(57)【要約】  ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子を有し、前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子及び前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つは菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物、並びにピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入された組換え微生物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子を有し、
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子及び前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つは菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物。
【請求項２】
前記ピリドキサミン合成酵素が、ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼである、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼが下記の部分アミノ酸配列（ａ）及び部分アミノ酸配列（ｂ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１又は請求項２に記載の組換え微生物。
（ａ）  ＮＸ１Ｘ２ＥＸ３ＹＧ（配列番号９７）
（ここで、Ｘ１は、Ｖ、Ｃ、Ｉ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｇ又はＬを表し、
Ｘ２は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｆ又はＬを表す）
（ｂ）  Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＫＧＸ７（配列番号９８）
（Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｆ又はＬを表し、
Ｘ５は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｃ又はＭを表し、
Ｘ６は、Ｃ、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｗ又はＦを表し、
Ｘ７は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＣを表す）
【請求項４】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼが酵素番号ＥＣ１．１．１．６５で表される、請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する、請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、
配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１３及び配列番号７５〜８１のいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１３及び配列番号７５〜８１のいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜請求項５のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅに由来する、請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号８のヌクレオチド配列を有するか、配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜請求項４及び請求項７のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号１、配列番号２及び配列番号２２〜配列番号２８のうちいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２及び配列番号２２〜２８のアミノ酸配列のうち少なくとも１つと８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜請求項８のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記ピリドキサミン合成酵素が、下記の部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有する、請求項１〜請求項９のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
（ｃ）  Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号９９）
（Ｘ８は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ９は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＡを表す）
（ｄ）  Ｘ１４Ｘ１５ＴＰＳＧＴＸ１６Ｘ１７（配列番号１００）
（Ｘ１４は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１５は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ１６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１７は、Ｎ又はＴを表す）
（ｅ）  Ｘ１８ＤＸ１９ＶＳＸ２０Ｘ２１（配列番号１０１）
（Ｘ１８は、Ｖ、Ｉ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ａ、Ｔ又はＳを表し、
Ｘ２０は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｗ、又はＶを表す）
（ｆ）  Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４ＫＣＸ２５ＧＸ２６Ｘ２７Ｐ（配列番号１０２）
（Ｘ２２は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ２３は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ２４は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ａ又はＱを表し、
Ｘ２５は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ２７は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表す）
（ｇ）  Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＳＸ３２ＧＸ３３Ｘ３４（配列番号１０３）
（Ｘ２８は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ２９は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３０は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ３１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ３２は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ３３は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ３４は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す）
（ｈ）  Ｘ３５Ｘ３６ＲＸ３７Ｘ３８ＨＭＧＸ３９Ｘ４０Ａ（配列番号１０４）
（Ｘ３５は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３６は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３７は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３８は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ３９は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ４０は、Ｔ、Ｖ又はＳを表す）
【請求項１１】
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３０で表される、請求項１〜請求項１０のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉに由来する、請求項１〜請求項１１のうちのいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、
配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域若しくは配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜請求項１２のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５のうちいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５のアミノ酸配列のうち少なくとも１つと８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜請求項１３のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
前記アミノ酸再生酵素がアラニンデヒドロゲナーゼである、請求項１０〜請求項１４のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記アラニンデヒドロゲナーゼが、ピルビン酸及びＮＨ３からＬ−アラニンを生成する反応の際にＮＡＤＰＨを補酵素として利用可能である、請求項１５に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
前記アラニンデヒドロゲナーゼが下記の部分アミノ酸配列（ｉ）、部分アミノ酸配列（ｊ）、部分アミノ酸配列（ｋ）及び部分アミノ酸配列（ｌ）のうち少なくとも１つを含み、且つピルビン酸及びＮＨ３からＬ−アラニンを生成する活性を有する請求項１５又は請求項１６に記載の組換え微生物。
（ｉ）  ＥＸ４１ＫＸ４２Ｘ４３ＥＸ４４ＲＸ４５Ｘ４６（配列番号１０５）
（Ｘ４１は、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｆ、Ｎ又はＶを表し、
Ｘ４２は、Ｎ、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｔ又はＤを表し、
Ｘ４３は、Ｈ、Ｎ、Ｌ又はＱを表し、
Ｘ４４は、Ｙ、Ｎ又はＦを表し、
Ｘ４５は、Ｖ、又はＩを表し、
Ｘ４６は、Ｇ又はＡを表す）
（ｊ）  Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９ＫＶＫＥＰＸ５０（配列番号１０６）
（Ｘ４７は、Ｍ又はＬを表し、
Ｘ４８は、Ｉ、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ４９は、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭを表し、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｌ、Ｖ、Ｎ又はＩを表す）
（ｋ）  ＬＸ５１ＴＹＬＨＬＡ（配列番号１０７）
（Ｘ５１は、Ｆ又はＹを表す）
（ｌ）  Ｘ５２ＤＸ５３ＡＸ５４ＤＱＧＧ（配列番号１０８）
（Ｘ５２は、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ５３は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ５４は、Ｉ又はＶを表す）
【請求項１８】
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子がＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０に由来する、請求項１５〜請求項１７のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、
配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１５〜請求項１８のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号５及び配列番号４５〜配列番号５２のうちいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号５及び配列番号４５〜配列番号５２のアミノ酸配列のうち少なくとも１つと８０％以上の配列同一性を有し且つアラニン再生酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１５〜請求項１９のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３１又はＥＣ２．６．１．１で表される、請求項１〜請求項９のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する、請求項１〜請求項９及び請求項２１のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するか、配列番号１０のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜請求項９、請求項２１及び請求項２２のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１〜請求項９及び請求項２１〜請求項２３のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記アミノ酸再生酵素がグルタミン酸デヒドロゲナーゼである、請求項２１〜請求項２４のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する、請求項２５に記載の組換え微生物。
【請求項２７】
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号１２のヌクレオチド配列を有するか、配列番号１２のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルタミン酸再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項２５又は請求項２６に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し且つグルタミン酸再生酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項２５〜請求項２７のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２９】
組換え大腸菌である、請求項１〜請求項２８のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３０】
請求項１〜請求項２９のうちいずれか一項に記載の組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを接触させ、ピリドキサミン又はその塩を生産させる、ピリドキサミン又はその塩の製造方法。
【請求項３１】
前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、前記ピリドキサミン合成酵素、及び前記アミノ酸再生酵素を含む、請求項３０に記載の製造方法。
【請求項３２】
前記組換え微生物の処理物又は前記組換え微生物の培養物の処理物が、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理による処理物である、請求項３０又は請求項３１に記載の製造方法。
【請求項３３】
以下の（１）〜（７）に記載のポリヌクレオチドのうち少なくとも１つが導入された組換え微生物：
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列において、１個〜５０個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記タンパク質はピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するものである、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記タンパク質はピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するものである、ポリヌクレオチド、
（４）配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（５）配列番号１３のヌクレオチド配列において、１個〜１５０個のヌクレオチドが欠失、付加又は置換されているヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（６）配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（７）配列番号１３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
前記組換え微生物が組換え細菌である、請求項３３に記載の組換え微生物。
【請求項３５】
前記組換え微生物が組換え大腸菌である、請求項３４に記載の組換え微生物。
【請求項３６】
前記タンパク質が、ＥＣ番号１．１．１．６５に分類される酵素である、請求項３３〜請求項３５のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３７】
前記タンパク質が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼである、請求項３３〜請求項３６のうちいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項３８】
請求項３３〜請求項３７のうちいずれか一項に記載の組換え微生物と、ピリドキシン若しくはその塩とを接触させることを含む、ピリドキサール若しくはその塩の製造方法。
【請求項３９】
請求項３３〜請求項３７のうちいずれか一項に記載の組換え微生物を培養して得られる培養物又は培養物の処理物と、ピリドキシン若しくはその塩とを接触させることを含む、ピリドキサール若しくはその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ピリドキサミン又はその塩を生産可能な組換え微生物及び該組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法、並びにピリドキサール又はその塩を生産可能な組換え微生物及び該組換え微生物を用いたピリドキサール又はその塩の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピリドキサミン及びその塩はビタミンＢ６の一種であり、糖化反応阻害作用を有することが知られている。ピリドキサミン及びその塩は例えば、種々の老化反応に関与する最終糖化産物（Advanced Glycation End Products; AGE）の体内への蓄積を阻害する。ＡＧＥはタンパク質の糖化によって生成する物質の総称であり、ＡＧＥの蓄積は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、慢性腎不全、アルツハイマー型認知症等の疾患を悪化させるとされている。このため、ピリドキサミン及びその塩はＡＧＥの蓄積を防ぐことでこれらの疾患の予防や治療を可能にすると期待される有望な物質である。【０００３】
また、ピリドキサミン及びその塩は統合失調症薬としての活性も有することが知られており、その実用化に向けての研究が種々なされている。その他、ピリドキサミン及びその塩の有する種々の生理活性を利用した健康食品や化粧品の開発も進められている。
ピリドキサミン及びその塩は化学的に合成することが可能である。例えば国際公開第２００６／０６６８０６号は、アラニンとギ酸を出発物質としてピリドキサミン二塩酸塩を化学的に合成する方法を開示している。また、国際公開第２００５／０７７９０２号は、ピリドキシンからピリドキサミンを化学的に合成する方法を開示している。【０００４】
一方、ピリドキサミンを生物学的に合成することも検討されている。国際公開第２００７／１４２２２２号はアクロモバクター属等の特定の微生物を用いてピリドキサールからピリドキサミンを得る方法を開示している。また、国際公開第２００７／１４２２２２号はピリドキシン存在下でアクレモニウム  フシジオイデスを培養することにより、一定量がピリドキサールに変換された実験も開示している。
特開平９−１０７９８５号公報はリゾビウム属に属しビタミンＢ６生産能を有する微生物を、好気的条件下、培地中で培養し、生成したビタミンＢ６を培養液から得るビタミンＢ６の製造方法を開示している。【０００５】
ビタミンＢ６合成に関する研究としては、国際公開第２００４／０３５０１０号はバチルス  サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｙａａＤ及びｙａａＥのうち少なくとも一方の活性が親生物よりも増強した生物を培養してビタミンＢ６混合物を製造する方法を開示している。特開２０００−２３６９０号公報は、リゾビウム メリロティ（Rhizobium meliloti）ＩＦＯ １４７８２の無細胞抽出物を用いたビタミンＢ６混合物の生産を記載している。Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110は配列改変によりＬ−グルタミン酸を利用可能となるように改変されたピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＰＰＡＴ)を開示している。この改変配列を有するＰＰＡＴを発現する大腸菌を、飽和量のピリドキサール存在下でインキュベートすることにより、ピリドキサミンを生産することができたことが記載されている。【０００６】
また、ピリドキサールも、ビタミンＢ６の１種であり、生物の生存に必要な栄養素である。ビタミンＢ６は、食品や食品添加物に利用されるのみならず、医薬品、化粧品原料など幅広い用途を有している。ピリドキサールは単独の成分として有用な用途がある。例えば、ピリドキサールリン酸は活性型のビタミンＢ６剤として用いられており、ピリドキサールはピリドキサールリン酸を製造するための中間体となり得る物質である。ピリドキサールは、医薬品、化粧品、食品、又はこれらの製造のための中間体として有用である。特公昭４３−５７１２号公報は、ピリドキシン酸化酵素によるピリドキシンからピリドキサールへの転換酵素反応において反応液中にカルボニル試薬を添加することを特徴とするピリドキサール−カルボニル誘導体の製造方法を開示している。また、The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274, No. 33, Issue of August 13, pp. 23185-23190もこのような転換酵素を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、化学的合成によるピリドキサミン合成によっては高い反応収率が得られていない。例えば、国際公開第２００６／０６６８０６号に記載の方法では、多くの化学反応を経てピリドキサミン二塩酸塩が合成されるため、反応収率は低くなってしまう。また、国際公開第２００５／０７７９０２号に記載の方法ではピリドキサミンの二量体と三量体が生成し、反応収率もさほど高いものではない。
一方、特定の種の微生物を用いた方法である国際公開第２００７／１４２２２２号に記載の方法では、ピリドキサールからピリドキサミンへの変換効率が微生物種によって大きくばらついており、また全体としてはさほど高いものではなかった。また、国際公開第２００７／１４２２２２号に記載のピリドキシン存在下でのアクレモニウム  フシジオイデスの培養実験では、生成物の大部分がピリドキサミンではなくピリドキサールであった。さらに、特開平９−１０７９８５号公報の記載においては、生成したビタミンＢ６は、そのほとんどがピリドキソール（ピリドキシン）であり、ピリドキサミンの生成はわずかであった。【０００８】
国際公開第２００４／０３５０１０号では、ｙａａＤやｙａａＥの遺伝子を高発現させた微生物を培地で培養させることにより、ビタミンＢ６が得られたことを記載しているものの、生成物はピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、ピリドキサミンリン酸などの混合物であって、ピリドキサミンを選択的に得ることはできなかった。
上記のように、ピリドキサミン又はその塩の化学的合成（例えば国際公開第２００６／０６６８０６号や国際公開第２００５／０７７９０２号）は、多くの反応及び精製工程を経るものであって、高い収率が得られていない。また、微生物の中にはピリドキサミン合成能を有するものもいるものの（例えば国際公開第２００７／１４２２２２号や特開平９−１０７９８５号公報）、そうした微生物を新たに発見することは手間がかかり、また、ビタミンＢ６群の中でピリドキサミン又はその塩を選択的に合成することができておらず、高いピリドキサミン生産効率も得られていない。また、このように天然に存在する微生物種から特定の微生物種をスクリーニングするというアプローチからは、ビタミンＢ６を高生産するためにはどの酵素あるいは遺伝子が重要であるかという分子生物学的な情報は得られない。【０００９】
さらにビタミンＢ６の生産に対して遺伝子組換え技術を用いて作製した組換え微生物を用いた例もあるが（国際公開第２００４／０３５０１０号及びJournal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110）、物質生産の際には通常の培地を用いてビタミンＢ６が非選択的に得られたか（国際公開第２００４／０３５０１０号）、あるいは高価な原料であるピリドキサールを飽和量で用いてピリドキサミンが得られており（Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110）、ピリドキサミン又はその塩を安価に且つ選択性よく生産することは達成できていない。【００１０】
以上のような状況に鑑みて、本開示の第１の態様では、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で安価に生産できる組換え微生物、及び該組換え微生物を用いてピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で安価に生産する方法を提供する。【００１１】
また、ピリドキサール生産について、工業的な生産に使用され得るような効率がよい酵素的生産方法は未だ実用化されていない。国際公開公報２００４／０３５０１０号に記載の方法及び特開２０００−２３６９０号公報に記載の方法においては、酵素的方法によってピリドキシン、ピリドキサール及びピリドキサミンの混合物が得られるが、これらの方法は、ピリドキサールを選択的に、つまりピリドキシンやピリドキサミンとの混合物としてではなく高い純度のピリドキサールとして、得ることができる方法ではない。
特公昭４３−５７１２号公報に記載の方法では、反応系にカルボニル試薬の添加が必須である。カルボニル試薬は、生成されたピリドキサールをカルボニル誘導体に変換するものである。しかし、ピリドキサールを中間体として次の反応に供するためには、カルボニル誘導体を生成する方法は適していないことが多い。
本発明者らは、ピリドキサールの工業的生産の観点から、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入された工業的に利用可能な組換え微生物の作製を試みた。このような遺伝子組換え微生物の宿主細胞は、コスト及び製造の容易さの観点から原核生物であることが好ましいが、例えば導入する遺伝子が真核生物の遺伝子である場合、真核生物において発現するタンパク質をコードする遺伝子を原核生物に導入し発現させることは多くの困難を伴い、しばしば活性を保持したままのタンパク質を発現させることができない。そこで、本開示の第２の態様では、導入されたピリドキシンデヒドロゲナーゼを有し発現する、組換え微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示の第１の態様は以下を含む。
＜１＞
ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子を有し、
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子及び前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つは菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物。
＜２＞
前記ピリドキサミン合成酵素が、ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ、ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、又はピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼである、＜１＞に記載の組換え微生物。
＜３＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼが下記の部分アミノ酸配列（ａ）及び部分アミノ酸配列（ｂ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有する、＜１＞又は＜２＞に記載の組換え微生物。
（ａ）  ＮＸ１Ｘ２ＥＸ３ＹＧ（配列番号９７）
（ここで、Ｘ１は、Ｖ、Ｃ、Ｉ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｇ又はＬを表し、
Ｘ２は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｆ又はＬを表す）
（ｂ）  Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＫＧＸ７（配列番号９８）
（Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｆ又はＬを表し、
Ｘ５は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｃ又はＭを表し、
Ｘ６は、Ｃ、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｗ又はＦを表し、
Ｘ７は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＣを表す）
＜４＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼが酵素番号ＥＣ１．１．１．６５で表される、＜１＞〜＜３＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜５＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来する、＜１＞〜＜４＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜６＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、
配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１３及び配列番号７５〜８１のいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１３及び配列番号７５〜８１のいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜５＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜７＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号７のヌクレオチド配列を有するか、配列番号７のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜６＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜８＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅに由来する、＜１＞〜＜４＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜９＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号８のヌクレオチド配列を有するか、配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜４＞及び＜８＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１０＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号１、配列番号２及び配列番号２２〜配列番号２８のうちいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号１、配列番号２及び配列番号２２〜２８のアミノ酸配列のうち少なくとも１つと８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜９＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１１＞
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列のうち少なくとも１つと８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜１０＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１２＞
前記ピリドキサミン合成酵素が、下記の部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有する、＜１＞〜＜１１＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
（ｃ）  Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号９９）
（Ｘ８は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ９は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＡを表す）
（ｄ）  Ｘ１４Ｘ１５ＴＰＳＧＴＸ１６Ｘ１７（配列番号１００）
（Ｘ１４は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１５は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ１６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１７は、Ｎ又はＴを表す）
（ｅ）  Ｘ１８ＤＸ１９ＶＳＸ２０Ｘ２１（配列番号１０１）
（Ｘ１８は、Ｖ、Ｉ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ａ、Ｔ又はＳを表し、
Ｘ２０は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｗ、又はＶを表す）
（ｆ）  Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４ＫＣＸ２５ＧＸ２６Ｘ２７Ｐ（配列番号１０２）
（Ｘ２２は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ２３は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ２４は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ａ又はＱを表し、
Ｘ２５は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ２７は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表す）
（ｇ）  Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＳＸ３２ＧＸ３３Ｘ３４（配列番号１０３）
（Ｘ２８は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ２９は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３０は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ３１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ３２は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ３３は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ３４は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す）
（ｈ）  Ｘ３５Ｘ３６ＲＸ３７Ｘ３８ＨＭＧＸ３９Ｘ４０Ａ（配列番号１０４）
（Ｘ３５は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３６は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３７は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３８は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ３９は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ４０は、Ｔ、Ｖ又はＳを表す）
