(57)【要約】  【課題】  多能性幹細胞からの機能的な外分泌腺の誘導方法を提供する。  【解決手段】  インビトロで機能的な外分泌腺を製造する方法であって、（ｉ）：口腔外胚葉を含む細胞凝集塊を、Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件下で培養する工程、および、（ｉｉ）：前記の工程（ｉ）において培養された細胞凝集塊の全部または一部を、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０を含む培地でさらに培養する工程、を含む、方法を提供する。【選択図】図１
2019093047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで機能的な外分泌腺を製造する方法であって、
（ｉ）：口腔外胚葉を含む細胞凝集塊を、Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件下で培養する工程、および、
（ｉｉ）：前記の工程（ｉ）において培養された細胞凝集塊の全部または一部を、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０を含む培地でさらに培養する工程、
を含む、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記口腔外胚葉が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から誘導された口腔外胚葉であることを特徴とする、
方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、
前記外分泌腺が、唾液腺であることを特徴とする、
方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法であって、
前記工程（ｉ）における「Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件」が、
（ａ）前記の口腔外胚葉を含む細胞凝集塊にＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子を導入することによって、Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件、または、
（ｂ）前もってＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子が導入された口腔外胚葉を含む細胞凝集塊において、前記導入されたＳｏｘ９遺伝子およびＦｏｘｃ１遺伝子の発現を誘導する条件、
であることを特徴とする、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記遺伝子の導入が、ウイルスベクターによる遺伝子の導入、トランスフェクション試薬による遺伝子の導入、または、エレクトロポレーションによる遺伝子の導入、であることを特徴とする、
方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または、センダイウイルスベクターであることを特徴とする、
方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、
前記工程（ｉｉ）が、前記の工程（ｉ）において培養された細胞凝集塊の外層の一部を、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０を含む培地でさらに培養するステップであることを特徴とする、
方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって、
前記工程（ｉｉ）において、培地中のＦＧＦ７の濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍｌであり、培地中のＦＧＦ１０の濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、
方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法であって、
前記工程（ｉ）は、実質的に成長因子を含まない培地を用いて実施されることを特徴とする、
方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記工程（ｉ）の培養期間は、０〜７日であり、
前記工程（ｉｉ）の培養期間は、１０〜３２日である、ことを特徴とする、
方法。
【請求項１１】
唾液腺の組織障害または機能障害を伴う疾患の治療に用いるための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって製造される再生唾液腺を含むことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、間葉系細胞から実質的に構成される細胞集合体と、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって製造される再生唾液腺とを含む複合体、
を含むことを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の医薬組成物であって、
前記複合体において、前記間葉系細胞から実質的に構成される細胞集合体と、前記再生唾液腺とを貫くように、糸状構造物が挿入されていることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記再生唾液腺の全部または一部、または、前記複合体の全部または一部が、細胞培養用足場材料に包埋されていることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の医薬組成物であって、
前記足場材料がコラーゲンゲルであることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
