(57)【要約】  本発明は、タンパク質精製用担体として有用な物質を提供する。リン酸イオンを含む水溶液Ａ、及び、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとを含む水溶液Ｂ、の混合を行い、リン酸アルミニウム化合物を含む混合物を得る工程を含む、リン酸アルミニウム化合物の製造方法によって得られるリン酸アルミニウム化合物は、タンパク質吸着性に優れているため、タンパク質精製用担体として有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イオンを含む水溶液Ａ、及び、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとを含む水溶液Ｂ、の混合を行い、リン酸アルミニウム化合物を含む混合液を得る工程を含む、リン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項２】
前記混合液のｐＨが３〜４である、請求項１に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項３】
前記水溶液Ａがリン酸一水素塩水溶液である、請求項１又は２に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項４】
前記水溶液Ｂが、前記カリウムイオン及び前記マグネシウムイオンを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項５】
前記水溶液Ｂが、硫酸カリウムアルミニウム及び硫酸マグネシウムの少なくともいずれかを水に溶解して調製したものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項６】
前記水溶液Ａに対し、前記水溶液Ｂを２体積％／分以下の速度で添加することによって前記混合を行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項７】
前記リン酸アルミニウム化合物が、タンパク質精製用担体に用いられるものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法によって得られるリン酸アルミニウム化合物。
【請求項９】
リン酸アルミニウムとともに、硫黄と、０．５重量％以上のカリウム及び０．０１重量％以上のマグネシウムの少なくともいずれかとを含む、リン酸アルミニウム化合物。
【請求項１０】
前記硫黄の含有量が０．５重量％以上である、請求項９に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１１】
アルミニウムの含有量が１０〜１６重量％である、請求項９又は１０に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１２】
水分量が１５重量％以上である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１３】
カルシウムの含有量が０．００１重量％以上である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１４】
タンパク質精製用担体に用いられるものである、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１５】
無細胞系により合成したタンパク質、並びに／若しくは、細菌、酵母、藻類、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び動物培養細胞からなる群より選択される宿主において発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１６】
大腸菌を宿主として発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸アルミニウム化合物に関する。特に、本発明は、タンパク質精製用担体として有用なリン酸アルミニウム化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の精製には、従来より、塩析法、遠心法、カラムクロマトグラフィー法等の精製法が広く用いられている。タンパク質の中でもワクチンの場合は、培養又は抗原の抽出過程の培地成分、宿主由来成分、その他ワクチンに不必要な成分を除去してヒトに接種した場合の副反応を軽減する必要性により、また、昨今の製剤基準の厳格化により、特に高度な精製法が要求される。ワクチンの精製法としては、具体的には、ポリエチレングリコール塩析法、超遠心法、ショ糖密度勾配遠心法、クロマトグラフィー法等が挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】一般社団法人日本ワクチン産業協会、２０１７（平成２９年）ワクチンの基礎−ワクチン類の製造から流通まで
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
様々なタンパク質精製法が開発されているものの、十分な精製ができないワクチン等もあり、ワクチン等のタンパク質の精製に有用な新たな方法が求められる。本発明者らは、新たなタンパク質精製方法の探求のため、精製担体として、リン酸アルミニウム等の無機化合物を検討したが、タンパク質精製の担体としての十分な機能を果たすものではなかった。【０００５】
そこで本発明は、タンパク質精製用担体として有用な物質を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は鋭意検討の結果、リン酸アルミニウムの生成において、敢えてリン酸アルミニウムの構成元素でない特定のイオンを含む水溶液を用いて得られたリン酸アルミニウム化合物が、予想外にも、試薬としてのリン酸アルミニウムには見られない、タンパク質に対する優れた吸着作用を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下に掲げる態様の発明を提供する。【０００７】
項１．  リン酸イオンを含む水溶液Ａ、及び、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとを含む水溶液Ｂ、の混合を行い、リン酸アルミニウム化合物を含む混合物を得る工程を含む、リン酸アルミニウム化合物の製造方法。
項２．  前記混合物のｐＨが３〜４である、項１に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
項３．  前記水溶液Ａがリン酸一水素塩水溶液である、項１又は２に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
項４．  前記水溶液Ｂが、前記カリウムイオン及び前記マグネシウムイオンを含む、項１〜３のいずれかに記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
項５．  前記水溶液Ｂが、硫酸カリウムアルミニウム及び硫酸マグネシウムの少なくともいずれかを水に溶解して調製したものである、項１〜４のいずれかに記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
項６．  前記水溶液Ａに対し、前記水溶液Ｂを２体積％／分以下の速度で添加することによって前記混合を行う、項１〜５のいずれかに記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
項７．  前記リン酸アルミニウム化合物が、タンパク質精製用担体に用いられるものである、項１〜６のいずれかに記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
項８．  項１〜７のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法によって得られるリン酸アルミニウム化合物。
項９．  リン酸アルミニウムとともに、硫黄と、０．５重量％以上のカリウム及び０．０１重量％以上のマグネシウムの少なくともいずれかとを含む、リン酸アルミニウム化合物。
