(57)【要約】  移植部において細胞に十分な酸素が供給され、そのためにより大きな細胞塊を封入し得る細胞封入デバイスとして、外殻の少なくとも一部が酸素透過性膜で形成され、内部に細胞が封入された複数のカプセル状構造体が、同一平面上の２次元方向に配列された細胞封入デバイスを提供する。
2018230588.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外殻の少なくとも一部が酸素透過性膜で形成され、内部に細胞が封入された複数のカプセル状構造体が、同一平面上の２次元方向に配列された細胞封入デバイス。
【請求項２】
酸素透過性膜上に２次元方向に配列された複数の凹部を形成する工程と、
前記凹部を一部封止し、同一平面上の２次元方向に配列され、互いの内腔が連通されたカプセル状構造体を形成する工程と、
前記カプセル状構造体に細胞を導入する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
【請求項３】
酸素透過性膜上に２次元方向に配列された複数の凹部を形成する工程と、
前記凹部に細胞を導入する工程と、
前記酸素透過性膜の陥凹面を、前記凹部の位置を一致させて貼り合せ、同一平面上の２次元方向に配列されたカプセル状構造体を形成する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
【請求項４】
外殻の少なくとも一部が酸素透過性膜で形成され、内部に細胞が封入された複数のカプセル状構造体を同一平面上の２次元方向に配列させる工程と、
配列させた複数のカプセル状構造体に、酸素透過性膜形成溶液を塗布した基材を接触させる工程と、
前記酸素透過性膜形成溶液を固化する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
【請求項５】
基板上に２次元方向に配列され、隔壁により互いに分離された複数の凹部内に細胞を収容する工程と、
基板の凹部形成面上に、酸素透過性膜形成溶液を導入する工程と、
前記酸素透過性膜形成溶液を固化し、前記基板から酸素透過性膜を前記細胞とともに分離する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞封入デバイス及びその製造方法に関する。
［発明の背景］【０００２】
移植細胞を封入した細胞移植治療用デバイスが開発されている。細胞封入デバイスによれば、低侵襲かつ簡便に体内の目的部位に移植細胞を移植できる。また、細胞封入デバイスは、移植細胞を体外に取り出す必要が生じた場合に、デバイスごと移植細胞を確実かつ簡便に除去できるという利点を有する。【０００３】
特許文献１には、宿主組織とチャンバー内の移植細胞との間に、宿主組織の免疫応答から移植細胞を隔離することが可能なポアサイズの多孔質の境界を形成した埋め込みアセンブリーが開示されている（特許文献１、請求項１参照）。このデバイスは、細胞を保持するための１つのチャンバーを有し、全体は平らな形状であって、該チャンバーは鉛直方向に薄く水平方向に幅広な「平板型」とされている（特許文献１、図８、図９参照）。また、特許文献２には、移植細胞をカプセル化するための少なくとも１つのチャンバーを含む、細胞カプセル化用アセンブリであって、周辺端部の第一の接着部、および、前記チャンバーの体積を効果的に減少させるがデバイス表面積を増加させる第二の接着部、を含む、アセンブリが開示されている（特許文献２、請求項１６参照）。このデバイスも、全体は平らな形状であって、チャンバーは鉛直方向に薄く水平方向に幅広な「平板型」とされている（特許文献２、図１参照）。平板型チャンバ―からなるデバイスについては、非特許文献１も参照。【０００４】
特許文献３には、「生細胞を封入するための少なくとも２つの細胞チャンバーと、前記細胞チャンバー同士を隔てる長軸に沿った無細胞領域とを含む、３次元細胞封入アセンブリーであって、無細胞領域が屈曲してフォールドを形成し、前記フォールドが、フォールドを伴わないアセンブリーと比較して、アセンブリーの実効面積を減少させ、これにより３次元細胞封入デバイスを形成する、３次元細胞封入アセンブリー」が開示されている（特許文献３、請求項１参照）。このデバイスにおいては個々のチャンバーは「平板型」とされているが、平板型のチャンバーがフォールドによって接続されて配列することによって、デバイス全体は「すだれ型」の形状とされている（特許文献３、図３，７，１５，２０，５７，６２参照）。【０００５】
細胞封入デバイスでは、治療効果を高めるために、より多くの細胞、すなわちより大きな細胞塊をデバイス内に封入することが望ましい。一方で、移植細胞を生体内で機能させるため、移植部においてデバイス内の細胞に十分な酸素が供給されることが必要であるが、封入される細胞塊が大きくなるほど、細胞塊の中心部で酸素の不足による壊死が生じやすくなる。酸素の供給を促進するために、多孔質膜等に膜厚を薄くすることも考えられるが、この場合には十分なデバイスの強度を維持するのが困難になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０８−５０７９４９号公報
【特許文献２】特表２０１２−５０８５８４号公報
【特許文献３】特表２０１６−５１２０２２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ohgawara H, et. al., "Membrane immunoisolation of a diffusion chamber for bioartificial pancreas", Artif. Organs, 1998, 22(9):788-94
