(57)【要約】  （Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を含有する、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
2019045036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を含有する、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項２】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項６】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項５に記載の治療方法。
【請求項７】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項５又は６に記載の治療方法。
【請求項８】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の治療方法。
【請求項９】
エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項１０】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項９に記載の（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。
【請求項１１】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項９又は１０に記載の（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。
【請求項１２】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。
【請求項１３】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための使用。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項１４】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項１３又は１４に記載の使用。
【請求項１６】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項１８】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２０】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩及び薬学的に許容できる担体を含む、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、医薬組成物。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項２２】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項２１又は２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
下記工程（１）〜（２）を含む、悪性腫瘍患者における（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項２６】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
下記工程（１）〜（３）を含む、悪性腫瘍患者の治療方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（３）上記工程（２）において（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された悪性腫瘍患者に、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項３０】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエクソン１８及び／又はエクソン２１変異型上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、「ＥＧＦＲ」とも称する）を有する癌に対する抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＧＦＲは受容体チロシンキナーゼであり、正常組織においてはリガンドである上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、以下「ＥＧＦ」とも称する）と結合することで生理機能を発揮し、上皮組織において増殖やアポトーシス阻害に寄与している（非特許文献１）。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は癌の原因遺伝子として知られており、例えばＥＧＦＲのエクソン１９のコドン７４６〜７５０が欠失したもの（以下、「エクソン１９欠失変異」とも称する）やエクソン２１のコドン８５８がコードするロイシンがアルギニンへ変異したもの（以下、「Ｌ８５８Ｒ変異」とも称する）はＥＧＦ非依存的なキナーゼ活性を恒常的に誘導し、癌細胞の増殖や生存に寄与する（非特許文献２）。これらの変異は、東アジアにおいては、例えば非小細胞肺癌の３０〜５０％で認められ、また、欧米においても非小細胞肺癌のおよそ１０％で認められると報告されており、癌の原因因子の１つとして考えられている（非特許文献３）。【０００３】
そのため、ＥＧＦＲ阻害剤の抗腫瘍剤としての研究開発は従来から活発に行われており、各種のＥＧＦＲ変異陽性肺癌の治療に導入されている（非特許文献２、４）。ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブは、ＥＧＦＲ変異の９０％を占めるエクソン１９欠失変異型及びＬ８５８Ｒ変異型ＥＧＦＲ陽性肺癌に対する治療薬として用いられている。また、これらの治療継続中に獲得耐性が生じることが知られており、その原因の５０％はエクソン２０のコドン７９０がスレオニンからメチオニンへ変異した（以下、「Ｔ７９０Ｍ変異」とも称する）耐性変異型ＥＧＦＲである。この変異を有する肺癌に対してはオシメルチニブが治療薬として用いられている。従って、主要なＥＧＦＲ変異を有する肺癌患者に対して、ＥＧＦＲ阻害剤を用いた治療が確立されつつある。【０００４】
しかしその一方、エクソン１８の点変異又は欠失変異、エクソン２１の点変異などのいくつかの希少なＥＧＦＲ変異に対するＥＧＦＲ阻害剤による治療は確立されておらず、これら変異型ＥＧＦＲの薬剤感受性は変異型によって異なることが報告されている（非特許文献４）。例えばエクソン１８のコドン７１９がコードするグリシンが任意のアミノ酸に置換した点変異（以下、「Ｇ７１９Ｘ変異」とも称する）を有する肺癌やエクソン２１のコドン８６１がコードするロイシンがグルタミンに置換した点変異（以下、「Ｌ８６１Ｑ変異」とも称する）を有する肺癌の、ゲフィチニブ、エルロチニブ、及びアファチニブに対するに感受性は、薬剤感受性変異であるエクソン１９欠失変異及びＬ８５８Ｒ変異に比して低い。また、アファチニブ、ゲフィチニブ及びエルロチニブの治療用量において共通して発現する副作用として皮膚の異常や消化管障害が報告されている。これらの副作用は、皮膚や消化管など正常組織に発現している野生型ＥＧＦＲの機能が治療薬により阻害されることに起因すると広く考えられており（非特許文献１）、副作用軽減の観点から腫瘍組織に発現する変異型ＥＧＦＲに比し、正常組織の野生型ＥＧＦＲに対する阻害活性が低い特徴を有する阻害剤の開発が望まれる。【０００５】
従って、エクソン１８及びエクソン２１の変異型ＥＧＦＲに対して高い阻害活性を有し、且つ野生型ＥＧＦＲに比し変異型ＥＧＦＲに高い選択性を有する薬剤の開発は、皮膚や消化管における副作用が発現するよりも低い投与量において、変異型ＥＧＦＲを有する肺癌細胞の増殖を抑制が可能となることが予想され、治療法の確立されていない変異型ＥＧＦＲ陽性癌患者の延命やＱＯＬ向上に貢献することが期待される。更に、ＥＧＦＲ阻害剤治療に対する獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍに対しても高い阻害活性を有する薬剤であれば、ｄｅ  ｎｏｖｏ変異であるエクソン１８やエクソン２１の変異型ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ阻害剤治療に際し、獲得耐性の発現頻度を減少させる可能性が予想され、がん患者の延命に貢献することが期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１７５６３２Ａ１号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１５／０２５９３６Ａ１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．６，ｐｐ８０３−８１２（２００６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１９，ｐｐ１３８９−１４００（２０１３）
