(57)【要約】  新規アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物を提供する。本願発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
2018164275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１０９５１番目〜第４２９１１０５４番目の塩基の領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
７〜１０４塩基からなる、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の（ａ）および（ｂ）のうちから選択される、請求項１〜３の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（ａ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列に対して、６０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつc.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜３０塩基からなるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは７〜２５塩基からなるロックド核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１〜４の何れか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物であって、
アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬効成分として含み、
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
【請求項７】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１０９５１番目〜第４２９１１０５４番目の塩基の領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６に記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
【請求項８】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜１０４塩基からなる、請求項６または７に記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
【請求項９】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下の（ａ）および（ｂ）から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６〜８の何れか一項に記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
（ａ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列に対して、６０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつc.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜３０塩基からなるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは７〜２５塩基からなるロックド核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項７〜９の何れか一項に記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖原病Ｉａ型は内因性血糖供給経路の最終段階を触媒する酵素「グルコース−６−ホスファターゼ（G6Pase）」の機能低下による先天代謝異常を伴う疾患である。糖原病Ｉａ型の主な治療はデンプン質の頻回食療法であり、アシドーシスに対するクエン酸製剤、高尿酸血症に対する尿酸合成阻害剤等が併用されるが、代謝障害による各種異常所見の是正には遠く及ばず、長期的に病態が進行すると肝癌発生や腎不全に至ることもある。このような肝癌発生例では肝移植、腎不全例には腎移植が選択される（非特許文献１）。【０００３】
日本人糖原病Ｉａ型患者では、その患者の約９割において、該疾患の責任遺伝子であって、G6Paseをコードする遺伝子であるG6PCに、コード領域ＤＮＡの６４８番目の塩基グアニン（Ｇ）がチミン（Ｔ）に置換した共通変異（c.648G>T）を有することが知られている（非特許文献２）。この変異はアミノ酸置換を起こさず、近傍配列が異所性スプライス受容部位となって、異常スプライシングが起こり、その結果９１塩基対短縮した転写産物を生じる（非特許文献３）。近年、スプライシング変異に関し、当該領域の塩基配列に相補的な核酸誘導体「アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）」によって正常な転写を回復させる技術が知られている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chou JY et al., J Inherit Metab Dis 38: 511-519, 2014.
【非特許文献２】Akanuma J et al., Am J Med Genet 91: 107-12, 2000.
【非特許文献３】Kajihara S et al., Am J Hum Genet 57: 549-55, 1995.
【非特許文献４】Havens MA et al., WIREs RNA 4: 247-66, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在までのところ糖原病Ｉａ型に対する特異的な治療薬は存在しない。本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行い、糖原病Ｉａ型患者の細胞において、c.648G>T変異型G6PC遺伝子のプレｍＲＮＡの配列を標的配列とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加をすることにより、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常なスプライシングが抑制され、正常な塩基長を有する遺伝子転写産物が生じることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の何れかの一態様を包含する。
＜１＞  アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜２＞  糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬効成分として含み、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび該アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬効成分として含む、糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物を提供する。本発明は、糖原病Ｉａ型の予防または治療に有効である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】c.648G>Tの変異によって生じるG6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシング領域を示す図である。
【図２】健常コントロール被験者由来（レーン１〜３）およびＧＳＤ−Ｉａの患者由来（レーン４〜６）のネステッドＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図３】ネステッドＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングの結果を示す図である。図３の（ａ）は、レーン１〜３における単一のバンド（３０５ｂｐ）の配列を示している。図３の（ｂ）は、レーン５および６における単一のバンド（２１４ｂｐ）およびレーン４におけるより短い方のバンド（２１４ｂｐ）の配列を示している。図３の（ｃ）は、レーン４におけるより長い方のバンド（３０５ｂｐ）の配列を示している。
【図４】各種ＬＮＡ ＡＳＯ（ＬＮＡ０１〜１３）添加およびＬＮＡ ＡＳＯ無添加（ブランク）サンプルのネステッドＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】ネステッドＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングの結果を示す図である。図５の（ａ）は、ＬＮＡ ＡＳＯ無添加サンプルにおけるネステッドＰＣＲ産物の配列を示している。図５の（ｂ）は、各種ＬＮＡ ＡＳＯ添加サンプルにおけるネステッドＰＣＲ産物のc.648G>T付近の波形を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１０】
〔用語の説明〕
「グルコース−６−ホスファターゼ（G6Pase）」は、糖新生およびグリコーゲン分解の最終ステップにおけるグルコース−６−リン酸（G6P）からグルコースおよびリン酸への加水分解を触媒し、また、グルコース恒常性の維持において重要な酵素タンパク質である。また、「G6PC」は、G6Paseをコードする遺伝子（遺伝子座17q21）である。
【００１１】
「糖原病（glycogen storage diseases、以下ＧＳＤとも称する）」とは、グリコーゲン代謝経路の酵素またはトランスポーターの遺伝子異常によって、グリコーゲンの合成あるいは分解が障害される疾患であり、１１種の病型が知られている。G6PC遺伝子の突然変異により、糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）が引き起こされる。
【００１２】
「糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａとも称する）」とは、最も代表的な糖原病であり、発生率は出生数１００，０００人に約１人である。また、別名としてフォン・ギールケ病としても知られている。ＧＳＤ−Ｉａは、G6Paseの先天的な欠損によって生じる遺伝子疾患である。糖原病Ｉａ型は、責任遺伝子のホモ接合または複合ヘテロ接合の変異により発症する。
【００１３】
ＧＳＤ−Ｉａでは、G6Paseの欠損により、グリコーゲンから、および糖新生から遊離のグルコースを産生する肝臓の能力が損なわれる。肝臓および腎臓におけるグリコーゲンおよび脂肪の蓄積に伴う重度の空腹時低血糖を特徴とする。グリコーゲンおよび糖新生前駆体から産生した過剰量のグルコース−６−リン酸からはグルコースは生じず、解糖系に入り、血中の乳酸、尿酸、コレステロールおよびトリグリセリドの副次的上昇が生じる。応答遺伝子G6PCは、肝臓、腎臓および小腸に発現しているため、グリコーゲンの蓄積によって、これらの組織が慢性的に損傷を受ける。このように、ＧＳＤ−Ｉａに罹患している患者は、グルコース恒常性を維持することができず、反復性低血糖症、慢性的な乳酸アシドーシス、成長障害、肝障害、腎肥大症、高脂血症、高尿酸血症、肝臓肥大、血中のアミノトランスフェラーゼの持続的上昇および糸球体過剰濾過等を示す。さらにこれらの症状によりしばしば肝臓における多発性腺腫、タンパク尿を発症し、最悪の場合、悪性肝腫瘍および慢性腎不全を発症することがある。
