(57)【要約】  本発明は、ミセル形成能が改善されたミセルおよびこれを含む脳への薬剤送達用組成物を提供する。具体的には、本発明によれば、外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量4000Da以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量3000Da以下のポリエチレングリコールであり、第１の高分子は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、これにより該キャリアの外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されているミセルおよびこれを含む脳への薬剤送達用組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物送達用のキャリアを含む、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、
投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
該キャリアは、その外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量4000Da以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量3000Da以下のポリエチレングリコールであり、
第１の高分子は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、これにより該キャリアの外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。
【請求項２】
第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が５０：５０〜３０：７０の範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が４５：５５〜３５：６５の範囲である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
薬剤を脳に送達するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
薬剤に血液脳関門を通過させるための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
薬剤を脳血管内皮細胞に送達するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
血糖値の上昇がグルコース投与により誘発される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
組成物がグルコースの投与と同時にまたはその前に投与される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
組成物が、静脈内に輸液投与され、輸液投与が１０分以上継続される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
キャリアが送達する薬剤を内包している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＧＬＵＴ１リガンドがグルコースである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
薬剤が、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、および造影剤から選択される少なくとも１つの薬剤である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
薬物送達用のキャリアを含む、組成物であって、
キャリアは、その外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量4000Da以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量3000Da以下のポリエチレングリコールであり、
第１の高分子は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、これにより該キャリアの外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。
【請求項１４】
第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が５０：５０〜３０：７０の範囲である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が４５：５５〜３５：６５の範囲である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳への薬剤送達用のキャリアおよびこれを含んでなる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液と脳との間には、物質交換を制限する血液脳関門が存在することが知られている。これは脳血管内皮細胞が密着結合を形成し、細胞の隙間が極めて狭いこと、並びに、細胞自体が選択的な物質の取り込みおよび排出を行なっていることによると考えられている。【０００３】
血液脳関門の透過選択性は高く、一部の物質（例えば、アルコール、カフェイン、ニコチンおよびグルコース）を除いてはほとんど通過することができない。そして、このことが、脳治療薬による脳疾患の治療、脳診断薬による脳疾患の診断または造影剤による脳の造影を困難なものにしてきた。【０００４】
グルコースが血液脳関門を通過する特性を利用して、薬剤を脳へ送達する技術が開発されている（引用することでその全体が本明細書に取り込まれる、特許文献１）。特許文献１では、グルコースが最外表面に露出するように表面をグルコース修飾ポリエチレングリコールで被覆したキャリアを対象に投与する。特許文献１では、投与対象は、予め血糖値が低下した状態で維持され、表面をグルコースで被覆したキャリアの投与と合わせて血糖値を上昇させることにより、キャリアを効率的に血液脳関門を通過させ、脳血管内皮細胞および脳実質にキャリアを送達する技術を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許公開公報第2016/0287714号
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、薬物を内包させたキャリアの製造において、キャリアを被覆するポリエチレングリコールの数平均分子量を特許文献１よりも増大させると、薬物内包キャリアの形成効率が高まることを見出した。一方で本発明者らは、キャリアを被覆するポリエチレングリコールの数平均分子量を特許文献１よりも増大させると、キャリアの脳への送達効率が顕著に低下することを見出した。本発明は、薬物内包時のキャリア形成効率とキャリアの脳への送達効率を両立したキャリア（またはミセル）および該キャリア（またはミセル）を含む組成物を提供する。
【０００７】
本発明者らは、外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量が第１の所定の数平均分子量（例えば、4000Da）以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量が第２の所定の数平均分子量（例えば、3000Da）以下のポリエチレングリコールである、キャリアを用いることで、ミセルの形成効率を維持しつつも、キャリアの脳への送達効率を改善できることを見出した（ここで、第１の所定の数平均分子量は、第２の所定の数平均分子量よりも大きい）。本発明者らはまた、第１の高分子と第２の高分子の混合比率が分子数比で５０：５０〜３０：７０の範囲、好ましくは４５：５５〜３５：６５の範囲であるときに、ミセルの形成効率を維持しつつも、キャリアの脳への送達効率が顕著に改善されることを見出した。本発明はこれらの知見に基づく発明である。
【０００８】
すなわち、本願発明によれば以下の発明が提供される。
（１）薬物送達用のキャリアを含む、投与計画に従って対象に投与するための組成物であって、
投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含み、
該キャリアは、その外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量が第１の所定分子量（例えば、4000Da）以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量が第２の所定分子量（例えば、3000Da）以下のポリエチレングリコールであり（ここで、第１の所定の数平均分子量は、第２の所定の数平均分子量よりも大きい）、
第１の高分子は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、これにより該キャリアの外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。
（２）第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が５０：５０〜３０：７０の範囲である、上記（１）に記載の組成物。
（３）第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が４５：５５〜３５：６５の範囲である、上記（１）または（２）に記載の組成物。
（４）薬剤を脳に送達するための、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）薬剤に血液脳関門を通過させるための、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）薬剤を脳血管内皮細胞に送達するための、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（７）血糖値の上昇がグルコース投与により誘発される、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）組成物がグルコースの投与と同時にまたはその前に投与される、上記（７）に記載の組成物。
（９）組成物が、静脈内に輸液投与され、輸液投与が１０分以上継続される、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）キャリアが送達する薬剤を内包している、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
