(57)【要約】  びまん性胃癌を含む胃癌等の治療に使用し得る新規免疫治療剤の提供。硫酸化グリコサミノグリカンに結合し、細胞増殖抑制活性を有する抗体を提供する。本発明の抗体は、細胞増殖抑制剤、薬物送達のための標的化試薬、及び癌の検出薬として使用することができる。
2018235855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸化グリコサミノグリカンに結合し、細胞増殖抑制活性を有する抗体。
【請求項２】
硫酸化グリコサミノグリカンがヘパラン硫酸グリコサミノグリカン又はヘパリンである、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
硫酸化グリコサミノグリカンがヘパリンである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
エフェクター細胞及び補体の不存在下で細胞増殖抑制活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体。
【請求項５】
以下の(1)〜(10)のいずれかから選択される、硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体：
(1)配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体；
(2)配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
(3)配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体；
(4)配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
(5)配列番号１又は４に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２又は６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体；
(6)配列番号７又は１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８又は１２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体；
(7)配列番号１に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号２に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体；
(8)配列番号７に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体；
(9)上記(1)〜(6)の抗体における重鎖可変領域及び／若しくは軽鎖可変領域の1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる重鎖及び／又は軽鎖を有する抗体；及び
(10)配列番号１に示されるアミノ酸配列における51番目のアミノ酸AspのAsnへの置換、56番目のアミノ酸AlaのGlyへの置換、及び66番目のアミノ酸IleのThrへの置換から選択される1以上の置換を有する、上記(9)の抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
細胞毒性を有する薬物と組み合わせて使用される、請求項６記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
癌細胞の増殖抑制のために使用される、請求項６又は７記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
癌細胞が、胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、肺癌、及び／又は胸膜悪性腫瘍における癌細胞である、請求項８記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体を含む、薬物送達のための標的化試薬。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれか１項記載の細胞増殖抑制剤、又は請求項１０記載の標的化試薬を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体を含む癌の検出薬。
【請求項１３】
胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、肺癌、及び胸膜悪性腫瘍から選択される癌を検出するための、請求項１２記載の検出薬。
【請求項１４】
請求項６〜９のいずれか１項記載の細胞増殖抑制剤、請求項１０記載の標的化試薬、又は請求項１１記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体における癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体に関する。本発明の抗体は、細胞増殖抑制活性を有し、細胞増殖抑制剤、薬物送達のための標的化試薬、及び癌の検出薬として使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
グリコサミノグリカンは、アミノ糖及びウロン酸若しくはガラクトースの二糖の反復単位を有する長鎖多糖であり、動物の体内の様々な組織に存在することが知られている。グリコサミノグリカンには、構成糖の種類、硫酸基の有無／程度及び部位、構成糖の結合様式等によって分類されており、主なものとして、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヘパリンが知られている。ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンは、さまざまな程度に硫酸基の付加した二糖の繰り返し構造からなる多糖類であり、典型的にはコアタンパクと呼ばれるタンパクに結合したプロテオグリカンとして存在している(非特許文献１)。ヘパリンもコアタンパク質に結合してプロテオグリカンを形成し、ヘパラン硫酸と比べて硫酸化の度合いが高いという特徴がある（非特許文献２）。【０００３】
非特許文献３では、グリコサミノグリカンの存在と腫瘍との関連性について概説されており、グリコサミノグリカンが腫瘍に対する治療標的となり得ることが記載されている。また、コンドロイチン硫酸に結合するマラリア由来ペプチドとジフテリア毒素とのコンジュゲートがin vivoにおける腫瘍細胞の増殖を阻害することが開示されている(非特許文献４)。【０００４】
一方、胃癌は、世界的に最も高頻度で見られる悪性腫瘍の一つであり、中でもびまん性胃癌（diffuse-type gastric carcinoma, DGC）の中には予後が非常に悪いサブタイプがあることが知られている（例えば非特許文献５）。胃癌の治療としては、内視鏡的切除を含む手術の他、抗癌剤や、場合によってトラスツズマブを併用する化学療法が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sasisekharan R et al., Nat Rev Cancer 2002 Jul;2(7):521-8
【非特許文献２】Mulloy et al., Pharmacol Review 68, 76-141, January 2016
【非特許文献３】Yip et al., Mol Cancer Ther 2006;5(9) 2139-2148
【非特許文献４】Salanti et al., Cancer Cell 28, 500-514, October 12, 2015
【非特許文献５】Koriyama et al., World J Castroenterol 2007, 13, 3925-3931
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌に特異的に発現する分子が明らかな場合、その分子を標的とする免疫療法を治療選択肢とし得る可能性がある。免疫療法は、その特異性から、一般的な抗癌剤を使用する化学療法と比較して有害な副作用が生じにくく、有望な治療方法となり得る。【０００７】
しかしながら、びまん性胃癌は体細胞変異の頻度が低いことが知られており、また一部で報告されている変異タンパク質を標的とする治療戦略も有効なものとはなっていない。更に、近年注目されている免疫チェックポイント阻害剤においても、その有効性は未だ明確なものとはなっていない。従って、びまん性胃癌を含む胃癌に対して有効な、抗腫瘍免疫に基づく新たな治療方法が必要とされている。【０００８】
