(57)【要約】  本発明の目的は、癌幹細胞の増殖を抑制でき、癌の効果的な治療を可能にする癌治療用の核酸医薬を提供することである。  hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608には、癌幹細胞の増殖抑制作用が格段に優れており、各種癌の治療用核酸医薬として有用である。
2018181877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608よりなる群から選択される少なくとも１種のmiRNAを有効成分とする、癌幹細胞の増殖抑制剤。
【請求項２】
抗癌剤と同時に、或は抗癌剤の投与前及び／又は投与後に投与される、請求項１に記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
【請求項３】
前記miRNAが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、請求項１又は２に記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
【請求項４】
前記miRNAが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、請求項１〜３のいずれかに記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
【請求項５】
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608よりなる群から選択される少なくとも１種のmiRNAの、癌幹細胞の増殖抑制剤の製造のための使用。
【請求項６】
前記癌幹細胞の増殖抑制剤が、抗癌剤と同時に、或は抗癌剤の投与前及び／又は投与後に投与されるものである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608よりなる群から選択される少なくとも１種のmiRNAの治療有効量を、癌患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
【請求項８】
前記miRNAが、抗癌剤と同時に、或は抗癌剤の投与前及び／又は投与後に投与される、請求項７に記載の癌の治療方法。
【請求項９】
hsa-miR-136-5pを有効成分とする、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤。
【請求項１０】
hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pを有効成分とする、癌の治療剤。
【請求項１１】
hsa-miR-378gを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤。
【請求項１２】
hsa-miR-181a-5pを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤。
【請求項１３】
hsa-miR-362-5pを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤。
【請求項１４】
hsa-miR-608を有効成分とする、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、血液癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞の増殖抑制剤に関する。具体的には、本発明は、特定のmiRNAによって、癌幹細胞の増殖を抑制でき、癌の効果的な治療を可能にする、癌幹細胞の増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
miRNAは、18〜24ヌクレオチドからなる小さなRNAで真核生物に広く存在しており、ヒトでは数千のmiRNAの存在が明らかになっている。miRNAは、1993年に初めて報告された内在性に発現する短いRNAである。DNAからpri-miRNAと呼ばれるループ構造を持つRNAが転写される。ループが酵素によって切断され、pre-miRNAを作る。このpre-miRNAが核外に輸送され、Dicerにより20〜25塩基程度のmiRNA配列が切り出される。これがRNA-induced silencing complex(RISC)と呼ばれるリボ核酸とArgonoute(アルゴノート)蛋白の複合体に取りこまれることでmiRNA-RISC複合体を形成し、mRNAの3'UTRと結合して遺伝子発現を抑制する。miRNAとmRNAの結合は不完全であるため標的遺伝子は１つとは限らず、複数の遺伝子を標的として制御することが可能である点が重要な特徴である。【０００３】
また、miRNAは、生体内の遺伝子発現の制御に重要な役割を果たしており、miRNAの制御システムの異常は、多くの疾患の原因や進展に関与していることも明らかにされている。特に、癌の発症や進展に関連性を示すmiRNAについて種々解明されており、癌治療用の核酸医薬の担い手として注目されている。従来、抗腫瘍作用を示すmiRNAについて種々報告されており、中でも、miRNA34aは、腫瘍増殖抑制作用があることが報告されており（特許文献１参照）、更に従来報告されているmiRNAの中でも固形腫瘍に対する抗癌作用が最も効果が高いとされており、核酸医薬としての実現可能性が検討されている。但し、癌は、深刻で生死に関わる疾患であるため、より優れた抗腫瘍効果を奏するmiRNAの開発が求められている。【０００４】
一方、癌細胞には、自己増殖能があり、周辺組織への浸潤や離れた組織への転移が可能であるという特性がある。しかしながら、癌組織を形成している癌細胞の全てにおいて、これらの特性を備わっているのではなく、癌を発症させたり、癌を進行させる癌細胞は、癌細胞の中でもごく僅かにしか存在しない癌幹細胞であることが分かっている。癌幹細胞は、正常幹細胞と同様に未分化な表面形質を示し、自己複製能と分化能を有し、癌組織を構成する多様な分化段階にあるあらゆる癌細胞を生みだす特性を有している。即ち、癌幹細胞は、癌組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しつつ、分化によって大多数の癌細胞を生み出すもとになっていると考えられている。【０００５】
しかしながら、従来、癌幹細胞の増殖を抑制できるmiRNAについては報告されていない。また、miRNA34aは、従来報告されているmiRNAの中でも固形腫瘍に対する抗癌作用が最も効果が高いとされているが、miRNA34aでも、癌幹細胞に対する増殖抑制作用は十分とは言えないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2008-239596号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、癌幹細胞の増殖を抑制でき、癌の効果的な治療を可能にする癌治療用の核酸医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608には、癌幹細胞の増殖抑制作用が格段に優れており、各種癌の治療用核酸医薬として有用であることを見出した。より具体的には、前記各miRNAは、癌幹細胞の増殖を抑制する作用が高く癌の治療に有効であり、例えば、前記各miRNAを、非癌幹細胞（癌幹細胞ではない癌細胞）に対して増殖抑制作用を発揮する抗癌剤と併用することによって、効果的に癌を治療できることを見出した。【０００９】
また、本発明者等は、前記各miRNAが、以下に示す各癌に対する癌治療剤として有用であることをも見出した。
hsa-miR-136-5p：食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、及び血液癌
hsa-miR-3065-3p：固形癌や血液癌を含むあらゆる癌
hsa-miR-4727-5p：固形癌や血液癌を含むあらゆる癌
hsa-miR-378g：食道癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、及び口腔癌
hsa-miR-181a-5p：食道癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、頭頚部癌、及び口腔癌
hsa-miR-362-5p：食道癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、頭頚部癌、口腔癌、及び血液癌
hsa-miR-608：食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、及び血液癌【００１０】
本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項1-1．  hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608よりなる群から選択される少なくとも１種のmiRNAを有効成分とする、癌幹細胞の増殖抑制剤。
項1-2．  抗癌剤と同時に、或は抗癌剤の投与前及び／又は投与後に投与される、項1-1に記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
項1-3．  前記miRNAが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項1-1又は1-2に記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
項1-4．  前記miRNAが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項1-1〜1-3のいずれかに記載の癌幹細胞の増殖抑制剤。
項1-5．  hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608よりなる群から選択される少なくとも１種のmiRNAの、癌幹細胞の増殖抑制剤の製造のための使用。
項1-6．  前記癌幹細胞の増殖抑制剤が、抗癌剤と同時に、或は抗癌剤の投与前及び／又は投与後に投与されるものである、項1-5に記載の使用。
項1-7．  前記miRNAが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項1-5又は1-6に記載の使用。
項1-8．  前記miRNAが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項1-5〜1-7のいずれかに記載の使用。
項1-9．  hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608よりなる群から選択される少なくとも１種のmiRNAの治療有効量を、癌患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
項1-10．  前記miRNAが、抗癌剤と同時に、或は抗癌剤の投与前及び／又は投与後に投与される、項1-9に記載の癌の治療方法。
項1-11．  前記miRNAが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項1-9又は1-10に記載の癌の治療方法。
項1-12．  前記miRNAが、炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項1-9〜1-11のいずれかに記載の癌の治療方法。
項2-1．  hsa-miR-136-5pを有効成分とする、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤。
項2-2．  前記hsa-miR-136-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項2-1に記載の治療剤。
項2-3．  前記hsa-miR-136-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項2-1又は2-2に記載の治療剤。
項2-4．  hsa-miR-136-5pの、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤の製造のための使用。
項2-5．  前記hsa-miR-136-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項2-4に記載の使用。
項2-6．  前記hsa-miR-136-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項2-4又は2-5に記載の使用。
