
工程２においては、第１導入用培養液貯留室２２から、培養室２１（詳しくは内面側空間２１ａ）を経て第１排出用培養液貯留室２３に向かう第１培養液Ｃ１の流れを継続させてもよいし、停止させてもよい。
【０１１４】
工程１および工程２を繰り返すことによって、隔膜２を伸縮させつつ、せん断力が加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。
【０１１５】
細胞培養装置１０Ｄは、内面側空間２１ａと外面側空間１ｂとの圧力差に応じて変位可能な隔膜２を有するため、伸縮刺激を与えつつ、せん断力が加えられる環境下で細胞２０の培養を行うことができる。そのため、例えば、医薬品候補物質などの被検体を評価するにあたって、例えば腸、腎臓、血液脳関門、肺などの膜型臓器の細胞２０を生体内に近い環境下で培養できる。よって、被検体を正確に評価することができる。
【０１１６】
細胞培養装置１０Ｄは、隔膜２の伸縮動作、および培養室２１に第１培養液Ｃ１および第２培養液Ｃ２の流れを生じさせるための流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【０１１７】
細胞培養装置１０Ｄでは、第１培養液Ｃ１および第２培養液Ｃ２の循環使用が可能となるため、第１培養液Ｃ１および第２培養液Ｃ２の使用量を削減できる。また、無菌的操作も容易になる。
【０１１８】
（第６実施形態）
第６実施形態に係る細胞培養装置１０Ｅについて、図９を参照して説明する。図９は、細胞培養装置１０Ｅを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図９に示すように、細胞培養装置１０Ｅでは、貯留槽１１Ｅの細胞培養ユニット９Ｅは、第１導入用培養液貯留室２２、第１排出用培養液貯留室２３、第２導入用培養液貯留室２７および第２排出用培養液貯留室２８の底面に、それぞれ、細胞保持凹部２２ｄ，２３ｄ，２７ｄ，２８ｄ（細胞保持部）が形成されている点で、第５実施形態に係る細胞培養ユニット９Ｄ（図８参照）と異なる。貯留槽１１Ｅは、容器状の槽本体１２Ｅと、蓋部１３Ｄとによって構成されている。
【０１１９】
細胞保持凹部２２ｄ，２８ｄにはそれぞれ細胞２０Ｅ１，２０Ｅ２が保持される。
【０１２０】
細胞培養装置１０Ｅでは、隔膜２に播種する細胞２０として、例えば、腸の細胞を用いることができる。第１導入用培養液貯留室２２で培養する細胞２０Ｅ１としては、例えば、腸と同じく消化器官の一部である胃の細胞を用いることができる。第２排出用培養液貯留室２８で培養する細胞２０Ｅ２としては、例えば、腸の外面側に相当する、肝臓の細胞を用いることができる。
被検体となる物質を系内（例えば第１導入用培養液貯留室２２）に添加することによって、被検体となる物質の、腸における吸収と、他の臓器の細胞に対する作用を評価することが可能となる。
【０１２１】
第２培養液導入流路２９および第２培養液返送流路３１には、それぞれ抵抗流路部位２９ａ，３６ａが形成されている。
【０１２２】
（第７実施形態）
第７実施形態に係る細胞培養装置１０Ｆについて、図１０を参照して説明する。図１０は、細胞培養装置１０Ｆを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
細胞培養装置１０Ｆは、複数の細胞培養ユニット９（図１および図３参照）を有する。
複数の細胞培養ユニット９の培養室１のうち少なくとも２つは、例えば蓋部１３（図４参照）に形成された気体流路１８によって互いに接続されている。気体流路１８は、培養室１の上部の気相空間に気体を流通させることができる。これによって、複数の培養室１は、気体流路１８を通して気体が流通可能となる。
複数の細胞培養ユニット９の培養液貯留室３のうち少なくとも２つは、例えば蓋部１３（図４参照）に形成された気体流路（図示略）によって互いに接続されていてもよい。前記気体流路は、培養液貯留室３の上部の気相空間に気体を流通させることができる。これによって、複数の培養液貯留室３は、気体流路を通して気体が流通可能となる。
【０１２３】
細胞培養装置１０Ｆでは、複数の細胞培養ユニット９が、気体流路１８によって互いに連通されているため、複数の細胞培養ユニット９の培養室１を一括的に加圧することができる。複数の培養液貯留室３が気体流路（図示略）によって互いに連通されている場合には、複数の細胞培養ユニット９の培養液貯留室３を一括的に加圧することができる。したがって、細胞培養装置１０Ｆでは、容易な操作で、複数の細胞培養ユニット９における試験を並列的に行うことができる。
換言すれば、例えば、特許文献１に記載の細胞培養装置と比較して、本実施形態によれば、スループットを向上する際にも多数の圧力ラインを必要とせず、装置構成を簡略化できる。
したがって、創薬スクリーニング等において効率の高い試験が可能である。
なお、本実施形態と同様に、他の実施形態における複数の培養液貯留室のうち少なくとも２つが気体流路によって互いに連通されていてもよい。
【０１２４】
また、生体内の肺では、肺胞の拡張・収縮を恒常的に繰り返して呼吸をしている。
