(57)【要約】本発明の目的は、シリンギルリグニンを多く含むバイオマスを原材料とすることができ、経済性が良好であり、かつ、収率が高いムコン酸の製造を可能にする微生物及び該微生物を利用したムコン酸の製造方法を提供することにある。上記目的は、宿主微生物が染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するスフィンゴモナド（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄ）科微生物であり、染色体上にある該プロトカテク酸分解酵素遺伝子が欠失しており、挿入されたｃａｔＡ遺伝子を発現し、かつ、挿入されたａｒｏＹ遺伝子又はａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を発現する、形質転換微生物及び該形質転換微生物を用いたムコン酸の製造方法などにより解決される。
2018199112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主微生物が染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するスフィンゴモナド（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄ）科微生物であり、
染色体上にある該プロトカテク酸分解酵素遺伝子が欠失しており、
挿入されたｃａｔＡ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子又はａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
【請求項２】
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子、前記ｋｐｄＢ遺伝子及び前記ｃａｔＡ遺伝子は、同一プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項３】
前記形質転換微生物は、挿入されたｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子をさらに発現する、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項４】
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子、前記ｋｐｄＢ遺伝子、前記ｃａｔＡ遺伝子、前記ｖａｎＡ遺伝子及び前記ｖａｎＢ遺伝子は、同一プロモーターの制御下にある、請求項３に記載の形質転換微生物。
【請求項５】
前記プロトカテク酸分解酵素遺伝子が、ｌｉｇＡ遺伝子、ｌｉｇＢ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｒａＡ遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項６】
前記宿主微生物が、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）  ＳＹＫ−６株である、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項７】
ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、請求項１〜６のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を含む、ムコン酸の製造方法。
【請求項８】
宿主微生物が染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するスフィンゴモナド科微生物であり、かつ、
染色体上にある該プロトカテク酸分解酵素遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。
【請求項９】
ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、請求項８に記載の形質転換微生物に作用させることにより、プロトカテク酸を得る工程を含む、プロトカテク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１７年４月２５日出願の日本特願２０１７−８６５９５号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ムコン酸又はプロトカテク酸が生産可能な形質転換微生物及び該形質転換微生物を利用したムコン酸又はプロトカテク酸の製造方法に関する。特に、本発明は、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物と、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物とを含むバイオマスを炭素源として増殖及びムコン酸又はプロトカテク酸の生産が可能な形質転換微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
リグニンは植物の維管束細胞壁成分として存在する無定形高分子物質であって、フェニルプロパン系の構成単位が複雑に縮合したものであり、メトキシ基を含有することが化学構造上の大きな特徴になっている。リグニンは木質化した植物細胞を相互に膠着し、組織を強化する働きをしており、木材中に約１８〜３６％、草本中には約１５〜２５％存在する。そこで、木材を有効利用するために、リグニンを分解し、有用化合物を得ようとする試みが種々なされている。【０００４】
一方、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸（以下、単にムコン酸とよぶ場合がある。）は、分子内に二重結合及びカルボキシ基が２個あることにより、反応性が高い化合物である。ムコン酸を出発物質とする種々のムコン酸誘導体が知られており、例えば、ラクトン、スルホン、ポリアミド、ポリエステル、チオエステル、付加ポリマーなどが挙げられる。このようなムコン酸誘導体は、様々な用途を有するものとして知られており、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などとして使用され得る。【０００５】
このように、ムコン酸は、種々の用途に供されるところ、リグニンからムコン酸を製造することができれば、資源の再生が達成され、非常に有用である。そこで、リグニン又はリグニンに由来する物質から、ムコン酸を製造する方法が試みられている。特にこのような方法として、微生物を用いたバイオコンバージョンが研究されている。【０００６】
例えば、下記非特許文献１（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）を宿主微生物として、染色体上のｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子（以下、合わせてｐｃａＨＧ遺伝子とよぶ場合がある。）並びにｃａｔＲ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｃａｔＣ遺伝子及びｃａｔＡ遺伝子を破壊し、かつ、挿入したｃａｔＡ遺伝子とａｒｏＹ遺伝子とを、又はｃａｔＡ遺伝子とａｒｏＹ遺伝子とｅｃｄＢ遺伝子とを発現する形質転換微生物を作製し、該形質転換微生物をグルコースにより増殖させ、次いでｐ−クマル酸によりムコン酸を製造したことが記載されている。また、下記非特許文献２（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）  ＳＹＫ−６株がバニリン酸及びシリンガ酸を炭素源として増殖し得ることが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】C.W. Johnson et al., Metabolic Engineering Communications, 3, 111-119, 2016.
【非特許文献２】T. Abe et al., Journal of Bacteriology, 187, 2030-2037, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
確かに、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、ｐ−クマル酸などのｐ−ヒドロキシフェニルリグニンに由来する芳香族化合物や、フェルラ酸などのグアイアシルリグニンに由来する芳香族化合物を代謝することができる。しかし、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、シリンギルリグニンに由来する芳香族化合物、例えば、シリンガ酸を代謝することができない。したがって、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いては、シリンギルリグニンを多く含むバイオマスを原材料としてムコン酸を製造することが実質的にできないという問題がある。【０００９】
また、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、増殖のための炭素源として高価なグルコースを要求することから、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いるムコン酸の製造方法は経済性が悪いという問題がある。さらに、菌体増殖のためのグルコースと、ムコン酸生産の基質としてのｐ−クマル酸というように２種以上の炭素源が求められることから、これらの炭素源の総量を基準にして考えれば、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いるムコン酸の製造方法はムコン酸の収率が悪いという問題がある。【００１０】
一方、非特許文献２に記載のスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株によっては、バニリン酸及びシリンガ酸を炭素源としてムコン酸を製造することができない。【００１１】
そこで、本発明は、シリンギルリグニンを多く含むバイオマスを原材料とすることができ、経済性が良好であり、かつ、収率が高いムコン酸の製造を可能にする微生物及び該微生物を利用したムコン酸の製造方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題の解決を試みようとして、まずはシリンギルリグニンを多く含むバイオマスからムコン酸を製造することができる微生物について鋭意検討した。【００１３】
図１に、非特許文献１に記載の形質転換微生物の代謝経路を示す。図１に示すように、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、宿主微生物がプロトカテク酸・３，４−開裂経路を経た分解を行うシュードモナス・プチダである。このことより、非特許文献１に記載の形質転換微生物によって効率よくムコン酸を製造しようとした場合、宿主微生物の染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を欠失させ、さらに挿入したａｒｏＹ遺伝子を発現させなければならない。こうすることによってはじめて、ｐ−クマル酸などのｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物やフェルラ酸などのグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物をプロトカテク酸に一旦は収束して、ムコン酸へと変換することができるようになる。【００１４】
しかし、図１に示されていないように、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、シリンガ酸などのシリンギルリグニンに由来する芳香族化合物をプロトカテク酸やムコン酸へと代謝することができず、さらにこれらを利用して増殖することもできない。また、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子を欠失していることから、微生物の増殖のために、グルコースなどのリグニン由来の芳香族化合物以外の基質を必要とする。【００１５】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を重ねたところ、シリンガ酸などのシリンギルリグニンに由来する芳香族化合物を代謝することができるスフィンゴモナド（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄ）科微生物に着眼するに至った。そして、本発明者らは、スフィンゴモナド科微生物の染色体上のプロトカテク酸・４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子を破壊した後、別途、外来遺伝子として挿入したａｒｏＹ遺伝子、ｋｐｄＢ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子などを発現する形質転換微生物を創作することに成功した。そして、驚くべきことに、本発明者らが作製した形質転換微生物は、シリンガ酸などのシリンギルリグニンに由来する芳香族化合物を利用して増殖する、すなわち、シリンギルリグニンに由来する芳香族化合物を資化することができつつも、グアイアシルリグニンやｐ−ヒドロキシフェニルリグニンに由来する芳香族化合物を利用してムコン酸を製造し得ることを見出した。このようにして、本発明者らは、本発明者らが作製した形質転換微生物を用いて、シリンギルリグニン、グアイアシルリグニン、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニンといった様々なタイプのリグニンに由来する芳香族化合物からムコン酸を製造する方法を創作することに成功した。【００１６】
さらに驚くべきことに、本発明者らが作製した形質転換微生物を用いる方法は、これらのリグニン由来の芳香族化合物を炭素源として用いながらも、グルコース及びリグニン由来の芳香族化合物を基質として必要とする非特許文献１などに記載の形質転換微生物を用いる方法と比べて、ムコン酸の収率について同程度又はそれ以上であることを見出した。【００１７】
本発明者らは、ムコン酸を製造し得る形質転換微生物を応用して、ムコン酸の中間体であるプロトカテク酸を製造し得る形質転換微生物を作製し、さらに該形質転換微生物を用いて、シリンギルリグニン、グアイアシルリグニン、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニンといった様々なタイプのリグニンに由来する芳香族化合物からプロトカテク酸を製造する方法を創作することに成功した。【００１８】
リグニン由来の芳香族化合物は、廃資材などのバイオマスから得ることができる。特に、広葉樹にはシリンギルリグニンが多く含まれている。そこで、我が国に多く繁茂する広葉樹に由来するバイオマスは非常に安価に入手できることから、本発明者らが作製した形質転換微生物を用いるムコン酸やプロトカテク酸の製造方法は、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いる方法などと比べて経済的に有利な方法である。本発明は、これらの知見及び成功例に基づき完成された発明である。【００１９】
したがって、本発明の一態様によれば、以下の（１）〜（６）の形質転換微生物が提供される。
（１）宿主微生物が染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するスフィンゴモナド（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄ）科微生物であり、
染色体上にある該プロトカテク酸分解酵素遺伝子が欠失しており、
挿入されたｃａｔＡ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子又はａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
（２）挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子、前記ｋｐｄＢ遺伝子及び前記ｃａｔＡ遺伝子は、同一プロモーターの制御下にある、（１）に記載の形質転換微生物。
（３）前記形質転換微生物は、挿入されたｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子をさらに発現する、（１）〜（２）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
（４）挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子、前記ｋｐｄＢ遺伝子、前記ｃａｔＡ遺伝子、前記ｖａｎＡ遺伝子及び前記ｖａｎＢ遺伝子は、同一プロモーターの制御下にある、（３）に記載の形質転換微生物。
（５）前記プロトカテク酸分解酵素遺伝子が、ｌｉｇＡ遺伝子、ｌｉｇＢ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｒａＡ遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
（６）前記宿主微生物が、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）ＳＹＫ−６株である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。【００２０】
本発明の別の一態様によれば、以下（７）のムコン酸の製造方法が提供される。
（７）ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、（１）〜（６）のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を含む、ムコン酸の製造方法。【００２１】
本発明の別の一態様によれば、以下（８）の形質転換微生物が提供される。
（８）宿主微生物が染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するスフィンゴモナド科微生物であり、かつ、
染色体上にある該プロトカテク酸分解酵素遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。【００２２】
本発明の別の一態様によれば、以下（９）のプロトカテク酸の製造方法が提供される。
（９）ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、（８）に記載の形質転換微生物に作用させることにより、プロトカテク酸を得る工程を含む、プロトカテク酸の製造方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の一態様の形質転換微生物及び本発明の一態様の製造方法によれば、従前の微生物を用いる方法では困難又は不可能であったシリンギルリグニンを多く含むバイオマスを原材料として、安価かつ収率を維持又は改善して、ムコン酸やプロトカテク酸を製造することができる。したがって、本発明の一態様の形質転換微生物及び本発明の一態様の製造方法によれば、様々なタイプのリグニンを含むバイオマスや我が国で比較的入手が容易なバイオマスの有効利用の一環として、工業的規模でのムコン酸やプロトカテク酸の製造が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、非特許文献１のＦｉｇ．１に記載のシュードモナス・プチダの代謝経路の概要図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の一態様である形質転換微生物及び製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【００２６】
