(57)【要約】種々の乳酸菌の乳酸生成を抑制し、高密度培養を可能とする乳酸菌の培養方法を提供する。流加培養により乳酸菌を培養する。流加培養により乳酸菌を培養すると、回分培養で培養した場合と比べて、乳酸の生成が抑制され、乳酸濃度が高くなることに起因する乳酸菌の増殖阻害を低減できる。したがって、回分培養で乳酸菌を培養した場合と比べて、高密度で乳酸菌を培養することが可能となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高密度培養を行うための乳酸菌の培養方法であって、
流加培養により乳酸菌を培養することを特徴とする、乳酸菌の培養方法。
【請求項２】
糖源として、スクロースまたはガラクトースを用いることを特徴とする、請求項１に記載の乳酸菌の培養方法。
【請求項３】
乳酸菌が、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus及びLactococcus lactisのいずれかである、請求項１または２に記載の乳酸菌の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は糖をピルビン酸に代謝することによってＡＴＰを獲得し、この過程で必要となるNAD+をピルビン酸から乳酸への変換により再生する。このため、乳酸菌の増殖に伴って生成された乳酸が蓄積して培地のｐＨが低下し、乳酸菌の増殖や物質生産が阻害される。培地のｐＨの低下は、アルカリを添加することによって抑制することができる。しかしながら、培地にアルカリを添加してｐＨを維持しても、乳酸が蓄積すると乳酸自体による乳酸菌の増殖阻害が生じるため、乳酸菌の高密度培養は困難とされている。【０００３】
さらに、乳酸菌から生成される乳酸は、増殖だけではなく、乳酸菌素材としての質にも影響を与える。近年、乳酸菌はプロバイオティクスとして注目を集めており、様々な食品に利用されているが、乳酸またはその塩は独特の風味を有するため、培養物中の乳酸量は少ないことが望ましい。また、乳酸菌を粉末素材に加工する際には、乳酸の存在は吸湿を引き起こす原因となる。このように、乳酸菌の培養時に生成される乳酸は、乳酸菌自身の増殖を阻害し、乳酸菌素材としての質を低下させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2001-211878号公報
【特許文献２】特公平6-69367号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
乳酸による増殖阻害を回避する方法として、生成された乳酸を低濃度に抑える高い希釈率で連続培養を行う方法や、濾過や電気透析等による乳酸を除去する方法がある（例えば、特許文献1及び2参照）。しかしながら、これらの方法には、排水処理及び設備にコストがかかるという問題がある。【０００６】
また、乳酸菌の乳酸生成を抑制する方法として、ヘミンの添加により呼吸鎖のNADHデヒドロゲナーゼを活性化してNADHからNAD+を再生し、ピルビン酸から乳酸への変換を抑制する培養法があるが、NADHの酸化に必要な酸素を供給する必要があるために酸素感受性の低い一部の菌株にしか利用できない。【０００７】
それ故に、本発明は、種々の乳酸菌の乳酸生成を抑制し、高密度培養を可能とする乳酸菌の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、高密度培養を行うための乳酸菌の培養方法であって、流加培養により乳酸菌を培養することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、種々の乳酸菌の培養時の乳酸生成を抑制し、高密度培養を可能とする乳酸菌の培養方法を提供できる。また、菌体収率、即ち、使用した糖あたりの菌体収量を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１における菌体量及び乳酸量の経時変化を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２における菌体量及び乳酸量の経時変化を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３における菌体量及び乳酸量の経時変化を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４における菌体量及び乳酸量の経時変化を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例５における菌体量及び乳酸量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る乳酸菌の培養方法は、流加培養により乳酸菌を培養することを特徴とするものである。流加培養は、培養中に培地または培地中の基質を供給しながら培養を行う培養方法である。培地中で乳酸菌を培養すると、乳酸菌の増殖に伴って生成される乳酸の濃度が増加し、乳酸自体による乳酸菌の増殖阻害が生じる。本願の発明者は、流加培養を行うことによって、回分培養を行った場合と比べて有意に乳酸の生成が抑制されることを見出した。