(57)【要約】  本発明は，筋幹細胞の未分化性を保持したまま細胞を培養する方法を提供する。より具体的には、レチノイドとラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することにより，筋幹細胞の未分化性を保持したまま細胞を培養することを可能とする。レチノイドとしては例えば，ａｔＲＡ，ＡＭ８０などが使用できる。レチノイドとラミニンを含む培地を用いて培養することにより増殖させた筋幹細胞は，細胞移植による筋ジストロフィーの治療等に利用されうる。
2018235899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法。
【請求項２】
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびそれらの混合物から成る群より選択される，請求項１記載の培養方法。
【請求項３】
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，請求項１または２記載の培養方法。
【請求項４】
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびそれらの混合物から成る群より選択される，請求項１〜３のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項５】
培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である，請求項１〜４のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項６】
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，請求項１〜５のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項７】
培地がＧ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）−ＰＦＩ−２およびそれらの混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，請求項１〜６のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項８】
筋サテライト細胞の未分化性が維持される，請求項１〜７のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項９】
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，請求項１〜８のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項１０】
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって，
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，
ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，培養方法。
【請求項１１】
２〜４％のＯ２の存在下で細胞を培養することを特徴とする，請求項１〜１０のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項１２】
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
【請求項１３】
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地。
【請求項１４】
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって，
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍであり，
ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして
培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，細胞培養培地。
【請求項１５】
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地サプリメント。
【請求項１６】
細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む，方法。
【請求項１７】
筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む，方法。
【請求項１８】
患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，方法。
【請求項１９】
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，患者がヒトであり，疾患が筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病，サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される，請求項１８記載の治療方法。
【請求項２０】
少なくとも５×１０５個の筋サテライト細胞を含む，細胞組成物。
【請求項２１】
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンをさらに含み，レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，筋サテライト細胞の純度が少なくとも８５％であり，筋サテライト細胞がヒトの細胞である，請求項２０記載の細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、特願２０１７−１２１７８７号（出願日：２０１７年６月２２日）の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は，筋幹細胞の培養方法に関する。より詳細には，筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法に関する。また，本発明は，細胞移植などに利用可能な筋幹細胞の製造方法，およびそれに用いる組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
骨格筋は，運動や姿勢の保持に必要であるだけでなく，最大のエネルギー利用器官として代謝調節にも重要である。また，骨格筋は再生能が高いという特徴をもつ。骨格筋は，骨格筋幹細胞（筋サテライト細胞）が活性化され，分化・融合することによって再生される（非特許文献１）。【０００４】
筋ジストロフィーは筋線維の壊死と再生を繰り返しながら筋萎縮が進行する遺伝性の疾患であり，有効な治療法は未だに確立されていない。開発段階にある筋ジストロフィーの治療法としては，例えば，核酸医薬品を用いたエキソンスキッピング療法がある（非特許文献２）。核酸医薬品とならび，細胞移植治療の応用も期待されているが，ｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋幹細胞を培養すると，幹細胞としての未分化性が失われ，増殖を停止してしまうことが知られている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Comai and Tajbakhsh, Curr Top Dev Biol. 2014;110:1-73. doi: 10.1016/B978-0-12-405943-6.00001-4.
【非特許文献２】Fairclough et al., Nat Rev Genet. 2013;14(6):373-8. doi: 10. 1038/nrg3460.
【非特許文献３】Fu et al., Cell Res. 2015;25(6):655-73. doi: 10.1038/cr.2015 .58.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は，筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法を提供することを目的の一つとする。また，本発明は，筋幹細胞の未分化性を保持したまま培養する方法において用いる組成物を提供することを別の目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは，レチノイドおよびラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本技術は簡便かつ安全で，高い効率で筋幹細胞の未分化性を維持できることから，筋ジストロフィーをはじめとした筋疾患に対する細胞移植治療や，化合物スクリーニング系の開発，再生医療への応用が期待される。本発明はこのような知見に基づくものであり，以下の態様を包含する：
［態様１］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法。
［態様２］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１記載の培養方法。
［態様３］
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様１または２記載の培養方法。
［態様４］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１〜３のいずれか記載の培養方法。
［態様５］
培地がレチノイドおよびラミニンを含む液体培地である，態様１〜４のいずれか記載の培養方法。
［態様６］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１〜５のいずれか記載の培養方法。
［態様７］
培地がＧ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）−ＰＦＩ−２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様１〜６のいずれか記載の培養方法。
［態様８］
筋サテライト細胞の未分化性が維持される，態様１〜７のいずれか記載の培養方法。
［態様９］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１〜８のいずれか記載の培養方法。
［態様１０］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む液体培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，ヒト筋サテライト細胞の培養方法であって，
レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍであり，
ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして
ヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，培養方法。
［態様１１］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物。
