(57)【要約】  本明細書において、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤が提供される。
2020040186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤。 
【請求項２】
癌が乳癌である、請求項１に記載の癌転移抑制剤。 
【請求項３】
癌が、ホルモン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、請求項２に記載の癌転移抑制剤。 
【請求項４】
ホルモン受容体が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体である、請求項３に記載の癌転移抑制剤。 
【請求項５】
癌細胞が、ＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、請求項３または４に記載の癌転移抑制剤。
【請求項６】
ＨＳＰ４７の阻害物質が、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクター、またはこれらで形質転換された細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤。 
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌転移抑制剤を含む医薬組成物。 
【請求項８】
癌を処置するための、請求項７に記載の医薬組成物。 
【請求項９】
転移性肺癌を処置するための、請求項８に記載の医薬組成物。 
【請求項１０】
癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＨＳＰ４７の阻害物質の使用。 
【請求項１１】
癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１０に記載の使用。 
【請求項１２】
癌の転移の抑制における使用のための、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む組成物。 
【請求項１３】
癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を癌患者に投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法。 
【請求項１５】
前記癌患者が乳癌患者であって、前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程を含む、請求項１４に記載の癌の転移抑制方法。 
【請求項１６】
前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、前記癌患者の癌組織がＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現しているか否かを確認する工程を含む、請求項１４または１５に記載の癌の転移抑制方法。
【請求項１７】
外科的治療、放射線治療、粒子線治療、化学療法、及び分子標的治療からなる群より選択される治療と共に行われる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の癌の転移抑制方法。 
【請求項１８】
癌患者由来の癌細胞を、有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を用いてインビトロで処置することを含む、インビトロで癌の転移を抑制する方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の転移を抑制するための医薬およびその方法に関する。 
【背景技術】
【０００２】
癌治療においては、癌細胞死の誘導による治療、癌細胞の増殖抑制による治療および癌組織の除去による治療が主流であるが、これらの治療と組み合わせて、癌細胞の転移抑制の治療を行うことは、癌の進行や癌の再発防止の観点で重要である。しかし、癌細胞の転移を抑制するための有効な治療が実現化されていない。そのため、癌治療において、癌細胞の転移を抑制する手法の確立が望まれている。癌治療の手法としては、特許文献１には、heat shock protein 47（ＨＳＰ４７）を標的化する分子を用いて、腫瘍の増殖を抑制することで、腫瘍を治療することが記載されている。 【０００３】
トリプルネガティブ乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、およびヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）の発現が陰性であり、高転移能を有していることから、従来の乳癌治療法（化学療法、ホルモン療法、分子標的治療）の効果がほとんど発揮されず、現状、それに対する解決策は皆無である。例えば、近年、乳癌治療の分子標的薬としてＨＥＲ２を標的とする抗体医薬が使用されているが、トリプルネガティブ乳癌はＨＥＲ２が陰性であるため、このような分子標的薬によって、細胞死や増殖抑制を誘導することが困難である。また、トリプルネガティブ乳癌には、ホルモン療法が奏効しない。トリプルネガティブ乳癌を外科的に除去する治療が可能であるが、外科的に癌組織を除去したとしても、癌細胞の一部が体内から除去しきれない場合がある。トリプルネガティブ乳癌は遠隔組織への転移能が非常に高いため、外科的な処置を施したとしても、残存するリスクを考慮して、転移を抑制する治療を併せて行うことが望ましい。しかしながら、一般的に、癌細胞の転移を抑制するための有効な治療は確立されていない。このように、乳癌、特にトリプルネガティブ乳癌についても高転移能の獲得機序は未解明であり、転移の制御・抑制を行える治療法も無い。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第2017/0218365号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高悪性度かつ高転移能の癌の転移を抑制することを課題とする。 
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねる中で、トリプルネガティブ乳癌において、その一部の細胞集団がＨＳＰ４７を高発現していること、ＨＳＰ４７陽性トリプルネガティブ乳癌細胞は非常に転移能が高いこと、そして、トリプルネガティブヒト乳癌において、ＨＳＰ４７の発現を抑制することにより、その転移能を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。 
さらに、本発明者らは、HSP４７タンパク質が、細胞運動の重要な因子であるnon-muscle myosin IIA; NMIIA (MYH9)に結合することを新たに見出している。HSP47は、細胞運動に重要な因子に結合して、細胞運動制御に関与しており、HSP47の阻害物質は、HSP47の発現阻害を介して、細胞運動を抑制することが予想される。MYH9は、トリプルネガティブヒト乳癌に限らず、乳癌以外の他の癌細胞においても発現しているため、HSP47の発現調節を介した細胞運動調節は、トリプルネガティブヒト乳癌以外の癌細胞に対しても適用できると予測される。【０００７】
すなわち、本発明は、以下に関するものである。 
（１）ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤。 
（２）癌が乳癌である、（１）に記載の癌転移抑制剤。 
（３）癌が、ホルモン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、（２）に記載の癌転移抑制剤。 
（４）ホルモン受容体が、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体である、（３）に記載の癌転移抑制剤。 
（５）癌細胞が、ＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、（３）または（４）に記載の癌転移抑制剤。
