(57)【要約】開示されているのは、R1-EN、及び該R1-ENのC末端若しくはN末端に融合したタンパク質又はループ中に該R1-ENを有するタンパク質を含有する融合タンパク質、該融合タンパク質を結晶化させる工程を含むタンパク質結晶の製造方法、該融合タンパク質を含むタンパク質結晶、該方法により得られるタンパク質結晶又は該タンパク質結晶を用いてX線結晶構造解析を行う工程を含むタンパク質の構造解析方法、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、該核酸が導入された形質転換体、並びに該融合タンパク質を使用するハニカム構造をした結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
R1-EN、及び該R1-ENのC末端若しくはN末端に融合したタンパク質又はループ中に該R1-ENを有するタンパク質を含有する融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の融合タンパク質を結晶化させる工程を含む、
タンパク質結晶の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の融合タンパク質を含むタンパク質結晶。
【請求項４】
請求項２に記載の方法により得られるタンパク質結晶、又は請求項３に記載のタンパク質結晶を用いてX線結晶構造解析を行う工程を含む、
タンパク質の構造解析方法。
【請求項５】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸が導入された形質転換体。
【請求項８】
請求項１に記載の融合タンパク質を使用するハニカム構造をした結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意のタンパク質の結晶を効率的に製造できる融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及び該核酸が導入された形質転換体に関する。また、本発明は、タンパク質結晶、タンパク質結晶の製造方法、タンパク質の構造解析方法、及び結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の立体構造は多くの生化学的理解を与え、疾病の発症機構解明、有効薬剤設計等に必須である。タンパク質の立体構造を解析する方法としては、X線結晶構造解析が広く用いられているが、タンパク質を結晶化するためには多数の結晶化条件をスクリーニングする必要がある上、必ずしも結晶が得られるとは限らないことがネックとなっている。このように、タンパク質の結晶構造解析は、結晶化の壁を越えなければならないという問題点を有する。結晶化を容易にする研究は今までにも多く行われてきたが、有効な方法は未だ存在していない。【０００３】
結晶構造解析ではタンパク質の結晶化が不可欠であるが、実際はタンパク質分子が規則的に整列している状態であればよい。そこで、予め三次元格子を構築して、それに特定の分子を結合させるというアプローチが考えられる。このような方法として、非特許文献１では「結晶スポンジ」を開発し、これに低分子有機化合物を結合させて構造解析を行ったことが報告されている。しかしながら、この方法は、タンパク質では分子が大きいため適用することはできない。【０００４】
また、非特許文献２ではDNA配列を設計して三次元的に組み上げる方法が報告されている。しかしながら、この方法は、特異的配列に結合するDNA結合タンパク質に限られるという問題点がある。【０００５】
その他の結晶化に利用するための高多孔性素材としては、低分子化合物による高多孔性素材、人工設計タンパク質による高多孔性素材などが報告されているが、大きなタンパク質には適用できない、分解能が低い、デザインが困難などの問題がある。【０００６】
高多孔性素材以外の結晶化を促進する技術としては、特許文献１においてタンパク質の二量体化を促進するポリペプチドを目的のタンパク質と融合させることで、目的のタンパク質の結晶化が効果的に促進されることが報告されている。しかしながら、この方法では、結晶化条件について決定する必要がある。【０００７】
R1はカイコ(Bombyx mori)で見出されたレトロトランスポゾンの1つであり、2つのオープンリーディングフレームの内のORF2pは、逆転写酵素(RT)及びエンドヌクレアーゼ(EN)をコードしている。そして、本発明者らは、このR1のENドメイン(R1-EN)について分解能2.0Åの結晶構造(空間群P321, 単位胞a=b=141.3Å, c=37.5Å)を報告している(非特許文献３)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2014/181786号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Y. Inokuma et al., Nature, Vol. 495, 461-466(2013)
【非特許文献２】J. Zheng et al., Nature, Vol. 461, 74-77(2009)
