(57)【要約】  異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーを含む各種ヘモグロビンを分離及び検出する方法の提供。ヘモグロビン分析方法であって、カチオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含み、該ヘモグロビンの分離において、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液が用いられる、方法。
2019203302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビン分析方法であって、
カチオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
該ヘモグロビンの分離において、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液が用いられる、
方法。
【請求項２】
前記溶離液が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記溶離液を用いたグラジエント溶離によりヘモグロビンを分離する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記グラジエントにおいて前記溶離液の割合が０％から１００％まで増加する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、及びＨｂＯ−Ａｒａｂからなる群より選択される少なくとも１種の異常ヘモグロビンを分離する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＨ、ＨｂＢａｒｔ’、及びＨｂＣｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｐｒｉｎｇからなる群より選択される少なくとも１種のサラセミアマーカーを分離する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液。
【請求項１２】
金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、請求項１１記載の溶離液。
【請求項１３】
前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、請求項１２記載の溶離液。
【請求項１４】
前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１２又は１３記載の溶離液。
【請求項１５】
前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の溶離液。
【請求項１６】
ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液としての使用。
【請求項１７】
ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液の製造のための使用。
【請求項１８】
前記液体組成物が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、請求項１６又は１７記載の使用。
【請求項１９】
前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記液体組成物中の前記緩衝剤の濃度が２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１８又は１９記載の使用。
【請求項２１】
前記液体組成物がヘモグロビン変性剤を含有する、請求項１６〜２０のいずれか１項記載の使用。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビンの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン（Ｈｂ）は、酸素と結合するヘム（色素部分）と、ヘムを抱えるグロビンからなる色素タンパク質であり、全身の細胞への酸素の運搬に関わる。正常ヒトグロビンのポリペプチドには、α、β、γ、δ鎖という４種類のサブユニットがあり、これらが２本のα鎖と２本の非α鎖からなるテトラマーを構成する。正常ヒトＨｂにはＨｂＡ（α２β２）、ＨｂＡ２（α２δ２）及びＨｂＦ（α２γ２）の３種類が存在するが、その大部分はＨｂＡである。ＨｂＡには主にＨｂＡ０と糖化したＨｂＡ１ｃが含まれ、ＨｂＡ１ｃは糖尿病などのマーカーとして使用される。【０００３】
グロビンサブユニットの立体構造の異常は異常Ｈｂ症を、一方、グロビンサブユニットの形成不全はサラセミアを引き起こし、いずれも貧血や、さらに重症例では溶血、発育不全、骨変形などをもたらす。異常Ｈｂ症は、一般にＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤなどの異常Ｈｂを検出することで診断される。サラセミアは、α鎖の形成不全によるαサラセミアとβ鎖の形成不全によるβサラセミアに大別され、一般にＨｂＡ２、ＨｂＦなどの高値を指標に診断される。【０００４】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてヘモグロビンの異常を検出する方法がある。特許文献１には、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）及びリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を異なる比率で含む複数の溶離液を順次送液するグラジエント溶出を用いたＨＰＬＣにより、異常ＨｂであるＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ及びＨｂＤや、サラセミアマーカーＨｂＡ２及びＨｂＦを分離可能であることが記載されている。特許文献２には、イオン対試薬を含有し、ｐＨが７．１〜７．３の範囲にある溶離液を用いたイオン交換液体クロマトグラフィーにより、ＨｂＡ０、ＨｂＳ及びＨｂＣを分離したことが記載されている。特許文献３には、カチオン交換高速液体クロマトグラフィーにより、ｐＨ６．８８〜７．５０の溶離液を用いてヘモグロビンＳを分析、又はｐＨ６．６０〜６．８０の溶離液を用いてヘモグロビンＡ２を分析する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１６−２７３２６号公報
