(57)【要約】  本発明は、ｃＡＭＰ阻害作用及びＨＵＶＥＣ増殖抑制作用を有する抗ＲＡＭＰ２抗体に関し、また当該抗体を有効成分として含有する血管新生抑制剤を提供するものである。具体的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖試験において血管内皮細胞の増殖抑制作用を有する、受容体活性調節タンパク質２（ＲＡＭＰ２）に対する抗体又はその免疫反応性断片、あるいは、アドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有する抗体又はその免疫反応性断片に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用を有する、受容体活性調節タンパク質２（ＲＡＭＰ２）に特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項２】
前記血管内皮細胞の増殖抑制作用が、３５ｎＭ以下のＩＣ５０値である、請求項１に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項３】
アドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有する、請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生試験において、ｃＡＭＰ産生抑制作用が、２ｎＭ以下のＩＣ５０値である、請求項３に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項５】
ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞に結合する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項６】
ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞を用いたＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ試験による結合親和性（ＥＣ５０）が３．５ｎＭ以下である、請求項５に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項７】
配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体、とＲＡＭＰ２への結合において競合する抗体又はその免疫反応性断片、あるいは、
配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体、と同じエピトープに結合する抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項８】
ＲＡＭＰ２の細胞外領域を構成するアミノ酸配列の一次構造を認識しない、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項９】
配列番号７１〜１０１に記載の各アミノ酸配列からなるペプチドの全てと結合しない、請求項８に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１０】
ＬＸ１ＩＸ２ＤＸ３ＹＸ４ＹＸ５ＭＸ６Ｘ７（配列番号２４）で表されるアミノ酸配列であって、ここで、Ｘ１はＧ又はＭであり、Ｘ２はＦ又はＹであり、Ｘ３はＡ又はＶであり、Ｘ４は存在しないかＨであり、Ｘ５はＡかＶであり、Ｘ６はＤかＥであり、かつ、Ｘ７はＹかＮである、アミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）３を有する重鎖を含む、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１１】
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）又はＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する重鎖を含む、請求項１０に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１２】
更に、重鎖がＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、及びＲＸ８ＮＰＹＮＧＤＸ９Ｘ１０ＹＸ１１ＱＫＦＸ１２Ｇ（配列番号６６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２を有する、請求項１０又は請求項１１に記載の抗体又はその免疫反応性断片、
ここで、Ｘ８はＮ又はＩであり、Ｘ９はＳ又はＴであり、Ｘ１０はＩ、Ｆ又はＬであり、Ｘ１１はＡ又はＮであり、Ｘ１２はＱ又はＫである。
【請求項１３】
更に、Ｘ１３ＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６９）のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＹＴＳＲＬＸ１４Ｘ１５（配列番号７０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及びＱＱＤＳＫＸ１６ＰＷＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する軽鎖を含む、請求項１２に記載の抗体又はその免疫反応性断片、
ここで、Ｘ１３はＱ又はＲであり、Ｘ１４はＥ又はＨであり、Ｘ１５はＳ又はＴであり、Ｘ１６はＨ又はＮである。
【請求項１４】
ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ  （配列番号１５）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）、ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＥＫＦＱＧ（配列番号６２）、ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＡＥＫＦＱＧ（配列番号６３）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号６４）、及びＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６５）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）又はＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する、請求項１２に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１５】
更に、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）又はＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）又はＹＴＳＲＬＥＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）又はＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する、請求項１４に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１６】
以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれか１つの重鎖ＣＤＲの組み合わせを有する、請求項１４に記載の抗体又はその免疫反応性断片：
（ｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＥＫＦＱＧ（配列番号６２）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｉｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＡＥＫＦＱＧ（配列番号６３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３
（ｉｖ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ  （配列番号１５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｖ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号６４）、のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｖｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；又は、
（ｖｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３。
【請求項１７】
更に、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの軽鎖ＣＤＲの組み合わせを有する、請求項１６に記載の抗体又はその免疫反応性断片：
（ａ）ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｂ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｃ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＥＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｅ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；又は、
（ｆ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＥＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３。
【請求項１８】
以下のいずれかである、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の抗体：
ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；あるいは、
ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１９】
配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨを有する、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項２０】
更に、配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１９に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項２１】
以下の群から選択されるいずれか１つのＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む、請求項２０に記載の抗体又はその免疫反応性断片：
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ。
【請求項２２】
請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項２３】
以下の群から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項２２に記載の核酸分子：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３２に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号５０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号５０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号６０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号５２に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号６０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号２０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２又は請求項２３に記載の核酸分子を有するベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片の製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項２８】
血管新生抑制剤である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
癌、癌転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、又は変形性関節症の治療薬又は予防薬である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生抑制作用を有する受容体活性調節タンパク質２（ＲＡＭＰ２）に対する抗体又はその免疫反応性断片、および、そのようなＲＡＭＰ２に対する抗体又はその免疫反応性断片を有効成分とする血管新生抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アドレノメジュリン（以下、「ＡＭ」という）はヒト褐色細胞腫から同定された５２個のアミノ酸からなるペプチドで主として血管から分泌され血管を拡張させる働きをもつ血管作動性物質として知られている。また、この他にも臓器保護作用、組織再生作用、抗炎症作用などの多彩な作用が報告されている。受容体活性調節タンパク質２（ＲＡＭＰ２）は、１回膜貫通型タンパク質で、７回膜貫通型タンパク質であるカルシトニン受容体様受容体（ＣＲＬＲ）と複合体を形成することでＡＭの共受容体として機能している。その発現は血管内皮細胞に見られ、オートクライン、パラクラインでＡＭを受けることで細胞内ｃＡＭＰが上昇しシグナルを伝達し、血管の恒常性を維持する。【０００３】
ＡＭ−ＲＡＭＰ２／ＣＲＬＲシグナルを阻害することにより、血圧調節などの循環器疾患、さらには血管透過性の調節により炎症や浮腫、血管新生の関わる癌・網膜疾患、臓器移植などの拒絶免疫など、様々な疾患に対して医薬品の可能性が考えられる。このような阻害剤としては、ＡＭ部分配列ペプチド（アンタゴニスト）であるＡＭ３７−５２が報告されている（特許文献１）。ＡＭ３７−５２は、アンタゴニスト活性が弱く、分子量が５ｋＤａ以下と小さいため血中動態が悪く医薬品として開発が困難である。【０００４】
その他、ＲＡＭＰ２に対するポリクローナル抗体やその混合物がこれまでに報告されている（特許文献２、３）が、ＲＡＭＰ２抗体（特にはモノクローナル抗体）単独で血管新生を効果的に抑制するには至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１６／１８３４７９号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１０／０１２９１１号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１２／０２９０２３号
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ＡＭ依存的なＲＡＭＰ２とＣＲＬＲ複合体の活性化を阻害する抗ＲＡＭＰ２抗体、特にはＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の増殖抑制能を有する抗ＲＡＭＰ２抗体を取得するため、ヒトＲＡＭＰ２タンパクをコードするペプチド断片を免疫しポリクローナル抗体を作製した。しかしながら、抗血清由来のポリクローナル抗体にはｃＡＭＰ抑制能は見られなかった。そこで、ＲＡＭＰ２の細胞外ドメインを無細胞合成したタンパクを免疫することにより、抗ＲＡＭＰ２抗体の取得を試みた。抗原として、ＲＡＭＰ２タンパク単体の他、共受容体であるＣＲＬＲとの複合タンパク質を使用した結果、優れたｃＡＭＰ抑制能を有する抗ＲＡＭＰ２抗体が得られた。しかし、これらの抗体はＨＵＶＥＣの増殖を抑制する作用は示さなかった。
【０００７】
そこで、本発明者らは、遺伝子導入した過剰発現細胞を抗原として免疫した。ヒトＲＡＭＰ２遺伝子単独ではＡＭペプチドの受容体としては機能しないため、ＲＡＭＰ２遺伝子をＣＲＬＲ遺伝子とともに共発現させた線維芽細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を作製した。
【０００８】
しかし、ＲＡＭＰ２タンパクは全長１７５アミノ酸（２０ｋＤａ）で、特に細胞外ドメインは１０２アミノ酸（１２ｋＤａ）の小さい分子であり、ヒトＲＡＭＰ２とマウスＲＡＭＰ２の相同性が高く細胞外ドメインの６２％が同一アミノ酸をコードするため、ヒトＲＡＭＰ２の機能ドメインに対して免疫が成立しにくく、通常のラット、ハムスター、又はマウスへの免疫では良質な抗体が取得できなかった。そこで、過剰免疫により自己に対して免疫反応（自己抗体）を生じるＭＲＬ／ｌｐｒマウスを免疫することにより、機能性に優れた抗ＲＡＭＰ２抗体を含む抗ＲＡＭＰ２抗体の取得に成功した。
【０００９】
得られたハイブリドーマから機能性に優れた抗ＲＡＭＰ２抗体をスクリーニングするため、遺伝子導入した過剰発現細胞のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡを実施した。抗原に使用したマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞では細胞自身に対する抗体の結合のため、擬陽性が見られる事から、ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）にヒトＲＡＭＰ２−ＣＲＬＲを遺伝子導入して得られた安定発現細胞（ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１）をＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡに用いた。
【００１０】
Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡで選択された候補抗体について、ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いＡＭ添加による細胞内ｃＡＭＰの上昇を抑制するか否かを指標としてシグナル阻害抗体をスクリーニングした。さらに、選択されたシグナル阻害抗体について生物活性の阻害試験としてＡＭ添加によるＨＵＶＥＣの増殖を阻害できる抗体をスクリーニングし、ｃＡＭＰ阻害作用及びＨＵＶＥＣ増殖抑制作用を有する抗ＲＡＭＰ２抗体を取得することに成功した。
【００１１】
よって、本発明は、ｃＡＭＰ阻害作用及びＨＵＶＥＣ増殖抑制作用を有する抗ＲＡＭＰ２抗体に関し、また当該抗体を有効成分として含有する血管新生抑制剤に関する。
（１）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用を有する、受容体活性調節タンパク質２（ＲＡＭＰ２）に特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片。