［態様１２］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１１記載の組成物。
［態様１３］
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様１１または１２記載の組成物。
［態様１４］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１１〜１３のいずれか記載の組成物。
［態様１５］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１１〜１４のいずれか記載の組成物。
［態様１６］
筋サテライト細胞の未分化性が維持される，態様１１〜１５のいずれか記載の組成物。
［態様１７］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１１〜１６のいずれか記載の組成物。
［態様１８］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地。
［態様１９］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１８記載の細胞培養培地。
［態様２０］
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様１８または１９記載の細胞培養培地。
［態様２１］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様１８〜２０のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２２］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様１８〜２１のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２３］
培地がＧ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）−ＰＦＩ−２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様１８〜２２のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２４］
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様１８〜２３のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２５］
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様１８〜２４のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２６］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様１８〜２５のいずれか記載の細胞培養培地。
［態様２７］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，細胞培養培地サプリメント。
［態様２８］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様２７記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様２９］
細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様２７または２８記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３０］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様２７〜２９のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３１］
細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様２７〜３０のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３２］
Ｇ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）−ＰＦＩ−２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様２７〜３１のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３３］
筋サテライト細胞の培養に用いるための態様２７〜３２のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３４］
筋サテライト細胞の未分化性を維持するための態様２７〜３３のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３５］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様２７〜３４のいずれか記載の細胞培養培地サプリメント。
［態様３６］
細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含む，方法。
［態様３７］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様３６記載の製造方法。
［態様３８］
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様３６または３７記載の製造方法。
［態様３９］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様３６〜３８のいずれか記載の製造方法。
［態様４０］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様３６〜３９のいずれか記載の製造方法。
［態様４１］
培地がＧ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）−ＰＦＩ−２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様３６〜４０のいずれか記載の製造方法。
［態様４２］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様３６〜４１のいずれか記載の製造方法。
［態様４３］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様３６〜４２のいずれか記載の製造方法。
［態様４４］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様３６〜４３のいずれか記載の製造方法。
［態様４５］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様３６〜４４のいずれか記載の製造方法。
［態様４６］
細胞が糖尿病の治療に用いるための細胞である，態様３６〜４５のいずれか記載の製造方法。
［態様４７］
患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，方法。
［態様４８］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様４７記載の治療方法。
［態様４９］
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様４７または４８記載の治療方法。
［態様５０］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様４７〜４９のいずれか記載の治療方法。
［態様５１］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様４７〜５０のいずれか記載の治療方法。
［態様５２］
培地がＧ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤，（Ｒ）−ＰＦＩ−２およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含む，態様４７〜５１のいずれか記載の治療方法。
［態様５３］
患者がヒトである，態様４７〜５２のいずれか記載の治療方法。
［態様５４］
疾患が筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病，サルコペニアおよび糖尿病から成る群より選択される，態様４７〜５３のいずれか記載の治療方法。
［態様５５］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様４７〜５４のいずれか記載の治療方法。
［態様５６］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様４７〜５５のいずれか記載の治療方法。
［態様５７］
少なくとも５×１０５個の筋サテライト細胞を含む，細胞組成物。
［態様５８］
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンをさらに含む，態様５７記載の細胞組成物。
［態様５９］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様５７または５８記載の細胞組成物。
［態様６０］
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様５７〜５９のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６１］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様５７〜６０のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６２］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様５７〜６１のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６３］
筋サテライト細胞の純度が少なくとも８５％である，態様５７〜６２のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６４］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様５７〜６３のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６５］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様５７〜６４のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６６］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様５７〜６５のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６７］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様５７〜６６のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６８］
