(57)【要約】  本発明は、新しいバイオマーカーに基づく、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法及びがんの悪性度を評価する方法を提供することを目的とする。本発明に係る被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法は、被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルを測定する工程と、ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程と、を備える。被験者のがんの悪性度を評価する方法は、被験者のがん組織から採取した試料を抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色する工程と、ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位の有無に基づいて被験者のがんの悪性度を評価する工程と、を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法であって、
前記被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルを測定する工程と、
前記ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて、前記被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程と、
を備える方法。
【請求項２】
前記被験者のがん組織から採取した試料のＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定する工程をさらに備え、
前記被験者に対する前記抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程において、前記ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて予測を行う、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−１抗体がニボルマブである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが肺がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記肺がんが非小細胞肺がんである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非小細胞肺がんが肺腺がんである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現レベルの測定を免疫組織化学により行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＡＴ１の発現レベルの測定を免疫組織化学により行い、前記免疫組織化学は、前記試料から調製された単一切片を単染色することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＡＴ１の発現レベルの測定と前記ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの測定とを免疫組織化学により行い、前記免疫組織化学は、前記試料から調製された各連続切片を単染色することを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＡＴ１の発現レベルの測定と前記ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの測定とを免疫組織化学により行い、前記免疫組織化学は、前記試料から調製された単一切片を二重染色することを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
被験者のがんの悪性度を評価する方法であって、
前記被験者のがん組織から採取した試料を抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色する工程と、
ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位の有無に基づいて、前記被験者のがんの悪性度を評価する工程と、
を備える方法。
【請求項１２】
前記がんが肺がん、大腸がん、膵がん又は胆道がんである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記染色工程が、前記試料から調製された各連続切片を単染色することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記染色工程が、前記試料から調製された単一切片を二重染色することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与されることを特徴とし、
前記抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同時に又は別々に投与される、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩。
【請求項１６】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩と、の組み合わせを含む、抗がん剤。
【請求項１７】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩と、を含む、がんを治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＰＤ−１抗体若しくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法、がんの悪性度を評価する方法、及び抗ＰＤ−１抗体若しくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を上昇させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫チェックポイント阻害薬として、ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １）／ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ−１）を標的とする薬剤が開発されている。例えば、抗ＰＤ−１モノクローナル抗体としてニボルマブ及びペムブロリズマブが開発されており、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体としてアテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブが開発されている。また、抗ＰＤ−１抗体療法の奏効性を予測する方法として、患者のがん細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現を調べる方法が開発されている。【０００３】
ＰＤ−Ｌ１の発現は、多くのがん（腎がん、食道がん、胃がん、尿路上皮がん、膵がん、黒色腫等）で予後との逆相関が認められている（非特許文献１）。しかしながら、近年の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体医薬又は抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体医薬の奏効率と、患者のがん組織のＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現強度との相関は明らかではなく、ＰＤ−Ｌ１の発現強度の測定がいわゆるコンパニオン診断としての役割を果たしているとは言い難い状態である。【０００４】
がん組織に発現しているＬＡＴ１（Ｌ−ｔｙｐｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  １）はがん胎児タンパク質の一種で、悪性度（致死率）の高いがん組織での発現レベルが高い。このＬＡＴ１の発現強度と患者の致死率との間の高い相関性が、多くのがん（肺がん；非特許文献２、胃がん；非特許文献３、膵がん；非特許文献４、胆道がん；非特許文献５、子宮内膜がん；非特許文献６、前立腺がん；非特許文献７、大腸がん、乳腺がん、頭頚部がん、生殖器がん、及び軟部組織がん；非特許文献８）で報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】本庶ら、「抗ＰＤ−１抗体によるがん治療の基礎と臨床応用」、２０１３台日科学技術フォーラム、トランスレーショナル医療とバイオ産業の発展、２０１３年９月２３日；http://www.tnst.org.tw/ezcatfiles/cust/img/img/20130923_jp11.pdf
【非特許文献２】Kaira et al., "Prognosticsignificance of L-type amino acid transporter 1 expression in resectable stageI-III nonsmall cell lung cancer.", Br J Cancer. 98(4):742-8, 2008.
【非特許文献３】Ichinoe et al., "High expressionof L-type amino-acid transporter 1 (LAT1) in gastric carcinomas: Comparisonwith non-cancerous lesions.", Pathol Int. 61(5):281-9, 2011.
【非特許文献４】Yanagisawa et al. "Highexpression of L-type amino acid tansporter 1 (LAT1) predicts poor prognosis inpancreatic ductal adenocarcinomas.", J Clin Pathol. 65(11): 1019-23, 2012.
【非特許文献５】Yanagisawa et al, "Highexpression of L-type amino acid transporter 1 (LAT1) as a prognostic marker inbile duct adenocarcinomas.", Cancer Med. 3(5):1246-55, 2014.
【非特許文献６】Watanabe et al., "L-typeamino acid transporter 1 (LAT1) expression increases in well-differentiated butdecreases in poorly differentiated endometrial endometrioid adenocarcinoma, andshows an inverse correlation with p53 expression.", Int J Gynecol Cancer.24(4): 659-63, 2014.
【非特許文献７】Sakata et al., "L-typeamino-acid transporter 1 as a novel biomarker for high-grade malignancy inprostate cancer.", Pathol Int. 59(1):7-18, 2009.