（６）ＨＳＰ４７の阻害物質が、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、これらを発現するベクター、またはこれらで形質転換された細胞である、（１）〜（５）のいずれかに記載の癌転移抑制剤。 
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の癌転移抑制剤を含む医薬組成物。 
（８）癌を処置するための、（７）に記載の医薬組成物。 
（９）転移性肺癌を処置するための、（８）に記載の医薬組成物。 
（１０）癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＨＳＰ４７の阻害物質の使用。 
（１１）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１０）に記載の使用。 
（１２）癌の転移の抑制における使用のための、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む組成物。 
（１３）癌がトリプルネガティブ乳癌である、（１２）に記載の組成物。 
（１４）有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を癌患者に投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法。 
（１５）前記癌患者が乳癌患者であって、前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程を含む、（１４）に記載の癌の転移抑制方法。 
（１６）前記有効量のＨＳＰ４７の阻害物質の投与前に、前記癌患者の癌組織がＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現しているか否かを確認する工程を含む、（１４）または（１５）に記載の癌の転移抑制方法。
（１７）外科的治療、放射線治療、粒子線治療、化学療法、及び分子標的治療からなる群より選択される治療と共に行われる、（１４）〜（１６）のいずれかに記載の癌の転移抑制方法。 
（１８）癌患者由来の癌細胞を、有効量のＨＳＰ４７の阻害物質を用いてインビトロで処置することを含む、インビトロで癌の転移を抑制する方法。 
【発明の効果】
【０００８】
本発明の癌転移抑制剤は、癌細胞におけるＨＳＰ４７の発現を阻害することにより、癌の転移を抑制することができる。本発明の方法は、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与することにより、癌の転移を抑制することができる。 
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ヒト乳癌細胞におけるＨＳＰ４７  ｍＲＮＡ（左図）とＨＳＰ４７タンパク質（右図）の発現を示す。トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類(MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157)および非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MCF7, BT474)におけるＨＳＰ４７  ｍＲＮＡおよびＨＳＰ４７タンパク質の発現をReal time-PCRとウエスタンブロット法にて検出した。
【図２】図２は、腫瘍由来トリプルネガティブヒト乳癌細胞におけるHSP47陽性細胞率を示す。トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-157)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに皮下移植を行い、腫瘍形成後、腫瘍細胞を採取して、抗ＨＳＰ４７抗体（Enzo Life Sciences）を用いて、フローサイトメーター解析を行った。
【００１０】
【図３】図３は、ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能を示す。pCMV6-entryプラスミド(Mock)、もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して作成したＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-157)を、1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。
【図４】図４は、ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞運動能を示す。pCMV6-entryプラスミド(Mock)、もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して作成したＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-157)を1×104 cells/wellでdouble chamberに播種し、培養開始後24時間目に、ヘマトキシリン染色を行い、細胞カウントにより細胞運動能を測定した。
【図５】図５は、ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の肺転移能を示す。pCMV6-entryプラスミド(Mock)、もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して作成したHSP47強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、ＨＥ染色にて調べた。
【００１１】
【図６】図６は、ＨＳＰ４７発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能を示す。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはＨＳＰ４７  ｓｈＲＮＡ発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。
【図７】図７は、ＨＳＰ４７発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞運動能を示す。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはHSP47 shRNA発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。
【図８】図８は、ＨＳＰ４７発現抑制によるヒトトリプルネガティブ乳癌細胞の肺転移能を示す。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはＨＳＰ４７  ｓｈＲＮＡ発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、ＨＥ染色にて調べた。
【図９】図９は、トリプルネガティブ乳癌細胞におけるＨＳＰ４７とＭＹＨ９との相互作用を示す。全細胞抽出液（WCL）と、抗Myc抗体結合担体を用いて抽出された成分とを、SDS-PAGEに供試し、ウエスタンブロッティングにてＭＹＨ９とＨＳＰ４７との会合を確認した。
【００１２】
