(57)【要約】  核酸医薬の安定性を確保すると共に、細胞内導入率が高く、効率的に核酸医薬の機能を発現させることができ、かつ低い細胞毒性である核酸送達用組成物及び核酸含有組成物を提供する。  ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーと、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つを含有する４〜３０残基のペプチドとを含有する、核酸送達用組成物及び核酸含有組成物。
2019013255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーと、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドとを含有する、核酸送達用組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、直接又は結合基を介して脂溶性基を含有する、請求項１に記載の核酸送達用組成物。
【請求項３】
前記脂溶性基が、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基、及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ３０）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基からなる群より選択される基である、請求項２に記載の核酸送達用組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、さらにヒスチジンを含有する、請求項１から３の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、アルギニン及びヒスチジンを含有する、請求項１から４の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
【請求項６】
前記ペプチドにおいて、アルギニン残基及びヒスチジン残基の合計数が、ペプチド全残基の合計数に対し、５０〜１００％である、請求項５に記載の核酸送達用組成物。
【請求項７】
前記ブロック型コポリマーが、ポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリエチレングリコール−ポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー）又はポリエチレングリコール−ポリ乳酸である、請求項１から６の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
【請求項８】
前記ブロック型コポリマーが、ポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）である、請求項１から７の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
【請求項９】
前記ブロック型コポリマーと前記ペプチドが粒子を形成している、請求項１から８のいずれか１つに記載の核酸送達用組成物。
【請求項１０】
前記粒子の粒径が、５０ｎｍ以下である、請求項９に記載の核酸送達用組成物。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーの水溶性有機溶剤溶液と、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドの水溶液とを混合した後、有機溶剤を除去する工程を含む、請求項１から１０の何れか１つに記載の核酸送達用組成物の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から８の何れか１つに記載の核酸送達用組成物が、核酸を含有する、核酸含有組成物。
【請求項１３】
請求項９又は１０に記載の核酸送達用組成物が核酸を含有する核酸含有組成物であって、前記核酸が、ブロック型コポリマーとペプチドと共に粒子を形成している、核酸含有組成物。
【請求項１４】
前記粒子の粒径が、５０ｎｍ以下である、請求項１３に記載の核酸含有組成物。
【請求項１５】
前記核酸が、ＲＮＡ干渉を利用したＲＮＡ又はアンチセンス核酸である、請求項１２から１４のいずれか１つに記載の核酸含有組成物。
【請求項１６】
前記核酸が、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、請求項１２から１５のいずれか１つに記載の核酸含有組成物。
【請求項１７】
ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーの水溶性有機溶剤溶液と、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドの水溶液とを混合し、有機溶剤を除去した後、核酸を混合する工程を含む、請求項１２から１６の何れか１つに記載の核酸含有組成物の製造方法。
【請求項１８】
請求項１２から１６の何れか１つに記載の核酸含有組成物が、さらに低分子薬剤を含有する、核酸含有組成物。
【請求項１９】
請求項１から１０の何れか１つに記載の核酸送達用組成物を含む、核酸送達用キット。
【請求項２０】
ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーを含有する第１の組成物と、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドを含有する第２の組成物とを含有する、核酸送達用キット。
【請求項２１】
請求項１２から１６及び１８の何れか１つに記載の核酸含有組成物を有効成分として含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特にｓｉＲＮＡを標的患部の細胞内に送達するための担体組成物、及びそれを用いた核酸含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬品は、疾病の原因分子に対して直接作用することにより疾患を治療できるため、酵素阻害剤などの従来の低分子医薬品では効果が期待できない疾病に対しても、有効な治療方法として期待されている。
しかし、ｓｉＲＮＡ等の核酸は、血中で容易に分解され、不安定であるため、これらを核酸医薬として幅広い疾患に適用するために、血中投与が可能であり、全身投与によって標的組織に効率よく送達する方法の開発が求められている。【０００３】
核酸医薬の送達システムとして、高分子キャリアを利用する方法が報告されている。例えば、メトキシポリエチレングリコールセグメント（以下、ＭＰＥＧと呼ぶ）及びポリ（ε−カプロラクトン）セグメント（以下、ＰＣＬと呼ぶ）からなるブロック型コポリマー（以下、ＭＰＥＧ−ＰＣＬと呼ぶ）と、システイン、ヒスチジン及びアルギニンからなる１０残基のペプチドとをコンジュゲーションして得られるポリマーを用いる、ｓｉＲＮＡの送達システムが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。該核酸送達システムは、疎水性のＰＣＬをコアとするミセル構造を有し、ｓｉＲＮＡが、正電荷を帯びたペプチドとの静電相互作用により該ミセルに担持され、血中安定性と細胞内取り込み能を両立できること、また担癌モデルマウスを用いた検討においても、高い治療効果が得られることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】インターナショナル  ジャーナル  オブ  ファーマシューティクス，４５５巻，４０−４７頁（２０１３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血中投与により機能発現させる核酸医薬において、該核酸医薬の安定性を確保すると共に、細胞内導入率が高く、効率的に該核酸医薬の機能発現をさせることができ、かつ低い細胞毒性である核酸送達用組成物及び核酸含有組成物が求められている。特に、ｓｉＲＮＡのような短鎖核酸医薬にも適用できる核酸送達用組成物及び核酸含有組成物が求められている。【０００６】
本発明の目的は、細胞毒性が低く、高い治療有効性を実現する、核酸送達用組成物及び核酸含有組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、非特許文献１に基づきＭＰＥＧ−ＰＣＬとペプチドをコンジュゲーションして得られるポリマーを用いて研究を行ったが、該ポリマーミセルに起因する細胞毒性が確認された。
その後、本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＭＰＥＧ−ＰＣＬにペプチドをコンジュゲーションするのではなく、脂溶性基を有する正電荷のペプチドとｓｉＲＮＡの静電相互作用複合体をミセル内部に非共有結合的に内包することで、細胞毒性を示すことなく、核酸分子の良好な細胞内導入効果を発揮し、インビボにおいて高い治療効果が得られることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の態様を包含する。【０００８】
１．ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーと、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドとを含有する、核酸送達用組成物。
２．前記ペプチドが、直接又は結合基を介して脂溶性基を含有する、１．に記載の核酸送達用組成物。
３．前記脂溶性基が、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基、及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ３０）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基からなる群より選択される基である、２．に記載の核酸送達用組成物。
４．前記ペプチドが、さらにヒスチジンを含有する、１．から３．の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
５．前記ペプチドが、アルギニン及びヒスチジンを含有する、１．から４．の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
６．前記ペプチドにおいて、アルギニン残基及びヒスチジン残基の合計数が、ペプチド全残基の合計数に対し、５０〜１００％である、５．に記載の核酸送達用組成物。【０００９】
７．前記ブロック型コポリマーが、ポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリエチレングリコール−ポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー）又はポリエチレングリコール−ポリ乳酸である、１．から６．の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
８．前記ブロック型コポリマーが、ポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）である、１．から７．の何れか１つに記載の核酸送達用組成物。
９．前記ブロック型コポリマーと前記ペプチドが粒子を形成している、１．から８．のいずれか１つに記載の核酸送達用組成物。
１０．前記粒子の粒径が、５０ｎｍ以下である、９．に記載の核酸送達用組成物。【００１０】
１１．ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーの水溶性有機溶剤溶液と、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドの水溶液とを混合した後、有機溶剤を除去する工程を含む、１．から１０．の何れか１つに記載の核酸送達用組成物の製造方法。【００１１】
１２．１．から８．の何れか１つに記載の核酸送達用組成物が、核酸を含有する、核酸含有組成物。
１３．９．又は１０．に記載の核酸送達用組成物が核酸を含有する核酸含有組成物で
あって、前記核酸が、ブロック型コポリマーとペプチドと共に粒子を形成している、核酸含有組成物。
１４．前記粒子の粒径が、５０ｎｍ以下である、１３．に記載の核酸含有組成物。
１５．前記核酸が、ＲＮＡ干渉を利用したＲＮＡ又はアンチセンス核酸である、１２．から１４．のいずれか１つに記載の核酸含有組成物。
１６．前記核酸が、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡである、１２．から１５．のいずれか１つに記載の核酸含有組成物。【００１２】
１７．ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーの水溶性有機溶剤溶液と、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドの水溶液とを混合し、有機溶剤を除去した後、核酸を混合する工程を含む、１２．から１６．の何れか１つに記載の核酸含有組成物の製造方法。【００１３】
１８．前記１２．から１６．の何れか１つに記載の核酸含有組成物が、さらに低分子薬剤を含有する、核酸含有組成物。
１９．前記１．から１０．の何れか１つに記載の核酸送達用組成物を含む、核酸送達用キット。
２０．ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーを含有する第１の組成物と、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸を含有する４〜３０残基のペプチドを含有する第２の組成物とを含有する、核酸送達用キット。
２１．前記１２．から１６．及び１８．の何れか１つに記載の核酸含有組成物を有効成分として含む、医薬組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、細胞毒性が低く、高い治療有効性を実現する、核酸送達用組成物及び核酸含有組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態に係る核酸含有組成物に対するマウスマクロファージ株化様細胞の細胞生存率を示すグラフである。
【図２】本実施形態に係る核酸含有組成物のマウスマクロファージ株化様細胞における細胞内への導入率を示すグラフである。
【図３Ａ】本実施形態に係る核酸含有組成物のマウスマクロファージ株化様細胞におけるＴＮＦ−αの産生量への影響を示すグラフである。
【図３Ｂ】本実施形態に係る核酸含有組成物のマウスマクロファージ株化様細胞におけるＩＬ−６の産生量への影響を示すグラフである。
【図４】本実施形態に係る核酸含有組成物のＣＩＡマウスにおける後肢の肥厚増加率への影響を示すグラフである。
【図５】本実施形態に係る核酸含有組成物のＣＩＡマウスにおける臨床スコアへの影響を示すグラフである。
【図６】本実施形態に係る核酸含有組成物のＣＩＡマウスの四肢におけるＲｅｌＡの産生量への影響を示すグラフである。
【図７】本実施形態に係る核酸含有組成物のＣＩＡマウスの四肢におけるＴＮＦ−αの産生量への影響を示すグラフである。
【図８】本実施形態に係る核酸含有組成物のＣＩＡマウスの四肢におけるＩＬ−６の産生量への影響を示すグラフである。
【図９】本実施形態に係る核酸含有組成物の膵臓癌細胞皮下移植マウスにおける腫瘍体積への影響を示すグラフである。
【図１０】本実施形態に係る核酸含有組成物の膵臓癌細胞皮下移植マウスにおける体重への影響を示すグラフである。
【図１１】本実施形態に係る核酸含有組成物の膵臓癌細胞皮下移植マウスにおける腫瘍体積への影響を示すグラフである。
【図１２】本実施形態に係る核酸含有組成物の膵臓癌細胞皮下移植マウスにおける体重への影響を示すグラフである。
【図１３】本実施形態に係る核酸含有組成物のヒト肺胞基底上皮腺癌細胞におけるスフェロイド浸透性を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１４】本実施形態に係る核酸含有組成物のマウス乳癌細胞におけるスフェロイド浸透性を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１５】本実施形態に係る核酸含有組成物のマウス乳癌細胞における細胞内への導入率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、標的組織及び標的細胞へ核酸分子を送達するための核酸送達用組成物であって、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとのブロック型コポリマーと、アルギニン及びリジンから選択される少なくとも一つを含有する４〜３０残基のペプチドとを含有する組成物に関する。更に、核酸を含む、核酸含有組成物に関する。以下に、本発明の詳細を説明する。
【００１７】
まず、本明細書における化学構造の記載に用いる用語を説明する。
尚、本発明中「ｎ−」はノルマル、「ｉ−」はイソ、「ｓ−」はセカンダリー、「ｔ−」はターシャリーを意味する。
「由来する基」とは、対象となる分子から任意の位置の水素原子を取り除いた基を意味する。
【００１８】
「置換基を有していてもよい」とは、無置換であるか、又は少なくとも１つの置換基で置換されていることを意味する。
【００１９】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
【００２０】
直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状又は環状の飽和炭化水素基であり、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基、シクロへキシルメチル基、シクロへキシルエチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ｎ−ウンデシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−トリデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ペンタデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−ヘプタデシル基、ｎ−オクタデシル基、ｎ−ノナデシル基、ｎ−イコシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、ｔ−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が具体例として挙げられる。
本明細書において（Ｃａ〜Ｃｂ）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基は、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基の例から、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００２１】
本明細書において、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状の飽和炭化水素基であり、その具体例は、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基に包含される。なお、環状のアルキル基は、直鎖状又は分岐鎖状の飽和炭化水素基には包含されない。本明細書において（Ｃａ〜Ｃｂ）の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基は、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる、前記直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、前記直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基の例から、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００２２】
直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基は、少なくともいずれか１カ所に炭素−炭素二重結合を有する、直鎖状、分岐鎖状又は環状の不飽和炭化水素基であり、例えば、１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、２−メチル−１，３−ブタジエニル基、１−オクテニル基、１−デセニル基、１−ドデセニル基、１−テトラデセニル基、１−ヘキサデセニル基、１−シクロヘキセニル基、３−シクロヘキセニル基、１−オクタデセニル基、ｃｉｓ−９−オクタデセニル基、９−ヘキサデセニル基等が挙げられる。