前記疾患が、シェーグレン症候群、唾石症、ＬＡＤＤ症候群（Ｌａｃｒｉｍｏ−ａｕｒｉｃｕｌｏ−ｄｅｎｔｏ−ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＡＬＳＧ（Ａｐｌａｓｉａ  ｏｆ  ｌａｃｒｉｍａｌ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ）、Ｍｉｋｕｌｉｃｚ病、その他の唾液腺炎症性疾患、または、放射線治療の副作用による唾液腺機能障害であることを特徴とする、
医薬組成物。
【請求項１７】
唾液腺の組織障害または機能障害を伴う疾患の治療に用いる医薬組成物の製造のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法で製造される再生唾液腺の使用。
【請求項１８】
唾液腺の組織障害または機能障害を伴う疾患の治療方法であって、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法で製造した再生唾液腺、または、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物を、前記疾患の治療を必要とする対象に適用する工程、を含む、
方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記対象が、ヒト以外の哺乳動物であることを特徴とする、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞からの機能的な外分泌腺の誘導方法、および、当該方法によって誘導される外分泌腺に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の究極の目標は、病気や損傷、加齢によって機能不全となった臓器または組織を、完全な機能を持つ再生臓器または再生組織と置き換える、置換再生医療である。しかしながら、現在までに生体内の臓器または組織と同等の機能と構造を持つ臓器または組織の再生には至っていない。【０００３】
近年の幹細胞技術の発達により、幹細胞から生体の様々な組織を構成する細胞を誘導する技術が確立されている。しかし、生体の器官は複数種類の機能的な細胞が三次元的な配置をとり、それぞれの細胞の相互作用によって発達が進むため、それぞれの細胞を誘導する場合と比較して、特定の器官を人為的に誘導することは非常に難しい。現在の再生医療技術では、すぐに移植可能な再生器官の構築技術はまだ開発されていない。【０００４】
本発明者らは、生体における器官の原基を由来とする上皮系細胞および間葉系細胞を用いて、人為的に毛包原基等の器官原基を再構築する技術（「器官原基法」という）を確立した（非特許文献１）。さらに本発明者らは、上記の器官原基法を用いて唾液腺や涙腺のような分泌腺の原基を作製し、当該原基にガイドを挿入したうえで培養を行うことで、生体側の導管と結合可能な導管を有する器官原基を製造する方法も示している（特許文献１）。しかし、これらの文献に示される方法は、再生器官原基の由来として、少なくとも一部に生体の組織由来の上皮系細胞および／または間葉系細胞を用いるものであった。そのため、より汎用性の高い器官の製造方法として、完全に多能性幹細胞を由来とする、インビトロでの器官の製造方法の開発が求められている。【０００５】
これまで、無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢｑ法）を用いて、多能性幹細胞の凝集体を無血清培地中で浮遊培養することにより、眼杯、前眼部組織、下垂体等をインビトロで誘導できることが報告されている（眼杯について非特許文献２、前眼部組織について非特許文献３、下垂体について非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１０８０６９
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｋａｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４，  ２２７−３０（２００７）
【非特許文献２】Ｍ．  Ｅｉｒａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４７２，  ５１  （Ａｐｒ  ０７，  ２０１１）
【非特許文献３】Ｔ．  Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  １０，  ７７１  （Ｊｕｎ  １４，  ２０１２）
【非特許文献４】Ｈ．  Ｓｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４８０，  ５７  （Ｎｏｖ  ０９，  ２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記のとおり、多能性幹細胞を材料とする組織の再構築方法については盛んに研究がなされている。しかし、唾液腺等の外分泌腺組織の発生過程の分子メカニズムは極めて複雑であり未だ不明な点が多く、多能性幹細胞を由来とするインビトロでの機能的な外分泌腺の分化誘導方法についてはこれまで報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、多能性幹細胞を由来とする機能的な外分泌腺の分化誘導方法について鋭意検討を重ねた。その結果、驚くべきことに、多能性幹細胞から誘導された口腔外胚葉に対して、所定の工程を加えることにより、インビトロで機能的な外分泌腺（例えば、唾液腺）を製造し得ることを見出し、本発明を完成させるに到った。【００１０】
すなわち本発明は、一実施態様において、インビトロで機能的な外分泌腺を製造する方法であって、
（ｉ）：口腔外胚葉を含む細胞凝集塊を、Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件下で培養する工程、および、
（ｉｉ）：前記の工程（ｉ）において培養された細胞凝集塊の全部または一部を、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０を含む培地でさらに培養する工程、
を含む、方法に関する。【００１１】