【非特許文献３】N. Maita et al., Nucleic Acid Research, Vol. 35, NO. 12, 3917-3927(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、任意のタンパク質の結晶を効率的に製造できる融合タンパク質、該融合タンパク質をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、及び該核酸が導入された形質転換体を提供することを目的とする。また、本発明は、上記融合タンパク質を含むタンパク質結晶、上記融合タンパク質を用いたタンパク質結晶の製造方法、該タンパク質結晶を用いたタンパク質の構造解析方法、及び上記融合タンパク質を使用する結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、R1-ENの結晶は溶媒領域が多く(69.7%)、中空のハニカム構造をしており、N末端及びC末端は共に溶媒領域に露出しているので、末端に融合させたタンパク質は溶媒領域に配置させることができること、このような融合タンパク質はR1-ENと同一の精製条件及び結晶化条件を適用できるという知見を得た。【００１２】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の融合タンパク質、核酸、発現ベクター、形質転換体、タンパク質結晶、タンパク質結晶の製造方法、タンパク質の構造解析方法等を提供するものである。【００１３】
項１．R1-EN、及び該R1-ENのC末端若しくはN末端に融合したタンパク質又はループ中に該R1-ENを有するタンパク質を含有する融合タンパク質。
項２．項１に記載の融合タンパク質を結晶化させる工程を含む、
タンパク質結晶の製造方法。
項３．項１に記載の融合タンパク質を含むタンパク質結晶。
項４．項２に記載の方法により得られるタンパク質結晶、又は項３に記載のタンパク質結晶を用いてX線結晶構造解析を行う工程を含む、
タンパク質の構造解析方法。
項５．項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
項６．項５に記載の核酸を含む発現ベクター。
項７．項５に記載の核酸が導入された形質転換体。
項８．項１に記載の融合タンパク質を使用するハニカム構造をした結晶格子の空隙に任意のタンパク質を配置させる方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のR1-ENに任意のタンパク質を融合させた融合タンパク質は、R1-ENと同じ精製条件及び結晶化条件により精製及び結晶化が可能であるので、結晶化条件のスクリーニングの必要が無く、任意のタンパク質の結晶化を効率的に行うことが可能である。また、本発明では、R1-EN結晶の溶媒領域中に任意のタンパク質を配置させることができ、この溶媒用領域の内径はおよそ110Åであるので、分子量の大きなタンパク質の結晶化も可能である。【００１５】
結晶化ができないために構造が不明の重要なタンパク質は未だ数多くあるが、本発明によって結晶化の問題が解消されることにより、構造が未知であったタンパク質の構造解析が促進されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のタンパク質結晶の結晶格子を示す図である。
【図２】R1-EN_Ubiの陽イオン交換カラムのクロマトグラムを示す図である。
【図３】R1-EN_Ubiのゲルろ過カラムのクロマトグラムを示す図である。
【図４】ユビキチン部分の電子密度(Fo-Fc/0.7σ)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１８】
なお、本明細書において「含む、含有する(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００１９】
本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、2本鎖DNA、1本鎖DNA(センス鎖又はアンチセンス鎖)、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００２０】
また、本発明において、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は同義であって、これらはDNA及びRNAの両方を含み、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。
【００２１】
本発明の融合タンパク質は、(1)R1-EN、及び(2)該R1-ENのC末端若しくはN末端に融合したタンパク質又はループ中に該R1-ENを有するタンパク質(以下、本明細書において「タンパク質A」と称することもある)を含有することを特徴とする。
【００２２】