項１０．  前記硫黄の含有量が０．５重量％以上である、項９に記載のリン酸アルミニウム化合物。
項１１．  アルミニウムの含有量が１０〜１６重量％である、項９又は１０に記載のリン酸アルミニウム化合物。
項１２．  水分量が１５重量％以上である、項９〜１１のいずれかに記載のリン酸アルミニウム化合物。
項１３．  カルシウムの含有量が０．００１重量％以上である、項９〜１２のいずれかに記載のリン酸アルミニウム化合物。
項１４．  タンパク質精製用担体に用いられるものである、項９〜１３のいずれかに記載のリン酸アルミニウム化合物。
項１５．  無細胞系により合成したタンパク質、並びに／若しくは、細菌、酵母、藻類、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び動物培養細胞からなる群より選択される宿主において発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、項９〜１４のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
項１６．  大腸菌を宿主として発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、項９〜１５のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、タンパク質精製用担体として有用な物質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】試験例１で得られた本発明のリン酸アルミニウム化合物のＳＥＭ写真を示す。
【図２】試験例３において、大腸菌（Ｈｉｓタグを付加した蛍光タンパク質を発現するように遺伝子導入したもの）由来タンパク質を、本発明のリン酸アルミニウム化合物へ吸着させた場合（実施例３）の吸着分の溶出液と、市販のリン酸アルミニウムへ吸着させた場合（比較例１）の吸着分の溶出液とを示す。
【図３】試験例３において、図２の溶出液を電気泳動した結果を示す。
【図４】試験例４において、肺炎球菌表面タンパク質を、本発明のリン酸アルミニウム化合物へ吸着させた場合（実施例３、４）の吸着分の溶出液を電気泳動した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［１．リン酸アルミニウム化合物の製造方法］
本発明のリン酸アルミニウム化合物の製造方法は、リン酸イオンを含む水溶液Ａ、及び、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとを含む水溶液Ｂ、の混合を行い、リン酸アルミニウム化合物を含む混合液を得る工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のリン酸アルミニウム化合物の製造方法について詳述する。
【００１１】
［１−１．水溶液Ａ］
水溶液Ａは、リン酸イオンを含む。水溶液Ａは、リン酸含有化合物が溶解された水性溶液として調製することができる。リン酸含有化合物としては、リン酸、リン酸無水素塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩等が挙げられる。
【００１２】
リン酸は、オルトリン酸である。リン酸無水素塩は、水素塩ではないリン酸塩であり、リン酸アンモニウム（（ＮＨ4）3ＰＯ4）、リン酸三ナトリウム（Ｎａ3ＰＯ4）、リン酸三カリウム（Ｋ3ＰＯ4）、リン酸アンモニウムマグネシウム（ＭｇＮＨ4ＰＯ4）、ヒドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2）等が挙げられる。リン酸一水素塩は、一水素塩のリン酸塩であり、リン酸水素二アンモニウム（（ＮＨ4）2ＨＰＯ4）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、リン酸一水素マグネシウム（ＭｇＨＰＯ4）、リン酸一水素カルシウム（ＣａＨＰＯ4）等が挙げられる。リン酸二水素塩は、二水素塩のリン酸塩であり、リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ4Ｈ2ＰＯ4）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2ＰＯ4）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）等が挙げられる。
【００１３】
リン酸含有化合物は、無水和物であってもよいし、水和物であってもよい。また、水和物の水和数は特に限定されない。これらリン酸含有化合物は、一種を単独で用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
【００１４】
上述のリン酸含有化合物の中でも、本発明においては、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、好ましくはリン酸一水素塩が挙げられ、より好ましくはリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）が挙げられる。
【００１５】
水溶液Ａにおけるリン酸イオンの濃度としては特に限定されないが、水溶液Ｂと反応させて効率的にリン酸アルミニウム化合物を得る等の観点から、水溶液Ａの調製に用いた上述のリン酸含有化合物を構成するリン酸イオンの総量として、例えば０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上が、より好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．２ｍｏｌ／Ｌ以上が挙げられ、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、例えば０．６ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．４５ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．３ｍｏｌ／Ｌ以下が挙げられる。水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオンの総量の具体的な範囲としては、０．０１〜０．６ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．４５ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．６ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．４５ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ、０．１〜０．６ｍｏｌ／Ｌ、０．１〜０．４５ｍｏｌ／Ｌ、０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ、０．２〜０．６ｍｏｌ／Ｌ、０．２〜０．４５ｍｏｌ／Ｌ、０．２〜０．３ｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
【００１６】
水溶液Ａの液性としては特に限定されないが、例えば塩基性溶液として調製することができる。塩基性溶液としての水溶液Ａは、上述のリン酸含有化合物を水に溶解させることで調製してもよいし、上述のリン酸化合物を水に溶解させるとともに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムなどの金属水酸化物の１種又は複数種を用いてｐＨを調整することにより調製してもよいし、あらかじめ調製した上記金属水酸化物の塩基性水溶液に上述のリン酸化合物を溶解させることで調製してもよい。水溶液Ａの具体的なｐＨ（２３℃、以下において同様）としては、好ましくは、後述の水溶液Ｂと混合して得られる混合物のｐＨが３〜４となるように、水溶液ＢのｐＨを考慮して決定することができる。具体的には、水溶液ＡのｐＨの下限としては、７．０以上、好ましくは７．５以上が挙げられ、上限としては、１４．０以下、好ましくは９．５以下が挙げられる。水溶液ＡのｐＨの具体的な範囲としては、７．０〜１４．０、７．０〜９．５、７．５〜１４．０、７．５〜９．５が挙げられる。
