(57)【要約】  下記式（１）：Ｑ−ＣＨＲ２        （１）（式中、Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、Ｒは、生分解性基を含む脂肪族基である）で表される化合物が開示される。この化合物は、その他の脂質、凝集を低減できる脂質と組わせて脂質粒子とすることができる。さらにこの脂質粒子は、細胞に活性剤を送達する医薬組成物に適用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
Ｑ−ＣＨＲ２        （１）
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１２〜Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
で表されることを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記Ｑが、下記式（１−Ｑ）：
ＲＱ１２Ｎ−（ＣＲＱ２２）ｑ１−ＮＲＱ１−（ＣＲＱ２２）ｑ２−＊  （１−Ｑ）（式中、
ＲＱ１は、それぞれ独立に、アルキルであり、
ＲＱ２は、それぞれ独立に、水素またはアルキルであり、
ＲＱ１およびＲＱ２のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成してもよく、ｑ１は、１〜４の数であり、
ｑ２は、０〜４の数であり、
＊は、−ＣＨＲ２への結合位置を表す）
で表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｑが、下記：
【化１】
2020039631.tif 000021
（式中、＊は−ＣＨＲ２への結合位置を表す）
に示される構造のいずれかである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｒが、下記式（１−Ｒ）：
−ＬＲ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＬＲ２    （１−Ｒ）
（式中、
ＬＲ１はアルキレンであり、
ＬＲ２はアルケニルである）
で表される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記ＬＲ１および前記ＬＲ２が、それぞれ下記式（１−Ｒ１）および（１−Ｒ２）：
−（ＣＨ２）ｒ１−      （１−Ｒ１）
−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｒ２−Ｈ      （１−Ｒ２）
（式中、
ｒ１は、１〜１０の数であり、
ｒ２は、１〜１０の数である）
で表される請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記ｒ１が４〜８の数である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記Ｒに含まれる、最も長い分子鎖が８原子以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
下記式（１−０１）〜（１−２１）で表される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【化２−１】
2020039631.tif 000022
【化２−２】
2020039631.tif 000023
【化２−３】
2020039631.tif 000024
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載された化合物を含む脂質粒子。
【請求項１０】
下記式（２）：
Ｐ−［Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｗ’−Ｚ］２        （２）
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立にＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
で表され、
構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含む化合物をさらに含む、請求項９に記載の脂質粒子。
【請求項１１】
前記Ｐが、３〜８個の炭素および１〜２個の酸素を含む、請求項１０に記載の脂質粒子。
【請求項１２】
前記Ｘが、それぞれ独立に、メチルイミノ、１，２−ピロリジンジイル、および１，３−ピロリジンジイルからなる群から選ばれる、請求項１０または１１に記載の脂質粒子。
【請求項１３】
前記Ｚが、脂溶性ビタミン残基またはステロール残基である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項１４】
膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含む請求項９〜１３のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項１５】
前記の膜を形成する脂質が、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０  ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール、
からなる群から選択され、
前記凝集を低減できる脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質である、請求項１４に記載の脂質粒子。
【請求項１６】
活性剤をさらに含む、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項１７】
前記活性剤が、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸である、請求項１６に記載の脂質粒子。
【請求項１８】
前記活性剤が、少なくとも一種のＤＮＡと、少なくとも一種のＲＮＡとの組み合わせを含む、請求項１６に記載の脂質粒子。
【請求項１９】
核酸と結合する化合物をさらに含む、請求項１７または１８に記載の脂質粒子。
【請求項２０】
前記核酸と結合する化合物が、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドである、請求項１９に記載の脂質粒子。
【請求項２１】
前記核酸と結合する化合物が、プロタミンまたはヒストンである、請求項１９または２０に記載の脂質粒子。
【請求項２２】
細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項２３】
請求項９〜２２のいずれか１項に記載の脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２４】
請求項９〜２２のいずれか１項に記載の脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする、活性剤を細胞へ送達するための組成物。
【請求項２５】
前記脂質粒子が、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
活性剤を細胞へ送達するための、請求項９〜２２のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項２９】
式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項２８に記載の脂質粒子。
【請求項３０】
式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項２９に記載の脂質粒子。
【請求項３１】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項３２】
活性剤を細胞へ送達するための方法であって、該活性剤を含む請求項９〜２２のいずれか１項に記載の脂質粒子を細胞に接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
前記脂質粒子を被験体に投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記脂質粒子が、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
活性剤を細胞へ送達するための、請求項９〜２２のいずれか１項に記載の脂質粒子の使用。
【請求項３８】
前記脂質粒子が、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含む、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比が１未満である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内で分解される構造を有する生分解性化合物と、それを含む脂質粒子に関する。また、本発明はその脂質粒子を含む、核酸のような活性剤の送達のために使用される組成物およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の疾病治療を目的としたリポソームの検討が進められている。リポソームは、脂質で構成されるナノメーターオーダーの粒径を有する微小なカプセルであり、その内部に種々の化合物等を内包でき、また生体適合性などにも優れていることから、治療薬や活性剤を、生体内の標的部位に選択的に送達するのに理想的な材料である。このような目的には、一般的に平均粒子径が１００ｎｍ以上の、巨大な一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）が用いられるが、その膜を構成する材料については、種々の材料が開発されている。【０００３】
このようなリポソームは、単一の脂質で構成することが可能である。このような場合、例えば脂質は頭部とそれに結合した疎水性部とを有するリン脂質が用いられ、この脂質が会合して膜を形成して、活性剤等を内包できる微小なカプセルを構成する。しかしながら、リポソームに優れた特性を付与するために、それを構成するために脂質混合物が用いられるのが一般的である。そして、この脂質混合物は、生分解性に優れた脂質、形成されるリポソームの凝集を抑制する脂質、内包物の漏出抑制効果を有する脂質、膜融合効果を有する脂質などの組み合わせを含んでいる。【０００４】
そして、リポソームの特性をより向上させるために、それぞれの脂質について検討がなされている。例えば、遺伝子導入に特化された医療向けリポソームには、高い生分解性、高い生体適合性、高い活性剤導入性、および低い細胞毒性を満たすことが好ましく、そのようなリポソームを構成できる脂質が望ましい。【０００５】
このような脂質として種々の化合物が開発されているが、適用する生体の状態や治療しようとする疾病は多岐にわたっている。これらの条件に応じて、選択できる脂質の種類を増やすことが望ましい。さらには、従来のリポソームを超える特性を有するリポソームを構成できる脂質が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５８９３６１１号
【特許文献２】特許第６０９３７１０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の課題に対して、本実施形態は、リポソームを構成することができる脂質として、新規な化合物と、それを用いた脂質粒子ならびに組成物およびキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本実施形態による化合物は、下記式（１）：
Ｑ−ＣＨＲ２        （１）
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１２〜Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
で表されることを特徴とするものである。【０００９】
また、実施形態による脂質粒子は、前記の化合物を含むことを特徴とするものである。【００１０】
また、実施形態による組成物は、前記脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とするものである。【００１１】
また、実施形態によるキットは、前記脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含む組成物を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例および比較例による、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図２】実施例および比較例による、ＭＣＦ−７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図３】実施例および比較例による、Ｈｕｈ−７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図４】実施例による、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図５】実施例による、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図６】実施例および比較例による、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いてＲＮＡを導入した場合の、ＲＮＡ発現量を示すグラフ。
【図７】実施例４−１と実施例４−２を比較するための、ＭＣＦ−７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図８】実施例４−１と実施例４−２を比較するための、Ｈｕｈ−７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図９】実施例４−１と実施例４−２を比較するための、Ｊｕｒｋａｔ細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図１０】実施例４−２と実施例４−３を比較するための、ＭＣＦ−７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【図１１】実施例４−２と実施例４−３を比較するための、Ｈｕｈ−７細胞において脂質粒子を用いた場合の酵素活性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［定義］
