(57)【要約】心筋組織により近い、心臓線維化モデルを提供する。多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を線維化誘導因子の存在下で培養することにより得られうる、細胞集団。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を線維化誘導因子の存在下で培養することにより得られうる、細胞集団。
【請求項２】
全細胞に対する前記多能性幹細胞由来心筋細胞の割合が、５０〜７０％である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記多能性幹細胞由来心筋細胞が、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞である、請求項１又は２に記載の細胞集団。
【請求項４】
心臓線維化モデルとして用いられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団。
【請求項５】
心臓線維症治療薬のスクリーニングのために用いられる、請求項４に記載の細胞集団。
【請求項６】
心臓線維化モデルとして用いられる細胞集団の製造方法であって、多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を線維化誘導因子の存在下で培養することにより前記細胞集団を得る工程を含む方法。
【請求項７】
心臓線維症治療薬のスクリーニング方法であって、
（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団に、候補化合物を接触させる工程と、
（２−１）前記工程（１）により得られた細胞集団における、線維化マーカーの発現量を測定する工程、及び／又は
（２−２）前記工程（１）により得られた細胞集団の収縮能及び／又は弛緩能を測定する工程と、
（３）前記工程（２−１）及び／又は（２−２）で測定された線維化マーカーの発現量、収縮能並びに弛緩能からなる群より選択される少なくとも一種のパラメーターに基づいて、線維症治療作用を有する化合物を選抜する工程
とを含む、方法。
【請求項８】
心臓線維化モデルを評価する方法であって、
（１−１）請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団におけるアポトーシスを評価する工程、及び／又は
（１−２）請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団における肥大化を評価する工程を含む、方法。
【請求項９】
心臓線維化モデルを評価するシステムであって、
（Ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団と、
（Ｂ）前記細胞集団（Ａ）を培養する装置と、
（Ｃ−１）前記細胞集団（Ａ）におけるアポトーシスを評価する装置、及び／又は
（Ｃ−２）前記細胞集団（Ａ）における肥大化を評価する装置
とを備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓線維化モデルとして用いられる細胞集団、その製造方法、それを利用したスクリーニング方法及び心臓線維化モデルの評価方法、並びに心臓線維化モデルの評価システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓の線維化は、心不全の主要因の一つであり、心線維化を標的とした新薬開発は心不全治療において重要である。【０００３】
しかし、そのための薬効評価系は現在、動物モデルを用いるものが主流であり、コスト面の問題や、ヒトにおける薬効と相違する結果が得られるといった問題等が指摘されている。【０００４】
このため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系の開発が求められている。例えば、細胞を用いない評価系として、ビメンチンと潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）部分断片との結合を阻害する活性を指標とし、ＴＧＦ−β活性化抑制剤をスクリーニングする方法等が提案されている（特許文献１）。【０００５】
さらに、好ましくは、細胞、より好ましくはヒト細胞、を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系の開発が求められている。【０００６】
これまで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞を用いた線維化モデルとして、線維芽細胞を単独で用いたモデルが提案されている。しかし、組織内であれば起こるはずの異種細胞間の相互作用を反映することができない、心筋組織としての反応を反映していない、といった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／１０５１４４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、心筋組織により近い、心臓線維化モデルを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を線維化誘導因子の存在下で培養することにより得られうる細胞集団を利用することにより、心筋組織により近い、心臓線維化モデルを提供できることを見出した。本発明は、さらなる試行錯誤を経て完成されたものであり、以下の態様を含む。【００１０】
