(57)【要約】  本発明の目的は、活性型ＶＤ３の前駆体である７−デヒドロコレステロールの産生量が増加した形質転換植物およびその利用技術を提供することである。異なる２種類の第１および第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子を有する植物において、当該第１および第２の２つの７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現が抑制されている植物を提供することにより、上記課題を解決する。
2019163601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる２種類の第１および第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子を有する植物において、当該第１および第２の２つの７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、植物。
【請求項２】
前記第１の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の植物：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項３】
前記第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子であることを特徴とする、請求項１に記載の植物：
（ｆ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｉ）配列番号４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項４】
前記植物が、コレステロール由来のステロイドサポニンを大量に生産する植物であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の植物。
【請求項５】
前記植物が、ナス科、ユリ科、ゴマノハグサ科、ヤマノイモ科またはシソ科の植物であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の植物。
【請求項６】
前記植物が、トマト、ジャガイモ、ヤコウボク、ルリヤナギまたはキダチタバコであることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載の植物。
【請求項７】
前記７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現の抑制が、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＰＰＲモチーフ、イオンビーム照射、紫外線照射、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたは相同組換えにより行われることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載の植物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の植物を用いた、７−デヒドロコレステロールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換植物、およびその利用技術、例えば、当該形質転換植物を用いた７−デヒドロコレステロールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＤ３（以下、「ＶＤ３」とも称する。）および活性型ＶＤ３は、生体内でカルシウム・リン代謝を調節する成分であり、骨粗鬆症および運動機能低下の予防・治療、欠乏治療等に有効であることが知られている。したがって、ＶＤ３もしくは活性型ＶＤ３、またはそれらの前駆体を、大量に、かつ、低価格で提供することが求められている。【０００３】
ＶＤ３もしくは活性型ＶＤ３、またはそれらの前駆体を大量に生産する技術として、植物を用いた生産が検討されている。例えば、ナス科植物には、植物ステロールの生合成系の他に、ＶＤ３の前駆体である７−デヒドロコレステロール（以下、「７−ＤＨＣ」とも称する。）を合成するコレステロールの生合成系が存在することが知られており、これを利用してＶＤ３もしくは活性型ＶＤ３、またはそれらの前駆体を大量に生産することが検討されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２３９４１２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述した技術では、活性型ＶＤ３等の効率的な生産技術としては十分ではなかった。【０００６】
そこで、本発明の一態様は、活性型ＶＤ３の前駆体である７−ＤＨＣの産生量が増加した形質転換植物およびその利用技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記の課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、異なる２種類の７−デヒドロコレステロールレダクターゼを有するナス科植物において、これら２種類の酵素遺伝子の発現を同時に抑制することにより、７−ＤＨＣの産生量を増加させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明の一態様は、以下の発明を包含する：
異なる２種類の第１および第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子を有する植物において、当該第１および第２の２つの７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、植物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様によれば、ＶＤ３の前駆体である７−ＤＨＣの産生量が増加した形質転換植物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、推定される植物ステロール合成経路およびコレステロール合成経路を示す図である。
【図２】図２は、７−ＤＨＣからコレステロールまたはＶＤ３へ変換される経路を示す図である。
【図３】図３は、ＬｅＤＷＦ５ＨをノックアウトするためのガイドＲＮＡの配列設計を示す図である。
【図４】図４は、ＬｅＤＷＦ５をノックアウトするためのガイドＲＮＡの配列設計を示す図である。
【図５】図５は、ガイドＲＮＡ発現ベクター（ｐＭｇＰ２３７−２Ａ−ｇｆｐ）を示す図である。
【図６】図６は、ガイドＲＮＡ発現ベクター（ｐＭｇＰ２３７）を示す図である。
【図７】図７は、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトするためのベクターを示す図である。
【図８】図８は、ＬｅＤＷＦ５Ｈをノックアウトしたトマト毛状根のＬＣ−ＭＳによる分析結果を示す図である。
【図９】図９は、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトしたトマト毛状根のＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトしたトマト毛状根の７−ＤＨＣおよびコレステロールの含有量を分析した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトしたトマト毛状根のＬＣ−ＭＳによる分析結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトしたトマト毛状根のＬＣ−ＭＳによる分析結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトしたトマト毛状根のＧＣ−ＭＳによる７−ＤＨＣの含有量を分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）にて存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）を変更してもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００１２】
＜１．本発明の概要＞
本発明の一実施形態において、異なる２種類の第１および第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子を有する植物において、当該第１および第２の２つの７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現が抑制されている植物（以下、「本発明の植物」と称することもある。）を提供する。以下、「異なる２種類の第１および第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼ」について、それぞれ「ＤＷＦ５」および「ＤＷＦ５Ｈ」（※Ｈはホモログを意味する）と称し、これらの遺伝子をそれぞれ「ＤＷＦ５遺伝子」および「ＤＷＦ５Ｈ遺伝子」と称することもある。また、総称としての「７−デヒドロコレステロールレダクターゼ」を「Ｃ７Ｒ」と称することもある。
【００１３】
