(57)【要約】  ナノ粒子と、前記ナノ粒子の表面に結合した分散性向上基と、前記ナノ粒子の表面に結合した、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、を含む修飾ナノ粒子、並びに、該修飾ナノ粒子を含む、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を検出するための試薬。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子と、
前記ナノ粒子の表面に結合した分散性向上基と、
前記ナノ粒子の表面に結合した、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、
を含む、修飾ナノ粒子。
【請求項２】
前記ナノ粒子が、金属ナノ粒子又はポリマーナノ粒子である、請求項１に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子の数平均粒子径が５ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項１又は請求項２に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項４】
前記オリゴ糖がインフルエンザウイルスを選択的に捕捉する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項５】
前記オリゴ糖が特定の種類のインフルエンザウイルスを選択的に捕捉する、請求項４に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項６】
前記分散性向上基が、末端にスルホベタイン基、カルボキシベタイン基又はホスホベタイン基を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子と、水性媒体と、を含む分散液。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子又は請求項７に記載の分散液と、抵抗パルスセンシング用有孔膜と、を含む、抵抗パルスセンシング用セット。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子又は請求項７に記載の分散液と、抵抗パルスセンシング装置と、を含む、特定のウイルス又は細菌の検出用セット。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子を含む、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を検出するための試薬。
【請求項１１】
粒子径分布における粒子径ピークのシフトの有無を基に前記特定のウイルス又は細菌を検出するための、請求項１０に記載の試薬。
【請求項１２】
（ａ）生物学的液体サンプル中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
（ｂ）前記生物学的液体サンプルを請求項１０又は請求項１１に記載の試薬と混合して混合液を得る工程、及び
（ｃ）前記混合液中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
を含み、前記ウイルス又は細菌に対応する粒子径範囲において、前記工程（ａ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置よりも前記工程（ｃ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置の方が大粒子径側にシフトしているピークが存在する場合に、前記生物学的液体サンプルは前記ウイルス又は細菌を含むと判定する、ウイルス又は細菌の検出方法。
【請求項１３】
前記工程（ａ）において、抵抗パルスセンシングによる測定の前に前記生物学的液体サンプルは前記オリゴ糖を表面に有しないナノ粒子と混合される、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）のうち少なくとも一方において、前記生物学的液体サンプルは水性媒体と混合される、請求項１２又は請求項１３に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、修飾ナノ粒子、該修飾ナノ粒子を含む分散液、抵抗パルスセンシング用セット、ウイルス又は細菌の検出用セット及び試薬、並びにウイルス又は細菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症は社会的な問題であり、その克服には、感染したか否かの迅速な判断が要求される。
ウイルスや細菌に感染したか否かを迅速にモニタリングする方法として、バイオセンサを用いる方法がある。バイオセンサには、より高感度でかつ多くの種類のウイルス又は細菌等を容易にモニタリングする能力が求められる。【０００３】
インフルエンザウイルスを検出する方法として、特開２０１４−０９５７２０号公報はインフルエンザウイルスＨ５亜型のヘマグルチニン蛋白に対する抗体を用いる免疫測定法からなるインフルエンザウイルスＨ５亜型の検出法を記載している。
一方、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを検出する手段として電界効果型トランジスタのゲート絶縁膜に、オリゴ糖を固定化したデバイスを用いた検出方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，８５，５６４１−５６４４）も報告されている。【０００４】
特開２０１４−１６９９６４号公報は、細菌またはウイルス由来のタンパク質若しくは生物毒素に特異的に結合する糖鎖を有する糖鎖含有化合物が、金ナノ粒子を表面に固定した基板表面に固定されているセンサーチップの作製方法を記載している。特開２０１１−２０９２８２号公報は、糖鎖とリンカー化合物とを結合させたリガンド複合体を、加熱処理した蛍光性ナノ粒子と結合させて、糖鎖を固定化した蛍光性ナノ粒子を得る、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法を記載している。【０００５】
粒子を用いて物質を検出する検討も行われている。特開２０１６−１２６００３号公報、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  （２０１６），ｖｏｌ．１０８，ｐ．１２３７０１−１  −  １２３７０１−５、ｓｍａｌｌ  ２００６，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ，ｖｏｌ．２，Ｎｏ．８−９，ｐ．９６７−９７２は、抗体で修飾された粒子が貫通孔に通過するときの電流の変化を観測して、検体中の測定対象物質の存在を検出することを記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ウイルスや細菌には、宿主の細胞表面に存在するオリゴ糖を特異的に認識して感染するものが存在することが知られている。本発明者らは、このオリゴ糖及び分散性向上基が表面に結合した修飾ナノ粒子を用いれば、前記オリゴ糖を介してナノ粒子を特異的に所望のウイルス又は細菌に付着させることができることを見いだした。また、当該修飾ナノ粒子の付着によるウイルス又は細菌のサイズ変化を抵抗パルスセンシングにより検出することで、標的となるウイルス又は細菌を選択的に検出できることを見いだした。【０００７】
本開示は上記の知見を基になされたものであり、ウイルス又は細菌に選択的に付着できる修飾ナノ粒子、該修飾ナノ粒子を含む分散液、該修飾ナノ粒子又は分散液を含む抵抗パルスセンシング用セット及び特定ウイルス又は細菌の検出用セット、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を選択的且つ高感度に検出できる試薬、並びに該試薬を用いたウイルス又は細菌の検出方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示に係る態様には、下記の＜１＞〜＜１４＞が含まれる。【０００９】
＜１＞
ナノ粒子と、
前記ナノ粒子の表面に結合した分散性向上基と、
前記ナノ粒子の表面に結合した、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、
を含む、修飾ナノ粒子。
＜２＞
前記ナノ粒子が、金属ナノ粒子又はポリマーナノ粒子である、＜１＞に記載の修飾ナノ粒子。
＜３＞
前記ナノ粒子の数平均粒子径が５ｎｍ〜１００ｎｍである、＜１＞又は＜２＞に記載の修飾ナノ粒子。
＜４＞
前記オリゴ糖がインフルエンザウイルスを選択的に捕捉する、＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の修飾ナノ粒子。
＜５＞
前記オリゴ糖が特定の種類のインフルエンザウイルスを選択的に捕捉する、＜４＞に記載の修飾ナノ粒子。
＜６＞
前記分散性向上基が、末端にスルホベタイン基、カルボキシベタイン基又はホスホベタイン基を有する、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の修飾ナノ粒子。【００１０】
＜７＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の修飾ナノ粒子と、水性媒体と、を含む分散液。【００１１】
＜８＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の修飾ナノ粒子又は＜７＞に記載の分散液と、抵抗パルスセンシング用有孔膜と、を含む、抵抗パルスセンシング用セット。【００１２】
＜９＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の修飾ナノ粒子又は＜７＞に記載の分散液と、抵抗パルスセンシング装置と、を含む、特定のウイルス又は細菌の検出用セット。【００１３】
＜１０＞
＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の修飾ナノ粒子を含む、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を検出するための試薬。
＜１１＞
粒子径分布における粒子径ピークのシフトの有無を基に前記特定のウイルス又は細菌を検出するための、＜１０＞に記載の試薬。【００１４】
＜１２＞
（ａ）生物学的液体サンプル中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
（ｂ）前記生物学的液体サンプルを＜１０＞又は＜１１＞に記載の試薬と混合して混合液を得る工程、及び
（ｃ）前記混合液中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
を含み、前記ウイルス又は細菌に対応する粒子径範囲において、前記工程（ａ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置よりも前記工程（ｃ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置の方が大粒子径側にシフトしているピークが存在する場合に、前記生物学的液体サンプルは前記ウイルス又は細菌を含むと判定する、ウイルス又は細菌の検出方法。【００１５】
＜１３＞
前記工程（ａ）において、抵抗パルスセンシングによる測定の前に前記生物学的液体サンプルは前記オリゴ糖を表面に有しないナノ粒子と混合される、＜１２＞に記載の検出方法。
＜１４＞
前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）のうち少なくとも一方において、前記生物学的液体サンプルは水性媒体と混合される、＜１２＞又は＜１３＞に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１６】
本開示に係る態様によれば、ウイルス又は細菌に選択的に付着できる修飾ナノ粒子、該修飾ナノ粒子を含む分散液、該修飾ナノ粒子又は分散液を含む抵抗パルスセンシング用セット及び特定ウイルス又は細菌の検出用セット、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を選択的且つ高感度に検出できる試薬、並びに該試薬を用いたウイルス又は細菌の検出方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】ウイルス粒子を含むサンプルを抵抗パルスセンシングにより測定している状態を示す概念図である。
【図１Ｂ】特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖を表面に有するナノ粒子（分子認識ナノ粒子）が付着したウイルス粒子を抵抗パルスセンシングにより測定している状態を示す概念図である。
【図１Ｃ】分子認識前後での粒子径ピークの移動（シフト）を示す図である。
【図２】テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸からの６’ＳＬＮ−ＧＮＰの調製を示す工程図である。
【図３Ａ】ウイルス溶液の抵抗パルスセンシング測定結果の、粒径及び持続時間についての散布図である。
【図３Ｂ】ウイルス溶液に６’ＳＬＮ−ＧＮＰを混合した場合の抵抗パルスセンシング測定結果の、粒径及び持続時間についての散布図である。
【図３Ｃ】ウイルス溶液に３’ＳＬＮ−ＧＮＰを混合した場合の抵抗パルスセンシング測定結果の、粒径及び持続時間についての散布図である。
【図４】図３Ａ〜３Ｃの散布図を変換して得られた、粒径毎の粒子数のヒストグラムである。縦軸は粒子数の相対値（最大値を基に規格化）を表す。
【図５】図３Ａ〜３Ｃの散布図を変換して得られた、持続時間（電気抵抗増大ピークの持続時間）毎の粒子数のヒストグラムである。縦軸は粒子数の相対値（最大値を基に規格化）を表す。
【図６】ナノ粒子溶液を回転エバポレーターを用いて濃縮した場合の凝集の有無を示す実験結果である。図中の％は使用したＭＵＡとＳＢ−ＳＨのモル比を表す。