上記の先行技術文献では、グリコサミノグリカンと腫瘍との関連性およびグリコサミノグリカンに結合するペプチドを用いた癌治療の可能性は開示されている。しかしながら、抗体医薬品となりうる具体的なモノクローナル抗体については、教示も示唆もされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、ヒトのびまん性胃癌症例において、腫瘍内に浸潤している免疫細胞の特徴を種々検討したところ、特定のB細胞クローン群の増殖を認め、そのクローン群について、産生される抗体分子をコードする遺伝子配列情報を取得することができた。得られた情報に基づいて抗体分子を再構築し、その抗体が認識する抗原を探索した結果、驚くべきことに、抗原はタンパク質ではなく、多糖である硫酸化グリコサミノグリカンであることが判明した。さらに本発明者等は、当該抗体が、胃癌、大腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌等様々なヒト細胞株に対して増殖抑制効果を呈することを確認した。本発明の抗硫酸化グリコサミノグリカン抗体は、エフェクター細胞及び補体の不在下でも細胞増殖抑制活性を有し、単独でも腫瘍の治療に有用であり得るが、抗癌剤等の他の薬物と組み合わせて、薬物送達のための標的化試薬としても使用可能であることを見出した。【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいてなされたものであり、以下の１〜１２を提供する。
１．  硫酸化グリコサミノグリカンに結合し、細胞増殖抑制活性を有する抗体。
２．  硫酸化グリコサミノグリカンがヘパラン硫酸グリコサミノグリカン又はヘパリンである、上記１記載の抗体。
３．  硫酸化グリコサミノグリカンがヘパリンである、上記１に記載の抗体。
４．  エフェクター細胞及び補体の不存在下で細胞増殖抑制活性を有する、上記１〜３のいずれか記載の抗体。
５．  以下の(1)〜(10)のいずれかから選択される、硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体：
(1)配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体；
(2)配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
(3)配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体；
(4)配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
(5)配列番号１又は４に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２又は６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体；
(6)配列番号７又は１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８又は１２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体；
(7)配列番号１に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号２に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体；
(8)配列番号７に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に対して90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体；
(9)上記(1)〜(6)の抗体における重鎖可変領域及び／若しくは軽鎖可変領域の1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる重鎖及び／又は軽鎖を有する抗体；及び
(10)配列番号１に示されるアミノ酸配列における51番目のアミノ酸AspのAsnへの置換、56番目のアミノ酸AlaのGlyへの置換、及び66番目のアミノ酸IleのThrへの置換から選択される1以上の置換を有する、上記(9)の抗体。
６．  上記１〜５のいずれか記載の抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤。
７．  細胞毒性を有する薬物と組み合わせて使用される、上記６記載の細胞増殖抑制剤。
８．  癌細胞の増殖抑制のために使用される、上記６又は７記載の細胞増殖抑制剤。
９．  癌細胞が、胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、肺癌、及び／又は胸膜悪性腫瘍における癌細胞である、上記８記載の細胞増殖抑制剤。
１０．  上記１〜５のいずれか記載の抗体を含む、薬物送達のための標的化試薬。
１１．  上記６〜９のいずれか記載の細胞増殖抑制剤、又は上記１０記載の標的化試薬を有効成分として含有する医薬組成物。
１２．  上記１〜５のいずれか記載の抗体を含む癌の検出薬。
１３．  胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、肺癌、及び胸膜悪性腫瘍から選択される癌を検出するための、上記１２記載の検出薬。
１４．  上記６〜９のいずれか記載の細胞増殖抑制剤、上記１０記載の標的化試薬、又は上記１１記載の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体における癌の治療方法。【００１１】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-120435号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ヒトの癌組織に存在する硫酸化グリコサミノグリカンに結合してその細胞増殖を抑制し得ると共に、細胞内への薬物送達のためにも使用し得る新たな抗体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ヒト胃癌症例において、腫瘍組織でドミナントに存在する抗体の重鎖(IgG)をコードする遺伝子のV-Jの組合せの相対頻度分布を示す。矢印で示すピークはGpat#2の重鎖遺伝子の配列に対応する。
【図１Ｂ】ヒト胃癌症例において、腫瘍組織でドミナントに存在する抗体の軽鎖(Igκ)をコードする遺伝子のV-Jの組合せの相対頻度分布を示す。矢印で示すピークはGpat#2の軽鎖遺伝子の配列に対応する。
【図２Ａ】Cy5標識されたGpat#1抗体がヘパラン硫酸グリコサミノグリカンに結合することを示す。Heparin（ヘパリン）、De2SHep（2-O-脱硫酸化ヘパリン）、De6SHep（6-O-脱硫酸化ヘパリン）、DeNSHep（N-脱硫酸化ヘパリン）及びDeNS/AcHep（N-脱硫酸化／アセチル化ヘパリン）。
【図２Ｂ】Cy5標識されたGpat#1抗体及びGpat#2抗体とN-グリカン（M9、NA2、A2、NA2F、NA3、A3及びNA4）、O-グリカン（STn及びT）、GAG（ヘパリン、De2SHep、De6SHep、DeNSHep及びDeNS/AcHep）、Lewis抗原（Lea、Lex、SLea及びSLex）、Lac（Lac、3SL、6SL、3SLNAc、6SLNAc、LNT及びLNnT）及びABO抗原（A、B及びO）との結合を示す。上図及び下図は、同じ実験の結果をCy5シグナル値を示す縦軸の数値を変えて示すものである。図中にヘパリン、De2SHep、De6SHep、DeNSHep及びDeNS/AcHepの主たる反復単位の構造を示す。
【図２Ｃ】Protein-G磁気ビーズに結合させたGpat#1抗体及びGpat#2抗体が、FITC-コンジュゲートヘパリンと結合することをFITC蛍光シグナルの凝集によって示す。
【図３Ａ】FITC標識した本発明の抗体を胃癌細胞株NUGC3及びKatoIII、膵癌細胞株Panc1、肝癌細胞株HuH7、肺癌細胞株NCI-H2170の培養培地に添加して培養した後のフローサイトメーターにおけるFITCシグナルを示す。
【図３Ｂ】FITC標識した本発明のGpat#1抗体及びGpat#2抗体のKatoIII及びNUGC3細胞内への取り込みを示す。
