(57)【要約】  糖化された異常ヘモグロビンを含む試料についても、測定誤差の少ない、或いは測定値と真の値との乖離を生じない糖化ヘモグロビンオキシダーゼを提供すること。  配列番号１のアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位又は１０２位に対応する位置のアミノ酸を正電荷を帯びたアミノ酸以外のアミノ酸、例えばグルタミン酸、アラニン、又はアスパラギン酸に置換した糖化ヘモグロビンオキシダーゼ並びにこれを用いた糖化ヘモグロビンの測定方法及び測定試薬キット。種々の遺伝型に対応し、糖化された異常ヘモグロビンを含む試料についても精度よく糖化ヘモグロビンを測定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HbS1cまたはHbC1cを含み得る試料に糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させる工程を含む、試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定する方法。
【請求項２】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼの作用により生じる還元型化合物の量を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定される還元型化合物が過酸化水素である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び／又は(b)の性質を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法、
(a)  HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b)  HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。
【請求項５】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が６〜８、作用pH範囲が５〜９、至適温度範囲が２５〜４０℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約４５〜５５ＫＤａである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択される糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法、
(i)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０９位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０６位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位、及び１０２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。
【請求項７】
試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定するための糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
【請求項８】
HbS1cまたはHbC1cに糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させて生じる還元型化合物の量を測定するためのものである、請求項７に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
【請求項９】
生じる還元型化合物が過酸化水素である、請求項８に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
【請求項１０】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び／又は(b)の性質を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(a)  HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b)  HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。
【請求項１１】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が６〜８、作用pH範囲が５〜９、至適温度範囲が２５〜４０℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約４５〜５５ＫＤａである、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
【請求項１２】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択されるものである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(i)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０９位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０６位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位、及び１０２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。
【請求項１３】
コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属のアマドリアーゼに基づくものである、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
【請求項１４】
アマドリアーゼがコニオカエタ  エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム  テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ  エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム  エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア  クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ  バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス  ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア  ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス  ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ  ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム  エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム  ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム  クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、請求項１３に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれか１項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、HbS1cまたはHbC1c測定用試薬組成物。
【請求項１６】
請求項７〜１４のいずれか１項に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼをコードする、遺伝子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の遺伝子を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９】
以下の工程を含む、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法、
（i）請求項１８に記載の宿主細胞を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件下で培養する工程、及び
（ii）培養物又は培養液から糖化ヘモグロビンオキシダーゼを単離する工程。
【請求項２０】
以下の工程を含む、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを改変して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製する方法、
(i) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を取得する、
(ii) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを発現させ、発現産物を単離する、(iii) 発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定する、(iv) アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位又は１０２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されるよう、前記アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を改変する、
(v) 改変後の遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、改変体を発現させ、発現産物を単離する、
(vi) 改変体の発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定し、工程(iii)の値と比較する、
(vii) 改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbS1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している、かつ／又は改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbC1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している場合、当該改変体を糖化ヘモグロビンオキシダーゼとする、並びに
(viii) 必要に応じて、工程(vii)の糖化ヘモグロビンオキシダーゼについて、工程(iv)〜(vi)を繰り返す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の糖化ヘモグロビンに対する活性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、及びこれを用いた糖化ヘモグロビン測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。【０００３】
中でも血糖コントロールマーカーとして、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ＨｂＡ１ｃは、へモグロビン「β鎖」のＮ末端（アミノ末端）のＶａｌ（バリン）の、α−アミノ基にグルコースが結合したタンパク質である。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃの値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、従来、アマドリアーゼを用いる数種類の酵素的方法が知られている。【０００４】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素の総称である。アマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃを酵素的方法により測定するために有用な酵素として知られている。アマドリアーゼにより酸化される基質としては、例えば、α−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）が知られている。【０００５】
アマドリアーゼはこれまでに、細菌、酵母、真菌から見出されており、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜９参照。）。これらの属のことを本明細書においてコニオカエタ(Coniochaeta)属等と呼ぶことがある。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。【０００６】
上述のような各種のアマドリアーゼを用いて、ＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法としては、プロテアーゼまたはペプチダーゼ（以下、プロテアーゼ等という）の切り出し用酵素でＨｂＡ１ｃを分解し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端より特定の測定用物質を遊離させ、遊離した測定用物質を、上述のようなアマドリアーゼを用いて定量する方法が知られている（例えば、特許文献１〜７参照）。【０００７】
具体的には、ＨｂＡ１ｃを特定のプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端よりαＦＶＨを遊離させたのちに、遊離したαＦＶＨを定量する方法が知られている。【０００８】