ＶＤ３の産生は、７−ＤＨＣの５位および７位に存在する二重結合が、紫外線等による開環反応によりプレＶＤ３となり、その後ＶＤ３へ異性化することにより生じる。したがって、５位および７位の二つの二重結合の存在が重要である。
【００１４】
ここで、トマトを含むナス科植物は、多くの植物が通常有する植物ステロール合成経路の他に、コレステロール合成経路を有する（図１）。このような植物では、７−ＤＨＣの７位の二重結合の還元が速やかに進行するため、結果として、７−ＤＨＣはコレステロールへ変換され、７−ＤＨＣの蓄積量はわずかである（図２）。
【００１５】
植物ステロール合成経路の他に、コレステロール合成経路を有する植物として、例えば、トマト（Solanum Lycopersicum）が挙げられる。トマトでは、ＤＷＦ５およびＤＷＦ５Ｈとして、それぞれＬｅＤＷＦ５およびＬｅＤＷＦ５Ｈを有する。ここで、従来、トマトでは、ＬｅＤＷＦ５が植物ステロール合成経路に関与し、ＬｅＤＷＦ５Ｈがコレステロール合成経路に関与すると考えられていた（Prashant et al., “Plant cholesterol biosynthetic pathway overlaps with phytosterol metabolism,” Nature Plant., (2016)）。このため、本発明者らは、トマトにおいてＬｅＤＷＦ５Ｈを抑制すれば、コレステロール合成経路における７−ＤＨＣからコレステロールへの変換が妨げられ、その結果として７−ＤＨＣが大量に蓄積すると仮定して実験を行った。しかし予想は外れ、７−ＤＨＣの蓄積の増加は見られなかった。
【００１６】
そこで、本発明者らは、さらに鋭意検討を進めた結果、驚くべきことに、後述する実施例に示すように、ＬｅＤＷＦ５およびＬｅＤＷＦ５Ｈの２つの遺伝子を同時に抑制することにより、７−ＤＨＣの産生量が増加することを初めて見出した。
【００１７】
したがって、本発明の植物は、ＶＤ３の前駆体である７−ＤＨＣの産生量が増加しているという、顕著な効果を奏する。
【００１８】
＜２．異なる２種類の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現が抑制されている植物＞
本発明の植物は、ＤＷＦ５遺伝子およびＤＷＦ５Ｈ遺伝子の発現が抑制されていればよく、その他の具体的な構成は特に限定されない。以下、本発明における態様について詳述する。
【００１９】
＜２−１．７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子＞
本明細書において、「７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（Ｃ７Ｒ）」は、コレステロールおよび／または植物ステロールのステロイド骨格の第７位の二重結合を還元する酵素活性を有するタンパク質を意味する。例えば、７−ＤＨＣのステロイド骨格の７位と８位との間の二重結合を還元する酵素活性を有するタンパク質を例示できる。Ｃ７Ｒの作用により、７−ＤＨＣがコレステロールへと変換される。コレステロールは、さらに、ステロイドサポニン、およびステロイドグリコアルカロイド（以下、「ＳＧＡ」とも称する）等へと変換される。
【００２０】
本発明の一実施形態において、Ｃ７Ｒは、上述の還元活性を有するタンパク質であれば、特に限定されない。ＤＷＦ５遺伝子は、例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子である。
【００２１】
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｃ７Ｒ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｃ７Ｒ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｃ７Ｒ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００２２】
また、ＤＷＦ５Ｈ遺伝子は、例えば、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子である。
【００２３】
（ｆ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｃ７Ｒ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、Ｃ７Ｒ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｉ）配列番号４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｃ７Ｒ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００２４】
上記（ａ）の遺伝子について説明する。配列番号１は、トマト由来のＣ７Ｒの一種であり、全長４３５アミノ酸残基から構成されるタンパク質である。
【００２５】
続いて、上記（ｆ）の遺伝子について説明する。配列番号３は、トマト由来のＣ７Ｒの一種であり、全長４３５アミノ酸残基から構成されるタンパク質である。また、上記（ｆ）の遺伝子は、上記（ａ）遺伝子のホモログである。
【００２６】
前記（ｂ）および（ｇ）の遺伝子は、それぞれ、配列番号１および３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、Ｃ７Ｒ活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。ここで、欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数は、上記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって欠失、置換または付加できる程度の数をいう。そのようなアミノ酸の数は、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、より好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは７アミノ酸以内、とりわけ好ましくは５アミノ酸以内（例えば、５、４、３、２または１アミノ酸）である。また、本明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等により人為的に導入された変位を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００２７】
変異するアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されていることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、標的アミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異させることがより好ましい。
【００２８】
本明細書において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、配列番号１および３のいずれかに記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。本明細書において、配列番号１および３のいずれかに記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質の生物学的機能や生化学的機能としては、例えば、７−ＤＨＣのステロイド骨格の７位と８位との間の二重結合を還元する機能を挙げることができる。生物学的機能には、発現する部位の特異性や、発現量等も含まれ得る。変異を導入したタンパク質が機能的に同等であるか否かは、そのタンパク質をコードする遺伝子を導入発現させた形質転換体を取得し、この形質転換体が７−ＤＨＣを基質として、当該７−ＤＨＣのステロイド骨格の７位と８位との間の二重結合を還元し得るかどうかを調べることにより判断できる。
【００２９】
前記（ｃ）および（ｈ）の遺伝子も、それぞれ、配列番号１および３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、７−ＤＨＣのステロイド骨格の７位と８位との間の二重結合を還元する酵素活性（すなわち、７−ＤＨＣを還元する活性）を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。
【００３０】
アミノ酸配列の同一性とは、アミノ酸配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の同一性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
【００３１】
本明細書において「同一性」（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、同一のアミノ酸残基数の割合を指す。なお、アミノ酸の性質については上述したとおりである。
【００３２】
上記（ｄ）および（ｉ）の遺伝子について、配列番号２および４は、それぞれ、配列番号１および３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列（Open Reading Frame：ＯＲＦ）を示す。
【００３３】
