(57)【要約】  細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、前記培養液を貯留する培養液貯留室と、前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、前記内面側空間から前記隔膜を透過して前記隔膜の前記第２面が面する外面側空間に流入した前記培養液を前記培養液貯留室に送る培養液排出流路と、を有する。
2019054288.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記細胞培養ユニットは、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、
細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、
前記培養液を貯留する培養液貯留室と、
前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、
前記内面側空間から前記隔膜を透過して前記隔膜の前記第２面が面する外面側空間に流入した前記培養液を前記培養液貯留室に送る培養液排出流路と、を有する、
細胞培養装置。
【請求項２】
前記培養液貯留室から前記内面側空間および前記外面側空間を経て前記培養液貯留室に戻る前記培養液の循環流れに対して逆の前記培養液の流れを規制する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記培養液導入流路に、前記逆流防止機構が設けられている、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記逆流防止機構は、前記循環流れとは逆の方向の気体の流れを阻止するラプラス弁であり、
前記ラプラス弁は、前記培養液導入流路に設けられ、
前記培養室内に、前記培養液導入流路に連設された延長管路が設けられている、請求項２または３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記内面側空間の前記培養液を、前記隔膜を経ずに前記培養液排出流路に導くバイパス流路を備える、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記バイパス流路は、流路断面積が前記バイパス流路における他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する、請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記培養室のうち少なくとも２つ、または、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける第２培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記培養室および前記培養液貯留室は、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する通気孔を有する、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットを互いに連通する気体流路を有し、
前記気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニット内を一括的に加圧することにより、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において前記培養液を循環させることが可能なように構成されている、
請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
細胞培養方法であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットが、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、前記培養液を貯留する培養液貯留室と、前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、を有する細胞培養装置を準備し、
前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記培養液を、前記内面側空間から前記隔膜を透過させて前記隔膜の第２面が面する外面側空間に流入させる、
細胞培養方法。
【請求項１１】
前記細胞は、肝細胞と血管内皮細胞とを含む、請求項１０に記載の細胞培養方法。
【請求項１２】
前記細胞を前記隔膜に接着する際に、前記肝細胞と前記血管内皮細胞とを含む細胞集塊を形成し、前記細胞集塊を前記隔膜に播種する、請求項１１に記載の細胞培養方法。
【請求項１３】
前記培養室および前記培養液貯留室は、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する通気孔を有し、
前記通気孔を介して、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する、請求項１０〜１２のうちいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１４】
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットを互いに連通する気体流路を有し、
前記気体流路を介して、前記複数の前記細胞培養ユニット内を一括的に加圧することにより、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において前記培養液を循環させる、
請求項１０〜１３のうちいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置および細胞培養方法に関する。
本願は、２０１７年９月１３日に日本に出願された特願２０１７−１７６１３７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年の医薬品開発コストは指数関数的に増加しており（例えば、非特許文献１を参照）、臨床試験の成功率も年々低下している（例えば、非特許文献２を参照）。一つの原因として、動物とヒトの種差のため、動物実験結果を臨床試験に直接的に適用できないことが挙げられる。また、化粧品等の化成品開発では、欧州を中心に実験動物の使用が困難となってきている。このような状況の中で、ヒト由来の培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイに対する期待が高まっている。
一方、従来の細胞アッセイで利用されてきた単層培養は、細胞を取り巻く環境が生体内と大きく異なり、培養細胞では体内で発現している機能の多くが失われている点がしばしば問題となる。近年の微細加工技術や三次元培養技術の進歩により、培養細胞で体内で発現している機能の多くが失われる問題が克服され、細胞アッセイのスループットと信頼性が同時に向上されると期待されている（例えば、非特許文献３，４を参照）。特に、生理学的な三次元培養環境をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再現したマイクロ流体デバイスを一つの臓器のように取り扱うＯｒｇａｎ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐという概念が広がり、医薬品開発への応用を意識した研究が世界的に広く展開されつつある（例えば、非特許文献５，６を参照）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構成した複数の臓器モデルをマイクロ流路等で接続し、個体応答の再現を目指すＢｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐという概念も提唱され、急速に注目を集めている（例えば、非特許文献７を参照）。【０００３】
このように、ヒト由来の培養細胞によって構成される臓器モデルを生体外で再構成し、生理学的な機能を再現した細胞培養装置は、細胞アッセイの信頼性が向上させると期待されている。例えば、肝臓は、生体の薬物代謝に関わる主要臓器であるため、三次元肝組織の培養技術への期待は特に大きい。三次元肝組織を用いて薬物代謝を評価するためには、生体外で長期にわたって肝機能を維持しなければならない。そのためには血管網を有する三次元組織の構築が必要であるが、血管網を有する三次元組織を生体外で構築する手法は確立されておらず、血管網を有する三次元組織を生体外で構築することは大きな課題となっている。
非特許文献８および特許文献１には、隔膜の上に細胞を配置し、隔膜に対して培養液を外部ペリスタポンプや内蔵型ペリスタポンプで送液することで三次元組織を灌流培養する装置が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】日本国特開２０１７−７９６３３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Scannell, J. W. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 11, 191 (2012)