（形質転換微生物の概要）
本発明の一態様である形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にある特定の遺伝子が欠失するように、宿主微生物を形質転換した微生物である。また、本発明の一態様である形質転換微生物は、さらに外来遺伝子として挿入したプロトカテク酸からのムコン酸の合成経路に関与する特定の遺伝子を発現するように、宿主微生物を形質転換しているか否かによって、２種類の態様がある。
【００２７】
本明細書における「遺伝子の欠失」は、遺伝子が正常に転写されないこと、遺伝子の発現によって産生されるべきタンパク質が正常に翻訳されないことなどのように、遺伝子が正常に機能せずに遺伝子の発現が妨げられていることを意味する。遺伝子の欠失は、例えば、遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、挿入などにより遺伝子の構造が変化することによって生じ得る。ただし、遺伝子の欠失は、遺伝子の構造に変化が生じずに、例えば、遺伝子の制御領域をブロックするなどの手段によって遺伝子の発現が抑えられることによっても生じ得る。
【００２８】
本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質が本来の構造や活性を有する態様で生産されることを意味する。また、本明細書における「遺伝子の過剰発現」とは、遺伝子が挿入されたことにより、宿主微生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質が生産されることを意味する。
【００２９】
（欠失又は挿入する遺伝子）
形質転換微生物について、宿主微生物は染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有する。プロトカテク酸分解酵素遺伝子は、プロトカテク酸を分解する活性を有する酵素を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、ｌｉｇＡ遺伝子、ｌｉｇＢ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｒａＡ遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子のうち、形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にあるプロトカテク酸分解酵素遺伝子の一部又は全部が欠失している。
【００３０】
ｌｉｇＡ遺伝子及びｌｉｇＢ遺伝子は、それぞれプロトカテク酸・４，５−ジオキシゲナーゼの小サブユニット及び大サブユニットを発現する遺伝子、又は一つのポリペプチドからなるプロトカテク酸・４，５−ジオキシゲナーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、それぞれ配列番号１９及び２０の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。プロトカテク酸・４，５−ジオキシゲナーゼは、例えば、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）  ＳＹＫ−６株などが保有し、プロトカテク酸から４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有し、Ｆｅ２＋を補因子として要求する。
【００３１】
ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子は、それぞれプロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼのβサブユニット及びαサブユニットを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、それぞれ配列番号３５及び３６の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。プロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）  ＫＴ２４４０株などが保有し、プロトカテク酸から３−カルボキシムコン酸を生成する反応を触媒する活性を有し、Ｆｅ３＋を補因子として要求する。
【００３２】
ｐｒａＡ遺伝子は、プロトカテク酸・２，３−ジオキシゲナーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３７の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。プロトカテク酸・２，３−ジオキシゲナーゼは、例えば、パエニバシラス・スピーシーズ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）  ＪＪ−１ｂ株などが保有し、プロトカテク酸から５−カルボキシ―２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有する。
【００３３】
本発明の一態様の形質転換微生物（以下、形質転換微生物（１）とよぶ。）は、挿入されたｃａｔＡ遺伝子を発現する。形質転換微生物（１）は、さらに挿入されたａｒｏＹ遺伝子又はａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を発現する。一方で、本発明の別の一態様の形質転換微生物（以下、形質転換微生物（２）とよぶ。）は、ｃａｔＡ遺伝子、ａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子のいずれも挿入されていない。すなわち、形質転換微生物（２）は、プロトカテク酸からムコン酸を製造することが実質的にできない。本明細書では、形質転換微生物（１）及び（２）をまとめて指すときには、単に「形質転換微生物」とよぶ。
【００３４】
ｃａｔＡ遺伝子は、カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（Ｃａｔｅｃｈｏｌ  １，２−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号２１の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．１）は、１，２−ジヒドロキシベンゼン・１，２−ジオキシゲナーゼなどともよばれる。カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）  ＫＴ２４４０株が保有し、カテコールからｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する反応を触媒する活性を有し、Ｆｅ３＋を補因子として要求する。
【００３５】
カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８Ｉ３５）中にＩｎｔｒａｄｉｏｌ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅドメインを有する。該ドメインは ［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−Ｇ−ｘ−［ＬＩＶＭ］−ｘ（４）−［ＧＳ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＡ］−ｘ（４）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＥ］−［ＬＩＶＭＦＹＣ］−ｘ（６）−Ｇ−ｘ−［ＦＹ］（Ｐｒｏｓｉｔｅ  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．Ｐ０００８３）からなり、配列中のＹが補因子であるＦｅ３＋の結合に関わる。カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列中のＬ１３７からＹ１６５が上記ドメインに相当する。
【００３６】
ａｒｏＹ遺伝子は、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号２２の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．６３）は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸・カルボキシリアーゼ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｌｙａｓｅ）ともよばれる。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼは、プロトカテク酸からカテコールを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。なお、３−Ｏ−メチルガリック酸から３−メトキシカテコールを生成する反応やガリック酸からピロガロールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素についても、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼとして使用できる可能性がある。また、バニリン酸脱炭酸酵素や４−ヒドロキシ安息香酸の脱炭酸酵素についても、プロトカテク酸を脱炭酸する可能性があることから、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼとして使用できる可能性がある。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼは、構造上は、ＵｂｉＤドメイン（Ｄｏｍａｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｈｔｕｒｅ  ＩＤ  １０４８７９５３）を含むタンパク質群（ＵｂｉＤ スーパーファミリー）に分類される。
【００３７】
プロトカテク酸・デカルボキシラーゼの具体例としては、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  Ａ１７０−４０株（ＡＴＣＣ  ２５５９７株）に由来するタンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ４７９３８４；ＡＢ４７９３８４タンパク質）などが挙げられる。ＡＢ４７９３８４タンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ  ＭＢＲＬ１０７７株由来のｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＭＪ７０６８６；配列同一性  ８７．２％）、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ  ｅ１０２６株由来のｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＣＺＵ７６０２２；配列同一性  ８５．７％）などのｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅとして登録されているタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素は、補因子としてＭｎ２＋、プレニル化フラビンモノヌクレオチド（ｐｒｅｎｙｌａｔｅｄ  ｆｌａｖｉｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｐｒｅｎｙｌ−ＦＭＮ）を要求する一連の酵素群として特徴付けられる。
【００３８】
ｋｐｄＢ遺伝子は、フラビン・プレニルトランスフェラーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢを発現する遺伝子などが挙げられ、具体的には配列番号２３の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。ＵｂｉＸファミリーの中にＰｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ｈｙｄｒｏｘｙａｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔＢがあり、その一つが４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢである。なお、Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの中には、ＡｒｏＹやＦｄｃ（酵母由来のＦｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）のようにホモオリゴマーの酵素もあれば、４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼやバニリン酸・デカルボキシラーゼのようにＢＣＤサブユニットからなるヘテロオリゴマーの酵素がある。
【００３９】
フラビン・プレニルトランスフェラーゼは、ジメチルアリル一リン酸（ＤＭＡＰ）からジメチルアリル構造をフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のフラビン骨格へと結合し、ｐｒｅｎｙｌ−ＦＭＮを合成する反応を触媒する。
【００４０】
４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢは、フラボプロテイン、ＵｂｉＸ／Ｐａｄ１ファミリーに分類される酵素であることから、そのアミノ酸配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株由来のＦｌａｖｉｎ  ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵｂｉＸ）のアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ０ＡＧ０３）と配列同一性が５０％であり；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８ｃ由来のＦｌａｖｉｎ  ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｐａｄ１）のアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ３３７５１）と配列同一性が３９．８％であり；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株由来のＰｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ（ＢｃｄＢ）のアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ９４４０４）と配列同一性が５４．５％である。Ｗｈｉｔｅ  ＭＤらの文献（Ｎａｔｕｒｅ，５２２：５０２−５０６，２０１５；該文献の全記載はここに開示として援用される。）により、ＵｂｉＸのアミノ酸配列中にＦＭＮの結合に関わるＳ３７及びＲ１２３、ＤＭＡＰの結合に関わるＹ１５３及びＲ１６９が同定され、ＫｐｄＢなどのＵｂｉＸ／Ｐａｄ１ファミリーに分類されるタンパク質のアミノ酸配列にもこれらＦＭＮ及びＤＭＡＰの結合に関わるアミノ酸残基が保存されている。
【００４１】
形質転換微生物（１）について、宿主微生物はシリンガ酸やシリンガアルデヒドなどのシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を炭素源として増殖する（資化する）能力を有する。宿主微生物がシリンガ酸やシリンガアルデヒドなどのシリンギル核を有する芳香族化合物を唯一の炭素源として利用して増殖する能力を有するためには、宿主微生物は染色体上にシリンガ酸・デメチラーゼ遺伝子（例えばｄｅｓＡ）、３−Ｏ−メチルガリック酸・３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子（例えばｄｅｓＺ）、３−Ｏ−メチルガリック酸・デメチラーゼ遺伝子（例えばｖａｎＡＢ、ｌｉｇＭ）、２−ピロン―４，６−ジカルボン酸・ヒドロラーゼ遺伝子（例えばｌｉｇＩ）、ガリック酸・ジオキシゲナーゼ遺伝子（例えばｄｅｓＢ）、４−オキサロメサコン酸・トートメラーゼ（例えばｌｉｇＵ）、４−オキサロメサコン酸・ヒドラターゼ遺伝子（例えばｌｉｇＪ）、４−カルボキシ−４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸・アルドラーゼ遺伝子（例えばｌｉｇＫ）、オキサロ酢酸・デカルボキシラーゼ遺伝子（例えばｌｉｇＫ）など、シリンガ酸をピルビン酸へと代謝するための酵素を生産する遺伝子を有することが好ましい。
【００４２】
上記遺伝子のうち、例えば、ｄｅｓＡ遺伝子は、シリンガ酸・デメチラーゼ（Ｓｙｒｉｎｇａｔｅ  Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３８の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。シリンガ酸・デメチラーゼは、例えば、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株などが保有し、シリンガ酸から３−Ｏ−メチルガリック酸を生成する反応を触媒する活性を有する。
【００４３】
また、前記ＶａｎＡＢは、シリンガ酸を３−Ｏ−メチルガリック酸に変換することができるので、シリンガ酸・デメチラーゼとしても使用することができる。
【００４４】
また、宿主微生物は、染色体上に、プロトカテク酸分解酵素遺伝子に加えて、バニリン酸脱メチル化酵素を発現する遺伝子を有することが好ましい。宿主微生物がバニリン酸脱メチル化酵素を発現する遺伝子を染色体上に有していない場合は、バニリン酸脱メチル化酵素を発現する遺伝子を形質転換微生物（１）に挿入することが好ましい。バニリン酸脱メチル化酵素を発現する遺伝子は特に限定されないが、例えば、ｌｉｇＭ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子などが挙げられる。
【００４５】
ｌｉｇＭ遺伝子は、テトラヒドロ葉酸依存型バニリン酸／３−Ｏ−メチルガリック酸・Ｏ−デメチラーゼ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｎｉｌｌａｔｅ／３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｇａｌｌａｔｅ  Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号２４の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【００４６】
