(57)【要約】  腸内細菌叢の変化が近視発症と相関があることを明らかとし、その結果腸内細菌叢の改善によって、近視を抑制できることを見出した。腸内細菌叢の変化を指標として、近視抑制剤をスクリーニングできること、また、ラクトフェリンが近視抑制剤として作用することを見出した。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌叢の変化を指標とする近視抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
近視モデル動物に、
腸内細菌叢を変化させる候補物質を投与し、
近視の指標を測定することにより近視抑制効果の有無を判定する近視抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記近視モデル動物が、
マイナスレンズを装用させ、
近視を誘導するものである請求項２記載の近視抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記近視の指標が、
眼軸長、屈折値、強膜の厚さ、強膜の炎症の少なくとも１つ以上である請求項２、又は３記載の近視抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
腸内細菌叢を改善する有効成分を含む近視抑制剤。
【請求項６】
前記有効成分がラクトフェリンである請求項５記載の近視抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近視の予防、及び治療薬に関する。特に、腸内環境を制御することにより近視進行を抑制する近視抑制剤のスクリーニング方法、及び近視抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、近視の患者数は増加し続けている。例えば、中国では９０％近くの若者が、ソウルでは１９歳男性の９６．５％が近視であると言われている。アジアだけではなく、アメリカやヨーロッパでも近視患者は５０年前に比べて倍増しており、世界の人口のおよそ１／３、すなわち２５億の近視患者がいるとの推定もある（非特許文献１）。【０００３】
患者数の多さにも関わらず、近視は眼鏡やコンタクトレンズで視力を矯正できるために、さほど深刻に受け止められていないのが実情である。しかしながら、重症の近視である強度近視は国内の失明原因の第４位であり、その他にも近視性牽引黄斑症など様々な眼疾患のリスクファクターであることが知られている。【０００４】
全世界において２０００年から２０５０年にかけて近視罹患率は２２．９％から４９．８％へ、重症の強度近視の罹患者数は１億６３００万人から９億３８００万人へと増加すると予想されている（非特許文献２）。上述のように、強度近視は失明を含めた様々な眼疾患のリスクを顕著に増加させることが知られていることから、強度近視患者が増加すれば失明などの眼疾患患者が増加することが予想される。そのため、近視予防の必要性が高まっている。【０００５】
最近の研究によれば、近視は炎症と関連し、眼局所での炎症が近視を進行させること、全身性の炎症性疾患が近視のリスクを増加することが報告されている（非特許文献３）。一方、腸内細菌叢が様々な疾患と相関することが明らかになってきており、腸内細菌叢を変化させることにより、疾患の治療に応用することが試みられている。例えば、炎症性腸疾患などの腸局所の炎症性疾患だけではなく、多発性硬化症など腸から離れた部位に生じる炎症性疾患や、糖尿病などの全身性の炎症性疾患に対しても、腸内細菌叢の改善が効果を有することが明らかになっている（非特許文献４、５）。【０００６】
日本をはじめとして近視が著しく増加しているアジア圏では、１９５０年代頃から大きく食生活が変化してきている。それに伴って腸内細菌叢も大きく変化していると考えられる。食生活の変化に呼応するかのように、アジア圏で近視患者の割合が大きく増加していることから、近視患者の増加に腸内細菌叢の変化が寄与している可能性がある。しかしながら、腸内細菌叢の変化と近視の相関に関する研究は未だ行われていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Dolgin, E., 2015, Nature, Vol.519, p.276-278.
【非特許文献２】Holden, B. A. et al., 2016, Ophthalmology, Vol.123(5), p.1036-1042.
【非特許文献３】Lin, H-J. et al., 2016, EBioMedicine, Vol.10, p.269-281.
【非特許文献４】Honda, K. and Littman, D. L., 2012, Annu. Rev. Immunol., Vol.30, pp.759-795.