乳酸菌は糖を解糖系によってピルビン酸に代謝することによってATPを獲得し、この過程で必要となるNAD+を乳酸脱水素酵素によるピルビン酸から乳酸への変換により再生する。しかし、乳酸菌は乳酸脱水素酵素以外にもNAD+を再生する経路をもっており、また、解糖系以外にも、ATPを獲得する経路を持っている。本発明の発明者は、これらの経路のほとんどが糖、特に、グルコースがある程度以上の濃度で存在すると抑制されてしまうこと気づいた。これは、培養に必要な糖を、培養開始時に一気に与えるのではなく、流加培養によって少量ずつ与えて培地中のグルコースをはじめとする糖の濃度を低く保てば、これらの経路が抑制されるのを回避できることを意味している。また、これらの経路が十分な能力をもっていない乳酸菌の場合、ATPの獲得を解糖系に頼り、NAD+の再生を乳酸脱水素酵素に頼ることになるが、糖を流加によって少量ずつ供給すれば、これらの経路が抑制されることを回避できるだけでなく、エネルギー生産に占める解糖系によるエネルギー獲得の割合を下げ、また、NAD+再生に占める乳酸脱水素酵素の寄与を下げることができ、結果として、乳酸生産の抑制につながる。乳酸の生成が抑制されると、乳酸菌の増殖阻害を低減できるので、回分培養を行う場合と比べて、高密度（高濃度）で乳酸菌を培養することが可能となる。
【００１２】
糖源として使用可能な糖としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース等の単糖類、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース等の二糖類を例示できる。これらの糖の中でも、グルコースまたはスクロースが好ましく、スクロースがより好ましい。糖源としてスクロースを用いた場合、グルコースを用いた場合と比べて更に乳酸の生成を抑制することができる。
【００１３】
培地には、常法に従い、糖源のほかに、アミノ酸、ビタミン、核酸、金属塩等の栄養素や、ｐＨ変動を抑制するための緩衝液等を配合する。
【００１４】
本発明に係る培養方法で培養可能な乳酸菌の菌株は特に限定されず、種々の菌株を高密度培養することができる。例えば、本発明に係る培養方法では、Lactobacillus属、Lactococcus属、Leuconostoc属に含まれる種・株を高密度培養することができる。ヘミンの添加により乳酸の生成を抑制する方法では、上述したように、酸素の供給が必要となるため、培養できる菌株が酸素感受性の低い一部の菌株に限られてしまうが、本発明に係る培養方法は、酸素供給を必要としないため、種々の菌株の培養に適用することができる。
【００１５】
培地のpH、溶存酸素の量、培養温度、培養時間等の培養条件、通常乳酸菌の培養に適用される条件であれば良く、菌株の種類に応じて適宜選択することができる。また、培養（本培養）の前に、前培養を行うことが好ましい。前培養とは、本培養に接種するための種菌を調製するための培養である。前培養を行うことにより、本培養の種菌として必要な菌体量を確保することができる。
【００１６】
また、本発明に係る培養方法は、乳酸菌が産生する特定の化学物質（ペプチド、タンパク質、多糖類等）を生産するために利用可能である。また、本発明に係る培養方法は、乳酸菌を高濃度で含有する発酵乳や、乳酸菌飲料、チーズ等の食品の製造にも利用可能である。本発明に係る培養方法を食品の製造に適用した場合、生理活性を有する特定の化学物質やこれを産生する乳酸菌を高濃度で含有する食品を製造することが可能となる。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明の実施例を説明する。【００１８】
（実施例1）
実施例1では、乳酸菌の菌株として、Lactobacillus gasseriJCM1131を使用した。【００１９】
まず、前培養を行った。糖源として、グルコースまたはスクロースを配合したMRS培地100 mLに、Lb. gasseriJCM1131のフローズンストックから100 μLを植菌し、37℃で12時間静置培養した。次に、糖源濃度が0 g/LのMRS培地100 mLを調製した。前培養液のOD660を測定し、本培養液を200 OD unitsにするのに必要な培養液量を算出した。前培養液を遠心分離（8,000×g、4℃、5 min）して生理食塩水で洗浄した後、本培養液に再懸濁し植菌した。【００２０】
流加培養における培地の流加速度Ｆ（L/h）は、比増殖速度を一定に保てるように下記式に基づいて計算した。
【数１】
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ここで、ｔは培養時間であり、初期培養液量V0は0.1 Lとした。初期菌体濃度X０は、OD660＝1.0のときに0.25 g-cell/Lであるとして算出した。流加培地の糖濃度SFは20 g/Lとし、菌体収率YX/Sは、糖源としてスクロースを用いる場合、0.1 g-cell/g-sugarとし、糖源としてグルコースを用いる場合、0.2 g-cell/g-sugarとした。比増殖速度μ*は、糖源としてスクロースを用いる場合、0.25 1/hとし、糖源としてグルコースを用いる場合、0.30 1/hに設定した。尚、糖源にスクロースを用いる場合とグルコースを用いる場合とで条件設定を同じにすると、実測値の比増殖速度に差が生じてしまうため、糖源にスクロースを用いる場合とグルコースを用いる場合とでそれぞれの菌体収率及び比増殖速度を設定した。これらの設定値を用いて上記の式から流加速度を決定した。また、3 M NaOH水溶液で培養液のpHを6.5に制御しながら直径3 cmのマグネットバーを用いて攪拌培養を行った。【００２１】