ｖａｎＡ遺伝子は、バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号２５の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【００４７】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ＥＣ  １．１４．１３．８２）としては、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８ＧＩ６）などが挙げられる。バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分は、Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔを介して供給されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子と、分子状酸素から供給される酸素原子とを利用して、バニリン酸のメチルエーテル結合を開裂し、プロトカテク酸、ホルムアルデヒド及び水を生成する。
【００４８】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分は、そのアミノ酸配列中にＲｉｅｓｋｅ［２Ｆｅ−２Ｓ］ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｄｏｍａｉｎ（Ｗ７−Ｖ１０７，ＰＲＯＳＩＴＥ  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．ＰＳ５１２９６）を有し、該ドメイン中のＣ及びＨ（Ｃ４７，Ｈ４９，Ｃ６６，Ｈ６９）がＦｅ−Ｓの結合に関わる。
【００４９】
ｖａｎＢ遺伝子は、バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号２６の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【００５０】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分（ＥＣ  １．１４．１３．８２）としては、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＢ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８ＧＩ５）などが挙げられる。バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子を抜き取り、酸素添加酵素（オキシゲナーゼ）へと伝達する酸化還元酵素の一つとして知られている。バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分はバニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分であるＶａｎＡにＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子を伝達する。
【００５１】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、そのアミノ酸配列中に、２Ｆｅ−２Ｓ  Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｇ２２９−Ｉ３１６、ＰＲＯＳＩＴＥ  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．ＰＳ５１０８５）を有し、該アミノ酸配列中のＣ（Ｃ２６５、Ｃ２７０、Ｃ２７３、Ｃ３０３）がＦｅ−Ｓの結合に関わる。また、バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、そのアミノ酸配列中に、ＮＡＤ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｌ１０９−Ｄ２０１，Ｐｆａｍ  ｅｎｔｒｙ ｎｏ．ＰＦ００１７５）及びＦｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＦＡＤ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｍ１−Ａ１０１、ＰＲＯＳＩＴＥ  ｅｎｔｏｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１３８４）を有する。
【００５２】
形質転換微生物について、宿主微生物が染色体上にｄｅｓＡ遺伝子とｌｉｇＭ遺伝子を有することが好ましい。また、宿主微生物がｄｅｓＡ遺伝子とｌｉｇＭ遺伝子を染色体上に有していない場合は、ｄｅｓＡ遺伝子とｌｉｇＭ遺伝子を形質転換微生物に挿入することが好ましい。
【００５３】
挿入する遺伝子は、遺伝子を有する由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、少なくとも野生型遺伝子が発現するタンパク質（すなわち、野生型タンパク質）と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質を発現する遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどであってもよい。
【００５４】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
【００５５】
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
【００５６】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）  核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社）、０．１％（ｗ／ｖ）  Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、一晩（８〜１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１〜０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ  、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
【００５７】
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５Ｍ〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０℃〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ−Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ場合がある。該文献の全記載はここに開示として援用される。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
【００５８】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。
【００５９】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、野生型遺伝子の塩基配列において１から数個、好ましくは１から５０個、より好ましくは１から３０個、さらに好ましくは１から２０個、なおさらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００６０】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ酵素活性を有するものである。
【００６１】
野生型タンパク質と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００６２】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００６３】
野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。
【００６４】
（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
【００６５】
２つの塩基配列やアミノ酸配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３；該文献の全記載はここに開示として援用される。）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
【００６６】
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．０．１（ジェネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１、１９８５；該文献の全記載はここに開示として援用される。）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
【００６７】
（挿入する遺伝子の由来）
挿入する遺伝子は、挿入する遺伝子を保有する微生物などに由来する。挿入する遺伝子の由来生物としては、例えば、プロトカテク酸からムコン酸を製造することができる微生物やプロトカテク酸を資化することによって増殖可能な微生物などが挙げられる。
【００６８】
挿入する遺伝子の由来生物の具体例としては、ｌｉｇＭ遺伝子及びｄｅｓＡ遺伝子についてはスフィンゴビウム・スピーシーズ、スフィンゴモナス・スピーシーズ、ノボスフィンゴビウム・アロマティシボランス、オルターエリスロバクター・スピーシーズ、エリスロバクターといったスフィンゴモナド目微生物やアルスロバクター・カステリ、アルスロバクター・スピーシーズといったアルスロバクター属微生物、レイフソニア・スピーシーズといったマイクロバクテリ科微生物、コクリア・ポラリス、コクリア・スピーシーズ、ネオマイクロコッカス・エスツアリ、ペニグルタミシバクター・ガンゴトリエンシス、シトロコッカス・スピーシーズ、テルシコッカス・スピーシーズといったマイクロコッカス科微生物、マイクロバクテリウム・スピーシーズといったマイクロバクテリア科微生物など；ｃａｔＡ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・レイネケイといったシュードモナス属微生物やアシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・ラジオレシステンスといったアシネトバクター属微生物、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・ピリジニボラス、ロドコッカス・ロドクロウスなどロドコッカス属微生物など；ａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子についてはクレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・クアシニューモニエといったクレブシエラ属微生物やエンテロバクター・クロアカ、エンテロバクター・アエロゲネスといったエンテロバクター属微生物、セディメントバクター・ヒドロキシベンゾイカスなど；ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・レジノボランス、シュードモナス・エルギノーサといったシュードモナス属微生物やコマモナス・テストステロニ、コマモナス・チオオキシダンスといったコマモナス属微生物、アセトバクタ―・パツツリアヌス、アセトバクタ―・アセチ、アセトバクタ―・トロピカリスといったアセトバクタ―属微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
上記のとおり、挿入する遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換微生物において発現される遺伝子が宿主微生物の生育条件によって不活化せず、又は活性を示すために、遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主微生物や宿主微生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
【００７０】
（遺伝子工学的手法による遺伝子のクローニング）
欠失及び挿入する遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主微生物に導入して、遺伝子を欠失した、又は遺伝子を挿入した形質転換体（形質転換微生物）を作製できる。欠失する遺伝子は野生型遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、挿入などにより遺伝子の構造が変化したものであることが好ましい。挿入する遺伝子は、野生型遺伝子と同一又は近似するタンパク質を発現する遺伝子であることが好ましい。
【００７１】
欠失及び挿入する遺伝子の取得方法、これらの遺伝子の塩基配列やこれらの遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列に関する情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換微生物の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。欠失及び挿入する遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
【００７２】
例えば、欠失又は挿入する遺伝子に関連する野生型遺伝子を有する由来生物や種々の微生物から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００７３】
例えば、挿入する遺伝子は、該遺伝子に関連する野生型遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。野生型遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、遺伝子の種類によって、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株及びクレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  Ａ１７０−４０株などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットなどが利用できる。本明細書において、染色体ＤＮＡとゲノムＤＮＡとは同義である。
【００７４】
次いで、染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、挿入する遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。その例としては、ｃａｔＡ遺伝子を増幅するものとして、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株のゲノム配列を参考として設計した配列番号１１及び１２で表されるプライマーなどが挙げられる。なお、このようなプライマーを用いると、目的遺伝子全長が増幅できる。別の方法として、ショットガンライブラリーからの目的遺伝子クローンのスクリーニングや、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることなどができる。
【００７５】
また、欠失又は挿入する遺伝子を取得する方法は、上記したとおりに特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて遺伝子を構築することが可能である。
【００７６】
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）などの公知又は市販のキット；ｐＡＫ４０５（Ａｎｄｒｅａｓ  Ｋａｃｚｍａｒｃｚｙｋら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，  ７８（１０）３７７４−３７７７；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＭＣＬ２００（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１６２，ｐ１５７−１５８，１９９５を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＪＢ８６６（Ｐｌａｓｍｉｄ，ｖｏｌ．３８，ｐ３５−５１，１９９７を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社）、ｐＱＥ３０（キアゲン社）、ｐＵＣ４Ｋ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９、ｐ２５９−２６８、１９８２を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＥＸ１８Ａｍｐ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７−８６，１９９８を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＰＳ８５８（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７−８６，１９９８を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）などの公知又は市販のプラスミドベクター；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの公知又は市販のバクテリオファージベクターなどが使用できる。
【００７７】
構築した組換え体ＤＮＡを大量に得たい場合は、組換え体ＤＮＡを、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌  ＤＨ５α株（タカラバイオ社）などに導入して形質転換し、次いで得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製することができる。
【００７８】
組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０−７８、１９８３などを参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社）、ＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を知り得る。
【００７９】
（遺伝子を含む組換えベクターの構築）
欠失又は挿入する遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、欠失又は挿入する遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、遺伝子の欠失又は発現が可能な形で結合することにより構築することができる。なお、欠失する遺伝子の場合は、組換えベクターを宿主微生物に導入して、相同組換えによって、組換えベクター中の遺伝子が宿主微生物中の遺伝子に置き換わるために、組換えベクターは欠失する遺伝子の上流及び下流の領域を含むことが好ましい。