本発明における「R1-EN」は、R1のオープンリーディングフレームの1つであるORF2pにコードされるENドメインを意味する。ENドメインはORF2pにコードされるアミノ酸配列の1-240番目の領域である。本発明のように結晶化を目的とする場合は、R1-ENとしては結晶化した際にハニカム構造の結晶格子が得られる部分のアミノ酸配列を有していればよく、そのようなアミノ酸配列としてはORF2pにコードされるアミノ酸配列の5-223番目の配列が挙げられる。R1はカイコ(Bombyx mori)で見出されたレトロトランスポゾンの1つである。
【００２３】
R1のORF2pのアミノ酸配列については、UniProt Accession No. Q7M4J4 (配列番号１)としてUniProtのweb siteに登録されている。また、R1-ENの立体構造がPDB ID: 2EI9としてPDBに登録されている。
【００２４】
本発明における「R1-EN」には、前述するようなデータベースに登録されているアミノ酸配列を有するもの以外であっても、その改変体も含まれ、改変体としては上記アミノ酸配列からなるタンパク質と同等のハニカム構造の結晶格子を作るタンパク質が望ましい。また、改変体としては、凝集を防ぐ目的で2つのシステイン(Cys55、Cys72)を他のアミノ酸に置換した物、DNA切断活性を無くす目的で活性残基(Glu44)を他の残基に置換した物などが挙げられる。
【００２５】
改変体としては、前述するようなデータベースに登録されているアミノ酸配列において、１又は2個以上、例えば１〜50個、1〜25個、1〜12個、1〜9個、1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられる。特定のアミノ酸配列において、1個若しくは2個以上のアミノ酸を置換、欠失、挿入及び／又は付加させる技術は公知である。
【００２６】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線(インターネット)を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。アミノ酸配列の同一性(%)は、当該分野で慣用のプログラム(例えば、BLAST、FASTA等)を初期設定で用いて決定することができる。      
【００２７】
本発明における「タンパク質A」としては、特に制限されず、天然のタンパク質、人工のタンパク質などが挙げられ、また、天然又は人工のペプチドも包含される。「タンパク質A」としては、立体構造が未知であるタンパク質又はペプチド、及び結晶化が可能ではなかったタンパク質又はペプチドが特に好適である。タンパク質Aの分子質量としては、R1-ENの結晶の溶媒領域に配置可能である限り特に制限されず、好ましくは5 kDa以上、より好ましくは5〜50 kDa、更に好ましくは5〜25 kDaである。また、タンパク質Aの大きさとしては、R1-ENの結晶の溶媒領域に配置可能である限り特に制限されず、好ましくは10〜60Å、より好ましくは10〜40Åである。
【００２８】
R1-ENの結晶は、図１に示すような中空のハニカム構造であって(ハニカムの内径はおよそ110Å)、空隙がc軸方向に続いており、N末端及びC末端は共に溶媒領域に露出しているので、N末端及びC末端のいずれに融合させてもタンパク質Aを溶媒領域に配置させることができる。また、R1-ENの結晶ではN末端とC末端が隣接しているので、タンパク質Aの外側に突出しているループ中に別のタンパク質を融合させてもタンパク質Aの構造に変化が生じない場合には、R1-ENの配列をタンパク質Aのループ中に挿入することでもR1-ENの結晶の溶媒領域にタンパク質Aを配置させることができる。
【００２９】
本発明における「ハニカム構造」とは、図１に示すような六角柱を隙間無く敷き詰めた構造を意味し、六角柱は正六角柱であることが望ましい。
【００３０】
本発明の融合タンパク質において、R1-EN及びタンパク質Aは直接結合していてもよく、又は間に任意のアミノ酸配列が存在して結合していてもよい。本発明の融合タンパク質には、これら2種のタンパク質以外にも、他のタンパク質及びペプチドが結合していてもよい。
【００３１】
本発明の融合タンパク質は、後述するような該融合タンパク質をコードする核酸を導入した形質転換体を培養することなどにより生産することができる。当該形質転換体の培養は、融合タンパク質の発現が可能となる条件下で宿主細胞に適切な栄養培地中で行うことで、形質転換体に融合タンパク質を細胞内又は培地中に生産させることができる。
【００３２】
生産したポリペプチドの精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、メンブレンフィルター、限外濾過、精密濾過、硫酸アンモニウム塩析法、蒸留処理、晶析などにより行うことができる。また、精製は、これらを単独で又は2種以上を任意の順序で適宜組み合わせて行うことができる。
【００３３】
本発明の融合タンパク質は、R1-ENと同じ又は同様の精製条件(例えば、非特許文献３参照)で精製可能であるので、精製条件について検討を行う必要が無く効率的な精製が可能なため、R1-ENと同じ又は同様の精製条件を適用することが望ましい。
