(57)【要約】  脂肪組織等の細胞含有試料から酵素処理により有核細胞を遊離させる。  本発明は、細胞含有試料を酵素処理して細胞含有試料から細胞を遊離させる方法であって、細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液２０１及び気相２０２を、反応混合液２０１と気相２０２との合計体積に対して気相２０２の体積が７体積％以上となる割合で収容し閉鎖した袋状容器１を振盪させる工程を含むことを特徴とする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞含有試料を酵素処理して、細胞含有試料から細胞を遊離させる方法であって、
細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液及び気相を、反応混合液と気相との合計体積に対して気相の体積が７体積％以上となる割合で収容し閉鎖した袋状容器を振盪させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞含有試料が脂肪組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
袋状容器の反応混合液及び気相を収容する収容部の、平面視での、短手方向幅をＡとし長手方向幅をＢとしたとき、Ａ／Ｂが０．１以上１以下である、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織等の細胞含有試料を酵素処理することで、細胞含有試料が細胞を遊離させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪組織に含まれる有核細胞の少なくとも一部は生体組織幹細胞であり、それらは成熟脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋芽細胞、血管内皮細胞等、様々な細胞へと分化可能であることが知られている。このような多分化能を有する脂肪由来生体組織幹細胞を効率良く分離・採取する方法は、再生医療発展の見地から極めて重要である。【０００３】
脂肪組織等の、有用細胞を含む生体組織から、有用細胞を取得する方法として、消化酵素で生体組織を分解して有用細胞を遊離させ、その後に遠心分離、濾過等の分離工程を経て有用細胞を回収する方法が知られている。【０００４】
例えば特許文献１の実施例１では、５０ｍＬ容の遠心チューブに、脂肪組織とコラゲナーゼ液とを収容し、３７℃、１２０回／ｍｉｎの条件で１時間振盪させて酵素反応を行い、その後にフィルターろ過及び遠心分離を行い、沈渣として沈降細胞集団（ＳＶＦ画分）を取得することが記載されている。【０００５】
特許文献２には、脂肪組織試料から非脂肪細胞を分離するための装置として、第１シートの物質と、前記第１シートの物質に結合された第２シートの物質と、前記第１シートの物質と前記第２シートの物質との間で画成された複数のチャンバとを備える装置が開示されている。そして、複数のチャンバの１つである第１チャンバ内で、脂肪組織試料を、コラゲナーゼ等の酵素を含む解離溶液により処理して、脂肪組織試料を解離することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０１８４５０号
【特許文献２】特表２０１５−５０００３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生体組織等の、細胞を含む細胞含有試料から、細胞を遊離させるために、細胞含有試料を酵素処理する方法が従来から行われている。【０００８】
しかし、目的とする細胞の回収量と、細胞含有試料から細胞を遊離させるための酵素処理時の容器、振盪方法等の条件との関係はこれまで十分に検討されているとは言えない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、驚くべきことに、特許文献１のように細胞含有試料の酵素処理を柔軟性のない通常の遠沈管内で振盪させながら行った場合に、十分な数の有核細胞が取得できないことを見出した。本発明者らはまた、驚くべきことに、柔軟性を有する袋状容器内に細胞含有試料と酵素液とを通常の方法で空気を含まないように充填し、振盪させながら酵素処理を行った場合にも、十分な数の有核細胞が取得できないことを見出した。そして本発明者らは鋭意検討した結果、次の方法を完成するに至った。【００１０】
