(57)【要約】  本発明は、Reb.C（ズルコサイドBともいう）を多く含む品種から検出される、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を決定し、その味質特性を把握することを目的とする。本発明によれば、式（１）：【化１】2018181515.tif 000042 で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物が提供される。
2018181515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
2018181515.tif 000032
（式中、
Ｒは、式（２）または式（３）：
【化２】
2018181515.tif 000033
【化３】
2018181515.tif 000034
の糖鎖を表し、
glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す）
で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物。
【請求項２】
植物由来物、化学合成物、または生合成物である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を含む、飲食品。
【請求項４】
請求項１または２に記載の化合物を含む、甘味料組成物。
【請求項５】
レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ，レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含む、請求項４に記載の甘味料組成物。
【請求項６】
請求項４または５に記載の甘味料組成物を含む飲食品。
【請求項７】
飲料である、請求項６に記載の飲食品。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物を含む植物体。
【請求項９】
請求項８に記載の植物体の、請求項１に記載の化合物を含む抽出物。
【請求項１０】
請求項８に記載の植物体または請求項９に記載の植物体の抽出物を含む飲食品。
【請求項１１】
飲料である請求項１０に記載の飲食品。
【請求項１２】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、
（Ａ）下記式（４）：
【化４】
2018181515.tif 000035
（式中、glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す）
で示されるレバウディオサイドＣから、下記式（５）：
【化５】
2018181515.tif 000036
（式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す。）
で示される中間体１を調製する工程と
（Ｂ）グルコピラノシド誘導体から式（６）：
【化６】
2018181515.tif 000037
で示される中間体２、または式（７）：
【化７】
2018181515.tif 000038
（式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す）
で示される中間体３を調製する工程と、
（Ｃ）前記中間体１と、前記中間体２または３とを、ホスフィン試薬およびアゾ化合物の存在下で反応させ、下記式（８）：
【化８】
2018181515.tif 000039
（式中、
Ｒ１は、式（９）または式（１０）：
【化９】
2018181515.tif 000040
【化１０】
2018181515.tif 000041
の糖鎖を表し、
p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す）
で示される中間体４を得る工程を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の化合物の甘味料としての使用。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、下記（ａ）〜（ｇ）： 
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｇ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、UDP-グルコースからUDP-ラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
の少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いることを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記非ヒト形質転換体が酵母である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステビオールを含む培地で前記非ヒト形質転換体の培養を行うことを特徴とする、請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物に関する。本発明はさらに、新規ステビオール配糖体を含む飲食品、植物およびその抽出物、ならびに風味増強剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
キク科ステビア(Stevia rebaudiana)の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール(Steviol)とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオール配糖体は砂糖の約300倍もの甘味を呈することからカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム(Aspartame)やアセスルファムカリウム(Acesulfame Potassium)が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料はより安全で消費者理解（Public Acceptance）が得られやすいと期待される。【０００３】
ステビアの主要なステビオール配糖体は最終的には4つの糖が付いたレバウディオサイドA  (Rebaudioside A; Reb.A)と呼ばれる配糖体にまで糖で修飾される（図1）。その前駆体であるステビオール3糖配糖体のステビオシド(Stevioside)が量的に最も多く、これら2つがステビアの甘味の中心的な物質である。ステビオシドは、ステビア葉で最も含有量が多く、砂糖の250〜300倍程の甘味を呈することが知られている。Reb.Aは、甘味が高く（砂糖の350〜450倍）、且つ味質が良いとされるステビオール4糖配糖体であり、これらはカロリーレス甘味料として注目されている。これら以外に反応中間体と思われる配糖体や糖の種類が異なる類縁体の存在が知られている。例えば、Reb.Aの4つの配糖体糖はすべてグルコースであるが、このうち13位のグルコースの2位にグルコースではなくラムノースが付加されたレバウディオサイドC(Reb.C)や、同位置にキシロースが付加されたレバウディオサイドF(Reb.F)が知られている。【０００４】
これまで4つの配糖体糖がすべてグルコースであるReb.Aの味質が良好であるとして、野生型のステビア植物よりもReb.Aの含有量の多いステビア植物を品種改良等によって得ようという試みがなされている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３４３６３１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方で、品種改良を行ったステビア品種の中には、未だ構造が特定されていないステビオール配糖体が微量含まれている場合があり、その微量のステビオール配糖体の存在によってステビア抽出物に特徴的な風味が付与されている可能性がある。また、これまで、Reb.Aにさらにグルコースを付加させたステビオール配糖体およびそれを含む品種の研究は進んでいるが、Reb.Cのようにラムノースを含むステビオール配糖体を多く含む品種や、それに含まれるステビオール配糖体については現時点においてあまり研究が行われていない。【０００７】
したがって、本発明の目的は、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を決定し、その味質特性を把握することにある。また、本発明の更なる目的は、新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を遂行した結果、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を決定することに成功した。本発明は、上記知見に基づくものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体を提供することができる。さらに本発明によれば、新規ステビオール配糖体の製造方法、ならびに新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物、飲食品、植物およびその抽出物、ならびに風味増強剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ステビオール配糖体の構造と名称を示す図である。
【図２】サンプル１のm/z 1095.4の選択イオンクロマトグラムを示す図である。
【図３】サンプル１のm/z 1257.5の選択イオンクロマトグラムを示す図である。
【図４】新規ステビオール配糖体１のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図５】新規ステビオール配糖体２のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図６】（ａ）は化合物１５の1H-NMRスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、（ｂ）は化合物１５の13C-NMRスペクトル(200MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図７】（ａ）は化合物１５の1H-1H cosyスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、（ｂ）は化合物１５のHSQCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図８】（ａ）は化合物１５のHMBCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、（ｂ）は化合物１５のTOCSYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図９】化合物１５のNOESYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図１０】（ａ）は化合物１７の1H-NMRスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、（ｂ）は化合物１７の13C-NMRスペクトル(200MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図１１】（ａ）は化合物１７の1H-1H cosyスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、（ｂ）は化合物１７のHSQCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図１２】（ａ）は化合物１７のHMBCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、（ｂ）は化合物１７のTOCSYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図１３】化合物１７のNOESYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。
【図１４】新規ステビオール配糖体１（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１５のβ体）の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。
【図１５】新規ステビオール配糖体１（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１５のβ体）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図１６】新規ステビオール配糖体２（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１７のβ体）の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。
【図１７】新規ステビオール配糖体２（ステビア葉抽出物）と化学合成品（化合物１７のβ体）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。
【図１８】生合成により得られたサンプルのm/z 1095.4の選択イオンクロマトグラム示す図である。
【図１９】生合成により得られたサンプルのm/z 1257.5の選択イオンクロマトグラム示す図である。
【図２０】新規ステビオール配糖体とレバウディオサイドＡおよびレバウディオサイドＤとを比較した官能評価の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【００１２】
本明細書において、「レバウディオサイド」、「レバウディオシド」および「Reb.」は同じ意味を表すものであり、いずれも「rebaudioside」を意味するものである。同様に、本明細書において、「ズルコサイド」は「ズルコシド」と同じ意味を表すものであり、いずれも「dulcoside」を意味するものである。
【００１３】
1.  新規ステビオール配糖体
本発明者らは、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を初めて特定した。本発明の新規ステビオール配糖体（以下、「本発明の配糖体」ともいう）は、式（１）：
【化１】
2018181515.tif 000003
（式中、
Ｒは、式（２）または式（３）：
【化２】
2018181515.tif 000004
【化３】
2018181515.tif 000005
の糖鎖を表し、
glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す）
で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物である。