【図７】Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型についての分子認識実験の結果を示す、粒径（横軸）−粒子数の相対値（縦軸：最大値を基に規格化）のヒストグラムである。
【図８】インフルエンザウイルスの抵抗パルスセンシングによる測定の際に得られた粒径（横軸）−粒子数の相対値（縦軸：最大値を基に規格化）のヒストグラムの波形分離を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本開示に係る種々の実施形態について、本開示において用いられる成分や工程を説明しながら、具体的に説明する。
【００１９】
本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても当該工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００２０】
本開示によれば、ウイルス又は細菌に選択的に付着できる修飾ナノ粒子、該修飾ナノ粒子を含む分散液、該修飾ナノ粒子又は分散液を含む抵抗パルスセンシング用セット及び特定ウイルス又は細菌の検出用セット、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を選択的且つ高感度に検出できる試薬、並びに該試薬を用いたウイルス又は細菌の検出方法が提供される。以下、本開示に係る実施形態について具体的に説明する。
【００２１】
＜修飾ナノ粒子＞
本開示に係る修飾ナノ粒子は、ナノ粒子と、前記ナノ粒子の表面に結合した分散性向上基と、前記ナノ粒子の表面に結合した、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、を含む。
【００２２】
本開示に係る修飾ナノ粒子は、特定のウイルス又は細菌に高度に選択的に付着することができる。これは、以下のような理由によるものと推定される。
本開示に係る修飾ナノ粒子においては、ナノ粒子の表面に特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖が結合している。特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖が表面に結合しているナノ粒子は、特定のウイルス又は細菌（以下、検出対象物とも呼ぶ）に選択的に付着する。しかし、実際には、検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖のみを表面に有するナノ粒子を用いた場合には、検出対象物以外の夾雑物、特に検出対象物と類似の構造を有する構造、にもナノ粒子は付着し、付着の選択性が低下することを本発明者等は見いだした。これは、ナノ粒子の分散安定性が十分でないためと考えられる。本開示に係る修飾ナノ粒子においては、ナノ粒子表面に検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖だけではなく、分散性向上基も結合しているため、得られたナノ粒子（修飾ナノ粒子）の夾雑物への付着は抑制され、検出対象物に対する修飾ナノ粒子のさらに高度に選択的な付着を達成することができることを見いだした。これは、修飾ナノ粒子の分散安定性の向上によるものであると考えられる。
【００２３】
このように、本開示に係る修飾ナノ粒子は、検出対象物となる特定のウイルス又は細菌に選択的に付着できる。このため、この修飾ナノ粒子の付着やその量を検出することで、検出対象物の存在の検出や量の測定を行うことが可能である。
【００２４】
（ナノ粒子）
本開示に係る修飾ナノ粒子に用いられるナノ粒子は、平均粒子径が１μｍ未満の粒子であればよく、平均粒子径が５００ｎｍ以下の粒子であることが好ましい。ここで、ナノ粒子の平均粒子径とは、透過型電子顕微鏡で１００個の粒子を観察した際に得られた各粒子の最大径の数平均値（数平均粒子径）を意味する。測定のための透過型電子顕微鏡は、例えば日本電子株式会社製ＪＥＭ−２１００Ｐである。
粒子の平均粒子径が１μｍ以上（マイクロ粒子）であると、粒子のサイズに比して検出対象物との接触部分の面積の比率が小さくなり、検出対象物への付着が不安定となりやすい。ナノ粒子の平均粒子径の下限は、例えば５ｎｍであってもよい。ナノ粒子の粒子径が小さすぎると、当該ナノ粒子から作製された修飾ナノ粒子が検出対象物に付着しても、検出対象物とその表面に付着した修飾ナノ粒子の複合体（以下、検出対象物−修飾ナノ粒子複合体と呼ぶ場合がある）のサイズは検出対象物自体のサイズと比べて大きくは増加せず、サイズの変化に基づいて付着を検出する手法を用いた場合に検出が困難となる傾向がある。
【００２５】
ナノ粒子の平均粒子径は、例えば、５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲内であってもよく、５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であってもよく、１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であってもよく、１５ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内であってもよい。適切なナノ粒子の大きさは、検出対象物のサイズや形状等を考慮して設定することができる。ナノ粒子の平均粒子径は、例えば、検出対象物の最大長さの１％〜８０％でもよく、５％〜５０％でもよく、１０％〜３０％であってもよい。ナノ粒子の平均粒子径がこのような範囲内にあると、ナノ粒子の検出対象物への安定な付着を可能としつつ、ナノ粒子の検出対象物への付着をサイズの変化等により明瞭に検出できる。ナノ粒子の平均粒子径が小さすぎると、ナノ粒子の付着を検出することがより難しくなる傾向がある。
【００２６】
ナノ粒子の粒子径は単分散であることが、修飾ナノ粒子の検出対象物への付着を信頼性高く検出する観点から好ましい。また、修飾ナノ粒子の検出対象物への付着を信頼性高く検出する観点からは、ナノ粒子の粒子径分布のピークの半値全幅は、ナノ粒子の平均粒子径の５０％以下であることが好ましく、３０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。
【００２７】
ナノ粒子の形状は特に限定されず、球状、柱状、回転楕円体状などが例として挙げられる。粒子の向きによる性質の不均等さを減少させる観点からは、球状又は球状に近い形状であることが好ましい。例えば、下記式より求められるＷａｄｅｌｌの実用球形度Ψｗの値（粒子毎の値の平均値）が、０．９以上であることが好ましく、０．９５以上であることがより好ましく、０．９８以上であることがさらに好ましい。なお、完全な球体の場合、Ψｗは１になるため、Ψｗの最大値は理論上１である。
球形度＝（投影面積の等しい円の周長）/（粒子の周長）
【００２８】
ナノ粒子の成分は特に限定されず、金属ナノ粒子であっても、ポリマーナノ粒子であっても、その他の材料のナノ粒子であってもよい。金属ナノ粒子の例としては、Ａｕナノ粒子、Ａｇナノ粒子、Ｚｎナノ粒子、Ａｌナノ粒子、Ｃｏナノ粒子、Ｃｕナノ粒子、Ｓｎナノ粒子、Ｔａナノ粒子、Ｔｉナノ粒子、Ｆｅナノ粒子、Ｎｉナノ粒子、Ｐｄナノ粒子、Ｍｏナノ粒子、などが挙げられる。金属ナノ粒子は合金のナノ粒子であってもよく、例えば、Ａｇ−Ｃｕナノ粒子、Ａｓ−Ｓｎナノ粒子、Ｃｕ−Ｚｎナノ粒子、Ｆｅ−Ｎｉナノ粒子などであってもよい。ポリマー粒子の例としては、ポリスチレンナノ粒子、ポリアクリル酸メチルナノ粒子、ポリメタクリル酸メチルナノ粒子、フッ素樹脂ナノ粒子、などが挙げられる。その他の材料のナノ粒子の例としては、金属酸化物のナノ粒子、カーボンナノ粒子、ダイヤモンドナノ粒子などが挙げられる。金属酸化物のナノ粒子の例としては、酸化カルシウムナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、ヒドロキシアパタイトナノ粒子、酸化セリウム（ＩＶ）ナノ粒子、酸化コバルト（ＩＩ又はＩＩＩ）ナノ粒子、酸化クロム（ＩＩＩ）ナノ粒子、酸化銅（Ｉ又はＩＩ）ナノ粒子、酸化鉄（ＩＩ又はＩＩＩ）ナノ粒子、酸化インジウム（ＩＩＩ）ナノ粒子、酸化マグネシウムナノ粒子、酸化モリブデン（ＩＶ）ナノ粒子、シリカナノ粒子、酸化スズ（ＩＶ）ナノ粒子、酸化Ｔｉ（ＩＶ）ナノ粒子、酸化亜鉛ナノ粒子、酸化ジルコニウム（ＩＶ）ナノ粒子、などが挙げられ、これらはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手可能である。
【００２９】
これらの中でも安定性や表面修飾適性等の観点から、Ａｕナノ粒子及びポリスチレンナノ粒子が好ましく、Ａｕナノ粒子がさらに好ましい。
ナノ粒子は上記のように均一粒径の市販品を入手してもよいし、ナノ粒子生成反応を行うことで得てもよい。例えば、金ナノ粒子の場合、テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸を還元することで作製することができ、還元剤として例えばＮａＢＨ４を用いてもよい。
【００３０】
（特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖）
本開示に係る修飾ナノ粒子においては、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖がナノ粒子表面に結合している。なお、本開示において、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖とナノ粒子表面との結合は、両者が直接結合している形態に限定されず、両者がリンカー等を介して間接的に連結している形態も包含するものである。
【００３１】
本開示に係る修飾ナノ粒子における特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖（検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖）は、検出対象となる特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するものであれば、特に限定されない。オリゴ糖の種類、すなわち、前記オリゴ糖を構成する糖残基の配列や糖残基数は、ターゲットとなるウイルス又は細菌に固有のものであるため、検出したいウイルスや細菌に応じて、より親和性の高いオリゴ糖が適宜選択される。
このように、オリゴ糖は、細菌やウイルスに対する結合能が高いものであることが好ましい。
【００３２】
オリゴ糖の長さは、上述のオリゴ糖の糖残基数で調整することができる。糖残基数は特に限定されないが、例えば２〜１０であってもよく、３〜５であってもよい。
【００３３】
また、オリゴ糖は、天然に存在するものでも存在しないものであってもよく、さらにオリゴ糖の一部が修飾されたものであってもよい。
【００３４】
このようなオリゴ糖としては、例えば、Ｎ結合型糖蛋白質糖鎖、Ｏ結合型糖蛋白質糖鎖、多糖類、シクロデキストリンなどが挙げられる。中でも、ウイルス検出を目的としたオリゴ糖としては、シアル酸を含有するオリゴ糖であることが好ましい。シアル酸を含有するオリゴ糖としては、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスを捕捉するα２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）、α２，６−シアリルラクトサミン（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮ）若しくはα２，６−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）、鳥インフルエンザウイルスを捕捉するα２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）、α２，３−シアリルラクトサミン（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮ）若しくはα２，３−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）、ヒトコロナウイルスを捕捉するシアリル２，６−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｎｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，６）ＧａｌＮＡｃ）、シアリル２，６−ガラクトサミン（Ｎｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，６）ＧａｌＮ）若しくはシアリル２，６−ガラクトース（Ｎｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，６）Ｇａｌ）、ウシコロナウイルスを捕捉するシアリル２，３−Ｎ−アセチルガラクトサミンＮｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，３）ＧａｌＮＡｃ）、シアリル２，３−ガラクトサミンＮｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，３）ＧａｌＮ）若しくはシアリル２，３−ガラクトースＮｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，３）Ｇａｌ）、マウス肝炎ウイルスを捕捉するシアル酸残基（Ｎｅｕ４，５Ａｃ２）、アデノウイルスを捕捉するガングリオシド（ＧＤ１a）（Ｎｅｕ４Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（Ｎｅｕ４Ａｃα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ−ＯＨ）が挙げられる。
前記オリゴ糖はインフルエンザウイルスを選択的に捕捉するオリゴ糖であってもよく、特に、特定の型のインフルエンザウイルス（ヒトや鳥などの特定の種に感染する特定のインフルエンザウイルス）を選択的に捕捉するものであってもよい。
【００３５】
