(57)【要約】本発明は、植物病原性菌および植物非病原性菌の２種類の菌の中から、試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供する。本発明では、まず、貫通孔を具備する基板の表側の面に、試験試料を配置する。基板は、セルロースフィルムを、その裏側の面に具備している。基板の貫通孔は、７．０６５マイクロ平方メートル以上１９．６２５マイクロ平方メートル以下の断面積を有している。セルロースフィルムは貫通孔を有せず、かつ０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有している。次に、試験試料を静置し、セルロースフィルムに紫外線を照射し、菌呈色試薬に接触させる。呈色が見られたら試験試料は植物病原性菌を含有すると判定される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）  貫通孔を具備する基板の表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
ここで、
前記基板は、セルロースフィルムを、その裏側の面に具備しており、
前記基板の貫通孔は、７．０６５マイクロ平方メートル以上１９．６２５マイクロ平方メートル以下の断面積を有しており、  前記セルロースフィルムは貫通孔を有しておらず、かつ
前記セルロースフィルムは、０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有しており、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記試験試料を静置する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記セルロースフィルムの表側の面に対向するように設置された紫外線光源を用いて、前記セルロースフィルムに紫外線を照射する工程、
（ｄ）  前記工程（ｃ）の後、前記セルロースフィルムの裏面の面を、菌呈色試薬に接触させる工程、および
（ｅ）  前記菌呈色試薬が呈色した場合には、前記試験試料は前記植物病原性菌を含有すると判定する工程、
を具備する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記植物病原性菌が、植物病原性真菌である、
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記植物病原性真菌が、Colletotrichum属、Fusarium属、Botrytis属、Passalora属およびPseudocercospora属からなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、
前記植物病原性真菌が、Colletotrichum gloeosporioides、Fusarium avenaceum、Botrytis cinerea、Passalora fulvaおよびPseudocercospora fuligenaからなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記植物病原性菌が、植物病原性卵菌である、
方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）の前に、前記試験試料に培地を供給する工程をさらに具備する、
方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である、
方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である、
方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記セルロースフィルムの裏面の面を培地に接触させながら、前記試験試料が静置される、
方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記培地が液体培地である、
方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、
前記培地が固体培地である、
方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が固体である、
方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
前記固体が、植物体の一部、土壌および破砕された植物からなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
前記試験試料が液体である、
方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記液体が、農業用水、水耕栽培のために用いられた液体、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、および衣類または靴を洗浄するために使用した後の液体からなる群から選択される少なくとも１つである、
方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法の実施に用いられるデバイスであって、
前記基板と、前記セルロースフィルムとを備えるデバイス。
【請求項１７】
積層体であって、
貫通孔を具備する基板、および
セルロースフィルム
を具備し、
前記セルロースフィルムは、前記基板上に積層されており、
前記基板の貫通孔は、７．０６５マイクロ平方メートル以上１９．６２５マイクロ平方メートル以下の断面積を有しており、
前記セルロースフィルムは貫通孔を有しておらず、かつ
前記セルロースフィルムは、０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有している、
積層体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、糸状菌計量方法を開示している。図１０は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。特許文献１に開示された糸状菌計量方法は、被験材料中の糸状菌数を計量するのに短時間の培養で糸状菌を計量し、また、正確な糸状菌を計量することができる糸状菌計量方法を提供することを目的としている。この糸状菌計量方法は、液体培養で培養した糸状菌１３、または微多孔膜支持体４の微多孔膜１上で培養した糸状菌１３の複数に伸びた菌糸を撮像した後、形状と面積および発光輝度を画像解析手段１０で認識し解析させることにより、糸状菌１３を短時間の培養で計量できるという作用を有する。微多孔膜１は、押さえリング２およびベース３の間に挟まれている。【０００３】