【非特許文献２】Pammolli, F. et al. Nat. Rev. Drug Discov., 10, 428 (2011)
【非特許文献３】van Midwoud, P. M. et al. Integr. Biol., 3, 509 (2012)
【非特許文献４】Ghaemmaghami, A. M. et al. Drug Discov. Today, 17, 173 (2012)
【非特許文献５】Bhatia, S. N. et al. Nat. Biotechnol., 32, 760 (2014)
【非特許文献６】Baker, M. Nature, 471, 661 (2011)
【非特許文献７】Sung, J. H. et al. Lab Chip, 13, 1201 (2013)
【非特許文献８】Domansky, K. et al. Lab Chip, 10, 51 (2010)
【非特許文献９】Takebe, T. et al. Nature., 499(7459): 481 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肝細胞と血管内皮細胞とを共培養して作製した血管網配備肝組織を生体内に移植して正着させた例が報告されている（非特許文献９を参照）。
しかしながら、前記培養装置では、生体内で形成される三次元組織を十分に再現するのは難しかった。例えば、前記培養装置では、肝細胞と血管内皮細胞とを共培養した系における、三次元組織内での血管組織の形成は報告されていない。そのため、長期にわたる肝機能の維持は難しいと考えられる（例えば、非特許文献８を参照）。【０００７】
本発明は、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を構築できる細胞培養装置および細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一態様に係る細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、前記培養液を貯留する培養液貯留室と、前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、前記内面側空間から前記隔膜を透過して前記隔膜の前記第２面が面する外面側空間に流入した前記培養液を前記培養液貯留室に送る培養液排出流路と、を有する。【０００９】
前記培養液貯留室から前記内面側空間および前記外面側空間を経て前記培養液貯留室に戻る前記培養液の循環流れに対して逆の前記培養液の流れを規制する逆流防止機構をさらに備えていてもよい。
前記培養液導入流路に、前記逆流防止機構が設けられていてもよい。
前記逆流防止機構は、前記循環流れとは逆の方向の気体の流れを阻止するラプラス弁であり、前記ラプラス弁は、前記培養液導入流路に設けられ、前記培養室内に、前記培養液導入流路に連設された延長管路が設けられていてもよい。
前記内面側空間の前記培養液を、前記隔膜を経ずに前記培養液排出流路に導くバイパス流路を備えていてもよい。
前記バイパス流路は、流路断面積が前記バイパス流路における他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有していてもよい。
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記培養室のうち少なくとも２つ、または、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける第２培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されていてもよい。
前記培養室および前記培養液貯留室は、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する通気孔を有していてもよい。
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、前記複数の前記細胞培養ユニットを互いに連通する気体流路を有し、前記気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニット内を一括的に加圧することにより、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において前記培養液を循環させることが可能なように構成されていてもよい。【００１０】
本発明の第二態様に係る細胞培養方法は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットが、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、前記培養液を貯留する培養液貯留室と、前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、を有する細胞培養装置を準備し、前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記培養液を、前記内面側空間から前記隔膜を透過させて前記隔膜の第２面が面する外面側空間に流入させる。
前記細胞は、肝細胞と血管内皮細胞とを含んでいてもよい。
前記細胞を前記隔膜に接着する際に、前記肝細胞と前記血管内皮細胞とを含む細胞集塊を形成し、前記細胞集塊を前記隔膜に播種してもよい。
前記培養室および前記培養液貯留室は、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する通気孔を有し、前記通気孔を介して、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出してもよい。
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、前記複数の前記細胞培養ユニットを互いに連通する気体流路を有し、前記気体流路を介して、前記複数の前記細胞培養ユニット内を一括的に加圧することにより、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において前記培養液を循環させてもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の上記態様によれば、培養液貯留室の培養液を培養室の内面側空間に導く培養液導入流路と、外面側空間の培養液を培養液貯留室に送る培養液排出流路とを備えている。そのため、内面側空間の圧力を高くする工程と、内面側空間の圧力を低くする工程とを繰り返すと、培養液が灌流する環境下で、細胞に加えられる圧力を変動させつつ、細胞を培養することができる。そのため、例えば、肝細胞と血管内皮細胞とを含む細胞の培養において、血管内皮細胞の管腔構造を形成できる。よって、前記細胞において、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を構築し、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を長期にわたって維持できる。したがって、医薬品候補物質などの被検体を正確に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図２】図１の細胞培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図３】図１の細胞培養装置の第１変形例を示す概略図である。
【図４】図１の細胞培養装置の第２変形例を示す概略図である。
【図５】図４の細胞培養装置を模式的に示す斜視図である。
【図６】第２実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図７】第３実施形態に係る細胞培養装置を模式的に示す概略図である。
【図８】ラプラス弁の説明図である。（Ａ）ラプラス弁が設けられた液体貯留室の部分拡大図である。（Ｂ）ラプラス弁を介して下流口から連絡流路に培地が流入する場合の模式図である。（Ｃ）下流口に空気が流入した際に、ラプラス弁が機能している際の模式図を示す。
【図９】培養液中のアルブミン濃度の変化を示すグラフである。
【図１０】細胞の位相差観察像である。
【図１１】細胞の共焦点レーザー顕微鏡の観察像および位相差観察像である。
【図１２】培養液中のアルブミン濃度の変化を示すグラフである。
【図１３】肝機能に関わる遺伝子発現を示すグラフである。
【図１４】肝機能に関わる遺伝子発現を示すグラフである。
【図１５】ＣＹＰ３Ａ４活性測定の結果を示すグラフである。
【図１６】各播種条件における免疫染色、ＨＥ染色像、および三次元構造を有する細胞の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（第１実施形態）
［細胞培養装置］
本発明の第１実施形態に係る細胞培養装置は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットは、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、前記培養液を貯留する培養液貯留室と、前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、前記内面側空間から前記隔膜を透過して前記隔膜の前記第２面が面する外面側空間に流入した前記培養液を前記培養液貯留室に送る培養液排出流路と、を有する。
