(57)【要約】要約  知的障害又は自閉症の治療に有効な新規な治療剤が開示されている。知的障害又は自閉症治療剤は、チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する。知的障害としては記憶障害が挙げられ、記憶障害としては、Tsc1遺伝子及び／又はTsc2遺伝子の異常に起因する記憶障害及びてんかん誘発性の記憶障害が挙げられる。チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種の有効量を知的障害又は自閉症の患者に投与することを含む、知的障害又は自閉症の治療方法も提供された。
2019093389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する知的障害又は自閉症治療剤。
【請求項２】
前記知的障害が、記憶障害である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
前記記憶障害が、Tsc1遺伝子及び／又はTsc2遺伝子の異常に起因する記憶障害である請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
前記記憶障害が、てんかん誘発性の記憶障害である、請求項２記載の治療剤。
【請求項５】
チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種の有効量を知的障害又は自閉症の患者に投与することを含む、知的障害又は自閉症の治療方法。
【請求項６】
知的障害又は自閉症治療用の、チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、知的障害又は自閉症治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
知的障害は、発達期までに生じた知的な機能障害により、認知能力が低い水準にとどまっている状態である。現在治療薬は無く、療育や教育、福祉的な対応が必要とされる。自閉症は3歳位までに現れ、(1)他人との社会的関係の形成の困難さ、(2)言葉の発達の遅れ、(3)特定のものにこだわることを特徴とする行動の障害であり、中枢神経系に何らかの要因による機能不全があると推定される。【０００３】
特許文献１には、特定のアザキノリン誘導体が記載されており、このアザキノリン誘導体は、自閉症や癇癪を包含する多数の疾患の治療に有効であることが記載されている。【０００４】
一方、チピファルニブ及びロナファルニブは、抗がん剤として有用であることが知られている（例えば特許文献２）。しかしながら、これらの薬剤が知的障害又は自閉症の治療に有効であることは全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2002-508768号公報
【特許文献２】特表2003-525255号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Crino, P.B., K.L. Nathanson, and E.P. Henske, The tuberous sclerosis complex. N Engl J Med, 2006. 355(13): p. 1345-56
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、知的障害又は自閉症の治療に有効な新規な治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
知的障害と自閉症がしばしば合併することから、両病態に共通の発症機構も存在すると推定される。そこで、遺伝的にこれらの病態を起こす疾患を探索し、結節性硬化症に着目した。結節性硬化症は全身に過誤腫が多発する母斑症であるが、中枢神経症状として難治性てんかん、精神遅滞や自閉症を随伴する（非特許文献１）。結節性硬化症の原因遺伝子はTsc1m又はTsc2であることが知られているので、そのノックアウトマウスは両者に共通する病態モデルになると考えられる。【０００９】