【図１０Ａ】図１０Ａは、非トリプルネガティブ乳癌細胞株MCF7であるMock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）におけるMYH9タンパク質およびHSP47タンパク質の発現を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）のインビトロ増殖を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）の浸潤をスクラッチアッセイによって調査した結果を示す。浸潤した領域の代表的な画像（上図）および定量化グラフ（下図）を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）の遊走を、ダブルチャンバーアッセイによって調査した結果を示す。遊走した細胞の代表的な画像（上図）および定量化グラフ（下図）を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）を、Balb/c nu/nu雌性マウスの乳房脂肪パッドに移植し、腫瘍形成能を調査した結果を示す。*P<0.05。 n.s: 有意でない。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、Mock細胞、MYH9発現細胞（Mock+MYH9-GFP）、HSP47ノックアウト（KO）細胞、および、MYH9発現HSP47 KO細胞（HSP47 KO+MYH9-GFP）を移植したBalb/c nu/nu雌性マウスの肺組織の組織学的分析の結果を示す。スケールバー：２００μｍ。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ヒト乳癌細胞におけるＭＹＨ９  ｍＲＮＡの発現を示す。トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-468)におけるＭＹＨ９  ｍＲＮＡの発現をReal time-PCRにて検出した。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、MYH9発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能を示す。siControl、もしくはMYH9 siRNA(siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231およびMDA-MB-468)を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。
【図１２】図１２Ａは、ＭＹＨ９発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞運動能を示す。siControl、もしくはMYH9 siRNA(siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231, MDA-MB-468)を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。図１２Ｂは、ＨＳＰ４７発現抑制によるヒトトリプルネガティブ乳癌細胞の肺転移能を示す。siControl、もしくはMYH9 siRNA(siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C)を遺伝子導入して作成したトリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231, MDA-MB-468)を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図１２Ｂに示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む癌転移抑制剤、これを含む医薬組成物およびキット、ならびにＨＳＰ４７の阻害物質を投与することを含む癌の転移を抑制するための方法が提供される。 
本発明の癌転移抑制剤、医薬組成物、キットおよび方法は、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、例えば配列番号１によって例示されるＨＳＰ４７のｍＲＮＡに結合する核酸分子（例えば短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖（double-stranded）ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））を使用すること、あるいは、ＨＳＰ４７遺伝子をゲノム編集技術を使用してノックアウトすることを特徴とする。 
【００１４】
１．本発明の癌転移抑制剤 
本発明の一側面は、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む癌転移抑制剤、例えば、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤を含む、癌転移抑制剤に関する。 
ＨＳＰ４７遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり、本発明において、ＨＳＰ４７のｍＲＮＡ配列は、配列番号１によって示される。 
【００１５】
本発明において、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡは、例えば、ヒト由来であり、配列番号１で示される塩基配列またはこの各塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入を含む塩基配列、或いは、上記の各塩基配列と７０％以上、８０％以上又は９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上もしくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。 
本明細書において、「数個」とは、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個の塩基数をいう。また、配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができる。 
【００１６】
本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤は、ＨＳＰ４７の発現を阻害する成分、又は、ＨＳＰ４７タンパク質の機能を阻害する成分であってもよく、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）作用を有する、ｓｉＲＮＡ若しくはその前駆体ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ）、又はそれらの修飾ＲＮＡ、或いは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写体ＲＮＡに対するｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを包含する。また、本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤は、例えば、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡなどであってもよい。ベクターは、アンチセンスＲＮＡ若しくはアンチセンスＤＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ若しくは該アンチセンスＤＮＡを含んでいてもよい。本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤は、例えば、ｓｈＲＮＡ、または、ｓｈＲＮＡを含むプラスミドベクターが好ましい。かかるｓｈＲＮＡは、Ｏｒｉｇｅｎ社から購入することができる。あるいは、本発明において、ＨＳＰ４７の発現の阻害剤として、ｇＲＮＡ配列(例えば、5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号８）)をコードするプラスミドを使用するゲノム編集技術を使用してＨＳＰ４７遺伝子をノックアウトすることもできる。
【００１７】
