(57)【要約】  メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡ、又は野生型と変異型遺伝子を検出するプライマーをＰＣＲ産物のＴｍ値が異なるように設計し、融解曲線を分析することにより、高感度かつ定量的にサンプル中のＤＮＡを検出することができる。
2019045016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲによって同一の遺伝子領域に混在する異なる遺伝子配列を検査する方法であって、
同一領域の異なる遺伝子配列を２組以上のプライマーセットを用いて同時に増幅し、
前記２組以上のプライマーセットの量比を変えて増幅することにより
サンプル中の異なる遺伝子配列の存在を定量的に検査する方法。
【請求項２】
請求項１記載の検査方法であって
融解曲線解析により、
サンプル中の異なる遺伝子配列の存在を定量的に検査する方法。
【請求項３】
請求項１、又は２記載の検査方法であって、
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡ、又は野生型と変異型遺伝子を検出するプライマーセットを混在させて定量的に検出する検査方法。
【請求項４】
一組のＰＣＲプライマーセットの少なくとも一方のプライマーにタグを付与することを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の検査方法。
【請求項５】
前記タグが、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はＬＮＡであることを特徴とする請求項４記載の検査方法。
【請求項６】
前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差を大きくするために付与するものであることを特徴とする請求項４又は５記載の検査方法。
【請求項７】
前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値を少なくとも２℃上昇させることを特徴とする請求項６記載の検査方法。
【請求項８】
同一の遺伝子領域に混在する異なる遺伝子配列の検査に用いるＰＣＲプライマーセットであって、
一組のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物が、他方のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物と比較してＴｍ値に差があることを特徴とするプライマーセット。
【請求項９】
請求項８に記載のプライマーセットが、
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡ、又は野生型と変異型遺伝子を定量的に検出するためのプライマーセットであることを特徴とするプライマーセット。
【請求項１０】
前記一組のプライマーセットにタグを付与することを特徴とする
請求項８、又は９記載のプライマーセット。
【請求項１１】
前記プライマーセットがメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するプライマーセットであり、
ＭＬＨ１、ＢＲＣＡ１、ＳＥＰＴ９、又はＴＳＰＹＬ５のプロモーター領域のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを定量的に検出するものである請求項９又は１０記載のプライマーセット。
【請求項１２】
配列番号３〜６、配列番号９〜１２、配列番号２０〜２３、又は配列番号２４〜２７で示される配列からなる請求項１１記載のプライマーセット。
【請求項１３】
請求項８〜１２いずれか１項記載のプライマーセットと
ＰＣＲ増幅試薬、及び必要な試薬を含むメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＰＣＲを用いて遺伝子増幅する際、混在する異なる配列のＤＮＡを同時に超高感度に検出するのみならず、定量的に測定するＡｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲに関する。本発明の方法は、超高感度域での定量性をもたらすＰＣＲであることから、Ｈｉｇｈｌｙ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ  （ＨｉＱＡＳＰ）と命名し、以下その名称を用いる。【０００２】
ＨｉＱＡＳＰによれば、リキッドバイオプシーや組織診断などにおいて、正常組織とがんなどの疾患組織におけるＤＮＡメチル化の差、遺伝子変異などを超高感度、かつ定量的に検査することができる。なお、ここでは、０．１％以下の割合で存在する核酸を検出することを超高感度、０．１％より高く５％以下の割合で存在する核酸を検出することを高感度と定義する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子配列の部分的な違いを明らかにすることは、先天異常やがんなどの医療分野では特に重要である。遺伝子配列の違いで引き起こされる先天異常やがんなどは、遺伝子配列を解析することによって、確定診断を行い、治療方針を立てることができる。また、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍｓ：ＳＮＰｓ）を解析することにより、特定の疾患に対する罹患のしやすさなど将来的な危険率の診断や予後診断を行うことも可能である。また、配列の違いだけではなく、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常は、がん、代謝疾患、精神・神経疾患など種々の疾患と深く関わっていることが報告されてきており、エピゲノム異常の検出も、疾患の検査において重要となっている。【０００４】
これまでに明らかになってきた遺伝子配列の違いやエピゲノム異常を臨床検査など一般に応用するためには、変異のある遺伝子領域を簡便にかつ確実に検出する技術が必須である。遺伝子配列の違いを検出するために、遺伝子配列全体を網羅的に解析する次世代シークエンス技術（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）や、特定の遺伝子領域を増幅して解析するＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの技術が開発されてきた。【０００５】
例えば、がんは、遺伝子異常を原因とする代表的な疾患である。がんにおいて遺伝子異常を明らかにする遺伝子診断は、がんを診断するだけではなく、治療において分子標的薬の効果を判別するためには欠くことができない。がんの遺伝子診断は、がん組織の手術標本、あるいは生検組織を用いて行われていた。近年、手術や生検によって得られる組織サンプルに代えて、末梢血や尿などの体液サンプルを用いたリキッドバイオプシーによる検査が開発され、臨床でも使用されるようになってきた（非特許文献１）。【０００６】
リキッドバイオプシーは、体液サンプル中に含まれるがん由来のＤＮＡである循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ：ｃｔＤＮＡ）、エキソーム中のがんマーカー、あるいは、末梢血に含まれる血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ:ＣＴＣ）と呼ばれるがん細胞を検出することにより、がんの確定診断や予後予測、治療方法の選択を行う方法である。従来からがん患者の体液サンプルで特異的に増加しているタンパク質などを腫瘍マーカーとして使用しているが、これらと比較して、ｃｔＤＮＡの遺伝子配列解析によって得られるがん細胞の遺伝子変化の情報は、特異性が高く、得られる情報量が多い。【０００７】
ｃｔＤＮＡの検出により、がん細胞の遺伝子変異を検出することができれば、分子標的薬の使用など適切な治療を行うことができる。がん細胞に生じている遺伝子変異が特定の分子標的薬の効果を左右するものであれば、従来は腫瘍組織で行われていたコンパニオン診断がリキッドバイオプシーでも行うことができる。実際に、肺がんにおける上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）の変異を血漿中で検出するキットは、保険収載されており、コンパニオン診断薬として用いられている。【０００８】