項2-7．  hsa-miR-136-5pの治療有効量を、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
項2-8．  前記hsa-miR-136-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項2-7に記載の治療方法。
項2-9．  前記hsa-miR-136-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項2-7又は2-8に記載の治療方法。
項3-1．  hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pを有効成分とする、癌の治療剤。
項3-2．  前記hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項3-1に記載の治療剤。
項3-3．  前記hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項3-1又は3-2に記載の治療剤。
項3-4．  hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pの、癌の治療剤の製造のための使用。
項3-5．  前記hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項3-4に記載の使用。
項3-6．  前記hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項3-4又は3-5に記載の使用。
項3-7．  hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pの治療有効量を、癌患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
項3-8．  前記hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項3-7に記載の治療方法。
項3-9．  前記hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項3-7又は3-8に記載の治療方法。
項4-1．  hsa-miR-378gを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤。
項4-2．  前記hsa-miR-378gが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項4-1に記載の治療剤。
項4-3．  前記hsa-miR-378gが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項4-1又は4-2に記載の治療剤。
項4-4．  hsa-miR-378gの、食道癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤の製造のための使用。
項4-5．  前記hsa-miR-378gが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項4-4に記載の使用。
項4-6．  前記hsa-miR-378gが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項4-4又は4-5に記載の使用。
項4-7．  hsa-miR-378gの治療有効量を、食道癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、又は口腔癌の患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
項4-8．  前記hsa-miR-378gが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項4-7に記載の治療方法。
項4-9．  前記hsa-miR-378gが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項4-7又は4-8に記載の治療方法。
項5-1．  hsa-miR-181a-5pを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤。
項5-2．  前記hsa-miR-181a-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項5-1に記載の治療剤。
項5-3．  前記hsa-miR-181a-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項5-1又は5-2に記載の治療剤。
項5-4．  hsa-miR-181a-5pの、食道癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤の製造のための使用。
項5-5．  前記hsa-miR-181a-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項5-4に記載の使用。
項5-6．  前記hsa-miR-181a-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項5-4又は5-5に記載の使用。
項5-7．  hsa-miR-181a-5pの治療有効量を、食道癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、頭頚部癌、又は口腔癌の患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
項5-8．  前記hsa-miR-181a-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項5-7に記載の治療方法。
項5-9．  前記hsa-miR-181a-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項5-7又は5-8に記載の治療方法。
項6-1．  hsa-miR-362-5pを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤。
項6-2．  前記hsa-miR-362-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項6-1に記載の治療剤。
項6-3．  前記hsa-miR-362-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項6-1又は6-2に記載の治療剤。
項6-4．  hsa-miR-362-5pの、食道癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤の製造のための使用。
項6-5．  前記hsa-miR-362-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項6-4に記載の使用。
項6-6．  前記hsa-miR-362-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項6-4又は6-5に記載の使用。
項6-7．  hsa-miR-362-5pの治療有効量を、食道癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
項6-8．  前記hsa-miR-362-5pが、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項6-7に記載の治療方法。
項6-9．  前記hsa-miR-362-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項6-7又は6-8に記載の治療方法。
項7-1．  hsa-miR-608を有効成分とする、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、血液癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤。
項7-2．  前記hsa-miR-608が、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項7-1に記載の治療剤。
項7-7．  前記hsa-miR-608が炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項7-1又は7-2に記載の治療剤。
項7-4．  hsa-miR-608の、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、血液癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の治療剤の製造のための使用。
項7-5．  前記hsa-miR-608が、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項7-4に記載の使用。
項7-6．  前記hsa-miR-608が炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項7-4又は7-5に記載の使用。
項7-7．  hsa-miR-608の治療有効量を、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、血液癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌の患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
項7-8．  前記hsa-miR-608が、成熟型miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAである、項7-7に記載の治療方法。
項7-9．  前記hsa-miR-608が炭酸アパタイト粒子に複合化されている、項7-7又は7-8に記載の治療方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、癌幹細胞の増殖抑制や死滅を効果的に導くことが可能であり、癌治療用の核酸医薬として臨床上の有用性が極めて高い。特に、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、非癌幹細胞（癌幹細胞ではない癌細胞）に対して増殖抑制作用を発揮する抗癌剤と併用することによって、癌幹細胞と非癌幹細胞の双方に対する増殖抑制作用を効果的に発揮でき、癌の治療効果を飛躍的に向上させることができる。【００１２】
更に、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、抗腫瘍効果が既に報告されているmiRNAよりも格段に優れた抗腫瘍効果を奏することができるので、単独で使用しても、各種癌の治療剤として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ａは、膵臓癌細胞株Panc-1にODC（ornithine decarboxylase）-degronシステムを導入し、癌幹細胞株（約0.06％）が樹立できたことを、蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す図である。ｂは、癌幹細胞株を濃縮し、濃縮前後で癌幹細胞株を観察した結果を示す図である。ｂにおける上図は濃縮前の細胞集団、下図は濃縮後の細胞集団を観察した結果である。
【図２】癌幹細胞集団（ZsGreen+、樹立した癌幹細胞の集団）及び非癌幹細胞集団（ZsGreen-、ネガティブコントロール）について、癌幹細胞の特性の有無を確認した結果を示す図である。ａにはスフェアー形成能を評価した結果、ｂには抗癌剤耐性を評価した結果、ｃには幹細胞マーカーの発現能を評価した結果、ｄには非対称性分裂能を評価した結果を示す。
【図３】癌幹細胞集団（ZsGreen+）及び非癌幹細胞集団（ZsGreen-）をマウスの皮下にそれぞれ150cells移植し、６週間後に移植部位を観察した結果である。
【図４】癌幹細胞の増殖を効果的に抑制できるmiRNAをスクリーニングした結果を示す図である。
【図５】マウス皮下固形腫瘍モデルにおいてhsa-miR-136-5pの抗腫瘍効果を評価した結果である。ａには腫瘍ボリュームを経時的に測定した結果、ｂには２４日目に摘出した腫瘍を観察した結果、ｃには２４日目に摘出した腫瘍の重量を測定した結果を示す。
