(57)【要約】  本発明は、ノロウイルスの細胞への感染を阻害する抗体の提供を目的とするもので、下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドを含むナノ抗体であって、HuNoV GII.3および／またはHuNoV GII.4の腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体である。（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、（ｃ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノロウイルスに結合し、該ノロウイルスの腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
【請求項２】
前記ノロウイルスがヒトノロウイルス（HuNoV）であることを特徴とする請求項１に記載のナノ抗体。
【請求項３】
相補性決定領域1〜3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）であることを特徴とする、HuNoV GII.3および／またはHuNoV GII.4の腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
（Ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｄ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドを含むナノ抗体であって、HuNoV GII.3および／またはHuNoV GII.4の腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体を含む重鎖抗体。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体の複数を連結したナノ抗体多量体。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体の１または複数と、該ナノ抗体と抗原特異性の異なるナノ抗体の１または複数を連結したナノ抗体多量体。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体をコードする核酸。
【請求項９】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０または配列番号１４で表される核酸。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１２】
請求項８または９に記載の核酸が導入され、前記ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のトランスジェニックイネから採取されたコメ。
【請求項１４】
請求項１ないし７のいずれかに記載のナノ抗体、重鎖抗体またはナノ抗体多量体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
治療または予防対象の疾患が、ノロウイルス感染症であることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノロウイルス抗体に関する。より具体的には、ノロウイルスに対する重鎖抗体の可変領域に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスは、十二指腸から小腸上部の細胞に侵入、非細菌性急性胃腸炎を引き起こす病原性ウイルスで、エンベロープを持たないカリシウイルス科に属する。
ノロウイルスのゲノムは、約7.7kbの一本鎖プラスセンスRNAである。VPgと呼ばれるウイルスタンパク質がゲノムの5’末端に共有結合しており、3'末端はポリアデニル化されている。ゲノムには、ORF1、VP1およびVP2の3つのタンパク質のコード領域が存在しており、各々、非構造タンパク質、構造タンパク質１および構造タンパク質２をコードしている。構造学的解析から、180分子のVP1がダイマーを形成してウイルス構造を構築していることが明らかとなっている。各VP1モノマーは、shellドメイン（Sドメイン）とprotrudingドメイン（Pドメイン）の２つのドメインに分けられ、このうちPドメインは、さらにP1およびP2のサブドメインに分けられる。P2は、感染の際のレセプターおよび宿主感染性因子として機能する血液型抗原を認識する。P2サブドメインにおける突然変異によって、血液型抗原との結合に変化が生じる（非特許文献１）。【０００３】
ヒトノロウイルスは、ゲノム配列に基づいて3つの遺伝子群（GI、GIIおよびGIV）に分類され、少なくとも25種の遺伝子型が存在するとされている。高い多様性を示すノロウイルスであるが、ここ数年では、GII、特に遺伝子型4（GII.4）などの少数の系統のみが感染流行の原因となっている（非特許文献１）。
ヒトノロウイルス感染症は、米国では毎年約2,000万人が感染、約7万人が入院しており、日本には明確なデータはないが1〜2万人程度の入院患者と700万人以上の感染者が毎年発生していると推測される。ヒトノロウイルス感染症の大半は軽快するが、小児と老人では死亡例も見られる等重症化するとともに、幼稚園、老人ホーム等の施設でアウトブレイク化するケースが多く、通院患者・入院患者数は相当規模に達し、社会保険システムに対する負担は大きい。【０００４】
現在のところ、ヒトノロウイルスに対する有効な抗ウイルス治療薬は存在しておらず、ワクチンの開発が進行しているのみである（特許文献１）。そのため、ヒトノロウイルスの治療および予防に有効な薬剤の開発および実用化は、感染症医療分野における緊急の課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2015-171363
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Glassら, N Engl J Med 361:1776-1785 2009
【非特許文献２】Hamers-Castermanら, Nature 363:446-448 1993
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明は、ヒトノロウイルス（Human Norovirus：HuNoV）に対する抗体の提供を目的とする。より具体的には、HuNoVの細胞への感染（HuNoVの侵入および／または複製）を阻害する抗体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、HuNoV GII.4株のVP1を抗原として、ラマに免疫をしたところ、ノロウイルスVLP（Virus-like particle）の腸管上皮細胞への侵入を阻害するナノ抗体の作製に成功した。そして、この抗体はノロウイルスの腸管上皮細胞への感染も阻害した。
通常ヒトの抗体は重鎖と軽鎖から構成されているが、ラマ、アルパカおよびラクダなどのラクダ科の動物には、重鎖のみからなる1本鎖抗体（重鎖抗体）が存在している。重鎖抗体は、通常の重鎖および軽鎖からなる抗体と同様に、標的抗原を認識し、抗原に結合することができる（非特許文献２）。重鎖抗体の可変領域（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody；VHH）は、抗原への結合親和性を有する最小単位であり、この可変領域断片は「ナノ抗体」と呼ばれている。ナノ抗体は、高耐熱性、消化耐性、常温安定性があり、遺伝子工学的手法により容易に大量に調製することが可能である。【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）である。