【図４Ａ】胃癌細胞株KatoIII、NUGC3、HGC27及びMKN1においてGpat#1抗体及びGpat#2抗体を使用したMTTアッセイの結果を示す。結果は独立した4回の実験の結果を平均及び標準偏差で示し、星印はp<0.05であることを示す。
【図４Ｂ】膵癌細胞株（Panc1、AsPC1及びCapan1）、大腸癌細胞株（SW480、SW620及びHCT116）、肝癌細胞株（HepG2、HuH7、Alex及びHLF）、並びに肺癌及び胸膜悪性腫瘍（HCI-H2170、A549及びNCI-H28）においてGpat#1抗体及びGpat#2抗体を使用したMTTアッセイの結果を示す。結果は独立した4回の実験の結果を平均及び標準偏差で示し、星印はp<0.05であることを示す。
【図４Ｃ】胃癌細胞株NUGC3においてヘパリンの非存在下（ヘパリン(-)）又は存在下（ヘパリン(+)：60μg/ml；ヘパリン(++)：100μg/ml）で実施したMTTアッセイの結果を示す。結果は4回の実験の結果を平均及び標準偏差で示し、星印はp<0.05であることを示す。
【図５】胃癌細胞株KatoIII及びNUGC3において、本発明の抗体と抗癌剤をコンジュゲートした二次抗体とを併用した場合の細胞増殖抑制効果を示す。
【図６Ａ】Gpat#1抗体のアミノ酸配列（配列番号１）に基づいて改変した5種の抗体（Gpat#1改変1〜Gpat#1改変5）の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２７〜３１）を、配列番号１の配列と比較して示す。それぞれのCDR1〜CDR3を太字及び四角で囲って示し、改変1〜改変5の配列中で配列番号１と異なるアミノ酸残基に下線を示す。配列の下に示す数字は、配列番号１及び２７〜３１におけるアミノ酸の位置に対応する。
【図６Ｂ】Gpat#1改変1〜改変5を用いたMTTアッセイの結果を、コントロールIgG、Gpat#1 Germline配列及びGpat#1抗体と比較して示す。結果は独立した4回の実験の結果を平均及び標準偏差で示し、Gpat#1抗体と比較して有意(p<0.05)に細胞増殖抑制効果が上昇した抗体に星印を付す。「Gpat#1 Germline配列」抗体は、Gpat#1抗体を構成するV領域について、somatic hypermutationがない場合の胚細胞遺伝子配列のアミノ酸配列（IMGT database: http://www.imgt.org/ よりIGHV3-9*01配列を取得）によって規定される抗体である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、硫酸化グリコサミノグリカンに結合し、細胞増殖抑制活性を有する抗体を提供する。
【００１５】
＜硫酸化グリコサミノグリカン＞
グリコサミノグリカンは、アミノ糖及びウロン酸若しくはガラクトースの二糖単位の反復構造を有する長鎖多糖であり、天然に存在するグリコサミノグリカンとして、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸及びヘパリンが知られている。
【００１６】
ヒアルロン酸は、D-グルコサミンとD-グルクロン酸で構成される二糖単位の反復構造、コンドロイチン硫酸は、D-ガラクトサミンとD-グルクロン酸で構成される二糖単位の反復構造、デルマタン硫酸は、D-ガラクトサミンとL-イズロン酸で構成される二糖単位の反復構造、ケラタン硫酸は、D-グルコサミンとD-ガラクトースで構成される二糖単位の反復構造、ヘパラン硫酸及びヘパリンは、アミノ糖としてD-グルコサミン、ウロン酸としてL-イズロン酸又はD-グルクロン酸で構成される二糖単位の反復構造をそれぞれ有している。本明細書において、グリコサミノグリカンは、アミノ糖、すなわちD-グルコサミン又はD-ガラクトサミンのアミノ基は、アセチル化されていても、アセチル化されていなくても良く、またグリコサミノグリカンは硫酸化されていてもいなくても良い。
【００１７】
グリコサミノグリカンは、分子量3,000〜30,000の範囲で生体内の様々な組織中に、例えば細胞表面上に発現しているタンパク質と結合してプロテオグリカンとして存在するが、グリコサミノグリカンの生体内での機能についてはまだ解明されていない点が多い。
【００１８】
本明細書において記載する「硫酸化グリコサミノグリカン」とは、二糖単位あたり1〜4個の硫酸基を有するグリコサミノグリカンをいう。硫酸基は、アミノ糖及び／又はウロン酸及び／又はガラクトース上の水酸基又はアミノ基の水素に代えてSO3-が導入されたものをいう。
【００１９】
従って、天然において硫酸基を有さないヒアルロン酸は硫酸化グリコサミノグリカンには含まれない。しかしながら、本明細書において、硫酸化グリコサミノグリカンは、天然のものだけでなく、人為的に硫酸基を導入されたグリコサミノグリカンも包含するものとし、例えば天然のヒアルロン酸又は合成されたグリコサミノグリカンに二糖単位あたり平均して1個以上の硫酸基を含むものを包含する。
【００２０】
ここで、「二糖単位あたり平均して」との記載は、二糖単位の反復構造を有するグリコサミノグリカンにおいて、グリコサミノグリカン分子全体における硫酸基の数を、二糖単位の数で除して得られる数値を意図するために使用し得る。従って、例えば「二糖単位あたり平均して3個以上」とは、グリコサミノグリカン分子全体における硫酸基の数を二糖単位の数で除した場合に、二糖単位あたり2.5〜3.4個の硫酸基が含まれることを意図する。
【００２１】
しかしながら、抗体が認識するエピトープ部位はグリコサミノグリカンの中でより限定された部分構造であるため、グリコサミノグリカンの一部の領域で二糖単位あたりの硫酸基の平均数が上記の範囲であっても良い。
【００２２】
＜ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン＞
上記の硫酸化グリコサミノグリカンには、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンが含まれる。本明細書において記載する「ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン」としては、低分子量のものが抗凝血剤として使用されるヘパリン、ヘパリンと構造の類似した狭義のヘパラン硫酸グリコサミノグリカンのいずれも含まれる。
【００２３】
＜抗硫酸化グリコサミノグリカン抗体＞
本発明の抗体は、硫酸化グリコサミノグリカンを特異的に認識して結合し得る。例えば、本発明の抗体は、二糖単位あたり平均して1個以上の硫酸基を有するグリコサミノグリカンには結合し、硫酸基を有さないグリコサミノグリカンには結合しない。また、本発明の抗体は、二糖単位あたり平均して2個以上の硫酸基を有するグリコサミノグリカンには結合し、平均して1個以下の硫酸基を有するグリコサミノグリカンには結合しない。あるいは、本発明の抗体は、二糖単位あたり平均して3個以上の硫酸基を有するグリコサミノグリカンには結合し、平均して2個以下の硫酸基を有するグリコサミノグリカンには結合しない。
言い換えれば、本発明の抗体が結合する硫酸化グリコサミノグリカンは、二糖単位あたり平均して1個以上、2個以上、又は3個以上の硫酸基を有する。
【００２４】
本発明の抗体の例として、二糖単位あたり平均して3個の硫酸基を有するヘパリン、及び2個の硫酸基を有する脱硫酸化ヘパリン（2-O-脱硫酸化ヘパリン、6-O-脱硫酸化ヘパリン、N-脱硫酸化ヘパリン及び／又はN-脱硫酸化／アセチル化ヘパリン）に結合し、特にヘパリンに対する結合親和性の高い抗体が挙げられる。本発明において特に好適な抗体の例として、ヘパリンを特異的に認識して結合する抗体が挙げられる。
【００２５】
また、本発明の抗体は、ヘパリンを含むヘパラン硫酸グリコサミノグリカンに結合し、M9、NA2、A2、NA2F、NA3、A3及びNA4等のN-グリカン；STn及びT等のO-グリカン；Lea、Lex、SLea及びSLex等のLewis抗原；Lac、3SL、6SL、3SLNAc、6SLNAc、LNT及びLNnT等のLac；及びA、B及びO等のABO抗原には結合しない。従って、本発明の抗体の一例としては、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンの特徴的な構造である上記の反復構造又は該反復構造から形成される立体構造を認識し得るものが挙げられる。
【００２６】
