(57)【要約】本発明は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＭをより高い含量で含む高レバウジオシドＭ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体を提供する。本発明はまた、そのような高レバウジオシドＭ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体を作出する方法、そのような植物体から得られる乾燥葉も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体。
【請求項２】
葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し９．５％以上のレバウジオシドＤをさらに含む、請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
以下の（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴を有する、請求項１又は２に記載の植物体。
（１）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
【請求項４】
Ｐ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーについて陽性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は植物培養細胞。
【請求項６】
胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスである請求項５記載の組織、組織培養物又は植物培養細胞。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体を作出する方法。
【請求項８】
第２の植物体が請求項１〜４のいずれか一項に記載のステビア植物体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体、請求項５に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
【請求項１０】
請求項９に記載の抽出物を含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体、請求項５に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドＭ含有抽出物の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載のレバウジオシドＭ含有抽出物からレバウジオシドＭを精製する工程を含む、レバウジオシドＭの製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法により得られる抽出物及び／又は請求項１２に記載の方法により得られるレバウジオシドＭと他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
【請求項１４】
被験植物のゲノムから以下の（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、高レバウジオシドＭ含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
（１）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
【請求項１５】
被験植物のゲノムからＰ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、葉組織のレバウジオシドＭの含有量を測定する工程を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
（１）配列番号１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号２における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（２）配列番号３における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号４における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（３）配列番号５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（４）配列番号７における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号８における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
（５）配列番号９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号１０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットであり、前記任意の連続する１５塩基以上の配列は各プライマーの３‘末端に位置する、前記プライマーセット。
【請求項１８】
請求項１７に記載のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含むキットであり、
前記プライマーセットが配列番号１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＸｂａＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号３における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＫｐｎＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＡｆｌＩＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＰｖｕＩを含む、
前記キット。
【請求項１９】
検出可能な標識と結合していてもよい、配列番号５５〜６４のいずれか一つに示す塩基配列を含むプローブ。
【請求項２０】
蛍光標識、色素又は結合部分を有する請求項１９に記載のプローブ。
【請求項２１】
Ｐ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出することを目的として被験植物のゲノムＤＮＡに対し請求項１７に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行う工程、及び前記多型マーカーがＰ０１〜Ｐ０３及びＰ０５からなる群より選択される少なくとも一つである場合、前記ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程を含む、高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記制限酵素がＸｂａＩ、ＫｐｎＩ、ＡｆｌＩＩ及びＰｖｕＩからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記多型マーカーがＰ０２及びＰ０５を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記制限酵素がＫｐｎＩ及びＰｖｕＩを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
スクリーニングにより得られる植物体が葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レバウジオシドＭの含有量が高いステビア植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様化する消費者ニーズに対応すべく、様々な飲料が開発され、市販されている。ショ糖等の糖類は、甘味を与える等の目的で飲料にごく普通に配合される成分であるが、過剰摂取による健康への影響が指摘されてきており、より低カロリーであり、かつ天然由来の甘味料に対するニーズが高まりつつある。例えば特許文献１は、ビタミン、高甘味度甘味料、及び甘味改善組成物を含有する機能性甘味料組成物を開示している。【０００３】
レバウジオシド（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ、以下「Ｒｅｂ」ともいう）は、ステビア抽出物に含まれる甘味成分として知られている。ステビア抽出物は、ステビアの葉から抽出、精製されたものである。ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）という。ステビアは砂糖の約３００倍以上の甘味を持つ成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。Ｒｅｂとしては、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ等、様々な配糖体の存在が報告されている（特表２０１２−５０４５５２）。様々なＲｅｂの中で、例えばＲｅｂＡは、高甘味度と良質甘味を有する甘味料として評価されており、広く用いられている。その他のＲｅｂについても、その独自の甘さ及び付随する味を有することが判明しつつある。【０００４】
そのような状況において、レバウジオシドＭ及びＤを乾燥葉あたりそれぞれ０．３８重量％、３．２８重量％含むステビア植物体が知られている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５１７０４３号明細書
【特許文献２】特表２０１６−５１５８１４号明細書
【特許文献３】ＵＳ２０１６／００５７９５５Ａ１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
レバウジオシドＭはステビオール配糖体の中では味質が良いとされているが、天然のステビア植物体からは多くを得ることができず、その入手が問題とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、野生型ステビア種と比べて高含有量でレバウジオシドＭを含む高レバウジオシドＭ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体並びに当該植物体の作出方法及びスクリーニング方法を提供する。【０００８】
具体的には、本発明は以下を提供する。
［１−１］  葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体。
［１−２］  葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し９．５％以上のレバウジオシドＤをさらに含む、［１−１］に記載の植物体。
［１−３］
以下の（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴を有する、［１−１］又は［１−２］に記載の植物体。
（１）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
［１−４］
Ｐ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーについて陽性である、［１−１］〜［１−３］のいずれか一項に記載の植物体。【０００９】
［１−５］  ［１−１］〜［１−４］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は植物培養細胞。
［１−６］  胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスである［１−５］に記載の組織、組織培養物又は植物培養細胞。
［１−７］  ［１−１］〜［１−４］のいずれか一項に記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体を作出する方法。
［１−８］  第２の植物体が［１−１］〜［１−４］のいずれか一項に記載のステビア植物体である、［１−７］に記載の方法。【００１０】
［１−９］  ［１−１］〜［１−４］のいずれか一項に記載の植物体、［１−５］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
［１−１０］  ［１−９］に記載の抽出物を含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。
［１−１１］  ［１−１］〜［１−４］のいずれか一項に記載の植物体、［１−５］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドＭ含有抽出物の製造方法。
［１−１２］  ［１−１１］に記載のレバウジオシドＭ含有抽出物からレバウジオシドＭを精製する工程を含む、レバウジオシドＭの製造方法。
［１−１３］  ［１−１１］に記載の方法により得られる抽出物及び／又は［１−１２］に記載の方法により得られるレバウジオシドＭと他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。【００１１】
［１−１４］  被験植物のゲノムから以下の（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、高レバウジオシドＭ含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
