(57)【要約】   本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を効果的に抑制する核酸分子、および当該核酸分子を含むＢ型肝炎ウイルス増殖抑制用、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの治療用医薬組成物を提供する。具体的には、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列をＢ型肝炎ウイルス遺伝子発現抑制配列として含む核酸分子（ｉ）配列番号２で表されるヌクレオチド配列；配列番号２で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または配列番号２で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または配列番号１で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列をＢ型肝炎ウイルス遺伝子発現抑制配列として含む核酸分子
（ｉ）配列番号２で表されるヌクレオチド配列；
配列番号２で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号２で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；
配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号１で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【請求項２】
塩基数の合計が１００塩基以下である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
（ｉ）のヌクレオチド配列および（ｉ）のヌクレオチド配列にアニーリング可能な相補配列であって、該相補配列が以下の（ｉｉｉ）である相補配列；または
（ｉｉ）のヌクレオチド配列および（ｉｉ）のヌクレオチド配列にアニーリング可能な相補配列であって、該相補配列が以下の（ｉｖ）である相補配列
を含む、請求項１または２に記載の核酸分子
（ｉｉｉ）配列番号４で表されるヌクレオチド配列；
配列番号４で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号４で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
（ｉｖ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列；
配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号３で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【請求項４】
（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が（ｉ）のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列であり、
（ｉｖ）のヌクレオチド配列が（ｉｉ）のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列である、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
二本鎖核酸分子であって、
一方の鎖に（ｉ）のヌクレオチド配列、他方の鎖に該（ｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列を含むか、；または
一方の鎖に（ｉｉ）のヌクレオチド配列、他方の鎖に該（ｉｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした（ｉｖ）のヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子である、請求項３または４に記載の核酸分子。
【請求項６】
塩基数の合計が６０塩基以下である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７】
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号２、１、４、３で表されるヌクレオチド配列である、請求項３〜６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項８】
二本鎖のうちの少なくとも１方の鎖の３’末端にオーバーハング配列を更に有する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項９】
配列番号１０で表されるヌクレオチド配列および該配列にアニーリングした配列番号１２で表されるヌクレオチド配列；または
配列番号９で表されるヌクレオチド配列および該配列にアニーリングした配列番号１１で表されるヌクレオチド配列
から成る、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現抑制配列として（ｉ）または（ｉｉ）で表されるヌクレオチド配列を含む、以下の（Ａ）または（Ｂ）の一本鎖核酸分子である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子：
（Ａ）領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）のみからなり、
５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）の順で配置され、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含む；
（Ｂ）領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）および領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）が、各々独立して存在しないか、ヌクレオチド残基から成るか、またはピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を含む。
【請求項１１】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、請求項１０に記載の鎖核酸分子。
【化１】
2018199338.tif 000014
前記式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されていてもよく、および／または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されていてもよく、および／または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されていてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）である。
【請求項１２】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（３）または式（５）の条件を満たす、請求項１０または１１に記載の核酸分子。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【請求項１３】
前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１１）の条件を満たす、請求項１２に記載の核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
【請求項１４】
前記（Ｂ）において、前記領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（２）の条件を満たす、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子。
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【請求項１５】
前記（Ｂ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の核酸分子：
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【請求項１６】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差が、下記条件を満たす、請求項１５に記載の核酸分子。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
【請求項１７】
前記（Ｂ）において、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜１１塩基である、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜７塩基である、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜３塩基である、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記（Ｂ）において、前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜１１塩基である、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜７塩基である、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜３塩基である、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記（Ａ）において、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１９〜３０塩基である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２４】
塩基数の合計が８０塩基以下である、請求項１０〜２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２５】
ＲＮＡ分子である、請求項１０〜２４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
前記（Ｂ）において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）が、１〜２０塩基のヌクレオチド残基から成る、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項２７】
（ｉ）のヌクレオチド配列と（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と（ｉｖ）のヌクレオチド配列とが、下記式で表される基で連結されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【化２】
2018199338.tif 000015
【請求項２８】
リンカー領域（Ｌｘ）および／またはリンカー領域（Ｌｙ）が下記式で表される基である、請求項１０〜２５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【化３】
2018199338.tif 000016
【請求項２９】
以下のいずれかで表される、請求項１〜４、１０〜１３または２３のいずれか１項に記載の核酸分子。
5’-AGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUU-3’（配列番号１３）
5’-GCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUU-3’（配列番号１４）
（該配列中、−Ｌｘ−は、下記式で表される基を示す。）
【化４】
2018199338.tif 000017
【請求項３０】
以下のいずれかで表される、請求項１〜４または１０〜２２のいずれか１項に記載の核酸分子。
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１７）
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１８）
（該配列中、−Ｌｘ−および−Ｌｙ−は、下記式で表される基を示す。）
【化５】
2018199338.tif 000018
【請求項３１】
以下のいずれかで表される、請求項１〜４、１０、１２〜２２または２６のいずれか１項に記載の核酸分子。
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCCCCACACCGGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUCUUCGG-3’（配列番号１５）
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCCCCACACCGGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUCUUCGG-3’（配列番号１６）
【請求項３２】
請求項５〜９、２６または３１記載の核酸分子を発現する発現ベクター。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか１項記載の核酸分子又は請求項３２記載の発現ベクターを含む、医薬組成物。
【請求項３４】
Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制用である、請求項３３記載の医薬組成物。
【請求項３５】
Ｂ型肝炎の治療用である、請求項３３記載の医薬組成物。
【請求項３６】
肝硬変の治療用である、請求項３３記載の医薬組成物。
【請求項３７】
肝臓がんの治療用である、請求項３３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子の発現を効果的に抑制する核酸分子、および当該核酸分子を含む、Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制用、Ｂ型肝炎、肝硬変および肝臓がんの治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルスには、日本国内で１３０万〜１５０万人、世界中ではおよそ３億５，０００万人が感染していると言われており、Ｃ型肝炎ウイルスと共に慢性肝炎の主な原因となっている。【０００３】
慢性Ｃ型肝炎では、現状の治療法によって、かなりの高率でＨＣＶウイルスの完全排除が期待できるが、慢性Ｂ型肝炎の現在の治療法では、ＨＢＶウイルスの完全排除は出来ない。現状の慢性Ｂ型肝炎に対する治療法にはインターフェロン（ＩＦＮ）療法と核酸アナログ製剤療法がある。ＩＦＮ療法の奏効率は３０〜４０％に留まり、強い副作用も伴う。一方の、核酸アナログ製剤は服用により肝炎が鎮静化し肝機能が改善するが、長期の服用を余儀なくされ、投薬中止によりほとんどの症例で肝炎が再燃する。これは、肝細胞核内に治療後も微量に存在するｃｃｃＤＮＡ（ｃｏｖａｌｅｎｔｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ、閉環状ＤＮＡまたは完全閉鎖二重鎖ＤＮＡ）からの転写が治療終了後に起こるためである。したがって、前記の治療法と作用機序の異なる新たな革新的治療薬の開発が求められている（非特許文献１、２）。【０００４】
慢性Ｂ型肝炎治療薬候補の作用機序が、非特許文献３にまとめられている。中でも、ｓｉＲＮＡによる全ウイルスタンパク質の翻訳抑制は、ＨＢＶのウイルスとしての機能を完全に遮断することが期待できる。【０００５】
核酸医薬品は従来の低分子医薬品や抗体医薬品では狙えないｍＲＮＡやｍｉＲＮＡ等の分子を創薬ターゲットとすることが可能であり、次世代の医薬品として高い期待が寄せられている。それにより、これまで治療が困難であった疾病に対する医薬品の創出が期待されており、全世界で研究が盛んに行われているのが現状である。【０００６】
その一方で、核酸医薬品の開発においては、「（１）核酸分子の生体内での不安定性」「（２）副作用の懸念」「（３）薬物送達技術（ＤＤＳ）の困難性」等の克服すべき課題があることが指摘されている。それにより、開発品の多さに比較して上市品は、未だ数少ないのが現状である。【０００７】
核酸医薬における、遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。近年、本出願人らはｓｉＲＮＡに代わるより効果的な一本鎖核酸分子を新たに見出している（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１２／００５３６８号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０１７９１９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１６；１２（１１）６７９−６８９
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１６；６４，Ｓ４１-Ｓ４８
【非特許文献３】Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ．２０１５；５（４）ａ０２１５０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