項１．
多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を線維化誘導因子の存在下で培養することにより得られうる、細胞集団。
項２．
全細胞に対する前記多能性幹細胞由来心筋細胞の割合が、５０〜７０％である、項１に記載の細胞集団。
項３．
前記多能性幹細胞由来心筋細胞が、ｉＰＳ細胞由来心筋細胞である、項１又は２に記載の細胞集団。
項４．
心臓線維化モデルとして用いられる、項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団。
項５．
心臓線維症治療薬のスクリーニングのために用いられる、項４に記載の細胞集団。
項６．
心臓線維化モデルとして用いられる細胞集団の製造方法であって、多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を線維化誘導因子の存在下で培養することにより前記細胞集団を得る工程を含む方法。
項７．
心臓線維症治療薬のスクリーニング方法であって、
（１）項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団に、候補化合物を接触させる工程と、
（２−１）前記工程（１）により得られた細胞集団における、線維化マーカーの発現量を測定する工程、及び／又は
（２−２）前記工程（１）により得られた細胞集団の収縮能及び／又は弛緩能を測定する工程と、
（３）前記工程（２−１）及び／又は（２−２）で測定された線維化マーカーの発現量、収縮能並びに弛緩能からなる群より選択される少なくとも一種のパラメーターに基づいて、線維症治療作用を有する化合物を選抜する工程
とを含む、方法。
項８．
心臓線維化モデルを評価する方法であって、
（１−１）項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団におけるアポトーシスを評価する工程、及び／又は
（１−２）項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団における肥大化を評価する工程を含む、方法。
項９．
心臓線維化モデルを評価するシステムであって、
（Ａ）項１〜３のいずれか一項に記載の細胞集団と、
（Ｂ）前記細胞集団（Ａ）を培養する装置と、
（Ｃ−１）前記細胞集団（Ａ）におけるアポトーシスを評価する装置、及び／又は
（Ｃ−２）前記細胞集団（Ａ）における肥大化を評価する装置
とを備える、システム。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、心筋組織により近い、心臓線維化モデルを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の細胞集団の作成方法及びその評価方法の一例を示す。
【図２】本発明の細胞集団の実施例における、細胞構成の解析結果の一例を示す。cTroponin(cTnT)陰性細胞の分画に含まれる細胞を解析したところ、心筋細胞マーカーの発現は認められず、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞のマーカーを示す細胞が含まれていた。
【図３】本発明の細胞集団の実施例における、線維化刺激への応答性（ECM産生）の一例を示す。TGF-βの刺激により、collagenやMMPなどの線維化関連因子の発現が有意に増加した。
【図４】本発明の細胞集団の実施例における、線維化刺激への応答性（心筋細胞機能）の一例を示す。細胞の動きを数値化することにより、収縮、弛緩能を評価したところ、TGF-βの刺激により、収縮・弛緩の速度、収縮力・弛緩力に相当するパラメーターはいずれも有意に低下した。
【図５】本発明の細胞集団の実施例における、線維化刺激への応答性（ECM産生）の一例を示す。心筋細胞純度が高くなるにつれ、collagenやMMPなどの線維化関連因子の発現が低下するなど、TGF-β刺激への応答性が低下する傾向が認められた。
【図６】本発明の細胞集団の実施例における、線維化刺激への応答性の一例を示す。TGF-β刺激による線維化関連遺伝子の発現変化を網羅的に解析したところ、心筋細胞純度により応答性が異なる傾向が認められた。
【図７】本発明の細胞集団の実施例における、薬剤応答性の一例を示す。TGF-βに加えてONO-1301またはPirfenidoneを添加することにより、collagen産生の低下、収縮・弛緩に関するパラメーターの改善傾向が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．本発明の細胞集団
１．１  多能性幹細胞由来心筋細胞
多能性幹細胞としては、特に限定されず、幅広く用いることができる。多能性幹細胞としては、人工多能性幹細胞又は胚性幹細胞のいずれも用いることができる。
【００１４】