【００１４】
本発明の配糖体は、上記のとおり、ステビオールの第13位に2分子のグルコースと1分子のラムノースを含む糖鎖を有し、第19位に１分子のグルコースと1分子のラムノースまたは２分子のグルコースと1分子のラムノースを含む糖鎖を有している。
【００１５】
また、上記のとおり、glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す。本明細書において、glcはα-グルコースまたはβ-グルコースであってよく、rhaはα-ラムノースまたはβ-ラムノースであってよい。あるいは本明細書において、glcはα-グルコースおよびβ-グルコースであってよく、rhaはα-ラムノースおよびβ-ラムノースであってよい。そして、「glc-1-」はグルコースの１位の炭素原子がステビオールとグリコシド結合していることを示し、「glc(1-3)-glc-1-」は「glc-1-」で示されるグルコースの３位の炭素原子に更なるグルコースの１位の炭素原子がグリコシド結合していることを示す。また、「rha(1-2)-glc-1-」は「glc-1-」で示されるグルコースの２位の炭素原子にラムノースの１位の炭素原子がグリコシド結合していることを示す。
【００１６】
本明細書において、式（１）で示される化合物のうち、Ｒが式（２）の糖鎖を有するものを「配糖体Ａ」とし、Ｒが式（３）の糖鎖を有するものを「配糖体Ｂ」とする。
【００１７】
配糖体Ａとしては例えば、式（１１）および式（１２）で示される構造を有する配糖体が含まれる。
【化４】
2018181515.tif 000006
式（１１）で示される配糖体Ａは、ステビオールの１９位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、式（１２）で示される配糖体Ａは、ステビオールの１９位のカルボキシル基にグルコースがαグルコシド結合している。
【００１８】
配糖体Ｂとしては例えば、式（１３）および式（１４）で示される構造を有する配糖体が含まれる。
【化５】
2018181515.tif 000007
式（１３）で示される配糖体Ｂは、ステビオールの１９位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、式（１４）で示される配糖体Ｂは、ステビオールの１９位のカルボキシル基にグルコースがαグルコシド結合している。
【００１９】
本発明の配糖体には上記のようにα体やβ体等の異性体も包含される。したがって、本発明の配糖体はα体のみ、β体のみ、またはα体とβ体の混合物のいずれであってもよい。本発明の配糖体は、β体の割合が、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９９%以上であることが特に好ましい。なお、α体とβ体は高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法を用いることにより、単離・精製することができる。
【００２０】
本発明の配糖体は、式（１）で示される化合物だけではなく、その誘導体、塩、若しくは水和物であってもよい。本明細書において、「誘導体」とは、化合物中の小部分の構造上の変化があってできる化合物をいい、例えば、水酸基の一部が他の置換基に置換されているような化合物を意味する。したがって、式（１）で示される化合物の誘導体としては、該化合物に含まれる水酸基の一部が、水素、ハロゲン、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、シアノ基などから選択される置換基で置換された化合物を含む。本明細書において、「式（1）の化合物の塩」とは式（1）の化合物の生理学的に許容可能な塩、例えばナトリウム塩、を意味する。また、本明細書について「式（1）の化合物の水和物」とは、式（1）の化合物に水分子が付加された化合物を意味する。
【００２１】
本発明の配糖体は、特に限定されないが、植物由来物、化学合成物、または生合成物であってもよい。例えば、Reb.Cを多く含む植物体から単離、精製してもよいが、化学合成や生合成によって得てもよい。本発明の配糖体の製造方法の詳細については本明細書において後述する。
【００２２】
本発明の配糖体は、砂糖（ショ糖）よりも高い甘味を有し、かつ、甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に良いという味質を有し、飲食品等に少量含まれるだけで味質に影響を与えることができる。したがって、本発明の配糖体は新規な甘味料として使用することができる。
【００２３】
本発明の好ましい態様の配糖体は、配糖体Ａまたは配糖体Ｂから選択される。配糖体Ｂは砂糖（ショ糖）よりも高い甘味を有し、かつ、甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に甘味後引きが良く、水溶性も高い。したがって後述のように甘味料として様々な用途に好適に使用することができる。配糖体Ａは配糖体Ｂよりも甘味は弱いものの、砂糖（ショ糖）よりも高い甘味を有し、かつ、甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に甘味後引きが良い。配糖体Ａも配糖体Ｂと同様に甘味料として様々な用途に好適に使用することができるが、配糖体Ｂよりも水溶性が低いため、乳酸菌飲料、懸濁荷重飲料、および濁りを有する飲料に特に好適に使用することができる。また、医薬品等の甘味調整にも好適に使用することができる。理論に拘束されるものではないが、水溶性が低いことで、舌で感じられる苦味を抑えつつ、のどでの刺激感を高めることができ、飲料の飲みごたえ向上に有利である。
【００２４】
2.  新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物
本発明の一態様によれば、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む甘味料組成物（以下、「本発明の甘味料組成物」ともいう）が提供される。本発明の甘味料組成物は、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物を含む組成物であってもよい。
【００２５】
本発明の甘味料組成物に含まれる本発明の配糖体の量は、特に限定されない。
【００２６】
あるいは、本発明の甘味料組成物は、野生型のステビアまたはステビア抽出物に存在する量よりも少なくとも0.01％多い量の本発明の配糖体を含む組成物であることが好ましい。なお、上記のとおり、本発明の配糖体はReb.Cを多く含む品種から初めて検出されたものであり、野生型のステビアまたはその抽出物には、全く含まれていないか、含まれていたとしても検出限界値以下の量である。
【００２７】
本発明の甘味料組成物は、さらに他のステビオール配糖体を含んでいてもよい。例えば、本発明の甘味料組成物は、本発明の配糖体に加え、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ，レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含んでいてもよい。なお、本明細書において「ズルコサイドＣ」とは、下記の構造を有する化合物をいう。
【化６】
2018181515.tif 000008
【００２８】
他のステビオール配糖体が含まれる場合、本発明の配糖体と他のステビオール配糖体との組成比は、質量比で０．０１：９．９９〜６：４が好ましい。
【００２９】
本発明の甘味料組成物は、さらに一般的な甘味料を含んでいてもよい。そのような一般的な甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。
【００３０】
３．新規ステビオール配糖体を含む飲食品
本発明の一態様によれば、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む飲食品（以下、「本発明の飲食品」ともいう）が提供される。本発明の飲食品は、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式（１）で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物や甘味料組成物を含む飲食品であってもよい。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な飲料又は食品を提供し、また、当該飲料又は食品の製造方法を提供する。
【００３１】
本発明の飲食品に含まれる本発明の配糖体の量は、具体的な飲食品によって異なるが、おおむね０．０００４％〜０．８％であるのが好ましく、０．０４％〜０．４％であることが特に好ましい。含有量をこの範囲とすることで後引きを抑えることができるという利点がある。
【００３２】
本発明の飲食品は、さらに他のステビオール配糖体を含んでいてもよい。例えば、本発明の甘味料組成物は、本発明の配糖体に加え、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ，レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含んでいてもよい。
【００３３】
他のステビオール配糖体が含まれる場合、本発明の配糖体と他のステビオール配糖体との組成比は、質量比で０．０１：９．９９〜６：４が好ましい。
【００３４】
本発明の飲食品は、さらに一般的な甘味料を含んでいてもよい。そのような一般的な甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。
【００３５】
本発明の食品の例としては、特に限定されるものではないが、食品としては、製菓、製パン類、穀粉、麺類、飯類、農産・林産加工食品、畜産加工品、水産加工品、乳・乳製品、油脂・油脂加工品、調味料またはその他の食品素材等が挙げられる。
【００３６】
本発明の飲料の例としては、特に限定されるものではないが、例えば炭酸飲料、非炭酸飲料、アルコール飲料、非アルコール飲料、ビールやノンアルコールビール等のビールテイスト飲料、コーヒー飲料、茶飲料、ココア飲料、栄養飲料、機能性飲料などが挙げられる。
【００３７】
本発明の飲料は、加熱殺菌をされ、容器に詰められた状態の容器詰飲料として調製してもよい。容器としては、特に限定されず、例えば、ＰＥＴボトル、アルミ缶、スチール缶、紙パック、チルドカップ、瓶などを挙げることができる。加熱殺菌を行う場合、その種類は特に限定されず、例えばＵＨＴ殺菌及びレトルト殺菌等の通常の手法を用いて行うことができる。加熱殺菌工程の温度は特に限定されないが、例えば６５〜１３０℃、好ましくは８５〜１２０℃で、１０〜４０分である。ただし、上記の条件と同等の殺菌価が得られれば適当な温度で数秒、例えば５〜３０秒での殺菌でも問題はない。
【００３８】
４．新規ステビオール配糖体を含む植物及びその抽出物
本発明の一態様によれば、新規ステビオール配糖体を含む植物体およびその抽出物が提供される。また本発明の他の一態様によれば、本発明の植物体または植物体の抽出物を含む、飲食品、好ましくは飲料、が提供される。本発明の植物体に含まれる本発明の配糖体の量は、特に限定されないが、0.001％〜1.000％であるのが好ましく、0.01％〜0.80％であることがより好ましい。
【００３９】
本発明の植物体は、野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0. 01％以上高い含量で含む植物体であることが好ましい。上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、野生型のステビアには、全く含まれていないか、含まれていたとしても検出限界値以下の量である。
【００４０】
「野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.01％以上高い含量で含む」とは、野生型ステビア植物体の新鮮葉（非乾燥葉）から得られた抽出液の単位量（例えば10ml）あたりに含まれる本発明の配糖体の量を基準（濃度）とした場合、本発明の植物体の新鮮葉（非乾燥葉）から得られた抽出液の同一単位量（前記野生型ステビア植物体の葉から得られた抽出液と同一量）あたりに含まれる本発明の配糖体の量（濃度）が0.01％以上高いことを意味する。ここで、本発明の植物体は、野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.02％以上、0.03％以上、0.04％以上、0.05％以上、0.07％以上、0.09％以上、0.10％以上、0.15％以上、0.20％以上、0.40％以上、0.60％以上、0.80％以上、1.0％以上、1.50％以上、2.00％以上、4.00％以上、6.00％以上、8.00％以上、10.00％以上高い含量で含んでいてもよい。
【００４１】
また、「総ステビオール配糖体に占める本発明の配糖体の割合が0.01％以上である」とは本発明のステビア植物体の新鮮葉（非乾燥葉）から得られた抽出液に存在する総ステビオール配糖体量に対して本発明の配糖体が0.01％以上の比率で存在することを意味する。ここで、総ステビオール配糖体とは、未知のステビオール配糖体を含むものではなく、また検出限界未満で存在するステビオール配糖体も含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ，レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる。
【００４２】
本発明の植物体に占める本発明の配糖体の含有量は以上のとおりであるが、本発明の植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉の重量に対し本発明の配糖体は0.01重量％以上、0.02重量％以上、0.03重量％以上、0.04重量％以上、0.05重量％以上、0.07重量％以上、0.10重量％以上、0.15重量％以上、0.20重量％以上、0.30重量％以上、0.50重量％以上、0.60重量％以上、0.80重量％以上、1.00重量％以上、2.00重量％以上、4.00重量％以上、6.00重量％以上、8.00重量％以上、10.00重量％以上の量で存在していてもよい。
【００４３】
ここで本発明の植物体の乾燥葉とは、本発明の植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下にまで減らしたものをいう。好ましくは、本発明の植物体の乾燥葉の含水量は３〜４重量％である。
【００４４】
本発明の植物体の例としては、例えば、Reb.Cを多く含む植物体が挙げられる。上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、野生型のステビアには、全く含まれていないか、含まれていたとしても検出限界値以下の量である。一方で、本発明者らは本発明のステビオール配糖体が、Reb.Cを多く含む植物体により多く含まれていることを知得した。したがって、新規ステビオール配糖体およびその抽出物には、このようなReb.Cを多く含む植物体およびその抽出物が含まれる。