本発明では、結節性硬化症のモデルマウスとそれ以外の原因による知的障害や自閉症様行動異常を示すマウスを作製し、行動異常をまず確認した。そして、これまで抗がん剤として研究されてきたチピファルニブ及びロナファルニブが、これらの知的障害や自閉症様行動異常に対して極めて有効であることを初めて明らかにし、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する知的障害又は自閉症治療剤を提供する。また、本発明は、チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種の有効量を知的障害又は自閉症の患者に投与することを含む、知的障害又は自閉症の治療方法を提供する。さらに本発明は、知的障害又は自閉症治療用の、チピファルニブ及びロナファルニブから成る群より選ばれる少なくとも１種の化合物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、知的障害又は自閉症の治療に有効な治療剤が初めて提供された。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】下記実施例１において行った、本発明の治療剤の効果を示す、文脈依存的恐怖弁別試験の結果を示す図である。aは文脈依存的恐怖弁別試験の模式図、bはTsc2+/-マウスの文脈依存的恐怖記憶の異常と本発明の治療剤投与による回復を示す、すくみ時間の測定結果を示す図である。cはペンチレンテトラゾール投与マウスの文脈依存的恐怖記憶の異常と本発明の治療剤投与による回復を示す、すくみ時間の測定結果を示す図である。
【図２】下記実施例１において行った、自閉症に対する本発明の治療剤の効果を示す、３チャンバー実験の結果を示す図である。aは、3チャンバー実験の模式図である。bは、カイニン酸投与による自閉症様行動異常と本発明の治療剤投与による回復を示す、各チャンバー内での滞在時間の測定結果を示す図である。
【図３】下記実施例１において行った、Tsc2変異マウス海馬初代培養ニューロンの樹状突起スパインにみられる形態異常と本発明の治療剤の効果を示す図である。aは、野生型(WT)およびTsc2変異(Tsc2+/-)海馬初代培養ニューロンに対して、本発明の２種類の治療剤（ロナファルニブ及びチピファルニブ）を3日間投与し、GFPおよびvGlut1(興奮性シナプスのマーカー)抗体にて染色した結果を示す図である。ｂは、Tsc2+/-ニューロンの樹状突起幅の測定結果を示す図である。cは、同じく樹状突起長さの測定結果を示す図である。ｄは、スパインシナプス数の測定結果を示す図である。eは、スパインシナプスの割合の測定結果を示す図である。
【図４】下記実施例２において行った、社会行動異常（自閉症）を示すマウスに対するロナファルニブの治療効果を示す、３チャンバー実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上記のとおり、本発明の治療剤は、チピファルニブ（6-[(R)-アミノ(4-クロロフェニル)(1-メチル-1H-イミダゾール-5-イル)メチル]-4-(3-クロロフェニル)-1-メチル-2(1H)-キノリノン）及びロナファルニブ（(11R)-5,6-ジヒドロ-3,10-ジブロモ-8-クロロ-11-[1-[1-オキソ-2-(1-カルバモイル-4-ピペリジニル)エチル]-4-ピペリジニル]-11H-ベンゾ[5,6]シクロヘプタ[1,2-b]ピリジン、4-[2-[4-[(11R)-8-クロロ-3,10-ジブロモ-6,11-ジヒドロ-5H-ベンゾ[5,6]シクロヘプタ[1,2-b]ピリジン-11-イル]-1-ピペリジニル]-2-オキソエチル]-1-ピペリジンカルボアミド）から成る群より選ばれる少なくとも１種を有効成分として含有する。これらの薬剤自体は公知であり、市販もされているので、市販品を利用することができる。これらの薬剤は、単独でも用いることができるし、両者を組み合わせて用いることもできる。
【００１４】
下記実施例に具体的に記載するように、上記有効成分は、TSC2遺伝子をノックアウトして作出した結節性硬化症モデル動物における記憶障害や、けいれん誘発薬のペンチレンテトラゾールを投与して作出したてんかん誘発性の記憶障害モデル動物において、優れた治療効果を示した。また、上記有効成分は、てんかん誘発薬のカイニン酸を投与して作出した自閉症モデル動物において、優れた治療効果を示した。これらの実験結果により、上記有効成分が、知的障害、特に記憶障害、とりわけTsc1遺伝子及び／又はTsc2遺伝子の異常に起因する記憶障害、並びに自閉症の治療に有効であることが確認された。
【００１５】
上記有効成分は、経口投与することもできるし、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、経腸、経皮、腹腔内、眼内等の非経口経路でも投与することができる。
【００１６】
上記有効成分の投与量は、患者の症状、年齢、体重等の条件に応じて適宜設定されるが、通常、患者の体重1kg当り１日当りの投与量（両者が併用される場合には合計投与量）は、75mg〜200mg程度、特に100mg〜150mg程度である。
【００１７】
上記有効成分は、通常の製剤方法により、錠剤、粉剤、丸剤、顆粒剤、カプセル、シロップ等の経口投与用の剤形や、注射剤、塗布剤、パッチ、座剤、点眼剤等の非経口投与用の剤形に製剤して投与することができる。
【００１８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