非特許文献１は、植物病原性卵菌の１種であるPhytophthora sojaeの偽菌糸が、３マイクロメートルの孔を有するＰＥＴ膜を貫通することを開示している。【０００４】
特許文献２は、試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２８７３３７号公報
【特許文献２】特開２０１７−０２９１３１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Paul F. Morris. et. al. “Chemotropic and Contact Responses of Phytophthora sojae Hyphae to Soybean Isoflavonoids and Artificial Substrates”, Plant Physiol. (1998) 117: 1171-1178
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、植物病原性菌および植物非病原性菌の２種類の菌の中から、試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを判定する方法を提供する。当該方法は、以下の工程を具備する。
（ａ）  貫通孔を具備する基板の表側の面に、前記試験試料を配置する工程、
ここで、
前記基板は、セルロースフィルムを、その裏側の面に具備しており、
前記基板の貫通孔は、７．０６５マイクロ平方メートル以上１９．６２５マイクロ平方メートル以下の断面積を有しており、  前記セルロースフィルムは貫通孔を有しておらず、かつ
前記セルロースフィルムは、０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有しており、
（ｂ）  工程（ａ）の後、前記試験試料を静置する工程、
（ｃ）  工程（ｂ）の後、前記セルロースフィルムの表側の面に対向するように設置された紫外線光源を用いて、前記セルロースフィルムに紫外線を照射する工程、
（ｄ）  前記工程（ｃ）の後、前記セルロースフィルムの裏面の面を、菌呈色試薬に接触させる工程、および
（ｅ）  前記菌呈色試薬が呈色した場合には、前記試験試料は前記植物病原性菌を含有すると判定する工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、植物病原性菌および植物非病原性菌の２種類の菌の中から、試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、第１容器１００の断面図を示す。
【図２】図２は、セルロースフィルム１０４を裏面の面に具備する基板１７０の断面図を示す。
【図３】図３は、試験試料が供給された第１容器１００の断面図を示す。
【図４】図４は、植物病原性菌が表面に配置された基板１７０の断面図を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、植物病原性菌が貫通孔１７２およびセルロースフィルム１０４を貫通した様子を示す断面図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、工程（ｃ）での断面図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、工程（ｃ）の後の断面図である。
【図６】図６は、菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。
【図７】図７は、図６に続き、菌の培養を加速させる方法の一例の断面図を示す。
【図８】図８は、セルロースフィルム１０４の裏面の面から菌を観察する様子を示す断面図である。
【図９】図９は、セルロースフィルム１０４の裏面の面から菌を観察する様子を示す断面図である。
【図１０】図１０は、特許文献１に開示された糸状菌計量方法のために用いられる微多孔膜支持体の断面図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
まず、本明細書において用いられる用語「菌」が説明される。用語「菌」は、真菌および卵菌を含む。菌は、植物病原性菌および植物非病原性菌の２種類の菌に大別される。植物病原性真菌は、例えば、Fusarium属、Colletotrichum属、Botrytis属、Passalora属またはPseudocercospora属を含む。植物病原性真菌の例は、Fusarium avenaceum、Colletotrichum gloeosporioides、Botrytis cinerea、Passalora fulvaまたはPseudocercospora fuligenaである。これらの植物病原性菌は、根腐れ病(Root rot disease)、いもち病(blast）、炭疽病(Anthrax)、灰色かび病(Gray mold)などを引き起こす。これらの植物病原性菌は、植物を枯らす。植物非病原性菌の例は、Saccharomyces cerevisiae、Penicillium chysogeum、またはAspergillus oryzaeである。
【００１２】
用語「植物病原性」とは、植物に対して病原性を有していることを意味する。用語「植物非病原性」とは、植物に対して病原性を有していないことを意味する。菌が病原性を有しているとしても、植物に対して病原性を有していないのであれば、その菌は「植物非病原性」である。言い換えれば、菌が植物に対して悪影響を与えないのであれば、その菌は「植物非病原性」である。用語「植物非病原性」に含まれる接頭語「非」は、「植物」を修飾しない。接頭語「非」は「病原性」を修飾する。
【００１３】
以下、本発明の実施形態が図面を参照しながら詳細に説明される。日本国特許第6167309号、米国特許第9695459号、欧州特許第3128001号、日本特許第6167310号、米国特許第9689020号、欧州特許第3128002号、国際特許出願PCT/JP2016/004417、および国際特許出願PCT/JP2017/008407は、本明細書に参考として援用される。
