(57)【要約】  蛍光相関分光装置は、光源と、光ファイバーカプラと、検出器と、光源と光ファイバーカプラの第１ポートとを接続する第１光ファイバーと、光ファイバーカプラの第４ポートと対象物とを接続する第２光ファイバーと、光ファイバーカプラの第２ポートと検出器とを接続する第３光ファイバーと、第２光ファイバーと対象物との間に配置された集光レンズとを有する。励起光を第１ポートから入射させたときの第３ポートと第４ポートとの分岐比は、Ｒ：１−Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）である。
2018235822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を出射するための光源と、
一方の側に設けられた第１ポートおよび第２ポートと、他方の側に設けられた第３ポートおよび第４ポートとを含む光ファイバーカプラと、
蛍光を検出するための検出器と、
前記光源から出射された励起光を前記第１ポートに誘導するための第１光ファイバーと、
前記第４ポートから出射された励起光を対象物に向けて出射させるとともに、前記対象物から放出された蛍光を前記第４ポートに誘導するための第２光ファイバーと、
前記第２ポートから出射された蛍光を前記検出器に誘導するための第３光ファイバーと、
前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部と前記対象物との間に配置された集光レンズと、
を有し、
励起光を前記第１ポートから入射させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、Ｒ：１−Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内である、
蛍光相関分光装置。
【請求項２】
励起光を前記第１ポートから入力させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、０.９０：０.１０〜０.９９：０.０１の範囲内である、請求項１に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項３】
励起光を前記第１ポートから入力させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、０.９５：０.１０〜０.９９：０.０１の範囲内である、請求項１に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項４】
前記集光レンズは、前記第２光ファイバーと一体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項５】
前記集光レンズは、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部に接合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項６】
前記集光レンズは、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部から離間している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項７】
前記集光レンズは、前記対象物を収容する容器と一体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項８】
前記第１光ファイバーおよび前記第２光ファイバーは、シングルモード光ファイバーであり、
前記第３光ファイバーは、マルチモード光ファイバーである、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項９】
前記第３光ファイバーは、励起光を低減するためのファイバーブラッググレーティングを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項１０】
前記第１光ファイバーは、励起光を狭スペクトル化するためのファイバーブラッググレーティングを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項１１】
前記検出器により検出された蛍光強度から自己相関関数または相互相関関数を算出する相関器をさらに有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光相関分光装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy：以下「ＦＣＳ」ともいう）は、微小な測定領域を蛍光分子が出入りすることに起因する蛍光強度の増減を測定する。この蛍光強度の増減を相関関数により表現することで、測定領域を通過する蛍光分子の動き（例えば拡散速度）や分子数などの情報を得ることができる。ＦＣＳを利用することで、蛍光標識を行ったプローブタンパク質の拡散速度や分子数などの情報を得ることができ、これらの情報からさらにタンパク質間の相互作用の情報も得ることができる。ＦＣＳは、１分子レベルの感度で生体分子の相互作用を生きた細胞内でリアルタイムに検出することが可能である。しかしながら、一般的な蛍光相関分光装置は、共焦点レーザー光学系を含むため、複雑かつ大型である。また、共焦点レーザー光学系を用いた蛍光相関分光装置では、対物レンズから離れた位置に測定領域を設定することが困難である。これらのことから、ＦＣＳを動物実験や医療などに適用することが困難であった。【０００３】