Ｂ型肝炎の治療のために、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖を強力に抑制することのできる核酸の探索が望まれている。そこで、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を効果的に抑制する核酸分子、および当該核酸分子を含むＢ型肝炎ウイルス増殖抑制用、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの治療用の医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ＨＢＶ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｃに対する新規なｓｉＲＮＡ配列を２種類設計し合成した。それらをＨＢＶウイルスを発現させた肝培養細胞Ｈｕｈ７に導入し、ＨＢＶウイルスのＳ抗原、ｅ抗原の分泌量を指標にウイルス産生抑制能を評価した。その結果、２配列（ｕｓ１、ｕｓ２）が高い抑制活性を有することを見出した。さらにこれらの２配列を搭載した一本鎖核酸分子もｓｉＲＮＡと同等の活性を有していることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］  以下の（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列をＢ型肝炎ウイルス遺伝子発現抑制配列として含む核酸分子
（ｉ）配列番号２で表されるヌクレオチド配列；
配列番号２で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号２で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；
配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号１で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［２］  塩基数の合計が１００塩基以下である、［１］に記載の核酸分子。
［３］  （ｉ）のヌクレオチド配列および（ｉ）のヌクレオチド配列にアニーリング可能な相補配列であって、該相補配列が以下の（ｉｉｉ）である相補配列；または
（ｉｉ）のヌクレオチド配列および（ｉｉ）のヌクレオチド配列にアニーリング可能な相補配列であって、該相補配列が以下の（ｉｖ）である相補配列
を含む、［１］または［２］に記載の核酸分子
（ｉｉｉ）配列番号４で表されるヌクレオチド配列；
配列番号４で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号４で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
（ｉｖ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列；
配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号３で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
［４］  （ｉｉｉ）のヌクレオチド配列が（ｉ）のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列であり、
（ｉｖ）のヌクレオチド配列が（ｉｉ）のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列である、［３］に記載の核酸分子。
［５］  二本鎖核酸分子であって、
一方の鎖に（ｉ）のヌクレオチド配列、他方の鎖に該（ｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列を含むか、；または
一方の鎖に（ｉｉ）のヌクレオチド配列、他方の鎖に該（ｉｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした（ｉｖ）のヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子である、［３］または［４］に記載の核酸分子。
［６］  塩基数の合計が６０塩基以下である、［３］〜［５］のいずれかに記載の核酸分子。
［７］  （ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号２、１、４、３で表されるヌクレオチド配列である、［３］〜［６］のいずれかに記載の核酸分子。
［８］  二本鎖のうちの少なくとも１方の鎖の３’末端にオーバーハング配列を更に有する、［５］〜［７］のいずれかに記載の核酸分子。
［９］  配列番号１０で表されるヌクレオチド配列および該配列にアニーリングした配列番号１２で表されるヌクレオチド配列；または
配列番号９で表されるヌクレオチド配列および該配列にアニーリングした配列番号１１で表されるヌクレオチド配列
から成る、［８］に記載の核酸分子。
［１０］  Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現抑制配列として（ｉ）または（ｉｉ）で表されるヌクレオチド配列を含む、以下の（Ａ）または（Ｂ）の一本鎖核酸分子である、［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸分子：
（Ａ）領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）のみからなり、
５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）の順で配置され、
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、ピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
かつ前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含む；
（Ｂ）領域（Ｘｃ）、リンカー領域（Ｌｘ）、領域（Ｘ）、領域（Ｙ）、リンカー領域（Ｌｙ）および領域（Ｙｃ）を、５’側から３’側にかけてこの順序で含み、
前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成し、
前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的であり、
前記領域（Ｙｃ）が、前記領域（Ｙ）と相補的であり、
かつ前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）が、各々独立して存在しないか、ヌクレオチド残基から成るか、またはピロリジン骨格およびピペリジン骨格の少なくとも一方を含む非ヌクレオチド構造を有し、
前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を含む。
［１１］  前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）が、下記式（Ｉ）で表わされる、［１０］に記載の鎖核酸分子。【００１３】
【化１】
2018199338.tif 000002
【００１４】
前記式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり；
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されていてもよく、および／または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されていてもよく、および／または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されていてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）である。
［１２］  前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（３）または式（５）の条件を満たす、［１０］または［１１］に記載の核酸分子。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
［１３］  前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、下記式（１１）の条件を満たす、［１２］に記載の核酸分子。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
［１４］  前記（Ｂ）において、前記領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記式（２）の条件を満たす、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の核酸分子。
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
［１５］  前記（Ｂ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす、［１０］〜［１４］のいずれかに記載の核酸分子：
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
［１６］  前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差が、下記条件を満たす、［１５］に記載の核酸分子。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１、２または３  ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１、２または３  ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
［１７］  前記（Ｂ）において、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜１１塩基である、［１０］〜［１６］のいずれかに記載の核酸分子。
［１８］  前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜７塩基である、［１７］に記載の核酸分子。
［１９］  前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１〜３塩基である、［１７］に記載の核酸分子。
［２０］  前記（Ｂ）において、前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜１１塩基である、［１０］〜［１９］のいずれかに記載の核酸分子。
［２１］  前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜７塩基である、［２０］に記載の核酸分子。
［２２］  前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）が、１〜３塩基である、［２０］に記載の核酸分子。
［２３］  前記（Ａ）において、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）が、１９〜３０塩基である、［１０］〜［１３］のいずれかに記載の核酸分子。
［２４］  塩基数の合計が８０塩基以下である、［１０］〜［２３］のいずれかに記載の核酸分子。
［２５］  ＲＮＡ分子である、［１０］〜［２４］のいずれかに記載の核酸分子。
［２６］  前記（Ｂ）において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および（Ｌｙ）が、１〜２０塩基のヌクレオチド残基から成る、[１０]に記載の核酸分子。
［２７］  （ｉ）のヌクレオチド配列と（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と（ｉｖ）のヌクレオチド配列とが、下記式で表される基で連結されている、［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸分子。【００１５】
【化２】
2018199338.tif 000003
【００１６】
［２８］  リンカー領域（Ｌｘ）および／またはリンカー領域（Ｌｙ）が下記式で表される基である、［１０］〜［２５］のいずれかに記載の核酸分子。【００１７】
【化３】
2018199338.tif 000004
【００１８】
［２９］  以下のいずれかで表される、［１］〜［４］、［１０］〜［１３］または［２３］のいずれかに記載の核酸分子。
5’-AGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUU-3’（配列番号１３）
5’-GCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUU-3’（配列番号１４）
（該配列中、−Ｌｘ−は、下記式で表される基を示す。）【００１９】
【化４】
2018199338.tif 000005
【００２０】
［３０］  以下のいずれかで表される、［１］〜［４］または［１０］〜［２２］のいずれかに記載の核酸分子。
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１７）
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１８）
（該配列中、−Ｌｘ−および−Ｌｙ−は、下記式で表される基を示す。）【００２１】
【化５】
2018199338.tif 000006
【００２２】
［３１］  以下のいずれかで表される、［１］〜［４］、［１０］、［１２］〜［２２］または［２６］のいずれかに記載の核酸分子。
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCCCCACACCGGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUCUUCGG-3’（配列番号１５）
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCCCCACACCGGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUCUUCGG-3’（配列番号１６）
［３２］  ［５］〜［９］、［２６］または［３１］記載の核酸分子を発現する発現ベクター。
［３３］  ［１］〜［３１］のいずれか記載の核酸分子又は［３２］記載の発現ベクターを含む、医薬組成物。
［３４］  Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制用である、［３３］記載の医薬組成物。
［３５］  Ｂ型肝炎の治療用である、［３３］記載の医薬組成物。
［３６］  肝硬変の治療用である、［３３］記載の医薬組成物。
［３７］  肝臓がんの治療用である、［３３］記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の核酸分子によって、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。本発明の核酸分子を含む医薬組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子、特に表面抗原遺伝子の発現を効果的に抑制することにより、Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制用、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの治療用として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明の、Ｂ型肝炎ウイルスゲノム配列に基づいて設計した各ｓｉＲＮＡの、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗原）遺伝子の発現抑制活性を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の、Ｂ型肝炎ウイルスゲノム配列に基づいて設計した各ｓｉＲＮＡの、濃度依存的なＨＢｓ抗原の発現抑制活性およびＨＢｅ抗原の発現抑制活性を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明のｓｉＲＮＡおよび一本鎖核酸分子の、ＨＢｓ抗原の発現抑制活性を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明のｓｉＲＮＡおよび一本鎖核酸分子の、濃度依存的なＨＢｓ抗原の発現抑制活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．核酸分子
【００２６】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する核酸分子を提供する。
【００２７】
Ｂ型肝炎ウイルスは、感染により肝細胞に侵入して増殖する。Ｂ型肝炎ウイルスが異物と認識された場合、それを排除するために免疫機能が働くが、肝細胞の中のウイルスのみを選択的に攻撃することは不可能であり、肝細胞自体が攻撃を受けて破壊され、肝炎の発症をもたらす。Ｂ型肝炎が重症化した場合には、肝硬変や肝臓がんが引き起こされる。
