(57)【要約】ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データが統合されて記録されたライブラリを作成する方法であって、生体への作用が既知である物質である作用既知物質を準備する工程、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、上記作用既知物質を投与していないゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、ゼブラフィッシュを入れた水浴に上記作用既知物質を投与し、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、上記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、上記作用既知物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化を検出する工程、得られた行動パラメータの変化を示すデータを細分化して多数の数値データに変換する工程、行動パラメータの変化から得られた上記多数の数値データを正規化する工程、上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程、いずれも正規化された、行動パラメータの変化から得られた上記多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す上記多数の数値データとを統合して記録する工程、により行われる、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリの作成方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データが統合されて記録されたライブラリを作成する方法であって、
生体への作用が既知である物質である作用既知物質を準備する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴における、前記作用既知物質を投与していないゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴に前記作用既知物質を投与し、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、前記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
前記作用既知物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化を検出する工程、
得られた行動パラメータの変化を示すデータを細分化して多数の数値データに変換する工程、
行動パラメータの変化から得られた前記多数の数値データを正規化する工程、
前記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程、
いずれも正規化された、行動パラメータの変化から得られた前記多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す前記多数の数値データとを統合して記録する工程、により行われる、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリの作成方法。
【請求項２】
前記作用既知物質は、医薬品の有効成分である請求項１に記載のライブラリの作成方法。
【請求項３】
前記作用既知物質は、前記作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が既に知られている物質であり、
前記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程では、
既に知られている前記関係を参照して、前記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程、及び、前記多数の数値データを正規化する工程を行う請求項１又は２に記載のライブラリの作成方法。
【請求項４】
前記作用既知物質は、前記作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が知られていない物質であり、
前記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程では、
前記作用既知物質を投与していない対照ゼブラフィッシュ、及び、前記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュからｍＲＮＡをそれぞれ抽出してｍＲＮＡの発現量を測定して、発現量が変化したｍＲＮＡの配列を特定する工程、
前記対照ゼブラフィッシュと前記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュとの比較において発現量が変化したｍＲＮＡの配列から、前記作用既知物質の投与により発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定し、前記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程、及び、
前記多数の数値データを正規化する工程を行う請求項１又は２に記載のライブラリの作成方法。
【請求項５】
前記作用既知物質は、中枢神経作用を有する物質である請求項１〜４のいずれかに記載のライブラリの作成方法。
【請求項６】
前記行動パラメータが、ゼブラフィッシュの相対移動速度、総移動距離、中心円通過回数、中心円からの距離及び進行方向の角度変化からなる群より選択される少なくとも１つの行動パラメータである請求項１〜５のいずれかに記載のライブラリの作成方法。
【請求項７】
ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データがいずれも正規化され、統合されて記録されたライブラリを準備する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴における、被験物質を投与していないゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴に被験物質を投与し、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、被験物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化する工程、
いずれも正規化された、前記被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと、前記ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより、発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定する工程、を行い、
前記同定された遺伝子の機能から、前記被験物質の生体への作用を予測する、被験物質の生体への作用を評価する方法。
【請求項８】
前記行動パラメータが、ゼブラフィッシュの相対移動速度、総移動距離、中心円通過回数、中心円からの距離及び進行方向の角度変化からなる群より選択される少なくとも１つの行動パラメータである請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
前記被験物質が、食品又は食品由来成分である請求項１〜６のいずれかに記載のライブラリの作成方法又は請求項７又は８に記載の評価方法。
【請求項１０】
前記被験物質に対し、前記被験物質を投与していない対照ゼブラフィッシュ、及び、前記被験物質投与後のゼブラフィッシュからｍＲＮＡをそれぞれ抽出してｍＲＮＡの発現量を測定して、発現量が変化したｍＲＮＡの配列を特定する工程、
前記対照ゼブラフィッシュと前記被験物質投与後のゼブラフィッシュとの比較において発現量が変化したｍＲＮＡの配列から、前記被験物質の投与により発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定し、前記被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程、及び、前記被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程を行うことにより、前記被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す前記多数の数値データを得て、
いずれも正規化された、前記被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す前記多数の数値データと、前記ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより、前記被験物質の新規作用又はメカニズムを推定する、請求項７〜９のいずれかに記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリの作成方法及びゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から被験物質の生体への作用を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに対して有効な作用を発揮することのできる材料、特に食品の材料を探索するために、げっ歯類を中心とした評価系が存在している。【０００３】