【００３４】
本発明の核酸は、上記融合タンパク質をコードすることを特徴とする。当該核酸は、融合タンパク質を構成する各タンパク質をコードする核酸を用いて、生化学的切断／再結合などの常法で作製することができる。当該核酸は、上記融合タンパク質の作製等に使用することができる。R1-EN及びタンパク質Aをコードする核酸は、市販品を入手することもできるし、GenBank等の公共のデータベースに登録されている公知の塩基配列の情報を利用し、cDNAライブラリーを鋳型としたPCR法等の常法により製造することも可能である。また、当該核酸を導入する宿主細胞で使用頻繁の高いコドンに変更することにより発現効率を上げることができる。
【００３５】
本発明の発現ベクターは、上記核酸を含むことを特徴とする。当該発現ベクターとしては、特に制限されず、公知の発現ベクターを広く使用することができる。上記核酸を導入する宿主細胞の種類等を考慮し、適切な発現ベクターを適宜選択し得る。発現ベクターは、上記核酸以外にも、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点などを含有し得る。発現ベクターは、自立的に複製するベクター、及び宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製される物のいずれも使用することができる。上記核酸は、公知の方法により発現ベクターに挿入することができる。
【００３６】
本発明の発現ベクターとしては、上記核酸の一方又は両方の末端にタグをコードする核酸が付加される物も使用することができる。当該タグとしては、Flag、Myc、HA(ヘマグルチニン)、GST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)、ヒスチジン等が挙げられる。このように、融合タンパク質がタグ化されることで、当該タグを利用した精製を行うことが可能となる。また、融合タンパク質とタグの間にプロテアーゼの認識配列を付加させておくことで、精製後にタグを切断することが可能となる。
【００３７】
発現ベクターの構築法、及び当該発現ベクターの宿主細胞への導入法は周知であり、例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等の記載を参考にして実施することができる。
【００３８】
本発明の形質転換体は、上記核酸が導入されていることを特徴とする。核酸の導入は上記のように当該核酸を含む発現ベクターを利用することにより行うことができる。宿主細胞への発現ベクターの導入は、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、酢酸リチウム法等の周知の方法により行うことができる。上記核酸を導入する宿主としては、例えば、細菌(例えば、大腸菌(Escherichia coli)、ストレプトマイセス(Streptomyces)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属)、真菌(例えば、酵母(サッカロマイセス(Saccharomyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属など)、アスペルギルス(Aspergillus)属)、昆虫細胞(例えば、ドロソフィラ(Drosophila)S2、スポドプテラ(Spodoptera)SF)、哺乳類動物細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００３９】
本発明のタンパク質結晶の製造方法は、上記融合タンパク質を結晶化させる工程を含むことを特徴とする。
【００４０】
結晶化工程に用いる溶液(以下、「結晶化溶液」と称する)は、上記融合タンパク質に加えて、必要により沈殿剤、緩衝剤、R1-EN等を含む。結晶化溶液中の融合タンパク質の濃度は、特に制限されず、通常、1〜10 mg/mL程度である。結晶化溶液にR1-ENを混ぜておくことで、後述するように、より大きなタンパク質Aについて結晶化を行える。
【００４１】
沈殿剤としては、例えば、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、クエン酸ナトリウムなどの塩、ポリエチレングリコール、Jeffamine (商標) M-600などの高分子化合物、2-メチル-2,4-ペンタンジオール、メタノール、2-プロパノールなどのアルコール類が挙げられる。これらは、単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。沈殿剤の濃度としては、通常、塩が0.5〜3M、高分子化合物が0.1〜2%(v/v)、アルコール類が2〜20%(v/v)程度である。
【００４２】
緩衝剤としては、例えば、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、HEPES緩衝剤、MES緩衝剤などが挙げられる。これらは、単独で又は2種以上を組み合わせて使用できる。
【００４３】