【非特許文献５】Miyake, S. et al., 2015, PLoS One, 10(9):e0137429. . doi:10.1371/journal.pone.0137429
【非特許文献６】Jiang X. et al., 2017, The Association for  Researchin Vision and Ophthalmology 2017 Annual Meeting
【非特許文献７】Jang Y.S. et al., 2015, Mucosal Immunol. Vol.8(4), p. 906-917.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
腸内細菌叢が近視発症に関与するのであれば、腸内細菌叢を改善し、近視を予防、あるいは近視の進行を抑制できる可能性がある。本発明は、腸内細菌叢の変化が近視発症に関与する可能性を検討するとともに、近視発症を抑制する方法を開発することを課題とする。腸内細菌叢の変化が近視発症に関与するのであれば、腸内細菌叢の変化を捉え、これを改善することにより、増加する近視患者の数を減少させることができるだけでなく、近視が原因となる失明や種々の眼疾患を減少させることが可能となる。【０００９】
特に、近視の予防法は未成年の子どもを中心に適用されることが予想されるため、より簡便で低侵襲な予防法が求められる。本発明は、腸内細菌叢を改善することによって、近視を予防、抑制する医薬、サプリメントを提供することを課題とする。また、近視を改善する医薬、サプリメントのスクリーニング法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の近視抑制剤のスクリーニング方法、及び近視抑制剤に関する。
（１）腸内細菌叢の変化を指標とする近視抑制剤のスクリーニング方法。
（２）近視モデル動物に、腸内細菌叢を変化させる候補物質を投与し、近視の指標を測定することにより近視抑制効果の有無を判定する近視抑制剤のスクリーニング方法。
（３）前記近視モデル動物が、マイナスレンズを装用させ、近視を誘導するものである（２）記載の近視抑制剤のスクリーニング方法。
（４）前記近視の指標が、眼軸長、屈折値、強膜の厚さ、強膜の炎症の少なくとも１つ以上である（２）、又は（３）記載の近視抑制剤のスクリーニング方法。
（５）腸内細菌叢を改善する有効成分を含む近視抑制剤。
（６）前記有効成分がラクトフェリンである（５）記載の近視抑制剤。
（７）腸内細菌叢を改善する有効成分を含む近視抑制剤を投与することによる近視の治療方法、又は予防方法。
（８）前記有効成分がラクトフェリンである（７）記載の近視の治療方法、又は予防方法。
【発明の効果】
【００１１】
腸内細菌叢が近視発症に関与することが明らかになったことから、近視進行を抑制する医薬を提供することが可能となった。腸内環境を改善し、炎症を抑制するという、新しいコンセプトによる近視抑制剤の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】抗生物質投与の近視誘導に対する影響を示す図。
【図２】ラクトフェリン投与の近視誘導に対する影響を示す図。
【図３】図３（Ａ）はラクトフェリン投与の近視誘導に対する影響を示す図。図３（Ｂ）は、図３（Ａ）における変化量の差を示す図。
【図４】ラクトフェリン投与の強膜における抗炎症効果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の近視抑制剤のスクリーニング方法は、近視を誘導した近視モデル動物に、候補物質を投与し、腸内細菌叢の変化を指標としてスクリーニングを行う方法である。近視を誘導する動物は、ヒヨコ、マウス、ラット、サルなど従来から使用されている動物に限らず、種々の動物に近視を誘導しモデル動物として使用することができる。特に、以下に示す近視モデルマウスは、ヒト強度近視の症状と酷似した症状を呈することから、好適に用いることができる。
【００１４】
具体的には近視モデル動物に候補物質を投与し、マイナスレンズ装用による近視誘導の前後において、近視の指標である眼軸長、屈折値を測定し比較することによって候補物質の効果を検討すればよい。以下に示すように、腸内細菌叢の変化が近視発症に関与していることが明らかであることから、腸内細菌叢を改善する物質を候補物質として投与し、その効果を見ることができる。
【００１５】
また、腸内細菌叢の解析を行い、近視抑制と相関する細菌を解析することも可能となる。近視誘導前後における腸内細菌叢を解析し、大きく減少、あるいは増加している細菌を特定し、これら細菌を指標として候補物質のスクリーニングを行うことができる。さらにこれら細菌を標的とする化合物等を投与することも可能となる。さらに減少している細菌については、培養した細菌を投与し、近視抑制剤とすることも可能となる。
【００１６】