【００１４】
（工程（ａ））
工程（ａ）では、貫通孔１７２を具備する基板１７０の表側の面に試験試料が配置される。基板１７０の裏側の面１７０ｂには、セルロースフィルム１０４が貼付されている。言い換えれば、セルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａは、基板１７０の裏側の面１７０ｂに接している。表側の面１０４ａとは、セルロースフィルム１０４の上側の面を意味する。
【００１５】
具体的には、図１に示されるように、容器１００が用意される。容器１００は、上端にフランジ１０２を具備していることが望ましい。容器１００の底面は、基板１７０から形成されている。
【００１６】
図２に示されるように、基板１７０は、その裏側の面１７０ｂに、セルロースフィルム１０４を具備する。基板１７０は、その表側の面１７０ａから裏側の面１７０ｂまで貫通する貫通孔１７２を具備している。貫通孔１７２は、３マイクロメートル以上５マイクロメートル以下の直径を有している。出願３および出願４を参照せよ。言い換えれば、貫通孔１７２は、７．０６５マイクロ平方メートル以上１９．６２５マイクロ平方メートル以下の断面積を有している。出願３および出願４を参照せよ。なお、基板１７０とは異なり、セルロースフィルム１０４は貫通孔を有さないことに留意せよ。
【００１７】
図３に示されるように、この容器１００の内部に、試験試料２００が供給される。このようにして、基板１７０の表側の面１７０ａ上に試験試料２００が配置される。試験試料２００が植物病原性菌２０２を含有している場合、図４に示されるように、基板１７０の表側の面１７０ａ上に植物病原性菌２０２が配置される。
【００１８】
試験試料２００は、固体、液体、または気体である。試験試料２００は、固体または液体であることが望ましい。固体の試験試料２００の例は、土壌または破砕された植物である。他の例は、バーミキュライト、ロックウール、またはウレタンのような農業資材である。液体の試験試料２００の例は、農業用水、水耕栽培のために用いられた溶液、植物を洗浄するために使用した後の液体、植物から抽出された液体、農業資材を洗浄するために使用した後の液体、または作業者の衣類あるいは靴を洗浄するために使用した後の液体である。
【００１９】
（工程（ｂ））
工程（ｂ）では、工程（ａ）の後、試験試料２００が所定の培養時間、静置される。望ましくは、試験試料２００は、４〜１５０時間程度（より望ましくは２４〜１２０時間程度）静置される。このようにして、菌は培養される。言い換えれば、培養時間はおおよそ４〜１５０時間程度（望ましくは２４〜１２０時間程度）であることが望ましい。以下、セルロースフィルム１０４の厚みおよび貫通孔１７２の大きさの重要性が以下、説明される。
【００２０】
工程（ｂ）においては、試験試料２００に含有される様々な菌が成長する。出願１〜出願４においても実証されているように、以下の（Ｉ）が充足される場合、植物病原性菌２０２は、図５Ａに示されるように、セルロースフィルム１０４を貫通するように成長する。その結果、セルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂに植物病原性菌２０２が現れる。
条件（Ｉ）  セルロースフィルム１０４が、０．５マイクロメートル以上、３．７マイクロメートル以下の厚みを有すること。
【００２１】
上記（Ｉ）の条件が充足される場合、植物非病原性菌は、セルロースフィルム１０４をほとんど貫通しない。そのため、植物非病原性菌は、セルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂにほとんど現れない。一方、植物病原性菌２０２が選択的に裏面の面１０４ｂに現れる。このように、植物病原性菌２０２が選択的に容器１００の外側に現れる。裏側の面１０４ｂとは、セルロースフィルム１０４の下側の面を意味する。
【００２２】
セルロースフィルム１０４が、３．７マイクロメートルを超える厚みを有する場合、植物非病原性菌だけでなく植物病原性菌も、セルロースフィルム１０４を貫通しない。従って、セルロースフィルム１０４が３．７マイクロメートルを超える厚みを有する場合、選択性が失われる。セルロースフィルム１０４が、０．５マイクロメートル未満の厚みを有する場合（セルロースフィルム１０４が設けられない場合を含む）、植物病原性菌だけでなく植物非病原性菌も、セルロースフィルム１０４を貫通する（または、基板１７０の裏側の面１７０ｂに見いだされる）。従って、セルロースフィルム１０４が０．５マイクロメートル未満の厚みを有する場合、選択性が失われる。
【００２３】
貫通孔１７２が７．０６５マイクロ平方メートル未満の断面積（すなわち、３マイクロメートル未満の直径）を有する場合、植物非病原性菌だけでなく植物病原性菌もまた、セルロースフィルム１０４を貫通しにくくなる。一方、貫通孔１７２が１９．６２５マイクロ平方メートルを超える断面積（すなわち、５マイクロメートルを超える直径）を有する場合、貫通孔１７２が１９．６２５マイクロ平方メートルの断面積（すなわち、５マイクロメートルの直径）を有する場合と比較して、侵入点数が減少する傾向がある。
【００２４】
セルロースフィルム１０４は、基板１７０の裏側の面１７０ｂ上にピンと張られる。このように、基板１７０はセルロースフィルム１０４をサポートする。
【００２５】
図２に示されるように、基板１７０は複数の貫通孔１７２を有する。基板１７０の厚みは限定されないが、一例として１マイクロメートル以上５００マイクロメートル以下である。セルロースフィルム１０４は非常に薄い。しかし、このような基板１７０上にセルロースフィルム１０４が配置されると、セルロースフィルム１０４の取り扱いが容易となる。
【００２６】
菌の培養を加速させるために、試験試料２００に培地が供給され得る。具体的には、試験試料２００を含有する容器１００の内部に培地が供給され得る。培地は液体であることが望ましい。培地は、工程（ｂ）において供給され得る。これに代えて、培地は工程（ｂ）よりも前に供給され得る。言い換えれば、培地は工程（ａ）において供給され得る。培地は工程（ａ）の前に容器１００の内部に供給されても良い。
【００２７】