【００１４】
本明細書において、「タンパク質」は、「ポリペプチド」とも換言できる。「タンパク質」は、アミノ酸がペプチド結合してなる構造を含むが、さらに、例えば、糖鎖、またはイソプレノイド基等の構造を含んでいてもよい。「タンパク質」は、特に明記しない場合は、天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる、天然に存在するアミノ酸の既知の類似体を含有するポリペプチドを包含する。
【００１５】
本明細書において「核酸」には、任意の単純ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。
【００１６】
本明細書において「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。
【００１７】
本明細書において「オリゴヌクレオチド」は、所定の個数のヌクレオチドが重合してなるヌクレオチドの重合体を意味する。本明細書において「オリゴヌクレオチド」というとき、その長さは限定されないが、「ポリヌクレオチド」の中でも、比較的短いヌクレオチド鎖を有するものを意図している。また、「アンチセンスオリゴヌクレオチド（Antisense Oligonucleotide、ＡＳＯとも称する）」は、標的核酸配列（センス配列に相当）にハイブリダイズして、該標的核酸配列を含む核酸配列によってコードされる標的遺伝子の発現を調節する機能を有するオリゴヌクレオチドの総称である。
【００１８】
本明細書において「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロン等の非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロン等の非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００１９】
「プレｍＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡ前駆体とも称し、エクソンとイントロンの両方を含むＲＮＡを指す。「ｍＲＮＡ」は、イントロンが除去され、エクソン同士が結合されたＲＮＡを指す。このｍＲＮＡからタンパク質が翻訳される。
【００２０】
本明細書において「標的配列」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズする標的核酸配列の部分、すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的にハイブリッド形成する配列をいう。
【００２１】
本明細書において「予防」とは、疾病、疾患または障害に罹患することを防ぐことを指す。また、「治療」とは、すでに罹患している疾病、疾患もしくは障害、またはそれに伴う症状を、緩和または除去することを指す。
【００２２】
本明細書において「健常」であるとは、糖原病Ｉａ型に罹患していないことを指す。また、本明細書で「健常」であるとは、例えばG6Paseの欠損などを有することなどによって、糖原病Ｉａ型に罹患するリスクを有しているが、臨床的症状の発症には至っていない場合も包含している。
【００２３】
〔１．アンチセンスオリゴヌクレオチド〕
近年、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子治療は、特定種類の遺伝的欠陥を修正するための有効な選択的手法として確立されつつある。ｍＲＮＡの異常スプライシングはＡＳＯ療法の有効な標的となり得る[参考文献1]。
【００２４】
本発明では、アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００２５】
糖原病Ｉａ型に関して、G6PCにおけるコード領域ＤＮＡの６４８番目の塩基Ｇ（グアニン）がＴ（チミン）に置換した変異体（c.648G>T）は、日本、韓国、台湾および中国等の東アジアの諸国で特異的にみられる主要な変異であることが報告されている[参考文献2]。
【００２６】
この変異は、以前の表記法では727G>Tとして知られており、アミノ酸変異の要因とはならないが、異所性のスプライス受容部位としての、G6PCにおけるコード領域ＤＮＡの６５２番目の塩基アデニン（Ａ）から６５３番目のグアニン（Ｇ）までの配列（c.652_653AG）を活性化し、エクソン５の５６３番目のＧ（c.563G、以降同様に表記する）からc.653Gまでの９１ｂｐの欠失（配列番号５）を生じる（実施例の図１）。このように、プレｍＲＮＡのスプライシング機序に影響する突然変異が存在すると、その突然変異はプレｍＲＮＡに異常スプライシングを引き起こさせ、通常のプレｍＲＮＡから生成されるｍＲＮＡとは異なる異常ｍＲＮＡあるいはｍＲＮＡ断片が生じる。その結果、正常なG6Pase転写産物の産生が阻害される。
【００２７】
より詳細には、変異型のG6PC遺伝子であるc.648G>T変異型G6PCでは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列の第４２９０９４１８番目のグアニン（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.562G）の３’側の２塩基、つまり第４２９０９４１９番目のグアニン（Ｇ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.562+1G）と第４２９０９４２０番目のチミン（Ｔ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.562+2T）がスプライス供与部位となり、第４２９１１００６番目のシトシン（Ｃ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.654C）の５’側の２塩基、つまり第４２９１１００４番目のアデニン（Ａ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.652A）と第４２９１１００５番目のグアニン（Ｇ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.653G）が新たなスプライス受容部位（異所性スプライス受容部位）となる。つまりc.648G>T変異型G6PCでは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列の第４２９０９４１９番目のグアニンから第４２９１１００５番目のグアニンをイントロンと認識し、第４２９１１００６番目のシトシンから第４２９１４４３３番目のアデニンをエクソンと認識する異常スプライシングが生じる。それゆえ、第４２９０９４１９番目のグアニン（Ｇ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.562+1G）と第４２９０９４２０番目のチミン（Ｔ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.562+2T）とからなるスプライス供与部位、および第４２９１１００４番目のアデニン（Ａ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.652A）と第４２９１１００５番目のグアニン（Ｇ）（ｃＤＮＡ（配列番号４）におけるc.653G）とからなるスプライス受容部位を用いる異常スプライシングを抑制すれば、異常ｍＲＮＡの発現量が減少し、同時に正常スプライシングに基づく正常な塩基長を有するG6PC ｍＲＮＡの発現が回復し、結果として正常型G6Paseタンパク質の生成が回復する。つまり、「c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する」とは、上述の異常スプライシングを阻害すること、および、その結果、異常ｍＲＮＡの発現量を減少させる、正常スプライシングに基づく正常な塩基長を有するG6PC ｍＲＮＡの発現を回復させる、および正常型G6Paseタンパク質を生成させる、という機能の少なくとも何れかの機能を有することを意図している。
【００２８】
また、G6PCの塩基配列およびG6Paseタンパク質のアミノ酸配列の情報は、例えば、NCBI Reference Sequence（RefSeq）やGenBank等から入手可能である。例えば、G6Paseタンパク質として、具体的には、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するヒトのG6Paseタンパク質のアミノ酸配列（RefSeq アクセッション番号：NP_000142.2）が挙げられる。
【００２９】
ここでGRCh38/hg38は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/等に登録されているヒトゲノムデータのアッセンブリ（RefSeq assembly accession: GCF_000001405.36, GenBank assembly accession: GCA_000001405.25）であり、ヒト第１７染色体領域はGenBank アクセッション番号: CM000679.2 に示される。
【００３０】
さらにヒト第１７染色体のG6PC領域の塩基配列のゲノムＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。当該配列は、RefSeq アクセッション番号：NG_011808.1に示される。また、c.648G>T変異型G6PCのゲノムＤＮＡの塩基配列は、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列の第４２９１１０００番目の塩基がＧからＴへ置換した配列である。
【００３１】
なお、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における第４２９１１０００番目の塩基には、配列番号１の１５２０３番目の塩基、配列番号２または配列番号３の６９４番目の塩基、配列番号４の６４８番目の塩基および配列番号１３の７２８番目の塩基が、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における第４２９１１００４番目の塩基には、配列番号１の１５２０７番目の塩基、配列番号２または配列番号３の６９８番目の塩基、配列番号４の６５２番目の塩基および配列番号１３の７３２番目の塩基が、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における第４２９１１００５番目の塩基には、配列番号１の１５２０８番目の塩基、配列番号２または配列番号３の６９９番目の塩基、配列番号４の６５３番目の塩基および配列番号１３の７３３番目の塩基が、それぞれ対応する。
【００３２】
また、G6PC ｍＲＮＡの塩基配列は、RefSeq アクセッション番号：NM_000151.3（配列番号１３）に示される。さらにまた、G6PCのコード領域の塩基配列は、GenBank アクセッション番号：BC130478.1（配列番号２）およびBC136369.1（配列番号３）に示される。なお、BC130478.1の配列番号２に示す配列は、BC136369.1（配列番号３）の２３４９番目のＴと２３５０番目のＧとの間にさらに１塩基Ｔが挿入されている点のみ異なるがそれ以外は同一の配列である。