第１実施形態に係る細胞培養装置１０について、図面を参照して説明する。
図１は、細胞培養装置１０を模式的に示す概略図である。図２は、細胞培養装置１０の一部を模式的に示す斜視図である。
図１に示すように、細胞培養装置１０は、貯留槽１１を備えている。貯留槽１１は、容器状の槽本体１２と、蓋部１３とによって構成されており、１つの細胞培養ユニット９を形成する。
【００１４】
図１および図２に示すように、細胞培養ユニット９は、培養室１と、隔膜２と、培養液貯留室３と、培養液導入流路４と、培養液排出流路５と、を有する。
培養室１および培養液貯留室３は、貯留槽１１の槽本体１２に形成された凹部によって確保された空間であり、培養液Ｃ（液体）を貯留可能である。
【００１５】
図１に示すように、培養室１は、主室１ｃと、主室１ｃの底面１ｅに形成された凹部１ｄとを有する。主室１ｃの内部空間および凹部１ｄの上部の内部空間は内面側空間１ａである。凹部１ｄの下部の内部空間であって、隔膜２で区画される空間は外面側空間１ｂである。外面側空間１ｂは隔膜２の下方に位置している。培養室１は、培養液Ｃを貯留可能である。
【００１６】
隔膜２は、培養室１内において、内面側空間１ａと外面側空間１ｂとを隔てている。隔膜２は、凹部１ｄの底面より高い位置にある。隔膜２の内面２ａ（一方の面、第１面）は内面側空間１ａに面しており、外面２ｂ（他方の面、第２面）は外面側空間１ｂに面している。
【００１７】
隔膜２は、内面側空間と外面側空間の圧力差により流体が透過可能である。細胞２０は隔膜２を透過できない。
隔膜２は多孔質膜であってもよい。隔膜２の平均細孔径は、例えば、０．１μｍ〜１０μｍである。隔膜２の細孔の大きさは、液体は通過するが、細胞２０が通過できない大きさである（隔膜２は液体に対して透過性を有する）。隔膜２の材質は、例えば、ポリカーボネート、ポリエステル、シリコーン樹脂等である。
【００１８】
隔膜２は、内面２ａが細胞接着性材料でコーティングされていることが好ましい。細胞接着性材料としては、例えば、細胞接着性を有するタンパク質が使用できる。細胞接着性材料としては、ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、マトリゲル、およびポリリジンなどが使用できる。
隔膜２の厚みは０．１〜１００μｍが好ましい。
【００１９】
培養液導入流路４は、一端（第１端）が培養液貯留室３の底部に接続され、他端（第２端）が培養室１の主室１ｃの底部に接続されている。培養液導入流路４によって、培養液貯留室３と内面側空間１ａとは連通している。培養液導入流路４は、培養液貯留室３の培養液Ｃを内面側空間１ａに導くことができる。
【００２０】
培養液排出流路５は、一端（第１端）が凹部１ｄの底部に接続され、他端（第２端）が培養液貯留室３の底部に接続されている。培養液排出流路５によって、培養液貯留室３と外面側空間１ｂとは連通している。培養液排出流路５は、外面側空間１ｂの培養液Ｃを培養液貯留室３に導くことができる。
【００２１】
蓋部１３は、槽本体１２の開口を開閉自在かつ気密に閉止する。詳しくは、蓋部１３は、培養室１および培養液貯留室３の上部開口をそれぞれ気密に閉止可能である。
【００２２】
蓋部１３は、培養室１および培養液貯留室３に相当する位置に、それぞれ通気孔１ｈ，３ｈを有する。通気孔１ｈ，３ｈは、それぞれ培養室１および培養液貯留室３に対して気体（例えば、空気）を供給、および、培養室１および培養液貯留室３から気体（例えば、空気）を排出することができる。通気孔１ｈ，３ｈにはそれぞれエアフィルタ１７が設けられることが好ましい。エアフィルタ１７によって、培養室１および培養液貯留室３に異物が混入するのを防ぐことができる。
【００２３】
培養室１の主室１ｃには、コンプレッサなどの加圧ポンプである第１圧力調整部１４Ａを用いて、通気孔１ｈを通して気体（例えば、空気）を供給できる。培養液貯留室３には、コンプレッサなどの加圧ポンプである第２圧力調整部１４Ｂを用いて、通気孔３ｈを通して気体（例えば、空気）を供給できる。
【００２４】
図１の細胞培養装置１０では、圧力調整部１４Ａ，１４Ｂが気体を供給することによって、培養室１（詳しくは内面側空間１ａ）および培養液貯留室３の圧力を調整することができるが、培養室１（内面側空間１ａ）および培養液貯留室３の圧力を調整する構造は圧力調整部１４Ａ，１４Ｂに限らない。例えば、水頭圧によって培養室１および培養液貯留室３に培養液を供給し、培養室１（内面側空間１ａ）および培養液貯留室３の圧力を高める構造を採用してもよい。
【００２５】
培養室１には、培養液導入流路４の他端（第２端）に、逆止弁５１が設けられている。逆止弁５１は、培養液導入流路４から内面側空間１ａへ向かう培養液Ｃの流れ（順方向の流れ）を許容し、かつその逆の方向の流れ（内面側空間１ａから培養液導入流路４へ向かう培養液Ｃの流れ）を阻止する。
【００２６】
逆止弁５１としては、例えば、弁孔を有する弁座と、弁体とを備えた構造を有する逆止弁を例示できる。この構造を有する逆止弁は、液が順方向に流れる際には、弁体が弁座から離れることにより弁孔が開かれるため、液は弁孔を通過して順方向に流れる。液が逆方向に流れる際には、弁体が弁座に当接して弁孔が閉止されるため、当該方向の液の流れ（逆方向への液の流れ）は阻止される。
逆止弁５１は、培養液の流れを規制する逆流防止機構の例である。逆止弁５１は、培養液Ｃの循環流れ（培養液貯留室３から、内面側空間１ａ、隔膜２、外面側空間１ｂを経て培養液貯留室３に戻る流れ）の方向とは逆の方向の流れを阻止できる。
【００２７】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０を用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
本実施形態に係る細胞培養方法は、１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットが、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、前記培養液を貯留する培養液貯留室と、前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、を有する細胞培養装置を準備し、前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記培養液を、前記内面側空間から前記隔膜を透過させて前記隔膜の第２面が面する外面側空間に流入させる。
細胞２０を隔膜２の内面２ａに播種して接着させるとともに、培養液Ｃを培養室１および培養液貯留室３に導入する。細胞２０は、例えば、肝細胞が挙げられる。細胞２０は、例えば、肝細胞と血管内皮細胞とを含むことが好ましい。細胞２０は、隔膜２の内面２ａにおいて複数の層を形成することが好ましい。複数の層を構成する細胞２０は三次元構造となる。
【００２８】
細胞２０を隔膜２に接着するにあたっては、隔膜２の内面側（内面２ａ）を細胞接着性材料で事前にコーティングしておくことが好ましい。また、細胞２０を隔膜２に導入するにあたっては、例えば、肝細胞と血管内皮細胞の懸濁液を隔膜２の内面側（内面２ａ）に導入する方法が可能である。また、肝細胞と血管内皮細胞とを含む細胞集塊（スフェロイドやliver bud）を形成し、この細胞集塊を隔膜２に播種する方法も可能である。
【００２９】
（１）工程１
蓋部１３をパッキン１６に押し当てるようにして閉じ、培養室１および培養液貯留室３の上部開口１ｇ，３ｇを気密に閉止する。
通気孔１ｈを通して培養室１に気体（例えば、空気）を供給して培養室１（詳しくは内面側空間１ａ）を加圧する。この際、培養液貯留室３は通気孔３ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
内面側空間１ａの圧力が外面側空間１ｂの圧力より高くなることによって、内面側空間１ａの培養液Ｃの一部は隔膜２を透過して外面側空間１ｂに移行する。これにより、培養室１の内面側空間１ａから隔膜２、外面側空間１ｂを経て、培養液排出流路５を通って培養液貯留室３に送られる培養液Ｃの流れが生じる。この際、細胞２０は隔膜２を透過しない。
なお、培養室１は逆止弁５１を有するため、内面側空間１ａの培養液Ｃは培養液導入流路４には流入しない。
【００３０】
（２）工程２
通気孔３ｈを通して培養液貯留室３に気体（例えば、空気）を供給して培養液貯留室３を加圧する。この際、培養室１は通気孔１ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
培養液貯留室３の圧力が内面側空間１ａの圧力より高くなることによって、培養液貯留室３の培養液Ｃの一部は培養液導入流路４を通して培養室１の内面側空間１ａに導入される。
【００３１】