このような問題を解消する手段として、光ファイバーを使用した蛍光相関分光装置が提案されている。たとえば、特許文献１には、光源、光ファイバーカプラ、スペクトルフィルタ、検知器、第１光ファイバー、第２光ファイバーおよび第３光ファイバーを有する蛍光相関分光装置が開示されている。この蛍光相関分光装置では、光源から出射された励起光は、第１光ファイバー、光ファイバーカプラおよび第２光ファイバーを順に通過して試料に照射される。これにより試料から蛍光が放出される。蛍光は、第２光ファイバー、光ファイバーカプラ、第３光ファイバーおよびスペクトルフィルタを順に通過して、検知器により検出される。このように特許文献１に記載の蛍光相関分光装置は、共焦点光学系の代わりに光ファイバーを用いた光学系を採用しているため、共焦点レーザー光学系を含む蛍光相関分光装置よりも小型である。また、第２光ファイバー導波管の端部を自由に移動させることが可能であるため、測定領域の位置をある程度自由に設定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平８−６８６９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のとおり、特許文献１には、光ファイバーおよび光ファイバーカプラを有する蛍光相関分光装置が開示されている。しかしながら、この蛍光相関分光装置には、蛍光の検出効率および小型化の点でさらなる改善の余地がある。【０００６】
そこで、本発明は、従来の蛍光相関分光装置よりも、効率よく蛍光を検出することが可能であり、かつ小型化することも可能である蛍光相関分光装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る蛍光相関分光装置は、励起光を出射するための光源と、一方の側に設けられた第１ポートおよび第２ポートと、他方の側に設けられた第３ポートおよび第４ポートとを含む光ファイバーカプラと、蛍光を検出するための検出器と、前記光源から出射された励起光を前記第１ポートに誘導するための第１光ファイバーと、前記第４ポートから出射された励起光を対象物に向けて出射させるとともに、前記対象物から放出された蛍光を前記第４ポートに誘導するための第２光ファイバーと、前記第２ポートから出射された蛍光を前記検出器に誘導するための第３光ファイバーと、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部と前記対象物との間に配置された集光レンズと、を有し、励起光を前記第１ポートから入射させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、Ｒ：１−Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来の蛍光相関分光装置よりも、効率よく蛍光を検出することが可能であり、かつ小型化することも可能である蛍光相関分光装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の一実施の形態に係る蛍光相関分光装置の構成を示す模式図である。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、集光レンズの構成を示す模式図である。
【図３】図３は、変形例に係る蛍光相関分光装置の構成を示す模式図である。
【図４】図４は、ビーズサイズと自己相関関数との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、ビーズ直径と拡散時間（ＤＴ）との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、ビーズ濃度と自己相関関数との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、ビーズ濃度と粒子数（ＮＰ）との関係を示すグラフである。
【図８】図８Ａは、直径１００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図８Ｂは、直径１００ｎｍのビーズの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、直径２００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図９Ｂは、直径２００ｎｍのビーズの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１１】