（１１）ＧＬＵＴ１リガンドがグルコースである、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の組成物。
（１２）薬剤が、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、および造影剤から選択される少なくとも１つの薬剤である、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の組成物。
（１３）薬物送達用のキャリアを含む、組成物であって、
キャリアは、その外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量4000Da以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量3000Da以下のポリエチレングリコールであり、
第１の高分子は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、これにより該キャリアの外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物。
（１４）第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が５０：５０〜３０：７０の範囲である、上記(１３)に記載の組成物。
（１５）第１の高分子の分子数と第２の高分子の分子数との比が４５：５５〜３５：６５の範囲である、上記（１３）または（１４）に記載の組成物。
（１６）ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、上記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、実施例２で作製したミセルの透過電子顕微鏡画像（ＴＥＭ像）を示す。図中、2ｋは、2kDの数平均分子量のPEGを有する高分子ミセルの結果であることを示し、12k75/2k25は、12kDの数平均分子量のPEGを有する高分子と2kの数平均分子量のPEGを有する高分子とを75：25の割合で用いて作製した高分子ミセルの結果であることを示し、12k30/2k70は、12kDの数平均分子量のPEGを有する高分子と2kの数平均分子量のPEGを有する高分子とを30：70の割合で用いて作製した高分子ミセルの結果であることを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、2kDの数平均分子量のPEGを有する高分子ミセルに各種薬剤を封入した結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、12kDの数平均分子量のPEGを有する高分子ミセルに各種薬剤を封入した結果を示す図である。
【図３】図３は、グルコース修飾を有する2kDの数平均分子量のPEGを有する高分子ミセル（Gluc/m(2k)）とグルコース修飾を有する12kDの数平均分子量のPEGを有する高分子ミセル（Gluc/m(12k)）の脳組織への送達効率を示す。
【図４】図４は、各種グルコース修飾ミセル（Gluc/m）のGLUT1発現細胞への取込み効率を示す。図中、Null/mはグルコース修飾がないミセルを意味する。図中、12kXX/2kxxは、数平均分子量が12kDであるPEGを有する高分子の割合（%）を示し、xxは数平均分子量が2kDであるPEGを有する高分子の割合（%）を示す。
【図５】図５は、数平均分子量が5kDであるPEGを有する高分子ミセル（5kミセル）と数平均分子量が5kDであるPEGと2kDであるPEGとで修飾した高分子ミセル（5k50/2k50ミセル）のGLUT1発現細胞への取込み効率を示す。図中、Null/mはグルコース修飾がないミセルを意味する。
【図６】図６は、GLUT1発現細胞へのグルコース修飾ミセルへの取込みが、GLUT1阻害剤により阻害されることを示す。
【図７】図７は、各種グルコース修飾ミセル（Gluc/m）の脳組織への送達効率を示す。図中、Null/mはグルコース修飾がないミセルを意味する。図中、12kXX/2kxxは、数平均分子量が12kDであるPEGを有する高分子の割合（%）を示し、xxは数平均分子量が2kDであるPEGを有する高分子の割合（%）を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、12kDのPEGを有する高分子と2kDのPEGを有する高分子を4：6の割合で含むミセルのmRNAの封入効率を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、12kDのPEGを有する高分子と2kDのPEGを有する高分子を4：6の割合で含むミセルのプラスミドＤＮＡ（pDNA）の封入効率を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、12kDのPEGを有する高分子と2kDのPEGを有する高分子を4：6の割合で含むミセルの抗体の封入効率を示す。
【発明の具体的な説明】
【００１０】
本発明では、「薬物輸送体」とは、薬物送達のためのキャリアを意味し、薬物を内包できる微粒子、例えば、小胞、デンドリマー、ハイドロゲルおよびナノスフェアなどが挙げられる。薬物輸送体は、一般的には、直径１０ｎｍ〜４００ｎｍの大きさを有する。
【００１１】
本明細書では、「小胞」とは、ミセルを意図している。小胞は、好ましくは生体適合性の外殻を有し、その外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾を受けている。これにより、小胞は、ＧＬＵＴ１と相互作用することができる。
【００１２】
本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
【００１３】
本明細書では、「リポソーム」とは、２層の分子膜により形成される小胞を意味する。分子膜は通常はリン脂質による二重膜である。
【００１４】
本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「PIC」ともいう）とは、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層である。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア−シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことでも知られている。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つがＰＥＧとの共重合体を形成しており、その両方がＰＥＧとの共重合体を形成していてもよい。ポリイオンコンプレックスの作製によく用いられるアニオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸および核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ）が挙げられ、カチオン性ポリマーまたはブロックとしては、例えば、ポリリジンおよびポリ（５−アミノペンチルアスパラギン酸）が挙げられる。ここで、ｍＲＮＡとは、翻訳によりタンパク質合成に用いられるメッセンジャーＲＮＡを意味し、ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる二本鎖ＲＮＡ（核酸）を意味する。ｓｉＲＮＡは、特に限定されないが、２０〜３０ｂｐ、好ましくは、２１〜２３ｂｐ、２５ｂｐ、２７ｂｐからなる二本鎖ＲＮＡであって、標的遺伝子の配列と相同な配列を有する二本鎖ＲＮＡである。PIC型のキャリアでは、核酸はカチオン性ポリマーとPICを形成している。
【００１５】
本明細書では、「薬剤送達用の」とは、生体適合性であること、および、薬剤を小胞に内包できることを意味する。本明細書では、「薬剤送達用の」とは、薬剤の血中滞留時間を、裸の薬剤の血中滞留時間と比べて長期化する作用を利用した用途を意味することがある。
【００１６】
本明細書では、「低血糖を誘発させる」とは、対象において、その処置がされなければ示したはずの血糖よりも血糖値を低下させることをいう。低血糖を誘発させる方法としては、糖尿病薬の投与などが挙げられる。例えば、低血糖を誘発させる際に、低血糖を誘発させるという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許容される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００１７】
本明細書では、「絶食させる」とは、対象に絶食、例えば、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上または４８時間以上の絶食をさせることを意味する。絶食により対象は低血糖を引き起こす。絶食期間は、対象の健康状態に鑑みて医師等により決定され、例えば、対象が空腹時血糖に達する時間以上の期間とすることが好ましい。絶食期間は、例えば、脳血管内皮細胞の血管内表面でのＧＬＵＴ１の発現が増大する、またはプラトーに達する以上の時間としてもよい。絶食期間は、例えば、１２時間以上、２４時間以上または３６時間以上である上記期間とすることができる。また、絶食は、血糖値やＧＬＵＴ１の血管内表面での発現に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００１８】
本明細書では、「血糖値の上昇を誘発させる」とは、低血糖を誘発させた対象、または、低血糖状態を維持させた対象において血糖値を上昇させることをいう。血糖値は、当業者に周知の様々な方法により上昇させることができるが、例えば、血糖値の上昇を誘発するものの投与、例えば、グルコース、フルクトース（果糖）、ガラクトースなどの血糖値の上昇を誘発する単糖の投与、マルトースなどの血糖値の上昇を誘発する多糖の投与、若しくは、デンプンなどの血糖値の上昇を誘発する炭水化物の摂取、または、食事により上昇させることができる。
【００１９】
本明細書では、「血糖操作」とは、対象に対して、低血糖を誘発させ、その後、血糖値を上昇させることをいう。対象に対して低血糖を誘発させた後は、対象の血糖値を低血糖に維持することができる。対象の血糖値を低血糖に維持する時間は、例えば、０時間以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上、４８時間以上とすることができる。その後、血糖値を上昇させることができる。本明細書では、「血糖を維持する」とは、対象において低血糖を維持するという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
【００２０】