【図６】マウス皮下固形腫瘍モデルにおいてhsa-miR-3065-3pの抗腫瘍効果を評価した結果である。ａには腫瘍ボリュームを経時的に測定した結果、ｂには２４日目に摘出した腫瘍を観察した結果を示す。
【図７】マウス皮下固形腫瘍モデルにおいてhsa-miR-181-5pの抗腫瘍効果を評価した結果であり、２４日目に摘出した腫瘍を観察した結果を示す。
【図８】ヒト膵臓癌細胞（Bxpc3株）を用いて、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、及びhsa-miR-181a-5pの増殖抑制効果を評価した結果である。
【図９】ヒト膵臓癌細胞（PSN-1株）を用いて、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、及びhsa-miR-181a-5pの増殖抑制効果を評価した結果である。
【図１０】ヒト膵臓癌細胞ヒト胃癌細胞（AGS株）を用いて、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、及びhsa-miR-181a-5pの増殖抑制効果を評価した結果である。
【図１１】ヒト大腸癌細胞（DLD1株）を用いて、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608の増殖抑制効果を評価した結果である。
【図１２】ヒト食道癌細胞（TE11株）を用いて、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、及びhsa-miR-181a-5pの増殖抑制効果を評価した結果である。
【図１３】hsa-miR-3065-3pを使用して、ヒト大腸癌細胞（HT29株、HCT116株、及びDLD1株）の増殖アッセイを行った結果である。
【図１４】hsa-miR-3065-3pを使用して、ヒト大腸癌細胞（DLD1株及びHT29株）のコロニー形成アッセイを行った結果である。
【図１５】hsa-miR-3065-3pを使用して、ヒト大腸癌細胞（DLD1株）の浸潤アッセイを行った結果である。
【図１６】hsa-miR-3065-3p及びオキサリプラチンを使用して、ヒト大腸癌細胞（HT29株）に対する薬剤感受性を評価した結果である。
【図１７】hsa-miR-3065-3p及びヒト大腸癌細胞を用いて、創傷治癒アッセイを行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．癌幹細胞の増殖抑制剤
本発明の一態様は、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608よりなる群から選択される少なくとも１種のmiRNAを有効成分とする、癌幹細胞の増殖抑制剤である。以下、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤について説明する。
【００１５】
（有効成分）
hsa-miR-136-5pは、ヒト由来のmiR-136-5pであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、配列番号１に示す塩基配列である。
【００１６】
hsa-miR-3065-3pは、ヒト由来のmiR-3065-3pであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、配列番号２に示す塩基配列である。
【００１７】
hsa-miR-4727-5pは、ヒト由来のmiR-4727-5pであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、配列番号３に示す塩基配列である。
【００１８】
hsa-miR-378gは、ヒト由来のmiR-378gであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、配列番号４に示す塩基配列である。
【００１９】
hsa-miR-181a-5pは、ヒト由来のmiR-181a-5pであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、配列番号５に示す塩基配列である。
【００２０】
hsa-miR-362-5pは、ヒト由来のmiR-362-5pであり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、配列番号６に示す塩基配列である。
【００２１】
hsa-miR-608は、ヒト由来のmiR-608であり、その塩基配列は、成熟型miRNA(mature-miRNA)であれば、配列番号７に示す塩基配列である。
【００２２】
本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、有効成分として、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608の中から１種のmiRNAを選んで単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００２３】
また、有効成分として使用される各miRNAは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、前記各miRNAは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体miRNAやpre-miRNAの塩基配列については、所望の塩基配列からなるポリヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００２４】
有効成分として使用される各miRNAは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００２５】
（用途）
本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、癌幹細胞の増殖を効果的に抑制できるので、各種癌の治療に使用することができる。
【００２６】
本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤の適用対象となる癌種については、特に制限されないが、例えば、例えば、食道癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、脳腫瘍、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。これらの癌種の中でも、好ましくは固形癌、更に好ましくは膵臓癌、胃癌、食道癌、及び大腸癌が挙げられる。
【００２７】
また、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、他の化学療法で治療効果が認められなかった癌に使用することにより、癌幹細胞の増殖を抑制して癌を効果的に治療することもできる。
【００２８】
また、癌幹細胞だけでなく、非癌幹細胞（癌幹細胞ではない癌細胞）の増殖を抑制することによって、癌の治療効果を飛躍的に高めることができるので、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤の好適な使用態様として、他の抗癌剤と併用投与が挙げられる。本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤と併用される抗癌剤の種類については、特に制限されないが、例えば、代謝拮抗剤、白金製剤、アルキル化薬、微小管作用薬、抗癌性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤等が挙げられる。代謝拮抗剤としては、具体的には、5-フルオロウラシル、メソトレキセート、ドキシフルリジン、テガフール、シタラビン、ゲムシタビン等が挙げられる。白金製剤としては、具体的には、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン等が挙げられる。アルキル化薬としては、具体的には、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、塩酸ニムスチン等が挙げられる。微小管作用薬としては、具体的には、ドセタキセル、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン等が挙げられる。抗癌性抗生物質としては、具体的には、塩酸ドキソルビシン、マイトマイシン、塩酸アムルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン等が挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、具体的には、イリノテカン、塩酸ノギテカン等が挙げられる。
【００２９】
発明の癌幹細胞の増殖抑制剤を他の抗癌剤と併用投与する場合、発明の癌幹細胞の増殖抑制剤と他の抗癌剤とを同時に投与してもよく、また、発明の癌幹細胞の増殖抑制剤と他の抗癌剤とを任意の順で個別に投与してもよい。発明の癌幹細胞の増殖抑制剤と他の抗癌剤とを任意の順で個別に投与する場合であれば、例えば、発明の癌幹細胞の増殖抑制剤を投与してから3時間程度以内後に、又は1〜14日程度後（特に3-14日程度後）に抗癌剤を投与してもよく、また抗癌剤を投与してから3時間程度以内後に、又は1〜14日程度後（特に3-14日程度後）に発明の癌幹細胞の増殖抑制剤を投与してもよい。発明の癌幹細胞の増殖抑制剤と他の抗癌剤の投与回数は、患者の状態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、それぞれ１回ずつ投与してもよく、また、発明の癌幹細胞の増殖抑制剤と他の抗癌剤のいずれか一方又は双方を２回以上投与してもよい。
【００３０】
（投与方法）
本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤の投与方法としては、前記miRNAを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００３１】
本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤の投与量については、適用対象となる癌幹細胞の種類、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、前記miRNAの成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【００３２】
本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は、前記miRNAが癌幹細胞内に送達されて機能発現することにより、癌幹細胞の増殖抑制効果を奏するので、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤は前記miRNAが癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤の好適な一態様としては、前記miRNAが炭酸アパタイト粒子との混合状態、又は前記miRNAが炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。前記miRNAの導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子については、「８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）」の欄にて説明する。
【００３３】
２．hsa-miR-136-5pを使用した癌治療剤
本発明の一態様は、hsa-miR-136-5pを有効成分とする、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌（白血病、悪性リンパ腫等）の治療剤（以下、「癌治療剤Ａ」と表記することがある）である。以下、癌治療剤Ａについて説明する。
【００３４】
（有効成分）
癌治療剤Ａにおいて有効成分として使用されるhsa-miR-136-5pは、ヒト由来のmiR-136-5pであり、その塩基配列は、前述する通りである。
【００３５】
hsa-miR-136-5pは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、miRNA136-5pは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体hsa-miR-136-5pやpre-hsa-miR-136-5pの塩基配列については、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００３６】
