(57)【要約】  ＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制することができるＴＲＰチャネル活性抑制剤であって、ＴＲＰチャネルの活性を抑制するための有効成分としてアルミニウムイオンを含有していることを特徴とするＴＲＰチャネル活性抑制剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＰチャネルの活性を抑制するためのＴＲＰチャネル活性抑制剤であって、前記ＴＲＰチャネルの活性を抑制するための有効成分としてアルミニウムイオンを含有していることを特徴とするＴＲＰチャネル活性抑制剤。
【請求項２】
ＴＲＰチャネルの活性を抑制するためのＴＲＰチャネル活性抑制剤であって、前記ＴＲＰチャネルの活性を抑制するための有効成分としてアルミニウムイオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰチャネル活性抑制剤。
【請求項３】
ＴＲＰチャネルの活性を抑制する活性抑制方法であって、アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとを接触させることを特徴とするＴＲＰチャネルの活性抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＲＰチャネル活性抑制剤に関する。さらに詳しくは、ＴＲＰチャネル活性抑制剤およびＴＲＰチャネルの活性抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚外用剤は、皮膚に適用され、皮膚に有用な効果を与える外用剤である。しかし、皮膚外用剤は、使用者の皮膚の状態などによっては、使用者に不快な感覚または不快な生理学的事象を引き起こさせることがある。しかし、近年、使用者の安全意識の高まりから、不快な感覚または不快な生理学的事象を使用者に引き起こさせないか、または引き起こさせにくく、しかも有用な効果を十分に発現する物質および方法が待ち望まれている。【０００３】
ところで、ＴＲＰチャネルは、外界から受ける種々の刺激を受容する感覚受容などに関与する一過性受容体電位チャネルである。ＴＲＰチャネルの１つであるＴＲＰＡ１は、例えば、アルカリ剤などによる不快な感覚の発現に関与することが、本発明者らによって見出されている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−６２３０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、ＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制するＴＲＰチャネル活性抑制剤およびＴＲＰチャネルの活性抑制方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
（１）ＴＲＰチャネルの活性を抑制するためのＴＲＰチャネル活性抑制剤であって、前記ＴＲＰチャネルの活性を抑制するための有効成分としてアルミニウムイオンを含有していることを特徴とするＴＲＰチャネル活性抑制剤、
（２）ＴＲＰチャネルの活性を抑制するためのＴＲＰチャネル活性抑制剤であって、前記ＴＲＰチャネルの活性を抑制するための有効成分としてアルミニウムイオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰチャネル活性抑制剤、および
（３）ＴＲＰチャネルの活性を抑制する活性抑制方法であって、アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとを接触させることを特徴とするＴＲＰチャネルの活性抑制方法
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のＴＲＰチャネル活性抑制剤およびＴＲＰチャネルの活性抑制方法は、ＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制するという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】試験例１において、ＴＲＰＶ１発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図２】試験例２において、ＴＲＰＶ１発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図３】試験例３において、硫酸アルミニウムカリウム濃度とＴＲＰＶ１活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図４】試験例４において、ＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図５】試験例５において、塩化アルミニウム濃度と抑制率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図６】試験例６において、ＴＲＰＭ８発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図７】試験例７において、蛍光強度比の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図８】試験例８において、蛍光強度比の経時的変化を調べた結果を示すグラフである。
【図９】試験例９において、試料の種類とＴＲＰＶ１活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１０】試験例１０において、試料の種類とＴＲＰＡ１活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１１】試験例１１において、硫酸アルミニウムカリウム濃度と抑制率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１２】試験例１２において、被験試料のｐＨと抑制率との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．ＴＲＰチャネル活性抑制剤
本発明は、１つの側面では、ＴＲＰチャネルの活性を抑制するためのＴＲＰチャネル活性抑制剤であって、ＴＲＰチャネルの活性を抑制するための有効成分としてアルミニウムイオンを含有していることを特徴とするＴＲＰチャネル活性抑制剤（以下、「活性抑制剤Ａ」という）に関する。
【００１０】
アルミニウムイオンは、アゴニストによるＴＲＰチャネルの活性を抑制する。したがって、本発明の活性抑制剤Ａは、アルミニウムイオンを有効成分として含有しているので、本発明の活性抑制剤ＡとＴＲＰチャネルとを接触させることにより、ＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制することができる。
【００１１】
本発明の活性抑制剤Ａでは、アルミニウムイオンは、例えば、水系溶媒中で解離した状態で存在していてもよい。水系溶媒としては、例えば、水、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。水系溶媒が水である場合、本発明の活性抑制剤ＡのｐＨは、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは７．５〜１４（以下、「高ｐＨ」という）または１〜６．５（以下、「低ｐＨ」という）である。本発明の活性抑制剤ＡのｐＨが高ｐＨである場合、本発明の活性抑制剤ＡのｐＨは、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは７．５以上、より好ましくは８以上、さらに好ましくは８．５以上であり、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは１４以下、より好ましくは１３以下である。本発明の活性抑制剤ＡのｐＨが低ｐＨである場合、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは１以上、より好ましくは２以上であり、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは６．５以下、より好ましくは６以下、さらに好ましくは５以下である。
【００１２】
本発明の活性抑制剤Ａにおけるアルミニウムイオン濃度は、適用対象のＴＲＰチャネルの種類、本発明の活性抑制剤Ａの用途などによって異なるので一概には決定することができないことから、適用対象のＴＲＰチャネルの種類、本発明の活性抑制剤Ａの用途などに応じて適宜決定することが好ましい。本発明の活性抑制剤Ａにおけるアルミニウムイオン濃度は、通常、ＴＲＰチャネルの活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは１０μＭ以上、より好ましくは１００μＭ以上であり、本発明の活性抑制剤Ａの保存安定性を向上させる観点から、好ましくは２０ｍＭ以下、より好ましくは１０ｍＭ以下である。本明細書において、アルミニウムイオン濃度は、金属指示薬〔（株）同仁化学研究所製、商品名：Ｃｕ−ＰＡＮ〕を用いて測定された値である。
【００１３】
本発明の活性抑制剤Ａは、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、ｐＨ調整剤、界面活性剤などの他の成分を含有していてもよい。
【００１４】
本発明の活性抑制剤Ａは、例えば、アルミニウムイオンに解離する物質と水系溶媒とを混合することによって製造することができる。本発明の活性抑制剤ＡがｐＨ調整剤、界面活性剤などの他の成分を含有する場合、当該活性抑制剤Ａは、例えば、アルミニウムイオンに解離する物質と他の成分とを混合することによって製造することができる。
【００１５】