【００４５】
そのようなReb.Cを多く含む植物体としては、特に限定されないが、例えば、野生型ステビア種と比べレバウディオサイドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウディオサイドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体であって、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウディオサイドＣの割合が４０％以上である植物体（以下、「高Reb.C植物体」ともいう）が挙げられる。
【００４６】
そのような高Reb.C植物体としては、例えば、野生型ステビア種と比べレバウディオサイドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウディオサイドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体であって、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウディオサイドＣの割合が４０％以上である植物体が挙げられる。
【００４７】
高Reb.C植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であり、レバウディオサイドＣが高くなるように遺伝子に変異が生じたものである。また、当該遺伝子の変異は、特に限定されるものではないが、例えば、天然条件下で生じるか、非遺伝子組換え的手法により生じるものか、あるいは遺伝子組み換えによって生じるものが挙げられる。
【００４８】
高Reb.C植物体は、例えば、当該植物体の組織から遺伝子多型を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、高Reb.C植物体とそれ以外の植物体とを識別し、高Reb.C植物体を選択することを意味する。
【００４９】
高Reb.C植物体は、被験植物のゲノムに配列番号１１に示す塩基配列の第６０番目の塩基配列が野生型のＡからＴに変異した多型を同定する工程を含む、スクリーニング方法によってもスクリーニングすることができる。
【００５０】
本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。
【００５１】
また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片およびカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明の植物体の抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はＷＯ２０１６／０９０４６０に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
【００５３】
本発明の植物体の抽出物は、好ましくは、野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.01％以上高い含量で含み、かつ総ステビオール配糖体に占める本発明の配糖体の割合が0.01％以上である。ここで、「野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.01％以上高い含量で含む」とは前述のとおりである。また、「総ステビオール配糖体に占める本発明の配糖体の割合が0.01％以上である」とは前述のとおりである。
【００５４】
５．新規ステビオール配糖体を含む風味調整剤
本発明の新規ステビオール配糖体は、ステビア抽出物の中に微量しか含まれていないものの、該ステビア抽出物の風味に影響を与えているものと考えられる。理論に拘束されるものではないが、本発明のステビオール配糖体を少量添加することで、飲食品の風味を調整できるものと考えられる。したがって、本発明の一態様によれば、上記式（１）で示される化合物またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む風味調整剤が提供される。
【００５５】
本明細書において、「風味調整剤」とは、飲食品に添加された場合に、その飲食品の風味を調整する物質のことをいう。本発明の風味調整剤は、好ましくは、飲食品に添加された際に、風味調整剤自体の味を消費者が認識することなく、その飲食品自体の風味を調整することができる。例えば、本発明のステビオール配糖体は、従来のステビオール配糖体に比べて甘味の後引きが良いという特徴を有するため、風味調整剤として使用することで飲食品の甘味の後引きを調整することができる。
【００５６】
本発明の風味増強剤は、上記式（１）で示される化合物またはその誘導体、塩、もしくは水和物に加え、一種以上の他の甘味料を含んでいることが好ましい。そのような甘味料としては、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ，レバウディオサイドＦ、レバウディオサイドＩ、レバウディオサイドＪ、レバウディオサイドＫ、レバウディオサイドＮ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＯ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＲ、ズルコサイドＡ、ズルコサイドＣ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体や、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液（黒糖蜜）、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。
【００５７】
６.新規ステビオール配糖体の製造方法
上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、（Ａ）植物体からの単離・精製、（Ｂ）化学合成、または（Ｃ）生合成によって製造することができる。それぞれについて以下に説明する。
【００５８】
（Ａ）植物体からの単離・精製
本発明の植物体は本発明の新規ステビオール配糖体を含むものであるため、該植物体から新規ステビオール配糖体を単離・精製することができる。新規ステビオール配糖体は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はＷＯ２０１６／０９０４６０に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
【００５９】
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法を用いることにより新規ステビオール配糖体を単離・精製することができる。
【００６０】
植物体中の新規ステビオール配糖体含有量は、ＷＯ２０１６／０９０４６０に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明の植物体から新鮮葉をサンプリングし、LC-MS/MSを行うことにより測定することができる。
【００６１】
（２）化学合成
本発明のステビオール配糖体の化学合成による製造方法について、以下に詳細に説明する。
【００６２】
ステビオール配糖体は、アグリコンのステビオールに各種の糖 (グルコース、ラムノース、キシロースなど) が、様々な結合様式 (結合位置や立体) で付加した構造を有する。したがって、選択する出発原料によって、様々な合成経路を経て目的とするステビオール配糖体を得ることができる。しかし、合成経路によって目的とする化合物を得るための時間や収率などが大きく変わってくることは、本発明の技術分野における当業者が理解しているものである。
【００６３】
本発明者らは、今般、特定の合成経路によって、本発明のステビオール配糖体を高選択性、かつ、高収率で得られる新規な製造方法を知得した。本発明のステビオール配糖体の製造方法では、ステビオール配糖体の化学合成を行う際、スキーム１に示したように、ステビオール配糖体を「ステビオールグリコシド」と「糖ヘミアセタール体」に分割して合成を進める。
【化７】
2018181515.tif 000009
【００６４】
ステビオールグリコシドは、既存の天然物 (レバウディオサイド、ズルコサイド、ステビオサイド、ステビオールビオサイド、ルブソサイドなど) から誘導することで調製することができる。一方、糖ヘミアセタール体は、既存の天然物から調製するか、あるいは化学合成によって調製することができる。本発明者らは、ステビオールグリコシドと糖ヘミアセタール体を、光延反応を用いて縮合すると、良好な収率かつ極めて高いβ選択性で、目的のステビオール配糖体が得られる事を知得した。
【００６５】
本発明の一態様によれば、式（１）で示される化合物の製造方法であって、
（Ａ）下記式（４）：
【化８】
2018181515.tif 000010
（式中、glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す）
で示されるレバウディオサイドＣから、下記式（５）：
【化９】
2018181515.tif 000011
（式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す。）
で示される中間体１を調製する工程と
（Ｂ）グルコピラノシド誘導体から式（６）：
【化１０】
2018181515.tif 000012
で示される中間体２、または式（７）：
【化１１】
2018181515.tif 000013
（式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す）
で示される中間体３を調製する工程と、
（Ｃ）前記中間体１と、前記中間体２または３とを、ホスフィン試薬及びアゾ化合物の存在下で反応させ、下記式（８）：
【化１２】
2018181515.tif 000014
（式中、
Ｒ１は、式（９）または式（１０）：
【化１３】
2018181515.tif 000015
【化１４】
2018181515.tif 000016
の糖鎖を表し、
p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す）
で示される中間体４を得る工程を含む、方法が提供される。
【００６６】
本明細書において、保護基としては、アシル系保護基、３置換されたシリル基、アセタール系保護基、エーテル系保護基などが挙げられる。好ましくは３置換されたシリル基（トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、およびｔ−ブチルジメチルシリル基など）またはアシル系保護基（アセチル基、およびベンゾイル基など）が挙げられる。
【００６７】
以下に本発明のステビオール配糖体の製造方法の具体的な一態様を示すが、本発明の配糖体の製造方法がこの態様に限定されるものではない。
【００６８】
（Ａ）第１工程（ステビオールグリコシドの合成）
ステビオールグリコシドは、例えば、天然に存在するレバウディオサイドC（ズルコサイドB）を原料として、下記スキーム２に従って得ることができる。
【化１５】
2018181515.tif 000017
【００６９】
まず、レバウディオサイド Cをメタノールなどの溶媒と水に溶解し、水酸化ナトリウムなどの強塩基を加え、６０℃〜１２０℃で２時間以上還流することで、レバウディオサイド Cの第１９位からグルコース分子が脱離し、上記化合物２が得られる。その際、反応液を陽イオン交換樹脂等で中和した上で溶媒を蒸発させてもよい。
【００７０】
化合物２はさらにピリジン等の溶媒に溶解し、無水酢酸などを加えて化合物２に含まれる水酸基を保護することで化合物３（中間体１）を得ることができる。
【００７１】
（Ｂ）第２工程（２糖または３糖ヘミアセタールの合成）
２糖ヘミアセタールと３糖ヘミアセタールは、例えば、市販されているグルコピラノシド誘導体を原料として得ることができる。２糖ヘミアセタール体の合成（第２ａ工程）をスキーム３に示し、３糖ヘミアセタール体の合成（第２ｂ工程）をスキーム４に示す。
【００７２】
２糖ヘミアセタール体の合成（第２ａ工程）を示すスキーム３は下記のとおりである。
【化１６】
2018181515.tif 000018
【００７３】
まず、4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine-β-D-glucopyranoside (化合物４)、化合物５、およびモレキュラーシーブス（ＭＳ）をジクロロメタン等の溶媒に溶解し、トリフルオロメタンスルホン酸 (酸触媒)を加え、２５℃〜８０℃にて２時間以上撹拌することで、化合物６が得られる。
【００７４】
次いで化合物６をエタノールやＴＨＦ等の溶媒に溶解させ、水酸化パラジウム等の触媒を室温で加え、水素雰囲気下、室温で２時間以上撹拌して反応を完了させた後、触媒を濾別することで化合物７が得られる。化合物７をピリジン等の溶媒に溶解し、無水酢酸を室温で加え、室温で１２〜３６時間撹拌する。その後、溶液を減圧濃縮し、アセトニトリルと水を加え、セリウムアンモニウムナイトレイト等の酸化剤を加えて５分〜２時間撹拌することで、化合物８（中間体２）が得られる。
【００７５】
３糖ヘミアセタール体の合成（第２ｂ工程）を示すスキーム４は下記のとおりである。
【化１７】
2018181515.tif 000019
【００７６】
まず、4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine-β-D-glucopyranoside (化合物４)、化合物５、およびモレキュラーシーブス（ＭＳ）をジクロロメタン等の溶媒に溶解し、トリフルオロメタンスルホン酸 (酸触媒)を加え、２５℃〜８０℃にて２時間以上撹拌することで、化合物６が得られる。
【００７７】
次いで化合物６をエタノールやＴＨＦ等の溶媒に溶解させ、水酸化パラジウム等の触媒を室温で加え、水素雰囲気下、室温で２時間以上撹拌して反応を完了させた後、触媒を濾別することで化合物７が得られる。化合物７をアセトニトリルに溶解させ、ベンズアルデヒドジメチルアセタールを室温で加えて２時間以上撹拌することで化合物９が得られる。
【００７８】
化合物９、化合物１０、およびモレキュラーシーブス（ＭＳ）をジクロロメタン等の溶媒に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸を室温で加えて、０度にて３〜９時間撹拌することで化合物１１が得られる。得られた化合物１１をエタノールやＴＨＦ等の溶媒に溶解させ、水酸化パラジウム等の触媒を室温で加え、水素雰囲気下、室温で２時間以上撹拌して反応を完了させた後、ピリジン等の溶媒に溶解し、無水酢酸を室温で加え、室温で１２〜３６時間撹拌することで化合物１２が得られる。その後、溶液を減圧濃縮し、アセトニトリルと水を加え、セリウムアンモニウムナイトレイト等の酸化剤を加えて５分〜２時間撹拌することで、化合物１３（中間体３）が得られる。