さらに、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼで消化し、α−フルクトシルヘキサペプチド（α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸、以降αＦ６Ｐと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦ６Ｐを定量する方法がある（例えば、特許文献１６−１８参照）。この方法は、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）により定められたＨｂＡ１ｃ測定法（非特許文献１０参照）に則った、酵素によるＨｂＡ１ｃの測定方法である。【０００９】
さらに、プロテアーゼでの前処理を必要とせず、直接ＨｂＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成させるアマドリアーゼと、それを利用したＨｂＡ１ｃ測定法が報告されている（特許文献２０、２１、２２）。このようなアマドリアーゼは、Ａ１ｃオキシダーゼ（A1cOX）と呼ぶことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】国際公開第２００４／３８０３４号
【特許文献１７】国際公開第２００８／１０８３８５号
【特許文献１８】国際公開第２０１３／１６２０３５号
【特許文献１９】国際公開第２０１５／００５２５７号
【特許文献２０】国際公開第２０１５／０６０４２９号
【特許文献２１】国際公開第２０１６／１５９３８４号
【特許文献２２】国際公開第２０１５／００５２５７号
【特許文献２３】国際公開第２０１２／０１８０９４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-11, 2003
【非特許文献２】Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010
【非特許文献３】J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006
【非特許文献４】Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-9, 2007
【非特許文献５】Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996
【非特許文献６】Mar. Biotechnol. 6, 625-32, 2004
【非特許文献７】Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002
【非特許文献８】Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002
【非特許文献９】Biotechnol. Letters 27, 27-32, 2005
【非特許文献１０】Jeppsson JO, et al.;Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood. Clin. Chem. Lab. Med. 40, 78-89,2002
【非特許文献１１】J. Biol. Chem., 283, 27007-27016 (2008)
【非特許文献１２】Proteins, 84, 744-758 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者は、プロテアーゼでの前処理を必要とせず、直接HbA1cのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成させるアマドリアーゼ、すなわちA1cOXを用いるHbA1c測定法を報告した（特許文献２０、２１）。そして、このような酵素を用いて種々の試験を行ったところ、A1cOXの、β鎖Ｎ末端のＶａｌのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンC（本明細書においてHbC1cという）やβ鎖Ｎ末端のＶａｌのα−アミノ基が糖化されたヘモグロビンS（本明細書においてHbS1cという）に対する相対活性が、HbA1cに対する活性と比較して、予想外に低いであろうことを示す知見を得た。
すなわちモデル基質として、下記３種のα−フルクトシルオクタペプチド(αF8P)を用意した：
α-fru-V-H-L-T-P-E-E-K（本明細書においてHbA1c型αF8Pという）
α-fru-V-H-L-T-P-V-E-K（本明細書においてHbS1c型αF8Pという）
α-fru-V-H-L-T-P-K-E-K（本明細書においてHbC1c型αF8Pという）【００１３】
HbA1c型αF8Pとは、HbA1cのN末端８アミノ酸に対応する糖化基質であるα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジンを意味する。HbA1c型αF8Pでは６位はグルタミン酸である（E6）。HbS1c型αF8Pでは６位がバリンである（E6V変異）。HbC1c型αF8Pでは６位がリシンである（E6K変異）。すなわちHbS1c型αF8PとHbC1c型αF8Pは第6位が変異しており、変異はそれぞれ、HbS1c及びHbC1cに対応する。【００１４】
これらの基質（10μM）に対する、A1cOXの相対活性を比較したところ、HbA1c型αF8Pに対する活性を１００％とした場合、HbS1c型αF8Pに対する活性が３９％であり、HbC1c型αF8Pに対する活性が１１％であることを見出した。【００１５】
ヘモグロビンS(HbS)は人口の一部に見られるヘモグロビンAの遺伝性のバリアントであり、へモグロビンAのβ鎖のＮ末端から数えて６つ目（すなわちN末端のバリンを１位とすると６位）のグルタミン酸がバリンとなっている（E6V変異）。またヘモグロビンC（HbC）は人口の一部に見られるヘモグロビンAの遺伝性のバリアントであり、へモグロビンAのβ鎖のＮ末端から数えて６つ目（すなわちN末端のバリンを１位とすると６位）のグルタミン酸がリシンとなっている（E6K変異）。A1cOXを用いて糖化ヘモグロビンを測定する場合、HbSやHbCの遺伝型を有する被験体については、これらの遺伝型ヘモグロビンに対応するαF8P基質の相対活性が低いことに鑑みれば、測定値が真の値と乖離する可能性がある。【００１６】
以上より、本発明者は、HbA1cのみならずHbS1cやHbC1cといった遺伝型にも対応可能な糖化ヘモグロビンオキシダーゼを提供する必要がある、という新規の課題を見出した。すなわち、本発明が解決しようとする課題は、HbA1cのみならずHbS1c及び／又はHbC1cにも作用する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ及びこれを用いた測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、A1cOXに特定のアミノ酸置換を導入することにより、HbA1cに対する活性と比較して、HbS1c及び／又はHbC1cに対する相対活性の向上した改変アマドリアーゼが得られることを見出し、本発明を完成させた。【００１８】
すなわち、本発明は以下を包含する。   
[１]  HbS1cまたはHbC1cを含み得る試料に糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させる工程を含む、試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定する方法。   
[２]  糖化ヘモグロビンオキシダーゼの作用により生じる還元型化合物の量を測定する、実施形態１に記載の方法。   
[３]  測定される還元型化合物が過酸化水素である、実施形態２に記載の方法。   
[４]  糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び／又は(b)の性質を有する、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法、
(a)  HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b)  HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。   
[５]  糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が６〜８、作用pH範囲が５〜９、至適温度範囲が２５〜４０℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約４５〜５５ＫＤａである、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。   
[６]  糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択される糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体である、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法、
(i)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０９位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０６位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位、及び１０２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。   
[７]  試料中のHbS1cまたはHbC1cを測定するための糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。   
[８]  HbS1cまたはHbC1cに糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させて生じる還元型化合物の量を測定するためのものである、実施形態７に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。   
[９]  生じる還元型化合物が過酸化水素である、実施形態８に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。   
[１０]  糖化ヘモグロビンオキシダーゼが(a)及び／又は(b)の性質を有する、実施形態７〜９のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(a)  HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、
(b)  HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上である。   
[１１]  糖化ヘモグロビンオキシダーゼの至適pH範囲が６〜８、作用pH範囲が５〜９、至適温度範囲が２５〜４０℃であり、SDS-PAGE上での分子量が約４５〜５５ＫＤａである、実施形態７〜１０のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。   
[１２]  糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、以下の(i)〜(viii)からなる群より選択されるものである、実施形態７〜１１のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ、
(i)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(ii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０９位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iii)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０６位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(iv)  糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(v)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位、及び１０２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vi)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、
(vii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体、或いは
(viii)  前記(i)、(ii)、(iii)、又は(iv)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４５のアミノ酸配列と５０％以上の配列同一性を有し、配列番号１又は配列番号４５の相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが７０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体。   
[１３]  コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属のアマドリアーゼに基づくものである、実施形態７〜１２のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。   