隔膜２には細胞２０が付着しているため、流体抵抗が培養液導入流路４の流体抵抗と比べて一般的に大きくなる。そのため、培養液貯留室３の培養液Ｃは主に培養液導入流路４を通して培養室１の内面側空間１ａに導入され、培養液排出流路５への流入量は少なくなる。特に、細胞２０が複数の層を有する三次元構造となっている場合、三次元構造を有する細胞２０が付着した隔膜２により、流体抵抗が大きくなるため、培養液貯留室３の培養液Ｃは培養液排出流路５には流れにくい。
【００３２】
工程１および工程２を繰り返すことによって、培養室１の内面側空間１ａから隔膜２を透過し、外面側空間１ｂを経て培養液貯留室３に送られ、再び培養室１の内面側空間１ａに戻る培養液Ｃの流れ（循環流れ）を生じさせることができる。培養液Ｃが隔膜２の透過方向に流れることによって、三次元構造の細胞２０の厚さ方向の全体に十分な量の培養液Ｃを供給できる。
【００３３】
本実施形態に係る細胞培養方法は、具体的には、例えば、次のような試験への適用が考えられる。
被検体となる物質を系内（例えば、培養室１の内面側空間１ａ）に添加することによって、被検体となる物質の、細胞２０に対する影響を評価することができる。被検体となる物質としては医薬品候補物質、その他の化成品（食品添加物、化粧品原料、塗料、農薬など）に用いられる化学物質が挙げられる。
【００３４】
細胞培養装置１０は、培養液貯留室３における培養液Ｃを内面側空間１ａに導く培養液導入流路４と、外面側空間１ｂにおける培養液Ｃを培養液貯留室３に送る培養液排出流路５とを備えている。そのため、内面側空間１ａの圧力を高くする工程１と、内面側空間１ａの圧力を低くする工程２とを繰り返すと、培養液Ｃが灌流する環境下で、細胞２０に加えられる圧力を変動させつつ、細胞２０を培養することができる。そのため、例えば、肝細胞と血管内皮細胞とを含む細胞２０の培養において、血管内皮細胞の管腔構造を形成できる。よって、細胞２０において、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を構築し、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を長期にわたって維持できる。したがって、医薬品候補物質などの被検体を正確に評価することができる。
【００３５】
細胞培養装置１０では、培養液Ｃの循環使用が可能となるため、被検体を連続的に細胞２０に曝露することができ、培養液Ｃの使用量を削減できる。また、蓋部１３が開閉可能な構成となっているため、無菌的操作も容易になる。
【００３６】
細胞培養装置１０は、流路等の構造が簡略であるため、装置構造を簡略化して装置を小型化するとともに、装置の設定等の操作を容易にすることができる。
【００３７】
（第１実施形態の第１変形例）
第１実施形態に係る細胞培養装置１０の第１変形例について、図３を参照して説明する。図３は、細胞培養装置１０の変形例である細胞培養装置１０ａを示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
【００３８】
図３に示すように、培養液貯留室３には、培養液排出流路５の他端（第２端）に、逆止弁５２が設けられている。逆止弁５２は、培養液排出流路５から培養液貯留室３へ向かう培養液Ｃの流れを許容し、かつその逆の方向の流れ（培養液貯留室３から培養液排出流路５への流れ）を阻止する。培養液貯留室３に逆止弁５２が設けられているため、工程２では、培養液貯留室３の培養液Ｃは培養液排出流路５には流入しない。
【００３９】
培養液導入流路４の一端（第１端）には、ラプラス弁５３が設けられている。ラプラス弁５３は、培養液貯留室３から培養液導入流路４への培養液Ｃの流れを許容し、かつ気体（例えば、空気）の流入を阻止する。
ラプラス弁５３は、培養液Ｃの循環流れ（培養液貯留室３から、内面側空間１ａ、隔膜２、外面側空間１ｂを経て培養液貯留室３に戻る流れ）の方向とは逆の方向の流れを阻止できる。
【００４０】
ラプラス弁５３の構造と機能を、図８（Ａ）〜図８（Ｃ）を用いて説明する。図８（Ａ）は、ラプラス弁１１７が設けられた液体貯留室の部分拡大図を示す。図８（Ｂ）は、ラプラス弁１１７を介して下流口１１４から連絡流路１１５に培地１３１が流入する場合の模式図を示す。図８（Ｃ）は、下流口１１４に空気が流入した際に、ラプラス弁１１７が機能している際の模式図を示す。図８（Ｃ）に示すように、微細な流路内において、培地１３１と空気との間には界面張力による圧力差、すなわちラプラス圧が発生する。流路の表面が液体培地で濡れている場合は、ラプラス圧未満の空気圧条件下において液体が満たされた微細流路に空気は流入しえない。このような条件下で微細流路は受動的な空気流入防止機構として扱うことができる。
【００４１】
ラプラス弁の設計について、以下に説明する。
ラプラス弁に空気が流入してしまう圧力（ラプラス圧、限界圧力）（ΔＰＬａｐ）は界面張力（γ）およびラプラス弁を構成するマイクロ流路の幅（ｗＬ）および深さ（ｈＬ）によって以下の式（１）で計算できる。
【００４２】
【数１】
2019054288.tif 000003
【００４３】
細胞培養装置を駆動するための現実的な圧力範囲は市販の圧力制御装置で調整可能な圧力範囲および細胞の耐圧性によって決定されると考えられる。
仮に細胞の耐圧性を生体内の血圧の上限程度（３０ｋＰａ＝２２５ｍｍＨｇ）とすると、本実施形態に係る細胞培養装置を駆動するために現実的な圧力範囲は１ｋＰａ〜３０ｋＰａ程度となる。培養液の界面張力は６０ｍＮ／ｍ程度であり、ラプラス弁を構成するマイクロ流路の断面が正方形の場合、つまりｗＬ＝ｈＬの場合、３０ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法（長さ）は上記式（１）よりｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ程度、１ｋＰａで空気が流入するマイクロ流路の寸法（長さ）はｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ程度と推算される。
ラプラス弁を構成するマイクロ流路の寸法を上記寸法（３０ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝８μｍ、１ｋＰａのときのｗＬ＝ｈＬ＝２４０μｍ）よりも小さくすることで、想定する圧力で運用した際にラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
すなわち、ラプラス弁が機能するための限界の圧力であるラプラス圧ΔＰＬａｐが、本実施形態に係る細胞培養装置で使用する圧力範囲よりも大きくなるように、ラプラス弁を構成するマイクロ流路を形成すれば、ラプラス弁に空気が流入してしまうことを防ぐことができる。
なお、ｗＬとｈＬの比率が１：１でない場合も同様に式（１）に基づいて流路の寸法を設計することが可能である。
ラプラス弁５３は、培養液の流れを規制する逆流防止機構の例である。
【００４４】
（第１実施形態の第２変形例）
第１実施形態に係る細胞培養装置１０の第２変形例について、図４および図５を参照して説明する。図４は、細胞培養装置１０の変形例である細胞培養装置１０ｂを示す概略図である。図５は、細胞培養装置１０ｂを模式的に示す斜視図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。図４では、第１圧力調整部１４Ａおよび第２圧力調整部１４Ｂ（図１参照）は省略されている。
【００４５】
図４および図５に示すように、培養室１の主室１ｃ内には、培養液導入流路４の他端（第２端）に連設されて上方に延出する延長管路（延長筒部）４１が設けられている。延長管路４１の上端開口４１ａは、延長管路４１の基端４１ｂより高い位置にある。
培養液貯留室３内には、培養液排出流路５の他端（第２端）に連設されて上方に延出する延長管路４２が設けられている。延長筒部４２の上端開口４２ａは、延長筒部４２の基端４２ｂより高い位置にある。
培養液排出流路５の他端（第２端）には、ラプラス弁５４が設けられている。ラプラス弁５４は、培養液排出流路５から培養液貯留室３への培養液Ｃの流れを許容し、かつ気体（例えば、空気）の流入を阻止する。
【００４６】
工程１では、培養室１（詳しくは内面側空間１ａ）の圧力上昇に伴って延長管路４１および培養液導入流路４の培養液Ｃは培養液貯留室３に流入できるが、延長管路４１および培養液導入流路４の培養液Ｃがなくなった時点で、ラプラス弁５３によって、培養液導入流路４を介した培養液貯留室３への培養液Ｃの流入は停止する。一方、培養室１から、隔膜２、培養液排出流路５を介して培養液貯留室３へ向かう培養液Ｃの流れは許容される。
培養液Ｃは、延長管路４２の上端開口４２ａから培養液貯留室３内に流れ込む。よって、培養液Ｃの循環流れ（培養室１の内面側空間１ａから、隔膜２、外面側空間１ｂ、培養液排出流路５、培養液貯留室３を経て培養室１の内面側空間１ａに戻る流れ）は許容され、逆の方向の流れは規制される。
【００４７】
工程２では、培養液貯留室３の圧力上昇に伴って延長筒部４２内の培養液Ｃは培養液排出流路５に流入できるが、延長筒部４２の培養液Ｃがなくなった時点で、ラプラス弁５４によって、培養液排出流路５への培養液Ｃの流入は停止する。一方、培養液貯留室３から、培養液導入流路４を介して培養室１に向かう培養液Ｃの流れは許容される。培養液Ｃは延長管路４１の上端開口４１ａから培養室１の主室１ｃ内に流れ込む。よって、培養液Ｃの循環流れは許容され、逆の方向の流れは規制される。
