(57)【要約】  本発明は、新規な一本鎖核酸分子およびその製造方法を提供する。  本発明は、一般式（Ｉ）：2019074110.tif 000080［式中の各記号は明細書に記載の通りである。］で表される一本鎖核酸分子の製造方法に関する。
2019074110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2019074110.tif 000073
［式中、
Ｒ１は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その３’末端ヌクレオチド残基が−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−Ｏ−と結合し；
Ｒ２は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その５’末端ヌクレオチド残基が−Ｏ−と結合し；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、ＮＨ、ＳまたはＯを示し；
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ１−３０アルキレン鎖、または−（ＣＨ２）ｌ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−）ｎ−（式中、ｌは１〜３の整数を示し、ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜１０の整数を示す。）を示し；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−は、アミノ酸残基を示し；
Ｒ３は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいは、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成する。］
で表される一本鎖核酸分子の製造方法であって、
（工程１）下記一般式（ＩＩ）：
【化２】
2019074110.tif 000074
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される核酸を、下記一般式（ＩＶ）：
【化３】
2019074110.tif 000075
［式中、
Ｚ１は、スクシンイミジルオキシ基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基またはハロゲン原子を示し；
Ｚ２は、ハロゲン原子を示し；
その他の記号は前記と同義である。］
で表される化合物と反応させて、下記一般式（Ｖ）：
【化４】
2019074110.tif 000076
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される核酸を得る工程；および
（工程２）一般式（Ｖ）で表される核酸を、下記一般式（ＩＩＩ）：
【化５】
2019074110.tif 000077
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される核酸と反応させて、上記一般式（Ｉ）で表される一本鎖核酸分子を得る工程；
を包含する、製造方法。
【請求項２】
アミノ酸残基が、プロリン残基、グリシン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
Ｘ２がＳである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
Ｘ１がＮＨである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
Ｌ１が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
Ｌ１が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
Ｌ２が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
Ｌ２が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
Ｚ１が、スクシンイミジルオキシ基である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
一本鎖核酸分子が、標的遺伝子の発現を抑制する配列を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
下記一般式（Ｉａ）：
【化６】
2019074110.tif 000078
［式中、
Ｒ１は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その３’末端ヌクレオチド残基が−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−Ｏ−と結合し；
Ｒ２は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その５’末端ヌクレオチド残基が−Ｏ−と結合し；
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ１−３０アルキレン鎖、または−（ＣＨ２）ｌ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−）ｎ−（式中、ｌは１〜３の整数を示し、ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜１０の整数を示す。）を示し；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−は、アミノ酸残基を示し；
Ｒ３は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいは、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成する。］
で表される一本鎖核酸分子。
【請求項１２】
アミノ酸残基が、プロリン残基、グリシン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基である、請求項１１に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１３】
Ｌ１が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、請求項１１に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１４】
Ｌ１が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、請求項１１に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１５】
Ｌ２が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、請求項１１に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１６】
Ｌ２が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、請求項１１に記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１７】
標的遺伝子の発現を抑制する配列を含む、請求項１１〜１６のいずれかに記載の一本鎖核酸分子。
【請求項１８】
請求項１１〜１７のいずれかに記載の一本鎖核酸分子を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の一本鎖核酸分子を含む、標的遺伝子の発現抑制剤。
【請求項２０】
下記一般式（ＩＶａ）：
【化７】
2019074110.tif 000079
［式中、
Ｚ２は、ハロゲン原子を示し；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−は、アミノ酸残基を示し；
Ｒ３は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいは、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成する。］
で表される化合物。
【請求項２１】
アミノ酸残基が、プロリン残基、グリシン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｚ２が、塩素原子または臭素原子である、請求項２０に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖核酸分子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一本鎖核酸分子としては、例えば特許文献1および２に記載のものが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／００５３６８
【特許文献２】ＷＯ２０１２／０１７９１９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般的な長鎖オリゴマーの合成では、技術的および生産的課題として、反応収量の低下、副生成物の除去の困難さ、アミダイトモノマーの使用の制限、コスト高などが挙げられており、これらの課題を解決することができる新たな簡易で汎用性を伴う、実用的な製造方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、式（ＩＩ）で表される核酸と式（ＩＶ）で表される化合物とを反応させた後、式（ＩＩＩ）で表される核酸と反応させる方法が、長鎖オリゴマーの合成でしばしば問題となるＮ−1、２、３等の短いオリゴマーのコンタミネーションを顕著に回避でき、そして反応生成物の精製が容易であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］  下記一般式（Ｉ）：【０００７】
【化１】
2019074110.tif 000003
【０００８】
［式中、
Ｒ１は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その３’末端ヌクレオチド残基が−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−Ｏ−と結合し；
Ｒ２は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その５’末端ヌクレオチド残基が−Ｏ−と結合し；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、ＮＨ、ＳまたはＯを示し；
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ１−３０アルキレン鎖、または−（ＣＨ２）ｌ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−）ｎ−（式中、ｌは１〜３の整数を示し、ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜１０の整数を示す。）を示し；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−は、アミノ酸残基を示し；
Ｒ３は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいは、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成する。］
で表される一本鎖核酸分子（以下、一本鎖核酸分子（Ｉ）ともいう）の製造方法であって、
（工程１）下記一般式（ＩＩ）：【０００９】
【化２】
2019074110.tif 000004
【００１０】
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される核酸（以下、核酸（ＩＩ）ともいう）を、下記一般式（ＩＶ）：【００１１】
【化３】
2019074110.tif 000005
【００１２】
［式中、
Ｚ１は、スクシンイミジルオキシ基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基またはハロゲン原子を示し；
Ｚ２は、ハロゲン原子を示し；
その他の記号は前記と同義である。］
で表される化合物（以下、化合物（ＩＶ）ともいう）と反応させて、下記一般式（Ｖ）：【００１３】
【化４】
2019074110.tif 000006
【００１４】
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される核酸（以下、核酸（Ｖ）ともいう）を得る工程；および
（工程２）一般式（Ｖ）で表される核酸を、下記一般式（ＩＩＩ）：【００１５】
【化５】
2019074110.tif 000007
【００１６】
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される核酸（以下、核酸（ＩＩＩ）ともいう）と反応させて、上記一般式（Ｉ）で表される一本鎖核酸分子を得る工程；
を包含する、製造方法。
［２］  アミノ酸残基が、プロリン残基、グリシン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基である、上記［１］に記載の製造方法。
［３］  Ｘ２がＳである、上記［１］に記載の製造方法。
［４］  Ｘ１がＮＨである、上記［１］に記載の製造方法。
［５］  Ｌ１が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、請求項１に記載の製造方法。
［６］  Ｌ１が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、上記［１］に記載の製造方法。
［７］  Ｌ２が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、上記［１］に記載の製造方法。
［８］  Ｌ２が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、上記［１］に記載の製造方法。
［９］  Ｚ１が、スクシンイミジルオキシ基である、上記［１］に記載の製造方法。
［１０］  一本鎖核酸分子が、標的遺伝子の発現を抑制する配列を含む、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の製造方法。
［１１］  下記一般式（Ｉａ）：【００１７】
【化６】
2019074110.tif 000008
【００１８】
［式中、
Ｒ１は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その３’末端ヌクレオチド残基が−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−Ｏ−と結合し；
Ｒ２は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その５’末端ヌクレオチド残基が−Ｏ−と結合し；
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ１−３０アルキレン鎖、または−（ＣＨ２）ｌ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−）ｎ−（式中、ｌは１〜３の整数を示し、ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜１０の整数を示す。）を示し；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−は、アミノ酸残基を示し；
Ｒ３は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいは、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成する。］
で表される一本鎖核酸分子（以下、一本鎖核酸分子（Ｉａ）ともいう）。
［１２］  アミノ酸残基が、プロリン残基、グリシン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基である、上記［１１］に記載の一本鎖核酸分子。
［１３］  Ｌ１が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、上記［１１］に記載の一本鎖核酸分子。
［１４］  Ｌ１が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、上記［１１］に記載の一本鎖核酸分子。
［１５］  Ｌ２が、Ｃ２−１１アルキレン鎖である、上記［１１］に記載の一本鎖核酸分子。
［１６］  Ｌ２が、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数を示す。）である、上記［１１］に記載の一本鎖核酸分子。
［１７］  標的遺伝子の発現を抑制する配列を含む、上記［１１］〜［１６］のいずれかに記載の一本鎖核酸分子。
［１８］  上記［１１］〜［１７］のいずれかに記載の一本鎖核酸分子を含む、医薬組成物。
［１９］  上記［１７］に記載の一本鎖核酸分子を含む、標的遺伝子の発現抑制剤。
［２０］  下記一般式（ＩＶａ）：【００１９】
【化７】
2019074110.tif 000009
【００２０】
［式中、
Ｚ２は、ハロゲン原子を示し；
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−は、アミノ酸残基を示し；
Ｒ３は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいは、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成する。］
で表される化合物（以下、化合物（ＩＶａ）ともいう）。
［２１］  アミノ酸残基が、プロリン残基、グリシン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基である、上記［２０］に記載の化合物。
［２２］  Ｚ２が、塩素原子または臭素原子である、上記［２０］に記載の化合物。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、高難易度の長鎖オリゴマーの合成が短鎖オリゴマーの技術を駆使して可能となる新規な一本鎖核酸分子の製造方法、および該方法によって製造される新規な一本鎖核酸分子を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、実施例２で合成されるセンス鎖＋ＰのＨＰＬＣチャートである。
