(57)【要約】  本発明は、α−シヌクレインの発現抑制について、より高い効果およびより長い持続性を有する核酸医薬を提供することを目的とする。本発明に係るオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを少なくとも１つ含み、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができ、該α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該α−シヌクレイン遺伝子と相補的であり、そして、特定のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１５ヌクレオチド長である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であって、
該オリゴヌクレオチドが、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができ、該α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該α−シヌクレイン遺伝子と相補的であり、そして、
配列番号１の４０〜４３、７４〜７６、２１５、２２７〜２３０、２３４、２５４、２５５、２６３、２６６〜２６９、２７３〜２７５、２７７、２７８、２８４〜２８６、２８８、２８９、３６６〜３６８、及び、４１２〜４１５位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項２】
配列番号１の４０〜４２、７４〜７６、２１５、２２７〜２３０、２３４、２５４、２５５、２６３、２６６、２６７、２６９、２７３〜２７５、２７７、２７８、２８４〜２８６、２８８、２８９、３６６〜３６８、及び、４１２〜４１５位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項３】
配列番号１の４１、４２、２１５、２２７〜２３０、２３４、２７４、２７７、２７８、２８４〜２８６、２８８、３６６〜３６８、及び、４１２〜４１４位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項４】
配列番号１の４２、２２７〜２３０、２７４、２７７、２７８、２８４〜２８６、４１３、及び、４１４位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項５】
配列番号１の４２、２２７、２２９、２７４、２７７、２７８、２８５、及び、４１３位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項６】
配列番号１の２２７、２２９、２７８、２８５、及び、４１３位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項７】
配列番号１の２２９、２７８、２８５、及び、４１３位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１５ヌクレオチド長、又は、配列番号１の２２７位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３ヌクレオチド長である請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、５〜７塩基のギャップ領域、３〜５塩基の５’ウイングおよび３〜５塩基の３’ウイングからなるギャップマーであり、
該ギャップ領域が、該５’ウイングと該３’ウイングの間に位置づけられ、そして
該５’ウイングおよび該３’ウイングが、少なくとも１つの２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを含む、
請求項１から７のいずれか１つに記載の１３〜１６ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項９】
リン酸ジエステル結合の修飾がホスホロチオエート結合である請求項１〜８のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する、α−シヌクレイン発現抑制剤。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか１つに記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１２】
α−シヌクレイン過剰症の治療または予防に用いられる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防に用いられる、請求項１１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α−シヌクレイン発現抑制作用を示す新規オリゴヌクレオチドと、当該新規オリゴヌクレオチドを含むα−シヌクレイン発現抑制剤、より詳細には、新規な人工核酸を用いたα−シヌクレイン発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、孤発性パーキンソン病および遺伝性パーキンソン病に分類され得る。【０００３】
孤発性パーキンソン病は、進行性の神経変性疾患で有病率は１０００人に１人であり、進行すると認知症を合併する。このような認知症はレビー小体型認知症であり、その治療は対症療法のみである。これは、脳内のα−シヌクレインの凝集・蓄積が原因とされる。【０００４】
遺伝性パーキンソン病は、パーキンソン病のうち５〜１０％であり、病因遺伝子ＰＡＲＫ１〜ＰＡＲＫ２０のうちＰＡＲＫ４遺伝子の関与が考えられている。ＰＡＲＫ４遺伝子が関与する遺伝性パーキンソン病は常染色体優性遺伝を示し、そのような患者は日本には数十人存在する。ＰＡＲＫ４遺伝子が関与する遺伝性パーキンソン病では正常α−シヌクレイン遺伝子が過剰となり、パーキンソン症状に認知症を合併することとなる。【０００５】
α−シヌクレインは、１４０アミノ酸残基からなるタンパク質であり、特有の天然構造を持たないアミロイドタンパク質である。α−シヌクレインは、シナプス小胞蓄積・放出に関連する。α−シヌクレインノックアウト（ＫＯ）マウスは、病理学的にも異常なしであり、神経毒のＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）に対する神経保護作用を示し得る。【０００６】
α−シヌクレインは、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）などの疾患におけるレビー小体の主成分である。ＰＤ剖検脳解析ブラークのステージ分類のため、剖検脳のα−シヌクレイン染色を行い、病気の進展とα−シヌクレイン病変とを対比したところ、神経細胞内のα−シヌクレイン凝集が病変の主体であることが判明している。また、α−シヌクレイントランスジェニック（Ｔｇ）マウスにα−シヌクレインフィブリルを投与したところ、このフィブリルを核に病変が伸展し、細胞外にも異常α−シヌクレインがみられるようになった（プリオン様細胞外伝播）。【０００７】
パーキンソン病の病態は次のとおりである。神経細胞内で異常α−シヌクレインが凝集することにより、中脳の黒質神経細胞が変性し、ドパミンの産生が低下し、そして運動機能障害または認知機能障害を引き起こす。従来の対症的治療法では、神経変性は徐々に進行し、ドパミン産生低下に対して、ドパミン補充のためＬ−ドパ製剤の投与またはドパミン分泌促進のためドパミンアゴニストの投与が行われていた。【０００８】
神経細胞内の異常α−シヌクレインの凝集を標的にして、α−シヌクレインノックダウンのための核酸医薬を用いる試みがなされている。【０００９】
過剰α−シヌクレインを抑制するための核酸医薬に関して、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）リボザイムのラットでの使用（非特許文献１）、レンチウイルス−ｓｈＲＮＡのラットでの使用（非特許文献２）、ＡＡＶ−ｓｈＲＮＡのラットでの使用（非特許文献３および４）、ネイキッドｓｉＲＮＡのマウスでの使用（非特許文献５）、エキソソームｓｉＲＮＡのマウスでの使用（非特許文献６）、ｓｉＲＮＡ（２−Ｏ−Ｍｅ）のサルでの使用（非特許文献７）が報告されている。しかし、非特許文献１〜４ではウイルスを使用しており、非特許文献５および６のｓｉＲＮＡの効果は早期に消失し、そして非特許文献７のｓｉＲＮＡの効果は充分でないという問題点がある。【００１０】
また、α−シヌクレイン遺伝子の発現抑制のために、人工核酸の使用が報告されている（特許文献１）。特許文献１では、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）で修飾されたヌクレオシドが用いられている。また、特許文献１においては、オリゴヌクレオチドは、線条体内ボーラス注射を介して注射投与されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１４−５０１５０７号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Kinoh et al. BBRC, 2006，vol. 341, pp.1088−95
【非特許文献２】Sapru et al. ExpNeurol, 2006，vol. 198, pp.382−90
【非特許文献３】Gorbatyuk et al. MolTher, 2010，vol. 18, pp.1450−7
【非特許文献４】Khodr et al. Brain Res, 2011，vol. 1395, pp.94−107
【非特許文献５】Lewis et al. MolNeurodegener, 2008，vol. 3, pp.19
【非特許文献６】Cooper et al. MovDisord, 2014，vol. 29, pp.1476−85
【非特許文献７】McCormack et al. PLoS One, 2010，vol. 5, pp.e12122
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、α−シヌクレインの発現抑制について、より高い効果およびより長い持続性を有する核酸医薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、
２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であって、
該オリゴヌクレオチドが、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができ、該α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有し、そして該α−シヌクレイン遺伝子と相補的であり、そして、
