(57)【要約】ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないハイドロゲルを原料として使用できる糸の製造方法を提供する。前記製造方法により得られ、優れた強度を有する糸を提供する。糸の製造方法は、柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、をこの順に備える方法である。糸は、ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、
前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、
前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、
をこの順に備える糸の製造方法。
【請求項２】
前記工程Ｃの後、さらに、前記糸状ビトリゲルを再ガラス化して、糸状ビトリゲル乾燥体を得る工程Ｄを備える請求項１に記載の糸の製造方法。
【請求項３】
前記工程Ｄの後、さらに、前記糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射する工程Ｅを備える請求項１又は２に記載の糸の製造方法。
【請求項４】
前記工程Ｅの後、さらに、紫外線を再照射された前記糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる工程Ｆを備える請求項１〜３のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
【請求項５】
前記ハイドロゲルが、アテロコラーゲンゲルである請求項１〜４のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
【請求項６】
前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸である請求項１〜５のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
【請求項７】
前記糸は、細胞移植用担体である請求項１〜５のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
【請求項８】
前記糸は、結膜瘻孔部の補填材である請求項１〜７のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
【請求項９】
前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤である請求項１〜５のいずれか一項に記載の糸の製造方法。
【請求項１０】
ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸された糸。
【請求項１１】
前記糸の破断強度が０．１ｋｇｆ以上である請求項１０に記載の糸。
【請求項１２】
前記糸の破断強度が０．２ｋｇｆ以上である請求項１０又は１１に記載の糸。
【請求項１３】
前記ビトリゲル乾燥体がアテロコラーゲンビトリゲル乾燥体である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の糸。
【請求項１４】
前記疎水性溶媒がシリコンオイルである請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の糸。
【請求項１５】
前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸である請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の糸。
【請求項１６】
前記糸は、細胞移植用担体である請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の糸。
【請求項１７】
前記糸は、結膜瘻孔部の補填材である請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の糸。
【請求項１８】
前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤である請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の糸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸及びその製造方法に関する。
本願は、２０１７年５月１８日に、日本に出願された特願２０１７−０９８９３１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、これまで、アテロコラーゲンビトリゲル膜を開発し、皮膚、角膜、気管、関節軟骨、鼓膜及び食道等の損傷組織を再生できることを実証してきた。この過程で、アテロコラーゲンビトリゲル膜は、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する生体適合性素材であることが明らかとなった。【０００３】
このような背景のもと、皮膚の組織再生に有用なアテロコラーゲンビトリゲル膜は、既に製薬企業等にて医療機器としての研究開発が進められている。一方、日本において使用可能なアテロコラーゲンを原料とする人工真皮としては、インテグラ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、テルダーミス（登録商標）（テルモ社製）及びペルナック（登録商標）（グンゼ社製）の３製品が存在する。これらの人工真皮は、アテロコラーゲンスポンジとシリコン膜とから構成された真皮再建用のテンプレートである。これらのことから、アテロコラーゲンビトリゲルは再生医療分野での適用拡大を見込めることから、膜状のみならず、糸状についても開発が求められていた。【０００４】
一方、本発明者らは、これまで、ネイティブコラーゲンビトリゲルを、膜状、糸状、管状等の任意の形状に加工する技術を開発してきた（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２０４８８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、アテロコラーゲンゲルはネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないため、特許文献１に記載の方法では、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないアテロコラーゲン等のハイドロゲルを用いて、糸状のビトリゲルを製造することが困難であった。【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないハイドロゲルを原料として使用できる糸の製造方法を提供する。また、前記製造方法により得られ、優れた強度を有する糸を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、柱状のハイドロゲルに紫外照射を施して、ガラス化し、再水和することで糸状のアテロコラーゲンビトリゲルが製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る糸の製造方法は、
柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、
前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、
前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、