本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。ここで疾患としては、脳神経疾患、例えば、精神病性障害、うつ病、気分障害、不安、睡眠障害、認知症および物質関連障害が挙げられる。また、認知症としては、特に限定されないがアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。
【００２１】
本明細書では、「血液脳関門」とは、血行と脳の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液脳関門の実態は、脳血管内皮細胞などであると考えられている。血液脳関門の物質透過性については、不明な点が多いが、グルコース、アルコールおよび酸素は血液脳関門を通過し易いことが知られ、脂溶性物質や小分子（例えば、分子量５００未満）は、水溶性分子や高分子（例えば、分子量５００以上）に比べて通過し易い傾向があると考えられている。多くの脳疾患治療薬や脳診断薬が血液脳関門を通過せず、このことが脳疾患の治療や脳の分析等の大きな障害となっている。本明細書では、「血液神経関門」とは、血行と末梢神経の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液髄液関門」とは、血行と脳脊髄液との間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液網膜関門」とは、血行と網膜組織の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液神経関門、血液髄液関門および血液網膜関門の実体は、それぞれの関門に存在する血管内皮細胞などであると考えられており、その機能は血液脳関門と同様であると考えられている。
【００２２】
本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンド」とは、ＧＬＵＴ１と特異的に結合する物質を意味する。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られ、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられ、ＧＬＵＴ１リガンドは、いずれも本発明でグルコースの代わりにキャリアまたはコンジュゲートの調製に使用することができる。ＧＬＵＴ１リガンドは、好ましくはＧＬＵＴ１に対してグルコースと同等またはそれ以上の親和性を有する。２−Ｎ−４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイル−１，３−ビス（Ｄ−マンノース−４−イルオキシ）−２−プロピルアミン（ＡＴＢ−ＢＭＰＡ）、６−（Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）−２−デオキシグルコース（６−ＮＢＤＧ）、４，６−Ｏ−エチリデン−α−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースおよび３−Ｏ−メチルグルコースもＧＬＵＴ１と結合することが知られ、これらの分子もＧＬＵＴ１リガンドとして本発明に用いることができる。
【００２３】
本発明では、薬物を内包させたキャリアの製造において、キャリアを被覆するポリエチレングリコールの数平均分子量を特許文献１よりも増大させると、薬物内包キャリアの形成効率が高まることを見出した。一方で本発明者らは、キャリアを被覆するポリエチレングリコールの数平均分子量を特許文献１よりも増大させると、キャリアの脳への送達効率が顕著に低下することを見出した。これに対して、本発明者らは、外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量が第１の所定の数平均分子量（例えば、4000Da）以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量第２の所定分子量（例えば、3000Da）以下のポリエチレングリコール（ここで、第１の所定の数平均分子量は、第２の所定の数平均分子量よりも大きい）である、キャリアが、薬物を内包させたときにも高い形成効率を有し、かつ、脳への送達効率が高いことを見出した。
【００２４】
第１の所定の数平均分子量は、例えば、4000Da以上100kDa以下とすることができる。第１の所定の数平均分子量は、例えば、4000Da以上、5000 Da以上、6000 Da以上、7000 Da以上、8000 Da以上、9000 Da以上、または10 kDa以上、20 kDa以上、30 kDa以上、40 kDa以上、50 kDa以上、60 kDa以上、70 kDa以上、80 kDa以上、または90 kDa以上とすることができる。
第２の所定の数平均分子量は、例えば、4000Da以上100kDa以下とすることができる。第２の所定の数平均分子量は、例えば、4000Da以上、5000 Da以上、6000 Da以上、7000 Da以上、8000 Da以上、9000 Da以上、または10 kDa以上、20 kDa以上、30 kDa以上、40 kDa以上、50 kDa以上、60 kDa以上、70 kDa以上、80 kDa以上、または90 kDa以上とすることができる。
但し、第１の所定の数平均分子量は、第２の所定の数平均分子量よりも大きいものとする。例えば、、第１の所定の数平均分子量は、第２の所定の数平均分子量よりも1 kD以上、2 kD以上、3 kD以上、4 kD以上、5 kD以上、6 kD以上、7 kD以上、8 kD以上、9 kD以上、または10 kD以上大きいものとすることができる。
ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、4000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、3000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、4000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、2000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、5000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、3000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、5000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、2000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、6000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、3000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、6000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、2000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、7000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、3000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、7000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、2000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、8000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、3000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、8000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、2000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、9000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、3000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、9000 Daであり、第2の所定の数平均分子量は、2000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、10 kDaであり、第2の所定の数平均分子量は、3000 Daである。ある態様では、第１の所定の数平均分子量は、10 kDaであり、第2の所定の数平均分子量は、2000 Daである。
第１の高分子は、第１の所定の数平均分子量以上の数平均分子量を有する。また、第２の高分子は、第２の所定の数平均分子量以上の数平均分子量を有する。
第１の高分子は、例えば、数平均分子量4000Da以上のポリエチレングリコールである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量5000Da以上のポリエチレングリコールである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量7000Da以上のポリエチレングリコールである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量9000Da以上のポリエチレングリコールである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量4000Daから20000Daであり得る。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量5000Daから20000Daであり得る。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量7000Daから20000Daであり得る。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量9000Daから20000Daであり得る。ある特定の態様では、第１の高分子は、数平均分子量9000Daから18000Daであり得る。ある特定の態様では、第１の高分子は、数平均分子量9000Daから15000Daであり得る。ある特定の態様では、第1の高分子は、数平均分子量11000Daから13000Daであり得る。