【非特許文献８】Kaira K et al., "L-typeamino acid transporter 1 and CD98 expression in primary and metastatic sites ofhuman neoplasms.", Cancer Sci. 99(12):2380-6, 2008.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
がん組織を構成するがん細胞の細胞膜には、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１が存在している。これらそれぞれについてがんの悪性度との関連性が示唆されているものの、これら２種のがん特異的タンパク質が相互に関連性を持つか否かにつき未だ明確な報告はない。【０００７】
本発明が解決すべき課題の一つは、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性の予測に使用できる新たなバイオマーカーの提供にある。また、本発明が解決すべき別の課題の一つは、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の関連性を明らかにすることにある。【０００８】
ある特定のがん（肺がん、胃がん、大腸がん等）組織を構成する多くのがん細胞は不揃いで、均一ではない。同一疾患名のがんに罹患している患者一人一人の状況は全て異なるため、抗がん療法には個別化医療が原則とされる。本発明者らは、２つのがんマーカーＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１を登場させることにより、多くの不均一患者のがん組織を、大雑把にではあるが、幾つかのサブタイプに分けることが可能と考え、実際に分類を試みた。その結果、表１にまとめたように、ＰＤ−Ｌ１の発現レベルが高いがん組織（Ｐ−優位タイプ）、ＬＡＴ１の発現レベルが高いがん（Ｌ−優位タイプ）、及び、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の両方を発現する細胞を含み、かつ、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の発現レベルが高いがん（ＰＬ−共存タイプ）の３タイプに、がん組織を分けることができた。
【表１】
2019093383.tif 000002
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＬＡＴ１ががんの新たなバイオマーカーとなることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法であって、被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルを測定する工程と、ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて、被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程とを備える方法を提供する。【００１０】
上記方法において、ＬＡＴ１の発現レベルとＰＤ−Ｌ１の発現レベルとの組み合わせから、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測してもよい。すなわち、上記方法において、被験者のがん組織から採取した試料のＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定する工程をさらに実施してもよく、また、被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程において、ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて予測を行ってもよい。【００１１】
上記方法において、抗ＰＤ−１抗体はニボルマブであってよい。【００１２】
上記方法において、がんは肺がんであってよく、非小細胞肺がんであってよく、肺腺がんであってよい。【００１３】
上記方法において、ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルの測定には免疫組織化学を用いることができる。【００１４】
上記方法において、免疫組織化学は、種々の条件で実施できる。表２に、免疫組織化学の種々の条件の例を示す。ＬＡＴ１のみを染色する免疫組織化学では、抗ＬＡＴ１抗体を用いて単一切片を単染色することができる。ＰＤ−Ｌ１のみを染色する免疫組織化学では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて単一切片を単染色することができる。ＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１の両方を染色する免疫組織化学では、２つの連続切片を用意し、片方の切片を抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて単染色し、もう片方の切片を抗ＬＡＴ１抗体を用いて単染色することができる。あるいは、ＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１の両方を染色する免疫組織化学では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＬＡＴ１抗体を用いて単一切片を二重染色することもできる。単染色の場合、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１を同じ色、例えば褐色（ＤＡＢ色素）に染めることができる。二重染色の場合、異なるがんマーカーを異なる色、例えば、緑色と赤色の色素を用いて染色してもよい。判定の精度は条件によって異なる。なお、免疫組織化学に先立って、病理組織に通常用いるヘマトキシリン−エオジン染色により細胞の形を観察することもできる。
【表２】
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【００１５】
すなわち、免疫組織化学は、被験者のがん組織から採取された試料から調製された単一切片を単染色することを含んでもよく、被験者のがん組織から採取された試料から調製された各連続切片を単染色することを含んでもよく、被験者のがん組織から採取された試料から調製された単一切片を二重染色することを含んでもよい。【００１６】
また、本発明者らは、ＰＬ−共存タイプのがん患者は予後が良くないことを見出した。すなわち、本発明は、被験者のがんの悪性度を評価する方法をも提供する。かかる方法は、被験者のがん組織から採取した試料を抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色する工程と、ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位の有無に基づいて、被験者のがんの悪性度を評価する工程と、を備える。がんは、肺がん、大腸がん、膵がん又は胆道がんであってよい。染色工程は、被験者のがん組織から採取された試料から調製された各連続切片を単染色することを含んでもよく、被験者のがん組織から採取された試料から調製された単一切片を二重染色することを含んでもよい。【００１７】
さらに、本発明は、以下に示す、がんを治療する方法及び抗ＰＤ−１抗体若しくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を上昇させる方法も提供する。
