(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞からの膵前駆細胞の製造方法に関する。より詳細には、サイクリン依存キナーゼ８及び／又はサイクリン依存キナーゼ１９（以下、CDK8/19と略す場合がある）に対する阻害活性を有する因子を作用させることを特徴とする膵前駆細胞の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CDK8/19阻害活性を有する因子の存在下でNKX6.1陰性細胞を培養することを含む、NKX6.1陽性細胞を製造する方法。
【請求項２】
CDK8/19阻害活性を有する因子と増殖因子の存在下でNKX6.1陰性細胞を培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
PDX-1陽性細胞が富化される、請求項1又は２に記載の方法。
【請求項４】
NKX6.1陽性細胞がPDX-1陽性細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ヒト細胞及びCDK8/19阻害活性を有する因子を含む細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも約１０％がNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞である細胞培養物。
【請求項６】
前記ヒト細胞の少なくとも約５０％が、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞である請求項５に記載の細胞培養物。
【請求項７】
前記ヒト細胞の少なくとも約８０％が、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞である請求項５に記載の細胞培養物。
【請求項８】
CDK8/19阻害活性を有する因子を使用して製造されるヒト多能性幹細胞由来のNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞。
【請求項９】
CDK8/19阻害活性を有する因子を使用して製造されるヒト多能性幹細胞由来のNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞を含む医薬。
【請求項１０】
CDK8/19阻害活性を有する因子を含む、膵前駆細胞への分化誘導剤。
【請求項１１】
CDK8/19阻害活性を有する因子を含む、膵前駆細胞への分化誘導用培地。
【請求項１２】
CDK8/19阻害活性を有する因子の膵前駆細胞への分化誘導剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１７−０４０２１９号（２０１７年３月３日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
［技術分野］
本発明は、多能性幹細胞からの膵前駆細胞の製造方法に関する。より詳細には、サイクリン依存キナーゼ８及び／又はサイクリン依存キナーゼ１９（以下、CDK8/19と略す場合がある）に対する阻害活性を有する因子を作用させることを特徴とする膵前駆細胞の製造方法に関する。【０００２】
［発明の背景］
iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞から膵前駆細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。【０００３】
従来、多能性幹細胞からの膵前駆細胞の分化誘導は、多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導し、これを膵前駆細胞に誘導する過程を、数段階のステップで行う。たとえば、Fiskらは、ヒト胚性幹細胞をアクチビンA、シクロパミン、ニコチンアミド等を用いて段階的に分化誘導することで、インスリン分泌細胞を誘導する方法を開示している（特許文献１）。【０００４】
Rezaniaらは、膵内分泌細胞に特徴的なマーカーを発現している細胞を、十分な量のサイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害剤を含む培地中で培養し、MAFAの発現の増加を生じさせる工程を含む、膵前駆細胞の分化誘導方法を開示している（特許文献２）。MMFAは成熟膵臓β細胞マーカーであり、CDK阻害剤は膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞をより成熟した膵β細胞に誘導する。使用されるサイクリン依存性キナーゼ（CDK）阻害剤は、CDK1,2,4,5,9を阻害し得ると記載されているが、CDK8やCDK19に対する阻害は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳ２００８／０１４５８８９号
【特許文献２】ＵＳ９２３４１７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、多能性幹細胞から膵前駆細胞を効率よく誘導するための新規な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、多能性幹細胞から膵前駆細胞を誘導する過程において、CDK8/19阻害活性を有する因子を作用させることで、NKX6.1陰性細胞をNKX6.1陽性細胞に分化誘導し、膵前駆細胞への効率的な分化誘導が可能になることを見出した。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［２６］を提供する。
［１］CDK8/19阻害活性を有する因子の存在下でNKX6.1陰性細胞を培養することを含む、NKX6.1陽性細胞を製造する方法；
［１Ａ］CDK8/19阻害活性を有する因子の存在下でNKX6.1陰性細胞を培養することを含む、NKX6.1陽性細胞またはNKX6.1陽性細胞を含む医薬を製造する方法；
［２］CDK8/19阻害活性を有する因子と増殖因子の存在下でNKX6.1陰性細胞を培養する、［１］に記載の方法；
［３］PDX-1陽性細胞が富化される、［１］又は［２］に記載の方法；
［４］NKX6.1陽性細胞がPDX-1陽性細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法；
［５］ヒト細胞及びCDK8/19阻害活性を有する因子を含む細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも約１０％がNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞である細胞培養物；
［５Ａ］ヒト多能性幹細胞由来のヒト細胞及びCDK8/19阻害活性を有する因子を含む細胞培養物であって、前記ヒト細胞の少なくとも約１０％がNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞である細胞培養物；
［６］前記ヒト細胞の少なくとも約５０％が、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞である［５］に記載の細胞培養物；
［７］前記ヒト細胞の少なくとも約８０％が、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞である［５］に記載の細胞培養物；
［８］CDK8/19阻害活性を有する因子を使用して製造されるヒト多能性幹細胞由来のNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞；
［９］CDK8/19阻害活性を有する因子を使用して製造されるヒト多能性幹細胞由来のNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞を含む医薬；
［９Ａ］糖尿病治療のために使用される、［８］又は［９］に記載の医薬；
［１０］CDK8/19阻害活性を有する因子を含む、膵前駆細胞への分化誘導剤；
［１１］CDK8/19阻害活性を有する因子を含む、膵前駆細胞への分化誘導用培地；
［１２］CDK8/19阻害活性を有する因子の膵前駆細胞への分化誘導剤としての使用；
［１３］化合物２（4-((4-フルオロフェニル)スルホニル)-3-(2-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-6-イルスルファニル)エチル)-3,4-ジヒドロキノキサリン-2(1H)-オン）又はその塩、化合物３（2-(ベンジルアミノ)-4-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル)ベンズアミド）又はその塩、化合物６（N-ブチル-8-(4-メトキシフェニル)-1,6-ナフチリジン-2-カルボキサミド）又はその塩及び化合物７（8-(4-メチルフェニル)-N,N-ジプロピル-1,6-ナフチリジン-2-カルボキサミド）又はその塩；
［１４］化合物２（4-((4-フルオロフェニル)スルホニル)-3-(2-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-6-イルスルファニル)エチル)-3,4-ジヒドロキノキサリン-2(1H)-オン）又はその塩；
［１５］化合物３（2-(ベンジルアミノ)-4-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル)ベンズアミド）又はその塩；
［１６］化合物６（N-ブチル-8-(4-メトキシフェニル)-1,6-ナフチリジン-2-カルボキサミド）又はその塩；
［１７］化合物７（8-(4-メチルフェニル)-N,N-ジプロピル-1,6-ナフチリジン-2-カルボキサミド）又はその塩；
［１８］CDK8/19阻害活性を有する因子が、US2012/0071477、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2013/116786、WO2014/0038958、WO2014/134169、JP2015/506376、US2015/0274726、US2016/0000787、WO2016/009076、WO2016/0016951、WO2016/018511、WO2016/100782及びWO2016/182904に記載の化合物のうち、選択的にCDK8/19阻害活性を有する化合物である、［１］〜[４]のいずれかに記載の方法；
［１９］後前腸細胞から膵前駆細胞への分化ステージにおいて、CDK8/19阻害活性を有する因子の存在下で培養することで、NKX6.1陰性細胞をNKX6.1陽性細胞へと誘導する、［１］〜[４]のいずれかに記載の方法；
［２０］培地に血清代替物及び抗生物質を含む、［１］〜[４]、[１８]、及び［１９］のいずれかに記載の方法；
［２１］血清代替物がB-27サプリメント、KSR、StemSure Serum Replacement、及びITS-Gから選択される、［１］〜[４]、及び[１８]〜[２０]のいずれかに記載の方法；
［２２］抗生物質がAntibiotic-Antimycotic、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びこれらの混合物から選択される、［２０］又は［２１］に記載の方法；
［２３］CDK8/19阻害活性を有する因子及び７０％以上のNKX6.1陽性細胞を含む、細胞培養物；
［２４］上記［１］〜[４]、及び[１８]〜[２２]のいずれかに記載の方法によって製造される、NKX6.1陽性細胞について富化された細胞集団；
［２５］上記［１］〜[４]、及び[１８]〜[２２]のいずれかに記載の方法によって製造される、NKX6.1陽性細胞を７０％以上含む細胞集団；
［２６］上記［２５]の細胞集団を含む、医薬組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、多能性幹細胞から膵前駆細胞の分化誘導過程において、NKX6.1陰性細胞からNKX6.1陽性細胞への分化を促し、膵前駆細胞を効率よく誘導しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、CDK8阻害活性及びCDK19阻害活性を有する様々な化学構造の化合物（化合物１〜７）を示す。
【図２】図２は、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞の割合（％）を示す。図２AはROCK阻害剤を含む培地を用いた場合（KENY50-KENT）、図２BはROCK阻害剤を含まない培地を用いた場合（KEN-KENT）。グラフは、左からiPS細胞、ステージ４の培養前の細胞（s3d2: ステージ3 デイ2）、ステージ４の培養後の細胞（CDK8/19阻害剤添加なし（陰性対照）、ステージ４の培養後の細胞（各種CDK8及びCDK 19阻害剤あり）を示す。
【図３】図３は、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞の割合（％）を示す。図３中、CDK1/2は、市販のCDK1/2阻害剤であるCAS443798-55-8（217714、メルク）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．用語