第２の高分子は、数平均分子量3000Da以下のポリエチレングリコールである。ある態様では、第２の高分子は、数平均分子量1500Daから3000Daのポリエチレングリコールであり得る。ある態様では、第２の高分子は、数平均分子量1700Daから2500Da、数平均分子量1800Daから2300Daであり得る。
ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量9000Daから15000Daのポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量1700Daから2500Da、数平均分子量1800Daから2300Daであり得る。
ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量4000Daから20000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1700Daから2500Da、数平均分子量1800Daから2300Daであり得る。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量5000Daから20000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1700Daから2500Da、数平均分子量1800Daから2300Daであり得る。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量7000Daから20000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1700Daから2500Da、数平均分子量1800Daから2300Daであり得る。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量11000Daから13000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1700Daから2500Da、数平均分子量1800Daから2300Daであり得る。
ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量4000Daから20000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1800Daから2300Daである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量5000Daから20000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1800Daから2300Daである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量7000Daから20000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1800Daから2300Daである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量9000Daから20000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1800Daから2300Daである。ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量11000Daから13000Daであり、第２の高分子は、数平均分子量1800Daから2300Daである。
ある態様では、第１の高分子は、数平均分子量4000Daから6000Daである。第２の高分子は、上記で定義した通りである。
【００２５】
本発明者らは、その外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、第２の高分子よりも数平均分子量が大きく、第１の高分子は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、これにより外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されているキャリアを用いることで、第２の高分子だけにより修飾されているミセルよりも、ミセルの形成効率を改善し、かつ、キャリアの脳への送達効率を改善できることを見出した。
本発明のある態様では、第１の高分子の数平均分子量は、第２の高分子の数平均分子量の１．２倍以上、１．３倍以上、１．４倍以上、１．５倍以上、２倍以上、３倍以上または４倍以上の数平均分子量であり得る。
本発明のある態様では、第２の高分子は、数平均分子量1500Daから3000Daのポリエチレングリコールである。この特定の態様では、第１の高分子は、数平均分子量5000Da以上、6000Da以上、7000Da以上、8000Da以上、または9000Da以上のポリエチレングリコールである。この特定の態様では、第１の高分子は、9000Da以上、20000Da以下、30ｋDa以下、40ｋDa以下、50ｋDa以下、60ｋDa以下、70ｋDa以下、80ｋDa以下、90ｋDa以下、または100ｋDa以下であり得る。
第１の高分子（共重合体の形態を含む）と第２の高分子（共重合体の形態を含む）との分子数比は、５０：５０〜２０：８０の範囲であり得、５０：５０〜３０：７０の範囲であり得、２０：８０〜４０：６０の範囲であり得、４５：５５〜３５：６５の範囲であり得る。分子数比は、第１の高分子と第２の高分子の混合比により調整することができる。
【００２６】
いずれの態様においても、少なくとも第１の高分子の一部は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されており、キャリアの最外表面には、ＧＬＵＴ１リガンドが露出している。
【００２７】
第１の高分子は、ブロック共重合体の一部であり得る。例えば、第１の高分子は、ポリカチオンまたはポリアニオンブロックとブロック共重合体を形成し得る。
第２の高分子は、ブロック共重合体の一部であり得る。例えば、第２の高分子は、ポリカチオンまたはポリアニオンブロックとブロック共重合体を形成し得る。
これらのポリカチオンブロックまたはポリアニオンブロックとブロック共重合体を形成した第１の高分子および第２の高分子はそれぞれ、ポリアニオンまたはポリカチオンとミセルを形成し得る。本発明では、このようにして得られたミセルは、第１の高分子と第２の高分子とで修飾されたミセルである。
【００２８】
ブロック共重合体中のポリアニオンブロックおよびポリカチオンブロックはそれぞれ、天然アニオン性アミノ酸および天然カチオン性アミノ酸を単量体単位とするポリマーとすることができ、また、後述するように、非天然アニオン性アミノ酸および非天然カチオン性アミノ酸を単量体単位とするポリマーとしてもよい。
【００２９】
本発明によれば、薬物送達用のキャリアを含む、組成物であって、
キャリアは、その外表面が第１の高分子と第２の高分子により修飾されており、第１の高分子は、数平均分子量が第１の所定の数平均分子量以上のポリエチレングリコールであり、第２の高分子は、数平均分子量が第２の所定の数平均分子量以下のポリエチレングリコール（ここで、第１の所定の数平均分子量は、第２の数平均分子量よりも大きい）であり、
第１の高分子は、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、これにより該キャリアの外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている、組成物が提供される。薬物送達用キャリアは、治療薬および／または診断薬を送達し得る。
【００３０】
グルコースでその外表面を修飾した上記キャリアは、対象に投与するだけでも脳への蓄積を示す。従って、本発明による投与計画では、絶食若しくは低血糖を誘発させなくてよく、および／または、血糖値の上昇を誘発させなくてもよい。また、本発明者らは、グルコースが表面に露出するようにグルコースでその外表面を修飾したキャリア、具体的にはポリイオンコンプレックスミセルなどの小胞をある投与計画に従って投与すると、顕著にこれらのキャリアが血液脳関門を超えて脳内（脳実質部）に送達されることを見出した。従って、本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。本発明による投与計画では、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に該対象に投与され得る。投与計画は、該対象への組成物の投与と該対象における血糖値の上昇の誘発との間にインターバルを有してもよいし、有さなくてもよい。該組成物が該対象における血糖値の上昇の誘発と同時に投与される場合には、該組成物は、血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤と混合した形態で該対象に投与してもよいし、該対象における血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤とは別の形態で投与してもよい。また、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、連続してまたは逐次的に該対象に投与される場合には、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与してもよいし、後に投与してもよいが、好ましくは、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与することができる。該対象への該組成物の投与よりも先に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象において血糖値の上昇を誘発させてから、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象に該組成物を投与することが好ましい。また、該対象への該組成物の投与よりも後に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象に該組成物を投与してから、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象において血糖値の上昇を誘発させることが好ましい。上記の投与計画のサイクルは、２回以上行なってもよい。グルコース投与とサンプル投与の前後関係は、血液脳関門を通過させるタイミングにより決定することができる。
【００３１】
大脳皮質は６層で構成され、表層から、分子層（第１層）、外顆粒層（第２層）、外錐体細胞層（第３層）、内顆粒層（第４層）、内錐体細胞層（第５層）および多形細胞層（第６層）が存在するが、これらのいずれの層においても脳実質にキャリアを送達することができる。これらの層の中では特に、外錐体細胞層（第３層）および内顆粒層（第４層）においてキャリアの送達が顕著に有効である。