hsa-miR-136-5pは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００３７】
（適用対象）
癌治療剤Ａの適用対象となる癌種は、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌（白血病、悪性リンパ腫等）である。癌治療剤Ａは、これらの癌組織の癌幹細胞の増殖を抑制でき、これらの癌を効果的に治療することができる。
【００３８】
癌治療剤Ａの治療対象となる癌の中でも、好ましくは胃癌、膵臓癌、食道癌、及び大腸癌が挙げられる。
【００３９】
（投与方法）
癌治療剤Ａの投与方法としては、癌治療剤Ａを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００４０】
癌治療剤Ａの投与量については、癌種、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、hsa-miR-136-5pの成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【００４１】
癌治療剤Ａは、hsa-miR-136-5pが前記癌の細胞内（特に癌幹細胞内）に送達されて機能発現することにより、癌治療効果を奏するので、癌治療剤Ａはhsa-miR-136-5pが癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、癌治療剤Ａの好適な一態様としては、hsa-miR-136-5pが炭酸アパタイト粒子との混合状態、又はhsa-miR-136-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。hsa-miR-136-5pの導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子については、「８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）」の欄にて説明する。
【００４２】
３．hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pを使用した癌治療剤
本発明の一態様は、hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pを有効成分とする癌の治療剤（以下、「癌治療剤Ｂ」と表記することがある）である。以下、癌治療剤Ｂについて説明する。
【００４３】
（有効成分）
癌治療剤Ｂにおいて有効成分として使用されるhsa-miR-3065-3pは、ヒト由来のmiR-3065-3pであり、その塩基配列は、前述する通りである。また、癌治療剤Ｂにおいて有効成分として使用されるhsa-miR-4727-5pは、ヒト由来のmiR-4727-5pであり、その塩基配列は、前述する通りである。癌治療剤Ｂでは、有効成分として、hsa-miR-3065-3p又はhsa-miR-4727-5pのいずれか一方を単独で使用してもよく、またこれらを組み合わせて使用してもよい。
【００４４】
癌治療剤Ｂに使用されるmiRNAは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、癌治療剤Ｂに使用されるmiRNAは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体miRNAやpre-miRNAの塩基配列については、所望の成熟型miRNAを生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００４５】
癌治療剤Ｂに使用されるmiRNAは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００４６】
（適用対象）
癌治療剤Ｂの治療対象となる癌種については、化学療法の対象となる癌であることを限度として特に制限されないが、例えば、食道癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、腎臓癌、脳腫瘍、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、皮膚癌、子宮体癌、甲状腺癌等の固形癌；白血病、悪性リンパ腫等の血液癌が挙げられる。癌治療剤Ｂは、癌組織の癌幹細胞の増殖を抑制でき、これらの癌を効果的に治療することができる。
【００４７】
癌治療剤Ｂの治療対象となる癌の中でも、好ましくは固形癌、更に好ましくは胃癌、膵臓癌、大腸癌、及び食道癌が挙げられる。
【００４８】
（投与方法）
癌治療剤Ｂの投与方法としては、hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００４９】
癌治療剤Ｂの投与量については、癌種、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pのmiRNAの成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【００５０】
癌治療剤Ｂは、hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが前記癌の細胞内（特に癌幹細胞内）に送達されて機能発現することにより、癌治療効果を奏するので、癌治療剤Ｂはhsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、癌治療剤Ｂの好適な一態様としては、hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが炭酸アパタイト粒子との混合状態、或はhsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。hsa-miR-3065-3p及び／又はhsa-miR-4727-5pの導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子については、「８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）」の欄にて説明する。
【００５１】
４．hsa-miR-378gを使用した癌治療剤
本発明の一態様は、hsa-miR-378gを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤（以下、「癌治療剤Ｃ」と表記することがある）である。以下、癌治療剤Ｃについて説明する。
【００５２】
（有効成分）
癌治療剤Ｃにおいて有効成分として使用されるhsa-miR-378gは、ヒト由来のmiR-378gであり、その塩基配列は、前述する通りである。
【００５３】
hsa-miR-378gは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、miRNA378gは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体hsa-miR-378gやpre-hsa-miR-378gの塩基配列については、配列番号４に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００５４】
hsa-miR-378は、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００５５】
（適用対象）
癌治療剤Ｃの適用対象となる癌種は、食道癌、膵臓癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、又は口腔癌である。癌治療剤Ｃは、これらの癌組織の癌幹細胞の増殖を抑制でき、これらの癌を効果的に治療することができる。
【００５６】
癌治療剤Ｃの治療対象となる癌の中でも、好ましくは膵臓癌、及び食道癌が挙げられる。
【００５７】
（投与方法）
癌治療剤Ｃの投与方法としては、癌治療剤Ｃを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００５８】
癌治療剤Ｃの投与量については、癌種、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、hsa-miR-378gの成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【００５９】
癌治療剤Ｃは、hsa-miR-378gが前記癌の細胞内（特に癌幹細胞内）に送達されて機能発現することにより、癌治療効果を奏するので、癌治療剤Ｃはhsa-miR-378gが癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、癌治療剤Ｃの好適な一態様としては、hsa-miR-378gが炭酸アパタイト粒子との混合状態、又はhsa-miR-378gが炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。hsa-miR-378gの導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子については、「８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）」の欄にて説明する。
【００６０】
５．hsa-miR-181a-5pを使用した癌治療剤
本発明の一態様は、hsa-miR-181a-5pを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、頭頚部癌、又は口腔癌の治療剤（以下、「癌治療剤Ｄ」と表記することがある）である。以下、癌治療剤Ｄについて説明する。
【００６１】
（有効成分）
癌治療剤Ｄにおいて有効成分として使用されるhsa-miR-181a-5pは、ヒト由来のmiR-181a-5pであり、その塩基配列は、前述する通りである。
【００６２】
hsa-miR-181a-5pは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、hsa-miR-181a-5pは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体hsa-miR-181a-5pやpre-hsa-miR-181a-5pの塩基配列については、配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００６３】
hsa-miR-181a-5pは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００６４】
（適用対象）
癌治療剤Ｄの適用対象となる癌種は、食道癌、膵臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌、頭頚部癌、又は口腔癌である。癌治療剤Ｄは、これらの癌組織の癌幹細胞の増殖を抑制でき、これらの癌を効果的に治療することができる。
【００６５】
癌治療剤Ｄの治療対象となる癌の中でも、好ましくは膵臓癌、胃癌、大腸癌、及び食道癌が挙げられる。
【００６６】
（投与方法）
癌治療剤Ｄの投与方法としては、癌治療剤Ｄを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００６７】
癌治療剤Ｄの投与量については、癌種、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、hsa-miR-181a-5pの成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【００６８】
癌治療剤Ｄは、hsa-miR-181a-5pが前記癌の細胞内（特に癌幹細胞内）に送達されて機能発現することにより、癌治療効果を奏するので、癌治療剤Ｄはhsa-miR-181a-5pが癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、癌治療剤Ｄの好適な一態様としては、hsa-miR-181a-5pが炭酸アパタイト粒子との混合状態、又はhsa-miR-181a-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。hsa-miR-181a-5pの導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子については、「８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）」の欄にて説明する。
【００６９】
６．hsa-miR-362-5pを使用した癌治療剤