本明細書において（Ｃａ〜Ｃｂ）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基は、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基であり、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基の例から、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００２３】
アリール基は、炭素環アリール基又は複素環アリール基を意味する。
炭素環アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
複素環アリール基は、環を構成する原子中に、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１乃至５個のヘテロ原子を含有する、単環系又は縮合環系のアリール基を意味し、例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、キナゾリニル基、ナフチリジニル基、フリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、トリアゾリル基、チエニル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、イミダゾピリジル基等が挙げられる。
【００２４】
直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基とは、いずれか１カ所の水素原子が炭素環アリール基で置換された、直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基である。例えば、ベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくは４−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
本明細書において（Ｃａ〜Ｃｂ）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基は、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる、前記直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基であり、前記直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基の例から、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００２５】
アルコキシ基は、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、オキシ基に結合した基を意味し、例えば、メトキシ基、ｎ−プロポキシ基、シクロプロピルメチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソプロポキシ基、ｓ−ブトキシ基、シクロヘキシルオキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−オクチルオキシ基等が挙げられる。
本明細書において（Ｃａ〜Ｃｂ）のアルコキシ基は、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる、前記アルコキシ基であり、前記アルコキシ基の例から、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００２６】
（Ｃ２〜Ｃ１２）のアルケニルオキシ基とは、少なくともいずれか１カ所に炭素−炭素二重結合を有し、炭素原子数が２〜１２である、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基がオキシ基に結合した基を意味し、例えば、１−プロペニルオキシ基、１−ブテニルオキシ基、２−メチル−２−ブテニルオキシ基、２−メチル−１，３−ブタジエニルオキシ基、１−オクテニルオキシ基、１−デセニルオキシ基、１−シクロヘキセニルオキシ基、３−シクロヘキセニルオキシ基等が挙げられる。
【００２７】
アラルキルオキシ基は、前記の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、オキシ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ７〜Ｃ８）のアラルキルオキシ基は、前記（Ｃ７〜Ｃ８）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、オキシ基に結合した基を意味し、例えば、ベンジルオキシ基、フェネチルオキシ基等が挙げられる。
【００２８】
アリールオキシ基は、前記アリール基が、オキシ基に結合した基を意味し、例えば、炭素環アリールオキシ基又は複素環アリールオキシ基であり、特には、フェノキシ基、ナフチルオキシ基、ピリジルオキシ基等が挙げられる。
【００２９】
（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン基は、前記（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基から、任意の位置の水素原子を取り除いた２価の置換基であり、例えば、メチレン基、エチレン基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、２，２−ジメチル−プロパン−１，３−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、３−メチルブタン−１，２−ジイル基、シクロプロパン−１，２−ジイル基等が挙げられる。
【００３０】
アルキルチオ基は、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、チオ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルチオ基は、前記（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、チオ基に結合した基を意味し、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、イソプロピルチオ基、シクロプロピルメチルチオ基、シクロペンチルチオ基、ｎ−ヘキシルチオ基、シクロヘキシルチオ基等が挙げられる。
アラルキルチオ基は、前記直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、チオ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ７〜Ｃ８）のアラルキルチオ基は、前記（Ｃ７〜Ｃ８）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、チオ基に結合した基を意味し、例えば、ベンジルチオ基、フェネチルチオ基等が挙げられる。
【００３１】
アリールチオ基は、前記アリール基が、チオ基に結合した基を意味し、例えば、炭素環アリールチオ基又は複素環アリールチオ基であり、特には、フェニルチオ基、ナフチルチオ基、ピリジルチオ基等が挙げられる。
【００３２】
アルキルスルフィニル基は、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、スルフィニル基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルフィニル基は、前記（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、スルフィニル基に結合した基を意味し、例えば、メチルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基等が挙げられる。
アラルキルスルフィニル基は、前記直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、スルフィニル基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ７〜Ｃ８）のアラルキルスルフィニル基は、前記（Ｃ７〜Ｃ８）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、スルフィニル基に結合した基を意味し、例えば、ベンジルスルフィニル基、フェネチルスルフィニル基等が挙げられる。
【００３３】
アリールスルフィニル基は、前記アリール基が、スルフィニル基に結合した基を意味し、例えば、炭素環アリールスルフィニル基又は複素環アリールスルフィニル基であり、特には、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、ピリジルスルフィニル基等が挙げられる。
【００３４】
アルキルスルホニル基は、前記直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、スルホニル基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルホニル基は、前記（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、スルホニル基に結合した基を意味し、例えば、メチルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基等が挙げられる。
アラルキルスルホニル基は、前記直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、スルホニル基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ７〜Ｃ８）のアラルキルスルホニル基は、前記（Ｃ７〜Ｃ８）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基が、スルホニル基に結合した基を意味し、例えば、ベンジルスルホニル基、フェネチルスルホニル基等が挙げられる。
【００３５】
アリールスルホニル基は、前記アリール基が、スルホニル基に結合した基を意味し、例えば、炭素環アリールスルホニル基又は複素環アリールスルホニル基であり、特には、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、ピリジルスルホニル基等が挙げられる。
【００３６】
モノアルキルアミノ基は、１つの前記の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、アミノ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ１０）のモノアルキルアミノ基は、１つの前記（Ｃ１〜Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、アミノ基に結合した基である。例えば、メチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、ｎ−ヘキシルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基等が挙げられる。
ジアルキルアミノ基は、同一又は異なる２つの前記の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、アミノ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ２〜Ｃ２０）のジアルキルアミノ基は、同一又は異なる２つの前記（Ｃ１〜Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が、アミノ基に結合した基である。例えばジメチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−シクロヘキシルアミノ基等が挙げられる。
【００３７】
環状アミノ基は、環を構成する原子として少なくとも１個の窒素原子を含有する３〜１１員の飽和の複素環から、窒素原子に結合する１つの水素原子を取り除いた基である。具体例としては、モルホリノ基、ピペラジン−１−イル基、４−メチルピペラジン−１−イル基、ピペリジン−１−イル基、ピロリジン−１−イル基等が挙げられる。
【００３８】
モノアリールアミノ基は、１つの前記アリール基が、アミノ基に結合した基を意味し、例えば、炭素環アリールアミノ基又は複素環アリールアミノ基であり、特には、フェニルアミノ基、ナフチルアミノ基、ピリジルアミノ基等が挙げられる。
ジアリールアミノ基は、同一又は異なる２つの前記アリール基が、アミノ基に結合した基を意味し、例えば、ジ（炭素環アリール）アミノ基、ジ（複素環アリール）アミノ基又はＮ−（炭素環アリール）−Ｎ−（複素環アリール）アミノ基であり、特には、ジフェニルアミノ基、Ｎ−フェニル−Ｎ−ピリジルアミノ基等が挙げられる。
【００３９】
アシル基は、水素原子、前記の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、前記の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基、アリール基、又は前記の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基がカルボニル基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ９）のアシル基は、水素原子、（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、（Ｃ２〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基、アリール基、又は（Ｃ７〜Ｃ８）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基がカルボニル基に結合した基を意味し、例えば、ホルミル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ピリジルカルボニル基等が挙げられる。
【００４０】
アルコキシカルボニル基は、前記のアルコキシ基がカルボニル基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ２〜Ｃ９）のアルコキシカルボニル基は、前記（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基がカルボニル基に結合した基を意味し、例えば、メトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基等が挙げられる。
アラルキルオキシカルボニル基は、前記のアラルキルオキシ基が、カルボニル基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ８〜Ｃ９）のアラルキルオキシカルボニル基は、前記（Ｃ７〜Ｃ８）のアラルキルオキシ基が、カルボニル基に結合した基を意味し、例えば、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００４１】
アシルオキシ基は、前記アシル基がオキシ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ９）のアシルオキシ基は、前記（Ｃ１〜Ｃ９）のアシル基がオキシ基に結合した基を意味し、例えば、ホルミルオキシ基、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基、ピリジルカルボニルオキシ基等が挙げられる。
アルコキシカルボニルオキシ基は、前記のアルコキシカルボニル基がオキシ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ２〜Ｃ９）のアルコキシカルボニルオキシ基は、前記（Ｃ２〜Ｃ９）のアルコキシカルボニル基がオキシ基に結合した基を意味し、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、ｔ−ブトキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
アラルキルオキシカルボニルオキシ基は、前記のアラルキルオキシカルボニル基がオキシ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ８〜Ｃ９）のアラルキルオキシカルボニルオキシ基は、前記（Ｃ８〜Ｃ９）のアラルキルオキシカルボニル基がオキシ基に結合した基を意味し、例えば、ベンジルオキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
【００４２】
アシルアミノ基は、前記アシル基がアミノ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ９）のアシルアミノ基は、前記（Ｃ１〜Ｃ９）のアシル基がアミノ基に結合した基を意味し、例えば、ホルミルアミノ基、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基等が挙げられる。
【００４３】
アルコキシカルボニルアミノ基は、前記アルコキシカルボニル基がアミノ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ２〜Ｃ９）のアルコキシカルボニルアミノ基は、前記（Ｃ２〜Ｃ９）のアルコキシカルボニル基がアミノ基に結合した基を意味し、例えば、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基等が挙げられる。
アラルキルオキシカルボニルアミノ基は、前記アラルキルオキシカルボニル基がアミノ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ８〜Ｃ９）のアラルキルオキシカルボニルアミノ基は、前記（Ｃ８〜Ｃ９）のアラルキルオキシカルボニル基がアミノ基に結合した基を意味し、例えば、ベンジルオキシカルボニルアミノ基等が挙げられる。
【００４４】
アルキルスルホニルアミノ基は、前記アルキルスルホニル基がアミノ基に結合した基を意味し、具体的に（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルホニルアミノ基は、前記（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルホニル基がアミノ基に結合した基を意味し、例えば、メタンスルホニルアミノ基が挙げられる。
アリールスルホニルアミノ基は、前記アリールスルホニル基がアミノ基に結合した基を意味し、例えば、炭素環アリールスルホニルアミノ基又は複素環アリールスルホニルアミノ基であり、特には、ベンゼンスルホニルアミノ基、ピリジルスルホニルアミノ基等が挙げられる。
【００４５】
置換基を有するカルバモイル基は、前記モノアルキルアミノ基（例えば、前記（Ｃ１〜Ｃ１０）のモノアルキルアミノ基）、前記ジアルキルアミノ基（例えば、前記（Ｃ２〜Ｃ２０）のジアルキルアミノ基）、前記環状アミノ基、前記モノアリールアミノ基又は前記ジアリールアミノ基が、カルボニル基に結合した基を意味し、例えば、ジメチルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基等が挙げられる。
置換基を有するスルファモイル基は、前記モノアルキルアミノ基（例えば、前記（Ｃ１〜Ｃ１０）のモノアルキルアミノ基）、前記ジアルキルアミノ基（例えば、前記（Ｃ２〜Ｃ２０）のジアルキルアミノ基）、前記環状アミノ基、前記モノアリールアミノ基又は前記ジアリールアミノ基が、スルホニル基に結合した基を意味し、例えば、ジメチルスルファモイル基、フェニルスルファモイル基等が挙げられる。
置換基を有するカルバモイルオキシ基としては、置換基を有する前記カルバモイル基が、オキシ基に結合した基を意味し、例えば、ジメチルカルバモイルオキシ基、フェニルカルバモイルオキシ基等が挙げられる。 
置換基を有するスルファモイルアミノ基は、置換基を有する前記スルファモイル基が、アミノ基、前記モノアルキルアミノ基（例えば、前記（Ｃ１〜Ｃ１０）のモノアルキルアミノ基等）、又は前記モノアリールアミノ基の窒素原子に結合した基を意味し、例えば、ジメチルスルファモイルアミノ基等が挙げられる。