本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に実質的に相補的な１８〜２５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２４ヌクレオチド、さらに好ましくは、２１〜２３ヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡ、を有し、かつＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）作用を有する、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡであってもよい。 
本発明において、「相補的」とは、核酸が、他の核酸配列と、古典的なワトソン−クリック型か、または他の非古典的なタイプにより水素結合を形成できることを意味する。 
また、本発明において、「実質的に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、他の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成する場合のみならず、核酸配列の全ての残基のうち、例えば、７０％、８０％、および９０％の残基が、他の核酸配列の残基と水素結合を形成する場合も含む。 
したがって、本発明において、ｓｉＲＮＡは、ＨＳＰ４７遺伝子の転写体ＲＮＡの一部に１００％相補的なヌクレオチドから数塩基変更されているヌクレオチドを含むアンチセンスＲＮＡを有していてもよい。 
また、本発明において、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの各３'末端には、２〜５ヌクレオチド、好ましくは２ヌクレオチドの突出末端を有していてもよい。また、本発明において、ｓｉＲＮＡは、修飾ｓｉＲＮＡであってもよい。 
例えば、本発明において、ｓｉＲＮＡは、センス鎖の5’- CUACGACGACGAGAAGGAAtt -3’（配列番号２）とアンチセンス鎖の5’- UUCCUUCUCGUCGUCGUAGta -3’（配列番号３）の組合せ（siHSP47-A）(Ambion)、センス鎖の5’- AGCCCUCUUCUGACACUAAtt -3’（配列番号４）とアンチセンス鎖の5’- UUAGUGUCAGAAGAGGGCUgg -3’（配列番号５）の組合せ（siHSP47-B）(Ambion)、センス鎖の5’- GGACAGGCCUCUACAACUAtt -3’（配列番号６）とアンチセンス鎖の5’- UAGUUGUAGAGGCCUGUCCtt -3’（配列番号７）の組合せ（siHSP47-C）（日東電工において作成）であってもよい。
また、本発明において、癌転移抑制剤は、ＨＳＰ４７の阻害物質に加えて、ＭＹＨ９（例えば、Accession No. NM_002473（配列番号１５））の阻害物質、例えば、ｇＲＮＡ配列をコードするプラスミド、あるいは、センス鎖の5’- GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt -3’（配列番号９）とアンチセンス鎖の5’- AUCGGUCACAUUGAUACCCaa -3’（配列番号１０）の組合せ（siMYH9-A）、センス鎖の5’- CCACCAACCUCACAGAAGAtt -3’（配列番号１１）とアンチセンス鎖の5’- UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg -3’（配列番号１２）の組合せ（siMYH9-B）、センス鎖の5’- CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt -3’（配列番号１３）とアンチセンス鎖の5’- UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc -3’（配列番号１４）の組合せ（siMYH9-C）（日東電工において作成）などのＭＹＨ９  ｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。 
【００１８】
ＨＳＰ４７またはＭＹＨ９の阻害物質の細胞への導入は、任意の既知の導入手法、例えば、限定されずに、リポフェクタミン法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、超音波導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターなど）を利用する方法、またはマイクロインジェクション法などを用いることができる。 
ウイルスベクターを使用する場合、ウイルスの力価としては１×１０３〜１×１０１５ｐ．ｆ．ｕ．（プラーク形成単位）であってもよく、好ましくは１×１０５〜１×１０１３、より好ましくは１×１０７〜１×１０１１、さらに好ましくは１×１０８〜１×１０１０で用いることができる。 
【００１９】
上記核酸分子は、裸の核酸として使用しても、種々の核酸構築物またはベクターに組み込んで使用してもよい。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。核酸構築物またはベクターは、例えば哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫遺伝子から誘導される適当な転写または翻訳制御配列を少なくとも含んでいることが好ましい。かかる制御配列は、遺伝子発現において調節的役割を有する配列、例えば転写プロモーターまたはエンハンサー、転写を調節するためのオペレーター配列、メッセンジャーＲＮＡ内部のリボゾーム結合部位をコードしている配列、ならびに、転写、翻訳開始または転写終了を調節する適切な配列を包含する。 
【００２０】
２．本発明の医薬組成物 
本発明はまた、上記の癌転移抑制剤を含む医薬組成物に関する。上記の癌転移抑制剤は、癌細胞の運動能の低減、および、癌の転移の抑制が可能であるため、医薬組成物の有効成分として有用である。本発明の医薬組成物は、上記のＨＳＰ４７の阻害物質と、１または２以上の薬学的に許容し得る界面活性剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよい。薬学的に許容し得る担体、希釈剤等は医薬分野でよく知られており、例えば、その全体を本明細書に援用するRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)などに記載されている。 
【００２１】
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、癌細胞の運動能および癌の転移を顕著に抑制することができ、例えば、スクラッチアッセイによって測定される細胞運動能が、例えば、２分の１、３分の１以下まで顕著に抑制される。本発明の医薬組成物は、癌細胞の運動能を抑制する結果として、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上、癌の転移の領域を減少させることができる。 
【００２２】
本発明の医薬組成物が対象とする癌としては、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡが発現している限り限定されないが、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられ、これらの中でも、固形癌の癌が好ましく、膵癌、大腸癌、乳癌がより好ましく、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌が特に好ましい。特にトリプルネガティブ乳癌は、MYH9タンパク質の発現も高く、非トリプルネガティブ乳癌よりも運動能が高い癌種となっており、本発明は、トリプルネガティブ乳癌のように、運動能の高くなっている癌種に特に好適に適用できる。また、本発明の医薬組成物が対象とする転移性癌としては、例えば、転移性肺癌が挙げられる。 
【００２３】