【００３２】
以下、本発明におけるグルコースの血液脳関門における役割を説明する。本発明におけるグルコースの役割は、脳の血管内皮細胞の血管内表面に発現するグルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ１に結合することであると考えられる。従って、本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドもグルコースと同じ役割を果たすことができる。また、本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドは、脳の血管内皮細胞の血管内表面に発現するグルコーストランスポーターに結合することができるように、その外表面に露出するように結合させることができる。従って、ＧＬＵＴ１にＧＬＵＴ１リガンドを提示することができる分子、複合体および小胞その他であれば、ＧＬＵＴ１と結合し得、結合後にグルコースによりＧＬＵＴ１が細胞内に取り込まれる際に、一緒に血管内皮細胞内に取り込まれるものと考えられる。また、血管内皮細胞に取り込まれると、取り込まれた小胞は、血液脳関門を通過して脳実質に移行する。小胞を修飾するグルコース分子が多いと、脳実質に到達する小胞の割合がわずかであるが低下した。このことは、小胞を修飾するグルコース分子が多いと、小胞がエンドサイトーシスにより細胞に取り込まれ、そのまま、細胞を脳実質に向けて通過すること、および、小胞が血管内皮細胞から脳実質に移行する際に、小胞と血管内皮細胞との解離の効率が低下することを示唆するものである。言い換えれば、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれた小胞の一部は、脳血管内皮細胞と解離せず、脳血管内皮細胞に蓄積する。従って、本発明の組成物またはコンジュゲートは、脳血管内皮細胞に送達することに用いることができる。また、本発明におけるグルコースの役割は、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門においても、同様である。特に、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門においても、低血糖時の血管内皮細胞にはＧＬＵＴ１が発現する。従って、本発明の組成物またはコンジュゲートは、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門を通過させるために用いることができる。本発明の組成物またはコンジュゲートはまた、血液神経関門、血液網膜関門および血液髄液関門に存在する血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。
【００３３】
グルコースは、その２位の炭素または６位の炭素原子を介して、好ましくは６位の炭素原子を介して高分子や薬剤とコンジュゲートさせることができる。このように本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドは、そのリガンドとしての機能を失わないように他の分子を修飾させることができ、当業者であればＧＬＵＴ１との結合様式に基づき容易に薬剤との結合箇所を決定できる。
本明細書では、ｎ位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（ｎ）」｛但し、ｎは、１〜４および６のいずれかの整数である｝と表記することがある。例えば、本明細書では、６位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（６）」と表記し、２位の炭素原子を介して結合したグルコースを「Ｇｌｃ（２）」と表記することがある。
【００３４】
本発明では、グルコースの代わりにＧＬＵＴ１に結合するグルコースの誘導体を用いてもよいであろう。
【００３５】
本発明では、外表面をＧＬＵＴ１リガンドで修飾することができるキャリアとしては、薬剤送達用のミセル、リポソームなどの小胞、並びにデンドリマー、ナノスフェアおよびハイドロゲルが挙げられる。本発明において、薬剤送達用のキャリアを用いる利点は、例えば、キャリア内部に薬剤を内包させ、標的部位での薬剤濃度を高めること、または、標的部位以外での薬剤による副作用を低減することである。本発明で用いられるキャリアは、特に限定されないが、例えば、その直径が４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下または８０ｎｍ以下であり、例えば、２０ｎｍ以上、３０ｎｍ以上または４０ｎｍ以上である。本発明で用いられるキャリアは、例えば３０ｎｍ〜１５０ｎｍ、または、例えば３０ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有する。
【００３６】
本発明で用いられるミセルとしては、薬剤送達用のミセルが挙げられる。薬剤送達用のミセルとしては、ブロック共重合体により形成されるミセルが知られている。ミセルを形成するブロック共重合体は、特に限定されないが、PICミセルの場合、荷電性ポリマーブロック（例えば、ポリアニオンブロックまたはポリカチオンブロック）と生体適合性ブロック（例えば、ポリエチレングリコールブロック）との共重合体または薬学的に許容可能なその塩とすることができる。また、ブロック共重合体としては、生分解性であるブロック共重合体を用いることが好ましく、そのような共重合体としては様々な共重合体が知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。例えば、生体適合性が高く、生分解性であるブロック共重合体としては、例えば、ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸、ポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸、およびポリエチレングリコール−ポリ（（５−アミノペンチル）−アスパラギン酸）ブロック共重合体などを用いることができる。ポリイオンコンプレックス型ミセル（PICミセル）として、ポリアニオンとポリカチオンとの静電的相互作用により形成されるポリイオンコンプレックス層を有するミセルが知られている。蛍光色素でのブロック共重合体へのラベルは、ブロック共重合体のポリエチレングリコール側と反対の末端を蛍光色素で修飾することにより行なうことができる。ＰＩＣミセルでは、ＰＥＧ側の末端にＧＬＵＴ１リガンドを連結させることで、ＧＬＵＴ１リガンドはミセルの外表面に露出する。
【００３７】
本発明によれば、下記式(I)〜(XV)で表される化合物またはその塩がそれぞれ提供される。塩は、好ましくは薬学的に許容可能な塩である。
【００３８】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸
【化１】
2018207864.tif 000002
｛式中、ｎ1は、ＰＥＧブロックの分子量が第１の高分子または第２の高分子の分子量となるように選択され、ｍ1は、５〜２０，０００である。｝
【００３９】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリグルタミン酸
【化２】
2018207864.tif 000003
｛式中、ｎ2は、ＰＥＧブロックの分子量が第１の高分子または第２の高分子の分子量となるように選択され、ｍ2は、５〜２０，０００である。｝
【００４０】
Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（（N-(５−アミノペンチル)−アスパラギン酸アミド）
【化３】
2018207864.tif 000004
｛式中、ｎ3は、ＰＥＧブロックの分子量が第１の高分子または第２の高分子の分子量となるように選択され、ｍ3は、５〜２０，０００である。｝
【００４１】
ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸
【化４】
2018207864.tif 000005
｛式中、ｎ4は、ＰＥＧブロックの分子量が第１の高分子または第２の高分子の分子量となるように選択され、ｍ4は、５〜２０，０００である。｝
【００４２】
ＰＥＧ−ポリグルタミン酸
【化５】
2018207864.tif 000006
｛式中、ｎ5は、ＰＥＧブロックの分子量が第１の高分子または第２の高分子の分子量となるように選択され、ｍ5は、５〜２０，０００である。｝
【００４３】
ＰＥＧ−ポリ（（N-(５−アミノペンチル)−アスパラギン酸アミド））
【化６】
2018207864.tif 000007
｛式中、ｎ6は、ＰＥＧブロックの分子量が第１の高分子または第２の高分子の分子量となるように選択され、ｍ6は、５〜２０，０００である。｝
【００４４】
上記式(I)〜式(XV)の化合物またはその塩は、その外表面がグルコースで修飾されたＰＩＣミセルを形成することに用いることができる。上記式(I)〜式(XV)の化合物の塩にポリイオンコンプレックスを形成させるためには、ｍ1、ｍ2、ｍ3、ｍ4、ｍ5、ｍ6、ｍ7、ｍ8、ｍ9、ｍ10、ｍ11、ｍ12、ｍ13、ｍ14およびｍ15は、それぞれ独立して、２〜２０，０００の整数、好ましくは２〜５，０００の整数、より好ましくは４０〜５００の整数、さらに好ましくは５〜１，０００の整数、さらにより好ましくは１０〜２００の整数とすることができる。塩は、好ましくは、薬学的に許容可能な塩である。
【００４５】
ＰＩＣミセルは、ある態様では、式(I)の化合物若しくはその塩、式（X）の化合物若しくはその塩または式(XIII)の化合物若しくはその塩と、式（IV）の化合物若しくはその塩と、式（VI）の化合物若しくはその塩とを混合して得られる。ＰＩＣミセルの更なる特定の態様では、上記式においてｍ1、ｍ10、ｍ13、およびｍ4は、８０であり、ｍ6は、７２である。塩は、好ましくは、薬学的に許容可能な塩である。
【００４６】
本発明で用いられるリポソームとしては、特に限定されないが、リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）により形成されるリポソームが挙げられる。リポソームは、古くから様々なものが知られ、当業者であれば適宜調製することが可能である。当業者であれば、リポソームに薬剤を適宜内包させることができる。
【００４７】