【非特許文献３】Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．７，ｐｐ１６９−１８１（２００７）
【非特許文献４】Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．ｖｏｌ．１３，ｅ２３−３１（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、従来のＥＧＦＲ阻害剤で治療効果が十分ではない、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異型ＥＧＦＲへの選択性が高い阻害剤であり、かつ、野生型ＥＧＦＲを阻害しないために副作用が低減した抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異型ＥＧＦＲが癌の治療標的として妥当であることと併せて、従来治療に導入されているＥＧＦＲ阻害剤が、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異型ＥＧＦＲ間の選択性に乏しいことを見出した。また、本発明に係る化合物が、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異型ＥＧＦＲに対する優れた選択性及び腫瘍増殖抑制効果を示すことを確認し、本発明を完成するに至った。【００１０】
本発明は以下の態様を包含する。【００１１】
項１、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を含有する、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００１２】
項２、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項１に記載の抗腫瘍剤。【００１３】
項３、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項１又は２に記載の抗腫瘍剤。【００１４】
項４、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項１〜３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。【００１５】
項５、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００１６】
項６、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項５に記載の治療方法。【００１７】
項７、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項５又は６に記載の治療方法。【００１８】
項８、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項５〜７のいずれか一項に記載の治療方法。【００１９】
項９、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００２０】
項１０、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項９に記載の（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。【００２１】
項１１、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項９又は１０に記載の（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。【００２２】
項１２、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項９〜１１のいずれか一項に記載の（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩。【００２３】
項１３、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための使用。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００２４】
項１４、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項１３に記載の使用。【００２５】
項１５、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項１３又は１４に記載の使用。【００２６】
項１６、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項１３〜１５のいずれか一項に記載の使用。【００２７】
項１７、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００２８】
項１８、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項１７に記載の使用。【００２９】
項１９、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項１７又は１８に記載の使用。【００３０】
項２０、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用。【００３１】
項２１、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩及び薬学的に許容できる担体を含む、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、医薬組成物。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００３２】
項２２、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項２１に記載の医薬組成物。【００３３】
項２３、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項２１又は２２に記載の医薬組成物。【００３４】
項２４、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項２１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。【００３５】
項２５、下記工程（１）〜（２）を含む、悪性腫瘍患者における（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００３６】
項２６、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項２５に記載の方法。【００３７】
項２７、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項２５又は２６に記載の方法。【００３８】
項２８、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。【００３９】
項２９、下記工程（１）〜（３）を含む、悪性腫瘍患者の治療方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（３）上記工程（２）において（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された悪性腫瘍患者に、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］【００４０】
項３０、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、項２９に記載の方法。【００４１】
項３１、エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、項２９又は３０に記載の方法。【００４２】
項３２、ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００４３】
本発明に係る抗腫瘍剤は、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異型ＥＧＦＲへの高い選択性を示す。したがって、従来のＥＧＦＲ阻害剤で治療効果が充分ではない、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に対する優れた治療効果を発揮する抗腫瘍剤を提供するものとして有用である。【００４４】
本発明はまた、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者の治療方法を提供するものとして有用である。【００４５】