【００７９】
（Ｃ）第３工程（式（１）で示される化合物の合成）
式（１）で示される化合物の合成は、例えば、上記工程１および２（２ａまたは２ｂ）から得られた化合物３（中間体１）および化合物８または１３（中間体２または３）を用いて、下記スキーム５または６に従って得ることができる。
【化１８】
2018181515.tif 000020
【化１９】
2018181515.tif 000021
【００８０】
まず、工程１および２（２ａまたは２ｂ）で得られた２糖ヘミアセタール体または３糖ヘミアセタール体とステビオールグリコシドとを、光延反応によって反応させることで、ステビオールの１９位のカルボキシル基に２糖ヘミアセタール体または３糖ヘミアセタール体が選択的に結合した配糖体を得ることができる。具体的には、これらの化合物を1,4-ジオキサンに溶解させ、トリブチルホスフィンあるいはトリフェニルホスフィン等のホスフィン試薬、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) 等のアゾ化合物を室温で加え、５０℃〜８０℃で２時間以上撹拌することで化合物１４または１６が得られる。最後に、化合物１４または１６の保護基を脱保護することにより、式（１）で示される化合物（配糖体ＡまたはＢ）が得られる。
【００８１】
（３）生合成
本発明のステビオール配糖体は、所定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して、ステビオールやステビオール配糖体、UDP-グルコースおよび/またはUDP-ラムノースを基質として生成することもできる。基質であるステビオール、ステビオール配糖体、UDP-グルコース、UDP-ラムノースは、与えてもよいし、細胞内で生合成させてもよい。所定のタンパク質の例としては、ステビア由来のUGT85C2（アミノ酸配列は配列番号２）、UGT74G1（アミノ酸配列は配列番号４）、UGT91D2（アミノ酸配列は配列番号６）、UGT76G1（アミノ酸配列は配列番号８）、及びシロイヌナズナ由来のUDP-ラムノース合成酵素AtRHM2（アミノ酸配列は配列番号１０）、が挙げられるが同等の活性を有するものであればこれに限定されない。
【００８２】
上記タンパク質は、シロイヌナズナまたはステビアに由来する酵素であり、シロイヌナズナやステビアといった植物細胞外の環境（例えば、細胞外、ステビア以外の宿主細胞内）においても高い活性を有することが期待される。この場合、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、UGT85C2遺伝子は配列番号１、UGT74G1遺伝子は配列番号３、UGT91D2遺伝子は配列番号５、UGT76G1遺伝子は配列番号７、及びAtRHM2遺伝子は配列番号９）を、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、基質であるステビオール、ステビオール配糖体、UDP-グルコース、UDP-ラムノースを与えることにより本発明の化合物を生成することができる。あるいは、宿主によっては、上記タンパク質を宿主細胞内で発現させ、適切な基質を与えることにより本発明の化合物を生成することもできる。
【００８３】
本発明の一態様によれば、本発明の新規ステビオール配糖体を製造する方法であって、下記の（ａ）〜（ｇ）の少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いることを特徴とする方法が提供される。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号８のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有し、かつ、UDP-グルコースからUDP-ラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００８４】
本発明の好ましい態様によれば、上記（ａ）〜（ｇ）に記載された各配列番号の塩基配列に対して、独立に、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを用いてもよい。
【００８５】
本発明の他の好ましい態様によれば、上記（ａ）〜（ｇ）に記載された各配列番号のアミノ酸配列に対して、独立に、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記（ａ）〜（ｇ）に記載された所定の活性を有するタンパク質を用いてもよい。
【００８６】
上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。上記ポリヌクレオチドは、個々に別のベクターに挿入されてもよい。
【００８７】
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
【００８８】
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法、あるいは必要な構成要素を有するDNA分子が挙げられるが特に限定されない。
【００８９】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００９０】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、GAL1/10プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、mouse mammary tumor virus（MMTV）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，ｖｏｌ．  ８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，  ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。
【００９１】
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000）、パーティクルデリバリー法（特開2005-287403）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983）、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。
【００９２】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、"Sambrook ＆ Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual （Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY）"等を参照することができる。
【００９３】
このようにして得られた非ヒト形質転換体を培養することにより、非ヒト形質転換体にステビオール配糖体を生産させることが可能である。このような非ヒト形質転換体は、好ましくは酵母である。また、非ヒト形質転換体の培養は、ステビオールを含む培地で行うことが好ましい。蓄積されたステビオール配糖体を抽出・精製することにより、本発明のステビオール配糖体を得ることができる。
【実施例】
【００９４】
［新規ステビオール配糖体の単離］
サントリーグローバルイノベーションセンター株式会社(SIC)で開発した、４系統の新規ステビア植物体(サンプル1(EM3-4)、サンプル2(EM2-27-8)、サンプル3(EM2-27-15)、およびサンプル4(EM2-11))の葉から得られた抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離-質量分析(MS)を行い、D-グルコピラノシル（Glc）、L-ラムノピラノシル（Rha）、キシロピラノシル（Xyl）が糖鎖で構成されたステビオール配糖体の分子量をもとに、ステビア植物体に含有されるステビオール配糖体のスクリーニング分析を行った。ここで、サンプル１はゲノムに配列番号１１に示す塩基配列の第６０番目の塩基配列が野生型のＡからＴに変異した多型を有する高Reb.C植物体である。なお、高Reb.C濃度の表現型と配列番号１１の多型との相関関係について統計解析を行ったところ、当該多型は高Reb.C濃度の表現型と統計学上の相関関係を有することが明らかになった。【００９５】
検液の調製方法は、凍結乾燥処理を行ったステビア乾燥葉それぞれ10.0  mgをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒として水/メタノール(1/1 vol/vol) を1.0 mL添加し、その後超音波洗浄器(AS ONE, AS52GTU)にて20分間、25°Cの設定温度にて超音波を照射し、ステビア葉からステビオール配糖体の抽出液を得た。さらにHPLC-MSに供するために、水/メタノールで10倍希釈を行い、細孔サイズ0.45 μmのフィルター(ナカライテスク、コスモナイスフィルターS(溶媒系))にてろ過を行った。【００９６】
HPLC - MSのHPLCは、送液ユニットLCポンプにはNexera LC-30AD(島津製作所)、分離カラムにはSM-C18 (4.6 x 250 mm)(インタクト社製)を用いた。LC移動相の送液は、移動相Aは0.2%酢酸含有ミリＱ水、移動相Bはメタノールを用い、バイナリーグラジエント勾配を0 - 5分間は移動相B濃度10%で一定にし、その後15分間で移動相B濃度を10%から70%まで変化させ、さらに5分間でB濃度を70%から100%まで変化させ、最後に5分間移動相B濃度を100%に維持して終了した。移動相の流速は0.4 mL/分で行い、希釈後フィルターろ過されたステビア葉抽出液は5 μL注入した。【００９７】
MSは、エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオン源を取り付けた三連四重極型質量分析計LCMS-8030 (島津製作所)を用いた。質量分析測定は、負イオン測定モード、m/z値を選択して測定を行う選択イオンモニタリング(SIM)モードで測定を行った。選択するm/z値は、D-グルコピラノシル（Glc），L-ラムノピラノシル（Rha），キシロピラノシル（Xyl）が糖鎖に構成されたステビオール配糖体の分子量をもとに計算したm/z値を選択した。したがって、m/z = 641.2 (Glc(2)), 773.2 (Glc (2), Xyl (1)), 787.2 (Glc (2), Rha (1)), 803.2 (Glc (3)), 935.3 (Glc (3), Xyl (1)), 949.3 (Glc (3), Rha (1)), 965.3 (Glc (4)), 1095.4 (Glc (3), Rha (2)), 1097.4 (Glc (4), Xyl (1)), 1111.4 (Glc (4), Rha (1)), 1127.4 (Glc (5)), 1257.5 (Glc (4), Rha (2)), 1259.5 (Glc (5), Xyl (1)), 1273.5 (Glc (5), Rha (1)), 1289.5 (Glc (6)), 1435.6 (Glc (6), Rha (1))を選択した。さらに、入手可能な高純度試薬、レバウディオサイド A、B、D、F、 M、N、O、ステビオサイド、ズルコサイドA、 Bの測定も同条件にて行うことにより、HPLCの負イオンm/z値、保持時間の確認を行った。検出された主なステビオール配糖体のピーク面積値（任意の単位：arbitrary unit）を表１に示す。【００９８】
【表１】
2018181515.tif 000022
【００９９】
図２にサンプル1(EM3-4)のm/z 1095.4の選択イオンクロマトグラムを示す。ステビオール配糖体の修飾されている糖鎖が3個のグルコース(Glc)と２個のラムノース(Rha)を含むステビオール配糖体（m/z 1095.4）の選択イオンクロマトグラム中にこれまでに報告の無い分子量を持つピークが観測された。つまり、図２に示される、Rt 28.73分のピークについては未知の物質である。レバウディオサイドCの含有率がレバウディオサイド Aと比べて低く、かつ糖鎖の伸長も他のサンプルよりも低いサンプル3からは Rt 28.73分のピーク値は検出限界以下であった。【０１００】
図３にサンプル1(EM3-4)のm/z 1257.5の選択イオンクロマトグラムを示す。ステビオール配糖体の修飾されている糖鎖が４個のグルコース(Glc)と２個のラムノース(Rha)を含むステビオール配糖体（m/z 1257.5）の選択イオンクロマトグラム中にこれまでに報告の無い分子量を持つピークが観測された。つまり、図３に示される、Rt 28.50分のピークについては未知の物質である。レバウディオサイドCの含有率がレバウディオサイド Aと比べて低く、かつ糖鎖の伸長も他のサンプルよりも低いサンプル４からは Rt 28.50分のピーク値は検出限界以下であった。【０１０１】
［新規ステビオール配糖体の構造解析］
本発明において、レバウディオサイドＣ高含有率品種から検出された新規ステビオール配糖体１および２の構造解析は次の手順で行った。
（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）− 高分解能質量分析（MS）およびMS/MS、3段階までのイオンの断片化（MS3断片化）のフラグメント化解析による構造推定、
（ｉｉ）化学反応による推定ステビオール配糖体標準品の化学合成、
（ｉｉｉ）化学合成標準品のHPLC− 高分解能MSおよびMS3断片化の保持時間と断片化パターンの一致による構造確認【０１０２】
上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の工程のそれぞれについて、以下に詳細に説明する。【０１０３】
（ｉ）高速液体クロマトグラフィー（HPLC）− 高分解能質量分析（MS）およびMS/MS，3段階までのイオンの断片化（MS3断片化）のフラグメント化解析による構造推定
検液の調製は、凍結乾燥処理を行ったステビア乾燥葉それぞれ10.0mgをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒として水/メタノール(1/1 vol/vol) を1.0 mL添加し、その後超音波洗浄器(AS ONE, AS52GTU)にて20分間、25°Cの設定温度にて超音波を照射し、ステビア葉からステビオール配糖体の抽出液を得た。さらにHPLC-MSに供するために、水/メタノールで10倍希釈を行い、細孔サイズ0.45 μmのフィルター(ナカライテスク、コスモナイスフィルターS(溶媒系))にてろ過を行った。【０１０４】