アルミニウムイオンに解離する物質としては、例えば、ハロゲン化アルミニウム、無機酸アルミニウム塩、有機酸アルミニウム塩などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ハロゲン化アルミニウムとしては、例えば、塩化アルミニウムなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。無機酸アルミニウム塩は、無機酸アルミニウム単塩であってもよく、無機酸アルミニウム複塩であってもよい。無機酸アルミニウム単塩としては、例えば、リン酸アルミニウムなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。無機酸アルミニウム複塩としては、例えば、硫酸アルミニウム複塩などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。硫酸アルミニウム複塩としては、例えば、硫酸アルミニウムナトリウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの硫酸アルミニウムアルカリ金属複塩、硫酸アルミニウムアンモニウムなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。有機酸アルミニウム塩としては、例えば、ギ酸アルミニウム、酢酸アルミニウム、クエン酸アルミニウムなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのアルミニウムイオンに解離する物質のなかでは、ＴＲＰチャネルの活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、ハロゲン化アルミニウム、無機酸アルミニウム塩および有機酸アルミニウム塩が好ましく、ハロゲン化アルミニウムおよび硫酸アルミニウム複塩がより好ましく、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび硫酸アルミニウムアンモニウムがより一層好ましく、塩化アルミニウムおよび硫酸アルミニウムカリウムがさらに好ましく、塩化アルミニウムがさらに一層好ましい。
【００１６】
本発明は、他の側面では、ＴＲＰチャネルの活性を抑制するためのＴＲＰチャネル活性抑制剤であって、ＴＲＰチャネルの活性を抑制するための有効成分としてアルミニウムイオンに解離する物質が配合されていることを特徴とするＴＲＰチャネル活性抑制剤（以下、「活性抑制剤Ｂ」という）に関する。
【００１７】
本発明の活性抑制剤ＢとＴＲＰチャネルとを接触させたとき、アルミニウムイオンに解離する物質から解離されたアルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとが接触することにより、ＴＲＰチャネルの活性が効果的に抑制される。したがって、本発明の活性抑制剤Ｂは、アルミニウムイオンに解離する物質が配合されているので、ＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制することができる。
【００１８】
アルミニウムイオンに解離する物質は、ＴＲＰチャネルと接触させる際に、アルミニウムイオンに解離していればよい。本発明の活性抑制剤Ｂに用いられるアルミニウムイオンに解離する物質は、本発明の活性抑制剤Ａの製造に用いられるアルミニウムイオンに解離する物質と同様である。アルミニウムイオンに解離する物質のなかでは、ＴＲＰチャネルの活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、ハロゲン化アルミニウム、無機酸アルミニウム塩および有機酸アルミニウム塩が好ましく、ハロゲン化アルミニウムおよび硫酸アルミニウム複塩がより好ましく、塩化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムおよび硫酸アルミニウムアンモニウムがより一層好ましく、塩化アルミニウムおよび硫酸アルミニウムカリウムがさらに好ましく、塩化アルミニウムがさらに一層好ましい。
【００１９】
本発明の活性抑制剤Ｂでは、アルミニウムイオンに解離する物質は、水系溶媒中に溶解した状態で存在していてもよい。本発明の活性抑制剤Ｂに用いられる水系溶媒は、前述の活性抑制剤Ａに用いられる水系溶媒と同様である。水系溶媒が水である場合、本発明の活性抑制剤ＢのｐＨは、アルミニウムイオンに解離する物質の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、アルミニウムイオンに解離する物質の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。水系溶媒が水であるときの本発明の活性抑制剤ＢのｐＨは、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは前記高ｐＨまたは前記低ｐＨである。本発明の活性抑制剤ＢのｐＨが高ｐＨである場合、本発明の活性抑制剤ＢのｐＨは、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは７．５以上、より好ましくは８以上、さらに好ましくは８．５以上であり、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは１４以下、より好ましくは１３以下である。本発明の活性抑制剤ＢのｐＨが低ｐＨである場合、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは１以上、より好ましくは２以上であり、水中で解離した状態でアルミニウムイオンを安定に存在させる観点から、好ましくは６．５以下、より好ましくは６以下、さらに好ましくは５以下である。
【００２０】
本発明の活性抑制剤Ｂにおけるアルミニウムイオンに解離する物質の濃度は、アルミニウムイオンに解離する物質の種類、適用対象のＴＲＰチャネルの種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、アルミニウムイオンに解離する物質の種類、適用対象のＴＲＰチャネルの種類などに応じて適宜決定することが好ましい。本発明の活性抑制剤Ｂ１００質量部あたりのアルミニウムイオンに解離する物質の量は、通常、ＴＲＰチャネルの活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、好ましくは０．０１質量部以上、より好ましくは０．０５質量部以上であり、ＴＲＰチャネルの活性に対する抑制効果を十分に発揮させる観点から、１００質量部以下である。本発明の活性抑制剤がアルミニウムイオンに解離する物質以外の成分を含有する場合、本発明の活性抑制剤Ｂ１００質量部あたりのアルミニウムイオンに解離する物質の量の上限値は、本発明の活性抑制剤Ｂの保存安定性を向上させる観点から、好ましくは１０質量部以下、より好ましく１質量部以下である。
【００２１】
本発明の活性抑制剤Ｂは、本発明の目的が妨げられない範囲内で、例えば、ｐＨ調整剤、界面活性剤などの他の成分を含有していてもよい。
【００２２】
使用時における本発明の活性抑制剤Ｂのアルミニウムイオン濃度は、通常、ＴＲＰチャネル活性抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、ＴＲＰチャネル活性抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下である。
【００２３】
本発明の活性抑制剤Ｂは、例えば、アルミニウムイオンに解離する物質と水系溶媒とを混合することによって製造することができる。本発明の活性抑制剤ＢがｐＨ調整剤、界面活性剤などの他の成分を含有する場合、例えば、当該活性抑制剤Ｂは、アルミニウムイオンに解離する物質と他の成分とを混合することによって製造することができる。
【００２４】
ＴＲＰチャネルとしては、例えば、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのＴＲＰチャネルのなかでは、効果的に活性を抑制することができることから、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ３およびＴＲＰＶ４が好ましい。
【００２５】
ＴＲＰＡ１としては、例えば、ヒトＴＲＰＡ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７３３２など）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１の活性としては、例えば、アリルイソチオシアネートなどによる化学刺激、ｐＨ１０〜１２の条件下での高ｐＨ刺激、１７℃前後の温度での冷刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの輸送能；当該刺激による膜電位の調節能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１が有するカルシウムイオンの輸送能は、例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞が有するＴＲＰＡ１へのＴＲＰＡ１アゴニストの結合に伴う細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの流入量を測定することによって調べることができる。ＴＲＰＡ１が有する膜電位の調節能は、例えば、ＴＲＰＡ１発現細胞が有するＴＲＰＡ１へのＴＲＰＡ１アゴニストの結合に伴う細胞内における電流の増加量などを測定することによって調べることができる。ＴＲＰＡ１アゴニストとしては、例えば、アリルイソチオシアナート、シンナムアルデヒド、アリシンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＡ１の活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象としては、例えば、炎症性疼痛、神経因性疼痛などの痛み、過度の刺激感、過度の冷感などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２６】
ＴＲＰＭ８としては、例えば、ヒトＴＲＰＭ８（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２４０８０など）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＭ８の活性としては、メントールなどによる化学刺激、２５〜２８℃前後の温度での冷刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの輸送能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＭ８が有するカルシウムイオンの輸送能は、例えば、ＴＲＰＭ８発現細胞が有するＴＲＰＭ８へのＴＲＰＭ８アゴニストの結合に伴う細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの流入量を測定することによって調べることができる。ＴＲＰＭ８アゴニストとしては、例えば、メントール、イシリンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＭ８の活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象としては、例えば、過度の冷感などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２７】