一例として、Ａ型インフルエンザウイルスを捕捉するα２，６−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）、及び鳥インフルエンザウイルスを捕捉するα２，３−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）について説明する。
【００３６】
α２，６−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ））の構造を下に示す。ヒトインフルエンザウイルス上のヘマグルチニンは、この糖鎖中のＮｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ部分を認識する。つまり、下の化学式の点線枠内の構造は、ヒトインフルエンザウイルスが特異的に認識する構造である。なお、α２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）も同様にヒトインフルエンザウイルスを捕捉する。また、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ部分を有する糖鎖であれば、上記以外の糖鎖であってもヒトインフルエンザウイルスを捕捉する糖鎖として使用可能である。
【００３７】
【化１】
2018199179.tif 000003
【００３８】
α２、３−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ））の構造を下に示す。鳥インフルエンザウイルス上のヘマグルチニンはＮｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ部分を認識する。つまり、下の化学式の点線枠内の構造は、鳥インフルエンザウイルスが特異的に認識する構造である。なお、α２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）も同様に鳥インフルエンザウイルスを捕捉する。また、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ部分を有する糖鎖であれば、上記以外の糖鎖であっても鳥インフルエンザウイルスを捕捉する糖鎖として使用可能である。
【００３９】
【化２】
2018199179.tif 000004
【００４０】
ここで、Ｇａｌ、Ｎｅｕ、Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃは糖残基の種類を表し、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｎｅｕはシアル酸残基であるＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基を表す。また、各糖残基間の表記は、結合の様式及び結合位置を示す。例えばＮｅｕ４Ａｃα２，３Ｇｌｃであれば、Ｎｅｕ４Ａｃの２位とＧｌｃの３位とが、αでグリコシド結合していることを表す。また、Ｎｅｕ４，５Ａｃ２とは、Ｎ−アセチルノイラミン酸残基の４位と５位にアセチル基が結合していることを示す。
【００４１】
上記例のようなオリゴ糖のナノ粒子表面側（ナノ粒子表面に連結している側）には、さらに追加の糖残基が存在していてもよい。このような追加の糖残基が存在していても、修飾ナノ粒子の表面（オリゴ糖が修飾ナノ粒子の周囲の媒体に面している側）には検出対象物を捕捉する糖鎖が存在しているので、修飾ナノ粒子は検出対象物に付着可能である。
【００４２】
上記のオリゴ糖は、天然物から公知の方法によって調製してもよいし、公知の方法によって化学的あるいは酵素的に調製してもよい。また、市販されているものをそのまま、あるいは化学的あるいは酵素的に誘導して調製してもよい。市販されているものとしては、例えばα２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、α２，３−シアリルラクトース、α２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン、及びα２，６−シアリルラクトースが挙げられる。
【００４３】
オリゴ糖はナノ粒子の表面に直接結合していてもよいし、リンカーを介して結合していてもよい。ナノ粒子の材質がオリゴ糖との直接の結合に適していない場合には、リンカーの使用は特に有用である。
オリゴ糖とナノ粒子又はリンカーとが結合する場合のオリゴ糖における結合の位置は、本開示に係る効果を奏する限り特に限定されず、ナノ粒子又はリンカーと、オリゴ糖を構成する糖残基のどの部位とが結合してもよい。しかし、ナノ粒子又はリンカーとの結合のしやすさからは、オリゴ糖の還元可能なヘミアセタール構造を有する末端の炭素と、ナノ粒子又はリンカーとの結合であることが好ましい。
【００４４】
また、例えば、ナノ粒子（例えばポリスチレンナノ粒子）の表面がアミノ基で修飾されている場合には、カルボキシ基とヒドロキシ基とを有する化合物（例えばグリコール酸）を用いてナノ粒子表面とオリゴ糖を連結することが可能である。ナノ粒子表面のアミノ基と前記化合物のカルボキシ基が反応してアミド結合を形成し、またオリゴ糖のヒドロキシ基と前記化合物のヒドロキシ基が反応してグリコシド結合を形成する。ナノ粒子（例えばポリスチレンナノ粒子）の表面がカルボキシ基で修飾されている場合には、複数のヒドロキシ基を有する又はアミノ基とヒドロキシ基とを有する化合物（例えばエチレングリコールやエタノールアミン）を用いてナノ粒子表面とオリゴ糖を連結することが可能である。ナノ粒子表面のカルボキシ基と前記化合物のヒドロキシ基又はアミノ基が反応してエステル結合又はアミド結合を形成し、またオリゴ糖のヒドロキシ基と前記化合物のヒドロキシ基が反応してグリコシド結合を形成する。
【００４５】
また、ナノ粒子（例えば金ナノ粒子等の金属ナノ粒子）の表面とオリゴ糖とをリンカーで連結する場合には、チオール基含有化合物であって、チオール基以外にも官能基を有している連結用化合物を用いてリンカーを形成することが好ましい。このチオール基は、ジスルフィド基から誘導されたものでもよい。このように、異なる２種以上の官能基を有していることで、ナノ粒子の表面とオリゴ糖とを連結しやすくなる。本開示において、チオールと例えば金属ナノ粒子との結合は、チオール基含有化合物を含む溶液中に金属ナノ粒子を接触（例えば該溶液に金属ナノ粒子を投入）することで容易に達成できる。結合のための反応時間は、例えば２０分〜２０時間、あるいは２時間〜１５時間とすることができ、反応温度は例えば５℃〜４０℃であってもよく、室温としてもよい。
【００４６】
前記官能基としては、上記したチオール基以外には、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルボニル基、アジド基、アルキニル基、エポキシ基及びイソシアネート基等が挙げられる。さらに、チオール基以外の官能基としては、オリゴ糖の還元末端炭素との結合能を考慮して、オキシルアミノ末端またはヒドラジド末端としてもよい。オリゴ糖と結合する側の末端がオキシルアミノ基またはヒドラジド末端であることで、オリゴ糖側に、結合のための官能基を付与することを必要としないため、オリゴ糖をそのまま連結用化合物との結合のために用いることができる。
【００４７】
また、連結用化合物としては、例えば、チオール基と共にチオール基以外の官能基又はジスルフィド基以外の官能基も有する１種類の化合物を用いてもよいし、チオール基と共にチオール基以外の官能基又はジスルフィド基以外の官能基も有する複数種類の化合物を用いてもよい。
オリゴ糖とナノ粒子表面とを連結するリンカーは、例えば、−Ｐ１−Ｔ１−Ｘ１−で表されるものであってもよい。Ｐ１は、−Ｓ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、又は−ＯＣＯ−である。Ｔ１は炭素数１〜２０の炭化水素連結基であり、その中に１個又は２個のエステル結合又はアミド結合（向きはどちら向きでもよい）を含んでいてもよい。Ｘ１は単結合であるか、オリゴ糖との連結基を表す。Ｔ１で表される炭化水素連結基は、それぞれ１個又は２個のエステル結合又はアミド結合を含んでいてもよい、炭素数１〜１５の直鎖の直鎖アルキレン基、炭素数２〜１５の直鎖アルケニレン基、炭素数３〜１５の分岐アルキレン基、炭素数４〜１５の分岐アルケニレン基、炭素数６〜１５の環状アルキレン基、炭素数６〜１５のアリーレン基、又は−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−（ｎは０又は任意の自然数であり、好ましくは０〜２０の整数、より好ましくは０〜１０の整数である）であることが好ましい。Ｘ１で表されるオリゴ糖との連結基は、−Ｏ−Ｎ＝又は−ＮＨ−Ｎ＝であることが好ましい。Ｐ１の結合手はナノ粒子表面に結合している。Ｘ１が単結合であるとき、Ｔ１はオリゴ糖の還元末端の酸素に結合しており、Ｘ１が−Ｏ−Ｎ＝又は−ＮＨ−Ｎ＝であるとき、Ｘ１はオリゴ糖の還元末端（開環している）のアルデヒド部の炭素に結合してオキシムを形成している。
【００４８】
ナノ粒子（例えば金ナノ粒子等の金属ナノ粒子）の表面とオリゴ糖とをリンカーで連結する場合には、例えば、オリゴ糖の還元末端を、ヒドロキシ基とアミノ基とを有する化合物（例えばエタノールアミン）と脱水反応により連結し（アミノ基含有構造の連結）、別個に、チオール基とカルボキシ基とを有する化合物（例えば１１−メルカプトウンデカン酸）をナノ粒子表面と反応させてチオール基をナノ粒子表面に結合させ、さらにオリゴ糖側の前記アミノ基とナノ粒子側の前記カルボキシ基とを反応させてアミド結合により連結してもよい。前記オリゴ糖の還元末端と反応させる化合物の例としては、エタノールアミン以外にも、メタノールアミン、プロパノールアミンなどが挙げられる。これらを反応させた場合、還元末端の酸素原子に２−アミノエチル、アミノメチル、３−アミノプロピルがそれぞれ結合することになる。つまり、エチルアミン、メチルアミン、プロピルアミン等を、オリゴ糖（例えば、α２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンやα２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン）とリンカーのナノ粒子側部分との連結基として（あるいは上記Ｔ１の一部として）用いることができる。また、ナノ粒子表面と反応させる化合物の例としては、１１−メルカプトウンデカン酸以外にも、８−メルカプトヘプタン酸や１２−メルカプトドデカン酸などがある。チオール基は特に金属への結合能が高いことが知られており、金属ナノ粒子表面への結合に好ましく用いられる。特に、金ナノ粒子表面に使用した場合、Ｓ−Ａｕ結合により、金ナノ粒子の表面を種々の分子により容易に修飾できる。前記アミノ基と前記カルボキシ基との反応の際には、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）等の縮合剤を存在させることによって反応を促進してもよい。反応後に残った余剰な遊離オリゴ糖やその他の副生物は、透析膜（例えば３．５ｋＤａをカットオフとする透析膜）による透析により除去できる。
【００４９】
なお、本開示において、オリゴ糖の還元末端のヒドロキシ基とアルコール（例えばエタノールアミン等）との脱水反応は、例えば酸触媒の存在下にオリゴ糖とアルコールとを反応させることで進めることができ、脱水反応は減圧条件下で行ってもよい。例えば、オリゴ糖の還元末端のヒドロキシ基に対して過剰量のアルコールを加え、６０℃〜１００℃程度で０．５〜４０時間程度反応させてもよい。酸触媒としては、塩酸、硫酸、リン酸、パラトルエンスルホン酸などが挙げられる。オリゴ糖中の、還元末端のヒドロキシ基以外のヒドロキシ基は、適宜保護基により保護してもよい。
【００５０】
また、本開示において、アミノ基とカルボキシ基との脱水縮合によるアミド結合の形成は、酸性条件かつ加熱下において行ってもよいし、カルボキシ基を一旦、酸塩化物や酸無水物に変換してからアミノ基と反応させてもよい。このような反応の例としては、酸塩化物とアミノ基を水又は含水溶媒中、水酸化ナトリウムや炭酸ナトリウムの存在下で反応させるショッテン・バウマン反応等が挙げられる。ただし中性に近い温和な条件で定量的に脱水縮合を行う観点からは縮合剤を用いて脱水縮合を行うことが好ましい。このような縮合剤の例としては、Ｎ’Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＤ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）、ＢＯＰ試薬、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、ＨＡＴＵ、ＴＡＴＵ、ＴＢＴＵ、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（ＣＤＭＴ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）等が挙げられる。縮合剤を用いる場合には、例えば０℃〜５０℃、あるいは１０℃〜３５℃の条件下で、０．５時間〜３０時間、あるいは１時間〜２０時間反応させてもよい。ｐＨは例えば４〜１０、あるいは５〜９とすることができる。
【００５１】
また、本開示において、ヒドロキシ基とカルボキシ基との脱水縮合によるエステル結合の形成は、酸性条件かつ加熱下において行ってもよいし、カルボキシ基を一旦、酸塩化物や酸無水物に変換してからヒドロキシ基と反応させてもよい。このような反応の例としては、フィッシャーエステル合成反応等が挙げられる。ただし中性に近い温和な条件で定量的に脱水縮合を行う観点からは縮合剤を用いて脱水縮合を行うことが好ましい。このような縮合剤の例としては、Ｎ’Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、２，４，４−トリクロロベンゾイルクロリド、２−メチル−６−ニトロ安息香酸無水物、ジメシチルアンモニウムペンタフルオロベンゼンスルホナート等が挙げられる。また、アミド結合形成のための縮合剤の例として挙げた縮合剤も、カルボキシ基の活性化能がエステル形成反応を引き起こすのに十分であれば、エステル結合形成に用いることができる。縮合剤を用いる場合には、例えば０℃〜５０℃、あるいは１０℃〜３５℃の条件下で、０．５時間〜３０時間、あるいは１時間〜２０時間反応させてもよい。ｐＨは例えば４〜１０、あるいは５〜９とすることができる。