高速液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化精密質量分析(HPLC-ESI-HRMS)の機器構成において、HPLCの機器構成は、送液ユニットLCポンプにはProminence LC-20AD(島津製作所)を用い、分離カラムにはSM-C18 (4.6 x 250 mm)(インタクト社製)を用いた。LC移動相の送液は、移動相Aとしては0.2% 酢酸含有ミリＱ水を用い、移動相Bとしてはメタノールを用い、バイナリーグラジエント勾配を0 - 5分間は移動相B濃度10%で一定とし、その後15分間で移動相B濃度を10%から70%まで変化させ、さらに5分間でB濃度を70%から100%まで変化させた。最後に5分間、移動相B濃度を100%に維持して終了した。移動相の流速は0.4 mL/分で行い、希釈後フィルターろ過されたステビア葉抽出液は20 μL注入した。質量分析部は、ESIイオン源を取り付けたOrbitrap Elite MS (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。質量分析測定は、負イオン測定モード、m/z 150 - 2000の範囲、設定分解能60,000で測定を行った。MS/MS測定は、ターゲットのm/z 1095.4または1257.5を選択し、不活性ガスとの衝突によって断片化を行うCIDモードで行った。MS3のターゲットイオンはMS/MSスペクトルで最も強度の強いイオンとした。断片化に必要なエネルギーの照射は装置固有の衝突エネルギー基準である35で行った。【０１０５】
新規ステビオール配糖体１および２の断片化パターンを理解するために構造既知である標品レバウディオサイド Aおよび D、MのMS/MSおよびMS3断片化パターン解析を行った。その結果、新規ステビオール配糖体のMS/MSでは19位にエステル結合している糖鎖の全てが脱離したピークのイオン強度が最も強く現れるデータが得られた。この結果は19位の炭素にエステル結合しており、糖鎖の分子量の合計を示している。【０１０６】
図４に新規ステビオール配糖体１（m/z 1095.4, Rt:28.73に相当する）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す。新規ステビオール配糖体のMS/MSスペクトルからはGlc 1個分とRha１個分の脱離に相当するm/z 787.38にピークが主ピークとして検出された。この結果から19位の炭素にエステル結合している糖鎖数がGlc 1個分とRha１個であることが分かる。さらに構造情報を得るために、MS/MSで得られた主ピークm/z 787.4を断片化するMS3スペクトルを取得した。その結果、レバウディオサイド CのMS3スペクトル (949.4 → 787.4 → )と同様のピークパターンを持つスペクトルが得られた。このことから、13位に結合した糖鎖は、レバウディオサイド Cと同じであると推測出来る。推定される構造を図４中に示す。【０１０７】
図５に新規ステビオール配糖体２（m/z 1257.5, Rt:28.50に相当する）のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す。新規ステビオール配糖体のMS/MSスペクトルからはGlc ２個分とRha１個分の脱離に相当するm/z 787.38にピークが主ピークとして検出された。この結果から19位の炭素にエステル結合している糖鎖数がGlc ２個分とRha１個であることが分かる。さらに構造情報を得るために、MS/MSで得られた主ピークm/z 787.4を断片化するMS3スペクトルを取得した。その結果、レバウディオサイド CのMS3スペクトル (949.4 → 787.4 → )と同様のピークパターンを持つスペクトルが得られた。このことから、13位に結合した糖鎖は、レバウディオサイド Cと同じであると推測出来る。推定される構造を図５中に示す。【０１０８】
（ｉｉ）化学反応による推定ステビオール配糖体標準品の化学合成
［新規ステビオール配糖体１の合成］
（１）合成経路の概要
【化２０】
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スキーム７に示したように、新規ステビオール配糖体１ (化合物15) の合成では、ステビオールグリコシド (化合物3) と2糖ヘミアセタール体 (化合物8) を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体 １(化合物15) の骨格を得る事とした。ステビオールグリコシドの合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドC (化合物1) をArk Pharm社から購入し、ステビオール19位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖の水酸基をアセチル (Ac) 基で保護することで、ステビオールグリコシドを得た。2糖ヘミアセタール体 の合成では、適切に保護されたグルコースアクセプター (化合物4) とラムノースドナー (化合物5) の縮合反応によって、2糖骨格を作り、還元末端1位の保護基を脱保護することで、2糖ヘミアセタール体を得た。得られたステビオールグリコシドと2糖ヘミアセタール体を、光延反応で縮合したところ、75% (α／β= 1/20) と良好な収率且つ高いβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体１(15) を得た。
次に、各合成工程について説明する。【０１０９】
（２）ステビオールグリコシドの合成
【化２１】
2018181515.tif 000024
スキーム８に示したように、ステビオールグリコシド (化合物3) の合成では、Ark Pharm社から購入したレバウディオサイドC (化合物1) (1.0g、1.05 mmol) を、メタノール (10mL) と水 (10mL) に溶解させ、4 mol/L水酸化ナトリウム (2.6mL、10.5mmol) を室温で加え、100 ℃にて20時間還流した。反応終了をTLC (クロロホルム/メタノール/水 = 5/4/0.1、Rf値 = 0.9) で確認後、反応液を陽イオン交換樹脂Dowex MAC-3水素フォーム (SIGMA-ALDRICH社) で中和 (pH 7) し、樹脂を濾別後、減圧濃縮して得られたシラップを真空ポンプで18時間乾燥させ、化合物2 (828mg、quant.)を得た。【０１１０】
化合物2 (828mg、1.05mmol) をピリジン (20mL) に溶解させ、無水酢酸 (5mL) を室温で加え、室温にて48時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1、Rf値 = 0.5) にて確認後、飽和の炭酸水素ナトリウム水溶液 (5 mL) を加え、反応液を減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1) にて化合物3 (1.1 g、92%) を得た。
[化合物3]  
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.81 (m, 2H), 0.83-1.45 (complex, 19H), 1.39-1.91 (complex, 24H), 1.91-2.35 (s, 30H), 3.58 (m, 1H), 3.71-3.81 (complex, 4H), 3.95-4.12 (complex, 7H), 4.34-4.46 (complex, 3H), 4.56-4.66 (complex, 4H), 4.69-4.92 (complex, 7H), 5.05-5.14 (complex, 5H), 5.23-5.38 (complex, 6H), 5.45 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 15.9, 17.3, 19.1, 20.5, 20.7, 20.8, 20.9, 21.1, 21.5, 21.7, 29.1, 37.8, 38.0, 39.5, 40.7, 41.4, 42.2, 43.8, 48.4, 53.8, 56.8, 61.6, 63.0, 65.5, 66.8, 68.0, 68.6, 69.3, 69.6, 69.8, 70.5, 70.9, 71.6, 71.9, 72.4, 72.8, 73.9, 74.9, 81.3, 87.3, 96.6, 96.8, 99.2, 99.4, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9, 151.9, 168.9, 169.2, 169.5, 169.6, 169.8, 170.1, 170.2, 170.3, 170.6, 170.9, 176.8, 183.4.  【０１１１】
（３）2糖ヘミアセタール体の合成
【化２２】
2018181515.tif 000025
スキーム９に示したように、2糖ヘミアセタール体 (化合物8) の合成では、東京化成から購入した4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine-β-D-glucopyranoside (化合物4) (3.0g、6.46mmol) と化合物5 (3.3g、7.10mmol)、モレキュラーシーブス4Å (6.0g) をジクロロメタン(136mL) に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸 (114μL、1.29mmol) を室温で加え、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/2、Rf値 = 0.5) にて確認後、トリエチルアミン (100μL) で中和 (pH 8) し、モレキュラーシーブス4Åを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液(酢酸エチル/ヘキサン = 1/1.5) にて化合物6 (3.9g、81%) を得た。
[化合物6]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.18 (d, J = 6.4 Hz, 3H, H-6 of Rha), 1.96 (s, 3H, OAc), 1.98 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 3.51 (m, 1H, H-5), 3.73-3.81 (complex, 5H, H-4, H-6, OMe), 3.83-3.96 (complex, 2H, H-2, H-3), 4.28 (m, 1H, H-5 of Rha), 4.36 (m, 1H, H-6’), 4.70 (d, 1H, CH2Ph), 4.95 (d, 1H, CH2Ph), 4.99 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H-1), 5.03 (t, 1H, H-4 of Rha), 5.20 (dd, 1H, H-3 of Rha), 5.32 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.34 (m, 1H, H-2 of Rha), 5.57 (s, 1H, CHPh), 6.90 (dd, 4H, OMePh), 7.21-7.49 (complex, 10H, Ph); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.2, 17.4, 20.8, 20.9, 21.0, 22.8, 31.7, 55.8, 66.2, 66.7, 68.8, 69.4, 69.5, 71.0, 75.2, 76.7, 77.5, 81.7, 81.8, 98.4, 100.8, 101.4, 114.8, 118.3, 126.1, 127.9, 128.4, 128.5×2, 129.2, 137.2, 137.9, 150.8, 155.7, 169.9, 170.1, 170.2.【０１１２】
化合物6 (3.9g、5.29mmol) をエタノール (27mL) とTHF (27mL) に溶解させ、水酸化パラジウム (2.0g) を室温で加え、水素雰囲気下、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (クロロホルム/メタノール = 10/1、Rf値 = 0.2) にて確認後、水酸化パラジウムを濾別し、濾液を減圧濃縮した化合物7 (2.9g、quant.)を得た。【０１１３】
化合物7 (1.1g, 1.97mmol) をピリジン (20mL)に溶解させ、無水酢酸 (740μL、7.88mmol) を室温で加え、室温にて24時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/1, Rf値 = 0.6) にて確認後、トルエン (30mL) を加えた共沸を3回繰り返した。その後、減圧濃縮して得られたシラップをアセトリトリル (14mL) と水 (7.0mL) に溶解し、セリウムアンモニウムナイトレイト (3.2g、5.91mmol) を室温で加え、室温にて30分攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1.5/1, Rf値 = 0.5) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (酢酸エチル / ヘキサン = 1 / 1) および (トルエン/酢酸エチル = 3/1) にて化合物8 (721mg、66%、3 steps) を得た。
[化合物8]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.16-1.19 (complex, 4.5H, H-6α of Rha, H-6β of Rha), 1.97-2.34 (complex, 27 H, OAc), 3.58 (t, 0.5H, H-2β), 3.72-3.75 (complex, 1.5H, H-2α, H-5β), 4.00 (m, 1H, H-4α of Rha), 4.05-4.16 (complex, 1.5H), 4.21-4.27 (complex, 3H), 4.76 (d, J = 7.6 Hz, 0.5H, H-1β), 4.86 (s, 1H, H-1α of Rha), 4.91 (s, 0.5H, H-1β of Rha), 4.98-5.08 (complex, 4.6H), 5.23-5.26 (complex, 2H), 5.34 (d, J = 3.2 Hz, 1H, H-1α), 5.48 (t, 1H, H-3α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 17.2, 17.5, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×2, 21.0, 21.6, 62.1, 62.2, 67.2, 67.3, 67.5, 68.5, 68.6, 68.7, 70.0, 70.4, 71.0, 74.2, 77.4, 77.9, 79.3, 92.0, 75.7, 98.4, 99.2, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9, 169.8, 169.9×2, 170.0, 170.1×2, 170.2, 170.4, 170.9×2.【０１１４】