＜１３＞
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３０で表される、＜１＞〜＜１２＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１４＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉに由来する、＜１＞〜＜１３＞のうちのいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１５＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、
配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域若しくは配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜１４＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１６＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号９のヌクレオチド配列を有するか、配列番号９のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜１５＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１７＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５のうちいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５のアミノ酸配列のうち少なくとも１つと８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜１６＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１８＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜１７＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜１９＞
前記アミノ酸再生酵素がアラニンデヒドロゲナーゼである、＜１２＞〜＜１８＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２０＞
前記アラニンデヒドロゲナーゼが、ピルビン酸及びＮＨ３からＬ−アラニンを生成する反応の際にＮＡＤＰＨを補酵素として利用可能である、＜１９＞に記載の組換え微生物。
＜２１＞
前記アラニンデヒドロゲナーゼが下記の部分アミノ酸配列（ｉ）、部分アミノ酸配列（ｊ）、部分アミノ酸配列（ｋ）及び部分アミノ酸配列（ｌ）のうち少なくとも１つを含み、且つピルビン酸及びＮＨ３からＬ−アラニンを生成する活性を有する＜１９＞又は＜２０＞に記載の組換え微生物。
（ｉ）  ＥＸ４１ＫＸ４２Ｘ４３ＥＸ４４ＲＸ４５Ｘ４６（配列番号１０５）
（Ｘ４１は、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｆ、Ｎ又はＶを表し、
Ｘ４２は、Ｎ、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｔ又はＤを表し、
Ｘ４３は、Ｈ、Ｎ、Ｌ又はＱを表し、
Ｘ４４は、Ｙ、Ｎ又はＦを表し、
Ｘ４５は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ４６は、Ｇ又はＡを表す）
（ｊ）  Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９ＫＶＫＥＰＸ５０（配列番号１０６）
（Ｘ４７は、Ｍ又はＬを表し、
Ｘ４８は、Ｉ、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ４９は、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭを表し、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｌ、Ｖ、Ｎ又はＩを表す）
（ｋ）  ＬＸ５１ＴＹＬＨＬＡ（配列番号１０７）
（Ｘ５１は、Ｆ又はＹを表す）
（ｌ）  Ｘ５２ＤＸ５３ＡＸ５４ＤＱＧＧ（配列番号１０８）
（Ｘ５２は、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ５３は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ５４は、Ｉ又はＶを表す）
＜２２＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子がＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０に由来する、＜１９＞〜＜２１＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２３＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、
配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するか、
配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するか、
配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１９＞〜＜２２＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２４＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号１１のヌクレオチド配列を有するか、配列番号１１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１９＞〜＜２３＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２５＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号５及び配列番号４５〜配列番号５２のうちいずれかのアミノ酸配列、又は配列番号５及び配列番号４５〜配列番号５２のアミノ酸配列のうち少なくとも１つと８０％以上の配列同一性を有し且つアラニン再生酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１９＞〜＜２４＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２６＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号５のアミノ酸配列、又は配列番号５のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し且つアラニン再生酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１９＞〜＜２５＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２７＞
前記ピリドキサミン合成酵素が酵素番号ＥＣ２．６．１．３１又はＥＣ２．６．１．１で表される、＜１＞〜＜１１＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２８＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する、＜１＞〜＜１１＞及び＜２７＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜２９＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するか、配列番号１０のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜１１＞、＜２７＞及び＜２８＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜３０＞
前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜１＞〜＜１１＞及び＜２７＞〜＜２９＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜３１＞
前記アミノ酸再生酵素がグルタミン酸デヒドロゲナーゼである、＜２７＞〜＜３０＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜３２＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来する、＜３１＞に記載の組換え微生物。
＜３３＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号１２のヌクレオチド配列を有するか、配列番号１２のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルタミン酸再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、＜３１＞又は＜３２＞に記載の組換え微生物。
＜３４＞
前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号６のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し且つグルタミン酸再生酵素活性を有するアミノ酸配列、をコードするヌクレオチド配列を有する、＜３１＞〜＜３３＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜３５＞
組換え大腸菌である、＜１＞〜＜３４＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜３６＞
＜１＞〜＜３５＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを接触させ、ピリドキサミン又はその塩を生産させる、ピリドキサミン又はその塩の製造方法。
＜３７＞
前記組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物が、前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、前記ピリドキサミン合成酵素、及び前記アミノ酸再生酵素を含む、＜３６＞に記載の製造方法。
＜３８＞
前記組換え微生物の処理物又は前記組換え微生物の培養物の処理物が、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理による処理物である、＜３６＞又は＜３７＞に記載の製造方法。【００１３】
本開示の第２の態様は以下を含む。
＜３９＞
以下の（１）〜（７）に記載のポリヌクレオチドのうち少なくとも１つが導入された組換え微生物：
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（２）配列番号１のアミノ酸配列において、１個〜５０個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記タンパク質はピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するものである、ポリヌクレオチド、
（３）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記タンパク質はピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するものである、ポリヌクレオチド、
（４）配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（５）配列番号１３のヌクレオチド配列において、１個〜１５０個のヌクレオチドが欠失、付加又は置換されているヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（６）配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（７）配列番号１３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドはピリドキシン若しくはその塩又はピリドキサール若しくはその塩の合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
＜４０＞
前記組換え微生物が組換え細菌である、＜３９＞に記載の組換え微生物。
＜４１＞
前記組換え微生物が組換え大腸菌である、＜４０＞に記載の組換え微生物。
＜４２＞
前記タンパク質が、ＥＣ番号１．１．１．６５に分類される酵素である、＜３９＞〜＜４１＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜４３＞
前記タンパク質が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼである、＜３９＞〜＜４２＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物。
＜４４＞
＜３９＞〜＜４３＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物と、ピリドキシン若しくはその塩とを接触させることを含む、ピリドキサール若しくはその塩の製造方法。
＜４５＞
＜３９＞〜＜４３＞のうちいずれか１つに記載の組換え微生物を培養して得られる培養物又は培養物の処理物と、ピリドキシン若しくはその塩とを接触させることを含む、ピリドキサール若しくはその塩の製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本開示の第１の態様によれば、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産できる組換え微生物、及び該組換え微生物を用いてピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産する方法が提供される。
本開示の第２の態様によれば、導入されたピリドキシンデヒドロゲナーゼを有し発現する、組換え微生物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１−１】配列番号１及び配列番号２２〜配列番号２８の配列のアラインメントを示す。
【図１−２】配列番号１及び配列番号２２〜配列番号２８の配列のアラインメントを示す。
【図２−１】配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５の配列のアラインメントを示す。
【図２−２】配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５の配列のアラインメントを示す。
【図３−１】配列番号３６〜配列番号４４の配列のアラインメントを示す。
【図３−２】配列番号３６〜配列番号４４の配列のアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示の第１の態様（以下、単に第１の態様と称する）は、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子を有し、
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子及び前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つは菌体外から導入された遺伝子であるか又は元々菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である、組換え微生物（以下、第１の態様に係る組換え微生物という）を提供する。本開示の第２の態様（以下、単に第２の態様と称する）は、（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（２）配列番号１のアミノ酸配列において、１個〜５０個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（３）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（４）配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、（５）配列番号１３のヌクレオチド配列において、１個〜１５０個のヌクレオチドが欠失、付加又は置換されているヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、（６）配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも６０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、又は、（７）配列番号１３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを導入された組換え微生物を提供する。「本開示」の記載は、第１の態様と第２の態様を包含する意味で用いられる。なお、本開示において導入とは、菌体内で発現可能となるように導入することをいう。また、「組換え」の語は「遺伝子組換え」と同義で用いられる。
【００１７】
＜第１の態様＞
これまで、化学的方法によっても生物学的方法によっても、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産する方法は知られていなかった。ピリドキサミンの構造を以下に示す。
【００１８】
【化１】
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【００１９】
しかし、驚くべきことに、上記のような構成を有する組換え微生物若しくは前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いることにより、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で且つ安価に生産できることを本発明者は見いだした。その理由は必ずしも明らかではないが、上記３種類の酵素が共に存在することによって、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩を生成する過程における各反応の平衡及びこの過程で生み出される副産物等や消費される原料等の量が、上記３種類の酵素の協働的な働きによって、ピリドキシン又はその塩からピリドキサミン又はその塩の生成に有利となるためではないかと推測される。また、上記３種類の酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つが、それぞれ、菌体外から導入されているか又は菌体に内在するがその発現が強化されていることによって、導入又は強化された遺伝子から酵素を高い発現量で発現することが可能となり、ピリドキサミン又はその塩の生産効率をさらに向上させていると推測される。
【００２０】
このような上記３種類の酵素の協働作用は、これまで見いだされていなかったものであり、これによってピリドキシン又はその塩を用いることにより、化学的合成方法のように多ステップの反応をいちいち行う必要なく、高効率でピリドキサミン又はその塩を製造することが可能となった。しかも、第１の態様に係る組換え微生物を用いることで、ビタミンＢ６群に含まれる他の物質を大量に副生することを避けることができる。また、ピリドキシンはピリドキサールと比較して工業的に安価に入手可能な原料であり、ピリドキシンを出発物質にできることで、ピリドキサミン又はその塩を安価に製造することが可能となった。
【００２１】
＜ピリドキシンデヒドロゲナーゼ＞
ピリドキシンデヒドロゲナーゼはピリドキサールレダクターゼあるいはピリドキシン−４−デヒドロゲナーゼとも呼ばれる酵素である。ピリドキシンデヒドロゲナーゼは酵素番号ＥＣ１．１．１．６５で表される酵素であってもよく、他の酵素番号で表される酵素であってもよい。ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、ピリドキサールに水素を加えてピリドキシンに変換する反応あるいはこれの逆反応を触媒する酵素活性を有する酵素である。なお、ピリドキサールやピリドキシンは周囲の環境により塩としても存在しうるが、表記の簡略化のため、本開示においては酵素の活性の記載については塩への言及は省略して表記する。ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、ピリドキサールに水素を付加する際には、補酵素としてＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を消費し、ピリドキシンから水素を引き抜く際には補酵素としてＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を消費する。一般的な条件下では、この酵素が触媒する反応の平衡はピリドキシン生成側に大きく偏っているため、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをピリドキシンを消費する反応のために用いても高い収率は達成できないと考えられてきた。しかし、第１の態様においては、上記のように特定の他の酵素と組み合わせることにより、ピリドキシン又はその塩を原料としたピリドキサミン又はその塩の生産が高い生産効率で達成できるという予想外の効果が得られた。
【００２２】
ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、例えば、子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）門に属する微生物に由来することが好ましく、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門又はチャワンタケ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門に属する微生物に由来するものであってもよい。より具体的には、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、例えば、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号１のアミノ酸配列を有する）、サッカロミセス  ユーバヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｂａｙａｎｕｓ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号２２のアミノ酸配列を有する）、トルラスポラ  デルブルツキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号２３のアミノ酸配列を有する）、チゴサッカロミセス  バイリイ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号２４のアミノ酸配列を有する）、クリベロマイセス  マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ    ｍａｒｘｉａｎｕｓ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号２６のアミノ酸配列を有する）、アスペルギルス オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号２５のアミノ酸配列を有する）、カンジダ  アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号２７のアミノ酸配列を有する）、ヤロウイア  リポリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼ（配列番号２８のアミノ酸配列を有する）などであってもよい。これらの微生物のうち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅはチャワンタケ亜門に属し、それ以外はサッカロミセス亜門に属している。
【００２３】
前記ＥＣ１．１．１．６５のピリドキシンデヒドロゲナーゼは、例えばサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やシゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などに由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼであってもよい。なお、サッカロミセス  セレビシエのピリドキシンデヒドロゲナーゼは配列番号１のアミノ酸配列を有し、シゾサッカロミセス  ポンベのピリドキシンデヒドロゲナーゼは配列番号２のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
＜ピリドキサミン合成酵素＞
第１の態様で用いられるピリドキサミン合成酵素とは、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有する任意の酵素を指す。なお、ピリドキサールやピリドキサミンは周囲の環境により塩としても存在しうるが、表記の簡略化のため、本開示においては酵素の活性の記載については塩への言及は省略して表記する。ピリドキサミン合成酵素の例としては、例えば、ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（例えば酵素番号ＥＣ２．６．１．３０で表される酵素）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（例えばＥＣ２．６．１．１で表される酵素）、ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（例えばＥＣ２．６．１．３１で表される酵素）及びピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼ（例えばＥＣ２．６．１．５４で表される酵素）が挙げられる。
なおＥＣ２．６．１．１で表されるアスパラギン酸トランスアミナーゼは、ピリドキサールリン酸を補酵素とするホロ酵素であり、アスパラギン酸のアミノ基を２−オキソグルタル酸に転移し、グルタミン酸とオキサロ酢酸を生成する酵素活性を有する。当該アスパラギン酸トランスアミナーゼはピリドキサールリン酸と結合していないアポ酵素の状態では、グルタミン酸又はアスパラギン酸のアミノ基をピリドキサールに転移しピリドキサミンを合成することが知られている（JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1962年1月, Vol.237, No.1, p.127-132）。つまりＥＣ２．６．１．１で表されるアスパラギン酸トランスアミナーゼのアポ酵素の形態がＥＣ２．６．１．３１のピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼである。このため、アスパラギン酸トランスアミナーゼは、補酵素であるピリドキサールリン酸が存在しない又は量が少ない場合にはアポ酵素として存在し、ピリドキサミンを合成する。
ピリドキサミン合成酵素は、ピリドキサール又はその塩からピリドキサミン又はその塩を合成する際に、特定のアミノ酸のアミノ基部分を（＝Ｏ）に酸化し、当該アミノ基を転移させてピリドキサミン又はその塩を生成する。例えば、ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼはＬ−アラニン及びＤ−アラニンのいずれも利用可能であり、ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ及びアポ酵素の状態のアスパラギン酸トランスアミナーゼはＤ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸、及びＬ−グルタミン酸のいずれも利用可能であり、ピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼはＤ−グルタミン酸を利用可能である。
【００２５】
前記ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは、例えば、プロテオバクテリア門、アクチノバクテリア門、スピロヘータ門又はフィルミクテス門に属する微生物に由来するものであってもよい。ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは、例えば、メゾリゾビウム  ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、オクロバクテリウム  アンスロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ）やシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＭＡ−１）などに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼであってもよい。なお、例えば、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは配列番号３のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
ピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼは、その他、例えば、メソリゾビウム  ｓｐ．ＹＲ５７７（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号２９のアミノ酸配列を有する）、シュードアミノバクター  サリシラトキシダンス（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓ）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号３０のアミノ酸配列を有する）、Ｂａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号３１のアミノ酸配列を有する）、Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号３２のアミノ酸配列を有する）、リゾビウム  ｓｐ．ＡＣ４４／９６（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号３３のアミノ酸配列を有する）、エルウィニア  トレタナ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａ）に由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号３４のアミノ酸配列を有する）、Ｈｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉに由来するピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（配列番号３５のアミノ酸配列を有する）であってもよい。
【００２７】
前記ピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼは、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）やドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）などに由来するピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼであってもよい。なお、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼは配列番号４のアミノ酸配列を有する。前記アスパラギン酸トランスアミナーゼは、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）などに由来するアスパラギン酸トランスアミナーゼであってもよい。また、前記ピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼは、例えばクロストリジウム  ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）由来のピリドキサミンリン酸トランスアミナーゼであってもよい。
【００２８】
＜アミノ酸再生酵素＞
第１の態様で用いられるアミノ酸再生酵素とは、前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有する任意の酵素を指す。ピリドキサミンはアミノ基を有しており、ピリドキサミン合成の際にはアミノ基の提供源としてアミノ酸が消費されると考えられる。なお、アミノ酸は周囲の環境により塩としても存在しうるが、表記の簡略化のため、本開示においては酵素の活性の記載については塩への言及は省略して表記する。
例えば、前記ピリドキサミン合成酵素がＬ−アラニンを消費する場合には、Ｌ−アラニンを再生できる酵素がアミノ酸再生酵素として使用可能である。また、前記ピリドキサミン合成酵素がＬ−グルタミン酸又はＬ−アスパラギン酸を消費する場合には、Ｌ−グルタミン酸又はＬ−アスパラギン酸を再生できる酵素がアミノ酸再生酵素として使用可能である。
このようなアミノ酸再生酵素の例としては、アラニンデヒドロゲナーゼ（例えば酵素番号１．４．１．１で表される酵素）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（例えば、酵素番号１．４．１．２、又は１．４．１．３、又は１．４．１．４で表される酵素）、アミノ酸配列の改変によりＮＡＤＰ＋／ＮＡＤＰＨを補酵素として利用可能となった改変型アラニンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。なお、第１の態様においては、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素として用いてピルビン酸及びＮＨ３からＬ−アラニンを生成する酵素活性のことをアラニン再生酵素活性と呼び、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素として用いて２−オキソグルタル酸及びＮＨ３からＬ−グルタミン酸を生成する酵素活性のことをグルタミン酸再生酵素活性と呼ぶことがある。
ピリドキサミン合成酵素との好ましい組み合わせとしては、ピリドキサミン合成酵素としてのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼと、アミノ酸再生酵素としてのアラニンデヒドロゲナーゼとの組み合わせ、及びピリドキサミン合成酵素としてのピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ又はアスパラギン酸トランスアミナーゼと、アミノ酸再生酵素としてのグルタミン酸デヒドロゲナーゼとの組み合わせ、が挙げられる。アミノ酸再生酵素は、菌体外から導入された遺伝子又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子によってコードされるピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有することが好ましい。
【００２９】
前記アミノ酸再生酵素は、例えばシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）ｓｐ．  Ａｃ１０に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号３６のアミノ酸配列を有する）であってもよいし、エロモナス  ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号３７のアミノ酸配列を有する）、リゾビウムｓｐ．  ＬＰＵ８３に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号３８のアミノ酸配列を有する）、シュードモナス  メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号３９のアミノ酸配列を有する）、ブラディリゾビウム  ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号４０のアミノ酸配列又は配列番号４１を有する）、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号４２のアミノ酸配列を有する）、アナベナ  シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号４３のアミノ酸配列を有する）、バチルス  サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼ（配列番号４４のアミノ酸配列を有する）等であってもよい。あるいは、前記アミノ酸再生酵素は、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などに由来するグルタミン酸デヒドロゲナーゼであってもよい。前記アミノ酸再生酵素（例えばアラニンデヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ）は、アミノ酸を再生する反応の際にＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素として利用可能であることが好ましい。