本実施形態において、〜を用いて数値範囲を示した場合、特に限定されない限り、これらは両方の端点を含み、単位は共通である。例えば、１０〜２５モル％は、１０モル％以上２５モル％以下を意味する。
【００１４】
本実施形態において、「Ｃｘ〜Ｃｙ」および「Ｃｘ」などの記載は、分子または置換基中の炭素の数を意味する。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、１以上６以下の炭素を有するアルキルを意味する。また、本実施形態においてハロゲン化アルキルとは、アルキル中の１つ以上の水素がフッ素などのハロゲンに置き換えられたものをいい、例えばフルオロアリールとは、アリール中の１つ以上の水素がフッ素に置き換えられたものをいう。
【００１５】
本実施形態において、特に限定されない限り、アルキルとはアルカンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。そしてアルキルとの用語は直鎖状または分岐鎖状アルキルを包含する。さらに、シクロアルキルとは環状構造を含むアルキルを意味する。環状構造に直鎖状または分岐鎖状アルキルが置換したものもシクロアルキルと称する。
【００１６】
また、アルケルとはアルケンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。
【００１７】
また、炭化水素基とは、１価または２価以上の、炭素および水素を含み、必要に応じて、酸素または窒素を含む基を意味する。そして、脂肪族基とは、芳香環を含まない炭化水素基であって、鎖状、分岐鎖状、または環状のいずれの構造をとってもよく、またそれらの組み合わせであってもよい。また、特に限定されない限り、脂肪族記は不飽和結合を含んでいてもよい。さらに、特に限定されない限り、脂肪族基は、窒素、酸素、硫黄、セレン、フッ素、塩素、臭素などのヘテロ原子を含んでいてもよい。また、脂肪族基は、１価基であっても、多価基であってもよい。また、芳香族炭化水素基とは、芳香環を含み、必要に応じて脂肪族炭化水素基を置換基として有する。
また、３級窒素とは、３つの炭素が結合している窒素を意味する。したがって、３級窒素は電子供与性を有する３級アミン構造を構成する。
【００１８】
［生分解性脂質化合物］
実施形態による化合物は、リポソームを構成する脂質として適切な化合物である。そして、その疎水部に生分解性基を有しており、生分解性脂質化合物として機能するものである。そして、その頭部にはカチオン性基を含んでおらず、生体に適用した場合には細胞内でのタンパク質の結合が抑制され、毒性が低いという特徴を有している。また、リポソームがこの脂質化合物によって構成されると、リポソームの表面が非カチオン性となるため、細胞への障害性が低くなり、核酸等の活性剤の導入率が高くなる。
【００１９】
このような脂質化合物は、下記一般式（１）で表されるものである。以下、式中のＱを頭部、Ｒを疎水性基と称することがある。
Ｑ−ＣＨＲ２        （１）
（式中、
Ｑは、３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１２〜Ｃ２４の脂肪族基であり、少なくとも一つのＲは、その主鎖中または側鎖中に、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基ＬＲを含む）
【００２０】
実施形態による化合物のひとつの特徴は、頭部Ｑが３級窒素を２つ以上含み、酸素を含まないことである。
実施形態の効果を損なわない範囲で、非置換アミノや、４級アンモニウムなどを構成する窒素をさらに含んでいてもよいが、その３級窒素以外の窒素は含まないことが好ましい。また、頭部Ｑは酸素を含まない。従って、頭部Ｑには、オキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、アルコキシ、カルボキシラトなどの構造が含まれない。また、頭部Ｑはイオン性基を含むこともできるが、極性基を含まない中性基であることが好ましい。
【００２１】
好ましいＱの一例は、下記一般式（１−Ｑ）で表すことができる。
ＲＱ１２Ｎ−（ＣＲＱ２２）ｑ１−ＮＲＱ１−（ＣＲＱ２２）ｑ２−＊  （１−Ｑ）
（式中、
ＲＱ１は、それぞれ独立に、アルキルであり、
ＲＱ２は、それぞれ独立に、水素またはアルキルであり、
ＲＱ１およびＲＱ２のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成してもよく、ｑ１は、１〜４の数であり、
ｑ２は、０〜４の数であり、
＊は、−ＣＨＲ２への結合位置を表す）
ここで、アルキルはＣ１〜Ｃ３アルキルであることが好ましい。
【００２２】
また、ＲＱ１およびＲＱ２のうちのいずれか二つが結合して含窒素脂環を形成することができる。含窒素脂環の構成員数は特に限定されないが、４〜１０であることが好ましく、５〜８であることが好ましい。典型的には、構成される含窒素脂環は、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、イミダゾリジン、ヘキサメチレンイミン、ホモピペラジン、ヘプタメチレンイミンなどが挙げられる。
【００２３】
このようなＱは、例えば、以下のような構造を有している。
【化１】
2020039631.tif 000002
（式中、＊は−ＣＨＲ２への結合位置を表す）
【００２４】
実施形態による化合物は、頭部に結合した、−ＣＨＲ２を有している。ここでＲは疎水性基を表し、二つのＲは同一であっても異なっていてもよい。疎水性基は、比較的長い炭化水素鎖を含むものが一般的である。そして、その一部にカルボキシラト等を含む連結基、具体的には−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−、および−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−からなる群から選択される連結基を含む。これらの連結基は、実施形態による化合物がリポソームに利用された場合に、生分解性基として機能する。
【００２５】
好ましい疎水性基Ｒの一例は、下記式（１−Ｒ）で表すことができる。
−ＬＲ１−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ＬＲ２    （１−Ｒ）
（式中、
ＬＲ１はアルキレンであり、
ＬＲ２はアルケニルである）
【００２６】
ＬＲ１およびＬＲ２は、分岐鎖構造や環状構造を有していてもよいが、分岐構造を有する場合には側鎖は少ないことが好ましく、直鎖状であることが最も好ましい。
【００２７】
より具体的には、ＬＲ１およびＬＲ２が、それぞれ下記式（１−Ｒ１）および（１−Ｒ２）で表されるものであることが好ましい。
−（ＣＨ２）ｒ１−      （１−Ｒ１）
−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｒ２−Ｈ      （１−Ｒ２）（式中、
ｒ１は、１〜１０の数であり、
ｒ２は、１〜１０の数である）
【００２８】
ここで、疎水性基が十分な疎水性を発揮するために、ｒ１は４〜８の数であることが好ましく、また疎水性基Ｒに含まれる、最も長い分子鎖が８原子以上であることが好ましい。
【００２９】
実施形態による化合物の各部位は、上記したとおりの構造を有するものであるが、実施形態による化合物は、下記式（１−０１）〜（１−２１）で表される構造を有するものが好ましい。
【化２−１】
2020039631.tif 000003
【化２−２】
2020039631.tif 000004
【化２−３】
2020039631.tif 000005
【００３０】
これらのうち、（１−０１）および（１−０２）はリポソームに用いた場合に優れた特性を発揮することができるので特に好ましい。
【００３１】
［化合物の製造方法］
本発明による化合物は任意の方法で製造することができる。例えば、化合物（１−０１）および（１−０２）は、例えば下記の工程図に従って製造することができる。
【化３】
2020039631.tif 000006
【化４−１】
2020039631.tif 000007
【化４−２】
2020039631.tif 000008
【００３２】
［脂質粒子］
実施形態に寄れば脂質粒子が提供される。この脂質粒子の代表例はリポソームであるが、それに限定されず、核酸等と複合したリポプレックスなども包含される。またリポソームは、一枚膜リポソーム、多重層膜リポソームのいずれであってもよい。
【００３３】
実施形態による脂質粒子は、上記した式（１）で表される化合物を含むものである。また、望ましくは膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含むものである。
【００３４】
膜を形成する脂質とは、一般的にリポソームに用いられる脂質であれば、任意に用いることができる。この脂質は生分解性に優れた脂質であることが好ましい。
【００３５】
このような膜を形成する脂質の具体例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドなどである。実施形態において脂質粒子に用いる膜を形成する脂質は目的とするリポソームのサイズや生体中におけるリポソームの安定性などを考慮して適切に選択される。これらのうち、ジアシルホスファチジルコリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミンは好ましいものである。ここで脂質に含まれるアシル基の炭化水素鎖の長さは１０〜２０であることが好ましい。この炭化水素鎖は飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。
【００３６】
このような膜を形成する脂質は種々のものが知られており、例えば、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０  ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール
などを好ましいものとして挙げることができる。また、これらのうちＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、またはコレステロールがより好ましく、ＤＯＰＥとコレステロールの組み合わせ、ＤＯＴＡＰとコレステロールの組み合わせ、ＤＯＰＥとＤＯＴＡＰとコレステロールの組み合わせが特に好ましい。これらは、リポソーム等の膜を形成する機能に加えて、膜の融合効果も発揮することができる。
【００３７】
実施形態に用いられる、凝集を低減できる脂質は、脂質粒子の調合中に粒子同士の凝集を含む機能を発揮するものである。このような脂質としては種々のものが知られており、実施形態による脂質粒子には任意のものを選択して用いることができる。このような脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、オメガ−アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）、モノシアロガングリオシドなどが挙げられる。より具体的には、米国特許第６，３２０，０１７号に挙げられている、ＡＴＴＡ８−ＤＰＳＥなどのＡＴＴＡ脂質や、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号、および同第５，８８５，６１３号に記載されているポリエチレングリコール脂質コンジュゲートを用いることができる。
【００３８】
ＰＥＧ修飾脂質は、脂質粒子が形成されたときに、脂質粒子の表面にアンカリング脂質部分を形成することができる。このようなＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば特許第３９２０３３０号明細書に記載されているＣ１４  ＰＥＧ−ＣｅｒまたはＣ２０  ＰＥＧ−Ｃｅｒ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール（例えばト１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−メトキシポリエチレングリコール；ＰＥＧ−ＤＭＧ）およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。このうち、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが特に好ましい。
【００３９】
ＰＥＧなどの嵩高い修飾基を脂質表面に結合させる場合、修飾基と脂質粒子との結合が脂質粒子ないしリポソームの安定性に影響する。例えば米国特許第５，８２０，８７３号には、ＰＥＧ修飾脂質におけるアシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、および立体障害頭部基のサイズなどの特性が、脂質粒子の安定性に影響を及ぼすことを示している。したがってこれらの特性を調整することで、目的に応じた脂質粒子を得ることができる。例えば、ＰＥＧ修飾脂質における修飾基を短くすることによってより早く脂質粒子を喪失させたり、修飾基を長くすることによって、血漿中の滞留時間を長くすることなどが可能である。
その結果、脂質粒子の標的組織への送達を改善できる場合もある。
【００４０】
脂質粒子は、さらにその他の脂質を含むこともできる。このようなその他の脂質は、脂質粒子において一般的に用いられている物から任意に選択して用いることができる。例えば、毒性を調整するために、相対的に毒性の低い脂質を組み合わせることができる。また、脂質粒子に配位子を結合させるための官能基を導入するために、特定の構造を有する脂質を組み合わせることもできる。
【００４１】
さらには脂質粒子をリポソームとして用いる場合には、その内包物の漏出を抑制するための脂質としてステロール、例えばコレステロールを含むこともできる。さらに脂質粒子に標的作用物質をカップリングさせることもできる。このような場合のカップリング方法は、従来知られている任意の方法を採用することができる。
【００４２】
また、実施形態による脂質粒子は、下記式（２）：
Ｐ−［Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｗ’−Ｚ］２        （２）
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｗは、それぞれ独立にＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｗ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、Ｚは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