【００２８】
Ｂ型肝炎ウイルスは、遺伝情報を保存している不完全二重鎖ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼが中心部に位置し、それがコア（ＨＢｃ抗原）、外殻（ＨＢｅ抗原）、および外膜（ＨＢｓ抗原）に取り囲まれている構造を有する。
【００２９】
Ｂ型肝炎ウイルスが肝細胞に侵入すると、ウイルス遺伝子が肝細胞の核内に移動し、不完全環状二重鎖ＤＮＡが完全閉鎖二重鎖ＤＮＡ、ｃｏｖａｌｅｎｔｙ  ｃｌｏｓｅｄ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に転換される。肝細胞核内のｃｃｃＤＮＡからは４種のｍＲＮＡ（３．５ｋｂ、２．４ｋｂ、２．１ｋｂ、０．７ｋｂ）が転写され、それらより構造タンパク質であるＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原、ＨＢｅ抗原および逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ、Ｘタンパク質が翻訳される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３；２１（５）９７３−９８５、Ｆｉｇｕｒｅ  ３ａ）。
【００３０】
ウイルスゲノムおよび前記４種類のｍＲＮＡには、タンパク質として翻訳可能な４つのＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）（Ｓ  ＯＲＦ、コアＯＲＦ、Ｘ  ＯＲＦ、ポリメラーゼＯＲＦ）の一部または全部が存在する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３；２１（５）９７３−９８５、Ｆｉｇｕｒｅ  ３ａ）。Ｓ  ＯＲＦはＨＢｓ抗原を構成する３種類のタンパク質、ｌａｒｇｅ  Ｓタンパク質（ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２およびＳ領域を含む）、Ｍｉｄｄｌｅ  Ｓタンパク質（ｐｒｅ−Ｓ２およびＳ領域を含む）、そしてＳｍａｌｌ  Ｓタンパク質（Ｓ領域のみから成る）をコードする。コアＯＲＦは、コアタンパク質およびプレコアタンパク質をコードする。コアタンパク質はコア粒子を形成し、プレコアタンパク質は１９個の疎水性シグナルペプチドとＣ末端の３４アミノ酸残基が切断された後にＨＢｅ抗原となる。Ｘ  ＯＲＦは、ウイルスの増殖や肝細胞癌の発症に関与すると考えられているＸタンパク質をコードする。また、ポリメラーゼＯＲＦは、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼタンパク質をコードする。
【００３１】
あるタイプのｍＲＮＡはｐｒｅｇｅｎｏｍｉｃ  ＲＮＡとしてコア粒子に取り込まれ、逆転写酵素の働きによりマイナス鎖ＤＮＡが合成され、次にプラス鎖ＤＮＡが合成され不完全環状二本鎖ＤＮＡとなる。さらに、ＨＢｓ抗原より形成されるエンベロープに包まれてウイルス粒子（Ｄａｎｅ粒子）となり血中に放出される。Ｄａｎｅ粒子の血中放出以外の増殖ルートとして、ｍＲＮＡにより翻訳されたＨＢｓ抗原、ＨＢｃ抗原とｐ２２ｃｒ抗原を含む中空粒子（ＤＮＡの核が無い粒子）や肝細胞膜を通過するＨＢｅ抗原などはＤａｎｅ粒子血中放出とは別ルートとして多量に血中に放出、分泌される。
【００３２】
Ｂ型肝炎の診断は、血液中の前記ＨＢｓ抗原および／またはＨＢｅ抗原を検出することにより行われる。
血液中のＨＢｓ抗原が陽性であることは肝臓にＨＢＶが存在し、ＨＢＶの成分が合成されていること、検査時にＢ型肝炎に感染していることを示す。血中のＨＢｓ抗原は肝臓内のウイルス増殖を把握し、治療完遂を判断する上での指標を提供する。
ＨＢｅ抗原はＨＢＶが増殖する際に過剰に産生されるタンパク質であり、肝臓でＨＢＶが活発に増殖している状態で、感染力が強いことを示す。
【００３３】
核酸分子の、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性は、評価対象の核酸分子をＢ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスゲノムを導入した細胞（好ましくは、ヒト細胞）等に導入し、当該細胞外に放出された（移行した）Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｓ抗原の量あるいはＢ型肝炎ウイルスＨＢｅ抗原の量を、評価対象の核酸分子を導入していないか、ネガティブコントロールの核酸分子を導入した、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞またはＢ型肝炎ウイルスゲノムを導入した細胞（好ましくは、ヒト細胞）から放出された（移行した）Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｓ抗原の量あるいはＢ型肝炎ウイルスＨＢｅ抗原の量と比較すること等により評価することが出来る。Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｓ抗原あるいはＨＢｅ抗原の量は、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢｓ抗原あるいはＨＢｅ抗原を特異的に認識する抗体を用いて、公知の免疫学的手法により抗原を検出することにより評価することができる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０：４１９−４３９（１９８０））、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができる。
【００３４】
本発明は、以下の（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列を発現抑制配列として含み、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する、核酸分子を提供する
（ｉ）配列番号２で表されるヌクレオチド配列；
配列番号２で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号２で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列；
配列番号１で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号１で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【００３５】
前記の配列番号１および２で表されるヌクレオチド配列は、以下の配列である。
5’-UCCACCACGAGUCUAGACU-3’（配列番号１）
5’-ACUCCCAUAGGAAUCUUGC-3’（配列番号２）
【００３６】
配列番号１および２で表されるヌクレオチド配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型Ｃ型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｃ）完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０１４３８１、Ｎｏ．ＡＢ１１３８７５、Ｎｏ．ＡＢ１１３８７６、Ｎｏ．ＡＢ１１３８７８、Ｎｏ．ＡＢ１１３８７９、Ｎｏ．ＡＢ２４６３４４）のヌクレオチド配列中、ヌクレオチド番号２４５〜２６３（5’-AGUCUAGACUCGUGGUGGA-3’（配列番号３））およびヌクレオチド番号６２９〜６４７（5’-GCAAGAUUCCUAUGGGAGU-3’（配列番号４））に対応する配列に完全に相補的な配列にそれぞれ相当する。
【００３７】
前記ヌクレオチド番号２４５〜２６３およびヌクレオチド番号６２９〜６４７で表される配列は、両方とも、Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質およびポリメラーゼタンパク質のコーディング領域中の配列である。Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの構造上、Ｓタンパク質およびポリメラーゼのコーディング領域は重複しているが、読み枠が異なっているため、別個のタンパク質に翻訳される。上記の通り、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムから転写されるｍＲＮＡには、複数のＯＲＦが存在し得る。従って、本発明のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する核酸分子によりＢ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子タンパク質をコードするｍＲＮＡの機能が阻害された場合、該ＲＮＡにコードされる他のタンパク質の翻訳も抑制されることがあり得る。本発明のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する核酸分子によりＢ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子タンパク質の発現が抑制された場合、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖が抑制され、結果的に他のＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現が抑制されることがあり得る。
【００３８】
発現抑制活性は、遺伝子転写の抑制、遺伝子転写産物分解、および／または遺伝子転写産物からのタンパク質の翻訳の阻害等により、結果的に遺伝子の発現が抑制されていることを意味する。
【００３９】
前記配列番号２又は１で表されるヌクレオチド配列において、欠失、置換、挿入、もしくは付加されるヌクレオチドの数は、結果として得られる核酸分子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常１個または２個、好ましくは１個である。
【００４０】
前記配列番号２又は１で表されるヌクレオチド配列において、置換される塩基の位置は、通常、５’末端から８塩基以内、好ましくは７、６、５、４、３、２もしくは１塩基以内、または３’末端から８塩基以内、好ましくは７、６、５、４、３、２もしくは１塩基以内である。
【００４１】
一態様において、前記（ｉ）のヌクレオチド配列は、配列番号５または配列番号７で表されるヌクレオチド配列であり得る。
【００４２】
配列番号５で表されるヌクレオチド配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型Ａ型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ａ）、Ｂ型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｂ）の、配列番号２で表されるヌクレオチド配列（Ｃ型、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｃ）に対応する配列である。配列番号５で表されるヌクレオチド配列は、配列番号２で表されるヌクレオチドの、３’末端から８番目の塩基及び５番目の塩基が、それぞれ、ＡからＵへ、ＣからＵへ置換された配列である。配列番号５で表されるヌクレオチド配列に完全に相補的な配列を、配列番号６に示す。
【００４３】
配列番号７で表されるヌクレオチド配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型Ｄ型（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｄ）の、配列番号２で表されるヌクレオチド配列（Ｃ型、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｃ）に対応する配列である。配列番号７で表されるヌクレオチド配列は、配列番号２で表されるヌクレオチドの、３’末端から５番目の塩基及び２番目の塩基が、それぞれ、ＣからＵへ、ＧからＣへ置換された配列である。配列番号７で表されるヌクレオチド配列に完全に相補的な配列を、配列番号８に示す。
【００４４】
前記配列番号２又は１で表されるヌクレオチド配列において、欠失される塩基の位置は、通常、５’末端から５塩基以内、好ましくは４、３、２もしくは１塩基以内、または３’末端から５塩基以内、好ましくは４、３、２もしくは１塩基以内である。
【００４５】
前記配列番号２又は１で表されるヌクレオチド配列において、挿入される塩基の位置は、通常、５’末端から５塩基と４塩基の間、好ましくは４塩基と３塩基の間、３塩基と２塩基の間、もしくは２塩基と１塩基の間、または３’末端から５塩基と４塩基の間、好ましくは４塩基と３塩基の間、３塩基と２塩基の間、もしくは２塩基と１塩基の間である。
【００４６】
前記配列番号２又は１で表されるヌクレオチド配列において、塩基が付加される位置は、５’末端から１塩基、または３’末端から１塩基である。
【００４７】
前記配列番号２又は１で表されるヌクレオチド配列において、配列同一性の程度は、結果として得られる核酸分子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常８５％以上、好ましくは９０％以上である。
【００４８】
ヌクレオチド配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、当該分野で慣用のプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を初期設定で用いて決定することができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップコスト＝Ｌｉｎｅａｒ；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−２）にて計算することができる。別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（１９７０）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８８，４：１１−１７）のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎらのアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２  ｍａｔｒｉｘまたはＰＡＭ２５０  ｍａｔｒｉｘ、ならびにｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ：１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４、およびｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ：１、２、３、４、５もしくは６のいずれかを使用することによって決定することができる。また、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれている。ヌクレオチド配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、例えば、ＰＡＭ１２０  ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ、ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ  １２、ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ４を用いることができる。ヌクレオチド配列同一性の算出については、前記の方法のなかで最も低い値を示す方法を採用してもよい。
【００４９】
前記ヌクレオチド配列の長さは、１７〜２１塩基長であり、好ましくは１８〜２０塩基長、より好ましくは１９塩基長である。
【００５０】
前記発現抑制配列は、例えば、前記ヌクレオチド配列からなる配列でもよいし、前記ヌクレオチド配列を含む配列でもよい。
【００５１】
前記発現抑制配列の長さは、特に制限されず、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。本発明において、例えば、塩基数の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００５２】
本発明の核酸分子は、例えば、さらに、前記発現抑制配列とアニーリング可能な相補配列を有することが好ましい。前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列と同じ鎖にあり、１つの一本鎖から構成される一本鎖核酸分子を形成する。
【００５３】
前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列とアニーリング可能であればよい。前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列と、１００％の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で１００％未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、９０％〜１００％、９３％〜１００％、９５％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％等が例示できる。
