(57)【要約】  本発明は、標的糖鎖含有抗原結合後に十分な洗浄が可能で、品質の安定した、高感度でかつ安価なレクチン固定化基材（レクチンプレートなど）を提供すること、及びそのための基材へのレクチン固定化方法を提供することを目的とする。  本発明は、標的糖鎖を認識するレクチンのＮ末端側もしくはＣ末端側に、PSタグなどの基材表面に吸着機能を有するペプチドを融合させたレクチン−ペプチド融合体を、前記ペプチドの側で基材に固定化する方法、及び当該方法で製造されたレクチン固定化基材を提供する。当該レクチン固定化基材を用いることで、標的糖鎖含有抗原を高感度に、バラツキ無く測定でき、かつ標的糖鎖を含有する細胞などの分離（濃縮、回収）も可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に吸着機能を有するペプチドを、標的糖鎖を認識するレクチンのＮ末端側もしくはＣ末端側に有する、レクチン−ペプチド融合体。
【請求項２】
当該ペプチドが、PSペプチド、PMMA/PCペプチド、SiNペプチド、及びPDMSペプチドのいずれかのペプチドからなる群から選択されたペプチドである、請求項１に記載の融合体。
【請求項３】
レクチンが、rACG、rPSL1a、rLSLN、rDiscoidin I、rDiscoidin II、rCGL2、rSRL、rF17AG、rGRFT、rOrysata、rCalsepa、rBC2LA、rAAL、rPAIIL、rRSIIL、rPPL、rCNL、rPAIL、rABA、rMOA、rPALa、rGal3CS、rMpL、rAAL2、rBambL、rPVLのいずれかのリコンビナントレクチンからなる群から選択されたレクチンである、請求項１又は２に記載の融合体。
【請求項４】
ペプチドが、配列番号１〜２３に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合体。
【請求項５】
ペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するPSIタグ、又は配列番号９のアミノ酸配列を有するPSSタグを含むPSペプチドである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の融合体。
【請求項６】
前記レクチン−ペプチド融合体を構成するレクチン及び／又はペプチドのアミノ酸配列が、それぞれの全アミノ酸配列に対し10％未満のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合体。
【請求項７】
請求項６に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、レクチン−ペプチド融合体遺伝子。
【請求項８】
請求項７に記載のレクチン−ペプチド融合体遺伝子を含み、レクチン−ペプチド融合体を発現可能なベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、レクチン−ペプチド融合体中のペプチドの側が基材に固定化されていることを特徴とする、固定化レクチン−ペプチド融合体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の、レクチン−ペプチド融合体が固定化された基材。
【請求項１１】
標的糖鎖含有抗原を含む試料と請求項１０に記載の基材とを接触させる工程を含む、標的糖鎖含有抗原の測定又は単離方法。
【請求項１２】
前記標的糖鎖含有抗原を認識する抗体をオーバレイする工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的糖鎖含有抗原を認識する抗体をオーバレイする工程において、レクチン−ペプチド融合体が固定化された基材の希釈液中、及び／又は抗体用希釈液中にブロッキング剤を含有させることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的糖鎖含有抗原が、被検試料由来の夾雑物を含有する溶液中に含まれる糖鎖含有抗原である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的糖鎖を細胞表面に有する細胞又は標的糖鎖を有する複合糖質を含む試料を、請求項１０に記載の基材に吸着させる工程、及び標的糖鎖含有物を回収する工程を含む、標的糖鎖を有する細胞又は複合糖質の濃縮又は単離方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の基材を含む、標的糖鎖含有抗原を測定又は単離するための、キット又は装置。
【請求項１７】
前記標的糖鎖含有抗原を認識する抗体をさらに含む、請求項１６に記載のキット又は装置。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のレクチン−ペプチド融合体を基材に接触させる工程を含む、レクチン−ペプチド融合体が固定化された基材の製造方法。
【請求項１９】
上記接触させる工程が、緩衝液中で行われる、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
上記緩衝液のpHが、6.5〜7.5である、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
上記緩衝液の塩濃度が、0.10〜0.20Mである、請求項１９又は２０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチンが固定化された基材、及び基材へのレクチンの固定化方法、並びに当該基材を用いた標的糖鎖、標的複合糖質又は標的複合糖質を有する細胞、細胞外小胞もしくはウイルスなど（以下、まとめて「標的糖鎖含有抗原」ともいう。）の検出、測定又は分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の細胞の表面は糖鎖で覆われており、糖鎖を介して他の細胞との情報のやりとりを行っていると考えられ、細胞表面の糖鎖構造は、生物の発生段階、生命活動、病原体感染、がん化など様々な場面での細胞の状態変化に応じて変化する。そのため、細胞表面の糖鎖を解析することで、細胞の分化の程度や、がんや病原体の罹患の有無や疾患重篤度などを知ることができる。また、がんや各種疾患への医薬品開発においても、治療のターゲットとして、又は副作用の原因解明などのために糖鎖抗原の解析は重要である。
近年、特定の標的糖鎖を含有する細胞、細胞外小胞、ウイルス表面上の複合糖質又は血液など体液中に分泌された複合糖質をターゲットとした、レクチン-レクチンサンドイッチ法やレクチン-抗体サンドイッチ法の研究開発が活発化してきている。【０００３】
特に最近では疾患の病状の変化に応じて、特定の糖タンパク質上の糖鎖が変化する現象に着目し、これらサンドイッチアッセイ法によりその糖鎖含有量の変化を定量化する技術が多数提案されている。例えば、（独）産業技術総合研究所が開発した、AAL及び／又はWFAレクチン結合性糖鎖含有セルロプラスミンからなる上皮性卵巣がん表面マーカーの検出（特許第5906447号）、PVL及び／又はSSAレクチン結合性糖鎖含有トランスフェリンからなる特発性正常圧水頭症の体液による診断（特許第5696273号）、WFA結合性糖タンパク質肝内胆管がん表面マーカーの検出（特許第5787389号）、WFA,BPLなどのレクチン結合性M2BP糖タンパク質からなる肝疾患病態指標糖鎖マーカーの検出（特許第5031928号）などの各種疾患の診断技術が挙げられる。【０００４】
また、本発明者らは、以前からBC2LCNが、iPS細胞など幹細胞表面の未分化糖鎖マーカー「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」及び／又は「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」を特異的に認識できるレクチンであることを見いだしていたが、さらに、その培養上清においてもポドカリキシンが含有する当該BC2LCN特異的糖鎖を測定することで幹細胞の未分化度が判定できることを見いだし、BC2LCNレクチンプローブを用いた幹細胞の培養上清中での未分化度判定用のレクチン-レクチンサンドイッチ法及びレクチン-抗体サンドイッチELISA法を開発している（特許文献１）。
同時に、本発明者らは、BC2LCNの未分化糖鎖マーカー特異性を利用し、BC2LCN固定化担体を用いた幹細胞濃縮技術及び生体移植材料など分化処理後の幹細胞の培養液から、未分化細胞を分離除去する技術も開発した（特許文献２）。【０００５】
このように、レクチンと糖鎖との結合量を正確にかつ簡便に測定するためのレクチン-レクチン又はレクチン-抗体サンドイッチアッセイ技術の重要性はますます増大している。
また、抗体では既に実用化されている各種のがんや病原体などの標的抗原マーカーを簡便に検査、診断できるイムノアッセイ用抗体プレートのような扱いやすいレクチンプレートが提供できれば、医療現場での診断の迅速性及び的確性が大きく向上することとなる。
しかしながら、一般にレクチンと糖鎖との相互作用は極めて低く、抗原抗体反応の結合常数より100倍から10,000倍も小さいとされている（一般的に、抗原抗体反応の結合定数は106-9M-1とされているのに対し、レクチンと糖鎖間の結合定数は104-7M-1とされている）。したがって、標的糖鎖抗原と結合したレクチンに対して十分な洗浄を施すことができない場合が多く、一般的なELISAなどの蛍光検出機器やイムノアッセイ用検出機器ではバックグラウンドが高く正確な測定が難しかった。（独）産業技術総合研究所が開発したエバネッセント波励起型蛍光検出法を利用したスキャナーを用いれば、洗浄操作が不要であり、試料中の糖鎖とレクチン間の弱い相互作用も検出できるため、正確な定量も可能であるが、装置が大きく、高価なこともあり、医療、研究の現場でまだ一般的に普及している測定機器とはなってはいない。しかも、目視でも直ちに判定ができるような簡便な診断用のレクチンプレートの測定には適さない。【０００６】
レクチンをプレートなどの基材表面に固定化する方法としては、プレートに直接固定化する直接法もあるが、レクチンをビオチン化して、又は市販のビオチン化レクチンをアビジンコートプレートに固定化するビオチン−アビジン間接法が、感度が高いため、広く用いられている。しかしながら、ビオチン化レクチンプレートの場合は、Lotごとにばらつきが出て品質が安定しない不具合があった。
したがって、各種の糖鎖マーカーとなる糖鎖抗原を認識するレクチンを固定化したレクチンプレートであって、広くレクチン-レクチン又はレクチン-抗体サンドイッチアッセイ法に適用可能な、品質の安定した高感度のレクチンプレートを提供することが強く望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０６５３０２
【特許文献２】ＷＯ２０１３／１２８９１４
【特許文献３】特許第５５５３３３６号公報
【特許文献４】特許第５６５５２５４号公報
【特許文献５】ＷＯ２０１３／１２２０６１
【特許文献６】ＷＯ２０１６／１２９６９５
