(57)【要約】  全く新しい作用機序による、ヒトに対する副作用の少ない抗真菌薬の開発手段の提供。  抗真菌活性を有する被験物質をＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗真菌活性を有する被験物質をＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含む培地で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する被験物質を選択し、選択された被験物質を、ステロールを含む培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含まない培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２５を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含む培地で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する被験物質を選択し、選択された被験物質を、ＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
抗真菌活性を有する被験物質が、真菌生育阻害作用によって選択された被験物質である請求項１〜４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
Ｅｒｇ１１の活性が阻害された状態が、被験物質とアゾール系抗真菌物質とを併用した評価系である請求項１〜５のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６の機能を阻害する物質を有効成分とする抗真菌薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しい作用機序を有する抗真菌薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
深在性真菌感染症では、免疫抑制剤、抗癌剤、加齢、ＡＩＤＳ、重度糖尿病等により、易感染状態になった患者に対して肝臓、腎臓、肺などに重篤な日和見感染症を発症する。日本国内では真菌症対策の重要性が認識されていないが、世界的には患者数が、２００万人／年以上に及び、そのうち２０−８０％が死亡しており（非特許文献１）、国内においても、患者数は約２万人／年で、このうち２０−５０％が死亡と推定されている（非特許文献２）。さらに、多剤耐性真菌Ｃａｎｄｉｄａ  ａｕｒｅｓの出現によりパンデミックの可能性が危惧されており、ＮＩＨのＧｒａｎｔ動向２０１４−２０１６年、疾患別研究対象において、感染症研究ではＨＩＶ感染症と並んでカンジダ感染症がトップ１０に含まれている（非特許文献１）。【０００３】
現在使用されている抗真菌薬としては、核酸合成阻害剤である５−フルオロシトシン、細胞壁合成酵素阻害剤であるキャンディン系抗真菌薬、エルゴステロール結合剤であるアムホテリシンＢ等のポリエン系抗真菌薬、エルゴステロール合成酵素Ｅｒｇ１１阻害剤であるアゾール系抗真菌薬が挙げられる。これらの抗真菌薬のうち、５−フルオロシトシンは腎障害の副作用が多く、また耐性菌も出現している。キャンディン系抗真菌薬は、非水溶性であり使用が制限され、また耐性菌も増加している。ポリエン系抗真菌薬は、非水溶性で使用が制限されるとともに強い腎障害の副作用がある。またアゾール系抗真菌薬は最も広く使用されている抗真菌薬であるが、最近耐性菌が増加している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｄｒｕｇｓ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｇｌｏｂａｌ  ｍａｒｋｅｔｓ，Ｐａｕｌ  Ｔａｙｌｏｒ  ２０１７
【非特許文献２】国立感染研、宮崎義継ら、日本医真菌学会総会（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、全く新しい作用機序による、ヒトに対する副作用の少ない抗真菌薬の開発手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
真菌は分子系統学的にヒトを含めた後生動物に近縁な生物であり、標的分子の類似度がヒトと真菌の間で高いために、薬効が高く副作用の少ない薬剤の開発が難しい。また、真菌感染症に対して早期診断・早期治療が重要であるが、感染初期における菌種の迅速同定が困難であり、菌種を同定せずとも投与が可能な広域性抗真菌薬の開発が求められている。そこで、本発明者は抗真菌薬の標的として、（１）真菌に必須分子であること、（２）病原真菌に共通であること、（３）ヒトの遺伝子に類似度が低いことを条件に抗真菌薬の標的分子を検討した。【０００７】