（１）ノロウイルスに結合し、該ノロウイルスの腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
（２）前記ノロウイルスがHuNoVであることを特徴とする上記（１）に記載のナノ抗体。
（３）相補性決定領域1〜3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）であることを特徴とする、HuNoV GII.3および／またはHuNoV GII.4の腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
（Ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｄ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（４）下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドを含むナノ抗体であって、HuNoV GII.3および／またはHuNoV GII.4の腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（５）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のナノ抗体を含む重鎖抗体。
（６）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のナノ抗体の複数を連結したナノ抗体多量体。
（７）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のナノ抗体の１または複数と、該ナノ抗体と抗原特異性の異なるナノ抗体の１または複数を連結したナノ抗体多量体。
（８）上記（１）ないし（４）のいずれかに記載のナノ抗体をコードする核酸。
（９）配列番号２、配列番号６、配列番号１０または配列番号１４で表される核酸。
（１０）上記（８）または（９）に記載の核酸を含むベクター。
（１１）上記（１０）に記載のベクターが導入された細胞。
（１２）上記（８）または（９）に記載の核酸が導入され、前記ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネ。
（１３）上記（１２）に記載のトランスジェニックイネから採取されたコメ。
（１４）上記（１）ないし（７）のいずれかに記載のナノ抗体、重鎖抗体またはナノ抗体多量体を含む医薬組成物。
（１５）治療または予防対象の疾患が、HuNoV感染症であることを特徴とする上記（１４）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、HuNoVの腸管上皮細胞への感染を阻害するナノ抗体が初めて提供される。【００１１】
本発明にかかるナノ抗体または重鎖抗体を含有する医薬または医薬組成物は、HuNoVによる感染症および該感染症に伴う諸症状の治療および／または予防に効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各種HuNoV GII VP1に特異的に結合するVHHのスクリーニング結果（１回目のスクリーニング）。GII.4（Sakai株、Saga1株、Narita104株）およびGII.3（U201株）由来のVP1と各種VHHとの結合に関するELISAの結果（450nmの吸光度）を示す。
【図２】各種HuNoV GII VP1に特異的に結合するVHHのスクリーニング結果（１回目のスクリーニング）。GII.2（MK04株）、GII.6（7K株）およびGII.17（kawasaki308株）由来のVP1と各種VHHとの結合に関するELISAの結果（450nmの吸光度）を示す。
【図３】各種HuNoV GII VP1に特異的に結合するVHHのスクリーニング結果（２回目のスクリーニング）。GII.4（Sakai株、Saga1株、Narita104株）およびGII.3（U201株）由来のVP1と各種VHHとの結合に関するELISAの結果（450nmの吸光度）を示す。
【図４】各種HuNoV GII VP1に特異的に結合するVHHのスクリーニング結果（２回目のスクリーニング）。GII.2（MK04株）、GII.6（7K株）およびGII.17（kawasaki308株）由来のVP1と各種VHHとの結合に関するELISAの結果（450nmの吸光度）を示す。
【図５】HuNoV（GII.4株）VP1の各ドメインの発現確認。大腸菌で発現させたVP1のPドメイン全長、P1-1とP2ドメイン、P2ドメインおよびP1-2ドメインを電気泳動（Ａ）し、anti-Hisタグ抗体でウエスタンブロッティングした結果である（Ｂ）。
【図６】ナノ抗体（KVP-7F10、KVP-7C6およびKVP-7B8）のリニアエピトープマッピングの結果。図５に示すVP1の各ドメインに対し、KVP-7B8（Ａ）、KVP-7F10（Ｂ）、KVP-7C6（Ｂ）およびKVP-12B8（Ｃ）でウエスタンブロッティングを行った。矢印は、ナノ抗体で検出されたVP1のP1-2ドメインのバンドを示す。
【図７】HuNoV VLPの腸管上皮細胞への結合に対するナノ抗体（KVP-7F10およびKVP-7B8）の影響。GII.6(7K)VLPのみ（Ａ）、GII.6(7K)VLPおよびKVP-7F10（Ｂ）、GII.6(7K)VLPおよびKVP-7B8（Ｃ）を腸管上皮細胞層に添加した結果を示す。スケールバーは、50μmである。DAPI；DAPI染色、Zo-1；抗Zo-1抗体による染色、7K VPL；HiLyte FluorTM 555色素で標識したGII.6(7K) VLP、Merge；DAPI、Zo-1および7K VPLの蛍光像を重ね合せた図。
【図８】HuNoV VLPの腸管上皮細胞への結合に対するナノ抗体（KVP-12B8およびKVP-7C6）の影響。GII.6(7K)VLPのみ（Ａ）、GII.6(7K)VLPおよびKVP-12B8（Ｂ）、GII.6(7K)VLPおよびKVP-7C6（Ｃ）を腸管上皮細胞層に添加した結果を示す。各図は、DAPI染色像、抗Zo-1抗体による染色像および7K VPLの蛍光像を重ね合わせたものである。ＡとＣのスケールバーは40μm、Ｂのスケールバーは50μmである。矢印はVLPが結合した細胞を示す。
【図９】HuNoV VLPの腸管上皮細胞への結合に対するナノ抗体（KVP-7G5およびKVP-7B4）の影響。GII.6由来のVP1に結合しないKVP-7G5またはKVP-7B4（Ａ）とGII.6(7K)VLPを腸管上皮細胞層に添加した結果を示す（Ｂ）。Ｂは、DAPI染色像、抗Zo-1抗体による染色像および7K VPLの蛍光像を重ね合わせた図である。KVP-7G5のスケールバーは50μm、KVP-7B4のスケールバーは30μmである。矢印はVLPが結合した細胞を示す。
【図１０】HuNoV GII.6(7K)VLPの腸管上皮細胞への侵入の確認。HiLyte FluorTM 555色素で標識したGII.6(7K) VLPを添加した単層上皮細胞の凍結切片を、DAPIおよび抗Zo-1抗体で染色した結果を示す。左はDAPI染色像、抗Zo-1抗体による染色像および7K VPLの蛍光像を重ね合わせた図で、右は7K VPLの蛍光像である。スケールバーは10μmである。矢印はVLPを、矢尻は核を示す。