癌細胞がＨＳＰ４７を発現しているか否かは、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡの発現を、遺伝子レベルで検出することにより判断できる。具体的には、遺伝子レベルでは、例えば、ノーザンブロッティング法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等のＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、in vitro転写法等の任意の公知の遺伝子発現解析法により検出することができる。また、癌細胞がＨＳＰ４７を発現しているか否かは、ＨＳＰ４７の発現を、タンパク質レベルで検出することにより判断できる。具体的には、例えば、免疫沈降法、ＥＩＡ（enzyme immunoassay）（例えば、ＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）など）、ＲＩＡ（radio immuno assay）（例えば、ＩＲＭＡ（immunoradiometric assay）、RAST（radioallergosorbent test）、RIST（radioimmunosorbent test）など）、ウエスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法により検出することができる。 
【００２４】
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡが発現している細胞である。正常細胞では、一般的に、線維芽細胞や筋線維芽細胞を除き、ＨＳＰ４７の転写体ＲＮＡは実質的に発現していない。本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ＨＳＰ４７のタンパク質を発現している癌細胞が好ましく、ＨＳＰ４７のタンパク質に加えて、ＭＹＨ９タンパク質を発現している細胞がより好ましい。ＨＳＰ４７陽性トリプルネガティブ乳癌は、ＭＹＨ９タンパク質も発現している。従って、本発明の医薬組成物は、ＨＳＰ４７の阻害物質に加えて、ＭＹＨ９の阻害物質を含んでいてもよい。
本発明の別の態様において、本発明の医薬組成物の投与対象となる細胞は、ホルモン受容体（例えば、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体）陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブヒト乳癌細胞である。トリプルネガティブ乳癌の診断は、生検により採取した腫瘍組織の病理検査（主に免疫組織染色）および遺伝子発現解析を必要とする。2つのホルモン受容体（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）、およびＨＥＲ２の病理検査と遺伝子発現解析を行い、これら全てにおいて陰性の場合、トリプルネガティブ乳癌であると診断する。図１に示すように、細胞培養されているトリプルネガティブ乳癌は、ＨＳＰ４７の発現が弱陽性である。しかしながら、図２に示すように、トリプルネガティブ乳癌細胞は、生体内の環境におかれるとＨＳＰ４７の発現が高くなる。癌病態で問題となるトリプルネガティブ乳癌は、生体内でＨＳＰ４７の発現が増加しており、このようなＨＳＰ４７陽性トリプルネガティブ乳癌は、転移能が高い。 
【００２５】
本発明の医薬組成物は、対象とする疾患を処置するのに有用な他の化学療法剤をさらに含んでもよい。化学療法剤としては、限定されずに、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド、ホルモン療法剤、白金錯体、血管新生阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および微小管作用薬などが挙げられる。 
【００２６】
本発明の医薬組成物において、ＨＳＰ４７の阻害物質を、他の化学療法剤と組み合わせて用いる場合、これらを単一の組成物に含めてもよく、複数の組成物に別々に含ませ、それらを別々に用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。 
【００２７】
本発明の種々の態様において、上記の医薬組成物は、種々の薬物送達担体に担持させて使用することもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、ポリマーナノ粒子、ポリマーミセル、デンドリマー、リポソーム、ウイルスナノ粒子、カーボンナノチューブ等が挙げられる（Cho K. et al., Clin Cancer Res. 2008 Mar 1;14(5):1310-6など参照）。 
【００２８】
本発明の医薬組成物は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、たとえば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、腫瘍内、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（たとえば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年、上記Remington's Pharmaceutical Sciencesなどを参照）。 
【００２９】
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であり得る。 
【００３０】
３．本発明のキット 
本発明は、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物に含まれ得る活性成分（例えば、ＨＳＰ４７の阻害物質）を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む転移抑制剤または医薬組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される癌転移抑制剤または医薬組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。 
【００３１】
４．本発明の癌の転移抑制方法 
本発明の一態様は、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与することを特徴とする、癌の転移抑制方法に関する。本方法において、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合とＨＳＰ４７の阻害物質を投与する場合とを比較すると、スクラッチアッセイによって測定する場合、癌細胞の運動能が、例えば、２分の１、３分の１以下まで低下している。また、本方法において、癌細胞の運動能を抑制する結果として、ＨＳＰ４７の阻害物質を投与しない場合と比較して、例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上、癌の転移の領域を減少させることができる。 
【００３２】
本発明の方法において、投与される患者は、典型的には、癌治療を必要とする患者である。かかる患者としては、限定されずに、例えば、上記のＨＳＰ４７の発現に関連する癌を患っているか、これらの癌を有すると診断されたか、これらの癌を発症するリスクが高い患者である。したがって、本発明の方法は、本発明のＨＳＰ４７の阻害物質を含む癌転移抑制剤または医薬組成物による処置を必要としている患者を同定する工程、例えば、乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程をさらに含んでもよい。乳癌患者がトリプルネガティブ乳癌患者であるか否かを確認する工程は、生検により採取した腫瘍組織の病理検査（主に免疫組織染色）および遺伝子発現解析を行う工程、より詳細には、2つのホルモン受容体（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体）、およびＨＥＲ２の病理検査と遺伝子発現解析を行い、これら全てにおいて陰性の場合、トリプルネガティブ乳癌を有すると決定する工程を含む。癌の具体例は、医薬組成物に関して上記したとおりである。 
【００３３】