エルゴステロールは、真菌の細胞膜必須構成成分であり、最も一般的な抗真菌薬であるアゾール系抗真菌薬はエルゴステロール合成経路中の酵素１４−αラノステロールジメチレラーゼ（Ｅｒｇ１１）を標的としている（表１）。本発明者は、スクアレンを基質としたエルゴステロール合成経路の１２遺伝子中５遺伝子、ＥＲＧ１（Ｅｒｇ１をコードする遺伝子）、ＥＲＧ７（Ｅｒｇ７をコードする遺伝子）、ＥＲＧ１１（Ｅｒｇ１１をコードする遺伝子）、ＥＲＧ２５（Ｅｒｇ２５をコードする遺伝子）、ＥＲＧ２６（Ｅｒｇ２６をコードする遺伝子）が生育必須遺伝子であることを同定した。このうち３遺伝子、ＥＲＧ７、ＥＲＧ２５、ＥＲＧ２６は既存抗真菌薬の標的ではなく新規標的の可能性があるが、ＥＲＧ７はヒト遺伝子にも相同性が高いために標的としては適切ではないと判断した。一方で、ＥＲＧ２５及びＥＲＧ２６はヒト遺伝子に対して相同性が低かったため、安全性が高いと判断した。次に真菌類での共通性について、ＥＲＧ２５は優れているが、ＥＲＧ２６はやや低いという結果が得られ、新しい抗真菌薬の標的としてＥＲＧ２５が最も優れており、次にＥＲＧ２６が優れた標的であると考えられた。【０００８】
【表１】
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【０００９】
また、アゾール系抗真菌薬耐性化メカニズムの一つとして、宿主の血清に含まれるコレステロールを真菌の細胞が取り込み、エルゴステロールの代替品として利用することが知られている。本発明者は、ＥＲＧ１１ノックダウン株において、血清コレステロールが利用される一方で、ＥＲＧ２５ノックダウン株及びＥＲＧ２６ノックダウン株では、コレステロールの取り込みが起きずに生育阻止に至ることを見出した。更にその原因が、ステロール取り込みポンプの局在に異常を来し、細胞膜上ではなく、細胞質中へ移行したためであるということを突き止めた。この結果より、アゾール系抗真菌薬と比較してＥｒｇ２５ならびにＥｒｇ２６に対する阻害剤は、低感受性株や耐性株の出現が低いことが期待できるという結論に至った。そしてさらに検討したところ、ＥＲＧ２５又はＥＲＧ２６ノックダウン株は、生育阻止が起こるが、全く意外にもＥｒｇ１１阻害剤であるアゾール系抗真菌薬と併用し、血清、胆汁、コレステロール、エルゴステロールなどのステロールを含んだ培地では良好な生育を示すことを見出した。しかし、Ｅｒｇ１１阻害剤であるアゾール系抗真菌薬と併用した培地で、血清、胆汁、コレステロール、エルゴステロールなどのステロールを含まない培地では、ＥＲＧ２５ノックダウン株は生育し、ＥＲＧ２６ノックダウン株は生育しないことを見出した（図２）。かかる知見に基いて、抗真菌活性を示す物質をスクリーニングしておき、当該物質をＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態、例えば当該物質とアゾール系抗真菌物質とを併用し、ステロールを含む培地やステロールを含まない培地で生育状態を評価し、生育する物質を選択すれば、Ｅｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする新たな抗真菌薬がスクリーニングできることを見出した。また、抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含む培地で真菌に対する作用を評価して生育を阻害する物質を選択し、さらに選択された被験物質がＥＲＧ１１の発現が阻害された状態で生育することができなければ、ＥＲＧ２６を標的とする新たな抗菌薬がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
従って、本発明は、次の〔１〕〜〔７〕を提供するものである。【００１１】
〔１〕抗真菌活性を有する被験物質をＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
〔２〕抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含む培地で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する被験物質を選択し、ステロールを含む培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
〔３〕抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含まない培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２５を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
〔４〕抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含む培地で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する被験物質を選択し、選択された被験物質を、ステロールを含まない培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する物質を選択することを特徴とする、真菌のＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法。