図１は、本発明の一実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、蛍光相関分光装置１００は、光源１１０、光ファイバーカプラ１２０、集光レンズ１３０、蛍光フィルター１４０、検出器１５０、相関器１６０、第１光ファイバー１７０、第２光ファイバー１８０および第３光ファイバー１９０を含む。蛍光相関分光装置１００は、第２光ファイバー１８０の端部から集光レンズ１３０を通して対象物（蛍光分子）１０に励起光を照射する。そして、蛍光相関分光装置１００は、対象物１０から放出された蛍光を集光レンズ１３０を通して検出し、蛍光の検出結果から自己相関関数または相互相関関数を算出する。この相関関数から、所望の情報が得られる。以下、各構成要素について説明する。
【００１２】
光源１１０は、励起光を出射する。励起光は、第１光ファイバー１７０の端部で第１光ファイバー１７０内に入射する。光源１１０の種類は、特に限定されず、対象物１０の種類（蛍光分子の励起波長）に応じて適宜選択されうる。光源１１０の例には、レーザーダイオード、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。本実施の形態では、レーザーダイオードである。光源の種類によっては、光源１１０から出射された光は、励起光フィルターにより狭スペクトル化されることが好ましい。励起光フィルターの例には、反射型フィルター、吸収型フィルター、ファイバーブラッググレーティング（以下「ＦＢＧ」ともいう）が含まれる。
【００１３】
光ファイバーカプラ１２０は、一方の側に設けられた第１ポート１２１および第２ポート１２２と、他方の側に設けられた第３ポート１２３および第４ポート１２４とを有する。本実施の形態では、２×２光ファイバーカプラである。光源１１０から出射された励起光は、第１光ファイバー１７０を介して第１ポート１２１に到達する。第１ポート１２１で入射した励起光は、第３ポート１２３および第４ポート１２４から所定の分岐比で出射される。一方、対象物１０から放出された蛍光は、第２光ファイバー１８０を介して第４ポート１２４に到達する。第４ポート１２４で入射した蛍光は、第１ポート１２１および第２ポート１２２から所定の分岐比で出射される。
【００１４】
本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、光ファイバーカプラ１２０の分岐比が５０：５０ではないことを一つの特徴とする。より具体的には、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、第１ポート１２１で入射した励起光の大部分（例えば９９％）は第３ポート１２３から出射され、励起光のごく一部（例えば１％）が第４ポート１２４から出射される。また、第４ポート１２４で入射した蛍光の大部分（例えば９９％）は第２ポート１２２から出射され、蛍光のごく一部（例えば１％）が第１ポート１２１から出射される。このように、分岐比を大きくすることで、励起光の光量を適切に低減させることが可能となり、かつ対象物１０から放出された蛍光の大部分を検出器１４０に導くことが可能となる。本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、第２光ファイバー１８０と対象物１０との間に配置されている集光レンズ１３０が励起光を集光するため、退色を防ぐ観点からは励起光の光量を低減させる必要がある。この点について、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０が励起光の光量を低減させる機能も担っているため、別途ＮＤフィルターなどを用いることなく励起光の光量を適切に低減させることができる。光ファイバーカプラ１２０の分岐比は、退色が生じず、かつ蛍光が十分に発生する強度の励起光を対象物１０に照射することが可能であり、かつ対象物１０から放出された蛍光をできるだけ多く検出器１４０に導くことが可能であるように、集光レンズ１３０などに応じて適宜設定されることが好ましい。
【００１５】
たとえば、光ファイバーカプラ１２０の分岐比は、以下のように設定してもよい。まず、対象物（蛍光分子）１０の種類に応じて、対象物１０が退色しない程度の励起光強度Ｉｅｘ（単位：Ｗ）を決定する。対象物１０を退色させないことを考慮すると、励起光強度Ｉｅｘは、１００μＷ以下であることが好ましい。決定した励起光強度Ｉｅｘ（単位：Ｗ）、光源の最大出力Ｉ０（単位：Ｗ）、および光ファイバー伝搬による光損失α（０＜α＜１）を以下の式（１）に導入することにより、分岐比Ｒ（０＜Ｒ＜１）を求めることができる。すなわち、対象物１０が退色しない程度の励起光強度Ｉｅｘを決定すれば、光源の最大出力Ｉ０から分岐比Ｒを決定することができる。なお、第３ポート１２３と第４ポート１２４との分岐比は、Ｒ：１−Ｒである。
【数１】
2018235822.tif 000003
【００１６】
具体的には、励起光を第１ポート１２１から入射させたときの第３ポート１２３と第４ポート１２４との分岐比は、Ｒ：１−Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内であることが好ましく、０.９０：０.１０〜０.９９：０.０１の範囲内であることがより好ましく、０.９５：０.１０〜０.９９：０.０１の範囲内であることがさらに好ましい。