【００８０】
非限定的な例として挿入する遺伝子を含む組換えベクターを作製する方法は、例えば、適当な制限酵素で挿入する遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドベクターとを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などの市販の組換えベクター作製キットなどを用いて連結することにより構築することができる。または、プラスミドベクターと相同的な配列を両末端に付加した遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
【００８１】
欠失又は挿入する遺伝子を含む組換えベクターは、欠失又は挿入する遺伝子とプラスミドベクター由来の遺伝子（塩基配列）とを少なくとも含む。組換えベクターの一例としては、ｃａｔＡ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を含む組換えベクター；ｃａｔＡ遺伝子、ａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を含む組換えベクターなどが挙げられる。組換えベクターは、ｃａｔＡ遺伝子、ａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子に加えて、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を含むことができる。また、組換えベクターは、上記した遺伝子以外の遺伝子を、本発明の課題解決を妨げない限りに含むものであってもよい。
【００８２】
組換えベクターは、異種遺伝子又は異種核酸配列を含むことが好ましい。異種遺伝子は宿主微生物に本来的に存在しない（ｎｏｔ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）遺伝子であれば特に限定されず、例えば、宿主微生物由来の核酸配列に依拠しない合成遺伝子、挿入する遺伝子と由来生物が相違する生物に由来する遺伝子、宿主微生物と相違する他の微生物、植物、動物、ウイルスなどの生物に由来する遺伝子などが挙げられる。宿主微生物がシュードモナス属微生物である場合の異種遺伝子の具体例としては、ｐＵＣ１１８由来のＤＮＡ断片、例えば、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）などが挙げられるが、これに限定されない。
【００８３】
（形質転換微生物の作製方法）
形質転換微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、遺伝子の欠失又は挿入が実現する態様で宿主微生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、挿入する遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、挿入する遺伝子を発現する形質転換微生物が得られる。又は、欠失する遺伝子並びに該遺伝子の上流及び下流の領域を含むＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、遺伝子を欠失する形質転換微生物が得られる。本明細書では、宿主微生物を形質転換するために作製された組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【００８４】
ＤＮＡコンストラクトを宿主微生物に導入する方法は特に限定されないが、例えば、当業者に知られているとおりである、導入したＤＮＡコンストラクトが自律的に増殖して遺伝子を発現するように宿主微生物に導入する方法；相同組換えを利用することによりＤＮＡコンストラクトを宿主微生物の染色体上に直接的に挿入する方法などが挙げられる。
【００８５】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを宿主微生物に導入する方法として、相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主微生物のゲノム中に挿入することができる。
【００８６】
形質転換微生物の作製に用いられるベクター−宿主系は、宿主微生物中において、挿入する遺伝子が発現し得る系又は染色体上の遺伝子が欠失し得る系であれば特に限定されないが、例えば、ｐＪＢ８６６−スフィンゴモナド科微生物の系、ｐＫＴ２３０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１６，ｐ２３７−２４７，１９８１；該文献の全記載はここに開示として援用される。）−スフィンゴモナド科微生物の系などが挙げられる。
【００８７】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトは、宿主微生物の染色体に導入しない形で、自律的に増幅して、挿入する遺伝子を発現しても、宿主微生物の染色体に導入した形で挿入する遺伝子を発現しても、どちらでもよい。
【００８８】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カルベニシリンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。マーカー遺伝子は、欠失する遺伝子の途中に、又は欠失する遺伝子に置換するように含まれていてもよい。
【００８９】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトは、遺伝子の種類によっては、宿主微生物中で遺伝子を発現することを可能にするプロモーター及びターミネーターに加えて、その他の制御配列（例えば、オペレーターなどの転写制御に関わるシス配列など）を含むことができる。
【００９０】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、後述する実施例に記載があるｐＴＳ０８２プラスミドベクター、ｐＴＳ０８４プラスミドベクター及びｐＴＳ０７９プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
スフィンゴモナド科微生物への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、エレクトロポレーション（電気穿孔）法、接合伝達法などによって実施できる。
【００９２】
形質転換微生物を選択及び増殖させるための培地は、用いる宿主微生物とマーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主微生物としてスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株を用い、マーカー遺伝子としてカナマイシン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子を用いた場合は、形質転換微生物の選択及び増殖は、例えば、形質転換微生物をこれらの薬剤を含むＬＢ培地で培養することなどによって実施できる。
【００９３】
形質転換微生物が作製されたことの確認は、例えば、遺伝子の欠失した形質転換微生物のみが生存し得る条件や挿入する遺伝子を発現する形質転換微生物のみが生存し得る条件下で形質転換微生物を培養することなどにより達成し得る。また、形質転換微生物を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるムコン酸の量が、同じ条件下で培養した宿主微生物の培養物におけるムコン酸の量よりも大きいことを確認することなどにより、形質転換微生物が作製されたことを確認することができる。
【００９４】
形質転換微生物が作製されたことの確認は、形質転換微生物から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることやＰＣＲ産物の特性や塩基配列を確認することなどにより行ってもよい。
【００９５】
例えば、欠失又は挿入する遺伝子のプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【００９６】
相同組換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。 
【００９７】
（宿主微生物）
宿主微生物は、染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するスフィンゴモナド科微生物であれば特に限定されず、例えば、染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンガ酸及びシリンガアルデヒドを利用して増殖するスフィンゴモナド科微生物である。このようなスフィンゴモナド科微生物としては、プロトカテク酸を分解することができるスフィンゴモナド科微生物であることが好ましく、プロトカテク酸分解酵素を欠失してもシリンガ酸又はシリンガアルデヒドを資化するスフィンゴモナド科微生物であることがより好まく、染色体上にｌｉｇＡ遺伝子及びｌｉｇＢ遺伝子を有するスフィンゴモナド科微生物がさらに好ましい。宿主微生物の具体的な好ましい態様は、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ６６−５４株、スフィンゴモナス・ヘングシュイエンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｈｅｎｇｓｈｕｉｅｎｓｉｓ）  ＷＨＳＣ−８株、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）  ＰＰ１Ｙ株、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＡＡＰ９３株といったスフィンゴモナド科微生物であり、より好ましくは染色体上にｌｉｇＡ遺伝子及びｌｉｇＢ遺伝子を有し、かつ、シリンガ酸及びシリンガアルデヒドを資化するスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株である。
【００９８】
（欠失又は挿入する遺伝子の具体例）
欠失又は挿入する遺伝子として、ｌｉｇＡ遺伝子、ｌｉｇＢ遺伝子及びｌｉｇＭ遺伝子の具体例は、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株が保有するｌｉｇＡ遺伝子、ｌｉｇＢ遺伝子及びｌｉｇＭ遺伝子であり、それぞれの塩基配列は配列番号１９〜２０及び２４に記載のものである。ｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の具体例は、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株が保有するｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子であり、それぞれの塩基配列は配列番号２１及び２５〜２６に記載のものである。ａｒｏＹ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  Ａ１７０−４０株が保有するａｒｏＹ遺伝子であり、塩基配列は配列番号２２に記載のものである。ｋｐｄＢ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ  ＮＢＲＣ１４９４０株が保有するｋｐｄＢ遺伝子であり、塩基配列は配列番号２３に記載のものである。また、これらの遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２７〜３４に記載のものである。
【００９９】
スフィンゴビウム・スピーシーズ、シュードモナス・プチダ、クレブシエラ・ニューモニエ以外の微生物から欠失又は挿入する遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株が保有するｌｉｇＡ遺伝子、ｌｉｇＢ遺伝子及びｌｉｇＭ遺伝子の塩基配列（配列番号１９〜２０及び２４）；シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株が保有するｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の塩基配列（配列番号２１及び２５〜２６）；クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  Ａ１７０−４０株が保有するａｒｏＹ遺伝子の塩基配列（配列番号２２）；クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  ＮＢＲＣ１４９４０株が保有するｋｐｄＢ遺伝子の塩基配列（配列番号２３）に基づいて、その他の微生物のゲノムＤＮＡ配列に対してＢＬＡＳＴ相同性検索を行って、上記塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、その他の微生物の総タンパク質を基に、上記遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２７〜３４）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質を発現する遺伝子を特定することにより得ることができる。得られた遺伝子が欠失又は挿入する遺伝子に相当することは、得られた遺伝子により由来生物を宿主微生物として形質転換し、宿主微生物に比してムコン酸の生産量が増強されていることで確認できる。
【０１００】
スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ６６−５４株、スフィンゴモナス・ヘングシュイエンシス  ＷＨＳＣ−８株、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＰＰ１Ｙ株及びノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＡＡＰ９３株はゲノム構成が近似していることから、これらそれぞれが有する遺伝子を挿入することにより、相互に形質転換できる蓋然性がある。例えば、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株から得られた遺伝子を、宿主微生物としてスフィンゴビウム・スピーシーズ  ６６−５４株、スフィンゴモナス・ヘングシュイエンシス  ＷＨＳＣ−８株、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＰＰ１Ｙ株及びノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＡＡＰ９３株に導入して形質転換することができる。また、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株から得られた遺伝子を、宿主微生物としてシュードモナス属微生物、クレブシエラ属微生物、エンテロバクター属微生物、大腸菌などに導入して、発現させることも可能である。なお、挿入する遺伝子は、宿主微生物に発現させるために、コドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化した遺伝子であってもよい。
【０１０１】
（形質転換微生物の一実施態様）
形質転換微生物（１）の具体的一態様は、宿主微生物がスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ６６−５４株、スフィンゴモナス・ヘングシュイエンシス  ＷＨＳＣ−８株、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＰＰ１Ｙ株及びノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＡＡＰ９３株からなる群から選ばれるスフィンゴモナド科微生物であって、染色体上にあるｌｉｇＡ遺伝子及びｌｉｇＢ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が欠失し、挿入されたｃａｔＡ遺伝子を発現し、かつ、挿入されたａｒｏＹ遺伝子又はａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を発現する、形質転換スフィンゴモナド科微生物である。また、形質転換微生物（１）の別の具体的一態様は、該形質転換スフィンゴモナド科微生物において、挿入されたｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を発現する、形質転換スフィンゴモナド科微生物である。なお、これらの形質転換スフィンゴモナド科微生物は、染色体上にｌｉｇＭ遺伝子を有する場合、ｌｉｇＭ遺伝子を発現するものであってもよい。
【０１０２】
このような形質転換微生物（１）は、染色体上にあるｌｉｇＡ遺伝子及び／又はｌｉｇＢ遺伝子が欠失し、挿入されたｃａｔＡ遺伝子を発現し、かつ、挿入されたａｒｏＹ遺伝子又はａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子が発現するという態様を少なくともとることにより、非特許文献１に記載の形質転換微生物では不可能である、バニリン酸などのグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物や４−ヒドロキシ安息香酸などのｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンガ酸などのシリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを炭素源として、増殖及びムコン酸の製造が可能である。後述する実施例に記載があるとおり、形質転換微生物のより好ましい態様は、さらに挿入されたｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を発現する形質転換微生物である。
【０１０３】
形質転換微生物（１）の具体的態様は、後述する実施例に記載があるＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株などであるが、これらに限定されない。
【０１０４】
形質転換微生物（２）の具体的一態様は、宿主微生物がスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ６６−５４株、スフィンゴモナス・ヘングシュイエンシス  ＷＨＳＣ−８株、ノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＰＰ１Ｙ株及びノボスフィンゴビウム・スピーシーズ  ＡＡＰ９３株からなる群から選ばれるスフィンゴモナド科微生物であって、染色体上にあるｌｉｇＡ遺伝子及びｌｉｇＢ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が欠失した、前記形質転換スフィンゴモナド科微生物である。
【０１０５】
