(57)【要約】  本発明の課題は、巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離する方法、並びに巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離するための血小板分離キットを提供することである。本発明によれば、磁性微粒子を少なくとも巨核球に取り込ませる取り込み工程、上記取り込み工程の前および／または後において巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程、上記取り込み工程および培養工程後の培養液に磁場を印加する磁場印加工程、および上記磁場印加工程後の培養液を回収する回収工程を含む、巨核球と血小板とを分離する方法が提供される。
2018169060.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性微粒子を少なくとも巨核球に取り込ませる取り込み工程、
前記取り込み工程の前および／または後において巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程、
前記取り込み工程および培養工程後の培養液に磁場を印加する磁場印加工程、および
前記磁場印加工程後の培養液を回収する回収工程を含む、
巨核球と血小板とを分離する方法。
【請求項２】
巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させ、磁性微粒子を前記巨核球および前記血小板に取り込ませ、前記培養液に磁場を印加し、その後に前記培養液を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
磁性微粒子を巨核球に取り込ませ、前記巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させ、前記培養液に磁場を印加し、その後に前記培養液を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
磁性微粒子が、平均粒子径１０〜１０００ｎｍの微粒子である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
磁性微粒子が、超常磁性酸化鉄粒子である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記取り込み工程において、培養液に磁性微粒子を１〜１０００μｇ／ｍｌの濃度で添加する、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記磁場印加工程において、培養液に１０〜４００ｍＴの磁場を印加する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
培養容器と、磁性微粒子と、磁場印加手段とを少なくとも含む、巨核球と血小板とを分離するための血小板分離キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球と、巨核球から生産された血小板とを分離する方法に関する。本発明はさらに血小板分離キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は血小板製剤として、輸血治療に用いられている。血小板製剤は、一般に献血によって得た血液から調製されるが、血小板製剤の供給量は献血者の減少等の外的要因の影響を受けやすい。そのため、献血に代替される血小板ソースの開発が着目されている。近年、多能性幹細胞や、造血前駆細胞、間葉系細胞をソースとして、巨核球を培養することによって血小板を体外で大量に生産する技術が報告されている(特許文献１)。巨核球の細胞質が千切れることによって、血小板が生産されるため、血小板生産後の培養液には、多数の巨核球が含まれる。巨核球が混入していることで血小板製剤は、免疫原性を示す可能性が有る。そのため、巨核球と巨核球から生産された血小板を分離する技術の開発が必要である。【０００３】
細胞を分離する手法として、細胞の比重差に基づいて分離する遠心分離法が一般的に用いられている。例えば、特許文献２には、内部に流入口および流出口に連通する貯血空間を有する遠心分離器と、遠心分離器の流入口と採血手段とに接続する第１のラインと、遠心分離器の流出口に接続された第２のラインと、第１のラインの途中に接続された第１のチューブおよび第２のラインに接続された第２のチューブを有する血漿採取バッグと、第２のラインに接続された血小板採取バッグとを備える血小板採取回路と、第１のラインに設けられた送血ポンプとを備え、遠心分離器により採血された血液を複数の血液成分に分離するとともに分離された血液成分のうち少なくとも血小板を血小板バッグに採取する血小板採取装置が記載されている。【０００４】
また、抗体を結合した磁気ビーズと細胞培養液を混合することで、特定のマーカーを持つ細胞だけを磁気ビーズに吸着させ、磁場を印加することで細胞を分離する方法も知られている。例えば、特許文献３には、磁気ビーズと所定の細胞とを含む流体を左右に分断するための第１の流体分断手段、左右に分断された流体を上方に分断するための第２の流体分断手段、左右に分断された流体を下方に分断するための第３の流体分断手段、および上方に分断された流体と下方に分断された流体とを合流させる流体合流手段を有するマイクロミキサーと、 マイクロミキサーを透過した後の、流体中における磁気ビーズと、磁気ビーズに付着した細胞とを、流体の残部から分離するためのセパレータと、を具えることを特徴とする、細胞分離装置が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０９／１２２７４７