上記（ｅ）の遺伝子は、上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意図する。また、上記（ｊ）の遺伝子は、上記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意図する。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、さらに好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、前記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する前記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、前記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【００３４】
また、上記（ｅ）および（ｊ）の遺伝子には、それぞれ、配列番号２および４に記載の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１〜５０個の塩基配列が置換、欠損、挿入および／または付加しているＤＮＡからなる遺伝子、および配列番号２および４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡからなる遺伝子も含まれる。
【００３５】
上記遺伝子・タンパク質を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit；東洋紡製、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit; Clontech製、QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製等）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（polymerase chain reaction：ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
【００３６】
また、上記遺伝子は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、特に限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。このような塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。
【００３７】
本発明の植物は、上述の通り、ＤＷＦ５遺伝子およびＤＷＦ５Ｈ遺伝子の発現が抑制されている。
【００３８】
上記遺伝子の発現を抑制する方法としては、特に限定されることなく、当分野において使用される任意の方法が用いられる。例えば、ＺＦＮ（Zinc Finger Nucleases）、ＴＡＬＥＮ（Transcription Activator Like Effector Nucleases）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats /CRISPR Associated Proteins 9）、ＰＰＲ（Pentatrico Peptide Repeat）モチーフ、イオンビーム照射、紫外線照射、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、相同組換え等の方法が挙げられる。各方法は、例えば、以下の文献に記載されている：ＺＦＮ（Kim YG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:1156-1160, 1996）、ＴＡＬＥＮ（Christian et al., Genetics, 186:757-761, 2010）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Gilbert et al., Cell, 154:442-451, 2013）、ＰＰＲモチーフ（国際公開第２０１４／１７５２８４号公報）、イオンビーム照射（A. Tanaka et a1., Int. J. Radiat. Bio1. 72: 121-127, 1997）、紫外線照射（鵜飼  保雄、植物育種学  東京大学出版センター（2003年））、ｓｉＲＮＡ（Elbashir SM et al., Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8）、ｍｉＲＮＡ（Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96, 2002）、ｓｈＲＮＡ（Bernstein E, Caudy AA et al, Nature; 409(6818): 363-6, 2001）、アンチセンスＲＮＡ（Ching et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10006-10010（1989）。
【００３９】
なお、上記の遺伝子発現抑制法により、本発明の植物を製造する方法もまた、本発明の範囲に包含されることを付言する。
【００４０】
本発明の一実施形態において、上記遺伝子発現の抑制の対象とする植物材料としては、例えば、根、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、細胞、カルス、それを酵素処理して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の一実施形態において、上記（ａ）〜（ｊ）遺伝子に改変（破壊）をもたらし得る適当なベクターを構築し、それを植物細胞に導入し、該細胞から形質転換植物を再生させることにより、本発明の植物を作製できる。
【００４２】
上述のように形質転換した植物細胞は、当業者に公知の手法により、植物個体に再生することができる。例えば、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法などが挙げられる。
【００４３】
他にも、形質転換の対象とする植物材料として植物組織、例えばリーフディスクを用いた場合、アグロバクテリウム感染後、これらを無機塩類、ビタミン類、炭素源（エネルギー源としての糖類など）、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン等の植物ホルモン）やカナマイシン等の選抜薬剤等を加えて滅菌した再分化固型培地上で適当な光および温度条件の下、培養することによって茎葉を形成させることができる。次に、上記固型培地より植物生長調節物質を除いた培地（発根培地）上で茎葉を培養することにより不定根を誘導し、完全な植物体へと再生することができる。なお、使用する培地としては、例えば、ＬＳ培地、ＭＳ培地などの一般的なものが挙げられる。
【００４４】
上記形質転換体において、遺伝子の発現が抑制されているか否かの確認は、上記（ａ）〜（ｊ）のいずれかの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が抑制されているか否かを判定することにより行われる。
【００４５】
上記（ａ）〜（ｊ）の遺伝子は、７−ＤＨＣを還元する活性を有するタンパク質をコードしているため、植物においてこれらの遺伝子の有無、あるいは該遺伝子の発現が抑制されているか否かを判定することにより、当該植物が７−ＤＨＣを大量に生産し得るか否かを簡易に判断できる。
【００４６】
具体的な判定方法については従来公知の方法を用いることができるが、例えば、（ｉ）対象となる植物体からＤＮＡ試料を得て、遺伝子の有無、または遺伝子に変異が導入されて発現が抑制されているか否かを調べる方法、（ｉｉ）上記遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの有無または量を調べる方法、（ｉｉｉ）上記遺伝子の転写産物であるタンパク質の有無または量を調べる方法等を挙げることができる。
【００４７】
上記ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を調べる手法としては、従来公知の方法を利用でき、特に限定されないが、例えば、プローブを用いる手法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、抗体を用いた各種イムノアッセイ法、マイクロアレイを利用する方法等を挙げることができる。
【００４８】
＜２−２．植物＞
本発明の一実施形態において、異なる２種類のＣ７Ｒをコードする遺伝子の発現を抑制する対象となる植物は、異なる２種類のＣ７Ｒを有する植物であれば、その他の構成は特に限定されない。
【００４９】