[１４]  アマドリアーゼがコニオカエタ  エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム  テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ  エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム  エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア  クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ  バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス  ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア  ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス  ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ  ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム  エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム  ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム  クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、実施形態１３に記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ。   
[１５]  実施形態７〜１４のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、HbS1cまたはHbC1c測定用試薬組成物。   
[１６]  実施形態７〜１４のいずれかに記載の糖化ヘモグロビンオキシダーゼをコードする、遺伝子。   
[１７]  実施形態１６に記載の遺伝子を含む、ベクター。   
[１８]  実施形態１７に記載のベクターを含む、宿主細胞。   
[１９]  以下の工程を含む、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法、
（i）実施形態１８に記載の宿主細胞を、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件下で培養する工程、及び
（ii）培養物又は培養液から糖化ヘモグロビンオキシダーゼを単離する工程。 
[２０]  以下の工程を含む、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを改変して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製する方法、
(i) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を取得する、
(ii) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを発現させ、発現産物を単離する、(iii) 発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定する、(iv) アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位又は１０２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されるよう、前記アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を改変する、
(v) 改変後の遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、改変体を発現させ、発現産物を単離する、
(vi) 改変体の発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定し、工程(iii)の値と比較する、
(vii) 改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbS1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している、かつ／又は改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbC1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している場合、当該改変体を糖化ヘモグロビンオキシダーゼとする、並びに
(viii) 必要に応じて、工程(vii)の糖化ヘモグロビンオキシダーゼについて、工程(iv)〜(vi)を繰り返す。【００１９】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-167890号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、HbA1cのみならずHbS1cやHbC1cといった遺伝型の糖化ヘモグロビンをも認識する糖化ヘモグロビンオキシダーゼが提供される。これは種々の遺伝型に対応可能な糖化ヘモグロビン測定試薬とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性を例示する１番目の図である。Co（Coniochaeta sp.）、Et（Eupenicillium terrenum）、Py（Pyrenochaeta sp.）、Ar（Arthrinium sp.）、Cc（Curvularia clavata）、Nv（Neocosmospora vasinfecta）のほか、Cn（Cryptococcus neoformans）、Pn（Phaeosphaeria nodorum）、An（Aspergillus nidulans）、En（Emericella nidulans）、Ul（Ulocladium sp.）及びPj（Penicillium janthinelum）をアライメントした。
【図１−２】図１−２は、図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−３は、図１−２のつづきである。
【図１−４】図１−４は、図１−３のつづきである。
【図１−５】図１−５は、図１−４のつづきである。
【図２−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する図である。図１に示すアマドリアーゼに加え、Ao2、Af2、At、Fo、Ao1、Af1、Pi、Dhをアライメントした。
【図２−２】図２−２は、図２−１の続きである。
【図２−３】図２−３は、図２−２の続きである。
【図２−４】図２−４は、図２−３の続きである。
【図２−５】図２−５は、図２−４の続きである。
【図２−６】図２−６は、図２−５の続きである。
【図２−７】図２−７は、図２−６の続きである。
【図２−８】図２−８は、図２−７の続きである。
【図２−９】図２−９は、図２−８の続きである。
【図２−１０】図２−１０は、図２−９の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
（糖化ヘモグロビン、ヘモグロビンＡ１ｃ、糖化されたHbS、糖化されたHbC）
ヘモグロビンとしては、正常ヘモグロビンであるヘモグロビンA(HbA)の他に、異常ヘモグロビン、例えばヘモグロビンS(HbS)やヘモグロビンC(HbC)が挙げられる。本明細書において糖化ヘモグロビンとは、非酵素的に糖化されたヘモグロビンをいう。本明細書において糖化ヘモグロビンという場合、この用語は、糖化されたHbAのみならず、糖化された異常ヘモグロビン、例えば糖化されたHbS及び糖化されたHbCも包含するものとする。糖化ヘモグロビンは生体内では血液等に存在する。糖化ヘモグロビンの中でもHbAのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンA1c(HbA1c)と言う。ここで、糖化されたHbSまたはHbCには、β鎖に結合した糖の種類に応じて種々の糖化HbSまたは糖化HbCがあり得る。しかしながら本明細書では、便宜上、糖化HbSという場合、特に断らない限り、これはHbSのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化されたものをいうものとする（HbS1cということもできる）。また本明細書では、便宜上、糖化HbCという場合、特に断らない限り、これはHbCのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化されたものをいうものとする（HbC1cということもできる）。
【００２４】
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−アミノ基が糖化されたα−糖化ペプチド（α−フルクトシルペプチド）である。
【００２５】
（基質特異性）
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1c、より具体的にはHbA1cのβ鎖に直接作用する。ここで直接作用する、とは、アマドリアーゼが酸素の存在下で糖化ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端のフルクトシル基に作用し、2-ケト-Dグルコースおよび過酸化水素、ヘモグロビンのβ鎖が生じることをいう。また本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1c型αF8Pに作用する。さらに、重要なこととして、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1c型αF8Pのみならず、HbS1c型αF8P及び／又はHbC1c型αF8Pにも作用する。HbA1c型αF8Pに作用するアマドリアーゼがHbA1cにも作用することが知られていることから（特許文献２１）、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼはHbA1cのみならず、糖化HbS及び／又は糖化HbCにも作用すると合理的に考えられる。すなわちある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、HbA1cのみならず、糖化HbS及び／又は糖化HbCにも作用する。
【００２６】
（糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体の相対活性）
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、改変前のA1cオキシダーゼと比較してHbS1c型αF8Pに対する相対活性が向上している。HbS1c型αF8Pに対する相対活性とは、酵素量や反応条件を一定とした場合のHbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8P（正常型αF8P）に対する活性との比、すなわち（HbS1c型αF8Pに対する活性／HbA1c型αF8Pに対する活性）をいう。HbS1c型αF8Pに対する活性／HbA1c型αF8Pに対する活性を便宜上、本明細書において相対活性[HbS1c/HbA1c]と表記することがある。
【００２７】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、改変前のA1cオキシダーゼと比較してHbC1c型αF8Pに対する相対活性が向上している。HbC1c型αF8Pに対する相対活性とは、酵素量や反応条件を一定とした場合のHbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち（HbC1c型αF8Pに対する活性／HbA1c型αF8Pに対する活性）をいう。HbC1c型αF8Pに対する活性／HbA1c型αF8Pに対する活性を、便宜上、本明細書において相対活性[HbC1c/HbA1c]と表記することがある。
【００２８】
すなわち、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、改変前のA1cオキシダーゼと比較して、相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大している。なお、本明細書では相対活性をモデル基質αF8Pとの関係で規定したが、これはあくまで便宜上のものであり、各種の糖化ヘモグロビンに対する相対的な活性についてもこの性質は同様に反映されると合理的に考えられる。
【００２９】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、改変前のアマドリアーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]と比較して、改変後の相対活性[HbS1c/HbA1c]が1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.5倍以上、例えば2.6倍以上増大していてもよい。例えば改変前のA1cOXの相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.39であり、改変後の糖化ヘモグロビンオキシダーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.77である場合、改変の前後で相対活性[HbS1c/HbA1c]は、約1.97倍増大している。
【００３０】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、改変前のアマドリアーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]と比較して、改変後の相対活性[HbC1c/HbA1c]が1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.4倍以上、1.5倍以上、2.0倍以上、2.5倍以上、3.0倍以上、4.0倍以上、5.0倍以上、6.0倍以上、7.0倍以上、8.0倍以上、例えば8.3倍以上増大していてもよい。例えば改変前のA1cOXの相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.11であり、改変後の糖化ヘモグロビンオキシダーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.91である場合、改変の前後で相対活性[HbC1c/HbA1c]は、約8.3倍増大している。