置換基を有するウレイド基は、置換基を有する前記カルバモイル基が、アミノ基、前記モノアルキルアミノ基（例えば、前記（Ｃ１〜Ｃ１０）のモノアルキルアミノ基等）、又は前記モノアリールアミノ基の窒素原子に結合した基を意味し、例えば、トリメチルウレイド基、１−メチル−３−フェニル−ウレイド基等が挙げられる。
【００４６】
シリル基としては、トリ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルシリル基又はモノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルジアリールシリル基、例えば、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。
【００４７】
［ブロック型コポリマーについて］
本発明は、ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性ポリエステルセグメントのブロック型コポリマーを用いる。
【００４８】
ブロック型コポリマーにおける、該ポリエチレングリコールセグメントは、エチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）単位の繰り返し構造を有するポリエチレングリコール鎖を含むセグメントである。該ポリエチレングリコールセグメントの重合度は、例えば、５〜１２，０００であり、好ましくは２０〜７００であり、より好ましくは、３０〜４００であり、さらに好ましくは３０〜２００であり、特に好ましくは、４０〜１００である。またポリエチレングリコールセグメントの平均分子量は、例えば２００〜５００，０００、好ましくは５００〜３０，０００であり、より好ましくは１，０００〜１０,０００であり、さらに好ましくは１，０００〜７,０００であり、さらにより好ましくは、１，０００〜６,０００であり、特に好ましくは１，０００〜３，０００である。なお、本発明で用いる平均分子量とは、ポリエチレングリコール標準品（シグマアルドリッチ社製）を基準としたＧＰＣ法（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により測定されるピークトップ分子量（重量平均）である。
【００４９】
該ポリエチレングリコールセグメントの一方の末端は、後述する疎水性ポリエステルセグメントと直接的に連結されているか、あるいは、結合基を介して疎水性ポリエステルセグメントと連結されている。もう一方の末端は、特に限定されるものではなく、ポリエチレングリコールの末端のヒドロキシ基であってもよく、又は末端のヒドロキシ基を修飾した任意の末端基であってもよい。したがって、もう一方の末端の末端基としては、水素原子、ヒドロキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ１２）のアルコキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ２〜Ｃ１２）のアルケニルオキシ基、置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルオキシ基等を挙げることができる。前記（Ｃ１〜Ｃ１２）のアルコキシ基、（Ｃ２〜Ｃ１２）のアルケニルオキシ基、（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルオキシ基における置換基としては、ヒドロキシ基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシ基等が挙げられる。好ましくは、前記置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシ基であり、より好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシ基であり、さらに好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ３）のアルコキシ基であり、さらにより好ましくはメトキシ基である。
【００５０】
また、前記末端基を介して、標的指向性分子を有してもよい。標的指向性分子としては、糖、脂質、ペプチド及びタンパク質並びにそれらの誘導体、又は葉酸等が挙げられる。その中で、例えば肝臓等に特異性高く効率的に送達する観点では、脂質、糖が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ，ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、それらの誘導体等が挙げられる。
糖としては、アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用を有する糖誘導体が挙げられる。「アシアロ糖タンパク質受容体」は肝臓細胞表面に存在し、アシアロ糖タンパク質のガラクトース残基を認識して、その分子を細胞内に取り込み分解する作用を持つ。「アシアロ糖タンパク質受容体と相互作用する糖誘導体」は、ガラクトース残基と類似した構造を持ち、アシアロ糖タンパク質受容体との相互作用により細胞内に取り込まれる化合物が好ましく、例えば、ＧａｌＮａｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体、ガラクトース誘導体及びラクトース誘導体が挙げられる。
また、脳に特異性高く効率的に送達する観点では、糖（例えば、グルコース、スクロース等）が挙げられる。また、がん組織に特異性高く効率的に送達する観点では、葉酸やペプチド（例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸配列を含有する環状ペプチド等）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に相互作用することにより、当該臓器に特異性高く効率的に送達できるという観点では、受容体のリガンド、抗体、それらの断片のペプチド又はタンパク質が挙げられる。
【００５１】
ブロック型コポリマーにおける、ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性ポリエステルセグメントは、直接的あるいは適切な結合基を介して間接的に連結されていてもよいが、好ましくは直接的に連結されている。ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性ポリエステルセグメントが直接的に連結される結合様式は、ポリエチレングリコールセグメントの末端ヒドロキシ基と、疎水性ポリエステルセグメントの末端カルボキシ基とで形成されるエステル結合であることが好ましい。ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性ポリエステルセグメントが間接的に連結される場合の結合基としては、２つのポリマーセグメントを化学結合により連結する基であれば、特に限定されるものではなく、ポリエチレングリコールセグメントの末端基及び疎水性ポリエステルセグメントの末端基と結合できる官能基から形成される結合基であれば良い。好ましくは、（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキレン基である。該結合基のポリエチレングリコールセグメントとの結合様式は、ポリ（オキシエチレン）基の末端酸素原子によるエーテル結合が好ましく、疎水性ポリエステルセグメントとの結合様式はアミド結合又はエステル結合であることが好ましい。
【００５２】
ブロック型コポリマーにおける、疎水性ポリエステルセグメントとは、分子内にカルボキシ基とヒドロキシ基を有するモノマーが重縮合した疎水性のセグメントである。疎水性ポリエステルセグメントを構成するモノマーが単一であるホモ重合体であってもよく、二種以上の共重合体であってもよい。単一のモノマーで構成される疎水性ポリエステルとしては、ポリ（ε−カプロラクトン）及びポリ乳酸が挙げられる。二種以上モノマーで構成される疎水性ポリエステルとしては、ポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー）が挙げられる。特に、ポリ（ε−カプロラクトン）が好ましい。
疎水性ポリエステルセグメント（例えば、上記ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ乳酸及びポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー））の平均分子量は、例えば５００〜３０，０００であり、好ましくは１，０００〜１０，０００であり、より好ましくは１，０００〜８，０００であり、さらに好ましくは、１，０００〜７，０００であり、さらにより好ましくは１，０００〜３，０００である。
その他の態様として、ポリ乳酸の平均分子量は、好ましくは、４，０００〜６，０００である。ポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー）の平均分子量は、好ましくは、６，０００〜８，０００である。
【００５３】
上述のような該ブロック型コポリマーとしては、モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）共重合体、モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ乳酸共重合体、及びモノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー）共重合体が挙げられ、好ましい例としては、モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）共重合体が挙げられる。中でもポリエチレングリコールの平均分子量が１，０００〜６，０００、ポリ（ε−カプロラクトン）の平均分子量が１，０００〜６，０００である、モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）共重合体が好ましく、ポリエチレングリコールの平均分子量が１，０００〜３，０００、ポリ（ε−カプロラクトン）の平均分子量が１，０００〜３，０００である、モノメトキシポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）共重合体が特に好ましい。なお、前記ポリ乳酸、及び前記乳酸−グリコール酸コポリマーの乳酸部分は、Ｄ体、Ｌ体、及びＤ体とＬ体との混合物のいずれを用いてもよいが、Ｄ体とＬ体との混合物が好ましい。
【００５４】
［ブロック型コポリマーの製造方法について］
本発明のブロック型コポリマーは、公知の方法により製造することができる。
例えば、ポリエチレングリコールセグメントと、疎水性ポリエステルセグメントを、適切な結合様式により結合させる方法で製造することができる。また、ポリエチレングリコールセグメントの末端ヒドロキシ基を開始点とし、環状エステルモノマーとの開環重合により、逐次重合反応させてブロック型コポリマーを調製してもよい。好ましくは、ポリエチレングリコールセグメントの末端ヒドロキシ基を開始点とし、環状エステルモノマーとの開環重合により、逐次重合反応させてブロック型コポリマーを調製する。ポリエチレングリコールセグメントに対する環状エステルモノマーの仕込み比を変化させることにより、各ユニットの種々の平均分子量（重合度）を有する共重合体を得ることが可能である。環状エステルモノマーとしてε−カプロラクトンを用いることで、ポリエチレングリコール−ポリ（ε−カプロラクトン）が製造され、ジラクチドを用いることで、ポリエチレングリコール−ポリ乳酸が製造される。ジラクチド及びグリコリドを用いることで、ポリエチレングリコール−ポリ（乳酸−グリコール酸コポリマー）が製造される。具体的な製造方法としては、例えば、バイオマテリアルズ，２４巻，３５６３−３５７０頁（２００３年）、バイオマテリアルズ，２６巻，２１２１−２１２８頁（２００５年）、インターナショナル  ジャーナル  オブ  ファーマシューティクス，１８２巻，１８７−１９７頁（１９９９年）などを参照できる。
【００５５】
[ペプチドについて]
本発明は、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つを含有する４〜３０残基のペプチドを用いる。
該ペプチドの結合様式はペプチド結合であり、α結合体であってもβ結合体であってもよく、その混合物であってもよい。該ペプチドを構成するアミノ酸残基としては、天然アミノ酸又は非天然アミノ酸であってもよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。
【００５６】
該ペプチドは、脂溶性基を直接又は結合基を介して含有することが好ましい。脂溶性基を含有することで、ブロック型コポリマーの疎水性ポリエステルセグメントとの疎水性相互作用が増し、核酸送達用組成物又は核酸含有組成物の安定性が向上する。
前記ペプチドが含有する脂溶性基は、脂溶性の基であれば、特に限定されないが、例えば、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ３０）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基から選択され、好ましくは、置換基を有していてもよい（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基及び置換基を有していてもよい（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基から選択される。また、別の形態として、前記脂溶性基は、好ましくはコレステロールに由来する基及び脂溶性ビタミンに由来する基から選択される。
【００５７】
前記脂溶性基におけるアルキル基、アルケニル基及びアラルキル基が有する置換基としては、スルファニル基、ヒドロキシ基、アミノ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、カルバモイル基、スルファモイル基、炭素環アリール基、複素環アリール基、アルキルチオ基、アラルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アラルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アラルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換基を有するスルファモイル基、アルコキシ基、アラルキルオキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アラルキルオキシカルボニルオキシ基、置換基を有するカルバモイルオキシ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、環状アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アラルキルオキシカルボニルアミノ基、置換基を有するウレイド基、アルキルスルホニルアミノ基、アリールスルホニルアミノ基、置換基を有するスルファモイルアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、アラルキルオキシカルボニル基、置換基を有するカルバモイル基及びシリル基等を挙げることができる。ここで、前記炭素環アリール基、複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換基を有するスルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、置換基を有するカルバモイルオキシ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、環状アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、置換基を有するウレイド基、アルキルスルホニルアミノ基、アリールスルホニルアミノ基、置換基を有するスルファモイルアミノ基、アシル基、アルコキシカルボニル基、置換基を有するカルバモイル基及びシリル基等は、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、及び（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基、（Ｃ７〜Ｃ８）のアラルキルオキシ基等により置換されていてもよい。
【００５８】
例えば、アルコキシ基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基が挙げられる。
例えば、ハロゲン原子で置換されたアルコキシ基としては、ハロゲン原子で置換された（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基が挙げられ、その具体例としては、トリフルオロメトキシ基、２，２，２−トリフルオロエトキシ基等が挙げられる。
例えば、ハロゲン原子で置換されたアルコキシカルボニルオキシ基としては、ハロゲン原子で置換された（Ｃ２〜Ｃ９）のアルコキシカルボニルオキシ基が挙げられ、その具体例としては、トリフルオロメトキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
【００５９】
前記ペプチドが含有する脂溶性基は、より好ましくは、（Ｃ１５〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、さらに好ましくは、（Ｃ１５〜Ｃ２０）の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基であり、さらにより好ましくは、ヘプタデシル基又はオクタデシル基であり、特に好ましくは、ヘプタデシル基である。
【００６０】
前記脂溶性基における脂溶性ビタミンとしては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫが挙げられる。
【００６１】
前記ペプチドが含有する脂溶性基は、ペプチドのＮ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキシ基に、直接又は結合基を介して結合する。脂溶性基が、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基、又は置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ３０）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基であり、前記アルキル基、アルケニル基、又はアラルキル基が、直接ペプチドのＮ末端と結合する場合、Ｎ末端アミノ基と、前記アルキル基、前記アルケニル基、又は前記アラルキル基の炭素原子が、直接結合する。しかし、前記アルキル基、前記アルケニル基、又は前記アラルキル基が、Ｎ末端アミノ基と、適切な結合基を介して結合する態様が、調製し易さの点で好ましい。
適切な結合基としては、−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＮＨ−(ＣＨ２)α−ＣＯ−、−ＮＨ−(ＣＨ２)α−ＮＨＣＯ−、−ＮＨ−(ＣＨ２)α−ＯＣＯ−、−Ｏ−(ＣＨ２)α−ＣＯ−、−Ｏ−(ＣＨ２)α−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−(ＣＨ２)α−ＯＣＯ−及び−ＮＨ−(ＣＨ２)２−ＳＳ−(ＣＨ２)２−ＮＨＣＯ−等が挙げられる。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、より好ましくは６〜１２の整数である。
適切な結合基は、特に好ましくは、−ＣＯ−である。
【００６２】
脂溶性基が置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルケニル基、又は置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ３０）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基であり、前記アルキル基、前記アルケニル基、又は前記アラルキル基が、直接ペプチドＣ末端と結合する場合、前記アルキル基、前記アルケニル基、又は前記アラルキル基が、Ｃ末端カルボキシ基のヒドロキシ基を置き換えて、ケトン型構造で結合する。しかし、前記アルキル基、前記アルケニル基、又は前記アラルキル基が、Ｃ末端カルボキシ基と、適切な結合基を介して結合する態様が、調製し易さの点で好ましい。