抗体と硫酸化グリコサミノグリカンとの結合の有無は、例えば天然の硫酸化グリコサミノグリカンとの結合を、当分野において一般的に使用される条件下で、例えば蛍光標識等で標識した抗体と接触させ、標識からのシグナルを検出することで確認することができる。例えば、後の実施例に示すように、結合強度は、Cy5蛍光標識した抗体と、抗原である可能性のある物質とを接触させた後、物質に結合した抗体量の情報を、蛍光強度、又はS/N比として得ることができる。あるいはまた、天然の硫酸化グリコサミノグリカンと、本発明の抗体、更に本発明の抗体を認識することができる標識化二次抗体とを接触させ、標識化二次抗体からのシグナルを検出することで確認することができる。本発明の抗体はまた、天然の硫酸化グリコサミノグリカンの代わりに、改変又は合成した分子量3,000〜30,000の範囲の硫酸化グリコサミノグリカンを抗原として使用して、これに結合し得る抗体であっても良い。
【００２７】
尚、本明細書において、「結合する」及び「特異的に結合する」とは、特に限定するものではないが、抗原と抗体との結合が10-8M以下、好ましくは10-9M以下、より好ましくは10-10M以下のKD値の結合親和性を有するものであることを意味し得る。従って、本発明の抗体は、硫酸化グリコサミノグリカンに対して上記の結合親和性を有し、他の糖類及びタンパク質を含む他の抗原に対しては上記の結合親和性を有さないことを特徴とする。
【００２８】
あるいはまた、本明細書において「標的物質に特異的に結合する」とは、標的物質、例えば硫酸化グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、又はヘパリンに対する結合が、例えば過剰量の標的物質を使用し、一般的な結合アッセイで検出して、標的物質以外の物質に対する結合と比較して2倍以上、3倍以上、4倍以上である場合を意味し得る。また、上記したように蛍光標識によって結合を検出する場合に、S/N比が2以上、3以上、4以上である場合を意味し得る。
【００２９】
本発明の抗体は、硫酸化グリコサミノグリカンとの結合を介して、硫酸化グリコサミノグリカンを有する細胞の増殖を抑制する。この活性は、エフェクター細胞及び補体の不存在下で検出することができ、従って、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）及び補体依存性細胞傷害活性（CDC）と識別することができる。しかしながら、本発明の抗体を細胞増殖抑制剤及び薬物送達のための標的化試薬として使用する場合、エフェクター細胞及び補体が存在しても良いことは理解されるべきである。当分野で理解されている通り、抗体のFc領域はエフェクター機能を有することが知られており、補体の活性化、及びエフェクター細胞の活性化をもたらすことができる。補体は、活性化すると、可変領域が結合した細胞を溶解させ得る。「エフェクター細胞」は、キラーT細胞、ヘルパーT細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等をいい、その表面上に存在するFc受容体が抗体のFc領域と結合して活性化され、細胞傷害活性を発揮し得る。
【００３０】
本発明の抗体の細胞増殖抑制活性は、例えば、目的の細胞と共に培養した後にMTTアッセイ等によって測定することができる。限定するものではないが、例えば1.0×103〜1.0×104個の細胞、例えば癌細胞に対して1.0〜4.0μgの抗体を用いた場合に、細胞増殖を10％以上、20％以上、又は30％以上抑制することができる。
【００３１】
本発明の抗体は、硫酸化グリコサミノグリカンに結合するものである限り、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体であっても良いが、モノクローナル抗体であることが好ましい。また、本発明の抗体は、マウス、ウサギ、ヤギ等の非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれであっても良いが、ヒトにおける癌等の疾患の治療に使用する場合、特に限定するものではないが、ヒト化抗体又はヒト抗体であることが好ましい。従って、本発明において好適に使用することができる抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域（FR）と、硫酸化グリコサミノグリカンに対して高い結合親和性をもたらし得る相補性決定領域（CDR）とを含む抗体であり得る。
【００３２】
本発明の抗体は、抗原として特定された硫酸化グリコサミノグリカンを非ヒト哺乳動物に免疫して、公知の手法によってポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体として取得することができる。本発明の抗体はまた、活性が実証された本発明の抗体のアミノ酸配列情報又は該抗体をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法を用い、あるいは化学合成手段を用いて、合成によって取得することもできる。
【００３３】
遺伝子工学的手法によって抗体を作製する場合、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入して発現させ、組換え蛋白質として得ることができる。この場合、ポリヌクレオチドはDNAであってもRNAであっても良く、また宿主細胞への導入手段は当分野で使用されているものを適宜利用することができる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するためのベクターとして、ウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクター等を適宜使用することができる。宿主細胞としては、例えば大腸菌等の細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等を利用することができる。ここで、重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、別個のベクターに導入しても、同一のベクターに連結して導入しても良い。
【００３４】
例えば、下記実施例に記載するように、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNAを、場合によってシグナル配列、ポリA配列、更にプロモーター配列等の調節配列、選択マーカーと共に含むベクターに組み込んで、適切な宿主細胞中に導入して培養することで、硫酸化グリコサミノグリカンを特異的に認識し得る抗体を組換えタンパク質として取得することができる。
【００３５】
本発明の抗体をモノクローナル抗体として使用する場合、抗体は、IgG抗体分子、又はその抗原結合性断片及び抗原結合性誘導体であり得る。例えば、抗体は、完全抗体、Fab、Fab'、F(ab')2断片、また重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）をリンカーで連結した一本鎖抗体（scFv）断片、scFv-Fc、sc(Fv)2、Fv、ダイアボディー等であり得る。
【００３６】
scFv、scFv-Fc、及びsc(Fv)2はリンカーで可変領域を連結した合成ポリペプチドである。リンカーとしては、当分野で通常使用されるものであればいずれでも良く、特に限定するものではないが、例えば5〜25個、好ましくは10〜20個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー、例えばGSリンカー等を好適に使用することができる。
【００３７】
本発明の抗体には更に、抗原結合性に影響しない範囲で当業者に理解され得る誘導体、例えば抗体精製を容易にしたり安定性を高めたりするための修飾が施された誘導体、及び抗癌剤等の薬物と結合させた複合体も含まれる。本明細書においては、硫酸化グリコサミノグリカンとの結合性を保持する断片及び誘導体を、文脈に矛盾のない限り、便宜的に「抗体」に含めることが意図される。
【００３８】
本発明の抗体はまた、二量体、三量体、四量体等の多量体として合成することもできる。更に、本発明の抗体は、硫酸化グリコサミノグリカンに結合する第1の特異性と、他の抗原に対して結合する第2の特異性とを有する二重特異性抗体であっても良い。第2の特異性は、例えば標的細胞が発現し得る別の抗原に対するものであっても、抗癌剤等の薬物に対するものであっても良く、目的に応じて適宜選択することができる。第2の特異性が、標的細胞、例えば癌細胞が発現し得る別の抗原に対するものである場合、二重特異性抗体の使用によって、標的細胞への送達がより特異的にもたらされる。また、第2の特異性が、抗癌剤等の薬物に対するものである場合、薬物を、二重特異性抗体と共に、複合体として標的部位に送達することができる。
当業者であれば、本明細書の記載、及び当分野における技術常識に基づいて、本発明の抗体を用途に応じた適切な形態のものとして取得することができる。