【００５４】
一態様において、本発明の核酸分子は、（ｉ）のヌクレオチド配列および（ｉ）のヌクレオチド配列にアニーリング可能な相補配列であって、該相補配列が以下の（ｉｉｉ）である相補配列；または
（ｉｉ）のヌクレオチド配列および（ｉｉ）のヌクレオチド配列にアニーリング可能な相補配列であって、該相補配列が以下の（ｉｖ）である相補配列を含む。
（ｉｉｉ）配列番号４で表されるヌクレオチド配列；
配列番号４で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号４で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列
（ｉｖ）配列番号３で表されるヌクレオチド配列；
配列番号３で表されるヌクレオチド配列において、１個もしくは２個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたヌクレオチド配列；または
配列番号３で表されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【００５５】
前記配列番号４又は３で表されるヌクレオチド配列において、欠失、置換、挿入、もしくは付加されるヌクレオチドの数は、結果として得られる核酸分子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常１個または２個、好ましくは１個である。
【００５６】
前記配列番号４又は３で表されるヌクレオチド配列において、置換される塩基の位置は、通常、５’末端から８塩基以内、好ましくは７、６、５、４、３、２もしくは１塩基以内、または３’末端から８塩基以内、好ましくは７、６、５、４、３、２もしくは１塩基以内である。
【００５７】
前記配列番号４又は３で表されるヌクレオチド配列において、欠失される塩基の位置は、通常、５’末端から５塩基以内、好ましくは４、３、２もしくは１塩基以内、または３’末端から５塩基以内、好ましくは４、３、２もしくは１塩基以内である。
【００５８】
前記配列番号４又は３で表されるヌクレオチド配列において、挿入される塩基の位置は、通常、５’末端から５塩基と４塩基の間、好ましくは４塩基と３塩基の間、３塩基と２塩基の間、もしくは２塩基と１塩基の間、または３’末端から５塩基と４塩基の間、好ましくは４塩基と３塩基の間、３塩基と２塩基の間、もしくは２塩基と１塩基の間である。
【００５９】
前記配列番号４又は３で表されるヌクレオチド配列において、塩基が付加される位置は、５’末端から１塩基、または３’末端から１塩基である。
【００６０】
前記配列番号４又は３で表されるヌクレオチド配列において、配列同一性の程度は、結果として得られる核酸分子が、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常８５％以上、好ましくは約９０％以上である。
【００６１】
（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列は、好ましくは、（ｉ）のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列であり、（ｉｖ）のヌクレオチド配列は、好ましくは、（ｉｉ）のヌクレオチド配列に完全に相補的な配列である。
【００６２】
本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＲＮＡとＤＮＡのキメラ核酸（以下、キメラ核酸分子と称する）分子またはハイブリッド核酸分子であり得る。ここでキメラ核酸分子とは、一本鎖または二本鎖の核酸分子において一本の核酸分子の中にＲＮＡとＤＮＡを含むことをいい、ハイブリッド核酸分子とは、二本鎖において、一方の鎖がＲＮＡ分子またはキメラ核酸分子でもう一方の鎖がＤＮＡ分子またはキメラ核酸分子である核酸分子をいう。
【００６３】
本発明の核酸分子は、一本鎖または二本鎖である。二本鎖の態様には、二本鎖ＲＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド核酸分子、ＲＮＡ／キメラ核酸ハイブリッド核酸分子、キメラ核酸／キメラ核酸ハイブリッド核酸分子およびキメラ核酸／ＤＮＡハイブリッド核酸分子が含まれる。
【００６４】
なお、本明細書においてヌクレオチド配列は、別段にことわりのない限りＲＮＡの配列として記載するが、ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合は、ウラシル（Ｕ）をチミン（Ｔ）に適宜読み替えるものとする。
【００６５】
本発明の、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を特異的に抑制し得る核酸分子の形態としては、例えば、ｓｉＲＮＡ分子、ｄｓＲＤＣ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ  ＤＮＡ  Ｃｈｉｍｅｒａ）分子、下記の本発明の一本鎖核酸分子、アンチセンス核酸分子、アンチジーン分子、リボザイム分子、アプタマー分子等が挙げられる。
【００６６】
本発明の核酸分子の長さは、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常１７塩基以上、好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２１塩基以上である。本発明の核酸分子の長さは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常２００塩基以下、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下（例、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下）である。即ち、本発明の核酸分子の長さは、通常、１７塩基〜２００塩基、好ましくは１９塩基〜１５０塩基、より好ましくは２１塩基〜１００塩基（２１塩基〜９０塩基、２１塩基〜８０塩基、約２１塩基〜７０塩基、２１塩基〜６０塩基、２１塩基〜５０塩基）である。
【００６７】
前記核酸分子の塩基数の合計は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常１７塩基以上、好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２１塩基以上である。本発明の核酸分子の塩基数の合計は、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常４００塩基以下、好ましくは３００塩基以下、より好ましくは２００塩基以下（例、１８０塩基以下、１６０塩基以下、１４０塩基以下、１２０塩基以下、１００塩基以下、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下）である。即ち、本発明の核酸分子の長さは、通常、１７塩基〜４００塩基、好ましくは１９塩基〜３００塩基、より好ましくは２１塩基〜２００塩基（２１塩基〜１８０塩基、２１塩基〜１６０塩基、約２１塩基〜１４０塩基、２１塩基〜１２０塩基、２１塩基〜１００塩基、２１塩基〜９０塩基、２１塩基〜８０塩基、２１塩基〜７０塩基、２１塩基〜６０塩基、２１塩基〜５０塩基）である。
【００６８】
本発明の核酸分子は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された核酸」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とする核酸重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上である。
２．二本鎖核酸分子
【００６９】
一態様において、上記本発明の核酸分子は二本鎖核酸分子である。該二本鎖核酸分子は、一方の鎖に（ｉ）のヌクレオチド配列を、他方の鎖に該（ｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした配列を含むか、または一方の鎖に（ｉｉ）のヌクレオチド配列を、他方の鎖に該（ｉｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした配列を含む。（ｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした配列は、アニーリング可能な配列であれば特に限定されないが、好ましくは（ｉｉｉ）のヌクレオチド配列である。（ｉｉ）のヌクレオチド配列にアニーリングした配列は、アニーリング可能な配列であれば特に限定されないが、好ましくは（ｉｖ）のヌクレオチド配列である。
【００７０】
前記二本鎖核酸分子においては、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２、１、４、３で表されるヌクレオチド配列であり得る。
【００７１】
二本鎖の本発明の核酸分子の長さは、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常１７塩基以上、好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２１塩基以上である。二本鎖の本発明の核酸分子の長さは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常１００塩基以下、好ましくは７５塩基以下、より好ましくは５０塩基以下（例、４５塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、２５塩基以下、２４塩基以下、２３塩基以下、２２塩基以下）である。即ち、本発明の核酸分子の長さは、通常、１７塩基〜１００塩基、好ましくは１９塩基〜７５塩基、より好ましくは２１塩基〜５０塩基（２１塩基〜４５塩基、２１塩基〜４０塩基、約２１塩基〜３５塩基、２１塩基〜３０塩基、２１塩基〜２５塩基、２１塩基〜２４塩基、２１塩基〜２３塩基、２１塩基〜２２塩基）である。
【００７２】
前記二本鎖核酸分子は、５’および／または３’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基（オーバーハング配列）を有していてもよい。該オーバーハング配列の長さは、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り特に限定されないが、通常５塩基以下、例えば２〜４塩基である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとＲＮＡ分子の安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００７３】
二本鎖の前記核酸分子の塩基数の合計は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制活性を有する限り、特に限定されないが、通常３４塩基以上、好ましくは３８塩基以上、より好ましくは４２塩基以上である。二本鎖の本発明の核酸分子の塩基数の合計は、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常２００塩基以下、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下（例、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、５０塩基以下、４８塩基以下、４６塩基以下、４４塩基以下）である。即ち、本発明の核酸分子の長さは、通常、３４塩基〜２００塩基、好ましくは３８塩基〜１５０塩基、より好ましくは４２塩基〜１００塩基（４２塩基〜９０塩基、４２塩基〜８０塩基、約４２塩基〜７０塩基、４２塩基〜６０塩基、４２塩基〜５０塩基、４２塩基〜４８塩基、４２塩基〜４６塩基、４２塩基〜４４塩基）である。
【００７４】
前記オーバーハング配列が付加された好ましい配列としては、例えば、配列番号９、１０、１１、１２で表される、配列番号１、２、３、４で表されるヌクレオチド配列にｔｔ−３’がそれぞれ付加された配列が挙げられる。
【００７５】
前記二本鎖核酸分子は、好ましくは、以下に示される、配列番号１０で表されるヌクレオチド配列および該配列にアニーリングした配列番号１２で表されるヌクレオチド配列；または
配列番号９で表されるヌクレオチド配列および該配列にアニーリングした配列番号１１で表されるヌクレオチド配列
から成る二本鎖核酸分子である。
【００７６】
前記二本鎖核酸分子は、好ましくは、下記に示されるｓｉＲＮＡ分子である。本明細書中、ｓｉＲＮＡは、前記二本鎖核酸分子のうち、オーバーハング配列以外の塩基配列がリボヌクレオチド残基のみで構成されているものを指す。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
３．一本鎖核酸分子
本発明の核酸分子は、前述のように、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制用であって、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制配列として、前記（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
【００７９】
前記発現抑制配列は、例えば、前記ヌクレオチド配列からなる配列でもよいし、前記ヌクレオチド配列を含む配列でもよい。
【００８０】
前記発現抑制配列の長さは、特に制限されず、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。本発明において、例えば、塩基数の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【００８１】
一本鎖の本発明の核酸分子は、例えば、さらに、前記発現抑制配列とアニーリング可能な相補配列を有することが好ましい。前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列と同じ鎖にあり、１つの一本鎖から構成される一本鎖核酸分子を形成する。
【００８２】
前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列とアニーリング可能であればよい。前記相補配列は、例えば、前記発現抑制配列と、１００％の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で１００％未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、９０％〜１００％、９３％〜１００％、９５％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％等が例示できる。
【００８３】
前記相補配列は、例えば、前記（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
以下、前記（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のヌクレオチド配列をｓヌクレオチド配列という。
【００８５】
前記相補配列は、例えば、前記ｓヌクレオチド配列からなる配列でもよいし、前記ｓヌクレオチド配列を含む配列でもよい。
【００８６】
前記相補配列の長さは、特に制限されず、例えば、１８〜３２塩基長であり、好ましくは１９〜３０塩基長であり、より好ましくは１９、２０、２１塩基長である。
【００８７】
前記発現抑制配列と前記相補配列はそれぞれ、例えば、リボヌクレオチド残基のみからなるＲＮＡ分子でもよいし、リボヌクレオチド残基の他に、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡ分子でもよい。
【００８８】
前記核酸分子は、例えば、前記発現抑制配列と前記相補配列とが、直接的に連結している形態および間接的に連結している形態があげられる。前記直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。前記間接的な連結は、例えば、リンカー領域を介した連結があげられる。前記発現抑制配列と前記相補配列との連結順序は、特に制限されず、例えば、前記発現抑制配列の３’末端と前記相補配列の５’末端とが連結してもよく、前記発現抑制配列の５’末端と前記相補配列の３’末端とが連結してもよく、好ましくは後者である。前記リンカー領域は、例えば、ヌクレオチド残基から構成されてもよいし、非ヌクレオチド残基から構成されてもよく、前記ヌクレオチド残基および非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。
【００８９】
以下に、前記一本鎖核酸分子の具体例を例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００９０】
（３−１）
前記一本鎖核酸分子の第１形態として、５’側領域および３’側領域が、互いにアニーリングして二重鎖構造（ステム構造）を形成する分子があげられる。これは、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡまたはｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）の形態とも言える。ｓｈＲＮＡは、ヘアピン構造をとっており、一般的に、一つのステム領域と一つのループ領域とを有する。
【００９１】
