(57)【要約】  大腸がん患者の予後を予測するための、及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーを提供する。  GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGALNT6遺伝子の転写産物若しくはその核酸断片からなる、大腸がん患者の予後を予測するための、及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーを提供する。
2019049829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGALNT6遺伝子の転写産物若しくはその核酸断片からなる、大腸がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー。
【請求項２】
GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGALNT6遺伝子の転写産物若しくはその核酸断片からなる、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカー。
【請求項３】
抗がん剤が5-FUである、請求項２に記載のバイオマーカー。
【請求項４】
前記GALNT6タンパク質が、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項５】
前記GALNT6遺伝子が、請求項４に示すタンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
【請求項６】
大腸がん患者の予後を予測するための、請求項１及び４〜５のいずれか一項に記載のバイオマーカーの使用。
【請求項７】
大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するための、請求項２〜５のいずれか一項に記載のバイオマーカーの使用。
【請求項８】
前記大腸がんが、ステージI〜IVの大腸がんである、請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
前記大腸がんが、ステージIIIの大腸がんである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
大腸がん患者の予後を予測する方法であって、
大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織における、請求項１及び４〜５のいずれか一項に記載のバイオマーカーの量を測定する測定工程、及び
前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、大腸がん患者の予後を予測する予測工程を含み、
ここで、前記大腸がん細胞又は組織が前記バイオマーカーについて陰性である場合、前記大腸がん患者の予後は悪いと予測する、方法。
【請求項１１】
大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定する方法であって、
大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織における、請求項２〜５のいずれか一項に記載のバイオマーカーの量を測定する測定工程、及び
前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定する判定工程を含み、
ここで、前記大腸がん細胞又は組織が前記バイオマーカーについて陰性である場合、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性は低いと判定する、方法。
【請求項１２】
請求項１及び４〜５のいずれか一項に記載のバイオマーカーの量を測定するための試薬を含む、大腸がん患者の予後を予測するためのキット。
【請求項１３】
請求項２〜５のいずれか一項に記載のバイオマーカーの量を測定するための試薬を含む、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸がん患者の予後を予測するための及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸がん(colorectal cancer、CRC)は、診断及び治療が大きく進歩しているにもかかわらず、世界中のがん死の主要な原因である。臨床現場で現在使用されている唯一の大腸がん予後分類は、臨床病理学的な病期(ステージ)分類であり、ステージに応じて治療方針が選択される。しかし、臨床病理学的に同一ステージと判定された大腸がんでも、薬剤感受性やがんの再発及び患者の生存などの臨床転帰は著しく異なる。例えば、ステージIII大腸がん患者は、根治手術後に補助化学療法を行うことが標準的であるが、約30〜40％の患者で大腸がんが再発する(非特許文献1〜3)。したがって、大腸がん患者の予後を予測することは重要であり、予後予測に基づく個別的な大腸がん患者のマネージメントが求められている。しかし、大腸がんの予後予測に臨床的に使用することができる臨床因子及び分子バイオマーカーは知られていない。また、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定することができれば大腸がんの治療に役立ち得るため、抗がん剤の有効性の判定に有効なバイオマーカーが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Andre T, et al. Adjuvant Fluorouracil, Leucovorin, and Oxaliplatin in Stage II to III Colon Cancer: Updated 10-Year Survival and Outcomes According to BRAF Mutation and Mismatch Repair Status of the MOSAIC Study. J Clin Oncol 33, 4176-4187 (2015).
【非特許文献２】Twelves C, et al. Capecitabine versus 5-fluorouracil/folinic acid as adjuvant therapy for stage III colon cancer: final results from the X-ACT trial with analysis by age and preliminary evidence of a pharmacodynamic marker of efficacy. Ann Oncol 23, 1190-1197 (2012).
【非特許文献３】Kawakami H, Zaanan A, Sinicrope FA. Implications of mismatch repair-deficient status on management of early stage colorectal cancer. J Gastrointest Oncol 6, 676-684 (2015).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、大腸がん患者の予後を予測するための、及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ね、大腸がん患者から切除された大腸がん組織の糖転移酵素GALNT6タンパク質の発現を調べた。その結果、ステージに関係なくほとんどの大腸がん患者は、GALNT6タンパク質を発現しているGALNT6陽性であったが、一部(約15％)の患者はGALNT6陰性であることを見出した。さらに、本発明者らは、GALNT6陽性の大腸がん患者は、大腸がん切除手術後の予後が良いのに対し、GALNT6陰性の大腸がん患者は、大腸がん切除手術後の予後が悪い傾向があること、及びGALNT6陽性の大腸がん患者は、GALNT6陰性の大腸がん患者よりも抗癌剤の有効性が高い傾向があることを見出した。本発明者は、これらの発見に基づいて本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち本発明は以下を包含する。