従来のＥＧＦＲ阻害剤は、野生型ＥＧＦＲに比べてエクソン１８及びエクソン２１変異型ＥＧＦＲへの選択性が低いため、抗腫瘍効果を発揮する投与量と野生型ＥＧＦＲに起因する副作用（皮膚の異常や消化管障害など）が生じる投与量との乖離が小さく、十分な治療効果を発揮することが困難であった。一方、本発明に係る抗腫瘍剤は、エクソン１８及びエクソン２１変異型ＥＧＦＲへの選択性が高いため、野生型ＥＧＦＲに起因する副作用を生じさせずに投与量を増加させることが可能であると考えられ、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に対して優れた治療効果を発揮することができる。【００４６】
加えて、本発明に係る抗腫瘍剤は、エクソン２０領域の獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍ変異存在下において、エクソン１８及びエクソン２１変異型ＥＧＦＲに対して、高い阻害活性を示した。従って、既存の抗腫瘍剤を使用することによって生ずる獲得耐性変異によって、既存の薬剤の効果が低くなった悪性腫瘍患者に対しても優れた治療効果を発揮することができる。【００４７】
更に、本発明に係る抗腫瘍剤は、エクソン２０領域の獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍ変異存在下においても、エクソン１８及びエクソン２１変異型ＥＧＦＲに対して、高い阻害活性を有するため、ｄｅ  ｎｏｖｏ変異であるエクソン１８やエクソン２１の変異型ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲ阻害剤治療に際し、獲得耐性の発現頻度を減少させうる点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】化合物Ａの抗腫瘍効果を測定するためのＧ７１９Ａ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株皮下移植モデルマウスにおける腫瘍体積（以下、「ＴＶ」とも称する）を示す。
【図２】化合物Ａの毒性を測定するためのＧ７１９Ａ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株皮下移植モデルマウスの化合物投与期間中の体重を示す。
【図３】化合物Ａの抗腫瘍効果を測定するためのＧ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株皮下移植モデルマウスにおける腫瘍体積を示す。
【図４】化合物Ａの毒性を測定するためのＧ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株皮下移植モデルマウスの化合物投与期間中の体重を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
明細書の上記又は下記記載において、本発明範囲に含まれる様々な定義の好適例を、下記で詳細に説明する。
【００５０】
本明細書において「ＥＧＦＲ」とは、ヒト上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質を示す。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ−１又はＨＥＲ１とも呼ばれている。
【００５１】
本明細書において「野生型ＥＧＦＲ」とは、体細胞変異を有していないＥＧＦＲを示し、具体的には配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００５２１９．２）。
【００５２】
本明細書において「エクソン１８」とは、野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）における６８８−７２８の領域を示す。
【００５３】
本明細書において「エクソン１８変異」とは、野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）のエクソン１８領域のアミノ酸における点変異を示す。好ましくは、エクソン１８変異としては、エクソン１８領域の１のアミノ酸が置換された点変異又は欠失変異であり、より好ましくは、エクソン１８のコドン７０９にコードされるグルタミン酸が任意のアミノ酸に置換した点変異であるＥ７０９Ｘ、及びエクソン１８のコドン７１９によりコードされるグリシンが任意のアミノ酸に置換した点変異であるＧ７１９Ｘである。具体的には、Ｅ７０９Ｘとしては、エクソン１８領域のコドン７０９にコードされるグルタミン酸がリシンに置換した点変異であるＥ７０９Ｋ、エクソン１８領域のコドン７０９にコードされるグルタミン酸がアラニンに置換した点変異であるＥ７０９Ａが挙げられ、これらが好ましい。Ｇ７１９Ｘとしては、エクソン１８領域のコドン７１９にコードされるグリシンがアラニンに置換した点変異であるＧ７１９Ａ、エクソン１８領域のコドン７１９にコードされるグリシンがセリンに置換した点変異であるＧ７１９Ｓ、又はエクソン１８領域のコドン７１９にコードされるグリシンがシステインに置換した点変異であるＧ７１９Ｃが挙げられ、これらが好ましく、このうち、Ｇ７１９Ａが特に好ましい。
【００５４】
本発明において「エクソン２１」とは、野生型ＥＧＦＲのアミノ酸配列（配列番号１）における８２４−８７５の領域を示す。
【００５５】
本明細書において「エクソン２１変異」とは、野生型ＥＧＦＲ（配列番号１）のエクソン２１領域のアミノ酸における点変異を示す。好ましくは、エクソン２１変異としては、エクソン２１領域の１のアミノ酸が置換された点変異であり、より好ましくは、エクソン２１領域のコドン８６１にコードされるロイシンが任意のアミノ酸に置換した点変異であるＬ８６１Ｘである。具体的には、エクソン２１領域のコドン８６１によりコードされるロイシンがグルタミンに置換した点変異であるＬ８６１Ｑが挙げられ、Ｌ８６１Ｑが好ましい。
【００５６】
本発明において、「エクソン１８及び／又はエクソン２１変異」は、「エクソン１８変異」「エクソン２１変異」、「エクソン１８及びエクソン２１変異」を包含する。
【００５７】
本発明において、「点変異」とは、１又は複数（例えば、１〜１０個程度、好ましくは１〜５程度個、より好ましくは１、２又は３個程度）のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失をもたらす変異を示し、核酸としてのインフレーム挿入及び／又は欠失変異も含みうる。
【００５８】
「エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲ」は、「エクソン１８を有するＥＧＦＲ」、「エクソン２１変異を有するＥＧＦＲ」及び「エクソン１８及びエクソン２１変異を有するＥＧＦＲ」を包含する。
【００５９】
本明細書において「エクソン１８変異を有するＥＧＦＲ」とは、エクソン１８変異を少なくとも一つ有するＥＧＦＲを示し、当該ＥＧＦＲは異なった２つ以上のエクソン１８変異を有してもよく、好ましくは１つのエクソン１８変異を有するものである。また、当該ＥＧＦＲはエクソン１８変異以外の変異（例えば、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ変異、Ｌ７９０Ｍ変異など）を有していてもよい。
【００６０】
本明細書において「エクソン２１変異を有するＥＧＦＲ」とは、エクソン２１変異を少なくとも一つ有するＥＧＦＲを示し、当該ＥＧＦＲは異なった２つ以上のエクソン２１変異を有してもよく、好ましくは１つのエクソン２１変異を有するものである。また、当該ＥＧＦＲはエクソン２１変異以外の変異（例えば、エクソン１９欠失変異、Ｌ８５８Ｒ変異、Ｌ７９０Ｍ変異など）を有していてもよい。
【００６１】
また、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲは、更にＴ７９０Ｍ変異を有していてもよい。Ｔ７９０Ｍはエクソン２０領域の獲得耐性変異であり、既存のＥＧＦＲ阻害剤を使用することによって生ずることが知られている。Ｔ７９０Ｍの獲得により、悪性腫瘍患者に対して既存の薬剤の効果が低くなる場合が多い。
【００６２】
本発明において、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲは、具体的には、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン１８領域のＥ７０９Ｘ及び／又はＧ７１９Ｘ変異を有するＥＧＦＲ、及びＴ７９０Ｍ変異を更に有するエクソン２１領域のＬ８６１Ｘ変異を有するＥＧＦＲのいずれかであることが好ましい。より具体的には、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＥ７０９Ｋ又はＥ７０９Ａ変異を有するＥＧＦＲ、及びＴ７９０Ｍ変異を更に有するＧ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、又はＧ７１９Ｃ変異を有するＥＧＦＲ、並びにＴ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８６１Ｑ変異を有するＥＧＦＲのいずれかであることが好ましい。このうち、Ｔ７９０Ｍ変異を更に有するＧ７１９Ａ変異を有するＥＧＦＲ及びＴ７９０Ｍ変異を更に有するＬ８６１Ｑ変異を有するＥＧＦＲが特に好ましい。