【００１７】
集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０の対象物１０側の端部と対象物１０との間に配置されている。集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０の端部から出射された励起光を対象物１０が存在する領域に集光して、励起光の強度を高めるとともに微小な測定領域を規定する。また、集光レンズ１３０は、対象物１０から放出された蛍光を集光して第２光ファイバー１８０に入射させる。集光レンズ１３０を設けることで、励起光の利用効率および蛍光の検出効率を向上させることができる。
【００１８】
集光レンズ１３０の構成は、特に限定されない。集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０と一体であってもよいし、第２光ファイバー１８０と別体であってもよい。たとえば、図２Ａに示されるように、第２光ファイバー１８０は、対象物１０側の端部が集光レンズ１３０ａとして機能するレンズド光ファイバーであってもよい。集光レンズ１３０が第２光ファイバー１８０と別体である場合、集光レンズ１３０は、第２光ファイバー１８０の端部に接合されていてもよいし、第２光ファイバー１８０の端部から離間していてもよい。たとえば、図２Ｂに示されるように、ＧＲＩＮレンズ１３０ｂが、第２光ファイバー１８０の端部に接合されていてもよい。また、図２Ｃに示されるように、対物レンズ１３０ｃが、第２光ファイバー１８０の端部と対象物１０との間に配置されていてもよい。このようにすることで、異なる蛍光相関分光装置１００において、または異なる測定において、１つの集光レンズ１３０（対物レンズ）を使いまわすことができる。また、図２Ｄに示されるように、集光レンズ１３０ｄは、対象物１０を収容する容器１１と一体であってもよい。このようにすることで、集光レンズ１３０をディスポーザブルのものとすることができる。図２Ｃおよび図２Ｄに示される態様では、第２光ファイバー１８０から出射された光を平行光にするためのコリメートレンズ１３０ｅがさらに配置されていることが好ましい。このように、集光レンズ１３０は、複数のレンズを含んでいてもよい。ただし、図２Ｃおよび図２Ｄに示される態様において、コリメートレンズ１３０ｅは必須ではない。なお、図２Ａ〜Ｄでは、わかりやすさを優先して各部材の縮尺を変えている。
【００１９】
蛍光フィルター１４０は、光ファイバーカプラ１２０と検出器１５０との間の光路上に配置されており、励起光（主として対象物１０で反射した励起光）を低減させる。検出器１５０に到達する励起光が十分に少ない場合は、蛍光フィルター１４０は無くてもよいが、蛍光の検出精度を向上させる観点からは、蛍光フィルター１４０を設置することが好ましい。蛍光フィルター１４０の種類は、励起光を低減させつつ蛍光を透過させることができれば特に限定されない。蛍光フィルター１４０の例には、反射型フィルター、吸収型フィルター、ファイバーブラッググレーティングが含まれる。
【００２０】
図３は、変形例に係る蛍光相関分光装置１００’の構成を示す模式図である。変形例に係る蛍光相関分光装置１００’は、励起光フィルターとして、第１光ファイバー１７０内に形成された、励起光を狭スペクトル化するためのファイバーブラッググレーティング（ＦＢＧ）１７１を有し、蛍光フィルター１４０として、第３光ファイバー１９０内に形成された、励起光を低減するためのファイバーブラッググレーティング（ＦＢＧ）１９１を有する。ＦＢＧ１７１は、励起光の中心波長から外れた波長の光を反射させることで、励起光を狭スペクトル化する、狭帯域バンドパスフィルタまたはノッチフィルタである。ＦＢＧ１９１は、励起光の波長の光を反射させることで、検出器１５０に到達する励起光を低減させる。このように第１光ファイバー１７０内に励起光フィルター（ＦＢＧ１７１）を設け、第３光ファイバー１９０内に蛍光フィルター１４０（ＦＢＧ１９１）を設けることで、集光レンズ１３０を除く光学系のすべてを光ファイバーで構成することとなり、蛍光相関分光装置１００’をより小型化することが可能となる。ＦＢＧ１７１およびＦＢＧ１９１におけるグレーティング周期Λは、励起光の中心波長に応じて適宜設定される。以下の式（２）に示されるように、ＦＢＧ１７１またはＦＢＧ１９１により反射される光の波長（ブラッグ波長）λｂは、第１光ファイバー１７０または第３光ファイバー１９０のコアの有効屈折率ｎおよびグレーティング周期Λにより決まる。したがって、ＦＢＧ１９１については、光源１１０から出射される励起光の中心波長がブラッグ波長λｂと一致するように、グレーティング周期Λを設定すればよい。検出器１５０に到達する励起光は少ないほど好ましいことから、ＦＢＧ１９１による励起光の反射率は高いほど好ましい。なお、変形例に係る蛍光相関分光装置１００’は、ＦＢＧ１７１およびＦＢＧ１９１の２つのＦＢＧを有しているが、どちらか一方のＦＢＧのみを有していてもよい。
【数２】