をこの順に備える方法である。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記工程Ｃの後、さらに、前記糸状ビトリゲルを再ガラス化して、糸状ビトリゲル乾燥体を得る工程Ｄを備えてもよい。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記工程Ｄの後、前記糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射する工程Ｅを備えてもよい。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記工程Ｅの後、さらに、紫外線を再照射された前記糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる工程Ｆを備えてもよい。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記ハイドロゲルが、アテロコラーゲンゲルであってもよい。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸であってもよい。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、細胞移植用担体であってもよい。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、結膜瘻孔部の補填材であってもよい。
上記第１態様に係る糸の製造方法において、前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤であってもよい。【００１０】
本発明の第２態様に係る糸は、ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。
前記糸の破断強度が０．１ｋｇｆ以上であってもよい。
前記糸の破断強度が０．２ｋｇｆ以上であってもよい。
前記ビトリゲル乾燥体がアテロコラーゲンビトリゲル乾燥体であってもよい。
前記疎水性溶媒がシリコンオイルであってもよい。
前記糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸であってもよい。
前記糸は、細胞移植用担体であってもよい。
前記糸は、結膜瘻孔部の補填材であってもよい。
前記糸は、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤であってもよい。
【発明の効果】
【００１１】
上記態様によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度がないハイドロゲルを原料として使用できる糸の製造方法を提供することができる。また、前記製造方法により得られ、優れた強度を有する糸を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】実施例１における各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１における破断強度を示すグラフである。
【図１Ｂ】実施例１における各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２における破断強度を示すグラフである。
【図１Ｃ】実施例１における各条件のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）における破断強度を示すグラフである。
【図２】実施例２におけるシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１を用いてマウス切開部を縫合した画像である。
【図３Ａ】実施例２における縫合７日目のシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（浸潤体１）を用いたマウス縫合部の組織切片をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色した結果を示す画像である。
【図３Ｂ】実施例２における縫合７日目のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（乾燥体３）を用いたマウス縫合部の組織切片をＨＥ染色した結果を示す画像である。
【図３Ｃ】実施例２における縫合７日目のシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（浸潤体１）を用いたマウス縫合部の組織切片を抗α平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ：α−ＳＭＡ）抗体による免疫染色した結果を示す画像である。
【図３Ｄ】実施例２における縫合７日目のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（乾燥体３）を用いたマウス縫合部の組織切片を抗αＳＭＡ抗体による免疫染色した結果を示す画像である。
【図４Ａ】実施例３における糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を補填材として用いてブタの結膜瘻孔部を塞いだ画像である。
【図４Ｂ】実施例３における従来の補填材であるプラスチックポートを用いてブタの結膜瘻孔部を塞いだ画像である。
【図５Ａ】実施例４における内皮細胞と共に培養した再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（再水和体１）の画像である。
【図５Ｂ】実施例４における線維芽細胞と共に培養した再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（再水和体１）の画像である。
【図５Ｃ】実施例４における線維芽細胞と共に培養した再水和させたポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（再水和体３）の画像である。
【図６Ａ】実施例５で用いられた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体（ＣＸＭ１及びＣＸＭ５）の画像である。
【図６Ｂ】実施例５における糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体のマウス腹腔内への挿入方法を示す図である。
【図６Ｃ】実施例５における糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体をマウス腹腔内へ挿入している様子を示す画像である。
【図７Ａ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目に開腹した各群のマウスの腹膜の様子を示す画像である。上図は開腹したマウスの腹部全体を示す画像であり、下図は腹膜を拡大した画像である。スケールバーは１ｃｍを示す。
【図７Ｂ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの組織切片のＨＥ染色像である。上図は壁側腹膜のＨＥ染色像であり、下図は臓側腹膜のＨＥ染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。
【図７Ｃ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの壁側腹膜の組織切片のアザン染色像である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図７Ｄ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの線維化した腹膜の中皮下結合織の厚さを示すグラフである。
【図８Ａ】実施例５における腹膜炎誘導後５６日目に開腹した各群のマウスの腹膜の様子を示す画像である。上図は開腹したマウスの腹部全体を示す画像であり、下図は腹膜を拡大した画像である。スケールバーは１ｃｍを示す。