（４）化合物１５の合成
【化２３】
2018181515.tif 000026
スキーム１０に示したように、化合物15の合成では、化合物8(291mg、0.503mmol)と化合物3(391mg、0.335mmol) を1,4-ジオキサン (17mL) に溶解させ、トリブチルホスフィン (252 μL、1.01 mmol)、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) (173 mg、1.01 mmol) を室温で加え、60℃にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1.5/1) にて化合物14 (435mg、75%、α／β= 1/20) を得た。
[化合物14]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.50-1.18 (complex, 7H), 1.15 (d, 3H, H-6 of Rham), 1.24 (s, 3H), 1.40-2.32 (complex, 70H), 3.60 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.82-4.28 (complex, 10H), 4.40-4.48 (complex, 2H), 4.63 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.75-4.88 (complex, 3H), 4.98 (s, 1H), 5.01-5.18 (complex, 8H), 5.24-5.31 (complex, 4H), 5.32 (s, 1H), 5.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1β), 6.31 (d, J = 3.0 Hz, 0.05H, H-1α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.6, 17.4, 17.6, 20.5, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×3, 21.6, 29.0, 39.5, 42.5, 44.1, 53.8, 57.9, 61.7, 66.6, 67.4, 68.0, 68.3, 68.5, 68.7, 69.7, 69.8, 70.8, 71.1, 71.4, 71.9×2, 72.4, 72.9, 74.2, 75.1, 86.6, 92.2, 96.4, 96.9, 97.7, 99.3, 125.4, 128.3, 129.1, 152.9, 169.0, 169.5, 169.8×2, 169.9, 170.0, 170.1, 170.2×2, 170.3, 170.5, 170.6, 170.9×2, 174.6.【０１１５】
化合物14 (435mg、0.252mmol) をメタノール (2.0mL)、THF (2.0mL) に溶解させ、ナトリウムメトキサイド (0.5M in MeOH) (0.5mL、0.252mmol) を室温で加え、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (クロロホルム/メタノール/水 = 5/4/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、減圧濃縮して得られたシラップをゲルろ過カラム(GE Healthcare、Sephadex LH-20、エタノール)に供し、化合物15 (220mg、80%、α／β= 1/20)を得た。その後、分取HPLC(C18 YMC HPLCカラム、20mM 酢酸アンモニウム水溶液/90%アセトニトリル・10%水 = 70/30 〜 10/90、45分)で、化合物15のβ体を単離し、凍結乾燥を行った。化合物１５の核磁気共鳴(NMR)法による構造解析データを図６〜９に示す。
[化合物15（β体）]
1H-NMR (pyridine-d5, 800 MHz) δ 0.68 (m, 1H), 0.86 (m, 1H), 0.98 (m, 1H), 1.11-1.15 (complex, 4H), 1.24 (m, 2H), 1.39 (m, 2H), 1.49 (s, 3H), 1.62 (m, 3H), 1.71 (d, 3H), 1.75 (d, 3H), 1.88 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 2.00 (m, 2H), 2.11 (m, 2H), 2.19 (m, 2H), 2.46 (m, 1H), 2.66 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.97-4.10 (complex, 5H), 4.17-4.42 (complex, 11H), 4.49 (m, 1H), 4.51-4.59 (complex, 3H), 4.73 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.87 (m, 1H), 4.98 (d, J = 8.0 Hz,1H), 5.08 (s, 1H), 5.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 6.26 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.41 (s, 1H), 6.47 (s, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 200 MHz) δ 17.1, 19.2×2, 20.1, 20.9, 22.3, 29.6, 37.9, 38.2, 39.9, 40.9, 41.9, 42.8, 43.7, 44.5, 48.4, 54.1, 58.3, 62.3, 62.4, 62.5, 69.8×2, 70.2, 71.2, 71.6, 72.4, 72.5, 72.6, 74.0, 74.1, 75.2, 76.4, 76.8, 77.4, 78.5, 78.8, 79.0, 79.5, 86.9, 89.8, 94.0, 98.4, 101.8, 101.9, 104.4, 105.3, 154.5, 176.2.
[α]D = -46.3°(c 0.05, MeOH)
MALDI-TOF-MS m/z found [M + Na]+1119.5, C50H80O26calcd for [M + Na]+1119.5.【０１１６】
［新規ステビオール配糖体２の合成］
（１）合成経路の概要
【化２４】
2018181515.tif 000027
スキーム１１に示したように、新規ステビオール配糖体２(化合物17)の合成では、ステビオールグリコシド (化合物3) と3糖ヘミアセタール体 (化合物13) を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体２の骨格を得る事とした。ステビオールグリコシド  の合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドC (化合物1) をArk Pharm社から購入し、ステビオール19位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖の水酸基をアセチル (Ac) 基で保護することで、ステビオールグリコシドを得た。3糖ヘミアセタール体の合成では、適切に保護されたグルコースアクセプター (化合物4) とラムノースドナー (化合物5) の縮合反応から2糖アクセプター(化合物9)を合成し、グルコースドナー(化合物10)との縮合反応によって、3糖骨格とした。得られた3糖の還元末端1位の保護基を脱保護することで、3糖ヘミアセタール体を得た。ステビオールグリコシドと3糖ヘミアセタール体を、光延反応で縮合したところ、44% (α／β= 1/10) と良好な収率且つ高いβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体２を得た。
次に、各合成工程について説明する。【０１１７】
（２）ステビオールグリコシドの合成
ステビオールグリコシドの合成は、「新規ステビオール配糖体１の合成」の場合と同様の方法で行った。【０１１８】
（３）3糖ヘミアセタール体の合成
【化２５】
2018181515.tif 000028
スキーム１２に示したように、「新規ステビオール配糖体１の合成」の場合と同様の方法で化合物６および化合物７を得た。【０１１９】
化合物7 (1.7g, 3.04mmol) をアセトニトリル (30mL)に溶解させ、ベンズアルデヒドジメチルアセタール (681μL、4.57mmol) を室温で加え、室温にて2時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/1, Rf値 = 0.7) にて確認した。トリエチルアミン (2mL) で中和(pH 8) 後、減圧濃縮し、化合物9 (2.0g) を得た。【０１２０】
化合物9 (2.0g、3.04mmol) と化合物10 (1.6g、3.34mmol)、モレキュラーシーブス4Å (4.0g) をジクロロメタン(64mL) に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸 (114μL、1.29mmol) を室温で加え、0度にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、トリエチルアミン (100μL) で中和 (pH 8) し、モレキュラーシーブス4Åを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液(酢酸エチル/ヘキサン = 1/2) にて化合物11 (650mg、22%、3 steps) を得た。
[化合物11]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.16 (d, J = 6.0 Hz, 1H, H-6 of Rha), 1.94-2.19 (complex, 21H, OAc), 3.43-3.52 (complex, 2H), 3.62-3.81 (complex, 5H, OMe), 3.96-4.04 (complex, 2H), 4.07-4.18 (complex, 3H), 4.28-4.35 (complex, 2H), 4.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.94-4.98 (complex, 2H, H-1), 5.01-5.11 (complex, 2H), 5.16-5.21 (complex, 2H), 5.28 (s, 2H, H-1 of Rha), 5.52 (s, 1H, PhCH), 6.90 (dd, 4H, PhOMe), 7.31-7.49 (complex, 5H, Ph); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.3, 17.3, 20.4, 20.7, 20.9×3, 21.0, 21.1, 55.8, 60.5, 62.0, 66.3, 66.9, 68.3, 68.7, 69.3, 69.4, 70.7, 71.6, 71.9, 72.9, 78.9, 81.0, 97.7, 99.3, 100.7, 101.6, 114.8, 118.4, 126.2, 128.4, 129.4, 137.1, 150.7, 155.8, 169.4, 169.5, 170.0, 170.2, 170.4, 170.5, 170.8, 171.2.【０１２１】
化合物11 (627mg、0.642mmol) をエタノール (3mL) とTHF (3mL) に溶解させ、水酸化パラジウム (1.0g) を室温で加え、水素雰囲気下、室温にて2時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1、Rf値 = 0.2) にて確認後、水酸化パラジウムを濾別し、濾液を減圧濃縮した。その後、ピリジン (6.4mL)に溶解させ、無水酢酸 (182μL、1.93mmol) を室温で加え、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1, Rf値 = 0.7) にて確認後、トルエン (20mL) を加えた共沸を3回繰り返した。その後、減圧濃縮して得られたシラップをアセトリトリル (4mL) と水 (2mL) に溶解し、セリウムアンモニウムナイトレイト (1.0g、1.87mmol) を室温で加え、室温にて30分攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1, Rf値 = 0.3) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1/1)にて化合物13 (468mg、84%、3 steps) を得た。
[化合物13]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.18 (d, J = 6.4 Hz, 1H, H-6 of Rha), 1.93-2.19 (complex, 27H, OAc), 3.60 (t, 1.6H, H-2β), 3.68 (m, 1.2H, H-5β), 3.78 (m, 1.4H, H-5’β), 3.97 (t, 1H, H-3β), 4.03 (dd, 1H, H-6’β), 4.15 (m, 2.3H, H-6β，H-6β), 4.22 (m, 1.2H, H-5β of Rha), 4.43 (dd, 1.2H, H-6’β), 4.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1β), 4.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1’β), 4.82-4.91 (complex, 2.4H, H-4β, H-2’β), 5.06-5.14 (complex, 2.3H, H-4’β, H-4β of Rha), 5.16 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.26-5.33 (complex, 2.4H, H-3’β, H-3β of Rha), 5.39 (m, 1.1H, H-2β of Rha); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 17.3, 17.5, 20.6, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×2, 21.6, 29.8, 31.1, 61.7, 61.8, 62.4, 67.4, 67.6, 67.9, 68.0, 68.1×2, 68.3, 68.8×2, 69.5, 69.9, 70.6×2, 71.5, 71.8, 71.9, 72.1, 72.3, 72.8, 73.0, 75.5, 79.9, 80.1, 80.5, 91.9, 95.8, 98.1, 98.9, 99.6, 99.8, 125.4, 128.4, 129.2, 169.1, 169.4, 169.5, 169.6, 169.7, 170.0×3, 170.1, 170.4, 170.5×2, 170.7.【０１２２】