配列番号１の４０〜４３、７４〜７６、２１５、２２７〜２３０、２３４、２５４、２５５、２６３、２６６〜２６９、２７３〜２７５、２７７、２７８、２８４〜２８６、２８８、２８９、３６６〜３６８、及び、４１２〜４１５位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を提供する。【００１５】
１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号１の４０〜４２、７４〜７６、２１５、２２７〜２３０、２３４、２５４、２５５、２６３、２６６、２６７、２６９、２７３〜２７５、２７７、２７８、２８４〜２８６、２８８、２８９、３６６〜３６８、及び、４１２〜４１５位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である。【００１６】
１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号１の４１、４２、２１５、２２７〜２３０、２３４、２７４、２７７、２７８、２８４〜２８６、２８８、３６６〜３６８、及び、４１２〜４１４位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である。【００１７】
１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号１の４２、２２７〜２３０、２７４、２７７、２７８、２８４〜２８６、４１３、及び、４１４位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である。【００１８】
１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号１の４２、２２７、２２９、２７４、２７７、２７８、２８５、及び、４１３位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である。【００１９】
１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号１の２２７、２２９、２７８、２８５、及び、４１３位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３〜１６ヌクレオチド長である。【００２０】
１つの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、配列番号１の２２９、２７８、２８５、及び、４１３位からなる群から選ばれるいずれか１つのヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１５ヌクレオチド長、又は、配列番号１の２２７位のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを５’末端とし、配列番号１の少なくとも一部と相補的で、１３ヌクレオチド長である。【００２１】
さらなる実施形態では、上記オリゴヌクレオチドが、５〜７塩基のギャップ領域、３〜５塩基の５’ウイング及び３〜５塩基の３’ウイングからなるギャップマーであり、該ギャップ領域が、該５’ウイングと該３’ウイングの間に位置づけられ、そして該５’ウイングおよび該３’ウイングが、少なくとも１つの２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを含む。なお、本開示においては、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドをＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）と表記する場合がある。
該５’ウイングおよび該３’ウイングには、２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドで修飾されたヌクレオシド、文献（Yahara,A. et al. ChemBioChem (2012), 13, 2513-2516.）又はＷＯ２０１４／１０９３８４記載のＡｍＮＡ、又は、Ｓ−ｃＥｔ（２’，４’−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）が含まれていてもよい。
２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドとしては、Ｄ−リボフラノースの２’−Ｏ−アルキル化（例えば、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−アミノエチル化、２’−Ｏ−プロピル化、２’−Ｏ−アリル化、２’−Ｏ−メトキシエチル化、２’−Ｏ−ブチル化、２’−Ｏ−ペンチル化、２’−Ｏ−プロパルギル化など）ヌクレオシドを用いてもよい。【００２２】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する、α−シヌクレイン発現抑制剤を提供する。【００２３】
さらに、本発明は、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。【００２４】
１つの実施形態では、上記医薬組成物は、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防に用いられる。【００２５】
１つの実施形態では、上記医薬組成物は、パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防に用いられる。【００２６】
さらに、本発明は、α−シヌクレイン発現抑制方法であって、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む、方法を提供する。【００２７】
さらに、本発明は、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防方法であって、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む、方法を提供する。【００２８】
なおさらに、本発明は、パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防方法であって、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩を個体に投与する工程を含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、α−シヌクレインの発現抑制効果および持続性を有するオリゴヌクレオチドが提供される。本発明によれば、臨床応用時に通常用いられる投与経路である髄腔内投与においても、オリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン抑制効果が発揮され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】試験例１におけるＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクション後のα−シヌクレインｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図２】試験例２におけるＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクション後のα−シヌクレインｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図３】試験例３におけるＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクション後のα−シヌクレインｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図４】試験例４におけるＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクション後のα−シヌクレインｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【図５】試験例５におけるＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクション後のα−シヌクレインｍＲＮＡ量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
【００３２】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」をいう。天然型のヌクレオシドを「天然ヌクレオシド」ともいう。修飾された非天然型のヌクレオシドを「修飾ヌクレオシド」ともいい、特に糖部分が修飾されたヌクレオチドを「糖修飾ヌクレオシド」という。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドの糖にリン酸基が結合した化合物を意味する。
【００３３】
本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」がリン酸ジエステル結合または他の結合で２〜５０個結合した「ヌクレオチド」のポリマーであり、天然型のものと非天然型のものを含む。非天然型の「オリゴヌクレオチド」としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えられたホスホロチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えられたホスホロチオエート誘導体、または、「糖部分が修飾された糖誘導体」及び「リン酸ジエステル結合の非架橋酸素原子が硫黄原子で置き換えたホスホロチオエート誘導体」が共存した誘導体が挙げられる。
【００３４】