［１］被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定する工程と、上記ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて、上記被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程と、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が高いと予測された上記被験者に抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程と、を備える、がんを治療する方法。
［２］抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が高いと予測された上記被験者に抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程において、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬とを投与する、［１］に記載の方法。
［３］被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルを測定する工程と、上記ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて、上記被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程と、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が低いと予測された上記被験者に抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬とを投与する工程と、を備える、がんを治療する方法。
［４］上記抗ＰＤ−１抗体がニボルマブである、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の方法。
［５］上記がんが肺がんである、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の方法。
［６］上記肺がんが非小細胞肺がんである、［５］に記載の方法。
［７］上記非小細胞肺がんが肺腺がんである、［６］に記載の方法。
［８］上記発現レベルの測定を免疫組織化学により行う、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］上記ＬＡＴ１の発現レベルの測定を免疫組織化学により行い、上記免疫組織化学は、上記試料から調製された単一切片を単染色することを含む、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］上記ＬＡＴ１の発現レベルの測定と上記ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの測定とを免疫組織化学により行い、上記免疫組織化学は、上記試料から調製された各連続切片を単染色することを含む、［１］に記載の方法。
［１１］上記ＬＡＴ１の発現レベルの測定と上記ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの測定とを免疫組織化学により行い、上記免疫組織化学は、上記試料から調製された単一切片を二重染色することを含む、［１］に記載の方法。
［１２］被験者に抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬とを投与する工程を備える、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を上昇させる方法。
［１３］上記被験者が、上記被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が高いと予測された被験者である、［１２］に記載の方法。
［１４］上記被験者が、上記被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルに基づいて、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が低いと予測された被験者である、［１２］に記載の方法。【００１８】
さらに、本発明は、以下に示す、抗がん化合物及びその使用、抗がん剤、キット、並びに医薬組成物も提供する。
［１５］抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与されることを特徴とし、上記抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同時に又は別々に投与される、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩。
［１６］抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩と、の組み合わせを含む、抗がん剤。
［１７］抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩と、の組み合わせを含む、がんを治療するためのキット。
［１８］抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩と、を含む、がんを治療するための医薬組成物。
［１９］抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与されることを特徴とし、上記抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同時に又は別々に投与される、がんの治療における使用のための、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩。
［２０］抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて投与されることを特徴とし、上記抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同時に又は別々に投与される医薬の製造のための、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩の使用。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、抗ＰＤ−１抗体若しくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測すること、がんの悪性度を評価すること、又は、抗ＰＤ−１抗体若しくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を上昇させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】表１に示したがん組織のタイプ分類によりＰ−優位タイプに分類された、ＰＤ−Ｌ１の発現レベルが高いがんの例を示す図である。
【図２】表１に示したがん組織のタイプ分類によりＬ−優位タイプに分類された、ＬＡＴ１の発現レベルが高いがんの例を示す図である。
【図３】表１に示したがん組織のタイプ分類によりＰＬ−共存タイプに分類された、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の両方を発現する細胞を含み、かつ、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の発現レベルが高いがんの例を示す図である。
【図４】大腸がん組織の染色の結果の一例を示す図である。
【図５】トリプルネガティブ乳がんの連続切片を用いた染色の結果の一例を示す図である。
【図６】膵がん組織の染色の結果の一例を示す図である。
【図７】膵がん組織の染色の結果の別の一例を示す図である。
【図８】ニボルマブを投与された肺がん症例におけるＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１発現の免疫組織学的病理画像の一例を示す図である。