図６は、菌の培養を加速させる他の方法を示す。図６に示されるように、セルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂを液体の培地３０２に接触させることが望ましい。まず、液体の培地３０２を内部に有する第２容器３００が用意される。以下、第２容器３００から区別するため、容器１００は「第１容器１００」と呼ばれる。フランジ１０２の下面が第２容器３００の上端に接触するように、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされる。言い換えれば、第１容器１００が第２容器３００の上端によって支持される。このようにして、液体の培地３０２がセルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に挟まれる。
【００２８】
あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、セルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に液体の培地３０２が供給されても良い。
【００２９】
液体の培地３０２に代えて、粘性を有する固体の培地も用いられ得る。図６に示されるように、固体の培地３０４および液体の培地３０２の両者が用いられ得る。この場合、液体の培地３０２が固体の培地３０４およびセルロースフィルム１０４の間に挟まれる。図５Ａに示されるように、裏面の面１０４ｂに現れた植物病原性菌の培養が、液体培地３０２および固体培地３０４の少なくとも一方により加速される。
【００３０】
（工程（ｃ））
工程（ｃ）では、工程（ｂ）の後、図５Ｂに示されるように、セルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａに対向するように設置された紫外線光源４００を用いて、セルロースフィルム１０４に紫外線を照射する。
【００３１】
紫外線の殺菌作用により、図５Ｃに示されるように、セルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａ上に位置している部分の植物病原性菌２０２は死滅する。図５Ｃに含まれる破線を参照せよ。同様に、セルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａ上に位置している植物非病原性菌もまた、死滅する。一方、セルロースフィルム１０４が、紫外線を遮蔽するため、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに位置している植物病原性菌２０２の部分（すなわち、セルロースフィルム１０４を貫通した植物病原性菌２０２の一部分）は、生存したままである。基板１７０もまた、紫外線を遮蔽する。
【００３２】
紫外線の強度および照射時間は、本明細書を読解した当業者によって適切に選択され得る。余りにも高い強度を有する紫外線は、セルロースフィルム１０４および基板１７０によって十分遮蔽されないため、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに位置している植物病原性菌２０２の部分も死滅させる。その結果、菌の選択性が失われる。余りにも長い紫外線の照射時間も、同様の問題を引き起こす。
【００３３】
（工程（ｄ））
工程（ｄ）では、工程（ｃ）の後、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂを、菌呈色試薬に接触させる。このようにして、セルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂに現れた植物病原性菌２０２の一部分（図５Ｃを参照せよ）は、菌呈色試薬を呈色させる。菌呈色試薬は、生きている菌と反応し呈色する一方で、死んでいる菌とは反応せず呈色しない。菌呈色試薬は、一般に水溶性である。
【００３４】
理論上、第二容器３００と第一容器１００はセルロースフィルム１０４によって隔てられているので、菌呈色試薬は第１容器１００の内部には広がらない。従って、第１容器１００に含有されている植物病原性菌は、菌呈色試薬を呈色させない。
【００３５】
しかし、実際には、セルロースフィルム１０４を貫通した植物病原性菌２０２の周囲に形成された小さな隙間を通って、菌呈色試薬は、第１容器１００の内部には広がり得る。また、菌呈示試薬は一般に水溶性であるため、セルロースフィルム１０４の内部を通ってセルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａに広がり得る。
【００３６】
そのため、セルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａ上に位置している植物病原性菌２０２の一部分も、菌呈色試薬を呈色させる。さらに、セルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａ上に位置している植物非病原性菌（図示せず）もまた、菌呈色試薬を呈色させる。そのため、菌の選択性が失われる。
【００３７】
一方、本実施形態では、図５Ｃに示されるように、紫外線の照射により、セルロースフィルム１０４の表側の面１０４ａ上では、植物病原性菌２０２および植物非病原性菌（図示せず）は死滅している。しかし、植物病原性菌２０２の一部分がセルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに生き残っており、当該一部分が菌呈色試薬を呈色させる。言うまでもないが、植物非病原性菌は、セルロースフィルム１０４を貫通しないので、菌呈色試薬を呈色させない。このようにして、本実施形態では、セルロースフィルム１０４を貫通した植物病原性菌２０２の一部分が、選択的に、菌呈色試薬を呈色させる。
【００３８】
菌呈色試薬の例は、以下の化１の化学構造を有する化学物質である。当該化学物質は、ＷＳＴ−８と呼ばれる。
【００３９】
【化１】
2018198681.tif 000003
【００４０】
具体的には、工程（ｃ）の後、第２容器３００から液体の培地３０２および固体の培地３０４が除去される。次いで、第２容器３００の内部に、菌呈色試薬が添加される。次いで、図７に示されるように、第１容器１００は、菌呈色試薬を内部に有する第２容器３００に重ね合わされる。あるいは、第１容器１００が第２容器３００に重ね合わされた後に、セルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂおよび第２容器３００の底面の間に菌呈色試薬を含有する溶液４０２が供給されても良い。また、セルロースフィルム１０４から液が染み出すため、菌呈色試薬を含有する溶液４０２が第１容器１００内に供給されても良い。