2018235822.tif 000004
【００２１】
検出器１５０は、対象物１０から放出され、第２光ファイバー１８０、光ファイバーカプラ１２０、第３光ファイバー１９０および蛍光フィルター１４０を介して到達した蛍光を検出する。検出器１５０の種類は、ＦＣＳにおいて必要な感度で蛍光を検出することができれば特に限定されない。検出器１５０の例には、アバランシェフォトダイオードおよび光電子増倍管が含まれる。本実施の形態では、検出器１５０は、アバランシェフォトダイオードである。
【００２２】
相関器１６０は、検出器１５０により検出された蛍光強度から自己相関関数または相互相関関数を算出する。相関器１６０は、ハードウェア相関器であってもよいし、ソフトウェア相関器であってもよい。本実施の形態では、相関器１６０は、ハードウェア相関器である。
【００２３】
第１光ファイバー１７０は、光源１１０から出射された励起光を光ファイバーカプラ１２０の第１ポート１２１に誘導する。第１光ファイバー１７０の種類は、励起光を光ファイバーカプラ１２０に適切に誘導することができれば特に限定されない。第１光ファイバー１７０は、マルチモード光ファイバーであってもよいし、シングルモード光ファイバーであってもよい。後述するように、測定領域を小さくして対象物１０の検出精度を高める観点からは、第２光ファイバー１８０は、シングルモード光ファイバーであることが好ましい。そして、第２光ファイバー１８０がシングルモード光ファイバーである場合は、効率的に光を伝搬する観点から、第１光ファイバー１７０もシングルモード光ファイバーであることが好ましい。本実施の形態では、第１光ファイバー１７０は、シングルモード光ファイバーである。
【００２４】
第２光ファイバー１８０は、光ファイバーカプラ１２０の第４ポート１２４から出射された励起光を対象物１０に向けて出射させる。第２光ファイバー１８０から出射された励起光は、集光レンズ１３０により集光されて対象物１０に照射される。これにより、対象物１０から蛍光が放出される。対象物１０から放出された蛍光は、集光レンズ１３０により集光されて第２光ファイバー１８０の端面から第２光ファイバー１８０に入射する。第２光ファイバー１８０は、蛍光を光ファイバーカプラ１２０の第４ポート１２４に誘導する。測定領域を小さくして対象物１０の検出精度を高める観点からは、第２光ファイバー１７０は、シングルモード光ファイバーであることが好ましい。本実施の形態では、第２光ファイバー１８０は、シングルモード光ファイバーである。
【００２５】
第３光ファイバー１９０は、光ファイバーカプラ１２０の第２ポート１２２から出射された蛍光を検出器１５０に誘導する。第３光ファイバー１９０の種類は、蛍光を検出器１５０に適切に誘導することができれば特に限定されない。第３光ファイバー１９０は、マルチモード光ファイバーであってもよいし、シングルモード光ファイバーであってもよい。蛍光をできるだけ多く検出器１５０に導く観点からは、第３光ファイバー１９０は、マルチモード光ファイバーであることが好ましい。本実施の形態では、第３光ファイバー１９０は、マルチモード光ファイバーである。
【００２６】
なお、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０の第３ポート１２３から出射される励起光は、利用されない。したがって、第３ポート１２３には、光ファイバーなどが接続されていない。第３ポート１２３での励起光の反射を防ぐ観点から、第３ポート１２３には、ライトトラップが接続されていてもよい。
【００２７】
次に、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００の動作について説明する。まず、光源１１０から、対象物（蛍光分子）１０に応じた波長の励起光が出射される。励起光は、第１光ファイバー１７０に入射し、第１ポート１２１から光ファイバーカプラ１２０に入射する。励起光の大部分（例えば９９％）は第３ポート１２３から出射され、励起光のごく一部（例えば１％）が第４ポート１２４から出射される。第４ポート１２４から出射された励起光は、第２光ファイバー１８０内に入射し、第２光ファイバー１８０の対象物１０側の端部から対象物１０に向かって出射される。このとき、励起光は、集光レンズ１３０により集光され、微小な測定領域が形成される。測定領域内の対象物１０は、励起光を照射されるため、対象物（蛍光分子）１０の種類に応じた波長の蛍光を放出する。
【００２８】
対象物１０から放出された蛍光は、集光レンズ１３０により集光され、第２光ファイバー１８０内に入射する。蛍光は、第４ポート１２４から光ファイバーカプラ１２０に入射する。蛍光の大部分（例えば９９％）は第２ポート１２２から出射され、蛍光のごく一部（例えば１％）が第１ポート１２１から出射される。第２ポート１２２から出射された蛍光は、第３光ファイバー１９０に入射し、蛍光フィルター１４０により励起光成分が除去され、検出器１５０により検出される。
【００２９】
相関器１６０は、検出器１５０により検出された蛍光強度から自己相関関数または相互相関関数を算出する。この相関関数から、測定領域を通過する対象物（蛍光分子）１０の動き（例えば拡散速度）や分子数などの所望の情報を得ることができる。