【図９】ニボルマブを投与された肺がん症例におけるＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１発現の免疫組織学的病理画像の別の一例を示す図である。
【図１０】ニボルマブを投与された肺がん症例におけるＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１発現の免疫組織学的病理画像のさらに別の一例を示す図である。
【図１１】ＰＤ−Ｌ１発現レベルに従ったＬＡＴ１発現（全症例）を表すグラフである。上はＰＤ−Ｌ１高発現群を、下はＰＤ−Ｌ１低発現群を表す。
【図１２】ＬＡＴ１発現レベルに従ったＰＤ−Ｌ１発現（全症例）を表すグラフである。上はＬＡＴ１高発現群を、下はＬＡＴ１低発現群を表す。
【図１３】ＰＤ−Ｌ１発現レベルに従ったニボルマブの治療効果（全症例）を表すグラフである。上はＰＤ−Ｌ１高発現群を、下はＰＤ−Ｌ１低発現群を表す。
【図１４】ＬＡＴ１発現レベルに従ったニボルマブの治療効果（全症例）を表すグラフである。上はＬＡＴ１高発現群を、下はＬＡＴ１低発現群を表す。
【図１５】ニボルマブ奏効例及び増悪例におけるＬＡＴ１発現の割合を表すグラフである。上は奏効群を、下は増悪群を表す。
【図１６】抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及びＬＡＴ１阻害薬の作用機序を示す概念図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
抗ＰＤ−１抗体療法及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法とは、患者にそれぞれ抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与するがんの治療方法である。抗ＰＤ−１抗体として、例えば、ニボルマブ及びペムブロリズマブなどのヒト型抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体として、例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブなどのヒト型抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体が挙げられる。
【００２２】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与に先立って、それぞれ抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体が奏効するか否かを予測することが、医療経済の観点及び患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｏｆ  Ｌｉｆｅ）の観点から重要である。本発明の一実施形態に係る、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法は、被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルを測定し、ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する。本発明の別の実施形態に係る抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法は、被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定し、ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する。ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の両方をバイオマーカーとして用いることで、ＬＡＴ１単独又はＰＤ−Ｌ１単独をバイオマーカーとして用いる場合よりも正確に奏効性を予測することが可能となる。
【００２３】
被験者のがん組織から採取した試料における、ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定する方法は特に限定されず、例えば、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）等の公知の方法が挙げられる。
【００２４】
ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する。奏効性予測の基準として、例えば、（ａ）ＬＡＴ１低発現の被験者に治療効果を示す可能性が高い、（ｂ）ＬＡＴ１高発現の被験者に治療効果を示す可能性が低い、を設定し得る。ＬＡＴ１の発現の高低は測定方法に依存するが、例えば、免疫組織化学の場合、試料中の全細胞に対してＬＡＴ１陽性細胞が２５％未満の場合をＬＡＴ１低発現と定義し、２５％以上の場合をＬＡＴ１高発現と定義することができる。
【００２５】
また、ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測することもできる。奏効性予測の基準として、例えば、（ｃ）ＬＡＴ１低発現かつＰＤ−Ｌ１高発現の被験者に治療効果を示す可能性が高い、（ｄ）ＬＡＴ１高発現かつＰＤ−Ｌ１低発現の被験者に治療効果を示す可能性が低い、を設定し得る。ＰＤ−Ｌ１の発現の高低は測定方法に依存するが、例えば、免疫組織化学の場合、試料中の全細胞に対してＰＤ−Ｌ１陽性細胞が１０％未満の場合をＰＤ−Ｌ１低発現と定義し、１０％以上の場合をＰＤ−Ｌ１高発現と定義することができる。
【００２６】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性の予測の対象となるがんは特に限定されないが、例えば、肺がん、特に、非小細胞肺がん及び肺腺がんを対象とし得る。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、がんを治療する方法も提供する。かかる方法では、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する上記方法により得られた結果に基づいて、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法を行うことができる。具体的には、本発明の一実施形態に係るがんを治療する方法は、被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定する工程と、ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて、被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程と、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が高いと予測された被験者に、それぞれ抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する工程と、を備える。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法の詳細は、上述したとおりである。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する方法は特に限定されず、例えば、静脈注射により抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することができる。
【００２８】