【図２】図２は、実施例２で合成されるアンチセンス鎖（ＳＨ体）のＨＰＬＣチャートである。
【図３】図３は、実施例２で合成される一本鎖核酸分子ＰＳ−０００１−Ｃ３のＨＰＬＣチャートである。
【図４】図４は、実施例４で合成される一本鎖核酸分子ＫＳ−０００１のＨＰＬＣチャートである。
【図５】図５は、参考例で合成される一本鎖核酸分子ＡＳ−０００１のＨＰＬＣチャートである。
【図６】図６は、試験例１におけるＴＧＦ−β１遺伝子の発現量の相対値を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の一本鎖核酸分子の一例を示す模式図である。
【図８】図８は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【図９】図９は、本発明の一本鎖核酸分子のその他の例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、本発明を詳細に説明する。まず、式中の各記号の定義について詳述する。
【００２４】
Ｒ１は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その３’末端ヌクレオチド残基が−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−Ｏ−と結合し、Ｒ２は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む領域であって、その５’末端ヌクレオチド残基が−Ｏ−と結合している。
「ヌクレオチド残基」とは、ヌクレオチド（ヌクレオシドの糖部分の５’位の水酸基にリン酸が結合）の５’位のリン酸基中のＯＨと、３’位の水酸基中のＨを除いた２価の基をいい、Ｒ１中の「３’末端ヌクレオチド残基」では、その３’位が、式（Ｉ）中の
【００２５】
【化８】
2019074110.tif 000010
【００２６】
と結合し、Ｒ２中の「５’末端ヌクレオチド残基」では、その５’位が、式（Ｉ）中の
【００２７】
【化９】
2019074110.tif 000011
と結合している。
【００２８】
Ｒ１は、後述する本発明の第１の一本鎖核酸分子中のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）および/またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を構成単位とするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをそれぞれ含む領域（Ｘ）及び領域（Ｘｃ）の一方であってもよく、かつＲ２は他方であってもよい。あるいは、Ｒ１は、後述する本発明の第２の一本鎖核酸分子中のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）および/またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を構成単位とするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをそれぞれ含む領域（Ｘ）および領域（Ｙ）ならびに領域（Ｘｃ）および領域（Ｙｃ）の一方であってもよく、かつＲ２は他方であってもよい。また、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とは、後述するように、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。
【００２９】
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、ＮＨ、ＳまたはＯを示す。
Ｘ１は、好ましくは、ＮＨである。
Ｘ２は、好ましくは、Ｓである。
【００３０】
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、Ｃ１−３０アルキレン鎖、または−（ＣＨ２）ｌ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−）ｎ−（式中、ｌは１〜３の整数を示し、ｍは１〜３の整数を示し、ｎは１〜１０の整数を示す。）を示す。
Ｌ１またはＬ２で示される「Ｃ１−３０アルキレン鎖」としては、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−（ＣＨ２）４−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、−Ｃ（ＣＨ３）２−、−ＣＨ（Ｃ２Ｈ５）−、−ＣＨ（Ｃ３Ｈ７）−、−（ＣＨ（ＣＨ３））２−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）４−、−（ＣＨ２）５−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）７−、−（ＣＨ２）８−、−（ＣＨ２）９−、−（ＣＨ２）１０−、−（ＣＨ２）１１−、−（ＣＨ２）１２−等が挙げられる。当該「Ｃ１−３０アルキレン鎖」は、好ましくはＣ２−１１アルキレン鎖であり、より好ましくはＣ３−６アルキレン鎖であり、特に好ましくは、Ｌ１においてはＣ４−６アルキレン鎖であり、Ｌ２においてはＣ３アルキレン鎖である。
【００３１】
Ｌ１またはＬ２で示される「−（ＣＨ２）ｌ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−）ｎ−」において、ｌは、好ましくは１〜２の整数であり、ｍは、好ましくは１〜２の整数である。ｎは、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは１〜２の整数である。
Ｌ１またはＬ２で示される「−（ＣＨ２）ｌ−（Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−）ｎ−」の具体例は、−ＣＨ２（ＯＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数である。）であり、
好適な具体例は、−ＣＨ２（ＯＣＨ２）ｎ−および−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数である。）であり、
さらに好適な具体例は、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数である。）であり、
特に好適な具体例は、−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜２の整数である。）である。
【００３２】
Ｌ１およびＬ２は、好ましくは、それぞれ独立して、Ｃ２−１１アルキレン鎖または−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜５の整数である。）である。
Ｌ１およびＬ２は、より好ましくは、それぞれ独立して、Ｃ３−６アルキレン鎖または−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜２の整数である。）である。
特に好ましくは、Ｌ１は、Ｃ４−６アルキレン鎖であり、かつＬ２は、Ｃ３アルキレン鎖である。
【００３３】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）および（Ｖ）において、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−は、アミノ酸残基を示し、Ｒ３は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を示すか、あるいは、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成する。
Ｒ３で示される「Ｃ１−６アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルが挙げられる。
Ｒ３とＡＡと一緒になって形成する「窒素含有複素環」としては、例えば、ピロリン、ピロリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾリン、チアゾリジン、ピペリジン、ピペラジン、テトラヒドロピリジン、ジヒドロピリジン、テトラヒドロピリミジン、テトラヒドロピリダジン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパニン、ジアゼパン、アゼピンなどの３ないし８員単環式窒素含有非芳香族複素環が挙げられる。中でも、ピロリジンが好ましい。
Ｒ３は、好ましくは、水素原子であるか、あるいはＡＡと一緒になってピロリジンを形成する。
当該「アミノ酸残基」とは、アミノ酸のカルボキシ基のＯＨとアミノ基の１個の水素原子を除いた２価の基を意味する。アミノ酸の側鎖にカルボキシ基やアミノ基が存在する場合、これらの基からのＯＨや水素原子を除いた２価の基も「アミノ酸残基」に含まれる。
当該「アミノ酸残基」は、特に限定されず、公知の全てのアミノ酸由来の残基がいずれも例示され、α−アミノ酸由来の残基、β−アミノ酸由来の残基、γ−アミノ酸由来の残基等が挙げられる。
Ｒ３は、ＡＡと一緒になって窒素含有複素環を形成してもよく、このような「アミノ酸残基」としては、プロリン残基等の環状アミノ酸残基が挙げられる。
また、アミノ酸残基が側鎖官能基(例、アミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、スルファニル基（ＳＨ）、アミド基（ＣＯＮＨ２）等)を有する場合は、当該側鎖官能基は公知の適切な保護基で保護されていてもよい。アミノ基の保護基としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等が挙げられ、カルボキシ基の保護基としては、メチル基、エチル基、ベンジル基等が挙げられる。ヒドロキシ基やスルファニル基（ＳＨ）の保護基としては、トリチル（トリフェニルメチル）基等が挙げられる。
さらに、アミノ酸残基は、側鎖官能基が糖、脂質、ペプチド等で修飾されていてもよい。
当該「アミノ酸残基」の好適な具体例としては、プロリン残基、グリシン残基、リジン残基、フェニルアラニン残基、ベータアラニン残基等が挙げられる。ここで、リジン残基は側鎖アミノ基が、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護されていてもよいし、又は、糖、脂質、ペプチド等で修飾されていてもよい。
好ましい「アミノ酸残基」としては、プロリン残基、グリシン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基（例えば、側鎖アミノ基がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護されていてもよいリジン残基）であり、プロリン残基、または側鎖アミノ基が保護されていてもよいリジン残基（例えば、側鎖アミノ基がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護されていてもよいリジン残基）がより好ましい。
【００３４】
Ｚ１は、スクシンイミジルオキシ基、ベンゾトリアゾリルオキシ基、ペンタフルオロフェノキシ基またはハロゲン原子を示す。
Ｚ１で示される「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、中でも、塩素原子または臭素原子が好ましい。
Ｚ１は、好ましくはスクシンイミジルオキシ基である。
【００３５】
Ｚ２は、ハロゲン原子を示す。
Ｚ２で示される「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、中でも、塩素原子または臭素原子が好ましい。
【００３６】
Ｚ３は、ハロゲン原子を示す。
Ｚ３で示される「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、中でも、塩素原子または臭素原子が好ましい。
【００３７】
一本鎖核酸分子（Ｉ）の製造法について以下に説明する。一本鎖核酸分子（Ｉ）は、例えば、以下の製造法１により製造することができる。
【００３８】
【化１０】
2019074110.tif 000012
【００３９】
［式中の各記号は前記と同義である。］
【００４０】
（工程１）
核酸（ＩＩ）を化合物（ＩＶ）と反応させて、核酸（Ｖ）を製造する。
反応は、通常、塩基性条件下（好ましくはｐＨ８〜９）（例えば、リン酸緩衝液または炭酸緩衝液中、あるいは、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン等の塩基存在下）で行われる。
また反応は、通常、溶媒中、０℃〜室温で行われる。溶媒としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等のエーテル系溶媒、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル等の極性溶媒；水等が挙げられ、中でも、ジメチルホルムアミドと水の混合溶媒又は水が好ましい。
反応終了後、簡易ゲルろ過カラム等で低分子化合物を除き、核酸（Ｖ）を得る。
【００４１】
（工程２）
核酸（Ｖ）を核酸（ＩＩＩ）と反応させて、一本鎖核酸分子（Ｉ）を製造する。
反応は、通常、塩基性条件下（好ましくはｐＨ８〜９）（例えば、リン酸緩衝液または炭酸緩衝液中）で行われる。
また反応は、通常、溶媒中、室温で行われる。
反応終了後、ＨＰＬＣ等により精製して、一本鎖核酸分子（Ｉ）を得る。
【００４２】
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が保護されたアミノ酸残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が保護されたアミノ酸残基である化合物（ＩＶ）を用いて、工程１および工程２を行うことにより得ることができる。
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が保護されたアミノ酸残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）は、自体公知の方法に従って脱保護を行い、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が保護されていないアミノ酸残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）に導くことができる。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖アミノ基がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護されたリジン残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）は、塩化水素、トリフルオロ酢酸等の酸処理により、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖アミノ基が保護されていないリジン残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）に導くことができる。
【００４３】
−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が修飾されたアミノ酸残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が修飾されたアミノ酸残基である化合物（ＩＶ）を用いて、工程１および工程２を行うことにより得ることができる。
あるいは、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が保護されていないアミノ酸残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）の当該側鎖官能基に、糖、脂質、ペプチド等を、アミド化反応、エステル化反応、エーテル化反応等により導入することにより、−Ｃ（＝Ｏ）−ＡＡ−ＮＲ３−が、側鎖官能基が修飾されたアミノ酸残基である一本鎖核酸分子（Ｉ）に導くことができる。
【００４４】
製造法１で使用する化合物（ＩＶ）は、例えば、以下の製造法２により製造することができる。
【００４５】
【化１１】
2019074110.tif 000013
【００４６】
［式中、Ｚ３は、ハロゲン原子を示し、その他の記号は前記と同義である。］
【００４７】
（工程３）
アミノ酸である化合物（ＶＩ）を化合物（ＶＩＩ）と反応させて、化合物（ＶＩＩＩ）を製造する。
Ｚ３が塩素原子の場合、反応は、通常、溶媒中、室温〜加熱下で行われる。溶媒としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等が挙げられ、中でも、テトラヒドロフランが好ましい。
Ｚ３が臭素原子の場合、反応は、通常、溶媒中、塩基存在下、冷却下〜室温で行われる。溶媒としては、水、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等のエーテル系溶媒；アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等が挙げられ、中でも、水とテトラヒドロフランの混合溶媒が好ましい。塩基としては、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
反応終了後、公知の後処理を行い、化合物（ＶＩＩＩ）を得る。
【００４８】
（工程４）
化合物（ＶＩＩＩ）のカルボキシル基を−Ｃ（＝Ｏ）Ｚ１に変換して、化合物（ＩＶ）を製造する。
Ｚ１がスクシンイミジルオキシ基の場合、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の縮合剤の存在下、化合物（ＶＩＩＩ）をＮ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させることにより行われる。
反応は、通常、溶媒中、室温で行われる。溶媒としては、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン系溶媒、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジオキサン等のエーテル系溶媒等が挙げられ、中でも、ジクロロメタンが好ましい。