人工多能性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞等を用いることができる。胚性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、通常のＥＳ細胞の他、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）等も用いることができる。これらの中でも、特に医薬としての利用を考えた場合、安全性等の面からｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞が特に好ましい。特にヒト由来のｉＰＳ細胞（ｈ−ｉＰＳ細胞）が好ましい。
【００１５】
心筋細胞への分化誘導方法は、従来公知の方法を適宜使用することができる。例えば、ｈ−ｉＰＳ細胞からの心筋細胞への分化誘導方法としては、Biochemical and Biophysical Research Communications 425 (2012) 321-327に記載の方法等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００１６】
１．２  多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団
本発明で用いる、多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団は、好ましくは、多能性幹細胞由来心筋細胞に加えて、その他の少なくとも一種の細胞を含む。その他の細胞としては、内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞からなる群より選択される少なくとも一種が含まれていることが好ましい。これらのうち少なくとも一種の細胞が含まれていることにより、細胞集団が全体として生体の心筋組織と類似の機能及び特性を有するようになる。多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団には、これら三種がいずれも含まれていることがより好ましい。これら三種は、いずれも生体の心臓組織を構成する細胞種である。
【００１７】
多能性幹細胞由来心筋細胞と、その他の細胞とを含む細胞集団は、それぞれを別々に用意した上で混合されていてもよい。また、多能性幹細胞から心筋細胞を分化誘導することにより得られる、心筋細胞とその他の細胞とを含む細胞集団を、そのまま使用することもできる。分化誘導により得られた細胞集団そのものにおける混合割合が好ましい範囲内にない場合は、この細胞集団をいったん、多能性幹細胞由来心筋細胞と、その他の細胞とにいったん分離した後に両者を好ましい割合で再混合して得られる細胞集団を使用してもよい。多能性幹細胞由来心筋細胞と、その他の細胞との分離は、特に限定されないが、例えば、多能性幹細胞由来心筋細胞を心筋細胞特異的マーカー陽性細胞として、その他の細胞を心筋細胞特異的マーカー陰性細胞として、セルソーター等を用いて分離することができる。このときの心筋細胞特異的マーカーとしては、特に限定されないが、ＣＤ１７２ａが好ましい。
【００１８】
かかる細胞集団の全体に占める、多能性幹細胞由来心筋細胞の割合は、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは５０〜８０％であり、さらに好ましくは５０〜７０％である。このような割合となっていることにより、細胞集団が全体として生体の心筋組織と類似の機能及び特性を示しやすくなる。なお、本発明において、細胞集団における多能性幹細胞由来心筋細胞の割合は、心筋細胞特異的マーカーを発現していることを指標として決定するものとする。具体的には、フローサイトメトリー解析により決定することができる。
【００１９】
心筋細胞特異的マーカーとしては、特に限定されないが、例えば、心筋トロポニン（ｃＴｎＴ）、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰＡ又はＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（ＣＤ３０９、ＦＬＫ１又はＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ，ＥＭＩＬＩＮ２及びＶＣＡＭ等が挙げられる。心筋細胞特異的マーカーとしては、一種単独を使用してもよいし、複数種を組み合わせて使用してもよい。心筋細胞特異的マーカーの好ましい組合せとしては、ｃＴｎＴ及びＣＤ１７２ａ等が挙げられる。心筋細胞特異的マーカーを単独で使用する場合、ｃＴｎＴ又はＣＤ１７２ａを使用することが好ましい。
【００２０】
フローサイトメトリー解析は、例えば以下のようにして行うことができる。培養ディッシュ上で付着培養した約１×１０５〜５×１０５個の細胞にＡｃｃｕｔａｓｅ等の細胞剥離液を３７℃、５分間作用させ、細胞を剥離及び遠心回収する。細胞を、０．５％程度のＢＳＡ又は１〜２％程度のＦＢＳを含むＰＢＳ１００μＬずつに懸濁し、蛍光標識された抗体及びアイソタイプコントロール抗体をそれぞれ添加し、４℃、暗所で２０分間反応させる。分化細胞をＰＢＳで洗浄し遠心回収後、それぞれＢＳＡ又はＦＢＳを含む上記のＰＢＳ３００μＬずつに懸濁し、セルストレイナーを通した後ＦＡＣＳチューブに回収する。フローサイトメトリー解析においては、標識蛍光に対応した検出器でその蛍光発光を検出し定量化する。アイソタイプコントロール抗体で染まる分画を陰性分画と定義し、それに比して蛍光強度の高い分画を陽性分画と定義する。抗体で染まる分画のうち、陽性分画に属する割合をパーセンテージで定量表記する。