【００６３】
本発明において、悪性腫瘍患者が発現しているＥＧＦＲがエクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有することの検出方法としては、上記の変異が検出できれば特に制限されず、公知の検出方法を使用することができる。
【００６４】
エクソン１８及び／又はエクソン２１変異の検出に供する試料としては、悪性腫瘍患者由来の生体試料、特に悪性腫瘍患者から採取したものであり悪性腫瘍細胞を含む試料であれば特に限定されない。生体試料としては、例えば体液（血液、尿等）、組織、その抽出物及び採取した組織の培養物などが例示できる。また、生体試料の採取方法は、生体試料の種類に応じ適宜選択することができる。
【００６５】
生体試料は、測定方法に応じて、適切な処理をされることにより調製される。また、検出に用いられるプライマー又はプローブを含む試薬は、これらの測定方法に応じて、慣用される方法により調整することができる。
【００６６】
本発明の1つの態様において、抗腫瘍剤の悪性腫瘍患者への投与の前に、悪性腫瘍患者が発現しているＥＧＦＲがエクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有することの検出する工程を行うことができる。
【００６７】
なお、悪性腫瘍は異なる２種以上の悪性腫瘍細胞を含む場合がある。また、一人の患者において２以上の複数の悪性腫瘍が発生する場合がある。そのため、一人の患者が、ＥＧＦＲの同一のアミノ酸位置に異なる変異（例えば、エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ及びＧ７１９Ｃのエクソン１８変異；Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａのエクソン１８変異）を同時に有する場合がある。
【００６８】
本発明の抗腫瘍剤は、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド（化合物Ａ）又はその塩を有効成分として含有する。化合物Ａは、下記化学式で表される。
【００６９】
【化１】
2019045036.tif 000003
【００７０】
次に、本発明に係る化合物の製造法について説明する：
本発明の化合物Ａは、例えば、ＷＯ２０１５／０２５９３６Ａ１号公報に記載された製造法又は実施例に示す方法等により製造することができる。ただし、本発明化合物の製造法はこれら反応例に限定されるものではない。
【００７１】
化合物Ａが、光学異性体、立体異性体、互変異性体等の異性体を有する場合には、特に明記しない限り、いずれの異性体も混合物も本発明化合物に包含される。例えば、本発明化合物に光学異性体が存在する場合には、特に明記しない限り、ラセミ体及びラセミ体から分割された光学異性体も本発明化合物に包含される。
【００７２】
化合物Ａの塩とは、薬学的に許容される塩を意味し、塩基付加塩又は酸付加塩を挙げることができる。
【００７３】
該塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、プロカイン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。
【００７４】
該酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、ギ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、トリフルオロ酢酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩等が挙げられる。
【００７５】
本発明化合物又はその塩には、そのプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応により本発明化合物又はその塩に変換する化合物、即ち酵素的に酸化、還元、加水分解等を起こして本発明化合物又はその塩に変化する化合物、胃酸等により加水分解等を起こして本発明化合物又はその塩に変化する化合物をいう。また、広川書店１９９０年刊「医薬品の開発」第７巻分子設計１６３頁から１９８頁に記載されているような生理的条件で本発明化合物又はその塩に変化するものであってもよい。
【００７６】
［疾患の記載］
本発明の対象となる腫瘍は特に制限はされないが、例えば、頭頚部癌、消化器癌（食道癌、胃癌、十二指腸癌、肝臓癌、胆道癌（胆嚢・胆管癌等）、膵臓癌、結腸直腸癌（結腸癌、直腸癌等）等）、肺癌（非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫等）、乳癌、生殖器癌（卵巣癌、子宮癌（子宮頚癌、子宮体癌等）等）、泌尿器癌（腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍等）、造血器腫瘍（白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等）、骨・軟部腫瘍、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられる。好ましくは、肺癌、乳癌、頭頸部癌、脳腫瘍、子宮癌、消化器癌、造血器腫瘍、又は皮膚癌であり、特に好ましくは肺癌である。
【００７７】
化合物Ａ又はその塩は医薬として用いるにあたっては、必要に応じて薬学的担体を配合し、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能である。該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでもよく、好ましくは、経口剤が採用される。これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【００７８】
本発明の抗腫瘍剤は、ある態様においては化合物Ａ又はその塩及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物として提供される。
【００７９】
薬学的に許容できる担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。
【００８０】
経口用固形製剤を調製する場合は、本発明化合物に賦形剤、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。
【００８１】
賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、無水ケイ酸等が挙げられる。結合剤としては、水、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、α−デンプン液、ゼラチン液、Ｄ−マンニトール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。崩壊剤としては、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。滑沢剤としては、精製タルク、ステアリン酸塩ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００８２】
経口用液体製剤を調製する場合は、本発明化合物に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
【００８３】
注射剤を調製する場合は、本発明化合物にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
【００８４】
ｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、グリセリン等が挙げられる。
【００８５】
坐剤を調製する場合は、化合物Ａに当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセリド等を、更に必要に応じてＴｗｅｅｎ８０（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００８６】
軟膏剤を調製する場合は、化合物Ａに通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。
【００８７】
基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。
【００８８】
保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００８９】
貼付剤を調製する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すればよい。
【００９０】