【非特許文献２】Rezania A, et. Al., "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells", Nat. Biotechnol., 2014, 32(11):1121-33
【非特許文献３】Iwata H, et. al., Agarose for a bioartificial pancreas., J. Biomed. Mater. Res., 1992, 26(7):967-77
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、移植部において細胞に十分な酸素が供給され、その結果、より大きな細胞塊を封入し得る細胞封入デバイスを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題解決のため、本発明は、以下の［１］〜［１７］を提供する。
［１］  外殻の少なくとも一部が酸素透過性膜で形成され、内部に細胞が封入された複数のカプセル状構造体が、同一平面上の２次元方向に配列された細胞封入デバイス。
［２］  前記酸素透過性膜が、多孔質膜又はハイドロゲル膜である、［１］の細胞封入デバイス。
［３］  前記細胞は、生理活性分子の分泌細胞である、［１］又は［２］の細胞封入デバイス。【００１０】
［４］  酸素透過性膜上に２次元方向に配列された複数の凹部を形成する工程と、
前記凹部を一部封止し、同一平面上の２次元方向に配列され、互いの内腔が連通されたカプセル状構造体を形成する工程と、
前記カプセル状構造体に細胞を導入する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
［５］  酸素透過性膜上に２次元方向に配列された複数の凹部を形成する工程と、
前記凹部に細胞を導入する工程と、
前記酸素透過性膜の陥凹面を、前記凹部の位置を一致させて貼り合せ、同一平面上の２次元方向に配列されたカプセル状構造体を形成する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
［６］  酸素透過性膜上に２次元方向に配列された複数の凹部を形成する工程と、
前記凹部に細胞を導入する工程と、
前記酸素透過性膜の陥凹面を、前記凹部の位置を一致させて貼り合せ、同一平面上の２次元方向に配列されたカプセル状構造体を形成する工程と、
前記細胞を前記カプセル状構造体内で増殖させる工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
［７］  前記酸素透過性膜に前記凹部をヒートセット法又は真空成型法により形成する、［４］〜［６］のいずれかの細胞封入デバイスの製造方法。
［８］  前記酸素透過性膜が、多孔質膜またはハイドロゲル膜である、［４］〜［７］のいずれかの細胞封入デバイスの製造方法。
［９］  前記細胞が、生理活性分子の分泌細胞である、［４］〜［８］のいずれかの細胞封入デバイスの製造方法。【００１１】
［１０］  外殻の少なくとも一部が酸素透過性膜で形成され、内部に細胞が封入された複数のカプセル状構造体を同一平面上の２次元方向に配列させる工程と、
配列させた複数のカプセル状構造体に、酸素透過性膜形成溶液を塗布した基材を接触させる工程と、
前記酸素透過性膜形成溶液を固化する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
［１１］  前記酸素透過性膜が、多孔質膜またはハイドロゲル膜である、［１０］の細胞封入デバイスの製造方法。
［１２］  前記細胞が、生理活性分子の分泌細胞である、［１０］又は［１１］の細胞封入デバイスの製造方法。【００１２】
［１３］  基板上に２次元方向に配列され、隔壁により互いに分離された複数の凹部内に細胞を収容する工程と、
前記基板の凹部形成面上に、酸素透過性膜形成溶液を導入する工程と、
前記酸素透過性膜形成溶液を固化し、前記基板から酸素透過性膜を前記細胞とともに分離する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
［１４］  基板上に２次元方向に配列され、隔壁により互いに分離された複数の凹部内に細胞を収容する工程と、
前記凹部内で前記細胞を増殖させる工程と、
前記基板の凹部形成面上に、酸素透過性膜形成溶液を導入する工程と、
前記酸素透過性膜形成溶液を固化し、前記基板から酸素透過性膜を前記細胞とともに分離する工程と、を含む、細胞封入デバイスの製造方法。
［１５］  前記酸素透過性膜形成溶液の比重が、前記細胞あるいはその凝集塊の比重に応じて決定される、［１３］又は［１４］の細胞封入デバイスの製造方法。
［１６］  前記細胞が、生理活性分子の分泌細胞である、［１３］〜［１５］のいずれかの細胞封入デバイスの製造方法。
［１７］  ［１］〜［３］の細胞封入デバイスを含む医薬。【００１３】
本明細書において、「実質的に（substantially）」又は「本質的に（essentially）」とは、基準値の90%以上、好ましくは95%、96%、97%、98%、又は99%以上の値であることを示す。例えば、「実質的に同一」又は「本質的に同一」とは、基準値との同一性が90％以上、好ましくは95%、96%、97%、98%、又は99%以上であることを意味し、「実質的に含まない（substantially free of）」又は「本質的に含まない（essentially free of）」とは、特定の物質を5%を超えて含まないこと、又は検出不可能であることを意味する。【００１４】
本明細書において、「〜を含む（comprise(s)又はcomprising）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。【００１５】
