(57)【要約】  本発明は、遺伝子組換え体より免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製する方法として、ポリペプチドの宿主やアミノ酸配列の違いによらず、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク、核酸からなる不純物を、より大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、ろ過性を向上させ、クロマトグラフィー工程における生産性を向上させうる処理法を提供することを特徴とする。本発明に係る免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法は、（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程、（２）前記工程（１）にて得られた培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、前記菌体懸濁液を菌体破砕することで得られる菌体破砕後液および前記破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清のいずれか一つ以上を酸性加熱処理する工程、（３）沈殿を分離する工程を有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（１）〜（３）を含む免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法。
（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
（２）下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つ以上を酸性で加熱処理する工程
（ａ）前記工程（１）にて得られた培養液
（ｂ）前記（ａ）の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
（ｃ）前記（ａ）の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
（ｄ）前記（ｃ）の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
（ｅ）前記（ｄ）の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
（３）沈殿を分離する工程
【請求項２】
前記工程（３）の後に沈殿分離後の上清をクロマトグラフィーにより処理する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、微生物由来である請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドである請求項１〜３のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが以下の（ｘ）および（ｙ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドを含有している請求項１〜４のいずれかに記載の精製方法。
（ｘ）  配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｙ）  配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
前記遺伝子組換え体が微生物である、請求項１〜５のいずれかに記載の精製方法。
【請求項７】
免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の製造方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の方法にて免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを製造する工程、
前記ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを製造する工程、
前記アフィニティー分離マトリックスと、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子組み換え体を培養することによって生産された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学、タンパク質工学、および、細胞工学の発展に伴い、抗体医薬と呼ばれる、免疫グロブリンの有する機能を利用した医薬品の開発が盛んに行われている。抗体医薬は、従来の医薬と比べて、標的分子に対してより特異的に働くために、副作用をより軽減させ、かつ、高い治療効果が得られることが期待されており、実際に様々な病態の改善に寄与している。【０００３】
抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）サブクラスに分類される。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、ＩｇＧのＦａｂ断片からなる抗体医薬が複数上市された（非特許文献１）。【０００４】
これら抗体医薬品の調製における初期精製工程ではプロテインＡ（ＰＡ）、プロテインＧ（ＰＧ）、プロテインＬ（ＰＬ）といった免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを、多糖類、合成ポリマー、シリカ等からなる不溶性の多孔質基材に結合させたアフィニティー担体が用いられる。【０００５】
これら免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドをリガンドとしたアフィニティー担体は、培養液から完全長抗体や断片化抗体を１回の処理で高純度に精製することができる。これを利用し、例えばプロテインＡアフィニティー担体（ＰＡ担体）やプロテインＧアフィニティー担体（ＰＧ担体）はＩｇＧを基本構造とした抗体医薬品の製造プロセスにおける初期精製工程に用いられている。【０００６】
また、プロテインＬアフィニティー担体（ＰＬ担体）は、断片化抗体を基本構造とした抗体医薬品や診断薬の研究開発段階における精製に用いられている。【０００７】
一方、これらアフィニティー担体は、医薬品製造用資材として高い品質が求められ、タンパク質からなるリガンド自体も抗体医薬品と同レベルの品質を要求されるため、生産コストが高くなり、アフィニティー担体を安価に提供することが難しくなっている。これにより、抗体医薬品製造コストのうち、アフィニティー担体が占める割合は大きく、抗体医薬品製造コスト増加の一因となっている。そのため、これら免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを安価に大量調製する方法として、従来法よりも簡便で、効果的で、定型化された手法が望まれていた。【０００８】
免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを調製する方法としてこれまでに種々の方法が検討されている。例えばＨｊｅｌｍらは、スタフィロコッカス・アウレウスの培養により生産された野生型のプロテインＡを回収精製する方法について報告している（非特許文献２）。当該文献では、野生型のプロテインＡを含むスタフィロコッカス・アウレウスの培養液をＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎにより処理し、遠心分離により宿主由来の細胞成分を除去後、得られた培養上清のｐＨを３．５とすることにより夾雑タンパク質を沈殿させており、さらにこの上清を回収し、中和後にフィルターろ過したものをＩｇＧを固定化したｓｅｐｈａｒｏｓｅ(R)  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にて精製している。【０００９】
またＬｅｅらは、形質転換された大腸菌を培養することにより生産された野生型プロテインＧの免疫グロブリン結合ドメインの回収精製方法について報告している（非特許文献３）。当該文献では、野生型プロテインＧを含む大腸菌培養液を８０℃で１０分間処理することにより培養上清中にプロテインＧを抽出し、これをクロスフローろ過することで、細胞成分を分離しており、さらに、得られた上清をＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(R)  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にて精製している。【００１０】
また、Ｒｉｃｈａｒｄらは、形質転換された大腸菌を培養することにより生産された野生型プロテインＡの回収精製法について記載している（特許文献１）。当該文献では、野生型プロテインＡを含む大腸菌培養液をビーズミルにて菌体破砕したのち、得られた菌体破砕後上清を８０℃で３０分加熱し、大腸菌由来の夾雑タンパク質を沈殿させて取り除いており、さらに、加熱処理後の培養上清のｐＨを調整した後に陰イオン交換クロマトグラフィーあるいは陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開昭６３−２７５６００
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００９    ，  ２７：３３１−３３７
【非特許文献２】Ｈｊｅｌｍら、ＦＥＢＳ．  ＬＥＴＴ．，  １９７２，  ２８：７    ３−７６
【非特許文献３】Ｌｅｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９２，  ２６：    ２１３−２２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前記のいずれの精製法も、クロマトグラフィーによる処理の前に、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液または培養上清に対し、酸性処理または加熱処理のいずれかの処理を行なっているが、前記のいずれかの方法による処理のみでは以下に述べるように宿主由来の菌体成分、夾雑タンパク、核酸といった不純物から形成される沈殿の粒子サイズが小さいことや、前記不純物を十分に除去できないことから、後段の精製プロセスにおける生産性が低下するといった課題があった。【００１４】
前記の生産性低下の影響を受ける後段の精製プロセスとは、前記酸性処理または加熱処理によって生じた沈殿を除去するろ過工程と免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収、精製するクロマトグラフィー工程が挙げられる。以下に前記の従来法にて酸性処理または加熱処理のみを行なう場合の個々のプロセスにおける問題点を具体的に述べる。【００１５】
前記の酸性処理または加熱処理のいずれかの方法による処理のみの場合、宿主由来の菌体成分、夾雑タンパク、核酸といった不純物からなる沈殿の粒子サイズが小さいために、精密ろ過フィルターや限外ろ過フィルターによるろ過速度が低下し、ろ過工程における生産性が低下するといった課題があった。さらに、前記のいずれかの方法による処理のみでは前記不純物を十分に除去できず、後段のクロマトグラフィー精製における一回当たりの処理量が低下するといった課題があった。【００１６】
これらを解決する方法として、例えば該ポリペプチドを含む該培養液または培養上清に対し、クロマトグラフィーによる処理の前に、酸性処理および加熱処理を組み合わせて行なうことによって、酸性処理または加熱処理を単独で実施する場合に比べ、より多くの不純物を沈殿化するとともに沈殿の粒子サイズを大きくすることでより高効率に前記不純物を沈殿化する処理法が考えられうるが、以下のような理由から、それらを組み合わせることは該ポリペプチドの構造を不可逆的に変化させ、免疫グロブリン結合活性を失わせるリスクが高まることが推察されるため、実施は避けられていた。【００１７】