【００１７】
リン酸含有化合物を溶解させる方法としては、特に限定されず、例えば、撹拌、振とう、超音波溶解等が挙げられる。また、リン酸含有化合物を溶解させるときの温度及び圧力の条件も特に限定されず、例えば、常温常圧下及び加温常圧下等の条件が挙げられる。
【００１８】
水溶液Ａは、室温で調製することができる、また、水溶液Ａは、調製された溶液をフィルターろ過したものであることが好ましい。用いるフィルターの孔径としては、例えば０．２〜１．０μｍ、好ましくは０．２〜０．５μｍ、より好ましくは０．２〜０．４μｍが挙げられる。
【００１９】
［１−２．水溶液Ｂ］
水溶液Ｂは、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとを含む。このように、本発明では、敢えてリン酸アルミニウムの構成元素でない特定のイオンを含む水溶液を用いることによって、得られるリン酸アルミニウム化合物を、タンパク質に対する優れた吸着作用を有する、タンパク質精製の担体として有用な物質として得ることができる。リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点からは、水溶液Ｂは、アルミニウムイオン、硫酸イオン、カリウムイオン及びマグネシウムイオンを含むことが好ましい。
【００２０】
水溶液Ｂは、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとを含む１種または２種以上の塩が溶解された水溶液として調製することができる。当該塩としては、単塩であってもよいし複塩であってもよい。
【００２１】
水溶液Ｂを調製するための塩としては、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとをそれぞれ単独で含む塩が複数種組み合わされてもよいし、複数種のイオンを含む塩が単独又は複数種組み合わされてもよい。水溶液Ｂを調製するための塩を２種以上用いる場合、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、いずれの塩も、硫酸イオンをアニオンとして有するものであることが好ましい。
【００２２】
アルミニウムイオンを含む塩としては、例えば、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）3）、酸化アルミニウム（Ａｌ2Ｏ3）、硫酸アルミニウム（Ａｌ2（ＳＯ4）3）、塩化アルミニウム（ＡｌＣｌ3）、硝酸アルミニウム（Ａｌ（ＮＯ3）3）、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）、硫酸マグネシウムアルミニウム（ＡｌＭｇＳＯ4）等が挙げられ、好ましくは、硫酸アルミニウム（Ａｌ2（ＳＯ4）3）、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）、硫酸マグネシウムアルミニウム（ＡｌＭｇＳＯ4）が挙げられ、より好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）、硫酸マグネシウムアルミニウム（ＡｌＭｇＳＯ4）が挙げられ、特に好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）が挙げられる。
【００２３】
硫酸イオンを含む塩としては、例えば、上述の硫酸アルミニウム（Ａｌ2（ＳＯ4）3）、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）、硫酸マグネシウムアルミニウム（ＡｌＭｇＳＯ4）に加え、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム等が挙げられ、より好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）及び硫酸マグネシウムが挙げられる。
【００２４】
カリウムイオンを含む塩としては、上述の硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）、硫酸カリウムに加え、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、硝酸カリウム（ＫＮＯ3）等が挙げられ、好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）、硫酸カリウムが挙げられ、より好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）が挙げられる。
【００２５】
マグネシウムイオンを含む塩としては、上述の硫酸マグネシウムアルミニウム（ＡｌＭｇＳＯ4）、硫酸マグネシウムに加え、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）2）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ2）、硝酸マグネシウム（Ｍｇ（ＮＯ3）2）が挙げられ、好ましくは、硫酸マグネシウムアルミニウム（ＡｌＭｇＳＯ4）、硫酸マグネシウムが挙げられ、より好ましくは、硫酸マグネシウムが挙げられる。
【００２６】
上述の塩は、無水和物であってもよいし、水和物であってもよい。また、水和物の水和数は特に限定されない。
【００２７】
上述の塩の中でも、本発明においては、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、好ましくは、硫酸カリウムアルミニウム（ＡｌＫ（ＳＯ4）2）と硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ4）との組み合わせが挙げられる。
【００２８】
水溶液Ｂにおけるアルミニウムイオンの濃度としては特に限定されないが、水溶液Ａと反応させて効率的にリン酸アルミニウム化合物を得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するアルミニウムイオンの総量として、例えば０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上が挙げられ、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、例えば０．３ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．２ｍｏｌ／Ｌ以下が挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた塩を構成するアルミニウムイオンの総量の具体的な範囲としては、０．０１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．３ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．２ｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
【００２９】
また、水溶液Ｂにおけるアルミニウムイオンの量としては、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するアルミニウムイオンの総量の下限として、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．１ｍｏｌ以上、好ましくは０．２ｍｏｌ以上が挙げられ、上限として、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．５ｍｏｌ以下、好ましくは０．３ｍｏｌ以下が挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するアルミニウムイオンの総量の具体的な範囲としては、溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．１〜０．５ｍｏｌ、０．１〜０．３ｍｏｌ、０．２〜０．５ｍｏｌ、０．２〜０．３ｍｏｌが挙げられる。