上記患者には、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせてＬＡＴ１阻害薬を投与してもよい。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬とは、同時に又は別々に投与することができる。ＬＡＴ１阻害薬は特に限定されず、例えば、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシンであってよい。ＬＡＴ１阻害薬を投与する方法は特に限定されず、例えば、静脈注射によりＬＡＴ１阻害薬を投与することができる。本発明者らの新たな発見によれば、ＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１とは相互に関連しており、驚くべきことに、ＬＡＴ１の発現又は活性が低下すると、ＰＤ−Ｌ１の発現が上昇する。したがって、患者のがん細胞におけるＬＡＴ１の発現レベル又は活性をＬＡＴ１阻害薬により低下させることにより、患者のがん細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現レベルを上昇させることができる。ＰＤ−Ｌ１の発現レベルが高いほど抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体による治療効果は上昇すると考えられるため、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせてＬＡＴ１阻害薬を投与することにより、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を単独で投与する場合と比べて、より顕著な抗がん効果を得ることができる。
【００２９】
また、本発明の別の一実施形態に係るがんを治療する方法は、被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルを測定する工程と、上記ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて、上記被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程と、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が低いと予測された上記被験者に、それぞれ抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬とを投与する工程と、を備える。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬とは、同時に又は別々に投与することができる。ＬＡＴ１の発現レベルが高い患者（Ｌ−優位タイプ又はＰＬ−共存タイプの患者）において抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体を単独で投与しても、その奏効性は低いと予測され得る。しかしながら、上述のとおり、ＬＡＴ１阻害薬は、患者におけるＬＡＴ１の発現レベル又は活性を低下させるだけでなく、ＰＤ−Ｌ１発現レベルを上昇させることができるため、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬を併用することにより、ＬＡＴ１の元々の発現レベルが高い、Ｌ−優位タイプ又はＰＬ−共存タイプの患者においても、ＬＡＴ１の発現レベルが低くかつＰＤ−Ｌ１の発現レベルが高いＰ−優位タイプにおいて得られる抗がん効果と同程度の抗がん効果を得ることができる。
【００３０】
同様の観点から、本発明の一実施形態は、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法とＬＡＴ１阻害療法とを併用することを含む、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を上昇させる方法を提供するといえる。かかる方法は、被験者に抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とＬＡＴ１阻害薬とを投与する工程を備える。上記被験者は、上記被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が高いと予測された被験者であってもよいし、上記被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルに基づいて、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法が治療効果を示す可能性が低いと予測された被験者であってもよい。
【００３１】
図１６に抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、及びＬＡＴ１阻害薬の作用機序を示す。図１６（Ａ）は、抗がん療法を行っていないときの、患者におけるＴ細胞とがん細胞を示す。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非存在下ではＴ細胞のＰＤ−１とがん細胞のＰＤ−Ｌ１とが結合可能な状態にある。患者に抗ＰＤ−１抗体を投与することで、図１６（Ｂ）−１に示すように、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合が阻害される。これにより貪食細胞がＰＤ−Ｌ１を認識することができるようになるため、抗がん効果が発揮される。一方、患者に抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することで、図１６（Ｂ）−２に示すように、がん細胞のＰＤ−Ｌ１と抗ＰＤ−Ｌ１抗体が結合する。これにより貪食細胞がＰＤ−Ｌ１を強く認識することができるようになるため、抗がん効果が発揮される。抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体に加えてＬＡＴ１阻害薬を患者に投与することで、図１６（Ｃ）−１及び（Ｃ）−２に示すように、ＬＡＴ１阻害薬がＬＡＴ１の働きを阻害するため、がん細胞内へのアミノ酸供給が低下し、がん細胞のアポトーシスが増加する。それだけでなく、ＬＡＴ１阻害薬によりＰＤ−Ｌ１の発現レベルが上昇するため、より多くの貪食細胞がＰＤ−Ｌ１を認識することができるようになり、よって、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の奏効性が上昇する。したがって、より顕著な抗がん効果を得ることができると推察される。
【００３２】
本発明の一実施形態に係る、被験者のがんの悪性度を評価する方法は、被験者のがん組織から採取した試料を抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色する工程と、ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位の有無に基づいて、被験者のがんの悪性度を評価する工程と、を備える。抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体による染色は、免疫組織化学により行うことができる。
【００３３】
悪性度が高いがん組織においては、ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位が存在する傾向にあり、悪性度が低いがん組織においては、ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位が存在しない傾向にあるという知見を本発明者らは見出している。したがって、ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位の有無に基づいてがんの悪性度を評価できる。
【００３４】
悪性度の評価に基づいて被験者に対する治療方針を決定することができる。
【００３５】
悪性度の評価の対象となるがんは特に限定されないが、例えば、肺がん、大腸がん、膵がん及び胆道がんを対象とし得る。
【実施例】