一般にタンパク質は、それが含まれる溶液のｐＨ、温度、塩、重金属、変性剤の影響により立体構造の不可逆的変化を起こし失活してしまう場合がある。例えば、タンパク質溶液のｐＨを酸性あるいはアルカリ性条件とすることにより、アミノ酸残基の側鎖のイオン化状態が変化したり、修飾反応が促進される（新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ分離・精製・性質」日本生化学会編）。これにより、タンパク質本来の立体構造を安定に保つ上で重要な役割を担っているイオン性の引力や反発力が失われ、タンパク質の立体構造を不安定化する。さらに、タンパク質溶液の温度を高温とすることにより、タンパク質の立体構造を安定化している非共有結合が壊され、折りたたみ構造をほどけやすくする。また、これら酸性やアルカリ性条件と高温条件を組み合わせると、タンパク質の立体構造の不安定化はそれらを単独で行なう場合よりもさらに促進されうる。さらに、特開昭６３−２７５６００には、大腸菌含有プロテアーゼが低ｐＨ（ｐＨ  ３．０〜ｐＨ  ３．５）でプロテインＡを破壊することが記載されており、低ｐＨでの処理と加熱処理を組み合わせて行なうことは、プロテインＡの破壊を促進することは容易に想像できる。つまり、前記免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む該溶液に対し、酸性処理および加熱処理を組み合わせて行なうことは、これらを単独で実施する場合に比べて、該ポリペプチドの立体構造を不可逆的に不安定化させたり、ポリペプチドを破壊させてしまうリスクが高まる（新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ分離・精製・性質」日本生化学会編）。また、免疫グロブリン結合活性は、ポリペプチドの立体構造やそのアミノ酸配列が少し変化しただけでも劇的に変化しうるため、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを精製する際に、酸性処理および加熱処理を組み合わせて行なうことは、免疫グロブリン結合活性の低下という問題が発生すると考えられ、これまで避けられてきた。【００１８】
また、複数種類のタンパク質を工業的に精製する際、それらの精製プロセスを共通化できると、プロセス開発期間の短縮や精製資材や設備の共通化によるコスト削減が可能となる。このような精製プロセスの共通化は「精製プラットフォーム技術」と呼ばれ、抗体医薬品では、製薬会社各社が独自のプラットフォームを構築している。製造コストの高い免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに関しても、精製プラットフォーム技術を確立できれば、産業上有用である。【００１９】
上記の理由から、遺伝子組換え体より免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製する方法として、前記ポリペプチドの宿主やアミノ酸配列の違いによらず、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク、核酸からなる不純物をより多く且つより大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することにより、ろ過性を向上させ、クロマトグラフィー工程における生産性を向上させうる処理法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、遺伝子組換え体より免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製する方法として、前記ポリペプチドの宿主やアミノ酸配列の違いによらず、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク、核酸からなる不純物を、より多く且つより大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、ろ過性を向上させ、クロマトグラフィー工程における生産性を向上させうる処理法について鋭意検討を行なった。その結果、驚くべきことに遺伝子組換え体を培養することによって得られた培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか一つ以上を酸性条件で加熱処理することにより、該ポリペプチドの活性を保ちつつ、前記の従来法に比べて宿主由来の菌体、夾雑タンパク質やＤＮＡを、より多く且つより大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、凝集沈殿画分のろ過性が向上するだけでなく、後段のクロマトグラフィー工程における生産性を向上させられるということを発見した。さらに、前記記載の調製法は由来となる宿主やアミノ酸配列の異なる複数の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに適用可能なことを発見し、該ポリペプチドの精製プラットフォーム技術の確立に至った。すなわち本発明は、下記の［１］〜［７］に関する。【００２１】
［１］  
下記工程（１）〜（３）を含む免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法。
（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
（２）下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つ以上を酸性で加熱処理する工程
（ａ）前記工程（１）にて得られた培養液
（ｂ）前記（ａ）の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
（ｃ）前記（ａ）の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
（ｄ）前記（ｃ）の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
（ｅ）前記（ｄ）の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
（３）沈殿を分離する工程【００２２】
［２］
前記工程（３）の後に沈殿分離後の上清をクロマトグラフィーにより処理する工程を有することを特徴とする前記［１］に記載の精製方法。【００２３】
［３］
前記ポリペプチドが、微生物由来である前記［１］または［２］に記載の精製方法。【００２４】
［４］
前記ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドである前記［１］〜［３］のいずれかに記載の精製方法。【００２５】
［５］
前記ポリペプチドが以下の（ｘ）および（ｙ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドを含有している前記［１］〜［４］のいずれかに記載の精製方法。
（ｘ）  配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｙ）  配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００２６】
［６］
前記遺伝子組換え体が微生物である、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の精製方法。【００２７】
［７］
免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の製造方法であって、
前記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法にて免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを製造する工程、
前記ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを製造する工程、
前記アフィニティー分離マトリックスと、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００２８】
免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養することによって得られた培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか１つ以上を酸性条件で加熱処理することにより、従来法に比べてより多くの宿主由来の菌体、夾雑タンパク質やＤＮＡを、より大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、凝集沈殿画分のろ過性が向上するだけでなく、後段のクロマトグラフィー工程における生産性を向上させられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の実施例１に係る、大腸菌由来のＳＰＧ・２ｄ菌体破砕後上清の酸性加熱処理後の各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図２】本発明の実施例１に係る、大腸菌由来のＳＰＧ・２ｄ菌体破砕後上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＳＰＧ・２ｄの純度である。
【図３】本発明の実施例２に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図４】本発明の実施例２に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＳＰＡ・５ｄの純度である。
【図５】本発明の実施例３に係る、ブレビバチルス由来のＰＰＬ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＰＰＬ・５ｄの純度である。
【図６】本発明の実施例４に係る、大腸菌由来のＰＰＬ・４ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＰＰＬ・４ｄの純度である。
【図７】本発明の実施例５に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルの同一条件下でのろ過量である。
【図８】本発明の実施例６に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後液をクロマトグラフィーにて精製した場合のクロマトグラムである。
【図９】本発明の実施例６に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後のサンプルのクロマトグラフィーによる溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含有する遺伝子組換え体を、下記工程により処理することで、該ポリペプチドの活性を保ちつつ、培養物中に共存する宿主由来の菌体成分、夾雑タンパク質および核酸等から該ポリペプチドを回収精製する方法に関するものである。
【００３１】
さらに、前記記載の方法は由来となる宿主やアミノ酸配列の異なる複数の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに適用可能であるため、複数種類の該ポリペプチドを製造する場合、プロセス開発期間の短縮や精製資材や設備の共通化によるコスト削減が可能となる。
【００３２】
すなわち本発明を実施するには、該培養物について、（１）〜（３）の工程にしたがって処理すれば良い。
【００３３】
（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
（２）下記（ａ）〜（ｅ）のいずれか一つ以上を酸性条件で加熱処理する工程
（ａ）前記工程（１）にて得られた培養液
（ｂ）前記（ａ）の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
（ｃ）前記（ａ）の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
（ｄ）前記（ｃ）の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