【特許文献７】特許第５８５１３９１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kumada,Y.,et al.,Biotechnol.Prog.,22(2),401-5(2006)
【非特許文献２】Kumada,Y.,et al.,J.Immunol.Methods.,385,15-22(2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、抗体プレートと同様に標的糖鎖含有抗原結合後の十分な洗浄が可能で、品質の安定した、高感度でかつ安価なレクチンプレートを提供すること、及び当該レクチンプレートを製造するためのレクチン固定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、以前、一本鎖抗体など片側に標的認識部位を有するタンパク質プローブの担体表面での配向性をそろえ、高密度化を図るための固定化技術として、各種固定化用担体それぞれに対し特異的な吸着能を有するペプチド群を開発した（特許文献３〜６）。
特に一本鎖抗体などの低分子抗体においては、当該方法により基材表面へ高密度かつ高い配向性を持たせて固定化することで、標的抗原特異的な高い親和性が発揮できている（非特許文献１、特許文献７）。
なお、本明細書では、特許文献３に記載の主として親水性ポリスチレン樹脂に親和性を有するペプチド群を「PSタグ」、特許文献４に記載のポリカーボネート及び／又はポリメタクリル酸メチル樹脂親和性ペプチド群を「PMMA/PCタグ」、特許文献５に記載の窒化ケイ素（Si3N4）親和性ペプチド群を「SiNタグ」、そして特許文献６に記載のポリジメチルシロキサン（PDMS：poly dimethylsiloxane）親和性ペプチド群を「PDMSタグ」と呼ぶ。
また、これらのタグ遺伝子とレクチン遺伝子との結合方法、及び発現ベクターによる宿主細胞からのタグ化レクチンの発現方法は同一であり、固相への吸着方法もほぼ共通しているため、主として「PSタグ」について述べる。すなわち、本発明で「PSタグ」というとき、「PMMA/PCタグ」、「SiNタグ」及び「PDMSタグ」も含めた本発明の「レクチンの固定化用タグ」全般を指すこともある。【００１１】
本発明者らが品質の安定した、高感度レクチンプレートの製造について鋭意研究する中で、本発明者らの開発したこれらペプチド群を固定化用タグとして用いることを思いついた。
しかしながら、レクチンの場合は一本鎖抗体とは異なり、嵩高で複雑な立体構造を有するタンパク質であって表面の電荷状態も多様であるため、どの程度高密度に固定化できるか否かは不明であり、またそもそも高密度化が有効か否かも不明であった。さらに、レクチンは通常多量体化によって標的認識部位を複数有しているため配向制御により親和性が向上するか否かも不明であった。【００１２】
本発明者は、まずレクチンとして、未分化糖鎖マーカーを認識するBC2LCN（配列番号２４）を選択し、固定化用タグ及び固定化用担体として、特許文献３などに記載の典型的なPSタグ及び親和性ポリスチレンプレートとの組合せを検討した。PSタグとしては、PSIタグ（RIIIRRIRR：配列番号２）及びPSSタグ（RSSSRRSRR：配列番号９）を用い、遺伝子組換え技術を利用してBC2LCNレクチンのN末側又はC末側にPSIタグ又はPSSタグが結合するような4種類のBC2LCN−PSタグを製造した。
その結果、BC2LCNレクチンの場合、C末側にPSSタグが結合したBC2LCN−PSSタグの収量が最も高かった。同様に他の14種類のリコンビナントレクチンに対してもC末側にPSIタグ又はPSSタグを結合するように発現させたところ、rBambLレクチン以外は全てでPSSタグ化レクチンの収量が高かったことから、リコンビナントレクチンの場合、一般的にPSタグとしては、PSSタグの有効性が高いことが示唆される。また、同時に、rBambLレクチンのように、PSSタグでは結合性は高まらないものの、PSIタグを用いれば結合性の向上が観察できる場合もあることから、PSタグにはレクチンの種類の応じたPSタグの相性があることがわかった。すなわち、固定化しようとするレクチンの種類に応じて、適宜相性の良いPSタグを選択すればよいこともわかった。【００１３】
次いで、BC2LCNレクチンのC末側をPSSタグ又はPSIタグ化して親水度が高く改変されたポリスチレンプレートに吸着させることで、高密度に配向させたBC2LCNレクチンプレートを作製したところ、均一なプレートが提供でき、十分な洗浄にも耐えられる。PSS/PSIタグ化したレクチンプレートは、ビオチン−アビジンの系での固定化に用いるプレートと比較して、プレートを事前にアビジンコートする手間やコストが不要であるメリットに加え、ロット間差が生じない均一なプレートが製造できるという顕著な効果を奏する。
得られたPSS/PSIタグ化したBC2LCNレクチンプレートをELISA法に適用し、iPS細胞培養上清中の未分化細胞糖鎖マーカーの検出を行い、従来のビオチン−アビジン結合プレートによる検出結果と比較したところ、ビオチン−アビジン結合プレートの場合と同等もしくはそれ以上の高い反応性（検出感度）及び低い検出限界値を達成できた。さらに、ブロッキング剤の選択、ブロッキング条件における最適化を行うことで、有意に検出限界値を低くすることができ、かつデータのバラツキも低くできることも確認できた。
また、ヒトiPS細胞との反応性及び検出限界値を調べたところ、高い反応性及び低い検出限界値を達成できた。【００１４】
他の複数のレクチンにおいても、PSSタグ化又はPSIタグ化により高密度の均一なレクチンプレートが提供できた。これらのレクチンについても、同様の高い反応性及び低い検出限界値が期待できる。
また、レクチンの種類によっては、PSSタグもしくはPSIタグ以外のPSタグを結合させることで固相親和性を増大させることができることも強く示唆された。そして、固相がポリカーボネート又はポリメタクリル酸メチル樹脂の場合には「PMMA/PCタグ」を、固相が窒化ケイ素（Si3N4）の場合には「SiNタグ」を、そして固相がポリジメチルシロキサンの場合には「PDMSタグ」を用いることができることも示唆される。【００１５】
以上の実験結果が得られたことで本発明を完成した。
本発明においては、各種レクチンと「PSタグ」などのタグペプチドとの融合体を、単に「レクチン−ペプチド融合体」又は「タグ化レクチン」とも称する。【００１６】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕  基材表面に吸着機能を有するペプチドを、標的糖鎖を認識するレクチンのＮ末端側もしくはＣ末端側に有する、レクチン−ペプチド融合体。
〔２〕当該ペプチドが、PSペプチド、PMMA/PCペプチド、SiNペプチド、及びPDMSペプチドのいずれかのペプチドからなる群から選択されたペプチドである、前記〔１〕に記載の融合体。
〔３〕  レクチンが、rACG、rPSL1a、rLSLN、rDiscoidin I、rDiscoidin II、rCGL2、rSRL、rF17AG、rGRFT、rOrysata、rCalsepa、rBC2LA、rAAL、rPAIIL、rRSIIL、rPPL、rCNL、rPAIL、rABA、rMOA、rPALa、rGal3CS、rMpL、rAAL2、rBambL、rPVLのいずれかのリコンビナントレクチンからなる群から選択されたレクチンである、前記〔１〕又は〔２〕に記載の融合体。
〔４〕  ペプチドが、配列番号１〜２３に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドである、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の融合体。
〔５〕  ペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するPSIタグ、又は配列番号９のアミノ酸を有するPSSタグを含むPSペプチドである、前記〔２〕〜〔４〕のいずれかに記載の融合体。
〔６〕  前記レクチン−ペプチド融合体を構成するレクチン及び／又はペプチドのアミノ酸配列が、それぞれの全アミノ酸配列に対し10％未満のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合体。
〔７〕  前記〔６〕に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、レクチン−ペプチド融合体遺伝子。
〔８〕  前記〔７〕に記載のレクチン−ペプチド融合体遺伝子を含み、レクチン−ペプチド融合体を発現可能なベクター。
〔９〕  前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の、レクチン−ペプチド融合体中のペプチドの側が基材に固定化されていることを特徴とする、固定化レクチン−ペプチド融合体。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の、レクチン−ペプチド融合体が固定化された基材。
ここで、例えばレクチンと融合するペプチドがPSIタグ、PSSタグなどのPSタグの場合、基材としては親水性表面を有する樹脂製基材、特に樹脂プレートが好ましいので、その場合は、以下のように表現できる。
前記〔５〕又は〔６〕に記載の、レクチン−PSタグ融合体が固定化された親水性表面を有する樹脂プレートからなる基材。
〔１１〕  標的糖鎖含有抗原を含む試料と前記〔１０〕に記載の基材とを接触させる工程を含む、標的糖鎖含有抗原の測定又は単離方法。
〔１２〕  前記標的糖鎖含有抗原を認識する抗体をオーバレイする工程を含む、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕  前記標的糖鎖含有抗原を認識する抗体をオーバレイする工程において、レクチン−ペプチド融合体が固定化された基材の希釈液中、及び／又は抗体希釈液中に、ブロッキング剤を含有させることを特徴とする、前記〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕  前記標的糖鎖含有抗原が、被検試料由来の夾雑物を含有する溶液中に含まれる糖鎖含有抗原である、前記〔１２〕又は〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕  標的糖鎖を細胞表面に有する細胞又は標的糖鎖を有する複合糖質を含む試料を、前記〔１０〕に記載の基材に吸着させる工程、及び標的糖鎖含有物を回収する工程を含む、標的糖鎖を有する細胞又は複合糖質の濃縮方法。
〔１６〕  前記〔１０〕に記載の基材を含む、標的糖鎖含有抗原を測定又は単離するための、キット又は装置。
〔１７〕  前記標的糖鎖含有抗原を認識する抗体をさらに含む、前記〔１６〕に記載のキット又は装置。
〔１８〕  前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載のレクチン−ペプチド融合体を基材に接触させる工程を含む、レクチン−ペプチド融合体が固定化された基材の製造方法。
〔１９〕  上記接触させる工程が、緩衝液中で行われる、前記〔１８〕に記載の製造方法。
〔２０〕  上記緩衝液のpHが、6.5〜7.5である、前記〔１９〕に記載の製造方法。