【００４１】
（工程（ｅ））
工程（ｅ）では、工程（ｄ）において菌呈色試薬が呈色された場合には、試験試料は植物病原性菌を含有すると判定される。
【００４２】
本発明には、上述の植物病原性菌を含有するかどうかを選択的に判定する方法の実施に用いられるデバイスも含まれる。
【００４３】
本発明のデバイスは、少なくとも、基板と、セルロースフィルムとを備える。基板は、７．０６５マイクロ平方メートル以上１９．６２５マイクロ平方メートル以下の断面積、言い換えれば３マイクロメートル以上５マイクロメートル以下の直径を有する貫通孔を具備する。基板は、当該基板で底面が構成され、フランジを備える容器であってもよい。セルロースフィルムは、基板の一方の面に具備され、０．５マイクロメートル以上３．７マイクロメートル以下の厚みを有し、貫通孔を有していない。
【００４４】
本発明のデバイスは、菌の培養を加速させるための培地、菌呈色試薬などを含んでいてもよい。また、本発明のデバイスは、セルロースフィルムに紫外線を照射するための紫外線光源、菌呈色試薬の呈色を光学的に検出するための光学センサ、検出した結果を表示するための表示素子などを備えることもできる。
【００４５】
本発明の効果を阻害しない限り、セルロースフィルムおよび基板の間には、他の層が挟まれ得る。しかし、セルロースフィルムは基板上に接していることが望ましい。言い換えれば、本発明の効果を阻害しない限り、セルロースフィルムは、基板と接する必要はなく、この場合には、セルロースフィルムおよび基板の間には、他の層が挟まれるように、基板の上にセルロースフィルムが位置し得る。しかし、繰り返しになるが、セルロースフィルムは基板上に接するように、基板の上にセルロースフィルムが位置していることが望ましい。
【００４６】
（実施例）
以下の実施例を参照しながら、本発明がさらにより詳細に説明される。
【００４７】
（培地の用意）
まず、本発明者らは、純水（１リットル）に、０．５６ｍＭの硫酸鉄（III）、１．５３ｍＭの硝酸亜鉛、および１，１ｍＭの硫酸マンガン（II)を溶解し、水溶液を調製した。次に、本発明者らは、この水溶液（２ミリリットル）に、純水（１リットル）、ラクトース（３７．５グラム、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より入手）、カゼイン水和物（３．０グラム、Ｄｉｆｃｏ社より入手）、リン酸二水素カリウム（１．０グラム、和光純薬工業株式会社より入手）、硫酸マグネシウム（０．５グラム、和光純薬工業株式会社より入手）を混合かつ溶解して、混合物を調製した。本発明者らは、オートクレーブを用いて混合物を滅菌した。得られた混合物のｐＨは６．０であった。本発明者らは、この混合物を純水で１０倍に希釈して、培地を得た。以下、このようにして得られた培地を「１０％ＬＣＨ培地」という。
【００４８】
（ＷＳＴ反応液の調製）
本発明者らは、Ｄｕｒｏｑｕｉｎｏｎｅ（東京化成工業株式会社より入手、CAS番号:527-17-3）をエタノール（和光純薬工業株式会社より入手）に溶解し、Ｄｕｒｏｑｕｉｎｏｎｅエタノール溶液（５０ｍＭ）を得た。これとは別に、本発明者らは、2-Cyclohexylaminoethanesulfonic Acid（東京化成工業株式会社より入手、CAS:103-47-9、以下「Ｃｈｅｍ」という）を純水に溶解し、Ｃｈｅｍ溶液（１００ｍＭ）を得た。本発明者らは、Ｃｈｅｍ溶液のｐＨを、NaOH水溶液（１Ｍ、和光純薬工業株式会社より入手）を滴下することにより、９．５に調整した。
【００４９】
本発明者らは、以下の表１に示される試薬を混合して、ＷＳＴ反応液を得た。
【００５０】
【表１】
2018198681.tif 000004
【００５１】
ＷＳＴ−８溶液は、株式会社  同仁化学研究所より、商品名：WST-8 Microbial Viability Assay Kit-WSTとして入手した商品に含まれていた。ＷＳＴ−８は、「化１」として上述された化学構造を有していた。
【００５２】
（実験例１）
（Colletotrichum gloeosporioideの培養）
植物病原菌の一種であるColletotrichum gloeosporioideが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で１週間静置された。Colletotrichum gloeosporioideは岐阜大学応用生物科学部に所属する清水准教授より与えられた。
【００５３】
次いで、菌糸の先端を含む部分が、培地と共に１センチメートル×１センチメートルの大きさで切り出された。切り出された部分は、１２ウェルプレート上に配置された１０％ＬＣＨ培地に浸された。各純水の容積は１ミリリットルであった。
【００５４】
１２ウェルプレート上に配置された水が光学顕微鏡で観察された。その結果、１２ウェルプレート上に配置された水にColletotrichum gloeosporioideの胞子が放出されていることが確認された。このようにして、Colletotrichum gloeosporioideを含有する水溶液が得られた。以下、この水溶液は、「植物病原性菌水溶液」と呼ばれる。
【００５５】
（実験例１）
実験例１は、実施例１Ａ〜実施例１Ｄからなる。
【００５６】
（実施例１Ａ）
図１に示される第１容器１００が以下のように用意された。
【００５７】
まず、セルロース（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より入手、商品名：Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ−１０１）がイオン液体に溶解され、１％の濃度を有するセルロース溶液が調製された。イオン液体は、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社より入手）であった。
【００５８】
セルロース溶液は、摂氏６０度に加温された。次に、セルロース溶液が、底面にポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器（ミリポア社より入手、商品名：Millicell PISP 12R 48）の裏面の面にスピンコート法により３０秒間、２０００ｒｐｍの回転速度で塗布された。ポリエチレンテレフタラートフィルムは、基板１７０として機能した。ポリエチレンテレフタラートフィルムは、３マイクロメートルの直径を有する複数の貫通孔１７２をランダムに有していた。このようにして、ポリエチレンテレフタラートフィルムの裏側の面に、０．５マイクロメートルの厚みを有するセルロースフィルム１０４が形成された。ミリポア社によると、貫通孔１７２の直径には、プラスマイナス１０％程度の誤差の範囲があり得る。