本明細書において、「約」又は「およそ」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ15%、10%、5%、又は1%の範囲を示す。
【００１２】
本明細書において、「実質的に（substantially）」又は「本質的に（essentially）」とは、基準値の90%以上、好ましくは95%、96%、97%、98%、又は99%以上の値であることを示す。「実質的に同一」又は「本質的に同一」とは、基準値との同一性が90％以上、好ましくは95%、96%、97%、98%、又は99%以上であることを意味し、「実質的に含まない（substantially free of）」又は「本質的に含まない（essentially free of）」とは、特定の物質を5%を超えて含まないこと、好ましくは、4%、3%、2%、1%を超えて含まないこと、又は検出不可能であることを意味する。
【００１３】
本明細書において、「〜を含む（comprise(s)又はcomprising）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
【００１４】
本明細書において、「〜からなる（consist(s) of又はconsisting of）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「〜から本質的になる」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
【００１５】
本明細書において、「促進する」、「増強する」、又は「増大する」とは、一般に、ビヒクル又はコントロールによって引き起こされる生理学的応答と比較して、より大きな応答を生じることを示す。例えば、「促進した」、「増大した」又は「増強した」応答は、好ましくは、統計的に有意な応答であり、ビヒクルもしくはコントロールによって生成される応答の1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍以上でありうる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「低下する」、「減少する」、又は「減弱する」とは、一般に、ビヒクル又はコントロールによって引き起こされる応答と比較して、より低い応答を生じることを示す。「低下した」、「減少した」又は「減弱した」応答は、好ましくは、統計的に有意な応答であり、ビヒクルもしくはコントロールによって生成される応答の1/1.1、1/1.2、1/1.5、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/15、1/20、1/30以下でありうる。
【００１７】
本明細書において、「エクスビボ（ex vivo）」とは、一般に、培養組織や培養細胞など、生体外の人工的な環境において生組織中で行われた実験又は測定を示すために使用される。使用される組織又は細胞は、保存のために凍結されてもよく、後に生体外処理のために解凍されたものでもよい。数日以上続けて、生細胞又は生組織の組織培養実験を行う場合は、「インビトロ（in vitro）」という用語が使用されるが、「インビトロ」は、「エクスビボ」と互換的に用いられる場合もある。これに対し、「インビボ（in vivo）」という用語は、一般に、細胞の増殖など、生体内で起きる現象を指すために使用される。
【００１８】
本明細書において、「フィーダー（細胞）を含まない」又は「フィーダーフリー」とは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。
なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンC処理などによって不活性化することができる。
【００１９】
本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。
【００２０】
本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ（成長させ）、かつ／又は分化させることを意味する。
【００２１】
本明細書において、「富化する（enrich）」及び「富化すること（enrichment）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（enriched）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも20％、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%富化される。
例えば、ステージ４でCDK8/19阻害活性を有する因子を加え4日間培養ことで、NKX6.1陽性細胞または／およびPDX-1陽性細胞が富化され、製造の効率が上がり、より安全性の高い細胞を作ることが可能となる。
【００２２】
本明細書において、「枯渇する（deplete）」及び「枯渇すること（depletion）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（depleted）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%減少（枯渇）している。
【００２３】
本明細書において、「純化する（purify）」及び「純化すること（purification）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（purified）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。
【００２４】
本明細書において、「単離された」とは、その元の環境から分離されている状態を指す。例えば、「単離された細胞集団」とは、インビトロ又は生体外において天然の細胞環境から、及び組織又は臓器の他の構成成分から分離されている細胞集団を示す。
【００２５】
本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型において細胞表面、細胞質内及び／又は核内等に特異的に発現されるタンパク質又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
【００２６】
マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカータンパク質に特異的な抗体としては、マーカータンパク質における特定のアミノ酸配列又はマーカータンパク質に結合した特定の糖鎖等に結合する抗体を用いることができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないマーカータンパク質（例えば転写因子またはそのサブユニットなど）の場合は、当該マーカータンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするマーカータンパク質を検出できる。この方法は、適当な細胞表面マーカーが認められない場合に好ましく用いられ得る。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。
【００２７】
本明細書中において、マーカータンパク質又は遺伝子が「陽性」であるとは、当該分野で公知の手法による検出可能量で発現していることを意味する。タンパク質の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、細胞内に発現し、細胞表面には現れないタンパク質（例えば転写因子またはそのサブユニットなど）の場合は、当該タンパク質とともにレポータータンパク質を発現させ、当該レポータータンパク質を検出することによって対象とするタンパク質を検出できる。、マーカータンパク質又は遺伝子が「陰性」であるとは、タンパク質又は遺伝子の発現量が、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップのような公知手法の全てあるいはいずれかにおいて検出下限値未満であることを意味する。  PDX1陽性マーカー及びNKX6.1陽性マーカーは、自体公知の方法（例えば、フローサイトメトリー）を利用して検出することができる。
【００２８】
本明細書において、「発現（expression）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
【００２９】
本明細書において、「自系」とは、同じ対象由来の細胞を指す。「同種異系」とは、比較する細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。「同系」とは、比較する細胞と遺伝的に同一である、異なる対象の細胞を指す。「異種」とは、比較する細胞とは異なる種の細胞を指す。
【００３０】
本明細書において、「多能性（pluripotency）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（pluripotency）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（totipotency）」とは区別される。
【００３１】
本明細書において「多能性（multipotency）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はmultipotentだが、pluripotentではない。
【００３２】
本明細書において、「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ES細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「iPS細胞」と称することもある）が挙げられる。
本明細書において、ヒト細胞とは、ヒト多能性幹細胞由来のヒト細胞を含む。
ヒト細胞は、好ましくは、ヒト多能性幹細胞由来のヒト細胞である。
【００３３】
「ES細胞」としては、マウスES細胞であれば、inGenious社、理研等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえばES細胞株としては、ESI Bio社が分譲するCHB-1〜CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1〜HUES28株等、WisCell Researchが分譲するH1株、H9株、理研が分譲するKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。
【００３４】
「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106））、ウイルスフリーで6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
【００３５】
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
人工多能性細胞株としては、NIH、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株が利用可能である。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学のFf-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、CDI社のMyCell iPS Cells（21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells（21526.101.10A)株、等が挙げられる。
【００３６】
「胚体内胚葉（definitive endoderm）細胞」とは、中内胚葉細胞に由来し、将来的に肝、膵、肺、小腸系に分化可能な細胞である。胚体内胚葉細胞は、通常SOX17陽性、CXCR4陽性、FOXA2陽性等によって特徴付けられる。胚体内胚葉細胞は、様々な誘導因子を用いて各種内胚葉系細胞へ分化誘導される。したがって、胚体内胚葉の誘導は、ヒト多能性幹細胞から内胚葉系細胞を誘導するための最初のステップともいえる。胚体内胚葉を誘導する方法は複数報告されており、市販のキットを利用することもできる。
【００３７】
本明細書において、「CDK8/19阻害活性を有する因子」とは、CDK8/19の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じCDKファミリーの他のタンパク質とは対照的に、CDK8は、細胞増殖には必要とされず、CDK8の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。CDK19とCDK8は上記で述べたように類似しており、CDK8阻害は通常CDK19の阻害も伴う。
本明細書において、CDK8/19阻害活性を有する因子の存在下でNKX6.1陰性細胞を培養することを含む、NKX6.1陽性細胞を製造する方法は、インビトロ（in vitro）または／およびインビボ（in vivo）で実施される。
