(57)【要約】  本発明は血管新生に関与する薬剤を評価する方法に関し、該方法は、病変部を有する被験対象について血管新生に関与する薬剤を投与する薬剤投与工程（Ａ）を含み、さらに血管内に金属ナノ粒子が存在する状態にした被験対象の放射線撮影を行う撮影工程（１）または二量体タンパク質を用いて蛍光染色および蛍光撮影を行う撮影工程（２）を行い、撮影工程（１）または（２）において取得した画像を用いて、前記薬剤の評価を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病変部を有する動物を被験対象として、行われる薬剤評価方法であって、
前記被験対象に血管新生に関与する薬剤を投与する工程である、薬剤投与工程（Ａ）を含み、さらに
下記撮影工程（１）を複数回行い、そのうち少なくとも一回は前記薬剤投与工程（Ａ）の後に行うか、または下記撮影工程（２）を行い、
さらに、該撮影工程（１）または（２）において取得した画像を用いて前記薬剤の評価を行う、薬剤評価方法。
撮影工程（１）：血管内に金属ナノ粒子が存在する状態にした被験対象の放射線撮影を行う
撮影工程（２）：いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体と、第２の単量体とからなる二量体タンパク質を用いて、
前記薬剤投与工程（Ａ）前の被験対象から採取した組織切片、前記薬剤投与工程（Ａ）後である第１の時点の被験対象から採取した組織切片、および前記第１の時点よりも後の時点である第２の時点の被験対象から採取した組織切片のうち、少なくとも２の組織切片を得て、該切片に対してそれぞれ蛍光染色を行い、さらに該蛍光染色した各検体の撮影を行う
【請求項２】
前記二量体タンパク質が、いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体といずれか一方の末端がストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している第２の単量体とからなる二量体タンパク質である、請求項１に記載の薬剤評価方法。
【請求項３】
前記第２の単量体が、末端のいずれか１つのみにおいて、ストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している融合ペプチドである、請求項１または２に記載の薬剤評価方法。
【請求項４】
前記第１の単量体と前記第２の単量体がいずれも直鎖状である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項５】
前記第１の単量体の、前記ストレプトアビジンに結合するタグ以外のペプチド配列と、
前記第２の単量体の、前記ストレプトアビジン以外に結合するタグ以外のペプチド配列とが、それぞれ同じ配列である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項６】
前記二量体タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項７】
前記蛍光染色が、前記二量体タンパク質と、蛍光標識体とを結合させることにより、前記二量体タンパク質と特異的に結合する目的タンパク質を染色する方法である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項８】
前記蛍光染色が、蛍光標識体と前記二量体タンパク質とが結合した蛍光標識プローブと前記目的タンパク質とを結合させることにより、前記二量体タンパク質と特異的に結合する目的タンパク質を染色する方法である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項９】
前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１に記載の薬剤評価方法。
【請求項１０】
前記蛍光標識体が、ストレプトアビジンと結合した、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光色素集積ナノ粒子である、請求項７または８に記載の薬剤評価方法。
【請求項１１】
前記撮影工程（２）において、さらに蛍光色素を用いた染色である蛍光色素染色を行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１２】
前記蛍光色素染色が、血管内皮細胞に特異的な染色である、請求項１１に記載の薬剤評価方法。
【請求項１３】
前記撮影工程（２）において、さらに色素による色素染色および明視野撮影を行う、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１４】
いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体と、第２の単量体とからなる二量体タンパク質。
【請求項１５】
いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体といずれか一方の末端がストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している第２の単量体とからなる二量体タンパク質。
【請求項１６】
前記第１の単量体と前記第２の単量体がいずれも直鎖状である、請求項１４または１５に記載の二量体タンパク質。
【請求項１７】
前記第１の単量体の、前記ストレプトアビジンに結合するタグ以外のペプチド配列と、
前記第２の単量体の、前記ストレプトアビジン以外に結合するタグ以外のペプチド配列とが、それぞれ同じ配列である、請求項１５に記載の二量体タンパク質。
【請求項１８】
前記二量体タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に由来する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の二量体タンパク質。
【請求項１９】
末端のいずれか１つのみにおいてストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである、第１の単量体と、
末端のいずれか１つのみにおいて、ストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している融合ペプチドである、第２の単量体とを混合し、
得られた混合物から、夾雑物を除去することにより、前記第１の単量体および前記第２の単量体からなる二量体タンパク質を精製する精製工程を含む、
二量体タンパク質の製造方法。
【請求項２０】
前記精製工程が、前記第１の単量体に融合しているタグと特異的に結合する担体を担持した第１精製カラムを用いて行われる第１精製工程、および前記第２の単量体に融合しているタグと特異的に結合する担体を担持した第２精製カラムを用いて行われる第２精製工程を含む、請求項１９に記載の二量体タンパク質の製造方法。
【請求項２１】
前記蛍光標識体と請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の二量体タンパク質とが結合した蛍光標識プローブ。
【請求項２２】
前記蛍光標識体が、ストレプトアビジンと結合した、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光色素集積ナノ粒子である、請求項２１に記載の蛍光標識プローブ。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の蛍光標識プローブが含まれる、蛍光染色液。
【請求項２４】
請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の二量体タンパク質と、蛍光標識体とを結合させることにより、前記第１の単量体と第２の単量体からなる二量体タンパク質と特異的に結合する目的タンパク質を染色する蛍光標識染色方法であって、
前記蛍光標識体が、ストレプトアビジンと結合した、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光色素集積ナノ粒子である、蛍光標識染色方法。
【請求項２５】
さらに蛍光色素染色を行う、請求項２４に記載の蛍光標識染色方法。
【請求項２６】
前記色素染色が、血管内皮細胞に特異的な染色である、請求項２４または２５のいずれか一項に記載の蛍光標識染色方法。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の染色方法を含む、生理活性評価方法。
【請求項２８】
撮影工程（１）または（２）において取得した画像から、血管情報を含む情報を取得することで、前記薬剤の評価を行う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項２９】
前記血管情報が、前記病変部の血管の体積についての情報を含む、請求項２８に記載の薬剤評価方法。
【請求項３０】
前記血管情報が、前記病変部の血管の位置情報を含む、請求項２８または２９に記載の薬剤評価方法。
【請求項３１】
前記情報が、さらに病理情報を含む、請求項１〜１３および２８〜３０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項３２】
前記病理情報が、前記病変部の体積についての情報を含む、請求項３１に記載の薬剤評価方法。
【請求項３３】
前記病理情報が、病変部の位置情報を含む、請求項３１または３２に記載の薬剤評価方法。
【請求項３４】
前記病変部が腫瘍部である、請求項１〜１３および２８〜３３のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項３５】
前記薬剤が血管新生に関与する薬剤である、請求項１〜１３および２８〜３４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項３６】
前記薬剤が血管新生阻害剤である。請求項１〜１３および２８〜３５のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項３７】
前記血管情報を含む情報が、前記病変部の血管の体積および病変部の体積についての情報を含み、
前記病変部の血管の体積を、前記病変部の体積で除した値を算出し、当該値の変化を観察する、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項３８】
前記撮影工程（１）における放射線撮影が三次元放射線撮影であり、前記撮影工程（２）における撮影が蛍光撮影である、請求項１〜１３および２８〜３７のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項３９】
前記被験対象が実験動物である、請求項１〜１３および２８〜３８のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項４０】
前記被験対象が担がんマウスである、請求項１〜１３および２８〜３９のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項４１】
放射線撮影装置および蛍光撮影装置の少なくとも一つを有する撮影装置と情報処理装置とを備える薬剤評価システムであって、
前記情報処理装置が、
前記放射線撮影装置または蛍光撮影装置により取得された画像を受け取り、
受け取った画像をを用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置である、
請求項１〜１３および２８〜４０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法を行うための、薬剤の評価システム。
【請求項４２】
放射線撮影装置および蛍光撮影装置の少なくとも一つを有する撮影装置と情報処理装置とを備える薬剤評価システムであって、
前記情報処理装置が、
前記放射線撮影装置または蛍光撮影装置により取得された画像を受け取り、
さらに、受け取った画像から取得する血管情報を含む情報を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置である、
請求項１〜１３および２８〜４０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法を行うための、請求項４１に記載の薬剤の評価システム。
【請求項４３】
前記撮影装置が、明視野撮影を行うための装置をさらに備える、請求項４１または４２に記載の薬剤の評価システム。
【請求項４４】
前記画像、前記血管情報を含む情報、前記解析結果、および薬剤の評価のうち少なくとも１つを表示する表示装置をさらに備える、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の薬剤の評価システム。
【請求項４５】
前記情報処理装置が、さらに前記画像、前記血管情報を含む情報、前記解析結果、および薬剤の評価のうち少なくとも１つをデータとして蓄積する情報蓄積装置を含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の薬剤の評価システム。
【請求項４６】
請求項１〜１３および２８〜４０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、固形がんや糖尿病性網膜症、関節リウマチなど多くの疾患に、血管新生が非常に重要な役割を果すことが明らかにされてきている。例えば、固形がんである腫瘍には、その急速な細胞増殖に必要な栄養や酸素が補給できるように、血管を新生する性質がある。このことから、近年血管新生を阻害する効果を有する抗がん剤が開発され、さまざまな種の腫瘍に対する抗腫瘍効果が期待されている。【０００３】
例えば、血管新生には、ＦＧＦ（Fibroblast Growth Factor；線維芽細胞成長因子）、ＶＥＧＦ（Vascular endothelial growth factor; 血管内皮細胞成長因子）、ＰＤＧＦ（Platelet-Derived Growth Factor；血小板由来成長因子）などさまざまな因子が関与している。なかでも、ＶＥＧＦは血管内皮細胞上のＶＥＧＦ受容体に結合し、血管内皮細胞における遺伝子発現、血管透過性および細胞増殖等を制御し、血管新生を促進することが知られており、血管新生阻害剤の開発における重要な標的となっている。【０００４】
これらの因子をはじめとした血管新生に関与する薬剤の開発、また候補薬の効果についての評価については、薬剤の標的となる因子や受容体、または病変部そのものを検出、可視化することが重要である。【０００５】
例えば、病変部や臓器の可視化手段としては、放射線などを利用して物体を走査した断面像をコンピュータを用いて画像化するコンピュータ断層撮影（Computed Tomography；ＣＴ）等の技術が広く臨床現場で利用されている。ＣＴは人体内部の血管や臓器の立体画像を非侵襲的に得られる有力な医療診断技術であり、体内組織の放射線吸収能の差を測定し、病変部位と周囲の正常組織とのコントラストの差を指標に診断が行われている。【０００６】