本明細書において、「〜からなる（consist(s) of又はconsisting of）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「〜から本質的になる」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。【００１６】
本明細書において、「エクスビボ（ex vivo）」とは、一般に、培養組織や培養細胞など、生体外の人工的な環境において生組織中で行われた実験又は測定を示すために使用される。使用される組織又は細胞は、保存のために凍結されてもよく、後に生体外処理のために解凍されたものでもよい。数日以上続けて、生細胞又は生組織の組織培養実験を行う場合は、「インビトロ（in vitro）」という用語が使用されるが、「インビトロ」は、「エクスビボ」と互換的に用いられる場合もある。これに対し、「インビボ（in vivo）」という用語は、一般に、細胞の増殖など、生体内で起きる現象を指すために使用される。【００１７】
本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、増殖させ（成長させ）、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ（成長させ）、かつ／又は分化させることを意味する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、移植部において細胞に十分な酸素が供給され、その結果、より大きな細胞塊を封入し得る細胞封入デバイスが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の細胞封入デバイスの第一実施形態を示す図である。（Ａ）は上面斜視図と一部拡大断面図、（Ｂ）は断面図である。
【図２】本発明の細胞封入デバイスの第二実施形態を示す図である。
【図３】本発明の細胞封入デバイスの第三実施形態を示す図である。
【図４】本発明の細胞封入デバイスの第四実施形態を示す図である。（Ａ）は上面斜視図、（Ｂ）は断面図である。
【図５】本発明の細胞封入デバイスの製造方法の第一実施形態を示す図である。
【図６】第一実施形態に係る細胞封入デバイスの製造方法の変形例を示す図である。
【図７】本発明に係る細胞封入デバイスの製造方法の第二実施形態を示す図である。
【図８】カプセル状構造体間を接続する連通路の構成を示す図である。
【図９】本発明の細胞封入デバイスの製造方法の第三実施形態を示す図である。
【図１０】本発明の細胞封入デバイスの製造方法の第四実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２１】
１．細胞封入デバイス
図１に、本発明の細胞封入デバイスの第一実施形態を示す。細胞封入デバイス１１は、複数のカプセル状構造体２１が、同一平面上の２次元方向に配列されてなる。
【００２２】
本発明においてカプセル状構造体とは、球形又は略球形の外殻あるいは半球形又は略半球形の外殻からなり、該外殻内に空間（内腔）を有する構造体を意味する。
略球形とは、構造体の任意の一方向における直径と、これに直交する方向の直径との比が０．７〜１．３、特に０．８〜１．２であることを意味する。また、略半球形とは、球形又は略球形の構造体を任意の一平面で切断してえられる２つの構造体のいずれかである。
細胞封入デバイス１１においては、カプセル状構造体２１は、球形又は略球形の外殻３１からなるものとされており、外殻３１内に内腔４１を有する。本明細書において、カプセル状構造体２１が略球形を有する場合、外殻３１の外径および内腔４１の内径は、それぞれの長径を意味する。
本発明に係る細胞封入デバイスにおいて、カプセル状構造体は、図２に示すように、半球形又は略半球形であってもよい。以下、球形、略球形、半球形及び略半球形を総称して、単に「略球形」とも記載するものとする。
カプセル状構造体の内腔は、外殻によりデバイス外部の空間と隔絶された密封空間であってよい。あるいは、カプセル状構造体は、隣接する他のカプセル状構造体と内腔が連通し合うものであってもよい（後述の図７，図８参照）。
【００２３】
カプセル状構造体２１の外殻３１は、カプセル構造体２１の外形をなすものであり、少なくともその一部が酸素透過性膜で形成される。これによって、移植部において、内腔４１に封入された細胞に酸素性透過膜を通じて酸素が供給される。酸素透過性膜は、少なくとも酸素に対する透過性を有することが必要であり、内腔４１に封入された細胞が本発明のデバイス外に漏出しない限り、酸素以外のガス、及び細胞の生存に必要な栄養質に対しても透過性を有していてもよい。さらに、酸素透過性膜は、内腔４１に封入された細胞が産生する物質に対する透過性を有する。これによって、内腔４１に封入された細胞が産生する物質が酸素性透過膜を通じて移植部に放出される。
酸素以外のガスとしては、二酸化炭素及び窒素等が挙げられる。
また、細胞の生存に必要な栄養物質としては、糖、アミノ酸、脂質、ビタミン及びミネラル等が挙げられる。
【００２４】
一方で、酸素透過性膜は、内腔４１に封入された細胞と宿主の細胞との隔壁として機能するために、宿主の細胞、好ましくはこれに加えて宿主の抗体、を通過させないものとされる必要がある。これによって、移植細胞が宿主細胞からの免疫応答によって排除されたり、不活化されたりするのを回避しえる。
【００２５】
酸素透過性膜は、多孔質膜であってよい。
多孔質膜のポアサイズは、酸素、栄養質及び細胞産生物質に対する透過性のため、１０〜５０００ｎｍ、好ましくは５０〜１０００ｎｍ、より好ましくは１００〜５００ｎｍとされる。酸素透過性膜が有する複数の孔は、全体として酸素、栄養質及び細胞産生物質の必要量を透過できるように酸素透過性膜上に均一に分散して存在していることが好ましい。
【００２６】