本発明の方法においては、本発明の医薬組成物を、対象とする癌を処置するのに有用な他の作用物質または処置方法と併用することもできる。本発明の方法は、処置方法として、放射線治療、粒子線治療などの物理療法、外科手術などの外科的治療、化学療法、及び分子標的治療などと併用することができる。本発明の方法は、他の作用物質として、上記のような化学療法剤を併用することができ、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド、ホルモン療法剤、白金錯体、血管新生阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および微小管作用薬などが挙げられる。本発明の方法は、このような構成を採用することにより、癌細胞除去、細胞死誘導、または細胞増殖抑制などの一般的な治療を行いながら、これらの治療と共に、癌の転移を抑制することができる。したがって、本発明の方法により、多面的に癌の治療を行うことができ、癌治療の効果を向上させることができる。 
【００３４】
本発明の癌の転移抑制方法における有効量とは、例えば、癌細胞の運動能を低下させる量、または、癌の転移の領域を減少させる量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。 
【００３５】
本明細書に記載される本発明の方法において投与する活性成分（例えば、ＨＳＰ４７の阻害物質）の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。本発明の方法に用いる活性成分の用量は、好ましくは、ヒトの場合、１回あたり、かつ成人１ｋｇ体重あたりｓｉＲＮＡ分子に換算して例えば０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇである。 
【００３６】
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、骨髄内、歯髄内、舌下、口腔内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。 
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。 
【００３７】
本明細書で用いる場合、用語「患者」は、任意の生物個体を意味するが、例えば、動物、哺乳動物、またはヒト個体である。本発明において、「患者」は、典型的には癌に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。 
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。 
【００３８】
今回本発明者により、本発明の癌転移抑制剤または医薬組成物が、ＨＳＰ４７（配列番号１）の発現を抑制することにより、トリプルネガティブ乳癌の細胞運動能を抑制し、結果として、転移性肺癌を抑制できることが明らかになった。 
したがって、本発明はまた、ＨＳＰ４７の阻害物質を含む、上記作用を提供するための癌転移抑制剤および医薬組成物、上記作用を提供するための医薬の製造における使用、ならびに、ＨＳＰ４７の阻害物質の上記作用を提供するための使用にも関する。 
【実施例】
【００３９】
本発明を下記の実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施例に限定されないものとする。 【００４０】
例１：細胞株の取得および培養 
本願明細書中で使用した全てのヒト乳癌細胞株（MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157, MCF7, BT474）は、American Type Culture Collectionから購入した。これらの細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。 【００４１】
例２：ヒト乳癌細胞におけるＨＳＰ４７  ｍＲＮＡとＨＳＰ４７タンパク質の発現 
トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類(MDA-MB-468, MDA-MB-231, MDA-MB-157)および非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MCF7, BT474)におけるＨＳＰ４７  ｍＲＮＡおよびＨＳＰ４７タンパク質の発現をReal time-PCRとウエスタンブロット法にて検出した。結果を図１に示す。 
トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類におけるｍＲＮＡの発現は、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。同様に、トリプルネガティブヒト乳癌細胞3種類におけるＨＳＰ４７タンパク質の発現も、非トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類におけるＨＳＰ４７タンパク質の発現と比較して、顕著に低かった。 【００４２】
例３：トリプルネガティブヒト乳癌細胞におけるＨＳＰ４７陽性細胞率 
トリプルネガティブヒト乳癌細胞2種類(MDA-MB-231, MDA-MB-157)を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに皮下移植を行い、腫瘍形成後、腫瘍細胞を採取して、抗ＨＳＰ４７抗体（Enzo Life Sciences）を用いて、フローサイトメーター解析を行った。結果を図２に示す。MDA-MB-231細胞は、19.7%がＨＳＰ４７を発現し、MDA-MB-157細胞は、16.7%がＨＳＰ４７を発現していた。 
したがって、図１に示すように、細胞培養されているトリプルネガティブ乳癌は、ＨＳＰ４７の発現が弱陽性であった。しかしながら、図２に示すように、トリプルネガティブ乳癌細胞は、生体内の環境におかれるとＨＳＰ４７の発現が高かった。 【００４３】
例４：ＨＳＰ４７強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能、運動能および肺転移能 
pCMV6-entryプラスミド(Mock)はOrigeneより入手した。pCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)は、Origeneより入手した。pCMV6-entryプラスミド(Mock)もしくはpCMV6-HSP47-Mycプラスミド(HSP47:Myc)を遺伝子導入して、HSP47強制発現トリプルネガティブヒト乳癌細胞(MDA-MB-231、MDA-MB-157)を作成した。 
これらの細胞を、1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図３に示す。MDA-MB-231細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞増殖能が、有意ではないものの若干増加していた。MDA-MB-157細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞増殖能が有意に増加していた。 
また、これらの細胞を1×104 cells/wellでdouble chamberに播種し、培養開始後24時間目に、ヘマトキシリン染色を行い、細胞カウントにより細胞運動能を測定した。結果を図４に示す。MDA-MB-231細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞運動能が３〜４倍程度に増加していた。MDA-MB-157細胞については、HSP47:Myc群では、Mock群およびWT群と比較して、細胞運動能が２倍程度に増加していた。 
さらに、これらの細胞を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、HE染色にて調べた。結果を図５に示す。MDA-MB-231細胞のHSP47:Myc群では、Mock群と比較して、顕著に高い肺転移が見られた（右図の中央の染色部分）。 【００４４】
