(57)【要約】  本発明は、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、該消化により得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、該モノクローナル抗体が、該モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は該モノクローナル抗体の標的分子の存在下でプロテアーゼ消化される、上記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、該消化により得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、該モノクローナル抗体が、該モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は該モノクローナル抗体の標的分子の存在下でプロテアーゼ消化される、上記方法。
【請求項２】
上記モノクローナル抗体の一部又は全てが、上記モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は上記モノクローナル抗体の標的分子に結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記モノクローナル抗体が、上記モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体に対して分子比で1:1以下の量で生物学的試料中に存在する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
上記モノクローナル抗体が、上記標的分子に対して1:100以下の量で生物学的試料中に存在する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
上記モノクローナル抗体がトラスツズマブであり、トラスツズマブに特異的に結合する抗体が抗イディオタイプ抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
上記モノクローナル抗体がベバシズマブであり、ベバシズマブに特異的に結合する抗体が抗イディオタイプ抗体である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
被験者に投与されたモノクローナル抗体の有効性を評価するための方法であって、被験者由来の生物学的試料中のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、消化されたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出することによって該生物学的試料中の該モノクローナル抗体濃度を算出し、該モノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗体の存在による算出結果への影響の有無及び／又は程度を決定することを含む、上記方法。
【請求項８】
上記モノクローナル抗体がトラスツズマブであり、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列を有するペプチド断片を検出する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
上記モノクローナル抗体がベバシズマブであり、配列番号５〜７に示すアミノ酸配列を有するペプチド断片を検出する、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体の定量方法に関し、より具体的には、モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又はモノクローナル抗体の標的分子および抗原の存在下におけるモノクローナル抗体の定量方法に関する。本発明はまた、抗体医薬としてモノクローナル抗体を投与した後、該モノクローナル抗体を定量した結果に基づいて、該モノクローナル抗体による治療の有効性、薬効特性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な疾患の治療において、抗体医薬が開発され、臨床において使用されるようになってきている。例えば、抗癌剤治療薬として知られているトラスツズマブは、乳癌等で高発現しているHER2タンパク質に対して特異的に結合して抗腫瘍効果を発揮し得るヒト化モノクローナル抗体である。【０００３】
抗体医薬の有効性指標の一つとして、投与後の血中濃度は重要な指標となり得る。従って、投与後の抗体医薬の動態を追跡することは、その有効性や薬効を判断し、その後の治療計画を検討する上で、非常に重要である。【０００４】
従来、血中の抗体医薬の定量のために使用される方法としてはELISA法が主流であり、様々な構成のELISAキットが販売され、使用されている。しかしながら、抗体医薬の構造の多様化や、抗体医薬の生体内での修飾、自己抗体等の結合による阻害により、ELISA法では正確な定量値を測定できない場合があるという問題が生じている。【０００５】
一方、LC-MS/MS法を用いた抗体医薬のバイオアナリシスは、ELISA法に代わる定量法として、近年その開発が盛んである。LC-MS/MS法は、ELISA法と異なり、抗体医薬に対する検出抗体の作製が必要でなく、分析対象の抗体医薬を直接測定するため、簡易的かつ汎用的に定量分析を行うことができ、開発段階の抗体医薬の分析にもすぐに対応可能である。また、LC-MS/MS分析による抗体医薬の定量は、ELISA法のように抗原抗体反応を介した方法ではなく、直接測定対象分子、若しくはトリプシン消化したペプチド断片を分析する手法であるため、ELISA法での測定で妨害となる血中の競合等による定量値への影響が抑えられることが示唆されている。LC-MS/MS法では、定量値の再現性と堅牢性を担保するために、分析に供するサンプル中に測定対象物以外のペプチドや、タンパク質、難揮発性物質の混入を防ぐことが必要である。【０００６】
本発明者等のグループは、質量分析によるモノクローナル抗体の特異的な検出及び定量を目的として、個々のモノクローナル抗体特有のペプチドを取得するために検討した結果、モノクローナル抗体と、これを基質として消化し得るプロテアーゼの両方を固相に固定化することで、モノクローナル抗体の位置選択的な固相-固相反応によるプロテアーゼ消化を実現することに成功している（特許文献１及び非特許文献１）。この方法は、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行う質量分析の前処理方法であり、得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって効果的に検出することができる画期的な技術である。本発明者等は本方法を「ナノ表面及び分子配向制限的タンパク分解（nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis）方法（nSMOL法）」と命名している。【０００７】
nSMOL法による血中抗体医薬の定量は、抗体医薬の特異的配列を有するFab領域のみを限定的にトリプシン消化し、LC-MS/MS分析において最も問題視される、イオンサプレッション効果を抑制し、より安定した信頼性の高い定量値を提供することが可能な方法である。【０００８】
本発明者等は既に、nSMOL法及びLC-MS/MS法を組み合わせて用いたモノクローナル抗体の検出方法が、約10種類以上の抗体医薬の血中濃度測定において、日本、米国及び欧州における生物学的分析方法のバリデーションのためのガイドラインの基準を満たすものであることを確認している（非特許文献２〜７）。【０００９】
上記ガイドラインでは、分子を妨害ピークから選択する能力、定量可能下限値、検量可能範囲、データ真度および精度、共存分子から受けるマトリックス効果、次分析に影響を及ぼすキャリーオーバー、高濃度サンプルの希釈妥当性、サンプル保存安定性、サンプル処理後の安定性、をすべて確認する必要があり、その基準値が、定量下限値では±20％以下、その他は±15％以下であることが求められている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開WO2015/033479号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. DOI: 10.1039/c3an02104a
【非特許文献２】Anal. Methods, 2015; 21: 9177-9183
【非特許文献３】Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 2016; 31: 46-50
【非特許文献４】Bioanalysis. 2016; 8(10):1009-20. doi: 10.4155. bio-2016-0018
【非特許文献５】Biol Pharm Bull, 2016;39(7):1187-94. doi: 10.1248/bpb.b16-00230
【非特許文献６】J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci; 2016; 1023-1024:9-16. doi: 10.1016/j.jchromb.2016.04.038
【非特許文献７】Clin Pharmacol Biopharm 2016; 5:164. doi:10.4172/2167-065X.1000164