あるいは、塩基存在下、化合物（ＶＩＩＩ）をジ（Ｎ−スクシンイミジルカーボネート）と反応させることにより行われる。
塩基としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン等が挙げられる。
反応は、通常、溶媒中、室温で行われる。溶媒としては、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等が挙げられ、中でも、アセトニトリルが好ましい。
Ｚ１がベンゾトリアゾリルオキシ基の場合、化合物（ＶＩＩＩ）を１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと反応させることにより行われる。この反応は、Ｚ１がスクシンイミジルオキシ基の場合と同様の方法で行われる。
Ｚ１がペンタフルオロフェノキシ基の場合、化合物（ＶＩＩＩ）をペンタフルオロフェノールと反応させることにより行われる。この反応は、Ｚ１がスクシンイミジルオキシ基の場合と同様の方法で行われる。
Ｚ１が塩素原子の場合、化合物（ＶＩＩＩ）を塩化チオニル等の塩素化剤と反応させることにより行われる。
【００４９】
化合物（ＩＶ）のうち、Ｚ１がスクシンイミジルオキシ基である下記一般式（ＩＶａ）：
【００５０】
【化１２】
2019074110.tif 000014
【００５１】
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される化合物は特に好適に使用される。
【００５２】
製造法１で使用する核酸（ＩＩ）は、
【００５３】
【化１３】
2019074110.tif 000015
【００５４】
［式中、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示し、その他の記号は前記と同義である。］
を含む担体から、ＤＭＴｒ基を除去後、ホスホロアミダイト法による固相合成を開始することにより合成できる。
【００５５】
製造法１で使用する核酸（ＩＩＩ）は、固相合成の最終工程で、５’末端水酸基の保護基を除去後、対応する試剤をホスホロアミダイト法により導入し、適切な処理をすることにより合成できる。例えば、核酸（ＩＩＩ）が、
【００５６】
【化１４】
2019074110.tif 000016
【００５７】
で表される核酸は、５’末端水酸基の保護基を除去後、ホスホロアミダイト法により
【００５８】
【化１５】
2019074110.tif 000017
【００５９】
［式中、ＤＭＴｒは前記と同義である。］
を導入し、定法に従い固相からの切り出しと脱保護を行った後、ジチオトレイトールで処理することにより、合成することができる。
【００６０】
このようにして製造される一本鎖核酸分子（Ｉ）のうち、下記一般式（Ｉａ）：
【００６１】
【化１６】
2019074110.tif 000018
【００６２】
［式中の各記号は前記と同義である。］
で表される一本鎖核酸分子（以下、一本鎖核酸分子（Ｉａ）ともいう）は新規である。
【００６３】
一本鎖核酸分子（Ｉａ）の好適な例としては、以下の式で表される一本鎖核酸分子が挙げられる。
【００６４】
【化１７】
2019074110.tif 000019
【００６５】
［式中、ｎ１およびｎ２は、それぞれ独立して１〜１０の整数を示し、ｎ３およびｎ４は、それぞれ独立して１〜５の整数を示し、その他の記号は前記と同義である。］
【００６６】
【化１８】
2019074110.tif 000020
【００６７】
［式中の各記号は前記と同義である。］
【００６８】
【化１９】
2019074110.tif 000021
【００６９】
［式中の各記号は前記と同義である。］
【００７０】
【化２０】
2019074110.tif 000022
【００７１】
［式中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示し、その他の記号は前記と同義である。］
上記式において、
ｎ１は、好ましくは３〜５の整数であり、
ｎ２は、好ましくは２であり、
ｎ３は、好ましくは１〜２の整数であり、
ｎ４は、好ましくは１〜２の整数である。
【００７２】
一本鎖核酸分子（Ｉａ）のより好適な例としては、以下の式で表される一本鎖核酸分子が挙げられる。
【００７３】
【化２１】
2019074110.tif 000023
【００７４】
［式中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を示し、その他の記号は前記と同義である。］
一本鎖核酸分子（Ｉａ）のさらに好適な例としては、以下のものが挙げられる。
【００７５】
【化２２】
2019074110.tif 000024
【００７６】
【化２３】
2019074110.tif 000025
【００７７】
【化２４】
2019074110.tif 000026
【００７８】
【化２５】
2019074110.tif 000027
【００７９】
【化２６】
2019074110.tif 000028
【００８０】
化合物（ＩＶ）の代わりに、化合物（ＩＶ’ｂ）〜（ＩＶ’ｇ）を用い、上記製造法に従って反応を行うこともできる。以下に、化合物（ＩＶ’ｂ）〜（ＩＶ’ｇ）の構造とその具体例を示す。
【００８１】
【化２７】
2019074110.tif 000029
【００８２】
【化２８】
2019074110.tif 000030
【００８３】
【化２９】
2019074110.tif 000031
【００８４】
【化３０】
2019074110.tif 000032
【００８５】
【化３１】
2019074110.tif 000033
【００８６】
【化３２】
2019074110.tif 000034
【００８７】
【化３３】
2019074110.tif 000035
【００８８】
各式中において、
Ｒは、水素原子、置換されていてもよいＣ６−１０アリール基、保護されたアミノ基、保護されたスルファニル基（ＳＨ）を示し；
Ｗは、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基を示し；
ｐは、０〜６の整数を示し；
ｑは、０〜６の整数を示し；
ｒは、０〜６の整数を示し；
Ｔｒｔはトリチル基を示し；
その他の記号は前記と同義である。
【００８９】
「Ｃ６−１０アリール基」としては、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ６−１０アリール基」における置換基としては、置換されていてもよいＣ１−６アルキル基が挙げられる。
「Ｃ１−６アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルが挙げられる。
「置換されていてもよいＣ１−６アルキル基」としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基；保護されたアミノ基、保護されたスルファニル基（ＳＨ）から選択される置換基で置換されたＣ１−６アルキル基；が挙げられる。
「保護されたアミノ基」としては、例えば、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等の保護基で保護されたアミノ基が挙げられる。
「保護されたスルファニル基」としては、例えば、トリチル（トリフェニルメチル）基等の保護基で保護されたスルファニル基が挙げられる。
「置換されていてもよいＣ１−６アルキル基」の好適な具体例としては、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基で保護されたアミノ基を有するＣ１−６アルキル基（例、メチル）、トリチル（トリフェニルメチル）基で保護されたスルファニル基を有するＣ１−６アルキル基（例、メチル）等が挙げられる。
「Ｃ１−６アルコキシ基」としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシが挙げられる。
【００９０】
上記化合物（ＩＶ’ｂ）〜（ＩＶ’ｇ）を用いることにより、以下の核酸（Ｉ’ｂ）〜（Ｉ’ｇ）を製造することができる。以下に、核酸（Ｉ’ｂ）〜（Ｉ’ｇ）の構造とその具体例を示す。
【００９１】
【化３４】
2019074110.tif 000036
【００９２】
核酸（Ｉ’ｂ）の具体例としては、以下の核酸が挙げられる。
【００９３】
【化３５】
2019074110.tif 000037
【００９４】
【化３６】
2019074110.tif 000038
【００９５】
核酸（Ｉ’ｃ）の具体例としては、以下の核酸が挙げられる。
【００９６】
【化３７】
2019074110.tif 000039
【００９７】
【化３８】
2019074110.tif 000040
【００９８】
核酸（Ｉ’ｄ）の具体例としては、以下の核酸が挙げられる。
【００９９】
【化３９】
2019074110.tif 000041
【０１００】
【化４０】
2019074110.tif 000042
【０１０１】
【化４１】
2019074110.tif 000043
【０１０２】
核酸（Ｉ’ｅ）の具体例としては、以下の核酸が挙げられる。
【０１０３】
【化４２】
2019074110.tif 000044
【０１０４】
【化４３】
2019074110.tif 000045
【０１０５】
【化４４】
2019074110.tif 000046
【０１０６】
核酸（Ｉ’ｆ）の具体例としては、以下の核酸が挙げられる。
【０１０７】
【化４５】
2019074110.tif 000047
【０１０８】
【化４６】
2019074110.tif 000048
【０１０９】
【化４７】
2019074110.tif 000049
【０１１０】
核酸（Ｉ’ｇ）の具体例としては、以下の核酸が挙げられる。
【０１１１】
【化４８】
2019074110.tif 000050
【０１１２】
【化４９】
2019074110.tif 000051
【０１１３】
核酸（Ｉ’ｈ）の具体例としては、以下の核酸が挙げられる。
【０１１４】
【化５０】
2019074110.tif 000052
【０１１５】
１．一本鎖核酸分子
上述した製造方法で製造される本発明の一本鎖核酸分子（Ｉ）は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する発現抑制配列を含む一本鎖核酸分子であって、領域（Ｘ）、リンカー領域（Ｌｘ）および領域（Ｘｃ）を含み（式（Ｉ）中のＲ１が、領域（Ｘ）および領域（Ｘｃ）の一方であるか（後述する第１の一本鎖核酸分子）、あるいは領域（Ｘ）および領域（Ｘｃ）の一方を含み（後述する第２の一本鎖核酸分子）、かつＲ２が他方であるか（後述する第１の一本鎖酢酸分子）、あるいは他方を含む（後述する第２の一本鎖核酸分子）。）、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との間に、前記リンカー領域（Ｌｘ）が連結され、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一方が、前記発現抑制配列を含み、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、下記式（ＩＬ）中に示す構造を有することを特徴とする。
【０１１６】
本発明において、「標的遺伝子の発現抑制」は、例えば、前記標的遺伝子の発現を阻害することを意味する。前記抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ダウンレギュレーションまたはサイレンシングでもよい。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質等があげられる。
【０１１７】
本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、標的遺伝子の発現抑制に使用できることから、「標的遺伝子の発現抑制用一本鎖核酸分子」または「標的遺伝子の発現抑制剤」ともいう。また、本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、ＲＮＡ干渉により、前記標的遺伝子の発現を抑制できることから、「ＲＮＡ干渉用一本鎖核酸分子」、「ＲＮＡ干渉誘導分子」、「ＲＮＡ干渉剤」または「ＲＮＡ干渉誘導剤」ともいう。また、本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、生体内におけるインターフェロン誘導等の副作用を抑制でき、ヌクレアーゼ耐性にも優れる。
【０１１８】
本発明の一本鎖核酸分子は、その５’末端と３’末端とが未連結であり、線状一本鎖核酸分子ということもできる。
【０１１９】
本発明の一本鎖核酸分子において、前記発現抑制配列は、例えば、本発明の一本鎖核酸分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡを分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【０１２０】
前記発現抑制配列は、例えば、前記標的遺伝子の所定領域に対して、９０％以上の相補性を有していることが好ましく、より好ましくは９５％であり、さらに好ましくは９８％であり、特に好ましくは１００％である。このような相補性を満たすことにより、例えば、オフターゲットを十分に軽減できる。
【０１２１】
具体例として、標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、前記発現抑制配列は、例えば、配列番号１に示す１９塩基長の配列が使用できる。
５’−UAUGCUGUGUGUACUCUGC−３’（配列番号１）
【０１２２】
本発明の一本鎖核酸分子において、前記リンカー領域は、例えば、下記式（ＩＬ）で表される。
【０１２３】
【化５１】
2019074110.tif 000053
【０１２４】
［式中の各記号は前記式（Ｉ）と同義である。］
【０１２５】
前記領域（Ｘｃ）の３’末端ヌクレオチド残基とリンカー領域（Ｌｘ）中の−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−Ｏ−とが結合し、前記領域（Ｘ）の５’末端ヌクレオチド残基とリンカー領域（Ｌｘ）中の−Ｏ−とが結合してもよく、あるいは前記領域（Ｘ）の３’末端ヌクレオチド残基とリンカー領域（Ｌｘ）中の−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)−Ｏ−とが結合し、前記領域（Ｘｃ）の５’末端ヌクレオチド残基とリンカー領域（Ｌｘ）中の−Ｏ−とが結合してもよい。
【０１２６】
本発明の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）と相補的である。このため、本発明の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）が前記領域（Ｘ）に向かって折り返し、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、自己アニーリングによって、二重鎖を形成可能である。本発明の一本鎖核酸分子は、このように、分子内で二重鎖を形成可能であり、例えば、従来のＲＮＡ干渉に使用するｓｉＲＮＡのように、分離した２本の一本鎖ＲＮＡがアニーリングによって二本鎖ＲＮＡを形成するものとは、明らかに異なる構造である。
【０１２７】
本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）のみが折り返して前記領域（Ｘ）と二重鎖を形成してもよいし、さらに、他の領域において新たな二重鎖を形成してもよい。以下、前者の一本鎖核酸分子、すなわち、二重鎖形成が１カ所である分子を「第１の一本鎖核酸分子」といい、後者の一本鎖核酸分子、すなわち、二重鎖形成が２カ所である分子を「第２の一本鎖核酸分子」という。以下に、前記第１の一本鎖核酸分子および前記第２の一本鎖核酸分子について、例示するが、本発明は、これには制限されない。
【０１２８】
（１）第１の一本鎖核酸分子
前記第１の一本鎖核酸分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）および前記リンカー領域（Ｌｘ）からなる分子である。
【０１２９】
前記第１の一本鎖核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよいし、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘ）を、前記順序で有してもよい。
【０１３０】
前記第１の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【０１３１】
前記第１の一本鎖核酸分子において、前記発現抑制配列は、前述のように、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の少なくとも一方に含まれる。前記第１の一本鎖核酸分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【０１３２】
後者の場合、前記１の一本鎖核酸分子は、例えば、同じ標的遺伝子に対する同じ発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、同じ標的に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよいし、異なる標的遺伝子に対する異なる発現抑制配列を２つ以上有してもよい。前記第１の一本鎖核酸分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一領域でもよいし、異なる領域であってもよい。前記第１の一本鎖核酸分子が、異なる標的遺伝子に対する前記発現抑制配列を２つ以上有する場合、例えば、前記第１の一本鎖核酸分子によって、２種類以上の異なる標的遺伝子の発現を抑制可能である。
【０１３３】
前記第１の一本鎖核酸分子の一例を、図７の模式図に示す。図７（Ａ）は、一例として、前記一本鎖核酸分子について、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図７（Ｂ）は、前記一本鎖核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図７（Ｂ）に示すように、前記一本鎖核酸分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間で、二重鎖が形成され、ショートヘアピン構造をとる。図７は、あくまでも、前記領域の連結順序および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、前記リンカー領域（Ｌｘ）の形状等は、これに制限されない。
【０１３４】
