(57)【要約】  本発明は、血清中の安定性が向上し、かつ細胞内に移行して遺伝子発現制御機能を発揮することができる核酸分子の提供を目的とする。下式（Ａ）：2018182008.tif 000067［式中、各記号の定義は明細書中に記載の通りである］で表される環状型核酸分子は、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の環状型核酸分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
2018182008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ａ）：
【化１】
2018182008.tif 000063
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’およびＲ４’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｚ１〜Ｚ４は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｗ１〜Ｗ６は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
ＱおよびＴは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり（一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である）；
Ｌは、リンカーであり；
ｍおよびｍ’は、それぞれ独立して、１〜１２の整数であり；
ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり；
ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して、０または１であり；
ｙ１およびｙ２は、それぞれ独立して、０または１であり；
ｚ１〜ｚ４は、それぞれ独立して、０、１または２であり；および
ｗ１〜ｗ６は、それぞれ独立して、０、１または２である］
で表される環状型核酸分子。
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
リンカーが、下式：
【化２】
2018182008.tif 000064
【化３】
2018182008.tif 000065
【化４】
2018182008.tif 000066
のいずれかで表される、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６のうち、すくなくとも１つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、請求項１〜３のいずれか1項に記載の核酸分子。
【請求項５】
Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６のうち、すくなくとも５つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、請求項１〜４のいずれか1項に記載の核酸分子。
【請求項６】
ガイド鎖及びパッセンジャー鎖、並びにリンカーを含むポリヌクレオチド鎖が、その一部において二本鎖構造を形成した際に、その両端が平滑末端である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の核酸分子。
【請求項７】
標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１〜６のいずれか1項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、標的遺伝子発現抑制用組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項９】
標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１〜６のいずれか1項に記載の核酸分子を使用することを特徴とする、発現抑制方法。
【請求項１０】
前記核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項９記載の発現抑制方法。
【請求項１１】
前記核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与する、請求項９または１０記載の発現抑制方法。
【請求項１２】
前記核酸分子を、非ヒト動物に投与する、請求項９または１０記載の発現抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現制御機能を有する環状型核酸分子、それを含む組成物およびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現を抑制する技術として、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が知られている（非特許文献１）。ＲＮＡ干渉による遺伝子の発現抑制は、例えば、短い二本鎖のＲＮＡ分子を、細胞等に投与することによって、実施されるのが一般的である。前記二本鎖のＲＮＡ分子は、通常、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる。この他に、環状のＲＮＡ分子であり、分子内アニールにより、部分的に二重鎖を形成したＲＮＡ分子によっても、遺伝子の発現が抑制できることが報告されている（特許文献１）。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子の発現を抑制する核酸分子として知られており、例えば、以下のような生成プロセスを経て、遺伝子がコードするタンパク質の転写を抑制すると報告されている。すなわち、まず、核内において、５’末端にキャップ構造、３’末端にポリ（Ａ）を有するｍｉＲＮＡ転写産物（Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ（Ｄｒｏｓｈａ）により切断され、ｍｉＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。前記Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ループ領域とステム領域とを有するヘアピン構造をとる。このＰｒｅ−ｍｉＲＮＡは、核外に移動した後、細胞質のＲＮａｓｅ（Ｄｉｃｅｒ）により分解され、３’末端に１〜４塩基のオーバーハングを有する、二本鎖のｍｉＲＮＡが切り出される。この二本鎖のｍｉＲＮＡのうち、一方の鎖は、ガイド鎖と呼ばれ、他方の鎖は、パッセンジャー鎖と呼ばれ、前記ガイド鎖が、ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）に類似した複合体に結合する。このｍｉＲＮＡ／ＲＩＳＣ複合体が特定のｍＲＮＡに結合することによって、前記ｍＲＮＡの切断あるいはタンパク質への翻訳の抑制が生じる。【０００３】
ｍｉＲＮＡは、分化、細胞増殖、アポトーシス等の生命現象やウイルス感染症、ガン等の多くの疾患に深く関わっていることが明らかになってきている（特許文献２、非特許文献２、非特許文献３）。このことから、特に医療分野における応用が期待されている。【０００４】
生体内での安定性改善や自然免疫応答の亢進による副作用軽減の目的で、ｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡ等の二本鎖核酸の末端を各種のリンカーで連結した、自己アニーリングする、１つもしくは２つのヘアピン型部分二次構造をとり得る一本鎖核酸分子が開発されている（特許文献２〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−２７８７８４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／０１７９１９号
【特許文献３】国際公開第２０１３／１０３１４６号
【特許文献４】国際公開第２０１２／００５３６８号
【特許文献５】国際公開第２０１３／１８００３８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fire,et al., 1998, Nature, 391, 806-811
【非特許文献２】Deiters, 2009, The AAPS Journal, 12, 51-60
【非特許文献３】Takeshita et al., 2010, Mol. Ther., 18, 181-187
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に核酸は、溶液中で分解されやすく不安定であり、特に血清中での安定性に劣るため、例えば遺伝子発現制御を目的として核酸分子を生体に投与した場合でも所望の効果が十分に得られないという問題点があった。また、細胞内移行性や薬物動態の問題も存在している。【０００８】
本発明は、血清中の安定性が向上し、かつ細胞内に移行して遺伝子発現制御機能を発揮することができる核酸分子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、遺伝子発現制御機能を有する一本鎖核酸分子をジスルフィド結合により環状にすることにより血清中の安定性を向上させ、さらに、３’側及びループ側の構造を工夫することでより血清中の安定性を高めることに成功して本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、次の通りである。
［１］下式（Ａ）：【００１０】
【化１】
2018182008.tif 000003
【００１１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’およびＲ４’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｚ１〜Ｚ４は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｗ１〜Ｗ６は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
ＱおよびＴは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり（一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である）；
Ｌは、リンカーであり；
ｍおよびｍ’は、それぞれ独立して、１〜１２の整数であり；
ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり；
ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して、０または１であり；
ｙ１およびｙ２は、それぞれ独立して、０または１であり；
ｚ１〜ｚ４は、それぞれ独立して、０、１または２であり；および
ｗ１〜ｗ６は、それぞれ独立して、０、１または２である］
で表される環状型核酸分子。
［２］Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である上記［１］記載の核酸分子。
［３］Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基であり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基であり；
Ｚ１〜Ｚ４は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｗ１〜Ｗ６は、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチドである、上記［１］または［２］記載の核酸分子。
［４］リンカーが、下式：【００１２】
【化２】
2018182008.tif 000004
【００１３】
【化３】
2018182008.tif 000005
【００１４】
【化４】
2018182008.tif 000006
【００１５】
のいずれかで表される、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の核酸分子。
［５］Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６のうち、すくなくとも１つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸分子。
［６］Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６のうち、すくなくとも５つが、それぞれ独立してメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の核酸分子。
［７］ガイド鎖及びパッセンジャー鎖、並びにリンカーを含むポリヌクレオチド鎖が、その一部において二本鎖構造を形成した際に、その両端が平滑末端である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の核酸分子。
［８］標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
上記［１］〜［７］のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、標的遺伝子発現抑制用組成物。
［９］上記［１］〜［７］のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とする、薬学的組成物。
［１０］標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
上記［１］〜［７］のいずれかに記載の核酸分子を使用することを特徴とする、発現抑制方法。
［１１］前記核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、上記［１０］記載の発現抑制方法。
［１２］前記核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与する、上記［１０］または［１１］記載の発現抑制方法。
［１３］前記核酸分子を、非ヒト動物に投与する、上記［１０］または［１１］記載の発現抑制方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の環状型核酸分子によれば、血清中の安定性が向上し、且つ、細胞内移行後に開裂して活性を示すので、効果の持続が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、PA-0001-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２】図２は、PA-0001-DSOのRP-HPLCチャート図である。
【図３】図３は、PA-0002-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図４】図４は、PA-0003-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図５】図５は、PA-0004-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図６】図６は、PA-0005-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図７】図７は、PA-0006-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図８】図８は、PA-0007-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図９】図９は、PA-0008-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１０】図１０は、PA-0009-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１１】図１１は、PA-0010-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１２】図１２は、PA-0011-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１３】図１３は、PA-0012-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１４】図１４は、PA-0013-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１５】図１５は、PA-0014-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１６】図１６は、PA-0015-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１７】図１７は、PA-0016-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１８】図１８は、PA-0017-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図１９】図１９は、PA-0018-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２０】図２０は、PA-0019-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２１】図２１は、PA-0020-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２２】図２２は、PA-0021-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２３】図２３は、PA-0024-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２４】図２４は、PA-0025-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２５】図２５は、PA-0026-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２６】図２６は、PA-0027-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２７】図２７は、PA-0028-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２８】図２８は、PA-0029-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図２９】図２９は、PA-0030-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図３０】図３０は、GA-0001-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図３１】図３１は、KA-0001-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図３２】図３２は、PA-0031-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図３３】図３３は、PA-0032-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図３４】図３４は、PA-0033-DSPのRP-HPLCチャート図である。