【００５２】
オリゴ糖の還元末端にアミノ基含有構造が連結している一例として、α２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンに２−アミノエチル基が連結している例（α２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクサミン−β−エチルアミン）、及びα２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンに２−アミノエチル基が結合している例（α２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクサミン−β−エチルアミン）を以下に示す。
【００５３】
【化３】
2018199179.tif 000005
【００５４】
【化４】
2018199179.tif 000006
【００５５】
また、一つの実施形態では、ナノ粒子又はリンカーがオキシルアミノ末端を有している。この場合、オリゴ糖の還元末端のヘミアセタールが、還元条件によって容易にアルデヒドとなるので、該アルデヒドが、ナノ粒子の表面又はリンカーのオキシルアミノ基と反応することにより、安定なオキシム構造を形成することができる。
【００５６】
また、上記のオキシルアミノ基は、他の官能基よりもオリゴ糖と結合しやすく、さらにこの結合によって水溶液中で安定であるオキシムを生じる。このため、ナノ粒子表面又はリンカーがオキシルアミノ基と他の官能基を有している場合、オリゴ糖とオキシルアミノ基とのみ結合させて、オリゴ糖と他の官能基とを結合させないようにすることができるので、ナノ粒子表面又はリンカーの他の官能基にオリゴ糖以外の置換基を導入することも可能となる。
【００５７】
ナノ粒子表面又はリンカーへのオリゴ糖の結合は、本開示に係る効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、ナノ粒子表面又はリンカーに存在する官能基に、国際公開第２００４０５８６８７号に記載の“グライコブロッティング法”を使用してオリゴ糖（例えば、α２，３−シアリルラクトースやα２，６−シアリルラクトース）を導入することができる。この場合に、例えば、オリゴ糖とナノ粒子表面又はリンカーのオキシルアミノ基とを反応させる場合の反応の条件としては、５０℃〜７０℃で１４０分間〜２４０分間であることが好ましい。また、グライコブロッティング法の使用においては、市販のキット、例えば、住友ベークライト社製のキット（BlotGlyco)を利用できる。
【００５８】
本開示において検出対象物となるウイルス又は細菌は、オリゴ糖によって捕捉されるうるウイルス又は細菌であれば特に限定されない。オリゴ糖によって捕捉される細菌としては、マイコプラズマ、結核菌、レンサ球菌、百日咳菌、レジオネラ菌、緑膿菌、各種病原性大腸菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、ディフシル菌、ヘリコバクターピロリ菌、赤痢菌、髄膜炎菌などの病原性を有し、かつオリゴ糖によって捕捉されうる可能性のある細菌が挙げられる。また、一部の乳酸菌（ビフィズス菌を含む）や病原性を有しない細菌も、オリゴ糖によって捕捉されるものであれば、検出対象物とできる。
また、オリゴ糖によって捕捉されるウイルスとしては、インフルエンザウイルス（Ａ型（亜種も含む）、Ｂ型、Ｃ型）、パラインフルエンザウイルス、ノロウイルス、アデノウイルス、デングウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）などが挙げられる。
【００５９】
検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖のナノ粒子上における量としては、ナノ粒子上に結合できるオリゴ糖分子の最大数（つまり、結合飽和時におけるナノ粒子上に結合しているオリゴ糖分子数）に対する比率（被覆率）で、１０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。結合しているオリゴ糖の数が多ければ、修飾ナノ粒子の検出対象物への付着能はより高まる傾向がある。ただし、ナノ粒子上には分散性向上基も結合するため、オリゴ糖による被覆率が高すぎると、ナノ粒子上に結合できる分散性向上基の数が減少し、分散性向上効果が低下するおそれがある。この観点からは、オリゴ糖による上記被覆率は９５％以下であることが好ましく、９０％以下であることがより好ましい。
【００６０】
（分散性向上基）
本開示に係る修飾ナノ粒子においては、分散性向上基がナノ粒子表面に結合している。なお、本開示において、分散性向上基とナノ粒子表面との結合は、両者が直接結合している形態に限定されず、両者がリンカー等を介して間接的に連結している形態も包含するものである。
【００６１】
本開示に係る修飾ナノ粒子における分散性向上基は、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖が表面に結合しているナノ粒子の溶媒中における分散性を向上させる任意の基であってよい。ナノ粒子表面に分散性向上基を結合させることで、修飾ナノ粒子の分散性が向上するだけではなく、検出対象物への付着の選択性も向上するという驚くべき効果が得られる。分散性向上基は、例えば、親水性溶媒中での分散性を向上させる親水性部分（例えばアミノ基やカルボキシ基）を有する基であり、ナノ粒子と結合する部分（例えばチオ構造等）を介してナノ粒子に結合していてもよい。
【００６２】
分散性向上基は、ベタイン構造を有する基であってもよい。ベタイン構造を有する基を用いることで、修飾ナノ粒子同士が疎水性相互作用により凝集及び沈殿することが抑制され、分散性が向上する。この結果、修飾ナノ粒子が検出対象物ではない構造に非特異的に付着することがさらに効果的に抑制できる。これは、ベタイン構造を有する基がナノ粒子上に結合していると、強固な水和表面が形成されるためであると推測される。
【００６３】
ベタイン構造の例としては、アミノ基とスルホ基を有するスルホベタイン基、アミノ基とカルボキシ基を有するカルボキシベタイン基、アミノ基とリン酸基とを有するホスホベタイン基などが挙げられる。これらの例としては、後述の式Ａの構造が挙げられる。ベタイン構造を有する基の例としては、以下に示すスルホベタイン３ウンデカンチオ基などが挙げられる。なお、メタクリロイロキシフォスファチジルコリンやポリエチレングリコールの使用も考えられるが、分散性向上基があまり大きくなると、オリゴ糖が検出対象物にアクセスするのが妨げられる場合がある。
【００６４】
【化５】
2018199179.tif 000007
【００６５】
ベタイン構造を有する基は、ベタイン構造を有する化合物（以下、ベタイン構造を有する分散性向上剤ともいう）をナノ粒子上に結合させることで、ナノ粒子上に固定することができる。ベタイン構造を有する基は、例えば、チオ基を介してナノ粒子表面に結合していてもよい。例えば、ベタイン構造を有する基とチオール基とを有する化合物（分散性向上剤）を、ナノ粒子表面と反応させることにより、チオ基を介してベタイン構造を有する基をナノ粒子表面上に連結できる。例えば、上記のスルホベタイン３ウンデカンチオ基を金ナノ粒子表面に結合させるには、Ｎ−（１１−メルカプトウンデシル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＳＢ−ＳＨ）（スルホベタイン３−ウンデカンチオールともいう）を金ナノ粒子表面と結合させればよい。
【００６６】
【化６】
2018199179.tif 000008
【００６７】
分散性向上性基は、例えば、−Ｐ２−Ｔ２−Ｘ２で表されるものであってもよい。Ｐ２は、−Ｓ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、又は−ＯＣＯ−である。Ｔ２は炭素数１〜１５の炭化水素連結基であり、Ｘ２はベタイン基を表す。Ｔ２で表される炭化水素連結基は、炭素数１〜１５の直鎖の直鎖アルキレン基、炭素数２〜１５の直鎖アルケニレン基、炭素数３〜１５の分岐アルキレン基、炭素数４〜１５の分岐アルケニレン基、炭素数６〜１５の環状アルキレン基、炭素数６〜１５のアリーレン基又は−ＣＨ２−ＣＨ２−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｍ−（ｍは０又は任意の自然数であり、好ましくは０〜２０の整数、より好ましくは０〜１０の整数である）であることが好ましい。Ｘ２で表されるベタイン基は、−Ｎ＋（Ｒ１）（Ｒ２）−Ｙ−Ｚ（下記式Ａ参照）であることが好ましい。式Ａにおいて＊はＴ２との接続点を表す。
【００６８】
【化７】
2018199179.tif 000009
【００６９】
ここでＲ１及びＲ２は、それぞれ独立に、炭素数１〜８の直鎖の直鎖アルキレン基、炭素数２〜８の直鎖アルケニレン基、炭素数３〜８の分岐アルキレン基、炭素数４〜８の分岐アルケニレン基、炭素数６〜８の環状アルキレン基、又は炭素数６〜８のアリーレン基であり、Ｙは単結合又は炭素数１〜８の直鎖の直鎖アルキレン基、炭素数２〜８の直鎖アルケニレン基、炭素数３〜８の分岐アルキレン基、炭素数４〜８の分岐アルケニレン基、炭素数６〜８の環状アルキレン基、又は炭素数６〜８のアリーレン基であり、Ｚは−ＳＯ３−、−ＣＯＯＨ、又は−ＰＯ３−を表す。Ｐ２の結合手はナノ粒子表面に結合している。
【００７０】
分散性向上基のナノ粒子上における量としては、ナノ粒子上に結合できる分散性向上基の最大数（つまり、結合飽和時におけるナノ粒子上に結合している分散性向上基数）に対する比率（被覆率）で、１０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。結合している分散性向上基の数が多ければ、修飾ナノ粒子の分散性はより高まる傾向がある。ただし、ナノ粒子上には検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖も結合するため、分散性向上基による被覆率が高すぎると、ナノ粒子上に結合できるオリゴ糖の分子数が減少し、検出対象物への結合の選択性が低下するおそれがある。この観点からは、分散性向上基による上記被覆率は８０％以下であることが好ましく、６０％以下であることがより好ましい。
【００７１】
本開示に係る修飾ナノ粒子は、ナノ粒子上に検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖を結合する反応と、ナノ粒子上に分散性向上基を結合する反応とを行うことにより作製できる。これらの反応はナノ粒子上に前記オリゴ糖を結合する反応を先に行っても、ナノ粒子上に分散性向上基を結合する反応を先に行っても、両者を同時に行ってもよい。上記の金属ナノ粒子の作製の場合、チオール基とカルボキシ基とを有する化合物（例えば１１−メルカプトウンデカン酸）をナノ粒子表面と反応させるのと同時に、ベタイン構造を有する基とチオール基とを有する化合物も、ナノ粒子表面と反応させ、その後に、オリゴ糖側のアミノ基とナノ粒子側の前記カルボキシ基とを反応させてアミド結合により連結することが好ましい。このようにすれば、オリゴ糖と分散性向上基のうち、ナノ粒子上に先に連結された構造によって、後から連結する構造を連結するための反応が妨害されることが避けられるためである。使用するチオール基とカルボキシ基とを有する化合物とベタイン構造を有する基とチオール基とを有する化合物との比率は、モル比で、２：８〜８：２としてもよく、４：６〜６：４としてもよく、等モルで用いてもよい。
【００７２】
こうした、ナノ粒子上に検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖を結合する反応や、ナノ粒子上に分散性向上基を結合する反応は、適切な溶媒中にナノ粒子を分散し、該分散液中に反応に用いる物質を共存させることによって行うことができる。反応時の反応条件（ｐＨ、温度、塩濃度等）は、常法に従って選択すればよい。
【００７３】
修飾ナノ粒子全体の粒子径（ナノ粒子及びその表面に結合しているオリゴ糖や分散性向上性基を含めたサイズ）は、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定することができ、例えば粒径測定装置（マルバーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）社のゼータサイザーナノＺＳ（商品名）など）によって測定することができる。その平均粒子径（ＤＬＳによる体積平均粒子径）は、例えば、１０ｎｍ〜２２０ｎｍの範囲内であってもよく、１５ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲内であってもよく、２０ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲内であってもよく、３０ｎｍ〜７０ｎｍの範囲内であってもよい。
【００７４】
本開示に係る修飾ナノ粒子は、例えば、生体から採取したサンプルと混合されると、当該サンプル中に検出対象物が存在していれば修飾ナノ粒子は検出対象物に付着する。このような付着は、粒子径分析方法により検出可能である。このため、本開示に係る修飾ナノ粒子を用いれば、サンプル中における検出対象物の有無を検出することができる。粒子径の分析方法としては、後述する抵抗パルスセンシング、動的光散乱法、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による測定、インピーダンス測定、などが挙げられる。抵抗パルスセンシングは、迅速な測定が可能であり、粒径分布が得られる点で好ましい。なお、修飾ナノ粒子の付着の検出方法は、粒子径の変化（シフト）によるものに限定されず、例えば、ナノ粒子自体あるいはナノ粒子上に結合している何らかのラベルとなる構造（例えば蛍光発色団等）を検出する任意の方法によって行うことも可能である。
【００７５】
＜修飾ナノ粒子と水性媒体とを含む分散液＞