【特許文献２】特開２０１０−２３７１１０号公報
【特許文献３】国際公開公報第２０１１／０９６４２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血液試料から、異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーを含む各種ヘモグロビンを分離及び検出する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕ヘモグロビン分析方法であって、
カチオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含み、
該ヘモグロビンの分離において、ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液が用いられる、
方法。
〔２〕前記溶離液が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、〔２〕記載の方法。
〔４〕前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌである、〔２〕又は〔３〕記載の方法。
〔５〕前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記溶離液を用いたグラジエント溶離によりヘモグロビンを分離する、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記グラジエントにおいて前記溶離液の割合が０％から１００％まで増加する、〔６〕記載の方法。
〔８〕ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、及びＨｂＯ−Ａｒａｂからなる群より選択される少なくとも１種の異常ヘモグロビンを分離する、〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＨ、ＨｂＢａｒｔ’、及びＨｂＣｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｐｒｉｎｇからなる群より選択される少なくとも１種のサラセミアマーカーを分離する、〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記クロマトグラフィーが高速液体クロマトグラフィーである、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液。
〔１２〕金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、〔１１〕記載の溶離液。
〔１３〕前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、〔１２〕記載の溶離液。
〔１４〕前記溶離液中の前記緩衝剤の濃度が２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌである、〔１２〕又は〔１３〕記載の溶離液。
〔１５〕前記溶離液がヘモグロビン変性剤を含有する、〔１１〕〜〔１４〕のいずれか１項記載の溶離液。
〔１６〕ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液としての使用。
〔１７〕ｐＨ８．１以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である液体組成物の、カチオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離用溶離液の製造のための使用。
〔１８〕前記液体組成物が金属イオンを含まない緩衝剤を含有する、〔１６〕又は〔１７〕記載の使用。
〔１９〕前記緩衝剤がＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳである、〔１８〕記載の使用。
〔２０〕前記液体組成物中の前記緩衝剤の濃度が２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌである、〔１８〕又は〔１９〕記載の使用。
〔２１〕前記液体組成物がヘモグロビン変性剤を含有する、〔１６〕〜〔２０〕のいずれか１項記載の使用。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、血液試料から、主要なヘモグロビンであるＨｂＡ０に加えて、ＨｂＡ１ｃ、異常Ｈｂ、サラセミアマーカーなどを迅速かつ高感度に分離することができる。本発明は、異常Ｈｂ症又はサラセミアの簡便、迅速かつ高感度な診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＴＥＳ含有溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによる実施例１でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの分析結果。
【図２】Ｔｒｉｃｉｎｅ含有溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによる実施例２でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの分析結果。
【図３】Ｂｉｃｉｎｅ含有溶離液を用いたカチオン交換クロマトグラフィーによる実施例３でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣの分析結果。
【図４】比較例５でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。
【図５】比較例６でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。
【図６】比較例７でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。
【図７】比較例８でのＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳの分析結果。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１１】
