(57)【要約】  本発明の目的はiR-29a及び／又はmiR-29bを利用し、炎症性腸疾患に対して優れた予防又は治療効果を示す、炎症性腸疾患の治療剤を提供することである。  miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を含み、全身投与される、炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
2018199121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を含み、
全身投与される、炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
血管内投与又は皮下投与によって投与される、請求項１に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が400〜3000 nmである、請求項１又は２に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
【請求項４】
miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子の、
全身投与される、炎症性腸疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
【請求項５】
前記全身投与が、血管内投与又は皮下投与である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が400〜3000 nmである、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を、炎症性腸疾患の予防又は治療が求められる患者に全身投与する、炎症性腸疾患の予防又は治療方法。
【請求項８】
前記全身投与が、血管内投与又は皮下投与である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が400〜3000 nmである、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性腸疾患の予防又は治療剤に関する。より具体的には、本発明は、miR-29a及び／又はmiR-29bを利用した炎症性腸疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（Inflammatory bowel disease；IBD）は、胃腸管における慢性炎症性疾患であり、主に潰瘍性大腸炎とクローン病に大別される（非特許文献１〜３）。特に、欧米では炎症性腸疾患の発生率が高まっており（非特許文献２）、炎症性腸疾患の再発率が高いことが深刻な問題となっている。従来、急性の炎症性腸疾患に対しては、基本的には、抗炎症薬、免疫抑制薬、グルココルチコイド等を用いた治療が行われている（非特許文献４）。また、炎症性腸疾患の新たな治療法として、TNF-α等の炎症誘発性サイトカイン又はその細胞表面受容体を標的とする粘膜炎症経路を阻害する手法が提案されている（非特許文献５及び６）。【０００３】
しかしながら、薬剤投与による炎症性腸疾患の治療を行っても、約30％の患者では、深刻な炎症、腸管狭窄又は中毒性巨大結腸症のため、外科的処置が必要とされているのが現状である。【０００４】
炎症性腸疾患の病因や病態については十分に解明されていないが、酸化ストレス障害、先天的及び適応的免疫障害、遺伝的要素、腸内細菌、食生活等の複数の要因が複合的に関与していると考えられ得ている。【０００５】
一方、核酸医薬は、様々な疾患の次世代治療法として注目を浴びている。核酸医薬の中でもマイクロRNA（miRNA）は、小さな非コーディングRNAであり、主に3'-UTR領域の相補的配列に結合することによって、複数の標的遺伝子の発現を調節するRNA分子である。最近の研究により、上皮バリア機能（miRs-7,21,150）、オートファジー（miRs-13A、93,106,142-3p）、NF-kBシグナル伝達経路（miRs-126,146a）、及びIL23/Th17炎症軸（miRs-20,23a、29b、155）等に関与しているmiRNAの存在が明らかになっている（非特許文献７）。従って、これらのmiRNA又は抗miRNAは、炎症性腸疾患の治療ツールとして期待されている。しかしながら、従来、miRNAを使用した核酸医薬において、有効な治療が認められている疾患は、眼疾患、高脂血症、及び筋変性疾患に限られているのが現状である。【０００６】
また、miRNAを使用した核酸医薬では、in vivoでmiRNAを標的細胞に効率的に送達することが重要になる。従来、in vitroにおけるmiRNAの細胞内への送達にはリポソームが広く使用されているが、炎症性腸疾患の治療において、in vivoでmiRNAを効率的に炎症患部に送達する技術は確立できていない。【０００７】
一方、miR-29a及びmiR-29bをノックアウトさせたマウスでは、硫酸デキストラン(DSS)によって誘発される大腸炎を悪化させることが報告されており（非特許文献８）、miR-29a及びmiR-29bは炎症性腸疾患の治療薬として期待されている。しかしながら、前述の通り、in vivoでmiRNAを効率的に炎症性腸疾の患部に送達する技術が開発されておらず、miR-29a及びmiR-29bを症性腸疾患の治療薬として実用化する上で、in vivoでのデリバリー技術を確立することが不可欠である（非特許文献９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nat Rev Immunol 3 : 521-33, 2003
【非特許文献２】J Clin Invest 117 : 514-21, 2007
【非特許文献３】Gastroenterology 115: 182-205, 1998
【非特許文献４】Drugs 65: 2253-86, 2005
【非特許文献５】Curr Opin Gastroenterol 23: 395-9, 2007
【非特許文献６】Surgery today 45: 933-8, 2015
【非特許文献７】Gut 64(6): 1008, 2015
【非特許文献８】Immunity 39: 521-36, 2013.
【非特許文献９】Int J Nanomedicine 11: 5287-5310, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、miR-29a及び／又はmiR-29bを利用し、炎症性腸疾患に対して優れた予防又は治療効果を示す、炎症性腸疾患の予防又は治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
炭酸アパタイト粒子には核酸を細胞内に送達する作用があることが知られている（特開2007-63194号公報）。炭酸アパタイト粒子は、炎症組織に集積する作用は知られていないため、従来技術からは、miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を全身投与しても、炎症性腸疾患の患部にmiR-29a及び／又はmiR-29bを効率的に送達できないと考えられる。そこで、本発明者等は、miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を炎症性腸疾患の患部に対する局所投与を試みたところ、炎症性腸疾患の改善は殆ど認められなかった（後記する参考試験例５参照）。【００１１】
このような状況の下、本発明者等は、鋭意検討を行ったところ、miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を全身投与すると、当該miRNAの一部が炎症性腸疾患の患部に取り込まれるだけでなく、当該miRNAの一部が患部の粘膜上に局在化する樹状細胞に取り込まれ、患部で直接取り込まれた当該miRNAの作用と、当該miRNAが取り込まれた樹状細胞の作用によって、炎症性腸疾患を効果的に改善できることを見出した。即ち、miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を全身投与することによって、当該miRNAが炎症性腸疾患の患部だけでなく、炎症の初期免疫反応に関与する樹状細胞に働きかけることにより、炎症性腸疾患の治療効果が格段に高まることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１２】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を含み、
