(57)【要約】  エピトープが、配列番号４に示すヒトＩｇＧ４のＣＨ３に存在する、ヒトＩｇＧ４に対するモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたＩｇＧ４の検出方法およびそれに使用するキットを提供する。
2019009346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩｇＧ４に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記抗体のエピトープが、配列番号４に示すヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列に存在し、２９９番目のグルタミン酸を含む、モノクローナル抗体。
【請求項２】
前記ヒトＩｇＧ４に、解離定数５．０×１０−１０以下で結合する請求項１に記載のモノクロナール抗体；
【請求項３】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するヒトＩｇＧ４に対する抗体であって、重鎖可変領域の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと記す）１、２および３がそれぞれ配列番号９、１０、および１１で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１２、１３および１４で示されるアミノ酸配列である、モノクローナル抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマＭａＩ４−０８が産生する請求項４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するヒトＩｇＧ４に対する抗体であって、重鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、２および３がそれぞれ配列番号１５、１６、および１７で示されるアミノ酸配列であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１８、１９および２０で示されるアミノ酸配列であるモノクローナル抗体。
【請求項７】
重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する請求項６に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
ハイブリドーマＭａＩ４−０９が産生する請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の抗原結合部位を２つもつ、二価抗体分子又は二価抗体断片。
【請求項１０】
Ｆ（ａｂ’）２である、請求項９に記載の抗体断片。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体或いは請求項９又は１０に記載の二価抗体分子又は二価抗体断片を用いて、試料中のヒトＩｇＧ４を測定検出する方法。
【請求項１２】
免疫学的粒子凝集阻止法である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって；
（１）試料中のヒトＩｇＧ４と請求項１〜８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体或いは請求項９又は１０に記載の二価抗体分子又は二価抗体断片を結合させ；次いで
（２）ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片が固定された不溶性担体を加えて、試料中のヒトＩｇＧ４と結合しなかった上記モノクローナル抗体或いは二価抗体分子又は二価抗体断片との間で凝集反応を起こし、そして
（３）凝集された不溶性担体を検出することにより、試料中のヒトＩｇＧ４を検出測定する方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体或いは請求項９又は１０に記載の二価抗体分子又は二価抗体断片を含む、ヒトＩｇＧ４の測定キット。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法のためのキットであって；
（１）請求項１〜８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体或いは請求項９又は１０に記載の二価抗体分子又は二価抗体断片；
（２）単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片；及び
（３）不溶性担体
を含むキット。
【請求項１６】
（２）単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片が、（３）不溶性担体に吸着している、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
（３）不溶性担体がラテックス粒子である、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
ＩｇＧ４関連疾患の診断を補助するための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＩｇＧ４関連疾患診断に用いるための、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
配列番号４に示すヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列の全部又は一部からなり、２９９番目のグルタミン酸を含む、単離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体、およびその抗体を利用したヒトＩｇＧ４測定試薬に関する。
本発明の抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いれば、試料中のヒトＩｇＧ４を特異的に検出測定することが可能であり、ＩｇＧ４関連疾患などの診断や臨床検査の分野において極めて有効である。
【背景技術】
【０００２】
近年ＩｇＧ４関連疾患という新しい疾患概念が提唱され、全身の諸臓器に発生する可能性がある疾患であることから、既知の諸臓器疾患とそれの鑑別を行えることが必要とされる。（非特許文献１）。ＩｇＧ４関連疾患包括診断基準２０１１が提唱され、血液中のＩｇＧ４値が１３５ｍｇ／ｄＬ以上であることを高ＩｇＧ４血症とした診断基準が策定された。被検患者の中には５０００ｍｇ／ｄＬを超える例も報告されており、臨床検査の現場では疑似低値を呈する検査結果が問題視されている（非特許文献２）。また、血中ＩｇＧ４測定試薬は、病院及び検査センター等で広く導入されている汎用型の一般生化学自動分析装置への適用が求められる。【０００３】
血中ＩｇＧ４測定試薬の汎用自動分析装置への適用に際しては、以下の２つの課題が挙げられる。
ＩｇＧ４は約146000の分子量を持つヘテロテトラマー分子であり、かかる分子を検出するのには抗体を用いるのが適している。
従って第１の課題として、測定試薬の重要な構成要素となる抗体の特異性が挙げられる。ＩｇＧ４はＩｇＧサブクラスの１つであり、その他のサブクラスであるＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３との相同性が非常に高いことが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。通常健常者血清においておよそＩｇＧ１：６５％、ＩｇＧ２：２３％、ＩｇＧ３：８％、ＩｇＧ４：４％の割合で存在しており、健常者における基準値はＩｇＧ１：３５１〜９６２；ＩｇＧ２：２３９〜８３８；ＩｇＧ３：８．５〜１４０；ＩｇＧ４：４．５〜１１７（ｍｇ／ｄＬ）であり、ＩｇＧ４の量比の少なさからＩｇＧ４にのみ反応できる優れた特異性を有する抗体の作製が必須となる。【０００４】
抗体を用いた測定方法として、間接酵素抗体法(ELISA法)、間接蛍光抗体法、CLEIA法（化学発光酵素免疫測定法）等の間接抗体法；一元放射状免疫拡散法（single radial immunodiffusion method : SRID）や二重免疫拡散法（double immunodiffusion method：ＤＩＤ）等の免疫拡散法、免疫比濁法（immunoturbidimetry：TIA）や免疫比ろう法（immunonephelometry : NIA）に分類されるラテックス（粒子）凝集法、などが用いられているが、現在臨床検査の現場において多用されているのは、低濃度の標的分子でも検出できる、抗原と抗体の結合に基づく凝集体を検出することに基づく、ラテックス（粒子）凝集法などの免疫比濁法（immunoturbidimetry：TIA）や免疫比ろう法（immunonephelometry : NIA）である。
しかしながら血液や尿といった試料中の抗原濃度が測定範囲を大きく上回っている場合、抗原過剰による凝集抑制が誘導される可能性がある（地帯現象またはプロゾーン現象と呼ばれる）。その結果、測定値が疑似的に低値となり、誤った診断につながる恐れがある。ＩｇＧ４の場合、上記のように健常者と高ＩｇＧ４血症患者との間で１０００倍近い濃度差があり、実際にＩｇＧ４測定試薬においてプロゾーン現象が発生した事例が報告されている（非特許文献２）。
従って第２の課題として、血中ＩｇＧ４測定試薬とし高濃度のＩｇＧ４も測定することが求められている。【０００５】
前記第１の課題について、ヒトＩｇＧ４に対するモノクローナル抗体が知られている（特許文献１）。しかしながら、ＩｇＧサブクラスのうちＩｇＧ４への特異性が高いものの、一般的にモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）は１つであることから、抗体：抗原の凝集体形成には不適である場合がある。免疫比濁法を用いたＩｇＧ４の測定に適用可能なＩｇＧ４特異的モノクローナル抗体は知られておらず、またモノクローナル抗体を用いた汎用自動分析装置に適応可能なＩｇＧ４測定試薬も知られていない。
この問題を解決する方法としては、モノクローナル抗体を疑似的に多価にすることで、前記課題２をも解決される方法が挙げられる。例えば、特許文献２にはモノクローナル抗体をビオチン化しストレプトアビジンにて多量体を形成する方法が、特許文献３にはプロテインＡや抗イムノグロブリン抗体等を用いて多量体を形成する方法が、さらに特許文献４には不溶性担体へモノクローナル抗体を固定化する方法が記載されている。しかしながら、いずれの方法もモノクローナル抗体の多価形成するための工程が煩雑であり、特に抗体の価数を常に一定に制御することが難しく、免疫比濁法を測定原理とした汎用自動分析装置対応の試薬としての性能を維持するのにコストと時間を要するという欠点がある。
