(57)【要約】  細胞活性機能を向上させることができ、細胞活性を失活させにくく、長期間の培養に使用することができる細胞培養用基材を提供する。  本発明の細胞培養用基材は、疎水性シリカエアロゲルを含む。本発明の細胞培養用基材の製造方法は、第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応することで疎水性シリカエアロゲルを製造する工程を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性シリカエアロゲルを含む、細胞培養用基材。
【請求項２】
前記疎水性シリカエアロゲルは、ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有する、請求項１に記載の細胞培養用基材。
【請求項３】
前記炭化水素基がアルキル基である、請求項１又は２に記載の細胞培養用基材。
【請求項４】
細胞培養用基材の製造方法であって、
第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応することにより疎水性シリカエアロゲルを製造する工程を備える、細胞培養用基材の製造方法。
【請求項５】
前記第１の加水分解性シラン化合物は、三官能アルコキシシランであり、
前記第２の加水分解性シラン化合物は、二官能アルコキシシランであり、
前記三官能アルコキシシラン１モルあたり、前記二官能アルコキシシランが０．００５モル以上、０．５モル以下含まれる、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養用基材を使用して細胞を培養する、細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養するために使用できる細胞培養用基材及びその製造方法、並びに細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療に対する関心が高まるとともに、細胞培養を行うための基材に注目が集まっており、種々の細胞培養用基材が開発されている。【０００３】
細胞を培養するための基材は、培養における細胞数の増加、細胞活性特性、細胞の分化等に大きな影響をおよぼしうるものであることが知られている。この観点から、最近では、例えば細胞培養用基材として、三次元構造化させた材料を適用する検討も精力的に行われている。具体的に特許文献１には、基材の表面に凹凸構造を設けた細胞培養用基材が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２４９５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来の細胞培養用基材、例えば、ティッシュカルチャー等を使用した細胞の培養においては、細胞活性機能（例えば、肝細胞のアルブミン分泌活性）の低下及び消失がみられることから、基材としてのさらなる機能性の向上が望まれていた。特に、細胞培養を通じて創薬や肝機能研究を行う場合、細胞が失活せず、細胞活性を維持することが望まれているところ、従来の細胞培養用基材を用いた細胞培養においては、長期間にわたって細胞活性を維持することが難しいものであった。【０００６】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、細胞活性機能を向上させることができ、細胞活性を失活させにくく、細胞を長期間にわたって培養するための基材として適している細胞培養用基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、特定構造を有するシリカエアロゲルを基材とすることにより、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、例えば、以下の項に記載の発明を包含する。
項１
疎水性シリカエアロゲルを含む、細胞培養用基材。
項２
前記疎水性シリカエアロゲルは、ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有する、項１に記載の細胞培養用基材。
項３
前記炭化水素基がアルキル基である、項１又は２に記載の細胞培養用基材。
項４
細胞培養用基材の製造方法であって、
第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応することにより疎水性シリカエアロゲルを製造する工程を備える、細胞培養用基材の製造方法。
項５
前記第１の加水分解性シラン化合物は、三官能アルコキシシランであり、
前記第２の加水分解性シラン化合物は、二官能アルコキシシランであり、
前記三官能アルコキシシラン１モルあたり、前記二官能アルコキシシランが０．００５モル以上、０．５モル以下含まれる、項４に記載の製造方法。