[１]GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGALNT6遺伝子の転写産物若しくはその核酸断片からなる、大腸がん患者の予後を予測するためのバイオマーカー。
[２]GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGALNT6遺伝子の転写産物若しくはその核酸断片からなる、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカー。
[３]抗がん剤が5-FUである、[２]に記載のバイオマーカー。
[４]前記GALNT6タンパク質が、以下の(a)〜(c)のいずれかのタンパク質である、[１]〜[３]のいずれかに記載のバイオマーカー。
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
[５]前記GALNT6遺伝子が、[４]に示すタンパク質をコードする、[１]〜[３]のいずれかに記載のバイオマーカー。
[６]大腸がん患者の予後を予測するための、[１]及び[４]〜[５]のいずれかに記載のバイオマーカーの使用。
[７]大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するための、[２]〜[５]のいずれかに記載のバイオマーカーの使用。
[８]前記大腸がんが、ステージI〜IVの大腸がんである、[６]又は[７]に記載の使用。
[９]前記大腸がんが、ステージIIIの大腸がんである、[８]に記載の使用。
[１０]大腸がん患者の予後を予測する方法であって、
大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織における、[１]及び[４]〜[５]のいずれかに記載のバイオマーカーの量を測定する測定工程、及び
前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、大腸がん患者の予後を予測する予測工程を含み、
ここで、前記大腸がん細胞又は組織が前記バイオマーカーについて陰性である場合、前記大腸がん患者の予後は悪いと予測する、方法。
［１１］大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定する方法であって、
大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織における、[２]〜[５]のいずれかに記載のバイオマーカーの量を測定する測定工程、及び
前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定する判定工程を含み、
ここで、前記大腸がん細胞又は組織が前記バイオマーカーについて陰性である場合、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性は低いと判定する、方法。
[１２][１]及び[４]〜[５]のいずれかに記載のバイオマーカーの量を測定するための試薬を含む、大腸がん患者の予後を予測するためのキット。
[１３][２]〜[５]のいずれかに記載のバイオマーカーの量を測定するための試薬を含む、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのキット。【０００７】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-170157号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、大腸がん患者の予後を予測するための、及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】(A)大腸腺腫(矢印で示される)、及び隣接する正常大腸粘膜(矢頭で示される)、(B)正常大腸粘膜、(C)大腸腺腫、並びに(D〜G)大腸がんにおける、GALNT6タンパク質発現についての免疫組織化学染色の代表的な画像を示す写真である。(A)、(D)及び(F)は100倍、(B)、(C)、(E)、及び(G)は400倍の倍率で画像を取得した。
【図２】免疫組織化学染色で判定したGALNT6陽性又は陰性の大腸がん患者における、治癒手術後の疾患特異的生存率を示すグラフである。(A)ステージI〜IVの267人の患者、(B)ステージII〜IIIの195人の患者、及び(C)ステージIIIの80人の患者の生存率を示す。
【図３】免疫組織化学によるGALNT6の発現陽性患者と陰性患者における無病生存率のカプランマイヤー曲線を示すグラフである。結果は手術後に化学療法を処置した患者と、手術のみを行った患者に分けて示す。(A)外科手術後にアジュバント化学療法を処置したステージII〜IIIの114人の患者、(B)外科手術のみで処置したステージIII〜IIIの76人の患者の結果を示す。(C)外科手術後にアジュバント化学療法を処置したステージIIIの56人の患者、(D)外科手術のみで処置したステージIIIの22人の患者の結果を示す。
【図４】図４は、GALNT6サイレンシングの生物学的効果を示す。GALNT6を標的とするsiRNA（siGALNT6-1及びsiGALNT6-2）又はスクランブル対照のSW480細胞へのトランスフェクション後の、GALNT6ノックダウンの効果を、qRT-PCR(A)及びウエスタンブロッティング(B)により確かめた。(C)様々な時点においてCCK-8アッセイで測定した細胞増殖を示す。結果は、3回の独立した実験の平均値±標準偏差として表す。(D)細胞生存性に対する5-FU処置の用量応答効果を示す。結果は、3回の独立した実験の平均値±標準偏差として表す(*P < 0.05、**P <0.01)。(E)10μMの5-FUで処置した細胞において、アポトーシスをAnnexin V-PE及び7-AADで標識したフローサイトメトリーによって解析した。結果は、3回の独立した実験の平均値±標準偏差として表す(*P < 0.05)。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
(大腸がん患者の予後を予測するための及び/又は抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカー)
本発明は、大腸がん患者の予後を予測するためのバイオマーカーを提供する。本発明はまた、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーを提供する。本発明に係るバイオマーカーは、GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGALNT6遺伝子の転写産物若しくはその核酸断片からなる。
【００１２】
本明細書において、「大腸がん」は、結腸、直腸及び肛門を含む大腸に発生するがんを指す。大腸がんは、特に、結腸がん及び直腸がんを含む。
【００１３】
本明細書において、「予後」は、大腸がん患者において、大腸がんの切除手術後に予測される経過(例えば、生死)を指す。「予後の予測」は、生存期間、又は手術から一定期間後(例えば、1、3、5、10、15若しくは20年後又はそれ以上の時点)の生存率の予測であってもよい。予後の予測は、予後の判定、評価、又は診断ということもできる。