本発明の一態様は、hsa-miR-362-5pを有効成分とする、食道癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌（白血病、悪性リンパ腫等）の治療剤（以下、「癌治療剤Ｅ」と表記することがある）である。以下、癌治療剤Ｅについて説明する。
【００７０】
（有効成分）
癌治療剤Ｅにおいて有効成分として使用されるhsa-miR-362-5pは、ヒト由来のmiR-362-5pであり、その塩基配列は、前述する通りである。
【００７１】
hsa-miR-362-5pは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、hsa-miR-362-5pは、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体hsa-miR-362-5pやpre-hsa-miR-362-5pの塩基配列については、配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００７２】
hsa-miR-362-5pは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００７３】
（適用対象）
癌治療剤Ｅの適用対象となる癌種は、食道癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、胃癌、肝臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌（白血病、悪性リンパ腫等）である。癌治療剤Ｅは、これらの癌組織の癌幹細胞の増殖を抑制でき、これらの癌を効果的に治療することができる。
【００７４】
癌治療剤Ｅの治療対象となる癌の中でも、好ましくは食道癌、膵臓癌、大腸癌、胃癌、及び肝臓癌が挙げられる。
【００７５】
（投与方法）
癌治療剤Ｅの投与方法としては、癌治療剤Ｅを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００７６】
癌治療剤Ｅの投与量については、癌種、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、hsa-miR-362-5pの成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【００７７】
癌治療剤Ｅは、hsa-miR-362-5pが前記癌の細胞内（特に癌幹細胞内）に送達されて機能発現することにより、癌治療効果を奏するので、癌治療剤Ｅはhsa-miR-362-5pが癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、癌治療剤Ｅの好適な一態様としては、hsa-miR-362-5pが炭酸アパタイト粒子との混合状態、又はhsa-miR-362-5pが炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。hsa-miR-362-5pの導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子については、「８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）」の欄にて説明する。
【００７８】
７．hsa-miR-608を使用した癌治療剤
本発明の一態様は、hsa-miR-608を有効成分とする、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、血液癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌（白血病、悪性リンパ腫等）の治療剤（以下、「癌治療剤Ｆ」と表記することがある）である。以下、癌治療剤Ｆについて説明する。
【００７９】
（有効成分）
癌治療剤Ｆにおいて有効成分として使用されるhsa-miR-608は、ヒト由来のmiR-608であり、その塩基配列は、前述する通りである。
【００８０】
hsa-miR-608は、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miRNAになる。また、hsa-miR-608は、相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖の前駆体は、癌細胞内で二本鎖が解けて成熟型miRNAを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体hsa-miR-608やpre-hsa-miR-608の塩基配列については、配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを成熟型miRNAとして生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００８１】
hsa-miR-608は、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００８２】
（適用対象）
癌治療剤Ｆの適用対象となる癌種は、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、肺癌、血液癌、前立腺癌、子宮頚癌、甲状腺癌、腎臓癌、頭頚部癌、口腔癌、又は血液癌（白血病、悪性リンパ腫等）である。癌治療剤Ｆは、これらの癌組織の癌幹細胞の増殖を抑制でき、これらの癌を効果的に治療することができる。
【００８３】
癌治療剤Ｆの治療対象となる癌の中でも、好ましくは食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌、及び肺癌が挙げられる。
【００８４】
（投与方法）
癌治療剤Ｆの投与方法としては、癌治療剤Ｆを生体内で前記癌の組織又は細胞に送達できることを限度として特に制限されないが、例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは動静脈内投与が挙げられる。
【００８５】
癌治療剤Ｆの投与量については、癌種、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、hsa-miR-608の成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【００８６】
癌治療剤Ｆは、hsa-miR-608が前記癌の細胞内（特に癌幹細胞内）に送達されて機能発現することにより、癌治療効果を奏するので、癌治療剤Ｆはhsa-miR-608が癌細胞内に送達され易いように、miRNA導入剤と共に製剤化されていることが望ましい。このようなmiRNA導入剤としては、特に制限されず、炭酸アパタイト粒子、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、RNAiフェクト等のいずれであってもよい。これらのmiRNA導入剤の中でも、炭酸アパタイト粒子は、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うことができるので、癌治療剤Ｆの好適な一態様としては、hsa-miR-608が炭酸アパタイト粒子との混合状態、又はhsa-miR-608が炭酸アパタイト粒子に複合化されてなる複合粒子の状態で存在するものが挙げられる。hsa-miR-608の導入剤として使用される炭酸アパタイト粒子については、「８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）」の欄にて説明する。
【００８７】
８．好適なmiRNA導入剤（炭酸アパタイト粒子）
以下、本発明の癌幹細胞の増殖抑制剤及び癌治療剤Ａ〜Ｆにおいて、miRNA導入剤として好適に使用される炭酸アパタイト粒子について説明する。
【００８８】
（炭酸アパタイト粒子）
炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）の水酸基の一部をCO3で置換した構造を有し、一般式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYnで表される化合物である。ここで、Xは、炭酸アパタイトにおけるCaを部分的に置換し得る元素であり、例えば、Sr、Mn、希土類元素等が挙げられる。mは、通常0以上1以下の正数であり、好ましくは0以上0.1以下であり、より好ましくは0以上0.01以下であり、更に好ましくは0以上0.001以下である。Yは、炭酸アパタイトにおけるCO3を部分的に置換しうる基又は元素であり、OH、F、Cl等が挙げられる。nは、通常0以上0.1以下の正数であり、好ましくは0以上0.01以下であり、より好ましくは0以上0.001以下であり、更に好ましくは0以上0.0001以下である。
【００８９】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径については、生体内に投与されて、癌細胞内へ移行できる程度の大きさである限り、特に制限されないが、生体内で癌細胞に集積させて癌細胞内への移行を効率的に行うという観点から、通常50nm以下、好ましくは1〜40nm、更に好ましくは1〜20nm、より好ましくは5〜10nmが挙げられる。
【００９０】
なお、前記の炭酸アパタイトの平均粒子径は、走査型プローブ顕微鏡を用いて観察することにより測定される値である。走査型プローブ顕微鏡による粒子径の測定に際して、測定部位をＣＣＤカメラで確認し、明らかに走査型プローブ顕微鏡を用いた測定に適さない巨大な粒子（例えば、粒径5μｍ以上）が存在する場合は、それらは測定対象範囲から除去される。また、本明細書において、粒径とは、走査型プローブ顕微鏡で測定した際に、別個の粒子として認識可能な独立した粒子の粒径を意味する。よって、複数の粒子が凝集している場合は、それらの集合体を一つの粒子と判断する。
【００９１】
炭酸アパタイト粒子は、公知の手法に従って得ることができる。例えば、水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを共存させることによって調製することにより得ることができる。水溶液中の各イオン濃度は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されず、下記を参考に適宜設定することができる。
【００９２】
水溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００９３】
水溶液中のリン酸イオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００９４】
水溶液中の炭酸水素イオン濃度は、通常1.0〜10000mM、好ましくは5〜1000mM、更に好ましくは10〜100mMが挙げられる。
【００９５】
カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンの供給源としては、水溶液中にこれらのイオンを供給可能である限り特に制限されないが、例えば、これらのイオンの水溶性塩が挙げられる。具体的には、カルシウムイオン源としてＣａＣｌ2を用いることができ、リン酸イオン源としてＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを用いることができ、炭酸イオン源としてＮａＨＣＯ3を用いることができる。
【００９６】
炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り、上述する各イオン供給源及び他の物質以外の成分を含んでも良い。例えば、水溶液中に上記組成物中に、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ等を添加することにより、炭酸アパタイトにおけるＣａまたはＣＯ3を部分的に置換してもよい。但し、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎの添加量は、形成される複合体粒子のｐＨ溶解性、粒径範囲に著しい影響を与えない範囲内とすることが好ましい。また、炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、基剤として水を使用すればよいが、細胞培養用の各種培地やバッファー等を使用してもよい。
【００９７】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の調製において、水溶液中への各イオン供給源及び他の物質の混合順序は特に限定されず、目的とする炭酸アパタイト粒子が得られる限り、いかなる混合順序で水溶液を調製してもよい。例えば、カルシウムイオン及び他の物質を含有する第１の溶液を調製すると共に、別途、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する第２の溶液を調製し、第１の溶液と第２の溶液とを混合して水溶液を調製することができる。