本発明の一実施態様においては、前記口腔外胚葉が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から誘導された口腔外胚葉であることを特徴とする。【００１２】
本発明の一実施態様においては、前記外分泌腺が、唾液腺であることを特徴とする。【００１３】
本発明の一実施態様においては、前記工程（ｉ）における「Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件」が、
（ａ）前記の口腔外胚葉を含む細胞凝集塊にＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子を導入することによって、Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件、または、
（ｂ）前もってＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子が導入された口腔外胚葉を含む細胞凝集塊において、前記導入されたＳｏｘ９遺伝子およびＦｏｘｃ１遺伝子の発現を誘導する条件、
であることを特徴とする。【００１４】
本発明の一実施態様においては、前記遺伝子の導入が、ウイルスベクターによる遺伝子の導入、トランスフェクション試薬による遺伝子の導入、または、エレクトロポレーションによる遺伝子の導入、であることを特徴とする。【００１５】
また、一実施態様においては、前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、または、センダイウイルスベクターであることを特徴とする。【００１６】
本発明の一実施態様においては、前記工程（ｉｉ）が、前記の工程（ｉ）において培養された細胞凝集塊の外層の一部を、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０を含む培地でさらに培養するステップであることを特徴とする。【００１７】
本発明の一実施態様においては、前記工程（ｉｉ）において、培地中のＦＧＦ７の濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍｌであり、培地中のＦＧＦ１０の濃度が１〜１０００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする。【００１８】
本発明の一実施態様においては、前記工程（ｉ）は、実質的に成長因子を含まない培地を用いて実施されることを特徴とする。【００１９】
本発明の一実施態様においては、前記工程（ｉ）の培養期間は、０〜７日であり、前記工程（ｉｉ）の培養期間は、１０〜３２日である、ことを特徴とする。【００２０】
本発明の他の実施形態は、唾液腺の組織障害または機能障害を伴う疾患の治療に用いるための医薬組成物に関し、ここで、前記医薬組成物は、上記のいずれかの方法によって製造される再生唾液腺を含むことを特徴とする。【００２１】
本発明の一実施形態においては、前記医薬組成物は、間葉系細胞から実質的に構成される細胞集合体と、上記のいずれかの方法によって製造される再生唾液腺とを含む複合体、
を含むことを特徴とする。【００２２】
本発明の一実施形態においては、前記複合体において、前記間葉系細胞から実質的に構成される細胞集合体と、前記再生唾液腺とを貫くように、糸状構造物が挿入されていることを特徴とする。【００２３】
本発明の一実施形態においては、前記再生唾液腺の全部または一部、または、前記複合体の全部または一部が、細胞培養用足場材料に包埋されていることを特徴とする。【００２４】
本発明の一実施形態においては、前記足場材料がコラーゲンゲルであることを特徴とする。【００２５】
本発明の一実施形態においては、前記疾患が、シェーグレン症候群、唾石症、ＬＡＤＤ症候群（Ｌａｃｒｉｍｏ−ａｕｒｉｃｕｌｏ−ｄｅｎｔｏ−ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＡＬＳＧ（Ａｐｌａｓｉａ  ｏｆ  ｌａｃｒｉｍａｌ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ）、Ｍｉｋｕｌｉｃｚ病（ＩｇＧ４  関連硬化性疾患）、その他の唾液腺炎症性疾患、または、放射線治療の副作用による唾液腺機能障害であることを特徴とする。【００２６】
本発明の他の実施態様は、唾液腺の組織障害または機能障害を伴う疾患の治療に用いる医薬組成物の製造のための、上記のいずれかの方法で製造した再生唾液腺の使用、に関する。【００２７】
本発明の他の実施態様は、唾液腺の組織障害または機能障害を伴う疾患の治療方法に関し、ここで、前記方法は、上記の方法で製造した再生唾液腺、または、上記の医薬組成物を、前記疾患の治療を必要とする対象に適用する工程、を含むことを特徴とする。【００２８】
本発明の一実施態様においては、前記対象が、ヒト以外の哺乳動物であることを特徴とする。【００２９】
上記に挙げた本発明の一または複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の実施例の手順を示す。図中の略語は以下を意味する。ＥＳ：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ（胚性幹細胞）ＭＥ：Ｍｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍ（胚性幹細胞）ＤＥ：Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｃｔｏｄｅｒｍ（胚性外胚葉）ＮＮＥ：Ｎｏｎ−ｎｅｕｒａｌ  Ｅｃｔｏｄｅｒｍ（非神経外胚葉）ＮＥ：Ｎｅｕｒａｌ  Ｅｃｔｏｄｅｒｍ（神経外胚葉）ＥＰＩ：Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ（表皮）ＯＥ：Ｏｒａｌ  Ｅｃｔｏｄｅｒｍ（口腔外胚葉）ＯＥＳＧ：Ｏｒａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｓａｌｉｖａｒｙ  Ｇｌａｎｄ（口腔上皮唾液腺）ＳＧ：Ｓａｌｉｖａｒｙ  Ｇｌａｎｄ（唾液腺）