【００３１】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、相対活性[HbS1c/HbA1c]が、0.4以上、0.41以上、0.42以上、0.43以上、0.44以上、0.45以上、0.5以上、0.55以上、0.6以上、0.65以上、0.7以上、0.75以上、0.8以上、0.85以上、0.9以上、例えば0.95以上であり得る。ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、相対活性[HbC1c/HbA1c]が、0.10以上、0.11以上、0.12以上、0.13以上、0.14以上、0.15以上、0.16以上、0.17以上、0.18以上、0.19以上、0.2以上、0.25以上、0.3以上、0.35以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、例えば0.9以上であり得る。
【００３２】
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、HbA1cに作用するのみならず、相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大しているため、糖化HbSや糖化HbCを含む試料の測定に用いることができ、測定値が真の値と乖離する問題を回避することができる。
【００３３】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、試料中の糖化ヘモグロビンを正確に測定することができ、測定値と真の値との乖離をもたらさない。ある実施形態において、測定値と真の値との乖離をもたらさないとは、試料中に実際に含まれる糖化ヘモグロビンが１００(任意単位)である場合に、例えば、測定値が９０(任意単位)未満または１１０を超える値を示すことをいう。
【００３４】
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼとも呼ばれる。アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
【００３５】
アマドリアーゼは、例えば、コニオカエタ属、ユーペニシリウム属、ピレノケータ属、アルスリニウム属、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、アスペルギルス属、エメリセラ属、ウロクラディウム属、ペニシリウム属、フザリウム属、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、レプトスフェリア属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、コニオケチジウム属、ピチア属、コリネバクテリウム属、アグロバクテリウム属、又はアルスロバクター属の微生物から得ることができる。
【００３６】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
アマドリアーゼをコードする遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００３７】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００３８】
アマドリアーゼ遺伝子の一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報）が挙げられる。また別の例として、Phaeosphaeria属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Neocosmospora属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Aspergillus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCryptococcus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCurvularia属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びEupenicillium属由来のアマドリアーゼ遺伝子が挙げられる。
【００３９】
アマドリアーゼ遺伝子は、ベクターに連結されていてもよい。ベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド等の任意のベクターが挙げられ、例えば、pBluescriptII SK+（Stratagene社製）が挙げられる。Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子及びこれを含むプラスミドは国際公開第２００７／１２５７７９号に開示されている。Eupenicillium terrenum ATCC 18547株由来のアマドリアーゼ遺伝子及びこれを含むプラスミドは国際公開第２００７／１２５７７９号に開示されている。Aspergillus nidulans FGSC A26株由来のアマドリアーゼ遺伝子及びこれを含むプラスミドは国際公開第２０１２／０１８０９４号に開示されている。Cryptococcus neoformans由来のアマドリアーゼ遺伝子及びこれを含むプラスミドは国際公開第２０１２／０１８０９４号に開示されている。Neocosmospora vasinfecta由来のアマドリアーゼ遺伝子及びこれを含むプラスミドは国際公開第２０１２／０１８０９４号に開示されている。プラスミドは、常法に従い取得しうる。例えばGenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Alcrich社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子を含むプラスミドを、抽出、精製し得る。例えば特許文献２０〜２２の教示を参考に、得られたアマドリアーゼ遺伝子を操作してA1cOX遺伝子を作製したり精製酵素を得ることができる。
【００４０】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００４１】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００４２】
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００４３】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法（Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)： Methods Enzymol., 154, 350 (1987)： Gene, 37, 73 (1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res., 13, 8749 (1985)： Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985)： Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488 (1985)： Methods Enzymol., 154, 367 (1987))等が挙げられる。
【００４４】
また、一般的なＰＣＲ法を用いることもできる（Technique, 1, 11(1989)参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子、或いは糖化ヘモグロビンオキシダーゼ遺伝子を合成することもできる。
【００４５】
アマドリアーゼ遺伝子の塩基配列は、例えばマルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）により確認し得る。
【００４６】
（形質転換・形質導入）
アマドリアーゼ遺伝子は、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込むことができる。これを用いて、各々のベクターに対応する宿主を、常法により形質転換又は形質導入しうる。大腸菌の宿主としては、各種大腸菌株、例えばＫ−１２株、ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）、ＤＨ５α株（タカラバイオ社）等が挙げられるがこれに限らない。
【００４７】
（A1cOX）
アマドリアーゼの中でもHbA1cに直接作用するものをA1cオキシダーゼ（A1cOX）と呼ぶことがある。A1cOX遺伝子は特許文献２０〜２２の教示に基づき、上記のアマドリアーゼ遺伝子から作製しうる。これらの均等物も本発明に利用しうる。
【００４８】
例えば特許文献２０及び２１は、Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）に基づくA1cOXを開示している。特許文献２１は、αF8Pに対する比活性が高いA1cOXを開示している。参照によりこれら全内容を本明細書に組み入れる。下記の表に、A1cOXが有し得る変異とその位置を示す。表中、示される位置の左のアミノ酸（１文字表記）が野生型アミノ酸であり、右が置換後のアミノ酸である。置換後のアミノ酸として複数のアミノ酸が開示されている場合は、各候補を句点で区切って示してある。
【００４９】
【表１】
2019045052.tif 000002
【００５０】
他の由来のアマドリアーゼの各配列における、配列番号１の６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、３５６位、６４位及び９９位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。対応する位置については後述する。
【００５１】
【表２】
2019045052.tif 000003
【００５２】
【表３】
2019045052.tif 000004
【００５３】
また特許文献２２はEmericella nidulans由来アマドリアーゼ（FPOX）に基づく改変体を開示している。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。下記表に、FPOX改変体が有し得る変異とその位置を示す。表中、左欄に示される位置が、本明細書の配列番号１に対応する位置であり、右欄の位置がそれぞれ対応する、当該アマドリアーゼにおける位置である。また表中、示される位置の左のアミノ酸が野生型アミノ酸であり、右が置換後のアミノ酸である。置換後のアミノ酸として複数のアミノ酸が開示されている場合は、各候補を句点で区切って示してある。
【００５４】
【表４】
2019045052.tif 000005
【００５５】
他の由来のアマドリアーゼの各配列における、配列番号１の６２位、６３位、６４位、７２位、１０９位、１１６位、７６位、６７位、９６位、１０６位、及び３５５位に対応するそれぞれの位置は次の表のとおりである。
【００５６】
【表５】
2019045052.tif 000006
【００５７】
【表６】
2019045052.tif 000007
【００５８】
A1cOXは上記の変異を有しうる。当業者であれば、特許文献２０〜２２の記載、及び上記の記載を参考にA1cOX遺伝子を作製しうる。例えばある実施形態において、A1cOXは配列番号１の62位に対応する位置にアルギニン以外のアミノ酸へのアミノ酸置換、例えば上記の表に示されるアミノ酸への置換や、さらにはリシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン等へのアミノ酸置換を有しうる。さらにA1cOXは配列番号１の63位に対応する位置、355位に対応する位置及び419位に対応する位置からなる群より選択される位置において、1以上、例えば２以上、例えば３つのアミノ酸置換を有し得る。置換アミノ酸は、上記の表に記載にものであり得る。或いは、A1cOXはさらに配列番号１の63位に対応する位置、64位に対応する位置、72位に対応する位置、109位に対応する位置、116位に対応する位置、76位に対応する位置、67位に対応する位置、96位に対応する位置、及び355位に対応する位置からなる群より選択される位置において、1以上、例えば２以上、例えば３以上、例えば４以上、例えば５以上、例えば６以上、例えば７以上、例えば８以上、例えば９つのアミノ酸置換を有し得る。置換アミノ酸は、上記の表に記載にものであり得る。場合によりA1cOXはさらに、配列番号１の68位に対応する位置、356位に対応する位置、64位に対応する位置、及び99位に対応する位置からなる群より選択される位置において、1以上、例えば２以上、例えば３以上、例えば４つのアミノ酸置換を有し得る。置換アミノ酸は、上記の表に記載にものであり得る。
【００５９】
（A1cOXの改変体）
A1cOX遺伝子に本発明の変異を導入することによりA1cOX改変体を作製し、糖化HbSや糖化HbCに対する相対活性の増大した糖化ヘモグロビンオキシダーゼを製造しうる。
【００６０】
（本発明の変異）
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、配列番号１の１１３位、１０９位、１０６位及び／又は１０２位に対応する位置に、変異を有しうる。対応する位置については下記に説明する。ある実施形態では、Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）に基づくA1cOX又はEmericella nidulans由来アマドリアーゼ（配列番号１１）に基づくアマドリアーゼ（例えば配列番号４５）に、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を導入しうる：
