(57)【要約】  リステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビを簡易かつ特異的に検出する手段の提供。  次の成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：（Ａ）β−グルコシダーゼで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、（Ｂ）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、及び（Ｃ）糖を含有するリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出用培地。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：
（Ａ）β−グルコシダーゼで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、
（Ｂ）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、及び
（Ｃ）糖
を含有するリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出用培地。
【請求項２】
成分（Ｃ）の糖が、ブドウ糖である請求項１記載のリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出用培地。
【請求項３】
成分（Ｃ）の糖を、検出時の濃度として２ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含有する請求項１又は２記載のリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出用培地。
【請求項４】
成分（Ａ）が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドである請求項１〜３のいずれか１項記載のリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出用培地。
【請求項５】
成分（Ａ）が、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシドである請求項１〜３のいずれか１項記載のリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出用培地。
【請求項６】
さらに、（Ｄ）ゲル化剤、（Ｅ）成分（Ｃ）以外の菌体栄養成分を含有する組成物を、繊維質吸水性シートに担持又は積層したものである請求項１〜５のいずれか１項記載のリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出用培地。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載の培地に、検体を接種して培養した後、当該培地上に生じたコロニーの色又は蛍光を検出することを特徴とするリステリア・モノサイトジェネス及び／又はリステリア・イバノビ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）及びリステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）を簡易かつ特異的に検出するための培地及び検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属に属する菌は、グラム陽性、通性嫌気性の非芽胞短桿菌である。現時点では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（以下、単にＬ．と記載する）ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌ．ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌ．ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌ．ｇｒａｙｉ、Ｌ．ｍａｒｔｈｉｉ、Ｌ．ｒｏｃｏｕｒｔｉａｅ、Ｌ．ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎｉｉ、Ｌ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．ａｑｕａｔｉｃａ、Ｌ．ｃｏｒｎｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｆｌｏｒｉｄｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｇｒａｎｄｅｎｓｉｓおよびＬ．ｒｉｐａｒｉａなどが存在する。それらのうち、通常ヒトに病原性を示すものは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのみであり、食品検査では本菌が検査対象となる。ただし、食品はＬ．ｉｎｎｏｃｕａをはじめとするいくつかの、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ以外のリステリア属菌で汚染されている場合も多いため、これらの菌との鑑別が重要となる（非特許文献１）。また、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは人畜共通感染症を引き起こすことが知られており、米国では環境検査の対象ともなる菌である。【０００３】
日本のリステリア属の標準試験方法には、定性試験と定量試験がある。定性試験では、検体をｈａｌｆ−Ｆｒａｓｅｒ液体培地で一次増殖培養し、さらにＦｒａｓｅｒ液体培地を用いて二次増菌培養し、酵素基質を含有した選択分離培地（酵素基質培地）を用いて、リステリア属を分離する。この際、二次増菌培養をせずに、一次増菌培養で得られたコロニーを酵素基質培地に接種する方法も同時に行う。一方、定量試験では、ＢＰＷ培地で蘇生培養（２０±２℃、１時間±５分）後に、酵素基質培地を用いて、リステリア属を分離する。定性方法および定量方法の酵素基質培地を用いた培養後、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを確定する方法として、炭水化物分解試験およびＣＡＭＰ試験などが知られているが、培養を必要とするため確定までに時間を要する。そのため、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの補助的な確認方法として、ＰＣＲ法、免疫診断学的方法を用いた迅速診断法とが知られている（非特許文献１）。例えば、リステリア属に属する菌種の鑑別手段としては、ＰＣＲ法の一種であるＬＡＭＰ法による検出法が知られている（特許文献１）。しかし、このＬＡＭＰ法は、菌種特異的なプライマーを４種使用する方法であり、日常の検査室で採用できる手段ではない。【０００４】