支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム或いは発泡体シートが適当である。
【００９１】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき化合物Ａの量は、これを適用すべき患者の症状により、或いはその剤形等により一定ではない。一般に投与単位形態あたり、経口剤では０．０５−１０００ｍｇ、注射剤では０．０１−５００ｍｇ、坐剤では１−１０００ｍｇとするのが望ましい。
【００９２】
また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できず、限定されない。一般に、化合物Ａとして通常成人（体重５０ｋｇ）１日あたり０．０５−５０００ｍｇ、好ましくは０．１−１０００ｍｇとすればよく、これを１日１回又は２−３回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００９３】
本発明はまた、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者に化合物Ａ又はその塩を投与する工程を含む、悪性腫瘍患者の治療方法を提供する。
【００９４】
本発明はまた、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、化合物Ａ又はその塩を提供する。
【００９５】
本発明はまた、化合物Ａ又はその塩の、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための使用を提供する。
【００９６】
本発明はまた、化合物Ａ又はその塩の、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用を提供する。
【００９７】
本発明はまた、化合物Ａ又はその塩及び薬学的に許容できる担体を含む、エクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、医薬組成物を提供する。
【００９８】
本発明はまた、下記工程（１）〜（２）を含む、悪性腫瘍患者における化合物Ａ又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法を提供する。
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
【００９９】
本発明はまた、下記工程（１）〜（３）を含む、悪性腫瘍患者の治療方法を提供する。
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８及び／又はエクソン２１変異を有している場合、当該患者に対する（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程、及び
（３）上記工程（２）において（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測された悪性腫瘍患者に、（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を投与する工程。
【０１００】
ＥＧＦＲ遺伝子の塩基配列は公知である。ｃＤＮＡの塩基配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ＮＭ＿００５２２８．４である。
【０１０１】
なお、「治療効果」は、腫瘍縮小効果、再発抑制効果、延命効果などにより評価することができ、再発抑制効果は無再発生存期間の延長や再発率の改善の程度、延命効果は全生存期間や無増悪生存期間の中央値の延長の程度などにより表すことができる。化合物Ａ又はその塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤を用いた化学療法が「十分な治療効果を示す」とは、化合物Ａ又はその塩を有効成分として含有する抗腫瘍剤を投与することにより、非投与の場合と比較して、生存期間を延長させたり、再発を抑制させたりするような優れた治療効果をいう。
【実施例】
【０１０２】
以下に試験例を示し、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例(試験例)に制限されるものではない。【０１０３】
試験例１  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  薬効試験
ＨＥＫ２９３細胞を用いた変異型ＥＧＦＲ強制発現系における細胞内リン酸化評価結果（阻害活性）
化合物の細胞内標的阻害活性は、Ｊｕｍｐ−Ｉｎ（商標）  Ｇｒｉｐ（商標）  ＨＥＫ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）（以下、「ＨＥＫ２９３細胞」とも称す）を用いた変異型ＥＧＦＲ強制発現系における細胞内ＥＧＦＲリン酸化を指標に評価した。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％  透析  ウシ胎児血清（ｄｉａｌｙｚｅｄ  ＦＢＳ）及び１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を含むＤ−ＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−Ｉ（Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）にて維持し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ、Ｅ７０９Ａ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ（＋は両方の変異を有することを示す。）、Ｌ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ）をコードしたｐＪＴＩＴＭＲ４  ＤＥＳＴ  ＣＭＶ  ｐＡベクターをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）  Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）と共にＶｉａＦｅｃｔ（商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ株式会社）を用いて導入した。変異型ヒトＥＧＦＲを発現したＨＥＫ２９３細胞を、３８４ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が１０，０００個になるように播種し、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で１日培養した。化合物Ａ、エルロチニブ、アファチニブ及びオシメルチニブ（以下、「比較化合物」とも称する）をＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯもしくは各細胞の懸濁に用いた培地を用いて希釈し、これを細胞の培養プレートの各ウェルに加え、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で６時間培養した。培養後、２０％  中性緩衝ホルマリン液（和光純薬工業株式会社）を用いて細胞を固定し、ＯＤＹＳＳＥＹ（商標）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）（Ｍ＆Ｓ  ＴｅｃｈｎｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）により細胞をブロッキングした後、ＯＤＹＳＳＥＹ（商標）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）を用いて２００分の１に希釈した一次抗体（ＥＧＦＲ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ１９／４８ＭＩＸ）＃ＡＨＲ５０６２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）及びＰｈｏｓｐｈｏ−ＥＧＦＲ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｔｙｒ１０６８）Ａｎｔｉｂｏｄｙ＃２２３４Ｌ（ＣＳＴ））に反応させ４℃で一晩浸透した。翌日、ＯＤＹＳＳＥＹ（商標）  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）を用いて８００分の１に希釈した二次抗体（ＩＲＤye  ８００ＣＷ  Ｇｏａｔ  ａＲａｂｂｉｔ＃９２６−３２２１１及びＩＲＤye  ６８０ＲＤ  Ｇｏａｔ  ａＭｏｕｓｅ＃９２６−６８０７０（Ｍ＆Ｓ  ＴｅｃｈｎｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．））に反応させ室温で１時間浸透した。蛍光強度（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：以下「ＦＩ」とも称す）の検出は、Ｏｄｙｓｓａｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ） を用いて、蛍光波長８００ｎｍ及び７００ｎｍで測定した。【０１０４】