（ｅ）前記（ｄ）の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
（３）沈殿を分離する工程
【００３４】
本発明における「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、かかる特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能に加えて、他の生体分子や細胞と協同して抗原を含む因子を無毒化・除去する機能も有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造を有し、軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖それぞれ２本ずつからなる“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【００３５】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるようアミノ酸配列に多彩な変化が見られるため可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
【００３６】
本発明方法で精製すべきポリペプチドとは、前記免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域、ＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドであれば特に限定はされない。このようなポリペプチドとして、例えば配列番号１〜５のアミノ酸配列を有する、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインであるＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメイン、配列番号６〜１０のアミノ酸配列を有する、プロテインＧの免疫グロブリン結合ドメインであるＢ１、Ｂ２ドメインおよびＣ１−Ｃ３ドメイン、配列番号１１〜１９のアミノ酸配列を有する、プロテインＬの免疫グロブリン結合ドメインであるＢ１−Ｂ５ドメインおよびＣ１−Ｃ４ドメイン、ならびにそれらの変異体や連結体が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．,ＵＳＡ，１９８３，８０：６９７−７０１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２８：１３３８８−１３３９１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７：１２８２０−１２８２５；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，１２（６）：９１１−９２０）。「変異体」とは、野生型のポリペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の変異が導入されたポリペプチドを言う。変異は、置換、付加、欠失から選択される１以上の変異をいう。変異するアミノ酸の数としては、１０以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下、３以下または２以下がより更に好ましい。また、「連結体」とは、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドあるいはその変異体を直列に連結して得られるポリペプチドである。同じポリペプチドを連結しても良く、異なるポリペプチドを連結しても良い。連結されるポリペプチドの数としては、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個が挙げられる。
【００３７】
本発明方法で精製すべきポリペプチドは配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を必須的に有するポリペプチドが好ましい。
【００３８】
本発明のポリペプチドとは配列番号１〜１９のいずれかで示されるアミノ酸配列との配列同一性が好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であればよい。
【００３９】
プロテインＡはグラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ・Ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、その免疫グロブリン結合ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）は抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる。いずれのドメインも、抗体のＦｃ領域、Ｆａｂ領域、および、Ｆａｂ領域中の特にＦｖ領域に結合する活性を有する。なお、本発明においてプロテインＡの由来は特に限定されないが、微生物であるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するプロテインＡであることが好ましい。
【００４０】
プロテインＧは、ストレプトコッカス属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、その免疫グロブリン結合ドメイン（Ｂ１、Ｂ２ドメインおよびＣ１−Ｃ３ドメイン）はほとんどの哺乳動物のＩｇＧのＦｃ領域と結合活性を示し、抗体のＦａｂ領域にも弱く結合する活性を有する。なお、本発明においてプロテインＧの由来は特に限定されないが、微生物であるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）に由来するプロテインＧであることが好ましい。
【００４１】
プロテインＬはペプトストレプトコッカス・マグニウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ）によって生産されるタンパク質の１種であり、その免疫グロブリン結合ドメイン（Ｂ１−Ｂ５ドメインおよびＣ１−Ｃ４ドメイン）は、免疫グロブリンのｋ軽鎖（ｋ１、ｋ３、ｋ４）との結合活性を示し、種々の動物種の抗体に結合する。また、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）やＦａｂとも結合することができる。なお本発明においてプロテインＬの由来は特に限定されないが、微生物であるペプトストレプトコッカス・マグニウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ・ｍａｇｎｕｓ）に由来するプロテインＬであることが好ましい。
【００４２】
本発明において「ポリペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆる「タンパク質」のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。また、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
【００４３】
本発明における遺伝子組換え体とは、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む発現ベクターを宿主となる細胞へ導入した形質転換細胞である。
【００４４】
前記宿主とは免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換され、導入されたＤＮＡを発現してポリペプチドを生産することができる微生物であれば、特に制限するものではない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属など宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属など宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特にＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２−５９４（１９８５））、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌および酵母が好ましく、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母が特に好ましい。
【００４５】
遺伝子を挿入するための発現ベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌を宿主として用いる場合には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）などを使用することができる。ピキア属酵母を宿主として用いる場合にはｐＰＩＣＨＯＬＩ、ｐＨＩＰ、ｐＨＲＰ、ｐＨＡＲＳなどが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００４６】
宿主細胞へのベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。
【００４７】
前記遺伝子組換え体を用いて目的のポリペプチドを製造する場合、遺伝子組換え体を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に目的のポリペプチドを生成蓄積させることにより製造することができ、該培養物から所望のポリペプチドを採取することができる。
【００４８】
遺伝子組換え体を用いてポリペプチドを製造する場合には、遺伝子組換え体の細胞内および／またはペリプラズム領域内にポリペプチドを蓄積することも可能である。この場合、細胞内に蓄積すると、ポリペプチドの酸化を防ぐことができ、培地成分との副反応もない点で有利であり、ペリプラズム領域内に蓄積すると、細胞内プロテアーゼによる分解を抑えることができる点で有利である。一方、ポリペプチドを製造する場合に、形質転換体の細胞外にポリペプチドを分泌することも可能である。この場合、菌体破砕や抽出の工程が不要となるため、製造コストが抑えられる点で有利である。
【００４９】
前記工程（１）の遺伝子組換え体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、目的のポリペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を含む培地を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００５０】
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ポリペプチドの分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００５１】
さらに、本発明の目的ポリペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。この場合、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明の目的ポリペプチドと共存させることができる。なお、本発明の目的ポリペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、例えば、ＬＢ培地（トリプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、ＮａＣｌ  １％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン  １．６％、酵母エキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％）等が挙げられる。
【００５３】
ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＴＭ培地（ペプトン  １％、肉エキス  ０．５％、酵母エキス  ０．２％、グルコース  １％、ｐＨ７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン  ４％、酵母エキス  ０．５％、グルコース  ２％、ｐＨ７．２）等が挙げられる。