【図１１】HuNoV GII.3（16-50株）の腸管上皮細胞への感染に対するナノ抗体（KVP-7B8、KVP-7C6、KVP-7F10およびKVP-12B8）の影響。ウイルスと各ナノ抗体とを混合してプレインキュベートした後、混合物を腸管上皮細胞層に添加してウイルスを感染させた。ウイルス感染後3時間（3 hpi）および感染後72時間（72 hpi）の培地中のウイルスコピー数を測定した。
【図１２】HuNoV GII.4（17-53株）の腸管上皮細胞への感染に対するナノ抗体（KVP-7B8、KVP-7C6、KVP-7F10およびKVP-12B8）の影響。ウイルスと各ナノ抗体とを混合してプレインキュベートした後、混合物を腸管上皮細胞層に添加してウイルスを感染させた。ウイルス感染後3時間（3 hpi）および感染後72時間（72 hpi）の培地中のウイルスコピー数を測定した。
【図１３】HuNoV GII.17（16-421株）の腸管上皮細胞への感染に対するナノ抗体（KVP-7B8、KVP-7C6、KVP-7F10およびKVP-12B8）の影響。ウイルスと各ナノ抗体とを混合してプレインキュベートした後、混合物を腸管上皮細胞層に添加してウイルスを感染させた。ウイルス感染後3時間（3 hpi）および感染後72時間（72 hpi）の培地中のウイルスコピー数を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、ノロウイルスに結合し、該ノロウイルスの腸管上皮細胞（例えば、小腸上皮細胞など）への感染を阻害するナノ抗体（以下、「本発明のナノ抗体」とも記載する）または該ナノ抗体を含む重鎖抗体である。
本発明の実施形態における、ノロウイルスは、好ましくは、HuNoVで、限定はしないが、例えば、GI、GIIおよびGIVのグループに分類されるウイルスであり、好ましくは、GII.3およびGII.4に分類されるウイルスである。
本明細書に記載されるVLP（Virus-like particle；ウイルス様粒子）は、VP1タンパク質からなるカプシドの殻を有し（すなわち、VP1タンパク質に結合するナノ抗体はVLPにも結合する）、ウイルスと同じ外殻構造を有しているが、その内部に遺伝子を保持していない。VP1タンパク質は、ノロウイルスの構造を形成する構造タンパク質１のことであり、詳細は、例えば、Glassら, N Engl J Med 361:1776-1785 2009などを参照のこと。
本発明の実施形態において、本発明のナノ抗体とは、抗体重鎖の可変領域（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody；VHH）からなり、ノロウイルスの腸管上皮細胞への感染を阻害し得るポリペプチドのことである。
【００１４】
本発明のナノ抗体は、例えば、下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドである。
（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、HuNoVに結合してHuNoVの腸管細胞への感染を阻害する活性を有するポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、HuNoVに結合してHuNoVの腸管細胞への感染を阻害する活性を有するポリペプチド
本明細書において、「１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列」と記す場合、置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸の数は、特に限定はしないが、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個程度が好ましい。また、本明細書において、「80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列」は80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であれば、何％であってもよいが、たとえば、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上または99％以上であってもよい。
上記（ｂ）および（ｃ）において、配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３に対するアミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加の箇所は、各配列のCDR1、CDR2およびCDR3以外の配列であることが望ましい。上記アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加は、タンパク質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。当該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、MutanTM-G（TaKaRa社））等を使用し、Guppedduplex法やKunkel法等の公知の方法、または、それらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
【００１５】
配列番号１、配列番号５、配列番号９または配列番号１３で表されるアミノ酸からなるポリペプチドは、本発明のナノ抗体であるが、各配列のCDR1〜CDR3は以下の通りである。
（i）配列番号１
CDR1；INTM（配列番号１７）、CDR2；ISSGGGTNY（配列番号１８）、CDR3；NLHNFSPISPPRSY（配列番号１９）
（ii）配列番号５
CDR1；INGV（配列番号２０）、CDR2；ISRSGWTNY（配列番号２１）、CDR3；NLHSGLGNVKNY（配列番号２２）
（iii）配列番号９
CDR1；PNVM（配列番号２３）、CDR2；KTSGRLSNY（配列番号２４）、CDR3；WDSARSTEY（配列番号２５）
（iv）配列番号１３
CDR1；DNAM（配列番号２６）、CDR2；ITNSNSTKY（配列番号２７）、CDR3；IERTGRTSIKWTY（配列番号２８）
上記（ｂ）および（ｃ）に記載のポリペプチドとVP1（VLP）との結合性については、ウエスタンブロッティング法やELISA法により、また、ノロウイルスの腸管上皮腸細胞（iPS細胞などから誘導した細胞も含む）への感染を阻害する活性の有無については、実施例に示すように調製した腸管上皮細胞層を用いて容易に確認することができる。
【００１６】
本発明のナノ抗体には、相補性決定領域1〜3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）であるポリペプチドも含まれる。
（Ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｄ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
【００１７】
さらに、本発明の実施形態には、上述の本発明にかかる「ナノ抗体」を可変領域として含む重鎖抗体（重鎖のみで形成される抗体）も含まれる。本発明の「重鎖抗体」は、遺伝子工学的手法で作製したものであっても、ラクダ科などの重鎖抗体を産生する動物が産生したものであってもよい。
さらに、「本発明のナノ抗体」には、VHHの単量体のみならず、同一または異なる複数の「本発明のナノ抗体」をペプチドリンカーなどで結合させた多量体の「ナノ抗体」（「ナノ抗体多量体」）も含まれる。