ポリクローナル抗体を得るための方法である、一般的な動物実験的手法に基づいたヤギ、ヒツジ、またはウサギ等へのヒトＩｇＧ４の免疫による該抗血清の取得は、産生される抗体のそのほとんどが各ＩｇＧサブクラスに共通した部分に対するものとなり、ＩｇＧ４以外の他のサブクラスにも反応しうる抗体の吸収工程が必要になり、ＩｇＧ４に対する特異的な抗体を入手するまでに、非常に煩雑な精製工程を必要とする。該抗血清に含まれるＩｇＧ４に対する特異的な抗体の相対的または絶対的な存在量と、前記の精製工程により、所望のＩｇＧ４に対する特異的な抗体の収量は非常に少なくなるという問題が懸念される。
またＩｇＧサブクラスのいずれかに特異性の高いポリクローナル抗体を取得する方法が知られている（特許文献５）。この方法によると、上記のような精製工程を必要とせず、免疫寛容により抗原特異的なポリクローナル抗体の取得が可能であるが、免疫寛容の惹起の程度には免疫される動物個体差が存在し、また免疫寛容を引き起こすまでに時間を要することから、定常的に所望のＩｇＧ４に対する特異的な抗体を取得するには多数の被免疫動物を必要とし、コスト並びに動物愛護の観点から適当な方法であるとは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭61-286754号公報
【特許文献２】特開平4-350559号公報
【特許文献３】特開2001-337092号公報
【特許文献４】国際公開2008/012944号公報
【特許文献５】特表2001-501579号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】N Engl J Med 2012; 366:539-551
【非特許文献２】Arthritis Rheumatol. 2014 Jan;66(1):213-7
【非特許文献３】J Mol Biol. 2014 Feb 6;426(3):630-44
【非特許文献４】Front Immunol. 2014; 5: 520
【非特許文献５】Consensus statement on the pathology of IgG4-related disease (Modern Pathology 2012 25, 1181-1192）
【非特許文献６】Epitope mapping of human immunoglobulin specific murine monoclonal antibodies with domain switched deleted and point mutated chimeric antibodies(Journal of Immunological Methods 158 1993 107-122)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
かかる問題に鑑み、本発明は、ＩｇＧ４に対して、さらに特異性と親和性の高いモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたＩｇＧ４の検出方法およびそれに使用するキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
免疫学的粒子凝集法（ラテックス（粒子）凝集法）は、不溶性担体に抗体を固定化し、これに測定対象である抗原を含む試料を混合し、抗原―抗体反応に基づく免疫凝集反応を生起させることにより、測定対象となる抗原を測定する方法である。かかる方法は、検出感度を高めるため、用いる抗体もポリクローナル抗体などの多用なエピトープを認識する複数種の抗体を用いることが望ましい。１つの抗原分子に対して、複数の抗体（不溶性担体）が結合することによって凝集が起こるからである。その代わり各々の抗体分子の中に親和性の低いものがあってもかまわない。【００１０】
一方、免疫学的粒子凝集阻止法（ラテックス（粒子）凝集阻止法）は抗原を固定化した不溶性担体、抗原に対する遊離抗体、抗原を含む試料を混合することにより、不溶性担体に固定化された抗原と試料に含まれる抗原が競合し、結果として凝集形成が抑制されることにより、測定対象である抗原量を測定する方法である。免疫学的粒子凝集阻止法においては測定範囲を大きく上回る抗原濃度が存在する場合でもプロゾーン現象が見られないことから、測定原理としては、汎用自動分析装置へ適用させる上で、プロゾーン現象のリスクを回避する理想的な方法であるといえる。しかしながら、かかる方法にはポリクローナル抗体を用いることは適さない。エピトープが複数存在するので、試料内抗原と担体に担持した抗原を介した凝集が起こりやすいため、モノクローナル抗体（単一エピトープを認識）と比較し、測定系の感度が下がり、減衰曲線を描きにくくなる可能性があるからである。【００１１】
以上により、本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトＩｇＧ４検出のための免疫学的粒子凝集阻止法（ラテックス（粒子）凝集阻止法）に適したモノクローナル抗体を作製することに成功し、本願発明を完成させるに至った。【００１２】
即ち、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［２１］の通りである。
［１］ヒトＩｇＧ４に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記抗体のエピトープが、配列番号４に示すヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列に存在し、２９９番目のグルタミン酸を含む、モノクローナル抗体；
［２］前記ヒトＩｇＧ４に、解離定数５．０×１０−１０以下で結合する［１］に記載のモノクロナール抗体；
［３］重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するヒトＩｇＧ４に対する抗体であって、重鎖可変領域の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと記す）１、２および３がそれぞれ配列番号９、１０および１１で示されるアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１２、１３および１４で示されるアミノ酸配列である、モノクローナル抗体、好ましくは［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体；
［４］重鎖可変領域が配列番号５のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を有する［３］に記載のモノクローナル抗体；
［５］ハイブリドーマＭａＩ４−０８が産生する［４］に記載のモノクローナル抗体。【００１３】
［６］重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有するヒトＩｇＧ４に対する抗体であって、重鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、２および３がそれぞれ配列番号１５、１６および１７で示されるアミノ酸配列であり、抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２および３が、それぞれ配列番号１８、１９および２０で示されるアミノ酸配列である、モノクローナル抗体、好ましくは［１］又は［２］に記載のモノクローナル抗体；
［７］重鎖可変領域が配列番号７のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する［６］に記載のモノクローナル抗体；
［８］ハイブリドーマＭａＩ４−０９が産生する［７］に記載のモノクローナル抗体。【００１４】
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載のモノクローナル抗体の抗原（認識）結合部位を１分子あたり２つ以上もつ、多価抗体又は多価抗体断片、より好ましくは１分子あたり２つもつ二価抗体又は二価抗体断片；
［１０］Ｆ（ａｂ’）２である、［９］に記載の抗体断片。【００１５】
［１１］［１］〜［８］のいずれかに記載のモノクローナル抗体或いは［９］又は［１０］に記載の抗体断片を用いて、試料中のヒトＩｇＧ４を測定検出する方法；
［１２］免疫比濁法又は免疫比ろう法である［１１］に記載の方法；
［１３］免疫学的粒子凝集法である［１２］に記載の方法；
［１４］免疫学的粒子凝集阻止法である［１２］に記載の方法；
［１５］免疫組織化学（IHC）染色である［１１］に記載の方法；
［１６］フローサイトメトリーによる［１１］に記載の方法。【００１６】
［１７］［１４］に記載の方法であって；【００１７】
［１８］［１］〜［８］のいずれかに記載のモノクローナル抗体或いは［９］又は［１０］に記載の抗体断片を含む、ヒトＩｇＧ４の測定キット。【００１８】
［１９］［１４］又は［１７］に記載の方法のためのキットであって；
（１）［１］〜［８］のいずれかに記載のモノクローナル抗体或いは［９］又は［１０］に記載の抗体断片；
（２）単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片；及び
（３）不溶性担体
を含むキット；
［２０］（２）単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片が、（３）不溶性担体に吸着している、［１９］に記載のキット。
［２１］（３）不溶性担体がラテックス粒子である、［１９］又は［２０］に記載のキット。【００１９】
［２２］ＩｇＧ４関連疾患の診断を補助するための、［１１］〜［１７］のいずれかに記載の方法；
［２３］ＩｇＧ４関連疾患診断に用いるための、［１８］〜［２１］のいずれかに記載のキット。
［２４］配列番号４に示すヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列の全部又は一部からなり、２９９番目のグルタミン酸を含む、単離されたペプチド。【００２０】
本発明の実施形態によって、生体試料中のＩｇＧ４を効率よく検出定量することが可能となり、様々な疾患の診断の一助とすることが出来る。例えばこれに限定されないが、ＩｇＧ４関連疾患（血清ＩｇＧ４高値と罹患臓器への著明なＩｇＧ４陽性形質細胞浸潤を特徴とする全身性、慢性炎症性疾患）の診断の一助とすることが出来、このような疾患としては、ミクリッツ病（Ｍｉｋｕｌｉｃｚ  ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｋｕｔｔｎｅｒ腫瘍、涙腺炎、ＩｇＧ４関連眼疾患、ＩｇＧ４関連呼吸器疾患、炎症性偽腫瘍、縦隔繊維症、腸炎、硬化性胆管炎、ＩｇＧ４関連肝障害、自己免疫性膵炎（ＡＩＰ）、ＩｇＧ４関連腎臓病、後腹膜線維症、前立腺炎、自己免疫性下垂体炎、甲状腺炎、肥厚性硬膜症、IgG4関連リンパ節症、関節炎、炎症性腹部大動脈瘤、動脈周囲炎が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】選定クローンの免疫学的粒子凝集阻止法への適応性評価