本形態の核酸分子は、例えば、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結された構造をとる。そして、前記領域（Ｘｃ）が、前記領域（Ｘ）と相補的である構造が好ましく、具体的には、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のうち、一方が、前記発現抑制配列を含み、他方が、前記相補配列を含むことが好ましい。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）は、それぞれ、前記発現抑制配列および前記相補配列のいずれかを有するため、例えば、分子内アニーリングにより、ステム構造を形成でき、前記リンカー領域（Ｌｘ）がループ構造となる。
【００９２】
前記核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）のいずれに配置してもよく、前記相補配列の下流側、すなわち、前記相補配列よりも３’側に配置することが好ましい。
【００９３】
本形態の核酸分子の一例を、図１の模式図に示す。図１（Ａ）は、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図１（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図１（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域が、その長さに応じてループ構造をとる。図１は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【００９４】
前記核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。
【００９５】
前記核酸分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２      ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
【００９６】
前記領域（Ｘ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、前述の通りである。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【００９７】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、Ｘｃの下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘｃ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基〜５０塩基であり、好ましくは、１９塩基〜３０塩基、より好ましくは１９塩基〜２５塩基である。
【００９８】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、より好ましくは４０塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。
【００９９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【０１００】
前記リンカー領域（Ｌｘ）が、前述のようにヌクレオチド残基を含む場合、その長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。
【０１０１】
前記核酸分子の全長は、特に制限されない。前記核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは４２塩基であり、さらに好ましくは４４塩基であり、特に好ましくは４６塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは４２塩基であり、さらに好ましくは４４塩基であり、特に好ましくは４６塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１０２】
（３−２）
前記一本鎖核酸分子の第２形態として、５’側領域および３’側領域が、それぞれ別個に分子内アニーリングして、２つの二重鎖構造（ステム構造）を形成する分子があげられる。
【０１０３】
本形態の核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、５’側領域（Ｘｃ）、内部領域（Ｚ）および３’側領域（Ｙｃ）を、前記順序で含み、前記内部領域（Ｚ）が、内部５’側領域（Ｘ）および内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成され、前記５’側領域（Ｘｃ）が、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）が、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である構造が好ましい。そして、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の少なくとも一つが、前記発現抑制配列を含むことが好ましい。具体的には、前記内部領域（Ｚ）の前記内部５’側領域（Ｘ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記５’側領域（Ｘｃ）が前記相補配列を有することが好ましく、前記内部領域（Ｚ）の前記内部３’側領域（Ｙ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記３’側領域（Ｙｃ）が前記相補配列を有することが好ましい。また、前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）の前記内部５’側領域（Ｘ）が前記相補配列を有することが好ましく、前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）の前記内部３’側領域（Ｙ）が前記相補配列を有することが好ましい。
【０１０４】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前記内部５’側領域（Ｘ）と相補的であり、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前記内部３’側領域（Ｙ）と相補的である。このため、５’側において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能であり、また、３’側において、前記領域（Ｙｃ）が前記領域（Ｙ）に向かって折り返し、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。
【０１０５】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、前記内部５’領域（Ｘ）と前記内部３’領域（Ｙ）が連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記内部５’側領域（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が連結して構成される」と表わすものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが、例えば、前記核酸分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【０１０６】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間に、リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｘ）を介して、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが連結している形態があげられる。
【０１０７】
前記核酸分子において、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態があげられる。
【０１０８】
前記核酸分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有してもよいし、いずれか一方を有してもよい。後者の場合、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有さない、つまり、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが直接連結された形態があげられる。また、後者の場合、例えば、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間に前記リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間に前記リンカー領域（Ｌｘ）を有さない、つまり、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが直接連結された形態があげられる。
【０１０９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、それぞれ、それ自体の領域内部において、自己アニーリングを生じない構造であることが好ましい。
【０１１０】
本形態の核酸分子について、前記リンカー領域を有さない一例を、図２の模式図に示す。図２（Ａ）は、前記核酸分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図２（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図２（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）が折り返し、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間で二重鎖が形成され、前記３’側領域（Ｙｃ）が折り返し、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）との間で二重鎖が形成される。図２は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【０１１１】
前記核酸分子について、前記リンカー領域を有する一例を、図３の模式図に示す。図３（Ａ）は、一例として、前記核酸分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図３（Ｂ）は、前記核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図３（Ｂ）に示すように、前記核酸分子は、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）との間、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成され、前記Ｌｘ領域および前記Ｌｙ領域が、ループ構造をとる。図３は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ等は、これに制限されない。
【０１１２】
前記核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）、前記内部５’側領域（Ｘ）、前記内部３’側領域（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されず、例えば、以下の通りである。
【０１１３】
前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１ないし数（２、３、４もしくは５）塩基が非相補的でもよい。
【０１１４】
また、前記５’側領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的であることが好ましい。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、５’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【０１１５】
前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１ないし数（２、３、４もしくは５）塩基が非相補的でもよい。
【０１１６】
また、前記３’側領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補であることが好ましい。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、３’末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域（セグメント）であることが好ましい。
【０１１７】
前記核酸分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ      ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ  ・・・（２）
【０１１８】
本発明の核酸分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の長さの関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たしてもよい。
Ｘ＝Ｙ  ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ  ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ  ・・・（２１）
【０１１９】
前記核酸分子において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ  ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ  ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ  ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ  ・・・（１０）
【０１２０】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３      ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２          ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０              ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０              ・・・（１８）
【０１２１】
前記（ａ）〜（ｄ）の核酸分子について、それぞれの構造の一例を、図４の模式図に示す。図４は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含む核酸分子であり、（Ａ）は、前記（ａ）の核酸分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）の核酸分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）の核酸分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）の核酸分子の例である。図４において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図４の核酸分子は、前記内部５’側領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記内部３’側領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」として表わすが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図４は、あくまでも、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）との関係、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状等は、これには制限されず、また、リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）の有無も、これには制限されない。
【０１２２】
前記（ａ）〜（ｃ）の核酸分子は、例えば、前記５’側領域（Ｘｃ）と前記内部５’側領域（Ｘ）、および、前記３’側領域（Ｙｃ）と前記内部３’側領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントできない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントできない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図４において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）の核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）の核酸分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）の核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【０１２３】