【図８Ｂ】実施例５における腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスの組織切片のＨＥ染色像である。上図は壁側腹膜のＨＥ染色像であり、下図は臓側腹膜のＨＥ染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。
【図８Ｃ】実施例５における腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスの壁側腹膜の組織切片のアザン染色像である。スケールバーは２００μｍを示す。
【図８Ｄ】実施例５における腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスの線維化した腹膜の中皮下結合織の厚さを示すグラフである。
【図９】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片の各種抗体による免疫染色像である。抗サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３（ＣＫ  ＡＥ１／ＡＥ３）抗体、抗ビメンチン抗体及び抗Ｎ−カドヘリン抗体による免疫染色像のスケールバーは５０μｍを示す。抗結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）抗体及び抗α−ＳＭＡ抗体による免疫染色像のスケールバーは１００μｍを示す。
【図１０Ａ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片の各種抗体による免疫染色像である。スケールバーは５０μｍを示す。
【図１０Ｂ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの中皮下間質層（ｓｕｂｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｌａｙｅｒ：ＳＭＩＬ）中のＣＤ４５陽性細胞の数を示すグラフである。
【図１０Ｃ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスのＳＭＩＬ中のＦ４／８０陽性細胞の数を示すグラフである。
【図１０Ｄ】実施例５における腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスのＳＭＩＬ中の増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）陽性細胞の割合を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
≪糸の製造方法≫
＜第１実施形態＞
本発明の第１実施形態に係る糸の製造方法は、
柱状ハイドロゲルに紫外線を照射する工程Ａと、
前記紫外線照射後の柱状ハイドロゲルをガラス化して、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る工程Ｂと、
前記糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して、糸状ビトリゲルを得る工程Ｃと、
をこの順に備える方法である。
【００１４】
従来の製造方法では、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを用いて糸を製造することができなかった。
これに対し、本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料としても、糸を製造することができる。
以下、本実施形態の糸の製造方法の各工程について、詳細を説明する。
【００１５】
［工程Ａ］
まず、柱状ハイドロゲルに紫外線を照射し、柱状ハイドロゲルの強度を上げる。
工程Ａで用いられる柱状ハイドロゲルは、例えば、ゾルを所望の径となるように筒状の型等を用いて、ゲル化させて得られたものであればよい。また、ゲル化する際にゾルを保温する温度は、用いるゾルの種類に応じて適宜調整すればよい。例えば、ゾルがコラーゲンゾルである場合、ゲル化する際の保温は、用いるコラーゲンの動物種に依存したコラーゲンの変性温度より低い温度とすればよく、一般的には２０℃以上３７℃以下の温度で保温することで数分から数時間でゲル化を行うことができる。
【００１６】
なお、本明細書において、「ゾル」とは、液体を分散媒とする分散質のコロイド粒子（サイズ：約１〜数百ｎｍ程度）が、特に高分子化合物で構成されるものを意味する。ゾルとしてより具体的には、天然物高分子化合物や合成高分子化合物の水溶液である。そのため、これら高分子化合物の化学結合により架橋が導入されて網目構造をとった場合は、その網目に多量の水を保有した半固形状態の物質である、「ハイドロゲル」に転移する。すなわち、「ハイドロゲル」とは、ゾルをゲル化させたものを意味する。
また、「ビトリゲル」とは、従来のハイドロゲルをガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）した後に再水和して得られる安定した状態にあるゲルのことを指し、本発明者によって、「ビトリゲル（ｖｉｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）」と命名されている。
また、本明細書においては、本実施形態の製造工程を詳細に説明するにあたり、当該ガラス化工程の直後であり再水和の工程を経ていないハイドロゲルの乾燥体に対しては、単に「ハイドロゲル乾燥体」とした。そして、当該ガラス化工程の後に再水和の工程を経て得られたゲルを「ビトリゲル」として区別して表し、そのビトリゲルをガラス化させて得られた乾燥体を「ビトリゲル乾燥体」とした。また、ビトリゲル乾燥体に紫外線照射する工程を施して得られるものを「紫外線を再照射された糸状ビトリゲル乾燥体」とした。従って、「ビトリゲル」は水和体である。
【００１７】
また、柱状ハイドロゲルの原料となるゾルとしては、生体適合性を有する材料であればよく、例えば、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分、フィブリン、寒天、アガロース、セルロース等の天然高分子化合物、及びポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等の合成高分子化合物が挙げられる。
前記ゲル化する細胞外マトリックス由来成分としては、例えば、コラーゲン（I型、II型、III型、V型、XI型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（IV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられ、これらに限定されない。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択し所望のビトリゲルを製造することが可能である。また、原料を組み合わせることで、様々な生体内組織を模倣したビトリゲルを得ることができる。
中でも、ゾルとしては、ゲル化する細胞外マトリックス由来成分が好ましく、コラーゲンがより好ましい。また、コラーゲンの中でもより好ましい原料としては、ネイティブコラーゲン又はアテロコラーゲンを例示でき、アテロコラーゲンがさらに好ましい。すなわち、本工程において用いられるハイドロゲルとしては、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する生体適合性素材であることから、アテロコラーゲンゲルが特に好ましい。
また、上記例示されたゾルから得られるハイドロゲルは、その組成及び含有量によっては、ネイティブコラーゲンゲルと同等の強度を有するゲル、又は、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないゲルとなる。また、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のあるゲルとなってもよい。いずれの強度のハイドロゲルであっても、本実施形態の製造方法によれば、上記例示されたゾルから得られるハイドロゲルを原料として、糸を製造することができる。