【００３０】
以上のように、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０の分岐比について、励起光を第１ポート１２１から入射させたときの第３ポート１２３と第４ポート１２４との分岐比をＲ：１−Ｒ（ただし０.６≦Ｒ＜１）の範囲内とすることで、十分な量の励起光を対象物１０に照射しつつも、第２光ファイバー１８０内に入射した蛍光の大部分を検出器１５０に導くことを実現している。また、第２光ファイバー１８０の端部と対象物１０との間に集光レンズ１３０を設けることで、対象物１０が存在する領域に効率よく励起光を集光しつつ、対象物１０から放出された蛍光を効率よく第２光ファイバー１８０に入射させることを実現している。本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、これらの特徴を有しているため、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置よりも蛍光の検出効率が優れている。
【００３１】
また、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、第２光ファイバー１８０と対象物１０との間に配置されている集光レンズ１３０が励起光を集光するため、退色を防ぐために励起光の光量を低減させる必要がある。この点について、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００では、光ファイバーカプラ１２０が励起光の光量を低減させる機能も担っているため、別途ＮＤフィルターなどを用いることなく励起光の光量を適切に低減させることができる。特許文献１に記載の蛍光相関分光装置では、集光レンズを用いて励起光を集光しないため、なるべく多くの励起光を対象物に照射すべく、光ファイバーカプラの分岐比を１：１程度にしていると推察される。このように、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、励起光の光量を低減させる目的でも光ファイバーカプラ１２０を使用している点でも、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置とは異なるものである。
【００３２】
また、本実施の形態に係る蛍光相関分光装置１００は、光学系が光ファイバーにより構成されているため、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置と同様に小型化されうる。特に、蛍光フィルター１４０として第３光ファイバー１９０内に形成されたＦＢＧ１９１を有する蛍光相関分光装置１００’（図３参照）は、特許文献１に記載の蛍光相関分光装置よりもより小型化されうる。
【００３３】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００３４】
［実施例１］
実施例１では、図１に示される蛍光相関分光装置１００を用いて、超純水中に分散させた蛍光ビーズを測定した結果を示す。集光レンズ１３０としては、第２光ファイバー１８０の端部に接合されたＧＲＩＮレンズ１３０ｂを使用した（図２Ｂ参照）。【００３５】
光源１１０および第１光ファイバー１７０としては、中心波長４８８ｎｍのレーザー光を出射するシングルモードファイバー出力レーザーダイオード（LP488-SF20、Thorlabs社）を使用した。光ファイバーカプラ１２０としては、波長４８８ｎｍの光についての分岐比が０.９９：０.０１の２×２光ファイバーカプラ（FC488-99B-FC-1、Thorlabs社）を使用した。蛍光フィルター１４０としては、中心波長が５４２ｎｍのシングルバンドパスフィルター（FF01-542/27-25、Semrock社）を使用した。検出器１５０としては、アバランシェフォトダイオード（SPCM-CD 3017、Perkin Elmer社）を使用した。相関器１６０としては、ハードウェア相関器（Flex02-01D、Correlator.com社）を使用した。第２光ファイバー１８０および集光レンズ１３０としては、ＧＲＩＮレンズが接着されたシングルモード光ファイバー（GT-SMFP-100-SP4.5-cus-50-NC, S/N# CRS 2946-3-SP355-01、GRINTECH社）を使用した。集光点における励起光のパワーは１５.３μＷとなった。第３光ファイバー１９０としては、マルチモード光ファイバー（M74L02、Thorlabs社）を使用した。また、光ファイバーカプラ１２０の第３ポート１２３には、ライトトラップ（ＦＴＦＣ１、Thorlabs社）を接続した。【００３６】
測定対象の対象物１０としては、直径４０ｎｍの蛍光ビーズ（F8795、Thermo Fisher Scientific社）、直径１００ｎｍの蛍光ビーズ（F8803、Thermo Fisher Scientific社）または直径２００ｎｍの蛍光ビーズ（F8811、Thermo Fisher Scientific社）を使用した。これらの蛍光ビーズの最大励起波長は５０５ｎｍであり、最大蛍光波長は５１５ｎｍである。購入した蛍光ビーズの分散液を超純水で希釈したものを試料とした。【００３７】