【００４８】
細胞培養装置１０ｂは、第１実施形態と同様に、培養液Ｃが灌流する環境下で、細胞２０に加えられる圧力を変動させつつ、細胞２０を培養することができる。そのため、例えば、肝細胞と血管内皮細胞とを含む細胞２０の培養において、血管内皮細胞の管腔構造を形成できる。よって、細胞２０において、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を構築し、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を長期にわたって維持できる。したがって、医薬品候補物質などの被検体を正確に評価することができる。
【００４９】
（第２実施形態）
［細胞培養装置］
第２実施形態に係る細胞培養装置１０Ａについて、図６を参照して説明する。図６は、細胞培養装置１０Ａを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
図６に示すように、細胞培養装置１０Ａは、貯留槽１１Ａを備えている。貯留槽１１Ａは、槽本体１２Ａと、蓋部１３とによって構成されており、細胞培養ユニット９Ａを形成する。
【００５０】
細胞培養ユニット９Ａは、培養室１と、隔膜２と、培養液貯留室３と、培養液導入流路４と、培養液排出流路５と、バイパス流路（バイパス経路）６とを有する。細胞培養ユニット９Ａは、バイパス流路６を有する点で、第１実施形態に係る細胞培養装置１０の細胞培養ユニット９（図１参照）と異なる。
【００５１】
バイパス流路６は、一端（第１端）が培養室１の主室１ｃの底部に接続され、他端（第２端）が培養液排出流路５に接続されている。バイパス流路６は、内面側空間１ａの培養液Ｃを、隔膜２を経ずに培養液排出流路５に導くことができる。これにより、隔膜２の内面側に形成された三次元組織の細胞２０を介した液の循環が困難な状態においても、細胞培養装置１０Ａの中の培養液の循環を可能とすることができる。
【００５２】
バイパス流路６は、流路断面積（培養液Ｃの流れ方向に直交する断面の面積）がバイパス流路６における他の部位より小さい（例えば、流路断面積が他の部位の１／１０以下である）抵抗流路部位６ａを有していてもよい。
抵抗流路部位６ａの流路断面積は、例えば、他の部位の１／１０以下であってよい。抵抗流路部位６ａの断面積が他の部位の断面積の１／１０となると、流路抵抗は他の部位に比べて１００倍となる。抵抗流路部位６ａによって、液の流量の調節が可能である。
【００５３】
抵抗流路部位６ａについて説明する。
断面が矩形のマイクロ流路を流れる液体の流量（Ｑ）と圧力損失（ΔＰ）には以下の関係がある（F. M. White, Viscous Fluid Flow, McGraw-Hill Companies, Inc, Boston, 2006を参照）。
【００５４】
【数２】
2019054288.tif 000004
【００５５】
【数３】
2019054288.tif 000005
【００５６】
式（２）および式（３）において、ΔＰはマイクロ流路の入口と出口の圧力差、Ｒは流路抵抗、μは流体の粘度、ｌはマイクロ流路の長さ、ｗはマイクロ流路の幅、ｈはマイクロ流路の深さである。当該式（２）および式（３）はｗ＞ｈの条件で成立する。
【００５７】
例えば、抵抗流路部位６ａが接続される培養液排出流路５において、抵抗流路部位と、抵抗流路部位以外の部分の部位との長さが等しい場合を考える。抵抗流路の断面積が他の部位の断面積の１／１０となると、幅ｗ、深さｈが１／１００．５となり、式（３）の抵抗流路の流路抵抗Ｒが、抵抗流路以外の部位の流路抵抗Ｒの１００倍となる。式（２）より、圧力損失についても抵抗流路の圧力損失が、抵抗流路以外の部位の圧力損失の１００倍となる。
流路の一部に、流路断面積が１／１０以下となっている抵抗流路部位が形成された場合には、抵抗流路の圧力損失のみを考慮して流路設計をすることで流路網の設計が容易になるという利点がある。
【００５８】
［細胞培養方法］
次に、細胞培養装置１０Ａを用いて細胞を培養する方法の一例について説明する。
（１）工程１
通気孔１ｈを通して培養室１に気体（例えば、空気）を供給して培養室１（詳しくは内面側空間１ａ）を加圧する。この際、培養液貯留室３は通気孔３ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
内面側空間１ａの圧力が外面側空間１ｂの圧力より高くなることによって、内面側空間１ａの培養液Ｃの一部は隔膜２を透過して外面側空間１ｂに移行する。これにより、培養室１の内面側空間１ａから隔膜２、外面側空間１ｂを経て、培養液排出流路５を通って培養液貯留室３に送られる培養液Ｃの流れが生じる。この際、細胞２０は隔膜２を透過しない。
【００５９】
隔膜２や隔膜２の内面側に形成された三次元組織の細胞２０の流通抵抗が大きい場合には、内面側空間１ａから隔膜２を通過して外面側空間１ｂに流れる培養液Ｃの流量が低くなるが、内面側空間１ａの培養液Ｃの一部はバイパス流路６を通って培養液排出流路５に流れるため、培養液Ｃの循環流量の低下を防ぐことができる。
【００６０】
（２）工程２
通気孔３ｈを通して培養液貯留室３に気体（例えば、空気）を供給して培養液貯留室３を加圧する。この際、培養室１は通気孔１ｈを通して大気に開放しておくことが好ましい。
培養液貯留室３の圧力が内面側空間１ａの圧力より高くなることによって、培養液貯留室３の培養液Ｃの一部は培養液導入流路４を通して培養室１の内面側空間１ａに導入される。
【００６１】
工程１および工程２を繰り返すことによって、培養室１の内面側空間１ａから隔膜２を透過し、外面側空間１ｂを経て培養液貯留室３に送られ、再び培養室１の内面側空間１ａに戻る培養液Ｃの流れ（循環流れ）を生じさせることができる。培養液Ｃが隔膜２の透過方向に流れることによって、三次元構造の細胞２０の厚さ方向の全体に十分量の培養液Ｃを供給できる。
【００６２】
細胞培養装置１０Ａは、第１実施形態と同様に、培養液Ｃが灌流する環境下で、細胞２０に加えられる圧力を変動させつつ、細胞２０を培養することができる。そのため、例えば、肝細胞と血管内皮細胞とを含む細胞２０の培養において、血管内皮細胞の管腔構造を形成できる。よって、細胞２０において、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を構築し、生体内における生理学的な機能を再現可能な三次元組織を長期にわたって維持できる。したがって、医薬品候補物質などの被検体を正確に評価することができる。
【００６３】
細胞培養装置１０Ａは、隔膜２の透過抵抗が大きい場合でも培養液Ｃの循環流量の低下を防ぐことができるため、培養室１において培養液Ｃが灌流する環境を維持できる。そのため、細胞２０および隔膜２における物質移動を促進できる。よって、細胞２０において、前述の三次元組織を、生理学的な機能を保ちつつ長期にわたって維持できる。
【００６４】
（第３実施形態）
第３実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂについて、図７を参照して説明する。図７は、細胞培養装置１０Ｂを模式的に示す概略図である。なお、既出の構成と同じ構成については、同じ符号を付して説明を省略する。
細胞培養装置１０Ｂは、複数の細胞培養ユニット９（図１および図２参照）を有する。
複数の細胞培養ユニット９の培養室１のうち少なくとも２つは、例えば、蓋部１３（図１参照）に形成された気体流路（第１の気体流路）１８によって互いに連通されている。
複数の細胞培養ユニット９の培養液貯留室３のうち少なくとも２つは、例えば、蓋部１３（図１参照）に形成された気体流路（第２の気体流路）１９によって互いに連通されていることが好ましい。
【００６５】
細胞培養装置１０Ｂでは、複数の細胞培養ユニット９が、気体流路１８によって互いに連通されているため、複数の細胞培養ユニット９の培養室１を一括的に加圧することができる。複数の培養液貯留室３が気体流路（図示略）によって互いに連通されている場合には、複数の細胞培養ユニット９の培養液貯留室３を一括的に加圧することができる。そのため、細胞培養装置１０Ｂでは、容易な操作で、複数の細胞培養ユニット９における試験を並列的に行うことができる。したがって、創薬スクリーニング等において効率の高い試験が可能である。
【００６６】
なお、例えば、非特許文献８において、内臓型ペリスタポンプで送液し、三次元組織の灌流培養を行う方法が記載されている。
一般的に、内臓型ペリスタポンプで送液する場合には、三次元組織内の構造と関係なく、一定流量の流れ条件における細胞組織培養が行われる。この場合、例えば、三次元組織内に血管組織が発達していない場合など、細胞組織に過剰の送液負荷がかかってしまう。
一方、上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法によれば、培養室および培養液貯留室に設置した通気孔を介して加圧、大気圧開放を繰り返すことで培養液を循環させる構成を有している。
すなわち、上記実施形態における圧力駆動による送液方式では、一定圧力で加圧して培養液を送液するため、三次元組織内の血管組織の発達に応じて、培養液の流量が調整される。