【図３５】図３５は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図３６】図３６は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図３７】図３７は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図３８】図３８は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図３９】図３９は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図４０】図４０は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図４１】図４１は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図４２】図４２は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図４３】図４３は、各環状型核酸分子の血清中安定性を評価した結果を示す電気泳動像である。
【図４４−１】図４４−１は、各環状型核酸分子の遺伝子発現抑制効果を示すグラフである。
【図４４−２】図４４−２は、各環状型核酸分子の遺伝子発現抑制効果を示すグラフである。
【図４５】図４５は、各環状型核酸分子の遺伝子発現抑制効果を示すグラフである。
【図４６】図４６は、各環状型核酸分子の遺伝子発現抑制効果を示すグラフである。
【図４７】図４７は、各核酸分子のマウス生体（血中）における安定性を評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１９】
（１）環状型核酸分子
本発明の環状型核酸分子は、前述のように、下記式（Ａ）で表されることを特徴とする。
【００２０】
式（Ａ）：
【化５】
2018182008.tif 000007
【００２１】
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１’およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ３’およびＲ４’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基またはヒドロキシであり；
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
Ｚ１〜Ｚ４は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチドであり；
Ｗ１〜Ｗ６は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基であり；
ＱおよびＴは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖であり（一方がガイド鎖の場合、他方はパッセンジャー鎖である）；
Ｌは、リンカーであり；
ｍおよびｍ’は、それぞれ独立して、１〜１２の整数であり；
ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり；
ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して、０または１であり；
ｙ１およびｙ２は、それぞれ独立して、０または１であり；
ｚ１〜ｚ４は、それぞれ独立して、０、１または２であり；および
ｗ１〜ｗ６は、それぞれ独立して、０、１または２である］。
【００２２】
本発明の環状型核酸分子は、例えば、標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質が挙げられる。
【００２３】
本発明の環状型核酸分子は、一本鎖の核酸分子の５’末端と３’末端とがジスルフィド結合により連結しているため、例えば、環状型核酸分子のように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。さらに、後述の実施例にて示されるように血清中での安定性が向上する。
また、本発明の環状型核酸分子は、ガイド鎖配列とパッセンジャー鎖配列とが、非ヌクレオチド構造のリンカー分子を介して連結されているため、比較的長いヌクレオチドループを有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡをもとにした一本鎖核酸分子に比べ、合成が容易かつ安価に提供でき、薬物動態や細胞内移行性にも優れる。
【００２４】
本発明の環状型核酸分子において、前記Ｑ領域は、任意の遺伝子発現制御機能を有する核酸分子のガイド鎖配列またはパッセンジャー鎖配列を含み、前記Ｑ領域が前記ガイド鎖配列を含む場合、前記Ｔ領域は、前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子のパッセンジャー鎖配列を含み、前記Ｑ領域が前記パッセンジャー鎖配列を含む場合、前記Ｔ領域は、前記ガイド鎖配列を含む。
【００２５】
本発明の環状型核酸分子において、前記Ｑ領域は、前述のように、ガイド鎖配列（パッセンジャー鎖配列）を含む。一方、前記Ｔ領域は、前記パッセンジャー鎖配列（ガイド鎖配列）を含む。遺伝子発現制御機能を有する核酸分子のガイド鎖およびパッセンジャー鎖配列は、例えば、各種データベースに登録されている（例えば、http://www.mirbase.org/等）。したがって、例えば、これらの情報に基づいて、前記Ｑ領域および前記Ｔ領域を設定できる。
【００２６】
前記Ｑ（Ｔ）領域において、前記ガイド鎖配列（パッセンジャー鎖配列）の長さは、特に制限されず、例えば、報告されているガイド鎖配列（パッセンジャー鎖配列）の長さが例示できる。具体例として、下限が、例えば、１０塩基長〜１５塩基長であり、上限が、例えば、２５塩基長〜３０塩基長であり、塩基長の範囲が、例えば、１０〜３０塩基長で、好ましくは、１５〜２０塩基長である。
【００２７】
本発明の環状型核酸分子において、前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子の配列は、例えば、本発明の環状型核酸分子が、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に導入された場合に、前記標的遺伝子の発現を抑制する活性を示す配列である。前記発現抑制配列は、特に制限されず、目的の標的遺伝子の種類に応じて、適宜設定できる。前記発現抑制配列は、例えば、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉に関与する配列を適宜適用できる。ＲＮＡ干渉は、一般に、長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内において、Ｄｉｃｅｒにより、３’末端が突出した１９〜２１塩基対程度の二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）に切断され、その一方の一本鎖ＲＮＡが標的ｍＲＮＡに結合して、前記ｍＲＮＡを分解することにより、前記ｍＲＮＡの翻訳を抑制する現象である。前記標的ｍＲＮＡに結合する前記ｓｉＲＮＡにおける一本鎖ＲＮＡの配列は、例えば、標的遺伝子の種類に応じて様々な種類が報告されている。本発明は、例えば、前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡの配列を、前記発現抑制配列として使用できる。本発明においては、例えば、出願時において公知となっている前記ｓｉＲＮＡの一本鎖ＲＮＡ配列の他、将来的に明らかとなる配列に関しても、前記発現抑制配列として利用できる。
【００２８】
具体的には、前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制用核酸分子が挙げられる。ＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制配列として、下記のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
3’-CGUCUCAUGUGUGUCGUAU-5’（配列番号１）
ガイド鎖配列として当該配列を選択した場合には、パッセンジャー鎖配列としてはその相補配列を用いることができる。前記相補配列は、例えば、前記ガイド鎖配列と、１００％の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で１００％未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、９０％〜１００％、９３％〜１００％、９５％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％等が例示できる。
前記相補配列は、例えば、下記のヌクレオチド配列を含むものが例示できる。
5’-GCAGAGUACACACAGCA-3’（配列番号２）
遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制用核酸分子を用いた場合には、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現抑制が可能なため、ＴＧＦ−β１遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、肺線維症および急性肺傷害等を予防または治療できる。
【００２９】
前記遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現抑制用核酸分子が挙げられる。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現抑制用核酸分子としては、miR-29b1が挙げられ、下記のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする。
3’-GUGACUAAAGUUUACCACGAU-5’（配列番号３）
ガイド鎖配列として当該配列を選択した場合には、パッセンジャー鎖配列としてはその相補配列を用いることができる。前記相補配列は、例えば、前記ガイド鎖配列と、１００％の相補性を示す配列でもよいし、アニーリング可能な範囲で１００％未満の相補性を示す配列でもよい。前記相補性は、特に制限されず、例えば、９０％〜１００％、９３％〜１００％、９５％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％等が例示できる。
前記相補配列は、例えば、下記のヌクレオチド配列を含むものが例示できる。
5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAGA-３’（配列番号４）
遺伝子発現制御機能を有する核酸分子としては、例えば、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現抑制用核酸分子を用いた場合には、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現抑制が可能なため、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現が原因となる疾患、例えば、骨形成不全症等を予防または治療できる。
【００３０】
式（Ａ）において、
ｎ個のＲ１およびＲ２、ｎ’個のＲ１’およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基（後述）、アルコキシ基（後述）またはヒドロキシである。ｎ個のＲ１、およびＲ２、ｎ’個のＲ１’およびＲ２’は、好ましくは同一であり、より好ましくは同一で水素原子である。
【００３１】
式（Ａ）において、
ｍ個のＲ３およびＲ４、ｍ’個のＲ３’およびＲ４’は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基（後述）、アルコキシ基（後述）またはヒドロキシである。ｍ個のＲ３およびＲ４、ｍ’個のＲ３’およびＲ４’は、好ましくは同一であり、より好ましくは同一で水素原子である。
【００３２】
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
Ｚ１〜Ｚ４は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
Ｗ１〜Ｗ６は、それぞれ独立して、修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６が、それぞれ独立して、メチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。好ましくは、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、Ｙ２、Ｚ１〜Ｚ４およびＷ１〜Ｗ６のうちのいずれか１つ、より好ましくはいずれか２つ、いっそう好ましくは３つ、特に好ましくは４つ、特により好ましくは５つ、最も好ましくは６つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、Ｚ１〜Ｚ４のいずれか１つ、より好ましくはいずれか２つ、特に好ましくはいずれか３つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
好ましくは、Ｗ１〜Ｗ６のいずれか１つ、より好ましくはいずれか２つ、いっそう好ましくは３つ、特に好ましくは４つ、特により好ましくは５つ、最も好ましくは６つがメチル基で修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基である。
【００３３】
本明細書において、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基を総称してヌクレオチド残基とも称する。前記ヌクレオチド残基は、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基が挙げられる。本発明の核酸分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。前記ヌクレオチド残基は、メトキシ基で置換されていてもよい。
【００３４】
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
【００３５】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記未修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されていてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。
【００３６】
修飾されていてもよいリボヌクレオチド残基又はデオキシリボヌクレオチド残基は、例えば、フッ素原子、メチル基または前記未修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等があげられる。
【００３７】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
前記塩基は、例えば、アデニンおよびグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシルおよびチミン等のピリミジン塩基があげられる。前記塩基は、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、プリン、イソグアニン、７−デアザアデニン等があげられる。前記塩基は、例えば、２−アミノアデニン、６−メチル化プリン等のアルキル誘導体；２−プロピル化プリン等のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化および他の８−置換プリン；５−トリフルオロメチル化および他の５−置換ピリミジン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；Ｎ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１、２、４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；Ｏ−アルキル化塩基等があげられる。また、プリンおよびピリミジンは、例えば、米国特許第３、６８７、８０８号、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈら）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３に開示されるものが含まれる。
【００３８】
式（Ａ）中、
ｍおよびｍ’は、それぞれ独立して、１〜１２の整数であり、好ましくは同一で４〜８の整数であり、特に好ましくは６である。
ｎおよびｎ’は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、好ましくは同一で２〜７の整数であり、特に好ましくは２または７である。
ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して、０または１であり、好ましくは同一で１である。
ｙ１およびｙ２は、それぞれ独立して、０または１であり、好ましくは同一で１である。
ｚ１〜ｚ４は、それぞれ独立して、０、１または２であり、好ましくは０または１であり、より好ましくは同一で１である。
ｗ１〜ｗ６は、それぞれ独立して、０、１または２であり、好ましくは０または１であり、より好ましくは同一で１である。
【００３９】
式（Ａ）中、Ｌはリンカーである。具体的には、リンカーは下記式（Ｉ）中のＬ領域で表わされる構造を有する。
【００４０】
下式（Ｉ）：
【００４１】
【化６】