【００１８】
なお、本明細書において「上皮化促進効果」とは、創傷部の治癒過程において、肉芽組織の形成を抑制し、さらに表皮細胞の増殖を促進することで、再生上皮の形成が促進されることを意味する。アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体からなる糸を縫合糸として使用することで、上皮化が促進されるため、従来よりも短期間での創傷部の治癒を期待できる。
また、「瘢痕形成抑制効果」とは、創傷部が治癒した後に残る痕（瘢痕）、いわゆる傷痕が形成されることを抑制する効果を意味する。アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体からなる糸を縫合糸として使用することで、傷痕を残さずに創傷部を治療することができる。
【００１９】
本工程における柱状ハイドロゲルへの紫外線の照射エネルギーは、ハイドロゲルが続く工程Ｂにおいて、例えば柱状ハイドロゲルを吊るした状態でガラス化を行った場合に、切断されない程度の強度となればよく、ハイドロゲルの組成及び含有量に応じて適宜調整すればよい。柱状ハイドロゲルへの紫外線の照射エネルギーは、例えば０．１ｍＪ／ｃｍ２以上６０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１０ｍＪ／ｃｍ２以上４０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１００ｍＪ／ｃｍ２以上３０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよい。
また、柱状ハイドロゲルへの紫外線の照射は、柱状ハイドロゲルの全面に紫外線が照射されるように、紫外線の照射部位を、柱状ハイドロゲルの一方の面と他方の面と（例えば、「上面と下面と」、又は、「表面と裏面と」等）に分けて照射して、その総照射量を、柱状ハイドロゲルへの単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。
【００２０】
［工程Ｂ］
次いで、紫外線照射後の柱状ハイドロゲルを乾燥し、ガラス化させることで、糸状ハイドロゲル乾燥体を得る。
柱状ハイドロゲルを乾燥させることにより、柱状ハイドロゲル内の自由水を完全に除去し、さらに結合水の部分除去を進行させることができる。
このガラス化工程（柱状ハイドロゲル内の自由水を完全に除去した後に、結合水の部分除去を進行させる工程）の期間を長くするほど、再水和した際には透明度、強度に優れた糸状ビトリゲルを得ることができる。なお、必要に応じて短期間のガラス化後に再水和して得た糸状ビトリゲルをＰＢＳ等で洗浄し、再度ガラス化することもできる。
【００２１】
乾燥方法としては、例えば、風乾、密閉容器内で乾燥（容器内の空気を循環させ、常に乾燥空気を供給する）、シリカゲルを置いた環境下で乾燥する等、種々の方法を用いることができる。例えば、風乾の方法としては、１０℃、４０％湿度で無菌に保たれたインキュベーターで２日間乾燥させる、又は、無菌状態のクリーンベンチ内で一昼夜、室温で乾燥する等の方法を例示することができる。
また、本工程において、上述の工程Ａで紫外線を照射させたことで、柱状ハイドロゲルは適度な強度を有するため、乾燥の際に、物干し等に吊り下げた状態で効率的に乾燥させることができる。
【００２２】
［工程Ｃ］
次いで、得られた糸状ハイドロゲル乾燥体を再水和して糸状ビトリゲルを得る。
このとき、生理食塩水、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）等を用いて、再水和させればよい。
【００２３】
＜第２実施形態＞
本発明の第２実施形態に係る糸の製造方法は、前記工程Ｃの後、さらに、前記糸状ビトリゲルを再ガラス化して、糸状ビトリゲル乾燥体を得る工程Ｄを備える方法である。
【００２４】
本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料としても、糸を製造することができる。
工程Ａ〜工程Ｃについては、上述の第１実施形態に記載のとおりである。本実施形態における工程Ｄについて、以下に詳細を説明する。
【００２５】
［工程Ｄ］
次いで、得られた糸状ビトリゲルを乾燥し、再度ガラス化する。
乾燥方法としては、上記工程Ｂで例示された方法と同様の方法が挙げられる。
また、本工程において、糸状ビトリゲルは適度な強度を有するため、乾燥の際に、物干し等に吊り下げた状態で効率的に乾燥させることができる。
【００２６】
＜第３実施形態＞
本発明の第３実施形態に係る糸の製造方法は、前記工程Ｄの後、さらに、前記糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射する工程Ｅを備える方法である。
【００２７】
本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料としても、糸を製造することができる。また、本実施形態の製造方法により得られる糸は、優れた強度を有する。
工程Ａ〜工程Ｄについては、上述の第１実施形態及び第２実施形態に記載のとおりである。本実施形態における工程Ｅについて、以下に詳細を説明する。
【００２８】
［工程Ｅ］
次いで、得られた糸状ビトリゲル乾燥体に紫外線を再照射して、糸状ビトリゲル乾燥体の強度をさらに上げる。
【００２９】
本工程における糸状ビトリゲル乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、糸状ビトリゲル乾燥体が縫合糸等で使用した場合に切断されない程度の強度となればよく、糸状ビトリゲル乾燥体の組成及び含有量に応じて適宜調整すればよい。糸状ビトリゲル乾燥体への紫外線の照射エネルギーは、例えば０．１ｍＪ／ｃｍ２以上６０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１０ｍＪ／ｃｍ２以上４０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよく、例えば１００ｍＪ／ｃｍ２以上３０００ｍＪ／ｃｍ２以下であればよい。
また、糸状ビトリゲル乾燥体への紫外線の照射は、糸状ビトリゲル乾燥体の全面に紫外線が照射されるように、紫外線の照射部位を、糸状ビトリゲル乾燥体の一方の面と他方の面と（例えば、「上面と下面と」、又は、「表面と裏面と」等）に分けて照射して、その総照射量を、糸状ビトリゲル乾燥体への単位面積あたりの紫外線総照射量としてもよい。
【００３０】
＜第４実施形態＞
本発明の第４実施形態に係る糸の製造方法は、前記工程Ｅの後、さらに、紫外線が再照射された前記糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる工程Ｆを備える方法である。
【００３１】
本実施形態の製造方法によれば、ネイティブコラーゲンゲルよりも強度のないハイドロゲルを原料として糸を製造することができる。また、本実施形態の製造方法により得られる糸は、疎水性溶媒が潤滑剤として作用することで、しなやかさが増しており、且つ、疎水性溶媒を含むことで、水系溶媒の存在下においても強度を保つことができる。
工程Ａ〜工程Ｅについては、上述の第１実施形態、第２実施形態及び第３実施形態に記載のとおりである。本実施形態における工程Ｆについて、以下に詳細を説明する。
【００３２】
［工程Ｆ］
次いで、紫外線再照射後の糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を付着又は含浸させる。これにより、糸状ビトリゲル乾燥体のしなやかさが増して、縫合糸等の用途で用いる際に、疎水性溶媒が潤滑剤として働き、裂傷部をひっかかりなく、なめらかに縫合することができる。また、疎水性溶媒を糸状ビトリゲル乾燥体の表面上に付着させる、又は、表面直下から内部へと含侵させることで、縫合部において体液等による再水和による強度の低下が防止され、糸の強度が維持される。