【図２】図２は、分化誘導開始８日目の凝集塊の外層に、Ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＰＫ）陽性の原始口腔粘膜（口腔外胚葉）が形成されていることを示す図である。
【図３】図３は、分化誘導開始８日目の凝集塊にアデノウイルスベクターを用いてＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子を導入し、その後凝集塊の外層を分離してＦＧＦ７およびＦＧＦ１０の存在下でさらに培養することを示した図である。
【図４】図４は、分化誘導２３日目の凝集塊から胎生期唾液腺原基に類似するｂｕｄｄｉｎｇ様構造が形成され、分化誘導２８日目には分枝形態形成が認められたことを示す図である。
【図５】図５は、分化誘導２３日目および２８日目におけるＥＳ細胞由来唾液腺はＰａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＰＫ）陽性の上皮細胞で構成され、Ｋｅｒａｔｉｎ１８（Ｋ１８）陽性の導管上皮が近心側に配置し、ＡＱＰ５陽性の腺房細胞、α−ＳＭＡ陽性の筋上皮細胞が遠心側に配置していることを示す図である。なお、図中の矢頭「ｅ」は腺房（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｂｕｄ）を示し、図中の矢印「ｄ」は導管（ｄｕｃｔ）を示す。
【図６】図６は、ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｅによる遺伝子発現プロファイルの成分解析の結果、ＥＳ細胞由来唾液腺（ｉ−ＳＧ）は胎生１５−１８日の唾液腺原器と遺伝子発現が類似していることを示す図である。
【図７】図７は、ＥＳ細胞由来唾液腺はｃａｒｂａｃｈｏｌ刺激によって細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇がみられ、その作用はａｔｒｏｐｉｎｅにより抑制されることを示す図である。
【図８】図８左は、移植３０日後のＥＳ細胞由来唾液腺の実体顕微鏡像である。図８中（ＧＦＰ／ＤＡＰＩ染色像）および図８右（ＰＡＳ染色像）は、耳下腺切除マウスにＥＳ細胞由来唾液腺（ｉ−ＳＧ）を移植することで、レシピエントの排泄部導管とＥＳ細胞由来唾液腺構造が接続し粘液産生能を持つ成熟した腺房細胞が生着していることを示した図である。
【図９】図９Ａは、本実施例におけるＥＳ細胞由来唾液腺の移植方法の概要を示した図である。図９Ｂは、胎児由来唾液腺間葉組織をＥＳ細胞由来唾液腺に付加して移植した場合の組織像を示す（図９Ｂ左：移植３０日後のＥＳ細胞由来唾液腺の実体顕微鏡像、図９Ｂ中：Ｈ＆Ｅ染色像、図９Ｂ右：ＰＡＳ染色像）。
【図１０】図１０は、移植したＥＳ細胞由来唾液腺構造に、レシピエント由来の神経が侵入していることを示した図である。図中の矢頭は神経線維、矢印はカルポニン陽性筋上皮細胞を表し、ＥＳ細胞由来の腺房（Ａ，Ｂ，Ｃ）を包むように筋上皮細胞が配置し、筋上皮細胞に近接して神経線維が配向している。
【図１１】図１１Ａは、胎齢１３．５日の唾液腺間葉組織を貼り合わせたＥＳ細胞由来唾液腺を移植したレシピエントへのクエン酸による味刺激によって唾液分泌量が増加することを示した図である。図１１Ｂは、移植したＥＳ細胞由来唾液腺を副交感神経作動薬であるピロカルピン酸で刺激することによる、唾液分泌量の増加を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明において、「多能性幹細胞」とは、生体のあらゆる細胞に分化できる分化万能性と、分化増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能をあわせもつ細胞をいい、その例としてＥＳ細胞やｉＰＳ細胞が挙げられる。
【００３２】
本発明において、「ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞株のことをいい、非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持つ。
【００３３】
本発明において用いることのできるＥＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物の内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。例えば、ＥＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、サルの内部細胞塊由来のＥＳ細胞を用いることができる。
【００３４】
「ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」とは、一般的に、体細胞へ、例えば数種類の遺伝子および／または薬剤を導入することにより、ＥＳ細胞のように非常に多くの細胞に分化できる分化万能性と、分裂増殖を経ても分化万能性を維持できる自己複製能を持たせた細胞をいう。ただし、本発明においては、上記の説明に限定されず、当業者が「ｉＰＳ細胞」であると認識する細胞を広く含む。
【００３５】
本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来は特に限定されず、あらゆる動物由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。例えば、ｉＰＳ細胞の由来として、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、サル由来のｉＰＳ細胞を用いることができる。また、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の由来となる体細胞も特に限定されず、あらゆる組織由来の細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を用いることができる。さらに、本発明において用いることのできるｉＰＳ細胞の誘導方法も特に限定されず、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる方法であれば、どのような方法を用いて誘導されたｉＰＳ細胞でも用いることができる。