2018182008.tif 000008
【００４２】
（式（Ｉ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｌ１は、ｎＬ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍＬ個の炭素原子を有するアルキレン鎖であり、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｍＬは、０〜３０の整数であり；
ｎＬは、０〜３０の整数であり；
Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（Ｉ）であり、
Ａは、任意の原子団であり、ただし、下式（Ｉａ）は、アミノ酸またはペプチドである。）
【００４３】
【化７】
2018182008.tif 000009
【００４４】
前記式（Ａ）中のＬは、前記式（Ｉ）中の−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合する。
【００４５】
前記式（Ｉ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（Ｉ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００４６】
前記式（Ｉ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００４７】
前記式（Ｉ）中、Ｌ１は、ｎＬ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００４８】
前記式（Ｉ）中、Ｌ２は、ｍＬ個の炭素原子を有するアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００４９】
Ｌ１のｎＬおよびＬ２のｍＬは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎＬおよびｍＬは、例えば、前記リンカー領域Ｌの所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎＬおよびｍＬは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎＬとｍＬは、同じでもよいし（ｎＬ＝ｍＬ）、異なってもよい。ｎＬ＋ｍＬは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【００５０】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例：ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。これらの置換基は、１または複数のさらなる置換基またはさらなる保護基で置換されていても良い。前記さらなる置換基は、特に限定されないが、例えば、上記例示に係る置換基でも良い。前記さらなる保護基は、特に限定されないが、例えば、下記例示に係る保護基でも良い。以下において同様である。
【００５１】
前記保護基（または、前記さらなる保護基）は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、下式（Ｐ１）および（Ｐ２）のシリル含有基があげられ、中でも、ＤＭＴｒ基および前記シリル含有基のいずれかであることが好ましい。
【００５２】
【化８】
2018182008.tif 000010
【００５３】
前記式（Ｉ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【００５４】
前記式（Ａ）中のＬは、前記式（Ｉ）中の−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、隣接するヌクレオチド残基のリン酸基に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（Ｉ)の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（Ｉ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌ）は、前記式（Ｉ）の構造からなる残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（Ｉ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（Ｉ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。
【００５５】
前記式（Ｉ）中、原子団Ａは、下式（Ｉａ）：
【００５６】
【化９】
2018182008.tif 000011
【００５７】
がアミノ酸またはペプチドとなる限り、特に制限されない。
例えば、前記（Ｉ）または（Ｉａ）中の原子団Ａは、例えば、鎖式原子団、脂環式原子団、および芳香族性原子団からなる群から選択される少なくとも一つを含んでいても含んでいなくても良い。前記鎖式原子団は、特に限定されないが、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等が挙げられる。前記脂環式原子団は、特に限定されないが、例えば、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル等が挙げられる。前記芳香族性原子団は、特に限定されないが、例えば、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、縮環系アリール、縮環系アリールアルキル、縮環系アルキルアリール等が挙げられる。また、前記式（Ｉ）または（Ｉａ）中の原子団Ａにおいて、前記各原子団は、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基または保護基は、複数の場合は同一でも異なってもよい。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。
【００５８】
本発明において、「アミノ酸」は、分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む任意の有機化合物をいう。また、「ペプチド」は、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した構造の有機化合物をいう。前記ペプチド結合は、酸アミド構造でも良いし、酸イミド構造でも良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にアミノ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているアミノ基は、いずれのアミノ基であっても良い。また、前記式（Ｉａ）で表すアミノ酸分子中にカルボキシ基が複数存在する場合は、前記式（Ｉａ）中に明示しているカルボキシ基は、いずれのカルボキシ基であっても良い。
【００５９】
本発明の環状型核酸分子の前記リンカー領域（Ｌ）において、前記アミノ酸は、天然アミノ酸でも良いし、人工アミノ酸であっても良い。なお、本発明において、「天然アミノ酸」は、天然に存在する構造のアミノ酸またはその光学異性体をいう。前記天然アミノ酸の製造方法は特に限定されず、例えば、天然物から抽出しても良いし、合成しても良い。また、本発明において、「人工アミノ酸」は、天然に存在しない構造のアミノ酸をいう。すなわち、前記人工アミノ酸は、アミノ酸すなわちアミノ基を含むカルボン酸誘導体（分子中にアミノ基およびカルボキシ基をそれぞれ１つ以上含む有機化合物）であって、天然に存在しない構造のカルボン酸誘導体をいう。前記アミノ酸は、例えば、タンパク質を構成するアミノ酸であっても良い。前記アミノ酸は、例えば、グリシン、α−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、ヒドロキシリシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、トリプトファン、β−アラニン、１−アミノ−２−カルボキシシクロペンタン、アミノ安息香酸、アミノピリジンカルボン酸および下記化学式（Ｉａ２）で表されるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１種類であっても良く、さらに置換基または保護基を有していても有していなくても良い。前記置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。前記保護基は、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した保護基と同様である。また、前記化学式（Ｉａ）のアミノ酸またはペプチドに、光学異性体、幾何異性体、立体異性体等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体でも良い。
【００６０】
【化１０】
2018182008.tif 000012
【００６１】
前記化学式（Ｉａ２）中、
Ｒ１００は、任意の置換基であり、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合は、１個でも複数でもよく、複数の場合は、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｒ１００における前記任意の置換基としては、例えば、前記Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄで例示した置換基が挙げられ、より具体的には、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、スルホ、ニトロ、カルバモイル、スルファモイル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、シリル、シリルオキシアルキル、ピロールイル、イミダゾリル等があげられる。また、前記化学式（Ｉａ２）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉａ３）であってもよい。
【００６２】
【化１１】
2018182008.tif 000013
【００６３】
なお、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ２）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２）で表される。下記化学式（Ａ２）中のＲ１００は、前記化学式（Ｉａ２）中のＲ１００と同じである。また、前記化学式（Ｉａ）の構造が、前記化学式（Ｉａ３）である場合、前記化学式（Ｉ）中の原子団Ａの構造は、下記化学式（Ａ２ａ）で表される。
【００６４】
【化１２】
2018182008.tif 000014
【００６５】
前記化学式（Ｉ）の構造は、例えば、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）が例示でき、下記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎＬおよびｍＬは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
【００６６】
【化１３】
2018182008.tif 000015
【００６７】
前記化学式（Ｉ−１）〜（Ｉ−７）において、ｎＬおよびｍＬは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（Ｉ−１）においてｎＬ＝１１およびｍＬ＝１２、または、ｎＬ＝５およびｍＬ＝４と、前記化学式（Ｉ−４）においてｎＬ＝５およびｍＬ＝４と、前記化学式（Ｉ−６）において、ｎＬ＝４およびｍＬ＝４と、前記化学式（１−７）においてｎＬ＝５およびｍＬ＝４とがあげられる。それらの構造を、下記化学式（Ｉ−１ａ）、（Ｉ−１ｂ）、（Ｉ−４ａ）、（Ｉ−６ａ）および（Ｉ−７ａ）に示す。中でも、式（Ｉ−１ｂ）、（Ｉ−４ａ）、（Ｉ−６ａ）および（Ｉ−７ａ）が好ましい。
【００６８】
【化１４】
2018182008.tif 000016
【００６９】
あるいは、本発明の環状型核酸分子において、前記リンカー領域Ｌは、下記式（ＩＩ）で表わされる。
【００７０】
【化１５】
2018182008.tif 000017
【００７１】
前記式（ＩＩ）中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり；
Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基であり、
Ｌ１は、ｎＬ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ１は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｌ２は、ｍＬ個の原子からなるアルキレン鎖であり、ここで、アルキレン炭素原子上の水素原子は、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されても置換されていなくてもよく、または、
Ｌ２は、前記アルキレン鎖の一つ以上の炭素原子が、酸素原子で置換されたポリエーテル鎖であり、
ただし、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接せず；
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立して、置換基または保護基であり；
ｌは、１または２であり；
ｍＬは、０〜３０の整数であり；
ｎＬは、０〜３０の整数であり；
環Ａは、前記環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素、硫黄で置換されてもよく、
前記環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよく、
Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記構造（ＩＩ）であり、
前記式（Ａ）中のＬは、前記式（ＩＩ）中の−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して隣接するヌクレオチド残基に結合する。
【００７２】
前記式（ＩＩ）中、Ｘ１およびＸ２は、例えば、それぞれ独立して、Ｈ２、Ｏ、ＳまたはＮＨである。前記式（ＩＩ）中において、Ｘ１がＨ２であるとは、Ｘ１が、Ｘ１の結合する炭素原子とともに、ＣＨ２（メチレン基）を形成することを意味する。Ｘ２についても同様である。
【００７３】
前記式（ＩＩ）中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して、単結合、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳである。
【００７４】
前記式（ＩＩ）中、Ｌ１は、ｎＬ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲａ、ＮＨ２、ＮＨＲａ、ＮＲａＲｂ、ＳＨ、もしくはＳＲａで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ１は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。前記ポリエーテル鎖は、例えば、ポリエチレングリコールである。なお、Ｙ１が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、ＯＲ１に結合するＬ１の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ１がＯの場合、その酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接せず、ＯＲ１の酸素原子とＬ１の酸素原子は隣接しない。
【００７５】
前記式（ＩＩ）中、Ｌ２は、ｍＬ個の原子からなるアルキレン鎖である。前記アルキレン炭素原子上の水素原子は、例えば、ＯＨ、ＯＲｃ、ＮＨ２、ＮＨＲｃ、ＮＲｃＲｄ、ＳＨもしくはＳＲｃで置換されてもよいし、置換されていなくてもよい。または、Ｌ２は、前記アルキレン鎖の１つ以上の炭素原子が酸素原子で置換されたポリエーテル鎖でもよい。なお、Ｙ２が、ＮＨ、ＯまたはＳの場合、Ｙ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、ＯＲ２に結合するＬ２の原子は炭素であり、酸素原子同士は隣接しない。つまり、例えば、Ｙ２がＯの場合、その酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接せず、ＯＲ２の酸素原子とＬ２の酸素原子は隣接しない。
【００７６】
Ｌ１のｎＬおよびＬ２のｍＬは、特に制限されず、それぞれ、下限は、例えば、０であり、上限も、特に制限されない。ｎＬおよびｍＬは、例えば、前記リンカー領域（Ｌ）の所望の長さに応じて、適宜設定できる。ｎＬおよびｍＬは、例えば、製造コストおよび収率等の点から、それぞれ、０〜３０が好ましく、より好ましくは０〜２０であり、さらに好ましくは０〜１５である。ｎＬとｍＬは、同じでもよいし（ｎＬ＝ｍＬ）、異なってもよい。ｎＬ＋ｍＬは、例えば、０〜３０であり、好ましくは０〜２０であり、より好ましくは０〜１５である。
【００７７】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基である。前記置換基および前記保護基は、例えば、前述と同様である。
【００７８】
前記式（ＩＩ）において、水素原子は、例えば、それぞれ独立して、Ｃｌ、Ｂｒ、ＦおよびＩ等のハロゲンに置換されてもよい。
【００７９】
前記式（Ａ）中の前記Ｌは、前記式（ＩＩ）中の−ＯＲ１−または−ＯＲ２−を介して、隣接するヌクレオチド残基のリン酸基に結合する。ここで、Ｒ１およびＲ２は、存在しても存在しなくてもよい。Ｒ１およびＲ２が存在する場合、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、ヌクレオチド残基または前記式（ＩＩ）の構造である。Ｒ１および／またはＲ２が前記式（ＩＩ）の構造の場合、前記リンカー領域（Ｌ）は、前記式（ＩＩ）の構造からなる残基が、２つ以上連結された構造となる。前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、１個、２個、３個または４個含んでもよい。このように、前記構造を複数含む場合、前記（ＩＩ）の構造は、例えば、直接連結されてもよいし、前記ヌクレオチド残基を介して結合してもよい。
【００８０】