ＣＴ画像のコントラストを向上させて診断精度を向上させるため、造影剤が通常使用されるが、現在一般的に病院等で使用されているヨウ素を用いた造影剤は副作用を引き起こすリスクがあるという問題点がある。非特許文献１には、ポリエチレングリコール鎖で表面修飾した様々な大きさの金ナノ粒子を、造影剤として用いてＣＴを行うことにより、腫瘍を検出する方法が記載されている。【０００７】
また、病変部の大きさのみならず、病変部およびその周囲の血管を可視化することによっても候補薬の薬効を評価することができる。【０００８】
特許文献１に開示された方法では、血管新生阻害剤を投与した担腫瘍モデルマウスを屠殺して、当該阻害剤の血管新生に対する効果を評価している。【０００９】
特許文献２には、ガドリニウム錯体を造影剤として用いた核磁気共鳴画像法（magnetic resonance imaging；ＭＲＩ）により、非特許文献２には金ナノ粒子を造影剤として用いたＣＴ撮影により、微小血管系を可視化する方法がそれぞれ記載されている。【００１０】
また、ＶＥＧＦ受容体をはじめとする血管新生に関与する因子に関しては、病変部から摘出した組織切片に対してＤＡＢ染色を行い、明視野において画像撮影を行うことにより可視化（画像化）する検出手法が従来広く用いられてきた。【００１１】
しかし、血管新生に関与する因子の動向を正確に評価するためにはその検出感度が重要であるが、既存の手法においては術者の熟練度および環境によって感度や染色度にぶれが生じるという問題があり、さらに定量性に欠けるという問題もあることから、組織内における血管新生に関与する因子の詳細な発現部位や、それぞれの細胞における発現量、または細胞間の因子の発現量の差を特定することは困難であった。そこで、近年ではＶＥＧＦをより詳細に検出するため、ＶＥＧＦリガンドであるＶＥＧＦを用いた新たな手法が試みられている。非特許文献３では、アミノ基をビオチン修飾したＶＥＧＦをストレプトアビジン結合量子ドットに担持させたものをプローブとして用い、ＶＥＧＦ受容体の検出を行っている。このような二量体のＶＥＧＦをプローブとして用いることで、ＶＥＧＦ受容体の精密な検出やその生理活性を評価することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特表２００７−５２６７５６号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０２９４０３５号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Nakagawa et al. Science and Technology of Advanced Materials, VOL. 17, NO. 1, 387-397, 2016
【非特許文献２】Quan-Yu Cai et al. Investigative Radiology. Volume 42, Number 12, 797-806, December 2007
【非特許文献３】Hamada et al., BLOOD, 29 SEPTEMBER 2011 VOLUME 118, NUMBER 13: e93-100
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように血管新生に関与する薬剤評価において血管を検出する場合、特許文献１に開示された方法ではマウスを屠殺する必要があり、同一マウスにおける血管の経日変化を追跡することができないという問題があった。また、非特許文献２には金ナノ粒子を造影剤としてＣＴ撮影を行い、微小血管系を可視化する方法が記載されているが、この文献にも血管の経日変化を測定したり、また薬剤の評価に用いる等の記載はない。【００１５】
特許文献２に開示された方法では、ガドリニウム錯体を造影剤として用いた核磁気共鳴画像法（magnetic resonance imaging；ＭＲＩ）を用いるが、該方法は比較的手間や時間のかかる検査法であり、空間分解能も充分なものではなかった。【００１６】
さらに、血管新生に関与する薬剤評価において血管新生に関与する因子を検出する手法を用いる場合、非特許文献３においては、ＶＥＧＦ受容体を染色するための手法が開示されているが、当該手法は血管内皮細胞にＶＥＧＦ受容体を人為的に高発現させた細胞における染色であり、ＶＥＧＦ受容体発現量が通常の細胞または低い細胞では染色できないか、あるいは充分な感度で検出できない可能性がある。特に、血管新生を阻害する薬剤を投与することにより、血管内皮細胞や腫瘍細胞におけるＶＥＧＦ受容体の発現が低下している場合においては、薬効の正確な評価を行うために充分な検出感度を得られない可能性が高い。【００１７】
本発明は血管新生に関与する薬剤について、その効果を継時的に充分な精度で観察することによって当該薬剤を評価する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は上記課題を解決するため、金属ナノ粒子を用いて被験対象の放射線撮影を行い、また、二量体タンパク質を用いて血管新生に関わる因子を蛍光染色して撮影することにより取得される画像を用いて、腫瘍の大きさや血管体積等の血管情報を含む情報の変化を比較・観察することにより、血管新生に関与する薬剤の効果を評価できることを見出した。【００１９】
すなわち、本発明は次のような薬剤評価方法を提供する。
［項１］
病変部を有する動物を被験対象として、行われる薬剤評価方法であって、
前記被験対象に血管新生に関与する薬剤を投与する工程である、薬剤投与工程（Ａ）を含み、さらに
下記撮影工程（１）を複数回行い、そのうち少なくとも一回は前記薬剤投与工程（Ａ）の後に行うか、または下記撮影工程（２）を行い、
さらに、該撮影工程（１）または（２）において取得した画像を用いて前記薬剤の評価を行う、薬剤評価方法。【００２０】
撮影工程（１）：血管内に金属ナノ粒子が存在する状態にした被験対象の放射線撮影を行う
撮影工程（２）：いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体と、第２の単量体とからなる二量体タンパク質を用いて、
前記薬剤投与工程（Ａ）前の被験対象から採取した組織切片、前記薬剤投与工程（Ａ）後である第１の時点の被験対象から採取した組織切片、および前記第１の時点よりも後の時点である第２の時点の被験対象から採取した組織切片のうち、少なくとも２の組織切片を得て、該切片に対してそれぞれ蛍光染色を行い、さらに該蛍光染色した各検体の撮影を行う
[項２]
前記二量体タンパク質が、いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体といずれか一方の末端がストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している第２の単量体とからなる二量体タンパク質である、請求項１に記載の薬剤評価方法。
[項３]
前記第２の単量体が、末端のいずれか１つのみにおいて、ストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している融合ペプチドである、請求項１または２に記載の薬剤評価方法。
[項４]
前記第１の単量体と前記第２の単量体がいずれも直鎖状である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項５]
前記第１の単量体の、前記ストレプトアビジンに結合するタグ以外のペプチド配列と、
前記第２の単量体の、前記ストレプトアビジン以外に結合するタグ以外のペプチド配列とが、それぞれ同じ配列である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項６]
前記二量体タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項７]
前記蛍光染色が、前記二量体タンパク質と、蛍光標識体とを結合させることにより、前記二量体タンパク質と特異的に結合する目的タンパク質を染色する方法である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項８]
前記蛍光染色が、蛍光標識体と前記二量体タンパク質とが結合した蛍光標識プローブと前記目的タンパク質とを結合させることにより、前記二量体タンパク質と特異的に結合する目的タンパク質を染色する方法である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項９]
前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１に記載の薬剤評価方法。
[項１０]
前記蛍光標識体が、ストレプトアビジンと結合した、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光色素集積ナノ粒子である、請求項７または８に記載の薬剤評価方法。
[項１１]
前記撮影工程（２）において、さらに蛍光色素を用いた染色である蛍光色素染色を行う、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項１２]
前記蛍光色素染色が、血管内皮細胞に特異的な染色である、請求項１１に記載の薬剤評価方法。
[項１３]
前記撮影工程（２）において、さらに色素による色素染色および明視野撮影を行う、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項１４]
いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体と、第２の単量体とからなる二量体タンパク質。
[項１５]
いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体といずれか一方の末端がストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している第２の単量体とからなる二量体タンパク質。
[項１６]
前記第１の単量体と前記第２の単量体がいずれも直鎖状である、請求項１４または１５に記載の二量体タンパク質。
[項１７]
前記第１の単量体の、前記ストレプトアビジンに結合するタグ以外のペプチド配列と、
前記第２の単量体の、前記ストレプトアビジン以外に結合するタグ以外のペプチド配列とが、それぞれ同じ配列である、請求項１５に記載の二量体タンパク質。
[項１８]
前記二量体タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に由来する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の二量体タンパク質。
[項１９]
末端のいずれか１つのみにおいてストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである、第１の単量体と、
末端のいずれか１つのみにおいて、ストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している融合ペプチドである、第２の単量体とを混合し、
得られた混合物から、夾雑物を除去することにより、前記第１の単量体および前記第２の単量体からなる二量体タンパク質を精製する精製工程を含む、
二量体タンパク質の製造方法。
[項２０]
前記精製工程が、前記第１の単量体に融合しているタグと特異的に結合する担体を担持した第１精製カラムを用いて行われる第１精製工程、および前記第２の単量体に融合しているタグと特異的に結合する担体を担持した第２精製カラムを用いて行われる第２精製工程を含む、請求項１９に記載の二量体タンパク質の製造方法。
[項２１]
前記蛍光標識体と請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の二量体タンパク質とが結合した蛍光標識プローブ。
[項２２]
前記蛍光標識体が、ストレプトアビジンと結合した、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光色素集積ナノ粒子である、請求項２１に記載の蛍光標識プローブ。
[項２３]
請求項２１または２２に記載の蛍光標識プローブが含まれる、蛍光染色液。
[項２４]
請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の二量体タンパク質と、蛍光標識体とを結合させることにより、前記第１の単量体と第２の単量体からなる二量体タンパク質と特異的に結合する目的タンパク質を染色する蛍光標識染色方法であって、
前記蛍光標識体が、ストレプトアビジンと結合した、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光色素集積ナノ粒子である、蛍光標識染色方法。
[項２５]
さらに蛍光色素染色を行う、請求項２４に記載の蛍光標識染色方法。
[項２６]
前記色素染色が、血管内皮細胞に特異的な染色である、請求項２４または２５のいずれか一項に記載の蛍光標識染色方法。
[項２７]
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の染色方法を含む、生理活性評価方法。
[項２８]
撮影工程（１）または（２）において取得した画像から、血管情報を含む情報を取得することで、前記薬剤の評価を行う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項２９]
前記血管情報が、前記病変部の血管の体積についての情報を含む、請求項２８に記載の薬剤評価方法。
[項３０]
前記血管情報が、前記病変部の血管の位置情報を含む、請求項２８または２９に記載の薬剤評価方法。
[項３１]
前記情報が、さらに病理情報を含む、請求項１〜１３および２８〜３０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項３２]
前記病理情報が、前記病変部の体積についての情報を含む、請求項３１に記載の薬剤評価方法。
[項３３]
前記病理情報が、病変部の位置情報を含む、請求項３１または３２に記載の薬剤評価方法。
[項３４]
前記病変部が腫瘍部である、請求項１〜１３および２８〜３３のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項３５]
前記薬剤が血管新生に関与する薬剤である、請求項１〜１３および２８〜３４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項３６]
前記薬剤が血管新生阻害剤である。請求項１〜１３および２８〜３５のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項３７]
前記血管情報を含む情報が、前記病変部の血管の体積および病変部の体積についての情報を含み、
前記病変部の血管の体積を、前記病変部の体積で除した値を算出し、当該値の変化を観察する、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項３８]