全身投与される、炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
項２．  血管内投与又は皮下投与によって投与される、項１に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
項３．  炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が400〜3000 nmである、項１又は２に記載の炎症性腸疾患の予防又は治療剤。
項４．  miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子の、
全身投与される、炎症性腸疾患の予防又は治療剤の製造のための使用。
項５．  前記全身投与が、血管内投与又は皮下投与である、項４に記載の使用。
項６．  前記炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が400〜3000 nmである、項４又は５に記載の使用。
項７．  miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を、炎症性腸疾患の予防又は治療が求められる患者に全身投与する、炎症性腸疾患の予防又は治療方法。
項８．  前記全身投与が、血管内投与又は皮下投与である、項７に記載の方法。
項９．  前記炭酸アパタイト粒子の平均粒子径が400〜3000 nmである、項７又は８に記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の炎症性腸疾患の予防又は治療剤によれば、miR-29a及び／又はmiR-29bが炭酸アパタイト粒子に担持されてなる複合粒子を全身投与することにより、当該miRNAが炎症性腸疾患の患部だけでなく、樹状細胞にも取り込まれることによって、格段に優れた治療効果を奏することができる。【００１４】
炎症性腸疾患の患部に直接取り込まれたmiR-29a及び／又はmiR-29bは、当該患部の症状の緩和又は治癒に寄与する。また、miR-29a及び／又はmiR-29bが取り込まれた樹状細胞は、ナイーブT細胞のTh-17細胞への分化に関与しているサイトカイン（IL-6及びTGF-β）とTh-17細胞を活性化させて病原性Th-17細胞（pathogenic Th17 cells）に導くサイトカイン（IL12 p40及びIL23 p19）の発現量を低下させることによって、炎症性腸疾患の治療効果に寄与する。即ち、本発明の炎症性腸疾患の予防又は治療剤では、miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を全身投与することによって、患部に直接働きかけるだけでなく、樹状細胞にも働きかけることができ、これによって格段に優れた治療効果を奏することが可能になっている。樹状細胞は炎症性腸炎の初期免疫反応に関わる重要な因子であり、本発明の炎症性腸疾患の予防又は治療剤では、これを阻害することでインターフェロンシグナルを介した腸管全体の炎症の拡がりを効果的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】参考試験例１の結果を示す図である。ａは、DSS誘導マウス腸炎モデルにMIRTX（miR-29b誘導体（人工miRNA））/sCA複合体を静脈投与した後に、直腸、横行結腸、盲腸、及び回腸におけるMIRTXの取り込み量を測定した結果を示す図である。ｂは、DSSにより惹起されたマウス腸炎モデルにAlexa647-miRNA/sCA複合体を静脈投与した後に、腸を核染色して蛍光顕微鏡で観察した結果を示す像である。
【図２】試験例１の結果を示す図である。ａは、DSSとmiR-29b/sCA複合体を静脈投与したマウスから取り出した大腸粘膜におけるmiR-29b-3ｐ発現量を測定した結果を示す図である。ｂは、DSSと各種miRNA/sCA複合体を静脈投与したマウスから摘出した直腸をHE染色して顕微鏡観察した結果を示す図である。ｃは、前記マウスの体重を経時的に測定した結果を示す図である。ｄは、試験開始から7日後の前記マウスの体重を経時的に測定した結果を示す図である。
【図３】試験例１の結果を示す図である。ａは、DSSと各種miRNA/sCA複合体を静脈投与したマウスについて、試験開始から7日後の大腸の長さを測定した結果を示す図である。ｂは、前記マウスについて、試験開始から7日後の結直腸の炎症の程度をスコア化した結果を示す図である。ｃは、試験開始時の正常群、試験開始から4日後及び6日後のDSS群について、大腸におけるmiR-29bの発現量を測定した結果を示す図である。
【図４】参考試験例２の結果を示す図である。ａは、DSS誘導マウス腸炎モデルにAlexa647-miRNA/sCA複合体を静脈投与した後に、直腸を抗CD11c抗体及びDAPIで免疫染色して蛍光顕微鏡で観察した結果を示す像である。ｂは、前記免疫染色された直腸をコンフォーカル顕微鏡にて観察した結果を示す像である。
【図５】試験例２において、DSS誘導マウス腸炎モデルにsCA-miR-29a/sCA複合体又はsCA-miR-29b/sCA複合体を静脈投与した後に、大腸を回収し、その粘膜から単離した樹状細胞における各種サイトカイン（IL12 p40、IL23 p19、IL-6、及びTGF-β）のメッセンジャーRNAの発現量を測定した結果を示す図である。
【図６】試験例３において、DSSと各種miRNA/sCA複合体を静脈投与したマウスから摘出した大腸を用いて、IPAによって遺伝子発現量を分析した結果を示す図である。
【図７】Toll-like receptor(TLR)からIFN及び炎症性サイトカインの産生に関する細胞内シグナル経路マップである。図７中、＊を付した分子では、DSSの静脈投与によって活性化が認められたものである。
【図８】IFNシグナル経路である。図８中、＊を付した分子はIPAによって遺伝子の活性化が予測されたものであり、○を付した分子はmRNAアレイによってアップレギュレートが確認された分子である。
【図９】試験例４の結果を示す図である。ａは、DSSと各種miRNA/sCA複合体を皮下投与したマウスの体重を経時的に測定した結果を示す図である。ｂは、前記マウスの試験終了時の体重を測定した結果を示す図である。ｃは、前記マウスの大腸の長さを測定した結果を示す図である。ｄは、前記マウスの直腸の炎症の程度をスコア化した結果を示す図である。ｅは、DSS+sCA-miR-29b群について、摘出した直腸をHE染色して顕微鏡に観察した結果を示す図である。
【図１０】試験例５の結果を示す図である。ａは、DSS誘導マウス腸炎モデルにAlexa647-miR-29b/sCA複合体を皮下投与した後に、直腸を抗CD11c抗体及びDAPIで免疫染色して蛍光顕微鏡で観察した結果を示す像である。ｂは、前記マウスの大腸から分離したCD11c陽性細胞とCD11c陰性細胞について、miR-29b量を測定した結果を示す図である。ｃは、前記マウスの直腸を抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体、及びDAPIで免疫染色して蛍光顕微鏡で観察した結果を示す像である。
【図１１】試験例５において、DSS誘導マウス腸炎モデルにAlexa647-miR-29b/sCA複合体を皮下投与した後に、直腸を抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体、及びDAPIで免疫染色して蛍光顕微鏡で観察した結果を示す像である。
【図１２】試験例６の結果を示す図である。ａは、DSS誘導マウス腸炎モデルにmiR-29b/sCA複合体(＞50nm)又はmiR-29b/sCA複合体(≦50nm)を静脈投与した後に、直腸をHE染色して顕微鏡に観察した結果を示す図である。ｂは、前記マウスの大腸について、組織学的に炎症度を評価した結果を示す図である。
【図１３】参考試験例３において、DSS誘導マウス腸炎モデルにAlexa647-miRNA/sCA複合体を皮下投与した後に、直腸を抗CD11c抗体及びDAPIで免疫染色して蛍光顕微鏡で観察した結果を示す像である。
