(57)【要約】  顕著なオートファジー誘導作用を有する、安全性の高い天然素材を有効成分とし、ヒトに安全かつ容易に比較的長期間に亘って投与可能なオートファジー誘導剤を提供することを課題とし、有効成分として環状グルコオリゴ糖を含んでなるオートファジー誘導剤とその用途を提供することにより、前記課題を解決する。
2018173653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として環状グルコオリゴ糖を含んでなるオートファジー誘導剤。
【請求項２】
環状グルコオリゴ糖が、環状四糖及び環状五糖から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載のオートファジー誘導剤。
【請求項３】
環状四糖又は環状五糖が、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する非還元性の環状四糖、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する非還元性の環状四糖、又はサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する非還元性の環状五糖であることを特徴とする、請求項２に記載のオートファジー誘導剤。
【請求項４】
環状グルコオリゴ糖を無水物換算で０．１質量％以上含んでなる請求項１乃至３のいずれかに記載のオートファジー誘導剤。
【請求項５】
更に、α,α−トレハロース、α,β−トレハロース、及びβ,β−トレハロースから選ばれる１種又は２種以上を含んでなる、請求項１乃至４のいずれかに記載のオートファジー誘導剤。
【請求項６】
前記α,α−トレハロース、α,β−トレハロース、及びβ,β−トレハロースから選ばれる１種又は２種以上を、無水物換算での合計で、０．１質量％以上含んでなる、請求項５に記載のオートファジー誘導剤。
【請求項７】
オートファジーの異常に起因する疾患又は症状を予防、治療、及び／又は緩和するための請求項１乃至６のいずれかに記載のオートファジー誘導剤。
【請求項８】
オートファジーの異常に起因する疾患又は症状が、神経変性疾患、肺性疾患、筋委縮疾患、筋疾患、心筋症、脳腫脹、疲労、睡眠不足、又は冷え性であることを特徴とする、請求項７に記載のオートファジー誘導剤。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載のオートファジー誘導剤を含んでなる、食品、健康食品、保健機能食品、機能性表示食品、栄養機能食品、特定保健用食品、飼料、餌料、ペットフード、化粧品、医薬品、又は医薬部外品の形態にある、オートファジー誘導用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー誘導剤とその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーとは、酵母からヒトに至る真核生物において見られる、細胞内の不要な蛋白質などを分解するための仕組みの一つであり、細胞が自己成分を分解処理することから自食作用とも呼ばれる。オートファジーは、細胞質の一部が隔離膜によって取り囲まれ、オートファゴソームと呼ばれる膜構造が形成されることを特徴とし、形成されたオートファゴソームの外膜がリソソーム膜と融合してオートリソソームとなり、このオートリソソーム内で老廃物や不要な蛋白質などが消化され、自己成分の分解過程が完結する。なお、オートファジーにより分解されるのは、老廃物や蛋白質に限られず、脂肪滴やグリコーゲン、更には、ミトコンドリア、ペルオキシソームなどの細胞内小器官にまで及ぶ（非特許文献１参照）。【０００３】
オートファジーという現象は、歴史的には１９５０年代後半から観察されていたが、その検出はもっぱら電子顕微鏡による形態学的観察であったため、研究が思うように進まない時期があった。その後、酵母の変異体の研究から種々のオートファジー関連因子が発見され、哺乳類などの高等動物にも類似の因子が存在することが明らかになり、研究が一気に加速された。特に、オートファゴソーム形成に関連する遺伝子として、１８個のオートファジー関連遺伝子［Ａｔｇ（Ａｕｔｏｐｈａｇｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）１乃至１０、Ａｔｇ１２乃至１４、Ａｔｇ１６乃至１８、Ａｔｇ２９、Ａｔｇ３１]が同定され、これにより、ノックアウトマウスの作製や遺伝子産物である蛋白質に対する抗体を用いた観察が可能となり、Ａｔｇ遺伝子の機能解析やオートファゴソームの形成・分布・挙動に関する研究が進んだ（非特許文献２参照）。【０００４】
更に、オートファジーは、細胞の様々な生理学的／病理学的機能において、根本的な役割を担っていることが見出され、その研究過程で、オートファジーの異常に起因すると考えられる疾患が多数報告されている。例えば、非特許文献３には、神経変性疾患、肺性疾患などの疾患が挙げられている。前記神経変性疾患としては、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病などが挙げられ、これらの疾患においては、オートファジーの機能が阻害されているため、アミロイドβやポリグルタミン、α−シヌクレインなどの凝集蛋白質が生体内に蓄積され、これが発症に関わっていることが知られている。前記パーキンソン病の発症には、オートファジーの機能の内、不良ミトコンドリアを除去する機能（ミトファジー）異常が関与していることが知られている。更に、代謝性疾患においてオートファジーの機能が損なわれると、膵臓のβ細胞にアミロイドペプチドが蓄積し、糖尿病の発症へと繋がることが知られている。また、オートファジーは、自然免疫や適応免疫において重要な役割を担っており、細菌やウイルスの分解（ゼノファジー）やウイルス由来ペプチドの抗原提示に関与していることも知られている。【０００５】
更に、オートファジーは飢餓時などにおいても誘導され、生体において、いわば恒常的に機能している。加齢に伴いその誘導能が低下すると、細胞内老廃物の蓄積、ひいては種々の老化現象が引き起こされると言われ（非特許文献４参照）、近年、オートファジーと寿命との関連性についても関心が高まりつつある。【０００６】
これら一連のオートファジーの研究において、種々のオートファジー活性測定方法が考案されている。最も繁用されている方法として、オートファゴソームの構成蛋白質であるＬＣ３と呼ばれる蛋白質、殊に、ＬＣ３のアイソフォームであるＬＣ３Ｂと呼ばれる蛋白質（以下、単に「ＬＣ３Ｂ」と言う。）、及びＬＣ３Ｂの膜結合型（脂溶性）蛋白質、すなわち、オートファゴソームの内膜表面と外膜表面の両面に発現し、その発現量がオートファゴソーム形成と正の相関を示すことが知られているＬＣ３Ｂ−ＩＩと呼ばれる蛋白質（以下、単に「ＬＣ３Ｂ−ＩＩ」と言う。）を検出する方法がある（非特許文献５参照）。ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの検出法としては、それら蛋白質に対する抗体を用いる方法を例示できる。抗体による検出方法においては、更に細胞を固定し、免疫細胞化学染色を行う方法と、細胞の抽出液を調製し、抽出されたＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩをウエスタンブロッティングにより検出する方法がある。免疫細胞化学染色法は、オートファゴソームを形態的に捉え、その細胞内局在を把握できるという利点がある。一方、ウエスタンブロッティングによる方法は、オートファゴソームを定量的に把握できるという利点がある。但し、オートファゴソームの形成が促進されてもその後の進行が不完全である場合、オートファジーは完結しないので、被験物質にオートファジー誘導作用があることを確認するためには、オートファゴソームの形成、オートリソソームの形成、及びオートリソソーム内で内容物が分解されるまでの一連の流れ、つまり、オートファジックフラックス（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｆｌｕｘ）が進行していることの確認が必要である（非特許文献６参照）。オートファジックフラックスが進行している場合には、例えば、ＮＨ４Ｃｌやクロロキンなどのリソソーム阻害剤の存在下で細胞を培養すると、リソソームの作用が阻害され、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩが分解されずに残存するため、リソソーム阻害剤非存在下で培養した場合と比べ、細胞内のＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの量が増加する。この原理に基づき、細胞を被験物質とともに、リソソーム阻害剤の存在下で培養したとき、リソソーム阻害剤非存在下で培養した場合と比べ、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの量が増加している場合には、オートファジックフラックスが進行していると判断される。一方、オートファジックフラックスが進行していない場合には、細胞を被験物質とともにリソソーム阻害剤の存在下で培養しても、リソソーム阻害剤非存在下で培養した場合と比べ、ＬＣ３Ｂ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの量は増加しない。【０００７】