前記撮影工程（１）における放射線撮影が三次元放射線撮影であり、前記撮影工程（２）における撮影が蛍光撮影である、請求項１〜１３および２８〜３７のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項３９]
前記被験対象が実験動物である、請求項１〜１３および２８〜３８のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項４０]
前記被験対象が担がんマウスである、請求項１〜１３および２８〜３９のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
[項４１]
放射線撮影装置および蛍光撮影装置の少なくとも一つを有する撮影装置と情報処理装置とを備える薬剤評価システムであって、
前記情報処理装置が、
前記放射線撮影装置または蛍光撮影装置により取得された画像を受け取り、
受け取った画像を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置である、
請求項１〜１３および２８〜４０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法を行うための、薬剤の評価システム。
[項４２]
放射線撮影装置および蛍光撮影装置の少なくとも一つを有する撮影装置と情報処理装置とを備える薬剤評価システムであって、
前記情報処理装置が、
前記放射線撮影装置または蛍光撮影装置により取得された画像を受け取り、
さらに、受け取った画像から取得する血管情報を含む情報を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置である、
請求項１〜１３および２８〜４０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法を行うための、請求項４１に記載の薬剤の評価システム。
[項４３]
前記撮影装置が、明視野撮影を行うための装置をさらに備える、請求項４１または４２に記載の薬剤の評価システム。
[項４４]
前記画像、前記血管情報を含む情報、前記解析結果、および薬剤の評価のうち少なくとも１つを表示する表示装置をさらに備える、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の薬剤の評価システム。
[項４５]
前記情報処理装置が、さらに前記画像、前記血管情報を含む情報、前記解析結果、および薬剤の評価のうち少なくとも１つをデータとして蓄積する情報蓄積装置を含む、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の薬剤の評価システム。
[項４６]
請求項１〜１３および２８〜４０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の評価方法によれば、従来の手法と比べてより正確に血管新生に関与する薬剤の評価を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は本発明の薬剤評価方法（撮影工程（１）を行った場合）におけるフローチャートである。
【図２】図２は実施例１において行った実験工程のフロー図である。
【図３】図３は実施例１におけるベバシズマブ処理群およびコントロール群において、ベバシズマブの投与によるａ）体重の変化ｂ）腫瘍体積の変化を示したグラフである。
【図４】図４ａ〜図４ｊはがん細胞移植から３週間後、５週間後、７週間後において、ベバシズマブ処理および生理食塩水処理を行ったマウスの腫瘍部に対して放射線撮影を行うことにより取得した、腫瘍および血管の放射線画像である。図５ｋ〜図５ｍはがん細胞移植から３週間後、５週間後、７週間後のそれぞれの時点において、ベバシズマブ処理および生理食塩水処理を行ったマウスの、腫瘍体積、血管体積、血管体積と腫瘍体積との比率（血管体積／腫瘍体積×１００（％））をそれぞれ示したグラフである。
【図５】図５は実施例２のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦの作製工程のフロー図である。
【図６】図６は実施例３における染色結果において測定された蛍光強度の定量結果を示したグラフである。ｕｔ  ＶＥＧＦはマウスＶＥＧＦ１６４リコンビナントタンパク質を、ｈｓ―ｔ  ＶＥＧＦはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦをそれぞれ示している。
【図７】図７ａ）〜ｅ）は実施例４で取得した蛍光画像である。点線により、画像内の腫瘍領域と血管内皮領域が区分されている。図７ｆ）、ｇ）はそれぞれ、コントロール群またはベバシズマブ処理群において取得した蛍光画像から算出した、腫瘍細胞領域および血管内皮領域のＶＥＧＦ受容体の発現量をそれぞれ示したグラフである。
【図８】図８は実施例５において行った細胞増殖試験の結果である。
【図９】図９Ａは本発明の一実施形態であるシステムであって、撮影装置として放射線撮影装置を備えるシステムの模式図である。図９Ｂは本発明の別の実施形態であるシステムであって、撮影装置として蛍光撮影装置を備えるシステムの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の薬剤評価方法は、病変部を有する動物である被験対象に血管新生に関与する薬剤を投与する、薬剤投与工程（Ａ）、および複数回の撮影工程（１）、または下記撮影工程（２）を行い、さらに、該撮影工程（１）または（２）において取得した画像を用いて薬剤の評価を行う方法である。
【００２４】
また、前記薬剤評価方法は、前記画像から、後述する血管情報を含む情報を取得することで、前記薬剤の評価を行うことが好ましい。
【００２５】
本発明の薬剤評価方法は、撮影工程（１）において取得した画像のみにおいて薬剤の評価を行ってもよいし、撮影工程（２）において取得した画像のみにおいて薬剤の評価を行ってもよい。また撮影工程（１）を行った薬剤評価方法と、撮影工程（２）を行った薬剤評価方法とを組み合わせて、言い換えると撮影工程（１）および撮影工程（２）において取得した画像を組み合わせることにより、複合的な薬剤評価を行ってもよい。
【００２６】
＜薬剤投与工程（Ａ）＞
本発明に係る薬剤投与工程（Ａ）は、後述する被験対象に対して血管新生に関与する薬剤を投与する工程である。被験対象が有する病変部は、特に限定されるものではないが、例えば、血管新生が大きく関与するという観点から、腫瘍が好適に選択される。
【００２７】
前記血管新生に関与する薬剤は、血管新生阻害剤であることが好ましく、抗がん剤またはその候補薬として用いられる血管新生阻害剤であることがより好ましい。上記血管新生阻害剤は特に限定されないが、前記抗がん剤として用いられる血管新生阻害剤の例としては、ベバシズマブ（商品名アバスチン）、スニチニブ（商品名スーテント）、ソラフェニブ（商品名ネクサバール）等が挙げられる。
【００２８】
前記薬剤投与工程（Ａ）においては、被験対象に対する薬剤の投与形態、投与経路、投与期間や投与回数などは、特に制限はない。また、前記薬剤の投与形態、投与経路、投与期間や投与回数などを適宜変更し、複数回本発明の評価方法を実行することで、より詳細に薬剤の評価を行うことができる。
【００２９】
＜撮影工程（１）＞
本発明に係る撮影工程（１）は、血管内に金属ナノ粒子が存在する状態にした被験対象の放射線撮影を行う工程である。前記放射線撮影は三次元放射線撮影であることが好ましい。
【００３０】
金属ナノ粒子が被験対象の血管内に存在する状態にするには、例えば金属ナノ粒子を血管内に注入することにより行われることが好ましい。血管内に注入するタイミングは、放射線撮影時に金属ナノ粒子が被験対象の血管内に存在し得る時点であれば任意に設定することができる。例えば、放射線撮影を行う各時点において、各撮影の直前に金属ナノ粒子を注入してもよい。また一回の金属ナノ粒子の注入で複数の放射線撮影を行っても良い。
【００３１】
本発明の薬剤評価方法において前記撮影工程（１）は複数回行われ、そのうち少なくとも一回は前記薬剤投与工程（Ａ）の後に行われる。
【００３２】
撮影工程（１）は、少なくとも一回は前記薬剤投与工程（Ａ）の後に行われる必要がある。その条件を満たす限り、薬剤投与前の時点および薬剤投与後の１以上の時点で行われてもよく、薬剤投与後における２以上の時点で行われてもよい。本発明の薬剤評価方法においては、前記撮影工程と情報取得工程とは、それぞれ薬剤投与前の１以上の時点および薬剤投与後の２以上の時点で行われることが好ましい。
【００３３】
撮影工程（１）が薬剤投与後に行われる場合において、撮影工程を行うタイミングは特に限定されないが、薬剤の効果が期待され得るために充分な時点を含んでいることが好ましい。
【００３４】
（金属ナノ粒子）
前記撮影工程（１）において用いられる金属ナノ粒子は、特に限定されないが、Ｘ線透過率が低く、分散性に優れる等の観点から銀、金、白金等の金属ナノ粒子が好ましく、金ナノ粒子がより好ましい。金属ナノ粒子を被験対象に投与する際の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜選択すればよい。注入する金属ナノ粒子の量は、被験対象の体重、疾患の程度等に応じて自由に選択することができる。
【００３５】
前記金属ナノ粒子は必要に応じて、有機ポリマー等により表面修飾されていることが好ましく、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール)で修飾されているものがより好ましい。
【００３６】
前記金属ナノ粒子の平均粒子径は特に限定されないが、好ましくは１〜３００ｎｍ、より好ましくは１〜１５０ｎｍ、さらにより好ましくは１〜５０ｎｍである。
【００３７】
前記金属ナノ粒子の粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、電子顕微鏡写真を撮影することで求められる。複数の金属ナノ粒子からなる集団の平均粒径および変動係数は、充分な数（たとえば１０００個）の金属ナノ粒子について上記のようにして粒径を算出した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
【００３８】
前記撮影工程（１）においては、その複数回の各回において同一の被験対象、例えばマウスを生きたままで撮影することができる。同一の被験対象において腫瘍や血管量を経日観察すること、従来の方法よりもコントラストが明瞭な画像を取得することなどの理由から、腫瘍部におけるより細かな血管の情報を取得することができる。さらに血管新生の効果を評価する際にマウス等の被験対象を屠殺する必要が無く、同一の被験対象を生きたまま使った実験ができるため、実験に使用する被験対象の数を減らすことができるという利点もある。
【００３９】
＜撮影工程（２）＞
本発明に係る撮影工程（２）は、いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体と、第２の単量体とからなる二量体タンパク質を用いて、前記薬剤投与工程（Ａ）前の被験対象から採取した組織切片、前記薬剤投与工程（Ａ）後である第１の時点の被験対象から採取した組織切片、および前記第１の時点よりも後の時点である第２の時点の被験対象から採取した組織切片のうち、少なくとも２の組織切片を得て、該切片に対してそれぞれ蛍光染色を行い、さらに該蛍光染色した各検体の撮影を行う工程である。
【００４０】
前記工程（２）で用いる二量体タンパク質は、いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体といずれか一方の末端がストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している第２の単量体とからなる二量体タンパク質であることが好ましい。
【００４１】
（蛍光染色）
前記蛍光染色は、前記二量体タンパク質と特異的に結合する目的タンパク質を蛍光染色する方法であり、ここで当該目的タンパク質は血管新生に関与する因子であることが好ましく、血管新生に関与するタンパク質であることがより好ましい。
【００４２】
前記蛍光染色は、前記二量体タンパク質と、後述する蛍光標識体とを結合させることにより、前記目的タンパク質を染色する方法であってもよく、また、蛍光標識体と前記二量体タンパク質とが結合した蛍光標識プローブ（後述）と前記目的タンパク質とを結合させることにより、前記目的タンパク質を染色する方法であってもよい。
【００４３】
前記蛍光標識体は、特に限定されないが、ストレプトアビジンと結合した、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光色素集積ナノ粒子であることが好ましく、ストレプトアビジンと結合した蛍光色素集積ナノ粒子であることがより好ましい。
【００４４】
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン系色素、ローダミン系色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、カスケード（登録商標、インビトロジェン社）系色素、クマリン系色素、ＮＢＤ（登録商標）系色素、ピレン系色素、シアニン系色素、ペリレン系色素、オキサジン系色素、ピロメテン系色素など、低分子有機化合物（ポリマー等の高分子有機化合物ではないもの）からなる蛍光色素が挙げられる。中でも、スルホローダミン１０１およびその塩酸塩であるＴｅｘａｓＲｅｄ（登録商標）などのローダミン系色素や、ペリレンジイミドなどのペリレン系色素、ピロメテン５５６等のピロメテン系色素は、比較的耐光性が高いため好ましい。
【００４５】
量子ドットは、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する粒子ドットの周囲にシェルを設けた量子ドットであることが好ましく、必要に応じて有機ポリマー等により表面処理が施されていてもよい。例えば、粒子表面がカルボキシ基で修飾されているＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社）、粒子表面がアミノ基で修飾されているＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社）等の、市販のものを用いてもよい。
【００４６】
前記蛍光体集積粒子は、特に制限されないが、有機物または無機物でできた母体となる粒子の内部または表面に、蛍光色素または量子ドットを複数個固定して集積した構造を有するナノサイズの（直径が１μｍ以下の）粒子であり、一粒子で十分な輝度の蛍光を発することができる粒子であることが好ましい。
【００４７】
ストレプトアビジンで修飾した蛍光体集積ナノ粒子の調製は、例えば、以下のようにして行うことができる。蛍光体集積ナノ粒子とストレプトアビジンとにそれぞれ官能基を導入する試薬により官能基を導入し、官能基同士の結合を介してストレプトアビジンと蛍光体集積ナノ粒子とを結合させる。この官能基同士の間にリンカーを介在させてもよい。官能基の組み合わせの例としては、ＮＨＳエステル基‐アミノ基、チオール基−マレイミド基の組み合わせ等を例示することができる。リンカーとしては、ＥＭＣＳ（Ｎ−［エプシロン−Maleimidocaproyloxy]succinimide ester）（サーモサイエンティフィック社）等のリンカーを例示することができる。