げっ歯類を使用した中枢神経作用の評価方法としては、高架式十字迷路、尾懸垂、強制水泳等の方法が知られており、例えば、ラットを用いた強制水泳試験が抗うつ薬のスクリーニング方法として利用されている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｏｒｓｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ２６６、７３０−７３２、１９７７
【非特許文献２】Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ａ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＴＪ．  （２０１７）  Ｍｏｄａｆｉｎｉｌ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ａｎｘｉｅｔｙ−ｌｉｋｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．  ＰｅｅｒＪ  ５：ｅ２９９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１に示したような、げっ歯類を使用した中枢神経作用の評価方法では一つの評価方法により複数の中枢神経作用を評価することはできない。
また、上記評価方法は医薬品の評価試験として使用されることの多い方法であるが、医薬品とは異なり生体に対して緩慢な作用を示す食品に対して上記評価方法を適用した場合には、明瞭な評価ができないことが多い。【０００６】
また、げっ歯類を使用した中枢神経作用の評価方法ではその評価に要するコスト、評価に要する時間に問題がある。【０００７】
このように、げっ歯類を中心とした評価系にはいくつかの問題があるため、げっ歯類代替のモデル生物を使用した評価系が求められている。【０００８】
ここで、ゼブラフィッシュは、全ゲノム配列がヒトと８０％程度の相同性があり、ヒトと同等の主要臓器を有していることから、げっ歯類に代わるモデル生物として着目されている。【０００９】
非特許文献２には、モダフィニルをゼブラフィッシュに与え、水浴内におけるゼブラフィッシュの行動解析を行うことにより、モダフィニルに抗不安作用があることが示唆されたと記載されている。【００１０】
非特許文献２では、抗不安作用があることが知られているエタノールをゼブラフィッシュに与えた場合のゼブラフィッシュの行動解析を行った結果と、モダフィニルをゼブラフィッシュに与えた場合の行動解析を行った結果の傾向を対比することによって、モダフィニルに抗不安作用があることが示唆されたと結論付けている。【００１１】
ここで、食品等が生体に与える作用、とくに中枢神経作用のような作用を評価する場合には、作用に関連する遺伝子の発現について考慮する必要があると考えられるが、非特許文献２においては、モダフィニルの投与と遺伝子の発現レベルの変化との関連は考慮されていなかった。【００１２】
現在、生体への中枢神経作用等の作用と遺伝子の発現レベルの変化の関連づけを行う場合、研究者が作用に関連する特定の遺伝子を推測し、推測に基づき対応関係があるかを確認することにより行われることが多い。
この場合、研究者の推測、主観に沿う関連付けは行うことができるが、研究者が予測し得ないような意外な遺伝子の発現が作用に関連していたとしても、その関連を発見することは困難であった。【００１３】
このような背景から、研究者の予測に含まれない範囲も含めて、被験物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化、及び、被験物質の生体への作用を網羅的に関連付けて評価する方法が望まれていた。【００１４】
本発明は、ゼブラフィッシュを使用して被験物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化、及び、被験物質の生体への作用を網羅的に関連付けて評価する方法を提供すること、及び、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリの作成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、被験物質を投与した際のゼブラフィッシュの行動パターンと遺伝子の発現レベルを関係づけることによって、被験物質の生体への作用を予測することができることを見出し、本発明を完成した。【００１６】
本発明は、以下の方法を包含する。
［１］ゼブラフィッシュの行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データが統合されて記録されたライブラリを作成する方法であって、
生体への作用が既知である物質である作用既知物質を準備する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴における、上記作用既知物質を投与していないゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴に上記作用既知物質を投与し、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、上記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
上記作用既知物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化を検出する工程、
得られた行動パラメータの変化を示すデータを細分化して多数の数値データに変換する工程、
行動パラメータの変化から得られた上記多数の数値データを正規化する工程、
上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程、
いずれも正規化された、行動パラメータの変化から得られた上記多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す上記多数の数値データとを統合して記録する工程、により行われる、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリの作成方法。【００１７】
［２］上記作用既知物質は、医薬品の有効成分である上記［１］に記載のライブラリの作成方法。【００１８】
［３］上記作用既知物質は、上記作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が既に知られている物質であり、
上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程では、
既に知られている上記関係を参照して、上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程、及び、上記多数の数値データを正規化する工程を行う上記［１］又は［２］に記載のライブラリの作成方法。【００１９】
［４］上記作用既知物質は、上記作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が知られていない物質であり、
上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程では、
上記作用既知物質を投与していない対照ゼブラフィッシュ、及び、上記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュからｍＲＮＡをそれぞれ抽出してｍＲＮＡの発現量を測定して、発現量が変化したｍＲＮＡの配列を特定する工程、
上記対照ゼブラフィッシュと上記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュとの比較において発現量が変化したｍＲＮＡの配列から、上記作用既知物質の投与により発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定し、上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程、及び、
上記多数の数値データを正規化する工程を行う上記［１］又は［２］に記載のライブラリの作成方法。【００２０】
［５］上記作用既知物質は、中枢神経作用を有する物質である上記［１］〜［４］のいずれかに記載のライブラリの作成方法。【００２１】
［６］上記行動パラメータが、ゼブラフィッシュの相対移動速度、総移動距離、中心円通過回数、中心円からの距離及び進行方向の角度変化からなる群より選択される少なくとも１つの行動パラメータである上記［１］〜［５］のいずれかに記載のライブラリの作成方法。【００２２】
［７］ゼブラフィッシュの行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データがいずれも正規化され、統合されて記録されたライブラリを準備する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴における、被験物質を投与していないゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴に被験物質を投与し、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、被験物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化する工程、
いずれも正規化された、上記被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと、上記ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより、発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定する工程、を行い、
