(57)【要約】【課題】  本発明は、形態学的極性や組織運動極性といったがん組織としての本来の生物学的特性を有するがん細胞集団を、インビトロで作製することを目的とする。【解決手段】  本発明は、基板と生体適合性ポリマー層とを有する細胞培養基材であって、生体適合性ポリマー層で覆われていない所定の形状の所定の表面構造を持つ複数の粗面部分を所定の間隔で基材表面上に有する前記細胞培養基材に関する。本発明によると、所定の構造を有する細胞培養基材上でがん細胞を培養するという、とても簡便な操作により、生体内で観察されるものと同様の形態学的極性及び組織運動極性を有するがん細胞集合体を生きた状態で得ることができ、これにより従来不可能であったインビトロでの微小腫瘍のライブイメージングが可能となる。また、このがん細胞集合体は、生体内に生じるがんの発生、増殖、浸潤、転移、再発の一連の流れを再現していると考えられるため、がん研究におけるリサーチツールとして、又は抗がん剤のスクリーニングのために利用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と生体適合性ポリマー層とを有する細胞培養基材であって、
該基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有し、
ここで
粗面部分の形状は、径が２０μｍ〜１００μｍのスポットであるか、又は幅が３μｍ〜３０μｍのグルーブであり、粗面部分の形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、
２つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも１０μｍ以上であり、
粗面部分はその表面に高さ２０ｎｍ〜２００ｎｍの凹凸構造を持つ、前記細胞培養基材。
【請求項２】
粗面部分の界面展開面積比（Ｓｄｒ）が０．００２以上である、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
２つの隣接する粗面部分間の距離が１０〜１２００μｍである、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
粗面部分表面の算術平均粗さ（Ｒａ）が４ｎｍ以上、最大高さ粗さ（Ｒｚ）が３０ｎｍ以上、及び／又は山頂点算術平均曲（Ｓｐｃ）が３００以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
生体適合性ポリマーが生物学的材料との非特異的吸着を抑制する両親媒性ポリマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
生体適合性ポリマーが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｅ）の特徴を持つ、接着性がん細胞から構成される、分離された生きたがん細胞集合体。
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
【請求項８】
さらに以下の（ｆ）〜（ｋ）のうちの少なくとも１つの特徴を持つ、請求項７に記載のがん細胞集合体。
（ｆ）生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
【請求項９】
請求項７又は８に記載のがん細胞集合体が３次元構造を有する細胞培養基材に接着してなる、複合体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、請求項７又は８に記載のがん細胞集合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、請求項９に記載の複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項７又は８に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
以下のがん細胞集合体の特徴
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
（ｆ）生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
のうちの少なくとも１つを観察し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下で上記特徴の減弱又は喪失がより強く観察された場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項７又は８に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
がん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを測定し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下でがん細胞集合体又はその仮足がより短くなった又はより小さくなった場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
薬剤が、がんの浸潤及び／又は転移を抑制する薬剤である、請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
薬剤が、がんの免疫回避機構を抑制及び／又は解除する薬剤である、請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞を培養する工程、及び
上皮系癌細胞が細胞培養基材に接着せずに増殖した場合に上皮系癌細胞はアノイキス耐性を有すると判定する工程
を含む、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の構造を有する細胞培養基材、がん細胞集合体及び該基材を用いたその製造方法、並びに該がん細胞集合体を用いたがんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、未だに完全に克服することのできない疾患の一つである。新薬開発費用の高額化、及び超高齢化に伴うがん患者数の増加は医療費の増大をもたらし、国家財政を圧迫する要因となってきている。このような状況において、効果的かつ安価な次世代のがん治療薬開発は、喫緊の課題とされている。【０００３】
疾患としてのがんの研究において、細胞レベルでの生物学的特性の解明は進んできたと言える一方、がん細胞が集まって形成されるがん組織レベルの生物学的動態の特性は、観察技術法の不在により、重要であるにもかかわらず注目されず、その結果その大部分が解明されていない。そのため、インビトロにおけるがん組織を対象とした基礎的な分子生理学的検討、特にがん組織としての生物学的動態特性の解明は、次世代のがん治療薬開発において、重要な意義を有するものと期待されている。【０００４】
がん研究において従来行われてきたがん組織レベルでの分子生理学的検討は、主に、生体外に摘出した生体組織試料を固定して病理診断学的に観察し、推測することによるものであった。一方、生体内のがん細胞集団をインビトロでライブイメージングする技術は、その技術的困難性故に開発されておらず、がん組織としての病態生理学的ダイナミクスはほとんど考慮されないまま、がんの基礎研究又は新規抗がん剤開発等が行われているのが、現状である。【０００５】
多くの上皮系癌細胞において、浸潤・転移にＥＭＴ（上皮間葉転換）が必要であることが知られている。上皮系癌細胞はＥＭＴによりその上皮系形質を失い、運動能や浸潤能といった間葉系形質を獲得して浸潤・転移を引き起こすものと考えられているが、近年の研究により膵管腺癌細胞においてＥＭＴを必要としない浸潤・転移が生じることが明らかになった（非特許文献１）。ＥＭＴを介さない新たながんの浸潤・転移機構として細胞集団運動（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が注目されており、生体内のがん細胞集団をインビトロで観察する技術へのニーズは益々高まっている。【０００６】
インビトロにおいて、２次元的な従来の単層細胞培養ではなく、より生体内環境を模倣するものとして、特殊な構造を有する培養基材を用いて３次元的な細胞塊を形成させる、いわゆる３次元細胞培養が報告されている（例えば特許文献１、２等）。しかし、３次元細胞培養によって形成される細胞塊のほとんどは、活発な運動極性及び形態学的極性を示さない膨張性増殖のスフェロイド（回転楕円がん細胞塊）であり、悪性腫瘍の特徴である浸潤性増殖を示す生体内のがん細胞集団を適切に反映したものであるとは言い難い。【０００７】
また、正常な上皮細胞の生存及び増殖には細胞外マトリクス等の足場への接着が必須であり、足場に適切に接着できなかった上皮細胞はアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）と呼ばれるアポトーシスを起こして死滅する。これに対し、ＥＭＴを起こした上皮系癌細胞は、アノイキス耐性を獲得することで細胞死を免れ、脈管内を浮遊して原発巣から他の組織に転移することが知られている。【０００８】
上皮系癌細胞のアノイキス耐性は癌の浸潤・転移のしやすさに関係することから、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を決定することの意義は大きい。しかしながら、従来上皮系癌細胞の培養に用いられる細胞培養基材に対しては、上皮系癌細胞はそのアノイキス耐性の有無にかかわらず接着してしまうため、インビトロで上皮系癌細胞のアノイキス耐性を評価することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，５２７（７５７９）：５２５−５３０．
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００７／０９７１２０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２０１３／０４２３６０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、形態学的極性や組織運動極性といったがん組織としての本来の生物学的特性を有するがん細胞集団を、インビトロで作製することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、所定の形状及び表面粗さを持つ粗面部分を所定の間隔で配置した細胞培養基材を用いてがん細胞を培養すると、がん細胞は粗面部分表面の凹凸構造を足場として、生体内のがん細胞集団に見られるような形態学的極性及び組織運動極性を持った細胞塊を形成することを見出し、以下の発明を完成させた。【００１３】
（１）  基板と生体適合性ポリマー層とを有する細胞培養基材であって、
該基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有し、
ここで
粗面部分の形状は、径が２０μｍ〜１００μｍのスポットであるか、又は幅が３μｍ〜３０μｍのグルーブであり、粗面部分の形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、
２つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも１０μｍ以上であり、
粗面部分はその表面に高さ２０ｎｍ〜２００ｎｍの凹凸構造を持つ、前記細胞培養基材。
（２）  粗面部分の界面展開面積比（Ｓｄｒ）が０．００２以上である、（１）に記載の細胞培養基材。
（３）  ２つの隣接する粗面部分間の距離が１０〜１２００μｍである、（１）又は（２）に記載の細胞培養基材。
（４）  粗面部分表面の算術平均粗さ（Ｒａ）が４ｎｍ以上、最大高さ粗さ（Ｒｚ）が３０ｎｍ以上、及び／又は山頂点算術平均曲（Ｓｐｃ）が３００以上である、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