本発明のヘモグロビン分析方法は、イオン交換クロマトグラフィーにより試料中のヘモグロビンを分離することを含む。当該本発明の方法に用いられる試料としては、通常のヘモグロビン分析に用いられるヘモグロビンを含む血液試料を用いることができる。例えば、ヒトから採取した血液を溶血又は希釈した血液試料を用いることができる。
【００１２】
本発明の方法で行われるクロマトグラフィーは、好ましくは液体クロマトグラフィーであり、より好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。本発明におけるイオン交換クロマトグラフィーは、公知の液体クロマトグラフィーシステム、すなわち、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えたシステムに接続したイオン交換カラムを用いて行うことができる。
【００１３】
好ましくは、本発明の方法で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、カチオン交換カラムを用いた、カチオン交換クロマトグラフィーである。本発明の方法で用いられるカチオン交換カラムは、カチオン交換基を有する固定相が充填されたカラムであればよい。該カチオン交換基としては、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基などが挙げられ、このうちスルホン酸基が好ましい。
【００１４】
該カチオン交換カラムの固定相としては、充填剤粒子、多孔質体等が挙げられ、充填剤粒子が好ましい。該充填剤粒子としては、無機系粒子、有機系粒子等が挙げられる。該無機系粒子としては、シリカ、ジルコニア等で構成される粒子が挙げられる。該有機系粒子としては、セルロース、ポリアミノ酸、キトサン等の天然高分子粒子や、ポリスチレン、ポリアクリル酸エステル等の合成高分子粒子が挙げられる。該カチオン交換基を有する固定相の好ましい例として、特開２０１１−０４７８５８号公報に開示されている、非架橋性の親水性アクリル系単量体とポリグリシジルエーテル類との混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、該架橋重合体粒子の表面に重合されたカチオン交換基を有するアクリル系単量体の層とを含む充填剤が挙げられる。
【００１５】
本発明のヘモグロビン分析方法では、従来のイオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分析と同様に、試料中のヘモグロビンをイオン交換カラムに吸着させた後、該カラムに溶離液を流して該カラムからヘモグロビンを溶離させることにより、試料中のヘモグロビンを分離する。したがって、本発明のヘモグロビン分析方法で使用される溶離液は、イオン交換クロマトグラフィーによるヘモグロビン分離のために使用される溶離液である。より好ましくは、該溶離液は、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて、カチオン交換カラムからのヘモグロビンの溶離のために使用される溶離液である。
【００１６】
本発明のヘモグロビン分析方法では、従来のヘモグロビン分析方法と比べて高ｐＨかつ低浸透圧の溶離液を用いる。本発明で使用される該溶離液は、ｐＨ８．１以上が好適である。より詳細には、該溶離液のｐＨは、好ましくは８．１以上、より好ましくは８．２以上であり、さらに好ましくは８．３以上であり、一方、好ましくは１０．０以下、より好ましくは９．０以下、さらに好ましくは８．６以下である。該溶離液がｐＨ８．１未満であると、カラムからのヘモグロビン、特にＨｂＣの溶出が不十分になることがあり、一方、ｐＨ１０を超えると、特にＨｂＳとＨｂＣの分離が不十分になることがある。本発明で使用される該溶離液のｐＨ範囲としては、ｐＨ８．１〜１０．０、ｐＨ８．１〜９．０、ｐＨ８．１〜８．６、ｐＨ８．２〜１０．０、ｐＨ８．２〜９．０、ｐＨ８．２〜８．６、ｐＨ８．３〜１０．０、ｐＨ８．３〜９．０、及びｐＨ８．３〜８．６が挙げられる。一方、従来のヘモグロビン分析方法で用いられていた溶離液のｐＨは、通常ｐＨ５．０〜８．０程度である。
【００１７】
本発明で使用される該溶離液の浸透圧は、４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下が好適である。より詳細には、該溶離液の浸透圧は、好ましくは４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは３７ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、さらに好ましくは３６ｍＯｓｍ／ｋｇ以下であり、一方、好ましくは１５ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは１９ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、さらに好ましくは２６ｍＯｓｍ／ｋｇ以上である。該溶離液の浸透圧が１５ｍＯｓｍ／ｋｇ未満であると、ヘモグロビン、特にＨｂＡ０とＨｂＡ２の溶出が不十分になることがあり、一方、４０ｍＯｓｍ／ｋｇを超えると、ヘモグロビン種間、特にＨｂＡ０とＨｂＡ２との分離が悪くなる。本発明で使用される該溶離液の浸透圧の範囲としては、１５〜４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１５〜３７ｍＯｓｍ／ｋｇ、１５〜３６ｍＯｓｍ／ｋｇ、１９〜４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、１９〜３７ｍＯｓｍ／ｋｇ、１９〜３６ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６〜４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、２６〜３７ｍＯｓｍ／ｋｇ、及び２６〜３６ｍＯｓｍ／ｋｇが挙げられる。一方、従来のクロマトグラフィーによるヘモグロビン分離において、浸透圧調整の観点で溶離液の組成を設計することは行われておらず、また従来用いられていた溶離液のｐＨは、通常１２５〜５７０ｍＯｓｍ／ｋｇ程度である。本明細書における浸透圧の値は、凝固点降下法により測定された浸透圧の値をいう。浸透圧は、市販の浸透圧計、例えばオズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）等を用いて測定することができる。また本明細書において、浸透圧の単位ｍＯｓｍ／ｋｇとは、ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏを意味し、これはｍＯｓｍ／Ｌ又はｍＯｓｍとも表記されることがある。