上記同定された遺伝子の機能から、上記被験物質の生体への作用を予測する、被験物質の生体への作用を評価する方法。【００２３】
［８］上記行動パラメータが、ゼブラフィッシュの相対移動速度、総移動距離、中心円通過回数、中心円からの距離及び進行方向の角度変化からなる群より選択される少なくとも１つの行動パラメータである上記［７］に記載の評価方法。【００２４】
［９］上記被験物質が、食品又は食品由来成分である上記［１］〜［６］のいずれかに記載のライブラリの作成方法又は上記［７］又は［８］に記載の評価方法。【００２５】
［１０］上記被験物質に対し、上記被験物質を投与していない対照ゼブラフィッシュ、及び、上記被験物質投与後のゼブラフィッシュからｍＲＮＡをそれぞれ抽出してｍＲＮＡの発現量を測定して、発現量が変化したｍＲＮＡの配列を特定する工程、
上記対照ゼブラフィッシュと上記被験物質投与後のゼブラフィッシュとの比較において発現量が変化したｍＲＮＡの配列から、上記被験物質の投与により発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定し、上記被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程、及び、上記被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程を行うことにより、上記被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す上記多数の数値データを得て、
いずれも正規化された、上記被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す上記多数の数値データと、上記ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより、上記被験物質の新規作用又はメカニズムを推定する、上記［７］〜［９］のいずれかに記載の評価方法。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、ゼブラフィッシュを使用して被験物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化、及び、被験物質の生体への作用を網羅的に関連付けて評価する方法を提供することができる。
また、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリの作成方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ユークリッド距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
【図２】図２は、マンハッタン距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
【図３】図３は、マキシマム距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
【図４】図４は、ユークリッド距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
【図５】図５は、図４において点線で囲んだ領域の拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の被験物質の生体への作用を評価する方法（以下、本発明の評価方法ともいう）は、ゼブラフィッシュの行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データがいずれも正規化され、統合されて記録されたライブラリを準備する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴における、被験物質を投与していないゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴に被験物質を投与し、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、被験物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化する工程、
いずれも正規化された、上記被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと、上記ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより、発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定する工程、を行い、
上記同定された遺伝子の機能から、上記被験物質の生体への作用を予測する方法である。
【００２９】
ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）は、人と比較して全ゲノム配列が８０％の相同性を持ち、遺伝子数もほぼ同じであり、さらに主要臓器・組織の発生・構造も良く似ていることが知られている。ゼブラフィッシュは６−７ｄｐｆ（ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ  ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、６−７日胚）で主要な臓器が形成されるため、本発明の評価方法に好適に用いることができる。
また、ゼブラフィッシュは１回の産卵で約２００個以上の受精卵が得られるため同じ遺伝的背景を持ったゼブラフィッシュが同時に多数得られ、多くの被験物質に対して条件を変えて一度に本発明の評価方法を適用することに適している。
本発明においては、同じ遺伝的背景を持ち同時に誕生したゼブラフィッシュを同時に使用することが好ましい。同じ遺伝的背景を持ち同時に誕生したゼブラフィッシュを使用すると、ゼブラフィッシュの個体差の影響を無視しうる程度に小さくすることができるためである。
【００３０】
ゼブラフィッシュの行動パラメータの測定は、ゼブラフィッシュを水浴に入れて、ゼブラフィッシュの行動を記録する装置により行うことができる。ゼブラフィッシュの行動を記録するための装置としてはＤａｎｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｎｏｌｄｕｓ社製）等を使用することができる。
このような記録装置は、ウェルプレート（４８ウェル、９６ウェル等）の載置部、照明、赤外線カメラ等を備えている。
ウェルプレートには水浴として例えば０．３×Ｄａｎｉｅａｕ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１９．３ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２３ｍＭ  ＫＣｌ、０．２３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、１．７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）を使用することができる。そして、各ウェルに水浴とゼブラフィッシュ１匹を入れて、行動パラメータを測定する。
被験物質を投与した場合のゼブラフィッシュの行動パラメータ等を測定する場合は、被験物質を所定の濃度で各ウェルごとに投与する。
同時に、被験物質を投与していないウェルにおいてゼブラフィッシュの行動パラメータを測定して比較対象のコントロールとする。
ウェルごとに被験物質の種類及び濃度を変えることができるので、多くの被験物質に対して条件を変えて一度に本発明の評価方法を適用することができる。
【００３１】
ゼブラフィッシュの行動パラメータとしては、例えば以下の指標が挙げられる。
Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｔｅ：相対移動速度
ＤＭＦ（Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｍｏｖｅｄ  Ｔｏｔａｌ）：総移動距離
ＩＺＦ（Ｉｎ  Ｚｏｎｅ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）：中心円通過回数
ＤＴＺ（Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  Ｚｏｎｅ）：中心円からの距離
ＴＡ（Ｔｕｒｎ  Ａｎｇｌｅ）： 進行方向の角度変化
Ｍｏｂｌｉｔｙ  Ｓｔａｔｅは測定期間において、後述するソフトウェアＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎで得られたゼブラフィッシュの相対移動速度を示している。
本明細書では、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎで得られた相対移動速度につき、高速（相対移動速度６５以上、９５以下）、中速（相対移動速度３５以上、６５未満）、低速（相対移動速度５以上、３５未満）の３段階に分類して使用する。
ＤＭＦは測定期間におけるゼブラフィッシュの総移動距離であり、総移動距離が大きいときに高い数値で表される。
ＩＺＦは測定期間において中心円（半径２ｍｍ）の中を通過した回数であり、通過回数が多いときに高い数値で表される。
ＤＴＺは測定期間において中心円から近い場所にいたか遠い場所にいたかの指標であり、中心円から近い場所にいた時間が長いときに低い数値で表される。
ＴＡは測定期間において進行方向を変えた頻度の指標であり、進行方向が変化した頻度が高いときに高い数値で表される。