肺活量測定の際には、肺内のガス体積からとして５倍程度の体積収縮が起こり、通常の呼吸では、機能的残気量（２，４００ｍＬ）のうちの５００〜１，０００ｍＬ程度が換気されていると言われている（標準生理学  第６版、医学書院、ｐ６３３−６３４）。
肺胞の体積変化も肺内のガス体積の変化と同程度と考えられるため、肺胞表面積の拡張は体積変化の２／３乗程度と推算され、通常の呼吸時において、１５〜３０％程度の面積変化が起こっている。
【０１２５】
非特許文献１においては、隔膜下の流路に隣接する動作チャネルへの加減圧によって隔膜を伸縮させる構成となっているが、このような構成では隔膜に大きな面積変化を引き起こすことは困難である。具体的には１５％までの伸縮刺激しか実現できていない。
原理的には、隔膜の膜面積に比較して動作チャネルを深く形成すれば隔膜の面積変化を大きくできるが、このためには面方向に比較して深さ方向に大きな構造を作製する必要がある。一般的な微細加工技術では面方向と深さ方向の比率、つまりアスペクト比の大きい構造の作製は困難となる傾向にあり、伸縮可能材料でアスペクト比の大きい構造を作製することは大変困難である。
そのため、動作チャネルを深く形成することは実現が難しい。
【０１２６】
一方、上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法では、膜面の上下の圧力差に基づいて膜の拡張を引き起こすことが可能である。
上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法によれば、膜の非伸縮時と比較して膜の１００％程度までの伸張（例えば、図２１の伸縮率２００％に該当）を行うことが可能であり、非特許文献１に示されたような手法と比較して、より大きな伸縮刺激を付与することが可能である。
【０１２７】
また、膜の伸縮の方向性について考慮すると、動物の生体内の膜型臓器、膜型組織では、伸縮刺激が異方的な物もあれば、等方的な物もある。
例えば、血管の拡張や筋肉の伸縮においては異方的な伸縮が組織に付与される。
一方、肺の肺胞組織の拡張・伸縮においては等方的な伸縮刺激が組織に付与される。
【０１２８】
本発明の上記実施形態によれば、例えば、図１２〜図１４においては、長方形のスリットに伸縮膜を形成しているため、図１６〜図２０に示すように、それぞれの図において、上下方向への膜の伸縮が確認されている。
一方、膜を形成するスリットの形状は任意であり、例えば、図３及び図１０に記載されているように、膜を円形に形成すると等方的な伸縮刺激を付加することも可能である。
このような等方的な伸縮刺激を膜に付与することは、非特許文献１のように隔膜下の流路に隣接する動作チャネルへの加減圧によって隔膜を伸縮させる構成では実現不可能である。
【実施例】
【０１２９】
（実施例１）
［１］ゲル薄膜（隔膜）の作製
図１２に示すゲル薄膜６４（隔膜２）を次のように作製した。【０１３０】
（１−１）ＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧ水溶液（８ｍＭ）の調製
滅菌したマイクロチューブの中に２４．０ｍｇのＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧ（ＭＷ：１１７５５．４）を秤量し、滅菌水で２５５μＬにメスアップした。この液をピペッティングによって混合した後、冷暗所に保存した。【０１３１】
（１−２）Ａｚｉｄｅ−ゼラチン水溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）の調製
滅菌したマイクロチューブの中に４８．８ｍｇのＡｚｉｄｅ−ゼラチン（アミノ基比２５ｍｏｌ％のａｚｉｄｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳで合成）を秤量し、３７℃の滅菌水で９７６μＬにメスアップした。この液をピペッティングによって混合した後に、５０００Ｇ、３ｍｉｎの遠心処理を行うことで不溶成分を沈降させ、上清のみを、滅菌したマイクロチューブに回収し、冷暗所に保存した。【０１３２】
（１−３）ゲル薄膜支持体の作製
図１３に示すように、ルミラーフィルムを矩形（７６ｍｍｘ２６ｍｍ）に切り出し、ゲル薄膜支持体６１を得た。ゲル薄膜支持体６１の中央に、長さ１０ｍｍｘ幅１．２ｍｍのスリット６２を形成した。【０１３３】
（１−４）ゲル薄膜の作製
（１−４−１）薄膜の形成
図１４に示すように、滅菌したマイクロチューブに、１０μＬのＡｚｉｄｅ−ゼラチン水溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）（前述）を入れた。マイクロチューブに、滅菌水で２．６ｍＭに希釈したＤＢＣＯ−４ａｒｍＰＥＧ水溶液を１０μＬ入れ、混合して原料液を得た。この原料液をゲル薄膜支持体６１の表面であってスリット６２に近い箇所に塗布した。
図１５に示すように、２００μＬ用のピペットチップを用いて、スリット６２を覆うように原料液を引き延ばすことによって、スリット６２に薄膜６３を形成した。
（１−４−２）ゲル化