また、分子標的薬による治療を続けていると、治療に伴いがん細胞に新たな変異が生じ、耐性となる場合がある。リキッドバイオプシーにより、経時的に新たな遺伝子変異を検査することができれば、耐性を速やかに検出し、治療方法を変えることも可能となる。リキッドバイオプシーであれば、組織を採取して行う従来の生検に比べ、患者の負担が少ないことから、繰り返し検査を行うことができる。【０００９】
しかしながら、リキッドバイオプシーに用いる体液サンプル中には、がん細胞だけではなく、正常細胞に由来する核酸やエキソームが多量に混在している。そのため、がん細胞の遺伝子変異を感度良く検出する技術が必要である。【００１０】
また、がんの診断、治療への応用に関していえば、遺伝子変異だけではなく、遺伝子配列の変化を伴わないエピゲノム異常もがん化の原因として重要である（非特許文献２、３）。特に、がん関連遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドに生じている高メチル化など、異常なＤＮＡメチル化情報を得ることができれば、がんの早期診断、予後判定など様々な応用が期待できる。【００１１】
ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域のことであり、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。ＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化は、がん抑制遺伝子の不活化などを通じて発がんに関与することが知られており、ＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進の程度によってがんを層別化できることが報告されている（非特許文献４）。しかし、リキッドバイオプシーサンプルには、がん細胞だけではなく正常細胞が多数含まれていることから、混在するがん細胞のＤＮＡメチル化情報を得るためには非常に高感度の検出方法が必要である。また、治療経過に伴って、疾患の状態の変化を検査するためには、定量的な検査結果を得る必要がある。【００１２】
高感度で定量的、かつ簡便な検査方法が確立すれば、リキッドバイオプシーサンプルによって、人間ドック、集団検診などにおけるがんの早期発見や、遺伝性腫瘍のサーベイなどを行うことができる。また、がん切除後の再発モニターやコンパニオン診断に使用することができる。また、上述のように、遺伝子配列の部分的な違いを明らかにすることは、先天異常やがんなどの医療分野で有用であるにとどまらず、種々の分野において重要である。例えば、遺伝子配列の違いを高感度かつ定量的に検出することは、犯罪捜査におけるＤＮＡ鑑定、農作物の有用遺伝子同定、産地同定、遺伝子改変作物（ＧＭＯ）由来の食品材料の使用、特定原材料（アレルゲン）検査など、多方面にわたって応用可能な技術となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Wan, J.C.M. et al., 2017, Nat. Rev.Cancer, Vol. 17(4), p.223-238.
【非特許文献２】Dawson, M. A., 2017, Science, Vol.355 (6330）,p.1147-1152.
【非特許文献３】Garraway, L. A. & Lander, E. S., 2013, Cell, Vol.153 (1), p.17-37.
【非特許文献４】Issa, J.-P., 2004, Nat. Rev. Cancer, Vol.4, p.988-993.
【非特許文献５】Herman, J. G. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, p.9821-9826.
【非特許文献６】Sadri, R. & Hornsby, P. J., 1996, Nucleic Acids Res., Vol.24, p.5058-5059.
【非特許文献７】Xiong, Z. & Laird, P. W., 1997, Nucleic Acids Res., Vol.25, p.2532-2534.
【非特許文献８】Ronaghi, M. et al., 1998, Science, Vol.281, p.363-365.
【非特許文献９】Ronaghi, M., 2001, Genome Res., Vol.11, p.3-11.
【非特許文献１０】Huang, W-Y. et al., 2015, Nuc. Acid Res., Vol.43, D857-D861., doi:10.1096/narlgku1151
【非特許文献１１】Gevaert, O. et al., 2015, Genome Biology, 16:17, DOI 10.1186/ｓ13059-014-0579-8
【非特許文献１２】Neidhart, M., 2016. “DNA METHYLATION AND COMPLEX HUMAN DISEASE”, ELSEVIER, p.9-22.
【非特許文献１３】Lofton-Day, C. et al., 2008, Clinincal Chemistry, Vol.54:2, p.414-423.
【非特許文献１４】Grutzmann, R. et al., 2008, PLoS ONE, Vol.3, Issue 11, e3759
【非特許文献１５】Provenzale D,et al., 2016, J. Natl. Compr. Canc. Netw. vol.14 (8), p.1010-1030.
【非特許文献１６】Dong A., et al., 2016, J. Cancer, Vol. 7 (11), p.1441-1451.
【非特許文献１７】Joosse, S. A. etal., 2010, Genes Chromosomes Cancer, Vol. 50 (2), p.71-81.
【非特許文献１８】Turner, N., et al., 2004, Nat. Rev. Cancer, Vol. 4 (10), p.814-819.
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５７８６１４６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述のように、様々な分野で高感度、かつ定量的に遺伝子配列を解析する方法が求められているものの、ＮＧＳなどのシークエンスによる方法は、時間と費用がかかることから、より簡便な検査方法の開発が望まれている。そのため、よりシンプルなＰＣＲを用いた検査方法の開発が望まれている。しかしながら、ＰＣＲを用いた方法に関しても、簡便・安価であり、かつ高感度域において精度良く定量的な方法は未だに開発されていない。【００１６】
通常のリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの安価なインターカレーターを使用したｑＰＣＲは、安価で簡便な定量的ＰＣＲが可能である。しかし、ダイナミックレンジが広く、桁単位の定量に向いているものの精度よく定量をすることができない。臨床検査の現場などでは、高感度であり、かつ数倍の違いも検出することができるような精度が求められる。【００１７】
例えば、ＤＮＡのメチル化異常に限っても、ＤＮＡメチル化異常が、がん化に深く関与していることが明らかにされてきているにもかかわらず、ＤＮＡメチル化異常を検出する方法が、がんの検査方法として臨床で広く使用されているわけではない。【００１８】
メチル化ＤＮＡの解析方法として、亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、バイサルファイト）反応を利用し、チミンに置き換わって増幅される非メチル化シトシンと、シトシンのまま増幅されるメチル化シトシンとの違いをＰＣＲで検出する方法が開発されている。このような方法には、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ（ＭＳＰ）法（特許文献１、非特許文献５、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法（非特許文献６、７）がある。【００１９】
ＭＳＰ法およびＣＯＢＲＡ法は、特別な装置なしにメチル化ＤＮＡの定量的な解析ができるという点で、現在でも広く使用されるメチル化ＤＮＡ解析方法である。しかし、解析に電気泳動法を利用する点と、ＣＯＢＲＡ法ではさらに制限酵素処理を必要とする点で、手間と時間がかかり、かつＰＣＲ産物を拡散してクロスコンタミネーションを引き起こすリスクがあるという問題がある。【００２０】