〔５〕抗真菌活性を有する被験物質が、真菌生育阻害作用によって選択された被験物質である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔６〕Ｅｒｇ１１の活性が阻害された状態が、被験物質とアゾール系抗真菌物質とを併用した評価系である〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のスクリーニング方法。
〔７〕真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６の機能を阻害する物質を有効成分とする抗真菌薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のスクリーニング方法によれば、Ｅｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的として特異的にこれらの標的の機能を阻害する抗真菌薬が選択できる。得られた抗真菌薬は、Ｅｒｇ２５又はＥｒｇ２６が真菌の生育必須成分であり、これらの標的が真菌に共通して存在しているが、ヒトとの類似性が極めて低いことから、安全性が高く、真菌に特異的に作用するものである。また、Ｅｒｇ２５及びＥｒｇ２６は、Ｅｒｇ１１のようにコレステロール代替性がないことから耐性も生じにくい。従って、Ｅｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする物質を有効成分とする抗真菌薬は、安全性も高く、耐性の生じにくい抗真菌薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】カンジダ・グラブラータでのエルゴステロール合成経路における生育必須遺伝子判定に用いるＴｅｔＯＦＦシステムを示す。
【図２】エルゴステロール合成経路における生育必須遺伝子ノックダウン時における血清とフルコナゾールの影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法は、抗真菌活性を有する被験物質をＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする。
本発明のスクリーニング方法は、Ｅｒｇ２５を分子標的とする場合とＥｒｇ２６を分子標的とする場合が含まれ、具体的には以下の態様が好ましい。
本発明の真菌のＥｒｇ２５を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法は、抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含まない培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする。
また、本発明の真菌のＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング法は、抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含む培地で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する被験物質を選択し、選択された被験物質を、コレステロールを含まない培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する物質を選択することを特徴とする。
本発明の真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法は、抗真菌活性を有する被験物質を、ステロールを含む培地で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌の生育を阻害する被験物質を選択し、選択された被験物質をステロールを含む培地でＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価し、真菌を生育させる物質を選択することを特徴とする。
【００１５】
本発明に用いられる被験物質は、抗真菌活性を有する被験物質である。このような被験物質は、通常の真菌生育阻害作用を有するか否かによって選択された物質である。
本発明において、阻害とは、発現、活性、増殖速度等が減少することを指す。
真菌の生育阻害作用は、一般的な抗真菌活性評価方法で評価できる。その方法としては、真菌を、被験物質を含有し、ステロールを含まない培地上で培養し、当該被験物質が真菌の生育を阻止できるか否かを評価する方法が挙げられる。ステロールとしては、コレステロール、エルゴステロール等が挙げられる。また、これらのステロールは、血清、胆汁に含まれているので、ステロールを含まない培地としては、血清や胆汁を含まない培地が挙げられる。
なお、薬剤排出ポンプ阻害剤等のそれ自体に抗真菌活性を有さない薬剤との併用で抗真菌活性を発揮する物質も、抗真菌活性を有する被験物質に含む。
【００１６】