項６
項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養用基材を使用して細胞を培養する、細胞の培養方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養用基材は、細胞活性機能を向上させることができ、細胞活性を失活させにくく、細胞を長期間にわたって培養するための基材として適している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（培養３日後）における細胞数変化（ａ）及びアルブミン分泌活性（ｂ）の結果を示すグラフである。
【図２】試験例２−１及び２−２の細胞培養試験（培養５日後及び１０日後）の細胞数変化（ａ）及びアルブミン分泌活性（ｂ）の結果を示すグラフである。
【図３】疎水性エアロゲル及びＴＣＰそれぞれを用いて細胞を培養した場合の細胞接着状態の観察結果を示す微走査顕微鏡の画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１２】
１．細胞培養用基材
本発明の細胞培養用基材は、疎水性シリカエアロゲルを含む。本発明の細胞培養用基材は、細胞を培養するための基材として使用される部材である。本発明の細胞培養用基材は、疎水性シリカエアロゲルを含むことから、細胞活性機能を向上させることができ、細胞活性を失活させにくく、長期間の培養に使用することができる。
【００１３】
シリカエアロゲルは、−Ｏ−Ｓｉ−Ｏ−の繰り返し単位を基本構造として有する材料である。
【００１４】
細胞培養用基材に含まれる疎水性シリカエアロゲルは、例えば、四官能アルコキシシランのみを含むアルコキシシランから製造されたシリカエアロゲルよりも疎水性が高いことを意味する。好ましくは、疎水性シリカエアロゲルは、水に溶解しないことである。
【００１５】
疎水性シリカエアロゲル中の炭素の含有量は、例えば８質量％以上であり、好ましくは８．８１質量％以上である。当該炭素の含有量が８質量％以上であれば、高い疎水性を有することができる。
【００１６】
疎水性シリカエアロゲルは、ケイ素原子に炭化水素基が結合した構造を有することが好ましい。この場合、疎水性シリカエアロゲルの疎水性がより高まるので、細胞培養用基材は、細胞活性機能をより向上させることができ、細胞活性をより失活させにくく、長期間の培養に使用することができる。
【００１７】
炭化水素基の種類は特に限定されない。炭化水素基は、飽和炭化水素基及び不飽和炭化水素基のいずれであってもよい。また、炭化水素基は、直鎖構造、分岐構造及び環状構造のいずれであってもよい。
【００１８】
炭化水素基としては、例えば、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数１〜２０のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基等を挙げることができる。さらに具体的な炭化水素基は、メチル基、エチル基、直鎖又は分岐のプロピル基、直鎖又は分岐のブチル基、フェニル基等を挙げることができる。
【００１９】
炭化水素基は、アルキル基であることが好ましい。この場合、細胞培養用基材は、細胞活性機能をより向上させることができ、細胞活性をより失活させにくく、細胞を長期間にわたって培養に使用することができる。また、炭化水素基がアルキル基である場合、疎水性シリカエアロゲルの構造が安定となりやすく、また、製造も容易である。特に好ましいアルキル基は、炭素数１〜３であり、この場合、疎水性シリカエアロゲルの構造を制御しやすく、容易に目的の疎水性シリカエアロゲルを製造できる。
【００２０】
疎水性シリカエアロゲルの形状は特に限定されず、例えば、球状粒子、楕円粒子、不定形粒子、繊維状、棒状、針状等の種々の形状を挙げることができる。疎水性シリカエアロゲルが粒子状である場合は、例えば、多数の粒子の集合体とすることができ、このような集合体としては、多孔質状の集合体、繊維状の集合体、網目構造を有する集合体等が挙げられる。
【００２１】
疎水性シリカエアロゲルの形態は特に限定されず、例えば、粉末状、バルク状、板状、スライム状、膜状、シート状等である。
【００２２】
疎水性シリカエアロゲルの製造方法は特に限定されない。例えば、従来から公知のシリカエアロゲルの製造方法に準じて、疎水性シリカエアロゲルを製造することができる。
【００２３】
例えば、疎水性シリカエアロゲルは、第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応する工程を備える製造方法によって製造することができる。以下、この工程を「工程Ａ」と表記する。
【００２４】