他のメチル化ＤＮＡ解析方法として、パイロシークエンシングがある（非特許文献８、９）。この方法は、バイサルファイト処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をパイロシークエンシングにかけ、チミンに置き換わったメチル化シトシンを検出する方法である。しかし、パイロシークエンシングは、専用のシークエンサーを必要とし、塩基を１つずつ読んでいく方法であるため、解析に時間がかかるという問題がある。【００２１】
一塩基の変異をＰＣＲによって高感度で簡便・安価でかつ精度良く定量的に検査する方法は今までのところ開発されていない。一般に、異なる遺伝子を同一チューブ内で定量的に解析する場合には、競合ＰＣＲ解析を行えば良い。同じ領域内の遺伝子情報の違いを検出する場合には、ＰＣＲプライマー内にその配列の違いを認識する部分が含まれるように設計し、異なる遺伝子配列を一度に競合させながら増幅する競合ＰＣＲを行う。しかしながら、リキッドバイオプシーサンプル中に含まれるがん細胞由来の配列など、一方の配列が極端に少ないことが予想されるサンプルでは、高感度なＰＣＲ増幅が求められるために、定量性がないという問題が生じていた。【００２２】
ＰＣＲを用いて遺伝子配列やＤＮＡメチル化などのエピゲノム情報の違う遺伝子を同一チューブ内で増幅し、その後にシークエンシングや電気泳動を行うことなく解析することができれば、非常に簡便な検査方法となり、検査の普及の点からも望ましい。しかしながら、今までに同じ領域内の遺伝子配列の違いやＤＮＡメチル化などのエピゲノム情報の違う遺伝子を同一チューブ内でＰＣＲにより増幅し、高感度域から超高感度域にかけて、精度良く定量的に解析する手法はなかった。ＰＣＲにより、同一領域の異なる遺伝子を増幅し、増幅したＤＮＡを分離し定量的な解析を行うことができれば、非常に簡便な方法とすることができる。【００２３】
最近開発された技術であるデジタルＰＣＲは、簡便に高感度域において精度よく定量性をもたらす。しかし、デジタルＰＣＲは高価な専用機器、高価なランニングコストが必要である。これに対し、ＨｉＱＡＳＰは一般に普及しているリアルタイムＰＣＲ機器が使えるだけではなく、高額な蛍光プローブを使用せずに高感度で精度よく定量アッセイを実施可能である。そのため、臨床検査など広く一般で使用することができる。また、プライマー比率を変えるというシンプルな方法により、求めたい感度に合わせて、高精度な定量性をもたらす条件を設定できるという利点がある。【００２４】
本発明は、超高感度に遺伝子情報の違いを検出するだけではなく、精度良く定量的に検出することの可能なＰＣＲ法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、以下の高感度かつ定量的に遺伝子配列を検査する方法、及びこれに用いるプライマーセット、検査キットに関する。
（１）ＰＣＲによって同一の遺伝子領域に混在する異なる遺伝子配列を検査する方法であって、同一領域の異なる遺伝子配列を２組以上のプライマーセットを用いて同時に増幅し、前記２組以上のプライマーセットの量比を変えて増幅することによりサンプル中の異なる遺伝子配列の存在を定量的に検査する方法。
（２）（１）記載の検査方法であって融解曲線解析により、サンプル中の異なる遺伝子配列の存在を定量的に検査する方法。
（３）（１）、又は（２）記載の検査方法であって、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡ、又は野生型と変異型遺伝子を検出するプライマーセットを混在させて定量的に検出する検査方法。
（４）一組のＰＣＲプライマーセットの少なくとも一方のプライマーにタグを付与することを特徴とする（１）〜（３）いずれか１つ記載の検査方法。
（５）前記タグが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はＬＮＡであることを特徴とする（４）記載の検査方法。
（６）前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差を大きくするために付与するものであることを特徴とする（４）又は（５）記載の検査方法。
（７）前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値を少なくとも２℃上昇させることを特徴とする（６）記載の検査方法。
（８）同一の遺伝子領域に混在する異なる遺伝子配列の検査に用いるＰＣＲプライマーセットであって、一組のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物が、他方のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物と比較してＴｍ値に差があることを特徴とするプライマーセット。
（９）（８）に記載のプライマーセットが、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡ、又は野生型と変異型遺伝子を定量的に検出するためのプライマーセットであることを特徴とするプライマーセット。
（１０）前記一組のプライマーセットにタグを付与することを特徴とする（８）、又は（９）記載のプライマーセット。
（１１）前記プライマーセットがメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するプライマーセットであり、ＭＬＨ１、ＢＲＣＡ１、ＳＥＰＴ９、又はＴＳＰＹＬ５のプロモーター領域のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを定量的に検出するものである（９）又は（１０）記載のプライマーセット。
（１２）配列番号３〜６、配列番号９〜１２、配列番号２０〜２３、又は配列番号２４〜２７で示される配列からなる（１１）記載のプライマーセット。
（１３）（８）〜（１２）いずれか１つ記載のプライマーセット、ＰＣＲ増幅試薬、及び必要な試薬を含むメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するキット。
【発明の効果】
【００２６】
遺伝子配列の違いやエピゲノム異常を高感度で定量的に解析することが可能となる。特に、がん組織やリキッドバイオプシーサンプルに、正常な遺伝子と共に微量に混在する遺伝子変異やエピゲノム異常を定量的に高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＭＬＨ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型非メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。
【図２】ＭＬＨ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。
【図３】ＭＬＨ１プロモーター領域解析においてプライマーの比率による定量可能な領域を示す図。図３（Ａ）は、図１で示した融解曲線解析から求めた検量線を、図３（Ｂ）は、図２で示した融解曲線解析から求めた検量線を示す。
【図４】ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型非メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。
【図５】ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型非メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。
【図６】ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。
【図７】ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析においてプライマーの比率による定量可能な領域を示す図。図７（Ａ）は、図４で示した融解曲線解析から求めた検量線を、図７（Ｂ）は、図５で示した融解曲線解析から求めた検量線を、図７（Ｃ）は、図６で示した融解曲線解析から求めた検量線を示す。
【図８】プライマーに付与するタグの長さによるＴｍ値の変化を検討した図。