更に、オートファジーと疾患との関連性において、オートファジー誘導剤を用いて、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状の予防、治療、或いは加齢を抑制する試みなどがなされている。オートファジーを誘導する物質として、例えば、ラパマイシン、トリン１、メトホルミン、塩化リチウム、カルバマゼピンなどが知られている。しかし、それらはオートファジーに特異的ではなく、多機能な薬効を有していることから、副作用を惹起し易いという欠点がある。一方、安全な天然素材であって、自体、穏やかな甘味を有し、多機能な特性を有する糖質として知られるα,α−トレハロース（以下、特に断りがない限り、単に「トレハロース」と言う。）にオートファジー誘導作用があることが知られている（非特許文献７参照）。トレハロースは、様々な病態モデルにおいてオートファジーの活性化に関与しており、殊に、高脂肪食による肝脂肪の病態モデル動物において詳細な解析がなされ、ヒトへの応用の可能性を示唆する報告もある（非特許文献８参照）。トレハロースは、整腸作用、抗う蝕作用、ミネラル吸収促進作用、血糖調節作用、コレステロール低下作用、インスリン抵抗性の予防／改善作用などの種々の生理機能を有する極めて有用な糖質であり、斯かる糖質が更にオートファジー誘導能をも有しているということは、天然素材としての糖質が有する生理機能の広がりにより一層の期待を抱かせるものである。【０００８】
斯かる状況下、トレハロースと同様、安全性の高い天然素材であって、オートファジー誘導作用を有するものが存在すれば、オートファジーの研究のみならず、オートファジーの異常に起因する種々の疾患及び症状の予防、治療、緩和に新たな展開がもたらされるものと期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】水島昇、『細胞が自分を食べるオートファジーの謎』、ＰＨＰサイエンス・ワールド新書、８０乃至８２頁、２０１１年
【非特許文献２】水島昇等、『ジ・アニュアル・レビュー・オブ・セル・アンド・ディベロプメンタンル・バイオロジー』、第２７巻、１０７乃至１３２頁、２０１１年
【非特許文献３】オーカズチン・エム・ケイ・チョイ等、『ザ・ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン』、第３６８巻、第７号、６５１乃至６６２頁、２０１３年
【非特許文献４】マウリジオ・レナ等、『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２８５巻、第１５号、１１０６１乃至１１０６７頁、２０１０年
【非特許文献５】クリオンスキー・ディ・ジェイ等、『オートファジー』、第１２巻、第１号、１乃至２２２頁、２０１６年
【非特許文献６】水島昇等、『セル』、第１４０巻、第３号、３１３乃至３２６頁、２０１０年
【非特許文献７】ソバン・サーカー等、『ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー』、第２８２巻、第８号、５６４１乃至５６５２頁、２００７年
【非特許文献８】ブリアン・ジェイ・デボッシュ等、『サイエンス・シグナリング』、第９巻、第４１６号、ｒａ２１、１乃至１３頁、２０１６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、オートファジーを顕著に誘導し、活性化し、及び／又は促進する作用（本願明細書においては、これらを纏めて「オートファジー誘導作用」と言う。）を有する安全性の高い天然素材を有効成分とする、ヒトに安全かつ容易に比較的長期間に亘って投与することのできる、新規なオートファジー誘導剤とその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、安全性の高い天然素材に着目し鋭意研究を重ねた結果、環状グルコオリゴ糖が、顕著なオートファジー誘導作用を有することを新規に見出した。すなわち、本発明は、環状グルコオリゴ糖を有効成分として含んでなるオートファジー誘導剤とその用途を提供することにより、前記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のオートファジー誘導剤は、顕著なオートファジー誘導作用を有しているとともに、毒性、副作用などを実質的に懸念する必要のない、安全な天然素材である環状グルコオリゴ糖を有効成分とするものであることから、ヒトに安全かつ容易に比較的長期間に亘って投与することができ、オートファジー誘導作用を効果的に発揮することができる。ちなみに、環状グルコオリゴ糖は、実質的に甘味を有さず、かつ、生体へのエネルギー源になり難いことから、これらの特徴を活かして、甘味や生体へのエネルギー供給が望ましくないとされる用途、対象者、対象動物に対しても投与することができる新たなオートファジー誘導剤を提供できるという利点を有している。したがって、本発明のオートファジー誘導剤によれば、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状、例えば、神経変性疾患（アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病など）、肺性疾患、筋委縮疾患、筋疾患、心筋症、脳腫脹、疲労、睡眠不足、又は冷え性などを効果的に予防、治療、及び／又は緩和することができる。更に、本発明のオートファジー誘導剤を飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、滋養強壮剤などに添加、混合、又は配合することにより、ユーザが当該オートファジー誘導剤の摂取を意識することなく、これを日常生活の中でごく自然に、かつ、安全に継続的に摂取できるという利点が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ）、ラクトース、又はα,α−トレハロースによりＮＨＥＫ細胞内に発現誘導されたＬＣ３Ｂを免疫細胞化学染色法により検出し、顕微鏡用デジタルカメラで撮影した画像である。
【図２】図の上段は、環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５）又はラクトースによりＣａｃｏ−２細胞内に発現誘導されたＬＣ３Ｂ−ＩＩをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）とウエスタンブロッティングに供した後、化学発光法により検出したバンドの画像であり、下段は各バンド強度を画像解析ソフトを用いて解析し、解析されたＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を対照に対する相対値で示した図である。
【図３】環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５）又はラクトースによりＭＫＮ４５細胞内に発現誘導されたＬＣ３Ｂ−ＩＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングにより検出定量し、定量されたＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を対照に対する相対値で示した図である。
【図４】ＮＨ４Ｃｌ存在下／非存在下、環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５）によりＣａｃｏ−２細胞を免疫細胞化学染色し、顕微鏡用デジタルカメラで撮影した画像である。
【図５】ＮＨ４Ｃｌ存在下／非存在下、環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ）又はα,α−トレハロースによりＮＨＥＫ細胞内に発現誘導されたＬＣ３Ｂ−ＩＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングにより検出定量し、定量されたＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を対照に対する相対値で示した図である。