また、「本発明のナノ抗体」の１または複数を、抗原特異性の異なる他のナノ抗体、例えば、ロタウイルスに対するナノ抗体（例えば、Tokuharaら, J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266）、ノロウイルスGIに結合するナノ抗体または細菌毒素に対するナノ抗体などの１または複数と組み合わせたナノ抗体多量体を作製してもよい。ナノ抗体多量体は、例えば、Schmidtら, Clin Vaccine Immuno. 23:774-784 2016に記載の方法を参考にして作製することができる。
【００１８】
本発明のナノ抗体は、当該技術分野における公知技術により容易に作製することができる。また、ペプチド固相合成法とネイティブ・ケミカル・リゲーション（Native Chemical Ligation；NCL）法を組み合わせて作製してもよい。
本発明のナノ抗体であるポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、配列番号２、配列番号６、配列番号１０および配列番号１４で表される配列）からなるDNAを適当な発現ベクターに挿入し、常法に基づいて、ポリペプチドを発現し、単離精製を行うことで、本発明のナノ抗体を調製することができる。
本発明のナノ抗体は、種々の宿主細胞、例えば、細菌細胞（例えば、Escherichia coli B strain, E. coli Kl2 strain, Corynebacterium ammoniagenes, C. glutamicum, Serratia liquefaciens, Streptomyces lividans, Pseudomonas putidaなど); カビ（ 例えば Penicillium camembertii, Acremonium chrysogenumなど）、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞（例えばSaccharomyces cerevisiae およびPichia pastorisなど）を使用し、これらの細胞内で発現させることができる。ナノ抗体を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現用ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pETなど（大腸菌宿主）、pEGF-C、pEGF-Nなど（動物細胞宿主）、pVL1392、pVL1393など（昆虫細胞宿主、バキュロウイルスベクター）、pG-1、Yep13またはpPICZなど（酵母細胞宿主）を使用することができる。これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカーおよびプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位およびポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、FLAGタグ、Hisタグ、HAタグおよびGSTタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
発現用ベクターの作製は、当業者に公知の手法により実施することができ、適宜、市販のキットなどを使用して行うこともできる。
【００１９】
発現させたナノ抗体を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のポリペプチドを取得することができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法（例えば、GSTタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはグルタチオンを担体に結合させた樹脂を、Hisタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはNi-NTA樹脂やCoベースの樹脂を、HAタグと共にポリペプチドを発現させた場合には抗HA抗体樹脂を、FLAGタグと共にポリペプチドを発現させた場合には、抗FLAG抗体結合樹脂などを使用する方法）、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００２０】
本発明の第２の実施形態は、本発明のナノ抗体または本発明の重鎖抗体を含む医薬である。本発明の医薬は、有効成分である本発明のナノ抗体または重鎖抗体自体を投与する形態でもよいが、一般的には、有効成分であるナノ抗体または重鎖抗体の他、１または２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。また、本発明の医薬または医薬組成物の有効成分としては、本発明のナノ抗体または重鎖抗体の中から１以上を選択し、それらを組み合わせて用いることができ、さらに、本発明のナノ抗体と抗原特異性の異なる他のナノ抗体、例えば、ロタウイルスに対するナノ抗体（例えば、Tokuharaら, J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266）、ノロウイルスGIに結合するナノ抗体または細菌毒素に対するナノ抗体などの１または複数と組み合わせたナノ抗体多量体を用いてもよい。また、医薬組成物中には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
【００２１】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤または注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００２２】
経口投与用または非経口投与用の製剤は、任意の製剤形態で提供される。製剤形態としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤または液剤等の形態の経口投与用剤、静脈内投与用、筋肉内投与用もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤または坐剤などの形態として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
【００２３】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬または医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して、例えば、0.1重量％〜99.9重量％、1重量％〜95.0重量％、または1重量％〜90.0重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコールまたは水等が挙げられる。
【００２４】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウムまたは無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウまたは硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油またはオリーブ油などに溶解した後ゼラチンで被覆し軟カプセルとすることができる。