【００３８】
「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（EGF）、酸性線維芽細胞増殖因子（aFGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、インスリン様増殖因子１（IGF-1）、インスリン様増殖因子２（IGF-2）、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、神経増殖因子（NGF）、血小板由来増殖因子（PDGF）、形質転換増殖因子ベータ（TGF-β）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、IL-1〜IL-18）、種々のコロニー−刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー−刺激因子（GM-CSF））、種々のインターフェロン（例えば、IFN-γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（SCF）及びエリスロポエチン（Epo）が挙げられる。
【００３９】
「ROCK阻害剤」とは、Rhoキナーゼ（ROCK:Rho-associated，coiled-coil containing protein kinase）を阻害する物質を意味し、ROCK IとROCK IIのいずれを阻害する物質であってもよい。ROCK阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、N-(4-ピリジニル)-4β-[(R)-1-アミノエチル]シクロヘキサン-1α-カルボアミド（本明細書中、Y-27632と称することもある）、Fasudil（HA1077）、(2S)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル]スルホニル]ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン（H-1152）、4β-[(1R)-1-アミノエチル]-N-(4-ピリジル)ベンゼン-1ゼンカルボアミド（Wf-536）、N-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4PER(R)-1-アミノエチル]シクロヘキサン-1α-カルボアミド（Y-30141）、N-(3-{[2-(4-アミノ-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-1-エチル-1H-イミダゾ[4, 5-c]ピリジン-6-イル]オキシ}フェニル)-4-{[2-(4-モルホリニル)エチル]-オキシ}ベンズアミド（GSK269962A）、N-(6-フルオロ-1H-インダゾール-5-イル)-6-メチル-2-オキソ-4-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-3,4-ジヒドロ-1H-ピリジン-5-カルボキサミド（GSK429286A）を挙げることができる。ROCK阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ROCKのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、ROCKに結合する抗体、ドミナントネガティブROCK変異体等もROCK阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【００４０】
「GSK3β阻害剤」とは、GSK3β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β）に対する阻害活性を有する物質である。GSK3（グリコーゲンシンターゼキナーゼ3）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。GSK3にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「GSK3β阻害剤」は、GSK3β阻害活性を有すれば特に限定されず、GSK3β阻害活性と合わせてGSK3α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
【００４１】
GSK3β阻害剤としては、CHIR98014（2-[[2-[(5-ニトロ-6-アミノピリジン-2-イル)アミノ]エチル]アミノ]-4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(1H−イミダゾール-1-イル)ピリミジン）、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]ニコチノニトリル）、TDZD-8(4-ベンジル-2-メチル-1，2，4-チアジアゾリジン-3，5-ジオン）、SB216763(3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2，5-ジオン）、TWS-119(3-[6-(3-アミノフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イルオキシ]フェノール)、ケンパウロン（Kenpaullone）、1-アザケンパウロン（Azakenpaullone）、SB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286(3-[(3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)アミノ]-4-(2-ニトロフェニル)-1H-ピロール-2，5-ジオン) 及びAR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-アセトキシム、ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム複合体、OTDZT、アルファ-4-ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。GSK3βはこれらに限定されるものではなく、GSK3βのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、GSK3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK3β変異体等もGSK3β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
【００４２】
本発明では、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。「血清代替物」としては、例えば、Knockout Serum Replacement（KSR:Invitrogen）、StemSure Serum Replacement（Wako）、B-27サプリメント、N2-サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、2-メルカプトエタノール、3'チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ITS-G）が挙げられる。血清代替物としては、B-27サプリメント、KSR、StemSure Serum Replacement、ITS-Gが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は0.01〜10重量％、好ましくは0.1〜2重量％である。
【００４３】
２．NKX6.1陽性細胞の製造方法
本発明は、CDK8/19阻害活性を有する因子の存在下でNKX6.1陰性細胞を培養することを含む、NKX6.1陽性細胞を製造する方法を提供する。
【００４４】
CDK8/19阻害活性を有する因子は、NKX6.1陰性細胞に作用して、NKX6.1陽性細胞に誘導する。換言すれば、CDK8/19阻害活性を有する因子は、NKX6.1陽性細胞を富化する。
【００４５】
本発明で使用する「CDK8/19阻害活性を有する因子」は、CDK8/19の阻害活性を有するものであれば特に限定されず、CDK8/19の機能を直接的又は間接的に阻害するあらゆる因子を使用することができる。「CDK8/19阻害活性を有する因子」とは、具体的には、CDK8/19を50％以上阻害する因子を指す。CDK8/19阻害活性の有無を見る方法としては、公知の方法から選択すればよく、例えば本明細書実施例１の方法が挙げられる。「CDK8/19阻害活性を有する因子」は、特許文献又は非特許文献から見つけることができるが、具体的には、「CDK8/19阻害活性を有する因子」としてはUS2012/0071477、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2013/116786、WO2014/0038958、WO2014/134169、JP2015/506376、US2015/0274726、US2016/0000787、WO2016/009076、WO2016/0016951、WO2016/018511、WO2016/100782及びWO2016/182904に記載の化合物のうち、CDK8/19阻害活性を有する化合物（又はその塩）が挙げられる。さらに具体的には、上記化合物のうち、CDK8/19に選択的に阻害活性を有する化合物（又はその塩）が挙げられる。
【００４６】
「CDK8/19阻害活性を有する因子」としては、以下一般式で示される構造式を有する化合物のうち、CDK8/19に選択的に阻害活性を有する化合物（又はその塩）が挙げられ、具体的には、以下一般式で示される構造式を有する化合物のうち、CDK8/19を50％以上阻害する化合物（又はその塩）が挙げられる。
【００４７】
CDK8/19阻害活性を有する化合物としては、式：
【化１】
2018159805.tif 000002
〔式中、環Ａは、置換基を有していてもよいベンゼンまたは置換基を有していてもよい複素環を示し（環Ａは、置換基を有していてもよい縮合環を形成してもよい）；
環ＢＤは、置換基を有していてもよいナフタレンまたは置換基を有していてもよい２または３環式複素環を示し（環ＢＤは、さらに置換基を有していてもよい縮合環を形成してもよい）；
Ｘは、リンカーを示す〕で表される化合物またはその塩、が挙げられる。
【００４８】
環Ａは、置換基を有していてもよいベンゼンまたは置換基を有していてもよい複素環を示す（環Ａは、縮合環を形成してもよい）。
環Ａで示される「置換基を有していてもよい複素環」の「複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、芳香族複素環および非芳香族複素環が挙げられる。
【００４９】
「芳香族複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する５ないし６員の芳香族複素環などが挙げられる。該「芳香族複素環」の好適な例としては、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、１，２，４−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、トリアゾール、テトラゾール、トリアジンなどの５ないし６員単環式芳香族複素環が挙げられる。
【００５０】
「非芳香族複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する３ないし１４員（好ましくは４ないし１０員）の非芳香族複素環などが挙げられる。該「非芳香族複素環」の好適な例としては、アジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピロリン、ピロリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾリン、チアゾリジン、テトラヒドロイソチアゾール、テトラヒドロオキサゾール、テトラヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、テトラヒドロピリジン、ジヒドロピリジン、ジヒドロチオピラン、テトラヒドロピリミジン、テトラヒドロピリダジン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパニン、ジアゼパン、アゼピン、アゾカン、ジアゾカン、オキセパンなどの４ないし８員単環式非芳香族複素環が挙げられる。
【００５１】
また、環Ａは、置換基を有していてもよい縮合環を形成してもよい。
環Ａが示す「置換基を有していてもよい縮合環」の「縮合環」としては、例えば、ナフタレンなどの芳香族炭化水素環；
ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾトリアゾール、イミダゾピリジン、チエノピリジン、フロピリジン、ピロロピリジン、ピラゾロピリジン、オキサゾロピリジン、チアゾロピリジン、イミダゾピラジン、イミダゾピリミジン、チエノピリミジン、フロピリミジン、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、チアゾロピリミジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロトリアジン、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フェノキサチイン、インドリン、イソインドリン、１Ｈ−インダゾール、プリン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジンなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環；
ジヒドロベンゾフラン、ジヒドロベンゾイミダゾール、ジヒドロベンゾオキサゾール、ジヒドロベンゾチアゾール、ジヒドロベンゾイソチアゾール、ジヒドロナフト［２，３−ｂ］チオフェン、テトラヒドロイソキノリン、テトラヒドロキノリン、４Ｈ−キノリジン、インドリン、イソインドリン、テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノキサリン、テトラヒドロフェナントリジン、ヘキサヒドロフェノチアジン、ヘキサヒドロフェノキサジン、テトラヒドロフタラジン、テトラヒドロナフチリジン、テトラヒドロキナゾリン、テトラヒドロシンノリン、テトラヒドロカルバゾール、テトラヒドロ−β−カルボリン、テトラヒドロアクリジン、テトラヒドロフェナジン、テトラヒドロチオキサンテン、オクタヒドロイソキノリンなどの９ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）非芳香族複素環が挙げられる。
【００５２】
環ＢＤは、置換基を有していてもよいナフタレンまたは置換基を有していてもよい２または３環式複素環を示す（環ＢＤは、さらに置換基を有していてもよい縮合環を形成してもよい）。
【００５３】
環ＢＤで示される「置換基を有していてもよい２または３環式複素環」の「２または３環式複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する８ないし１４員の複素環などが挙げられる。該「２または３環式複素環」の好適な例としては、
ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾトリアゾール、イミダゾピリジン、チエノピリジン、フロピリジン、ピロロピリジン、ピラゾロピリジン、オキサゾロピリジン、チアゾロピリジン、イミダゾピラジン、イミダゾピリミジン、チエノピリミジン、フロピリミジン、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、チアゾロピリミジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロトリアジン、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フェノキサチイン、インドリン、イソインドリン、１Ｈ−インダゾール、プリン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジンなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環；
ジヒドロベンゾフラン、ジヒドロベンゾイミダゾール、ジヒドロベンゾオキサゾール、ジヒドロベンゾチアゾール、ジヒドロベンゾイソチアゾール、ジヒドロナフト［２，３−ｂ］チオフェン、テトラヒドロイソキノリン、テトラヒドロキノリン、４Ｈ−キノリジン、インドリン、イソインドリン、テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン、テトラヒドロベンゾアゼピン、テトラヒドロキノキサリン、テトラヒドロフェナントリジン、ヘキサヒドロフェノチアジン、ヘキサヒドロフェノキサジン、テトラヒドロフタラジン、テトラヒドロナフチリジン、テトラヒドロキナゾリン、テトラヒドロシンノリン、テトラヒドロカルバゾール、テトラヒドロ−β−カルボリン、テトラヒドロアクリジン、テトラヒドロフェナジン、テトラヒドロチオキサンテン、オクタヒドロイソキノリンなどの９ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）非芳香族複素環が挙げられる。
【００５４】
また、環ＢＤは、さらに置換基を有していてもよい縮合環を形成してもよい。
環ＢＤが示す「さらに置換基を有していてもよい縮合環」の「縮合環」としては、例えば、ベンゼンまたは上記単環複素環（５ないし６員単環式芳香族複素環または４ないし８員単環式非芳香族複素環）に、ナフタレンなどの芳香族炭化水素環、８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環、または９ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）非芳香族複素環が縮合して形成された環が挙げられる。
Ｘで示されるリンカーとしては、例えば、結合手、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ−置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、置換基を有していてもよいアルキレン基（好ましくはＣ１−１３アルキレン基）、または置換基を有していてもよいアルケニレン基（好ましくはＣ２−１３アルケニレン基）で、該アルキレン基または該アルケニレン基の中の−Ｃ−が−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−で置換されていてもよい基などが用いられる。ここで、アルキレン基またはアルケニレン基の中の−Ｃ−が−Ｏ−、−Ｎ−または−Ｓ−に置換される位置は、該アルキレン基または該アルケニレン基の末端または鎖中の何れであってもよい。
また、「アルキレン基」または「アルケニレン基」の置換基としては、例えばＣ１−６アルキル基、オキソ基、Ｃ６−１４アリール基（例、フェニル）などが挙げられる。置換基の数は、例えば１ないし３個である。
【００５５】
本明細書中、「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよい複素環基、アシル基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいカルバモイル基、置換されていてもよいチオカルバモイル基、置換されていてもよいスルファモイル基、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいスルファニル（ＳＨ）基、置換されていてもよいシリル基が挙げられる。
【００５６】
本明細書中、「炭化水素基」（「置換されていてもよい炭化水素基」における「炭化水素基」を含む）としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基が挙げられる。
【００５７】
本明細書中、「置換されていてもよい炭化水素基」としては、例えば、下記の置換基群Ａから選ばれる置換基を有していてもよい炭化水素基が挙げられる。
［置換基群Ａ］
（１）ハロゲン原子、
（２）ニトロ基、
（３）シアノ基、
（４）オキソ基、
（５）ヒドロキシ基、
（６）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、
（７）Ｃ６−１４アリールオキシ基（例、フェノキシ、ナフトキシ）、
（８）Ｃ７−１６アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ）、
（９）５ないし１４員芳香族複素環オキシ基（例、ピリジルオキシ）、
（１０）３ないし１４員非芳香族複素環オキシ基（例、モルホリニルオキシ、ピペリジニルオキシ）、
（１１）Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ基（例、アセトキシ、プロパノイルオキシ）、
（１２）Ｃ６−１４アリール−カルボニルオキシ基（例、ベンゾイルオキシ、１−ナフトイルオキシ、２−ナフトイルオキシ）、
（１３）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルオキシ基（例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシ）、
（１４）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ基（例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシ、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシ）、
（１５）Ｃ６−１４アリール−カルバモイルオキシ基（例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシ）、
（１６）５ないし１４員芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、ニコチノイルオキシ）、
（１７）３ないし１４員非芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、モルホリニルカルボニルオキシ、ピペリジニルカルボニルオキシ）、
（１８）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルホニルオキシ基（例、メチルスルホニルオキシ、トリフルオロメチルスルホニルオキシ）、
（１９）Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１４アリールスルホニルオキシ基（例、フェニルスルホニルオキシ、トルエンスルホニルオキシ）、
（２０）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルチオ基、
（２１）５ないし１４員芳香族複素環基  、
（２２）３ないし１４員非芳香族複素環基  、
（２３）ホルミル基、
（２４）カルボキシ基、
（２５）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル−カルボニル基、
（２６）Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、
（２７）５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、
（２８）３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、
（２９）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、
（３０）Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基（例、フェニルオキシカルボニル、１−ナフチルオキシカルボニル、２−ナフチルオキシカルボニル）、
（３１）Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、
（３２）カルバモイル基、
（３３）チオカルバモイル基、
（３４）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、
（３５）Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、
（３６）５ないし１４員芳香族複素環カルバモイル基（例、ピリジルカルバモイル、チエニルカルバモイル）、
（３７）３ないし１４員非芳香族複素環カルバモイル基（例、モルホリニルカルバモイル、ピペリジニルカルバモイル）、
（３８）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルホニル基、
（３９）Ｃ６−１４アリールスルホニル基、
（４０）５ないし１４員芳香族複素環スルホニル基（例、ピリジルスルホニル、チエニルスルホニル）、
（４１）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキルスルフィニル基、
（４２）Ｃ６−１４アリールスルフィニル基（例、フェニルスルフィニル、１−ナフチルスルフィニル、２−ナフチルスルフィニル）、
（４３）５ないし１４員芳香族複素環スルフィニル基（例、ピリジルスルフィニル、チエニルスルフィニル）、
（４４）アミノ基、
（４５）モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基（例、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアミノ）、
（４６）モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリールアミノ基（例、フェニルアミノ）、
（４７）５ないし１４員芳香族複素環アミノ基（例、ピリジルアミノ）、