（１）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
［１−１５］  被験植物のゲノムからＰ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出する工程を含む、［１−１４］に記載の方法。
［１−１６］  さらに、葉組織のレバウジオシドＭの含有量を測定する工程を含む、［１−１４］又は［１−１５］に記載の方法。【００１２】
［１−１７］
（１）配列番号１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号２における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（２）配列番号３における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号４における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（３）配列番号５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（４）配列番号７における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号８における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
（５）配列番号９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号１０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットであり、前記任意の連続する１５塩基以上の配列は各プライマーの３‘末端に位置する、前記プライマーセット。
［１−１８］
［１−１７］に記載のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含むキットであり、
前記プライマーセットが配列番号１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＸｂａＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号３における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＫｐｎＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＡｆｌＩＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、制限酵素ＰｖｕＩを含む、
前記キット。【００１３】
［１−１９］
検出可能な標識と結合していてもよい、配列番号５５〜６４のいずれか一つに示す塩基配列を含むプローブ。
［１−２０］
蛍光標識、色素又は結合部分を有する［１−１９］に記載のプローブ。
［１−２１］  Ｐ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出することを目的として被験植物のゲノムＤＮＡに対し［１−１７］に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行う工程、及び前記多型マーカーがＰ０１〜Ｐ０３及びＰ０５からなる群より選択される少なくとも一つである場合、前記ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程を含む、高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法。
［１−２２］  前記制限酵素がＸｂａＩ、ＫｐｎＩ、ＡｆｌＩＩ及びＰｖｕＩからなる群より選択される少なくとも一つである、［１−２１］に記載の方法。
［１−２３］  前記多型マーカーがＰ０２及びＰ０５を含む、［１−２１］に記載の方法。
［１−２４］  前記制限酵素がＫｐｎＩ及びＰｖｕＩを含む、［１−２３］に記載の方法。
［１−２５］  スクリーニングにより得られる植物体が葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含む、［１−２１］〜［１−２４］のいずれか一項に記載の方法。【００１４】
本発明はまた、以下を提供する。
［２−１］  乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体。
［２−２］  乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し９．５％以上のレバウジオシドＤをさらに含む、前記［２−１］に記載の植物体。
［２−３］
Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４及びＰ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーについて陽性である、前記［２−１］又は［２−２］に記載の植物体。
［２−４］  前記［２−１］〜［２−３］のいずれか一つに記載の植物体の種子。
［２−５］  前記［２−１］〜［２−３］のいずれか一つに記載の植物体の乾燥葉。
［２−６］  前記［２−１］〜［２−３］のいずれか一つに記載の植物体の組織培養物又は植物培養細胞。
［２−７］  胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスである前記［２−６］に記載の組織培養物又は植物培養細胞。【００１５】
［２−８］  前記［２−１］〜［２−３］のいずれか一つに記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体を作出する方法。
［２−９］  第２の植物体が前記［２−１］〜［２−３］のいずれか一つに記載のステビア植物体である、前記［２−８］に記載の方法。
［２−１０］  前記［２−１］〜［２−３］のいずれか一つに記載の植物体、前記［２−４］に記載の種子又は前記［２−５］に記載の乾燥葉の抽出物。
［２−１１］  前記［２−１０］に記載の抽出物を含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。【００１６】
［２−１２］  前記［２−１］〜［２−３］のいずれか一つに記載の植物体、前記［２−４］に記載の種子又は前記［２−５］に記載の乾燥葉から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドＭ含有抽出物の製造方法。
［２−１３］  前記［２−１２］に記載のレバウジオシドＭ含有抽出物からレバウジオシドＭを精製する工程を含む、レバウジオシドＭの製造方法。
［２−１４］  前記［２−１２］に記載の方法により得られる抽出物及び／又は前記［２−１３］に記載の方法により得られるレバウジオシドＭと他の成分とを混合する工程を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
［２−１５］  被験植物のゲノムからＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４及びＰ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出する工程を含む、高レバウジオシドＭ含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
［２−１６］  さらに、葉組織のレバウジオシドＭの含有量を測定する工程を含む、前記［２−１５］に記載の方法。【００１７】
［２−１７］
（１）配列番号１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号２における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（２）配列番号３における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号４における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（３）配列番号５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（４）配列番号７における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号８における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
（５）配列番号９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号１０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットであり、前記任意の連続する１５塩基以上の配列は各プライマーの３‘末端に位置する、前記プライマーセット。
［２−１８］
前記［２−１７］に記載の（１）〜（５）より選択される少なくとも１つのプライマーセットと制限酵素を含むキットであり、
前記プライマーセットが（１）の場合は、前記制限酵素はＸｂａＩであり、
前記プライマーセットが（２）の場合は、前記制限酵素はＫｐｎＩであり、
前記プライマーセットが（３）の場合は、前記制限酵素はＡｆｌＩＩであり、
前記プライマーセットが（５）の場合は、前記制限酵素はＰｖｕＩである、
前記キット。【００１８】
［２−１９］
検出可能な標識と結合していてもよい、配列番号１〜１０のいずれか一つに示す塩基配列を含むプローブ。
［２−２０］
蛍光標識、色素又は結合部分を有する前記［２−１９］に記載のプローブ。
［２−２１］  Ｐ０１、Ｐ０２、Ｐ０３、Ｐ０４及びＰ０５からなる群より選択される少なくとも一つの多型マーカーを検出することを目的として被験植物のゲノムＤＮＡに対し前記［２−１７］に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行う工程、及び
前記多型マーカーがＰ０１、Ｐ０２、Ｐ０３及びＰ０５からなる群より選択される少なくとも一つである場合、前記ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程、
を含む、高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法。
［２−２２］  前記制限酵素がＸｂａＩ、ＫｐｎＩ、ＡｆｌＩＩ及びＰｖｕＩからなる群より選択される少なくとも一つである、前記［２−２１］に記載の方法。
［２−２３］  前記多型マーカーがＰ０２及びＰ０５である、前記［２−２１］に記載の方法。
［２−２４］  前記制限酵素がＫｐｎＩ及びＰｖｕＩである、前記［２−２３］に記載の方法。
［２−２５］  スクリーニングにより得られる植物体が乾燥葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含む、前記［２−２１］〜［２−２４］のいずれか一つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によって、レバウジオシドＭをより多く含むステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる葉、この葉より得られたレバウジオシドＭを含む食物や飲料などの提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は第Ｉ個体群のマーカー検出で得られた電気泳動図を示す。
【図２】図２は第ＩＩ個体群のマーカー検出で得られた電気泳動図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１７年１０月１２日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１７-１９８５１５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００２２】
１．本発明の高レバウジオシドＭ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体
本発明は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体（以下、「本発明の植物体」又は「本発明のステビア植物体」と称する場合がある）を提供する。
本発明のステビア植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であるが、レバウジオシドＭが高くなるように遺伝子に変異が生じたものである。かつ当該遺伝子の変異は非遺伝子組換え的に生じるものである（後述）。
本発明において、高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体のうち、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２〜４．６％のレバウジオシドＭを含むことを特徴とするステビア植物体を高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体と称することがあり、４．７％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とするステビア植物体は超高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体と称することもある。