凍結されている，態様５７〜６７のいずれか記載の細胞組成物。
［態様６９］
１つの容器に納められている，態様５７〜６８のいずれか記載の細胞組成物。
［態様７０］
筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，
（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，
培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，
試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程
を含む，方法。
［態様７１］
レチノイドがａｔＲＡ，ＡＭ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３，およびその混合物から成る群より選択される，態様７０記載のスクリーニング方法。
［態様７２］
レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍである，態様７０または７１記載のスクリーニング方法。
［態様７３］
ラミニンがラミニン５１１，ラミニン５２１，ラミニン５２２，ラミニン５２３，およびその混合物から成る群より選択される，態様７０〜７２のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７４］
ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌである，態様７０〜７３のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７５］
筋サテライト細胞がヒトの細胞である，態様７０〜７４のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７６］
筋サテライト細胞がｉＰＳ細胞由来の細胞である，態様７０〜７５のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７７］
筋サテライト細胞が筋ジストロフィー患者由来の細胞である，態様７０〜７６のいずれか記載のスクリーニング方法。
［態様７８］
筋サテライト細胞が遺伝子改変細胞である，態様７０〜７７のいずれか記載のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】培養骨格筋幹細胞をａｔＲＡ（all-trans-RetinoicAcid）で処理した時のＰａｘ７陽性細胞，ＭｙｏＤ陽性細胞，そしてＰａｘ７陽性ＭｙｏＤ共陽性細胞割合を示したグラフである。
【図１ｂ】培養骨格筋幹細胞をＡｍ８０で処理した時のＰａｘ７陽性細胞，ＭｙｏＤ陽性細胞，そしてＰａｘ７陽性ＭｙｏＤ共陽性細胞割合を示したグラフである。
【図２】培養骨格筋幹細胞培養系において，分化培地にall-trans-RetinoicAcid（ａｔＲＡ），あるいはＡｍ８０を添加し，３日間培養した時の筋管形成を抗ミオシン重鎖抗体によって解析した顕微鏡像である。ＤＭＳＯは対照。
【図３】１０−７Ｍのall-trans-RetinoicAcid（ａｔＲＡ）を添加した増殖培地で培養した骨格筋幹細胞の細胞増殖をＭｙｏＤ陽性細胞中のＥｄＵを取り込んだ細胞を検出することにより解析したグラフである。
【図４ａ】１０−７Ｍのall-trans-RetinoicAcid（ａｔＲＡ）を添加（atRA+），あるいは無添加（Control）の増殖培地で培養し，５回経代した骨格筋幹細胞を示す顕微鏡像である。
【図４ｂ】骨格筋組織より単離し，増殖培地で４日間培養した初代骨格筋幹細胞を示す顕微鏡像である。
【図４ｃ】１０−７Ｍのall-trans-RetinoicAcid（ａｔＲＡ）を添加，あるいは無添加の増殖培地で培養し，５回経代した骨格筋幹細胞を用いてウェスタンブロット法によりＰａｘ７，ＭｙＨＣ，β−Ｔｕｂｕｌｉｎの発現を解析したものである。
【図５】１０−７Ｍのall-trans-RetinoicAcid（ａｔＲＡ）を添加した増殖培地で培養し，１６回経代した時の骨格筋幹細胞培養系におけるＰａｘ７陽性細胞，ＭｙｏＤ陽性細胞，そしてＰａｘ７陽性ＭｙｏＤ共陽性細胞割合を示したグラフである。
【図６】増殖培地に１０−７Ｍのall-trans-RetinoicAcid（ａｔＲＡ）を添加し，１７回経代した時の骨格筋幹細胞培養系を分化培地で３日間培養し，分化能を抗ＭｙｏＤ抗体と抗ミオシン重鎖抗体によって解析した顕微鏡像である。
【図７】分化培地に１０−８〜１０−６Ｍのレチノイド化合物を添加し，９６時間培養した時の筋細胞である。コントロール（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ）およびＲＸＲアゴニストを添加した筋細胞は筋管を形成するが，ＲＡＲアゴニストを添加すると筋管の形成が抑制される。
【図８】骨格筋幹細胞をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）でプレコーティング（Ｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇ）した培養皿（Matrigel-Precoated），ｉＭａｔｒｉｘ−５１１でＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿（iMatrix511-Precoated）および継代時にｉＭａｔｒｉｘ−５１１を０．２または０．５μｇ／ｃｍ２となるように添加した実験区において４８時間増殖培地で培養した時のＰａｘ７，Ｍｙｏｇ，ＭＣＫの発現を解析したグラフである。
【図９】Ｍａｔｒｉｇｅｌ上あるいはｉＭａｔｒｉｘ５１１（ａｔＲＡ処理＋／−）を含む培地中で４８時間培養した骨格筋幹細胞におけるＰａｘ７陽性細胞，Ｍｙｏｇ陽性細胞割合を示したグラフである。
【図１０】図１０は（１）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；（２）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，１０−７Ｍのオールトランス型レチノイン酸（ａｔＲＡ）を添加した増殖培地で培養する方法；（３）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ−５１１でＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、増殖培地で培養する方法；（４）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ−５１１でＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、１０−７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法；（５）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；および（６）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，１０−７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法，のいずれかにより骨格筋幹細胞を培養し，４８時間後に解析した結果を示すグラフである。ｉＭａｔｒｉｘ−５１１とａｔＲＡを併用した実験区において最もＰａｘ７の陽性細胞率が高く，Ｍｙｏｇ陽性細胞率が低くなっていた。
【図１１】図１１は，ヒト骨格筋幹細胞培養系において，ａｔＲＡあるいはＡｍ８０を増殖培地に添加して３日間培養し，骨格筋幹細胞の増殖をＷＳＴ−８アッセイにより評価した結果を示すグラフである。縦軸は４５０ｎｍの吸光度。対照（ｃｏｎｔ）はａｔＲＡあるいはＡｍ８０の代わりにＤＭＳＯを加えたもの。グラフは，１０−６ＭのＡｍ８０添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が抑制されることを示している。
【図１２】図１２は，ヒト骨格筋幹細胞の筋分化誘導において，レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した結果を示す顕微鏡像である。抗ミオシン重鎖抗体による免疫染色を行い，筋細胞が融合した筋管を可視化した。ａｔＲＡ，Ａｍ８０ともに１０−７Ｍおよび１０−６Ｍの濃度で筋管の形成を抑制している。
【図１３】図１３は，ａｔＲＡが筋分化制御因子の発現に及ぼす影響を解析した結果を示すグラフである。ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法で相対定量解析した。縦軸は対照（ｃｏｎｔ）に対する相対量（Relative quantity）。グラフは，１０−７Ｍ〜１０−６ＭのａｔＲＡの添加により，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現が抑制されることを示している。
【図１４】図１４は，ヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡおよび／またはｉＭａｔｒｉｘ−５１１を添加して３日間培養し，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法で相対定量解析した結果を示すグラフである。ＮＤＵＦＡ１３を内部コントロール遺伝子とした。縦軸は対照（ｃｏｎｔ）に対する相対量（Relative quantity）。グラフは，１０−６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ−５１１を添加した場合において，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現が最も抑制されたことを示している。
【図１５】図１５は，ヒト骨格筋幹細胞をａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ−５１１の存在下で３日間培養し，吸光度により細胞増殖の定量を行った結果を示すグラフである。縦軸は対照（control）に対する相対ＯＤ。グラフは，ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ−５１１の添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が促進されたことを示している。
【図１６ａ】図１６ａは，ヒト骨格筋幹細胞をａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ−５１１の存在下で培養し，培養された細胞（細胞数４ｘ１０５個を）をＮＯＧ−ｍｄｘマウスの前脛骨筋に移植した結果を示す顕微鏡像である。移植４週間後，前脛骨筋の迅速凍結切片を作成し，ウサギ抗ジストロフィン抗体とマウス抗ヒトスペクトリン抗体，ラット抗ラミニンα２鎖抗体を用いて染色した。
【図１６ｂ】図１６ｂは，ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ−５１１を添加して培養したヒト骨格筋幹細胞の移植効率を示したグラフである。縦軸は，前脛骨筋の断面の全筋線維に対するヒトスペクトリン陽性筋線維の割合。横軸は，対照（ｃｏｎｔ），ａｔＲＡ（ＲＡ），ａｔＲＡ＋ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ＲＡ＋ｉＭ）。１０−６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ−５１１を添加して培養したヒト骨格筋幹細胞が最も高い移植効率を示し、その値は細胞移植の治療効果が見込める１０％を超えた。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