【００１８】
上記のｐＨと浸透圧の範囲を有する溶離液を調製するために、本発明においては、該溶離液に金属イオンを含まない緩衝剤を含有させる。リン酸緩衝液等の従来の溶離液で一般に使用されている緩衝液は、金属イオンを含むため、高ｐＨ性と低浸透圧性を同時に実現することは困難である。該金属イオンを含まない緩衝剤の例としては、グッド緩衝剤が挙げられ、なかでも、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン）、又はＴＥＳ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸）が好ましく、ＴＥＳがより好ましい。
【００１９】
本発明で使用される該溶離液における上述した緩衝剤の濃度は、後述する添加剤等の影響を考慮した上で、最終的な溶離液のｐＨ及び浸透圧を上記範囲に調整できる濃度であればよい。該溶離液における該緩衝剤の濃度は、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは２．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、一方、好ましくは１７ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。本発明で使用される該溶離液における該緩衝剤の濃度の範囲としては、２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌ、２〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、２〜１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５〜１７ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５〜１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５〜１７ｍｍｏｌ／Ｌ、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、及び５〜１２．５ｍｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
【００２０】
好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有する溶液状の液体組成物である。該溶離液中の該緩衝剤の濃度は２〜１７ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が１５〜４０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが、好ましくは８．１〜１０．０、より好ましくはｐＨ８．２〜９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２〜８．６、なお好ましくはｐＨ８．３〜８．６である。
【００２１】
より好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は２．５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が１５〜３７ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが、好ましくは８．１〜１０．０、より好ましくはｐＨ８．２〜９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２〜８．６、なお好ましくはｐＨ８．３〜８．６である。
【００２２】
さらに好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が１９〜３７ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが、好ましくは８．１〜１０．０、より好ましくはｐＨ８．２〜９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２〜８．６、なお好ましくはｐＨ８．３〜８．６である。
【００２３】
さらにより好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が２６〜３６ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨが好ましくはｐＨ８．２〜９．０、さらに好ましくはｐＨ８．２〜８．６、なお好ましくはｐＨ８．３〜８．６である。
【００２４】
なお好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、緩衝剤としてＢｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｃｉｎｅ又はＴＥＳを含有し、該溶離液中の該緩衝剤の濃度は５〜１２．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、該溶離液は、浸透圧が２６〜３６ｍＯｓｍ／ｋｇであり、かつｐＨがｐＨ８．３〜８．６である。
【００２５】
本発明で使用される該溶離液は、上述した緩衝剤以外に、溶媒、及びヘモグロビン変性剤、三価ヘム鉄への結合剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤などの添加剤を含有していてもよい。
【００２６】
好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、ヘモグロビン変性剤を含有する。ヘモグロビン変性剤は、ヘモグロビンのヘム鉄を二価から三価に変化させ、メトヘモグロビンを生成することができる酸化剤であればよい。そのような酸化剤の例としては、亜硝酸塩、フェリシアン化カリウム、メチレンブルー、過酸化水素、アスコルビン酸、硫化水素などが挙げられる。このうち、亜硝酸塩が好ましく、亜硝酸ナトリウム又は亜硝酸カリウムがより好ましい。該溶離液における該ヘモグロビン変性剤の濃度は、好ましくは０．０５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２７】