【００２３】
総ステビオール配糖体（Ｔｏｔａｌ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ：ＴＳＧ）とは、未知のステビオール配糖体を含むものではなく、また検出限界未満で存在するステビオール配糖体も含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＱ、レバウジオシドＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群より選択される２つ以上の任意の組み合わせである。例えば、ある実施形態では、総ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ及びステビオールからなり、別の実施形態では総ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ及びステビオールからなるものであってもよい。
【化１】
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【００２４】
葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むとは、レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）の含量を、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）から得られたステビオール配糖体総量に対する比率としてＲｅｂＭ／ＴＳＧ％で表した場合、ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値の下限が２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１２％以上、１４％以上、１６％以上、１８％以上、２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上であることを特徴とする。一方、ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値の上限は、１５％以下、１６％以下、１８％以下、２０％以下、２２％以下、２４％以下、２６％以下、２８％以下、３０％以下、３２％以下、３４％以下、３６％以下、３８％以下、４０％以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、２％以上かつ４．７％未満のものを高レバウジオシドＭ含有表現型、４．７％以上かつ１５％以下のものを超高レバウジオシドＭ含有表現型と称することがある。
【００２５】
また、本発明の植物体は、乾燥葉１００ｇ中に０．１９ｇ以上のレバウジオシドＭを含むものであってもよい。これは、本発明の植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉１００ｇ当たりレバウジオシドＭが０．１９ｇ以上、０．２０ｇ以上、０．２５ｇ以上、０．３０ｇ以上、０．３５ｇ以上、０．４０ｇ以上、０．４５ｇ以上、０．５０ｇ以上、０．５５ｇ以上、０．６０ｇ以上、０．６５ｇ以上、０．７０ｇ以上、０．７５ｇ以上、０．８０ｇ以上、０．８５ｇ以上、０．９０ｇ以上、０．９５ｇ以上、１．００ｇ以上、１．０５ｇ以上、１．１０ｇ以上、１．１５ｇ以上、１．２０ｇ以上、１．２５ｇ以上、１．３０ｇ以上、１．３５ｇ以上、１．４０ｇ以上、１．４５ｇ以上の量で存在することを意味する。
【００２６】
ここで本発明の植物体の乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を３〜４重量％にまで減らしたものをいう。
【００２７】
ここで、本発明の植物体は、乾燥葉１００ｇ中に１．００ｇ以上、１．０５ｇ以上、１．１０ｇ以上、１．１５ｇ以上、１．２０ｇ以上、１．２５ｇ以上、１．３０ｇ以上、１．３５ｇ以上、１．４０ｇ以上、１．４５ｇ以上、１．５０ｇ以上、１．５５ｇ以上、１．６０ｇ以上、１．６５ｇ以上、１．７０ｇ以上、１．７５ｇ以上、１．８０ｇ以上、１．８５ｇ以上、１．９０ｇ以上、１．９５ｇ以上、２．００ｇ以上、２．０５ｇ以上、２．１０ｇ以上、２．１５ｇ以上、２．２０ｇ以上、２．２５ｇ以上、２．３０ｇ以上、２．３５ｇ以上、２．４０ｇ以上、２．４５ｇ以上、２．５０ｇ以上、２．５５ｇ以上、２．６０ｇ以上、２．６５ｇ以上、２．７０ｇ以上、２．７５ｇ以上、２．８０ｇ以上、２．８５ｇ以上、２．９０ｇ以上、２．９５ｇ以上、３．００ｇ以上、３．０５ｇ以上、３．１０ｇ以上、３．１５ｇ以上、３．２０ｇ以上、３．２５ｇ以上、３．３０ｇ以上、３．３５ｇ以上、３．４０ｇ以上、３．４５ｇ以上、３．５０ｇ以上、３．５５ｇ以上又は３．５７ｇ以上のレバウジオシドＤをさらに含んでいてもよい。
ここで、レバウジオシドＭとＤとの含量の組み合わせは特に限定されず、任意である。
好ましくは、本発明の植物体は、乾燥葉１００ｇ中に１．０３ｇ以上のレバウジオシドＭと１．１ｇ以上のレバウジオシドＤを含む。
【００２８】
あるいは、本発明の植物体の葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）は、野生型ステビア植物体の葉１００ｇ当たりに含まれるレバウジオシドＭの量（ｇ）を１００％とした場合に、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＭを３００％以上、４００％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１１００％以上、１２００％以上、１３００％以上、１４００％以上、１５００％以上、１６００％以上、１７００％以上、１８００％以上、１９００％以上、２０００％以上、２１００％以上、２２００％以上、２３００％以上、２４００％以上、２５００％以上、２６００％以上、２７００％以上、２８００％以上、２９００％以上、３０００％以上高い含量で含んでいてもよい。
【００２９】
また、本発明のステビア植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）中のレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）及びレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）の含量をＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの比率で表した場合、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの値の下限が０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．８以上、１．０以上であることを特徴とする。一方、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの値の上限は、０．３以下、０．４以下、０．５以下、０．６以下、０．８以下、１．０以下、１．１以下、１．２以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは０．２以上かつ１．２以下、あるいは０．６以上かつ１．１以下である。
また、本発明のステビア植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）中のレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）及びレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）の含量をステビオール配糖体総量に対する比率として（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧ％で表した場合、（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の下限が１４％以上、１６％以上、１８％以上、２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上であることを特徴とする。一方、（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の上限は、１８％以下、２０％以下、２２％以下、２４％以下、２６％以下、２８％以下、３０％以下、３２％以下、３４％以下、３６％以下、３８％以下、４０％以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは１４％以上かつ４０％以下、あるいは１６％以上かつ４０％以下である。
【００３０】
別の実施態様において、本発明の植物体は、ステビオール配糖体総量が野生型より少ないものであってもよい。具体的には乾燥葉１００ｇ中に１９ｇ未満のステビオール配糖体総量を含むものであってもよい。これは、本発明の植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉１００ｇ当たりステビオール配糖体総量が１９ｇ未満、１８ｇ未満、１７ｇ未満、１６ｇ未満、１５ｇ未満、１４ｇ未満、１３ｇ未満、１２ｇ未満、１１ｇ未満、１０ｇ未満、９ｇ未満、８ｇ未満、７ｇ未満の量であることを意味する。
【００３１】
また、本発明のステビア植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）１００ｇ中のレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）及びレバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）の含量をＲｅｂＭ／ＲｅｂＡの比率で表した場合、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＡの値の下限が０．０３以上、０．０４以上、０．０５以上、０．０６以上、０．０８以上、０．１０以上、０．１２以上、０．１４以上であることを特徴とする。一方、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＡの値の上限は、０．０８以下、０．１０以下、０．１２以下、０．１４以下、０．１６以下、０．１８以下、０．２０以下、０．２４以下、０．２６以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは０．０３以上かつ０．２６以下、あるいは０．１０以上かつ０．２６以下である。
【００３２】
また、本発明のステビア植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）１００ｇ中のレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）及びレバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）の含量をステビオール配糖体総量に対する比率として（ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧで表した場合、（ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の下限が４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１２％以上、１４％以上、１６％以上、１８％以上、２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上であることを特徴とする。一方、（ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の上限は、１０％以下、１２％以下、１４％以下、１６％以下、１８％以下、２０％以下、２２％以下、２４％以下、２６％以下、２８％以下、３０％以下、３２％以下、３４％以下、３６％以下、３８％以下、４０％以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは４％以上かつ４０％以下、あるいは１６％以上かつ４０％以下である。
【００３３】
前述のとおり、本発明のステビア植物体は、レバウジオシドＭが高くなる変異が生じたものである。この変異は、以下の（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴」と称する場合がある）を有する。
（１）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
【００３４】