【００４８】
＜蛍光色素染色＞
前記撮影工程（２）においては、さらに蛍光色素を用いた染色である蛍光色素染色を合わせて行うことができる。前記蛍光色素は、前記二量体タンパク質、前記蛍光標識プローブ、または後述する蛍光染色液以外の、蛍光色素、量子ドット、または、蛍光体集積ナノ粒子等であることが好ましい。
【００４９】
蛍光色素染色の方法は特に限定されず、免疫蛍光染色等適宜公知の手段を用いることができる。
【００５０】
前記蛍光色素染色の対象は特に限定されないが、血管内皮細胞に特異的に存在する物質であることが好ましく、血管内皮細胞に特異的に発現する糖鎖であることが好ましい。
【００５１】
＜色素染色＞
前記撮影工程（２）においては、さらに、明視野観察用の色素による色素染色および明視野撮影を行ってもよい。前記色素染色は検体に含まれる細胞等の形態を観察するためのものであってもよいし、血管内皮細胞に特異的に存在する物質を観察するためのものであってもよく、また、血管内皮細胞に特異的に発現する糖鎖であってもよい。
【００５２】
＜薬剤評価方法＞
上述したように本発明の薬剤評価方法は、薬剤投与工程（Ａ）、および複数回の撮影工程（１）または撮影工程（２）を行い、さらに、該撮影工程（１）または（２）において取得した画像を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う方法であり、前記薬剤評価方法は、前記画像から、後述する血管情報を含む情報を取得することで、前記薬剤の評価を行うことが好ましい。
【００５３】
具体的には、例えば、撮影工程（１）を行った場合においては、放射線撮影装置により被験対象の血管内に存在する金属ナノ粒子により血管をあらわす画像が得られるが、当該画像を用いて、好ましくは当該画像から後述する血管情報を取得して前記薬剤の評価を行うことができる。
【００５４】
また、例えば、撮影工程（２）を行った場合においても、取得した蛍光画像を用いて薬剤評価を行うが、この場合には前記目的タンパク質をあらわす蛍光発光に基づいて当該薬剤評価を行うことができる。具体的には前記二量体タンパク質がＶＥＧＦやＰＤＧＦであった場合にはこれらに特異的に結合するＶＥＧＦＲやＰＤＧＦＲをあらわす蛍光発光に基づいて薬剤評価を行うことができ、好ましくは当該蛍光発光から後述する血管情報を取得することができる。
【００５５】
前記血管情報を含む情報の、血管情報以外の情報としては病理情報が含まれていることが好ましい。また、薬剤の評価をするにあたっては血管情報を含む情報以外の情報（以下「その他の情報」と称する）を取得することで薬剤の評価を行ってもよい。
【００５６】
また、薬剤の評価に対しては、例えば任意の情報について一定の閾値を設定して、被験対照群を分類することでおこなうことができる。例えば、血管体積の変化率について、５０％以上を効果が高い（Ｒａｎｋ  Ａ）と判定し、３０％以上５０％以下を効果は中程度（Ｒａｎｋ  Ｂ）と判定し、それ以外の場合は効果が低い（Ｒａｎｋ  Ｃ）と判定する。また複数の情報に対して閾値を設定し、複合的に判断することでより正確な薬剤評価が可能になる。
【００５７】
＜血管情報＞
血管情報は、被験対象の血管に関する情報であり、好ましくは病変部の血管の体積についての情報が含まれ、より好ましくはさらに病変部における血管の位置情報が含まれる。さらに、病変部の血管の分布、薬剤投与前後における病変部の血管の体積の変化、薬剤投与前後における病変部の血管の分布の変化などについての情報が含まれていてもよい。
【００５８】
血管情報は、病変部およびその周辺を関心領域内(region of interest;ＲＯＩ）として設定して取得された画像から取得してもよいし、被検対象全体を関心領域として設定して取得された画像から取得してもよい。
【００５９】
例えば、血管の局在パターンを取得する場合には、さらに分布状態を任意のいくつかのパターン（例えば、病変部の中心部に集積・病変部辺縁に分布・病変部全体に偏在など）に分類することもできる。
【００６０】
＜病理情報＞
病理情報には、好ましくは病変部の体積が含まれ、より好ましくは病変部の位置情報が含まれる。さらに薬剤投与前後における病変部の体積の変化などが含まれていてもよい。
【００６１】
＜その他の情報＞
前記情報取得工程においては、血管情報、病理情報以外の、前記その他の情報も取得され得る。そのような情報およびそれを取得するための方法は、特に限定されないが、例えば、蛍光色素結合抗体を用いた免疫染色等の手段により検出され得るタンパク質の発現量、ＦＤＧ−ＰＥＴ検査等の手段により測定し得る糖の取り込み量（細胞のブドウ糖代謝レベル）、ＭＲＩや超音波等の手段で計測し得る血流速度や血流速度分布などが挙げられる。また、前記その他の情報は血管情報を含む情報や病理情報などの複数の情報を複合して得られる情報を含んでいても良い。例えば、血管体積を病変部の体積で除した値（（血管の体積）÷（病変部の体積））を求めることで、病変部における血管の占有率およびその変化を求めることができる。
【００６２】
＜二量体タンパク質＞
本発明の二量体タンパク質は、第１の単量体と第２の単量体からなる二量体タンパク質であり、細胞表面に発現している前記目的タンパク質と特異的に結合することで目的タンパク質の検出に用いられる。
【００６３】
前記二量体タンパク質は、いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体と、第２の単量体とからなる二量体タンパク質であり、前記第２の単量体がいずれか一方の末端がストレプトアビジン以外に結合するタグと融合していることが好ましい、換言すると本発明の二量体タンパク質は、好ましくは、いずれか一方の末端がストレプトアビジンに結合するタグと融合している融合ペプチドである第１の単量体といずれか一方の末端がストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している第２の単量体とからなる二量体タンパク質である。
【００６４】
（第１の単量体）
前記第１の単量体は後述する第２の単量体と結合することで本発明の二量体タンパク質となるペプチドであり、末端のいずれか１つのみがストレプトアビジンに結合するタグと融合している、融合ペプチドである。ペプチドは前記二量体タンパクを構成しうるものであれば特に限定されないが、直鎖状のペプチドであることが好ましく、このときペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれか一方のみがストレプトアビジンと結合するタグと融合している。
【００６５】
第１の単量体は、前述のようにストレプトアビジンに結合するタグをその構造中に１つのみ有し、ストレプトアビジン以外に結合するタグを有さないことが好ましい。
【００６６】
（第２の単量体）
本発明の第２の単量体は第１の単量体と結合することで本発明の二量体タンパク質となるペプチドであり、通常は末端のいずれか１つのみがストレプトアビジン以外に結合するタグと融合している、融合ペプチドである。第２の単量体の末端に融合しているタグは特に限定されないが、ストレプトアビジンと相互作用をおこさないタグを選択することが好ましい。ペプチドは前記二量体タンパクを構成しうるものであれば特に限定されないが、直鎖状のペプチドであることが好ましく、このときペプチドのＣ末端またはＮ末端のいずれか一方のみがストレプトアビジン以外と結合するタグと融合している。
【００６７】
第２の単量体は、前述のようにストレプトアビジン以外に結合するタグをその構造中に１つのみ有し、ストレプトアビジンに結合するタグを有さないことが好ましい。
【００６８】
したがって、本発明の二量体タンパク質は１分子中にストレプトアビジンに結合できるタグを１つのみ有しており、好ましくはさらにストレプトアビジン以外に結合するタグを１つのみ有している。
【００６９】
前記第１の単量体と第２の単量体間の結合様式は特に限定されず、例えば、ジスルフィド結合等の共有結合、イオン結合、水素結合等を介して結合することができる。第１の単量体と第２の単量体は上述のように直鎖状であることが好ましく、特に第１の単量体と第２の単量体のいずれもが直鎖状であることが好ましい。第１の単量体と第２の単量体について、それぞれのペプチド配列はタグを除いて同じであってもよいし、それぞれ異なっていてもよい。二量体に含まれる２つのペプチドのうちどちらが第１の単量体であり、どちらが第２の単量体であるかは、該二量体タンパク質の性質や構造によって任意に決定することができる。
【００７０】
本発明の二量体タンパク質は特に限定されないが、細胞表面に発現している目的タンパク質と特異的に結合するタンパク質に由来するタンパク質であることが好ましい。
【００７１】
例えば前記目的タンパク質が血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）や血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）である場合では、二量体タンパク質はそれらと特異的に結合する血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）または血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）に由来することが好ましい。
【００７２】
具体的には目的タンパク質がＶＥＧＦＲであり、二量体タンパク質がＶＥＧＦに由来するとき、前記第１の単量体は、ＶＥＧＦを構成する単量体ペプチドの末端のどちらか一方のみにおいてストレプトアビジンと結合するタグと融合している配列のペプチドであり、前記第２の単量体は、好ましくはＶＥＧＦを構成する単量体ペプチドの末端のどちらか一方のみにおいてストレプトアビジン以外と結合するタグと融合している配列のペプチドである。換言するとこの場合において、本発明の二量体タンパク質は、ＶＥＧＦの末端の１つのみにストレプトアビジンに結合するタグが融合しており、好ましくはストレプトアビジンに結合するタグが融合している単量体ではない方の単量体の末端の１つのみに、ストレプトアビジン以外に結合するタグが融合している、二量体タンパク質であるということになる。
【００７３】
＜蛍光標識染色方法＞
本発明の一実施形態である蛍光標識染色方法は、前記蛍光標識体と前記目的タンパク質を結合させることにより、目的タンパク質を染色する方法である。
【００７４】
前記蛍光染色方法は、前記目的タンパク質と二量体タンパク質とを結合させ、さらに前記蛍光標識体とを結合させることにより、目的タンパク質を染色する方法であってもよく、また、蛍光標識体と前記二量体タンパク質とをあらかじめ結合させた蛍光標識プローブ（後述）と前記目的タンパク質とを結合させることにより、前記目的タンパク質を染色する方法であってもよい。
【００７５】
前者の様態として、具体的には、病変部を有する動物である被験対象から採取した組織切片や細胞中と前記二量体タンパク質とを接触させることで当該組織切片等に存在し得る目的タンパク質と二量体タンパク質とを結合させ、さらに当該二量体タンパク質と接触させた組織切片等について前記蛍光標識体を接触させて、当該蛍光標識体と組織切片中の二量体タンパク質と結合させることで、目的タンパク質が蛍光染色される。
【００７６】
後者の様態として、具体的には、前記組織切片や細胞と蛍光標識プローブとを結合させることで目的タンパク質の染色を行うことができる。
【００７７】
上述したとおり、本発明の二量体タンパク質は１分子あたりに１つのみストレプトアビジンに結合するタグを有するものであり、前記蛍光標識体はストレプトアビジンと結合した蛍光色素等であることから、前記二量体タンパク質１分子あたりには蛍光標識体が１分子結合することになる。したがって、具体的には、前記蛍光標識体の構成成分であるストレプトアビジンが、目的タンパク質と特異的に結合した二量体タンパク質を構成している第１の単量体の末端に融合している「ストレプトアビジンに結合するタグ」に結合することで染色を行う。
【００７８】
＜蛍光色素染色＞
前記蛍光標識染色方法においては、後述する蛍光標識プローブや蛍光染色液以外を用いて行う、蛍光色素染色を併せて行ってもよい。前記蛍光色素染色は、上述したような蛍光色素、量子ドット、または、蛍光体集積ナノ粒子等を用いて行なう蛍光染色であることが好ましい。前記蛍光色素染色の対象は特に限定されないが、血管内皮細胞に特異的に存在する物質であることが好ましく、血管内皮細胞に特異的に発現する糖鎖であることが好ましい。
【００７９】
また、前記染色方法においては、明視野観察用の色素による色素染色および明視野撮影を併せて行ってもよい。前記色素染色は検体に含まれる細胞等の形態を観察するためのものであってもよいし、血管内皮細胞に特異的に存在する物質を観察するためのものであってもよく、また、血管内皮細胞に特異的に発現する糖鎖であってもよい。
【００８０】
＜蛍光標識プローブ＞
本発明の一実施形態においては、蛍光染色前にあらかじめ前記二量体タンパク質に前記蛍光標識体を結合させた複合体である蛍光標識プローブを提供する。具体的には、前記蛍光標識体の構成成分であるストレプトアビジンが、二量体タンパク質を構成する第１の単量体の末端に融合している「ストレプトアビジンに結合するタグ」に結合することで本発明の蛍光標識プローブが構成される。上述したように本発明の二量体タンパク質は１分子あたりにストレプトアビジンに結合できるタグを１つのみ有しており、したがって本発明の蛍光標識プローブは、前記二量体タンパク質１分子あたりに蛍光標識体が１分子のみ結合している構成を有する。
【００８１】
＜蛍光染色液＞
本発明の一実施形態に係る蛍光染色液は、前記蛍光標識プローブを含有する。蛍光染色液は一般的に、蛍光標識プローブを調製し、回収した後、その蛍光標識プローブを適切な分散媒、例えば１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に分散させた分散液として調製することができる。
【００８２】
蛍光染色液を、２種類以上の目的タンパク質を蛍光標識の対象とする実施形態において使用する場合は、各目的タンパク質に対応する２種類以上の蛍光標識プローブを含有していてもよい。その場合、２種類以上の蛍光標識プローブは、各目的タンパク質を標識する蛍光標識プローブの蛍光（輝点）の識別性に悪影響を及ぼさないよう、蛍光波長のピークは互いに十分に離れていることが好ましく、例えば１００ｎｍ以上離れていることが好ましい。また、このような複数の目的タンパク質を対象として用いる蛍光染色液は、２種類以上の蛍光標識プローブが同じパック（分散液）に含まれている一液型であってもよいし、各蛍光プレミックス粒子が別々のパックに含まれている多液型であってもよい。染色方法の実施形態に応じて、蛍光染色液は、蛍光標識プローブの１液型または多液型のパックに加えて、それ以外の試薬（例えば後述する色素染色用の染色液）のパックを含んでもよい。