ＴＲＰＶ１としては、例えば、ヒトＴＲＰＶ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０８０７０４など）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ１の活性としては、例えば、カプサイシンなどによる化学刺激、ｐＨ３〜５．５の条件下での低ｐＨ刺激、４３℃前後の温度での熱刺激、痛み刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの輸送能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ１が有するカルシウムイオンの輸送能は、例えば、ＴＲＰＶ１発現細胞が有するＴＲＰＶ１へのＴＲＰＶ１アゴニストの結合に伴う細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの流入量を測定することによって調べることができる。ＴＲＰＶ１アゴニストとしては、例えば、カプサイシン、カンファー、アリシンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ１の活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象としては、例えば、過度の熱感などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２８】
ＴＲＰＶ３としては、例えば、ヒトＴＲＰＶ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１４５０６８など）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ３の活性としては、例えば、カンファーなどによる化学刺激、３３〜３９℃前後の温度での熱刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオン輸送能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ３が有するカルシウムイオンの輸送能は、例えば、ＴＲＰＶ３発現細胞が有するＴＲＰＶ３へのＴＲＰＶ３アゴニストの結合に伴う細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの流入量を測定することによって調べることができる。ＴＲＰＶ３アゴニストとしては、例えば、カンファー、オイゲノール、カルバクロールなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ３の活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象としては、例えば、過度の熱感、皮膚の過角化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２９】
ＴＲＰＶ４としては、例えば、ヒトＴＲＰＶ４（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５など）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ４の活性としては、例えば、４α−ホルボール−１２，１３−ジデカノエートなどによる化学刺激、２７〜３４℃前後の温度での熱刺激、低浸透圧刺激、機械刺激などの刺激による細胞外から細胞内へのカルシウムイオン輸送能などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ４が有するカルシウムイオンの輸送能は、例えば、ＴＲＰＶ４発現細胞が有するＴＲＰＶ４へのＴＲＰＶ４アゴニストの結合に伴う細胞外から細胞内へのカルシウムイオンの流入量を測定することによって調べることができる。ＴＲＰＶ４アゴニストとしては、例えば、４α−ホルボール  １２，１３−ジデカノエートなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ＴＲＰＶ４の活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象としては、例えば、過度の熱感、痒み感覚などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の活性抑制剤Ａおよび活性抑制剤Ｂが有するＴＲＰチャネル活性抑制作用は、例えば、ＴＲＰチャネルを発現する細胞（以下、「ＴＲＰチャネル発現細胞」という）の細胞内カルシウムイオン濃度、ＴＲＰチャネル発現細胞内における電流などを指標として用いることによって評価することができる。
【００３１】
ＴＲＰチャネル発現細胞は、内因性ＴＲＰチャネルを発現する細胞であってもよく、外因性ＴＲＰチャネルを発現する細胞であってもよい。ＴＲＰチャネル発現細胞は、１種類のＴＲＰチャネルを発現する細胞であってもよく、２種類以上のＴＲＰチャネルを発現する細胞であってもよい。外因性ＴＲＰチャネルを発現する細胞としては、例えば、外因性ＴＲＰチャネルをコードする核酸を宿主細胞に導入することによって得られる細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３２】
ＴＲＰチャネル活性抑制作用の評価方法の具体例としては、以下の評価法１、評価法２などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３３】
＜評価法１＞
（１Ａ）ＴＲＰチャネル発現細胞と本発明の活性抑制剤Ａまたは活性抑制剤ＢとＴＲＰチャネルのアゴニストとを接触させ、当該ＴＲＰチャネル発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ａを測定するステップ、
（１Ｂ）ＴＲＰチャネル発現細胞とＴＲＰチャネルのアゴニストとを接触させ、当該ＴＲＰチャネル発現細胞の細胞内カルシウムイオン濃度Ｂを測定するステップ、および
（１Ｃ）細胞内カルシウムイオン濃度Ａと細胞内カルシウムイオン濃度Ｂとを比較するステップを含む方法。
【００３４】
＜評価法２＞
（２Ａ）ＴＲＰチャネル発現細胞と本発明の活性抑制剤Ａまたは活性抑制剤ＢとＴＲＰチャネルのアゴニストとを接触させ、当該ＴＲＰチャネル発現細胞内における電流Ａを測定するステップ、
（２Ｂ）ＴＲＰチャネル発現細胞とＴＲＰチャネルのアゴニストとを接触させ、当該ＴＲＰチャネル発現細胞内における電流Ｂを測定するステップ、および
（２Ｃ）電流Ａと電流Ｂとを比較するステップ
を含む方法。
【００３５】
評価法１における細胞内カルシウムイオン濃度Ａおよび細胞内カルシウムイオン濃度Ｂの測定方法としては、例えば、カルシウムイオンに結合するカルシウム指示薬を用いる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。カルシウム指示薬を用いる方法では、ＴＲＰチャネル発現細胞に導入して当該ＴＲＰチャネル発現細胞内のカルシウムイオンにカルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を調べることによって細胞内カルシウムイオン濃度を測定することができる。カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合したカルシウム指示薬の量を簡便な操作で測定することができることから、カルシウムイオンとの結合前後の変化を光学的特性の変化などによって検出することができる試薬であることが好ましい。光学的特性の変化としては、例えば、蛍光強度の変化、吸光度の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものでない。カルシウム指示薬としては、例えば、カルシウムイオンとの結合前後に蛍光強度が変化する蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。カルシウム指示薬の具体例としては、１−［６−アミノ−２−（５−カルボキシ−２−オキサゾリル）−５−ベンゾフラニルオキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル（Ｆｕｒａ  ２−ＡＭ）、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジクロロ−６−ヒドロキシ−３−オキソ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラアセトキシメチルエステル（Ｆｌｕｏ  ３−ＡＭ）、１−［２−アミノ−５−（２，７−ジフルオロ−６−アセトキシメトキシ−３−オキソ−９−キサンテニル）フェノキシ］−２−（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラアセトキシメチルエステル（Ｆｌｕｏ  ４−ＡＭ）などの蛍光カルシウム指示薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３６】
評価法１では、細胞内カルシウムイオン濃度Ｂと比べて細胞内カルシウムイオン濃度Ａが低い場合、本発明の活性抑制剤Ａまたは活性抑制剤Ｂは、ＴＲＰチャネル活性抑制作用を有すると評価することができる。また、細胞内カルシウムイオン濃度Ａと細胞内カルシウムイオン濃度Ｂとの間の差が大きいほど、本発明の活性抑制剤Ａまたは活性抑制剤Ｂは、高いＴＲＰチャネル活性抑制作用を有すると評価することができる。
【００３７】
評価法２における電流Ａおよび電流Ｂの測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３８】
評価法２では、電流Ｂの絶対値と比べて電流Ａの絶対値が小さい場合、本発明の活性抑制剤Ａまたは活性抑制剤Ｂは、ＴＲＰチャネル活性抑制作用を有すると評価することができる。また、電流Ａの絶対値と電流Ｂの絶対値との間の差が大きいほど、本発明の活性抑制剤Ａまたは活性抑制剤Ｂは、高いＴＲＰチャネル活性抑制作用を有すると評価することができる。
【００３９】
以上説明したように、本発明のＴＲＰチャネル活性抑制剤は、不快な感覚または生理学的事象の発現に関与するＴＲＰチャネルの活性を抑制することができる。したがって、本発明のＴＲＰチャネル活性抑制剤は、ＴＲＰチャネルの活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象の発現を抑制する用途、例えば、ＴＲＰＡ１の活性化に起因する刺激を抑制する用途に用いられる刺激抑制剤、ＴＲＰＭ８の活性化に起因する冷感を調整する用途に用いられる冷感調整剤、ＴＲＰＶ１の活性化に起因する痛みを抑制する用途に用いられる痛み抑制剤、ＴＲＰＶ３の活性化に起因する皮膚細胞の過角化を抑制する用途に用いられる皮膚細胞の過角化抑制剤、ＴＲＰＶ４の活性化に起因する痒みを抑制する用途に用いられる痒み抑制剤などに好適に用いることができる。
【００４０】
２．ＴＲＰチャネルの活性抑制方法