他方、前記（ｄ）の核酸分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）の核酸分子において、前記５’側領域（Ｘｃ）の５’末端と前記３’側領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【０１２４】
前記核酸分子について、各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【０１２５】
前記５’側領域（Ｘｃ）、前記３’側領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数（Ｆ）およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【０１２６】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。
【０１２７】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、前述の通りである。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【０１２８】
前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記５’側領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【０１２９】
前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記５’側領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【０１３０】
前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、より好ましくは１〜７塩基であり、さらに好ましくは１〜４塩基であり、特に好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記５’側領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【０１３１】
前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記３’側領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記３’側領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【０１３２】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記５’側領域（Ｘｃ）および前記３’側領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基の領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【０１３３】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、前述のようにヌクレオチド残基を含む場合、その長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記内部５’側領域（Ｘ）と前記５’側領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記内部３’側領域（Ｙ）と前記３’側領域（Ｙｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、例えば、同じでも異なってもよく、また、その塩基配列も、同じでも異なってもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【０１３４】
前記核酸分子の全長は、特に制限されない。前記核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは４２塩基であり、さらに好ましくは４４塩基であり、特に好ましくは４６塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは４２塩基であり、さらに好ましくは４４塩基であり、特に好ましくは４６塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１３５】
本形態の核酸分子は、例えば、５’末端と３’末端とが、結合してもよいし、未結合でもよい。前者の場合、本形態の核酸分子は、環状の一本鎖核酸分子である。後者の場合、本形態の核酸分子は、例えば、両末端の未結合を維持できることから、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
【０１３６】
（３−３）
前記一本鎖核酸分子の第３形態として、前記リンカー領域が、非ヌクレオチド構造である分子があげられる。
【０１３７】
本形態は、前記第１形態および前記第２形態の核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および／または前記リンカー領域（Ｌｙ）が、非ヌクレオチド構造を有する以外は、前述の説明を援用できる。
【０１３８】
前記非ヌクレオチド構造は、特に制限されず、例えば、ポリアルキレングリコール、ピロリジン骨格、ピペリジン骨格等があげられる。前記ポリアルキレングリコールは、例えば、ポリエチレングリコールがあげられる。
【０１３９】
前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピロリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、５員環の２位の炭素（Ｃ−２）の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピロリジン骨格は、例えば、ピロリジンの５員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピロリジン骨格において、ピロリジンの５員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）と、例えば、前記ピロリジン骨格に置換されたいずれの基を介して結合してもよく、置換基の置換される好ましい位置は、前記５員環のいずれか１個の炭素と窒素であり、好ましくは、前記５員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチドの主要構造としては、例えば、プロリン、プロリノール等があげられる。前記プロリン、プロリノール等は、例えば、生体内物質およびその還元体であるため、安全性にも優れる。
【０１４０】
前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環を構成する炭素が、１個以上、置換されたピペリジン誘導体の骨格でもよく、置換される場合、例えば、ピペリジンの２位の炭素（Ｃ−２）の炭素以外の炭素原子であることが好ましい。前記炭素は、例えば、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。前記ピペリジン骨格は、例えば、ピペリジンの６員環内に、例えば、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。前記ピペリジン骨格において、ピペリジンの６員環を構成する炭素および窒素は、例えば、水素基が結合してもよいし、後述するような置換基が結合してもよい。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）と、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）と、例えば、前記ピペリジン骨格のいずれの基を介して結合してもよく、好ましくは、前記６員環のいずれか１個の炭素原子と窒素であり、より好ましくは、前記６員環の２位の炭素（Ｃ−２）と窒素である。
【０１４１】
前記リンカー領域は、例えば、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基のみを含んでもよいし、前記非ヌクレオチド構造からなる非ヌクレオチド残基と、ヌクレオチド残基とを含んでもよい。
【０１４２】
前記リンカー領域は、例えば、下記式（Ｉ）で表わされる。
【０１４３】
【化６】
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【０１４４】
前記式（Ｉ）中、例えば、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されていてもよく、および／または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されていてもよく、および／または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍは、０〜３０の範囲の整数であり；
ｎは、０〜３０の範囲の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されていてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｘ）に結合し、
前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、前記リンカー領域（Ｌｙ）に結合し、
ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）である。
【０１４５】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【０１４６】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【０１４７】
前記式（Ｉ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格を含む非ヌクレオチドの主要構造は、例えば、プロリン、プロリノール等があげられる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａに不斉炭素が存在するときは、いずれの光学異性体であってもよい。
【０１４８】
前記式（Ｉ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【０１４９】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【０１５０】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基でもよい。
【０１５１】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７３）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、日本国特許第5555346号明細書の［化５］のシリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【０１５２】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されていてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【０１５３】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍ個の炭素原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【０１５４】
Ｌ１のｎおよびＬ２のｍは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎおよびｍは、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）または（Ｌｙ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎおよびｍは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎとｍは、同じでもよいし（ｎ＝ｍ）、異なってもよい。ｎ＋ｍは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【０１５５】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【０１５６】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【０１５７】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）は、前記リンカー領域（Ｌｘ）に、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）は、前記リンカー領域（Ｌｙ）に、例えば、それぞれ、−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ）の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記ヌクレオチド残基の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、ヌクレオチド残基Ｒ１および／またはＲ２を除く前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。他方、Ｒ１およびＲ２が存在しない場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記式（Ｉ）の構造からなる前記非ヌクレオチド残基のみから形成される。
【０１５８】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基とから形成される場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）における、前記非ヌクレオチド残基と、前記ヌクレオチド残基の合計数は、その下限が、例えば、２個、３個または４個であり、その上限が、例えば、１００個、８０個または５０個である。前記各リンカー領域中の環Ａの数は、具体例として、例えば、２〜５０個、２〜３０個、２〜２０個、２〜１０個、２〜７個、２〜４個、２〜３個等が例示できるが、これには制限されない。
【０１５９】
前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）が、前記非ヌクレオチド残基から形成される場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）における、前記非ヌクレオチド残基の数は、その下限が、例えば、１個、２個または３個であり、その上限が、例えば、１００個、８０個または５０個である。前記各リンカー領域中の環Ａの数は、具体例として、例えば、１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜７個、１〜４個、１〜２個等が例示できるが、これには制限されない。
【０１６０】
前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）、ならびに、前記領域（Ｙｃ）および前記領域（Ｙ）と、前記−ＯＲ１−および−ＯＲ２−との結合の組合せは、特に制限されず、例えば、以下のいずれかの条件があげられる。
条件（１）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（２）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（３）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
条件（４）
前記領域（Ｘｃ）は、−ＯＲ１−を介して、前記領域（Ｘ）は、−ＯＲ２−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合し、
前記領域（Ｙｃ）は、−ＯＲ２−を介して、前記領域（Ｙ）は、−ＯＲ１−を介して、前記式（Ｉ）の構造と結合する。
【０１６１】
前記式（Ｉ）の構造は、例えば、下記式（Ｉ−１）〜式（Ｉ−９）が例示でき、下記式において、ｎおよびｍは、前記式（Ｉ）と同じである。下記式において、ｑは、０〜１０の整数である。
【０１６２】
【化７】
2018199338.tif 000009
【０１６３】
前記式（Ｉ−１）〜（Ｉ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（Ｉ−１）において、ｎ＝８、前記（Ｉ−２）において、ｎ＝３、前記式（Ｉ−３）において、ｎ＝４または８、前記（Ｉ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（Ｉ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（Ｉ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（Ｉ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（Ｉ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（Ｉ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（Ｉ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（Ｉ−４ａ）に、前記式（Ｉ−６）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（Ｉ−６ａ）に示す。