【００３９】
特に限定するものではないが、本発明の硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体の例として、ヘパリンに結合する以下の抗体を挙げることができる。
(1)配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体；
(2)配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体；
(3)配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域を有する抗体；
(4)配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を有する抗体。
【００４０】
また、本発明の硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体として、ヘパリンに結合する以下の抗体を挙げることができる：
(5)配列番号１又は４に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号２又は６に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体；
(6)配列番号７又は１０に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び配列番号８又は１２に示すアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有する抗体。
【００４１】
また、本発明の硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体として、ヘパリンに結合する以下の抗体を挙げることができる：
(7)配列番号１に対して90％以上、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号２に対して90％以上、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体；(8)配列番号７に対して90％以上、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号８に対して90％以上、例えば90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を有する抗体。
【００４２】
また、本発明の硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体として、ヘパリンに結合する以下の抗体を挙げることができる：
(9)上記(1)〜(6)の抗体における重鎖可変領域及び／若しくは軽鎖可変領域の1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる重鎖及び／又は軽鎖を有する抗体。
【００４３】
ここで、「数個」とは、5個以下、例えば1個、2個、3個、4個又は5個であり得る。従って、本発明の抗体は、上記(1)〜(6)の抗体における重鎖可変領域及び／若しくは軽鎖可変領域でそれぞれ5個以下のアミノ酸の改変を有し得る。ある抗体と機能的に同等な抗体の調製は、例えば部位特異的変異誘発法等の当分野で周知の手法によって行うことができる。
【００４４】
抗体の結合特性は、基本的には重鎖及び軽鎖のCDRによって決定される。従って、改変は、結合特性に与える影響が少ないという観点から、フレームワーク領域又は定常領域内にあることが好ましい。置換は、特に限定するものではないが、保存的置換であり得る。また、改変は、抗体の立体構造を大きく変更しないものであることが好ましい。
【００４５】
しかしながら、生体内において、ある抗原に対する抗体が生じた後、「親和性成熟（affinity maturation）」と呼ばれるプロセスにより、初代の抗体よりも抗原に対する親和性が向上した抗体が生じることが知られている。本発明者等の知見においても、腫瘍浸潤B細胞クローン内で体細胞超変異（somatic hypermutation）によって様々に変異した抗体分子の産生が認められている。従って、上記の具体的に開示した抗体のアミノ酸配列及び塩基配列情報に基づいて、開示した抗体と同等、又は開示した抗体よりも向上した活性を有する抗体、具体的には硫酸化グリコサミノグリカンに対する結合親和性、細胞増殖抑制活性、薬物送達のための標的化試薬としての機能性が向上した抗体を取得することが可能である。実際に、本発明者等は、後の実施例に記載するように、開示した配列に基づいて改変した抗体が、改変前の抗体と比較して細胞増殖抑制活性の向上を示し得ることを確認している。これらの改変は、フレームワーク領域及び定常領域内である場合に加えて、CDR領域内においても生じ得る。
【００４６】
従って、本発明の抗体は、本明細書において具体的に開示した配列におけるCDR領域に置換、欠失、及び／又は付加による改変を有するものであっても良い。
【００４７】
そのように改変された抗体の例として、本発明の硫酸化グリコサミノグリカン、具体的にはヘパリンに結合する以下の抗体を挙げることができる：
(10)配列番号１に示されるアミノ酸配列における51番目のアミノ酸AspのAsnへの置換、56番目のアミノ酸AlaのGlyへの置換、及び66番目のアミノ酸IleのThrへの置換から選択される1以上の置換を有する、上記(9)の抗体。
【００４８】
上記の3種の改変を有する抗体は、改変前の抗体と比較して、細胞増殖抑制活性の向上を示した。更に、配列番号１における54番目のアミノ酸SerのThrへの置換、又は102番目のアミノ酸ProのSerへの置換を有する抗体も、改変前の抗体と同等の細胞増殖抑制活性を示した。従って、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有する重鎖可変領域において、51番目のアミノ酸AspのAsnへの置換、54番目のアミノ酸SerのThrへの置換、56番目のアミノ酸AlaのGlyへの置換、66番目のアミノ酸IleのThrへの置換、及び102番目のアミノ酸ProのSerへの置換から選択される1、2、3、4、又は5種の置換を含む抗体も、本発明の抗体として好適に使用可能である。
【００４９】
尚、上記の置換において、51番目のアミノ酸AspのAsnへの置換、54番目のアミノ酸SerのThrへの置換、及び56番目のアミノ酸AlaのGlyへの置換は保存的置換とされる置換であり、一方、66番目のアミノ酸IleのThrへの置換、及び102番目のアミノ酸ProのSerへの置換は非保存的置換とされるものである。
【００５０】
＜細胞増殖抑制剤＞
本発明はまた、硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体を有効成分として含有する、細胞増殖抑制剤を提供する。硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体は、上記した通りの抗体である。本発明の細胞増殖抑制剤は、細胞増殖抑制活性を有する他の薬物と組み合わせて使用することができる。また、本発明の細胞増殖抑制剤は、細胞毒性を有する薬物と組み合わせて使用することができる。本発明の抗体は、硫酸化グリコサミノグリカンを有する細胞に結合した後、その細胞に取り込まれる（インターナライズされる）ことが確認されており、従って、本発明の細胞増殖抑制剤と組み合わせて使用する薬物、例えば細胞毒性を有する薬物が細胞内に取り込まれて、細胞傷害活性を発揮し得ることが予想される。本発明の細胞増殖抑制剤と、細胞傷害活性を有する薬物とは、同時に、又は別個に細胞と接触させることができる。また、本発明の細胞増殖抑制剤は、放射線治療等の他の抗癌治療と組み合わせて使用することもできる。
【００５１】
細胞増殖抑制活性又は細胞毒性を有する薬物としては、限定するものではないが、毒素等の蛋白質、抗有糸分裂薬、アルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗薬、アポトーシス薬、アルカロイド剤、タキソイド剤等の抗癌剤、放射性同位元素等が挙げられる。毒素としては、例えばジフテリア毒素、サポリン毒素、緑膿菌毒素、アブリン毒素、リシンＡ毒素、腫瘍壊死因子、インターフェロン-γ等が挙げられる。抗癌剤としては、限定するものではないが、例えばシクロホスファミド、ダカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、フルオロウラシル、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アファチニブ、ラパチニブ、イマチニブ、エルロチニブ、エベロリムス等の分子標的薬、モノメチルアウリスタチンE（MMAE）、モノメチルアウリスタチンF（MMAF）、デュオカルマイシン（DM）、ドラスタチン（MD10）、アマニチン（AAMT）、PNU-159682（ネモルビシン代謝物）等が挙げられる。放射性同位元素としては90Ｙ、131Ｉ等が挙げられる。