本明細書において、用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（ＡＯＮ、または、ＡＳＯと表記される）とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体またはｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）に対して相補的なオリゴヌクレオチドをいい、１本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはそれらの類似体から構成される。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体またはｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することによりｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体またはｎｃＲＮＡの働きを抑制する。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」には、標的となるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体またはｎｃＲＮＡと完全に相補的であるものが含まれる。また、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体またはｎｃＲＮＡと結合し、かつこれらの働きを抑制することができる限り、１もしくは数個のミスマッチが存在するものやゆらぎ塩基対を形成する塩基を含むものも含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡの類似体とは、ＤＮＡまたはＲＮＡに似た構造を持つ分子を意味する。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。ｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）とは、タンパク質へ翻訳されずに機能するＲＮＡの総称である。例えば、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。
【００３５】
本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」とは、本発明のオリゴヌクレオチドの塩であって、本発明のオリゴヌクレオチドの生理学的におよび製薬上許容される塩、すなわち、当該オリゴヌクレオチドの所望される生物学的な活性を保持し、そこで望まれない毒物学的効果を与えない塩のことをいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のようなアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
【００３６】
以下、本発明について詳述する。
【００３７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡが化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドの活性に影響を与える。例えば、標的遺伝子に対する親和性を高め、核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）に対する耐性を高め、オリゴヌクレオチドの薬物動態または組織分布に影響を与える。その標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高めることにより、より短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし得る。
【００３８】
本発明は、下述するようなオリゴヌクレオチドおよびその薬理学上許容される塩を包含する。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを任意の位置に少なくとも１つ含む。この２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドは、その糖環の２位と４位との間でエチレン架橋を有する。
【００４０】
オリゴヌクレオチドの塩基部分は、以下の構造式：
【００４１】
【化１】
2019009299.tif 000002
【００４２】
でそれぞれ表される基（すなわち、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５−メチルシトシニル基、およびウラシリル基）、ならびに２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、６−アミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が好適であり、特に、チミニル基、シトシニル基、アデニニル基、グアニニル基、５−メチルシトシニル基、およびウラシリル基が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基およびアミノ基が保護基により保護されていることが好ましい。核酸塩基のうち、ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）は、互換性がある。ウラシル（Ｕ）とチミン（Ｔ）のどちらも、相補鎖のアデニン（Ａ）との塩基対形成に使うことができる。
【００４３】
上記のような２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシド  ホスホロアミダイトを用いて、例えば、国際公開第２０００／４７５９９号に記載されるような方法を用いて合成することができる。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、α−シヌクレイン遺伝子と結合することができる。本明細書において、本発明のオリゴヌクレオチドの「α−シヌクレイン遺伝子との結合」は、本発明のオリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン遺伝子への直接結合、本発明のオリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン遺伝子のｍＲＮＡへの結合、および本発明のオリゴヌクレオチドのα−シヌクレイン遺伝子のｍＲＮＡ前駆体への結合を包含する。
【００４５】
「結合することができる」とは、１本鎖オリゴヌクレオチドが、標的遺伝子と核酸塩基の相補性により２本鎖核酸の構造を形成できることをいう。結合の熱安定性の指標は、２本鎖核酸の融解温度（Ｔm）に限定されない。２本鎖核酸の融解温度（Ｔm）は、例えば、下記のように決定され得る：緩衝液（８．１ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4，２．６８ｍＭ  ＫＣｌ，１．４７ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4，ｐＨ７．２）中で、オリゴヌクレオチドと標的ＲＮＡとを等モル混合し、９５℃にて５分間加熱後、室温まで徐冷してアニーリングさせ、２本鎖核酸を形成させる。２本鎖核酸の温度を２０℃から９５℃まで０．５℃／分の速度で加温していき、２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ）の温度（Ｔ）による変化を測定し、この測定結果よりｄＡ／ｄＴ  ｖｓ  Ｔのグラフを描き、ｄＡ／ｄＴの値が最も大きくなる温度、つまりＡのＴによる変化が最も大きくなる温度を、２本鎖核酸のＴmとする。融解温度（Ｔm）は、例えば、４０℃〜９０℃であり、好ましくは５０℃〜７５℃である。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、α−シヌクレイン遺伝子と相補的であるが、完全な相補性を有する必要はなく、ミスマッチを有していてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとα−シヌクレイン遺伝子は、２本鎖を形成する領域の塩基配列が完全に相補性を有する必要はなく、２本鎖核酸を形成し得、発現抑制作用を有する限り、１もしくは数個のミスマッチを有し得る。１もしくは数個のミスマッチとは、オリゴヌクレオチドの長さに依存し得るが、１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１または２個のミスマッチを意味している。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、２本鎖を形成する領域の塩基配列に対して完全に（１００％）相補性を有するものである。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチドの標的遺伝子であるα−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）遺伝子としては、例えば、ヒトＳＮＣＡ（「ｈＳＮＣＡ」）遺伝子、マウスＳＮＣＡ（「ｍＳＮＣＡ」）遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
α−シヌクレイン（「ＳＮＣＡ」）は、１４０アミノ酸残基からなるタンパク質であり、特有の天然構造を持たないアミロイドタンパク質である。α−シヌクレインは、シナプス小胞蓄積・放出に関連する。ヒトＳＮＣＡ（ｈＳＮＣＡ）のコーディング領域（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００３４５）のＤＮＡ配列（塩基配列）を配列表の配列番号１に記載する。本発明における「ＳＮＣＡ」は、配列番号１の配列に限定されるものではなく、ＳＮＣＡタンパク質の機能が保持される限り、アミノ酸やＤＮＡの変異数や変異部位に制限はないものとする。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性を有する。ＳＮＣＡ発現抑制活性（ノックダウン活性）は、公知の方法により測定することが可能である。例えば、後述するＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）のトランスフェクションまたはα−シヌクレイントランスジェニックマウス（ＳＮＣＡ  Ｔｇマウス）の脳室内投与の方法により測定することができる。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば１３〜１６ヌクレオチド長、好ましくは１３〜１５ヌクレオチド長、より好ましくは１４または１５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドが上記のような長さであることにより、ＳＮＣＡ標的遺伝子への結合、ＳＮＣＡ標的遺伝子のｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ前駆体への結合およびＳＮＣＡ発現抑制（ノックダウン）をより効果的に行い得る。
【００５１】
１つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の表１−１、及び表１−２記載の塩基配列からなり、表１−１、及び表１−２記載のα−シヌクレイン遺伝子の標的領域と結合することができる。但し、配列中、少なくとも１つのヌクレオシドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドである。表１−１および表１−２では、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドの位置は示しておらず、塩基配列のみを示している。上記標的領域は、ヒトＳＮＣＡ遺伝子において、特に、α−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制する活性またはノックダウン活性に関連する領域である。
【００５２】
【表１−１】
2019009299.tif 000003
【００５３】
【表１−２】
2019009299.tif 000004
【００５４】
本発明において「標的領域」は、標的となるＳＮＣＡ遺伝子上の領域（例えば、示された塩基配列（例えば、配列番号１の２８位〜４０位の塩基配列）からなる標的領域）、および、該遺伝子上の領域に対応するＳＮＣＡ遺伝子のｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ前駆体上の領域を含む。また、「標的領域と結合」とは、標的領域全体と必ずしも２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成する必要はなく、その領域の一部である領域と２本以上の鎖（好ましくは２本鎖）を形成するものであってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、この標的領域の少なくとも一部と相補的であり、好ましくは完全な相補性を有する。ここで「一部」とは、当該標的領域のうち１３〜１５ヌクレオチド長の領域である。好ましくは、この標的領域の３’末端が、配列番号１の塩基配列の４０位であるような「一部」の領域が、標的領域として選択され得る。「標的領域の少なくとも一部と相補的である」とは、ＳＮＣＡ遺伝子上の標的領域（例えば、配列番号１の２８位〜４０位の塩基配列からなる）の少なくとも一部の領域の塩基と相補的であること、および、当該少なくとも一部の領域に対応するｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ前駆体上の領域の塩基と相補的であることを含む。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい塩基配列としては、表１−１および表１−２に記載された標的領域に対応するｍＲＮＡ上の領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド）に示される塩基配列の一部からなる塩基配列が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する塩基数（オリゴヌクレオチドのヌクレオチド長に対応する）分、３’から５’の方向（３’→５’）に、配列番号１に示される標的領域の塩基に対して相補的な塩基を並べるように設計され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を５’から３’の方向（５’→３’）で表す場合、配列番号１に示される標的領域の塩基配列に対して逆相補（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列となり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの配列において、ＳＮＣＡ発現抑制活性を有する限り、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。好ましくは、１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。
【００５６】
上記糖修飾以外の当該分野で公知のヌクレオチドの修飾は、いずれも本発明のオリゴヌクレオチドに利用可能である。ヌクレオチドの修飾としては、リン酸修飾、核酸塩基修飾が知られている。このような核酸修飾は、当該分野で公知の方法に基づいて行うことができる。
【００５７】
リン酸修飾としては、例えば、天然の核酸が有するリン酸ジエステル結合、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）、Ｄ−オリゴ（ホスホジエステル）、Ｍ−オリゴ（メチルフォスフォネイト）、ボラノホスフェート等が挙げられる。これらの修飾は公知の方法に従って、オリゴヌクレオチドに取り込まれる。Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）は、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合のリン酸基部の非架橋酸素原子を硫黄原子で置換された骨格である。ホスホロチオエートの修飾は、オリゴヌクレオチド中の１つもしくは複数、或いは、すべてのリン酸ジエステル結合を変換してもよい。
【００５８】
核酸塩基修飾としては、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−プロピニルシトシン等が挙げられる。
【００５９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーであることが好ましい。ギャップマーとは、中心領域となる「ギャップ」と該ギャップの両側の領域、２つのウイング、すなわち、５’側の「５’ウイング」および３’側の「３’ウイング」を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６０】
本発明におけるギャップマーのギャップ領域は５〜７ヌクレオチド長、好ましくは６〜７ヌクレオチド長、より好ましくは７ヌクレオチド長であり得る。ギャップは、ＤＮＡからなる天然ヌクレオシドから構成されている。
【００６１】
本発明におけるギャップマーのウイング領域は３〜５ヌクレオチド長、好ましくは３〜４ヌクレオチド長、さらに好ましくは３ヌクレオチド長であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、「５’ウイング」および／または「３’ウイング」に、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを少なくとも１つ含む。好ましくは、「５’ウイング」に、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを少なくとも１つ、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２〜３、特に好ましくは２含む。好ましくは、「３’ウイング」に、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを少なくとも１つ、好ましくは１〜４、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２〜３、特に好ましくは２含む。
【００６２】
１つの実施形態では、５〜７ヌクレオチドのギャップ領域、３〜５ヌクレオチドの５’ウイングおよび３〜５ヌクレオチドの３’ウイングからなり、ギャップ領域が５’ウイングと３’ウイングの間に位置づけられ、５’ウイングおよび３’ウイングは、少なくとも１つの２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを含み得る。さらに、リン酸修飾、塩基修飾などを含んでいてもよい。一方のウイング内の修飾の種類、数、位置は、他方のウイングにおける修飾の種類、数、位置と同じであってもまたは異なっていてもよい。
【００６３】
１つの好ましい実施形態では、５〜７ヌクレオチドのギャップ領域、３ヌクレオチドの５’ウイングおよび３ヌクレオチドの３’ウイングからなり、５’ウイングおよび３’ウイングは、各々少なくとも１つ２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを含み得る。
【００６４】
より好ましい実施形態では、６〜７ヌクレオチドのギャップ領域、３ヌクレオチドの５’ウイングおよび３ヌクレオチドの３’ウイングからなり、５’ウイングの３つのうち２つが２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドであり、３’ウイングの３つのうち２つが２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを含み得る。
【００６５】
このようなギャップマーとしては、例えば、３−７−３、４−６−３、３−６−４、４−５−４、４−７−３、３−７−４、４−６−４、５−６−３、３−６−５、３−７−５、５−７−３、４−７−４、４−６−５、５−６−４、５−５−５、５−６−５などが挙げられる。ここで、「Ａ−Ｂ−Ｃ」または「Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ」の表記において、「Ａ」は５’ウイングの塩基数を示し、「Ｂ」はギャップの塩基数を示し、「Ｃ」は３’ウイングを形成する塩基のうち糖修飾ヌクレオシドの数を示し、「Ｄ」は３’ウイングを形成する塩基のうち天然ヌクレオシドの数を示す。例えば、３−７−３の表記の場合、ギャップの７ヌクレオチドが天然ヌクレオシド（ＤＮＡ）であり、５’ウイング（５’末端から３ヌクレオチド）、３’ウイング（３’末端から３塩ヌクレオチド）からなり、５’ウイングおよび３’ウイングは、各々少なくとも１つ２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを含み得る。
該５’ウイングおよび該３’ウイングには、２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドで修飾されたヌクレオシド、文献（Yahara, A. et al., ChemBioChem, (2012), 13, 2513-2516）又は国際公開第２０１４／１０９３８４号記載のＡｍＮＡ、又は、Ｓ−ｃＥｔ（２’，４’−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）が含まれていてもよい。数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。２つ以上の２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシド、ＡｍＮＡ、Ｓ−ｃＥｔは、互いに、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。