蛍光波長８００ｎｍ及び７００ｎｍで検出したＦＩ値から細胞を含まないウェルのＦＩ値を差し引いた数値をそれぞれ、ＦＩ（８００，ＥＧＦＲ）−Ｂｌａｎｋ、ＦＩ（７００，ｐ−ＥＧＦＲ）−Ｂｌａｎｋとする。各ウェルのＦＩ（７００，ｐ−ＥＧＦＲ）−ＢｌａｎｋからＦＩ（８００，ＥＧＦＲ）−Ｂｌａｎｋを除した値をＦＩ（ｐ−ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）値とする。以下の式よりリン酸化ＥＧＦＲ阻害率を算出し、リン酸化ＥＧＦＲを５０％阻害することのできる被検化合物の濃度（ＩＣ５０（μＭ））を求めた。結果を表１に示す。【０１０５】
リン酸化ＥＧＦＲ阻害率（％）＝Ｔ  ／  Ｃ  ×１００
Ｔ：被検化合物を添加したウェルのＦＩ（ｐ−ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）
Ｃ：被検化合物を添加しなかったウェルのＦＩ（ｐ−ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲ）。  【０１０６】
表１から明らかなとおり、化合物Ａはエクソン１８又はエクソン２１変異型ＥＧＦＲに対して高い細胞内リン酸化阻害活性を示し、その活性はエルロチニブ、オシメルチニブに比して高く、アファチニブと同等であった。獲得耐性変異であるＴ７９０Ｍ変異存在下においては、化合物Ａのエクソン１８又はエクソン２１変異型ＥＧＦＲに対する阻害活性はアファチニブに比して高かった。【０１０７】
【表１】
2019045036.tif 000004
【０１０８】
試験例２
野生型及び変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対する細胞増殖抑制効果の評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
化合物の野生型ＥＧＦＲ及び変異型ＥＧＦＲに対する阻害活性は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子を導入したマウスＢリンパ球前駆細胞株であるＢａ／Ｆ３細胞を用いて行った。Ｂａ／Ｆ３細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）及び１ｎｇ／ｍＬ  マウスインターロイキン−３（ｍＩＬ−３）（ＣＳＴ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）にて維持し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（野生型（ＷＴ）、Ｇ７１９Ａ、Ｌ８６１Ｑ）をコードしたＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＧＦＰ＋ＰｕｒｏベクターもしくはＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋ＰｕｒｏベクターをＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  （商標）  Ｋｉｔ  Ｖによる電気穿孔法により導入した後ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）にて選択した。野生型ＥＧＦＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞（以下、「Ｂａ／Ｆ３―ＥＧＦＲ＿ＷＴ」とも称する）は５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ）存在下でｍＩＬ−３非依存的な増殖を示し、又エクソン１８及びエクソン２１活性変異型ＥＧＦＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞（以下、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ」、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ」）はＥＧＦ非存在下でｍＩＬ−３非依存的な増殖を示した。【０１０９】
細胞増殖抑制効果の評価に際し、Ｂａ／Ｆ３―ＥＧＦＲ＿ＷＴ細胞を１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン及び５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて懸濁し、細胞懸濁液を９６ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が３０，０００個になるよう播種した。一方、Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ細胞及びＢａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ細胞は１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて懸濁し、細胞懸濁液を９６ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が１５，０００個になるように播種した。次に化合物Ａ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ及びオシメルチニブ（以下、「比較化合物」とも称する）をＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯもしくは各細胞の懸濁に用いた培地を用いて希釈し、これを細胞の培養プレートの各ウェルに加え、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で３日培養した。培養後の細胞数の計測はＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いて、メーカーの推奨するプロトコールに基づき行った。以下の式より増殖阻害率を算出し、５０％阻害する被検化合物の濃度（ＩＣ５０（μＭ））を求めた。【０１１０】
増殖阻害率（％）＝Ｔ  ／  Ｃ  ×１００
Ｔ：被検化合物を添加したウェルの発光強度
Ｃ：被検化合物を添加しなかったウェルの発光強度。【０１１１】
また、以下の式より野生型ＥＧＦＲとＧ７１９Ａ変異型ＥＧＦＲ又はＬ８６１Ｑ変異型ＥＧＦＲのＩＣ５０値の比を算出した。結果を表２に示す。【０１１２】
ＩＣ５０  ｒａｔｉｏ＝ＩＣ５０（ＷＴ）／ＩＣ５０（Ｇ７１９Ａ又はＬ８６１Ｑ）。【０１１３】
表２から明らかなとおり、化合物Ａは、Ｇ７１９Ａ又はＬ８６１Ｑ変異に対する選択的阻害活性を示した。【０１１４】
【表２】
2019045036.tif 000005
【０１１５】
試験例３  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  薬効試験
Ｇ７１９Ａ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株マウス皮下移植モデルを用いた抗腫瘍効果の評価  Ｇ７１９Ａ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株のマウス皮下移植モデルを用いた評価では、ヒトＥＧＦＲ遺伝子を導入したマウス線維芽細胞株であるＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いて行った。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は１０％ウシ新生児血清（ＮＢＣＳ）、１，５００ｍｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地（和光純薬）にて維持し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（Ｇ７１９Ａ）をコードしたＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋ＰｕｒｏベクターをＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｋｉｔ  Ｒによる電気穿孔法により導入した後ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）にて選択した。エクソン１８変異型ＥＧＦＲを発現したＮＩＨ−３Ｔ３細胞（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ」とも称する）は１％ＮＢＣＳ条件下かつＥＧＦ非存在下で増殖を示した。【０１１６】