【図６】マウスに環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ）又はα,α−トレハロースを静脈内投与又は経口投与し、リソソーム阻害剤であるクロロキンを腹腔内へ投与又は投与せずに所定の時間絶食させ、腎臓組織を採取し、その抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングに供した後、化学発光法によりＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンドを検出し、検出したバンド強度を画像解析ソフトを用いて解析し、解析されたＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を対照に対する相対値で示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、有効成分として環状グルコオリゴ糖を含んでなるオートファジー誘導剤に関する。本発明で言う環状グルコオリゴ糖とは、４個以上のグルコース残基が、α−１，３結合、α−１，４結合、及び／又はα−１，６結合を介して環状に連なった構造を有する環状糖質、更には、それら環状糖質のグリコシル誘導体を意味する（以下、特に断りがない限り、これらを纏めて「環状グルコオリゴ糖」と言う。）。環状グルコオリゴ糖は、実質的に甘味を有さず、生体へのエネルギー源となり難い糖質であり、しかも、ヒトに比較的長期間に亘って安全かつ容易に投与でき、これにより、所望のオートファジー誘導作用を発揮させることができる。有効成分として使用される環状グルコオリゴ糖は、上記環状構造を有する環状グルコオリゴ糖であれば良く、当該環状構造を構成する糖の数に特段の制限はないが、オートファジー誘導作用、安全性、取り扱い性、安定性などの点から、構成糖の数が４乃至１０、好適には、４乃至６、より好適には４乃至５の環状グルコオリゴ糖が特に好ましい。ちなみに、構成糖の数が多い環状グルコオリゴ糖は、必然的に分子量が大きくなり、細胞への取り込み効率が低下する傾向にある。
【００１５】
とりわけ、本発明において好適に用いられる環状グルコオリゴ糖としては、例えば、特許第４９１９１９８号公報に開示された、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する非還元性の環状四糖（別名：シクロニゲロシルニゲロース；本願明細書においては、特に断りがない限り「ＣＮＮ」と言う。）；特許第４５６８０３５号公報に記載のサイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する非還元性の環状四糖（別名：シクロマルトシルマルトース；本願明細書においては、特に断りがない限り「ＣＭＭ」と言う。）、及び特許第４９８３２５８号公報に開示された、サイクロ｛→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→｝の構造を有する非還元性の環状五糖（別名：イソサイクロマルトペンタオース；本願明細書においては、特に断りがない限り「ＩＣＧ５」と言う。）を例示できる。なお、環状四糖及び環状五糖の安全性に関しては、特許第４９１９１９８号公報には、ＣＮＮのＬＤ５０値は５０ｇ／ｋｇマウス体重以上、特許第４５６８０３５号公報には、ＣＭＭのＬＤ５０値は５ｇ／ｋｇマウス体重以上、また特許第４９８３２５８号公報には、ＩＣＧ５のＬＤ５０値は５ｇ／ｋｇマウス体重以上であることが開示されている。このように、環状四糖及び環状五糖は、自体、安全な天然素材であり、ヒトに安全かつ容易に比較的長期間に亘って投与可能である。本発明を実施するに際し、環状四糖及び環状五糖などの環状グルコオリゴ糖は、それらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。また、本発明で用いる環状グルコオリゴ糖は、本発明のオートファジー誘導剤の形態にもよるが、必ずしも、最高純度のものに限定されることはなく、環状グルコオリゴ糖含有量が、通常、３０質量％（以下、特に断りがない限り、「質量％」は「％」と略記する。）以上、好適には５０％以上、より好適には７０％以上、更には８０％以上、更に好適には９０％以上１００％以下であるものが好適に用いられる。
【００１６】
本発明のオートファジー誘導剤は、環状グルコオリゴ糖以外に、飲食品、飼料、餌料、ペットフード、化粧品、医薬品などの分野で用いられる、賦型剤、増量剤、増粘剤、結合剤、安定剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、呈味剤、甘味剤、着色剤、食物繊維（グアガム、グアガム酵素分解物、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ペクチン、大麦βグルカン、ポリデキストロース、難消化性デキストリン、イソマルトデキストリンなど水溶性食物繊維を含む）、アミノ酸、オリゴペプチド、及び蛋白質などの１種又は２種以上の他の成分を適宜の割合で配合し、更に、必要に応じて、飲食品、飼料、餌料、ペットフード、化粧品、又は医薬品用素材の１種又は２種以上を配合して、液状、懸濁状、ペースト状、粉体状、顆粒状、球状、短棒状、板状、シート状、層状、立方体状、錠剤状、丸剤状、又はカプセル状などの各種形状の組成物に加工して用いることができる。斯かる組成物としては、食品、健康食品、保健機能食品、機能性表示食品、栄養機能食品、特定保健用食品、飼料、餌料、ペットフード、化粧品、医薬品、又は医薬部外品などの形態にあるものを例示できる。なお、前記他の成分の内、甘味剤は、本発明のオートファジー誘導剤が経口投与される形態にある場合、その甘味付与のために用いられる。この際、トレハロースは、適度の穏やかな甘味を有するとともに、オートファジー誘導作用を有していることから、本発明のオートファジー誘導剤に甘味を付与する必要がある場合、極めて好適に用いることができる。トレハロース以外の他の甘味剤の具体例としては、例えば、粉飴、水飴、異性化糖、蜂蜜、グルコース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、Ｄ−プシコース、スクロース、マルトース、オリゴ糖（ラフィノース、パノース、メレチトース、スタキオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオースなど）、糖アルコール（ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトール、マルチトール、ラクチトールなど）、メープルシュガー、グリシン、アラニン、ジヒドロカルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシド、ラカンカ甘味物、グリチルリチン、ソーマチン、サッカリン、サッカリンナトリウム、スクラロース、アセスルファムＫ、α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（別名：アスパルテーム）などを例示できる。
【００１７】
本発明のオートファジー誘導剤に含まれる環状グルコオリゴ糖の量は、環状グルコオリゴ糖を無水物換算で、オートファジー誘導剤の質量当たり、通常、０．１％以上、好適には１％以上、より好適には５％以上、更には１０％以上、更に好適には２０乃至１００％、より更に好適には３０乃至１００％、更に好適には４０乃至１００％の範囲とするのが良い。環状グルコオリゴ糖の配合量が０．１％を下回る場合には、所期の作用効果が著しく低下するか発揮できなくなる場合があるので好ましくない。一方、環状グルコオリゴ糖の配合量の上限は、オートファジー誘導剤の形態又は投与対象者（ヒト以外の温血動物全般を含む）の年齢、性別、体重、疾患、症状などに応じて適宜設定すればよい。
【００１８】
更に、本発明のオートファジー誘導剤は、従来公知のオートファジー誘導剤の１種又は２種以上と併用することにより、従来公知のオートファジー誘導剤のオートファジー誘導作用をより高めたり、その副作用を軽減したりすることもできる。従来公知のオートファジー誘導剤としては、例えば、ラパマイシン、トリン１、メトホルミン、塩化リチウム、カルバマゼピン、フルスピリレン、トリフルオペラジン、ピモジド、ニカルジピン、ペニトレムＡ、ニグルジピン、ロペラミド、アミオダロン、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、レスベラトール、スペルミジン、ビタミンＤ、ペルヘキシリン、ニクロスアミド、アミオダロン、ロットレリン、バルプロ酸ナトリウム、ベラパミル、ニモジピン、ニトレンジピン、カルパスタチン、カルペプチン、クロニジン、リルメニジン、２′，５′−ジデオキシアデノシン、ＮＦ４４９、ミノキシジル、α,α−トレハロース、α,β−トレハロース、β,β−トレハロースなどを例示できる。前記従来公知のオートファジー誘導剤は、無水物換算で、本発明のオートファジー誘導剤に、通常、０．１％以上、好適には１％以上、より好適には２乃至９０％、更には５乃至８０％更には１０乃至６０％の範囲で配合することができる。
【００１９】