２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドとしては、Ｄ−リボフラノースの２’−Ｏ−アルキル化（例えば、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−アミノエチル化、２’−Ｏ−プロピル化、２’−Ｏ−アリル化、２’−Ｏ−メトキシエチル化、２’−Ｏ−ブチル化、２’−Ｏ−ペンチル化、２’−Ｏ−プロパルギル化など）を用いてもよい。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチドとしては、例えば、実施例２３、２８、２９、３２、１７０のオリゴヌクレオチド等が挙げられる。これらの配列において、ＳＮＣＡ発現抑制活性を有する限り、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。好ましくは、１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入されたものであってもよい。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上述したような糖修飾ヌクレオシドおよび天然ヌクレオシドを用いて、常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、株式会社ジーンデザイン製など）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、Tetrahedron Letters,1981, vol. 22. pp.1859-1862、国際公開第２０１１／０５２４３６号等に開示されている。
【００６８】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを含有するα−シヌクレイン発現抑制剤も包含する。本開示において「α−シヌクレイン発現抑制剤」は、α−シヌクレイン遺伝子に結合しα−シヌクレイン遺伝子の発現を抑制することにより、α−シヌクレインの生合成を阻害する。さらに本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物も包含する。本発明のα−シヌクレイン発現抑制剤または医薬組成物の投与方法および製剤は、当該分野で公知の投与方法および製剤であれば、いずれも利用可能である。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、局所的あるいは全身的な治療、または治療すべき領域に応じて様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、または、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射もしくは点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注入、吸引もしくは吸入による肺投与、髄腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。
【００７０】
本発明の医薬組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
【００７１】
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解させた懸濁液または溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
【００７２】
非経口、髄腔内、または、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤およびその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
【００７４】
賦形剤としては、乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウムまたは結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンまたはポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末またはラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウムまたはマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴールまたはメチルセルロース等を用いることができる。また、液剤または乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加してもよい。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えてもよい。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）遺伝子に関連した疾患の治療または予防に用いられ得る。本発明の医薬組成物は、例えば、ＳＮＣＡ発現抑制活性（ノックダウン活性）に基づく治療または予防に用いられ得る。本発明の医薬組成物が用いられ得る疾患としては、例えば、α−シヌクレイン過剰症が挙げられる。本発明の医薬組成物によれば、そのＳＮＣＡ発現抑制活性（ノックダウン活性）により、神経変性の進行の予防および認知症の発症の予防（特にＤＬＢなど）が期待できる。本発明の医薬組成物は、例えば、パーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防に用いられ得る。
【００７６】
本発明は、α−シヌクレイン発現抑制方法を提供する。さらに本発明は、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防方法；ならびにパーキンソン病またはレビー小体型認知症の治療または予防方法も提供する。これらの方法は、本発明のオリゴヌクレオチド個体に投与する工程を含む。「個体」とは、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスであり、さらに好ましくはヒトである。これらの方法においては、本発明のオリゴヌクレオチドの有効量が投与される限り、投与方法および剤型は問わない。投与有効量は、投与される個体に依存するが、個体の性別、年齢、体重、症状等、ならびに投与の方法、経路、頻度などに応じて任意に定めることができる。例えば、投与量として０．１〜１０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。投与方法等は上述したとおりである。
【００７７】
本願は、２０１７年７月５日に出願された日本国特許出願第２０１７−１３２２９０号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年７月５日に出願された日本国特許出願第２０１７−１３２２９０号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。【００７９】
実施例１：  ＨＯ−Ｃe2s−Ｃm1s−Ｔe2s−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇs−５ｍｅＣs−Ｃe2s−Ｔm1s−Ｔe2t−Ｈ（４０−１３Ａ）（配列番号２）の合成
核酸自動合成機（「ＭｅｒＭａｄｅ  １９２Ｘ」ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ製）を用い、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，４５３９（１９８４））を用いて標記オリゴヌクレオチドを合成した。但し、縮合には、アクチベーター溶液−３（０．２５ｍｏｌ／Ｌ  ５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール・アセトニトリル溶液，和光純薬工業社製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．０１３−２００１１）に、１−メチルイミダゾール（和光純薬工業社製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．１３４−１２８０１）を０．４％加えた溶液を用い、反応時間は約１０分間とした。ホスホロチオエート結合を形成するためのチオ化試薬として、０．２Ｍになるようにフェニルアセチルジスルフィド（ＣＡＲＢＯＳＹＮＴＨ製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＦＰ０７４９５）を、脱水アセトニトリル（関東化学製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．０１８３７−０５）：脱水ピリジン（関東化学製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．１１３３９−０５）＝１：１（ｖ／ｖ）混合液を用いて溶解して用いた。その他使用した試薬としては、ＣＡＰ  Ａ  ｆｏｒ  ＡＫＴＡ（１−メチルイミダゾール・アセトニトリル溶液，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｌ０４００５０）、Ｃａｐ  Ｂ１  ｆｏｒ  ＡＫＴＡ（無水酢酸・アセトニトリル溶液，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｌ０５００５０）、Ｃａｐ  Ｂ２  ｆｏｒ  ＡＫＴＡ（ピリジン・アセトニトリル溶液，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｌ０５０１５０）、ＤＣＡ  Ｄｅｂｌｏｃｋ（ジクロロ酢酸・トルエン溶液，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製，ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｌ０２３０５０）を用いた。アミダイト試薬としては、２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオシドのホスホロアミダイト（アデノシン体ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＡＮＰ−５７５１，シチジン体ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＡＮＰ−５７５２，グアノシン体ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＡＮＰ−５７５３，ウリジン体ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＡＮＰ−５７５４）はＣｈｅｍＧｅｎｅｓ製のものを用いた。非天然型のホスホロアミダイトは特開２０００−２９７０９７の実施例１４（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２７（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−２−Ｎ−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例２２（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、実施例９（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）、の化合物を用いた。固相担体として、Ｇｌｅｎ  Ｕｎｙｓｕｐｐｏｒｔ  ＦＣ  ９６ウェルフォーマット０．２μｍｏｌ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ製）を用い、標記の化合物を合成した。