蓋を外した直径３．５ｃｍのディッシュ中に１ｍＬの滅菌水を入れ、このディッシュの縁の上に前述のゲル薄膜支持体６１（図１５参照）を置いた。これらを直径１０ｃｍのディッシュの中に置き、蓋をして４℃の条件で３０分間、置くことによって、薄膜６３をゲル化させてゲル薄膜６４（図１２参照）（隔膜２）とした。【０１３４】
［２］ゲル薄膜（隔膜）への細胞接着
（２−１）底面無しマイクロ流路器材（ｓｔｉｃｋｙ  Ｓｌｉｄｅ  Ｉ  ０．６Ｌｕｅｒ，  ｉｂｉｄｉ  ＧｍｂＨ，  Ｍｕｎｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）２つを、ゲル薄膜支持体６１を上下から挟み込むように両面テープで貼り付けることによって、ゲル薄膜６４（隔膜２）の両面にそれぞれ空間（マイクロ流路）を有する流路デバイスを得た。
ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路は、図１の細胞培養装置１０における内面側空間１ａに相当する。下面側のマイクロ流路は、図１の細胞培養装置１０における外面側空間１ｂに相当する。【０１３５】
（２−２）両面側のマイクロ流路器材のマイクロ流路にＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）を満たし、続いて、上面側のマイクロ流路器材のマイクロ流路にラット正常胃粘膜由来ＲＧＭ細胞のＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）懸濁液（８．３３ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）約２００μＬを流し込んで、マイクロ流路内を細胞含有培地で置換した。直径１０ｃｍのディッシュ中において３７℃の条件で、５％ＣＯ２の環境下で前記細胞を培養した。３日後、ゲル薄膜６４への細胞の接着が確認された。【０１３６】
［３］ゲル薄膜（隔膜）の変位（培養液の流通あり）
（３−１）ゲル薄膜支持体６１の両面側のマイクロ流路器材に、それぞれ廃液用のシリコーンチューブの一端（第１端）を接続し、他端（第２端）を廃液容器に入れた。【０１３７】
（３−２）ゲル薄膜支持体６１の両面側のマイクロ流路器材に、それぞれ送液用のシリコーンチューブの一端（第１端）を接続し、他端（第２端）に５０ｍＬシリンジを取り付けた。シリンジに、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）（培養液）１０ｍＬを入れた。【０１３８】
（試験１）
ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面と、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面とを同じ高さとした。同様に、下面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面と、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面とを同じ高さとした。これによって、ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路（内面側空間）の圧力と、下面側のマイクロ流路（外面側空間）の圧力とはほぼ等しくなる。
図１６（Ａ）に示すように、この状態で、ゲル薄膜６４（隔膜）を顕微鏡で観察した。【０１３９】
（試験２）
ゲル薄膜支持体６１の下面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面と、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面とを同じ高さとした。上面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面は、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面より１５ｃｍ高くした。これによって、培養液を上面側のマイクロ流路に流通させるとともに、ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路の圧力を下面側のマイクロ流路の圧力より高くした。
図１６（Ｂ）は、焦点位置を下方に１８９．２５μｍずらせたときのゲル薄膜６４の観察像である。
図１６（Ｂ）に示すように、この状態で、ゲル薄膜６４（隔膜）を顕微鏡で観察し、焦点位置を計測した。その結果、ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路の圧力と下面側のマイクロ流路の圧力とがほぼ等しい場合（図１６（Ａ）参照）を基準として、本試験ではゲル薄膜６４の中央部が下方に最大１８９．２５μｍ変位したことが確認された。【０１４０】
（試験３）