【０１６４】
【化８】
2018199338.tif 000010
【０１６５】
リンカー領域Ｌｘが上記式（Ｉ−６ａ）に示す構造である本発明の核酸分子の好ましい実施態様として、配列番号１３または１４で表される塩基配列からなる核酸分子を挙げることができる。また、リンカー領域ＬｘおよびＬｙがヌクレオチド残基を含む場合の本発明の核酸分子の好ましい実施態様として、配列番号１５または１６で表される塩基配列からなる核酸分子を挙げることができる。更に、リンカー領域ＬｘおよびＬｙが上記式（Ｉ−６ａ）に示す構造である本発明の核酸分子の好ましい実施態様として、配列番号１７または１８で表される塩基配列からなる核酸分子を挙げることができる。
Psh_upstream1_P, S (Psh_us1)
5’-AGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUU-3’（配列番号１３）
Psh_upstream1_P, S (Psh_us2)
5’-GCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUU-3’（配列番号１４）
nk_upstream1_P, S (nk_us1)
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCCCCACACCGGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUCUUCGG-3’（配列番号１５）
nk_upstream1_P, S (nk_us2)
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCCCCACACCGGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUCUUCGG-3’（配列番号１６）
PnK_upstream1_P, S (PnK_us1)
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１７）
PnK_upstream2_P, S (Pnk_us2)
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１８）
【０１６６】
上記本発明の核酸分子において、リンカー領域ＬｘおよびＬｙは、さらに好ましくは、下記式で表される基である。
【０１６７】
【化９】
2018199338.tif 000011
【０１６８】
本発明の核酸分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１６９】
本発明の核酸分子において、前記リンカー以外の領域の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１７０】
本発明の核酸分子において、前記リンカー領域の構成単位は、特に制限されず、例えば、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１７１】
本発明の核酸分子が、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の両方を有する場合、例えば、両方の構成単位が同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、例えば、両方のリンカー領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基である形態、両方のリンカー領域の構成単位が前記非ヌクレオチド残基である形態、一方の領域の構成単位が前記ヌクレオチド残基であり、他方のリンカー領域の構成単位が非ヌクレオチド残基である形態等があげられる。
【０１７２】
本発明の核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明の核酸分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方でもよい。前記核酸分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明の核酸分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜８個、１〜６個、１〜４個、１、２または３個である。
【０１７３】
前記核酸分子が、例えば、非修飾リボヌクレオチド残基の他に修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基でもよい。前記核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１７４】
前記核酸分子が、例えば、非修飾デオキシリボヌクレオチド残基の他に修飾デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾デオキシリボヌクレオチド残基に対する前記修飾デオキシリボヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボース残基がリボース残基に置換された前記リボヌクレオチド残基でもよい。前記核酸分子が、例えば、前記非修飾デオキシリボヌクレオチド残基の他に前記リボヌクレオチド残基を含む場合、前記リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１７５】
本発明の核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【０１７６】
本発明の核酸分子は、前述のように、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスが原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝臓がん等があげられる。
【０１７７】
本発明の核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記Ｂ型肝炎ウイルスを有する投与対象に、前記核酸分子を投与すればよい。
【０１７８】
前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。また、例えば、ヒトまたは非ヒト動物等の細胞、組織または器官に投与してもよく、本発明の核酸分子は、好ましくは、肝細胞、肝臓の組織、肝臓に投与される。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、Ｈｕｈ７、Ａ５４９、ＨｅＬａ、２９３、ＣＯＳ７等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞、造血幹細胞等の体性幹細胞、前記多能性幹細胞もしくは体性幹細胞から分化誘導された各種培養細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１７９】
本発明の核酸分子を投与対象にｉｎ  ｖｉｖｏで投与する場合、該核酸分子は、生体内の特定の器官、組織または細胞に臓器への送達を効率よく行なうために、細胞表面受容体と結合するリガンドとコンジュゲートしていてもよい。本発明の核酸分子は、肝臓への送達効率を向上させるために、肝臓の細胞に特徴的な表面受容体のリガンド等とコンジュゲートすることができる。
かかるリガンドとしては、コレステロールおよびＮ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）クラスター等が挙げられる。
Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＧａｌＮＡｃ）クラスターとしては、例えば、以下の構造式の化合物が挙げられる。
【０１８０】
【化１０】
2018199338.tif 000012
【０１８１】
本発明の核酸分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
【０１８２】
本発明の核酸分子は、前述のように、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１８３】
４．ヌクレオチド残基
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０１８４】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０１８５】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基でもよい。
【０１８６】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾があげられる。
【０１８７】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等のハロゲンに置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０１８８】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０１８９】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０１９０】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０１９１】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換でき、前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明の核酸分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０１９２】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０１９３】
本発明の核酸分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０１９４】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明の核酸分子の検出等に利用できる。
【０１９５】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０１９６】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０１９７】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０１９８】
本発明の核酸分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０１９９】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０２００】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０２０１】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０２０２】
５．本発明の核酸分子の合成方法
本発明の核酸分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
【０２０３】
６．発現ベクター
本発明の発現ベクターは、前記本発明の核酸分子をコードする核酸を含み、本発明の核酸分子を発現させることを特徴とする。本発明の核酸分子の「発現」には、転写によって本発明の核酸分子が形成される場合に加え、転写後のプロセッシングによって本発明の核酸分子が形成される場合も含まれる。本発明の発現ベクターは、前記核酸を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現ベクターは、例えば、ベクターに発現可能なように前記核酸が挿入されている。前記核酸を挿入するベクターは、特に制限されず、例えば、一般的なベクターが使用でき、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター等があげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクターがあげられる。
【０２０４】
当該発現ベクターにおいては、好ましくは、上述の本発明の核酸分子またはそれをコードする核酸が、投与対象である細胞（例えば、ヒト肝細胞等）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。
【０２０５】
使用されるプロモーターは、投与対象であるヒト肝細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーター、ならびにｔＲＮＡプロモーター等のＲＮＡプロモーター等が用いられる。
【０２０６】
ＲＮＡの発現を意図する場合には、プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用することが好ましい。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター等を挙げることができる。
【０２０７】
前記発現ベクターは、好ましくは本発明の核酸分子またはそれをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
【０２０８】
本発明において、ヒトへの投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ＩＴＲ）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
【０２０９】
７．組成物
本発明の組成物は、前述のように、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明の核酸分子または発現ベクターを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の核酸分子または発現ベクターを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０２１０】
本発明によれば、例えば、前記Ｂ型肝炎ウイルスが存在する対象に投与することで、前記Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０２１１】
また、本発明の組成物は、前述のように、前記本発明の核酸分子または発現ベクターを含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の核酸分子または発現ベクターを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の組成物は、例えば、医薬品または医薬組成物ということもできる。
【０２１２】
本発明によれば、例えば、前記Ｂ型肝炎ウイルスが原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療できる。前記疾患は、例えば、前述の通りであって、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝臓がん等があげられる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０２１３】
本発明の医薬組成物は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記Ｂ型肝炎ウイルスを有する投与対象に、前記核酸分子または発現ベクターを投与すればよい。
【０２１４】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、前述のような細胞等があげられる。
【０２１５】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【０２１６】
本発明の医薬組成物は、例えば、本発明の核酸分子または発現ベクターのみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、医薬的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０２１７】
本発明の医薬組成物において、前記核酸分子または発現ベクターは、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記核酸分子を効率よくデリバリーすることができる。前記核酸分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体があげられる。
【０２１８】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０２１９】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
【０２２０】
担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０２２１】