【特許文献２】特開２００３−０９３４９９号公報
【特許文献３】特開２００６−００６１６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献２に記載されているような細胞の比重差に基づいて細胞を分離する遠心分離法により血小板を分離する場合においては、巨核球と血小板の比重が近いため、遠心分離法でこれらの分泌物を分離する際には大きな遠心加速度が必要となり、その遠心力による分泌物の活性化や変形が懸念される。また、巨核球と血小板とは膜表面マーカーの発現の有無に差は見られないと考えられていることから、特許文献３に記載されているような特定のマーカーを持つ細胞だけを磁気ビーズに吸着させて磁場を印加することで細胞を分離する方法は、巨核球と血小板の分離のためには適用することができない。【０００７】
本発明の課題は、巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離する方法、並びに巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離するための血小板分離キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、細胞質内に磁性粒子を導入して細胞を磁性化した後に磁場を印加することで、巨核球と血小板とを分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  磁性微粒子を少なくとも巨核球に取り込ませる取り込み工程、
上記取り込み工程の前および／または後において巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程、
上記取り込み工程および培養工程後の培養液に磁場を印加する磁場印加工程、および
上記磁場印加工程後の培養液を回収する回収工程を含む、
巨核球と血小板とを分離する方法。
［２］  巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させ、磁性微粒子を上記巨核球および上記血小板に取り込ませ、上記培養液に磁場を印加し、その後に上記培養液を回収する、［１］に記載の方法。
［３］  磁性微粒子を巨核球に取り込ませ、上記巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させ、上記培養液に磁場を印加し、その後に上記培養液を回収する、［１］に記載の方法。
［４］  磁性微粒子が、平均粒子径１０〜１０００ｎｍの微粒子である、［１］から［３］の何れか一に記載の方法。
［５］  磁性微粒子が、超常磁性酸化鉄粒子である、［１］から［４］の何れか一に記載の方法。
［６］  上記取り込み工程において、培養液に磁性微粒子を１〜１０００μｇ／ｍｌの濃度で添加する、［１］から［５］の何れか一に記載の方法。
［７］  上記磁場印加工程において、培養液に１０〜４００ｍＴの磁場を印加する、［１］から［６］のいずれか一に記載の方法。
［８］  培養容器と、磁性微粒子と、磁場印加手段とを少なくとも含む、巨核球と血小板とを分離するための血小板分離キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法およびキットによれば、巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、磁性微粒子を導入した細胞の切片をベルリンブルー染色した結果を示す。
【図２】図２は、磁性微粒子を導入した細胞について、磁石非接触の場合と磁石接触の場合の様子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による巨核球と血小板とを分離する方法は、
磁性微粒子を少なくとも巨核球に取り込ませる取り込み工程、
上記取り込み工程の前および／または後において巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程、
上記取り込み工程および培養工程後の培養液に磁場を印加する磁場印加工程、および
上記磁場印加工程後の培養液を回収する回収工程を含む。
【００１３】
本発明の方法は、輸血治療等に用いる血小板製剤を製造する上で、体外で血小板を大量に生産する際の血小板の分離方法として利用可能である。
【００１４】
＜巨核球および血小板について＞
巨核球は造血幹細胞に由来する細胞であり、巨核球系前駆細胞、巨核芽球細胞、および前巨核球を経て形成される多形核を有する細胞である。巨核球は、骨髄の中に存在し直径３５〜１６０μｍの骨髄中で最大の造血系細胞である。巨核球は、血小板を産出する。１個の巨核球から数千個の血小板が産出される。なお、巨核球の細胞質が分解して血小板になった後、巨核球は細胞質を失い裸核となり、裸核はマクロファージにより分解される。本発明で言う巨核球とは、成熟した巨核球のほか、巨核球系前駆細胞、巨核芽球細胞、前巨核球等を含んでいてもよい。
【００１５】
血小板は、血液に含まれる細胞成分の一種である。血小板は、血栓の形成に中心的な役割を果たし、血管壁が損傷した際には血小板凝集によって止血する作用を有する。
【００１６】