Ｇ７１９Ａ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株のマウス皮下移植モデルを用いた評価に際し、ヒト変異型ＥＧＦＲを導入したＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ細胞をヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍が生着したヌードマウスの腫瘍体積が１００−２００ｍｍ３程度になった時点で、各群の腫瘍体積の平均が均一になるよう無作為層別化により１群５−６匹を割付、化合物Ａ、アファチニブ及びオシメルチニブを１４日間、１日１回連日経口投与した。【０１１７】
投与用量は、アファチニブでは本試験の投与期間である１４日間での最大耐薬用量（投与期間中の体重減少が２０％未満となる最大投与用量）の２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、オシメルチニブでは、臨床薬効相当用量の２５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、化合物Ａでは、最大耐薬用量である２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙより３ｄｏｓｅ設定し、２００、１００、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを使用した。なお、最大耐薬用量は、アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）による「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｓ」に従って人道的観点から設定した。【０１１８】
各被験化合物投与における腫瘍の経時的増殖推移を比較するため、腫瘍の体積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、以下、「ＴＶ」とも称する）を指標にした。毒性の指標として経時的に体重を測定して群分け日に対する平均体重変化率（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ、以下、「ＢＷＣ（％）」とも称する）を以下の式に従って算出した。【０１１９】
ＢＷＣ（％）＝（体重測定日の体重）／（群分け時の体重）。【０１２０】
最終評価日のｃｏｎｔｒｏｌ群と薬剤投与群の平均ＴＶの差が統計学的に有意（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、Ｐ＜０．０５）であり、かつ下記式を用いて算出されるｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔ／Ｃ）値が１００未満の場合に効果ありと判定し、図中に＊印で示した。【０１２１】
Ｔ／Ｃ（％）＝（薬剤投与群の平均ＴＶ）/（Ｃｏｎｔｒｏｌ群の平均ＴＶ）× １００。【０１２２】
図１に示す結果から明らかなように、本発明化合物Ａはヌードマウスの皮下に移植したＧ７１９Ａ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対して腫瘍退縮を伴う顕著な抗腫瘍効果を示した。またその効果はアファチニブやオシメルチニブに比して高かった。図２に示すように、マウスでの重篤な体重減少、便異常、皮膚異常の症状は認められなかった。【０１２３】
試験例４  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  薬効試験
Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対する細胞増殖抑制効果の評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
化合物のＴ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲに対する阻害活性は、ヒトＥＧＦＲ遺伝子を導入したマウスＢリンパ球前駆細胞株であるＢａ／Ｆ３細胞を用いて行った。Ｂａ／Ｆ３細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）及び１ｎｇ／ｍＬ  マウスインターロイキン−３（ｍＩＬ−３）（ＣＳＴ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）にて維持し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（野生型（ＷＴ）、Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ）をコードしたＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＧＦＰ＋ＰｕｒｏベクターもしくはＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋ＰｕｒｏベクターをＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  （商標）  Ｋｉｔ  Ｖによる電気・孔法により導入した後ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）にて選択した。Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ及びＬ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲを発現したＢａ／Ｆ３細胞（以下、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ」、「Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ」）はＥＧＦ非存在下でｍＩＬ−３非依存的な増殖を示した。【０１２４】
細胞増殖抑制効果の評価に際し、Ｂａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ細胞及びＢａ／Ｆ３−ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ細胞は１０％  ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて懸濁し、細胞懸濁液を９６ウェル平底マイクロプレートの各ウェルに１ウェルあたりの細胞数が１５，０００個になるように播種した。次に化合物Ａ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ及びオシメルチニブ（以下、「比較化合物」とも称する）をＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯもしくは各細胞の懸濁に用いた培地を用いて希釈し、これを細胞の培養プレートの各ウェルに加え、５％炭酸ガス含有の培養器中３７℃で３日培養した。培養後の細胞数の計測はＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いて、メーカーの推奨するプロトコールに基づき行った。以下の式より増殖阻害率を算出し、５０％阻害する被検化合物の濃度（ＩＣ５０（μＭ））を求めた。【０１２５】
増殖阻害率（％）＝Ｔ  ／  Ｃ  ×１００
Ｔ：被検化合物を添加したウェルの発光強度
Ｃ：被検化合物を添加しなかったウェルの発光強度【０１２６】
また、以下の式より野生型ＥＧＦＲとＧ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ又はＬ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲのＩＣ５０値の比を算出した。結果を表３に示す。【０１２７】
ＩＣ５０  比＝ＩＣ５０（ＷＴ）／ＩＣ５０（Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ又はＬ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ）。【０１２８】
表３から明らかなとおり、化合物Ａは、Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ又はＬ８６１Ｑ＋Ｔ７９０Ｍ変異に対する選択的阻害活性を示した。【０１２９】
【表３】
2019045036.tif 000006
【０１３０】
試験例５  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  薬効試験
Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株マウス皮下移植モデルを用いた抗腫瘍効果の評価
Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株のマウス皮下移植モデルを用いた評価では、ヒトＥＧＦＲ遺伝子を導入したマウス線維芽細胞株であるＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いて行った。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は１０％ウシ新生児血清（ＮＢＣＳ）、１，５００ｍｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン／１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を含むＤ−ＭＥＭ（高グルコース）培地（和光純薬）にて維持し、ヒトＥＧＦＲ遺伝子（Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ）をコードしたＰＢ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ＲＦＰ＋ＰｕｒｏベクターをＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃＴｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクターと共にＡｍａｘａ（商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）  Ｋｉｔ  Ｒによる電気・孔法により導入した後ピューロマイシン（ＳＩＧＭＡ）にて選択した。エクソン１８変異型ＥＧＦＲを発現したＮＩＨ−３Ｔ３細胞（以下、「ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ」とも称する）は１％ＮＢＣＳ条件下かつＥＧＦ非存在下で増殖を示した。【０１３１】
Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株のマウス皮下移植モデルを用いた評価に際し，ヒト変異型ＥＧＦＲを導入したＮＩＨ３Ｔ３−ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ細胞をヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍が生着したヌードマウスの腫瘍体積が１００−３００ｍｍ３程度になった時点で、各群の腫瘍体積の平均が均一になるよう無作為層別化により１群５匹を割付、本発明化合物Ａ，アファチニブを１日間、１日１回連日経口投与した。【０１３２】
投与用量は、アファチニブでは本試験の投与期間である１４日間での最大耐薬用量（投与期間中の体重減少が２０％未満となる最大投与用量）の２０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、本発明化合物Ａでは、最大耐薬用量である２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙより３ｄｏｓｅ設定し、２００、１００、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを使用した。なお、最大耐薬用量は、アメリカ国立がん研究所（ＮＣＩ）による「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｐｒｏｐｏｓａｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒａｔｓ」に従って人道的観点から設定した。【０１３３】
各被験化合物投与における腫瘍の経時的増殖推移を比較するため、腫瘍の体積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ、以下、「ＴＶ」とも称する）を指標にした。ＴＶの経時的推移を図３に示した。また毒性の指標として経時的に体重を測定して群分け日に対する平均体重変化率（Ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｈａｎｇｅ，以下、「ＢＷＣ（％）」とも称する）を以下の式に従って算出し、経時的推移を図４に示した。
ＢＷＣ（％）＝（体重測定日の体重）／（群分け時の体重）。【０１３４】
最終評価日の平均ＴＶを指標としてダネット検定を行い、ｃｏｎｔｒｏｌ群と薬剤投与群の平均ＴＶの差が統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であり、かつ下記式を用いて算出されるｔｒｅａｔｍｅｎｔ／ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｔ／Ｃ）値が１００未満の場合に効果ありと判定し、図３及び表４に＊印で示した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。また発明化合物Ａ投与群とアファチニブ投与群の平均ＴＶの差が統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であり、かつ発明化合物Ａ投与群のＴ／Ｃ値がアファチニブ投与群のＴ／Ｃ値より低い場合にアファチニブよりも高い抗腫瘍効果があると判定し、図３及び表４に＃で示した（＃：Ｐ＜０．０５，＃＃：Ｐ＜０．０１、＃＃＃：Ｐ＜０．００１）。【０１３５】
Ｔ／Ｃ（％）＝（薬剤投与群の平均ＴＶ）/（Ｃｏｎｔｒｏｌ群の平均ＴＶ）× １００【０１３６】
図３に示す結果から明らかなように、本発明化合物Ａはヌードマウスの皮下に移植したＧ７１９Ａ＋Ｔ７９０Ｍ変異型ＥＧＦＲ発現細胞株に対して有意な抗腫瘍効果を示した。また、表４に示すように、その効果はアファチニブに比して高く、その際に図４に示すようにマウスでの重篤な体重減少、便異常、皮膚異常の症状は認められなかった。【０１３７】
【表４】
2019045036.tif 000007
【図１】
2019045036.tif 000008
【図２】
2019045036.tif 000009
【図３】
2019045036.tif 000010
【図４】
2019045036.tif 000011
【配列表】
2019045036000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月17日(2020.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を含有する、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための抗腫瘍剤。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項２】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【請求項４】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩の、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための医薬を製造するための使用。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項６】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩及び薬学的に許容できる担体を含む、エクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するＥＧＦＲを発現している悪性腫瘍患者を治療するための、医薬組成物。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項１０】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
下記工程（１）〜（２）を含む、悪性腫瘍患者における（Ｓ）−Ｎ−（４−アミノ−６−メチル−５−（キノリン−３−イル）−８，９−ジヒドロピリミド［５，４−ｂ］インドリジン−８−イル）アクリルアミド又はその塩を有効成分とする抗腫瘍剤を用いた化学療法の治療効果を予測する方法：
（１）当該患者から採取された生体試料に含まれるＥＧＦＲ遺伝子の変異の有無を検出する工程、及び
（２）上記工程（１）における検出の結果、ＥＧＦＲ遺伝子がエクソン１８のＧ７１９Ｘ変異、エクソン１８のＥ７０９Ｘ変異及びエクソン２１のＬ８６１Ｘ変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有している場合、当該患者に対する当該化学療法が十分な治療効果を示す可能性が高いと予測する工程。
［Ｘは任意のアミノ酸残基を示す。］
【請求項１４】
エクソン１８変異が、Ｇ７１９Ａ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ｃ、Ｅ７０９Ｋ及びＥ７０９Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エクソン２１変異が、Ｌ８６１Ｑである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＧＦＲが更にＴ７９０Ｍ変異を有する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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