【００３０】
水溶液Ｂにおける硫酸イオンの濃度としては特に限定されないが、水溶液Ａと反応させて効率的にリン酸アルミニウム化合物を得る、及び／又はリン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成する硫酸イオンの総量の下限として、例えば０．１ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは０．１５ｍｏｌ／Ｌ以が挙げられ、上限として、例えば１ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．３ｍｏｌ／Ｌ以下が挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成する硫酸イオンの総量の具体的な範囲としては、０．１〜１ｍｏｌ／Ｌ以下、０．１〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１〜０．３ｍｏｌ／Ｌ、０．１５〜１ｍｏｌ／Ｌ、０．１５〜０．５ｍｏｌ／Ｌ、０．１５〜０．３ｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
【００３１】
また、水溶液Ｂにおける硫酸イオンの量としては、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成する硫酸イオンの総量の下限としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．５ｍｏｌ以上、好ましくは０．７ｍｏｌ以上が挙げられ、上限としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、２ｍｏｌ以下、好ましくは１ｍｏｌ以下が挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成する硫酸イオンの総量の具体的な範囲としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．５〜２ｍｏｌ、０．５〜１ｍｏｌ、０．７〜２ｍｏｌ、０．７〜１ｍｏｌが挙げられる。
【００３２】
水溶液Ｂ中にカリウムイオンを含む場合、水溶液Ｂにおけるカリウムイオンの濃度としては特に限定されないが、水溶液Ａと反応させて効率的にリン酸アルミニウム化合物を得る、及び／又はリン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するカリウムイオンの総量の下限としては、例えば０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上が挙げられ、上限としては、０．２ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌが挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するカリウムイオンの総量の具体的な範囲としては、０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．１ｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
【００３３】
また、水溶液Ｂ中にカリウムイオンを含む場合、水溶液Ｂにおけるカリウムイオンの量としては、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するカリウムイオンの総量の下限としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．１ｍｏｌ以上、好ましくは０．２ｍｏｌ以上が挙げられ、上限としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、２．０ｍｏｌ以下、好ましくは１．２ｍｏｌ以下、より好ましくは０．８ｍｏｌ以下、さらに好ましくは０．４ｍｏｌ以下が挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するカリウムイオンの総量の具体的な範囲としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．１〜２．０ｍｏｌ、０．１〜１．２ｍｏｌ、０．１〜０．８ｍｏｌ、０．１〜０．４ｍｏｌ、０．２〜２．０ｍｏｌ、０．２〜１．２ｍｏｌ、０．２〜０．８ｍｏｌ、０．２〜０．４ｍｏｌが挙げられる。
【００３４】
水溶液Ｂ中にマグネシウムイオンを含む場合、水溶液Ｂにおけるマグネシウムイオンの濃度としては特に限定されないが、水溶液Ａと反応させて効率的にリン酸アルミニウム化合物を得る、及び／又はリン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するマグネシウムイオンの総量の下限としては、例えば０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは０．０７ｍｏｌ／Ｌ以上が挙げられ、上限としては、例えば０．２ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ以下が挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するマグネシウムイオンの総量の具体的な範囲としては、０．０５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．０５〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、０．０７〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、０．０７〜０．１ｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
【００３５】
また、水溶液Ｂ中にマグネシウムイオンを含む場合、水溶液Ｂにおけるマグネシウムイオンの量としては、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するマグネシウムイオンの総量の下限としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、０．１ｍｏｌ以上、好ましくは０．２ｍｏｌ以上が挙げられ、上限としては、水溶液Ａの調製に用いたリン酸含有化合物を構成するリン酸イオン１ｍｏｌ当たり、２．０ｍｏｌ以下、好ましくは１．２ｍｏｌ以下、より好ましくは０．５ｍｏｌ以下が挙げられる。水溶液Ｂの調製に用いた上述の塩を構成するマグネシウムイオンの総量の具体的な範囲としては、０．１〜２．０ｍｏｌ、０．１〜１．２ｍｏｌ、０．１〜０．５ｍｏｌ、０．２〜２．０ｍｏｌ、０．２〜１．２ｍｏｌ、０．２〜０．５ｍｏｌが挙げられる。
【００３６】
水溶液Ｂの液性としては特に限定されないが、例えば酸性溶液として調製することができる。酸性溶液としての水溶液Ｂは、上述の塩を水に溶解させることで調製してもよいし、上述の塩を水に溶解させるとともに、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の鉱酸の１種又は複数種を用いてｐＨを調整することにより調製してもよいし、あらかじめ調製した上記鉱酸の酸性水溶液に上述の塩を溶解させることで調製してもよい。水溶液Ｂの具体的なｐＨとしては、好ましくは、前述の水溶液Ａと混合して得られる混合物のｐＨが３〜４となるように、水溶液ＡのｐＨを考慮して決定することができる。具体的には、水溶液ＢのｐＨの下限としては、１．０以上、好ましくは２．５以上が挙げられ、上限としては、７．０以下、好ましくは３．５以下が挙げられる。水溶液ＢのｐＨの具体的な範囲としては、１．０〜７．０、１．０〜３．５、２．５〜７．０、２．５〜３．５が挙げられる。
【００３７】
上述の塩を溶解させる方法としては、特に限定されず、例えば、撹拌、振とう、超音波溶解等が挙げられる。また、上述の塩を溶解させるときの温度及び圧力の条件も特に限定されず、例えば、常温常圧下及び加温常圧下等の条件が挙げられる。