【００１４】
グリコシル化、すなわちタンパク質の糖鎖付加は、多様な生理学的過程を調節する、一般的かつ重要なタンパク質翻訳後修飾の1つである。グリコシル化は、標的タンパク質へ単一の糖残基を逐次的に付加することを伴い、その結果、グリカンが伸長する。さらなる化学修飾及び分枝化により、最終的に、様々なグリカン構造が形成され得る。グリコシル化は、一般に、糖転移酵素(グリコシルトランスフェラーゼ)の多酵素反応によって生じる。
【００１５】
GALNT6(ポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ6)タンパク質は、UDP-N-アセチル-α-D-ガラクトサミン:ポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ(GalNAc-T)ファミリーに属する糖転移酵素である。GalNAc-T酵素は、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)の、標的タンパク質上のセリン又はトレオニン残基への糖転移を触媒することによって、グリコシル化を開始することが知られている。
【００１６】
本発明では、原則として、大腸がん患者の内在遺伝子に由来するGALNT6タンパク質又はその遺伝子転写産物がバイオマーカーとなり得る。例えば、前記患者がヒトであれば、ヒトGALNT6遺伝子に由来するヒトGALNT6タンパク質及びヒトGALNT6遺伝子の転写産物(mRNA)が本発明のバイオマーカーとなり得る。
【００１７】
GALNT6タンパク質の具体例として、配列番号1で示される622残基のアミノ酸配列からなるヒト由来のGALNT6(ヒトGALNT6)タンパク質が挙げられる。
【００１８】
また、GALNT6タンパク質には、配列番号1で示されるGALNT6タンパク質と機能的に同等の活性を有するGALNT6バリアントや他生物種のGALNT6オルソログも包含される。具体的には、配列番号1で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、あるいは配列番号1で示されるアミノ酸配列に対して90％、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上のアミノ酸同一性を有するGALNT6タンパク質が包含される。
【００１９】
本明細書において「複数個」とは、例えば、2〜20個、2〜15個、2〜10個、2〜7個、2〜5個、2〜4個又は2〜3個をいう。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン、ヒスチジン)、酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性アミノ酸(グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン)、無極性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン)、分枝鎖アミノ酸(ロイシン、バリン、イソロイシン)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン)等に分類することができる。
【００２０】
本明細書において「アミノ酸同一性」とは、2つのアミノ酸配列を整列(アラインメント)し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるGALNT6タンパク質の全アミノ酸残基に対する2つのアミノ酸配列間で同一アミノ酸残基の割合(％)をいう。アミノ酸同一性は、BLASTやFASTAによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる。
【００２１】
「GALNT6遺伝子」は、前記GALNT6タンパク質をコードする遺伝子である。GALNT6遺伝子の具体例として、配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるヒトGALNT6タンパク質をコードするヒトGALNT6遺伝子が挙げられる。より具体的には、GALNT6遺伝子は、配列番号2で示される塩基配列からなる遺伝子である。
【００２２】
また、GALNT6遺伝子には、配列番号2で示されるGALNT6遺伝子がコードするGALNT6タンパク質と機能的に同等の活性を有するGALNT6バリアントや他生物種のGALNT6オルソログをコードするGALNT6遺伝子も包含される。具体的には、配列番号2で示される塩基配列において1若しくは複数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列、あるいは配列番号2で示される塩基配列に対して90％、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の塩基同一性を有するGALNT6遺伝子が包含される。さらに、配列番号2で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列の一部からなる核酸断片と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、かつGALNT6タンパク質と機能的に同等の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が包含される。
【００２３】
本明細書において「塩基同一性」とは、2つの塩基配列を整列(アラインメント)し、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときに、配列番号2で示される塩基配列からなるGALNT6遺伝子の全塩基に対する2つの塩基配列間で同一塩基の割合(％)をいう。
【００２４】
本明細書において「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、低塩濃度及び/又は高温の条件下でハイブリダイゼーションと洗浄を行うことをいう。例えば、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS、100μg/mL変性断片化サケ精子DNA中で65℃〜68℃にてプローブと共にインキュベートし、その後、2×SSC、0.1％SDSの洗浄液中で室温から開始して、洗浄液中の塩濃度を0.1×SSCまで下げ、かつ温度を68℃まで上げて、バックグラウンドシグナルが検出されなくなるまで洗浄することが例示される。高ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件については、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning： A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載されているので参考にすることができる。
【００２５】
このようなGALNT6遺伝子の塩基配列情報は、公共のデータベース(GenBank、EMBL、DDBJ)より検索可能である。例えば、配列番号2で示されるGALNT6遺伝子の既知塩基配列情報に基づいて、塩基同一性の高い遺伝子をデータベースから検索し、入手することができる。
【００２６】
「GALNT6遺伝子の転写産物」とは、GALNT6 mRNAを意味する。mRNAは、mRNA前駆体(pre-mRNA)及び成熟mRNA(mature mRNA)を問わない。通常、mRNA前駆体は、核内において直ちにスプライシングされて、成熟mRNA成熟体となることから、実質的に本発明のバイオマーカーとなるGALNT6遺伝子の転写産物は、GALNT6成熟mRNAである。