「〜に相当する位置（又は部分）」とは、ゲノム中に基準配列（例えば、配列番号３５、３７、３９、４２、４３など）と同一の配列が存在する場合は、ゲノム中に存在するその配列中の位置又は部分（例えば、４４位、４０位、４１位、５５〜７２位、５０位など）を意味し、ゲノム中に基準配列と同一の配列が存在しない場合は、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を意味する。ゲノム中に基準配列と同一又はそれに相当する配列が存在するかどうかは、例えば、基準配列をＰＣＲで増幅し得るプライマーで、対象となるステビア植物のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物のシーケンシングを行い、得られた配列と基準配列とのアラインメント解析を行うことで決定することができる。基準配列に相当する配列の非限定例としては、例えば、基準配列に対し６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分は、基準配列中の位置又は部分の前後の塩基配列等を考慮して決定することができる。例えば、基準配列とゲノム中の基準配列に相当する配列とのアライメント解析により、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を決定することができる。
【００３５】
例えば、遺伝的特徴（１）の「配列番号３５の４４位に相当する位置」を例にとると、ステビア植物体のゲノムが配列番号３５と同一の塩基配列からなる部分を有している場合、「配列番号３５の４４位に相当する位置」はゲノム中の配列番号３５と同一の塩基配列からなる部分の５’側から４４位である。一方、ステビア植物体のゲノムが配列番号３５と同一ではないがこれに相当する塩基配列からなる部分を有している場合、ゲノムは配列番号３５と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、「配列番号３５の４４位に相当する位置」は、必ずしも配列番号３５に相当する部分の５’側から４４位に該当するわけではないが、配列番号３５の４４位の前後の塩基配列等を考慮し、かかるステビア植物のゲノムにおける「配列番号３５の４４位に相当する位置」を特定することができる。例えば、ステビア植物のゲノムにおける配列番号３５に相当する部分の塩基配列と、配列番号３５の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物のゲノムにおける「配列番号３５の４４位に相当する位置」を特定することができる。
【００３６】
「配列番号３５に相当する塩基配列からなる部分」は、例えば、配列番号３５の塩基配列に対し、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる部分を意味する。
【００３７】
一部の態様において、「配列番号３５に相当する塩基配列からなる部分」には、配列番号３５の５’末端から１５〜２５塩基長の部分の相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマーと、配列番号３５の３’末端側から１５〜２５塩基長の部分にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。
ここでは簡潔のため遺伝的特徴（１）を例に説明したが、遺伝的特徴（２）〜（５）についても同様である。
【００３８】
特定の態様において、「配列番号３５に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号４５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４６の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号３７に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号４７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４８の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号３９に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号４９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５０の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号４２に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号５１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５２の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号４３に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号５３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５４の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
【００３９】
特定の態様において、「配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号５５、６５又は７５の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号５７、６７又は７７の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号５９、６９又は７９の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレル」は、配列番号６１、７１又は８１の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」は、配列番号６３、７３又は８３の塩基配列を含む。
【００４０】
ここで、（１）配列番号３５の４４位に相当する位置、（２）配列番号３７の４０位に相当する位置、（３）配列番号３９の４１位に相当する位置、（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分、及び（５）配列番号４３の５０位に相当する位置からなる群から選択される位置を、「本発明の多型部位」又は「本発明の変異部位」と称することがある。
また、（１）配列番号３５の４４位に相当する位置におけるＡからＴへの変異、（２）配列番号３７の４０位に相当する位置におけるＣからＴへの変異、（３）配列番号３９の４１位に相当する位置におけるＧからＣへの変異、（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分の欠失、及び（５）配列番号４３の５０位に相当する位置におけるＧからＡへの変異からなる群から選択される変異を、「本発明の多型」又は「本発明の変異」と称することがある。
【００４１】
上記の遺伝的特徴は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ−ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
特定の態様において、上記の遺伝的特徴は、本発明者らが開発した多型マーカーを用いて「多型マーカー陽性」のものとして検出することが可能である。
ここで多型マーカーはＰ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つである。
【００４３】
Ｐ０１について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長：例えば、配列番号２１又は２２）にＸｂａＩ制限酵素処理を行っても約３８３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号２１）しか得られないことを意味する。反対に、上記ＰＣＲ産物に対しＸｂａＩ制限酵素処理を行った場合に約３４４ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２３）を生じた場合、その候補植物体はＰ０１陰性となる。
Ｐ０２について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号３に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（２９７ｂｐ長）（例えば、配列番号２４又は２５）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行っても約２９７ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号２４）しか得られないことを意味する。反対に、約２５８ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２６）を生じる場合、その候補植物体はＰ０２陰性となる。
Ｐ０３について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長）（例えば、配列番号２７又は２８）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行っても約３９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号２７）しか得られないことを意味する。反対に、約３４７ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２９）を生じる場合、その候補植物体はＰ０３陰性となる。
【００４４】
Ｐ０４について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号８に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った場合に約１４０ｂｐのＰＣＲ産物（例えば、配列番号３０）のみを生じることを意味し、１４０ｂｐ（例えば、配列番号３０）及び１５８ｂｐ（例えば、配列番号３４）のＰＣＲ産物を生じる場合は陰性であることを意味する。
Ｐ０５について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号９に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２８８ｂｐ長）（例えば、配列番号３１又は３２）に対しＰｖｕＩ制限酵素処理を行っても約２８８ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号３１）しか得られないことを意味する。反対に、約２４０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号３３）を生じる場合、その候補植物体はＰ０５陰性となる。
上記ｂｐ長に関し、「約」とは、±５ｂｐを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
【００４５】
本発明の植物体のスクリーニング方法の詳細については、後述の項目「３．本発明の植物体のスクリーニング方法」を参照することができる。
上記遺伝的特徴（例えば、上記多型マーカー陽性の多型）は、高レバウジオシドＭ含有及び/又は高レバウジオシドＤ含有という表現型と統計学上の相関関係を有することが実施例において確認されている。
【００４６】
レバウジオシドＭ及びＤは、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はOhta et al.,J. Appl. Glycosci.、 Vol. 57、 No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドＭを精製することができる。
【００４７】
本発明に係るレバウジオシドＭ含量は、Ohta et al., J. Appl. Glycosci.、 Vol. 57、 No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳを行うことにより測定することができる。
【００４８】
本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。また、葉は先に述べた乾燥葉であってもよい。
【００４９】
また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
２．本発明の植物体の作出方法
本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」と称する場合がある）を提供する。
当該方法により作出される「葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
【００５１】
具体的には、本発明の作出方法によって得られた植物体から葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）を得た場合、葉に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含む。これはレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）の含量を、葉から得られたステビオール配糖体総量に対する比率としてＲｅｂＭ／ＴＳＧ％で表した場合、ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値の下限が２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１２％以上、１４％以上、１６％以上、１８％以上、２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上であることを特徴とする。一方、ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値の上限は、１５％以下、１６％以下、１８％以下、２０％以下、２２％以下、２４％以下、２６％以下、２８％以下、３０％以下、３２％以下、３４％以下、３６％以下、３８％以下、４０％以下であることを意味する。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは２％以上かつ２０％以下、あるいは７％以上かつ１５％以下である。