で表され、
構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含む化合物をさらに含むことが好ましい。
【００４３】
式（２）で表される化合物も生分解性を有する脂質化合物である。式（１）の化合物に対して、式（２）の化合物を組み合わせることで、新たな機能を発現させることが可能となる。例えば、式（２）の化合物をリポソームに適用した場合、核酸の内包量を向上させることができ、式（１）の化合物と式（２）の化合物をリポソームに適用した場合には、遺伝子治療や核酸医療、ゲノム診断などへの応用しやすくなる。
【００４４】
式（２）の化合物のひとつの特徴は、式（２）中のＰがエーテル結合を含むことである。すなわち、Ｐは少なくとも一つの酸素を含み、その酸素は二つの炭素と結合している。
Ｐが含む酸素の数は特に限定されないが、好ましくは１〜２個の酸素を含む。また、Ｐが含む炭素の数も特に限定されないが、Ｐに含まれる炭化水素鎖は炭素数が１〜３であることが好ましく、Ｐに含まれる炭素の総数が３〜８個であることが好ましい。好ましいＰとして、以下のものが挙げられる。
−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−
−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−
−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｏ−（ＣＨ２）２−
−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−
−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−
このような構造を有することによって。立体構造の自由度が高くなる。この化合物をリポソームの構成に用いた場合、エーテル結合に含まれる酸素が、組み合わされる核酸等と水素結合を形成するため、核酸等の内包量が多くなる。
【００４５】
また、Ｘは三級アミン構造を含む２価連結基であり、好ましくはメチルイミノ、１，２−ピロリジンジイル、および１，３−ピロリジンジイルからなる群から選ばれる。この化合物をリポソームの構成に用いた場合、三級アミン構造によって、高い細胞膜透過性が発揮される。
【００４６】
式（２）中、−Ｗ−Ｙ−Ｗ’−Ｚは、疎水部を構成している。この疎水部には生分解性基を含んでいる。ここで、生分解性基は、カルボン酸エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオカルボン酸エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）、ジチオカルボン酸エステル結合（−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−）、アミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、カルバメート結合（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキシジオキシ結合（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、および尿素結合（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）からなる群から選ばれる。
【００４７】
この生分解性基は、Ｙとして構造中に存在する場合の他、Ｚに含まれている場合もある。すなわち、Ｚが脂溶性ビタミンやステロールに由来する基であり、その構造中にカルボン酸エステル基などが含まれていてもよい。また生分解性基は、ＺとＹとの両方に含まれていてもよいし、またいずれかが２つ以上の生分解性基を含んでいてもよい。
【００４８】
ＹおよびＷ’は、ＷとＺとを連結する２価基である。
【００４９】
Ｙは、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基である。またＷ’は、単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンである。
【００５０】
これらは元素を含まない単結合であってもよい。一方で、Ｚが生分解性基を含まない場合には、Ｙは生分解性基を含む。
【００５１】
Ｚは、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である。これらのうち、脂溶性ビタミン残基またはステロール残基が好ましく、脂溶性ビタミン残基がより好ましい。
【００５２】
脂溶性ビタミン残基は、脂溶性ビタミンから誘導される基である。脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、レチナール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、およびトコトリエノールが挙げられる。これらの脂溶性ビタミンは末端にヒドロキシを有する。脂溶性ビタミン残基の一例は、これらのヒドロキシから水素が脱離したものである。また、脂溶性ビタミン誘導体に由来する基を用いることもできる。この脂溶性ビタミン誘導体とは、脂溶性ビタミンに含まれるヒドロキシが、チオヒドロキシ、カルボキシ、チオカルボキシ、またはジチオカルボキシに置換された化合物である。これらの脂溶性ビタミン残基は、末端に−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、または−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−を有する。脂溶性ビタミン残基のうち、特に好ましいものは、レチノール（ビタミンＡ）、トコフェロール（ビタミンＥ）、またはそれらのカルボン酸誘導体に由来する基である。
【００５３】
ステロール残基は、ステロールから誘導される基である。ステロールとしては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、およびエルゴステロールが挙げられる。ステロール残基の一例は、これらステロールのヒドロキシから水素が脱離したものである。また、ステロール残基は、前記した脂溶性ビタミン誘導体に由来する基と同様の末端基を有していてもよい。特に好ましいステロール残基は、ステロール、コレステロール、またはそれらのカルボン酸誘導体に由来する基である。
【００５４】
Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基は、直鎖状、分岐鎖状のいずれであってもよく、また環状構造を有していてもよい。また、脂肪族炭化水素基は、不飽和結合を含んでいてもよく、含む場合には一般に６個以下、好ましくは３個以下の不飽和結合を含む。脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１２〜１８であり、より好ましくは１３〜１７である。
【００５５】
これらのＺのうち、紫外線を吸収する構造を含むものが好ましい。具体的にはシクロヘキセン構造を含むことが好ましい。このように紫外線を吸収する構造を含むことによって、この化合物を成分として含有する脂質粒子の光による劣化の軽減することができ、また脂質粒子の挙動解析が必要な場合に、その解析を容易にすることが可能となる。
【００５６】
なお、式（２）の化合物は、二つの［Ｘ−Ｗ−Ｙ−Ｗ’−Ｚ］を含み、それぞれのＸ、Ｗ、Ｙ、Ｗ’、Ｚは独立であって、同一であっても異なっていてもよいが、同一であって化合物の構造が対象であることが好ましい。
【００５７】
実施形態による化合物の各部位は、上記したとおりの構造を有するものであるが、実施形態による化合物は、下記式（２−０１）〜（２−１２）で表される構造を有するものが好ましい。
【００５８】
【化５−１】
2020039631.tif 000009
【００５９】
【化５−２】
2020039631.tif 000010
【００６０】
【化５−３】
2020039631.tif 000011
【００６１】
これらのうち、（２−０１）〜（２−０４）は、式（１）の化合物と組み合わせてリポソームに用いた場合に優れた特性を発揮することができるので特に好ましい。
【００６２】
式（２）の化合物は、例えば下記の工程図に従って製造することができる。
【化６】
2020039631.tif 000012
【００６３】
これらの脂質を組み合わせて脂質粒子が構成されるが、その脂質粒子を構成する各脂質の配合比は目的に応じて調整されるので、限定されるものではない。しかし、脂質粒子に用いられる脂質の総モル数を基準として、一般に、
式（１）および（２）で表される脂質化合物を合計２５〜７５モル％、
膜を形成する脂質を２５〜７５モル％、
凝集を低減できる脂質を、１〜１０モル％
で配合されるのが一般的であり、好ましくは
式（１）および（２）で表される脂質化合物を合計３０〜６０モル％、
膜を形成する脂質を３０〜６５モル％、
凝集を低減できる脂質を、１〜１０モル％、例えば２．５モル％
である。ここで、式（１）の化合物と、膜を形成する脂質とのバランスが重要であり、一方だけが存在しても活性剤の導入率が十分高くならない。このため、式（１）または（２）の化合物と、膜を形成する脂質との配合比は、モル数基準で１：０．５〜１：３であることが好ましく、１：０．７５〜１：２．１であることがより好ましい。
【００６４】
なお、式（１）または（２）で表される化合物はいずれも、膜を形成する脂質としても機能するが、実施形態においては、「膜を形成する脂質」は、式（１）または（２）の化合物を包含しないものとする。
【００６５】
実施形態による脂質粒子は、さらに活性剤を含むことができる。実施形態において活性剤とは、細胞、組織、器官、または被検体に特定効果を与えることのできる物質である。特定効果は、生物学的、生理学的、または美容的効果のいずれであってもよい。実施形態による脂質粒子を用いることで、さまざまな活性剤を生体内の目的部位に送達することができる。この活性剤は、脂質粒子の内部に封入されていても、外側または内側の脂質表面に結合していても、また脂質層の内部に配置されていてもよい。
【００６６】
活性剤の典型的な例は核酸であり、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸が挙げられる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、ａＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｍＲＮＡなどを用いることもできる。異なる種類のＤＮＡやＲＮＡを組み合わせて用いてもよい。
【００６７】
ｍｉＲＮＡとしては、ヌクレオチド単位が１７〜２５個連結したｍｉＲＮＡを用いることができる。）。１つのより好ましい実施形態では、核酸はヌクレオチド単位が１５〜５０個または２０〜３０個連結したオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、例えば、ヌクレオチド単位を１６〜３０個を含み、二本鎖領域を有するものあることができる。別の実施形態では、核酸は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スーパーｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣体、またはｍｉＲＮＡインヒビターである。スーパーｍｉｒとは、ＲＮＡもしくはデオキシリボ核酸ＤＮＡ、またはこれらの両方、あるいは、これらの変性体の一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーであって、ｍｉＲＮＡと実質的に同一のヌクレオチド配列を有するとともに、その標的に対してアンチセンスであるオリゴマーまたはポリマーを指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣する目的で用いることのできる分子群を表す。したがって、「ｍｉＲＮＡ模倣体」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入れるとともに、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡ模倣体は、内在性ｍｉＲＮＡの供給源から精製することによっては得られない）。
【００６８】
核酸を脂質粒子に組み合わせる場合、核酸の形態は特に限定されない。この核酸は、例えば、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＲＮＡの例としてはｓｉＲＮＡが挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ酵素、ｍｉＲＮＡ、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００６９】
実施形態による脂質粒子は、核酸を含む場合には、核酸と結合する化合物をさらに含むことができる。このような化合物としては、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドが挙げられ、好ましくはプロタミン、ヒストン、およびそれらの塩が挙げられる。たとえばヒストンおよびその塩は、核酸と結合し、核酸分子を畳み込む性質をもっている。またプロタミンは、核酸と結合し、さらにその核酸を巻き込む性質を持っている。このため、これらの化合物は脂質粒子に核酸を封入するのに有効である。
【００７０】
また、実施形態による脂質粒子は、細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含むことができる。細胞内での核酸の発現を調整することによりリポソームが送達された細胞に対して、可視化や細胞死の効果が得られるので、好ましい。このような化合物としてはレチノイン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００７１】
また、実施形態による脂質粒子は、リポタンパク、アポリポタンパクなどを含んでいてもよい。
【００７２】