【００３６】
本発明において、多能性幹細胞を分化させずに培養する方法は特に限定されず、当業者が公知の培養環境や培地を適宜選択することができる。例えば、フィーダー細胞等を用いて接着培養してもよく、フィーダー細胞等を用いずに浮遊培養してもよい。また、多能性幹細胞を培養するための培地としては、一般的に多能性幹細胞の培養に用いられる培地を用いることができ、その組成については特に限定されず、当業者が本分野の技術常識に基づいて適宜調製することができる。
【００３７】
本発明における「外分泌腺」とは、外分泌細胞からの分泌顆粒が直接ないし導管を介して体表あるいは管腔の上皮表面に放出される腺をいう。本発明における「外分泌腺」の例としては、涙腺、唾液腺、噴門腺、幽門腺、胃腺、腸陰窩、前立腺、汗腺、皮脂腺等を挙げることができ、好ましくは唾液腺であってよい。なお、本発明の方法によって唾液腺を製造する場合、唾液腺が形成されたことの確認は、組織像による解析や、刺激による機能解析等、当業者に利用可能な手法を適宜用いることができる。
【００３８】
本発明における「口腔外胚葉」とは、胚の発生過程で、口腔の粘膜上皮を形成する１層の細胞シートいう。口腔外胚葉は初期胚において間脳に隣接する外胚葉から発生し、その一部は下垂体のもとになるラトケ嚢を形成する。組織における口腔外胚葉の存在は、例えばｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅａｒｔｉｎ（ＰＫ）の発現等によって確認することができる。
【００３９】
本発明の方法において用いられる口腔外胚葉は、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）から誘導されたものであってよい。多能性幹細胞から口腔外胚葉を誘導する方法は限定されず、当業者に公知の方法を用いることができる。例えば、本発明の実施例におけるＥＳ細胞からの口腔外胚葉の誘導はＫ．Ｒ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｍｉｋｏｓｚ，Ａ．Ｉ．Ｍｏｌｏｓｈ，Ｄ．Ｐａｔｅｌ，Ｅ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ５００，２１７（Ａｕｇ  ０８，２０１３）に記載の方法を参考にしているが、他にもＨ．Ｓｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４８０，５７（Ｎｏｖ  ０９，２０１１）の記載や、Ｏｃｈｉａｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：２９０−２９８，２０１５の記載等を参照して実施することができる。
【００４０】
上記に挙げた方法のいくつかにおいては、ＳＦＥＢｑ法（無血清凝集浮遊培養法：Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｑｕｉｃｋ  ｒｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を利用する。ＳＦＥＢｑ法においては、多能性幹細胞を酵素で単一細胞化し、それを３０００個程度の細胞の塊に再凝集させたものを分化培養の材料に用いる。この細胞凝集塊を培養する場合、通常の細胞培養で行うような細胞を培養シャーレに接着させて培養する方法では、立体的な組織形成が損なわれて、きれいな構造体を作ることができない。そのため、培養容器を細胞非接着性ポリマーでコーティングし、細胞や組織が容器に付着しないようにすることで、細胞塊を培養液の中で浮遊させる培養方法で立体的な組織形成を可能にする。ＳＦＥＢｑ法では、血清や転写因子などの神経分化阻害効果のある成分を一切含まない特殊な培養液に浮遊させて数日培養する。この方法により、一部の細胞を外胚葉系の細胞に分化させることが可能になる。なお、ＳＦＥＢｑ法の具体的手順に関しては、ＷＯ２００９／１４８１７０の記載を参照することができる。
【００４１】
本発明における「口腔外胚葉を含む細胞凝集塊」は、外分泌腺への誘導に必要な数の口腔外胚葉を含む細胞凝集塊であればよく、例えば上述の方法によって作製することができる。
【００４２】
本発明の第１の培養工程においては、口腔外胚葉を含む細胞凝集塊を、Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件下で培養する。本発明の第１の工程における培養は、好ましくは浮遊培養であってよい。ここで、「Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件」とは、例えば、前記口腔外胚葉を含む細胞凝集塊にＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子を導入することによって、Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件であってよい。具体的には、ウイルスベクターによる遺伝子の導入、トランスフェクション試薬による遺伝子の導入、または、エレクトロポレーションによる遺伝子の導入によって、口腔外胚葉を含む細胞凝集塊にＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子を導入してよい。ウイルスベクターによって遺伝子を導入する場合、例えばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いることができる。
【００４３】
他の「Ｓｏｘ９およびＦｏｘｃ１の発現を誘導する条件」としては、例えば、前もってＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子が導入された口腔外胚葉を含む細胞凝集塊において、前記導入されたＳｏｘ９遺伝子およびＦｏｘｃ１遺伝子の発現を誘導する（開始させる）条件を挙げることができる。具体的には、例えば、Ｔｅｔ発現誘導システムを利用して、ＥＳ細胞の段階で導入したＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子を、本発明の第１の培養工程において薬剤で誘導することにより、発現を開始させることができる。なお、上記の例に限定されず、当業者に利用可能な様々な遺伝子発現誘導システムを本発明において用いることができる。