このような形質転換微生物（２）は、染色体上にあるｌｉｇＡ遺伝子及び／又はｌｉｇＢ遺伝子が欠失したという態様を少なくともとることにより、バニリン酸などのグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物や４−ヒドロキシ安息香酸などのｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンガ酸などのシリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを炭素源として、増殖及びプロトカテク酸の製造が可能である。
【０１０６】
形質転換微生物（２）の具体的態様は、後述する実施例に記載があるＳＭＥ２５７株などであるが、これらに限定されない。
【０１０７】
プ ロトカテク酸はムコン酸の前駆体であるとともに、プロトカテク酸・２，３−、３，４−、４，５−環開裂代謝産物の前駆体でもあり、該代謝産物の中には、例えば２−ピロン−４，６−ジカルボン酸（例えば、特許第４６５８２４４号；該文献の全記載はここに開示として援用される。）などの合成樹脂原料としての用途を有するものもある。また、プロトカテク酸は、医薬、農薬、香料などに対する合成原料としての用途もある。
【０１０８】
なお、特開２０１０−２０７０９４号公報（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には、シュードモナス・プチダを宿主微生物として、染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子並びにプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子を破壊又は変異させ、かつ、挿入したｔｐａＫ遺伝子とｔｐａＡａ遺伝子とｔｐａＡｂ遺伝子とｔｐａＢ遺伝子とｔｐａＣ遺伝子とを発現する形質転換微生物を作製し、該形質転換微生物をグルコースにより増殖させ、次いでテレフタル酸によりプロトカテク酸を製造したことが記載されている。しかし、特開２０１０−２０７０９４号公報には、リグニン又はリグニン由来の芳香族化合物によりプロトカテク酸を製造していない。実際、特開２０１０−２０７０９４号公報に記載の形質転換微生物は、シリンギルリグニンに由来する芳香族化合物、例えば、シリンガ酸を代謝することはできない。
【０１０９】
（製造方法）
本発明の一態様の製造方法（以下、製造方法（１）とよぶ。）は、バニリン酸といったグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物とシリンガ酸やシリンガアルデヒドといったシリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、形質転換微生物（１）に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を少なくとも含む。この際、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物とともに、又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物に代えて、４−ヒドロキシ安息香酸といったｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物を形質転換微生物（１）に作用させてもよい。
【０１１０】
本発明の別の一態様のムコン酸の製造方法（以下、製造方法（２）とよぶ。）は、バニリン酸といったグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物とシリンガ酸といったシリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、形質転換微生物（２）に作用させることにより、プロトカテク酸を得る工程を少なくとも含む。この際、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物とともに、又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物に代えて、４−ヒドロキシ安息香酸といったｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物を形質転換微生物（２）に作用させてもよい。
【０１１１】
本明細書では、製造方法（１）及び（２）をまとめて指すときには、単に「製造方法」とよぶ。
【０１１２】
リグニン由来の芳香族化合物を形質転換微生物に作用させる方法は、リグニン由来の芳香族化合物と形質転換微生物とが接触して、形質転換微生物が有する酵素によってムコン酸又はプロトカテク酸が生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、リグニン由来の芳香族化合物を含有し、かつ、形質転換微生物の生育に適した培地を用いて、形質転換微生物に適した各種培養条件下で形質転換微生物を培養することによって、ムコン酸又はプロトカテク酸を製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。なお、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及びシリンギルリグニン由来の芳香族化合物と形質転換微生物との接触の順序は特に限定されないが、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物に次いでグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物を形質転換微生物に接触させること、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物とを同時に形質転換微生物に作用させることのいずれかが好ましい。
【０１１３】
培地は、宿主微生物を培養する通常の培地、すなわち、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主微生物はスフィンゴモナド科微生物であることから、後述する実施例に記載があるようなＷｘ最少培地などを利用することができるが、特に限定されない。炭素源は、リグニン由来の芳香族化合物、糖や有機酸などのその他の炭素源又はこれらの組み合わせを用いることができる。ただし、培地成分には、ムコン酸又はプロトカテク酸の製造に関与する酵素の活性化に必要な成分、例えば、Ｆｅ２＋が含まれることが好ましい。鉄イオン、マグネシウムイオンなどを化合物として培地に添加することができるが、ミネラル含有物として添加してもよい。
【０１１４】
リグニン由来の芳香族化合物は、グアイアシルリグニン、シリンギルリグニン及びｐ−ヒドロキシフェニルリグニンのいずれかのリグニン並びにこれらのリグニンから誘導し得る芳香族化合物であれば特に限定されないが、例えば、グアイアシルリグニン、シリンギルリグニン及びｐ−ヒドロキシフェニルリグニンの分解物に相当する化合物などが挙げられ、具体的には、ｐ−クマル酸、フェルラ酸、シリンガ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、プロトカテク酸などが挙げられる。リグニン由来の芳香族化合物は、リグニンのモデル化合物とされている化合物、例えば、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルなどを含む。リグニン由来の芳香族化合物は、リグニンを含むバイオマスや該バイオマスを前処理に供して抽出したものであることが好ましいが、該バイオマスとは関係なく化学的に合成及び精製したものであってもよい。リグニン由来の芳香族化合物は、上記したものの１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１１５】
リグニンを含むバイオマス（以下、リグノセルロースとよぶ場合がある。）は特に限定されないが、例えば、草や木などの天然物、これら天然物に処理を加えて得られるもの、農業廃棄物などが挙げられるが、具体的には針葉樹や広葉樹などの木質系のバイオマスなどが挙げられる。例えば、広葉樹は、シリンギルリグニンを多く含むことが知られている。
【０１１６】
リグノセルロースは、前処理の有無などによって、例えば、固体状、懸濁状、液体状などであり得る。例えば、リグノセルロースを粉砕したものを液体に加えて得られる懸濁液とすることもできる。
【０１１７】
リグノセルロースは、リグニン抽出物であってもよい。リグニン抽出物としては、例えば、リグノセルロースの粉末化したものを、０．１％Ｗ／Ｖ〜５０％Ｗ／Ｖ、好ましくは１％Ｗ／Ｖ〜２０％Ｗ／Ｖとなるように、リグニンの抽出に適した溶媒中に懸濁した懸濁液などが挙げられる。また、リグニン抽出物は、該懸濁液を１０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜１３０℃、より好ましくは２０℃〜８０℃で、数時間〜数日間、好ましくは１時間〜６日間の抽出処理に供し、次いで抽出処理液から固形分を除いた液体状のリグニン抽出物、又は液体状のリグニン抽出物から溶媒を留去し、乾固することにより得られる、固体状のリグニン抽出物などであってもよい。
【０１１８】
リグニン抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法などが挙げられる。すなわち、小型オートクレーブ装置（耐圧硝子工業株式会社、ポータブルリアクター  ＴＶＳ−１）のステンレスベッセルに２Ｍ  ＮａＯＨ  ５０ｍＬ、脱脂シラカバ木粉  １．５ｇ、ニトロベンゼン  ３ｍＬを入れ、５００ｒｐｍで攪拌しながら１７０℃で２．５時間処理する。６０℃以下まで放冷し、遠心分離（６，０００ｇ、１０ｍｉｎ）により上清を回収する。得られた上清を、ジエチルエーテル抽出を３回繰り返す（水層を回収）。水層を塩酸で酸性化した後、ジエチルエーテル抽出を３回繰り返す（エーテル層を回収）。エーテル層に硫酸ナトリウムを加え、冷蔵庫内で一晩脱水処理する。エーテル層を回収し、抽出物を減圧乾固する。エーテル抽出物を、水酸化ナトリウムを加えながらイオン交換水に溶解し（ｐＨ≒９）、シラカバリグニン由来の芳香族化合物溶液とする。
【０１１９】
リグニンの抽出や処理に適した溶媒は特に限定されず、例えば、水、ジオキサン、メタノール、イソプロパノールなどの低分子アルコール、ニトロベンゼン、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
【０１２０】
培養条件は、当業者により通常知られるスフィンゴモナド科微生物の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０℃〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１〜７日間、より好ましくは２〜５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静置培養などを採用することができる。ただし、ｄｅｓＡ遺伝子が発現するＤｅｓＡの酵素活性及びｌｉｇＭ遺伝子が発現するＬｉｇＭの酵素活性を利用する場合、溶存酸素濃度は特に限定されないが、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子が発現するＶａｎＡ及びＶａｎＢの酵素活性を利用する場合は溶存酸素が十分になるような条件下で培養することが好ましい。例えば、培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるとおりの、炭素源としてシリンガ酸及びバニリン酸を含有するＷｘ最少培地を用いた、３０℃、１８０ｒｐｍでの１〜５日間の振盪培養や撹拌培養などが挙げられる。なお、炭素源その他の成分は、培養開始後に適宜追加することができる。
【０１２１】
培養終了後に培養物からムコン酸又はプロトカテク酸を取得する方法は特に限定されない。ムコン酸又はプロトカテク酸は培養液中に蓄積することから、培養物から濾過、遠心分離などの通常の固液分離操作により菌体と培養上清とを分離し、回収した培養上清からカラムを用いた固相抽出やムコン酸又はプロトカテク酸が可溶性のある溶媒を用いた溶媒抽出などによりムコン酸又はプロトカテク酸を抽出する。
【０１２２】
抽出溶媒はムコン酸又はプロトカテク酸が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒などが挙げられる。抽出温度は特に限定されないが、例えば、室温から１００℃に設定することができる。
【０１２３】
ムコン酸の抽出方法の具体的一態様としては、例えば、Ｖａｒｄｏｎらの方法（Ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８，ｐ３３９７−３４１３，２０１６；該文献の全記載はここに開示として援用される。）や該方法を一部変更した方法などが挙げられる。具体的には、培養上清に活性炭（１２．５％（ｗ／ｖ）、１００メッシュ）を添加し、１時間攪拌する。吸引ろ過により活性炭を除去し、ろ液を回収する。回収したろ液に塩酸を加え、ｐＨ≒２に調製した後、４℃で一晩静置する。吸引ろ過により沈殿物を回収し、沈殿物はイオン交換水で洗浄した後、吸引ろ過により回収し、減圧乾燥する。乾燥した固体をエタノールに懸濁し、吸引ろ過により不要物を除去し、ろ液を回収する。ろ液をエバポレーターで減圧乾固して、精製ムコン酸を得る。
【０１２４】
プロトカテク酸の抽出方法の一態様としては、例えば、培養上清に塩酸を加え、ｐＨ≒２に調製した後、酢酸エチル等の有機溶媒によって抽出することが出来る。得られた抽出物を再結晶化またはイオン交換樹脂を用いることによってプロトカテク酸を得る方法が挙げられる。
【０１２５】
ムコン酸若しくはプロトカテク酸の定性的又は定量的分析は特に限定されず、例えば、ＨＰＬＣなどにより行うことができる。ＨＰＬＣ分離条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
【０１２６】
形質転換微生物を用いれば、ムコン酸又はプロトカテク酸を高収率で得ることができる。例えば、５ｍＭ  バニリン酸及び５ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は３５時間の培養で９３％の収率（対理論収量）でムコン酸を得ることができ；５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び５ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は３５時間の培養で７５％の収率（対理論収量）でムコン酸を得ることができ；シラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液を炭素源とした場合は４８時間の培養で１６．５ｍｇ／Ｌのムコン酸を得ることができ；５ｍＭ  バニリン酸及び５ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は４２時間の培養で８３％の収率（対理論収量）でプロトカテク酸を得ることができ；５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び５ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は３０時間の培養で７５％の収率（対理論収量）でプロトカテク酸を得ることができる。
【０１２７】
本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【０１２８】
（ムコン酸及びプロトカテク酸の用途）
本発明の一態様の形質転換微生物や製造方法を利用して得られたムコン酸及びプロトカテク酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などとしての利用が期待できるムコン酸誘導体の原料として利用することができる。具体的には、ムコン酸誘導体の一つであるアジピン酸は、ナイロン６６（ポリアミドの一つ）として現実に利用されている。プロトカテク酸は、ムコン酸を製造するための原材料となり得るとともに、医薬、農薬、香料等の合成原料としての用途もある。また、プロトカテク酸は、プロトカテク酸・２，３−、３，４−、４，５−環開裂代謝産物の前駆体でもあり、該代謝産物の中には、例えば２−ピロン―４，６−ジカルボン酸（例えば、特許第４６５８２４４号；該文献の全記載はここに開示として援用される。）など合成樹脂原料としての用途を有するものもある。
【０１２９】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【０１３０】
［１．Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．ＳＭＥ２５７株の作製］
以下の手順により、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）ＳＹＫ−６株からプロトカテク酸  ４，５−ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｌｉｇＡＢ遺伝子）を破壊した変異株である、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＭＥ２５７株を作製した。【０１３１】
スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１及び２のプライマー１及び２からなるプライマーセット並びに配列番号３及び４のプライマー３及び４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、プロトカテク酸・４，５−ジオキシゲナーゼ・小サブユニット（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ４，５−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｌｉｇＡ）遺伝子の上流領域及びプロトカテク酸・４，５−ジオキシゲナーゼ・大サブユニット（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ４，５−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｌｉｇＢ）遺伝子下流領域を得た。【０１３２】
得られたＤＮＡ断片と、予めＢａｍＨＩで消化したｐＡＫ４０５プラスミドＤＮＡとを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社）を用いて連結することによって、ｐＡＫＤｌｉｇＡＢプラスミドＤＮＡを得た。【０１３３】
ｐＡＫＤｌｉｇＡＢプラスミドＤＮＡを用いて、三親接合法により、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株を形質転換した。形質転換体は、ナリジクス酸（Ｎａｌ）  １２．５ｍｇ／Ｌ及びカナマイシン（Ｋｍ）  ５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上で生育可能であるＮａｌ−Ｋｍ耐性株として選抜した。得られたＮａｌ−Ｋｍ耐性株を、Ｎａｌ  １２．５ｍｇ／Ｌ及びストレプトマイシン（Ｓｍ）  １００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で４８時間振盪培養した。【０１３４】