【００５４】
ピキア属酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＹＰＤ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）等が挙げられる。
【００５５】
また、培養温度は、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより本発明の目的ポリペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
【００５６】
前記工程（２）−（ａ）における「培養液」とは、前記工程（１）にて得られた培養液をそのまま用いても良いし、リゾスタフィンまたはリゾチームあるいはリチケースといった酵素や、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、両イオン性の界面活性剤を添加しても良いが、この方法に限定されるものではない。
【００５７】
前記工程（２）−（ｂ）における「培養上清」は、目的ポリペプチドが培養溶液（細胞外）に蓄積している場合に用いる。前記工程（２）−（ｃ）における「菌体の懸濁液」は、目的ポリペプチドが培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積している場合に用いる。前記工程（２）−（ｂ）または（２）−（ｃ）において、前記工程（１）にて得られた培養液から菌体または培養上清を分離除去する方法としては、以下の方法に限られるものではないが、培養終了後に、培養液を静置または遠心分離したのちに培養上清を回収することで菌体と分離することができる。また、該培養液をデッドエンドろ過またはクロスフローろ過のいずれかのろ過方式にて処理することによっても分離することができる。また、該培養液をアコースティックウェーブセパレーションによって処理することで、分離することもできる。さらに、前記デッドエンドろ過、クロスフローろ過、アコースティックウェーブセパレーションによる処理は該培養液を遠心分離した後に行なっても良いし、該培養液をそのまま用いても良い。
【００５８】
前記デッドエンドろ過とはフィード溶液がメンブレンに対して垂直に移動するろ過方式であり、ろ液はメンブレンを通過する。デッドエンドろ過により、前記菌体と培養上清を分離する方法としては、ボトルトップフィルターや遠心式フィルターユニットを用いた該培養液の精密ろ過または限外ろ過が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
【００５９】
前記クロスフローろ過とは、フィード溶液が膜表面に平行に移動するろ過方式であり、ろ液はメンブレンを通過する。クロスフローろ過により、前記菌体と培養上清を分離する方法としては、カセットメンブレンあるいは中空子を用いた該培養液の精密ろ過または限外ろ過が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
【００６０】
前記、アコースティックウェーブセパレーションによる処理とは、フィード溶液に定在波を照射することにより、定在波の節の位置に不溶物を集め、沈降させることで、フィード溶液中の不溶物と上清を分離する方法である。アコースティックウェーブセパレーションにより、前記菌体と培養上清を分離する方法としては、アコースティックウェーブセパレーターによって該培養液を処理する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
【００６１】
前記デッドエンドろ過を行なう場合のボトルトップフィルターとしては、
Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｒａｐｉｄ−Ｆｌｏｗ  ＰＥＳ  膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター  ０．４５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｒａｐｉｄ−Ｆｌｏｗ  ＰＥＳ  膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター  ０．２μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
ＩＷＡＫＩ  ボトルトップフィルター５００ｍＬ  ＰＥＳ  ０．２２ｕｍ  ３３口径（ＡＧＣテクノグラス・ＩＷＡＫＩ社）
Ｂｏｔｔｌｅ  ｔｏｐ  ｖａｃｕｕｍ  ｆｉｌｔｅｒ  ０．２２μｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）
Ｂｏｔｔｌｅ  ｔｏｐ  ｖａｃｕｕｍ  ｆｉｌｔｅｒ  ０．４５μｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
前記デッドエンドろ過を行なう場合の遠心式フィルターユニットとしては、
Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０−３Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０−５Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０−１０Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０−３０Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０−５０Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０−１００Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １０ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３０ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ５０ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １００ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
前記クロスフローろ過を行なう場合のカセットメンブレンとしては、
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ  ５０  精密ろ過モジュール  ０．６５μｍ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ  ５０  精密ろ過モジュール  ０．２２μｍ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ  ５０  精密ろ過モジュール  ０．４５μｍ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ  ５０  精密ろ過モジュール  ０．１０μｍ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  ５０  ｃｍ2，  ５  ＫＤ，  ＰＥＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  ５０  ｃｍ2，  １０  ＫＤ，  ＰＥＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  ５０  ｃｍ2，  ３０  ＫＤ，  ＰＥＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  ５０  ｃｍ2，  ５０  ＫＤ，  ＰＥＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  ５０  ｃｍ2，  １００  ＫＤ，  ＰＥＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅ−Ｂｉｏｍａｘ(R)  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ  Ｓｃｒｅｅｎ    ５ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅ−Ｂｉｏｍａｘ(R)  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ  Ｓｃｒｅｅｎ    ８ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅ−Ｂｉｏｍａｘ(R)  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ  Ｓｃｒｅｅｎ    １０ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅ−Ｂｉｏｍａｘ(R)  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ  Ｓｃｒｅｅｎ    ３０ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅ−Ｂｉｏｍａｘ(R)  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ  Ｓｃｒｅｅｎ    ５０ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２  Ｃａｓｓｅｔｔｅ−Ｂｉｏｍａｘ(R)  Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ  Ｓｃｒｅｅｎ    １００ｋＤａ（ＭＥＲＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
前記クロスフローろ過を行なう場合のホロファイバーとしては、
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ０．１  ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ０．２  ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ０．４５  ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ０．６５  ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  １  ｋＤ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ３  ｋＤ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  １０  ｋＤ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ３０  ｋＤ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  ５０  ｋＤ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，  １００  ｋＤ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
前記、アコースティックウェーブセパレーターとしては、
ケイデンス  Ａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＰＡＬＬ社）
が挙げられるが、これに限定されない。
【００６６】