例えば、アラニンデヒドロゲナーゼの場合は、ピルビン酸及びＮＨ３からＬ−アラニンを生成する反応の際にＮＡＤＰＨを補酵素として利用可能であるアラニンデヒドロゲナーゼであることが好ましい。ＮＡＤＰＨを補酵素として利用可能なアミノ酸再生酵素を使用した場合には、ＮＡＤＰＨの消費によりＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比が変化し、ピリドキシンデヒドロゲナーゼが触媒する反応の平衡や速度に影響を与えて、ピリドキサミン又はその塩の生産効率をより高めることができる。また、ほとんどのアラニンデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を補酵素として利用可能であるが、ＮＡＤＰＨを利用することができない。ＮＡＤＰＨを補酵素として利用可能であるアラニンデヒドロゲナーゼを使用した場合には、上記のとおりＮＡＤＰＨの消費によりＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比が変化し、ピリドキシンデヒドロゲナーゼが触媒する反応の平衡や速度に影響を与えて、ピリドキサミン又はその塩の生産効率をより高めることができる。また、前記アミノ酸再生酵素（例えばアラニンデヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ）は、アミノ酸を再生する反応の際にＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）及びＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）のどちらも補酵素として利用可能であることも好ましい。このようなアラニンデヒドロゲナーゼの例としては、後述の配列番号５及び配列番号４５〜配列番号５２のうちいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素は、いずれも、当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、例えば上記例示した微生物等の天然の微生物が有する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）を未改変のまま有するタンパク質であってもよいし、このようなアミノ酸配列に対してその酵素活性（上述の酵素活性）を失わない範囲で配列の改変を加えたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。このような改変としては、アミノ酸残基の挿入、欠失、置換及びアミノ酸配列Ｎ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加が挙げられる。アミノ酸残基の挿入、欠失及び置換のうち１つ以上がある場合は、挿入、欠失及び置換の各々は、存在する場合は、例えば１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜２０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよく、アミノ酸残基の挿入、欠失及び置換の総数は例えば１〜５０アミノ酸残基、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよい。また、末端に付加されるアミノ酸残基の数としては、存在する場合は一末端当たり例えば１〜５０アミノ酸残基、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜１０アミノ酸残基、あるいは１〜５アミノ酸残基であってもよい。このような追加のアミノ酸残基は、細胞外への分泌等のためのシグナル配列を形成していてもよい。シグナル配列の例としては、大腸菌のＯｍｐＡシグナル配列などが挙げられる。
あるいは、各酵素は、当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）そのものを有するタンパク質、又は当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）に対して８０％以上、あるいは８５％以上、あるいは９０％以上、あるいは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、所望の酵素活性（上述の酵素活性）を有するタンパク質であってもよい。ここで、配列同一性は例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで評価することができる。
【００３１】
例えば、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号２のアミノ酸配列のうち１つ以上に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はピリドキシンデヒドロゲナーゼとしての活性を有しているべきである。ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性は、例えば、基質としてのピリドキシン及び必要なＮＡＤ＋若しくはＮＡＤＰ＋を含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサールを高速液体クロマトグラフィーで定量するか、あるいは生成したピリドキサールとトリスヒドロキシメチルアミノメタンのようなアミンとの間でシッフ塩基を形成させ４１５ｎｍ等での吸光度測定などで該シッフ塩基を定量することにより測定できる。
【００３２】
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号２２〜配列番号２８のうちいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列、及び配列番号２８のアミノ酸配列のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。該タンパク質も、ピリドキシンデヒドロゲナーゼとしての活性を有しているべきである。
【００３３】
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、下記の部分アミノ酸配列（ａ）及び部分アミノ酸配列（ｂ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するピリドキシンデヒドロゲナーゼであってもよい。
（ａ）  ＮＸ１Ｘ２ＥＸ３ＹＧ（配列番号９７）
（ここで、Ｘ１は、Ｖ、Ｃ、Ｉ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｇ又はＬを表し、
Ｘ２は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｆ又はＬを表す）
（ｂ）  Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＫＧＸ７（配列番号９８）
（Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｆ又はＬを表し、
Ｘ５は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｃ又はＭを表し、
Ｘ６は、Ｃ、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｗ又はＦを表し、
Ｘ７は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＣを表す）アミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
図１−１及び図１−２には、配列番号１及び配列番号２２〜配列番号２８の配列のアラインメントを示す。図１−１及び図１−２中、ＳｃＰｌｒはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＳｅＰｌｒはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｂａｙａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＴｄＰｌｒはＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＺｂＰｌｒはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＫｍＰｌｒはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ    ｍａｒｘｉａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＡｏＰｌｒはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＣａＰｌｒはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＹｌＰｌｒはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのピリドキシンデヒドロゲナーゼを表す。部分アミノ酸配列（ａ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から５５番目〜６１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｂ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８６番目〜９１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。本開示において配列同士のアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで行うことができる。部分アミノ酸配列（ａ）は、タンパク質のＮ末端から４５番目〜７１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から４６番目〜６６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｂ）は、タンパク質のＮ末端から７６番目〜１０１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から７９番目〜９６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３４】
本開示において、酵素Ｂのアミノ酸配列における「酵素ＡのＮ末端からＸ番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基」とは、前記酵素Ａのアミノ酸配列を酵素Ｂのアミノ酸配列に対してアラインメントしたときに、酵素Ａのアミノ酸配列のＮ末端からＸ番目のアミノ酸残基と対応する酵素Ｂのアミノ酸配列上のアミノ酸残基を指す。
【００３５】
図１−１及び図１−２から分かるように、部分アミノ酸配列（ａ）及び部分アミノ酸配列（ｂ）は、一群のピリドキシンデヒドロゲナーゼの間で高度に保存された領域である。したがって、部分アミノ酸配列（ａ）及び部分アミノ酸配列（ｂ）のうち少なくとも１つを含むピリドキシンデヒドロゲナーゼのバリエーションは、本開示におけるピリドキシンデヒドロゲナーゼとして機能する蓋然性が高いと考えられる。また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から６０番目のチロシン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８９番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は、いずれもＮＡＤＰＨ結合残基と考えられており（Journal of Biological Chemistry 1990, 274(33), 23185-23190）、ピリドキシンデヒドロゲナーゼの機能上、重要な残基である。これらの残基が保存されていれば、本開示におけるピリドキシンデヒドロゲナーゼとして機能する蓋然性が高いと考えられる。
【００３６】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から６０番目のチロシン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ａ−１）が挙げられる。ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ａ）の代わりに部分アミノ酸配列（ａ−１）を含んでいてもよい。
（ａ−１）Ｘ１Ｘ２ＮＸ３Ｘ４ＥＸ５ＹＧＸ６Ｘ７（配列番号１０９）
Ｘ１は、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｙ又はＶを表し、
Ｘ２は、  Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｌ、Ｗ又はＶを表し、
Ｘ３は、Ｖ、Ｃ、Ｉ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｇ又はＬを表し、
Ｘ４は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ５は、Ｆ又はＬを表し、
Ｘ６は、Ｐ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｅ、Ｔ、Ａ、Ｎ又はＳを表し、
Ｘ７は、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｅ、Ｐ、Ｌ又はＩを表す。
部分アミノ酸配列（ａ−１）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から５３番目〜６３番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ａ−１）は、タンパク質のＮ末端から４３番目〜７３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から４５番目〜６８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８９番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｂ−１）が挙げられる。ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ｂ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｂ−１）を含んでいてもよい。
（ｂ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＫＧＸ９（配列番号１１０）
Ｘ１は、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｓ又はＮを表し、
Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｄ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｑ又はＲを表し、
Ｘ４は、Ｖ、Ｔ、Ｉ、Ｍ又はＬを表し、
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＴを表し、
Ｘ６は、Ｉ、Ｖ、Ｆ又はＬを表し、
Ｘ７は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｃ又はＭを表し、
Ｘ８は、Ｃ、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｗ又はＦを表し、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＣを表す。
部分アミノ酸配列（ｂ−１）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８１番目〜９１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ａ−１）は、タンパク質のＮ末端から７１番目〜１０１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から７４番目〜９６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００３８】
また、ピリドキサミン合成酵素は、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号３のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号３のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号３のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号３のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はピリドキサミン合成酵素としての活性（ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性、第１の態様においてはピリドキサミン合成酵素活性ともいう）を有しているべきである。ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性は、例えば、基質としてのピリドキサール及び必要なアミノ酸（配列番号３のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質の場合は例えばＬ−アラニン）を含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
【００３９】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５のうちいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号３のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、配列番号３４のアミノ酸配列、及び配列番号３５のアミノ酸配列のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。該タンパク質も、ピリドキサミン合成酵素としての活性を有しているべきである。この場合、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性は、例えば、基質としてのピリドキサール及びＬ−アラニンを含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
【００４０】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、下記の部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性を有するピリドキサミン合成酵素であってもよい。この場合、ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性は、例えば、基質としてのピリドキサール及びＬ−アラニンを含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
（ｃ）  Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（配列番号９９）
（Ｘ８は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ９は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＡを表す）
（ｄ）  Ｘ１４Ｘ１５ＴＰＳＧＴＸ１６Ｘ１７（配列番号１００）
（Ｘ１４は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１５は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ１６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１７は、Ｎ又はＴを表す）
（ｅ）  Ｘ１８ＤＸ１９ＶＳＸ２０Ｘ２１（配列番号１０１）
（Ｘ１８は、Ｖ、Ｉ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ａ、Ｔ又はＳを表し、
Ｘ２０は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ２１は、Ｆ、Ｗ、又はＶを表す）
（ｆ）  Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４ＫＣＸ２５ＧＸ２６Ｘ２７Ｐ（配列番号１０２）
（Ｘ２２は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ２３は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ２４は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ａ又はＱを表し、
Ｘ２５は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ２７は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表す）
（ｇ）  Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１ＳＸ３２ＧＸ３３Ｘ３４（配列番号１０３）
（Ｘ２８は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ２９は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３０は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ３１は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ３２は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ３３は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ３４は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す）
（ｈ）  Ｘ３５Ｘ３６ＲＸ３７Ｘ３８ＨＭＧＸ３９Ｘ４０Ａ（配列番号１０４）
（Ｘ３５は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３６は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３７は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ３８は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ３９は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ４０は、Ｔ、Ｖ又はＳを表す）
【００４１】
図２−１及び図２−２には、配列番号３及び配列番号２９〜配列番号３５の配列のアラインメントを示す。図２−１及び図２−２中、ＭｌＰＰＡＴはＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＭｓＰＰＡＴはＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＰｓＰＰＡＴはＰｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＢｌＰＰＡＴはＢａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＳｓＰＰＡＴはＳｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＲｓＰＰＡＴはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＥｔＰＰＡＴはＥｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを、ＨｇＰＰＡＴはＨｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを表す。部分アミノ酸配列（ｃ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６５番目〜７０番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｄ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１４４番目〜１５２番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｅ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１７０番目〜１７６番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｆ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１９４番目〜２０３番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｇ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３２９番目〜３３７番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｈ）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３４３番目〜３５３番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｃ）は、タンパク質のＮ末端から５５番目〜８０番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から５６番目〜７５番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｄ）は、タンパク質のＮ末端から１３４番目〜１６２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１３９番目〜１５７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｅ）は、タンパク質のＮ末端から１６０番目〜１８６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１６５番���〜１８１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｆ）は、タンパク質のＮ末端から１８４番目〜２１３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１８９番目〜２０８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｇ）は、タンパク質のＮ末端から３１９番目〜３４７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３２４番目〜３４２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｈ）は、タンパク質のＮ末端から３３３番目〜３６３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３３８番目〜３５８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４２】
図２−１及び図２−２から分かるように、部分アミノ酸配列（ｃ）、部分アミノ酸配列（ｄ）、部分アミノ酸配列（ｅ）、部分アミノ酸配列（ｆ）、部分アミノ酸配列（ｇ）及び部分アミノ酸配列（ｈ）は、一群のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼの間で高度に保存された領域である。したがって、部分アミノ酸配列（ｃ）〜部分アミノ酸配列（ｈ）のうち少なくとも１つを含むピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのバリエーションは、本開示におけるピリドキサミン合成酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１９７番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はピリドキサールとの結合に重要であり、Ｎ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は触媒活性に重要であり、Ｎ末端から１７１番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基及びＮ末端から１４６番目のトレオニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はピリドキサールとの結合を補助し、Ｎ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基及びＮ末端から３４５番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はアミノ酸認識に重要であると考えられており（Journal of Biological Chemistry, 2008, vol. 283, No.2 pp1120-1127）、ピリドキシン合成酵素の機能上、重要な残基である。これらの残基が保存されていれば、本開示におけるピリドキシン合成酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。ただし、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は、グルタミン酸以外にアスパラギン酸であってもよい。また、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基は、アルギニン以外にメチオニン又はグルタミンであってもよい。
【００４３】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６８番目のグルタミン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｃ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｃ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｃ−１）を含んでいてもよい。
（ｃ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９（配列番号１１１）
Ｘ１が、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭを表し、
Ｘ２は、Ｉ、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ３は、Ｌ、Ｍ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ４は、Ｈ又はＱを表し、
Ｘ５は、Ｇ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ６は、Ｅ又はＤを表し、
Ｘ７は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ８は、Ｖ、Ｉ、Ａ又はＬを表し、
Ｘ９は、Ｌ、Ｍ、Ｐ又はＶを表し、
Ｘ１０は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｌ又はＩを表し、
Ｘ１２は、Ｅ又はＱを表し、
Ｘ１３は、Ａ又はＧを表し、
Ｘ１４は、Ａ又はＶを表し、
Ｘ１５は、Ａ又はＬを表し、
Ｘ１６は、Ａ、Ｌ、Ｈ又はＹを表し、
Ｘ１７は、Ｓ、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ１８は、Ｌ、Ｆ、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ１９は、Ｉ、Ｆ、Ｖ又はＬを表す。
部分アミノ酸配列（ｃ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から６３番目〜８１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｃ−１）は、タンパク質のＮ末端から５３番目〜９１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から５８番目〜８６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４４】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１４６番目のトレオニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｄ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｄ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｄ−１）を含んでいてもよい。
（ｄ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＴＰＳＧＴＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４  Ｘ１５Ｘ１６     （配列番号１１２）
Ｘ１は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ２は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ３は、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｃ又はＦを表し、
Ｘ４は、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｌ又はＴを表し、
Ｘ５は、Ｃ又はＶを表し、
Ｘ６は、Ｈ、Ｎ又はＡを表し、
Ｘ７は、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ８は、Ｄ又はＥを表し、
Ｘ９は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ１０は、Ｎ又はＴを表し、
Ｘ１１は、Ｐ又はＤを表し、
Ｘ１２は、Ｉ、Ｖ、Ｌ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｑ、Ｖ、Ｒ又はＰを表し、
Ｘ１４は、Ａ、Ｅ、Ｑ又はＤを表し、
Ｘ１５は、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ１６は、Ｇ又はＡを表す。
部分アミノ酸配列（ｄ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１３８番目〜１５８番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｄ−１）は、タンパク質のＮ末端から１２８番目〜１６８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１３３番目〜１６３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４５】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１７１番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｅ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｅ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｅ−１）を含んでいてもよい。
（ｅ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＸ７ＶＳＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２（配列番号１１３）
Ｘ１は、Ｇ、Ｄ又はＡ
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｑ、Ｒ又はＥを表し、
Ｘ３は、Ｙ、Ｎ、Ｌ又はＦを表し、
Ｘ４は、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＶを表し、
Ｘ５は、Ｉ、Ｌ又はＹを表し、
Ｘ６は、Ｖ、Ａ又はＩを表し、
Ｘ７は、Ａ、Ｓ又はＴを表し、
Ｘ８は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ９は、Ｆ、Ｗ又はＶを表し、
Ｘ１０は、Ｇ、Ａ又はＬを表し、
Ｘ１１は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ１２は、Ｍ、Ｖ又はＬを表す。
部分アミノ酸配列（ｅ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１６５番目〜１７９番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｅ−１）は、タンパク質のＮ末端から１５５番目〜１８９番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１６０番目〜１８４番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４６】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１９７番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｆ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｆ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｆ−１）を含んでいてもよい。
（ｆ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＫＣＸ１０ＧＸ１１Ｘ１２ＰＸ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｓ（配列番号１１４）
Ｘ１は、Ａ、Ｓ、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ２は、Ｄ、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ又はＭを表し、
Ｘ４は、Ｙ、Ｆ、Ｌ又はＣを表し、
Ｘ５は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ６は、Ｔ又はＡを表し、
Ｘ７は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ８は、Ｐ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ９は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｑ又はＡを表し、
Ｘ１０は、Ｌ又はＭを表し、
Ｘ１１は、Ａ、Ｓ、Ｃ又はＧを表し、
Ｘ１２は、Ｐ、Ｔ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ１３は、Ｇ、Ａ又はＳを表し、
Ｘ１４は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ１５は、Ｔ、Ｓ又はＡを表し、