本開示に係る修飾ナノ粒子と水性媒体とを含む分散液は、水性媒体と、該水性媒体中に分散した本開示に係る修飾ナノ粒子と、を含む分散液である。このような分散液中では、修飾ナノ粒子は自由に運動可能であり、検出対象物が存在する場合には検出対象物に付着することも可能である。例えば、前記分散液を生体から採取したサンプルと混合することにより、当該サンプル中に検出対象物が存在していれば修飾ナノ粒子は検出対象物に付着する。このような付着は、修飾ナノ粒子の説明の中で挙げた手法により検出可能である。また、本開示に係る修飾ナノ粒子は、分散性向上基の存在により高い分散安定性を有するため、本開示に係る分散液は長期間にわたり安定して保存できる。
【００７６】
本開示に係る分散液に用いられる水性媒体としては、水若しくは水溶性有機溶媒又は水と水溶性有機溶媒の混合液であれば、特に限定されない。水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール等のアルコール、ジエチレングリコール、ポリエチレングリコール等のグリコール、等が挙げられる。水性媒体は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌやＰＢＳ（例えば１／３×ＰＢＳ）等のバッファー物質を含んでいてもよい。水性媒体のｐＨは、検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖や分散性向上基の性能が大きく低下しない程度のｐＨであることが好ましく、具体的には５〜９であってもよく、６〜８であってもよい。
【００７７】
本開示に係る分散液は、本開示に係る修飾ナノ粒子を水性媒体中に分散することで得られる。この分散には、スターラー、パドルミキサー、インペラーミキサー、ホモミキサー、ディスパーミキサー、ウルトラミキサー、等の撹拌器具又は撹拌装置を用いることができる。
【００７８】
＜修飾ナノ粒子又は分散液と、抵抗パルスセンシング用有孔膜とを含む抵抗パルスセンシング用セット＞
本開示に係る抵抗パルスセンシング用セットは、本開示に係る修飾ナノ粒子又は分散液と、抵抗パルスセンシング用有孔膜とを含む。抵抗パルスセンシングとは、後述のとおり、膜を境界として第１のチャンバと第２のチャンバを設け、第１のチャンバと第２のチャンバの間に電圧を印加し、第１のチャンバに導入したサンプル中の粒子が第２のチャンバへと移動する過程で膜に開けられた微小な孔を通過する際における電気抵抗値の上昇を検出することで、前記粒子の粒子径等を測定する手法である。
【００７９】
本開示に係る抵抗パルスセンシング用セットは、本開示に係る修飾ナノ粒子又は分散液と、抵抗パルスセンシング用有孔膜とを含んでいるため、医療施設などに設置された抵抗パルスセンシング機器に装填することによって、サンプル中の検出対象物を選択的かつ高感度に検出することが可能である。抵抗パルスセンシング用有孔膜についての詳細は後述する。
【００８０】
＜特定のウイルス又は細菌の検出用セット＞
本開示に係る特定のウイルス又は細菌の検出用セットは、本開示に係る修飾ナノ粒子又は分散液と、抵抗パルスセンシング装置とを含む。本開示に係る特定のウイルス又は細菌の検出用セットは、本開示に係る修飾ナノ粒子又は分散液と、抵抗パルスセンシング装置とを含んでいるため、生物学的サンプル等のサンプルと本開示に係る修飾ナノ粒子又は分散液とを混合し、抵抗パルスセンシング装置で測定することで、検出対象物を選択的かつ高感度に検出することが可能である。抵抗パルスセンシング装置についての詳細は後述する。
【００８１】
＜特定のウイルス又は細菌を検出するための試薬＞
本開示に係る、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を検出するための試薬（以下、本開示に係る試薬とも呼ぶ）は、本開示に係る修飾ナノ粒子を含む。本開示に係る試薬は、本開示に係る修飾ナノ粒子そのものでもよいし、さらに水やバッファー溶液等の分散媒等を含んでいてもよい。
【００８２】
本開示に係る特定のウイルス又は細菌を検出するための試薬によれば、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖が検出対象物を特異的に捕捉することによって、修飾ナノ粒子が検出対象物上に選択的に付着する。修飾ナノ粒子−検出対象物複合体のサイズが、検出対象物単独のサイズよりも増大していることを抵抗パルスセンシングにより測定することで、修飾ナノ粒子の付着を検出することができる。この修飾ナノ粒子の付着の検出によって、検出対象物の存在や量を測定できる。
前記試薬は、例えば粒子径分布における粒子径ピークのシフトの有無を基に前記特定のウイルス又は細菌を検出するために用いることができる。
【００８３】
従来、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖が表面に結合したナノ粒子を用いて、抵抗パルスセンシングにより検出対象物を検出することは行われたことはなかった。例えば、従来から、インフルエンザウイルスの検出に広く用いられているのはイムノクロマトグラフィーによる方法である。しかし、抗ウイルス薬の発展と共に、投与が大きな効果を奏する感染の初期発見の重要性が再認識されており、イムノクロマトグラフィーにより得られる検出感度はなお改善の余地があった。
【００８４】
高齢者は感染性疾患に罹患した場合に状態が悪化する傾向があるため、高齢化した集団はインフルエンザ等の重篤な感染性疾患の脅威にさらされる。例えば、インフルエンザ感染はしばしば肺炎などの感染合併症を引き起こし、重篤な結果につながる。高齢者は免疫系が弱くなっていることが多いため、初期の段階での検出を可能とするために診断技術が改善されることが求められている。現在では、診断方法として並行流イムノクロマトグラフィーが広く用いられている。しかし、この技術を用いても、低い検出感度のため、対象疾患を常に検出できるとは限らない。インフルエンザウイルス用の薬はほとんどがノイラミニダーゼ阻害剤で、感染から４８時間以内に投与すべきであるため、検出感度の向上は解決すべき最も重要な課題の一つである。
【００８５】
イムノクロマトグラフィーの場合、個々のウイルス粒子からは僅かな情報しか得られず、ある程度の数が集まって始めて集団としての情報が得られるだけである。しかし、本開示で用いられる抵抗パルスセンシングでは、個々の粒子について電気抵抗の変化の形で情報を得ているだけでなく、その情報の内容も、単に個々の粒子の存在の検出ではなく、個々の粒子のサイズについての情報まで得られる。このように、抵抗パルスセンシングではイムノクロマトグラフィーよりも少ないウイルス粒子数であっても検出が可能である。
【００８６】
一方で、抵抗パルスセンシングによりウイルス粒子を測定しても、サイズが類似するウイルス粒子同士を区別することはできなかった。これらは、抵抗ピークシグナル上は類似する位置にピークを示すためである。このため、ヒトインフルエンザウイルスと鳥インフルエンザウイルスなど、インフルエンザウイルスの特定の型同士を区別することは困難であった。
具体的には、インフルエンザウイルスは８０〜１２０ｎｍのサイズを有しているが、いくつかの型及び亜型が存在し、このためインフルエンザの特性は多様である。ヒトにおける高度に病原性の鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）は、ヒトインフルエンザウイルスに比べて高い死亡率を有する新たに生じた感染症として知られている。しかし、２種のインフルエンザＡウイルスの間の物理的特性の違いを用いてヒトインフルエンザウイルスと鳥インフルエンザウイルスとを区別することは難しかった。
【００８７】
これに対して、本開示においては、表面に検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖と、分散性向上基とを結合したナノ粒子（修飾ナノ粒子）を用い、修飾ナノ粒子の検出対象物への付着を抵抗パルスセンシングにより検出対象物の粒子サイズ変化（検出対象物自体の粒子サイズと検出対象物−修飾ナノ粒子複合体の粒子サイズの差）として検出する。このため、同様の粒子サイズを有するインフルエンザウイルスの異なる型又は亜型同士についても、オリゴ糖の捕捉選択性に基づいて、区別可能である。この結果、特定の種類（型、亜型等）のインフルエンザウイルスを高感度に検出することが可能である。
【００８８】
ナノ粒子を用いた検出対象物の検出については、抗体を固定したナノ粒子を用いている例があった。しかし、抗体は作製に時間と労力を要し、また抗体はポリペプチドから形成されているためにその安定性を長期間保持することが難しい場合がある。さらに抗体が認識する抗原上の部位を事前に設計することができないため、ウイルスに結合する抗体であってもウイルスの類似する種類（型、亜型等）同士を区別できるとは限らない。本開示においては、検出対象物を捕捉するために検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖を用い、さらに非特異的付着を抑制するために分散性向上基を用いることによって、抗体の使用に付随するこうした問題を乗り越えている。なお、上記の説明ではインフルエンザウイルスを一例として用いて説明したが、これ以外のウイルスや細菌についても同様の説明が当てはまる。
【００８９】
本開示に係る試薬においては、ナノ粒子上にさらに分散性向上基が結合していることで、修飾ナノ粒子の夾雑物等への非特異的付着が低減され、修飾ナノ粒子が検出対象物を捕捉する選択性がさらに向上している。
【００９０】
＜ウイルス又は細菌の検出方法＞
本開示に係るウイルス又は細菌の検出方法は、
（ａ）生物学的液体サンプル中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
（ｂ）前記生物学的液体サンプルを本開示に係る試薬と混合して混合液を得る工程、及び
（ｃ）前記混合液中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
を含み、前記ウイルス又は細菌に対応する粒子径範囲において、前記工程（ａ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置よりも前記工程（ｃ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置の方が大粒子径側にシフトしているピークが存在する場合に、前記生物学的液体サンプルは前記ウイルス又は細菌を含むと判定する、方法である。
【００９１】
（抵抗パルスセンシング）
抵抗パルスセンシングは、粒子が孔を通過する際の電気抵抗値の変化を測定する技術である。具体的には、抵抗パルスセンシング装置は、第１のチャンバと、第２のチャンバと、第１と第２のチャンバの間の隔壁として設けられ且つ微細な孔を有する膜を有する。第１のチャンバと第２のチャンバは、電解液で満たされている。測定の際には、第１のチャンバに液体サンプルを添加し、第１のチャンバと第２のチャンバの間に電圧を印加する。電圧の印加は、例えば第１のチャンバの壁及び第２のチャンバの壁にそれぞれ電極を設け、これらの電極間に電位差を与えることにより行うことができる。電圧が印加されると、電極間に電流が流れる。第１のチャンバと第２のチャンバを連絡する孔を粒子が通過する際には、一時的に電流が減少する（つまり抵抗値が増加する）が、Ｍａｘｗｅｌｌの理論によれば抵抗値の増加量は粒子によって排除される電解液の体積（つまり粒子の体積）に比例する。このため、電気抵抗値の変化をモニターすることで、通過する粒子の数と、それぞれの粒子の大きさを測定することができる。これが、抵抗パルスセンシングの原理である。
【００９２】
電気抵抗の増加（イオン電流の阻止（ｂｌｏｃｋａｄｅ））のシグナル（パルス）は、その高さ（つまり抵抗増加の大きさ）が通過している粒子のサイズを表しているが、その持続時間は粒子の移動速度を反映している。粒子のイオン速度は、チャンバ間に与えられた圧力差だけでなく、チャンバ間に印加された電圧にも影響されるため、持続時間の情報を基に粒子のゼータ電位等を読み取ることも可能である。
【００９３】
前記電解液としては種々の塩溶液を用いることができるが、生理学的バッファー溶液であることが好ましい。例えば１／３×ＰＢＳ等のＰＢＳバッファー溶液、Ｔｒｉｓバッファー溶液などが挙げられる。孔のサイズが大きい場合には、電流値が大きくなるため、電解質のモル濃度を下げることが好ましい。
【００９４】
抵抗パルスセンシングの際には、第１のチャンバと第２のチャンバとの間に圧力差を設けて、孔を通過する流れを作ってもよい。測定サンプル中の粒子は自身が有する電荷によって自発的に孔を通過する場合もあるが、物理的な流れを作ることによって孔を通過させることにより、より短時間に多くの粒子を測定できるようになる。
【００９５】
電極間に印加する電圧は、低すぎると電流が微弱となって測定精度が低下し、また高すぎてもイオン電流量が大きくなり過ぎたり短絡が生じたりする可能性がある。これらの問題が生じない限りは電圧は特に限定されないが、例えば１０ｍＶ〜１００Ｖであり、あるいは５０ｍＶ〜１０Ｖであってもよい。また、チャンバ間の圧力差も特に限定されないが、例えば０．００５ｋＰａ〜５ｋＰａであり、あるいは０．０１ｋＰａ〜２．０ｋＰａであってもよい。
【００９６】
第１及び第２のチャンバの容量は特に限定されないが、例えば０．１ｍｌ〜５０ｍｌであり、あるいは０．５ｍｌ〜１０ｍｌである。また、添加する液体サンプルの量は、例えば１０μＬ〜１ｍＬであり、あるいは３０μＬ〜０．５ｍＬであってもよい。添加する液体サンプルは、液体サンプル中の粒子濃度が１０５／ｍＬ〜１０１２ｍＬの範囲内となるように調製することが、各粒子による電気抵抗値上のピークを迅速且つ正確に検出する上で好ましい。
【００９７】
このような抵抗パルスセンシング測定装置の例としては、ＩＺＯＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ社（ＩＺＯＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＬＩＭＩＴＥＤ）製のｑＮＡＮＯ（商品名）等がある。ベックマン社製のコールターカウンターシリーズでは、測定可能な粒子径の下限値が４００ｎｍ程度であって、例えば１００ｎｍ前後のサイズのウイルスを測定するのには使用できないが、上記下限値よりも大きなサイズを有する検出対象物を測定する際には使用してもよい。