【００２５】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムまたはリン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリンまたはゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート80またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ、注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２６】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリドまたはポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し、型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコールまたは大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００２７】
本発明の実施形態に医薬または医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師または薬剤師の判断により適宜選択することが可能である。
一般的には、経口投与における成人1日あたりの投与量は0.01〜1,000 mg（有効成分重量）程度であり、1日1回または数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して1日量0.001〜100ｍｇ（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
【００２８】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生物分解性および生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。
【００２９】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる医薬または医薬組成物は、有効成分の活性を長期間有効に持続し、剤等が容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質させることのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。
また、キットには使用説明書が添付されてもよい。本キットの使用説明は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROMまたはDVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存され、供給されてもよい
【００３０】
本発明の第３の実施形態は、本発明のナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネおよび当該コメである。
ナノ抗体は、その特性を失わせること無くコメに蓄積させることが可能である。ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネの作製方法は、すでに公知であり、詳細については、例えば、WO2015/011396またはTokuharaら, J Clin Invest. Doi:10.1172/JCI70266などを参照のこと（本発明者らの発明による特許第5616449「ナノ抗体を発現するトランスジェクックイネ」が日本で成立）。
【００３１】
さらに、本発明の実施形態には、本発明のナノ抗体または重鎖抗体を含有する医薬または医薬組成物を患者等に投与して、ノロウイルス感染症もしくはその他の感染症、およびノロウイルス感染症もしくはその他の感染症に伴う諸症状を治療または予防するための方法が含まれる。
ここで「治療」とは、疾患等に罹患した哺乳動物において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによって該疾患の進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
また、「予防」とは、疾患等に罹患するおそれがある哺乳動物について、該疾患の発症または罹患を予め阻止することを意味し、これによって該疾患の諸症状等の発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコおよびウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジおよびウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。
【００３２】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
１．ノロウイルスに対するナノ抗体の調製
１−１．ファージライブラリーの作製
本発明のナノ抗体は、QVQ社（Utrecht, Netherlands）に委託して作製した。
ここでは、ナノ抗体の調製の概要を示す。
2頭のラマをVP1抗原溶液（配列番号２９）300 μg/injectionで免疫した。抗原溶液中のVP1の含有量は、10 %であるため、各免疫あたり約30 μgのVP1を免疫したことになる。免疫は、最初の免疫の日から0（最初の免疫日）、14、28および35日目に行った。最初の免疫から40日目に免疫を完了し、末梢血リンパ球（peripheral blood lymphocyte; PBL）を調製するために約200 mlの血液サンプルを採取した。抗体価の測定には、免疫0日目と44日目の血清を使用した。50 μlのPBS中でイムノプレートの各ウェルを、200ngのVP1でコートした（4℃で一晩）。プレートを洗浄し、4 % Marvel（PBS中）でブロッキングした後、血清を2 % Marvel（PBS中）で段階希釈して各ウェルに添加した。その後、各ウェルを洗浄した後、ラマIgGに対するモノクローナル抗体（HRP標識mAb 27E10）を用いて、VP1に対する抗体の検出を行った。【００３４】
ラマから採取した血液から、Ficoll gradientによりPBLsを調製し、得られたPBLsからフェノール−クロロホルム法によりRNAを調製した。得られたRNAは、逆転写酵素キット（Invitrogen）を使用して、cDNAに逆転写した。IGH（抗体重鎖）をコードするDNA断片を、リーダー配列領域に結合するプライマーを使用して増幅した。約700bpのVHHをコードするDNA断片が増幅された。この約700bpのDNA断片を電気泳動後、アガロースから切り出し、抽出した。得られたDNA断片の約80 ngをテンプレートとして、nested PCRを行った。増幅された断片をBstEIIおよびSfiIで切断し、約350bpの断片を単離、精製した。
約330 ngの精製したDNA断片をファージミドpUR8100に挿入し、大腸菌TG1に導入して、VHHファージミドライブラリーを作製した。次いで、VHHファージミドライブラリーから、ファージを回収し、VHHファージライブラリーを調製した。
調製したファージライブラリーから、ヒトVP1を抗原（既存の抗体VP1抗体を介してマイクロプレートのウェルに固定化）としてELISA法により、2ラウンドのバイオパンニングを行い、ヒトVP1と結合するファージクローンを選択した。【００３５】
１−２．ヒトノロウイルスVP1に結合するVHHのスクリーニング（１回目および２回目）