（２）  前記血管内皮細胞の増殖抑制作用が、０．５〜５ｎＭのＩＣ５０値である、（１）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（３）  アドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有する、（１）又は（２）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（４）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生試験において、ｃＡＭＰ産生抑制作用が、０．０３〜０．５ｎＭのＩＣ５０値である、（３）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（５）  配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体、及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体から選択されるいずれか１種類の抗体とＲＡＭＰ２への結合において競合する抗体又はその免疫反応性断片、あるいは、
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体、及び配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体から選択されるいずれか１種類の抗体と同じエピトープに結合する抗体又はその免疫反応性断片。
（６）  ＬＸ１ＩＸ２ＤＸ３ＹＸ４ＹＸ５ＭＸ６Ｘ７（配列番号２４）のアミノ酸配列であって、ここで、Ｘ１はＧ又はＭであり、Ｘ２はＦ又はＹであり、Ｘ３はＡ又はＶであり、Ｘ４は存在しないかＨであり、Ｘ５はＡかＶであり、Ｘ６はＤかＥであり、かつ、Ｘ７はＹかＮであるアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）３を有する重鎖を含む抗体又はその免疫反応性断片。
（７）  ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）又はＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する重鎖を含む、（６）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（８）  ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、ＲＸ８ＮＰＹＮＧＤＸ９Ｘ１０ＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び、ＬＸ１ＩＸ２ＤＸ３ＹＸ４ＹＸ５ＭＸ６Ｘ７（配列番号２４）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する重鎖を含む、（６）に記載の抗体又はその免疫反応性断片、
ここで、Ｘ１はＧ又はＭであり、Ｘ２はＦ又はＹであり、Ｘ３はＡ又はＶであり、Ｘ４は存在しないかＨであり、Ｘ５はＡかＶであり、Ｘ６はＤかＥであり、Ｘ７はＹかＮであり、Ｘ８はＮ又はＩであり、Ｘ９はＳ又はＴであり、Ｘ１０はＩ、Ｆ又はＬである。
（９）  更に、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及びＱＱＤＳＫＸ１１ＰＷＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する軽鎖を含む、（８）に記載の抗体又はその免疫反応性断片、
ここで、Ｘ１１はＨ又はＮである。
（１０）  （ｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有するか、
（ｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有するか、又は
（ｉｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する、（６）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（１１）  更に、（ｉ）の場合、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有し、
（ｉｉ）の場合、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有し、
（ｉｉｉ）の場合、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する、（１０）に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
（１２）  以下の群から選択されるいずれか１つの抗体又はその免疫反応性断片である、（１）〜（１１）のいずれか１項に記載の抗体：
ＶＨが、配列番号２に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号４に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；
ＶＨが、配列番号１２に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号１４に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；
ＶＨが、配列番号１９に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号２１に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；
ＶＨが、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；
ＶＨが、配列番号１２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号１４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；及び
ＶＨが、配列番号１９のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号２１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。
（１３）  以下の群から選択されるいずれか１つの抗体又はその免疫反応性断片である（１１）に記載の抗体又はその免疫反応性断片：
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体又はその免疫反応性断片；
配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体又はその免疫反応性断片；及び
配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体又はその免疫反応性断片。
（１４）  （１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
（１５）  配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；又は
配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号２０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチドを含有する、（１４）に記載の核酸分子。
（１６）  （１４）又は（１５）に記載の核酸分子を有するベクター。
（１７）  （１６）に記載のベクターを有する宿主細胞。
（１８）  （１７）の宿主細胞を培養することを含む、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片の製造方法。
（１９）  （１）〜（１３）のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
（２０）  血管新生抑制剤である、（１９）に記載の医薬組成物。
（２１）  癌、癌転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、又は変形性関節症の治療薬又は予防薬である、（１９）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、細胞表面に発現したＲＡＭＰ２に結合して単独で血管内皮細胞の増殖を抑制することができることから、新規なメカニズムに基づく血管新生抑制剤、及び血管新生が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療薬又は予防薬を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いて、ＡＭ添加時のｃＡＭＰ産生に対する各種抗ＲＡＭＰ２抗体（１０ｎＭ）の抑制効果を表すグラフである。縦軸は、ＡＭ添加／抗体非投与（コントロール）のｃＡＭＰ量（１００％）に対する、各群のｃＡＭＰ量の割合（％）を示す。横軸は、ＡＭ及び抗体の添加の有無、及び添加した抗体を示す。
【図２】ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いて、各種濃度の２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体のＡＭ添加によるｃＡＭＰ産生の抑制能を測定した結果を表すグラフである。縦軸は、抗体非添加時のｃＡＭＰ量（１００％）に対する、各抗体投与時のｃＡＭＰ量の割合（％）を示す。横軸は、抗体濃度（ｎＭ）を示す。
【図３】ＡＭ添加によるＨＵＶＥＣ増殖に対する、各種抗ＲＡＭＰ２抗体（１０ｎＭ）の抑制作用を示すグラフである。縦軸は、ＡＭ添加／抗体非投与（コントロール）のＨＵＶＥＣ細胞数（１００％）に対する、各群のＨＵＶＥＣ細胞数の割合（％）を示す。横軸は、ＡＭ及び抗体の添加の有無、及び添加した抗体を示す。
【図４】ＨＵＶＥＣを用いて、各種濃度の２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体のＡＭ添加による増殖の抑制能を測定した結果を表すグラフである。縦軸は、抗体非添加時のＨＵＶＥＣ細胞数（１００％）に対する、各抗体投与時のＨＵＶＥＣ細胞数の割合（％）を示す。横軸は、抗体濃度（ｎＭ）を示す。
【図５】２５Ｈ４−４Ｆ９抗体のＶＨ（配列番号２）及び軽鎖可変領域（配列番号４）、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体のＶＨ（配列番号１２）及び軽鎖可変領域（配列番号１４）、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体のＶＨ（配列番号１９）及び軽鎖可変領域（配列番号２１）のアミノ酸配列、及びそれらに含まれるＣＤＲ部分を示す。
【図６】取得した抗体が抗ＲＡＭＰ２特異的である事をＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによって確認した結果を示すグラフである。横軸は、使用した抗体を示す。ドットの白抜きバーはヒトＣＲＬＲ単独の発現細胞を用いた結果を示し、黒色のバーはヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現させた細胞（ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１）を示す。縦軸は、これら発現細胞への各抗体の結合量（ＯＤ４５０）を示す。
【図７】実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９（黒四角）、８５Ｈ７−２Ｂ１１（黒丸）、及び３３Ｈ４−１Ｇ３（黒三角）、並びに、市販の抗ＲＡＭＰ２抗体である、４Ｅ５（白丸）、２Ｆ５（白四角）、及びＢ５（白三角）を用いて、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによる細胞膜表面タンパクに対する結合親和性を解析した結果を示すグラフである。縦軸は結合割合（％）、横軸は抗体濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を表す。各抗体について、結合割合が５０％となる抗体濃度をグラフから求めてＥＣ５０値とした。
【図８】実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、及び３３Ｈ４−１Ｇ３、並びに、市販の抗ＲＡＭＰ２抗体である、４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５を被検抗体として、細胞膜表面上の抗原に対する結合をＦＡＣＳで解析した結果を表すグラフである。各グラフの上部に使用した各被検抗体名を示す。各グラフの縦軸は細胞数（×１０３細胞）、横軸は細胞に結合したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ標識二次抗体の蛍光強度を示す。グラフ中、左側に位置するピークはコントロール（各被検抗体非存在下）を示し、右側に位置するピークは各被検抗体存在下を表す。
【図９】実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９（黒三角）、８５Ｈ７−２Ｂ１１（黒丸）、及び３３Ｈ４−１Ｇ３（黒四角）、並びに市販抗体４Ｅ５（白丸）の細胞表面上の抗原への結合がビオチン化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体と競合するか否かをＦＡＣＳにより解析した結果を示すグラフである。縦軸は細胞に結合したビオチン化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体と結合した蛍光標識の蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）、横軸は使用した各抗体の濃度（μｇ／ｍＬ）を表す。標識化抗体と同じ抗体で競合させた８５Ｈ７−２Ｂ１１（黒丸）の結果は、結合が競合していることを示す。
【図１０】２５Ｈ４−４Ｆ９抗体の配列を基にデザインされたヒト化抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ）及び軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ）の可変領域の配列を示す。２５Ｈ４−４Ｆ９抗体のＶＨの配列ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｈ（配列番号２）を基に、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｈ１（配列番号２７）、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｈ２（配列番号２９）、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｈ３（配列番号３１）、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｈ４（配列番号３３）、及びｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｈ５（配列番号３５）をデザインした。また、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体のＶＬの配列ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｋ（配列番号４）を基に、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｋ１（配列番号３７）、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｋ２（配列番号３９）、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｋ３（配列番号４１）、及びｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖｋ４（配列番号４３）をデザインした。下線部は各ＣＤＲ配列を示す。
【図１１】８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体の配列を基にデザインされたヒト化抗体の重鎖（Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ）及び軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ）の可変領域の配列を示す。８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体のＶＨの配列ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｈ（配列番号１２）を基に、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｈ１（配列番号４５）、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｈ２（配列番号４７）、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｈ３（配列番号４９）、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｈ４（配列番号５１）、及びｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｈ５（配列番号５３）をデザインした。また、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体のＶＬの配列ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｋ（配列番号１４）を基に、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｋ１（配列番号５５）、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｋ２（配列番号５７）、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｋ３（配列番号５９）、及びｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖｋ４（配列番号６１）をデザインした。下線部は各ＣＤＲ配列を示す。
【図１２】ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いて、１６．７ｎＭのヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体（２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６、及び２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８）のＡＭ添加によるｃＡＭＰ産生の抑制能を測定した結果を表すグラフである。縦軸は、抗体非添加時のｃＡＭＰ量（１００％）に対する、各抗体投与時のｃＡＭＰ量の割合（％）を示す。横軸は、ＡＭ添加の有無及び使用した抗体を示す。
【図１３】ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いて、１６．７ｎＭのヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体（８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７、及び８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８）のＡＭ添加によるｃＡＭＰ産生の抑制能を測定した結果を表すグラフである。縦軸は、抗体非添加時のｃＡＭＰ量（１００％）に対する、各抗体投与時のｃＡＭＰ量の割合（％）を示す。横軸は、ＡＭ添加の有無及び使用した抗体を示す。