上述のとおり，レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることが見出された。以下に，本発明を詳細に説明する。
【００１０】
筋幹細胞（筋サテライト細胞）
骨格筋の組織幹細胞は，筋幹細胞あるいは筋サテライト細胞と呼ばれる小さな多能性の細胞であり，基底膜と筋鞘の間に存在している。筋サテライト細胞は，通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持しているが，骨格筋に何らかの損傷を受けると活性化して分裂し，筋芽細胞へと分化し，筋管を形成して筋線維を再生させる。
【００１１】
静止期の未分化の筋サテライト細胞は，Ｐａｘ７の発現を指標として同定することができる。筋サテライト細胞の活性化により筋芽細胞が分化するにつれて，Ｐａｘ７の発現は減少し，ＭｙｏＤの発現が上昇する。さらに，筋芽細胞が筋管を形成するのに伴い，ミオゲニンの発現が上昇する。また，筋細胞が融合した筋管は，抗ミオシン重鎖抗体による免疫染色により可視化することができる。
【００１２】
細胞の形態に関しては，未分化の筋サテライト細胞は丸い形態を示すのに対し，分化の進んだ細胞は扁平で巨大な形態を示すことから，未分化の筋サテライト細胞を同定することができる。
【００１３】
本発明において用いる筋サテライト細胞は，動物の筋サテライト細胞であることが好ましく，哺乳動物の筋サテライト細胞であることがより好ましく，マウス，ラット，ブタ，ウサギ，サルまたはヒトの筋サテライト細胞であることがさらに好ましく，ヒトまたはマウスの筋サテライト細胞であることがさらに好ましく，ヒトの筋サテライト細胞であることが特に好ましい。
【００１４】
本発明において用いる筋サテライト細胞は，動物の組織から単離することができる。単離方法としては，（ｉ）０．１４％プロテアーゼ（Sigma-Aldrich社）を含むＤＭＥＭ培地で３７°Ｃ，３０分間処理し，ＤＭＥＭ培地による洗浄を行った後に播種する方法，（ｉｉ）酵素消化後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により単離する方法（Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20, 255-264,2014）などが挙げられるが，これらに限定はされない。組織から筋サテライト細胞を分離する方法は，当業者には公知であり，例えば，Fukada et al. Exp Cell Res2004;296:245-255.を参照してもよい。
【００１５】
本発明において用いる筋サテライト細胞は，動物のＥＳ細胞，ｉＰＳ細胞や，他の幹細胞から作製してもよい。なお，ｉＰＳ細胞等から誘導された細胞は，「サテライト細胞様」筋幹細胞であり得るが，本願においては，これも筋サテライト細胞に含まれるものとみなす。
【００１６】
レチノイド
レチノイドとは，ビタミンＡまたはそれに化学的に関連する一群の化合物のことをいう。ビタミンＡとは，レチノール，レチナール，レチノイン酸（これらをビタミンＡ１と呼ぶ）およびこれらの３−デヒドロ体（ビタミンＡ２と呼ぶ）と，その誘導体の総称で，ビタミンの中の脂溶性ビタミンに分類される。レチノイドは，上皮細胞の増殖を調節する医薬として使用されている。レチノイドは，視力における役割，細胞増殖および分化の調節，骨組織の増殖，免疫機能，および腫瘍抑制遺伝子の活性化など，全身において多くの重要な機能を有している。本発明者らは，レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本発明において使用されうるレチノイドには，トレチノイン，タミバロテンなどが含まれるが，これらに限定はされない。
【００１７】
トレチノイン（オールトランスレチノイン酸（ａｔＲＡ）ともいう）は，ビタミンＡ誘導体の一種であり，レチノイン酸のうち，二重結合がすべてトランス型をとった，オール・トランス異性体である。
【００１８】
【化１】
2018235899.tif 000003
【００１９】
タミバロテン（ＡＭ８０，レチノ安息香酸ともいう）は，合成レチノイドであり，トレチノイン（ＡＴＲＡ）耐性急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に対する化学療法剤として用いられる経口剤である。
【００２０】
【化２】
2018235899.tif 000004
【００２１】
本発明において使用されうるレチノイドには，ＲＡＲアゴニストが含まれ，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０などの他のＲＡＲアゴニストも含まれる。本発明において使用されうるレチノイドとしては他に，フェンレチニド，ＣＤ４３７，ＢＭＳ４５３，タザロテン，ドコサヘキサエン酸，Ａ１１２０，Ｃｈ５５，ＥＣ２３，Ａ７４０００３なども挙げられる。
【００２２】
ラミニン
ラミニンは，細胞外マトリクスの高分子量タンパク質（およそ４００〜９００ｋＤａ）であり，基底膜の主要な構成要素となっている。ラミニンは，基底膜の重要な成分であり，細胞の分化，遊走，および接着に影響を及ぼす。ラミニンは，α鎖，β鎖およびγ鎖を含むヘテロ三量体タンパク質であり，１５種類のアイソフォームを形成しうる５種のα鎖，３種のβ鎖，および３種のγ鎖が特定されている。
【００２３】
ラミニン分子は各鎖の組成に従って命名される。本明細書においては，例えば，α５鎖，β１鎖及びγ１鎖から構成されるラミニンを「ラミニンα５β１γ１」または「ラミニン５１１」と記載する。その他の１４種類のアイソフォームは，ラミニン１１１，ラミニン２１１，ラミニン１２１，ラミニン２２１，ラミニン３３２，ラミニン３１１，ラミニン３２１，ラミニン４１１，ラミニン４２１，ラミニン５２１，ラミニン２１３，ラミニン４２３，ラミニン５２２，ラミニン５２３と記載される。ラミニンは，全長であってもよいしその一部であってもよく，例えば，ラミニン５１１は，そのα５鎖，β１鎖及びγ１鎖のそれぞれが，互いに独立に，全長であってもよいしその一部であってもよい。ラミニンは，組換えタンパク質の製造および精製が容易であることからＥ８フラグメントであることが好ましく，実用化の観点からヒトラミニンのＥ８フラグメントであることがさらに好ましい。
【００２４】
本明細書においては，ラミニンのＥ８フラグメントのことを単に「ラミニンＥ８」と記載することもあり，また，例えば，ラミニン５１１のＥ８フラグメントのことを「ラミニン５１１Ｅ８」とも記載する（他のラミニンのアイソフォームについても同様）。なお，単に「ラミニンＥ８」と記載したときは，ラミニンのアイソフォームは限定されず，いずれのアイソフォームのラミニンのＥ８フラグメントであってもよいものとする。
【００２５】
ヒトラミニン５１１タンパク質のＥ８フラグメントは，ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を含む幹細胞の培養用基質として，スライドガラスやシャーレなどの培養容器の表面をコーティングすることにより使用されている。本発明者らは，予想外なことに，ラミニンを培養容器底面のコーティングとして用いるのではなく，液体培養培地中にレチノイドと共に含めることによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，効率的に細胞を増殖させることが可能であることを見出した。このようなレチノイドとラミニンとの組み合わせにより，予想を超える相乗的な効果を得ることができる。なお，ラミニンの液体培地への添加と培養容器表面のコーティングとの併用は，排除されない。
【００２６】
ラミニンのＥ８フラグメントは，マウスラミニンα１β１γ１（以下，「マウスラミニン１１１」とも記す。）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で，強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoe nen H. The heparin-binding domainof laminin is responsible for its effects on ne urite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468,1984.，Goodman SL., 
Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin canin dependently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598,1987.）。例えば，ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８フラグメント（マウスラミニン１１１Ｅ８）に相当するフラグメントの存在が推定されるが，これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって，本発明に用いられるヒトラミニンのＥ８フラグメントは，対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく，マウスラミニン１１１Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し，同様の構造を有し，同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
【００２７】
ラミニンのＥ８フラグメントの製造方法は特に限定されず，例えば，ラミニンの所望のアイソフォームの全長をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し，目的のフラグメントを分取，精製する方法や，組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量，品質の均一性，製造コスト等の観点から，組換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００２８】