適切な結合基としては、オキシ基、アミノ基又はチオ基が好ましい。前記結合基としてオキシ基（酸素原子）を用いる場合、前記脂溶性基である置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）のアルキル基、置換基を有していてもよい（Ｃ４〜Ｃ３０）のアルケニル基又は置換基を有していてもよい（Ｃ７〜Ｃ３０）のアラルキル基は、エステル結合の様式にて前記ペプチドに結合する。また、前記結合基としてアミノ基を用いる場合、前記アルキル基、前記アルケニル基、又は前記アラルキル基は、アミド結合の様式にて前記ペプチドに結合する。前記結合基としてチオ基（硫黄原子）を用いる場合、前記アルキル基、前記アルケニル基、又は前記アラルキル基は、チオエステル結合の様式にて前記ペプチドに結合する。
また、Ｃ末端カルボニル基への別の適切な結合基としては、−ＮＨ−(ＣＨ２)α−ＮＨ−、−ＮＨ−(ＣＨ２)α−Ｏ−、−Ｏ−(ＣＨ２)α−ＮＨ−、−Ｏ−(ＣＨ２)α−Ｏ−及び−ＮＨ−(ＣＨ２)２−ＳＳ−(ＣＨ２)２−ＮＨ−等が挙げられる。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。
【００６３】
脂溶性基がコレステロールに由来する基又は脂溶性ビタミンに由来する基である場合は、コレステロール又は脂溶性ビタミンのヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分と、前記ペプチドＣ末端カルボキシ基からヒドロキシ基を取り除いた部分（以下、Ｃ末端カルボニル基と呼ぶ）とで、エステル結合の様式にて結合することが好ましい。あるいは、前記ペプチドＣ末端カルボニル基と、−(ＣＨ２)α−ＮＨ−又は−(ＣＨ２)α−Ｏ−等の結合基を介して結合することが好ましい。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。
脂溶性基がコレステロールに由来する基又は脂溶性ビタミンに由来する基である場合の別の形態としては、コレステロール又は脂溶性ビタミンのヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分と、前記ペプチドＮ末端アミノ基とで、−ＣＯ−、−(ＣＨ２)α−ＣＯ−、−(ＣＨ２)α−ＮＨＣＯ−、−(ＣＨ２)α−ＯＣＯ−、−(ＣＨ２)２−ＳＳ−(ＣＨ２)２−ＮＨＣＯ−等の結合基を介して結合することが好ましい。ここで、αは１〜１２の整数であり、好ましくは４〜１２の整数であり、特に好ましくは６〜１２の整数である。
【００６４】
該ペプチドの残基数は、４〜３０であり、好ましくは５〜２０であり、より好ましくは５〜１５であり、さらに好ましくは、６〜１２であり、特に好ましくは８〜１０である。
該ペプチドは、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つを含有する。アルギニン及びリジンは中性条件下で正電荷を帯びているため、静電相互作用により負電荷を持つ核酸と複合体を形成することが出来る。さらに、アルギニンはグアニジンユニットを有することによって、細胞膜あるいはエンドソームなどのオルガネラ膜との相互作用により核酸送達の効率を向上できるため、該ペプチドは、少なくとも１つのアルギニンを有することが好ましい。
【００６５】
該ペプチドを構成する、その他のアミノ酸残基としては、例えばグリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、プロリン、トリプトファン等の環状系アミノ酸、システイン等の硫黄系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。システイン等の硫黄系アミノ酸は、分子間でジスルフィド結合を形成することにより、核酸送達用組成物又は核酸含有組成物の安定性を向上させる点で好ましい。一方、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸は、酸性の生体環境下においてプロトン化し、塩を形成することにより、核酸送達の効率を向上できる点で好ましい。
【００６６】
上述の観点から、アルギニン及びヒスチジンを共に含有することが好ましい。両残基の合計数は、ペプチド全残基の合計数に対し、５０〜１００％であることが好ましく、７５〜１００％であることがさらに好ましい。
この様なペプチドの好ましい配列例として、Ｎ末端から
システイン−ヒスチジン−ヒスチジン−アルギニン−アルギニン−アルギニン−アルギニン−ヒスチジン−ヒスチジン−システイン（配列番号１８）、
システイン−ヒスチジン−ヒスチジン−アルギニン−アルギニン（配列番号２５）、
ヒスチジン−ヒスチジン−アルギニン−アルギニン−アルギニン−アルギニン−ヒスチジン−ヒスチジン（配列番号２６）、
ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−アルギニン−アルギニン−アルギニン−アルギニン（配列番号２７）、
アルギニン−アルギニン−アルギニン−アルギニン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン−ヒスチジン（配列番号２８）等が挙げられる。
【００６７】
該ペプチドを構成するアミノ酸残基の組み合わせは、好ましくは、
アルギニン及びヒスチジン、
アルギニン、ヒスチジン及びシステイン、
又は、リジン、ヒスチジン及びシステインであり、
さらに好ましくは、アルギニン、ヒスチジン及びシステインである。
【００６８】
［ペプチドの製造方法について］
ペプチドの合成法は、多くの方法が知られている。例えば、ペプチド固相合成は、日本化学会編「第５版実験化学講座 １６」（丸善，２００５年、２８３−３２６頁）等に記載されている。本発明のペプチドは、例えば上記文献に記載の公知の方法を用いて合成できる。
脂溶性基が直接Ｎ末端と結合したペプチドは、ペプチドの末端アミノ基と、アルデヒド基やケトン基、適切な脱離基（ハロゲン、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基など）、エポキシ基等を有する、前記脂溶性基に対応する化合物とを既知のＮ−アルキル化条件などにより反応させることで製造できる。
前記脂溶性基が、ペプチドのＮ末端アミノ基と、結合基を介して結合したペプチドは、末端アミノ基と、カルボン酸、エステル、活性エステル（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド化等）、酸クロリド、活性化炭酸ジエステル（４−ニトロフェニル化炭酸ジエステル等）、イソシアネート等を有する、対応する脂溶性基を有する化合物とを既知のＮ−カルボニル化条件などにより反応させることで製造できる。
脂溶性基が直接Ｃ末端と結合したペプチドは、ペプチドの末端カルボン酸を、酸クロリド、酸無水物、エステルへ変換し、該酸クロリド、酸無水物、エステルを、対応する脂溶性基を有する有機金属化合物等（例えば、グリニヤール反応剤、有機リチウム化合物、有機亜鉛化合物等）とを既知のケトン化反応条件などにより反応させることで製造できる。
脂溶性基が、ペプチドのＣ末端カルボキシ基と、結合基を介して結合したペプチドは、ペプチドの末端カルボキシ基と、アミノ基、ヒドロキシ基又はチオール基を有する、対応する脂溶性基を有する化合物とを既知の縮合反応により反応することで製造できる。また、ペプチドの末端カルボキシ基をエステル、活性エステル（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド化等）、酸クロリド等へ変換した基質を用いて、既知の縮合反応などにより反応させることもできる。
前記、Ｎ−アルキル化条件、Ｎ−カルボニル化条件、ケトン化反応条件、縮合反応の条件の具体的な反応条件としては、例えば、｛コンプリヘンシブ  オーガニック  トランスフォーメーションズ  セカンド  エディション（Comprehensive Organic Transformations Second Edition）１９９９年、ジョン  ウィリー  アンド  サンズ（John Wiley & Sons, INC.）｝等を参照することができる。これら既知の文献に記載の方法、それに準じた方法、又はこれらと常法とを組み合わせることにより本発明のペプチドを製造することができる。
【００６９】
［核酸送達用組成物について］
本発明の核酸送達用組成物は、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーと、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つを含有する４〜３０残基のペプチドを含有する。前記ブロック型コポリマーと前記ペプチドの好ましい態様は、上述の通りである。
【００７０】
前記ブロック型コポリマーと前記ペプチドの含有比率としては、前記ペプチド１当量に対して、前記ブロック型コポリマーが、好ましくは０．０５〜５０当量であり、より好ましくは０．２〜２．０当量であり、特に好ましくは０．５〜１．５当量である。
前記ブロック型コポリマーと前記ペプチドとは、粒子を形成することが好ましく、その粒子径は、１００ｎｍ以下が好ましく、５０ｎｍ以下がより好ましく、３０ｎｍ以下が特に好ましい。ブロック型コポリマーの疎水性ポリエステルセグメントと、前記ペプチドの脂溶性基とが、疎水性相互作用により会合することにより、ミセル粒子が形成されると考えられる。
【００７１】
前記粒子径は、動的光散乱法により、光散乱粒子径測定装置（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ；大塚電子（株）製、ＤＬＳ−７０００など）を用いて測定できる。光散乱粒子径測定装置は、キュムラント平均粒径や、質量平均粒径を測定できる。いずれの光散乱粒子径測定装置も、互換可能に使用できるが、好ましくは、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳで測定されるキュムラント平均粒径が用いられる。
【００７２】
次に、本発明の核酸送達用組成物の作製法について説明する。
本発明の核酸送達用組成物の作製法は、特に限定されないが、５０ｎｍ程度以下の粒子径の粒子を含む核酸送達用組成物又は核酸含有組成物が高い再現性で作製できるという観点で、以下の方法で作製することが好ましい。まず、前記ブロック型コポリマーを水溶性有機溶剤に溶解し、ブロック型コポリマーの溶液を調製する。別途、前記ペプチドを水に溶解し、ペプチドの水溶液を調製し、これを前記ブロック型コポリマーの水溶性有機溶剤溶液と混合する。この混合溶液から、有機溶剤を除去することで、該核酸送達用組成物が水分散液の形態で作製される。作製された核酸送達用組成物の溶液に、更に希釈、撹拌、超音波照射、透析、濃縮等の操作を適宜実施してもよい。
【００７３】
前記水溶性有機溶剤としては例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔ−ブチルアルコール、エチレングリコール等のアルコール溶媒、１，２−ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル溶媒、アセトン等のケトン溶媒、アセトニトリル等のニトリル溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド溶媒等が挙げられる。好ましくは、エーテル溶媒が用いられる。中でも、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール及びジメチルスルホキシドから選択される１つ以上の溶媒を用いることが好ましく、テトラヒドロフランを用いることがより好ましい。
水としては、水、生理食塩水、グルコース水溶液、リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］や４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］等の緩衝液等を用いることができる。 
【００７４】
混合溶液から有機溶剤を除去する方法としては例えば、限外ろ過膜を用いる方法（例えば、透析又は、遠心式限外ろ過デバイスを用いる方法等）及び溶媒留去法等が挙げられるが、限外ろ過膜を用いる方法が好ましい。
また、各成分の溶液及びそれら混合液のｐＨは、粒子形成能を阻害しない範囲で適宜調整することが可能である。ｐＨは好ましくは５〜９、より好ましくは６．５〜８．０であり、さらに好ましくは７．０〜８．０である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を使用することで、容易に行うことができる。各成分の溶液、及びそれら混合液の緩衝液の塩の濃度は、粒子形成能を阻害しない限り適宜調整することが可能であるが、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜１５０ｍＭである。 
【００７５】
前記調製方法において、各成分の溶液調製時及びそれらの混合時の温度は、ポリマーの溶解度を考慮して設定することが好ましく、通常、０℃以上であり、好ましくは０〜６０℃であり、より好ましくは、５〜４０℃である。
前記調製方法において、混合液を静置することにより平衡化する時間を設けてもよい。具体的には、例えば０℃〜６０℃で、０．１〜５０時間静置されることが好ましい。
【００７６】
本発明の核酸送達用組成物には、例えば、様々な製剤型の核酸含有組成物を調製するため、通常使用されている薬学的に許容される添加剤を含んでもよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、滑沢剤、潤滑剤、界面活性剤、崩壊剤、溶剤、可溶化剤、分散剤、緩衝剤、安定化剤、懸濁化剤、溶解補助剤、保存剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、等張化剤、粘稠化剤、色素、香料等を使用できる。かかる添加剤は、１種を単独で使用しても、２種以上を任意の比率で組み合わせて使用してもよい。これらその他の成分の種類や使用量等の詳細は、本発明の核酸送達用組成物又は核酸含有組成物の目的、用途、使用方法等に応じて、当業者であれば適宜決定することが可能である。
【００７７】
製剤型としては、注射剤及び点滴剤等が望まれているため、塩化ナトリウム；緩衝用塩；ブドウ糖、乳糖、マンニトール等の糖類；水溶性セルロース類；ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等の水溶性高分子；水；グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモフォール等の水溶性有機溶媒等をさらに添加できる。
【００７８】
本発明は、前記核酸送達用組成物を含み、該核酸送達用組成物に核酸を添加する方法が記載された添付文書を一体に包装したキットを包含する。
本発明は、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性ポリエステルセグメントとが連結したブロック型コポリマーを含有する第１の組成物と、アルギニン及びリジンからなる群より選択される少なくとも一つを含有する４〜３０残基のペプチドを含有する第２の組成物を一体に包装したキットを包含する。該キットは、前記第１の組成物と前記第２の組成物とを混合して、前記核酸送達用組成物を作製する方法が記載された添付文書を含んでいてもよい。該ブロック型コポリマーと該ペプチドの含有比率は、核酸送達用組成物と同様である。該ブロック型コポリマーと該ペプチドは、前記添加剤や溶剤と共に充填されていて良い。
【００７９】
［核酸含有組成物について］
本発明は、前記ブロック型コポリマーと前記ペプチドからなる核酸送達用組成物に、核酸を含有させた核酸含有組成物を包含する。該核酸含有組成物は、その核酸分子を標的組織に送達し、細胞内に導入することができる。本発明を用いることにより、生理活性を有する核酸を、生体内の様々な核酸分解因子を回避して標的組織まで送達し、該核酸を標的細胞に導入し、エンドソームから脱出させることにより、核酸を細胞内へ放出させ、該核酸の機能を発揮させることができる。
【００８０】
本発明において、用いられる核酸は特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その他天然の核酸、及びそれらの修飾核酸等が挙げられる。また、該核酸としては、一本鎖状態の核酸であっても、二本鎖状態の核酸であってもよい。該核酸は、生体内に送達された後、生体、組織、細胞等に対して何らかの生理活性作用を有することが好ましい。
該核酸としては、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、デコイ核酸、リボザイム、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡ酵素、各種抑制遺伝子（癌抑制遺伝子等）等が挙げられ、修飾核酸も含まれる。
【００８１】
該修飾核酸としては、例えば、核酸のリン酸部分がホスホロチオエート、メチルホスホナート、ホスフェートトリエステル、ホスホロアミデート等に修飾された核酸や、ミセル粒子の安定化等のために、コレステロールやビタミンＥ等の疎水性官能基が結合された核酸等を挙げることができる。糖部分（リボース又はデオキシリボース）が修飾された核酸の例としては、ヘキシトールヌクレオチド（ＨＮＡ）、シクロヘキセンヌクレオチド（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオヌクレオチド（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化ヌクレオチド、２’−フルオロ化ヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド（２’−Ｆ−ＡＮＡ）、架橋化ヌクレオチド（ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid））、２’−Ｏ−（Ｎ−メチルアセトアミド）（ＮＭＡ）化ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルカルバモイルエチル（ＭＣＥ）化ヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドを含む核酸を挙げることができる。架橋化ヌクレオチドとしては、ＬＮＡとも称されるロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（登録商標））、当業者に知られた他の架橋化ヌクレオチド等が挙げられる。また、Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 59, pp 9645-9667、Medicinal Chemistry Communication, 2014, 5, pp 1454-1471、Future Medicinal Chemistry, 2011, 3, pp 339-365、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2008, 18, pp 2296-2300、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開２０１７／１４２０５４号等にも、修飾されたヌクレオチドが、開示されている。
【００８２】
用いる核酸の種類は、その核酸の薬理活性を発揮させて、薬効を得るための目的や用途に応じて、適宜選択することができる。
例えば、プラスミドＤＮＡとしては、標的組織の細胞において所望の機能を発揮し得るものであれば良い。かかるプラスミドＤＮＡは種々のものが知られており（例えば、マイクロバイオロジースペクトラム、２巻、６号、２０１４年）、核酸送達用組成物の用途に応じて所望のプラスミドＤＮＡを選択することが可能である。
ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡとしては、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して目的の遺伝子発現を抑制し得るものであれば良い。ＲＮＡ干渉の標的遺伝子としては、特に限定されないが、癌（腫瘍）遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、細胞周期関連遺伝子、増殖シグナル遺伝子、転写因子遺伝子等が挙げられる。またＲＮＡの塩基長は限定されない。
【００８３】