選択したファージクローンからVHH DNAをPCRで増幅し、増幅されたDNAを挿入したpMEK222（FLAGタグおよびHisタグを含んでいる）で大腸菌（E.coli TG1）を形質転換した。インサート（VHH DNA断片）を保持する大腸菌をスクリーニングし、VHHの配列を決定した。大腸菌で発現されたVHHポリペプチドは、細胞抽出液をCo樹脂に通して精製した。
得られたVHHの特異性および交差活性を確認するため、ヒトノロウイルスGIIに属する遺伝子型（GII.2（MK04株）、GII.3（U201株）、GII.4（Sakai株、Saga1株、Narita104株）、GII.6（7K株）、GII.17（kawasaki308株））のVP1を抗原としてELISAを実施した。
前日にPBSで希釈した1μg/ml濃度の各VP1（100ng/well）を、マイクロプレートウェルに添加し、4℃で一晩、固定化した。固定化後、PBST（250μl/well）で5回洗浄し、1%BSA-PBST(200μl/well)で室温1.5時間ブロッキングを行い、PBST（250μl/well）で3回洗浄後、ブロッキングバッファーで1nM、10nMおよび100nMにそれぞれ希釈した各ナノ抗体を100μl/well添加し、室温で2時間インキュベートした。インキュベーション後、PBST（250μl/well）で5回洗浄し、PBSTで10,000倍希釈したHRP conjugated anti-FLAG(M2)（SIGMA）を100μl/well添加し、室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、PBST（250μl/well）で5回洗浄し、基質液（TMB Microwell Peroxidase Substrate System、KPL）を100μl/well添加し、室温で5分間反応させ、2N硫酸を50μl/well添加し、発色を停止した。その後、マイクロプレートリーダー(BIO-RAD)にて450nmの吸光度を測定した。
以上の工程を２回行った。
１回目のスクリーニングの結果、GII.4（Sakai株、Saga1株およびNarita104株）、GII.3（U201株）、GII.2（MK04株）、GII.6（7K株）およびGII.17（Kawasaki308株）由来のVP1に特異的に結合するKVP-7F10（配列番号１）、KVP-7B8（配列番号５）およびKVP-7C6（配列番号９）が得られた（図１および図２）。さらに、２回目のスクリーニングの結果、GII.4（Sakai株、Saga1株およびNarita104株）、GII.3（U201株）、GII.2（MK04株）、GII.6（7K株）およびGII.17（kawasaki308株）由来のVP1に特異的に結合するKVP-12B8（配列番号１３）が得られた（図３および４）。なお、ここで得られたナノ抗体は、GI.4（Chiba株）、GI.6（W18株）との結合性は低かった。
配列番号１、配列番号５、配列番号９および配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるナノ抗体のCDR1〜CDR3は、ロタウイルスのVHHのCDRs配列を参照して決定した（Stability of llama heavy chain antibody fragments under extreme conditions Chapter 4 “Decreasing trypsin susceptibility of single domain anitibodies,: implications for structural stability:” / Edward Dolk - [S.l.] : [s.n.], 2004 -Universiteit Utrecht ISBN nr:90-393-3643-1 (https://dspace.library.uu.nl/bitstream/handle/1874/251/inhoud.htm;jsessionid=ADE7F83BC64DB071D664C9CF587B01E5?sequence=16)；Spinelliら, Biocehmistry 39:1217-1222 2000）。【００３６】
２．リニアエピトープマッピング（ウエスタンブロット）
得られたナノ抗体のエピトープを調べるために、ヒトノロウイルス（GII.4株）のVP1（配列番号２９）の各ドメイン、Pドメイン全長（配列番号２９中、アミノ酸224〜540）、P1-1およびP2（配列番号２９中、アミノ酸224〜411）、P2（配列番号２９中、アミノ酸271〜411）およびP1-2（配列番号２９中、アミノ酸412〜540）を大腸菌で発現させた。
具体的には、VP1遺伝子（配列番号３０）を用いて、5’末端にEcoRI切断配列+GATGが、3’末端にXhoI切断配列が付加するように各ドメインの塩基配列をPCRで増幅し、pET20b(+)発現ベクター（C末端に6xHisが付加されている）を作製した。
各ドメインの発現ベクターを保持する大腸菌をクローニング後、大腸菌Rosetta2 pLysS  (Novagen 71403) にヒートショック法で形質転換し、SOC 培地で振とう培養した。培養物をLB-Amp 寒天培地に播種し、37℃で培養後、コロニーを液体培地に植菌して培養し、得られた培養駅をグリセロールストックとした。
次に、ストックを培養し、1 mM IPTG誘導によりタンパク質の発現を確認し、回収した菌体を6 M UreaのLysis bufferに溶解して、各ドメインタンパク質を抽出した。抽出した各ドメインは、6 M Ureaによる変性状態にてHis-tag（金属キレートアフィニティークロマトグラフィー）で精製した。得られた各タンパク質はAnti-His抗体を用いるウエスタンブロットで確認した（図５）。【００３７】
次に発現させた各ドメインを用いて各ナノ抗体のリニアエピトープマッピングを行った。
精製した各ドメインタンパク質と分子量マーカーを、各5 μl/lane添加し、SDS-PAGEにて分離後、ゲルをメンブレンに転写した。転写後、メンブレンを5%スキムミルク-TBSTに浸し、室温にて１時間ブロッキングした。上記１で調製したナノ抗体を、各10 μg/mlの濃度になるようTBSTで希釈し、転写後のメンブレン上で室温にて1.5時間反応させた。反応後のメンブレンを、TBST中、室温にて5分間、3回洗浄した。洗浄後、TBSTで3,000倍希釈したMonoclonal Anti-FLAG M2-HRP抗体をメンブレンに添加し、室温にて1時間反応させた。反応後、TBST中、室温にて5分間、3回洗浄した。次いで、メンブレンに基質を加えて室温にて5分間反応させ、ImageQuant LAS 4000miniを用い、化学発光を測定した。
第１回目のスクリーニングで得られたナノ抗体KVP-7F10（図６Ｂ）およびKVP-7B8（図６Ａ、Ｃ）はP1-2に反応しているが、KVP-7C6は反応していなかった（図６Ｂ）。第２回目のスクリーニングで得られたKVP-12B8も反応しなかった（図６Ｃ）。同条件でKPV-7B8は確実にP1-2に反応している（図６Ｃ）。少なくとも７F10、７B8はこの付近を含む部分に結合すると考えられるが、このLiner sequenceに結合しないからといって、この付近に結合性を示さないと結論はできない。なお、Hansmanらは、GIIコモンに対するマウスモノクロ抗体がP1-2付近に結合することを報告している（J Virol. 2012 Apr;86(7):3635-46. doi: 10.1128/JVI.06868-11. Epub 2012 Jan 25.）。【００３８】
３．ナノ抗体のノロウイルス侵入阻害効果の検討
３−１．単層の腸管上皮細胞層の作製