【００５９】
容器は、エタノール中で１２時間、室温で静置された。このようにして、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅは、エタノールに置換された。言い換えれば、１−Ｂｕｔｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌ  ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅがセルロースフィルム１０４から除去された。
【００６０】
最後に、容器は真空デシケーター内で乾燥された。このようにして、図１に示される第１容器１００が得られた。図１においては、基板１７０として機能するポリエチレンテレフタラートフィルムが図示されていないことに留意せよ。
【００６１】
次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。第２容器３００としては、２４ウェルプレート（コーニング社より入手）が用いられた。セルロースフィルム１０４の裏面の面１０４ｂは、液体の培地３０２に接していた。液体の培地３０２としては、１０％ＬＣＨ培地が用いられた。１０００個のColletotrichum gloeosporioideの胞子を含む植物病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。
【００６２】
第１容器１００は、摂氏２５度の温度で２４時間静置された。言い換えれば、実施例１Ａでは、培養時間は２４時間であった。
【００６３】
（菌の検出）
次いで、本発明者らは、第１容器１００を第２容器３００から分離した。さらに、本発明者らは、第１容器１００の内部に含まれている溶液を、ピペットを用いて除去した。その後、本発明者らは、第１容器１００の周囲を、黒色２４ウェルプレート（zell-kontakt社より入手、商品名：Ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｌａｔｅ  ＦＣ）を用いて取り囲み、第１容器１００を遮光した。
【００６４】
図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、紫外線光源４００（パナソニック株式会社製、商品名：ＵＶ−ＥＣ９１０ＺＡ）を用いて、セルロースフィルム１０４に紫外線を照射した。紫外線光源４００およびセルロースフィルム１０４の間の間隔は、１．５ｃｍであった。紫外線光源４００には、０．１アンペアの電流が１０分間、流された。
【００６５】
次いで、本発明者らは、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに、ＷＳＴ反応液（１００マイクロリットル）を接触させた。続いて、光がセルロースフィルム１０４に照射されないように、摂氏２５度で１時間、第１容器１００は遮光された。
【００６６】
本発明者らは、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに接触されたＷＳＴ反応液（５０マイクロリットル）を、９６ウェル平底透明プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社より入手）に移した。次いで、本発明者らは、４６０ナノメートルの波長でのＷＳＴ反応液の吸光度を、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社より入手、商品名：Ｍ１０００Ｐｒｏ）を用いて測定した。
【００６７】
これとは別に、参照として、ＷＳＴ反応液が摂氏２５度で１時間静置され、次いでその吸光度が同様に測定された。言うまでもないが、参照として用いられたＷＳＴ反応液は、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに接触されなかった。実施例１Ａは２回、繰り返された。
【００６８】
本発明者らは、以下の数式（Ｉ）に従って、呈色度を算出した。
呈色度＝（セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに接触されたＷＳＴ反応液の吸光度）−（参照としてのＷＳＴ反応液の吸光度）  （Ｉ）
【００６９】
結果は、以下の表２に示される。
【００７０】
【表２】
2018198681.tif 000005
【００７１】
上記の表２から、実施例１におけるColletotrichum gloeosporioideの呈色度の平均値は、０．３２（＝（（０．４２８−０．０４６）＋（０．３０８−０．０４４））／２）である。
【００７２】
（実施例１Ｂ）
実施例１Ｂにおいては、セルロース溶液が３％の濃度を有していたこと、およびセルロースフィルム１０４が３．７マイクロメートルの厚みを有していたことを除き、実施例１Ａと同様の実験が行われた。結果は以下の表３に示される。
【００７３】
【表３】
2018198681.tif 000006
【００７４】
（実施例１Ｃ）
実施例１Ｃにおいては、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂの全面に、防水テープ（日東電工株式会社より入手、商品名：５７１３０ＳＢ）が貼付されたこと以外は、実施例１Ａと同様の実験が行われた。防水テープは、菌が、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂの外側に伸び出すことを抑制した。結果は以下の表４に示される。
【００７５】
【表４】
2018198681.tif 000007
【００７６】
（実施例１Ｄ）
実施例１Ｄにおいては、セルロース溶液が３％の濃度を有していたこと、セルロースフィルム１０４が３．７マイクロメートルの厚みを有していたこと、およびセルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂの全面に防水テープが貼付されたことを除き、実施例１Ａと同様の実験が行われた。結果は以下の表５に示される。
【００７７】
【表５】
2018198681.tif 000008
【００７８】
（実験例２）