図４は、ビーズサイズと自己相関関数との関係を示すグラフである。横軸は時間τ（ミリ秒）で、縦軸は振幅が１になるように規格化した自己相関関数である。このグラフから、ビーズサイズが大きくなると、自己相関関数の半値幅が大きくなることがわかる。【００３８】
表１に、各試料の自己相関関数から求められる拡散時間（ＤＴ）および粒子数（ＮＰ）を示す。拡散時間（ＤＴ）は、測定領域中にビーズが滞在する平均時間であり、自己相関関数の半値幅に対応する。拡散時間（ＤＴ）は、ビーズの直径に比例する。粒子数（ＮＰ）は、測定領域中に存在するビーズの平均個数であり、自己相関関数の振幅の逆数に対応する。粒子数（ＮＰ）は、ビーズの濃度に比例する。
【表１】
2018235822.tif 000005
【００３９】
図５は、ビーズ直径と拡散時間（ＤＴ）との関係を示すグラフである。このグラフから、拡散時間（ＤＴ）がビーズ直径に比例すること、すなわち蛍光相関分光装置１００がビーズサイズを計測できることがわかる。【００４０】
図６は、ビーズ濃度と自己相関関数との関係を示すグラフである。横軸は時間τ（ミリ秒）で、縦軸は自己相関関数である。この実験では、直径１００ｎｍの蛍光ビーズを使用した。このグラフから、ビーズ濃度が下がると、自己相関関数の振幅が大きくなることがわかる。【００４１】
表２に、各濃度の試料の自己相関関数から求められる拡散時間（ＤＴ）および粒子数（ＮＰ）を示す。前述のとおり、粒子数（ＮＰ）は、ビーズの濃度に比例する。
【表２】
2018235822.tif 000006
【００４２】
図７は、ビーズ濃度と粒子数（ＮＰ）との関係を示すグラフである。このグラフから、粒子数（ＮＰ）がビーズ濃度に比例すること、すなわち蛍光相関分光装置１００がビーズ濃度を計測できることがわかる。【００４３】
［実施例２］
実施例２でも、図１に示される蛍光相関分光装置１００を用いて、超純水中に分散させた蛍光ビーズを測定した結果を示す。集光レンズ１３０としては、コンデンサーレンズを使用した。【００４４】
測定対象の対象物１０としては、直径１００ｎｍの蛍光ビーズ（F8803、Thermo Fisher Scientific社）または直径２００ｎｍの蛍光ビーズ（F8811、Thermo Fisher Scientific社）を使用した。これらの蛍光ビーズの最大励起波長は５０５ｎｍであり、最大蛍光波長は５１５ｎｍである。購入した蛍光ビーズの分散液を超純水で希釈したものを試料とした。【００４５】
光源１１０、第１光ファイバー１７０、光ファイバーカプラ１２０、第３光ファイバー１９０、蛍光フィルター１４０、検出器１５０および相関器１６０は、実施例１と同じものを使用した。第２光ファイバー１８０としては、シングルモード光ファイバー（460HP、Thorlabs社）を使用した。集光レンズ１３０としては、非球面コンデンサーレンズ（#35-044、Edmund Optics社）を使用した。直径１００ｎｍの蛍光ビーズを対象物１０としたときの集光点における励起光のパワーは３２.０μＷとなった。また、直径２００ｎｍの蛍光ビーズを対象物１０としたときの集光点における励起光のパワーは２３.３μＷとなった。光ファイバーカプラ１２０の第３ポート１２３には、ライトトラップ（ＦＴＦＣ１、Thorlabs社）を接続した。【００４６】
図８Ａは、直径１００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図８Ｂは、直径１００ｎｍのビーズの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。図９Ａは、直径２００ｎｍのビーズの８００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフであり、図９Ｂは、直径２００ｎｍの１６００倍希釈液を試料とした場合の自己相関関数を示すグラフである。横軸は時間τ（ミリ秒）で、縦軸は自己相関関数である。これらのグラフに示されるように、自己相関関数の振幅は、ビーズの分散液の希釈倍率が増大することによって大きくなった。また、自己相関関数の半値幅は、ビーズの直径が大きくなることによって大きくなった。これらの結果から、集光レンズ１３０としてコンデンサーレンズを使用した場合であっても、蛍光相関分光装置１００がビーズ濃度およびビーズサイズを計測できることがわかる。【００４７】
本出願は、２０１７年６月１９日出願の特願２０１７−１１９５３２に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明に係る蛍光相関分光装置は、小型であり、かつ測定領域の位置を自由に設定することができるため、動物実験や医療などを含む様々な分野において利用されうる。
【符号の説明】
【００４９】
１０  対象物（蛍光分子）
１１  容器
１００、１００’  蛍光相関分光装置
１１０  光源
１２０  光ファイバーカプラ
１２１  第１ポート