【非特許文献８】The AAPS Journal, 2015; 17(1): 1-16. doi:10.1208/s12248-014-9685-5
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
患者に抗体医薬が投与された場合、標的分子である抗原に対して抗体医薬が結合して薬効が発揮される一方、長期投与によって、抗体医薬に対する抗体、すなわち抗薬物抗体（Anti-drug antibodies, ADA、抗抗体ともいう）が産生される場合がある。従って、患者の血中では抗体医薬が標的分子及び／又はADAと結合した状態で存在し得る。様々な抗体医薬が開発され、使用される中で、このようなADAの産生が比較的短期間でしばしば見られる医薬や、長期間投与してもそれ程ADAが産生されない医薬とが存在することが分かってきている。ADAの産生はまた、個々の患者によって異なり、また患者の状態によっても異なることがある。ADAとの結合によって、投与された抗体医薬はその後体内から除去されることとなるため、標的分子のみならず、患者の体内で生じたADAと抗体医薬との結合を評価すること、また標的分子又はADAと結合した状態での抗体医薬を検出することは、抗体医薬の薬効評価の上で非常に重要な情報をもたらし得る。抗体医薬の血中濃度をより正確に定量するためには、このような標的分子及びADAの存在による影響を考慮することが必要である。【００１３】
上記の通り、ELISA法を用いたモノクローナル抗体の定量では、ADA及び標的分子の存在によって、正確な定量値を出すことができない。また、ELISAキットには、抗体医薬の標的分子を固相し、検出抗体としてヒトIgGのFab領域を認識する抗体を用いるものや、抗イディオタイプADAを固相し、検出抗体として別のADAを用いるもの等があり、その結果、検出対象の抗体医薬にADA又は標的分子が結合している場合、使用するELISAキットのタイプによっても測定値にばらつきが生じることになる。【００１４】
一方、nSMOL法が生物学的試料中に存在するモノクローナル抗体を非常に高い感度及び精度で検出でき、様々な抗体医薬の血中濃度測定に適用可能な前処理方法であることが証明されているが、ADAや標的分子と結合した抗体医薬の定量に関しては未解明な点も存在していた。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記の課題に鑑み、我々は、nSMOL法が、ADA又は標的分子が結合した抗体医薬の測定において、どのような影響を受け得るかを明らかにするために、複数のADA及びリガンドとなる標的分子を抗体医薬に結合させ、nSMOL法を用いてLC-MS/MS分析による定量を行った。【００１６】
その結果、抗イディオタイプ抗体であって、解離速度定数 (Kd値) が低いADAが抗体医薬に対して2倍以上のモル比で存在すると、ADAの濃度上昇に伴い、モノクローナル抗体の定量値の真度が下がることが示唆された。ADAが抗イディオタイプ抗体でない場合や抗イディオタイプ抗体であっても解離速度定数が高いADAは、モノクローナル抗体のnSMOLの定量分析に影響しないことが示唆された。【００１７】
一方で、標的分子の存在下では、モノクローナル抗体の100倍まで標的分子が存在した場合であっても、正確な定量値を示すことが明らかになった。【００１８】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．  測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、該消化により得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、該モノクローナル抗体が、該モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は該モノクローナル抗体の標的分子の存在下でプロテアーゼ消化される、上記方法。
２．  上記モノクローナル抗体の一部又は全てが、上記モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は上記モノクローナル抗体の標的分子に結合している、上記１記載の方法。
３．  上記モノクローナル抗体が、上記モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体に対して分子比で1:1以下の量で生物学的試料中に存在する、上記１又は２記載の方法。
４．  上記モノクローナル抗体が、上記標的分子に対して1:100以下の量で生物学的試料中に存在する、上記１又は２記載の方法。
５．  上記モノクローナル抗体がトラスツズマブであり、トラスツズマブに特異的に結合する抗体が抗イディオタイプ抗体である、上記１〜３のいずれか記載の方法。
６．  上記モノクローナル抗体がベバシズマブであり、ベバシズマブに特異的に結合する抗体が抗イディオタイプ抗体である、上記１〜３のいずれか記載の方法。
７．  被験者に投与されたモノクローナル抗体の有効性を評価するための方法であって、被験者由来の生物学的試料中のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、消化されたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出することによって該生物学的試料中の該モノクローナル抗体濃度を算出し、該モノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗体の存在による算出結果への影響の有無及び／又は程度を決定することを含む、上記方法。
８．  上記モノクローナル抗体がトラスツズマブであり、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列を有するペプチド断片を検出する、上記７記載の方法。
９．  上記モノクローナル抗体がベバシズマブであり、配列番号５〜７に示すアミノ酸配列を有するペプチド断片を検出する、上記７記載の方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の方法は、生物学的試料中にADA又は標的分子と共に存在するモノクローナル抗体を、高い感度及び精度で検出できる。また、本発明の方法により、抗体医薬による治療の有効性についての有用な情報を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、一実施形態において、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、該消化により得られたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出する方法であって、該モノクローナル抗体が、該モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は該モノクローナル抗体の標的分子の存在下でプロテアーゼ消化される、上記方法を提供する。
【００２１】
本明細書において、「被験者」とは、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、ヒト等の哺乳動物、特にヒトである。測定対象のモノクローナル抗体は、より具体的には、被験者、主としてヒト患者に投与され、被験者由来の生物学的試料中に存在するモノクローナル抗体である。本明細書において、生物学的試料とは、被験者の血液又は組織由来の試料であり、好ましくは血漿または血清、もしくは組織ホモジネート抽出液である。生物学的試料は、患者又は被験者から取得した後、直ちに本発明の方法に供することができるが、室温又は低温下で保存した後に本発明の方法に供することもできる。
【００２２】
本発明の方法において、生物学的試料中のモノクローナル抗体の濃度は、それぞれ0.05〜300μg/mlの範囲内であれば良い。
【００２３】
質量分析によりモノクローナル抗体を検出・定量するためには、まず血液や組織などの生物学的試料より測定対象物質以外をできる限り排除し、適切な溶媒に溶解することが必要である。また、抗体はそのまま分析するには分子量が大きいため、プロテアーゼによりペプチドに分解し、その後液体クロマトグラフで分離した後に質量分析を行う。分析に適したペプチドの分子量は約1000〜3000 Da程度である。
【００２４】
一般的なタンパク質分子をプロテアーゼ分解すると、ペプチド断片が約100本程度、抗体の場合には200本を遙かに超えるペプチド断片が生成する。従って、単一のタンパク質だけでも測定対象数は膨大になり、複雑な生物学的試料を対象にした場合には、巨大なサンプルセットとなり、個別の分析を妨害する可能性を捨てきれない。
【００２５】
本発明者等が開発したnSMOL法は、モノクローナル抗体の検出のために有効なFab領域選択的なペプチド断片を生成する質量分析の前処理方法として利用することができる。
【００２６】
＜nSMOL法の概要＞
