(57)【要約】  本発明はアンバーグリスノートを呈する香料素材のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程とを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
アンバーグリスノートを呈する香料が、次式：
【化１】
2018190118.tif 000005
で示される化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上または嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
嗅覚受容体の応答をレポーターアッセイにより測定する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が２以上であるときに、工程（ｉｉｉ）においてアンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンバーグリス（龍涎香）は、香水におけるアニマリック香調の中でも、ムスクとならんで重要な香りである。アンバーグリスは、マッコウクジラの結石が海岸に漂着して得られた天然の香料であるが、商業捕鯨の禁止等により非常に貴重であるため、現在では、合成香料による代替品の使用がほとんどである。各香料会社によってパフォーマンスのより優れたアンバーグリスノートを呈する香料の開発が行われている。
一方、近年、新しい香料素材の候補物質を探索するために嗅覚受容体（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を発現する培養細胞を利用する方法が提案されている（例えば、特許第５５２０１７３号公報（特許文献１）、特許第５９２１２２６号公報（特許文献２）など）。
嗅覚受容体は、脊椎動物では主に鼻腔内の嗅上皮の嗅毛に発現し、様々な香気化合物に応答するセンサータンパク質である。香気化合物が嗅覚受容体へ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換する。ｃＡＭＰはＣＮＧチャネルを開口し、それによってナトリウムイオン（Ｎａ＋）やカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が細胞内へと流入して受容器電位を発生させ、脳へと情報を送る。嗅覚受容体を発現する培養細胞に香気化合物を接触させたときの細胞内のｃＡＭＰ増加量やカチオン増加量を測定することにより、匂いを判別することが可能であると考えられる。
ヒトの嗅覚受容体は４００種弱あることが知られており、一種の香気化合物は一種または複数種の嗅覚受容体に応答し、一種の嗅覚受容体は複数種の香気化合物に応答することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５５２０１７３号公報
【特許文献２】特許第５９２１２２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
アンバーグリスノートを呈する既知の香気化合物に応答する嗅覚受容体を探索し、その嗅覚受容体を用いることでアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングできる可能性がある。しかし、アンバーグリスノートを呈する香料素材に応答する嗅覚受容体はこれまでに知られていなかった。
このような状況の下、アンバーグリスノートを呈する香料素材に応答する嗅覚受容体を探索し、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法を提供することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行ったところ、アンバーグリスノートを代表するＡＭＢＲＯＸＡＮ（登録商標）またはＡｍｂｅｒ  Ｘｔｒｅｍｅ（商標）に特異的に応答する嗅覚受容体を特定することに成功した。本発明者はさらに検討を進め、これらの嗅覚受容体を用いることにより、アンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物を適切にスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、以下に示すアンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法を提供するものである。
［１］アンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含む、方法。
［２］アンバーグリスノートを呈する香料が、次式：
【化１】
2018190118.tif 000002
で示される化合物からなる群より選択される、［１］に記載の方法。
［３］嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上または嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］嗅覚受容体の応答をレポーターアッセイにより測定する、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が２以上であるときに、工程（ｉｉｉ）においてアンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法を用いることにより、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献できるものと期待される。また、新しい香料素材を開発するために多数の候補化合物の匂いを人間の嗅覚のみで評価することは、嗅覚疲労や個人差の問題があり、適切に候補化合物を選択することに困難を伴う場合があるが、本発明の方法によれば、このような問題を解消または軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】化合物（ａ）に対する各種嗅覚受容体の応答の測定結果を示す図である。
【図１Ｂ】化合物（ｂ）に対する各種嗅覚受容体の応答の測定結果を示す図である。
【図２Ａ】様々な濃度の化合物（ａ）に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７の応答の測定結果を示す図である。
【図２Ｂ】様々な濃度の化合物（ｂ）に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ｃ１の応答の測定結果を示す図である。
【図３Ａ】化合物（ｃ）に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７の応答の測定結果を示す図である。
【図３Ｂ】化合物（ｄ）に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ｃ１の応答の測定結果を示す図である。
【図３Ｃ】化合物（ｅ）に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ｃ１の応答の測定結果を示す図である。
【図３Ｄ】化合物（ｆ）に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ｃ１の応答の測定結果を示す図である。
【図３Ｅ】化合物（ｇ）に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ｃ１の応答の測定結果を示す図である。
【図４】各種化合物に対する嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１の応答の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明のスクリーニング方法について具体的に説明する。
【００１０】
本発明は、アンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含むことを特徴としている。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体に対する被験化合物の応答性を指標として、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択するものである。