【００９８】
液体サンプル中に含まれる粒子の粒子径は４０ｎｍ〜１０μｍの範囲内とすることが好ましい。粒子径が大きすぎる粒子が含まれると、孔が塞がれて正しく測定ができないため、粗大粒子が含まれる可能性のある液体サンプルについては、フィルターによる濾過（例えば５００μｍあるいは１００μｍの目開きのフィルター）あるいは透析等で粗大粒子を除去してから測定すればよい。
【００９９】
第１と第２のチャンバの間の隔壁となる膜（抵抗パルスセンシング用有孔膜）は、例えばポリマーの膜であり、ポリウレタン膜であることがより好ましい。膜厚は特に限定されないが、例えば０．１ｍｍ〜５ｍｍであり、０．５ｍｍ〜３ｍｍであってもよい。
【０１００】
膜が有する孔の径は、例えば、４０ｎｍ〜１０μｍの範囲内で、液体サンプルに含まれると予想される粒子のサイズに合わせて選択することができる。例えば、上記のｑＮＡＮＯ用の膜としては、孔径の異なるＮＰ−１００、ＮＰ−１５０、ＮＰ−２００、ＮＰ−３００、ＮＰ−４００、ＮＰ−８００、ＮＰ−１０００、ＮＰ−２０００及びＮＰ−４０００（いずれも商品名）といった抵抗パルスセンシング用有孔膜がＩＺＯＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ社から提供されている。また、膜の形状は丸型や正方形、長方形、その他の多角形であってもよいが、孔の大きさを調節するために、膜に９０°ずつ離れた方向に伸びる４つのアームを設け、アーム間に適切な張力を加えることで孔の大きさを適切な大きさに調節できるようにすることが好ましい。この場合は、膜の形状は十字架状となる。上記のＩＺＯＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ社から提供されている膜は、このように可変の孔径を有している。
このような孔径が可変な孔を用いる抵抗パルスセンシングは、サイズ可変抵抗パルスセンシング（Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｅｎｓｉｎｇ，  ＴＲＰＳ）と呼ばれており、本開示においてもＴＲＰＳを用いることが高い測定感度を得る上で好ましい。
【０１０１】
膜の断面における孔の形状は、円柱状でも頂部を欠く円錐状でもよいが、頂部を欠く円錐状であることが好ましい。孔の形状が頂部を欠く円錐状であると、ピークがより鮮鋭に現れるため、個々の粒子のピークの判別や分離がより容易になる。
【０１０２】
抵抗パルスセンシングの詳細については、参照により本明細書に取り込まれるNano Today. 2011 October 1; 6(5): 531-545. doi:10.1016/j.nantod.2011.08.012等の文献を参考にすることもできる。
【０１０３】
非常に微小な孔を用いる場合には、膜輸送タンパク質の有する孔を利用することもできる。しかし、膜輸送タンパク質を用いた検出の問題点は、サイズ上の限界と分解であり、このため、核酸、ペプチド、タンパク質、細菌全体、ウイルス全体及び細胞外ベジクルなどの種々の粒子を検出するために上記のとおり人工的なナノポア又はマイクロポアが開発されてきている。多分散ナノ粒子試料のサイズ分布は、ＴＥＭ像と同様に抵抗パルスセンシングによって迅速且つ正確に計算することができ、一方、動的光散乱（ＤＬＳ）は多分散試料を測定して各々の粒子径を求めることはできない。
【０１０４】
ウイルスは各種毎に特有のサイズを有し、例えばＡ型インフルエンザウイルスは８０〜１２０ｎｍの直径を有し、対照的にエンテロウイルスなどのピコルナウイルスは３０ｎｍの直径を有する。孔径は、検出対象物が通過可能な孔径であり、かつ検出対象物のサイズに比して過剰に大きくはない孔径とすることが好ましい。例えば、検出対象物の最大径は、孔径の５％〜９０％であることが好ましく、１０％〜８５％であることがより好ましい。
本開示によれば、インフルエンザ等のウイルスを個別に区別することによって、流行性疾患の予防のための早期診断に貢献することができる。近年、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ亜種Ａ等の高病原性鳥インフルエンザ（ＨＰＡＩ）がヒトに高い死亡率をもたらす流行性疾患として知られているが、Ａ型インフルエンザウイルスの亜型の間ではウイルスの物理的性質はほとんど同じである。これらの亜型についても本開示によれば区別して検出可能である。
【０１０５】
本開示において、抵抗パルスセンシングはＩＺＯＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製のｑＮＡＮＯ（商品名）を用い、上記ＮＰ−１００、ＮＰ−１５０（商品名）等のｑＮＡＮＯ用の膜を装着することによって測定することが好ましい。その際の設定については、メーカーのマニュアルに従って設定すればよく、デフォールト設定であっても構わない。
【０１０６】
本開示に係るウイルス又は細菌の検出方法においては、工程（ａ）において、生物学的液体サンプル中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する。生物学的液体サンプルは、例えば被験者の鼻水、唾液、尿、血液、等の液体サンプルであってもよいし、口腔上皮、皮膚、髪、爪等の固体のサンプルを例えば破砕及び液体に溶解して作製した液体サンプルであってもよいし、これらの液体サンプルに希釈、濃縮、濾過（例えば５００μｍの目開きのフィルターによる濾過）等の処理を行った液体サンプルであってもよい。測定対象の液体サンプルは生理学的バッファー溶液の状態であることが好ましく、例えば１／３×ＰＢＳ等のＰＢＳバッファー溶液やＴｒｉｓバッファー溶液であってもよい。
医療機関において迅速な測定を行うという観点からは、処理を行うとしてもなるべく簡便な処理（例えば適切な目開きのフィルターによる濾過のみの処理）であることが好ましい。本開示においては、液体サンプル中に検出対象物以外の夾雑物が多数含まれていたとしても、検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖により修飾ナノ粒子は検出対象物に選択的に付着し、分散性向上基は非特異的付着をさらに抑制するため、高感度の測定を行うことが可能である。検出可能となるために必要な検出対象物の粒子数の下限は、例えば、２０個〜１０００個の範囲内であり、あるいは５０個〜２００個である。このような感度は、従来から行われているイムノクロマトグラフィーによる検出よりもはるかに高感度である。もちろん下限値以上の粒子を計測しても何の問題もなく、５００〜１０００個程度の粒子を測定してもよい。インフルエンザウイルスの検出の場合は、１ヘマグルチニンユニット（ＨＡＵ）以上のウイルス粒子を測定すれば、十分な検出が可能である。
【０１０７】
上記のように、本開示に係るウイルス又は細菌の検出方法においてはサンプルの前処理を最小化でき、また、電気抵抗値のピークのシフトもコンピューターで自動検出可能であるため、例えば１０分以内で検出対象物の存在や量についての判定結果を出すことが可能である。また、抵抗パルスセンシング装置は小型化でき、医療機関に容易に設置することができる。
【０１０８】
抵抗パルスセンシングによれば、個々の粒子が膜の孔を通過する際に、電気抵抗値が増加するピークが観察される。このピークの高さにより、個々の粒子の大きさを求め、粒子径分布のヒストグラムを作成できる。なお、既に粒子径が既知である粒子を含む較正用標準試料を用いた較正のための測定も行うことが好ましいが、抵抗パルスセンシングではピーク高さと粒子容積とは比例するため、較正は複数の標準試料を用いずに１種類の標準試料を用いるだけでもよい。また、粒子径は、得られた粒子容積に相当する球の直径として得ることができる。
【０１０９】
なお、工程（ａ）においては、抵抗パルスセンシングによる測定の前に、前記生物学的液体サンプルを、検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖を表面に有しないナノ粒子（前記オリゴ糖を有しない以外は、工程（ｂ）に使用する修飾ナノ粒子と同様のナノ粒子）と混合してもよい。このように、検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖を表面に有しないナノ粒子と混合した場合には、遊離のナノ粒子も粒子径分布に含まれるため、工程（ｃ）で得られる粒子径分布との比較が一段と容易になる。
【０１１０】
工程（ｂ）においては、生物学的液体サンプルを本開示に係る試薬と混合して混合液を得る。この混合により、生物学的液体サンプル中に検出対象物が存在する場合には、本開示に係る試薬中の検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖が検出対象物を捕捉し、その結果、検出対象物に修飾ナノ粒子が付着する。生物学的液体サンプル中に検出対象物が存在しない場合には、修飾ナノ粒子は遊離のままとどまる。工程（ａ）や工程（ｂ）における測定は、常温で行うことができる。
【０１１１】
混合は、手で攪拌することにより行ってもよいし、ボルテックス等で振動を与えたり、スターラーで攪拌したり、又はピペッティングを行うこと等で行ってもよい。生物学的液体サンプルと本開示に係る試薬との混合比は特に限定されないが、本開示に係る試薬が少なすぎればサイズの変化（サイズシフト）が検出しにくくなる。このため、生物学的液体サンプル中に検出対象物が存在した場合に、修飾ナノ粒子による被覆率が５０％以上となるような条件（例えば５０％〜９９％となるような条件）で混合を行うことが好ましい。好ましくは、ウイルスが存在する場合に推定されるウイルス粒子数の１０倍以上の個数の、修飾ナノ粒子を用いることが好ましく、修飾ナノ粒子の個数は推定されるウイルス粒子数の１００倍以上であることがより好ましく、１０００倍以上であることがさらに好ましい。修飾ナノ粒子をウイルス粒子に対して飽和させることにより、粒子径の変化量が大きくなり、より明瞭な検出が可能となる。例えば、推定されるウイルス粒子数を１０９個／ｍＬオーダー、修飾ナノ粒子数を１０１２個／ｍＬオーダーとしてもよい。修飾ナノ粒子の個数の推定されるウイルス粒子数に対する比率の上限は特には無いが、修飾ナノ粒子の個数は推定されるウイルス粒子数の例えば１０万倍以下としてもよい。
【０１１２】
前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）のうち少なくとも一方において、前記生物学的液体サンプルは水性媒体と混合してもよい。前記生物学的液体サンプルの粘度が高かったり、粒子濃度が高かったりする場合には、水性媒体により希釈することが測定の精度を上げる上で有利である。水性媒体との混合を行う場合には、前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）の両方において行うことが好ましい。
【０１１３】
工程（ｃ）においては、前記混合液中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する。この工程は、測定対象が変更されていること以外は工程（ａ）と同様である。この測定の結果、生物学的液体サンプル中に検出対象物が存在する場合には、工程（ａ）で得られた粒子径分布と、工程（ｃ）で得られた粒子径分布を比較すると、工程（ａ）で得られた粒子径分布中の検出対象となるウイルス又は細菌のピークが、工程（ｃ）で得られた粒子径分布中では修飾ナノ粒子の付着により大粒子径側にシフトする。このシフトが見いだされた場合には、検出対象となるウイルス又は細菌が生物学的液体サンプル中に存在していると判定できる。また、本明細書において、「ウイルス又は細菌に対応する粒子径範囲において」とは、ウイルス又は細菌の粒子径〜修飾ナノ粒子が付着可能な最大量付着したときの当該ウイルス又は細菌の粒子径の範囲を指す。ピークのシフトの有無の判定は、「ウイルス又は細菌に対応する粒子径範囲において」行われ、前記ウイルス又は細菌に対応する粒子径範囲とは関係の無い粒子径においてピークのシフトが見られても、これは前記ウイルス又は粒子の存在を示すものではない。例えば、ウイルス又は細菌自身の粒子径〜ウイルス又は細菌自身の粒子径＋２×（修飾ナノ粒子の平均粒子径）の範囲で粒子径分布の移動が起こっているかを観察してもよい。また、ピークのシフトの程度（粒子径の増分）については、使用する試薬又は修飾ナノ粒子の粒子径を基にカットオフ値を定めることができる。例えば、カットオフ値は、修飾ナノ粒子の平均粒子径の１０％〜７０％としてもよい。また、ピークのシフト量はピークの頂点のシフト量を基に求めてもよい。
【０１１４】
また、細菌やウイルスの粒子が複数集合した集合体が含まれている場合には、粒子径分布中のピークの形状が複雑となる。この場合は、複数の正規分布にフィッティングさせることにより、当該ピークを複数のピークに波形分離し、各々のピークのシフトを確認すればよい。
【０１１５】
なお、生物学的液体サンプル中に検出対象物が存在しない場合には、工程（ａ）で得られた粒子径分布と、工程（ｃ）で得られた粒子径分布を比較しても、工程（ａ）で得られた粒子径分布中の検出対象となるウイルス又は細菌のピークは、工程（ｃ）で得られた粒子径分布中でも同じ粒子径の位置に観察される。ただし、工程（ｃ）で得られた粒子径分布には修飾ナノ粒子も含まれているため、工程（ａ）で修飾ナノ粒子を添加していない場合には、遊離の修飾ナノ粒子に対応するピークが新たに加わっている。
【０１１６】
また、抵抗パルスセンシングにおいては、個々の粒子を測定できることを利用すれば、シフトが生じたピークに含まれる粒子数を計数することによって、生物学的液体サンプル中に含まれる特定ウイルス又は細菌の濃度を測定することも可能である。つまり、抵抗パルスセンシングによれば、特定ウイルス又は細菌の有無だけではなく、特定ウイルス又は細菌の個数についての定量的な測定も可能である。これまで、特定ウイルス又は細菌の定量的測定においては、力価の測定が主に行われてきたが、特定ウイルス又は細菌の個数そのものを計数できた例は無く、本開示に係る方法はこの点でも斬新なものである。
【０１１７】