本発明の方法は、本発明者等のグループが先に開発したnSMOL法を適用して実施する。nSMOL法の詳細は、例えばWO 2015/033479号；及びIwamoto N et.al., Selective detection of complementarity-determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst. 2014 Feb 7; 139(3): 576-80. DOI: 10.1039/c3an02104aに記載されている。また、nSMOL法の改良技術等に関して、例えばWO 2016/143223号；WO 2016/143224号；WO 2016/143226号；WO 2016/143227号；Iwamoto N et.al., Bioanalysis, doi: 10.4155/bio-2016-0018；及びIwamoto N et. al., Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2016, doi:10.1248/bpb.b16-00230等に開示されている。これらの文献の開示内容は、参照により本明細書に組み入れるものとする。
【００２７】
より具体的には、nSMOL法は、測定対象のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行う方法である。nSMOL法によって得られるペプチドは、抗体のFab領域由来、例えば重鎖又は軽鎖のCDR1、CDR2、CDR3領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
【００２８】
＜抗体＞
本発明の方法における測定対象であるモノクローナル抗体は、FabドメインとFcドメインがヒンジを介してつながった免疫グロブリンIgGであり、抗体分子を構成する2本の重鎖及び2本の軽鎖はそれぞれ定常領域と可変領域から成っている。定常領域は、同一種由来の抗体のほとんどで共通するアミノ酸配列を有し、一方、可変領域には、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる特異的な配列を持つ部位が各3つずつ存在する。このCDR（CDR1、CDR2、CDR3）領域が規定する立体構造が抗原との特異的結合に関わっており、それによって抗体−抗原複合体が形成される。
【００２９】
本発明の方法において測定対象となり得るモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、例えばパニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ラムシルマブ、アダリムマブ等のヒト抗体；トシリズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ-DM1、ベバシズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、ゲムツズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、モガムリズマブ、エクリズマブ等のヒト化抗体；リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ等のキメラ抗体等が挙げられる。尚、モノクローナル抗体の分子径は約１４．５ｎｍである。
【００３０】
また、モノクローナル抗体の特異性を維持しつつ更なる機能を付加した複合体、例えばFc融合タンパク質、抗体-薬物複合体（例えばブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、トラスツズマブ-エムタンシン等）も本発明の方法における測定対象のモノクローナル抗体に含めるものとする。測定に先立って複合体の結合を解離させ、抗体部分のみを分析に供しても良いが、複合体の形態のままで分析に供することもできる。当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、測定対象に応じて本発明の方法のための最適な条件を設定することができる。
【００３１】
モノクローナル抗体の一例として本明細書中に記載するトラスツズマブは、HER2タンパク質に対して特異的に結合し得るヒト化モノクローナル抗体であり、ハーセプチンの商品名で入手することができる。トラスツズマブのアミノ酸配列の情報は、例えば京都遺伝子ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）から取得することができる。
【００３２】
また、モノクローナル抗体の別の例として本明細書中に記載するベバシズマブは、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）に対して特異的に結合し得るヒト化モノクローナル抗体であり、アバスチンの商品名で入手することができる。ベバシズマブのアミノ酸配列の情報も、例えば京都遺伝子ゲノム百科事典（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）から取得することができる。
【００３３】
nSMOL法を用いた本発明の方法は、モノクローナル抗体のFab領域を選択的にプロテアーゼ消化して得られたペプチド断片の質量分析により、抗体由来のペプチド断片を直接測定する方法である。従って、本発明の方法は、抗体の種類に関わらず適用可能であり、上記例示の抗体に限定されず、新規に開発されたモノクローナル抗体等にも適用できる。当業者であれば、本発明者等が先に報告した上記論文及び特許出願の開示、並びに質量分析に関する技術常識に基づいて、目的の抗体を検出するための情報を入手し、好適なシグネチャーペプチドを選択することができる。
【００３４】
本発明者等は、nSMOL法が、目的のモノクローナル抗体が、該モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は該モノクローナル抗体の標的分子の存在下におけるプロテアーゼ消化によっても好適な定量結果を示し、抗体医薬による治療や薬効評価の有効性についての有用な情報をもたらすことができることを見出した。すなわち、本発明の方法において、モノクローナル抗体の一部又は全てが、該モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体、又は該モノクローナル抗体の標的分子に結合していても良い。
【００３５】
例えば、モノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体に特異的に結合する抗体に対して分子比で100:1、10:1、5:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:50、又は1:100以下、例えば1:1以下の量で生物学的試料中に存在していても、モノクローナル抗体の定量値に影響を及ぼさない。
【００３６】
また、モノクローナル抗体は、標的分子に対して10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:50、又は1:100以下で生物学的試料中に存在していても、モノクローナル抗体の定量値に影響を及ぼさない。
【００３７】
本発明の一実施形態では、モノクローナル抗体はトラスツズマブであり、トラスツズマブに特異的に結合する抗体は抗イディオタイプ抗体であり得る。また、別の一実施形態では、モノクローナル抗体はベバシズマブであり、ベバシズマブに特異的に結合する抗体は抗イディオタイプ抗体であり得る。
【００３８】
＜多孔質体＞
本発明の方法に使用する多孔質体は、多数の細孔を有するものであれば、その材料は特に限定されず、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等を用いることができる。これらの中でも、抗体を部位特異的に結合可能なものが特に好ましい。
【００３９】
細孔の形状は特に限定されない。また、多孔質膜のように、多孔質体を貫通する細孔が形成されたものを用いることもできる。多孔質体の細孔の大きさは特に限定されず、抗体を固定化した際に、細孔の表層付近に選択的に消化されるべき部位が位置するように、抗体の分子径等を考慮して決定することが好ましい。多孔質体の平均細孔径は、１０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の範囲で、かつナノ粒子の平均粒径よりも小さい範囲で適宜に設定される。多孔質体の平均細孔径は、例えば、２０ｎｍ〜２００ｎｍ程度が好ましく、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ程度がより好ましい。抗体のFcドメインを細孔内に固定化し、Fabドメインを位置選択的にプロテアーゼ消化するためには、多孔質体の細孔径は、３０ｎｍ〜１５０ｎｍが好ましく、４０ｎｍ〜１２０ｎｍがより好ましく、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、特に約１００ｎｍがさらに好ましい。
【００４０】
nSMOL法では、測定対象のモノクローナル抗体を多孔質体の細孔内に固定化する。この目的で、多孔質体の細孔内に、抗体と部位特異的に相互作用するリンカー分子が固定化されたものが好ましく用いられる。抗体とリンカー分子との相互作用としては、化学結合、水素結合、イオン結合、錯体形成、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、立体選択的相互作用等が挙げられる。
【００４１】
リンカー分子としては、抗体のFcドメインと部位特異的に結合するProtein AやProtein G等が好ましく用いられる。細孔内にこれらのリンカー分子が固定化された多孔質体を用いることにより、細孔内に抗体のFcドメインが固定化され、Fabドメインが細孔の表層付近に位置する。このように、細孔内での抗体の配向が制御されることで、プロテアーゼによるFabドメインの位置選択的消化が可能となる。