【００２１】
同様に、細胞集団におけるその他の細胞は、例えば、ＣＤ３１陽性細胞及び／又はＣＤ１４４陽性細胞を第一のその他の細胞集団、デスミン陽性細胞及び／又はカルポニン陽性細胞を第二のその他の細胞集団、並びにＴＥ−７陽性細胞及び／又はビメンチン陽性細胞を第三のその他の細胞集団であるとして分類することができる。さらに第四以上の細胞集団が含まれていてもよい。具体的には、フローサイトメトリー解析により決定することができる。第一のその他の細胞集団は主に血管内皮細胞であり、第二のその他の細胞集団は主に平滑筋細胞であり、第三のその他の細胞集団は主に線維芽細胞である。
【００２２】
１．３  線維化誘導因子の存在下での培養
本発明の細胞集団は、多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団を線維化誘導因子の存在下で培養することにより得られうる。
【００２３】
線維化誘導因子としては、特に限定されず、公知のものを幅広く使用できる。例えば、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、エンドセリン、アンジオテンシン、ＣＣＮ２等が挙げられる。線維化誘導因子は、一種を単独で使用してもよいし、二種以上を組み合わせて使用してもよい。線維化誘導因子としては、ＴＧＦ−βが好ましく用いられる。
【００２４】
このとき、多能性幹細胞由来心筋細胞を含む細胞集団においては、多能性幹細胞由来心筋細胞と、その他の細胞との混合割合が先述のとおりとなっていることが好ましい。分化誘導により得られた細胞集団そのものにおける混合割合が好ましい範囲内になく、先述のように多能性幹細胞由来心筋細胞と、その他の細胞とにいったん分離した後に両者を好ましい割合で再混合した場合は、再混合の後、線維化誘導因子の存在下で培養する前に、７２〜１２０時間培養することが好ましい。
【００２５】
線維化誘導因子の存在下での培養は、特に限定されず、適宜設定することができる。一例として、４８〜７２時間行うことができる。線維化誘導因子の培養液中の濃度は、５〜１０μｇ/ｍｌが好ましい。
【００２６】
線維化誘導因子の存在下で培養することにより、本発明の細胞集団は、心臓線維化モデルとして用いることができるようになる。具体的には、線維化マーカーの産生が増加する。本発明の細胞集団においては、好ましくは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）、α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）からなる群より選択される少なくとも一種の線維化マーカーの産生が増加している。本発明の細胞集団においては、より好ましくは、上記四種全ての産生が増加している。上記において、産生が増加する程度は、好ましくは、遺伝子発現量が、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、増加する程度である。また、この場合において、遺伝子発現量は、通常、３倍以下である。遺伝子発現量の測定は、特に限定されないが、例えば、リアルタイムＰＣＲ法等により行うことができる。
【００２７】
２．本発明の、心臓線維症治療薬のスクリーニング方法
本発明の、心臓線維症治療薬のスクリーニング方法は、
（１）本発明の細胞集団に、候補化合物を接触させる工程と、
（２−１）前記工程（１）により得られた細胞集団における、線維化マーカーの発現量を測定する工程、及び／又は
（２−２）前記工程（１）により得られた細胞集団の収縮能及び／又は弛緩能を測定する工程と、
（３）前記工程（２−１）及び／又は（２−２）で測定された線維化マーカーの発現量、収縮能並びに弛緩能からなる群より選択される少なくとも一種のパラメーターに基づいて、線維症治療作用を有する化合物を選抜する工程
とを含む、方法。である。
【００２８】
工程（１）における、細胞集団と候補化合物との接触は、細胞集団が死滅など重大な影響を受けない限りにおいていかなる条件、時間で行われてもよく、候補化合物の特性等に応じて適宜設定することができる。通常は、細胞集団を培養している培地中に候補化合物を添加することにより行うことができる。
【００２９】
工程（２−１）における、線維化マーカー発現量の測定方法は、特に限定されないが、例えば、リアルタイムＰＣＲ法等により行うことができる。
【００３０】
工程（２−１）において、線維化マーカーとしては、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）、α−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、ＡＣＴＡ２、ＡＧＴ、ＡＫＴ１、ＢＣＬ２、ＢＭＰ７、ＣＡＶ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＲ２、ＣＥＢＰＢ、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＲ４、ＤＣＮ、ＥＤＮ１、ＥＧＦ、ＥＮＧ、ＦＡＳＬＧ、ＧＲＥＭ１、ＨＧＦ、ＩＦＮＧ、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬＫ、ＩＮＨＢＥ、