（１）細胞含有試料を酵素処理して、細胞含有試料から細胞を遊離させる方法であって、
細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液及び気相を、反応混合液と気相との合計体積に対して気相の体積が７体積％以上となる割合で収容し閉鎖した袋状容器を振盪させる工程を含むことを特徴とする方法。
（２）細胞含有試料が脂肪組織である、（１）に記載の方法
（３）袋状容器の反応混合液及び気相を収容する収容部の、平面視での、短手方向幅をＡとし長手方向幅をＢとしたとき、Ａ／Ｂが０．１以上１以下である、（１）又は（２）に記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１７−１７８２６７の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、脂肪組織等の細胞含有試料から有核細胞の状態で遊離する細胞の量を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】細胞含有試料の酵素処理を行うための酵素処理用バッグ（袋状容器）の一例を示す。
【図２】酵素処理用バッグ内での、細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液及び気相の状態を説明するための断面模式図である。
【図３】細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液及び気相（収容物）を加えた図１に示す酵素処理用バッグをクランプにより封止して、酵素処理用バッグの収容部のうち、収容物を収容する部分の体積を、収容物の体積と一致するように調節したことを説明するための模式図である。
【図４】細胞含有試料の酵素処理を行うための酵素処理用バッグ（袋状容器）の別の一例を示す。
【図５】細胞含有試料の酵素処理を行うための酵素処理用バッグ（袋状容器）の別の一例を示す。
【図６】細胞含有試料の酵素処理を行うための酵素処理用バッグ（袋状容器）の別の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜用語、材料＞
細胞含有試料としては生体組織、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製した細胞培養物等が例示できる。生体組織は典型的には動物より採取した生体組織であり、例えば、脂肪、皮膚、血管、角膜、口腔、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、神経、筋肉、前立腺、腸、羊膜、胎盤、臍帯などに由来する生体組織が挙げられる。本明細書で開示する方法は特に脂肪組織から間質血管画分（ＳＶＦ）細胞を取り出すのに有用である。
【００１４】
脂肪組織とは典型的には哺乳動物の脂肪組織であり、例えば、ヒト由来の皮下脂肪、内臓脂肪、白色脂肪、褐色脂肪である。脂肪組織は、任意の形状であってよく、例えば、脂肪組織をハサミ等の鋭利な器具を用いて破砕したもの、濾し器等を用いてミンチ状にしたもの、脂肪吸引法を用いて分解したものであってよい。ここで脂肪吸引法とは、一般的な美容成形外科で行なわれている吸引法であれば特に限定されず、例えば、超音波脂肪吸引、カニューレ等を用いたパワードリポサクション、シリンジ吸引等による方法である。
有核細胞とは、細胞内に核を有する細胞である。
【００１５】
本発明において遊離される細胞としては、生体組織幹細胞、白血球、単球、顆粒球、リンパ球、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、周細胞等、細胞治療や実験等の目的で採取が必要とされる有核細胞が例示できる。生体組織幹細胞は、好ましくは、脂肪由来間葉系幹細胞、脂肪由来間質幹細胞であり、より好ましくは細胞表面のＣＤ３４、７３、９０、１０５、１０６、１３３、１６６から選ばれる少なくとも一つを発現している脂肪由来間葉系細胞、脂肪由来間質幹細胞である。
【００１６】