本発明のオートファジー誘導剤を、液状、懸濁状、又はペースト状の形態とする場合、当該オートファジー誘導剤の有効成分である環状グルコオリゴ糖を溶解、分散、又は懸濁するための好適な溶媒としては、例えば、水、アルコール（エタノールなど）、ジメチルスルホキシドなどの１種又は２種以上の溶媒を例示できる。この際、本発明のオートファジー誘導剤のｐＨは、当該オートファジー誘導剤の有効成分である環状グルコオリゴ糖を安定に保つために、通常、ｐＨ３乃至１０、好適には、ｐＨ４乃至９、より好適にはｐＨ５乃至８の範囲とする。
【００２０】
本発明のオートファジー誘導剤は、有効成分として含まれる環状グルコオリゴ糖が、無水物換算で、通常、ヒト成人（体重６０ｋｇ）当たり、０．１乃至５０ｇ／日、好適には０．５乃至２５ｇ／日、より好適には１乃至２０ｇ／日、更には２乃至１０ｇ／日の割合でヒトに投与されるよう、通常、１日当たり１乃至３回に分けて、経口又は非経口的に投与される。投与期間は、対象者の年齢、性別、体重、疾患、症状などに応じて変動するけれども、通常、１週間以上、好適には２週間以上、より好適には３週間以上、更に好適には１乃至１２カ月間から選ばれる期間を例示することができる。
【００２１】
本発明のオートファジー誘導剤は、前記形態、用量、用法でヒトに投与したとき、顕著なオートファジー誘導作用を発揮する。すなわち、本発明のオートファジー誘導剤によれば、オートファジーの異常に起因する疾患又は症状、例えば、神経変性疾患（アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病など）、肺性疾患、筋委縮疾患、筋疾患、心筋症、脳腫脹、疲労、睡眠不足、又は冷え性などを効果的に予防、治療、及び／又は緩和することができる。更に、本発明のオートファジー誘導剤は、ヒト以外のウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜、更には、サル、ゾウ、トラ、ライオン、チータ、パンダ、レッサーパンダ、クマ、ヌートリア、コアラ、イタチ、シカ、イノシシ、イヌ、ネコ、ウサギ、キツネ、マウス、ラット、ハムスター、リスなどの温血動物全般（ニワトリなどの鳥類全般を含む）に対しても、顕著なオートファジー誘導作用を発揮する。
【００２２】
以下、実験に基づき、本発明をより詳細に説明する。
【００２３】
＜実験１：環状グルコオリゴ糖によるオートファジー誘導作用（１）＞
ヒト由来の細胞を用いた免疫細胞化学染色法により、環状グルコオリゴ糖のオートファジー誘導作用について調べた。すなわち、正常ヒト新生児包皮角化細胞株であるＮＨＥＫ細胞（製品番号：ＫＫ−４００９、クラボウ社製）を、無血清細胞培養用培地（商品名『ＥｐｉＬｉｆｅ培地』、製品番号：Ｍ−ＥＰＩ−５００−ＣＡ、ギブコ社製）に増殖因子(ＥｐｉＬｉｆｅ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＥＤＧＳ）（製品番号：Ｓ−０１２−５、ギブコ社製）を添加した培地を用いて、細胞濃度が１．０×１０５個／０．４ｍＬ／ウェルとなるように、予めタイプＩＶゼラチン（商品名『セルマトリックス  タイプ  ＩＶ』、新田ゼラチン社製）で表面を被覆しておいた、８穴プレート（商品名『Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  チャンバー』、カタログ番号：１５４５３４、ヌンク社製）の各ウェルに播種し、３７℃に設定された５％ｖ／ｖＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。次いで、各ウェル中の培地を除去した後、環状グルコオリゴ糖として、特許第４９１９１９８号公報の実験２４に開示された方法に準じて得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＮＮ）を用い、これを濃度５０ｍＭで含むＥｐｉＬｉｆｅ培地を各ウェルに添加し、４８時間培養した。次いで、培養後の細胞に−２０℃に冷却したメタノールを添加し、−２０℃の冷凍室にて１０分間冷却して細胞を固定した後、免疫細胞化学染色に供した。染色は、細胞を一次抗体（商品名『抗ＬＣ３Ｂ抗体』、ＣＳＴコード番号：２７７５、セル・シグナリング・テクノロジー社製）と４℃で一晩接触させ、次いで、蛍光標識した二次抗体（商品名『Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体』、カタログ番号：Ａ−１１０１２、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）と室温で１時間反応させ、次いで、蛍光核酸染色剤（商品名『Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２』、製品番号：８６１４０５、シグマアルドリッチ社製）で核染色し、細胞を識別し易くした後、グリセロールを濃度５０％で含有する、マグネシウム及びカルシウム不含有のリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ（−）」と言う。］を添加し、システム生物顕微鏡（商品名『ＢＸ５３Ｆ』、オリンパス社製）を用いて、前記蛍光標識した二次抗体から発せられる蛍光を顕微鏡観察するとともに、その視野内の培養細胞を顕微鏡用デジタルカメラ（商品名『ＤＰ８０』、オリンパス社製）にて撮影した。また、ＣＮＮに代えて、オートファジー誘導作用を有さないことが知られているラクトース（純度９８％、和光純薬工業社製）、又はオートファジー誘導作用を有することが知られているα,α−トレハロース（商品名『ＴＲＥＨＡＬＯＳＥ，ＥＮＤＯＴＯＸＩＮ  ＦＲＥＥ』、純度９９．０％以上、コード番号：ＴＨ２２３、株式会社林原製）を、それぞれ濃度５０ｍＭで含む培地を用いた以外は、ＣＮＮの場合と同様にして試験に供し、蛍光顕微鏡観察を行うとともに、その視野内の培養細胞を顕微鏡用デジタルカメラにて撮影した。更に、対照として、ＣＮＮ、ラクトース、及びα,α−トレハロースのいずれも含まない培地を用いる系を設け、ＣＮＮの場合と同様にして、蛍光顕微鏡観察を行うとともに、その視野内の培養細胞を顕微鏡用デジタルカメラにて撮影した。顕微鏡用デジタルカメラにて撮影した画像を図１に示す。
【００２４】
図１に示すとおり、ラクトースを含む培地中で培養したＮＨＥＫ細胞（図１の右上の画像）においては、蛍光ドットの輝度と、細胞当たりの蛍光ドット数が、対照（図１の左上の画像）とほぼ同じであったのに対し、ＣＮＮを含む培地中で培養した培養細胞（図１の左下の画像）においては、対照と比べ、蛍光ドットの輝度と、細胞当たりの蛍光ドット数が共に顕著に増加し、しかも、その増加の程度は、オートファジー誘導作用を有するα,α−トレハロースを含む培地中で培養したＮＨＥＫ細胞（図１の右下の画像）と同等以上に高レベルであった。図１に示す画像において、撮影された画像における蛍光ドットの輝度と細胞当たりの蛍光ドットの数は、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂの量を反映しているので、上記の結果は、ＮＨＥＫ細胞を用いた培養試験において、ＣＮＮが、α,α−トレハロースとほぼ同等以上のオートファジー誘導作用を有することを物語っている。
【００２５】
本実験結果から、ＣＮＮは、オートファゴソームの構成蛋白質であって、オートファジー活性化の指標である、細胞内ＬＣ３Ｂの発現量を顕著に増加させる作用を有することが判明し、ＣＮＮには、顕著なオートファゴソーム形成増強作用があることが判明した。なお、ＣＮＮによるオートファゴソーム形成増強作用についての定量的な実験データは、後述する実験５に示す。
【００２６】
＜実験２：環状グルコオリゴ糖によるオートファジー誘導作用（２）＞
ＬＣ３Ｂと同様、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂ−ＩＩを指標とし、環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５）を濃度１０ｍＭ、２５ｍＭ、又は５０ｍＭ含む培地中でヒト由来の細胞を培養し、細胞内ＬＣ３Ｂ−ＩＩを定量することにより、ＣＮＮ、ＣＭＭ、及びＩＣＧ５によるオートファジー誘導作用について調べた。本試験において、ＣＮＮは、実験１で用いたと同じものを、ＣＭＭは、特許第４５６８０３５号公報の実験１４に開示された方法に準じて得た純度９８．９％のものを、また、ＩＣＧ５は、特許第４９８３２５８号公報の実験１に開示された方法準じて得た純度９９％のものを用いた。
【００２７】