【００５２】
これらの薬物は、本発明の抗体にコンジュゲートして使用することができる。抗体と薬物との連結方法は、限定されるものではないが、例えば共有結合によって結合させることが好ましく、例えばリンカーを介して抗体に薬物が付加されていてもよい。リンカーは、ペプチド、脂肪酸、脂肪酸エステルなどの、薬物と抗体との連結部を構成できる任意の物質であり得る。リンカーは、抗体の立体構造を阻害しないためのスペーサーとして、あるいはプロテアーゼ認識部位を含む切断可能な連結部分として、薬物と抗体との間に挿入されたものでもよい。本発明の抗体への薬物の連結は、抗体と硫酸化グリコサミノグリカンとの結合を妨げない部位、例えばFc領域に対して行うことが好ましい。薬物と抗体との連結は、標的細胞に取り込まれた後に、切断されるものとすることができる。
【００５３】
また、上記したように、本発明の抗体を、硫酸化グリコサミノグリカンに対する第1の特異性と、標的細胞、例えば癌細胞が発現し得る別の抗原に対する第2の特異性を有する二重特異性抗体とすることによって、標的細胞への送達がより特異的にもたらされ、細胞増殖抑制活性をより効果的に発揮し得る。また、第2の特異性が、細胞増殖抑制活性又は細胞毒性を有する抗癌剤等の薬物に対するものとすれば、薬物を、二重特異性抗体と共に、複合体として標的部位に送達することができる。
【００５４】
あるいはまた、薬物は、本発明の抗体に結合し得る二次抗体（Secondary Antibody-Drug Conjugate）にコンジュゲートし、本発明の抗体と組み合わせて使用することができる。薬物と二次抗体との連結も、上記と同様にして行うことができる。あるいは、薬物と連結した二次抗体を、市販品として入手することもできる。
【００５５】
本発明の細胞増殖抑制剤は、具体的には、例えば癌細胞の増殖抑制のために使用することができる。癌細胞は、胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、胆管癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、前立腺癌、及び／又は胸膜悪性腫瘍における癌細胞であり得る。
【００５６】
後の実施例において、本発明の抗体と組み合わせて抗癌剤とコンジュゲートさせた二次抗体を使用した場合に、癌細胞の増殖抑制及び細胞死が誘導されることが実証されている。
【００５７】
＜標的化試薬＞
本発明はまた、硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体を含む、薬物送達のための標的化試薬を提供する。硫酸化グリコサミノグリカンに結合する抗体は、上記した通りの抗体である。本発明の標的化試薬と組み合わせることにより、抗癌剤等の薬物を、硫酸化グリコサミノグリカンを有する標的細胞に送達することができる。
【００５８】
標的細胞は、抗癌剤等の薬物の送達によって細胞増殖抑制のみでなく細胞傷害効果がもたらされることが意図される細胞、例えば癌細胞である。本発明の標的化試薬と、標的細胞への送達が意図される薬物とは、同時に、又は別個に、標的細胞を有する被験体に投与することができる。
【００５９】
例えば、上記したように、本発明の抗体を、硫酸化グリコサミノグリカンに対する第1の特異性と、薬物に対する第2の特異性を有する二重特異性抗体とすることによって、薬物を、二重特異性抗体と共に、複合体として標的部位に送達することができる。
あるいはまた、上記したように、薬物は、本発明の抗体に結合し得る二次抗体にコンジュゲートし、本発明の標的化試薬と組み合わせて使用することができる。
【００６０】
本発明の標的化試薬は、標的細胞の細胞死を目的としない用途に使用することもできる。この場合、標的化試薬及び薬物を投与された被験体の体内でエフェクター細胞及び／又は補体の活性化が生じて抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）及び補体依存性細胞傷害活性（CDC）をもたらすことを回避する目的で、標的化試薬に含まれる本発明の抗体を、Fc領域を含まない形態のものとすることが好ましい。
【００６１】
＜医薬組成物＞
本発明はまた、単独、又は他の有効成分と組み合わせて上記の本発明の細胞増殖抑制剤、又は上記の本発明の標的化試薬を有効成分として有効量で含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物には、本発明の細胞増殖抑制剤又は標的化試薬及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される、製薬上許容される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。
【００６２】
本発明の細胞増殖抑制剤、標的化試薬又は医薬組成物は、被験体に対して局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば静脈内、腹腔内、患部若しくは患部の近辺に注射又は注入により投与することが好ましい。例えば癌組織内への局所的投与によって本発明の抗体、及び任意に本発明の抗体によって標的化される薬物を癌組織に集積させ、癌細胞特異的な細胞増殖抑制効果をより効果的に発揮させることができる。
【００６３】
有効成分としての本発明の抗体の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001〜100mg/kg体重の範囲で１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。
【００６４】
＜検出薬＞
上記の通り、ヒトのびまん性胃癌組織に硫酸化グリコサミノグリカンに対する抗体が浸潤していることが認められ、また様々なヒト癌細胞に本発明の抗体が結合することが確認された。従って、本発明はまた、上記の本発明の抗体を含む癌の検出薬を提供する。本発明の検出薬は、胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、肺癌、乳癌、皮膚癌、口腔癌、食道癌、胆管癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、腎細胞癌、尿路上皮癌、前立腺癌、及び／又は胸膜悪性腫瘍、例えば胃癌、膵癌、大腸癌、肝癌、肺癌、及び胸膜悪性腫瘍から選択される癌を検出するために使用することができる。
【００６５】
具体的には、被験体に由来する生物学的サンプル、例えば血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、間質液、胸膜液、生検サンプルと、本発明の抗体を含む検出薬とを接触させ、本発明の抗体と結合する抗原、すなわち硫酸化グリコサミノグリカンの有無を検出することができる。例えば本発明の抗体、又は本発明の抗体に対する二次抗体を蛍光試薬や発色試薬等で標識し、蛍光又は発色を検出することで確認することができる。
【００６６】
従って、本発明はまた、上記のステップを含む、癌細胞の検出方法も提供することができる。検出方法としては、限定するものではないが、例えばELISA、免疫沈降法、免疫組織化学法等の当分野において公知の手段を利用することができる。
【００６７】
更に、本発明の検出薬は、抗体と硫酸化グリコサミノグリカンとの結合反応のための反応液、反応容器、検出のための標識試薬、二次抗体、緩衝剤、使用説明書等を含む検出キットに含めて提供することもできる。
【００６８】
＜治療方法＞
本発明はまた、上記の本発明の細胞増殖抑制剤、上記の本発明の標的化試薬、又は上記の本発明の医薬組成物を被験体に投与することを含む、被験体における癌の治療方法を提供する。本発明の方法は、硫酸化グリコサミノグリカンを有する細胞に起因する疾患を有する被験体に、本発明の細胞増殖抑制剤、標的化試薬、又は医薬組成物を投与することを含む。
本発明の治療方法の対象となる被験体は、非ヒト動物及びヒトであり、特にヒトである。
【実施例】
【００６９】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７０】