〔２１〕  上記緩衝液の塩濃度が、0.10〜0.20Mである、前記〔１９〕又は〔２０〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、高密度で配向性のそろった感度の高いレクチンプレートが安価に提供できたことで、より精度の高いレクチン-レクチンサンドイッチアッセイやレクチン−抗体サンドイッチアッセイが簡便に行えるようになった。標的糖鎖マーカーを含有する複合糖質を簡便で速やかにかつ的確に検出、測定できるので、医療現場でも癌や各種疾患の診断を簡単に高い精度で行える。
また、本発明の高密度で配向性のそろった感度の高いレクチン基材を用いることで、標的糖鎖を含有する糖タンパク質や細胞をより速やかに且つ的確に分離できる。例えば、幹細胞、又は幹細胞から分化させた各種体細胞の単離工程に利用することにより、今後の再生医療における幹細胞由来の安全な移植材料の提供にも繋がる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】PSSタグ化rBC2LCNとPSIタグ化rBC2LCNレクチンのコンストラクト
【図２】C末端にPSIもしくはPSSタグを付加したrBC2LCNを大腸菌で発現させて、フコースアガロースで精製した。C末端側にタグを付加した場合、PSIタグ化rBC2LCNでは52 mg/L、PSSタグ化rBC2LCNでは76 mg/L精製することができた。
【図３】N末端にPSIもしくはPSSタグを付加したrBC2LCNを大腸菌で発現させて、フコースアガロースで精製した。N末端側にタグを付加した場合には、PSIタグ化rBC2LCNでは4mg/L、PSSタグ化rBC2LCNは1 mg/Lしか精製できなかった。タグはレクチンのC末端側に付加するほうが収量が高いことが分かった。
【図４】rACGなど各種リコンビナントレクチンについても、そのC末端側にPSIタグ、又はPSSタグが結合されるように、組換え大腸菌で発現させ、フコースアガロースによる精製を行い、1L大腸菌培養当たりの各PSタグ化レクチンの収量を測定した。その結果、ほぼ全てのレクチンでPSIタグ化レクチンよりもPSSタグ化レクチンの方が収量は高い傾向にあることがわかった。
【図５Ａ】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rBC2LCNレクチンをPBSに懸濁し、異なる濃度で各種プレートと室温1時間反応させた。PBSTで5回洗浄後、micro BCA assay（ThemoFisher）で吸着されたレクチン量を測定した。その際、プレートとして、ELISA用のNunc、Polysorp、Maxisorpプレートと共に、PSタグ用により表面の親水性を高める処理を施したカルボ、AGCプレートの5種類を試した。その結果、PSタグを付加した場合は、吸着を観察したが、最も親水性の低いPolysorpプレートでの吸着性は良くないことがわかった。
【図５Ｂ】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rBC2LCNレクチンを0.1％Tween20を含むPBS（PBST）に懸濁し、図５Ａと同じプレートを用いて同様の操作を行った。その結果、PSタグを融合した場合でも、より親水性の高いカルボプレート及びAGCプレートのみで吸着された。
【図６】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rAGCレクチンについても、rBC2LCNレクチンの場合と同様のPBS又はPBSTに懸濁した場合の各種プレートと室温1時間反応させ、PBSTで5回洗浄した後のmicro BCA assay（ThemoFisher）による吸着量を測定した。親水性の高いカルボプレート及びAGCプレートでの効果が高かった点はrBC2LCNレクチンの場合と同様であったため、図ではカルボプレート及びAGCプレートのみの吸着量を示している。以下の各レクチンの場合も同様。
【図７】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rLSLNレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図８】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rDiscoidinIIレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図９】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rCGL2レクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１０】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rF17AGレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１１】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rGRFTレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１２】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rOrysataレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１３】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rCalsepaレクチンをのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１４】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rRSIILレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１５】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rCNLレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１６】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rGal3CレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１７】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rPSL1aレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１８】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rPALaレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図１９】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rBC2LAレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図２０】タグなし、PSIタグ化、PSSタグ化rPA1LレクチンのPBS又はPBSTに懸濁した場合のカルボプレート及びAGCプレートへの各種濃度での吸着量。
【図２１】レクチンを固定化する際の最適化条件の検討：最適pH範囲
【図２２】レクチンを固定化する際の最適化条件の検討：最適塩濃度
【図２３】PSタグ化レクチンプレートとアビジンプレートとの反応性比較（標準曲線）
【図２４】PSタグ化レクチンプレートとアビジンプレートとのバラつき度（変動定数：CVの平均値）比較
【図２５】PSタグ化レクチンプレートとアビジンプレートとの検出限界値比較
【図２６】PSI又はPSSタグ化rBC2LCNとヒトiPS細胞201B7の疎水性分画との反応性（PBS懸濁液）。
【図２７】PSI又はPSSタグ化rBC2LCNとヒトiPS細胞201B7の疎水性分画との反応性（PBST懸濁液）。
【図２８】PBSもしくはPBSTに懸濁した各種PSS/PSIタグ化レクチンと、カルボプレート上に固定化したヒトiPS細胞201B7及びヒト皮膚線維芽細胞の疎水性分画との反応性。
【図２９】ブロッキング条件の違いによるPSIタグ化レクチンプレートの反応性比較
【図３０】ブロッキング条件の違いによるPSSタグ化レクチンプレートの反応性比較
【図３１】ブロッキング条件の違いによるPSタグ化レクチンプレートの検出限界値比較
【図３２】ブロッキング剤の違いによるPSタグ化レクチンプレートの検出限界値比較（１）
【図３３】ブロッキング剤の違いによるPSタグ化レクチンプレートの検出限界値比較（２）
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．本発明で用いられるレクチンの固定化用タグ
（１−１）本発明で用いられるレクチン固定化用タグの種類
本発明で用いられるレクチン固定化用タグとしては、本発明者らが以前に開発した親水性ポリスチレン親和性ペプチド群からなる「PSタグ」（特許文献３）、ポリカーボネート及び／又はポリメタクリル酸メチル樹脂親和性ペプチド群からなる「PMMA/PCタグ」（特許文献４）、窒化ケイ素（Si3N4）親和性ペプチド群からなる「SiNタグ」（特許文献５）、及びポリジメチルシロキサン親和性ペプチド群からなる「PDMSタグ」（特許文献６）が全て含まれる。固定化用の基材にあわせて、また用いるレクチンとの相性も考慮してこれらの各種ペプチド群から適宜選択することができる。
上述のように本発明のタグ化レクチン融合タンパク質を製造する場合のレクチン遺伝子との結合方法、及び発現ベクターによる宿主細胞からのタグ化レクチンの発現方法は同一であり、固相への吸着方法もほぼ共通しているため、本明細書では、本発明の固定化用タグとして、主として「PSタグ」について述べるが「PSタグ」には限定されない。
また、本発明に用いるレクチンの固定化用タグのアミノ酸配列は、その固相（基材）吸着能を損なわない範囲内で、以下に具体的に示す各配列番号で示されるアミノ酸配列において、10％未満、好ましくは8％未満、より好ましくは5％未満であればアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。上記をアミノ酸残基数で言えば、例えば3個以下、例えば2個以下、例えば1個であれば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。その際の欠失、置換、付加又は挿入箇所は、当該タグのC末端又はN末端のみであることが好ましい。
【００２０】
（１−２）PSタグについて
本発明で用いることができるPSタグは、特許文献３に記載された、親水性の樹脂表面を有する固相表面に対して特異的吸着機能を発揮するペプチド群に含まれるペプチドを指し、特に表面の親水性を高めたポリスチレン樹脂又はポリカーボネート樹脂を固相とする場合に適している。レクチンアレイやELISA、イムノアッセイ法などの抗体とのサンドイッチアッセイ用の固相として一般的なポリスチレン樹脂又はポリカーボネート樹脂全般に適用できる。