【００３８】
水溶液Ｂは、室温で調製することができる、また、水溶液Ｂは、調製された溶液をフィルターろ過したものであることが好ましい。用いるフィルターの孔径としては、例えば０．２〜１．０μｍ、好ましくは０．２〜０．５μｍ、より好ましくは０．２〜０．４μｍが挙げられる。
【００３９】
［１−３．混合］
水溶液Ａ及び水溶液Ｂは、混合することで、リン酸アルミニウム化合物を生じる。リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、好ましくは、水溶液Ａに対して水溶液Ｂを添加することで混合することができる。添加方法としては特に限定されず、一括添加、滴下添加、分割添加、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、好ましくは、滴下添加、分割添加、及びそれらの組み合わせが挙げられ、より好ましくは滴下添加が挙げられる。同様の観点から、水溶液Ａに対する水溶液Ｂの添加速度を、２体積％／分以下とすることがさらに好ましい。なお、添加速度２体積％／分とは、１分当たりに添加する水溶液Ｂの量が、添加前の水溶液Ａの体積の２体積％となる量で添加する速度をいう。また、水溶液Ａと水溶液Ｂとを反応させて効率的にリン酸アルミニウム化合物を得る等の観点から、水溶液Ａに対する水溶液Ｂの添加速度を、０．１体積％／分以上とすることができる。これらの効果をより好ましく得る観点から、水溶液Ａに対する水溶液Ｂの滴下速度の下限としては、１体積％／分以上、好ましくは１．６体積％／分以上が挙げられ、好ましい上限としては、１．８体積％／分が挙げられる。水溶液Ａに対する水溶液Ｂの滴下速度の具体的な範囲としては、１〜２体積％／分、１〜１．８体積％／分、１．６〜２体積％／分、１．６〜１．８体積％／分が挙げられる。
【００４０】
得られた水溶液Ａと水溶液Ｂとの混合物のｐＨは特に限定されないが、リン酸アルミニウム化合物のタンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、好ましくは３〜４が挙げられる。水溶液Ａと水溶液Ｂとの混合によって、リン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルとして得ることができる。
【００４１】
［１−４．後処理］
生成したリン酸アルミニウム化合物は、混合物からの回収、洗浄、乾燥等の後処理に供される。混合物からの回収、洗浄、乾燥の方法としては特に限定されない。混合物からの回収の方法としては、例えば、ろ過や遠心分離が挙げられ、好ましくは遠心分離が挙げられる。回収されたリン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルの状態で得ることができる。洗浄の方法としては、水溶液への懸濁および遠心分離が挙げられる。好ましくは、回収したリン酸アルミニウム化合物を生理食塩水に懸濁して撹拌し、その後、遠心分離を行う方法が挙げられる。このような洗浄操作は、１回又は複数回行うことができる。洗浄されたリン酸アルミニウム化合物は、沈殿物またはゲルの状態で得ることができる。乾燥の条件としては特に限定されず、製造スケールにもよるが、例えば、５５〜６５℃で１〜２時間が挙げられる。
【００４２】
［２．リン酸アルミニウム化合物］
本発明のリン酸アルミニウム化合物はリン酸アルミニウムとともに、硫黄と、０．５重量％以上のカリウム及び０．０１重量％以上のマグネシウムの少なくともいずれかとを含むことを特徴とする。このように、本発明のリン酸アルミニウム化合物は、リン酸アルミニウム以外の不純物を含んで構成されることで、優れたタンパク質吸着性が奏され、タンパク質精製用担体として有用な物質となる。以下、本発明のリン酸アルミニウム化合物について詳述する。
【００４３】
［２−１．組成］
本発明のリン酸アルミニウム化合物は、リン酸アルミニウムだけでなく、硫黄と、０．５重量％以上のカリウム及び０．０１重量％以上のマグネシウムの少なくともいずれかを含む。タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、本発明のリン酸アルミニウム化合物は、リン酸アルミニウム、硫黄、０．５重量％以上のカリウム及び０．０１重量％以上のマグネシウムを含むことが好ましい。
【００４４】
リン酸アルミニウム化合物中の硫黄（硫黄原子）の含有量は特に限定されないが、タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、下限として、０．５重量％以上、好ましくは１．０重量％以上、より好ましくは１．３重量％以上が挙げられ、上限として、５．０重量％以下、好ましくは３．０重量％以下、より好ましくは２．０重量％以下が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物中の硫黄（硫黄原子）の含有量の具体的な範囲としては、０．５〜５．０重量％、０．５〜３．０重量％、０．５〜２．０重量％、１．０〜５．０重量％、１．０〜３．０重量％、１．０〜２．０重量％、１．３〜５．０重量％、１．３〜３．０重量％、１．３〜２．０重量％が挙げられる。
【００４５】
リン酸アルミニウム化合物中のカリウム（カリウム原子）の含有量は、タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、下限としては、０．５重量％以上であり、好ましくは１．０重量％以上、より好ましくは１．３重量％以上が挙げられ、上限としては５．０重量％以下、好ましくは３．０重量％以下、より好ましくは２．０重量％以下が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物中のカリウム（カリウム原子）の含有量の具体的な範囲としては、０．５〜５．０重量％、０．５〜３．０重量％、０．５〜２．０重量％、１．０〜５．０重量％、１．０〜３．０重量％、１．０〜２．０重量％、１．３〜５．０重量％、１．３〜３．０重量％、１．３〜２．０重量％が挙げられる。
【００４６】
リン酸アルミニウム化合物中のマグネシウム（マグネシウム原子）の含有量は、タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、下限としては、０．０１重量％以上であり、好ましくは０．１０重量％以上、より好ましくは０．１４重量％以上が挙げられ、上限としては１．０重量％以下、好ましくは０．５重量％以下、より好ましくは０．２重量％以下が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物中のマグネシウム（マグネシウム原子）の含有量の具体的な範囲としては、０．０１〜１．０重量％、０．０１〜０．５重量％、０．０１〜０．２重量％、０．１０〜１．０重量％、０．１０〜０．５重量％、０．１０〜０．２重量％、０．１４〜１．０重量％、０．１４〜０．５重量％、０．１４〜０．２重量％が挙げられる。
【００４７】
リン酸アルミニウム化合物中においては、上記の不純物以外に、他の不純物を含んでいてもよい。他の不純物としては、水分およびカルシウム等が挙げられる。
【００４８】
リン酸アルミニウム化合物中における水分量としては、タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、下限としては、好ましくは１５重量％以上、より好ましくは１７重量％以上が挙げられ、上限としては、４０重量％以下、好ましくは３０重量％以下、より好ましくは２０重量％以下が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物中における水分量の具体的な範囲としては、１５〜４０重量％、１５〜３０重量％、１５〜２０重量％、１７〜４０重量％、１７〜３０重量％、１７〜２０重量％が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物における水分量は、後述実施例のように、熱重量−質量分析装置（ＴＧ−ＭＳ）を用いて測定することができる。
【００４９】