【図１４】ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いて、各種濃度のヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体（２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６、及び２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８）（上図）、及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体（８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７、及び８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８）（下図）のＡＭ添加によるｃＡＭＰ産生の抑制能を測定した結果を表すグラフである。各グラフにおいて縦軸は、抗体非添加時のｃＡＭＰ量（１００％）に対する、各抗体投与時のｃＡＭＰ量の割合（％）を示す。横軸は、抗体濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を示す。凡例と共に、各抗体のＩＣ５０値（グラフにおいてｃＡＭＰを５０％阻害する濃度）を示す。
【図１５】ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体（２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６、及び２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８）（上図）、及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体（８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７、及び８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８）（下図）を６．７ｎＭ用いて、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡを行い、細胞膜表面タンパクに対する結合親和性を解析した結果を示すグラフである。縦軸は結合割合（ＯＤ４５０％）、横軸は用いた抗体を表す。
【図１６】ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体（２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６、及び２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８）（上図）、及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体（８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７、及び８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８）（下図）を用いて、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによる細胞膜表面タンパクに対する結合親和性を解析した結果を示すグラフである。縦軸は結合割合（％）、横軸は抗体濃度（ｎＭ）のｌｏｇ値を表す。各抗体について、結合割合が５０％となる抗体濃度をグラフから求めてＥＣ５０値とした。凡例と共に、各抗体のＥＣ５０値（ｎＭ）を示す。
【図１７】抗体のエピトープを解析した結果を表すグラフである。縦軸は結合した抗体量をＯＤ４５０（二次抗体の発色強度）で表す。横軸は結合に用いたＲＡＭＰ２の細胞外領域に由来する各ペプチドを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（抗体又はその免疫反応性断片）
本発明の抗体は、ＲＡＭＰ２と特異的に結合する。特には、本発明の抗体は細胞膜又は細胞表面上に発現したＲＡＭＰ２と特異的に結合する。本明細書において、抗体又はその免疫反応性断片が「特異的に」認識する（結合する）とは、その抗体又はその免疫反応性断片が他のタンパク質やペプチドに対する親和性よりも、ＲＡＭＰ２に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性で結合する」とは、所望の測定装置または方法によって、目的とする特定のタンパク質やペプチドを他のタンパク質やペプチドから区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば、実質的に高い親和性は、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡにより検出された強度（例えば、蛍光強度）として、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、１００倍以上であることを意味していてもよい。
【００１５】
本発明の抗体とＲＡＭＰ２との結合における結合速度定数（Ｋａ１）としては、例えば、１×１０４Ｍｓ−１以上、１×１０５Ｍｓ−１以上、５×１０５Ｍｓ−１以上を挙げることができる。また、本発明の抗体とＲＡＭＰ２との結合における解離速度定数（Ｋｄ１）としては、例えば、１×１０−３以下、１×１０−４以下を挙げられる。本発明の抗体とＲＡＭＰ２との結合における結合定数（ＫＤ）としては、例えば、１×１０−８（Ｍ）以下、５×１０−８（Ｍ）以下、１×１０−９（Ｍ）以下、５×１０−９（Ｍ）以下であり得る。本明細書における抗体の結合速度定数（Ｋａ１）、解離速度定数（Ｋｄ１）、及び結合定数（ＫＤ）はＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ−Ｘ１００）を用いて、製造者提供のマニュアルに従い、ＳＡチップにビオチン化ＲＡＭＰ２を固定後、被検抗体を流し、結合速度定数Ｋａ１、解離速度定数Ｋｄ１を測定し、ｂｉｖａｌｅｎｔフィッティングを用いて結合定数ＫＤ値を決定することができる。
【００１６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。本発明において、「モノクローナル抗体」は、単一な抗原決定基と反応する、構造がほぼ均一な抗体である。更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウス、ラット又はウサギの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体を挙げることができる。上記において、「キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であってＲＡＭＰ２と特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０１２５０２３参照）である。「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であってＲＡＭＰ２と特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３）またはＣｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７）のいずれの定義によるものであってもよい。「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことであり、例えば、ヒトの抗体産生に関与する遺伝子を導入したトランスジェニック動物を用いて作製したモノクローナル抗体（欧州特許公開公報ＥＰ０５４６０７３参照）等を挙げることができる。例えば、本発明の抗体を治療、予防、又は体内に投与することにより用いる診断に使用する場合には、本発明の抗体として好ましくは、ヒト・非ヒト動物のキメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体である。また、好ましくは本発明の抗体は天然に存在しない抗体である。
【００１７】
本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラス（アイソタイプ）であってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体がＩｇＧの場合、いずれのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であってもよい。また、本発明の抗体は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性抗体）、トリスペシフィック（三重特異性抗体）（例えば、ＷＯ１９９１／００３４９３号）、又はマルチスペシフィック（多重特異性抗体）であってもよい。
【００１８】
抗体はその可変領域（特には、ＣＤＲｓ）が結合特性を付与していることが知られており、完全抗体でない抗体断片であってもその結合特性を利用可能であることが当業者に広く知られている。本明細書において、「免疫反応性断片」とは、抗体の一部分（部分断片）を含むタンパク質又はペプチドであって、抗体の抗原への作用（免疫反応性・結合性）を保持するタンパク質又はペプチドを意味する。このような免疫反応性断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくは（ｓｃＦｖ−ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２９（１）：５−６  （２０１１）；Ｍａｎｅｅｓｈ  Ｊａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２５（７）（２００７）：３０７−３１６；及び、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈ  ｓｔｅｉｎら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１）：８８−１２３（２０１２）参照）。本明細書において、免疫反応性断片は、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性）、トリスペシフィック（三重特異性）、及びマルチスペシフィック（多重特異性）のいずれであってもよい。本明細書において、特にそのように解釈することが不整合である場合を除き、「抗体」の語は抗体の免疫反応性断片をも含むことを意図している。
【００１９】
一態様において、本発明は、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８抗体、又は３３Ｈ４−１Ｇ３抗体に関する。これらの抗体はそれぞれ、表２に示された配列番号に記載のアミノ酸配列からなる重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を有する。
【００２０】
一態様において、本発明の抗体は、細胞表面上のＲＡＭＰ２内の細胞外領域の立体構造を特異的に認識する。例えば、本発明の抗体は、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８抗体、又は３３Ｈ４−１Ｇ３抗体が結合する、細胞表面上のＲＡＭＰ２内に存在し得るエピトープを特異的に認識する。
【００２１】
また、本発明の抗体は、ＲＡＭＰ２の細胞外領域を構成するアミノ酸配列の一次構造をエピトープとして認識しない。ここで、アミノ酸配列の一次構造をエピトープとして認識しないとは、ホールディングされていない（立体構造を形成していない）直鎖状の当該アミノ酸配列からなるペプチド又はタンパク質とは結合しないことを意味する。より具体的には、本発明の抗体は、ＲＡＭＰ２の細胞外領域を構成するアミノ酸配列である、配列番号７１〜１０１に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドにいずれとも結合しない。
【００２２】
本明細書において、被検抗体が、目的のエピトープ（例えば、上述の特定の抗体が結合するエピトープ）、抗原、又はペプチドと「特異的に結合する（認識する）」か否かは、当該エピトープを有するペプチド若しくはタンパク質、当該抗原、又は当該ペプチドへの当該抗体の結合と、その他のペプチド、タンパク質又はその他の抗原への当該抗体の結合を調べることにより判定することができる。特に、本発明の抗体は、細胞表面上のＲＡＭＰ２内の細胞外領域の立体構造を特異的に認識することから、前記方法における当該エピトープを有するタンパク質として、細胞表面上に発現させたＲＡＭＰ２を用いることにより結合特異性を判定することができる。目的のエピトープを有するペプチド若しくはタンパク質、目的の抗原、又は目的のペプチドと結合し、その他のペプチド、タンパク質、又はその他の抗原と結合しない場合、当該被検抗体は目的のエピトープ、抗原、又はペプチドと特異的に結合する（認識する）と判定される。
【００２３】
また、本明細書において、被検抗体が、特定のペプチド又はタンパク質と結合しないことは、当該ペプチド若しくはタンパク質への当該抗体の結合を調べることにより判定することができる。
【００２４】
別の態様において、本発明の抗体は、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８抗体、又は３３Ｈ４−１Ｇ３抗体（本段落において、「２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等」という）と、ＲＡＭＰ２（特には、細胞表面上のＲＡＭＰ２）への結合において競合する。被検抗体が、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等と、ＲＡＭＰ２への結合において競合するか否かは、標識化された２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等を被検抗体と共に抗原（ＲＡＭＰ２）に接触させることにより決定することができる。好ましくは、コントロールとして、被検抗体非存在下で標識化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等を単独で抗原（ＲＡＭＰ２）に接触させたものを用いることができる。抗原に結合した標識化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等の標識量を比較して、被検抗体と同時に抗原に接触させた場合の標識化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等の抗原への結合量が被検抗体非存在下で抗原に接触させた場合の標識化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等の抗原への結合量よりも少ない場合には、当該被検抗体は用いた２５Ｈ４−４Ｆ９抗体等と競合すると決定することができる。
【００２５】
抗体とタンパク質又はペプチドとの結合の測定方法は、例えば、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＦＡＣＳ法、共免疫沈降法、プルダウンアッセイ法、ファーウェスタンブロッティング法、ホモバイファンクショナルクロスリンカー若しくはヘテロバイファンクショナルクロスリンカーを利用するクロスリンク法、ラベル転移反応法、相互作用マッピング法、表面プラズモン共鳴法、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）法、ＢＩＡＣＯＲＥ法、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）やＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）などのＡｌｐｈａＰＰＩアッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）など、多様な方法が本技術分野において周知であり、目的とする結合の検出に応じて適宜好ましい方法を採用することができる。
【００２６】
一態様において、本発明は、ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片に関する。本明細書において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば、ハイブリダイズの条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。好ましくは、本発明は、ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，又は５３に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、それぞれ順に、ＶＬが配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，又は６１に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片である。
【００２７】
また、本発明は、ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片に関する。アミノ酸配列の同一性は、２種類のタンパク質間において，比較対象とするアミノ酸配列範囲における種類が同一なアミノ酸数の割合（％）を意味し、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。本発明の抗体としては、例えば、ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片であってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、それぞれ順に、ＶＬが、配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片である。
【００２８】
好ましくは、本発明は、本明細書の表２に記載の配列番号に記載された重鎖（ＶＣ）と軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列、又はＶＨとＶＬのアミノ酸配列、又はＣＤＲＨ１〜３とＣＤＲＬ１〜３のアミノ酸配列の組み合わせを有する抗体である。
【００２９】
上述のＶＨ及びＶＬが、特定のアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片、並びに、ＶＨ及びＶＬが、特定のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片は、好ましくは、以下に記載されたＣＤＲＨｓ及びＣＤＲＬｓを有する。
【００３０】
一態様において、本発明は、ＬＸ１ＩＸ２ＤＸ３ＹＸ４ＹＸ５ＭＸ６Ｘ７（配列番号２４）のアミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）３を有する重鎖を含む抗体又はその免疫反応性断片に関する。ここで、Ｘ１はＧ又はＭであり、Ｘ２はＦ又はＹであり、Ｘ３はＡ又はＶであり、Ｘ４は存在しないかＨであり、Ｘ５はＡかＶであり、Ｘ６はＤかＥであり、Ｘ７はＹかＮである。好ましくは、本発明はＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）又はＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する重鎖を含む抗体又はその免疫反応性断片である。抗体において、ＣＤＲＨ３がその特異性決定において重要であることは既に知られている（Ｘｕ  ＪＬら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２０００  Ｊｕｌ；１３（１）：３７−４５．）。ＣＤＲＨ３は、好ましくは、ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）又はＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列を有する。