【００５２】
また、本発明の作出方法によって得られた植物体は、乾燥葉１００ｇ中に０．１９ｇ以上のレバウジオシドＭを含むものであってもよい。これは、本発明の植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉１００ｇ当たりレバウジオシドＭが０．１９ｇ以上、０．２０ｇ以上、０．２５ｇ以上、０．３０ｇ以上、０．３５ｇ以上、０．４０ｇ以上、０．４５ｇ以上、０．５０ｇ以上、０．５５ｇ以上、０．６０ｇ以上、０．６５ｇ以上、０．７０ｇ以上、０．７５ｇ以上、０．８０ｇ以上、０．８５ｇ以上、０．９０ｇ以上、０．９５ｇ以上、１．００ｇ以上、１．０５ｇ以上、１．１０ｇ以上、１．１５ｇ以上、１．２０ｇ以上、１．２５ｇ以上、１．３０ｇ以上、１．３５ｇ以上、１．４０ｇ以上、１．４５ｇ以上の量で存在することを意味する。
【００５３】
ここで、本発明の作出方法によって得られた植物体は、乾燥葉１００ｇ中に１．００ｇ以上、１．０５ｇ以上、１．１０ｇ以上、１．１５ｇ以上、１．２０ｇ以上、１．２５ｇ以上、１．３０ｇ以上、１．３５ｇ以上、１．４０ｇ以上、１．４５ｇ以上、１．５０ｇ以上、１．５５ｇ以上、１．６０ｇ以上、１．６５ｇ以上、１．７０ｇ以上、１．７５ｇ以上、１．８０ｇ以上、１．８５ｇ以上、１．９０ｇ以上、１．９５ｇ以上、２．００ｇ以上、２．０５ｇ以上、２．１０ｇ以上、２．１５ｇ以上、２．２０ｇ以上、２．２５ｇ以上、２．３０ｇ以上、２．３５ｇ以上、２．４０ｇ以上、２．４５ｇ以上、２．５０ｇ以上、２．５５ｇ以上、２．６０ｇ以上、２．６５ｇ以上、２．７０ｇ以上、２．７５ｇ以上、２．８０ｇ以上、２．８５ｇ以上、２．９０ｇ以上、２．９５ｇ以上、３．００ｇ以上、３．０５ｇ以上、３．１０ｇ以上、３．１５ｇ以上、３．２０ｇ以上、３．２５ｇ以上、３．３０ｇ以上、３．３５ｇ以上、３．４０ｇ以上、３．４５ｇ以上、３．５０ｇ以上、３．５５ｇ以上又は３．５７ｇ以上のレバウジオシドＤをさらに含んでいてもよい。
ここで、レバウジオシドＭとＤとの含量の組み合わせは特に限定されず、任意である。
好ましくは、本発明の作出方法によって得られた植物体は、乾燥葉１００ｇ中に１．０３ｇ以上のレバウジオシドＭと１．１ｇ以上のレバウジオシドＤを含む。
【００５４】
あるいは、本発明の作出方法によって得られた植物体の葉は、野生型ステビア植物体の葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）１００ｇ当たりに含まれるレバウジオシドＭの量（ｇ）を１００％とした場合に、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＭを３００％以上、４００％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１１００％以上、１２００％以上、１３００％以上、１４００％以上、１５００％以上、１６００％以上、１７００％以上、１８００％以上、１９００％以上、２０００％以上、２１００％以上、２２００％以上、２３００％以上、２４００％以上、２５００％以上、２６００％以上、２７００％以上、２８００％以上、２９００％以上、３０００％以上高い含量で含んでいてもよい。
【００５５】
また、本発明の作出方法によって得られた植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）中のレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）及びレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）の含量をＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの比率で表した場合、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの値の下限が０．２以上、０．３以上、０．４以上、０．５以上、０．６以上、０．８以上、１．０以上であることを特徴とする。一方、ＲｅｂＭ／ＲｅｂＤの値の上限は、０．３以下、０．４以下、０．５以下、０．６以下、０．８以下、１．０以下、１．１以下、１．２以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは０．２以上かつ１．２以下、あるいは０．６以上かつ１．１以下である。
また、本発明の作出方法によって得られた植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）中のレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）及びレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）の含量をステビオール配糖体総量に対する比率として（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧ％で表した場合、（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の下限が１４％以上、１６％以上、１８％以上、２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上であることを特徴とする。一方、（ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の上限は、１８％以下、２０％以下、２２％以下、２４％以下、２６％以下、２８％以下、３０％以下、３２％以下、３４％以下、３６％以下、３８％以下、４０％以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは１４％以上かつ４０％以下、あるいは１６％以上かつ４０％以下である。
【００５６】
別の実施態様において、本発明の作出方法によって得られた植物体は、ステビオール配糖体総量が野生型より少ないものであってもよい。具体的には乾燥葉１００ｇ中に１９ｇ未満のステビオール配糖体総量を含むものであってもよい。これは、本発明の植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉１００ｇ当たりステビオール配糖体総量が１９ｇ未満、１８ｇ未満、１７ｇ未満、１６ｇ未満、１５ｇ未満、１４ｇ未満、１３ｇ未満、１２ｇ未満、１１ｇ未満、１０ｇ未満、９ｇ未満、８ｇ未満、７ｇ未満の量であることを意味する。
【００５７】
また、本発明の作出方法によって得られた植物体は、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）１００ｇ中のレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）及びレバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）の含量をステビオール配糖体総量に対する比率として（ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧで表した場合、（ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の下限が４％以上、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１２％以上、１４％以上、１６％以上、１８％以上、２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上、４０％以上であることを特徴とする。一方、（ＲｅｂＡ＋ＲｅｂＭ）／ＴＳＧの値の上限は、３０％以下、３２％以下、３４％以下、３６％以下、３８％以下、４０％以下、４２％以下、４４％以下、４６％以下、４８％以下、５０％以下、５２％以下、５４％以下、５６％以下、５８％以下、６０％以下、６２％以下、６４％以下、６６％以下、６８％以下、７０％以下、７２％以下、７４％以下、７６％以下、７８％以下、８０％以下であることを特徴とする。この下限と上限の組み合わせは、上限値が下限値を上回る組み合わせであれば特に限定されないが、好ましくは４％以上かつ８０％以下、あるいは４０％以上かつ８０％以下である。
【００５８】
本発明の作出方法によって得られた植物体は、レバウジオシドＭが高くなる以下の（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴を有する。
（１）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
かかる遺伝的特徴は、本発明者らが開発した多型マーカーを用いて「多型マーカー陽性」のものとして検出することが可能である。
ここで多型マーカーはＰ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つである。
【００５９】
Ｐ０１について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長：例えば、配列番号２１又は２２）にＸｂａＩ制限酵素処理を行っても約３８３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号２１）しか得られないことを意味する。反対に、上記ＰＣＲ産物に対しＸｂａＩ制限酵素処理を行った場合に約３４４ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２３）を生じた場合、その候補植物体はＰ０１陰性となる。
Ｐ０２について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号３に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（２９７ｂｐ長）（例えば、配列番号２４又は２５）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行っても約２９７ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号２４）しか得られないことを意味する。反対に、約２５８ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２６）を生じる場合、その候補植物体はＰ０２陰性となる。
Ｐ０３について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長）（例えば、配列番号２７又は２８）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行っても約３９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号２７）しか得られないことを意味する。反対に、約３４７ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２９）を生じる場合、その候補植物体はＰ０３陰性となる。
【００６０】
Ｐ０４について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号８に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った場合に約１４０ｂｐのＰＣＲ産物（例えば、配列番号３０）のみを生じることを意味し、１４０ｂｐ（例えば、配列番号３０）及び１５８ｂｐ（例えば、配列番号３４）のＰＣＲ産物を生じる場合は陰性であることを意味する。
Ｐ０５について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号９に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２８８ｂｐ長）（例えば、配列番号３１又は３２）に対しＰｖｕＩ制限酵素処理を行っても約２８８ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号３１）しか得られないことを意味する。反対に、約２４０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号３３）を生じる場合、その候補植物体はＰ０５陰性となる。
上記ｂｐ長に関し、「約」とは、±５ｂｐを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
【００６１】