本開示に係る抵抗パルスセンシングの一例を図面を参照して説明する。図１Ａは、ステップ（ａ）において、ウイルス粒子を含むサンプルを抵抗パルスセンシング装置により測定している状態を示す概念図である。図に示される抵抗パルスセンシング装置は、電解液で満たされた２つのチャンバと、チャンバ間の隔壁となる膜と、膜に設けられた孔（ポア）と、両チャンバ間に電圧を印加する２つの電極と、電圧印加のための電源と、流れる電流量を測定するための電流計を備えている。孔（ポア）を有する膜の両側に形成された第１のチャンバ及び第２のチャンバには電圧が印加されている。ウイルスが孔を通過する際の電流値の変化は電流計によって測定され、この測定値から抵抗値をモニターしている。
【０１１８】
図１Ｂは、ステップ（ｃ）において、検出対象物を選択的に捕捉するオリゴ糖を表面に有するナノ粒子（分子認識ナノ粒子）が付着したウイルス粒子を抵抗パルスセンシングにより測定している状態を示す概念図である。孔を通過するウイルス粒子−ナノ粒子複合体の粒子径は、ウイルス粒子単独での粒子径よりも増大している。
【０１１９】
図１Ｃは、ステップ（ａ）で得られた粒子径分布中のウイルス粒子のピーク（分子認識前）と、ステップ（ｃ）で得られた粒子径分布中のウイルス粒子のピーク（分子認識後）との間でピークが大粒子径側に移動（シフト）したことを示す図である。また、ピーク中に含まれている粒子数も求めることができるので、これを基に液体サンプル中のウイルス粒子の数を計測することも可能である。液体サンプル中に検出対象物が含まれない場合には、このようなシフトは起こらない。
【０１２０】
以上のとおり、本開示によれば、ウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖を表面に結合した修飾ナノ粒子を用いてウイルス又は細菌に選択的かつ高感度に検出することができる。これにより、ウイルスや細菌に感染した患者をより早期に感染判定することが可能となり、より早期に適切な治療を開始することが可能となる。
【実施例】
【０１２１】
以降、実施例により本開示の実施形態をより具体的に説明する。ただし、本開示に係る実施形態は以下の実施例によって限定されるものではない。【０１２２】
（実施例で使用した試薬）
１１−メルカプトウンデカン酸（以下、単にＭＵＡと呼ぶ）はシグマアルドリッチ社から購入し、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−６）Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ−β−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（６’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン−β−エチルアミン；以下、単に６’ＳＬＮと呼ぶ）及びＮｅｕ５Ａｃα（２−３）Ｇａｌβ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ−β−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（３’−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン−β−エチルアミン；以下、単に３’ＳＬＮと呼ぶ）は東京化成工業株式会社から購入し、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ−水和物（以下、単にＤＭＴ−ＭＭと呼ぶ）は和光純薬工業株式会社から購入し、Ｎ−（１１−メルカプトウンデシル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（以下、単にＳＢ−ＳＨと呼ぶ。ＳＢはスルホベタインを、ＳＨはチオールを表している）は、同仁化学研究所から購入した。これらの化学物質は、購入時のままの状態で使用した。【０１２３】
なお、６’ＳＬＮの構造及び３’ＳＬＮの構造は、それぞれ、上記に示したα２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクサミン−β−エチルアミンの構造及びα２，３−シアリル−Ｎ−アセチルラクサミン−β−エチルアミンの構造のとおりである。【０１２４】
クエン酸安定化金ナノ粒子（２０ｎｍ径）は、シグマアルドリッチ社から購入した。透析はＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）透析膜（Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＣＥチューブ、分子量カットオフ：３．５ｋＤ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より入手）を用いて行われた。インフルエンザＡ  Ｈ１Ｎ１溶液のサイズ分布はナノ粒子測定器ｑＮａｎｏ（Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社より入手）により測定された。ゼータ電位測定はＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社より入手）により測定された。ヒトＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４）はニワトリ胚で培養され、０．０５％（重量／重量）ホルマリン溶液で無毒化した。得られた無毒化Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型の溶液のＨＡ力価は２５６ＨＡＵであった。【０１２５】
（テトラクロロ金（ＩＩＩ）酸からのＭＵＡ−ＧＮＰの作製）
０．１ＭのＮａＯＨを用いて４．４４ｍＭのＭＵＡ溶液を作製し、２０ｍＬの１．４２ｍＭテトラクロロ金（ＩＩＩ）酸を２ｍＬのＭＵＡ溶液と混合した。１０分後に、１５０ｍＭのＮａＢＨ４溶液を３５０μＬ、非常にゆっくりと加えた。溶液は一晩攪拌した（図２左側の反応）。
この金イオンの還元操作においては、小さな金ナノクラスターが形成され、これをナノ粒子に成長させた。ＭＵＡ分子はＳ−Ａｕ結合により金表面に強固に結合し、自己集合単層（ＳＡＭ）を形成する。この層は金ナノ粒子（以下、単にＧＮＰと呼ぶ）の懸濁状態を維持し、さらなる成長を防止する。【０１２６】
ゼータ電位及びＤＬＳ測定の結果から、１４．９ｎｍの径を有する、ＭＵＡを固定化したアニオン性ＧＮＰがこの反応により得られた（ＭＵＡ−ＧＮＰ；ゼータ電位−３８．０ｍＶ、多分散指数０．２６７）。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像から、Ａｕコアサイズは約１０ｎｍであると分かった。【０１２７】
（６’ＳＬＮ−ＧＮＰ及び３’ＳＬＮ−ＧＮＰの作製）
３．０４μｍｏｌの６’ＳＬＮ又は３’ＳＬＮを４．８ｍＬのＭＵＡ−ＧＮＰ溶液に溶かし、３５３ｍＭのＤＭＴ−ＭＭ溶液を４．８μＬ（３．３８μｍｏｌ）加え、室温で３時間攪拌した。これをさらに４℃で一晩保管した。余剰量の遊離ＳＬＮ及び副生物を透析で除去した（図２右側の反応）。６’ＳＬＮ−ＧＮＰの表面修飾の概略図を下に示す。【０１２８】
【化８】
2018199179.tif 000010
【０１２９】
この、６’ＳＬＮによる修飾プロセスにおいては、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウムクロリドｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）が縮合剤として用いられた。６’ＳＬＮとの反応の後、ＧＮＰ溶液の色は僅かに変化した（６’ＳＬＮ−ＧＮＰ、図２右側）。この色変化の詳細をより明確に説明すると、ＭＵＡ−ＧＮＰ及び６’ＳＬＮ−ＧＮＰの吸収スペクトルを測定した。この結果によると、６’ＳＬＮ層がＧＮＰ上に形成されたことによる屈折率変化に由来する表面プラズモンピークの赤色へのシフト（５２０ｎｍ近辺の極大ピークの位置がＭＵＡ−ＧＮＰでは５１５ｎｍであったのに対し６’ＳＬＮ−ＧＮＰでは５２１ｎｍ）が確認された。６’ＳＬＮ−による修飾後、ゼータ電位は−３８．０ｍＶから−２４．６ｍＶへと変化した。この結果はまた６’ＳＬＮの固定も証明している。なぜなら、ＭＵＡ−ＧＮＰは密に詰まったＣＯＯ−表面を有している一方、６’ＳＬＮ−ＧＮＰは嵩高なシアル酸を表面に有しているからである。このため、ＧＮＰ表面の電荷密度は減少した。以上の結果から、６’ＳＬＮは縮合反応によりＧＮＰに確かに固定されたことを確認した。なお、３’ＳＬＮによる修飾の結果も同様であった。【０１３０】
（ＳＢ−ＧＮＰ、６’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰ及び３’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰの作製）
１０μＬのクエン酸で安定化したＧＮＰ（１ＯＤ、６．５４×１０１１粒子／ｍＬ）を、０．１ＭＮａＯＨを含む１ｍＭのＳＢ−ＳＨ溶液２ｍＬと混合し、一晩攪拌した。溶液を減圧蒸発により５ｍＬに濃縮し、５００ｍＬの純粋で３回透析した（それぞれ、２時間、４時間、及び１２時間）。得られたＳＢ−ＧＮＰ溶液を４℃で保管した。
この実験で用いられたクエン酸に懸濁した均一ＧＮＰでは、クエン酸は金表面と物理的吸着により相互作用し、クエン酸層がＧＮＰの分散安定性を維持する。クエン酸の物理的吸着は、強いＳ−Ａｕ結合により容易に交換されるため、この層はＳＨ末端分子により容易に交換される。【０１３１】
１０ｍＬのクエン酸安定化ＧＮＰ（１ＯＤ、６．５４×１０１１粒子／ｍＬ）を、０．１ＭのＮａＯＨを含む１ｍＭのＳＢ−ＳＨ溶液１ｍＬ及び０．１ＭのＮａＯＨを含む１ｍＭのＭＵＡ溶液１ｍＬと混合し、一晩攪拌した。溶液を減圧蒸発により５ｍＬに濃縮し、５００ｍＬの純粋で３回透析した（それぞれ、２時間、４時間、及び１２時間）。得られたＳＢ／ＭＵＡ−ＧＮＰ溶液を４℃で保管した。ＳＢ／ＭＵＡ−ＧＮＰの表面修飾の概略図を下に示す。【０１３２】
【化９】
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【０１３３】
ＳＢ／ＭＵＡ−ＧＮＰ溶液のうち半分を、４ｍＭの６’ＳＬＮ溶液０．２５ｍＬと混合し、ＳＢ−ＭＵＡ−ＧＮＰ溶液のうち残りの半分を４ｍＭの３’ＳＬＮ溶液０．２５ｍＬと混合した。４ｍＭのＤＭＴ−ＭＭ溶液０．２５ｍＬを両方の溶液に添加し、室温で３時間攪拌した。縮合反応の後、溶液を４℃で一晩保管した。これらの溶液を５００ｍＬの純水で透析し、過剰量の６’ＳＬＮ又は３’ＳＬＮ、及び副生成物を除去した（各回２時間、４時間及び１２時間）。得られた６’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰ及び３’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰを４℃で保管した。対照実験として、ＳＢ−ＧＮＰも同じ手順で６’ＳＬＮ及びＤＭＴ−ＭＭに曝した。【０１３４】
分散安定性の向上を理解するため、得られたナノ粒子溶液を回転エバポレーターを用いて濃縮した。ＭＵＡ−ＧＮＰは濃縮後に不可逆的に凝集したが、ＭＵＡ／ＳＢ−ＧＮＰは分散安定性を維持した（図６）。ＳＢ−ＧＮＰも分散安定性を維持していた。ＭＵＡ−ＧＮＰは負電荷により静電的に水中に分散しており、分散安定性を維持しているが、エバポレーターでの濃縮の際に塩濃度が上昇するとよりイオン電場が遮蔽され、静電反発が弱まってしまう。加えて濃縮によるＭＵＡ−ＧＮＰ同士の衝突頻度上昇のため、ＭＵＡ−ＧＮＰでは疎水性相互作用による凝集が観察された。一方、ＳＢ−ＳＨが固定化されたＧＮＰはクエン酸バッファーにより負電荷が遮蔽されているにも関わらず分散安定性を維持した。ベタイン構造を有する表面の場合、非常に強固な水和表面が形成されており、疎水性相互作用による凝集が抑制されたと考えられる。【０１３５】
（ウイルスの６’ＳＬＮ−ＧＮＰによる抵抗パルスセンシング）
Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型溶液を１／３ＰＢＳバッファー中に１ＨＡＵとなるように希釈した。１／３ＰＢＳバッファー中の６’ＳＬＮ−ＧＮＰ溶液（１．５２ＯＤ、２．４９×１０１２粒子／ｍＬ）も調製した。４５μＬずつの各溶液を混合し、１０分間静置し、ＩＺＯＮ ＳＣＩＥＮＣＥ社製ｑＮＡＮＯ（商品名）を用いて抵抗パルスセンシングによる測定を行った。ウイルスのみの測定及び３’ＳＬＮ−ＧＮＰを用いた場合のウイルスの測定も、対照実験として同じ条件で行った。【０１３６】
具体的には、６’ＳＬＮ−ＧＮＰであることの確認の後、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型との相互作用の確認のために抵抗パルスセンシング測定を行った。図３Ａ〜図３Ｃは抵抗パルスセンシング測定結果の粒径及び持続時間による散布図である。図３Ａは、ウイルス溶液の抵抗パルスセンシング測定結果の、粒径及び持続時間についての散布図である。図３Ｂは、ウイルス溶液に６’ＳＬＮ−ＧＮＰを混合した場合の抵抗パルスセンシング測定結果の、粒径及び持続時間についての散布図である。図３Ｃは、ウイルス溶液に３’ＳＬＮ−ＧＮＰを混合した場合の抵抗パルスセンシング測定結果の、粒径及び持続時間についての散布図である。これらの結果は、ウイルスのサイズ分布は６’ＳＬＮ−ＧＮＰとの混合後に大粒径側に移動したことを示している。このことは、ウイルスと６’ＳＬＮ−ＧＮＰとの間の相互作用を示している。散布図から変換して得られたサイズのヒストグラム（図４）では、ＧＮＰのウイルスへの付着によるサイズ分布のシフトがより明瞭に理解できる。しかし、ウイルスが３’ＳＬＮ−ＧＮＰと混合された際にも、６’ＳＬＮ−ＧＮＰの場合のサイズシフトほど大きくはないものの、サイズシフトは観察された。このことは、ウイルスと３’ＳＬＮ−ＧＮＰとの間で非特異的相互作用が起こったことを示している。ただし、これらのデータの比較ではサイズシフトが特異的な相互作用であることを確認することができない。【０１３７】