【００３３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述の変異型G6PC遺伝子をコードする塩基配列の一部であり得る。例えば、正常型G6PCまたはc.648G>T変異型G6PCのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの塩基配列に基づいて設計し得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはプレｍＲＮＡ分子とハイブリッド形成し、スプライシングが可能な条件で二本鎖分子を作る。つまり、本発明のアンチセンスヌクレオチドは、c.648G>T変異型G6PC遺伝子の転写段階において、一次転写産物であるプレｍＲＮＡの上記異常スプライシングを抑制し、正常スプライシング反応に修復させる。これにより、正常な塩基長を有するG6PC ｍＲＮＡを発現させ、正常型G6Paseタンパク質の生成を回復させることができる。
【００３４】
本発明においては、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列とは異なるヒト第１７染色体塩基配列における、上述のGRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列の第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基に対応する（相当する）塩基および一塩基多型のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。ここで、「対応する（相当する）塩基および一塩基多型」とは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列とは異なるヒト第１７染色体塩基配列の該当塩基および一塩基多型を意味し、ヒトの個体の違いなどによって若干変化しているヒト第１７染色体塩基配列なども標的配列に包含されることを意味している。
【００３５】
アンチセンスヌクレオチドの具体的配列としては、上述の異常スプライシングに用いられる異所性スプライス受容部位の周辺配列を標的配列とするものであり得る。一実施形態としては、アンチセンスヌクレオチドは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を基準として、５０塩基上流の塩基から５０塩基下流の塩基までの領域に含まれる配列のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズするものであり得る。言い換えると、一実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドはGRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１０９５１番目〜第４２９１１０５４番目の塩基（ｃＤＮＡ（配列番号４）のc.599G〜c.702C）の領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。別の実施形態としては、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を基準として、３０塩基上流の塩基から３０塩基下流の塩基までの領域に含まれる配列のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズするものであり得る。言い換えると別の実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１０９７１番目〜第４２９１１０３４番目の塩基（ｃＤＮＡ（配列番号４）のc.619A〜c.682A）の領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
ある実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの１つ、２つまたは３つ全ての塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する。
【００３７】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、異常スプライシングが生じる要因となる異所性スプライス受容部位をブロックするように選択されている。
【００３８】
このアンチセンスヌクレオチドを用いれば、正常スプライシングにより正常なイントロン領域が除去され、正常型G6Paseタンパク質をコードするｍＲＮＡが産生する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述の標的配列とハイブリダイズ可能な塩基配列を含んでおり、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有している。
【００３９】
一実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡ配列のエクソン５内領域の異所性スプライス受容部位を含む領域に十分に相補的な塩基配列を含む。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常なスプライシングを抑制し、それにより、正常な活性を有する正常型G6Paseタンパク質の発現を増加させることができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの具体的配列としては、例えば、配列番号７にハイブリダイズする塩基配列（配列番号１４）を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。配列番号７に示す塩基配列は、G6PCのコード領域のＤＮＡの塩基配列（配列番号４）のc.648G>T変異型における第６３０番目〜６５４番目と一致する配列である。
【００４０】
一実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、具体的には以下の（ａ）〜（ｃ）から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
（ａ）配列番号１４に示される塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１４に示される塩基基配列において１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失、置換、挿入、および／または付加された塩基配列を含み、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｃ）配列番号１４に示される塩基配列に対して、６０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつc.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。ここで、配列同一性は、６５％以上であることが好ましく、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であることが特に好ましい。
【００４２】
上記（ｂ）および（ｃ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、具体的には上記（ａ）のアンチセンスオリゴヌクレオチドの変異体であるということができる。つまり、集団の遺伝子間の多型などに対応することを意図している。
【００４３】
つまり、一実施形態のアンチセンスヌクレオチドは、G6PCのプレｍＲＮＡのrs80356484（Ｇ／Ｔの多型）で表される一塩基多型（single nucleotide polymorphism（ＳＮＰ））を含む領域に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。rs80356484のrs番号はNational Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示し、ウェブサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=80356484&pt=1ZSlUX0_YR_X1REc5s-B-00w7e7HgeIfXE3I8aMuPnEiTRLgNu）から取得可能である。
【００４４】
なお、rs80356484について、ＳＮＰの塩基（c.648G/T）、c.652Aおよびc.653Gとその前後の領域を含む合計１０４ｂｐの長さの配列（c.599G〜c.702C）を、配列番号８に示した。５０番目の塩基が多型を有する。
【００４５】
また、本発明のさらなる実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、具体的には以下の（ｄ）〜（ｈ）から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４６】
（ｄ）その塩基配列が配列番号１５（配列番号８にハイブリダイズする配列）の全体または一部の配列で表されるものであり、配列番号１５の第５０番目〜５５番目で示された全ての塩基を少なくとも含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｅ）配列の長さが７塩基以上、１０塩基以上、１１塩基以上、１２塩基以上、１３塩基以上、１４塩基以上、１５塩基以上、１６塩基以上、１７塩基以上、１８塩基以上、１９塩基以上、２０塩基以上、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、または、２５塩基以上である、上記（ｄ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｆ）配列の長さが、１０４塩基以下、１０３塩基以下、１０２塩基以下、１０１塩基以下、１００塩基以下、９０塩基以下、８０塩基以下、７０塩基以下、６０塩基以下、 ５０塩基以下、４０塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、２９塩基以下、２８塩基以下、２７塩基以下、又は、２６塩基以下である、上記（ｄ）または（ｅ）のアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｇ）  上記（ｄ）〜（ｆ）の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または、９９％以上の配列同一性を示すアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｈ）  好ましくは、Ａ）配列番号１５の第５０番目の塩基がＣ、Ｂ）第５１番目の塩基がＴ、Ｃ）第５５番目の塩基がＡという条件のうち少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つを満たす、上記（ｄ）〜（ｇ）の何れかのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【００４７】
なお、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的配列に対してハイブリダイズするとは、ハイブリダイズが生じうる領域においてアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列と標的配列の塩基配列とが完全に相補的な関係にある場合に限定されない。一例では、ハイブリダイズが生じうる上記領域が２５ｂｐ以上である場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該領域におけるプレｍＲＮＡの塩基配列と完全に相補的な配列に対して、６０％以上、好ましくは６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。あるいは、ハイブリダイズが生じうる上記領域が２５ｂｐ以上である場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全に相補的な上記配列に対して、１０塩基以下、好ましくは５塩基以下、４塩基以下、より好ましくは３塩基以下、さらに好ましくは２塩基以下、特に好ましくは１塩基の相違を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。または、別の例では、ハイブリダイズが生じうる上記領域が７ｂｐ以上である場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該領域におけるプレｍＲＮＡの塩基配列と完全に相補的な配列に対して、好ましくは２塩基以下、より好ましくは１塩基の相違を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、およびＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッド分子の何れであってもよい。安定性の観点からは、ＤＮＡ分子であることが好ましい場合がある。