具体的には、主としてアミノ酸配列「RXXXRRXRR（ここで、X=I、L、V、A、G、M、S又はTの一つ又は複数のアミノ酸残基の組み合わせ）：配列番号１」を含むペプチドとして示されるペプチド群であり、例えば、「RIIIRRIRR（配列番号２）」「RAIARRIRR（配列番号３）」、「RLLLRRLRR（配列番号４）」、「RVVVRRVRR（配列番号５）」、「RAAARRARR（配列番号６）」「RGGGRRGRR（配列番号７）」、「RMMMRRMRR（配列番号８）」、「RSSSRRSRR（配列番号９）」、又は「RTTTRRTRR（配列番号１０）」を含むペプチドである。
【００２１】
その他、「KGLRGWREMISL（配列番号１１）」、「ADYLSRWGSIRN（配列番号１２）」、「SRVHRAVLNGVS（配列番号１３）」、「RPPGVVRRYALG（配列番号１４）」、「VRSWEEQARVTT（配列番号１５）」「RAFIASRRIKRP（配列番号１６）」、「RESTLKGTSRAV（配列番号１７）」、「AGLRLKKAAIHR（配列番号１８）」、「SSLLRAVPEPTG（配列番号１９）」又は「RAFIASRRIRRP（配列番号２０）」を含むペプチドも同様に親水性の樹脂表面を有する固相に特異的な吸着能を有するため、本発明の「PSタグ」として同様に用いることができる。
【００２２】
これらのPSタグのうち、本発明のレクチンプレート作製用として好ましいPSタグは「RIIIRRIRR（配列番号２）」又は「RSSSRRSRR（配列番号９）」を含むペプチドであり、前者をPSIタグ、後者をPSSタグと呼ぶこともある。
また、PSタグには、レクチンの種類ごとに相性があるため、固定化しようとするレクチンの種類に応じて、適宜、相性の良いPSタグを選択して用いることが好ましい。
【００２３】
（１−３）PMMA/PCタグについて
本発明で用いることができるPMMA/PCタグは、主として固相表面がポリカーボネート又はポリメタクリル酸メチル樹脂である固相の場合に固相親和性が高い。ポリカーボネートはエンジニアリングプラスチックとして広範に使用されており、ポリメタクリル酸メチル樹脂はプロテインチップなどの基板として用いられている（特許文献４）。
具体的には、例えば、PMMAタグのうち、特許文献４でPMOMP25ペプチドと呼ばれている「配列番号２１（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これには限定されず特許文献４に示されたいずれのペプチドも使用できる。
【００２４】
（１−４）SiNタグについて
本発明で用いることができるPCタグは、固相表面が窒化ケイ素（Si3N4）である固相の場合に固相親和性が高い。窒化ケイ素は、半導体材料として広範に用いられている（特許文献５）。
具体的には、SiNタグのうち、特許文献５でV821ペプチドと呼ばれている「配列番号２２（GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIELPE）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これに限定されず特許文献５に示されたいずれのペプチドも使用できる。
【００２５】
（１−５）PDMSタグについて
本発明で用いることができるPDMSタグは、固相表面がシリコーンゴムの一種であるポリジメチルシロキサンである固相の場合に固相親和性が高い。ポリジメチルシロキサンは、マイクロ流路などマイクロチップ基材の一つとして知られている（特許文献６）。
具体的には、PDMSタグのうち、特許文献６でELN-V81ペプチドと呼ばれている「配列番号２３（MVMPGDNIKMVVTLIHPIAMDDGLRFAIRE）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これに限定されず特許文献６に示されたいずれのペプチドも使用できる。
【００２６】
２．本発明の固定化対象のレクチンの種類
本発明のレクチンとしては、特定の標的糖鎖を認識するどのようなレクチンであってもよいが、PSタグなど本発明の固定化用タグと結合させるためには、PSタグなどをコードする遺伝子とレクチン遺伝子を繋ぎリコンビナント体で取得することが好ましいので、全長アミノ酸配列もしくは少なくとも糖鎖認識部位を含むアミノ酸配列が既知のレクチンであることが好ましい。
例えば、rACG、rPSL1a、rLSLN、rDiscoidin I、rDiscoidin II、rCGL2、rSRL、rF17AG、rGRFT、rOrysata、rCalsepa、rBC2LA、rAAL、rPAIIL、rRSIIL、rPPL、rCNL、rPAIL、rABA、rMOA、rPALa、rGal3CS、rMpL、rAAL2、rBambL、rPVLレクチンなどが例示できるが、これらレクチンには限られない。
またこれらレクチンの由来や糖鎖特異性などの特性は、「Lectin Frontier DataBase (LfDB)（http://acgg.asia/lfdb2/）」などに記載されており、いずれもリコンビナントレクチンとして和光純薬工業（株）などにより市販されている。
【００２７】
そして、本発明の固定化用タグは、その際固定化しようとするレクチンの種類に応じて、または固定化する固相表面の種類に応じて、適宜、本発明の固定化用タグの中から選択して用いることが好ましい。
PSタグなど本発明の固定化用タグをコードする遺伝子をレクチン遺伝子の5’末端又は3’末端に結合する際に、リコンビナントのタグ化レクチンの検出や精製を容易にするために、その反対側の3’末端又は5’末端にFLAGタグ，3×FLAGタグ，Hisタグ（例えば6×Hisタグ）等のタグペプチドや他のタンパク質との融合蛋白として発現させてもよい。
【００２８】
なお、天然由来レクチンなど塩基配列が不明なレクチンを用いる場合は、本発明の固定化用タグペプチドを、直接対象のレクチンと化学的に結合させることもできる。
【００２９】
また、本発明に用いるレクチンのアミノ酸配列は、特定の標的糖鎖の認識部位を保持していれば全長である必要はなく、標的糖鎖の認識部位を有する部分配列であってもよい。
また、特定の標的糖鎖の認識能を損なわない範囲内で、アミノ酸配列において10％未満、好ましくは8％未満、より好ましくは5％未満、さらに好ましくは3％未満、もっと好ましくは2％未満、特に好ましくは1％未満であればアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。上記をアミノ酸残基数で言えば、例えば20個以下、例えば10個以下、例えば5個以下、例えば3個以下、例えば2個以下、例えば1個であれば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。その際の欠失、置換、付加又は挿入は、当該レクチンのアミノ酸配列のC末端又はN末端のみであることが好ましい。
【００３０】
また、本発明に用いるレクチン−ペプチド融合体のアミノ酸配列についても、特定の標的糖鎖を認識能及び固相（基材）吸着能を損なわない範囲内で、アミノ酸配列において10％未満、好ましくは8％未満、より好ましくは5％未満、さらに好ましくは3％未満、もっと好ましくは2％未満、特に好ましくは1％未満であればアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。上記をアミノ酸残基数で言えば、例えば20個以下、例えば10個以下、例えば5個以下、例えば3個以下、例えば2個以下、例えば1個であれば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。左記の欠失、置換、付加又は挿入は、当該融合体のレクチン又はペプチドのアミノ酸配列のC末端又はN末端のみであることが好ましい。
【００３１】
３．本発明の固定化用タグ化レクチンの製造
（３−１）本発明の固定化用タグ化レクチン製造用ベクター
標的糖鎖結合性を有するレクチンのアミノ酸配列をコードする塩基配列の5’末端又は3’末端にPSタグなど本発明の固定化用タグをコードする塩基配列を繋ぎ、好ましくはその反対側末端にFLAGタグをコードする塩基配列を繋いだカセットを、常法に従って適当な発現用ベクターに組み込み、発現用組み換えベクターを得る。ここで、標的糖鎖結合性を有するレクチンのアミノ酸配列は全長でなくても、少なくとも標的糖鎖結合部分を含んでいればよい。
発現ベクターは、各種の宿主細胞中での本発明の固定化用タグ化レクチンを融合タンパク質として発現し、産生する機能を有するものであれば特に制限されない。市販されているプラスミドベクター、ファージベクター及びウイルスベクターを用いることができる。
宿主細胞としては大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などを用いることができるが、大腸菌が好ましい。
【００３２】
（３−２）本発明の固定化用タグ化レクチンの製造方法
発現用組み換えベクターによる宿主細胞の形質転換は、従来公知の方法を用いて行うことができ、市販のCompetent Cellを用いる場合には、その製品プロトコールに従って形質転換を行えばよい。
また、天然由来レクチンなど塩基配列が不明なレクチンと、あらかじめ化学合成により又は遺伝子組換えにより合成した固定化用タグペプチドとを、通常のタンパク質とペプチドとのカップリング反応（例えば、NHS基を利用したアミンカップリングやSH基、マレイミド基を利用したジオールカップリング）を用いることで融合タンパク質を得ることができるがこれらに限定されない。ストレプトアビジン−ビオチン反応など共有結合以外の融合方法も利用できる。
【００３３】
４．本発明のレクチンを固相化するための基材（固相）
（２−１）固相化レクチンの基板
本発明のレクチン−ペプチド融合体を固相化する基材（固相）としては、プレート（例、マイクロウェルプレート）、マイクロアレイ基板（例、マイクロアレイ用スライドガラス）、チューブ、ビーズ（例、プラスチックビーズ、磁気ビーズ）、クロマトグラフィー用担体（例、Sepharose（商標））、メンブレン（例、ニトロセルロースメンブレン、PVDF膜、ポリスチレン不織布）、ゲル（例、ポリアクリルアミドゲル）などが例示される。その中でもプレート、ビーズおよびメンブレンが好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からプレートが最も好ましく用いられる。
以下、主としてプレートを用いた「レクチン−ペプチド融合体結合プレート」（「タグ化レクチンプレート」ともいう。）の場合について述べるが、本発明の固相はプレートのみに制限されない。
【００３４】
PSタグを用いる場合は、プレートの材質は親水性の樹脂表面を有していることが好ましく、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリメタクリル酸メチル（PMMA）等などのプラスチック樹脂表面を変質させて親水化処理したものを用いることができる。特に親水性ポリスチレン、又はポリカーボネートを用いることが好ましい。