【００３１】
好ましくは、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１を有する。
また、好ましくは、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、ＲＸ８ＮＰＹＮＧＤＸ９Ｘ１０ＹＸ１１ＱＫＦＸ１２Ｇ（配列番号６６）又はＲＸ８ＮＰＹＮＧＤＸ９Ｘ１０ＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２を有する。ここで、Ｘ８はＮ又はＩであり、Ｘ９はＳ又はＴであり、Ｘ１０はＩ、Ｆ又はＬであり、Ｘ１１はＡ又はＮであり、Ｘ１２はＱ又はＫである。ＣＤＲＨ２は、好ましくは、ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ  （配列番号１５）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）、ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＥＫＦＱＧ（配列番号６２）、ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＡＥＫＦＱＧ（配列番号６３）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号６４）、又はＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６５）のアミノ酸配列を有する。
【００３２】
更に好ましくは、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、Ｘ１３ＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６９）のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１を有する。ここで、Ｘ１３はＱ又はＲである。ＣＤＲＬ１は、好ましくは、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）又はＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列を有する。
【００３３】
また、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、ＹＴＳＲＬＸ１４Ｘ１５（配列番号７０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２を有する。ここで、Ｘ１４はＥ又はＨであり、Ｘ１５はＳ又はＴである。ＣＤＲＬ２は、好ましくは、ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）又はＹＴＳＲＬＥＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列を有する。
【００３４】
また、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、及びＱＱＤＳＫＸ１６ＰＷＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する。ここで、Ｘ１６はＨ又はＮである。ＣＤＲＬ３は、好ましくはＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）又はＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列を有する。
【００３５】
一例において、本発明の抗体は以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれか１つの重鎖ＣＤＲの組み合わせを有する：
（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６２のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｉｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６３のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｉｖ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｖ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６４のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｖｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号６５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；又は、
（ｖｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３。
【００３６】
更に、本発明の抗体は、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの軽鎖ＣＤＲの組み合わせを有していてもよい：
（ａ）配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｂ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｃ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１０のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｅ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号９のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；又は、
（ｆ）配列番号６７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号６８のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３。
【００３７】
例えば、本発明は、以下のＣＤＲの組み合わせを有する抗体又はその免疫反応性断片を含む：
【００３８】
【表１】
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【００３９】
本明細書において、アミノ酸は一文字表記で表される。具体的には、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｒはアルギニン、Ｋはリシン、Ｎはアスパラギン、Ｍはメチオニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｃはシステイン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｔはトレオニン、Ｇはグリシン、Ｗはトリプトファン、Ｈはヒスチジン、Ｙはチロシン、Ｉはイソロイシン、Ｖはバリンを表す。
【００４０】
本発明の抗体及びその免疫反応性断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用を有する。被検抗体又はその免疫反応性断片がｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用を有するか否かは、適切な培地中で数時間程度前培養した血管内皮細胞に被検抗体又はその免疫反応性断片を添加し、ＡＭを終濃度５０〜２００ｎＭとなるように添加して、２〜７日培養した後における血管内皮細胞の増殖を観察することにより行うことができる。血管内皮細胞の増殖は、細胞数をカウントしてもよいし、細胞数の指標となるＯＤ４５０等を測定してもよい。被検抗体又はその免疫反応性断片を添加せずに培養した血管内皮細胞数と比較して、被検抗体又はその免疫反応性断片の存在下で培養した血管内皮細胞数が少ない場合、当該被検抗体又はその免疫反応性断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用を有すると判定される。また、被検抗体又はその免疫反応性断片を添加せずに培養した血管内皮細胞数を１００として、被検抗体又はその免疫反応性断片の存在下で培養した血管内皮細胞数が５０となる、被検抗体又はその免疫反応性断片の濃度をＩＣ５０値（Ｍ）として求めてもよい。例えば、本発明の抗体は、ＩＣ５０値が３５ｎＭ以下、３０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、４ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２ｎＭ以下、若しくは１．６ｎＭ以下であってもよい。ＩＣ５０値の下限値は特に定められる必要はないが、例えば、０．１ｎＭ以上、０．２ｎＭ以上、０．３ｎＭ以上、０．４ｎＭ以上、０．５ｎＭ以上、０．６ｎＭ以上、０．７ｎＭ以上、若しくは０．８ｎＭ以上であってもよい。また、ＩＣ５０値としては、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせの範囲であってもよく、例えば、０．１〜３５ｎＭ、０．８〜３２．７ｎＭ、０．２〜３０ｎＭ、０．３〜２５ｎＭ、０．４〜２０ｎＭ、０．５〜１５ｎＭ、０．５〜１０ｎＭ、０．５〜５ｎＭ、０．８〜１．６ｎＭであってもよい。また、これらのＩＣ５０値の場合、当該被検抗体又はその免疫反応性断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用を有すると判定してもよい。
【００４１】
好ましくは、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用に加えて、アドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有する。被検抗体又はその免疫反応性断片がアドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有するか否かは、アドレノメジュリン添加によりｃＡＭＰを産生する動物細胞（例えば、ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞）を適切な培地で一晩培養し、被検抗体又はその免疫反応性断片を添加し、終濃度５０〜３００ｐＭのＡＭを添加し、ｃＡＭＰを測定することにより決定することができる。ｃＡＭＰは、市販のキット（例えば、ＬＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａ  ｃＡＭＰ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社）など）を用いて測定することができる。抗体非添加の細胞によるｃＡＭＰ産生と比較して、被検抗体又はその免疫反応性断片添加の細胞によるｃＡＭＰ産生が少ない場合、当該抗体又はその免疫反応性断片は、アドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有すると判定される。また、被検抗体又はその免疫反応性断片を添加せずに培養した細胞が産生するｃＡＭＰを１００として、被検抗体又はその免疫反応性断片の存在下で培養した細胞が産生するｃＡＭＰが５０となる、被検抗体又はその免疫反応性断片の濃度をＩＣ５０値（Ｍ）として求めてもよい。例えば、本発明の抗体は、ＩＣ５０値が、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．４ｎＭ以下、０．３ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、若しくは０．１５ｎＭ以下であってもよい。ＩＣ５０値の下限値は特に定められる必要はないが、例えば、０．０１ｎＭ以上、０．０２ｎＭ以上、若しくは０．０３ｎＭ以上であってもよい。また、ＩＣ５０値としては、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせの範囲であってもよく、例えば、０．０１〜２ｎＭ、０．０１〜１．５ｎＭ、０．０１〜１ｎＭ、０．０１〜０．５ｎＭ、０．０３〜１．３５ｎＭ、又は０．０３〜０．１５ｎＭであってもよい。また、これらのＩＣ５０値の場合、当該被検抗体又はその免疫反応性断片は、アドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有すると判定してもよい。
【００４２】
好ましくは、本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞に結合する。本明細書において、「ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞」は、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を細胞遺伝子導入して得られた安定発現細胞であって、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞あれば特に限定されるものではないが、好ましくは、ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）又はＮＩＨ３Ｔ３細胞にヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を遺伝子導入して得られた安定発現細胞株（ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１又はｈＣＲ２−ＮＩＨ３Ｔ３）である。ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞は、ヒトＣＲＬＲ（ＮＭ＿００５７９５）及びヒトＲＡＭＰ２（ＮＭ＿００５８５４）を遺伝子導入用のベクターにタンデムに組み込み、目的の細胞に遺伝子導入することにより得ることができる。安定発現株は、予めベクターに挿入されていた薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤存在下で選択培養することにより得ることができる。
【００４３】
例えば、本発明の抗体は、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞を用いたＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ試験による結合親和性（ＥＣ５０）が３．５ｎＭ以下であってもよい。例えば、被検抗体のイムノグロブリンクラスがＩｇＧの場合、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ試験は、以下の方法により行うことができる。適切な培地中のヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞を１×１０３〜１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ培養プレートに添加して一晩培養した後、４％パラホルムアルデヒド溶液を添加して４℃で数十分間静置することにより細胞を固定し、洗浄した後１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間以上のブロッキング処理を行う。精製した各被検抗体を適宜段階希釈して添加し、二次抗体として標識化抗ＩｇＧ抗体を反応させ、当該標識に合致する試薬を反応させて、標識による発光強度や発色強度を測定することにより結合量を決定することができる。ＥＣ５０値は最大結合量の５０％と結合する抗体濃度として求めることができる。例えば、本発明の抗体は、ＥＣ５０値が、４ｎＭ以下、３．５ｎＭ以下、３．１９ｎＭ以下、３ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、２ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、若しくは０．５ｎＭ以下であってもよい。ＥＣ５０値の下限値は特に定められる必要はないが、例えば、０．０１ｎＭ以上、０．０３ｎＭ以上、０．０５ｎＭ以上、若しくは０．１４ｎＭ以上であってもよい。また、ＥＣ５０値としては、これらの上限値及び下限値の任意の組み合わせの範囲であってもよく、例えば、０．０１〜４ｎＭ、０．０３〜３ｎＭ、０．０５〜２ｎＭ、又は０．１４〜３．１９ｎＭであってもよい。また、これらのＥＣ５０値の場合、当該被検抗体又はその免疫反応性断片は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞に結合すると判定してもよい。
【００４４】
（核酸分子）
別の態様において、本発明は、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子に関する。具体的には、本発明の核酸分子は、ＶＨとして、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを有し、かつ、ＶＬとして配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子であってもよい。例えば、本発明の核酸分子は、ＶＨとして配列番号２及びＶＬとして配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号２７及びＶＬとして配列番号３７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号２９及びＶＬとして配列番号３７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号２９及びＶＬとして配列番号３９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号３１及びＶＬとして配列番号３９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号３１及びＶＬとして配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号３３及びＶＬとして配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号３５及びＶＬとして配列番号４３に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号１２及びＶＬとして配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号４５及びＶＬとして配列番号５５に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号１２及びＶＬとして配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号４７及びＶＬとして配列番号５５に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号４７及びＶＬとして配列番号５７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号４９及びＶＬとして配列番号５７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号４９及びＶＬとして配列番号５９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号５１及びＶＬとして配列番号５９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号５１及びＶＬとして配列番号６１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；ＶＨとして配列番号５３及びＶＬとして配列番号６１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子；並びに、ＶＨとして配列番号１９及びＶＬとして配列番号２１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを有する核酸分子であってもよい。