逆に、上面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面と、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面とを同じ高さとし、下面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面を、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面より１５ｃｍ高くした。これによって、培養液を下面側のマイクロ流路に流通させるとともに、下面側のマイクロ流路の圧力を上面側のマイクロ流路の圧力より高くした。
図１６（Ｃ）は、焦点位置を上方に２６２．３５μｍずらせたときのゲル薄膜６４の観察像である。
図１６（Ｃ）に示すように、この状態で、ゲル薄膜６４（隔膜）を顕微鏡で観察し、焦点位置を計測した。その結果、ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路の圧力と下面側のマイクロ流路の圧力とがほぼ等しい場合（図１６（Ａ）参照）を基準として、本試験ではゲル薄膜６４の中央部が上方に最大２６２．３５μｍ変位したことが確認された。【０１４１】
（試験４）
ゲル薄膜支持体６１の下面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面と、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面とを同じ高さとした。
上面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにおける培養液の液面の、このマイクロ流路器材に接続した廃液容器の液面に対する高さを、０〜１５ｃｍの範囲で変化させた。
これによって、ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路の圧力を変動させた。【０１４２】
図１７（１）〜図１７（３４）は、ゲル薄膜６４（隔膜）の動作を示す連続写真である。図１７（１）〜図１７（３４）に示すように、上面側のマイクロ流路の圧力の変動に応じて、ゲル薄膜６４の中央部が上下の変位を繰り返した。
例えば、図１７（１）ではゲル薄膜６４が通常位置にあるため、ゲル薄膜６４に焦点が合っている。これに対し、図１７（４）および図１７（５）では、上面側のマイクロ流路の圧力が高くなることによってゲル薄膜６４の中央部が下方に変位したことから、焦点が合っていない。以後、焦点の合致と非合致が繰り返されている。このように、図１７（１）〜図１７（３４）では、ゲル薄膜６４の中央部の上下の変位が確認できる。【０１４３】
［４］ゲル薄膜（隔膜）の変位（培養液の流通なし）
（試験５）
ゲル薄膜支持体６１の上面側および下面側のマイクロ流路器材に接続した廃液側のシリコーンチューブをクリップで閉塞させることによって、マイクロ流路に培養液が流通しないようにした。それ以外は試験４と同様にして、ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路の圧力を変動させた。
図１８（１）〜図１８（３５）は、ゲル薄膜６４（隔膜）の動作を示す連続写真である。図１８（１）〜図１８（３５）に示すように、その結果、試験４と同様に、ゲル薄膜６４の中央部の上下の変位が確認できた。
このことから、マイクロ流路における培養液の流れがない場合でも、圧力の変動によって、ゲル薄膜６４の変位が可能であることがわかる。【０１４４】
［５］細胞の生死の確認
試験４の終了後の細胞について、次のようにして生死を確認した。
ゲル薄膜支持体６１の上面側のマイクロ流路器材に接続したシリンジにカルセイン−ＡＭ（終濃度２μＭ）とエチジウムホモダイマー（終濃度２μＭ）を溶解したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）を入れてマイクロ流路に導入し、１５分間放置した。蛍光顕微鏡で細胞の生死を確認した。図１９（Ａ）は、細胞の位相差観察像である。図１９（Ｂ）は生細胞を示し、図１９（Ｃ）は死細胞を示す。図１９（Ｄ）は、生細胞と死細胞とを合わせて示す写真である。
これらの結果より、ほぼ全ての細胞が生存し（図１９（Ｂ）参照）、死細胞はごく少数であったことがわかる（図１９（Ｃ）参照）。【０１４５】
［６］マイクロ流路の圧力とゲル薄膜の伸縮率との関係
下面側のマイクロ流路に接続するシリンジに加圧ポンプを取り付け、マイクロ流路に圧力をかけながら、ゲル薄膜の変位による焦点距離の変化と、ゲル薄膜の伸縮率を評価した。ゲル薄膜の伸縮率は２細胞間の距離から算出した。
図２０（Ａ）〜図２０（Ｆ）は、各圧力におけるゲル薄膜および細胞の写真である。
図２１は、焦点距離と圧力との関係、および、伸縮率と圧力との関係を示すグラフである。【０１４６】
図２１に示すように、マイクロ流路の高さが６００μｍであったため、ゲル薄膜の変位は、およそ６００μｍ（２．６ｋＰａ）で最大となった。一方、伸縮率については、ゲル薄膜が変形により流路の壁に接触しても伸長し続け、２倍程度となっても伸長限界には到達しなかった。これらの結果より、ゲル薄膜は、伸縮操作に対応できることが確認された。【０１４７】