【００４９】
本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは特に限定されないが、オリゴヌクレオチドの修飾の種類等によって好適な長さが異なる場合がある。ある実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドでは、７〜１０４塩基であることが好ましく、１０〜１０４塩基であることがより好ましく、１５〜６４塩基であることがさらにより好ましく、１５〜４４塩基であることが特に好ましく、１５〜３０塩基であることが最も好ましい。別の例示として、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドが、後述するモルホリノオリゴヌクレオチドである場合は、１４〜３０塩基であることが好ましく、２０〜３０塩基であることが特に好ましい。また別の例示として、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドが、後述するロックド核酸（locked nucleic acids、ＬＮＡ）を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、ＬＮＡオリゴヌクレオチド）である場合は、７〜２５塩基であることが好ましく、７〜２３塩基であることがより好ましく、９〜２０塩基であることがさらにより好ましく、１０〜１７塩基であることが特に好ましい。
【００５０】
また、本発明に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチドであってもよく、非天然型のオリゴヌクレオチドであってもよい。非天然型のオリゴヌクレオチドとしては、例えば、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル骨格、チオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルホメート骨格、スルホネート骨格、スルホンアミド骨格、メチレンイミノ骨格、メチレンヒドラジノ骨格、アミド骨格等の修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。よって非天然型のオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロアミダートモルホリノオリゴヌクレオチドまたはホスホロジアミダートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）等のモルホリノオリゴヌクレオチド、ＰＭＯ−Ｘ、ＰＰＭＯ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（locked nucleic acids、ＬＮＡ）、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド、トリシクロ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド、トリシクロ−ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド、２’Ｏ−Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチド、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋型核酸種（ＥＮＡ）等が挙げられる。これらの非天然型のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによって分解されにくいため、細胞内で効率的に作用する。例えば、モルホリノオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する安定性を向上させ、細胞への取り込みを促進することが知られている。モルホリノオリゴヌクレオチドは、デオキシリボース環またはリボース環の代わりにモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。また、ＬＮＡの場合は、標的となる核酸に対する結合親和性を高め、かつヌクレアーゼに対する耐性を有することが知られている。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、天然型のオリゴヌクレオチド中の1つ以上のヌクレオチドをＬＮＡに置換することによって作製され得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドがＬＮＡオリゴヌクレオチドである場合において、オリゴヌクレオチド当たりの好ましいＬＮＡ含有割合はアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さによって異なる。例えば、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの長さが１０〜１７塩基である場合、ＬＮＡを好ましくは２０％〜５５％、より好ましくは２５％〜５５％、さらにより好ましくは３０％〜５０％で含有することが好ましい。
【００５１】
一方、例えば、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの長さが７〜９塩基である場合、ＬＮＡを好ましくは４０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％、さらにより好ましくは７０％〜１００％で含有することが好ましい。
【００５２】
ある実施形態に係るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記（ｄ）〜（ｈ）から選択され、かつヌクレオチドの一部または全部がＬＮＡであるアンチセンスオリゴヌクレオチドである。また、一実施形態のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記（ｄ）〜（ｈ）から選択され、かつヌクレオチドが一塩基おきにＬＮＡである、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一例は、１５塩基長とし、３’末端および５’末端の塩基は天然型のヌクレオチドとしてＬＮＡを１残基おきに導入し、各塩基間はホスホロチオエート結合にした、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３で示される塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００５３】
さらにまた、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’末端および／または３’末端が修飾されていてもよい。修飾の例示としては、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）修飾、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）修飾、ドデカエチレングリコール（ＤＯＤＥＧ）修飾等が挙げられる。あるいは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する塩基と塩基との間にスペーサー化合物を有していてもよい。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つ以上の修飾されたヌクレオチド、ヌクレオチド間の修飾または改変された1つ以上の結合などを含んでいてもよい。例えばヌクレオチド間の結合の例として、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合などが挙げられる。
【００５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法およびポリヌクレオチド合成方法によって得ることができる。具体的には、化学合成、in vitro transcription等の公知の方法を用いて調製し得る。
【００５５】
（ベクター）
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能に組み込んだベクターも提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするオリゴヌクレオチドが組み込まれるベクターは、特に限定されないが、遺伝子治療に適用可能なベクターであることが好ましい。例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびレトロウイルスベクター等のウイルスベクター、ならびにプラスミドベクター等が挙げられる。ウイルスベクターは、自己複製能を欠損するように改変されているものであることが好ましい。
【００５６】
上記ベクターには、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを被験体細胞に特異的に発現させる発現調節配列が組み込まれていることが好ましい。ここで、発現調節配列とは、例えば、プロモータまたはエンハンサ等が挙げられる。発現ベクターの構築は、公知の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００５７】
上記ベクターには、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与対象の被験体の標的器官に特異的に発現させる発現調節配列が組み込まれていることが好ましい。ここで、発現調節配列とは、例えば、プロモータまたはエンハンサが挙げられる。
【００５８】
（宿主細胞）
本発明は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むベクターを導入した宿主細胞も提供する。例えば、単離された宿主細胞は、組換え細胞を作製するのに適した細胞（または細胞株）であってよい。いくつかの例では、宿主細胞は、ＨＥＫ−２９３細胞およびＢＨＫ細胞等の哺乳動物細胞である。
【００５９】
〔２．c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する方法〕
すなわち、本発明のある態様として、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび、後述する本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物は、c.648G>T変異型G6PC遺伝子における異常スプライシングを抑制するための、in vitroまたはin vivoの方法または分子生物学的な研究の手段として用いることにも当然有効である。
【００６０】