巨核球および血小板は、成体組織から採取した巨核球および血小板でもよいし、多能性幹細胞、造血前駆細胞または間葉系細胞等の分化能を有する細胞から分化させた巨核球および血小板でもよいし、通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで作製された巨核球および血小板でもよいし、上記を組み合わせたものでもよい。
【００１７】
巨核球および血小板が由来する生物種は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、羊、ブタ、サルなど）であり、より好ましくはヒトである。
【００１８】
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。
造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員（Ｇ−ＣＳＦ）末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞または末梢血由来細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの造血前駆細胞としては、例えば、ＣＤ３４陽性のもの（例えばＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞あるいはＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−およびＣＤ３４＋細胞のもの）が挙げられる（国際公開ＷＯ２００４／１１０１３９）。
間葉系細胞としては、例えば、間葉系幹細胞および脂肪前駆細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞としては、例えば、繊維芽細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
多能性幹細胞、造血前駆細胞または間葉系細胞等の分化能を有する細胞を分化させることによって巨核球および血小板を産生する方法は、当業者に一般的に知られた方法に従って行えばよく、特に限定されない。分化能を有する細胞を、巨核球に分化させるのに適した分化誘導培地を用いて適切な培養条件下において培養することにより、分化能を有する細胞を巨核球へと分化させることができ、巨核球からさらに血小板が産生されるようになる。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで巨核球および血小板を産生する方法としては、巨核球への誘導遺伝子を発現するように遺伝子導入するか、または、特定の核酸、タンパク質もしくは低分子化合物等を培養液中に添加することで、通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞を巨核球に分化することで巨核球へと分化させることができる。
【００２０】
＜磁性微粒子を少なくとも巨核球に取り込ませる取り込み工程＞
磁性微粒子としては、超常磁性体、常磁性体および強磁性体の微粒子の何れを使用してもよいが、超常磁性体の微粒子を使用することが好ましい。
【００２１】
常磁性とは、外部磁場が無いときには磁化を持たず、磁場を印加するとその方向に弱く磁化する磁性を示す。
強磁性とは、隣り合うスピンが同一方向を向いて整列し、全体として大きな磁気モーメントを持つ物質の磁性を示す。強磁性体は、外部磁場が無くても自発磁化を持つことができる。
超常磁性は、強磁性体のナノ粒子に発現する性質である。磁性ナノ粒子では磁化の向きが温度の影響でランダムに反転しうるが、反転が起こるまでの時間をネール緩和時間という。外場の無い状態で、磁性ナノ粒子の磁化測定時間がネール緩和時間よりもずっと長い時、磁化は平均してゼロであるように見え、この状態を超常磁性という。
【００２２】
本発明で用いる磁性微粒子の平均粒子径は特に限定されないが、好ましくは１０〜１０００ｎｍであり、より好ましくは１０〜５００ｎｍであり、さらに好ましくは１０〜１００ｎｍである。
磁性微粒子の平均粒子径は、光子相関分光法により測定することができる。
【００２３】
超常磁性体の微粒子としては、鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）またはガドリニウム（Ｇｄ）を含む微粒子が挙げられ、鉄（Ｆｅ）を含む微粒子が好ましい。
鉄（Ｆｅ）を含む微粒子としては、好ましくは、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）微粒子が挙げられ、具体的には、酸化鉄（ＩＩ）（ＦｅＯ）、酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）（Ｆｅ3Ｏ4）、酸化鉄（ＩＩＩ）（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、または、それらの混合物を含む微粒子が挙げられる。
【００２４】
超常磁性酸化鉄は、高分子で被覆されていることが好ましく、カルボキシデキストランで被覆された超常磁性酸化鉄（酸化鉄（ＩＩＩ）（γ−Ｆｅ2Ｏ3））（例えば、リゾビスト（登録商標））およびデキストランで被覆された超常磁性酸化鉄（酸化鉄（ＩＩ）（ＦｅＯ）と酸化鉄（ＩＩ，ＩＩＩ）（Ｆｅ3Ｏ4）の混合物（例えば、フェリデックス（登録商標））がより好ましい。
【００２５】