【００４２】
リンカー分子の大きさは、抗体の選択的切断部位が細孔の表層付近に位置するように選択される。リンカー分子と抗体とが結合した状態の分子サイズは、多孔質体の細孔径の０．５倍〜１．５倍程度が好ましく、０．６倍〜１．２倍程度がより好ましく、０．７倍〜１．１倍程度がさらに好ましく、０．８倍〜１倍程度が特に好ましい。なお、多孔質体にリンカー分子が固定されておらず、細孔内に抗体を直接結合させる場合は、抗体の分子径と多孔質体の細孔径が上記関係を満たすことが好ましい。
【００４３】
本発明において好適に使用可能な多孔質体として、特に限定するものではないが、例えばProtein G Ultralink樹脂（Pierce社製）、トヨパール TSKgel（TOSOH社製）、トヨパール AF-rProtein A HC-650F resin（TOSOH社製）、Protein A Sepharose（GEヘルスケア）、KanCapA（KANEKA）等が挙げられる。
【００４４】
抗体を多孔質体の細孔内に固定化する方法は特に限定されず、抗体と多孔質体あるいはリンカー分子の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。例えば、細孔内にProtein AやProtein Gが固定化された多孔質体に抗体を固定化する場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。
【００４５】
多孔質体と抗体の量比は、目的に応じて適宜に設定できる。例えば、抗体の定量分析を行う場合、試料中の抗体のほぼ全量が多孔質体に固定化されることが望まれる。そのため、試料中の抗体の推定含有量に対して、多孔質体の量が過剰となるように量比を設定することが好ましい。
【００４６】
＜ナノ粒子＞
ナノ粒子は、その表面にプロテアーゼを固定化して、多孔質体の細孔内に固定化された抗体へのプロテアーゼのアクセスを制御する目的で用いられる。そのため、ナノ粒子は、多孔質体の細孔の奥深くまで入り込まないように、その平均粒径が、多孔質体の平均細孔径よりも大きいものとする。
【００４７】
ナノ粒子の形状は特に限定されないが、多孔質体の細孔へのプロテアーゼのアクセスの均一化の観点から、球状のナノ粒子が好ましい。また、ナノ粒子は、分散性が高く、平均粒径が均一であることが好ましい。
【００４８】
ナノ粒子は、上記のプロテアーゼを表面に固定化できるものであれば、その材質は特に限定されず、金属や樹脂、シリカゲル等が適宜に用いられる。また、金属表面を樹脂で被覆したものや、樹脂表面を金属で被覆したもの等を用いることもできる。
【００４９】
ナノ粒子の種類としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁気分離または磁性沈殿分離により容易に回収することができる磁気ナノ粒子が好ましい。また、凝集が起こりにくいという点において、その表面が有機ポリマーで被覆された磁気ナノ粒子がより好ましい。磁気ナノ粒子の基材としては、酸化鉄（マグネタイト（Fe3O4）、マグヘマイト（γ‐Fe2O3））、フェライト（Fe/M)3O4などの強磁性合金が挙げられる。フェライト（Fe/M)3O4において、Mは、鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンを意味し、典型的にはCo2+、Ni2+、Mn2+、Mg2+、Cu2+、Ni2+などが用いられる。また、磁気ナノ粒子を被覆する有機ポリマーとしては、ポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）、GMAとスチレンのコポリマー、ポリメタクリル酸メチル(PMMA)、ポリアクリル酸メチル（PMA)などを挙げることができる。有機ポリマーで被覆された磁性ナノビーズの具体例としては、FGビーズ、SGビーズ、Adembeads、nanomagなどが挙げられる。市販品としては、例えば、多摩川精機株式会社製のFG beads（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリGMA）で被覆した粒径約２００ｎｍのポリマー磁性ナノ粒子）が好適に用いられる。
【００５０】
上記ナノ粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサ分子で修飾されていることが好ましい。スペーサ分子を介してプロテアーゼを固定化することにより、ナノ粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼ消化の位置選択性が高められる。また、スペーサの分子サイズを調整することにより、抗体の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。
【００５１】
上記分子径で、プロテアーゼを固定化できるスペーサ分子は、非タンパク質が好ましく、末端にアミノ基、カルボキシル基、エステル基、エポキシ基、トシル基、ヒドロキル基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド基、アジド基、ビオチン、アビジン、キレート等の官能基を有する分子が好ましい。例えば、トリプシンの固定には、活性化されたエステル基を有するスペーサ分子が好ましい。また、スペーサ分子のうち、上記官能基以外のスペーサアーム部分は、ポリエチレングリコール及びその誘導体、ポリプロピレングリコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその誘導体、ポリエチレンイミン及びその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）及びその誘導体、ポリ（エチレンテレフタル酸）及びその誘導体などの親水性分子が用いられる。
【００５２】
このようなスペーサ分子で表面修飾されたナノ粒子もまた市販されており、それらを利用すればよい。例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサ分子で修飾されたナノ粒子は、商品名「FG beads NHS」（多摩川精機株式会社）として市販されている。FG beads NHSの粒子径は約２００ｎｍ±２０ｎｍ、例えば１９０ｎｍであり、ナノ粒子として非常に均質のものである。
【００５３】
＜プロテアーゼ＞
nSMOL方法では、プロテアーゼが、多孔質体の細孔内に固定化された抗体を特定のアミノ酸配列部位で切断して、Fab領域のアミノ酸を含むペプチド断片を生じさせることができる。ペプチド断片は、例えばCDR2領域由来のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有するものであり得る。
【００５４】
ナノ粒子に固定化させるプロテアーゼの種類は、質量分析による定量又は同定の対象となるモノクローナル抗体の種類に応じて適宜選択すればよく、限定はされないが、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ、V8プロテアーゼ、AspNプロテアーゼ（Asp-N）、ArgCプロテアーゼ（Arg-C）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼなどが挙げられる。プロテアーゼは２種以上を組み合わせて用いることもできる。プロテアーゼとして、特にトリプシンが好ましく用いられる。
【００５５】
市販のプロテアーゼを用いる場合、質量分析グレードや配列決定（シーケンス）グレードのプロテアーゼを用いることが好ましい。例えば、質量分析グレードとして、トリプシンのリジン残基を還元メチル化して自己消化に対する抵抗性を高めたものが市販されている。あるいは、目的のモノクローナル抗体の種類によっては、粗精製のプロテアーゼ若しくは還元メチル化処理等の自己消化耐性処理を行っていないプロテアーゼ、トリプシン活性及びキモトリプシン活性を有するプロテアーゼを用いることが好ましい場合もある。
【００５６】
本発明の方法におけるnSMOL法によるプロテアーゼ消化において好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばTrypsin Gold（プロメガ社製）、Trypsin TPCK-treated（シグマ社製）等が挙げられる。
【００５７】
＜ナノ粒子へのプロテアーゼの固定化＞
プロテアーゼをナノ粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼとナノ粒子（あるいはナノ粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用でき、例えば、プロテアーゼをスペーサ修飾されたナノ粒子表面に固定化する場合は、ナノ粒子の懸濁液とプロテアーゼを含む溶液とを混合することにより、ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化できる。上記のスペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのアミンカップリング法が好ましい。例えば、ナノ粒子に表面修飾したカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）でエステル化して活性化エステル基とし、これに、プロテアーゼのアミノ基を結合させることができる。このカップリング反応には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDAC)、N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC)、ビス（2,6-ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド（DIPC)等のカルボジイミドを縮合剤の存在下に行うことができる。また、ナノ粒子に表面修飾したアミノ基に、グルタルアルデヒド、2官能性スクシンイミド、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3)、スルホニルクロリド、マレイミド、ピリジルジスルフィド等の架橋剤を用いてプロテアーゼのアミノ基を結合させてもよい。