（５）  生体適合性ポリマーが生物学的材料との非特異的吸着を抑制する両親媒性ポリマーである、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
（６）  生体適合性ポリマーが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
（７）  以下の（ａ）〜（ｅ）の特徴を持つ、接着性がん細胞から構成される、分離された生きたがん細胞集合体。
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
（８）  さらに以下の（ｆ）〜（ｋ）のうちの少なくとも１つの特徴を持つ、（７）に記載のがん細胞集合体。
（ｆ）生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
（９）  （７）又は（８）に記載のがん細胞集合体が３次元構造を有する細胞培養基材に接着してなる、複合体。
（１０）  （１）〜（６）のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、（７）又は（８）に記載のがん細胞集合体の製造方法。
（１１）  （１）〜（６）のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、（９）に記載の複合体の製造方法。
（１２）  （７）又は（８）に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
以下のがん細胞集合体の特徴
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
（ｆ）生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
のうちの少なくとも１つを観察し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下で上記特徴の減弱又は喪失がより強く観察された場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
（１３）（７）又は（８）に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
がん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを測定し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下でがん細胞集合体又はその仮足がより短くなった又はより小さくなった場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
（１４）薬剤が、がんの浸潤及び／又は転移を抑制する薬剤である、（１２）又は（１３）に記載のスクリーニング方法。
（１５）薬剤が、がんの免疫回避機構を抑制及び／又は解除する薬剤である、（１２）又は（１３）に記載のスクリーニング方法。
（１６）（１）〜（６）のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞を培養する工程、及び
上皮系癌細胞が細胞培養基材に接着せずに増殖した場合に上皮系癌細胞はアノイキス耐性を有すると判定する工程
を含む、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を判定する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、所定の構造を有する細胞培養基材上でがん細胞を培養するという簡便な操作により、生体内で観察されるものと同様の形態学的極性及び組織運動極性を有するがん細胞集合体を生きた状態で得ることができ、これにより従来不可能であったインビトロでの微小腫瘍のライブイメージングが可能となる。また、このようながん細胞集合体は生体内に生じるがんの発生、増殖、浸潤、転移、再発の一連の流れをインビトロで模したものと考えられることから、がん研究におけるリサーチツールとして、又は新規抗がん剤開発における化合物スクリーニングのために利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の第１の態様の細胞培養基材による、第２の態様のがん細胞集合体（以下、「微小腫瘍」ともいう）形成のイメージ図である。
【図２】細胞培養基材の作製手順を示す図である。
【図３】微小腫瘍のライフサイクルのイメージ図である。
【図４】細胞培養基材のマイクロパターンを示す図である。パターン１のスポットは径３０μｍ、パターン２は径３００μｍ、パターン３は径９５μｍである。
【図５】パターン１の細胞培養基材の全体構成を示す図である。
【図６】細胞培養基材のスポット表面の写真及び高さ方向の凹凸を示す図である。左側は平坦なスポット表面を持つ対照の細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（−）、右側はスポット表面に凹凸構造を持つ本発明の細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）である。
【図７】細胞培養基材のスポット表面の算術平均粗さ（Ｒａ）、最大高さ粗さ（Ｒｚ）、山頂点算術平均曲（Ｓｐｃ）及び界面展開面積比（Ｓｄｒ）を示すグラフである。
【図８】スポット径３０μｍ、９５μｍ、３００μｍの細胞培養基材上で培養したＫＲＡＳ変異ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ−５５の微分干渉顕微鏡（ＤＩＣ）での観察画像である。
【図９】細胞培養基材のスポット表面における細胞占有率（細胞が接着したスポット数／全てのスポット数）を示すグラフである。
【図１０】スポット径３０μｍの細胞培養基材上で培養したＰＣＩ−５５細胞塊の底面積と、１つのスポットの表面積との比を集計した円グラフである。
【図１１】スポット径３０μｍの細胞培養基材上で培養したＰＣＩ−５５細胞塊の底面積と円形度との相関を示す散布図である。
【図１２】スポット径３０μｍのＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）の細胞培養基材（以下、「細胞培養基材１」という）上に播種されたＰＣＩ−５５細胞が微小腫瘍を形成する様子を示すタイムラプスＤＩＣ画像である。
【図１３】微小腫瘍の組織運動極性を示すタイムラプスＤＩＣ画像である。図中、円状の点線はスポットの位置を表す。
【図１４】細胞培養基材１上で２４時間培養した微小腫瘍の広視野ＤＩＣ画像である。
【図１５】スポット径４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍのＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）の細胞培養基材上で培養したＰＣＩ−５５細胞の蛍光画像（α−チューブリン染色）である。
【図１６】細胞培養基材１上で培養したＫＲＡＳ変異ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ−５５、ＰＣＩ−２４及びＰＣＩ−４３の、培養２４時間及び４８時間後の透過光画像である。
【図１７】細胞培養基材１上で培養後に固定し、蛍光免疫染色を施行したＰＣＩ−２４及びＰＣＩ−４３のＤＩＣ画像及び蛍光画像（ヘキスト３３３４２及びα−チューブリンの重ね合わせ）である。
【図１８】細胞培養基材１上で培養したヒト上皮系がん細胞株であるヒト舌癌細胞株ＨＳＣ−３及びＳＣＣ−９、ヒト肺癌細胞株Ｈ１９７５及びＡ５４９、ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１及びＷｉＤｒのＤＩＣ画像である。
【図１９】細胞培養基材１上で培養したＰＣＩ−５５微小腫瘍の３次元蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ファロイジン、α−チューブリン及びこれらの重ね合わせ）である。
【図２０】微小腫瘍のＸＹ及びＸＺ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ファロイジン及びα−チューブリンの重ね合わせ）である。図中、円状の点線はスポットの位置を表す。
【図２１】３次元蛍光画像上面図（左側の２図）及び３次元蛍光画像斜視図（右側の３図）である。一番左の画像はヘキスト３３３４２、他の画像はヘキスト３３３４２、ファロイジン及びα−チューブリンの重ね合わせである。図中、円状の点線はスポットの位置を表し、矢頭は繊毛を表す。
【図２２】乳頭状微小腫瘍の下層を異なるＺ座標で切断したＸＹ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ファロイジン及びα−チューブリンの重ね合わせ）である。
【図２３】微小腫瘍のＤＩＣ画像及び蛍光画像（ＤＡＰＩ、ファロイジン、α−チューブリン及びこれらの重ね合わせ）である。
【図２４】ＰＣＩ−５５細胞を腹腔内接種したマウス腹膜組織切片のＤＩＣ画像及び蛍光画像（ＤＡＰＩ、ＣＦＳＥ、α−チューブリン及びこれらの重ね合わせ）である。
【図２５】膵管腺癌患者２症例の組織標本のヘマトキシリン・エオジン染色画像及びα−チューブリン免疫染色の画像である。Ｎは正常な膵管上皮部分を、Ｐは癌化した膵管上皮病変部位を示す。
【図２６】細胞の凝集体がエントーシスを生じながらスポット上に接着する様子を示すタイムラプスＤＩＣ画像である。図中、円状の点線はスポットの位置を表す。
【図２７】微小腫瘍の可逆的エントーシスを示すタイムラプスＤＩＣ画像である。
【図２８】微小腫瘍のＸＹ、ＹＺ及びＸＺ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ＣＦＳＥ、α−チューブリン及びこれらの重ね合わせ）である。図中、矢頭は、エントーシスにより細胞が他の細胞の細胞膜を貫通している部分を示す。
【図２９】微小腫瘍を異なるＺ座標で切断したＸＹ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ファロイジン及びα−チューブリンの重ね合わせ）である。
【図３０】細胞培養基材１上で培養した正常ヒト胎児膵臓由来細胞株１Ｃ３ＩＫＥＩの蛍光画像（ヘキスト３３３４２及びα−チューブリンの重ね合わせ）である。図中、円状の点線はスポットの位置を表す。
【図３１】培養後の１Ｃ３ＫＥＩ細胞のＸＹ、ＹＺ及びＸＺ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ファロイジン、α−チューブリン及びこれらの重ね合わせ）である。
【図３２】微小腫瘍が細胞破片（デブリ）を取り込む様子を示すタイムラプスＤＩＣ画像である。図中２個所の矢頭（左上、中央左）は、貪食されたデブリの位置を表す。
【図３３】緑色蛍光ナノビーズと共存させた微小腫瘍の、ＤＩＣと蛍光（ＣＦＳＥ、エチジウムホモダイマー（ＥｔｈＤ））を重ね合わせたタイムラプス画像である。
【図３４】微小腫瘍が死細胞を貪食する様子を示す、ＤＩＣと蛍光（アネキシンＶ、ＥｔｈＤ）を重ね合わせたタイムラプス画像である。図中、矢頭は微小腫瘍の葉状仮足の位置を示す。
【図３５】微小腫瘍が死細胞を貪食する様子を示す、ＤＩＣと蛍光（アネキシンＶ、ＥｔｈＤ）を重ね合わせたタイムラプス画像（上段）、タイムラプス蛍光画像（中段）、各時点における微小腫瘍内の蛍光強度分布を示すグラフ（下段）である。
【図３６】２４時間培養後の生きた微小腫瘍のＤＩＣ画像及び蛍光画像（アネキシンＶ、ＥｔｈＤ）である。
【図３７】ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１細胞と共培養した微小腫瘍の、ＤＩＣと蛍光（ＣＦＳＥ、ＥｔｈＤ）を重ね合わせたタイムラプス画像である。