得られた６’ＳＬＮ−ＧＮＰおよび３’ＳＬＮ−ＧＮＰの分散安定性が低いため、３’ＳＬＮ−ＧＮＰのウイルス上への望まれない付着が生じた可能性がある。３’ＳＬＮ−ＧＮＰあるいは６’ＳＬＮ−ＧＮＰの場合、粒子は静電的相互作用により懸濁している。１／３×ＰＢＳの条件では電荷は遮蔽される可能性があり、これにより望まれない付着が疎水性相互作用、水素結合及びファンデルワールス力などの分子間力により生じたものと推測される。さらに、Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型の溶液は、感染したニワトリの胚の漿尿液から収集したものであり、ここにはタンパク質など多くの不純物が含まれる。これらの不純物もＧＮＰの望まれない凝集を促進する可能性がある。しかし、ウイルスが３’ＳＬＮ−ＧＮＰと混合されたときの分布シフトの量は、６’ＳＬＮ−ＧＮＰの場合よりも小さかった。ウイルスとＧＮＰとの間の非特異的相互作用が抑制されたなら、６’ＳＬＮ−ＧＮＰの特異的認識はより明瞭に観察されることになる。持続時間（電気抵抗増大ピークの持続時間）のヒストグラムを参考のため比較した（図５）が、分布シフトと持続時間との間に相関は無かった。【０１３８】
（６’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰを有するウイルスの抵抗パルスセンシング）
Ａ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型の溶液を１／３ＰＢＳバッファーで２ＨＡＵとなるように希釈した。１／３ＰＢＳバッファー中の６’ＳＬＮ−ＧＮＰ溶液（１．２９ＯＤ、８．４１×１０１１粒子／ｍＬ）も調製した。４５μＬずつの各溶液を混合し、１０分間静置し、抵抗パルスセンシングによる測定を行った（ウイルスの最終濃度は１ＨＡＵ（８．６１×１０８粒子／ｍＬ）であった）。ウイルスのみの測定、ＳＢ−ＧＮＰを有するウイルスの測定及び６’ＳＬＮ−ＧＮＰを有するウイルスの測定も、対照実験として同じ条件で行った。【０１３９】
この測定性能を評価するための分子認識実験の結果は以下のとおりであった。ウイルス溶液と比較して、ＳＢ−ＧＮＰ（ＳＡ受容体無し）を有するウイルスではウイルスサイズ分布に変化は見られなかった（図７の最上段のグラフ及び上から２番目のグラフ）。この結果によると、ＧＮＰのウイルスへの非特異的吸着は分散安定性の向上により完全に抑制された。一方、６’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰを含むウイルス溶液のサイズ分布は、大粒径側への明らかなシフトを示した（図７の上から３番目のグラフ）。この結果は、ウイルスとＧＮＰとの間の相互作用が６’ＳＬＮ部分により促進されることを示している。この相互作用の特異性を確認するために、３’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰのサイズ分布も対照実験として評価したが、分布のシフトは見られなかった（図７の最下段のグラフ）。これらの結果から、ＳＢ−ＳＨ共固定技術を用いることにより非特異的相互作用は抑制されたものと結論づけた。【０１４０】
この検出結果はＩＣＴと比較して高感度である。鳥インフルエンザ又はヒトインフルエンザを区別するイムノクロマトグラフィー（ＩＣＴ）技術についての先の報告によれば、陽性の結果が３２ＨＡＵから観察された。ＨＡＵはヘマグルチネーションユニット（あるいは血球凝集化単位）を意味し、この値はニワトリの赤血球細胞を用いた場合のウイルスの感染能力として定義される。本実験結果においては、サイズシフトは１ＨＡＵウイルス溶液において既に観察され、これはＩＣＴ技術によるものよりも低濃度であった。我々の実験によれば、１０分間に５６７ウイルス粒子がポアを通過した。このウイルス粒子数でサイズシフトを検出するのに十分なサイズ分布ヒストグラムが得られているため、測定粒子数をさらに低減させてもウイルス粒子の検出は十分に可能と推測できる。もし１００ウイルス粒子で統計的情報が得られるならば、感度は０．２ＨＡＵ以上ということになる。また、本実験結果を基にさらに実験条件を最適化すればさらに高い感度を達成できると予想できる。このように、分子認識技術を用いた抵抗パルスセンシング測定は標的粒子を正確に検出する有望な技術である。【０１４１】
（ウイルスの定量的算出）
我々の実験では、得られたウイルスのサイズ分布は全ての場合において非対称な形状となっているが、これは凝集ウイルスに由来するものである。ウイルスのサイズは８０〜１２０ｎｍの径であるから、分布のピークが単分散インフルエンザウイルスであることには疑問はない。しかし、ウイルスは独立した分散状態で溶液中に懸濁しているとは限らず、凝集して分散していることもある。このため、我々はサイズ分布がモノマー、ダイマー及びトリマーの合計であったと仮定して、ウイルスの量を定量的に計算した。図８には、サイズ分布を、モノマー、ダイマー及びトリマーに起因する３つのガウス分布曲線に波形分離したものを示している。この計算によれば、サイズ分布における９８ｎｍ、１１８ｎｍ及び１６６ｎｍの各ピークが得られた。なお、サイズ分布中のダイマー及びトリマーのピークは平均流体力学半径として得られる。例えば、ダイマーがポアの面に垂直に通過したならば、電流の阻止は単独のウイルスの場合とほとんど同じであり、一方ダイマーがポアの面に平行な通過したならば電流の阻止は最大になる。つまり、イオン電流を排除している断面の面積によって、電流の阻止の大きさが影響される。この、粒子方向への依存性は、孔の断面積が深さ方向に一定ではない（この実施例ではコニカル型）ことに起因している。得られたサイズ分布における広く広がった幅は、ウイルスがポアを通過する際の向きによるものである。波形分離の結果、粒子のうち、個数基準で４３．８％は単独のウイルス粒子であり、３５．８％はダイマーであり、２０．４％はトリマーであった。【０１４２】
６’ＳＬＮ／ＳＢ−ＧＮＰ処理の後では、分布における全てのピークがシフトし、粒子含有量の比はウイルスのみの場合における比とよく一致した。このため、分子認識を用いた分布変化は、標的ウイルスを検出するための信頼に足る情報である。抵抗パルスセンシング測定の利点は、定量的計算がウイルス粒子の直接計数により簡単に得られることである。ほとんどの場合、医療分野におけるウイルスの定量的計算はウイルスの物理的量として表されるものではなく、血球凝集単位（ＨＡＵ）、プラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）及び５０％組織培養感染性用量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）等の感染力価によって表される。これらの値は、ウイルスの数を表しているものではないが、感染リスクの測定のためにはよく適している。ウイルスの感染性はウイルスの種類に依存する、つまり抵抗パルスセンシング測定技術は、物理的量及びウイルス力価と比較して感染性を理解するのに有用なものである。数的測定は、従来知識とは異なる観点から免疫学的システムを調べる新興の技術となりうる。【０１４３】
以上の実験結果から示されるように、本開示に係る修飾ナノ粒子を用いて検出対象物の検出を行った場合には、ヒトインフルエンザと鳥インフルエンザという類似性が高い検出対象物同士を区別して、検出対象物の選択的な検出が可能であった。また、その検出感度も高いものであった。なお、実験で用いたＡ型ヒトインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４）はニワトリ胚での培養により得たものであって、多量の夾雑物が含まれる。しかし、そのように夾雑物が多い生物学的サンプルであっても、選択的且つ高感度での検出が可能であった。また、本実験においてはサンプルは希釈して用いているが、希釈せずに用いればより微量であっても検出が可能である。【０１４４】
また、上記の実施例では６’ＳＬＮをヒトインフルエンザの検出に用いたが、６’ＳＬＮを他のオリゴ糖に置き換えることにより、容易に他のウイルスや細菌を検出するための試薬や修飾ナノ粒子を得ることができる。【０１４５】
２０１７年４月２８日に出願された日本国特許出願２０１７−０９０５６７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月28日(2019.2.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾ナノ粒子及び水性媒体を含む分散液と、抵抗パルスセンシング装置と、を含む、特定のウイルスの検出用セットであって、
前記修飾ナノ粒子は、
金ナノ粒子と、
前記金ナノ粒子の表面に結合した分散性向上基と、
前記金ナノ粒子の表面に結合した、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、
を含み、
前記特定のウイルスはＡ型インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１亜型であり、
前記オリゴ糖はα２，６−シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミンであり、前記オリゴ糖の前記金ナノ粒子の表面への結合は以下の構造式によって表され、
【化１】
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前記分散性向上基はスルホベタイン基であって、前記分散性向上基の金ナノ表面への結合は以下の構造式によって表され、
【化２】
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前記抵抗パルスセンシング装置は、第１のチャンバと、第２のチャンバと、第１のチャンバと第２のチャンバの間の隔壁として設けられ且つ４０ｎｍ〜１０μｍの範囲内の孔径を有する孔を有するポリマー膜とを有し、前記第１のチャンバ及び前記第２のチャンバは電解液で満たされており、前記第１のチャンバと前記第２のチャンバとの間には０．０１ｋＰａ〜２．０ｋＰａの範囲内の圧力差が適用され、前記第１のチャンバの壁に設けられた電極と前記第２のチャンバの壁に設けられた電極との間に５０ｍＶ〜１０Ｖの範囲内の電圧が印加される、特定のウイルスの検出用セット。
【請求項２】
ナノ粒子と、
前記ナノ粒子の表面に結合した分散性向上基と、
前記ナノ粒子の表面に結合した、特定のウイルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、
を含む、修飾ナノ粒子。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、金属ナノ粒子又はポリマーナノ粒子である、請求項２に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項４】
前記ナノ粒子の数平均粒子径が５ｎｍ〜１００ｎｍである、請求項２又は請求項３に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項５】
前記オリゴ糖がインフルエンザウイルスを選択的に捕捉する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項６】
前記オリゴ糖が特定の種類のインフルエンザウイルスを選択的に捕捉する、請求項５に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項７】
前記分散性向上基が、末端にスルホベタイン基、カルボキシベタイン基又はホスホベタイン基を有する、請求項２〜６のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子。
【請求項８】
請求項２〜７のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子と、水性媒体と、を含む分散液。
【請求項９】
請求項２〜７のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子又は請求項７に記載の分散液と、抵抗パルスセンシング用有孔膜と、を含む、抵抗パルスセンシング用セット。
【請求項１０】
請求項２〜７のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子又は請求項７に記載の分散液と、抵抗パルスセンシング装置と、を含む、特定のウイルス又は細菌の検出用セット。
【請求項１１】
請求項２〜７のいずれか１項に記載の修飾ナノ粒子を含む、抵抗パルスセンシングにより特定のウイルス又は細菌を検出するための試薬。
【請求項１２】
粒子径分布における粒子径ピークのシフトの有無を基に前記特定のウイルス又は細菌を検出するための、請求項１１に記載の試薬。
【請求項１３】
（ａ）生物学的液体サンプル中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
（ｂ）前記生物学的液体サンプルを請求項１１又は請求項１２に記載の試薬と混合して混合液を得る工程、及び
（ｃ）前記混合液中に含まれる粒子の粒子径分布を抵抗パルスセンシングにより測定する工程、
を含み、前記ウイルス又は細菌に対応する粒子径範囲において、前記工程（ａ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置よりも前記工程（ｃ）で得られた粒子径分布におけるピーク位置の方が大粒子径側にシフトしているピークが存在する場合に、前記生物学的液体サンプルは前記ウイルス又は細菌を含むと判定する、ウイルス又は細菌の検出方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）において、抵抗パルスセンシングによる測定の前に前記生物学的液体サンプルは前記オリゴ糖を表面に有しないナノ粒子と混合される、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
前記工程（ａ）及び前記工程（ｂ）のうち少なくとも一方において、前記生物学的液体サンプルは水性媒体と混合される、請求項１３又は請求項１４に記載の検出方法。
【国際調査報告】
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