また、アンチセンス核酸としては、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ；例えばリボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）に対して相補的な一本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの構造類似体であるものであれば良い。アンチセンス核酸の標的は特に限定されず、アンチセンス核酸の塩基長も特に限定されない。また、国際公開第２０１３／０８９２８３号、国際公開第２０１７/０６８７９１号、国際公開第２０１７/０６８７９０号又は国際公開第２０１８/００３７３９号等に記載されているような、アンチセンス核酸と該核酸に相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、及びアンチセンス核酸と該核酸に相補的なＰＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド、及びアンチセンス核酸と該核酸に相補的なＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチド等を用いても良い。
【００８４】
また、アンチセンス核酸として、アンチセンス核酸と該核酸に相補的なＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドとが、連結されたオリゴヌクレオチドや、アンチセンス核酸と該核酸に相補的なＰＮＡオリゴヌクレオチドとが連結されたオリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸と該核酸に相補的なＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドとが連結されたオリゴヌクレオチドを用いてもよい。前記オリゴヌクレオチドの連結は、直接的であっても、生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチドに由来する基や、非ヌクレオチド構造を含む連結基等を介して間接的であってもよい。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、国際公開第２０１７／１３１１２４に記載されている。
【００８５】
「非ヌクレオチド構造を含む連結基」は、少なくとも１つの「非ヌクレオチド構造」を構成単位として有する連結基である。非ヌクレオチド構造としては、例えば核酸塩基を有さない構造が挙げられる。非ヌクレオチド構造を含む連結基は、例えば、国際公開第２０１２／０１７９１９号、国際公開第２０１３／１０３１４６号、国際公開第２０１３／１３３２２１号、国際公開第２０１５／０９９１８７号、国際公開第２０１６／１０４７７５号等に記載されており、非ヌクレオチド構造を含む連結基を有するオリゴヌクレオチドの合成法も、これら文献を参照できる。
【００８６】
「生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチド」は、生理的条件にて各種ＤＮａｓｅ（デオキシリボヌクレアーゼ）及びＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）等の酵素によって分解されるオリゴヌクレオチドであればよく、該オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、その一部あるいは全部において、塩基、糖若しくはリン酸結合に化学修飾がされていてもよく、されていなくてもよい。「生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチド」は、例えば、ホスホジエステル結合を少なくとも１つ含み、好ましくはホスホジエステル結合で連結されたオリゴヌクレオチドであり、より好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡであり、さらに好ましくはＲＮＡである。
生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチドは、生理的条件で分解されるオリゴヌクレオチド内において部分的に相補的な配列を含んでいてもよく、含んでいなくてもよいが、好ましくは、部分的に相補的な配列を含まない。そのようなオリゴヌクレオチドの例として、ホスホジエステル結合で連結された（Ｎ）ｋ（Ｎは、それぞれ独立してアデノシン、ウリジン、シチジン、グアノシン、２’−デオキシアデノシン、チミジン、２’−デオキシシチジン、または２’−デオキシグアノシンであり、ｋは１〜４０の整数（繰り返し数）である）を挙げることができる。中でも、ｋは好ましくは３〜２０であり、より好ましくは４〜１０であり、さらに好ましくは４〜７であり、さらにより好ましくは、４又は５であり、特に好ましくは４である。
【００８７】
本発明において、該核酸は、特にＲＮＡ干渉を利用した標的遺伝子の発現抑制作用を有するＲＮＡ又はアンチセンス核酸が好ましく、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡがより好ましく、ｓｉＲＮＡがより好ましい。ｓｉＲＮＡの塩基長は、好ましくは１０〜３０塩基であり、より好ましくは１５〜２５塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基であり、さらにより好ましくは２０〜２５塩基であり、特に好ましくは２１塩基である。
アンチセンス核酸の塩基長は、例えば、８〜４０塩基であり、好ましくは、１０〜３０塩基であり、より好ましくは、１１〜２０塩基であり、さらに好ましくは、１２〜１４塩基であり、特に好ましくは、１３塩基である。前記二本鎖オリゴヌクレオチドや、アンチセンス核酸と該核酸に相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチド又はＰＮＡオリゴヌクレオチドとが連結されたオリゴヌクレオチドの場合には、アンチセンスの配列を有する部分（すなわち、生理活性を有する部分）の好適な塩基長は、前記のアンチセンス核酸の塩基長と同様である。
【００８８】
本発明において、前記ブロック型コポリマーと前記ペプチドとを含有する前記核酸送達用組成物に、核酸を添加して核酸含有組成物を調製する場合、これらの構成成分の相互作用により複合体が形成されていることが好ましい。
ペプチドが脂溶性基を有する場合、アニオン性荷電体である核酸とカチオン性荷電体であるペプチドとが静電相互作用により会合し、更にブロック型コポリマーの疎水性ポリエステルセグメントとペプチドの脂溶性基部分とが疎水性相互作用により会合することで、ミセル粒子が形成されていることが好ましい。
【００８９】
ペプチドが脂溶性基を有さない場合、アニオン性荷電体である核酸とカチオン性荷電体であるペプチドとが静電相互作用により複合体を形成し、該複合体が、ブロック型コポリマーの疎水性ポリエステルセグメント同士の疎水性相互作用により自己会合することで形成されるミセル粒子の内部に取り込まれていることが好ましい。
【００９０】
該核酸含有組成物のペプチドと核酸の含有比率は、前記複合体が形成される条件であれば特に制限されない。前記含有比率は、ペプチドの総カチオン数（Ｎ値）と、核酸の総アニオン数（Ｐ値）の比で規定される、Ｎ／Ｐ比（Ｎ値をＰ値で除した値）で表されることが好ましい。
本発明の核酸含有組成物において、Ｎ／Ｐ比は特に限定されないが、好ましくは１〜１００であり、より好ましくは１〜５０であり、さらに好ましくは５〜３０であり、さらにより好ましくは５〜２０であり、特に好ましくは、５〜１５であり、最も好ましくは、１０である。その他の態様として、Ｎ／Ｐ比は、好ましくは、２０〜３０である。Ｎ／Ｐ比を前記範囲内に収めることで、核酸分解酵素に対する安定性の向上と、細胞内導入率の向上の両立が可能となる。
【００９１】
前記核酸含有組成物の調製方法は、特に限定されず、ブロック型コポリマー、ペプチド及び核酸を、適当な溶剤を用いて混合することで調製することができる。５０ｎｍ程度以下の粒子径の粒子を含む核酸送達用組成物又は核酸含有組成物が高い再現性で作製できるとういう観点で、水に分散した状態の核酸送達用組成物を前述の方法で作製した後、前記核酸を混合することで、該核酸含有組成物が水中に分散した状態で作製されることが好ましい。作製された核酸含有組成物溶液は、更に希釈、撹拌、超音波照射、透析、濃縮等の操作を適宜付加してもよい。
【００９２】
ペプチドが脂溶性基を含有しない場合、ペプチドの水溶液と核酸の水溶液とを混合し、さらに前記ブロック型コポリマーの水溶性有機溶剤の溶液を混合した後に、有機溶剤を除去することで、該核酸含有組成物が水分散液の形態で作製される。作製された核酸含有組成物の溶液に、更に希釈、撹拌、超音波照射、透析、濃縮等の操作を適宜実施してもよい。
前記水溶性有機溶剤は、核酸送達用組成物の作製法で前述した通りである。
水としては、通常、水や生理食塩水、グルコース水溶液、ＰＢＳや、ＨＥＰＥＳの緩衝液等を用いることができる。 
混合溶液から有機溶剤を除去する方法、各成分の溶液及びそれら混合液のｐＨ、各成分の溶液調製時及びそれら混合時における温度、混合液を静置して平衡化する時間は、核酸送達用組成物の作製法で前述した通りである。
【００９３】
本発明の核酸含有組成物において、前記ブロック型コポリマーと、前記ペプチドと、前記核酸とは粒子を形成していることが好ましく、その粒子径は、１００ｎｍ以下が好ましい。上記調製法に従うことで、１００ｎｍ以下の粒子径の粒子を含む核酸含有組成物が得られる。さらに、腫瘍組織への浸透性の向上により、抗腫瘍効果が向上するという観点から、核酸含有組成物の粒子の粒子径は、５０ｎｍ以下がより好ましく、４０ｎｍ以下がさらに好ましく、３０ｎｍ以下が特に好ましい。前記粒子は、ブロック型コポリマーの疎水性ポリエステルセグメント同士の疎水性相互作用、又は該疎水性ポリエステルセグメントとペプチドの脂溶性基部分との疎水性相互作用により、ミセル構造を有していると考えられる。
【００９４】
前記粒子径は、前記核酸送達用組成物と同様、動的光散乱法により、測定できる。
【００９５】
本発明の核酸含有組成物は、さらに低分子薬剤を含有してもよい。低分子薬剤を含有する本発明の核酸含有組成物は、上述した核酸含有組成物の調製時に、さらに低分子薬剤を添加することで、作製できる。該低分子薬剤は、核酸含有組成物の前記粒子の内部に包含されていることが好ましい。内包できる低分子薬剤としては、特に限定されないが、各種抗がん剤、中枢神経系疾患治療薬、各種抗生物質、末梢神経疾患治療薬、感覚器官疾患治療薬、循環器官疾患治療薬、呼吸器官系疾患治療薬、消化器官系疾患治療薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官疾患治療薬、外皮疾患治療薬、歯科口腔疾患治療薬、ビタミン剤、滋養強壮薬、細胞賦活用剤及び抗アレルギー剤等が挙げられる。これらの薬物の内、１種が単独で内包されてもよく、２種以上が内包されてもよい。
【００９６】
内包される好ましい物質は抗がん剤である。使用可能な抗がん剤は特に制限されないが、例えば、次の化合物を挙げることができる：シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミド等のアルキル化剤；メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム等の代謝拮抗剤；ドキソルビシン、ダウノルビシン、プラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、アムルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ブレオマシイン、プペロマシン、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシン等の抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル等の微小管阻害剤；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物等のアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤；イリノテカン、ノギテカン、エトポシド、ソブゾキサン等のトポイソメラーゼ阻害剤；プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド；サリドマイド、レナリドマイド等のサリドマイド誘導体；ボルテゾミブ等のプロテアーゼ阻害剤。これらの抗がん剤は、商業的に入手可能であり、１種が内包されてもよく、２種以上が内包されてもよい。
【００９７】
核酸含有組成物の作製に用いる、前記低分子薬剤の濃度は、その使用目的に応じて適宜設定することができるが、例えば、１０〜１０００μＭ、好ましくは２０〜５００μＭ、より好ましくは４０〜２００μＭである。
【００９８】
本発明の核酸含有組成物は、各種疾患の原因となる細胞又は組織を標的として、所望の核酸を送達し、細胞内へ導入する治療（遺伝子治療）に用いることができる。
本核酸含有組成物による治療対象となる疾患としては特に限定されないが、がん（例えば肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、大腸癌、神経芽細胞腫及び膀胱癌等）、循環器疾患、運動器疾患及び中枢系疾患等が挙げられる。
本発明の核酸含有組成物は、薬剤の製造において一般に使用されるその他の添加剤を含んでもよい。添加剤としては、例えば、核酸送達用組成物への添加剤と同様の添加剤などが挙げられる。かかる添加剤は、１種を単独で使用しても、２種以上を任意の比率で組み合わせて使用してもよい。これらその他の成分の種類や使用量等の詳細は、医薬組成物の目的、用途、使用方法等に応じて、当業者であれば適宜決定することが可能である。
【００９９】
本発明の核酸含有組成物は、様々な製剤型を採用できるが、通常は、注射剤（中でも静脈内注射剤）及び点滴剤が採用される。例えば、単位投与量のアンプルの状態等で提供される。別の形態としては、経鼻投与、経口投与、経皮投与、経眼投与などが採用される。
【０１００】
本発明の核酸含有組成物は、インビトロ又はインビボにおいて標的細胞又は組織と接触させることにより、標的細胞又は組織に核酸を送達する。インビトロにおいて好ましい接触方法としては、培養前の培地に予め核酸含有組成物を添加する方法（リバーストランスフェクション法）、及び培養中の培地に後から核酸含有組成物を添加する方法（フォワードトランスフェクション法）が挙げられる。またインビボにおいて好ましい接触方法としては、局所投与や血中投与等が挙げられる。これらの方法により、標的細胞へ、核酸を導入することができ、該核酸分子の生理活性機能を効率的に発揮させることができる。 
【０１０１】
ヒトなどの霊長類に加えて、様々な他の哺乳類の疾患を、本発明の核酸含有組成物により治療、予防、改善することができる。例えば、それだけに限らないが、ウシ（ｃｏｗ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、ヤギ、ウマ（ｈｏｒｓｅ）、イヌ（ｄｏｇ）、ネコ（ｃａｔ）、テンジクネズミ、又は他のウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ウマ（ｅｑｕｉｎｅ）、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）、マウスなどの齧歯類の種を含めた哺乳類の種の疾患を治療することができる。また、本発明の核酸含有組成物は、鳥類（例えば、ニワトリ）などの他の種の疾患を治療することができる。
【０１０２】
本発明の核酸含有組成物を、ヒトを含む動物に投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、その投与量又は摂取量は、含有する核酸に換算して０．０００１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
【実施例】
【０１０３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
以下の実施例において、ブロック型コポリマーの構造は、ポリエチレングリコールセグメント及び疎水性ポリエステルセグメントの種類と分子量を順に示して表す。例えば、分子量が２，０００のモノメトキシポリエチレングリコール［ＭＰＥＧ］と、分子量が５，０００のポリ（ε−カプロラクトン）［ＰＣＬ］のブロック型コポリマーは、「ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−５０００）」と略記する。モノメトキシポリエチレングリコールとポリ（乳酸−グリコール酸）のコポリマーは、「ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ」、モノメトキシポリエチレングリコールとポリ乳酸のコポリマーは「ＭＰＥＧ−ＰＬＡ」と略記する。実施例において、「ＭＰＥＧ−ＰＬＧＡ」のポリ（乳酸−グリコール酸）部分の乳酸部分、及び「ＭＰＥＧ−ＰＬＡ」のポリ乳酸部分は、Ｄ体とＬ体の混合物である。
ペプチドの配列は、Ｎ末端からＣ末端へ順に、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢガイドラインの１文字表記によって示す。例えば、Ｎ末端から、システイン−ヒスチジン−アルギニンであるペプチドの場合は、「ＣＨＲ」と略記する。特に記載が無い限り、アミノ酸は天然型である。さらに、このペプチドのＮ末端アミノ基に、−ＣＯ−基を介してヘプタデシル基が結合している場合は、「ＳＴＲ−ＣＨＲ」と略記する。
「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を、「ＦＢＳ（＋）」は前記ＦＢＳが添加されていることを、「ＦＢＳ（−）」は前記ＦＢＳが添加されていないことを、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝生理食塩水を、「ＨＥＰＥＳ」は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を、「ＬＰＳ」はリポポリサッカライドを、「ｗ／ｏ型エマルジョン」は、油相に水滴が分散する油中水型のエマルジョンを意味する。
また、以下の実施例及び図１〜１２において、「Example」は、実施例を意味し、「Comparative」は、比較例を意味する。【０１０４】
以下の実施例において使用したブロック型コポリマーは、シグマアルドリッチ、日油等より入手できる。
ペプチドは、当業者に公知の通常の方法によって合成できる。
ｓｉＲＮＡは、株式会社ジーンデザイン、株式会社ニッポンジーン又はコスモ・バイオ株式会社等から入手できる。尚、配列表記において、「（Ｍ）」は、その直前の塩基が２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドであることを意味し、「（Ｌ）」は、その直前の塩基がＬＮＡ（locked nucleic acid）を意味し、小文字のアルファベットはデオキシリボヌクレオチドを意味し、大文字のアルファベット（前記（Ｍ）付のアルファベットは除く）はリボヌクレオチドを意味し、「＾」はホスホロチオエート結合を意味し、「５」は、そのヌクレオチドの塩基が５−メチルシトシンであることを意味する。核酸送達用組成物の調製に用いた核酸は以下の通りである。【０１０５】
ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）：血管内皮細胞増殖因子遺伝子を標的として設計され、センス鎖として、５’−ＣＣＡＵＧＡＡＧＣＣＣＵＧＧＡＧＵＧＣｔｔ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖として５’−ＧＣＡＣＵＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＡＵＣＧｔｔ−３’（配列番号２）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）：血管内皮細胞増殖因子遺伝子を標的として設計され、センス鎖５’末端にコレステロール［Ｃｈｏｌ］が付加されており、センス鎖として、５’−ＣＣＡＵＧＡＡＧＣＣＣＵＧＧＡＧＵＧＣｔｔ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖として５’−ＧＣＡＣＵＣＣＡＧＧＧＣＵＵＣＡＵＣＧｔｔ−３’（配列番号２）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡ（ＲｅｌＡ）：転写因子ＲｅｌＡ遺伝子を標的として設計され、センス鎖として、５’−ＧＧＵＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＣＡＵＵｔｔ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖として５’−ＡＡＵＧＵＣＵＵＣＵＵＵＣＵＧＣＡＣＣｔｔ−３’（配列番号４）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）：ポル様キナーゼ１遺伝子を標的として設計され、センス鎖として、５’−ＡＧＡＵ（Ｍ）ＣＡＣＣＣＵ（Ｍ）ＣＣＵＵ（Ｍ）ＡＡＡＵ（Ｍ）−３’（配列番号５）、アンチセンス鎖として５’−ＵＡＵＵＵＡＡＧ（Ｍ）ＧＡＧＧＧＵＧＡＵ（Ｍ）ＣＵＵＵ−３’（配列番号６）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。【０１０６】
ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）：コントロール用として設計され、センス鎖として、５’−ＡＵＣＣＧＣＧＣＧＡＵＡＧＵＡＣＧＵＡｔｔ−３’（配列番号７）、アンチセンス鎖として５’−ＵＡＣＧＵＡＣＵＡＵＣＧＣＧＣＧＧＡＵｔｔ−３’（配列番号８）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ２）：コントロール用として設計され、センス鎖として、５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｔｔ−３’（配列番号９）、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｔｔ−３’（配列番号１０）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）：ルシフェラーゼ遺伝子を標的として設計され、センス鎖として、５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｔｔ−３’（配列番号１１）、アンチセンス鎖として５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧｔｔ−３’（配列番号１２）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。
ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）：コントロール用として設計され、アンチセンス鎖の５’末端に蛍光標識である６−カルボキシフルオレセイン［６ＦＡＭ］が付加されており、センス鎖として、５’−ＡＵＣＣＧＣＧＣＧＡＵＡＧＵＡＣＧＵＡｔｔ−３’（配列番号７）、アンチセンス鎖として５’−ＵＡＣＧＵＡＣＵＡＵＣＧＣＧＣＧＧＡＵｔｔ−３’（配列番号８）を用い、常法により２本鎖を形成させたｓｉＲＮＡである。【０１０７】
ここで、センス鎖５’末端へのＣｈｏｌの付加は、５’末端のヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分に、
式：  −Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）６−Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）−
で表される基を介して、Ｃｈｏｌの１つのヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分が、結合していることを意味する。なお、式中、カルボニル基の炭素原子がＣｈｏｌの１つのヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分に結合し、リン原子は、５’末端のヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分に結合する。
また、アンチセンス鎖５’末端への６ＦＡＭの付加は、５’末端のヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分に、
式：  −Ｐ（＝Ｏ）−Ｏ−（ＣＨ２）６−Ｎ（Ｈ）−
で表される基を介して、６ＦＡＭの１つのカルボキシ基からヒドロキシ基を取り除いた部分が、結合していることを意味する。なお、式中、窒素原子が６ＦＡＭの１つのカルボキシ基からヒドロキシ基を取り除いた部分に結合し、リン原子は、５’末端のヒドロキシ基から水素原子を取り除いた部分に結合する。【０１０８】
ＡＳＯ（Ｓｒｂ１）：スカベンジャー受容体クラスＢメンバー１遺伝子を標的として設計され、５’−Ｔ（Ｌ）＾５（Ｌ）＾ａ＾ｇ＾ｔ＾ｃ＾ａ＾ｔ＾ｇ＾ａ＾ｃ＾ｔ＾Ｔ（Ｌ）＾５（Ｌ）−３’（配列番号２１）であるアンチセンス核酸である。
ＨＤＯ（ＡｐｏＢ）：アポリポタンパクＢ遺伝子を標的として設計され、アンチセンス鎖として５’−Ｇ（Ｌ）＾５（Ｌ）＾ａ＾ｔ＾ｔ＾ｇ＾ｇ＾ｔ＾ａ＾ｔ＾Ｔ（Ｌ）＾５（Ｌ）＾Ａ（Ｌ）−３’（配列番号２２）、センスとして５’−Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｍ）＾ＡＵＡＣＣＡＡＵ＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）−３’（配列番号２３）を用い、常法により２本鎖を形成させた二本鎖オリゴヌクレオチド（ＨＤＯ）である。
ｓｓ−ＨＤＯ（ＡｐｏＢ）：アポリポタンパクＢ遺伝子を標的として設計され、５’−Ｕ（Ｍ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ａ（Ｍ）＾ＡＵＡＣＣＡＡＵＧＣＡＡＡＡＧ（Ｌ）＾５（Ｌ）＾ａ＾ｔ＾ｔ＾ｇ＾ｇ＾ｔ＾ａ＾ｔ＾Ｔ（Ｌ）＾５（Ｌ）＾Ａ（Ｌ）−３’（配列番号２４）であり、常法により分子内で２本鎖を形成させた、一本鎖オリゴヌクレオチドである。【０１０９】
ドセタキセル分析時の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、以下の条件で測定した。
ＨＰＬＣ条件例：
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、粒子径３．５μｍ
オーブン温度：３５℃
溶媒：アセトニトリルと０．１％酢酸ナトリウム水溶液の混合溶液
アセトニトリル：０．１％酢酸ナトリウム水溶液の比率（体積比）は、５分間は、５０：５０とし、その後１０分間は、９０：１０とした。
流速：１．０ｍＬ／分
検出波長：２３０ｎｍ【０１１０】
≪試験群Ａ−１：核酸送達用組成物の調製１≫
実施例１
ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）（９．６ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、５２８μＬを抜き出した（Ａ液）。ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド（配列番号１３）（４．０ｍｇ）を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１．６ｍＬ）に溶解して、７９８μＬ抜き出し、これに１００ｍＭジチオトレイトール（７５０μＬ）を混合した（Ｂ液）。Ｂ液にＡ液を混合して撹拌後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１６５０μＬ）で希釈し、遠心式フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、メンブレンＮＭＷＬ３，０００、メルクミリポア社製)を用いて、約９００μＬまで濃縮した。さらに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２４００μＬ）による希釈と濃縮を２回繰り返し、核酸送達用組成物を得た。
上記で得られた核酸送達用組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定したところ、２２ｎｍであった。【０１１１】
≪試験群Ａ−２：核酸送達用組成物の調製２≫
実施例２〜８
表１に記載のブロック型コポリマーとペプチド（配列番号１３〜１７）を用いて、実施例１と同様の方法により、核酸送達用組成物を得た。得られた核酸送達用組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果を、表１に示した。【０１１２】
【表１】
2019013255.tif 000003
【０１１３】
≪試験群Ａ−３：核酸送達用組成物の調製３≫
実施例９
ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）（９．６ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、５２．８μＬを抜き出した（Ａ液）。ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド（配列番号１３）（４．０ｍｇ）を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１．６ｍＬ）に溶解して、３９．４μＬ抜き出し、これに１００ｍＭのジチオトレイトール（３７．５μＬ）と１０ｍＭのＨＥＰＥＳの緩衝液（ｐＨ＝７．４，７７μＬ）を混合した（Ｂ液）。Ｂ液にＡ液を混合して撹拌後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１６５μＬ）で希釈し、遠心式フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、メンブレンＮＭＷＬ３，０００、メルクミリポア社製)を用いて、約１００μＬまで濃縮した。さらに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２４０μＬ）による希釈と濃縮を２回繰り返し、核酸送達用組成物を得た。
上記で得られた核酸送達用組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定したところ、２１ｎｍであった。【０１１４】
≪試験群Ｂ−１：核酸含有組成物の調製１≫
実施例１０
ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）（１５０μｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２２５０μＬ）で希釈した（Ｃ液）。実施例１にて得られた核酸送達用組成物に、Ｃ液を混合して撹拌することで、核酸含有組成物を得た。この場合は、Ｎ／Ｐ比は１０である。
上記で得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定したところ、２９ｎｍであった。【０１１５】
≪試験群Ｂ−２：核酸含有組成物の調製２≫
実施例１１〜１８
表２に記載のブロック型コポリマー及びペプチド（配列番号１３〜１６）を用いて、実施例１と同様の方法により、核酸送達用組成物を得た後、該核酸送達用組成物を用い実施例１０と同様の方法により、Ｎ／Ｐ比が１０の核酸含有組成物を得た。得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果を、表２に示した。【０１１６】
【表２】
2019013255.tif 000004
【０１１７】
≪試験群Ｂ−３：核酸含有組成物の調製３≫
実施例１９
ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）の代わりにｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を用いて、実施例１０と同様の方法により、Ｎ／Ｐ比が１０の核酸含有組成物を得た。
上記で得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（大塚電子、ＤＬＳ−７０００）を用い、動的光散乱法により質量平均粒径を測定したところ、２７ｎｍであった。【０１１８】
≪試験群Ｂ−４：核酸含有組成物の調製４≫
実施例２０〜２２
ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）の代わりに表３に記載のｓｉＲＮＡを用いて、実施例１０と同様の方法により、核酸含有組成物を得た。得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果を、表３に示した。【０１１９】
【表３】
2019013255.tif 000005
【０１２０】
表３から、ｓｉＲＮＡの配列を変えても、同程度の粒径の粒子が得られることが確認できた。【０１２１】
≪試験群Ｂ−５：核酸含有組成物の調製５≫
実施例２３〜２５
ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）（１０ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶液した（Ａ１液）。ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド（配列番号１３）（６．５ｍｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１．０ｍＬ）に溶解した（Ｂ１液）。ｓｉＲＮＡ（ＲｅｌＡ）（１．０ｍｇ）を水（１．０ｍＬ）に溶解した（Ｃ１液）。Ｂ１液とＣ１液を体積比１：１で混合すると、Ｎ／Ｐ比は５となる。前記体積比を２：１、４：１、又は６：１で混合すると、Ｎ／Ｐ比はそれぞれ、１０、２０、３０となる。
下記には、Ｎ／Ｐ比は１０の場合の核酸含有組成物の調製例を示す。Ａ１液（１５．６μＬ）をテトラヒドロフラン（４４．４μＬ）で希釈し、全体量を６０μＬとした（Ａ２液）。Ｂ１液（１０μＬ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１４０μＬ）で希釈し、全体量を１５０μＬとした（Ｂ２液）。Ｃ１液（５μＬ）を水（１４５μＬ）で希釈し、全体量を１５０μＬとした（Ｃ２液）。
Ｂ２液にＣ２液を混合し５秒間撹拌した後、Ａ２液を混合し撹拌した。遠心式フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、メンブレンＮＭＷＬ３，０００、メルクミリポア社製)を用いて、濃縮した。さらに、水（４８０μＬ）による希釈と濃縮を３回繰り返し、核酸送達用組成物を得た。これを、水で希釈し全体量を５００μＬとした。【０１２２】
同様に、Ｎ／Ｐ比が２０の場合は、Ａ１液（３１．２μＬ）とＢ１液（２０μＬ）を用いて調製し、Ｎ／Ｐ比が３０の場合は、Ａ１液（４６．８μＬ）とＢ１液（３０μＬ）を用いて調製した。
得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（大塚電子、ＤＬＳ−７０００）を用い、動的光散乱法により質量平均粒径を測定した結果を、表４に示した。【０１２３】
【表４】
2019013255.tif 000006
【０１２４】
≪試験群Ｂ−６：核酸含有組成物の調製６≫
実施例２６〜２７
ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）（５．０ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１ｍＬ）に溶解し、１８μＬ抜き出し、テトラヒドロフラン（６０μＬ）で希釈し、全体量を７８μＬとした（Ａ液）。表５に示した配列のペプチド（配列番号１８〜１９）（５．０ｍｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２．０ｍＬ）に溶解して、Ｎ／Ｐ比が１０となるように抜き出し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）で希釈し、全体量を１５０μＬとした（Ｂ液）。ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）（５０μｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１．０ｍＬ）で希釈した後、６０μＬ抜き出し、さらに１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，９０μＬ）で希釈し、全体量を１５０μＬとした（Ｃ液）。
Ｃ液にＢ液を混合し、５秒間撹拌した後、Ａ液を混合し撹拌した。これを１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，０．４ｍＬ）で希釈し、遠心式フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、メンブレンＮＭＷＬ３，０００、メルクミリポア社製)を用いて、濃縮した。さらに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，０．８ｍＬ）による希釈と濃縮を３回繰り返し、核酸送達用組成物を得た。これを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）で希釈し全体量を１．０ｍＬとした。
得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果を、表５に示した。【０１２５】
【表５】
2019013255.tif 000007
【０１２６】
≪試験群Ｂ−７：核酸含有組成物の調製７≫
実施例２８〜２９
ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）（１５μｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２２５μＬ）で希釈した（Ｃ液）。また、Ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）（１５．８μｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２２５μＬ）で希釈した（Ｄ液）。実施例９にて得られた核酸送達用組成物に、Ｃ液又はＤ液を混合し撹拌することで、核酸含有組成物を得た。この場合は、Ｎ／Ｐ比は５である。
上記で得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果を、表６に示した。【０１２７】
【表６】
2019013255.tif 000008
【０１２８】
≪試験群Ａ−４：核酸送達用組成物の調製４≫
実施例３０
実施例１のペプチドの代わりに表７のペプチド（配列番号２０）を用い、実施例１と同様の方法で、核酸送達用組成物を得た。得られた核酸送達用組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果を、表７に示した。【０１２９】
【表７】
2019013255.tif 000009
【０１３０】
≪試験群Ｂ−８：核酸含有組成物の調製８≫
実施例３１
実施例１の代わりに実施例３０で得られた核酸送達用組成物を用いて、実施例１０と同様の方法により、Ｎ／Ｐ比が１０の核酸含有組成物を得た。得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定したところ、２８ｎｍであった。【０１３１】
≪試験群Ｂ−９：核酸含有組成物の調製９≫
実施例３２〜３３
ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）（９．６ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、５２．８μＬを抜き出した（Ａ液）。ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド（配列番号１３）（４．０ｍｇ）を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１．６ｍＬ）に溶解して、３９．４μＬ抜き出し、これに１００ｍＭのジチオトレイトール水溶液（３７．５μＬ）と１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，７７μＬ）を混合した（Ｂ液）。ドセタキセル（５．０ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、１５．０μＬ又は、３０．０μＬを抜き出した（Ｃ液）。ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）（１５０μｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２２５０μＬ）で希釈した（Ｄ液）。