すなわち、ヒト結腸腺癌細胞株[Ｃａｃｏ−２細胞、欧州細胞培養収集機関（ＥＣＡＣＣ）、カタログ番号：８６０１０２０２］を細胞濃度が４×１０４個／０．８ｍＬ／ウェルとなるように１０％ｖ／ｖ牛胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（以下、本願明細書においては、『Ｄ−ＭＥＭ培地』と言う。）に懸濁し、この細胞懸濁液を予めタイプＩＶゼラチンで表面を被覆しておいた２４穴プレ−ト（商品名『セルカルチャー２４ウェル  マルチウェルプレート、カタログ番号：３５３０４７、ファルコン社製）に播種し、３７℃の５％ｖ／ｖＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。次いで、各ウェル中の培地を除去した後、所定濃度のＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含むＤ−ＭＥＭ培地を各ウェルに０．８ｍＬ加え、２日間培養した。次いで、各ウェルの培地を除去し、０．５ｍＬのＰＢＳ（−）にて細胞を洗浄後、ＳＤＳ緩衝溶液［５０ｍＭトリスＨＣｌ、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、及び１００ｍＭジチオスレイトールを含む溶液（ｐＨ６．８）］を１５０μＬ加え、1時間室温に保って細胞抽出処理を行った。次いで、抽出物を１００℃で５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。次いで、サンプルを、常法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、蛋白質をニトロセルロース膜（製造元コード：１２１２５９６、フナコシ社製）上へ転写した。転写後の膜を免疫実験用ブロッキング剤（商品名『ブロックエース』、ＤＳファーマバイオメディア社販売）でブロッキングした後、ＬＣ３Ｂ−ＩＩを検出するための抗体としては、『Ａｎｔｉ−ＬＣ３ｍＡｂ』（コード番号：Ｍ１８６−３、ＭＢＬライフサイエンス社製）を用い、β−アクチンを検出するための抗体としては、『抗β−アクチン抗体』（カタログ番号：ＭＡＢ１５０１、ミリポア社製）を用いた。二次抗体としてはいずれも西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇポリクローナル抗体（商品名『Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇｓ−ＨＲＰ』、商品コード：Ｐ０４４７、ダコ社製）を用いた。検出には化学発光法としてウエスタンブロッティング検出システム（商品名『ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ』、ＧＥヘルスケア社製）を用いた。バンド強度の測定は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）から提供されている画像解析ソフト『ＩｍａｇｅＪ』を用いた。また、環状グルコオリゴ糖に代えて、オートファジー誘導作用を有さないことが知られているラクトースを用い、濃度を５０ｍＭとした以外は、前記環状グルコオリゴ糖の場合と同様の試験に供した。なお、ＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンド強度を比較定量するに際し、β−アクチンは、生体内での産生量が一定で普遍的に存在する蛋白質なのでこれを内部標準とし、このβ−アクチンのバンド強度に対するＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンド強度の比に基づき、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を標準化した。また、細胞をＤ−ＭＥＭ培地中でのみ培養したときのＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を調べる系として、前記環状グルコオリゴ糖及びラクトースのいずれも含まない培地を用いる系を設け、これを対照とした。結果は図２に示す。
【００２８】
図２において、上段はウエスタンブロッティング後の化学発光法により検出されたＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンドをデジタルカメラで撮影した画像であり、中段は同じく化学発光法により検出されたβ−アクチンのバンドの画像である。図２の下段には、バンド強度を画像解析ソフトを用いて解析した結果を示しており、各被験試料毎のバンド強度を表す棒グラフは、対照におけるＬＣ３Ｂ−ＩＩ／β−アクチンの比を「１」とし、これに対する相対値で示した。ＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンド強度は、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を反映しているので、ＬＣ３Ｂ−ＩＩ／β−アクチンの比が高いほど、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量が多いことを意味している。すなわち、ラクトース（濃度５０ｍＭ）存在下で培養した培養細胞のＬＣ３Ｂ−ＩＩ発現量は約１．１であり、対照の「１」と同等であったのに対し、濃度１０乃至５０ｍＭのＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地中で培養した培養細胞のＬＣ３Ｂ−ＩＩ発現量はそれぞれ、対照の約２乃至約３倍、約２．３乃至約３．３倍、及び約１．５乃至約５．６倍増加していた。この結果は、環状グルコオリゴ糖が顕著にＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を増加させたことを示している。殊に、ＩＣＧ５は、濃度１０乃至５０ｍＭの範囲で、濃度依存的にＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を顕著に増加させた。
【００２９】
本実験結果に示されるとおり、環状グルコオリゴ糖は、オートファゴソーム形成と正の相関関係にあるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を顕著に増加させたことから、環状グルコオリゴ糖には、顕著なオートファゴソーム形成増強作用があることが確認された。
【００３０】
＜実験３：環状グルコオリゴ糖によるオートファジー誘導作用（３）＞
ヒト結腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２細胞）に代えて、ヒト胃癌細胞株（ＭＫＮ４５細胞、ＪＣＲＢ細胞バンク登録番号：ＪＣＲＢ０２５４)を細胞濃度が１．６×１０４個／０．８ｍＬ／ウェルとなるように播種した以外は実験２と同様にして、環状グルコオリゴ糖（ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５）によるオートファジー誘導作用を調べた。結果は図３に示す。なお、図３において、ウエスタンブロッティング後に化学発光法で検出したバンドの画像は割愛した。
【００３１】
図３に示すとおり、ＭＫＮ４５細胞を用いた培養試験において、ラクトース（濃度５０ｍＭ）（図３右端）を含む培地中で培養した培養細胞のＬＣ３Ｂ−ＩＩ／β−アクチンの比は約１．１であり、ラクトースのＬＣ３Ｂ−ＩＩ発現量は対照の「１」とほぼ変わらなかった。これに対し、濃度１０乃至５０ｍＭのＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地中で培養した培養細胞のＬＣ３Ｂ−ＩＩ／β−アクチンの比は、それぞれ、対照の約１．６乃至約２．１倍、約１．８乃至約２．７倍、及び約１．５乃至約２．７倍まで増加し、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５は、ＬＣ３Ｂ−ＩＩ発現量を顕著に増加させた。
【００３２】
本実験結果に示されるとおり、環状グルコオリゴ糖は、実験２で用いたＣａｃｏ−２細胞と同様、ＭＫＮ４５細胞においても、オートファゴソーム形成と正の相関関係にあるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を顕著に増加させたことから、環状グルコオリゴ糖は、細胞の種類を問わず、顕著なオートファゴソーム形成増強作用を発揮することが判明した。
【００３３】
＜実験４：環状グルコオリゴ糖によるオートファジー誘導作用（４）＞
環状グルコオリゴ糖の存在下でヒト細胞を培養したとき、オートファジックフラックスが進行しているか否かを調べるために以下の実験を行った。なお、環状グルコオリゴ糖は、前記実験２で用いたと同じ、ＣＮＮ、ＣＭＭ、及びＩＣＧ５を用いた。
【００３４】