具体的な真菌の生育阻止試験法としては、例えばペーパーディスク法（ハローテスト）及びＭＩＣ法（生育阻止最小濃度を測定する方法）が挙げられる。
ペーパーディスク法は、寒天培地に試験する真菌を全面に塗抹し、その上に被験物質を浸み込ませたペーパーディスクを載せる。一定温度・時間培養した後、ペーパーディスク周囲の真菌の生育阻止帯（ハロー）の大きさから、定性的に真菌に対する抗菌力を評価する方法である。
【００１７】
ＭＩＣ法は、各濃度の被験物質を加えた培地中に試験する真菌を接種し、真菌の生育を阻止する最小濃度（ＭＩＣ）を調べる方法である。より具体的には、平板希釈法と微量液体希釈法が用いられる。平板希釈法では、被験物質を１０段階又はそれ以上希釈し、各濃度含有の寒天培地を準備する。これらの培地に、試験真菌を種菌、培養し、試験真菌の被験物質に対する感受性によりおこる、コロニーの大きさの差やその有無により抗真菌活性を確認する。
微量液体希釈法では、まず、被験物質を液体培地で一定濃度まで希釈した、希釈溶液を作製する。希釈溶液及び試験真菌の菌液を９６ウェルプレートの各ウェルに分注し、培養する。培養後、各ウェルの濁度をプレートリーダーにて吸光度測定し、その結果から試験真菌の生育を阻止する被験物質の最小有効濃度を推定する。
【００１８】
被験物質が真菌に対して生育阻害作用を示すか否かは、通常ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ）が１０μｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは１μｇ／ｍＬであれば生育阻害作用を示すと判断できる。
【００１９】
評価対象の真菌としては、例えば、ツボカビ門；クモノスカビ属、ケカビ属などの接合菌門；子嚢菌門；クリプトコッカス属（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等）、マラセチア属（例えば、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ等）、さび病菌などの担子菌門；白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属、黒色真菌などの不完全菌；酵母などが挙げられる。子嚢菌門としては、白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属（例えば、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ等）、アスペルギルス属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニューモシスチス属（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ等）；カンジダ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒａｂｒａｔａ等）、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）などの出芽酵母、シゾサッカロマイセス属などの分裂酵母などの酵母；アオカビ、コウジカビ、アカパンカビなどのカビ；アミガサタケ、トリュフなどのキノコ、ユーティパ（Ｅｕｔｙｐａ）属、いもち病菌、うどんこ病菌、黒星病菌、さび病菌などが挙げられる。このうち、ヒトに対する病原性が知られている白癬菌、スポロトリックス属、アスペルギルス属、ニューモシスチス属、カンジダ属、サッカロマイセイ属等を対象とするのが好ましい。
【００２０】
前記通常の生育阻害試験により選択することのできる抗真菌活性を有する被験物質をＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態で真菌の生育に対する作用を評価する。ここで、ＥＲＧ１１の発現が阻害された状態には、例えば、ＥＲＧ１１ノックアウト株を用いる評価系や、ＥＧＲ１１に対するテトラサイクリン転写抑制株とテトラサイクリンとを併用する評価系が挙げられる。Ｅｒｇ１１の活性が阻害された状態には、被験物質とＥｒｇ１１阻害剤とを併用する評価系が挙げられる。Ｅｒｇ１１阻害剤としては、アゾール系抗真菌物質が挙げられる。ここで用いられるアゾール系抗真菌物質は、Ｅｒｇ１１の活性を阻害するアゾール系抗真菌薬であり、例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロミダゾール、クロトリマゾール、クロコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、ネチコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、ラノコナゾール、フルコナゾール、テルコナゾール、ヘキサコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾールイトラコナゾール、ボリコナゾールなど、テルビナフィン、ブテナフィンなどのアリルアミン系抗真菌薬、およびアモロルフィンなどが挙げられる。さらに、アゾール系抗真菌薬としては、例えば、フェナリモール、フルオトリマゾール、トリアジメフォン、トリアジメノール、ジクロブトラゾール、ジニコナゾール、トリフミゾール、プロピコナゾール、フルトリアホール、ＤＰＸ−Ｈ６５７３、ペンコナゾール、ブチオベート、プロクロラズ、テブコナゾール、エクロメゾール、メトコナゾール、ヒドロキシイソキサゾール、ビテルタノール、シメコナゾール、テトラコナゾールなどが挙げられる。この評価系は、血清を含む培地又は血清を含まない培地を用いた、前記の通常の真菌生育阻害試験系であるのが好ましい。