本発明のＴＲＰチャネルの活性抑制方法（以下、「活性抑制方法」という）は、ＴＲＰチャネルの活性を抑制する活性抑制方法であって、アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとを接触させることを特徴とするＴＲＰチャネルの活性抑制方法である。なお、医療行為は、本発明の活性抑制方法の概念から除かれていてもよく、除かれていなくてもよい。本明細書において、医療行為は、医師および医師の指示を受けた者がヒトに対して治療を実施する行為をいう。本発明の活性抑制方法によれば、アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとを接触させるので、ＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制することができる。
【００４１】
アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとの接触は、ＴＲＰチャネルを含む部位にアルミニウムイオンを供給することによって行なうことができる。ＴＲＰチャネルを含む部位としては、例えば、皮膚表皮、気道上皮、末梢神経、眼粘膜などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４２】
アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとの接触の際には、アルミニウムイオンと、アルミニウムイオンを安定に維持する成分などとを併用することができる。アルミニウムイオンを安定に維持する成分としては、例えば、水系溶媒などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとの接触の際には、本発明の活性抑制剤を用いてもよい。
【００４３】
アルミニウムイオンは、通常、液体に含まれる状態でＴＲＰチャネルと接触させる。ＴＲＰチャネルに接触させる液体に含まれるアルミニウムイオンの量は、本発明の活性抑制方法の用途、適用対象のＴＲＰチャネルの種類、適用対象のＴＲＰチャネルを含む部位の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、本発明の活性抑制方法の用途、適用対象のＴＲＰチャネルの種類、適用対象のＴＲＰチャネルを含む部位の種類などに応じて適宜決定することが好ましい。ＴＲＰチャネルと接触させる液体におけるアルミニウムイオンの量は、例えば、本発明の活性抑制方法の適用対象が末梢神経に含まれるＴＲＰチャネルである場合、通常、ＴＲＰチャネル活性抑制作用を十分に発現させる観点から、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、他の組織への作用を低減させる観点から、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下である。
【００４４】
アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとの接触時間は、本発明の活性抑制方法の用途、適用対象のＴＲＰチャネルの種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、本発明の活性抑制方法の用途、適用対象のＴＲＰチャネルの種類などに応じて適宜決定することが好ましい。
【００４５】
本発明の活性抑制方法によるＴＲＰチャネル活性抑制効果は、前記活性抑制剤によるＴＲＰチャネル活性抑制作用の評価と同様の手法によって評価することができる。
【００４６】
本発明の活性抑制方法によれば、痛み、過度の刺激感、過度の冷感、過度の熱感、痒みなどの不快な感覚の発現などとの関連性があるＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制することができる。したがって、例えば、ＴＲＰチャネルの活性化に起因する不快な感覚を与える可能性がある成分を含む外用剤を使用するときに、アルミニウムイオンと当該外用剤とを併用して本発明の活性抑制方法を行なうことにより、ＴＲＰチャネルの活性を抑制し、ＴＲＰチャネルの活性化に起因する不快な感覚の発現を抑制することができる。
【００４７】
以上説明したように、本発明の活性抑制方法によれば、アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとを接触させるので、ＴＲＰチャネルの活性を効果的に抑制することができる。したがって、本発明の活性抑制剤は、ＴＲＰチャネルの活性化に起因する不快な感覚または不快な生理学的事象の発現を抑制する用途、例えば、ＴＲＰＡ１の活性化に起因する刺激を抑制する用途、ＴＲＰＭ８の活性化に起因する冷感を調整する用途、ＴＲＰＶ１の活性化に起因する痛みを抑制する用途、ＴＲＰＶ３の活性化に起因する皮膚細胞の過角化を抑制する用途、ＴＲＰＶ４の活性化に起因する痒みを抑制する用途などに用いられることが期待される。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。以下において、各略語の意味は、以下のとおりである。
＜略語の説明＞
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＮＭＤＧ−Ｃｌ：Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩化物
ＢＡＰＴＡ：１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシド）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸
ＨＥＰＥＳ：２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸
ＡＩＴＣ：アリルイソチオシアネート
４αＰＤＤ：４α−ホルボール−１２，１３−ジデカノエート
蛍光強度340nm：励起波長３４０ｎｍにおける蛍光強度
蛍光強度380nm：励起波長３８０ｎｍにおける蛍光強度【００４９】
調製例１
（１）ＴＲＰＶ１発現細胞の調製
ヒトＴＲＰＶ１  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０８０７０４に示される塩基配列の２７６〜２７９５位に対応するｃＤＮＡ）を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＶ１発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＶ１発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μＬとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μＬと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）〕２００μＬとを混合し、混合物ＩＩを得た。【００５０】
５体積％二酸化炭素雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中において、５×１０５個のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞にヒトＴＲＰＶ１発現ベクターを導入し、ＴＲＰＶ１発現細胞を得た。【００５１】
（２）ＴＲＰＡ１発現細胞の調製
調製例１（１）において、ヒトＴＲＰＶ１  ｃＤＮＡを用いる代わりにヒトＴＲＰＡ１  ｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００７３３２に示される塩基配列の６３〜３８８８位に対応するｃＤＮＡ〕を用いたことを除き、調製例１（１）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＡ１発現細胞を得た。【００５２】
（３）ＴＲＰＭ８発現細胞の調製
調製例１（１）において、ヒトＴＲＰＶ１  ｃＤＮＡを用いる代わりにヒトＴＲＰＭ８  ｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０に示される塩基配列の４１〜３３５５位に対応するｃＤＮＡ〕を用いたことを除き、調製例１（１）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＭ８発現細胞を得た。【００５３】
（４）ＴＲＰＶ３発現細胞の調製
調製例１（１）において、ヒトＴＲＰＶ１  ｃＤＮＡを用いる代わりにヒトＴＲＰＶ３  ｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１４５０６８に示される塩基配列の３２３〜２６９５位に対応するｃＤＮＡ〕を用いたことを除き、調製例１（１）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＶ３発現細胞を得た。【００５４】
（５）ＴＲＰＶ４発現細胞の調製
調製例１（１）において、ヒトＴＲＰＶ１  ｃＤＮＡを用いる代わりにヒトＴＲＰＶ４  ｃＤＮＡ〔ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２１６２５に示される塩基配列の９０〜２７０５位に対応するｃＤＮＡ〕を用いたことを除き、調製例１（１）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＶ４発現細胞を得た。【００５５】
実施例１
塩化アルミニウムをその濃度が５ｍＭとなるように溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ  ＮＭＤＧ−Ｃｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、５ｍＭ  ＢＡＰＴＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液〕に添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５ｍＭ）。【００５６】
比較例１
溶媒Ａに塩酸を添加することにより、溶媒ＡのｐＨを５に調整して低ｐＨ刺激用試料を得た。【００５７】
試験例１
調製例１（１）で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞を洗浄した。つぎに、洗浄後のＴＲＰＶ１発現細胞を溶媒Ａが入った循環定温チャンバーに入れた。循環定温チャンバー中のＴＲＰＶ１発現細胞に電極の先端を接触させ、電流記録ソフトウェア〔モルキュラーデバイス社製、商品名：ｐＣＬＡＭＰ１０〕と電流記録装置〔モルキュラーデバイス社製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ〕とを用い、電圧を−６０ｍＶに固定したときのＴＲＰＶ１発現細胞内の電流を経時的に測定した。測定開始時から３０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例１で得られた低ｐＨ刺激用試料を循環させた。低ｐＨ刺激用試料の循環開始時から５０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、実施例１で得られた被験試料を循環させた。実施例１で得られた被験試料の循環開始時から３０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例１で得られた低ｐＨ刺激用試料を３０秒間循環させた。その後、電流変化の測定を終了した。【００５８】