（４８）Ｃ７−１６アラルキルアミノ基（例、ベンジルアミノ）、
（４９）ホルミルアミノ基、
（５０）Ｃ１−６アルキル−カルボニルアミノ基（例、アセチルアミノ、プロパノイルアミノ、ブタノイルアミノ）、
（５１）（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル−カルボニル）アミノ基（例、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ）、
（５２）Ｃ６−１４アリール−カルボニルアミノ基（例、フェニルカルボニルアミノ、ナフチルカルボニルアミノ）、
（５３）Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ基（例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノ、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）、
（５４）Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニルアミノ基（例、ベンジルオキシカルボニルアミノ）、
（５５）Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ基（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ）、
（５６）Ｃ１−６アルキル基で置換されていてもよいＣ６−１４アリールスルホニルアミノ基（例、フェニルスルホニルアミノ、トルエンスルホニルアミノ）、
（５７）ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル基、
（５８）Ｃ２−６アルケニル基、
（５９）Ｃ２−６アルキニル基、
（６０）Ｃ３−１０シクロアルキル基、
（６１）Ｃ３−１０シクロアルケニル基、及び
（６２）Ｃ６−１４アリール基。
【００５８】
「置換されていてもよい炭化水素基」における上記置換基の数は、例えば、１ないし５個、好ましくは１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
本明細書中、「複素環基」（「置換されていてもよい複素環基」における「複素環基」を含む）としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、(i)芳香族複素環基、(ii)非芳香族複素環基および(iii)７ないし１０員複素架橋環基が挙げられる。
【００５９】
本明細書中、「芳香族複素環基」（「５ないし１４員芳香族複素環基」を含む）としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環基が挙げられる。
該「芳香族複素環基」の好適な例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの５ないし６員単環式芳香族複素環基；
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト［２，３−ｂ］チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの８ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）芳香族複素環基が挙げられる。
【００６０】
本明細書中、「非芳香族複素環基」（「３ないし１４員非芳香族複素環基」を含む）としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし４個のヘテロ原子を含有する３ないし１４員（好ましくは４ないし１０員）の非芳香族複素環基が挙げられる。
該「非芳香族複素環基」の好適な例としては、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロイソチアゾリル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロピリダジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、アゼパニル、ジアゼパニル、アゼピニル、オキセパニル、アゾカニル、ジアゾカニルなどの３ないし８員単環式非芳香族複素環基；
ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソチアゾリル、ジヒドロナフト［２，３−ｂ］チエニル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル、４Ｈ−キノリジニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジニル、テトラヒドロベンゾアゼピニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロフェナントリジニル、ヘキサヒドロフェノチアジニル、ヘキサヒドロフェノキサジニル、テトラヒドロフタラジニル、テトラヒドロナフチリジニル、テトラヒドロキナゾリニル、テトラヒドロシンノリニル、テトラヒドロカルバゾリル、テトラヒドロ−β−カルボリニル、テトラヒドロアクリジニル、テトラヒドロフェナジニル、テトラヒドロチオキサンテニル、オクタヒドロイソキノリルなどの９ないし１４員縮合多環式（好ましくは２または３環式）非芳香族複素環基が挙げられる。
【００６１】
本明細書中、「７ないし１０員複素架橋環基」の好適な例としては、キヌクリジニル、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタニルが挙げられる。
本明細書中、「含窒素複素環基」としては、「複素環基」のうち、環構成原子として少なくとも１個以上の窒素原子を含有するものが挙げられる。
本明細書中、「置換されていてもよい複素環基」としては、例えば、前記した置換基群Ａから選ばれる置換基を有していてもよい複素環基が挙げられる。
「置換されていてもよい複素環基」における置換基の数は、例えば、１ないし３個である。置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
【００６２】
本明細書中、「アシル基」としては、例えば、「ハロゲン原子、ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、ヒドロキシ基、ニトロ基、シアノ基、アミノ基およびカルバモイル基から選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、５ないし１４員芳香族複素環基および３ないし１４員非芳香族複素環基から選ばれる１または２個の置換基」をそれぞれ有していてもよい、ホルミル基、カルボキシ基、カルバモイル基、チオカルバモイル基、スルフィノ基、スルホ基、スルファモイル基、ホスホノ基が挙げられる。
また、「アシル基」としては、炭化水素−スルホニル基、複素環−スルホニル基、炭化水素−スルフィニル基、複素環−スルフィニル基も挙げられる。
ここで、炭化水素−スルホニル基とは、炭化水素基が結合したスルホニル基を、複素環−スルホニル基とは、複素環基が結合したスルホニル基を、炭化水素−スルフィニル基とは、炭化水素基が結合したスルフィニル基を、複素環−スルフィニル基とは、複素環基が結合したスルフィニル基を、それぞれ意味する。
「アシル基」の好適な例としては、ホルミル基、カルボキシ基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ２−６アルケニル−カルボニル基（例、クロトノイル）、Ｃ３−１０シクロアルキル−カルボニル基（例、シクロブタンカルボニル、シクロペンタンカルボニル、シクロヘキサンカルボニル、シクロヘプタンカルボニル）、Ｃ３−１０シクロアルケニル−カルボニル基（例、２−シクロヘキセンカルボニル）、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、Ｃ６−１４アリールオキシ−カルボニル基（例、フェニルオキシカルボニル、ナフチルオキシカルボニル）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ−カルボニル基（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニル）、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−カルバモイル基（例、ジアリルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−カルバモイル基（例、シクロプロピルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、５ないし１４員芳香族複素環カルバモイル基（例、ピリジルカルバモイル）、チオカルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−チオカルバモイル基（例、メチルチオカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−チオカルバモイル基（例、ジアリルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−チオカルバモイル基（例、シクロプロピルチオカルバモイル、シクロヘキシルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−チオカルバモイル基（例、フェニルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−チオカルバモイル基（例、ベンジルチオカルバモイル、フェネチルチオカルバモイル）、５ないし１４員芳香族複素環チオカルバモイル基（例、ピリジルチオカルバモイル）、スルフィノ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基（例、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル）、スルホ基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ６−１４アリールスルホニル基、ホスホノ基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキルホスホノ基（例、ジメチルホスホノ、ジエチルホスホノ、ジイソプロピルホスホノ、ジブチルホスホノ）が挙げられる。
【００６３】
本明細書中、「置換されていてもよいアミノ基」としては、例えば、置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基およびＣ６−１４アリールスルホニル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいアミノ基が挙げられる。
置換されていてもよいアミノ基の好適な例としては、アミノ基、モノ−またはジ−（ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル）アミノ基（例、メチルアミノ、トリフルオロメチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、ジブチルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニルアミノ基（例、ジアリルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキルアミノ基（例、シクロプロピルアミノ、シクロヘキシルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリールアミノ基（例、フェニルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキルアミノ基（例、ベンジルアミノ、ジベンジルアミノ）、モノ−またはジ−（ハロゲン化されていてもよいＣ１−６アルキル）−カルボニルアミノ基（例、アセチルアミノ、プロピオニルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニルアミノ基（例、ベンゾイルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルボニルアミノ基（例、ベンジルカルボニルアミノ）、モノ−またはジ−５ないし１４員芳香族複素環カルボニルアミノ基（例、ニコチノイルアミノ、イソニコチノイルアミノ）、モノ−またはジ−３ないし１４員非芳香族複素環カルボニルアミノ基（例、ピペリジニルカルボニルアミノ）、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルアミノ基（例、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）、５ないし１４員芳香族複素環アミノ基（例、ピリジルアミノ）、カルバモイルアミノ基、（モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル）アミノ基（例、メチルカルバモイルアミノ）、（モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル）アミノ基（例、ベンジルカルバモイルアミノ）、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ基（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノ）、Ｃ６−１４アリールスルホニルアミノ基（例、フェニルスルホニルアミノ）、（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ１−６アルキル−カルボニル）アミノ基（例、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルアミノ）、（Ｃ１−６アルキル）（Ｃ６−１４アリール−カルボニル）アミノ基（例、Ｎ−ベンゾイル−Ｎ−メチルアミノ）が挙げられる。