リン酸アルミニウム化合物中におけるカルシウム（カルシウム原子）の含有量としては、タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、下限としては、０．００１重量％以上、好ましくは０．００３重量％以上が挙げられ、上限としては、０．１重量％以下、好ましくは０．０１重量％以下、より好ましくは０．００６重量％以下が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物中におけるカルシウム（カルシウム原子）の含有量の具体的な範囲としては、０．００１〜０．１重量％、０．００１〜０．０１重量％、０．００１〜０．００６重量％、０．００３〜０．１重量％、０．００３〜０．０１重量％、０．００３〜０．００６重量％が挙げられる。
【００５０】
リン酸アルミニウム化合物中のアルミニウムの含有量は、上述の不純物を含むことを限度として特に限定されないが、タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、下限としては、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは１２重量％以上が挙げられ、上限としては、３５重量％以下、より好ましくは３０重量％以下、さらに好ましくは２８重量％以下、一層好ましくは１６重量％以下、特に好ましくは１５重量％以下が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物中のアルミニウムの含有量の具体的な範囲としては、１０〜３５重量％、１０〜３０重量％、１０〜２８重量％、１０〜１６重量％、１０〜１５重量％、１２〜３５重量％、１２〜３０重量％、１２〜２８重量％、１２〜１６重量％、１２〜１５重量％、１０〜３５重量％、１０〜３０重量％、１０〜２８重量％、１０〜１６重量％、１０〜１５重量％が挙げられる。
【００５１】
リン酸アルミニウム化合物中のリンに対するアルミニウムのモル比（Ａｌ（ｍｏｌ）／Ｐ（ｍｏｌ））としては、下限としては、例えば０．１以上、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．７以上、一層好ましくは０．９以上が挙げられ、上限としては２．０以下、好ましくは１．５以下、より好ましくは１．０以下が挙げられる。リン酸アルミニウム化合物中のリンに対するアルミニウムのモル比の具体的な範囲としては、０．１〜２．０、０．１〜１．５、０．１〜１．０、０．５〜２．０、０．５〜１．５、０．５〜１．０、０．７〜２．０、０．７〜１．５、０．７〜１．０、０．９〜２．０、０．９〜１．５、０．９〜１．０が挙げられる。
【００５２】
［２−２．物理的特性］
本発明のリン酸アルミニウム化合物は、非晶質であり、表面に微細な凹凸を有する。微細な凹凸は、例えば、電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察において、５０００倍視野において確認することができる。具体的には、リン酸アルミニウム化合物は、タンパク質吸着性をより良好に得る等の観点から、累積細孔容積として、好ましくは１．０〜１．５ｍＬ／ｇ、より好ましくは１．０〜１．２ｍＬ／ｇが挙げられ；平均細孔直径として、好ましくは０．０１〜０．１μｍ、より好ましくは０．０１〜０．０４μｍが挙げられ；かさ密度として、好ましくは０．５〜１．０ｇ／ｍＬ、より好ましくは０．６３〜１．０ｇ／ｍＬが挙げられ；見掛け密度として、好ましくは２．０〜２．５ｇ／ｍＬ、より好ましくは２．１〜２．４ｇ／ｍＬが挙げられ；気孔率としては、好ましくは６０〜８０％、より好ましくは６０〜７０％が挙げられる。累積細孔容積、平均細孔直径、かさ密度、見掛け密度、及び気孔率は、後述の実施例に記載のように水銀圧入法によって測定することができる。水銀圧入法は、細孔に水銀圧入する際の圧力と圧入量とから細孔分布を求めることができるとともに、セルの容積、セル内の水銀の重量から求めた水銀の体積、細孔容積から、かさ密度、見掛け密度、気孔率も求めることができる方法として公知の方法である。
【００５３】
［２−３．製造］
本発明のリン酸アルミニウム化合物の製造方法としては、上述の組成でリン酸アルミニウム化合物を得ることができる方法であれば特に限定されないが、好ましくは、上述の「１．リン酸アルミニウム化合物の製造方法」で述べた方法によって製造される。なお、カルシウムを上述の含有量で含ませるために、リン酸アルミニウム化合物の製造方法においてカルシウムを含む塩を原料に用いても構わないが、好ましくは、カルシウムを含む塩を原料に用いず、上述の水分量で保持される水に由来する成分としてカルシウムを包含させることができる。
【００５４】
［２−４．用途］
本発明のリン酸アルミニウム化合物は、タンパク質の吸着性に優れているため、タンパク質精製用の担体として有用である。これまでの精製用担体では十分な精製が不可能であったタンパク質、特にワクチンに対する精製用の担体として好適に用いられる。ワクチンの種類としては特に限定されないが、例えば、インフルエンザＨＡワクチン、ポリオワクチン、日本脳炎ワクチン、百日咳ワクチン、ムンプスワクチン、破傷風ワクチン、ジフテリアワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザｂ型ワクチン、ヒトパピローマウイルスワクチン、ロタウイルスワクチン等が挙げられる。
【００５５】
本発明のリン酸アルミニウム化合物は、無細胞系により合成したタンパク質、並びに／若しくは、細菌、酵母、藻類、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び動物培養細胞等を宿主として発現させたタンパク質の精製用担体として用いることができる。
【００５６】
また、本発明のリン酸アルミニウム化合物は、医薬品の品質管理にとって大きな問題となる大腸菌由来のエンドトキシンも効果的に除去することができる。従って、本発明のリン酸アルミニウム化合物は、大腸菌を宿主として発現させたタンパク質の精製に特に好適である。
【００５７】
さらに、本発明のリン酸アルミニウム化合物は、ヒスチジンタグとの親和性に優れていることから、ヒスチジンタグが付された状態で合成又は発現させたタンパク質の精製にも好適である。なお、本発明のリン酸アルミニウム化合物は、ヒスチジンタグが付加されていないタンパク質に対しても優れた特異性を示すため、ヒスチジンタグ付加の有無にかかわらず、広範なタンパク質の精製に好適である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例及び比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５９】
［試験例１：リン酸アルミニウム化合物の製造］
以下の組成の水溶液Ａ及び水溶液Ｂを、それぞれ、常温（室温２３℃）、常圧下で調製し、孔径０．２２μｍのフィルターでろ過した。
・水溶液Ａ
リン酸水素二ナトリウム１２水和物３５．９ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（リン酸イオン濃度：０．２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ（２３℃）：９．０〜９．５）を調製した。
・水溶液Ｂ
硫酸カリウムアルミニウム１２水和物２８．４ｇ及び硫酸マグネシウム七水和物９．８６ｇに水を加えて撹拌して溶解し、全体で１０００ｍＬの水溶液（アルミニウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、硫酸イオン濃度：０．２ｍｏｌ／Ｌ、カリウムイオン濃度：０．０６ｍｏｌ／Ｌ、マグネシウムイオン濃度：０．０８ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ（２３℃）：３．０〜３．５）を調製した。【００６０】
水溶液Ａと水溶液Ｂを体積比１：１で混合した。具体的には、水溶液Ａを表１に記載の撹拌速度で撹拌しながら、表１に記載の添加速度速度で水溶液Ｂを滴下添加して得られた混合物（ｐＨ（２３℃）：３．０〜３．５）を５，０００×ｇで１５分間遠心分離し、ゲル状の沈殿物を回収した。回収したゲル状物を０．９ｗ／ｖ％生理食塩水に投入し、ホモジナイザーを用いて懸濁させて洗浄し、その後、５，０００×ｇで１５分間遠心分離を行って、ゲル状物を回収した。ゲル状物の生理食塩水への懸濁及び遠心分離を同じ条件でもう１回行った。得られたゲル状物をトレーに広げて１〜２時間、６０℃で乾燥させた。これによって、白色結晶である乾燥ゲルを得た。乾燥ゲルを、手作業で破砕・粉末化し、リン酸アルミニウム化合物を得た。【００６１】