リステリア属に属する菌種の鑑別手段としては、前記のとおり選択分離培地を使用する手段が簡便である。このような選択分離培地としては、β−グルコシダーゼで分解されることにより発色する色原性物質を用いたＡＬＯＡ（登録商標）寒天培地（シスメックス・ビオメリュー社）、ＣＨＲＯＭａｇａｒ（登録商標）Ｌｉｓｔｅｒｉａ（ＣＨＲＯＭａｇａｒ社）が知られている。前記酵素基質培地は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種すると、乳白色のハローを伴った青緑色の典型集落を示し、それ以外のリステリア属では、ハローが生じない。同様に、β−グルコシダーゼで分解されることにより発色する色原性物質を用いた培地として特許文献２が知られている。また、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬ Ｃ）によって特異的に切断される色素原基質を含有する培地（特許文献３）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−６１０６１号公報
【特許文献２】特開２０１２−１３０２７４号公報
【特許文献３】特表２００１−５１００５４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】食品衛生検査指針  微生物編  ２０１５、公益社団法人日本食品衛生協会著Ｐ３４０−３６３（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記酵素基質培地ならびに特許文献２及び３の選択分離培地によっては、リステリア属のうちＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓとＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉは明確に鑑別することが困難である。よって、前記酵素基質培地で得られたコロニーを用いて、確認試験を行う必要があるため、時間と手間がかかり煩雑である。
従って、本発明の課題は、ヒトに対する病原性や食品汚染の原因となるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉを簡便かつ特異的に検出する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、前記課題を解決すべく種々検討した結果、β−グルコシダーゼで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光原性物質と、ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬ Ｃ）で分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光原性物質に加え、糖を併用することにより、Ｌ．ｉｖａｎｏｖｉｉとＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが、コロニー周囲の色の変化ではなく、コロニーの色又は蛍光が明確に識別できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、次の発明〔１〕〜〔７〕を提供するものである。【００１０】
〔１〕次の成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：
（Ａ）β−グルコシダーゼで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、
（Ｂ）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、及び
（Ｃ）糖
を含有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出用培地。
〔２〕成分（Ｃ）の糖が、ブドウ糖である〔１〕記載のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出用培地。
〔３〕成分（Ｃ）の糖を、検出時の濃度として２ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下含有する〔１〕又は〔２〕記載のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出用培地。
〔４〕成分（Ａ）が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシドである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出用培地。
〔５〕成分（Ａ）が、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシドである〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出用培地。
〔６〕さらに、（Ｄ）ゲル化剤、（Ｅ）成分（Ｃ）以外の菌体栄養成分を含有する組成物を、繊維質吸水性シートに担持又は積層したものである〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出用培地。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の培地に、検体を接種して培養した後、当該培地上に生じたコロニーの色又は蛍光を検出することを特徴とするＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の培地を用いれば、リステリア属に属する菌が選択的に検出でき、リステリア属に属する菌種のうち、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓと及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉとその他のリステリア属の菌種とをコロニーの色又は蛍光で明確に鑑別することができる。さらに、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉの確認試験をする必要がなくなるため、検査の手間と時間を削減できる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉ検出用培地は、次の成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含有する。
【００１３】
（Ａ）β−グルコシダーゼで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、
（Ｂ）ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣで分解されることにより発色する色原性物質又は蛍光を発する蛍光原性物質、及び
（Ｃ）糖。
【００１４】