細胞含有試料から細胞を遊離させるための酵素としては、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、キモトリプシン、ペプシン、アミノペプチダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びそれらのリコンビナントから選ばれる少なくとも１種の分解酵素が使用できる。細胞含有試料として生体組織、特に脂肪組織を用いる場合には、酵素としては、短時間に、かつ低侵襲で分解するという観点から、コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ、トリプシン及びヒアルロニダーゼから選択される少なくとも１種の分解酵素が好ましい。
【００１７】
＜袋状容器＞
本発明で用いる袋状容器は、柔軟性（可撓性ともいう）を有する材料により形成された袋状の容器である。袋状容器は、少なくとも一部を透明または半透明の材料からなるものとすると、内部の細胞懸濁液の様子を目視で観察できるため好ましい。
【００１８】
袋状容器を形成する柔軟性を有する材料の具体例としては、軟質塩化ビニル、塩化ビニル、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリエチレンやポリプロピレンのようなポリオレフィン、スチレン−ブタジエン−スチレン共重合体又はその水添物及びスチレン−イソプレン−スチレン共重合体またはその水添物等の熱可塑性エラストマー、ならびに、熱可塑性エラストマーとポリオレフィン及びエチレン−エチルアクリレート等の軟化剤との混合物等の、柔軟性を有する樹脂が挙げられる。
【００１９】
袋状容器が樹脂シートにより形成される実施形態では、樹脂シートの厚さは特に限定されないが、例えば０．２ｍｍ〜０．６ｍｍであることができる。
【００２０】
袋状容器は、好ましくは、柔軟性を有する樹脂のシートにより壁面が形成された容器であり、特に好ましくは、柔軟性を有する樹脂シートを２枚重対向配置し、周縁部を熱融着又は接着剤により接合して袋状に形成した容器である。
【００２１】
２枚の柔軟性を有する樹脂シートにより形成される袋状容器の具体的な実施形態を、図１を参照して説明する。
【００２２】
本実施形態の容器１は、容器本体１０、第１入口ポート２１、第２入口ポート２２、第３入口ポート２３、第１出口ポート３１、第２出口ポート３２を備える。
【００２３】
第１入口ポート２１は、液体の流路を形成する管部２１１と、管部２１１の入口を連通可能に封鎖するメスルアーロック２１２と、メスルアーロック２１２を保護する着脱自在の蓋部２１３と、管部２１１を通る液体を濾過するフィルター部２１４とを備える。
【００２４】
第２入口ポート２２は、液体の流路を形成する管部２２１と、管部２２１の入口を連通可能に封鎖するニードルレスポート２２２と、ニードルレスポート２２２を保護する着脱自在の蓋部２２３とを備える。
【００２５】
第３入口ポート２３は、液体の流路を形成する管部２３１と、管部２３１の入口を連通可能に封鎖するニードルレスポート２３２と、ニードルレスポート２３２を保護する着脱自在の蓋部２３３とを備える。
【００２６】
第１出口ポート３１は、液体の流路を形成する管部３１１と、管部３１１の出口を連通可能に封鎖するニードルレスポート３１２と、ニードルレスポート３１２を保護する着脱自在の蓋部３１３とを備える。
【００２７】
第２出口ポート３２は、液体の流路を形成する管部３２１と、管部３２１の出口を連通可能に封鎖するニードルレスポート３２２と、ニードルレスポート３２２を保護する着脱自在の蓋部３２３とを備える。
【００２８】
容器本体１０は、概ね長方形の第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２とを対向配置し、周縁部を熱融着により接合して袋体としたものである。第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２が熱融着により接合した部分を融着部１３とする。容器本体１０には、第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２との間に収容部１４が形成されている。収容部１４において後述する酵素処理が行われる。