なお、加水分解性シラン化合物とは、ケイ素原子を有し、加水分解反応が可能な化合物であることを意味し、例えば、加水分解性シラン化合物としては、アルコキシシランを挙げることができる。
【００２５】
工程Ａで使用できる第１の加水分解性シラン化合物は、三官能アルコキシシランを挙げることができる。
【００２６】
三官能アルコキシシランとしては、例えば、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、ｎ−プロピルトリメトキシシラン、ｎ−プロピルトリエトキシシラン、ｉ−プロピルトリメトキシシラン、ｉ−プロピルトリエトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン等が挙げられる。これらは１種単独又は２種以上を併用することができる。
【００２７】
工程Ａで使用できる第２の加水分解性シラン化合物は、二官能アルコキシシランを挙げることができる。二官能アルコキシシランとしては、例えば、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、ジフェニルジメトキシシラン、メチルフェニルジエトキシシラン、メチルフェニルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、ジエチルジメトキシシラン等が挙げられる。これらは１種単独又は２種以上を併用することができる。
【００２８】
工程Ａで使用する原料には、前記第１の加水分解性シラン化合物及び前記第２の加水分解性シラン化合物以外の加水分解性シラン化合物も含むことができる。そのような加水分解性シラン化合物として、例えば、四官能アルコキシシランを挙げることができる。
【００２９】
四官能アルコキシシランとしては、例えば、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等が挙げられる。また、その他のアルコシシシランとして、ビストリメチルシリルメタン、ビストリメチルシリルエタン、ビストリメチルシリルヘキサン、ビニルトリメトキシシランなどを用いることもできる。これらは１種単独又は２種以上を併用することができる。
【００３０】
なお、アルコキシシランの部分加水分解物を第１の加水分解性シラン化合物及び第２の加水分解性シラン化合物として使用することもできる。
【００３１】
工程Ａで使用する原料には、異なる二種以上の第１の加水分解性シラン化合物が含まれていてもよい。また、工程Ａで使用する原料には、異なる二種以上の第２の加水分解性シラン化合物が含まれていてもよい。
【００３２】
工程Ａで使用する原料は、第１の加水分解性シラン化合物が三官能アルコキシシランであり、前記第２の加水分解性シラン化合物が二官能アルコキシシランである組み合わせであることが好ましい。この組み合わせにおいて、三官能アルコキシシラン１モルあたり、二官能アルコキシシランの含有量は、例えば、０．００１モル以上であり、好ましくは０．００５モル以上であり、より好ましくは０．０１モル以上であり、また、例えば、０．５モル以下であり、好ましくは０．１５モル以下である。この場合、得られる細胞培養用基材は、細胞培養において細胞活性機能をより向上させることができ、細胞活性をより失活させにくく、長期間の細胞の培養に好適に使用することができる。また、三官能アルコキシシラン１モルあたり、二官能アルコキシシランの含有量が上記上限及び下限である場合は、エアロゲルがより疎水性となりやすく、しかも透明性も損なわれにくい。
【００３３】
なお、工程Ａで使用する原料は、第１の加水分解性シラン化合物及び第２の加水分解性シラン化合物以外に他の材料を含むこともできる。
【００３４】
工程Ａの加水分解反応の条件は特に限定されず、例えば、公知のアルコキシシランを加水分解反応させる条件と同様の条件を採用することができる。具体的には、加水分解反応として、ゾル−ゲル法等を採用することができる。
【００３５】
ゾル−ゲル法は、第１の加水分解性シラン化合物及び第２の加水分解性シラン化合物を含む原料を溶媒の存在下で加水分解及び縮重合させ、これにより、シリカ骨格からなる湿潤状態のゲル状化合物を得る方法である。
【００３６】
ゾル−ゲル法で使用する溶媒は、特に限定されず、公知のゾル−ゲル法で使用される溶媒を選択することができる。この溶媒としては、例えば、水、メタノール、エタノール等のアルコール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン等が挙げられる。溶媒は二種以上の混合物であってもよく、また、水と有機溶媒の混合物であってもよい。
【００３７】
ゾル−ゲル法は、酸の存在下で行うこともできる。酸としては、例えば、塩酸、クエン酸、酢酸、硝酸、硫酸等が挙げられる。
【００３８】
ゾル−ゲル法は、塩基の存在下で行うこともできる。塩基としては、例えば、アンモニア、アミン化合物、ピペリジン、尿素等が挙げられる。