【図２】ＥＬＩＳＡによるＭａＩ４−０８抗体の特異性の評価  図２は、ＭａＩ４−０８産生抗体において、各ヒトグロブリンに対するＥＬＩＳＡの反応吸光度を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡによるＭａＩ４−０９産生抗体の特異性の評価  図３は、ＭａＩ４−０９産生抗体において、各ヒトグロブリンに対するＥＬＩＳＡの反応吸光度を示す。
【図４】ＭａＩ４−０８産生抗体を用いた抗体吸光度変化量の測定  図４は、ヒトＩｇＧ４の標準試料、ＭａＩ４−０８産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の吸光度変化を示す。なお標準試料として、ヒトＩｇＧ４濃度をそれぞれ１．６、６．３、１２．５、２５、５０ｍｇ／ｄＬに調整した標準ヒト血清を用いた。本測定では検体試料の測定を２０倍希釈にして測定することを前提とするため、最終的な標準試料濃度は２０倍となり、３１．３、１２５、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｄＬとなる。以降に記載する試料濃度は全て２０倍した最終的な試料濃度とする。
【図５】ＭａＩ４−０９産生抗体を用いた抗体吸光度変化量の測定  図５は、ヒトＩｇＧ４の標準試料、ＭａＩ４−０９産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の吸光度変化を示す。他の条件は図４と同じである。
【図６】ＭａＩ４−０５産生抗体を用いた抗体吸光度変化量の測定（比較例）  図６は、ヒトＩｇＧ４の標準試料、ＭａＩ４−０５産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の吸光度変化を示す。他の条件は図４と同じである。
【図７】ＨＰ６０２５を用いた抗体吸光度変化量の測定（比較例）  図７は、ヒトＩｇＧ４の標準試料、ＨＰ６０２５含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の吸光度変化を示す。他の条件は図４と同じである。
【図８】ＭａＩ４−０８産生抗体を用いた希釈直線性の評価  図８は、０〜１０００ｍｇ／ｄＬのヒトＩｇＧ４段階希釈系列試料、ＭａＩ４−０８産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の測定値を示す。
【図９】ＭａＩ４−０９産生抗体を用いた希釈直線性の評価  図９は、０〜１０００ｍｇ／ｄＬのヒトＩｇＧ４段階希釈系列試料、ＭａＩ４−０９産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の測定値を示す。
【図１０】ＭａＩ４−０８産生抗体を用いたプロゾーン現象への耐性の評価  図１０は、０〜８０００ｍｇ／ｄＬのヒトＩｇＧ４段階希釈系列試料、ＭａＩ４−０８産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の測定値を示す。
【図１１】ＭａＩ４−０９産生抗体を用いたプロゾーン現象への耐性の評価  図１１は、０〜８０００ｍｇ／ｄＬのヒトＩｇＧ４段階希釈系列試料、ＭａＩ４−０９産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の測定値を示す。
【図１２】ＭａＩ４−０８産生抗体のヒトＩｇＧ４に対する特異性の評価  図１２は、３０００ｍｇ／ｄＬのヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３及びヒトＩｇＧ４の各試料、ＭａＩ４−０８産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の測定値を示す。
【図１３】ＭａＩ４−０９産生抗体のヒトＩｇＧ４に対する特異性の評価  図１３は、３０００ｍｇ／ｄＬのヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３及びヒトＩｇＧ４の各試料、ＭａＩ４−０９産生抗体含有緩衝液（第一試薬）、ヒトＩｇＧ４感作ラテックス含有緩衝液（第二試薬）を混合し、反応させた際の測定値を示す。
【図１４】Ｕｎｉｐｒｏｔより取得したヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列Ｈ１（Ｐ０１８６１、配列番号４）、およびその配列を部分的に欠損させた各ペプチドＨ２〜１２のアミノ酸配列のアライメントを示す。９９番目〜１１０番目はヒンジ領域を示す。
【図１５】ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号４）の２２１番目から３２７番目のＣＨ３領域のアミノ酸配列（Ｈ−１０）、並びにＨ−１０の一部をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の対応するアミノ酸（太字）に置換させたアミノ酸配列（Ｈ−３１〜Ｈ−３９）のアライメントを示す。
【図１６】ＭａＩ４−０８産生抗体のペプチドＨ１〜１２に対するウェスタンブロット解析
【図１７】ＭａＩ４−０９産生抗体のペプチドＨ１〜１２に対するウェスタンブロット解析
【図１８】ＭａＩ４−０８産生抗体のペプチドＨ１０及びＨ３１〜３９に対するウェスタンブロット解析
【図１９】ＭａＩ４−０９のペプチドＨ１０及びＨ３１〜３９に対するウェスタンブロット解析
【図２０】ＭａＩ４−０５のペプチドＨ１〜１２に対するウェスタンブロット解析
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の実施形態に係るモノクローナル抗体は、例えば精製ヒトＩｇＧ４を免疫原として動物を免疫し、その動物が産生する抗ヒトＩｇＧ４抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。用いられる動物は限定しないが、ヒト以外の動物例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、などがこれにあたる。特に、ＩｇＧのサブタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３であるマウスが好ましい。
【００２３】
上記ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち、ヒトＩｇＧ４を、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等の既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットなどの脾臓等より得ることができる。
上記融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法(Nature.256,495.1975)によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
【００２４】
上記融合した細胞からヒトＩｇＧ４を認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地およびＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒトＩｇＧ４に対する抗体が含まれている場合には、ヒトＩｇＧ４をプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等の２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、ヒトＩｇＧ４に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでヒトＩｇＧ４特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒトＩｇＧ４プレートで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡで陰性のクローンを選択できる。
【００２５】
本発明の実施形態に係るハイブリドーマとしては、ヒトＩｇＧ４を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、特にヒトＩｇＧ４と結合し、他のヒト免疫グロブリン（他のＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭ）に結合しない抗体を産生するハイブリドーマが望ましい。
ここで「ヒトＩｇＧ４に結合し、他のヒト免疫グロブリンに結合しない」とは、たとえば、簡便には通常のＥＬＩＳＡにおいて、下記以外の測定条件を同一とした際、固相抗原としてヒトＩｇＧ４を含む場合にいずれのヒト免疫グロブリンを含まないものを対照（ブランク）としたときの吸光度の比が４０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは１００以上を示すものであり、かつ、固相抗原としてヒトＩｇＧ４以外を含む場合にいずれのヒト免疫グロブリンを含まないものを対照（ブランク）としたときの吸光度の比が５以下、好ましくは２以下、を示すものであることをいう。
また、他のヒト免疫グロブリンよりもヒトＩｇＧ４に対して高い結合親和性を示すものであることをいい、結合速度定数と解離定数を用いて評価することもできる。具体的には、本発明の好ましい実施形態による抗体では、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の特定のエピトープに、４．０×１０５以上、通常４．０×１０５〜６．０×１０５の結合速度定数、並びに５．０×１０−１０以下、通常５．０×１０−１０〜３．０×１０−１０の解離定数で結合する。
【００２６】
上記ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。
上記の上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。たとえば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインＧなどによるアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００２７】
本発明の実施形態に係るモノクローナル抗体を用いた免疫測定法によって検体中のヒトＩｇＧ４を高感度で且つ特異的に検出することができる。対象となる検体としては、検体から採取、単離された血液、血清、血漿などが挙げられる。全身の病変組織、例えば、下垂体、涙腺、唾液腺、甲状腺、前立腺、気管支上皮、肺胞隔壁、膵管、後腹膜、胆管壁、あるいは関節リウマチ滑膜からの生検サンプルであってもよい。