ＧＬＵＴ１リガンドによる小胞の修飾は、特に限定されないが、例えば小胞を形成する高分子をＧＬＵＴ１リガンドにより修飾してから小胞を形成させることにより行なうことができる。小胞の外表面に露出させる観点からは、高分子の修飾部位は、小胞を形成させたときに外表面に位置する部位とすることができる。このようなＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された高分子は、当業者であれば適宜調製することができる。一例として、グルコースにより修飾された高分子（特に、Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）ブロック共重合体またはＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）ブロック共重合体）の調製方法の例を以下に説明する。Ｇｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（アニオン）ブロック共重合体またはＧｌｃ（６）−ＰＥＧ−ポリ（カチオン）ブロック共重合体は、例えば、グルコースの６位以外の炭素上の水酸基を保護した上で、グルコースにブロック共重合体を重合させて得ることができる。
【００４８】
これらの高分子は、米国特許公開公報第2016/0287714号の記載に従って作製することができる。また、小胞は、米国特許公開公報第2016/0287714号の記載に従って作製することができる。
【００４９】
本発明で用いられる薬剤としては、特に限定されないが、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いることができる。本発明では、薬剤を選択性高く脳に送達することができる。従って、薬剤としては、特に限定されないが、例えば、脳の生理機能を高める生理活性物質、脳の疾患を処置し得る生理活性物質、脳疾患に特徴的な抗原を認識する抗体、脳疾患に関連する遺伝子の発現を調節する核酸、脳を染色できる生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いることができる。例えば、薬剤として脳の生理機能を高める生理活性物質、脳の疾患を処置し得る生理活性物質、脳疾患に特徴的な抗原を認識する抗体、脳疾患に関連する遺伝子の発現を調節する核酸を用いた本発明の組成物は、医薬組成物として提供され得る。薬剤として脳を染色できる生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤を用いた本発明の組成物は、診断薬として提供され得る。
【００５０】
本発明の組成物は、本発明による投与計画に基づき投与することもできる。本発明による投与計画では、好ましくは、まず、対象に絶食させるか、または対象に低血糖を誘発させるが、その後、該対象に該組成物を投与する。本発明による投与計画では、より好ましくは、まず、対象に絶食させるか、または対象に低血糖を誘発させるが、その後、該対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させる。ここで、本発明による投与計画では、該対象への該組成物の投与は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に行なわれる。低血糖状態の誘発は、ＧＬＵＴ１を血管内皮細胞（例えば、脳血管内皮細胞）の内表面に発現させるために有用であると考えられる。但し、本発明によれば、本発明の組成物またはコンジュゲートは、投与対象における血糖値の上昇がこれらの脳への送達に極めて効果的である。本発明によれば、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象における本発明の組成物（キャリアなど）またはコンジュゲートの血中濃度が一定値以上であるときに、血糖値を上昇させることにより、本発明の組成物（キャリアなど）またはコンジュゲートが極めて効果的に脳内に送達できるのである。また、本実施例によれば、対象において血糖値の上昇を誘発させた後もしばらくの間は本発明の組成物（キャリアなど）またはコンジュゲートは該対象の脳内へ送達される。
【００５１】
本発明の組成物（キャリアなど）の血中濃度を一定値以上に保つ観点では、本発明の組成物またはコンジュゲートを対象に輸液投与することが好ましい。このようにすることで、血中滞留時間の短い組成物またはコンジュゲートであっても、一定の血中濃度を確保し易い。例えば、血中滞留時間の短いｓｉＲＮＡを内包するｓｉＲＮＡミセルは、輸液により対象に投与すると効果を上げやすい。輸液投与は、好ましくは、１０分以上、１５分以上、３０分以上、４５分以上、６０分以上、９０分以上、または２時間以上行なうことができる。輸液投与は、好ましくは一定の輸液速度で行なう。例えば、精密投与ポンプを用いれば、一定の輸液速度による投与が可能である。輸液投与は、対象における血糖値の上昇の誘発と同時になされてもよく、輸液投与中に対象において血糖値の上昇を誘発させてもよい。
【００５２】
本発明の組成物は、本発明による投与計画に基づき投与すると、脳への送達効率が選択的に高まる。従って、本発明の組成物は、脳に薬剤を送達するために用いることができる。本発明の組成物はまた、薬剤に血液脳関門を通過させることができる。従って、本発明の組成物は、従来は送達が困難であった脳実質に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達することに用いることができる。本発明の組成物はまた、薬剤を脳血管内皮細胞に蓄積させることができる。従って、本発明の組成物は、従来は送達が困難であった脳血管内皮細胞に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達することに用いることができる。また、本発明の組成物は、脳血管内皮細胞間の接着を弱める、または破壊する薬剤を脳血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。同様に、本発明の組成物は、網膜、末梢神経および／または髄液に、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達するために用いることができる。本発明の組成物はまた、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞に生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を送達するために用いることができる。本発明の組成物は、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞間の接着を弱める、または破壊する薬剤を脳血管内皮細胞に送達することに用いることもできる。血管内皮細胞間の接着を弱め、または破壊することにより、関門の機能を弱め、様々な薬剤に関門を通過させることができるようになる。
【００５３】
本発明の組成物は、経口投与および非経口投与（例えば、静脈内投与または腹腔内投与）により投与することができる。
【００５４】
本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、脳組織を標的化する方法が提供される。本発明によればまた、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、脳血管内皮細胞を標的化する方法が提供される。本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該キャリアを投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。同様に本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、末梢神経組織、網膜および／または髄液を標的化する方法が提供される。本発明によればまた、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されている薬剤送達用キャリアを投与計画に従って対象に投与することを含んでなる、血液神経関門、血液網膜関門または血液髄液関門にそれぞれ存在する血管内皮細胞を標的化する方法が提供される。
【００５５】
本発明によれば、キャリアには、生理活性物質、抗体、核酸、生体適合性の蛍光色素、並びに超音波、ＭＲＩおよびＣＴ用造影剤などの造影剤などの薬剤を内包することができ、これにより、キャリアに内包された薬剤を脳、末梢神経組織、網膜および／または髄液に効果的に送達することが可能である。
【００５６】
本発明によれば、薬剤として脳疾患治療薬または予防薬を用いることができる。この場合、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ脳疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ末梢神経疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、外表面がＧＬＵＴ１リガンドにより修飾され、かつ網膜疾患治療薬または予防薬を内包した薬剤送達用キャリアを投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。
【００５７】
本発明によれば、薬剤として脳疾患治療薬または予防薬を用いることができる。この場合、本発明によれば、脳疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは脳疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、脳疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、末梢神経疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは末梢神経疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、末梢神経疾患の治療または予防方法が提供される。同様に、本発明によれば、網膜疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとのコンジュゲートまたは網膜疾患治療薬若しくは予防薬とＧＬＵＴ１リガンドとがリンカーを介して連結してなるコンジュゲートを、投与計画に従ってその必要のある対象に投与することを含んでなる、網膜疾患の治療または予防方法が提供される。本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。
【００５８】