また、回分培養は、糖源としてグルコースまたはスクロースを20 g/Lの濃度で含有するMRS培地を用いて行った。培養液の量、植菌量及び培養条件は流加培養と同じとした。【００２２】
5 mLのシリンジを用いて、30分間間隔または１時間間隔でサンプリングラインから培養液をサンプリングした。サンプリングに際して、サンプリングラインに残存した培養液を捨てた後、1 mLの培養液をサンプリングした。【００２３】
サンプリングした培養液の濁度（OD660）を紫外可視分光光度計UV-1850（島津製作所社製）を用いて測定し、測定したOD660の値に基づいて培養液中の菌体量を算出した。また、サンプリングした培養液中の乳酸濃度は、バイオセンサーBF-5（王子計測機器株式会社製）及び酵素電極（王子計測機器株式会社製）を用いて測定した。乳酸濃度は、D-乳酸及びL-乳酸の合計濃度である。得られた菌体量に基づいて、菌体量の自然対数を培養時間に対してプロットしたグラフの傾きから実際の比増殖速度μを、積算菌体量に対して乳酸量をプロットしたグラフの傾きから比生産速度ρを求めた。増殖菌体量当たりの乳酸量YL/Xは、対数増殖している区間において、ρをμで除すことによって、菌体収率は消費した糖量で増加した菌体量を除すことによって算出した。【００２４】
表１に、本培養開始から所定時間後（流加培養では６時間後、回分培養では２時間後）の菌体量および乳酸量から算出した比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μ、菌体収率を示す。また、図1に、菌体量及び乳酸量の経時変化のグラフを示す。尚、以下に示す表1〜5において、誤差範囲は回帰分析による95%信頼区間を示している。【００２５】
【表１】
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【００２６】
表1に示すように、増殖菌体当たりの乳酸量は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で少なくなった。また、グルコース糖源を用いた回分培養と、スクロース糖源を用いた回分培養とを比べると、増殖菌体当たりの乳酸量は、スクロース糖源を用いた場合により少なかった。ただし、グルコースを糖源とした流加培養でもグルコースリプレッションによる影響が十分に軽減されたものと考えられる。また、菌体収率（g-cell/g-sugar）は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で高くなった。【００２７】
また、図1に示すように、流加培養を行った場合の菌体量は、本培養開始から5時間で回分培養を行った場合の菌体量を上回った。また、本培養開始から5時間における乳酸量を比較しても、回分培養に比べて流加培養で抑制されていた。【００２８】
（実施例2）
実施例2では、乳酸菌の菌株として、Lactobacillus plantarum subsp. plantarumNBRC15891を使用し、スクロースを糖源に用いた回分培養と、スクロースを糖源に用いた流加培養と、グルコースを糖源に用いた流加培養とを行った。培養方法、サンプリング方法、各評価値の算出方法は実施例1と同じである。【００２９】
表2に、本培養開始から所定時間後（流加培養では6時間後、回分培養では4時間後）の菌体量および乳酸量から算出した比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μ、菌体収率を示す。また、図2に、菌体量及び乳酸量の経時変化のグラフを示す。【００３０】
【表２】
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表2に示すように、糖源としてスクロースを用いた場合における増殖菌体当たりの乳酸量は、回分培養よりも流加培養で少なくなった。また、グルコース糖源を用いた回分培養と、スクロース糖源を用いた回分培養とを比べると、増殖菌体当たりの乳酸量は、スクロース糖源を用いた場合により少なかった。また、菌体収率（g-cell/g-sugar）は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で高くなった。【００３１】
また、図2に示すように、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、流加培養を行った場合の乳酸量は、糖源としてスクロースを用いた回分培養を行った場合と比べて抑制されていた。【００３２】
（実施例3）