【００２８】
「免疫測定法」とは抗原と抗体の反応を利用して、生物学的試料の中に含まれる物質のレベルを測定する生化学的試験測定法を意味する。
【００２９】
本発明の実施形態に係るモノクローナル抗体を用いた「免疫測定法」による検出方法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ラテックス（粒子）凝集法（比濁法）等が挙げられるが、より好ましくは、ラテックス（粒子）凝集阻止法である。
【００３０】
「ＥＬＩＳＡ法」は、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）／ＥＩＡ（EnzymeImmuno Assay））を意味し、試料中に含まれる物質の濃度を酵素反応を用いて検出定量する方法を指す。酵素反応に基づく発色発光をシグナルに用いることで対象を検出測定する。
「競合ＥＬＩＳＡ法」とは「標識した抗原」と「試料中の存在する抗原」が、競合条件下でどの割合で抗体に結合するかを測定するＥＬＩＳＡ法を意味する。
【００３１】
「免疫比濁法」とは抗原に抗体を反応させ、免疫複合体の沈降物を形成させ、その凝集塊に光を照射して、散乱による照射光の減衰（吸光度）を自動分析器で計測して検体に含まれる抗原量を測定する方法である。
【００３２】
「免疫比ろう法」とは抗原に抗体を反応させ、免疫複合体の沈降物を形成させ、その複合物に光をあて、散乱した光を測定することで、検体に含まれる、抗原を検出する方法である。
【００３３】
「ラテックス(粒子)凝集法」とは、抗体をラテックス粒子に固相化し、抗原存在下でラテックス粒子を凝集させ、この凝集を観察することで、抗原を検出する方法である。
「ラテックス(粒子)凝集阻止法」とは、抗原をラテックス粒子に固相化し、「ラテックス粒子に結合した抗原」と「試料中の存在する抗原」が、競合条件下でどの割合で抗体に結合するかを、ラテックス粒子の凝集を観察し、間接的に「試料中の存在する抗原」を検出する方法である。
いずれの場合も、その凝集の観察に、散乱による照射光の減衰（吸光度）を計測（免疫比濁法）してもよいし、散乱した光を測定（免疫比ろう法）してもよい。
【００３４】
本願発明の実施形態において「ラテックス粒子に結合した抗原」は必ずしも、「試料中に存在する抗原」と同一分子である必要はなく、本願発明に係る抗体またはその抗原結合断片との結合において「試料中に存在する抗原」と競合する分子であればよい。逆に定義すれば、本願発明に係る抗体を「ラテックス(粒子)凝集阻止法」を用いる場合、「ラテックス粒子に結合した抗原」及び「試料中に存在する抗原」が該抗体のエピトープを含むことが好ましい。
【００３５】
エピトープ(epitope) とは、抗体が認識する抗原の一部分のことを指す。ヒトＩｇＧ４は、可変領域ＶＬと定常領域ＣＬからなる軽鎖２分子と；可変領域ＶＨと定常領域ＣＨ１、ヒンジ領域、定常領域ＣＨ２及び定常領域ＣＨ３からなる重鎖２分子；からなる約146000の分子量を持つヘテロテトラマー分子であるが、抗体はその全体を認識するわけではなく、抗原の比較的小さな一部分のみを認識して結合する。エピトープとして機能するためには少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは５アミノ酸残基の長さが必要である。この抗体結合部分を「エピトープ」又は「抗原決定基 (antigenic determinant)」 とも呼ぶ。
本発明の実施形態に係る抗体は、ＩｇＧ４を認識し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３を認識しないことが求められる。軽鎖はＩｇＧ１〜ＩｇＧ４で共通するため、エピトープは重鎖、とりわけ、重鎖定常領域にあることが望ましい。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の重鎖定常領域は各々配列番号１、２、３及び４で示され、配列番号１〜３と配列番号４の相同性の低い部分をエピトープとすることが望ましく、後述する実施例で実証する通り、特に、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域、より具体的には、配列番号４に示すヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列の範囲内に存在し、２９９番目のグルタミン酸を含むエピトープが他のＩｇＧサブクラスへの交差反応が無くＩｇＧ４への特異的な結合を達成する上で望ましい。換言すると、本発明の好ましい実施形態に係る抗体のエピトープは、配列番号４に示すヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列の全部又は一部からなり、２９９番目のグルタミン酸を含む。従って、本発明の好ましい他の実施形態によれば、エピトープを含むペプチド、より具体的には、配列番号４に示すヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列の全部又は一部（通常、５個から５０個、好ましくは１０個から３０個）からなり、２９９番目のグルタミン酸を含むペプチドも提供される。
【００３６】
「ラテックス(粒子)凝集法」は、通常エピトープが異なる複数のモノクローナル抗体（ポリクローナル）を用いないと凝集が起こらないが、ＩｇＧ４自体、軽鎖と重鎖のヘテロダイマーのダイマーであるため、モノクローナル抗体でも凝集反応に適用することができるものがありうる。さらに、ラテックス粒子に複数の抗体分子を吸着させれば、抗体分子が一価抗体分子（抗原（認識）結合部位が１分子あたり１つ）であっても凝集が起こりうる。
「１価抗体」とは、天然の抗体をパパインで処理して出来るＦａｂ断片や、遺伝子工学的に、軽鎖可変領域と重鎖可変領域を結合させた、ｓｃＦＶ（single-chain variable fragment）などがこれにあたる。
【００３７】
一方、「ラテックス(粒子)凝集阻止法」の場合、ポリクローナル抗体などの、結合定数、エピトープ、特異性の異なる抗体を複数用いる場合、測定系内での反応にばらつきが出る可能性はあるので、ポリクローナル抗体は不適である。
さらに、用いる抗体が一価抗体分子だと、抗体を介した（抗原の吸着した）ラテックス粒子間の凝集反応が起こらないため、同じく不適である。抗原（認識）結合部位が、１分子あたり２つ以上必要であり、天然のイムノグロブリンタイプ（ＩｇＧ（２価）、ＩｇＡ（４価）、ＩｇＤ（２価）、ＩｇＥ（２価）及びＩｇＭ（１０価））や、ペプシン処理でできるＦ（ａｂ’）２（２価）や上記「１価抗体」のマルチマー抗体である必要がある。
【００３８】
「抗原（認識）結合部位」とは、抗原に結合できる抗体の最小部位を示す。これに限定されないが、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む部位を差す。軽鎖の可変領域であるＶＬ領域と重鎖の可変領域であるＶＨ領域を含んでもよい。これらは、遺伝子工学的に、あるいはＳＳ結合などを介して結合されていてもよい。
【００３９】
ラテックスとは、本来、ポリマー樹脂のコロイド状水分散物を指すが、本願において、「ラテックス粒子」とは、均一な粒子径を有するポリマー樹脂を指す。通常の免疫測定法に用いることの出来るラテックス粒子であれば、特に限定しないが、ポリスチレンを主材料としているものが望ましい。
本願に用いるラテックス粒子の粒子径は、５０ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは７５ｎｍ〜３０６ｎｍ、より好ましくは１００ｎｍ〜１１１ｎｍであってよい。
【００４０】
本発明の実施形態に係る測定方法を実施するときは、ヒトＩｇＧ４を免疫測定するためのキットであって、（１）本発明抗体、（２）単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片及び（３）固相支持体、を含むキットを用いて行える。
このキットにおいては、固相支持体と単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片溶液とを別々に作製しておき、ＩｇＧ４を測定する際、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、あらかじめ、抗体を固相支持体に吸着させた状態で提供してもよい。このキットにおいては、検体中の単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片を抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。
さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００４１】
「単離ヒトＩｇＧ４又はそのペプチド断片」は、上記のように「ラテックス粒子に結合した抗原」として使用するので、本発明抗体のエピトープを含む必要がある。天然のＩｇＧ４分子を単離精製したものでもかまわないが、遺伝子工学的に作製されたその「ペプチド断片」、例えば、ヒトＩｇＧ４の軽鎖又は重鎖の定常領域の一部又は全部をクローニングしたものであってもかまわない。該ヒトＩｇＧ４の重鎖の定常領域の一部又は全部は配列番号４のアミノ酸配列の一部又は全部を含んでいてよい。
【００４２】
本発明の実施形態においては、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法により、ＩｇＧ４を測定することもできる。この場合、モノクローナル抗体として、本発明抗体以外に、他のＩｇＧ４に対する別な抗体も用いて実施することができる。サンドイッチアッセイによるＩｇＧ４を測定する方法の具体例は、以下の通りである。まず、一次抗体として本発明抗体を、固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、検体、例えば、血清中のＩｇＧ４と反応させ、固相支持体を洗浄し、次いで、吸着したＩｇＧ４と、ビオチン化した２次抗体、例えばビオチン化した別なＩｇＧ４に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応、次いで、発色反応を行うことにより、ＩｇＧ４を検出することができる。また、２次抗体を直接ペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼ等により酵素標識したものを用いることにより、同様の測定をすることができる。また、２次標識抗体に結合させる物質は測定方法によって酵素に限られるものではなく、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００４３】