従って、本発明は、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する方法も提供する。一実施形態における方法は、in vitroまたはin vivoの細胞において、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加し、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制することを包含する、方法である。本方法は、プレｍＲＮＡのスプライシングをさせる工程、およびプレｍＲＮＡの該スプライシングによって生じるｍＲＮＡを翻訳させる工程をさらに包含するものであってもよい。なお、in vitroまたはin vivoの細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの添加量および添加後の細胞培養期間等は細胞の種類または目的等に応じて適宜設定される。
【００６１】
また、異常スプライシングが抑制されたか否かは、該スプライシング領域周辺のG6PCｍＲＮＡの塩基配列を調べることによって行うことができる。配列を調べる方法としては、ダイレクトシークエンス法等の公知の配列決定方法を用いることができる。あるいは、例えば、ネステッドＰＣＲ等の公知のポリヌクレオチド増幅方法を用いて、増幅された配列長で判断することもできる。
【００６２】
異常スプライシングが抑制されていること、および正常な塩基長を有するG6PC ｍＲＮＡの発現が回復していることは、例えば、被験体の細胞（例えば、リンパ芽球細胞）に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、当該細胞を試料として定量ＲＴ−ＰＣＲ等の公知のｍＲＮＡ測定方法を用いることにより確認することができる。また、正常型G6Paseタンパク質の生成が回復していることは、被験体の細胞を試料としてウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の公知のタンパク質測定法を用いることにより確認することができる。なお、正常なスプライシングにより生成される正常な塩基長を有するG6PC ｍＲＮＡの発現量が高いほど正常型G6Paseタンパク質の発現量も高いことが予想される。
【００６３】
〔３．糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物〕
本発明に係る糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬効成分として含み、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する組成物である。
【００６４】
本発明の一実施形態に係る予防または治療用組成物に含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、〔１．アンチセンスオリゴヌクレオチド〕の項目において上述した通りのものである。なお、単一の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物において、複数種のアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれていてもよい。また、本発明に係る組成物に含まれるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、そのオリゴヌクレオチド自体の状態で含まれ、被験体に投与される形態のものであってもよいし、適当なプロモータ配列の下流に組み込まれたアンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして、被験体の生体内へ取り込まれる形態のものであってもよい。
【００６５】
本実施形態の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物は、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制するので、これを被験体に投与することにより、糖原病Ｉａ型を予防または治療することができる。よって、本実施形態の組成物を用いれば、例えば、糖原病Ｉａ型を罹患している患者の治療に有用である。また、本発明の組成物は、糖原病Ｉａ型を発症する危険性（リスク）が高くなっている被験体を治療的または予防的に処置するために用いることができる。
【００６６】
一実施形態の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物は、上記G6PCのc.648G>T共通変異を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むため、共通変異を有する糖原病Ｉａ型患者、すなわち上述したように日本を含む東アジア諸国の大多数の患者への特異的な薬物療法を実現することが期待される。
【００６７】
（溶媒）
一実施形態の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の溶媒の例としては、水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液として具体的には、生理食塩水、リン酸緩衝液、リンゲル液等が挙げられる。また、組成物に用いられる溶媒は上述の溶媒の２種類以上の混合物であってもよい。
【００６８】
（その他成分）
一実施形態の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物は、上述のアンチセンスオリゴヌクレオチド以外のその他の成分をさらに含んでいてもよい。当該その他の成分は特に限定されないが、例えば、薬学的に許容される担体、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、着色剤、香味料、甘味料、抗酸化剤、および粘度調整剤等が挙げられる。また、必要に応じて、公知の薬剤を、本発明に係る糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の一構成として加えて複合剤を構成してもよい。組成物に含有されるこれらの成分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの機能を阻害せず、かつ、投与対象となる被験体に対して実質的な悪影響を及ぼさないという性質を備えることが好ましい。
【００６９】
上記その他の成分としては、この分野で公知のものを広く使用でき、具体的には、例えばラクトース、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、タルク、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられるが、特にこれらに限定されない。担体の種類は、組成物の剤型および投与方法等に応じて、適宜選択すればよい。
【００７０】
（剤型）
上記糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の剤型も特に限定されず、液体、固体または半固体もしくは半液体とすることができる。さらに凍結乾燥製剤としてもよい。例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、および注射剤等が挙げられ、好ましくは注射剤または錠剤等の経口投与用の剤型である。
【００７１】
（投与経路）
上記糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の投与経路としては、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、経皮等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
（投与方法）
上記糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の投与方法は特に限定されず、経口投与、血管内投与、腸内投与といった手法によって全身投与されてもよく、経皮投与、舌下投与といった手法によって局所投与されてもよい。被験体への投与は、公知の方法に基づいて行われればよいが、具体的には、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内等への直接注射、鼻腔内、口腔内、肺内、膣内、直腸内等の粘膜への噴霧、経口投与、静脈内または動脈内への血管内投与等が挙げられる。１つの好ましい投与方法は、皮下、静脈内または動脈内への直接注射による全身投与である。別の好ましい投与方法は、投与が容易である観点から、経口投与である。
【００７３】
（投与量および投与期間）
上記糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の投与量（治療有効量）は、投与の対象となる被験体の年齢、体重、性別、投与する剤型、目的とする糖原病Ｉａ型予防または治療効果の程度等によって適宜選択可能である。また、糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の投与期間についても、目的とする糖原病Ｉａ型予防または治療効果が得られるように適宜選択することができる。
【００７４】
また、例えば、糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の糖原病Ｉａ型予防または治療効果を損なわない限り、別の糖原病Ｉａ型予防または治療効果を有する医薬品または別の効果を有する医薬品と併用投与されてもよい。
【００７５】
（投与の対象）
本発明に係る組成物の投与対象となる被験体としては、あらゆる動物が挙げられるが、脊椎動物が好ましく、哺乳類であることがより好ましい。さらに、哺乳類の被験体としては、ヒトの他に、家畜類（ニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等）、ペット動物（ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギ、モルモット等）および実験動物（マウス、ラット等のげっ歯類、サル等）が挙げられるが、特にヒトが好ましい。さらに、被験体がヒトの場合、なかでも、東アジア（日本、中国、韓国、台湾等）の人種であることが好ましい。
【００７６】
例示的な被験体は、糖原病Ｉａ型を有する患者であるか、糖原病Ｉａ型を発症するリスクを有する。また、別の実施形態では、被験体は、G6PCにおけるc.648G>Tの変異をホモ接合または複合ヘテロ接合で有しており、好ましくはホモ接合で有している。
【００７７】
さらに被験体は、いかなる年齢であってもよい。なお、糖原病Ｉａ型は乳児期から発症しうる疾患であるため、０歳の被験体を含め可能な限り早期に投与を開始することが望ましい。より低い年齢から投与することにより、成長障害および腎障害などを早期に防止することができる。また、疾患の早期予防および治療の早期開始により、重篤な障害等が生じることを防ぐことができる。
【００７８】
一実施形態の被験体は、肝臓、腎臓および小腸を含む１以上の組織中のグリコーゲン蓄積が増加しているか、上述した糖原病Ｉａ型の少なくとも１つの臨床的症状を呈している。
【００７９】
本発明の組成物は、投与が容易であり、かつ、安全性が高いため、長期間にわたる投与、または乳幼児への投与にも用いることができる。したがって、糖原病Ｉａ型予防または治療のために好適に使用可能である。
【００８０】
〔４．糖原病Ｉａ型（ＧＳＤ−Ｉａ）の治療方法〕
本発明に係る糖原病Ｉａ型の治療方法は、上述の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物を、被験体に対して、治療有効量投与する工程を含む。一実施形態においては、投与対象となる被験体へ、該組成物のみを単独で投与してもよく、または、投与の目的に適した薬学的組成物の一構成成分として投与してもよい。