実験例２は、実施例２Ａ〜実施例２Ｄからなる。実験例２では、Colletotrichum gloeosporioideに代えて、Fusarium avenaceumが用いられたこと以外は、実験例１と同様の実験が行われた。
【００７９】
実施例２Ａの結果は以下の表６に示される。
【００８０】
【表６】
2018198681.tif 000009
【００８１】
実施例２Ｂの結果は以下の表７に示される。
【００８２】
【表７】
2018198681.tif 000010
【００８３】
実施例２Ｃの結果は以下の表８に示される。
【００８４】
【表８】
2018198681.tif 000011
【００８５】
実施例２Ｄの結果は以下の表９に示される。
【００８６】
【表９】
2018198681.tif 000012
【００８７】
以下の表１０は、実施例１Ａ〜実施例１Ｄおよび実施例２Ａ〜実施例２Ｄの結果を示す。
【００８８】
【表１０】
2018198681.tif 000013
【００８９】
上記の表１０から明らかなように、セルロースフィルム１０４を貫通した植物病原性菌が検出された。
（実験例３）
植物病原菌の一種であるBotrytis cinerea（トマト灰色カビ病菌）について、上述の実験例１と同様にして、Botrytis cinereaの胞子を含む植物病原菌水溶液が得られた。
【００９０】
実験例３は、実施例３および比較例３Ａ〜３Ｃからなる。
【００９１】
（実施例３）
図１に示される第１容器１００が、上述の実施例１と同様に用意された。
【００９２】
次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。第２容器３００および液体の培地３０２としては、上述の実施例１と同様のものが用いられた。１０００個のBotrytis cinereaの胞子を含む植物病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。
【００９３】
第１容器１００は、摂氏２５度の温度で４０時間静置された。
【００９４】
次いで、上述の実施例１と同様に、第１容器１００が第２容器３００から分離され、第１容器１００の内部に含まれている溶液が除去された後、第１容器１００が遮光された。
【００９５】
図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、上述の実施例１と同様にして、紫外線光源４００を用いて、セルロースフィルム１０４に紫外線が照射された。
【００９６】
次いで、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに、ＷＳＴ反応液（１００マイクロリットル）が接触された。続いて、光がセルロースフィルム１０４に照射されないように、摂氏２５度で３時間、第１容器１００は遮光された。
【００９７】
次いで、上述の実施例１と同様にして、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに接触されたＷＳＴ反応液（５０マイクロリットル）の吸光度が測定された。  （比較例３Ａ）
【００９８】
比較例３Ａにおいては、実施例３における第１容器１００を用意する際、１％の濃度を有するセルロース溶液に代えて、５％の濃度を有するセルロース溶液が用いられたこと、および底面に複数の貫通孔を有するポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器として、貫通孔の直径が３マイクロメートルのもの（ミリポア社 商品名：Millicell PISP 12R 48）に代えて、貫通孔の直径が１マイクロメートルのもの（ミリポア社 商品名：Millicell PIRP 12R 48）が用いられたことを除いては、上述の実施例３と同様の実験が行われた。
【００９９】
（比較例３Ｂ）
比較例３Ｂにおいては、セルロースフィルム１０４に紫外線が照射されなかったこと以外は、上述の実施例３と同様の実験が行われた。
【０１００】
（比較例３Ｃ）  比較例３Ｃにおいては、セルロースフィルム１０４に紫外線が照射されなかったこと以外は、上述の比較例３Ａと同様の実験が行われた。
【０１０１】
（実験例４）
植物病原菌の一種であるPassalora fulva（トマト葉カビ病菌）について、上述の実験例１と同様にして、Passalora fulvaの胞子を含む植物病原菌水溶液が得られた。
【０１０２】
実験例４は、実施例４および比較例４Ａ〜４Ｂからなる。
【０１０３】
（実施例４）
図１に示される第１容器１００が、上述の実施例１と同様に用意された。
【０１０４】
次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。第２容器３００および液体の培地３０２としては、上述の実施例１と同様のものが用いられた。１０００個のPassalora fulvaの胞子を含む植物病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。
【０１０５】
第１容器１００は、摂氏２５度の温度で１２０時間静置された。
【０１０６】
次いで、上述の実施例１と同様に、第１容器１００が第２容器３００から分離され、第１容器１００の内部に含まれている溶液が除去された後、第１容器１００が遮光された。
【０１０７】
図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、上述の実施例１と同様にして、紫外線光源４００を用いて、セルロースフィルム１０４に紫外線が照射された。
【０１０８】
次いで、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに、ＷＳＴ反応液（１００マイクロリットル）が接触された。続いて、光がセルロースフィルム１０４に照射されないように、摂氏２５度で３時間、第１容器１００は遮光された。
【０１０９】
次いで、上述の実施例１と同様にして、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに接触されたＷＳＴ反応液（５０マイクロリットル）の吸光度が測定された。
【０１１０】
（比較例４Ａ）