活性剤として、その他の治療剤を用いることもできる。用いることのできる治療剤の具体例は、ペプチド、ポリペプチド、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、ホルモンなどが挙げられる。より具体的には、治療剤は、抗炎症化合物、抗うつ薬、興奮薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、血管新生阻害剤、細胞血管作動薬（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅｎｔｓ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬、腫瘍薬、ホルモン、およびステロイドが挙げられる。
【００７３】
脂質粒子に活性剤を組み合わせる場合、活性剤がより高い導入率で脂質粒子に導入されることが好ましい。また、脂質の特性に依存する細胞毒性による細胞死が低いことも好ましい。従来知られている脂質粒子を用いて核酸を導入した場合、一般的には導入率が低く、細胞毒性による細胞死の割合も高かった。これに対して、本実施形態による脂質粒子を用いた場合には、核酸の導入率が高く、細胞死も低減することができる。具体的には、従来の脂質粒子においては、導入率が１０％程度、エレクトロポレーションによる細胞死が６０〜７０％であるのに対して、実施形態による脂質粒子を用いた場合には、それぞれ７０％以上、３０％以下に低減される。
【００７４】
実施形態による脂質粒子は、目的に応じて任意の大きさに形成させることができる。しかしながら、実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いようとする場合には、脂質粒子はナノオーダーサイズの粒子とされるのが一般的である。具体的には、実施形態による脂質粒子の平均粒子径は、一般に５０ｎｍ〜３００ｎｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜２００ｎｍである。脂質粒子のサイズは、任意の方法で調整することができる。例えば、超音波処理によって脂質粒子を小さくすることができる。また、ポリカーボネート膜やセラミック膜を透過させて、脂質粒子を分別することでサイズ調整をすることもできる。なお、実施形態において、脂質粒子の平均粒子径は、例えば動的光散乱法を用いたゼータサイザーによって測定することができる。
【００７５】
また実施形態による脂質粒子のインビボ半減期（ｔ１／２）は、一般に３時間未満であり、好ましくは２時間未満、特に好ましくは１時間未満である。ここで、インビボ半減期とは、例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中の半減期を意味する。実施形態においては、脂質を構成する式（１）の化合物が生分解性基を有することによって、生分解性基を含まない脂質からなる脂質粒子に比較して、半減期が例えば１０％未満となっている。
【００７６】
［脂質粒子の製造方法］
実施形態による脂質粒子は、従来知られている任意の方法で製造することができる。脂質粒子やリポソームを製造する方法としては、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などが知られており、それらを採用することもできる。また、例えば、式（１）で表される化合物、さらには膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とを、アルコールなどの有機溶媒に導入し、水性緩衝液を添加することで自然発生的に脂質粒子を形成させることもできる。この水性緩衝液に活性剤を組み合わせておくことで、脂質粒子に活性剤を導入することが可能である。
【００７７】
［脂質粒子の用途］
本実施形態による脂質粒子は、活性剤を細胞へ送達するために使用することができる。特に核酸等の活性剤の細胞への送達は、遺伝子工学、組み換えタンパク質の生産、及び遺伝子治療や細胞診断として知られている医療技術など、あらゆる分野で用いられる。一つの実施形態では、実施形態による脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする、活性剤を細胞へ送達するための組成物が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための、実施形態による脂質粒子が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための方法であって、該活性剤を含む実施形態による脂質粒子を細胞に接触させる（例えば、前記脂質粒子を被験体に投与する）ことを含む方法が提供される。他の実施形態では、活性剤を細胞へ送達するための、請求項９〜２２のいずれか１項に記載の脂質粒子の使用が提供される。一つの実施形態では、前記脂質粒子は、式（１）の化合物と式（２）の化合物の両方を含むものとされ、好ましくは、式（１）の化合物の含有量に対する式（２）の化合物の含有量のモル比は１未満とされる。一つの実施形態では、前記細胞は腫瘍細胞とされる。前記被験体は、好ましくはそのような処置を必要とする動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトとされる。これらの用途につき、以下に具体的に説明する。
【００７８】
［組成物］
本実施形態による脂質粒子は、組成物として用いることができる。例えば、本実施形態の脂質粒子と担体とを含む組成物が提供される。このような組成物は医薬用途にも適用できるものである。
【００７９】
担体としては、従来知られているものから任意に選択して用いることができるが、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液、緩衝液などが挙げられる。さらにこれらの担体に加え、安定性を改良するなどの目的で、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリンなどの糖タンパクを組合せてもよい。
【００８０】
実施形態による組成物は、標準的な方法により調製することができる。担体としては、生理食塩水が用いられることが一般的である。食塩水またはその他の塩含有担体を含む組成物中では、担体は好ましくは、脂質粒子の形成の後に加える。したがって、脂質粒子と核酸などの活性剤を組み合わせた後に、その組成物を生理食塩水のような製薬学的に許容可能な担体で置換または希釈することが一般的である。
【００８１】
実施形態による組成物は、必要に応じて補助剤を含んでもよい。たとえば、医薬用途の場合、製薬学的に許容可能な補助剤、例えばｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤などを補助剤として含めることで、医薬組成物を生理的状態に近づけることができる。このような機能を奏する補助剤としては、ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリド、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられる。また、実施形態による組成物は、貯蔵安定性を改良するための脂質保護剤を含むこともできる。このような保護剤としては、フリーラジカルによるダメージを抑制する、α−トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャーや、脂質の過酸化損傷を抑制するフェリオキサミンのような水溶性キレーターが挙げられる。
【００８２】
その他、前記した活性剤などを組成物に添加することもできる。この活性剤は、脂質粒子に組み合わせた活性剤と同一のものであっても、異なったものであってもよい。また、核酸と結合する化合物や核酸の発現を調整する化合物を組成物に添加することもできる。
【００８３】
実施形態による組成物中に含まれる脂質粒子の濃度は、特に限定されず、組成物中に含まれる脂質粒子の含有率は、一般に０．０１〜３０質量％、好ましくは０．０５〜１０質量％である。脂質粒子の濃度は、目的に応じて適切に選択することができる。
【００８４】
実施形態による組成物は、従来の周知の方法によって滅菌することができる。滅菌された組成物は、そのまま投与可能な製剤として包装することのほか、乾燥させて包装することもできる。乾燥した組成物は、投与の直前に滅菌水溶液と組み合わせることで投与可能な調製物とすることができる。
【００８５】
実施形態による組成物は、キット形態とすることもできる。実施形態によるキットは、前記した脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含むが、その形態は任意である。例えば活性剤を含まない脂質粒子を担体に分散させた分散物と活性剤とを個別容器に収容したキットや、乾燥させた脂質粒子と、活性剤と、担体とを個別容器に収容したキットなどが挙げられる。さらに、乾燥させた脂質粒子または脂質粒子分散物と、活性剤とを個別の製品とし、利用者が各製品を目的に応じて選択できるようにすることもできる。
該キットには、核酸導入の際に使用する試薬を組み合わせることができる。
【００８６】
［医薬組成物の利用方法］
実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いた場合、組成物は、ヒトまたは動物の各種疾病の治療または診断に用いることができる。例えば、脂質粒子と組み合わせる活性剤として治療剤を適用することで治療剤を目的細胞に送達することで治療が可能となる。
【００８７】
例えば、各種の核酸を細胞に送達して接触させて疾患の予防又は治療をすることが可能である。このような核酸としては、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、アンチセンス、またはリボザイムが挙げられる。これらの実施形態による脂質化合物は、これらの核酸を効率かつ迅速に取り込むことができる。例えば、ＲＮＡを短時間に、かつ安全に脂質粒子に導入することは、従来は難しかったが、実施形態による脂質化合物を用いることによって、それが容易に行うことが可能となる。
【００８８】
脂質粒子の調製に用いる脂質化合物や膜を形成する化合物を適切に組み合わせることによって、より効果的な細胞ターゲティングも可能となる。具体的には、化合物（１−０１）、化合物（２−０１）、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、肝癌細胞への送達に、化合物（１−０１）または化合物（１−０２）、ＤＯＴＡＰ、およびコレステロールの組み合わせはＴ細胞性白血病細胞への送達に、化合物（１−０１）、化合物（２−０１）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、乳がん細胞への送達に、好適に用いることができる。
【００８９】
また、脂質粒子の調製に用いる脂質化合物や膜を形成する化合物を適切に組み合わせることによって、より効果的な診断、治療および予防も可能となる。具体的には、化合物（１−０１）、化合物（２−０１）、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、肝癌の診断、治療および予防に、化合物（１−０１）または化合物（１−０２）、ＤＯＴＡＰ、およびコレステロールの組み合わせはＴ細胞性白血病の診断、治療および予防に、化合物（１−０１）、化合物（２−０１）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＰＥおよびコレステロールの組み合わせは、乳がんの診断、治療および予防に好適に用いることができる。
【００９０】
また、核酸の送達は、インビトロまたはインビボのいずれで行うことができる。インビボ投与の方法としては、医薬組成物は、好ましくは非経口投与、すなわち、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が採用される。医薬組成物の静脈内投与または腹腔内投与を、ボーラス注入によって行うこともできる。
【００９１】
また、実施形態による医薬調製物を標的組織に直接塗布して、医薬組成物を標的組織に接触させることもできる。また、点滴による髄膜等への投与、内視鏡器具による投与も可能である。
【００９２】
特定の実施形態では、医薬組成物による処理は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、１〜２４時間、好ましくは２〜８時間の期間で行われる。インビトロによる適用において、対象となる細胞は特に限定されない。例えば、脊椎動物の細胞であっても、非脊椎動物の細胞であっても、あるいは植物の細胞であってもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【実施例】
【００９３】
［合成例１］  化合物（１−０１）の合成
前記した製造プロセスに従って、化合物（１−０１）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。【００９４】
第１工程
アルゴン雰囲気下、５００ｍＬフラスコにマグネシウム（１７．３８ｇ、７１４．９６ｍｏｌ、４．４ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）とヨウ素（７ｍｇ）を仕込んだ。９−ブロモノン−１−エン（１００．００ｇ、４８７．４７ｍｏｌ、３ｅｑ．）を室温下で数滴滴下した後、還流させながら２  時間かけて滴下した。室温で一晩熟成させ、滴下漏斗にグリニャール試薬をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で洗い込みながら移した。ギ酸エチル（１２．０４ｇ、１６２．４９ｍｏｌ、１ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）を仕込んだ１０００ｍＬ４つ口フラスコに、０℃以下で１．５時間かけてグリニャール試薬を滴下した。【００９５】
１時間室温で反応させた後、アセトン（１００ｍＬ）を加え、水（２００ｍＬ）と１０％硫酸水溶液（２６７ｍＬ）を順次添加して分液した。水層をジエチルエーテル（３００ｍＬ）で抽出し、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（７２．１ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７２１ｇ、展開：ヘキサン→３％酢酸エチル／９７％ヘキサン）で精製し、白色固体として中間体（１−０１−１）を４１．１ｇ（収率９８％）得た。【００９６】
第２工程
アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬフラスコに中間体（１−０１−１）（４１．１ｇ、１４６．５３ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をジクロロメタン（３３０ｍＬ）に溶解させて投入し、トリエチルアミン（５９．３１ｇ、５８６．１２ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）、４−ジメチルアミノピリジン（１．７９ｇ、１４．６５ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ．）を加えた。−５℃でメタンスルホニルクロリド（３３．５７ｇ、２９３．０６ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を滴下した。室温で１時間攪拌後、氷水（１７．６ｍＬ）でクエンチした。続いて、１Ｎ塩酸（３０ｍＬ）と水（３００ｍＬ）、飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して、橙色オイルとして中間体（１−０１−２）を４９．６ｇ（収率９４％）得た。【００９７】
第３工程
アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬフラスコにＤＭＦ（３００ｍＬ）とシアン化ナトリウム（１３．５６ｇ、２７６．６５ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を仕込んだ。ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解した中間体（１−０１−２）（４９．６ｇ、１３８．３２ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を添加し、５５℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水（５００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（８００ｍＬ）で３回で抽出を繰り返した。抽出した有機層を水（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（８４．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０１２ｇ  展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間耐３を２８．１ｇ（収率７０％）を得た。【００９８】
第４工程
アルゴン雰囲気下、２０００ｍＬフラスコに中間体（１−０１−３）（２８．１ｇ、９７．０６ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とヘキサン（２８０ｍＬ）を仕込んだ。−７０℃で１Ｍ水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）のｎ−ヘキサン溶液（１９４．１３ｍＬ、１９４．１３ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）を滴下し、室温下で３０分攪拌させた。０℃に氷冷し、メタノール（１４ｍＬ）でクエンチした。この反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液（１２００ｍＬ）を加えて２０分攪拌し、１０％硫酸（４５０ｍＬ）を加えて分液した。続いてジエチルエーテル（５００ｍＬ）で２回で抽出した。抽出した有機層を、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して黄色オイルとして中間体（１−０１−４）を２５．３ｇ（収率８９％）を得た。【００９９】
第５工程
１０００ｍＬフラスコに中間体（１−０１−４）（２５．３ｇ、８６．５ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）とメタノール（２５３ｍＬ）を仕込んだ。０℃で水素化ホウ素ナトリウム（１．１６ｇ、３０．２７ｍｍｏｌ、０．３５ｅｑ．）を少しずつ加え、室温下で終夜攪拌した。反応液に酢酸（７ｍＬ）をｐＨ４になるまで加えた。水（１６０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（４００ｍＬ）で３回抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３０．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０４ｇ  展開：５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１−０１−５）を２２．１３ｇ（収率８７％）得た。【０１００】
第６工程
アルゴン雰囲気下、１０００ｍＬフラスコに中間体（１−０１−５）（２２．１３ｇ、７５．１４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をジクロロメタン（２２０ｍＬ）で溶かし、テトラブロモメタン（２９．９０ｇ、９０．１７ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ．）を加えた。０℃でジクロロメタン（６３ｍＬ）に溶かしたトリフェニルホスフィン（２９．５６ｇ、１１２．７１ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を滴下した。室温下で１  時間攪拌後、反応液を濃縮して得た粗体（２１．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ  展開：ヘキサン）で精製し無色透明オイルとして中間体（１−０１−６）を１４．５ｇ（収率５４％）を得た。【０１０１】
第７工程
１０００ｍＬフラスコに６（５ｇ、１３．９９ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）を入れ、クロロメタン（２３０ｍＬ）とアセトニトリル（２３０ｍＬ）に溶かし、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）  （１４５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、Ｒｕ＝４０％）を添加した。１０℃以下で水（１１５ｍＬ）に溶かした過ヨウ素酸ナトリウム（２９．９２ｇ、１３９．８９ｍｍｏｌ、１０ｅｑ．）を滴下し、室温下で終夜攪拌した。反応終了後、水（２３０ｍＬ）を加え、分液した。水層をジクロロメタン（１００ｍＬ×２  回）で抽出して合わせた有機層に飽和食塩水（２３０ｍＬ）を加え、色が変わるまで３％硫化ナトリウムを滴下した。１Ｍ塩酸を酸性になるまで加え、分液した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１４．７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３００ｇ  展開：クロロホルム→２％  メタノール／９８％クロロホルム）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１−０１−７）を２．７３ｇ（収率４９％）を得た。【０１０２】
第８工程
１００ｍＬフラスコに７（２．７３ｇ、６．９４ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をジクロロメタン（４５ｍＬ）に溶かし、シス−２−ノネン−１−オル（２．４１ｇ、１６．９３ｍｍｏｌ、２．４４ｅｑ．）、４−ジメチルアミノピリジン（８５ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ、０．１ｅｑ．）、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．３９ｇ、３４．０１ｍｍｏｌ、４．９ｅｑ．）  を仕込んだ。その後、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド塩酸塩（３．２５ｇ、１６．９３ｍｍｏｌ、２．４４ｅｑ．）を加え、室温下で終夜攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン（４５ｍＬ）で希釈し、水（４５ｍＬ）、１Ｍ  塩酸（９０ｍＬ）、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（９０ｍＬ）、飽和食塩水（９０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３．７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３７ｇ  展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し、中間体（１−０１−８）を微黄色オイルとして１．６２ｇ（収率３６％）得た。【０１０３】
第９工程
５０ｍＬ  のオートクレーブに８  （１．６２ｇ、２．５２ｍｍｏｌ、１ｅｑ．）をＴＨＦ（３０ｍＬ）で溶かし、Ｎ，Ｎ，Ｎ’トリメチルエチレンジアミン（５．１６ｇ、５０．４８ｍｍｏｌ、２０ｅｑ．）と炭酸カリウム（１．２６ｇ、９．０９ｍｍｏｌ、３．６ｅｑ．）を仕込んだ。５５℃に加温して６日間反応させた。反応終了後、反応液を室温に戻して、ジクロロメタン（６０ｍＬ）で希釈し、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。水層をジクロロメタン（２０ｍＬ）で３回抽出して、合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（２．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２５ｇ  展開：クロロホルム→５％メタノール／９５％クロロホルム）で精製し微黄色オイルとして、目的の化合物（１−０１）１．２１ｇ（収率７２％）を得た。【０１０４】
［合成例２］  化合物（２−０１）の合成
前記した製造プロセスに従って、化合物（２−０１）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。【０１０５】
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬフラスコ中ニトリエチレングリコール５．００ｇ（３３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１４．３９ｍＬ（１１２ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（５０ｍＬ）を導入した。０℃でメタンスルホニルクロライド７．９７ｍＬ（１０３ｍｍｏｌ）を滴下後、室温で１時間撹拌した。続いて、エタノール１０ｍＬを滴下し、未反応のメタンスルホニルクロライドを処理した後、濾過した。濾過後の反応液を５０ｍＬのジクロロメタンで４回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。乾燥後の反応液を濾過した後、濃縮して、橙色オイル状の中間体（２−０１−１）を８．２１ｇ得た（収率８１％）。【０１０６】
次に、１００ｍＬフラスコに中間体（２−０１−１）を８４２ｍｇ（２．７５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３を９５０ｍｇ（６．８７ｍｍｏｌ）およびアセトニトロル１５ｍＬを導入した。室温で１５分撹拌後、３−（メチルアミノ）−１−プロパノール７３５ｍｇ（８．２５８ｍｍｏｌ）を滴下した。７０℃に保温しながら一晩撹拌した。反応液を放冷後、不溶物を濾過により除去した。濾液を濃縮して粗製物７２０ｍｇを得た。この粗製物を、カラムクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル１５ｇ、展開液５０％ヘキサン／クロロホルム）により精製して、微黄色透明オイル状の中間体（２−０１−２）を３４８ｍｇ得た（収率４３％）。【０１０７】
３０ｍＬナスフラスコに中間体（２−０１−２）を３００ｍｇ（１．０３ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン１０ｍＬを導入し、レチノイン酸７７０ｍｇ（２．５６ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン５０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド５９０ｍｇ（３．０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。続いて反応液を１０ｍＬの水で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。乾燥後の反応液を濾過した後、濃縮して、粗製物２．１ｇを得た。この粗製物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｇ、展開液５０％ヘキサン／クロロホルムおよびクロロホルム）により精製して、濃橙色オイル状の化合物（２−０１）を２６２ｍｇ得た（収率２９％）。【０１０８】
（脂質化合物を含むＤＮＡ／ペプチド・コア複合体内包リポソームの調製）
ベクターＤＮＡ溶液とＤＮＡ凝縮ペプチドを用いて、ベクターＤＮＡ−ＤＮＡ凝縮ペプチドからなるコア複合体を調製した。ベクターＤＮＡとして、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー、Ｎｌｕｃ遺伝子、転写終結シグナルを組込んだプラスミドを使用した。ＤＮＡ凝縮ペプチドとして、ｍＨＰ−１（ＲＱＲＱＲ−ＹＹ−ＲＱＲＱＲ−ＧＧ−ＲＲＲＲＲＲ：配列番号１）とｍＨＰ−２（ＲＲＲＲＲＲ−ＹＹ−ＲＱＲＱＲ−ＧＧ−ＲＲＲＲＲＲ：配列番号２）を１：３の割合で混合した混合物を使用した。【０１０９】
マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、ＤＮＡ凝縮ペプチド溶液（０．２４  ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）１００μｌを分注した。分注したペプチド溶液をボルテックスミキサー（１，５００ｒｐｍ）（ＭＳＶ−３５００（商品名）、ＢＩＯＳＡＮ社製）で撹拌しながら、ベクターＤＮＡ溶液（０．１５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）２００μｌを滴下して混合した。【０１１０】