すなわち、組織培養用タイプＩＶゼラチンで表面を予め被覆しておいた８穴プレート（商品名『Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  チャンバー』、カタログ番号：１５４５３４、ヌンク社製）に前記培地を入れ、これにヒト細胞として、Ｃａｃｏ−２細胞をその濃度が４×１０４個／０．４ｍＬ／ウェルとなるように播種し、３７℃の５％ｖ／ｖＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。次いで、各ウェル中の培地を除去した後、新たな培地として、（ア）前記３種類の環状グルコオリゴ糖のいずれかを２５ｍＭ含むＤ−ＭＥＭ培地、（イ）前記３種類の環状グルコオリゴ糖のいずれかを２５ｍＭ含むとともに、リソソーム阻害剤であるＮＨ４Ｃｌを１０ｍＭ含むＤ−ＭＥＭ培地、（ウ）Ｄ−ＭＥＭ培地のみからなる培地、又は（エ）前記３種類の環状グルコオリゴ糖のいずれも含まず、ＮＨ４Ｃｌを１０ｍＭ含むＤ−ＭＥＭ培地のいずれかと交換し、更に４８時間培養し、培養後の細胞を実験１と同様の手法で免疫細胞化学染色に供し、ＬＣ３Ｂの発現を蛍光顕微鏡観察するとともに、視野内の培養細胞を顕微鏡用デジタルカメラにて撮影した。なお、前記（ウ）又は（エ）の培地を用いる系をそれぞれ、「対照１」、「対照２」とした。上記顕微鏡用デジタルカメラにて撮影した画像を図４に示す。
【００３５】
図４の上段の画像Ａ１乃至Ａ４は、左から順に、ＮＨ４Ｃｌ非存在下で、Ｃａｃｏ−２細胞をＣＮＮ、ＣＭＭ、及びＩＣＧ５の何れも含まない培地中で培養した系（対照１：Ａ１）、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地中で培養した系（それぞれ、Ａ２、Ａ３、及びＡ４）における培養細胞を顕微鏡用デジタルカメラで撮影したものである。これら４枚の画像に見られるとおり、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地で培養した培養細胞（Ａ２乃至Ａ４）は、それらのいずれも含まない培地で培養された培養細胞（対照１：Ａ１）と比べ、蛍光ドットの輝度が顕著に増大していたとともに、細胞当たりの蛍光ドット数も顕著に増加していた。これは、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂの発現量が顕著に増加していたことを示している。
【００３６】
一方、図４下段の画像Ｂ１乃至Ｂ４は、左から順に、ＮＨ４Ｃｌ存在下、Ｃａｃｏ−２細胞をＣＮＮ、ＣＭＭ、及びＩＣＧ５の何れも含まない培地中で培養した系（対照２：Ｂ１）、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地中で培養した系（それぞれ、Ｂ２、Ｂ３、及びＢ４）における培養細胞を顕微鏡用デジタルカメラで撮影したものである。これら４枚の画像に見られるとおり、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地で培養した培養細胞（Ｂ２乃至Ｂ４）は、それらのいずれも含まない培地で培養した培養細胞（対照２：Ｂ１）と比べ、蛍光ドットの輝度が顕著に増大し、細胞当たりのドット数も顕著に増加していた。
【００３７】
ＮＨ４Ｃｌ非存在下で、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地中で培養した培養細胞を撮影した図４の上段に示す画像Ａ２乃至Ａ４と、ＮＨ４Ｃｌ存在下で、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地中で培養した培養細胞を撮影した図４の下段に示す画像Ｂ２乃至Ｂ４とを比較すると、蛍光ドットの輝度及び細胞当たりの蛍光ドット数のいずれにおいても、Ａ２と比べＢ２の方が、Ａ３と比べＢ３の方が、また、Ａ４と比べＢ４の方が顕著に増加していた。これは、ＮＨ４Ｃｌ存在下では、ＮＨ４Ｃｌ非存在下の場合より、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂの量が顕著に増加していたことを示している。ここで、オートファジックフラックスが進行している場合には、ＮＨ４Ｃｌ非存在下で培養した培養細胞と比べ、ＮＨ４Ｃｌ存在下で培養した培養細胞におけるＬＣ３Ｂの量が増加するので、ＣＮＮ、ＣＭＭ、又はＩＣＧ５を含む培地中で培養した培養細胞においては、オートファジックフラックスが進行していたことが確認された。
【００３８】
本実験結果によれば、実験１と同様、環状グルコオリゴ糖が、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂの量を顕著に増加させることが確認されたとともに、その作用は、オートファジックフラックス進行下での作用であることが確認された。
【００３９】
＜実験５：環状グルコオリゴ糖によるオートファジー誘導作用（５）＞
本実験においては、実験４で確認された、オートファジックフラックス進行下での環状グルコオリゴ糖によるオートファジー誘導作用について、ＬＣ３Ｂの膜結合型蛋白質であるＬＣ３Ｂ−ＩＩを指標にして、定量的に調べた。すなわち、ＥｐｉＬｉｆｅ培地に増殖因子［ＥｐｉＬｉｆｅ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＥＤＧＳ）］を添加した培地を用いて、ＮＨＥＫ細胞を細胞濃度が１．０×１０５個／１．５ｍＬ／ウェルとなるように、予めタイプＩＶゼラチンで表面を被覆しておいた１２穴プレ−ト（商品名『１２ウェルマルチプルウェルプレート』、製品番号：３５１３、コースター社製）の各ウェルに播種し、３７℃の５％ｖ／ｖＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。次いで、各ウェル中の培地を除去し、濃度１０ｍＭのＮＨ４Ｃｌの存在下、前記実験１で用いたと同じＣＮＮ又はα,α−トレハロースを濃度５０ｍＭで含む培地を各ウェルに１．２ｍＬずつ加えた。なお、ＮＨ４Ｃｌは、リソソーム阻害剤として用いた。細胞を３７℃の５％ｖ／ｖＣＯ２インキュベーター内で２日間培養した後、各ウェル中の培地を除去し、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、ＳＤＳサンプルバッファー溶液を各ウェル当たり３００μＬ加え、実験２と同様にして細胞抽出処理を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを調製し、実験２と同様にして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングに供し、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を対照に対する相対値で求めた。対照として、ＮＨ４Ｃｌ、ＣＮＮ、及びα,α−トレハロースのいずれも含まない培地を用いる系を設けた。結果は、図５に示す。
【００４０】
図５に示すとおり、ＮＨＥＫ細胞を用いた培養試験において、ＮＨ４Ｃｌ非存在下、ＣＮＮのＬＣ３Ｂ−ＩＩ／β−アクチンの比は約１０であり、対照の「１」に対し約１０倍増加し、ＣＮＮは、細胞のＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を約１０倍増加させた。一方、ＮＨ４Ｃｌ存在下、ＣＮＮのＬＣ３Ｂ−ＩＩ／β−アクチンの比は約２１であり、ＣＮＮによるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量は、ＮＨ４Ｃｌ非存在下の場合と比べ、約２倍以上も高い値を示した。
【００４１】
これらの結果から、ＣＮＮを含む培地中で培養した培養細胞においては、オートファジックフラックスが進行していたことが確認された。なお、既述したとおり、オートファジックフラックスが進行している場合には、ＮＨ４Ｃｌ非存在下で培養した培養細胞と比べ、ＮＨ４Ｃｌ存在下で培養した培養細胞におけるＬＣ３Ｂ−ＩＩの量は増加するので、前記結果は、ＣＮＮを含む培地中で培養した培養細胞においては、オートファジックフラックスが進行していたことを示している。また、ＣＮＮによるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量及びオートファジックフラックスの進行の程度に関し、培養細胞試験において、ＮＨ４Ｃｌの存在下、非存在下に拘わらず、ＣＮＮによるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量は、陽性対照のα,α−トレハロースのそれとほぼ同等以上に高レベルであったことから、ＣＮＮには顕著なオートファゴソーム形成増強作用があることが再確認された。
【００４２】
本実験結果から、ＣＮＮによるオートファジー誘導作用は、オートファジックフラックス進行下での作用であることが確認された。
【００４３】
＜実験６：環状グルコオリゴ糖によるオートファジー誘導作用（６）＞
実験１乃至５において、ＣＮＮが、顕著なオートファジー誘導作用を有することを培養細胞試験（生体外試験）により確認した。引き続き、本実験においては、実験動物を用いる生体内試験により、ＣＮＮによるオートファジー誘導作用について、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂ−ＩＩを指標にして調べた。なお、本実験において、ＣＮＮは前記実験１で用いたと同じものを用いた。