【００３９】
ゾル−ゲル法は、酸及び塩基の両方の存在下で行うこともできる。酸及び塩基は、例えば、水溶液で使用することができる。
【００４０】
ゾル−ゲル法は、その他、適宜の成分の存在下で行うことができる。適宜の成分としては、例えば、公知の界面活性剤、分散安定剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤等を挙げることができる。界面活性剤は、アニオン性、カチオン性及びノニオン性のいずれを使用することもできる。
【００４１】
ゾル−ゲル法における反応温度及び反応時間も特に限定されず、例えば、公知と同様の条件とすることができる。また、ゾル−ゲル法における原料と溶媒の使用割合、任意の成分の使用量等も特に限定されず、公知のシリカエアロゲル粒子を得るための反応と同様の条件を選択することができる。
【００４２】
ゾル−ゲル法で得られたゲルは、必要に応じて熟成及び溶媒置換を行うことができる。熟成条件は特に限定されず、公知の条件と同様とすることができる。
【００４３】
溶媒置換の方法も特に限定されず、例えば、公知の方法で溶媒置換を行うことができる。溶媒置換では、例えば、ゾル−ゲル法で得られたゲル中の溶媒を、後記する超臨界乾燥が可能である溶媒に置換することが好ましい。後記の超臨界乾燥が可能である溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール；ベンゼン、トルエン等の芳香族化合物、その他、炭化水素溶媒、アミド溶媒、ケトン溶媒、エステル溶媒を挙げることができる。溶媒置換は、異なる２種以上の溶媒を使用し、それぞれの溶媒に順次置換することもできる。溶媒置換は、複数回行うこともできる。
【００４４】
ゾル−ゲル法で得られたゲルを溶媒置換した後は、溶媒を乾燥させることにより、疎水性シリカエアロゲルが得られる。溶媒を乾燥させる方法は特に限定されず、例えば、超臨界乾燥法を採用できる。
【００４５】
超臨界乾燥法の条件は特に限定されず、公知の超臨界乾燥法を採用することができる。例えば、公知の超臨界二酸化炭素を使用した超臨界乾燥法を採用することができる。
【００４６】
超臨界乾燥を行う前に、ゾル−ゲル法で得られたゲルの粉砕処理等を行うことができる。あるいは、超臨界乾燥を行った後に、ゾル−ゲル法で得られたゲルの粉砕処理等を行うことができる。
【００４７】
以上のように、工程Ａを含み、必要に応じて、溶媒置換を行う工程及び超臨界乾燥法等による溶媒の乾燥を行う工程を備える製造方法によって、細胞培養用基材に適した疎水性シリカエアロゲルを得ることができる。
【００４８】
本発明の細胞培養用基材は、本発明の効果が阻害されない限りは、他の材料を含むこともできる。本発明の細胞培養用基材は、疎水性シリカエアロゲルのみで形成することもできる。
【００４９】
本発明の細胞培養用基材は、特にその形状は限定されず、公知の基材と同様の形状とすることができる。
【００５０】
本発明の細胞培養用基材の使用方法は特に限定されず、また、本発明の細胞培養用基材を使用した細胞の培養方法も特に限定されない。例えば、本発明の細胞培養用基材に対して、公知の方法により細胞を含む培地を播種することで細胞を培養することができる。
【００５１】
本発明の細胞培養用基材に加工処理（例えば、成形処理、加熱処理、表面処理等）を施すこともできる。例えば、表面処理等の方法は特に限定されず、公知の培地用基材に対して行われている表面処理を広く採用することができる。例えば、細胞培養用基材表面にはコラーゲンがコーティング処理され得る。
【００５２】
本発明の細胞培養用基材は、例えば、細胞の培養を行うための容器に収容又は固着された状態であってもよい。
【００５３】
一般的にシリカエアロゲルは親水性が強いため、何ら疎水化処理がされていないシリカエアロゲルを細胞培養用基材として使用すると、水に溶解する等の減少が生じるため、細胞培養用基材として不適である。
【００５４】
これに対し、本発明の細胞培養用基材は、疎水性エアロゲルを含むことから、細胞培養用基材の水への溶解が起こりにくく、細胞培養用の基材として好適である。特に、本発明の細胞培養用基材を使用して細胞培養を行うことで、細胞活性機能を向上させることができ、しかも、細胞活性を失活させにくい。そのため、本発明の細胞培養用基材は、長期間にわたって細胞培養のための使用に適している。
【００５５】
特に、疎水性エアロゲルを細胞培養用基材として用いることにより、細胞の過度の伸展を抑制することができ、細胞を立体的に成長させることができる。従って、本発明の細胞培養用基材は、長期間の細胞培養を行う場合に特に適した方法である。細胞培養を通じて創薬や肝機能研究を行う場合、細胞が失活せず、活性を維持することが望まれることから、本発明は、そのようなニーズに好適である。