スクリーニングによって近視抑制に効果があった物質は、これを有効成分とする医薬組成物、あるいはサプリメント、特定保健栄養食品、栄養機能食品、機能性表示食品として近視抑制や予防に用いることができる。医薬組成物やサプリメントは、有効成分の他に許容される担体、アジュバント、賦形剤、緩衝剤、希釈剤など、通常医薬組成物やサプリメントに含有させることのできるものを含むことができる。
【００１７】
以下に示すように、本願発明者らは、腸内細菌叢を改善し、近視抑制剤としてラクトフェリンが効果を有することを見出した。ラクトフェリンは、トランスフェリンと類似の構造を持つ分子量約８０，０００の鉄結合性の糖タンパク質であり、初乳での濃度が高く、涙や唾液などの外分泌液や好中球に存在することから、乳児（仔）の感染防御に重要な役割を果たしていると考えられている。
【００１８】
ラクトフェリンの生理機能としては、抗炎症作用、抗菌・抗ウイルス活性、免疫調節作用、抗酸化作用、鉄吸収調節作用、ビフィズス菌増殖促進作用など種々の作用が知られているが、近視抑制に効果を有するという報告は今までにない。
【００１９】
以下、実施例を示しながら、本発明について詳細に説明する。マイナスレンズを用いて誘導した（Ｌｅｎｓ−ｉｎｄｃｕｅｄ  Ｍｙｏｐｉａ、以下、ＬＩＭと記載することもある。）近視モデルマウスを用いて、腸内細菌叢が変化するか解析を行った。本発明者らが開発した近視モデルマウスは、眼軸長の伸長の程度、屈折値、強膜が正常よりも薄くなるというヒト強度近視の症状と酷似した症状を有するマウスモデルである（非特許文献６）。−３０ジオプター（ｄｉｏｐｔｅｒ、Ｄ）のレンズを少なくとも３週間マウスに装用させ近視誘導を行うことによって、屈折値、眼軸長、強膜の厚さ、すべてにおいてヒト近視と同様の性質を備えた近視モデルを誘導できることを確認している。
【００２０】
簡単に近視モデルマウスの作製方法について説明する。幼若なマウスの方が近視誘導を行いやすいので、離乳後なるべく早期にマイナスレンズを装用するのが望ましい。ここでは、３週齢のＣ５７ＢＬ６Ｊの雄性マウスを用いている。マウスはドミトール（登録商標、日本全薬工業）、ベトルファール（登録商標、ＭｅｉｊｉＳｅｉｋａファルマ）、ミダゾラム（サンド）の３種混合麻酔で麻酔し、ハサミで頭蓋を露出させる。頭蓋にネジ山を備えた支柱を立設し、歯科用セメント（Ｓｕｐｅｒ−Ｂｏｎｄ、サンメディカル）で固定する。１週間後（４週齢時）、近視を誘導するために−３０Ｄのマイナスレンズ（レインボーオプチカル研究所）を片側に、コントロールとしてフレームのみを他方に装用させる。フレームは、フレーム上部に設けられた孔を頭蓋に立設された支柱に通し、ナットによって固定する。レンズはマウスに装用させた際に、マウスが前脚等によって傷をつけないように、レンズ下側のフレーム部に側方に突出した形状のプロテクターが接着されている。プロテクターによって、マウスはレンズを触ることができず、レンズに傷がつくことがない。また、レンズは支柱にナットを用いて固定されているので、マウスの成長に合わせて位置を調節したり、外して汚れを掃除することができる。
【００２１】
＜腸内細菌叢の変化と近視発症との相関＞
［実施例１］抗生物質による腸内細菌叢の変化の誘導と近視抑制効果
近視モデルマウスに抗生物質を投与し腸内細菌を死滅させ、近視誘導への影響を解析した。マウスに３週齢から７週齢になるまでの４週間、コントロール群（ｎ＝５）には通常水、抗生物質投与群（ｎ＝５）には抗生物質水を与えて近視誘導への影響を解析した。抗生物質水は、アンピシリン１．０ｇ／Ｌ、バンコマイシン０．５ｇ／Ｌ、ネオマイシン１．０ｇ／Ｌを超純水に溶かして調製した。これら３種の抗生物質投与によりほとんどの腸内細菌が死滅するものと考えられる。
【００２２】
４週齢時に近視評価項目として屈折値及び眼軸長をそれぞれレフラクトメーター、ＳＤ−ＯＣＴ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｏｍａｉｎ−Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を用いて測定し、その後右眼に−３０ジオプターのマイナスレンズ、左眼にはレンズなしのフレームのみを装用し、３週間近視誘導を行なった。その間、２日に１度レンズをマウスから外し、レンズの汚れを掃除したのち再度装用した。３週間の近視誘導後（７週齢時）、再び眼軸長、屈折値の測定を行い、近視誘導前との変化（ＬＩＭ後の屈折値、又は眼軸長−ＬＩＭ前の屈折値、又は眼軸長）を算出した（図１）。データは平均値±標準誤差で示した。群間の差は一元配置分散分析による有意性の検定を行い、ｐ値が０．０５未満の場合を統計学的に有意差があるとし図中*で示している。特に断りのない限り、明細書で有意差があるという場合は、ｐ値が０．０５未満の場合をいう。また、ｐ値が０．０１未満の場合には**で示している。以下のデータについても同様である。
【００２３】