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ８、ＪＵＮ、ＬＯＸ、ＬＴＢＰ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＹＣ、ＮＦＫＢ１、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＡＴ、ＰＬＡＵ、ＰＬＧ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＮＡＩ１、ＳＰ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ６、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＩＦ１、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４、ＴＮＦ及びＶＥＧＦＡ等が挙げられる。
【００３１】
線維化マーカーとしては、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）及びα−平滑筋アクチン（αＳＭＡ）からなる群より選択される少なくとも一種の線維化マーカーが好ましい。
【００３２】
工程（２−２）における、収縮能は、具体的には、収縮速度及び／又は収縮変形距離により測定できる。同様に弛緩能は、弛緩速度及び／又は弛緩変形距離により測定できる。
これらのパラメーターの測定は、特に限定されないが、例えば、高性能ビデオカメラを利用した動画像処理等により行うことができる。例えば、セルモーションイメージングシステムＳＩ８０００（ソニー株式会社製）等を使用できる。
【００３３】
３．心臓線維化モデルを評価する本発明の方法
心臓線維化モデルを評価する本発明の方法は、
（１−１）本発明の細胞集団におけるアポトーシスを評価する工程、及び／又は
（１−２）本発明の細胞集団における肥大化を評価する工程
を含む、方法である。
【００３４】
心臓線維化モデルを評価する本発明の方法によって、心臓線維化の病態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察することができる。
【００３５】
アポトーシスの評価は、従来公知の方法により行うことができる。例えば、カスパーゼ染色によりアポトーシスの様子を可視化することができる。
【００３６】
細胞の肥大化は、細胞のサイズを測定することにより評価できる。特に限定されないが、例えば、写真を撮影することにより行うことができる。
【００３７】
心臓線維化モデルを評価する本発明の方法においては、必要に応じて、線維化に影響を与えうる、あるいは影響を与えることが期待ないし予想される刺激を細胞集団に与える工程をさらに含んでいてもよい。
【００３８】
４．心臓線維化モデルを評価する本発明のシステム
心臓線維化モデルを評価する本発明のシステムは、
（Ａ）本発明の細胞集団と、
（Ｂ）前記細胞集団（Ａ）を培養する装置と、
（Ｃ−１）前記細胞集団（Ａ）におけるアポトーシスを評価する装置、及び／又は
（Ｃ−２）前記細胞集団（Ａ）における肥大化を評価する装置
とを備える、システムである。
本発明のシステムは、心臓線維化モデルを評価する本発明の方法を実行するためのシステムである。
【実施例】
【００３９】
以下に実施例を示して、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。【００４０】
＜実験方法＞
１．フローサイトメトリー解析
細胞を0.5% BSA/PBSで洗浄後、細胞表面マーカーの測定には、洗浄後の細胞をPE標識抗CD31、CD144抗体［BD社製］と反応させた。細胞内、または核内抗原の測定には、洗浄後の細胞を固定・透過処理剤（BD Cytofix Cytoperm、Fixation/Permeabilization Solution Kit、BD社製）で固定、透過処理し、処理後の細胞を抗cTnT抗体（Santa Cruz biotechnology社製、またはThermo Fisher Scientific社製）、抗Nkx2.5、calponin、vimentin（abcam社製）、TE-7（ミリポア製）、desmin（DAKO社製）抗体、次いで、蛍光標識二次抗体（Alexa Fluor 647標識ヤギ-抗マウスIgG2a、マウスIgG1、またはウサギ抗体、Thermo Fisher Scientific社製）と反応することにより行った。
標識した細胞を、BD FACS Canto IIフローサイトメーターおよびBD FACS Divaソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。【００４１】
２．心筋細胞の分離
iPS細胞から分化誘導した胚様体を0.05%トリプシン/EDTAにより単一細胞に分離した後、PE標識抗CD172a抗体（Biolegend社製）、抗PEマイクロビーズ（ミルテニ社製）と順次反応させた。反応後の細胞をMACSシステム（ミルテニ社製）を用いてCD172a陽性分画と陰性分画とに分離した。【００４２】
３．蛍光免疫染色