Ｘ１６は、Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＦを表し、
Ｘ１７は、Ｍ、Ｌ、Ｖ、Ａ又はＩを表し、
Ｘ１８は、Ｇ、Ａ、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ１９は、Ｖ、Ｉ又はＡを表す。
部分アミノ酸配列（ｆ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から１８８番目〜２１１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｆ−１）は、タンパク質のＮ末端から１７８番目〜２２１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から１８３番目〜２１６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４７】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３３６番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｇ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｇ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｇ−１）を含んでいてもよい。
（ｇ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＳＸ６ＧＸ７Ｘ８（配列番号１１５）
Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、Ｈ又はＳを表し、
Ｘ２は、Ｇ又はＤを表し、
Ｘ３は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ４は、Ｖ、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｉ又はＬを表し、
Ｘ５は、Ｆ、Ｍ、Ｌ、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｉ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ７は、Ｒ、Ｍ又はＱを表し、
Ｘ８は、Ｇ、Ｒ、Ａ、Ｄ、Ｈ又はＫを表す。
部分アミノ酸配列（ｇ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３２８番目〜３３７番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｇ−１）は、タンパク質のＮ末端から３１８番目〜３４７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３２３番目〜３４２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４８】
Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３４５番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｈ−１）が挙げられる。ピリドキサミン合成酵素は、部分アミノ酸配列（ｈ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｈ−１）を含んでいてもよい。
（ｈ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＲＸ６Ｘ７ＨＭＧＸ８Ｘ９ＡＸ１０Ｘ１１（配列番号１１６）
Ｘ１は、Ｌ、Ｑ、Ｋ、Ａ、Ｆ、Ｙ又はＷを表し、
Ｘ２は、Ｇ、Ｎ、Ｈ又はＤを表し、
Ｘ３は、Ｋ、Ｒ又はＮを表し、
Ｘ４は、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ５は、Ｔ、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ６は、Ｉ、Ｖ又はＬを表し、
Ｘ７は、Ｇ又はＳを表し、
Ｘ８は、Ｐ、Ａ又はＲを表し、
Ｘ９は、Ｔ、Ｖ又はＳを表し、
Ｘ１０は、Ｑ、Ｒ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｙ又はＧを表し、
Ｘ１１は、Ｐ又はＧを表す。
部分アミノ酸配列（ｈ−１）は、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼのＮ末端から３４０番目〜３５５番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｈ−１）は、タンパク質のＮ末端から３３０番目〜３６５番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３３５番目〜３６０番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００４９】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、例えば、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号４のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号４のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号４のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はピリドキサミン合成酵素としての活性（ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性）を有しているべきである。ピリドキサールからピリドキサミンを合成する酵素活性は、例えば、基質としてのピリドキサール及び必要なアミノ酸（配列番号４のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質の場合は例えばＬ−グルタミン酸若しくはＬ−アスパラギン酸又はその塩）を含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、生成したピリドキサミンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
【００５０】
また、アミノ酸再生酵素は、例えば、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０由来アミノ酸再生酵素のアミノ酸配列（配列番号３６）に対してＤ１９８Ａのアミノ酸置換を行ったアミノ酸配列（配列番号５）を有するタンパク質を用いてもよい。このタンパク質は、酵素番号１．４．１．１で表されるアラニンデヒドロゲナーゼである。これに限らず、酵素番号１．４．１．１で表されるアラニンデヒドロゲナーゼに対して、ＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアラニンデヒドロゲナーゼを使用可能である。下記のJournal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 30 (2004) 173-176に記載のとおり、アラニンデヒドロゲナーゼはほとんどのものが補酵素としてＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を使用できるが、ＮＡＤＰ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）は使用できない。しかし、上記Ｄ１９８Ａのアミノ酸置換を行った配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質は、補酵素としてＮＡＤ＋とＮＡＤＰ＋のどちらも使用できる（上記文献参照）。なお、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質は、逆反応（ピルビン酸及びＮＨ３からのＬ−アラニン再生）の際には、もちろん、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨのどちらも使用できる。
【００５１】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０由来アラニンデヒドロゲナーゼ以外のアラニンデヒドロゲナーゼについても同様のアミノ酸置換を行うことができる。ここで、アラニンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列中における、配列番号３６のアミノ酸配列のＮ末端から１９８番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応する残基を、アラニン残基に置換することを、ＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換と称する。アミノ酸再生酵素としてのアラニンデヒドロゲナーゼは、エロモナス  ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換（この場合はＤ１９８Ａ）を行ったアミノ酸配列（配列番号４５）を有するタンパク質、リゾビウムｓｐ．  ＬＰＵ８３（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＰＵ８３）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換（この場合はＤ１９８Ａ）を行ったアミノ酸配列（配列番号４６）を有するタンパク質、シュードモナス  メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換（この場合はＤ１９８Ａ）を行ったアミノ酸配列（配列番号４７）を有するタンパク質、ブラディリゾビウム  ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換（この場合はＤ１９８Ａ）を行ったアミノ酸配列（配列番号４８又は配列番号４９）を有するタンパク質、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換（この場合はＤ１９８Ａ）を行ったアミノ酸配列（配列番号５０）を有するタンパク質、アナベナ  シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換（この場合はＤ１９８Ａ）を行ったアミノ酸配列（配列番号５１）を有するタンパク質、バチルス  サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換（この場合はＤ１９６Ａ）を行ったアミノ酸配列（配列番号５２）を有するタンパク質などであってもよい。
【００５２】
なお、ＮＡＤ＋が利用可能な反応条件の場合には、上記のアミノ酸再生酵素をＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換無しに用いることができ、これ以外にも、酵素番号１．４．１．１で表されるアラニンデヒドロゲナーゼを一般的に用いることができる。
【００５３】
また、アミノ酸再生酵素は、例えば配列番号６のアミノ酸配列を有する、大腸菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼであってもよい。グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素として用いて２−オキソグルタル酸及びＮＨ３からＬ−グルタミン酸を生成する酵素活性を有する。
【００５４】
また、アミノ酸再生酵素は、例えば、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号５のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、アミノ酸再生酵素は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号５のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号５のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はアラニン再生酵素活性を有しているべきである。また、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端から１９８番目のＡｌａ残基又はこれに配列アラインメント上対応するＡｌａ残基を保持していることが好ましい。
【００５５】
あるいは、アミノ酸再生酵素は、配列番号５及び配列番号４５〜配列番号５２のうちいずれかのアミノ酸配列を有するタンパク質、又は配列番号５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号５、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１及び配列番号５２のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はアラニン再生酵素活性を有しているべきである。また、配列番号５のアミノ酸配列のＮ末端から１９８番目のＡｌａ残基又はこれに配列アラインメント上対応するＡｌａ残基を保持していることが好ましい。
【００５６】
あるいは、アミノ酸再生酵素は、例えば、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよいし、配列番号６のアミノ酸配列に対してアミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加のうち１つ以上を行ったアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及びアミノ酸配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のアミノ酸残基の付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、アミノ酸再生酵素は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質又は配列番号６のアミノ酸配列に対して例えば８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
上記のような、配列番号６のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質を使用する場合には、該タンパク質はグルタミン酸再生酵素活性を有しているべきである。
【００５７】
アミノ酸再生酵素活性は、例えば、必要な基質及び必要に応じてＮＡＤＰ若しくはＮＡＤＰＨを含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、反応生成物としての所望のアミノ酸の量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。例えば、アラニン再生酵素活性は、例えばピルビン酸、ＮＨ３及びＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、反応生成物としてのＬ−アラニンの量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。また、グルタミン酸再生酵素活性は、例えば２−オキソグルタル酸、ＮＨ３及びＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨを含む水溶液に試験対象のタンパク質を加え、反応生成物としてのＬ−グルタミン酸の量を高速液体クロマトグラフィーなどで定量することにより測定できる。
【００５８】
あるいは、アラニンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ｉ）、部分アミノ酸配列（ｊ）、部分アミノ酸配列（ｋ）及び部分アミノ酸配列（ｌ）のうち少なくとも１つを含み、且つピルビン酸及びＮＨ３からＬ−アラニンを生成する活性を有する酵素であってもよい。このようなアラニンデヒドロゲナーゼについても、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のＮ末端から１９８番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基をアラニン残基に置き換えることによって、補酵素としてＮＡＤ＋とＮＡＤＰ＋のどちらも使用できるようにすることができる。
（ｉ）  ＥＸ４１ＫＸ４２Ｘ４３ＥＸ４４ＲＸ４５Ｘ４６（配列番号１０５）
（Ｘ４１は、Ｉ、Ｔ、Ｓ、Ｆ、Ｎ又はＶを表し、
Ｘ４２は、Ｎ、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｔ又はＤを表し、
Ｘ４３は、Ｈ、Ｎ、Ｌ又はＱを表し、
Ｘ４４は、Ｙ、Ｎ又はＦを表し、
Ｘ４５は、Ｖ、又はＩを表し、
Ｘ４６は、Ｇ又はＡを表す）
（ｊ）  Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９ＫＶＫＥＰＸ５０（配列番号１０６）
（Ｘ４７は、Ｍ又はＬを表し、
Ｘ４８は、Ｉ、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ４９は、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭを表し、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｌ、Ｖ、Ｎ又はＩを表す）
（ｋ）  ＬＸ５１ＴＹＬＨＬＡ（配列番号１０７）
（Ｘ５１は、Ｆ又はＹを表す）
（ｌ）  Ｘ５２ＤＸ５３ＡＸ５４ＤＱＧＧ（配列番号１０８）
（Ｘ５２は、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ５３は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ５４は、Ｉ又はＶを表す）
【００５９】
図３−１及び図３−２には、配列番号３６〜配列番号４４の配列のアラインメントを示す。図３−１及び図３−２中、ＳｓＡｄｈはＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼを、ＡｈＡｄｈはＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａのアラニンデヒドロゲナーゼを、ＲｓＡｄｈはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＰＵ８３のアラニンデヒドロゲナーゼを、ＰｍＡｄｈはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａのアラニンデヒドロゲナーゼを、ＢｊＡｄｈ１はＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのアラニンデヒドロゲナーゼのうちの一つを、ＢｊＡｄｈ２はＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのアラニンデヒドロゲナーゼの別の一つを、ＳａＡｄｈはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓのアラニンデヒドロゲナーゼを、ＡｃＡｄｈはＡｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａのアラニンデヒドロゲナーゼを、ＢｓＡｄｈはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアラニンデヒドロゲナーゼを表す。部分アミノ酸配列（ｉ）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８番目〜１７番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｊ）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から７０番目〜７８番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｋ）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から９１番目〜９８番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｌ）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から２６５番目〜２７３番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｉ）は、タンパク質のＮ末端から２番目〜２７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３番目〜２２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｊ）は、タンパク質のＮ末端から６０番目〜８８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から６５番目〜８３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｋ）は、タンパク質のＮ末端から８１番目〜１０８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から８６番目〜１０３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｌ）は、タンパク質のＮ末端から２５５番目〜２８３番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から２６０番目〜２７８番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００６０】
図３−１及び図３−２から分かるように、部分アミノ酸配列（ｉ）、部分アミノ酸配列（ｊ）、部分アミノ酸配列（ｋ）及び部分アミノ酸配列（ｌ）は、一群のアラニンデヒドロゲナーゼの間で高度に保存された領域である。したがって、部分アミノ酸配列（ｉ）〜部分アミノ酸配列（ｌ）のうち少なくとも１つを含むアラニンデヒドロゲナーゼのバリエーションは、本開示におけるアミノ酸再生酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。また、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から１５番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基及びＮ末端から７５番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はＮＡＤＨとの結合に重要であり、Ｎ末端から９６番目のヒスチジン残基及びＮ末端から２７０番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基はタンパク質の構造形成上重要であると考えられており（J. Mol. Biol., 2008, 377, 1161-1173、Enzyme and Microbial Technology, 2018, 110, 61-68）、アラニンデヒドロゲナーゼの機能上、重要な残基である。これらの残基が保存されていれば、本開示におけるアミノ酸再生酵素として機能する蓋然性が高いと考えられる。
【００６１】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から１５番目のアルギニン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｉ−１）が挙げられる。アラニンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ｉ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｉ−１）を含んでいてもよい。
（ｉ−１）ＧＸ１ＰＸ２ＥＸ３ＫＸ４Ｘ５ＥＸ６ＲＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＰＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６（配列番号１１７）
Ｘ１は、Ｖ、Ｉ、Ｌ又はＣを表し、
Ｘ２は、Ｔ、Ｋ又はＲを表し、
Ｘ３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、Ｓ、Ｆ又はＮを表し、
Ｘ４は、Ｎ、Ｍ、Ａ、Ｄ、Ｖ、Ｌ又はＴを表し、
Ｘ５は、Ｈ、Ｎ、Ｑ又はＬを表し、
Ｘ６は、Ｙ、Ｎ又はＦを表し、
Ｘ７は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ８は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ９は、Ｍ、Ｌ又はＩを表し、
Ｘ１０は、Ｖ、Ｔ、Ｉ又はＳを表し、
Ｘ１１は、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、Ｎ、Ｌ又はＧを表し、
Ｘ１２は、Ｓ、Ａ、Ｎ、Ｇ又はＶを表し、
Ｘ１３は、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ１４は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ａ、Ｌ又はＨを表し、
Ｘ１５は、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ１６は、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｆ又はＹを表す。
部分アミノ酸配列（ｉ−１）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から４番目〜２６番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｉ−１）は、タンパク質のＮ末端から２番目〜３６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から３番目〜３１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００６２】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から７５番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｊ−１）が挙げられる。アラニンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ｊ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｊ−１）を含んでいてもよい。
（ｊ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＫＶＫＥＰＸ５Ｘ６Ｘ７ＥＸ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号１１８）
Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、Ｑ又はＫを表し、
Ｘ２は、Ｍ又はＬを表し、
Ｘ３は、Ｉ、Ｌ又はＶを表し、
Ｘ４は、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＭを表し、
Ｘ５は、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＮを表し、
Ｘ６は、Ａ、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｍ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｖ、Ｉ又はＥを表し、
Ｘ７は、Ｖ、Ｉ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ａ、Ｄ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｉ、Ｄ、Ｇ、Ｗ又はＫを表し、
Ｘ８は、Ｒ、Ｃ、Ｙ又はＷを表し、
Ｘ９は、Ａ、Ｅ、Ｒ、Ｑ、Ｋ、Ｔ、Ｓ、Ｍ、Ｎ、Ｖ、Ｐ、Ｇ、Ｃ又はＨを表し、
Ｘ１０は、Ｍ、Ｌ、Ｋ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｗ、Ｆ又はＹを表す。
部分アミノ酸配列（ｊ−１）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から６９番目〜８４番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｊ−１）は、タンパク質のＮ末端から５９番目〜９４番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から６４番目〜８９番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００６３】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から９６番目のヒスチジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｋ−１）が挙げられる。アラニンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ｋ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｋ−１）を含んでいてもよい。
（ｋ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＬＸ７ＴＹＬＨＬＡＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＬＸ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９（配列番号１１９）
Ｘ１は、Ｌ又はＦを表し、
Ｘ２は、Ｒ、Ｋ、Ｃ、Ｓ、Ｈ、Ｇ又はＱを表し、
Ｘ３は、Ｈ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｑ又はＡを表し、
Ｘ４は、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、Ｅ、Ｓ、Ｎ又はＭを表し、
Ｘ５は、Ｑ又はＨを表し、
Ｘ６は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｔ、Ｃ又はＡを表し、
Ｘ７は、Ｆ又はＹを表し、
Ｘ８は、Ｐ又はＡを表し、
Ｘ９は、Ｄ、Ｓ、Ｎ、Ｈ又はＥを表し、
Ｘ１０は、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｖ、Ｑ、Ｅ又はＫを表し、
Ｘ１１は、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、Ｄ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｓ又はＭを表し、
Ｘ１２は、Ｑ、Ｃ又はＬを表し、
Ｘ１３は、Ｔ、Ａ又はＶを表し、
Ｘ１４は、Ｅ、Ｉ、Ｑ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ｄ又はＮを表し、
Ｘ１５は、Ｅ、Ｄ、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｈ、Ｙ又はＳを表し、
Ｘ１６は、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、Ｔ又はＫを表し、
Ｘ１７は、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｄ、Ｈ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｒ、Ｇ又はＱを表し、
Ｘ１８は、Ｓ、Ｇ、Ｃ、Ａ又はＫを表し、
Ｘ１９は、Ｇ、Ｋ、Ｒ、Ｑ又はＤを表す。
部分アミノ酸配列（ｋ−１）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８５番目〜１１１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｋ−１）は、タンパク質のＮ末端から７５番目〜１２１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から８０番目〜１１６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００６４】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から２７０番目のアスパラギン酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｌ−１）が挙げられる。アラニンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ｌ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｌ−１）を含んでいてもよい。
（ｌ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＤＸ６ＡＸ７ＤＱＧＧＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１（配列番号１２０）
Ｘ１は、Ｇ、Ｒ又はＳを表し、
Ｘ２は、Ｓ、Ａ又はＧを表し、
Ｘ３は、Ａ又はＶを表し、
Ｘ４は、Ｉ、Ｌ、Ｍ又はＶを表し、
Ｘ５は、Ｖ又はＡを表し、
Ｘ６は、Ｖ又はＩを表し、
Ｘ７は、Ｉ又はＶを表し、
Ｘ８は、Ｃ又はＩを表し、
Ｘ９は、Ｖ、Ｉ、Ａ、Ｆ、Ｓ又はＣを表し、
Ｘ１０は、Ｅ又はＡを表し、
Ｘ１１は、Ｔ又はＤを表す。
部分アミノ酸配列（ｌ−１）は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのＮ末端から２６１番目〜２７７番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｌ−１）は、タンパク質のＮ末端から２５１番目〜２８７番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から２５６番目〜２８２番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【００６５】
＜ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及びアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子＞
ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、上述のピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする任意の遺伝子であってよい。ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、上述のピリドキサミン合成酵素をコードする任意の遺伝子であってよい。アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、上述のアミノ酸再生酵素をコードする任意の遺伝子であってよい。これらの遺伝子がコードする酵素は、当該酵素活性を有する既知のアミノ酸配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列）に限られず、前記既知のアミノ酸配列とは異なる改変されたアミノ酸配列を有する酵素であってもよい。
【００６６】
このような遺伝子は、各酵素を有する微生物として上に例示された微生物（由来となる微生物）が天然に有する遺伝子等の、既知の遺伝子であってもよいし、所望の酵素活性が得られる範囲内において、上述のように当該酵素の既知のアミノ酸配列から改変された改変アミノ酸配列をコードするようにヌクレオチド配列を改変させた遺伝子であってもよい。そのような改変アミノ酸配列の例としては、上記のような、配列番号１〜６のアミノ酸配列のいずれかに類似するアミノ酸配列が挙げられる。また、特定のアミノ酸配列をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、コドンの縮重の範囲内で変化させることができる。この場合、組換え微生物の宿主となる微生物において使用頻度が高いコドンを使用した方が、遺伝子の発現効率の点からは好ましい。
【００６７】
なお、遺伝子のヌクレオチド配列は、コードすべきアミノ酸配列からコドン表を元に設計することもできる。設計したヌクレオチド配列は、既知のヌクレオチド配列を遺伝子組換え技術を利用して改変することで得てもよいし、ヌクレオチド配列を化学的に合成することで得てもよい。
ヌクレオチド配列を改変する方法としては、例えば、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））、リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法、遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、又は、ニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法、市販の突然変異導入キットを使用する方法などが挙げられる。
【００６８】
例えば、前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、いずれも、当該酵素活性を有するポリヌクレオチドをコードする既知のヌクレオチド配列（例えば、上記例示した微生物等の生物中に天然に存在する遺伝子が有するヌクレオチド配列）を未改変のまま有するＤＮＡであってもよいし、このようなヌクレオチド配列に対して、コードされる酵素がその酵素活性（上述の酵素活性）を失わない範囲で配列の改変を加えたヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。このような改変としては、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換及びヌクレオチド配列５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加が挙げられる。ヌクレオチドの挿入、欠失及び置換のうち１つ以上がある場合は、挿入、欠失及び置換の各々は、存在する場合は、例えば１〜９０ヌクレオチド、あるいは１〜６０ヌクレオチド、あるいは１〜３０アミノ酸残基、あるいは１〜２０アミノ酸残基、あるいは１〜１５ヌクレオチド、あるいは１〜１０ヌクレオチド、あるいは１〜５ヌクレオチドであってもよく、ヌクレオチドの挿入、欠失及び置換の総数は例えば１〜１００ヌクレオチド、あるいは１〜５０ヌクレオチド、あるいは１〜３０ヌクレオチド、あるいは１〜１０ヌクレオチド、あるいは１〜５ヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの挿入や欠失は局所的には存在していてもよいが、ヌクレオチド配列全体としては大規模なフレームシフトを生じていないことが好ましい。また、末端に付加されるヌクレオチドの数としては、存在する場合は一末端当たり例えば１〜１５０ヌクレオチド、あるいは１〜１００ヌクレオチド、あるいは１〜５０ヌクレオチド、あるいは１〜３０ヌクレオチド、あるいは１〜１０ヌクレオチド、あるいは１〜５ヌクレオチドであってもよい。このような追加のヌクレオチドは、細胞外への分泌等のためのシグナル配列をコードしていてもよい。