コア複合体を内包するリポソームは、エタノール注入法で調製した。マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、表１に示された配合比の脂質溶液を、それぞれ５０μｌ分注した。ここで、比較に用いる化合物として、式（Ｒ−０１）で表される化合物を用いた。【０１１１】
【表１】
2020039631.tif 000013
【０１１２】
【化７】
2020039631.tif 000014
【０１１３】
分注した脂質溶液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、コア複合体５０μｌを滴下して混合した。滴下後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）４００μｌを穏やかに添加して、ベクターＤＮＡ内包リポソームを調製した。更に１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を４００μｌ加え、穏やかに混合した後、限外濾過スピンカラム（ＰＴ−１０１４（商品名）、株式会社アプロサイエンス製）を用いて、遠心によるバッファー交換と濃縮をおこない、１００μＬのコア複合体内包リポソーム（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を調製した。【０１１４】
［内包ＤＮＡ量の評価］
得られたリポソームについて、内包ＤＮＡ量の測定を行った。測定は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でおこなった。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（商品名）を含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液９５μＬに、リポソーム溶液５．０μＬを加えて穏やかに縣濁した。室温に３０分間静置した後、溶液にＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液１００μＬを加えてよく混合した。室温に５分間静置した後、溶液の蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）をマイクロタイタープレートリーダー：Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０（商品名、ベルトール社製）で測定した。
ＤＮＡ濃度は、既知濃度のλＤＮＡで作成した検量線を用いて定量した。得られた数値から、リポソーム内包ＤＮＡ量を、溶液１ｍＬあたりのＤＮＡ量（μｇ  ＤＮＡ／ｍＬ）として算出した。結果は表２に示した通りである。【０１１５】
式（１−０１）の化合物を含むリポソームは、式（Ｒ−０１）の化合物を含むリポソームより、内包ＤＮＡ量が高いことが明らかとなった。また、脂質化合物として式（２）の化合物を組み合わせると内包ＤＮＡ量が多くなることも確認された。【０１１６】
［リポソーム表面電荷の測定］
リポソームの表面電荷（ゼータ電位）を、ゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳ（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）で測定した。ゼータ電位測定用セル（ＤＴＳ−１０７０（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）にリポソーム溶液３０μｌを分注し、蒸留水８７０μｌを加えて混合した後、セルをゼータサイザーにセットしてゼータ電位を測定した。得られた結果は表２に示すとおりであった。【０１１７】
膜を形成する脂質として、中性脂質であるＤＯＰＥのみ使用した場合（実施例１−４）と、ＤＯＰＥに対してカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰを組み合わせた場合（実施例１−６）とを比較すると、後者のほうがゼータ電位をよりプラス側にシフトさせることができることがわかった。【０１１８】
［リポソームによるベクターＤＮＡ導入量の測定］
リポソームによる細胞へのベクターＤＮＡの導入は、ベクターＤＮＡ上のＮｌｕｃ遺伝子の発現により定量化した。ＮＬｕｃ遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー：  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（製品名、Ｔｅｃａｎ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒト乳がん由来の細胞株ＭＣＦ−７、ヒト肝臓がん由来の細胞株Ｈｕｈ−７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を使用した。９６穴培養プレートに、１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ播種した後、表１に示されるリポソーム溶液を１μＬ添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、ＮＬｕｃの酵素活性を測定した。ＮＬｕｃの酵素活性は、ＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（製品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は図１（Ｊｕｒｋａｔ）、図２（ＭＣＦ−７）、図３（Ｈｕｈ−７）に示すとおりであった。【０１１９】
式（１）の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物を選択することで、比較に用いた（Ｒ−０１）よりも高いＮｌｕｃ遺伝子発現効率を示すことが確認できた。【０１２０】
また、リポソームにより細胞内に取り込まれたＮｌｕｃ遺伝子発現効率は、式（１）の脂質化合物に式（２）の化合物を組み合わせることで、浮遊性よりも付着性の細胞に取り込まれやすくなることが示された。さらにＤＯＴＡＰの有無で表面電荷を制御することにより、増殖様式の異なる細胞へ指向性があることがわかった。【０１２１】
【表２】
2020039631.tif 000015
【０１２２】
［合成例３］  化合物（１−０２）の合成
前記した製造プロセスに従って、化合物（１−０２）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。【０１２３】
第１工程
アルゴン雰囲気下、５００ｍＬフラスコにマグネシウム（１７．３８ｇ，７１４．９６ｍｍｏｌ，４．４０ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）とヨウ素（７ｍｇ）を仕込んだ。９−ブロモノン−１−エン（１００．００ｇ，４８７．４７ｍｏｌ，３．００ｅｑ．）を室温下で数滴滴下した後、還流させながら２  時間かけて滴下した。室温で一晩熟成させ、滴下漏斗にグリニャール試薬をジエチルエーテル（４０ｍＬ）で洗い込みながら移した。ギ酸エチル（１２．０４ｇ，１６２．４９ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）とジエチルエーテル（１６５ｍＬ）を仕込んだ１０００ｍＬ４つ口フラスコに、０℃以下で１．５  時間かけてグリニャ−ル試薬を滴下した。１時間室温で反応させた後、アセトン（１００ｍＬ）を加え、水（２００ｍＬ）と１０％硫酸（２６７ｍＬ）を順次添加して分液した。水層をジエチルエーテル（３００ｍＬ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で有機層を乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（７２．１ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７２１ｇ，展開：ヘキサン→３％酢酸エチル／９７％ヘキサン）で精製し、白色固体として中間体（１−０２−１）を４１．１ｇ（収率９８％）得た。【０１２４】
第２工程
アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬ  フラスコに中間体（１−０２−１）（４１．１ｇ，１４６．５３ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（３３０ｍＬ）で溶解させて投入し、トリチルアミン（５９．３１ｇ，５８６．１２ｍｍｏｌ、４．００ｅｑ．）、４−ジメチルアミノピリジン（１．７９ｇ，１４．６５ｍｍｏｌ，０．１０ｅｑ．）を加えた。−５℃でメタンスルホニルクロリド（３３．５７ｇ，２９３．０６ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を滴下した。室温で１時間攪拌後、氷水（１７．６ｍＬ）でクエンチした。続いて、１Ｎ塩酸（３０ｍＬ）と水（３００ｍＬ）、飽和食塩水（３００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して、橙色オイルとして中間体（１−０２−２）を４９．６ｇ（収率９４％）得た。【０１２５】
第３工程
アルゴン雰囲気下で、１０００ｍＬ  フラスコにＤＭＦ（３００ｍＬ）とシアン化ナトリウム（１３．５６ｇ，２７６．６５ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を仕込んだ。ＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解した中間体（１−０２−２）４９．６ｇ，１３８．３２ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を添加し、５５℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水（５００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（８００ｍＬ×３  回）で抽出した。抽出した有機層を水（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（８４．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０１２ｇ、展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１−０２−３）を２８．１ｇ（収率７０％）を得た。【０１２６】
第４工程
アルゴン雰囲気下、２０００ｍＬ  フラスコに中間体（１−０２−３）（２８．１ｇ，９７．０６ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）とヘキサン（２８０ｍＬ）を仕込んだ。−７０℃で１Ｍ  ＤＩＢＡＬ−ｎ−ヘキサン（１９４．１３ｍＬ，１９４．１３ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を滴下し、室温下で３０分攪拌させた。０℃に氷冷し、メタノール（１４ｍＬ）でクエンチした。この反応液に飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１２００ｍＬ）を加えて２０  分攪拌し、１０％Ｈ２ＳＯ４（４５０ｍＬ）を加えて分液した。続いてジエチルエーテル（５００ｍＬ×２回）で抽出した。抽出した有機層を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍＬ）、飽和食塩水（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して黄色オイルとして中間体（１−０２−４）を２５．３ｇ（収率８９％）を得た。【０１２７】
第５  工程
１０００ｍＬフラスコに中間体（１−０２−４）（２５．３ｇ，８６．５ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）と、メタノール（２５３ｍＬ）を仕込んだ。０℃で水素化ホウ素ナトリウム（１．１６ｇ，３０．２７ｍｍｏｌ，０．３５ｅｑ．）を少しずつ加え、室温下で終夜攪拌した。反応液に酢酸（７ｍＬ）をｐＨ４になるまで加えた。水（１６０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（４００ｍＬ×３回）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３０．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０４ｇ、展開：５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し薄黄色オイルとして中間体（１−０２−５）を２２．１３ｇ（収率８７％）得た。【０１２８】
第６工程
アルゴン雰囲気下、１０００ｍＬ  フラスコに中間体（１−０２−５）（２２．１３ｇ，７５．１４ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（２２０ｍＬ）で溶かし、テトラブロモメタン（２９．９０ｇ，９０．１７ｍｍｏｌ，１．２０ｅｑ．）を加えた。０℃でジクロロメタン（６３ｍＬ）に溶かしたトリフェニルホスフィン（２９．５６ｇ，１１２．７１ｍｍｏｌ，１．５０ｅｑ．）を滴下した。室温下で１  時間攪拌後、反応液を濃縮して得た粗体（２１．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ、展開：ヘキサン）で精製し無色透明オイルとして中間体（１−０２−６）を１４．５ｇ（収率５４％）を得た。【０１２９】
第７工程
アルゴン雰囲気下で、２００ｍＬ  フラスコにエタノール  （９０ｍＬ）、２０％エトキシナトリウム（溶媒：エタノール）（５０．５５ｇ，１４８．５７ｍｍｏｌ，５．９０ｅｑ．）を仕込み、６５℃に加熱した。次いで、マロン酸ジエチル（２４．２０ｇ，  １５１．０９ｍｍｏｌ，６．００ｅｑ．）、中間体（１−０２−６）（９ｇ，２５．１８ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を加え、一晩加熱環流した。反応終了後、１０℃以下で１Ｎ塩酸（９０ｍＬ）を加え、クエンチした。反応液を酢酸エチル（２００ｍＬ×３回）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（９０ｍＬ）、飽和食塩水（９０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮し、橙色オイルとして中間体（１−０２−７）を７．３１ｇ（収率６６％）を得た。【０１３０】