なお、ここでいう「付着させる」とは、疎水性溶媒を糸状ビトリゲル乾燥体の表面にくっつかせることを意味し、「含浸させる」とは疎水性溶媒を糸状ビトリゲル乾燥体の表面直下から内部へと染み込ませることを意味する。
【００３３】
本工程において用いられる疎水性溶媒としては、生体適合性を有するものであればよく、公知の医療用途で用いられる疎水性溶媒が例示される。疎水性溶媒として具体的には、例えば、医療用パラフィン；植物、海産物、又は動物源からの液状油（例えば、オリーブオイル、コーン油、大豆油、キャノーラ油、綿実油、ヤシ油、胡麻油、ヒマワリ油、ルリヂサ種子油、チョウジ油、麻実油、ニシン油、タラ肝油、サケ油、アマニ油、麦芽油、マツヨイグサ油、及びそれらの任意の割合の混合物等）；リノール及びリノレン酸、γ -リノール酸（ＧＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、並びにドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）等のω−３及びω−６脂肪酸を含む多価不飽和油；バラ、チャノキ、メボウキ、カンファー、カルダモン、ニンジン、コウスイガヤ、オニサルビア（クラリー）、セージ、チョウジ、イトスギ、乳香、ショウガ、グレープフルーツ、ヒソップ、ジャスミン、ラベンダー、レモン、マンダリン、マヨラナ、没薬、ネロリ油、ナツメグ、プチグレン、セージ、タンジェリン、バニラ、及びバーベナ等由来の精油；トリグリセリドオイル、シリコンオイル等が挙げられ、これらに限定されない。これら疎水性溶媒を単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
中でも、疎水性溶媒としては、シリコンオイルであることが好ましい。シリコンオイルは変性されていないものであってもよく、変性されたものであってもよい。シリコンオイルとしてより具体的には、例えば、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリジフェニルシロキサン、ポリメチルハイドロジェンシロキサン等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３４】
疎水性溶媒を付着又は含浸させる温度は、特別な限定はなく、例えば１０℃以上４０℃以下であればよい。
疎水性溶媒を付着又は含浸させる時間は、特別な限定はなく、例えば３０分以上４８時間以下であればよい。
疎水性溶媒を付着又は含浸させる方法としては、例えば、疎水性溶媒に糸状ビトリゲル乾燥体を浸漬させる方法、糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を塗布する方法、糸状ビトリゲル乾燥体に疎水性溶媒を噴霧する方法等が挙げられ、これらに限定されない。
【００３５】
＜用途＞
本実施形態の製造方法により得られた糸は、後述の実施例に示すとおり、例えば、組織再生糸、細胞移植用担体等として用いることができる。又は、本実施形態の製造方法により得られた糸は、後述の実施例に示すとおり、硝子体手術の際に治療機器を硝子体内に挿入するために作製する結膜瘻孔部の補填材として用いることができる。又は、本実施形態の製造方法により得られた糸は、後述の実施例に示すとおり、腹腔内へ挿入して腹膜炎及び腹膜線維化を抑制する留置材として用いることができる。
【００３６】
≪糸≫
本発明の一実施形態に係る糸は、ビトリゲル乾燥体からなり、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。
【００３７】
本実施形態の糸は、ビトリゲル乾燥体から構成されながらも、優れた強度を有するため、縫合糸等として利用することができる。また、本実施形態の糸は、疎水性溶媒が潤滑剤として作用することで、しなやかさが増しており、且つ、疎水性溶媒を含むことで、水系溶媒の存在下においても強度を保つことができる。そのため、本実施形態の糸を縫合糸として用いた場合において、手術後に縫合部が離開することなく、維持される。
【００３８】
＜物性＞
本実施形態の糸の横断面の形状は、特別な限定はなく、例えば、三角形、四角形（正方形、長方形、台形含む）、五角形、六角形、七角形、八角形等の多角形；円形、楕円形、略円形、楕円形、略楕円形、半円形、扇形等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、糸の横断面の形状は、円形であることが好ましい。
また、本実施形態の糸の横断面の形状が円形である場合、その平均直径は、用途に応じて適宜選択すればよい。糸の平均直径としては、例えば１μｍ以上１ｍｍ以下であればよく、例えば３μｍ以上９００μｍ以下であればよい。
【００３９】
本実施形態の糸の破断強度は、縫合糸等の用途で用いた場合に切断しない程度の強度であればよい。糸の破断強度として具体的には、例えば０．１ｋｇｆ以上であればよく、例えば０．２ｋｇｆ以上であればよい。糸の破断強度の下限値が上記範囲以上であることにより、縫合糸等の用途で用いた場合に切断しない程度の強度を有することができる。
なお、糸の破断強度の測定方法は、以下のとおりである。
デジタルフォースゲージ（日本電産シンポ社製）を使用して、糸を全長５ｃｍに切断した後に両端の１ｃｍを固定して、毎分９ｍｍで引っ張った時の破断強度（ｋｇｆ）を測定すればよい。
次いで、本実施形態の糸の構成成分について、以下に詳細を説明する。
【００４０】
＜ビトリゲル乾燥体＞
本実施形態の糸は、ビトリゲル乾燥体からなる。
ビトリゲル乾燥体の原料となるゾルとしては、上述の糸の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の糸を構成するビトリゲル乾燥体としては、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する生体適合性素材であることから、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体であることが好ましい。
【００４１】
＜疎水性溶媒＞
本実施形態の糸は、疎水性溶媒が付着又は含浸されている。
疎水性溶媒としては、上述の糸の製造方法において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、本実施形態の糸に含まれる疎水性溶媒としては、シリコンオイルであることが好ましい。
【００４２】
＜用途＞
本実施形態の糸は、後述の実施例において示すとおり、優れた強度を有し、且つ、体液等が存在してもその強度が維持されることから縫合糸として有用である。さらに、本実施形態の糸を縫合糸として使用した場合に、創傷部において組織の再生が促進され、且つ、瘢痕が形成されない。すなわち、本実施形態の糸は、縫合糸として使用可能な組織再生糸として有用である。
特に、本実施形態の糸が、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体で構成される場合、創傷部における上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有することから、組織再生糸として好適である。
なお、本明細書において、「組織再生糸」とは、縫合部における組織の再生を促進する糸を意味する。ここで、「組織の再生の促進」とは、具体的には、創傷部の治癒過程における創収縮の促進、肉芽組織の形成抑制、表皮細胞の増殖による再生上皮の形成促進等を示す。
【００４３】
また、本実施形態の糸は、後述の実施例において示すとおり、優れた細胞接着性及び細胞増殖性を有する。このことから、本実施形態の糸を用いて所望の細胞を培養し、当該細胞が接着された状態の糸を被検体の生体に移植することができる。すなわち、本実施形態の糸は、細胞移植用担体として有用である。