得られた培養液をＳｍ  １００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上に塗抹し、３０℃で７２時間静置培養した。生育した複数のコロニーから、ゲノムＤＮＡをそれぞれ抽出し、次いでＰＣＲ法によって、ゲノムＤＮＡ上のｌｉｇＡＢ遺伝子が欠失している形質転換体を、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＭＥ２５７株としてスクリーニングした。【０１３５】
［２．シリンガ酸（ＳＡ）及びバニリン酸（ＶＡ）を炭素源としたプロトカテク酸（ＰＣＡ）生産］
ＳＭＥ２５７株をＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で３６時間振盪培養した。得られた培養液をＷｘ緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４  １．７ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ９．８ｇ／Ｌ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４  １ｇ／Ｌ）で洗浄した後、５ｍＭ  ＶＡ、５ｍＭ  ＳＡ及び１ｇ／Ｌ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅを含むＷｘ最少培地（ＫＨ２ＰＯ４  １．７ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ９．８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ９．５ｍｇ／Ｌ、ＭｇＯ  １０．７５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．４４ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １．１２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２８ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．０６ｍｇ／Ｌ及び１２Ｎ  ＨＣｌ  ５１．３μＬ／Ｌ）  １０ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０１３６】
培養開始後、一定時間毎に、培養液の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ）を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びＰＣＡの濃度を測定した。【０１３７】
ＯＤ測定には６００ｎｍの波長を使用し、ＧｅｎｅＱｕａｎｔ  １００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いてＯＤ６００値を測定した。ＳＡ、ＶＡ及びＰＣＡの濃度は、高速液体クロマトグラフ（Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ；日本ウォーターズ株式会社）を用いて測定した。カラムはＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１４０ＨＴＰ  ｃｏｌｕｍｎ（径  ２．１ｍｍ、長さ  １００ｍｍ、粒径  ２．３μｍ；東ソー株式会社）を使用し、３０℃で保温した。勾配（グラジエント）溶離モード（溶媒Ａ：９９．９％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ、０．１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨ、溶媒Ｂ：９９．９％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨ）を使用し、溶媒Ａを９９％、溶媒Ｂを１％で平衡化した後、分析を開始して３分後から６分後にかけて溶媒Ｂの割合を２５％まで上昇させ、次いで１分かけて溶媒Ｂの割合を１％まで低下させた。移動相の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、測定波長はＳＡについて２７０ｎｍとし、ＶＡ及びＰＣＡについて２６０ｎｍとした。【０１３８】
培養時間０、６、１８、３０及び４２時間後のＯＤ６００値、ＳＡ濃度、ＶＡ濃度及びＰＣＡ濃度の測定結果をまとめたものを表１に示す。【０１３９】
【表１】
2018199112.tif 000003
【０１４０】
表１が示すとおり、ＳＭＥ２５７株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡからＰＣＡを経時的に生産した（理論収量に対する収率は８３％）。【０１４１】
［３．ＳＡ及び４−ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）を炭素源としたＰＣＡ生産］
ＳＭＥ２５７株を、ＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で３６時間振盪培養した。得られた培養液をＷｘ緩衝液で洗浄した後、５ｍＭ  ＨＢＡ、５ｍＭ  ＳＡ及び１ｇ／Ｌ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅを含むＷｘ最少培地１０ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０１４２】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＨＢＡ及びＰＣＡの濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記２に記載の方法と同様に行った。【０１４３】
培養時間０、６、１８及び３０時間後のＯＤ６００値、ＳＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びＰＣＡ濃度の測定結果をまとめたものを表２に示す。
【表２】
2018199112.tif 000004
【０１４４】
表２が示すとおり、ＳＭＥ２５７株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＨＢＡからＰＣＡを経時的に生産した（理論収量に対する収率は７５％）。【０１４５】
［４．ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株の作製］
以下の手順により、ａｒｏＹ遺伝子、ｋｐｄＢ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ０８４プラスミドＤＮＡを用いて、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＭＥ２５７株を形質転換し、ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株を作製した。【０１４６】
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  Ａ１７０−４０株のゲノムＤＮＡの部分断片を鋳型として、配列番号５及び６のプライマー５及び６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼ（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ａｒｏＹ）遺伝子を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩで消化し、予めＫｐｎＩで消化したｐＭＣＬ２００プラスミドＤＮＡにクローニングすることにより、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡを得た。【０１４７】
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  ＮＢＲＣ１４１９０株のＤＮＡを鋳型として、配列番号７及び８のプライマー７及び８のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ；ｋｐｄＢ）遺伝子を含む約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片の両末端を平滑化処理に供し、次いでＸｂａＩで消化した後、予め平滑化処理したｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡに連結することにより、ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡを得た。ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡとしては、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡに含まれるａｒｏＹ遺伝子と順方向にｋｐｄＢ遺伝子が連結されたクローンとして選択して得た。【０１４８】
ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号９及び１０のプライマー９及び１０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＪＢ８６６プラスミドＤＮＡにＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０７４プラスミドＤＮＡを得た。【０１４９】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１１及び１２のプライマー１１及び１２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（ｃａｔｅｃｈｏｌ  １，２−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｃａｔＡ）遺伝子を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＳａｃＩで消化したｐＴＳ０７４プラスミドＤＮＡにＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０７９プラスミドＤＮＡを得た。【０１５０】
ｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１３及び１４のプライマー１３及び１４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）を含む約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ｐＴＳ０７９プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩサイトにＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡを得た。【０１５１】
シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１５及び１６のプライマー１５及び１６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、バニレート・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；ｖａｎＡ）遺伝子及びバニレート・デメチラーゼ・オキシドレダクターゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；ｖａｎＢ）遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ＳａｃＩ及びＳｍａＩで消化し、予めＳａｃＩ及びＳｍａＩで消化したｐＱＥ３０プラスミドＤＮＡと連結することにより、ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを得た。【０１５２】
ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１７及び１８のプライマー１７及び１８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０８４プラスミドＤＮＡを得た。【０１５３】
得られたｐＴＳ０８４プラスミドＤＮＡを用いて、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＭＥ２５７株を形質転換することにより、ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株を作製した。【０１５４】
［５．ＳＡ及びＶＡを炭素源としたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸（ｃｃＭＡ）生産］
ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株を、テトラサイクリン（Ｔｃ）  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で３６時間振盪培養した。得られた培養液をＷｘ緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４  １．７ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ９．８ｇ／Ｌ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４  １ｇ／Ｌ）で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、５ｍＭ  ＶＡ、５ｍＭ  ＳＡ及び１ｇ／Ｌ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅを含むＷｘ最少培地（ＫＨ２ＰＯ４  １．７ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ９．８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ９．５ｍｇ／Ｌ、ＭｇＯ  １０．７５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．４４ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １．１２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２８ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．０６ｍｇ／Ｌ及び１２Ｎ  ＨＣｌ  ５１．３μＬ／Ｌ）  １０ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０１５５】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記２に記載の方法と同様に行った。【０１５６】
培養時間０、５、１０、２０及び３５時間後のＯＤ６００値、ＳＡ濃度、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表３に示す。【０１５７】
【表３】
2018199112.tif 000005
【０１５８】
表３が示すとおり、ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡからｃｃＭＡを経時的に生産した（理論収量に対する収率は９３％）。【０１５９】
［６．ＳＡ及びＨＢＡを炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で３６時間振盪培養した。得られた培養液をＷｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、５ｍＭ  ＨＢＡ、５ｍＭ  ＳＡ及び１ｇ／Ｌ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅを含むＷｘ最少培地１０ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０１６０】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記２に記載の方法と同様に行った。【０１６１】
培養時間０、５、１０、２０及び３５時間後のＯＤ６００値、ＳＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表４に示す。
【表４】
2018199112.tif 000006
【０１６２】
表４が示すとおり、ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＨＢＡからｃｃＭＡを経時的に生産した（理論収量に対する収率は７５％）。【０１６３】
［７．シラカバリグニン由来芳香族化合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産］
常法に従い、シラカバ木粉をアルコール−ベンゼン抽出処理に供し、次いで処理後のシラカバ木粉１．５ｇをアルカリニトロベンゼン酸化分解処理及びジエチルエーテル抽出処理に供した（木質科学実験マニュアル、日本木材学会編、文永堂出版を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。ニトロベンゼン酸化分解後のアルカリ溶液をジエチルエーテル抽出処理し、得られた水層を酸性化処理に供し、さらにジエチルエーテル抽出処理に供した。エーテル層として得られたジエチルエーテル抽出物をシラカバリグニン由来芳香族化合物とし、シラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を炭素源として添加したＷｘ培地におけるｃｃＭＡ生産を評価した。【０１６４】
ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で３６時間振盪培養した。得られた培養液をＷｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ及び０．１ｇ／Ｌ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅを含むＷｘ最少培地１０ｍＬに接種し、炭素源としてシラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液  ５μＬを添加し、３０℃で振盪培養した。培養４時間毎にシラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液  ５μＬを追添加した。【０１６５】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ｃｃＭＡ濃度を測定した。ｃｃＭＡの濃度測定は上記２に記載の方法と同様に行い、高速液体クロマトグラフでの分離条件は溶媒Ａを９９％、溶媒Ｂを１％で平衡化した後、分析を開始して３分後から６分後にかけて溶媒Ｂの割合を２５％まで上昇させ、次いで１分かけて溶媒Ｂの割合を９９％まで上昇させて１分間保持し、その後、１分かけて溶媒Ｂの割合を１％まで低下させた。移動相の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、測定波長はｃｃＭＡについて２６０ｎｍとした。【０１６６】