上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法においては、肝細胞と血管内皮細胞を灌流条件下で共培養し、血管様構造を有する肝細胞の三次元組織を構築して培養することができる。これに伴い、狭い培養面積においても大量の細胞を代謝酵素などの発現が保持されたまま培養できることが期待できる。
また、上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法によれば、従来の培養方法と比較して、多くの細胞を培養容器に導入して培養することが可能であり、例えば、面積あたり８０倍程度の細胞を培養容器に導入して培養することが可能である。
一般的に、Ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐやＢｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐに実装する培養装置および培養方法では、狭い空間で高い代謝活性が求められており、上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法は、従来の細胞培養装置および細胞培養方法と比較して優位な方法である。
また、肝細胞のインビトロ培養技術において胆汁排泄を適切に評価する技術は存在しない。
上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法によると、肝細胞の胆管側の膜に発現するトランスポーター（ＭＲＰ２）の発現が向上することが確認されており、従来の培養方法では実現することができなかった機能を発現させることが可能である。
【実施例】
【００６７】
（実施例１〜３）
図１に示す細胞培養装置１０を作製した。隔膜２としては、薄層マトリゲルコートを施したトランズウェル（孔径１μｍ）を使用した。
薄層マトリゲルコートは、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を無血清培地で希釈し、１００μｇ／ｃｍ２となるようトランズウェルに添加することによって形成した。この薄層マトリゲルコートを、室温で１時間以上静置した後にＰＢＳで２回洗浄した。
細胞２０として、ヒト肝癌由来細胞ＨｅｐＧ２と、ヒト血管内皮細胞ＨＵＶＥＣと、ヒト不死化間葉系幹細胞ＵＣＢＴＥＲＴ−２１とを表１に示す組成で使用し、細胞培養装置１０で培養した。【００６８】
細胞を蛍光観察するため、ＨＵＶＥＣはＣｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて蛍光染色を行った。ＨｅｐＧ２、およびＵＣＢＴＥＲＴ−２１はＣｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて蛍光染色を行った。細胞培養装置１０の各流路には空気抜きのため、細胞を播種する直前に培養液を注入した。各細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣ、ＵＣＢＴＥＲＴ−２１）は、トリプシン処理にて剥離した後に培地（培養液）に懸濁して細胞数をカウントした。
細胞２０の播種は、１５ｍＬチューブにそれぞれ表１の細胞数に相当する細胞懸濁液をそれぞれ入れ、遠心分離によって細胞を回収した後に培地（７０μＬ）に再懸濁した懸濁液を直接播種することで行った。【００６９】
細胞２０の播種後、３時間程度、静置培養して十分に細胞をトランズウェル（隔膜２）に接着させた後に、ウェル内に培地をさらに添加し、総培地量を１．１５ｍＬとした。そのまま約２４時間置き、循環培養を開始した。この循環培養開始日をＤａｙ０（培養０日目）とし、１〜３日ごとに１．１５ｍＬの培地を交換しつつ循環培養を行った。
アルブミン定量のための培地のサンプリングは１〜３日ごとに行い、その際に培地交換および位相差顕微鏡による観察を行った。アルブミン定量はＥＬＩＳＡにて行った（ＡｓｓａｙＰｒｏ，  Ａｌｂｕｍｉｎ，  Ｈｕｍａｎ，  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ，  ＡｓｓａｙＭａｘを使用）。細胞塊内のそれぞれの細胞の局在は共焦点レーザー顕微鏡（横河電機、ＣＳＵ１０）にて観察した。【００７０】
培養１３日目の各細胞の定量ＰＣＲによる遺伝子発現を解析した。解析の対象とした遺伝子は薬物代謝酵素のＣＹＰ１Ａ２、  ＣＹＰ３Ａ４およびアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ）の３種類である。各細胞はＰＢＳで２回洗浄した後に、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出した。ｃＤＮＡはＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖ．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。
定量ＰＣＲはＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。各遺伝子に対するプライマーとしては、ＣＹＰ１Ａ２：Ｈｓ＿ＣＹＰ１Ａ２＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＣＹＰ３Ａ４：ＣＹＰ３Ａ４＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ
Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）、Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｈｓ＿ＡＬＢ＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、内部標準としてＧＡＰＤＨ：ＧＡＰＤＨ＿１＿ＳＧ  ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。定量ＰＣＲの結果は、それぞれの細胞数の比率に応じてＤａｙ０の遺伝子発現量で規格化した。
培養１３日目のＣＹＰ３Ａ４活性は、Ｐ４５０−ＧｌｏＴＭ  ＣＹＰ３Ａ４  Ａｓｓａｙ  （Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−ＩＰＡ）、（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。なお、基質添加時の培地量は１ｍＬとし、２時間反応させた後に発光測定を行った。【００７１】
実施例１の培養液のアルブミン濃度の変化を図９に示す。
実施例１〜３における細胞の位相差観察像（培養６日目）を、それぞれ図１０（Ａ）〜図１０（Ｃ）に示す。
実施例３におけるＨＵＶＥＣの共焦点レーザー顕微鏡の観察像を図１１（Ａ）に示す。
実施例３におけるＨｅｐＧ２、ＵＣＢＴＥＲＴ−２１の共焦点レーザー顕微鏡の観察像を図１１（Ｂ）に示す。実施例３における位相差観察像（培養５日目）を図１１（Ｃ）に示す。
実施例１〜３の培養液中のアルブミン濃度の変化を図１２に示す。
実施例１と実施例３との肝機能に関わる遺伝子発現を、それぞれ図１３および図１４に示す。
実施例１と実施例３のＣＹＰ３Ａ４活性測定の結果を図１５に示す。【００７２】
（比較例１，２）
表１に示す細胞を用いて、直径３５ｍｍのディッシュにより培養を行った。
細胞の播種は、１５ｍＬチューブにそれぞれ表１の細胞数に相当する細胞懸濁液をそれぞれ入れ、遠心分離によって細胞を回収した後に培地（２ｍＬ）に再懸濁した懸濁液を直接播種することで行った。
比較例１，２における細胞の位相差観察像（培養６日目）を、それぞれ図１０（Ｄ）〜図１０（Ｅ）に示す。【００７３】
【表１】
2019054288.tif 000006
【００７４】
細胞播種の約２４時間後に培地を交換し、この日をＤａｙ０とした。１〜３日ごとに２ｍＬの培地を交換しつつ静置培養を行った。
その他の条件は実施例１〜３と同様とした。
比較例１の培養液中のアルブミン濃度の変化を図９に示し、比較例１，２の培養液中のアルブミン濃度の変化を図１２に示す。
比較例１と比較例２との肝機能に関わる遺伝子発現を図１３および図１４に示す。
比較例１と比較例２とのＣＹＰ３Ａ４活性測定の結果を図１５に示す。【００７５】
図９に示すように、実施例１では、培養８日目頃からアルブミンの産生量が増え始め、１２日目においても産生量は増加傾向にあった。一方、比較例１においては培養用８日目頃からアルブミンの産生量が頭打ちとなった。そのため、培養８日目以降では、図１の細胞培養装置１０を用いた実施例１は、既存の培養容器である３５ｍｍディッシュを用いて培養した比較例１と比べてアルブミン産生量が高くなることがわかった。
図１０（Ｃ）に示すように、ＨｅｐＧ２を、ＨＵＶＥＣおよびＵＣＢＴＥＲＴ−２１と共培養した実施例３（細胞数の比率はＨｅｐＧ２：ＨＵＶＥＣ：ＵＣＢＴＥＲＴ−２１＝１：４：１）において、血管様の網目構造（管腔構造）の形成が確認された。
図１０（Ａ）に示すように、ＨＵＶＥＣおよびＵＣＢＴＥＲＴ−２１を含まない条件（実施例１；細胞数の比率は１：０：０）では網目構造の形成は確認されなかった。
図１０（Ｂ）に示すように、実施例３に比べてＨＵＶＥＣおよびＵＣＢＴＥＲＴ−２１の含有率の低い実施例２（細胞数の比率は１：１：０．２５）では網目構造の形成は部分的にのみ確認された。