本発明において使用する以下の細胞株：ヒト胃癌細胞株KATOIII、HGC27、MKN1、及びNUGC3；ヒト膵癌細胞株Panc-1、AsPC-1及びCapan-1；ヒト大腸癌細胞株SW480、SW620及びHCT116；ヒト肝癌細胞株HepG2、HuH7、Alexander及びHLF；及びヒト肺癌及び胸膜悪性腫瘍細胞株NCI-H2170、A549及びNCI-H28は、それぞれ理化学研究所（RIKEN）、JCRB細胞バンク、又はATCCから入手し、適切な条件下で培養した後に使用した。【００７１】
［実施例１  抗体の作製］
ヒトびまん性胃癌30症例由来の凍結腫瘍試料から10μmの厚さの切片を作製し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）を用いてmRNAを抽出した。【００７２】
腫瘍内に浸潤したB細胞が産生する抗体を同定するために、抽出したmRNAを鋳型として、米国iRepertoire社製のmultiplexプライマーセットを用い、B細胞抗原受容体(免疫グロブリン)の重鎖及び軽鎖の遺伝子の増幅を症例毎に行い、PCR産物について米国illumina社のMiSeqシステムを用いた300bp ペアエンド・リードによる次世代シーケンス解析を行った。【００７３】
得られた配列情報を統合・フィルタリングした後、V、D及びJセグメント、及びCDR領域の位置についての情報を取得した（iRepertoire(登録商標)、http://www.irepertoire.com/）。更にIMGT (http://www.imgt.org) のツールを用い、遺伝子再構成によって形成された抗原受容体遺伝子のV(D)J,Cのアラインメントを実施し、その頻度分布を重鎖及び軽鎖のそれぞれについてグラフ化した。その結果、腫瘍環境内で高度にドミナントな存在を呈する複数のB細胞・形質細胞クローンが同定された。【００７４】
図１Ａ及び１Ｂは、同一の一症例から取得された抗体をコードする重鎖及び軽鎖（κ）遺伝子のV-J遺伝子の組み合わせの相対頻度分布をそれぞれ三次元的に示すものである。【００７５】
同定されたクローンが有する重鎖及び軽鎖遺伝子からcDNA構築物を作製した。ここで、上記のシーケンス解析で取得した塩基配列では重鎖及び軽鎖の5'末端が含まれていないため、V-セグメントのアライメントで推定される5'配列を付加すると共に、哺乳動物での発現に適したコドン最適化を行った。尚、付加した5'配列は、重鎖及び軽鎖のCDR領域よりもN末端側のフレームワーク領域（FW1）をコードする。【００７６】
重鎖及び軽鎖をコードするcDNA構築物の各々をpcDNA3プラスミド(Life Technologies社)に組込み、それぞれのクローンにおける組合せでHEK293細胞に導入して重鎖及び軽鎖を強制発現させ、精製を実施して、2種の抗体分子（Gpat#1及びGpat#2抗体）を再構築した（ACRO Biosystems社）。【００７７】
Gpat#1抗体は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖2分子、及び配列番号２に示すアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖2分子から構成されるIgG抗体である。Gpat#1抗体の重鎖は、シーケンス解析で取得した配列情報（塩基配列：配列番号３；アミノ酸配列：配列番号４）に基づき、N末端に抗体の再構築のために必要な配列を付加して得ることができる。Gpat#1抗体の軽鎖は、シーケンス解析で取得した配列情報（塩基配列：配列番号５；アミノ酸配列：配列番号６）に基づき、N末端に抗体の再構築のために必要な配列を付加して得ることができる。【００７８】
Gpat#2抗体は、配列番号７に示すアミノ酸配列からなる可変領域を有する重鎖2分子、及び配列番号８に示すアミノ酸配列からなる可変領域を有する軽鎖2分子から構成されるIgG抗体である。Gpat#2抗体の重鎖は、シーケンス解析で取得した配列情報（塩基配列：配列番号９；アミノ酸配列：配列番号１０）に基づき、N末端に抗体の再構築のために必要な配列を付加して得ることができる。Gpat#2抗体の軽鎖は、シーケンス解析で取得した配列情報（塩基配列：配列番号１１；アミノ酸配列：配列番号１２）に基づき、N末端に抗体の再構築のために必要な配列を付加して得ることができる。
再構築により得られたGpat#1及びGpat#2抗体の各CDRのアミノ酸配列を表１に示す。【００７９】
【表１】
2018235855.tif 000003
【００８０】
［実施例２  抗原の同定］
実施例１で再構築されたGpat#1及びGpat#2抗体が認識する抗原の同定を行った。まず、様々なタンパク質抗原の可能性について検討したが、これらの抗体と結合するタンパク質抗原を同定することはできなかった。【００８１】
次いで、糖抗原の可能性を検討した。Gpat#1及びGpat#2抗体を、Lightning-Link(R) Rapid Cy5 conjugation kit (Innova Biosciences社)を使用してCy5蛍光標識した後、住友ベークライト社製糖鎖固定化アレイ(BS-X1731)上で反応させ、Cy5蛍光シグナルを検出した。図２Ａは、Gpat#1抗体での検出結果の一部であり、Gpat#1抗体がアレイ上に固定化された5種のグリコサミノグリカンの中で特にヘパリンに結合していることが明瞭に示されている。【００８２】
図２Ｂは、N-グリカン（M9、NA2、A2、NA2F、NA3、A3及びNA4）、O-グリカン（STn及びT）、グリコサミノグリカン（ヘパリン、De2SHep、De6SHep、DeNSHep及びDeNS/AcHep）、Lewis抗原（Lea、Lex、SLea及びSLex）、ラクトース含有糖鎖（Lac、3SL、6SL、3SLNAc、6SLNAc、LNT及びLNnT）及びABO抗原（A、B及びO）に対するGpat#1抗体及びGpat#2抗体の結合を示す。図２Ｂの結果から、Gpat#1及びGpat#2抗体が、アレイ上の様々な糖鎖の中で硫酸化グリコサミノグリカン、特にヘパリン分子に特異的に結合することが示され、これらの抗体の抗原分子が硫酸化グリコサミノグリカンであることが同定された。【００８３】
図２Ｂに示すように、Gpat#1抗体は、DeNSHep（N-脱硫酸化ヘパリン）に対する結合と比較してヘパリンに対して2倍以上の結合シグナル値（S/N比）を示し、特にヘパリンに対して強く結合した。また、Gpat#2抗体は、二糖単位あたり3個の硫酸基を有するヘパリンに対して、二糖単位あたり2個の硫酸基を有する脱硫酸化ヘパリン（De2SHep）と比較して3倍以上の量で結合した。【００８４】
また、Gpat#1抗体及びGpat#2抗体をProtein-G磁気ビーズ(米国BioRad社)に結合させ、FITC-コンジュゲートヘパリン (米国Life Technologies社)と混じて反応させた。ビーズを3回洗浄した後に蛍光顕微鏡下で観察したところ、抗体との結合反応によって、Gpat#1抗体及びGpat#2抗体を結合させたビーズでFITCの蛍光シグナルの凝集塊が観察され、Gpat#１抗体及びGpat#2抗体に対するヘパリンの結合が確認された(図２Ｃ)。【００８５】
したがって、2種の異なる実験系において、Gpat#1抗体およびGpat#2抗体が硫酸化グリコサミノグリカン、特にヘパリンと結合することが示された。【００８６】
［実施例３  癌細胞の認識及び癌細胞内へのインターナライゼーション］
実施例１で取得したGpat#1抗体及びGpat#2抗体をFITC標識し、胃癌細胞株NUGC3及びKatoIII、膵癌細胞株Panc1、肝癌細胞株HuH7、肺癌細胞株NCI-H2170の培養培地に添加して37℃にて一晩培養した。FITCシグナルをフローサイトメーターを用いて検出し（MoFlo XDP, Beckman Coulter社）、これらの抗体が様々なヒト癌細胞を認識して結合することが確認された（図３Ａ）。また、蛍光顕微鏡での観察では、当該抗体がヒト癌細胞を認識して結合するだけでなく、細胞との結合後に細胞内に取り込まれている(インターナライゼーション)ことも確認された（図３Ｂ）。尚、コントロールIgGは、細胞内の別のタンパク質に結合することが判明している本発明者等の有する別の抗体であるが、これは上記癌細胞に対する反応性はほとんど又は全くないことが確認された。使用したコントロールIgGの重鎖及び軽鎖可変領域の配列をそれぞれ配列番号２５及び２６で示す。【００８７】
［実施例４  MTTアッセイによる細胞増殖抑制効果の実証］