Ｂ液にＡ液とＣ液を順に混合し撹拌した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１６５μＬ）で希釈し、遠心式フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、メンブレンＮＭＷＬ３，０００、メルクミリポア社製)を用いて、約１００μＬまで濃縮した。さらに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２４０μＬ）による希釈と濃縮を２回繰り返し、ドセタキセル含有の核酸送達用組成物を得た。ここにＣ液を混合し撹拌することで、ドセタキセル含有の核酸含有組成物を得た。この場合は、Ｎ／Ｐ比は１０である。
上記で得られたドセタキセル含有の核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果と、ＨＰＬＣによる定量分析により算出したドセタキセルの内包量及び内包率を表８に示した。なお、内包率は、ドセタキセルの仕込み量（Ｃ液に含まれるドセタキセルの重量）に対する内包量を百分率で表した値である。【０１３２】
【表８】
2019013255.tif 000010
【０１３３】
≪試験群Ｂ−１０：核酸含有組成物の調製１０≫
実施例３４
ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）（９．６ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、５２．８μＬを抜き出した（Ａ液）。ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド（配列番号１３）（４．０ｍｇ）を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１．６ｍＬ）に溶解して、３９．４μＬ抜き出し、これに１００ｍＭのジチオトレイトール水溶液（３７．５μＬ）と１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，７７μＬ）を混合した（Ｂ液）。ドセタキセル（５．０ｍｇ）をテトラヒドロフラン（１．０ｍＬ）に溶解し、３０．０μＬを抜き出した（Ｃ液）。ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）（１５０μｇ）を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２２５０μＬ）で希釈した（Ｄ液）。
Ｂ液にＡ液とＣ液を順に混合し撹拌した後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，１６５μＬ）で希釈し、室温下２４時間静置することにより、テトラヒドロフランを自然蒸発させた。その後、遠心式フィルターユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、メンブレンＮＭＷＬ３，０００、メルクミリポア社製)を用いて、約１００μＬまで濃縮した。さらに、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４，２４０μＬ）による希釈と濃縮を２回繰り返すことで、ドセタキセル含有の核酸送達用組成物を得た。ここにＣ液を混合し撹拌することで、ドセタキセル含有の核酸含有組成物を得た。この場合は、Ｎ／Ｐ比は１０である。
上記で得られたドセタキセル含有の核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果と、ＨＰＬＣによる定量分析により算出したドセタキセルの内包量及び内包率を表９に示した。【０１３４】
【表９】
2019013255.tif 000011
【０１３５】
比較例１
文献（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．４５５，ｐ．４０−４７，２０１３）を参考に、ＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）と、ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド（配列番号１８）をコンジュゲーションして得られるポリマーを作製した。ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）をＮ／Ｐ比が１０となるように混合し、複合体を得た。
上記で得られた複合体を、光散乱粒子径測定装置（大塚電子、ＤＬＳ−７０００）を用い、動的光散乱法により質量平均粒径を測定したところ、８８ｎｍであった。【０１３６】
≪試験群Ｃ：インビトロ評価  細胞毒性≫
マウスマクロファージ株化様細胞ＲＡＷ２６４．７細胞１×１０５ 個をＤＭＥＭ （含１０％ ＦＢＳ、１００ Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）１０ ｍＬに懸濁し、細胞培養用フラスコに播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下にて培養した。培養したＲＡＷ２６４．７細胞（約８０％コンフルエント）をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液によりフラスコから剥離させ、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加し、２×１０５ 個／ｍＬの細胞懸濁液とした。これを９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、２４時間培養した。培地（ＦＢＳ（−））９０μＬに培地交換し、実施例１９及び比較例１で調製したサンプルを、１ウェルあたりｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）が１００ｎＭとなるように添加して（トランスフェクション）、３７ ℃、５％二酸化炭素条件下で４時間培養した。細胞の生存性をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（プロメガ社製）を用いて測定した。各群ｎ＝８で実施した。コントロール（水）を基準とした際の細胞生存率の平均値を、図１に示す。なお、図１中、「control」はコントロールを意味し、「Cell Viability」は、細胞生存率を意味し、エラーバーは、標準偏差を示す。
図１に示す通り、比較例１の複合体は細胞生存率が約６０％であったのに対し、本発明の核酸含有組成物は約８０％であり、低毒性であることが示された。【０１３７】
≪試験群Ｄ：インビトロ評価  細胞内取込み効率≫
マウスマクロファージ株化様細胞ＲＡＷ２６４．７細胞１×１０５ 個をＤＭＥＭ（含１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン) １０ ｍＬに懸濁し、細胞培養用フラスコに播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下にて培養した。培養したＲＡＷ２６４．７細胞（約８０％コンフルエント）をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液によりフラスコから剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加し、１×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液とした。これを２４ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、２４時間培養した。ＦＢＳ（−）の培地９００μＬに交換し、実施例２３〜２５と同様の方法でＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を内包した各サンプル（Ｎ／Ｐ比が１０、２０、３０）を、１ウェルあたりＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）が１００ｎＭとなるように添加して（トランスフェクション）、３７℃、５％二酸化炭素条件下で６時間培養した。トランスフェクション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を３００μＬ加え３７℃、５％二酸化炭素条件下で５分間培養した。培地（ＦＢＳ（＋）：前記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）７００μＬを加え細胞を剥離した後、剥離した細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに回収し、遠心分離後、上清を吸引し、ＰＢＳ（１ｍＬ）で１回洗浄して遠心分離した。上清を吸引除去後、ＰＢＳ（５００μＬ）を加え、２００メッシュのナイロン網でろ過し細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液についてＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定し、細胞への取り込み効率を評価した。前方散乱光に対して側方散乱光を表示したプロット上で、細胞集団にゲートをかけ、目的細胞群のコントロールにおける蛍光強度に対する細胞数のプロットで、９５％の細胞が含まれる範囲をＰ１領域とし、それよりも蛍光強度の強い範囲をＰ２領域とした。ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）が細胞に取り込まれるとＰ２領域の細胞数が増大するため、細胞集団のＰ２領域に含まれる細胞の割合をＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）の細胞への取り込み量の指標とした。【０１３８】
コントロールとして、トランスフェクション時に、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系と、遺伝子又は核酸導入試薬を含むキットである、ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（登録商標）ＥＸ Ｏｌｉｇｏ（北海道システム・サイエンス（株）製）を用いて、当該キットのプロトコールに従った系を、同時に実施した。【０１３９】
各群ｎ＝８で実施した。結果を図２に示す。なお、図２中、「siRNA only」は、前記ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系を意味し、「LipoTrust」は、前記ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（登録商標）ＥＸ Ｏｌｉｇｏを用いて当該キットのプロトコールに従った系を、「Ｃｅｌｌ  Ｕｐｔａｋｅ」は、細胞導入率を、「Ｕｐｔａｋｅ」は導入率を意味する。図２では、導入率の平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ群と比較したＰ値（Ｄｕｎｎｅｔｔテスト）を＊の数で示し、＊はＰ＜０．００１である。
図２に示す通り、本発明の核酸含有組成物においては、トランスフェクション６時間で細胞内取り込みはいずれも８０％を超え、細胞内導入能は十分であることが認められた。【０１４０】
≪試験群Ｅ：インビトロ評価  マクロファージを用いた炎症性サイトカインの産生抑制効果≫
マウスマクロファージ株化様細胞ＲＡＷ２６４．７細胞１×１０５ 個を（含１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン) １０ ｍＬに懸濁し、細胞培養用フラスコに播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下にて培養した。培養したＲＡＷ２６４．７細胞（約８０％コンフルエント）をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液によりフラスコから剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加し、１×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液とした。これを２４ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、２４時間培養した。ＦＢＳ（−）の培地９００μＬに交換し、実施例２３〜２５と同じ方法で調製した各サンプル（Ｎ／Ｐ比は１０、２０又は３０）を、１ウェルあたりｓｉＲＮＡ（ＲｅｌＡ）が０．５μｇとなるように添加して（トランスフェクション）、３７℃、５％二酸化炭素条件下で６時間培養した。トランスフェクションした細胞をＰＢＳで２回洗浄し、培地（ＦＢＳ（−））を１ウェルあたり１０００μＬずつ加えて３７℃、５％二酸化炭素条件下で１８時間培養した。さらに、ＰＢＳで２回洗浄し、培地（ＦＢＳ（＋）：前記１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）を１ウェルあたり９００μＬずつ加えて、ＬＰＳ水溶液 (２μｇ／ｍｌ）１００μＬを添加し、３７℃、５％二酸化炭素条件下で８時間培養した。前記ＬＰＳ刺激８時間後に、培地上清を回収し、サンプルとした。使用時まで−４０℃で保存した。これを原液のまま用いて腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）によって測定した。なお、ＥＬＩＳＡによる測定は前記キットのプロトコールに従って行った。【０１４１】
比較例として、上述のトランスフェクション及びＬＰＳ刺激を行わず、代わりに水を添加した系（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と、トランスフェクションを行わず代わりに水を添加した系（ＬＰＳのみ）と、トランスフェクション時に、ｓｉＲＮＡ（ＲｅｌＡ）を単独で添加した系（ｓｉＲＮＡのみ）を、同時に実施した。【０１４２】
各群ｎ＝８で実施した。ＴＮＦ−αの産生量を図３Ａに、ＩＬ−６の産生量を図３Ｂに示す。なお、図３Ａ及び図３Ｂ中、「control」は、前記Ｃｏｎｔｒｏｌの系を、「LPS only」は、前記ＬＰＳのみの系を、「siRNA only」は、前記ｓｉＲＮＡのみの系を意味する。図３Ａ及び図３Ｂには、平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。ＬＰＳのみの群と比較したＰ値（Ｄｕｎｎｅｔｔテスト）を＊の数で示し、＊はＰ＜０．００１である。
図３Ａ及び図３Ｂに示す通り、本発明の核酸含有組成物は、ＬＰＳのみの場合とｓｉＲＮＡのみの場合に比較して有意に炎症性サイトカインの産生を抑制した。【０１４３】
≪試験群Ｆ：インビボ評価  ＣＩＡマウスの関節炎治療効果≫
Ｆ−１：ＣＩＡ（コラーゲン誘発関節炎）マウスの作製
氷冷下にて、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）へ、等量のII型コラーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を滴下しながらホモジナイズしエマルジョンを調製した。同様に、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ)へ、等量のII型コラーゲン溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を滴下しながらホモジナイズしエマルジョンを調製した。調製したエマルジョンは、水面に滴下しても球体を維持することでｗ／ｏ型エマルジョンを形成したことを確認して実験に用いた。
８週令雄性ＤＢＡ/１Ｊマウスを用い、ＣＩＡマウスを作製した。以下にＣＩＡ マウス作製のスケジュールを示す。−２１日目に調製したII型コラーゲンとＣＦＡから得られたエマルジョン１００μＬを、尾根部に皮内投与し、初回免疫誘導を行った。０日目に調製したII型コラーゲンとＩＦＡから得られたエマルジョン１００μＬを同様に皮内投与し、追加で免疫誘導した。この際に、皮内投与が確実に行われたことを投与部位が白く隆起したことで確認した。【０１４４】
Ｆ−２：核酸含有組成物の投与と薬理効果
実施例２４と同様の方法で作製した、ｓｉＲＮＡ（ＲｅｌＡ）の核酸含有組成物（Ｎ／Ｐ比が２０）を、上述のＦ−１に示したＣＩＡマウスに対し、−１、１、５、９日目に、１個体あたりのｓｉＲＮＡ（ＲｅｌＡ）の投与量が２０μｇ／日となるように尾静脈内投与を行い、１５日目まで観察した（各群ｎ＝５で実施した）。
コントロールとして、生理食塩水を尾静脈内投与した系（Non-treated CIA mice）、ｓｉＲＮＡ（ＲｅｌＡ）を単独で尾静脈内投与した系（ｓｉＲＮＡ  ｏｎｌｙ）、メトトレキサート９０μｇを含有したメトトレキサート溶液（メトトレキサート１．０８ｍｇを７５μＬのＮａＯＨ水溶液（０．１Ｍ）と、生理食塩水２３２５μＬに溶解した溶液から、２００μＬを使用）を腹腔内投与した系（ＭＴＸ）を同時に実施した。また、コラーゲン誘発を行わない、かつ薬剤の投与を行わないＤＢＡ／１Ｊマウスを正常マウス群（normal mice）とした（各群ｎ＝５で実施した）。
薬理効果の指標として、後肢踝関節部位の肥厚と下記臨床スコアを用いた。
後肢踝関節部位の肥厚は、マイクロメーターを用いて測定した。初回免疫後から、週2-3回測定を行った。
臨床スコアは下記の様に算出した。
前肢：指一本が腫れるにあたって０．５ポイントを加算。前肢全体が腫れるにあたって１ポイントを加算。したがって、前肢における最大臨床スコアは３ポイントとする。  
後肢：指一本が腫れるにあたって０．５ポイントを加算。後肢全体が腫れるにあたって１ポイントを加算。後肢を引きずりながら歩く行動に対し１ポイントを加算。したがって、後肢における最大臨床スコアは４．５ポイントとする。
以上より、一匹当たりの最大臨床スコアは１５ポイントとなる。【０１４５】
後肢の肥厚増加率を図４に、臨床スコアを図５に示す。なお、図４中、「percentage increase of paw thickness」は、後肢肥厚増加率（％）を意味し、図５中、「Clinical score」は、臨床スコアを意味する。図４及び図５では、平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。実施例２４投与群と比較したＰ値（Ｄｕｎｎｅｔｔテスト）を＊の数で示し、＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０２であり、＊＊＊はＰ＜０．０１であり、＊＊＊＊はＰ＜０．００２である。
図４に示す通り、未治療、ｓｉＲＮＡのみ、ＭＴＸ投与群において、後肢の肥厚の増加が認められた。一方で本発明の核酸含有組成物を投与した群においては、肥厚はほとんど確認されなかった。
図５に示す通り、未治療、ｓｉＲＮＡのみ、ＭＴＸ投与群において、臨床スコアは顕著な増加が認められた。一方で本発明の核酸含有組成物を投与した群においては、臨床スコアの増加は僅かであった。【０１４６】
Ｆ−３：四肢組織における標的分子ＲｅｌＡのサイレンシング効果及び炎症性サイトカイン産生抑制効果
上記１５日目においてマウスを麻酔後に安楽死させ、四肢の組織を回収した。この組織は使用時まで−４０℃で保存した。組織には、組織１ｇ当たり１０ｍＬのＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを加えて、可能な限り細断し、氷冷下で均質化（ホモジナイズ）した。このホモジナイズされた懸濁液を遠心分離し、上清を回収した。この上清は使用時まで−４０℃で保存した。前記上清を原液のまま用いて、組織１g当たりの、標的分子であるＲｅｌＡの産生量と、炎症性のサイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生量をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）によって測定した。なお、ＥＬＩＳＡによる測定は前記キットのプロトコールに従って行った。各群ｎ＝５で実施した。【０１４７】
ＲｅｌＡの産生量を図６に、ＴＮＦ−αの産生量を図７に、ＩＬ−６の産生量を図８に示す。図６から図８には、平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示し、実施例２４投与群と比較したＰ値（Ｄｕｎｎｅｔｔテスト）を＊の数で示す。図６中、＊＊はＰ＜０．０１であり、＊はＰ＜０．００５である。図７及び図８中、＊＊はＰ＜０．００５であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００２であり、＊＊＊＊はＰ＜０．００１である。