図１左は、近視誘導前後の眼軸長の差を算出した結果である。抗生物質投与群、コントロール群においてフレームのみを装用した眼（ｆｒａｍｅ）、近視誘導を行った眼（ＬＩＭ）の眼軸の伸長の変化を示している。コントロール群では、近視誘導を行った方の眼は有意（Ｐ＜０．０１）に眼軸長が伸長しているのに対し、抗生物質投与群では、フレームのみ、近視誘導を行った眼で眼軸長に差は見られなかった。
【００２４】
また、屈折値に対する抗生物質の投与の影響についてもコントロール群と抗生物質投与群では有意な差（Ｐ＜０．０１）が生じていた（図１右）。近視誘導を行った眼について、コントロール群と抗生物質投与群との屈折値を比較すると、抗生物質投与群では近視誘導を行った眼の変化量がコントロール群と比較して有意に小さかった。これらの結果は、投与した抗生物質により腸内細菌が減少し、腸内環境が変化したため近視進行が抑制されたことを示唆する。すなわち、近視誘導に腸内細菌叢の変化が直接関わっていることが初めて示された。
【００２５】
＜腸内細菌叢を改善することによる近視抑制剤の例＞
［実施例２］ラクトフェリン投与による腸内細菌叢の変化の誘導
実施例１の結果から、腸内細菌叢を改善することにより、近視抑制を行うことができることが示唆された。そこで、腸内細菌叢を改善する物質を投与することにより、近視抑制が生じるか検討を行った。具体的には抗炎症作用があることが報告されているラクトフェリンを近視モデルマウスに投与して効果の検討を行った。
【００２６】
ウシラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、純度≧９５％）はリンゲル液（大塚製薬）にて５０または１６０ｍｇ／ｍｌとなるよう調整し使用時まで−２０℃で保存した。３週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスに週６日ラクトフェリンまたはコントロールとしてリンゲル液を胃ゾンデにより経口投与した。投与は４週間、７週齢になるまで行なった。ラクトフェリンの投与量は、５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、又は１６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した。コントロール群にはラクトフェリン投与群と等量のリンゲル液を投与した。ラクトフェリン投与開始１週間、すなわち４週齢時に近視評価項目としてマウスの屈折値及び眼軸長をそれぞれレフラクトメーター及びＳＤ−ＯＣＴを用いて測定した。その後、実施例１と同様に右眼に−３０ジオプターのマイナスレンズ、左眼にはレンズなしのフレームのみを装用し３週間マイナスレンズ装用による近視誘導を行なった。３週間の近視誘導後（すなわち４週間のラクトフェリン投与後、７週齢時）で、再び屈折値、眼軸長の測定を行い、近視誘導前との変化を算出した。
【００２７】
図２に、５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙでラクトフェリンを投与した結果を示す。各群５匹ずつで実験を開始したが、胃ゾンデの操作等によりマウスが死亡したため、７週齢の測定時において、コントロール群、ラクトフェリン投与群（図中ＬＦと記載する。）、夫々ｎ＝２、ｎ＝３になった。
【００２８】
解析数（ｎ）が少ないことから、眼軸長の変化量、屈折値の変化量ともに、コントロール群、ラクトフェリン投与群のいずれにおいても、フレームのみを装用した眼と近視誘導を行った眼で有意差はなかった。しかし、ラクトフェリン投与による眼軸長の変化量（図２左）、及び屈折値の変化量（図２右）が減少する傾向が見られた。
【００２９】
次に、１６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙでラクトフェリンを投与し、近視抑制効果を解析した結果を示す。ラクトフェリンの投与量以外は、５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで投与した場合と同様にして実験を行った。眼軸長はコントロール群においてはフレームのみを装用した眼と近視誘導を行った眼との間に有意差が見られたのに対し、ラクトフェリン投与群では両者に有意差は見られなかった（図３（Ａ）左）。すなわち、ラクトフェリン投与によって眼軸長の伸長が抑制されていることが示された。
【００３０】
一方屈折値はコントロール群とラクトフェリン投与群、いずれにおいても、フレームのみを装用した眼と近視誘導を行った眼の間に有意差が見られた（コントロール：Ｐ＜０．０１、ラクトフェリン投与群：Ｐ＜０．０５、図３（Ａ）右）。どちらの群においても、マイナスレンズによる近視誘導を行った眼では、屈折値の減少が認められたが、ラクトフェリン投与群では変化量が減少する傾向が見られた。
【００３１】