【図３８】細胞培養基材１上で培養した後に通常の細胞培養用ディッシュでの培養に移した微小腫瘍の、ＤＩＣと蛍光を重ね合わせたタイムラプス画像である。
【図３９】ＰＣＩ−５５死細胞と共存させた微小腫瘍の、ＤＩＣと蛍光（ＥｔｈＤ）を重ね合わせたタイムラプス画像である。
【図４０】死細胞と共存させた微小腫瘍の、ＤＩＣと蛍光（ＥｔｈＤ）を重ね合わせたタイムラプス画像である。図中、矢頭は貪食された死細胞デブリの位置を表す。
【図４１】死細胞の添加による微小腫瘍底面積の拡大を示す散布図である。
【図４２】チミジンヌクレオシド類似体である５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を取り込ませた死細胞と共存させたＣＦＳＥ標識微小腫瘍のＸＹ、ＹＺ及びＸＺ方向断面及び３次元の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ＣＳＦＥ、ＥｄＵ及びこれらの重ね合わせ）である。
【図４３】ＥｄＵを予め取り込ませた死細胞と共存させたＣＦＳＥ標識微小腫瘍のＸＹ、ＹＺ及びＸＺ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ＣＳＦＥ及びＥｄＵの重ね合わせ）である。図中、円状の点線はスポットの位置を表し、拡大画像及び矢頭は、微小腫瘍に取り込まれたＥｄＵ局在を示す。
【図４４】ＥｄＵを取り込ませた死細胞が添加された微小腫瘍のＸＹ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２及びリソソームの重ね合わせ、ＥｄＵ、並びにこれらの重ね合わせ）である。
【図４５】ＥｄＵを取り込ませた死細胞が添加された微小腫瘍下層のＸＹ方向断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、微小管関連タンパク質軽鎖３Ｂ（ＬＣ３Ｂ）、ＥｄＵ及びこれらの重ね合わせ）である。図中、円状の点線はスポットの位置を表す。
【図４６】微小腫瘍下層のＸＹ方向断面の蛍光画像（α−チューブリン、ＬＣ３Ｂ及びこれらの重ね合わせ）である。
【図４７】微小腫瘍下層の３次元蛍光画像（ヘキスト３３３４２、α−チューブリン及びＬＣ３Ｂの重ね合わせ）である。
【図４８】微小管重合阻害剤ノコダゾールで処理した微小腫瘍のタイムラプスＤＩＣ画像である。図中、円状の点線はスポットの位置を表す。
【図４９】ノコダゾール処理から２４時間後の微小腫瘍の底面、上面、側面及び断面の蛍光画像（ヘキスト３３３４２、ファロイジン及びα−チューブリンの重ね合わせ）である。図中、円状の点線はスポットの位置を表す。
【図５０】ノコダゾール処理した微小腫瘍の、ＤＩＣと蛍光（アネキシンＶ、ＥｔｈＤ）を重ね合わせたタイムラプス画像である。
【図５１】幅１０μｍ又は３０μｍのグルーブ状粗面部分を有する細胞培養基材上で培養したＰＣＩ−５５細胞のＤＩＣ画像である。図中、右下の画像は、右上の画像の白線枠内を拡大したものである。
【図５２】細胞培養基材１上で培養した上皮系形質のＰＣＩ−５５細胞及び間葉系形質のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞のＤＩＣ画像である。
【図５３】細胞培養基材１上で培養した生きたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の洗浄前後のＤＩＣ画像である。
【図５４】一般的な細胞培養基材上で培養した上皮系形質のＰＣＩ−５５細胞及び間葉系形質のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の抗Ｋｉ６７抗体の免疫蛍光染色画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の第１の態様に係る細胞培養基材の一例及び基材上に形成される本発明の第２の態様に係るがん細胞集合体を、図１に模式的に表す。細胞培養基材は、所定の特徴を持つ複数の粗面部分を有し、粗面部分表面の凹凸構造を足場として細胞に提供する。この細胞培養基材上に播種されたがん細胞は、本発明の第２の態様に係るがん細胞集合体を、複数の粗面部分にまたがるようにして形成する。
【００１７】
１．細胞培養基材
本発明の第１の態様は、基板と生体適合性ポリマー層とを有する細胞培養基材であって、該基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有し、ここで粗面部分の形状は、径が２０μｍ〜１００μｍのスポットであるか、又は幅が３μｍ〜３０μｍのグルーブであり、粗面部分の形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、２つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも１０μｍ以上であり、粗面部分はその表面に高さ２０ｎｍ〜２００ｎｍの凹凸構造を持つ、前記細胞培養基材に関する。
【００１８】
第１の態様の細胞培養基材は、基板と生体適合性ポリマー層とを有する。「基板」は、細胞培養の基材として一般に利用されている素材であって、例えばプラズマ処理又はエッチング処理等の表面微細加工技術によってナノメートル単位の凹凸を成形することができる素材から構成される板状の物質である。本発明における基板の好ましい例は、シリコン、ガラス又はプラスチック等の素材から構成される板状物質を挙げることができる。本発明の第１の態様において好ましい基板は、ガラス基板である。
【００１９】
基板の大きさ及び厚さに特に制限はなく、細胞培養の基材のために普通に用いられる程度のものであればよい。
【００２０】
「生体適合性ポリマー」は、細胞に対して有害な影響を及ぼさない高分子化合物をいう。本発明における生体適合性ポリマーは、細胞等の生物学的材料が細胞培養基材に非特異的に吸着することを抑制するものであればよく、細胞に対して非特異的な吸着性を持たない両親媒性ポリマー、例えばジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、オリゴエチレングリコール（ＯＥＤ）又は２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣと表すこともある）等が好ましく、特にＭＰＣが好ましい。生体適合性ポリマー層の厚さは、通常、細胞培養基材のコーティングに用いられる程度の厚さであればよい。
【００２１】
第１の態様の細胞培養基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有する。「粗面部分」は、細胞培養基材表面における、生体適合性ポリマー層が存在せず生体適合性ポリマー層の下にある物質が露出していて、その表面に凹凸構造を持つ部分をいい、例えば基板の上に生体適合性ポリマーが直接接している場合は基板が露出していて、その表面に凹凸構造を持つ部分を指す。
【００２２】
第１の態様の細胞培養基材における粗面部分は、形状が径２０μｍ〜１００μｍのスポットであるか、又は幅３μｍ〜３０μｍのグルーブ（溝）であり、形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、また２つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも１０μｍ以上であり、粗面部分表面に高さ２０ｎｍ〜２００ｎｍの凹凸構造を持つという特徴を有する。ここで「粗面部分表面」とは、生体適合性ポリマー層の下にある物質が露出している部分の表面を意味する。
【００２３】
粗面部分がスポットである場合、その輪郭形状は特に限定はされないが、四角形以上の多角形、半円、楕円又は円であることが好ましく、その径は２０μｍ〜１５０μｍ、好ましくは２０μｍ〜１００μｍ、より好ましくは２０μｍ〜８０μｍ、さらにより好ましくは３０μｍ〜８０μｍである。ここで径とは、スポットの平面方向の大きさ又は幅の算術平均値、すなわちスポットの輪郭形状が多角形の場合は各頂点からの対角線の長さの算術平均値を、輪郭形状が円形の場合はその直径を、輪郭形状が楕円形又はそれに類似した形状の場合はその長径と短径の算術平均値をいい、スポットの形状を円に限定することを意味するものではない。
【００２４】
粗面部分がグルーブである場合、グルーブの幅は３μｍ〜３０μｍ、好ましくは５μｍ〜２０μｍである。グルーブの長さは、１００μｍ以上であればよく、最大長に特に制限はない。がん細胞集合体をより効率的に形成させるという観点では、グルーブの長さは、１５０μｍ以上であることが望ましく、好ましくは２００μｍ以上、より好ましくは４００μｍ以上である。グルーブの形状は、直線状であっても曲線状であってもよく、直線と曲線を組み合わせた形状であってもよい。またグルーブは、一部が他のグルーブと交差していてもよい。さらにグルーブの端部は他のグルーブの端部と連結されていてもよい。
【００２５】
後述のがん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを指標としたがんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法において、粗面部分の形状がグルーブである細胞培養基材を用いる場合、特にがん細胞集合体の仮足を効率的に伸長させるため、グルーブは、２０μｍ以上の直線状の部分を有することが好ましい。
【００２６】
粗面部分は、隣接する粗面部分間の距離が少なくとも１０μｍ以上となるように細胞培養基材表面に設けられる。ここで隣接する粗面部分間の距離とは、隣接する一方の粗面部分の縁から他方の粗面部分の縁までの距離の最小値をいう。粗面部分間の距離は、１０μｍ〜４０４５μｍ、好ましくは１０μｍ〜３２２０μｍ、より好ましくは１０μｍ〜１２００μｍである。なお、隣接する粗面部分間の距離が上記の数値範囲内にあればがん細胞集合体の形成は可能であるが、より効率的にがん細胞集合体を形成させるという観点では、１つの細胞培養基材に設けられる粗面部分間の最短距離は、上記範囲内でより短めに、例えば１０μｍ〜１２０μｍ、好ましくは１０μｍ〜８０μｍ、より好ましくは１０μｍ〜６０μｍ、さらにより好ましくは１０μｍ〜４０μｍに設定することが望ましい。
【００２７】
後述するように、第２の態様のがん細胞集合体は、がん細胞が凝集、自己組織化して、複数の粗面部分にまたがるように第１の態様の細胞培養基材上に形成されるものである。推測ではあるが、粗面部分間の距離が細胞１個分の長さより短いと、がん細胞は複数の粗面部分上に生育するものの、複数の粗面部分を複数として認識できず、がん細胞集合体の形成は誘導されない。したがって、粗面部分間の距離は、培養される細胞１個分の長さよりも長くなるように培養細胞の大きさに応じて上記の範囲内で適宜調節される。
【００２８】
また同様の理由により、粗面部分の深さが培養される細胞１個分の長さよりも深いと、がん細胞は粗面部分から出ることができずに、がん細胞集合体は形成されないものと推測される。したがって、粗面部分の深さは、培養される細胞１個分の長さより浅く設定することが好ましい。
【００２９】
本発明の第１の態様における粗面部分は、粗面部分表面に高さ２０ｎｍ〜２００ｎｍの凹凸構造を持つ。凹凸構造の高さとは、１つの粗面部分表面における基準面からの凹の深さ及び凸の高さの絶対値である。粗面部分表面の凹凸構造の高さは、２０ｎｍ〜２００ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは４０ｎｍ〜６０ｎｍである。ここで「基準面」とは、生体適合性ポリマー層がない状態の基板、すなわち生体適合性ポリマー層が形成される前の基板の表面をいう。
【００３０】