【００４４】
また、本実施形態の糸は、後述の実施例において示すとおり、硝子体手術の際に治療機器を硝子体内に挿入するために作製する結膜瘻孔部の補填材として有用である。
【００４５】
また、本実施形態の糸が、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体で構成される場合、後述の実施例に示すとおり、壁側腹膜及び臓側腹膜の炎症及び線維化に対して抑制作用を有する。さらに、臓側腹膜（腸管同士）の癒着に対して抑制作用を有する。また、本実施形態の糸は、生体内に留置しても安全であり、腹膜以外の組織においても同様に炎症抑制作用又は線維化抑制作用を有すると考えられる。すなわち、本実施形態の糸は、炎症抑制剤又は線維化抑制剤（特に、腹膜炎抑制剤又は腹膜線維化抑制剤）として有用である。また、本実施形態の糸は、腸管癒着抑制剤として有用である。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４７】
［製造例１］糸の製造
（１）柱状アテロコラーゲンゲルの調製
まず、１．０％ブタアテロコラーゲン溶液（関東化学社製）と無血清培養液とを等量混和した０．５％のブタ由来アテロコラーゲン溶液を調製した。次いで、調製したアテロコラーゲン溶液を１ｍＬピペット内に１．４ｍＬ、５ｍＬピペット内に７ｍＬ、それぞれ吸い込ませた。次いで、各ピペットの両端をパラフィルムで密閉し、細胞培養用インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で２時間静置し、ゲル化させて、柱状アテロコラーゲンゲルを調製した。【００４８】
（２）柱状アテロコラーゲンゲルへの紫外線照射
次いで、各ピペットの両端からパラフィルムを除去した。ピペット内から柱状アテロコラーゲンゲルを取り出し、ビニールシートが敷かれた平面状のトレイの上に直線的に張った状態で静置した。次いで、紫外線を照射し（照射エネルギー：８００ｍＪ／ｃｍ２）、柱状アテロコラーゲンゲルを反転させて、再度紫外線を照射した（照射エネルギー：８００ｍＪ／ｃｍ２）。合計の紫外線照射エネルギーは、１６００ｍＪ／ｃｍ２であった。【００４９】
（３）糸状アテロコラーゲンゲル乾燥体の調製
次いで、紫外線が照射された柱状アテロコラーゲンゲルの一端をポリプロピレン樹脂製の物干しの縁に固定して吊るした。次いで、温度１０℃、湿度４０％の条件の恒温恒湿機を備えた簡易クリーンベンチ内で、充分に風乾して、吊るされた状態の柱状アテロコラーゲンゲルをガラス化させて、糸状アテロコラーゲンゲル乾燥体を調製した。【００５０】
（４）糸状アテロコラーゲンビトリゲルの調製
次いで、得られた糸状アテロコラーゲンゲル乾燥体をＰＢＳで再水和し、糸状アテロコラーゲンビトリゲルを調製した。【００５１】
（５）糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の調製
次いで、得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲルの一端をポリプロピレン樹脂製の物干しの縁に固定して吊るした。次いで、温度１０℃、湿度４０％の条件の恒温恒湿機を備えた簡易クリーンベンチ内で、充分に風乾して、吊るされた状態の糸状アテロコラーゲンゲルを再ガラス化させて、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を調製した。【００５２】
（６）糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体への紫外線照射
次いで、得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を平面状のトレイの上に直線的に張った状態で静置した。次いで、紫外線を照射し（照射エネルギー：４００ｍＪ／ｃｍ２）、糸状アテロコラーゲンゲルを反転させて、再度紫外線を照射した（照射エネルギー：４００ｍＪ／ｃｍ２）。合計の紫外線照射エネルギーは、８００ｍＪ／ｃｍ２であった。
得られた紫外線照射後の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の平均直径について、１ｍＬのピペットを用いて製造されたもの（以下、「糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１」と称する場合がある）は、１４８±４２μｍであり、５ｍＬのピペットを用いて製造されたもの（以下、「糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２」と称する場合がある）は、４４４±３０μｍであった。【００５３】
［実施例１］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の破断強度確認試験
製造例１で製造された糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２の破断強度を測定した。
測定対象として、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（以下、「乾燥体１」と称する場合がある）、乾燥体１を再水和した糸状アテロコラーゲンビトリゲル（以下、「再水和体１」と称する場合がある）、シリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１（以下、「浸潤体１」と称する場合がある）、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２（以下、「乾燥体２」と称する場合がある）、乾燥体２を再水和した糸状アテロコラーゲンビトリゲル（以下、「再水和体２」と称する場合がある）及びシリコンオイルを浸潤させた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２（以下、「浸潤体２」と称する場合がある）を準備した。
また、対照として、ポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（７−０、縫合糸の規格の平均直径：５０〜６９μｍ程度）（以下、「乾燥体３」と称する場合がある）、乾燥体３を再水和したバイクリル（登録商標）（以下、「再水和体３」と称する場合がある）及びシリコンオイルを浸潤させたバイクリル（登録商標）（以下、「浸潤体３」と称する場合がある）も準備した。【００５４】
また、破断強度の具体的な測定方法としては、デジタルフォースゲージ（日本電産シンポ社製）を使用して、全長５ｃｍに切断した後に両端の１ｃｍを固定して、毎分９ｍｍで引っ張った時の破断強度（ｋｇｆ）を計測した。結果を図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃに示す。
図１Ａは、各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１における破断強度、図１Ｂは各条件の糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２における破断強度、及び、図１Ｃは各条件のポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）における破断強度を示したものである。【００５５】
図１Ａ〜図１Ｃから、乾燥体１及び浸潤体１は、対照であるバイクリル（登録商標）の乾燥体３、再水和体３及び浸潤体３とほぼ同等の破断強度であることが確かめられた。一方、再水和体１及び再水和体２は、破断強度が０．１ｋｇｆよりも小さかった。
また、乾燥体２及び浸潤体２は破断強度が１ｋｇｆよりも大きく、対照であるバイクリル（登録商標）の乾燥体３、再水和体３及び浸潤体３よりも優れた強度を有することが確かめられた。これは、平均直径の大きさに由来するものであると推察された。【００５６】