【図１４】参考試験例４において、DSS誘導マウス腸炎モデルにMIRTX/sCA複合体を皮下投与した後に、大腸を回収し、その粘膜から単離したCD11c陽性細胞（樹状細胞）とCD11c陰性細胞におけるMIRTXの取り込み量を測定した結果を示す図である。
【図１５】参考試験例５の結果を示す図である。ａは、DSSと各種miRNA/sCA複合体を局所投与したマウスの体重を経時的に測定した結果を示す図である。ｂは、前記マウスの試験終了時の体重を測定した結果を示す図である。ｃは、前記マウスの大腸の長さを測定した結果を示す図である。ｄは、前記マウスの直腸の炎症の程度をスコア化した結果を示す図である。ｅは、DSS+sCA-miR-29b群について、摘出した直腸をHE染色して顕微鏡観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の予防又は治療剤は、炎症性腸疾患を予防又は治療するために使用される薬剤であって、miR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に担持させた複合粒子を含み、全身投与されることを特徴とする。以下、本発明の予防又は治療剤について詳述する。
【００１７】
miRNA
本発明の予防又は治療剤は、miRNAとして、miR-29a及び／又はmiR-29bを含む。miR-29a及びmiR-29bをノックアウトさせたマウスでは、硫酸デキストラン(DSS)によって誘発される大腸炎を悪化させることが報告されているが（非特許文献８）、これらのmiRNAが、樹状細胞において、IL-6、TGF-β、IL12 p40及びIL23 p19等のサイトカインの発現量を低下させる作用があることについては、従来知られていない。
【００１８】
本発明で使用されるmiR-29aは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miR-29aになる。相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖RNAは、細胞内で二本鎖が解けて成熟型miR-29aを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体のmiR-29aの塩基配列については、生体内でプロセシングを受けて成熟型miR-29aを生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００１９】
本発明で使用されるmiR-29aの由来については、適用対象となる動物の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、ヒトの炎症性腸疾患の治療に使用する場合であれば、ヒト由来のmiR-29aを使用すればよい。本発明で使用されるヒト由来のmiR-29aとしては、具体的には、以下に示す成熟型miR-29aが挙げられる。なお、マウス由来のmiR-29aの塩基配列は、ヒト由来のmiR-29aと同一である。
成熟型has-miR-29a（sense）：5'-UAG CAC CAU CUG AAA UCG GUU A-3'（配列番号１）
成熟型has-miR-29a（antisense）：5'-UAA CCG AUU UCA GAU GGU GCU A-3'（配列番号２）
【００２０】
また、本発明で使用されるmiR-29bは、成熟型miRNAであってもよく、またヘヤピン型前駆体miRNA（pri-miRNA）や、pri-miRNAの一部が切断されたpre-miRNAであってもよい。当該pri-miRNAやpre-miRNAは、細胞内でプロセシングを受けて成熟型miR-29bになる。相補的な塩基配列を有するRNAとからなる二本鎖の前駆体を形成していてもよい。当該二本鎖RNAは、細胞内で二本鎖が解けて成熟型miR-29bを遊離させる。また、ヘヤピン型前駆体のmiR-29bの塩基配列については、生体内でプロセシングを受けて成熟型miR-29bを生じさせるように設定すればよく、このような塩基配列は当業者にとって適宜設定可能である。
【００２１】
本発明で使用されるmiR-29bの由来については、適用対象となる動物の種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、ヒトの炎症性腸疾患の治療に使用する場合であれば、ヒト由来のmiR-29bを使用すればよい。本発明で使用されるヒト由来のmiR-29bとしては、具体的には、以下に示す成熟型miR-29bが挙げられる。なお、マウス由来のmiR-29bの塩基配列は、ヒト由来のmiR-29bと同一である。
成熟型has-miR-29b（sense）：5'-UAG CAC CAU UUG AAA UCA GUG UU-3'（配列番号３）
成熟型has-miR-29b（antisense）：5'-AAC ACU GAU UUC AAA UGG UGC UA-3'（配列番号４）
【００２２】
miR-29a及び／又はmiR-29bは、酵素に対する分解耐性等を付与するために、必要に応じて、一般的に核酸に施される各種修飾がなされていてもよい。このような修飾としては、例えば、2'-Oメチル化等の糖鎖部分の修飾；塩基部分の修飾；アミノ化、低級アルキルアミノ化、アセチル化等のリン酸部分の修飾等が挙げられる。
【００２３】
本発明の予防又は治療剤において、miRNAとして、miR-29a又はmiR-29bの一方のみを使用してもよく、またこれらを組み合わせて使用してもよい。
【００２４】
炭酸アパタイト粒子
炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）の水酸基の一部をCO3で置換した構造を有し、一般式Ca10-mXm(PO4)6(CO3)1-nYnで表される化合物である。ここで、Xは、炭酸アパタイトにおけるCaを部分的に置換し得る元素であり、例えば、Sr、Mn、希土類元素等が挙げられる。mは、通常0以上1以下の正数であり、好ましくは0以上0.1以下であり、より好ましくは0以上0.01以下であり、更に好ましくは0以上0.001以下である。Yは、炭酸アパタイトにおけるCO3を部分的に置換しうる基又は元素であり、OH、F、Cl等が挙げられる。nは、通常0以上0.1以下の正数であり、好ましくは0以上0.01以下であり、より好ましくは0以上0.001以下であり、更に好ましくは0以上0.0001以下である。
【００２５】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径については、生体内に投与されて、細胞内へ移行できる程度の大きさである限り、特に制限されないが、樹状細胞における取り込みは、主にファゴトーシスによって行われるため、血中投与される核酸キャリアーとして使用されている従来の炭酸アパタイト粒子の平均粒子径(50nm以下)よりも、大きいものを好適に使用できる。具体的には、本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の平均粒子径として、通常50nm超（例えば50nm超3000nm以下）、好ましくは100〜3000nm、更に好ましくは100〜2000nm、より好ましくは200〜2000nm又は400〜3000nm、特に好ましくは400〜2000nmが挙げられる。
【００２６】
なお、前記の炭酸アパタイトの平均粒子径は、動的光散乱法粒子計測（DLS）により測定される値である。DLSを用いた測定に適さない巨大な粒子（例えば、粒径5μｍ以上）が存在する場合は、それらは測定対象範囲から除去される。また、本明細書において、粒径とは、走査型プローブ顕微鏡で測定した際に、別個の粒子として認識可能な独立した粒子の粒径を意味する。よって、複数の粒子が凝集している場合は、それらの集合体を一つの粒子と判断する。
【００２７】
炭酸アパタイト粒子は、公知の手法に従って得ることができる。例えば、水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを共存させることによって調製することにより得ることができる。水溶液中の各イオン濃度は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されず、下記を参考に適宜設定することができる。
【００２８】
水溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００２９】
水溶液中のリン酸イオン濃度は、通常0.1〜1000mM、好ましくは0.5〜100mM、更に好ましくは1〜10mMが挙げられる。
【００３０】
水溶液中の炭酸水素イオン濃度は、通常1.0〜10000mM、好ましくは5〜1000mM、更に好ましくは10〜100mMが挙げられる。
【００３１】
カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンの供給源としては、水溶液中にこれらのイオンを供給可能である限り特に制限されないが、例えば、これらのイオンの水溶性塩が挙げられる。具体的には、カルシウムイオン源としてＣａＣｌ2を用いることができ、リン酸イオン源としてＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏを用いることができ、炭酸イオン源としてＮａＨＣＯ3を用いることができる。
【００３２】
炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り、上述する各イオン供給源及び他の物質以外の成分を含んでも良い。例えば、水溶液中に上記組成物中に、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ、ポリエチレングリコール（PEG）等を添加することにより、炭酸アパタイトにおけるＣａまたはＣＯ3等を部分的に置換、或は修飾したりしてもよい。但し、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ、PEG等の添加量は、形成される複合体粒子のｐＨ溶解性、粒径範囲に著しい影響を与えない範囲内とすることが好ましい。また、炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液は、基剤として水を使用すればよいが、細胞培養用の各種培地やバッファー等を使用してもよい。
【００３３】
本発明で使用される炭酸アパタイト粒子の調製において、水溶液中への各イオン供給源及び他の物質の混合順序は特に限定されず、目的とする炭酸アパタイト粒子が得られる限り、いかなる混合順序で水溶液を調製してもよい。例えば、カルシウムイオン及び他の物質を含有する第１の溶液を調製すると共に、別途、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する第２の溶液を調製し、第１の溶液と第２の溶液とを混合して水溶液を調製することができる。
【００３４】
炭酸アパタイト粒子は、上記の各イオンを含有する水溶液のｐＨを6.0〜9.0の範囲に調整し、一定時間放置（インキュベート）することによって得ることができる。炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のｐＨとしては、例えば7.0〜8.5、好ましくは7.1〜8.5、更に好ましくは7.2〜8.5、より更に好ましくは7.3〜8.5、特に好ましくは7.4〜8.5、最も好ましくは7.5〜8.0が挙げられる。
【００３５】
炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液の温度条件は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常4℃以上であり、好ましくは25〜80℃、更に好ましくは37〜70℃以上が挙げられる。
【００３６】
炭酸アパタイト粒子を形成するための当該水溶液のインキュベート時間は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常1分〜24時間、好ましくは5分〜1時間が挙げられる。粒子形成の有無は、例えば、顕微鏡下で観察することによって確認することができる。
【００３７】
また、炭酸アパタイト粒子の平均粒径を前記範囲に制御する方法としては、特に制限されないが、例えば、前記の水溶液中で形成した炭酸アパタイト粒子を超音波振動処理する方法が挙げられる。超音波振動処理としては、具体的には、超音波破砕機等の超音波振動子を直接試料に接触させて超音波をかける処理；超音波振動子及び水槽（洗浄槽）を備えた超音波洗浄器を用いて、当該水槽に液体（例えば、水）を入れ、そこに炭酸アパタイト粒子を収容した容器（例えば、プラスチック製のチューブ）を浮かべ、液体を介して炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に超音波をかける処理等が挙げられる。このような超音波振動処理によって、簡便且つ効率的に炭酸アパタイト粒子の粒径を前記範囲に微細化することができる。更に、超音波処理した後に、所定の孔径のフィルターにて所望の粒子径の炭酸アパタイト粒子を分離することによっても、炭酸アパタイト粒子の粒径を前記範囲に調整することができる。
【００３８】
上記の超音波振動処理の条件は、粒子径を所定範囲に制御可能である限り特に制限されない。例えば、超音波振動子及び水槽（洗浄槽）を備えた超音波洗浄器を用いて行う場合であれば、以下の条件が例示される。
水槽の温度：例えば5〜45℃、好ましくは10〜35℃、更に好ましくは20〜30℃
高周波出力：例えば10〜500Ｗ、好ましくは20〜400Ｗ、更に好ましくは30〜300Ｗ、より好ましくは40〜100Ｗ。
発振周波数：例えば10〜60Ｈｚ、好ましくは20〜50Ｈｚ、更に好ましくは30〜40Ｈｚ。
処理時間：例えば、30秒〜30分、好ましくは1〜20分、更に好ましくは3〜10分。
【００３９】
超音波振動処理を行う際に用いる、炭酸アパタイト粒子を包含する容器の種類は、粒子を所定の粒子径範囲に微細化することが可能である限り制限されず、水溶液の容量や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、1〜1000ml容量のプラスチック製チューブを用いることができる。
【００４０】
また、超音波振動処理は、分散剤の存在下（即ち、分散剤を、炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に添加した状態）で行うことが好ましい。これは、分散剤と炭酸アパタイト粒子とが共存する環境で超音波振動処理を行うことにより、より微細な粒径を有する炭酸アパタイトナノ粒子が得られ、粒子の再凝集を抑制することも可能となるためである。分散剤の種類については、炭酸アパタイト粒子を分散可能であることを限度として特に制限されず、一般に医薬品に添加される分散剤であればよいが、一例としてアルブミンが挙げられる。分散剤は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。炭酸アパタイト粒子を含む水溶液中での分散剤の濃度としては、微細化及び／又は再凝集抑制の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、0.1〜500mg/ml、好ましくは1〜100mg/ml、更に好ましくは1〜10mg/ml程度；或は0.001〜10重量％程度が挙げられる。
【００４１】
（miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合粒子）
本発明の予防又は治療剤では、miR-29a及び／又はmiR-29bが炭酸アパタイト粒子に担持されて複合化した複合粒子を使用する。このようにmiR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に複合化させることによって、miR-29a及び／又はmiR-29bを、炎症性腸疾患の患部に送達させるだけでなく、樹状細胞に効率的に取り込ませることが可能になる。また、当該複合粒子は、細胞内に導入された後に、細胞内でmiR-29a及び／又はmiR-29bが炭酸アパタイト粒子から遊離できるので、miR-29a及び／又はmiR-29bに所望の活性を発揮させることができる。
【００４２】