実施例3では、乳酸菌の菌株として、Lactobacillus reuteriJCM1112を使用した。培養方法、サンプリング方法、各評価値の算出方法は実施例1と同じである。【００３３】
表3に、本培養開始から所定時間後（流加培養では3時間後、回分培養では2時間後）の菌体量および乳酸量から算出した比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μ、菌体収率を示す。また、図３に、菌体量及び乳酸量の経時変化のグラフを示す。【００３４】
【表３】
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【００３５】
表3に示すように、増殖菌体当たりの乳酸量は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で少なくなった。また、グルコース糖源を用いた流加培養と、スクロース糖源を用いた流加培養とを比べると、増殖菌体当たりの乳酸量は、スクロース糖源を用いた場合により少なかった。ただし、グルコースを糖源とした流加培養でもグルコースリプレッションによる影響が十分に軽減されたものと考えられる。また、菌体収率（g-cell/g-sugar）は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で高くなった。更に、実施例3では、グルコース糖源を用いた回分培養と、スクロース糖源を用いた回分培養とを比べると、増殖菌体当たりの乳酸量は、スクロース糖源を用いた場合により少なかった。Lb. reuteriは、スクロースをグルコースとフルクトースに分解し、フルクトースをマンニトールに変換することで、1分子のNAD+を再生することが報告されている。糖源にスクロースを用いることで、マンニトール生成によりNAD+を再生し、スクロース糖源で流加培養を行うことでさらにこの経路のフラックスが大きくなり、乳酸生成抑制に繋がったと考えられる。【００３６】
（実施例4）
実施例4では、乳酸菌の菌株として、Lactobacillus rhamnosusATCC53103を使用した。培養方法、サンプリング方法、各評価値の算出方法は実施例1と同じである。【００３７】
表4に、本培養開始から所定時間後（流加培養では5時間後、回分培養では2.5時間後）の菌体量および乳酸量から算出した比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μ、菌体収率を示す。また、図4に、菌体量及び乳酸量の経時変化のグラフを示す。【００３８】
【表４】
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【００３９】
表4に示すように、増殖菌体当たりの乳酸量は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で少なくなった。また、グルコース糖源を用いた流加培養と、スクロース糖源を用いた流加培養とを比べると、増殖菌体当たりの乳酸量は、スクロース糖源を用いた場合により少なかった。ただし、グルコースを糖源とした流加培養でもグルコースリプレッションによる影響が十分に軽減されたものと考えられる。また、菌体収率（g-cell/g-sugar）は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で高くなった。【００４０】
（実施例5）
実施例5では、乳酸菌の菌株として、Lactobacillus plantarumNCIMB8826を使用した。培養方法、サンプリング方法、各評価値の算出方法は実施例1と同じである。【００４１】
表5に、本培養開始から所定時間後（流加培養では5時間後、回分培養では4時間後）の菌体量および乳酸量から算出した比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μ、菌体収率を示す。また、図5に、菌体量及び乳酸量の経時変化のグラフを示す。【００４２】
【表５】
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【００４３】
表5に示すように、増殖菌体当たりの乳酸量は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で少なくなった。また、グルコース糖源を用いた流加培養と、スクロース糖源を用いた流加培養とを比べると、増殖菌体当たりの乳酸量は、スクロース糖源を用いた場合により少なかった。ただし、グルコースを糖源とした流加培養でもグルコースリプレッションによる影響が十分に軽減されたものと考えられる。また、菌体収率（g-cell/g-sugar）は、糖源としてグルコース及びスクロースのいずれを用いた場合においても、回分培養よりも流加培養で高くなった。【００４４】
（実施例6）
実施例6では、乳酸菌の菌株として、Lb. rhamnosusATCC53103を使用した。【００４５】
まず、前培養を行った。糖源として、グルコースまたはガラクトースを2%で含有するMRS培地100 mLに、Lb. rhamnosusATCC53103のフローズンストックから100 μLを植菌し、37℃で15時間静置培養した。【００４６】