【００９８】
炭酸アパタイト粒子は、上記の各イオンを含有する水溶液のｐＨを6.0〜9.0の範囲に調整し、一定時間放置（インキュベート）することによって得ることができる。炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のｐＨとしては、例えば7.0〜8.5、好ましくは7.1〜8.5、更に好ましくは7.2〜8.5、より更に好ましくは7.3〜8.5、特に好ましくは7.4〜8.5、最も好ましくは7.5〜8.0が挙げられる。
【００９９】
炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液の温度条件は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常10℃以上であり、好ましくは25〜80℃、更に好ましくは37〜70℃以上が挙げられる。
【０１００】
炭酸アパタイト粒子を形成するための当該水溶液のインキュベート時間は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常1分〜24時間、好ましくは10分〜1時間が挙げられる。粒子形成の有無は、例えば、顕微鏡下で観察することによって確認することができる。
【０１０１】
また、炭酸アパタイト粒子の平均粒径を50nm以下に制御する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記の水溶液中で形成した炭酸アパタイト粒子を超音波振動処理する方法が挙げられる。ここで、超音波振動処理とは、いわゆる菌体破砕等に用いられる超音波破砕機やホモジナイザー等の超音波振動子を直接試料に接触させて超音波をかける処理ではなく、一般に精密機器や試験管等の洗浄に用いられる超音波振動子と洗浄槽とが一体となった超音波洗浄器を用いた処理である。超音波洗浄器の洗浄槽（水槽）に液体（例えば、水）を入れ、そこに炭酸アパタイト粒子を収容した容器（例えば、プラスチック製のチューブ）を浮かべ、精密機器を洗浄する要領で液体を介して炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に超音波をかける処理を意味する。これによって、簡便且つ効率的に炭酸アパタイト粒子の粒径を50nm以下に微細化することができる。
【０１０２】
超音波振動処理に使用可能な装置は、上記超音波洗浄器のように、水などの溶媒を介して間接的に炭酸アパタイト粒子を収容した容器に超音波振動を与えることが可能であるものであれば特に制限されない。汎用性及び取り扱い性の良さという観点から、超音波振動子及び恒温槽を備えた超音波洗浄器を用いることが好ましい。
【０１０３】
上記の超音波振動処理の条件は、粒子径を所定範囲に制御可能である限り特に制限されない。例えば、水槽の温度としては、5〜45℃の温度から適宜選択することができ、好ましくは10〜35℃、更に好ましくは20〜30℃が挙げられる。超音波振動処理の高周波出力としては、例えば、10〜500Ｗの範囲で適宜設定することができ、好ましくは20〜400Ｗ、更に好ましくは30〜300Ｗであり、より好ましくは40〜100Ｗが挙げられる。発振周波数としては、通常10〜60Ｈｚ、好ましくは20〜50Ｈｚ、更に好ましくは30〜40Ｈｚである。また、超音波振動処理時間としては、例えば、30秒〜30分、好ましくは1〜20分、更に好ましくは3〜10分が挙げられる。
【０１０４】
超音波振動処理を行う際に用いる、炭酸アパタイト粒子を包含する容器の種類は、粒子を所定の粒子径範囲に微細化することが可能である限り制限されず、水溶液の容量や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、1〜1000ml容量のプラスチック製チューブを用いることができる。
【０１０５】
また、超音波振動処理は、アルブミンの存在下（即ち、アルブミンを、炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に添加した状態）で行うことが好ましい。これは、アルブミンと炭酸アパタイト粒子とが共存する環境で超音波振動処理を行うことにより、より微細な粒径を有する炭酸アパタイトナノ粒子が得られ、粒子の再凝集を抑制することも可能となるためである。炭酸アパタイト粒子を含む水溶液中でのアルブミンの濃度としては、微細化及び／又は再凝集抑制の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、0.1〜500mg/ml、好ましくは1〜100mg/ml、更に好ましくは1〜10mg/ml程度添加することができる。
【０１０６】
（前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合粒子）
本発明の癌治療剤Ａ〜Ｆ及び癌幹細胞の増殖抑制剤の好適な一態様では、前記miRNAと炭酸アパタイト粒子が複合化した複合粒子が使用される。このように前記miRNAを炭酸アパタイト粒子に複合化させることによって、炭酸アパタイトの作用によって生体内前記miRNAを癌細胞に効率的に集積させて、癌細胞内に前記miRNAを導入させることが可能になる。また、細胞内に導入された後に、細胞内で前記miRNAが炭酸アパタイト粒子から遊離できるので、前記miRNAによる抗腫瘍効果を効率的に発揮させることも可能になる。
【０１０７】
本発明において、前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合粒子とは、前記miRNAが炭酸アパタイト粒子に対してイオン結合、水素結合等によって吸着して担持された状態を指す。前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成方法については、特に制限されないが、例えば、前記miRNAと炭酸アパタイト粒子を水溶液中で共存させることにより形成する方法；炭酸アパタイト粒子を調製する水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンと共に、前記miRNAを共存させることにより、炭酸アパタイト粒子の形成と前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う方法等が挙げられる。
【０１０８】
前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成を、炭酸アパタイト粒子の形成と前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う場合、炭酸アパタイトの調製に使用される水溶液中に前記miRNAを、例えば0.1〜1000nM、好ましくは0.5〜500nM、更に好ましくは1〜200nMとなるように添加すればよい。
【０１０９】
前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合粒子において、前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の比率については特に制限されず、前記miRNAの投与量等に応じて適宜設定すればよい。例えば、2mgの前記miRNAを炭酸アパタイト粒子に複合化させる場合、前述する炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液2.5Lに、5mgの前記miRNAを添加して、炭酸アパタイト粒子の形成と前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行えばよい。
【０１１０】
また、本発明において、炭酸アパタイト粒子と複合化させた前記miRNAを使用する場合、生体への投与に適した溶媒中に分散した状態で使用される。前述するように、炭酸アパタイト粒子は、各種のイオン供給源となる物質を水、培地、又はバッファー等の溶媒に溶解させることによって得られるが、そのようにして得られる炭酸アパタイト粒子分散溶液は、浸透圧、緩衝能、無菌性等の観点から必ずしも生体への投与（血管内投与）に適していない。よって、炭酸アパタイト粒子が分散した溶媒を生体への投与に適した溶媒（例えば、生理食塩水等）に置換するためには、通常、遠沈によって炭酸アパタイト粒子を溶媒から分離し、回収して溶媒を置き換える操作が必要である。しかしながら、このような操作を行うと炭酸アパタイト粒子同士が凝集し、粒子が巨大化するため、却って生体への投与には適さない状態へと変化してしまう。そこで、凝集した炭酸アパタイト粒子を生体への投与に適した溶媒に添加した上で、前述する超音波振動処理を行うことにより、前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合粒子が、生体への投与に適した溶媒中で適度な粒子径（好ましくは平均粒径が50nm以下）で分散させることができる。
【０１１１】
また、本発明の癌治療剤Ａ〜Ｆ及び癌幹細胞の増殖抑制剤において、炭酸アパタイト粒子と複合化させた前記miRNAを使用する場合、本発明の癌治療剤Ａ〜Ｆ及び癌幹細胞の増殖抑制剤の投与は前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合粒子を超音波振動処理によって微小な粒子の状態で分散させた後に、当該粒子が凝集する前に速やかに行うことが望ましい。例えば、超音波振動処理後１分以内、好ましくは３０秒以内の投与が好適である。但し、前述するように、アルブミンを添加することによって炭酸アパタイト粒子の凝集を抑制する場合は、超音波振動処理後、数分〜数十分経過後に投与することも可能である。
【実施例】
【０１１２】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。【０１１３】
試験例１：核酸（miRNA）のスクリーニング
１．試験材料
１−１．癌幹細胞の調製
１−１−１．癌幹細胞の樹立
膵臓癌細胞株（Panc-1）に対して、癌幹細胞の性質である低代謝を可視化するODC (Ornithine Decarboxylase)-Degronシステムを、レトロウイルスベクターにて形質導入を行って癌幹細胞株を樹立した（図１a）。使用したODC-Degronをコードしている延期配列は、配列番号１０に示す通りである。通常、癌幹細胞は26sプロテアソーム低代謝性であるため、導入した蛍光標識したOrnithine Decarboxylase Degronを分解できず、蛍光タンパクが貯まり、可視化が可能となる。【０１１４】
但し、膵臓癌細胞株Panc-1にODC-degronシステムを導入しても、蛍光（緑）を発する細胞は全体の約0.06％しか得られなかった。このような少数の癌幹細胞では、薬剤のスクリーニングをはじめとする一連の実験ができないため、更に癌幹細胞を濃縮することにより、蛍光の発色認められる細胞（即ち、癌幹細胞）が、全体の約81.18％を占める癌幹細胞集団を得た（図１b）。得られた癌幹細胞集団をZsGreen+とした。【０１１５】
１−１−２．樹立した癌幹細胞の特性の解析
得られた癌幹細胞集団（ZsGreen+）について、癌幹細胞の特性を確認するために、スフェアーの形成能、抗癌剤耐性、幹細胞マーカーの発現能、及び非対称性分裂能の確認を行った。なお、比較のために、膵臓癌細胞株Panc-1にODC-degronシステムを導入し、蛍光を発しなかった非癌幹細胞集団（ZsGreen-）についても、同様に特性解析を行った。【０１１６】
スフェアーの形成能については、（DMEM）培地に各細胞集団を96-well Ultra Low Cluster Plateを用いて100〜3000 cells/wellとなるように接種し、37℃で培養した後に、２週間に渡り細胞の状態を観察することにより確認した。【０１１７】
抗癌剤耐性については、オキサリプラチン（L-OHP）を2又は5μMとなるように添加した培地（FBSを10容量％含むDMEM培地）に各細胞集団を96穴プレートにて5000〜10000 cells/wellとなるように接種し、37℃で2〜４日間培養した後に、生細胞数を計測し、細胞生存率（Cell viability、%）を求めた。【０１１８】
幹細胞マーカーの発現については、幹細胞マーカーであるBmi1及びCD44v9、並びに癌幹細胞特異的マーカーであるDclk1の発現を（qPCRおよびウエスタンブロッティング）により測定した。なお、Bmi1及びDclk1の発現量についてはハウスキーピング遺伝子（GAPDH）の発現量で補正し、CD44v9の発現量についてはハウスキーピング遺伝子（Actin）の発現量で補正した。【０１１９】