【図９】大腸がん、乳がんＤＮＡにおけるＳＥＰＴ９のメチレーションの検出結果を示す図。
【図１０】大腸がん、乳がんＤＮＡにおけるＴＳＰＹＬ５のメチレーションの検出結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、主としてがん細胞のエピゲノム異常のうちＤＮＡメチル化異常を検出する方法について記載するが、がん細胞における塩基の挿入欠失変異（indel）、点突然変異、ＳＮＰｓなどの一塩基の遺伝子多型なども同様に感度良く検出することができることは言うまでもない。また、上述のように、種々のＤＮＡ鑑定、農業分野での遺伝子改変作物やアレルゲンの検査など、配列の異なる遺伝子が混在しているサンプルにおいて、定量的かつ高感度に遺伝子の検出を行うことができる。
【００２９】
がんにおいてＤＮＡメチル化異常が報告されている遺伝子としては、ＭｅｔｈＨＣ（Ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔｈｈｃ．ｍｂｃ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／ｐｈｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）に挙げられている遺伝子など、多数の遺伝子が報告されている（例えば、非特許文献１０〜１２）。これらの遺伝子におけるＤＮＡメチル化異常は、ＨｉＱＡＳＰによって検査することによって、がんを検出することが可能となる。
【００３０】
さらに、ＳＥＰＴ９は、大腸がんに特異的にメチレーションが報告されており（非特許文献１３、１４）、血液中のＳＥＰＴ９ＤＮＡのメチレーションを検出する診断薬が販売されている。また、ＴＡＣ１、ＥＹＡ４、ＴＭＥＦＦ２、ＮＧＦＲ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＴＳＰＹＬ５などの遺伝子も、大腸がんでメチル化されているとの報告がある。これらの遺伝子でも、メチレーションを検出することにより、大腸がんを特異的に検出することが可能となる。
【００３１】
また、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）など分子標的薬によって治療に抵抗性を有する変異が生じた場合の検出にも応用することができる。
【００３２】
ＨｉＱＡＳＰは、異なる遺伝子配列を２組以上のプライマーセットによって、塩基組成、あるいは鎖長が異なるＰＣＲ産物として増幅する際に、プライマーの比率を変えることによって、定量的な解析を行う方法である。ここでは、Ｔｍ値が異なるＰＣＲ産物として増幅し、融解曲線解析により定量を行う方法を主として説明するが、増幅したＰＣＲ産物を核酸分析用のカラムで分離するクロマトグラフィーによって解析したり、電気泳動によって分離解析することも可能である。
【００３３】
Ｔｍ値（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｅｕｒｅ）とは、二重鎖核酸が加熱により融解する際、５０％が乖離する温度として定義される。増幅したＰＣＲ産物のＴｍ値が異なれば融解曲線解析によって、ＰＣＲ産物を定量的に解析することができる。したがって、融解曲線解析を行うことのできるＰＣＲ機器であればどのような機器を用いてもよい。例えば、リアルタイムＰＣＲ機器に付属している融解曲線解析ソフトを利用し、増幅されたＰＣＲ産物の存在比を定量することができる。リアルタイムＰＣＲ機器に付属している融解曲線解析ソフトであればどのようなソフトを使用してもよい。実施例で示すように、本方法では、得られたＰＣＲ産物を融解曲線解析するだけでよく、その後に電気泳動、シークエンスなどによる解析を必要としないため、簡便であるだけではなく、コンタミネーションのリスクがないという長所がある。
【００３４】
以下に示す高感度定量的ＰＣＲ法は、プライマー比を変えてＰＣＲを行うことにより、至適な定量範囲を調節することが可能となる。したがって、数％の量的な差であっても検出することができる。ダイナミックレンジが広く、大きな違いを広い範囲で定量できるリアルタイム定量ＰＣＲ法と比較すると小さな差であっても検出することが可能となる。また、従来の競合ＰＣＲ法と比較すると、高感度領域で定量性をもたらすことができる。
【００３５】
また、デジタルＰＣＲ法は、定量的かつ高感度な検出方法ではあるものの、目的外のＰＣＲ産物が生成されている場合を検知することができない。ＨｉＱＡＳＰは、融解曲線解析によってＴｍ値の違う産物を検出することから、目的外のＰＣＲ産物の生成を検知することができる。したがって、得られた結果が正確であるか否かの確認を行うことができる。組織から得たＤＮＡ、あるいはリキッドバイオプシーサンプルには、種々のものが夾雑物として含まれている可能性が高い。そのため、得られた結果が対象の変異を反映したものであるかを検証できることは重要である。また、特異性を上げるためにインターナルプローブを用いる必要がないことから、付加的にコストの必要がないという利点がある。
【００３６】
１．ＤＮＡ抽出方法
本実施例ではモデル実験としてプラスミドに組み込んだＤＮＡを鋳型として用いているが、実際は、血液、組織などの臨床検体、農産物等あらゆるものから抽出した核酸を対象とすることができる。以下に、血液サンプルによるリキッドバイオプシーを想定したＤＮＡ抽出法を記載するが、生検組織サンプル、他の試料であってもこれに準じて精製し解析を行うことができる。
【００３７】
新鮮なＥＤＴＡ採血検体をＮｕｃｌｅｏＳｎａｐ（商標）ＤＮＡ  Ｐｌａｓｍａ  キット（マッハライ・ナーゲル社）、ＥＺ１  ｃｃｆＤＮＡ  キット（キアゲン株式会社）、ＭａｇＭＡＸ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して、末梢血循環ＤＮＡ（Ｃｅｌｌ  ｆｒｅｅ  ＤＮＡ；  ｃｆＤＮＡ）を抽出精製した。なお、上記キットは例示であり、同様のキットであればどのようなキットを使用してもよい。
【００３８】
２．ＰＣＲ
融解曲線解析のためのＰＣＲ機器には、ここではＳｔｅｐＯｎｅ＆ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用しているが、同様の機器であればどのような機器を用いても解析することができる。そのような機器として、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０システム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）がある。すでに広く普及している機器を使用することができることは、本検査方法のメリットである。
【００３９】
ＰＣＲ増幅に用いる試薬としては、ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ（商標）ＨＲＭ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ｌｕｍｉｎａｒｉｓ  Ｃｏｌｏｒ  ＨＲＭ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（以上、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、ＫＡＰＡ  ＨＲＭ  ＦＡＳＴ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）、ＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）等を使用することができる。
【００４０】
以下の実施例では、増幅する２組のＰＣＲ産物のＴｍ値の差を広げるために、一組のプライマーセットのプライマーにタグを付与している。タグはＦｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅどちらのプライマーに付与してもよく、また、場合によっては両者に付与してもよい。
【００４１】
付与するタグは、Ｔｍ値に差が生じればよく、標的核酸とのハイブリダイズを阻害しなければどのようなものを用いてもよい。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ヌクレオチドアナログを使用したＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）などを用いることができる。また、増幅される２種のＰＣＲ産物の配列のＴｍ値が大きく異なり、融解曲線解析によって分離することが可能であれば、タグを付与せずにプライマーを設計することもできる。