【００８１】
（投与量および投与期間）
上記糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の投与量（治療有効量）は、投与対象となる被験体の年齢、性別、体重、症状、投与経路、投与回数、および投与期間等に応じて適宜設定すればよい。投与方法、投与量、投与期間等は〔３．糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物〕に記載した通りである。
【００８２】
上記糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物の投与回数も治療効果が得られる限り特に限定されず、例えば、被験体の疾患症状の重症度、上記投与量、投与経路、症状、被験体の年齢、性別、体重等に応じて適宜設定すればよい。
【００８３】
なお、臨床的に健常な被験体に対して、糖原病Ｉａ型を発症する前に該糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物を投与する工程を包含する、予防投与の形態も、本発明の治療方法の範疇に含まれる。すなわち、被験体に該組成物が有効量以上生体中に投与された状態にし、あらかじめ糖原病Ｉａ型を予防するという態様である。
【００８４】
（併用療法）
本発明に係る糖原病Ｉａ型の治療方法において、本発明に係る糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物以外の糖原病Ｉａ型の治療に用いられる薬剤（例えば、アシドーシスに対するクエン酸製剤、高尿酸血症に対する尿酸合成阻害剤等）の投与、およびデンプン質の頻回食療法等の、従来の療法のうちの１以上と組み合わせた併用療法を行ってもよい。本発明に係る糖原病Ｉａ型の治療方法は、従来の糖原病Ｉａ型の治療とは異なるメカニズムを利用した新規な治療方法である。それゆえ、本併用療法を採用すれば、併用剤の治療効果と相乗的な治療効果が期待できる。
【００８５】
上記治療方法を用いて治療中の被験者の治療効果は、〔２．c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する方法〕に記載した、異常スプライシングの抑制有無を調べる方法や、正常な塩基長を有するG6PC ｍＲＮＡの発現を調べる方法、正常型G6Paseタンパク質の発現を調べる方法を適宜用いて調べることもできる。生体におけるG6Paseタンパク質の量は、該生体の有する糖原病Ｉａ型の重症度に比例し得る。そのため、治療の各段階において、治療効果の有無の検査を行うことができる。
【００８６】
〔５．本発明に係る具体的な態様の例示〕
本発明は以下の何れかの態様を包含する。
＜１＞  アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜２＞  上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１０９５１番目〜第４２９１１０５４番目の塩基の領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、＜１＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜３＞  ７〜１０４塩基からなる、＜１＞または＜２＞に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜４＞  上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の（ａ）および（ｂ）のうちから選択される、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【００８７】
（ａ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列に対して、６０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつc.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜５＞  上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜３０塩基からなるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは７〜２５塩基からなるロックド核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドである、＜１＞〜＜４＞の何れかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜６＞  糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬効成分として含み、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１１０００番目の塩基、第４２９１１００４番目の塩基および第４２９１１００５番目の塩基のうちの少なくとも１つの塩基を含む領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有する、糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
＜７＞  上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、GRCh38/hg38のヒト第１７染色体塩基配列における、第４２９１０９５１番目〜第４２９１１０５４番目の塩基の領域のプレｍＲＮＡの配列にハイブリダイズし、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、＜６＞に記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
＜８＞  上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜１０４塩基からなる、＜６＞または＜７＞に記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
＜９＞  上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、以下の（ａ）および（ｂ）から選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、＜６＞〜＜８＞の何れかに記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
【００８８】
（ａ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０または配列番号２３に示される塩基配列に対して、６０％以上の配列同一性を有する塩基配列を含み、かつc.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを抑制する活性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
＜１０＞  上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１４〜３０塩基からなるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは７〜２５塩基からなるロックド核酸（ＬＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドである、＜６＞〜＜９＞の何れかに記載の糖原病Ｉａ型予防または治療用組成物。
【００８９】
以上に示したように、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９０】
以下、本発明の実施例について説明する。【００９１】
〔実施例１〕
まず、c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシング部位について、図を参照して説明する。図１は、c.648G>Tの変異によって生じるG6PCのプレｍＲＮＡの異常スプライシング領域を示す図である。【００９２】
G6PC変異体c.648G>Tはエクソン５の５’側の９１ｂｐのヌクレオチド（配列番号５）が欠失したｍＲＮＡを生じる。これは、変異配列“ccttcttcctTttcAG”の伸長したポリピリミジン領域が、正常配列“ccttcttcctGttcAG”および野生型のスプライス受容部位“ctttcttccactcAG”の配列を超える増大したスプライシング効果を有していることによる可能性がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドはエクソン５における変異型配列における異所性スプライス受容部位をブロックするように設計した。【００９３】
＝材料および方法＝
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡにおける異常スプライシングの異所性スプライス受容部位を標的とする２５ ｍｅｒのモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｍＡＳＯ）を設計した。c.648Gがc.648Tに置換されたG6PCの配列のうちの、c.630Tからc.654Cまでの配列（5'-TCTCATTACCTTCTTCCTTTTCAGC-3'（配列番号７））の相補配列（5'-GCTGAAAAGGAAGAAGGTAATGAGA-3'（配列番号１４））となるように設計したｍＡＳＯと、同一の長さのコントロールのモルホリノオリゴヌクレオチド（ｍＣＯ）（5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'（配列番号９））とを、Gene Tools, LLC （Philomath, OR）によって合成した。Endo-Porter （Gene Tools）をモルホリノオリゴヌクレオチドの細胞への組み込みに用いた。【００９４】
（患者および細胞株）
臨床症状およびＧＳＤ−Ｉａの生物学的な異常表現型を有する、日本人の乳児期からの患者の血液から白血球を分離した。ゲノムＤＮＡの双方向シークエンシングによって、c.648G>Tのホモ接合体であるものを探索した。【００９５】
Epstein-Barrウイルス（EBV）による形質転換後、リンパ芽球細胞を、１０％ウシ胎児血清（HyClone, Logan, Utah, USA）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するRMPI 1640培地にて、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。健康な成人由来の別の細胞を健常コントロールとして準備した。【００９６】
（アンチセンスオリゴヌクレオチドの曝露）
ｍＡＳＯまたはｍＣＯの何れかを１．０μｍｏｌ／ＬおよびEndo-Porterを０．８μＬ含んでいる新しい培地２００μＬに、１０５の細胞を再懸濁した。３７℃で４８時間インキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、回収した。【００９７】
（ＲＮＡ調製、ＲＴ−ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲ）
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをRNeasy kit （Qiagen, Valencia, CA）を用いて抽出し、first-strand synthesis system for RT-PCR （SuperScript; Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。【００９８】