例５：ＨＳＰ４７の発現抑制によるトリプルネガティブヒト乳癌細胞の細胞増殖能、運動能力能および肺転移能 
Control shRNA発現プラスミド(shControl)はOrigeneより入手した。HSP47 shRNA発現プラスミド(shHSP47)は、Origeneより入手した。Control shRNA発現プラスミド(shControl)、もしくはHSP47 shRNA発現プラスミド(shHSP47)を遺伝子導入して、HSP47発現抑制トリプルネガティブヒト乳癌細胞(HSP47(+)MDA-MB-231, HSP47(-)MDA-MB-231)を作成した。 
これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図６に示す。MDA-MB-231細胞については、shHSP47群では、shControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。 
また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図７に示す。MDA-MB-231細胞については、shHSP47群では、shControl群と比較して、細胞運動能が、４分の１程度に有意に減少していた。 
さらに、これらの細胞を1×106 cells/50 μL PBSの濃度でBalb/c nu/nuマウスに尾静脈投与を施し、肺への転移能は、細胞投与後30日目に肺組織を採取して、ＨＥ染色にて調べた。結果を図８に示す。MDA-MB-231細胞については、shControl群では、肺転移が見られたが（左下図の左側）、shHSP47群では、肺転移がほとんど確認されなかった（右下図）。したがって、癌細胞におけるＨＳＰ４７発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。 【００４５】
例６：トリプルネガティブ乳癌細胞におけるＨＳＰ４７とＭＹＨ９との相互作用 
MDA-MB-231細胞(Mock)およびHSP47:Mycを発現するMDA-MB-231細胞を、氷冷したPBSで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics)を補充した溶解バッファー（50 mM Tris、250 mM NaCl、25 mM EDTA、1% NP-40）を用いて溶解した。細胞溶解液からのHSP47の免疫沈降を、４℃で１６時間、抗Myc固定磁気マイクロビーズ(Medical & Biological Laboratories)を使用して行い、ビーズを磁場上で溶解バッファーを用いて洗浄した。タンパク質を、SDS-PAGEサンプルバッファーを含有する50 mM グリシン-HClバッファー(pH 3.5)を用いて、ビーズから溶出した。0.1 Mグリシンバッファー(pH 2.8)を用いて溶出した後、サンプルをSDS-PAGEにアプライし、ポリビニリデンジフロライドメンブレン(Millipore, Billerica, MA)に転写した。0.05% Tween-20を含有するPBS中の5%スキムミルクでブロッキングした後、メンブレンを以下の一次抗体でプローブした：マウス抗HSP47モノクローナル抗体(Enzo Life Sciences)およびマウス抗MYH9モノクローナル抗体(Elabscience)。一次抗体で処理した後、メンブレンを以下の二次抗体と共にインキュベートした：西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ウサギIgG(Cell Signaling Technology)およびHRP結合ヤギ抗マウスIgG(Cell Signaling Technology)。タンパク質を、ECL(GE Healthcare, Waukesha, WI)を使用する化学発光法によって検出した。 
その結果、免疫沈降したMock群ではバンドが見られなかったが、免疫沈降したHSP47:Myc群では、複合体の形成により、HSP47およびMYH9のそれぞれのバンドが見られた（図９）。従って、HSP47とMYH9は相互作用することが示された。 【００４６】
例７：ＨＳＰ４７およびＭＹＨ９の両方が非トリプルネガティブ乳癌の転移能を増強する
MYH9発現の誘導が、MYH9ではなくHSP47が発現される非トリプルネガティブ乳癌細胞（MCF7）の転移能を増強するか否かを決定するために、MYH9を安定して発現する非トリプルネガティブ乳癌細胞株(Mock+MYH9-GFP)を作製し（図１０Ａ）、Mock+MYH9-GFP細胞の転移能を調査した。MYH9（別名NMIIA）を発現するプラスミドとして、pCMV-NMIIA-GFPプラスミド（Origene）を入手し、これを使用した。インビトロ培養条件下で、Mock+MYH9-GFP細胞の増殖速度は、このプラスミドを導入していない、対応するMock細胞よりもわずかに高かった（図１０Ｂ）。これに対し、Mock+MYH9-GFP細胞の腫瘍形成能は、Mock細胞とは全く異なっていた（図１０Ｅ）。Mock+MYH9-GFP細胞の浸潤および遊走の能力は、対応するMock細胞よりも顕著に高かった（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。さらに、組織学的分析により、Mock+MYH9-GFP細胞の肺への転移能は、Mock細胞よりも顕著に高いことが示された（図１０Ｆ）。組織学的分析は、例５と同様にして行った。
また、HSP47の発現をノックアウトした（KO）MCF7細胞（HSP47 KO）を以下のとおり作製した（図１０Ａ）。HSP47 KO細胞は、信州大学の桜井博士より譲り受けた、Cas9配列およびgRNA配列についてのクローニング部位を含むpCG:SapIプラスミドを使用して作製した（Sakurai, T. et al. (2014) BMC Biotechnol. 14, 69、および、Sakurai, T. et al. (2016) Sci. Rep. 6, 20011を参照）。ヒトHSP47ゲノムのエキソン５について設計されたgRNA配列(5’-CAAGATGCGAGACGAGTTATAGG-3’（配列番号８）)をpCG:SapIプラスミドに挿入した。pP2A-mCherry-N1プラスミド(Addgege)を使用して、P2A-mCherry cDNAのDNAフラグメントを増幅した。構築された標的化ベクターおよびpcDNA3.1(+)(Promega)をLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を使用してMCF7細胞株に同時トランスフェクトした。処理した細胞を10%FBSおよびG418(1000μg/mL, Thermo Fisher Scientific)を補充したDMEM中で培養し、細胞クローンを選択した。細胞クローンから抽出したHSP47ゲノムDNAのDNA配列決定を実施して、HSP47遺伝子の下流部位へのP2A-mCherry遺伝子の挿入を確認した。単一細胞クローンは、DNA配列分析によって評価して、標的アレルにおける挿入欠失を検出した。
増殖速度を確認したところ、HSP47 KO細胞の増殖速度が、Mock細胞およびMock+MYH9-GFP細胞よりも顕著に低下していたことを見出した（図１０Ｂ）。HSP47 KO細胞の増殖速度の低下は、MYH9を発現しても回復しなかった（図１０Ｂ）。HSP47の欠失はまた、MYH9を発現するプラスミドによるMYH9の発現に関わらず、MCF7細胞の腫瘍形成能を低下させた（図１０Ｅ）。MYH9の誘導によるMCF7細胞の運動能力能の増強は、HSP47発現の欠失によって顕著に抑制された（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。MYH9-GFP細胞の肺への転移能はまた、HSP47発現の欠失により完全に抑制された（図１０Ｆ）。組織学的分析は、例５と同様にして行った。
これらの結果により、HSP47およびMYH9の両方の発現が、非トリプルネガティブ細胞の転移能を担っていることが示唆された。【００４７】