（ａ）配列番号１の１１３位に対応する位置
（ａ’）配列番号１の１０９位に対応する位置
（ｂ）配列番号１の１０６位に対応する位置
（ｃ）配列番号１の１０２位に対応する位置
【００６１】
上記の位置に関し、配列番号１の（ａ）１１３位、（ａ’）１０９位、（ｂ）１０６位及び／又は（ｃ）１０２位に対応する位置のアミノ酸を、正電荷を帯びたアミノ酸（リシン、ヒスチジン、アルギニン）以外のアミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、バリン、グルタミン、アスパラギン、例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニンに置換することができる。
【００６２】
一部の限定的な実施形態では、置換後のアミノ酸から、天然アマドリアーゼ配列におけるアミノ酸（天然アミノ酸）への復帰変異は除かれる。別の実施形態では、配列番号１の１０２位、１０６位、１０９位又は１１３位に対応する位置の置換後のアミノ酸は、天然アマドリアーゼ配列における当該位置のアミノ酸（天然アミノ酸）と同一でありうる。これは見かけ上、復帰変異のように見える。しかしながら、当該天然アミノ酸が、当該天然アマドリアーゼから前記A1cオキシダーゼを作製するに当たり、別のアミノ酸へと置換されていた場合、それは、A1cオキシダーゼにとって好ましい構成又は必要な構成と理解される。そうすると、A1cオキシダーゼから出発してHbA1cのみならず糖化HbSや糖化HbCにも作用する糖化ヘモグロビンオキシダーゼを得る上では、そのような好ましい構成又は必要と考えられていた構成を改変するアミノ酸置換は、天然アマドリアーゼへの復帰変異ではなく、本発明の課題を解決するための基質特異性改変アミノ酸置換と理解される。したがって、ある実施形態において本発明は、見かけ上、天然アミノ酸への復帰変異に見える置換であっても、本発明の課題を解決することができるアミノ酸置換としてこれを包含する。
【００６３】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、10μMのHbS1c型αF8Pに対する比活性が20mU/mg以上、30mU/mg以上、40mU/mg以上、50mU/mg以上、60mU/mg以上、70mU/mg以上、80mU/mg以上、90mU/mg以上、100mU/mg以上、110mU/mg以上、120mU/mg以上、130mU/mg以上、140mU/mg以上、150mU/mg以上、160mU/mg以上、170mU/mg以上、例えば180mU/mg以上でありうる。ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、10μMのHbC1c型αF8Pに対する比活性が20mU/mg以上、30mU/mg以上、40mU/mg以上、50mU/mg以上、60mU/mg以上、70mU/mg以上、80mU/mg以上、90mU/mg以上、100mU/mg以上、110mU/mg以上、120mU/mg以上、130mU/mg以上、140mU/mg以上、150mU/mg以上、160mU/mg以上、170mU/mg以上、例えば180mU/mg以上でありうる。ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、10μMのHbA1c型αF8Pに対する比活性が20mU/mg以上、30mU/mg以上、40mU/mg以上、50mU/mg以上、60mU/mg以上、70mU/mg以上、80mU/mg以上、90mU/mg以上、100mU/mg以上、110mU/mg以上、120mU/mg以上、130mU/mg以上、140mU/mg以上、150mU/mg以上、160mU/mg以上、170mU/mg以上、例えば180mU/mg以上でありうる。
【００６４】
（対応する位置）
本明細書において、ある基準となるアミノ酸配列中の特定の位置が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置と対応する場合、これを対応する位置という。また対応する位置のアミノ酸を対応するアミノ酸という。本明細書では便宜上、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列を基準として説明する。この場合、アミノ酸配列における「対応する位置」とは、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
【００６５】
アミノ酸配列における「対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。対応する位置（相同位置）は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００６６】
（変異の対応位置）
本明細書において、「配列番号１のアミノ酸配列の１１３位に対応する位置」とは、対象のアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１の１１３位に対応する位置をいう。これは、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１又は図２より特定することができる。配列番号１の１０９位に対応する位置、１０６位に対応する位置、及び１０２位に対応する位置についても同様である。
【００６７】
各種アマドリアーゼ配列における、配列番号１の１０２位、１０６位、１０９位及び１１３位に対応する位置は次の表のとおりである。
【００６８】
【表７】
2019045052.tif 000008
【００６９】
さらに、種々のアマドリアーゼ配列における、配列番号１の１０２位、１０６位、１０９位及び１１３位に対応する位置を次の表に示す。
【００７０】
【表８】
2019045052.tif 000009
【００７１】
（アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性）
アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、GENETYX（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはDNASIS Pro（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
【００７２】
また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似（similar）と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
【００７３】
（相同性領域）
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が、配列番号１のアマドリアーゼを基準として７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.由来アマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp. 由来アマドリアーゼを基準として、１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位は相同性領域に該当しうる。ある実施形態においてアマドリアーゼの相同性領域はこれらの位置からなる領域である。別のアマドリアーゼを基準とした場合、配列番号１のこれらの位置にそれぞれ対応する位置も相同性領域に該当しうる。例えば、同様に、配列番号４５で示されるEmericella nidulans由来アマドリアーゼを基準として、配列番号４５の９位〜３１位、３５〜４０位、４８〜５１位、５３〜５７位、６２〜６４位、７２〜７４位、８３〜８５位、８７〜８９位、１１９〜１２１位、１４４〜１４９位、１５５〜１６１位、１６３〜１６９位、１７９〜１８１位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２４〜４３２位は相同性領域に該当しうる。ある実施形態においてアマドリアーゼの相同性領域はこれらの位置からなる領域である。配列番号４５の元となった配列番号１１についても同様である。
【００７４】
ある実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp. 由来アマドリアーゼを基準として、第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。別の実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号４５で示されるEmericella nidulans由来アマドリアーゼを基準として、配列番号４５の１０位〜３１位、３５〜４０位、４９〜５１位、５３〜５７位、８３〜８５位、８７〜８９位、１４４〜１４９位、１５６〜１６７位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。配列番号４５の元となった配列番号１１についても同様である。
【００７５】
ある実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp. 由来アマドリアーゼを基準として第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。別の実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号４５で示されるEmericella nidulans由来アマドリアーゼを基準として、配列番号４５の第１０〜１７位、１９〜３１位、４９〜５１位、５３〜５７位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。配列番号４５の元となた配列番号１１についても同様である。
【００７６】
（保存性の高いアミノ酸残基）
アマドリアーゼの特定のアミノ酸残基は基質の糖部分（例えばフルクトシル基）と相互作用することが知られている。そしてそのようなアミノ酸残基は、各種アマドリアーゼにおいて保存性が高い。ある実施形態において、アマドリアーゼは、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである。これらのアミノ酸残基は、基質の糖部分（フルクトシル基）を認識することが知られている(J. Biol. Chem., 283, 27007-27016 (2008); Proteins, 84, 744-758 (2016))。
【００７７】
アマドリアーゼは特定のアミノ酸配列モチーフを介して補酵素と結合することが知られている。FAD結合型アマドリアーゼでは、補酵素FADと結合するモチーフ配列は、Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）であり(Eur. J. Biochem., 242, 499-505 (1996))、これは各種のFAD結合型アマドリアーゼにおいて保存性が高い。同モチーフ配列は、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列に見られる。したがって、ある実施形態において、アマドリアーゼは、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である。
【００７８】
ある実施形態において、アマドリアーゼが糖化アミノ酸のみならず、糖化ペプチドを基質とするためには、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸はグリシンであることが望ましい（国際公開第２０１２／０１８０９４号）。ある実施形態において、アマドリアーゼ中の、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸はセリン、グルタミン酸、ヒスチジン、グルタミンではない。
【００７９】
各種アマドリアーゼ配列における、配列番号１の２３９位、２８２位、３７６位、４１８位、１５位、１７位、２０位及び６０位に対応する位置は次の表のとおりである。
【００８０】
【表９】
2019045052.tif 000010
【００８１】
さらに、種々のアマドリアーゼ配列における、配列番号１の２３９位、２８２位、３７６位、４１８位、１５位、１７位、２０位及び６０位に対応する位置を次の表に示す。
【００８２】
【表１０】
2019045052.tif 000011
【００８３】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、５５％以上、６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、かつ、改変前のA1cOXと比較して相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大している。さらに、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、例えば９９％以上の配列同一性を有するものであり得る。
【００８４】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体は、配列番号１の１１３位、１０９位、１０６位、及び１０２位に対応する位置以外の位置に、１又は数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ改変前のA1cOXと比較して相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大している。ここで１又は数個のアミノ酸とは、１〜１５個、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜４個、例えば１〜３個、例えば１又は２個のアミノ酸をいう。
【００８５】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、