前記式（ＩＩ）中、環Ａにおいて、ｌは、１または２である。ｌ＝１の場合、環Ａは、５員環であり、例えば、前記ピロリジン骨格である。前記ピロリジン骨格は、例えば、プロリン骨格、プロリノール骨格等があげられ、これらの二価の構造が例示できる。ｌ＝２の場合、環Ａは、６員環であり、例えば、前記ピペリジン骨格である。環Ａは、環Ａ上のＣ−２以外の１個の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄で置換されてもよい。また、環Ａは、環Ａ内に、炭素−炭素二重結合または炭素−窒素二重結合を含んでもよい。環Ａは、例えば、Ｌ型およびＤ型のいずれでもよい。
【００８１】
前記式（ＩＩ）中、Ｒ３は、環Ａ上のＣ−３、Ｃ−４、Ｃ−５またはＣ−６に結合する水素原子または置換基である。Ｒ３が前記置換基の場合、置換基Ｒ３は、１でも複数でも、存在しなくてもよく、複数の場合、同一でも異なってもよい。
【００８２】
置換基Ｒ３は、例えば、ハロゲン、ＯＨ、ＯＲ４、ＮＨ２、ＮＨＲ４、ＮＲ４Ｒ５、ＳＨ、ＳＲ４またはオキソ基（＝Ｏ）等である。
【００８３】
Ｒ４およびＲ５は、例えば、それぞれ独立して、置換基または保護基であり、同一でも異なってもよい。前記置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリールアルキル、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。以下、同様である。置換基Ｒ３は、これらの列挙する置換基であってもよい。
【００８４】
前記保護基は、例えば、反応性の高い官能基を不活性に変換する官能基であり、公知の保護基等があげられる。前記保護基は、例えば、文献（J. F. W. McOmie, 「Protecting Groups in Organic Chemistry」 Prenum Press, London and New York, 1973）の記載を援用できる。前記保護基は、特に制限されず、例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、ビス（２−アセトキシエチルオキシ）メチル基（ＡＣＥ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル基（ＴＯＭ）、１−（２−シアノエトキシ）エチル基（ＣＥＥ）、２−シアノエトキシメチル基（ＣＥＭ）およびトリルスルフォニルエトキシメチル基（ＴＥＭ）、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）等があげられる。Ｒ３がＯＲ４の場合、前記保護基は、特に制限されず、例えば、ＴＢＤＭＳ基、ＡＣＥ基、ＴＯＭ基、ＣＥＥ基、ＣＥＭ基およびＴＥＭ基等があげられる。この他にも、シリル含有基もあげられる。以下、同様である。
【００８５】
前記式（ＩＩ）の構造は、例えば、下記式（ＩＩ−１）〜式（ＩＩ−９）が例示でき、下記式において、ｎＬおよびｍＬは、前記式（ＩＩ）と同じである。下記式において、ｑＬは、０〜１０の整数である。
【００８６】
【化１６】
2018182008.tif 000018
【００８７】
前記式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−９）において、ｎＬ、ｍＬおよびｑＬは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記式（ＩＩ−１）において、ｎＬ＝８、前記（ＩＩ−２）において、ｎＬ＝３、前記式（ＩＩ−３）において、ｎＬ＝４または８、前記（ＩＩ−４）において、ｎＬ＝７または８、前記式（ＩＩ−５）において、ｎＬ＝３およびｍＬ＝４、前記（ＩＩ−６）において、ｎＬ＝８およびｍＬ＝４、前記式（ＩＩ−７）において、ｎＬ＝８およびｍＬ＝４、前記（ＩＩ−８）において、ｎＬ＝５およびｍＬ＝４、ｎＬ＝７およびｍＬ＝６、ｎＬ＝９およびｍＬ＝８、またはｎＬ＝１１およびｍＬ＝１０、前記式（ＩＩ−９）において、ｑＬ＝１およびｍＬ＝４があげられる。前記式（ＩＩ−４）の一例（ｎＬ＝８）を、下記式（ＩＩ−４ａ）に、前記式（ＩＩ−８）の一例（ｎＬ＝５、ｍＬ＝４）を、下記式（ＩＩ−８ａ）に示す。中でも式（ＩＩ−８ａ）が好ましい。
【００８８】
【化１７】
2018182008.tif 000019
【００８９】
本発明において、「アルキル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキル基を含む。前記アルキルの炭素数は、特に制限されず、例えば、１〜３０であり、好ましくは、１〜６または１〜４である。前記アルキル基は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等があげられる。好ましくは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル等があげられる。
【００９０】
本発明において、「アルケニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルケニルを含む。前記アルケニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の二重結合を有するもの等があげられる。前記アルケニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルケニルは、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル、３−メチル−２−ブテニル等があげられる。
【００９１】
本発明において、「アルキニル」は、例えば、直鎖状または分枝状のアルキニルを含む。前記アルキニルは、前記アルキルにおいて、１個または複数の三重結合を有するもの等があげられる。前記アルキニルの炭素数は、特に制限されず、例えば、前記アルキルと同様であり、好ましくは２〜８である。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル等があげられる。前記アルキニルは、例えば、さらに、１個または複数の二重結合を有してもよい。
【００９２】
本発明において、「アリール」は、例えば、単環芳香族炭化水素基および多環芳香族炭化水素基を含む。前記単環芳香族炭化水素基は、例えば、フェニル等があげられる。前記多環芳香族炭化水素基は、例えば、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル、１−フェナントリル、２−フェナントリル、３−フェナントリル、４−フェナントリル、９−フェナントリル等があげられる。好ましくは、例えば、フェニル、１−ナフチルおよび２−ナフチル等のナフチル等があげられる。
【００９３】
本発明において、「ヘテロアリール」は、例えば、単環芳香族複素環式基および縮合芳香族複素環式基を含む。前記ヘテロアリールは、例えば、フリル（例：２−フリル、３−フリル）、チエニル（例：２−チエニル、３−チエニル）、ピロリル（例：１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル）、イミダゾリル（例：１−イミダゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル）、ピラゾリル（例：１−ピラゾリル、３−ピラゾリル、４−ピラゾリル）、トリアゾリル（例：１，２，４−トリアゾール−１−イル、１，２，４−トリアゾール−３−イル、１，２，４−トリアゾール−４−イル）、テトラゾリル（例：１−テトラゾリル、２−テトラゾリル、５−テトラゾリル）、オキサゾリル（例：２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、５−オキサゾリル）、イソキサゾリル（例：３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル）、チアゾリル（例：２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル）、チアジアゾリル、イソチアゾリル（例：３−イソチアゾリル、４−イソチアゾリル、５−イソチアゾリル）、ピリジル（例：２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル）、ピリダジニル（例：３−ピリダジニル、４−ピリダジニル）、ピリミジニル（例：２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル）、フラザニル（例：３−フラザニル）、ピラジニル（例：２−ピラジニル）、オキサジアゾリル（例：１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）、ベンゾフリル（例：２−ベンゾ［ｂ］フリル、３−ベンゾ［ｂ］フリル、４−ベンゾ［ｂ］フリル、５−ベンゾ［ｂ］フリル、６−ベンゾ［ｂ］フリル、７−ベンゾ［ｂ］フリル）、ベンゾチエニル（例：２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、４−ベンゾ［ｂ］チエニル、５−ベンゾ［ｂ］チエニル、６−ベンゾ［ｂ］チエニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル）、ベンゾイミダゾリル（例：１−ベンゾイミダゾリル、２−ベンゾイミダゾリル、４−ベンゾイミダゾリル、５−ベンゾイミダゾリル）、ジベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリニル（例：２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、６−キノキサリニル）、シンノリニル（例：３−シンノリニル、４−シンノリニル、５−シンノリニル、６−シンノリニル、７−シンノリニル、８−シンノリニル）、キナゾリニル（例：２−キナゾリニル、４−キナゾリニル、５−キナゾリニル、６−キナゾリニル、７−キナゾリニル、８−キナゾリニル）、キノリル（例：２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、６−キノリル、７−キノリル、８−キノリル）、フタラジニル（例：１−フタラジニル、５−フタラジニル、６−フタラジニル）、イソキノリル（例：１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、６−イソキノリル、７−イソキノリル、８−イソキノリル）、プリル、プテリジニル（例：２−プテリジニル、４−プテリジニル、６−プテリジニル、７−プテリジニル）、カルバゾリル、フェナントリジニル、アクリジニル（例：１−アクリジニル、２−アクリジニル、３−アクリジニル、４−アクリジニル、９−アクリジニル）、インドリル（例：１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、４−インドリル、５−インドリル、６−インドリル、７−インドリル）、イソインドリル、フェナジニル（例：１−フェナジニル、２−フェナジニル）またはフェノチアジニル（例：１−フェノチアジニル、２−フェノチアジニル、３−フェノチアジニル、４−フェノチアジニル）等があげられる。
【００９４】
本発明において、「シクロアルキル」は、例えば、環状飽和炭化水素基であり、炭素数は、例えば、３〜１５である。前記シクロアルキルは、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、橋かけ環式炭化水素基、スピロ炭化水素基等があげられ、好ましくは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、橋かけ環式炭化水素基等があげられる。
【００９５】
本発明において、「橋かけ環式炭化水素基」は、例えば、ビシクロ［２．１．０］ペンチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチルおよびビシクロ［３．２．１］オクチル、トリシクロ［２．２．１．０］ヘプチル、ビシクロ［３．３．１］ノナン、１−アダマンチル、２−アダマンチル等があげられる。
【００９６】
本発明において、「スピロ炭化水素基」は、例えば、スピロ［３．４］オクチル等があげられる。
【００９７】
本発明において、「シクロアルケニル」は、例えば、環状の不飽和脂肪族炭化水素基を含み、炭素数は、例えば、３〜７個である。前記基は、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル等があげられ、好ましくは、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等である。前記シクロアルケニルは、例えば、環中に不飽和結合を有する橋かけ環式炭化水素基およびスピロ炭化水素基も含む。
【００９８】
本発明において、「アリールアルキル」は、例えば、ベンジル、２−フェネチル、およびナフタレニルメチル等があげられ、「シクロアルキルアルキル」または「シクリルアルキル」は、例えば、シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル等があげられ、「ヒドロキシアルキル」は、例えば、ヒドロキシメチルおよび２−ヒドロキシエチル等があげられる。
【００９９】
本発明において、「アルコキシ」は、例えば、前記アルキル−Ｏ−基を含み、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、およびｎ−ブトキシ等があげられ、「アルコキシアルキル」は、例えば、メトキシメチル等があげられ、「アミノアルキル」は、例えば、２−アミノエチル等があげられる。
【０１００】
本発明において、「ヘテロシクリル」は、例えば、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、ピロリジノン、１−イミダゾリニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、１−イミダゾリジニル、２−イミダゾリジニル、４−イミダゾリジニル、イミダゾリジノン、１−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、４−ピラゾリニル、１−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノン、ピペリジノ、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−ピペリジニル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、ピペラジノン、２−モルホリニル、３−モルホリニル、モルホリノ、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル等があげられる。
【０１０１】
本発明において、「ヘテロシクリルアルキル」は、例えば、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル等があげられ、「ヘテロシクリルアルケニル」は、例えば、２−ピペリジニルエテニル等があげられ、「ヘテロアリールアルキル」は、例えば、ピリジルメチルおよびキノリン−３−イルメチル等があげられる。
【０１０２】
本発明において、「シリル」は、式Ｒ３Ｓｉ−で表される基を含み、Ｒは、独立して、前記アルキル、アリールおよびシクロアルキルから選択でき、例えば、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等があげられ、「シリルオキシ」は、例えば、トリメチルシリルオキシ基等があげられ、「シリルオキシアルキル」は、例えば、トリメチルシリルオキシメチル等があげられる。
【０１０３】
本発明において、「アルキレン」は、例えば、メチレン、エチレン、およびプロピレン等があげられる。
【０１０４】
本発明において、前述した各種基は、置換されてもよい。前記置換基は、例えば、ヒドロキシ、カルボキシ、スルホ、ハロゲン、ハロゲン化アルキル（ハロアルキル、例：ＣＦ３、ＣＨ２ＣＦ３、ＣＨ２ＣＣｌ３）、ニトロ、ニトロソ、シアノ、アルキル（例：メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル）、アルケニル（例：ビニル）、アルキニル（例：エチニル）、シクロアルキル（例：シクロプロピル、アダマンチル）、シクロアルキルアルキル（例：シクロヘキシルメチル、アダマンチルメチル）、シクロアルケニル（例：シクロプロペニル）、シクリルアルキル、ヒドロキシアルキル（例：ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル）、アルコキシアルキル（例：メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル）、アリール（例：フェニル、ナフチル）、アリールアルキル（例：ベンジル、フェネチル）、アルキルアリール（例：ｐ−メチルフェニル）、ヘテロアリール（例：ピリジル、フリル）、ヘテロアリールアルキル（例：ピリジルメチル）、ヘテロシクリル（例：ピペリジル）、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキル（例：モルホリルメチル）、アルコキシ（例：メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ）、ハロゲン化アルコキシ（例：ＯＣＦ３）、アルケニルオキシ（例：ビニルオキシ、アリルオキシ）、アリールオキシ（例：フェニルオキシ）、アルキルオキシカルボニル（例：メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）、アリールアルキルオキシ（例：ベンジルオキシ）、アミノ［アルキルアミノ（例：メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ）、アシルアミノ（例：アセチルアミノ、ベンゾイルアミノ）、アリールアルキルアミノ（例：ベンジルアミノ、トリチルアミノ）、ヒドロキシアミノ］、アミノアルキル（例：アミノメチル）、アルキルアミノアルキル（例：ジエチルアミノメチル）、カルバモイル、スルファモイル、オキソ、シリル、シリルオキシアルキル等があげられる。
【０１０５】
あるいは、本発明の環状型核酸分子において、前記リンカー領域（Ｌ）は、下記式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）のいずれかで表わされる。各式中、ｎＬおよびｍＬは、前記化学式（Ｉ）と同じである。
【０１０６】
【化１８】
2018182008.tif 000020
【０１０７】
前記化学式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）において、ｎＬおよびｍＬは、特に制限されず、前述の通りである。具体例として、前記化学式（ＩＩＩ−１）において、ｎＬ＝５およびｍＬ＝４と、前記化学式（ＩＩＩ−２）においてｎＬ＝５およびｍＬ＝４と、前記化学式（ＩＩＩ−３）において、ｎＬ＝５およびｍＬ＝４とがあげられる。それらの構造を、下記化学式（ＩＩＩ−１ａ）、（ＩＩＩ−２ａ）および（ＩＩＩ−３ａ）に示す。好ましくは、式（ＩＩＩ−１ａ）、（ＩＩＩ−２ａ）および（ＩＩＩ−３ａ）である。