【００３６】
（染色例１）
がん患者３名からがん組織を採取し、単一切片を抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて二重染色した結果を図１〜図３に示した。【００３７】
図１は、肺がん組織の染色の結果の一例である（倍率４００倍）。上段左はＬＡＴ１を緑色の色素で染めたときの写真を表し、上段右はＰＤ−Ｌ１を赤色の色素で染めたときの写真を表し、下段は両者を重ねた写真を表す。この肺がん組織ではＰＤ−Ｌ１が優位に染め出されている。【００３８】
図２は、乳がん組織の染色の結果の一例である（倍率４００倍）。上段左はＬＡＴ１を緑色の色素で染めたときの写真を表し、上段右はＰＤ−Ｌ１を赤色の色素で染めたときの写真を表し、下段は両者を重ねた写真を表す。この乳がん組織ではＬＡＴ１が優位に染め出されている。【００３９】
図３は、肺がん組織の染色の結果の別の一例である（倍率４００倍）。上段左はＬＡＴ１を緑色の色素で染めたときの写真を表し、上段右はＰＤ−Ｌ１を赤色の色素で染めたときの写真を表し、下段は両者を重ねた写真を表す。下段の枠で囲った部分に黄色の染色像が認められた。黄色の染色像は、赤色の染色像と緑色の染色像が重なった結果であり、黄色で染まった部分には、ＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１の両方が存在していることを意味する。すなわち、この肺がん組織は、ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の両方を発現する細胞を含む、ＰＬ−共存タイプのがん組織の一例である。【００４０】
（染色例２）
大腸がん患者からがん組織を採取し、単一切片をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）及び抗体（抗ＬＡＴ１、抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１）を用いて染色した。結果を図４に示した（倍率２００倍）。ＨＥは切片を紫色に染色し、抗体は切片を褐色に染める。上段左はＨＥ染色像である。上段右は抗ＬＡＴ１抗体による染色像である。下段左は抗ＰＤ−１抗体による染色像である。下段右は抗ＰＤ−Ｌ１抗体による染色像である。この大腸がん組織ではＬＡＴ１が強陽性であった。【００４１】
（染色例３）
トリプルネガティブ乳がん患者からがん組織を採取し、連続切片をＨＥ及び抗体（抗ＬＡＴ１、抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ１）を用いて染色した。結果を図５に示した（倍率４００倍）。上段左はＨＥ染色像である。上段右は抗ＬＡＴ１抗体による染色像である。下段左は抗ＰＤ−１抗体による染色像である。下段右は抗ＰＤ−Ｌ１抗体による染色像である。この乳がん組織ではＰＤ−Ｌ１が陽性であった。【００４２】
（染色例４）
膵がん患者からがん組織を採取し、単一切片を抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて二重染色した。結果を図６に示した（倍率４００倍）。上段左はＬＡＴ１を緑色の色素で染めたときの写真を表し、上段右はＰＤ−Ｌ１を赤色の色素で染めたときの写真を表し、下段は両者を重ねた写真を表す。下段の写真に、ＰＬ−共存タイプのがん組織を示す黄色は認められなかった。【００４３】
図７に、別の膵がん患者のがん組織の結果を示す。上段左はＬＡＴ１を緑色の色素で染めたときの写真を表し、上段右はＰＤ−Ｌ１を赤色の色素で染めたときの写真を表し、下段は両者を重ねた写真を表す。下段の写真に、ＰＬ−共存タイプのがん組織を示す黄色の陽性所見（矢印の部分）が明白に認められた。【００４４】
（試験例１）非小細胞性肺がんでのニボルマブの奏効性の予測（１）
以下の試験例１〜３において、ＬＡＴ１の発現レベル、又はＬＡＴ１の発現レベルとＰＤ−Ｌ１の発現レベルとの組み合わせに基づいた、ニボルマブの奏効性の予測について検討した。本試験に組み込まれた、初回化学療法無効な再発進行非小細胞肺がんの患者２１名（ステージＩＩＩ／ＩＶ）からがん組織を採取し、抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた免疫組織化学によりＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現を調べた。ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１発現の高発現及び低発現の判定基準を表３及び表４に示す。ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１ともに、腫瘍の細胞膜が染色されたときを陽性と判定して、１０％以上のＰＤ−Ｌ１陽性細胞を有する腫瘍をＰＤ−Ｌ１高発現であると定義し、２５％以上のＬＡＴ１陽性細胞を有する腫瘍をＬＡＴ１高発現であると定義した。
【表３】
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【表４】
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【００４５】
非小細胞肺がんの患者２１名（ステージＩＩＩ／ＩＶ）の患者背景を表５に示す。
【表５】
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【００４６】
その後、患者にニボルマブを投与し、ニボルマブの奏効性を調べた。ニボルマブの治療効果は、ＲＥＣＩＳＴ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ）によるＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）で判定した。奏効率は、腫瘍の大きさをＣＴで計測して、奏効、増悪、又は安定のいずれかに分類する国際判断基準に従って評価した。奏効は、薬剤の投与後に、腫瘍の長径に３０％以上の縮小が認められた場合を指す。増悪は、薬剤の投与後に、腫瘍の長径に２０％以上の増大が認めた場合を指す。安定は、奏効と分類するには腫瘍の縮小が不十分で、かつ増悪と分類するには治療開始以降の最小の最長径の和に比して腫瘍の増大が不十分である場合を指す。【００４７】
図８〜図１０に、いくつかの症例におけるＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１発現の免疫組織学的病理画像を示した。【００４８】
図８は、ニボルマブ治療に奏効して、１０カ月以上無増悪生存が得られている患者の治療前のがん組織の染色の結果を示す図である（倍率２００倍）。左はＰＤ−Ｌ１抗体による染色像を示し、右はＬＡＴ１抗体による染色像を示す。ＰＤ−Ｌ１は高発現であるのに対し、ＬＡＴ１は低発現であった。【００４９】
図９は、ニボルマブ治療で増悪した患者の治療前のがん組織の染色の結果を示す図である（倍率２００倍）。左はＰＤ−Ｌ１抗体による染色像を示し、右はＬＡＴ１抗体による染色像を示す。ＬＡＴ１は高発現であるのに対し、ＰＤ−Ｌ１は低発現であった。【００５０】
図１０は、ニボルマブ治療で増悪した患者の治療前のがん組織の染色の結果を示す図である（倍率２００倍）。左はＰＤ−Ｌ１抗体による染色像を示し、右はＬＡＴ１抗体による染色像を示す。ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の発現は共に高発現であった。【００５１】
図８〜図１０の結果から、ＰＤ−Ｌ１が高発現でありＬＡＴ１が低発現である患者（Ｐ−優位タイプの患者）においてはニボルマブ治療の奏効性が高くなり、ＰＤ−Ｌ１が低発現でありＬＡＴ１が高発現である患者（Ｌ−優位タイプの患者）並びにＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の両方が高発現である患者（ＰＬ−共存タイプの患者）においては、ニボルマブを単独で用いた治療が奏効しないか、奏効性が低くなることが示唆された。【００５２】