第８工程
２００ｍＬ  フラスコに中間体（１−０２−７）（７．３１ｇ，１６．７４ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）、ジメチルスルホキシド（７０ｍＬ）、塩化ナトリウム（９．７８ｇ，１６７．４０ｍｍｏｌ）を仕込み、一晩加熱環流した。反応終了後、反応液を濃縮して得た粗体（２１．３ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２００ｇ  展開：ヘキサン→２％酢酸エチル／９８％ヘキサン）で精製し中間体（１−０２−８）を淡黄色オイルとして４．７ｇ（収率５１％）得た。【０１３１】
第９  工程
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬ４つ口フラスコにリチュムアルミニウムハイドライド  （７３４ｍｇ，１９．３４ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ．）とＴＨＦ（４０ｍＬ）を仕込んだ。０℃でＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させた中間体（１−０２−８）（４．７ｇ，３４．５４ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を滴下し、室温で一晩反応させた。０℃に氷冷し、水（３．３ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム（０．８ｍＬ）でクエンチした。この反応液に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えてセライト濾過し、酢酸エチル（１００ｍＬ）でセライトを洗浄した。濾液を濃縮して得た粗体（４．９ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、展開：５％酢酸エチル９５％ヘキサン）で精製し中間体（１−０２−９）を無色オイルとして３．８６ｇ（収率９３％）得た。【０１３２】
第１０工程
アルゴン雰囲気下で、１００ｍＬ  フラスコに中間体（１−０２−９）（３．８６ｇ，１１．９７ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（３０ｍＬ）で溶解させて投入し、トリエチルアミン（４．８４ｇ，４７．８７ｍｍｏｌ，４．００ｅｑ．）、４−ジメチルアミノピリジン（１４６ｍｇ，１．２０ｍｍｏｌ，０．１０ｅｑ．）を加えた。−５℃でメタンスルホニルクロリド（２．７４ｇ，２３．９３ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を滴下した。室温で１時間攪拌後、氷水（１７．６ｍＬ）でクエンチした。続いて、１Ｎ塩酸（１０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して中間体（１−０２−１０）を褐色オイルとして、４．７９ｇ（収率９９％）得た。【０１３３】
第１１工程
アルゴン雰囲気下で、１００ｍＬフラスコにＤＭＦ（２８ｍＬ）とシアン化カリウム（１．１７ｇ，２３．９４ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）を仕込んだ。ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した中間体（１−０２−１０）（４．７９ｇ，１１．９７ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を添加し、５５℃に加温して一晩反応させた。反応液を室温に戻して、水（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬ×３回）で抽出した。抽出した有機層を水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１１．４ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、展開：ヘキサン→５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し中間体（１−０２−１１）を無色オイルとして、３．６ｇ（収率９０％）得た。【０１３４】
第１２工程
アルゴン雰囲気下で、１００ｍＬフラスコに中間体（１−０２−１１）（３．６ｇ，  １０．８６ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）とヘキサン（３６ｍＬ）を仕込んだ。−７０℃で１Ｍ  ＤＩＢＡＬ−ｎ−ヘキサン（２１．７１ｍＬ，２１．７１ｍｍｏｌ，２．００ｅｑ．）  を滴下し、室温下で３０  分攪拌させた。０℃に氷冷し、メタノール（１．６ｍＬ）でクエンチした。この反応液に飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１５０ｍＬ）を加え２０分攪拌し、１０％  硫酸（５０ｍＬ）を加えて分液した。続いてジエチルエーテル（５０ｍＬ×２回）で抽出した。抽出した有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水（５０ｍＬ）、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して中間体（１−０２−１２）を黄色オイルとして、３．２ｇ（収率８８％）得た。【０１３５】
第１３工程
１００ｍＬ  フラスコに中間体（１−０２−１２）（３．２ｇ，  ９．５６ｍｍｏｌ，  １．００ｅｑ．）とメタノール（３２ｍＬ）を仕込んだ。０℃で水素化ホウ素ナトリウム（１２７ｍｇ，  ３．３５ｍｍｏｌ，０．３５ｅｑ．）を少しずつ加え、室温下で一晩攪拌した。反応液に酢酸（１ｍＬ）をｐＨ４になるまで加えた。水（３０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン  （３０ｍＬ×３回）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（３．１７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３２ｇ、展開：５％酢酸エチル／９５％ヘキサン）で精製し中間体（１−０２−１３）を淡黄色オイルとして、１．１２ｇ（収率３５％）得た。【０１３６】
第１４工程
アルゴン雰囲気下で、３０ｍＬ  フラスコに中間体（１−０２−１３）（１ｇ，  ２．９７ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（１０ｍＬ）で溶かし、テトラブロモメタン（１．１８ｇ，３．５７ｍｍｏｌ，１．２０ｅｑ．）を加えた。０℃でジクロロメタン（５ｍＬ）に溶かしたトリフェニルホスフィン（１．１７ｇ，４．４６ｍｍｏｌ，１．５０ｅｑ．）を滴下した。室温下で１時間攪拌後、反応液を濾過濃縮して得た粗体（７ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル７０ｇ、展開：ヘキサン）で精製し中間体（１−０２−１４）を無色透明オイルとして、１．１２ｇ（収率９４％）得た。【０１３７】
第１５工程
２００ｍＬフラスコに中間体（１−０２−１４）（１．１２ｇ，２．８０ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）を入れ、ジクロロメタン（５１ｍＬ）とアセトニトリル（５１ｍＬ）に溶かし、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（２９ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ，Ｒｕ＝４０％）を添加した。１０℃以下で水（５１ｍＬ）に溶かした過ヨウ素酸ナトリウム（５．９９ｇ，２８．０ｍｍｏｌ，１０．００ｅｑ．）を滴下し、１０℃以下で一晩攪拌した。反応終了後、水５１ｍＬ）を加え、分液した。有機層に飽和食塩水（５０ｍＬ）を加え、色が変わるまで３％Ｎａ２Ｓ水溶液を滴下した。１Ｎ塩酸を酸性になるまで加え、分液した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過濃縮して得た粗体（５．２４ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、展開：クロロホルム→５％メタノール／９５％クロロホルム）で精製し中間体（１−０２−１５）を微黄色オイルとして、１．０５ｇ（収率８６％）得た。【０１３８】
第１６工程
１００ｍＬフラスコに中間体（１−０２−１５）（１．００ｇ，２．３０ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶かし、シス−２−ノネン−１−オル（７９７ｍｇ，５．６０ｍｍｏｌ，２．４４ｅｑ．）、４−ジメチルアミノピリジン（２８ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ，０．１０ｅｑ．）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．４５ｇ，１１．２５ｍｍｏｌ，４．９０ｅｑ．）  を仕込んだ。その後、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド塩酸塩（１．０７ｇ，５．６０３ｍｍｏｌ，  ２．４４ｅｑ．）  を加え、室温下で一晩攪拌した。反応終了後、ジクロロメタン（３０ｍＬ）で希釈し、水（３０ｍＬ）、１Ｎ塩酸（３０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水（３０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で順次洗浄し、有機層をＮａ２ＳＯ４  で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１．９２ｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２０ｇ、展開：ヘキサン→２％酢酸エチル／９８％ヘキサン）で精製し中間体（１−０２−１６）を微黄色オイルとして、７７ｍｇ（収率５％）得た。【０１３９】
第１７工程
５０ｍＬのオートクレーブに中間体（１−０２−１６）（７７ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ，１．００ｅｑ．）をＴＨＦ（３ｍＬ）で溶かし、１−メチルピペラジン（２２５ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ，２０．００ｅｑ．）と炭酸カリウム（５６ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ，３．６ｅｑ．）を仕込んだ。５５℃に加温して６日間反応させた。反応終了後、反応液を室温に戻して、ジクロロメタン（６ｍＬ）で希釈し、水（５ｍＬ）を加えて分液した。水層をジクロロメタン（６ｍＬ×３回）で抽出して合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過濃縮して得た粗体（１０８ｍｇ）をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１ｇ、展開：クロロホルム→１０％メタノール／９０％クロロホルム）で精製し、濃黄色オイルとして化合物（１−０２）を５４ｍｇ（収率６８％）得た。【０１４０】
［脂質化合物を含むＤＮＡ／ペプチド・コア複合体内包リポソームの調製］
ベクターＤＮＡ溶液とＤＮＡ凝縮ペプチドを用いて、ベクターＤＮＡ−ＤＮＡ凝縮ペプチドからなるコア複合体を調製した。ベクターＤＮＡとして、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー、Ｎｌｕｃ遺伝子、転写終結シグナルを組込んだプラスミドを使用した。ＤＮＡ凝縮ペプチドとして、ｍＨＰ−１（ＲＱＲＱＲ−ＹＹ−ＲＱＲＱＲ−ＧＧ−ＲＲＲＲＲＲ：配列番号１）とｍＨＰ−２（ＲＲＲＲＲＲ−ＹＹ−ＲＱＲＱＲ−ＧＧ−ＲＲＲＲＲＲ：配列番号２）を４：１の割合で混合した混合物を使用した。【０１４１】
マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、ＤＮＡ凝縮ペプチド溶液（０．２５５  ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）１００μｌを分注した。分注したペプチド溶液をボルテックスミキサー（１ ，５００ｒｐｍ）（ＭＳＶ−３５００（商品名）、ＢＩＯＳＡＮ社製）で撹拌しながら、ベクターＤＮＡ溶液（０．１５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）２００ μｌを滴下して混合した。【０１４２】
コア複合体を内包するリポソームは、エタノール注入法で調製した。マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ（商品名）１．５ｍｌ、住友ベークライト株式会社製）に、表３に示された配合比の脂質溶液を、それぞれ５０μｌ分注した。なお、表３中の参照例２−１および２−２は、前記した実施例１−２および１−４と同処方による別調製物である。【０１４３】
【表３】
2020039631.tif 000016
【０１４４】
分注した脂質溶液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、コア複合体５０μｌを滴下して混合した。滴下後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）９００μｌを穏やかに添加して、コア複合体内包リポソームを調製した。限外濾過フィルター（ＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐＹＭ−５０（商品名）、メルク株式会社製）を用いて、遠心によるバッファー交換と濃縮を行い、コア複合体内包リポソーム３２ｍｌを６００μｌに調製した。【０１４５】
［内包ＤＮＡ量の評価］