図１０（Ｄ）および図１０（Ｅ）に示すように、比較例１，２では、細胞数の比率にかかわらず、血管様の網目構造の形成は確認されなかった。【００７６】
図１１（Ａ）に示すように、蛍光染色したＨＵＶＥＣと、ＵＣＢＴＥＲＴ−２１とを、ＨｅｐＧ２と共培養した条件（細胞数の比率はＨｅｐＧ２：ＨＵＶＥＣ：ＵＣＢＴＥＲＴ−２１＝１：４：１）で、実施例３と同様の細胞培養を行い、培養５日目において共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、ＨＵＶＥＣが網目構造を形成し、血管様の組織が形成されていることが確認された。
図１１（Ｂ）に示すように、ＨｅｐＧ２とＵＣＢＴＥＲＴ−２１とによって構成される二種類の細胞群は、組織全体において存在していることが確認された。
図１２に示すように、ＨｅｐＧ２をＨＵＶＥＣおよびＵＣＢＴＥＲＴ−２１と共培養した実施例２，３（細胞数の比率は１：１：０．２５および１：４：１）では、ＨｅｐＧ２を単独で用いた実施例１（細胞数の比率は１：０：０）に比べて、アルブミンの産生量はやや少なくなった。
しかし、実施例１〜３は、長期間の培養の後（例えば、培養１３日目）には、アルブミンの産生量は比較例１，２に比べて多くなった。
一方、図１３および図１４に示すように、実施例１および実施例３のＣＹＰ１Ａ２遺伝子およびＡｌｂｕｍｉｎ遺伝子の発現は比較例１および比較例２に比べて増大した。また、図１５に示すように、実施例３におけるＣＹＰ３Ａ４の活性は実施例１，比較例１および比較例２と比較して増大した。【００７７】
（実施例４、比較例３、４）
以下には、上述の実施形態に係る細胞培養装置の一例に対応する実施例４の細胞培養装置と、一般的な細胞培養容器に対応する比較例３、および、比較例４に係る細胞培養容器と、の面積当たりの細胞数の比較を行った結果を示す。【００７８】
実施例４においては、上述の実施例１〜３と同様に、図１に示す細胞培養装置１０を作製し、以下の表２に示すように、細胞を播種した。【００７９】
また、比較例１、２と同様に、比較例３として、一般的な細胞培養容器である３５ｍｍディッシュを用意し、以下の表２に示すように、細胞を播種した。
さらに、比較例４として、一般的な細胞培養容器である９６ｗｅｌｌプレートを用意し、以下の表２に示すように、細胞を播種した。【００８０】
【表２】
2019054288.tif 000007
【００８１】
表２に示すように、比較例３、および、比較例４のような従来の培養方法と比較して、実施例４では、面積あたり８０倍程度の細胞を培養容器に導入して培養することが可能であった。
このように、実施例４に係る細胞培養装置によれば、培養面積が狭い条件においても大量の細胞を代謝酵素などの発現が保持されたまま培養を行うことが可能であった。【００８２】
（実施例５〜８）
実施例１と同様に、図１に示す細胞培養装置１０を作製した。
実施例５〜８における細胞２０の播種は、１５ｍＬチューブにそれぞれ表３で示した細胞数に相当するように調整した細胞懸濁液をそれぞれ入れ、遠心分離によって細胞を回収した後に培地（６０〜８０μＬ）に再懸濁した懸濁液を直接播種することで行った。
細胞２０の播種後、３時間程度、静置培養して十分に細胞をトランズウェル（隔膜２）に接着させた後に、ウェル内に培地をさらに添加し、総培地量を１．１５ｍＬとした。
そのまま約２４時間置き、循環培養を開始した。この循環培養開始日をＤａｙ０（培養０日目）とし、２〜３日ごとに１．１５ｍＬの培地を交換しつつ循環培養を行った。
表４に示すように、Ｄａｙ１（培養１日目）、Ｄａｙ３（培養３日目）、Ｄａｙ１５（培養１５日目）に培地の流量測定を行い、Ｄａｙ１６（培養１６日目）に４％パラホルムアルデヒドで細胞塊を固定した。
作製した切片を用いて、ＨＵＶＥＣの細胞膜を染色する抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）抗体と、肝臓の胆管側膜を染色する抗ＭＲＰ２（ＡＢＣＣ２）抗体と、を用いて蛍光免疫染色を行った。【００８３】
【表３】
2019054288.tif 000008
【００８４】
【表４】
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【００８５】
各培養条件における培地流量の結果を表４に示す。
表４に示すように、実施例５〜８のいずれも、Ｄａｙ３が最も培地流量が多く、アルブミン産生量や酵素活性の上昇が観察される培養１５日目にはどの条件も培地流量が低下する傾向を観察した。
Ｄａｙ３までの結果のように、組織成熟に伴って培地流量が増加する点は、圧力駆動型の循環培養の利点であると考えられる。【００８６】
培養１５日目において、実施例５の６倍の細胞数の細胞を播種した実施例６（６：０：０）では培地循環が確認できなかった。
この結果は、増殖したＨｅｐＧ２が流路に流れ込み、せき止めてしまったことが原因と思われる。
また、培養容器の培地は１．７〜９．６時間で一巡することが示された。【００８７】
図１６に、細胞の免疫染色（ＭＲＰ２／ＣＤ３１）の結果、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）の結果、三次元構造を有する細胞の概略図を示す。
なお、実施例６（６：０：０）の結果は、細胞死が進行し、組織がもろい点など実施例５（１：０：０）とほぼ同様であるため、図示しなかった。
実施例５、および、実施例６のように、ＨｅｐＧ２単独では細胞塊の構造が比較的密な部分と疎な部分の差が大きく、ＭＲＰ２のシグナルもほとんど観察することが出来なかった。【００８８】
図１６に示すように、ＨｅｐＧ２、ＨＵＶＥＣ、およびＵＣＢＴＥＲＴ−２１を共培養した実施例７（１：１：０．２５）および実施例８（１：４：１）では、ＨｅｐＧ２が隣り合っていると思われる部分においてＭＲＰ２の発現が多く観察された。
すなわち、肝細胞の胆管側の膜に発現するトランスポーターであるＭＲＰ２は、ＨＵＶＥＣのような血管内皮細胞と、ＵＣＢＴＥＲＴ−２１のような間葉系幹細胞との共培養において発現が昂進し、血管内皮細胞と間葉系幹細胞との共培養による胆汁排泄機能の向上が期待される結果が確認された。
共培養を実施した実施例７と実施例８との二条件を比較すると実施例８（１：４：１）のほうが細胞の密度が均一な組織形成が起きていたが、ＭＲＰ２の発現については実施例７と実施例８とでは明確な差は見られなかった。【００８９】
図１６に示すように、実施例７および実施例８においては、ＨＵＶＥＣは多孔質膜と平行にシート状に集合し（図１６の概略図中Ａ１の矢印の箇所）、ＨＵＶＥＣの上にＨｅｐＧ２の積層（図１６の概略図中Ｂ１の矢印の箇所）が観察された。
また、実施例８（１：４：１の条件）のように、ＨＵＶＥＣ量を増やすと、ＨＵＶＥＣのシートが２層になった（図１６の概略図中の矢印Ａ１およびＢ１の箇所を参照）。【００９０】
非特許文献８において、内臓型ペリスタポンプで送液し、三次元組織の灌流培養を行う方法が記載されている。
一方、本発明の上記実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法では、培養室および培養液貯留室に設置した通気孔を介して加圧、大気圧開放を繰り返すことで培養液を循環させる構成を有している。
一般的に、内臓型ペリスタポンプで送液する場合には、三次元組織内の構造と関係なく、一定流量の流れ条件のもとで細胞の培養が行われる。この場合、三次元組織内に血管組織が発達していない場合、組織に過剰の送液負荷がかかってしまう。
一方、上記実施形態に係る圧力駆動による送液方式では、一定圧力で加圧して送液するため、三次元組織内の血管組織の発達に応じて、培地等の液体の流量が調整される。【００９１】
実際に、表４に示すように、実施例５〜８において、Ｄａｙ１からＤａｙ３において、血管組織や肝組織の発達に応じた培地流量の増加が観察されている。
また、実施例７および８のように、ＨＵＶＥＣのような血管内皮細胞を含む培養系において、三次元組織内の血管組織の発達に応じて、培地等の液体の流量が調整される傾向は顕著であった。【００９２】
また、実施例５〜８においては、Ｄａｙ３からＤａｙ１５にかけては肝細胞の増殖に伴う流量低下および閉塞が確認されているが、流量低下および閉塞の点に関しては血管組織を長期維持できる培養液の使用等で解決されると考えられる。
血管組織を長期維持するためには、例えば、培養液に血管内皮細胞増殖因子であるＶＥＧＦ等の増殖因子を添加する方法などが考えられる。【００９３】
本実施形態に係る細胞培養装置、および、細胞培養方法によれば、肝細胞と血管内皮細胞とを灌流条件下で共培養し、血管様構造を有する肝細胞の三次元組織を構築して培養することができる。
これに伴い、表２に示したように、従来の培養方法と比較して、本実施形態に係る細胞培養装置および細胞培養方法では、例えば、面積あたり８０倍程度の細胞を培養容器に導入して培養することが可能であった。
すなわち、本実施形態によれば、狭い培養面積においても大量の細胞を代謝酵素などの発現が保持されたまま培養することができることが期待できる。
一般的に、Ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐやＢｏｄｙ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐに実装する培養系では、狭い空間で高い代謝活性が求められており、本実施形態に係る細胞培養装置、および、細胞培養方法は従来の培養方法と比較して優位な方法である。