また好ましくは、本発明で使用される該溶離液は、三価ヘム鉄への結合剤を含有する。該三価ヘム鉄への結合剤は、該ヘモグロビン変性剤により生成されたメトヘモグロビンを安定化させて、その溶出挙動を安定化させる。該三価ヘム鉄への結合剤の例としては、アジ化物、シアン化物等が挙げられる。アジ化物の例としては、アジ化ナトリウム、ジフェニルリン酸アジド、４−ドデシルベンゼンスルフォニルアジド、４−アセチルアミノベンゼンスルフォニルアジド、アジ化カリウム、アジ化リチウム、アジ化鉄、アジ化水素、アジ化鉛、アジ化水銀、アジ化銅、アジ化銀等が挙げられる。シアン化物の例としては、シアン化カリウム、シアン化水素、シアン化ナトリウム、シアン化銀、シアン化水銀、シアン化銅、シアン化鉛、シアン化鉄、シアン化リチウム、シアン化アンモニウム等が挙げられる。好ましくは、該三価のヘム鉄への結合剤はアジ化物であり、より好ましくはアジ化ナトリウムである。該溶離液における該三価ヘム鉄への結合剤の濃度は、好ましくは０．０５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２８】
該ｐＨ調整剤としては、公知の酸及び塩基が挙げられ、酸の例としては、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、塩基の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウムなどが挙げられる。
【００２９】
該溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトン等の水溶性有機溶媒が挙げられる。該溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度であることが好ましく、例えば８０％（ｖ／ｖ）以下が好ましく、より好ましい範囲は０．１％（ｗ／ｗ）以上５０％（ｗ／ｗ）以下である。
【００３０】
好ましくは、本発明のヘモグロビン分析方法では、上記溶離液を用いたグラジエント溶離により、ヘモグロビンを分離する。好ましくは、本発明の方法では、上記溶離液を溶離液Ｂ（以下、Ｂ液、又は単にＢと称する）とし、別の溶離液を溶離液Ａ（以下、Ａ液、又は単にＡと称する）として、Ｂ液の割合が段階的に高くなるように、Ａ液とＢ液の間でグラジエントをかける。
【００３１】
溶離液Ａは、公知の塩化合物を含む緩衝剤を含有するものであればよい。該溶離液Ａに含まれ得る緩衝剤の例としては、有機酸又は無機酸を含む緩衝液が挙げられる。有機酸の例としては、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等、及びこれらの塩が挙げられ、無機酸の例としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、過塩素酸等、及びこれらの塩が挙げられる。該溶離液Ａに用いられる緩衝液は、これらの有機酸及び無機酸のいずれか１種又は２種以上を組み合わせて含有することができる。このうち、リン酸塩、コハク酸塩、又は過塩素酸塩を含む緩衝液が好ましい。リン酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウムが好ましい。コハク酸塩の例としては、ナトリウム塩及びカリウム塩などが挙げられ、コハク酸一ナトリウム、コハク酸二ナトリウムが好ましい。過塩素酸塩の例としては、過塩素酸ナトリウムが挙げられる。これらのリン酸塩、コハク酸塩及び過塩素酸塩は、単独で用いられてもよく、２種以上で併用されてもよい。
【００３２】
溶離液Ａは、上述した緩衝剤以外に、上述した溶離液Ｂに含有され得るものと同様の溶媒、及び添加剤（例えば上述したヘモグロビン変性剤、三価ヘム鉄への結合剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤など）を含有していてもよい。
【００３３】
溶離液ＡのｐＨは、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．２以上であり、好ましくは６．０以下、より好ましくは５．８以下である。溶離液ＡのｐＨ範囲は、好ましくは５．０〜６．０であり、より好ましくは５．２〜５．８である。また、溶離液Ａの浸透圧は、好ましくは１３０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上、より好ましくは１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であり、好ましくは２１０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、より好ましくは１９０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である。溶離液Ａの浸透圧の範囲は、好ましくは１３０〜２１０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、より好ましくは１５０〜１９０ｍＯｓｍ／ｋｇである。好ましい実施形態において、溶離液Ａは、ｐＨ５．０〜６．０であり、かつ浸透圧が１３０〜２１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１５０〜１９０ｍＯｓｍ／ｋｇである。より好ましい実施形態において、溶離液Ａは、ｐＨ５．２〜５．８であり、かつ浸透圧が１３０〜２１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは１５０〜１９０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００３４】
好ましくは、本発明の方法におけるグラジエント溶離では、まず、Ａ液１００％（Ｂ液０％）で通液し、次いでグラジエントをかけてＢ液の割合を増加させ、Ｂ液の割合を１００％まで上げる。グラジエントの大きさは、カラムの性能等に合わせて適宜調整すればよく、特に限定されない。グラジエントの一例は、Ａ：Ｂ＝１００：０  →  Ｂの割合を５０〜９８容量％（好ましくは７０〜９５容量％）まで増加  →  段階的にＢの割合をさらに増加  →  Ａ：Ｂ＝０：１００である。グラジエントの別の一例は、Ａ：Ｂ＝１００：０  →  溶離液が全体でｐＨ６．５〜８．０、浸透圧２０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇになるようＢの割合を増加  →  段階的にＢの割合をさらに増加  →  Ａ：Ｂ＝０：１００である。必要に応じて、この後に再びＡ：Ｂ＝１００：０の通液時間を設けてもよい。