【００４５】
例えば、本発明の核酸分子は、以下の配列を有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい：配列番号１に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列；配列番号２６に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号３６に記載のヌクレオチド配列；配列番号２８に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号３６に記載のヌクレオチド配列；配列番号２８に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号３８に記載のヌクレオチド配列；配列番号３０に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号３８に記載のヌクレオチド配列；配列番号３０に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号４０に記載のヌクレオチド配列；配列番号３２に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号４０に記載のヌクレオチド配列；配列番号３４に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号４２に記載のヌクレオチド配列；配列番号１１に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号１３に記載のヌクレオチド配列；配列番号４４に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号５４に記載のヌクレオチド配列；配列番号４６に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号５４に記載のヌクレオチド配列；配列番号４６に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号５６に記載のヌクレオチド配列；配列番号４８に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号５６に記載のヌクレオチド配列；配列番号４８に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号５８に記載のヌクレオチド配列；配列番号５０に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号５８に記載のヌクレオチド配列；配列番号５０に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号６０に記載のヌクレオチド配列；配列番号５２に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号６０に記載のヌクレオチド配列；又は配列番号１８に記載のヌクレオチド配列、及び配列番号２０に記載のヌクレオチド配列。
【００４６】
更に、本発明は、前記核酸分子を有するベクターを包含する。このようなベクターとしては、抗体の発現に利用可能なベクターであれば特に制限されるものではなく、適切なウイルスベクター又はプラスミドベクターなどを使用する宿主に応じて選択することができる。別の態様において、本発明は、前記ベクターを含有する宿主細胞に関する。宿主細胞としては、抗体の発現に利用可能な宿主細胞であれば特に制限されるものではなく、哺乳類細胞（マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ヒト細胞など）、酵母、微生物（大腸菌など）を挙げることができる。
【００４７】
また、別の態様において、本発明は、上述の本発明の抗体又はその免疫反応性断片を有効成分として含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物の対象疾患は、血管新生が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害であり、例えば、癌、癌転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、又は変形性関節症を挙げることができる。よって、本発明の医薬組成物は、これらの疾患又は障害の予防薬、治療薬、進行抑制剤又は改善薬とすることができる。あるいは、本発明は、前記医薬組成物を製造するための、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用に関する。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、患者に投与することができる製剤であれば経口又は非経口のいかなる製剤を採用してもよい。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤、貼布剤、軟膏等を挙げることができる。好ましくは、注射剤である。本発明の医薬組成物の剤形は、例えば、液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合、必要に応じて、プロピレングリコール、エチレンジアミン等の溶解補助剤、リン酸塩等の緩衝材、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を加えることができる。また、本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。
【００４９】
（抗体の取得）
本発明の抗体は、ヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ２を発現している細胞を免疫原として、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、免疫反応を生じる非ヒト動物を免疫することにより作製することができる。免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ラビット、イヌ、サル、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスまたはラットであり、より好ましくはマウスであり、最も好ましくはＭＲＬ／ｌｐｒマウスである。免疫原となる細胞は、目的とする抗原以外への抗体産生を抑制するため、免疫動物と同種の細胞であることが望ましい。動物への免疫原の投与は、例えば、１×１０６ｃｅｌｌｓを１回または適当な間隔をあけて数回（通常１〜６週毎に１回の免疫を合計２〜１０回程度）、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射により行うことができる。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩または尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
【００５０】
モノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６）を挙げることができる。使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができる。使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５，１９７５）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６，２９２，１９７６）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１，１，１９７８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４８，１９７９）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９，１９７８）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３５，１，１９８０）、ＳＰ２ａｂ等を挙げることができ、好ましくは、抗体産生細胞と同種動物由来の細胞であり、より好ましくは、抗体産生細胞と同系統の動物由来の細胞である。
【００５１】
培養後、培養上清を採取し、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞（例えば、ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞）を用いたＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにより、ＲＡＭＰ２に結合するクローンを選択する。選択されたクローンについて、限界希釈法を１〜５回繰り返すことにより単一細胞化を行い、当該単一細胞化されたクローンが産生する抗体のうち、更に、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡで選択された候補抗体を、ＡＭ添加によるヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞（例えば、ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞）の細胞内ｃＡＭＰの上昇を抑制するか否かを指標としてシグナル阻害抗体をスクリーニングする。選択されたシグナル阻害抗体について生物活性の阻害試験としてＡＭ添加によるＨＵＶＥＣの増殖を阻害できる抗体をスクリーニングし、ｃＡＭＰ阻害作用及びＨＵＶＥＣ増殖抑制作用を有する抗ＲＡＭＰ２抗体を取得することができる。
【００５２】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィ等のカラムクロマトグラフィ、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。アフィニティークロマトグラフィに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。更に、抗体のクラスによらず、ＲＡＭＰ２（又はヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ２）固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィ、疎水相互作用クロマトグラフィ等を用いることもできる。
【００５３】
あるいは、例えば、抗体ファージライブラリーを利用することによりＲＡＭＰ２に結合する抗体を得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７））。抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、ヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ２を発現している細胞を固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。
【００５４】
あるいは、本明細書記載のアミノ酸配列を参照して、目的の抗体又はその免疫反応性断片のアミノ酸配列をデザインし、当該デザインされたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製して、発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得た抗体から、上述の方法に従ってＲＡＭＰ２への特異性が高い抗体をスクリーニングすることにより得ることができる。
【００５５】
（ヒト型キメラ抗体作製）
本発明の抗体がヒト型キメラ抗体の場合、ＲＡＭＰ２を特異的に認識する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５，１９８４）。
【００５６】
（ヒト化抗体作製）
本発明の抗体がヒト化抗体の場合は、ＲＡＭＰ２を特異的に認識する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｒｅｇｉｏｎ（ＦＲ）に移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，４，７７３−７８３，１９９１；Ｃｌａｒｋ  Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７−４０２，２０００参照）。非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。また、ヒト化抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域（以下、「Ｖ領域」という）がＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と同一性が高いヒト抗体ＦＲである。ヒト化抗体において、ヒト抗体に由来するＦＲを構成するアミノ酸の一部（特には、立体的にＣＤＲと近接した位置に存在するアミノ酸）は、必要に応じてＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲ配列に置換されていてもよい（Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５５８５０８９号参照）。使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。
【００５７】
（ヒト抗体）
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６−１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、ヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ２を発現している細胞を固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の本発明の抗体作製方法に準じて抗原（好ましくは、ヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ２を発現している細胞）を免疫することにより、ＲＡＭＰ２を特異的に認識するヒト抗体を得ることができる。
【００５８】
（核酸、ベクター、宿主細胞）
本発明の核酸は、上述において得られた抗体を産生するハイブリドーマからクローニングするか、あるいは、上述において得られた抗体またはその免疫反応性断片のアミノ酸配列を基に、適宜核酸配列を設計することにより得ることができる。本発明のベクターは、得られた核酸を適宜発現に適したベクターに組み込むことにより得ることができる。本発明のベクターは、本発明の核酸の他、発現に必要な領域（プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）を含んでいてもよい。また、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターを適切な細胞株（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、大腸菌等の微生物）に導入することにより得ることができる。
【００５９】
（医薬組成物（治療薬、予防薬）及び治療方法）
本発明の抗体又はその免疫反応性断片は、必要により精製した後、常法に従って製剤化することにより、医薬組成物として用いることができる。また、本発明は、医薬組成物を製造するための、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の使用を含む。あるいは、本発明は、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の、血管新生が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療若しくは予防のための使用を含む。更に、本発明は、本発明の抗体又はその免疫反応性断片の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含む、血管新生が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療方法若しくは予防方法に関する。
【００６０】
例えば、本発明の医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）は、注射剤として利用することができ、静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、硝子体内注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体等を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、その他の補助薬を含む等張液等が用いることができ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕等を添加することができる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などを用いることができ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を添加することができる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、バイアル、シリンジに充填される。また、本発明の抗体又はその免疫反応性断片に適当な賦形剤を添加することにより、凍結乾燥製剤を調製し、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。なお、一般的に抗体などのタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため困難とされるが、抗体断片や修飾した抗体断片と剤形の創意工夫により、経口投与の可能性もある。経口投与の製剤としては、例えば、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤等を挙げることができる。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ）が例示され、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、５〜１００ｍｇ、１０〜２５０ｍｇの本発明の抗体又はその免疫反応性断片を含有していても良い。
【００６２】