(i)  配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位及び／又は１０２に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アラニン、アスパラギン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている、
(ii)  前記(i)において、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位、及び１０２位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているたアミノ酸配列からなる、
(iii)  前記(i)若しくは(ii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、または９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有する、
(iv)  前記(i)、又は(ii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号１１若しくは配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、または９０％以上、例えば９５％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である、
(v)  前記(i)、(ii)若しくは(iii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号１１又は配列番号４５のアミノ酸配列と７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上の配列同一性を有し、配列番号１または配列番号２２若しくは２４の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが８０％以上、８５％以上、９０％、９５%以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する、
(vi)  前記(i)又は(ii)において、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号１１若しくは配列番号４５のアミノ酸配列と５０％以上、５５％以上、６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８５％以上、例えば９０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上の配列同一性を有し、当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼにおける、配列番号１の６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の２３９位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファン、フェニルアラニン又はチロシンであり、配列番号１の２８２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸であり、配列番号１の３７６位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであり、配列番号１の４１８位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の１５〜２０位に対応する位置のアミノ酸配列がGly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly（ここでXaaは任意のアミノ酸を示す）である。この糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、
(a)  改変前のA1cオキシダーゼと比較して、HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比が増大している、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が増大している、かつ／又は
(ｂ)  改変前のA1cオキシダーゼと比較して、HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比が増大している、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大している、か、並びに／或いは、
(c)  HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、例えば0.9以上である、かつ／又は
(d)  HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上、0.2以上、0.3以上、0.4以上、0.5以上、0.6以上、0.7以上、0.8以上、例えば0.9以上である。
【００８６】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、
(i)糖化ヘモグロビンオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位、及び／又は１０２位に対応する位置のアミノ酸の１、２または３つが、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されており、かつ、
(a)  HbS1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbS1c/HbA1c]が0.45以上である、及び／又は
(ｂ)  HbC1c型αF8Pに対する活性とHbA1c型αF8Pに対する活性との比、すなわち相対活性[HbC1c/HbA1c]が0.15以上、例えば0.2以上である。
【００８７】
本発明者は、配列番号１の１０２位、１０６位、１０９位、又は１１３位に対応する位置に、正電荷を帯びたアミノ酸ではないアミノ酸へのアミノ酸置換を有する糖化ヘモグロビンオキシダーゼが、改変前の酵素と比較して、相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大していることを見出した。当業者であれば、これらの知見に基づき、配列番号１に示すアミノ酸配列における１０２位、１０６位、１０９位、又は１１３位に対応する位置に、正電荷を帯びたアミノ酸ではないアミノ酸へのアミノ酸置換を有する他のA1cOxも同様に相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]が増大し、各種遺伝型の糖化ヘモグロビンに作用し、その測定に用いることができると理解する。
【００８８】
（糖化ヘモグロビンオキシダーゼの生産）
ある実施形態において、本発明は、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ産生能を有する菌株を当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液から糖化ヘモグロビンオキシダーゼを単離する工程を含む、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの製造方法を提供する。この方法には、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここで糖化ヘモグロビンオキシダーゼを発現しうる条件とは、糖化ヘモグロビンオキシダーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
【００８９】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【００９０】
また、培地に当該糖化ヘモグロビンオキシダーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化タンパク質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
【００９１】
培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【００９２】
培養終了後、該培養物より糖化ヘモグロビンオキシダーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
【００９３】
粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製された糖化ヘモグロビンオキシダーゼ酵素標品を得ることができる。
【００９４】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、好ましくは
基質としてHbA1cを認識し、かつ、糖化HbS及び／又は糖化HbCを認識し、
作用として糖化ヘモグロビンのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成し、
至適ｐＨ範囲をｐＨ６〜８の範囲に有し、
作用ｐＨ範囲をｐＨ５〜９の範囲に有し、
作用温度が２５〜４０℃であり、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量が約４５〜５５ＫＤａ、例えば約４８〜５０ＫＤａであるものであり得る。
【００９５】
ある実施形態において、本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼは、３０〜４０℃、例えば３５℃で30分熱処理後の残存活性が50%以上、60%以上、70%以上、例えば80%以上でありうる。
【００９６】
本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼ改変体からは、糖化ヘモグロビンに対する活性を全く示さないアマドリアーゼは除くものとする。
【００９７】
（組成物、試薬、キット）
ある実施形態において本発明は、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用試薬組成物、測定試薬又はキットを提供する。ある実施形態において本発明は、糖化ヘモグロビンオキシダーゼを含む、HbS1c又はHbC1c測定用試薬組成物、測定試薬又はキットを提供する。該組成物、試薬又はキットは、還元型化合物の測定用試薬、過酸化水素の測定用試薬、緩衝剤、界面活性剤、塩類、防腐剤などを含み得る。また、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、糖化ヘモグロビン変性剤、還元剤、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を添加してもよい。該組成物、試薬又はキットは、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを追加しうる。糖化ヘモグロビンに作用するプロテアーゼ等を使用し糖化ペプチドを酵素法により測定する従来の各種の試薬やキットに用いられている技術を、適宜改変して本発明の組成物、試薬又はキットに用いることができる。本発明の組成物、測定試薬又はキットはプロテアーゼを含んでもよく、含まなくともよい。
【００９８】
界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、イオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
【００９９】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
【０１００】
カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
【０１０１】
過酸化水素の測定用試薬は、ペルオキシダーゼ及び／又は発色基質を含みうる。発色基質としては、４−アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム）、ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３、７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノシアジン）、ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４、４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）等が挙げられる。
【０１０２】
（糖化ヘモグロビンの測定方法）
ある実施形態において、本発明は糖化ヘモグロビンの測定方法を提供する。糖化ヘモグロビン測定は、定性的又は定量的な方法であり得る。定量法は、糖化ヘモグロビンを含む試料と本発明の糖化ヘモグロビンオキシダーゼとを接触させる工程、及び反応生成物又は消費物を測定する工程を含み得る。糖化ヘモグロビンは未変性でもよく、または変性したものでもよい。該定量法についていう接触とは、糖化ヘモグロビンオキシダーゼが糖化ヘモグロビンの酸化反応を触媒しうるように、該酵素と試料とを物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素と糖化ヘモグロビンを混合する場合のみならず、固相担体に担持された酵素に糖化ヘモグロビンを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
【０１０３】
ある実施形態において、本発明はHbS1cまたはHbC1cを測定する方法を提供する。この方法は、HbS1cまたはHbC1cを含み得る試料に糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させる工程を含む。ある実施形態では、糖化ヘモグロビンオキシダーゼの作用により生じる還元型化合物の量が測定される。ある実施形態では、測定される還元型化合物は過酸化水素である。
【０１０４】
測定に用いる試料（サンプル）は、糖化ヘモグロビンを含む可能性のあるあらゆる生物学的試料、例えば血液、体液、リンパ液等に由来する試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。