【００４２】
増幅するＰＣＲ産物のＴｍ値は、融解曲線解析においてピーク分離が可能であることが必須であるが、少なくとも２℃以上、好ましくは３℃以上、より好ましくは５℃以上の差があることが好ましい。また、融解曲線解析でのピーク形状や必要な感度によっては、６℃以上、より好ましくは７℃以上の差があることが好ましい。
【００４３】
３．ＤＮＡメチル化の検出方法
ＤＮＡのメチル化異常をＰＣＲで検出するためには、上述のように、ＤＮＡをバイサルファイト（亜硫酸水素ナトリウム）処理して塩基置換を利用する方法を用いるのがよい。バイサルファイト処理を行うと、ＤＮＡでは、一般にシトシン塩基（Ｃ）がチミン塩基に変換されるが、５位の炭素のメチル化修飾されたシトシン塩基は変換されないため、正常と異常のメチル化ＤＮＡでは遺伝子配列に違いを生じる。
【００４４】
バイサルファイト処理は、精製後のＤＮＡを、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  キット（キアゲン株式会社）、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎキット（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  社）、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）Ｘｃｅｅｄ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  キット（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ社）等を使用してＣのバイサルファイト変換を行う。ＤＮＡ配列内のＣがメチル化されていなければ脱アミノ化によりウラシル（Ｕ）塩基に変換され、Ｃの５位がメチル化されていれば、Ｕへの変換が生じない。この後のＰＣＲにより、Ｕの位置はチミン塩基（Ｔ）に置き換わるため、ＣからＴへの変換が観察される。
【００４５】
ＤＮＡメチル化異常はＣｐＧ配列の存在する広範な領域で生じることが多い。したがって、通常周辺のＣｐＧ配列が同時に異常をきたすため、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅの双方のプライマーをＤＮＡメチル化異常が生じている配列上に設定することができる。その結果、０．０１％以下で混在する異常メチル化ＤＮＡを検出することが可能である。したがって、ＤＮＡメチル化異常は点突然変異などの遺伝子変異と比較して、非常に感度良く定量することができる。一般に、プライマーの３’側から１〜数塩基の位置に、塩基配列の異なる部分が含まれるようにプライマーを設計すると感度良く異なる配列を検出することができる。
【００４６】
４．実施例
以下、実施例を示しながら、さらに詳細に説明するが、実施例に示した変異に限らず、上述のように種々の変異を検出できることは言うまでもない。
【００４７】
［実施例１］ＭＬＨ１プロモーター領域の解析
ＭＬＨ１は、ミスマッチ修復系で働く一群のタンパク質の１つであり、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２とともに、リンチ症候群の原因遺伝子として同定されている。リンチ症候群は遺伝性腫瘍の一つであり、患者は大腸がんや子宮内膜がんなどが好発することが知られている（非特許文献１５）。リンチ症候群の患者では、ＭＬＨ１遺伝子の生殖細胞系列変異が認められる。一方、散発性の大腸癌では約５−１０％でＭＬＨ１遺伝子の異常が認められるが、これは後天的にプロモーター領域の異常メチル化が生じており、両者を鑑別することは臨床的にも重要である。
【００４８】
ＭＬＨ１プロモーター領域の異常メチル化は、リンチ症候群と関連があることから、詳細に解析されている。そこでＭＬＨ１プロモーター領域の高メチル化が生じる領域を鋳型として合成した。重亜硫酸処理を行うとメチル化シトシンはシトシンのままであるのに対し、非メチル化シトシンはウラシルに変換されＰＣＲ段階でさらにチミンに置き換わって増幅される。そこで、メチル化／非メチル化を実験的に解析するための鋳型配列として、非メチル化配列は、シトシンをチミンに代えた配列を鋳型としてオリゴＤＮＡを合成した。
【００４９】
オリゴＤＮＡは相補鎖も合わせて合成し、２重鎖を作製した後にプラスミドに組込んで大腸菌にトランスフォーメーションし、シーケンスにより配列を確認のうえ、プラスミドＤＮＡを鋳型として下記実験に用いている。また、プラスミドを増幅するプライマーセットは下記の配列のプライマーを用いた。
【００５０】
（ａ）人工遺伝子鋳型
非メチル化用鋳型配列（配列番号１、Ｌ１＿１６２ｎｔ＿Ｕｍ）、メチル化用鋳型配列（配列番号２、Ｌ１＿１６２ｎｔ＿Ｍｅｔ）として、プロモーター領域（ＮＧ＿００７１０９．２、４，８６０〜５，０２１位）の各１６２ｎｔを別々に人工遺伝子として作成し、種々の比率で混在させたものを増幅の鋳型として用いた。メチル化用鋳型配列、非メチル化用鋳型配列ともに、重亜硫酸処理によってシトシンからチミンに置き換わる配列はすべて置き換えて人工遺伝子を作成している。また、以下の遺伝子配列はすべて５´から３´の方向に記載している。
【００５１】
非メチル化用鋳型配列：ＧＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号１）
メチル化用鋳型配列：ＧＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＡＣＧＣＧＴＡＡＧＣＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＡＧＣＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＣＧＴＴＴＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号２）
【００５２】
また、非メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号３、４）、メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号５、６）を合成した。メチル化配列検出用のＦｏｒｗａｒｄプライマーにはタグ配列を付加し、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差が広がるようにデザインした。
【００５３】
（ｂ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｌ１＿Ｕ＿Ｆ１：ＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴ（配列番号３）
Ｌ１＿Ｕ＿Ｒ３：ＴＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＡＡＣＡ（配列番号４）
（ｃ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ１：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号５）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｒ３：ＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＡＡＣＧ（配列番号６）
【００５４】
なお、プライマーセットにおいてＦはＦｏｒｗａｒｄ、ＲはＲｅｖｅｒｓｅプライマーであることを示す。また、Ｕは非メチル化配列を、Ｍはメチル化配列を検出するプライマーであることを示す。また、小文字はタグ配列を示す。
【００５５】
Ｌ１＿Ｕ＿Ｆ１とＬ１＿Ｕ＿Ｒ３を等量混和したプライマーセットを非メチル化配列検出プライマーセット（ＭＬＨ１のＦＲ＿Ｕ）、Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ１とＬ１＿Ｍ＿Ｒ３を等量混和したプライマーセットをメチル化配列検出プライマーセット（ＭＬＨ１のＦＲ＿Ｍ）として解析に用いた。各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡはＮＧ＿００７１０９．２の４，９１４〜５，００５位、メチル化ＤＮＡは４，９１８〜５００２位までのプロモーター領域を増幅することになる。