【００４４】
実験動物として、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（日本クレア社より購入）４０匹を無作為に５匹ずつ８群［対照１、対照２、及びＡ乃至Ｆ群（表１参照）］に分けた。Ａ群及びＤ群の各マウスにはＣＮＮを静脈内投与し、Ｂ群及びＥ群の各マウスにはＣＮＮを経口投与し、Ｃ群及びＦ群の各マウスには後述するα,α−トレハロースを経口投与した。対照１及び対照２の各マウスには、ＣＮＮ又はα,α−トレハロースに代えて、生理食塩水を経口投与した。ＣＮＮのマウスへの経口投与は、ＣＮＮを３０％水溶液となるように精製水に溶解し、胃ゾンデを用いて、ＣＮＮの投与量が無水物換算で３ｇ／ｋｇマウス体重の割合となるように強制的に経口投与した。一方、ＣＮＮを静脈内投与するに際しては、ＣＮＮを注射用水に１５％水溶液となるように溶解し、注射器を用いて、ＣＮＮの投与量が無水物換算で１ｇ／ｋｇマウス体重の割合となるように尾静脈内投与した。また、オートファジー誘導作用を有することが知られている、陽性対照としてのα,α−トレハロースは、注射剤用の低エンドトキシンタイプのα,α−トレハロース（商品名『トレハロースＳＧ』、ロット番号：６Ｄ１１、株式会社林原製）を３０％水溶液となるように精製水に溶解し、α,α−トレハロースの投与量が無水物換算で３ｇ／ｋｇマウス体重の割合となるように、ＣＮＮの場合と同様にして経口投与した。一方、対照１及びＡ乃至Ｃ群の各マウスに対しては、生理食塩水を１０ｍＬ／ｋｇマウス体重の割合で腹腔内投与するとともに、対照２及びＤ乃至Ｆ群の各マウスには、リソソーム阻害剤であるクロロキン（和光純薬工業株式会社販売）（予め生理食塩水に濃度１２ｍｇ／ｍＬとなるように溶解しておいたもの）を１２０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇマウス体重の割合で腹腔内投与した。各群のマウスは、生理食塩水又はクロロキンを腹腔内投与後、絶食とし、各被験物質（生理食塩水、ＣＮＮ、又はα,α−トレハロース）を投与してから６時間後、常法に従って深麻酔下で各群マウスの腎臓の一部を採取し、それら腎臓組織サンプルを液体窒素を用いて瞬間凍結し、ウエスタンブロッティング解析に供するまで−８０℃で保存した。また、上記とは別に、各群マウスの腎臓組織サンプルを常法にしたがってホルマリン固定し、組織学的評価に供するまで室温にて保管した。
【００４５】
【表１】
2018173653.tif 000003
【００４６】
＜ウエスタンブロッティング解析＞
対照１、対照２、及びＡ乃至Ｆ群の各マウスの腎臓組織サンプルそれぞれにつき、腎臓組織重量の３乃至１０倍量のＲＩＰＡ緩衝液（製造元コード：１８８−０２４５３、和光純薬工業社製）と前記ＲＩＰＡ緩衝液の１／１００量のプロテアーゼ阻害剤カクテル（商品コード：２５９５５−１１、ナカライテスク社販売)の混合液を加えてホモジネートし、３０分間氷冷した後、４℃下、１０，０００ｐｒｍで２０分間遠心分離し、上清を回収し、上清中の総蛋白質量を『ＰｉｅｒｃｅＴＭ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ』（カタログ番号：２３２２７、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて定量した。別途、対照１、対照２、及びＡ乃至Ｆ群の各マウスの腎臓組織サンプルそれぞれに、ＳＤＳサンプルバッファー［２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）５０ｍＭ含有６２．５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）］を加えて細胞抽出液を得、各サンプルをそれぞれ、常法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、蛋白質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上へ転写した。転写後の膜を免疫実験用ブロッキング剤（商品名『ブロックエース』、ＤＳファーマバイオメディカル社販売）でブロッキングした後、ＬＣ３Ｂ−ＩＩを下記表２に示す一次抗体、二次抗体、及びウェスタンブロッティング検出システム（商品名『ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ』、ＧＥヘルスケア社製）と反応させ、化学発光用フィルム（商品名『Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ』、ＧＥヘルスケア社製)により前記ＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンドを検出した。次いで、実験２と同様にして、各検出バンドを画像解析ソフト『ＩｍａｇｅＪ』を用いて解析し、対照１又は対照２におけるＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンド強度を「１」とし、これに対する相対値を求めた。なお、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量をバンド強度に基づいて比較定量するに際し、実験２と同様、内部標準としてβ−アクチンを用い、そのバンド強度に対するＬＣ３Ｂ−ＩＩのバンド強度の比に基づいてＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を標準化した。結果は、図６に示す。
【００４７】
【表２】
2018173653.tif 000004
【００４８】
図６から明らかなとおり、ＣＮＮをマウスに経口投与したとき、クロロキン投与の有無に拘わらず、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量が有意に増加した（Ｂ群、Ｅ群参照）。同様に、ＣＮＮをマウスに静脈内投与したときにも、クロロキン投与の有無に拘わらず、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量が顕著に増加又は有意に増加した（Ａ群、Ｄ群参照）。また、ＣＮＮをマウスに経口投与したときのＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量（Ｂ群、Ｅ群参照）は、オートファジー誘導作用を有することが知られている、陽性対照としてのα,α−トレハロースによるＬＣ３Ｂ−ＩＩ発現量（Ｃ群、Ｆ群参照）とほぼ同等であった。
【００４９】
これらの結果から、ＣＮＮは、生体に投与したとき、顕著なオートファジー誘導作用を発揮することが判明した。しかも、Ｂ群とＣ群との対比、及びＥ群とＦ群との対比から、ＣＮＮのオートファジー誘導作用は、クロロキン投与の有無に拘わらず、オートファジー誘導作用を有することが知られているα,α−トレハロースのそれと同程度に強いことも判明した。また、ＣＮＮによる生体内でのオートファジー誘導作用は、リソソーム阻害剤であるクロロキンを投与した場合、対照と比べ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量が有意に高レベルであり、かつ、クロロキンを投与しなかった場合と比べ、ＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量が顕著ないしは有意に増加したことから、ＣＮＮによるオートファジー誘導作用は、オートファジックフラックス進行下での作用であることが確認された。また、ＣＮＮは、その投与経路にかかわらず、陽性対照としてのα,α−トレハロースを経口投与した場合と同程度のＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を示したことから、ＣＮＮは、α,α−トレハロースと同程度に強いオートファジー誘導作用を有していることが判明した。
【００５０】
本実験結果から、環状グルコオリゴ糖がマウスの腎臓組織に作用し、顕著なオートファジー誘導作用を発揮することが確認されたことから、環状グルコオリゴ糖は、生体内の各種臓器、器官、組織などにおける細胞において、顕著なオートファジー誘導作用を発揮すると結論される。
【００５１】
前記実験１乃至６の結果を要約すると、下記（１）乃至（６）に示すとおりのものである。
（１）環状グルコオリゴ糖は、ＮＨＥＫ細胞において、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂの発現量を顕著に増加させた。
（２）環状グルコオリゴ糖は、Ｃａｃｏ−２細胞において、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を顕著に増加させた。