【００４４】
なお、本発明の工程において、「Ｓｏｘ９の発現を誘導する条件」と「Ｆｏｘｃ１の発現を誘導する条件」とは同じであってよく、異なっていてもよい。それぞれの条件は、本分野の技術常識に基づいて、当業者が適宜選択することができる。
【００４５】
本発明の第１の培養工程は、０〜７日間（好ましくは０〜３日、さらに好ましくは０〜１日）実施されてよい。第１の工程が０日とは、例えば、口腔外胚葉を含む細胞凝集塊にＳｏｘ９発現遺伝子およびＦｏｘｃ１発現遺伝子を導入したその日に、本発明の第２の工程を開始することを意味する。
【００４６】
本発明の第１の培養工程において用いる培地は、実質的に成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含まない培地（例えば、ＳＦＥＢｑ法において用いられるｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ−ｆｒｅｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｇｆＣＤＭ培地））であることが好ましいが、口腔外胚葉に意図しない分化誘導を引き起こさない限りにおいて、他の様々な培地を用いてもよい。なお、口腔外胚葉に意図しない分化誘導を引き起こさない限りにおいて、細胞培養用培地に一般的に添加される物質（例えば、アミノ酸やトランスフェリン等のサプリメント、抗生剤、等）を培地に添加してもよい。
【００４７】
本発明の第２の培養工程においては、第１の工程で準備された細胞凝集塊の全部または一部を、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０を含む培地でさらに培養する。本発明の第２の工程における培養は、好ましくは浮遊培養であってよい。培地中のＦＧＦ７の濃度およびＦＧＦ１０は、口腔外胚葉から外分泌腺（例えば、唾液腺）を誘導するために必要な濃度で含まれていればよく、当業者が適宜調節することができる。例えば、培地中のＦＧＦ７の濃度は、１〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲であってよく、好ましくは、５〜７５０ｎｇ／ｍｌ、１０〜５００ｎｇ／ｍｌ、２０〜４００ｎｇ／ｍｌ、３０〜３００ｎｇ／ｍｌ、４０〜２００ｎｇ／ｍｌ、または、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌの範囲であってよい。また、例えば、培地中のＦＧＦ１０の濃度は、１〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲であってよく、好ましくは、５〜７５０ｎｇ／ｍｌ、１０〜６００ｎｇ／ｍｌ、３０〜５００ｎｇ／ｍｌ、５０〜４００ｎｇ／ｍｌ、１００〜３００ｎｇ／ｍｌ、または、１５０〜２５０ｎｇ／ｍｌの範囲であってよい。
【００４８】
本発明の第２の培養工程において用いる培地は、口腔外胚葉に意図しない分化誘導を引き起こさない限りにおいて、様々な培地を用いることができる。例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地およびこれらの混合培地等が挙げられる。なお、口腔外胚葉に意図しない分化誘導を引き起こさない限りにおいて、細胞培養用培地に一般的に添加される物質（例えば、アミノ酸やトランスフェリン等のサプリメント、抗生剤等）を培地に添加してもよい。
【００４９】
本発明の第２の培養工程においては、第１の培養工程において培養された細胞凝集塊をそのまま用いてもよいが、第１の培養工程において培養された細胞凝集塊の一部のみを用いてもよい。例えば、第１の培養工程において培養された細胞凝集塊の外層の一部を単離して第２の培養工程に適用することで、外分泌腺（例えば、唾液腺）の誘導効率を上昇させることができる。細胞凝集塊の外層の一部を単離する方法は限定されず、例えば、ピペット、注射針、医療用メス等を用いて、機械的に単離してよい。
【００５０】
本発明の第２の培養工程は、１０〜３２日間（好ましくは１２〜２０日、さらに好ましくは１５〜１８日）実施される。
【００５１】
その他、一般的な細胞培養条件については、当業者の技術常識に基づき、適宜調製することができる。
【００５２】
本発明の方法によって製造される再生唾液腺は、例えば、唾液腺の組織障害または機能障害を伴う疾患の治療に用いることができる。このような疾患の非限定的な例としては、シェーグレン症候群、唾石症、ＬＡＤＤ症候群（Ｌａｃｒｉｍｏ−ａｕｒｉｃｕｌｏ−ｄｅｎｔｏ−ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ＡＬＳＧ（Ａｐｌａｓｉａ  ｏｆ  ｌａｃｒｉｍａｌ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ）、Ｍｉｋｕｌｉｃｚ病（ＩｇＧ４  関連硬化性疾患）、その他の唾液腺炎症性疾患、または、放射線治療の副作用による唾液腺機能障害を挙げることができる。
【００５３】
本発明を利用する疾患の治療は、どのような動物に対しても用いることができるが、例えば、哺乳動物（マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、サル、ヒト等）であってよい。なお、好ましくない場合は、ヒトを対象から除くことができる。
【００５４】
本発明の方法によって製造される再生唾液腺を疾患の治療に用いる場合には、治療を必要とする対象に、本発明の方法によって製造される再生唾液腺を移植することが好ましい。再生唾液腺の対象への移植方法は限定されないが、例えばＷＯ２０１２／１０８０６９を参照して、再生唾液腺へ、分泌腺の導管の形成を促すためのガイド（糸状構造物）を挿入したうえで、対象へ移植することができる。再生唾液腺へガイドを挿入して対象へ移植することにより、移植先の組織において、分泌腺の導管の形成を方向付けることができる。