前記第１の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。以下に各領域の長さを例示するが、本発明は、これには制限されない。本発明において、「塩基数」は、例えば、「長さ」を意味し、「塩基長」ということもできる。本発明において、塩基数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、具体例として、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
【０１３５】
前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の５’末端から３’末端の全領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）とが、同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的であることを意味する。
【０１３６】
また、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に完全に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的な塩基配列からなることを意味し、すなわち、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなり、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的であることを意味する。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【０１３７】
前記第１の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記（３）または（５）の条件を満たし、前者の場合、具体的には、例えば、下記（１１）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（３）
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２または３、
より好ましくは１または２   ・・・（１１）
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（５）
【０１３８】
前記領域（Ｘ）および／または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記発現抑制配列を含む領域は、例えば、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基である。
【０１３９】
前記領域（Ｘ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｘ）が、前記発現抑制配列を含む場合、その下限は、例えば、１９塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは３０塩基であり、より好ましくは２５塩基である。前記領域（Ｘ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基〜５０塩基であり、好ましくは、１９塩基〜３０塩基、より好ましくは１９塩基〜２５塩基である。
【０１４０】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、特に制限されない。その下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。その上限は、例えば、５０塩基であり、より好ましくは４０塩基であり、さらに好ましくは３０塩基である。
【０１４１】
前記一本鎖核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）とが二重鎖を形成可能な長さであることが好ましい。
【０１４２】
前記第１の一本鎖核酸分子の全長は、特に制限されない。前記第１の一本鎖核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第１の一本鎖核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１４３】
（２）第２の一本鎖核酸分子
前記第２の一本鎖核酸分子は、例えば、前記領域（Ｘ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記領域（Ｘｃ）の他に、さらに、領域（Ｙ）および前記領域（Ｙ）に相補的な領域（Ｙｃ）を有する分子である。前記第２の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結して、内部領域（Ｚ）を形成している。なお、特に示さない限り、前記第２の一本鎖核酸分子は、前記第１の一本鎖核酸分子の記載を援用できる。
【０１４４】
前記第２の一本鎖核酸分子は、例えば、５’側から３’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、５’側領域（Ｘｃ）ともいい、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部５’側領域（Ｘ）ともいい、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部３’領域（Ｙ）ともいい、前記領域（Ｙｃ）を、３’側領域（Ｙｃ）ともいう。また、前記第２の一本鎖核酸分子は、例えば、３’側から５’側にかけて、前記領域（Ｘｃ）、前記リンカー領域（Ｌｘ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）を、前記順序で有してもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）を、３’側領域（Ｘｃ）ともいい、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｘ）を、内部３’側領域（Ｘ）ともいい、前記内部領域（Ｚ）中の前記領域（Ｙ）を、内部５’領域（Ｙ）ともいい、前記領域（Ｙｃ）を、５’側領域（Ｙｃ）ともいう。
【０１４５】
前記内部領域（Ｚ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが連結されている。前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）は、例えば、直接的に連結され、その間に介在配列を有していない。前記内部領域（Ｚ）は、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）との配列関係を示すために、「前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）が連結して構成される」と定義するものであって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とが、前記一本鎖核酸分子の使用において、別個の独立した領域であることを限定するものではない。すなわち、例えば、前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列が配置されてもよい。
【０１４６】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｘ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｘｃ）は、前記領域（Ｘ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【０１４７】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）に相補的である。ここで、前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に相補的な配列を有していればよく、好ましくは、前記領域（Ｙ）の全領域またはその部分領域に対して相補的な配列を含む、または、前記相補的な配列からなる。前記領域（Ｙｃ）は、前記領域（Ｙ）の相補的な前記全領域または相補的な前記部分領域に対して、例えば、完全に相補的でもよいし、１もしくは数塩基が非相補的であってもよいが、完全に相補的であることが好ましい。前記１塩基若しくは数塩基は、例えば、１〜３塩基、好ましくは１塩基または２塩基である。
【０１４８】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記発現抑制配列は、例えば、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とから形成される前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）の少なくとも一つに含まれ、さらに、前記領域（Ｙｃ）に含まれてもよい。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を有する場合、例えば、前記領域（Ｘ）および前記領域（Ｙ）のいずれに前記発現抑制配列を有してもよく、また、前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｙ）とにわたって、前記発現抑制配列を有してもよい。前記第２の一本鎖核酸分子は、前記発現抑制配列を、例えば、１つ有してもよいし、２つ以上有してもよい。
【０１４９】
前記第２の一本鎖核酸分子が、２つ以上の前記発現抑制配列を有する場合、各発現抑制配列の配置箇所は、特に制限されず、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方でもよいし、前記内部領域（Ｚ）および前記領域（Ｘｃ）のいずれか一方と、さらに他の異なる領域であってもよい。
【０１５０】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とは、例えば、直接連結してもよいし、間接的に連結してもよい。前者の場合、直接的な連結は、例えば、ホスホジエステル結合による連結等があげられる。後者の場合、例えば、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）との間に、リンカー領域（Ｌｙ）を有し、前記リンカー領域（Ｌｙ）を介して、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）とが連結している形態等があげられる。
【０１５１】
前記第２の一本鎖核酸分子が前記リンカー領域（Ｌｙ）を有する場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基からなるリンカーでもよいし、前述した式（ＩＬ）で表される構造を有するリンカーでもよい。後者の場合、前記リンカー領域（Ｌｘ）における前記式（ＩＬ）の説明を全て援用できる。
【０１５２】
また、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいてもよい。前記リンカー領域は、アミノ酸残基、ポリアミン残基、およびポリカルボン酸残基以外の残基を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。例えば、前記リンカー領域は、ポリカルボン酸残基、テレフタル酸残基またはアミノ酸残基のいずれかを含むものであってよい。
【０１５３】
本発明において、「ポリアミン」は、アミノ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。本発明において、前記ポリアミンは、特に限定されないが、例えば、１，４−ジアミノベンゼン、１，３−ジアミノベンゼン、１，２−ジアミノベンゼン等が挙げられる。また、本発明において、「ポリカルボン酸」は、カルボキシ基を複数（２つ、または３つ以上）含む任意の化合物をいう。本発明において、前記ポリカルボン酸は、特に限定されないが、例えば、１，４−ジカルボキシベンゼン（テレフタル酸）、１，３−ジカルボキシベンゼン（イソフタル酸）、１，２−ジカルボキシベンゼン（フタル酸）等が挙げられる。また、本発明において、「アミノ酸」は、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。前記「アミノ基」は、−ＮＨ２基に限定されず、イミノ基（−ＮＨ−）も含む。例えば、プロリン、ヒドロキシプロリン等は、分子中に−ＮＨ２基を含まず、イミノ基（−ＮＨ−）を含むが、本発明における「アミノ酸」の定義に含まれる。本発明において、前記「アミノ酸」は、天然アミノ酸でもよいし、人工アミノ酸でもよい。
【０１５４】
前記一本鎖核酸分子において、前記アミノ酸残基は、複数のアミノ酸残基が連結したものであってもよい。なお、本発明において、複数のアミノ酸残基が連結したアミノ酸残基とは、例えば、ペプチド構造を含む残基をいう。より具体的には、例えば、グリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）などの構造があげられる。
【０１５５】
前記一本鎖核酸分子において、前記アミノ酸残基は、グリシン残基、テレフタル酸アミド残基、プロリン残基またはリシン残基であってもよい。また、前記アミノ酸残基は、修飾アミノ酸残基またはアミノ酸の誘導体であってもよい。
【０１５６】
好ましい一実施態様において、前記リンカー領域（Ｌｙ）は、国際公開第２０１２/０１７９１９号パンフレット、国際公開第２０１３/１０３１４６号パンフレット、国際公開第２０１２/００５３６８号パンフレット、国際公開第２０１３/０７７４４６号パンフレット、国際公開第２０１３/１３３３９３号パンフレット、国際公開第２０１６／１０８２６４号パンフレット、国際公開第２０１６／１０４７７５号パンフレット等に記載されるリンカー領域であり得、本発明はこれらの文献を援用し得る。
【０１５７】
より具体的には、例えば、国際公開第２０１６／１０４７７５号パンフレット中に記載の以下の構造を含むものがあげられる。
【０１５８】
【化５２】
2019074110.tif 000054
【０１５９】
【化５３】
2019074110.tif 000055
【０１６０】
前記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎおよびｍは、特に制限されず、例えば、ｍは、０〜３０の範囲の整数であり、ｎは、０〜３０の範囲の整数である。具体例として、前記化学式（Ｉ−１）においてｎ＝１１およびｍ＝１２、または、ｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ−４）においてｎ＝５およびｍ＝４と、前記化学式（Ｉ−６）において、ｎ＝４およびｍ＝４と、前記化学式（１−７）においてｎ＝５およびｍ＝４とがあげられる。その構造を、下記化学式（Ｉ−１ａ）、（Ｉ−１ｂ）、（Ｉ−４ａ）、（Ｉ−６ａ）および（Ｉ−７ａ）に示す。
【０１６１】
【化５４】
2019074110.tif 000056
【０１６２】
【化５５】
2019074110.tif 000057
【０１６３】
【化５６】
2019074110.tif 000058
【０１６４】
【化５７】
2019074110.tif 000059
【０１６５】
前記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）において、ｎ、ｍおよびｑは、特に制限されず、例えば、例えば、ｍは、０〜３０の範囲の整数であり、ｎは、０〜３０の範囲の整数であり、ｑは、０〜１０の整数である。具体例として、前記式（ＩＩ−１）において、ｎ＝８、前記（ＩＩ−２）において、ｎ＝３、前記式（ＩＩ−３）において、ｎ＝４または８、前記（ＩＩ−４）において、ｎ＝７または８、前記式（ＩＩ−５）において、ｎ＝３およびｍ＝４、前記（ＩＩ−６）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記式（ＩＩ−７）において、ｎ＝８およびｍ＝４、前記（ＩＩ−８）において、ｎ＝５およびｍ＝４、前記式（ＩＩ−９）において、ｑ＝１およびｍ＝４があげられる。前記式（ＩＩ−４）の一例（ｎ＝８）を、下記式（ＩＩ−４ａ）に、前記式（ＩＩ−８）の一例（ｎ＝５、ｍ＝４）を、下記式（ＩＩ−８ａ）に示す。
【０１６６】
【化５８】
2019074110.tif 000060
【０１６７】
前記領域（Ｙｃ）のいずれか一方の末端ヌクレオチド残基、および前記領域（Ｙ）のいずれか一方の末端ヌクレオチド残基は、例えば、それぞれ、前記リンカー領域（Ｌｙ）とホスホジエステル結合により結合している。
【０１６８】
前記第２の一本鎖核酸分子について、前記リンカー領域（Ｌｙ）を有する一本鎖核酸分子の一例を、図８の模式図に示す。図８（Ａ）は、一例として、前記一本鎖核酸分子について、５’側から３’側に向かって、各領域の順序の概略を示す模式図であり、図８（Ｂ）は、前記一本鎖核酸分子が、前記分子内において二重鎖を形成している状態を示す模式図である。図８（Ｂ）に示すように、前記一本鎖核酸分子は、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）との間、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との間で、二重鎖が形成された両端折り返し構造をとる。図８は、あくまでも、各領域の連結順番および二重鎖を形成する各領域の位置関係を示すものであり、例えば、各領域の長さ、リンカー領域の形状等は、これに制限されない。また、図８は、前記領域（Ｘｃ）を５’側に示したが、これには制限されず、前記領域（Ｘｃ）が、３’側に位置してもよい。
【０１６９】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、特に制限されない。各領域の長さを以下に例示するが、本発明は、これには制限されない。
【０１７０】
前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｘ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【０１７１】