【０１０５】
糖化ヘモグロビンオキシダーゼと糖化ヘモグロビンとの反応効率を高めるためには、変性処理された糖化ヘモグロビンを用いてもよい。変性処理としては界面活性剤処理、熱処理、酸・アルカリでの変性処理、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０６】
用いる酵素量及び反応時間を一定とし、添加する糖化ヘモグロビンの量を変化させた場合に、糖化ヘモグロビン添加量が減少するにつれて、検出される発光基質の吸光度も比例的に減少する糖化ヘモグロビン濃度範囲を調べることで、当該アマドリアーゼを用いた場合の検出可能な最低糖化ヘモグロビン濃度（検出限界濃度）を決定することができる。検出限界が、測定試料中又は血中の糖化ヘモグロビン濃度よりも低くなるよう酵素量及び反応時間を設定しうる。
【０１０７】
定量的測定では、予め、濃度既知の糖化ヘモグロビンを含む対照の吸光度等の測定値から最小二乗法などの回帰分析を行うことによって検量線を作成しておくこともできる。作成した検量線に対し、糖化ヘモグロビン濃度が未知である試料の測定値をプロットすることで、当該試料中の糖化ヘモグロビン濃度を定量できる。
【０１０８】
糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作用させる時間は、例えば５秒以上、１０秒以上、２０秒以上、３０秒以上、１分以上、６０分未満、３０分未満、１０分未満、例えば５分未満、例えば０．５分以上〜６０分未満、１分以上〜３０分未満、１分以上〜２０分未満、例えば１分以上〜１０分未満、例えば１分以上〜５分未満としうる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【０１０９】
使用する糖化ヘモグロビンオキシダーゼの酵素量は、試料溶液中に含まれる基質の量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、例えば０．２〜１０Ｕ／ｍＬとなるように添加しうる。作用させる際のｐＨは、アマドリアーゼが作用可能なｐＨ、例えば至適ｐＨを考慮して、緩衝剤を用いて調整しうる。反応pHは、例えば３〜１１、５〜９、例えば６〜８である。
【０１１０】
過酸化水素の測定は、過酸化水素を生成する工程と同時に行うことができ、アマドリアーゼの作用時と同時に進行させることができる。生成物の代わりに消費物を測定してもよく、測定する消費物としては溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。
【０１１１】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
以下に、モデル基質としてHbA1c型αF8P、HbS1c型αF8P、又はHbC1c型αF8Pを用いた、アマドリアーゼ活性の測定方法を例示するが、測定方法はこれに限らない。これらの基質は合成基質でありうる（ペプチド研究所製）。本明細書において、特に断らない限り、酵素力価は、HbA1c型αF8Pを基質として測定した時の、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
【０１１２】
他の基質での評価が必要であれば、αＦＶ、αＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報）。αF6Pは、HbA1cをエンドプロテイナーゼGlu-Cで処理することにより得られる（Clin.Chem.,43,1994-1951(1997))。合成基質として提供されるαF6P（ペプチド研究所製）を用いてもよい。
【０１１３】
Ａ：活性測定用試薬
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（東洋紡製）、０．４９ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．５
（試薬２）：１５ｍＭ  ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製）溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳをイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。   
（試薬３）：３００μＭHbA1c型、HbC1c型、又はHbS1c型αF8P（ペプチド研究所製）溶液（終濃度１０μＭ）
Ｂ：活性測定法
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３９００、日立ハイテクサイエンス社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を３７℃で観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定する。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定する。３７℃で１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(Ｕ)とし、下記の式に従って算出する。   
活性(U/ml)＝｛(ΔAs−ΔA0)×3.0×df｝÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数。
【０１１４】
（さらなる糖化ヘモグロビンオキシダーゼの作製方法）
本発明者は、HbA1cのみならずHbS1cやHbC1cにも対応可能な糖化ヘモグロビンオキシダーゼが必要である、という新規の課題を見出し、A1cOXに特定のアミノ酸置換を導入して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製することによりこの課題を解決した。本発明の変異は適宜組み合わせることができる。また本発明の知見に基づいてさらなる改変体を作製することもできる。したがってある実施形態において本発明は、以下の工程を含む、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを改変して糖化ヘモグロビンオキシダーゼを作製する方法を提供する：
(i) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を取得する、
(ii) アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼを発現させ、発現産物を単離する、(iii) 発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定する、(iv) アマドリアーゼ又はA1cオキシダーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における１１３位、１０９位、１０６位又は１０２位に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、グリシン、プロリン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されるよう、前記アマドリアーゼ遺伝子又はA1cオキシダーゼ遺伝子を改変する、
(v) 改変後の遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、改変体を発現させ、発現産物を単離する、
(vi) 改変体の発現産物の相対活性[HbS1c/HbA1c]及び／又は相対活性[HbC1c/HbA1c]を測定し、工程(iii)の値と比較する、
(vii) 改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbS1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbS1c/HbA1c]が1.1倍以上増大しているか、又は改変前のアマドリアーゼ若しくはA1cオキシダーゼの相対活性[HbC1c/HbA1c]と比較して、改変後の改変体の相対活性[HbC1c/HbA1c]が1.1倍以上増大している場合、当該改変体を糖化ヘモグロビンオキシダーゼとする、並びに
(viii) 必要に応じて、工程(vii)の改変体について、工程(iv)〜(vi)を繰り返す。上記工程(iii)や(vi)の評価基質は、便宜上αF8Pとすることができるが、6アミノ酸以上の鎖長を有する他のフルクトシル基質やHbA1c、HbS1c、HbC1cを用いてもよい。
【０１１５】
（実施例）
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【０１１６】
１．Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの調製
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２３）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹ）株（国際公開第２０１６／１５９３８４号参照）を、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
【０１１７】
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹを抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹを得た。
【０１１８】
２．Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹを鋳型として、配列番号２５、２６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを行った。
【０１１９】
すなわち、10× PCR Buffer for KOD -Plus- Neoを５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を３μｌ、鋳型となるプラスミドDNAを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏを１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、３分」のサイクルを１５回繰り返した。
【０１２０】
得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、慣用法によりプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、変異が導入されていることを確認した。目的の変異が導入された、改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３９−１Ｍ）を得た。
【０１２１】
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３９−Ｍを鋳型として、配列番号２７、２８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを行った。
【０１２２】
すなわち、10× PCR Buffer for KOD -Plus- Neoを５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を３μｌ、鋳型となるプラスミドDNAを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏを１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「６８℃、３分」のサイクルを７回繰り返した。
【０１２３】
得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した。ＤｐｎＩ処理後の反応液を２μｌ、Ligation high Ver.2（東洋紡製）を５μｌ、T4 Polynucleotide Kinase (東洋紡製)を５Ｕｎｉｔｓ加えて、滅菌水により全量を１５μｌとして、１６℃で１時間ライゲーション反応を行った。得られた環状ＤＮＡを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、慣用法によりプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、変異が導入されていることを確認した。目的の変異が導入された、改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３９−３Ｍ）を得た。
【０１２４】
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３９−３Ｍを鋳型として、配列番号２９、３０の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを行った。
【０１２５】
すなわち、10× PCR Buffer for KOD -Plus- Neoを５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を３μｌ、鋳型となるプラスミドDNAを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏを１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、３分」のサイクルを１５回繰り返した。
【０１２６】
得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、慣用法によりプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、変異が導入されていることを確認した。目的の変異が導入された、改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４０−３Ｍ）を得た。
【０１２７】
３．Coniochaeta属由来アマドリアーゼの生産、精製