【０１０８】
【化１９】
2018182008.tif 000021
【０１０９】
本発明の環状型核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
【０１１０】
本発明の環状型核酸分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の環状型核酸分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明の環状型核酸分子が、例えば、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する遺伝子のガイド鎖配列を有する場合、例えば、前記標的遺伝子の発現抑制により、前記疾患を治療できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等のがん、肺線維症、肝線維症等の疾患があげられる。
【０１１１】
本発明の環状型核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記環状型核酸分子を投与すればよい。
【０１１２】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１１３】
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前述のように、前記標的遺伝子の種類に応じて、前記環状型核酸分子を選択すればよい。
【０１１４】
本発明の環状型核酸分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
【０１１５】
本発明の環状型核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
【０１１６】
本発明の環状型核酸分子の合成方法は、例えば、従来タンパク質化学で公知の製造方法を利用することができる。前記合成に必要となる直鎖の一本鎖核酸分子の製造方法は、例えば、遺伝子工学的手法を利用した合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
かくして得られた一本鎖核酸分子は、例えば、ジスルフィド結合を有する化合物を用いて環化反応に付し５’末端と３’末端とを連結させて環状の核酸分子を得ることができる。該環化反応としては、当分野で通常実施される各種反応を利用することができ、例えば、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)（ＤＳＰ）やジチオビス(スクシンイミジルオクタノエート)（ＤＳＯ）等のホモ二官能性の架橋剤を用いる方法があげられる。
具体的には、固相合成方法で得られた一本鎖核酸分子（５’、３’−末端いずれもアミノ基を含む）を、例えば、リン酸緩衝液に溶かし、ホモ二官能性の架橋剤（約１０当量）を加え、２５℃にて数時間反応させる。出発原料の一本鎖核酸分子は、ほぼ消失し、反応混合物は、逆相クロマトにより精製し、目的化合物を高収率で得ることができる。
【０１１７】
（２）組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の環状型核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の環状型核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
【０１１８】
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
【０１１９】
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の環状型核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の環状型核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
【０１２０】
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
【０１２１】
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定し、さらに、前記標的遺伝子に応じて、前記環状型核酸分子のガイド鎖配列を選択すればよい。
【０１２２】
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記環状型核酸分子を投与すればよい。
【０１２３】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
【０１２４】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【０１２５】
本発明の組成物は、例えば、本発明の環状型核酸分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１２６】
本発明の組成物において、前記環状型核酸分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記環状型核酸分子を効率よくデリバリーすることができる。
【０１２７】
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
【０１２８】
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
【０１２９】
（３）発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の環状型核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の環状型核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１３０】
本発明の発現抑制方法において、前記標的遺伝子の発現抑制のメカニズムは、特に制限されず、例えば、環状型核酸分子による発現抑制があげられる。
【０１３１】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記環状型核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記環状型核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでもｉｎ  ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１３２】
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記環状型核酸分子を単独で投与してもよいし、前記環状型核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
【０１３３】
（４）治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の環状型核酸分子を、患者に投与する工程を含み、前記環状型核酸分子における前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する環状型核酸分子のガイド鎖配列であることを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の環状型核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【０１３４】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
【０１３５】
（５）環状型核酸分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の環状型核酸分子の使用である。
【０１３６】
本発明の環状型核酸分子は、疾患の治療に使用するための環状型の核酸分子であって、前記環状型核酸分子における前記ガイド鎖配列が、前記疾患に関与する遺伝子の発現を抑制する環状型核酸分子のガイド鎖配列であることを特徴とする。
【０１３７】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１３８】
製造例：環状型核酸分子の合成
一本鎖核酸分子の合成
以下に示す一本鎖核酸分子を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標登録）８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムスおよび商品名ＡＢＩ  ３９００  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、アプライドバイオシステムス）により合成した。３’側よりＲＮＡアミダイトとして、ＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた固相合成を行った。また、リンカー領域にはＬ−プロリンアミダイト（日本国特許４９６５７４５）、グリシンアミダイト（日本国特許５８７６８９０）、Ｌ−リジンアミダイト（日本国特許５８７６８９０）を用いた。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。
本発明の一本鎖核酸分子の３’末端には、下記Ｐｈｔｈａｌａｍｉｄｏ  Ｃ−６  Ｌｉｎｋｅｒ  ｌｃａａ  ＣＰＧ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用いた。【０１３９】
【化２０】
2018182008.tif 000022
【０１４０】
本発明の一本鎖核酸分子の５’末端には、下記Ｔｆａ−ＮＨ−Ｃ６アミダイトを用いた。Ｔｆａ−ＮＨ−Ｃ６アミダイトは、６−アミノ−１−ヘキサノール（１ｇ）とトリフルオロ酢酸エチル（１．６ｇ）をエタノール中で反応させ、溶媒留去して乾燥させた後、常法でホスホロアミダイト化させることにより合成した（２．６ｇ）。Ｔｆａ−ＮＨ−Ｃ６アミダイトは商業的に入手したものを用いてもよい。【０１４１】
【化２１】
2018182008.tif 000023
【０１４２】
本発明の一本鎖核酸分子のリンカー領域（Ｌ）には、下記構造のＬ−プロリンリンカー（以下、Ｐ又はＰＡとする）、グリシンリンカー（以下、Ｇｌｙとする）、Ｌ−リジンリンカー（以下、Ｋ又はＫＡとする）を用いた。【０１４３】
【化２２】
2018182008.tif 000024
【０１４４】
得られた一本鎖核酸分子は、ＨＰＬＣにより精製後、次工程である環状化反応に使用した。ＰＡ−００２８〜ＰＡ−００３３については未精製のまま、次工程に使用した。表１に調製した一本鎖核酸分子の名称および塩基配列を示す。配列中、大文字はＲＮＡ、小文字はＤＮＡ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を表す。また、下線太字は２’−Ｏ−メチルリボース（ＳａｍｃｈｕｌｌｙＰｈａｒｍ）を含むヌクレオチドを表す。【０１４５】
【表１−１】
2018182008.tif 000025
【０１４６】
【表１−２】
2018182008.tif 000026
【０１４７】
参考例として用いた、二本鎖核酸分子であるｓｉＲＮＡ及び一本鎖核酸分子の名称および塩基配列を表２に示す。
各核酸分子は、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ＡＢＩ  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（登録商標）  ８９０９  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、アプライドバイオシステムス）により合成した。前記合成には、ＲＮＡアミダイトとして、ＲＮＡ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）およびＥＭＭアミダイト（国際公開第２０１３／０２７８４３号）を用いた。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成したＲＮＡは、ＨＰＬＣにより精製した。【０１４８】
【表２】
2018182008.tif 000027
【０１４９】
実施例１：ＰＡ−０００１−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００１−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００１−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００１の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（以下、ＤＳＰ−ＯＮＳｕとする、同仁堂）を結合させた環状型核酸分子である。【０１５０】
【化２３】
2018182008.tif 000028
【０１５１】
ＰＡ−０００１−ＤＳＰの合成
１１４μｍｏｌ／ＬのＰＡ−０００１  ３５０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ６５μＬ、エタノール  ２５０μＬ、１％トリエチルアミン水溶液  ３５μＬを混合し、４０℃にて６時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５、５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：４０℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。純度９８．６９％のＰＡ−０００１−ＤＳＰを得た。質量分析：１６２２４．００（計算値：１６２２４．０８）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１に示す。【０１５２】
実施例２：ＰＡ−０００１−ＤＳＯの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００１−ＤＳＯの構造を示す。
ＰＡ−０００１−ＤＳＯは、前記ＰＡ−０００１の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｏｃｔａｎｏａｔｅ）（以下、ＤＳＯ−ＯＮＳｕとする、同仁堂）を結合させた環状型核酸分子である。【０１５３】
【化２４】
2018182008.tif 000029
【０１５４】
ＰＡ−０００１−ＤＳＯの合成
１６０μｍｏｌ／ＬのＰＡ−０００１  ２５０μＬ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＤＳＯ−ＯＮＳｕ／ＤＭＳＯ溶液  １６０μＬ、イソプロパノール  ２５５μＬ、１％トリエチルアミン水溶液  ３５μＬを混合し、４０℃にて４時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５、５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：４０℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：ＣＨ３ＣＮ）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。純度９７．３９％のＰＡ−０００１−ＤＳＯを得た。質量分析：１６３６４．２０（計算値：１６３６４．３５）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２に示す。【０１５５】
実施例３：ＰＡ−０００２−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００２−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００２−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００２の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１５６】
【化２５】
2018182008.tif 000030
【０１５７】
ＰＡ−０００２−ＤＳＰの合成
１２０μｍｏｌ／ＬのＰＡ−０００２  ３５０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ６５μＬ、イソプロパノール  ２５０μＬ、１％トリエチルアミン水溶液  ３５μＬを混合し、４０℃にて４時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５、５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．７ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：４０℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水（大塚製薬）に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度８９．３２％のＰＡ−０００２−ＤＳＰを０．２５ｍｇ得た。質量分析：１６８８１．９０（計算値：１６８８２．５０）。精製後のＨＰＬＣチャートを図３に示す。【０１５８】
実施例４：ＰＡ−０００３−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００３−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００３−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００３の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１５９】
【化２６】
2018182008.tif 000031
【０１６０】
ＰＡ−０００３−ＤＳＰの合成
２８６μｍｏｌ／ＬのＰＡ−０００３  １１０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ５０μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ４０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を混合し、３５℃にて３５分間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥヘルスケア）した。分取したフラクションのＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度７０．９９％のＰＡ−０００３−ＤＳＰを０．１６ｍｇ得た。質量分析：１６８７６．５０（計算値：１６８７６．５８）。精製後のＨＰＬＣチャートを図４に示す。【０１６１】