粗面部分表面の凹凸の程度は、粗面部分表面の界面展開面積比（Ｓｄｒ）が０．００２以上となる程度であることが好ましい。Ｓｄｒは国際規格のＩＳＯ  ２５１７８で定められている表面性状パラメーターの一つである。Ｓｄｒは、定義領域の展開面積（表面積）が定義領域の面積に対してどれだけ増大しているかを表すものであり、完全に平坦な面のＳｄｒは０となる。本発明における粗面部分表面についていえば、１つの粗面部分表面が完全に平坦な面であるとした場合に対して同じ形状で凹凸構造を有する粗面部分の表面積が凹凸によってどれだけ増加しているかを表す指標となる。本発明においては、粗面部分表面のＳｄｒは０．００２以上、好ましくは０．００３以上、より好ましくは０．００４以上である。
【００３１】
また、特定の実施形態において、粗面部分表面は、算術平均粗さ（Ｒａ）が４ｎｍ以上、最大高さ粗さ（Ｒｚ）が３０ｎｍ以上、又は山頂点算術平均曲（Ｓｐｃ）が３００以上であることが望ましい。Ｒａ及びＲｚは日本工業規格ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１−２００１及びＩＳＯ  １３５６５−１で、ＳｐｃはＩＳＯ  ２５１７８で定められている表面性状パラメーターである。
【００３２】
Ｒａは、輪郭曲線が粗さ曲線の場合の、基準長さにおけるＺ（ｘ）絶対値の平均を表すパラメーターである。本発明における粗面部分表面についていえば、Ｒａは、１つの粗面部分表面における基準面からの凹の深さ及び凸の高さの絶対値の平均値である。本発明における粗面部分表面のＲａは４ｎｍ以上、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは６ｎｍ以上である。
【００３３】
Ｒｚは、輪郭曲線が粗さ曲線の場合の、基準長さにおける輪郭曲線の中でもっとも高い山の高さ（Ｚｐ）ともっとも深い谷の深さ（Ｚｖ）の和を表すパラメーターである。本発明における粗面部分表面についていえば、Ｒｚは、１つの粗面部分表面における基準面から最も深い凹の深さと最も高い凸の高さの絶対値の和である。本発明における粗面部分表面のＲｚは３０ｎｍ以上、好ましくは４０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上である。
【００３４】
Ｓｐｃは、表面の山頂点の主曲率の平均を表すパラメーターであり、小さい値は山頂点は丸みを帯びていることを、大きい値は山頂点が尖っていることを示す。本発明における粗面部分表面のＳｐｃは３００以上、好ましくは４００以上、より好ましくは６００以上である。
【００３５】
第１の態様において、細胞基材表面に設けられる粗面部分の数は、粗面部分の形状及び粗面部分間の距離が上記範囲内にあるかぎり制限はなく、例えば、粗面部分の総面積が細胞培養基材表面積の０．０３〜６５％となるように適宜設定される。また同様に、細胞培養基材表面における各粗面部分の分散の程度も、粗面部分の形状及び粗面部分間の距離が上記範囲内にあるかぎり制限はない。さらに、粗面部分間の距離、粗面部分表面の凹凸の高さ、スポットの輪郭形状及び径、グルーブの幅、長さ及び形状その他前記の各数値パラメーターは、１つの細胞培養基材上の複数の粗面部分で全てが同一であってもよく、粗面部分毎に各パラメーターのいずれか若しくは全てが異なっていてもよい。また粗面部分は規則的に配置されていても、又は不規則に配置されていてもよい。例えば、一つの細胞基板表面における粗面部分の形状は、スポットのみ、グルーブのみであってもよく、スポットとグルーブが混在していてもよい。また例えば、粗面部分の形状がグルーブの場合、一つのグルーブの伸長方向に他のグルーブを設けてもよく、また一つのグルーブと並行する位置に他のグルーブを設けてもよい。
【００３６】
第１の態様の細胞培養基材は、粗面部分の形状、粗面部分間の距離及び粗面部分表面の凹凸構造を上記の通りとなるように設計した上で、国際公開ＷＯ２０１０／０３２８４６号パンフレット（特許文献１、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載された生体適合性ポリマーのパターニング方法にしたがって製造することができる。この方法の典型例の概略を図２に示す。
【００３７】
最初に、ガラス基板の上に生体適合性ポリマー（ＭＰＣポリマー）の層を形成し、さらにその上に樹脂（パリレン（登録商標）等のポリパラキシリレン）の層を形成する（図２（ｉ））。
【００３８】
生体適合性ポリマー層及び樹脂層は、例えば基板表面にこれらのポリマーを薄く塗布することで作製してもよく、基板表面にこれらのポリマーからなる薄層を貼り付けることで作製してもよい。また、これらのポリマーの構成単位となるモノマーを基板表面にコーティングして重合反応を起こさせることで作製することもできる。また、この典型例においては、生体適合性ポリマー層は基板に接するように形成されるが、基板と生体適合性ポリマーの間に別の物質の層を設けることも可能である。
【００３９】
次いで、樹脂層の上にアルミニウム及びフォトレジスト層を形成した後（図２（ｉｉ））、アルミニウム及びフォトレジスト層の上からＯ２プラズマを照射する。Ｏ２プラズマの照射強度及び時間を調節することにより、アルミニウム及びフォトレジスト層で保護されていない部分の樹脂層及び生体適合性ポリマー層が除去され、ガラス基板が露出した部分が形成されると同時に、その表面に凹凸構造が形成される（図２（ｉｉｉ））。その後、樹脂層を除去することによって、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有する、第１の態様の細胞培養基材が得られる（図２（ｉｖ））。
【００４０】
上記の典型例においては、樹脂層及び生体適合性ポリマー層を除去して基板が露出した部分の形成及びその表面の凹凸構造の形成にＯ２プラズマを用いたが、ドライエッチング法、ウエットエッチング法、その他当業者に周知の方法を用いることもできる。
【００４１】
第１の態様の細胞培養基材は、接着性細胞の培養に適している。基材に接した細胞は、細胞に対して非特異的な吸着性を持たない生体適合性ポリマー層に付着することができず、生体適合性ポリマー層で覆われていない、ナノオーダーの凹凸構造を持つ粗面部分部分にのみ付着して増殖する。
【００４２】
本発明者らは、第１の態様の細胞培養基材を用いて接着性のがん細胞を培養すると、想定外に、培養中にがん細胞が凝集、自己組織化して、複数の粗面部分を足場にしてまたいだ形のがん細胞集合体を形成することを見出した。
【００４３】
２．がん細胞集合体及びその製造方法
本発明の第２の態様は、以下の（ａ）〜（ｅ）の特徴を持つ、接着性がん細胞から構成される、分離された生きたがん細胞集合体に関する。
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
【００４４】
第２の態様のがん細胞集合体は、さらに以下の（ｆ）〜（ｋ）のうちの少なくとも１つの特徴を持つことがある。
（ｆ）生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
【００４５】
第２の態様のがん細胞集合体は、形態学的極性及び組織運動極性を有する、自己組織化した足場依存性の非スフェロイド様がん細胞塊であり、図３に示すようなあたかも１つの生物であるようなライフサイクルを有するものと推測されている。図３において、足場依存期にある細胞集合体が、本発明の第２の態様のがん細胞集合体に相当する。第２の態様のがん細胞集合体は分離された生きた状態のものであるが、ここで「分離された」とは、生体内環境下ではなく、インビトロ環境下にあることを意味する。以下、図３に沿ってがん細胞集合体の特徴を詳細に説明する。
【００４６】
まず、培地に播種されたがん細胞は、単細胞が相互に凝集して、複数個の細胞が連なった鎖状の凝集体となる。次いで鎖状凝集体は、足場となる付着可能な構造、典型的には第１の態様の細胞培養基材における粗面部分表面の凹凸構造に付着する。足場にアンカリングされた鎖状凝集体は、細胞が他の細胞内に取り込まれるエントーシスと呼ばれる現象により、膜状に発現したα−チューブリン（微小管と推定される）に覆われた細胞内細胞構造を有するがん細胞集合体（「微小腫瘍」ともいう）となる。このエントーシスは可逆的であり、微小腫瘍は生きたがん細胞を取り込むのみならず、生きたがん細胞として放出することもできる。
【００４７】
微小腫瘍は高さ方向に乳頭状に成長し、その下層表面において繊毛形成が誘導される。また、微小腫瘍は、その成長につれて形態学的極性及び組織運動極性を有するようになる。ここで、形態学的極性とは周囲の状況に応じて偏った形状を示す性質を、また組織運動極性とは周囲の状況に応じて偏った方向に進展する性質を意味する。具体的には、微小腫瘍は糸状仮足や葉状仮足を形成し、これらを利用して周囲に存在する死細胞デブリを捕捉、貪食するのみならず、活発な運動能を示して、死細胞デブリを求めるように付着した粗面部分から隣接する粗面部分へと進展し、複数粗面部分にまたがった形状を示すようになる。微小腫瘍はさらに、周囲のデブリを捕捉するための強力な吸引力をも有する。糸状仮足、葉状仮足、さらには吸引力を利用して死細胞デブリを積極的に貪食した微小腫瘍は、さらに巨大化していく。
【００４８】
微小腫瘍に貪食された死細胞デブリ由来のヌクレオシドは微小腫瘍内の液胞に取り込まれるのに対し、死細胞デブリ由来のホスファチジルセリンは微小腫瘍の表面に蓄積される。微小腫瘍は、一度内部に取り込んだホスファチジルセリンをターンオーバーによって自らの表面、特に外表面に提示するのみならず、その強力な吸引力によって死細胞デブリを自らの周囲に引き付けることで外表面にホスファチジルセリンを蓄積させる。このように、微小腫瘍は、その表面におけるホスファチジルセリンの存在、特に外表面におけるホスファチジルセリンの存在、すなわち外在化を特徴の１つとし、これは、微小腫瘍が死細胞フェノタイプを呈することを意味する。このことは、微小腫瘍が免疫系細胞からの攻撃を逃れる、つまり、がんの免疫回避に寄与すると考えられる。
【００４９】
微小腫瘍は、微小管阻害剤の存在下等の細胞ストレス環境下におかれることにより足場から離れ、スフェロイド様の形態になる。この形態変化と合わせて、細胞内細胞構造、α−チューブリンの膜状発現、形態学的極性、組織運動極性、集合体表面のホスファチジルセリン陽性といった、微小腫瘍の特徴も失われる。細胞内細胞構造の喪失により、微小腫瘍を構成していたがん細胞は単独のがん細胞として集合体から放出され、周囲に播種されて、細胞ストレス環境ではなくなると、再び、がん細胞は足場依存性の新たな微小腫瘍を形成していく。
【００５０】
以上のように、本発明の第２の態様のがん細胞集合体は、がん細胞の３次元培養において従来観察されるスフェロイド様の細胞塊とは大きく異なるものである。第２の態様のがん細胞集合体は、がん細胞の細胞集団運動の評価系として利用可能であり、この系は生体内に生じるがんの発生、増殖、浸潤、転移、再発といった一連のがんの進行過程を模した評価系となるものと期待される。実際、がん細胞を移植した実験動物やがん患者の病理検体において、第２の態様のがん細胞集合体と共通する特徴を持つ構造体が観察されており、例えば後述の実施例において示すように、膵管腺癌から構成されるがん細胞集合体は、膵管腺癌患者検体において認められる管腔構造と同様の構造を有することが本発明者らにより確認されている。
【００５１】
本発明の第２の態様のがん細胞集合体は足場依存的であり、足場のない環境、例えば従来の２次元細胞培養基材上に置かれるとその特徴を喪失する。そのため、第２の態様のがん細胞集合体をその特徴を保ったまま生体外で維持するには、足場となる構造を有する基材に付着させることが求められる。したがって、本発明の第３の態様として、第２の態様のがん細胞集合体が３次元構造を有する細胞培養基材に接着してなる複合体が提供される。３次元構造を有する細胞培養基材は、がん細胞集合体が付着できる足場構造を提供するかぎり制限はなく、市販されている３次元培養用の細胞培養基材を使用してもよいが、好適には第１の態様の細胞培養基材が使用される。
【００５２】
本発明の第２の態様のがん細胞集合体及び第３の態様の複合体は、第１の態様の細胞培養基材を用いて接着性のがん細胞を培養することにより製造することができる。したがって、本発明は、第１の態様の細胞培養基材を用いて接着性のがん細胞を培養する工程を含む、第２の態様のがん細胞集合体又は第３の態様の複合体の製造方法をも提供するものである。