非対称性分裂能については、ibidi 35mm Plateにて培地（FBSを10容量％含むDMEM培地）に各細胞集団を1000〜10000 cells/plateとなるように接種し、37℃で１日間培養した後に、１週間に渡り細胞の状態を継続的に観察することにより確認した。なお、癌幹細胞では、癌幹細胞では、非対称に分裂して異なる性質の娘細胞を産み、遺伝的に不均一な細胞分裂を行う特性がある。【０１２０】
図２に、癌幹細胞集団（ZsGreen+）及び非癌幹細胞集団（ZsGreen-、ネガティブコントロール）について、癌幹細胞の特性の有無を確認した結果を示す。図２において、ａにはスフェアー形成能を評価した結果、ｂには抗癌剤耐性を評価した結果、ｃには幹細胞マーカーの発現能を評価した結果、ｄには非対称性分裂能を評価した結果を示す。この結果、癌幹細胞集団（ZsGreen+）には、スフェアー形成能、抗癌剤耐性、及び対称性分裂能があり、幹細胞マーカーと癌幹細胞特異的マーカーの発現が認められ、癌幹細胞としての特性を有していることが確認された。【０１２１】
１−１−３．樹立した癌幹細胞の造腫瘍能の解析
得られた癌幹細胞集団（ZsGreen+）の造腫瘍能を確認するために、以下の試験を行った。先ず、６〜８週齢のSCID beigeマウス（n=3）に、癌幹細胞集団（ZsGreen+）をそれぞれ150cellsとなるように皮下移植を行なった。６週間後に、細胞を移植した部位を観察し、腫瘍の形成の有無を確認した。また、比較のために、非癌幹細胞集団（ZsGreen-）についても、同様に造腫瘍能の解析を行った。【０１２２】
得られた結果を図３に示す。この結果、癌幹細胞集団（ZsGreen+）は、わずか150 cellsの移植で腫瘍を形成できており、造腫瘍能が高いことが明らかとなった。一方、非癌幹細胞集団（ZsGreen-）では、150 cellsの移植では腫瘍を形成できていなかった。【０１２３】
１−２．候補となるmiRNAの選出
癌幹細胞特異的に発現する遺伝子であるDCLK1に作用し得るmiRNAをin silico解析し、候補となる32個のmiRNAを選出した。更に、非癌幹細胞集団（ZsGreen-）と癌幹細胞集団（ZsGreen+）のnCounter miRNA expression arrayにより、800個のmiRNAの中から35個のmiRNAを選出した。これらの合計67個のmiRNAを後述するスクリーニングに供した。なお、スクリーニングに供したmiRNAはいずれも成熟型miRNAである。【０１２４】
２．スクリーニング方法
癌幹細胞集団（ZsGreen+）を培地（FBSを10容量％含むDMEM培地）に懸濁させた細胞液を、24穴プレートの各wellに5000〜10000 cells/wellとなるように接種して37℃で終夜培養を行った。その後、lipofectamin 2000のプロトコールに従い、各miRNAを10pmol/wellとなるようにトランスフェクションを行い、48時間及び72時間後に細胞数を測定した。また、miRNAを導入しなかった場合（未処置群、コントロール）、選出したmiRNAの代わりにhas-miR-34a（配列番号８）を使用した場合（ポジティブコントロール）、及び選出したmiRNAの代わりにコントロールmiRNA（配列番号９）を使用した場合（NC1、ネガティブコントロール）についても同様の条件で試験を行った。また、比較のために、癌幹細胞集団（ZsGreen+）の代わりに、非癌幹細胞集団（ZsGreen-）を使用して、同様の条件で試験を行った。【０１２５】
miRNAを導入しなかったコントロールの細胞数に対して、各条件での細胞数の割合（細胞生存率：Cell viability、%）を求めた。【０１２６】
３．結果
前記スクリーニングの結果、癌幹細胞の増殖を効果的に抑制できるmiRNAとして、７つのmiRNA（hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608）が見出された。これらの７つのmiRNAの中でも、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608は、癌幹細胞に対する増殖抑制効果が際立っていた。図４に、これらの７つのmiRNAを使用した場合の細胞生存率を示す。一方、従来、固形腫瘍に対する治療効果が最も高いとされるhas-miR-34aでは、癌幹細胞の増殖抑制効果は十分といえるものではなかった（図４）。【０１２７】
また、前記７つのmiRNAは、癌幹細胞の増殖抑制の点では卓越していたが、非癌幹細胞の増殖抑制の程度は、has-miR-34aをやや上回る程度であった。この結果から、前記７つのmiRNAは、他の抗癌剤と併用することによって、癌幹細胞と非癌幹細胞の双方の増殖を効果的に抑制でき、癌に対して卓越した治療効果を奏し得ることが明らかとなった。【０１２８】
試験例２：マウス皮下固形腫瘍モデルにおけるhsa-miR-136-5pの抗腫瘍効果の評価
１．miRNAと炭酸アパタイトの複合粒子の製造
100mlの蒸留水に、0.37gのNaHCO3、90μlのNaH2PO4・2H2O（1M）、及び180μlのCaCl2（1M）をこの順に添加して溶解させ、1NのHClでpHを7.5に調整した。これを直径0.2μmのフィルターでろ過した。得られたバッファー1ml当たりに2μgのmiRNA、4μlのCaCl2（1M）を混合し、37℃の水浴中で30分間インキュベートした。その後、15000rpm×5分で遠沈し、得られたペレットを生理食塩水（0.5重量％アルブミン含有）に分散させ、miRNAを炭酸アパタイト粒子に内包させた複合粒子の分散液を得た。試験に供する直前に、得られた分散液を10分間超音波振動処理にかけた。なお、超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、20℃に設定した水に、プラスチック容器に収容した前記分散液を浮かべ、高周波出力55W、発振周波数38kHzの条件で10分間行った。斯して得られた製剤は、直ちに、後述する試験に使用した。【０１２９】
なお、超音波振動処理の分散液には、miRNAを包含した炭酸アパタイトナノ粒子からなる複合粒子の平均粒径が50nm以下であることが、走査型プローブ顕微鏡を用いた測定において確認されている。また、得られた複合粒子には、炭酸アパタイト1mg当たり約20μg程度のmiRNAが含まれていることも確認できている。【０１３０】
２．マウス皮下固形腫瘍モデル試験
6〜8週齢のＢＡＬＢ／ｃＡヌードマウス（日本クレア社製）の背部左右に、前記試験例１で得られた癌幹細胞集団（ZsGreen+）を5×105 cellsとなるように皮下注射し、固形腫瘍を有するモデルマウスを作製した。腫瘍が約20 mm3の大きさに達した時点でマウスをランダムに、hsa-miR-136-5p投与群（hsa-miR-136-5p）、未処置群、及びネガティブコントロール群（コントロールmiRNA）に分けた。hsa-miR-136-5p投与群では、腫瘍が約20 mm3の大きさに達した時点を０日目として、０日目、３日目、５日目、７日目、１０日、１２日目、１４日目、１７日目、及び１９日目に、hsa-miR-136-5p量換算で40μg/回となるようにhsa-miR-136-5pを包含した炭酸アパタイトナノ粒子を尾静脈より静脈注射した。ネガティブコントロール群では、miRNA136-5p投与群と同様のスケジュール及び用量で、コントロールmiRNA（配列番号９）を包含した炭酸アパタイトナノ粒子を尾静脈より静脈注射した。未処置群では、薬剤の投与を行わなかった。試験期間中、マウス背部の腫瘍ボリューム（長径×短径×短径×1/2）を経時的に測定し、また２４日目にマウスから腫瘍を摘出して大きさを観察し、その重量を測定した。【０１３１】
３．結果
得られた結果を図５に示す。図５において、ａには腫瘍ボリュームを経時的に測定した結果、ｂには２４日目にマウスから摘出した腫瘍を観察した結果、ｃには２４日目にマウスから取り出した腫瘍の重量を測定した結果を示す。この結果から、hsa-miR-136-5p投与群では、未処置群及びネガティブコントロール群（コントロールmiRNA）と比較して、顕著に高い抗腫瘍効果が認められた。特に、７日目以降では、hsa-miR-136-5p投与群は、未処置群及びネガティブコントロール群と比較して腫瘍ボリュームが有意に小さくなっていた（図５ａ）。また、２４日目に摘出した腫瘍は、hsa-miR-136-5p投与群では、未処置群及びネガティブコントロール群と比較して有意に小さかった（図５ｂ及びｃ）。【０１３２】
試験例３：マウス皮下固形腫瘍モデルにおけるhsa-miR-3065-3pの抗腫瘍効果の評価
hsa-miR-136-5pの代わりにhsa-miR-3065-3pを使用したこと以外は、前記試験例２と同様の方法でマウス皮下固形腫瘍モデル試験を行った。【０１３３】
得られた結果を図６に示す。図６において、ａには腫瘍ボリュームを経時的に測定した結果、ｂには２４日目にマウスから摘出した腫瘍を観察した結果を示す。この結果から、hsa-miR-3065-3p投与群では、未処置群及びネガティブコントロール群（コントロールmiRNA）と比較して、１７日目以降で、腫瘍ボリュームが有意に小さくなることが確認された。【０１３４】
試験例４：マウス皮下固形腫瘍モデルにおけるhsa-miR-181-5pの抗腫瘍効果の評価
hsa-miR-136-5pの代わりにhsa-miR-181-5pを使用したこと以外は、前記試験例２と同様の方法でマウス皮下固形腫瘍モデル試験を行った。【０１３５】
２４日目にマウスから摘出した腫瘍を観察した結果を図７に示す。この結果、hsa-miR-181-5p投与群では、未処置群及びネガティブコントロール群（コントロールmiRNA）と比較して、顕著に高い抗腫瘍効果が認められた。【０１３６】
試験例４：ヒト膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果の評価（１）
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、及びhsa-miR-181a-5pについて、ヒト膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価した。具体的な試験方法は以下に示す通りである。【０１３７】
ヒト膵臓癌細胞（Bxpc3株）をD-MEM培地（10容量％FBS含有）に懸濁させた細胞液を、24穴プレートの各wellに3×103 cells/wellとなるように接種して37℃で終夜培養を行った。その後、lipofectamin 2000のプロトコールに従い、各miRNAを10pmol/wellとなるようにトランスフェクションを行い、48時間後に細胞数を測定した。また、miRNAを導入しなかった場合（未処置群）、miRNAの代わりにhsa-miR-34a（配列番号８）を使用した場合（ポジティブコントロール）、及び選出したmiRNAの代わりにコントロールmiRNA（配列番号９）を使用した場合（コントロールmiRNA、ネガティブコントロール）についても同様の条件で試験を行った。【０１３８】
得られた結果を図８に示す。この結果、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、及びhsa-miR-181a-5pは、膵臓癌細胞に対する増殖抑制作用が強く、hsa-miR-34aよりも格段に優れた抗腫瘍効果が認められた。とりわけ、hsa-miR-136-5pには、特に顕著な抗腫瘍効果が認められた。膵臓癌細胞（Bxpc3株）の中には、癌幹細胞が存在しており、前記miRNAは、特に癌幹細胞の増殖を集中的に抑制することによって、膵臓癌細胞全体の増殖抑制をもたらしたと考えられる。【０１３９】
試験例５：ヒト膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果の評価（２）
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、及びhsa-miR-181a-5pについて、ヒト膵臓癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価した。具体的な試験方法は、ヒト膵臓癌細胞としてPSN-1株を使用したこと以外は、前記試験例４と同様である。【０１４０】
得られた結果を図９に示す。この結果からも、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、及びhsa-miR-181a-5pは、膵臓癌細胞に対する増殖抑制作用が強いことが確認された。とりわけ、hsa-miR-136-5pには、特に顕著な抗腫瘍効果が認められた。膵臓癌細胞（PSN-1株）の中には、癌幹細胞が存在しており、前記miRNAは、特に癌幹細胞の増殖を集中的に抑制することによって、膵臓癌細胞全体の増殖抑制をもたらしたと考えられる。【０１４１】
試験例６：ヒト胃癌細胞に対する抗腫瘍効果の評価