本発明の一実施形態において、植物は、例えば、コレステロール由来のステロイドサポニンを大量に生産する植物であり得る。コレステロール由来のステロイドサポニンを大量に生産する植物においては、コレステロールが大量に生産されていると推測される。よってこのような植物においては、７−ＤＨＣからコレステロールへの変換を抑制することによって、７−ＤＨＣの産生量が増加した植物を実現することができる。そのような植物としては、例えば、ナス科、ユリ科、ゴマノハグサ科、ヤマノイモ科またはシソ科の植物が挙げられる。より具体的には、そのような植物として、ナス科のジャガイモ（Solanum tuberosum)、トマト（Solanum lycopersicum)、ルリヤナギ(Solanum glaucophyllum）、ヤコウボク（Cestrum nocturnum）、キダチタバコ（Nicotiana glauca）、ゴマノハグサ科のジギタリス(Digitalis purpurea)、ヤマノイモ科のヤムイモ（Dioscorea sp.）、シソ科のジュウニヒトエ（Ajuga reptans）等が挙げられる。好ましくは、植物は、トマトまたはジャガイモであり得る。これらの植物では、代謝経路が明らかとなっているため、異なる２種類のＣ７Ｒをコードする遺伝子の発現を抑制する対象として好適である。
【００５０】
本発明の植物は、植物体全体、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、果実等）、植物組織（例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、植物細胞、カルス等のいずれをも包含する。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。
【００５１】
また、一旦、染色体内の上記（ａ）〜（ｊ）の遺伝子が破壊もしくは発現抑制された形質転換植物が得られれば、上記植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。上記植物やその子孫、あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に上記植物を量産することもできる。また、本発明の植物は、形質転換処理を施した再分化当代である「Ｔ０世代」やＴ０世代の植物の自殖種子である「Ｔ１世代」などの後代植物や、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物を含む。
【００５２】
＜３．７−デヒドロコレステロールの製造方法＞
本発明の一実施形態において、上記＜２＞に記載の本発明の植物を用いた、７−ＤＨＣの製造方法（以下、「本発明の製造方法」と称することもある。）を提供する。
【００５３】
本発明の製造方法は、上記＜２＞に記載の本発明の植物を用いるものであれば、特に限定されない。
【００５４】
上述した通り、異なる２種類のＣ７Ｒをコードする遺伝子の発現が抑制されている植物では、７−ＤＨＣの産生量が増加している。したがって、本発明の製造方法により、ビタミンＤ３の前駆体である７−ＤＨＣを効率的に製造することができる。
【００５５】
本発明の製造方法において、本発明の植物は、当分野における任意の方法を用いて、培養することができる（例えば、大沢勝次、図集・植物バイテクの基礎知識、農山漁村文化協会（２００５）、大沢勝次、植物バイテクの実際、農山漁村文化協会（２００３）等を参照）。
【００５６】
本発明の製造方法により生産された７−ＤＨＣは、植物から分離し、実質的に純粋で均一な化合物として精製することができる。７−ＤＨＣの分離、精製は、通常の化合物の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、透析および再結晶等を適宜選択または組み合せることにより、７−ＤＨＣを分離、精製することができる。さらに、これらの方法を複数組み合わせることもできる。
【００５７】
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオンのイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィーおよび吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００５８】
本発明の一実施形態は、以下の構成を包含する。
【００５９】
（１）異なる２種類の第１および第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子を有する植物において、当該第１および第２の２つの７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現が抑制されていることを特徴とする、植物。
【００６０】
（２）前記第１の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子であることを特徴とする、（１）の植物：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００６１】
（３）前記第２の７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子が、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子であることを特徴とする、（１）の植物：
（ｆ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｇ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｈ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｉ）配列番号４に記載される塩基配列からなる遺伝子；
（ｊ）前記（ｆ）〜（ｉ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００６２】
（４）前記植物が、コレステロール由来のステロイドサポニンを大量に生産する植物であることを特徴とする、（１）から（３）のいずれかの植物。
【００６３】
（５）前記植物が、ナス科、ユリ科、ゴマノハグサ科、ヤマノイモ科またはシソ科の植物であることを特徴とする、（１）から（４）のいずれかの植物。
【００６４】
（６）前記植物が、トマト、ジャガイモ、ヤコウボク、ルリヤナギまたはキダチタバコであることを特徴とする、（１）から（５）のいずれかの植物。
【００６５】
（７）前記７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現の抑制が、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＰＰＲモチーフ、イオンビーム照射、紫外線照射、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたは相同組換えにより行われることを特徴とする、（１）から（６）のいずれかの植物。
【００６６】
（８）（１）〜（６）のいずれかの植物を用いた、７−デヒドロコレステロールの製造方法。
【００６７】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００６８】
本発明の実施例について以下に説明する。本実施例においては、代謝経路がほぼ明らかになっているナス科植物のトマトを用いた。また、本実施例においては、遺伝子の発現を抑制するための方法としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いているが、特にこの方法に限定されない。【００６９】
＜１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のための植物形質転換ベクターｐＭｇＰ２３７の構築＞
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９植物形質転換バックボーンベクターは、ｐＭｇＰ２３７−２Ａ−ｇｆｐ（徳島大刑部敬史より分与）を用いた（図５）。このベクターは、ガイドＲＮＡをシロイヌナズナのＵ６−２６（ＡｔＵ６−２６）プロモーターでドライブし、Ｃａｓ９を２×３５Ｓのプロモーターでドライブするベクターである。このベクターの特徴は、ガイドＲＮＡとｔＲＮＡをタンデムにつなぎ、複数のガイドＲＮＡを一つのプロモーター直下で発現させることである。ｔＲＮＡは、植物体内でプロセッシングを受けるため、一本のｍＲＮＡとして転写された複数のガイドＲＮＡが植物体内で切断され、それぞれのガイドＲＮＡが現れる。以下にベクターの作成方法を示す。【００７０】
選抜したガイドＲＮＡの配列からロングオリゴをデザインし、北海道システムサイエンスに合成を依頼した。購入したロングオリゴをプライマーにして、ｐＭＤ＿ｇｔＲＮＡを鋳型にＰＣＲを行った。ＰＣＲ用の組成は、以下のとおり調整した。また、使用したプライマー配列は表１に示す。
・Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ（２０ｐｇ）  １．０μＬ
・１０μＭ  Ｆ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．７５μＬ
・１０μＭ  Ｒ  ｐｒｉｍｅｒ  ０．７５μＬ
・ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｕｒｅ  ０．７５μＬ
・５×ＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ
・ＰｒｉｍｅＳＴＲＡ  ＨＳ  ０．２５μＬ
・ＭｉｌｌｉＱ  １５．２５ｍＬ
以下の反応条件でＰＣＲを行った。
・９５℃、３０秒→（９８℃、１０秒／５５℃、２０秒／７２℃、１０秒）を３５サイクル→７２℃、５分間