多孔質膜の素材としては、熱可塑性を有する材料（ポリフッ化ビニリデン、アクリロニトリル−塩化ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、エチレンビニルアルルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリプロピレン、延伸ポリプロピレン、イオントラックドポリエステル及びイオントラックドポリカーボネート）、及び熱可塑性を有しない材料（延伸ポリテトラフルオロエチレン（ＥＰＴＦＥ）、再生セルロース、セルロースアセテート及びセルロース混合エステル等）が挙げられる。
【００２７】
また、酸素透過性膜は、水により膨潤するハイドロゲル膜であってもよい。
ハイドロゲル膜の素材として、アガロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、セルロース、ゼラチン等の天然高分子、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリ２−ヒドロキシエイチルメタクリレート、ポリ２−ヒドロキシエイチルアクリレート及びポロビニルピロリドン、並びにそれぞれのモノマーの共重合体等の合成高分子の化学的また物理的架橋体等が挙げられる。
酸素透過性膜は市販品を用いてもよいし、自体公知の方法で、固化することによって酸素透過性膜を形成する溶液（酸素透過性膜形成溶液）から調製することもできる。
【００２８】
内腔４１には、細胞が封入される。細胞としては、ホルモン（インスリン等）及びサイトカインなどの生理活性分子を分泌する細胞（例えば膵ベータ細胞およびその前駆細胞等）が挙げられる。
これらの細胞は、ドナーから分離されたex vivoの細胞であってよく、またin vitroで培養された細胞であってもよい。in vitroで培養された細胞とは、例えば胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞等の多能性幹細胞（pluripotent stem cell）あるいは間葉系幹細胞等の多分化能性幹細胞（multipotent stem cell）であってよく、またこれらから分化誘導された細胞であってよい。
【００２９】
ここで、「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胚性幹細胞（ES細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ES細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「iPS細胞」と称することもある）が挙げられる。
【００３０】
「ES細胞」としては、マウスES細胞であれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、米国ウイスコンシン大Thomsonら、米国NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトES細胞株としては、NIHのCHB-1〜CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1〜HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。
【００３１】
「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101 - 106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；、Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
容易に入手可能な人工多能性細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株がある。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等が挙げられる。
【００３２】
「間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cell）」とは、骨芽細胞、筋細胞、軟骨細胞、及び脂肪細胞を含めた間葉系に分化しうる多分化能性幹細胞（multipotent stem cell）である。本発明において、間葉系幹細胞は生体組織から単離された細胞であってもよいし、ES細胞やiPS細胞に由来する細胞であってもよい。間葉系幹細胞に特異的なマーカーは、例えば、Vasileios Karantalis and Joshua M. Hare, Circ Res. 2015 April 10; 116(8): 1413-1430、及びImran Ullah, et al., Biosci. Rep. (2015), 35/art:e00191等に記載されているが、これらに限定されない。
【００３３】
内腔３１に封入される細胞は、１種類又は２種類以上であってよい。また、内腔３１に封入される細胞は、１個あるいは２個以上の細胞であってよく、２個以上の細胞が封入される場合それらは分散された細胞であっても、凝集した細胞塊であってもよい。
【００３４】
これらの細胞が産生する物質としては、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、パラトルモン及びステロイドなどのホルモン；ドーパミン、セロトニン、アドレナリン及びノルアドレナリン等の神経伝達物質；などの生理活性物質が挙げられる。
【００３５】
カプセル状構造体２１の内腔４１の径（内径）ｄは、{(ρ/(2+ρ)}1/2rs00以下（ここで「rs00」は、球状の細胞塊を生体内にそのまま移植したときに細胞の壊死を生じない細胞塊の最大半径を意味し、「ρ」は、細胞塊内の酸素核酸定数(D0)と酸素透過性膜（外殻３１）内の酸素核酸定数（D1）との比（D1/D0）を意味する）とされる。