本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体（第一代（Ｓ１））と、第２の植物体（Ｓ１）とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体（第二代（Ｓ２）））を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体（Ｓ２）を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝的特徴を有する植物体）（Ｓ１）と交雑させて、本発明の遺伝子的特徴を有する植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体（Ｓ１）が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。本発明の遺伝子多型はメンデルの法則に従って遺伝し、これに伴って当該遺伝子多型と相関する表現型、つまり高レバウジオシドＭ含有という表現型も、メンデルの法則に従って遺伝する。
【００６２】
あるいは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
【００６３】
本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的性質が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体とを交雑させることにより、葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれる総ステビオール配糖体量に対し２％以上のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体を作出することも可能である。
【００６４】
別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants、 Method in molecular biology、 vo. 1391、 pp113-123.）。
【００６５】
あるいは、本発明の植物体は非遺伝子組み換え体であるので、野生型のステビア植物体に非遺伝子組換え的手法により上記多型を組み込むことによって作成することもできる。「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１〜４８時間、２〜３６時間、３〜３０時間、４〜２８時間、５〜２６時間、６〜２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
【００６６】
あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１〜１００Ｇｒ、０．０３〜７５Ｇｒ、０．０５〜５０Ｇｒ、０．０７〜２５Ｇｒ、０．０９〜２０Ｇｒ、０．１〜１５Ｇｒ、０．１〜１０Ｇｒ、０．５〜１０Ｇｒ、１〜１０Ｇｒであり、照射距離は１ｃｍ〜２００ｍ、５ｃｍ〜１００ｍ、７ｃｍ〜７５ｍ、９ｃｍ〜５０ｍ、１０ｃｍ〜３０ｍ、１０ｃｍ〜２０ｍ、１０ｃｍ〜１０ｍであり、照射時間は１分〜２年、２分〜１年、３分〜０．５年、４分〜１か月、５分〜２週間、１０分〜１週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００６７】
また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）などの手法も公知である。
一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
なお、本発明の植物体は非遺伝子組み換えステビア植物体であるが、本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換え（例えばゲノム編集等により）を行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
【００６８】
３．本発明の植物体のスクリーニング方法
本発明の植物体及び本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝的特徴を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
したがって、本発明は、別の実施形態として、被験植物のゲノムから以下の（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、高レバウジオシドＭ含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称する場合がある）を提供する。
（１）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
（５）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である。
本発明のスクリーニング方法は、上記（１）〜（５）の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
【００６９】
本発明の遺伝的特徴の存在は、
（Ａ）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル、
（Ｂ）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル、
（Ｃ）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル、
（Ｄ）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレル、及び
（Ｅ）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレル
からなる群から選択されるアレルの存在の検出、及び／又は、
（ａ）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル、
（ｂ）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル、
（ｃ）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＧであるアレル、
（ｄ）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失していないアレル、及び
（ｅ）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＧであるアレル
からなる群から選択されるアレルの不在の検出
により決定することができる。
【００７０】
本発明の遺伝的特徴の不在は、
（Ａ）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル、
（Ｂ）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル、
（Ｃ）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル、
（Ｄ）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレル、及び
（Ｅ）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＡであるアレル
からなる群から選択されるアレルの不在の検出、及び／又は、
（ａ）配列番号３５の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル、
（ｂ）配列番号３７の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル、
（ｃ）配列番号３９の４１位に相当する位置の塩基がＧであるアレル、
（ｄ）配列番号４２の５５〜７２位に相当する部分が欠失していないアレル、及び
（ｅ）配列番号４３の５０位に相当する位置の塩基がＧであるアレル
からなる群から選択されるアレルの存在の検出
により決定することができる。
【００７１】
本発明の遺伝的特徴の検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、ＡＳＯ法、ＡＲＭＳ法、ＤＧＧＥ法、ＣＣＭ法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ法、ＶＳＥＴ法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ−ＩＴ法、融解曲線分析法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が本発明の多型部位に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが多型を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明の変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
あるいは、本発明の多型とプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子変異をＰＣＲ増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝的特徴を検出することができる。
ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
【００７３】
TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてＤＮＡ配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の多型と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の多型の有無を検出することができる。ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
【００７４】
インベーダー法とは、ＳＮＰ等の多型のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
【００７５】
一態様において、本発明のスクリーニング方法は、被験植物のゲノムから本発明の多型マーカー陽性を検出する工程を含んでもよい。かかる工程は、被験植物からゲノムＤＮＡを抽出し、当該ゲノムＤＮＡに対して本発明の多型マーカーを検出する操作を含む。多型マーカーはすでに述べたとおり、Ｐ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つである。また、多型マーカー陽性とは、Ｐ０１〜Ｐ０５からなる群より選択される少なくとも一つのマーカーについて陽性であることを意味する。
Ｐ０１〜Ｐ０５の陽性の検出方法については既に述べた通りである。
この態様において、本発明のスクリーニング方法は、本発明の多型マーカー陽性が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
【００７６】
ある実施態様では、被験植物のゲノムＤＮＡに対し下記のプライマーセット（１）〜（５）の少なくとも一つを用いてＰＣＲ増幅を行う工程、
前記ＰＣＲ増幅により得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、制限酵素処理産物を検出する工程、
を含む、高レバウジオシドＭ含有非遺伝子組み換えステビア植物体のスクリーニング方法が提供される。
（１）配列番号１に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号２に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（２）配列番号３に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号４に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（３）配列番号５に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号６に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（４）配列番号７に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号８に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、又は
（５）配列番号９に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号１０に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。  ＰＣＲ増幅の条件についてはすでに述べたとおりである。
【００７７】
但し、プライマーセットは配列番号１〜１０の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号１、３、５、７又は９の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよくリバースプライマーとしては配列番号２、４、６、８又は１０の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよい。このようなプライマーは、１５〜５０塩基長、２０〜４５塩基長の長さにあってもよい。
【表１】
2019074089.tif 000003