目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を６００μＬの濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。オリゴマーの混合溶液を、Ｃｌａｒｉｔｙ  ＱＳＰ  ＤＮＡ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）３００μＬと混合し、Ｃｌａｒｉｔｙ  ＳＰＥ  ９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製）上にチャージした。Ｃｌａｒｉｔｙ  ＱＳＰ  ＤＮＡ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ：水＝１：１溶液１ｍＬ、０．１Ｍテトラブチルアンモニウムブロミド水溶液：アセトニトリル＝８：２（ｖ／ｖ）溶液２ｍＬ、３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）水溶液３ｍＬ、水４ｍＬ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ水溶液２ｍＬの順に添加した後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ水溶液：アセトニトリル＝９：１溶液にて抽出される成分を集めた。溶媒留去後、目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、２．８４９分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：４３２６．５１、実測値：４３２６．５１）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４０に相補的な配列である。
なお、配列表には、天然ヌクレオシドと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドとを区別することなく塩基配列を示す。【００８０】
実施例２〜１２
表２に示す実施例２乃至１２の化合物を、実施例１と同様に合成した。【００８１】
【表２】
2019009299.tif 000005
【００８２】
表中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【００８３】
実施例１３：  ＨＯ−Ｇe2s−Ｃm1s−Ｔe2s−Ｇm1s−Ｔs−５ｍｅＣs−Ａs−５ｍｅＣs−Ａs−５ｍｅＣs−Ｃe2s−Ｃm1s−Ｇe2t−Ｈ（２２７−１３Ｂ）（配列番号４）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、２．３２６分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：４３９９．５５、実測値：４３９９．５４）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２１５−２２７に相補的な配列である。【００８４】
実施例１４〜２０
表３に示す実施例１４乃至２０の化合物を、実施例１３と同様に合成した。【００８５】
【表３】
2019009299.tif 000006
【００８６】
表３中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【００８７】
実施例２１：  ＨＯ−Ｔe2s−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｃm1s−Ｔs−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇs−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｕm1s−Ｔe2t−Ｈ（４２−１５Ａ）（配列番号３４）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、３．０１分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：４９９７．５６、実測値：４９９７．５５）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４２に相補的な配列である。【００８８】
実施例２２〜３４
表４に示す実施例２２乃至３４の化合物を、実施例２１と同様に合成した。【００８９】
【表４】
2019009299.tif 000007
【００９０】
表４中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【００９１】
実施例３５：  ＨＯ−Ａe2s−Ｕm1s−Ｇe2s−Ｃm1s−Ｔs−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｇs−５ｍｅＣs−Ｕm1s−Ｃe2s−Ｃm1s−Ｃe2t−Ｈ（２６３−１５Ａ）（配列番号３９）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、表５に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、２．９６９分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：５００５．５９、実測値：５００５．５８）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２４９−２６３に相補的な配列である。【００９２】
実施例３６，３７
表５に示す実施例３６及び３７の化合物を、実施例３５と同様に合成した。【００９３】
【表５】
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【００９４】
表５中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【００９５】
実施例３８：  ＨＯ−Ｔe2s−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｃm1s−Ｔe2s−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇs−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｕm1s−Ｔe2t−Ｈ（４２−１５Ｂ）（配列番号３４）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、表６に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、２．７５０分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：５０３９．５７、実測値：５０３９．５９）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４２に相補的な配列である。【００９６】
実施例３９〜８８
表６に示す実施例３９乃至８８の化合物を、実施例３８と同様に合成した。【００９７】
【表６】
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【００９８】
表６中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【００９９】
実施例８９：  ＨＯ−Ｃe2s−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｕm1s−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇs−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｕm1s−Ｔe2t−Ｈ（４１−１４Ａ）（配列番号１４）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、表７に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、３．１０１分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：４６７７．５４、実測値：４６７７．５４）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４１に相補的な配列である。【０１００】
実施例９０〜１０８
表７に示す実施例９０乃至１０８の化合物を、実施例８９と同様に合成した。実施例８９乃至１０８のデータについて表７に記載する。【０１０１】
【表７】
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【０１０２】
表７中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【０１０３】
実施例１０９：  ＨＯ−Ｃe2s−Ｕm1s−Ｃe2s−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｔs−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇe2s−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｕm1s−Ｔe2t−Ｈ（４３−１６Ａ）（配列番号５１）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、表８に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、３．１３２分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：５４００．６２、実測値：５４００．６１）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４３に相補的な配列である。【０１０４】