１２２  第２ポート
１２３  第３ポート
１２４  第４ポート
１３０、１３０ａ、１３０ｄ  集光レンズ
１３０ｂ  集光レンズ（ＧＲＩＮレンズ）
１３０ｃ  集光レンズ（対物レンズ）
１３０ｅ  集光レンズ（コリメートレンズ）
１４０  蛍光フィルター
１５０  検出器
１６０  相関器
１７０  第１光ファイバー
１７１  ファイバーブラッググレーティング
１８０  第２光ファイバー
１９０  第３光ファイバー
１９１  ファイバーブラッググレーティング
【図１】
2018235822.tif 000007
【図２】
2018235822.tif 000008
【図３】
2018235822.tif 000009
【図４】
2018235822.tif 000010
【図５】
2018235822.tif 000011
【図６】
2018235822.tif 000012
【図７】
2018235822.tif 000013
【図８】
2018235822.tif 000014
【図９】
2018235822.tif 000015
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月17日(2019.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光を出射するための光源と、
一方の側に設けられた第１ポートおよび第２ポートと、他方の側に設けられた第３ポートおよび第４ポートとを含む光ファイバーカプラと、
蛍光を検出するための検出器と、
前記光源から出射された励起光を前記第１ポートに誘導するための第１光ファイバーと、
前記第４ポートから出射された励起光を対象物に向けて出射させるとともに、前記対象物から放出された蛍光を前記第４ポートに誘導するための第２光ファイバーと、
前記第２ポートから出射された蛍光を前記検出器に誘導するための第３光ファイバーと、
前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部と前記対象物との間に配置された集光レンズと、
を有し、
励起光を前記第１ポートから入射させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、Ｒ：１−Ｒ（ただし０．６≦Ｒ＜１）の範囲内である、
蛍光相関分光装置。
【請求項２】
励起光を前記第１ポートから入力させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、０．９５：０．０５〜０．９９：０．０１の範囲内である、請求項１に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項３】
励起光を前記第１ポートから入力させたときの前記第３ポートと前記第４ポートとの分岐比は、０．９９：０．０１である、請求項１に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項４】
前記第２光ファイバーおよび前記集光レンズは、一体のレンズド光ファイバーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項５】
前記集光レンズは、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部に接合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項６】
前記集光レンズは、前記第２光ファイバーの前記対象物側の端部から離間している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項７】
前記集光レンズは、前記対象物を収容する容器と一体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項８】
前記第１光ファイバーおよび前記第２光ファイバーは、シングルモード光ファイバーであり、
前記第３光ファイバーは、マルチモード光ファイバーである、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項９】
前記第３光ファイバーは、励起光を低減するためのファイバーブラッググレーティングを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項１０】
前記第１光ファイバーは、励起光を狭スペクトル化するためのファイバーブラッググレーティングを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【請求項１１】
前記検出器により検出された蛍光強度から自己相関関数または相互相関関数を算出する相関器をさらに有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の蛍光相関分光装置。
【国際調査報告】
2018235822.tif 000016
2018235822.tif 000017
2018235822.tif 000018
2018235822.tif 000019