【００５３】
また、本発明の第３の態様の複合体は、第１の態様の細胞培養基材上に形成された第２の態様のがん細胞集合体を、３次元構造を有する別の細胞培養基材に継代することによって製造することもできる。
【００５４】
がん細胞集合体の製造において用いられる接着性のがん細胞は、好ましくは上皮系の癌細胞であり、例えばＨｅＬａ細胞などの子宮頸癌細胞、膵癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞又は頭頸部癌細胞、好適には膵癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞又は頭頸部癌細胞、より好適には膵管腺癌細胞を挙げることができる。
【００５５】
がん細胞は、第１の態様の細胞培養基材と接触可能な状態で、典型的には細胞培養基材を設置した細胞培養容器内で培養される。細胞培養基材以外の培地、培養温度、培養時間等の培養条件は、使用されるがん細胞の培養において通常用いられるものであればよい。なお、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のコーティングは必要としない。例えば、膵癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞又は頭頸部癌細胞を用いる場合は、ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ中で、３７℃、一晩から４８時間程度培養することにより、これらの細胞から構成された、第２の態様のがん細胞集合体を得ることができる。がん細胞の種類によってがん細胞集合体が形成されるまでの時間は異なることから、培養時間は、使用するがん細胞に応じて適宜設定される。また、がん細胞集合体の形態は、使用するがん細胞によって異なることもあるが、上記特徴（ａ）〜（ｅ）を有するかぎり本発明の第２の態様に包含される。
【００５６】
得られたがん細胞集合体が上記の特徴を持つか否かは、細胞生物学及び分子生物学において通常用いられる公知の手法により確認することができる。がん細胞の培養及び上記特徴の確認のための手法は、当該分野の標準的な教科書及び文献、例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２００１）、「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｍａｓｔｅｒｓ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、第３版、２０００）等に記載されており、当業者はこれらの記載に従って、又は記載された手法を適宜改変してがん細胞の培養及び上記特徴の確認を行うことができる。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００５７】
本発明の第２の態様のがん細胞集合体及び第３の態様の複合体は、生体内に生じるがんの発生、増殖、浸潤、転移、再発の一連の流れをインビトロで再現したものと考えられることから、がんの研究のための、特にがん細胞の細胞集団運動の研究のためのリサーチツールとして利用することができる。とりわけ膵管腺癌は、膵癌の約９０％を占める最も致死的な悪性腫瘍の１つであり、高頻度のＤＮＡ損傷及び有糸分裂異常によって急速に進行する攻撃性の高い癌であるにもかかわらず、生存腫瘍動態は未解明のままである。したがって、膵管腺癌細胞を用いて製造されるがん細胞集合体及び複合体は、膵管腺癌の予防及び／又は治療に寄与する新薬の創薬スクリーニングに有用である。また、第２の態様のがん細胞集合体においては、繊毛形成誘導、エンドサイトーシス亢進、外表面のホスファチジルセリンによる被覆が認められる。ホスファチジルセリンは、強力な免疫抑制作用があることから、第２の態様のがん細胞集合体は、がんの免疫回避状態が誘導されていると考えられる。がんの免疫回避は、がん治療における未解決の大きな課題である。それゆえ、第２の態様のがん細胞集合体及び第３の態様の複合体は、がん免疫研究のためのリサーチツールとして利用することができる。さらにオートファジーの中心タンパク質である微小管関連タンパク質軽鎖３（ＬＣ３）の強発現が確認されていることから、オートファジーが亢進しているものと考えられる。それゆえに第２の態様のがん細胞集合体及び第３の態様の複合体は、がん組織レベルのオートファジー研究のためのリサーチツールとしても利用することができる。
【００５８】
３．スクリーニング方法
本発明のさらなる態様は、第２の態様のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、以下のがん細胞集合体の特徴
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
（ｆ）生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
のうちの少なくとも１つを観察し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び被験物質共存下で上記特徴の減弱又は喪失がより強く観察された場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法に関する。
【００５９】
本発明のさらなる別の態様は、第２の態様のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、がん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを測定し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び被験物質共存下でがん細胞集合体又はその仮足がより短くなった又はより小さくなった場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法に関する。
【００６０】
本発明の第２の態様のがん細胞集合体は、生体内に生じるがんの発生、増殖、浸潤、転移、再発の一連の流れをインビトロで再現したものであり、この集合体の特徴を減弱させる又は失わせる物質は、特にがんの浸潤及び転移を抑制する、すなわちがんの転移及び／又は再発を予防及び／又は治療する薬剤になり得ると考えられる。したがって、被験物質と共存させた際のがん細胞集合体の上記特徴を被験物質非存在下のがん細胞集合体のそれと比較することにより、がんの予防及び／又は治療のための薬剤をスクリーニングすることができる。
【００６１】
また、特に粗面部分の形状がグルーブである第１の態様の細胞培養基材を用いてがん細胞集合体を形成させると、当該がん細胞集合体はグルーブの伸長方向に沿った多くの仮足を発達させる。がん細胞集合体自体又はその仮足の長さ又は大きさを減少させる物質は、特にがんの浸潤及び転移を抑制する、すなわちがんの転移及び／又は再発を予防及び／又は治療する薬剤になり得ると考えられる。したがって、被験物質と共存させた際のがん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを被験物質非存在下のがん細胞集合体のそれと比較することにより、がんの予防及び／又は治療のための薬剤をスクリーニングすることができる。
【００６２】
がん細胞集合体と被験物質との共存は、がん細胞集合体の培養に用いられる培地又は適当な緩衝液中に被験物質を添加することによって行うことができる。培地又は緩衝液を、３次元構造を有する細胞培養基材に付着したがん細胞集合体と接触させ、上記特徴の少なくともいずれか１つの有無又は程度、がん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを、被験物質を含まない培地又は緩衝液と接触させた対照のがん細胞集合体のそれと比較する。上記評価パラメーターが被験物質存在下で減弱又は喪失した場合、その被験物質はがん細胞集合体に抑制的に働く物質であり、がんの予防及び／又は治療のための候補薬剤として選抜される。
【００６３】
上述のとおり、第２の態様のがん細胞集合体は免疫系からの攻撃を回避する免疫回避能を有することから、本態様のスクリーニング方法は、がんの免疫回避機構を抑制及び／又は解除する薬剤のスクリーニングに特に有用である。
【００６４】
４．上皮系癌細胞のアノイキス耐性判定方法
本発明のまたさらなる別の態様は、第１の態様の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞を培養する工程、及び上皮系癌細胞が細胞培養基材に接着せずに増殖した場合に上皮系癌細胞はアノイキス耐性を有すると判定する工程を含む、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を判定する方法に関する。
【００６５】
本発明の第１の細胞培養基材は、従来の細胞培養基材と異なり、アノイキス耐性のない上皮系癌細胞を培養した場合には細胞が接着・増殖してがん細胞集合体を形成する一方、アノイキス耐性のある上皮系癌細胞を培養した場合には細胞が接着せずに増殖するという特性を有する。したがって、第１の態様の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞の培養を行い、基材に接着せずに細胞が増殖した場合には、当該細胞はアノイキス耐性、すなわち間葉系形質を有すると判定することができる。また、アノイキス耐性の獲得はＥＭＴの有無及び浸潤・転移能と相関する現象であるため、本態様は、上皮系癌細胞のＥＭＴの有無を判定する方法、上皮系癌細胞の浸潤・転移能を評価する方法と表すこともできる。
【００６６】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６７】
材料
１）細胞及び培地
・ヒト膵管腺癌細胞株：ＰＣＩ−５５、ＰＣＩ−２４及びＰＣＩ−４３（いずれも北海道大学病院にて外科切除された膵癌原発巣組織から樹立されたヘテロ接合型ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ変異（ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／ＷＴ）を有する細胞株）並びにＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ）、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（ＪＣＲＢ細胞バンク）
・ヒト舌癌細胞株    ：ＨＳＣ−３（ＪＣＲＢ細胞バンク）、ＳＣＣ−９（ＡＴＣＣ）
・ヒト肺癌細胞株    ：Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ）、Ａ５４９（ＪＣＲＢ細胞バンク）、
・ヒト大腸癌細胞株  ：ＤＬＤ−１、ＷｉＤｒ（いずれもＪＣＲＢ細胞バンク）
以上のがん細胞株は、１０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭで継代培養した。【００６８】
・正常ヒト胎児膵臓由来細胞株：１Ｃ３ＩＫＥＩ（理研バイオリソースセンター）
１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で維持した。
・ヒトＮＫ細胞株    ：ＫＨＹＧ−１（ＪＣＲＢ細胞バンク）
１００Ｕの組換えヒトＩＬ−２、１０％ＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で継代培養した。【００６９】
２）試薬