【００５６】
非メチル化、メチル化ＤＮＡを検出するプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅ合わせて一定の濃度になるように調整した。非メチル化ＤＮＡ検出プライマー対メチル化ＤＮＡ検出プライマーの量比を変えてＰＣＲを行い解析した。異なる量比で増幅した場合も、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅ各プライマー濃度は各々平均０．１５μＭずつ、すなわち4種類のプライマー濃度が合計０．６μＭになるようにして解析を行っている。
【００５７】
ＰＣＲ試薬はＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ（商標）ＨＲＭ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＰＣＲ機器は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。ＰＣＲ条件及び融解曲線解析条件は下記のとおりである。なお、ＰＣＲ増幅直後、自動的に融解曲線解析を行っている。
【００５８】
ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１０秒→５９℃、２５秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６５℃１分から８５℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ  ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。
【００５９】
図１は、非メチル化（ＦＲ＿Ｕ）、メチル化検出用プライマーセット（ＦＲ＿Ｍ）の混合比を７：１、５：１、３：１に、鋳型ＤＮＡの非メチル化配列用ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えたもの、図２は、ＦＲ＿Ｕ、ＦＲ＿Ｍの混合比を１：３、１：２、１：１、鋳型ＤＮＡのメチル化配列用ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えてＰＣＲ増幅を行い、融解曲線解析を行った結果を示す。Ｘ軸は温度、Ｙ軸はＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ（−Ｒ’）値を示す。デュプリケートで行った解析結果を示している。
【００６０】
なお、鋳型の混合比率は各鋳型ＤＮＡが１ウェルあたり表１の分子数で含まれていることを示す。プライマーの混合比を変えてＰＣＲを行うことにより、図１及び図２に示すように、１ウェルあたり５分子の遺伝子が存在すれば、定量的に検出可能であり、絶対定量的にも非常に高感度な検出方法であるといえる。
【００６１】
【表１】
2019045016.tif 000003
【００６２】
図３には、上記融解曲線解析の結果を、非メチル化、メチル化ＰＣＲ産物を数値化し、定量性があるかを解析した結果である。図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ図１、２の融解曲線解析の結果をプロットした図である。７８℃付近のピークの最大値をメチル化ＤＮＡの、７１℃付近のピークの最大値を非メチル化ＤＮＡのＰＣＲ産物の値とし、メチル化、非メチル化ＰＣＲ産物のＴｍ値の間で融解曲線が安定して水平性を示す温度である７４℃をバックグラウンドとして差し引き、メチル化、非メチル化両ピークのＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ（−Ｒ’）値を合計した数値を１００％とし、鋳型ＤＮＡ濃度との相関を示したものである。デュプリケートで行った解析結果を１つにまとめ、近似曲線はデュプリケートの結果の平均値を求めて作成した。
【００６３】
Ｒ２はすべて０．９５以上であり、鋳型濃度と非常に良く相関しており、定量的な解析であることを示している。特に非メチル化用鋳型配列ＤＮＡにおいて、プライマー比７：１のデータ（図１参照）とメチル化用鋳型配列ＤＮＡにおいて、プライマー比１：３のデータ（図２参照）ではどちらも少ない方の鋳型ＤＮＡが０．００１％と非常に僅かしか含まれない場合であっても、プライマーの比を変えることにより、定量性良く検出できることが確認できた。
【００６４】
図３に示すように、本発明者らは、プライマー比を最適にすることで超高感度域での定量性を持たせることが可能となることを見出した。また、ＨｉＱＡＳＰは、融解曲線解析を用いることにより、ＰＣＲ産物を取り出すことなく同じ機器に設置したまま自動的に解析し定量することができるので、簡便・安価・迅速な方法である。
【００６５】
［実施例２］ＢＲＣＡ１プロモーター領域の解析
ＢＲＣＡ１はがん抑制遺伝子の１つであり、家族性乳がん原因遺伝子として同定された遺伝子である。遺伝子不安定性を生じ、乳がんや卵巣がんを引き起こすことが知られている。散発性の乳がんではＢＲＣＡ１に変異が見られることは少なく、ＢＲＣＡ１遺伝子のプロモーター領域の高メチル化によるＢＲＣＡ１タンパク質の発現減少が起こることが知られている（非特許文献１６〜１８）。最近、分子標的薬であるＰＡＲＰ阻害薬のコンパニオン診断としてＢＲＣＡ１の遺伝子検査が注目されている。ＢＲＣＡ１の機能不全の診断として生殖細胞系列の病的変異のみならずプロモーター領域のメチル化症例までＰＡＲＰ阻害薬の適応が拡大すれば、臨床的な意義は大きい。
【００６６】
実施例１と同様に、非メチル化配列は、シトシンをチミンに代えた配列を鋳型としてオリゴＤＮＡを合成した。実施例１と同様にして相補鎖を合成のうえ、プラスミドに組込んで配列をシーケンスにより確認の後、鋳型として用いた。
【００６７】
（ａ）人工遺伝子鋳型
非メチル化用鋳型配列（配列番号７、Ｂ１＿１５７ｎｔ＿Ｕｍ）、メチル化用鋳型配列（配列番号８、Ｂ１＿１５７ｎｔ＿Ｍｅｔ）として、プロモーター領域（ＮＧ＿００００５９０５．２の９２，５０８〜９２，６６４位）の各１５７ｎｔを合成し、種々の比率で混在させたものを増幅の鋳型として用いた。
【００６８】
非メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号９、１０）、メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号１１、１２）を合成した。メチル化配列検出用のＦｏｒｗａｒｄプライマーにはタグ配列を付与し、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差が広がるようにデザインした。
【００６９】
非メチル化用鋳型配列：ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴ（配列番号７）
メチル化用鋳型配列：ＧＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＧＣＧＧＧＡＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＣＧＡＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＧＡＧＴＴＣＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴ（配列番号８）
（ｂ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｂ１＿Ｕ＿Ｆ４：ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴ（配列番号９）
Ｂ１＿Ｕ＿Ｒ２：ＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＣＡ（配列番号１０）
（ｃ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｂ１＿Ｍ＿Ｆ４：ｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＡＡＣ（配列番号１１）
Ｂ１＿Ｍ＿Ｒ４：ＡＡＴＣＴＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＧ（配列番号１２）
【００７０】