本発明の抗体や医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、上述のとおり非経口的又は経口的に投与される。非経口的投与経路としては、眼内、皮下、腹腔内、血中（静脈内、若しくは動脈内）又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ、好ましくは、眼内又は血中への投与である。本発明の医薬組成物（治療薬若しくは予防薬）は、一時的に投与してもよいし、持続的又は断続的に投与してもよい。例えば、投与は、１分間〜２週間の持続投与することもできる。また、本発明の抗体は、単独で投与されてもよいし、他の薬剤と共に併用により投与されてもよい。あるいは、本発明の抗体は当該他の薬剤が結合した抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）であってもよい。他の薬剤としては、血管新生が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害への治療効果が知られている薬剤などを用いることができる。
【００６３】
本発明の医薬組成物の投与量は、所望の治療効果又は予防効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、血管新生が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の治療効果又は予防効果を指標として決定することができる。例えば、血管新生が発症又は増悪化に寄与する疾患又は障害の患者の予防および／または治療のために使用する場合には、本発明の医薬組成物の有効成分の１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１月１〜１０回程度、好ましくは１月１〜５回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数を増加させてもよい。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、本願は日本国特許出願第２０１７−１７５３１１号からの優先権を主張する。本願が優先権を主張する日本国特許出願第２０１７−１７５３１１号記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。【００６５】
（実施例１）抗ＲＡＭＰ２抗体の産生
ハイブリドーマの作製にあたり、抗原として用いる細胞を以下の方法により調製した。ヒトＣＲＬＲ（ＮＭ＿００５７９５）及びヒトＲＡＭＰ２（ＮＭ＿００５８５４）をＴｈｅｒｍｏ社のｐＣＨＯ１．０ベクターにタンデムに組み込み、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ社）を使用してＮＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５８）に遺伝子導入した（ｈＣＲ２−ＮＩＨ３Ｔ３）。安定発現株を作製するため、１０μｇ／ｍＬ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎと１００ｎＭ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅを含むＤ−ＭＥＭ培地（和光純薬、日本）で選択培養を行った。【００６６】
得られたｈＣＲ２−ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス１匹あたり１×１０６ｃｅｌｌｓとなるように調製し、週一回で５週間腹腔内投与して抗原による免疫を行った。免疫前後の血清を採取し、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡで抗原特異的な抗体価の上昇を確認した。抗体価の上昇確認後、最終免疫として１×１０６ｃｅｌｌｓのｈＣＲ２−ＮＩＨ３Ｔ３細胞を抗原として再度免疫した。【００６７】
細胞融合はマウスミエローマ細胞としてＳＰ２ａｂ細胞株を用い、脾臓及びリンパ節由来の細胞とＰＥＧ法により融合し、９６ｗｅｌｌ培養プレートに播種した。融合翌日からＨＡＴ含有１０％ＦＢＳ−ＴＩＬ培地を添加し、３日毎に培地交換を行いハイブリドーマを作製した。【００６８】
抗ヒトＲＡＭＰ２抗体の産生株をスクリーニングするために、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞と同様の方法で作製したｈＣＲＬＲ／ｈＲＡＭＰ２発現ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１）を９６ｗｅｌｌ培養プレートに播種した。４％ＰＦＡにより固定化し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、培養上清を添加して、二次抗体としてＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を反応させた。ＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）による発色で陽性ｗｅｌｌをピックアップし、候補ハイブリドーマとした。【００６９】
候補ハイブリドーマのうち、３株をＡＳＦ１０４培地（味の素株式会社、日本）に馴化した後、培養上清を回収し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ誘導体Ａｂ−Ｃａｐｃｈｅｒ  ＥｘＴｒａ（プロテノバ株式会社、日本）でＩｇＧ抗体を精製し抗ＲＡＭＰ２抗体、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体を得た。【００７０】
（実施例２）ｃＡＭＰ抑制試験
ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いて、得られた抗ＲＡＭＰ２抗体のｃＡＭＰの抑制試験を実施した。コントロール抗体として、公知の市販抗体（Ｎｏｖｕｓ  ｂｉｏ社、４Ｅ５、ＣａｔＮｏ．ＮＢＰ２−０１８５３；Ａｂｎｏｖａ社、２Ｆ５、ＣａｔＮｏ．Ｈ０００１０２６６−Ｍ０５；及びＳａｎｔａｃｒｕｚ社、Ｂ５、ＣａｔＮｏ．ｓｃ−３６５２４０）を用いた。測定にはＨａｌｆ  ａｒｅａ  ９６ｗｅｌｌ  プレートを使用した。２５００ｃｅｌｌｓのｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ−１２（和光純薬、日本）で一晩培養し、終濃度が０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１０００ｎＭとなるように、各抗体（２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、３３Ｈ４−１Ｇ３、４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５）を添加し、終濃度１５０ｐＭのヒトＡＭ（株式会社ペプチド研究所、日本）を添加した。ｃＡＭＰは、ＬＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａ  ｃＡＭＰ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って測定した。コントロールとして、抗体非添加／ＡＭ添加、及び抗体非添加／ＡＭ非添加のｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞によるｃＡＭＰ産生を同様に測定した。【００７１】
抗体を１０ｎＭ添加した時のｃＡＭＰ抑制を表す結果を図１に示す。図１は、抗体非添加の場合のｃＡＭＰ濃度を１００とした場合の各抗体添加群のｃＡＭＰ濃度の割合を示す。コントロール抗体はほとんどｃＡＭＰ産生を抑制しなかったのに対し、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体は、ＡＭ非添加群と同等までｃＡＭＰ産生を抑制した。また、各抗体の濃度とｃＡＭＰ抑制率との関係を図２に示す。２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体のｃＡＭＰ抑制に対するＩＣ５０値は、それぞれ、０．１５ｎＭ、０．０３ｎＭ、及び０．０４５ｎＭであった。【００７２】
（実施例３）ＨＵＶＥＣの増殖抑制試験
増殖因子を除いた２％ＦＢＳ含有Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２培地中のＨＵＶＥＣ（ＫＵＲＡＢＯ社）を９６ｗｅｌｌ培養プレートに１ｗｅｌｌ当たり２５００ｃｅｌｌｓで播種し、３時間の前培養により接着させた。終濃度が０．０００１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、及び１０００ｎＭとなるように、各抗体（２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、３３Ｈ４−１Ｇ３、４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５）を添加し、終濃度１００ｎＭのＡＭを添加して、９６時間後におけるＨＵＶＥＣの増殖を観察することで、ＨＵＶＥＣの増殖抑制試験を行った。細胞数の測定にはＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用い、増殖因子を除いた２％ＦＢＳ含有Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２培地で１０倍希釈した溶液を１００μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターで４時間発色させ、ＯＤ４５０として計測した。【００７３】
抗体を１０ｎＭ添加した時の増殖抑制を表す結果を図３に示す。図３は、抗体非添加の場合のＯＤ４５０（ＨＵＶＥＣ細胞数）を１００とした場合の各抗体添加群のＯＤ４５０（ＨＵＶＥＣ細胞数）の割合を示す。コントロール抗体はほとんどＨＵＶＥＣの増殖を抑制しなかったのに対し、２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体は、３０％程度にまで増殖を抑制した。また、各抗体の濃度とＨＵＶＥＣ増殖抑制率との関係を図４に示す。２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制に対するＩＣ５０値は、それぞれ、１．２ｎＭ、０．８ｎＭ、及び１．６ｎＭであった。【００７４】
（実施例４）配列解析
各抗体産生ハイブリドーマのセルペレットからＳＶ−Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてＲＮＡを抽出し、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社）によりｃＤＮＡを合成して、ハイブリドーマの抗体配列を解析した。既存マウスのＣＤＲ配列よりｗｏｂｂｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ（縮重プライマー）を設計し、重鎖・軽鎖それぞれの配列をタカラバイオ社のＥｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅した。得られた塩基配列からアミノ酸配列を決定し、ＫＡＢＡＴ法によりＣＤＲ領域を特定した。【００７５】
決定された２５Ｈ４−４Ｆ９抗体のＶＨ（配列番号２）及びＶＬ（配列番号４）、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体のＶＨ（配列番号１２）及びＶＬ（配列番号１４）、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体のＶＨ（配列番号１９）及びＶＬ（配列番号２１）の配列を図５に示す。また、決定された各ＣＤＲ配列を以下に示す。
２５Ｈ４−４Ｆ９抗体  重鎖ＣＤＲ配列：
ＣＤＲＨ１：ＧＹＦＭＮ（配列番号５）
ＣＤＲＨ２：ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）
ＣＤＲＨ３：ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）
２５Ｈ４−４Ｆ９抗体  軽鎖ＣＤＲ配列：
ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）
ＣＤＲＬ２：ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）
ＣＤＲＬ３：ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）
８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体  重鎖ＣＤＲ配列：
ＣＤＲＨ１：ＧＹＦＭＮ（配列番号５）
ＣＤＲＨ２：ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１５）
ＣＤＲＨ３：ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）
８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体  軽鎖ＣＤＲ配列：
ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）
ＣＤＲＬ２：ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）
ＣＤＲＬ３：ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）
３３Ｈ４−１Ｇ３抗体  重鎖ＣＤＲ配列：
ＣＤＲＨ１：ＧＹＦＭＮ（配列番号５）
ＣＤＲＨ２：ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）
ＣＤＲＨ３：ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）
３３Ｈ４−１Ｇ３抗体  軽鎖ＣＤＲ配列：
ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）
ＣＤＲＬ２：ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）
ＣＤＲＬ３：ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）【００７６】
（実施例５）抗ＲＡＭＰ２特異的な抗体の確認
取得した抗体が抗ＲＡＭＰ２特異的である事をＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによって確認した。具体的には、実施例１に準じて、ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）に、ヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ２を遺伝子導入した。ヒトＣＲＬＲ及びヒトＲＡＭＰ２を遺伝子導入した細胞と、ヒトＣＲＬＲのみを遺伝子導入した細胞との間で、抗体の結合性を比較した。【００７７】
結果を図６に示す。２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体、及び３３Ｈ４−１Ｇ３抗体は、ヒトＣＲＬＲのみを発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞にはほとんど結合せず、ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現させたＣＨＯ−Ｋ１細胞には特異的に結合する事を示している。【００７８】
（実施例６）Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによる細胞膜表面タンパクに対する結合親和性解析
１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中のｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ培養プレート（ＢＤ−ＦＡＬＣＯＮ社）に添加し、一晩培養した。等量の４％パラホルムアルデヒド溶液（ＭＵＴＯ化学）を添加し４℃で２０分間静置して細胞を固定し、ＰＢＳＴで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間以上のブロッキング処理を行った。抗体としては、実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、及び３３Ｈ４−１Ｇ３、並びに、市販の抗ＲＡＭＰ２抗体である、４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５を用いた。精製した各抗体を６７．５ｎＭから１／２段階希釈して添加し、二次抗体としてＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を反応させた。ＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を加えて発色させた後、２ＮのＨ２ＳＯ４溶液を添加して反応を停止した。ＯＤ４５０は、ｉＭａｒｋ（ＢｉｏＲＡＤ社）を用いて測定した。得られた結合データから、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を用いて結合親和性（ＥＣ５０）を算出した。【００７９】
図７に示すように実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、及び３３Ｈ４−１Ｇ３は、市販抗体である４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５と比較して明らかに優れた結合活性を示した。縦軸は同一試験において得られた抗体の最大結合量（ＯＤ値）を１００％として、最大結合量に対する割合として算出した。各抗体の結合親和性を表すＥＣ５０は、２５Ｈ４−４Ｆ９が０．４０ｎＭ、８５Ｈ７−２Ｂ１１が０．１４ｎＭ、３３Ｈ４−１Ｇ３が０．３０ｎＭだった。市販抗体は、いずれも結合能が低いことから正常な結合曲線が描けず、ＥＣ５０値としては、は４Ｅ５が３７．７ｎＭ以上、２Ｆ５とＢ５は６６．７ｎＭ以上であった。【００８０】
（実施例７）ＦＡＣＳによる細胞膜表面タンパクに対する結合解析
各抗体（実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、及び３３Ｈ４−１Ｇ３、並びに、市販の抗ＲＡＭＰ２抗体である、４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５）のｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞の膜表面ＲＡＭＰ２タンパクに対する結合能をフローサイトメーター（ＡＣＥＡ社）にて測定した。３×１０５ｃｅｌｌｓの剥離したｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞と３μｇ／ｍＬの抗体溶液５０μＬを９６ウェルＶ底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に加え、氷上で１時間静置し抗体を結合させた。ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡ／０．０５％ＮａＮ３／ＰＢＳ）にて３回洗浄し、２．５μｇ／ｍＬに調製したＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を加え、氷上遮光下で３０分間静置し二次抗体を結合させた。一回洗浄した後、５００μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁して、実施例７と同様の方法でＦＡＣＳにより蛍光を測定した。【００８１】