内腔４１の内径ｄが上記数値範囲であれば、外殻３１の厚さｔは何ら制限されるものではない。例えば、厚さｔは、０．１μｍ以上であってよく、好ましくは１μｍ以上、より好ましくは１０μｍ以上とされ得る。
カプセル状構造体２１の外径Ｄは、内腔４１の内径ｄと外殻３１の厚さｔによって規定される。
【００３６】
カプセル状構造体２１は、同一平面上の２次元方向に配列される。
カプセル状構造体２１の配設数は、特に限定されず、移植細胞の種類、移植部位及び移植の目的等に応じて任意に設定されえる。
配設数は、例えば縦１０〜１０００００個×横１０〜１００００個、好ましくは縦１００〜１００００個×横１０〜１００００個、より好ましくは縦１００〜１０００個×横１００〜１００００個とされる。
ただし、本発明に係る細胞封入デバイスにおけるカプセル状構造体２１の配列態様から、縦１個×横複数個の配列（一次元方向での配列）を排除するものではない。また、細胞封入デバイス１１を複数積み重ねて配置することで、カプセル状構造体２１を３次元方向にも配列させ得る。本発明に係る細胞封入デバイスにおけるカプセル状構造体２１の配列態様は、移植部において個々のカプセル状構造体２１の周囲の体液の流れが確保され、酸素濃度が維持される限りにおいて特に制限されない。
【００３７】
本発明においては、同一平面上により多数のカプセル状構造体を配列させるため、カプセル状構造体は互いの距離が最小となるように密に配列されることが好ましいが、互いに所定の距離をおいて配列されていてもよい。すなわち、カプセル状構造体２１は、図３に示すように最密充填で配置されることが好ましいが、図４に示すように互いに距離Ｗをおいて配列されていてもよく、細胞封入デバイス１１は各カプセル状構造体２１間に平面領域を有していてもよい。
【００３８】
本発明に係るカプセル状構造体は、略球形の外形を有することによって、移植部において外部から内腔への酸素供給が効率的に行われえるため、従来の細胞封入デバイスが備える細胞塊が平板状に封入された「平板型」あるいは「スダレ型」のチャンバーと異なり封入に用いる膜の厚さに制限がなく、内腔に封入した細胞または細胞塊（もしくは細胞塊の一部）の壊死が生じにくいことが期待できる。したがって、本発明に係る細胞封入デバイスでは、一般的に入手が困難である薄くかつ丈夫な酸素透過性膜を用いる必要がなく、膜選択の自由度が飛躍的向上する。
【００３９】
移植部において外部から内腔への酸素供給が効率的に行われるようするため、カプセル状構造体は互いの曲面同士で癒合することなく、それぞれが独立した略球形の外形を有して配列されていることが好ましい。ただし、カプセル状構造体同志の癒合は完全に排除されるものではなく、カプセル状構造体は互いに点であるいは小面積で接触していてもよいものとする。また、この実施形態において、カプセル状構造体の内腔同士は連通していてもよいし、していなくてもよい。
【００４０】
本発明により得られた細胞封入デバイスは、細胞を含んだ状態で体内に移植、もしくは移植後に細胞を封入することで、細胞医薬として有用である。特に、ホルモン（インスリン等）及びサイトカインなどの生理活性分子を分泌する細胞（例えば膵ベータ細胞およびその前駆細胞等）を含む医薬として、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病等）等の治療に使用することができる。
【００４１】
２．細胞封入デバイスの製造方法
（１）製造方法Ｉ
本発明の細胞封入デバイスの製造方法の第一実施形態は、以下の工程（Ｉ−２）（ＡＩ−３）を含み、場合によってさらに工程（Ｉ−１）（Ｉ−４）を含むものである。
（Ｉ−１）酸素透過性膜上に２次元方向に配列された複数の凹部を形成する工程。
（Ｉ−２）前記凹部に細胞を導入する工程。
（Ｉ−３）前記酸素透過性膜の陥凹面を、前記凹部の位置を一致させて貼り合せ、同一平面上の２次元方向に配列されたカプセル状構造体を形成する工程。
（Ｉ−４）前記細胞を前記カプセル状構造体内で増殖させる工程。
以下、図５を参照して、各工程を順に説明する。
【００４２】
（Ｉ−１）凹部形成工程
本工程では、２枚の酸素透過性膜５１，６１上にそれぞれ２次元方向に配列された複数の凹部２１１（図Ｃ参照）を形成する。凹部２１１はカプセル状構造体２１（図Ｅ参照）の外殻３１に応じた形状を有し、そのサイズはカプセル状構造体２１の内腔４１の径（内径）を考慮して適宜設定されえる。
【００４３】
具体的には、まず、凹部２１１に対応する形状を有するオス型金型Ｋ１とメス型金型Ｋ２を用意する（図Ａ参照）。次に、ポリフッ化ビニリデン、アクリロニトリル−塩化ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、エチレンビニルアルルコール共重合体、ポリエステル系ポリマーアロイ、ポリプロピレン、延伸ポリプロピレン、イオントラックドポリエステル及びイオントラックドポリカーボネート等の熱可塑性材料からなる酸素透過性膜５１をオス型金型Ｋ１とメス型金型Ｋ２を用いたヒートセット法により成形する（図Ｂ参照）。同様に、もう一枚の酸素透過性膜６１も成形する。金型型から分離した成形後の酸素透過性膜５１、６１を図Ｃに示す。この際、酸素透過性膜５１，６１の厚さは、カプセル状構造体２１の外殻３１の厚さを考慮して適宜設定されえる。なお、酸素透過性膜５１，６１として、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ＥＰＴＦＥ）、再生セルロース、セルロースアセテート及びセルロース混合エステル等の熱可塑性を有しない材料を用いる場合には、適宜可塑剤などを材料に加えヒートセット法により成形する。
【００４４】
成形後の酸素透過性膜５１、６１は、必要に応じて、滅菌処理を行ってもよい。