実施例１１０〜１１７
表８に示す実施例１１０乃至１１７の化合物を、実施例１０９と同様に合成した。【０１０５】
【表８】
2019009299.tif 000011
【０１０６】
表８中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【０１０７】
実施例１１８：  ＨＯ−Ｃm1s−Ｃe2s−Ｔe2s−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇs−５ｍｅＣs−Ｃe2s−Ｔe2s−Ｕm1t−Ｈ（４０−１３Ｅ）（配列番号２）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、表９に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、２．５０９分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：４３２６．５１、実測値：４３２６．５１）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４３に相補的な配列である。【０１０８】
実施例１１９〜１２９
表９に示す実施例１１９乃至１２９の化合物を、実施例１１８と同様に合成した。【０１０９】
【表９】
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【０１１０】
表９中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【０１１１】
実施例１３０：  ＨＯ−Ｃe3s−Ｃm1s−Ｔe3s−Ｃs−Ｃs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇs−Ｃs−Ｃe3s−Ｕm1s−Ｔe2t−Ｈ（４０−１３Ｆ）（配列番号２）の合成
核酸自動合成機を用い、ホスホロアミダイト法（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (1984)）を用いて合成を行った。但し、ＡｍＮＡのホスホロアミダイトは、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載の方法を参照して合成した。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４０に相補的な配列である。【０１１２】
実施例１３１〜１６４
表１０に示す実施例１３１乃至１６４の化合物を、実施例１３０と同様に合成した。【０１１３】
【表１０】
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【０１１４】
表１０中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシド、下線を付した小文字はＡｍＮＡを示す。但し、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドとＡｍＮＡのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【０１１５】
実施例１６５：  ＨＯ−Ｇe2s−Ｃm1p−Ｔe2p−Ｇs−Ｔs−５ｍｅＣs−Ａs−５ｍｅＣs−Ａs−５ｍｅＣs−Ｃe2p−Ｃm1p−Ｇe2t−Ｈ（２２７−１３Ａ１）（配列番号４）の合成
実施例１と同様の条件で合成および精製を行い、表１１に示す目的化合物を得た。但し、ホスホジエステル結合を形成するための試薬として、Ｏｘｉｄｉｚｅｒ  ０．０５Ｍ  ｆｏｒ  ＡＫＴＡ（ヨウ素／ピリジン／水混合溶液、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製、ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．Ｌ５６０２５０−０４）を用いた。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、２．５０８分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：４３０５．６３、実測値：４３０５．６４）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２１５−２２７に相補的な配列である。【０１１６】
実施例１６６〜１７４
表１１に示す実施例１６６乃至１７４の化合物を、実施例１６５と同様に合成した。【０１１７】
【表１１】
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【０１１８】
表１１中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【０１１９】
実施例１７５：  ＨＯ−Ｃe2s−Ｃm1p−Ｔe2p−５ｍｅＣs−５ｍｅＣs−Ｔs−Ｔs−Ｇs−Ｇs−５ｍｅＣs−Ｃe2p−Ｕm1p−Ｔe2t−Ｈ（４０−１３Ａ１）（配列番号２）の合成
実施例１６５と同様の条件で合成および精製を行い、表１２に示す目的化合物を得た。本化合物は、逆相ＨＰＬＣ（カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｃｌａｒｉｔｙ  ２．６μｍ  Ｏｌｉｇｏ−ＭＳ  １００Ａ（２．１×５０ｍｍ））、Ａ溶液：１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、８ｍＭトリエチルアミン水溶液、Ｂ溶液：メタノール、Ｂ％：１０％→２５％（４ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）；６０℃；０．５ｍＬ／ｍｉｎ；２６０ｎｍ）で分析すると、１．９９９分に溶出された。化合物は負イオンＥＳＩ質量分析により同定した（計算値：４２６２．６０、実測値：４２６２．６１）。
本化合物の塩基配列は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号２８−４０に相補的な配列である。【０１２０】
実施例１７６〜１９７
表１２に示す実施例１７６乃至１９７の化合物を、実施例１７５と同様に合成した。【０１２１】
【表１２】
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【０１２２】
表１２中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。分子量は、負イオンＥＳＩ質量分析による実測値を示す。【０１２３】
実施例１９８−２９５
実施例１６５と同様の条件で合成することにより、下記の表１３乃至１９に記載の化合物も合成することができる。【０１２４】
【表１３】
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【０１２５】
表１３中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。【０１２６】
【表１４】
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【０１２７】
表１４中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。【０１２８】
【表１５】
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【０１２９】
表１５中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。【０１３０】
【表１６】
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【０１３１】
表１６中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。【０１３２】
【表１７】
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【０１３３】
表１７中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。【０１３４】
【表１８】
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【０１３５】
表１８中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドの間は、ｏであればホスホジエステル結合を、無記載であればホスホロチオエート結合を表す。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。【０１３６】
【表１９】
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【０１３７】
表１９中の配列において大文字はＤＮＡ、小文字は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、下線を付した大文字は２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドを示す。但し、ＤＮＡと２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシドのＣの塩基部位は、５−メチルシトシンである。各ヌクレオシドはホスホロチオエートで結合している。標的領域は、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ，ａｌｐｈａ（ＳＮＣＡ），ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｖａｒｉａｎｔ  １，ｍＲＮＡ（ＮＣＢＩ−ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００３４５）のコーディング領域のヌクレオチド番号を示す。【０１３８】