成分（Ａ）は、リステリア属菌の有するβ−グルコシダーゼの作用により検出可能な遊離性基を遊離することにより発色させ、リステリア属菌のコロニーを検出するためのものである。該遊離性基としては、色原体化合物、蛍光性化合物が挙げられる。具体的なβ−グルコシダーゼ基質としては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−β−グルコシド、青色）、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＡＧＥＮＴＡ−β−グルコピラノシド、赤紫）、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（赤紫）、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ピンク）、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド、４−メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−インドキシル−β−グルコピラノシドトリハイドレート、ｎ−ヘプティル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド等が挙げられ、このうちＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ検出性の点から５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−β−グルコシド）、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシドが好ましい。検出可能な遊離性基を有するβ−グルコシダーゼ基質の濃度は、検出時の濃度として、０．００１ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下が好ましく、特に０．０１ｇ／Ｌ以上０．２５ｇ／Ｌ以下、更に０．０２ｇ／Ｌ以上０．１５ｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００１５】
成分（Ｂ）は、リステリア属菌の有するＰＩＰＬ Ｃの作用により検出可能な遊離性基を遊離することにより発色させ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉのコロニーを検出するためのものである。該遊離性基としては、色原体化合物、蛍光性化合物が挙げられる。このようなＰＩＰＬ  Ｃ基質としては、特許第５７１１２１８号記載の化合物が挙げられ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル基、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドキシル基、６−クロロ−３−インドキシル基等の発色団を有するイノシトールリン酸が好ましい。これらの化合物は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩の形態で用いるのが好ましい。好ましい市販品としては、Ａｌｄｏｌ ５１４（登録商標）ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）、Ａｌｄｏｌ  ４９５（登録商標）ｉｎｏｓｉｔｏｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）等が挙げられる。成分（Ｂ）の濃度は、検出時の濃度として、０．００１ｇ／Ｌ以上５ｇ／Ｌ以下が好ましく、０．０５ｇ／Ｌ以上２ｇ／Ｌ以下がより好ましく、０．１ｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。
【００１６】
成分（Ｃ）糖は、リステリア属が利用できるものであれば、特に制限はなく、ブドウ糖、果糖、ガラクトース、マンノース、マンニット、ソルビット、ズルシット、イノシット、アラビノース、キシロース、ラムノース、アドニットなどが好ましく、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉの糖代謝能力から、ブドウ糖がより好ましい。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉのコロニーの色又は蛍光を明確にし、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉを容易かつ正確にする作用を有する。成分（Ｃ）の含有量は、コロニーの色を明確にする観点及びリステリア属菌の発育性の観点から検出時の濃度として２ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下であるのが好ましい。より好ましい成分（Ｃ）の濃度は、コロニーの色を明確にする観点から５ｇ／Ｌ以上３０ｇ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは５ｇ／Ｌ以上２０ｇ／Ｌ以下である。
【００１７】
本発明の培地は、さらにリステリア属菌の選択性を高めるため、モクサラクタム及びコリスチン硫酸塩から選ばれる１種又は２種以上を含有するのが好ましく、モクサラクタム及びコリスチン硫酸塩を含有するのがより好ましい。モクサラクタムの含有量は、リステリア属菌の選択性の点から、検出時の濃度として０．００１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下が好ましく、０．００５ｇ／Ｌ以上０．３ｇ／Ｌ以下がより好ましく、０．０１ｇ／Ｌ以上０．２ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。コリスチン硫酸塩の含有量は、リステリア属菌の選択性の点から、０．００１ｇ／Ｌ以上０．５ｇ／Ｌ以下が好ましく、０．００５ｇ／Ｌ以上０．２ｇ／Ｌ以下が好ましく、０．００５ｇ／Ｌ以上０．１ｇ／Ｌ以下がさらに好ましい。
【００１８】
本発明の培地には、前記成分以外に、成分（Ｃ）以外の菌体栄養成分、無機塩類、糖類、pH調整剤を配合することができる。菌体栄養成分としては、ペプトン、酵母エキス、獣肉エキス、魚肉エキス等が挙げられる。
【００１９】
ここで無機塩類としては、塩化ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩；クエン酸鉄アンモニウム、クエン酸ナトリウム等の有機酸金属塩等が挙げられる。また、他の無機塩類は、胆汁末、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。糖類としては、単糖類及びオリゴ糖類が使用でき、例えばラクトース、シュークロース(白糖)、キシロース、セロビオース、マルトース等が挙げられる。
【００２０】
本発明培地の形態は特に限定されず、通常の寒天培地の他、シート状簡易培地（特開昭５７−５０２２００号、特開平６−１８１７４１号及び例えばメッシュを有する繊維状吸水シートに担持させた構造（特開平９−１９２８２号、特開２０００−３２５０７２））とすることもできる。このうち、前記成分（Ａ）〜（Ｃ）、必要に応じてモクサラクタム及びコリスチン硫酸塩に加えて、（Ｄ）ゲル化剤、（Ｅ）成分（Ｃ）以外の菌体栄養成分を含有する組成物を、繊維質吸水性シートに担持又は積層した簡易培地とするのが好ましい。
【００２１】
ここで、ゲル化剤としては、水溶性ゲル化剤、すなわち水に容易に分散してゲル化する高分子が挙げられ、具体的にはペクチン、グアーガム、キサンタンガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、ジェランガム、アラビアガム、タラガム、カラギーナン、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。このうち、水に対する分散性、ゲルの安定性等の点から、ペクチン、グアーガム、キサンタンガムがより好ましく、キサンタンガムが特に好ましい。
