(57)【要約】本発明は、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有しているかどうかを判定する方法を提供する。本発明の方法は、前記試料を、N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamineおよび5-(2,4-disulfophenyl)-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumを含有する水溶液（ｐＨ：５．１以上６．５以下）に添加して得られた混合物に４００ｎｍ〜５００ｎｍの波長を有する光および５００ｎｍ〜８００ｎｍの波長を有する光を照射して、それぞれ第１吸光度Ａｙおよび第２吸光度Ａｘを測定し、Ａｙ／Ａｘ≧１．５が充足されるか、または混合物がオレンジ色である場合には、試料が菌を含有していると判定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）  前記試料を、N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamineおよび5-(2,4-disulfophenyl)-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumを含有する水溶液に添加して混合物を得る工程、
ここで、
前記水溶液は、５．１以上６．５以下のｐＨを有しており、
（ｂ）  前記混合物に、４００ナノメートル以上５００ナノメートル以下の波長を有する光を照射し、前記混合物の第１吸光度Ａｙを測定する工程、
（ｃ）  前記混合物に、５００ナノメートルを超えて８００ナノメートル以下の波長を有する光を照射し、前記混合物の第２吸光度Ａｘを測定する工程、および
（ｄ）  以下の数式（Ｉ）が充足される場合には、前記試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有していると判定する工程、
Ａｙ／Ａｘ≧１．５  （Ｉ）
を具備する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記セルコスポラ属の菌が、Cercospora sorghiおよびCercospora zeae-maydisからなる群から選択される少なくとも１種である、
方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記シュードセルコスポラ属の菌が、Pseudocercospora fuligenaである、
方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記水溶液が緩衝液である、
方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法の実施に用いられるデバイスであって、
N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamineおよび5-(2,4-disulfophenyl)-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumを備えるデバイス。
【請求項６】
試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有しているかどうかを判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）  前記試料を、N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamineおよび5-(2,4-disulfophenyl)-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumを含有する水溶液に添加して混合物を調製する工程、
ここで、
前記水溶液は、５．１以上６．５以下のｐＨを有しており、および
（ｅ）  前記混合物がオレンジ色である場合には、前記試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有していると判定する工程、
を具備する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記セルコスポラ属の菌が、Cercospora sorghiおよびCercospora zeae-maydisからなる群から選択される少なくとも１種である、
方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、
前記シュードセルコスポラ属の菌が、Pseudocercospora fuligenaである、
方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法であって、
前記水溶液が緩衝液である、
方法。
【請求項１０】
請求項６から９のいずれか１項に記載の方法の実施に用いられるデバイスであって、
N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamineおよび5-(2,4-disulfophenyl)-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumを備えるデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料がセルコスポラ属またはシュードセルコスポラ属の菌を含有しているかどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルコスポラ属の菌は、斑点病を引き起こす。非特許文献１は、マメ科の植物中のセルコスポラ属の菌を免疫学的かつ分子的に速やかに検出する方法を開示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Maria Gabriela Latorre Rapela et. al. “Early Detection of Cercospora Species in Soybean Plants: Immunologic and Molecular Methods”, American Journal of Plant Sciences, 2015, 6, 2939-2948
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、試料がセルコスポラ属またはシュードセルコスポラ属の菌を含有しているかどうかを判定する新規な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有しているかどうかを判定する方法を提供する。本発明の方法は、以下の工程：