【００７８】
プライマーセットは配列番号１〜１０の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号１、３、５、７又は９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよく、リバースプライマーとしては配列番号２、４、６、８又は１０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよい。
（１’’）配列番号１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号２における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（２’’）配列番号３における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号４における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（３’’）配列番号５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（４’’）配列番号７における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号８における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは
（５’’）配列番号９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号１０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。  このようなプライマーは、前記任意の連続する１５塩基以上の配列が３‘側末端に存在すれば、１５〜５０塩基長、２０〜４５塩基長、３０〜６５塩基長の長さにあってもよい。
【００７９】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物の組織（例えば葉）のＲｅｂＭの含有量を測定する工程をさらに含んでもよい。ＲｅｂＭ含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＭの含有量が高い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物組織のＲｅｂＭの含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＭの含有量が高い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択したＲｅｂＭの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｖｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物組織のＲｅｂＭの含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物体のうち、ＲｅｂＭの含有量が高い個体を選択する工程。
【００８０】
選択するＲｅｂＭの含有量が高い個体は、例えば、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＭの含有量の高さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体などであってよい。また、交配する他のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴を含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、ＲｅｂＭの含有量がより高いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
【００８１】
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
【００８２】
また、本発明は、上記に記載されたプライマーセット、例えば、上記（１）〜（５）、（１’）〜（５’）及び（１’’）〜（５’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを提供する。本発明は、さらに、配列番号３５〜４４からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセット、例えば、配列番号４５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４６の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号４７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４８の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号４９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５０の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号５１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５２の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号５３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号５４の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセットを提供する。
【００８３】
さらに、本発明は、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブは、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在の各種検出方法に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブは、本発明の変異部位を含むゲノムの部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号５５〜６４から選択される塩基配列を含むものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号５５、５７、５９、６１及び６３は本発明の変異を含むアレルに特異的であり、配列番号５６、５８、６０、６２及び６４は、本発明の変異を含まないアレルに特異的である。本発明の遺伝的特徴の存在は、本発明の変異を含むアレルの検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの非検出により検出することができ、本発明の遺伝的特徴の不在は、本発明の変異を含むアレルの非検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの検出により検出することができる。本発明のプローブは、好ましくは標識を有する。かかる標識の非限定例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、色素、酵素、クエンチャー、検出可能な標識との結合部分等が挙げられる。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号５５〜６４から選択される塩基配列と、標識とを有する。
【００８４】
本発明はさらに、上記（１）〜（５）、（１’）〜（５’）及び（１’’）〜（５’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含む、スクリーニング用キットを提供する。
当該キットにおいて、（１）、（１’）及び（１’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＸｂａＩである。
当該キットにおいて、（２）、（２’）及び（２’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＫｐｎＩである。
当該キットにおいて、（３）、（３’）及び（３’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＡｆｌＩＩである。
当該キットにおいて、（５）、（５’）及び（５’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＰｖｕＩである。
【００８５】
当該キットの別の態様において、
前記プライマーセットが配列番号１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＸｂａＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号３における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＫｐｎＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＡｆｌＩＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号９における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＰｖｕＩを含む。
【００８６】
本発明はまた、配列番号３５〜４４からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、本発明のプローブとを含む、スクリーニング用キットを提供する。
【００８７】
これらのプライマーセット、プローブ及びキットは、本発明の遺伝的特徴を検出するために用いること、本発明のスクリーニング方法に用いることなどが可能である。また、これらのプライマーセット及びキットには、本発明の遺伝的特徴の検出や、本発明のスクリーニング方法に関する説明を含む指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが含まれていてもよい。
【００８８】
５．植物体由来抽出物の製造方法及び当該抽出物を用いた製品
本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドＭ含有抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある）が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からレバウジオシドＭを精製する工程を含む、レバウジオシドＭの製造方法（以下、「本発明のレバウジオシドＭの製造方法」と称する場合がある）が提供される。
具体的には、本発明の高レバウジオシドＭ含有型ステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別された高レバウジオシドＭ含有型ステビア植物体又は本発明の方法により製造された高レバウジオシドＭ含有型ステビア植物体からレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方を含む抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方の製造方法が提供される。
レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方を含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はOhta et al.、J. Appl. Glycosci.、 Vol. 57、 No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
また、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方を含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方を精製することができる。
【００８９】
本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方をより高い含量で含む。
本発明の抽出物は、野生型ステビア種から得られた抽出物と比べレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方を３００％以上、４００％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１１００％以上、１２００％以上、１３００％以上、１４００％以上、１５００％以上、１６００％以上、１７００％以上、１８００％以上、１９００％以上、２０００％以上、２１００％以上、２２００％以上、２３００％以上、２４００％以上、２５００％以上、２６００％以上、２７００％以上、２８００％以上、２９００％以上、３０００％以上、３１００％以上、３２００％以上、３３００％以上、３４００％以上、３５００％以上、３６００％以上、３７００％以上、３８００％以上、３９００％以上、４０００％以上、４１００％以上、４２００％以上、４３００％以上、４４００％以上、４５００％以上、４６００％以上、４７００％以上、４８００％以上、４９００％以上、５０００％以上高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、野生型ステビア種から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