磁性微粒子を少なくとも巨核球に取り込ませる取り込み工程としては、巨核球（または巨核球および血小板）を含む培養液に磁性粒子を添加するインキュベーション法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ソノポレーション、レーザー照射等の物理的な方法；並びにトランスフェクション等の化学的な方法等が挙げられる。
【００２６】
上記の中でも、好ましくは、巨核球（または巨核球および血小板）を含む培養液に磁性微粒子を添加するインキュベーション法を採用することができる。インキュベーション法においては、巨核球（または巨核球および血小板）を含む培養液に磁性微粒子を添加し、適当な温度（例えば２５℃〜５０℃、好ましくは３０℃〜４５℃）で適当な時間（例えば、１時間から４８時間、好ましくは４時間〜２４時間）インキュベートすればよい。
【００２７】
巨核球（または巨核球および血小板）を含む培養液に磁性微粒子を添加する場合、磁性微粒子の濃度は、本発明の目的が達成できる限り特に限定されないが、１〜１０００μｇ／ｍｌが好ましく、１０〜１０００μｇ／ｍｌがより好ましく、１００〜１０００μｇ／ｍｌがさらに好ましく、５００〜１０００μｇ／ｍｌが特に好ましい。
【００２８】
巨核球（または巨核球および血小板）の細胞質内部への磁性微粒子の取り込みは、培養後の細胞の細胞切片の塗抹標本を作製し、ベルリンブルーなどの適当な染色液で染色することにより確認することができる。
【００２９】
＜巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程＞
本発明においては、上記の取り込み工程の前および／または後において、巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程を行う。即ち、本発明においては、巨核球と血小板の分離は、巨核球を培養して、あらかじめ血小板を産生させた後に、巨核球と血小板の混合液に対して適用することもできるし、巨核球に磁性微粒子を取り込ませた後に、血小板を産生させて得られた混合液に対して適用することもできる。
【００３０】
従って、本発明は、以下の態様の何れでもよい。
（態様１）巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させ、磁性微粒子を巨核球および血小板に取り込ませ、培養液に磁場を印加し、その後に培養液を回収する。
（態様２）磁性微粒子を巨核球に取り込ませ、巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させ、培養液に磁場を印加し、その後に培養液を回収する。
（態様３）巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させ、磁性微粒子を巨核球および血小板に取り込ませ、巨核球を培養液中でさらに培養して血小板を産生させ、培養液に磁場を印加し、その後に培養液を回収する。
【００３１】
上記の中でも好ましくは態様１または態様２であり、より好ましくは態様１である。
【００３２】
巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程は、通常の細胞培養の方法に従って行うことができる。培養期間は特に限定されないが、一般的には３時間〜３０日であり、好ましくは２４時間〜２０日であり、より好ましくは３日〜１４日程度である。
【００３３】
＜培養液に磁場を印加する磁場印加工程＞
培養液に磁場を印加する手段（磁場印加手段）としては、永久磁石または電磁石を用いる方法が挙げられる。永久磁石としては、セラミック磁石、金属磁石およびボンド磁石が挙げられ、セラミック磁石および金属磁石が好ましい。セラミック磁石または金属磁石としては、サマリウムコバルト（サマコバ）磁石、アルニコ磁石、フェライト磁石およびネオジム磁石が挙げられる。サマコバ磁石はサマリウムとコバルトを主成分とした磁石である。アルニコ磁石は、アルミニウム、ニッケル、コバルトなどを原料として鋳造された磁石である。フェライト磁石は、フェライト磁性体による磁石である。ネオジム磁石は、ネオジム、鉄およびホウ素を主成分とする磁石である。
【００３４】
上記の永久磁石は単体で用いてもよいし、永久磁石を含む装置を用いてもよい。電磁石は、超電導電磁石であってもよい。
【００３５】
磁場印加工程においては、培養液に１０〜４００ｍＴの磁場を印加することが好ましく、培養液に１０〜１５０ｍＴの磁場を印加することがより好ましい。
磁場を印加する時間は特に限定されないが、一般的には３０秒〜５分程度である。
【００３６】
＜磁場印加工程後の培養液を回収する回収工程＞
巨核球は、巨核球から産生される血小板よりも多くの磁性微粒子をその内部に取り込むことが予想される。このため、巨核球および血小板を含む培養液に磁場を印加することにより、血小板に比べて、多数の巨核球が磁界方向に沿って移動することになる。従って、磁場印加工程後の培養液を回収することにより、血小板を効率的に回収することができる。
【００３７】
磁性微粒子を取り込んだ巨核球が磁界方向に沿って移動することは、細胞を顕微鏡等で観察することにより確認することができる。
【００３８】
回収液中における巨核球および血小板の存在量（細胞数）を確認するためには、回収液を標識した抗ＣＤ４１ａ抗体と反応させ、次いで核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２と反応させ、フローサイトメトリーを行うことができる。巨核球分画および血小板分画を決定し、血小板分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陰性細胞を血小板とし、巨核球分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陽性細胞を巨核球とすることにより、回収液中の血小板数および巨核球数を算出することができる。