これらの親水性樹脂プレートは多数市販されているが、疎水性の樹脂表面にUV＋O3処理やプラズマ酸化処理を行うことにより親水性化することができる。
【００３５】
（２−２）レクチン−ペプチド融合体結合プレートの製造方法
PSタグなど本発明の固定化用タグ化レクチンを、形質転換細胞から産生させる場合、そのままの培養液、菌体破砕液、又は菌体破砕液を遠心分離して得られた可溶性画分をそのまま、もしくは適宜希釈して用いてもよいが、通常のタンパク質精製方法により精製した融合タンパクを水性溶媒に溶解した溶液を用いることが好ましい。化学合成された融合タンパク質の場合も、水性溶媒に溶解した溶液を用いる。
これらの本発明の固定化用タグ化レクチンを含む溶液、又は懸濁液をタグの種類及びプレートに応じ、特許文献３〜６に記載された方法に準じて最適化した条件に調整し、固定化しようとするプレートなどの基材（固相）表面に接触させる。
【００３６】
（２−３）タグ化レクチンを固定化する際のpH条件及び塩濃度条件
本発明のタグ化レクチンを固定化する際には、通常pH6.0〜8.0の範囲で行うが、PSタグ化レクチンを、親水性ポリスチレン樹脂など親水性樹脂表面に固定化する場合は、pH=6.5〜7.5が好ましく、pH=7.0〜7.5の範囲がより好ましい。特に、PSタグとしてPSIタグを用いる場合は、pH6.5〜pH7.5の範囲が好ましく、特にpH6.8〜7.2などのpH7.0付近で用いることが特に好ましい。PSタグとしてPSSタグを用いる場合は、pH6.5〜pH7.5の範囲が好ましく、特にpH7.3〜7.7などのpH7.5付近で用いることが特に好ましい。
また、固定化する際の好ましい塩濃度は、NaCl濃度に換算して0.05〜0.30Mであり、0.10〜0.20Mがより好ましく、最も好ましい濃度はNaCl濃度換算で0.13〜0.17Mなどの0.15M付近である。
【００３７】
３．本発明の測定方法及びそのためのキット
（３−１）本発明の測定対象となる試料
本発明のレクチン−ペプチド融合体固定化基材（レクチンプレートなど）を用いることで、試料中の標的糖鎖を含有する抗原を、検出及び／又は測定（以下、あわせて「測定」という。）することができる。
本発明の測定対象となる試料は、標的となる糖鎖、標的糖鎖を含む複合糖質又は当該標的複合糖質を持つ細胞、細胞外小胞もしくはウイルス（すなわち、「標的糖鎖含有抗原」）が存在する可能性がある試料である。
標的となる糖鎖又は複合糖質としては、培養細胞表面などの未分化細胞マーカーなどの各種細胞特異的な糖鎖又は糖タンパク質もしくは糖脂質などの複合糖質、又は培養上清中の糖鎖もしくは複合糖質の他、被験者、被検動物の血液などの体液中、もしくは臓器、組織、細胞表面で観察される疾患特異的な糖鎖もしくは複合糖質などが挙げられる。
すなわち、本発明の測定対象となる試料は、これら標的糖鎖又は標的複合糖質を含む可能性のある試料であり、培養細胞もしくは生体由来の細胞自体を含む懸濁液、細胞ライセート、細胞培養上清、又は被験者、被検動物由来の血液などの体液を含む懸濁液、又は精製された溶液、希釈液などである。
【００３８】
（３−２）本発明のレクチン−ペプチド融合体結合基材（タグ化レクチン固定化基材）を用いた測定方法
本発明のタグ化レクチン固定化基材を適用できる測定方法としては、典型的にはELISAなどの免疫学的測定方法であるが、他にイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光イムノアッセイ（FIA法）、化学発光イムノアッセイに対しても同様に適用可能である。また、複数のレクチンを同一基材上に固定化してレクチンアレイとして用いることもできる。
以下、典型的なサンドイッチELISAについて述べるが、これらには制限されない。
【００３９】
＜サンドイッチELISA＞
本発明のタグ化レクチン固定化プレート（以下、単にレクチンプレートともいう。）は、サンドイッチELISAの固相として用いることができる。
例えば、PSタグ化レクチンが結合した固相（プレート）を複数回洗浄し、ブロッキング後さらに複数回洗浄する。目的物質を含有する試料と固相上のレクチンとを反応させた後、複数回洗浄し、オーバレイした抗体と目的物質と反応させて複数回洗浄する。オーバレイ抗体と反応する酵素標識抗体との反応後にも複数回の洗浄工程がある。酵素標識抗体と基質とを反応させ、吸光度を測定し、試料中の目的物質を検出し、又は濃度を測定する。
本発明のPSタグ化レクチン結合プレートの場合、これだけの洗浄工程を行っても、レクチン量はほとんど減少しない。
【００４０】
オーバレイする抗体は、標的糖鎖を含有する糖タンパク質のタンパク質部分と結合活性を有する抗体が好ましく、抗体を直接標識化することもできる。
標識物質としては、蛍光物質（FITC、ローダミン、Cy3、Cy5など）、放射性物質（13C、3Hなど）、酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなど）、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。また、抗体をビオチン標識し、ストレプトアビジンを上記標識物質で標識して、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用してもよい。
標識物質として酵素を用いる場合、使用する酵素に応じた適切な基質を用いて検出を行なう。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、基質としてはo-フェニレンジアミン（OPD）、テトラメチルベンジジン（TMB）などが使用される。酵素反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを適宜選択して使用することができる。また、標識シグナルの測定は、使用した標識物質に応じて適切な測定装置を用いて行なえばよい。
【００４１】
（３−３）測定条件及びブロッキング剤の選定
本発明のレクチンプレートを用いて測定する際には、検出用標識化抗体と反応させる前及び後でレクチンプレートを界面活性剤（例えば0.1％Tween20）含有PBS緩衝液で洗浄することが好ましい。特に反応前のレクチンプレートに対して、ブロッキング剤（例えば2％BSA0.1％Tween20含有PBS緩衝剤）でブロッキング処理を施すことが好ましい。また、反応させる検出用標識化抗体の希釈液として当該ブロッキング剤（例えば、2％BSA0.1％Tween20含有PBS緩衝剤）を用いることも有効である。
その際のブロッキング剤としては、2％BSA含有ブロッキング剤に代えて、WO2014/196650に記載のコーティング膜形成用組成物を含むブロッキング剤「prevelexTM LS1004（日産化学工業(株)製）」を用いても、また、ブロッキングワン（ナカライテスク社製）、ブロックマスターCE210、CE510（JSRライフサイエンス社製）を用いても同程度又はそれ以上のLLOD値低下効果を示す。
【００４２】
（３−４）測定用キット
本発明のPSタグ化レクチンの1種類以上を固定化した固相（レクチンプレート）を、標的糖鎖もしくは標的複合糖質を測定するためのELISA用キットなど各種の測定用キットとすることができる。さらに、検出用標識化抗体、ブロッキング剤、緩衝液、希釈液などの1種以上と組み合わせることが好ましい。キットには、使用説明書などを加えることもできる。ここで、ブロッキング剤としては、WO2014/196650に記載のコーティング膜形成用組成物を含むブロッキング剤「prevelexTM LS1004（日産化学工業(株)製）」などが好ましい。また、検出用標識化抗体の希釈液として、ブロッキング剤、特にコーティング膜形成用組成物含有ブロッキング剤を含む抗体希釈液を組み合わせることがさらに好ましい。
【００４３】
４．本発明のタグ化レクチンを用いた分離法
（４−１）細胞の分離、回収
本発明のタグ化レクチンを用いることで、分離、回収をしようとする細胞の表面に存在する糖鎖を標的として、当該細胞を含有する試料から、当該細胞のみを濃縮、分離及び／又は回収（以下、あわせて「分離」ともいう。）することができる。
具体的には、標的糖鎖特異的なレクチンを、本発明のレクチン固定化用タグを介して磁気ビーズなどのビーズ、粒子、又はプレートなどの基材（固相）に固定化し、標的糖鎖を細胞表面に有する細胞を含有する試料と接触させた後、基材を十分に洗浄し、当該レクチン特異的な単糖類溶液を作用させて、細胞を回収する。
例えば、ヒトなどの哺乳動物の血液などの体液試料又は組織由来の細胞含有試料から、幹細胞糖鎖マーカー又は未分化細胞糖鎖マーカーを標的として、幹細胞のみを単離することができる。癌細胞糖鎖マーカー又は特定の疾患特異的に発現する糖鎖マーカーなどを標的とすれば、癌細胞や病変細胞を単離することもできる。
その際、細胞自身の表面はマイナスにチャージされているので、本発明の固定化用タグとしては、PMMAタグ（例えば、配列番号２１）を用いることが好ましい。
【００４４】
（４−２）糖タンパク質などの複合糖質の分離（濃縮、分離、精製、回収）
糖タンパク質などの複合糖質の測定法と同様の手法でレクチンに結合させた状態で分離（濃縮又は単離）することができる。レクチンからの複合糖質の回収は、各レクチン特異的な単糖類溶液を作用させることで簡単に回収できる。
【００４５】
（４−３）分離用キット
本発明のPSタグ（好ましくはPMMAタグ）付きレクチンの1種類以上を固定化した磁気ビーズなどのビーズ、カラム、プレートなどの固相を、標的糖鎖又は標的糖鎖含有物（標的複合糖質、又は標的複合糖質を持つ細胞、細胞外小胞もしくはウイルスなど）を濃縮、分離、精製するためのキットとすることができる。さらに、標的糖鎖又は標的複合糖質を認識する他のレクチンもしくは抗体、ブロッキング剤、緩衝液、希釈液などの1種以上と組み合わせてキット化することが好ましい。使用説明書などをキットに加えることもできる。
ここで、標的複合糖質を認識する抗体と組み合わせる場合は、ブロッキング剤、特にコーティング膜形成用組成物含有ブロッキング剤を含む抗体希釈液を組み合わせることが好ましい。
また、本発明の分離用キットとして、分離用カラムや分離用フィルターなどを含めた器具、装置などをキットに含めることもできる。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。【００４７】
（実施例１）PSSタグ化rBC2LCNとPSIタグ化rBC2LCNレクチンの合成
本実施例では、レクチンとしてはrBC2LCNレクチンを用い、PSタグとして典型的なPSIタグ（配列番号２）と共にPSSタグ（配列番号９）を選択し、rBC2LCNレクチンのN末側又はC末側に結合した4種類のコンストラクトを合成した。
具体的には、BC2LCN（配列番号２４；GenBank／NCBI-GI登録番号：YP_002232818（Genome ID：206562055））をコードする遺伝子の5’末端側又は3’末端側にPSIタグ（配列番号２）又はPSSタグ（配列番号９）のいずれかをコードする遺伝子を結合し、それぞれの反対側の末端にはFLAGタグを結合させた4種類のコンストラクト（図１）を合成し、各コンストラクトをpET27bベクターに挿入した。