上述の実施形態における各構成およびそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
例えば、図１に示す細胞培養装置１０は、第１圧力調整部１４Ａおよび第２圧力調整部１４Ｂを備えているが、細胞培養装置は、圧力調整部を備えていなくてもよい。図１に示す細胞培養装置１０では、第１圧力調整部１４Ａが内面側空間１ａの圧力を調整し、第２圧力調整部１４Ｂが外面側空間１ｂの圧力を調整するが、圧力調整部は、内面側空間と外面側空間のうち一方のみを調整できる構成であってもよい。【０１４８】
図１に示す細胞培養装置１０は、貯留槽１１と、第１圧力調整部１４Ａと、第２圧力調整部１４Ｂとを備えた構成であってもよい。図４に示す細胞培養装置１０ａは、貯留槽１１と、第１圧力調整部１４Ｃと、第２圧力調整部１４Ｄとを備えた構成であってもよい。
図４に示す細胞培養装置１０ａの貯留槽１１は、槽本体１２と蓋部１３とを有するが、これに限らず、槽本体と蓋部とが一体となった貯留槽を採用してもよい。
図１３に示すスリット６２の形状（平面視形状）は特に限定されず、例えば円形状、楕円形状、矩形状などであってもよい。
隔膜の伸び率（例えばＪＩＳ  Ｋ  ６２５１準拠）は、例えば、引張試験機を用い、例えば厚さ２ｍｍ、幅５ｍｍの試験片を、つかみ具間距離２０ｍｍ、引張り速度５００ｍｍ／分、試験温度２３℃で測定することができる。
図９に示す細胞培養装置１０Ｅでは、細胞は、細胞保持凹部２２ｄ，２３ｄ，２７ｄ，２８ｄのうち少なくともいずれか１つに播種されていればよい。【０１４９】
本実施形態において培養する細胞は、特に限定されず、例えばヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できる。
本実施形態は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。特に、医薬品の開発、細胞生物学の基礎研究に有用である。
【符号の説明】
【０１５０】
１，２１    培養室
１ａ    内面側空間
１ｂ    外面側空間
１ｈ，３ｈ，２２ｈ，２３ｈ，２７ｈ，２８ｈ    通気孔
２    隔膜
２ａ  内面（細胞が接着可能な一方の面、第１面）
３    培養液貯留室（第２培養液貯留室）
９，９Ａ，９Ｂ，９Ｄ    細胞培養ユニット
１０，１０ａ，１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄ，１０Ｅ    細胞培養装置
１１，１１Ａ，１１Ｂ，１１Ｃ，１１Ｄ    貯留槽
１２，１２Ａ，１２Ｂ，１２Ｃ，１２Ｄ，１２Ｅ    槽本体
１３，１３Ａ，１３Ｄ    蓋部
１４Ａ，１４Ｂ，１４Ｃ，１４Ｄ    圧力調整部
２１    主培養室
２２    第１導入用培養液貯留室
２２ｄ，２３ｄ，２７ｄ，２８ｄ    細胞保持凹部（細胞保持部）
２３    第１排出用培養液貯留室
２４    第１培養液導入流路
２５    第１培養液排出流路
２６    第１培養液返送流路
２７    第２導入用培養液貯留室
２８    第２排出用培養液貯留室
５１，５２    逆止弁（逆流防止機構）
５３，５４，５５，１１７    ラプラス弁（逆流防止機構）
Ｃ１    第１培養液
Ｃ２    第２培養液
【図１】
2019054287.tif 000012
【図２】
2019054287.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019054287.tif 000026
【図１６】
2019054287.tif 000027
【図１７】
2019054287.tif 000028
【図１８】
2019054287.tif 000029
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月6日(2020.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、
細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、
第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、
前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、
前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能であり、
前記隔膜は、親水性を有する高分子を主成分とし、２価以上の架橋点を有する架橋剤で架橋されたハイドロゲルで構成されている、
細胞培養装置。
【請求項２】
前記第１培養液を貯留する第１導入用培養液貯留室と、前記第１導入用培養液貯留室に貯留された前記第１培養液を前記内面側空間に導く第１培養液導入流路と、前記内面側空間に貯留された前記第１培養液を排出する第１培養液排出流路と、前記第１培養液排出流路を経た前記第１培養液が導入される第１排出用培養液貯留室と、をさらに有し、