【００３９】
＜血小板分離キット＞
本発明によれば、培養容器と、磁性微粒子と、磁場印加手段とを少なくとも含む、巨核球と血小板とを分離するための血小板分離キットが提供される。
培養容器としては、細胞を培養し、細胞に磁場を印加するのに適した容器であれば特に限定されず、例えばプレート、ディッシュ、シャーレ、または培養フラスコなどを使用することができる。プレートとしては、マルチウエルプレート（例えば、６ウエルプレート、２４ウエルプレートなど）を使用してもよい。
磁性微粒子および磁場印加手段としては、本明細書中で上記したものを使用することができる。
【００４０】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
下記略号は以下の意味を示す。
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＤＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）
ＰＥ：フィコエリシン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）
７−ＡＡＤ：７−アミノ−７−アクチノマイシンＤ
【実施例】
【００４１】
＜実施例１＞
（１）細胞液の調製
ヒト巨核球および血小板を調製するための分化誘導培地として、Ｓｔｅｍｓｐａｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（×１００）（和光純薬工業社製）を添加したＳｔｅｍｓｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。上記の分化誘導培地を使用して、ＢＭ−ＣＤ３４＋Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌｌｃｅｌｌ社）を低接着ポリスチレン製６ウエルプレート（Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）上で１４日培養した。培養中の浮遊細胞を１５ｍＬチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、１７００×ｇ、室温で５分遠心した。上清を捨て１％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）入りのＤＰＢＳ（１００μｌ）で懸濁した。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（登録商標）標識抗ＣＤ４１ａ抗体（日本ベクトンディッキンソン社製）１０μｌ、ＰＥ標識抗ＣＤ４２ｂ抗体（日本ベクトンディッキンソン社製）１０μｌを加え、遮光で３０分反応した。１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１ｍＬ）を加えて、１７００×ｇ、室温で５分遠心し、上清を捨てた。７−ＡＡＤを加えた１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１００μｌ）で懸濁し、遮光で１５分反応した後に、１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（３００μｌ）を加えて、フローサイトメトリー（ＢＤ（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）社製、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）により測定した。巨核球系細胞株であるＭＥＧ−０１（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入）をコントロールとして、ＦＳＣ（前方散乱光：  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）、ＳＳＣ（側方散乱光  ：ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）ゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。各抗体のアイソタイプコントロール抗体で染色したサンプルとの比較から、ＣＤ４１ａ陽性およびＣＤ４２ｂ陽性細胞の存在を確認し、ＢＭ−ＣＤ３４＋  Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓからの巨核球分化および巨核球からの血小板産生を確認した。【００４２】
（２）細胞への磁性微粒子導入
上記（１）の方法で得たヒト巨核球および血小板培養液にカルボキシデキストランで被覆された平均粒子径（光子相関分光法）約５７ｎｍの超常磁性酸化鉄から成る親水性コロイド液であるリゾビスト（登録商標）注（富士フイルムＲＩファーマ製）を培養液１ｍＬ当たり３．５９μＬ（超常磁性酸化鉄１００μｇ）添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。巨核球の細胞質内部への超常磁性酸化鉄の取り込みを確認するため、培養後の細胞をパラフィン包埋した後に、ミクロトームを用いて５μｍ厚にスライスし、細胞切片の塗抹標本を作製し、ベルリンブルー染色（和光純薬工業社製）を行った結果を図１に示す。【００４３】