（ａ）  前記試料を、N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamineおよび5-(2,4-disulfophenyl)-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazoliumを含有する水溶液に添加して混合物を得る工程、
ここで、
前記水溶液は、５．１以上６．５以下のｐＨを有しており、
（ｂ）  前記混合物に、４００ナノメートル以上５００ナノメートル以下の波長を有する光を照射し、前記混合物の第１吸光度Ａｙを測定する工程、
（ｃ）  前記混合物に、５００ナノメートルを超えて８００ナノメートル以下の波長を有する光を照射し、前記混合物の第２吸光度Ａｘを測定する工程、および
（ｄ）  以下の数式（Ｉ）が充足される場合には、前記試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有していると判定する工程、
Ａｙ／Ａｘ≧１．５  （Ｉ）
を具備する。
工程（ｂ）〜工程（ｄ）に代えて、本発明の方法は、
（ｅ）  前記混合物がオレンジ色である場合には、前記試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有していると判定する工程、
を具備する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、試料がセルコスポラ属またはシュードセルコスポラ属の菌を含有しているかどうかを判定する新規な方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【０００８】
（第１実施形態）
第１実施形態による方法は、以下の４つの工程（ａ）〜（ｄ）を具備する。
【０００９】
（工程（ａ））
工程（ａ）では、試料を、N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamine（以下、「ＴＭＰＤ」という）および以下の化学式により表される化合物（以下、「ＷＳＴ−８」という）を含有する水溶液に添加して、混合物を得る。
【００１０】
【化１】
2018207562.tif 000002
【００１１】
ＴＭＰＤは、N,N,N',N'-Tetramethyl-1,4-phenylenediamine Dihydrochloride（ＣＡＳ番号：637-01-4）として入手可能である。ＷＳＴ−８は、5-(2,4-disulfophenyl)-3-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt, monosodium salt（ＣＡＳ番号：193149-74-5）として入手可能である。
【００１２】
水溶液は、５．１以上６．５以下のｐＨを有する。水溶液が５．１未満のｐＨを有する場合、セルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌の検出は不可能になる。より詳細には、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有しているにも拘わらず、後述される工程（ｄ）において試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のいずれも含有していないという誤った結論に至る。後述される比較例２を参照せよ。
【００１３】
水溶液が６．５を超えるｐＨを有する場合にも、セルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌の検出は不可能になる。より詳細には、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のいずれも含有していないにも拘わらず、後述される工程（ｄ）において試料がセルコスポラ属の菌またはシュードセルコスポラ属の菌を含有しているという誤った結論に至る。後述される比較例１９を参照せよ。
【００１４】
従って、水溶液は、５．１以上６．５以下のｐＨを有する。
【００１５】
本発明は、適切なｐＨ条件下（すなわち、５．１以上６．５以下）でのＴＭＰＤおよびＷＳＴ−８の組み合わせによりセルコスポラ属の菌またはシュードセルコスポラ属の菌が検出されることに特徴づけられる。ＴＭＰＤおよびＷＳＴ−８のいずれか一方の欠如は、セルコスポラ属の菌またはシュードセルコスポラ属の菌の検出を不可能にする。
【００１６】
混合物は、１日以上室温で静置されることが望ましい。
【００１７】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、工程（ａ）において得られた混合物に、４００ナノメートル以上５００ナノメートル以下の波長を有する光を照射し、混合物の第１吸光度Ａｙを測定する。一例として、混合物に、４６０ナノメートルの波長を有する光を照射し、混合物の第１吸光度Ａｙを測定し得る。
【００１８】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ａ）において得られた混合物に、５００ナノメートルを超えて８００ナノメートル以下の波長を有する光を照射し、混合物の第２吸光度Ａｘを測定する。一例として、６１０ナノメートルの波長を有する光を照射し、混合物の第２吸光度Ａｘを測定し得る。
【００１９】
工程（ｂ）および工程（ｃ）の順序は限定されない。言い換えれば、工程（ｂ）が先に行われ、次いで工程（ｃ）が行われても良い。あるいは、工程（ｃ）が先に行われ、次いで工程（ｂ）が行われても良い。
【００２０】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、以下の数式（Ｉ）が充足される場合には、前記試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有していると判定される。
Ａｙ／Ａｘ≧１．５  （Ｉ）
【００２１】
後述される実施例からも明らかなように、混合物がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有している場合、Ａｙ／Ａｘの値は１．５以上である。一方、混合物がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のいずれも含有していない場合、Ａｙ／Ａｘの値は１．５未満である。
【００２２】