Gpat#1抗体及びGpat#2抗体を使用して、4種の胃癌細胞株（KatoIII、NUGC3、HGC27及びMKN1）並びに膵癌細胞株（Panc1、AsPC1及びCapan1）、大腸癌細胞株（SW480、SW620及びHCT116）、肝癌細胞株（HepG2、HuH7、Alex及びHLF）、及び肺癌及び胸膜悪性腫瘍（HCI-H2170、A549及びNCI-H28）でCell Proliferation Kit I (MTT)（Roche Diagnostics社）を使用してMTTアッセイを実施した。【００８８】
96ウェルプレートにKatoIII（1.0×104個）、NUGC3（6.0×103個）、HGC27（5.0×103個）、MKN1（5.0×103個）、Panc1（6.0×103個）、AsPC1（8.0×103個）、Capan1（1.0×104個）、SW480（8.0×103個）、SW620（8.0×103個）、HCT116（8.0×103個）、HepG2（1.0×104個）、HuH7（6.0×103個）、Alex（6.0×103個）、HLF（7.0×103個）、HCI-H2170（6.0×103個）、A549（5.0×103個）、及びNCI-H28（1.0×104個）をそれぞれまき、20μg/ml（ウェルあたり2.0μg）のコントロールIgG（ヒトIgG(正常)、Invitrogen）、Gpat#1抗体又はGpat#2抗体と共に37℃で4日間培養した。培養は、細胞株に応じて、D-MEM又はRPMI培地中で、FBS（Sigma-Aldrich社）、ペニシリン/ストレプトマイシン（Wako Pure Chemical Industries社）、L-グルタミン酸（Wako Pure Chemical Industries社）及びピルビン酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific社）を適宜添加して行った。【００８９】
培養後、10μlのMTT標識試薬を添加して更に4時間培養し、次いで100μlの溶解液を添加して一晩インキュベートした。各ウェルについて550nmの吸光度を測定し、ブランクのウェルの数値を差し引いた。実験は独立して4回実施した。【００９０】
その結果、Gpat#1抗体及びGpat#2抗体が、コントロール抗体と比較して、様々なヒト癌細胞株に対して増殖抑制効果を呈することが確認された（図４Ａ及び４Ｂ）。異なる濃度の抗体を用いて同様のアッセイを行った結果、この増殖抑制効果は抗体濃度に依存することも確認された（データは示さない）。【００９１】
［実施例５  ヘパリンによる細胞増殖抑制効果の中和］
NUGC3細胞株に対するGpat#1抗体及びGpat#2抗体の細胞増殖抑制効果がヘパリンによって中和されるか否かを検討した。【００９２】
Gpat#1抗体及びGpat#2抗体（20μg/ml）を、60μg/ml又は100μg/mlの低分子量ヘパリン（H3149、Sigma Aldrich）と共に室温で3時間インキュベートした後、NUGC3（6.0×103個）を含むウェルに添加して、実施例４と同様のMTTアッセイを実施した。【００９３】
その結果、図４Ｃに示すように、ヘパリンを添加しなかった場合（ヘパリン(-)）と比較して、ヘパリンを添加した場合（ヘパリン(+)及びヘパリン(++)）には細胞増殖抑制効果が低減した。このことから、これらの抗体が認識する抗原が硫酸化グリコサミノグリカン（ヘパリン）であることが再確認された。
同様の結果は、他の細胞株においても確認された（データは示さない）。【００９４】
［実施例６  抗癌剤との併用効果の実証］
本発明の抗体と、薬物をコンジュゲートさせた二次抗体との併用によって、ヒト癌細胞に細胞死が誘導されることを実証した。【００９５】
薬物として、公知の抗癌剤であるモノメチルアウリスタチンF（MMAF）、デュオカルマイシン（DM）、及びアマニチン（AAMT）を選択し、これらが予め結合された抗ヒトIgG二次抗体（Moradec LLC社）を使用した。【００９６】
ヒト胃癌細胞株KatoIIIおよびNUGC3を96ウェルプレート中に1.0×104個の細胞濃度でまき、4時間37℃で培養した。次いで、1.0μg/ウェルのGpat#1抗体又は実施例３と同じコントロールIgGを各ウェルに添加し、1時間後に0.5μg/ウェルの二次抗体を添加して、3日間更に培養した。【００９７】
3日後、細胞の形態を顕微鏡下に観察したところ、コントロールIgGと抗癌剤の併用の場合と比較して、Gpat#1抗体と抗癌剤の併用によって、より明瞭な増殖抑制および細胞死が誘導されていることが確認された(図５)。【００９８】
［実施例７  血清中の抗硫酸化グリコサミノグリカン抗体の検出］
びまん性胃癌患者血清および非癌コントロール血清（BioreclamationIVT社）を用い、実施例２と同様にProtein-G 磁気ビーズ(米国BioRad社)を使用して、血清中の抗硫酸化グリコサミノグリカン抗体の存在を検出した。【００９９】
各血清10μlとProtein-G 磁気ビーズを反応させ、次にFITC-コンジュゲートヘパリン (米国Life Technologies社)と混じて反応させた。ビーズを洗浄した後に蛍光顕微鏡下で観察したところ、びまん性胃癌患者血清において、抗体との結合反応によって凝集したFITC-ヘパリンの凝集塊が観察されたが、非癌コントロール血清では観察されなかった（データは示さない）。この結果から、抗硫酸化グリコサミノグリカン抗体（抗ヘパリン抗体）が、癌組織のみならず血清中にも存在していることが示され、癌患者において抗硫酸化グリコサミノグリカン抗体が増加していると考えられた。【０１００】
［実施例８  改変抗体の作製及び細胞増殖抑制効果］
Gpat#1抗体に関して、胃癌サンプル内のクローンにおいて高い頻度でみられた体細胞超変異（somatic hypermutation）のデータに基づき、公知の遺伝子組換え法および実施例１に記載したタンパク発現系を用い、重鎖可変領域のアミノ酸が置換された改変抗体（Gpat#1改変1〜改変5）を作成した（図６Ａ）。いずれも置換による改変とし、改変するアミノ酸の位置および置換するアミノ酸残基は、実施例１に記載した胃癌症例における免疫グロブリン配列データを基盤として、Gpat#1抗体に類似するアミノ酸配列を抽出することで決定した。これらの改変抗体の軽鎖はGpat#1抗体と同じアミノ酸配列を有するものとし、軽鎖可変領域の配列は配列番号２に示される。【０１０１】
具体的には、Gpat#1改変1抗体は、Gpat#1抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）における51番目のアミノ酸AspのAsnへの置換を有する（配列番号２７）。この位置は、Gpat#1抗体のCDR2領域のアミノ酸配列（配列番号１４）における4番目のアミノ酸の位置に相当する。【０１０２】
Gpat#1改変2抗体は、配列番号１における54番目のアミノ酸SerのThrへの置換を有する（配列番号２８）。この位置は、Gpat#1抗体のCDR2領域のアミノ酸配列（配列番号１４）における7番目のアミノ酸の位置に相当する。【０１０３】
Gpat#1改変3抗体は、配列番号１における56番目のアミノ酸AlaのGlyへの置換を有する（配列番号２９）。この位置は、Gpat#1抗体のCDR2領域に隣接するフレームワーク（FR）3領域の最初のアミノ酸の位置に相当する。【０１０４】
Gpat#1改変4抗体は、配列番号１における66番目のアミノ酸IleのThrへの置換を有する（配列番号３０）。この位置は、Gpat#1抗体のFR3領域の11番目のアミノ酸の位置に相当する。【０１０５】
Gpat#1改変5抗体は、配列番号１における102番目のアミノ酸ProのSerへの置換を有する（配列番号３１）。この位置は、Gpat#1抗体のCDR3領域のアミノ酸配列（配列番号１５）における9番目のアミノ酸の位置に相当する。【０１０６】
得られた改変抗体について、実施例４と同様にMTTアッセイを実施した。その結果、いずれの改変抗体も、Gpat#1と同等又はGpat#1を超える細胞増殖抑制効果を示し、中でもGpat#1改変1、改変3及び改変4において、Gpat#1よりも高い細胞増殖抑制効果が得られた（図６Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明により、従来有効な治療手段がないとされていたびまん性胃癌をはじめ、様々な癌において細胞上に見出される硫酸化グリコサミノグリカンを標的として、癌等の疾患の治療及び検出に役立つ新規な手段が提供される。【０１０８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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