続いて、ネステッドＰＣＲを行い、ｍＲＮＡのスプライシングにおけるｍＡＳＯの効果を調べた。ネステッドＰＣＲに用いたプライマーを表１に示す。first ＰＣＲでは、プライマーセットG6PC-F1/G6PC-Rを用い、c.648G>Tを含むセグメントを増幅した。second ＰＣＲでは、別のプライマーセットG6PC-F2/G6PC-Rを用いた。正常なスプライシング由来のＰＣＲ産物の予想サイズは３０５ｂｐであり、異常なスプライシング由来のＰＣＲ産物の予想サイズは２１４ｂｐであった。アガロースゲル電気泳動によって分離後、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから抽出し、BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit （Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）およびABI PRISM 310 genetic analyzer （Applied Biosystems）を用いて直接配列決定した。【００９９】
【表１】
2018164275.tif 000003
＝結果＝
（ネステッドＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動）
図２は、健常コントロール被験者由来（レーン１〜３）およびＧＳＤ−Ｉａの患者由来（レーン４〜６）のネステッドＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。【０１００】
レーン１〜３には約３００ｂｐの長さの単一のバンド、レーン５および６には約２００ｂｐの長さの単一のバンドが見られ、両方のバンドがレーン４において観察された。より長いネステッドＰＣＲ産物のバンドがレーン４の★印に見られた。これは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドによるG6PC c.648G>Tの異常スプライシングの回復を示している。【０１０１】
続いて、図２において示したネステッドＰＣＲ産物をゲルから抽出し、直接配列決定した。図３は、ネステッドＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングの結果を示す図である。図３の（ａ）は、レーン１〜３における単一のバンド（３０５ｂｐ）の配列を示している。エクソン４の３’末端（c.561_562AG）に、正常なエクソン５（c.563G_753C）が続いている。図３の（ｂ）は、レーン５および６における単一のバンド（２１４ｂｐ）およびレーン４におけるより短い方のバンド（２１４ｂｐ）の配列を示している。エクソン４の３’末端（c.561_562AG）にc.654C_753Cが続いている。このことは、９１ｂｐ（c.563G_653G）の欠失を示している。図３の（ｃ）は、レーン４におけるより長い方のバンド（３０５ｂｐ）の配列を示している。より短い方のバンドの断片によるコンタミネーションが生じていたが、エクソン４の３’末端（c.561_562AG）にc.563G_753Cが続いており、c.648Gはc.648Tに置換されていた。【０１０２】
健常コントロールのサンプルにおいて、ｍＡＳＯもしくはｍＣＯで処理されたサンプル間、または処理の有無で相違は見られず、すべてのサンプルで約３００ｂｐの単一のバンドが現れた。同様に、ｍＣＯによる処理有りまたは無しの患者サンプルで約２００ｂｐの単一のバンドが見られた。これと比較して、ｍＡＳＯで処理した患者サンプルでは、約２００ｂｐおよび約３００ｐの２つのバンドが現れた。このことは、患者サンプルにおける正常なスプライシングの部分的な回復を示唆している（図３）。【０１０３】
健常コントロールサンプルでは、エクソン４およびエクソン５の結合領域の配列はｍＡＳＯまたはｍＣＯの何れの処理の場合も正常であった。一方患者サンプルにおいては、ｍＣＯによる処理または処理無しのサンプルの約２００ｂｐのバンドで９１ｂｐ欠失が観察された。ｍＡＳＯで処理したサンプルの約３００ｂｐのバンドは２種類のＤＮＡ断片を含んでいた。１つの断片は、塩基置換c.648Tを含む正常な長さのｃＤＮＡとしての配列を示しており、もう１つの断片は、９１ｂｐの欠失を含む異常な長さの配列を示していた。これは、アガロースゲル電気泳動の工程において、上記の正常な長さのｃＤＮＡ断片より下流に位置している異常な長さの断片がコンタミネーションを起こしたものであると考えられた。【０１０４】
＝議論＝
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、先天性の代謝異常を含む様々な遺伝疾患に対するスプライシング変異を回復させることが広く示されてきている[参考文献1]。様々な種類のＡＳＯ分子の中でもモルホリノＡＳＯはin vivoで効果的に投与され、輸送され得る。様々な種類のＡＳＯ分子の中でも、モルホリノＡＳＯは、樹状分子トランスポーターとの結合によってin vivoで効果的に投与され、輸送され得る。グロブリン遺伝子のイントロンにスプライシング変異を有するトランスジェニックマウスへの、樹状分子トランスポーターとモルホリノＡＳＯとの複合体の静脈投与は、骨格筋、肝臓、腎臓および小腸においてほとんど完全な正常なｍＲＮＡの回復を示した。一方、脾臓、心臓、肺および脳では、あまり効果が見られなかった[参考文献3]。G6PCは、肝臓、腎臓および小腸のみにおいてG6Paseを発現するので、G6PC c.648G>Tの変異によるＧＳＤ−ＩａはＡＳＯベースの治療のための好適な標的となり得る。【０１０５】
一般的に、遺伝疾患における変異体の多くは散発性のため、この種の薬剤の実用的な使用への導入は困難であることも多く、医薬開発の好適な標的ではない場合もあるが、G6PC c.648G>T変異体の場合はＡＳＯ療法の標的として好適である。【０１０６】
この変異による異常スプライシングは罹患患者の肝臓組織において最初に報告され[参考文献4]、続いて、EBVによる形質転換リンパ芽球細胞において成功した別の観察の報告がなされた[参考文献5]。これらの発見がされたのち、この変異体アレル頻度が東アジア人集団で非常に高いことが分かった（表２）。日本においては、罹患集団の８０〜８５％がG6PC c.648G>Tのホモ接合体であり、残りは主にc.648G>Tのヘテロ接合体および散発性の変異であった[参考文献5, 6]。【０１０７】
【表２】
2018164275.tif 000004
これらのことから、日本人のＧＳＤ−Ｉａの患者のおよそ９５％は、少なくとも１つのアレルにおいてこの変異を有していると思われる。台湾[参考文献7]、中国[参考文献8]および韓国[参考文献9]でのこの変異の検出に関するいくつかの報告によれば、c.648G>Tの少なくとも1つのアレルを有している患者の割合は、ぞれぞれ、韓国人で９２．３％、中国人で８８．６％であった。【０１０８】
これらの知見は、上記で列挙している国のＧＳＤ−Ｉａ患者の大部分に対し単一のＡＳＯベースの治療薬が有効であることを示唆している。ＡＳＯが罹患患者において観察された病理学的な変化を改善するか否かは、例えばc.648G>T 変異型G6PCを有するＧＳＤ−Ｉａ患者由来の人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem （iPS） cells）細胞株を確立して、それらの細胞を、細胞内へのグリコーゲンの蓄積を示す肝細胞様の細胞へと分化させる方法などによって確認する [参考文献10]。【０１０９】
以上の通り、本発明は新規なＧＳＤ−Ｉａ型特異的医薬を確立する、非常に有効な知見を得たものである。【０１１０】
＝実施例１の参考文献の一覧＝
[参考文献1] M.A. Havens, D.M. Duelli, M.L. Hastings, Targeting RNA splicing for disease therapy, Wiley Interdiscip. Rev. RNA 4 (3) (2013) 247-266.
[参考文献2] J.Y. Chou, B.C. Mansfield, Mutations in the Glucose-6-Phosphatase-α (G6PC) gene that cause type Ia glycogen storage disease, Hum. Mutat. 29 (7) (2008) 921-930.
[参考文献3] Y.F. Li, P.A. Morcos, Design and synthesis of dendritic molecular transporter that achieves efficient in vivo delivery of morpholino antisense oligo, Bioconjugate Chem. 19 (7) (2008) 1464-1470.
[参考文献4] S. Kajihara, S. Matsuhashi, K. Yamamoto, K. Kido, K. Tsuji, A. Tanae, S. Fujiyama, T. Itoh, K. Tanigawa, M. Uchida, Y. Setoguchi, M. Motomura, T. Mizuta, T. Sakai, Exon redefinition by a point mutation within exon 5 of the glucose-6-phosphatase gene is the major cause of glycogen storage disease type Ia in Japan, Am. J. Hum. Genet. 57 (3) (1995) 549-555.
[参考文献5] J. Akanuma, T. Nishigaki, K. Fujii, Y. Matsubara, K. Inui, K. Takahashi, S. Kure, Y. Suzuki, T. Ohura, S. Miyabayashi, E. Ogawa, K. Iinuma, S. Okada, K. Narisawa, Glycogen storage disease type 1a: molecular diagnosis of 51 Japanese patients and characterization of splicing mutations by analysis of ectopically transcribed mRNA from lymphoblastoid cells, Am. J. Med. Genet. 91 (2) (2000) 107-112.
[参考文献6] J. Kido, K. Nakamura, S. Matsumoto, H. Mitsubuchi, T. Ohura, Y. Shigematsu, T. Yorifuji, M. Kasahara, R. Horikawa, F. Endo, Current status of hepatic glycogen storage disease in Japan: clinical manifestations, treatments and long-term outcomes. J. Hum. Genet. 58 (5) (2013) 285-292.
[参考文献7] S.C. Chiang, Y.M. Lee, M.H. Chang, T.R. Wang, T.M. Ko, W.L. Hwu, Glucose-6-phosphatase gene mutations in Taiwan Chinese patients with glycogen storage disease type 1a, J. Hum. Genet. 45 (4) (2000) 197-199.