結晶化溶液の溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられ、好ましくは水である。
【００４４】
結晶化溶液には、種結晶が含まれていることが好ましく、種結晶が存在することで結晶化を促進させることが可能となる。
【００４５】
タンパク質を結晶化させる方法としては、公知の結晶化方法を利用することができ、例えば、蒸気拡散法(ハンギング・ドロップ法、シッティング・ドロップ法等)、バッチ法、液液拡散法、透析法、シーディング法等が挙げられる。
【００４６】
結晶化の温度としては、結晶化が可能な限り特に制限されず、通常、0〜20℃である。結晶化を行う時間としては、結晶が得られる限り特に制限されず、通常、20時間〜30日である。
【００４７】
本発明のタンパク質結晶は、上記融合タンパク質を含むことを特徴とする。このようなタンパク質結晶は、例えば、上記の方法により製造することができる。
【００４８】
上記融合タンパク質は、R1-ENと同じ又は同様の結晶化条件により結晶化が可能であるので、R1-ENと同じ又は同様の結晶化条件(例えば、非特許文献３参照)を適用することが、結晶化条件のスクリーニングの必要が無く、効率的な結晶化が可能なため望ましい。
【００４９】
本発明のタンパク質結晶は、結晶格子がハニカム構造をしており、空隙は内径約110Åの孔がc軸方向に続いているため(図１参照)、結晶格子の空隙に入れることが可能であれば、形状及び種類に制限無く任意のタンパク質(すなわち、タンパク質A)を配置させることができる。ハニカムの内径はおよそ110Åであるので、分子量の大きな任意のタンパク質も孔に入れることが可能である。また、上記融合タンパク質に(タンパク質を融合させていない)R1-ENを一定量混ぜて結晶化することで、より分子量の大きなタンパク質Aについても結晶化が可能となると考えられる。そのような結晶における上記融合タンパク質とR1-ENの分子の割合としては、例えば、3:1〜1:3が挙げられる。また、本発明のタンパク質結晶は溶媒領域が中空の管状になっているので、棒状のタンパク質Aであれば、ある程度の長さを有する物であっても結晶化できると考えられる。
【００５０】
後述する実施例では、タンパク質Aの一例としてユビキチンを使用しているが、ユビキチン以外の任意のタンパク質であっても、溶媒領域に配置させることができればユビキチンと同様に結晶化が可能であると考えられる。
【００５１】
本発明のタンパク質の構造解析方法は、上記方法により得られるタンパク質結晶、又は上記タンパク質結晶を用いてX線結晶構造解析を行う工程を含むことを特徴とする。
【００５２】
X線結晶構造解析は、公知の方法に従って実施可能である。X線結晶構造解析も、R1-ENの構造を基にすることで、システマチックに行うことができるので、効率的な解析が可能である。また、2.0Å以下の高分解能の回折データを得ることが可能である。以下、X線結晶構造解析の一般的な手順について概説する。
【００５３】
まず、大型放射光施設のビームライン、X線照射装置等を用いて、タンパク質結晶にX線の照射を行うことでX線回折データを得る。当該X線回折データに基づいて、融合タンパク質を構成する分子の電子密度図を求め、更に、この電子密度図に基づいて該分子のモデリングを行うことにより、融合タンパク質の三次元構造を構築する。
【００５４】
電子密度図を導き出すためには、分子置換法による位相の決定が必要である。本発明においては、R1-ENの構造を基にして分子置換法で最適解を得ることができる。分子置換法にて良好な初期位相が得られれば、その電子密度図を描くことができる。このようにして得られた電子密度図に基づいて、公知のプログラムを用いることで、三次元グラフィックス上にてタンパク質Aのモデルの構築を行える。その次に、構築された分子のモデルは、より正確に近い構造へと近づけていくために、公知のプログラムを用いて精密化(リファインメント)を行う。
【００５５】
X線の照射をタンパク質結晶を凍結させたまま行う場合は、タンパク質結晶の凍結を防ぐため、ポリエチレングリコール、グリセロール、スクロースなどのクライオプロテクタントを含む抗凍結溶液を用いてタンパク質結晶の抗凍結処理を行うことが望ましい。
【００５６】
本発明の融合タンパク質は、R1-ENと同じ精製条件及び結晶化条件により精製及び結晶化が可能であるので、結晶化条件のスクリーニングの必要が無く、任意のタンパク質の結晶化を効率的に行える。また、本発明の融合タンパク質を使用することで、R1-EN結晶の溶媒領域中に任意のタンパク質を配置させることができるので、分子量の大きなタンパク質の結晶化も可能である。
【００５７】
結晶化ができないために構造が不明の重要なタンパク質は未だ数多くあるが、本発明の融合タンパク質を利用することで結晶化の問題が解消されることにより、構造が未知であったタンパク質の構造解析も可能となる。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。【００５９】
＜参考例＞
R1-ENの発現方法(非特許文献３参照)