【００５５】
本発明の方法によって製造される再生唾液腺は、単独で対象へ移植されてもよいが、間葉系細胞から実質的に構成される細胞集合体と接着されて、複合体として移植されると、移植先における唾液腺組織の成長効率が向上する。本発明に用いられる間葉系細胞の由来は限定されず、例えば多能性幹細胞（例えばＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）から公知の方法で誘導された間葉系細胞であってよく、または、生体組織由来の間葉系細胞（例えば、胎児由来間葉系細胞）であってもよい。
【００５６】
また、本発明の方法によって製造される再生唾液腺、または、再生唾液腺と間葉系細胞との複合体の全部または一部を、細胞培養用足場材料に包埋したうえで対象へ移植することで、対象組織における生着率を高めることができる。本発明において用いることができる細胞培養用足場材料の例としては、コラーゲンゲル（より具体的には、Ｉ型コラーゲンゲル、ＩＩＩ型コラーゲンゲル、ＩＶ型コラーゲンゲル、マトリゲル、等）を挙げることができる。
【００５７】
本発明において再生唾液腺の導管の形成を促すためのガイドとして用いられる糸状構造物の材質は限定されないが、例えば、合成または天然の生体吸収可能なポリマーより作られた繊維、ステンレス等の金属繊維、炭素繊維やガラス繊維等の化学繊維、天然の動物繊維や植物繊維等を挙げることができ、より具体的には、ナイロン糸やステンレス線等を挙げることができる。また、ガイドは、糸状である限りにおいて様々な形状であってよく、例えば中空糸の形状とすることもできる。なお、移植後、糸状構造物が再生唾液腺とともにレシピエントの皮下に埋まる場合には、生体吸収性のものを用いることが好ましい。
【００５８】
再生唾液腺の導管の形成を促すためのガイドとして用いられる糸状構造物の直径および長さは、対象に応じて適宜設計することができる。例えば、その直径は、５〜１００μｍであってよく、１０〜７０μｍとすることがより好ましく、２０μｍ〜５０μｍとすることがさらに好ましい。また、また、ガイドの長さは、例えば１ｍｍ〜１０ｍｍとしてよく、２〜８ｍｍとすることがより好ましく、２ｍｍ〜５ｍｍとすることがより好ましい。
【００５９】
糸状構造物の再生唾液腺への挿入方法は、再生唾液腺の組織を破壊しないように挿入される限り、限定されない。また、再生唾液腺と間葉系細胞の集合体とが接着されて、複合体として移植される場合には、当該糸状構造物は、再生唾液腺と間葉系細胞の集合体とを貫くように挿入されることが好ましい。
【００６０】
また、再生唾液腺へ糸状構造物を挿入した後は、当該再生唾液腺を、糸状構造物が挿入された状態で一定期間培養し、その後移植に供してもよい。ガイド挿入後の培養期間は、対象により適宜設定することができるが、例えば、１〜７日間培養することができる。
【００６１】
本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【００６２】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【００６３】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００６４】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００６５】
図１に本実施例の手順の概要を示す。なお、図１に示した手順のうち、口腔外胚葉（ＯＥ）から唾液腺（ＳＧ）までを誘導する手順が本発明の対象である。【００６６】
材料と方法
マウスＥＳ細胞をトリプシン処理により単一細胞に分散し、ＳＦＥＢｑ法（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，１０（６）：７７１−７８５，２０１２）に準じて凝集塊を形成し、分化誘導のための浮遊凝集塊培養を３７℃、５％ＣＯ２存在下で行った。具体的な手順を以下に示す。【００６７】
（１）ＥＳ細胞から口腔外胚葉への誘導
分散した３０００個のマウスＥＳ細胞を、低細胞吸着性の表面コートをした丸底型９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。分化誘導用の培養液は、成長因子を含まない化学合成培地（ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ−ｆｒｅｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ；  ｇｆＣＤＭ；  Ｗａｔａｙａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  １０５（３３）：  １１７９６−１１８０１，  ２００８）を用いた。【００６８】
ＥＳ細胞播種の１日後（分化誘導開始１日後）に、最終濃度１％のＧｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｒｅｅ  ｍａｔｒｉｇｅｌを添加した。分化誘導開始後３日目にＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＳＢ−４３１５４２（１μＭ）を添加し、５日目にＦＧＦ２（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＬＤＮ−１９３１８９（１μＭ）を添加した。【００６９】
なお、本実施例におけるＥＳ細胞から口腔外胚葉への誘導は、Ｋ．Ｒ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｍｉｋｏｓｚ，Ａ．Ｉ．Ｍｏｌｏｓｈ，Ｄ．Ｐａｔｅｌ，Ｅ．Ｈａｓｈｉｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ５００，２１７（Ａｕｇ  ０８，２０１３）に記載の方法を参照して実施した。ＢＭＰ４は幹細胞の外胚葉への誘導のため、ＳＢ−４３１５４２（ＴＧＦ−βのｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は中内胚葉への分化抑制のため、ＦＧＦ２は細胞塊の外層の上皮を肥厚させるため、ＬＤＮ−１９３１８９（ＢＭＰのｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は表皮への分化抑制のために、それぞれ添加されている（図１参照）。【００７０】