一種の嗅覚受容体は類似構造を有する複数種の香気化合物に応答することが知られていることから、アンバーグリスノートを呈する既知の香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を特定し、その嗅覚受容体に対する被験化合物の応答性を評価することによって、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択することができる。なお、本明細書において「アンバーグリスノートを呈する香料素材」とは、アンバーグリスノートを呈する香料の素材となる化合物、組成物または混合物をいうものとする。以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について説明する。
【００１２】
＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）では、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する。
【００１３】
嗅覚受容体としては、ＯＲ７Ａ１７、ＯＲ７Ｃ１、および配列番号２または４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体が用いられる。
ＯＲ７Ａ１７は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿０３０９０１として登録されており、配列番号１で示される塩基配列の第１番目から第９３０番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質である。
ＯＲ７Ｃ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿１９８９４４として登録されており、配列番号３で示される塩基配列の第１番目から第９６３番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）からなるタンパク質である。
ＯＲ７Ａ１７は、化合物（ａ）および化合物（ｃ）に強く応答し、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｂ）、化合物（ｄ）、化合物（ｅ）、化合物（ｆ）および化合物（ｇ）などに選択的に強く応答することから、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１を用いたスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する香料素材の開発に貢献できるものと期待される。
【００１４】
嗅覚受容体としてこれらの嗅覚受容体が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアンバーグリスノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体を用いてもよい。なお、本明細書においてアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩより公に入手できる）によって算出される。
【００１５】
本発明において、アンバーグリスノートを呈する香料としては、次式で示される化合物からなる群より選択される一種以上が好ましく挙げられる。
【００１６】
【化２】
2018190118.tif 000003
【００１７】
化合物（ａ）（３ａＲ，５ａＳ，９ａＳ，９ｂＲ）−３ａ，６，６，９ａ−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，４，５，５ａ，７，８，９，９ｂ−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−１Ｈ−ｂｅｎｚｏ［ｅ］［１］ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎは、ＡＭＢＲＯＸＡＮ（登録商標）という名称で知られており、花王株式会社より入手可能である。
化合物（ｂ）（２，２，６，６，７，８，８−ｈｅｐｔａｍｅｔｈｙｌ−３，３ａ，４，５，５ａ，７，８ａ，８ｂ−ｏｃｔａｈｙｄｒｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｇ］［１］ｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）は、Ａｍｂｅｒ  Ｘｔｒｅｍｅ（商標）という名称で知られる香料の主成分であり、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社より入手可能である。
化合物（ｃ）（１−（１，２，３，４，５，６，７，８−ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２，３，８，８，−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈｙｌ）ｅｔｈａｎ−１−ｏｎｅ）は、ＯＲＢＩＴＯＮＥ（登録商標）という名称で知られており、高砂香料工業株式会社より入手可能である。
化合物（ｄ）（１Ｒ，６Ｓ）−（１−（２，２，６−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ）ｈｅｘａｎ−３−ｏｌ）は、Ａｍｂｅｓｔｏｌ（登録商標）またはＮＯＲＬＩＭＢＡＮＯＬ（登録商標）  ＤＥＸＴＲＯという名称で知られており、高砂香料工業株式会社またはＦｉｒｍｅｎｉｃｈ社より入手可能である。
化合物（ｅ）（ ２−（２，２，７，７−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［６．２．１．０］（１，６）ｕｎｄｅｃ−５−ｅｎ−５−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎ−１−ｏｌおよび２−（２，２，７，７−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｒｉｃｙｃｌｏ［６．２．１．０］（１，６）ｕｎｄｅｃ−  ４−ｅｎ−５−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎ−１−ｏｌの異性体混合物）は、ＡＭＢＥＲＭＡＸ（登録商標）という名称で知られており、Ｇｉｖａｕｄａｎ社より入手可能である。
化合物（ｆ）（（４ａＲ，５Ｒ，７ａＳ，９Ｒ）−Ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２，２，５，８，８，９ａ−ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌ−４Ｈ−４ａ，９−ｍｅｔｈａｎｏｚｕｌｅｎｏ［５，６−ｄ］−１，３−ｄｉｏｘｏｌｅ）は、ＡＭＢＲＯＣＥＮＩＤＥ（商標）という名称で知られており、Ｓｙｍｒｉｓｅ社より入手可能である。
化合物（ｇ）（３，８，８，  １１ａ−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｄｏｄｅｃａｈｙｄｒｏ−５Ｈ−３，５ａ−ｅｐｏｘｙ−ｎａｐｈｔ（２，  １−ｃ）  ｏｘｅｐｉｎ  ａｎｄ  ｉｓｏｍｅｒｓ）は、ＡＭＢＥＲＫＥＴＡＬという名称で知られており、Ｇｉｖａｕｄａｎ社より入手可能である。
【００１８】
これらの中でも、アンバーグリスノートを呈する香料としては、化合物（ａ）、化合物（ｂ）、化合物（ｃ）および化合物（ｅ）がより好ましく、化合物（ａ）および化合物（ｅ）が特に好ましい。なお、本明細書において「応答性を示す」とは、嗅覚受容体発現細胞において、香料非存在下と比較して何らかの変化が見られることを意味する。
【００１９】
嗅覚受容体は、一種で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
本発明において嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されない。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で被験化合物と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で被験化合物と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよい。嗅覚受容体と被験化合物を接触させる時間は、被験化合物の濃度にも依存するため一概には言えないが、通常、２〜４時間である。
【００２１】
嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、嗅覚受容体と共に、ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込んでもよい。ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込むことにより、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができる。
ウシロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０１４８９０として登録されている。ウシロドプシンは、配列番号５で示される塩基配列の第１番目から第１０４７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）からなるタンパク質である。
また、ウシロドプシンに代えて、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができるタンパク質を用いてもよい。
なお、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進できるものであれば、ウシロドプシンに限らず、他のタンパク質のアミノ酸残基を用いてもよい。
【００２３】
嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されなく、当分野で用いられている任意の方法を用いることができる。例えば、香気化合物が嗅覚受容体へ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換し、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、ｃＡＭＰ量を測定することで嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が用いられる。中でも、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定することが好ましい。
【００２４】
＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）では、被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する。
嗅覚受容体の応答を測定する方法は、嗅覚受容体と被験化合物を接触させないことを除いて、工程（ｉ）で示した方法と同様の方法を用いることができる。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよい。工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定結果を適切に比較するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定条件は、被験化合物の接触の有無を除いて、同じであることが好ましい。
【００２５】
＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として選択する。
本発明では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して応答性に変化が見られた場合、工程（ｉ）で用いた被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として評価することができる。
本発明の一実施態様によれば、応答性の変化は、工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値を指標として評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定する場合、Ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは１０以上の被験化合物を、アンバーグリスノートを呈する候補化合物として評価することができる。
【００２６】
上記のようにして、被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物をスクリーニングすることができる。本発明によれば、人間の嗅覚によって行う官能評価による嗅覚疲労や個人差などによる問題を生じることなく、多数の被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択することができる。
選択された化合物は、アンバーグリスノートを呈する香料素材の候補化合物として用いることができる。選択された化合物を基に必要に応じて改変等を行い、最適な匂いのする化合物を開発することもできる。さらには、選択された化合物を他の香料素材とブレンドして最適な匂いのする香料素材を開発することも可能である。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。【００２８】
［実施例１］
アンバーグリスノートを呈する香料化合物（ａ）および化合物（ｂ）に応答する嗅覚受容体の探索
（１）嗅覚受容体遺伝子クローニング
ヒト嗅覚受容体ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ：  Ｆｅｍａｌｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）よりＰＣＲ法にてクローニングすることで得た。ｐＭＥ１８ＳベクターにウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込み、さらにその下流に、得られたヒト嗅覚受容体遺伝子を組み込むことで、ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクターを得た。【００２９】
（２）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での嗅覚受容体遺伝子の発現
ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクター０．０５μｇ、ＲＴＰ１Ｓベクター０．０１μｇ、ｃＡＭＰ応答配列プロモーターを含むホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．２９（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．０１μｇ、およびチミジンキナーゼプロモーターを含むウミシイタケルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．７４（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．００５μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）１０μＬに溶解して遺伝子溶液（１穴分）とした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４時間後にコンフルエントに達する細胞数で９６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００の使用法に従ってリポフェクション法によって遺伝子溶液を各穴に添加して、細胞に遺伝子導入を行い、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で２４時間培養した。【００３０】
（３）ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ
培養液を除去した後に、検体となる香料化合物を測定する濃度になる様にＣＤ２９３（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地（２０μＭ  Ｌ−グルタミン添加）で調製したものを５０μＬずつ添加し、３時間の刺激を行った後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の使用方法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。嗅覚受容体の応答強度は、香料化合物の刺激によって生じたルシフェラーゼ活性を、香料化合物を含まない試験系で生じたルシフェラーゼ活性で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値で表現した。【００３１】
（４）化合物（ａ）および化合物（ｂ）に対する嗅覚受容体応答の測定
ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１を発現させた細胞で、化合物（ａ）（花王株式会社）１００μＭおよび化合物
（ｂ）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒｓ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社）３００μＭに対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図１ＡおよびＢにそれぞれ示す。化合物（ａ）に対してはＯＲ７Ａ１７のみが、化合物（ｂ）に対してはＯＲ７Ｃ１のみが、Ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値１０以上の応答を示した。
一方で、嗅覚受容体を発現させなかった細胞を用いたＭｏｃｋ試験、および米国特許出願公開第２０１５／０２６０７０７号明細書にアンバーグリス香料化合物への応答が記載されているＯＲ２Ｌ８およびＯＲ４Ｋ５は、Ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値１０以上の応答を示さなかった。
なお、ＯＲ２Ｌ８は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００１９６３として登録されており、配列番号７で示される塩基配列の第１番目から第９３９番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）からなるタンパク質である。またＯＲ４Ｋ５は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００５４８３として登録されており、配列番号９で示される塩基配列の第１番目から第９７２番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）からなるタンパク質である。【００３２】
また、ＯＲ７Ａ１７の、様々な濃度の化合物（ａ）に対する受容体応答、およびＯＲ７Ｃ１の、様々な濃度の化合物（ｂ）に対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図２ＡおよびＢにそれぞれ示す。ＯＲ７Ａ１７は化合物（ａ）に、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｂ）に対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ７Ａ１７は化合物（ａ）に対して、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｂ）に対して、特異的に応答することが示された。【００３３】
［実施例２］
アンバーグリス香料化合物に対するＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１の応答強度の評価
化合物（ａ）または化合物（ｂ）に対して強い応答を示したＯＲ７Ａ１７またはＯＲ７Ｃ１を用いて、アンバーグリスノートを呈する香料化合物である化合物（ｃ）（高砂香料株式会社）、化合物（ｄ）（高砂香料工業株式会社）、化合物（ｅ）（Ｇｉｖａｕｄａｎ社より５０％Ｄｏｗａｎｏｌ  ＴＰＭ希釈品として入手）、化合物（ｆ）（Ｓｙｍｒｉｓｅ社より１０％ＴＥＣ希釈品として入手）および化合物（ｇ）（Ｇｉｖａｕｄａｎ社より８．５％ＩＰＭ希釈品として入手）に対する応答強度を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図３Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥにそれぞれ示す。ＯＲ７Ａ１７は化合物（ｃ）に対して、ＯＲ７Ｃ１は化合物（ｄ）、化合物（ｅ）、化合物（ｆ）および化合物（ｇ）に対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１は各種アンバーグリス香料化合物に特異的に応答することが示された。【００３４】
［実施例３］
様々な香調の香料化合物に対するＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１の応答強度の評価
前出のアンバーグリスノート香料化合物（ａ）、化合物（ｃ）、化合物（ｄ）、化合物（ｂ）、化合物（ｅ）、化合物（ｆ）および化合物（ｇ）に加えて、比較として様々な香調の表１に記載の非アンバーグリスノート香料化合物に対する、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１の応答強度を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。各化合物の濃度は、細胞毒性やＭｏｃｋ試験系での受容体非特異的な応答を示さない条件とした。【００３５】
【表１】
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【００３６】
なお、表１に記載の非アンバーグリスノート香料化合物は、以下のものを使用した。
Ｄ−Ｌｉｍｏｎｅｎｅ（ナカライテスク株式会社）
Ｃｉｓ−３−Ｈｅｘｅｎｏｌ（日本ゼオン株式会社）
Ｍｅｌｏｎａｌ（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）
Ｌ−Ｍｅｎｔｈｏｌ（高砂香料工業株式会社）
Ｌｉｎａｌｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ（東京化成工業株式会社）
Ｖａｎｉｌｌｉｎ（東京化成工業株式会社）
Ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ（Ｒｅｎｅｓｓｅｎｚ社）
ＴＨＥＳＡＲＯＮ（登録商標）、（１Ｒ，６Ｓ）−Ｅｔｈｙｌ  ２，２，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（高砂香料工業株式会社）
ＣＡＬＯＮＥ（登録商標）、７−Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎ−３−ｏｎｅ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社）
ＨＩＮＤＩＮＯＬ（登録商標）、（Ｒ，Ｅ）−２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−（２，２，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｅｎｔ−３−ｅｎｙｌ）ｂｕｔ−２−ｅｎ−１−ｏｌ）（高砂香料工業株式会社）
ＪＡＶＡＮＯＬ（登録商標）、［（１Ｒ，２Ｓ）−１−ｍｅｔｈｙｌ−２−［［（１Ｒ，３Ｓ，５Ｓ）−１，２，２−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−３−ｂｉｃｙｃｌｏ［３．１．０］ｈｅｘａｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌ］ｍｅｔｈａｎｏｌ（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）
Ｌ−Ｍｕｓｃｏｎｅ、（Ｒ）−３−ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｄｅｃａｎ−１−ｏｎｅ（高砂香料工業株式会社）【００３７】
結果を図４に示す。ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１はアンバーグリスノートを呈する７種の化合物のいずれかに応答し、その他の香調の化合物に対しては応答しなかった。すなわち、ＯＲ７Ａ１７およびＯＲ７Ｃ１はアンバーグリスノート香料化合物に特異的に応答することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、多数の被験化合物の中からアンバーグリスノートを呈する候補化合物を選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、アンバーグリスノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献できるものと期待される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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