言い換えれば、混合物が、ＴＭＰＤと、ＷＳＴ−８と、セルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌の少なくとも一方とのすべてを含有している場合、４００ナノメートル以上５００ナノメートル以下の波長を有する光が混合物によく吸収される。５００ナノメートルを超えて８００ナノメートル以下の波長を有する光は混合物を透過しやすい。
【００２３】
一方、混合物が、ＴＭＰＤと、ＷＳＴ−８と、セルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方とのいずれか１つを含有していない場合、４００ナノメートル以上５００ナノメートル以下の波長を有する光は混合物にあまり吸収されない。５００ナノメートルを超えて８００ナノメートル以下の波長を有する光は混合物を透過しにくい。この吸収度の差が、Ａｙ／Ａｘの値に反映される。
【００２４】
（第２実施形態）
第２実施形態による方法は、工程（ａ）および工程（ｅ）を具備する。第２実施形態に含まれる工程（ａ）は、第１実施形態に含まれる工程（ａ）と同一である。
【００２５】
（工程（ｅ））
後述される実施例からも明らかなように、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有している場合に限り、混合物はオレンジ色になる。一方、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のいずれも含有していない場合には、混合物はＴＭＰＤが原因で紫色になっている。従って、工程（ｅ）では、混合物がオレンジ色になっている場合、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌の少なくとも一方を含有していると判定される。一方、混合物がオレンジ色になっていない場合、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のいずれも含有していないと判定される。判定は目視により容易になされ得る。
【００２６】
セルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌の少なくとも一方を含有している混合物がオレンジ色となる理由は、透明なＷＳＴ−８がセルコスポラ属の菌またはシュードセルコスポラ属の菌のために還元されてオレンジ色のＷＳＴ−８ホルマザンに変化するためと考えられる。
【００２７】
本発明には、上述の判定方法の実施に用いられるデバイスも含まれる。本発明のデバイスは、少なくとも、ＷＳＴ−８と、ＴＭＰＤとを備える。
【００２８】
本発明のデバイスは、さらに、試料を収容するための容器、菌を培養するための培地、所定の波長を有する光を照射することが可能な光源、吸光度を測定するための吸光度計、菌呈色試薬の呈色を光学的に検出するための光学センサ、検出した結果を表示するための表示素子などを備えることもできる。
【００２９】
（実施例）
以下の実施例を参照しながら、本発明がさらにより詳細に説明される。
【００３０】
（実施例１）
本発明者は、菌Cercospora sorghiが３日以上培養された寒天培地を、金属鉤を用いて切り出した。次いで、本発明者らは、切り出された培地を、１０％ポテトデキストロース液体培地（Ｄｉｆｃｏ研究所製、以下、「１０％ＰＤＢ」という）に添加して、混合物を得た。混合物は、マイクロピペットを用いて撹拌された。混合物は、セルストレーナー（コーニング株式会社から商品名＃３５２２３５として購入）を用いて濾過した。このようにして、寒天培地が除去された。
【００３１】
本発明者は、血球計数盤（サンリード硝子有限会社より、商品名Ａ１３１として入手）を用いて、濾液に含有される胞子の濃度を計算した。次いで、本発明者らは、この胞子の濃度に基づいて１０％ＰＤＢを用いて混合物を希釈して、含有される胞子の数が１０万個になるように試料溶液を調製した。試料溶液（１７０マイクロリットル）は、透明平底９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに供給された。次いで、酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ：５．５、２０マイクロリットル）が各ウェルに添加された。続いて、ＷＳＴ−８およびＴＭＰＤの混合溶液（１０マイクロリットル）が各ウェルに添加された。１つのウェルに含有される混合物の容量は２００マイクロリットルであった。
【００３２】
これに先立って、本発明者は、ＷＳＴ−８溶液（株式会社  同人化学研究所から購入、「Microbial Viability Assay Kit-WST」に含まれる）を、ＴＭＰＤ水溶液（１０ｍＭ、東京化成工業株式会社から購入）と、９：１の体積比で混合し、ＷＳＴ−８およびＴＭＰＤの混合溶液を調製した。
【００３３】
透明平底９６ウェルマイクロプレートは、摂氏２５度の温度で１日間静置された。本発明者らは、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社から購入、商品名「Ｍ１０００Ｐｒｏ」）を用いて、４００ナノメートル以上８００ナノメートル以下の波長での１つのウェルの吸光度を１０ナノメートル間隔で測定した。本発明者は、４６０ナノメートルでの吸光度Ａｙの６１０ナノメートルでの吸光度Ａｘに対する比を計算した。計算された比は、３．３であった。当該１つのウェルは、オレンジ色であった。実施例１は、４回、繰り返された。詳細な実験結果は、表１に示される。
【００３４】
（実施例２）
実施例２では、酢酸緩衝液に代えて１０％ＰＤＢが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。混合溶液は、５．１のｐＨを有していた。実施例２は、４回、繰り返された。
【００３５】
（実施例３）
実施例３では、Cercospora sorghiに代えてCercospora zeae-maydisが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００３６】
（実施例４）
実施例４では、（ｉ）  Cercospora sorghiに代えてCercospora zeae-maydisが用いられたこと、および（ｉｉ）  酢酸緩衝液に代えてBis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane（ＣＡＳ番号：6976-37-0、以下「Bis-Tris」という）を含有する緩衝液が用いられたこと、（ｉｉｉ）緩衝液が６．５のｐＨを有していたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００３７】
（実施例５）