ＰＣＲ反応産物を２．０％アガロースゲル電気泳動に供し、ＷｉｚａｒｄＲ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）を用いて、ゲルからの抽出および精製を行った。精製したＰＣＲ断片とバックボーンベクターであるｐＭｇＰ２３７−２Ａ−ｇｆｐとを混ぜ合わせ、以下の反応組成でゴールデンゲートクローニングを行った。
・Ｖｅｃｔｏｒ（１００ｎｇ／μＬ）  １．０μＬ
・ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ（１０ｎｇ／μＬ）  ３．０μＬ
・１０×Ｔ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．０μＬ
・ＢｓａＩ  １．０μＬ
・Ｔ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  １．０μＬ
ＭｉｌｌｉＱを用いて、Ｔｏｔａｌを２５μＬとした。【００７１】
２つのガイドＲＮＡを発現させる場合は１つのＰＣＲプロダクトを用い、４つのガイドＲＮＡを発現させる場合は３つのＰＣＲプロダクトを用いた。反応条件は以下に示す通りである。
・（３７℃、５分／１６℃、１０分）を１０サイクル→１２℃
反応溶液中の未消化なベクターを消化するために、ゴールデンゲートクローニング溶液２０μＬに０．５μＬを加えて、５０℃、６０分→８０℃、１５分の条件下で反応を行った。得られた消化済みゴールデンゲーツローニング溶液により大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、ＬＢ寒天培地（Ｋｍ：５０ｍｇ／Ｌ）に播種した。その後、大腸菌のコロニーをかきとり、ＬＢ液体培地（Ｋｍ：５０ｍｇ／Ｌ）で液体培養を行い、プラスミド抽出を行った。得られたプラスミドをシークエンシングにかけ、配列のエラーがなく構築されていることを確認した。これを、形質転換ベクターとした（図６）。【００７２】
【表１】
2019163601.tif 000003
＜２．毛状根の形質転換＞
〔２−１．形質転換ベクターのアグロバクテリウム・リゾゲネスＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓへの導入〕
上記＜１＞で構築した形質転換ベクターを、以下の方法で、Ａ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  １５８３４株へ導入した。まず、構築した形質転換ベクター２μＬとＡ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  １５８３４株のコンピテントセル５０μＬとを十分に混合し、ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーションキュベット／０．１ｃｍギャップ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）に注入した。続いて、キュベットをＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）にセットした後、パルス送出を行った。得られたＡ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  １５８３４株を含む溶液を、ＹＥＢ液体培地１ｍＬに懸濁し、ロータリーシェイカーを用いて、暗所２８℃、２００ｒｐｍの条件下で４時間振とう培養した。振とう培養後の溶液を、ＹＥＢ寒天培地（カナマイシン：５０ｍｇ／Ｌ）に播種し、暗所２８℃で７２時間培養した。得られたシングルコロニーをＹＥＢ液体培地（カナマイシン：５０ｍｇ／Ｌ）３ｍＬに接種し、ロータリーシェイカーを用いて暗所２８℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。得られた培養液３ｍＬのうち２ｍＬはアルカリＳＤＳによるプラスミド抽出に用いた。得られたプラスミドを鋳型として適当なプライマーでＰＣＲを行い、目的遺伝子の挿入を確認した。ＰＣＲはＥｘ  Ｔａｑ  ＨＳ（ＴａＫａＲａ製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の組成は、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ  ０．１μＬ、プラスミド０．５μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ０．８μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、各プライマー（１００μＭ）０．５μＬ、ＭｉｌｌｉＱ水  ６．６μＬを加え、全量１０μＬとした。反応条件は、９５℃で５分間の初期変性後に、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長反応を３５サイクル繰り返し、その後、７２℃で５分間の最終伸長を行った。ＰＣＲによる増幅が見られ、目的遺伝子の挿入が確認できたものは、培養液の残りの１ｍＬでグリセロールストックを作製し、−８０℃で保存した。【００７３】
〔２−２．トマトの準備〕
Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｍ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｂａｕｇｈ，  １９８９）の種子２５粒をエッペンドルフチューブに入れ、そこへ７０％エタノール１ｍＬを加えて１分間転倒混和し、ピペットマンで７０％エタノールを除去した。次に、家庭用キッチンハイター２００μＬとＭｉｌｌｉＱ  ８００μＬとを加えて１５分間転倒混和し、クリーンベンチ内で、ピペットマンを用いて混合液を除去した。滅菌ＭｉｌｌｉＱ水１ｍＬを加えて、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を捨てる作業を３回行ない、種子を洗浄した。滅菌種子を、ＭＳ（１．５％Ｓｕｃｒｏｓｅ）寒天培地５０ｍＬが入ったプラスチックポットに並べ、暗所２５℃で約１０日間育てた。茎が１０ｃｍほど伸びたところで、２５℃、１６時間明条件下（４０〜５０μｍｏｌ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｎｓ／ｍ２／ｓ）に２〜３日間程置き、葉を色づかせた。【００７４】
〔２−３．毛状根の形質転換〕
上記〔２−１〕で各遺伝子を導入したＡ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのグリセロールストックをＹＥＢ寒天培地（カナマイシン：５０ｍｇ／Ｌ）にスプレッドし、暗所２８℃で７２時間培養した。上記〔２−２〕で得られたトマトの茎を１〜１．５ｃｍに切断し、茎の根側の先端をＡ．  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのコロニーに付着させ、Ｂ５寒天培地  ５０ｍＬの入ったプラスチックポットにこの茎の切片を根側が上になるように立てた。これを暗所２５℃で２０日間おき、毛状根が確認できた茎の上部のみを切ってＭＳ寒天培地（２％Ｓｕｃｒｏｓｅ，ＣＥＦ：２５０ｍｇ／Ｌ）に移し、暗所２５℃で７日間おいた。伸びた毛状根は根の先端約１  ｃｍをＢ５寒天培地（２％Ｓｕｃｒｏｓｅ，ＣＥＦ：２５０ｍｇ／Ｌ）に個体ごとで区別がつくように植え継ぎ、暗所２５℃で７日間おいた。Ｂ５寒天培地（２％Ｓｕｃｒｏｓｅ，ＣＥＦ：２５０ｍｇ／Ｌ）で根の先端を植え継ぐ作業を、毛状根ができるまで繰り返した。【００７５】
＜３．毛状根のゲノム抽出およびＰＣＲによる形質転換の確認＞
毛状根に目的遺伝子が挿入されているかどうかをゲノムＰＣＲによって確認した。Ｂ５寒天培地（２％Ｓｕｃｒｏｓｅ，ＣＥＦ：２５０ｍｇ／Ｌ）で植え継いだ毛状根を各遺伝子のラインごとに１本、先端１ｃｍをエッペンドルフチューブに入れ、そこへＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を１５０μＬ加えて爪楊枝ですりつぶした。１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。そこに、イソプロパノールを１５０μＬを加えて十分にピペッティングした後、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を除去した。７０％エタノールを３００μＬ加えて、１５，０００ｒｐｍ、１分間４℃で遠心分離し、上清をデカンテーションで除去した。再度、１５，０００ｒｐｍ、１分間４℃で遠心分離し、ピペットマンで上清を除去した。光照射下で乾燥させ、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ２０μＬに溶かして、十分にピペッティングした。【００７６】