本発明の実施形態において、本発明抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡを行うときは、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ用のキットを用いて実施することができる。
サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法で本発明の測定方法を実施するときは、例えば、ＩｇＧ４を免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体、ｉｉｉ）標識された、別なＩｇＧ４に対する抗体、及びｉｖ）標識を検出するための成分を含むキットを用いることによっても、ＩｇＧ４を測定することができる。
標識を検出するための成分とは、抗体が標識されたものを測定するための成分で、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素を含む試薬であり、標識がアルカリホスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルリン酸を含む試薬である。このキットには、必要に応じ、洗浄液を含んでいてもよい。
本発明において、このキットを使用するときは、検体中のＩｇＧ４を抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００４４】
このような、組織免疫染色法による検出は、ｉ）本発明のモノクローナル抗体、ｉｉ）標識された二次抗体およびｉｉｉ）発色試薬を構成成分として含むキットを用いて実施できる。標識された二次抗体としては、例えばペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した、動物由来の抗ＩｇＧ抗血清、抗ＩｇＧポリクローナル抗体などが挙げられ、発色試薬としては、標識に用いた酵素を発色するための通常用いられる発色基質などの試薬が用いられる。
【００４５】
本発明において、本発明抗体を用いた化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）又はラテックス凝集法を行う場合は、公知の化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ法）用キット、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）用キット又はラテックス凝集法用のキットを各々用いて実施することができる。
【実施例】
【００４６】
以下の実施例、比較例及び参考例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４７】
＜実施例１＞モノクローナル抗体の作製と評価
（１）モノクローナル抗体作製用抗原の選択と準備
ヒトＩｇＧ４を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを公知の方法（例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７）に準じて作製した。抗原として用いるＩｇＧ４はヒト血清より調製した。具体的にはヒト血清を硫安沈殿により分画・透析後、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＩｇＧ４  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）の製品添付文書に従い、ＩｇＧ４抗原を精製した。【００４８】
（２）免疫
ヒト血清より上記の方法で精製した０．５ｍｇ／ｍＬヒトＩｇＧ４と同体積量のフロイント完全アジュバント（シグマアルドリッチ）を乳化するまでよく混和し、乳化懸濁液を作製した。４週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスをジエチルエーテル麻酔し、上記の乳化懸濁液を１匹あたり５０μｇのヒトＩｇＧ４にて腹腔内投与を実施した。約２週間間隔で６回、上記と同様にフロイント不完全アジュバント（シグマアルドリッチ）にて作製した乳化懸濁液をそれぞれマウスに注射した。最終免疫として上記６回目の注射から約３週間後、同様に乳化懸濁液を注射した。【００４９】
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後にジエチルエーテル麻酔下にて外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。ポリエチレングリコールを用いて、脾臓細胞数と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）数の融合比率を５：１にて融合を実施した。融合細胞を１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ社）ＡＳＦ（コスモ・バイオ株式会社）ＨＡＴ（コスモ・バイオ株式会社）培地に分散し、４８ウェルプレート（住友ベークライト）に分注して３７℃、５％ ＣＯ２条件にて培養した。以下のスクリーニングに用いたハイブリドーマコロニー数は４４８１であった。【００５０】
（４）スクリーニング
得られたハイブリドーマのスクリーニングを１）ＩｇＧ４への結合能確認、２）特異性確認、３）免疫学的凝集阻止法への適応性確認、という３段階にて実施した。【００５１】
１）ＩｇＧ４への結合能評価
上記抗原として用いた精製したヒトＩｇＧ４を０．１μｇ／ウェルになるように９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に分注した。シェイカーにて７００ｒｐｍ、２５．０℃の条件で１時間振盪した。廃液し３００μＬのＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム；１５０ｍＭ塩化ナトリウム；０．０５％ポリオキシエチレン（２０） ソルビタンモノラウレート；ｐＨ７．４）にて３回洗浄後、１００μＬのブロッキング緩衝液（１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム；１５０ｍＭ塩化ナトリウム；１％ブロックエース粉末（大日本住友製薬）；ｐＨ７．４）を添加し、１晩以上４℃にて保存した。同様にＰＢＳＴにて洗浄後、ハイブリドーマコロニーの培養上清を１００μＬずつ添加し、上記と同条件にて振盪させた。同様にＰＢＳＴにて洗浄後、抗体希釈緩衝液（１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム；１５０ｍＭ塩化ナトリウム；０．０５％ポリオキシエチレン（２０） ソルビタンモノラウレート；０．０５％ウシ血清アルブミン；ｐＨ７．４）にて１００００倍希釈した抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）  ＨＲＰ標識抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１００μＬずつ添加し、上記と同条件にて振盪させた。同様にＰＢＳＴにて洗浄後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ）を１００μＬ添加した。室温にて１５分間静置した後、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸（和光純薬工業）を１００μＬ添加した。波長４５０ｎｍをマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にて測定した。合計４４８１ウェル中、ＩｇＧ４への結合能が確認された１９２ウェルを選定した。選定されたハイブリドーマを単クローン化し、培養を続けた。【００５２】
２）特異性評価
１）にて選定されたクローンから産生される抗体の特異性を評価した。Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ１（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ２（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ３（シグマアルドリッチ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ４（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ（−）にて調整した。調整した試料を９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に１００μＬずつ添加した。シェイカーによる振盪以降の操作を上記１）と同様に行った。１９２クローン中、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ１、２、３と比べて、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ４に強い反応を示す８クローンを選定した。【００５３】
（３）免疫学的粒子凝集阻止法への適応性評価
２）にて選定されたクローンから産生される抗体において、免疫学的凝集阻止法への適用性を評価した。
１）第一試薬（Ｒ１）の調製
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝溶液１に、上記の通り選定された８クローン由来の産生抗体をそれぞれ含む溶液を１５μｇ／ｍＬの濃度になるように加え、第一試薬とした。
２）第二試薬（Ｒ２）の調製
２％濃度の粒径１０７ｎｍのポリスチレン製のラテックス粒子溶液１８ｍＬに、ヒト血清から通常の方法で粗精製したヒトＩｇＧ４  ０．３５ｍｇ／ｍＬ溶液１８ｍＬを加え、室温にて１時間撹拌してラテックス粒子にヒトＩｇＧ４を物理吸着させた。その後２０，０００ｒｐｍで９０分間遠心分離を行い、上清を廃棄して沈殿物を回収した。この沈殿物に３％濃度のウシ血清アルブミンを含むコート緩衝液を２４ｍＬ加えて懸濁し、超音波処理を行って完全に分散させた後、室温で１時間撹拌した。次いで、再び遠心分離を行って得られた沈殿物にＨＥＰＥＳ緩衝溶液２を１２ｍＬ加え懸濁し超音波処理を行って完全に分散させた後、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２にてラテックス濃度０．１２％に調整したヒトＩｇＧ４感作ラテックス粒子懸濁液を得て、各第一試薬に対し共通する第二試薬として用いた。
なお、各試薬の組成は以下の通りである。
ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１