試験例１において、ＴＲＰＶ１発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を図１に示す。図中、「ｐＨ５」は低ｐＨ刺激の継続期間、「被験試料」は被験試料の循環期間を示す。【００５９】
図１に示された結果から、ＴＲＰＶ１発現細胞内の電流の絶対値は、低ｐＨ刺激によって増加するが、被験試料の添加によって減少することがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムから解離したアルミニウムイオンは、低ｐＨ刺激によって活性化されたＴＲＰＶ１の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００６０】
実施例２
塩化アルミニウムおよびカプサイシンを塩化アルミニウムの濃度が５ｍＭおよびカプサイシンの濃度が１００ｎＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５ｍＭ）。【００６１】
比較例２
カプサイシンをその濃度が１００ｎＭとなるように溶媒Ａに添加してアゴニスト含有試料を得た。【００６２】
試験例２
試験例１において、実施例１で得られた被験試料を用いる代わりに実施例２で得られた被験試料を用いたことおよび比較例１で得られた低ｐＨ刺激用試料を用いる代わりに比較例２で得られたアゴニスト含有試料を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行ない、ＴＲＰＶ１発現細胞内の電流を経時的に測定した。【００６３】
試験例２において、ＴＲＰＶ１発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を図２に示す。図中、「ＣＡＰ」はカプサイシンによる刺激の継続期間、「被験試料」は被験試料の循環期間を示す。【００６４】
図２に示された結果から、ＴＲＰＶ１発現細胞内の電流の絶対値は、アゴニスト含有試料に含まれるカプサイシンによる刺激によって増加するが、被験試料の添加によって減少することがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムから解離したアルミニウムイオンは、カプサイシンによる刺激によって活性化されたＴＲＰＶ１の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００６５】
なお、実施例２において、塩化アルミニウムを用いる代わりにリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの無機酸アルミニウム塩；酢酸アルミニウムなどのアルミニウムイオンに解離する他の物質を用いたときも、塩化アルミニウムを用いたときと同様の傾向が見られる。これらの結果から、アルミニウムイオンは、ＴＲＰＶ１の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００６６】
試験例３
（１）試料の調製
硫酸アルミニウムカリウムおよびカプサイシンを硫酸アルミニウムカリウムの濃度が１μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１μＭ（実験番号１）〕、１０μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０μＭ（実験番号２）〕、１００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１００μＭ（実験番号３）〕、２００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：２００μＭ（実験番号４）〕、５００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：５００μＭ（実験番号５）〕、１０００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０００μＭ（実験番号６）〕、５０００μＭ（〔アルミニウムイオン濃度：５０００μＭ（実験番号７）〕または１００００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１００００μＭ（実験番号８）〕およびカプサイシンの濃度が１００ｎＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。【００６７】
（２）蛍光強度比アゴニストの算出
調製例１（１）で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を、蛍光カルシウムイオン指示薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、指示薬導入細胞を得た。指示薬導入細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の循環定温チャンバーに入れた後、溶媒Ａで洗浄した。つぎに、循環定温チャンバーに比較例２で得られたアゴニスト含有試料を入れた。その後、アゴニスト存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ａ）とアゴニスト存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｂ）とを測定した。【００６８】
また、前記において、比較例２で得られたアゴニスト含有試料を用いる代わりに対照（溶媒Ａ）を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、対照存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｃ）と対照存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｄ）とを測定した。【００６９】
蛍光強度Ａ〜Ｄを用い、式（Ｉ）：
［Δ蛍光強度比アゴニスト］
＝［蛍光強度Ａ／蛍光強度Ｂ］−［蛍光強度Ｃ／蛍光強度Ｄ］      （Ｉ）
にしたがい、Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。【００７０】
また、比較例２で得られたアゴニスト含有試料を用いる代わりに実験番号１〜８の各被験試料を用いたことを除き、比較例２で得られたアゴニスト含有試料を用いたときと同様の操作を行ない、アルミニウムイオンおよびアゴニストの存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｅ）とアルミニウムイオンおよびアゴニストの存在下での蛍光強度380nmにおける（蛍光強度Ｆ）とを測定した。【００７１】
蛍光強度Ｃ〜Ｆを用い、式（ＩＩ）：
［Δ蛍光強度比活性抑制剤］
＝［蛍光強度Ｅ／蛍光強度Ｆ］−［蛍光強度Ｃ／蛍光強度Ｄ］    （ＩＩ）
にしたがい、Δ蛍光強度比活性抑制剤を算出した。【００７２】
算出されたΔ蛍光強度比アゴニストとΔ蛍光強度比活性抑制剤とを用い、式（ＩＩＩ）：
［ＴＲＰＶ１活性］
＝［Δ蛍光強度比活性抑制剤／Δ蛍光強度比アゴニスト］                （ＩＩＩ）【００７３】
にしたがい、ＴＲＰＶ１活性を算出した。【００７４】
試験例３において、硫酸アルミニウムカリウム濃度とＴＲＰＶ１活性との関係を調べた結果を図３に示す。【００７５】
図３に示された結果を用い、ＴＲＰＶ１活性に対する硫酸アルミニウムカリウムの５０％阻害濃度を算出した。その結果、ＴＲＰＶ１活性に対する硫酸アルミニウムカリウムの５０％阻害濃度は、２４６μＭであることがわかった。以上の結果から、ＴＲＰＶ１活性に対するアルミニウムイオンの５０％阻害濃度は、２４６μＭであることがわかった。【００７６】
実施例３
塩化アルミニウムおよびＡＩＴＣを塩化アルミニウムの濃度が５ｍＭおよびＡＩＴＣの濃度が２０μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５ｍＭ）。【００７７】
比較例３
ＡＩＴＣをその濃度が２０μＭとなるように溶媒Ａに添加してアゴニスト含有試料を得た。【００７８】
試験例４
調製例１（２）で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、ＴＲＰＡ１発現細胞を洗浄した。洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞を溶媒Ａが入った循環定温チャンバーに入れた。循環定温チャンバー中のＴＲＰＡ１発現細胞に電極の先端を接触させ、電流記録ソフトウェアと電流記録装置とを用い、電圧を−６０ｍＶに固定したときのＴＲＰＡ１発現細胞内の電流を経時的に測定した。測定開始時から３０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例３で得られたアゴニスト含有試料を循環させた。比較例３で得られたアゴニスト含有試料の循環開始時から５０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、実施例３で得られた被験試料を循環させた。実施例３で得られた被験試料の循環開始時から２５秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例３で得られたアゴニスト含有試料を循環させた。比較例３で得られたアゴニスト含有試料の循環開始時から５０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、溶媒Ａを循環させ、電流変化の測定を終了した。【００７９】
試験例４において、ＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を図４に示す。図中、「ＡＩＴＣ」はＡＩＴＣによる刺激の継続期間、「被験試料」は被験試料の循環期間を示す。【００８０】
図４に示された結果から、ＴＲＰＡ１発現細胞内の電流の絶対値は、アゴニスト含有試料に含まれるＡＩＴＣによる刺激によって増加するが、被験試料の添加によって減少することがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムから解離したアルミニウムイオンは、ＡＩＴＣによる刺激によって活性化されたＴＲＰＡ１の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００８１】