（２）口腔外胚葉から唾液腺への誘導：第１の培養工程
８日目にアデノウイルスベクターを用いて細胞凝集塊の外層にｈｕｍａｎ  Ｓｏｘ９およびｍｏｕｓｅ  Ｆｏｘｃ１を過剰発現させた。なお、この工程における培地はｇｆＣＤＭ培地を用いた。【００７１】
（３）口腔外胚葉から唾液腺への誘導：第２の培養工程
凝集塊の外層を実体顕微鏡下で機械的に単離し、低細胞吸着性の表面コートをした２４ウェルプレートに移した。培地はＦＧＦ７（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦ１０（２００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地（ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２にＮ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加した培地）に１％ｍａｔｒｉｇｅｌを加えたものを用いた。２日に一回の培地交換を継続した。【００７２】
（４）誘導された唾液腺の解析
マウスＥＳ細胞由来唾液腺の解析としては組織学的解析や、ＲＮＡ−ｓｅｑを用いた遺伝子発現プロファイルの作製、Ｃａｒｂａｃｏｌ刺激による細胞内Ｃａ２＋濃度の測定、耳下腺切除モデルマウスへの移植実験による組織学的解析および唾液分泌測定を行った。【００７３】
（５）結果
ＥＳ細胞の分化誘導開始８日後には凝集塊の最外層にＰａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（ＰＫ）陽性の原始口腔粘膜（口腔外胚葉）を含む細胞凝集塊が誘導された（図２）。【００７４】
分化誘導開始８日後において、誘導された口腔外胚葉を含む細胞凝集塊に、アデノウイルスベクターを用いて転写因子２種（Ｓｏｘ９、Ｆｏｘｃ１）を発現する遺伝子を導入した。その後、細胞凝集塊の外層を外科的に単離後、ＦＧＦ７およびＦＧＦ１０存在下で浮遊培養を継続した（図３）。ＥＳ細胞からの分化誘導開始２３日後（転写因子の導入から１５日後）には、凝集塊の表層に、マウス唾液腺原器に類似したｂｕｄｄｉｎｇ様の形態変化が観察され、２８日（転写因子の導入から２０日後）には３次元的な分枝形態形成が認められた（図４）。【００７５】
この構造はＰａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ陽性の上皮細胞から構成されＫｅｒａｔｉｎ１８陽性の導管上皮、ＡＱＰ５陽性の腺房細胞、α−ＳＭＡ陽性の筋上皮細胞が極性を持って配列していた（図５）。また、ＲＮＡ−ｓｅｑｕｅｎｃｅによる遺伝子発現プロファイルの結果も、胎生１５−１８日の唾液腺原器における遺伝子発現プロファイルと類似していた（図６）。【００７６】
さらに、このＥＳ細胞由来唾液腺はｃａｒｂａｃｈｏｌ刺激により細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇がみられ（図７左、中）、その作用はａｔｒｏｐｉｎｅにより抑制された（図７右）。【００７７】
また、耳下腺を切除したマウスにＥＳ細胞由来唾液腺を移植すると、既存の排泄導管と接合し、唾液分泌タンパクを含む唾液の産生がみられた（図８左：移植３０日後のＥＳ細胞由来唾液腺の実体顕微鏡像、図８中：ＧＦＰ／ＤＡＰＩ染色像、図８右：ＰＡＳ染色像）。なお、再生唾液腺の移植は、ＷＯ２０１２／１０８０６９に記載の方法に準じて行った。すなわち、単離した再生唾液腺を足場材料（コラーゲンゲル）に包埋し、分泌腺の導管の形成を促すためのガイド（糸状構造物）を挿入したうえで、マウスへ移植した（図９Ａ）。【００７８】
上記と同様の手順で、胎児由来唾液腺間葉組織をＥＳ細胞由来唾液腺に付加して移植した場合も、既存の排泄導管と接合し、唾液分泌タンパクを含む唾液の産生がみられた（図９Ｂ左：移植３０日後のＥＳ細胞由来唾液腺の実体顕微鏡像、図９Ｂ中：Ｈ＆Ｅ染色像、図９Ｂ右：ＰＡＳ染色像）。【００７９】
移植したＥＳ細胞由来唾液腺は組織学的解析の結果、レシピエント由来の神経および血管を含んでいた（図１０）。すなわち、本発明の方法によって製造した再生唾液腺は、レシピエントの組織に適切に生着し、周辺組織と連携することが示された。【００８０】
なお、再生唾液腺のみを足場材料に包埋して移植した場合においても、移植先において機能的な唾液腺の生着が見られたが、再生唾液腺に間葉系細胞を付加して足場材料に包埋し、移植した場合には、移植先における再生唾液腺の成長がさらに良好であった。【００８１】
胎齢１３．５日の唾液腺間葉組織を貼り合わせて移植したＥＳ細胞由来唾液腺は、クエン酸による味刺激に対しても唾液分泌が認められた（図１１Ａ）。また、移植したＥＳ細胞由来唾液腺を副交感神経作動薬であるピロカルピン酸で刺激すると、唾液分泌量の増加が認められた（図１１Ｂ）。すなわち、本発明の方法によって製造した再生唾液腺は、レシピエントの組織に適切に生着し、機能することが示された。
【図１】
2019093047.tif 000003
【図２】
2019093047.tif 000004
【図３】
2019093047.tif 000005
【図４】
2019093047.tif 000006
【図５】
2019093047.tif 000007
【図６】
2019093047.tif 000008
【図７】
2019093047.tif 000009
【図８】
2019093047.tif 000010
【図９】
2019093047.tif 000011
【図１０】
2019093047.tif 000012
【図１１】
2019093047.tif 000013
【国際調査報告】
2019093047.tif 000014
2019093047.tif 000015
2019093047.tif 000016
2019093047.tif 000017