実施例５：ＰＡ−０００４−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００４−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００４−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００４の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１６２】
【化２７】
2018182008.tif 000032
【０１６３】
ＰＡ−０００４−ＤＳＰの合成
２３４μｍｏｌ／ＬのＰＡ−０００４  １１６μＬ、１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ４４μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ４０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を混合し、３５℃にて３５分間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥヘルスケア）した。分取したフラクションのＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度６７．１３％のＰＡ−０００４−ＤＳＰを０．１８ｍｇ得た。質量分析：１６７８０．１９（計算値：１６７８０．５９）。精製後のＨＰＬＣチャートを図５に示す。【０１６４】
実施例６：ＰＡ−０００５−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００５−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００５−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００５の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１６５】
【化２８】
2018182008.tif 000033
【０１６６】
ＰＡ−０００５−ＤＳＰの合成
５７２μｍｏｌ／ＬのＰＡ−０００５  ７０μＬ（４０ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  １３７．３μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ６０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ），１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ３２．７μＬを混合し、３５℃にて３５分間撹拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（以下、ＤＴＴとする）溶液  ３０μＬを加え、２５℃にて４５分間撹拌した。エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度７４．０４％のＰＡ−０００５−ＤＳＰを０．３３ｍｇ得た。質量分析：１６７９７．１０（計算値：１６７９８．５６）。精製後のＨＰＬＣチャートを図６に示す。【０１６７】
実施例７：ＰＡ−０００６−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００６−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００６−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００６の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１６８】
【化２９】
2018182008.tif 000034
【０１６９】
ＰＡ−０００６  ４０ｎｍｏｌについてＰＡ−０００５と同様に反応を行った。エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度７７．５９％のＰＡ−０００６−ＤＳＰを０．３６ｍｇ得た。質量分析：１６８１５．７０（計算値：１６８１６．５３）。精製後のＨＰＬＣチャートを図７に示す。【０１７０】
実施例８：ＰＡ−０００７−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００７−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００７−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００７の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１７１】
【化３０】
2018182008.tif 000035
【０１７２】
ＰＡ−０００７  ４０ｎｍｏｌについてＰＡ−０００５と同様に反応を行った。エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度７５．３２％のＰＡ−０００７−ＤＳＰを０．３５ｍｇ得た。質量分析：１６７６３．８０（計算値：１６７６４．５９）。精製後のＨＰＬＣチャートを図８に示す。【０１７３】
実施例９：ＰＡ−０００８−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００８−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００８−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００８の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１７４】
【化３１】
2018182008.tif 000036
【０１７５】
ＰＡ−０００８−ＤＳＰの合成
２１８μｍｏｌ／ＬのＰＡ−０００８  １３７．６μＬ（３０ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  １６．３μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ４０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ），１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ６．０７μＬを混合し、３５℃にて４時間撹拌した。反応液に１０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ溶液  １０μＬを加え、２５℃にて３時間撹拌した。
エタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させ、ゲルろ過にて精製（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥヘルスケア）した。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度７５．２８％のＰＡ−０００８−ＤＳＰを０．０４ｍｇ得た。質量分析：１７００８．４０（計算値：１７００９．５５）。精製後のＨＰＬＣチャートを図９に示す。【０１７６】
実施例１０：ＰＡ−０００９−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−０００９−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−０００９−ＤＳＰは、前記ＰＡ−０００９の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１７７】
【化３２】
2018182008.tif 000037
【０１７８】
ＰＡ−０００９  ３０ｎｍｏｌについてＰＡ−０００８と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度７０．１７％のＰＡ−０００９−ＤＳＰを０．０４ｍｇ得た。質量分析：１６９６６．４０（計算値：１６９６７．２０）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１０に示す。【０１７９】
実施例１１：ＰＡ−００１０−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１０−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１０−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１０の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１８０】
【化３３】
2018182008.tif 000038
【０１８１】
ＰＡ−００１０  ３０ｎｍｏｌについてＰＡ−０００８と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度６６．６１％のＰＡ−００１０−ＤＳＰを０．０４ｍｇ得た。質量分析：１６９２４．１０（計算値：１６９２４．８５）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１１に示す。【０１８２】
実施例１２：ＰＡ−００１１−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１１−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１１−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１１の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１８３】
【化３４】
2018182008.tif 000039
【０１８４】
ＰＡ−００１１  ３０ｎｍｏｌについてＰＡ−０００８と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度６６．４３％のＰＡ−００１１−ＤＳＰを０．０７ｍｇ得た。質量分析：１６８８２．３０（計算値：１６８８２．５０）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１２に示す。【０１８５】
実施例１３：ＰＡ−００１２−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１２−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１２−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１２の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１８６】
【化３５】
2018182008.tif 000040
【０１８７】
ＰＡ−００１２  ３０ｎｍｏｌについてＰＡ−０００８と同様に反応、エタノール沈殿、ゲルろ過にて精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度５１．９９％のＰＡ−００１２−ＤＳＰを０．０４ｍｇ得た。質量分析：１６７３８．００（計算値：１６７３８．５０）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１３に示す。【０１８８】
実施例１４：ＰＡ−００１３−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１３−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１３−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１３の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１８９】
【化３６】
2018182008.tif 000041
【０１９０】
３９４μｍｏｌ／ＬのＰＡ−００１３  ２５．４μＬ（１０ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  ５０．５μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ２０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ），１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ４．１μＬを混合し、２５℃にて５時間撹拌した。反応液をゲルろ過にて精製（ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｇ−２５  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＧＥヘルスケア）した。遠心濃縮機にて濃縮後、注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度８２．５７％のＰＡ−００１３−ＤＳＰを０．１４ｍｇ得た。質量分析：１６９８１．２０（計算値：１６９８１．３１）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１４に示す。【０１９１】
実施例１５：ＰＡ−００１４−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１４−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１４−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１４の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１９２】
【化３７】
2018182008.tif 000042
【０１９３】
ＰＡ−００１４  １０ｎｍｏｌについてＰＡ−００１３と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度８０．１４％のＰＡ−００１４−ＤＳＰを０．１２ｍｇ得た。質量分析：１７０２３．３０（計算値：１７０２３．６７）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１５に示す。【０１９４】
実施例１６：ＰＡ−００１５−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１５−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１５−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１５の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１９５】
【化３８】
2018182008.tif 000043
【０１９６】
ＰＡ−００１５  １０ｎｍｏｌについてＰＡ−００１３と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度７６．２１％のＰＡ−００１５−ＤＳＰを０．０９ｍｇ得た。質量分析：１８１３８．８０（計算値：１８１３８．２３）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１６に示す。【０１９７】
実施例１７：ＰＡ−００１６−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１６−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１６−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１６の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０１９８】
【化３９】
2018182008.tif 000044
【０１９９】
ＰＡ−００１６  １０ｎｍｏｌについてＰＡ−００１３と同様に反応を行った。反応液をＨＰＬＣにて精製（カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：６０℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションを遠心濃縮機にて濃縮後、注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度６２．４８％のＰＡ−００１６−ＤＳＰを０．０５ｍｇ得た。質量分析：１８０３７．４０（計算値：１８０３６．３２）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１７に示す。【０２００】
実施例１８：ＰＡ−００１７−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１７−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１７−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１７の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２０１】
【化４０】
2018182008.tif 000045
【０２０２】