【００２２】
本発明で用いる繊維質吸水性シートは、接種された被検液が毛細管現象により容易に拡散することが必要であり、例えばレーヨン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布等が挙げられる。これらのシートの形状は特に制限されず、正方形、長方形、円形等の何れであってもよい。またその大きさも特に制限されないが、簡易検出用であることから、長径１ｃｍ以上１５ｃｍ以下のものが好ましい。また、網目の大きさが１５メッシュ以上１００メッシュ以下、特に２０メッシュ以上５０メッシュ以下で、厚さが１０μｍ以上１０００μｍ以下、特に５０μｍ以上６００μｍ以下のものが好ましい。
【００２３】
このような繊維質吸水性シートは防水性平板に載置されているのが好ましく、かかる防水性平板としては、プラスチック、ガラス等の防水性の材質のものであれば何れでもかまわないが、外部からの観察のため透明のものが好ましい。
【００２４】
本発明培地の測定対象としては、乳製品、食肉製品、サラダ、ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｅａｔ食品、環境検体（水、土壌等）、臨床検体（ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ等）などが挙げられる。また、これらの検体を予めトリプトソーヤブイヨン培地で培養した培養液やこれを増菌用培地で培養した培養液も試料とすることができる。
【００２５】
本発明培地を用いてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉを検出するには、検体を培地に接種して培養し、コロニーの着色、蛍光等の特性を観察することにより行われる。培養は通常２５〜３５℃で２４〜７２時間行うのが好ましい。
【００２６】
本発明の簡易培地を用いてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及び／又はＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉを検出するには、当該培地表面に被検液を接種する。そうすると、被検液がメッシュ間の立体的な空洞部の毛細管現象によって容易に拡散し、それに続いて膨潤ゲル化が起こって、被検液中のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉは捕捉され、自由移動が抑制され、培養によってコロニーが形成される。従って、培地形成面を観察すれば、形成したコロニーが容易に観察できる。試料を定量的に簡易培地へ接種すれば、培養後出現したコロニーを計測することにより、容易に菌数を算定することができる。
【００２７】
なお、菌体液の接種は通常ピペット等により一定量を接種する方法が採用されるが、水分の多い個体へスタンプする方法や試料液へ浸す方法でもよい。また、被検液接種後の培養は、静置して行っても、また輸送期間中に行ってもよい。
【実施例】
【００２８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。【００２９】
実施例１（発色基質含有寒天培地）
表１に培地組成を示した。本培地組成を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌を行い、約５０℃になるまで冷却後、プラスチックシャーレ（直径９０ｍｍ）に２０ｍＬずつ無菌的に分注して培地が固まるまで静置し、本発明の培地を作製した。
また、表１中のブドウ糖を０、２、５、２０、３０ｇ／Ｌとしたものも同様に作製した。【００３０】
【表１】
2018225821.tif 000002
【００３１】
供試菌株を羊血液寒天培地にて２４時間前培養し、コロニーを滅菌生理食塩水に懸濁して菌液を作製し、それぞれの菌液を白金耳にて画線塗抹により接種した。３７℃、４４時間培養後のコロニーの発色について表２に示す。【００３２】
【表２】
2018225821.tif 000003
【００３３】
表２より、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）に加えて成分（Ｃ）ブドウ糖２ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌを含有した寒天培地を用いることで、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉと、他のリステリア属菌とのコロニーを明確に鑑別することができた。【００３４】
実施例２（蛍光基質含有寒天培地）
表３に培地組成を示した。本培地組成を１リットルの精製水に加え、１２１℃、１５分間高圧蒸気滅菌を行い、約５０℃になるまで冷却後、プラスチックシャーレ（直径９０ｍｍ）に２０ｍＬずつ無菌的に分注して培地が固まるまで静置し本発明の培地を作製した。【００３５】
【表３】
2018225821.tif 000004
【００３６】
供試菌株を羊血液寒天培地にて２４時間前培養し、コロニーを滅菌生理食塩水に懸濁して菌液を作製し、それぞれの菌液を白金耳にて画線塗抹により接種した。３７℃、４４時間培養後のコロニーの発色および蛍光の有無について表４に示す。【００３７】
【表４】
2018225821.tif 000005
【００３８】
表４より、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）に加えて成分（Ｃ）ブドウ糖１０ｇ／Ｌを含有した寒天培地を用いることで、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉと、他のリステリア属菌とのコロニーを明確に鑑別することができた。【００３９】
実施例３（発色基質含有簡易培地）
表５に培地組成を示した。本培地組成物をエタノール溶液１０００ｍＬに加え、懸濁液とした。このエタノール懸濁液を１ｍＬずつ繊維質吸水性シート（コットン不織布、直径５０ｍｍ）を収納した容器（直径５０ｍｍ）に無菌的に分注した後、これらが重ならないように、非開放空間内で一夜静置して乾燥した後、蓋をして本発明の簡易培地を作製した。【００４０】
【表５】
2018225821.tif 000006
【００４１】
供試菌株を羊血液寒天培地にて２４時間前培養し、コロニーを滅菌生理食塩水に懸濁、適宜希釈を行って菌液を作製し、それぞれ１ｍＬを、作製した簡易培地に接種した。３７℃、４４時間培養後のコロニーの発色について表６に示す。【００４２】
【表６】
2018225821.tif 000007
【００４３】
表６より、成分（Ａ）及び成分（Ｂ）に加えて成分（Ｃ）ブドウ糖１０ｇ／Ｌを含有した簡易培地を用いることで、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｉｖａｎｏｖｉｉと、他のリステリア属菌とのコロニーを明確に鑑別することができた。
【国際調査報告】
2018225821.tif 000008
2018225821.tif 000009
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