第１入口ポート２１の管部２１１、第２入口ポート２２の管部２２１及び第３入口ポート２３の管部２３１は、それらのメスルアーロック２１２、ニードルレスポート２２２、２３２が配置されていない側の端部が、容器本体１０の長手方向の一端の辺上の、第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２との間に配置され、その周りの第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２が熱融着により接合されて、容器本体１０と一体化されている。同様に、第１出口ポート３１の管部３１１及び第２出口ポート３２の管部３２１は、それらのニードルレスポート３１２、３２２が配置されていない側の端部が、容器本体１０の長手方向の他端の辺上の、第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２との間に配置され、その周りの第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２が熱融着により接合されて、容器本体１０と一体化されている。第１入口ポート２１の管部２１１、第２入口ポート２２の管部２２１、第３入口ポート２３の管部２３１、第１出口ポート３１の管部３１１及び第２出口ポート３２の管部３２１は、それぞれ、容器本体１０の収容部１４と容器本体１０の外側とを連通する流路であり、メスルアーロック２１２、ニードルレスポート２２２、２３２、３１２、３２２を介して他の流路と連通可能である。
【００２９】
本実施形態では容器本体１０の第１〜第３入口ポート２１、２２、２３が配置される側の辺の両端の、融着部１３よりも外側の部分に、貫通孔１５、１５が形成されている。貫通孔１５は容器１をフックなどに掛けるために用いることができる。
【００３０】
２枚の柔軟性を有する樹脂シートにより形成される袋状容器の別の実施形態を、図４に示す。
本実施形態の容器１は、容器本体１０、入口ポート４１及び出口ポート５１を備える。
【００３１】
入口ポート４１は、液体の流路を形成する管部４１１と、管部４１１の入口を連通可能に封鎖するメスルアーロック４１２と、メスルアーロック４１２を保護する着脱自在の蓋部４１３を備える。
【００３２】
出口ポート５１は、液体の流路を形成する管部５２１と、管部５２１の入口を連通可能に封鎖するニードルレスポート５２２と、ニードルレスポート５２２を保護する着脱自在の蓋部５２３とを備える。
【００３３】
容器本体１０は、概ね正方形の第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２とを対向配置し、周縁部を熱融着により接合して袋体としたものである。第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２が熱融着により接合した部分を融着部１３とする。図４に示す実施形態における、容器本体１０、入口ポート４１及び出口ポート５１の構造及び機能は、図１に示す実施形態と同様であり説明を省略する。
【００３４】
２枚の柔軟性を有する樹脂シートにより形成される袋状容器の別の実施形態を、図５に示す。
本実施形態の容器１は、容器本体１０及び入口ポート兼出口ポート６１を備える。
【００３５】
入口ポート兼出口ポート６１は、液体の流路を形成する管部６１１と、管部６１１の入口を連通可能に封鎖するメスルアーロック６１２と、メスルアーロック６１２を保護する着脱自在の蓋部６１３を備える。
【００３６】
容器本体１０は、概ね長方形の第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２とを対向配置し、周縁部を熱融着により接合して袋体としたものである。第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２が熱融着により接合した部分を融着部１３とする。図５に示す実施形態における、容器本体１０及び入口ポート兼出口ポート６１の構造及び機能は、図１に示す実施形態と同様であり説明を省略する。
【００３７】
２枚の柔軟性を有する樹脂シートにより形成される袋状容器の別の実施形態を、図６に示す。
本実施形態の容器１は、容器本体１０及び入口ポート兼出口ポート６１を備える。
【００３８】