近視誘導を行った眼とフレームのみを装用し近視誘導を行わなかった眼との変化量の差を見るため、近視誘導を行った場合（ＬＩＭ）と行わなかった場合（ｆｒａｍｅ）の変化量の差を算出した（図３（Ｂ））。眼軸長は、コントロール群とラクトフェリン投与群との間に有意差が見られた（図３（Ｂ）左）が、屈折値はコントロール群に比べて、ラクトフェリン投与群では、変化が減少する傾向を示すが、有意差は認められなかった（図３（Ｂ）右）。
【００３２】
＜ラクトフェリンによる抗炎症作用の検証＞
［実施例３］強膜における遺伝子発現解析
上記解析結果から、近視発症に腸内細菌叢の変化が深く関与していることが示された。また、ラクトフェリンは、種々の生理活性が知られているが、近視抑制と関連する作用としては、抗炎症作用があることが知られている（非特許文献７）。ラクトフェリンの近視抑制効果が抗炎症作用に起因しているのであれば、強膜における炎症が抑制されている可能性がある。そこで、近視モデルマウスにおいて、ラクトフェリンによって強膜の炎症反応が抑制されているか解析を行った。
【００３３】
実施例２と同様にして、マウスに、ラクトフェリン投与群には１６００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの投与量でラクトフェリンを、コントロール群にリンゲル液を３週齢から７週齢まで投与し、４週齢から７週齢までマイナスレンズによる近視誘導を行った。各群（ｎ＝３）のフレームのみを装用したコントロール眼、レンズを装用した近視誘導眼から実体顕微鏡下で物理的に強膜を単離し、各３つの強膜を１つのサンプルとしてＲＮＡを抽出した。
【００３４】
ＲＮＡ抽出はｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。逆転写はＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  （東洋紡株式会社）用い、ｒｅａｌｔｉｍｅ−ＰＣＲはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（東洋紡株式会社）を用いてＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（アプライド  バイオシステムズ）で行った（増幅条件：９５℃、１５ｓｅｃ、６０℃、６０ｓｅｃを４０サイクル）。
【００３５】
炎症反応を検出するプライマーとしてＩＬ−６を、コントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。使用したプライマーの配列は以下の通りである。
ＩＬ−６
ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＡＣＣＣＣＡＡＴＴＴＣＣＡＡＴＧＣＴ−３’（配列番号１）
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＧＡＧＧＡＡＴＧＴＣＣＡ−３’（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ
ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＣＣＣＡＣＴＡＡＣ−３’（配列番号３）
ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＣＴＣＣＡＣ−３’（配列番号４）
【００３６】
図４に示すように、コントロール群においては、近視誘導眼においてＩＬ−６発現量が有意に増加していたのに対し、ラクトフェリン投与群では近視誘導眼におけるＩＬ−６発現量の増加が見られなかった。したがって、ラクトフェリン投与によって、強膜の炎症が抑制されていることは明らかである。ラクトフェリンは、腸内細菌叢の変化を改善することにより、強膜の炎症を抑制し、近視抑制に効果があることが示唆される。
【００３７】
本発明者らは、腸内環境を改善し炎症を抑制する物質が近視抑制効果を示すことを初めて見出した。腸内環境を改善し炎症を抑制する効果を有する物質には同様の効果を期待することができることから、新たなコンセプトの近視抑制剤を探索することが可能となった。また、腸内細菌叢の変化が近視発症に関与することが示されたことから、今後近視発症を抑制する菌を特定し、近視進行を抑制することも可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
今まで有効な治療法のなかった近視を抑制する近視抑制剤を提供することができる。その結果、強度近視を原因とする失明や、他の眼疾患の予防にもつながる。また、乳に含まれるラクトフェリンに近視抑制効果が見られたことから、サプリメントとして投与することにより、近視の進行を抑制できる可能性がある。さらに、腸内細菌叢に作用するという新たなコンセプトによる近視抑制剤のスクリーニングが可能となった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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