上記のようにして得られたアマドリアーゼを生産する形質転換大腸菌（ＪＭ１０９）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地１００ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。
【０１２８】
HiScreen CaptoQカラム（ＧＥヘルスケア社製）を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した後、調製した変異体アマドリアーゼを含む各粗酵素液をアプライして該アマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中のＮａＣｌ濃度を０ｍＭから２５０ｍＭのに直線的に増加させながら樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【０１２９】
得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ（ミリポア社製）により濃縮し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。樹脂の平衡化、溶出には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収し、アマドリアーゼの精製標品とした。H40とH40-3Mの基質特異性は同じであることを確認した。
【０１３０】
４．Coniochaeta属由来アマドリアーゼの活性測定
精製CFP-T7-H40-3M標品を用いて10μM のHbA1c型、HbS1c型及びHbC1c型のαF8Pを基質とした時の活性を測定した。その結果CFP-T7-H40-3Mの、HbA1c型αF8Pに対する活性を１００％とした場合、HbS1c型αF8Pに対する活性は３９％であり、HbC1c型αF8Pに対する活性は１１％であった。
【０１３１】
５．Coniochaeta属由来アマドリアーゼの改変体の作製
上記のCFP-T7-H40-3M（A1cOX）に基づき、鋳型としてｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ４０−３Ｍさらに以下のプライマーを使用し、下記の変異を導入した。プラスミド調製、導入変異の配列確認、精製酵素の調製等は上記と同様の方法により行った。変異導入時のPCRの班応益組成および反応条件は、下記プライマーを用いる点以外は、組み換体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３９−１Ｍを調製する時と同一の条件で実施した。   
配列番号３１、３２    導入変異：K102A
配列番号３１、３３    導入変異：K102E
配列番号３４、３５    導入変異：K106A
配列番号３４、３６    導入変異：K106D
配列番号３７、３８    導入変異：K113A
配列番号３７、３９    導入変異：K113E
配列番号３７、４０    導入変異：K113S
配列番号３７、４１    導入変異：K113T
配列番号３７、４２    導入変異：K113N
配列番号３７、４３    導入変異：K113Q
配列番号３７、４４    導入変異：K113D
【０１３２】
６．Coniochaeta属由来アマドリアーゼの改変体の評価
得られた各種の精製酵素標品を用いてHbA1c型及びHbS1c型のαF8Pを基質とした時の活性を測定した。結果を下記の表に示す。各酵素の、HbA1c型αF8Pに対する活性を１００％としたときの、HbS1c型αF8Pに対する相対活性を示す。
【０１３３】
【表１１】
2019045052.tif 000012
【０１３４】
上記の表のとおり、K102A及びK102E変異は、アマドリアーゼの、HbS1c型基質に対する相対活性を向上させた。改変の前後で相対活性[HbS1c/HbA1c]は、K102A変異体について約1.97倍、K102E変異体について約1.74倍増大した。
【０１３５】
さらなる変異体について、３種の基質で試験を行った。得られた各種の精製酵素標品を用いてHbA1c型、HbS1c型及びHbC1c型のαF8Pを基質とした時の活性を測定した。結果を下記の表に示す。各酵素の、HbA1c型αF8Pに対する活性を１００％としたときの、HbS1c型αF8P及びHbC1c型αF8Pに対する相対活性を示す。
【０１３６】
【表１２】
2019045052.tif 000013
【０１３７】
上記の表のとおり、K106A、K106D、K113A、K113E K113S、K113T、K113N、K113Q、K113D及びK113H変異は、アマドリアーゼの、HbS1c型及びHbC1c型基質に対する相対活性を向上させた。改変により相対活性[HbS1c/HbA1c]は約2.1倍〜約3.3倍増大し、相対活性[HbC1c/HbA1c]は約2.8倍〜約9.4倍増大した。なお、各変異体の各基質に対する比活性はいずれも20mU/mg以上であることを確認した。これらの結果から、K113位、K106位、K102位を、正電荷を帯びたアミノ酸（K、H、R）以外のアミノ酸、例えばD、E、S、T、N、Q、C、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、Wに変異させても同様に相対活性が向上すると期待される。例えば、K113位をC、G、P、V、I、L、M、F、Y又はWに変異させても同様に相対活性が向上すると期待される。例えば、K106位をE、S、T、N、Q、C、G、P、V、I、L、M、F、Y又はWに変異させても同様に相対活性が向上すると期待される。例えば、D、S、T、N、Q、C、G、P、V、I、L、M、F、Y又はWに変異させても同様に相対活性が向上すると期待される。
【０１３８】
７．Emericella属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位
配列番号４５は、国際公開第ＷＯ２０１５／００５２５８号に開示されているEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ（FPOX-42、本明細書中ではEn42FXと表記する）のアミノ酸配列であり、配列番号４６の遺伝子にコードされている。En42FX遺伝子をpET22bプラスミドベクターにサブクローニングしたpET22b-En42FX（調製方法は国際公開第ＷＯ２０１６／０６３９８４号参照）を鋳型にして、以下のプライマーを使用し、下記の変異を導入した。プラスミド調製は（１．Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの調製）および（２．Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作）と同様の方法により行った。変異導入時のPCRは（２．Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作）に記載の方法に沿って、pET22b-En42FXを鋳型として、下記プライマーを用いて実施した。PCR反応条件、導入変異の配列確認等は、（２．Coniochaeta属由来アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作）と同一の条件で実施した。   
配列番号４７、４８    導入変異：R105A
配列番号４７、４９    導入変異：R105S
配列番号４７、５０    導入変異：R105L
配列番号４７、５２    導入変異：R105N
配列番号４７、５３    導入変異：R105Q
配列番号４７、５４    導入変異：R105D
配列番号４７、５５    導入変異：R105E
配列番号５６、５７    導入変異：R108A
配列番号５６、５８    導入変異：R108S
配列番号５６、５９    導入変異：R108L
配列番号５６、６１    導入変異：R108Q
配列番号５６、６２    導入変異：R108D
配列番号５６、６３    導入変異：R108E
配列番号６４、６５    導入変異：S112D
配列番号６４、６６    導入変異：S112E
【０１３９】
目的の変異が導入されたことを確認したプラスミドは、大腸菌BL21(DE3)株に形質導入し、各改変型En42FX生産株を得た。
【０１４０】
８．Emericella属由来アマドリアーゼの生産
各改変型En42FX生産株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。その後、各菌体をｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各粗酵素液４．０ｍｌを調製した。各粗酵素液はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ（ミリポア社製）を用いて、およそ１．０ｍｌに濃縮して活性測定に使用した。
【０１４１】
９．Emericella属由来アマドリアーゼの改変体の評価
得られた各種の精製酵素標品を用いてHbA1c型及びHbS1c型のαF8Pを基質とした時の活性を測定した。結果を下記の表に示す。各酵素の、HbA1c型αF8Pに対する活性を１００％としたときの、HbS1c型αF8P及びHbS1c型αF8Pに対する相対活性を示す。
【表１３】
2019045052.tif 000014
上記の表のとおり、En42FXに対するR105A、R105S、R105L、R105N、R105Q、R105D、R105E、R108A、R108S、R108L、R108Q、R108D、R108E、S112D、S112E変異は、アマドリアーゼの、HbS1c型及びHbC1c型基質に対する相対活性を向上させた。改変により相対活性[HbS1c/HbA1c]は約１．４倍〜約３．７倍増大し、相対活性[HbC1c/HbA1c]は約１．１倍〜約１０．８倍増大した。これらの結果から、R105、R108を、正電荷を帯びたアミノ酸（K、H、R）以外のアミノ酸、例えばD、E、S、T、N、Q、C、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、Wに変異させても同様に相対活性[HbS1c/HbA1c]及び相対活性[HbC1c/HbA1c]が向上すると期待される。S112を負電荷を帯びたアミノ酸（D、E）に変異させると相対活性[HbS1c/HbA1c]及び相対活性[HbC1c/HbA1c]が向上すると期待される。
【０１４２】
本発明で見出した、HbS1c型及び／又はHbC1c型αF8Pに対する相対活性を向上させる変異を導入したA1cオキシダーゼは、HbA1cのみならず、糖化HbS及び／又は糖化HbCに対する相対活性が向上していると考えられる。これは種々の遺伝型の糖化ヘモグロビンを有する被験者群についての測定に用いることができ、産業上の利用価値が期待される。
【０１４３】
[配列表の簡単な説明]
配列番号１  Coniochaeta属由来のアマドリアーゼ（CFP-T7）
配列番号２  CFP-T7遺伝子配列
配列番号３  Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号４  Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号５  Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号６  Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号７  Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号８  Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号９  Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１０  Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１１  Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号１２  Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１３  Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号１４  Ao2 (Aspergillus oryzae由来アマドリアーゼ、別称FaoAo2)
配列番号１５  Af2 (Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ、別称AmadoriaseII)
配列番号１６  At (Aspergillus terreus由来アマドリアーゼ、別称FAOD-A)
配列番号１７  Fo (Fusarium oxysporum由来アマドリアーゼ)
配列番号１８  Ao1 (Aspergillus oryzae由来アマドリアーゼ、別称FaoAo 1)
配列番号１９  Af1 (Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ、別称AmadoriaseI)
配列番号２０  Pi (Pichia sp.由来アマドリアーゼ)
配列番号２１  Dh (Debaryomyces hansenii由来アマドリアーゼ)
配列番号２２  CFP-T7-H38-GY  アミノ酸配列
配列番号２３  CFP-T7-H38-GY遺伝子配列
配列番号２４  CFP-T7-H40-3M  アミノ酸配列
配列番号２５〜４４  プライマー
配列番号４５  En42FXアミノ酸配列
配列番号４６  En42FX遺伝子配列
配列番号４７〜６６  プライマー
【０１４４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。他の文献と記載が齟齬する場合は本明細書が優先する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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