【表１】
2019225667.tif 000003
【００６２】
［試験例２：リン酸アルミニウム化合物の分析］
実施例１及び実施例２のリン酸アルミニウム化合物について、以下の分析を行った。【００６３】
（１）元素分析（Ａｌ、Ｋ、Ｐ、Ｓ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｎａ）の測定
・測定方法：酸分解／ＩＣＰ−ＡＥＳ法
・測定装置：Ａｇｉｌｅｎｔ５１１０（アジレント・テクノロジー社製）
・結果：元素分析の結果を下記表２及び表３に示す。下記表に示すように、Ａｌ及びＰが主成分として検出されており、そのほかにＮａ及びＣｌ（表中に示ず）が検出された。Ｎａ及びＣｌについては、後述のＸＲＤでも検出確認されており、ＮａＣｌ由来であると推測できる。主成分であるＡｌ及びＰを含む化合物は、後述のＸＲＤから非晶質と判断された。検出元素より、非晶質の組成は、無水リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウム水和物、及びリン酸水素アルミニウムが挙げられる。後述の熱重量−質量分析によって水分が含まれていることから、無水リン酸アルミニウムではないと考えられる。また、リン酸水素アルミニウムであれば潮解性を認める筈であるところ、各測定時に潮解の挙動が認められなかったため、リン酸水素アルミニウムではないと考えられる。したがって、得られた非晶質はリン酸アルミニウム水和物と考えられる。水分量とＡｌの定量値とから、水和数としては、１．５〜２と考えられる。【００６４】
【表２】
2019225667.tif 000004
【００６５】
【表３】
2019225667.tif 000005
【００６６】
（２）累積細孔容積、平均細孔直径、かさ密度、見掛け密度、及び気孔率の測定
・測定法：水銀圧入法
・前処理及び測定条件：
試料を室温一昼夜、真空乾燥させた。水銀圧入法により細孔直径約０．００３６〜２００μｍの細孔分布を求めた。細孔径はＷａｓｈｂｕｒｎの式を用いて算出した。
【数１】
2019225667.tif 000006
・測定装置：オートポアＩＶ９５２０（ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ社製）
・結果：測定結果を下記表４に示す。【００６７】
【表４】
2019225667.tif 000007
【００６８】
（３）Ｘ線回折
・前処理及び測定条件：
試料をメノウ乳鉢で粉砕した後、試料セル（Ａｌ製）に充填した。
Ｘ線管球        ：ＣｕＫα
光学系          ：集中法
管電圧・管電流  ：４５ｋＶ−２００ｍＡ
スキャン範囲    ：５−８０ｄｅｇ
スキャンステップ：０．０２ｄｅｇ
スキャンスピード：１０ｄｅｇ／分
検出器          ：一次元半導体検出器
・測定装置：Ｘ線回折分析装置  ＳｍａｒｔＬａｂ（Ｒｉｇａｋｕ製）
・結果：測定結果を下記表５に示す。なお、測定結果は、同定された化合物のみで試料が構成されると仮定し、ライブラリパターンとのマッチングから算出した。【００６９】
【表５】
2019225667.tif 000008
【００７０】
（４）熱重量−質量分析
・前処理及び測定条件：
（ＴＧ−ＤＴＡ）
パン      ：Ｐｔ（開放式）
測定範囲  ：ＲＴ〜１０００℃
昇温速度  ：１０℃／分
雰囲気    ：Ｎ2２００ｍＬ／分
（ＭＳ）
イオン化  ：ＥＩ
走査範囲  ：ｍ／ｚ＝２〜２００
・測定装置：熱重量質量分析同時測定装置  ＴＧ−ＤＴＡ２０２０ＳＡ／ＭＳ９６１０（ＢｒｕｋｅｒＡＸＳ製）
・結果：ｍ／ｚ＝１８のイオン強度から算出した脱水量評価は、実施例１で１８重量％、実施例２で１７重量％であった。【００７１】
（５）電子顕微鏡観察
・測定方法：電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）法
・前処理及び測定条件：
試料を採取し、白金蒸着後、試料の表面５００倍及び５０００倍視野をＦＥ−ＳＥＭにて観察及び撮影した。
・測定装置：ＦＥ−ＳＥＭ／ＥＤＸ  ＪＳＭ−７５００ＦＡ（ＪＥＯＬ製）
観察結果を図１に示す。図１に示すように、実施例１及び実施例２のリン酸アルミニウム化合物の表面に微細凹凸が確認された。なお、表面に所々存在する粒子は、ＮａＣｌであることを確認した。【００７２】
［試験例３：ヒスチジンタグを有するタンパク質の精製］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）：メルク社製）に、Ｈｉｓ−Ｆｌａｇ−蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ：クロンテック社製）を発現させた後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁して、超音波破砕した。これによって、粗タンパク質液を得た。この粗タンパク質液のうち、タンパク質の量として１０ｍｇを含む粗タンパク質液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁し、担体として、実施例１で作製したリン酸アルミニウム化合物３００ｍｇ又は市販のリン酸アルミニウム（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製ＣＡＳ：７７８４−３０−７  Ｃａｔ＃：１１１０９）３００ｍｇを混合してタンパク質を吸着させた。【００７３】
【表６】
2019225667.tif 000009
【００７４】
タンパク質を吸着させた担体を回収し、溶出液（１２０ｍＭ  ＥＤＴＡ−３ＮＡを添加したリン酸緩衝液）を加え、担体に吸着していたタンパク質を溶出液に遊離させ、溶出液を回収した。得られた溶出液を図２に示す。図２に示すように、本発明のリン酸アルミニウム化合物を担体として用いた実施例３では、比較例１に比べて明らかに強い蛍光を示しており、比較例１に比べて多量のタンパク質を吸着していることが認められる。【００７５】
回収した溶出液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。ゲルとしては、アクリルアミドの濃度勾配をつけたゲル（５〜２０重量％グラジエントゲル）を用い、溶出液のアプライ量は１７μＬとした。電気泳動結果を図３に示す。図３中、レーン（i）は担体に吸着させる前の粗タンパク質液の結果、レーン（ii）は実施例３の結果、レーン（iii）は比較例１の結果を示す。また、矢印で示されたバンドが、Ｈｉｓ−Ｆｌａｇ−蛍光タンパク質に相当する。図３のレーン（ii）（実施例３）とレーン（iii）（比較例１）との比較からわかるように、市販のリン酸アルミニウムはタンパク質精製の担体として十分な機能を果たすものではなかった一方で、本発明のリン酸アルミニウム化合物はタンパク質精製の担体として好適であることが示された。【００７６】
［試験例４：ヒスチジンタグを有しないタンパク質の精製］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）：メルク社製）に肺炎球菌表面タンパク質を発現させた後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に懸濁して、圧力式ホモジナイザーを用いて破砕した。これによって、粗タンパク質液を得た。この粗タンパク質液のうち、タンパク質の量として４ｍｇを含む粗タンパク質液を、界面活性剤および塩化ナトリウムを含む３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７５）に懸濁し、担体として、実施例１および２で作製したリン酸アルミニウム化合物１２０ｍｇを混合して、タンパク質を吸着させた。【００７７】
【表７】
2019225667.tif 000010
【００７８】