【００２１】
ステロールを含むあるいは含まない培地で生育を阻害する被験物質をＥＲＧ１１の発現阻害、欠損、あるいはＥｒｇ１１が阻害された状態、例えばアゾール系抗真菌物質をステロールを含む培地で併用した場合に真菌を生育させる物質を選択する。この状態で真菌を生育させることは、例えば、被験物質又はアゾール系抗真菌薬単独使用の場合のＭＩＣに比べて、併用の場合のＭＩＣが１０倍以上、好ましくは１００倍以上になったことにより確認できる。かくして選択された物質は、真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を特異的に阻害する抗真菌薬である（図２Ｂ、Ｃ、Ｄ）。
【００２２】
上記の手段により選択されたＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６に特異的に阻害する抗真菌物質のうち、ステロールを含まない培地で当該被験物質をＥＲＧ１１が欠損あるいは発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態、例えばアゾール系抗真菌物質と併用し場合にＥｒｇ２５の阻害剤は生育させ、Ｅｒｇ２６の阻害剤は生育を阻害する（図Ｅ）。
【００２３】
本発明においては、前記被験物質及びＥｒｇ１１阻害剤（アゾール系抗真菌物質）のそれぞれ単独では真菌に対して生育阻害作用を示すにもかかわらず、ステロールを含まない培地で当該被験物質をＥｒｇ１１が阻害された状態、例えばステロールを含まない培地で当該被験物質とアゾール系抗真菌物質を併用した場合に真菌を生育させる物質を選択する。この状態で真菌を生育させることは、例えば、被験物質又はアゾール系抗真菌薬単独使用の場合のＭＩＣに比べて、併用の場合のＭＩＣが１０倍以上、好ましくは１００倍以上になったことにより確認できる。かくして選択された物質は、真菌のＥｒｇ２５を特異的に阻害する抗真菌薬である。
【００２４】
本発明の真菌のＥｒｇ２６を分子標的とする抗真菌薬のスクリーニング方法においては、まず、抗真菌活性を有する被験物質をステロールを含む培地で真菌の生育に対する作用を評価する。この評価方法は、前述の一般的な真菌生育阻害活性評価方法を、ステロールを添加した培地で実施すればよい。ステロールを含む培地としては、血清や胆汁を含む培地、特に血清を含む培地を使用するのが好ましい。血清としては、ヒトを含む哺乳類の血清、例えばヒト血清、ウシ血清、ウマ血清などが用いられる。血清の添加量は、培地中に１０％（ｖ／ｖ）となる濃度であるのが好ましい。
ステロールを含む培地で真菌の生育を阻害することは、前記同様にＭＩＣを測定することにより評価である。
【００２５】
このスクリーニング方法では、次に、選択された被験物質をＥＲＧ１１が欠損あるいは発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態、例えばアゾール系抗真菌物質と併用し、真菌の生育に対する作用を評価する。この評価方法は、ＥＲＧ１１の発現が阻害もしくはＥｒｇ１１の活性が阻害された状態、例えばアゾール系抗真菌物質を併用する以外は、前述の一般的な真菌生育阻害活性評価方法を実施すればよい。
また、この状態により真菌の生育を阻害することは、例えば被験物質又はアゾール系抗真菌薬単独使用の場合と同様のＭＩＣを有することにより確認できる。かくして選択された物質は、真菌のＥｒｇ２６を分子標的として、これを特異的に阻害する抗真菌薬である。
【００２６】
本発明方法によりスクリーニングされた物質がＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を特異的に阻害する物質であるか否かは、真菌のＥＲＧ２５又はＥＲＧ２６ノックダウン株に対する感受性又は酵素反応を、他の生育必須遺伝子のノックダウン株に対する感受性または酵素反応と比較することより確認することができる。
【００２７】
真菌のＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６の機能を阻害する物質、すなわち、本発明方法によりスクリーニングされた抗真菌薬は、ヒトに対して安全な可能性が高く、広範囲の真菌に対して有効であり、かつ耐性菌の出現可能性の低い抗真菌薬として有用である。
すなわち、後記試験結果に示すように、Ｅｒｇ２５又はＥｒｇ２６は、真菌の生育に必須であり、真菌共通性が高く、かつヒトタンパクとの類似性が低い。特にＥｒｇ２５は、この３条件全てにおいて、他のエルゴステロール合成酵素に比べて優れている。