【００２７】
本明細書において「ペプチド断片」とは、GALNT6タンパク質を構成するアミノ酸配列の一部からなるペプチド断片であって、その断片を構成するアミノ酸配列からGALNT6タンパク質の断片であることを同定することができるものをいう。通常は、GALNT6タンパク質の全長アミノ酸配列のうちの20個以上200個以下、30個以上150個以下、40個以上100個以下、又は50個以上80個以下の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであればよい。
【００２８】
本明細書において「核酸断片」とは、GALNT6 mRNAを構成する塩基配列の一部からなる核酸断片であって、その断片を構成する塩基配列からGALNT6 mRNAの断片であることを同定することができるものをいう。通常は、GALNT6 mRNAの全長塩基配列のうちの40個以上600個以下、50個以上450個以下、60個以上300個以下、又は70個以上200個以下の連続する塩基からなる核酸であればよい。
【００２９】
(バイオマーカーを指標とした予後の予測及び/又は抗がん剤の有効性の判定)
本発明は、大腸がん患者の予後を予測するための、上述の本発明に係るバイオマーカーの使用を提供する。本発明はまた、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するための、上述の本発明に係るバイオマーカーの使用を提供する。
【００３０】
本発明はまた、大腸がん患者の予後を予測する方法を提供する。本方法は、大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織における、上述の本発明に係るバイオマーカーの量を測定する測定工程、及び前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、大腸がん患者の予後を予測する予測工程を含む。測定工程は、インビトロで行うことができる。
以下に各工程について具体的に説明する。
【００３１】
(1)測定工程
大腸がんは、進行度の低い方からステージ0、I、II、III及びIVに分類される。本発明では、病期(ステージ)の決定は、国際対がん連合(UICC)のTNM分類(UICC第7版; Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind C, International Union against Cancer. TNM classification of malignant tumours, 7th edn. Wiley-Blackwell (2010))に基づいて行う。上記の国際対がん連合(UICC)のTNM分類を、UICC-TNM分類と本明細書で称する。UICC-TNM分類では、壁深達度(T分類)、リンパ節転移(N分類)及び遠隔転移(M分類)の3つの因子により、がん病変の進行度を分類する。UICC-TNM分類に基づく病期の決定は当業者の通常の知識に従って行うことができる。
【００３２】
具体的には、大腸がんが粘膜内に留まる(Tis)場合をステージ0、大腸がんが粘膜下層(T1)又は固有筋層(T2)に留まる場合をステージI、大腸がんが固有筋層を超え漿膜下層(T3)又は漿膜若しくは隣接臓器(T4)に浸潤する場合をステージIIと判定する。なおステージ0〜IIではいずれもリンパ節転移を伴わない(N0)。リンパ節転移を伴う(N1〜2)場合はステージIIIと判定する。ステージ0〜IIIはいずれも遠隔転移のない(M0)がんであり、遠隔転移を伴う(M1)がんはステージIVと判定する。
【００３３】
本発明の対象となる患者が患う大腸がんは、ステージI〜IV、好ましくはステージII及びIII、より好ましくはステージIIIの大腸がんであってよい。
【００３４】
本発明における大腸がん患者は、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【００３５】
本発明において使用する大腸がん細胞又は組織は、特に限定されないが、例えば、生検又は切除手術によって大腸がん患者から得ることができる。当該細胞又は組織は、そのままバイオマーカーの測定に用いてもよいが、測定のために適宜前処理してもよい。例えば、免疫組織化学染色法でバイオマーカーを検出する場合は、患者由来の試料からパラフィン包埋切片を調製してもよい。また、例えば、ウエスタンブロット法又はRT-PCR法によってバイオマーカーを検出する場合は、患者由来の試料からタンパク質抽出液又はmRNA抽出液を調製してもよい。
【００３６】
本方法で測定すべきバイオマーカーは、GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片又はGALNT6遺伝子の転写産物若しくはその核酸断片のいずれであってもよい。量(発現量)の測定は、発現の有無、又は発現量若しくは発現濃度の大小等を測定することを包含する。本発明において、「測定」という用語には、検出、定性、定量及び半定量のいずれもが包含される。
【００３７】
測定すべきバイオマーカーがGALNT6タンパク質又はそのペプチド断片の場合、その測定方法は、公知のタンパク質定量方法であればよく、特に限定はしないが、例えば、免疫学的検出法が挙げられる。
【００３８】
「免疫学的検出法」は、抗原である標的分子と特異的に結合する抗体又は抗体断片を用いて、標的分子の量を測定する方法である。
【００３９】
抗体は、哺乳動物及び鳥を含めたいずれの動物由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ又はヒト等が挙げられる。
【００４０】
免疫学的検出法で使用する抗体は、特に限定されないが、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を使用してよい。
【００４１】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、単一免疫グロブリンのクローン群をいう。モノクローナル抗体を構成する各免疫グロブリンは、共通するフレームワーク領域及び共通する相補性決定領域を含み、同一抗原の同一エピトープを認識し、それに結合することができる。モノクローナル抗体は、単一細胞由来のハイブリドーマから得ることができる。
【００４２】
本明細書において「ポリクローナル抗体」とは、同一抗原の異なるエピトープを認識し結合する複数種の免疫グロブリン群をいう。ポリクローナル抗体は、標的分子を抗原として動物に免疫後、その動物の血清から得ることができる。
【００４３】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合、免疫グロブリン分子には、IgG、IgM、IgA、IgE、及びIgDの各クラスが知られているが、本発明の抗体は、いずれのクラスであってもよい。好ましくはIgGである。
【００４４】
GALNT6タンパク質を認識し結合するポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する方法は、GALNT6タンパク質又はその断片を抗原として当該分野で公知の抗体作製方法に準じて行えばよい。抗体はまた、例えばSigma-Aldrich社等の製造業者から得てもよい。
【００４５】
本明細書において「抗体断片」とは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の部分断片であって、該抗体が有する抗原特異的結合活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチド鎖又はその複合体をいう。例えば、抗原結合部位を少なくとも1つ包含する抗体部分、すなわち、少なくとも1組のVLとVHを有するポリペプチド鎖、又はその複合体が該当する。具体例としては、免疫グロブリンを様々なペプチダーゼで切断することによって生じる多数の十分に特徴付けられた抗体断片等が挙げられる。より具体的な例としては、Fab、F(ab')2、Fab'等が挙げられる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含しており、抗原である標的分子と特異的に結合する能力を有している。