４６９μｍｏｌ／ＬのＰＡ−００１７  ４２．６μＬ（２０ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  ２９．３μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ２０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ），１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ８．１μＬを混合し、２５℃にて３．５時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５、５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：４０℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９０．７６％のＰＡ−００１７−ＤＳＰを０．１３ｍｇ得た。質量分析：１６８００．５０（計算値：１６８００．５３）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１８に示す。【０２０３】
実施例１９：ＰＡ−００１８−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１８−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１８−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１８の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２０４】
【化４１】
2018182008.tif 000046
【０２０５】
ＰＡ−００１８  ２０ｎｍｏｌについてＰＡ−００１７と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９２．８７％のＰＡ−００１８−ＤＳＰを０．１３ｍｇ得た。質量分析：１６７７６．００（計算値：１６７７６．６４）。精製後のＨＰＬＣチャートを図１９に示す。【０２０６】
実施例２０：ＰＡ−００１９−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００１９−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００１９−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００１９の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２０７】
【化４２】
2018182008.tif 000047
【０２０８】
ＰＡ−００１９  ２０ｎｍｏｌについてＰＡ−００１７と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９６．３７％のＰＡ−００１９−ＤＳＰを０．１５ｍｇ得た。質量分析：１６７７９．９０（計算値：１６７８０．５９）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２０に示す。【０２０９】
実施例２１：ＰＡ−００２０−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２０−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２０−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２０の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２１０】
【化４３】
2018182008.tif 000048
【０２１１】
ＰＡ−００２０−ＤＳＰの合成
ＰＡ−００２０  ２０ｎｍｏｌについてＰＡ−００１７と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９８．１３％のＰＡ−００２０−ＤＳＰを０．１３ｍｇ得た。質量分析：１６７３１．７０（計算値：１６７３２．５９）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２１に示す。【０２１２】
実施例２２：ＰＡ−００２１−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２１−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２１−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２１の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２１３】
【化４４】
2018182008.tif 000049
【０２１４】
ＰＡ−００２１  ２０ｎｍｏｌについてＰＡ−００１７と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９１．１６％のＰＡ−００２１−ＤＳＰを０．１４ｍｇ得た。質量分析：１６７６３．８０（計算値：１６７６４．５９）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２２に示す。【０２１５】
実施例２３：ＰＡ−００２４−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２４−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２４−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２４の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２１６】
【化４５】
2018182008.tif 000050
【０２１７】
３３７μｍｏｌ／ＬのＰＡ−００２４  １４９μＬ（５０ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  ３１μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ５０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ２０μＬを混合し、２５℃にて１．５時間撹拌した。反応液を陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製（カラム：ＤＮＡＰａｃＰＡ２００、９×２５０ｍｍ；流速：２．５ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ＣＨ３ＣＮ、７００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌＯ４）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９６．８９％のＰＡ−００２４−ＤＳＰを０．３５ｍｇ得た。質量分析：１６８９７．２０（計算値：１６８９６．６１）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２３に示す。【０２１８】
実施例２４：ＰＡ−００２５−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２５−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２５−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２５の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２１９】
【化４６】
2018182008.tif 000051
【０２２０】
ＰＡ−００２５  ５０ｎｍｏｌについてＰＡ−００２４と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９３．３３％のＰＡ−００２５−ＤＳＰを０．３９ｍｇ得た。質量分析：１６７４５．２０（計算値：１６７４４．６４）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２４に示す。【０２２１】
実施例２５：ＰＡ−００２６−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２６−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２６−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２６の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２２２】
【化４７】
2018182008.tif 000052
【０２２３】
ＰＡ−００２６  ５０ｎｍｏｌについて、反応時間を３０分間としてＰＡ−００２４と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９５．８６％のＰＡ−００２６−ＤＳＰを０．３３ｍｇ得た。質量分析：１６９１１．２０（計算値：１６９１０．７３）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２５に示す。【０２２４】
実施例２６：ＰＡ−００２７−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２７−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２７−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２７の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２２５】
【化４８】
2018182008.tif 000053
【０２２６】
ＰＡ−００２７  ５０ｎｍｏｌについて、反応時間を４０分間としてＰＡ−００２４と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９２．８３％のＰＡ−００２７−ＤＳＰを０．３９ｍｇ得た。質量分析：１６７６１．１０（計算値：１６７６０．６４）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２６に示す。【０２２７】
実施例２７：ＰＡ−００２８−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２８−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２８−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２８の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２２８】
【化４９】
2018182008.tif 000054
【０２２９】
未精製物として３４３μｍｏｌ／ＬのＰＡ−００２８  ５８３μＬ（未精製物として２００ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  １３６μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ２００μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ８１μＬを混合し、２５℃にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製（カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：６０℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）した。分取したフラクションをさらに陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製（カラム：ＤＮＡＰａｃＰＡ２００、９×２５０ｍｍ；流速：２．５ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ＣＨ３ＣＮ、７００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌＯ４）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度８６．０４％のＰＡ−００２８−ＤＳＰを０．２２ｍｇ得た。質量分析：１６９０７．４０（計算値：１６９０７．６４）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２７に示す。【０２３０】
実施例２８：ＰＡ−００２９−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００２９−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００２９−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００２９の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２３１】
【化５０】
2018182008.tif 000055
【０２３２】
ＰＡ−００２９  ２００ｎｍｏｌ（未精製物として）についてＰＡ−００２８と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度８６．８８％のＰＡ−００２９−ＤＳＰを０．１０ｍｇ得た。質量分析：１６９２２．１０（計算値：１６９２１．７６）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２８に示す。【０２３３】
実施例２９：ＰＡ−００３０−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００３０−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００３０−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００３０の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２３４】
【化５１】
2018182008.tif 000056
【０２３５】
ＰＡ−００３０  ２００ｎｍｏｌ（未精製物として）についてＰＡ−００２８と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度８８．７７％のＰＡ−００３０−ＤＳＰを０．１１ｍｇ得た。質量分析：１６９２９．１０（計算値：１６９２９．２８）。精製後のＨＰＬＣチャートを図２９に示す。【０２３６】
実施例３０：ＧＡ−０００１−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＧＡ−０００１−ＤＳＰの構造を示す。
ＧＡ−０００１−ＤＳＰは、前記ＧＡ−０００１の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２３７】
【化５２】
2018182008.tif 000057
【０２３８】
ＧＡ−０００１  ５０ｎｍｏｌについて、反応時間を１時間としてＰＡ−００２４と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９０．８９％のＧＡ−０００１−ＤＳＰを０．４２ｍｇ得た。質量分析：１６８４３．４０（計算値：１６８４２．４３）。精製後のＨＰＬＣチャートを図３０に示す。【０２３９】
実施例３１：ＫＡ−０００１−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＫＡ−０００１−ＤＳＰの構造を示す。
ＫＡ−０００１−ＤＳＰは、前記ＫＡ−０００１の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２４０】
【化５３】
2018182008.tif 000058
【０２４１】
６０８μｍｏｌ／ＬのＫＡ−０００１  １３２μＬ（８０ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  １３９μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  ８０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、１ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ４９μＬを混合し、２５℃にて１時間撹拌した。反応液をＨＰＬＣにて精製（カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ８−ＵＧ−５、５μｍ、１０×５０ｍｍ；流速：４．０ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；カラムオーブン：４０℃；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）、５０％ＣＨ３ＣＮ）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度９４．９０％のＫＡ−０００１−ＤＳＰを０．２４ｍｇ得た。質量分析：１６９１４．００（計算値：１６９１３．５５）。精製後のＨＰＬＣチャートを図３１に示す。【０２４２】
実施例３２：ＰＡ−００３１−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００３１−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００３１−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００３１の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２４３】
【化５４】
2018182008.tif 000059
【０２４４】
未精製物として８１２μｍｏｌ／ＬのＰＡ−００３１  ３６９μＬ（未精製物として３００ｎｍｏｌ）、注射用蒸留水  ５０μＬ、ｐＨ８．５のリン酸緩衝液  １２０μＬ（最終濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌ）、１０ｍｇ／ｍＬのＤＳＰ−ＯＮＳｕ／ＤＭＦ溶液  ６１μＬを混合し、２５℃にて１時間撹拌した。反応液をエタノール沈殿し、陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製（カラム：ＤＮＡＰａｃＰＡ１００、９×２５０ｍｍ；流速：２．５ｍＬ／ｍｉｎ；検出：ＵＶ２６０ｎｍ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ＣＨ３ＣＮ；Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ：２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％ＣＨ３ＣＮ、７００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌＯ４）し、目的物のピークを分取した。分取したフラクションのエタノール沈殿を行い、生じた沈殿を注射用蒸留水に溶解させた。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度６０．０６％のＰＡ−００３１−ＤＳＰを０．４１ｍｇ得た。質量分析：１８００８．８０（計算値：１８００８．２７）。精製後のＨＰＬＣチャートを図３２に示す。【０２４５】