抽出したゲノムのＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ（ＴａＫａＲａ製）を用いて行った。用いたプライマーは表１に示す。ＰＣＲ反応液の組成は、Ｅｘ  Ｔａｑ  ０．０５μＬ、ｔｅｍｐｌａｔｅ  １μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ０．８μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  １μＬ、各プライマー（５μＭ）０．６μＬ、ＭｉｌｌｉＱ水  ５．９５μＬを加え、全量１０μＬとした。反応条件は、９５℃で５分間の初期変性後に、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分の伸長反応を３５サイクル繰り返し、その後、７２℃で５分間の最終伸長を行った。アガロースゲル電気泳動で目的遺伝子の挿入が確認できた毛状根を、形質転換毛状根として、後の解析に用いた。【００７７】
＜４．形質転換毛状根の電気泳動を用いた変異解析＞
抽出したゲノムＤＮＡを用いてターゲット領域の変異解析を行った。変異解析には、Ｈｅｔｅｌｏｄｕｐｌｅｘ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ（ＨＭＡ）法を用いた。その具体的な方法を以下に示す。抽出したゲノムＤＮＡをＱｕｂｉｔ  ２．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて定量し、１ｎｇ／μＬとなるようにＴＥ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した。希釈したゲノムＤＮＡ溶液を、鋳型にそれぞれターゲットサイトを挟み込むように５００ｂｐほどのフラグメントサイズとなるようにデザインしたプライマー（表１）を用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）を用いた。反応組成および反応条件を以下に示す。【００７８】
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ０．１μＬ，５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ，ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）０．８μＬ，Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）１μＬ，各Ｐｒｉｍｅｒ（１０μＭ）０．２５μＬ，ＭｉｌｌｉＱ  ５．６μＬでトータル１０μＬの反応溶液を調整した。反応条件は、９８℃で３分間の初期変性後に、９８℃で１０秒間の変性、５８℃で５秒間のアニーリング、７２℃で３０秒の伸長反応を３５サイクル繰り返し、その後、７２℃で５分間の最終伸長を行った。得られたＰＣＲ産物を５％アクリルアミド、泳動バッファーは１ｘＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｒｉｓ  ８９ｍＭ，Ｂｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ８９ｍＭ，ＥＤＴＡ  ２ｍＭ）を用いて１００Ｖの定電圧で泳動を行った。ゲルの組成は以下のとおりである。４０％アクリルアミド  １．２５ｍＬ，５ｘＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ２ｍＬ，ＭｉｌｌｉＱ  ６．７５ｍＬ，１０％過硫酸アンモニウム１００μＬ，ＴＥＭＥＤ  １０μＬを混合した。電気泳動の結果エキストラバンドの生じたラインを変異導入ラインとして、変異導入ラインの割合の算出を行った。【００７９】
＜５．毛状根の液体培養および形質転換＞
Ｂ５寒天培地（セフォタキシム：２５０μｇ／ｍＬ）で７日間育てた毛状根１０〜１５切片を、２００ｍＬ容フラスコに入れたＢ５液体培地（２％  Ｓｕｃｒｏｓｅ，ＣＥＦ：２５０ｍｇ／Ｌ）５０ｍＬに入れ、暗所２５℃、１００ｒｐｍで１４日間ほど振とう培養した。回収した根は液体窒素で凍らせて、−８０℃で保存した。〔２−３．毛状根の形質転換〕と同様の方法で、毛状根の形質転換を行った。【００８０】
＜６．毛状根のゲノム抽出およびＰＣＲによる形質転換の確認＞
毛状根に目的遺伝子が挿入されているかどうかをゲノムＰＣＲによって確認した。ゲノムＤＮＡの抽出およびＰＣＲによる挿入確認については＜３．毛状根のゲノム抽出およびＰＣＲによる形質転換の確認＞の方法と同様に行った。【００８１】
＜７．形質転換した毛状根の電気泳動を用いた変異解析＞
上記＜４＞と同様に、ＤＷＦ５Ｈ上のターゲット領域を挟み込むように設計したプライマーを用いて、ターゲット領域の変異解析を行った。用いたプライマーは、下記の表２の通りである。なお、プライマーは、それぞれ以下の２つを１セットとして用いた。
・ＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ１  ＦｗとＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ１  Ｒｖ
・ＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ５  ＦｗとＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ５  Ｒｖ
・ＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ６  ＦｗとＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ６  Ｒｖ
・ＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ９  ＦｗとＳＬＤＷＦ５Ｈ＿ｅｘ９  Ｒｖ【００８２】
【表２】
2019163601.tif 000004
＜８．形質転換毛状根の内生ＳＧＡおよび蓄積産物のＬＣ−ＭＳ解析＞
ＬＣ−ＭＳを用いて形質転換毛状根の内生ＳＧＡの分析を行った。具体的には、液体培養を行った毛状根を液体窒素で凍結し破砕した。粉末約３０ｍｇを１．５ｍＬチューブに量り取り、３００μＬの１００％  ＭｅＯＨを加えた。ミルミキサー（Retch社製）を用いて、２７Ｈｚ、１０分間試料を破砕した。その後、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。上清を新しい１．５ｍＬチューブに移し、残渣に再び抽出溶液を３００μＬ加え、同様の操作を繰り返した。抽出溶液を４℃、１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を１００％  ＭｅＯＨで適宜希釈し、ＬＣ−ＭＳ分析用の試料とした。各試料は０．２μｍ  ＰＴＦＥフィルター（Waters社製）を用いてフィルター濾過し、ＬＣ−ＭＳおよび分析に供した。ＬＣ−ＭＳ分析の条件を以下に示す。【００８３】
（ＬＣ−ＭＳ分析条件）
・ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ  ＡＣＱＵＩＴＹＴＭ（Waters社製）、カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３  Ｃｏｌｕｍｎ  １．８μｍ（２．１×１００ｍｍ）（Waters社製）、カラムオーブン温度：４０℃、流速：０．２ｍＬ／分、溶媒条件：二溶媒によるグラジエント溶出、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ：Ｈ２Ｏ（０．１％ギ酸）、Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ：１００％ＭｅＣＮ、グラジエント条件：０〜２５分：９０％  Ａ／１０％  Ｂ−５２％  Ａ／４８％  Ｂ、２５〜３０分：０％  Ａ／１００％  Ｂ
（マススペクトロメーター）
・Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ＥＳＩ  ｍｏｄｅ、ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３ｋＶ、ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔａｇｅ：６０Ｖ、ｓｏｕｒｃｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：１２０℃、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｇａｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：３５０℃、ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  Ｎ２  ｇａｓ  ｆｌｏｗｓ：５０Ｌ／ｈ、ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｎ２  ｇａｓ  ｆｌｏｗｓ：５５０Ｌ／ｈ、注入量：２μＬ、測定モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ、ＭＳ  ｓｃａｎ  ｍｏｄｅ（ｍ／ｚ  ３５０−１４００）
解析結果を、図１に示す。なお図１において、ＤＷＦ５ｋｏ１、ＤＷＦ５Ｈｋｏ２、ＤＷＦ５Ｈｋｏ３、およびＤＷＦ５Ｈｋｏ４はそれぞれ、形質転換ベクターｐＭｇＰ２３７＿ＤＷＦ５Ｈｋｏ１、ｐＭｇＰ２３７＿ＤＷＦ５Ｈｋｏ２、ｐＭｇＰ２３７＿ＤＷＦ５Ｈｋｏ３、およびｐＭｇＰ２３７＿ＤＷＦ５Ｈｋｏ４により形質転換された株を指す。【００８４】