【００５６】
本発明の細胞培養用基材を使用して細胞培養を行う場合、培養液の種類は特に限定されず、例えば、公知の培養液と同様とすることができる。培養液には、その他、公知の成分、例えば、糖分、脂質、アミノ酸やミネラル、ビタミン等の細胞培養のための栄養成分、細胞培養の増殖因子となる成分、あるいは、ｐＨ調整剤等が含まれていてもよい。
【００５７】
本発明の細胞培養用基材を使用して作製する培地では、各種の細胞を培養することができる。細胞は、幹細胞、前駆細胞及び機能性細胞のいずれでもよい。ここでの機能性細胞とは、肝細胞等、分化した細胞を意味する。細胞は、一種類のみであってもよく、二種類以上でもよい。
【００５８】
本発明の細胞培養用基材を用いて、細胞培養用のキットを製作することもできる。このようなキットは、細胞を培養するための使用に好適である。
【００５９】
２．細胞培養用基材の製造方法
本発明の細胞培養用基材の製造方法は、特に限定されない。前述の疎水性シリカエアロゲルの製造方法と同様の方法で疎水性シリカエアロゲルを製造し、この疎水性シリカエアロゲルを用いて細胞培養用基材を得ることができる。
【００６０】
本発明の細胞培養用基材の製造方法は、例えば、第１の加水分解性シラン化合物と、該第１の加水分解性シラン化合物以外である第２の加水分解性シラン化合物とを含む原料を加水分解反応することで疎水性シリカエアロゲルを製造する工程を備えることができる。当該工程は、前記「工程Ａ」と同様であり、具体的態様も同様である。また、工程Ａの後、必要に応じて備えられる前記溶媒置換及び溶媒の乾燥方法も前述と同様である。
【００６１】
得られた疎水性シリカエアロゲルを用いて、本発明の細胞培養用基材を製造することができる。例えば、疎水性シリカエアロゲルをそのまま細胞培養用基材とすることができ、また、必要に応じて、成形処理、コーティング処理等を施すことで、細胞培養用基材を得ることもできる。
【００６２】
細胞培養用基材は、例えば、細胞を培養するために使用する容器中で製造することもできる。例えば、細胞を培養するために使用する容器中で、前記工程Ａによって疎水性シリカエアロゲルを製造することにより、容器中に疎水性シリカエアロゲルを含む細胞培養用基材を形成することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の態様に限定されるものではない。【００６４】
（実施例１）
細胞培養用のシャーレに、界面活性剤として臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）０．８ｇと、尿素６．０ｇとを、０．０５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液２０ｇに溶解させて、３０分間撹拌し混合溶液Ａを得た。【００６５】
一方、第１の加水分解性シラン化合物としてトリメトキシメチルシラン（ＭＴＭＳ、関東化学製試薬）９．６１ｇを、第２の加水分解性シラン化合物としてジメトキリジメチルシラン０．５２ｇを混合溶液Ａに溶解させて、３０分間撹拌することで、加水分解反応を行った。つまり、三官能アルコキシシラン１モルあたり、二官能アルコキシシランが０．０５モル含まれるようにした。その後、シャーレ内を６０℃に保持し、静置することで内容物をゲル化させ、続けて９６時間静置することによりゲルを熟成させた。このゲルをシャーレごと５倍体積量のエタノールに移し、６時間保持した後、エタノールを除去し、さらに新しいエタノールを加えて溶媒交換を行った。この溶媒交換を全３回繰り返した後、ゲルを２−プロパノールに移し、同様に２−プロパノールでの溶媒交換を６時間ごとに行った。これにより、ゲル中の溶媒が２−プロパノールで溶媒置換されたゲル化物を、シャーレ内に得た。【００６６】
このゲル化物をシャーレごと耐圧容器に収容し、二酸化炭素を供給して、耐圧容器を４０℃、９ＭＰａとして３０分保持することで、ゲル化物内の２−プロパノールを二酸化炭素に置換した。その後、耐圧容器内を二酸化炭素の超臨界条件である８０℃、１４ＭＰａにし、超臨界乾燥を約２４時間行って、シャーレ内に目的の疎水性シリカエアロゲルが形成され、これを細胞培養用基材として得た。【００６７】
（試験例１−１）
上記実施例１で得られたシャーレ中の疎水性エアロゲルに対し、前処理として、１５０℃で３時間、乾熱滅菌を行った後、２時間のＵＶ照射を行うことで滅菌処理を施した。次いで、シャーレ中の疎水性エアロゲルに対し、０．３ｍｇ／ｍＬのＩ型コラーゲンを表面にコーティングし、これを基材とした。この基材を用いてヒト肝芽腫細胞（ＨｅｐＧ２）の培養試験を行った。
・培養条件：３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下（標準的な培養条件とした）