組換えヒトラミニン（全長またはその一部）は，公知の配列情報と，公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン５１１Ｅ８の製造方法を例として以下説明する。組換えヒトラミニン５１１Ｅ８の製造方法としては，例えば，ヒトラミニン５１１Ｅ８のα鎖，β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し，これをそれぞれ発現ベクターに挿入し，得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ，３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる。例えば，Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamu ra, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Se kiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position fr om the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins ” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154,2007.）に記載の方法に従って作製することができるが，これに限定されるものではない。例えばヒトラミニン５１１を構成するα５鎖，β１鎖，γ１鎖をそれぞれコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は，公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。ラミニンは例えば，これら特定のアミノ酸配列において，少なくとも１個のアミノ酸が欠失，置換及び／又は付加されたタンパク質であってもよい。
【００２９】
ラミニンは，例えば，株式会社ニッピ（東京，日本）から市販されている培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１−Ｅ８またはｉＭａｔｒｉｘ５１１−Ｅ８−ｓｉｌｋを用いることができる。ｉＭａｔｒｉｘ５１１−Ｅ８は，ヒトラミニン５１１−Ｅ８フラグメントと同一の配列を有する，遺伝子組換えＣＨＯ−Ｓ細胞由来の組換えタンパク質である。ｉＭａｔｒｉｘ５１１−Ｅ８−ｓｉｌｋは，ヒトラミニン５１１−Ｅ８フラグメントと同一の配列を有する，遺伝子組換えカイコ生産系由来の組換えタンパク質である。
【００３０】
細胞培養方法
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法に関する。細胞の培養は，例えば，増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン，２〜１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ）を用いて，５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃にて行うことができる。培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。培地には，Ｇ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤（例えば，Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のＳＢ２０３５８０），または（Ｒ）−ＰＦＩ−２（Cell stem cell 22, 177-190, 2018）などの他の因子がさらに含まれていてもよい。培養容器としては，例えば，シャーレ，細胞培養皿，細胞培養フラスコなどを使用することができる。
【００３１】
また，筋サテライト細胞の培養時には，酸素濃度を適宜調整することができる。例えば，Ｏ２の濃度は，少なくとも０．５％以上，１％以上，２％以上，３％以上，４％以上，５％以上，６％以上のいずれかの濃度とすることができる。また，Ｏ２は１０％以下，８％以下，６％以下，５％以下，４％以下，３％以下とすることができる。Ｏ２濃度は，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，１％〜５％の範囲，好ましくは２％〜４％の範囲とすることができる。ヒト細胞の培養の場合，好適なＯ２濃度は例えば２．５〜３．５％，より具体的には３％である。よって，ヒト細胞の培養は，例えば，増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸，２．５ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅを用いて３７℃，３％Ｏ２，  ５％ＣＯ２インキュベーター内で行うことができる。このように，本発明の一つの態様は，２〜４％の酸素濃度，好ましくは３％Ｏ２の存在下で細胞を培養することを特徴とする，筋サテライト細胞の培養方法に関する。
【００３２】
レチノイドは，少なくとも１０−１３Ｍ以上，１０−１２Ｍ以上，１０−１１Ｍ以上，１０−１０Ｍ以上，１０−９Ｍ以上，１０−８Ｍ以上，１０−７Ｍ以上，１０−６Ｍ以上，１０−５Ｍ以上，１０−４Ｍ以上，１０−３Ｍ以上のいずれかの濃度で培地に添加することができる。また，レチノイドは，１０−２Ｍ未満，１０−３Ｍ未満，１０−４Ｍ未満，１０−５Ｍ未満，１０−６Ｍ未満，１０−７Ｍ未満，１０−８Ｍ未満，１０−９Ｍ未満，１０−１０Ｍ未満，１０−１１Ｍ未満，１０−１２Ｍ未満のいずれかの濃度で添加することができる。よって，レチノイドは，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，１０−１１Ｍ〜１０−５Ｍの濃度範囲，好ましくは１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍの濃度範囲，１０−９Ｍ〜１０−７Ｍの濃度範囲のいずれかの濃度で添加することができる。好適なレチノイドの添加濃度は例えば，１０−８Ｍまたは１０−７Ｍである。
【００３３】
本発明の一部の態様では，１０−８Ｍまたは１０−７ＭのａｔＲＡまたはＡＭ８０を使用することができる。
【００３４】
ラミニンは，培養容器の底面積に基づき，少なくとも０．０１μｇ／ｃｍ２以上，０．０５μｇ／ｃｍ２以上，０．１μｇ／ｃｍ２以上，０．２μｇ／ｃｍ２以上，０．３μｇ／ｃｍ２以上，０．４μｇ／ｃｍ２以上，０．５μｇ／ｃｍ２以上，０．６μｇ／ｃｍ２以上，０．７μｇ／ｃｍ２以上，０．８μｇ／ｃｍ２以上，０．９μｇ／ｃｍ２以上，１．０μｇ／ｃｍ２以上，１．５μｇ／ｃｍ２以上，２．０μｇ／ｃｍ２以上のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。また，レチノイドは，５．０μｇ／ｃｍ２未満，２．０μｇ／ｃｍ２未満，１．５μｇ／ｃｍ２未満，１．０μｇ／ｃｍ２未満，０．９μｇ／ｃｍ２未満，０．８μｇ／ｃｍ２未満，０．７μｇ／ｃｍ２未満，０．６μｇ／ｃｍ２未満，０．５μｇ／ｃｍ２未満，０．４μｇ／ｃｍ２未満，０．３μｇ／ｃｍ２未満，０．２μｇ／ｃｍ２未満，０．１μｇ／ｃｍ２未満，０．０５μｇ／ｃｍ２未満のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。よって，レチノイドは，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，０．０１μｇ／ｃｍ２〜５．０μｇ／ｃｍ２の濃度範囲，好ましくは０．１μｇ／ｃｍ２〜１．０μｇ／ｃｍ２の濃度範囲，０．２μｇ／ｃｍ２〜０．５μｇ／ｃｍ２の濃度範囲のいずれかの濃度で培地に添加あるいは培養容器にコーティングすることができる。好適なラミニンの使用濃度は例えば，０．２μｇ／ｃｍ２または０．５μｇ／ｃｍ２である。
【００３５】
ラミニンは，液体培地中における濃度の観点では，少なくとも０．１μｇ／ｍｌ以上，０．５μｇ／ｍｌ以上，１．０μｇ／ｍｌ以上，１．５μｇ／ｍｌ以上，２．０μｇ／ｍｌ以上，３．０μｇ／ｍｌ以上，４．０μｇ／ｍｌ以上，５．０μｇ／ｍｌ以上，６．０μｇ／ｍｌ以上，７．０μｇ／ｍｌ以上，８．０μｇ／ｍｌ以上，９．０μｇ／ｍｌ以上，１０．０μｇ／ｍｌ以上のいずれかの濃度で培地に添加することができる。また，レチノイドは，１５．０μｇ／ｍｌ未満，１０．０μｇ／ｍｌ未満，９．０μｇ／ｍｌ未満，８．０μｇ／ｍｌ未満，７．０μｇ／ｍｌ未満，６．０μｇ／ｍｌ未満，５．０μｇ／ｍｌ未満，４．０μｇ／ｍｌ未満，３．０μｇ／ｍｌ未満，２．０μｇ／ｍｌ未満，１．５μｇ／ｍｌ未満，１．０μｇ／ｍｌ未満，０．５μｇ／ｍｌ未満，０．１μｇ／ｍｌ未満，０．０５μｇ／ｍｌ未満のいずれかの濃度で培地に添加することができる。よって，レチノイドは，上記の上限および下限の任意の組み合わせ，例えば，０．０５μｇ／ｍｌ〜１５．０μｇ／ｍｌの濃度範囲，好ましくは１．０μｇ／ｍｌ〜１０．０μｇ／ｍｌの濃度範囲，１．５μｇ／ｍｌ〜５．０μｇ／ｍｌの濃度範囲のいずれかの濃度で添加することができる。本発明において０．２μｇ／ｃｍ２のラミニン濃度は，１．５〜２μｇ／ｍｌに相当する。よって，好適なラミニンの添加濃度は例えば，１．５μｇ／ｍｌ，２．０μｇ／ｍｌまたは５．０μｇ／ｍｌである。
【００３６】
本発明の一部の態様では，０．２μｇ／ｃｍ２または０．５μｇ／ｃｍ２のヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントを使用することができる。本発明の一部の態様では，１．５μｇ／ｍｌ，２．０μｇ／ｍｌまたは５．０μｇ／ｍｌのヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントを使用することができる。
【００３７】
分化抑制剤
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，筋サテライト細胞の筋分化を抑制するための組成物に関する。このような組成物を培地に加えて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。このような組成物は，分化抑制剤と呼ぶこともできる。使用するレチノイド，ラミニンおよび組成物中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。
【００３８】
分化誘導
本発明に係る分化抑制剤を含む培地を用いて増殖させた筋サテライト細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで筋肉細胞に分化させるためには，培地を本発明に係る分化抑制剤を含まない分化培地（例えば，２％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）に交換して，細胞を培養することができる。
【００３９】
培地組成物
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，細胞培養培地に関する。このような培地を用いて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，筋サテライト細胞の未分化性を維持しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド，ラミニンおよび培地組成物中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む，ヒト筋サテライト細胞を培養するための液体細胞培養培地であって，レチノイドがａｔＲＡまたはＡＭ８０であり，レチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍであり，ラミニンがヒトラミニン５１１Ｅ８フラグメントであり，ラミニンが液体培地中に含められており，ラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌであり，そして，培地中で培養されたヒト筋サテライト細胞の未分化性が維持される，細胞培養培地に関する。
【００４０】
培地サプリメント