【００４６】
免疫学的検出法としては、例えば、免疫組織化学染色法、酵素免疫測定法(ELISA法、EIA法を含む)、ウエスタンブロット法、放射免疫測定(RIA)法、免疫沈降法、又はフローサイトメトリー法が挙げられる。
【００４７】
「免疫組織化学染色法」は、公知の方法を採用することができる。例えば、患者由来の試料をホルマリン固定後、パラフィンに包埋して組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用してよい。切片試料は、場合により熱処理して抗原を賦活化し、その後、Dako EnVision+ System(Agilent社)などの市販の検出システムを用いて切片試料について免疫組織化学染色を行ってよい。
【００４８】
また、測定すべきバイオマーカーがGALNT6遺伝子転写産物又はその核酸断片の場合、その測定方法は、公知の核酸定量方法であればよく、特に限定はしないが、例えば、プライマーを用いる核酸増幅法又はプローブを用いるハイブリダイゼーション法が挙げられる。
【００４９】
「核酸増幅法」は、フォワード/リバースプライマーセット用いて、標的核酸の特定の領域を核酸ポリメラーゼによって増幅させる方法をいう。核酸増幅法としては、例えば、RT-PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)法などのPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法が挙げられる。
【００５０】
「ハイブリダイゼーション法」は、検出すべき標的核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有する核酸断片をプローブとして用い、その核酸と該プローブ間の塩基対合を利用して、標的核酸若しくはその断片を検出、定量する方法である。ハイブリダイゼーション法には、検出手段の異なるいくつかの方法が知られているが、例えば、ノザンハイブリダイゼーション法(ノザンブロットハイブリダイゼーション法)、in situハイブリダイゼーション法、又はマイクロアレイ法が挙げられる。
【００５１】
プライマー及びプローブ等の核酸鎖は、公知のバイオマーカー配列情報を基に当業者に公知の方法により適宜設計し、化学合成などの公知の作製方法により得ることができる。
【００５２】
上述の各測定法は、いずれも当該分野に公知の技術である。したがって、具体的な測定方法については、公知の方法に準じて行えばよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012(前述)に記載の方法を参考にすることができる。
【００５３】
(2)予測工程
本工程では、前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、大腸がん患者の予後を予測する。本工程は、前記測定工程で得られた測定結果から、前記大腸がん細胞又は組織がバイオマーカーについて陽性であるか又は陰性であるかを判定することを包含し得る。
【００５４】
免疫組織化学染色法を用いる場合、例えば、腫瘍細胞総数に対して染色された腫瘍細胞数が一定割合(例えば10％、15％又は20％)を超える場合、陽性と判定し、腫瘍細胞総数に対して染色された腫瘍細胞数が前記一定割合以下の場合、陰性と判定してもよい。
【００５５】
あるいは、大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織において測定したバイオマーカーの量を、対照試料(対照細胞又は組織)において測定した対照量と比較して、陽性又は陰性を判定してもよい。対照試料は、健常個体(例えば健常人)、又は良性の大腸腺腫患者に由来してもよい。本発明において「健常個体」とは、被験個体と同じ生物種の、がんに罹患していない健康な個体をいう。
【００５６】
本発明者らは、後述の実施例で述べるとおり、GALNT6タンパク質の発現量が、正常大腸粘膜で無く又は低く、一方、大腸腺腫組織で高いことを見出した。したがって、大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織において測定したバイオマーカーの量が、健常個体に由来する対照試料において測定した対照量と比べて高い(例えば、統計学的に有意に高い)場合、当該大腸がん細胞又は組織はバイオマーカーについて陽性であると判定し得る。また、大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織において測定したバイオマーカーの量が、健常個体に由来する対照試料において測定した対照量と比べて同じ又は低い(例えば、統計学的に有意に低い)場合、当該大腸がん細胞又は組織はバイオマーカーについて陰性であると判定し得る。
【００５７】
あるいは、大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織において測定したバイオマーカーの量が、大腸腺腫患者に由来する対照試料において測定した対照量と比べて同じ又は高い(例えば、統計学的に有意に高い)場合、当該大腸がん細胞又は組織はバイオマーカーについて陽性であると判定し得る。また、大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織において測定したバイオマーカーの量が、大腸腺腫患者に由来する対照試料において測定した対照量と比べて低い(例えば、統計学的に有意に低い)場合、当該大腸がん細胞又は組織はバイオマーカーについて陰性であると判定し得る。
【００５８】
本明細書において「統計学的に有意」とは、得られた値の危険率(有意水準)が小さい場合、具体的には、p＜0.05(5％未満)、p＜0.01(1％未満)又はp＜0.001(0.1％未満)の場合を指す。統計学的検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、多重比較検定法、ログランク検定法を用いることができる。
【００５９】
また、あらかじめ対照試料においてバイオマーカーの量を測定しておき、該測定値に基づいてカットオフ値(閾値)を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準としカットオフ値を超えた場合に、陽性であると判断することができる。カットオフ値は、例えば、ROC(receiver operating characteristic curve：受信者動作特性曲線)解析により定めることができる。
【００６０】
本発明者らは、後述の実施例で述べるとおり、GALNT6タンパク質の発現量が大腸がん患者の予後と相関することを見出した。したがって、本工程では、大腸がん細胞又は組織がバイオマーカーについて陰性である場合、大腸がん患者の予後は悪いと予測し得る。一方、大腸がん細胞又は組織がバイオマーカーについて陽性である場合、大腸がん患者の予後は良いと予測し得る。
【００６１】
本明細書において、「予後が悪い」とは、臨床転帰が不良である(例えば、大腸がんの切除手術後の再発率が高い、疾患(がん)特異的生存率が低い、又は全生存率が低い)ことをいう。予後が悪い場合、大腸がんの切除手術後の5年生存率は90％未満、85％未満、80％未満、75％未満、70％未満、65％未満又は60％未満であり得る。本発明では生存率は、累積生存率を意味する。本発明では生存率は、疾患(がん)特異的生存率又は全生存率であってもよい。