【００８３】
＜二量体タンパク質の製造方法＞
本発明の二量体タンパク質の製造方法は、第１の単量体と、第２の単量体とを混合し、得られた混合物から夾雑物を除去することにより、第１の単量体および第２の単量体からなる二量体タンパク質を精製する精製工程を含む。
【００８４】
第１の単量体および第２の単量体の製造方法は特に限定されず、公知の手法で人工的に合成したペプチドをそれぞれの単量体として用いてもよいし、大腸菌に遺伝子を導入し、発現させたペプチドをそれぞれの単量体として用いてもよい。
【００８５】
本発明の二量体タンパク質は、第１の単量体と、第２の単量体とを適当な環境下において、混合することで製造される。この時、混合後の反応溶液には、本発明の二量体タンパク質に加え、夾雑物として、未反応の第１の単量体、未反応の第２の単量体、第１の単量体のみからなる二量体、第２の単量体のみからなる二量体が含まれうる。
【００８６】
本発明の製造方法においてはこれらの夾雑物を混合後の溶液から除去する精製工程を含み、該精製工程はカラムを用いて行うことが好ましく、２種類の精製カラムを用いて段階的に行うことがより好ましい。好適には、第１の単量体に融合しているタグと特異的に結合する担体を担持した第１精製カラム、および第２の単量体に融合しているタグと特異的に結合する担体を担持した第２精製カラムに、混合後の反応溶液を順次通すことで精製を行うことができる。このとき、第１精製カラムを通す工程を第１精製工程、第２精製カラムを通す工程を第２精製工程とする。第１精製工程と第２精製工程はどちらを先に行ってもよい。
【００８７】
第１精製工程により、未反応の第２の単量体、第２の単量体のみからなる二量体が除去され、さらに第２精製工程により未反応の第１の単量体、第１の単量体のみからなる二量体が除かれることにより、本発明の二量体タンパク質が精製される。
【００８８】
＜第１精製カラムおよび第２精製カラム＞
本発明の第１精製カラムおよび第２精製カラム（以下精製カラムと総称することもある）は、精製の対象となる二量体タンパク質が通過可能なサイズの細孔を有する担体を備える。第１精製カラムに担持されている担体は第１の単量体に融合しているタグと特異的に結合する性質を有し、第２精製カラムに担持されている担体は前記第２の単量体に融合しているタグと特異的に結合する性質を有していることが好ましい。具体的には、タグとしてstrep-tagを用いる場合には、市販のストレプトアビジン類似物質固定化樹脂を用いてもよいし、任意のマトリックスにストレプトアビジン類似物質を固定したものを作成してもよい。また、タグとしてＨｉｓ−ｔａｇ（登録商標）を用いる場合にはＮｉ−ＮＴＡ (nickel-nitrilotriacetic acid)等市販の担体を用いてもよいし、ニッケルなどＨｉｓ−ｔａｇと結合する金属イオンやＨｉｓ−ｔａｇ特異的な抗体をマトリックスに結合させたものを作成してもよい。
【００８９】
このような担体のマトリックスは特に限定されず、架橋された共重合体からなる多孔性ポリマーなど、様々な材質のマトリックスを用いることができる。例えば、デキストランまたはその誘導体（アリルデキストラン等）とアクリルアミドまたはその誘導体（Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド等）との架橋共重合体からなる多孔性ポリマー等が好適に用いられる。
【００９０】
本発明の「製造方法」においては、通常、各精製工程の後、担体に捕捉されたペプチドを担体から脱離させる脱離工程を含む。この脱離工程は、例えば、担体に、脱離液を流すことなどにより行うことができる。
【００９１】
前記脱離液としては、特に制限されないが、二量体タンパク質を担体から十分に脱離させることができる液体であることが好ましく、さらに、二量体タンパク質の構造や機能を失わせない液体であることがより好ましく、例えばグリシン−ＨＣｌ等が好適に用いられる。
【００９２】
＜生理的活性評価方法＞
本発明の一実施形態にかかる生理活性評価方法は、前記二量体タンパク質を用いて目的タンパク質の生理活性を評価する方法である。評価に用いる手段は特に限定されないが、例えば細胞に前記二量体タンパク質を投与した後、その細胞や細胞が有する生体物質の動向を観察することで、該細胞が有する目的タンパク質の生理的な活性を評価する方法などが挙げられる。
【００９３】
（画像の取得）
上述したように本発明の薬剤評価方法は撮影工程（１）または（２）において取得した画像を用いて前記血管新生に関与する薬剤の評価を行う方法であり、前記画像から、血管情報を含む情報を取得することで、前記薬剤の評価を行うことが好ましい。したがって、本発明の薬剤評価方法は、撮影工程（１）または（２）において取得した画像を取得する工程を含む。前記画像はデジタル画像であることが好ましく、立体画像情報として取得されることがより好ましい。
【００９４】
本発明の薬剤評価方法における薬剤の評価に用いるために、前記画像は任意のアルゴリズムに基づいて解析（画像解析等）してもよいし、また前記画像を任意の方法で数値化、またはグラフ化など、定量的に変換してもよい。このような解析および変換は、例えば市販の画像解析システム等を用いることによって行うことができる。
【００９５】
＜被験対象＞
本発明における被験対象は病変部を有する、ヒトまたはヒト以外の動物であり、好ましくは病変部を有する実験動物である。病変部は特に限定されないが、好ましくは腫瘍部であることが好ましく、具体的には、例えば、細胞腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、頭頸部がん、胃がん、肺がん、乳がん、肝がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、膀胱がんなどの固形がん、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫などを挙げることができる。
【００９６】
前記実験動物は、目的に応じて選択することが好ましく、特に疾患モデル動物が好適に用いられ、例えば上記病変部が腫瘍部のときは、疾患モデル動物としては、例えば、腫瘍細胞または腫瘍組織に由来して生体内で生成した腫瘍部をあらかじめ保持している担腫瘍動物が好適に用いられる。
【００９７】
実験動物として担腫瘍動物モデルを用いる場合、実験動物に腫瘍部を保持させるための手法は特に限定されるものではなく、公知の手法を用いることができる。
【００９８】
実験動物として用いられる動物種の例としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、フェレット、イヌ、ミニブタ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジなど、ある程度の遺伝学的な制御がなされており、均質な遺伝的要件を備えている動物が挙げられ、特にマウスが広く用いられている。
【００９９】
担腫瘍モデルマウスとしては、担がんマウスは化学発現モデルマウス、遺伝子改変モデルマウス、異種移植モデルマウスの３種に大別できる（下記表参照；Kohrt et al., Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies. Annals of Oncology (2016)27 (7): 1190-1198）。
【０１００】
異種移植モデルマウスは患者から取り出した腫瘍細胞に由来する培養細胞を免疫不全マウスに移植して作成される。ヒトに由来する培養がん細胞が移植されたマウスとしては、ＣＤＸ（Cell-line derived xenograft）モデルマウスが挙げられる。ヒト(患者)に由来する腫瘍組織が移植されたマウスとしては、ＰＤＸ（Patient derived xenograft）モデルマウスのほか、Immuno-avatarモデルマウス、造血リンパ系ヒト化（Hemato-lymphoid humanized）モデルマウス、Immune-PDXモデルマウスなどが挙げられる。
【０１０１】
ＰＤＸマウスは患者由来の腫瘍組織を免疫不全マウスに移植することによって作製される。また、Immuno-avatar モデルマウス、造血リンパ系ヒト化（Hemato-lymphoid humanized）モデルマウスおよびImmune-PDXモデルマウスは、それぞれヒトの末梢血単核細胞、CD34 +ヒト造血幹細胞およびその前駆細胞（HSPC）または腫瘍浸潤リンパ球を移植した免疫不全マウス（免疫系ヒト化マウス）に、患者由来の腫瘍組織を移植することによって作製される。
【０１０２】
【表Ａ】
2019098385.tif 000002
本発明の薬剤評価方法においては、具体的には、例えば撮影工程（２）において、同系のマウスに同一の患者由来の腫瘍組織を移植したＰＤＸマウスを複数作製することで、薬剤の投与前および薬剤の投与後の一以上の時点における腫瘍の大きさおよびその変化を測定することで薬剤の効果を評価することができる。
【０１０３】
＜評価システム＞
本発明の一実施形態である薬剤の評価システムは、前記薬剤評価方法を行うためのシステムであり、放射線撮影装置および蛍光撮影装置の少なくとも一つを有する撮影装置と、情報処理装置とを備える薬剤の評価システムである。
【０１０４】
前記放射線撮影装置は、放射線撮影を行う装置であり、前記蛍光撮影装置は蛍光撮影を行う装置であり、前記撮影装置が放射線撮影装置および蛍光撮影装置の両方を備える場合、放射線撮影および蛍光撮影は同時に行われてもよいし、どちらか一方の装置を用いてその装置に対応する撮影を行ってもよい。また、前記撮影装置は明視野撮影を行うための装置をさらに備えていてもよい。
【０１０５】
前記情報処理装置は、前記放射線撮影装置または蛍光撮影装置により取得された画像から受け取った画像を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置であり、好ましくはさらに前記受け取った画像から取得する血管情報を含む情報を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置である。また、前記情報処理装置は表示装置や情報蓄積装置をさらに備えていてもよい。
【０１０６】
（放射線撮影装置）
前記放射線撮影装置は、被験対象について放射線撮影を行うことができる装置であれば特に限定されるものではないが、三次元放射線撮影装置であることが好ましい。通常、放射線撮影装置は、放射線を放射する放射線源と放射線を検出する放射線画像検出器を含み、入力装置からの指示に基づいて、被験対象を固定した支持台の周りを回転する照射部と検出器を回転させながら放射線を照射しつつ、支持台を移動させて撮影を行う。
【０１０７】
放射線源としては、例えば医療現場で広く一般に用いられているクーリッジＸ線管や回転陽極Ｘ線管を用いることができる。
【０１０８】
放射線検出器は、通常複数の検出素子を含んで構成されており、放射線源から照射された放射線および被験者を透過した放射線をそれぞれ検出し、その強度に応じた電気信号を出力する。放射線検出器は大別するとシンチレーション検出器と半導体検出器の二種類がある。シンチレーション検出器はシンチレータにより放射線は光に変換され、さらに光はフォトダイオードによって電気信号に変換されるものであり、半導体検出器では放射線が直接電気信号に変換される。このように変換された電気信号はデジタルラジオグラフィーによって画像として情報処理装置へ伝達する。
【０１０９】
（蛍光撮影装置）
前記蛍光撮影装置は、蛍光画像の撮影を行うことができる装置であれば特に限定されるものではないが、蛍光撮影機器を備えた蛍光顕微鏡であることが好ましく、さらに蛍光撮影機器を備えた共焦点顕微鏡であることがより好ましい。前記蛍光撮影機器は蛍光画像を撮影しうるものであれば特に限定されず、例えば前記蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラなどが挙げられる。蛍光撮影装置によって取得された蛍光画像は情報処理装置へ伝達される。
【０１１０】
（明視野撮影を行うための装置）
前記明視野撮影を行うための装置は、前記明視野観察用の色素による色素染色を行った組織切片において、色素染色の対象となった細胞や物質を観察できる装置であれば特に限定されるものではなく、典型的には光学撮影機器を備えた光学顕微鏡や実態顕微鏡が用いられる。また前記蛍光撮影装置が蛍光撮影機器を備えた蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡であり、当該顕微鏡が光学顕微鏡としての機能を有しているか、または光学顕微鏡と一体化している場合は、前記蛍光撮影装置を明視野撮影を行うための装置としても用いることができる。
【０１１１】
前記蛍光撮影機器は明視野画像を撮影しうるものであれば特に限定されず、例えば前記蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡に取り付けられたデジタルカメラなどが挙げられる。明視野撮影を行うための装置によって取得された画像は情報処理装置へ伝達される。
【０１１２】
（情報処理装置）
上述したように本発明の評価システムに備えられる前記情報処理装置は、前記放射線撮影装置または蛍光撮影装置により取得された画像から受け取った画像を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置であり、具体的には、前記撮影装置から受け取った画像を解析し、得られた解析結果を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う。解析方法は特に限定されないが、前記画像を直接任意のアルゴリズム（例えば、最近傍法、バイリニア補間法、バイキュービック補間法、Lanczos補間法等）に基づいて解析（画像解析等）したものであってもよいし、また前記画像を任意の方法で数値化やグラフ化など、定量的に変換して解析を行ってもよい。
【０１１３】
前記情報処理装置は、さらに、前記放射線撮影装置ないしは蛍光撮影装置から受け取った画像から取得する血管情報を含む情報を用いて血管新生に関与する薬剤の評価を行う装置であることが好ましい。
本発明の評価システムは、好ましくはさらにシステムを制御する入力装置と、前記情報処理装置により取得された情報を出力する表示装置を備える。
【０１１４】
前記情報処理装置には、血管情報を含む情報を蓄積する、情報蓄積部が含まれることが好ましい。例えば、測定時点において、入力装置等から被験対象のＩＤ情報と薬剤のＩＤ情報を入力して、複数の時点において撮影を行い、情報処理装置にデータを蓄積することで、ある特定の個体について継時的に血管情報を含む情報を参照することができる。またそのように継時的に測定を行うことで測定値の変化量やその割合、変動等を観察することができる。
【０１１５】
各値の測定は薬剤投与前の時点を含んでいることが望ましいが、投与後のみの複数回の測定から変化量を算出してもよい。
＜表示装置＞
前記評価システムは、前記血管情報を含む情報、前記解析結果、および薬剤の評価のうち少なくとも１つを表示する表示装置をさらに備えていることが好ましい。
【０１１６】