続いて、大腸菌（BL21-CodonPlus）宿主に導入し、対応する4種類のPSタグを付加したBC2LCNを発現させた。【００４８】
そして、菌体破砕後、フコースアガロースで精製したところ、C末端側にタグを付加した場合には、PSIタグ化rBC2LCNで52 mg/L、PSSタグ化rBC2LCNの場合で76 mg/L精製することができた（図２）。一方、N末端にタグを付加した場合には、PSIタグ化rBC2LCNでは4mg/L、PSSタグ化rBC2LCNは1 mg/Lしか精製できなかった（図３）。
これらの結果から、少なくともBC2LCNレクチンでは、PSI及びPSSいずれのPSタグにおいてもC末端側に付加する方が、PSタグ化レクチンの収量が高いことが分かった。そして、PSIタグ及びPSSタグのうちではPSSタグ化の収量が高かった。【００４９】
（実施例２）リコンビナントPSタグ化レクチンの収量比較
レクチンとして、rACG、rPSL1a、rLSLN、rDiscoidin I、rDiscoidin II、rCGL2、rSRL、rF17AG、rGRFT、rOrysata、rCalsepa、rBC2LA、rAAL、rPAIIL、rRSIIL、rPPL、rCNL、rPAIL、rABA、rMOA、rPALa、rGal3CS、rMpL、rAAL2、rBambL、rPVLを選択し、そのC末端側にPSIタグ、又はPSSタグが結合され、かつその反対側にFLAGタグが結合されるようにそれぞれの遺伝子を結合し、実施例１と同様に大腸菌での発現後にフコースアガロースによる精製を行い、各PSタグ化レクチンの収量を測定した。
その結果、ほぼ全てのレクチンでPSIタグ化レクチンよりもPSSタグ化レクチンのほうが収量は高い傾向にあることがわかった。唯一rBambLの場合に、PSIタグ化rBambLの方が収量が高かった（図４）。【００５０】
（実施例３）PSタグ化レクチンの各種プレートへの吸着量
（３−１）rBC2LCNレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化したrBC2LCNレクチンを、PBSもしくは0.1％Tween20を含むPBS（PBST）に懸濁し、異なる濃度で各種プレートと室温１時間反応させた。その際、プレートとしては、ELISA用のポリスチレンプレートである、Nunc(260860)（Thermo社製）、Polysorp（Thermo社製）及びMaxisorp（Thermo社製）及びCarbo-Bind表面加工によりヒドラジド基を含有させたカルボプレート（住友ベークライト社製）、表面に酸素プラズマ照射を施してカルボン酸、カルボニル、ヒドロキシル基等を含有させたAGCプレート（組織培養用ガラス製、Iwaki社製）を用いた。なお、親水度は、AGC、カルボ＞Maxisorp、Nunc(260860)＞＞Polysorpである。
その後、PBSTで5回洗浄後、micro BCA assayのタンパク質定量用キット（ThemoFisher社）を用いて、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した（図５）。
その結果、PBS中では、どのプレートでもPSタグ化した場合に、ほぼ全てのプレートで0.5μg/wellまでの高い吸着量を示したが、PSSタグ化の場合、最も親水性の低いPolysorpでの吸着量が低いことがわかる。カルボプレートとAGCプレートでは、Tween20の存在下（PBST）でも高い吸着量を示したが、他のプレートではほとんど吸着が見られなかった。
すなわち、PSS又はPSIタグ化rBC2LCNレクチンのAGC又はカルボプレートからなる高密度のrBC2LCNレクチンプレートが提供できた。【００５１】
（３−２）rACGレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化したrACGレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、Tween20の存在下（PBST）では、PSタグ化した場合に、カルボプレートとAGCプレートでは吸着性があるが、通常のELISA用のポリスチレンプレート（Maxisorp、Nunc、Polysorp）には、ほとんど吸着しない（data not shown）。図６としては、カルボプレートとAGCプレートの場合のみを示す。以下、（図７）〜（図２０）の場合も同様にカルボプレートとAGCプレートの場合のみを示している。【００５２】
（３−３）rLSLNレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rLSLNレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rLSLNレクチンも、（３−２）でのrACGレクチンと同様の傾向を示した（図７）。【００５３】
（３−４）rDiscoidinIIレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rDiscoidinIIレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rDiscoidinIIレクチンも、（３−２）でのrACGレクチンと同様の傾向を示した（図８）【００５４】
（３−５）rCGL2レクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rCGL2レクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rCGL2レクチンの場合は、カルボプレートとAGCプレートの場合に、PBSのみならずTween20の存在下（PBST）でも、PSタグ化した場合の吸着量が高い傾向は同様であったが、PSタグなしでも濃度が高ければ高い吸着性を示した。（図９）【００５５】
（３−６）rF17AGレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rF17AGレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rF17AGレクチンの場合も、（３−５）のrCGL2レクチンと同様の傾向を示した（図１０）。【００５６】
（３−７）rGRFTレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rGRFTレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rF17AGレクチンの場合は、（３−２）でのrACGレクチンと同様の傾向を示した（図１１）。【００５７】
（３−８）rOrysataレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rOrysataレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rOrysataレクチンの場合は、Tween20の存在下（PBST）では、PSタグ化した場合に濃度が高ければ少し吸着性が見られる程度で、PSタグ化していない場合はほとんど吸着しない（図１２）。【００５８】
（３−９）rCalsepaレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rCalsepaレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rCalsepaレクチンの場合は、（３−２）でのrACGレクチンと同様の傾向を示した（図１３）。【００５９】
（３−１０）rRSIILレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rRSIILレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rRSIILレクチンの場合は、Tween20の存在下（PBST）では、PSIタグ化の場合はPBSよりも高い吸着性を観測したが、PSSタグ化の場合には、反対にPBSTではほとんど吸着しなかった（図１４）。【００６０】
（３−１１）rCNLレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rCNLレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rCNLレクチンの場合は、（３−２）でのrACGレクチンと同様の傾向を示した（図１５）。【００６１】
（３−１２）rGal3Cレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rGal3Cレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rGal3Cレクチンの場合は、（３−２）でのrACGレクチンと同様の傾向を示した（図１６）。【００６２】
（３−１３）rPSL1aレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rPSL1aレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rPSL1aレクチンの場合は、Tween20の存在下（PBST）では、PSタグ化の有無にかかわらず、濃度が高ければいずれも少し吸着性が見られる程度であった（図１７）。【００６３】
（３−１４）rPALaレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rPALaレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rPALaレクチンの場合は、Tween20の存在下（PBST）では、PSタグ化した場合に濃度が高ければ少し吸着性が見られる程度で、Psタグ化していない場合はほとんど吸着しない（図１８）。【００６４】
（３−１５）rBC2LAレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rBC2LAレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rBC2LAレクチンの場合、（３−１）の場合とは全く異なり、（３−１４）のrPALaレクチンの場合と同様の結果が得られた（図１９）。【００６５】
（３−１６）rPA1Lレクチン
タグなし、PSIタグ化、又はPSSタグ化rPA1Lレクチンに対しても、（３−１）と同様の方法を適用して、各プレート表面に吸着されたレクチン量を測定した。
その結果、rPA1Lレクチンの場合、Tween20の存在下（PBST）では、PSタグ化した場合には吸着性を示したが、PSタグなしではほとんど吸着しなかった。PSタグのうちではPSIタグの場合の吸着性が高かった（図２０）。【００６６】
（実施例４）レクチンを固定化する際の最適化条件
（４−１）pHの最適化条件
PSSタグ化rBC2LCNレクチン及びPSIタグ化rBC2LCNレクチンを用い、培養上清中の未分化糖鎖マーカー検出ELISA系において、レクチンを固定化する際の緩衝液のpHの最適化を行った。