（３）環状グルコオリゴ糖は、ＭＫＮ４５細胞において、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を顕著に増加させた。
（４）環状グルコオリゴ糖は、Ｃａｃｏ−２細胞において、リソソーム阻害剤であるＮＨ４Ｃｌ存在下／非存在下で、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂの発現量を顕著に増加させ、その際、オートファジックフラックスが進行していた。
（５）環状グルコオリゴ糖は、ＮＨＥＫ細胞において、リソソーム阻害剤であるＮＨ４Ｃｌ存在下でオートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を顕著に増加させ、その際、オートファジックフラックスが進行していた。
（６）環状グルコオリゴ糖は、実験動物を用いた生体内試験において、オートファジー活性化の指標であるＬＣ３Ｂ−ＩＩの発現量を有意ないしは顕著に増加させた。また、ＣＮＮによるオートファジー誘導作用は、オートファジックフラックス進行下での作用であり、しかも、その作用は、オートファジー誘導作用を有することが知られているα,α−トレハロースと同程度に強い作用であった。
【００５２】
以上述べたとおり、環状グルコオリゴ糖は、顕著なオートファジー誘導作用を有していることから、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状を予防、治療、及び／又は緩和するためのオートファジー誘導剤の有効成分として極めて有用である。しかも、環状グルコオリゴ糖は、自体、毒性、副作用などを実質的に懸念することのない安全な天然素材であることから、当該環状グルコオリゴ糖を有効成分とするオートファジー誘導剤は、安心して安全かつ容易に比較的長期間に亘って投与することができるので、ヒトを含む温血動物において所期の作用効果を効果的に発揮できる優れた利点を有している。
【００５３】
以下、実施例に基づき、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００５４】
＜オートファジー誘導剤＞
無水物換算で、特許第４９１９１９８号公報の実験２４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＮＮ）、特許第４５６８０３５号公報の実験１４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＭＭ）、又は特許第４９８３２５８号公報の実験１に開示された方法で得た粉末状の環状五糖（純度９９％のＩＣＧ５）を２００質量部と、ショ糖脂肪酸エステル１質量部とを均一に混合し、得られた３種類の混合物をそれぞれ、顆粒成形機にかけ、常法に従って、１ｇずつ分包し、３種類の本発明の顆粒状のオートファジー誘導剤を得た。本品は、顕著なオートファジー誘導作用を発揮することから、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状の予防、治療、及び／又は緩和に有利に用いることができる。また、本品は、室温保存下、１年以上もの比較的長期間に亘って、変質劣化の懸念も無く、安定である。
【実施例２】
【００５５】
＜オートファジー誘導剤＞
無水物換算で、特許第４５６８０３５号公報の実験１４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＭＭ）１ｇを精製水１０ｍＬに溶解し、常法に従って、精密ろ過し、無菌的に１００ｍＬ容滅菌容器に充填し、本発明の液状のオートファジー誘導剤を得た。本品は、顕著なオートファジー誘導作用を発揮することから、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状の予防、治療、及び／又は緩和に有利に用いることができる。また、本品は、室温保存下、１年以上もの比較的長期間に亘って、変質劣化の懸念も無く、安定である。
【実施例３】
【００５６】
＜オートファジー誘導剤＞
無水物換算で、特許第４５６８０３５号公報の実験１４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＭＭ）１質量部と、α,α−トレハロース含水結晶（登録商標『トレハ』、株式会社林原製）０．５質量部とを均一に混合し、常法に従って、打錠成形機にかけ、１錠２５０ｍｇの本発明の錠剤状のオートファジー誘導剤を得た。本品は、ＣＭＭとα,α−トレハロースの作用とが相俟って、それら単独の場合と比べより顕著なオートファジー誘導作用を発揮することから、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状の予防、治療、及び／又は緩和に有利に用いることができる。また、本品は、適度の甘味を有するので、口当たりが良く、室温保存下、１年以上もの比較的長期間に亘って、変質劣化の懸念も無く、安定である。
【実施例４】
【００５７】
＜オートファジー誘導剤＞
無水物換算で、特許第４９１９１９８号公報の実験２４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＮＮ）１質量部と、特許第４５６８０３５号公報の実験１４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＭＭ）１質量部と、増粘安定剤（商品名『プルラン』、株式会社林原製）０．１質量部とを均一に混合し、打錠成形機にかけ、１錠３００ｍｇの本発明の錠剤状のオートファジー誘導剤を得た。本品は、顕著なオートファジー誘導作用を発揮することから、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状の予防、治療、及び／又は緩和に有利に用いることができる。また、本品は、室温保存下、１年以上もの比較的長期間に亘り、変質劣化の懸念が無く、安定である。
【実施例５】
【００５８】
＜オートファジー誘導剤＞
無水物換算で、特許第４５６８０３５号公報の実験１４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＭＭ）１質量部と、特許第４９８３２５８号公報の実験１に開示された方法で得た粉末状の環状五糖（純度９９％のＩＣＧ５）を１質量部とを均一に混合し、一袋当たり５ｇ含むように容器に充填し、本発明の粉末状のオートファジー誘導剤を得た。本品は、顕著なオートファジー誘導作用を発揮することから、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状の予防、治療、及び／又は緩和に有利に用いることができる。また、本品は、口当たりが良く、これをそのまま、或いは水などに溶解し、容易に経口摂取できる。更に、本品は、室温下で１年以上もの比較的長期間に亘って、変質劣化の懸念も無く、安定である。
【実施例６】
【００５９】
＜オートファジー誘導剤＞
無水物換算で、特許第４９１９１９８号公報の実験２４に開示された方法で得た結晶状粉末の環状四糖（純度９９．９％のＣＮＮ）２質量部と、特許第４９８３２５８号公報の実験１に開示された方法で得た粉末状の環状五糖（純度９９％のＩＣＧ５）を１質量部とを０．０５Ｍリン酸緩衝生理食塩水７質量部に溶解し、常法によりｐＨを７．２に調整後、膜濾過し、除菌し、無菌的に５ｍＬずつアンプルに封入して、本発明のパイロジェンフリーの注射用オートファジー誘導剤を得た。本品は、顕著なオートファジー誘導作用を発揮することから、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状の予防、治療、及び／又は緩和に有利に用いることができる。また、本品は、室温保存下、１年以上もの比較的長期間に亘って、変質劣化の懸念も無く、安定である。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
以上述べたとおり、本発明のオートファジー誘導剤は、顕著なオートファジー誘導作用を有するとともに、毒性、副作用を実質的に懸念することなく、ヒトを含む温血動物全般に対して、安全かつ容易に比較的長期間に亘って投与することができる。したがって、本発明のオートファジー誘導剤をヒトに適用する場合、オートファジーの異常に起因する各種疾患又は症状、例えば、神経変性疾患（アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病など）、肺性疾患、筋委縮疾患、筋疾患、心筋症、脳腫脹、疲労、睡眠不足、又は冷え性などの疾患又は症状を効果的に予防、治療、及び／又は緩和することができる。本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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