図１に示す通り、ＬｅＤＷＦ５Ｈのノックアウトのみによっては、ＳＧＡの産生量は有意には低下しないことが分かった。このことから、ＬｅＤＷＦ５の機能とＬｅＤＷＦ５Ｈの機能とは重複しており、ＬｅＤＷＦ５がＳＧＡの産生を補完した可能性が考えられた。よって本発明者らは、以下に示すように、ＬｅＤＷＦ５およびＬｅＤＷＦ５Ｈの両方をノックアウトした植物を作成した。【００８５】
＜９．ＤＷＦ５ＨおよびＤＷＦ５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素機能解析＞
〔９−１．Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成〕
トマト葉を、あらかじめ液体窒素で冷却しておいた乳鉢に入れ、粉末状になるまですりつぶした。粉末状の試料からＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。操作は以下の手順で、室温で行った。【００８６】
粉末状の試料１００ｍｇにＲＬＴ  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μＬ、メルカプトエタノール５μＬを添加した。ボルテックスでよく混合し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（ｐｕｒｐｌｅ  ｃｏｌｕｍｎ）に移し、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心した。通過液の上澄みを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上清を新しい１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、１００％エタノールを２２５μＬ加え、混合した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（ｐｉｎｋｃｏｌｕｍｎ）に混合液を入れ、１５，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心した。通過液を捨てｐｉｎｋ  ｃｏｌｕｍｎに１００％エタノールを２２５μＬ加え、ｃｏｌｕｍｎの向きを１８０℃反転させ、１５，０００ｒｐｍ、３０秒間遠心した。この操作をもう一度行った。通過液を捨て、次にＲＷ１  ｂｕｆｆｅｒ  ３５０μＬをｐｉｎｋ  ｃｏｌｕｍｎに入れ、１５，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心し、溶出液を除去した。ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １０μＬにＲＤＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ７０μＬを加え、緩やかに混合した。これをｐｉｎｋ  ｃｏｌｕｍｎに入れ、１５分間静置した。ＲＷ１  ｂｕｆｆｅｒ  ３５０μＬをｐｉｎｋ  ｃｏｌｕｍｎに入れ、１５，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心し、溶出液を除去した。ＲＰＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μＬをｐｉｎｋ  ｃｏｌｕｍｎに入れ、１５，０００ｒｐｍ、１５秒間遠心し、溶出液を除去した。さらに、ＲＰＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μＬをｐｉｎｋ  ｃｏｌｕｍｎに入れ、ｃｏｌｕｍｎの向きを１８０℃反転させ、１５，０００ｒｐｍ、２分間遠心し、溶出液を除去した。１５，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離した。ｐｉｎｋ  ｃｏｌｕｍｎを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒを１５μＬ加え、１分間４℃で静置し、１５，０００ｒｐｍ、１分間遠心した。もう一度この操作を行い、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡとした。得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ製）を用い、ｃＤＮＡを合成した。【００８７】
〔９−２．プライマー設計〕
ＭｉＢＡＳＥを基にＯＲＦを取得するためのプライマーを設計した（表１）。得られたクローンをＴＡクローニング用ベクターおよび酵母発現用ベクターに挿入するための制限酵素認識部位をプライマーのＮ末端とＣ末端に付加した。【００８８】
〔９−３．ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅〕
ＳｌＤＷＦ５ＨおよびＳｌＤＷＦ５について、上記〔９−１〕で得られたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴａＫａＲａ製）のプロトコルに基づいて行った。組成は、Ｅｘ  Ｔａｑ  ＨＳ  ０．１μＬ、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）１．６μＬ、ｃＤＮＡ  ２μＬ、１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  １μＬ、１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  １μＬにＭｉｌｌｉＱ  １２．３μＬを加えて総量を２０μＬとした。【００８９】
反応条件は、初期変性が９５℃で２分間、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分３０秒の伸長反応を３０サイクル繰り返し、その後、７２℃で５分間伸張した。全てのＰＣＲ産物はＧｅｌＲｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ，１０，０００ｘ  ｉｎ  ＤＭＳＯで染色した１×ＴＡＥ  ｂｕｆｆｅｒで作製した１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いた電気泳動に供した。【００９０】
電気泳動後、目的サイズ付近の単一なバンドをアガロースゲル上からメスで切り出し、Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いてｃＤＮＡを抽出した。なお、操作は添付の説明書に従って行った。【００９１】
〔９−４．ＴＡクローニング〕
上記〔９−３〕で精製したＤＮＡ断片４μＬ、Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ１９（ＴａＫａＲａ製）１μＬ、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ製）５μＬを混合し、１６℃で３０分間ライゲーション反応を行った。さらに、ライゲーション溶液をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．  ｃｏｌｉ（ＤＨ５α株）へ形質転換した。【００９２】
〔９−５．制限酵素処理によるインサートＤＮＡの確認〕
ベクターに目的のＤＮＡ断片が挿入されたことを確認するために制限酵素処理を行った。プラスミド溶液  ２μＬ、１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬ、末端の制限酵素サイトと内部の制限酵素サイトを選び、各０．５μＬを含む反応溶液  １０μＬを３７℃で１時間インキュベートした。処理後の試料をアガロースゲル電気泳動に供し、消化の確認およびインサートＤＮＡ断片のサイズの確認をした。試薬は、特に断りがない限り東洋紡株式会社製を用いた。【００９３】
〔９−６．インサートＤＮＡの塩基配列の解読〕
挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を取得するために、得られた約１００ｎｇのプラスミドを用いて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｒ  ｖ３．１／１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）によりシークエンス反応を行った。【００９４】
〔９−７．発現ベクターの構築〕
プラスミドｐＭＤ１９にサブクローニングされたＳｌＤＷＦ５ＨおよびＳｌＤＷＦ５遺伝子全長配列を各制限酵素で処理した。電気泳動により消化の確認後、目的の断片を切り出し、精製した。上記と同様の制限酵素処理を行った酵母発現用ベクターｐＹＥＳ２（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ製）に各クローンのＤＮＡ断片をライゲーションし、該ライゲーション産物を用いてトランスフォーメーションを行った。コンピテントセルをヒートショックした後、常温のＳＯＣ培地  ３００μＬを加え、ＬＢ固形培地（アンピシリン：１００μｇ／ｍＬ）に溶液を１００μＬ撒き、３７℃で約１８時間インキュベートした。翌日、形成されたコロニーを１００μｇ／ｍＬアンピシリン入りのＬＢ液体培地２ｍＬで生育させ、プラスミド抽出、制限酵素処理を行い、正確な配列を含む発現ベクターを作製した。【００９５】
〔９−８．酵母（ＩＮＶＳｃ１）を用いた組み換え酵素発現〕