PSSタグ化rBC2LCNレクチンもしくはPSIタグ化rBC2LCNレクチンを、0.1％Tween20と0.15 M NaClを含む各種pHの緩衝液 bufferに0.5μg/mLの濃度になるように調整し、ELISA用カルボプレート（住友ベークライト社製）に 50μL加え、室温で1時間静置した。5回洗浄後、2％BSAと0.1％Tween20を含むPBSを250μL加え、室温で1時間静置してブロッキングした。
次いで、洗浄後ヒトiPS細胞201B7株の培養上清を50μL加え、室温で1時間静置した。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識R10G抗体を 50μLずつアプライして室温で1時間静置した。
洗浄後、TMB（和光純薬工業社製）を 50μL加え、30分発色後、1N 塩酸を各ウェルに 50μL加えて反応を停止し、プレートリーダーで 主波長 450nm,副波長 620nmで測定した。
その結果、PSSタグ化した場合の検出下限値（LLOD）はpH6.5〜pH8で低く、特にpH7.5で最も低い検出下限値（LLOD）が得られることが分かった。一方、PSIタグ化した場合は、pH6.5〜pH7.5で低く、最も低い値はpH7であった。PSSタグ化した場合のpH7.5（HEPES buffer）の値が両者を併せて最も低く、LLOD=21 cells/mLであった（図２１）。すなわち、レクチンを固定化する際の最適pH値は、pH=6.5〜7.5、好ましくはpH=7.0〜7.5であるといえる。なお、LLODの値は、n=3の平均値（Ave）と標準偏差値（SD）から、LLOD=Ave+3.3SDの式で計算した（以下、同様）。【００６７】
（４−２）NaCl濃度の最適化条件
次にpH7.5のpH条件下でPSSタグ化rBC2LCNレクチンを用いて、NaCl濃度の最適化を行った。
PSSタグ化rBC2LCNレクチンを、0.1％Tween20と各種濃度のNaClを含むHEPES bufferで0.5μg/mLに調整し、ELISA用カルボプレート（住友ベークライト社製）に 50μLずつアプライして、室温で1時間静置した。5回洗浄後、2％BSAと0.1％Tween20を含むPBSを250μLずつ加え、室温で1時間静置した。
次いで、洗浄後、ヒトiPS細胞201B7株の培養上清を50μL加えて、室温で1時間静置した。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識R10G抗体を50μL加えて、室温で1時間静置した。洗浄後、TMB（和光純薬工業社製）を 50uL加え、30分発色後、1N 塩酸を各ウェルに 50μL加えて反応を停止し、プレートリーダーで 主波長 450nm、副波長 620nmで測定した。
その結果、PSSタグ化rBC2LCNのHEPES buffer pH7.5懸濁液において、NaCl濃度を0.15Mに調整した場合に、最も低い検出下限値のLLOD=220 cells/mLが得られることが分かった（図２２）。すなわち、固定化する際の好ましい塩濃度は、NaCl濃度に換算して0.10〜0.20Mが好ましく、特に0.15M付近に調整することが好ましいといえる。【００６８】
（実施例５）PSタグ化法とビオチン化法とのLLOD値及びバラツキ度比較
本実施例では、PSタグ化法によるPSS又はPSIタグ化レクチンプレートとビオチン化レクチンを結合させたアビジンプレートとを用いて、ヒトiPS細胞201B7株の培養上清中の未分化糖鎖マーカーとの検出下限値（LLOD）及びバラツキの程度（CV）を比較する。【００６９】
（５−１）標準曲線
PPSタグ化したrBC2LCNレクチンを、（実施例４）により決定した最適化したpH条件及びNaCl濃度条件下でELISA用カルボプレート（住友ベークライト社製）に固定化した（PSタグ化法という。）。比較のため、ビオチン化したrBC2LCNをアビジンプレート（住友ベークライト社製）に固定化し（この方法をビオチン化法とよぶ。Tateno et al Regenerative therapy 2017, in press）、両プレートを用いて、ヒトiPS細胞201B7株の培養上清中の未分化糖鎖マーカー検出ELISA系における標準曲線を作成した（図２３）。【００７０】
（５−２）PSタグ化レクチンプレートの製造
PSS又はPSIタグ化rBC2LCNレクチンが0.05 μg/mL含まれるように調整した緩衝液（NaCl 150mMを含むHEPES緩衝剤及び0.1％Tween20含有PBS）を、ELISA用カルボプレート（住友ベークライト社製）上に 50 μL/wellをアプライし、室温で1hourインキュベートした。
プレートを、緩衝液で洗浄し、ブロッキング液（2％BSA/0.1％Tween20 PBS）を250μL/wellアプライし、室温で1hour放置し、プレートを、緩衝液で洗浄した。
被検試料（iPS細胞）を、培地（mTeSR1）で希釈し、50μL/wellアプライし、室温で1hourインキュベートし、緩衝液で洗浄した。次いで、HRP標識抗体（R10G (NH2)）を緩衝液（2％BSA/0.1％Tween20 PBS）で調整し、50μl/wellアプライした。プレートを、室温で1hourインキュベートし、緩衝液で洗浄し、TMB溶液を50μl/wellアプライし、室温でインキュベートした。1N HCL 50μl/wellにより反応を停止させ、プレートリーダー（主波長 450 nm、副波長 620 nm）でスキャンし、吸光度を測定した。
以上の操作を、3連で行い、同じ操作を3回繰り返した。【００７１】
（５−３）ビオチン化レクチンのアビジンプレートの製造
Streptavidinを0.5もしくは1μg/mL (in PBS)を、プレート上に 50μL/wellをアプライし、室温で1hourインキュベートした。プレートを、緩衝液で洗浄し、ブロッキング液（2％BSA/0.1％Tween20 PBS）を250μL/wellアプライし、室温で1hour放置し、プレートを、緩衝液で洗浄した。
ビオチン化rBC2LCNをPBSで0.3μg/mLに希釈し50μL/wellアプライし、室温で1hourインキュベートした後、プレートを、緩衝液で洗浄した。
被検試料（iPS細胞）を、培地（mTeSR1）で希釈し、50μL/wellアプライし、室温で1hourインキュベートし、緩衝液で5回洗浄した。次いで、HRP標識抗体（R10G (NH2)）1μg/mLを緩衝液（2％BSA/0.1％Tween20 PBS）で調整し、50μl/wellアプライした。プレートを、室温で1hourインキュベートし、緩衝液で洗浄し、TMB溶液を50μl/wellアプライし、室温で30分インキュベートした。1N HCL 50μl/wellにより反応を停止させ、プレートリーダー（主波長 450 nm、副波長 620 nm）でスキャンし、吸光度を測定した。
以上の操作を、3連で行い、同じ操作を3回繰り返した。【００７２】
（５−４）バラつき度の比較
PSS又はPSIタグ化レクチンプレートとビオチン化レクチン-アビジンプレートを用いた場合のそれぞれについて、検量線に用いた各シグナルのバラつき度を表す変動係数（CV）を算出した。3回同じ実験を行い、CVの平均値を算出した（図２４）。バラつきの程度としては、PSIタグ化レクチンプレートとアビジンプレートとの間には大きな差異がなかったが、PSSタグ化レクチンプレートの場合は最も変動係数（CV）平均値が低く、バラつき度が低いという結果が得られた。【００７３】
（５−５）LLOD値の比較
PSS又はPSIタグ化レクチンプレートとビオチン化レクチン-アビジンプレートを用いた場合のそれぞれについて、ヒトiPS細胞201B7株の培養上清中の未分化糖鎖マーカーの検出下限値（LLOD）を比較した。
なお、LLODは、同じ実験を３回繰り返した結果（cells/mL）の平均値（Ave）から、「LLOD=Ave＋3.3SD」の計算式で計算している。
その結果、PSタグ化レクチンプレートはいずれも検出下限値（LLOD）において、アビジンプレートを用いた場合よりも低い値を呈しており、特にPSIタグ化レクチンプレートの場合が最も低い値を示した（図２５）。【００７４】
（実施例６）PSタグ化rBC2LCNレクチンとiPS細胞との反応性比較
（実施例１）の方法と同様に、C末側をPSIタグ化又はPSSタグ化したrBC2LCNを調製し、PSタグなしのrBC2LCNと共に、それぞれPBSもしくはPBSTに懸濁し（0.25 μg/well）、室温1時間でカルボプレート（住友ベークライト社製）に固定化した。PBSTで洗浄後、2％BSA/PBSTを250 μL/well添加して室温1時間ブロッキングした。
次にヒトiPS細胞201B7（（独）理化学研究所バイオリソースセンターから入手）から調製した疎水性分画をビオチン化し、異なる濃度で室温１時間反応させた。10 ng/mLのペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを50 μL/wellを添加して室温1時間反応後、基質を加えて発色した。室温30分後に1N塩酸を50 μL/well添加して反応停止後、主波長450 nm/副波長620 nmで測定した（図２６）。【００７５】
その結果、PSタグなしのrBC2LCNレクチンと比べて、PSSもしくはPSIタグ化したrBC2LCNでは有意に高いシグナルを示し、両者のうちではPSSタグ化rBC2LCNの方が反応性が高い。
特に、PSSタグ化rBC2LCNの場合は、Tween20の存在下（PBST）でもほぼ同程度の安定した反応性を示した（図２７）。このことは、PSSタグ化したrBC2LCNでは、反応系に被検試料に由来する夾雑物が存在しても標的糖鎖との高い反応性が維持できることが推測できる。
細胞表面上の標的糖鎖を細胞ライセートを用いて直接検出する際、細胞ライセート又はその疎水性分画をビオチン標識し、HRP標識ストレプトアビジンにより検出する手法が一般的である。その場合には、レクチンプレートとしてアビジンプレートを用いることができないので、その点でもPSS/PSIタグ化レクチンプレートの有用性は極めて高い。【００７６】
（実施例７）PSタグ化rBC2LCNレクチンの検出下限値
（実施例６）で用いたPSタグなし、PSI又はPSSタグ化rBC2LCNをPBSもしくはPBSTに懸濁し（0.25 μg/well）、室温1時間でカルボプレート（住友ベークライト社製）に固定化した後、ヒトiPS細胞201B7を異なる濃度で反応させ、検出下限値（LLOD）を測定した。
その結果、PSS/PSIタグ化したrBC2LCNは、タグなしと比べて10〜200倍高い感度を示すことが分かった。PSIとPSSタグを比較すると、PSSタグの方が高い感度を示した（図２８）。
（実施例６）及び（実施例７）の結果から見て、PSタグ化、特にPSSタグ化したrBC2LCNの場合は、プレート上に高密度に配向させたことでレクチン本来のクラスター効果が発揮でき、標的糖鎖との結合性が高まり、感度が飛躍的に高まったと考えられる。【００７７】
（実施例８）各種レクチンと未分化糖鎖マーカーとの反応性の比較