【００３５】
一実施形態において、本発明のヘモグロビン分析方法は、異常ヘモグロビンの検出に利用される。本発明の方法で検出される異常ヘモグロビンとしては、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＥ、ＨｂＤ、及びＨｂＯ−Ａｒａｂからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはＨｂＣ及びＨｂＳからなる群より選択される少なくとも１種である。本発明の方法においては、上記に挙げた異常ヘモグロビンの各々を、一度の分析で全て分離検出することが可能である。
【００３６】
別の一実施形態において、本発明のヘモグロビン分析方法は、サラセミアマーカーの検出に利用される。本発明の方法で検出されるサラセミアマーカーとしては、ＨｂＡ２、ＨｂＦ、ＨｂＨ、ＨｂＢａｒｔ’、及びＨｂＣｏｎｓｔａｎｔ  Ｓｐｒｉｎｇからなる群より選択される少なくとも１種が挙げられ、好ましくはＨｂＡ２である。本発明の方法においては、上記に挙げたサラセミアマーカーの各々を、一度の分析で全て分離検出することが可能である。
【００３７】
さらに、本発明のヘモグロビン分析方法においては、上記に挙げた異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーの両方を検出することができる。さらに、該異常ヘモグロビン及び／又はサラセミアマーカーを検出するとともに、ＨｂＡ０、又は糖化ヘモグロビンＨｂＡ１ｃを検出することができる。したがって、本発明のヘモグロビン分析方法により、試料中における異常ヘモグロビン及びサラセミアマーカーの有無を一度に分析することができ、さらに試料中における異常ヘモグロビン、サラセミアマーカー、及びＨｂＡ１ｃの有無を一度に分析することも可能である。したがって、本発明の方法は、一度の分析で多種のヘモグロビンを検出することができるので、異常Ｈｂ症やサラセミアの簡便かつ迅速な診断を可能にする。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３９】
（参考例１：ヘモグロビン分離用カラムの調製）
非架橋性の親水性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールモノメタクリレート（日油社製）２００ｇ、及び、ポリグリシジルエーテル類としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（日油社製）２００ｇを混合した単量体混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．０ｇを溶解した。得られた混合物を、４重量％のポリビニルアルコール（日本合成化学工業社製、「ゴーセノールＧＨ−２０」）水溶液５Ｌに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で８０℃に加温し、１時間重合反応を行なった。温度を３０℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亜合成社製）１００ｇを反応系に添加し、再び８０℃に加温して１時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基が導入された架橋重合体粒子を得た。得られたヘモグロビン分離用カラム充填剤を、内径４ｍｍ、長さ２０ｍｍのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン分離用カチオン交換カラムを調製した。【００４０】
（参考例２：検体の調製）
検体Ａ：健常人から採取した血液検体を０．１％トリトンＸ−１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。
検体Ｂ：Ｌｙｐｈｏｃｈｅｃｋ（登録商標）Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ２  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｌｅｖｅｌ  ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２及びＨｂＳ含有）を０．１％トリトンＸ−１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。
検体Ｃ：ＡＦＳＣヘモコントロール（ヘレナ研究所社製、ＨｂＡ０、ＨｂＳ及びＨｂＣ含有）を０．１％トリトンＸ−１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。
検体Ｄ：Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ａ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＨｂＡ２含有）を０．１％トリトンＸ−１００含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．００）で適宜希釈して検体を調製した。【００４１】
（試験１）
参考例２で調製した検体Ａ〜Ｃについてヘモグロビン分析を行った。分析条件を以下に示す。
ＨＰＬＣ装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
検出器：ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所社製）
送液ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所社製）
脱気ユニット：ＤＧＵ−２０Ａ５Ｒ（島津製作所社製）
カラムオーブン：ＣＴＯ−２０ＡＣ（島津製作所社製）
オートサンプラー：ＳＩＬ−２０ＡＣ（島津製作所社製）
カラム：参考例１で作成したヘモグロビン分離用カチオン交換カラム
流速：１．１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
溶離液