実施例３３：ＰＡ−００３２−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００３２−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００３２−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００３２の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２４６】
【化５５】
2018182008.tif 000060
【０２４７】
ＰＡ−００３２  ３００ｎｍｏｌ（未精製物として）についてＰＡ−００３１と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度６９．７４％のＰＡ−００３２−ＤＳＰを０．４３ｍｇ得た。質量分析：１８１５３．８０（計算値：１８１５３．２４）。精製後のＨＰＬＣチャートを図３３に示す。【０２４８】
実施例３４：ＰＡ−００３３−ＤＳＰの合成
以下に本発明の環状型核酸分子であるＰＡ−００３３−ＤＳＰの構造を示す。
ＰＡ−００３３−ＤＳＰは、前記ＰＡ−００３３の５’末端および３’末端のアミノ基に、後述する方法にてジスルフィド結合を含有するＤＳＰ−ＯＮＳｕを結合させた環状型核酸分子である。【０２４９】
【化５６】
2018182008.tif 000061
【０２５０】
ＰＡ−００３３  ３００ｎｍｏｌ（未精製物として）についてＰＡ−００３１と同様に反応、精製を行った。ＵＶ２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、収量を算出した。純度５７．２７％のＰＡ−００３３−ＤＳＰを０．４８ｍｇ得た。質量分析：１８０３７．８０（計算値：１８０３７．３１）。精製後のＨＰＬＣチャートを図３４に示す。【０２５１】
試験例１（血清中安定性評価実験法）
前記各核酸分子を注射用蒸留水（大塚製薬）で希釈し、ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＵＭ  ＳＴＥＲＩＬＥ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を添加して任意の時間反応させた。具体的には、１．５ｍＬマイクロチューブを用いた反応液中で前記核酸分子の最終濃度は２．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨＵＭＡＮ  ＳＥＲＵＭ  ＳＴＥＲＩＬＥの最終濃度を５０％とした。
反応後の溶液をＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）で処理し、タンパク質除去を行った。水層を回収し、エタノール沈澱を行って血清処理済み核酸分子を回収した。前記血清処理済み核酸分子を注射用蒸留水に溶解し、レーンあたり５ｐｍｏｌを１５％ポリアクリルアミドゲル（バイオクラフト）にて電気泳動した。
参考例１では処理前のバンドが２分以内に消失した。これを基準にＴＧＦ−β１発現抑制配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図３５〜図４１に示す。参考例２では処理前のバンドが３０分以内に消失した。これを基準にＧＡＰＤＨ発現抑制配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図４２に示す。参考例３では処理前のバンドが２分以内に消失した。これを基準にmiR-29bガイド鎖配列を搭載した各核酸分子の血清中安定性を評価した。結果を図４３に示す。各図に示すように、本発明の核酸分子は血清中の安定性が高いことがわかった。【０２５２】
試験例２（遺伝子発現抑制活性測定法）
細胞は、Ａ５４９細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
まず、細胞を培地中で培養し、その細胞懸濁液を２４穴プレートに４００μＬずつ、４×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞に、前記核酸分子をトランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付のプロトコールに従って、トランスフェクションした。具体的には、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定しトランスフェクションを行った。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、核酸分子溶液であり、両者をあわせて９８．５μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記核酸分子の終濃度は１ｎｍｏｌ／Ｌ、あるいは１、１０ｎｍｏｌ／Ｌとした。【０２５３】
【表３】
2018182008.tif 000062
【０２５４】
トランスフェクション後２４時間培養した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。次に、逆転写酵素（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、以下に示すように、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ＴＧＦ−β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量および内部標準であるβ−アクチン遺伝子の発現量を測定した。前記ＴＧＦ−β１遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子およびＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現量は、β−アクチン遺伝子の発現量により補正した。【０２５５】
前記ＰＣＲは、試薬としてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）、機器としてＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  II（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。ＴＧＦ−β１遺伝子、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、β−アクチン遺伝子、およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅には、それぞれ、以下のプライマーセットを使用した。
ＴＧＦ−β１遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
5’-ttgtgcggcagtggttgagccg-3’ （配列番号４５）
5’-gaagcaggaaaggccggttcatgc-3’ （配列番号４６）
ＣＯＬ１Ａ１遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
5’- cccaaggacaagaggcatgt-3’ （配列番号４７）
5’- ccgccatactcgaactggaa-3’ （配列番号４８）
β−アクチン遺伝子用プライマーセット
5’-gccacggctgcttccagctcctc-3’ （配列番号４９）
5’-aggtctttgcggatgtccacgtcac-3’ （配列番号５０）
ＧＡＰＤＨ遺伝子用ＰＣＲプライマーセット
5’- atggggaaggtgaaggtcg-3’ （配列番号５１）
5’- gggtcattgatggcaacaatatc-3’ （配列番号５２） 【０２５６】
また、コントロールとして、トランスフェクションにおいて、前記ＲＮＡ溶液を未添加とし、前記トランスフェクション試薬１．５μＬと前記（Ｂ）とを合計１００μＬ添加した以外は、同様にして処理した細胞についても、遺伝子発現量を測定した（ｍｏｃｋ）。【０２５７】
補正後のＴＧＦ−β１遺伝子、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量について、コントロール（ｍｏｃｋ）の細胞における発現量を１として、各核酸分子を導入した細胞での発現量の相対値を求めた。【０２５８】
これらの結果を図４４（ＴＧＦ−β１遺伝子）、４５（ＣＯＬ１Ａ１遺伝子）及び４６（ＧＡＰＤＨ遺伝子）に示す。縦軸は相対遺伝子発現量である。各図に示すように、本発明の核酸分子は強い遺伝子発現抑制活性を示すことがわかった。【０２５９】
試験例３（マウス生体（血中）における安定性）
（実験方法）
各被験物質に生理食塩水を添加後、ボルテックスミキサーで攪拌して復水し、１ｍｇ／ｍＬ核酸溶液を調製した。復水後、0.2 μmフィルターを用いて濾過し、投与液とした。雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊｃｌ、８週齢、日本クレア製）の尾静脈内に５ｍｇ核酸／５ｍＬ／ｋｇの投与量で投与した。投与後０時間後に採血する群、０．５時間後に採血する群、１時間後に採血する群、３時間後に採血する群、６時間後に採血する群に分け、１群当たり３匹のマウスを用いた。投与後０、０．５、１、３、６時間後にマウスをイソフルラン吸入麻酔下で心臓よりＥＤＴＡ処理した注射筒を用いて血液を採取して脱血死させた。血液１容量に対してＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）３容量を添加してボルテックスミキサーで攪拌した後、試薬説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡ溶液にＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｐ１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を添加し、６０℃で２時間加温した。その後、１０×Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒを規定量加えて攪拌後、Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加して５６℃で２時間加温した。放冷後、生成したＤｉｍｅｒの量を高速液体クロマトグラフ−質量分析計で定量した
結果を図４７に示す。ＰＨ−０００９は０．５時間で全く検出できなかったが，本発明のＰＡ−０００４−ＤＳＰ及びＰＡ−０００７−ＤＳＰは０．５時間で検出された。すなわち，既知の一本鎖核酸分子に比べ，本発明の核酸分子は血液中において安定であることが示された。【０２６０】
安定性及び遺伝子発現抑制効果の両面から、特にPA-0004-DSP、PA-0018-DSP及びPA-0025-DSPが優れていることがわかった。
以上の結果より、遺伝子発現制御機能を有する一本鎖核酸分子（好ましくは５’末端と３’末端を平滑末端化する）をジスルフィド結合により環状にすることで、インビトロにおける発現抑制効果を損ねることなく、二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に比べヒト血清中での安定性を大幅に向上させることが示された。【０２６１】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２６２】
本発明の環状型核酸分子によれば、容易に低コストで合成でき、且つ、前記遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制が可能である。本発明の環状型核酸分子は、前述のように標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農学、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。【０２６３】
本出願は、日本で出願された特願２０１７−０７０６９５（出願日：２０１７年３月３１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表フリーテキスト】
【０２６４】
配列番号１：発現抑制配列
配列番号２：発現抑制配列の相補配列
配列番号３：発現抑制配列
配列番号４：発現抑制配列の相補配列
配列番号５：一本鎖核酸分子_PA-0001
配列番号６：一本鎖核酸分子_PA-0002
配列番号７：一本鎖核酸分子_PA-0003
配列番号８：一本鎖核酸分子_PA-0004
配列番号９：一本鎖核酸分子_PA-0005
配列番号１０：一本鎖核酸分子_PA-0006
配列番号１１：一本鎖核酸分子_PA-0007
配列番号１２：一本鎖核酸分子_PA-0008
配列番号１３：一本鎖核酸分子_PA-0009
配列番号１４：一本鎖核酸分子_PA-0010
配列番号１５：一本鎖核酸分子_PA-0011
配列番号１６：一本鎖核酸分子_PA-0012
配列番号１７：一本鎖核酸分子_PA-0013
配列番号１８：一本鎖核酸分子_PA-0014
配列番号１９：一本鎖核酸分子_PA-0015
配列番号２０：一本鎖核酸分子_PA-0016
配列番号２１：一本鎖核酸分子_PA-0017
配列番号２２：一本鎖核酸分子_PA-0018
配列番号２３：一本鎖核酸分子_PA-0019
配列番号２４：一本鎖核酸分子_PA-0020
配列番号２５：一本鎖核酸分子_PA-0021
配列番号２６：一本鎖核酸分子_PA-0024
配列番号２７：一本鎖核酸分子_PA-0025
配列番号２８：一本鎖核酸分子_PA-0026
配列番号２９：一本鎖核酸分子_PA-0027
配列番号３０：一本鎖核酸分子_PA-0028
配列番号３１：一本鎖核酸分子_PA-0029
配列番号３２：一本鎖核酸分子_PA-0030
配列番号３３：一本鎖核酸分子_GA-0001
配列番号３４：一本鎖核酸分子_KA-0001
配列番号３５：一本鎖核酸分子_PA-0031
配列番号３６：一本鎖核酸分子_PA-0032
配列番号３７：一本鎖核酸分子_PA-0033
配列番号３８：siRNA_NI-0053（センス鎖）
配列番号３９：siRNA_NI-0053（アンチセンス鎖）
配列番号４０：siRNA_NI-0011（センス鎖）
配列番号４１：siRNA_NI-0011（アンチセンス鎖）
配列番号４２：siRNA_NI-0211（センス鎖）
配列番号４３：siRNA_NI-0211（アンチセンス鎖）
配列番号４４：一本鎖核酸分子_PH-0009
配列番号４５：TGF-β1プライマー
配列番号４６：TGF-β1プライマー
配列番号４７：ＣＯＬ１Ａ１プライマー
配列番号４８：ＣＯＬ１Ａ１プライマー
配列番号４９：βアクチンプライマー
配列番号５０：βアクチンプライマー
配列番号５１：ＧＡＰＤＨプライマー
配列番号５２：ＧＡＰＤＨプライマー
【図１】
2018182008.tif 000068
【図２】
2018182008.tif 000069
【図３】
2018182008.tif 000070
【図４】
2018182008.tif 000071
【図５】
2018182008.tif 000072
【図６】
2018182008.tif 000073
【図７】
2018182008.tif 000074
【図８】
2018182008.tif 000075
【図９】
2018182008.tif 000076
【図１０】
2018182008.tif 000077
【図１１】
2018182008.tif 000078
【図１２】
2018182008.tif 000079
【図１３】
2018182008.tif 000080
【図１４】
2018182008.tif 000081
【図１５】
2018182008.tif 000082
【図１６】
2018182008.tif 000083
【図１７】
2018182008.tif 000084
【図１８】
2018182008.tif 000085
【図１９】
2018182008.tif 000086
【図２０】
2018182008.tif 000087
【図２１】
2018182008.tif 000088
【図２２】
2018182008.tif 000089
【図２３】
2018182008.tif 000090
【図２４】
2018182008.tif 000091
【図２５】
2018182008.tif 000092
【図２６】
2018182008.tif 000093
【図２７】
2018182008.tif 000094
【図２８】
2018182008.tif 000095
【図２９】
2018182008.tif 000096
【図３０】
2018182008.tif 000097
【図３１】
2018182008.tif 000098
【図３２】
2018182008.tif 000099
【図３３】
2018182008.tif 000100
【図３４】
2018182008.tif 000101
【図３５】
2018182008.tif 000102
【図３６】
2018182008.tif 000103
【図３７】
2018182008.tif 000104
【図３８】
2018182008.tif 000105
【図３９】
2018182008.tif 000106
【図４０】
2018182008.tif 000107
【図４１】
2018182008.tif 000108
【図４２】
2018182008.tif 000109
【図４３】
2018182008.tif 000110
【図４４−１】
2018182008.tif 000111
【図４４−２】
2018182008.tif 000112
【図４５】
2018182008.tif 000113
【図４６】
2018182008.tif 000114
【図４７】
2018182008.tif 000115
【配列表】
2018182008000001.app
【国際調査報告】
2018182008.tif 000116
2018182008.tif 000117
2018182008.tif 000118
2018182008.tif 000119