また、前記領域（Ｘｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記領域（Ｘ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｘ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｘｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｘ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｘｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｘ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補的である。前記領域（Ｘ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｘ）における、前記領域（Ｘｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【０１７２】
前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、前記領域（Ｙ）の全領域に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。なお、これには制限されず、例えば、前述のように、１もしくは数塩基が非相補的であってもよい。
【０１７３】
また、前記領域（Ｙｃ）は、前述のように、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域に相補的でもよい。この場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記領域（Ｙ）の部分領域と同じ塩基長であり、すなわち、前記領域（Ｙ）よりも、１塩基以上短い塩基長の塩基配列からなることが好ましい。前記領域（Ｙｃ）は、より好ましくは、前記領域（Ｙ）の前記部分領域と同じ塩基長であり、且つ、前記領域（Ｙｃ）の全ての塩基が、前記領域（Ｙ）の前記部分領域の全ての塩基と相補的である、つまり、例えば、完全に相補である。前記領域（Ｙ）の前記部分領域は、例えば、前記領域（Ｙ）における、前記領域（Ｙｃ）側の末端の塩基（１番目の塩基）から連続する塩基配列からなる領域であることが好ましい。
【０１７４】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）との関係、前記内部領域（Ｚ）の塩基数（Ｚ）と、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）および前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）との関係は、例えば、下記式（１）および（２）の条件を満たす。
Ｚ＝Ｘ＋Ｙ     ・・・（１）
Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ ・・・（２）
【０１７５】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）の関係は、特に制限されず、例えば、下記式のいずれの条件を満たす。
Ｘ＝Ｙ ・・・（１９）
Ｘ＜Ｙ ・・・（２０）
Ｘ＞Ｙ ・・・（２１）
【０１７６】
第２の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）、前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の関係は、例えば、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの条件を満たす。
（ａ）下記式（３）および（４）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（３）
Ｙ＝Ｙｃ ・・・（４）
（ｂ）下記式（５）および（６）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（５）
Ｙ＞Ｙｃ ・・・（６）
（ｃ）下記式（７）および（８）の条件を満たす。
Ｘ＞Ｘｃ ・・・（７）
Ｙ＞Ｙｃ ・・・（８）
（ｄ）下記式（９）および（１０）の条件を満たす。
Ｘ＝Ｘｃ ・・・（９）
Ｙ＝Ｙｃ ・・・（１０）
【０１７７】
前記（ａ）〜（ｄ）において、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）の塩基数（Ｘｃ）の差、前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）の塩基数（Ｙｃ）の差は、例えば、下記条件を満たすことが好ましい。
（ａ）下記式（１１）および（１２）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３ ・・・（１１）
Ｙ−Ｙｃ＝０ ・・・（１２）
（ｂ）下記式（１３）および（１４）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０ ・・・（１３）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは１、２、３または４、
より好ましくは１、２または３ ・・・（１４）
（ｃ）下記式（１５）および（１６）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１５）
Ｙ−Ｙｃ＝１〜１０、好ましくは、１、２または３、
より好ましくは１または２ ・・・（１６）
（ｄ）下記式（１７）および（１８）の条件を満たす。
Ｘ−Ｘｃ＝０ ・・・（１７）
Ｙ−Ｙｃ＝０ ・・・（１８）
【０１７８】
前記（ａ）〜（ｄ）の第２の一本鎖核酸分子について、それぞれの構造の一例を、図９の模式図に示す。図９は、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）を含む一本鎖核酸分子であり、（Ａ）は、前記（ａ）の一本鎖核酸分子、（Ｂ）は、前記（ｂ）の一本鎖核酸分子、（Ｃ）は、前記（ｃ）の一本鎖核酸分子、（Ｄ）は、前記（ｄ）の一本鎖核酸分子の例である。図９において、点線は、自己アニーリングにより二重鎖を形成している状態を示す。図９の一本鎖核酸分子は、前記領域（Ｘ）の塩基数（Ｘ）と前記領域（Ｙ）の塩基数（Ｙ）を、前記式（２０）の「Ｘ＜Ｙ」と表わしたが、これには制限されず、前述のように、前記式（１９）の「Ｘ＝Ｙ」でも、前記式（２１）の「Ｘ＞Ｙ」でもよい。また、図９は、あくまでも前記領域（Ｘ）と前記領域（Ｘｃ）との関係、前記領域（Ｙ）と前記領域（Ｙｃ）との関係を示す模式図であり、例えば、各領域の長さ、形状、リンカー領域（Ｌｙ）の有無等は、これには制限されない。
【０１７９】
前記（ａ）〜（ｃ）の一本鎖核酸分子は、例えば、前記領域（Ｘｃ）と前記領域（Ｘ）、および、前記領域（Ｙｃ）と前記領域（Ｙ）が、それぞれ二重鎖を形成することによって、前記内部領域（Ｚ）において、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）のいずれともアライメントしない塩基を有する構造であり、二重鎖を形成しない塩基を有する構造ともいえる。前記内部領域（Ｚ）において、前記アライメントしない塩基（二重鎖を形成しない塩基ともいう）を、以下、「フリー塩基」という。図９において、前記フリー塩基の領域を、「Ｆ」で示す。前記領域（Ｆ）の塩基数は、特に制限されない。前記領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）は、例えば、前記（ａ）の一本鎖核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数であり、前記（ｂ）の一本鎖核酸分子の場合、「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数であり、前記（ｃ）の一本鎖核酸分子の場合、「Ｘ−Ｘｃ」の塩基数と「Ｙ−Ｙｃ」の塩基数との合計数である。
【０１８０】
他方、前記(ｄ)の一本鎖核酸分子は、例えば、前記内部領域（Ｚ）の全領域が、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）とアライメントする構造であり、前記内部領域（Ｚ）の全領域が二重鎖を形成する構造ともいえる。なお、前記（ｄ）の一本鎖核酸分子において、前記領域（Ｘｃ）の５’末端と前記領域（Ｙｃ）の３’末端は、未連結である。
【０１８１】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｙｃ）、および前記内部領域（Ｚ）における前記フリー塩基（Ｆ）の塩基数の合計は、前記内部領域（Ｚ）の塩基数となる。このため、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の長さは、例えば、前記内部領域（Ｚ）の長さ、前記フリー塩基の数およびその位置に応じて、適宜決定できる。
【０１８２】
前記内部領域（Ｚ）の塩基数は、例えば、１９塩基以上である。前記塩基数の下限は、例えば、１９塩基であり、好ましくは２０塩基であり、より好ましくは２１塩基である。前記塩基数の上限は、例えば、５０塩基であり、好ましくは４０塩基であり、より好ましくは３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）の塩基数の具体例は、例えば、１９塩基、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、または、３０塩基である。前記内部領域（Ｚ）が、前記発現抑制配列を有する場合、例えば、この条件が好ましい。
【０１８３】
前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記内部領域（Ｚ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の塩基数は、例えば、１９〜３０塩基であり、好ましくは、１９、２０または２１塩基である。前記内部領域（Ｚ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜３１塩基であり、好ましくは、１〜２１塩基であり、より好ましくは、１〜１１塩基であり、さらに好ましくは、１〜７塩基である。
【０１８４】
前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｘｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【０１８５】
前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｘｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【０１８６】
前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜２９塩基であり、好ましくは１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１〜４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。前記内部領域（Ｚ）または前記領域（Ｘｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、例えば、このような塩基数が好ましい。具体例として、前記内部領域（Ｚ）の塩基数が、１９〜３０塩基（例えば、１９塩基）の場合、前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは１〜７塩基であり、より好ましくは１塩基、２塩基、３塩基または４塩基であり、さらに好ましくは１塩基、２塩基、３塩基である。
【０１８７】
前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記領域（Ｙｃ）は、例えば、前記発現抑制配列のみから構成される領域でもよいし、前記発現抑制配列を含む領域でもよい。前記発現抑制配列の長さは、例えば、前述の通りである。前記領域（Ｙｃ）が前記発現抑制配列を含む場合、前記発現抑制配列の５’側および／または３’側に、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列の塩基数は、例えば、１〜１１塩基であり、好ましくは、１〜７塩基である。
【０１８８】
前述のように、前記内部領域（Ｚ）、前記領域（Ｘｃ）および前記領域（Ｙｃ）の塩基数は、例えば、前記式（２）の「Ｚ≧Ｘｃ＋Ｙｃ」で表わすことができる。具体例として、「Ｘｃ＋Ｙｃ」の塩基数は、例えば、前記内部領域（Ｚ）と同じ、または、前記内部領域（Ｚ）より小さい。後者の場合、「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、１〜１０、好ましくは１〜４、より好ましくは１、２または３である。前記「Ｚ−（Ｘｃ＋Ｙｃ）」は、例えば、前記内部領域（Ｚ）におけるフリーの領域（Ｆ）の塩基数（Ｆ）に相当する。
【０１８９】
前記第２の一本鎖核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）および前記リンカー領域（Ｌｙ）の長さは、特に制限されない。前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前述の通りである。前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位が塩基を含む場合、前記リンカー領域（Ｌｙ）の塩基数は、その下限が、例えば、１塩基であり、好ましくは２塩基であり、より好ましくは３塩基であり、その上限が、例えば、１００塩基であり、好ましくは８０塩基であり、より好ましくは５０塩基である。前記各リンカー領域の塩基数は、具体例として、例えば、１〜５０塩基、１〜３０塩基、１〜２０塩基、１〜１０塩基、１〜７塩基、１〜４塩基等が例示できるが、これには制限されない。
【０１９０】
前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）と同じでもよいし、異なってもよい。
【０１９１】
前記第２の一本鎖核酸分子の全長は、特に制限されない。前記第２の一本鎖核酸分子において、前記塩基数の合計（全長の塩基数）は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、その上限は、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。前記第２の一本鎖核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌｘ）およびリンカー領域（Ｌｙ）を除く塩基数の合計は、下限が、例えば、３８塩基であり、好ましくは４２塩基であり、より好ましくは５０塩基であり、さらに好ましくは５１塩基であり、特に好ましくは５２塩基であり、上限が、例えば、３００塩基であり、好ましくは２００塩基であり、より好ましくは１５０塩基であり、さらに好ましくは１００塩基であり、特に好ましくは８０塩基である。
【０１９２】
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、前記リンカー領域（Ｌｘ）が、式（ＩＬ）で表される構造を有していればよく、その他の構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基等があげられる。本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
【０１９３】
前記領域（Ｘｃ）、前記領域（Ｘ）、前記領域（Ｙ）および前記領域（Ｙｃ）の構成単位は、それぞれ、前記ヌクレオチド残基が好ましい。前記各領域は、例えば、下記（１）〜（３）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１９４】
前記リンカー領域（Ｌｘ）は、前記非ヌクレオチド残基のみから構成される。
【０１９５】
前記リンカー領域（Ｌｙ）の構成単位は、特に制限されず、例えば、前述のように、前記ヌクレオチド残基および前記非ヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカー領域は、例えば、前記ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記非ヌクレオチド残基のみから構成されてもよいし、前記ヌクレオチド残基と前記非ヌクレオチド残基から構成されてもよい。前記リンカー領域（Ｌｙ）は、例えば、下記（１）〜（７）の残基で構成される。
（１）非修飾ヌクレオチド残基
（２）修飾ヌクレオチド残基
（３）非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（４）非ヌクレオチド残基
（５）非ヌクレオチド残基および非修飾ヌクレオチド残基
（６）非ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
（７）非ヌクレオチド残基、非修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基
【０１９６】
本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記ヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記ヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。本発明の一本鎖核酸分子において、前記ヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾ヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾ヌクレオチド残基および前記修飾ヌクレオチド残基の両方であってもよい。前記一本鎖核酸分子が、前記非修飾ヌクレオチド残基と前記修飾ヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。本発明の一本鎖核酸分子が、前記非ヌクレオチド残基を含む場合、前記非ヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１または２個である。
【０１９７】
本発明の一本鎖核酸分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。この場合、本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、「一本鎖ＲＮＡ分子」という。前記ｓｓＲＮＡ分子は、例えば、前記リンカー領域（Ｌｘ）を除き、前記リボヌクレオチド残基のみから構成される分子、前記リボヌクレオチド残基の他に前記非ヌクレオチド残基を含む分子等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子において、前記リボヌクレオチド残基は、前述のように、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記修飾リボヌクレオチド残基のみでもよいし、前記非修飾リボヌクレオチド残基および前記修飾リボヌクレオチド残基の両方を含んでもよい。