２１人の患者のがん組織試料における、２つのがんマーカーの発現レベルの結果を図１１と図１２に示す。ＰＤ−Ｌ１の高発現群は２１例中８例（図１１上）であり、低発現群は１３例（図１１下）であった。ＰＤ−Ｌ１の高発現群のうち、ＬＡＴ１の高発現群は１例であり、低発現群は７例であり、この差異は統計学的に有意であった（ｐ＝０．０１０）。ＰＤ−Ｌ１の低発現群のうち、ＬＡＴ１の高発現群は８例であり、低発現群は５例であり、統計学的有意差は認められなかった（ｐ＝０．４３３）。【００５３】
ＬＡＴ１の高発現群は２１例中９例（図１２上）であり、低発現群は１２例（図１２下）であった。ＬＡＴ１の高発現群のうち、ＰＤ−Ｌ１の高発現群は１例であり、低発現群は８例であり、この差異は統計学的に有意であった（ｐ＝０．００３）。ＬＡＴ１の低発現群のうち、ＰＤ−Ｌ１の高発現群は７例であり、低発現群は５例であり、統計学的有意差は認められなかった（ｐ＝０．６８４）。【００５４】
以上の結果から、非小細胞性肺がん患者のがん組織中のＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１発現の間には、負の相関が認められた。【００５５】
表５の組織型の行に示すように、非小細胞性肺がんの全症例２１症例中、１７例は肺腺がんであり、４例は扁平上皮がんであった。この肺腺がん１７例を解析すると、ＰＤ−Ｌ１高発現の７例すべてがＬＡＴ１低発現であった（図示せず）。また、ＬＡＴ１高発現の８例すべてがＰＤ−Ｌ１低発現であった（図示せず）。したがって、いずれの組織型のがんにおいても、２つのがんマーカーに負の相関が認められた。ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１発現の間の上記負の相関は、がん組織内での両マーカーの未知のＣｒｏｓｓ−ｔａｌｋの存在を伺わせる。【００５６】
（試験例２）非小細胞性肺がんでのニボルマブの奏効性の予測（２）
ＰＤ−Ｌ１の発現レベルのみに基づいてニボルマブの奏効性を予測することの可能性について検討した。２つのがんマーカーを指標にした、上記２１人の患者のがん組織試料におけるニボルマブの奏効性を表す結果を、図１３及び図１４に示す。図１３上はＰＤ−Ｌ１高発現群の奏効性を、図１３下はＰＤ−Ｌ１低発現群の奏効性を表す。ＰＤ−Ｌ１高発現群は８例であり、そのうち４例が奏効であり、１例が増悪であり、３例が安定であった。他方、ＰＤ−Ｌ１低発現群は１３例であり、そのうち３例が奏効であり、７例が増悪、３例が安定であった。【００５７】
図１４上はＬＡＴ１高発現群の奏効性を、図１４下はＬＡＴ１低発現群の奏効性を表す。ＬＡＴ１高発現群は９例であり、そのうち１例が奏効であり、６例が増悪、２例が安定であった。他方、ＬＡＴ１低発現群は１２例であり、そのうち４例が奏効であり、３例が増悪、５例が安定であった。【００５８】
以上の結果から、ＰＤ−Ｌ１高発現の場合にニボルマブの奏効性が高いと予測し、ＰＤ−Ｌ１低発現の場合にニボルマブの奏効性が低いと予測したとすると、奏効性を正しく予測できた例は、２１例中７例（ＰＤ−Ｌ１高発現群の奏効例４例＋ＰＤ−Ｌ１低発現群の奏効例３例）、すなわち全患者の３分の１にとどまることになる。つまり、ニボルマブの奏効には大前提としてＰＤ−Ｌ１の発現が必須ではあるが、ＰＤ−Ｌ１の発現レベルのみに基づいてニボルマブの奏効性を予測した場合、予測の正確性は３３％となる。【００５９】
（試験例３）非小細胞性肺がんでのニボルマブの奏効性の予測（３）
ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の発現レベルに基づいてニボルマブの奏効性を予測することの可能性について検討した。上記２１症例の非小細胞性肺がん患者でのニボルマブの奏効と増悪の結果を図１５にまとめた。図１５上は奏効群を、図１５下は増悪群を表す。奏効群７例のうち、ＬＡＴ１高発現群は１例であり、ＬＡＴ１低発現群は６例であり、統計学的有意差が認められた（ｐ＝０．０２９）。また、増悪群７例のうちＬＡＴ１高発現群は５例であり、ＬＡＴ１低発現群は２例であり、統計学的有意差は認められなかった。【００６０】
ＰＤ−Ｌ１の発現自体は２１例全部に認められたが、７例が奏効（奏効率＝３３％）で、１４例が非奏効であり、非奏効の半分の７例は増悪を示した。奏効した７例のうちＬＡＴ１の低発現群が６例であることから、ＰＤ−Ｌ１を発現し、かつＬＡＴ１低発現である場合にニボルマブの奏効性が高いと予測することにより、奏効率の予測の正確性は８５％（＝６／７）に達する。一方、上記結果から、ＬＡＴ１の高発現に基づく増悪率の予測の正確性は、７１％（＝５／７）となる。【００６１】
（試験例４）ＰＤ−Ｌ１とＬＡＴ１が同一細胞に発現するがん細胞を有する患者の予後予測
既に図３及び図１０で示したような、上記２つのがんマーカーが同一細胞に存在する、ＰＬ−共存タイプのがん組織を有する患者の予後を表６に例示した。ＰＬ−共存タイプにおいては、同一細胞に２つのがんマーカーが発現しているので、ＰＬ−共存タイプは、各マーカーに対する分子標的に特異的な治療薬に対して抵抗性を発揮すると考えられる。ＰＬ−共存タイプ組織の検出には、単一切片を用いた二重染色を施す必要があるので、高い技術が必要とされる。標的がん細胞に対する新規の治療法の開発が、この治療抵抗性を克服できるものと思われる。【００６２】
大腸がん、膵がん、肺がん及び胆道がんの患者２名ずつからがん組織を採取し、抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いた免疫組織化学によりＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現を調べた。ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の両方を発現する細胞が存在するか否かを調べ、表６にまとめた。【００６３】
【表６】
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【００６４】
表６から明らかなように、ＬＡＴ１とＰＤ−Ｌ１の両方を発現する細胞をがん組織中に含む患者は、ＬＡＴ１とＰＤ−Ｌ１の両方を発現する細胞をがん組織中に含まない患者と比較して、生存年数が短いことが分かった。【００６５】
（試験例５）ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１のノックダウンの相互効果
ｓｉＲＮＡを使ってＰＤ−Ｌ１又はＬＡＴ１のｍＲＮＡ発現の転写レベルでの抑制を試みた。ＷｉＤｒ細胞（ヒト結腸腺がん由来）、ＳＫＮ細胞（ヒト子宮平滑筋肉腫細胞由来）、及びＨ５２０細胞（ヒト肺扁平上皮がん細胞由来）を培養皿に播種した。ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ＬＡＴ１のｍＲＮＡ発現を抑制するｓｉＲＮＡ、又はコントロールｓｉＲＮＡを細胞に導入した。ｓｉＲＮＡとしては、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社のＡｍｂｉｏｎ（登録商標）シリーズのＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ  ｓｉＲＮＡｓを用いた。具体的には、ＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現を抑制するｓｉＲＮＡとしては、配列番号１及び２で示されるｓｉＰＤ−Ｌ１＃２（ｓｉＲＮＡ  ＩＤ：ｓ２６５４８）を、ＬＡＴ１のｍＲＮＡ発現を抑制するｓｉＲＮＡとしては、配列番号３及び４で示されるｓｉＬＡＴ１＃３（ｓｉＲＮＡ  ＩＤ：ｓ１５６５３）を、コントロールｓｉＲＮＡとしては、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃２（Ｃａｔ＃：３９０８４７）を用いた。発現抑制の効果が顕著に表れやすい４８時間後に細胞を回収し、定量ＰＣＲ法にて、細胞当たりのＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現量を解析した。結果を表７に示す。【００６６】