【００５８】
スペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのカップリング法は、ナノ粒子の懸濁液にプロテアーゼ溶液を添加し、一定の条件下で混合撹拌するという簡便な操作で行うことができる。
【００５９】
ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化後に、ナノ粒子表面のプロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化させることが好ましい。例えば、ナノ粒子表面にプロテアーゼが固定化されていないスペーサ分子が存在すると、未結合のスペーサ分子が、試料中の夾雑物等と結合して、プロテアーゼ消化に悪影響を及ぼしたり、プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片がナノ粒子に固定化される等の不具合を生じる場合がある。プロテアーゼを固定化後に、未結合のスペーサ分子をブロックすることにより、このような不具合が抑制される。プロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化する方法としては、化学修飾が好ましい。例えば、活性化エステル基は、一級アミンとの反応によりアミド結合を形成して不活性化させることができる。
【００６０】
尚、プロテアーゼとしてのトリプシンが固定化されたナノ粒子であるFG beads Trypsin DART（登録商標）が、LC/MS/MS用前処理キット「nSMOL Antibody BA Kit」（島津製作所）に含まれており、本発明の方法に好適に用いることができる。
【００６１】
＜プロテアーゼ消化＞
抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化されたナノ粒子とを液体中で接触させることにより、抗体がプロテアーゼ消化され、ペプチド断片が産生される。ここで、「液体」とは、基質（固相）及び酵素（固相）が液相中で接触することを意味するものであり、またプロテアーゼ消化反応に適した水性媒体を意図する。
【００６２】
プロテアーゼ消化の条件は特に限定されず、一般的なプロテアーゼ消化と同様の条件を適宜に採用できる。例えば、プロテアーゼの至適ｐＨ近傍に調整された緩衝溶液中で、通常３７℃程度の温度で、１時間〜２０時間程度インキュベートすることが好ましい。あるいはまた、飽和蒸気圧下、約５０℃で３〜８時間程度インキュベートしても良い。
【００６３】
抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化されたナノ粒子との混合量比も特に制限されず、抗体の量に応じたプロテアーゼ量となるように設定すればよい。なお、一般的なプロテアーゼ消化条件は、基質：プロテアーゼ＝１００：１〜２０：１（重量比）程度である。これに対して、本発明では、多孔質体とナノ粒子との組み合わせにより、抗体とプロテアーゼとのアクセスが物理的に制限されるため、一般的なプロテアーゼ消化に比べて、プロテアーゼ量を多くすることが好ましい。例えば、抗体：プロテアーゼ＝３０：１〜３：１程度が好ましく、１５：１〜４：１程度がより好ましく、１０：１〜５：１程度がさらに好ましい。
【００６４】
より具体的には、例えば細孔径１００ｎｍのProtein G樹脂上に抗体のC末端側を固定化し、抗体の可変領域は必ず溶液側に配向するようにする。次に、粒子径２００ｎｍのナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化する。
【００６５】
プロテアーゼ消化は、特に限定するものではないが、多孔質体とナノ粒子とを、液体中で均一分散を保持する程度の緩やかな回転による撹拌とともに定期的なタッピングを伴うタッピングローテーション下で行うことができる。「緩やかな回転」は、例えば３〜１０ｒｐｍ程度の回転数を指し、また、「タッピング」は、弾くような、若しくは、ショックを与えるような瞬間動作（頻度：例えば、１分間あたり１〜５回、好ましくは２〜４回）を指す。これによって、抗体を固定化した多孔質体とプロテアーゼを固定化したナノ粒子が共に分散状態を保持しながら効果的に接触し、プロテアーゼ消化反応効率を高めることができる。
【００６６】
上記のように、本発明の方法によって基質であるモノクローナル抗体とプロテアーゼとの接触を制限することで、モノクローナル抗体の特異性を示すFab領域由来のペプチドを簡便かつ効率的に消化し、質量分析に供することができる。
【００６７】
＜多孔質体及びナノ粒子の除去＞
プロテアーゼ消化によって得られた目的のペプチド断片を質量分析に供するためには、多孔質体及びナノ粒子を除去することが必要である。これは、プロテアーゼ消化後のサンプルに対して濾過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。
【００６８】
ろ過によって多孔質体及びナノ粒子を除去する場合、使用するろ過膜の孔径は、上記の多孔質体及びナノ粒子が通過できず、かつ消化されたペプチドの通過を可能とする範囲で選択される。例えばポリフッ化ビニリデン（PVDF）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PVDF、孔径0.2μm、ミリポア社製）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製のろ過膜（Low-binding hydrophilic PTFE、孔径0.2μm、ミリポア社製）等を用いてろ過することにより、多孔質体及びナノ粒子を簡便に除去することができる。ろ過は、遠心ろ過とすると迅速かつ簡便なろ過が可能である。
【００６９】
＜液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）＞
上記で得られたペプチド断片を含む試料を、LC-MSにより分析することで、抗体の同定や定量を行い得る。
【００７０】
ペプチド断片の分離をより確実にして、分析精度を高める等の目的で、質量分析に供する前の試料を、液体クロマトグラフ（LC）により、分離・濃縮する。LCにより試料の分離を行う場合、LCからの溶出液を直接イオン化して質量分析に供しても良い。LCとタンデム質量分析を組み合わせたLC/MS/MSやLC/MSnにより分析を行うこともできる。また、LCからの溶出液を一度分取してから、質量分析に供してもよい。LCのカラムは特に限定されず、ペプチドの分析に一般的に用いられるC30、C18、C8、C4等の疎水カラムや、親水性アフィニティークロマトグラフィー用の担体等を適宜に選択して用いることができる。
【００７１】
質量分析は、アミノ酸配列を決定可能であるため、ペプチド断片が抗体等の特定のタンパク質に由来のペプチド断片であるか否かを判別可能である。また、ピーク強度に基づいて試料中のペプチド断片の濃度を決定できる。分析に際しては、必要に応じて、脱塩、可溶化、抽出、濃縮、乾燥等の処理を行った後、試料を分析に用いてもよい。
【００７２】
質量分析におけるイオン化法は特に限定されず、電子イオン化（EI）法、化学イオン化（CI）法、電界脱離（FD）法、高速原子衝突（FAB）法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化（ESI）法等を採用し得る。イオン化された試料の分析方法も特に限定されず、磁場偏向型、四重極（Ｑ）型、イオントラップ（IT）型、飛行時間（TOF）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（FT-ICR）型等を、イオン化法に応じて適宜に決定できる。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、MS/MS分析、あるいはMS3以上の多段階質量分析を行うこともできる。
【００７３】
近年では主に三連四重極と呼ばれるハイブリッド型質量分析装置が利用されている。この型の装置では、イオン化された生体分子はまず、オクトポールと呼ばれる部分を通過することで、そのイオン分子振動半径を小さくする。次に第１四重極の中で、特定の質量数を持つイオンを共振させることで選択し、他のイオンを排除する。選択されたイオンは第２四重極に運ばれ、アルゴンと衝突することで開裂が行われる。この反応は衝突誘起解離（collision-induced dissociation, CID）という。この開裂反応の結果、生成した特異的な断片を第３四重極で選択することで、非常に高感度で、かつ高選択的な定量が可能となる。この一連の分析を多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring, MRM）と呼ぶ。