細胞核の染色にＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）又はヘキスト３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、アクチンの染色にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８標識ファロイジン（Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、α−チューブリンの免疫染色にマウス抗ヒトα−チューブリンモノクローナル抗体（クローンＤＭ１Ａ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、微小管関連タンパク質軽鎖３Ｂ（ＬＣ３Ｂ）の免疫染色にウサギ抗ＬＣ３Ｂ／ＭＡＰＬＣ３Ｂポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を、蛍光免疫染色の二次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識抗ヒトＩｇＧヤギポリクローナル抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、免疫組織化学染色の発色にはＥＮＶＩＳＩＯＮキット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ＤＡＫＯ）を、生細胞の染色に５−（ａｎｄ  ６−）ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ、同仁化学研究所）及びＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、ホスファチジルセリンの染色にアネキシンＶ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、死細胞の核染色にエチジウムホモダイマー（ＥｔｈＤ−１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した。【００７０】
また、マウス腹膜の凍結組織切片作製にＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラファインテックジャパン）を、膵管腺癌患者のホルマリン固定膵管組織切片免疫染色の検出にＬＳＡＢ２  Ｋｉｔ／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を、培地の流れのトラッキングにＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（０．２μｍ黄緑色蛍光；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、リソソームのライブイメージングにＣｅｌｌ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ（商標）  Ｌｙｓｏｓｏｍｅ染色キットＲｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）を、ヌクレオシドアナログであるＥｄＵ（５−ｅｔｈｙｎｙｌ−２’−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）の検出にはＣｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ＥｄＵ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４  イメージングキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、微小管阻害剤としてノコダゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
３）統計解析
Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ及び反復測の定分散分析を用い、Ｐ値が０．０５以下を有意差とした。【００７１】
実施例１  細胞培養基材の作製及び表面粗さパラメーターの測定
ガラス基板（２０ｍｍ×２０ｍｍ）にＭＰＣポリマー液をスピンコーティングして平均厚み４０ｎｍ（湿潤時）のＭＰＣポリマー層を形成した後、ＭＰＣポリマー層の上に１μｍ厚のポリパラキシレン（パリレン（登録商標））層を蒸着させ、さらにその上にアルミニウム及びフォトレジストの層を形成させた。【００７２】
電子ビーム描画装置（ＥＬＳ−３７００、ＥＬＩＯＮＸ）、ＥＢ加熱・抵抗加熱蒸着装置（ＥＢＸ−８Ｃ、アルバック）、両面マスクアライナー（ＭＡ−６、Ｓｕｓｓ  ＭｉｃｒｏＴｅｃ）及び反応イオンエッチング装置（ＲＩＥ−１０ＮＲ、サムコ）を用いて、フォトリソグラフィー法によって、直径３０μｍの円形スポットが最短４０μｍの間隔で１ｍｍ２あたり１００個並んだパターン（図４のパターン１）が図５のように配置されたフォトマスクを作製し、マスクのパターンをフォトレジスト層に転写した。【００７３】
次いで、誘導結合プラズマ装置（ＥＩＳ−７００、ＥＬＩＯＮＸ）を用いてＯ２プラズマを照射することで、非マスク部のポリパラキシレン層及びＭＰＣポリマー層を除去し、表面に凹凸構造を持つパターニングされたスポットを形成した。Ｏ２プラズマの照射条件は、ステージ：５０Ｗ、アンテナ：３００Ｗ、照射時間：４分３０秒とした。【００７４】
プラズマ照射終了後、残存するポリパラキシレン層を剥離して細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）を作製した。この細胞培養基材は、表面に凹凸構造を持つスポットが図４のパターン１のように配置され、スポット以外の部分がＭＰＣポリマー層に覆われたものである。【００７５】
また、Ｏ２プラズマの照射時間を３分３０秒とすること以外は、パターンニングを含め上記と同じ条件で作業を行い、スポット表面に凹凸構造を持たない比較用の細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（−）を作製した。【００７６】
上記２種類の細胞培養基材に形成されたスポット表面について、形状解析レーザー顕微鏡（ＶＫ−Ｘ２５０、キーエンス）を使用して粗さを測定した。スポット表面の高さをｘｚ座標系で表したグラフを図６に示す。細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（−）のスポット表面はほぼ平坦であったのに対し、細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）のスポット表面は２０〜５０ｎｍ程度の凹凸構造を有することが確認された。【００７７】
また、各細胞培養基材のスポット表面の算術平均粗さ（Ｒａ）、最大高さ粗さ（Ｒｚ）、山頂点の算術平均曲（Ｓｐｃ）及び界面の展開面積比（Ｓｄｒ）を図７に示す。細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（−）のスポット表面と比べて、細胞培養基材Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）のスポット表面はいずれのパラメーターについても高い値を示し、特にＳｄｒは４倍強の高値であった。【００７８】
実施例２  表面に凹凸構造を持つスポットを有する細胞培養基材上での微小腫瘍形成
直径３００μｍの円形スポットが９００μｍ間隔で１ｍｍ２あたり１個並んだパターン（図４のパターン２）を持つ細胞培養基材、及び直径９５μｍの円形スポットが最短約５７μｍの間隔で１ｍｍ２あたり１０個並んだパターン（図４のパターン３）を持つ細胞培養基材それぞれのＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）と（−）とを、実施例１と同様にして作製した。図４のパターン１〜３では、細胞培養基材の表面積に占めるスポット総面積の割合はいずれも約７．１％である。【００７９】
スポット径３０、９５又は３００μｍ及びＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）又は（−）の計６種類の細胞培養基材を用いて、ヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ−５５の培養を行った。細胞培養の直前に、細胞培養基材を蒸留水に約３０分間浸漬し、ポリパラキシレン層を剥離した。水洗し、７０％エタノールで殺菌処理を行った後に風乾した細胞培養基材を、直径４０ｍｍ×深さ１３．５ｍｍの培養シャーレ（アズノールシャーレ、アズワン）の内底にワセリンを介して固定した。ＤＭＥＭを加えて細胞培養基材を３回洗浄した後、３ｍＬのＤＭＥＭに懸濁した３×１０６個のＰＣＩ−５５細胞を各細胞培養基材上に播種し、３７℃で一晩〜４８時間培養した。【００８０】
培養終了後の細胞塊の微分干渉顕微鏡（ＤＩＣ）観察画像を図８に示す。スポット径３０μｍでＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（−）の細胞培養基材では、主に、１つのスポット上に１，２個の細胞が単層状に接着、散在的に、足場形成の弱いスフェロイド状の細胞塊を形成した。スポット径９５μｍでＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（−）の細胞培養基材では、大部分がスポット上に単層状に接着し、スポットを跨ぐ細胞塊はほとんど観察されなかった。また、スポット径３００μｍの細胞培養基材を用いて培養した細胞は、基材のＲｏｕｇｈｎｅｓｓの有無にかかわらず、単層培養時と同様の形態を示した。これに対し、スポット径３０μｍ又は９５μｍのＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）の細胞培養基材では、１つのスポット上に高さ方向に伸長した乳頭状細胞塊、並びに２つ以上のスポットを跨いでスポットに強固に接着した非スフェロイド状細胞塊が複数形成された。【００８１】
上記６種類の細胞培養基材上の細胞塊について、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ  Ｖｅｒ  ４．６０．００  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｎｉｋｏｎ）を用いた解析を行った。各細胞培養基材上のスポットがどの程度細胞で覆われているかを示す細胞占有率を図９に示す。スポット径３０μｍ及び９５μｍの細胞培養基材ではいずれも、スポット表面の凹凸構造が細胞占有率を向上させることが確認された。【００８２】
スポット径３０μｍのＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）又は（−）の細胞培養基材上で培養したＰＣＩ−５５細胞から構成される細胞塊の底面積と、１つのスポットの表面積との比を集計した円グラフを図１０に示す。比が１倍より大きい細胞塊は１つのスポットからはみ出た形状であることを意味する。スポット表面の凹凸構造は、細胞塊を巨大化させ、複数スポットに跨った細胞塊の割合を増加させた。【００８３】
細胞塊の底面積と円形度との相関を図１１に示す。Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）の細胞培養基材では、底面積の増加に伴って円形度が低下する、すなわち形態学的極性が高まる傾向が認められた。一方、Ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ（−）の細胞培養基材では、そのような傾向は認められなかった。【００８４】