なお、本明細書において、Ａt、Ｇt、５ｍｅＣt、Ｃt、Ｔt、Ｕt、Ａp、Ｇp、５ｍｅＣp、Ｃp、Ｔp、Ｕp、Ａs、Ｇs、５ｍｅＣs、Ｃs、Ｔs、Ｕs、Ａm1t、Ｇm1t、Ｃm1t、５ｍｅＣm1t、Ｕm1t、Ａm1p、Ｇm1p、Ｃm1p、５ｍｅＣm1p、Ｕm1p、Ａm1s、Ｇm1s、Ｃm1s、５ｍｅＣm1s、Ｕm1s、Ａ2t、Ｇ2t、Ｃ2t、Ｔ2t、Ａe2p、Ｇe2p、Ｃe2p、Ｔe2p、Ａe2s、Ｇe2s、Ｃe2s、Ｔe2s、Ａ1t、Ｇ1t、Ｃ1t、Ｔ1t、Ａe1p、Ｇe1p、Ｃe1p、Ｔe1p、Ａe1s、Ｇe1s、Ｃe1s、Ｔe1s、Ａ3t、Ｇ3t、Ｃ3t、Ｔ3t、Ａe3p、Ｇe3p、Ｃe3p、Ｔe3p、Ａe3s、Ｇe3s、Ｃe3s、Ｔe3s、Ａm2t、Ｇm2t、５ｍｅＣm2t、Ｔm2t、Ａm2p、Ｇm2p、５ｍｅＣm2p、Ｔm2p、Ａm2s、Ｇm2s、５ｍｅＣm2s、Ｔm2sは、下記に示す構造を有する基である。【０１３９】
【化２】
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【０１４０】
【化３】
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【０１４１】
【化４】
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【０１４２】
【化５】
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【０１４３】
【化６】
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【０１４４】
【化７】
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【０１４５】
試験例１：  ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング（１）
トランフェクションの前日に、２４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社製）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．５ｍＬ中に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞（「型番Ｒ７０５−０７」ＡＴＣＣ社製）を５×１０4個まいた。ＡＳＯ１種類あたり１ウェル、ＡＳＯを含まないコントロールとしてｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ（「ｄｄＷ」ナカライテスク社製）用に２ウェル分作成した。
９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、３５μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に２．５μＬ  ＡＳＯ（濃度は１０μＭ）を加えたものに、さらに３７．５μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭと０．９μＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えたものを１ウェル分として作成し、室温で約２０分放置し、その後細胞に添加した。ＡＳＯを含まないコントロールのウェルは次のように作成した。３５μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに２．５μＬ  ｄｄＷを加えたものに、さらに３７．５μＬ  ＯｐｔｉＭＥＭに０．９μＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸを加えたものを１ウェル分として２ウェル分作成し、室温で約２０分静置した後、細胞に添加した。そしておよそ２４時間後に各ウェルをＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて２回洗浄した。
ＲＮＡ抽出及び逆転写反応は、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ＲＴ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲ（タカラバイオ社製）を用いて、キットのプロトコルに従って実施した。これにより得られたｃＤＮＡをｄｄＷで３倍希釈し、定量的ＰＣＲにより内因性ヒトα−ｓｙｎｕｌｃｌｅｉｎ（ｈＳＮＣＡ）のｍＲＮＡ量を定量した。
定量的ＰＣＲはＴａｇＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、以下のように行った。得られたｃＤＮＡをｄｄＷで５倍希釈した（ｃＤＮＡ２０μＬおよびｄｄＷ８０μＬ）。３８４  ＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）の１ウェルあたり、２×Ｔａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ：ｄｄＷ：５倍希釈済のｃＤＮＡ：ｈＳＮＣＡプライマー（「Ｈｓ０１１０３３８３」Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）：β−Ａｃｔｉｎプライマー（「Ｈｓ９９９９９９０３」Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）＝５：２：２：０．５：０．５（μＬ）の割合で混ぜて計１０μＬを調製し、各ｃＤＮＡに対して２ｗｅｌｌ分作製した。Ｖｉｉａ  ７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によりリアルタイムＰＣＲを行い、ＳＮＣＡのｍＲＮＡ量をｄｕｐｌｉｃａｔｅの平均値として定量した。ＡＳＯを含まないｄｄＷをトランスフェクションした２ウェルのｃＤＮＡそれぞれの２ｗｅｌｌ間の平均値を平均したものをコントロールとして用いた。
上述の実験を３回行い、実験間の平均値および標準偏差（ＳＤ）を算出した。
結果を図１に示す。図１の縦軸は、ｍＲＮＡ量を示す。コントロール（図１中「Ｎｏ  ＡＳＯ」）におけるｍＲＮＡ量を１．０として、ＡＳＯのトランスフェクション後のｍＲＮＡ量を相対的に表した。配列名称が４０−１３Ａ，２１５−１３Ａ，２２７−１３Ａ，２２９−１３Ａ，２３４−１３Ａ，２６６−１３Ａ，２６７−１３Ａ，２７３−１３Ａ，２７４−１３Ａ，２７５−１３Ａ，２７７−１３Ａ、及び、４１２−１３ＡであるＡＳＯが優れたα−シヌクレインｍＲＮＡを抑制する効果を示した。【０１４６】
試験例２：  ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング（２）
試験例１と同様に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションを行い、ｍＲＮＡ量を定量し、４回の実験の平均値とＳＤを算出した。
結果を図２に示す。図２の縦軸は、ｍＲＮＡ量を示す。コントロール（図２中「Ｎｏ  ＡＳＯ」）におけるｍＲＮＡを１．０として、ＡＳＯのトランスフェクション後のｍＲＮＡ量を相対的に表した。配列名称が２２７−１３Ｂ，２２７−１３Ｄ，２６６−１３Ｄ，２７３−１３Ｃ，２７５−１３Ｂ，２７５−１３Ｄ、及び、２７７−１３ＢであるＡＳＯが優れたα−シヌクレインｍＲＮＡを抑制する効果を示した。【０１４７】
試験例３：  ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング（３）
試験例１と同様に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションを行い、ｍＲＮＡ量を定量し、３回の実験の平均値とＳＤを算出した。
結果を図３に示す。図３の縦軸は、ｍＲＮＡ量を示す。コントロール（図３中「Ｎｏ  ＡＳＯ」）におけるｍＲＮＡを１．０として、ＡＳＯのトランスフェクション後のｍＲＮＡ量を相対的に表した。配列名称が２３４−１３ＣであるＡＳＯが優れたα−シヌクレインｍＲＮＡを抑制する効果を示した。【０１４８】
試験例４：  ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング（４）
試験例１と同様に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションを行い、ｍＲＮＡ量を定量し、４回の実験の平均値とＳＤを算出した。
結果を図４に示す。図４の縦軸は、ｍＲＮＡ量を示す。コントロール（図４中「Ｎｏ  ＡＳＯ」）におけるｍＲＮＡを１．０として、ＡＳＯのトランスフェクション後のｍＲＮＡ量を相対的に表した。配列名称が４２−１５Ａ，７５−１５Ａ，２２９−１５Ａ，２５４−１５Ａ，２５５−１５Ａ，２６９−１５Ａ，２７４−１５Ａ，２７８−１５Ａ，２８５−１５Ａ，２８６−１５Ａ，３６７−１５Ａ，４１３−１５Ａ，４１４−１５Ａ、及び、４１５−１５ＡであるＡＳＯが優れたα−シヌクレインｍＲＮＡを抑制する効果を示した。これらのＡＳＯは、特表２０１４−５０１５０７号公報記載のＩＳＩＳ３８７９８５と比較して高いｍＲＮＡ抑制効果を示した。【０１４９】
試験例５：  ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションに基づく追加スクリーニング（５）
試験例１と同様に、ＨＥＫ２９３Ａ細胞に対するＡＳＯのトランスフェクションを行い、ｍＲＮＡ量を定量し、４回の実験の平均値とＳＤを算出した。
結果を図５に示す。図５の縦軸は、ｍＲＮＡ量を示す。コントロール（図５中「Ｎｏ  ＡＳＯ」）におけるｍＲＮＡを１．０として、ＡＳＯのトランスフェクション後のｍＲＮＡ量を相対的に表した。配列名称が２２７−１３Ａ１，２２７−１３Ａ２，２２７−１３Ｂ１，２２７−１３Ｂ２，２２７−１３Ｂ３，２２７−１３Ｂ４，２２７−１３Ｂ５，２２７−１３Ｄ１，２２７−１３Ｄ２、及び、２２７−１３Ｄ３であるＡＳＯが優れたα−シヌクレインｍＲＮＡを抑制する効果を示した。これらのＡＳＯは、特表２０１４−５０１５０７号公報記載のＩＳＩＳ３８７９８５と比較して高いｍＲＮＡ抑制効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１５０】
本発明によれば、α−シヌクレインの発現抑制に有用なオリゴヌクレオチドが提供される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、α−シヌクレイン過剰症の治療または予防、ならびにパーキンソン病やレビー小体型認知症などの治療または予防に有用な核酸医薬としての利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019009299.tif 000035
2019009299.tif 000036
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