容器本体１０は、概ね長方形の第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２とを対向配置し、周縁部を熱融着により接合して袋体としたものである。第１樹脂シート１１と第２樹脂シート１２が熱融着により接合した部分を融着部１３とする。図５に示す実施形態における、容器本体１０及び入口ポート兼出口ポート６１の構造及び機能は、図１に示す実施形態と同様であり説明を省略する。図６に示す実施形態における、入口ポート兼出口ポート６１の構造及び機能は、図５に示す実施形態と同様であり説明を省略する。
【００３９】
本発明で用いる袋状容器は、好ましくは、平面視での、反応混合液及び気相を収容する収容部の短手方向幅をＡとし長手方向幅をＢとしたとき、Ａ／Ｂが好ましくは０．１以上１以下、より好ましくは０．２以上１以下、より好ましくは０．３以上１以下、特に好ましくは０．５以上１以下である。Ａ／Ｂがこの範囲の袋状容器を用いることにより、細胞含有試料から有核細胞の状態で遊離する細胞の量が顕著に増大するという驚くべき効果を奏する。その原因は必ずしも明らかではないが、振盪時に反応混合液が撹拌され易いことによると考えられる。
【００４０】
ここで袋状容器の収容部の平面視とは、空の状態の袋状容器を、最も面積が広くなるように平面上に広げた状態での平面視である。特に、図１に示す袋状容器１のように、２枚のシートを対向配置し周囲を接合して形成した袋状容器においてＡ／Ｂが上記範囲であることが好ましい。袋状容器の収容部の平面視形状は、図１に示すような概ね四角形には限定されず、概ね円形、楕円形、三角形、五角形以上の多角形等の任意の形状であってよい。図１〜６に、収容部１４の平面視形状が概ね四角形の袋状容器１において、収容部１４の全体を収容部として用いる場合の短手方向幅Ａ、長手方向幅Ｂを示す。
【００４１】
＜酵素処理の方法＞
本発明は、
細胞含有試料を酵素処理して細胞含有試料から細胞を遊離させる方法であって、
細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液及び気相を、反応混合液と気相との合計体積に対して気相の体積が７体積％以上となる割合で収容し閉鎖した袋状容器を振盪させる工程を含むことを特徴とする。
【００４２】
この方法によると、柔軟性のない通常の遠沈管内で振盪させながら細胞含有試料の酵素処理を行う場合や、柔軟性を有する袋状容器内に細胞含有試料と酵素液とを通常の方法で空気を含まないように充填し、振盪させながら酵素処理を行う場合と比較して、細胞含有試料から有核細胞の状態で遊離する細胞の量が顕著に増大するという驚くべき効果を奏する。その原因は必ずしも明らかではないが、袋状容器の壁面は柔軟性を有するため、振盪中に遊離細胞が袋状容器の壁面に衝突しても衝撃が小さく損傷を受けにくいこと、容器内に気相が多く含まれるため振盪の際に反応混合液が気相により撹拌され易いこと等の原因によると推定される。
【００４３】
本方法において、反応混合液は、細胞含有試料と酵素とを少なくとも含むものであればよいが、通常は、適当な水系媒体を更に含む。水系媒体としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ブドウ糖液、リンゲル液、ハンクス液、注射溶液、培地、等張液等が例示できる。
【００４４】
水系媒体を含む酵素処理開始時の反応混合液中では、酵素は、酵素が水系媒体中に溶解又は懸濁した液として存在する。この液を「酵素液」とする。酵素液は、予め酵素と水系媒体とを全量混合して酵素液としてから容器に投入したものに限らず、酵素、水系媒体を別々に容器に投入し、容器内で酵素液を形成したものも指す。酵素液の体積は、細胞含有試料の酵素処理を行うために容器内に投入された酵素、酵素液及び水系媒体の体積を合計して算出することができる。そして、袋状容器内に収容される反応混合液における、細胞含有試料と酵素液との割合は、生体組織等の細胞含有試料の体積に対して、酵素液の体積が、好ましくは５０％〜５００％、より好ましくは６０％〜２００％、より好ましくは７０％〜１００％である。
【００４５】
気相は空気、窒素、酸素、不活性ガス等の気体の相であればよいが、好ましくは、空気の相である。
【００４６】