【００４５】
（Ｉ−２）細胞導入工程
本工程では、酸素透過性膜５１，６１の一方の凹部２１１に細胞Ｃを導入する（図Ｄ参照）。
【００４６】
細胞Ｃの導入は、例えば、酸素透過性膜５１，６１の陥凹面を対向させて配置して袋状とし、両者の間に形成される空間に導入管７１を挿入して、細胞懸濁液を導入する方法を採用できる。導入管７１の対側には、酸素透過性膜５１，６１の間に形成される空間から細胞懸濁液を排出するための排出管８１を挿入することが好ましい。
【００４７】
（Ｉ−３）貼り合せ工程
本工程では、酸素透過性膜５１，６１の陥凹面を、互いの凹部２１１の位置を一致させて貼り合せる。これによって、凹部２１１を封止し、同一平面上の２次元方向に配列されたカプセル状構造体２１を形成し、細胞封入デバイスを得る（図Ｅ参照）。この際、導入管７１及び排出管８１は抜去されてよい。
【００４８】
（Ｉ−４）細胞増殖工程
本工程では、必要に応じて、細胞Ｃをカプセル状構造体２１の内腔４１内で増殖させる。
【００４９】
細胞Ｃの増殖は、例えば、貼り合せ工程後に得られた細胞封入デバイスを、細胞Ｃの増殖に適した培養液に浸漬し、細胞増殖に適した雰囲気下におくことにより行うことができる。細胞の増殖により、内腔４１内に細胞Ｃの細胞隗が形成される。
【００５０】
細胞の培養は、細胞の種類に応じて従来公知の条件を適用して行うことができる。例えば、膵前駆細胞の培養は、非特許文献２に記載の方法を採用できる。
本工程では、必要に応じて、さらに増殖前あるいは増殖後の細胞Ｃに対して分化誘導を行ってもよい。
分化誘導は、出発細胞及び分化細胞の種類に応じて従来公知の条件を適用して行うことができる。例えば膵前駆細胞から膵ベータ細胞への分化誘導は、非特許文献２に記載の方法を採用できる。
【００５１】
図６は、上述の第一実施形態に係る細胞封入デバイスの製造方法の変形例であり、凹部形成工程（Ｉ−１）でのみ上述の方法と異なっている。本発明において、凹部形成工程（Ｉ−１）では、上述のヒートセット法に替えて真空成型法を用いてもよい。
【００５２】
具体的には、図６に示す製造方法では、凹部形成工程（Ｉ−１）において、上述したオス型金型Ｋ１のみを用い、オス型金型Ｋ１上に酸素透過性膜５１を位置させ（図Ａ参照）、これらを真空下におくことによりオス型金型Ｋ１に酸素透過膜５１を圧着させて、酸素透過性膜５１に凹部２１１を形成する（図Ｂ参照）。なお、真空成型は、メス型金型Ｋ２のみを用いて、真空下でこれに酸素透過膜５１を圧着させて行うことも当然に可能である。
【００５３】
真空条件下での成形効果を高めるため、酸素透過性膜５１，６１として多孔質膜を用いる場合には、膜に除去可能な高分子又はその溶液を塗布することで孔を一時的に塞いでもよい。成型後、溶剤を用いて膜から高分子を除去する。
高分子としては、例えば、ポリビニルアルコールが挙げられる。
【００５４】
（２）製造方法ＩＩ
本発明の細胞封入デバイスの製造方法の第二実施形態は、以下の工程（ＩＩ−２）（ＡＩＩ−３）を含み、場合によってさらに工程（ＩＩ−１）（ＩＩ−４）を含むものである。
（ＩＩ−１）酸素透過性膜上に２次元方向に配列された複数の凹部を形成する工程。
（ＩＩ−２）前記凹部を一部封止し、同一平面上の２次元方向に配列され、互いの内腔が連通されたカプセル状構造体を形成する工程。
（ＩＩ−３）前記カプセル状構造体に細胞を導入する工程
（ＩＩ−４）前記細胞を前記カプセル状構造体内で増殖させる工程。
以下、図７を参照して、各工程を順に説明する。
【００５５】
（ＩＩ−１）凹部形成工程
本工程では、２枚の酸素透過性膜５１，６１上にそれぞれ２次元方向に配列された複数の凹部を形成する。上述の製造方法Ｉの凹部形成工程（Ｉ−１）では、酸素透過性膜５１，６１のそれぞれに対して別々にオス型金型Ｋ１及びメス型金型Ｋ２を適用して凹部２１１を形成する態様を説明したが、本工程では樹脂型Ｋ３を用いて酸素透過性膜５１，６１の両方にいちどきに凹部を形成する。
【００５６】
具体的には、まず、凹部に対応する形状を有する樹脂型Ｋ３を用意する（図Ａ参照）。樹脂型Ｋ３は、凹部に対応する形状に加えて、後述するカプセル状構造体２１同士の連通路２１３に対応する形状を有する。
【００５７】
酸素透過性膜５１，６１の間に樹脂型３を位置させた状態でヒートセット又は真空成型を行って、酸素透過性膜５１，６１に凹部を成形する（図Ｂ参照）この際、酸素透過性膜５１，６１の間には、樹脂型Ｋ３を溶解する溶媒及び細胞懸濁液を導入するための導入管７１を挿入し、導入管７１の対側に溶解した樹脂型Ｋ３及び細胞懸濁液を排出するための排出管８１を挿入することが好ましい。
【００５８】
酸素透過性膜５１，６１の厚さは、カプセル状構造体２１の外殻３１の厚さを考慮して適宜設定され得る。成形後の酸素透過性膜５１、６１は、必要に応じて、滅菌処理を行ってもよい。
【００５９】
（ＩＩ−２）封止工程
本工程では、凹部を一部封止し、同一平面上の２次元方向に配列され、互いの内腔４１が連通されたカプセル状構造体２１を形成する。
【００６０】
前記工程（ＩＩ−１）後の酸素透過性膜５１，６１及び樹脂型３を、溶剤に浸漬して樹脂型３を溶解、除去することによって、内腔４１を有するカプセル状構造体２１が得られる。溶剤による除去を可能とするため、樹脂型Ｋ３の材質には、例えば、ポリスチレン、メタクリル酸メチル及びポリカーボネイトなどが用いられる。溶剤には、トルエン、ベンゼン及びクロロホルムなどが用いられる。
【００６１】
樹脂型Ｋ３を除去後の酸素透過性膜５１，６１は、樹脂型３の形状に由来してカプセル状構造体２１同士の連通路２１３に対応する形状を有しているので（図Ｃ参照）。両者のの陥凹面を連通路２１３の部分を除いて貼り合せることで、互いの内腔４１が連通路２１３を介して連通されたカプセル状構造体２１が得えられる（図Ｃ参照）。カプセル状構造体２１は、連通路２１３を介してのみ隣接する他のカプセル状構造体２１と連通しており、他の部分は封止されている（図８も参照）。