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、及びhsa-miR-181a-5pについて、ヒト胃癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価した。具体的な試験方法は、癌細胞としてヒト胃癌細胞（AGS株）を使用したこと以外は、前記試験例４と同様である。【０１４２】
得られた結果を図１０に示す。この結果から、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、及びhsa-miR-181a-5pには、胃癌細胞に対する増殖抑制作用が強く、hsa-miR-34aよりも格段に優れた抗腫瘍効果が認められた。とりわけ、hsa-miR-136-5p及びhsa-miR-181a-5pには、特に顕著な抗腫瘍効果が認められた。胃癌細胞（AGS株）の中には、癌幹細胞が存在しており、前記miRNAは、特に癌幹細胞の増殖を集中的に抑制することによって、胃癌細胞全体の増殖抑制をもたらしたと考えられる。【０１４３】
試験例７：ヒト大腸癌細胞に対する抗腫瘍効果の評価
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608について、ヒト大腸癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価した。具体的な試験方法は、癌細胞としてヒト大腸癌細胞（DLD1株）を使用したこと、及びトランスフェクションから72時間後に細胞数を計測したこと以外は、前記試験例４と同様である。【０１４４】
得られた結果を図１１に示す。この結果から、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608には、大腸癌細胞に対する増殖抑制作用が強く、hsa-miR-34aよりも格段に優れた抗腫瘍効果が認められた。とりわけ、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-362-5p、及びhsa-miR-608には、特に顕著な抗腫瘍効果が認められた。大腸癌細胞（DLD1株）の中には、癌幹細胞が存在しており、前記miRNAは、特に癌幹細胞の増殖を集中的に抑制することによって、大腸癌細胞全体の増殖抑制をもたらしたと考えられる。【０１４５】
試験例８：ヒト食道癌細胞に対する抗腫瘍効果の評価
hsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、及びhsa-miR-181a-5pについて、ヒト食道癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価した。具体的な試験方法は、癌細胞としてヒト食道癌細胞（TE11株）を使用したこと、及びトランスフェクションから72時間後に細胞数を計測したこと以外は、前記試験例４と同様である。【０１４６】
得られた結果を図１２に示す。この結果からhsa-miR-136-5p、hsa-miR-3065-3p、hsa-miR-4727-5p、hsa-miR-378g、及びhsa-miR-181a-5pには、食道癌細胞に対する増殖抑制作用が強く、hsa-miR-34aよりも格段に優れた抗腫瘍効果が認められた。とりわけ、hsa-miR-3065-3p及びhsa-miR-181a-5pには、特に顕著な抗腫瘍効果が認められた。食道癌細胞（TE11株）の中には、癌幹細胞が存在しており、前記miRNAは、特に癌幹細胞の増殖を集中的に抑制することによって、食道癌細胞全体の増殖抑制をもたらしたと考えられる。【０１４７】
試験例９：ヒト大腸癌細胞に対する増殖抑制効果の評価
hsa-miR-3065-3pを用いて、ヒト大腸癌細胞の増殖アッセイを行った。具体的な試験方法は以下に示す通りである。【０１４８】
ヒト大腸癌細胞（HT29株、HCT116株、及びDLD1株）をDMEM培地（10容量％FBS含有）に懸濁させた細胞液を、96穴プレートの各wellに3×103 cells/wellとなるように接種して37℃で終夜培養を行った。その後、lipofectamin RNAiMAX Regent（ウェル中の終濃度0.03μL/ml）とhsa-miR-3065-3p（ウェル中の終濃度50nM）との混合液を添加してトランスフェクションを行った。引き続き96時間培養を行い、経時的に450nmでの吸光度を測定した。また、hsa-miR-3065-3pの代わりにコントロールmiRNA（配列番号９）を使用した場合（コントロールmiRNA、ネガティブコントロール）についても同様の条件で試験を行った。【０１４９】
得られた結果を図１３に示す。図１３には、hsa-miR-3065-3pのトランスフェクションから２４時間培養後の吸光度を１とした相対値を求め、当該吸光度の相対値の経時変化を示す。この結果から、hsa-miR-3065-3pには、ヒト大腸癌細胞に対する増殖抑制効果が高いことが確認された。前記の通り、ヒト大腸癌細胞（HT29株、HCT116株、及びDLD1株）の中には、癌幹細胞が存在しており、hsa-miR-3065-3pは、特に癌幹細胞の増殖を集中的に抑制することによって、本結果をもたらしたと考えられる。【０１５０】
試験例１０：ヒト大腸癌細胞のコロニー形成に対する阻害能の評価
hsa-miR-3065-3pを用いて、ヒト大腸癌細胞のコロニー形成アッセイを行った。具体的な試験方法は以下に示す通りである。【０１５１】
ヒト大腸癌細胞（DLD1株及びHT29株）をRPMI培地（10容量％FBS含有）に懸濁させた細胞液を、6穴プレートの各ウェルに3×105cells/wellとなるように接種して2日間培養を行った。その後、培地をRPMI培地（FBS不含有）に交換し、lipofectamin RNAiMAX Regent（ウェル中の終濃度0.03μL/ml）とhsa-miR-3065-3p（ウェル中の終濃度50nM）との混合液を添加してトランスフェクションを行い、8時間培養を行った。次いで、トランスフェクション後の細胞を回収してRPMI培地（10容量％FBS含有）に懸濁させ、6穴プレートの各wellに500 cells/wellとなるように接種して10日間培養を行った。その後、培養上清を除去し、メタノールで固定した後に、細胞をcrystal violetで染色し、形成されているコロニー数を計測した。また、hsa-miR-3065-3pの代わりにコントロールmiRNA（配列番号９）を使用した場合（コントロールmiRNA、ネガティブコントロール）についても同様の条件で試験を行った。【０１５２】
得られた結果を図１４に示す。この結果、hsa-miR-3065-3pには、ヒト大腸癌細胞のコロニー形成能を阻害する作用があることが確認された。【０１５３】
試験例１１：ヒト大腸癌細胞の遊走に対する阻害能の評価
hsa-miR-3065-3pを用いて、ヒト大腸癌細胞の浸潤アッセイを行った。具体的な試験方法は以下に示す通りである。【０１５４】
浸潤アッセイは、BD Matrigel Invasion Chambers,12 Chambers per 24-Well Plate（BD Biosciences）を用いて行った。先ず、コンパニオンプレートのウェル内にRPMI培地（10容量％FBS含有）650mlを添加した。更に、マトリゲル基底膜を有するセルカルチャーインサート内に、ヒト大腸癌細胞（DLD1株）1×106cells/wellと、lipofectamin RNAiMAX Regent（セルカルチャーインサート中の終濃度2μL/ml）及びhsa-miR-3065-3p（セルカルチャーインサート中の終濃度20pmol/セルカルチャーインサート）の混合液とを添加し、48時間培養を行った。その後、セルカルチャーインサートを取り出し、マトリゲル基底膜の外側に接着している細胞をホルマリンで固定化した後にヘマトキシリンで染色し、マトリゲル基底膜の外側に遊走した細胞数を計測した。また、hsa-miR-3065-3pの代わりにコントロールmiRNA（配列番号９）を使用した場合（コントロールmiRNA、ネガティブコントロール）についても同様の条件で試験を行った。【０１５５】
得られた結果を図１５に示す。この結果、hsa-miR-3065-3pには、ヒト大腸癌細胞の遊走を阻害する作用があることが確認された。【０１５６】
試験例１１：抗癌剤との併用によるヒト大腸癌細胞の薬剤感受性の評価
hsa-miR-3065-3p及びオキサリプラチン（L-OHP）を用いて、ヒト大腸癌細胞の薬剤感受性の評価を行った。具体的な試験方法は以下に示す通りである。【０１５７】
ヒト大腸癌細胞（HT29株）をRPMI培地に懸濁させた細胞液を、6穴プレートの各wellに3×105cells/wellとなるように接種し、更に、lipofectamin RNAiMAX Regent（ウェル中の終濃度0.03μL/well）及びhsa-miR-3065-3p（ウェル中の終濃度50nM）の混合液を添加して、1日間培養を行った。次いで、細胞を回収してRPMI培地に懸濁し、96穴プレートの各wellに3×103cells/wellとなるように接種して2日間培養した。その後、オキサリプラチンを0,2,4,8,16,32,64,128μMとなるように各ウェルに添加し、更に72時間培養した。培養後、各ウェル中の生細胞数をGloMax-Multi Detection System(Promega Corporation)によって測定した。オキサリプラチンを添加しなかった条件での生細胞数を100%として各条件での生細胞数の割合（細胞生存率：Cell viability、%）を求めた。また、hsa-miR-3065-3pの代わりにコントロールmiRNA（配列番号９）を使用した場合（コントロールmiRNA、ネガティブコントロール）、及びmiRNAを添加しなかった場合についても同様の条件で試験を行った。【０１５８】
得られた結果を図１６に示す。この結果、hsa-miR-3065-3pとオキサリプラチンの双方の処理を行った場合には、オキサリプラチンのみの処理、及びコントロールとオキサリプラチンの双方の処理を行った場合に比べて、ヒト大腸癌細胞の生細胞数を有意に減少させることができていた。即ち、本結果から、hsa-miR-3065-3pが癌幹細胞の増殖を効果的に抑制すると共に、オキサリプラチンが癌幹細胞以外の癌細胞の増殖を抑制することによって、トータルの癌細胞数を飛躍的に低減できたと考えられる。【０１５９】
試験例１２：ヒト大腸癌細胞の遊走性の評価
hsa-miR-3065-3p及びヒト大腸癌細胞を用いて、創傷治癒アッセイを行った。具体的な試験方法は以下に示す通りである。【０１６０】
創傷治癒アッセイは、Culture-Insert（NIPPON Genetics Co, Ltd）を用いて行った。24穴プレートの各ウェルに、ヒト大腸癌細胞（DLD1株）をRPMI培地（10容量％FBS含有）に懸濁させた細胞液70μl（4.9×104cells/well）、及び細胞間に幅0.5±0.05mmの一定のギャップを作成できるインサートを入れて、1日間培養し、ウェルの底部に細胞の単一層と、前記ギャップに対応する細胞が存在しない領域（Wound area）を形成した。次いで、インサート及び培養上清を取り除き、各ウェルにDMEM培地（無血清）500μｌを添加し、更にlipofectamin RNAiMAX Regent（ウェル中の終濃度2μL/well）及びhsa-miR-3065-3p（ウェル中の終濃度20pmol/well）の混合液を添加して、1日間培養した。その後、培地をRPMI培地（10容量％FBS含有）に交換して48時間培養を行った。なお、RPMI培地（10容量％FBS含有）を用いた培養は、培養開始から24時間後の時点で新鮮な培地に交換した。RPMI培地（10容量％FBS含有）を用いた培養開始から、0、24及び48時間の時点で、Wound areaの面積を求めた。培養開始から0時間の時点でのWound areaを100％として、培養から24及び48時間の時点でのWound areaの比率を求めた。また、hsa-miR-3065-3pの代わりにコントロールmiRNA（配列番号９）を使用した場合（コントロールmiRNA、ネガティブコントロール）についても同様の条件で試験を行った。【０１６１】
得られた結果を図１７に示す。この結果、hsa-miR-3065-3pで処理したヒト大腸癌細胞では、ネガティブコントロールに比べて、Wound areaの減少を有意に抑制できていた。即ち、本結果から、hsa-miR-3065-3pは、ヒト大腸癌細胞の遊走を抑制する作用があることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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