前記工程（２）−（ｂ）における培養上清とは、宿主より分泌生産された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む溶液である。前記工程（１）にて得られた培養液から菌体を取り除いた培養上清をそのまま用いても良いし、酸、アルカリ等で中性にｐＨ調整しても良いし、中性バッファーで希釈しても良い。この時に用いる酸としては、ギ酸、酢酸、リン酸、塩酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、アンモニア、酢酸Ｎａ等が挙げられるが、該ポリペプチドの免疫結合活性を失わせることなくｐＨ調整できるものであればこれらに限定されるものではない。また、中性バッファーとしては該ポリペプチドが免疫グロブリン結合活性を失うことの無い緩衝液であれば特に限定されないが、例えば酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液やリン酸Ｎａ緩衝液、リン酸Ｋ緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等を用いればよい。
【００６７】
前記工程（２）−（ｃ）における菌体の懸濁液は、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む懸濁液であり、前記工程（１）にて得られた培養液から培養上清を取り除いた菌体を中性バッファーで懸濁したものであっても良いし水で希釈後、酸やアルカリで中性にｐＨ調整しても良い。この時に用いる酸としては、ギ酸、酢酸、リン酸、塩酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、アンモニア、酢酸Ｎａ等が挙げられるが、該ポリペプチドの免疫結合活性を失わせることなくｐＨ調整できるものであればこれらに限定されるものではない。また、中性バッファーとしては該ポリペプチドが免疫グロブリン結合活性を失うことの無い緩衝液であれば特に限定されないが、例えば酢酸−酢酸Ｎａ緩衝液やリン酸Ｎａ緩衝液、リン酸Ｋ緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等を用いればよい。
【００６８】
前記工程（２）−（ｄ）における菌体破砕後液とは、前記工程（２）−（ｃ）の菌体の懸濁液中の菌体を破砕することで得られた懸濁液のことである。菌体は完全に破砕されている必要はなく、例えば、ペリプラズム領域に該ポリペプチドが蓄積している場合は、外膜を部分的に破壊して得られた懸濁液も菌体破砕後液に含まれる。ここで、菌体破砕の方法としては特に限定されないが、懸濁液中の菌体が十分に破砕されるものであれば良く、例えば浸透圧ショック法、凍結融解法、界面活性剤による破砕法、酵素消化法、超音波処理法、フレンチプレス法、乳鉢による粉砕法、ホモジナイザーによる破砕法、ガラスビーズによる破砕法、サンプル破砕キットによる破砕法等が挙げられ、より好ましくは超音波処理法、ホモジナイザーによる破砕法であれば懸濁液中の菌体を十分に破砕できる。
【００６９】
前記工程（２）−（ｅ）における菌体破砕後上清とは、前記工程（２）−（ｄ）の菌体破砕後液から不溶性沈殿物を除去した上清のことである。不溶性沈殿の除去方法としては前記工程（１）にて得られた培養液から培養上清あるいは菌体を分離する方法と同様の方法を用いることができるが、これに限定されない。
【００７０】
前記工程（２）における酸性条件は宿主となる微生物の菌体成分および細胞質内またはペリプラズムまたは細胞外に生産された宿主由来の夾雑タンパク質および核酸が特異的に沈殿する範囲であればよく、好ましくはｐＨ３．０〜６．０、より好ましくはｐＨ３．２〜５．９、より好ましくはｐＨ３．４〜５．８、より好ましくはｐＨ３．６〜５．７、より好ましくはｐＨ３．８〜５．６であれば良い。
【００７１】
前記工程（２）において前記工程（１）にて得られた免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか一つ以上のｐＨを調整するための酸やアルカリとしては該ポリペプチドの免疫結合活性を失わせることなくｐＨ調整できるものであればこれらに限定されるものではないが、酸としては、ギ酸、酢酸、リン酸、塩酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、アンモニア、酢酸Ｎａ等が挙げられる。また、ｐＨ調整する方法としては、前記培養液、前記培養上清、前記菌体の懸濁液、前記菌体破砕後液または前記菌体破砕後上清をプラスチックボトル中で均一に攪拌しながらｐＨメーターやｐＨ試験紙でｐＨをモニタリングし、水で５Ｍに希釈した酢酸溶液をピペットを用いて滴下する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また前記ｐＨ調整は安全上の観点から温度調節を行う前に行なうことが好ましいが、温度調節中または温度調節後に行うこともできる。
【００７２】
前記工程（２）における温度は宿主となる微生物の細胞質内またはペリプラズムまたは細胞外に生産された宿主由来の夾雑タンパク質が特異的に沈殿する範囲であればよく、温度は好ましくは５０℃〜７０℃、より好ましくは５１℃〜６９℃、より好ましくは５２℃〜６８℃、より好ましくは５３℃〜６７℃、より好ましくは５４℃〜６６℃、さらに好ましくは５５℃〜６５℃の範囲であれば良い。また、温度調節の方法としては以下の方法に限られるものではないが、温度調節機器によって前記温度範囲内に保った水浴に前記ｐＨ調整後の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液または培養上清、菌体の懸濁液またはその菌体破砕後液もしくはその菌体破砕後上清を含んだプラスチックボトルを入れ、均一に攪拌しながら温度計で該溶液内の温度が前記温度範囲内に達するまでモニタリングする方法が挙げられる。また温度調節は安全上の観点からｐＨ調整後に行なうことが好ましいが、ｐＨ調整前またはｐＨ調整中に行なうこともできる。
【００７３】
前記工程（２）において酸性で加熱処理する方法としては、温度調節機器によって前記温度範囲内に保った水浴により前記ｐＨおよび温度調整後の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか一つ以上を均一に攪拌しながら３０分から１時間処理し、その後、水浴の温度を２５℃とすることで、該溶液の温度を２５℃まで低下させる方法が挙げられるが、これに限定されない。
【００７４】
前記工程（３）における沈殿を分離する工程とは、前記工程（２）の酸性加熱処理により生じた夾雑タンパク質などの沈殿を分離する工程であり、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク質および核酸からなる沈殿と免疫グロブリン結合活性を有するポリプチドを含む上清を分離できる方法であれば、特に限定されないが、前記工程（１）にて得られた培養液から培養上清あるいは菌体を分離する方法と同様の方法にて分離することができる。
【００７５】
前記工程（３）の後に、クロマトグラフィーにより、目的ポリペプチドを含む上清から目的ポリペプチドを精製しても良い。使用するクロマトグラフィー担体としては、前記（１）〜（３）の工程後の上清から免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製できる方法であれば特に限定されないが、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィー担体が挙げられ、これらを単独で使用しても良いし、組み合わせて使用しても良い。また、酸性加熱処理後の該ポリペプチドを含む溶液をｐＨ調整等することなくそのまま負荷できるという利点から、特に陽イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィーが好ましく、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いるとさらに良い。
【００７６】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーに用いられる陰イオン交換樹脂は、陰イオン交換作用を示すものであれば限定されない。陰イオン交換樹脂としては、
Ｃａｐｔ  Ｑ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｃａｐｔ  ＤＥＡＥ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）Ｃａｐｔ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＳＯＵＲＣＥ  ３０Ｑ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  Ｑ  （ＹＭＣ社）
ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ＤＡ  （ＹＭＣ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐＱ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  ＤＥＡＥ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｑ−ｒ  （ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｑ−ｈ  （ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  ＤＥＡＥ  （ＪＮＣ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
前記陽イオン交換クロマトグラフィーに用いられる陽イオン交換樹脂は、陽イオン交換作用を示すものであれば限定されない。陽イオン交換樹脂としては、
Ｃａｐｔ  Ｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｃａｐｔ  ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＳＯＵＲＣＥ  ３０Ｓ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  Ｓ  （ＹＭＣ社）
ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ＣＭ  （ＹＭＣ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧｉｇａＣａｐ  ＣＭ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｓ−ｒ  （ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｓ−ｈ  （ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  ＣＭ  （ＪＮＣ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
前記疎水クロマトグラフィーに用いられる疎水クロマトグラフィー樹脂は、疎水相互作用を示すものであれば限定されない。疎水クロマトグラフィー樹脂としては、
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｂｕｔｈｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｂｕｔｈｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｂｕｔｈｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＨＩＣ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｅｔｈｙｌ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＰＧ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｈｙｌ−６５０  （ＴＯＳＯＨ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｐｈｅｎｙｌ  （ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｂｕｔｈｙｌ  （ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ  ＭＡＸ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＬＳ  （ＪＮＣ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