【００２８】
本発明により得られる抗真菌薬であるＥｒｇ２５阻害剤及びＥｒｇ２６阻害剤はアゾール系抗真菌薬との併用はできないが、広範囲の真菌感染症の予防及び治療薬として有用である。その対象となる真菌としては、Ｅｒｇ２５及びＥｒｇ２６のアミノ酸配列の共通性が高いことから、広範囲であり、白癬菌、スポロトリックス属、アスペルギルス属、ニューモシスチス属、カンジダ属、サッカロマイシス属等の病原性を有する真菌が挙げられる。また、アゾール系抗真菌薬は、近年耐性菌が増加していること、またカンジダ・グラブラータについては、血清存在下でコレステロールを代替使用することによる耐性が知られているがＥｒｇ２５又はＥｒｇ２６を標的とする抗真菌薬ではコレステロールを代替できないことから、本発明の抗真菌薬は、アゾール系抗真菌薬耐性菌に有効である。
【００２９】
本発明の抗真菌薬は、経口又は非経口的に投与することができる。抗真菌薬は、薬学的に許容される担体と組み合わせることによって医薬組成物とすることができる。薬学的に許容される担体として、賦形剤、結合剤、緩衝剤、増粘剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等の公知のものを使用することができ、通常の方法により製剤化することができる。
【００３０】
経口投与用製剤としては、例えば錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。
【００３１】
この経口投与用製剤は製剤分野において通常用いられる添加剤を配合し、公知の方法に従って製造することができる。このような添加剤としては、例えば乳糖、マンニトール、無水リン酸水素カルシウム等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤；でんぷん、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤等が挙げられる。非経口的には、注射剤、直腸投与製剤、局所投与剤等として投与することができ、なかでも注射剤が好ましい。
【００３２】
注射剤としては、例えば無菌の溶液又は懸濁液等が挙げられる。これらの注射剤は、例えば本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩を日局注射用水に溶解又は懸濁することにより製造される。必要により塩化ナトリウム等の等張化剤；リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム等の緩衝剤；溶解補助剤等を配合してもよい。また、用時溶解型（粉末充填、凍結乾燥）の注射剤とすることができ、この場合、マンニトール、乳糖等の賦形剤を添加して、通常の方法で製造することができる。
【００３３】
直腸投与製剤としては坐剤等が挙げられる。坐剤は例えば抗真菌薬をカカオ脂、マクロゴール等の基剤に溶解又は懸濁した後、鋳型に注いで成形して製造される。また、液又はクリームを注入用の容器に入れ、直腸投与製剤とすることもできる。
【００３４】
局所投与製剤は液剤、点眼剤、クリーム、軟膏、ゲル製剤、スプレー剤、粉剤等が挙げられる。液剤は、本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩を水に加え、安定化剤、溶解剤、増粘剤、分散剤、懸濁化剤等を必要に応じて加えて製造することができる。この増粘剤としては、ゼラチン、ヒアルロン酸ナトリウム、高分子デキストラン、アルギン酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸ナトリウム等を用いることができる。点眼剤は、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤のほかに防腐剤を加えて製造することができる。クリーム及び軟膏は、水性又は油性の基剤、例えば水、流動パラフィン、植物油（ピーナッツ油、ひまし油等）、マクロゴール等を用いて製造することができる。ゲル製剤は、公知の方法により、ゼラチン、ペクチン、カラゲナン、寒天、トラガント、アルギン酸塩、セルロースエーテル（メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース等）、ペクチン誘導体、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン等を用いて製造することができる。スプレー剤は本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩を水等に溶解又は懸濁した後、スプレー容器に入れて製造することができる。粉剤とする場合は、本発明化合物又はその薬学的に許容しうる塩をそのまま使用することもできるが、適当な賦形剤と混合して製造することができる。
【００３５】