pET16b (Novagen)の制限酵素NdeI／XhoIの間にR1-ORF2pの5-243の配列と、直後に停止コドンを挿入し、発現用プラスミドベクターとした。【００６０】
このプラスミドを大腸菌BL21(DE3) pLysS株に形質転換し、アンピシリン(シグマアルドリッチ社)とクロラムフェニコール(和光純薬工業株式会社)を加えた800 mLのLB培地で対数増殖期(濁度(OD600)が0.8程度)まで37℃で激しく振盪培養した後、最終濃度0.2 mMのIPTGを加えて20℃でゆっくりと振盪しながらおよそ20時間放置する。その後、遠心分離機で大腸菌体を沈殿させて回収し、-80℃で冷凍保存する。【００６１】
R1-ENの精製方法
大腸菌の菌体15 gに対し50 mLのバッファーA(注１)に懸濁し、0.1% Triton X100 (シグマアルドリッチ社)、1 mM PMSF (和光純薬工業株式会社)、10μg/mL RNaseA (シグマアルドリッチ社)、10μg/mL Lysozyme (和光純薬工業株式会社)(いずれも最終濃度)を加えて氷上で超音波破砕する。【００６２】
破砕液を6000 g×30 min、4℃で遠心し、上清を取る。さらに、上清に最終濃度0.5%のポリエチレンイミン(シグマアルドリッチ社)を加え、懸濁後6000 g×30 min、4℃で遠心する。上清を0.45μmのフィルターに通し、ろ液をHisTrap HP 5 mLカラム(GEヘルスケア社)に通す。【００６３】
次に、30 mLのバッファーAでカラムを洗い、30 mLのバッファーB(注２)で溶出させる。【００６４】
溶出液に、60%飽和となるように硫酸アンモニウム(和光純薬工業株式会社)を加え、硫酸アンモニウムを完全に溶解させた後で6000 g×20 min、4℃で遠心する。上清を捨て、沈殿にファクターXa用バッファー(注３)を10 mL加えて緩やかに沈殿を懸濁する。【００６５】
吸光度計(nano-drop ND-1000(サーモフィッシャーサイエンティフィック社))でUV280からタンパク質濃度を測り、タンパク質量の重量比300分の1のファクターXa (New England Biolab社)を加えて、10℃で一晩放置する。【００６６】
反応液を再び60%飽和硫酸アンモニウムとし、6000 g×20 min、4℃で遠心し、上清を捨てる。沈殿物を20 mLのSPバッファーA(注４)に懸濁し、0.45μmのフィルター(メルク社)に通した後、HiTrap SP HP 1 mL (GEヘルスケア社)にロードする。続いて、カラムを50-800 mM NaClの直線勾配にかける。R1-ENは、およそ500 mM NaClの画分に溶出される。【００６７】
R1-EN画分に60%飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、6000 g×20 min、4℃で遠心し、上清を捨てる。沈殿を1-2 mLのゲルろ過用バッファー(注５)に溶かし、0.22μmのフィルター(メルク社)に通した後、HPLCを用いてゲルろ過カラム(Superdex200 10/300 (GEヘルスケア社))で分離する。R1-ENは、およそ18 mLの画分に溶出される。R1-EN画分を回収し、10kDaの限外ろ過膜(Amicon Ultra(メルク社))で7-8 mg/mLまで濃縮する。
(注１)バッファーAの組成：30 mM Tris, 50 mM Imidazole, pH7.5, 0.5 M NaCl
(注２)バッファーBの組成：30 mM Tris, 350 mM Imidazole, pH7.5, 0.5 M NaCl
(注３)ファクターXa用バッファーの組成：50 mM Tris-HCl pH7.5, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM DTT
(注４)SPバッファーAの組成：40 mM リン酸ナトリウム pH5.5, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT
(注５)ゲルろ過用バッファーの組成：40 mM Hepes-NaOH pH7.2, 180 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA【００６８】
R1-ENの結晶化
結晶化方法は非特許文献３に詳細に記載されている。【００６９】
結晶化はハンギングドロップ蒸気拡散法で行う。上記の精製で得られた7-8 mg/mLの R1-EN溶液1.5μLに沈殿剤溶液(1.8 M 酢酸ナトリウム(和光純薬工業株式会社)(pH7.3)、10 mM 硫酸アンモニウム、1.0% Jeffamine M-600 (ハンプトンリサーチ社)) 1.5μLを加えて10℃で静置する。結晶はおよそ7-10日で成長する。【００７０】
マイクロシーディングを行うと、再現性良く結晶が得られる。【００７１】
＜製造例＞
融合タンパク質作製のためのプラスミドベクターのデザイン(pET16b-R1EN)
１）R1-ENの安定化