スポット径３０μｍのＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）の細胞培養基材（以下、「細胞培養基材１」という）を用いて、ＰＣＩ−５５細胞を６４時間培養した際のタイムラプスＤＩＣ画像を図１２に示す。培養開始時は分散状態にあったＰＣＩ−５５細胞は時間経過と共に凝集してスポット上に細胞塊を形成し、複数の細胞塊が融合しながら巨大化していく様子が観察された。このうち１つの細胞塊に着目したタイムラプスＤＩＣ画像を図１３に示す。１つのスポット上にある細胞塊が隣のスポットに向かって這うように伸展しており、細胞塊の組織運動極性が確認された。【００８５】
また、細胞培養基材１上で培養したＰＣＩ−５５細胞塊の広視野ＤＩＣ画像を図１４に示す。細胞塊は、培養２４時間で、スポットが存在する領域内で長さ３０００μｍ超まで巨大化した。また、スポットが存在しない長さ１２００μｍの領域を跨ぐ様子も観察された。【００８６】
次に、直径４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ、１００μｍの円形スポットが１ｍｍ２あたりそれぞれ６４個、３６個、２５個、２５個ずつ並んだパターンを持つ４種類のＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）の細胞培養基材を用いて、ＰＣＩ−５５細胞を上記と同様に一晩培養した。これらの細胞培養基材の表面積に占めるスポット総面積の割合はそれぞれ約８．０％、約１０．２％、約１２．６％、約１９．６％である。【００８７】
培養終了後、細胞塊をパラホルムアルデヒドで固定し、抗α−チューブリン抗体を用いてα−チューブリンを染色し、オールインワン蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、ＢＺ−９０００、キーエンス）により２次元画像を取得した。いずれの細胞培養基材においても２つ以上のスポットを跨いだα−チューブリン陽性細胞塊の形成が認められた（図１５）。【００８８】
同様に、直径２０μｍの円形スポットが１ｍｍ２あたり１個並んだパターン、又は直径１００μｍの円形スポットが１ｍｍ２あたり８１個並んだパターンを持つＲｏｕｇｈｎｅｓｓ（＋）の細胞培養基材においても２つ以上のスポットを跨いだＰＣＩ−５５細胞塊が形成された（データ図示せず）。これらの細胞培養基材の表面積に占めるスポット総面積の割合はそれぞれ約０．０３％、約６５％である。【００８９】
細胞塊の形成は、他の癌細胞においても観察された。一例として、細胞培養基材１上で培養したヒト膵管腺癌細胞株ＰＣＩ−２４及びＰＣＩ−４３、並びにヒト舌癌細胞株ＨＳＣ−３及びＳＣＣ−９、ヒト肺癌細胞株Ｈ１９７５及びＡ５４９、ヒト大腸癌細胞株ＤＬＤ−１及びＷｉＤｒが形成した細胞塊の画像を図１６〜図１８に示す。【００９０】
以上から、表面に凹凸構造を有する直径２０〜１００μｍのスポットを持つ細胞培養基材は、形態学的極性及び組織運動極性を有する、自己組織化した足場依存性の非スフェロイド様がん細胞塊の形成を促すことが示された。以下、実施例において、細胞培養基材上に接着して形成されたこのような細胞塊を微小腫瘍と呼ぶ。【００９１】
実施例３  微小腫瘍の形態学的構造解析及び生体内膵管腺癌との比較
実施例２において細胞培養基材１上に形成されたＰＣＩ−５５細胞からなる微小腫瘍をパラホルムアルデヒドで固定した後、ヘキスト３３３４２を用いて細胞核を、ファロイジンを用いてアクチンを、抗α−チューブリン抗体を用いてα−チューブリンを染色した。染色後の微小腫瘍について、２次元画像をオールインワン蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、ＢＺ−９０００、キーエンス）により取得し、また３次元画像を高速共焦点顕微鏡（Ｔｉ−Ｅ、ニコン）、高速スペクトル共焦点システム（Ａ１Ｒ、ニコン）及び画像取得ソフトウェア（ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ、ニコン）により取得し、解析した。【００９２】
微小腫瘍の３次元蛍光画像を図１９に示す。微小腫瘍の内部には複数の細胞核が含まれ、また微小腫瘍の表面付近は全体にわたってα−チューブリンが発現していた。このα−チューブリンの膜状発現は、他の細胞株（例として図１７）においても、また異なるスポット径の細胞培養基材を用いた場合（例として図１５）においても確認された。【００９３】
同じ微小腫瘍のＸＹ及びＸＺ方向断面の蛍光画像を図２０に示す。微小腫瘍の内部には、ヘキスト３３３４２、ファロイジン、抗α−チューブリン抗体で染色されない液胞と考えられる部分が存在していた。【００９４】
別の微小腫瘍の蛍光画像を図２１に示す。微小腫瘍が伸展すると推定される方向に、繊毛と考えられるα−チューブリンの発現が認められた（図２１の矢頭）。【００９５】
乳頭状に自己組織化した別の微小腫瘍の下層を異なるＺ座標で切断したＸＹ方向断面の蛍光画像を図２２に示す。乳頭状微小腫瘍の下層表面部分では多数の毛様体が形成されており、繊毛形成の誘導が認められた。【００９６】
また、微小腫瘍は葉状仮足を一体的に形成することもあり（図２３）、α−チューブリンの膜状発現によって覆われた形態極性が単一細胞のそれに非常に近いことが見出された。【００９７】
次に、上記のα−チューブリン膜状発現が生体内でも生じる現象であるかを調べた。６〜８週齢の雄性Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄＪｃｌマウス（日本クレア）に、２００μＬのＰＢＳに懸濁したＣＦＳＥ標識ＰＣＩ−５５細胞及び未標識ＰＣＩ−５５細胞（それぞれ５×１０６個ずつ）の混合物を腹腔内投与した。投与３日後のマウス腹膜組織染色画像を図２４に示す。ＰＣＩ−５５細胞がマウス腹膜上に定着して形成された微小腫瘍においても、α−チューブリンの膜状発現が観察された。【００９８】
膵管腺癌患者２症例の検体のヘマトキシリン・エオジン染色画像及びα−チューブリン免疫染色画像を図２５に示す。Ｐで示される癌化した膵管上皮病変部位においてα−チューブリン（微小管と推定される）の膜状発現が観察された一方、Ｎで示される正常な膵管上皮部分ではα−チューブリンの発現はほとんど観察されなかった。また、細胞異形や構造異形の悪性度が高いほど、特に膵臓上皮内腫瘍（図２５の最下段のＰＤＡＣ  ｐａｔｉｅｎｔ２）及び浸潤性の膵管腺癌の病変において、α−チューブリンの膜状発現はより強くなる傾向があった。【００９９】
以上から、細胞培養基材上で形成された微小腫瘍の表面付近におけるα−チューブリンの膜状発現はインビボでも観察される現象であり、微小腫瘍は生体の膵管腺癌のモデルとなることが示された。【０１００】
実施例４  微小腫瘍におけるエントーシス及び細胞内細胞構造の解析
実施例２において細胞培養基材１上で培養したＰＣＩ−５５細胞が基材に接着する様子をＤＩＣで観察した。図２６に示す９つの細胞からなる鎖状凝集体は、細胞が他の細胞内に取り込まれるエントーシスという現象を起こしながらスポットに定着し、最終的には１つの微小腫瘍となった。エントーシスで他の細胞内に取り込まれた細胞が再び外に出て複数細胞の凝集体に戻った後、再度エントーシスで他の細胞内に取り込まれる様子も観察されており（図２７）、微小腫瘍におけるエントーシスは可逆的であると考えられた。【０１０１】
次に、ＣＦＳＥで標識されたＰＣＩ−５５細胞を細胞培養基材１上に播種し、実施例２と同様に微小腫瘍を形成させ、蛍光顕微鏡で観察した。ＣＦＳＥ標識細胞の蛍光強度は１回の細胞分裂により半減することから、細胞分裂回数に応じて蛍光強度が変化する。この微小腫瘍は３個の細胞を内部に含み、うち１個の強蛍光細胞が、弱蛍光細胞により形成された微小腫瘍の細胞膜を貫通していている様子が観察された（図２８）。【０１０２】
ＣＦＳＥ標識ＰＣＩ−５５細胞により形成された別の微小腫瘍の蛍光画像を図２９に示す。この微小腫瘍は、弱蛍光細胞の中に６個の強蛍光細胞が含まれた細胞内細胞構造を有していた。【０１０３】
エントーシスにより生じるこのような細胞内細胞構造は、膵管腺癌症例の検体においても観察された（図２５のａ、ｂの部分）。【０１０４】
対照的に、正常ヒト胎児膵臓由来細胞株１Ｃ３ＩＫＥＩを細胞培養基材１上で培養した場合には、細胞塊表面におけるα−チューブリンの膜状発現及び細胞内細胞構造は観察されなかった（図３０、図３１）。【０１０５】
以上から、細胞培養基材上で形成された微小腫瘍はエントーシスによる細胞内細胞構造を有すること、及びこの構造は膵管腺癌患者においても観察されることから、微小腫瘍は生体内の膵管腺癌のモデルとなることが示された。【０１０６】
実施例５  微小腫瘍の死細胞貪食及び免疫回避の解析
実施例２において細胞培養基材１上に形成されたＰＣＩ−５５細胞からなる微小腫瘍がデブリを取り込む様子を、タイムラプスＤＩＣ画像を取得して観察した。微小腫瘍は糸状仮足及び葉状仮足を使用して能動的にデブリを捕捉していた（図３２、矢頭）。【０１０７】
また、微小腫瘍の培地に緑色蛍光ナノビーズを加えて培地の流れを観察した（図３３）。ナノビーズ添加から４時間後には微小腫瘍の周辺に多くのナノビーズが集まっていたことから、微小腫瘍は強力な吸引力を有するものと考えられた。【０１０８】
次に、培地にＰＣＩ−５５死細胞デブリを加えて、微小腫瘍が死細胞を貪食する様子を観察した。死細胞デブリの調製は以下のように行った。ＰＣＩ−５５細胞（５×１０５細胞）を６０ｍｍ組織培養皿で２４時間培養した後、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて２５０ｍＪ／ｃｍ２の強度でＵＶ照射した。ＵＶ照射した単層培養ＰＣＩ−５５細胞は、洗浄後、ＤＭＥＭ３ｍＬを加えて３時間インキュベートして細胞死を誘導させ、セルスクレイパーによって培地に懸濁させたものを、死細胞デブリを含んだ培地とし、２４時間培養により細胞培養基材１上に形成されたＰＣＩ−５５細胞からなる微小腫瘍に添加した。さらにアネキシンＶ（２５μＬ）及びＥｔｈＤ−１（２μＬ）を添加してライブイメージング解析を行い、パラホルムアルデヒドで固定、核染色後、コンフォーカルによる３Ｄイメージング解析を行った。【０１０９】
微小腫瘍は巨大な葉状仮足（図３４、矢頭）を使用して死細胞及びそのデブリを捕捉し、微小腫瘍内部に取り込んだ。また、死細胞が微小腫瘍に取り込まれた際、ＥｔｈＤ−１は微小腫瘍内部に取り込まれたのに対し、アネキシンＶは微小腫瘍の表面に蓄積された（図３５、図３６）。【０１１０】
さらに、３×１０６個のＰＣＩ−５５細胞を細胞培養基材１上で３７℃、一晩培養することで形成された微小腫瘍に対して、３×１０６個のヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１を加え、６時間１５分、タイムラプスＤＩＣ画像を取得しながら共培養を行った。ＫＨＹＧ−１細胞は微小腫瘍を攻撃せず、フラトリサイドを起こして死滅していく様子が観察された（図３７）。【０１１１】
以上から、微小腫瘍は死細胞を取り込む又は引き付けることにより従来の死細胞フェノタイプであるアネキシンＶ陽性（すなわちホスファチジルセリン陽性）及び／又はＥｔｈＤ−１陽性を呈するようになることが確認された。また、その外表面に死細胞由来のホスファチジルセリンが蓄積した微小腫瘍は、免疫細胞により非生存組織と誤認識され、免疫系の攻撃を免れることが示唆された。【０１１２】
実施例６  従来型培養基材上での微小腫瘍の培養
実施例５において死細胞と共存させた微小腫瘍を採取し、通常の細胞培養用ディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）  セルカルチャーディッシュ  ３５×１０ｍｍ  イージーグリップタイプ、ファルコン）に戻して培養したところ、微小腫瘍の形態学的極性は低下し、表面上のアネキシンＶの蓄積も失われた（図３８）。以上から、微小腫瘍がその特徴を維持した状態で生存するには、足場となる３次元構造を有する細胞培養基材での培養が必要であることが推測された。【０１１３】
実施例７  死細胞を貪食した微小腫瘍の成長