本発明の一つの態様は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含むことを特徴とする，細胞培養培地サプリメントに関する。このようなサプリメントを培養培地に加えて筋サテライト細胞，好ましくはヒトの筋サテライト細胞を培養することにより，細胞の筋分化を抑制しながら細胞を増殖させることができる。使用するレチノイド，ラミニンおよびサプリメント中の他の成分の種類，濃度等は，本明細書の開示および技術常識に基づき適宜決定することができる。本サプリメントは，液体の形態であっても，粉末の形態であってもよい。本培地サプリメントは，筋サテライト細胞の培養に使用するキットに要素の一つとして含められてもよい。
【００４１】
本細胞培養培地サプリメントは，例えば，細胞培養培地に加えられた際のレチノイドの濃度が少なくとも１０−８Ｍとなるように調製されうる。また，本細胞培養培地サプリメントは，例えば，細胞培養培地に加えられた際のラミニンの濃度が少なくとも１．５μｇ／ｍｌとなるように調製されうる。本細胞培養培地サプリメントは，Ｇ−ＣＳＦ，ｂＦＧＦ，ＩＬ−１α，ＩＬ−１３，ＩＦＮ−γ，ＴＮＦ−α，ＧＳＫ３阻害剤，ｓａｌ００３，ｐ３８阻害剤（例えば，Stem cell reports, 2015, 5, p621-632に記載のＳＢ２０３５８０），（Ｒ）−ＰＦＩ−２（Cell stem cell 22, 177-190, 2018）およびその混合物から成る群より選択される少なくとも１つの因子をさらに含んでいてもよい。
【００４２】
細胞製造方法
本発明の一つの態様は，細胞移植に用いるための細胞の製造方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程を含むことを特徴とする，細胞の製造方法に関する。培養する筋サテライト細胞は，当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。使用する培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。
【００４３】
細胞の移植は，例えば，損傷した部位の再生を目的として，あるいは機能の低下した臓器・組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象は，好ましくはヒトであるが，特に限定はされない。ヒトに対して移植を行う場合は，細胞の培養にはＧＭＰグレードの試薬が用いられる。本製造方法において用いられる筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。
【００４４】
細胞組成物
本発明の一つの態様は，少なくとも１０５個の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。従来，筋サテライト細胞を未分化状態を維持したまま増殖させて大量に得ることは困難であったが，このような細胞組成物は，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養することにより調製されうる。本細胞組成物は，少なくとも１０５個，例えば，１０６個以上，好ましくは１０７個以上，より好ましくは１０８個以上，さらに好ましくは１０９個以上の筋サテライト細胞を含む。なお，本細胞組成物には筋サテライト細胞以外の細胞が混入していても良いが，筋サテライト細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物における筋サテライト細胞の純度は，少なくとも５０％以上，好ましくは８０％以上，より好ましくは８５％以上，９０％以上，または９５％以上である。本細胞組成物に含まれる細胞は，好ましくはヒトの細胞であるが，特に限定はされない。本発明の一つの態様では，筋サテライト細胞を含む細胞組成物は１つの容器に納められている。
【００４５】
本細胞組成物は，例えば，治療を目的とした移植に用いることができる。細胞の移植は，例えば，損傷した部位の再生を目的として，あるいは機能の低下した組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象は，好ましくはヒトであるが，特に限定はされない。本発明の一つの態様は，疾患または傷害の治療に用いるための，少なくとも１０５個，例えば，１０６個以上，好ましくは１０７個以上，より好ましくは１０８個以上，さらに好ましくは１０９個以上の筋サテライト細胞を含む細胞組成物に関する。治療の対象となる疾患は例えば，筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病,およびサルコペニアであるが，これらに限定はされない。
【００４６】
本細胞組成物に含まれる筋サテライト細胞は，何らかの疾患を有する患者，または疾患を発症する遺伝的素因を有する被験者に由来する細胞であってもよい。疾患は例えば，筋ジストロフィーである。このような疾患に関連する細胞組成物は，医薬品の開発を目的としたスクリーニングやアッセイに用いることができる。
【００４７】
筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。筋サテライト細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であってもよい。
【００４８】
また，本発明の一つの態様は，少なくとも５×１０５個，例えば，１０６個以上，好ましくは１０７個以上，より好ましくは１０８個以上，さらに好ましくは１０９個以上の筋サテライト細胞の封入されたバイアルまたは容器に関する。バイアルまたは容器は，ガラス製またはプラチック製でありうる。バイアルまたは容器中の細胞は，凍結状態または反凍結状態であってもよい。
【００４９】
治療方法
本発明の一つの態様は，患者における疾患または傷害の治療方法であって，（ｉ）レチノイド，および（ｉｉ）ラミニンを含む培地を用いて筋サテライト細胞を培養する工程，および，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を患者に移植する工程を含む，治療方法に関する。
【００５０】
培養する筋サテライト細胞は，当業者に公知の任意の方法を用いて調製することができる。筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。筋サテライト細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であってもよい。筋サテライト細胞に由来する細胞とは，筋サテライト細胞から分化した細胞を含む。使用する培地の組成，培養条件（温度，期間等）は，当業者であれば適宜調整することができる。
【００５１】
細胞の移植は，例えば，損傷した部位の再生を目的として，あるいは機能の低下した臓器・組織の再生を目的として行うことができる。移植の対象となる患者は，好ましくはヒトであるが，特に限定はされない。治療の対象は，イヌ，ネコ，サルなどを含む非ヒト哺乳動物であってもよい。治療の対象となる疾患は例えば，筋ジストロフィー，先天性ミオパチー，遠位型ミオパチー，筋強直性疾患，炎症性筋疾患，周期性四肢麻痺，代謝性筋疾患，重症筋無力症，先天性筋無力症候群，ミトコンドリア病,およびサルコペニアであるが，これらに限定はされない。治療の対象となる疾患には例えば，糖尿病も含まれる。疾患または傷害の治療に有効な物質を分泌するように遺伝子改変した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞を体内に埋め込むことにより，疾患を治療することも可能である。
【００５２】
移植は，例えば，移植部位に細胞を直接注入することにより行うことができる。あるいは，細胞を例えばスキャフォールド上で培養し，スキャフォールドと細胞を共に体内に移植してもよい。
【００５３】
スクリーニング方法
本発明の一つの態様は，筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響する物質のスクリーニング方法であって，（ｉ）レチノイドおよび（ｉｉ）ラミニンの存在下で筋サテライト細胞を培養する工程，培養した筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞に試験物質を接触させる工程，試験物質が筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の分化，増殖または生存に影響するか否かを評価する工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【００５４】
筋サテライト細胞の単離は，当業者に公知の任意の方法により行うことができる。筋サテライト細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であってもよい。
【００５５】
筋サテライト細胞は，何らかの疾患を有する患者，または疾患を発症する遺伝的素因を有する被験者に由来する細胞であってもよい。疾患は例えば，筋ジストロフィーである。例えば，筋ジストロフィー患者の筋サテライト細胞またはそれに由来する細胞の増殖または生存を改善する物質は，筋ジストロフィーの治療に有用となりうると考えられる。「細胞の分化に影響する」とは，細胞の分化を促進または抑制することを含む。「細胞の増殖に影響する」とは，細胞の増殖を促進または抑制することを含む。「細胞の生存に影響する」とは，細胞の生存期間もしくは生存率を改善する，または細胞をアポトーシスやネクローシス等により死滅させることを含む。本スクリーニング方法において用いられる筋サテライト細胞は，ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。試験物質には，低分子化合物，ペプチド，タンパク質，核酸などが含まれるが，特に限定はない。
【００５６】
以下に，実施例を示して本発明を具体的に説明するが，これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００５７】
実施例１：骨格筋幹細胞の調製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（３〜１０週齢）の後肢筋（大.四頭筋，前頸骨筋，腓腹筋等）より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては，（ｉ）０．１４％プロテアーゼ（Sigma-Aldrich社）を含むＤＭＥＭ培地で３７℃，３０分間処理し，ＤＭＥＭ培地による洗浄を行った後に播種する方法，あるいは（ｉｉ）酵素消化後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により単離する方法（Exp Cell Res. 10, 245-255, 2004; Nat Med. 20 , 255-264,2014）を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン，２〜１０ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦ（Peprotec社）を添加したDMEM, High Glucose, GlutaMAX,Pyruvate（Thermo FisherScientific社）で３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。【００５８】