【００６４】
本明細書中、「置換されていてもよいカルバモイル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基およびモノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいカルバモイル基が挙げられる。
置換されていてもよいカルバモイル基の好適な例としては、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−カルバモイル基（例、ジアリルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−カルバモイル基（例、シクロプロピルカルバモイル、シクロヘキシルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルバモイル基（例、フェニルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル−カルバモイル基（例、アセチルカルバモイル、プロピオニルカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニル−カルバモイル基（例、ベンゾイルカルバモイル）、５ないし１４員芳香族複素環カルバモイル基（例、ピリジルカルバモイル）が挙げられる。
【００６５】
本明細書中、「置換されていてもよいチオカルバモイル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基およびモノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいチオカルバモイル基が挙げられる。
置換されていてもよいチオカルバモイル基の好適な例としては、チオカルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−チオカルバモイル基（例、メチルチオカルバモイル、エチルチオカルバモイル、ジメチルチオカルバモイル、ジエチルチオカルバモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−チオカルバモイル基（例、ジアリルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−チオカルバモイル基（例、シクロプロピルチオカルバモイル、シクロヘキシルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−チオカルバモイル基（例、フェニルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−チオカルバモイル基（例、ベンジルチオカルバモイル、フェネチルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル−チオカルバモイル基（例、アセチルチオカルバモイル、プロピオニルチオカルバモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニル−チオカルバモイル基（例、ベンゾイルチオカルバモイル）、５ないし１４員芳香族複素環チオカルバモイル基（例、ピリジルチオカルバモイル）が挙げられる。
【００６６】
本明細書中、「置換されていてもよいスルファモイル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基およびモノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基から選ばれる１または２個の置換基」を有していてもよいスルファモイル基が挙げられる。
置換されていてもよいスルファモイル基の好適な例としては、スルファモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−スルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ２−６アルケニル−スルファモイル基（例、ジアリルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ３−１０シクロアルキル−スルファモイル基（例、シクロプロピルスルファモイル、シクロヘキシルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−スルファモイル基（例、フェニルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−スルファモイル基（例、ベンジルスルファモイル、フェネチルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルボニル−スルファモイル基（例、アセチルスルファモイル、プロピオニルスルファモイル）、モノ−またはジ−Ｃ６−１４アリール−カルボニル−スルファモイル基（例、ベンゾイルスルファモイル）、５ないし１４員芳香族複素環スルファモイル基（例、ピリジルスルファモイル）が挙げられる。
【００６７】
本明細書中、「置換されていてもよいヒドロキシ基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環カルボニル基、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニル基、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、５ないし１４員芳香族複素環基、カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ１−６アルキル−カルバモイル基、モノ−またはジ−Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基およびＣ６−１４アリールスルホニル基から選ばれる置換基」を有していてもよいヒドロキシ基が挙げられる。
置換されていてもよいヒドロキシ基の好適な例としては、ヒドロキシ基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基（例、アリルオキシ、２−ブテニルオキシ、２−ペンテニルオキシ、３−ヘキセニルオキシ）、Ｃ３−１０シクロアルキルオキシ基（例、シクロヘキシルオキシ）、Ｃ６−１４アリールオキシ基（例、フェノキシ、ナフチルオキシ）、Ｃ７−１６アラルキルオキシ基（例、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ）、Ｃ１−６アルキル−カルボニルオキシ基（例、アセチルオキシ、プロピオニルオキシ、ブチリルオキシ、イソブチリルオキシ、ピバロイルオキシ）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルオキシ基（例、ベンゾイルオキシ）、Ｃ７−１６アラルキル−カルボニルオキシ基（例、ベンジルカルボニルオキシ）、５ないし１４員芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、ニコチノイルオキシ）、３ないし１４員非芳香族複素環カルボニルオキシ基（例、ピペリジニルカルボニルオキシ）、Ｃ１−６アルコキシ−カルボニルオキシ基（例、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルオキシ）、５ないし１４員芳香族複素環オキシ基（例、ピリジルオキシ）、カルバモイルオキシ基、Ｃ１−６アルキル−カルバモイルオキシ基（例、メチルカルバモイルオキシ）、Ｃ７−１６アラルキル−カルバモイルオキシ基（例、ベンジルカルバモイルオキシ）、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ基（例、メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ）、Ｃ６−１４アリールスルホニルオキシ基（例、フェニルスルホニルオキシ）が挙げられる。
【００６８】
本明細書中、「置換されていてもよいスルファニル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、Ｃ６−１４アリール−カルボニル基および５ないし１４員芳香族複素環基から選ばれる置換基」を有していてもよいスルファニル基、ハロゲン化されたスルファニル基が挙げられる。
置換されていてもよいスルファニル基の好適な例としては、スルファニル（−ＳＨ）基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ２−６アルケニルチオ基（例、アリルチオ、２−ブテニルチオ、２−ペンテニルチオ、３−ヘキセニルチオ）、Ｃ３−１０シクロアルキルチオ基（例、シクロヘキシルチオ）、Ｃ６−１４アリールチオ基（例、フェニルチオ、ナフチルチオ）、Ｃ７−１６アラルキルチオ基（例、ベンジルチオ、フェネチルチオ）、Ｃ１−６アルキル−カルボニルチオ基（例、アセチルチオ、プロピオニルチオ、ブチリルチオ、イソブチリルチオ、ピバロイルチオ）、Ｃ６−１４アリール−カルボニルチオ基（例、ベンゾイルチオ）、５ないし１４員芳香族複素環チオ基（例、ピリジルチオ）、ハロゲン化チオ基（例、ペンタフルオロチオ）が挙げられる。
【００６９】
本明細書中、「置換されていてもよいシリル基」としては、例えば、「置換基群Ａから選ばれる１ないし３個の置換基をそれぞれ有していてもよい、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ６−１４アリール基およびＣ７−１６アラルキル基から選ばれる１ないし３個の置換基」を有していてもよいシリル基が挙げられる。
置換されていてもよいシリル基の好適な例としては、トリ−Ｃ１−６アルキルシリル基（例、トリメチルシリル、tert-ブチル（ジメチル）シリル）が挙げられる。
「CDK8/19阻害活性を有する因子」としては、たとえば、下記及び図１に記載の化合物１〜７又はその塩を使用することができる。化合物１〜５はフリー体が好ましく、化合物６及び７はトリフルオロ酢酸塩が好ましい。
【００７０】
【化２】
2018159805.tif 000003
【００７１】
CDK8/19阻害活性を有する因子は、増殖因子の存在下において細胞に作用させることが好ましい。増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、EGF及び／又はKGFがより好ましく、EGF及びKGFがさらに好ましい。
【００７２】
CDK8/19阻害活性を有する因子により、NKX6.1陽性細胞と同時に、PDX-1陽性細胞をも富化される。すなわち、CDK8/19阻害活性を有する因子によって、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞が富化される。
【００７３】
３．膵前駆細胞の製造方法（分化誘導）
多能性幹細胞から膵前駆細胞を誘導する過程は、４つのステージ：ステージ１：多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞への分化、ステージ２：胚体内胚葉細胞から原腸管細胞への分化、ステージ３：原腸管細胞から後前腸細胞への分化、ステージ４：後前腸細胞から膵前駆細胞への分化、に分けることができる。CDK8/19阻害活性を有する因子は、とくにステージ４において、後前腸細胞集団に作用し、膵前駆細胞への分化を促す。
【００７４】
本発明は、CDK8/19阻害活性を有する因子を利用した、多能性細胞からNKX6.1陽性及びPDX-1陽性の膵前駆細胞を製造する方法も提供する。前記方法は、以下の工程を含む。
工程１）ヒト多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞を分化誘導する；
工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞を分化誘導する；
工程３）原腸管細胞から後前腸細胞を分化誘導する；
工程４）後前腸細胞をCDK8/19阻害活性を有する因子を含む培地で培養する。
【００７５】