反応混合液と気相との合計体積に対する気相の体積の割合は７体積％以上であり、好ましくは９体積％以上、より好ましくは１５体積％以上、より好ましくは２０体積％以上であり、上限は特に限定されないが、好ましくは８０体積％以下、より好ましくは７０体積％以下、より好ましくは６５体積％以下である。
【００４７】
図２は、図１に示す袋状容器１の収容部１４に、反応混合液２０１及び気相２０２を収容し、第１入口ポート２１、第２入口ポート２２、第３入口ポート２３の側を鉛直方向上方に向けて配置した状態を示す。図示しないが、反応混合液２０１と気相２０２とを収容した袋状容器１を振盪する際には、第１入口ポート２１、第２入口ポート２２、第３入口ポート２３、第１出口ポート３１、第２出口ポート３２は、それぞれメスルアーロック２１２、ニードルレスポート２２２、ニードルレスポート２３２、ニードルレスポート３１２、ニードルレスポート３２２により封鎖されている。細胞含有試料、酵素、水系媒体、空気等は、第１入口ポート２１、第２入口ポート２２、第３入口ポート２３のいずれかから収容部１４に供給すればよい。
【００４８】
反応混合液２０１と気相２０２とからなる収容物の体積が、袋状容器１の収容部１４の内容積（収容部１４が収容できる収容物の最大体積）と比較して大幅に小さい場合（例えば体積比で５０％以下の場合）は、図３に示すように、袋状容器１をクランプ３００により封止して、袋状容器１の収容部１４のうち、収容物を収容する部分１４Ａの内容積を、収容物の体積と近くなるように調節してもよい。なお、図３は、反応混合液２０１と気相２０２を収容しクランプ３００で封止した袋状容器１を水平面上に置き、平面視した図である。図３に示すように、袋状容器の収容部の全体を用いず、一部分のみに反応混合液及び気相を収容する場合は、上記の短手方向幅Ａ及び長手方向幅Ｂは、反応混合液及び気相を収容する部分を平面視したときの短手方向幅及び長手方向幅を指す。具体的には、図３に示すように、袋状容器１をクランプ３００により封止して形成される収容部１４の部分１４Ａのみに反応混合液及び気相を収容する場合は、収容部１４の部分１４Ａの短手方向幅をＡ、長手方向幅をＢとする。
【００４９】
上記割合で反応混合液及び気相を収容し閉塞した袋状容器を振盪する方法としては、袋状容器を、水平面又は水平面と交差する面（特に水平面に対し略垂直な面）上で、直線往復動、閉じた軌道に沿った旋回動、及び／又は、回動させる方法が挙げられる。これらの振盪方法により、細胞を生きた細胞の状態で細胞含有試料から遊離させることが可能である。ここで水平面に対して略垂直な面とは、水平面との間で成す角が例えば７０°〜９０°の平面を指す。図１に示す袋状容器１のように、２枚のシートを対向配置し周囲を接合して形成した袋状容器を振盪させる場合には、前記水平面又は水平面と交差する面と、２枚のシートが対向する方向とが垂直になるように、袋状容器を配置し、前記水平面又は水平面と交差する面上で袋状容器を振盪することが好ましい。
【００５０】
袋状容器を振盪させる工程の時間、温度は、細胞含有試料及び酵素の種類や濃度に応じて適宜設定すればよく、例えば１０〜４０分間、２５〜４０℃が例示できる。
【００５１】
反応混合液と所定量の気相とを含む袋状容器を振盪させる工程により、袋状容器内で、細胞含有試料が酵素処理され、生きた状態で細胞が遊離する。遊離した細胞は、フィルター濾過、遠心分離等の方法で反応混合液から分離し、必要に応じて洗浄して回収することができる。
【実施例】
【００５２】
５名の人（ドナー１、ドナー２、ドナー３、ドナー４、ドナー５）からの脂肪組織を、コラゲナーゼにより処理し、細胞懸濁液を調製する工程を異なる条件で行った。【００５３】
下記の第１の酵素処理用バッグ及び第２の酵素処理用バッグは共に図１に示す袋状容器１の具体例である。【００５４】
第１の酵素処理用バッグ（袋状容器１）として、厚さ０．４ｍｍの軟質ポリ塩化ビニルの概ね長方形の柔軟なシート１１、１２を２枚対向配置し、長手方向の一端の辺上に第１入口ポート２１、第２入口ポート２２、第３入口ポート２３を設け、他端の辺上に第１出口ポート３１、第２出口ポート３２を設け、周縁部を熱融着により融着して融着部１３を形成することで、前記２枚のシート１１、１２に挟まれた、空の状態で内寸が幅１１４ｍｍ、長さ１９６ｍｍの概ね長方形の収容部１４が形成されたバッグを用いた。第１の酵素処理用バッグの収容部１４の内容積（収容部１４が収容できる収容物の最大体積）は約６００ｍＬである。【００５５】