【００６２】
本明細書において、「予後が良い」とは、臨床転帰が良好であることをいう。予後が良い場合、大腸がんの切除手術後の5年生存率は90％以上又は95％以上であり得る。
【００６３】
本発明によれば、大腸がん患者の予後を予測することができ、その結果に基づき、治療方針(例えば、抗がん剤の種類、投与量、投与間隔など)を決定し、又は大腸がんの再発及び転移の検査の間隔を決定することができる。
【００６４】
本発明により、大腸がん患者の予後が悪いと予測された場合、大腸がんの再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善するために、患者に抗がん剤を投与してもよい。したがって、本発明はまた、本発明の方法により予後が悪いと予測された大腸がん患者に抗がん剤を投与することを含む、大腸がんの再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善する方法を提供する。
【００６５】
抗がん剤としては、以下に限定されないが、5-フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン、オキサリプラチン、イリノテカン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ及びレゴラフェニブなどが挙げられる。抗がん剤は、単独で又は組みあわせて使用できる。抗がん剤は、注射、静脈内投与、経口投与などの経路で投与され得る。
【００６６】
本発明はまた、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定する方法を提供する。本方法は、大腸がん患者から得た大腸がん細胞又は組織における、上述の本発明に係るバイオマーカーの量を測定する測定工程、及び前記測定工程で得られた測定結果に基づいて、抗がん剤の有効性を判定する判定工程を含む。
【００６７】
測定工程については、上記大腸がん患者の予後を予測する方法について記載したのと同様であるから記載を省略する。また、判定工程についても、測定結果に基づいて、大腸がん患者の予後を予測するのにかえて、抗がん剤の有効性を判定することを除いては上記大腸がん患者の予後を予測する方法について記載したのに準ずるから、異なる部分についてのみ以下記載する。
【００６８】
本工程では、大腸がん細胞又は組織がバイオマーカーについて陰性である場合、大腸がん患者に対する抗がん剤の効果は低いと判定し得る。一方、大腸がん細胞又は組織がバイオマーカーについて陽性である場合、大腸がん患者に対する抗がん剤の効果は高いと判定し得る。
【００６９】
本明細書において、バイオマーカーについて陰性である患者における「抗がん剤の効果が低い」とは、バイオマーカーについて陽性である患者に比べて効果が低い(例えば、無病生存率が低い、疾患(がん)特異的生存率が低い、又は全生存率が低い)ことをいう。抗がん剤の効果が低い場合、大腸がんの切除手術5年後の生存率、例えば無病生存率は80％未満、75％未満、70％未満、65％未満、60％未満、55％未満又は50％未満であり得る。本発明では生存率は、累積生存率を意味する。本発明では生存率は、無病生存率、疾患(がん)特異的生存率又は全生存率であってもよい。
【００７０】
本明細書において、「抗がん剤の効果が高い」とバイオマーカーについて陽性である患者に比べて効果が高いことを意味し、例えば、大腸がんの切除手術5年後の無病生存率は60％以上又は70％以上であり得る。
【００７１】
本発明により、大腸がん患者に対する抗癌剤が高いと判定された場合、大腸がんの再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善するために、患者に抗がん剤を投与してもよい。したがって、本発明はまた、本発明の方法により大腸がん患者に対する抗癌剤が高いと判定された大腸がん患者に抗がん剤を投与することを含む、大腸がんの再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善する方法を提供する。
【００７２】
抗がん剤としては、以下に限定されないが、5-フルオロウラシル(5-FU)、カペシタビン、オキサリプラチン、イリノテカン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ及びレゴラフェニブなどが挙げられる。抗がん剤は、単独で又は組みあわせて使用できる。抗がん剤は、注射、静脈内投与、経口投与などの経路で投与され得る。
【００７３】
本発明により、大腸がん患者に対する抗癌剤が低いと判定された場合、大腸がんの再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善するために、患者に抗がん剤以外の療法（例えば放射線療法等）を適用してもよい。したがって、本発明はまた、本発明の方法により大腸がん患者に対する抗癌剤が高いと判定された大腸がん患者に抗がん剤以外の療法を適用することを含む、大腸がんの再発を防止し、又は予後を改善し、又は生存率を改善する方法を提供する。
【００７４】
(キット)
本発明はまた、上述の本発明に係るバイオマーカーの量を測定するための試薬を含む、大腸がん患者の予後を予測するためのキットも提供する。本発明はさらに、上述の本発明に係るバイオマーカーの量を測定するための試薬を含む、大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのキットも提供する。
【００７５】
バイオマーカーの量を測定するための試薬としては、例えば、上述のような抗体若しくは抗体断片、又はプローブ若しくはプライマーが挙げられる。キットは、公知の免疫組織化学染色、ELISA、ウエスタンブロット、又はRT-PCR用の試薬等、例えば、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤、並びに試験に必要な器具及びコントロール等をさらに含んでもよい。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００７７】
[実施例1]
(大腸がん組織におけるGALNT6タンパク質の免疫組織化学染色)
GALNT6タンパク質発現のための免疫組織化学染色を行った。
福島県立医科大学附属病院で1990〜2010年の間に治癒的切除手術を受けた原発性大腸がん(primary colorectal cancer)患者368人を本研究に登録した。各患者からはインフォームドコンセントを得るか、又は患者の拒否機会を保障した(オプトアウト)。腫瘍のステージを、悪性腫瘍のTNM分類(UICC第7版; Sobin LH, Gospodarowicz MK, Wittekind C, International Union against Cancer. TNM classification of malignant tumours, 7th edn. Wiley-Blackwell (2010))に従って決定した。手術前に化学療法又は放射線療法を受けた患者を除外し、ステージ0〜IVの335人の患者から切除された大腸がん組織のホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed, paraffin-embedded; FFPE)切片を用いた。これらのうち304個の切片では、がん細胞に隣接する正常粘膜も評価のために利用可能であった。また、40例の大腸腺腫組織のFFPE切片も用いた。なお、本研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施され、福島県立医科大学の施設内審査委員会の承認を受けた。【００７８】