培養時間０、１２、２４及び４８時間後のｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表５に示す。【０１６７】
【表５】
2018199112.tif 000007
【０１６８】
表５が示すとおり、ＳＭＥ２５７／ｐＴＳ０８４株は、シラカバリグニン由来芳香族化合物を利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した。【０１６９】
配列表に記載の配列は以下のとおりである：
［配列番号１］プライマー１
ATCCGCCCTAGTGGACGAATGGTCCTCTCTTTAGTGATTTCG
［配列番号２］プライマー２
CGACTCTAGAGGATCAGATTTCGGACGACGAGATCC
［配列番号３］プライマー３
TCGTCCACTAGGGCGGATCGACATTC
［配列番号４］プライマー４
CGGTACCCGGGGATCAGGTGCCGAGCGGCCCG
［配列番号５］プライマー５
AGCTGGTACCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGCACCGATTCAG
［配列番号６］プライマー６
AGCTGGTACCTTATTTTGCGCTACCCTGGTT
［配列番号７］プライマー７
AGCTGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAAACTGATTATTGGGATGACG
［配列番号８］プライマー８
AGCTTCTAGATTATTCGATCTCCTGTGCAAAT
［配列番号９］プライマー９
GAAGCTTCGTGGATCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGCACCGATT
［配列番号１０］プライマー１０
ACGTCTCGAGGAATTCTTATTCGATCTCCTGTGCAAAT
［配列番号１１］プライマー１１
CGGCCGCGGTACCAGTTAAAGAGGAGAAATTAACTATGACCGTGA
［配列番号１２］プライマー１２
CTAGATACCTAGGTGTCAGCCCTCCTGCAACGCC
［配列番号１３］プライマー１３
ATGTGAATTGCGGCCAGCGCCCAATACGCAAACC
［配列番号１４］プライマー１４
ACTGGTACCGCGGCCGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC
［配列番号１５］プライマー１５
ATGCGAGCTCATGTACCCCAAAAACACCT
［配列番号１６］プライマー１６
ATGCCCGGGTCAGATGTCCAGCACCAGCA
［配列番号１７］プライマー１７
CATGATTACGCGGCCATTAAAGAGGAGAAATTAAC
［配列番号１８］プライマー１８
ACTGGTACCGCGGCCTCAGATGTCCAGCACCAGCA
［配列番号１９］ｌｉｇＡ遺伝子
ATGACCGAGAAGAAAGAGAGAATCGACGTTCACGCCTATCTCGCCGAGTTTGACGACATTCCCGGCACCCGCGTGTTCACCGCCCAGCGCGCGCGCAAGGGCTATAATCTCAACCAGTTCGCGATGAGCCTGATGAAGGCCGAGAACCGCGAGCGGTTCAAGGCCGACGAGAGCGCCTATCTGGACGAGTGGAACCTCACGCCCGCCGCCAAGGCCGCCGTGCTGGCCCGCGACTACAATGCGATGATCGACGAGGGCGGGAATGTCTATTTCCTGTCCAAGCTGTTCTCGACCGACGGCAAGAGCTTCCAGTTCGCCGCCGGCTCGATGACCGGCATGACTCAGGAAGAATATGCACAGATGATGATCGATGGCGGCCGTTCGCCCGCGGGTGTGCGCTCGATCAAGGGAGGCTACTGA
［配列番号２０］ｌｉｇＢ遺伝子
ATGGCACGCGTTACCACGGGCATCACGTCCAGCCACATTCCCGCGCTCGGCGCGGCCATCCAGACCGGCACCAGCGACAATGATTACTGGGGCCCGGTGTTCAAGGGCTACCAGCCGATCCGCGACTGGATCAAGCAGCCCGGCAACATGCCGGACGTCGTGATCCTGGTCTATAACGACCATGCCTCGGCCTTCGACATGAACATCATCCCGACCTTCGCGATCGGCTGCGCGGAAACGTTCAAGCCCGCCGACGAGGGATGGGGCCCGCGCCCGGTGCCCGACGTGAAGGGCCATCCGGACCTTGCCTGGCACATCGCCCAGAGCCTGATCCTCGACGAGTTCGACATGACCATCATGAACCAGATGGACGTCGATCATGGCTGCACCGTGCCGCTCTCGATGATCTTCGGCGAGCCCGAGGAATGGCCGTGCAAGGTCATCCCCTTCCCGGTCAATGTCGTCACTTATCCGCCGCCGTCGGGCAAGCGCTGCTTCGCGCTCGGTGACAGCATCCGCGCCGCGGTCGAGAGCTTCCCGGAAGACCTCAACGTCCATGTCTGGGGCACCGGCGGCATGAGCCACCAGCTTCAGGGCCCGCGCGCCGGCCTCATCAACAAGGAGTTCGACCTGAACTTCATCGACAAGCTGATCAGCGACCCCGAGGAGCTGAGCAAGATGCCGCACATCCAGTATCTGCGCGAAAGCGGATCGGAAGGCATCGAGCTGGTCATGTGGCTCATCATGCGCGGCGCGCTGCCGGAGAAGGTGCGGGATCTCTACACCTTCTATCACATCCCGGCCTCCAACACCGCGCTCGGCGCGATGATCCTGCAGCCGGAGGAGACCGCAGGTACACCGCTCGAACCGCGCAAGGTGATGAGCGGACACAGCCTGGCCCAGGCCTGA
［配列番号２１］ｃａｔＡ遺伝子
ATGACCGTGAAAATTTCCCACACTGCCGACATTCAAGCCTTCTTCAACCGGGTAGCTGGCCTGGACCATGCCGAAGGAAACCCGCGCTTCAAGCAGATCATTCTGCGCGTGCTGCAAGACACCGCCCGCCTGATCGAAGACCTGGAGATTACCGAGGACGAGTTCTGGCACGCCGTCGACTACCTCAACCGCCTGGGCGGCCGTAACGAGGCAGGCCTGCTGGCTGCTGGCCTGGGTATCGAGCACTTCCTCGACCTGCTGCAGGATGCCAAGGATGCCGAAGCCGGCCTTGGCGGCGGCACCCCGCGCACCATCGAAGGCCCGTTGTACGTTGCCGGGGCGCCGCTGGCCCAGGGCGAAGCGCGCATGGACGACGGCACTGACCCAGGCGTGGTGATGTTCCTTCAGGGCCAGGTGTTCGATGCCGACGGCAAGCCGTTGGCCGGTGCCACCGTCGACCTGTGGCACGCCAATACCCAGGGCACCTATTCGTACTTCGATTCGACCCAGTCCGAGTTCAACCTGCGTCGGCGTATCATCACCGATGCCGAGGGCCGCTACCGCGCGCGCTCGATCGTGCCGTCCGGGTATGGCTGCGACCCGCAGGGCCCAACCCAGGAATGCCTGGACCTGCTCGGCCGCCACGGCCAGCGCCCGGCGCACGTGCACTTCTTCATCTCGGCACCGGGGCACCGCCACCTGACCACGCAGATCAACTTTGCTGGCGACAAGTACCTGTGGGACGACTTTGCCTATGCCACCCGCGACGGGCTGATCGGCGAACTGCGTTTTGTCGAGGATGCGGCGGCGGCGCGCGACCGCGGTGTGCAAGGCGAGCGCTTTGCCGAGCTGTCATTCGACTTCCGCTTGCAGGGTGCCAAGTCGCCTGACGCCGAGGCGCGAAGCCATCGGCCGCGGGCGTTGCAGGAGGGCTGA
［配列番号２２］ａｒｏＹ遺伝子
ATGACCGCACCGATTCAGGATCTGCGCGACGCCATCGCGCTGCTGCAACAGCATGACAATCAGTATCTCGAAACCGATCATCCGGTTGACCCTAACGCCGAGCTGGCCGGTGTTTATCGCCATATCGGCGCGGGCGGCACCGTGAAGCGCCCCACCCGCATCGGGCCGGCGATGATGTTTAACAATATTAAGGGTTATCCACACTCGCGCATTCTGGTGGGTATGCACGCCAGCCGCCAGCGGGCCGCGCTGCTGCTGGGCTGCGAAGCCTCGCAGCTGGCCCTTGAAGTGGGTAAGGCGGTGAAAAAACCGGTCGCGCCGGTGGTCGTCCCGGCCAGCAGCGCCCCCTGCCAGGAACAGATCTTTCTGGCCGACGATCCGGATTTTGATTTGCGCACCCTGCTTCCGGCGCCCACCAACACCCCTATCGACGCCGGCCCCTTCTTCTGCCTGGGCCTGGCGCTGGCCAGCGATCCCGTCGACGCCTCGCTGACCGACGTCACCATCCACCGCTTGTGCGTCCAGGGCCGGGATGAGCTGTCGATGTTTCTTGCCGCCGGCCGCCATATCGAAGTGTTTCGCCAAAAGGCCGAGGCCGCCGGCAAACCGCTGCCGATAACCATCAATATGGGTCTCGATCCGGCCATCTATATTGGCGCCTGCTTCGAAGCCCCTACCACGCCGTTCGGCTATAATGAGCTGGGCGTCGCCGGCGCGCTGCGTCAACGTCCGGTGGAGCTGGTTCAGGGCGTCAGCGTCCCGGAGAAAGCCATCGCCCGCGCCGAGATCGTTATCGAAGGTGAGCTGTTGCCTGGCGTGCGCGTCAGAGAGGATCAGCACACCAATAGCGGCCACGCGATGCCGGAATTTCCTGGCTACTGCGGCGGCGCTAATCCGTCGCTGCCGGTAATCAAAGTCAAAGCAGTGACCATGCGAAACAATGCGATTCTGCAGACCCTGGTGGGACCGGGGGAAGAGCATACCACCCTCGCCGGCCTGCCAACGGAAGCCAGTATCTGGAATGCCGTCGAGGCCGCCATTCCGGGCTTTTTACAAAATGTCTACGCCCACACCGCGGGTGGCGGTAAGTTCCTCGGGATCCTGCAGGTGAAAAAACGTCAACCCGCCGATGAAGGCCGGCAGGGGCAGGCCGCGCTGCTGGCGCTGGCGACCTATTCCGAGCTAAAAAATATTATTCTGGTTGATGAAGATGTCGACATCTTTGACAGCGACGATATCCTGTGGGCGATGACCACCCGCATGCAGGGGGACGTCAGCATTACGACAATCCCCGGCATTCGCGGTCACCAGCTGGATCCGTCCCAGACGCCGGAATACAGCCCGTCGATCCGTGGAAATGGCATCAGCTGCAAGACCATTTTTGACTGCACGGTCCCCTGGGCGCTGAAATCGCACTTTGAGCGCGCGCCGTTTGCCGACGTCGATCCGCGTCCGTTTGCACCGGAGTATTTCGCCCGGCTGGAAAAAAACCAGGGTAGCGCAAAATAA
［配列番号２３］ｋｐｄＢ遺伝子
ATGAAACTGATTATTGGGATGACGGGGGCCACCGGGGCACCGCTTGGGGTGGCATTGCTGCAGGCGCTGCGCGATATGCCGGAGGTGGAAACCCATCTGGTGATGTCGAAATGGGCCAAAACCACCATCGAGCTGGAAACGCCCTGGACGGCGCGCGAAGTGGCCGCGCTGGCGGACTTTTCCCACAGCCCGGCAGACCAGGCCGCCACCATCTCATCCGGTTCATTTCGTACCGACGGCATGATCGTTATTCCCTGCAGTATGAAAACGCTTGCAGGCATTCGCGCGGGTTATGCCGAAGGACTGGTGGGCCGCGCGGCGGACGTGGTGCTCAAAGAGGGGCGCAAGCTGGTGTTGGTCCCGCGGGAAATGCCGCTCAGCACGATCCATCTGGAGAACATGCTGGCGCTGTCCCGCATGGGCGTGGCGATGGTCCCGCCGATGTCAGCTTACTACAACCACCCGGAGACGGTTGACGATATCACCAATCATATCGTCACCCGGGTGCTGGATCAGTTTGGCCTCGACTATCACAAAGCGCGCCGCTGGAACGGCTTGCGCACGGCAGAACAATTTGCACAGGAGATCGAATAA
［配列番号２４］ｌｉｇＭ遺伝子
ATGTCGGCACCTACCAATCTTGAACAAGTGCTTGCCGCCGGCGGCAACACCGTCGAAATGCTGCGCAACAGCCAGATCGGTGCCTATGTGTATCCGGTGGTGGCGCCGGAATTCTCCAACTGGCGCACCGAGCAGTGGGCATGGCGCAATTCGGCAGTGCTCTTCGACCAGACCCACCACATGGTCGACCTCTACATCCGTGGCAAGGACGCGCTGAAGCTGCTCTCCGACACGATGATCAACTCGCCCAAGGGCTGGGAGCCCAACAAGGCGAAGCAGTACGTGCCCGTGACGCCTTATGGCCATGTCATCGGCGACGGCATCATCTTCTACCTCGCCGAGGAAGAGTTCGTGTATGTCGGCCGCGCGCCGGCCGCCAACTGGCTGATGTATCATGCGCAGACCGGCGGTTATAACGTCGACATCGTGCATGACGACCGCTCGCCGAGCCGCCCGATGGGCAAGCCGGTGCAGCGCATCTCCTGGCGCTTCCAGATCCAGGGCCCGAAGGCCTGGGACGTGATCGAGAAGCTGCACGGCGGCACGCTCGAGAAGCTCAAATTCTTCAACATGGCCGAGATGAACATCGCCGGTATGAAGATCCGCACCCTGCGTCACGGCATGGCCGGCGCGCCGGGTCTCGAGATCTGGGGTCCCTACGAAACCCAGGAGAAGGCCCGCAACGCGATCCTCGAGGCAGGCAAGGAATTCGGCCTCATCCCGGTCGGTTCGCGCGCCTATCCGTCCAACACGCTGGAATCCGGCTGGATCCCGAGCCCGCTGCCGGCCATCTACACCGGCGACAAGCTCAAGGCCTATCGCGAGTGGCTGCCGGCCAACAGCTATGAGGCGAGCGGCGCCATCGGCGGTTCGTTCGTGTCCAGCAACATCGAGGACTATTACGTCAATCCCTACGAGATCGGCTATGGTCCCTTCGTGAAGTTCGACCACGACTTCATCGGCCGCGACGCTCTCGAGGCGATCGACCCGGCCACGCAGCGCAAGAAGGTCACGCTGGCCTGGAACGGCGACGACATGGCGAAGATCTACGCTTCGCTGTTCGACACCGAGGCCGACGCGCACTACAAGTTCTTCGACCTGCCGCTGGCCAATTATGCCAACACCAACGCCGACGCCGTGCTCGACGCGGCCGGCAACGTGGTCGGCATGTCGATGTTCACCGGCTATTCCTACAACGAGAAGCGCGCGCTTTCGCTCGCGACGATCGACCACGAGATCCCCGTCGGCACCGAGCTGACGGTCCTGTGGGGCGAGGAAAATGGCGGTACGCGCAAGACCACGGTCGAGCCGCACAAGCAGATGGCCGTGCGCGCCGTCGTGAGCCCGGTCCCCTATTCGGTGACCGCGCGCGAGACGTACGAAGGCGGCTGGCGCAAGGCTGCCGTCACGGCCTGA
［配列番号２５］ｖａｎＡ遺伝子
ATGTACCCCAAAAACACCTGGTACGTCGCCTGCACCCCCGATGAGATCGCCACCAAACCCCTGGGCCGGCAGATCTGCGGGGAAAAAATCGTGTTCTACCGCGCCCGCGAGAACCAAGTAGCCGCCGTCGAGGACTTCTGCCCGCACCGCGGCGCACCGTTGTCGTTGGGCTATGTCGAGGACGGCAACCTGGTGTGCGGCTACCACGGCCTGGTGATGGGTTGCGACGGCAAGACCGTGTCGATGCCGGGCCAACGGGTGCGTGGCTTCCCCTGCAACAAGACCTTTGCGGCCGTCGAGCGCTATGGCTTCATCTGGGTCTGGCCCGGTGACCAGGCGCAGGCCGACCCGGCGCTGATTCCGCATCTGGAATGGGCGGTGAGTGATGAGTGGGCCTACGGCGGCGGGCTGTTCCACATCGGTTGCGACTACCGCCTGATGATCGACAACCTCATGGACCTCACCCATGAAACCTATGTGCACGCCTCCAGCATCGGCCAGAAGGAGATCGACGAGGCACCGCCGGTCACCACCGTCACCGGCGACGAAGTGGTCACCGCCCGGCACATGGAAAACATCATGGCGCCACCGTTCTGGCGCATGGCCTTGCGTGGCAATGGCCTGGCCGACGATGTACCAGTGGACCGCTGGCAGATCTGCCGTTTCACCCCACCTAGCCATGTGCTGATCGAAGTGGGTGTAGCGCATGCCGGCAAGGGCGGCTACCACGCCGAGGCACAGCATAAGGCGTCGAGCATCGTGGTCGACTTCATCACCCCTGAGAGCGATACCTCTATCTGGTACTTCTGGGGCATGGCGCGCAACTTCGCTGCGCACGACCAGACCCTGACCGACAACATTCGTGAGGGCCAGGGCAAGATTTTCAGCGAAGACCTGGAAATGCTCGAACGCCAGCAGCAGAACCTGCTGGCCCACCCCGAGCGCAACTTGCTGAAGCTGAATATCGACGCCGGCGGCGTGCAGTCACGCAAAGTGCTGGAGCGGATCATCGCCCAAGAGCGTGCGCCGCAGCCGCAACTGATCGCCACCAGCGCCAACCCTGCCTGA
［配列番号２６］ｖａｎＢ遺伝子