これらの指標は、いずれもゼブラフィッシュの行動を記録するための装置に付属するソフトウェア（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  Ｎｏｌｄｕｓ社製）で測定することができる。
【００３２】
本発明の評価方法では、ゼブラフィッシュの行動パラメータ等と遺伝子の発現レベルとの関係が記録されたライブラリを使用する。
ライブラリは、被験物質を用いた本発明の評価方法の実施に先立ち準備しておき、記録媒体に保存しておく。
【００３３】
ライブラリには、ゼブラフィッシュの行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データがいずれも正規化され、統合されて記録されている。
本発明の評価方法では、いずれも正規化された、被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと、ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより、発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定する。
【００３４】
上記解析は、データの前処理（正規化など）を実施したうえで、バイオインフォマティクスの手法により行うことができる。
例えば、多変量解析やネットワーク解析等の手法により行うことができる。
多変量解析の具体的な例としては、一般的なクラスター解析法により行うことができる。
クラスター解析法としては、例えば、階層的クラスタリング（類似度：ユークリッド距離、マンハッタン距離又はマキシマム距離）が挙げられる。
また、非階層的クラスタリング（Ｋ−ｍｅａｎｓ、自己組織化マップ）も挙げられる。
また、ネットワーク解析の例としては、ベイジアンネットワークやブーリアンネットワークを用いた解析が挙げられる。
これらの解析は、処理ソフトウェアを搭載したパーソナルコンピュータにより行うことができる。
【００３５】
ライブラリには、行動パラメータの指標の例として挙げた、相対移動速度、総移動距離、中心円通過回数、中心円からの距離及び進行方向の変化を示すデータが細分化された多数の数値データが記録されている。
行動パラメータの変化を示すデータの細分化は、例えば以下のような方法で行うことができる。
・各指標を数値化する際の閾値の区別を細かくする
・行動パラメータの測定時間を変更する
・測定された行動パラメータから特定の時間だけを抜き出したデータとする
【００３６】
また、行動パラメータ等の変化を示すデータは、ゼブラフィッシュに与えられたストレスに関するデータと組み合わせてさらに細分化して多数の数値データとして記録されていてもよい。
ストレスとしては、明期と暗期の繰り返し、所定時間の明期刺激、水温変動、化学物質刺激、赤外線刺激、紫外線刺激、電気刺激、音刺激、振動刺激等が挙げられる。
これらのストレスに関するデータと組み合わせた行動パラメータ等の変化を示すデータの細分化は、例えば以下のような方法で行うことができる。
・明期と暗期を繰り返す際の明期の期間と暗期の期間の変更
・明期と暗期を繰り返す際の特定の明期又は暗期を抜き出したデータとする
・明期刺激を与える際の刺激の加え方の変更
行動パラメータ等の変化を示すデータとストレスに関するデータと組み合わせてデータを細分化する場合は、行動パラメータ等の変化を示すデータの数とストレスの与え方の種類の数の掛け算になる。
そのため、ストレスを加えた条件やデータを抜き出す条件に応じて細分化された、行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データがライブラリに記録されることになる。
【００３７】
上記に説明した、行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データは、正規化されたうえで遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データと統合して同一のライブラリに記録されている。
【００３８】
ライブラリに記録される多数の数値データとしては、遺伝子の発現レベルの変化を表すデータの数と行動パラメータ等の変化を表すデータの数が同程度であることが好ましい。
【００３９】
ライブラリは、以下の手順により作成して準備しておくことができる。
このようなライブラリの作成方法は、本発明のライブラリの作成方法である。
生体への作用が既知である物質である作用既知物質を準備する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴における、上記作用既知物質を投与していないゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
ゼブラフィッシュを入れた水浴に上記作用既知物質を投与し、ゼブラフィッシュを入れた水浴における、上記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する工程、
上記作用既知物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化を検出する工程、
得られた行動パラメータの変化を示すデータを細分化して多数の数値データに変換する工程、
行動パラメータの変化から得られた上記多数の数値データを正規化する工程、
上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程、
いずれも正規化された、行動パラメータの変化から得られた上記多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す上記多数の数値データとを統合して記録する工程。
以下に、このライブラリ作成について説明する。
【００４０】
作成するライブラリにおいて着目する生体への作用、予想される行動パラメータの変化等を考慮して、ライブラリ作成に使用する作用既知物質を選択する。
作用既知物質としては医薬品の有効成分を用いることが好ましい。医薬品の有効成分は医薬品の有効成分の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が既に知られていることが多いため、生体への作用と遺伝子の発現レベルの変化の関連付けを、公知の資料を参照することで行うことができるためである。また、その使用量も少なくて済むことから好ましい。
また、医薬品の有効成分は生体への作用が強いので、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化が明確に表れるという点でも好ましい。
【００４１】
本発明のライブラリの作成方法で使用する上記作用既知物質は、上記作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が既に知られている物質であることが好ましく、上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化する工程では、既に知られている上記関係を参照して、上記作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程、及び、上記多数の数値データを正規化する工程を行うことが好ましい。
作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化の関係が既に知られていれば、作用既知物質を投与した際のゼブラフィッシュの行動パラメータの変化を測定することで、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化して得られた数値データと、遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化して得られた数値データとを統合してライブラリにデータとして格納することができる。
なお、作用既知物質を投与した際のゼブラフィッシュの行動パラメータの変化を測定する際には、同時に、作用既知物質を投与していないウェルにおいてゼブラフィッシュの行動パラメータを測定して比較対象のコントロールとする。
【００４２】
作用既知物質を投与した際のゼブラフィッシュの行動パラメータ等の変化を測定すると、行動パラメータ等の変化から多数の数値データが得られるので、この多数の数値データを正規化する。
【００４３】
行動パラメータの変化から得られた多数の数値データの正規化は、実験間の比較を行う上で必要になる。
本明細書における正規化とは、多数の数値データを一定のルール（規則）に基づいて変形して利用しやすくすることを意味し、確率的、統計学的に相互比較できるようにデータを変換する操作を指す。
正規化の手法の例としてＺスコアを用いる方法がある。
Ｚスコアは、以下の式で算出され、この値をクラスター解析に使用することができる。
Ｚスコア＝（生データ値−コントロール平均値）／コントロール標準偏差
なお、行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化する方法はＺスコアを用いる方法に限定されるものではなく、他の方法を使用することも可能である。
【００４４】
作用既知物質としては中枢神経作用を有する物質を使用することが好ましく、中枢神経作用を有する医薬品の有効成分を使用することが好ましい。
中枢神経作用としては、鎮静作用、催眠作用、麻酔作用、興奮作用、抗うつ作用、抑うつ作用、抗不安作用、覚醒作用、睡眠作用等が挙げられる。