【００６９】
あるいは、各酵素をコードする遺伝子は、当該酵素活性を有するポリヌクレオチドをコードする既知のヌクレオチド配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列）そのものを有するＤＮＡ、又は前記既知のヌクレオチド配列に対して８０％以上、あるいは８５％以上、あるいは９０％以上、あるいは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、所望の酵素活性（上述の酵素活性）を有する酵素をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、配列同一性は例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで評価することができる。
【００７０】
あるいは、各酵素をコードする遺伝子は、当該酵素活性を有するポリヌクレオチドをコードする既知のヌクレオチド配列（例えば、生物中に天然に存在する遺伝子のヌクレオチド配列）そのものを有するＤＮＡ、又は前記既知のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有し、所望の酵素活性（上述の酵素活性）を有する酵素をコードするＤＮＡであってもよい。また、ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーションとは以下のようにして行うことができる。
ハイブリダイゼーションでは、基準となるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列からなるＤＮＡをプローブとして、対象とするＤＮＡに対してハイブリダイゼーションを行い、ストリンジェントな条件下で洗浄後にプローブが対象とする核酸に有意にハイブリダイズしているかを確認する。プローブの長さは例えば連続した２０ヌクレオチド以上、好ましくは５０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは１００ヌクレオチド以上、さらに好ましくは２００ヌクレオチド以上を用いることができる。基準となるヌクレオチド配列と同じヌクレオチド長を有し、全長に渡って相補的なＤＮＡをプローブとして用いることも好ましい。ハイブリダイゼーションのための条件とは、特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出するために当業者が一般的に用いている条件を例示できる。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件を意味する。例えば、６×ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中でプローブとともに５５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。ついでフィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄するなどを例示することができる。ストリンジェントな条件としては、フィルターの洗浄工程における０．１×ＳＳＣ、５０℃の条件であり、更にストリンジェントな条件としては、同工程における０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を挙げることができる。
【００７１】
例えば、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号７のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号７のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号７のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号７のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００７２】
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号８のヌクレオチド配列（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号８のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号８のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号８のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、配列番号８のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号８のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００７３】
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、配列番号７及び配列番号５３〜配列番号５９のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号７のヌクレオチド配列、配列番号５３のヌクレオチド配列（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｂａｙａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号５４のヌクレオチド配列（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号５５のヌクレオチド配列（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号５７のヌクレオチド配列（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ    ｍａｒｘｉａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号５６のヌクレオチド配列（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号５８のヌクレオチド配列（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、及び配列番号５９のヌクレオチド配列（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００７４】
大腸菌などの原核生物を宿主とした組換え微生物において発現させる場合、発現を容易とするためにコドンを最適化してもよい。例えば、宿主となる原核生物において各アミノ酸をコードするコドンのうち最も使用頻度が高いものを当該アミノ酸のコドンとして高い頻度で使用するようにヌクレオチド配列を改変してもよい。このような観点からは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡとして、例えば、配列番号１３及び配列番号７５〜配列番号８１のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡを用いてもよいし、配列番号１３及び配列番号７５〜配列番号８１のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを用いてもよい。配列番号１３及び配列番号７５〜配列番号８１のヌクレオチド配列は、いずれも、その５’末端から１７ヌクレオチドは上流領域となっており、１８番目のヌクレオチド〜２０番目のヌクレオチドに開始コドンがある。このため、これらのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域をピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子領域として用いてもよい。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、例えば、配列番号１３及び配列番号７５〜配列番号８１のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１３及び配列番号７５〜配列番号８１のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、配列番号１３及び配列番号７５〜配列番号８１のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡ、又は配列番号１３のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号７５のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｂａｙａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号７６のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号７７のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号７９のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ    ｍａｒｘｉａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号７８のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８０のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、及び配列番号８１のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００７５】
ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号９のヌクレオチド配列（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号９のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号９のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号９のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号９のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号９のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００７６】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１０のヌクレオチド配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１０のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１０のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号１０のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号１０のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００７７】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号９及び配列番号６０〜配列番号６６のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号９のヌクレオチド配列、配列番号６０（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号６１（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号６２（Ｂａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号６３（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号６４（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、配列番号６５（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列、及び配列番号６６（Ｈｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のヌクレオチド配列のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００７８】
大腸菌などの原核生物を宿主とした組換え微生物において発現させる場合、発現を容易とするために上記のようにコドンを最適化してもよい。このような観点からは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡとして、例えば、配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡを用いてもよいし、配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを用いてもよい。配列番号１４のヌクレオチド配列は、その５’末端から１７ヌクレオチドは上流領域となっており、１８番目のヌクレオチド〜２０番目のヌクレオチドに開始コドンがある。このため、これのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域をピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子領域として用いてもよい。同様に、配列番号８２〜配列番号８８のヌクレオチド配列は、いずれも、その５’末端から１７ヌクレオチドは上流領域となっており、１８番目のヌクレオチド〜２０番目のヌクレオチドに開始コドンがある。このため、これらのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域をピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子領域として用いてもよい。
あるいは、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域又は配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
【００７９】
あるいは、ピリドキサミン合成酵素は、配列番号１４のヌクレオチド配列における１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域若しくは配列番号８２〜配列番号８８のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡ、又は配列番号１４のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８２のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＹＲ５７７のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８３のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｃｙｌａｔｏｘｉｄａｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８４のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｂａｕｌｄｉａ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８５のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｓｋｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｓｔｉｂｉｉｒｅｓｉｓｔｅｎｓのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８６のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＣ４４／９６のピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８７のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔｏｌｅｔａｎａのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、及び配列番号８８のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｈｅｒｂｉｃｏｎｉｕｘ  ｇｉｎｓｅｎｇｉのピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、ピリドキサミン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００８０】
アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１１のヌクレオチド配列（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  Ａｃ１０のアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１１のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１１のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、アラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、アミノ酸再生酵素は、配列番号１１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号１１のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００８１】
あるいは、アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１２のヌクレオチド配列（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１２のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つグルタミン酸再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１２のヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、グルタミン酸再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、アミノ酸再生酵素は、配列番号１２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ又は配列番号１２のヌクレオチド配列に対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、グルタミン酸再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００８２】
アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
あるいは、アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、アラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、アミノ酸再生酵素は、配列番号１１及び配列番号６７〜配列番号７４のうちいずれかのヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、又は配列番号１１のヌクレオチド配列、配列番号６７のヌクレオチド配列（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａのアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号６８のヌクレオチド配列（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＰＵ８３のアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号６９のヌクレオチド配列（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａのアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号７０のヌクレオチド配列（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのアラニンデヒドロゲナーゼのうちの一つをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号７１のヌクレオチド配列（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのアラニンデヒドロゲナーゼのうちの別の一つをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号７２のヌクレオチド配列（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓのアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、配列番号７３のヌクレオチド配列（Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａのアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）、及び配列番号７４のヌクレオチド配列（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列）のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００８３】
大腸菌などの原核生物を宿主とした組換え微生物において発現させる場合、発現を容易とするために上記のようにコドンを最適化してもよい。このような観点からは、アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡとして、例えば、配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡを用いてもよいし、配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域と相補的なヌクレオチド配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡを用いてもよい。配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のヌクレオチド配列は、いずれも、その５’末端から１７ヌクレオチドは上流領域となっており、１８番目のヌクレオチド〜２０番目のヌクレオチドに開始コドンがある。このため、これらのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域をアラニン再生酵素をコードする遺伝子領域として用いてもよい。
あるいは、アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は、例えば、配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡであってもよいし、配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域に対してヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加のうち１つ以上を行ったヌクレオチド配列であって、アラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。ヌクレオチドの置換、欠失、挿入及びヌクレオチド配列のＮ末端若しくはＣ末端若しくはその両方への追加のヌクレオチドの付加の程度の例については、上記のとおりである。
あるいは、アミノ酸再生酵素は、配列番号１５及び配列番号８９〜配列番号９６のうちいずれかのヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域を有するＤＮＡ、又は配列番号１５のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＣ１０のアラニンデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列に対してＤ１９８Ａのアミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号８９のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａのアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号９０のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＰＵ８３のアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号９１のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａのアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号９２のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのアラニンデヒドロゲナーゼのうちの一つにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号９３のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍのアラニンデヒドロゲナーゼのうちの別の一つにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号９４のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓのアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、配列番号９５のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ａｎａｂａｅｎａ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａのアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）、及び配列番号９６のヌクレオチド配列の１８番目のヌクレオチド〜３’末端までの領域（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのアラニンデヒドロゲナーゼにＮＡＤＰ＋対応アミノ酸置換を行ったアミノ酸配列をコードする遺伝子のコドン最適化ヌクレオチド配列）のうち少なくとも１つに対して例えば８０％以上、若しくは８５％以上、若しくは９０％以上、若しくは９５％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、アラニン再生酵素活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡであってもよい。
【００８４】
＜ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及びアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子を有する組換え微生物＞
本開示に係る組換え微生物内において、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子の各々は、菌体に内在する遺伝子であってもよいし、菌体に内在するがその発現を強化した遺伝子であってもよいし、菌体外から菌体内へと導入された遺伝子であってもよい。ただし、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つは菌体外から導入された遺伝子であるか又は菌体に内在するがその発現が強化された遺伝子である。
言い換えると、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子の各々は、組換え前の宿主微生物のゲノムに内在する遺伝子であってもよいし、宿主微生物のゲノムに内在するがプロモーターの置換等の操作を行うことによってその発現を強化した遺伝子であってもよいし、プラスミド等のベクターを用いて菌体外から菌体内へと導入された遺伝子であってもよい。第１の態様においては、前記３種類の酵素の組み合わせによるピリドキサミン生産能力を発揮すると共に、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つについて、それぞれ、宿主微生物の細胞外から導入するか、あるいはプロモーターの置換等によって宿主微生物の細胞に内在する当該遺伝子の発現を強化することによって、当該遺伝子の発現を上昇させ、前記３種類の酵素の組み合わせによるピリドキサミン生産能力をさらに増強している。ここで、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子の各々については、導入又は発現強化を行う場合には、宿主微生物の細胞外からの導入と、プロモーターの置換等による当該遺伝子発現の強化のうち、一方のみを行ってもよいし、両方を行ってもよい。
【００８５】
ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つについて、上記のような遺伝子発現の上昇を行わなければ、ピリドキサミン又はその塩の高生産のための十分な生産能力は得られない。なお、ここでいうアミノ酸再生酵素とは、ピリドキサミン合成酵素が消費する特定のアミノ酸種を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素のことを指すため、ピリドキサミン合成酵素とアミノ酸再生酵素とは一種のペアともとらえることが可能である。ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち少なくとも２つについて、上記のような遺伝子発現の上昇が行われることから、組換え微生物の菌体内には上記のペアが存在し、且つ上記のペアのうち少なくとも一方については遺伝子発現の上昇が行われていることになる。
【００８６】
菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化のうちの少なくとも一方を行う対象は、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び該ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち２つだけであっても構わない。ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち２つについて、それぞれ、菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化のうち少なくとも一方を行う場合には、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子について、それぞれ、菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化のうち少なくとも一方を行ってもよいし、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子について、それぞれ、菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化のうち少なくとも一方を行ってもよいし、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子及びアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子について、それぞれ、菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化のうち少なくとも一方を行ってもよい。
【００８７】
ピリドキサミン又はその塩の生産における生産効率向上の観点からは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及びアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち全てについて、それぞれ、菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化のうち少なくとも一方を行うことが好ましい。少なくともアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子については、菌体外からの導入及び菌体に内在する遺伝子の発現強化のうち少なくとも一方を行うことが、ピリドキサミン又はその塩の生産効率向上の観点から好ましい。なお、菌体外からの酵素遺伝子の導入は、必ずしも、宿主微生物に存在しない酵素遺伝子を補うための導入に限られず、宿主微生物に内在する酵素遺伝子についても発現を増大させることを目的に行ってもよい。宿主微生物に存在しない酵素遺伝子については、例えばＫＥＧＧやＢＲＥＮＤＡといった酵素データベースを用いて容易に確認することができる。
【００８８】
宿主微生物に内在する遺伝子のプロモーターを別のプロモーターで置換することによって当該遺伝子の発現を強化する場合、そのような別のプロモーター（新たに導入するプロモーター）としては宿主微生物中で遺伝子の発現を強化できる（プロモーター置換前よりも強化することができる）ものであれば特に制限はなく、構成型プロモーターでも誘導型プロモーターでもよい。プロモーターの置換は、一般的な遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。なお、宿主微生物に内在するプロモーターの配列は、新たに導入したプロモーターによる発現に実用上問題となる悪影響を与えなければ、部分的に又は完全に残しておいても構わない。
宿主微生物が例えば原核生物である場合には、新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例としては、大腸菌由来のｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変又は設計されたプロモーター配列も利用できる。
【００８９】
宿主微生物が例えば糸状菌である場合には、新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例としては、セロビオヒドロラーゼ（ｃｂｈ）プロモーター、エンドグルカナーゼ（ｅｇｌ）プロモーター、キシラナーゼＩＩＩ（ｘｙｎ３）プロモーター、Ｕ６プロモーター、α−アミラーゼ（ａｍｙ）プロモーター、などが挙げられる。
【００９０】
宿主微生物が例えば酵母である場合には、新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例としては、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ペプチド鎖伸長因子（ＴＥＦ）プロモーター、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、メタロチオネイン（ＣＵＰ１）プロモーター、抑制性酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターなどが挙げられる。なお、上記プロモーターの配列の由来は宿主微生物となる酵母に限定されない。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなどのように、外来のプロモーターを用いてもよい。
【００９１】
宿主微生物の菌体外から遺伝子（外来（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子）を導入する場合には、その方法としては、菌体内（細胞内）に遺伝子を導入し、該遺伝子にコードされる酵素を発現させることができれば、特に制限はなく、酵素遺伝子を保有するプラスミドによる形質転換、酵素遺伝子のゲノムへの導入、及びこれらの組み合わせを挙げることができる。遺伝子を導入する際には、該遺伝子を組み込んだ発現ベクターを菌体内に導入してもよい。該発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列を組み込んだものであれば特に限定されるものではないが、形質転換効率や翻訳効率を向上させるなどの観点より、以下に示すような構成を示すプラスミドベクターやファージベクターであることがより好ましい。
【００９２】
発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列を含み、前記宿主微生物を形質転換しうるものであれば特に限定されない。必要に応じて、該ヌクレオチド配列の他に、他の領域を構成するヌクレオチド配列（以下、単に「他の領域」とも言う。）を含んでいてもよい。他の領域としては、例えば、形質転換によって得られる組換え微生物が、所望の酵素を産生するために必要とする制御領域や、自律複製に必要な領域などが挙げられる。