次に、糖を含有しないMRS培地100 mLを調製した。前培養液のOD660を測定し、本培養液を100 OD unitsにするために必要な培養液量を算出した。前培養液を遠心分離（8,000×g、4℃、5 min）して生理食塩水で洗浄した後、本培養液に再懸濁し植菌した。流加培養における培地の流加速度F（L/h）は、比増殖速度を一定に保てるように下記式に基づいて計算した。ペリスタルティックポンプを用いて、算出した流速で流加培地を本培地に流加した。【００４７】
【数２】
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ここで、tは培養時間（h）であり、初期培養液量V0は0.1 Lとした。初期菌体濃度X0は、OD660＝1のときに0.25 g-cell/Lであるとして算出した。流加培地の糖濃度SFは10 g/Lとし、菌体収率YX/Sは、0.2 g-cell/g-sugarとした。マグネットスターラーの上に温度設定した恒温槽を置き、500 rpmでの撹拌培養を行った。【００４８】
また、回分培養は、糖源としてグルコースまたはガラクトースを2％で含有するMRS培地を用いて行った。培養液の量、植菌量及び培養条件は流加培養と同じとした。【００４９】
5 mLのシリンジを用いて、サンプリングラインから培養液をサンプリングした。サンプリングに際して、サンプリングラインに残存した培養液を捨てた後、1 mLの培養液をサンプリングした。【００５０】
サンプリングした培養液の濁度（OD660）を紫外可視分光光度計UV-1850（島津製作所社製）を用いて測定し、測定したOD660の値に基づいて培養液中の菌体量を算出した。また、サンプリングした培養液中の乳酸濃度は、バイオセンサーBF-5（王子計測機器株式会社製）及び酵素電極（王子計測機器株式会社製）を用いて測定した。
乳酸濃度は、D-乳酸及びL-乳酸の合計濃度である。得られた菌体量に基づいて、評価値として、比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μを算出した。【００５１】
表6に、本培養開始から流加培養と回分培養ともに3時間後の菌体量および乳酸量から算出した比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μを示す。尚、誤差範囲は回帰分析による95%信頼区間を示している。【００５２】
【表６】
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【００５３】
表6に示すように、Lb. rhamnosusATCC53103をガラクトースを用いて流加培養した場合、増殖菌体量当たりの乳酸量は2.56 g-lactate/g-cellとなり、最も抑制された。グルコースの回分培養と比較すると36%にまで抑制された。グルコースの流加培養、ガラクトースの回分培養と比較するとそれぞれ40%、49%にまで抑制されることが分かった。【００５４】
（実施例7）
実施例7では、乳酸菌の菌株として、Lactococcus lactis MG1363を使用した。【００５５】
まず、前培養を行った。糖源として、グルコースまたはガラクトースを2%で含有するMRS培地100 mLに、Lc. lactis MG1363のフローズンストックから100 μLを植菌し、30℃で15時間静置培養した。【００５６】
表7に、本培養開始から所定時間後（流加培養では3時間後、回分培養では2時間後）の菌体量および乳酸量から算出した比増殖速度μ、比生産速度ρ、増殖菌体量当たりの乳酸量ρ/μを示す。尚、誤差範囲は回帰分析による95%信頼区間を示している。【００５７】
【表７】
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【００５８】
表7に示すように、Lc. lactisMG1363をガラクトースを用いて流加培養した場合、増殖菌体量当たりの乳酸量は1.09 g-lactate/g-cellとなり、最も抑制された。グルコースの回分培養と比較すると11%にまで大幅に抑制され、ガラクトースの回分培養と比較すると、28%にまで抑制されることが分かった。【００５９】
以上のように、流加培養により乳酸菌を培養することにより、菌体量当たりの乳酸生成量が抑制されることが確認された。また、流加培養による乳酸生成量の抑制効果は、種々の乳酸菌の菌株において発現することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明は、乳酸菌の高密度培養に利用でき、特に、乳酸菌が産生する特定の化学物質の生産や、乳酸菌またはその産生物を高濃度で含有する食品の製造に利用できる。本発明により得られた培養物は、乳酸量が少ないため、乳酸の有する独特の風味が緩和されており、粉末加工時には吸湿が起こりにくいことから、食品やその素材として好適に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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