抗真菌薬の投与量は対象とする疾患や症状、投与対象の年齢、体重、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。通常、経口投与の場合、成人（体重約６０ｋｇ）１日当たりの抗真菌薬の投与量は、１〜１０００ｍｇ、好ましくは１〜８００ｍｇ、さらに好ましくは１〜５００ｍｇであり、これを１回で、あるいは２〜４回に分けて投与する。また、静脈内投与される場合は、通常、成人１日の投与量は体重１ｋｇあたり０．１〜５０ｍｇ、好ましくは０．１〜３０ｍｇ、より好ましくは０．１〜２０ｍｇであり、１日１回〜複数回に分けて投与する。
【実施例】
【００３６】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００３７】
試験例１（各抗真菌薬標的遺伝子群における必須遺伝子）
カンジダ・グラブラータについては、Ｔｅｔ株を作製し、ノックダウン時の生育状況によって必須か否かの判定を行った。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅについては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ＧＥＮＯＭＥ  ＤＡＴＡＢＡＳＥ（https://www.yeastgenome.org）のＬａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  Ｓｕｒｖｅｙ情報においてｉｎｖｉａｂｌｅの判定が表示されたものを必須とした。Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓについては、Ｃａｎｄｉｄａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂｓｅ(http://www.candidagenome.org)、Ｍｕｔａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ情報においてｉｎｖｉａｂｌｅと表示された遺伝子を必須とした結果を表２に示した。【００３８】
【表２】
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【００３９】
試験例２（各抗真菌薬標的遺伝子群の種間相同性解析）
カンジダ・グラブラータの各エルゴステロール合成酵素遺伝子の真菌種間及びヒトにおける相同性についてＢＬＡＳＴＸを用いて解析した。その結果を表３及び表４に示す。表２と表３及び表４の結果から、各エルゴステロール合成酵素の抗真菌薬標的としての適性を評価した結果を表３に示した。【００４０】
【表３】
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【００４１】
【表４】
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【００４２】
表３及び表４より、ＥＲＧ２５及びＥＲＧ２６が抗真菌薬標的遺伝子として好ましく、ＥＲＧ２５がより好ましいことが判明した。【００４３】
試験例３
（方法１）
Ｔｅｔシステムを利用したノックダウン株の作製（図１）
ＨＥＴＳ２０２株を親株として目的遺伝子であるＥＲＧ１、ＥＲＧ７、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ２５、ＥＲＧ２６、ＥＲＧ２７遺伝子の上流にＴｅｔプロモーターを挿入することにより各目的遺伝子のＴｅｔ株であるＴｅｔ−ＥＲＧ１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ７、Ｔｅｔ−ＥＲＧ１１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２５、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２６、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２７株を其々作製した。本作製方法は以下の文献に記載されている。本ＴｅｔシステムはＴｅｔＯＦＦシステムと呼ばれており、Ｔｅｔ株では最小培地（ＳＤ）で培養すると、Ｔｅｔプロモーターの下流遺伝子が定常的に発現し、培地中に２０μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを加えると、Ｔｅｔプロモーターの下流遺伝子の転写が抑制（ＯＦＦ）になる（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｙｅａｓｔ  Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｃｙｂ２ｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌａｃｔａｔｅ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｄａｐｔ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｕｅｎｏ  Ｋ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｙ，Ｕｎｏ  Ｊ，Ｓａｓａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｓｅｋｉｍｉｚｕ  Ｋ，Ｋｉｎｊｏ  Ｙ，Ｃｈｉｂａｎａ  Ｈ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（９）：ｅ２４７５９．）。【００４４】