4μm厚の切片を脱パラフィン処理し、再水和し、内在性ペルオキシダーゼをメタノール中の0.3％過酸化水素でブロックした。切片を、10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)中で105℃にて5分間オートクレーブ処理し、抗原を回復した。一次ウサギポリクローナル抗GALNT6抗体(HPA011762、Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国)を、Tween 20(Sigma-Aldrich社)を含有する10mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で500倍に希釈して抗GALNT6抗体溶液を調製し、切片を抗体溶液と4℃で一晩インキュベートした。次いで、Dako EnVision+ System(Agilent社(旧Dako社))を用いて、切片を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合抗ウサギポリマーとインキュベートし、その後、ジアミノベンジジンとインキュベートして、抗GALNT6抗体を可視化した。切片をヘマトキシリンで対比染色した。陰性対照は、一次抗体をPBSで置き換えることによって行った。陽性対照として、肺、膵臓、乳房及び胃に由来するいくつかの腺がん組織を用いた。【００７９】
免疫組織化学スライドを、患者の臨床情報を知らない2人の独立した観察者によって評価し、10％を超える腫瘍細胞が細胞質において染色された場合、切片をGALNT6陽性とみなした。【００８０】
GALNT6タンパク質の免疫組織化学染色の代表的な画像を、図1に示す。304個の正常大腸粘膜を示す切片のうち92.8％がGALNT6陰性とみなされ(図1Aの矢頭、及び図1B)、GALNT6タンパク質発現は、大部分の正常大腸粘膜細胞では検出されないことが示された。【００８１】
一方、大腸腺腫のほぼ全て(97.5％)において、実質的に腫瘍領域全体にわたってGALNT6の強い顆粒状細胞質染色が観察された(図1Aの矢印、及び図1C)。【００８２】
さらに、335個の大腸がん切片のうち286個(85.4％)において、がん細胞内に強いGALNT6染色が散在して見られた(図1D及びEの茶色染色)。これらの286個の切片のうち、17個はステージ0、52個はステージI、103個はステージII、74個はステージIII、40個はステージIVの大腸がん患者に由来した。【００８３】
しかし、335個の大腸がん切片のうち49個(14.6％)では、GALNT6タンパク質発現が見られなかった(図1F及びG)。これらの49個の切片のうち、10個はステージI、19個はステージII、15個はステージIII、5個はステージIVの大腸がん患者に由来した。【００８４】
これらの結果から、正常大腸粘膜ではGALNT6は発現せず、前がん状態及び前浸潤状態でGALNT6の発現が高くなること、さらに、様々なステージの大腸がん患者の大部分ではGALNT6の発現が高いが、大腸がんの患者の一部(約15％)においてGALNT6発現が低下又は消失することが示された。【００８５】
[実施例2]
(大腸がん患者の切除手術後の予後評価)
福島県立医科大学附属病院で1990〜2010年の間に治癒的切除手術を受けたステージI〜IVの267人の原発性大腸がん患者の予後を評価した。腫瘍のステージを、実施例1に記載したように決定した。患者から切除した大腸がん組織について、実施例1に記載したように免疫組織化学染色の結果に基づいてGALNT6陰性又は陽性を決定した。患者の臨床情報は、医療記録を再調査することによって遡及的に得た。【００８６】
カプラン-マイヤー(Kaplan-Meier)法により累積生存率を推定した。生存率として、疾患特異的生存率(disease-specific survival)及び全生存率(overall survival)を用いた。疾患特異的生存率及び全生存率は、それぞれ、手術日からがんによる死亡までの期間、及び手術日から任意の原因による死亡までの期間と定義される。2群(GALNT6陽性群及びGALNT6陰性群)間の生存率をログランク検定により比較した。全ての統計分析は両側(two-sided)であり、Graphpad Prism v6.0(Graphpad Software社、ラホヤ、カリフォルニア州、米国)及びSPSS Statisticsバージョン24(IBM社、ニューヨーク州、米国)を用いて行った。全てのP値は両側であり、0.05未満のP値を統計学的に有意であるとみなした。【００８７】
疾患特異的生存率の結果を図2に示す。GALNT6陽性の腫瘍を有するステージI〜IVの大腸がん患者は、高い疾患特異的生存率を示した(図2A；5年生存率95.7％、10年生存率90.8％)。一方、GALNT6陰性の腫瘍を有するステージI〜IVの大腸がん患者は、GALNT6陽性患者と比較して、有意に低い(P=0.0038)疾患特異的生存率を示した(図2A；5年生存率84.4％、10年生存率75.7％)。【００８８】
ステージII及びIIIのみについても、GALNT6陽性の大腸がん患者は、高い疾患特異的生存率を示し(図2B；5年生存率96.4％、10年生存率91.3％)、一方、GALNT6陰性の大腸がん患者は、GALNT6陽性患者と比較して有意に低い(P=0.0008)疾患特異的生存率を示した(図2B；5年生存率78.8％、10年生存率73.1％)。【００８９】
さらに、ステージIIIのみにおいても、GALNT6陽性の大腸がん患者は、高い疾患特異的生存率を示し(図2C；5年生存率95.4％、10年生存率90.7％)、一方、GALNT6陰性の大腸がん患者は、GALNT6陽性患者と比較して有意に低い(P<0.0001)疾患特異的生存率を示した(図2C；5年生存率57.1％、10年生存率57.1％)。特にステージIIIの大腸がん患者において、GALNT6陽性患者と陰性患者の生存率の違いが顕著であった。
また、全生存率でも、疾患特異的生存率と同様の傾向が示された。【００９０】
以上の結果から、GALNT6陽性の大腸がん患者は、大腸がん切除手術後の予後が良いのに対し、GALNT6陰性の大腸がん患者は、大腸がん切除手術後の予後が悪い傾向があることが示された。【００９１】
[実施例3]
(大腸がん患者における化学療法の有効性)
福島県立医科大学附属病院で1990〜2010年の間に治癒的切除手術を受けたステージII〜IIIの190人の原発性大腸がん患者の予後を評価した。腫瘍のステージを、実施例1に記載したように決定した。患者から切除した大腸がん組織について、実施例1に記載したように免疫組織化学染色の結果に基づいてGALNT6陰性又は陽性を決定した。患者の臨床情報は、医療記録を再調査することによって遡及的に得た。【００９２】
カプラン-マイヤー(Kaplan-Meier)法により累積生存率を推定した。生存率として、無病生存率(disease-free survival)を用いた。無病生存率は、手術日から疾患の再発までの期間と定義される。統計的手法は実施例2に従った。【００９３】
本実施例では、GALNT6の発現が、アジュバント化学療法に対する応答性と関係しているかを調べた。アジュバント化学療法の適用の有無に関する情報が利用可能である、190人のステージII及びIIIの患者において、免疫組織化学の結果と無病生存率の相関を調べた。本実施例で解析した患者のうち114人は切除手術後に静脈内又は経口5-FUベースの化学療法で処置されており、76人は切除手術のみで処置されていた。【００９４】
図3に結果を示す。化学療法で処置したステージII〜IIIの患者のうち、GALNT6陰性の患者は、GALNT6陽性患者より低い無病生存率を示した（図3A）。また、化学療法で処置したステージIIIの患者のうち、GALNT6陰性の患者は、GALNT6陽性患者より統計的に有意に低い治療結果を示した（図3C）。このような結果は、切除手術のみで処置した患者では認められなかった（ステージII〜III：図3B、ステージIII：3D）。【００９５】