中枢神経作用を有する医薬品の有効成分の例としては、Ｆｌｕｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（フルフェナジン）、Ｄｉａｚｅｐａｍ（ジアゼパム）、Ｃｌｏｎａｚｅｐａｍ  Ｃ−ＩＶ（クロナゼパム）、Ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（アミノトリプチリン塩酸塩）、Ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ（ハロペリドール）、Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（クロルプロマジン）、Ｓｕｖｏｒｅｘａｎｔ（スボレキサント）、Ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ（イミプラミン）等が挙げられる。
また、作用既知物質としては、末梢神経作用又は筋肉作用を有する物質を使用することが好ましく、末梢神経作用又は筋肉作用を有する医薬品の有効成分を使用することが好ましい。
いずれの医薬品の有効成分も、医薬品の有効成分の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が既に知られており、ＧＥＯ  Ｄａｔａｓｅｔｓ（ＮＣＢＩ）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/を参照することで知ることができる。
【００４５】
作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が知られている場合には、上記データベース［ＧＥＯ  Ｄａｔａｓｅｔｓ（ＮＣＢＩ）］からアレイデータを引用後、アレイ内のデータを正規化する。
アレイ内のデータの正規化の手順としては、具体的には（１）〜（３）の手順を用いることができるが、これらはＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いて行うことができる。
（１）７５％Ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ  ｓｈｉｆｔによる正規化を行う。
全体の遺伝子発現量に変化がなく、Ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ値は各アレイ間でほとんど変動しないという仮定に基づき、各サンプルの７５％を０に補正する。
（２）ベースライン補正
コントロールサンプルからの比をとる。
（３）各ＧｅｎｅＳｙｍｂｏｌにおけるＬｏｇ２  ＦＣ（Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ）値を抽出する。
アレイ間で共通のＧｅｎｅＳｙｍｂｏｌを抽出し、Ｌｏｇ２  ＦＣ値を取得する。
【００４６】
続いて、アレイ間のデータを正規化する。正規化は、行動パラメータの変化から得られた数値データの正規化と同様に、Ｚスコアを用いる方法により行うことができる。
Ｚスコアは、以下の式で算出され、この値をクラスター解析に使用することができる。
Ｚスコア＝（生データ値−コントロール平均値）／コントロール標準偏差
なお、アレイ間のデータを正規化する方法はＺスコアを用いる方法に限定されるものではなく、他の方法を使用することも可能である。
【００４７】
作用既知物質について、行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データを正規化したデータと、遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータが得られるので、これらを統合して記録する。
この統合は、例えば多変量解析を用いた統計学的手法に基づいて行うこともでき、いずれも正規化された、行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを、同軸上に並べることにより統合して記録することができる。
この手順により、当該作用既知物質についてのデータがライブラリに記録される。
他の作用既知物質についても同様の作業を行い、ライブラリに記録された作用既知物質の数を増やすことにより、ライブラリの精度を向上させることができる。
【００４８】
ライブラリを作成するための作用既知物質が、作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が知られていない物質である場合は、ライブラリの作成にあたって、データベースによらずに作用既知物質の投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータを得る必要がある。
【００４９】
作用既知物質の投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程は、例えば以下の工程により行うことができる。
上記作用既知物質を投与していない対照ゼブラフィッシュ、及び、上記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュからｍＲＮＡをそれぞれ抽出してｍＲＮＡの発現量を測定して、発現量が変化したｍＲＮＡの配列を特定する工程、
上記対照ゼブラフィッシュと上記作用既知物質投与後のゼブラフィッシュとの比較において発現量が変化したｍＲＮＡの配列から、上記作用既知物質の投与により発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定し、遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る工程。
【００５０】
ゼブラフィッシュからｍＲＮＡをそれぞれ抽出してｍＲＮＡの発現量を測定して、発現量が変化したｍＲＮＡの配列を特定する方法の例としては、ＲＮＡ  Ｓｅｑや、ＤＮＡマイクロアレイ等が挙げられるが、他の方法であってもよい。
【００５１】
なお、作用既知物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータの変化を測定する際には、同時に、作用既知物質を投与していないウェルにおいて対照ゼブラフィッシュの行動パラメータを測定して、対照ゼブラフィッシュからもｍＲＮＡを抽出してｍＲＮＡの発現量を測定し、発現量が変化したｍＲＮＡの配列を特定する。
これにより、ｍＲＮＡの発現量を作用既知物質投与後のゼブラフィッシュと対照ゼブラフィッシュで比較して、発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定することができる。
【００５２】
上記で得られた、作用既知物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データをアレイ内のデータとして、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いて上記（１）〜（３）の手順でアレイ内のデータの正規化を行う。
続けて、アレイ間のデータを、Ｚスコアを用いる方法により正規化する。
これにより、作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が知られている場合と同様に、遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータが得られる。
【００５３】
作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が知られていない物質についても、行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを得て、この多数の数値データを正規化することができる。
正規化の手法としてはＺスコアを用いることができる。
なお、上記アレイ間のデータの正規化及び行動パラメータの変化から得られた多数の数値データの正規化の方法は、Ｚスコアを用いる方法に限定されるものではなく、他の方法を使用することも可能である。
【００５４】
そして、当該作用既知物質についても、行動パラメータ等の変化から得られた多数の数値データを正規化したデータと、遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータが得られるので、これらを統合して記録する。
【００５５】
このような方法により、作用既知物質が、作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が知られている物質であっても、知られていない物質であっても、当該作用既知物質投与後のゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データと遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統合してライブラリに記録することができる。
これにより、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリを作成することができる。
【００５６】
本発明のライブラリの作成方法及び本発明の評価方法では、ゼブラフィッシュの行動パラメータを測定する際に、ゼブラフィッシュにストレスを与えておいてもよい。
ストレスを与えることによって、ストレス存在下での行動パラメータの変化を測定し、ストレス存在下で被験物質が投与された際に特異的にみられる行動パラメータの変化を測定することができる。また、ストレス存在下で被験物質が投与された際に特異的に発現レベルが相関して変化した遺伝子を同定することができる。
ストレスの種類としては、明期と暗期の繰り返し、所定時間の明期刺激、水温変動、化学物質刺激、赤外線刺激、紫外線刺激、電気刺激、音刺激、振動刺激等が挙げられる。
【００５７】
本発明の評価方法により評価する生体への作用は、中枢神経作用、末梢神経作用又は筋肉作用であることが好ましい。本発明の評価方法は中枢神経作用、末梢神経作用又は筋肉作用に対して評価することに適している。
【００５８】