また、前記組換え微生物の選択を容易にするという観点より、選択マーカーとなりうる選択遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。
所望の酵素を産生するために必要となる制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列等を挙げることができる。
【００９３】
酵母を宿主微生物とした場合に使用可能な発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列の他に、前記遺伝子の発現効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、酵母を宿主微生物とする形質転換体中で前記遺伝子を発現できるものであればいずれを用いてもよい。例としては、宿主微生物が酵母である場合に新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例として上に記載したプロモーターが挙げられる。
【００９４】
また、前記発現ベクターは、分泌シグナルを含んでいてもよい。これにより、組換え微生物が所望の酵素を産生した場合、細胞外に該酵素を分泌することが可能となる。
分泌シグナルとしては、宿主微生物となる酵母から所望の酵素を分泌できるものであれば、特に限定されない。分泌効率の観点より、αファクターシグナル配列、インベルターゼシグナル配列、酸ホスファターシグナル配列、グルコアミラーゼシグナル配列などを用いることが好ましい。
【００９５】
以上のようなプロモーター配列や分泌シグナルを有する発現ベクターとしては、具体的にはｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ＹＥｐｌａｃ１９５等が挙げられる。
【００９６】
糸状菌を宿主微生物とした場合に使用可能な発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列の他に、前記遺伝子の発現効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。プロモーター配列としては、糸状菌を宿主微生物とする形質転換体中で前記遺伝子を発現できるものであればいずれを用いてもよい。例としては、宿主微生物が糸状菌である場合に新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例として上に記載したプロモーターが挙げられる。
【００９７】
糸状菌に対して適切な発現ベクターは、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，Ｃ．Ａ．Ｍ．  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｉｎ：Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｗ．ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，  Ｌ．Ｌ．（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６−４２８に記載されている。
また、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１００、ｐＳＬ１１８０（ファルマシア  インク社製）、ｐＦＢ６及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ｐＲＡＸ、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｐＴＥＸ等のような一般的に用いられる他の発現ベクターを用いることもできる。
【００９８】
大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核生物を宿主微生物とする場合に使用可能な発現ベクターは、前記遺伝子のヌクレオチド配列の他に、前記遺伝子の発現効率の観点より、プロモーター配列を含んでいることが好ましい。また、プロモーター配列の他にリボゾーム結合配列や転写終結配列等を含んでいてもよい。
【００９９】
プロモーター配列の例としては、宿主微生物が原核生物である場合に新たに導入するプロモーターとして使用可能なプロモーターの例として上に記載したプロモーターが挙げられる。
【０１００】
リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来又は枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主微生物内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。
前記リボゾーム結合配列としては、例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列のうち、４ヌクレオチド以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列などが挙げられる。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、特に制限されるものではないが、転写効率を考慮すると５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、目的酵素をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【０１０１】
宿主微生物が原核生物である場合に使用可能な発現ベクターの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等が挙げられる。
また、２種類以上の宿主微生物内での自律複製が可能な発現ベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を発現ベクターとして利用することができる。
【０１０２】
なお、宿主微生物の菌体外から遺伝子を導入する場合には、当該遺伝子は宿主微生物のゲノム中には存在しないヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもよいが、宿主微生物のゲノム中に存在するヌクレオチド配列を有する遺伝子であってもかまわない。たとえ、宿主微生物のゲノム中に元々同じ遺伝子が存在していたとしても、菌体外からの遺伝子の導入によりより強い遺伝子発現が得られ、増強された酵素活性によって、ピリドキサミン又はその塩の生産効率をさらに向上することができる。
【０１０３】
菌体外（細胞外）から菌体内（細胞内）へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）などに記載されている。例えば、コンピテントセルを用いる方法や、エレクトロポレーションを用いる方法が挙げられる。
【０１０４】
宿主微生物としては、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及びアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子が存在する場合にこれらを発現可能な微生物であれば、特に限定されない。宿主微生物の例としては、酵母、糸状菌、及び原核生物が挙げられる。酵母の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母、が挙げられる。糸状菌の例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ若しくはｖｉｒｉｄｅ等のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属糸状菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ若しくはｏｒｙｚａｅ等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ等のフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属糸状菌、及びＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ若しくはｆｕｓｉｄｉｏｉｄｅｓ等のアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属の糸状菌、が挙げられる。また、原核生物の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．ＡＣ１０等のシェワネラ（Ｓｃｈｅｗａｎｅｌｌａ）属細菌、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ等のメゾリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ等のリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属枯草菌等の枯草菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ等のストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属放線菌等の放線菌が挙げられる。
【０１０５】
これらの宿主微生物中に、例えば所望の遺伝子を含む発現ベクターを導入する（形質転換する）ことによって、所望の遺伝子を宿主微生物中に導入することができる。そして、導入された遺伝子は、例えば発現ベクター中に含まれたプロモーターの活性により、得られた組換え微生物中で高発現させることが可能である。
【０１０６】
宿主微生物の細胞に発現ベクター等の組換えＤＮＡを移入する方法としては、例えば宿主微生物が大腸菌の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。このようにして得られた組換え微生物は、培養されることにより、導入された遺伝子がコードする酵素を高い発現量で安定に生産することができる。
また、これらの酵素をコードするＤＮＡは、組換え微生物から取り出すことができ、他の微生物に移入させることも可能である。また、このＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲにより酵素をコードするＤＮＡ断片を増幅し、制限酵素等で処理した後、他のベクターＤＮＡ断片と結合させ、宿主微生物に新たに導入することも容易に実施できる。
【０１０７】
＜ピリドキサミン又はその塩の製造方法＞
一実施形態においては、ピリドキサミン又はその塩の製造方法は、第１の態様に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを接触させて、ピリドキサミン又はその塩を生産させることを含む。
ピリドキシンの塩の例としては、ピリドキシンと酸との塩が挙げられる。酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。ピリドキシンの塩は、例えばピリドキシン塩酸塩である。
【０１０８】
ピリドキサミンの塩の例としては、ピリドキサミンと酸との塩が挙げられる。酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸、などが挙げられる。医薬としての使用の観点からは、ピリドキサミンの塩は、医薬用途への応用が最も進んでいるピリドキサミン二塩酸塩であることが好ましい。
なお、このような組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いるピリドキサミン又はその塩の製造方法のことを、単に「組換え微生物を用いたピリドキサミン又はその塩の製造方法」とも称する。
【０１０９】
組換え微生物の培養物とは、組換え微生物を培養して得られる、菌体と周囲の培地等からなる産物を指す。培養物は使用しなくともよく、例えば、予め調製された乾燥若しくは凍結させた組換え微生物の細胞を、直接反応系に添加してもよい。
【０１１０】
組換え微生物の培養の際には、培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で、振とう培養、通気攪拌培養、連続培養又は流加培養などの通常の培養方法を用いて行うことができる。
【０１１１】
より具体的には、前記組換え微生物の培養の条件は、元々の宿主微生物の培養条件と同様であり、公知の条件を用いることができる。
培地に使用する成分としては、公知のものを用いることができる。例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン及びジャガイモ等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン及び有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム及び鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。
なお、前記選択マーカーを含む発現ベクターにより形質転換した組換え微生物の培養においては、例えば、前記選択マーカーが薬剤耐性である場合には、それに対応する薬剤を含む培地を使用し、前記選択マーカーが栄養要求性である場合には、それに対応する栄養素を含まない培地を使用する。
【０１１２】
培養条件は、前記組換え微生物、培地、培養方法の種類により適宜選択すればよく、組換え微生物が生育し、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素を産生できる条件であれば特に制限はない。
培地のｐＨは、例えば４〜８の範囲で選べばよく、５〜８の範囲であってもよい。
培養温度は例えば２０℃〜４５℃であり、好ましくは２４℃〜３７℃である。培養は、微生物の種類に応じて、好気的に行ってもよいし、嫌気的に行ってもよい。
培養期間は例えば１日間〜７日間である。培養期間は、目的の酵素の産生量が最大になるように設定してもよい。
【０１１３】
また、前記組換え微生物の処理物とは、組換え微生物が産生するピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素の活性を失わない範囲で、組換え微生物に対して任意の処理を行った産物を指す。このような処理としては、例えば、加熱処理、冷却処理、機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、自己消化、界面活性剤処理及び酵素処理（例えば細胞溶解処理）からなる群から選択される１つ以上を含む処理などが挙げられる。たとえ、このような処理によって組換え微生物自体が死滅したとしても、当該微生物が産生した酵素の活性が残存していれば、反応に用いることが可能である。
【０１１４】
前記培養物の処理物とは、組換え微生物が産生するピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素の活性を失わない範囲で、組換え微生物の培養物に対して任意の処理を行った産物を指す。このような処理としては、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理（例えば細胞破壊処理）、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理が挙げられる。例えば、組換え微生物の細胞を培地等から分離して、分離された細胞を反応系に添加してもよい。このような分離には、濾過又は遠心分離などの手段が使用可能である。あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素を夾雑物から分離するための精製処理を行い、該精製処理により得られた酵素を含む溶液を反応系に添加してもよい。あるいは、培養物を、メタノールやアセトニトリル等の有機溶媒又は有機溶媒と水との混合溶媒を用いて抽出した抽出物を反応系に添加してもよい。このような精製物又は抽出物は、組換え微生物の細胞を含まないものであってもよい。当該微生物の細胞が存在しなくても、酵素の活性が残存していれば、反応に用いることが可能である。
【０１１５】
上記のような細胞の破砕あるいは溶解処理は、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い組換え微生物の細胞膜を破壊することにより、行うことができる。
【０１１６】
第１の態様に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触は、以下のような条件で行うことが好ましい。
接触は基質としてのピリドキシン又はその塩を含む溶液中で行うことが好ましい。溶液のｐＨは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、６．０〜９．０であることが好ましく、７．０〜８．５であることがより好ましい。溶液の温度も、溶液のｐＨは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、２０〜７０℃であることが好ましく、２５℃〜５０℃であることがより好ましい。
溶液の媒体としては、水若しくは水性媒体、有機溶媒又は水若しくは水性媒体と有機溶媒の混合液が用いられる。水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エタンスルホン酸）緩衝液、トリス［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］塩酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。有機溶媒としては反応を阻害しないものであればいずれでもよく、例えばアセトン、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、キシレン、メタノール、エタノール、ブタノール等が用いられる。
【０１１７】
第１の態様に係る組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触は、振盪若しくは攪拌下で行うのが好ましい。例えば、このような接触は溶液中で行うことができる。例えば、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に、ピリドキシン又はその塩を基質溶液の形態であるいは固体の形態で添加してもよい。また、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液には、ピリドキサミン合成酵素によって消費されるアミノ酸をさらに添加してもよい。前記アミノ酸は、ピリドキシン又はその塩を基質溶液に含まれていてピリドキシン又はその塩と共に、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に添加されてもよい。また、ピリドキシン又はその塩を基質溶液とは別の基質溶液に含まれて、あるいは固体の形態で、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を含む溶液に添加されてもよい。
【０１１８】
反応開始時若しくは反応途中において、反応液のｐＨを適切な範囲に維持するため、酸やアルカリを添加してもよい。反応溶液に添加可能なアルカリの例としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物の他、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、リン酸二カリウム、リン酸二ナトリウム、ピロリン酸カリウム、アンモニアなど水に溶解して、液性を塩基性とするものが挙げられる。反応溶液に添加可能な酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸などが挙げられる。
【０１１９】
上記接触は、例えば、空気雰囲気下で行ってもよく、脱酸素雰囲気下で行ってもよい。脱酸素雰囲気は、不活性ガスによる置換、減圧、沸騰やこれらを組み合わせることにより達成できる。少なくとも、不活性ガスによる置換、即ち、不活性ガス雰囲気を用いるのが好適である。上記不活性ガスとしては、例えば、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス、炭酸ガス等を挙げることができ、好ましくは窒素ガスである。
【０１２０】
好ましい実施形態では、使用される、組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物は、前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、前記ピリドキサミン合成酵素、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素を含んでいる。このため、前記接触により、反応溶液中に共に存在している前記ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、前記ピリドキサミン合成酵素、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素が協働的に作用し、ピリドキサミン又はその塩を高い生産効率で生産する。なお、前記組換え微生物の処理物若しくは前記培養物の処理物が生きた状態の前記組換え微生物を含んでいることは必須ではないが、反応に関与する物質を代謝により継続的に供給することができるという観点からは、生きた状態の前記組換え微生物を含むことが好ましい。
【０１２１】
組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物の添加時期は、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。同様に、原料となるピリドキサミンも、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。
【０１２２】
反応溶液は、ピリドキサミン合成酵素によりピリドキサミン又はその塩を生成する際に消費されるアミノ酸を含んでいてもよい。このアミノ酸も、反応開始時に一括で添加しても構わないし、反応中に分割して又は連続して添加しても構わない。例えば、ピリドキサミン合成酵素としてピリドキサミン−ピルビン酸トランスアミナーゼを用いる場合には、反応溶液はＬ−アラニン又はＤ−アラニンを含んでいてもよい。また、ピリドキサミン合成酵素としてピリドキサミン−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ又はアスパラギン酸トランスアミナーゼを用いる場合には、反応溶液はＬ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、及びＤ−グルタミン酸のうち少なくとも１つを含んでいてもよい。なお、アミノ酸は周囲の環境によって塩としても存在しうるが、本明細書においては、これらも含めてアミノ酸として記載している例えばＬ−グルタミン酸との記載は塩を形成していないＬ−グルタミン酸だけでなく、塩を形成しているＬ−グルタミン酸（例えばＬ−グルタミン酸ナトリウム一水和物）をも包含している。塩を形成している場合の対イオンは、カチオンとしてはナトリウムイオン、カリウムイオンなどが挙げられ、アニオンとしては塩化物イオン、酢酸イオン、硝酸イオンなどが挙げられる。
【０１２３】
ピリドキシン又はその塩の反応溶液中における濃度は、例えば１０ｍＭ〜１Ｍであり、あるいは５０ｍＭ〜８００ｍＭであっても、あるいは７０ｍＭ〜５００ｍＭでもよい。また、前記アミノ酸（ピリドキサミン合成酵素によりピリドキサミン又はその塩を生成する際に消費されるアミノ酸）の反応溶液中における濃度は、例えば０．１ｍＭ〜２Ｍであり、あるいは１ｍＭ〜１Ｍでもよく、あるいは２ｍＭ〜５００ｍＭでもよく、あるいは２ｍＭ〜４００ｍＭでもよく、あるいは５ｍＭ〜１５０ｍＭでもよく、あるいは１０ｍＭ〜１００ｍＭでもよい。あるいは、５ｍＭ〜８００ｍＭ、１０ｍＭ〜４００ｍＭ、又は１０ｍＭ〜２００ｍＭであってもよい。
【０１２４】
第１の態様に係るピリドキサミン又はその塩の製造方法においては、反応溶液中の前記アミノ酸の濃度が比較的低濃度であっても高い生産効率でピリドキサミン又はその塩の製造が可能である。このように比較的低濃度のアミノ酸濃度であっても高い生産効率でピリドキサミン又はその塩の製造が可能であることは、驚くべき効果である。これまで、ピリドキサールからのピリドキサミンの製造については、Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110においては比較的高濃度のグルタミン酸を用いており、国際公開第２００７／１４２２２２号の実施例においては比較的高濃度のアラニン及びグルタミン酸が用いられている。ピリドキサミンはアミノ基を有しており、その提供源としてアミノ酸が消費されると考えられる。このため、Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic、2010、vol. 67、p. 104-110や国際公開第２００７／１４２２２２号においては、アミノ酸の消費を考慮して高濃度のアミノ酸を反応溶液に含ませていると考えられる。第１の態様に係るピリドキサミン又はその塩の製造方法において、上記のような効果が得られる理由は必ずしも明らかではないが、第１の態様に係る組換え微生物においては、アミノ酸再生酵素の存在により、アミノ酸を再生できるため、高濃度のアミノ酸が存在しなくても、ピリドキサミン又はその塩の生産が停止せず、高い生産効率での生産が可能になっていると考えられる。この結果、第１の態様に係るピリドキサミン又はその塩の製造方法によれば、アミノ酸を大量に添加するためのコストを省くことができ、また、反応中にアミノ酸の濃度を監視して高いアミノ酸濃度を維持するための操作を行う手間も省くことができる。
【０１２５】
前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩とを接触させる方法としては、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物をピリドキシン又はその塩を含む溶液に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物をピリドキシン又はその塩を含む溶液に加え、振とうしながら反応を進行させる方法、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物とピリドキシン又はその塩とを溶液中で充分に混和の後、静置して反応を進行させる方法などが挙げられる。好ましくは、反応効率の観点より、前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物をピリドキシン又はその塩を含む溶液に加え、攪拌しながら反応を進行させる方法が挙げられる。
【０１２６】
反応に使用可能な反応容器としては特に制限はない。好ましくは、添加した前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物とピリドキシン又はその塩を含む溶液とが十分混和されるように攪拌できるとともに、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素の最適温度範囲内に保てるように温度調節機能を有する反応容器であることが好ましい。
【０１２７】
前記組換え微生物、前記組換え微生物の培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物と、ピリドキシン又はその塩との接触時間（反応時間）は、ピリドキシンデヒドロゲナーゼ、ピリドキサミン合成酵素、及びアミノ酸再生酵素の酵素活性が維持される限りは特に制限されないが、例えば３０分〜１００時間であり、あるいは２時間〜５０時間であってもよい。また、反応はバッチ式で行ってもよく、反応途中で、基質及び前記微生物、前記培養物若しくは前記処理物のうち一方又は両方を逐次添加するセミバッチ式で行ってもよく、連続式で行ってもよい。セミバッチ式や連続式の場合は、新たな原料及び前記組換え微生物、前記培養物若しくは前記処理物のうち一方又は両方が供給される等の操作が行われるため、反応時間の上限は特に限定はされない。
【０１２８】
上記の方法においては、ピリドキシン又はその塩を原料として第１の態様に係る組換え微生物若しくは前記培養物又は前記組換え微生物若しくは前記培養物の処理物を用いることにより、化学的合成方法における場合のように煩雑なステップを経ることなく、安価に、ピリドキサミンその塩を高い生産効率で製造することができる。上記の方法により得られたピリドキサミン又はその塩は、例えばその生理活性を利用した製品の製造に用いることができる。例えば、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、慢性腎不全、アルツハイマー型認知症等のＡＧＥの蓄積に起因する疾患や統合失調症の予防や治療、健康食品、化粧品といった用途に利用可能である。
【０１２９】
＜第２の態様＞
ピリドキシンを基質としてピリドキサールを選択的かつ高効率に生産する組換え微生物は、これまで知られていなかった。
ピリドキシン及びピリドキサールの構造を以下に示す。なお、本開示において、ピリドキシン及びピリドキサールの語は、特に塩を除外する旨が明示されない限り、それぞれその塩も含む意味で使用される。ピリドキシンの塩は、例えば、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキシン硫酸塩、ピリドキシン硝酸塩、ピリドキシンリン酸塩を含む。ピリドキサールの塩は、例えば、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキサール硫酸塩、ピリドキサール硝酸塩、ピリドキサールリン酸塩を含む。
【化２】
2018207931.tif 000003
【０１３０】
＜第２の態様に係る組換え微生物＞
[配列番号１のアミノ酸配列]
配列番号１のアミノ酸配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼである。ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、以下に示す通り、ピリドキシンとＮＡＤＰ＋とから、ピリドキサールとＮＡＤＰＨとＨ＋とを生成する反応、及びその逆方向の反応を触媒する酸化還元酵素である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するピリドキシンデヒドロゲナーゼは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号ＥＣ１．１．１．６５に分類される。
【化３】
2018207931.tif 000004
【０１３１】
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、以下の（１）〜（７）のいずれかに示されるポリヌクレオチドの少なくとも１つである。
[（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド]
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば、いかなるコドンが使用されていてもよい。好ましくは、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが用いられる。
【０１３２】
[（２）配列番号１のアミノ酸配列において、１個〜５０個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド]
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列において、１個〜５０個のアミノ酸が欠失、付加又は置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドでもよい。前記タンパク質はピリドキシン又はピリドキサールの合成活性を有する。好ましくは、ＥＣ１．１．１．６５に分類される酵素活性を有している。
【０１３３】
第２の態様において、ピリドキシンの合成活性とは、ピリドキサールを基質としてピリドキシンを合成する能力を指し、ピリドキサールの合成活性とは、ピリドキシンを基質としてピリドキサールを合成する能力を指す。
【０１３４】
配列番号１のアミノ酸配列において欠失、付加又は置換されているアミノ酸残基数は、１〜４０個又は１〜３０個であることが好ましく、１〜２０個又は１〜１５個であることがさらに好ましく、１〜１０個又は１〜５個であることが特に好ましい。
【０１３５】
ピリドキシンの合成活性は、例えば、上述の（１）〜（７）のいずれかのポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水などの適切な環境下で、ピリドキサール及びＮＡＤＰＨと接触させてピリドキシンの生成を検出することによって確認することができる。ピリドキサールの合成活性は、上述の（１）〜（７）のいずれかのポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水などの適切な環境下で、ピリドキシン及びＮＡＤＰ＋と接触させてピリドキサールの生成を検出することによって確認することができる。
ピリドキサール又はピリドキシンの検出は、公知の方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって行うことができる。
【０１３６】
[（３）配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド]
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性を有し、ピリドキシン又はピリドキサールの合成活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドでもよい。前記タンパク質は、好ましくは、ＥＣ１．１．１．６５に分類される酵素活性を有している。
配列同一性は、少なくとも７０％であることが好ましく、少なくとも８０％又は少なくとも８５％以上であることがさらに好ましく、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％であることが特に好ましい。
【０１３７】
[（４）配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド]
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードしている。
【０１３８】
[（５）配列番号１３のヌクレオチド配列において、１個〜１５０個のヌクレオチドが欠失、付加又は置換されているヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド]
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド酸配列において、１個〜１５０個のヌクレオチドが欠失、付加又は置換されているヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、ピリドキシン又はピリドキサールの合成活性を有しており、好ましくは、ＥＣ１．１．１．６５に分類される酵素活性を有している。
【０１３９】
配列番号１３のヌクレオチド配列において欠失、付加又は置換されているヌクレオチド数は、１〜１４０個、１〜１２０個、１〜１００個、１〜９０個、１〜８０個、１〜７０個、１〜６０個又は１〜５０個であることが好ましく、１〜４０個、１〜３０個、１〜２０個又は１〜１５個であることがさらに好ましく、１〜１０個又は１〜５個であることが特に好ましい。
【０１４０】
[（６）配列番号１３のヌクレオチド配列と６０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド]
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド配列と６０％以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、ピリドキシン又はピリドキサールの合成活性を有しており、前記タンパク質は、好ましくは、ＥＣ１．１．１．６５に分類される酵素活性を有している。
配列同一性は、少なくとも７０％であることが好ましく、少なくとも８０％又は少なくとも８５％以上であることがさらに好ましく、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％であることが特に好ましい。
【０１４１】
[（７）配列番号１３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド]
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドでもよい。前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、ピリドキシン又はピリドキサールの合成活性を有しており、前記タンパク質は、好ましくは、ＥＣ１．１．１．６５に分類される酵素活性を有している。
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）の記載に基づいて、比較する配列に応じた条件を適宜設定することができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
典型的なストリンジェントな条件は、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とストリンジェントな洗浄条件を意味する。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中でプローブとともに５５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。ついでフィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄するなどを例示することができる。ストリンジェントな条件としては、フィルターの洗浄工程における０．１×ＳＳＣ、５０℃の条件であり、更にストリンジェントな条件としては、同工程における０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件を挙げることができる。
【０１４２】
ここで、配列番号１のアミノ酸配列との配列同一性は、比較対象とされるアミノ酸配列と最適なアライメントを行った場合に、同一であるアミノ酸の数を配列番号１のアミノ酸残基数である３４５で除した値に１００を乗じて％で表示したものである。
また、配列番号１３のポリヌクレオチド配列との配列同一性は、比較対象とされるポリヌクレオチド配列と最適なアライメントを行った場合に、同一であるヌクレオチドの数を配列番号１３のポリヌクレオチドのヌクレオチド数である１０５５で除した値に１００を乗じて％で表したものである。
最適なアラインメントとは、２つの配列間で一致するアミノ酸又はヌクレオチドの数が最も大きくなるアラインメントを指す。配列同士の最適なアラインメントは、公知の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムのデフォルトパラメータにおいてマスクフィルタリングをオフにして使用することによって行うことができる。