２５ｍＭ  ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（埼京化成工業）；１００ｍＭ  ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパン  スルホン酸（埼京化成工業）；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム（和光純薬工業）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光純薬工業）；３．３％デキストラン７０（東京化成工業）；０．１％  ブロックエース（大日本住友製薬）；０．０９％  アジ化ナトリウム（和光純薬工業）；ｐＨ７．４０。
コート緩衝液
２５ｍＭ  ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（埼京化成工業）；１５０ｍＭ  塩化ナトリウム（和光純薬工業）；     １ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光純薬工業）；３％  ウシ血清アルブミン（メルクミリポア）；０．０９％  アジ化ナトリウム（和光純薬工業）；ｐＨ７．５０。
ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２
５００ｍＭ  ２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（埼京化成工業）；     ２５ｍＭ  ２−モルホリノエタンスルホン酸（和光純薬工業）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ（和光純薬工業）；１５０ｍＭ  Ｌ−アルギニン塩酸塩（和光純薬工業）；０．０７５％  プロクリン９５０（シグマアルドリッチ）；ｐＨ６．００。【００５４】
３）吸光度変化量の測定
標準試料として、ヒトＩｇＧ４濃度をそれぞれ０．０、１．６、６．３、１２．５、２５．０、５０．０ｍｇ／ｄＬに調整した標準ヒト血清を用いた。なお０．０ｍｇ／ｄＬには生理食塩水を用いた。日立７１８０形自動分析装置を用い、試料３μＬに対し第一試薬１２０μＬ、第二試薬１２０μＬを反応させ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて１８〜２８測光ポイント間（Ｒ２添加後約１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した（ｎ＝２）。８クローン中５クローンより産生される抗体は、０．０ｍｇ／ｄＬ時に最も大きい吸光度変化量を示し、ヒトＩｇＧ４濃度が上昇するに従って吸光度変化量が減少した。よって、５クローン（MaI4-09、MaI4-08、MaI4-01、MaI4-06、MaI4-03）は免疫学的凝集阻止法への適応性を示した。一方で他３クローン（MaI4-02、MaI4-04、MaI4-05）に関しては０．０ｍｇ／ｄＬ時における最も大きい吸光度変化量、及びヒトＩｇＧ４濃度上昇に伴う吸光度変化量の減少が認められず、免疫学的凝集阻止法へ適応しなかった（図１）。免疫学的凝集阻止法への適応性を示した抗体を産生する５クローンのうち、０．０ｍｇ／ｄＬ時の吸光度変化量が高い抗体を産生する上位２クローンを選定し、以降の解析に用いた。【００５５】
（４）寄託
上記で選定されたハイブリドーマＭａＩ４−０８及びＭａＩ４−０９は、２０１５年９月１日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構内特許微生物寄託センターに対して２０１５年９月１日に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１１２（ＭａＩ４−０８）及びＮＩＴＥ  ＡＰ−０２１１３（ＭａＩ４−０９）で受領され、２０１５年９月１４日生存確認後、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１１２（ＭａＩ４−０８）及びＮＩＴＥ  Ｐ−０２１１３（ＭａＩ４−０９）が付与された（受託証２０１５年９月３０日発行）。
以下に、寄託を特定する内容を記載する。
［１］寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人  製品評価技術基盤機構産業技術総合研究所  特許微生物寄託センター
あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）
［２］寄託日：２０１５年９月１日
［３］受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１１２（ハイブリドーマＭａＩ４−０８）
ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１１３（ハイブリドーマＭａＩ４−０９）
その後、同じハイブリドーマを国際寄託するために、独立行政法人製品評価技術基盤機構内特許微生物寄託センターに対して微生物移管請求を行い、２０１８年６月８日に受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２１１２（ＭａＩ４−０８）及びＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２１１３（ＭａＩ４−０９）で受領された。【００５６】
（５）細胞培養法によるモノクローナル抗体の産生
上記ハイブリドーマより抗体を産生させる方法として、公知の方法（例えば  モノクローナル抗体：生化学実験法  東京化学同人）に準じて行った。具体的にはモノクローナル抗体を産生するためにはｉｎ  Ｖｉｒｔｏでの培養及びＩｎ  Ｖｉｖｏでの培養がある。Ｉｎ  Ｖｉｒｔｏでの培養としては培養液中におけるハイブリドーマの培養等があり、一方でＩｎ  Ｖｉｖｏでの培養方法としてマウス腹水を作製する方法等があるが、Ｉｎ  Ｖｉｒｔｏでの培養を選択し、モノクローナル抗体を含む培養液上清を取得した。【００５７】
（６）モノクローナル抗体の精製
上記よりモノクローナル抗体を精製する方法として、公知の方法（例えばモノクローナル抗体：生化学実験法  東京化学同人）に準じて行った。モノクローナル抗体の精製としてアフィニティークロマトグラフィー精製が一般的であり、プロテインＧやプロテインＡ等を担持したセファロースカラムを用いるが、プロテインＧを担持したプロテインＧセファロースカラム（ＧＥヘルスケア）を選択し、精製を行った。得られたモノクローナル抗体における２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体濃度を確認した。濃度を調整後、０．４５μｍ以下フィルターで濾過滅菌した。【００５８】
（７）抗体の確認
ＭａＩ４−０８、ＭａＩ４−０９産生抗体をそれぞれＩｓｏ−Ｇｏｌｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｗｉｔｈ  κ ａｎｄ λ）（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ）の製品添付文書に従い、アイソタイプの同定を実施した。アイソタイプは表１の通りであった。
【表１】
2019009346.tif 000003
【００５９】
（８）ＥＬＩＳＡによる特異性の評価
Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＡ１（Ａｂｃａｍ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＡ２（Ａｂｃａｍ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＤ（Ａｂｃａｍ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＥ（Ａｂｃａｍ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＭ（Ａｂｃａｍ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ１（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ２（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ３（シグマアルドリッチ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ４（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ（−）にて調整した。調整した試料を９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に１００μＬずつ添加した。シェイカーにて７００ｒｐｍ、２５．０℃の条件で１時間振盪した。廃液し３００μＬのＰＢＳＴにて３回洗浄後、１００μＬのブロッキング緩衝液を添加し、１晩以上４℃にて保存した。同様にＰＢＳＴにて洗浄後、１μｇ／ｍＬになるように抗体希釈緩衝液にて調整したＭａＩ４−０８、ＭａＩ４−０９産生抗体をそれぞれ１００μＬずつ添加し、上記と同条件にて振盪させた。同様にＰＢＳＴにて洗浄後、抗体希釈緩衝液にて４０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ標識抗体（Ａｂｃａｍ）を１００μＬずつ添加し、上記と同条件にて振盪させた。同様にＰＢＳＴにて洗浄後、ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ）を１００μＬ添加した。ＭａＩ４−０８、ＭａＩ４−０９それぞれ５、３分後に０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸（和光純薬）を１００μＬ添加した。波長４５０ｎｍをマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にて測定した。その結果、他調整試料と比べＭｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ４に強いシグナルが確認された（表２及び３、図２及び３）。【００６０】
【表２】
2019009346.tif 000004
【００６１】
【表３】
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【００６２】
（９）モノクローナル抗体のアミノ酸配列解析
ＭａＩ４−０８、ＭａＩ４−０９はそれぞれＦｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社のプロトコルによって、ｍＲＮＡの抽出、クローニング及びシークエンシグを行った。解析した結果、ＭａＩ４−０８の可変領域は配列番号５（重鎖可変領域）及び配列番号６（軽鎖可変領域）であり、ＭａＩ４−０９の可変領域は配列番号７（重鎖可変領域）及び配列番号８（軽鎖可変領域）であり、ＣＤＲのアミノ酸配列は表４の通りになった。