結晶構造から、タンパク質表面上にフリーのシステイン残基が2つ見られた。凝集を防ぐ目的でこれらの残基をセリンに置換した(C55S/C72S)。また、R1-ENの本来のDNA切断活性を無くす目的で活性残基であるE44をアラニンに置換した。【００７２】
２）余分な配列の除去
結晶構造ではC末端側の222番目のグリシンまでしか見えていなかった。見えていない領域は21残基あり、これが物理的に孔の内部で邪魔になるので、224-243の部分を除去した。【００７３】
３）マルチクローニングサイトの挿入
様々なタンパク質をコードする配列を挿入可能とするため、R1-ENの直後にマルチクローニングサイトを導入した。【００７４】
【化１】
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【００７５】
・CATATGはNdeIサイトで、これより前の部分はpET16bと共通である。
・太字の部分はR1-ENの5-223の配列である。
・GCAは元の配列gaaに変異を入れて、Glu44→Ala44としている
・TCCは元の配列tgtに変異を入れて、Cys55→Ser55としている
・TCGは元の配列tgcに変異を入れて、Cys72→Ser72としている
・イタリック体はマルチクローニングサイトで、5'側から、BamHI (GGATCC), SmaI (CCCGGG), SalI (GTCGAC), XhoI (TCTGAG), SacI (GAGTCT)の認識配列が並んでいる。
・灰色の部分以降はpET16bの5392以降と同じ配列である。【００７６】
融合タンパク質作製のためのプラスミドベクターのデザイン２
上はR1-ENのC末にタンパク質を融合させるデザインであるが、R1-ENのN末に融合させるためのプラスミドもデザインした。【００７７】
上の１）、２）を踏襲した上で、今度はpGEX6P-1をベースにコンストラクトを作製した。【００７８】
【化２】
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【００７９】
・GGATCCはBamHIの認識配列で、AAGCTTはHindIIIの認識配列である。これにより、この2つの制限酵素で任意のタンパク質を導入可能となる。また、GGATCCより前はpGEX6P-1と共通である。
・太字の部分はR1-ENの9-222の配列である。
・灰色のtaaは停止コドンである。
・CTCGAGはXhoIの認識配列で、これ以降はpGEX6P-1と同一である。【００８０】
R1-EN_hUbiの発現ベクターの作製
ヒトユビキチン(hUbi)の配列をpET16b-R1ENのBamHI/XhoIを用いて挿入し、R1-EN_hUbiを発現するプラスミドを作製した。【００８１】
挿入した配列は以下であった。【００８２】
【化３】
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【００８３】
GGATCC: BamHI、CTCGAG: XhoI【００８４】
R1-EN_hUbiの精製
上で作製したR1-EN_hUbiを発現するプラスミドを大腸菌BL21(DE3) pLysS株に形質転換し、[R1-ENの発現方法]の項に記した方法で発現させた。また、[R1-ENの精製方法]の項に記した方法と同じ方法で精製を行った。【００８５】
ただし、R1-EN_Ubiは陽イオン交換カラムではおよそ600 mM NaClの画分に溶出され(図２)、ゲルろ過カラムではおよそ17.4 mLの画分に溶出された(図３)。【００８６】
R1-EN_hUbi画分を回収し、10 kDaの限外ろ過膜(Amicon Ultra)で2 mg/mLまで濃縮した。【００８７】
＜試験例＞
R1-EN_hUbiの結晶化
上で精製したR1-EN_hUbiを沈殿剤(1.8 M 酢酸ナトリウム pH7.6, 10 mM 硫酸アンモニウム, 0.8% Jeffamine M600 pH7.0)で[R1-ENの結晶化]の項と同じ方法で結晶化を行った。この際、[R1-ENの結晶化]で得られたR1-EN結晶を微小ホモジナイザーで砕いたものを種結晶としてシーディングを行うと、再現性良く結晶が得られた。【００８８】
R1-EN_hUbiの結晶構造解析
上で得られた結晶をナイロンループ(ハンプトンリサーチ社)で掬い、抗凍結溶液(グリセリン1μL＋沈殿剤5μL)に移して再度掬って液体窒素に浸して結晶を凍結させた。凍結させたまま放射光施設SPring-8 BL44XUでX線照射し、最大1.8Å分解能のデータを得た。【００８９】
このデータは空間群P321、a=b=141.21, c=37.67Åであり、R1-ENの空間群(P321、a=b=141.30, c=37.51Å)と誤差範囲内で同一であった。R1-ENの構造を基に分子置換法で最適解が得られ、その位相を用いて電子密度を計算したところ、空隙部分に電子密度が得られた。βシートの特徴からユビキチン構造を当てはめることができた(図４)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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