PBSもしくはPBSTに懸濁した各種PSS/PSIタグ化レクチンをカルボプレート（住友ベークライト社）に100 μg/wellで室温１時間固定化した。PBSTで洗浄後、2％BSA/PBSTを250 μL/well添加して室温1時間ブロッキングした。
ヒトiPS細胞201B7もしくはヒト皮膚線維芽細胞（ATCCから入手）から調製した疎水性分画をビオチン化し、異なる濃度で室温1時間反応させた。10 ng/mLのぺルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを50 μL/well添加して室温１時間反応後、基質を加えて発色した。室温30分後に1N塩酸を50 μL/well添加して反応停止後、主波長450 nm/副波長620 nmで測定した。
その結果、rBC2LCNレクチンの場合は、PSタグなしの場合と比較して、PSSもしくはPSIタグ化すると有意に高いシグナルを示す。
一方、他のレクチンはいずれもヒトiPS細胞とヒト皮膚線維芽細胞とで反応性にほとんど差がなく、PSタグ化による反応性の差異もそれほど大きくはない。ただし、rGRFT、rPSL1a、rLSLNの場合はPSタグ化で反応性が高まり、PSIタグ化したrRSIILの場合、ヒトiPS細胞でのみ反応性が高まった。また、これらの傾向は、Tween20の存在の有無による影響は大きくなかった。【００７８】
（実施例９）PSタグ化レクチン固定化プレートのLLOD値及びデータのバラツキ度を最小にする最適化条件の検索
本実験では、（実施例６）などで用いたヒトiPS細胞とPSタグ化rBC2LCNレクチンを固定化したELISA用カルボプレートとの組合せで、その反応強度測定のLLOD値、及びデータのバラツキ度が最小になるような、反応の各工程での洗浄液、ブロッキング液の最適化を検討し、従来法のビオチン化レクチンを固定化したアビジンプレートでの結果と比較した。【００７９】
（９−１）実験方法
＜条件１＞
PSタグ化レクチン（rBC2LCN）を、緩衝液（50 mM HEPES/150 mM NaCl 0.1％Tween20）で0.5μg/mLに調整し、ELISA用カルボプレート（S-BIO MS-8708F）の各ウェルに50μLずつアプライする。室温で1時間静置後、固定化されたPSタグ化レクチンを洗浄（0.1％ Tween20/PBS 350μL/well、以下単に「0.1％Tween20/PBS」という。）し、洗浄液を取り除く。
被検試料としてiPS細胞（201B7 sup）に培地を加えて希釈系列を作成し、それぞれを各PSタグ化レクチン固定化ウェルに 50μLずつアプライし、室温で1時間静置後、5回洗浄（0.1％Tween20/PBS）し、洗浄液を取り除く。
次いで、ペルオキシダーゼ標識抗体をPBSで2μg/mLに調整した検出用標識抗体溶液を各ウェルに50μLずつアプライし、室温で1時間静置する。
洗浄（0.1％Tween20/PBS）後基質を50μLずつアプライする。30分静置した各ウェルに、反応停止液として1N塩酸を50μLずつアプライし、プレートリーダー（主波長 450 nm、副波長 620 nm）で吸光度を測定する。なお、コントロール（Control medium）としては、細胞培養に使用していない培地のみを用いて、解析した結果を用いた。【００８０】
＜条件２＞
＜条件１＞と同様の方法で、PSタグ化レクチンをELISA用カルボプレート（S-BIO MS-8708F）の各ウェル内に固定化し、洗浄（0.1％Tween20/PBS）、洗浄液除去工程を施し、被検細胞（iPS細胞：201B7 sup）の希釈系列を各ウェルで反応させる工程、洗浄（0.1％Tween20/PBS）、洗浄液除去工程を行う。
次いで、検出用標識抗体溶液として、ペルオキシダーゼ標識抗体を 2％BSA/0.1％Tween20PBSで2μg/mLに調整した溶液を用いて、各ウェルに50μLずつアプライし、シールをして室温で1時間静置する。
＜条件１＞と同様の方法で、洗浄（0.1％Tween20/PBS）工程、洗浄液除去工程、TMBとの反応工程、反応停止工程、及び吸光度測定工程を行う。【００８１】
＜条件３＞
＜条件１＞と同様の方法で、PSタグ化レクチンをELISA用カルボプレート（S-BIO MS-8708F）の各ウェル内に固定化し、洗浄（0.1％Tween20/PBS）、洗浄液除去工程を施す。
続いて、各ウェルに2％BSA/0.1％Tween20 PBSを250μLずつアプライし、室温で1時間静置し、350μL/wellのPBSで洗浄して洗浄液を除去する。
被検細胞（iPS細胞：201B7 sup）の希釈系列を、各ウェルに 50μLずつアプライし、室温で1時間静置後に、洗浄液としてPBSを用いて350μL/well で洗浄し、洗浄液を除去する。
次いで、検出用標識抗体溶液として、ペルオキシダーゼ標識抗体を 2％BSA/0.1％Tween20 PBSで2μg/mLに調整した溶液を用いて、各ウェルに50μLずつアプライし、室温で1時間静置する。
洗浄液としてPBSを用いて350μL/well で洗浄し、洗浄液を除去した後、＜条件１＞と同様の方法で、TMBとの反応工程、反応停止工程、及び吸光度測定工程を行う。【００８２】
＜条件４＞
アビジンプレート（ブロッキングレスタイプ S-BIO BS-X7603）を、洗浄液（0.1％Tween20/PBS）で350μL/well で2回洗浄し、PBS緩衝液で0.3μg/mLに調整したbiotin化rBC2LCNを、各ウェル内に50μlずつアプライする。室温で1時間静置後、洗浄液として、0.1％Tween20/PBSを用い、350μL/wellで5回洗浄し、洗浄液を除去する。
被検細胞（iPS細胞：201B7 sup）の希釈系列を、各ウェルに 50μLずつアプライし室温で1時間静置後に、洗浄液として0.1％Tween20/PBSを用いて350μL/well で洗浄し、洗浄液を除去する。
次いで、検出用標識抗体溶液として、ペルオキシダーゼ標識抗体をPBSで1μg/mLに調整した溶液を用いて、各ウェルに50μLずつアプライし、室温で1時間静置する。
洗浄液として0.1％Tween20/PBSで350μL/wellを用いて350μL/well で洗浄し、洗浄液を除去した後、＜条件１＞と同様の方法で、TMBとの反応工程、反応停止工程、及び吸光度測定工程を行う。
各条件を簡単に表にまとめると以下の（表１）となる。【００８３】
【表１】
2018190357.tif 000002
【００８４】
（９−２）最適化条件
いずれの実験も3回繰り返し、その平均を取った結果、PSIタグ及びPSSタグのいずれの場合も、＜条件１＞〜＜条件３＞を比較すると、＜条件１＞で行った場合が最も吸光度が高い結果が得られた。そして、rBC2LCNレクチンの場合はPSIタグよりも、PSSタグの方が吸光度が高かった（図２９、図３０）。
また、LLOD値については、PSIタグの場合は＜条件２＞の場合が最も低く、PSSタグの場合は＜条件２＞及び＜条件３＞のいずれも同程度に低かった。いずれの場合もアビジンプレートを用いた＜条件４＞の場合よりも低く、特に＜条件２＞の場合は、PSIタグ及びPSSタグのいずれにおいても有意差をもってアビジンプレートの結果に勝っていた（図３１）。
このことから、２次抗体（R-10G）溶液にブロッキング剤を添加する方法が有効であると考えられる。【００８５】
（実施例１０）PSタグ化レクチン固定化プレートのLLOD値を最小にするブロッキング剤の検索
（１０−１）各種ブロッキング剤の検討
本実験では、（実施例９）と同様にヒトiPS細胞とPSタグ化rBC2LCNレクチンを固定化したELISA用カルボプレートとの組合せを用い、（実施例９）で最も低いLLODが得られた条件３と同様のプロトコールで、その反応強度測定のLLOD値を最小にするブロッキング剤の検索を行った。
具体的には、＜条件３＞と同様に、PSタグ化rBC2LCNレクチンを、ELISA用カルボプレート（S-BIO MS-8708F）の各ウェルに固定化した後、下記（表１）に示したブロッキング剤など各種ブロッキング剤を0.1％Tween20で10倍希釈したものを用いて検出用ペルオキシダーゼ標識抗体を1μg/mLに調製し、条件３のプロトコールに従い、プレートリーダー（主波長 450 nm、副波長 620 nm）で吸光度を測定した（図３２）。
N101とN102は検量線を作成することが出来なかったので、検量線を作成できた下記（表１）の５種のブロッキング剤の効果について、更に詳細にBSAと比較して検討した。何れも３回実験を行い、得られた平均値とSDでグラフを作成した。その結果、rBC2LCN-PSSとブロッキング剤のうちコーティング剤含有ブロッキング剤である「prevelexTM LS1004（日産化学工業(株)製）」で最も低いLLODが得られることが分かった（図３３）。【００８６】
【表２】
2018190357.tif 000003
【図１】
2018190357.tif 000004
【図２】
2018190357.tif 000005
【図３】
2018190357.tif 000006
【図４】
2018190357.tif 000007
【図５Ａ】
2018190357.tif 000008
【図５Ｂ】
2018190357.tif 000009
【図６】
2018190357.tif 000010
【図７】
2018190357.tif 000011
【図８】
2018190357.tif 000012
【図９】
2018190357.tif 000013
【図１０】
2018190357.tif 000014
【図１１】
2018190357.tif 000015
【図１２】
2018190357.tif 000016
【図１３】
2018190357.tif 000017
【図１４】
2018190357.tif 000018
【図１５】
2018190357.tif 000019
【図１６】
2018190357.tif 000020
【図１７】
2018190357.tif 000021
【図１８】
2018190357.tif 000022
【図１９】
2018190357.tif 000023
【図２０】
2018190357.tif 000024
【図２１】
2018190357.tif 000025
【図２２】
2018190357.tif 000026
【図２３】
2018190357.tif 000027
【図２４】
2018190357.tif 000028
【図２５】
2018190357.tif 000029
【図２６】
2018190357.tif 000030
【図２７】
2018190357.tif 000031
【図２８】
2018190357.tif 000032
【図２９】
2018190357.tif 000033
【図３０】
2018190357.tif 000034
【図３１】
2018190357.tif 000035
【図３２】
2018190357.tif 000036
【図３３】
2018190357.tif 000037
【配列表】
2018190357000001.app
【国際調査報告】
2018190357.tif 000038
2018190357.tif 000039
2018190357.tif 000040
2018190357.tif 000041