本発明において、miR-29a及び／又はmiR-29bが炭酸アパタイト粒子に担持されて複合化した複合粒子とは、miR-29a及び／又はmiR-29bが炭酸アパタイト粒子に対してイオン結合、水素結合等によって吸着して担持された状態を指す。miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成方法については、特に制限されないが、例えば、miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子を水溶液中で共存させることにより形成する方法；炭酸アパタイト粒子を調製する水溶液中で、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンと共に、miR-29a及び／又はmiR-29bを共存させることにより、炭酸アパタイト粒子の形成と前記miRNAと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う方法等が挙げられる。
【００４３】
miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合粒子の形成を、炭酸アパタイト粒子の形成とmiR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行う場合、炭酸アパタイトの調製に使用される水溶液中にmiR-29a及び／又はmiR-29bを、例えば0.1〜1000nM、好ましくは0.5〜500nM、更に好ましくは1〜200nMとなるように添加すればよい。通常、水溶液中に存在するmiR-29a及び／又はmiR-29bの60％程度が、炭酸アパタイト粒子に内包されて複合化される。
【００４４】
miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合粒子において、miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の比率については特に制限されず、miR-29a及び／又はmiR-29bの投与量等に応じて適宜設定すればよい。例えば、2mgのmiR-29a及び／又はmiR-29bを炭酸アパタイト粒子に複合化させる場合、前述する炭酸アパタイト粒子を調製するための水溶液2.5Lに、5mgのmiR-29a及び／又はmiR-29bを添加して、炭酸アパタイト粒子の形成と、miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合化を同時に行えばよい。
【００４５】
また、本発明では、miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合粒子を生体への投与に適した溶媒中に分散した状態で使用される。前述するように、炭酸アパタイト粒子は、各種のイオン供給源となる物質を水、培地、又はバッファー等の溶媒に溶解させることによって得られるが、そのようにして得られる炭酸アパタイト粒子分散溶液は、浸透圧、緩衝能、無菌性等の観点から必ずしも生体への全身投与に適していない。炭酸アパタイト粒子が分散した溶媒を生体への投与に適した溶媒（例えば、生理食塩水等）に置換するためには、通常、遠心分離、濾過、重力沈降等によって炭酸アパタイト粒子を溶媒から分離し、回収して溶媒を置き換える操作が必要である。炭酸アパタイト粒子を生体への投与に適した溶媒に添加した上で、前述した超音波振動処理を行うことにより、miR-29a及び／又はmiR-29bと炭酸アパタイト粒子の複合粒子が、生体への投与に適した溶媒中で前記適度な粒子径で分散させることができる。このように分散させた後に、当該複合粒子が凝集する前に速やかに生体への投与を行うことが望ましい。例えば、超音波振動処理後１分以内、好ましくは３０秒以内の投与が好適である。但し、前述するように、分散剤を添加することによって炭酸アパタイト粒子の凝集を抑制する場合は、超音波振動処理後、数分〜数十分、或は1日から数日の経過後に投与することも可能である。
【００４６】
用途
miR-29a及び／又はmiR-29bを担持した炭酸アパタイト粒子の複合粒子は、炎症性腸疾患の症状を効果的に治癒又は改善できるので、本発明の予防又は治療剤は、炎症性腸疾患は治療用途に使用できる。また、炎症性腸疾患は再発と寛解を繰り返しながら、徐々に進行することもあるので、本発明の予防又は治療剤は、炎症性腸疾患の予防や再発防止のために使用することもできる。
【００４７】
炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎とクローン病に大別されるが、本発明の予防又は治療剤は、これらのいずれに対しても適用することができる。
【００４８】
投与方法
本発明の予防又は治療剤は、全身投与により投与される。局所投与では、樹状細胞に対してmiR-29a及び／又はmiR-29bを送達することができないが、全身投与することによって、前記miRNAの一部を患部に直接送達すると共に、前記miRNAの一部を樹状細胞に効率的に取り込ませることが可能になる。
【００４９】
全身投与としては、具体的には、血管内（動脈内又は静脈内）投与、皮下投与、筋肉内投与、腹膜内投与等が挙げられる。これらの中でも、炎症性腸疾患の治療効果をより一層向上させるという観点から、好ましくは血管内投与、皮下投与、更に好ましくは静脈内注射が挙げられる。
【００５０】
本発明の予防又は治療剤の投与量については、炎症性腸疾患の程度、患者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、miR-29a及び／又はmiR-29bの成熟型miRNA量換算で１日当たり1〜100mg/m2（体表面積）程度が挙げられる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例等に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下に示す試験は、全て、大阪大学医学部の動物管理使用委員会、及び大阪大学動物実験委員会（承認番号:260033-006）の承認の下で行った。【００５２】
参考例１：miRNA及び炭酸アパタイトの複合体の調製
試験例６以外では、以下の方法で製造したmiRNA及び炭酸アパタイトの複合体を使用した。先ず、無機水溶液(NaHCO3; 44 mM, NaH2PO4; 0.9 mM, CaCl2; 1.8 mM, pH 7.5)を調製した。この無機水溶液50mlにmiRNA100μgを添加し、37℃で30分間インキュベートした。その後、12,000rpm×3分で遠沈して、60μgのmiRNAを含むペレット（miRNAを炭酸アパタイト粒子に内包させた複合粒子；miRNA/sCA複合体）を得た。当該ペレットに200μLとなるように生理食塩水（0.5重量%アルブミン含有）を添加して分散させ、これを超音波振動処理（38 kHz, 80 W）に10分間かけて、直ちに試験に使用した。なお、得られたmiRNA/sCA複合体は、平均粒径が400〜2000nmであることがゼータサイザーナノZS（マルバーン）を用いた動的光散乱法粒子計測（DLS）において確認されている。【００５３】
以下の試験例では、以下に示す成熟miRAN（2本鎖）を使用した。以下の試験例において、使用したmiRNAの量は、センス鎖とアンチセンス鎖の合計量である。以下、miR-29aを包含した炭酸アパタイト粒子を「miRNA-29a/sCA複合体」と表記することもある。また、他のmiRNAを包含した炭酸アパタイト粒子についても、同様の記載形式で表記することもある。【００５４】
【表１】
2018199121.tif 000003
【００５５】
参考試験例１
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）に、デキストラン硫酸（DSS）2重量％を含む水を7日間飲水させて、炎症性腸炎を発症させ、DSS誘導マウス腸炎モデルを作成した。当該DSS誘導マウス腸炎モデルに、MIRTX/sCA複合体又はAlexa647-miRNA/sCA複合体を、miRNAの投与量が60μg/マウスとなるように、尾静脈投与した。【００５６】
MIRTX/sCA複合体を投与した群では、投与から４時間後にマウスを犠死させ、直腸、横行結腸、盲腸、及び回腸をすりつぶし、RNAを回収した。次いで、定量RT-PCRでMIRTXの各腸管での取り込み量を測定した（n=3）。なお、MIRTXの定量は、RNU6Bを内部標準として使用しRNU6B量に対するMIRTX量の相対値として求めた。【００５７】