表示装置は、例えば、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等のモニターを備えて構成されており、入力装置の表示制御に従って、情報処理装置で取得された情報を表示する。前記表示装置は、血管情報を含む情報に加えて、画像（画像情報）についても表示可能な装置であることが好ましい。表示される情報は、さらに任意の方法で整理された情報であってもよい。例えば、薬剤ＩＤ（薬剤名、ＬＯＴ番号等）、被験対象情報（マウスのＩＤ、患者情報等）、投薬および撮影履歴、各情報変化量、測定日時、撮影画像、および各被験対象における薬剤判定結果等が併せて表示されることが好ましい（図１：表示装置参照）。
【０１１７】
＜情報蓄積装置＞
前記評価システムは、前記画像、前記血管情報を含む情報、前記解析結果、および薬剤の評価のうち少なくとも１つを表示する表示装置情報を蓄積する、情報蓄積部が含まれることが好ましい。例えば、測定時点において、入力装置等から検体のＩＤ情報と薬剤のＩＤ情報を入力して、複数の時点において撮影を行い、情報処理装置にデータを蓄積することで、ある検体について継時的な画像や血管情報の変化等を参照することができる。
【０１１８】
＜プログラム＞
本発明の一実施形態であるプログラムは、前記薬剤評価方法をコンピュータにより実行させるためのプログラムである。例えば、前記評価システムにおいて、放射線撮影装置または蛍光撮影装置によって画像を撮影する処理、当該画像を情報処理装置に提示させる処理、ならびに情報処理装置が受け取った画像から血管情報を含む情報およびその他の情報を検出させる処理や、当該画像や情報を解析させる処理、複数の時点において取得した画像や各情報の継時的な変化を算出させる処理、以上の処理の結果に基づいて被験対象に投与した薬剤評価を行わせる処理、および当該薬剤評価を表示装置に表示させ、情報蓄積装置に送信するための処理などを実行させるためのプログラムである。
【０１１９】
前記プログラムは情報処理装置に記憶されていてもよいし、それ以外のコンピュータ可読記録媒体、例えば、磁気テープ（デジタルデータストレージ（ＤＳＳ）など）、磁気ディスク（ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）など）、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、光磁気ディスク（ＭＯ）、フラッシュメモリ（ＳＳＤ（Solid State Drive）、メモリーカード、ＵＳＢメモリなどに記録されていてもよいし、また独立して提供されるものであってもよい。前記プログラムを情報処理装置や可読媒体に記憶させる場合、当該情報処理装置等はプログラムの実行に必要なデータを併せて記憶していることが好ましい。例えば、患者ＩＤ及び患者名等の被験対象情報、薬剤ＩＤ等の薬剤情報、撮影部位(被写体部位)情報等が挙げられる。
【実施例】
【０１２０】
以下、実施例に基づいて本発明の好適な態様をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。【０１２１】
［作製例１］
＜担がんマウスの作製＞
５×１０6個のヒト卵巣がん由来培養細胞株ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection)より入手）を、ＳＣＩＤ（Sevefe Combined ImmunoDeficiency；チャールスリバー社；BALB/c-nu））マウスの背部へ皮下注射により移植することで担がんマウスを作製した。【０１２２】
［作製例２］
＜ＰＥＧ修飾金ナノ粒子の作製＞
ＰＥＧ修飾金ナノ粒子を調製するために、９９．４ｍｇの塩化金酸（Strem Chemicals Inc.、Newburyport、MA、USA）を２３３ｍｌの超純水に溶解し、沸騰するまで加熱した。塩化金酸溶液を激しく撹拌し、３９ｍＭクエン酸ナトリウム２８ｍｌを絶え間なく攪拌しながら溶液に添加した。試料を３０分間沸騰させた。【０１２３】
溶液を２５℃に冷却した後、９９．４ｍｇのＨＳ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ（Poly(ethylene glycol) 2-mercaptoethyl ether acetic acid  NANOCS社；品名Thiol PEG Acid, HS-PEG-COOH；型番PG2-CATH-3k）を添加し、攪拌しながら２５℃で１２時間インキュベートした。インキュベーション後、２２０００ｇ４０分での遠心分離とＰＢＳへの懸濁を３回繰り返すことで洗浄を行い、最後にＰＢＳに再懸濁することで、粒径１５ｎｍのＰＥＧ修飾金ナノ粒子を、最終濃度０．６Ｍの溶液になるように調製した。【０１２４】
［実施例１］
＜金ナノ粒子を用いた薬剤評価＞
作製例１で作製した担がんマウスおよび作製例２で作製したPEG修飾金ナノ粒子を用いて抗がん剤として用いられる抗体医薬、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）；中外製薬株式会社）の薬剤評価を行った。【０１２５】
前記担がんマウスにおいて、がん細胞移植から３週間後および５週間後、尾静脈より、生理食塩水で２５μｇ／μＬになるように調製したベバシズマブ（アバスチン（登録商標）；中外製薬株式会社）の溶液を、ベバシズマブ換算で５μｇ／ｇとなるように投与した。コントロールとして同様に作製した担がんマウスに、同量の生理食塩水を投与した。【０１２６】
がん細胞移植から、３週間後、５週間後、および７週間後の各時点において、マウス体重および腫瘍体積を測定した。腫瘍の体積はノギスを用いて、腫瘍の短軸（ａ）および長軸（ｂ）を測り、以下の計算式でもとめた。【０１２７】
「体積」＝（４／３）πａ＾２×ｂ
また、体重の測定と同じ各時点において、作製例２で作製した０．６ＭＰＥＧ修飾金ナノ粒子溶液を２００μＬ尾静脈投与し、投与後すぐに小動物用Ｘ線マイクロＣＴスキャナSkySan1176（ブルカー社）を用いて、ピクセルサイズ９ミクロン、５０ｋＶｐおよび４９０μＡにおいてＸ線ＣＴ撮影を行った。ＣＴシグナルはハンスフィールドユニット単位（Hounsfield units；ＨＵ）で定量した。【０１２８】
各時点において、撮影された画像を観察し、さらに画像解析ソフトウェアＣＴＶｏｘ（ブルカー社）を用いて各画像から腫瘍の体積、ならびに血管の密度および体積、ならびに腫瘍体積に占める血管体積の割合（血管体積÷がん体積）を取得した。【０１２９】
がん細胞移植から、３週間後と５週間後の結果を比較すると、腫瘍体積においては、生理食塩水投与群では４．８倍、ベバシズマブ投与群では３．８倍であり、その結果に大きな差は見られなかった。一方で、５週間後と７週間後の結果を比較すると、生理食塩水投与群では４．０倍（３週間後と７週間後では19.2倍）、ベバシズマブ投与群では２．０倍（３週間後と７週間後では7.6倍）、に増加しており、ベバシズマブ投与群では腫瘍体積の増加が有意に抑制されていることがわかる。【０１３０】
また、血管体積においても同様に、３週間後と５週間後の結果を比較すると、ベバシズマブ投与群では５．０倍、生理食塩水投与群では６．４倍であり、その結果に大きな差は見られなかったが、５週間後と７週間後の結果を比較すると、生理食塩水投与群では７．８倍（３週間後と７週間後では49.9倍）、ベバシズマブ投与群では２．８倍（３週間後と７週間後では14.0倍）、に増加しており、ベバシズマブ投与群では血管体積の増加が有意に抑制されていることがわかる。【０１３１】
また同様に、血管体積の割合においても、３週間後と５週間後の結果を比較すると、生理食塩水投与群では１．４倍、ベバシズマブ投与群では１．４倍であり、その結果に差は見られなかったが、５週間後と７週間後の結果を比較すると、生理食塩水投与群では１．９倍（３週間後と７週間後では２．７倍）、ベバシズマブ投与群では１．１倍（３週間後と７週間後では１．６倍）であり、ベバシズマブ投与群では血管体積の増加が有意に抑制されていることがわかる。【０１３２】
以上の結果を図３に示す。がん細胞移植後３〜５週間の時点において、ベバシズマブを投与したマウスと生理食塩水を投与したマウスとの間において、腫瘍体積、血管体積、および血管体積の割合は大きく変わらなかった。一方で、がん細胞移植後５〜７週間の時点において、ベバシズマブを投与したマウスでは生理食塩水を投与したマウスに比べ、腫瘍体積、血管体積、および血管体積の割合の増加が抑制されており、したがってベバシズマブには抗腫瘍効果および血管新生を阻害する効果もあること、および当該効果を期待するには少なくとも当該薬剤の２回以上の投与が必要であるだろうことがわかった。【０１３３】
［比較例１］
金ナノ粒子を投与しないこと以外は実施例１と同様の方法で、ベバシズマブを投与したマウス、生理食塩水を投与したマウスにおいて、Ｘ線ＣＴ撮影を行った。【０１３４】
腫瘍部の体積は求められ、抗腫瘍効果については確認することはできたが、血管は観察することができず、血管新生を阻害する効果については確認できなかった。【０１３５】
（考察）
上記の実験において、図４ｋ）〜ｍ）に示されたグラフから判るように、がん細胞移植投与後７週間後の時点では腫瘍体積、血管体積、腫瘍体積に占める血管体積の割合の、いずれの結果にも実験群と対照群との間に有意差は観察されなかった。一方がん細胞移植後７週間後の時点、つまりベバシズマブが２回投与されてからさらに２週間後の時点においては、実験群と対照群の間にはいずれも大きな差が出来ていることがわかった。このように、生きたマウスを用いて継時的に血管や腫瘍を可視化し、さらに腫瘍や血管の体積を数値化し、それらの変化を観察することで、血管新生阻害剤の薬効の評価ができることがわかる。さらに、この方法による薬剤評価においてはマウス等の被験対象を屠殺する必要が無いことから、実験動物を無駄にしないという動物愛護の観点からのメリットが得られると考えられる。【０１３６】
また、上記の結果は、ベバシズマブを単回投与するのみでは薬剤の効果は不十分であり、複数回の投与が重要である事を示唆している。したがってこのような評価を行うことにより薬剤の投与方法、または好適な薬剤の組み合わせなどを判断することができるという可能性を提示することができる。【０１３７】
また血管体積や腫瘍体積に占める血管体積の割合を高精度に評価することで、その薬剤の抗がん作用が血管新生阻害作用に基づくものかどうかを評価することができ、新たな候補薬をスクリーニングする際に利用することも考えられる。さらに、マウス等の被験対象を屠殺する必要が無いことから、実験動物を無駄にしないという動物愛護の観点からのメリットが得られると考えられる。【０１３８】
［作製例３］
＜Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）融合ＶＥＧＦサブユニット＞
・ｃＤＮＡの作成
精製した２０ｎｇのＭｏｕｓｅ  Ｖｅｇｆ１６４  ｃＤＮＡ（ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社）、１０μＭの５'−プライマー（5'-ATACCATGGCACCCACGACA-3'）、１０μＭの３'−プライマー（5'-TGTTCGGTTCCGCCGAGCTCAAA-3'）およびＫＯＤ  Ｆｘ（東洋紡株式会社）を含む混合液を９８℃２分間→３０×（９８℃１０秒→５５℃で３０秒→７２℃で９０秒）のプログラムで、ＰＣＲ装置（Takara PCR Thermal Cycler Dice（登録商標） Gradient；タカラバイオ株式会社）にかけることで、ＤＮＡを増幅した。【０１３９】
得られたＰＣＲ産物を、１×ＴＡＥ緩衝液中１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルで泳動し、SYBER Green（タカラバイオ株式会社）を用いて染色することで、目的のバンドを抽出し、Wizard（登録商標） SV GELおよびPCR Clean Up system（いずれもプロメガ株式会社）を用いて精製した。【０１４０】
精製したＰＣＲ産物およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）発現ベクターであるpASK-IBA63a-plus（ＩＢＡ社）を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで処理した後、２：１のモル比で混合した。混合液を同量のDNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞（製品コード 6023；タカラバイオ株式会社）とさらに混合し、１６℃で１２時間インキュベートすることでライゲーションを行った。得られた反応溶液について、上述したＰＣＲ産物と同様の手法で泳動、染色、抽出および精製を行った。【０１４１】
精製された反応溶液を用いて、大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（東洋紡株式会社）のトランスフォーメーションを行ない、アンピシリン２００μｇ／ｍＬ含有ＬＢプレートを用いてコロニーの選択を行った。両方のcDNAをQIAprep Spin Miniprep Kit（株式会社キアゲン）を用いて選択されたコロニーからＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４  ｃＤＮＡを精製した。【０１４２】
精製したｃＤＮＡのＤＮＡ配列をユーロフィンジェノミクス社に委託して解析した結果、ＶＥＧＦ１６４のＣ末端にＳｔｒｅｐ−ｔａｇが結合している配列であることを確認した。
・タンパク質の発現
精製したｃＤＮＡを用いて、ＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ（登録商標）  ２（ＤＥ３）コンピテントセル（メルクミリポア社）にトランスフォーメーションを行った。コロニーの選択は、２００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール含有ＬＢプレートを用いてコロニーの選択を行った。選択したコロニー、１０μＭの３’−プライマー（5'-TGACGCAGTAGCGGTAAACGGCAGAC-3'）、１０μＭの５’−プライマー（5'-GAGTTATTTTACCACTCCCTATCAGTG-3'）およびGo-Taq（登録商標） Green Master Mix（プロメガ社製）を含む混合液について、上述したものと同様のプログラムでコロニーＰＣＲを行い、電気泳動を行うことで、選択したコロニーにＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４  ｃＤＮＡが導入されていることを確認した。【０１４３】
選択したコロニーを２００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地２５ｍｌ中で３７℃、１６０ｒｐｍで１２時間培養し、次いで同じ組成のＬＢ培地２００ｍＬに移し、３７℃、１６０ｒｐｍで６０分間インキュベートし、さらにアンヒドロテトラサイクリン５０μｇを培地に添加し３７℃、１６０ｒｐｍで６時間さらにインキュベートすることでＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４の発現を誘導した。その後、４℃、６０００ｇで１５分間遠心分離し、沈殿した大腸菌を回収した。【０１４４】