また、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂としては、
Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  社）
Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｆｌｕｏｌｏａｐａｔｉｔｅ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  社）
ＭＰＣ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｄｒｏｘｙＦｌｕｏｌｏａｐａｔｉｔｅ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  社）
ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ  （ＰＡＬＬ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
また、ミックスモードクロマトグラフィー樹脂としては、
Ｃａｐｔ  ＭＭＣ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｃａｐｔ  Ａｄｈｅｒｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｅｓｈｕｍｕｎｏ  ＨＣＸ  （Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
また、アフィニティークロマトグラフィー樹脂としては、
ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
などが挙げられるが、これに限定されない。
【００８２】
本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することができる。即ち、当該ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンをアフィニティーカラムクロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。
【００８３】
前記ポリペプチドを、水不溶性の基材からなる担体にアフィニティーリガンドとして固定化して、アフィニティー分離マトリックスを製造することができる。ここで、「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
【００８４】
本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００８５】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００８６】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、または、チオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００８７】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。したがって、固定化のために、本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに対して、化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。
【００８８】
アフィニティー分離マトリックスは、本発明の精製方法により精製した、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを固定化して得られるので、前記ポリペプチド自体の活性に基づき、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合することができる。よって、本発明の精製方法により精製したポリペプチドおよびアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。「免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質」とは、前記ポリペプチドが結合するタンパク質のことである。ただし、前記ポリペプチドが結合できれば、Ｆｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域を完全に含むポリペプチドである必要はない。
【００８９】
免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質としては、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
前記「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどの、本発明の精製方法にて精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドが結合し得る改変型人工タンパク質を総称する名称である。
【００９１】
また、結合する領域をＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域というように広く定義したが、抗体の立体構造はすでに既知であるので、本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドおよびアフィニティー分離マトリックスが結合する対象となるタンパク質は、タンパク質工学的に該ポリペプチドが結合する領域の立体構造を保持した上で、Ｆｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域にさらなる改変（断片化など）が施されたものであってもよい。
【００９２】
免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させ、前記タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる工程（吸着工程）、および、アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程（溶出工程）により、前記タンパク質を高純度に回収精製できる。
【００９３】
免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の精製方法の吸着工程では、前記タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させることにより吸着させる。具体的には、前記タンパク質を含有する液体試料を中性となるように調整した後、該液体試料をアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、前記タンパク質を吸着させる。液体試料の溶媒としては、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、クエン酸、２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＥＳ）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＤＡ）、Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）、Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＥＳ）、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、３−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、もしくはＢｉｃｉｎｅ、ＮＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）を含む緩衝液、およびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液が挙げられる。前記タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる際のｐＨは、ｐＨ６．５〜８．５であることが好ましく、ｐＨ７〜８であることがより好ましい。前記タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる際の温度は、１〜４０℃であることが好ましく、４〜２５℃であることがより好ましい。
【００９４】
吸着工程に次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄してもよい。この時点では免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質はカラム内のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。洗浄のために使用する緩衝液は、吸着工程で使用する緩衝液と同じものを使用できる。
【００９５】
免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の精製方法の溶出工程では、ｐＨ２．７以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、前記タンパク質を溶出させる。溶出液としては、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ギ酸緩衝液、プロピオン酸緩衝液、γ−アミノ酪酸緩衝液、乳酸緩衝液が挙げられる。
【００９６】
溶出液のｐＨは、ｐＨ２．７以上であれば抗体を回収することが可能であるが、より高いｐＨの溶出液を用いれば抗体の凝集や活性低下を回避できるため好適である。具体的には、ｐＨ３．０以上がより好ましく、ｐＨ３．５、ｐＨ３．７５、ｐＨ３．８、ｐＨ３．９以上がさらに好ましく、ｐＨ４.０以上が最も好ましい。溶出液のｐＨの上限はｐＨ６．０であることが好ましい。
【００９７】
アフィニティー分離マトリックスからの免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の溶出には複数のｐＨの溶出液を用いて段階的に溶出することも可能である。また、ｐＨの異なる２種類以上の溶出液（例えばｐＨ６とｐＨ３）を用いたグラジエント溶出でｐＨに勾配をつけて溶出すれば、より高度に精製できるため、好適である。吸着時、洗浄時、溶出時の緩衝液には界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）やカオトロープ剤（例えば、尿素やグアニジン）、アミノ酸（例えば、アルギニン）を添加することも可能である。
【００９８】
同様に、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を溶出させる際の、アフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラム内のｐＨは、ｐＨ２．７以上であることが好ましく、ｐＨ３．０以上であることがより好ましく、ｐＨ３．６、ｐＨ３．７５、ｐＨ３．８、ｐＨ３．９以上であることがさらに好ましく、ｐＨ４．０以上であることが最も好ましい。ｐＨ３．０以上の条件で溶出すると、前記タンパク質へのダメージを低減できる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ., ２００５, ９２(６)：６６５−６７３）。また、前記タンパク質を溶出させる際の、アフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラム内のｐＨの上限はｐＨ６．０であることが好ましい。