本発明の核酸分子または発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明の医薬組成物は更に核酸導入用試薬を含むことができる。また、核酸導入試薬としては、リポフェクチン、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、もしくはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質またはシゾフィラン（ＳＰＧ）等の多糖類を用いることが出来る。また、発現ベクターとしてレトロウイルスを用いる場合には、導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。
【０２２２】
本発明の医薬組成物の投与単位形態としては、液剤、錠剤、丸剤、飲用液剤、散剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、エキス剤、細粒剤、シロップ剤、浸剤、煎剤、点眼剤、トローチ剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、眼軟膏剤、硬膏剤、カプセル剤、坐剤、浣腸剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）、貼付剤、軟膏剤、ゼリー剤、パスタ剤、吸入剤、クリーム剤、スプレー剤、点鼻剤、エアゾール剤などが例示される。
【０２２３】
医薬組成物中の本発明の核酸分子または発現ベクターの含有量は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、医薬組成物全体の約０．０１ないし１００重量％である。
【０２２４】
医薬組成物中の本発明の核酸分子または発現ベクターの含有濃度は、特に限定されず広範囲に適宜選択されるが、例えば、医薬組成物全体の約０．０１ｎＭないし１Ｍであり、好ましくは０．１ｎＭないし１０ｍＭであり、より好ましくは１ｎＭないし１００ｎＭである。
【０２２５】
本発明の医薬組成物は、その使用に際し各種形態に応じた方法で投与される。例えば、錠剤、丸剤、飲用液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合には経口投与され、注射剤の場合には静脈内、筋肉内、皮内、皮下、関節腔内、腹腔内もしくは腫瘍組織内に投与され、坐剤の場合には直腸内投与される。
【０２２６】
本発明の医薬組成物の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約２．０ｇである。
【０２２７】
本発明の医薬組成物は、通常、本発明の核酸分子または発現ベクターが、標的とする細胞（例、肝細胞、肝臓の癌細胞）に送達されるように、ヒトに対して安全に投与される。
【０２２８】
Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子発現を本発明の核酸分子により抑制すると、Ｂ型肝炎ウイルスの増殖が低下する。従って、本発明の医薬組成物は、Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制用医薬組成物として有用である。本発明の核酸分子または発現ベクターの有効量を対象のＢ型肝炎ウイルスに感染したヒトに投与することにより、当該ヒトにおけるＢ型肝炎ウイルスの増殖を抑制することができる。Ｂ型肝炎ウイルスの増殖を抑制できれば、Ｂ型肝炎の発症を阻止することができ、また、既にＢ型肝炎を発症している場合は、回復させることができる。本発明のＢ型肝炎ウイルス増殖抑制用医薬組成物を用いることにより、Ｂ型肝炎を治療することができる。従って、本発明の医薬組成物は、Ｂ型肝炎の治療に有用である。本発明の核酸分子または発現ベクターの有効量を対象ヒトに投与することにより、当該ヒトにおけるＢ型肝炎を治療することができる。
【０２２９】
Ｂ型肝炎は重症化すると肝硬変や肝臓がんを引き起こす。本発明のＢ型肝炎治療用医薬組成物を用いることにより、肝硬変や肝臓がんを治療することができる。従って、本発明の医薬組成物は、肝硬変や肝臓がんの治療に有用である。本発明の核酸分子または発現ベクターの有効量を対象ヒトに投与することにより、当該ヒトにおける肝硬変や肝臓がんを治療することができる。
【０２３０】
８．発現抑制方法、Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を抑制する方法またはＢ型肝炎ウイルス増殖抑制方法であって、前記本発明の核酸分子、発現ベクターおよび／または医薬組成物を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法またはＢ型肝炎ウイルス増殖抑制方法は、前記本発明の核酸分子、発現ベクターおよび／または医薬組成物を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０２３１】
本発明の発現抑制方法またはＢ型肝炎ウイルス増殖抑制方法は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスが存在する対象に、前記核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。
【０２３２】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記核酸分子を単独で投与してもよいし、前記核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０２３３】
９．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の核酸分子、発現ベクターおよび／または医薬組成物を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明が対象とする疾患は、例えば、前述の通りであって、Ｂ型肝炎、肝硬変、肝臓がん等があげられる。
【０２３４】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
本発明の治療方法における本発明の核酸分子の投与量は、前記疾患の治療上有効な量であれば特に制限されず、疾患の種類、重症度、投与対象の動物種、齢、体重、薬物受容性、投与経路等によって異なるが、通常、成人１回あたり約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約５ｍｇ／ｋｇであり得る。当該量を、例えば、１日３回〜２週間に１回、好ましくは１日〜１週間に１回の間隔で投与することができる。
【０２３５】
１０．核酸分子の使用
本発明の使用は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の核酸分子、発現ベクターおよび／または医薬組成物の使用である。
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制、Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制、あるいはＢ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの治療における使用のための、本発明の核酸分子、発現ベクターおよび／または医薬組成物を提供する。
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現抑制、Ｂ型肝炎ウイルス増殖抑制、あるいはＢ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの治療剤の製造のための、本発明の核酸分子、発現ベクターおよび／または医薬組成物の使用を提供する。
【０２３６】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０２３７】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【０２３８】
［実施例１］
ＨＢＶ由来ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡの評価方法
評価には、株化ヒト肝がん細胞Ｈｕｈ７細胞を用いた。Ｈｕｈ７細胞の培養はペニシリン・ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）培地を使用した。プラスミドの導入以降の実験には、ペニシリン・ストレプトマイシンを含まない培地を用いた。【０２３９】
Ｈｕｈ７細胞を３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう２４ウエルプレートに播種し、２４時間後にリポフェクション法により１．４倍長のＨＢＶゲノムを発現するプラスミドと導入効率補正用として分泌型ルシフェラーゼのＧａｕｓｓｉａＬｕｃ発現プラスミドを共導入した。リポフェクション試薬にはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用した。具体的には、５０ｎｇのｐＧａｕｓｓｉａＬｕｃ、２２５ｎｇのｐＴＲＥ２／１．４ｘＨＢＶ（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｃ）、２２５ｎｇのｃａｒｒｉｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄを１μＬのｐ３０００試薬と混合後、全量が５０μＬとなるよう無血清培地のＯＰＴＩ−ＭＥＭで希釈し、１．５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００試薬と混合し、５分後に２４ウエルで培養中のＨｕｈ７細胞へ添加した。
さらに２４時間後に培地を新しい培地５００μＬに交換し、リポフェクション法によりｓｉＲＮＡを導入した。リポフェクション試薬にはＲＮＡｉＭＡＸを使用した。具体的には、全量が５０μＬとなるよう無血清培地のＯＰＴＩ−ＭＥＭで希釈した５０ｎＭのｓｉＲＮＡ溶液に１．５μＬのＲＮＡｉＭＡＸを添加し、５分後に２４ウエルのＨｕｈ７細胞へ（最終ｓｉＲＮＡ濃度５ｎＭとして）添加した。【０２４０】
導入したｓｉＲＮＡは、以下の通りである。
(a) siRNA_upstream1_P, S (us1)
5’-  AGUCUAGACUCGUGGUGGAtt-3’（配列番号１１）
3’-ttUCAGAUCUGAGCACCACCU  -5’（配列番号９）
(b) siRNA_upstream2_P, S (us2)
5’-  GCAAGAUUCCUAUGGGAGUtt-3’（配列番号１２）
3’-ttCGUUCUAAGGAUACCCUCA  -5’（配列番号１０）
(c) Negative Control siRNA (Negative)
5’-  UACUAUUCGACACGCGAAGtt-3’（配列番号１９）
3’-ttAUGAUAAGCUGUGCGCUUC  -5’（配列番号２０）【０２４１】
さらに２４時間後に、培養液の一部を用いてプラスミド導入効率を補正するためＧａｕｓｓｉａＬｕｃのアッセイを行った。具体的には、５μＬの培養上清に１５μＬの基質溶液（ＮＥＢ社、ＢｉｏＬｕｘ  Ｇａｕｓｓｉａ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を添加し、１分後にプレートリーダーにより発光測定を行った。【０２４２】
ＧａｕｓｓｉａＬｕｃのアッセイと同時に（プラスミド導入４８時間後）、あるいはさらに培養を継続しプラスミド導入７２時間後、９６時間後に培養上清を回収し、遠心により細胞残渣を除去し、ＨＢｓ抗原量あるいはＨＢｅ抗原量の定量を行った。あるいは、プラスミド導入４８時間後より、２４時間おきに培地交換を行い、回収したそれぞれの培養上清中のＨＢｓ抗原量あるいはＨＢｅ抗原量の定量を行った。【０２４３】
ＨＢｓ抗原量あるいはＨｂｅ抗原量の定量は、それぞれｓｙｓｍｅｘ社Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原キットのＨＩＳＣＬ  ＨＢｓＡｇ試薬、ＨＩＳＣＬ  ＨＢｅＡｇ試薬を用いて、添付書に従い実施した。【０２４４】
その結果、ｕｓ１のｓｉＲＮＡおよびｕｓ２のｓｉＲＮＡを導入した場合に、ｓｉＲＮＡ導入なしの場合、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを導入した場合と比較して、検出されたＨＢｓ抗原量が顕著に少なかった（図５、ｎ＝１）。【０２４５】
［実施例２］
また、導入するｕｓ１のｓｉＲＮＡおよびｕｓ２のｓｉＲＮＡの、無血清培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭの溶液各５０μＬに、１．５μＬのＲＮＡｉＭＡＸを添加して、それらを培地中のＨｕｈ７細胞に、最終濃度０．１ｎＭ（ｕｓ１＿０．１、ｕｓ２＿０．１）、１ｎＭ（ｕｓ１＿１、ｕｓ２＿１）、または１０ｎＭ（ｕｓ１＿１０、ｕｓ２＿１０）として加え、プラスミド導入９６時間後に上記と同様に試験したところ、濃度依存的なＨＢｓ抗原およびＨＢｅ抗原の産生抑制効果が観察された（図６、ｎ＝３）。【０２４６】
［実施例３］
更に、ｕｓ１のｓｉＲＮＡおよびｕｓ２のｓｉＲＮＡの配列について、以下のＲＮＡ配列を作製し、プラスミド導入９６時間後に上記と同様に試験した。PnK_upstream1_P, S (PnK_us1)
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１７）
PnK_upstream2_P, S (Pnk_us2)
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUC−Ｌｙ−G-3’（配列番号１８）
nk_upstream1_P, S (nk_us1)
5’-AAGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCCCCACACCGGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUUCUUCGG-3’（配列番号１５）
nk_upstream1_P, S (nk_us2)
5’-AGCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCCCCACACCGGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUUCUUCGG-3’（配列番号１６）
Psh_upstream1_P, S (Psh_us1)
5’-AGUCUAGACUCGUGGUGGAUUCC−Ｌｘ−GGAAUCCACCACGAGUCUAGACUUU-3’（配列番号１３）Psh_upstream1_P, S (Psh_us2)
5’-GCAAGAUUCCUAUGGGAGUUUCC−Ｌｘ−GGAAACUCCCAUAGGAAUCUUGCUU-3’（配列番号１４）
ここで、ＬｘおよびＬｙは下記式で表される基である。【０２４７】
【化１１】
2018199338.tif 000013
【０２４８】
その結果、いずれの核酸分子を導入した場合も、ｓｉＲＮＡ導入なしの場合、ネガティブコントロールのｓｉＲＮＡを導入した場合と比較して、検出された抗原量が顕著に少なかった（図７、ｎ＝３）。これらのうち、最も高い効果を示したのはＰｓｈ＿ｕｓ２であった。【０２４９】
［実施例４］
また、各核酸分子の、無血清培地ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭの溶液各５０μＬに、１．５μＬのＲＮＡｉＭＡＸを添加して、それらを培地中のＨｕｈ７細胞に、最終濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭとして加え、ｓｉＲＮＡ導入後２４時間ごとに培地を交換し、ＨＢＶ導入後２４〜４８時間、４８〜７２時間、７２〜９６時間、９６〜１２０時間培養した培養液の上清により上記と同様に試験し培養上清中のＨＢｓ抗原量を定量したところ、経時的且つ濃度依存的なＨＢｓ抗原産生抑制効果が観察された（図８、ｎ＝１）。
【産業上の利用可能性】
【０２５０】
本発明により、細胞への毒性が少なく、安定な、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の発現を効果的に抑制できる核酸分子、および該核酸分子を含む医薬組成物が提供される。Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原を産生抑制することにより、本発明の医薬組成物は、副作用が軽減されたＢ型肝炎ウイルス増殖抑制用、ひいてはＢ型肝炎、肝硬変、肝臓がんの治療用として有用である。【０２５１】
本出願は日本で出願された特願２０１７−０８８９６０（出願日：２０１７年４月２７日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2018199338.tif 000019
【図２】
2018199338.tif 000020
【図３】
2018199338.tif 000021
【図４】
2018199338.tif 000022
【図５】
2018199338.tif 000023
【図６】
2018199338.tif 000024
【図７】
2018199338.tif 000025
【図８】
2018199338.tif 000026
【配列表】
2018199338000001.app
【国際調査報告】
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2018199338.tif 000029
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