前記内面側空間は、前記第１培養液導入流路から導入された前記第１培養液が前記第１培養液排出流路に向けて流通可能である、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記第１排出用培養液貯留室に貯留された前記第１培養液を前記第１導入用培養液貯留室に送る第１培養液返送流路をさらに有する、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記第１導入用培養液貯留室から前記内面側空間および前記第１排出用培養液貯留室を経て前記第１導入用培養液貯留室に戻る循環流れとは逆の方向の前記第１培養液の流れを規制する逆流防止機構をさらに備えている、請求項３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記逆流防止機構は、前記循環流れとは逆の方向の気体の流れを阻止するラプラス弁である、請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記第２培養液貯留室に貯留された前記第２培養液を前記外面側空間に導く第２培養液導入流路と、前記外面側空間に貯留された前記第２培養液を排出する第２培養液排出流路と、前記第２培養液排出流路を経た前記第２培養液が導入される第２排出用培養液貯留室と、を有する、請求項２〜５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記第１導入用培養液貯留室と、前記第１排出用培養液貯留室と、前記第２培養液貯留室である第２導入用培養液貯留室と、前記第２排出用培養液貯留室とのうち少なくともいずれか１つに、播種された細胞が保持される細胞保持部を有する、請求項６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記培養室のうち少なくとも２つ、または、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記第２培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに接続されている、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記架橋剤は、ポリエチレングリコールを主鎖とする、請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記隔膜における前記細胞が接着可能な前記第１面は、細胞接着性を有するタンパク質によってコーティングされている、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記高分子は、ゼラチンである、請求項１〜１０のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記ハイドロゲルは、ジベンゾシクロオクチンとアジド基との反応によって得られるゲルである、請求項１〜１１のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記隔膜は、保管時には乾燥状態であり、培養時には前記第１培養液および前記第２培養液に触れることで膨潤する、請求項１〜１２のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記隔膜の厚みは、０．１〜１００μｍである、請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
含水時の前記隔膜の伸び率は、１１０〜１０００％である、請求項１〜１４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記内面側空間と前記外面側空間のうち少なくともいずれか一方の圧力を調整する圧力調整部をさらに備えている、請求項１〜１５のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
細胞培養方法であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、第１培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、第２培養液が貯留される第２培養液貯留室と、を有し、前記培養室は、前記隔膜の前記第２面が面する空間であって前記第２培養液貯留室に貯留される前記第２培養液が導入される外面側空間を有し、前記隔膜は伸縮性を有し、前記内面側空間と前記外面側空間との圧力差に応じて、伸縮により少なくとも一部が厚さ方向に変位可能である細胞培養装置を準備し、
前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記内面側空間と前記外面側空間とのうち少なくともいずれか一方の圧力を調整することによって、前記隔膜を伸縮により厚さ方向に変位させる、
細胞培養方法。
【国際調査報告】
2019054287.tif 000035
2019054287.tif 000036
2019054287.tif 000037
2019054287.tif 000038