（４）化合物１７の合成
【化２６】
2018181515.tif 000029
スキーム１３に示したように、化合物17の合成では、化合物13 (468mg、0.540mmol)と化合物3(420mg、0.360mmol) を1,4-ジオキサン (18mL) に溶解させ、トリブチルホスフィン (270μL、1.08mmol)、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) (186mg、1.08mmol) を室温で加え、60℃にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1.5/1) および (トルエン/アセトン = 3/1)にて化合物16(320mg、44%、α／β= 1/10) を得た。
[化合物16]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.45-1.18 (complex, 8H), 1.28 (d, 3H, H-6 of Rham), 1.40-1.81 (complex, 20H), 1.81-2.35 (complex, 54H, OAc), 3.60 (m, 1.2H), 3.71-3.78 (complex, 3H), 3.81-3.91 (complex, 2.4H), 3.98-4.20 (complex, 10H), 4.40-4.50 (complex, 3.4H), 4.62 (d, J = 8.0 Hz, 1.1H, H-1), 4.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.75-4.91 (complex, 7H), 4.96-5.12 (complex, 7H), 5.17 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.21-5.31 (complex, 6H), 5.32 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.38 (t, 1.1H), 5.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1β), 6.22 (d, J = 3.0 Hz, 0.1H, H-1α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.7, 17.5, 20.5, 20.7×2, 20.8×2, 20.9×2, 21.0, 21.6, 29.0, 39.6, 42.5, 44.0, 53.9, 58.1, 61.7, 66.7, 67.6, 68.0, 68.1, 68.3, 68.5, 69.8, 70.2, 70.7, 71.2, 71.4, 71.8, 71.9, 72.2, 72.4, 72.8, 72.9, 75.2, 80.3, 81.4, 86.6, 92.2, 96.4, 96.9, 99.3, 99.8, 125.4, 128.4, 129. 2, 138.0, 152.9, 169.0, 169.3, 169.5×2, 169.6×2, 169.8, 170.1×3, 170.2, 170.5, 170.6, 170.9×2, 174.7.【０１２３】
化合物16 (300mg、0.149mmol) をメタノール (2.0mL)、THF (2.0mL) に溶解させ、ナトリウムメトキサイド (0.5 M in MeOH) (0.3mL、0.149mmol) を室温で加え、室温にて3時間攪拌した。反応終了をTLC (クロロホルム / メタノール/水 = 5/4/1、Rf値 = 0.5) にて確認後、減圧濃縮して得られたシラップをゲルろ過カラム(GE Healthcare、Sephadex LH-20、エタノール)に供し、化合物17 (188mg、96%、α／β= 1/10)を得た。その後、分取HPLC(C18 YMC HPLCカラム、20mM 酢酸アンモニウム水溶液/90%アセトニトリル・10%水 = 70/30 〜 10/90、45分)で、化合物17のβ体を単離し、凍結乾燥を行った。化合物１７の核磁気共鳴(NMR)法による構造解析データを図１０〜１３に示す。
[化合物17（β体）]  
1H-NMR (pyridine-d5, 800 MHz) δ 0.67 (m, 1H), 0.86 (m, 1H), 0.96 (m, 1H), 1.07 (m, 1H), 1.14 (s, 3H), 1.26 (m, 1H), 1.36 (m, 1H), 1.41 (m, 1H), 1.48 (s, 3H), 1.61 (m, 3H), 1.70 (m, 6H), 1.87-2.21 (complex, 11H), 2.46 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.95-4.09 (complex, 8H), 4.14-4.31 (complex, 14H), 4.33 (m, 1H), 4.45 (m, 2H), 4.55 (m, 3H), 4.78 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.05-5.11 (complex, 3H), 5.66 (s, 1H), 6.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 6.46 (s, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 200 MHz) δ 17.0, 19.2, 20.1, 20.9, 22.3, 29.6, 37.8, 38.3, 39.9, 40.8, 41.9, 42.7, 43.7, 44.5, 48.4, 54.2, 58.4, 61.9, 62.4, 62.5, 69.1, 69.8×2, 70.5, 71.6, 71.7, 72.3, 72.4, 72.5×2, 73.9, 74.1, 75.2, 76.4, 76.5, 77.5, 78.3, 78.4, 78.5, 78.8×2, 86.9, 88.8, 89.8, 93.8, 98.4, 101.8, 101.9, 104.4, 104.5, 105.3, 154.4, 176.0.
[α]D = -44.5°(c 0.1, MeOH)
MALDI-TOF-MS m/z found [M + Na]+1281.4, C56H90O31calcd for [M + Na]+1281.5.【０１２４】
（ｉｉｉ）化学合成標準品のＨＰＬＣ− 高分解能MS/MSおよびMS3断片化の保持時間と断片化パターンの一致による構造決定
（ｉ）と同条件で、ＨＰＬＣ− 高分解能MS/MSおよびMS3断片化による新規ステビオール配糖体１の化学合成品（化合物15のβ体）とステビア葉抽出液の比較を行った結果、保持時間29.1分のピークで化学合成品とステビア葉抽出液からのピークが検出された（図１４）。また、それぞれのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトル（図１５）も一致した。この結果から、植物体の抽出液から得られた新規ステビオール配糖体１は化合物15のβ体と同じ構造を有することが確認された。【０１２５】
さらに、（ｉ）と同条件で、ＨＰＬＣ− 高分解能MS/MSおよびMS3断片化による新規ステビオール配糖体２の化学合成品（化合物17のβ体）とステビア葉抽出液の比較を行った結果、保持時間28.9分のピークで化学合成品とステビア葉抽出液からのピークが検出された（図１６）。また、それぞれのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトル（図１７）も一致した。この結果から、植物体の抽出液から得られた新規ステビオール配糖体２は化合物17のβ体と同じ構造を有することが確認された。【０１２６】
［新規ステビオール配糖体の生合成］
酵母において、ステビオールから新規ステビオール配糖体を生成させた。まず、ステビア由来の配糖化酵素遺伝子UGT85C2、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1の4種と、シロイヌナズナ由来UDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2を同時に発現させる酵母を育種した。【０１２７】
本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning（Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001）に記載の方法に従った。【０１２８】
ステビア由来の4つの配糖化酵素遺伝子をクローニングするために、下記のプライマーセットを合成し、ステビア葉から調製したcDNAを鋳型にPCRを行った。
UGT85C2遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw（下線部NdeI認識部位）：
5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’（配列番号１２）
BglII-SrUGT85C2-Rv（下線部BglII認識部位）：
5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’（配列番号１３）
UGT91D2遺伝子増幅用プライマーセット
SrUGT91D2-pET15b-FW
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’（配列番号３５）
SrUGT91D2-pET15b-RV
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’（配列番号３６）
UGT74G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw（下線部NdeI認識部位）： 
5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’ （配列番号１４）
BamHI-SrUGT74G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’ （配列番号１５）
UGT76G1遺伝子増幅用プライマーセット
CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw（下線部NdeI認識部位）： 
5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’ （配列番号１６）
BamHI-SrUGT76G1-Rv（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’ （配列番号１７）
【０１２９】
ステビア葉cDNAについてはステビア葉からRNeasy Plant Miniキット（QIAGEN）を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo-dTプライマーで逆転写（RT）反応することによって得た。【０１３０】
PCR反応液（50μl）は、ステビア葉由来cDNA 1μl、1×KOD plus buffer（TOYOBO）、0.2mM dNTPs、プライマー各0.4pmol/μl、1mM MgSO4, 1U 耐熱性 KOD plus polymeraseからなる組成とした。PCR反応は、95℃で5分間反応させた後、94℃で0.5分間、50℃で0.5分間、68℃で2分間の反応を計30サイクルの増幅を行った。各PCR産物を0.8％アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型DNAから推定された約1.4kbのサイズに増幅バンドが得られた。
このPCR産物はpENTR-TOPO Directionalベクター（Invitrogen）に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子、すなわちUGT85C2、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1の全てのUGT遺伝子がクローニングできたことを確認した。【０１３１】
酵母用発現ベクターの構築
これらのUGT遺伝子、およびシロイヌナズナ由来のUDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2（J Biol Chem 2007 Oka et. al）を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
SrUGT85C2セット
Bgl2-UGT85C2-F（下線部BglII認識部位）：
5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’ （配列番号１８）
Sal-UGT85C2-R（下線部SalI認識部位）：
5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’ （配列番号１９）
SrUGT91D2セット
NotI-UGT91DIL3-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ （配列番号２０）
Pac-UGT91D1L3-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ （配列番号２１）
SrUGT74G1セット
Not-UGT74G1-F（下線部NotI認識部位）：
5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’ （配列番号２２）
Pac-UGT74G1-R（下線部PacI認識部位）：
5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’ （配列番号２３）
SrUGT76G1セット
Bam-UGT76G1-F(下線部BamHI認識部位）：