【００７４】
本発明の方法において特に適した装置は、特に限定するものではないが、例えばLCMS-8030、LCMS-8040、LCMS-8050、LCMS-8060、及びLCMS-8080（いずれも島津製作所）、LCMS-IT-TOF、LCMS-Q-TOF（島津製作所）を挙げることができる。
【００７５】
質量分析結果に基づいて、抗体を同定するために、既存のデータベースを用いることもできる。例えば、Mascot検索（Matrix Science社）を利用して、質量分析で得られたスペクトル情報から、想定される親イオンやフラグメントイオン系列の帰属を自動で行うことで、様々な情報を取得することができる。
【００７６】
また、多段階の質量分析等により、ペプチド断片のアミノ酸配列を特定することにより、抗体を同定することができる。抗体に特異的なFab領域、例えば重鎖及び／又は軽鎖のCDR1領域、CDR2領域、CDR3領域のアミノ酸配列を含むペプチド断片が検出できれば、目的の抗体を同定・定量することができる。
【００７７】
なお、検出結果に基づいて、抗体の同定や定量を行う場合、検出対象のペプチドは、アミノ酸残基数が５〜３０程度のものが好ましく、７〜２５程度がより好ましい。アミノ酸残基数が過度に小さいと、夾雑物や同一タンパク質の別の部位に由来するペプチド断片との区別がつき難く、誤検出等の原因となり得る。また、アミノ酸残基数が過度に大きいと、イオン化が困難となる等の理由により、検出が困難となったり、定量性が低下する場合がある。
【００７８】
抗体の濃度を定量する場合、検出されたペプチド断片イオン（多段階MSの場合は、親イオンの開裂により得られたフラグメントイオン）のピーク面積やピーク強度に基づいて、抗体の量を算出できる。例えば、予め求められた検量線（較正曲線）とピーク面積との関連付けや、試料中に添加された内部標準に由来するピーク面積と試料由来のピーク面積との関連付け等によって、試料中のペプチド断片の濃度が算出され、ペプチド断片濃度に基づいて、抗体の量や濃度が算出される。
【００７９】
また、質量分析では、1種のペプチドの検出において、数種のフラグメントイオンが生成することは周知である。内部標準ペプチドの分析結果や予め判明している分析結果と参照すれば、1種のペプチドの1種のイオンのみの検出で目的のモノクローナル抗体の同定が可能であるが、1種の親イオンより生成する複数のフラグメントイオン、例えば2種以上、3種以上、4種以上のフラグメントイオンを同時に検出・定量することで、より詳細な構造情報を得ることができる。しかしながら、フラグメント情報量が多すぎると、分析時間が長くなり、結果的に分析精度の低下にもつながるため、一般的には1種のペアレントイオンに対し、2〜5種程度のフラグメントイオンを同時モニターすることが好ましい。また、フラグメントイオンは、イオン系列としてｙイオン系列を選択することが望ましいが、その優位候補が無ければ、次にｂイオン系列を選択しても良い。フラグメントイオンの中で最もイオン収率が高いイオンを定量用、その他を構造確認用イオンとすることで、構造特異性を確保することができる。
【００８０】
複数のモノクローナル抗体の同時定量のためには、数ミリ秒〜数十ミリ秒の範囲の測定時間で各抗体の測定を行い、チャンネルを切り替えながら連続的に分析を行うことができる。これにより、試料中に存在し得る複数のモノクローナル抗体を一斉に定量することができる。質量分析による検出は迅速かつ正確であり、短時間で非常に多くの情報量が得られる。本発明の方法は、特定の患者若しくは被験者に過去に投与された抗体及び投与中の抗体をまとめて同時に定量することが可能である。
【００８１】
尚、nSMOL法の実施のために、LC/MS/MS用前処理キット「nSMOL Antibody BA Kit」（島津製作所）が市販されており、これを例えばLCMS-8050/8060と共に使用することによって、簡便に高精度・低コストでモノクローナル抗体の定量を実施することができる。
【００８２】
＜分析条件の検討＞
抗体医薬として使用することが意図されるモノクローナル抗体は、そのアミノ酸配列情報等が公開されており、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列、Fab及びFcドメイン、相補性決定領域（CDR）、ジスルフィド結合等の情報を入手することが可能である。従って、nSMOL法によるプロテアーゼ消化で複数のペプチドが得られるが、それぞれのペプチドについてのアミノ酸配列情報が得られれば、そのペプチドがモノクローナル抗体のいずれの位置に存在するものであるかを容易に理解することができる。従って、Fab領域由来の複数のペプチドのうち、特に好適なペプチドを分析対象として選択することができる。このように選択されるペプチドは「シグネチャーペプチド」と呼ばれている。
【００８３】
モノクローナル抗体は、特に定常領域において、ヒト患者が内在的に有する抗体と同一又は類似のアミノ酸配列も含んでおり、そのため、特異的な定量のためには、Fab領域に選択的なプロテアーゼ消化を行ってペプチドを取得する方法が好適である。しかしながら、Fab領域由来のペプチドであっても、内在する抗体又は試料中に共存し得る他の抗体医薬であるモノクローナル抗体と配列が同一又は類似であって、検出に適さないことも想定される。
【００８４】
従って、当分野において通常行われるように、分析目的のモノクローナル抗体のアミノ酸配列を、他の共存する可能性のあるモノクローナル抗体のアミノ酸配列とアライメントすることで、特異的な検出のために好適なシグネチャーペプチドの選択を確認することが好ましい。
【００８５】
配列アライメントのためには、例えば欧州バイオインフォマティクス研究所等から提供され、インターネット上で利用できるClustalW（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）を使用することができる。ClustalWにより、各モノクローナル抗体のCDRを推定し、CDRの配列を少なくとも一部に含み、プロテアーゼ消化によって得られることが予想されるペプチドの情報を得ることができる。
【００８６】
また、米国ワシントン大学のMacCoss等のグループによって開発されたSkyline（https://skyline.gs.washington.edu）を利用して、取得した配列情報から、分析用のパラメーター、例えばシグネチャーペプチド及びトランジションの最適化を行うことができる。更に、LabSolutions（島津製作所）はデータ制御・解析・管理のためのシステムであり、得られた情報をインポートすることで、最適なMRM分析条件についての情報を取得することができる。
【００８７】
nSMOL法によって実際にプロテアーゼ消化を行うと共に、上記のようなデータベース及びシステムを利用することで、各モノクローナル抗体について最適なシグネチャーペプチド及びそのMRM分析条件をより容易に得ることが可能となる。最適なシグネチャーペプチド及び最適なMRM分析条件が得られれば、各モノクローナル抗体の定量において利用できる検量線を予め準備することが可能であり、複数のモノクローナル抗体における混合定量で同様のバリデーションが得られることから、複数のモノクローナルを同時に定量する場合に使用できる複数の検量線を作成することもできる。
【００８８】
本発明の方法において好適に使用できるトラスツズマブのシグネチャーペプチドとしては、限定するものではないが、例えば重鎖CDR2領域のアミノ酸を含むIYPTNGYTR（配列番号１）、FTISADTSK（配列番号２）、DTYIHWVR（配列番号３）、NTAYLQMNSLR（配列番号４）等が挙げられる。ヒト血漿からの干渉の有無や血中濃度との特に高い相関性等を考慮すれば、IYPTNGYTR（配列番号１）を使用することが最も好ましい。
【００８９】
また、本発明の方法において好適に使用できるベバシズマブのシグネチャーペプチドとしては、例えばSTAYLQMNSLR（配列番号５）、FTFSLDTSK（配列番号６）、VLIYFTSSLHSGVPSR（配列番号７）等が挙げられる。ヒト血漿からの干渉の有無や血中濃度との特に高い相関性等を考慮すれば、FTFSLDTSK（配列番号６）、およびVLIYFTSSLHSGVPSR（配列番号７）を使用することが最も好ましい。
【００９０】
本発明はまた、被験者に投与されたモノクローナル抗体の有効性を評価するための方法であって、被験者由来の生物学的試料中のモノクローナル抗体を細孔内に固定化した多孔質体と、プロテアーゼを固定化したナノ粒子とを液体中で接触させてモノクローナル抗体の選択的プロテアーゼ消化を行い、消化されたペプチド断片を液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）によって検出することによって該生物学的試料中の該モノクローナル抗体濃度を算出し、該モノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗体の存在による算出結果への影響の有無及び／又は程度を決定することを含む、上記方法を提供する。
【００９１】
モノクローナル抗体を抗体医薬として被験者に投与した場合、他の薬剤と同様に、投与直後には体内での抗体濃度、例えば血中濃度が上昇するが、その後次第に濃度が低下する。反復的に投与すると、濃度の増減が繰り返され、血中濃度の場合、その最高値及び最低値はそれぞれピーク値及びトラフ値と呼ばれている。有効な薬剤の投与のためには、その臨床効果の確認と合わせて、投与後の薬剤濃度をピーク値及びトラフ値と比較できることが重要である。本発明の方法を用いれば、被験者に投与されたモノクローナル抗体の濃度をモニタリングすることによって、その有効性を評価することができる。