タンパク質を吸着させた担体を回収し、溶出液（１２０ｍＭ  ＥＤＴＡ−３ＮＡを添加したリン酸緩衝液）を加え、担体に吸着していたタンパク質を溶出液に遊離させ、溶出液を回収した。さらに、回収した溶出液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。ゲルとしては、アクリルアミドの濃度が均一なゲル（１２．５％ゲル）を用い、溶出液のアプライ量は１７μＬとした。電気泳動結果を図４に示す。図中、レーン（i）は実施例４（実施例１のリン酸アルミニウム化合部を担体として使用）、レーン（ii）は実施例５（実施例２のリン酸アルミニウム化合部を担体として使用）の結果を示す。また、矢印で示されたバンドが、肺炎球菌表面タンパク質に相当する。図４のレーン（i）とレーン２（ii）との比較からわかるように、実施例１のリン酸アルミニウム化合部を担体として使用した方が、より一層タンパク質の精製効率が良いことが示された。【００７９】
なお、大腸菌由来のエンドトキシンは医薬品の品質管理にとって大きな問題となるが、本試験例においては、回収した溶出液から大腸菌由来のエンドトキシンは検出されなかった。つまり、本発明のリン酸アルミニウム化合物によって、大腸菌由来のエンドトキシンも効果的に除去できることが分かった。
【図１】
2019225667.tif 000011
【図２】
2019225667.tif 000012
【図３】
2019225667.tif 000013
【図４】
2019225667.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月28日(2019.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イオンを含む水溶液Ａ、及び、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンの少なくともいずれかとを含む水溶液Ｂ、の混合を行い、リン酸アルミニウム化合物を含むｐＨが３〜４の混合液を得る工程を含む、リン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項２】
前記水溶液Ａがリン酸一水素塩水溶液である、請求項１に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項３】
前記水溶液Ｂが、前記カリウムイオン及び前記マグネシウムイオンを含む、請求項１又は２に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項４】
前記水溶液Ｂが、硫酸カリウムアルミニウム及び硫酸マグネシウムの少なくともいずれかを水に溶解して調製したものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項５】
前記水溶液Ａに対し、前記水溶液Ｂを２体積％／分以下の速度で添加することによって前記混合を行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項６】
前記リン酸アルミニウム化合物が、タンパク質精製用担体に用いられるものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法によって得られるリン酸アルミニウム化合物。
【請求項８】
リン酸アルミニウムとともに、硫黄と、０．５重量％以上のカリウム及び０．０１重量％以上のマグネシウムの少なくともいずれかとを含み、タンパク質精製用担体に用いられる、リン酸アルミニウム化合物。
【請求項９】
前記硫黄の含有量が０．５重量％以上である、請求項８に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１０】
アルミニウムの含有量が１０〜１６重量％である、請求項８又は９に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１１】
水分量が１５重量％以上である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１２】
カルシウムの含有量が０．００１重量％以上である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１３】
無細胞系により合成したタンパク質、並びに／若しくは、細菌、酵母、藻類、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び動物培養細胞からなる群より選択される宿主において発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、請求項８〜１２のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１４】
大腸菌を宿主として発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、請求項８〜１３のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月9日(2019.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イオンを含む水溶液Ａ、及び、アルミニウムイオン及び硫酸イオンと、カリウムイオン及びマグネシウムイオンとを含む水溶液Ｂ、の混合を行い、リン酸アルミニウム化合物を含むｐＨが３〜４の混合液を得る工程を含む、リン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項２】
前記水溶液Ａがリン酸一水素塩水溶液である、請求項１に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項３】
前記水溶液Ｂが、硫酸カリウムアルミニウム及び硫酸マグネシウムを水に溶解して調製したものである、請求項１又は２に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項４】
前記水溶液Ａに対し、前記水溶液Ｂを２体積％／分以下の速度で添加することによって前記混合を行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項５】
前記リン酸アルミニウム化合物が、タンパク質精製用担体に用いられるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物の製造方法。
【請求項６】
リン酸アルミニウムとともに、硫黄と、０．５重量％以上のカリウム及び０．０１重量％以上のマグネシウムとを含み、タンパク質精製用担体に用いられる、リン酸アルミニウム化合物。
【請求項７】
前記硫黄の含有量が０．５重量％以上である、請求項６に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項８】
アルミニウムの含有量が１０〜１６重量％である、請求項６又は７に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項９】
水分量が１５重量％以上である、請求項６〜８のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１０】
カルシウムの含有量が０．００１重量％以上である、請求項６〜９のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１１】
無細胞系により合成したタンパク質、並びに／若しくは、細菌、酵母、藻類、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び動物培養細胞からなる群より選択される宿主において発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【請求項１２】
大腸菌を宿主として発現させたタンパク質の精製に用いられるものである、請求項６〜１１のいずれか一項に記載のリン酸アルミニウム化合物。
【国際調査報告】
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