溶離液Ａ：４０ｍｍｏｌ/Ｌコハク酸ナトリウム、４５ｍｍｏｌ/Ｌ過塩素酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ/Ｌアジ化ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ５．３、浸透圧１７０ｍＯｓｍ／ｋｇ）
溶離液Ｂ：溶離液Ｂ１〜Ｂ６（表１）
グラジエント：表２のとおり
ｐＨメーター：Ｆ−５２（堀場製作所製）
浸透圧計：オズモメーター３２５０（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）【００４２】
【表１】
2019203302.tif 000003
【００４３】
【表２】
2019203302.tif 000004
【００４４】
実施例１〜６での検体Ａ〜Ｃの分析結果を表３に示す。また、実施例１、２及び３で得られた検体Ａ〜Ｃのクロマトグラムを図１、図２、及び図３にそれぞれ示す。実施例１〜６において、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、及びＨｂＣがそれぞれ別個のピークとして検出された。本結果より、緩衝剤ＴＥＳ、Ｔｒｉｃｉｅｎ又はＢｉｃｉｎｅを含む溶離液を用いることで、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ、及びＨｂＣを検出できることが示された。【００４５】
【表３】
2019203302.tif 000005
【００４６】
（試験２）
参考例２で調製した検体Ａ〜Ｃについてヘモグロビン分析を行った。溶離液Ｂ及びグラジエント条件以外の条件は、試験１と同様にした。溶離液Ｂとしては、表４〜６に記載の溶離液を用いた。グラジエント条件は、ＨｂＡ０を２．１ｍｉｎに溶出させるよう、溶離液Ａと溶離液Ｂの混合割合を適宜決定した。また、ＨｂＣ溶出確認のため、溶離液Ｂ濃度１００％の時間を適宜延長した。【００４７】
分析結果を表４〜６に示す。表６に示すとおり、ｐＨ８．０の溶離液Ｂを用いた比較例１〜３ではＨｂＣが検出されなかった。また、浸透圧が４０ｍＯｓｍ／ｋｇを超える溶離液Ｂを用いた比較例３〜４では、ＨｂＡ０のピークショルダーにＨｂＡ２が重なり、両種のピークが十分に分離されなかった。一方、表４〜５に示すとおり、ｐＨが８．０より高く、かつ浸透圧が４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下である実施例７〜１８では、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣがそれぞれ検出された。ただし実施例１０、１１では、ＨｂＡ２の溶出がやや早くなり、ＨｂＡ０とＨｂＡ２のピークが接近する傾向がみられた（データ示さず）。これらの結果より、ｐＨ８．１以上、かつ浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の溶離液Ｂが、各種ヘモグロビンの分析に適していることが示された。【００４８】
【表４】
2019203302.tif 000006
【００４９】
【表５】
2019203302.tif 000007
【００５０】
【表６】
2019203302.tif 000008
【００５１】
（試験３）
参考例２で調製した検体Ｂ及び検体Ｄについてヘモグロビン分析を行った。グラジエントと溶離液Ｂ以外の分析条件は、試験１と同じとした。溶離液Ｂには、表７に記載のｐＨ及び浸透圧を有するリン酸ナトリウムと過塩素酸ナトリウムを含有する緩衝液を含む溶離液を用いた。なお、表７に記載の溶離液の組成は、従来のヘモグロビン分析で一般的に用いられているリン酸緩衝液を含む溶離液の組成を基にした。グラジエント条件は表８に示すとおりとした。【００５２】
分析結果を表７に示す。また比較例５〜８のクロマトグラムを図４〜７に示す。検体ＢにはＨｂＡ２が５〜７質量％程度含有されていたが、比較例５〜８では、ＨｂＡ０のピークとＨｂＡ２のピークが重なり、両種のピークが十分に分離されなかった。この結果より、ｐＨ８．０以下、浸透圧が１３０ｍＯｓｍ／ｋｇ以上であるような従来使用される溶離液では、ＨｂＡ０とＨｂＡ２を十分に検出できないことが示された。【００５３】
【表７】
2019203302.tif 000009
【００５４】
【表８】
2019203302.tif 000010
（試験４）
参考例２で調製した検体Ａ〜Ｃについて、表９に記載のリン酸緩衝液を含む溶離液Ｂを用いてヘモグロビン分析を行った。溶離液Ｂ以外の条件は試験２と同様にした。溶離液Ｂとしては、表９に記載のリン酸緩衝液を含む溶離液を用いた。【００５５】
分析結果を表９に示す。比較例９、１０では、ＨｂＡ０とＨｂＡ２とのピークの分離が十分でなく、さらにＨｂＳ及びＨｂＣのいずれか又は両方が検出されなかった。比較例１１〜１４では、ＨｂＳ及びＨｂＣは検出されたが、ＨｂＡ０とＨｂＡ２とのピークの分離が十分でなかった。比較例９〜１４の溶離液Ｂは、上述した実施例の溶離液と比べて浸透圧が高く、またｐＨもより高いか又はより低くなり、ｐＨ８．０以上、浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の条件を達成することができなかった。このことが、比較例９〜１４における不十分なヘモグロビン検出につながったと考えられた。【００５６】
【表９】
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【００５７】
（試験５）
参考例２で調製した検体Ａ〜Ｃについてヘモグロビン分析を行った。溶離液Ｂ及びグラジエント条件以外の条件は試験１と同様にした。溶離液Ｂとしては表１０に記載の溶離液を用いた。グラジエント条件は表１１のとおりとした。分析結果を表１０に示す。実施例１９及び２０の両方で、ＨｂＡ０とＨｂＡ２のピークが良好に分離され、かつＨｂＳとＨｂＣのピークも良好に分離され、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＳ及びＨｂＣを検出することができた。【００５８】
【表１０】
2019203302.tif 000012
【００５９】
【表１１】
2019203302.tif 000013
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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