【００９２】
モノクローナル抗体を投与した場合、投与直後は該モノクローナル抗体に対する抗薬物抗体（ADA）がほとんど存在しないため、高い血中濃度が達成されるが、投与が長期間に及ぶとADAが生じて投与したモノクローナル抗体に結合し、その薬効を阻害するようになる。そして、同一のモノクローナル抗体を投与した場合であっても、被験者の免疫システムの状況により、その抗体医薬に対して生じ得るADAの種類及び量は異なり得る。
【００９３】
また、実際の臨床において、患者の免疫システムの相違だけでなく、抗体医薬として選択されるモノクローナル抗体の種類によっても、ADAが比較的早期に生じ、治療効果が顕著に阻害される場合と、ADAがあまり生じないために、長期間にわたって治療が有効である場合とがあることが知られている。従って、投与されたモノクローナル抗体が、その患者の治療にとって適しているか否かの情報を得ることが非常に重要となる。
【００９４】
しかしながら、本明細書中に記載したように、ADAもしくは他の因子の影響により、モノクローナル抗体の血中濃度計測値が影響を受ける可能性がある。このことは、抗体医薬によってもたらされる治療結果の考察に影響することとなり得る。ELISA法による測定で、ADAの存在によって計測に大きな影響が生じ、実血中濃度の計測が困難になることは実施例に示す通りである。これに対して、本発明の方法は、抗体医薬の実血中濃度計測値を提供することで、抗体医薬による治療や薬効評価の有効性についての有用な情報をもたらすことができる。
【００９５】
すなわち、上記の方法によって、モノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗体の存在による算出結果への影響がない、又は影響が小さい場合には、生物学的試料中に治療的に有効な濃度でモノクローナル抗体が存在することが示唆され、モノクローナル抗体による治療が有効であることが示唆される。一方、モノクローナル抗体に対して特異的に結合する抗体の存在による算出結果への影響が大きい場合、該モノクローナル抗体の存在量が大きくなりすぎている、つまりそのモノクローナル抗体に反応しやすい免疫システムであることを示唆し、モノクローナル抗体による治療が有効であるかどうかについて検討する必要があることが示唆され、場合によって、例えばモノクローナル抗体の投与量を増大させるか、又は投与方法・治療方法の変更、治療薬の変更を検討することが必要となり得る。
【００９６】
算出結果への影響の有無及び／又は程度は、例えば、特定のモノクローナル抗体について、被験者において生じる可能性があり、異なるエピトープに結合し得る複数のADAを取得し、その存在下において本発明の方法によってモノクローナル抗体を検出し、また複数の被験者における検出結果を比較すること等によって、そのモノクローナル抗体についての多数の情報を蓄積し、場合によっては経時的に検出した具体的な検出結果と比較することによって決定することができる。
【００９７】
本発明の一実施形態では、モノクローナル抗体はトラスツズマブであり、この場合、配列番号１〜４に示すアミノ酸配列を有するペプチド断片を検出することが好ましい。別の実施形態では、モノクローナル抗体はベバシズマブであり、この場合、配列番号５〜７に示すアミノ酸配列を有するペプチド断片を検出することが好ましい。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【００９９】
［実施例１］
抗トラスツズマブ抗体（ADA）として、HCA168、HCA176、HCA177（いずれもBIO-RAD社）、及びMAB11130（Abnova社）を使用した。各ADAの作製に使用されている免疫原、ADAの型及びトラスツズマブとの親和性を表１に示す。
【表１】
2018235228.tif 000002
【０１００】
表１に示す3種の抗トラスツズマブ抗体（ADA）及びトラスツズマブ（中外製薬株式会社）を、0.1％ n-オクチル-β-D-チオグルコピラノシド（OTG）を含有するPBS中で、室温で30分間反応させて結合した。トラスツズマブへのADAの結合をウェスタンブロットで確認した。【０１０１】
ヒト血漿(コージンバイオ株式会社製、5μmのフィルターで濾過後、0.8μmのフィルターで濾過したもの)を10μL加えた。nSMOL法で定量するサンプルはnSMOL法による前処理及び定量まで-30℃で保存した。ADA結合トラスツズマブの血漿中濃度をELISA法とnSMOL法で定量した。【０１０２】
ELISA法は、捕捉試薬としてトラスツズマブ特異的抗イディオタイプモノクローナル抗体、検出試薬としてトラスツズマブ特異的ポリクローナル抗体を使用するELISAキット（Trastuzumab PK ELISA, Somru BioScience, SBA-100-007-035）を使用した。【０１０３】
本実施例で行ったnSMOL法の手順を以下に記載する。尚、使用する試薬及び容器等は、取扱説明書と共に「nSMOL Antibody BA Kit」として島津製作所から提供されているものを使用することができる。【０１０４】
懸濁液をすべて、ウルトラフリーPVDF（0.2μm、メルクミリポア社）に移し、10,000×gで0.5〜1分間遠心分離し、上清を除去する。次いで0.1％ n-オクチル-β-D-チオグルコピラノシドを含むPBS（洗浄液１）を150μL加え、上記と同様に2回遠心分離して洗浄する。次いでPBS（洗浄液２）を150μL加え、同様に2回遠心分離して洗浄する。【０１０５】
洗浄後、ウルトラフリーフィルターカップを、反応専用容器に移し、底までしっかりと押し込んだ後、反応促進溶液80μl及び内部標準（10fmol/μL P14R）を加える。【０１０６】
次いでFG beads Trypsin DART（登録商標、粒径200nm）を10μL（0.5mg/mL トリプシン）加え、飽和蒸気圧下50℃にて、穏やかに攪拌しながら反応（4〜6時間）を行う。【０１０７】
反応停止溶液（10％ギ酸水溶液）を5μL加えて反応を停止させた後、10,000×gで0.5〜1分間遠心分離して上清を回収し、磁気スタンドに立てて、約1分間静置する。【０１０８】
上清をLCMSバイアルに移し、分析を行う。上清中にnSMOL法による選択的プロテアーゼ消化によって消化されたFab領域由来のペプチドが含まれる。【０１０９】
＜LC-MS分析条件＞
本実施例において使用したLC-MS分析条件は以下の通りである。
[LC] NexeraX2 システム（島津製作所）
溶媒A：0.1% ギ酸＋水
溶媒B：0.1% ギ酸＋アセトニトリル
オートサンプラー洗浄：超純水
流速：0.4 mL/分
カラム：Shim-pack GISS 2.1 x 50 mm, 1.9 μm, 20 nm pore
カラムオーブン温度：50℃
サンプルクーラー温度：5℃
勾配：3％B (1.5 分) / 3-30％B (3.5 分) / 95％B (1 分) / 3％B (1 分)
注入量：10μL【０１１０】
[MS] LCMS-8050（島津製作所）
インターフェイス条件：
インターフェイス電圧：4 kV
ネブライザーガス流量：3 L/分
ヒーティングガス流量：10 L/分
ドライイングガス流量：10 L/分
インターフェイス温度：300℃
DL温度：250℃
ヒートブロック温度：400℃【０１１１】
本実施例において、トラスツズマブの定量のためのペプチド断片（シグネチャーペプチド）として、重鎖のCDR2領域に存在するIYPTNGYTR（配列番号１）を選択した。このペプチドの親イオン及びフラグメントイオン、並びにMRM分析条件を表２に示す。3つのフラグメントイオンのうちの1つを定量のために使用し、2つを構造確認のために使用した。
【表２】
2018235228.tif 000003
【０１１２】
表３は、トラスツズマブ濃度0.5μg/mLとして、様々なトラスツズマブ対ADA比とした場合のnSMOL法及びELISA法の検出結果を示す。【０１１３】
【表３】
2018235228.tif 000004
表３に示すように、ELISA法では、全てのADAの存在によって、定量値（真度）が大きく影響を受け、MAB11130ではトラスツズマブに対して2倍以上存在する場合に検出できないという結果となったのに対し、nSMOL法による定量ではADAの種類によって定量値への影響度合いが異なったが、いずれのADAの存在下においても、1:1以上のトラスツズマブ対ADA比において非常に精度が高く、1:50の比率においても80％以上の真度を達成することができた。親和性の高い抗イディオタイプ抗体であるヒトIgG (HCA177) がもっともnSMOL法による定量を阻害し、トラスツズマブのFabに対する抗体 (MAB11130) はトラスツズマブの定量値に影響を及ぼさなかった。【０１１４】
［実施例２］
トラスツズマブ濃度50μg/mLとして、実施例１と同様の試験を行った結果を表４に示す。【０１１５】
【表４】
2018235228.tif 000005
【０１１６】
表４に示すように、トラスツズマブ濃度が50μg/mLの場合も、ELISA法では全てのADAによって、定量値（真度）が大きな影響を受けたのに対し、nSMOL法による定量ではADAの種類によって定量値への影響度合いが異なった。イディオタイプ抗体であるヒトのIgG (HCA177) がもっともnSMOL法による定量を阻害し、トラスツズマブのFabに対する抗体 (MAB11130) はトラスツズマブの定量値に影響を及ぼさなかった。【０１１７】