【０１９８】
前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記ｓｓＲＮＡ分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１または２個である。
【０１９９】
本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓ等があげられる。
【０２００】
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、例えば、前記非ヌクレオチド構造に前記標識物質を導入することが好ましく、前記リンカー領域（Ｌｘ）の前記非ヌクレオチド残基に前記標識物質を導入することが好ましい。前記非ヌクレオチド残基への標識物質の導入は、例えば、簡便かつ安価に行うことができる。
【０２０１】
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現を抑制ができる。このため、本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を含む前記一本鎖核酸分子であれば、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０２０２】
本発明の一本鎖核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記一本鎖核酸分子を投与すればよい。
【０２０３】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０２０４】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定でき、前記遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設計すればよい。
【０２０５】
本発明の一本鎖核酸分子の具体例を以下に示すが、本発明はこれには何ら制限されない。前記一本鎖核酸分子の塩基配列は、標的遺伝子がＴＧＦ−β１の場合、例えば、配列番号１の塩基配列が例示でき、プロレニン受容体の場合、例えば、配列番号２の塩基配列が例示でき、ｍｉｒ―２９ｂの場合、例えば、配列番号３の塩基配列が例示できる。また、前記塩基配列において、例えば、１もしくは数個の欠失、置換および／または付加された塩基配列でもよい。
【０２０６】
プロレニン受容体  5'- UUAUAUGCAAGGUUAUAGGGA -3'（配列番号２）
miR-29b  5'-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3'（配列番号３）
【０２０７】
本発明の一本鎖核酸分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を援用できる。
【０２０８】
本発明の一本鎖核酸分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０２０９】
２．ヌクレオチド残基
本発明の一本鎖核酸分子を構成するヌクレオチド残基は、前述の通りであり、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）を有する。
【０２１０】
前記ヌクレオチド残基は、未修飾ヌクレオチド残基および修飾ヌクレオチド残基等があげられる。前記未修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【０２１１】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基を修飾したヌクレオチド残基である。前記修飾ヌクレオチドは、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」は、例えば、前記構成要素の置換、付加および／または欠失、前記構成要素における原子および／または官能基の置換、付加および／または欠失であり、「改変」ということができる。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基は、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。
【０２１２】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、リボース−リン酸骨格（以下、リボリン酸骨格）の修飾等があげられる。
【０２１３】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、２’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、２’位炭素に結合する水酸基を、水素またはフルオロ等に置換できる。前記２’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。
【０２１４】
前記リボリン酸骨格は、例えば、非リボース残基および／または非リン酸を有する非リボリン酸骨格に置換してもよい。前記非リボリン酸骨格は、例えば、前記リボリン酸骨格の非荷電体等があげられる。前記非リボリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等があげられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸モノマー残基等があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられ、好ましくはＰＮＡである。
【０２１５】
前記リボリン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記リボリン酸骨格において、糖残基に最も近いリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の２つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における４つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である２つの酸素原子は、以下、「非結合（ｎｏｎ−ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している２つの酸素原子は、以下、「結合（ｌｉｎｋｉｎｇ）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、または、前記非結合原子における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【０２１６】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｅ（セレン）、Ｂ（ホウ素）、Ｃ（炭素）、Ｈ（水素）、Ｎ（窒素）およびＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル基またはアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Ｓで置換される。前記非結合酸素は、例えば、両方が置換されていることが好ましく、より好ましくは、両方がＳで置換される。前記修飾リン酸基は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステル等があげられ、中でも、前記２つの非結合酸素が両方ともＳで置換されているホスホロジチオエートが好ましい。
【０２１７】
前記リン酸基は、例えば、前記結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｃ（炭素）およびＮ（窒素）のいずれかの原子で置換できる。前記修飾リン酸基は、例えば、Ｎで置換した架橋ホスホロアミデート、Ｓで置換した架橋ホスホロチオエート、およびＣで置換した架橋メチレンホスホネート等があげられる。前記結合酸素の置換は、例えば、本発明の一本鎖核酸分子の５’末端ヌクレオチド残基および３’末端ヌクレオチド残基の少なくとも一方において行うことが好ましく、５’側の場合、Ｃによる置換が好ましく、３’側の場合、Ｎによる置換が好ましい。
【０２１８】
前記リン酸基は、例えば、前記リン非含有のリンカーに置換してもよい。前記リンカーは、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ等を含み、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含む。
【０２１９】
本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、３’末端および５’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、３’末端および５’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述の通りであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における１つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【０２２０】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加等があげられる。前記他の分子は、例えば、前述のような標識物質、保護基等の機能性分子等があげられる。前記保護基は、例えば、Ｓ（硫黄）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｂ（ホウ素）、エステル含有基等があげられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明の一本鎖核酸分子の検出等に利用できる。
【０２２１】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基または前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、または、糖残基のＯ、Ｎ、ＳもしくはＣに、付加または置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、３’位のＣもしくは５’位のＣ、またはこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記ＰＮＡ等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加または置換することもできる。
【０２２２】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、およびモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬およびフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、ｎは、正の整数であり、ｎ＝３または６が好ましい。
【０２２３】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）等があげられる。
【０２２４】
本発明の一本鎖核酸分子は、前記５’末端が、例えば、リン酸基またはリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸化は、例えば、５’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、５’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)PO-P(HO)(O)-O-5’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、５’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、５’−ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸等）、５’−ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)PO-5’）、５’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Ｒはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、５’−アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Ｒはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等があげられる。
【０２２５】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
【０２２６】
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基等があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、プリン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）、７−デアザアデニン等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツジェーアイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【０２２７】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基のリボリン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、米国仮出願第６０／４６５，６６５号（出願日：２００３年４月２５日）、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（出願日：２００４年３月８日）に記載される残基が使用でき、本発明は、これらの文献を援用できる。
【０２２８】
３．非ヌクレオチド残基
前記非ヌクレオチド残基は、特に制限されない。本発明の一本鎖核酸分子は、例えば、前記非ヌクレオチド残基として、アミノ酸残基またはペプチド残基を含む非ヌクレオチド構造を有してもよい。前記アミノ酸残基またはペプチド残基を構成するアミノ酸としては、例えば、塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸等があげられる。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン等があげられる。前記酸性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。
【０２２９】
４．組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であり、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０２３０】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０２３１】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の一本鎖核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０２３２】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０２３３】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患等があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記発現抑制配列を適宜設定すればよい。
【０２３４】
具体例として、前記標的遺伝子を前記ＴＧＦ−β１遺伝子に設定し、前記遺伝子に対する発現抑制配列を前記一本鎖核酸分子に配置すれば、ＴＧＦ−β１を抑制することにより治療効果が期待される疾患や病態、例えば、炎症性疾患、具体的には、急性肺傷害等の治療に使用できる。
【０２３５】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記一本鎖核酸分子を投与すればよい。
【０２３６】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０２３７】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。前記投与がｉｎ  ｖｉｖｏの場合、例えば、経口投与でもよいし、非経口投与でもよい。前記非経口投与は、例えば、注射、皮下投与、局所投与等があげられる。
【０２３８】
本発明の組成物は、例えば、本発明の一本鎖核酸分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０２３９】
本発明の組成物において、前記一本鎖核酸分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体により、例えば、前記一本鎖核酸分子を効率よくデリバリーできる。前記一本鎖核酸分子と前記複合化剤との結合は、特に制限されず、例えば、非共有結合等があげられる。前記複合体は、例えば、包接複合体等があげられる。
【０２４０】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０２４１】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤等があげられる。
【０２４２】
前記担体は、例えば、高分子が好ましく、より好ましくは、生体高分子である。前記担体は、例えば、生分解性が好ましい。前記担体は、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グロブリン等のタンパク質；例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、ヒアルロン酸等の糖質；脂質等があげられる。前記担体は、例えば、合成ポリアミノ酸等の合成ポリマーも使用できる。前記ポリアミノ酸は、例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｉｎｅ)等があげられる。