【０１４３】
前述の（２）、（３）、（５）又は（６）のいずれかに記載のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１３のヌクレオチド配列において欠失、付加又は置換されているアミノ酸残基数又はヌクレオチド数は少ない方が好ましく、また、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１３のヌクレオチド配列との同一性は高い方が好ましい。しかし、酵素活性に影響をおよぼさない又は影響が少ない変異であれば欠失、付加又は置換されているアミノ酸残基数又はヌクレオチド数が多くても第２の態様に係る組換え微生物による効果を発揮することができる。例えば、類似する性質を有するアミノ酸同士の置換がタンパク質の機能に影響が少ないことは当業者に周知である。別の例として、１つのアミノ酸をコードするコドンには複数の種類があり、同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであっても、使用コドンの相違により配列番号１３のヌクレオチド配列との相違が多くなる場合があることは当業者に周知である。
【０１４４】
第２の態様に係る組換え微生物は、導入された遺伝子から、ピリドキシンを基質としてピリドキサールを合成する能力を有するタンパク質、又はピリドキサールを基質としてピリドキシンを合成する能力を有するタンパク質が発現しており、好ましくは、ＥＣ１．１．１．６５に分類される酵素活性を有するタンパク質が発現している。
第２の態様に係る組換え微生物が、導入された遺伝子からピリドキシンを基質としてピリドキサールを合成する能力を有するタンパク質、又はピリドキサールを基質としてピリドキシンを合成する能力を有するタンパク質を発現していることは、公知の方法で確認すればよい。遺伝子を導入された組換え微生物を、基質としてのピリドキシン又はピリドキサールと接触させて酵素反応の結果物としてのピリドキシン又はピリドキサールの生成を検出することによって、前記タンパク質の発現を確認することができる。ピリドキシン又はピリドキサール合成の前後に別の反応を行う組換え微生物である場合には、当該前後の反応を勘案して基質としてのピリドキシン又はピリドキサールから、酵素反応の結果物としてのピリドキシン又はピリドキサールの生成がなされていることを理論的に確認することができる。
【０１４５】
＜第２の態様に係る組換え微生物の調製＞
[宿主]
第２の態様に係る組換え微生物を調製する際に宿主となる微生物は、一般的にタンパク質の発現に用いられる微生物を宿主として使用することができる。宿主微生物の例としては、酵母、糸状菌、及び原核生物が挙げられる。酵母の例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母、及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母、が挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主とした場合には、内在性のピリドキシンデヒドロゲナーゼに加えて、前述の（１）〜（７）のいずれか１つのポリヌクレオチドを導入することによって、ピリドキサールを選択的に効率的に生産することができる微生物を得ることができる。
糸状菌の例としては、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ若しくはｖｉｒｉｄｅ等のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属糸状菌、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ若しくはｏｒｙｚａｅ等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ等のフミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属糸状菌、及びＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ若しくはｆｕｓｉｄｉｏｉｄｅｓ等のアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属の糸状菌、が挙げられる。
細菌の例としては、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属等が例示される。工業的な使用の実績が豊富な大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が特に好適に使用される。大腸菌以外の宿主としては、例えば、ブレビバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ及びＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓが挙げられる。
【０１４６】
[ポリヌクレオチドの宿主への導入]
ポリヌクレオチドを宿主に導入する方法は公知である。例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ」（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）等に記載されている分子生物学、生物工学、及び遺伝子工学の分野において公知の一般的な方法によって、目的のポリヌクレオチドを宿主に導入することができる。例えば、前記（１）〜（６）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用意し、この発現ベクターにより任意の宿主微生物を形質転換して組換え微生物を得ることができる。
宿主が最近である場合、宿主細菌の細胞に発現ベクター等の組換えＤＮＡを導入する方法としては、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。このようにして得られた組換え細菌は、培養されることにより、多量のピリドキシンデヒドロゲナーゼを安定的に発現させることができる。
【０１４７】
発現ベクターは、前述の（１）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含んでいれば特に限定されず、遺伝子工学の分野において公知の一般的な発現ベクターを採用することができる。発現ベクターは、前記ポリヌクレオチドの発現に必要な制御領域及び自律複製に必要な領域などの、組換え微生物によるタンパク質の産生を可能にする要素を必要に応じて含んでいてもよい。発現に必要な制御領域としては、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む。）、リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）、転写終結配列、制限酵素切断配列等、あるいは他の遺伝子を挙げることができる。他の遺伝子は、例えば、生成したピリドキシン又はピリドキサールを中間体として、他の物質に変換する作用を持つタンパク質であってもよい。
【０１４８】
プロモーター配列の例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ(ｇａｄＡ)プロモーター、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ(ｇｌｙＡ)プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）又はα−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。
また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変又は設計されたプロモーター配列も利用できる。
【０１４９】
リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来又は枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主細胞内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。
前記リボゾーム結合配列としては、例えば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列のうち、４ヌクレオチド以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成した配列などが挙げられる。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
これら制御領域の発現ベクター上での配列順序は、特に制限されるものではないが、転写効率を考慮すると５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、目的蛋白質をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
【０１５０】
ここでいう発現ベクターの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を含んでいるｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を含んでいるｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等を発現ベクターとして利用することができる。
また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能な発現ベクターの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を発現ベクターとして利用することができる。
【０１５１】
＜ピリドキサールの製造方法＞
第２の態様に係るピリドキサールの製造方法は、第２の態様に係る組換え微生物とピリドキシンとを接触させることを含む。上述した発現ベクターを所望の宿主微生物に導入して得られた組換え微生物は、前記発現ベクターが含むポリヌクレオチドがコードするタンパク質を生産する。生産されたタンパク質は、ピリドキシンを基質としてピリドキサールを生成する。
【０１５２】
第２の態様に係る組換え微生物を培養することによって増殖させてもよい。培養の条件は、宿主細胞の培養条件と同様であり、公知の条件を用いることができる。
培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である。培地に使用する成分としては、公知のものを用いることができる。例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン及びジャガイモ等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン及び有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム及び鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。
なお、前記選択マーカーを含む発現ベクターにより形質転換した組換え微生物の培養においては、例えば、前記選択マーカーが薬剤耐性である場合には、それに対応する薬剤を含む培地を使用し、前記選択マーカーが栄養要求性である場合には、それに対応する栄養素を含まない培地を使用する。培地のｐＨは、ｐＨ４〜ｐＨ８の範囲で選べばよい。
培養は前記培地を含有する液体培地中で、組換え微生物を振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行なうことができる。
培養条件は、宿主、培地、培養方法の種類により適宜選択すればよく、組換え微生物が生育し、第２の態様に係る組換え微生物を産生できる条件であれば特に制限はない。
培養温度は２０℃〜４５℃、好ましくは２４℃〜３７℃で好気的に培養を行う。
【０１５３】
例えば、宿主が大腸菌の場合、組換え大腸菌を培養する培地としてＬＢ（Lysogeny Broth）培地やＭ９培地などが一般的に用いられるが、より好ましくはそのような培地に成分としてＦｅイオン及びＣｏイオンを０．１μｇ／ｍＬ以上含ませた培地である。組換え大腸菌を培地に植菌した後、適当な培養温度（一般的には、２０℃〜５０℃）で生育させればよい。
【０１５４】
ピリドキサールを製造するためには、第２の態様に係る組換え微生物を培養して得られる培養物又は培養物の処理物と、基質としてのピリドキシンとを接触させればよい。第２の態様に係る組換え微生物が生成する組換えタンパク質が、ピリドキシンを基質としてピリドキサールを生成することができる。
組換え微生物を培養して得られる培養物は、組換え微生物の培養から得られたものであれば特に限定はされない。培養物は、培地から回収した菌体であってもよいし、培地から回収した上述の（１）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質でもよい。あるいは、菌体を含む培地又は菌体を含まないが組換え微生物が生成する組換えタンパク質を含む培地をそのまま用いてもよい。
【０１５５】
培養物の処理物とは、第２の態様に係る組換え微生物が産生する組換えタンパク質の活性を失わない範囲で、組換え微生物の培養物に対して任意の処理を行った産物を指す。このような処理としては、加熱処理、冷却処理、細胞の機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、加圧又は減圧処理、浸透圧処理、細胞の自己消化、界面活性剤処理、酵素処理（例えば細胞破壊処理）、細胞分離処理、精製処理及び抽出処理からなる群から選択される１つ以上を含む処理が挙げられる。例えば、組換え微生物の細胞を培地等から分離して、分離された細胞を反応系に添加してもよい。このような分離には、濾過又は遠心分離などの手段が使用可能である。あるいは、第２の態様に係る組換え微生物が産生する組換えタンパク質を夾雑物から分離するための精製処理を行い、該精製処理により得られた酵素を含む溶液を反応系に添加してもよい。あるいは、培養物を、メタノールやアセトニトリル等の有機溶媒又は有機溶媒と水との混合溶媒を用いて抽出した抽出物を反応系に添加してもよい。このような精製物又は抽出物は、組換え微生物の菌体を含まないものであってもよい。当該菌体が存在しなくても、第２の態様に係る組換え微生物が産生する組換えタンパク質の活性が残存していれば、ピリドキシン又はピリドキサールの製造に使用することが可能である。
上記のような細胞の破砕あるいは溶解処理は、リゾチーム処理、凍結融解、超音波破砕などの公知の方法に従い組換え微生物の細胞膜を破壊することにより、行うことができる。
【０１５６】
第２の態様において、培養物の処理物は、菌体又は上述の（１）〜（７）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を、例えば、ビーズや膜等の固相に固定化したものでもよい。菌体又はタンパク質を固相に固定化する方法は従来知られている方法を用いることができる。
【０１５７】
ピリドキサールを製造するためには、第２の態様に係る組換え微生物の培養中に、組換え微生物と、基質としてのピリドキシンとを接触させてもよい。組換え微生物とピリドキシンとを接触させるためには、例えば、培地にピリドキシンを加えればよい。ピリドキシンは培養の当初から培地に含まれていてもよいし、培養を開始した後、例えば、微生物が増殖期に入ってから加えてもよい。
【０１５８】
第２の態様に係るピリドキサールの製造方法において、生成されたピリドキサールは、培養された組換え微生物自体、培地その他から回収してもよいし、回収せずに直接に所望の次の工程に供してもよい。ピリドキサールを回収する方法は、この分野で慣用されている方法を使用することができる。また、次の工程は、ピリドキサールを用いるものであれば特に限定されない。次の工程の例としては、ピリドキサールをリン酸化する工程などが挙げられる。
【０１５９】
上記のとおり、第２の態様に係る組換え微生物及びピリドキサールの製造方法によって、選択的に、かつ高効率でピリドキサールを製造することができる。
【０１６０】
なお、本開示において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。また本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【実施例】
【０１６１】
以下の実施例により実施形態を更に説明するが、本開示は以下の実施例によって何等限定されるものではない。また、実施例の組成物における含有成分量を示す「％」は、特に断らない限り質量基準である。【０１６２】
<分析条件>
ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキサミン二塩酸塩は高速液体クロマトグラフィーにより定量した。これらの分析条件は次の通りである。
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＯＤＰ−５０  ６Ｅ（昭和電工株式会社）
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＯＤＰ−５０Ｇ  ６Ａ（昭和電工株式会社）
カラム温度：３０℃
ポンプ流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）
検出：ＵＶ２５４ｎｍ【０１６３】
比較例１  ppat発現株の作成
Mesorhizobium loti MAFF303099由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１４のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号１８のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１９のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ製）のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによる処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１６４】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１４のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppatと命名した。ここで、ppatはピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子の略称である。【０１６５】
比較例２．ppat-plr発現株の作成
Saccharomyces cerevisiae由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１３のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号１６のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号１７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例１で作製したpUC18-ppatをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１６６】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１３のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-plrと命名した。ここで、plrはピリドキサールレダクターゼ遺伝子（ピリドキシンデヒドロゲナーゼに該当）の略称である。なお、大腸菌ＤＨ５αは、元来、ピリドキシンデヒドロゲナーゼの遺伝子を有していない。また、大腸菌ＤＨ５αは、元来、ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼが消費するＬ−アラニンを再生できるアラニン再生酵素の遺伝子は有していない。したがって、ここで得られたppat-plr発現株は、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、前記ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子及び前記アミノ酸再生酵素をコードする遺伝子のうち２つが菌体外から導入されているものの、導入されたピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子は有していないため、比較例に相当する。【０１６７】
比較例３  ppat-adh発現株の作成
Shewanella sp. AC10由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号２０のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例１で作製したpUC18-ppatをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。この形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１６８】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１５のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adhと命名した。ここで、adhはアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の略称である。先に述べたように、大腸菌ＤＨ５αは、元来、ピリドキシンデヒドロゲナーゼの遺伝子を有していないため、ここで得られたppat-adh発現株は比較例に相当する。【０１６９】
実施例１  ppat-adh-plr発現株の作成
Shewanella sp. AC10由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化したものをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡを鋳型として用い配列番号２０のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理した処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。この形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。【０１７０】
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１５のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-plrと命名した。【０１７１】
試験１  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
ｐＵＣ１８、比較例１〜３及び実施例１で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水１ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（６００ｍＭ）及びＬ−アラニン（６００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液５００μｌと菌体懸濁液１０００μｌを混合し、３７℃で２４時間反応させた。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析した。結果を表１に示す。なお、表１に示す収率とは、基質液中のピリドキシン塩酸塩のモル量に対する得られたピリドキサミン二塩酸塩のモル量の比を表す。【０１７２】
【表１】
2018207931.tif 000005
【０１７３】
表１に示されたように、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ピリドキサミン合成酵素をコードする遺伝子、及び前記ピリドキサミン合成酵素が消費するアミノ酸を再生する酵素活性を有するアミノ酸再生酵素をコードする遺伝子の全てが揃い、かつ、これらの遺伝子の２つ以上が細胞外から導入された場合には、ピリドキサミン二塩酸塩が高い生産効率で生産された。【０１７４】
試験２  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（Ｌ−アラニン濃度の検討）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-adh-plr）で形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．５ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。【０１７５】
ピリドキシン塩酸塩を水で溶解し、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整して、ピリドキシン塩酸塩（６００ｍＭ）を含む基質液（１）を調製した。Ｌ−アラニンを水で溶解し、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整して、Ｌ−アラニン（１，２００ｍＭ）を含む基質液（２）を調製した。基質液（１）を５００μｌと所定量の基質液（２）とを混合した。各混合液に、菌体懸濁液５００μｌを加え、さらに水を加えることで１，５００μｌの反応液を調製し、３７℃で２４時間反応させた。この際の基質液（２）の量は、反応液中におけるＬ−アラニンの濃度がそれぞれ０ｍＭ，１ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，５０ｍＭ，２００ｍＭ，４００ｍＭ，及び８００ｍＭとなるように、変化させた。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析することで、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキサミン二塩酸塩を定量した。結果を表２に示す。なお、表２に示す収率とは、基質液中のピリドキシン塩酸塩のモル量に対する得られたピリドキサミン二塩酸塩のモル量の比を表す。【０１７６】
【表２】
2018207931.tif 000006
【０１７７】
表２に示されるように、基質混合液中のＬ−アラニンの濃度について、広い範囲のＬ−アラニン濃度で高い収率が達成された。Ｌ−アラニンの濃度が０ｍＭから５０ｍＭの濃度範囲においては、Ｌ−アラニン濃度以上のピリドキサミンが生成した。これは、アラニンデヒドロゲナーゼを導入したことにより、ピリドキサミン生成のための反応で消費されたＬ−アラニンを再生することが可能となり、Ｌ−アラニン濃度が低い場合であってもＬ−アラニンの再生によりピリドキサミン生成反応が進んだことを示している。【０１７８】
試験３  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造（Ｌ−アラニン濃度の検討）
実施例１で作製したプラスミド（pUC18-ppat-adh-plr）を形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．５ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩を水で溶解し、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整して、ピリドキシン塩酸塩（６００ｍＭ）を含む基質液を調製した。この基質液を５００μｌ、菌体懸濁液５００μｌ、及び残量の水を混合して１，５００μｌの反応液を調製し、Ｌ−アラニン粉末を飽和溶解度となるように添加し、３７℃で２４時間反応させた。反応液を一部採取し、上記に示す分析条件で分析することで、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、ピリドキサミン二塩酸塩を定量した。その結果、反応収率は３９％であった。つまり、Ｌ−アラニンをより低濃度で用いた場合の方が高い収率を達成できていた。【０１７９】
このように、第１の態様に係るピリドキサミン又はその塩の製造方法によれば、消費されるアミノ酸を大量に添加するのではなく比較的少量用いるだけでも、ピリドキシン又はその塩から高い生産効率で安価にピリドキサミン又はその塩を生産することができることが示された。【０１８０】
実施例２  ppat-adh-Seplr発現プラスミドの作成
Saccharomyces eubayanus由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＳａｌＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号７５のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例３で作製したpUC18-ppat-adhをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体はＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号７５のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-Seplrと命名した。【０１８１】
実施例３  ppat-adh-Tdplr発現プラスミドの作成
Torulaspora delbrueckii由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＳａｌＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号７６のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例３で作製したpUC18-ppat-adhをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号７６のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-Tdplrと命名した。【０１８２】
実施例４  ppat-adh-Zbplr発現プラスミドの作成
Zygosaccharomyces bailii 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＳａｌＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入した遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号７７のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例３で作製したpUC18-ppat-adhをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号７７のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-Zbplrと命名した。【０１８３】
実施例５  ppat-adh-Aoplr発現プラスミドの作成
Aspergillus oryzae 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＳａｌＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入した遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号７８のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例３で作製したpUC18-ppat-adhをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号７８のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-Aoplrと命名した。【０１８４】
実施例６  ppat-adh-Kmplr発現プラスミドの作成
Kluyveromyces marxianus 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＳａｌＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入した遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号７９のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例３で作製したpUC18-ppat-adhをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号７９のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-Kmplrと命名した。【０１８５】
実施例７  ppat-adh-Caplr発現プラスミドの作成
Candida albicans由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＳａｌＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８０のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例３で作製したpUC18-ppat-adhをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８０のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-Caplrと命名した。【０１８６】
実施例８  ppat-adh-Ylplr発現プラスミドの作成
Yarrowia lipolytica 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＳａｌＩ、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを導入した遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して合成し、配列番号８１のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例３で作製したpUC18-ppat-adhをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８１のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-adh-Ylplrと命名した。【０１８７】
試験４  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
実施例２〜８で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調整した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌ及び菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表３に示す。なお、表３に示すピリドキサミン生産量とは、実施例１で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。【０１８８】
【表３】
2018207931.tif 000007
【０１８９】
表３に示されたように、ピリドキシンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子として、実施例１にて使用したSaccharomyces cerevisiae由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子に代えて、Saccharomyces eubayanus由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子、Torulaspora delbrueckii由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子、Zygosaccharomyces bailii 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子、Aspergillus oryzae 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子、Kluyveromyces marxianus 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子、Candida albicans由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子、又はYarrowia lipolytica 由来ピリドキサールレダクターゼ遺伝子を導入することによっても、ピリドキシン塩酸塩からピリドキサミン二塩酸塩を生産することができた。【０１９０】
比較例４  adh-plr発現プラスミドの作成
比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、回収したピリドキサールレダクターゼ遺伝子（ｐｌｒ）断片と、比較例３で作製したpUC-ppat-adhをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理し、回収したアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｄｈ）断片とpUC18のＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによる処理物とを、ライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出し、得られたプラスミドをpUC18-adh-plrと命名した。【０１９１】
実施例９  Msppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Mesorhizobium sp. YR577由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８２のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例４で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８２のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Msppat-adh-plrと命名した。【０１９２】