多能性幹細胞は、分化培養に先だって、常法にしたがい、多能性幹細胞用培地で培養する。多能性幹細胞用培地としては、市販のStemFit（登録商標）（リプロセル）などを用いることができる。この際、必要に応じて、ROCK阻害剤（例えば、Y-27632）等を含む培地で予め１日あるいは一晩培養してもよい。
【００７６】
工程１）胚体内胚葉への分化
ヒト多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。ヒト多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、ヒト多能性幹細胞は、アクチビンAを含む培地、より好ましくはアクチビンA、ROCK阻害剤、GSK3β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、22000〜150000 cells／cm2、好ましくは22000〜100000 cells／cm2、より好ましくは22000〜80000 cells／cm2である。培養期間は1日〜4日、好ましくは1日〜3日、特に好ましくは3日である。
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。
【００７７】
本工程で用いる培地としては、RPMI 1640培地、MEM培地、iMEM培地、DMEM／F12培地、Improved MEM Zinc Option培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。
【００７８】
アクチビンAの培地中の濃度は、通常30〜200ng/mL、好ましくは50〜150ng/mL、より好ましくは70〜120ng/mL、特に好ましくは約100ng/mLである。
【００７９】
GSK3β阻害剤の培地中の濃度は、用いるGSK3β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばGSK3β阻害剤としてCHIRを使用する場合の濃度は、通常2〜5μM、好ましくは2〜4μM、特に好ましくは約3μMである。
【００８０】
ROCK阻害剤の培地中の濃度は、用いるROCK阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばROCK阻害剤としてY27632を使用する場合の濃度は、通常5〜20μM、好ましくは5〜15μM、特に好ましくは約10μMである。
【００８１】
具体的には、アクチビンA、ROCK阻害剤、GSK3β阻害剤を含む培地で1日培養した後、アクチビンAのみを含む培地で1日毎に培地を交換しながらさらに2日培養する。
【００８２】
工程２）原腸管細胞への分化
ステージ１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日〜８日、好ましくは約４日である。
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。
【００８３】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００８４】
増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、EGF及び／又はKGFがより好ましく、KGFがさらに好ましい。
【００８５】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約0.1nM〜1000μM、好ましくは約0.1nM〜100μMである。EGFの場合、その濃度は、約5〜2000ng／ml（すなわち、約0.8〜320nM）、好ましくは約5〜1000ng／ml（すなわち、約0.8〜160nM）、より好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約1.6〜160nM）である。FGF10の場合、その濃度は、約5〜2000ng／ml（すなわち、約0.3〜116nM）、好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約0.6〜58nM）、より好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約0.6〜58nM）である。例えば増殖因子としてKGFを使用する場合の濃度は、通常5〜150ng/mL、好ましくは30〜100ng/mL、特に好ましくは約50ng/mLである。
【００８６】
工程３）後前腸細胞への分化
工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日〜５日、好ましくは約２日程度である。
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。
【００８７】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００８８】
増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、EGF及び／又はKGFがより好ましく、KGFがさらに好ましい。
【００８９】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約0.1nM〜1000μM、好ましくは約0.1nM〜100μMである。EGFの場合、その濃度は、約5〜2000ng／ml（すなわち、約0.8〜320nM）、好ましくは約5〜1000ng／ml（すなわち、約0.8〜160nM）、より好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約1.6〜160nM）である。FGF10の場合、その濃度は、約5〜2000ng／ml（すなわち、約0.3〜116nM）、好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約0.6〜58nM）、より好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約0.6〜58nM）である。例えば増殖因子としてKGFを使用する場合の濃度は、通常5〜150ng/mL、好ましくは30〜100ng/mL、特に好ましくは約50ng/mLである。
【００９０】
シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常0.5〜1.5μM、好ましくは0.3〜1.0μM、特に好ましくは約0.5μMである。
【００９１】
ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常10〜200ng/mL、好ましくは50〜150ng/mL、特に好ましくは約100ng/mLである。
【００９２】
工程４）膵前駆細胞への分化
工程３）で得られた後前腸細胞を、さらにCDK8/19阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはCDK8/19阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞（NKX6.1陽性及びPDX1陽性細胞を含む細胞集団）に分化誘導する。培養期間は２日〜１０日、好ましくは約５日程度である。
【００９３】
工程３）で得られた後前腸細胞を、既報（Toyoda et al.,Stem cell Research(2015)14, 185-197)に従い、0.25%トリプシン-EDTAで処理後にピペッティングすることにより分散し、0.25%トリプシン-EDTAを遠心分離して懸濁した後、工程４の新しい培地に再播種する。
【００９４】
培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
【００９５】
CDK8/19阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約0.00001μM-5μM、好ましくは0.00001μM-1μMである。CDK8/19阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、CDK8/19に対して50%以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。
【００９６】
増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、KGF及び／又はEGFがより好ましく、KGF及びEGFがさらに好ましい。
【００９７】
増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約0.1nM〜1000μM、好ましくは約0.1nM〜100μMである。EGFの場合、その濃度は、約5〜2000ng／ml（すなわち、約0.8〜320nM）、好ましくは約5〜1000ng／ml（すなわち、約0.8〜160nM）、より好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約1.6〜160nM）である。FGF10の場合、その濃度は、約5〜2000ng／ml（すなわち、約0.3〜116nM）、好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約0.6〜58nM）、より好ましくは約10〜1000ng／ml（すなわち、約0.6〜58nM）である。例えば増殖因子としてKGF及びEGFを使用する場合の濃度は、KGFは通常通常5〜150ng/mL、好ましくは30〜100ng/mL、特に好ましくは約50ng/mL、EGFは通常10〜200ng/mL、好ましくは50〜150ng/mL、特に好ましくは約100ng/mLである。
【００９８】
工程４）における培養の最初の1日はROCK阻害剤の存在下で行い、以後はROCK阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
【００９９】
CDK8/19阻害活性を有する因子を作用させることで、凝集塊形成後においても分化誘導効果を示すことが確認されている。
【０１００】
いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、B-27サプリメント、ITS-G）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質（例えば、Antibiotic-Antimycotic（本明細書中、AAと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンB）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常0.01〜20重量％、好ましくは0.1〜10重量％である。
【０１０１】
また細胞培養は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、OptiCell（製品名）（Nunc社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：BDマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Type I-collagen、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ-D-リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ-D-リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
【０１０２】
培養温度は、特に限定されないが、30〜40℃（例えば、37℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5％程度である。
【０１０３】
工程４）で得られた膵前駆細胞は、表面マーカーであるPDX1及び／又はNKX6.1を利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗PDX-1抗体及び／又は抗NKX6.1抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
【０１０４】
４．NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞が富化された培養物
本発明は、ヒト細胞及びCDK8/19阻害活性を有する因子を含む細胞培養物であって、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞が富化された細胞培養物も提供する。前記細胞培養物は、ヒト細胞の少なくとも約１０％がNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞であり、好ましくは約３０％、より好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、とくに好ましくは約８０％、もっとも好ましくは約９０％がNKX6.1陽性及びPDX-1陽性の細胞である。
【０１０５】