【表４】
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【００６３】
＜実施例２＞ＭａＩ４−０８、ＭａＩ４−０９産生抗体を用いた測定試薬調製及び測定
（１）試薬の調製
１）第一試薬（Ｒ１）の調製
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝溶液１に、ＭａＩ４−０８またはＭａＩ４−０９産生抗体溶液を１５μｇ／ｍＬの濃度になるように加え、第一試薬とした。また対照試薬として、ＭａＩ４−０５産生抗体及び市販抗体ＨＰ６０２５（メルクミリポア）を同様にＨＥＰＥＳ緩衝溶液１に添加した溶液を調製した。
２）第二試薬（Ｒ２）の調製
２％濃度の粒径１０７ｎｍのポリスチレン製のラテックス粒子溶液１８ｍＬに、ヒト血清から通常の方法で粗精製したヒトＩｇＧ４  ０．３５ｍｇ／ｍＬ溶液１８ｍＬを加え、室温にて１時間撹拌してラテックス粒子にヒトＩｇＧ４を物理吸着させた。その後２０，０００ｒｐｍで９０分間遠心分離を行い、上清を廃棄して沈殿物を回収した。この沈殿物に３％濃度のウシ血清アルブミンを含むコート緩衝液を２４ｍＬ加えて懸濁し、超音波処理を行って完全に分散させた後、室温で１時間撹拌した。次いで、再び遠心分離を行って得られた沈殿物にＨＥＰＥＳ緩衝溶液２を１２ｍＬ加え懸濁し超音波処理を行って完全に分散させた後、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２にてラテックス濃度０．１２％に調整したヒトＩｇＧ４感作ラテックス粒子懸濁液を得て、各第一試薬に対し共通する第二試薬として用いた。【００６４】
なお、各試薬の組成は以下の通りである。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００６５】
（２）吸光度変化量の測定
標準試料として、ヒトＩｇＧ４濃度をそれぞれ１．６、６．３、１２．５、２５、５０ｍｇ／ｄＬに調整した標準ヒト血清を用いた。本測定では検体試料の測定を２０倍希釈にして測定することを前提とするため、最終的な標準試料濃度は２０倍となり、３１．３、１２５、２５０、５００、１０００ｍｇ／ｄＬとなる。以降に記載する試料濃度は全て２０倍した最終的な試料濃度とする。ヒトＩｇＧ４濃度０．０ｍｇ／ｄＬの試料には塩化ナトリウムを０．８５％含む生理食塩水を用いた。ヒトＩｇＧ４濃度の測定は日立７１８０形自動分析装置を用い、試料３μＬに対し第一試薬１２０μＬ、第二試薬１２０μＬを反応させ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて１８〜２８測光ポイント間（Ｒ２添加後約１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した（ｎ＝２）。【００６６】
（３）測定結果
上記試薬を用いて、ヒトＩｇＧ４濃度を測定した際の吸光度変化量を表８並びに図４、５、６、及び７にそれぞれ示した。
【表８】
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【００６７】
表８並びに図４から７に示されるように、第一試薬に用いるマウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体としてＭａＩ４−０８産生抗体またはＭａＩ４−０９産生抗体を用いた場合、ヒトＩｇＧ４濃度が高くなるにしたがって、吸光度変化量が減少した。一方でＭａＩ４−０５産生抗体および市販抗体ＨＰ６０２５で調製した対照試薬を用いた場合、ヒトＩｇＧ４濃度依存的な吸光度変化は見られなかった。以上より、ＭａＩ４−０５産生抗体および、市販の抗体ＨＰ６０２５にて調製した試薬は自動分析装置でのラテックス（粒子）凝集阻止法に適用させることが困難であることがわかった。一方でＭａＩ４−０８およびＭａＩ４−０９産生抗体にて調製した試薬はラテックス（粒子）凝集阻止法に適用することが可能であり、自動分析装置を用いたヒトＩｇＧ４濃度測定に有用であることが明らかとなった。【００６８】
（４）希釈直線性の評価
第一試薬に用いるマウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体としてＭａＩ４−０８産生抗体またはＭａＩ４−０９産生抗体を用いた場合について、希釈直線性の評価を行った。試料としてヒトＩｇＧ４濃度を１０００ｍｇ／ｄＬに調整した標準ヒト血清を、塩化ナトリウムを０．８５％含む生理食塩水により段階希釈した試料を検体として用いた。ヒトＩｇＧ４濃度０．０ｍｇ／ｄＬの試料には生理食塩水をそのまま用いた。ヒトＩｇＧ４濃度の測定は日立７１８０形自動分析装置を用い、試料３μＬに対し第一試薬１２０μＬ、第二試薬１２０μＬを反応させ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて１８〜２８測光ポイント間（Ｒ２添加後約１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した（ｎ＝２）。表６の結果から検量線を作成し、試料中のヒトＩｇＧ４濃度を算出した。【００６９】
（５）プロゾーン現象への耐性の評価
第一試薬に用いるマウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体としてＭａＩ４−０８産生抗体またはＭａＩ４−０９産生抗体を用いた場合について、プロゾーン現象への耐性評価を行った。試料としてヒトＩｇＧ４濃度を８０００ｍｇ／ｄＬに調整した標準ヒト血清を、塩化ナトリウムを０．８５％含む生理食塩水により段階希釈し、検体として用いた。ヒトＩｇＧ４濃度の測定は日立７１８０形自動分析装置を用い、試料３ｕＬに対し第一試薬１２０μＬ、第二試薬１２０ｕＬを反応させ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて１８〜２８測光ポイント間（Ｒ２添加後約１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した（ｎ＝２）。表６の結果から検量線を作成し、試料中のヒトＩｇＧ４濃度を算出した。【００７０】
（６）ヒトＩｇＧ４に対する特異性の評価
第一試薬に用いるマウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体としてＭａＩ４−０８産生抗体またはＭａＩ４−０９産生抗体を用いた場合について、ヒトＩｇＧ４に対する特異性の評価を行った。試料として３０００ｍｇ／ｄＬに調整したＭｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ４溶液（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。また対照試料として、同様に調整したＭｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ１溶液（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ２溶液（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｍｙｅｌｏｍａ  ヒトＩｇＧ３溶液（シグマアルドリッチ）を用いた。ブランク試料には生理食塩水を用いた。ヒトＩｇＧ４濃度の測定は日立７１８０形自動分析装置を用い、試料３μＬに対し第一試薬１２０μＬ、第二試薬１２０μＬを反応させ、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍにて１８〜２８測光ポイント間（Ｒ２添加後約１分後から４分後に相当）において、２ポイントエンド法による吸光度変化量を測定した（ｎ＝２）。表６の結果から検量線を作成し、試料中のヒトＩｇＧ４濃度を算出した。【００７１】
（７）測定結果
結果を図８〜１３、表９及び１０にそれぞれ示した。
【表９】
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【表１０】
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本発明のハイブリドーマが産生したマウス抗ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体を第一試薬に用いた場合、０〜１０００ｍｇ／ｄＬの検量範囲で十分な希釈直線性を有することが判明した（図８及び９）。また、プロゾーン現象については８０００ｍｇ／ｄＬまで測定値の低下は見られなかった（図１０及び１１）。さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３への反応性はほとんど認められなかった（図１２及び１３、表９及び１０）。【００７２】
以上のように、スクリーニング段階だけでなく、抗ＩｇＧ４モノクローナル抗体として報告されている抗体（ＨＰ６０２５）（非特許文献６）でも、免疫学的粒子凝集阻止法に適さない抗体があることが新たにわかった。免疫学的粒子凝集阻止法に適した抗体と適さない抗体の違いを明確にすべく、抗体の相互作用の解析及びエピトープ解析を行った。【００７３】
＜実施例３＞相互作用の解析
ＭａＩ４−０８及びＭａＩ４−０９の産生抗体と、対照としてＭａＩ４−０５産生抗体及びＨＰ６０２５とを１ｍｇ／ｍＬになるように調製した。またヒト血清より精製した１  ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ４を調製した。株式会社住化分析センターのプロトコルに沿って、ＩｇＧ４をアミンカップリング法にてチップに固定化し、Ｂｉａｃｏｒｅ機種を用いたセンサーグラム取得を行った。得られた結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）及び解離定数（ＫＤ）は表１１の通りとなった。
【表１１】
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３種類の抗体のうち、ＭａＩ４−０５産生抗体の結合速度定数ｋａはＭａＩ４−０８およびＭａＩ４−０９産生抗体の１０分の１以下であり、ＨＰ６０２５抗体の結合速度定数ｋａはＭａＩ４−０８およびＭａＩ４−０９産生抗体の１００分の１以下であった。【００７４】
＜実施例４＞エピトープの解析
ＵｎｉｐｒｏｔよりヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のアミノ酸配列を取得した（Ｐ０１８６１、配列番号４）。得られたアミノ酸配列を部分的に欠損させたそれぞれ配列番号４及び２５〜３５で示されるアミノ酸配列Ｈ１〜１２（図１４）のＮ末端にＧＳＴタグを連結したペプチドを設計した。Ｈ１（配列番号４）はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域全長のアミノ酸配列からなるものである。Ｈ２はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の１から２７４番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号２５）。Ｈ３はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の１から２２０番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号２６）。Ｈ４はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の１から１６５番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号２７）。Ｈ５はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の１から１１０番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号２８）。Ｈ６はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の１から５５番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号２９）。Ｈ７はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の５６から３２７番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号３０）。Ｈ８はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の１１１から３２７番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号３１）。Ｈ９はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の１６６から３２７番目までのアミノ酸配列からなるたものである（配列番号３２）。Ｈ１０はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２２１から３２７番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号３３）。Ｈ１１はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２７５から３２７番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号３４）。Ｈ１２はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の９９から２２０番目までのアミノ酸配列からなるものである（配列番号３５）。【００７５】
また、ヒトＩｇＧ４重鎖ＣＨ３領域中のアミノ酸配列（Ｈ１０、配列番号３３）において、ヒトＩｇＧ４特異配列を部分的にヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の対応するアミノ酸に部分的に置換させた、それぞれ配列番号３６〜４４によって示されるアミノ酸配列Ｈ３１−３９（図１５）のＮ末端にＧＳＴタグを連結したペプチドを設計した。Ｈ３１はＨ１０のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２３５番目のグルタミン残基をアルギニン残基へ置換したものである（配列番号３６）。Ｈ３２はＨ１０のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２８９番目のアルギニン残基をリシン残基へ置換したものである（配列番号３７）。Ｈ３３はＨ１０のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２９９番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基へ置換したものである（配列番号３８）。Ｈ３４はＨ１０のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の３２５番目のロイシン残基をプロリン残基へ置換したものである（配列番号３９）。Ｈ３５はＨ１０のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２３５番目のグルタミン残基をアルギニン残基へ、２８９番目のアルギニン残基をリシン残基へ、２９９番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基へ、３２５番目のロイシン残基をプロリン残基へ置換したものである（配列番号４０）。Ｈ３６はヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２２１から３２７番目のアミノ酸配列中のＩｇＧ４特異配列を全て対応するＩｇＧ１のアミノ酸配列へ置換したものである（配列番号４１）。Ｈ３７はＨ１０のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２８９番目のアルギニン残基をリシン残基へ、３２５番目のロイシン残基をプロリン残基へ置換したものである（配列番号４２）。Ｈ３８はＨ１０のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２８９番目のアルギニン残基をリシン残基へ、２９９番目のグルタミン酸残基をグルタミンへ、３２５番目のロイシン残基をプロリン残基へ置換したものである（配列番号４３）。Ｈ３９はＨ３６のアミノ酸配列を元に、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２９９番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に置換したものである（配列番号４４）。【００７６】
設計した各アミノ酸配列を元に、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社のプロトコルによって大腸菌での蛋白質発現に適した塩基配列を設計し、各塩基配列を挿入したベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス）を作製した。大腸菌ＢＬ２１株に作製した発現プラスミドを導入し形質転換体を得た。形質転換体を通常の方法にて培養し、ＩＰＴＧによる蛋白質発現を誘導した。遠心分離にて集菌後、通常の溶解液にて溶解し、超音波処理を行った。得られた溶解液６μＬにＳＤＳサンプル緩衝液６μＬを添加した。各調製した試料は９５℃にて５分間加熱処理を行った。ＳＤＳ泳動緩衝液を添加した５〜２０％泳動ゲル（アトー）の各ウェルに、上記の大腸菌破砕試料を１０μＬずつ添加した。また分子量スタンダード（バイオラッド）も同様にウェルに添加し泳動した。泳動終了後、泳動ゲルを転写緩衝液にてＰＶＤＦメンブレン（メルクミリポア）に転写した。ＰＶＤＦメンブレンをメンブレンブロッキング緩衝液に浸漬し、室温にて３０分間振盪させた。ＭａＩ４−０８、ＭａＩ４−０９、ＭａＩ４−０５産生抗体のアミノ基に対し、ＰＯＤ標識キット（同人化学研究所）を用いてＰＯＤ標識処理を施した。得られた標識抗体をＰＢＳＴにてそれぞれ１０００倍希釈した。ＰＶＤＦメンブレンをＰＢＳＴにて洗浄後、それぞれ調製した前記抗体溶液をＰＶＤＦメンブレンへ添加し、室温にて１時間反応させた。ＰＶＤＦメンブレンをＰＢＳＴにて洗浄後、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用しＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｌａｓ４０００にてシグナルを検出した。【００７７】
その結果、ＭａＩ４−０８及びＭａＩ４−０９産生抗体のどちらもＨ−１、Ｈ−７、Ｈ−８、Ｈ−９及びＨ−１０においてシグナルが確認された。よってＭａＩ４−０８及びＭａＩ４−０９産生抗体のエピトープは、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列に存在する事が明らかとなった（図１６及び図１７）。
さらに、ＭａＩ４−０８、ＭａＩ４−０９産生抗体に関しては２９９番目のグルタミン酸が保存された条件（Ｈ−１０、Ｈ−３１、Ｈ−３２、Ｈ−３４、Ｈ−３７）においてシグナルが確認されたが、２９９番目のグルタミン酸をグルタミンに置換した条件（Ｈ−３３、Ｈ−３５、Ｈ−３６、Ｈ−３８）ではシグナルは確認されなかった。したがってＭａＩ４−０８，ＭａＩ４−０９産生抗体のエピトープはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２９９番目のグルタミン酸残基を含むことを必須とするヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の２２１番目から３２７番目のアミノ酸配列に存在することが明らかとなった（図１８及び図１９）。
一方、ＭａＩ４−０５産生抗体は、９９から１１０番目のアミノ酸配列、すなわちヒンジ領域を含む配列（Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−７、Ｈ−１２）にのみシグナルが確認された。したがって、ＭａＩ４−０５産生抗体のエピトープはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域の９９から１１０番目のアミノ酸配列に存在することが明らかとなった（図２０）。【００７８】
Ｈ−１乃至Ｈ−１２、並びにＨ−３１乃至Ｈ−３９のアミノ酸配列を以下に示す。
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【００７９】
また、各試薬の組成は以下の通りである。
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【００８０】
以上に詳細に説明した通り、本発明の免疫測定法では、測定対象目的物質（ヒトＩｇＧ４）に対して反応性及び選択性の高い抗体を用いて使用することで反応系中の競合物質（ＩｇＧ１〜３など）の影響を除き、目的物質を特異的に精密測定することができる。本発明の抗ヒトＩｇＧ４抗体を用いれば、試料中のヒトＩｇＧ４を特異的に検出測定することか可能であり、ＩｇＧ４関連疾患などの診断や臨床検査の分野において極めて有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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