第２の酵素処理用バッグ（袋状容器１）として、厚さ０．４ｍｍの軟質ポリ塩化ビニルの概ね長方形の柔軟なシート１１、１２を２枚対向配置し、長手方向の一端の辺上に第１入口ポート２１、第２入口ポート２２、第３入口ポート２３を設け、他端の辺上に第１出口ポート３１、第２出口ポート３２を設け、周縁部を熱融着により融着して融着部１３を形成することで、前記２枚のシート１１、１２に挟まれた、空の状態で内寸が幅６７ｍｍ、長さ１１６ｍｍの概ね長方形の収容部１４が形成されたバッグを用いた。第２の酵素処理用バッグの収容部１４の内容量は約１２０ｍＬである。【００５６】
第３の酵素処理用バッグ（袋状容器１）を図４に、第４の酵素処理用バッグ（袋状容器１）を図５に、第５の酵素処理用バッグ（袋状容器１）を図６に、それぞれ示す。【００５７】
図４に示す第３の酵素処理用バッグ（袋状容器１）は、厚さ０．４ｍｍの軟質ポリ塩化ビニルの概ね正方形の柔軟なシート１１、１２を２枚対向配置し、１つの辺上に入口ポート４１、出口ポート５１を設け、周縁部を熱融着により融着して融着部１３を形成することで、前記２枚のシート１１、１２に挟まれた、空の状態で内寸が幅５８ｍｍ、長さ５８ｍｍの概ね正方形の収容部１４が形成されたバッグである。第３の酵素処理用バッグの収容部１４の内容量は約４３ｍＬである。【００５８】
図５に示す第４の酵素処理用バッグ（袋状容器１）は、厚さ０．４ｍｍの軟質ポリ塩化ビニルの概ね長方形の柔軟なシート１１、１２を２枚対向配置し、長手方向の一端の辺上に入口ポート兼出口ポート６１を設け、周縁部を熱融着により融着して融着部１３を形成することで、前記２枚のシート１１、１２に挟まれた、空の状態で内寸が幅１３２３ｍｍ、長さ２５２ｍｍの概ね長方形の収容部１４が形成されたバッグである。第４の酵素処理用バッグの収容部１４の内容量は約３３ｍＬである。【００５９】
図６に示す第５の酵素処理用バッグ（袋状容器１）は、厚さ０．４ｍｍの軟質ポリ塩化ビニルの概ね長方形の柔軟なシート１１、１２を２枚対向配置し、長手方向の一端の辺上に入口ポート兼出口ポート６１を設け、周縁部を熱融着により融着して融着部１３を形成することで、前記２枚のシート１１、１２に挟まれた、空の状態で内寸が幅１８ｍｍ、長さ１８７．７ｍｍの概ね長方形の収容部１４が形成されたバッグである。第５の酵素処理用バッグの収容部１４の内容量は約２２ｍＬである。【００６０】
遠沈管として、ポリプロピレン製の内容量が５０ｍＬの遠沈管を用いた。
第１又は第２の酵素処理用バッグ１の第１出口ポート３１及び第２出口ポート３２を蓋３１３、３２３で封鎖し、収容部１４内に、１０〜５０ｍＬの脂肪組織と、１０〜５０ｍＬのコラゲナーゼ液（コラゲナーゼ濃度０．１ｗ／ｖ％となるようにコラゲナーゼを生理食塩液で溶解して調製）とを、脂肪組織とコラゲナーゼ液との体積比が１：１〜１：３となるように収容して反応混合液２０１とし、収容部１４内の空気相２０２の体積が、収容部１４の体積（すなわち反応混合液２０１と空気相２０２との合計体積）に対して表１に示す所定の割合（％）となるように空気を加えて、第１又は第２の酵素処理用バッグ１の第１入口ポート２１、第２入口ポート２２、第３入口ポート２４を蓋２１３、２２３、２３３で封鎖して密封した。【００６１】
同様に、第３の酵素処理用バッグ１の出口ポート５１を蓋３１３で封鎖し、収容部１４内に、２０ｍＬの脂肪組織と、２０ｍＬのコラゲナーゼ液とを収容して反応混合液２０１とし、収容部１４内の空気相２０２の体積が収容部１４の体積に対して７％となるように３ｍＬの空気を加え、第３の酵素処理用バッグ１の入口ポート４１を蓋４１３で封鎖して密封した。【００６２】
同様に、第４の酵素処理用バッグ１の収容部１４内に、１５ｍＬの脂肪組織と、１５ｍＬのコラゲナーゼ液とを収容して反応混合液２０１とし、収容部１４内の空気相２０２の体積が収容部１４の体積に対して７％となるように２．２ｍＬの空気を加え、第４の酵素処理用バッグ１の入口ポート兼出口ポート６１を蓋６１３で封鎖して密封した。【００６３】