以上の結果から、GALNT6陽性の大腸がん患者は、化学療法の有効性が高いのに対し、GALNT6陰性の大腸がん患者は、化学療法の有効性が低い傾向があることが示された。【００９６】
[実施例4]
(GALNT6発現と5-FUに対する抵抗性の関連)
＜材料と方法＞
SW480細胞は、American Typed Culture Collection（ATCC、マナサス、バージニア州、米国）から購入した。SW480は、10%ウシ胎児血清及びペニシリン/ストレプトマイシン（ThermoFisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を含むRPMI-1640培地（Promega、マディソン、ウィスコンシン州、米国）において、5%CO2を含む加湿した雰囲気下で維持した。【００９７】
定量RT-PCRは、以下の通り行った。全RNAをTRIzol試薬を用いて抽出し、全RNAの1μgをSuperScript III First-Strand Synthesis System（ThermoFisher Scientific）を用いて、製造業者の指示に従って逆転写した。GALNT6（Assay ID Hs00926629_m1）、及びACTB（Hs99999903_m1）を対象とするqRT-PCRは、TaqMan Gene Expression Master Mixを用いて、7500 real time PCR systemにて、三連でTaqManにより行った（ThermoFisher Scientific）。相対発現レベルを2-ΔΔCt法により、SDSソフトウェアによって製造業者の指示に従って測定し、ACTBを校正遺伝子として用いた。【００９８】
ウエスタンブロッティングは、以下の通り行った。全タンパク質を、Halt Protease Inhibitor Cocktail（ThermoFisher Scientific）を加えたRIPA溶解バッファーを用いて抽出し、Tris-Glycine SDSサンプルバッファー（ThermoFisher Scientific）中で加熱した。等量のタンパク質を10% SDS-PAGEゲルに供して分離し、PVDF膜（ThermoFisher Scientific）に転写した。膜を5%の脱脂乾燥スキムミルク粉末（Cell signaling Technology）でブロッキングし、一次抗体としてウサギ抗GALNT6抗体（(#HPA011762、1:250、Atlas Antibodies）又はマウス抗βアクチン抗体（(#SC-69879、1:2000、Santa Cruz Biotechnology）とインキュベートした。続いて膜をヤギ抗ウサギ又は抗マウスHRP二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）とインキュベートし、SuperSignal West Pico chemiluminescent Substrate（ThermoFisher Scientific）により発色させ、LAS4000 imager（GE Healthcare）により観察した。【００９９】
siRNAトランスフェクションは、以下の通り行った。対数増殖期において、細胞を6ウェルプレートに播種し、siRNAオリゴヌクレオチド又はスクランブル対照（Ambion（登録商標） Silencer Select、s22154、s22155及び陰性対照#1、ThermoFisher Scientific）を用いて、Lipofectamine RNAiMAX試薬（ThermoFisher Scientific）により、製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。48時間後、細胞を回収した。実験は少なくとも3回行い、ノックダウン効率をqRT-PCR及びウエスタンブロット解析により評価した。【０１００】
細胞増殖アッセイは、Cell Counting Kit-8（CCK-8、同仁化学）を用いて製造業者の指示に従って行った。手短には、トランスフェクションの24時間後、3つの群のSW480細胞を回収し、再懸濁して4×103細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。完全培地においてトランスフェクションの後24時間、48時間及び72時間インキュベーションした後、10μlのCCK-8試薬を加え、5%CO2を含む加湿した雰囲気下で3時間インキュベートした。450nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定した。実験は各回3連で、3回行った。【０１０１】
アポトーシス細胞は、Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit（BD Biosciences、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、米国）を用いて、製造業者のプロトコルに従って行った。手短には、GALNT6 siRNA及び対照siRNAをトランスフェクトした細胞を6ウェルプレートに播種した。48時間のインキュベーション後、細胞をAnnexin V及び7-AADによる標識で処理し、フローサイトメトリーを行った。Annexin V陽性細胞を、アポトーシス細胞とみなした。
5-FUの細胞毒性アッセイは以下の通り行った。GALNT6 siRNA及び対照siRNAをトランスフェクトしたSW480細胞を、96ウェルプレートに5×103/ウェルの密度で播種した。24時間インキュベーション後、細胞を様々な濃度の5-FU（Sigma-Aldrich）で処理し、5%CO2下で37℃にて72時間インキュベートした。細胞毒性は、CCK-8により上記の通り評価した。まず、0.1〜1000μg/mlの範囲の5-FU濃度又はビヒクル単独で予備的に処理し、用量応答曲線を作成した。続いて、1、5、10、50、及び100μg/mlの5-FUを実験に用いた。実験は各回3連で、少なくとも3回行った。【０１０２】
＜結果＞
GALNT6の生物学的機能を明らかにするため、SW480細胞株を用いて以下の実験で用いた。なお、SW480細胞が比較亭高いGALNT6 mRNA発現及びタンパク質発現を示すことは事前に確認している（データ示さず）。【０１０３】
GALNT6を標的とする2つの異なるsiRNAを用い、GALNT6が有効にサイレンシングされたことを、qRT-PCR及びウエスタンブロッティングによって確かめた（図4A、B）。GALNT6のサイレンシングは、細胞増殖に対しては有意な影響を示さなかった（図4C）。【０１０４】
続いて、GALNT6発現が5-FU処置に対する感受性の有無に寄与するか否かをインビトロで調べた。GALNT6ノックダウン細胞において、コントロールsiRNAで処置した細胞に対して、有意な5-FU抵抗性の増加が認められた（図4D）。これと対応して、5-FUで処置したGALNT6ノックダウン細胞において、アポトーシスが有意に抑制されていた（図4E）。【０１０５】
以上の結果から、GALNT6の発現を低減させると、5-FUに対する抵抗性が増加することが示された。この結果は、実施例3において認められた、GALNT6陰性の大腸がん患者における化学療法の有効性が低い傾向を裏付けるものである。【０１０６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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