また、Alexa647-miRNA/sCA複合体を投与した群では、投与から４時間後にマウスから直腸（炎症が一番強く現れる直腸部位）を取り出して凍結切片を作成し、4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）を用いて核染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察を行った。【００５８】
なお、比較のために、DSSを投与していない正常マウスを使用したこと以外は、前記と同条件で試験を行った。【００５９】
MIRTX/sCA複合体を投与してMIRTXの各腸管での取り込み量を測定した結果を図１のａに示す。この結果、DSSを与えていない正常マウスと比べて、DSS誘導マウス腸炎モデルでは、MIRTXの腸管での取り込み量が有意に高くなっていたが、MIRTXの取り込み量自体は、さほど多くなかった。【００６０】
また、Alexa647-miRNAを投与した後に回収された直腸を核染色して顕微鏡観察した結果を図１のｂに示す。なお、図１のｂにおいて、スケールバーは50μｍである。この結果、DSS誘導マウス腸炎モデルは、DSSを与えていない正常マウスと比べて、直腸においてAlexa647-miRNAが取り込まれたことを示す赤色シグナル（Alexa647の蛍光）が少し増加していたものの、依然としてそのシグナルは比較的少数であった。以上の結果から、miRNA/sCA複合体を尾静脈投与しても、腸管へのmiRNAの取り込み量は、高いレベルに到達しないことが確認された。【００６１】
試験例１
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）を表２に示す6つの群に分けた。各群のマウスに表２に示す条件でDSSとmiRNA/sCA複合体又はmiRNAの投与を行った。【００６２】
【表２】
2018199121.tif 000004
【００６３】
試験開始から終了時までにマウスの体重を計測した（n=5）。また、試験開始時のNormal群、試験開始から4日目及び6日目のDSS群及びDSS+ sCA-miR-29b群について、マウスを犠死させ、大腸粘膜を回収してすりつぶし、RNAを回収した。次いで、定量RT-PCRでmiR-29b-3ｐ発現量を測定した（n=3）。なお、miR-29b-3ｐ発現量の定量は、RNU6Bを内部標準として使用し、RNU6B量に対するmiR-29bの発現量の相対値として求めた。【００６４】
また、9日目に犠死させたマウスから大腸を回収した。回収した大腸から、大腸の長さを測定すると共に、炎症が一番強く現れる直腸部位についてHematoxylin-Eosin(HE)染色を行い、炎症の状態を顕微鏡にて観察した（n=5）。また、炎症が一番強く現れる直腸部位の炎症の程度を下記の基準に従って、粘膜ダメージ、粘膜下組織ダメージ、及び筋層ダメージをスコア化し、これらのスコアの合計値を組織学的炎症スコア（Histological inflammation score）として算出した（n=5）。
＜粘膜ダメージ＞
０：normal
１：3-10 intraepithelial lymphocytes (IEL)/high power field (HPF) and focal damage
２：10 IEL/HPF and rare crypt abscesses
３：10 IEL/HPF, multiple crypt abscesses and erosion/ulceration
＜粘膜下組織ダメージ＞
０：normal or widely scattered leukocytes
１：focal aggregates of leukocytes
２：diffuse leukocyte infiltration with expansion of submucosa
３：diffuse leukocyte infiltration
＜筋層ダメージ＞
０：normal or widely scattered leukocytes
１：widely scattered leukocyte aggregates between muscle layers
２：leukocyte infiltration with focal effacement of the muscularis
３：extensive leukocyte infiltration with transmural effacement of the muscularis【００６５】
DSS群及びDSS+ sCA-miR-29b群について、大腸粘膜におけるmiR-29b-3ｐ発現量を測定した結果を図２のａに示す。この結果、DSS群では、Normal群に比べてmiR-29bの発現量の低下が認められたが、DSS+ sCA-miR-29b群では、DSS群に比べてmiR-29bの発現量の低下を有意に抑制できていることが確認された。【００６６】
直腸をHE染色して観察した結果を図２のｂに示す。この結果、DSS群、DSS+sCA-NC-miR群、及びDSS+miR-29b群では、直腸の粘膜構造が破壊され、多数の炎症細胞が粘膜に浸潤していることが確認された。これに対して、DSS+sCA-miR-29a群及びDSS+sCA-miR-29b群では、結腸の粘膜構造は殆ど正常に維持されており、炎症細胞の浸潤もほとんど認められなかった。【００６７】
マウスの体重を経時的に測定した結果を図２のｃに示し、試験開始から7日後のマウスの体重を測定した結果を図２のｄに示す。また、大腸の長さを測定した結果を図３のａに示し、組織学的炎症スコアの結果を図３のｂに示す。この結果、DSS+sCA-miR-29a群及びDSS+sCA-miR-29b群では、DSS群、DSS+sCA-NC-miR群、及びDSS+miR-29b群に比べて、マウスの体重の減少の抑制、大腸の短縮化の抑制、及び組織学的炎症スコアの低値化が、有意に認められた。【００６８】
以上の結果から、miR-29a/sCA複合体及びmiR-29b/sCA複合体は静脈投与すると、腸管への直接的なmiRNAの取り込みが低いにも拘わらず（前記参考試験例１の結果）、炎症性腸疾患を効果的に改善できることが明らかとなった。【００６９】
また、試験開始時の正常群、試験開始から4日後及び6日後のDSS群について、大腸におけるmiR-29bの発現量を測定した結果を図３のｃに示す。この結果、炎症性腸疾患を発症しているマウスでは、大腸におけるmiR-29bの発現量が低下することが明らかとなった。【００７０】
参考試験例２
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）に、DSS 2重量％を含む水を7日間飲水させて、炎症性腸炎を発症させ、DSS誘導マウス腸炎モデルを作成した。当該DSS誘導マウス腸炎モデルに、Alexa647-miRNA/sCA複合体を、miRNAの投与量が60μg/マウスとなるように尾静脈投与した。Alexa647-miRNA/sCA複合体の投与から4時間後にマウスから大腸を取り出し、炎症が一番強く現れる直腸部位について凍結切片を作成し、抗CD11c抗体及びDAPIを用いて免疫染色（CD11cは緑色）を行い、蛍光顕微鏡及びコンフォーカル顕微鏡にて観察を行った。また、比較のために、DSSを投与していない正常マウスを使用したこと以外は、前記と同条件で試験を行った。【００７１】
免疫染色した凍結切片について、蛍光顕微鏡で観察した結果を図４のａに示し、DSS誘導マウス腸炎モデルを使用した場合についてコンフォーカル顕微鏡にて観察した結果を図４のｂに示す。なお、図４のａにおけるスケールバーは50μｍであり、図４のｂにおけるスケールバーは5μｍである。図４のａにおいて、上段の像はAlexa647-miRNAが発する赤色シグナルとDAPIが発する青色シグナルを観察した結果、中段の像は抗CD11c抗体が発する緑色シグナルとDAPIが発する青色シグナルを観察した結果、下段の像は、上段の像と中段の像のマージした像である。抗CD11c抗体による発色は樹状細胞が存在していることを表している。【００７２】
図４のａから分かるように、Alexa647-miRNAが発する赤色シグナルと抗CD11c抗体による緑色シグナルの分布が一致していることが確認された。また、図４のｂから、抗CD11c抗体による緑色シグナルは細胞表面に存在し、Alexa647-miRNAが発する赤色シグナルは細胞質内に充満していることが分かった。以上の結果から、siRNA/sCA複合体を静脈投与すると、siRNA/sCA複合体が樹状細胞に取り込まれ、当該樹状細胞が腸管で活動していることが明らかとなった。【００７３】