比較例４Ａにおいては、実施例４における第１容器１００を用意する際、１％の濃度を有するセルロース溶液に代えて、５％の濃度を有するセルロース溶液が用いられたこと、および底面に複数の貫通孔を有するポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器として、貫通孔の直径が３マイクロメートルのもの（ミリポア社 商品名：Millicell PISP 12R 48）に代えて、貫通孔の直径が１マイクロメートルのもの（ミリポア社 商品名：Millicell PIRP 12R 48）が用いられたことを除いては、上述の実施例４と同様の実験が行われた。
【０１１１】
（比較例４Ｂ）
比較例４Ｂにおいては、セルロースフィルム１０４に紫外線が照射されなかったこと以外は、上述の実施例４と同様の実験が行われた。
【０１１２】
（実験例５）
植物病原菌の一種であるPseudocercospora fuligena（トマトすすカビ病菌）について、上述の実験例１と同様にして、Pseudocercospora fuligenaの胞子を含む植物病原菌水溶液が得られた。
【０１１３】
実験例５は、実施例５および比較例５Ａ〜５Ｂからなる。
【０１１４】
（実施例５）
図１に示される第１容器１００が、上述の実施例１と同様に用意された。
【０１１５】
次に、図６に示されるように、第１容器１００が第２容器３００に重ねられた。第２容器３００および液体の培地３０２としては、上述の実施例１と同様のものが用いられた。１０００個のPseudocercospora fuligenaの胞子を含む植物病原菌水溶液が第１容器１００の内部に添加された。
【０１１６】
第１容器１００は、摂氏２５度の温度で７５時間静置された。
【０１１７】
次いで、上述の実施例１と同様に、第１容器１００が第２容器３００から分離され、第１容器１００の内部に含まれている溶液が除去された後、第１容器１００が遮光された。
【０１１８】
図５Ｂおよび図５Ｃに示されるように、上述の実施例１と同様にして、紫外線光源４００を用いて、セルロースフィルム１０４に紫外線が照射された。
【０１１９】
次いで、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに、ＷＳＴ反応液（１００マイクロリットル）が接触された。続いて、光がセルロースフィルム１０４に照射されないように、摂氏２５度で１時間、第１容器１００は遮光された。
【０１２０】
次いで、上述の実施例１と同様にして、セルロースフィルム１０４の裏側の面１０４ｂに接触されたＷＳＴ反応液（５０マイクロリットル）の吸光度が測定された。
【０１２１】
（比較例５Ａ）
比較例５Ａにおいては、実施例５における第１容器１００を用意する際、１％の濃度を有するセルロース溶液に代えて、５％の濃度を有するセルロース溶液が用いられたこと、および底面に複数の貫通孔を有するポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器として、貫通孔の直径が３マイクロメートルのもの（ミリポア社 商品名：Millicell PISP 12R 48）に代えて、貫通孔の直径が１マイクロメートルのもの（ミリポア社 商品名：Millicell PIRP 12R 48）が用いられたことを除いては、上述の実施例５と同様の実験が行われた。
【０１２２】
（比較例５Ｂ）
比較例５Ｂにおいては、セルロースフィルム１０４に紫外線が照射されなかったこと以外は、上述の実施例５と同様の実験が行われた。
【０１２３】
以下の表１１は、実験例３〜５の結果を示す。なお、表１１の貫通菌糸数は、セルロースフィルム１０４を貫通した菌糸の数が光学顕微鏡観察よりカウントされた結果を示したものである。
【０１２４】
【表１１】
2018198681.tif 000014
【０１２５】
実施例３〜５における呈色度は、紫外線照射により基板１７０上の菌が死滅し、セルロースフィルム１０４を貫通した菌糸のみによる呈色である。
【０１２６】
また、比較例３Ａ、４Ａ、５Ａは、菌が貫通し難い条件で実施されているため、菌の貫通がないか、菌の貫通があってもごく少数である。従って、紫外線照射により基板１７０上の菌が死滅し、実施例３〜５に比べて非常に低い呈色度を示している。かかる比較例３Ａ、４Ａ、５Ａと、実施例３〜５のそれぞれとの比較から、本発明の方法によって貫通菌糸の有無が呈色度により判定できることが理解される。
【０１２７】
また、比較例３Ｂ、３Ｃ、４Ｂ、５Ｂでは、紫外線が照射されないため、基板１７０上の菌が死滅しない。そのため、貫通菌糸の有無に関わらず、実施例３〜５のそれぞれよりも高い呈色度を示しており、貫通菌糸の有無が判定できていない。
【０１２８】
以上、実験例３〜５の結果より、本発明の方法によれば、セルロースフィルムを貫通した植物病原性菌が菌呈色試薬を呈色させることにより、試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを判定することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、農業用水、植物体破砕物、または土壌のような試験試料が植物病原性菌を含有するかどうかを簡単に判定するために用いられ得る。
【符号の説明】
【０１３０】
１００  第１容器
１０２  フランジ
１０４  セルロースフィルム
１０４ａ  表側の面
１０４ｂ  裏側の面
１７０  基板
１７０ａ  表側の面
１７０ｂ  裏側の面
２００  試験試料
２０２  植物病原性菌
２０２ａ  植物病原性菌の一部分
３００  第２容器
３０２  液体の培地
３０４  固体の培地
４０２  菌呈色試薬を含有する溶液
５００  光源
６００  顕微鏡
【図１】
2018198681.tif 000015
【図２】
2018198681.tif 000016
【図３】
2018198681.tif 000017
【図４】
2018198681.tif 000018
【図５Ａ】
2018198681.tif 000019
【図５Ｂ】
2018198681.tif 000020
【図５Ｃ】
2018198681.tif 000021
【図６】
2018198681.tif 000022
【図７】
2018198681.tif 000023
【図８】
2018198681.tif 000024
【図９】
2018198681.tif 000025
【図１０】
2018198681.tif 000026
【国際調査報告】
2018198681.tif 000027
2018198681.tif 000028
2018198681.tif 000029
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