[参考文献8] W.J. Qiu, X.F. Gu, J. Ye, L.S. Han, Y.F. Zhang, X.Q. Liu, Molecular genetic analysis of glycogen storage disease type Ia in 26 Chinese patients, J. Inherit. Metab. Dis. 26 (8) (2003) 811-812.
[参考文献9] C.S. Ki, S.H. Han, H.J. Kim, S.G. Lee, E.J. Kim, J.W. Kim, Y.H. Choe, J.K. Seo, Y.J. Chang, J.Y. Park, Mutation spectrum of the glucose-6-phosphatase gene and its implication in molecular diagnosis of Korean patients with glycogen storage disease type Ia, Clin. Genet. 65 (6) (2004) 487-489.
[参考文献10] S.T. Rashid, S. Corbineau, N. Hannan, S.J. Marciniak, E. Miranda, G. Alexander, I. Huang-Doran, J. Griffin, L. Ahrlund-Richter, J. Skepper, R. Semple, A. Weber, D.A. Lomas, L. Vallier, Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells, J. Clin. Invest. 120 (9) (2010) 3127-3136.
〔実施例２〕
ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、生体投与において効果が期待できるlocked nucleic acid (LNA) を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、異常スプライシングの抑制を試みた。【０１１１】
＝材料および方法＝
（ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド）
c.648G>T変異型G6PCのプレｍＲＮＡにおける異常スプライシングの異所性スプライス受容部位を標的とする１５ ｍｅｒのＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ ＡＳＯ）を下記の条件で設計した。c.648Gがc.648Tに置換されたG6PCの配列のうちの、c.639Cからc.665Gまでの領域に含まれる１５ ｍｅｒの配列の相補配列となるようにＬＮＡ ＡＳＯを７種類設計した。７種類のＬＮＡ ＡＳＯをそれぞれＬＮＡ０１、ＬＮＡ０３、ＬＮＡ０５、ＬＮＡ０７、ＬＮＡ０９、ＬＮＡ１１およびＬＮＡ１３とした。合成は受託合成（株式会社ジーンデザイン，大阪府茨木市）によって行った。【０１１２】
（ＬＮＡ ＡＳＯの設計条件）
・１５塩基長とし、ＬＮＡを１残基おきに導入した（表３の網掛け部位）。
・３’末端および５’末端の塩基は天然ＤＮＡとした。
・各塩基間はホスホロチオエート（ＰＳ）結合とした。
・設計領域を２塩基ごとにずらして設計した。【０１１３】
【表３】
2018164275.tif 000005
（細胞株）
c.648G>T変異を同定済みの糖原病Ｉａ型患者（ホモ接合体）から、末梢血リンパ球を採取し、EBVを感染させて不死化リンパ球細胞株を樹立し、実施例１と同様の方法で維持した。【０１１４】
（トランスフェクション）
CaCl2を最終濃度９ｍＭ、ＬＮＡ０１〜１３をそれぞれ最終濃度１μＭとなるように添加した新しい培地２００μＬに、４．５×１０４個の細胞を再懸濁し、ポリ-D-リジンで表面をコーティングしたマイクロプレート（９６ウェル）（Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA）に播種した。ＬＮＡ無添加のウェルをブランクとした。３７℃でconfluencyとなるまで７日間培養した後、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、回収した。【０１１５】
（ＲＮＡ調製、ＲＴ−ＰＣＲおよびネステッドＰＣＲ）
回収した細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した。続いて、ネステッドＰＣＲを行い、G6PC エクソン４およびエクソン５の結合領域からc.648G>Tの変異部位と異所性スプライス受容部位（c.652_653AG）とを含む領域の配列を増幅することによって、ｍＲＮＡのスプライシングにおけるＬＮＡ ＡＳＯの効果を調べた。ネステッドＰＣＲは実施例１で用いたプライマーセットと同じものを用いて行った。【０１１６】
実施例1と同様に、正常なスプライシング由来のＰＣＲ産物の予想サイズは３０５ｂｐ（正常長）であり、異常なスプライシング由来のＰＣＲ産物の予想サイズは２１４ｂｐ（欠失長）であった。アガロースゲル電気泳動によって分離後、ゲル上の欠失長バンドと正常長バンドとを一塊としてアガロースゲルからＤＮＡ抽出し、直接配列決定を行った。【０１１７】
なお、実施例２におけるＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成方法、アガロースゲル電気泳動および直接配列決定は実施例１と同様の方法を用いた。【０１１８】
＝結果＝
（ネステッドＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動）
図４は、各種ＬＮＡ ＡＳＯ（ＬＮＡ０１〜１３）添加およびＬＮＡ ＡＳＯ無添加（ブランク）サンプルのネステッドＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。【０１１９】
各種ＬＮＡ ＡＳＯ添加サンプルにおいては両方のバンドが観察された。これは、ＬＮＡ ＡＳＯによるG6PC c.648G>Tの異常スプライシングからの回復を示しており、正常長バンドが濃いほどＬＮＡ ＡＳＯの異常スプライシングからの回復効果が高いことが予想された。【０１２０】
図５は、ネステッドＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングの結果を示す図である。図５の（ａ）は、ＬＮＡ ＡＳＯ無添加（ＬＮＡ００）サンプルにおけるネステッドＰＣＲ産物の配列を示している。図５の（ｂ）は、各種ＬＮＡ ＡＳＯ添加サンプルにおけるネステッドＰＣＲ産物のc.648G>T付近の波形を示している。【０１２１】
＝考察＝
ＬＮＡ ＡＳＯは、他の各種の構造のオリゴヌクレオチドに比較して作用が強く、導入薬剤または物理的刺激によらない、細胞への自然な取り込み（"gymnosis"または"free-uptake"）でもアンチセンス効果を発揮することが報告されており[参考文献12,13]、実施例２ではこの方法で検討を行った。【０１２２】
EBV不死化リンパ球細胞株でのc.648G>T変異型G6PCの異常スプライシングによる発現においては、若干量であるが、正常スプライシングによる正常型の発現産物も自発的に生じていた。【０１２３】
上述のアガロースゲル電気泳動で得られた欠失長バンドの濃さに対する正常長バンドの濃淡と、ゲル抽出における欠失バンド由来波高と正常長バンド由来波高との相対関係とには相関性が示唆されることから、ＬＮＡ０１〜ＬＮＡ１３のうち、特にＬＮＡ０１、ＬＮＡ０７およびＬＮＡ１３がＬＮＡ ＡＳＯの候補として特に有望と思われる。
＝実施例２の参考文献の一覧＝
[参考文献11] Shimo T, Tachibana K, Saito K, Yoshida T, Tomita E, Waki R, Yamamoto T, Doi T, Inoue T, Kawakami J, Obika S, Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro, Nucleic Acids Res. 42 (12) (2014) 8174-8187.
[参考文献12] Soifer HS, Koch T, Lai J, Hansen B, Hoeg A, Oerum H, Stein CA, Silencing of gene expression by gymnotic delivery of antisense oligonucleotides, Methods Mol. Biol. 815 (2012) 333-346.
[参考文献 13] Hori S, Yamamoto T, Waki R, Wada S, Wada F, Noda M, Obika S, Ca2+ enrichment in culture medium potentiates effect of oligonucleotides, Nucleic Acids Res. 43 (19) (2015) e128.
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明は、例えば、糖原病Ｉａ型の予防または治療に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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