従って、本発明によれば、脳疾患治療薬または予防薬を含んでなる、脳疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の脳への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は脳疾患の治療または治療に有用であることが明らかである。本発明によればまた、末梢神経疾患治療薬若しくは予防薬を含んでなる、末梢神経疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の末梢神経への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は末梢神経疾患の治療または治療に有用であることが明らかである。本発明によればさらに、網膜疾患治療薬若しくは予防薬を含んでなる、網膜疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。本発明によれば、薬剤の網膜への取り込みが向上し、本発明の医薬組成物は網膜疾患の治療または治療に有用であることが明らかである。本発明によれば、上記治療薬または予防薬は、キャリアに内包された形態で組成物に含まれるか、または、ＧＬＵＴ１リガンドとリンカーを介してまたは介さずにコンジュゲートされた形態で組成物に含まれ得る。
【００５９】
脳疾患としては、脳疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる脳疾患、例えば、不安、うつ病、睡眠障害、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症などが挙げられる。従って、本発明では、これらの脳疾患を治療するために、抗不安剤、抗うつ剤、睡眠導入剤、アルツハイマー治療薬、パーキンソン病治療薬および多発性硬化症治療薬などの脳疾患治療薬または予防薬が用いられ得る。アルツハイマー病治療薬としては、例えば、Ａβ抗体がよく知られ、パーキンソン病治療薬としては、例えば、ドーパミン受容体アゴニストおよびＬ−ドーパがよく知られ、多発性硬化症治療薬としては、例えば、副腎ステロイド薬、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、および免疫抑制剤がよく知られ、これらの治療薬が本発明で用いられ得る。末梢神経疾患としては、末梢神経疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる末梢神経疾患、例えば、ギランバレー症候群、フィッシャー症候群および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチーが挙げられる。網膜疾患としては、網膜疾患治療薬に血液脳関門を通過させることで治療できる網膜疾患、例えば、網膜色素変性症、脳回状網脈膜萎縮、コロイデレミア、クリスタリン網膜症、先天黒内障、先天性停在性夜盲、小口病、白点状眼底、白点状網膜症、色素性傍静脈網脈絡膜萎縮、スターガルト病、卵黄状黄斑ジストロフィー、若年網膜分離症、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィー、オカルト黄斑ジストロフィー、家族性滲出性硝子体網膜症および網膜色素線条が挙げられる。
【００６０】
本発明では、薬剤送達用のキャリアやこれを含む組成物は、薬学上許容されるものである。「薬学上許容される」とは、許容されない毒性を奏しないこと、および／または、許容されない毒性を奏しない用量で投与されることを意味する。
【００６１】
実施例１：各種ブロック共重合体の合成
【００６２】
1.1 メトキシ−ポリエチレングリコール−ポリアスパラギン酸（meO-PEG-PAsp）の合成
meO-PEG-PAspは既報に従い合成した。α-メトキシ-ω-アミノ-ポリエチレングリコール(meO-PEG-NH2, PEGの分子量: 2, 5, 12 kDa)を開始剤としたα-アミノ酸-N-カルボン酸無水物の開環重合(NCA重合)によってメトキシ-PEG-ポリ(β-ベンジル-L-アスパラギン酸) (meO-PEG-PBLA)を合成した。具体的には、meO-PEG-NH2を秤量しジクロロメタン、ベンゼンに溶解後一晩凍結乾燥させた。100 mg/mLになるようジクロロメタンに溶解し、100 mg/mLになるようN, N-ジメチルホルムアミド(DMF)、ジクロロメタンの1:9混合溶媒に溶解したNCA-BLAと混合した。35 ℃で3日間攪拌した。これらの操作はすべてアルゴン雰囲気下で行った。再沈殿、減圧乾燥により生成物を白色固体として得た。プロトン核磁気共鳴分光法(1H-NMR)により生成物の構造及びポリアスパラギン酸の重合度(DP)を、ゲル濾過クロマトグラフィー(GPC)により分子量分布を評価した。生成物のPEGの分子量(単位：Da)とPBLAの重合度(DP)の組み合わせは12k-80, 5k-72, 2k-78であった。得られたmeO-PEG-PBLAの脱保護によってメトキシ-PEG-ポリ-アスパラギン酸(meO-PEG-PAsp)を合成した。meO-PEG-PBLAを秤量しベンジル基に対し5 eq.の0.25 N水酸化ナトリウム水溶液に溶解、室温で1時間攪拌し反応させた。純水に対し室温で1日透析を行い、凍結乾燥によって白色粉末として生成物を得た。1H-NMR、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により生成物を評価した。1H-NMRによりベンジル基由来のピークが消失していることが確認され、脱保護反応が完了したことが示された。HPLCにより得られた分子量分布は単峰性で、反応によって二量体の生成や主鎖の分解が進行していないことが確認された。
【００６３】
1.2 グルコース修飾PEG-PAsp（Gluc(6)-PEG-PAsp）の合成
Gluc(6)-PEG-PAspは、WO2015/075942に記載されるグルコースが6位の酸素でPEG-PAspと連結した分子である。上記と同様にDIG(6)-PEG-NH2(PEGの分子量: 5, 12 kDa)を開始剤としたNCA重合、脱保護によりGluc(6)-PEG-PAspを合成した（WO2015/075942参照）。1H-NMRおよびHPLCにより生成物を評価した。得られたブロック共重合体のPEGの分子量、ポリアスパラギン酸のDPの組み合わせは5k-72, 12k-67であった。
【００６４】
1.3 meO-PEG-PAsp(AP)の合成
1.1で合成したmeO-PEG-PBLA(PEGの分子量: 2, 5, 12 kDa)のアミノリシス反応により、既報に従いPEG-PAsp(AP)を合成した。具体的には、meO-PEG-PBLAを秤量しジクロロメタン、ベンゼンに溶解後一晩凍結乾燥させた。15 mg/mLになるようにN-メチル-2-ピロリドン(NMP)に溶解し35 ℃で1日攪拌し溶解させた。meO-PEG-PBLAのベンジル基に対し100等量の1,5-ジアミノペンタン(DAP)とその半量のNMPを混合し氷水浴中で滴下、12 ℃で1時間攪拌し反応させた。これらの操作は全てアルゴン雰囲気下で行った。氷浴中でDAPのアミノ基に対し1.5等量の5 N塩酸で中和した。4 ℃で10 mM塩酸に対し1日、純水に対し1日透析し、凍結乾燥により白色固体として生成物を得た。1H-NMR及びHPLCにより生成物を評価した。得られたブロック共重合体のPEGの分子量、DPの組み合わせは2k-85, 5k-65, 12k-80であった。
【００６５】
実施例２：高分子ミセルの調製
既報に従いポリイオンコンプレックス(PIC)ミセルを調製した（WO2015/075942参照）。
【００６６】
実施例1の手順で合成した各ブロック共重合体を秤量し、それぞれ1 mg/mLになるよう10 mMリン酸緩衝液(PB, pH = 7.4)に溶解した。各ブロック共重合体溶液を荷電比が1 : 1になるよう混合し2000 rpmで2分間攪拌した後、動的光散乱法(DLS)により粒径、粒度分布(PdI)を測定した。各ブロック共重合体溶液の混合比を変化させることで、高分子ミセル表層のグルコースリガンド率、鎖長の異なるPEGの混合比を制御した。いずれのリガンド率、PEG混合比においても粒径30〜40 nm程度、PdI < 0.15の単分散な粒子として高分子ミセルが得られた。得られた高分子ミセル中のカルボキシル基に対し10 eq.の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩(EDC)を10 mg/mLになるよう10 mM PBに溶解し添加後、室温で一晩静置し、高分子ミセルコアを架橋した。VIVASPIN 6(MWCO = 6-8 kDa)中、2000 rpmでの遠心によって精製を行い未反応のEDC等を除去し、必要に応じて溶媒をPBS、純水等に置換した。PBS置換後の得られた高分子ミセルの直径、PdIを表１に示す。
【００６７】
【表１】
2018207864.tif 000008
【００６８】
純水中に置換した高分子ミセルを酢酸ウラニルにより染色し、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて形態観察を行った。高分子ミセルのTEM像を図１に示す。球状の粒子が得られていることが確認された。
【００６９】
実施例３：フェノール硫酸法による高分子ミセルに装着したグルコース分子の定量
糖の定量法であるフェノール硫酸法を用いて実施例２の手順で調製した高分子ミセル表層のグルコース分子の定量を行った。高分子ミセルを10 mM PBに溶解した溶液100 μLに、試験管中で5 w/v%フェノール溶液を100 μL添加、さらに濃硫酸500 μLを添加し、10秒程度激しく振蕩攪拌した。30分間室温で静置し、反応後の溶液を96 well black plateに200 μL/wellとり、490 nmにおける吸光をマルチプレートリーダーで測定した。高分子ミセルの調製に用いたグルコース修飾ブロック共重合体で検量線を作成し、高分子ミセル中のグルコース分子量を算出した。算出した高分子ミセル中のグルコースリガンド率を表２に示す。ブロック共重合体混合比とほぼ等しい比率でグルコース分子が高分子ミセルに修飾されていることが示された。
【００７０】
【表２】
2018207864.tif 000009
【００７１】
実施例４：薬物封入ミセルの形成効率
本実施例では、薬物として、DNA、RNAまたは抗体のミセル化を試みた。
【００７２】
RNAとしては、GLucをコードしたmRNA（784 base）を用いた。DNAとしては、pCAG-LucをコードしたプラスミドDNA（6527bp）を用いた。抗体としては、Ｆａｂ’断片を用いた。得られたミセルをそれぞれ、mRNA封入ミセル、pDNA封入ミセルおよび抗体封入ミセルと呼ぶ。
【００７３】
ミセルの構成因子であるカチオン性ポリマーは、ＰＥＧとポリリジンとのブロック共重合体とし、ＰＥＧ１２ｋＤのブロックと平均重合度５０のポリリジンブロックとからなるブロック共重合体（１２ｋ−５０）またはＰＥＧ２ｋＤのブロックと平均重合度５０のポリリジンブロックとからなるブロック共重合体（２ｋ−５０）を用いた。上記カチオン性ポリマーと薬物とのミセルは、ポリイオンコンプレックス型ミセルとして得た。このため、Ｆａｂ’断片は、無水シトラコン酸処理をし、アニオン性を高めたものを用いた。カチオン性ポリマーと薬物とを、常法に従って電荷が中和するように混合してミセルを形成させた。結果は、図２Ａおよび２Ｂに示される通りであった。