【０２４３】
前記結合物質は、例えば、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Ｎｅｐｒｏｘｉｎ)、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド擬似体等があげられる。
【０２４４】
前記融合剤および縮合剤は、例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等のポリアミノ鎖等があげられる。ＰＥＩは、例えば、直鎖状および分岐状のいずれでもよく、また、合成物および天然物のいずれでもよい。前記ＰＥＩは、例えば、アルキル置換されてもよいし、脂質置換されてもよい。また、前記融合剤は、この他に、例えば、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン、ポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール等）等が使用できる。前記融合剤は、例えば、αらせん構造を有してもよい。前記融合剤は、例えば、メリチン等の膜崩壊剤でもよい。
【０２４５】
本発明の組成物は、例えば、前記複合体の形成等について、米国特許第６，５０９，３２３号、米国特許公報第２００３／０００８８１８号、ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号等を援用できる。
【０２４６】
前記添加剤は、この他に、例えば、両親媒性分子等があげられる。前記両親媒性分子は、例えば、疎水性領域および親水性領域を有する分子である。前記分子は、例えば、ポリマーが好ましい。前記ポリマーは、例えば、二次構造を有するポリマーであり、反復性の二次構造を有するポリマーが好ましい。具体例としては、例えば、ポリペプチドが好ましく、より好ましくは、αらせん状ポリペプチド等である。
【０２４７】
前記両親媒性ポリマーは、例えば、２つ以上の両親媒性サブユニットを有するポリマーでもよい。前記サブユニットは、例えば、少なくとも１つの親水性基および１つの疎水性基を有する環状構造を有するサブユニット等があげられる。前記サブユニットは、例えば、コール酸等のステロイド、芳香族構造等を有してもよい。前記ポリマーは、例えば、芳香族サブユニット等の環状構造サブユニットとアミノ酸の両方を有してもよい。
【０２４８】
５．発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０２４９】
本発明の発現抑制方法において、前記遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、ＲＮＡ干渉による発現抑制等があげられる。ここで、本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉を誘導する方法であり、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することを特徴とする発現誘導方法ともいえる。
【０２５０】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記一本鎖核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記一本鎖核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官等があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。
【０２５１】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記一本鎖核酸分子を単独で投与してもよいし、前記一本鎖核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類の種類に応じて適宜選択できる。
【０２５２】
６．治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の一本鎖核酸分子を、患者に投与する工程を含み、前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の一本鎖核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法を援用できる。
【０２５３】
７．一本鎖核酸分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の一本鎖核酸分子の使用である。また、本発明の使用は、ＲＮＡ干渉の誘導のための、前記本発明の一本鎖核酸分子の使用である。
【０２５４】
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明の一本鎖核酸分子であり、前記一本鎖核酸分子が、前記発現抑制配列として、前記疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制する配列を有することを特徴とする。
【実施例】
【０２５５】
本発明は、更に以下の実施例、試験例および製剤例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。【０２５６】
実施例１：Ｎ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン−サクシンイミジルエステル（３）の合成
下記スキームに従い、Ｎ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン−サクシンイミジルエステル（３）を合成した。【０２５７】
【化５９】
2019074110.tif 000061
【０２５８】
〔１〕Ｎ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン（２）の合成
Ｌ−プロリン（１）（1.0 g, 8.7 mmol）と脱水ＴＨＦ（10 mL）を加えた懸濁液に、クロロアセチルクロリド（1.05 mL, 13.2 mmol）と脱水ＴＨＦ（1.5 mL）の溶液をアルゴン雰囲気下で滴下しながら撹拌した。この反応混合物を６時間加熱還流し、室温に戻してから脱イオン水（2 mL）を加え１０分間撹拌し、飽和食塩水と酢酸エチルにて分液操作を行い、有機層を分けた。残った水層がｐＨ２より低いことを確認し、酢酸エチルにて２回抽出した。有機層を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をジイソプロピルエーテルでトリチュレーションし、白色粉末の化合物（２）（0.97 g, 収率58.4%）を得た。以下に、化合物（２）の機器分析値を示す。
化合物（２）：
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 8.35 (1H, br.s), 4.56-4.63 (1H, m), 4.00-4.14 (2H, m), 3.57-3.73 (2H, m), 1.93-2.35 (4H, m). 
融点：110−111℃
ＥＳＩ−ＭＳ：214.03[M+Na]+【０２５９】
〔２〕Ｎ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン−サクシンイミジルエステル（３）の合成
Ｎ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン（２）（0.1 g, 0.5 mmol）をジクロロメタン（3 mL）に溶解し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（0.12 g, 0.6 mmol）とＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（0.07 g, 0.6 mmol）を加えて室温で２時間撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンを加えて水で２回、飽和食塩水で２回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮し白色発泡体の化合物（３）（0.11 g, 収率73%）を得た。以下に、化合物（３）の機器分析値を示す。
化合物（３）：
1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 4.83-4.96 (1H, m), 4.04-4.11 (2H, m), 3.61-3.78 (2H, m), 2.83-2.87 (4H, m), 2.02-2.50 (4H, m). 
ＥＳＩ−ＭＳ：311.05[M+Na]+【０２６０】
実施例２：新規一本鎖核酸分子の合成（ＰＳ−０００１−Ｃ３）
（１）核酸合成
以下に示す核酸を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標登録）８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムス）により合成した。ＲＮＡアミダイトとして、ＴＢＤＭＳアミダイトを用いた固相合成を行った。センス鎖の合成では、３’末端にＰｈｔｈａｌａｍｉｄｏ  Ａｍｉｎｏ  Ｃ６  ｌｃａａ  ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）（以下に構造を示す）を用いた。アンチセンス鎖の合成では、５’末端に５’−Ｔｈｉｏｌ  Ｃ−３  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ＣＥＤ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）（以下に構造を示す）を用いた。固相からの切り出しと脱保護は、定法に従った。合成した核酸は、ＨＰＬＣにより精製した。下記アンチセンス鎖核酸中の下線部は、ヒトＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制配列である。【０２６１】
【化６０】
2019074110.tif 000062
【０２６２】
【化６１】
2019074110.tif 000063
【０２６３】
（２）新規一本鎖核酸分子の合成
以下に本発明の一本鎖核酸分子であるＰＳ−０００１−Ｃ３の構造を示す。
ＰＳ−０００１−Ｃ３は、前記センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を、後述する方法にて、実施例１で得られたＮ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン−サクシンイミジルエステル（３）を介して結合させることにより得られる一本鎖核酸分子である。【０２６４】
【化６２】
2019074110.tif 000064
【０２６５】
センス鎖＋Ｐの合成
１ｍｍｏｌ／Ｌのセンス鎖  ４０μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）  ２０μＬ、２．０ｍｇ／１００μＬのＮ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン−サクシンイミジルエステル（３）／ＤＭＦ  １０μＬ（６９３ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  ３０μＬを混合し、２５℃にて５０分間撹拌した。さらに、２．０ｍｇ／１００μＬのＮ−２−クロロアセチル−Ｌ−プロリン−サクシンイミジルエステル（３）／ＤＭＦ  ５μＬを追加し、７０分間静置した。この反応液について、注射用蒸留水（大塚製薬）を溶出液としたｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製し、センス鎖＋Ｐを得た。質量分析：７６８９．００（計算値：７６８９．２９）。ＨＰＬＣ分析結果を図１に示す。分析条件は、ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８（４．６×５０ｍｍ）、移動相Ａ：５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７）、５％ＣＨ３ＣＮ、移動相Ｂ：５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７）、５０％ＣＨ３ＣＮ、グラジエントＢ：０−３０％／２０ｍｉｎ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出：ＵＶ２６０ｎｍである。【０２６６】
【化６３】
2019074110.tif 000065
【０２６７】
アンチセンス鎖（ＳＨ体）の合成
１ｍｍｏｌ／Ｌのアンチセンス鎖  ４０μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）  ２０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのジチオトレイトール水溶液  ２０μＬ、注射用蒸留水  ２０μＬを混合し、２５℃にて４５分間撹拌した。さらに、１０ｍｇ／ｍＬのジチオトレイトール水溶液  ５μＬを追加し、１．５時間撹拌した。この反応液について、注射用蒸留水（大塚製薬）を溶出液としたｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製し、アンチセンス鎖（ＳＨ体）を得た。質量分析：８０８４．３０（計算値：８０８４．８５）。ＨＰＬＣ分析結果を図２に示す。分析条件は、ＸＢｒｉｄｇｅ  ＯＳＴ  Ｃ１８（４．６×５０ｍｍ）、移動相Ａ：５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７）、５％ＣＨ３ＣＮ、移動相Ｂ：５０ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７）、５０％ＣＨ３ＣＮ、グラジエントＢ：０−３０％／２０ｍｉｎ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：６０℃、検出：ＵＶ２６０ｎｍである。【０２６８】
【化６４】
2019074110.tif 000066
【０２６９】
ＰＳ−０００１−Ｃ３の合成
センス鎖＋Ｐ  １７０μＬ、アンチセンス鎖（ＳＨ体）  １７０μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）  １００μＬ、注射用蒸留水  ６０μＬを混合し、２５℃にて２時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣ（カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラム温度：４０℃；移動相Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；移動相Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）にて精製し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、ＰＳ−０００１−Ｃ３を得た。質量分析：１５７３７．８０（計算値：１５７３７．６７）。精製後のＨＰＬＣ分析結果を図３に示す。分析条件は、ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００（４×２５０ｍｍ）、移動相Ａ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％ＣＨ３ＣＮ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、移動相Ｂ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％ＣＨ３ＣＮ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、７００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、グラジエントＢ：１０−４０％／２０ｍｉｎ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：８０℃、検出：ＵＶ２６０ｎｍである。【０２７０】
実施例３：Ｎα−２−ブロモアセチル―Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン−サクシンイミジルエステル（６）の合成
下記スキームに従い、Ｎα−２−ブロモアセチル―Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン−サクシンイミジルエステル（６）を合成した。【０２７１】
【化６５】
2019074110.tif 000067
【０２７２】
〔１〕Ｎα−２−ブロモアセチル―Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（５）の合成
Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（４）(１．００ g, ４．０６ mmol) に水(４ mL)、THF (４ mL) および4N NaOH水溶液(８８０ μL, ３．５２ mmol) を室温で加えて溶解した。この溶液を０ ℃に冷却し、４ｍｏｌ／Ｌ 水酸化ナトリウム水溶液(１．２ mL, ４．８ mmol) およびブロモアセチルブロミド (４００ μL, ４．６２ mmol) を添加した。反応後の溶液に３ｍｏｌ／Ｌ臭化水素酸(２ mL) を添加し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１０ｍＬで３回抽出した。合わせた有機層を炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、洗浄後の有機層を減圧濃縮し、化合物（５）(３０７ mg, 収率２１%)を無色油状物として得た。以下に、化合物（５）の機器分析値を示す。
化合物（５）：
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.54 (1H, br.s), 6.76 (1H, br.s), 4.10-4.15 (1H, m), 3.85-3.91 (2H, m), 2.84-2.89 (2H, m), 1.51-1.71 (2H, m),1.19-1.39 (4H, m), 1.35 (9H, s).