実施例２：レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の未分化性の維持に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系において，オールトランスレチノイン酸（all-trans-Retinoicacid：以下ａｔＲＡ）あるいは合成レチノイド化合物Ａｍ８０を増殖培地に１０−１１Ｍ〜１０−５Ｍの濃度で添加し，３７℃，５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。骨格筋幹細胞の未分化性は，以下に示す免疫染色法によって解析した。まず細胞を４％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した後，３回ＰＢＳによって洗浄した。次に０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳによって室温，５分間処理し，再度ＰＢＳによって３回洗浄を行った。５％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温，１時間ブロッキング処理を行った後，抗Ｐａｘ７抗体（SantaCruz社）と抗ＭｙｏＤ抗体（Ｄａｋｏ社）を用いて４℃，overnightで処理した。ＰＢＳによって３回洗浄を行った後，二次抗体（抗マウスＩｇＧ−Alexa Fluor594と抗ウサギＩｇＧ−Alexa Fluor488）で室温，１時間処理し，再度ＰＢＳで３回洗浄した後，Hoechst33342を用いて核染色を行い，蛍光顕微鏡（オリンパス社）によって観察した。【００５９】
まず全細胞数中のＭｙｏＤ陽性細胞を算出し，実験に用いた筋細胞培養系の純度を解析した。その結果，１００％筋系譜のＭｙｏＤ陽性細胞であることを確認した。次にＭｙｏＤ陽性細胞中の，未分化性マーカーであるＰａｘ７陽性の細胞（骨格筋幹細胞）割合を解析した。その結果，ａｔＲＡおよびＡｍ８０ともに１０−７Ｍ〜１０−５Ｍの濃度でＰａｘ７陽性細胞割合が有意に増加した（図１ａおよびｂ）。【００６０】
実施例３：レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の筋管形成能に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系を分化培地（２％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）で培養し，筋分化を誘導した。さらに分化培地にａｔＲＡあるいはＡｍ８０を１０−１１Ｍ〜１０−５Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体（Developmental Studies HybridomaBank）による免疫染色を実施例２と同様に行い，筋細胞が融合した筋管を可視化した。【００６１】
結果として，ａｔＲＡ，Ａｍ８０ともに１０−７Ｍおよび１０−５Ｍの濃度で著しく筋管の形成を抑制した（図２）。【００６２】
実施例４：レチノイド化合物の骨格筋幹細胞の増殖能に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡを１０−７Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の筋細胞の増殖能に対する作用を解析した。解析にはClick-iT(登録商標) Plus EdU AlexaFluor(登録商標) 594 Imaging Kit（Thermo Fisher SCIENTIFIC社）と抗ＭｙｏＤ抗体を用いて，定法に従って検出した。また，免疫染色は実施例２と同様の方法で行った。【００６３】
結果として，１０−７ＭのａｔＲＡの添加により，ＭｙｏＤ陽性の骨格筋細胞の増殖能（ＥｄＵを取り込んだ細胞割合）が有意に増加した（図３）。【００６４】
実施例５：レチノイド化合物添加による骨格筋幹細胞の長期的な維持
実施例１で調製した骨格筋幹細胞培養を１０−７ＭのａｔＲＡを添加あるいは無添加の増殖培地で培養し，５回経代した。これらの細胞におけるＰａｘ７，ミオシン重鎖および内在性コントロールとしてベータチューブリン（β-Tubulin）を定法に従いウェスタンブロット法によって解析した。さらに１０−７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で１６回経代した骨格筋筋幹細胞培養系における未分化性を抗Ｐａｘ７抗体と抗ＭｙｏＤ抗体を用いて，実施例２と同様に解析した。【００６５】
結果として，５回の経代によってａｔＲＡ無添加の培地で培養した骨格筋幹細胞は多くの細胞が扁平で巨大な形態を示すのに対し，ａｔＲＡ添加区の細胞はその多くが経代をしていない初代の骨格筋細胞と同様に丸い形態を示した（図４ａおよびｂ）。また，ａｔＲＡ添加区の骨格筋細胞は，無添加区の細胞と比較して幹細胞マーカーであるＰａｘ７を高く発現し，分化マーカーであるミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）の発現が減弱した（図４ｃ）。さらに１６回経代し，長期的に維持した骨格筋幹細胞においても８８％の細胞が未分化マーカーであるＰａｘ７を発現し，１０−７ＭのａｔＲＡの添加することで未分化性を長期に維持できることが明らかとなった。（図５）。また，この細胞を分化培地によって分化誘導したところ，正常にミオシン重鎖を発現する筋管を形成した（図６）。【００６６】
実施例６：他のレチノイド化合物の筋分化抑制に対する作用
実施例１で調製した骨格筋幹細胞を分化培地にＲＡＲアゴニストであるａｔＲＡ，Ａｍ８０，ＡＭ５８０，Ａｍ５５５Ｓ，Ｅｓ８０，Ｅｓ５８０，Ｒｅ８０，Ｆｖ８０，Ｃｈ５５，Ａｚ８０，さらにＲＸＲアゴニストであるＰＡ０２４，ＨＸ６３０，ＬＧ２６８を１０−６Ｍ〜１０−８Ｍの濃度で添加して９６時間培養した。その後，筋管形成能を比較することによって筋分化抑制に対するレチノイド化合物の作用を解析した。【００６７】
結果として，ＲＡＲアゴニストは全て筋管の形成を抑制した。一方，ＲＸＲアゴニストは筋管の形成を抑制しなかった（図７）。【００６８】
実施例７：培養基質ｉＭａｔｒｉｘ−５１１の骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する作用
株式会社ニッピ（東京，日本）から購入した培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１−Ｅ８−ｓｉｌｋを用いて，骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで，ｉＭａｔｒｉｘ-５１１によってヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている（Sci Rep 4:3594）。また，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１は継代時の細胞懸濁液に添加することで，培養皿にプレコーティング（ｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇ）した時と同様の効果が得られることが報告されている（Sci Rep 7:41165）。そこで，実施例１で調製した骨格筋幹細胞をＭａｔｒｉｇｅｌでＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿，０．５μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ−５１１でＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿，継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２，あるいは０．５μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，４８時間培養した。その後，MACHEREY-NAGEL社のNucleoSpin RNAを用いてＲＮＡを抽出し，ＴＯＹＯＢＯ社のReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Removerを用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡをKAPABiosystems社のKAPA SYBR FAST qPCR MasterMixを用いて，Ｐａｘ７，Ｍｙｏｇｅｎｉｎ（Ｍｙｏｇ），さらにMuscle CreatineKinase（ＭＣＫ）の発現量をｑＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した。【００６９】
結果として，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１をＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした実験区とｉＭａｔｒｉｘ−５１１を継代時に細胞懸濁液に添加した実験区（０．２μｇ／ｃｍ２および０．５μｇ／ｃｍ２）において，Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした実験区と比較してＭｙｏｇとＭＣＫの発現が有意に減少した。一方，Ｐａｘ７の発現量には影響しなかった。（図８）【００７０】
実施例８：レチノイド化合物とｉＭａｔｒｉｘ−５１１の骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する相乗効果
実施例６と同様に，骨格筋幹細胞を下記の３通りの方法で培養した：
（１）ＭａｔｒｉｇｅｌでＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；
（２）ｉＭａｔｒｉｘ−５１１を継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるように添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法；
（３）ｉＭａｔｒｉｘ−５１１を継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるように添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，１０−７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法。【００７１】
その後，実施例２と同様の方法でＰａｘ７陽性細胞率およびＭｙｏｇ陽性細胞率から骨格筋幹細胞の未分化性・分化抑制に対するｉＭａｔｒｉｘ−５１１とａｔＲＡの相乗効果を解析した。【００７２】
結果として，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１とａｔＲＡを併用した実験区が最もＰａｘ７の陽性細胞率が高く，Ｍｙｏｇ陽性細胞率が低くなり，筋分化を抑制して未分化性が維持されていることが明らかとなった（図９）。【００７３】
実施例９：培養基質ｉＭａｔｒｉｘ−５１１とレチノイド化合物添加による骨格筋幹細胞の未分化性維持・分化抑制に対する作用
株式会社ニッピ（東京，日本）から購入した培養基質ｉＭａｔｒｉｘ５１１−Ｅ８−ｓｉｌｋを用いて，骨格筋幹細胞の分化抑制効果を検討した。これまで，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１によってヒトＥＳ細胞とｉＰＳ細胞の樹立から拡大まで行えることが報告されている（Sci Rep 4:3594）。また，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１は継代時の細胞懸濁液に添加することで，培養皿にプレコーティング（ｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇ）した時と同様の効果が得られることが報告されている（Sci Rep 7:41165）。そこで，下記６通りの実験区に実施例１で調製した骨格筋幹細胞を播種し，培養４８時間後に解析した。