図８に示すように、実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、及び３３Ｈ４−１Ｇ３は、全て細胞膜表面タンパクに結合した。また、市販抗体のうち４Ｅ５は細胞膜表面タンパクへの結合が認められたが、市販抗体２Ｆ５とＢ５は結合が観察されなかった。【００８２】
（実施例８）ＦＡＣＳによるエピトープの競合解析
ビオチン化した８５Ｈ７−２Ｂ１１とビオチン化していない各抗体（実施例１で得られた２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、及び３３Ｈ４−１Ｇ３、並びに市販抗体４Ｅ５）をｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１に同時に反応させることにより、抗原に対する競合試験を行った。製造者のマニュアルに従って、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ−ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体をビオチン化した。ビオチン化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体３μｇ／ｍＬとビオチン化していない各抗体の０、０．１、０．３、１、３、１０、及び３０μｇ／ｍＬをｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞に加え、氷上で１時間静置し、競合条件下で抗体を結合させた。３回洗浄の後、２．５μｇ／ｍＬに調製したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を加え、氷上遮光下で３０分間静置し二次抗体を結合させた。一回洗浄の後、５００μＬのＦＡＣＳバッファーに懸濁して、実施例７と同様の方法でＦＡＣＳにより蛍光を測定した。【００８３】
図９に示すように２５Ｈ４−４Ｆ９、８５Ｈ７−２Ｂ１１、及び３３Ｈ４−１Ｇ３は抗原に対する結合において８５Ｈ７−２Ｂ１１と競合したが、市販抗体の４Ｅ５は８５Ｈ７−２Ｂ１１と競合しなかった。【００８４】
（実施例９）ヒト化抗体のデザイン
２５Ｈ４−４Ｆ９及び８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体について、ヒト化抗体（ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９、ヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体）をデザインした。ヒト化配列のデザインは、Ｘｏｍａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで考案された方法（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ５，７６６，８８６；ＭＯＤＩＦＩＥＤ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＶＡＲＩＡＢＬＥ  ＤＯＭＡＩＮＳ、特許期間満了）に従い、アミノ酸配列の設計を行った。２５Ｈ４−４Ｆ９マウス抗体重鎖及びＶＬまたは８５Ｈ７−２Ｂ１１マウス抗体重鎖及びＶＬのアミノ酸配列を用いてヒト免疫グロブリンＧＥＲＭＬＩＮＥデータベース（ＮＣＢＩ：ＩＧＢＬＡＳＴ）で相同性検索を行い、最も高い相同性を示したアミノ酸配列（２５Ｈ４−４Ｆ９重鎖：ＩＧＨＶ１−６９−２＊０１、ＩＧＨＶ１−１８＊０４及びＩＧＨＪ６＊０１、２５Ｈ４−４Ｆ９軽鎖：ＩＧＫＶ１−３３＊０１及びＩＧＫＪ２＊０１、８５Ｈ７−２Ｂ１１重鎖：ＩＧＨＶ１−４６＊０１、ＩＧＨＶ１−１８＊０４及びＩＧＨＪ６＊０１、８５Ｈ７−２Ｂ１１軽鎖：ＩＧＫＶ１−３３＊０１及びＩＧＫＪ２＊０１、なお、２５Ｈ４−４Ｆ９と８５Ｈ７−２Ｂ１１のＶＬのアミノ酸配列は一か所を除いて相同であるため、同一配列をフレームワークとして選択した）をヒト化抗体のフレームワークとした。これらフレームワークの各アミノ酸残基につき、マウスの配列をヒトの配列に変更した場合に抗体の３次元構造や抗原への結合性が失われてしまうリスクを３段階（ＨＩＧＨ，ＭＯＤＥＲＡＴＥ，ＬＯＷ）で評価し、ＬＯＷリスクのアミノ酸残基をはじめにヒト型のアミノ酸配列に変換し、その後、ＭＯＤＥＲＡＴＥ及びＨＩＧＨリスクのアミノ酸残基の変換を行い、各抗体の重鎖については５種類（ｖｈ１〜ｖｈ５）、軽鎖は４種類（ｖｋ１〜ｖｋ４）の配列をデザインした。さらに、重鎖と軽鎖を組み合わせて、各抗体につき計８種類のヒト化抗体を作製した。【００８５】
デザインされた２５Ｈ４−４Ｆ９のＶＨ及びＶＬの配列を図１０に、デザインされた８５Ｈ７−２Ｂ１１のＶＨ及びＶＬの配列を図１１に示す。また、作製したヒト化抗体における重鎖と軽鎖及びＶＨ，ＶＬ，ＣＤＲの配列の組み合わせを以下の表２に示す。【００８６】
【表２】
2019054460.tif 000003
【００８７】
（実施例１０）リコンビナントヒト化抗体の作製
リコンビナント抗体を作製するために重鎖をコードする遺伝子配列（配列番号１０２，１０４，１０６，１０８，１１０，１２０，１２２，１２４，１２６，及び１２８）及び軽鎖をコードする遺伝子配列（配列番号１１２，１１４，１１６，１１８，１３０，１３２，１３４，及び１３６）を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４（Ｔｈｅｒｍｏ）にクローニングした。重鎖及び軽鎖をクローニングしたベクターを重量比１：１になるように混合し、１０μｇから３０μｇのベクターＤＮＡを用いて、哺乳類細胞ＣＨＯ−Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ）にトランスフェクションした。トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＣＨＯ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用い、１０ｍＬから３０ｍＬの細胞懸濁液を１４日間フラスコによる旋回培養を行った。１４日間培養した培養液から遠心操作により細胞を除き、０．４５μｍのフィルターを通した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎＡレジン（Ａｍｓｐｈｅｒｅ  Ａ３；ＪＳＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）により精製した。ＰｒｏｔｅｉｎＡレジンと培養上清を４℃で一晩混合し、リコンビナント抗体を結合させた後、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０で洗浄した。レジンに結合したリコンビナント抗体を０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｐＨ３．２のＥｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで溶出し、１／５０容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．０で中和した。中和後、３０ｋＤａの限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ：ミリポア）を用いてリン酸緩衝液にＢｕｆｆｅｒを置換し、２８０ｎｍの吸光度を測定してリコンビナント抗体の濃度を決定した。【００８８】
（実施例１１）ヒト化抗体のｃＡＭＰ抑制試験
ｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を用いて、ヒト化抗体のｃＡＭＰの抑制試験を実施した。測定にはマウス抗体の活性測定と同様に、Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社製のＨａｌｆ  ａｒｅａ  ９６ｗｅｌｌプレートを使用し、２５００ｃｅｌｌｓのｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を１０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（和光純薬、日本）中で一晩培養し、各抗体（ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９、ヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１、４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５）を添加し、終濃度１５０ｐＭのヒトＡＭ（株式会社ペプチド研究所、日本）を添加した。ｃＡＭＰは、ＬＡＮＣＥ  Ｕｌｔｒａ  ｃＡＭＰ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社）を用いて、製造者のマニュアルに従って測定した。コントロールとして、抗体非添加／ＡＭ添加、及び抗体非添加／ＡＭ非添加のｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞によるｃＡＭＰ産生を同様に測定した。【００８９】
図１２及び図１３は、それぞれヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体を１６．７ｎＭ添加した時のｃＡＭＰ抑制率を示す。ｃＡＭＰ抑制率は、抗体非添加の場合のｃＡＭＰ濃度を１００とした場合の各抗体添加群のｃＡＭＰ濃度の割合で示した。コントロールとして用いた市販抗体（４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５）はほとんどｃＡＭＰ産生を抑制しなかったのに対し、ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体は、ＡＭ非添加群と同等までｃＡＭＰ産生を抑制した。【００９０】
また、各抗体の濃度とｃＡＭＰ抑制率との関係を図１４に示す。ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体のｃＡＭＰ抑制に対するＩＣ５０値は、それぞれ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１が０．１７ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２が０．１４ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３が０．２６ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４が０．１７ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５が０．５０ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６が１．３５ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８が１．０７ｎＭ、そして、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１が０．０７ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２が０．１１ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３が０．０８ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４が０．１３ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５が０．１４ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６が０．１８ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７が０．１２ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８が０．１８ｎＭであった。【００９１】
（実施例１２）ヒト化抗体のＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡによる結合親和性解析
９６ｗｅｌｌプレート（ＢＤ−ＦＡＬＣＯＮ社）に１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（和光純薬）中のｈＣＲ２−ＣＨＯＫ１細胞を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで添加し、一晩培養した。等量の４％パラホルムアルデヒド溶液（ＭＵＴＯ化学）を添加し、４℃で２０分間静置して細胞を固定し、ＰＢＳＴで洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間以上のブロッキング処理を行った。精製抗体を６７ｎＭから１／１０段階希釈して添加し、二次抗体として４０．０ｎｇ／ｍＬのＧｏａｔ−Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ−ＩｇＧ−Ｆｃ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ−ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（Ｂｅｔｈｙｌ社）を１００μＬ添加して反応させた。ＴＭＢ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４溶液で反応を停止してｉＭａｒｋ（ＢｉｏＲＡＤ社）を用いてＯＤ４５０を測定した。得られた結合データについて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を用いて結合親和性（ＥＣ５０）を算出した。【００９２】
図１５に示すように、抗体を６．７ｎＭ添加した際の結合は、ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１において、市販抗体の４Ｅ５、２Ｆ５、及びＢ５と比較して明らかに優れていた。【００９３】
また、各濃度での結合を図１６に示す。各抗体の結合活性（ＥＣ５０）は、それぞれｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１が０．７３ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２が１．０５ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ３が０．８３ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ４が１．８３ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ５が２．３２ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ６が３．１９ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ８が３．０３ｎＭ、そして、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１が０．１８ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２が０．２４ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３が０．２３ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４が０．２２ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５が０．２５ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６が０．２４ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７が０．２３ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８が０．２０ｎＭであった。【００９４】
（実施例１３）ヒト化抗体のＨＵＶＥＣの増殖抑制試験
ヒト化抗体のＨＵＶＥＣ増殖抑制能について、実施例３と同様の方法で調べた。９６ｗｅｌｌ培養プレートに２，５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＨＵＶＥＣを播種し、３時間の前培養により接着させた。その後、各濃度のヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９、及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１を添加し、終濃度１００ｎＭのＡＭを添加し、９６時間後におけるＨＵＶＥＣの増殖を観察して、ＨＵＶＥＣの増殖抑制能を確認した。細胞数の測定にはＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を用いた。増殖因子を除いた２％ＦＢＳ含有Ｈｕｍｅｄｉａ−ＥＧ２培地で１０倍希釈した発色溶液を１００μＬ添加し、ＣＯ２インキュベーターで４時間発色させＯＤ４５０として計測した。【００９５】
抗体非添加の場合のＯＤ４５０（ＨＵＶＥＣ細胞数）を１００として、各抗体の添加濃度の割合からＨＵＶＥＣ増殖抑制率（ＩＣ５０）を算出した。その結果、ヒト化２５Ｈ４−４Ｆ９抗体、及びヒト化８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体のＩＣ５０値は、それぞれｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ１が１６．０ｎＭ、ｈ２５Ｈ４−４Ｆ９ｖ２が１０．９ｎＭ、そして、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ１が５．１ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ２が９．５ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ３が１．５ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ４が１．４ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ５が２１．４ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ６が１４．８ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ７が３２．７ｎＭ、ｈ８５Ｈ７−２Ｂ１１ｖ８が２２．６ｎＭであった。【００９６】
（実施例１４）抗体のエピトープ解析
８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体が認識する特定のエピトープ一次配列が存在するか否かを決定するために、ヒトＲＡＭＰ２タンパクの細胞外領域について、１２アミノ酸が重複するように３アミノ酸ずらした以下の３１個の１３〜１５アミノ酸からなるペプチド断片（配列番号７１〜１０１）を作製し、それらのペプチドに対する抗体の結合能をＥＬＩＳＡ法により調べた。ペプチドとタンパクの固相は１．０μｇ／ｍＬの十分量を用い、結合には８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体を２０ｎｇ／ｍＬで反応させた。二次抗体としてＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ−ＨＲＰを５０．０ｎｇ／ｍＬで反応させ、結合した抗体をＴＭＢ溶液で発色させ、２ＮのＨ２ＳＯ４溶液で反応を停止した後にＯＤ４５０を測定した。