【００７４】
図２Ａに示されるように、ＰＥＧブロックにおけるＰＥＧの平均分子量が２ｋＤの場合、ミセルは形成されるものの、ミセルの形成効率は高くなかったのに対して、図２Ｂに示されるように、１２ｋＤのＰＥＧブロックを有するミセルは、高いミセル形成効率を示した。また、１２ｋＤのＰＥＧブロックを有するミセルは、単分散性の粒径分布を示した。このことから、薬物封入ミセルにおいては、封入する薬物によらず、２ｋＤよりも大きな平均分子量のＰＥＧを用いることが好ましいことが明らかとなった。
【００７５】
実施例５：脳への集積量の評価
本実施例では、薬物を封入しないミセルで脳への蓄積量を評価した。
【００７６】
実施例3に示した手順で高分子ミセルの調製、架橋、精製を行い、各サンプルの蛍光強度をNanodropによって10,000に揃えた。24時間絶食した6週齢のBalb/c(♀)にサンプル200μLをi. v. 投与し、30分後に20 w/v%グルコース溶液200 μLをi. p. 投与した。さらに1時間後に採血、PBS灌流、臓器回収を行なった。脳は全脳を摘出したうえで半脳に600 μLのlysis bufferを添加し、マルチビーズショッカーを用いて (2500 rpmで5分間、5 cycle) 組織を破砕した。サンプルを100 μLずつ96 well black plateにアプライし、マルチプレートリーダーを用いCy5の蛍光強度を測定した。
【００７７】
サンプル200 μLすべてが全脳に集積した場合の半脳あたりの蛍光強度を100%doseとし（すなわち、半脳に対し高分子ミセル100 μL、lysis buffer 500 μLを添加したサンプルの蛍光強度を100 %doseとする）、高分子ミセルを投与しないcontrolの蛍光強度を0 %doseとし、各サンプルの集積量を算出し、全脳の質量で規格化した。結果は、図３に示される通りであった。
【００７８】
図３に示されるように、脳へのミセルの集積量は、２ｋＤの平均分子量のＰＥＧブロックを有するミセル（Gluc/m(2k)）では、脳への集積が６．２％であったのに対して、１２ｋＤの平均分子量のＰＥＧブロックを有するミセル（Gluc/m(12k)）では、脳への集積が０．２％であった。この結果から、脳へのミセルの送達効率の面では、２ｋＤの平均分子量のＰＥＧブロックを有するミセルが有利であることが明らかとなった。
【００７９】
実施例６：培養細胞を用いた高分子ミセル表層のリガンド分子と受容体の相互作用の評価
【００８０】
6.1 培養細胞におけるグルコース修飾高分子ミセル取り込み量の評価
培養細胞を用いた評価では、MDA-MB-231細胞を2000 cells/wellになるように96 well black plateに播種し、10 v/v%仔ウシ血清(FBS)、RPMI 200 μL/well中で24時間インキュベーションした。インキュベーション後培地を除去し、培地50 μL/well、1 mg/mL高分子ミセルPBS溶液15 μL/wellになるように混合した溶液に置換する。さらに1時間インキュベーションし、PBSで洗浄後100 μL/wellのPBSを添加しマルチプレートリーダーを用い高分子ミセル中のCy5に由来する蛍光の強度を測定した。結果を図４および５に示す。図４に示されるように、Gluc-PEG-PAsp(12k-67)を有する高分子ミセルのうち、分子量12 kDaのPEGのみからなるものはグルコース分子を有さない高分子ミセル(Null/m)と比較しMDA-MB-231への取り込み量に有意な差は確認されなかったが、分子量2 kDaのPEGからなるブロック共重合体を混合し調製した高分子ミセルはPEG(12 k) : PEG(2 k) = 50 : 50もしくは40 : 60のものでNull/mと比較しMDA-MB-231への取り込み量が有意に増加した。PEG(12 k): PEG(2 k) = 30:70の高分子ミセルについてはグルコースリガンドを導入した高分子ミセルとNull/mとで取り込み量に有意な差は確認されなかった。導入できるグルコースリガンド分子の比率の上限が30 %に制限されていたためと考えられる。また、図５に示されるように、Gluc-PEG-PAsp (5k-80)を有する高分子ミセルのうち、分子量5 kDaのPEGのみからなるものはNull/mと比較して取り込み量に有意な差は確認されなかったが、50 %の比率で分子量2 kDaのPEGを混合し調製した高分子ミセルはNull/mと比較し有意に取り込み量が増加した。
【００８１】
6.2 阻害剤の添加によるグルコース修飾高分子ミセルの取り込み量の評価
6.1に示した手順において、高分子ミセル添加前にGLUT1阻害剤(フロレチン, サイトカラシンB)をそれぞれ10 μL/wellを添加した培地で1時間インキュベーションし、GLUT1阻害に伴う高分子ミセル取り込み量の低下を評価した。結果を図６に示す。GLUT1の阻害剤としてフロレチンまたはサイトカラシンBいずれを添加した場合でも鎖長の異なるPEGを有するグルコース修飾高分子ミセル(Gluc/m)の取り込み量は有意に減少した一方でNull/mの取り込み量は阻害剤の添加による有意な差は確認されなかった。鎖長の異なるPEGを有するGluc/mのMDA-MB-231への取り込みがGLUT1とグルコース分子の相互作用によるものであることが示唆された。
【００８２】
実施例７：インビボにおける脳組織への集積の評価
鎖長の異なるPEGを混合することによるリガンド認識能の向上を、動物実験により検討した。
【００８３】
実施例3に示した手順で高分子ミセルの調製、架橋、精製を行い、各サンプルの蛍光強度をNanodropによって10,000に揃えた。24時間絶食した6週齢のBalb/c(♀)にサンプル200μLをi. v. 投与し、30分後に20 w/v%グルコース溶液200 μLをi. p. 投与した。さらに1時間後に採血、PBS灌流、臓器回収を行なった。脳は全脳を摘出したうえで半脳に600 μLのlysis bufferを添加し、マルチビーズショッカーを用いて (2500 rpmで5分間、5 cycle) 組織を破砕した。サンプルを100 μLずつ96 well black plateにアプライし、マルチプレートリーダーを用いCy5の蛍光強度を測定した。
【００８４】
サンプル200 μLすべてが全脳に集積した場合の半脳あたりの蛍光強度を100%doseとし（すなわち、半脳に対し高分子ミセル100 μL、lysis buffer 500 μLを添加したサンプルの蛍光強度を100 %doseとする）、高分子ミセルを投与しないcontrolの蛍光強度を0 %doseとし、各サンプルの集積量を算出し、全脳の質量で規格化した。結果を図７に示す。分子量12kと2kのPEGを任意の割合で混合して調製した高分子ミセル(25%Gluc/m, 12kXX/2kxxミセル、ここでXXは12k高分子の割合（%）を示し、xxは2k高分子の割合（%）を示し、XX＋xx＝100である。)は、12kのPEGのみで調製した高分子ミセル (25%Gluc/m、12kミセル)と比較して脳への集積率が向上した。2kPEGを50 %, 70 %混合したGluc/mと比較し、特に2kPEGを60 %混合したGluc/mの脳への集積率の向上が顕著であった。
【００８５】
上記実施例から、脳への薬剤の送達においては、平均分子量数平均分子量4000Da以上のポリエチレングリコールと数平均分子量3000Da以下のポリエチレングリコールを含むブロック共重合体を４：６のモル比で含む高分子ミセルが有用であることが明らかとなった。
【００８６】
実施例８：薬剤封入実験
本実施例では、薬物として、DNA、RNAまたは抗体のミセル化を試みた。
【００８７】
RNAとしては、ガウシアルシフェラーゼ（GLuc）をコードしたmRNA（784 base）を用いた。DNAとしては、pCAG-LucをコードしたプラスミドDNA（6527bp）を用いた。抗体としては、Ｆａｂ’断片を用いた。得られたミセルをそれぞれ、mRNA封入ミセル、pDNA封入ミセルおよび抗体封入ミセルと呼ぶ。
【００８８】
ミセルの構成因子であるカチオン性ポリマーは、ＰＥＧとポリリジンとのブロック共重合体とし、ＰＥＧ１２ｋＤのブロックと平均重合度５０のポリリジンブロックとからなるブロック共重合体（１２ｋ−５０）またはＰＥＧ２ｋＤのブロックと平均重合度５０のポリリジンブロックとからなるブロック共重合体（２ｋ−５０）を用いた。上記カチオン性ポリマーと薬物とのミセルは、ポリイオンコンプレックス型ミセルとして得た。このため、Ｆａｂ’断片は、無水シトラコン酸処理をし、アニオン性を高めたものを用いた。
【００８９】
カチオン性ポリマーと薬物とを、常法に従って電荷が中和するように混合してミセルを形成させた。この際に、カチオン性ポリマーとして、１２ｋ−５０のみを用いたもの、２ｋ−５０のみを用いたもの、１２ｋ−５０と２ｋ−５０とを４：６のモル比で含む混合物用いたものを用いて、ミセルの形成効率を確認した。結果は、図８Ａ〜Ｃに示される通りであった。
【００９０】
図８Ａに示されるように、mRNA封入ミセルでは、脳への送達効率の高い２ｋ−５０のみを用いてミセルを形成させようとするとその形成効率は低かった。これに対して、１２ｋ−５０と２ｋ−５０とを４：６のモル比で含む混合物を用いて作製したミセルは、ミセルの形成効率が高く、単分散性の粒径分布を示した。
また、図８Ｂに示されるように、pDNA封入ミセルでは、脳への送達効率の高い２ｋ−５０のみを用いてミセルを形成させようとするとその形成効率は低かった。これに対して、１２ｋ−５０と２ｋ−５０とを４：６のモル比で含む混合物を用いて作製したミセルは、ミセルの形成効率が高く、単分散性の粒径分布を示した。図８Ｃに示されるように、抗体封入ミセルでも同様の傾向が確認された。
【００９１】
このように、平均分子量１２ｋＤのポリエチレングリコールと平均分子量２ｋのポリエチレングリコールをそれぞれ含むポリマーミセルは、そのモル比４：６の場合に、良好なミセル形成能を示した。一方で、平均分子量２ｋＤのポリエチレングリコールのみを含む高分子ミセルは、その形成効率が低かった。
【００９２】
これらの結果から、ＰＥＧ修飾ミセルを薬剤を封入する用途に用いる場合には、数平均分子量のより大きなＰＥＧでさらに修飾することにより、その形成効率が改善され、脳組織への送達効率も改善されることが明らかとなった。この際、グルコースは、数平均分子量のより大きなＰＥＧに対して修飾することができることも明らかとなった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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