実施例１
１．  方法
(1)  動物
Tsc2+/-マウスは公知の方法（Kobayashi, T., et al., Renal carcinogenesis, hepatic hemangiomatosis, and embryonic lethality caused by a germ-line Tsc2 mutation in mice. Cancer Res, 1999. 59(6): p. 1206-11）の通り繁殖・交配して作出した。結節性硬化症とは異なる記憶障害モデルマウスは、ペンチレンテトラゾール（35 mg/kg, i.p.（腹腔内投与））10回投与により、また社会行動異常を示すマウスは、生後1週目にカイニン酸（1.5 mg/kg, i.p.）の１回投与により、それぞれ作製した。【００２０】
(2)  文脈依存的恐怖弁別試験
文脈依存的恐怖弁別試験（Auerbach, B.D., E.K. Osterweil, and M.F. Bear, Mutations causing syndromic autism define an axis of synaptic pathophysiology. Nature, 2011. 480(7375): p. 63-8.)により、マウスの文脈依存的恐怖記憶を測定した。すなわち、マウスをフットショック（FS）のかかるケージへ入れ、FSをかけた後、翌日同じケージ(既知条件（Familiar condition)）へ戻し、すくみ時間(Freeze time)を計測した（図1a）。チピファルニブ又はロナファルニブ（以下、単に「活性成分」と呼ぶことがある）の効果を調べるため、マウスに担体（Vehicle、カルボキシメチルセルロース）と活性成分を経口投与し、6時間後にFSをかけ、翌日同じケージへ戻した時のすくみ時間を比較した。また、対照実験として、FSの翌日に異なるケージ(新規条件（Novel condition) ）に入れた場合のすくみ時間を計測した（図1a）。【００２１】
(3)  ３チャンバー試験
３チャンバー試験により社会的相互作用を調べた。これは、部屋が3つに区切られ、その間は自由に行き来できる実験装置であり、まず片方の部屋にマウスの入ったケージ（ストレンジャー(stranger)1マウス）、もう一方に空のケージを置いた（図2a）。被検マウスを中央の部屋に置き、それぞれの部屋に滞在した時間（図中のチャンバー内滞在時間(s)：秒表示）を計測した。 次に、片方のケージにいたマウスを空ケージの方へ移し（ストレンジャー1 マウス）、空いたケージに新しいマウス（ストレンジャー2 マウス）を入れた（図2a）。そして、被検マウスが最初からいたマウスの部屋（ストレンジャー1 チャンバー）へ行く時間、新しいマウスのいる部屋（ストレンジャー2 チャンバー）へ行く時間を計測・比較した。【００２２】
(4) 海馬ニューロンの初代培養
生後0あるいは1日目Tsc2+/-マウスより海馬を摘出し、0.25 %トリプシン含有Hank’s緩衝液中において37℃10分間反応させた。洗浄した後、細胞を縣濁し、B27添加物含有Neurobasal培養液を用いて37℃、5%CO2条件下にて培養した。固定の2日前に担体 (DMSO)、活性成分(2μM)を培養液中に添加した。遺伝子強制発現にはLipofectamine 2000を用いた。【００２３】
(5)  免疫細胞染色
培養ニューロンを4 %パラホルムアルデヒドにて固定した。固定したニューロンを10 %ヤギ血清含有緩衝液にてブロッキングし、一次抗体と反応させた。更に、蛍光二次抗体を用いて目的蛋白質を標識した。標識したニューロンをCarl Zeiss社製LSM780にて観察した。【００２４】
２．  結果
(1)   Tsc2遺伝子異常に起因する記憶障害に対する効果
活性成分の知的障害に対する効果を調べるため、まず文脈依存的恐怖記憶の異常を示すTsc2+/-マウスを用いて実験を行った。FSの6時間前にロナファルニブ (40 mg/kg)又はチピファルニブ (40 mg/kg)をTsc2+/-マウスに経口投与し、文脈依存的恐怖記憶を調べた（図1a）。翌日、FSを受けた箱にマウスを戻し、すくみ時間を測定した。野生型(WT)のどの群も前日のFSを記憶しており、すくみ反応の増加を示したが、Tsc2+/-マウスの担体投与群はすくみ反応の増加を示さず、FSをかけられた箱を覚えていないと考えられた（図1b）。しかし、ロナファルニブ又はチピファルニブを投与した群ではすくみ行動が増加し、記憶が回復した（図1b）。すなわち、一回の活性成分投与によって結節性硬化症の記憶障害が改善することがわかった。【００２５】
(2)   てんかん誘発性の記憶障害に対する効果