得られたリポソームについて、内包ＤＮＡ量の測定を行った。測定は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）でおこなった。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（商品名）とヘパリンナトリウム塩（シグマアルドリッチジャパン合同会社）を含む Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液９９．５μＬに、リポソーム溶液０．５μＬを加えて穏やかに縣濁した。室温に３０分間静置した後、溶液にＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液１００μＬを加えてよく混合した。室温に５分間静置した後、溶液の蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）をマイクロタイタープレートリーダー：Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０（商品名、ベルトール社製）で測定した。【０１４６】
ＤＮＡ濃度は、既知濃度のλＤＮＡで作成した検量線を用いて定量した。得られた数値から、リポソーム内包ＤＮＡ量を、溶液１ｍＬあたりのＤＮＡ量（μｇ  ＤＮＡ／ｍＬ）として算出した。結果は表４に示した通りである。
式（１−０２）の化合物を含むリポソームは、式（１−０１）の化合物を含むリポソームと、同等の内包ＤＮＡ量を示すことが明らかとなった。また、式（２−０１）の化合物を組み合わせると、内包ＤＮＡ量が多くなることも確認された。【０１４７】
［リポソーム表面電荷の測定］
リポソームの表面電荷（ゼータ電位）を、ゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳ（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）で測定した。ゼータ電位測定用セル（ＤＴＳ−１０７０（商品名）、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）にリポソーム溶液１０μｌを分注し、蒸留水８９０μｌを加えて混合した後、セルをゼータサイザーにセットしてゼータ電位を測定した。得られた結果は表４に示すとおりであった。
膜を形成する脂質として、中性脂質であるＤＯＰＥを使用した場合（参照例２−２および実施例２−２）と、ＤＯＰＥに対してカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰを使用した場合（参照例２−１および実施例２−１）とを比較すると、後者のほうがゼータ電位をよりプラス側にシフトさせることができることがわかった。【０１４８】
［リポソームによるベクターＤＮＡ導入量の測定］
リポソームによる細胞へのベクターＤＮＡの導入は、ベクターＤＮＡ上のＮｌｕｃ遺伝子の発現により定量化した。ＮＬｕｃ遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー：ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（製品名、Ｔｅｃａｎ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）、ヒト末梢血単核球細胞ＰＢＭＣ（ロンザジャパン株式会社より購入）を使用した。９６穴培養プレートに、Ｊｕｒｋａｔは１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ、ＰＢＭＣは５×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ、播種した後、表１に示されるリポソーム溶液を、ＤＮＡ量が０．８μｇ／ウェルになるように添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、ＮＬｕｃの酵素活性を測定した。ＮＬｕｃの酵素活性は、ＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（製品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は、図４（Ｊｕｒｋａｔ）、図５（ＰＢＭＣ）に示すとおりであった。
式（１−０２）の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物としてＤＯＴＡＰを選択すると、Ｊｕｒｋａｔ細胞において、式（１−０１）よりも高いＮｌｕｃ遺伝子発現効率を示すことが確認できた。また、式（１−０１）の脂質化合物は、膜を形成する脂質化合物として式（２−０１）とＤＯＰＥを選択すると、ＰＢＭＣ細胞において、式（１−０２）よりも高いＮｌｕｃ遺伝子発現効率を示すことが確認できた。【０１４９】
【表４】
2020039631.tif 000017
【０１５０】
［脂質化合物を含むＲＮＡ内包リポソーム］
［ＲＮＡ内包リポソームの調整］
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質ＧＦＰのｍＲＮＡ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。ＲＮＡ内包リポソームは、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ溶液を、表５に示された配合比の脂質溶液に加え、ピペッティングで縣濁した後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄・濃縮して調整した。ここで、比較に用いる化合物として、式（Ｒ−０１）で表される化合物を用いた。なお、比較例Ｒ−３は、比較例Ｒ−１と同処方による別調製物である。【０１５１】
【表５】
2020039631.tif 000018
【０１５２】
［内包ＲＮＡ量の測定］
リポソームに内包されたＲＮＡ量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ  キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。測定は、キット添付のマニュアルに従った。ＲＮＡ内包量の測定結果を表６に示した。表５の配合比の脂質溶液で調整したＲＮＡ内包リポソームにおいては、リポソームの内包ＲＮＡ量に顕著な違いは見られなかった。【０１５３】
【表６】
2020039631.tif 000019
【０１５４】
［リポソーム表面電荷の測定］
ＲＮＡ内包リポソームの表面電荷（ゼータ電位）は、ゼータサイザー（ゼータサイザーナノＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）で測定した。リポソーム溶液をゼータ電位測定用セル（ＤＴＳ−１０７０、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）に加えて、蒸留水で希釈・混合した後、セルをゼータサイザーの所定の位置にセットしてゼータ電位を測定した。表５で調整したＲＮＡ内包リポソームの内包ＲＮＡ量と平均ゼータ電位は、表６に示すとおりであった。【０１５５】
［リポソームによるＲＮＡ導入量の測定］
リポソームによる細胞へのＲＮＡの導入は、ＲＮＡがコードするＧＦＰ遺伝子の発現により定量化した。ＧＦＰ遺伝子の発現は、その蛍光量をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株：Ｊｕｒｋａｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を使用した。ＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）で培養したＪｕｒｋａｔを遠心で回収した後、０．６５×１０７細胞となるように新鮮なＴｅｘＭＡＣＳに縣濁した。４８ウェル培養プレートに、１．０×１０６細胞／ウェルとなるように、細胞縣濁液とＴｅｘＭＡＣＳを各１５０μＬを加えた。その後、表５に記載したＲＮＡ内包リポソームで、ＧＦＰ  ＲＮＡ量を０．５μｇ／ウェルとなるようにウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。ここで、比較に用いるＲＮＡ導入方法として、リポフェクタミン試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたリポフェクションと、エレクトロポレーションとによるＲＮＡ導入方法をおこなった。リポフェクションによる導入は、試薬に添付されたマニュアルに従って行った。エレクトロポレーションによる導入は、Ｊｕｒｋａｔを遠心で回収し、ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて洗浄後、再度遠心で細胞を回収した。回収した細胞をＯｐｔｉＭＥＭに１．０×１０７細胞／ｍＬとなるように縣濁後、１００μＬの細胞縣濁液に０．５μｇのＧＦＰ  ＲＮＡを加えてキュベット電極に移し、エレクトロポレーションをおこなった。エレクトロポレーションは、ＣＵＹ２１  ＥＤＩＴ  ＩＩ（ＢＥＸ）を使用し、以下の条件でおこなった。【０１５６】
＜ポアリングパルス（Ｐｐ）条件＞
Ｐｐ，  ２２５Ｖ；  Ｐｐ  ｏｎ，  ２．５ｍｓ；  Ｐｐ  ｏｆｆ，  ５０．０ｍｓ
＜ドライビングパルス（Ｐｄ）条件＞
Ｐｄ，  ２０Ｖ；  Ｐｄ  ｏｎ，  ５０．０ｍｓ；  Ｐｄ  ｏｆｆ，  ５０．０ｍｓ；  ５サイクル；  Ｃａｐａｃｉｔｏｒ、１４１６．３μＦ【０１５７】
ＧＦＰ  ＲＮＡを導入した細胞を４８時間培養した後、細胞を回収して１％  ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含むリン酸緩衝液ＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターで、細胞のＧＦＰ蛍光強度（緑色蛍光強度）を測定した。図６に、測定結果をグラフで示した。グラフの縦軸は、相対蛍光強度とした。この結果、実施例３−１および３−２の脂質溶液を用いて調製したＲＮＡ内包リポソームは、他のＲＮＡ導入方法、すなわちリポフェクションによる導入とエレクトロポレーションによる導入よりも高い導入量を示した。また、ＲＮＡ内包リポソームでは、実施例３−１の脂質溶液を含むリポソームが最も高い導入量を示すことが明らかになった。【０１５８】
［リポソームによるベクターＤＮＡ導入量の測定］
実施例１−３、１−４および１−６に従って、ＮＬｕｃを発現するプラスミドを含むコア複合体内包リポソーム（実施例４−１、４−２および４−３）を作製した。該リポソームを構成する脂質溶液の組成と表面電荷の測定結果を、以下の表７に示す。【０１５９】
【表７】
2020039631.tif 000020
【０１６０】
リポソームによる細胞へのベクターＤＮＡの導入は、ベクターＤＮＡ上のＮｌｕｃ遺伝子の発現により定量化した。ＮＬｕｃ遺伝子の発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー：  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ２００（製品名、Ｔｅｃａｎ社製）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒト乳がん由来の細胞株ＭＣＦ−７、ヒト肝臓がん由来の細胞株Ｈｕｈ−７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより購入）を使用した。９６穴培養プレートに、１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ播種した後、表７に示されるリポソーム溶液を１μＬ添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、ＮＬｕｃの酵素活性を測定した。ＮＬｕｃの酵素活性は、ＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（製品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。得られた結果は図７〜１１に示すとおりであった。【０１６１】
図７〜９は、実施例４−１と実施例４−２とを比較したグラフであり、図７は乳がん細胞（細胞株ＭＣＦ−７）、図８は肝臓がん細胞（細胞株Ｈｕｈ−７）、図９は白血病細胞（Ｔ−リンパ球、細胞株Ｊｕｒｋａｔ）におけるＮｌｕｃ遺伝子の発現効率を示す。図７〜９に示される結果から、化合物（２−０１）の配合により、リポソームに含まれるベクターＤＮＡは、浮遊性細胞よりも付着性細胞に取り込まれやすくなることが示された。【０１６２】
図１０および１１は、実施例４−２と実施例４−３とを比較したグラフであり、図１０は乳がん細胞（細胞株ＭＣＦ−７）、図１１は肝臓がん細胞（細胞株Ｈｕｈ−７）におけるＮｌｕｃ遺伝子の発現効率を示す。図１０および１１に示される結果から、化合物（１−０１）と化合物（２−０１）の組合せを含有するリポソームにおいて、表面電荷の制御にＤＯＴＡＰを使用するか否かにより、増殖様式の異なる細胞へ指向性を該リポソームに付与できることがわかった。【０１６３】
以上の通り、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の組み合わせ、省略、置き換え、変更などを行うことが可能である。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【図１】
2020039631.tif 000025
【図２】
2020039631.tif 000026
【図３】
2020039631.tif 000027
【図４】
2020039631.tif 000028
【図５】
2020039631.tif 000029
【図６】
2020039631.tif 000030
【図７】
2020039631.tif 000031
【図８】
2020039631.tif 000032
【図９】
2020039631.tif 000033
【図１０】
2020039631.tif 000034
【図１１】
2020039631.tif 000035
【配列表】
2020039631000001.app
【国際調査報告】
2020039631.tif 000036
2020039631.tif 000037
2020039631.tif 000038
2020039631.tif 000039
2020039631.tif 000040
2020039631.tif 000041
2020039631.tif 000042