上記〔９−７〕で構築した酵母発現用ベクターを酵母（ＩＮＶｓｃ１）に導入した。導入にはＥＺ−Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＰ製）を用い、操作については添付のプロトコルに従った。得られた形質転換酵母を用いて以下の操作で組換えタンパク質の発現を行った。【００９６】
（１．）形質転換を行った酵母のシングルコロニーをかきとり、１５ｍＬのＳＣ−Ｕ培地（２％ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）で３０℃、一晩培養を行った。【００９７】
（２．）培養液のＯＤ６００値を測定し、５０ｍＬの発現誘導培地中（ＳＣ−Ｕ，２％ｇａｌａｃｔｏｓｅ，１％ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）でＯＤ６００値が０．４となるように菌懸濁液を加えた。【００９８】
（３．）（２．）で得られた菌液を３０℃で２４時間培養を行い組換えタンパク質の発現を誘導した。【００９９】
（４．）得られた培養液を１，５００×ｇ，５ｍｉｎ，４°Ｃで遠心を行い、菌体の回収を行った。【０１００】
〔９−９．酵素溶液の調製〕
上記〔９−８〕で得られた菌体をＢｕｆｆｅｒ１（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ−ｐＨ７．５，５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。洗浄後の菌体に５００μＬのＢｕｆｆｅｒ１を加え、そこに２５０μＬのａｃｉｄ−ｗａｓｈｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄｓ（ＳＩＧＭＡ製）を加え、４℃で６０ｓｅｃのボルテックスを行った。このボルテックスを５回行い、組換え酵母の破砕を行った。得られた酵母破砕液を、ビーズを吸い上げないようにして別の１．５ｍＬマイクロチューブに移し、このホモジネートを酵素溶液とした。【０１０１】
〔９−１０．組換え酵素アッセイ〕
得られた組換え酵素溶液を用いて、以下表３の反応組成で酵素アッセイを行った。調製した反応溶液を３０℃で２時間反応させた。【０１０２】
【表３】
2019163601.tif 000005
〔９−１１．酵素反応物のＧＣ−ＭＳ解析〕
反応後の酵素溶液から、以下のようにステロールの抽出を行った。具体的には、反応後の酵素溶液（２００μＬ）に等量の酢酸エチルとヘキサンを加え、ボルテックスミキサーで懸濁した。その後、室温、１５０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行い、上層の有機層を回収した。下層には再び等量の酢酸エチルとヘキサンを加えて、同様の操作を行った。この混合溶媒を用いた抽出を合計３回行った。回収した有機層は、ガラス製褐色ミクロチューブに集めて減圧乾固操作を施した。乾固物サンプルに４２μＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ、Thermo scientific1社製）を加え、ヒートブロックで、８０℃、３０分の熱処理を施して試料のトリメチルシリル化（ＴＭＳ化）を行った。ＴＭＳ化を行ったサンプルをＧＣ−ＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｕｌｔｒａ（SHIMADZU社製）に供し、分析を行った。分析条件を以下に示す。【０１０３】
（ＧＣ−ＭＳ分析条件）
・カラム：ＤＢ−１（J & W scientific社、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、内径０．２５ｍｍ）
（ＧＣ条件）
・カラムオーブン温度：１８０℃（０〜１分）、１８０〜２８０℃（１〜６分）、２８０〜３００℃（６〜１６分）、３００℃（１６〜３２分）、気化室温度：２５０℃、注入モード：スプリットレス、サンプリング時間：１分、キャリアガス：Ｈｅ、圧力（１０３．８ｋＰａ）、全流量（１０７．０ｍＬ／分）、カラム流量（１．００ｍＬ／分）、線速度（３８．４ｃｍ／秒）、パージ流量（６．０ｍＬ／分）、スプリット比（１００）
（ＭＳ条件）
・イオン源温度：２５０℃、インターフェース温度：３００℃、溶媒溶出時間：１．５分、スキャン範囲：ｍ／ｚ  ５０〜７００、１５〜３０分
ＧＣ−ＭＳ解析の結果を、図９に示す。なお、図９において、７−ＤＨＣ  ｓｔｄ．は、７−ＤＨＣの定性のためのサンプルを指す。ｅｍｐｔｙは、空の形質転換ベクターにより形質転換された毛状根をサンプルとした結果を示す。ＤＷＦ５ｄｋｏ３＿＃１および＃９は、形質転換ベクターｐＭｇＰ２３７  ｄｋｏ３により形質転換された毛状根をサンプルとした結果を示す。【０１０４】
コントロールとしての空の形質転換ベクターを導入したｅｍｐｔｙ＿＃１  酸加水分解およびｅｍｐｔｙ＿＃１  アルカリ加水分解においては、酸処理およびアルカリ処理にかかわらず、７−ＤＨＣが検出されなかった。それに対して、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトしたＤＷＦ５ｄｋо３＿＃１  酸加水分解、ＤＷＦ５ｄｋо３＿＃１  アルカリ加水分解、ＤＷＦ５ｄｋо３＿＃９  酸加水分解、およびＤＷＦ５ｄｋо３＿＃９  アルカリ加水分解のすべてにおいて、７−ＤＨＣが検出された（すなわち、酸処理、アルカリ処理にかかわらず、７−ＤＨＣが検出された）。このことから、７−ＤＨＣの蓄積には、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方のノックアウトが必要であることが判明した。【０１０５】
ＧＣ−ＭＳ解析の結果から、コレステロールおよび７−ＤＨＣの含有量を解析した結果を図１０に示す。図１０に示す通り、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトすることによって、コレステロール（ＣＨＲ）含有量が低下し、７−ＤＨＣの含有量が増加することが分かった。このことから、ＬｅＤＷＦ５ＨおよびＬｅＤＷＦ５の両方をノックアウトすることにより、図２に示すＣＨＲへのＣ７Ｒによる還元反応が阻害され、その結果として７−ＤＨＣが増加していることが明らかになった。【０１０６】
〔９−１２．毛状根中のＳＧＡのＬＣ−ＭＳ解析〕
（ａ）また、ＤＷＦ５ｄｋｏ２およびＤＷＦ５ｄｋｏ３の毛状根中のＳＧＡの含有量を、ＬＣ−ＭＳにより解析した。毛状根サンプル１００ｍｇに対し、３００μＬのメタノールを３回に分けて加え、１０分間ソニケーションした。その後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行なった。メタノールを回収して、ＬＣ−ＭＳ解析に供した。【０１０７】
ＤＷＦ５ｄｋｏ３の解析結果を図１１に示す。図１１においては、７−デヒドロトマチン（以下、７−ＤＨＴとも称する。）に対応するピークを、丸でマーキングしてある。【０１０８】
なお、ＤＷＦ５ｄｋｏ２の解析結果は、ＤＷＦ５ｄｋｏ３と同様の結果となった（データは示さない）。【０１０９】
また、図１１の結果をさらに解析し、各毛状根中のα−トマチン、および７−ＤＨＴの含有量を算出した結果を、図１２に示す。図１２に示すように、ＤＷＦ５およびＤＷＦ５Ｈをノックアウトすることにより、ＳＧＡの一種であるα−トマチンの含有量が低下することが分かった。一方で、７−ＤＨＣの一部が７−ＤＨＴへと変換されている可能性が示唆された。【０１１０】
（ｂ）また、ＤＷＦ５  ｄｋｏ３＿＃９の毛状根中に含まれる７−ＤＨＣの含有量を、さらに加水分解していない遊離型の７−ＤＨＣと、アルカリ加水分解エステル型の７−ＤＨＣとに分けて、ＧＣ−ＭＳにより解析した。ＧＣ−ＭＳ解析は、上記〔９−１１．酵素反応物のＧＣ−ＭＳ解析〕と同様の方法により行った。結果を、図１３に示す。野生株においては、７−ＤＨＣは検出限界以下の量しか存在しないが、図１３に示すように、ＤＷＦ５およびＤＷＦ５Ｈをノックアウトすることにより、遊離型の７−ＤＨＣが、１０μｇ／ｇＦＷもの量蓄積することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明は、食品添加物、飼料添加物、医薬品原体および中間物、および健康食品等に利用することができる。
【図１】
2019163601.tif 000006
【図２】
2019163601.tif 000007
【図３】
2019163601.tif 000008
【図４】
2019163601.tif 000009
【図５】
2019163601.tif 000010
【図６】
2019163601.tif 000011
【図７】
2019163601.tif 000012
【図８】
2019163601.tif 000013
【図９】
2019163601.tif 000014
【図１０】
2019163601.tif 000015
【図１１】
2019163601.tif 000016
【図１２】
2019163601.tif 000017
【図１３】
2019163601.tif 000018
【配列表】
2019163601000001.app
【国際調査報告】
2019163601.tif 000019
2019163601.tif 000020
2019163601.tif 000021
2019163601.tif 000022