（方法２）
組換え体の親株であるＨＥＴＳ２０２とＴｅｔ−ＥＲＧ１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ７、Ｔｅｔ−ＥＲＧ１１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２５、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２６、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２７を以下に示す各種寒天培地に菌濃度の傾斜をつけてスポッティングアッセイを実施した。
Ａ：ＳＤ培地には６．７ｇ／ＬのＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｃｅ（ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、２０ｇ／Ｌのグルコース、７９０ｍｇ／ＬのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅが含まれている。
Ｂ：ＳＤ＋Ｄｏｘ培地には上記ＳＤ培地の成分に加えて２０ｍｇ／Ｌのドキシサイクリン塩酸塩が含まれている。
Ｃ：ＳＤ＋Ｄｏｘ＋Ｓｅｒｕｍ培地には上記ＳＤ＋Ｄｏｘ培地の成分に加えて１００ｍＬ／Ｌの牛血清が含まれている。
Ｄ：ＳＤ＋Ｄｏｘ＋Ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ培地には上記ＳＤ＋Ｄｏｘ培地の成分に加えて２００ｍｇ／Ｌのフルコナゾール塩酸塩が含まれている。
Ｅ：ＳＤ＋Ｄｏｘ＋Ｆｌｕｃｏｎａｚｏｌｅ培地には上記ＳＤ＋Ｄｏｘ培地の成分に加えて２００ｍｇ／Ｌのフルコナゾール塩酸塩が含まれている。
植菌後、３７度２４時間培養した。【００４５】
（結果）
結果を図２に示す。
Ａ：ＳＤ培地上では全組換え体が良好に生育した。
Ｂ：ドキシサイクリンを添加することによって各Ｔｅｔ株では目的遺伝子の転写抑制が生じ生育が阻害された。親株であるＨＥＴＳ２０２は、Ｔｅｔプロモーターは挿入されていないためにドキシサイクリンによる生育阻害はなかった。
Ｃ：ドキシサイクリン添加によって、各Ｔｅｔ株の目的遺伝子が転写抑制されていながら、血清を添加することによって、Ｔｅｔ−ＥＲＧ１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ７、Ｔｅｔ−ＥＲＧ１１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２７は生育が復帰し、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２５、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２６の生育は復帰しなかった。
Ｄ：フルコナゾールはアゾール系抗真菌薬の１つであり、分子標的はＥｒｇ１１である。Ｅｒｇ１１が不活化あるいは欠損すると、迂回経路が生じ中間代謝産物であるラノステロールがＥｒｇ６、Ｅｒｇ２５、Ｅｒｇ２６、Ｅｒｇ２７、Ｅｒｇ３による修飾によって１４α−Ｍｅｔｈｙｌｅｒｇｏｓｔａ  ８，２４（２８）−ｄｉｅｎ−３β，６α−ｄｉｏｌが生成され、これに細胞毒性があり真菌の生育が阻害される。本培地上ではドキシサイクリンによって各Ｔｅｔ株において、該当する目的遺伝子の転写が抑制されているが、血清の添加によって、Ｔｅｔ−ＥＲＧ１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ７、Ｔｅｔ−ＥＲＧ１１、Ｔｅｔ−ＥＲＧ２７の生育は復帰した。ＴｅｔＥＲＧ２５並びにＴｅｔＥＲＧ２６では、Ｅｒｇ１１の阻害剤であるフルコナゾールが添加されることによって、迂回経路が生じ、Ｅｂｕｒｉｃｏｌおよび４−Ｃａｒｂｏｘｙｌ−Ｅｂｕｒｉｃｏｌ生成されるが、コレステロールの取り込みは可能となり細胞は生育を復帰することができる。
Ｅ：ドキシサイクリン添加によって、各Ｔｅｔ株の目的遺伝子が転写抑制されている。そこにフルコナゾールを添加すると、迂回経路が生じ、ＴｅｔＥＲＧ２５ではＥｂｕｒｉｃｏｌが生成されエルゴステロールの代替品となり生育阻害は生じない。一方ＴｅｔＥＲＧ２６では４−Ｃａｒｂｏｘｙｌ−Ｅｂｕｒｉｃｏｌ生成されるが、生育は復帰しない。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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