なお、実施例３において、塩化アルミニウムを用いる代わりにリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの無機酸アルミニウム塩；酢酸アルミニウムなどのアルミニウムイオンに解離する他の物質を用いたときも、塩化アルミニウムを用いたときと同様の傾向が見られる。これらの結果から、アルミニウムイオンは、ＴＲＰＡ１の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００８２】
実施例４
塩化アルミニウムおよびＡＩＴＣを塩化アルミニウムの濃度が５００μＭおよびＡＩＴＣの濃度が２０μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５００μＭ）。【００８３】
実施例５
塩化アルミニウムおよびＡＩＴＣを塩化アルミニウムの濃度が５０μＭおよびＡＩＴＣの濃度が２０μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５０μＭ）。【００８４】
試験例５
調製例１（２）で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、ＴＲＰＡ１発現細胞を洗浄した。つぎに、洗浄後のＴＲＰＡ１発現細胞を溶媒Ａが入った循環定温チャンバーに入れた。循環定温チャンバー中のＴＲＰＡ１発現細胞に電極の先端を接触させ、電流記録ソフトウェアと電流記録装置とを用い、電圧を−６０ｍＶに固定したときのＴＲＰＡ１発現細胞内の電流を経時的に測定した。測定開始時から３０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例３で得られたアゴニスト含有試料を循環させた。比較例３で得られたアゴニスト含有試料の循環開始時から５０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、実施例５で得られた被験試料を３０秒間、実施例４で得られた被験試料を３０秒間、実施例３で得られた被験試料を３０秒間循環させた。その後、循環定温チャンバー内において、比較例３で得られたアゴニスト含有試料を循環させた。比較例３で得られたアゴニスト含有試料の循環開始時から３０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、溶媒Ａを循環させ、電流変化の測定を終了した。式（ＩＶ）：
［抑制率］
＝［（アゴニスト含有試料の循環前後の電流の変化量）−（被験試料の循環前後の電流の変化量）］／［アゴニスト含有試料の循環前後の電流の変化量］      （ＩＶ）
にしたがい、抑制率を算出した。【００８５】
試験例５において、塩化アルミニウム濃度と抑制率との関係を調べた結果を図５に示す。【００８６】
図５に示された結果から、塩化アルミニウムは、濃度依存的にＴＲＰＡ１の活性を抑制することがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムから解離したアルミニウムイオンは、濃度依存的にＴＲＰＡ１の活性を抑制することがわかる。【００８７】
実施例６
塩化アルミニウムおよびメントールを塩化アルミニウムの濃度が５ｍＭおよびメントールの濃度が１ｍＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５ｍＭ）。【００８８】
比較例４
メントールをその濃度が１ｍＭとなるように溶媒Ａに添加してアゴニスト含有試料を得た。【００８９】
試験例６
調製例１（３）で得られたＴＲＰＭ８発現細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、ＴＲＰＭ８発現細胞を洗浄した。つぎに、洗浄後のＴＲＰＭ８発現細胞を溶媒Ａが入った循環定温チャンバーに入れた。循環定温チャンバー中のＴＲＰＭ８発現細胞に電極の先端を接触させ、電流記録ソフトウェアと電流記録装置とを用い、電圧を−６０ｍＶに固定したときのＴＲＰＭ８発現細胞内の電流を経時的に測定した。測定開始時から２０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例１で得られた低ｐＨ刺激用試料を循環させた。低ｐＨ刺激用試料の循環開始時から１５秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例４で得られたアゴニスト含有試料を循環させた。比較例４で得られたアゴニスト含有試料の循環開始時から３０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、実施例６で得られた被験試料を循環させた。実施例６で得られた被験試料の循環開始時から３０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例４で得られたアゴニスト含有試料を循環させた。比較例４で得られたアゴニスト含有試料の循環開始時から５０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例１で得られた低ｐＨ刺激用試料を循環させた。低ｐＨ刺激用試料の循環開始時から６０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、溶媒Ａを循環させ、電流変化の測定を終了した。【００９０】
試験例６において、ＴＲＰＭ８発現細胞内の電流の経時的変化を調べた結果を図６に示す。図中、「メントール」はメントールによる刺激の継続期間、「ｐＨ５」は低ｐＨ刺激の継続期間、「被験試料」は被験試料の循環期間を示す。【００９１】
図６に示された結果から、ＴＲＰＭ８発現細胞内の電流の絶対値は、アゴニスト含有試料に含まれるメントールによる刺激によって増加するが、低ｐＨ刺激によって減少し、被験試料の添加によってさらに減少することがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムから解離したアルミニウムイオンは、メントールによる刺激によって活性化されたＴＲＰＭ８の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００９２】
なお、実施例６において、塩化アルミニウムを用いる代わりにリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの無機酸アルミニウム塩；酢酸アルミニウムなどのアルミニウムイオンに解離する他の物質を用いたときも、塩化アルミニウムを用いたときと同様の傾向が見られる。これらの結果から、アルミニウムイオンは、ＴＲＰＭ８の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００９３】
実施例７
塩化アルミニウムおよびカンファーを塩化アルミニウムの濃度が５ｍＭおよびカンファーの濃度が１ｍＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５ｍＭ）。【００９４】
比較例５
カンファーをその濃度が１ｍＭとなるように溶媒Ａに添加してアゴニスト含有試料を得た。【００９５】
試験例７
調製例１（４）で得られたＴＲＰＶ３発現細胞を、蛍光カルシウムイオン指示薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、ＴＲＰＶ３発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、指示薬導入細胞を得た。指示薬導入細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、指示薬導入細胞を洗浄した。洗浄後の指示薬導入細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の循環定温チャンバーに入れた後、対照（溶媒Ａ）を循環させるとともに、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmの測定を開始した。対照（溶媒Ａ）の循環開始時から５０秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、比較例５で得られたアゴニスト含有試料を循環させた。比較例５で得られたアゴニスト含有試料の循環開始時から１００秒間経過後に、循環定温チャンバー内において、実施例７で得られた被験試料を１００秒間循環させた。【００９６】
蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmを用い、式（Ｖ）：
［蛍光強度比］
＝［蛍光強度340nm／蛍光強度380nm］                              （Ｖ）
にしたがい、蛍光強度比を算出した。【００９７】
試験例７において、蛍光強度比の経時的変化を調べた結果を図７に示す。図中、「カンファー」はカンファーによる刺激の継続期間、「被験試料」は被験試料の循環期間を示す。【００９８】
図７に示された結果から、蛍光強度比は、アゴニスト含有試料に含まれるカンファーによる刺激の開始によって増加するが、被験試料の添加によって減少することがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムから解離したアルミニウムイオンは、カンファーによる刺激によって活性化されたＴＲＰＶ３の活性を抑制する作用を有することがわかる。【００９９】
なお、実施例７において、塩化アルミニウムを用いる代わりにリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの無機酸アルミニウム塩；酢酸アルミニウムなどのアルミニウムイオンに解離する他の物質を用いたときも、塩化アルミニウムを用いたときと同様の傾向が見られる。これらの結果から、アルミニウムイオンは、ＴＲＰＶ３の活性を抑制する作用を有することがわかる。【０１００】
実施例８
塩化アルミニウムおよび４αＰＤＤを塩化アルミニウムの濃度が５ｍＭおよび４αＰＤＤの濃度が１０μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを５に調整して被験試料を得た。得られた被験試料中にはアルミニウムイオンが解離した状態で存在していた（アルミニウムイオン濃度：５ｍＭ）。【０１０１】
比較例６
４αＰＤＤをその濃度が１０μＭとなるように溶媒Ａに添加してアゴニスト含有試料を得た。【０１０２】
試験例８
試験例７において、調製例１（４）で得られたＴＲＰＶ３発現細胞を用いる代わりに調製例１（５）で得られたＴＲＰＶ４発現細胞を用いたこと、比較例５で得られたアゴニスト含有試料を用いる代わりに比較例６で得られたアゴニスト含有試料を用いたことおよび実施例７で得られた被験試料を用いる代わりに実施例８で得られた被験試料を用いたことを除き、試験例７と同様の操作を行ない、蛍光強度比の経時的変化を調べた。【０１０３】
試験例８において、蛍光強度比の経時的変化を調べた結果を図８に示す。図中、「４αＰＤＤ」は４αＰＤＤによる刺激の継続期間、「被験試料」は被験試料の循環期間を示す。【０１０４】