５．NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞
本発明は、CDK8/19阻害活性を有する因子を使用して製造されるヒト多能性幹細胞由来のNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞も提供する。
【０１０６】
本発明は、CDK8/19阻害活性を有する因子を使用して製造されるヒト多能性幹細胞由来のNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞を含む医薬も提供する。NKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞は膵前駆細胞として機能し、公知文献に記載の方法に従い、インスリンを産生し得るβ細胞に分化することで、β細胞不全による糖尿病等の治療に有用である。それゆえ、本発明の医薬は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、糖尿病、特にI型糖尿病を治療するための細胞医薬あるいはデバイスとして有用である。
【０１０７】
６．膵前駆細胞への分化誘導剤
CDK8/19阻害活性を有する因子によって誘導されるNKX6.1陽性及びPDX-1陽性細胞は膵前駆細胞として機能する。したがって、CDK8/19阻害活性を有する因子は、膵前駆細胞への分化誘導剤として利用できる。また、CDK8/19阻害活性を有する因子を含む培地は、膵前駆細胞への分化誘導用培地として利用できる。
本明細書において、CDK8/19阻害活性を有する因子を含む培地の、膵前駆細胞への分化誘導用培地としての利用は、インビトロ（in vitro）または／およびインビボ（in vivo）で実施される。
【実施例】
【０１０８】
以下、参考例及び実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１０９】
参考例１：ヒトiPS細胞Ff-WJ-18細胞の維持培養
ヒトiPS細胞はFf-WJ-18細胞（京都大学）を使用した。
Ff-WJ-18細胞の維持培養には、培地としてStemFit（登録商標）AK03N培地（味の素ヘルシーサプライ株式会社）を使用し、培養容器としてiMatrix-511 solution （和光純薬株式会社）をコートしたものを用いた。細胞の培養は37℃、5％CO2下で行った。
ヒトiPS細胞として、Ff-WJ-18細胞の他に、Ff-I01-S1細胞（京都大学）でも同様の試験を実施した。【０１１０】
実施例１：CDK8/19阻害剤のCDK8阻害活性及びCDK19阻害活性の評価
１．CDK8/19阻害剤の合成（図１参照）
（１）化合物１
8-(2,4-ジフルオロフェノキシ)-1-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-チエノ[3,4-g]インダゾール-6-カルボキサミド
化合物１又はその塩は、WO2001/074823に記載の方法及びそれに準ずる方法により製造する。
（２）化合物２
4-((4-フルオロフェニル)スルホニル)-3-(2-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-6-イルスルファニル)エチル)-3,4-ジヒドロキノキサリン-2(1H)-オン
化合物２又はその塩は、US2005-0020591に記載の方法と公知の方法及びそれに準ずる方法により製造する。
（３）化合物３
2-(ベンジルアミノ)-4-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-イル)ベンズアミド
化合物３又はその塩は、Bioorganic & Medicinal Chemistry, 24(11), 2466-2475; 2016又はWO2005/095400に記載の方法と公知の方法及びそれに準ずる方法により製造する。
（４）化合物４
3-(3-(ベンジルオキシ)フェニル)-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン
化合物４又はその塩は、WO2005/095400に記載の方法及びそれに準ずる方法により製造する。
（５）化合物５
4-(4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)ベンゼン-1,3-ジオール
化合物５又はその塩は、市販されているものを入手することができる（WO2015/159937参照）。
（６）化合物６
N-ブチル-8-(4-メトキシフェニル)-1,6-ナフチリジン-2-カルボキサミド トリフルオロ酢酸塩
化合物６又はその塩は、WO2014079787に記載の方法と公知の方法及びそれに準ずる方法により製造する。
（７）化合物７
8-(4-メチルフェニル)-N,N-ジプロピル-1,6-ナフチリジン-2-カルボキサミド トリフルオロ酢酸塩
化合物７又はその塩は、WO2014/079787に記載の方法と公知の方法及びそれに準ずる方法により製造する。【０１１１】
２．CDK8 阻害活性及びCDK19阻害活性
以下の方法により、試験化合物の CDK8 阻害活性及びCDK19阻害活性を評価した。
ジメチルスルホキシドに溶解した試験化合物をアッセイバッファー（25 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 2 mM DL-Dithiothreitol, 0.01 ％ Tween-20）で希釈し、DMSO濃度 3 ％ の一次希釈溶液を得た。上記一次希釈溶液 2 μL を 384 穴プレートに分注した後、アッセイバッファーで 267 倍に希釈した Eu3+  Cryptate conjugated mouse monoclonal antibody anti-glutathione S-transferase（CisBio）と 60 nM の Kinase Tracer-236（Life technologies）を混合した溶液 2 μL を添加した。上記添加後、さらにキナーゼ溶液（CDK8阻害活性測定用にはアッセイバッファーで希釈した 84 ng/mL CDK8/CycC（Carna Biosciences）が、CDK19阻害活性測定用にはアッセイバッファーで希釈した87 ng/mL CDC2L6/CycC（Carna Biosciences）が各々用いられる）を 2 μL 添加した。上記添加後、室温で 1 時間静置してからプレートリーダー EnVision（Perkin Elmer）で蛍光強度（励起波長 320 nm、蛍光波長 615 nm、665 nm、遅延時間 50 μsec）を測定した。【０１１２】
試験化合物の CDK8 又はCDK19に対する阻害率は、化合物非添加条件の反応液の蛍光強度をコントロール、ならびに 10μM 対照化合物添加条件の反応液の蛍光強度をブランクとして以下の式で算出することができる。
阻害率 (％) = (1−(試験化合物の蛍光強度−ブランク) ÷ (コントロール−ブランク) )×100【０１１３】
なお、対照化合物としては、市販されている4-(4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-1H-ピラゾール-3-イル)ベンゼン-1,3-ジオールを用いた。参考のため、CDK8又はCDK19に対して阻害率 50% を示すのに必要な対照化合物の濃度 (IC50値) を表１に示す。【０１１４】
【表１】
2018159805.tif 000004
【０１１５】
試験化合物 10 μM及び1 μM における CDK8阻害率（%）及びCDK19阻害率 (%) を表２に示す。【０１１６】
【表２】
2018159805.tif 000005
【０１１７】
表２より、試験化合物１〜７がCDK8及びCDK19を強く阻害することが示された。【０１１８】
実施例２：CDK8/19阻害剤によるステージ４における膵前駆細胞の富化
１．iPS細胞からの膵前駆細胞の分化誘導
ヒトiPS細胞はFf-WJ-18細胞（京都大学）を使用した。参考例１にしたがって維持培養したFf-WJ-18細胞を、以下の手順で膵前駆細胞に分化誘導した。培養はいずれも37℃、5％CO2下で行い、培養容器はiMatrix-511（商標）（Nippi）をコートしたものを用いた。【０１１９】
（１）ステージ１
1% penicillin/streptomycin、1% B27、ActivinA(100 ng/mL)、CHIR99021 (3 μM)、Y27632(10 uM)を含むRPMI1640培地に、Ff-WJ-18細胞(70万 cells/9.6 cm2)を播種して1日培養を行った。さらに、1% penicillin/streptomycin、1% B27、ActivinA (100 ng/mL)を含むRPMI1640培地で2日間、1日毎に培地を交換しながら培養を行った。【０１２０】
（２）ステージ２
1% penicillin/streptomycin、1% B27、KGF (50 ng/mL)を含むiMEM培地に代えて、4日間培養した。【０１２１】
（３）ステージ３
1% penicillin/streptomycin、1% B27、KGF (50 ng/mL)、Noggin (100 ng/mL)、KAAD-Cyclopamine(Cyclopamineの細胞透過性アナログ、ヘッジホッグシグナル阻害剤(0.5 μM))、TTNPB（Arotinoid Acid、RARアゴニスト(10 nM)を含むiMEM培地に代えて、2日間培養した。【０１２２】
（４）ステージ４
ステージ３で得られた細胞を0.25%トリプシン-EDTAで処理後にピペッティングすることにより分散し、0.25%トリプシン-EDTAを遠心分離して懸濁した後、(i)1% penicillin/streptomycin、1% B27、KGF (100 ng/mL)、EGF (50 ng/mL)、Nicotinamide (10 mM)、Y27632 (50 μM)を含むiMEM培地、あるいは(ii) 1% penicillin/streptomycin、1% B27、KGF (100 ng/mL)、EGF (50 ng/mL)、Nicotinamide (10 mM) を含むiMEM培地に再播種して１日培養した。さらに、1% penicillin/streptomycin、1% B27、KGF (100 ng/mL)、EGF (50 ng/mL)、Nicotinamide (10 mM)、実施例１に記載のCDK8/19阻害活性を有する化合物を0.00001μM-1μM加えたiMEM培地で、4日間培養した。比較のために、CDK8/19阻害活性を有する化合物を加えない培地（陰性対照）、CDK8/19阻害活性を有する化合の代わりにCDK1/2阻害剤（CAS443798-55-8（217714、メルク）を0.00001μM-1μM）を加えた培地についても同様に実験を行った。【０１２３】
ステージ４の培養後の細胞を集め、NKX6.1陽性／PDX-1陽性細胞の比率をフローサイトメトリーで求めた。iPS細胞、ステージ４の培養前の細胞（s3d2：ステージ3 デイ2）についても同様に細胞の比率を求めた。(i)ROCK阻害剤（Y27632 (50 μM)）をs3d0（ステージ3 デイ0）で含む培地を用いた場合を図２A（KENY50-KENT）に、(ii)ROCK阻害剤（Y27632）を含まない培地を用いた場合を図２B（KEN-KENT）に示す。図２の結果から明らかなように、CDK8/19阻害活性を有する化合物のいずれも、対照に比べて基本的に用量依存的に高いNKX6.1陽性／PDX-1陽性細胞率を示した。【０１２４】
また、同様の方法によりCDK1/2阻害活性を有する因子とCDK8/19阻害活性を有する因子について、効果を比較した。すなわち、ステージ３で得られた細胞に、CDK1/2阻害活性を有する化合物（CAS443798-55-8（217714、メルク））又はCDK8/19阻害活性を有する化合物１を0.00001μM-1μM加えて4日間培養し、NKX6.1陽性／PDX-1陽性細胞率を求めた。結果を図３に示す。図３の結果から明らかなように、CDK1/2阻害活性を有する化合物をCDK8/19阻害活性を有する化合物の代わりに作用させた場合、膵前駆細胞への効率的な分化誘導は見られなかった。【０１２５】
なお、ヒトiPS細胞として、Ff-WJ-18細胞の他に、Ff-I01-S1細胞（京都大学）でも同様の効果が見られた。このことから、iPS細胞株の種類に関係なく、CDK8/19阻害作用を有する因子を添加することで、NKX6.1陽性及びPDX-1陽性の膵前駆細胞を効率的に分化することが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
本発明によれば、多能性幹細胞からNKX6.1陽性及びPDX-1陽性の膵前駆細胞を効率的に分化誘導することができる。本発明で得られる膵前駆細胞は糖尿病等の疾患を治療するための細胞医薬あるいはデバイスとして利用できる。【０１２７】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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