回収したペレットを、２μＬのＤＮａｓｅ（プロメガ社）、２μＬのＢｅｎｚｏｎａｚｅ（シグマアルドリッチ社）および２０μＬの１００×プロテアーゼ阻害剤混合物（ＧＥヘルスケア）を添加したＰＢＳ２ｍＬとよく混合し、さらに２０μＬの１００×リゾチーム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）と混合して３７℃で５分間インキュベートし、次いで氷冷しながら超音波処理を行った。超音波処理した溶液を４℃、２００００ｇで１５分間遠心分離して回収したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４を含むペレット（封入体）を、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭ尿素および０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む緩衝液で３回洗浄した。封入体を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，５ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０および１０ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液でさらに３回洗浄した。【０１４５】
・封入体の可溶化による発現タンパクの精製・回収
封入体を６Ｍグアニジン塩酸塩、０．１ＭのＮａＨ2ＰＯ4および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含む２ｍＬのグアニジン溶液により可溶化した。可溶化された封入体を、６Ｍ尿素、０．１ＭのＮａ2ＰＯ4および１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む４００ｍＬ尿素溶液に４℃で６時間透析し、続いて同様の組成の尿素溶液で４時間さらに、尿素溶液を交換し１２時間透析を行うことによりＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合  ＶＥＧＦ単量体を含有する尿素溶液の調製を行った。【０１４６】
なおすべての透析は、透析膜：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）６（分画分子量２０００；スペクトラム ラボ ジャパン株式会社）を用いて行った。【０１４７】
透析後のＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４溶液は前記尿素溶液で０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。クーマシー（ブラッドフォード）タンパク質アッセイキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 ）を用いて分光光度計Ｕ−４１００（日立ハイテクノロジーズ社製）により吸光度を測定することで溶液のタンパク定量を使用した。【０１４８】
［作製例４］
＜Ｈｉｓ−ｔａｇ融合  ＶＥＧＦサブユニット＞
５'−プライマーに代えてＨｉｓ−ｔａｇ５'−プライマー（ 5'-CATCACCATTAATGAGCTTGACCTGTGAAGTGAAAA-3'）、３'−プライマーに代えてＨｉｓ−ｔａｇ３'−プライマー（ 5'-GTGATGGTGAGCGCTCTCGAGCCGCCTTGGCTTGTC-3'）を用いる以外は作製例１と同様の手法でＤＮＡを増幅して精製した。精製されたPCR産物は、Ｓｔｒｅｐ―ＴａｇがＨｉｓ―Ｔａｇに変換されている。Mighty Cloning Reagent Set-Blunt End（タカラバイオ社製）を用いて、精製したＨｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦのＰＣＲ産物２００ｎｇをｃDNAとした。【０１４９】
作製例１と同様の手法で、泳動、ｃDNAの精製を行い、さらに同様の手法でＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ（登録商標）  ２（ＤＥ３）コンピテントセル（メルクミリポア社）にトランスフォーメーションを行うことでＨｉｓ−ｔａｇ融合  ＶＥＧＦ単量体の発現、精製および回収を行った。【０１５０】
［作製例５］
＜ストレプトアビジン結合ペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子＞
Ｎ,Ｎ'−ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）−１,６,７,１２−テトラフェノキシペリレン−３,４：９，１０−テトラカルボキシジイミドを濃硫酸で処理し、ペリレンジイミドスルホン酸誘導体を作製した。これを酸クロリドに変換してペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体とした。ペリレンジイミドスルホン酸クロリド誘導体１７．３ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」（日本カーバイド工業株式会社）０．７８ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の混合液にギ酸１００μＬを加え、混合液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、その混合液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の反応混合液を遠心用チューブに分注し、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することで混合液に含まれるペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿したペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子をエタノールおよび水で洗浄した。このペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子の平均粒子径（ＳＥＭ像でカウントした１００粒子についての粒子径の平均値）は１３５ｎｍであった。【０１５１】
ペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン「ＬＳ−３１５０」（信越化学工業社）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。【０１５２】
次いで、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて上記表面アミノ化処理を行なった粒子を３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社、succinimidyl-[(N-maleimidopropionamido)-dodecaethyleneglycol]ester）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことでマレイミド修飾ペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子を得た。【０１５３】
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社）について、N-succinimidyl  S-acetylthioacetate（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行なうことで、マレイミド修飾ペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジン溶液を得た。【０１５４】
上記マレイミド修飾ペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子と上記処理によりチオール基を付加したストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。その後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた混合液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジン修飾ペリレンジイミド集積メラミン樹脂粒子を得た。【０１５５】
［実施例２］
＜Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦの作製＞
作製例２および３で作製したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４およびＨｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４をサブユニットとする二量体タンパク質を以下の方法で作製した。【０１５６】
１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭのシステイン、２ｍＭのシスチン、０．５Ｍのグアニジン塩酸塩、０．５Ｍのアルギニン塩酸塩を含む溶液を調製しリフォールディング用緩衝液として使用した。【０１５７】
作製例１、２で作製したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４およびＨｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４を１：１のモル比で混合し、５０倍量のリフォールディング用緩衝液を用いて３７℃で６時間、緩衝液を交換して４時間、さらに緩衝液を交換して１２時間の透析を行った。【０１５８】
透析後の液に対し５０倍量の０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を用いて４℃で６時間、緩衝液を交換し４時間、さらに緩衝液を交換して１２時間透析した。【０１５９】
リフォールディングされたタンパク質試料をＨｉｓ−ｔａｇアフィニティーカラム（HisTALON（商標） Superflow Cartridge、タカラバイオ株式会社）および（Strep-Tactin（登録商標） Superflow高容量カートリッジ、IBA社）で精製した。精製手順は、それぞれのマニュアルに従って行った。【０１６０】
精製物はアミコンウルトラ（Amicon Ultra 遠心式フィルターユニット（分画分子量３０００；メルクミリポア社）を用いて５０００ｇ、４℃で１ｍｌ未満となるまで遠心濃縮した。【０１６１】
さらに１００ｍｌのＰＢＳを用いて４℃で６時間ＰＢＳを交換して４時間、さらにＰＢＳを交換して１２時間透析を行った。【０１６２】
透析後、同量のグリセロールを添加し濃度５０ｎｇ／μＬに調整した。【０１６３】
上記グリセロール溶液について、ウサギ抗マウスＶＥＧＦポリクローナル一次抗体（アブカム社製）、ウサギ抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇポリクローナル抗体（Ａｂｎｏｖａ社製）およびウサギ抗Ｈｉｓ−ｔａｇポリクローナル抗体（アブカム社）を用いてウェスタンブロッティングを行い、抗ＶＥＧＦ抗体、抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体、抗ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ抗体のいずれとも反応することを確認した。このことは前記グリセロール溶液には、目的とする二量体タンパク質、つまりＳｔｒｅｐ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４およびＨｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ１６４をサブユニットとする、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ（本発明の二量体タンパク質）が含まれていることを示す。【０１６４】
［実施例３］
＜蛍光標識プローブによる細胞の染色＞
実施例１で作製したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦとＱｄｏｔ（登録商標）７０５ストレプトアビジンコンジュゲート（以下、ＱＤ７０５とも記す）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社)とをモル比で８：１になるように混合し、２５℃で１時間静置して蛍光標識プローブを作製した。【０１６５】
マウス膵臓由来培養細胞株ＭＳ１（ＡＴＣＣから入手）を、５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭを用いて、９６ウェルプレートに播種して培養した。１日後、上記蛍光標識プローブをウェルに１０ｎＭとなるように添加し、１０℃で１時間静置したあと、ＰＢＳで洗浄した。ウェルに丸型カバーガラスを載せて標本スライドとし、顕微鏡にセットして蛍光画像の撮影および画像処理を行った。なお、コントロールとしてＱＤ７０５のみを用いて、およびＶＥＧＦ２量体（ビオチン修飾無し）とＱＤ７０５とを用いて、細胞を処理し、同様に蛍光画像の撮影および画像処理を行った。【０１６６】
蛍光観察における励起光の照射および蛍光の発光の観察には、共焦点スキャナユニットCSU（横河電機株式会社）を接続した倒立型蛍光顕微鏡  IX71（オリンパス光学工業株式会社）を用い、撮影には、当該蛍光顕微鏡に取り付けたＥＭＣＣＤカメラ  iXon DV887（Andor社）を用いた。【０１６７】
まず、ペリレンジイミドに対応する励起光を標本スライドに照射して蛍光を発光させて、その状態の蛍光画像を撮影した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて５３２ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６９５〜７４０ｎｍに設定した。蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度は、視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるようにした。画像撮影時の露光時間は、画像の輝度が飽和しないような範囲で調節し、例えば４０００μ秒に設定した。【０１６８】