ＥＳＩ−ＭＳ：３８９．１０［Ｍ＋Ｎａ］＋【０２７３】
〔２〕Ｎα−２−ブロモアセチル―Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン−サクシンイミジルエステル（６）の合成
Ｎα−２−ブロモアセチル―Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン（５）(４３９．４ mg, １．２０mmol) およびジ（Ｎ−スクシンイミジルカーボネート）(３２２．０mg, １．２６ mmol) のアセトニトリル(４．４ mL) 懸濁液に、室温でＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン(２９．６ mg, ０．２４ mmol) を加えた。２０分間攪拌した後、反応液を減圧濃縮し、残渣をクロロホルム(１１ mL) で希釈した。水(８．８mL) で 4 回洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥し、減圧濃縮して化合物（６）（５０７．１ｍg, 収率９１%）を無色泡状の固体として得た。以下に、化合物（６）の機器分析値を示す。
化合物（６）：
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.98 (1H, br.s), 6.79 (1H, br.s), 4.59-4.64 (1H, m), 3.89-3.95 (2H, m), 2.89-2.91 (2H, m), 2.81-2.83 (4H, m), 1.73-1.90 (2H, m), 1.34-1.40 (4H, m), 1.37 (9H, s).
ＥＳＩ−ＭＳ：４８６．０８［Ｍ＋Ｎａ］＋【０２７４】
実施例４：新規一本鎖核酸分子の合成（ＫＳ−０００１）
実施例２で調製された以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖を用いた。【０２７５】
【化６６】
2019074110.tif 000068
【０２７６】
以下に本発明の一本鎖核酸分子であるＫＳ−０００１の構造を示す。
ＫＳ−０００１は、前記センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を、後述する方法にてＮα−２−ブロモアセチル―Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン−サクシンイミジルエステル（６）を介して結合させることにより得られる一本鎖核酸分子である。【０２７７】
【化６７】
2019074110.tif 000069
【０２７８】
ＫＳ−０００１の合成
８４４μｍｏｌ／Ｌのセンス鎖  ４８μＬ、注射用蒸留水  ４３８μＬ、ジイソプロピルエチルアミン  １４μＬの混合溶液を、１７．２ｍｇ／２００μＬの、実施例３で得られたＮα−２−ブロモアセチル―Ｎε−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン−サクシンイミジルエステル（６）／ＤＭＦ  ２００μＬに５回に分けて添加し、２５℃にて２０分間撹拌した。
１ｍｍｏｌ／Ｌのアンチセンス鎖  ２０μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）  ２０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのジチオトレイトール水溶液  ２０μＬ、注射用蒸留水  ４０μＬを混合し、２５℃にて２時間撹拌した。この反応液を前出の反応液に添加し、２５℃にて２０分間撹拌した。反応液をエタノール沈殿後、ＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５、５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラム温度：５０℃；移動相Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；移動相Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）にて精製し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションを減圧濃縮し、ＫＳ−０００１を得た。質量分析：１５８６９．５０（計算値：１５８６８．８５）。精製後のＨＰＬＣ分析結果を図４に示す。分析条件は、ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００（４×２５０ｍｍ）、移動相Ａ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％ＣＨ３ＣＮ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、移動相Ｂ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％ＣＨ３ＣＮ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、７００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、グラジエントＢ：１０−４０％／２０ｍｉｎ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：８０℃、検出：ＵＶ２６０ｎｍである。【０２７９】
参考例：新規一本鎖核酸分子の合成（ＡＳ−０００１）
実施例２で調製された以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖を用いた。【０２８０】
【化６８】
2019074110.tif 000070
【０２８１】
以下に本発明の一本鎖核酸分子であるＡＳ−０００１の構造を示す。
ＡＳ−０００１は、前記センス鎖の３’末端とアンチセンス鎖の５’末端を、後述する方法にて２−ブロモ酢酸サクシンイミジルエステルを介して結合させることにより得られる一本鎖核酸分子である。【０２８２】
【化６９】
2019074110.tif 000071
【０２８３】
ＡＳ−０００１の合成
８４４μｍｏｌ／Ｌのセンス鎖  ４８μＬ、注射用蒸留水  ４３８μＬ、ジイソプロピルエチルアミン  １４μＬの混合溶液を、７．５μｍｏｌ／Ｌの２−ブロモ酢酸サクシンイミジルエステル／ＤＭＦ  ２００μＬに５回に分けて添加し、２５℃にて２０分間撹拌した。反応液をエタノール沈殿後、ＨＰＬＣ（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５、５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラム温度：５０℃；移動相Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；移動相Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）にて精製し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションを減圧濃縮し、センス鎖＋ブロモアセチル体を得た。質量分析：７６３６．９０（計算値：７６３６．６２）。
１ｍｍｏｌ／Ｌのアンチセンス鎖  ４μＬ、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．０）  ４μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのジチオトレイトール水溶液  ４μＬ、注射用蒸留水  ８μＬを混合し、２５℃にて３０分間撹拌した。この反応液１７．５μＬとセンス鎖＋ブロモアセチル体  ７５０μＬ（３．４５ｎｍｏｌ）、１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．５）  ８５μＬを混合し、２５℃にて３０分間撹拌した。反応液をエタノール沈殿後、注射用蒸留水（大塚製薬）を溶出液としたｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製し、ＡＳ−０００１を得た。質量分析：１５６４１．４０（計算値：１５６４０．５６）。精製後のＨＰＬＣ分析結果を図５に示す。分析条件は、ＤＮＡＰａｃ  ＰＡ−１００（４×２５０ｍｍ）、移動相Ａ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％ＣＨ３ＣＮ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、移動相Ｂ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％ＣＨ３ＣＮ、８Ｍ  Ｕｒｅａ、７００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、グラジエントＢ：１０−４０％／２０ｍｉｎ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：８０℃、検出：ＵＶ２６０ｎｍである。【０２８４】
試験例１（遺伝子発現抑制活性測定法）
細胞は、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
まず、細胞を培地中で培養し、その細胞懸濁液を２４穴プレートに４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、核酸分子をウェル中の細胞にトランスフェクションした。具体的には、ウェルあたりの組成を以下のように設定しトランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、核酸分子溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、ウェルにおいて、核酸分子の終濃度は０．０１、０．１、１ ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０２８５】
【表１】
2019074110.tif 000072
【０２８６】
トランスフェクション後２４時間培養した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。ＴＧＦ−β１遺伝子の発現量は、β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。【０２８７】
ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  II（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。ＴＧＦ−β１遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＴＧＦ−β１遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
5’-ttgtgcggcagtggttgagccg-3’ （配列番号６）
5’-gaagcaggaaaggccggttcatgc-3’ （配列番号７）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-gccacggctgcttccagctcctc-3’ （配列番号８）
5’-aggtctttgcggatgtccacgtcac-3’ （配列番号９） 【０２８８】
コントロールとして、トランスフェクションにおいて、核酸分子を未添加とし、（Ａ）トランスフェクション試薬 １．５μＬと（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。
補正後のＴＧＦ−β１遺伝子の発現量について、コントロール（ｍｏｃｋ）の細胞における発現量を１として、各核酸分子を導入した細胞での発現量の相対値を求めた。
これらの結果を図６に示す。図６に示すように、実施例の核酸分子は強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２８９】
本発明によれば、高難易度の長鎖オリゴマーの合成が短鎖オリゴマーの技術を駆使して可能となる新規な一本鎖核酸分子の製造方法、および該方法によって製造される新規な一本鎖核酸分子を提供できる。【０２９０】
本出願は、日本で２０１７年１０月１３日に出願された特願２０１７−１９９９４５号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含される。
【図１】
2019074110.tif 000081
【図２】
2019074110.tif 000082
【図３】
2019074110.tif 000083
【図４】
2019074110.tif 000084
【図５】
2019074110.tif 000085
【図６】
2019074110.tif 000086
【図７】
2019074110.tif 000087
【図８】
2019074110.tif 000088
【図９】
2019074110.tif 000089
【配列表】
2019074110000001.app
【国際調査報告】
2019074110.tif 000090
2019074110.tif 000091
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