細胞をPBSで洗浄後、4%パラホルムアルデヒドで固定、0.3％Tritonを含むPBDで透過処理した。抗コラーゲンタイプI、MMP2抗体（Abcam社製）cTNT抗体を反応させた後、蛍光標識2次抗体（Alexa Fluor 488、または555標識ヤギ-抗ウサギ、マウスIgG2a、またはマウスIgG1抗体）と反応させた。Hoechst33342（Thermo Fisher Scientific社製）で核染したのち、観察を行った。【００４３】
４．遺伝子発現解析
細胞から、RNAeasy kit（QIAGEN社製）、SuperScript VILO cDNA synthesisキット（Thermo Fisher Scientific社製）を使用し、添付プロトコルに従ってトータルRNAを抽出、cDNA合成を行った。リアルタイムPCRにはTaqMan PCR master mix、Taqman gene expression assay（Thermo Fisher Scientific社製）を使用し、Viia７Real-time PCR system（Thermo Fisher Scientific社製）を用いてコラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIII、MMP2、αSMAの発現について、サンプル間の比較を行った。【００４４】
５．網羅的遺伝子発現解析
細胞から、RNAeasy kit、RT2 First Strand Kit（QIAGEN社製）を用いて添付プロトコルに従ってトータルRNAの抽出、cDNA合成を行った。網羅的遺伝子発現の解析にはRT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix、RT2 ProfilerTM PCR Array Human Fibrosis（QIAGEN社製）を用いて、Viia７Real-time PCR systemにより測定を行った。【００４５】
６．心筋細胞機能の解析
プレート上にて培養中の細胞をSI8000（ソニー社製）にセットし、動画を撮影した後、SI8000C Analyzer software（ソニー社製）を用いて動画を解析し、収縮速度、弛緩速度、収縮変形距離及び弛緩変形距離を算出した。【００４６】
＜実施例１＞細胞構成の解析
ヒトiPS細胞から心筋分化誘導後の胚様体を単一細胞に分散した後、フローサイトメトリー解析によりTnT陰性の分画に含まれる細胞の構成を解析した。その結果、TnT陰性細胞は心筋マーカーであるNkx2.5の発現はほとんど認められないのに対して、内皮細胞マーカー（CD31、CD144）が４%程度、平滑筋マーカー（desmin、calponin）が30〜40％程度、線維芽細胞マーカーTE-7が30〜40％程度、ビメンチンが90%程度の細胞において陽性であった（図２）。【００４７】
＜実施例２＞線維化刺激への応答性
ヒトiPS細胞から分化誘導した心筋細胞を含む細胞集団を3×10e5 cells/cm2の密度で播種し、3日間培養した。3日目に無血清、もしくは1%FBS/DMEMに培地を交換して1日培養した後、TGF-β（5μg/ml）を添加し、さらに48〜72時間培養して遺伝子発現、心筋細胞機能の評価を行った。その結果、TGF-βの添加により、コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIII、MMP2の有意な発現増加が認められた。さらに、心筋細胞機能については、収縮・弛緩速度、収縮・弛緩変形距離の有意な低下が認められた。以上の結果より、本評価系が生体と同様の線維化刺激に対して応答しうることが示唆された（図３、４）。【００４８】
＜実施例３＞心筋細胞純度による応答性の違い
ヒトiPS細胞から分化誘導した心筋細胞を含む細胞集団から心筋細胞と非心筋細胞とをMACSにより分離したのち、心筋細胞が50、60、70、80％の割合で含まれるよう細胞を再混合した。混合した細胞に対して２と同様に線維化への応答性を解析した。その結果、コラーゲンタイプI、MMP2の発現に関して、心筋細胞純度が高くになるにつれてTGF-β刺激への応答性が低下する傾向が認められた（図５）。【００４９】
＜実施例４＞線維化関連遺伝子の網羅的解析
実施例３と同様に心筋細胞が50、60、70、80％含まれる細胞集団に対してTGF-β刺激を与えた後、線維化関連遺伝子の発現変化を網羅的に解析した。その結果、心筋細胞純度の違いにより応答性が異なり、特に60〜70％において応答性が高い傾向が示された（図６）。【００５０】
＜実施例５＞薬剤応答性
実施例２と同様にTGF-βによる刺激を行う際、同時にONO-1301（0.1、0.3、1μM）、ピルフェニドン（0.1、0.3、1ｍM）（東京化成工業製）を培養系に添加し、遺伝子発現、細胞機能への影響を評価した。その結果、TGF-β刺激に加えて抗線維化作用の知られるオキシム誘導体ONO-1301、又は抗線維化薬ピルフェニドンを添加することにより、コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプIIIの発現増加の抑制、心筋細胞収縮・弛緩能の低下の低減が認められた。以上の結果より、本評価系はTGF-βによる線維化刺激に応答するとともに、線維化抑制剤への刺激にも応答することが明らかとなった（図７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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