同様に、第５の酵素処理用バッグ１の収容部１４内に、１０ｍＬの脂肪組織と、１０ｍＬのコラゲナーゼ液とを収容して反応混合液２０１とし、収容部１４内の空気相２０２の体積が収容部１４の体積に対して７％となるように１．５ｍＬの空気を加え、第５の酵素処理用バッグ１の入口ポート兼出口ポート６１を蓋６１３で封鎖して密封した。【００６４】
ここで、ドナー１、ドナー２又はドナー３からの脂肪組織を用いた試験では、酵素処理用バッグとして第１の酵素処理用バッグを用いた。ドナー４からの脂肪組織を用いた試験では、酵素処理用バッグとして第２の酵素処理用バッグを用いた。ドナー５からの脂肪組織を用いた試験では、酵素処理用バッグとして第３〜第５の酵素処理用バッグを用いた。【００６５】
第１の酵素処理用バッグの収容部の内容積は６００ｍＬであるのに対して、脂肪組織とコラゲナーゼ液とを含む反応混合液と気相とからなる収容物は最大でも１００ｍＬであり内容量と比較して体積が小さい。このため、第１の酵素処理用バッグを用いる試験では、収容部に反応混合液と気相とを収容した第１の酵素処理用バッグを、図３に示すようにクランプ３００により一部を封止して、第１の酵素処理用バッグ１の収容部１４のうち、収容物（反応混合液と気相）を収容する部分１４Ａの、図３中「Ａ」で示す短手方向幅を、表１に示すように１００ｍｍ又は７５ｍｍとなるように調節した。【００６６】
収容部の内容量が約１２０ｍＬ、約４３ｍＬ、約３３ｍＬ及び約２２ｍＬである第２、第３、第４及び第５の酵素処理用バッグを用いる場合は、そのような調節は行わなかった。【００６７】
前記遠沈管を用いる試験では、前記遠沈管に、１０〜２３．３ｍＬの脂肪組織と、２０〜３０ｍＬのコラゲナーゼ液（コラゲナーゼ濃度０．１ｗ／ｖ％となるように生理食塩液で溶解して調製した）とを、脂肪組織とコラゲナーゼ液との体積比が１：１〜１：３となるように収容し蓋を閉じて密閉した。このとき、前記遠沈管内の気相の体積は、遠沈管内体積（脂肪組織とコラゲナーゼ液と気相との合計体積）に対して２０％又は７％であった。【００６８】
脂肪組織、コラゲナーゼ液及び気相を収容した第１〜第５の酵素処理用バッグ或いは遠沈管を３７℃、３０分間、６０ｒｐｍ（ドナー１、２の脂肪組織試料を用いる場合は２００ｒｐｍ）の条件でシェーカーにより振盪させ酵素反応を行った。第１〜第５の酵素処理用バッグを振盪する場合、シェーカーの振盪台の設置面に、前記バッグを構成する２枚のシート１１、１２の一方の側が接するように前記バッグを固定し、振盪台をその設置面に沿った方向に振盪させることで前記バッグを振盪させた。【００６９】
３０分の酵素反応後に、第１〜第５の酵素処理用バッグ或いは遠沈管を静置して反応混合液を水層（下層）と脂肪を含む油層（上層）とに分離し、水層を回収し、水層中の有核細胞数及び脂肪由来幹細胞数をフローサイトメーターおよびＢＤ  ＴｒｕｃｏｕｎｔＴｕｂｅｓを用いて測定した。有核細胞数は、ＣＤ３４陽性細胞数とＣＤ４５陽性細胞数の和から算出した。同様に、脂肪由来幹細胞数は、ＣＤ３４陽性／ＣＤ４５陰性／ＣＤ３１陰性の細胞数から算出した。
結果を表１に示す。【００７０】
【表１】
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【００７１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞含有試料を酵素処理して、細胞含有試料から細胞を遊離させる方法であって、
細胞含有試料と酵素とを含む反応混合液及び気相を、反応混合液と気相との合計体積に対して気相の体積が７体積％以上となる割合で収容し閉鎖した袋状容器を振盪させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
袋状容器が、柔軟性を有する袋状容器である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞含有試料が脂肪組織である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
袋状容器の反応混合液及び気相を収容する収容部の、平面視での、短手方向幅をＡとし長手方向幅をＢとしたとき、Ａ／Ｂが０．１以上１以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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