ＱＰＬＰＴＴＧＴＰＧＳＥＧＧＴ（配列番号７１）
ＰＴＴＧＴＰＧＳＥＧＧＴＶＫＮ（配列番号７２）
ＧＴＰＧＳＥＧＧＴＶＫＮＹＥＴ（配列番号７３）
ＧＳＥＧＧＴＶＫＮＹＥＴＡＶＱ（配列番号７４）
ＧＧＴＶＫＮＹＥＴＡＶＱＦＳＷ（配列番号７５）
ＶＫＮＹＥＴＡＶＱＦＳＷＮＨＹ（配列番号７６）
ＹＥＴＡＶＱＦＳＷＮＨＹＫＤＱ（配列番号７７）
ＡＶＱＦＳＷＮＨＹＫＤＱＭＤＰ（配列番号７８）
ＦＳＷＮＨＹＫＤＱＭＤＰＩＥＫ（配列番号７９）
ＮＨＹＫＤＱＭＤＰＩＥＫＤＷＳ（配列番号８０）
ＫＤＱＭＤＰＩＥＫＤＷＳＤＷＡ（配列番号８１）
ＭＤＰＩＥＫＤＷＳＤＷＡＭＩＳ（配列番号８２）
ＩＥＫＤＷＳＤＷＡＭＩＳＲＰＹ（配列番号８３）
ＤＷＳＤＷＡＭＩＳＲＰＹＳＴＬ（配列番号８４）
ＤＷＡＭＩＳＲＰＹＳＴＬＲＤＳ（配列番号８５）
ＭＩＳＲＰＹＳＴＬＲＤＳＬＥＨ（配列番号８６）
ＲＰＹＳＴＬＲＤＳＬＥＨＦＡＥ（配列番号８７）
ＳＴＬＲＤＳＬＥＨＦＡＥＬＦＤ（配列番号８８）
ＲＤＳＬＥＨＦＡＥＬＦＤＬＧＦ（配列番号８９）
ＬＥＨＦＡＥＬＦＤＬＧＦＰＮＰ（配列番号９０）
ＦＡＥＬＦＤＬＧＦＰＮＰＬＡＥ（配列番号９１）
ＬＦＤＬＧＦＰＮＰＬＡＥＲＩＩ（配列番号９２）
ＬＧＦＰＮＰＬＡＥＲＩＩＦＥＴ（配列番号９３）
ＰＮＰＬＡＥＲＩＩＦＥＴＨＱＩ（配列番号９４）
ＬＡＥＲＩＩＦＥＴＨＱＩＨＦＡ（配列番号９５）
ＲＩＩＦＥＴＨＱＩＨＦＡＮＳＳ（配列番号９６）
ＦＥＴＨＱＩＨＦＡＮＳＳＬＶＱ（配列番号９７）
ＨＱＩＨＦＡＮＳＳＬＶＱＰＴＦ（配列番号９８）
ＨＦＡＮＳＳＬＶＱＰＴＦＳＤＰ（配列番号９９）
ＮＳＳＬＶＱＰＴＦＳＤＰＰＥＤ（配列番号１００）
ＬＶＱＰＴＦＳＤＰＰＥＤＶ（配列番号１０１）【００９７】
図１７に示すように、等量のヒトＲＡＭＰ２タンパクに対しては十分量の８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体が結合した。一方で、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体はいずれのヒトＲＡＭＰ２ペプチド断片にも結合しなかった。このことから、８５Ｈ７−２Ｂ１１抗体がＲＡＭＰ２タンパク質の特定の一次構造ではなく、立体構造などの高次構造により構成されるエピトープを認識していることが示された。また、実施例８の結果から、本発明の抗体が抗原への結合において互いに競合することから、本発明の抗体はいずれもＲＡＭＰ２タンパク質の特定の一次構造ではなく、立体構造などの高次構造により構成されるエピトープを認識すると考えられた。これらの結果から、ＨＵＶＥＣの増殖を抑制するためには、ＲＡＭＰ２タンパク質の特定の一次構造ではなく、細胞外の立体構造により構成されるエピトープを認識することが重要であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本抗体は、ヒトアドレノメジュリン受容体であるヒトＲＡＭＰ２の機能を特異的に抑制できることから、ＲＡＭＰ２に関連する疾患の予防、診断又は治療方法の提供や、該疾患の予防薬、診断薬又は治療薬の開発において重要な役割を果たす事が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月28日(2019.10.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による血管内皮細胞増殖試験において、血管内皮細胞の増殖抑制作用を有する、受容体活性調節タンパク質２（ＲＡＭＰ２）に特異的に結合する抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項２】
前記血管内皮細胞の増殖抑制作用が、３５ｎＭ以下のＩＣ５０値である、請求項１に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項３】
アドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生を抑制する作用を有する、請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアドレノメジュリン添加による動物細胞によるｃＡＭＰ産生試験において、ｃＡＭＰ産生抑制作用が、２ｎＭ以下のＩＣ５０値である、請求項３に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項５】
ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞に結合する、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項６】
ヒトＣＲＬＲとヒトＲＡＭＰ２を共発現する細胞を用いたＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ試験による結合親和性（ＥＣ５０）が３．５ｎＭ以下である、請求項５に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項７】
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片であって、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体、とＲＡＭＰ２への結合において競合する抗体又はその免疫反応性断片、あるいは、
配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体、と同じエピトープに結合する抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項８】
ＲＡＭＰ２の細胞外領域を構成するアミノ酸配列の一次構造を認識しない、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項９】
配列番号７１〜１０１に記載の各アミノ酸配列からなるペプチドの全てと結合しない、請求項８に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１０】
ＬＸ１ＩＸ２ＤＸ３ＹＸ４ＹＸ５ＭＸ６Ｘ７（配列番号２４）で表されるアミノ酸配列であって、ここで、Ｘ１はＧ又はＭであり、Ｘ２はＦ又はＹであり、Ｘ３はＡ又はＶであり、Ｘ４は存在しないかＨであり、Ｘ５はＡかＶであり、Ｘ６はＤかＥであり、かつ、Ｘ７はＹかＮである、アミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）３を有する重鎖を含む、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１１】
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）又はＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する重鎖を含む、請求項１０に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１２】
更に、重鎖がＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、及びＲＸ８ＮＰＹＮＧＤＸ９Ｘ１０ＹＸ１１ＱＫＦＸ１２Ｇ（配列番号６６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２を有する、請求項１０又は請求項１１に記載の抗体又はその免疫反応性断片、
ここで、Ｘ８はＮ又はＩであり、Ｘ９はＳ又はＴであり、Ｘ１０はＩ、Ｆ又はＬであり、Ｘ１１はＡ又はＮであり、Ｘ１２はＱ又はＫである。
【請求項１３】
更に、Ｘ１３ＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６９）のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＹＴＳＲＬＸ１４Ｘ１５（配列番号７０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及びＱＱＤＳＫＸ１６ＰＷＴ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する軽鎖を含む、請求項１２に記載の抗体又はその免疫反応性断片、
ここで、Ｘ１３はＱ又はＲであり、Ｘ１４はＥ又はＨであり、Ｘ１５はＳ又はＴであり、Ｘ１６はＨ又はＮである。
【請求項１４】
ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ  （配列番号１５）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）、ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＥＫＦＱＧ（配列番号６２）、ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＡＥＫＦＱＧ（配列番号６３）、ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号６４）、及びＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６５）からなる群から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）又はＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を有する、請求項１２に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１５】
更に、ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）又はＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）又はＹＴＳＲＬＥＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）又はＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有する、請求項１４に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１６】
以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）のいずれか１つの重鎖ＣＤＲの組み合わせを有する、請求項１４に記載の抗体又はその免疫反応性断片：
（ｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＮＥＫＦＱＧ（配列番号６２）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｉｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＮＮＰＹＮＧＤＳＩＹＡＥＫＦＱＧ（配列番号６３）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＭＩＦＤＡＹＹＡＭＤＹ（配列番号７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３
（ｉｖ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧ  （配列番号１５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｖ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＱＧ（配列番号６４）、のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；
（ｖｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＦＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号６５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３；又は、
（ｖｉｉ）ＧＹＦＭＮ（配列番号５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、
ＲＩＮＰＹＮＧＤＴＬＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２２）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び
ＬＧＩＹＤＶＹＨＹＶＭＥＮ（配列番号１６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３。
【請求項１７】
更に、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つの軽鎖ＣＤＲの組み合わせを有する、請求項１６に記載の抗体又はその免疫反応性断片：
（ａ）ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｂ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｃ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＥＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＨＰＷＴ（配列番号１０）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｄ）ＲＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；
（ｅ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号９）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３；又は、
（ｆ）ＱＡＳＱＤＩＲＮＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、
ＹＴＳＲＬＥＴ（配列番号６８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び
ＱＱＤＳＫＮＰＷＴ（配列番号１７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３。
【請求項１８】
以下のいずれかである、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の抗体：
ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片；あるいは、
ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項１９】
配列番号２、１２、１９、２７、２９，３１，３３、３５、４５，４７，４９、５１，及び５３から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨを有する、請求項１〜請求項１７のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項２０】
更に、配列番号４、１４，２１、３７，３９，４１、４３、５５，５７，５９，及び６１から選択されるいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬを含む、請求項１９に記載の抗体又はその免疫反応性断片。
【請求項２１】
以下の群から選択されるいずれか１つのＶＨ及びＶＬの組み合わせを含む、請求項２０に記載の抗体又はその免疫反応性断片：
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号２９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号３５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号５３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ；
配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するＶＨ及び配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＬ。
【請求項２２】
請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項２３】
以下の群から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項２２に記載の核酸分子：
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号２８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３２に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号３４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５４に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５６に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号５０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号５８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号５０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号６０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；
配列番号５２に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号６０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を有するＶＨをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号２０に記載のヌクレオチド配列を有するＶＬをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２２又は請求項２３に記載の核酸分子を有するベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターを有する宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片の製造方法。
【請求項２７】
請求項１〜請求項２１のいずれか１項に記載の抗体又はその免疫反応性断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項２８】
血管新生抑制剤である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
癌、癌転移、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、血管新生緑内障、炎症性皮膚疾患、関節リウマチ、又は変形性関節症の治療薬又は予防薬である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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