【００９９】
免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を溶出する際の温度は、１〜４０℃であることが好ましく、４〜２５℃であることがより好ましい。
【０１００】
本発明の精製方法により回収される免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の回収率は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。回収率は、例えば、下記式により算出される。
回収率（％）＝［｛（溶出した免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ））×（溶出した液量（ｍＬ））｝／｛（負荷した免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ））×（負荷した液量（ｍＬ））｝］×１００
【０１０１】
本発明の精製方法では、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を発現させるための宿主に由来するタンパク質の混入を低減できる。これらのタンパク質の混入により、抗体の製造における精製工程の負荷増大（工数の増加や収率の低減）や不純物タンパク質が医薬品として重大な副作用をもたらす可能性があるが、本発明の精製方法ではこれらの問題を回避できる。
【０１０２】
本発明のアフィニティー分離マトリックスは免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質と宿主由来タンパク質を分離するのに効果的である。宿主細胞タンパク質の由来となる宿主細胞は前記タンパク質を発現できる細胞であり、特に遺伝子組換え技術が確立されているＣＨＯ細胞や大腸菌が例として挙げられる。これらの宿主由来タンパク質は、市販のイムノアッセイキットによって定量することが可能である。例えば、ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ社）を用いれば、ＣＨＯ細胞由来のタンパク質を定量できる。
【０１０３】
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
【０１０４】
本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドおよびアフィニティー分離マトリックスの、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）などのバイオセンサーによって試験することができる。本発明のタンパク質が有する免疫グロブリンに対する親和性は、ヒト免疫グロブリンＧ製剤に対する親和性を後述のＢｉａｃｏｒｅシステムにより測定した時に、結合定数（ＫA）が１０6（Ｍ-1）以上であることが好ましく、１０7（Ｍ-1）以上であることがより好ましい。
【０１０５】
上記親和性の測定条件としては、本発明の精製法にて精製された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれかに結合した時の結合シグナルが検出できる条件であればよく、温度２０〜４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
【０１０６】
結合相手の免疫グロブリン分子としては、例えば、ポリクローナル抗体であるガンマグロブリン・ニチヤク（ヒト免疫グロブリンＧ）（日本製薬）や市販医薬品のモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１０７】
親和性の違いは、同じ測定条件にて、同じ免疫グロブリン分子に対する結合反応曲線を得て、解析した時に得られる結合パラメータにて、変異を導入する前のタンパク質と変異を導入した後のタンパク質とを比較することで当業者が容易に検証することができる。
【０１０８】
結合パラメータとしては、例えば、結合定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明で得られたポリペプチドとＦａｂの結合定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＶＨ３サブファミリーに属する免疫グロブリンのＦａｂフラグメントを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、ポリペプチドを流路添加する実験系で求めることができる。なお、文献によっては結合定数は親和定数と表記されることもあるが、基本的に両者の定義は同じである。
【０１０９】
本願は、２０１７年５月２日に出願された日本国特許出願第２０１７−９１６０７号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年５月２日に出願された日本国特許出願第２０１７−９１６０７号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【０１１０】
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。
・  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）
・  村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。
また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。【０１１１】
参考例１：  プロテインＧを含む菌体破砕上清の調製
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＧＸ７８０９株が生産する野生型プロテインＧの免疫グロブリン結合領域を含むポリペプチドＳＰＧ・２ｄ（配列番号２０）をコードするＤＮＡの５’末端にＮｄｅＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２１）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したベクターｐＵＣＳＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）へライゲーションし、ＳＰＧ・２ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがベクターｐＵＣＳＮＴに挿入された発現プラスミドを調製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＨＢ１０１株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＳＰＧ・２ｄを生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍＬの２ＹＴ培地（ポリペプトン  １．６％、酵母エキス  １．０％、塩化ナトリウム  ０．５％）にて、３７℃で２４時間、振盪培養した。培養後、培養液から遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により培養上清を除去し、菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕機により菌体破砕した。遠心分離により、沈殿を除去し、ＳＰＧ・２ｄの菌体破砕上清を得た。【０１１２】
参考例２：  プロテインＡを含む培養上清の調製
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＣｏｗａｎＩ株（ＡＴＣＣ１２５９８）が生産する野生型プロテインＡの免疫グロブリン結合領域（Ｅ・Ｄ・Ａ・Ｂ・Ｃドメイン）を含むポリペプチドＳＰＡ・５ｄ（配列番号２２）をコードするＤＮＡの５’末端にＮｃｏＩ認識サイト、３’末端にＢａｍＨＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２３）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＳＰＡ・５ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を用いた。
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  ＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＳＰＡ・５ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン  ３．０％、酵母エキス  ０．５％、グルコース  ３％、硫酸マグネシウム  ０．０１％、硫酸鉄  ０．００１％、塩化マンガン  ０．００１％、塩化亜鉛  ０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。培養後、培養液から遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により菌体を除去し、ＳＰＡ・５ｄの培養上清を得た。【０１１３】
参考例３：  プロテインＬを含む培養上清の調製
Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｍａｇｎｕｓ３１２株由来株が生産する野生型プロテインＬの免疫グロブリン結合領域を含むポリペプチドＰＰＬ・５ｄ（配列番号２４）をコードするＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２５）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＰＰＬ・５ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株を用いた。
Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ  ＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＰＰＬ・５ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を参考例３と同様に培養、菌体分離し、ＰＰＬ・５ｄの培養上清を得た。【０１１４】
参考例４：  プロテインＬを含む菌体破砕後液の調製
Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ  ３３１６株が生産する野生型プロテインＬの抗体結合領域を含むポリペプチドＰＰＬ・４ｄ（配列番号２６）をコードするＤＮＡの５’末端にＮｄｅＩ認識サイト、３’末端にＰｓｔＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２７）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したベクターｐＵＣＳＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）へライゲーションし、ＰＰＬ・４ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがベクターｐＵＣＳＮＴに挿入された発現プラスミドを調製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＰＰＬ・４ｄを生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を参考例１と同様に培養、菌体分離、菌体破砕し、ＰＰＬ・４ｄの菌体破砕後液を得た。【０１１５】
実施例１
（１）ＳＰＧ・２ｄ菌体破砕上清／大腸菌由来の酸性加熱処理