［実施例２］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いたマウス切開部の縫合試験
製造例１で得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１をシリコンオイルで浸潤させたもの（浸潤体１）が手術用に耐えうる強度であることを確かめるために、マウス表皮切開部の縫合試験を行った。縫合を行った当日のマウスの画像を図２に示す。【００５７】
図２から、浸潤体１は縫合糸としての強度を充分に有し、手術後に創部離開を来さないことが確かめられた。【００５８】
また、縫合７日目の縫合部の組織切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色及び抗α平滑筋アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ：α−ＳＭＡ）抗体を用いた免疫染色を行った。ＨＥ染色の結果を図３Ａに、抗α−ＳＭＡ抗体による免疫染色による結果を図３Ｃに示す。
さらに、対照としてポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）（７−０、縫合糸の規格の平均直径：５０〜６９μｍ程度）（乾燥体３）を用いてマウス表皮切開部の縫合試験を行った。浸潤体１を用いた場合と同様に、縫合７日目の縫合部の組織切片を作製し、ＨＥ染色及び抗α−ＳＭＡ抗体を用いた免疫染色を行った。ＨＥ染色の結果を図３Ｂに、抗α−ＳＭＡ抗体による免疫染色による結果を図３Ｄに示す。【００５９】
図３Ａ及び図３Ｂから、浸潤体１を用いた縫合部では、乾燥体３と同様に、良好に結紮され、組織同士の結合が確認された。
さらに、図３Ｃ及び図３Ｄから、乾燥体３を用いた場合と比較して、浸潤体１を用いた場合では、瘢痕形成の主体となるαＳＭＡ陽性の筋線維芽細胞数が、縫合部周囲で圧倒的に少ないことが明らかとなった。【００６０】
［実施例３］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いたブタ結膜瘻孔部の補填試験
製造例１で得られた糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２（乾燥体２）が優れた強度を有することを確かめるために、ブタの結膜欠損部（瘻孔部）に補填材として使用した。補填材として埋め込んだ当日のブタの結膜瘻孔部の画像を図４Ａに示す。図４Ａにおいて、矢印は、埋め込まれた乾燥体２を示す。
また、対照として、通常、結膜瘻孔部の補填材として用いられるプラスチックポートを埋め込んだ。その結果を図４Ｂに示す。図４Ｂにおいて、矢印は、埋め込まれたプラスチックポートを示す。【００６１】
図４Ａ及び図４Ｂから、乾燥体２は優れた強度を有し、結膜瘻孔部を塞ぐ補填材として利用可能であることが確かめられた。【００６２】
［実施例４］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いた細胞接着性及び増殖性確認試験
製造例１で糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１を再水和したもの（再水和体１）が良好な細胞接着性及び増殖性を有することを確かめるために、内皮細胞及び線維芽細胞を用いた細胞培養試験を行った。
具体的には、内皮細胞（ＭＳ−１、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））及び線維芽細胞（Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ由来初代培養真皮線維芽細胞）をそれぞれ、５ｃｍに切断した再水和体１とともにシャーレで１０日間培養した。培養後、再水和体１を取り出し、ＨＥ染色を行い、光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＢＸ５３）を用いて観察した。図５Ａは、内皮細胞と共に培養した再水和体１を示す画像であり、図５Ｂは線維芽細胞と共に培養した再水和体１を示す画像である。図５Ａにおいて、矢印は、再水和体１に接着した内皮細胞を示す。【００６３】
さらに、対照として製造例１でポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）を再水和したもの（再水和体３）についても同様に、５ｃｍに切断し、線維芽細胞とともにシャーレで１０日間培養した。培養後、再水和体３を取り出し、ＨＥ染色を行い、光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＢＸ５３）を用いて観察した。図５Ｃは、線維芽細胞と共に培養した再水和体３を示す画像である。【００６４】
図５Ｃから、再水和させたポリグラクチン縫合糸バイクリル（登録商標）を用いた場合では、非常に少数の細胞のみが接着し増殖も低かった。一方、図５Ｂから、再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲルを用いた場合では、多数の細胞が接着し増殖していた。
また、図５Ａ及び図５Ｂから、再水和させた糸状アテロコラーゲンビトリゲルは、内皮細胞及び線維芽細胞共に良好な接着性及び増殖性を示すことが確認された。【００６５】
［実施例５］糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を用いた腹膜炎抑制効果及び腹膜線維化抑制効果確認試験
製造例１で製造された糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を腹膜線維化モデルマウスに留置することによる影響を調べた。【００６６】
（１）糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体のマウス腹腔内への挿入及び留置
図６Ａは、製造例１で製造された糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を示す画像である。図６Ａにおいて、「ＣＸＭ１」は糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１を示し、「ＣＸＭ５」は糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２を示す。また、図６Ｂは、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体のマウス腹腔内への挿入方法を示す図である。
体重４０ｇの雌のＩＣＲマウスの腹腔内に、留置針及びピンセットを用いて、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体１及び糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体２をそれぞれ挿入し、留置した（図６Ｃ参照）。【００６７】
（２）クロルヘキシジンの腹腔内注入による腹膜線維化モデルマウスの誘導
糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体を留置させた翌日に、当該マウスの腹腔内に０．１％のクロルヘキシジン溶液（１５％エタノール含有生理食塩水溶液を用いて予め調製）を体重１ｋｇ当たり１０ｍＬの投与量で、１日おきに投与した。
なお、対照試験群も含め、以下の４群を準備した。
Ｓｈａｍ群：針穿刺のみ、クロルヘキシジン腹腔内注射なし
ＣＧ群：クロルヘキシジン腹腔内注射のみ
Ｇｅｌ群：アテロコラーゲンゲル腹腔内注入、クロルヘキシジン腹腔内注射あり
ＣＸＭ群：糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体腹腔内挿入、クロルヘキシジン腹腔内注射あり【００６８】