実施例５では、Cercospora sorghiに代えてPseudocercospora fuligenaが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００３８】
（比較例１）
比較例１では、緩衝液が、７．５のｐＨを有するＨＥＰＥＳ緩衝液（シグマアルドリッチ社より購入）であったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。ＨＥＰＥＳ緩衝液（濃度：０．１Ｍ）のｐＨは、水酸化ナトリウムにより調整された。
【００３９】
（比較例２）
比較例２では、（ｉ）  Cercospora sorghiに代えてCercospora zeae-maydisが用いられたこと、および（ｉｉ）  酢酸緩衝液が４．５のｐＨを有していたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００４０】
（比較例３〜比較例１０）
比較例３〜比較例１０では、Cercospora sorghiに代えて、それぞれ、Aspergillus oryzae、Colletotrichum gloeosporioides、Colletotrichum higginsianum、Fusarium avenaceum、Fusarium equiseti、Fusarium oxysporum、Trichoderma harzianum、およびPenicillium chrysogenumが用いられたこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。比較例４は、３回、繰り返された。
【００４１】
（比較例１１）
比較例１１では、Cercospora sorghiが用いられなかったこと以外は、実施例１と同様の実験が行われた。比較例１１は、３回、繰り返された。
【００４２】
（比較例１２〜比較例１５）
比較例１２〜比較例１５では、
（ｉ）  菌Cercospora sorghiに代えて、それぞれ、Colletotrichum higginsianum、Fusarium equiseti、Fusarium oxysporum、およびTrichoderma harzianumが用いられたこと、
（ｉｉ）  酢酸緩衝液に代えて１０％ＰＤＢが用いられたこと、および
（ｉｉｉ）  混合溶液が、５．１のｐＨを有していたこと
以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００４３】
（比較例１６）
比較例１６では、
（ｉ）Cercospora sorghiが用いられなかったこと、
（ｉｉ）  酢酸緩衝液に代えて１０％ＰＤＢが用いられたこと、および
（ｉｉｉ）  混合溶液が、５．１のｐＨを有していたこと
以外は、実施例１と同様の実験が行われた。比較例１６は、３回、繰り返された。
【００４４】
（比較例１７）
比較例１７では、
（ｉ）Cercospora sorghiに代えて、Fusarium equisetiが用いられたこと、
（ｉｉ）  酢酸緩衝液に代えてBis-Trisを含有する緩衝液が用いられたこと、および
（ｉｉｉ）  緩衝液が、６．５のｐＨを有していたこと
以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００４５】
（比較例１８）
比較例１８では、
（ｉ）Cercospora sorghiが用いられなかったこと、
（ｉｉ）  酢酸緩衝液に代えてBis-Trisを含有する緩衝液が用いられたこと、および
（ｉｉｉ）  緩衝液が、６．５のｐＨを有していたこと
以外は、実施例１と同様の実験が行われた。比較例１８は、３回、繰り返された。
【００４６】
（比較例１９）
比較例１９では、
（ｉ）Cercospora sorghiに代えて、Fusarium equisetiが用いられたこと、
（ｉｉ）  酢酸緩衝液に代えて、HEPES緩衝液が用いられたこと、および
（ｉｉｉ）  HEPES緩衝液が、７．５のｐＨを有していたこと、
以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００４７】
（比較例２０）
比較例２０では、
（ｉ）Cercospora sorghiが用いられなかったことこと、
（ｉｉ）  酢酸緩衝液に代えて、HEPES緩衝液が用いられたこと、および
（ｉｉｉ）  HEPES緩衝液が、７．５のｐＨを有していたこと、
以外は、実施例１と同様の実験が行われた。
【００４８】
以下の表１〜表５は、実施例１〜実施例５および比較例１〜比較例２０の結果を示す。
【００４９】
【表１】
2018207562.tif 000003
【００５０】
【表２】
2018207562.tif 000004
【００５１】
【表３】
2018207562.tif 000005
【００５２】
【表４】
2018207562.tif 000006
【００５３】
【表５】
2018207562.tif 000007
【００５４】
上記の表から明らかなように、以下の条件（Ｉ）、条件（ＩＩ）、および条件（ＩＩＩ）が充足される場合には、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有していることが選択的に判定される。
条件（Ｉ）  水溶液がＴＭＰＤを含有すること。
条件（Ｉ）  水溶液が５．１以上６．５以下のｐＨを有すること。
条件（ＩＩ）  Ａｙ／Ａｘの値が１．５以上であること
【００５５】
実施例３を比較例２と比較すれば明らかなように、水溶液が４．５のｐＨを有する場合、試料がセルコスポラ属の菌を含有し、かつ水溶液がＴＭＰＤを含有しているにも拘わらず、Ａｙ／Ａｘの値は１．５未満である。一方、実施例２および実施例４を比較例１および比較例１９と比較すると明らかなように、水溶液が７．５のｐＨを有する場合、試料がセルコスポラ属の菌を含有しているかどうかに拘わらず、Ａｙ／Ａｘの値は１．５以上である。言い換えれば、水溶液が７．５のｐＨを有する場合、試料がセルコスポラ属の菌を含有していなくても、Ａｙ／Ａｘの値は１．５以上である。
【００５６】
実施例１〜実施例５を、比較例２〜比較例１８および比較例２０と比較すれば明らかなように、試料がセルコスポラ属の菌またはシュードセルコスポラ属の菌を含有しなければ、Ａｙ／Ａｘの値は１．５未満である。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、試料がセルコスポラ属の菌およびシュードセルコスポラ属の菌のうちの少なくとも一方を含有しているかどうかを判定する方法を提供する。
【国際調査報告】
2018207562.tif 000008
2018207562.tif 000009
2018207562.tif 000010
2018207562.tif 000011