本発明の評価方法において被験物質として用いる物質は特に限定されるものではないが、医薬品、医薬品の有効成分、食品又は食品由来成分であることが好ましく、食品又は食品由来成分であることがより好ましい。
食品には、飲料以外の食品、飲料及び食品添加物が包含される。
食品由来成分は、食品に含まれる物質を単離したものを意味する。
医薬品の有効成分として既に知られている物質は、その作用も既に知られていると考えられるため、本発明の評価方法を用いて生体への作用を予測する必要性は低い。しかしながら、食品の中には生体への作用が知られていないものが多く、生体への作用を予測することが有益である。
被験物質として用いることのできる物質の例であり、食品由来成分の例としては、Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ（エピガロカテキンガレート）、４−Ａｍｉｎｏ−ｎ―ｂｕｔｙｒｉｃ−Ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ）、Ｌ−Ｔｈｅａｎｉｎｅ（Ｌ−テアニン）、８ｂｅｔａ−（４’−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｉｇｌｏｙｌｏｘｙ）  ｃｏｓｔｕｎｏｌｉｄｅ（８ｂｅｔａ）等が挙げられる。
【００５９】
以下に、本発明の具体的な実施形態の一例として、中枢神経作用を有する物質について、ゼブラフィッシュの行動パラメータの測定と、発現レベルが相関して変化した遺伝子の同定を行う場合の例について説明する。
【００６０】
［水浴の準備］
水浴として０．３×Ｄａｎｉｅａｕ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１９．３ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２３ｍＭ  ＫＣｌ、０．２３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、１．７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）を用いる。
以下、この実施形態の例の説明において水浴という場合この水浴を指すこととする。
【００６１】
［ゼブラフィッシュの準備］
以下の条件でゼブラフィッシュを６ｄｐｆまで飼育して準備する。
ゼブラフィッシュ：ＡＢ  Ｌｉｎｅ  ６ｄｐｆ
水浴温度：２８℃
飼育時の明期と暗期の繰り返し：明期１４時間（７：００−２１：００）−暗期１０時間（２１：００−７：００）
【００６２】
［ライブラリ作成用の試薬の準備］
ライブラリ作成のための作用既知物質として以下の物質（医薬品の有効成分）を使用する。
Ｄｉａｚｅｐａｍ（図中：Ｄｉａｚｅｐａｍと表記する）
Ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ（図中：Ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌと表記する）
各作用既知物質について、上記水浴に溶解させて濃度１０μＭに調整した試薬を準備した。
これらの作用既知物質は、いずれも中枢神経作用を有する物質であり、その投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が既に知られている物質である。
【００６３】
［行動パラメータの測定手順］
（１）４８ウェルプレートの各ウェル内に上記水浴を１ｍｌ加える。そこにゼブラフィッシュ（６ｄｐｆ）を１匹／ウェル入れて、温度を２８℃とし３０分〜１時間維持する。
（２）４８ウェルプレート内の液をピペットで除去した後、いずれかの試薬を１ｍｌ／ウェル添加する。
（３）Ｄａｎｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｎｏｌｄｕｓ社製）に４８ウェルプレートをセットし、行動記録を行う。
明期と暗期の繰り返しを、明期３時間（期間Ｌ１）−暗期１０時間（期間Ｄ）−明期１１時間（期間Ｌ２）のサイクルで行い、ゼブラフィッシュの行動を２４時間記録する。
（４）ソフトウェア（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  Ｎｏｌｄｕｓ社製）を用いて、行動解析を行う。相対移動速度につき、高速（相対移動速度６５以上、９５以下）、中速（相対移動速度３５以上、６５未満）、低速（相対移動速度５以上、３５未満）の３段階に分類する。
各相対移動速度ごとに分類したそれぞれについて、ＤＭＦ、ＩＺＦ、ＤＴＺ、ＴＡの指標を測定する。相対移動速度ごとに分類したＤＭＦ、ＩＺＦ、ＤＴＺ、ＴＡのデータを、明期と暗期の繰り返しの期間である期間Ｌ１、期間Ｄ、期間Ｌ２ごとに分ける。
【００６４】
［ライブラリの作成］
（１）４８ウェルプレートに、［ライブラリ作成用の試薬の準備］で準備した各試薬を１ｍｌ入れたウェル、及び、コントロールとして、上記水浴に対して各試薬に含まれるＤＭＳＯと同濃度になるようにＤＭＳＯを加えたコントロール用水浴を１ｍｌ入れたウェルを準備し、［ゼブラフィッシュの準備］で準備した６ｄｐｆのゼブラフィッシュをウェルに入れて、［行動パラメータの測定手順］に従って行動パラメータを測定する。
なお、試薬中にＤＭＳＯが含まれない場合にはコントロール試薬にＤＭＳＯを加える必要はない。
【００６５】
（２）測定した行動パラメータを以下のような形式の生データとして保管する。
・試薬種類（［ライブラリ作成用の試薬の準備］で準備した各試薬のいずれか、又は、コントロール）
・相対移動速度（９５−６５（高速）、６５−３５（中速）又は３５−０５（低速））
・明期と暗期の繰り返し（Ｌ１、Ｄ又はＬ２）
・指標（ＤＭＦ、ＩＺＦ、ＤＴＺ又はＴＡ）
相対移動速度が３種、明期と暗期の繰り返しが３種、指標が４種であれば、生データの数は３×３×４＝３６種類であるが、実際には明期と暗期の繰り返しの条件や他の刺激の条件等を変更することにより、より多数の生データを得ることができる。
【００６６】
（３）保管した作用既知物質使用時の行動パラメータの指標と、コントロールの行動パラメータの差分（行動パラメータの変化）を検出する。
【００６７】
（４）上記行動パラメータの変化をＺスコアを用いて正規化する。Ｚスコアによる正規化の方法は上述の通りである。
【００６８】
（５）続いて、作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化の関連付けを行う。
公開ＤＢ（Ｇｅｏ  Ｄａｔａｓｅｔｓ）より、Ｄｉａｚｅｐａｍ（ＧＳＥ２３１５７）とＨａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ（ＧＳＥ８９７８０）のアレイデータを引用することにより行うことができる。
そして、これらのアレイデータから、上述の手順によりＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いてアレイ内のデータの正規化を行い、さらにＺスコアを用いる方法によりアレイ間のデータを正規化する。
【００６９】
（６）このようにして、作用既知物質であるＤｉａｚｅｐａｍとＨａｌｏｐｅｒｉｄｏｌについて、行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化したデータと、遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータが得られるので、これらを統合してライブラリに記録する。
【００７０】
［被験物質の生体への作用の評価］
被験物質としてＥｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ（以下、明細書及び図中でＥＧＣＧと表記する）を使用する例について以下に説明する。
【００７１】
（１）ＥＧＣＧを上記水浴に溶解させて濃度を０．００３ｍｇ／ｍＬに調整した試薬を準備する。
４８ウェルプレートに、ＥＧＣＧを上記水浴に溶解させた上記試薬を１ｍｌ入れたウェル、及び、コントロールとしての上記水浴のみを１ｍｌ入れたウェルを準備し、［ゼブラフィッシュの準備］で準備した６ｄｐｆのゼブラフィッシュをウェルに入れて、［行動パラメータの測定手順］に従って行動パラメータを測定する。
【００７２】
（２）測定した行動パラメータを、［ライブラリの作成］と同様の手順により生データとして保管し、行動パラメータを検出し、さらに、行動パラメータの変化をＺスコアを用いて正規化する。
【００７３】
（３）ＥＧＣＧの投与と遺伝子の発現レベルの変化の関連付けは、マイクロアレイ実験を用いて行う。
マイクロアレイ実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ社  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  オリゴＤＮＡマイクロアレイ  Ｖｅｒ．３．０を用いて、プロトコールに従って実験することにより行うことができる。
このマイクロアレイ実験により得られたアレイデータから、上述の手順によりＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いてアレイ内のデータの正規化を行い、さらにＺスコアを用いる方法によりアレイ間のデータを正規化する。
【００７４】
（４）このようにして、ＥＧＣＧについて、行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化したデータが得られる。また、ＥＧＣＧを投与した際の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータが得られる。
【００７５】
［統計学的照合による解析］