ペリレンジイミドの蛍光画像の蛍光画像は、画像処理ソフトウェア「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）を用いた画像処理により重ねあわせた。また蛍光強度は取得した画像を同ソフトウェアでグレースケールに変換し、２５０画素×３００画素領域で切り取った。バックグラウンド補正を行い、１００視野の画素値の平均値からピクセルあたりの画素値の平均値を算出し、１０００ピクセルを掛けることで全蛍光強度を定量した。【０１６９】
それぞれ取得した蛍光画像において定量した蛍光強度のグラフを図６に示す。蛍光標識プローブを用いて染色された細胞において測定された蛍光強度は１６×１０3（a.u.）であり、コントロールと比べ、極めて強い感度で検出することができることが判った。【０１７０】
［比較例２］
マウスＶＥＧＦ１６４リコンビナントタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社)に対して、ビオチン化キットEZ-Link（登録商標） Micro Sulfo-NHS-LC-Biotinylation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 製）を用い、非特許文献１と同様の手法でビオチン化を行った。得られたビオチン化ＶＥＧＦ１６４についてビオチン定量キットBiotin Quantitation Kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）および分光光度計U-4100（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて、ＶＥＧＦ１モルあたりの平均ストレプトアビジン結合部位数を測定した、ＶＥＧＦ１モルあたりの平均ストレプトアビジン結合部位数は５個であった。【０１７１】
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦの代わりに上記ビオチン化ＶＥＧＦ１６４を用いる以外は実施例２と同様の手法で、マウス膵臓由来培養細胞株ＭＳ１、およびＭＳＩ細胞に遺伝子導入をおこないＶＥＧＦ産生を亢進させた細胞であるＭＳ１  ＶＥＧＦ（ＡＴＣＣから入手）を用いて蛍光染色を行った。なお、コントロールとしてＱＤ７０５のみで処理した細胞について、同様に蛍光画像の撮影および画像処理を行った。【０１７２】
（結果・考察）
比較例１においてはＶＥＧＦＲ高発現細胞であるＭＳ１‐ＶＥＧＦ細胞においては蛍光画像において輝点が確認されたが、ＭＳ１細胞においてはほとんど輝点が見られなかった。また、蛍光強度に関しても、ＭＳ１細胞では９×１０3（a.u.）であり、これはコントロール（ＱＤ７０５）において得られる数値と大きな差はない。【０１７３】
実施例３において上述したように、本発明の蛍光標識プローブを用いた染色では、ＶＥＧＦＲ発現量の低いＭＳ１細胞においても明確に輝点を観察することができ、コントロールと比べた蛍光強度の差も有意に大きかった。【０１７４】
以上の結果から、従来の手法で作製されたビオチン化ＶＥＧＦではＶＥＧＦＲが検出できない細胞においても、本発明の蛍光標識プローブを用いることでＶＥＧＦが検出でき、したがって本発明の蛍光標識プローブによると従来よりもさらに高い感度で染色を行えること、ひいては本発明の薬剤評価方法において当該蛍光標識プローブを用いることでより精度の高い薬剤評価を行うことができることが示唆される。【０１７５】
［実施例４］
＜Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦを用いた薬剤評価＞
がん細胞移植後３週間後、５週間後、尾静脈よりベバシズマブ（アバスチン（登録商標）；中外製薬株式会社）を２５μｇ／μＬになるように生理食塩水で調製したものを投与した。マウス体重に対する投与量は、５μｇ／ｇとした。コントロールとして同様に作製した担がんマウスに、同量の生理食塩水を投与した。また、各時点において、マウスの体重および腫瘍体積を測定した。腫瘍の体積はノギスを用いて、腫瘍の短軸（ａ）および長軸（ｂ）を測り、以下の計算式でもとめた。【０１７６】
「体積」＝（４／３）πａ＾２×ｂ
各時点における体重および腫瘍体積の平均値を図３に示す。５週間後の時点における腫瘍細胞領域の腫瘍体積の抑制がみられないことから、ベバシズマブについては複数回の投与が有効であるということが強く示唆される。【０１７７】
がん細胞移植後３週間後、５週間後または７週間後の時点におけるベバシズマブ投与後、実施例１で作製したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦ２．５μｇおよびＤｙｌｉｇｈｔ４８８標識レクチン（ベクターラボラトリーズ社）１００ｕｇを尾静脈注射により投与した。投与４５分後にマウスを堵殺してがん細胞を含む組織を摘出した。組織を定法によりホルマリン固定、脱水処理、パラフィン包埋し、さらに１００〜４００μｍの切片にすることで組織試料を作製した。【０１７８】
前記組織試料に対して常法に従い脱パラフィン処理および賦活化処理を行った後に、ＰＢＳを入れた容器に３０分間浸漬して洗浄した。その後組織試料を１００ｕｇ／ｍＬカゼイン溶液に４℃１時間浸漬することでブロッキングを行った。ブロッキング後、再度ＰＢＳで洗浄を行った。【０１７９】
作製例４で作製したストレプトアビジン結合ペリレンジイミド集積メラミン樹脂ナノ粒子をＰＢＳで０．１ｎＭに調製した分散液に、組織試料を４℃で２時間浸漬した。その後ＰＢＳで３回洗浄を行い、カバーガラスに載せ、さらに、アルミプレート、ネジにて標本を顕微鏡に固定した。実施例２と同様の手法でペリレンジイミドに対する蛍光画像の撮影を行い、次に励起光の波長を４８８ｎｍ、観察する蛍光の波長を５００〜５４０ｎｍに設定して、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８に対応する蛍光画像を撮影した。ペリレンジイミドの蛍光画像およびＤｙｌｉｇｈｔ４８８の蛍光画像は、実施例２と同様の手法で画像処理を行い、蛍光強度の測定を行った。【０１８０】
各時点における蛍光画像を図７ａ〜ｅに、定量結果のグラフを図７ｇ、ｆに示す。
（結果・考察）
生理食塩水投与群における結果を表１に示す。がん細胞移植から３週間後の結果と比較して、５週間後の時点においては血管内皮領域および腫瘍細胞領域において共に有意にＶＥＧＦ受容体の発現量の増加が観察された。一方７週間後の時点においては血管内皮領域でさらなる発現量の増加がみられたが、腫瘍細胞領域においてはほぼ変化しなかった。【０１８１】
この結果から、まず腫瘍細胞のＶＥＧＦ受容体の発現量が増加し、それにともない血管新生が誘導され、遅れて血管内皮の受容体の発現量が増加したものと考えられる。【０１８２】
【表１】
2019098385.tif 000003
ベバシズマブ投与群における結果を表２に示す。５週間後の時点においては血管内皮領域におけるＶＥＧＦ受容体の発現量に有意差はなく、一方腫瘍細胞領域では有意差をもってＶＥＧＦ受容体の発現量が増加していた。一方７週間後の時点においては、血管内皮領域のＶＥＧＦ受容体の発現量について有意な変化は観察されなかったが、腫瘍細胞領域では有意差を持って発現量が低下していた。【０１８３】
【表２】
2019098385.tif 000004
各群間の結果を比較すると、がん細胞移植から５週間後の時点におけるＶＥＧＦ受容体の発現量について、血管内皮領域では生理食塩水投与群とベバシズマブ投与群との間で有意な差は見られなかったが、腫瘍細胞領域においてはベバシズマブ投与群で有意に抑制されているということがわかった（０．７０倍）。また７週間後のＶＥＧＦ受容体の発現量については、生理食塩水投与群に対してベバシズマブ投与群においては、腫瘍細胞領域（０．３６倍）、血管内皮領域（０．３３倍）のいずれにおいても、ＶＥＧＦ受容体の発現量は有意に抑制されているということがわかった。【０１８４】
［実施例５］
＜Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦの生理活性評価＞
２．０×１０3個のマウス膵臓由来培養細胞株ＭＳ１（ＡＴＣＣから入手）を９６ウェルプレートに播種して５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭで培養した。播種１日後、５％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭに実施例１で作製したＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦまたはコントロールとしてマウスＶＥＧＦ１６４リコンビナントタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社）をそれぞれ０、０．１、１、１０、１００ｐｇ／ｍＬとなるように添加したものと交換した。４日後にCellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution細胞増殖試験キット（プロメガ社）を用いて細胞増殖試験を行った。【０１８５】
結果を図８に示す。マウスＶＥＧＦ１６４リコンビナントタンパク質を添加した場合（白）と、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦを添加した場合（グレー）とでは、吸光度に有意差はみられなかった。このことは、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦはマウスＶＥＧＦ１６４リコンビナントタンパク質と同様に、ＶＥＧＦ受容体へ特異的に結合能を保持し、ＶＥＧＦ受容体発現細胞の増殖能を活性化できることを示しており、細胞膜上のＶＥＧＦ受容体の局在や量を計測可能であることを示している。したがってＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦは細胞膜上のＶＥＧＦ受容体の局在や量などの生理的評価を行うために用いることができると考えられる。【０１８６】
［実施例６］
＜金ナノ粒子およびＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦを用いた薬剤評価＞
下記表は上述した実施例１、および３〜５の結果をまとめたものである、腫瘍体積、血管体積、および血管体積／腫瘍体積は実施例１の結果を、ＶＥＧＦＲ発現量（腫瘍領域）、ＶＥＧＦＲ発現量（血管内皮領域）は実施例３〜５の結果である。【０１８７】
【表３】
2019098385.tif 000005
（考察）
ここで、撮影工程（１）で取得した画像を用いて行った薬剤評価（実施例１）、および撮影工程（２）で取得した画像を用いて行った薬剤評価（実施例３〜５）を併せることで以下のことが示唆される。【０１８８】
上述したように、実施例１において、がん細胞移植後３〜５週間の時点においてはベバシズマブ投与群と生理食塩水投与群との間において、腫瘍体積、血管体積、および血管体積の割合は大きく変わらなかったが、移植後５〜７週間の時点において、ベバシズマブ投与群では生理食塩水投与群に比べ、腫瘍体積、血管体積、および血管体積の割合の増加が抑制されていることがわかった。【０１８９】
一方、ＶＥＧＦＲ発現量について、ベバシズマブ投与群において、５週間後では腫瘍細胞領域で有意な抑制がみられたが、血管内皮領域では有意差は見られない。つまりこの段階ではベバシズマブは腫瘍細胞に留まり、血管内皮細胞のＶＥＧＦＲ発現量に対して与える影響が小さいといえる。そして上記実施例１の結果、つまり、腫瘍体積ならびに撮影工程（１）で取得した血管情報である、血管体積および腫瘍体積に占める血管体積の割合もこの時点では有意差がない。【０１９０】
さらに、ベバシズマブ投与群の７週間後においては、腫瘍細胞領域および血管内皮領域のいずれにおいてもＶＥＧＦＲ発現量は有意に抑制されている。【０１９１】
ここから、ベバシズマブの腫瘍細胞に対するＶＥＧＦＲ発現抑制効果が血管内皮細胞にも波及し、血管におけるＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ間のシグナル伝達を抑制するのではないかということが示唆される。そして、上記実施例１の結果、つまり、腫瘍体積ならびに撮影工程（１）で取得した血管情報である、血管体積および腫瘍体積に占める血管体積の割合のベバシズマブ投与群の有意な抑制はこのことによって引き起こされるのではないかと考えられる。【０１９２】
換言すると、３〜５週間の時点に関しては主に腫瘍細胞領域のＶＥＧＦＲ発現量、５〜７週間の時点に関しては主に血管内皮領域のＶＥＧＦＲ発現量の増加が、それぞれの時点における血管体積および腫瘍体積に占める血管体積の割合の増加に結びついている事が強く示唆される。【０１９３】
また、５〜７週間の時点において腫瘍細胞領域のＶＥＧＦＲ変化量のほうが血管内皮細胞領域のＶＥＧＦＲ変化量よりも大きかったことから、腫瘍細胞領域のＶＥＧＦＲ発現量が血管内皮領域のＶＥＧＦＲ発現量に影響を与え、血管体積および腫瘍体積に占める血管体積の割合の優位な変化につながっているのではないかと考えられる。【０１９４】
以上、上記のような本発明の撮影工程（１）にあたる金ナノ粒子を用いて取得した画像により、従来の技法よりもより詳細に血管情報を含む情報を取得することができ、また本発明の撮影工程（２）にあたるＳｔｒｅｐ−ｔａｇ／Ｈｉｓ−ｔａｇ融合ＶＥＧＦを用いて取得した画像により、より感度の高いＶＥＧＦＲの検出が可能になる。【０１９５】
その結果、血管情報を含む情報に基づく評価とＶＥＧＦＲの発現量に基づく評価を併せることにより、より精確な薬剤評価が可能になると考えられ、また、その薬剤の抗がん作用が腫瘍細胞のＶＥＧＦによる血管新生阻害作用に基づくものかどうかを判断できるだろうことから、新たな抗ＶＥＧＦ候補薬をスクリーニングする際の薬剤評価においても有用である。
【符号の説明】
【０１９６】
１・・・蛍光観察装置
１０・・・放射線撮影装置
２０・・・情報処理装置
２５・・・表示装置
３０・・・入力装置
３１・・・制御部
３３・・・反射画像生成部
３６・・・蛍光画像生成部
５０・・・光源
５１・・・ミラー
５２・・・ハーフミラー
５５・・・フィルター
６０・・・レンズ
７０・・・試料
８０・・・ステージ
【図１】
2019098385.tif 000006
【図２】
2019098385.tif 000007
【図３】
2019098385.tif 000008
【図４】
2019098385.tif 000009
【図５】
2019098385.tif 000010
【図６】
2019098385.tif 000011
【図７】
2019098385.tif 000012
【図８】
2019098385.tif 000013
【図９】
2019098385.tif 000014
【国際調査報告】
2019098385.tif 000015
2019098385.tif 000016
2019098385.tif 000017
2019098385.tif 000018
2019098385.tif 000019
2019098385.tif 000020
2019098385.tif 000021
2019098385.tif 000022