実施例５において死細胞と共存させた微小腫瘍が死細胞を取り込む様子を、タイムラプスＤＩＣ画像を取得して観察した。微小腫瘍は多数の死細胞を貪食し、その内部に多量のＥｔｈＤ−１を取り込んだ（図３９、図４０）。また、死細胞添加から４８時間後の微小腫瘍は、死細胞を添加しない微小腫瘍よりも底面積が有意に増加し、腫瘍サイズの増大が確認された（図４１）。以上から、微小腫瘍はあたかも単一細胞のように死細胞を貪食して成長することが示された。【０１１４】
実施例８  微小腫瘍における外来死細胞由来ヌクレオシドの取り込みの実証
実施例２において細胞培養基材１上に形成されたＰＣＩ−５５細胞からなる微小腫瘍におけるヌクレオシド代謝を、予めチミジンヌクレオシド類似体である５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）を取り込ませた死細胞（ＥｄＵ死細胞）を用いて調べた。ＥｄＵ死細胞は、ＰＣＩ−５５細胞を１０μＭ  ＥｄＵ添加培地で培養した以外は実施例５と同様に調製した。ＣＳＦＥ標識ＰＣＩ−５５細胞からなる微小腫瘍にＥｄＵ死細胞を添加して培養した後、微小腫瘍をパラホルムアルデヒドで固定し、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ（登録商標）  ＰｌｕｓアッセイによってＥｄＵを検出した。【０１１５】
蛍光顕微鏡での観察画像を図４２〜図４４に示す。微小腫瘍の周辺にはＥｄＵ陽性の死細胞デブリが大量に集積しており（図４２）、さらに微小腫瘍内の液胞においても相当量のＥｄＵが検出された（図４３）。微小腫瘍内のＥｄＵの一部はリソソーム内部において検出された（図４４）。また、ＥｄＵは、オートファジーの中心タンパク質であるＬＣ３陽性の液胞においても検出された（図４５）。【０１１６】
なお、ＬＣ３は、微小腫瘍の表面において、特に微小腫瘍表面上の繊毛根部において、αーチューブリンと共局在することも確認された（図４６、図４７）。【０１１７】
以上から、死細胞由来のヌクレオシドは微小腫瘍の表面を通過し、その一部が微小腫瘍内の液胞内に局在し、またリソソームに取り込まれること、並びに微小腫瘍はその表面及び液胞内にＬＣ３を高度に発現しており、取り込まれたヌクレオシドはＬＣ３陽性液胞、つまり、オートファゴソーム内に局在することが確認された。膵管腺癌においてはオートファジー及びリソソーム異化の亢進が知られていることから、微小腫瘍は生体内の膵管腺癌におけるオートファジー及び核酸代謝に関する研究モデルとして有用であることが示された。
実施例９  微小腫瘍を用いた抗がん剤の評価【０１１８】
実施例２において細胞培養基材１上に形成されたＰＣＩ−５５細胞からなる微小腫瘍の培地中に、微小管重合阻害作用を有する抗がん剤として知られるノコダゾールを終濃度１μＭになるように加え、形態変化を観察した。ノコダゾール処理により、微小腫瘍は細胞培養基材上のスポットへの接着が妨げられ、スフェロイド様の形態になった（図４８）。また、微小腫瘍におけるα−チューブリンの膜状発現は消失し、細胞内細胞構造は破壊され、多数の生存細胞が微小腫瘍内部からこぼれて溢れ出すように播種した（図４９）。【０１１９】
さらに、逆説的に、ノコダゾール処理は微小腫瘍表面のアネキシンＶの蓄積を減少させ（図５０）、死細胞フェノタイプを失わせた。【０１２０】
以上から、薬剤処理時の微小腫瘍の形態や分子発現等の特徴を指標とすることにより、その薬剤の抗がん作用の評価が可能であることが示された。【０１２１】
実施例１０  表面に凹凸構造を持つグルーブを有する細胞培養基材上での微小腫瘍形成
実施例１と同様の手法により、幅１０μｍ、長さ１００００μｍの直線状グルーブが５０μｍ間隔で１０ｍｍ２あたり１６６本並んだパターンを有する細胞培養基材、及び幅３０μｍ、長さ１００００μｍの直線状グルーブが５０μｍ間隔で１０ｍｍ２あたり１２５個並んだパターンを有する細胞培養基材を作製した。これらの細胞培養基材におけるグルーブは、細胞培養基材１におけるスポットと同様の凹凸構造をその表面に持つ。【０１２２】
実施例２と同様に、３ｍＬのＤＭＥＭに懸濁した３×１０６個のＰＣＩ−５５細胞を上記２種類の細胞培養基材上に播種し、３７℃で一晩〜４８時間培養した。培養終了後の細胞塊のＤＩＣ観察画像を図５１に示す。実施例２に示される直径２０〜１００μｍのスポット状粗面部分を持つ細胞培養基材と同様に、幅１０μｍ又は３０μｍのグルーブを持つ細胞培養基材においても、微小腫瘍の形成が確認された。この微小腫瘍は、特に幅１０μｍのグルーブを持つ細胞培養基材において顕著なように、グルーブの伸長方向に沿って多くの糸状仮足を有していた。【０１２３】
実施例１１  膵管腺癌細胞のアノイキス耐性の評価
実施例２と同様に、３ｍＬのＤＭＥＭに懸濁した３×１０６個のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を細胞培養基材１上に播種し、３７℃で一晩〜４８時間培養した。ＰＣＩ−５５はＥＭＴを起こしていない、上皮系形質を維持したアノイキス耐性のないヒト膵管腺癌細胞株であるのに対し、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２はＥＭＴを起こして間葉系形質を獲得した、アノイキス耐性のヒト膵管腺癌細胞株である（https://cellbank.nibiohn.go.jp/~cellbank/cgi-bin/search_res_det.cgi?ID=245）。【０１２４】
培養終了後の細胞のＤＩＣ観察画像を図５２に示す。同条件で培養したＰＣＩ−５５細胞（図５２左）が基材に接着して微小腫瘍を形成したのに対し、世界中で広く利用される膵管腺癌の接着細胞株であるＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞は基材に接着せず培地中を浮遊したまま増殖した（図５２右）。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の培養後に細胞培養基材１を洗浄したところ、ほとんどの細胞が基材から除去された（図５３）。【０１２５】
一方、細胞培養に一般的に用いられるポリスチレン製細胞培養基材（組織培養用フラスコ（トラディショナルタイプ）２５ｍＬ、ＦＡＬＣＯＮ）を用いてＰＣＩ−５５細胞及びＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を一晩培養したところ、いずれの細胞も基材に接着して増殖し、接着性及び増殖性に差は認められなかった（図５４）。【０１２６】
以上から、表面に凹凸構造を有する粗面部分を持つ細胞培養基材は、上皮系癌細胞がアノイキス耐性を獲得しているか否か、ＥＭＴを起こし、間葉系形質を獲得しているか否か、さらには浸潤・転移能を有するか否かといった癌細胞の悪性度を判定するツールとして利用可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月7日(2019.1.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と生体適合性ポリマー層とを有する細胞培養基材であって、
該基材は、生体適合性ポリマー層で覆われていない複数の粗面部分を基材表面上に有し、
ここで
粗面部分の形状は、径が２０μｍ〜１００μｍのスポットであるか、又は幅が３μｍ〜３０μｍのグルーブであり、粗面部分の形状がグルーブの場合、粗面部分はその端部において他の粗面部分と連結されていてもよく、
２つの隣接する粗面部分間の距離は少なくとも１０μｍ以上であり、粗面部分はその表面に高さ２０ｎｍ〜２００ｎｍの凹凸構造を持つ、前記細胞培養基材。
【請求項２】
粗面部分の界面展開面積比（Ｓｄｒ）が０．００２以上である、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
２つの隣接する粗面部分間の距離が１０〜１２００μｍである、請求項１又は２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
粗面部分表面の算術平均粗さ（Ｒａ）が４ｎｍ以上、最大高さ粗さ（Ｒｚ）が３０ｎｍ以上、及び／又は山頂点算術平均曲（Ｓｐｃ）が３００以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
生体適合性ポリマーが生物学的材料との非特異的吸着を抑制する両親媒性ポリマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
生体適合性ポリマーが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞培養基材。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｆ）の特徴を持つ、接着性がん細胞から構成される、分離された生きたがん細胞集合体。
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
（ｆ）複数の生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
【請求項８】
さらに以下の（ｇ）〜（ｋ）のうちの少なくとも１つの特徴を持つ、請求項７に記載のがん細胞集合体。
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
【請求項９】
請求項７又は８に記載のがん細胞集合体が３次元構造を有する細胞培養基材に接着してなる、複合体。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、請求項７又は８に記載のがん細胞集合体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養する工程を含む、請求項９に記載の複合体の製造方法。
【請求項１２】
請求項７又は８に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
以下のがん細胞集合体の特徴
（ａ）細胞内細胞構造を有する
（ｂ）非スフェロイド状形態を示す
（ｃ）表面にα−チューブリンの膜状発現がある
（ｄ）形態学的極性を有する
（ｅ）組織運動極性を有する
（ｆ）生きたがん細胞を可逆的に放出し、取り込む能力がある
（ｇ）表面に繊毛を有する
（ｈ）糸状仮足又は葉状仮足様形態を示す
（ｉ）死細胞を取り込む能力がある
（ｊ）細胞デブリ吸引力を有する
（ｋ）表面がホスファチジルセリン陽性である
のうちの少なくとも１つを観察し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下で上記特徴の減弱又は喪失がより強く観察された場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項７又は８に記載のがん細胞集合体と被験物質を共存させる工程、
がん細胞集合体又はその仮足の長さ又は大きさを測定し、被験物質と共存させないがん細胞集合体のそれと比較する工程、及び
被験物質共存下でがん細胞集合体又はその仮足がより短くなった又はより小さくなった場合、被験物質は抗がん作用を有すると判定する工程
を含む、がんの予防及び／又は治療のための薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
薬剤が、がんの浸潤及び／又は転移を抑制する薬剤である、請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
薬剤が、がんの免疫回避機構を抑制及び／又は解除する薬剤である、請求項１２又は１３に記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞培養基材を用いて被験上皮系癌細胞を培養する工程、及び
上皮系癌細胞が細胞培養基材に接着せずに増殖した場合に上皮系癌細胞はアノイキス耐性を有すると判定する工程
を含む、上皮系癌細胞のアノイキス耐性を判定する方法。
【国際調査報告】
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