【００９０】
このようにして得られた本発明の抽出物及び／又は本発明のレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方の製造方法により得られるレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方と他の成分とを混合することにより、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方の含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物及び／又は本発明のレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方の製造方法により得られるレバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方と他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ又はその両方の含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な医薬品、香料、飲料又は食品を提供し、また、当該医薬品、香料、飲料又は食品の製造方法を提供する。
【実施例】
【００９１】
以下に本発明に関する実験例、実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。【００９２】
［実施例１］高ＲｅｂＭステビア植物の作製
１．育種素材の導入及び初期選抜
２０１４年８月に市販ステビア種子を播種、育苗し、同年１０月〜２０１５年３月までの間に約３、０００個体について生育状況及び葉形態によって選抜を行った。２０１５年４月に得られた１１５個体についてＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた定量分析により各ステビオール配糖体の含有量及び含有率を測定し、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの含有率が高い３個体（２成分合計でＴＳＧに占める割合が２０％以上の個体）を選抜した。同時に、総ステビオール配糖体（ＴＳＧ）含量によっても選抜も実施し、ＴＳＧ収率（単位リーフ乾物重より得られる測定可能なステビオール配糖体の総量）が２０％以上の１４個体を得た。【００９３】
２．自殖系統の作製及び選抜
上記で得られた１１５個体より、生育状況が良い高ＲｅｂＡ型の５個体を選抜し、２０１５年１月より個体間もしくは個体内で人工授粉を行い、同年３月に集団採種を実施して自殖第一代（Ｓ１種子）を得た。さらに、これらＳ１種子を播種・育苗し、１０５個体のＳ１個体群を得た。２０１５年６月、これらのＳ１個体群を個体別に育成し、個体内での人工授粉により自殖第二代（Ｓ２種子）を得た。得られたＳ２種子は得られたＳ１個体ごとに系統として区別し１０５系統のＳ２個体群を得た。その後、得られたＳ２個体の生育状況を確認し、生育良好な個体について各個体の葉を４枚サンプリングし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてステビオール配糖体量の定量分析を行った。得られた分析結果より、ＲｅｂＤ含量、ＲｅｂＭ含量及びＴＳＧ量を算出し、葉１００ｇ当たりのＲｅｂＤ含量＋ＲｅｂＭ含量の合算値が２ｇ（＝２％）を超える個体を優良個体として選抜した。【００９４】
３．雑種系統の作製及び選抜
成分分析によって選抜した高ＲｅｂＤかつ高ＲｅｂＭ植物体（３個体）、及び高ＴＳＧ植物体（６個体）を育種母本として合計５３組合せの交雑試験に供した。上記選抜個体は２０１５年４月に挿し木によって栄養繁殖を行い同年６月に苗を確立し、同年１１月までの間に養生してそれぞれ複数株の親株を確立した。２０１６年１月より人工交配を開始し、各組合せ１、０００粒程度の雑種種子（Ｆ１種子）を得たのち、同年３月より得られたＦ１種子の播種・育苗を行った。その後、得られたＦ１個体の生育状況を確認し、生育良好な個体について各個体の葉を４枚サンプリングし、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてステビオール配糖体量の定量分析を行った。得られた分析結果より、ＲｅｂＤ含量、ＲｅｂＭ含量及びＴＳＧ量を算出し、ＲｅｂＤ含量＋ＲｅｂＭ含量の合算値が２ｇ／１００ｇ（＝２％）を超える個体を優良個体として選抜した。【００９５】
４．遺伝マーカーの作製
初期選抜で得られた１０個体を用いて遺伝マーカーの作製を行った。２０１５年６月、ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ含量率の合算値に基づいて高（２９．１６％以上）・低（６．０６％以下）の２グループに分類し、二次代謝物の生合成経路を活性化することで知られているＷＲＫＹコード領域及びＷＤ４０コード領域において各グループに共通する多型探索を実施、特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を取得した。得られたＳＮＰに基づいてプライマー設計と制限酵素の選択を行い、特定のＳＮＰの識別を可能とする多型マーカー（１）〜（５）を確立した。【００９６】
（１）Ｐ０１
マーカーＰ０１の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＸｂａＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’−ＡＡＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴＧＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＧＴＡＴＣＴＡＧ−３’（配列番号１）
Ｒｖプライマー：５’−ＣＣＴＴＡＴＧＴＡＣＡＣＡＴＧＣＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２）
得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長）に対しＸｂａＩ制限酵素処理を行い、約３４４ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２３）を生じなかったものをＰ０１陽性とした。【００９７】
（２）Ｐ０２
マーカーＰ０２の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＫｐｎＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’−ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣ−３’（配列番号３）
Ｒｖプライマー：５’−ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＣ−３’（配列番号４）
得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行い、約２６０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２６）を生じなかったものをＰ０２陽性とした。【００９８】
（３）Ｐ０３
マーカーＰ０３の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＡｆｌＩＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’−ＣＧＡＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＡＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＣＣＣＧＣＴＴＡＡ−３’（配列番号５）
Ｒｖプライマー：５’−ＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＣＣＴＴＧＡＡＴＴＡＧ−３’（配列番号６）
得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行い、約３４７ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２９）を生じなかったものをＰ０３陽性とした。【００９９】
（４）Ｐ０４
マーカーＰ０４の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をマイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴで電気泳動させ、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’−ＣＧＣＡＡＡＣＡＣＧＴＡＴＡＣＴＡＡＴＣ−３’（配列番号７）
Ｒｖプライマー：５’−ＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＧＴＡＣＡＡＣ−３’（配列番号８）
約１４０ｂｐのＰＣＲ産物のみ（例えば、配列番号３０）を生じたものをＰ０４陽性とした。【０１００】
（５）Ｐ０５
マーカーＰ０５の検出には以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＰｖｕＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’−ＡＴＡＣＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＡＴＴＣＡＴＧＡＧＣＧＡＴＣ−３’（配列番号９）
Ｒｖプライマー：５’−ＣＣＣＴＴＧＴＡＡＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＡＧ−３’（配列番号１０）
得られたＰＣＲ産物（約２８８ｂｐ長）に対しＰｖｕＩ制限酵素処理を行い、約２４０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号３３）を生じなかったものをＰ０５陽性とした。【０１０１】
５．遺伝マーカーの検証
上記で確立した多型マーカーと第Ｉ個体群を用いて、マーカーの検証実験を実施した。第Ｉ個体群１９２個体の成分分析を行い、ＲｅｂＭ含量値に基づいて、上位８個体（０．３５％以上）・下位８個体（０．１２％以下）を選抜し、上記のとおりマーカー検定を行った。その結果、ＲｅｂＭ含量が高い上位８個体のみが目的の多型を陽性に持つ個体として選抜された（図１）。
第ＩＩ個体群についても同様に検証実験を行った。第ＩＩ個体群１３７個体の成分分析を行い、ＲｅｂＭ含量値に基づいて、上位８個体（０．２４％以上）・下位８個体（０．０１％以下）を選抜し、マーカー検定を行った。その結果、ＲｅｂＭ含量が高い上位８個体のみが目的の多型を持つ個体として選抜された（図２）。図１及び２では高ＲｅｂＭ表現型を有する個体にのみ目的サイズのバンドが生じていることが分かる。【０１０２】
６．サンプル集団の増加
遺伝マーカーの検証時に用いた２つの分離集団、第Ｉ及び第ＩＩ個体群について、さらなる検証のために個体数を増加して実験を行った。上記の個体数を含めてそれぞれ、６２個体、１０９個体を用いた。ＲｅｂＭ含量に基づいて０．２％以上、０．１％以上〜０．２％未満、０％以上〜０．１％未満の３群に分割し、マーカー検定を行った結果、０．２％以上群が本マーカーにより優先的に検出される結果となり、陽性個体の出現頻度が群間で統計的に有意に異なることが証明された（カイ二乗検定による適合度検定、帰無仮説はマーカー検定結果と表現型が紐づかず頻度分布が均等であると仮定。検定結果は下表を参照）。
【表２】
2019074089.tif 000004
【表３】
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【表４】
2019074089.tif 000006
【表５】
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【０１０３】
７．高ＲｅｂＭ植物体の選抜
上記で得られた遺伝マーカーを用いて高ＲｅｂＭ植物体の選抜を行ったところ、検証用集団以外の分離集団においても下表のとおりＲｅｂＭ比率が２％以上の個体を選抜することができ、実用的な選抜マーカーになり得ることを確認した。高ＲｅｂＭ植物体の選抜結果を以下の表に示す。表中の「○」はマーカー検定結果が陽性であることを表す。
【表６】
2019074089.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明によってレバウジオシドＭ及びＤがより効率的に提供可能になるので、レバウジオシドＭ及びＤを十分な量含むことによって上質な味質の医薬品、香料又は飲食品などを提供することができる。
【図１】
2019074089.tif 000009
【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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