培養可能なヒト単層上皮細胞を樹立するために新生児皮膚由来ヒトiPS細胞（TkDN4-M；東京大学 幹細胞治療研究センター 幹細胞プロセシング分野/ステムセルバンク、大津真博士より供与を受けた）をActivin A、Wnt3a等を含む培地で3日間培養し内胚葉系細胞へ分化させ、さらにFGF4およびWnt3aを含む培地で3〜4日間培養して下部消化管への分化を誘導し、管状構造をもつ球状細胞塊（Spheroid）が形成されたら、R-spondin1、EGF等を含む培地で2週間三次元培養を行い、オルガノイドを得て、さらにWnt3aおよびHGF等を含む培地で継代しながらオルガノイドを増殖させた。増殖させたオルガノイドを破砕して幹細胞を取り出し、Transwell（登録商標）（24 well）に播種して10日間培養し、単層化したヒト腸管上皮細胞を樹立した。
なお、生体からのbiopsyによるオルガノイド、単層化上皮細胞の誘導については、Ettayebiら, Science 353:1387-1393 2016などを、また、iPS細胞からのオルガノイドの誘導は、McCrackenら, Nat. protocol. 6:1920 2011などを参照して実施することができる。【００３９】
３−２．免疫組織染色
３−２−１．ホールマウント染色
ナノ抗体による、VLPの上皮細胞結合阻害を確認するため、Transwell上で単層化した上皮細胞にあらかじめ室温にて1時間プレインキュベートしたGII.6(7K) VLP（Virus-like particle）−ナノ抗体混合液（モル比1:1、1:0.1および1:0.01）およびポジティブコントロールとしてのVLP（500ng）（国立感染症研究所ウイルス部、片山和彦博士（現、北里大学北里生命科学研究所教授）より供与を受けた）のみを、各々、100 μl/well添加し、37℃で3時間インキュベートした。洗浄後、4%PFA固定、0.5%TritonX-100-PBSで透過処理の後、Transwellメンブレンを裏から切り取った。メンブレンは5% Goat Serum-NETG buffer （150mM NaCl、5mM EDTA、50mM Tris-HCl、0.05% TritonX-100、0.25% gelatin） に浸し室温で1時間ブロッキング後、NETG bufferで150倍希釈した1次抗体（anti-Zo-1 (Invitrogen)；Zo-1は上皮細胞のタイトジャンクションに存在する分子で、細胞間接着形成のマーカーである） に浸し、4℃で一晩反応させた。1次抗体反応後のメンブレンを洗浄後、HiLyte FluorTM 555 Labeling Kit-NH2（同仁化学）を用いてHiLyte FluorTM 555色素を標識したGII.6(7K) VLP（100倍）、2次抗体としてのDyLightTM488 conjugated anti-Mouse IgG(Jackson, 400倍)、DAPI (1000倍)をNETG bufferで希釈した反応液に浸し、室温で3時間反応させた。その後、PBSTとPBSで洗浄、封入後、共焦点レーザー顕微鏡を用い、蛍光を検出した。【００４０】
図７は、VLPの上皮細胞への結合に対するKVP-7F10およびKVP-7B8の結合阻害能を調べた結果である。VLPのみのコントロールにおいては、図７Ａの「7K VLP」および「Merge」に示されるように、上皮細胞に結合したVLPの蛍光が検出されている。これに対し、KVP-7F10およびKVP-7B8をGII.6(7K)VLPに対するモル比、1:1および1:0.1で添加した場合には、VLPの蛍光がほとんど検出されなかった（図７ＢおよびＣの「7K VLP」および「Merge」を参照のこと）。従って、KVP-7F10およびKVP-7B8はGII.6(7K)VLPの上皮細胞への結合を有効に阻害することが示された。
図８は、VLPの上皮細胞への結合に対するKVP-12B8およびKVP-7C6の結合阻害能を調べた結果である。VLPのみのコントロールにおいては、図８Ａにおいて矢印に示す細胞に、VLPからの蛍光が検出されていた。これに対し、KVP-12B8をGII.6(7K)VLPに対するモル比1:1で添加すると、VLPからの蛍光はほぼ検出されなかった（図８Ｂ）。また、KVP-7C6をGII.6(7K)VLPに対するモル比、1:1および1:0.1で添加した場合には、若干VLPの蛍光が認められたものの、コントロールと比較すると、VLPの細胞への結合がほぼ阻害されていることが分かる（図８Ｃ）。
以上の結果から、KVP-7F10、KVP-7B8、KVP-12B8およびKVP-7C6はGII.6(7K)VLPの上皮細胞への結合を有効に阻害することが示された。なお、GII.6(7K)VLPと結合しないKVP-7G5やKVP-7B4（図９Ａ）は、VLPの上皮細胞への結合を阻害しなかった（図９Ｂ）。【００４１】
３−２−２．VLPの上皮細胞への侵入の確認（凍結切片染色）
VLPが上皮細胞内部に取り込まれるのかを確認するために、Transwell上で単層化した上皮細胞にGII.6(7K) VLP(300ng)を、100 μl/well添加し、37℃で3時間インキュベートした。洗浄後、10%ホルマリン固定、70% EtoH洗浄後、メンブレンを裏から切り取った。O.C.T. Compound（サクラファインテック）に包埋した凍結ブロックを作製した後、クライオスタットにて7〜8μmの凍結切片を作製した。
凍結切片は、5% Goat Serum-NETG buffer（150mM NaCl、5mM EDTA、50mM Tris-HCl、0.05% TritonX-100、0.25% gelatin) を添加し、室温で1時間ブロッキング後、NETG bufferで150倍希釈した1次抗体（anti-Zo-1 (Invitrogen)）を添加し、4℃で一晩反応させた。1次抗体反応後のメンブレンを洗浄後、HiLyte FluorTM 555 Labeling Kit-NH2（同仁化学）を用いてHiLyte FluorTM 555色素を標識したGII.6(7K) VLP（100倍）、2次抗体としてのDyLightTM488 conjugated anti-Mouse IgG(Jackson, 400倍)、DAPI (1000倍)をNETG bufferで希釈した反応液に浸し、室温で3時間反応させた。その後、PBSTとPBSで洗浄、封入後、共焦点レーザー顕微鏡を用い、蛍光を検出した（図１０）。
図１０から、GII.6(7K)VLPはヒト上皮細胞に結合するだけでなく、その細胞質内に侵入するVLPであることが確認できた（図１０の矢印はVLPからの蛍光を示す）。
上記３−２−１および３−２−２の結果から、本発明の実施形態にかかるナノ抗体は、ノロウイルスVLPの単層化ヒト腸管上皮細胞への侵入を有効に阻害することが確認された。【００４２】
４．ナノ抗体のノロウイルス感染阻害効果の検討
ヒトノロウイルス（Human Norovirus：HuNoV）は、大阪健康安全基盤研究所から供与を受けた（GII.3（16-50株）、GII.4（17-53株）およびGII.17（16-421株））。
また、iPS細胞（TkDN4-M株；Takayamaら, J. Exp. Med., 207:2817-2830 2010）由来単層化腸管上皮細胞は、大阪大学微生物病研究所の佐藤慎太郎博士から供与されたオルガノイドから調製した。具体的には、Takahashiらの方法（Stem cell Reports 10:314-328, 2018）で維持、継代しているヒトiPS細胞誘導オルガノイドから細胞を回収し、96well細胞培養用プレートに1 wellあたり2×104 cellsずつ播種し、Takahashiらの方法（EBioMedicine 23:43-45, 2017）で5日間培養して単層化上皮細胞を調製した。ウイルスを感染させる前の48時間は、GII.3感染用の細胞については0.03 %ブタ胆汁を添加した条件で、GII.4およびGII.17感染用の細胞については、胆汁非添加の条件で培養した。