（１）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法
（２）Ｍａｔｒｉｇｅｌをｐｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し，１０−７Ｍのオールトランス型レチノイン酸（ａｔＲＡ）を添加した増殖培地で培養する方法
（３）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ−５１１でＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、増殖培地で培養する方法
（４）０．２μｇ／ｃｍ２となるようｉＭａｔｒｉｘ−５１１でＰｒｅ−ｃｏａｔｉｎｇした培養皿に播種し、１０−７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法
（５）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，増殖培地で培養する方法
（６）継代時に細胞懸濁液に０．２μｇ／ｃｍ２となるよう添加し，コーティング無しの培養皿に播種し，１０−７ＭのａｔＲＡを添加した増殖培地で培養する方法【００７４】
培養４８時間後に細胞を４％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した後，３回ＰＢＳによって洗浄した。次に０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳによって室温，５分間処理し，再度ＰＢＳによって３回洗浄を行った。５％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温，１時間ブロッキング処理を行った後，抗Ｐａｘ７抗体（Santa Cruz社）と抗ＭｙｏＤ抗体（Ｄａｋｏ社）を用いて４℃，overnightで処理した。ＰＢＳによって３回洗浄を行った後，二次抗体（抗マウスＩｇＧ−Alexa Fluor 594と抗ウサギＩｇＧ−Alexa Fluor 488）で室温，１時間処理し，再度ＰＢＳで３回洗浄した後，Hoechst 33342を用いて核染色を行い，蛍光顕微鏡（オリンパス社）によって観察した。Ｐａｘ７陽性細胞率およびＭｙｏｇ陽性細胞率を解析し，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１とレチノイド化合物の相乗効果を検討した。【００７５】
結果として，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１とａｔＲＡを併用した実験区が最もＰａｘ７の陽性細胞率が高く，Ｍｙｏｇ陽性細胞率が低くなり，筋分化を抑制して未分化性が維持されていることが明らかとなった（図１０）。【００７６】
実施例１０：ヒト骨格筋幹細胞の調製
ヒト骨格筋検体（中臀筋）より骨格筋幹細胞を単離した。単離方法としては，筋検体を酵素消化し単離された細胞を培養後にフローサイトメーター（ＢＤ社，AriaII）により純化する方法（Methods Mol Biol. 1460:241-253, 2016）を用いた。得られた骨格筋幹細胞は増殖培地（２０％ウシ胎児血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸，２.５ｎｇ／ｍｌ最終濃度のｂＦＧＦ（Peprotec社）を添加したＤＭＥＭ，Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Thermo Fisher Scientific社）を用いて３７℃，３％Ｏ２, ５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した。【００７７】
実施例１１：レチノイド化合物のヒト骨格筋幹細胞の増殖に対する効果
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系において，ａｔＲＡあるいはＡｍ８０を増殖培地に１０−８Ｍ〜１０−６Ｍの濃度で添加し，３７℃，３％Ｏ２, ５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間培養した。骨格筋幹細胞の増殖をＷＳＴ−８アッセイ（Dojindo社）により評価した。アッセイ溶液添加３時間後，Multiskan JX（Thermo Fisher Scientific社）を用いて４５０ｎｍの吸光度を測定することで細胞増殖の定量を行った。【００７８】
その結果，１０−６ＭのＡｍ８０添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が抑制された（図１１）。【００７９】
実施例１２：レチノイド化合物のヒト骨格筋幹細胞の筋管形成能に対する作用
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系を分化培地（5％ウマ血清，ペニシリン・ストレプトマイシン・グルタミン酸を含むＤＭＥＭ）で培養し，筋分化を誘導した。さらに分化培地にａｔＲＡあるいはＡｍ８０を１０−８Ｍ〜１０−６Ｍの濃度で添加し，レチノイド化合物の分化能に対する作用を解析した。具体的には抗ミオシン重鎖抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank）による免疫染色を実施例２と同様に行い，筋細胞が融合した筋管を可視化した。【００８０】
結果として，ａｔＲＡ，Ａｍ８０ともに１０−７Ｍおよび１０−６Ｍの濃度で筋管の形成を抑制したが、分化抑制効果はａｔＲＡの方が強かった（図１２）。【００８１】
実施例１３：ａｔＲＡのヒト骨格筋幹細胞における筋分化制御因子の発現に及ぼす影響
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡを１０−７Ｍ〜１０−６Ｍの濃度で添加し，ａｔＲＡの筋分化制御因子の発現に及ぼす影響を解析した。３日間の培養後、RNeasy Micro Kit（Qiagen社）を用いてＲＮＡを単離し、QuantiTect RT Kit（Qiagen社）を用いて逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを用いてＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法（Thermal Cycler Dice: Takara社）で相対定量解析した。内部コントロール遺伝子としてＮＤＵＦＡ１３を用いた。【００８２】
結果として，１０−７Ｍ〜１０−６ＭのａｔＲＡの添加により，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現は抑制されたが、１０−６Ｍの方がより強く抑制された（図１３）。【００８３】
実施例１４：ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ−５１１がヒト骨格筋幹細胞における筋分化制御因子の発現に及ぼす相乗効果
実施例１０で調製したヒト骨格筋幹細胞培養系の増殖培地にａｔＲＡは１０−６Ｍの濃度で，また，ｉＭａｔｒｉｘ−５１１は０．１〜０．５μｇ／ｃｍ２となるように添加し，３日間培養した。実施例１３と同様の方法で，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現をリアルタイムＰＣＲ法で相対定量解析した。【００８４】
その結果，１０−６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ−５１１を添加した場合において，ＭＹＯＤ１，ＭＹＯＧの遺伝子発現が最も抑制された（図１４）。【００８５】
実施例１５：ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ−５１１がヒト骨格筋幹細胞の増殖に及ぼす相乗効果
実施例１１と同様の方法で，ヒト骨格筋幹細胞を１０−６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ−５１１の存在下で３日間培養した。実施例１１と同様の方法で，細胞増殖の定量を行った。【００８６】
その結果，１０−６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ−５１１の添加によりヒト骨格筋幹細胞の増殖が促進された（図１５）。【００８７】
実施例１６：ａｔＲＡとｉＭａｔｒｉｘ−５１１がヒト骨格筋幹細胞の移植効率に及ぼす影響
実施例１１と同様の方法で，ヒト骨格筋幹細胞を１０−６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ−５１１の存在下で培養した。５週齢のＮＯＧ−ｍｄｘマウスの前脛骨筋に，培養された細胞を移植した（細胞数４ｘ１０５個）。移植４週間後，前脛骨筋の迅速凍結切片を作成し，ウサギ抗ジストロフィン抗体（Abcam社）とマウス抗ヒトスペクトリン抗体（Leica社），ラット抗ラミニンα２鎖抗体（Santa Cruz社）を用いて染色した。二次抗体（抗ウサギＩｇＧ−Alexa Fluor 488と抗マウスＩｇＧ−Ｃｙ３，抗ラットＩｇＧ−Alexa Fluor 647）による二次染色の後，蛍光顕微鏡（Leica社）によって染色像を取得した。前脛骨筋の断面の全筋線維に対するヒトスペクトリン陽性筋線維の割合を算出し，移植効率とした。【００８８】
その結果，１０−６ＭのａｔＲＡと０．１μｇ／ｃｍ２のｉＭａｔｒｉｘ−５１１を添加し培養されたヒト骨格筋幹細胞が最も高い移植効率を示し（図１６ａ）、その値は細胞移植の治療効果が見込める１０％を超えた（図１６ｂ）。【００８９】
本明細書には，本発明の好ましい実施態様を示してあるが，そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは，当業者には明らかであり，当業者であれば，本発明から逸脱することなく，様々な変形，変更，置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が，本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また，本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む，全ての刊行物に記載の内容は，その引用によって，本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明者らは，レチノイドとラミニンを含む培地中で細胞を培養することによって，筋幹細胞の未分化性を保持したまま，細胞を増殖させることが可能であることを見出した。本技術は簡便かつ安全で，高い効率で筋幹細胞の未分化性を維持できることから，筋ジストロフィーをはじめとした筋疾患に対する細胞移植治療や，化合物スクリーニング系の開発，再生医療への応用が期待される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【国際調査報告】
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