【００６２】
連通路２１３の内径は、次の細胞導入工程（ＩＩ−３）において導入される細胞懸濁液が流通可能な限りにおいてその下限値は特に限定されない。連通路２１３の内径の下限値は、例えば、細胞の直径と同等の１０〜３０μｍ程度である。一方、連通路２１３の内径の上限値（及びこれに依存して決定される連通路２１３の外径）に関しては、カプセル状構造体２１の外表面面積（図８（Ｂ）、符号Ｓ１）のうち連通路２１３の接続に供される面積（同、符号Ｓ２参照）の占める割合が２０％以下となるように設定される。同割合は、好ましくは１５％以下又は１０％以下、より好ましくは５％以下又は３％以下、特に好ましくは２％又は１％以下とされる。連通路２１３の内径の上限値を上記範囲とすることで、カプセル状構造体２１が移植部において体液と十分に接触し、内腔４１への酸素供給が維持される。カプセル状構造体２１と連通路２１３を同一の酸素透過性膜で形成する場合、連通路２１３の外径は、酸素透過性膜の膜厚をＬμｍとして「２Ｌ ＋ (１０〜３０)」μｍになる。
【００６３】
ここでは、樹脂型Ｋ３を用いて酸素透過性膜５１，６１の両方にいちどきに凹部を形成し、カプセル状構造体２１の形成時の凹部の位置合わせを不要とする態様を説明した。しかし、上述の製造方法Ｉで説明したように、別々に成形した酸素透過性膜５１，６１の陥凹面を、凹部の位置を一致させてかつ連通路２１３の部分を除いて、貼り合せることによりカプセル状構造体２１を形成することも当然に可能である。
【００６４】
（ＩＩ−３）細胞導入工程
本工程では、カプセル状構造体２１に細胞Ｃを導入する（図Ｄ参照）。
【００６５】
細胞Ｃの導入は、導入管７１を挿入して細胞懸濁液を注入し、連通路２１３を介して各カプセル状構造体２１の内腔４１に細胞懸濁液を満たしていく方法を採用できる。過剰な細胞懸濁液は、最終的に排出管８１からデバイス外へ排出される。細胞Ｃの導入後、導入管７１及び排出管８１は抜去されてよい。
【００６６】
（ＩＩ−４）細胞増殖工程
本工程では、必要に応じて、細胞Ｃをカプセル状構造体２１の内腔４１内で増殖させる。本工程は、製造方法Ｉの細胞増殖工程（Ｉ−４）と同様にして行うことができる。
【００６７】
（３）製造方法ＩＩＩ
本発明の細胞封入デバイスの製造方法の第三実施形態は、以下の工程（ＩＩＩ−１）（ＩＩＩ−２）（ＩＩＩ−３）を含むものである。
（ＩＩＩ−１）外殻の少なくとも一部が酸素透過性膜で形成され、内部に細胞が封入された複数のカプセル状構造体を同一平面上の２次元方向に配列させる工程。
（ＩＩＩ−２）配列させた複数のカプセル状構造体に、酸素透過性膜形成溶液を塗布した基材を接触させる工程。
（ＩＩＩ−３）前記酸素透過性膜形成溶液を固化する工程。
以下、図９を参照して、各工程を順に説明する。
【００６８】
（ＩＩＩ−１）配列工程
本工程は、外殻３２の少なくとも一部が酸素透過性膜で形成され、内部に細胞または細胞凝集体Ｃが封入された複数のカプセル状構造体２２を同一平面上の２次元方向に配列させる。
【００６９】
まず、カプセル状構造体２２を、公知の手法（非特許文献３）に従って作製する（図Ａ参照）。
【００７０】
外殻３２はハイドロゲル膜であることが好ましく、その素材としてはアガロース、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、セルロース、ゼラチン等の天然高分子、光照射などで架橋する官能基を導入したポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリイソプロピルアクリルアミド、ポリ２−ヒドロキシエイチルメタクリレート、ポリ２−ヒドロキシエイチルアクリレート及びポロビニルピロリドン、並びにそれぞれのモノマーの共重合体等の合成高分子の架橋体等が挙げられる。
【００７１】
このようにして得たカプセル状構造体２２を、プラスチック製や金属製のガイド板Ｓ１上に２次元方向に並べる（図Ｂ参照）。この際、ガイド板Ｓ１に溝あるいは凹みを設けて、当該溝あるいは凹みにカプセル状構造体２２をはめ込むようにして並べるとよい。
【００７２】
（ＩＩＩ−２）基材積層工程
本工程では、配列させた複数のカプセル状構造体２２に、酸素透過性膜形成溶液Ｇを塗布した基材Ｓ２を接触させる。
【００７３】
まず、酸素透過性膜形成溶液Ｇを表面に塗布した基材Ｓ２を用意する（図Ｃ参照）。
基材Ｓ２には、ナイロンメンブレン、ポリエステルメンブレン及びポリイミドメンブランなどを用いればよく、その材質や厚みは限定されない。
【００７４】
酸素透過性膜形成溶液Ｇには、カプセル状構造体２２の外殻３２と同じ材料を用いることが好ましい。すなわち、外殻３２がアガロースゲルからなる場合にはアガロースゲル溶液を用い、外殻３２がアルギン酸ゲルからなる場合にはアルギン酸ナトリウム溶液を用いることが好ましい。
【００７５】
次に、基材Ｓ２を、酸素透過性膜形成溶液Ｇの塗布面を下にして、基材Ｓ２上に配列させたカプセル状構造体２２に積層する（図Ｄ参照）。なお、ガイド板Ｓ１を用いることなく、酸素透過性膜形成溶液Ｇを表面に塗布した基材Ｓ２上に直接カプセル状構造体２２を並べてもよい。
【００７６】
（ＩＩＩ−３）固化工程
本工程では、酸素透過性膜形成溶液Ｇを固化させる。酸素透過性膜形成溶液Ｇは、固化して酸素透過性膜５１となり、カプセル状構造体２４に固着する。固化後、必要に応じてガイド板Ｓ１から酸素透過性膜５１をカプセル状構造体２２とともに分離する（図Ｅ参照）。ゲル溶液Ｇを表面に塗布した基材Ｓ２上に直接カプセル状構造体２２を並べる場合には、ガイド板Ｓ１からの分離は不要である。
【００７７】