ATGATCGATGCCGTAGTGGTATCCCGTAACGATGAAGCGCAGGGTATCTGCAGCTTCGAGCTGGCCGCGGCAGATGGCAGCCTGCTGCCGGCGTTCAGCGCCGGCGCCCATATCGACGTGCACCTGCCCGACGGGCTGGTGCGCCAGTATTCGCTGTGCAACCACCCCGAAGAACGCCATCGCTATCTGATTGGCGTACTCAACGACCCGGCTTCGCGGGGCGGTTCTCGTAGCCTGCACGAACAGGTGCAAGCCGGTGCCCGGCTGCGTATCAGTGCGCCGCGCAACCTGTTCCCGCTGGCCGAGGGTGCGCAGCGCAGTTTGCTGTTTGCTGGCGGTATCGGCATTACCCCAATCCTGTGCATGGCCGAGCAGCTGTCCGACAGCGGCCAGGCCTTCGAGCTGCACTACTGTGCCCGCTCCAGCGAGCGTGCGGCGTTTGTCGAGCGGATCCGCAGCGCGCCGTTCGCTGATCGGCTGTTCGTGCATTTTGACGAGCAGCCGGAAACGGCGCTGGACATCGCCCAGGTGCTGGGCAACCCGCAAGATGATGTGCACCTGTATGTATGCGGGCCCGGCGGGTTCATGCAGCATGTGCTGGACAGCGCGAAGGGGCTGGGCTGGCAGGAGGCCAACCTGCACCGCGAGTACTTCGCCGCAGCACCGGTGGATGCCAGCAACGATGGCAGTTTCGCGGTGCAGGTGGGCAGCACGGGACAGGTGTTCGAGGTGCCAGCCGACCGGACCGTGGTGCAGGTGCTGGAAGAGAATGGTATCGAGATCGCCATGTCGTGCGAGCAGGGTATTTGCGGCACCTGCCTGACACGCGTGCTGCAGGGCACACCGGACCATCGCGATCTGTTTCTCACCGAAGAGGAACAGGCCCTGAACGATCAGTTCACGCCCTGCTGCTCGCGCTCGAAGACGCCGCTGCTGGTGCTGGACATCTGA
［配列番号２７］ＬｉｇＡ
MTEKKERIDVHAYLAEFDDIPGTRVFTAQRARKGYNLNQFAMSLMKAENRERFKADESAYLDEWNLTPAAKAAVLARDYNAMIDEGGNVYFLSKLFSTDGKSFQFAAGSMTGMTQEEYAQMMIDGGRSPAGVRSIKGG
［配列番号２８］ＬｉｇＢ
MARVTTGITSSHIPALGAAIQTGTSDNDYWGPVFKGYQPIRDWIKQPGNMPDVVILVYNDHASAFDMNIIPTFAIGCAETFKPADEGWGPRPVPDVKGHPDLAWHIAQSLILDEFDMTIMNQMDVDHGCTVPLSMIFGEPEEWPCKVIPFPVNVVTYPPPSGKRCFALGDSIRAAVESFPEDLNVHVWGTGGMSHQLQGPRAGLINKEFDLNFIDKLISDPEELSKMPHIQYLRESGSEGVELVMWLIMRGALPEKVRDLYTFYHIPASNTALGAMILQPEETAGTPLEPRKVMSGHSLAQA
［配列番号２９］ＣａｔＡ
MTVKISHTADIQAFFNRVAGLDHAEGNPRFKQIILRVLQDTARLIEDLEITEDEFWHAVDYLNRLGGRNEAGLLAAGLGIEHFLDLLQDAKDAEAGLGGGTPRTIEGPLYVAGAPLAQGEARMDDGTDPGVVMFLQGQVFDADGKPLAGATVDLWHANTQGTYSYFDSTQSEFNLRRRIITDAEGRYRARSIVPSGYGCDPQGPTQECLDLLGRHGQRPAHVHFFISAPGHRHLTTQINFAGDKYLWDDFAYATRDGLIGELRFVEDAAAARDRGVQGERFAELSFDFRLQGAKSPDAEARSHRPRALQEG
［配列番号３０］ＡｒｏＹ
MTAPIQDLRDAIALLQQHDNQYLETDHPVDPNAELAGVYRHIGAGGTVKRPTRIGPAMMFNNIKGYPHSRILVGMHASRQRAALLLGCEASQLALEVGKAVKKPVAPVVVPASSAPCQEQIFLADDPDFDLRTLLPAPTNTPIDAGPFFCLGLALASDPVDASLTDVTIHRLCVQGRDELSMFLAAGRHIEVFRQKAEAAGKPLPITINMGLDPAIYIGACFEAPTTPFGYNELGVAGALRQRPVELVQGVSVPEKAIARAEIVIEGELLPGVRVREDQHTNSGHAMPEFPGYCGGANPSLPVIKVKAVTMRNNAILQTLVGPGEEHTTLAGLPTEASIWNAVEAAIPGFLQNVYAHTAGGGKFLGILQVKKRQPADEGRQGQAALLALATYSELKNIILVDEDVDIFDSDDILWAMTTRMQGDVSITTIPGIRGHQLDPSQTPEYSPSIRGNGISCKTIFDCTVPWALKSHFERAPFADVDPRPFAPEYFARLEKNQGSAK
［配列番号３１］ＫｐｄＢ
MKLIIGMTGATGAPLGVALLQALRDMPEVETHLVMSKWAKTTIELETPWTAREVAALADFSHSPADQAATISSGSFRTDGMIVIPCSMKTLAGIRAGYAEGLVGRAADVVLKEGRKLVLVPREMPLSTIHLENMLALSRMGVAMVPPMPAYYNHPETVDDITNHIVTRVLDQFGLDYHKARRWNGLRTAEQFAQEIE
［配列番号３２］ＬｉｇＭ
MSAPTNLEQVLAAGGNTVEMLRNSQIGAYVYPVVAPEFSNWRTEQWAWRNSAVLFDQTHHMVDLYIRGKDALKLLSDTMINSPKGWEPNKAKQYVPVTPYGHVIGDGIIFYLAEEEFVYVGRAPAANWLMYHAQTGGYNVDIVHDDRSPSRPMGKPVQRISWRFQIQGPKAWDVIEKLHGGTLEKLKFFNMAEMNIAGMKIRTLRHGMAGAPGLEIWGPYETQEKARNAILEAGKEFGLIPVGSRAYPSNTLESGWIPSPLPAIYTGDKLKAYREWLPANSYEASGAIGGSFVSSNIEDYYVNPYEIGYGPFVKFDHDFIGRDALEAIDPATQRKKVTLAWNGDDMAKIYASLFDTEADAHYKFFDLPLANYANTNADAVLDAAGNVVGMSMFTGYSYNEKRALSLATIDHEIPVGTELTVLWGEENGGTRKTTVEPHKQMAVRAVVSPVPYSVTARETYEGGWRKAAVTA
［配列番号３３］ＶａｎＡ
MYPKNTWYVACTPDEIATKPLGRQICGEKIVFYRARENQVAAVEDFCPHRGAPLSLGYVEDGNLVCGYHGLVMGCDGKTVSMPGQRVRGFPCNKTFAAVERYGFIWVWPGDQAQADPALIPHLEWAVSDEWAYGGGLFHIGCDYRLMIDNLMDLTHETYVHASSIGQKEIDEAPPVTTVTGDEVVTARHMENIMAPPFWRMALRGNGLADDVPVDRWQICRFTPPSHVLIEVGVAHAGKGGYHAEAQHKASSIVVDFITPESDTSIWYFWGMARNFAAHDQTLTDNIREGQGKIFSEDLEMLERQQQNLLAHPERNLLKLNIDAGGVQSRKVLERIIAQERAPQPQLIATSANPA
［配列番号３４］ＶａｎＢ
MIDAVVVSRNDEAQGICSFELAAADGSLLPAFSAGAHIDVHLPDGLVRQYSLCNHPEERHRYLIGVLNDPASRGGSRSLHEQVQAGARLRISAPRNLFPLAEGAQRSLLFAGGIGITPILCMAEQLSDSGQAFELHYCARSSERAAFVERIRSAPFADRLFVHFDEQPETALDIAQVLGNPQDDVHLYVCGPGGFMQHVLDSAKGLGWQEANLHREYFAAAPVDASNDGSFAVQVGSTGQVFEVPADRTVVQVLEENGIEIAMSCEQGICGTCLTRVLQGTPDHRDLFLTEEEQALNDQFTPCCSRSKTPLLVLDI
［配列番号３５］ｐｃａＨ遺伝子
ATGCCCGCCCAGGACAACAGCCGCTTCGTGATCCGTGATCGCAACTGGCACCCTAAAGCCCTTACGCCTGACTACAAGACCTCCGTTGCCCGCTCGCCGCGCCAGGCACTGGTCAGCATTCCGCAGTCGATCAGCGAAACCACTGGTCCGGACTTTTCCCATCTGGGCTTCGGCGCCCACGACCATGACCTGCTGCTGAACTTCAATAACGGTGGCCTGCCCATTGGCGAGCGCATCATCGTCGCCGGCCGTGTCGTCGACCAGTACGGCAAGCCTGTGCCGAACACTTTGGTGGAGATGTGGCAAGCCAACGCCGGCGGCCGCTATCGCCACAAGAACGATCGCTACCTGGCGCCCCTGGACCCGAACTTCGGTGGTGTTGGGCGGTGTCTGACCGACCGTGACGGCTATTACAGCTTCCGCACCATCAAGCCGGGCCCGTACCCATGGCGCAACGGCCCGAACGACTGGCGCCCGGCGCATATCCACTTCGCCATCAGCGGCCCATCGATCGCCACCAAGCTGATCACCCAGTTGTACTTCGAAGGTGACCCGCTGATCCCGATGTGCCCGATCGTCAAGTCGATCGCCAACCCGCAAGCCGTGCAGCAGTTGATCGCCAAGCTCGACATGAGCAACGCCAACCCGATGGACTGCCTGGCCTACCGCTTTGACATCGTGCTGCGCGGCCAGCGCAAGACCCACTTCGAAAACTGCTGA
［配列番号３６］ｐｃａＧ遺伝子
ATGCCAATCGAACTGCTGCCGGAAACCCCTTCGCAGACTGCCGGCCCCTACGTGCACATCGGCCTGGCCCTGGAAGCCGCCGGCAACCCGACCCGCGACCAGGAAATCTGGAACTGCCTGGCCAAGCCAGACGCCCCGGGCGAGCACATTCTGCTGATCGGCCACGTATATGACGGAAACGGCCACCTGGTGCGCGACTCGTTCCTGGAAGTGTGGCAGGCCGACGCCAACGGTGAGTACCAGGATGCCTACAACCTGGAAAACGCCTTCAACAGCTTTGGCCGCACGGCTACCACCTTCGATGCCGGTGAGTGGACGCTGCAAACGGTCAAGCCGGGTGTGGTGAACAACGCTGCTGGCGTGCCGATGGCGCCGCACATCAACATCAGCCTGTTTGCCCGTGGCATCAACATCCACCTGCACACGCGCCTGTATTTCGATGATGAGGCCCAGGCCAATGCCAAGTGCCCGGTGCTCAACCTGATCGAGCAGCCGCAGCGGCGTGAAACCTTGATTGCCAAGCGTTGCGAAGTGGATGGGAAGACGGCGTACCGCTTTGATATCCGCATTCAGGGGGAAGGGGAGACCGTCTTCTTCGACTTCTGA
［配列番号３７］ｐｒａＡ遺伝子
ATGTCACTGGAAATGGCTTTGTTAGCCGCGCATGTCCCAAGCATTTGTCATGAATCTAATGTGCCTGATTTCCAACAGGATTTGGTCAAGGGGCTGAAGCAGATGCGGGACCGCATCAACGAGCTTCAGACAGATGTGATTTTGCTGATGTCCTGCCACTTTCCGGCAACCTTTCATCACTATGTGGATGCAACACCGCGGCATACCGGCATATTAACGGCGATGGAGTGTCCGGATCTGATCTCGGACGTACCGTATGACTATCCTGGGGATGAGGAGCTGGCGCGTAAGCTGGTAACCGCGGGCCAAGAGGCAGGCCTTCCCATCGTGGAGATCAATGATCCGACTTACATTTGGGATTACGGTACCGTCGTTCCGCTGCGGTACTTGGTTCCGAACCAAGACAAATCGGTCATCAGCTTGTCGGTATGCTGGGCTTCCAGCCTGGAGGAATCGTACCAGTGGGGCGTTCAAATCGGCAAGGTGCTGAGGGAAAGCGAGAAGCGGGCGGTGTTCATCAGCAGCGGCGCTTTATCTCACAACTTGGTCCGGGGACGTCACCATATGCCGAGCCGCTCCGAGCAAGCCATGGATAACCAATTCATCGAATATTTACTGAACGGAGATTATAACGCTGCCCGTGAAATGCTAAACCAATATGCGCGTATTGCGGGTGTGGAATCCGGAGGACGCCATCTGGCCGCCTTGCTGGGTGTGCTGGATGATAAGCAGCGCGCCGAGTTTTGGGGATACGGCCAATCTTCCGGCAGCGGCAACGCCATTATCTCGTTTGTATCATGA
［配列番号３８］ｄｅｓＡ遺伝子
ATGGCGAAAAGTCTTCAAGATGTGCTGGACAATGCCGGAAATGCAGTCGATTTCCTGCGCAACCAGCAGACCGGCCCGAACGTCTATCCCGGCGTCCCGGCGGAATATTCCAACTGGCGCAACGAGCAGCGCGCATGGGCCAAGACCGCCGTGCTCTTCAACCAGAGCTACCACATGGTCGAGCTGATGGTCGAAGGCCCCGACGCCTTCGCCTTCCTCAACTATCTCGGCATCAACAGCTTCAAGAACTTCGCGCCCGGCAAGGCCAAGCAGTGGGTTCCGGTGACGGCCGAGGGCTATGTCATCGGCGACGTGATCCTGTTCTATCTCGCCGAGAACCAGTTCAACCTCGTCGGCCGCGCGCCGGCCATCGAGTGGGCCGAGTTCCATGCCGCCACCGGCAAGTGGAACGTGACGCTCACCCGTGACGAGCGCACCGCGCTGCGCACCGACGGCGTGCGTCGCCACTATCGCTTCCAGCTGCAGGGCCCCAACGCCATGGCGATCCTAACGGACGCGATGGGCCAGACCCCGCCGGACCTCAAATTCTTCAACATGGCGGACATCCAGATCGCCGGGAAGACCGTCGGCGCGCTGCGTCACGGCATGGCCGGTCAGCCGGGCTATGAGCTCTATGGTCCCTGGGCGGATTATGAGGCGGTTCATTCGGCGCTGGTCGCGGCCGGCAAGAACCATGGGCTGGCGCTCGTCGGCGGCCGTGCCTATTCGTCCAACACGCTGGAATCCGGCTGGGTGCCCTCGCCGTTCCCGGGCTATCTCTTCGGCGAAGGCTCGGCCGACTTCCGCAAGTGGGCCGGCGAGAACAGCTATGGCGCCAAGTGCTCCATCGGCGGTTCCTATGTGCCCGAGAGCCTGGAAGGCTATGGCCTGACGCCCTGGGACATCGGCTATGGCATCATCGTCAAGTTCGACCATGACTTCATCGGCAAGGAAGCGCTGGAGAAGATGGCGAACGAGCCGCACCTCGAGAAGGTGACGCTGGCGCTGGACGACGAGGACATGCTGCGCGTGATGAGCAGCTATTTCTCGGACTCCGGTCGTGCGAAATATTTCGAGTTCCCGAGCGCGGTCTACTCGATGCACCCCTATGACTCGGTGCTGGTCGACGGCAAGCATGTCGGCGTCTCGACCTGGGTCGGCTACTCGTCGAACGAGGGCAAGATGCTCACGCTCGCGATGATCGATCCCAAATATGCCAAGCCCGGCACGGAAGTCTCGCTGCTCTGGGGCGAGCCCAATGGCGGCACCTCCAAGCCGACCGTCGAGCCGCACGAGCAGACGGAGATCAAGGCGGTCGTGGCGCCGGTGCCGTACTCGGCCGTGGCGCGCACGGGCTATGCCGACAGCTGGCGCACCAAGAAGGCCTGA
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明の一態様の形質転換微生物や製造方法によって、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物や広葉樹由来のシリンギルリグニンを含むバイオマスなどから、ムコン酸やプロトカテク酸が得られる。ムコン酸やプロトカテク酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤、医薬品、農薬、香料などの原料として利用することができる。
【図１】
2018199112.tif 000008
【配列表】
2018199112000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月22日(2019.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主微生物が染色体上にプロトカテク酸分解酵素遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するスフィンゴモナド（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄ）科微生物であり、
染色体上にある該プロトカテク酸分解酵素遺伝子が欠失しており、
挿入されたｃａｔＡ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子又はａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を発現する、形質転換微生物。
【請求項２】
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子、前記ｋｐｄＢ遺伝子及び前記ｃａｔＡ遺伝子は、同一プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項３】
前記形質転換微生物は、挿入されたｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子をさらに発現する、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項４】
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子、前記ｋｐｄＢ遺伝子、前記ｃａｔＡ遺伝子、前記ｖａｎＡ遺伝子及び前記ｖａｎＢ遺伝子は、同一プロモーターの制御下にある、請求項３に記載の形質転換微生物。
【請求項５】
前記プロトカテク酸分解酵素遺伝子が、ｌｉｇＡ遺伝子、ｌｉｇＢ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｒａＡ遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子である、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項６】
前記宿主微生物が、スフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）  ＳＹＫ−６株である、請求項１に記載の形質転換微生物。
【請求項７】
ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、請求項１〜６のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を含む、ムコン酸の製造方法。
【国際調査報告】
2018199112.tif 000009
2018199112.tif 000010
2018199112.tif 000011
2018199112.tif 000012
2018199112.tif 000013