・培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（培養液）
・培地量：３ｍＬ
・培養期間：３日間（１日目に前記培地交換を行った）
・細胞播種密度：２×１０５個／ディッシュ
ディッシュ（シャーレ）の直径は３．５ｃｍとした。【００６８】
（試験例１−２）
疎水性エアロゲル基材を使用せずに、ティッシュカルチャープレート（ＴＣＰ；Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ）を基材として用いたこと以外は試験例１−１と同様の方法で培養試験を行った。【００６９】
図１は、試験例１−１及び１−２の細胞培養試験（ただし、いずれも培養３日後）の結果であり、（ａ）は細胞数変化、（ｂ）はアルブミン分泌活性の結果を示すグラフである。【００７０】
アルブミン分泌活性は、培地中に分泌されたアルブミン量を酵素標識免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により定量し、単位細胞数あたりのアルブミン分泌速度に換算して計測した。細胞数の測定は、ＤＮＡ−ＤＡＰＩ（４，６−ｄｉａｍｉｎｏｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、和光純薬工業社製）蛍光法を用いた。すなわち、一定細胞から抽出したＤＮＡとＤＮＡ−ＤＡＰＩの蛍光強度間の検量線を作製し、この関係をもとに培養した細胞の細胞数を算出した。また、この細胞数をもとに、上記の細胞当りのアルブミン分泌速度を算出した。【００７１】
図１（ａ）において、試験例１−１（疎水性エアロゲル）及び１−２（ＴＣＰ）の対比から、両者間で細胞の増殖には有意差は見られず、疎水性エアロゲルを基材として使用しても、細胞の増殖には何ら影響がないことがわかる。一方、図１（ｂ）から、アルブミン分泌活性については、疎水性エアロゲルを基材として使用した場合はＴＣＰに比べて有意に向上することがわかった。【００７２】
（試験例２−１）
試験例１−１で得た培地用の基材を用いてラット肝細胞の培養試験を行った。
・培養条件：３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下（標準的な培養条件とした）
・培地：ＨＤＭ（培養液）
・培地量：３ｍＬ
・培養期間：１０日間（２日毎に前記培地交換を行った）
・細胞播種密度：５×１０５個／ディッシュ
ディッシュ（シャーレ）の直径は３．５ｃｍとした。【００７３】
（試験例２−２）
疎水性エアロゲル基材を使用せずに、ティッシュカルチャープレート（ＴＣＰ）を基材として用いたこと以外は試験例２−１と同様の方法で培養試験を行った。【００７４】
図２は、試験例２−１及び２−２の細胞培養試験（培養５日後及び１０日後）の結果であり、（ａ）は細胞数変化、（ｂ）はアルブミン分泌活性の結果を示すグラフである。【００７５】
図２において、試験例２−１（疎水性エアロゲル）及び２−２（ＴＣＰ）の対比から、疎水性エアロゲルを基材とする培養では、培養前の播種数と比較して細胞数の減少が見られるものの、その維持性（つまり、経日による減少数の傾向）には差は見られなかった。疎水性エアロゲルを基材として使用しても、細胞の増殖には何ら影響がないことがわかる。【００７６】
一方、培養日数を５日及び１０日とすることにより、疎水性エアロゲルとＴＣＰとの間に、アルブミン分泌活性には顕著な差が見られ、特に、疎水性エアロゲルを有する基材は、長期間の細胞培養の使用に適していることが確認された。【００７７】
図３は、疎水性エアロゲル及びＴＣＰそれぞれを用いて培養した場合の細胞接着状態の観察結果を示す位相差顕微鏡の画像で、培養１，３、５及び１０日目における細胞接着状態の観察結果を示している（上段４枚がＴＣＰ、下段４枚が疎水性エアロゲルを用いた培養）。【００７８】
図３の画像から、疎水性エアロゲルを基材とする場合では細胞の進展性が弱く、凝集化を誘起していると考えられる。つまり、疎水性エアロゲルを基材として用いることにより、細胞の過度の伸展が抑制され、細胞を立体的に成長させることができることを示している。このことから、疎水性エアロゲルを有する基材は、長期間の細胞培養の使用に適しているといえる。【００７９】
以上の結果から、本発明の疎水性エアロゲルを含む細胞培養用基材は、細胞培養において、細胞活性機能を向上させることができ、細胞活性を失活させにくいことが実証され、長期間の細胞培養に好適に使用することができる。
【図１】
2018181760.tif 000002
【図２】
2018181760.tif 000003
【図３】
2018181760.tif 000004
【国際調査報告】
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