実施例１０  Psppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Pseudaminobacter salicylatoxidans由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８３のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例４で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８３のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Psppat-adh-plrと命名した。【０１９３】
実施例１１  Blppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Bauldia litoralis由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８４のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例４で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８４のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Blppat-adh-plrと命名した。【０１９４】
実施例１２  Ssppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Skermanella stibiiresistens由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８５のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例４で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８５のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Ssppat-adh-plrと命名した。【０１９５】
実施例１３  Rsppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Rhizobium sp. AC44/96由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８６のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例４で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８６のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Rsppat-adh-plrと命名した。【０１９６】
実施例１４  Etppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Erwinia toletana由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８７のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例４で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８７のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Etppat-adh-plrと命名した。【０１９７】
実施例１５  Hgppat-adh-plr発現プラスミドの作成
Herbiconiux ginsengi由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、５’末端にＥｃｏＲＩ、３’末端にＢａｍＨＩを導入した遺伝子をｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８８のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例４で作製したpUC18-adh-plrをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８８のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-Hgppat-adh-plrと命名した。【０１９８】
試験５  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
実施例９〜１５で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調整した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌと菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表４に示す。なお、表４に示すピリドキサミン生産量とは、実施例１で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。【０１９９】
【表４】
2018207931.tif 000008
【０２００】
表４に示されたように、ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子として、実施例１にて使用したMesorhizobium loti MAFF303099由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子に代えて、Mesorhizobium sp. YR577由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Pseudaminobacter salicylatoxidans由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Bauldia litoralis 由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Skermanella stibiiresistens 由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Rhizobium sp. AC44/96由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、Erwinia toletana由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子、又はHerbiconiux ginsengi 由来ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子を導入することによっても、ピリドキシン塩酸塩からピリドキサミン二塩酸塩を生産することができた。【０２０１】
実施例１６  ppat-Ahadh-plr発現プラスミドの作成
Aeromonas hydrophila由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、さらに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｌＩを導入したものをｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号８９のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号８９のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Ahadh-plrと命名した。【０２０２】
実施例１７  ppat-Rsadh-plr発現プラスミドの作成
Rhizobium sp. LPU83由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、さらに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｌＩを導入したものをｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号９０のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９０のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Rsadh-plrと命名した。【０２０３】
実施例１８  ppat-Pmadh-plr発現プラスミドの作成
Pseudomonas mendocina由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、さらに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｌＩを導入したものをｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号９１のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９１のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Pmadh-plrと命名した。【０２０４】
実施例１９  ppat-Bjadh1-plr発現プラスミド及びppat-Bjadh2-plr発現プラスミドの作成
Bradyrhizobium japonicum由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子はBradyrhizobium japonicum中に２種存在する。これら２種のBradyrhizobium japonicum由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、さらに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｌＩを導入したものをｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号９２及び配列番号９３のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡ２種を得た。配列番号９２を含む該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９２のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Bjadh1-plrと命名した。
同様に配列番号９３を含む該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９３のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Bjadh2-plrと命名した。【０２０５】
実施例２０  ppat-Saadh-plr発現プラスミドの作成
Streptomyces aureofaciens由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、さらに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｌＩを導入したものをｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号９４のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９４のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Saadh-plrと命名した。【０２０６】
実施例２１  ppat-Acadh-plr発現プラスミドの作成
Anabaena cylindrica由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９８Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、さらに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｌＩを導入したものをｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号９５のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９５のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Acadh-plrと命名した。【０２０７】
実施例２２  ppat-Bsadh-plr発現プラスミドの作成
Bacillus subtilis由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列に、コードするアミノ酸配列においてＤ１９６Ａとなる変異を導入し、かつ大腸菌にコドン最適化するようにデザインし、さらに５’末端にＢａｍＨＩ、３’末端にＳａｌＩを導入したものをｅｕｒｏｆｉｎｓ社に委託して合成し、配列番号９６のヌクレオチド配列を有する合成ＤＮＡを得た。該合成ＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、比較例２で作製したpUC18-ppat-plrをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理したＤＮＡ断片とをライゲーション  ハイ（東洋紡株式会社製）を用いてライゲーションした。このライゲーション産物でエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。このようにして得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。
通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号９６のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-ppat-Bsadh-plrと命名した。【０２０８】
試験６  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
実施例１６〜２２で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調整した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌと菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表５に示す。なお、表５に示すピリドキサミン生産量とは、実施例１で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。【０２０９】
【表５】
2018207931.tif 000009
【０２１０】
表５に示されたように、アラニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子として、実施例１にて使用したShewanella sp. AC10由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子に代えて、Aeromonas hydrophila由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、Rhizobium sp. LPU83由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、Pseudomonas mendocina 由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、Bradyrhizobium japonicum 由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子（Bradyrhizobium japonicum の２種のアラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子の各々）、Streptomyces aureofaciens 由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、Anabaena cylindrica由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子、又はBacillus subtilis 由来アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入することによっても、ピリドキシン塩酸塩からピリドキサミン二塩酸塩を生産することができた。【０２１１】
実施例２３  配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を発現する大腸菌の作成
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼ遺伝子（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を大腸菌にコドン最適化したＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に委託して作成した（配列番号１３）。得られた合成ＤＮＡを鋳型として、配列番号１８及び配列番号１７に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により目的遺伝子を増幅した。増幅したＤＮＡをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、得られたＤＮＡ断片と、ｐＵＣ１８（Ｔａｋａｒａ社製）のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理物とを、ライゲーション  ハイ(東洋紡株式会社製)を用いてライゲーションして発現ベクターを得た。発現ベクターを含むライゲーション産物によってエシェリヒア  コリＤＨ５α（東洋紡株式会社製）を形質転換した。形質転換体をＬＢ寒天培地で培養し、アンピシリン耐性株の中から目的のプラスミドを有する株を選択した。【０２１２】
選択した株が、配列番号１３のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含んでいることを確認するために、得られた形質転換体からプラスミドを抽出した。通常のヌクレオチド配列の決定法に従い、プラスミドに導入されたＤＮＡ断片のヌクレオチド配列が配列番号１３のヌクレオチド配列であることを確認した。得られたプラスミドをpUC18-plrと命名した。【０２１３】
実施例２４  ピリドキシンデヒドロゲナーゼ発現株によるピリドキシンを基質としたピリドキサール合成
pUC18-plrによって形質転換した大腸菌ＤＨ５α株をＬＢ液体培地２ｍＬ（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有) へ接種し、試験管で３７℃にて２４時間振盪培養した。１ｍＬの培養液を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた菌体を水１ｍＬに懸濁して菌体懸濁液を得た。
ピリドキシン塩酸塩及びβ−ＮＡＤＰ＋をそれぞれ1００ｍＭとなるよう水に溶かして基質液を得た。１００μＬの基質液、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び７００μＬの水を混合し、そこに１００μＬの菌体懸濁液を添加して反応を開始した。反応は３７℃で１時間行った。【０２１４】
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析を行った。
１時間の反応によって３７．２μｇのピリドキサールが得られ、ＯＤ６６０当たりのピリドキサール生成速度は２．１×１０−３μｍｏｌ／ｍｉｎ／ＯＤ６６０であった。
・ＨＰＬＣの分析条件
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ−５０  ６Ｅ（商品名、昭和電工株式会社製）
ガードカラム：Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＯＤＰ-５０Ｇ ６Ａ（商品名、昭和電工株式会社製）
カラム温度：３０℃
ポンプ流速：１．０ｍＬ／分
溶離液：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）
検出：ＵＶ２９４ｎｍ。【０２１５】
比較例５  酵母によるピリドキシンを基質としたピリドキサール合成
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｘ−２１８０−１Ａ（ＡＴＣＣ２６４８６）を２ｍＬのＹＰＤ液体培地へ接種し、試験管で３０℃にて２４時間振盪培養した。１ｍＬの培養液を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた菌体を１ｍＬの水で懸濁して菌体懸濁液を得た。
基質液として、実施例２４の基質液と同じ組成のものを調製し、実施例２４の反応条件と同じ条件で反応を行った。【０２１６】
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
１時間の反応によってピリドキサールは得られなかった。【０２１７】
実施例２５  ピリドキシンデヒドロゲナーゼ発現株によるピリドキサールを基質としたピリドキシン合成
実施例２４と同様に菌体懸濁液を調製し、ピリドキサール塩酸塩及びβ−ＮＡＤＰＨをそれぞれ１００ｍＭとなるよう水に溶かして基質液を得た。１００μＬの基質液、１００μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び７００μＬの水を混合し、そこに１００μＬの菌体懸濁液を添加して反応を開始した。
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
１時間の反応によって８１５．５μｇのピリドキシンが得られ、ＯＤ６６０当たりのピリドキシン生成速度は４．５×１０−２μｍｏｌ／ｍｉｎ／ＯＤ６６０であった。【０２１８】
比較例６  酵母によるピリドキサールを基質としたピリドキシン合成（ＯＤ６６０当たりのピリドキシン生成速度）
比較例５と同様に菌体懸濁液を調製し、基質液として実施例２５の基質液と同じ組成のものを調製し、実施例２５の反応条件と同じ条件で反応を行った。
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
１時間の反応によって１０．９μｇのピリドキシンが得られ、ＯＤ６６０当たりのピリドキシン生成速度は１．７×１０−４μｍｏｌ／ｍｉｎ／ＯＤ６６０であった。【０２１９】
実施例２４〜２５及び比較例５〜６の結果を表６に示す。実施例２４及び２５では、比較例５及び６と比較して、ピリドキサール又はピリドキシンの収量及び生成速度は顕著に優れていた。特に、ピリドキサール合成においては、比較例５では検出感度以下であったピリドキサールを、実施例２４では生産することができた。【０２２０】
【表６】
2018207931.tif 000010
【０２２１】
実施例２６  ピリドキシンデヒドロゲナーゼ発現株によるピリドキシンを基質としたピリドキサール合成
pUC18-plrによって形質転換した大腸菌ＤＨ５α株をＬＢ液体培地１００ｍＬ（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ含有) へ接種し、バッフル付三角フラスコで３７℃にて２４時間振盪培養した。４０ｍＬの培養液を８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた菌体を水４００μＬに懸濁して菌体懸濁液を得た。基質液として実施例２４の基質液と同じ組成のものを調製し、実施例２４の反応条件と同じ条件で反応を行った。反応は３７℃で３０分行った。
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
３０分の反応によって２６２．４μｇのピリドキサールが得られ、乾燥菌体重量当たりのピリドキサール生成速度は５．８μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌであった。【０２２２】
比較例７  ドライイーストによるピリドキシンを基質としたピリドキサール合成
スーパーカメリヤ  ドライイースト（商品名、日清）を１００ｍｇ/ｍｌになるよう水で懸濁し、菌体懸濁液を得た。
基質液として、実施例２４の基質液と同じ組成のものを調製し、実施例２４の反応条件と同じ条件で反応を行った。
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
３０分の反応によって３４．１μｇのピリドキサールが得られ、乾燥菌体重量当たりのピリドキサール生成速度は０．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌであった。【０２２３】
実施例２７  ピリドキシンデヒドロゲナーゼ発現株によるピリドキサールを基質としたピリドキシン合成
実施例２６と同様に菌体懸濁液を調製し、基質液として実施例２５の基質液と同じ組成のものを調製し、実施例２５の反応条件と同じ条件で反応を行った。
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
３０分の反応によって１４５７．４μｇのピリドキシンが得られ、乾燥菌体重量当たりのピリドキシン生成速度は３３．５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌであった。【０２２４】
比較例８  ドライイーストによるピリドキサールを基質としたピリドキシン合成（乾菌体重量当たりのピリドキシン生成速度）
比較例７と同様に菌体懸濁液を調製し、基質液として実施例２５の基質液と同じ組成のものを調整し、実施例２５の反応条件と同じ条件で反応を行った。
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
３０分の反応によって３２５．３μｇｎｏピリドキシンが得られ、乾燥菌体重量当たりのピリドキシン生成速度は１３．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌであった。【０２２５】
実施例２６〜２７及び比較例７〜８の結果を表７に示す。実施例２６及び２７では、比較例７及び８と比較して、ピリドキサール又はピリドキシンの収量及び生成速度は顕著に優れていた。実施例２６では、比較例７の約８倍のピリドキサール収量が得られ、乾燥菌体重量１ｇ当たりの生成速度は約６．５倍であった。実施例２７では比較例８の約４．５倍のピリドキシン収量が得られ、乾燥菌体重量１ｇ当たりの生成速度は約２．５倍であった。【０２２６】
【表７】
2018207931.tif 000011
【０２２７】
２０１７年５月１２日に出願された日本国特許出願２０１７−０９５５７１号及び２０１７年５月１２日に出願された日本国特許出願２０１７−０９５５７３号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１−１】
2018207931.tif 000012
【図１−２】
2018207931.tif 000013
【図２−１】
2018207931.tif 000014
【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
2018207931.tif 000017
【配列表】
2018207931000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月8日(2019.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
あるいは、ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、下記の部分アミノ酸配列（ａ）及び部分アミノ酸配列（ｂ）のうち少なくとも１つを含み、且つピリドキシンデヒドロゲナーゼ活性を有するピリドキシンデヒドロゲナーゼであってもよい。
（ａ）  ＮＸ１Ｘ２ＥＸ３ＹＧ（配列番号９７）
（ここで、Ｘ１は、Ｖ、Ｃ、Ｉ、Ａ、Ｍ、Ｓ、Ｇ又はＬを表し、
Ｘ２は、Ｇ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｆ又はＬを表す）
（ｂ）  Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＫＧＸ７（配列番号９８）
（Ｘ４は、Ｉ、Ｖ、Ｆ又はＬを表し、
Ｘ５は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｃ又はＭを表し、
Ｘ６は、Ｃ、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｗ又はＦを表し、
Ｘ７は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＣを表す）
図１−１及び図１−２には、配列番号１及び配列番号２２〜配列番号２８の配列のアラインメントを示す。図１−１及び図１−２中、ＳｃＰｌｒはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＳｅＰｌｒはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｕｂａｙａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＴｄＰｌｒはＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＺｂＰｌｒはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＫｍＰｌｒはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ    ｍａｒｘｉａｎｕｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＡｏＰｌｒはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＣａＰｌｒはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのピリドキシンデヒドロゲナーゼを、ＹｌＰｌｒはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａのピリドキシンデヒドロゲナーゼを表す。部分アミノ酸配列（ａ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から５５番目〜６１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当し、部分アミノ酸配列（ｂ）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８６番目〜９１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。本開示において配列同士のアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ（登録商標、National Library of Medicine）プログラムを用いてデフォールトパラメータで行うことができる。部分アミノ酸配列（ａ）は、タンパク質のＮ末端から４５番目〜７１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から４６番目〜６６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。部分アミノ酸配列（ｂ）は、タンパク質のＮ末端から７６番目〜１０１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から７９番目〜９６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８９番目のリジン残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基を含む領域の別の表記として、以下の部分アミノ酸配列（ｂ−１）が挙げられる。ピリドキシンデヒドロゲナーゼは、部分アミノ酸配列（ｂ）の代わりに部分アミノ酸配列（ｂ−１）を含んでいてもよい。
（ｂ−１）Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＫＧＸ９（配列番号１１０）
Ｘ１は、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｓ又はＮを表し、
Ｘ２は、Ｋ、Ｓ、Ｅ、Ｑ、Ｄ又はＡを表し、
Ｘ３は、Ｄ、Ｈ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｑ又はＲを表し、
Ｘ４は、Ｖ、Ｔ、Ｉ、Ｍ又はＬを表し、
Ｘ５は、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｍ又はＴを表し、
Ｘ６は、Ｉ、Ｖ、Ｆ又はＬを表し、
Ｘ７は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｃ又はＭを表し、
Ｘ８は、Ｃ、Ｖ、Ａ、Ｉ、Ｗ又はＦを表し、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、Ｓ又はＣを表す。
部分アミノ酸配列（ｂ−１）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのピリドキシンデヒドロゲナーゼのＮ末端から８１番目〜９１番目のアミノ酸残基にアラインメント上対応するアミノ酸残基に相当する。部分アミノ酸配列（ｂ−１）は、タンパク質のＮ末端から７１番目〜１０１番目のアミノ酸残基の領域内に存在することが好ましく、Ｎ末端から７４番目〜９６番目のアミノ酸残基の領域内に存在することがより好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
［（５）配列番号１３のヌクレオチド配列において、１個〜１５０個のヌクレオチドが欠失、付加又は置換されているヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド］
第２の態様に係る組換え微生物において宿主微生物に導入されるポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド配列において、１個〜１５０個のヌクレオチドが欠失、付加又は置換されているヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドでもよい。前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質は、ピリドキシン又はピリドキサールの合成活性を有しており、好ましくは、ＥＣ１．１．１．６５に分類される酵素活性を有している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
試験４  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
実施例２〜８で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌ及び菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表３に示す。なお、表３に示すピリドキサミン生産量とは、実施例１で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
試験５  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
実施例９〜１５で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌと菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表４に示す。なお、表４に示すピリドキサミン生産量とは、実施例１で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０８】
試験６  ピリドキシンを原料としたピリドキサミンの製造
実施例１６〜２２で作製したプラスミドのそれぞれで形質転換したＤＨ５αを、５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコ中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３０℃にて２４時間振盪培養した。培養液の４０ｍｌを取り、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿物として得られた菌体を水０．９ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を調製した。
ピリドキシン塩酸塩及びＬ−アラニンを水で溶解し、ピリドキシン塩酸塩（５００ｍＭ）及びＬ−アラニン（５００ｍＭ）を含む基質液を調製した。基質液のｐＨを、２５％アンモニア水でｐＨ８．０に調整した。基質液４００μｌ、水５００μｌと菌体懸濁液１００μｌを混合し、３７℃で１時間反応させた。反応液を一部採取し、上記した分析条件で分析した。結果を表５に示す。なお、表５に示すピリドキサミン生産量とは、実施例１で作製したppat-adh-plr発現株が生産するピリドキサミン二塩酸塩のモル量を１００とした相対量で表す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
比較例８  ドライイーストによるピリドキサールを基質としたピリドキシン合成（乾菌体重量当たりのピリドキシン生成速度）
比較例７と同様に菌体懸濁液を調製し、基質液として実施例２５の基質液と同じ組成のものを調製し、実施例２５の反応条件と同じ条件で反応を行った。
反応終了後に反応液の一部を採取して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、実施例２４と同様の条件で分析を行った。
３０分の反応によって３２５．３μｇｎｏピリドキシンが得られ、乾燥菌体重量当たりのピリドキシン生成速度は１３．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ−ｄｒｙ  ｃｅｌｌであった。
【国際調査報告】
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