図８に示された結果から、蛍光強度比は、アゴニスト含有試料に含まれる４αＰＤＤによる刺激の開始によって増加するが、被験試料の添加によって減少することがわかる。これらの結果から、塩化アルミニウムから解離したアルミニウムイオンは、４αＰＤＤによる刺激によって活性化されたＴＲＰＶ４の活性を抑制する作用を有することがわかる。【０１０５】
なお、実施例８において、塩化アルミニウムを用いる代わりにリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウムなどの無機酸アルミニウム塩；酢酸アルミニウムなどのアルミニウムイオンに解離する他の物質を用いたときも、塩化アルミニウムを用いたときと同様の傾向が見られる。これらの結果から、アルミニウムイオンは、ＴＲＰＶ４の活性を抑制する作用を有することがわかる。【０１０６】
比較例７
水酸化アルミニウムゲル（水酸化アルミニウムの含有率１．３質量％）およびカプサイシンを水酸化アルミニウムゲルの濃度が５質量％（２０倍希釈）およびカプサイシンの濃度が１μＭとなるように溶媒Ａに添加して被験試料を得た。【０１０７】
比較例８
カプサイシンをその濃度が１μＭとなるように溶媒Ａに添加して被験試料を得た。【０１０８】
試験例９
調製例１（１）で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を、蛍光カルシウムイオン指示薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、指示薬導入細胞を得た。指示薬導入細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、指示薬導入細胞を洗浄した。洗浄後の指示薬導入細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置の循環定温チャンバーに入れた。その後、溶媒Ａを循環させるとともに、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmの測定を開始した。溶媒Ａの循環開始時から５０秒間経過時（対照の循環終了時）に対照存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｇ）および対照存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｈ）を取得した。循環定温チャンバー内において、比較例７で得られた被験試料を５０秒間循環させ、当該被験試料の循環終了時に水酸化アルミニウムゲルおよびアゴニスト存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｉ）および水酸化アルミニウムゲルおよびアゴニスト存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｊ）を取得した。つぎに、循環定温チャンバー内において、対照（溶媒Ａ）を１００秒間循環させた。その後、循環定温チャンバー内において、比較例８で得られた被験試料を５０秒間循環させ、当該被験試料の循環終了時にアゴニスト存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｋ）およびアゴニスト存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｌ）を取得した。【０１０９】
蛍光強度Ｇ，Ｈ、ＩおよびＪを用い、式（ＶＩ）：
［Δ蛍光強度比水酸化アルミニウムゲル］
＝［蛍光強度Ｉ／蛍光強度Ｊ］−［蛍光強度Ｇ／蛍光強度Ｈ］    （ＶＩ）
にしたがい、Δ蛍光強度比水酸化アルミニウムゲルを算出した。【０１１０】
蛍光強度Ｇ、Ｈ、ＫおよびＪを用い、式（ＶＩＩ）：
［Δ蛍光強度比アゴニスト］
＝［蛍光強度Ｋ／蛍光強度Ｌ］−［蛍光強度Ｇ／蛍光強度Ｈ］  （ＶＩＩ）
にしたがい、Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。【０１１１】
算出されたΔ蛍光強度比水酸化アルミニウムゲルとΔ蛍光強度比アゴニストとを用い、式（ＶＩＩＩ）：
［ＴＲＰＶ１活性またはＴＲＰＡ１活性］
＝［Δ蛍光強度比水酸化アルミニウムゲル／Δ蛍光強度比アゴニスト］      （ＶＩＩＩ）
にしたがい、ＴＲＰＶ１活性を算出した。【０１１２】
試験例９において、試料の種類とＴＲＰＶ１活性との関係を調べた結果を図９に示す。図中、レーン１は比較例７で得られた被験試料を用いたときのＴＲＰＶ１活性、レーン２は比較例８で得られた被験試料を用いたときのＴＲＰＶ１活性を示す。【０１１３】
図９に示された結果から、水酸化アルミニウムゲルとアゴニストとを含む被験試料（比較例７）を用いたときのＴＲＰＶ１活性は、アゴニストを含む被験試料（比較例８）を用いたときのＴＲＰＶ１活性と比べて高いことがわかる。これらの結果から、水酸化アルミニウムゲルは、ＴＲＰＶ１活性抑制作用を有しておらず、ＴＲＰＶ１活性促進作用を有していることがわかる。【０１１４】
比較例９
水酸化アルミニウムゲル（水酸化アルミニウムの含有率１．３質量％）およびＡＩＴＣを水酸化アルミニウムゲルの濃度が５質量％（２０倍希釈）およびＡＩＴＣの濃度が２０μＭとなるように溶媒Ａに添加して被験試料を得た。【０１１５】
比較例１０
ＡＩＴＣをその濃度が２０μＭとなるように溶媒Ａに添加して被験試料を得た。【０１１６】
試験例１０
試験例９において、調製例１（１）で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用いる代わりに調製例１（２）で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を用いたこと、比較例７で得られた被験試料を用いる代わりに比較例９で得られた被験試料を用いたことおよび比較例８で得られた被験試料を用いる代わりに比較例１０で得られた被験試料を用いたことを除き、試験例９と同様の操作を行ない、ＴＲＰＡ１活性を算出した。【０１１７】
試験例１０において、試料の種類とＴＲＰＡ１活性との関係を調べた結果を図１０に示す。図中、レーン１は比較例９で得られた被験試料を用いたときのＴＲＰＡ１活性、レーン２は比較例１０で得られた被験試料を用いたときのＴＲＰＡ１活性を示す。【０１１８】
図１０に示された結果から、水酸化アルミニウムゲルとアゴニストとを含む被験試料（比較例９）を用いたときのＴＲＰＡ１活性は、アゴニストを含む被験試料（比較例１０）を用いたときのＴＲＰＡ１活性と比べて高いことがわかる。これらの結果から、水酸化アルミニウムゲルは、ＴＲＰＡ１活性抑制作用を有しておらず、ＴＲＰＡ１活性促進作用を有していることがわかる。【０１１９】
調製例２
（１）被験試料Ａの調製
硫酸アルミニウムカリウムをその濃度が１μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１μＭ（実験番号９）〕、１０μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０μＭ（実験番号１０）〕、１００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１００μＭ（実験番号１１）〕、２００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：２００μＭ（実験番号１２）〕、５００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：５００μＭ（実験番号１３）〕、１０００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０００μＭ（実験番号１４）〕、５０００μＭ（〔アルミニウムイオン濃度：５０００μＭ（実験番号１５）〕または１００００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１００００μＭ（実験番号１６）〕となるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを４に調整して被験試料Ａを得た。【０１２０】
（２）被験試料Ｂの調製
硫酸アルミニウムカリウムおよびＡＩＴＣを硫酸アルミニウムカリウムの濃度が１μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１μＭ（実験番号９）〕、１０μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０μＭ（実験番号１０）〕、１００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１００μＭ（実験番号１１）〕、２００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：２００μＭ（実験番号１２）〕、５００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：５００μＭ（実験番号１３）〕、１０００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０００μＭ（実験番号１４）〕、５０００μＭ（〔アルミニウムイオン濃度：５０００μＭ（実験番号１５）〕または１００００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１００００μＭ（実験番号１６）〕およびＡＩＴＣの濃度が５μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを４に調整して被験試料Ｂを得た。【０１２１】
調製例３
ＡＩＴＣをその濃度が５μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸を添加することにより、当該混合物のｐＨを４に調整してアゴニスト含有試料を得た。【０１２２】
試験例１１
調製例１（２）で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、ＴＲＰＡ１発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、指示薬導入細胞を得た。指示薬導入細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、指示薬導入細胞を洗浄した。洗浄後の指示薬導入細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置の循環定温チャンバーに入れた。その後、循環定温チャンバー内において、溶媒Ａを循環させるとともに、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmの測定を開始した。【０１２３】