例８：ＭＹＨ９  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたトリプルネガティブ細胞のインビトロ増殖
ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）細胞を、Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Life Technologies)を使用して、以下のsiRNAでトランスフェクトし、大気中３７℃で５時間培養した。
対照siRNA(siControl, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、
MYH9-A siRNA (siMYH9-A, センス鎖: 5’-GGGUAUCAAUGUGACCGAUtt-3’（配列番号９）; アンチセンス鎖: 5’-AUCGGUCACAUUGAUACCCaa-3’（配列番号１０）)、
MYH9-B siRNA (siMYH9-B, センス鎖: 5’-CCACCAACCUCACAGAAGAtt-3’（配列番号１１）; アンチセンス鎖: 5’-UCUUCUGUGAGGUUGGUGGtg-3’（配列番号１２）)、または、
MYH9-C siRNA (siMYH9-C, センス鎖: 5’-CGGCAAGGUGGAUUACAAAtt-3’（配列番号１３）; アンチセンス鎖: 5’-UUUGUAAUCCACCUUGCCGgc-3’（配列番号１４）)
siRNAでのトランスフェクションの５時間後、細胞を、１０％胎児ウシ血清(FBS, Invitrogen Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で培養した。
例２と同様にして、トリプルネガティブヒト乳癌細胞（MDA-MB-231およびMDA-MB-468）におけるＭＹＨ９タンパク質の発現をReal time-PCRにて検出した。結果を図１１Ａに示す。試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）におけるＭＹＨ９  ｍＲＮＡの発現は、siControl群におけるＭＹＨ９  ｍＲＮＡの発現と比較して、顕著に低かった。
また、例５と同様にして、これらの細胞を1×104 cells/wellで6-well plateに播種し、培養開始後5日間、細胞カウントにより細胞増殖能を測定した。結果を図１１Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞増殖能が、有意に減少していた。 
また、これらの細胞を1×105 cells/wellで35-mm dishに播種し、培養開始後24時間目に、スクラッチアッセイを用いて細胞運動能を測定した。結果を図１２Ａに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞運動能が、５分の１〜３分の１程度に有意に減少していた。
さらに、これらの細胞を2×104 cells/インサートの濃度で、トランズウェルチャンバー中で培養した。培養開始から２４時間後、トランズウェルメンブレンを通過した細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリンを用いて染色した。フィールド当たりの細胞数の結果を図１２Ｂに示す。MDA-MB-231およびMDA-MB-468の両方の細胞について、試験群（siMYH9-A、siMYH9-B、siMYH9-C）では、siControl群と比較して、細胞浸潤能が、４分の１〜３分の１程度に有意に減少していた（図１２Ｂ）。したがって、癌細胞におけるＭＹＨ９発現の抑制が、癌の転移抑制に有効であることが示唆された。
【図１】
2020040186.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月13日(2020.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、およびこれらを発現するベクターからなる群より選択されるＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤であって、癌が、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、前記癌転移抑制剤。 
【請求項２】
癌細胞が、ＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、請求項１に記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の癌転移抑制剤を含む、トリプルネガティブ乳癌の転移を抑制するための医薬組成物。 
【請求項４】
トリプルネガティブ乳癌を処置するための、請求項３に記載の医薬組成物。 
【請求項５】
転移性肺癌を処置するための、請求項３に記載の医薬組成物。 
【請求項６】
癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、およびこれらを発現するベクターからなる群より選択されるＨＳＰ４７の阻害物質の使用であって、癌が、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、前記使用。
【請求項７】
癌の転移の抑制における使用のための、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、およびこれらを発現するベクターからなる群より選択されるＨＳＰ４７の阻害物質を含む組成物であって、癌が、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、前記組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月11日(2020.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、およびこれらを発現するベクターからなる群より選択されるＨＳＰ４７の阻害物質を含む、癌転移抑制剤であって、癌が、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、前記癌転移抑制剤。 
【請求項２】
癌細胞が、ＨＳＰ４７に加えて、ＭＹＨ９を発現するトリプルネガティブ乳癌細胞である、請求項１に記載の癌転移抑制剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の癌転移抑制剤を含む、トリプルネガティブ乳癌の転移を抑制するための医薬組成物。 
【請求項４】
トリプルネガティブ乳癌を処置するための、請求項３に記載の医薬組成物。 
【請求項５】
トリプルネガティブ乳癌の肺転移を抑制するための、請求項３に記載の医薬組成物。 
【請求項６】
癌の転移を抑制するための医薬の製造における、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、およびこれらを発現するベクターからなる群より選択されるＨＳＰ４７の阻害物質の使用であって、癌が、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、前記使用。
【請求項７】
癌の転移の抑制における使用のための、ＨＳＰ４７に対する干渉核酸、リボザイム、アンチセンス核酸、マイクロＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、およびこれらを発現するベクターからなる群より選択されるＨＳＰ４７の阻害物質を含む組成物であって、癌が、エストロゲン受容体陰性およびプロゲステロン受容体陰性かつヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）陰性のトリプルネガティブ乳癌である、前記組成物。
【国際調査報告】
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