各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡはＮＧ＿００５９０９．２の９２，５４４〜９２，６３０位、メチル化ＤＮＡは９２，５４７〜９２，６２８位までのプロモーター領域を増幅することになる。なお、実施例１と同様に小文字はタグ配列を示す。
【００７１】
実施例１と同様に、非メチル化、メチル化ＤＮＡを検出するプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅ合わせて一定の濃度になるように調整した。非メチル化ＤＮＡ検出プライマー、メチル化ＤＮＡ検出プライマーの量比を変えてＰＣＲを行い解析した。図４、及び図６に示す結果は、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー濃度は、いずれの比率で混合した場合でも、合わせて平均０．１５μＭになるようにして、図５に示す結果は０．２２５μＭになるようにして解析を行っている。
【００７２】
図４、及び図６に示す結果は、実施例１と同様のＰＣＲ条件を用いて得られた。図５に示す結果は、以下のＰＣＲ条件を用いて解析した結果である。
ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→６１℃、２５秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６８℃１分から８５℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ  ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。
【００７３】
図４は、非メチル化（ＦＲ＿Ｕ）、メチル化検出用プライマーセット（ＦＲ＿Ｍ）の混合比を６：１、４：１、３：１に、図５は、混合比を１０：１、７：１、３：１にし、鋳型ＤＮＡの非メチル化ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えたもの、図６は、ＦＲ＿Ｕ、ＦＲ＿Ｍの混合比を１：２、１：１、２：１、鋳型ＤＮＡのメチル化ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えてＰＣＲ増幅を行い、融解曲線解析を行った結果を示す。デュプリケートで行った解析結果を示している。
【００７４】
図７は、実施例１と同様にして、融解曲線解析の結果を、非メチル化、メチル化ＰＣＲ産物を数値化し、定量性があるかを解析した結果である。図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ図４、５、６の融解曲線解析の結果をプロットした図である。なお、８１℃付近のピークの最大値をメチル化ＤＮＡの、７１．５℃付近のピークの最大値を非メチル化ＤＮＡのＰＣＲ産物の値とし、メチル化、非メチル化ＰＣＲ産物のＴｍ値の間で安定した水平性を示す温度である７４℃の値をバックグラウンドとして差し引いている。Ｒ２は全て０．９０以上であり、３グラフを除くと０．９５以上を示し、鋳型濃度と非常に相関を示しており、定量的な解析であることを示している。また、鋳型ＤＮＡとして非メチル化配列を用いた場合にはプライマー比率１０：１（ＦＲ＿Ｕ：ＦＲ＿Ｍ）、メチル化配列を用いた場合にはプライマー比率１：２で０．００１％と非常に僅かしか含まれない鋳型ＤＮＡを定量的に検出することができた。
【００７５】
［実施例３］ＰＣＲプライマーの検討
ＰＣＲプライマーによって、同一領域であってもＴｍ値が異なるＰＣＲ産物を増幅し分離することができる。そこで、Ｔｍ値とピークの分離について検討を行った。メチル化検出用Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにタグを付与することによりＴｍ値が大きく異なる産物が増幅されるように設計した。ここでは、タグはメチル化検出用Ｆｏｒｗａｒｄプライマーに付与しているが、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーに付与してもよい。以下に示す配列番号１３から１９までのＰＣＲプライマーは、タグの長さを長くすることによって、メチル化検出用鋳型ＤＮＡから増幅されるＰＣＲ産物のＴｍ値が高くなるように設計している。小文字はタグ配列であることを示す。プライマーは以下の配列を用いた。
【００７６】
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ２：ｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１３）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ３：ｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１４）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ４：ｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１５）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ５：ｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１６）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ１：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号５）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ６：ｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧ（配列番号１７）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ７：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧ（配列番号１８）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ８：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧＡ（配列番号１９）
【００７７】
また、非メチル化検出用Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは、Ｌ１＿Ｕ＿Ｆ１（配列番号３）、ＲｅｖｅｒｓｅプライマーはＬ１＿Ｕ＿Ｒ３（配列番号４）、メチル化検出用Ｒｉｖｅｒｓｅプライマーは、Ｌ１＿Ｍ＿Ｒ３（配列番号６）を用いた。
【００７８】
メチル化検出用鋳型ＤＮＡは、細胞株ＨＣＴ１１６由来のＤＮＡであるＥｐｉＳｃｏｐｅ（商標）Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＨＣＴ１１６  ｇＤＮＡとＥｐｉＳｃｏｐｅ（商標）Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＨＣＴ１１６  ＤＫＯ  ｇＤＮＡ（タカラバイオ社）をそれぞれバイサルファイト処理したＤＮＡを等量混和して用いた。プライマーの比率は１：１で実施例１と同じ条件でＰＣＲを行った。結果を図８に示す。
【００７９】
実施例３で用いた鋳型ＤＮＡは細胞株由来のＤＮＡなので、臨床材料のようにヒトゲノムの他領域の配列が入っている。したがって、リキッドバイオプシーなどの臨床材料と非常に近い条件での解析である。他領域のＤＮＡが多量に含まれていても、明瞭にメチル化、非メチル化を区別して検出することができることを示している。
【００８０】
Ｔｍ値の差が３．８℃（図８、Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ２プライマー）と近接していてもメチル化、非メチル化双方のピークが分離しており、比率を計算することが可能である。融解曲線のピーク形状がよりシャープな場合には、２℃程度の差であっても区別することが十分に可能であり、定量することができる。
【００８１】
増幅されるＰＣＲ産物のＴｍ値の差が大きくなればなるほど、２つのピークを見分けることが容易となる。しかし、タグ配列が長くなることにより、ＰＣＲ増幅の効率に関わる場合があり、定量性に問題が生じる場合もある。一般的には増幅されるＰＣＲ産物のＴｍ値の差が４℃〜１０℃程度であれば、超高感度、かつ定量的な解析を行うことが可能である。