5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’ （配列番号２４）
Sal-UGT76G1-R(下線部SalI認識部位）：
5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA-3’ （配列番号２５）
AtRHM2セット
Bam-AtRHM2-F（下線部BamHI認識部位）：
5’-GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3’  （配列番号２６）
Xho-AtRHM2-R（下線部XhoI認識部位）：
5’-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3’  （配列番号２７）
【０１３２】
UGT85C2を鋳型としてSrUGT85C2セット、UGT91D2を鋳型としてSrUGT91D2セット、UGT74G1を鋳型としてSrUGT74G1セット、UGT76G1を鋳型としてSrUGT76G1セット、AtAHM2を鋳型としてAtAHM2セットの鋳型とプライマーの組み合わせで、耐熱性KOD DNAポリメラーゼ（東洋紡）を用いて、PCRにより増幅し、それぞれのORFの両端に制限酵素サイトを付加した。得られたDNA断片を、ゼロBlunt-TOPO  PCRクローニングキット（インビトロジェン）を用いてサブクローニングし、DNA Sequencer model 3100（Applied Biosystems）を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子がそれぞれクローン化されていることを確認した。【０１３３】
pESC酵母発現システム（ストラタジーン）を用いて、上記遺伝子を酵母で発現させるために、次の発現ベクターを構築した。
（1）プラスミドpESC-URA-UGT56の構築
UGT85C2を制限酵素BglIIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-URA（ストラタジーン）を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-URA-UGT-5を得た。このプラスミドpESC-URA-UGT-5を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT91D2を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切り出したものを連結し、pESC-URA-UGT56を得た。
（2）プラスミドpESC-HIS-UGT78の構築
UGT76G1を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-HIS（ストラタジーン）を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-HIS-UGT-8を得た。このプラスミドpESC-HIS-UGT-8を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT74G1をNotIとPacIで切り出したものを連結し、pESC-HIS-UGT78を得た。
（3）プラスミドpESC-TRP-AtRHM2の構築
AtAHM2を制限酵素BamHIと制限酵素XhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP（ストラタジーン）を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-TRP-AtAHM2を得た。【０１３４】
酵母の形質転換
Saccharomyces cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amberade2-101ochre trp1-Δ63  his3-Δ200 leu2-Δ1  a）を宿主として、酢酸リチウム法で、表２のプラスミドを導入した。形質転換株として、SC-Trp&Ura＆His寒天培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース  20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His  1.3g、Bacto agar  20g）で生育するものを選抜した。
【表２】
2018181515.tif 000030
【０１３５】
なお、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&Hisは、アデニン硫酸塩  2.5g、L-アルギニン塩酸塩  1.2g、L-アスパラギン酸  6.0g、L-グルタミン酸  6.0g、L-ロイシン3.6g、L-リジン  1.8g、L-メチオニン  1.2g、L-フェニルアラニン  3.0g、L-セリン  22.5g、L-スレオニン12g、L-チロシン  1.8g、L-バリン  9.0gを混ぜて調製した。【０１３６】
導入遺伝子の発現誘導と発現解析
得られた形質転換株を以下の通り培養した。
まず、前培養としてSC-Trp&Ura&His液体培地（SC- Trp&Ura&His寒天培地のBacto agarを除く）10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp&Ura&His液体培地（1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース  20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His  1.3g）に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。【０１３７】
形質転換株で導入した遺伝子が発現したかどうかを確認するため、培養液から菌体を集め、RNeasy Mini Kitを用いて、トータルRNAを精製した。【０１３８】
トータルRNA  1μgをとり、スーパースクリプトII逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ランダムヘキサマーをプライマーとして、cDNAを合成した。【０１３９】
導入遺伝子の発現を確認するために、以下のプライマーを作製した。
UGT85C2発現確認用
UGT85C2-r1：
5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ （配列番号２８）
UGT91D2発現確認用
UGT91D1L3-r1：
5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ （配列番号２９）
UGT74G1発現確認用
UGT74G1-r1：
5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ （配列番号３０）
UGT76G1発現確認用
UGT76G1-r1：
5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ （配列番号３１）
AtAHM2 発現確認用
AtAHM2-r1
5’-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3’ （配列番号３２）
GAL10p領域 （プロモーター領域）
PGAL10-f3：
5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ （配列番号３３）
GAL1p領域（プロモーター領域）
PGAL1-f3：
5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ （配列番号３４）【０１４０】
各導入遺伝子が発現していることは、以下のプライマーの組み合わせで、先に合成したcDNAを鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）を用いてPCRを行い、その産物をアガロースゲル電気泳動により確認した。
UGT85C2：UGT85C2-r1（配列番号２８）とPGAL1-f3（配列番号３４）
UGT91D2またはUGT91D2L3：UGT91D1L3-r1（配列番号２９）とPGAL10-f3（配列番号３３）
UGT74G1：UGT74G1-r1（配列番号３０）とPGAL1-f3（配列番号３４）
UGT76G1：UGT76G1-r1（配列番号３１）とPGAL10-f3（配列番号３３）
AtAHM2：AtAHM2-r1（配列番号３２）とPGAL10-f3（配列番号３３）
これにより、形質転換株で、導入した遺伝子が発現していることが確認できた。【０１４１】
新規ステビオール配糖体の生産
培養は、本培養用の液体培地に培地1 mlあたり0.5μgまたは2μｇのステビオール（ChromaDex Inc.）を添加した以外は、上記実施例と同様の条件で行った。培養終了後、培養液を遠心分離により、上清と菌体に分離した。培養上清を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-Pak C18カラムに供し、20％ アセトニトリルで洗浄後、80％アセトニトリルで溶出し、乾固後、少量の80％ アセトニトリルに溶解して配糖体サンプルを調製した。この配糖体サンプルを以下の分析に供した。【０１４２】
LC-MSによる分析
LC-MSによる分析は、「新規ステビオール配糖体の単離」についての実施例に記載のとおり分析した。【０１４３】
結果を図１８および１９に示した。A-5678株で新規ステビオール配糖体１および２が生成していることが確認できた。この結果は、上記の化学合成によって得られたステビオール配糖体と一致していた。【０１４４】
新規ステビオール配糖体の甘味度評価
新規ステビオール配糖体の甘味度を評価するため、Brix０．５から３まで０．５刻となるようショ糖を純水に添加したサンプルを調製した。新規ステビオール配糖体２と同じ構造を有する化合物１７を１，７００ｐｐｍとなるように純水に添加してサンプルを調製した。ここで、化合物１７中に含まれるα体とβ体との比率（α：β、モル比）は１：１０であった。【０１４５】
評価は新規ステビオール配糖体を添加されたサンプルと同等の甘味強度を持つショ糖添加サンプルを選択することによって行われ、甘味料の官能に関して訓練を受けた者（５名）がパネラーとなって官能評価を行った。その結果、新規配糖体２を添加した調製サンプルがＢｒｉｘ１のショ糖添加サンプルと同等の甘味を持つことがわかった。したがって、本新規ステビオール配糖体はショ糖に対し１４．７の甘味度を持つことがわかった。新規ステビオール配糖体１については、水に十分に溶解しなかったため正確な甘味度は得られなかったが、後述のとおり、新規ステビオール配糖体１も甘味を有することが確認された。【０１４６】
新規ステビオール配糖体（化合物１７）の官能評価
各種ステビオール配糖体の味質の評価を行うため、図２０に示した添加量となるようにＲｅｂ．Ａと、Ｒｅｂ．Ｄと、新規ステビオール配糖体２と同じ構造を有する化合物１７とをそれぞれ純水に添加して、飲料サンプルを調製した。飲料サンプルは全て、甘味度をＲｅｂ．Ａについては３００、Ｒｅｂ．Ｄについては２５０、新規配糖体２（化合物１７）については１４．７として、ショ糖（スクロース）換算のＢｒｉｘが最終的に２となるように調整した。【０１４７】
得られた飲料サンプルについて、甘味立ち上がり、甘味の後引き、甘味総量、雑味、および雑味の後引きの指標で官能評価を行った。なお、雑味とは本明細書において苦味を含む、渋味など甘味以外の好ましくない香味を意味する。甘味料の官能に関して訓練を受けた者（７名：サントリー食品インターナショナル株式会社）がパネラーとなって評価を行い、評価基準は次の通りとした。とても弱い（−３）、弱い（−２）、やや弱い（−１）、普通（０）、やや強い（＋１）、強い（＋２）、およびとても強い（＋３）。結果を図２０に示す。図中に示す評点は７名のパネラーによる評点の平均値である。【０１４８】
官能評価の結果、新規ステビオール配糖体２と同じ構造を有する化合物１７は従来の甘味料であるＲｅｂ．ＡやＲｅｂ．Ｄよりも甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に良かった。また、Ｒｅｂ．Ｄと同程度の甘味総量を有することが分かった。【０１４９】
新規ステビオール配糖体（化合物１５および１７）の粉体の香味評価
新規ステビオール配糖体１および２それぞれの粉体における香味を評価した。具体的には、化学合成によって得られた化合物１５（新規ステビオール配糖体１に対応）と化合物１７（新規ステビオール配糖体２に対応）を高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）を用いてβ体のみを単離し、粉体状としたものについて香味を評価した。甘味料の官能に関して訓練を受けた者（３名：サントリー食品インターナショナル株式会社）がパネラーとなって評価を行った。結果を表３に示す。
【表３】
2018181515.tif 000031
【０１５０】
上記の結果から、新規ステビオール配糖体１および２はいずれも甘味を有しており、甘味料として有用であることが分かる。またいずれの配糖体も、苦味のような望ましくない香味が弱いという特徴があることが分かる。なお、化合物１７については、甘味度評価に用いたα体とβ体の混合物と類似した香味を有していた。
【図１】
2018181515.tif 000043
【図２】
2018181515.tif 000044
【図３】
2018181515.tif 000045
【図４】
2018181515.tif 000046
【図５】
2018181515.tif 000047
【図６】
2018181515.tif 000048
【図７】
2018181515.tif 000049
【図８】
2018181515.tif 000050
【図９】
2018181515.tif 000051
【図１０】
2018181515.tif 000052
【図１１】
2018181515.tif 000053
【図１２】
2018181515.tif 000054
【図１３】
2018181515.tif 000055
【図１４】
2018181515.tif 000056
【図１５】
2018181515.tif 000057
【図１６】
2018181515.tif 000058
【図１７】
2018181515.tif 000059
【図１８】
2018181515.tif 000060
【図１９】
2018181515.tif 000061
【図２０】
2018181515.tif 000062
【配列表】
2018181515000001.app
【国際調査報告】
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2018181515.tif 000064
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