図６に示す通り、未治療、ｓｉＲＮＡのみの群、ＭＴＸ投与群に比較して、本発明の核酸含有組成物を投与した群はＲｅｌＡの産生を顕著に抑制した。したがって、本発明の核酸含有組成物は、全身投与によって炎症部位に到達後、免疫担当細胞に取り込まれ、ＲＮＡ干渉を発揮したことが示唆された。
図７及び図８に示す通り、未治療、ｓｉＲＮＡのみ、ＭＴＸ投与群に比較して、本発明の核酸含有組成物を投与した群は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生量を、有意に抑制した。また、正常マウスとの比較においても、同等の産生量となった。
これら結果より、関節リウマチの病態形成において中心的な役割を担う二つの炎症性サイトカインの産生を、本発明の核酸含有組成物を投与することで顕著に抑制可能であることが示された。さらに、この抑制効果は現在の関節リウマチ治療薬におけるアンカードラッグであるメトトレキサート（ＭＴＸ）よりも高いことが示された。【０１４８】
≪試験群Ｇ−１：インビボ評価  膵臓癌細胞皮下移植マウスの抗腫瘍効果（１）≫
６週齢の雄性ＢＡＬＢ/ｃ−ｎｕマウスの皮下に膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）を５×１０６個／１００μｌを移植した。がん腫瘤が平均として約１００ｍｍ３となった日（移植から１９日目）を治療０日目として、０、３、８、１１、１４、１７日目に、各マウスにｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）の投与量が１個体あたり２５μｇ／日となるように、実施例２０で調製したサンプルを尾静脈投与した。その後、２９日目まで観察した（各群ｎ＝４で実施した）。
コントロールとして、１０％ＨＥＰＥＳ緩衝液を尾静脈内投与したマウス（ＨＥＰＥＳ）を、同時に観察した（各群ｎ＝４で実施した）。【０１４９】
投与開始後の腫瘍体積の変化を図９に、体重の変化を図１０に示す。 なお、図９及び又は図１０中「Tumor volume」は腫瘍体積を意味し、「Body Weight」は体重を意味し、「days」は日数を意味する。図９及び図１０には、平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。図１０中、実施例２０投与群と比較したＰ値（Ｓｔｕｄｅｎｔテスト）を＊の数で示し、＊＊＊はＰ＜０．００１である。
図９に示すように、ＨＥＰＥＳを投与した群に比べて、本発明の核酸含有組成物を投与した群では、腫瘍体積の増加が大幅に抑制されており、顕著な抗腫瘍効果が確認された。また、図１０に示されるように、マウスの体重の変化について、ＨＥＰＥＳを投与した群と本発明の核酸含有組成物を投与した群で、差は認められなかったため、本発明の核酸含有組成物の毒性は低いことが示された。【０１５０】
≪試験群Ｇ−２：インビボ評価  膵臓癌細胞皮下移植マウスの抗腫瘍効果（２）≫
６週齢の雄性ＢＡＬＢ/ｃ−ｎｕマウスの皮下に膵臓癌細胞（ＢｘＰＣ−３）を５×１０６個／１００μｌを移植した。がん腫瘤が平均として約１００ｍｍ３となった日（移植から１６日目）を治療０日目として、０、４、７、１０、１３、１７、２０、２４、２８日目に、各マウスにｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）の投与量が２５μｇとなるように、実施例２０で調製したサンプルを尾静脈投与した。その後、３８日目まで観察した（各群ｎ＝５で実施した）。
コントロールとして、１０％ＨＥＰＥＳ緩衝液を尾静脈内投与したマウス（ＨＥＰＥＳ）を同時に実施した（Ｎ＝４）。さらにコントロールとして、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）の代わりにｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を用い、実施例２０に記載の方法で調製したサンプルを尾静脈投与したマウス（ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ））も同時に観察した（各群ｎ＝５で実施した）。
また、３８日目に、ｓｉＲＮＡ（Ｐｌｋ１）投与群とＨＥＰＥＳ投与群に関して、定法に従って血液生化学的検査を実施した。【０１５１】
投与開始後の腫瘍体積の変化を図１１に、体重の変化を図１２に、血液生化学的検査の結果を表１０に示す。 なお、図１１及び図１２中「Tumor volume」は腫瘍体積を意味し、「Body Weight」は体重を意味し、「days」は日数を意味する。図１１及び図１２には、平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。実施例２０投与群と比較したＰ値（Ｗｉｌｃｏｘｏｎテスト）を＊の数で示し、＊はＰ＜０．００１である。表１０の各項目は、平均値±標準偏差として示した。
【表１０】
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【０１５２】
図１１に示すように、ＨＥＰＥＳやｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を投与した群に比べて、本発明の核酸含有組成物を投与した群では、腫瘍体積の増加が大幅に抑制されており、顕著な抗腫瘍効果が確認された。また、ＨＥＰＥＳを投与した群とｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ）を投与した群では、抗腫瘍効果における差が見られないため、本抗腫瘍効果はＰｌｋ１のノックダウンに由来することが示唆された。図１２及び表１０に示されるように、マウスの体重の変化、血液生化学的検査における各パラメータについて、各群で差は認められなかったため、本発明の核酸含有組成物の毒性は低いことが示された。【０１５３】
≪試験群Ｈ：インビトロ評価  スフェロイド浸透性≫
ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞Ａ５４９細胞１×１０５ 個をＤＭＥＭ（含１０％ ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００Ｕ／ｍＬストレプトマイシン) １０ ｍＬに懸濁し、細胞培養用フラスコに播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下にて培養した。培養したＡ５４９細胞（約８０％コンフルエント）をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液によりフラスコから剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加し、１×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液とした。これをスフェロイド用９６ ウェルプレート (ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅＴＭ  ＭＳ-９０９６Ｕ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ、住友ベークライト) に２．０×１０４個／ウェルで播種し、４日間培養することでＡ５４９凝集塊（スフェロイド）を作製した。培養した各ウェル中のＡ５４９スフェロイドの培地を５０μＬ除去し、実施例２３及び２５と同様の方法でＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を内包した各サンプル（Ｎ／Ｐ比が１０、又は３０）を、１ウェルあたりＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）が２００ｎＭとなるように添加して（トランスフェクション）、３７℃、５％二酸化炭素条件下で１０時間培養した。溶液を除去し、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を１００μＬ／ウェルで添加し１０分間反応させ、スフェロイドを固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、水２００μＬに置換した後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００ＤＩＸ８１、オリンパス）において、スフェロイド表面から２００ μｍの位置の断面を撮影した。【０１５４】
コントロールとして、トランスフェクション時に、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系と、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）とＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチドをＮ／Ｐ比が１０又は３０で混合した複合体を添加した系を同時に実施した。【０１５５】
結果を図１３に示す。なお、図１３中、「siRNA only」は、前記ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系を意味し、「siRNA+peptide」は、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）とＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチドを混合した複合体を添加した系を意味し、「siRNA+peptide+MPEG-PCL」は本発明の核酸含有組成物（前記ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）、ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド及びＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）を混合した複合体（実施例２３又は２５と同様））を添加した系を意味する。【０１５６】
図１３に示す通り、ｓｉＲＮＡ単独及びｓｉＲＮＡとのペプチドの複合体（Ｎ／Ｐ比が１０）では、スフェロイドへの浸透性は低いことが示された。また、ｓｉＲＮＡとペプチドとの複合体（Ｎ／Ｐ比が３０）においては、スフェロイドの崩壊が観察され、高い細胞毒性が示唆された。一方で、本発明の核酸含有組成物は、いずれのＮ／Ｐ比においても、スフェロイドへの高い浸透性を示し、またスフェロイドの崩壊も無かった。【０１５７】
≪試験群Ｂ−１０：核酸含有組成物の調製１０≫
実施例３５〜３７
ｓｉＲＮＡ（ＶＥＧＦ）の代わりに表１１に記載の核酸を用いて、実施例１０と同様の方法により、核酸含有組成物を得た。得られた核酸含有組成物中の粒子について、光散乱粒子径測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）を用い、動的光散乱法によりキュムラント平均粒径を測定した結果を、表１１に示した。【０１５８】
【表１１】
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【０１５９】
≪試験群Ｈ−２：インビトロ評価  スフェロイド浸透性２≫
マウス乳癌細胞４Ｔ１細胞１×１０５ 個をＲＰＭＩ１６４０培地（含１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン）１０ ｍＬに懸濁し、細胞培養用フラスコに播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下にて培養した。培養した４Ｔ１細胞（約８０％コンフルエント）をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液によりフラスコから剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を添加し、１×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液とした。これをスフェロイド用９６ ウェルプレート (ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅＴＭ  ＭＳ-９０９６Ｕ ９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ、住友ベークライト) に１．０×１０４個／１００μＬ／ウェルで播種し、３日間培養することで４Ｔ１凝集塊（スフェロイド）を作製した。培養した各ウェル中の４Ｔ１スフェロイドの培地を５０μＬ除去し、実施例１０と同様の方法でＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を内包した各サンプル（Ｎ／Ｐ比が１０）を、１ウェルあたりＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）が１００ｎＭとなるように添加して（トランスフェクション）、３７℃、５％二酸化炭素条件下で６時間培養した。溶液を除去し、４％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液を９０μＬ／ウェルで添加し３０分間反応させ、スフェロイドを固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、水２００μＬに置換した後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００ＤＩＸ８１、オリンパス）において、スフェロイド表面から８０ μｍの位置の断面を撮影した。【０１６０】
コントロールとして、トランスフェクション時に、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系を同時に実施した。【０１６１】
結果を図１４に示す。なお、図１４中、「siRNA only」は、前記ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系を意味し、「siRNA+peptide+MPEG-PCL」は本発明の核酸含有組成物（前記ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）、ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド及びＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）を混合した複合体（実施例１０と同様））を添加した系を意味する。【０１６２】
図１４に示す通り、ｓｉＲＮＡ単独では、スフェロイドへの浸透性は低いことが示された。一方で、本発明の核酸含有組成物は、スフェロイドへの高い浸透性を示した。【０１６３】
≪試験群Ｄ−２：インビトロ評価  細胞内取込み効率２≫
マウス乳癌細胞４Ｔ１細胞１×１０５ 個をＲＰＭＩ１６４０培地（含１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン）１０ ｍＬに懸濁し、細胞培養用フラスコに播種し、３７℃、５％二酸化炭素条件下にて培養した。培養した４Ｔ１細胞（約８０％コンフルエント）をＰＢＳで２回洗浄後、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液によりフラスコから剥離させ、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、１×１０５個／ｍＬの細胞懸濁液とした。これを２４ウェルプレートに１ｍＬずつ播種し、２４時間培養後ＰＢＳで２回洗浄した。その後、ＦＢＳ（−）のＲＰＭＩ１６４０培地９００μＬに交換し、実施例１０と同様の方法でＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を内包した各サンプル（Ｎ／Ｐ比が１０）を、１ウェルあたりＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）が１００ｎＭとなるように添加して（トランスフェクション）、３７℃、５％二酸化炭素条件下で６時間培養した。トランスフェクション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液を３００μＬ加え３７℃、５％二酸化炭素条件下で５分間培養した。培地（ＦＢＳ（＋）：前記１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０）７００μＬを加え細胞を剥離した後、剥離した細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに回収し、遠心分離後、上清を吸引し、ＰＢＳ（１ｍＬ）で１回洗浄して遠心分離した。上清を吸引除去後、ＰＢＳ（５００μＬ）を加え、２００メッシュのナイロン網でろ過し細胞懸濁液を回収した。この細胞懸濁液についてＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて測定し、細胞への取り込み効率を評価した。前方散乱光に対して側方散乱光を表示したプロット上で、細胞集団にゲートをかけ、目的細胞群のコントロールにおける蛍光強度に対する細胞数のプロットで、９５％の細胞が含まれる範囲をＰ１領域とし、それよりも蛍光強度の強い範囲をＰ２領域とした。ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）が細胞に取り込まれるとＰ２領域の細胞数が増大するため、細胞集団のＰ２領域に含まれる細胞の割合をＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）の細胞への取り込み量の指標とした。【０１６４】
コントロールとして、トランスフェクション時に、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系と、遺伝子又は核酸導入試薬を含むキットである、ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（登録商標）ＥＸ Ｏｌｉｇｏ（北海道システム・サイエンス（株）製）を用いて、当該キットのプロトコールに従った系を、同時に実施した。【０１６５】
各群ｎ＝８で実施した。結果を図１５に示す。なお、図１５中、「siRNA only」は、前記ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）を単独で添加した系を意味し、「LipoTrust」は、前記ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（登録商標）ＥＸ Ｏｌｉｇｏを用いて当該キットのプロトコールに従った系を、「siRNA+peptide+MPEG-PCL」は本発明の核酸含有組成物（前記ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（Ｃｏｎｔ１）、ＳＴＲ−ＣＨＨＲＲＲＲＨＨＣで表される配列のペプチド及びＭＰＥＧ−ＰＣＬ（２０００−２０００）を混合した複合体（実施例１０と同様））を添加した系を、「Ｃｅｌｌ  Ｕｐｔａｋｅ」は、細胞導入率を、「Ｕｐｔａｋｅ」は導入率を意味する。図１５では、導入率の平均値を示し、エラーバーは、標準偏差を示す。ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ群と比較したＰ値（Ｄｕｎｎｅｔｔテスト）を＊の数で示し、＊はＰ＜０．００１である。
図１５に示す通り、本発明の核酸含有組成物においては、トランスフェクション６時間で細胞内取り込みはおよそ８０％であり、細胞内導入能は十分であることが認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明によれば、細胞毒性が低く、高い治療有効性を実現する、核酸送達用組成物及び核酸含有医薬組成物が提供される。かかる組成物は、例えば、治療用の医薬組成物として使用でき、その産業上の価値は極めて大きく、疾病の原因分子を制御して、治療効果を得るための核酸医薬治療剤を提供することができる。【０１６７】
日本国特許出願２０１７−１３５５４７（出願日：２０１７年７月１１日）の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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