酸素透過性膜形成溶液Ｇの固化は、例えばアガロースゲル溶液の場合は温度を下げることにより、またアルギン酸ゲル溶液の場合には塩化カルシウムまたは塩化バリウム溶液に浸漬することまたは光照射などで架橋する官能基を導入したポリビニルアルコールなどを用いた場合には光照射により行うことができる。
【００７８】
最後に、酸素透過性膜５１から基材Ｓ２を剥離することで細胞封入デバイスを得ることができる。
【００７９】
（４）製造方法ＩＶ
本発明の細胞封入デバイスの製造方法の第四実施形態は、以下の工程（ＩＶ−１）（ＩＶ−３）（ＩＶ−４）を含み、場合によってさらに工程（ＩＶ−２）を含むものである。
（ＩＶ−１）基板上に２次元方向に配列され、隔壁により互いに分離された複数の凹部内に細胞を収容する工程。
（ＩＶ−２）前記凹部内で前記細胞を増殖させる工程と、
（ＩＶ−３）前記基板の凹部形成面上に、酸素透過性膜形成溶液を導入する工程。
（ＩＶ−４）前記酸素透過性膜形成溶液を固化し、前記基板から酸素透過性膜を前記細胞とともに分離する工程。
以下、図１０を参照して、各工程を順に説明する。
【００８０】
（ＩＶ−１）細胞収容工程
本工程では、ガイド板Ｓ２上に２次元方向に配列され、隔壁により互いに分離された複数の凹部２１２内にそれぞれ細胞Ｃを収容する（図Ａ参照）。
【００８１】
ガイド板Ｓ２には、プラスチック製や金属製の基板に、細胞Ｃを収容可能な凹部２１１を設けたものである。ガイド板Ｓ２としては、凹部２１２に収容した細胞Ｃをそのまま次の細胞増殖工程に供することができるものが好ましく、例えば汎用のＵ底シャーレを用いることができる。
【００８２】
凹部２１２は、カプセル状構造体２１（図Ｄ参照）の外殻に応じた形状を有し、そのサイズはカプセル状構造体２１の外径を考慮して適宜設定されえる。
【００８３】
（ＩＶ−２）細胞増殖工程
本工程では、必要に応じて、凹部２１２内で細胞Ｃを増殖させる（図Ｂ参照）。
【００８４】
細胞Ｃの増殖は、例えば、凹部２１２に培養液Ｍに満たした後、ガイド板Ｓ２を細胞増殖に適した雰囲気下におくことにより行うことができる。細胞の増殖により、凹部２１１内に細胞Ｃの細胞隗が形成される。得られた細胞隗の最大直径は、得られる細胞封入デバイスのカプセル状構造体２１の内腔の径に相当する。
【００８５】
本工程では、必要に応じて、さらに増殖前あるいは増殖後の細胞Ｃに対して分化誘導を行ってもよい。分化誘導の具体的な方法は上述のとおりである。
【００８６】
（ＩＶ−３）膜形成溶液導入工程
本工程では、ガイド板Ｓ２の凹部２１２の形成面上に、酸素透過性膜形成溶液Ｇを導入する（図Ｃ参照）。前工程で用いた培養液Ｍは、酸素透過性膜形成溶液Ｇに置換される。
【００８７】
酸素透過性膜形成溶液Ｇには、カプセル状構造体２１の外殻の材料と同じものを用いることが好ましい。すなわち、外殻がアガロースゲルからなる場合にはアガロースゲル溶液を用い、外殻がアルギン酸ゲルからなる場合にはアルギン酸ゲル溶液を用いることが好ましい。
【００８８】
酸素透過性膜形成溶液Ｇの比重は、細胞Ｃ又はその凝集隗の比重に応じて決定される。具体的には、導入された酸素透過性膜形成溶液Ｇ中に細胞隗が浮遊できるように、酸素透過性膜形成溶液Ｇの比重は細胞隗の比重と実質的に同一なるように調整される。ガイド板Ｓ１を浸透し、酸素透過性膜形成溶液Ｇ中への細胞隗の浮遊を促すことが好ましい。
【００８９】
酸素透過性膜形成溶液Ｇの導入量は、カプセル状構造体２１の外径、及び、酸素透過性膜形成溶液Ｇを固化して得られる酸素透過性膜５１の厚さ（カプセル状構造体２１の外殻の一部の厚さに相当）を考慮して適宜設定されえる。
【００９０】
（ＩＶ−４）膜溶液固化・分離工程
本工程では、酸素透過性膜形成溶液Ｇを固化し、ガイド板Ｓ２から酸素透過性膜５１を細胞Ｃとともに分離する（図Ｄ参照）。
【００９１】
酸素透過性膜形成溶液Ｇの固化は、例えばアガロースゲル溶液の場合は温度を下げることにより、またアルギン酸ゲル溶液の場合には塩化カルシウムまたは塩化バリウム溶液に浸漬することまたは光照射などで架橋する官能基を導入したポリビニルアルコールなどを用いた場合には光照射により行うことができる。
【００９２】
最後に、酸素透過性膜５１をガイド板Ｓ２から分離することにより、カプセル状構造体２１が同一平面上の２次元方向に配列された細胞封入デバイスを得る。
【００９３】
以上に説明した本発明に係る細胞封入デバイスの製造方法Ｉ〜ＩＶによれば、カプセル状構造体において内部に封入された細胞隗と酸素透過性膜との間に空隙（死空）ができることがない。したがって、空隙が生じた場合に問題となる空隙による細胞への酸素供給阻害のおそれがなく、細胞に十分な酸素を供給し得る。
【符号の説明】
【００９４】
１１：細胞封入デバイス
２１、２２：カプセル状構造体
２１１，２１２：凹部
２１３：連通路
３１，３２：外殻
４１：内腔
５１，６１：酸素透過性膜
７１：導入管
８１：排出管
Ｃ：細胞
Ｇ：酸素透過性膜形成溶液
Ｋ１：オス型金型
Ｋ２：メス型金型
Ｋ３：樹脂型
Ｍ：培養液
Ｓ１，Ｓ２：ガイド板
Ｓ２：基材
【図１】
2018230588.tif 000003
【図２】
2018230588.tif 000004
【図３】
2018230588.tif 000005
【図４】
2018230588.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018230588.tif 000011
【図１０】
2018230588.tif 000012
【国際調査報告】
2018230588.tif 000013
2018230588.tif 000014
2018230588.tif 000015
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2018230588.tif 000017
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