［実施例３］
Protein A上に固定されたトラスツズマブの配向性がnSMOL法による定量へのADAの影響に関与するかを検討した。すべての条件で配向性を揃えるために、先にProtein A上にトラスツズマブを固定し、Protein A上に固定したトラスツズマブにADAを結合させ、実施例１に記載の条件でnSMOL法による測定を行った。ADAは実施例１及び２と同じものを使用した。【０１１８】
IgGのFcドメインと部位特異的に結合するプロテインAを細孔内に固定化した粒径100nmの多孔質体（トヨパール AF-rProtein A HC-650F resin（TOSOH社製, 50％スラリー, 10μL) にトラスツズマブ (50μg/mL, 10μL) を加え、10分間室温で軽く振盪しながら反応させた。
ヒトIgG (1 mg/mL、コスモバイオ社) を400μg加え、10分間室温で軽く振盪しながら反応させた。
未反応のIgGを濾過によって除去し、0.1％OTGを含有するPBSで洗浄を行った。
ADAを加えて、30分間室温で軽く振盪しながら反応させた。
ADA結合トラスツズマブの濃度をnSMOL法で定量した。結果を表５に示す。【０１１９】
【表５】
2018235228.tif 000006
【０１２０】
トラスツズマブの配向性を一定にした場合、HCA177をトラスツズマブに対して1:1の割合で反応させた場合、定量値への阻害効果は約10％程度であった。この結果から、トラスツズマブのProtein A上での配向性はnSMOL法での反応を制御していないことが示唆された。【０１２１】
［実施例４］
トラスツズマブ濃度0.5μg/mLとして、異なるキットを用いたELISA法の検出結果を検討した。
ELISAキットとして、捕捉試薬としてトラスツズマブ特異的抗イディオタイプモノクローナル抗体、検出試薬としてトラスツズマブ特異的ポリクローナル抗体を使用するキットA（Trastuzumab PK ELISA, Somru BioScience, SBA-100-007-035）、及び、捕捉試薬としてリガンドとなるヒト組換えHER2、検出試薬としてHRPコンジュゲート抗ヒトIgG Fcモノクローナル抗体を使用するキットB（MATRIKS BIOTEK, TR-TRASV1）を用いた。表６に示すように、ELISAキットの種類によってADA結合トラスツズマブの定量値に差が生じることが明らかとなった。【０１２２】
【表６】
2018235228.tif 000007
【０１２３】
［実施例５］
トラスツズマブ0.5μg/mLとして、標的分子であるHER2の存在下での検出結果への影響を検討した。
ヒト組換えHER2（フナコシ）及びトラスツズマブ（中外製薬株式会社）を、0.1％OTGを含有するPBS中で室温で30分間反応させて結合した。トラスツズマブへのHER2の結合をウェスタンブロットで確認した。
ヒト血漿(コージンバイオ株式会社製、5μmのフィルターで濾過後、0.8μmのフィルターで濾過したもの)を10μL加えた。nSMOL法で定量するサンプルはnSMOL法による前処理及び定量まで-30℃で保存した。
HER2結合トラスツズマブの血漿中濃度を実施例１に記載の条件でELISA法とnSMOL法で定量した。
その結果、表７に示すように、トラスツズマブに対して100倍量のHER2が存在しても、nSMOL法では検出結果にほとんど影響しなかった。これに対してELISA法では、HER2の量に依存して、検出結果が大きく影響を受けた。【０１２４】
【表７】
2018235228.tif 000008
【０１２５】
［実施例６］
抗ベバシズマブ抗体（ADA）として、HCA182、HCA185、HCA177（いずれもBIO-RAD社）、及びMAB11128（clone2C8、Abnova社）を使用した。各ADAの作製に使用されている免疫原、ADAの型及びトラスツズマブとの親和性を表８に示す。
【表８】
2018235228.tif 000009
【０１２６】
本実施例において、ベバシズマブの定量のためのペプチド断片（シグネチャーペプチド）として、重鎖のCDR2領域に存在するFTFSLDTSK（配列番号６）を選択した。このペプチドの親イオン及びフラグメントイオン、並びにMRM分析条件を表９に示す。3つのフラグメントイオンのうちの1つを定量のために使用し、2つを構造確認のために使用した。本実施例において使用したLC-MS分析条件は、インターフェイス電圧を1.5kVとし、インターフェイス温度を350℃とする以外は実施例１と同じとした。
【表９】
2018235228.tif 000010
【０１２７】
ELISAキットとして、捕捉抗体としてベバシズマブ特異的抗イディオタイプモノクローナル抗体、検出抗体としてベバシズマブ特異的ポリクローナル抗体を使用するBevacizumab PK ELISA（Somru BioScience, SBA-100-007-041）を用いた。
表１０は、ベバシズマブ濃度0.5μg/mLに対して様々な比率で抗ベバシズマブ抗体を使用した場合のnSMOL法及びELISA法での検出結果における真度（％）を示す。【０１２８】
【表１０】
2018235228.tif 000011
【０１２９】
ELISA法は今回検討に用いたすべてのタイプのADAによって、定量値に影響を及ぼす (真度が-5から-100％) のに対し、nSMOL法による定量ではADAの種類によって定量値への影響度合いが異なった。イディオタイプ抗体であるヒトのIgG (HCA185) がもっともnSMOL法による定量を阻害し、ベバシズマブのFabに対する抗体 (MAB11128) はベバシズマブの定量値に影響を及ぼさなかった。【０１３０】
［実施例７］
ベバシズマブ濃度50μg/mLとして、実施例６と同様の試験を行った結果を表１１に示す。【０１３１】
【表１１】
2018235228.tif 000012
【０１３２】
ELISA法は今回検討に用いたすべてのタイプのADAによって、定量値に影響を及ぼす (真度が-5から-95％) のに対し、nSMOL法による定量ではADAの種類によって定量値への影響度合いが異なった。イディオタイプ抗体であるヒトのIgG (HCA185) がもっともnSMOL法による定量を阻害し、ベバシズマブのFabに対する抗体 (MAB11128) はベバシズマブの定量値に影響を及ぼさなかった。【０１３３】
［実施例８］
Protein A上に固定されるベバシズマブの配向性がnSMOL法による定量へのADAの影響に関与するかを検討した。すべての条件で配向性を揃えるために、先にProtein A上にベバシズマブを固定し、Protein A上に固定したベバシズマブにADAを結合させ、nSMOL法による測定を行った。ADAは実施例６及び７と同じものを使用した。【０１３４】
【表１２】
2018235228.tif 000013
【０１３５】
表１２に示すように、ベバシズマブの配向性を一定にした場合、HCA185をベバシズマブに対して1:1の割合で反応させた場合、定量値への阻害効果は約50％程度であった。この結果は、ベバシズマブのイディオタイプ抗体がベバシズマブの二量体両方に結合するのではなく、ベバシズマブの片方のFv領域に結合し、トリプシンによる酵素消化反応を抑制していることが示唆される。【０１３６】
［実施例９］
ベバシズマブ0.5μg/mLとして、標的分子であるVEGFの存在下での検出結果への影響を検討した。
ヒト組換えVEGF（223-01311、Wako社）及びベバシズマブ（中外製薬株式会社）を、反応条件は0.1％OTGを含有するPBS中で室温で30分間反応させて結合した。ベバシズマブへのVEGFの結合をウェスタンブロットで確認した。
ヒト血漿(コージンバイオ株式会社製、5μmのフィルターで濾過後、0.8μmのフィルターで濾過したもの)を10μL加えた。nSMOL法で定量するサンプルはnSMOL法による前処理及び定量まで-30℃で保存した。
VEGF結合ベバシズマブの血漿中濃度を実施例６と同様にELISA法とnSMOL法で定量した。【０１３７】
その結果、表１３に示すように、ベバシズマブに対して100倍量のVEGFが存在しても、nSMOL法では検出結果にほとんど影響しなかった。これに対してELISA法では、VEGFの量に依存して、検出結果が大きく影響を受けた。【０１３８】
【表１３】
2018235228.tif 000014
【０１３９】
［実施例１０］
VEGFをベバシズマブに等量反応させ、ベバシズマブの各濃度での定量値の真度を実施例９と同様の条件でnSMOL法により検討した。その結果、表１４に示すように、nSMOL法によるベバシズマブの定量に対して、VEGFの結合は検量線の範囲内の濃度いずれにも影響を及ぼさなかった。【０１４０】
【表１４】
2018235228.tif 000015
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明の方法を用いることにより、抗体医薬の正確な血中濃度を検出することができ、抗体医薬による治療や薬効評価の有効性についての有用な情報を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【配列表】
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【国際調査報告】
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