ライブラリに記録された、Ｄｉａｚｅｐａｍ及びＨａｌｏｐｅｒｉｄｏｌに関する数値データと、ＥＧＣＧの投与による数値データとを統計学的に照合して解析する処理を、クラスター解析により以下のようにして行った。
【００７６】
図１〜３は、クラスター解析の結果を示す図である。
図１は、ユークリッド距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
図２は、マンハッタン距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
図３は、マキシマム距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
【００７７】
各図の中で、Ｌ−、Ｍ−、Ｈ−で始まる記号（計３６個）は、行動パラメータの変化データである。残りの小文字アルファベット（計１８個）の記号は遺伝子の発現レベルの変化データ（Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ）である。
各図に示すＧｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌは、遺伝子の発現レベルの変化を示す多数の数値データから、本明細書において上述した、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いた手法により、遺伝子の発現レベルが有意に変化したＧｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌを抽出して示したものである。
なお、これらの図には、行動パラメータの変化データ及び遺伝子の発現レベルの変化データをまとめて示している。
各ハッチングの模様及び濃さは、行動パラメータの変化データ及び遺伝子発現データの変化データの正規化後のＺスコアを反映している。ドットを付したハッチングはＺスコアの変化量が−側、塗りのハッチングはＺスコアの変化量が＋側であることを示しており、色が濃い方がＺスコアの変化量の絶対値が大きいことを示している。
【００７８】
まず、行動パラメータに関するクラスター解析の結果から、図１〜３に点線で示した四角で囲んだ領域の行動パラメータがＥＧＣＧとＤｉａｚｅｐａｍで類似していることがわかる。このことから、ＥＧＣＧはＤｉａｚｅｐａｍに近縁であることが示唆される。このように近縁の医薬品を特定することができれば、医薬品情報から被験物質の作用やフェノタイプの推定が可能となる。医薬品情報は、ＫＥＧＧ  ＭＥＤＩＣＵＳ  医薬品情報や、ｉｙａｋｕＳｅａｒｃｈ等のデータベースで検索可能である。
Ｄｉａｚｅｐａｍは鎮静作用を有することが知られていることから、ＥＧＣＧも鎮静作用を有することが推定される。
【００７９】
また、被験物質の投与により発現する遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得ることができる場合には、被験物質の投与により発現する遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを使用して統計学的に照合して解析することにより、被験物質の新規作用又はメカニズムをより詳しく推定することができる。
具体的には、いずれも正規化された、被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データと、ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより行うことができる。
被験物質の投与により発現する遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る手法としては、上記［被験物質の生体への作用の評価］の項目（３）に示したマイクロアレイ実験及び正規化の工程が挙げられる。
このマイクロアレイ実験及び正規化の工程で得られたデータを使用して、ＥＧＣＧを被験物質とした場合の被験物質の新規作用やメカニズムを推定した例は以下のとおりである。
【００８０】
遺伝子の発現レベルの変化データを含めたクラスター解析結果において、ＥＧＣＧとＤｉａｚｅｐａｍで相関の高いデータ（近縁にクラスター化されたデータ）に着目し、遺伝子発現データのＧｅｎｅ  Ｏｎｔｒｏｇｙ（ＧＯ）の情報からＥＧＣＧの作用・メカニズムを推定することができる。ＧＯは、ＡｍｉＧＯ  ２等のデータベースで検索可能である。
クラスター解析の結果より、ＥＧＣＧとＤｉａｚｅｐａｍで相関して変動している遺伝子発現データ（Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ）として、例えばｐｅｒ１ｂが挙げられる。本遺伝子は、Ｌ−ＤＭＴ  Ｄ、Ｌ−ＤＭＴ  Ｌ１、Ｌ−ＤＭＴ  Ｌ２等の行動解析データと近縁のクラスターを形成している。ｐｅｒ１ｂのＧｅｎｅ  Ｏｎｔｒｏｇｙは、ＧＯ：０００９２６６｜ＧＯ：００７１５４２｜ＧＯ：００４２７５２｜ＧＯ：０００９４１６であり、これらは概日リズムの調節やドーパミン作動性ニューロンの分化に作用しているとされている。このように、クラスター解析の結果からＧＯ解析やパスウェイ解析を活用することにより、被験物質の新規作用やメカニズムを推定できる可能性が示される。
【００８１】
以下に、本発明の具体的な実施形態の別の一例として、中枢神経作用（特に睡眠作用）を有する物質について、ゼブラフィッシュの行動パラメータの測定と、発現レベルが相関して変化した遺伝子の同定を行う場合の例について説明する。
【００８２】
［水浴の準備］
水浴として０．３×Ｄａｎｉｅａｕ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１９．３ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２３ｍＭ  ＫＣｌ、０．２３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭ  Ｃａ（ＮＯ３）２、１．７ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）、０．１％ＤＭＳＯ含有の水浴を用いる。
以下、この実施形態の例の説明において水浴という場合この水浴を指すこととする。
【００８３】
［ゼブラフィッシュの準備］
以下の条件でゼブラフィッシュを８ｄｐｆまで飼育して準備する。
ゼブラフィッシュ：ＭｉｅＫｏｍａｃｈｉ  ００２  Ｌｉｎｅ  ８ｄｐｆ
水浴温度：２８℃
飼育時の明期と暗期の繰り返し：明期１４時間（５：００−１９：００）−暗期１０時間（１９：００−５：００）
【００８４】
［ライブラリ作成用の試薬の準備］
ライブラリ作成のための作用既知物質として以下の物質（医薬品の有効成分）を使用する。
Ｓｕｖｏｒｅｘａｎｔ（図中：Ｓｕｖｏｒｅｘａｎｔと表記する）
Ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ（図中：Ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅと表記する）
各作用既知物質について、上記水浴に溶解させて濃度１μＭに調整した試薬を準備した。
これらの作用既知物質は、いずれも中枢神経作用を有する物質であり、その投与と遺伝子の発現レベルの変化との関係が既に知られている物質である。
【００８５】
［行動パラメータの測定手順］
（１）４８ウェルプレートの各ウェル内に上記水浴を１ｍｌ加える。そこにゼブラフィッシュ（８ｄｐｆ）を１匹／ウェル入れて、温度を２８℃とし３０分〜１時間維持する。
（２）４８ウェルプレート内の液をピペットで除去した後、いずれかの試薬を１ｍｌ／ウェル添加する。
（３）Ｄａｎｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ（Ｎｏｌｄｕｓ社製）に４８ウェルプレートをセットし、行動記録を行う。
明期と暗期の繰り返しを、明期３時間（期間Ｌ１）−暗期１０時間（期間Ｄ）−明期１１時間（期間Ｌ２）のサイクルで行い、ゼブラフィッシュの行動を２４時間記録する。
（４）ソフトウェア（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ  Ｎｏｌｄｕｓ社製）を用いて、行動解析を行う。相対移動速度につき、高速（相対移動速度６５以上、９５以下）、中速（相対移動速度３５以上、６５未満）、低速（相対移動速度５以上、３５未満）の３段階に分類する。
各相対移動速度ごとに分類したそれぞれについて、ＤＭＦ、ＩＺＦ、ＤＴＺ、ＴＡの指標を測定する。相対移動速度ごとに分類したＤＭＦ、ＩＺＦ、ＤＴＺ、ＴＡのデータを、明期と暗期の繰り返しの期間である期間Ｌ１、期間Ｄ、期間Ｌ２ごとに分ける。
【００８６】
［ライブラリの作成］
（１）４８ウェルプレートに、［ライブラリ作成用の試薬の準備］で準備した各試薬を入れたウェル、及び、コントロールとして、上記水浴に対して各試薬に含まれるＤＭＳＯと同濃度になるようにＤＭＳＯを加えたコントロール用水浴を入れたウェルを準備し、［ゼブラフィッシュの準備］で準備した８ｄｐｆのゼブラフィッシュをウェルに入れて、［行動パラメータの測定手順］に従って行動パラメータを測定する。
【００８７】
（２）測定した行動パラメータを以下のような形式の生データとして保管する。
・試薬種類（［ライブラリ作成用の試薬の準備］で準備した各試薬のいずれか、又は、コントロール）
・相対移動速度（９５−６５（高速）、６５−３５（中速）又は３５−０５（低速））
・明期と暗期の繰り返し（Ｌ１、Ｄ又はＬ２）
・指標（ＤＭＦ、ＩＺＦ、ＤＴＺ又はＴＡ）
相対移動速度が３種、明期と暗期の繰り返しが３種、指標が４種であれば、生データの数は３×３×４＝３６種類であるが、実際には明期と暗期の繰り返しの条件や他の刺激の条件等を変更することにより、より多数の生データを得ることができる。