感染当日、予めウイルスゲノムコピー数を算定済みのHuNoVを1 wellあたり5×106コピーとナノ抗体(1 wellあたり5 μg)（KVP-7B8、KVP-7C6、KVP-7F10およびKVP-12B8）を混合し、37℃にて2時間プレインキュベートした。プレインキュベート後のウイルスのみもしくはウイルスとナノ抗体の混合液をiPS細胞由来単層化腸管上皮細胞に添加し、37℃にて3時間感染させた。感染から3時間後、全てのwellのウイルス液を除去して2回洗浄後、100 μlの培地を添加して、添加した培地を回収し、3hpiサンプル（感染後3時間のサンプル）として回収した。3hpiサンプル回収後のwellに新たな培地100 μlを添加し、感染から72時間後まで引き続き培養を続けた。72時間後、全てのwellから上清を回収し、72hpiサンプル（感染後72時間のサンプル）とした。
3hpiおよび72hpiサンプルからRNAを抽出し、公定法に基づいたリアルタイムPCR（4x TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix/ life technologies #4444434)により各サンプルのウイルスコピー数を算出した。【００４３】
図１１にGII.3（16-50株）のヒト腸管上皮細胞への感染に対する本発明にかかるナノ抗体の影響を示す。KVP-7C6およびKVP-12B8でGII.3を処理した場合、72hpiサンプル中のウイルスコピー数が顕著に減少した。従って、KVP-7C6およびKVP-12B8はHuNoVの腸管上皮細胞への結合を阻害するのみならず、感染も阻害することが分かった。【００４４】
図１２に、GII.4（17-53株）のヒト腸管上皮細胞への感染に対する本発明にかかるナノ抗体の影響を示す。KVP-7B8、KVP-7C6、KVP-7F10およびKVP-12B8でGII.4を処理した場合、72hpiサンプル中のウイルスコピー数が顕著に減少した。従って、KVP-7B8、KVP-7C6およびKVP-12B8はHuNoVの腸管上皮細胞への結合を阻害するのみならず、感染も阻害することが分かった。【００４５】
図１３に、GII.17（16-421株）のヒト腸管上皮細胞への感染に対する本発明にかかるナノ抗体の影響を示す。GII.17の腸管上皮細胞への感染に対しては、KVP-7B8、KVP-7C6、KVP-7F10およびKVP-12B8のいずれも効果を示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明にかかる抗体は、ノロウイルス感染を有効に阻害する効果を有する。従って、本発明は、医療分野における利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月24日(2019.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノロウイルスに結合し、該ノロウイルスの腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
【請求項２】
前記ノロウイルスがヒトノロウイルス（HuNoV）であることを特徴とする請求項１に記載のナノ抗体。
【請求項３】
相補性決定領域1〜3（CDR1、CDR2およびCDR3）のアミノ酸配列が下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）または（Ｄ）であることを特徴とする、HuNoV GII.4の腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
（Ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号１８で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｂ）配列番号２０で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２２で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｃ）配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２４で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
（Ｄ）配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むCDR1、
配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含むCDR2、および
配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むCDR3。
【請求項４】
下記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のポリペプチドを含むナノ抗体であって、HuNoV GII.4の腸管細胞への感染を阻害するナノ抗体。
（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、および、
（ｃ）配列番号１、配列番号５、配列番号９もしくは配列番号１３で表されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体を含む重鎖抗体。
【請求項６】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体の複数を連結したナノ抗体多量体。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体の１または複数と、該ナノ抗体と抗原特異性の異なるナノ抗体の１または複数を連結したナノ抗体多量体。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれかに記載のナノ抗体をコードする核酸。
【請求項９】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０または配列番号１４で表される核酸。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターが導入された細胞。
【請求項１２】
請求項８または９に記載の核酸が導入され、前記ナノ抗体がコメに発現しているトランスジェニックイネ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のトランスジェニックイネから採取されたコメ。
【請求項１４】
請求項１ないし７のいずれかに記載のナノ抗体、重鎖抗体またはナノ抗体多量体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
治療または予防対象の疾患が、ノロウイルス感染症であることを特徴とする請求項１４に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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