（３）腹膜の観察
腹膜炎誘導後４０日目及び５６日目に、各群のマウス１匹ずつを開腹し、目視により観察した。結果を図７Ａ（腹膜炎誘導後４０日目）及び図８Ａ（腹膜炎誘導後５６日目）に示す。図７Ａにおいて、ＣＧ群及びＧｅｌ群に記載の矢頭は、腹膜と腸管との癒着を示し、Ｇｅｌ群に記載の矢印は腹膜に留置されたコラーゲンゲルを示し、ＣＸＭ群に記載の矢印は腹膜に留置された糸状アテロコラーゲンビトリゲルを示す。また、図８Ａにおいて、ＣＧ群に記載の矢頭は、腹膜と腸管との癒着を示し、ＣＸＭ群に記載の矢印は腹膜に留置された糸状アテロコラーゲンビトリゲルを示す。【００６９】
（４）ＨＥ染色及びアザン染色
次いで、腹膜炎誘導後４０日目及び５６日目の各群のマウスの腹膜の組織切片を作製し、ＨＥ染色及びアザン染色を行った。腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスにおける結果を図７Ｂ（ＨＥ染色像）及び図７Ｃ（アザン染色像）に示す。また、腹膜炎誘導後５６日目の各群のマウスにおける結果を図８Ｂ（ＨＥ染色像）及び図８Ｃ（アザン染色像）に示す。
図７Ｂ及び図８Ｂにおいて、上図は壁側腹膜のＨＥ染色像であり、下図は臓側腹膜のＨＥ染色像である。スケールバーは１００μｍを示す。また、図７Ｃ及び図８Ｃにおいて、スケールバーは２００μｍを示す。
さらに、図７Ｃ及び図８Ｃそれぞれに示すアザン染色像から、各群のマウスの中皮下結合織の厚さ（μｍ）を測定し、その平均値をグラフ化した（図７Ｄ及び図８Ｄ参照）。【００７０】
図７Ａ〜図７Ｄから、腹膜炎誘導後４０日目の時点で、Ｇｅｌ群及びＣＭＸ群は、ＣＧ群と比較して、壁側腹膜の線維化が有意に抑制されていた。また、ＣＭＸ群は、Ｇｅｌ群よりも、壁側腹膜の線維化抑制効果が特に顕著であった。
また、図８Ａ〜図８Ｄから、腹膜炎誘導後５６日目の時点で、ＣＭＸ群は、ＣＧ群と比較して、壁側腹膜の線維化が有意に抑制されていた。また、これ以降は、ＣＧ群の体重減少が著しく、試験の継続が不能であった。【００７１】
（５）線維化マーカーに対する抗体を用いた免疫染色
次いで、腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片を作製し、各種抗体を用いて免疫染色を行った。用いた抗体を以下に示す。
抗サイトケラチンＡＥ１／ＡＥ３（ＣＫ  ＡＥ１／ＡＥ３）抗体：ＣＫ  ＡＥ１／ＡＥ３は、汎用の上皮性マーカーである。
抗ビメンチン（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）抗体：ビメンチンは、間葉系細胞に特有の中間径フィラメントである。間葉系細胞のマーカー。
抗Ｎ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体：上皮細胞が間葉系細胞へと分化するプロセスで、Ｎ−カドヘリンを発現する。上皮−間葉分化転換のマーカー。
抗結合組織成長因子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＣＴＧＦ）抗体：ＣＴＧＦは、線維芽細胞の増殖とコラーゲンの産生を冗進させる因子である。線維化マーカー。
抗α−ＳＭＡ抗体：上皮細胞が間葉系細胞へと分化するプロセスで、α−ＳＭＡを発現する。上皮−間葉分化転換のマーカー。
また、免疫染色の結果を図９に示す。図９において、抗ＣＫ  ＡＥ１／ＡＥ３抗体、抗ビメンチン抗体及び抗Ｎ−カドヘリン抗体による免疫染色像のスケールバーは５０μｍを示す。抗ＣＴＧＦ抗体及び抗α−ＳＭＡによる免疫染色像のスケールバーは１００μｍを示す。また、図９の抗α−ＳＭＡ抗体による免疫染色像において、矢頭は、陽性コントロールとなる血管壁を示す。【００７２】
図９から、腹膜炎誘導後４０日目の時点で、ＣＸＭ群は、ＣＧ群と比較して、ビメンチン陽性細胞、Ｎ−カドヘリン陽性細胞及びα−ＳＭＡ陽性細胞の出現が抑制されていた。これは腹膜の線維化の原因となる中皮細胞の上皮−間葉分化転換と筋線維芽細胞の出現とが抑制されたことを意味する。【００７３】
（６）炎症マーカーに対する抗体を用いた免疫染色
次いで、腹膜炎誘導後４０日目の各群のマウスの腹膜の組織切片を作製し、各種抗体を用いて免疫染色を行った。用いた抗体を以下に示す。
抗ＣＤ４５抗体：ＣＤ４５は、白血球のマーカーである。
抗Ｆ４／８０抗体：Ｆ４／８０は、マウスの成熟マクロファージのマーカーである。
抗増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）抗体：ＰＣＮＡは、細胞周期関連核タンパク質である。細胞増殖と細胞周期とのマーカー（Ｇ１〜Ｓ期）。
また、免疫染色の結果を図１０Ａに示す。図１０Ａにおいて、スケールバーは５０μｍを示す。
さらに、図１０Ａの各免疫染色像から、マウスの中皮下間質層（ｓｕｂｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｌａｙｅｒ：ＳＭＩＬ）中のＣＤ４５陽性細胞の数、Ｆ４／８０陽性細胞の数及びＰＣＮＡ陽性細胞の割合を算出して、グラフ化した（図１０Ｂ〜図１０Ｄ参照）。なお、図１０Ｂ及び図１０Ｃでは、各陽性細胞の数を面積（ｍｍ２）で表し、図１０Ｄでは、ＳＭＩＬ全体の面積に対するＰＣＮＡ陽性細胞の面積の割合（％）で表した。【００７４】
図１０Ａ〜図１０Ｄから、腹膜炎誘導後４０日目の時点で、ＣＸＭ群は、ＣＧ群と比較して、ＣＤ４５陽性の白血球、Ｆ４／８０陽性のマクロファージ及びＰＣＮＡ陽性の間葉系細胞の出現が有意に抑制されていた。この結果から、ＣＭＸ群では、腹膜炎が抑制されたことで、腹膜線維化が抑制されたことが示唆された。【００７５】
以上のことから、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体は、クロルヘキシジンによる腹膜の炎症及び線維化を抑制することが明らかとなった。ゲル状のコラーゲンにおいても同様の腹膜の炎症抑制効果及び線維化抑制効果が認められたが、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体とゲル状のコラーゲンとの間ではその効果に有意差が見られた。すなわち、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体は、ゲル状のコラーゲンよりも、顕著に優れた腹膜の炎症抑制効果及び線維化抑制効果を有していた。
また、腹膜炎誘導後５６日目でも、糸状アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体の性状に大きな変化が見られなかった（図８Ａ〜図８Ｃ参照）。このことから、これ以降も腹膜線維化抑制効果は継続するものと推察された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本実施形態の糸の製造方法によれば、優れた強度を有する糸を製造することができる。また、前記製造方法により得られた糸がアテロコラーゲンビトリゲル乾燥体からなる場合、アテロコラーゲンビトリゲル乾燥体が高密度に収束した構造であり、上皮化促進効果及び瘢痕形成抑制効果を有する。そのため、前記糸は、組織再生糸として有用である。さらに、前記製造方法により得られた糸は、良好な細胞接着性及び増殖性を有する。そのため、細胞移植用担体として有用である。さらに、前記製造方法により得られた糸は、壁側腹膜及び臓側腹膜の炎症及び線維化に対して抑制作用を有する。また、臓側腹膜（腸管同士）の癒着に対して抑制作用を有する。そのため、腹膜炎抑制剤、腹膜線維化抑制剤又は腸管癒着抑制剤として有用である。
【図１Ａ】
2018211877.tif 000003
【図１Ｂ】
2018211877.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【国際調査報告】
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