【００８８】
（３）保管した作用既知物質使用時の行動パラメータの指標と、コントロールの行動パラメータの差分（行動パラメータの変化）を検出する。
【００８９】
（４）上記行動パラメータの変化をＺスコアを用いて正規化する。Ｚスコアによる正規化の方法は上述の通りである。
【００９０】
（５）続いて、作用既知物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化の関連付けを行う。
関連付けは、マイクロアレイ実験を用いて行う。
マイクロアレイ実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ社  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  オリゴＤＮＡマイクロアレイ  Ｖｅｒ．３．０を用いて、プロトコールに従って実験することにより行うことができる。
このマイクロアレイ実験により得られたアレイデータから、上述の手順によりＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いてアレイ内のデータの正規化を行う。
【００９１】
（６）このようにして、作用既知物質であるＳｕｖｏｒｅｘａｎｔとＩｍｉｐｒａｍｉｎｅについて、行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化したデータと、遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータが得られるので、これらを統合してライブラリに記録する。
【００９２】
［被験物質の生体への作用の評価］
被験物質として、食品素材として使用することができる、８ｂｅｔａ−（４’−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｉｇｌｏｙｌｏｘｙ）  ｃｏｓｔｕｎｏｌｉｄｅ（以下、明細書及び図中で８ｂｅｔａと表記する）を使用する例について以下に説明する。
【００９３】
（１）８ｂｅｔａを上記水浴に溶解させて濃度１０μＭに調整した試薬を準備する。
４８ウェルプレートに、８ｂｅｔａを上記水浴に溶解させた上記試薬を１ｍｌ入れたウェル、及び、コントロールとしての上記水浴のみを１ｍｌ入れたウェルを準備し、［ゼブラフィッシュの準備］で準備した８ｄｐｆのゼブラフィッシュをウェルに入れて、［行動パラメータの測定手順］に従って行動パラメータを測定する。
【００９４】
（２）測定した行動パラメータを、［ライブラリの作成］と同様の手順により生データとして保管し、行動パラメータを検出し、さらに、行動パラメータの変化をＺスコアを用いて正規化する。
【００９５】
（３）８ｂｅｔａの投与と遺伝子の発現レベルの変化の関連付けは、マイクロアレイ実験を用いて行う。
マイクロアレイ実験は、Ａｇｉｌｅｎｔ社  Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  オリゴＤＮＡマイクロアレイ  Ｖｅｒ．３．０を用いて、プロトコールに従って実験することにより行うことができる。
このマイクロアレイ実験により得られたアレイデータから、上述の手順によりＧｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いてアレイ内のデータの正規化を行い、さらにＺスコアを用いる方法によりアレイ間のデータを正規化する。
【００９６】
（４）このようにして、８ｂｅｔａについて、行動パラメータの変化から得られた多数の数値データを正規化したデータが得られる。また、８ｂｅｔａを投与した際の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを正規化したデータが得られる。
【００９７】
［統計学的照合による解析］
ライブラリに記録された、Ｓｕｖｏｒｅｘａｎｔ及びＩｍｉｐｒａｍｉｎｅに関する数値データと、８ｂｅｔａの投与による数値データとを統計学的に照合して解析する処理を、クラスター解析により以下のようにして行った。
【００９８】
図４は、ユークリッド距離によるクラスター解析の結果を示す図である。
図５は、図４において点線で囲んだ領域の拡大図である。
【００９９】
図５において、Ｌ−、Ｍ−、Ｈ−で始まる記号は、行動パラメータの変化データである。残りの小文字アルファベットの記号は遺伝子の発現レベルの変化データ（Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ）である。
各図に示すＧｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌは、遺伝子の発現レベルの変化を示す多数の数値データから、本明細書において上述した、Ｇｅｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｓのソフトウェアを用いた手法により、遺伝子の発現レベルが有意に変化したＧｅｎｅＳｙｍｂｏｌを抽出して示したものである。
なお、これらの図には、行動パラメータの変化データ及び遺伝子の発現レベルの変化データをまとめて示している。
各ハッチングの模様及び濃さは、行動パラメータの変化データ及び遺伝子発現データの変化データの正規化後のＺスコアを反映している。
【０１００】
まず、行動パラメータに関するクラスター解析の結果から、図５に点線で示した領域の行動パラメータが８ｂｅｔａとＳｕｖｏｒｅｘａｎｔで類似していることがわかる。このことから、８ｂｅｔａはＳｕｖｏｒｅｘａｎｔに近縁であることが示唆される。このように近縁の医薬品を特定することができれば、医薬品情報から被験物質の作用やフェノタイプの推定が可能となる。医薬品情報は、ＫＥＧＧ  ＭＥＤＩＣＵＳ  医薬品情報や、ｉｙａｋｕＳｅａｒｃｈ等のデータベースで検索可能である。
Ｓｕｖｏｒｅｘａｎｔは睡眠作用を有することが知られていることから、８ｂｅｔａも睡眠作用を有することが推定される。
【０１０１】
また、被験物質の投与により発現する遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得ることができる場合には、被験物質の投与により発現する遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを使用して統計学的に照合して解析することにより、被験物質の新規作用又はメカニズムをより詳しく推定することができる。
具体的には、いずれも正規化された、被験物質の投与によるゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び被験物質投与後の遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データと、ライブラリに統合されて記録された、ゼブラフィッシュの行動パラメータの変化から得られた多数の数値データ及び遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データとを統計学的に照合して解析することにより行うことができる。
被験物質の投与により発現する遺伝子の発現レベルの変化を表す多数の数値データを得る手法としては、上記［被験物質の生体への作用の評価］の項目（３）に示したマイクロアレイ実験及び正規化の工程が挙げられる。
このマイクロアレイ実験及び正規化の工程で得られたデータを使用して、８ｂｅｔａを被験物質とした場合の被験物質の新規作用やメカニズムを推定した例は以下のとおりである。
【０１０２】
遺伝子の発現レベルの変化データを含めたクラスター解析結果において、８ｂｅｔａとＳｕｖｏｒｅｘａｎｔで相関の高いデータ（近縁にクラスター化されたデータ）に着目し、遺伝子発現データのＧｅｎｅ  Ｏｎｔｒｏｇｙ（ＧＯ）の情報から８ｂｅｔａの作用・メカニズムを推定することができる。ＧＯは、ＡｍｉＧＯ  ２等のデータベースで検索可能である。
クラスター解析の結果より、８ｂｅｔａとＳｕｖｏｒｅｘａｎｔで相関して変動している遺伝子発現データ（Ｇｅｎｅ  Ｓｙｍｂｏｌ）として、例えばｎｆｉｌ３−６が挙げられる。本遺伝子は、Ｈ−ＤＭＴ  Ｄ、Ｈ−ＤＭＴ  Ｌ１、Ｈ−ＤＭＴ  Ｌ２、Ｍ−ＤＭＴ  Ｄ、Ｍ−ＤＭＴ  Ｌ１、Ｍ−ＤＭＴ  Ｌ２、Ｌ−ＤＭＴ  Ｄ、Ｌ−ＤＭＴ  Ｌ１、Ｌ−ＤＭＴ  Ｌ２等の行動解析データと近縁のクラスターを形成している。ｎｆｉｌ３−６のＧｅｎｅ  Ｏｎｔｒｏｇｙは、ＧＯ：００４３５６５｜ＧＯ：０００１０７８｜ＧＯ：０００６３５５｜ＧＯ：０００３７００｜ＧＯ：０００５６３４｜ＧＯ：００３２９２２であり、概日リズムの調節に関与していると言われている。このように、クラスター解析の結果からＧＯ解析やパスウェイ解析を活用することにより、被験物質の新規作用やメカニズムを推定できる可能性が示される。
【０１０３】
なお、ゼブラフィッシュを用いた本動物実験は、動物愛護管理法他関連法令を遵守して実施した。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明により、ゼブラフィッシュを使用して被験物質の投与と遺伝子の発現レベルの変化、及び、被験物質の生体への作用を網羅的に関連付けて評価する方法が提供される。また、被験物質の生体への作用を予測するために用いられるライブラリの作成方法が提供される。
本発明の評価方法を用いると、げっ歯類を用いた場合に比べて低コストで簡単な方法により、食品等の生体への作用を網羅的にスクリーニングすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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