大腸菌の菌体破砕後上清２０ｍＬに水を加え５倍希釈後、フィルターろ過（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ５００ｍＬ  Ｒａｐｉｄ−Ｆｌｏｗ  Ｂｏｔｔｌｅ  Ｔｏｐ  Ｆｉｌｔｅｒ，０．２μｍ  ａＰＥＳ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，７５ｍｍ  ｄｉａ，４５ｍｍ  ｎｅｃｋ）することで培養上清を得た。この培養上清に１０ｍＭとなるよう１Ｍ酢酸Ｎａを加え、２．５ｍＬずつ５本の１５ｍＬ遠沈管に分注し、ｐＨを酢酸によりそれぞれ５．２、５．６、７．０に調整した。これらの溶液を各ｐＨにつき０．５ｍＬずつ４本の１．５ｍＬチューブに分注し、各ｐＨの溶液を２５℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度に設定したブロックヒーターにて６０分間、加熱処理した。さらに処理後の各サンプルを遠心分離（１２０００ｒｐｍ，５分間）した後に上清を回収した。回収した上清を１５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０で３倍希釈し、ＳＤＳＰＡＧＥにて分析した。また、得られた上清中に含まれるＳＰＧ・２ｄの純度をデンシトメトリー法にて求めた。結果を図１および図２に示す。【０１１６】
（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
各希釈液２０μＬを２倍濃縮のサンプル緩衝液（下記参照）にて希釈し、それぞれ４０μＬのサンプル溶液とした。これをｅ−パジェルＥ−Ｒ１５Ｌ（アトー製）１５％均一ゲルの各ウェルに１０μＬずつアプライし、電気泳動を行なった（４０ｍＡ、９０分）。その後、ゲルをＢｉｏ−Ｓａｆｅ  ＣＢＢ  Ｇ−２５０ステイン（バイオラッド）にて染色した。【０１１７】
各緩衝液の組成は以下の通り
・泳動緩衝液  （２５ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１９２ｍＭ  グリシン、０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム）
・２倍濃縮サンプル緩衝液  （１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ６．８）１２．４８ｍＬ、ブロモフェノールブルー  ０．０２ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム  ４ｇ、グリセロール  ２８ｇ、超純水  ３０ｍＬ）【０１１８】
（３）デンシトメトリーによる純度の算出
前記操作にて得られたゲルを画像データとし、ＩｍａｇｅＪ（Ｂｒｏｋｅｎ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．４．３．６７）にて解析を行なった。ゲルの各レーンにおけるタンパク質由来バンドの全面積に対する目的物バンドの面積の割合を算出することで、各条件における目的物の純度を算出した。【０１１９】
（４）結果
図１および図２より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、ＳＰＧ・２ｄの純度は４７％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを５．２まで低下させてもＳＰＧ・２ｄの純度は３６％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを５．６以下で且つ温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＳＰＧ・２ｄの純度は８６％以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＳＰＧ・２ｄをより高純度に精製できることが分かる。【０１２０】
実施例２
（１）ＳＰＡ・５ｄ培養上清／ブレビバチルス由来の酸性加熱処理
ブレビバチルスの菌体培養液１００ｍＬを遠心分離（７５００ｒｐｍ，１５分間）し、フィルターろ過（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ５００ｍＬ  Ｒａｐｉｄ−Ｆｌｏｗ  Ｂｏｔｔｌｅ  Ｔｏｐ  Ｆｉｌｔｅｒ，０．２μｍ  ａＰＥＳ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，７５ｍｍ  ｄｉａ，４５ｍｍ  ｎｅｃｋ）することで培養上清を得た。この培養上清に１０ｍＭとなるよう１Ｍ酢酸Ｎａを加え、２．５ｍＬずつ５本の１５ｍＬチューブに分注し、ｐＨを酢酸によりそれぞれ４．６、５．０、７．０に調整した。これらの溶液を各ｐＨにつき０．５ｍＬずつ４本の１．５ｍＬチューブに分注し、各ｐＨの溶液を２５℃、５５℃、６０℃、６５℃の温度に設定したブロックヒーターにて６０分間、加熱処理した。さらに処理後の各サンプルを遠心分離（１２０００ｒｐｍ，５分間）した後に上清を回収した。回収した上清を１５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０で２倍希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。また、得られた上清中に含まれるＳＰＡ・５ｄの純度をデンシトメトリー法にて求めた。結果を図３および図４に示す。【０１２１】
（２）結果
図３および図４より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、ＳＰＡ・５ｄの純度は６４％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを４．６まで低下させてもＳＰＡ・５ｄの純度は６４％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを５．０以下、温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＳＰＡ・５ｄの純度は８５％以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＳＰＡ・５ｄをより高純度に精製できることが分かる。【０１２２】
実施例３
（１）ＰＰＬ・５ｄ培養上清／ブレビバチルス由来の酸性加熱処理
培養上清の調製ｐＨを４．５、７．０とした以外は実施例２に記載の方法にて実験を行なった。デンシトメトリーによって求めた各条件におけるＰＰＬ・５ｄの純度を図５に示す。【０１２３】
（２）結果
図５より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、ＰＰＬ・５ｄの純度は４９％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを４．５としてもＰＰＬ・５ｄの純度は５３％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを４．５、温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＰＰＬ・５ｄの純度は８９％以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＰＰＬ・５ｄをより高純度に精製できることが分かる。【０１２４】
実施例４
（１）ＰＰＬ・４ｄ菌体破砕上清／大腸菌由来の酸性加熱処理
処理時の温度を２５℃、５５℃、６５℃、ｐＨを４．８、７．０とし、各条件における処理量を１ｍＬとした以外は、実施例１に記載の方法にて実験を行った。デンシトメトリーによって求めた各条件におけるＰＰＬ・４ｄの純度を図６に示す。【０１２５】
（２）結果
図６より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱してもＰＰＬ・４ｄの純度は８８％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを４．８としてもＰＰＬ・４ｄの純度は７６％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを４．８、温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＰＰＬ・４ｄの純度は最高で９９％となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＰＰＬ・４ｄをより高純度に精製できることが分かる。【０１２６】
実施例５
（１）ＳＰＡ・５ｄ培養上清／ブレビバチルス由来の酸性加熱処理後のフィルターろ過
処理時の温度を２５℃、６０℃、６５℃とし、各条件における処理量を１ｍＬとした以外は、実施例２に記載の方法にて酸性加熱処理を行った。得られた酸性加熱処理液のうち０．８ｍＬを、０．２μｍフィルター（０．２２μｍ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ，４ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ，Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ(R)（ＰＶＤＦ）ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）を装着した１ｍＬシリンジに投入後、シリンジの押子が止まるまでろ過した。ろ液を１．５ｍＬチューブに受け、ろ過前後のチューブ重量からろ液量を算出した。結果を図７に示す。【０１２７】
（２）結果
図７より、加熱処理（ｐＨ７．０  ６０℃、ｐＨ７．０  ６５℃）あるいは酸性処理（２５℃  ｐＨ４．６、２５℃  ｐＨ５．０）の場合、ろ過量は０．０５ｇから０．２４ｇであった。それに対して、加熱処理と酸性処理を組み合わせるとろ過量は増大し、６５℃  ｐＨ  ４．６、６０℃  ｐＨ  ４．６の処理ではそれぞれ０．３７ｇ、０．４ｇとなった。
以上の結果から、酸性処理と加熱処理を組み合わせることによって酸性処理のみの場合に比べ約２倍、加熱処理のみに比べて約８倍も、ろ過量が向上することが分かった。【０１２８】
実施例６
（１）酸性加熱処理後の抗体結合活性を持ったポリペプチドの活性確認
実施例５にて得られた４種の酸性加熱処理液（６０℃  ｐＨ  ４．６、６０℃  ｐＨ５．０、６５℃  ｐＨ  ４．６、６５℃  ｐＨ５．０）を１５ｍＬ遠沈管に集め、遠心分離により上清と沈殿に分離した（１２０００ｒｐｍ，５分間）。得られた上清に１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．８を加えてｐＨを８．０とした。
得られた溶液を、ＰＢＳにて平衡化したＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ（クロマトシステム：Ａｋｔａ  ａｖａｎｔ２５  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カラム：ｏｍｎｉｆｉｔ  株式会社アイシス、内径６．６ｍｍ×高さ６．２ｃｍ）に１ｍＬ負荷した。その後ＰＢＳにて洗浄を行い、５ｍＭ酢酸アンモニウムー酢酸バッファー（ｐＨ  ５．０）により中間洗浄を行った。５０ｍＭクエン酸（ｐＨ  ３．０）により溶出を行い、ＰＢＳ  ２Ｍ尿素により洗浄を行った。サンプル負荷、中間洗浄、溶出、洗浄工程のそれぞれにおいて、０．５ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた溶出液を実施例１と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。得られたクロマトグラムと溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図８および図９に示す。【０１２９】
（２）結果
図８および図９よりＳＰＡ・５ｄはフロースルー画分および押し出し画分には漏出せずにほぼ全て溶出画分に回収できたことが分かった。以上の結果より、ＳＰＡ・５ｄは酸性加熱処理後も抗体結合活性を保っていることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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