また、肝細胞のインビトロ培養技術において胆汁排泄を適切に評価する技術は、現時点では確認されていない。
本実施形態に係る細胞培養装置、および、細胞培養方法によれば、実施例７および８に示されるように、肝細胞の胆管側の膜に発現するトランスポーター（ＭＲＰ２）の発現が向上することが確認されており、従来の培養方法では実現し得ない機能を発現させることができると考えられる。【００９４】
上述の実施形態における各構成およびそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
図１に示す細胞培養装置１０は、貯留槽１１と、第１圧力調整部１４Ａと、第２圧力調整部１４Ｂとを備えた構成であってもよい。
図１に示す細胞培養装置１０の貯留槽１１は、槽本体１２と蓋部１３とを有するが、槽本体１２と蓋部１３とを別々に有する構成に限らず、槽本体と蓋部とが一体となった貯留槽を採用してもよい。
本実施形態に係る細胞培養装置は、培養室の圧力を調整する第１圧力調整部と、培養液貯留室の圧力を調整する第２圧力調整部とを備えていてもよい。
本実施形態に係る細胞培養装置において、培養室および培養液貯留室の圧力を調整する構造は特に限定されない。例えば、培養液の供給によって培養室の内面側空間（または培養液貯留室）の圧力を高める構造を採用してもよいし、培養室の外面側空間（または培養液貯留室）の培養液の一部を排出することによって、培養室の内面側空間（または培養液貯留室）の圧力を低下させる構造を採用してもよい。また、培養室および培養液貯留室の容積の変化によってその圧力を変化させる構造を採用してもよい。【００９５】
本実施形態において培養する細胞は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む動物由来の細胞、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を目的に応じて使用できる。
本実施形態は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。特に、医薬品の開発、細胞生物学の基礎研究に有用である。
【符号の説明】
【００９６】
１    培養室
１ａ    内面側空間
１ｂ    外面側空間
２    隔膜
３    培養液貯留室
４    培養液導入流路
５    培養液排出流路
６    バイパス流路（バイパス経路）
６ａ    抵抗流路部位
９，９Ａ    細胞培養ユニット
１０，１０ａ，１０ｂ，１０Ａ，１０Ｂ    細胞培養装置
１１，１１Ａ    貯留槽
５１，５２    逆止弁（逆流防止機構）
５３，５４，１１７    ラプラス弁（逆流防止機構）
Ｃ    培養液
【図１】
2019054288.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019054288.tif 000019
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月5日(2020.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養装置であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、
前記細胞培養ユニットは、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、
細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、
前記培養液を貯留する培養液貯留室と、
前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、
前記内面側空間から前記隔膜を透過して前記隔膜の前記第２面が面する外面側空間に流入した前記培養液を前記培養液貯留室に送る培養液排出流路と、を有し、
前記培養液導入流路は、第１端で前記培養液貯留室に接続され、第２端で前記内面側空間に接続され、
前記培養液排出流路は、第１端で前記外面側空間に接続され、第２端で前記培養液貯留室に接続されている、
細胞培養装置。
【請求項２】
前記培養液貯留室から前記内面側空間および前記外面側空間を経て前記培養液貯留室に戻る前記培養液の循環流れに対して逆の前記培養液の流れを規制する逆流防止機構をさらに備えている、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記培養液導入流路に、前記逆流防止機構が設けられている、請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記逆流防止機構は、前記循環流れとは逆の方向の気体の流れを阻止するラプラス弁であり、
前記ラプラス弁は、前記培養液導入流路に設けられ、
前記培養室内に、前記培養液導入流路に連設された延長管路が設けられている、請求項２または３に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
前記内面側空間の前記培養液を、前記隔膜を経ずに前記培養液排出流路に導くバイパス流路を備える、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記バイパス流路は、流路断面積が前記バイパス流路における他の部位に比べて１／１０以下である抵抗流路部位を有する、請求項５に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットにおける前記培養室のうち少なくとも２つ、または、前記複数の前記細胞培養ユニットにおける第２培養液貯留室のうち少なくとも２つは、気体が流通可能となるように互いに連通されている、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記培養室および前記培養液貯留室は、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する通気孔を有する、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットを互いに連通する気体流路を有し、
前記気体流路は、前記複数の前記細胞培養ユニット内を一括的に加圧することにより、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において前記培養液を循環させることが可能なように構成されている、
請求項１〜８のうちいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
細胞培養方法であって、
１または複数の細胞培養ユニットを有する貯留槽を備え、前記細胞培養ユニットが、培養液が貯留される内面側空間を有する培養室と、細胞が接着可能な第１面と前記第１面とは反対の第２面とを有し、かつ、前記第１面が前記内面側空間に面する透過性の隔膜と、前記培養液を貯留する培養液貯留室と、前記培養液貯留室の前記培養液を前記内面側空間に導く培養液導入流路と、を有する細胞培養装置を準備し、
前記内面側空間に面する前記隔膜の前記第１面に前記細胞を接着させた状態で、前記培養液を、前記内面側空間から前記隔膜を透過させて前記隔膜の第２面が面する外面側空間に流入させる工程と、
前記培養液を前記外面側空間から前記培養液排出流路に流して前記培養液貯留室に戻す工程と、を有し、
これらの工程を繰り返すことによって、前記培養液は、（i）前記培養液貯留室、（ii）前記培養液導入流路、（iii）前記培養室、および（iv）前記培養液排出流路、の順序で前記細胞培養装置内を循環し、
前記隔膜における前記培養液の主な流れ方向は、前記隔膜の表面と垂直である、
細胞培養方法。
【請求項１１】
前記細胞は、肝細胞と血管内皮細胞とを含む、請求項１０に記載の細胞培養方法。
【請求項１２】
前記細胞を前記隔膜に接着する際に、前記肝細胞と前記血管内皮細胞とを含む細胞集塊を形成し、前記細胞集塊を前記隔膜に播種する、請求項１１に記載の細胞培養方法。
【請求項１３】
前記培養室および前記培養液貯留室は、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する通気孔を有し、
前記通気孔を介して、前記培養室および前記培養液貯留室に対して気体を供給し、かつ、排出する、請求項１０〜１２のうちいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１４】
前記貯留槽が複数の前記細胞培養ユニットを有し、
前記複数の前記細胞培養ユニットを互いに連通する気体流路を有し、
前記気体流路を介して、前記複数の前記細胞培養ユニット内を一括的に加圧することにより、前記複数の前記細胞培養ユニットの間において前記培養液を循環させる、
請求項１０〜１３のうちいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【国際調査報告】
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