溶媒Ａの循環開始時から５０秒間経過時（対照の循環終了時）に対照存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｍ）および対照存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｎ）を取得した。その後、循環定温チャンバー内において、実験番号９の被験試料Ａを５０秒間循環させた。つぎに、循環定温チャンバー内において、実験番号９の被験試料Ｂを１００秒間循環させ、当該被験試料Ｂの循環終了時にアルミニウムイオンおよびアゴニスト（ＡＩＴＣ）存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｏ）およびアルミニウムイオンおよびアゴニスト（ＡＩＴＣ）存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｐ）を取得した。つぎに、循環定温チャンバー内において、対照（溶媒Ａ）を１００秒間循環させた。その後、循環定温チャンバー内において、調製例３で得られたアゴニスト含有試料を１００秒間循環させ、当該アゴニスト含有試料の循環終了時にアゴニスト存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｑ）およびアゴニスト存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｒ）を取得した。【０１２４】
蛍光強度Ｍ、Ｎ、ＯおよびＰを用い、式（ＩＸ）：
［Δ蛍光強度比活性抑制剤］
＝［蛍光強度Ｏ／蛍光強度Ｐ］−［蛍光強度Ｍ／蛍光強度Ｎ］
（ＩＸ）
にしたがい、Δ蛍光強度比活性抑制剤を算出した。【０１２５】
蛍光強度Ｍ、Ｎ、ＱおよびＲを用い、式（Ｘ）：
［Δ蛍光強度比アゴニスト］
＝［蛍光強度Ｑ／蛍光強度Ｒ］−［蛍光強度Ｍ／蛍光強度Ｎ］
（Ｘ）
にしたがい、Δ蛍光強度比アゴニストを算出した。【０１２６】
算出されたΔ蛍光強度比活性抑制剤とΔ蛍光強度比アゴニストとを用い、式（ＸＩ）：
［抑制率］
＝［Δ蛍光強度比アゴニスト−Δ蛍光強度比活性抑制剤］／［Δ蛍光強度比アゴニスト］
（ＸＩ）
にしたがい、ＴＲＰＡ１活性の抑制率を算出した。【０１２７】
また、前記において、実験番号９の被験試料Ａおよび被験試料Ｂを用いる代わりに実験番号１０〜１６の被験試料Ａおよび被験試料Ｂを用いたことを除き、実験番号９の被験試料Ａおよび被験試料Ｂを用いたときと同様の操作を行ない、ＴＲＰＡ１活性の抑制率を算出した。【０１２８】
試験例１１において、硫酸アルミニウムカリウム濃度とＴＲＰＡ１活性の抑制率との関係を調べた結果を図１１に示す。【０１２９】
図１１に示された結果を用い、ＴＲＰＡ１活性に対する硫酸アルミニウムカリウムの５０％阻害濃度を算出した。その結果、ＴＲＰＡ１活性に対する硫酸アルミニウムカリウムの５０％阻害濃度は、１０３μＭであることがわかった。以上の結果から、ＴＲＰＡ１活性に対するアルミニウムイオンの５０％阻害濃度は、１０３μＭであることがわかった。【０１３０】
調製例４
（１）被験試料Ｃの調製
硫酸アルミニウムカリウムをその濃度が１０００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０００μＭ〕となるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸または水酸化ナトリウムを添加することにより、当該混合物のｐＨを４、６（実験番号１７）、６（実験番号１８）または７．４（実験番号１９）に調整して被験試料Ｃを得た。【０１３１】
（２）被験試料Ｄの調製
硫酸アルミニウムカリウムとカプサイシンを硫酸アルミニウムカリウムの濃度が１０００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０００μＭ〕およびカプサイシンの濃度が１００ｎＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸または水酸化ナトリウムを添加することにより、当該混合物のｐＨを４、６（実験番号１７）、６（実験番号１８）または７．４（実験番号１９）に調整して被験試料Ｃを得た。【０１３２】
（３）被験試料Ｅの調製
硫酸アルミニウムカリウムとＡＩＴＣを硫酸アルミニウムカリウムの濃度が１０００μＭ〔アルミニウムイオン濃度：１０００μＭ〕およびＡＩＴＣの濃度が５μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸または水酸化ナトリウムを添加することにより、当該混合物のｐＨを４、６（実験番号１７）、６（実験番号１８）または７．４（実験番号１９）に調整して被験試料Ｄを得た。【０１３３】
調製例５
カプサイシンをその濃度が１００ｎＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸または水酸化ナトリウムを添加することにより、当該混合物のｐＨを４、６（実験番号１７）、６（実験番号１８）または７．４（実験番号１９）に調整してアゴニスト含有試料を得た。【０１３４】
調製例６
ＡＩＴＣをその濃度が５μＭとなるように溶媒Ａに添加して混合物を得た。得られた混合物に塩酸または水酸化ナトリウムを添加することにより、当該混合物のｐＨを４、６（実験番号１７）、６（実験番号１８）または７．４（実験番号１９）に調整してアゴニスト含有試料を得た。【０１３５】
試験例１２
（１）ＴＲＰＶ１活性の抑制率の算出
調製例１（１）で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、ＴＲＰＶ１発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、指示薬導入細胞を得た。指示薬導入細胞を溶媒Ａ中、３７℃で２分間振盪させながらインキュベーションすることにより、指示薬導入細胞を洗浄した。洗浄後の指示薬導入細胞を循環定温チャンバー付蛍光測定装置の循環定温チャンバーに入れた後、溶媒Ａを循環させるとともに、蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmの測定を開始した。【０１３６】
溶媒Ａの循環開始時から５０秒間経過時（対照の循環終了時）に対照存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｍ）および対照存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｎ）を取得した。その後、循環定温チャンバー内において、実験番号１７の被験試料Ｃを５０秒間循環させた。つぎに、循環定温チャンバー内において、実験番号１７の被験試料Ｄを１００秒間循環させ、当該被験試料Ｄの循環終了時にアルミニウムイオンおよびアゴニスト（カプサイシン）存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｏ）およびアルミニウムイオンおよびアゴニスト（カプサイシン）存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｐ）を取得した。つぎに、循環定温チャンバー内において、対照（溶媒Ａ）を１００秒間循環させた。その後、循環定温チャンバー内において、調製例５で得られた実験番号１７のアゴニスト含有試料を１００秒間循環させ、当該アゴニスト含有試料の循環終了時にアゴニスト存在下での蛍光強度340nm（蛍光強度Ｑ）およびアゴニスト存在下での蛍光強度380nm（蛍光強度Ｒ）を取得した。【０１３７】
蛍光強度Ｍ〜Ｒを用い、式（ＩＸ）、式（Ｘ）および式（ＸＩ）にしたがい、ＴＲＰＶ１活性の抑制率を算出した。【０１３８】
また、前記において、実験番号１７の被験試料Ｃおよび被験試料Ｄを用いる代わりに実験番号１８〜１９の被験試料Ｃおよび被験試料Ｄを用いたことを除き、実験番号１７の被験試料Ｃおよび被験試料Ｄを用いたときと同様の操作を行ない、ＴＲＰＶ１活性の抑制率を算出した。【０１３９】
試験例１２において、被験試料のｐＨとＴＲＰＶ１活性の抑制率との関係を調べた結果を図１２に示す。【０１４０】
（２）ＴＲＰＡ１活性の抑制率の算出
試験例１２（１）において、調製例１（１）で得られたＴＲＰＶ１発現細胞を用いる代わりに調製例１（２）で得られたＴＲＰＡ１発現細胞を用いたこと、被験試料Ｄを用いる代わりに被験試料Ｅを用いたことおよび調製例５で得られたアゴニスト含有試料を用いる代わりに調製例６で得られたアゴニスト含有試料を用いたことを除き、試験例１２（１）と同様の操作を行ない、ＴＲＰＡ１活性の抑制率を算出した。【０１４１】
試験例１２において、被験試料のｐＨとＴＲＰＡ１活性の抑制率との関係を調べた結果を図１２に示す。図中、黒色バーはＴＲＰＶ１活性の抑制率、白色バーはＴＲＰＡ１活性の抑制率を示す。【０１４２】
図１２に示された結果から、ＴＲＰＶ１活性の抑制率およびＴＲＰＡ１活性の抑制率は、ｐＨが４、６および７．４の順に高いことがわかる。これらの結果から、アルミニウムイオンに解離する物質として硫酸アルミニウムカリウムを用いた場合、活性抑制剤のｐＨを１〜６．５、好ましくは４〜６に調整することにより、ＴＲＰＶ１活性およびＴＲＰＡ１活性の抑制率を向上させることができることがわかる。【０１４３】
以上説明したように、アルミニウムイオンは、ＴＲＰＡ１、ＴＲＰＶ１、ＴＲＰＭ８、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４などのＴＲＰチャネルの活性を抑制することがわかる。したがって、本発明の活性抑制剤は、アルミニウムイオンを含有するので、ＴＲＰチャネルの活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象の発現を抑制または調整する薬剤、例えば、ＴＲＰＡ１の活性化に起因する刺激を抑制する用途に用いられる刺激抑制剤、ＴＲＰＭ８の活性化に起因する冷感を調整する用途に用いられる冷感調整剤、ＴＲＰＶ１の活性化に起因する痛みを抑制する用途に用いられる痛み抑制剤、ＴＲＰＶ３の活性化に起因する皮膚細胞の過角化を抑制する用途に用いられる皮膚細胞の過角化抑制剤、ＴＲＰＶ４の活性化に起因する痒みを抑制する用途に用いられる痒み抑制剤などの用途に用いられることが期待される。また、本発明の活性抑制方法は、アルミニウムイオンとＴＲＰチャネルとを接触させるので、ＴＲＰチャネルの活性化に起因する不快な感覚または生理学的事象の発現の抑制または調整、例えば、ＴＲＰＡ１の活性化に起因する刺激の抑制、ＴＲＰＭ８の活性化に起因する冷感の調整、ＴＲＰＶ１の活性化に起因する痛みの抑制、ＴＲＰＶ３の活性化に起因する皮膚細胞の過角化の抑制、ＴＲＰＶ４の活性化に起因する痒みの抑制などに用いられることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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