（３）磁性化細胞への磁場印加
上記（２）の方法で得た培養液のプレートの底面に、円柱型、φ２０×１０（ｍｍ）径のサマコバ磁石を１分間接触させることで、超常磁性酸化鉄を取り込んだ巨核球がプレート中央部に集積することを確認した（図２）。磁石に集積していない巨核球および血小板を回収するため、クエン酸−デキストロース溶液（ＡＣＤ）（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）が入った１５ｍＬ遠心分離用コニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に培養液上清を全回収した。また、ＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で２回洗浄し、洗浄液をコニカルチューブに回収した。【００４４】
（４）回収細胞数のカウント
回収液を１５ｍＬチューブに回収し、１７００×ｇ、室温で１０分遠心した。上清を捨て１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１００μｌ）で懸濁した。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（登録商標）標識抗ＣＤ４１ａ抗体１０μｌを加え、遮光で３０分反応した。１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１ｍＬ）を加えて、１７００×ｇ、室温で１０分遠心し、上清を捨てた。核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えた１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１００μＬ）で懸濁し、遮光環境で１５分反応した。１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（３００μＬ）を加え、ＢＤ  Ｔｒｕｃｏｕｎｔ  ｔｕｂｅｓ（日本ベクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）により測定した。巨核球系細胞株であるＭＥＧ−０１をコントロールとして、ＦＳＣ、ＳＳＣゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。血小板分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陰性細胞を血小板とし、巨核球分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陽性細胞を巨核球とすることで、回収液中の血小板数および巨核球数を算出した。以下の式から得た血小板回収率および巨核球回収率を表１に示す。【００４５】
血小板回収率（％）＝
（磁場印加後に得た回収液中の血小板数／元の液中の血小板数）×１００【００４６】
巨核球回収率（％）＝
（磁場印加後に得た回収液中の巨核球数／元の液中の巨核球数）×１００【００４７】
巨核球除去率（％）＝１００−巨核球回収率（％）【００４８】
超常磁性酸化鉄を取り込ませた後に、磁場を印加することで得られる血小板の分離性能は以下の指標を基に分類した。
指標値（Ｉ）  血小板回収率（％）／巨核球回収率（％）
指標値（ＩＩ）巨核球除去率（％）【００４９】
分離性能Ａ：指標値（Ｉ）≧１．５、指標値（ＩＩ）≧２５％
分離性能Ｂ：指標値（Ｉ）＜１．５、指標値（ＩＩ）≧２５％
分離性能Ｃ：指標値（Ｉ）＜１．５、指標値（ＩＩ）＜２５％【００５０】
＜実施例２〜６および比較例１＞
実施例１の（２）の方法において、ヒト巨核球および血小板培養液にリゾビスト(登録商標)注を培養液１ｍＬ当たり０．０３５９μＬ（１．００μｇ、実施例２）、０．３５９μＬ（１０．０μｇ、実施例３）、１．７９μＬ（５０．０μｇ、実施例４）、１７．９μＬ（５００μｇ、実施例５）、３５．９μＬ（１０００μｇ、実施例６）で添加したこと以外は実施例１と同様の操作を実施した。比較例１については、リゾビストを添加せず、実施例１と同様の操作を実施した。結果を図３および表１に示す。【００５１】
＜実施例７〜９および比較例２＞
実施例１の（３）の方法において、プレートの底面に接触させる際の磁石を円柱型、φ２０×１０（ｍｍ）径のアルニコ磁石（実施例７）、フェライト磁石（実施例８）、またはネオジム磁石（実施例９）としたこと以外は実施例１と同様の操作を実施した。なお、各磁石を接触させた際の培養液に印加された磁場の磁束密度は、テスラメーター（ＴＭ−７０１、カネテック社製）を用いて、測定した。
比較例２については、磁場を印加せず、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表２に示す。【００５２】
【表１】
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【００５３】
【表２】
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【図１】
2018169060.tif 000005
【図２】
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【国際調査報告】
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