活性成分が結節性硬化症の記憶障害以外に対して有効かどうかを調べるため、別の記憶障害マウスの作製を試みた。けいれん誘発薬のペンチレンテトラゾールをマウスに10回投与し、てんかん発作を連続的に起こさせた。このマウスの文脈依存的恐怖記憶を上記と同様に調べたところ、顕著な記憶障害を示すことがわかった。そこで、このマウスの記憶障害に対する活性成分の効果も調べた。ロナファルニブ (40 mg/kg, i.p.)の1回投与により、ペンチレンテトラゾール誘発性の記憶障害も改善した（図1c）。以上の結果から、活性成分は結節性硬化症だけでなく、てんかん誘発性の記憶障害も改善する作用があることがわかった。【００２６】
(3)  自閉症に対する効果
自閉症様行動異常を示すモデルマウスを用いて、薬物の効果を調べた（図2a）。社会行動異常を示すモデルを作製するため、カイニン酸（1.5 mg/kg）を生後1週目のマウスに注射し、その後2か月生育させた後、3チャンバー試験を行った。ストレンジャー1マウスとストレンジャー2マウスに対した時、野生型マウスはストレンジャー2へと近づくが、カイニン酸を新生仔期に注射されたマウスではストレンジャー1とストレンジャー2の部屋滞在時間に有意差は見られなかった（図2b）。すなわち、社会行動異常があると考えられた。そこで、このマウスにロナファルニブ（40 mg/kb, i.p.）を一回投与し、3チャンバー試験を行ったところ、ストレンジャー2のチャンバー滞在時間(time spent in chamber)が有意に長くなり、正常な社会行動を示した（図2b）。以上の結果から、活性成分は結節性硬化症以外の社会行動異常（自閉症）も改善する作用があることがわかった。【００２７】
(4)  シナプス形成異常に対する効果
活性成分の結節性硬化症モデルのシナプス形成異常に対する効果を調べた。Tsc2+/-マウスから、海馬ニューロンを初代培養し、培養21日後のニューロン形態を野生型と比較した。野生型では典型的なキノコ型のスパインを形成したのに対し、Tsc2+/-マウスでは樹状突起スパインが形成されず、フィロポディアと呼ばれる細長い未熟な形態を示した（図3a-c）。また、興奮性シナプスが作られているかどうかをvGlut1に対する免疫染色にて検討したところ、Tsc2+/-マウスのフィロポディア上ではシナプスを形成していなかった（図3a, d）。一方、興奮性シナプスは樹状突起上に直接形成されており、シャフトシナプス形態を示した（図3a, e）。そこで、これらのTsc2+/-ニューロンの培養液に担体又は活性成分(2μM)を添加し、二日後に固定後、形態を観察した。その結果、活性成分処理により、野生型と変わらないスパイン形態を示すようになり、さらにスパインに一致してvGlut1が染色されるスパインシナプスを形成した（図3a-e）。以上の結果から、結節性硬化症において、活性成分投与によりシナプスが正常化することが明らかとなった。【００２８】
実施例２
１．  動物
社会行動異常を示す結節性硬化症モデルを得るため、アストロサイト特異的にCreを発現するGFAP-CrとTsc1fl/flマウスを交配し、GFAP-Cre;Tsc1fl/fl (GFAP-Tsc1 cKO)マウスを作製した。すなわち、まず、社会性行動の異常を示す結節性硬化症モデルマウスを作製した。様々なCreドライバーマウスとTsc1fl/flマウスを交配した結果、アストロサイト特異的にCreに発現するGFAP-Creと交配したGFAP-Cre;Tsc1fl/fl (GFAP-Tsc1 cKO)マウスが社会行動異常を示すことがわかった。【００２９】
２．  薬物の調製と投与
ロナファルニブとチピファルニブは、4mg/mlの懸濁液（溶媒は1w/v% CMC, 0.9w/v% NaCl, 5v/v% DMSO）を作製し、40mg/kgになるよう経口投与した。ペンチレンテトラゾール(PTZ)は2mg/mlの溶液（溶媒は0.9w/v% NaCl）を調製し、腹腔内投与した。【００３０】
３．  結果
実施例１と同様に３チャンバー試験を行った。３チャンバー試験において、ストレンジャー１マウスとストレンジャー２マウスの間に野生型マウスを置くとストレンジャー２の方へより長く近づくが、GFAP-Tsc1 cKOマウスではストレンジャー１とストレンジャー２の部屋滞在時間に有意差が見られず、社会行動の異常が見られた（図４）。【００３１】
そこで、このマウスにロナファルニブ（40mg/kg, i.p.）を一回経口投与し、３チャンバー試験を行ったところ、ストレンジャー２の部屋滞在時間が有意に長くなり、社会行動が正常化した（図４）。
【図１】
2019093389.tif 000003
【図２】
2019093389.tif 000004
【図３】
2019093389.tif 000005
【図４】
2019093389.tif 000006
【国際調査報告】
2019093389.tif 000007
2019093389.tif 000008