【表７】
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【００６７】
表７において、細胞当たりのｍＲＮＡの発現量は、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞のｍＲＮＡの発現量を１とした相対値で表した。ＷｉＤｒ細胞、ＳＫＮ細胞、及びＨ５２０細胞のいずれにおいても、ＰＤ−Ｌ１及びＬＡＴ１の発現を、それぞれのマーカーに対応するｓｉＲＮＡにより十分に抑制できることが確認された。また、ＰＤ−Ｌ１の発現を抑制するとＬＡＴ１の発現が増加し、ＬＡＴ１の発現を抑制するＰＤ−Ｌ１の発現が増加した。これらの結果より、ＰＤ−Ｌ１又はＬＡＴ１どちらか一方の発現の抑制が他方の発現を増加させること、及び、これらのタンパク質はがん細胞において相補的に働くことが示唆された。【００６８】
（試験例６）ＪＰＨ２０３によるＰＤ−Ｌ１発現量の変化
ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子抑制のかわりに、阻害薬ＪＰＨ２０３を用いたＬＡＴ１活性の抑制を行い、試験例５と同様の結果が得られるかを調べた。ＪＰＨ２０３はＯ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシンである。ＨｕｃｃＴ１細胞（ヒト胆管がん由来）及びＯＳＴ細胞（ヒト骨線維肉腫由来）を培養皿に播種した。３０μＭのＪＰＨ２０３（ＬＡＴ１選択的阻害薬）で２４時間処理した後、細胞を回収し、定量ＰＣＲ法にてＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現量を解析した。結果を表８に示す。【００６９】
【表８】
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【００７０】
表８において、細胞当たりのｍＲＮＡの発現量は、ＪＰＨ２０３で処理しなかったコントロールの発現量を１とした相対値で表した。ＨｕｃｃＴ１細胞及びＯＳＴ細胞の両方で、ＰＤ−Ｌ１の発現が増加した。この結果より、ＬＡＴ１活性の選択的阻害によってＰＤ−Ｌ１の発現が増加することが示された。この結果は、試験例５の結果とともに、ＬＡＴ１とＰＤ−Ｌ１ががん細胞において相補的に働くことを裏付ける。また、ＬＡＴ１の阻害によりＰＤ−Ｌ１の発現が増加したことから、ＬＡＴ１阻害療法によって、患者におけるＬＡＴ１の発現レベル又は活性を低下させるとともにＰＤ−Ｌ１の発現レベルを上昇させることができると考えられる。すなわち、ＬＡＴ１阻害療法によって、患者におけるＰＤ−Ｌ１の発現レベルをＰ−優位タイプの患者におけるそれに近づけることができると考えられる。試験例１及び試験例３の結果が示すように、ＰＤ−Ｌ１高発現かつＬＡＴ１低発現の患者（Ｐ−優位タイプの患者）におけるニボルマブの奏効性は高い。したがって、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法とＬＡＴ１阻害療法とを組み合わせることによって、患者に抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を上昇させることができることが、本試験例により示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月4日(2019.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する方法であって、
前記被験者のがん組織から採取した試料のＬＡＴ１の発現レベルを測定する工程と、
前記ＬＡＴ１の発現レベルに基づいて、前記被験者に対する抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程と、を備える方法。
【請求項２】
前記被験者のがん組織から採取した試料のＰＤ−Ｌ１の発現レベルを測定する工程をさらに備え、
前記被験者に対する前記抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法の奏効性を予測する工程において、前記ＬＡＴ１及びＰＤ−Ｌ１の発現レベルに基づいて予測を行う、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＰＤ−１抗体がニボルマブである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記がんが肺がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記肺がんが非小細胞肺がんである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記非小細胞肺がんが肺腺がんである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現レベルの測定を免疫組織化学により行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＡＴ１の発現レベルの測定を免疫組織化学により行い、前記免疫組織化学は、前記試料から調製された単一切片を単染色することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＡＴ１の発現レベルの測定と前記ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの測定とを免疫組織化学により行い、前記免疫組織化学は、前記試料から調製された各連続切片を単染色することを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＡＴ１の発現レベルの測定と前記ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの測定とを免疫組織化学により行い、前記免疫組織化学は、前記試料から調製された単一切片を二重染色することを含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
被験者のがんの悪性度を評価する方法であって、
前記被験者のがん組織から採取した試料を抗ＬＡＴ１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体で染色する工程と、
ＬＡＴ１陽性かつＰＤ−Ｌ１陽性の部位の有無に基づいて、前記被験者のがんの悪性度を評価する工程と、
を備える方法。
【請求項１２】
前記がんが肺がん、大腸がん、膵がん又は胆道がんである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記染色工程が、前記試料から調製された各連続切片を単染色することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記染色工程が、前記試料から調製された単一切片を二重染色することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩と、の組み合わせを含む、抗がん剤。
【請求項１７】
抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と、Ｏ−（５−アミノ−２−フェニルベンズオキサゾール−７−イル）メチル−３，５−ジクロロ−Ｌ−チロシン又はその薬理学的に許容される塩と、を含む、がんを治療するための医薬組成物。
【国際調査報告】
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