【００８２】
ＨｉＱＡＳＰにより解析するＤＮＡは、鋳型となるＤＮＡの配列自体に差があることから、場合によってはタグを付与せずともＴｍ値が異なり定量的に検出することが可能となる。しかしながら、タグを付与することによって、どのような鋳型配列であっても、ＰＣＲ産物のＴｍ値を増大させピークの分離を確実にすることができる。
【００８３】
［実施例４］メチレーションによる大腸がんの検出（ＳＥＰＴ９）
大腸がんは、患者数、死亡者数が年々増加している。大腸がん検診は、症状のない集団について便潜血検査による一次スクリーニングを行い、大腸がんの疑いの高い者について、大腸内視鏡を用いて診断することが多い。しかしながら、便潜血検査は偽陽性、偽陰性が多く、確実な検査とは言い難い。
【００８４】
近年ＳＥＰＴ９（Ｓｅｐｔｉｎ９）が、大腸がん患者で高率にメチレーションされていることが明らかになってきた。すでに、血液中のＳＥＰＴ９のメチレーションを検出することにより大腸がんを検出するリキッドバイオプシー検査がＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）の承認を受けている。
【００８５】
そこで、ＨｉＱＡＳＰを用いて、大腸がん患者のＤＮＡを用い、ＳＥＰＴ９のメチレーションを検出することができるか検討した。用いた試料はＢｉｏＣｈａｉｎから市販されている大腸がん由来のＤＮＡ、及び比較として乳がん由来のＤＮＡと健常人の末梢血の由来ＤＮＡを用いた。
【００８６】
用いたプライマー配列を下記に示す。
（ａ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｓ３Ｒ＿Ｕ＿ｆ１：ＡＧＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴＴ（配列番号２０）
Ｓ３Ｒ＿Ｕ＿ｒ１：ＣＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＣＡ（配列番号２１）
（ｂ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｓ３Ｒ＿Ｓ１５Ｍ＿ｆ１：ｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＧＡＡＧＴＴＣ（配列番号２２）
Ｓ３Ｒ＿Ｍ＿ｒ１：ＣＡＴＣＡＴＡＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧ（配列番号２３）
【００８７】
ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→５５℃、３０秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６５℃１分から８８℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ  ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。
【００８８】
各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットはヒトゲノム標準配列（ＵＣＳＣ  ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｇ１９）のｃｈｒ１７：７５，３６９，５７５〜７５，３６９，６４８の７４ｂｐがバイサルファイト変換された領域を、メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットはｃｈｒ１７：７５，３６９，５７６〜７５，３６９，６４６の７１ｂｐのＣｐＧサイトのシトシンがメチル化されていて、かつバイサルファイト変換された領域を増幅することになる。
【００８９】
非メチル化検出用プライマーセットとメチル化検出用プライマーセットの比を１：１．５で解析した結果を図９に示す。市販大腸がんＤＮＡ（図中ＣＴで示す。）４０症例中、増幅可能であった３９例全てにおいて、メチル化されたＳＥＰＴ９プロモーター領域のＤＮＡが検出された。一方、健常者末梢血ＤＮＡ（図中ＢＮで示す。）では８例とも非メチル化ＤＮＡのみが検出され、メチル化ＤＮＡは検出されなかった。また、乳がんＤＮＡ（図中ＢＴで示す。）はメチル化が検出されるものも、されないものもあった。したがって、ＳＥＰＴ９のプロモーター領域のメチル化は、がん種によっても異なり、大腸がんにおいては特異的にメチル化されているものと考えられる。したがって、ＨｉＱＡＳＰを用いることによって、より簡便、かつ高精度でＳＥＰＴ９のメチレーションを検出することが可能となる。
【００９０】
［実施例５］メチレーションによる大腸がんの検出（ＴＳＰＹＬ５）
さらに、ＴＳＰＹＬ５についても同様に解析を行った。ＴＳＰＹＬ５は大腸がんについてはＤＮＡメチル化異常が報告されていない遺伝子である。
【００９１】
鋳型配列、用いたプライマー配列を下記に示す。
（ａ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｔ１＿Ｕ＿ｆ２：ＧＡＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴ（配列番号２４）
Ｔ１＿Ｕ＿ｒ２：ＣＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣＡ（配列番号２５）
（ｃ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｔ１＿Ｃ１５Ｍ＿ｆ２：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃＴＴＴＣＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＣ（配列番号２６）
Ｔ１＿Ｍ＿ｒ２：ＧＣＡＴＣＡＣＧＴＣＣＴＣＴＣＧＣＧ（配列番号２７）
【００９２】
また、ＰＣＲ条件、及び融解曲線解析条件配下のとおりである。
ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１０秒→５４℃、１５秒→６０℃、１０秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６０℃１分から９５℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ  ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。
【００９３】
各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡはヒトゲノム標準配列（ＵＣＳＣ  ｇｅｎｏｍｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｈｇ１９）のｃｈｒ８：９８，２９０，１２２〜９８，２９０，２２１の１００ｂｐがバイサルファイト変換された領域を、メチル化ＤＮＡはｃｈｒ８：９８，２９０，１３１〜９８，２９０，２１５の８５ｂｐのＣｐＧサイトのシトシンがメチル化されていて、かつバイサルファイト変換された領域を増幅することになる。
【００９４】
結果を図１０に示す。非メチル化プライマーとメチル化プライマーの比は１：１で解析した。市販大腸がんＤＮＡ（ＣＴ）２４症例中、増幅可能であった２３例全てにおいて、ＴＳＰＹＬ５ＤＮＡのメチル化が検出された。一方、乳がんＤＮＡ（ＢＴ）ではほとんどメチル化ＤＮＡが検出されず、健常者末梢血ＤＮＡ（ＢＮ）では８例とも非メチル化ＤＮＡのみが検出され、メチル化ＤＮＡは検出されなかった。
【００９５】
上記示してきたように、いずれの遺伝子の場合もＰＣＲ産物のＴｍ値が異なるように設定し、融解曲線を解析することにより非常に高感度に異なる配列の遺伝子を検出することが可能となる。実施例で示したように短時間で高感度にＤＮＡメチル化もしくは非メチル化を検出することができることから、リキッドバイオプシーに応用し、がんの診断等に用いることができる。また、ＤＮＡメチル化だけではなく、配列が数塩基異なるＤＮＡの検出を行うことも可能であることから、種々の分野に応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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