試験例２
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）に、DSS 2重量％を含む水を7日間飲水させて、炎症性腸炎を発症させ、DSS誘導マウス腸炎モデルを作成した。当該DSS誘導マウス腸炎モデルに、sCA-miR-29a/sCA複合体又はsCA-miR-29b/sCA複合体を、miRNAの投与量が1回当たり60μg/マウスとなるように、1日目、2日目、及び3日目に尾静脈投与し、4日目にマウスから大腸を取り出した。当該大腸の粘膜から粘膜固有層細胞（Lamina propria cells）を抽出し、抗CD11c抗体とautoMACS Pro Separatorを用いて、CD11c陽性細胞を分離した。得られたCD11c陽性細胞からRNAを抽出した。次いで、定量RT-PCRで各種サイトカイン（IL12 p40、IL23 p19、IL-6、及びTGF-β）の発現量を測定した（n=3）。なお、各サイトカインの発現量の定量は、β-actinを内部標準として使用し、β-actin量に対する各サイトカインの発現量の相対値として求めた。【００７４】
また、比較のために、DSS及びmiRNA/sCA複合体を投与していない正常マウス（Normal）、並びにDSSのみの投与を行い、miRNA/sCA複合体を投与していないDSS誘導マウス腸炎モデル（DSS）についても、前記と同様に各サイトカイン発現量の測定を行った。【００７５】
得られた結果を図５に示す。この結果、DSS誘導マウス腸炎モデルにsCA-miR-29a/sCA複合体又はsCA-miR-29b/sCA複合体を静脈投与することによって、IL12 p40、IL23 p19、IL-6、及びTGF-βの発現量の有意な低下が認められた。IL-6及びTGF-βは、ナイーブT細胞のTh-17細胞への分化に関与していることが知られているサイトカインであり、IL12 p40及びIL23 p19はTh-17細胞を活性化させて病原性Th-17細胞（pathogenic Th17 cells）に導くサイトカインであることが知られている。つまり、sCA-miR-29a/sCA複合体又はsCA-miR-29b/sCA複合体を静脈投与することによって、miR-29a又はmiR-29ｂが樹状細胞に蓄積することによって、IL-6及びTGF-βをダウンレギュレーションしてナイーブT細胞がTh-17細胞に分化するのを抑制すると共に、IL12 p40及びIL23 p19をダウンレギュレーションしてTh-17細胞が病原性Th-17細胞に活性化するのが抑制されたと類推される。【００７６】
試験例３
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）を表３に示す４つの群に分けた。各群のマウスに表３に示す条件でDSSとmiRNA/sCA複合体の投与を行った。【００７７】
【表３】
2018199121.tif 000005
【００７８】
犠死させたマウスから大腸を回収した。回収した大腸からRNAを抽出し、TruSeq stranded mRNA sample prep kit (Illumina, San Diego, CA)を使用して、製造元の指示書に従ってmRNAライブラリーを作成した。シーケンス決定は、Illumina HiSeq 2500 platform（75-base single-end mode）を用いて行った。ベースコールは、Illumina Casava1.8.2 ソフトウェアを用いて行った。決定した配列は、Bowtie2 ver. 2.2.3 とSAMtools ver. 0.1.19TopHat v2.0.13を組み合わせたTopHat v2.0.13を用いて、マウス参照ゲノム配列（mm10）にマップした。100万個のリード配列をマッピングし、転写産物（フラグメント）の長さを1キロbaseとしたときの正規化された遺伝子発現量をCuffnorm version2.2.1を用いて算出した。【００７９】
次いで、QIAGEN's Ingenuity Pathway Analysis(IPA, QIAGENRedwood City、www.qiagen.com/ingenuity)でpathway解析を行った(カットオフ値は各遺伝子に対してP < 0.05に設定)。【００８０】
IPAによって遺伝子発現量を分析した結果を図６のａに示す。図６には、Normal群とsCA-NC-miR群との対比で、sCA-NC-miR群において活性化が認められた分子、即ちDSSの投与で活性化した分子をピックアップしている。図６において、色が濃い程、活性化（発現量）の程度が高いことを示している。また、図６において下線を示している分子は、多くのIFN経路関連分子として同定されているものである。この結果、sCA-miR-29a群及びsCA-miR-29b群では、sCA-NC-miR群で活性化が認められた分子のＺスコア（活性化の程度）を低下させる傾向が認められた。【００８１】
また、図７に、Toll-like receptor(TLR)からIFN及び炎症性サイトカインの産生に関する細胞内シグナル経路マップを示す。図７において＊を付した分子では、DSSの投与によって活性化が認められた。更に、図８に公知のIFNシグナル経路を示す。図８において、＊を付した分子はIPAによって活性化が予測された遺伝子の活性化が予測されたものであり、○を付した分子はmRNAアレイによってアップレギュレートが確認された分子である。【００８２】
試験例４
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）を表４に示す４つの群(各群n=3)に分けた。各群のマウスに表４に示す条件でDSSとmiRNA/sCA複合体の投与を行った。【００８３】
【表４】
2018199121.tif 000006
【００８４】
試験開始から終了時までにマウスの体重を計測した。また、マウスから大腸を回収し、大腸の長さを測定すると共に、炎症が一番強く現れる直腸部位についてHematoxylin-Eosin(HE)染色を行い、炎症の状態を顕微鏡にて観察した。更に、炎症が一番強く現れる直腸部位の炎症の程度を、前記試験例１と同様の方法でスコア化し、組織学的炎症スコア（Histological inflammation score）を求めた。【００８５】
マウスの体重を経時的に測定した結果を図９のａに示し、試験終了時（miRNA/sCA複合体投与開始から９日目）のマウスの体重を測定した結果を図９のｂに示す。また、大腸の長さを測定した結果を図９のｃ、及び組織学的炎症スコアの結果を図９のｄに示す。この結果、DSS+sCA-miR-29b群では、DSS群及びDSS+sCA-NC-miR群に比べて、マウスの体重の減少の抑制、大腸の短縮化の抑制、及び組織学的炎症スコアの低値化が、有意に認められた。【００８６】
また、DSS+sCA-miR-29b群について、直腸をHE染色して観察した結果を図９のｅに示す。図９のｅから分かるように、DSS+sCA-miR-29b群では、結腸の粘膜構造は殆ど正常に維持されており、炎症細胞の浸潤もほとんど認められなかった。【００８７】
以上の結果から、miR-29b/sCA複合体は、静脈投与だけでなく、皮下投与であっても、炎症性腸疾患を効果的に改善できることが確認された。即ち、これらの結果から、miR-29a/sCA複合体及びmiR-29b/sCA複合体は、全身投与することによって、炎症性腸疾患を効果的に治療できることが強く示唆された。【００８８】
試験例５
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）に、DSS 2重量％を含む水を7日間飲水させて、炎症性腸炎を発症させ、DSS誘導マウス腸炎モデルを作成した。当該DSS誘導マウス腸炎モデルに、Alexa647 conjugated miR-29b/sCA複合体を、miRNAの投与量が60μg/マウスとなるように皮下投与した。【００８９】
前記複合体の投与から4時DSS間後にマウスから大腸を取り出し、炎症が一番強く現れる直腸部位の凍結切片を作成し、抗CD11c抗体、抗Ly-6G抗体、抗F4/80抗体、抗CD4抗体、抗CD45R抗体、及びDAPIを用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡にて観察を行った。【００９０】
抗CD11c抗体（緑）及びDAPI（青）で核とCD11c+樹状細胞を免疫染色した凍結切片について、蛍光顕微鏡で観察した結果を図１０ａに示す。図１０ａから分かるように、Alexa647-miRNAが発する赤色シグナルと抗CD11c抗体による緑色シグナルの分布が一致していることが確認された。即ち、この結果から、Alexa647 conjugated miR-29b/sCA複合体を皮下投与すると、miRNAが効率的に樹状細胞に取り込まれて、炎症を起こしている腸管に局在化することが確認された。【００９１】
また、前記で取り出した大腸から粘膜固有層細胞（Lamina propria cells）を抽出し、抗CD11c抗体とautoMACS Pro Separatorを用いて、CD11c陽性細胞とCD11c陰性細胞に分離した。得られたCD11c陽性細胞とCD11c陰性細胞から、それぞれRNAを回収した。次いで、定量RT-PCRでmiR-29b量を測定した。なお、miR-29b量の定量は、前記複合体を投与しなかった場合のmiR-29bの発現量を１とする相対値として求めた。結果を図１０ｂに示す。この結果、CD11c陽性細胞において、Alexa647-miRNAを投与した群（DSS+sCA-miR-29b）では、DSSのみを投与した群（DSS alone）に比べて、miR-29b量が増大していることが確認された。当該miR-29b量の増大は、CD11c陽性細胞において外来のmiR-29b（即ち、Alexa 647 conjugated miR-29b）が取り込まれていることに起因しているといえる。以上の結果から、皮下投与されたAlexa 647 conjugated miR-29bとCD11c陽性細胞の局在パターンが一致していることが明らかとなり、皮下投与されたAlexa 647 conjugated miR-29bは樹状細胞に取り込まれて、炎症を起こしている腸管に局在化することが確認された。【００９２】
また、抗Ly-6G抗体（緑）及びDAPI（青）で核とLy-6G+好中球を免疫染色した結果、抗F4/80抗体（緑）及びDAPI（青）で核とF4/80+マクロファージを免疫染色した結果、抗CD4抗体（緑）及びDAPI（青）で核とCD4+ヘルパーT細胞を免疫染色した結果、抗CD45R抗体（緑）及びDAPI（青）で核とCD45R+B細胞を免疫染色した結果を図１１に示す。この結果、Alexa 647 conjugated miR-29bが呈する赤色は、前記各免疫細胞が呈する緑色と重なっておらず、皮下投与されたAlexa 647 conjugated miR-29bは、樹状細胞以外の免疫細胞には取り込まれていないことが確認された。【００９３】
試験例６
（１）miR-29b/sCA複合体の調製
先ず、無機水溶液(NaHCO3; 44 mM, NaH2PO4; 0.9 mM, CaCl2; 1.8 mM, pH 7.5)を調製した。この無機水溶液50mlにmiR-29b 100μgを添加し、37℃で30分間インキュベートした。その後、12,000rpm×3分で遠沈して、60μgのmiRNAを含むペレット（miRNAを炭酸アパタイト粒子に内包させた複合粒子；miRNA/sCA複合体）を得た。当該ペレットに200μLとなるように生理食塩水（0.5重量%アルブミン含有）を添加して分散させ、これを超音波振動処理（38 kHz, 80 W）を行った後に、メンブレンフィルターによって、50 nm超且つ約3000nm以下の粒子（以下、miR-29b/sCA複合体(＞50nm)）と10 nm以上50 nm以下の粒子（以下、miR-29b/sCA複合体(≦50nm)）に分離して、直ちに試験に使用した。【００９４】
（２）試験方法
8週齢のBALB/cAJclマウス（雌）を表５に示す３つの群（各群当たり2匹）に分けた。各群のマウスに表５に示す条件でDSSとmiR-29b/sCA複合体の投与を行った。【００９５】
【表５】
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【００９６】
犠死させたマウスから大腸を回収してHematoxylin-Eosin(HE)染色を行い、炎症の状態を顕微鏡にて観察し、組織学的に炎症度を評価した。炎症度は、「粘膜固有層の傷害」、「粘膜下層の傷害」及び「筋層の傷害」の3項目について、下記判定基準に従って0〜３点に評点化し、合計9点満点として評価した。また、炎症度の評価は、回収した大腸全長を10等分し、それぞれ10視野の評価結果を平均することによりスコア化した。
＜粘膜固有層の傷害の判定基準＞
０点：正常所見。
１点：強拡大1視野(high power field；HPF)当たり、3〜10個の上皮ない細胞(intraepithelial lymphocytes；IEL)の存在、局所の粘膜障害が認められる。
２点：HPF当たり10個以上のIELと、陰窩膿瘍が僅かに認められる。
３点：HPF当たり10個以上のIELと、陰窩膿瘍の散在、及び糜爛・潰瘍が僅かに認められる。
＜粘膜下層の傷害の判定基準＞
０点：正常、又は好中球浸潤像がわずかに散見される。
１点：局所の好中球浸潤が認められる。
２点：瀰漫性に好中球浸潤を認め、粘膜下層の拡大を伴う。
３点：粘膜下層全体に好中球浸潤が認められる。
＜筋層の傷害の判定基準＞
０点：正常、又は好筋層の一部に好中球が散見される。
１点：筋層は保持されているが、筋層間に瀰漫性に好中球浸潤が認められる。
２点：好中球浸潤のため、筋層の配列の乱れが認められる。
３点：広範な好中球浸潤のため、貫壁性に筋層の配列の乱れが認められる。【００９７】
（３）試験結果
HE染色して観察した結果を図１２のａに示す。図１２のａから分かるように、DSS+sCA(＞50nm)-miR-29b群及びDSS+sCA(≦50nm)-miR-29b群では、DSS群に比べて大腸の粘膜構造の破壊の程度が低くなっており、特にDSS+sCA(＞50nm)-miR-29b群では、DSS+sCA(≦50nm)-miR-29b群に比べて、大腸の粘膜構造の破壊の程度が格段低くなっていた。【００９８】
また、組織学的に炎症度を評価した結果を図１２のｂに示す。組織学的な評価結果からも、DSS+sCA(＞50nm)-miR-29b群では、DSS群に比べて有意な差が認められ、炎症抑制効果が格段に高いことが確認された。【００９９】
以上の結果から、miR-29bを担持させる炭酸アパタイトとして、粒子径が50nm超という大きな粒子を使用することによって、炎症性腸疾患の治療効果がより一層向上することが明らかとなった。【０１００】
参考試験例３
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）に、DSS 2重量％を含む水を7日間飲水させて、炎症性腸炎を発症させ、DSS誘導マウス腸炎モデルを作成した。当該DSS誘導マウス腸炎モデルに、Alexa647-miRNA/sCA複合体を、miRNAの投与量が60μg/マウスとなるように皮下投与した。Alexa647-miRNA/sCA複合体の投与から4時間後にマウスから大腸を取り出し、炎症が一番強く現れる直腸部位の凍結切片を作成し、抗CD11c抗体及びDAPIを用いて免疫染色（CD11cは緑色）を行い、蛍光顕微鏡にて観察を行った。【０１０１】
免疫染色した凍結切片について、蛍光顕微鏡で観察した結果を図１３に示す。図１３から分かるように、Alexa647-miRNAが発する赤色シグナルと抗CD11c抗体による緑色シグナルの分布が一致していることが確認された。即ち、miRNA/sCA複合体を皮下投与しても、静脈投与の場合と同様に、miRNAが効率的に樹状細胞に取り込まれて、炎症を起こしている腸管に局在化することが確認された。【０１０２】
参考試験例４
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）に、デキストラン硫酸（DSS）2重量％を含む水を7日間飲水させて、炎症性腸炎を発症させ、DSS誘導マウス腸炎モデルを作成した。当該DSS誘導マウス腸炎モデルに、MIRTX/sCA複合体を、miRNAの投与量が60μg/マウスとなるように、皮下脈投与した。【０１０３】
MIRTX/sCA複合体の投与から４時間後にマウスを犠死させ、大腸を取り出した。当該結腸の粘膜から粘膜固有層細胞（Lamina propria cells）を抽出し、抗CD11c抗体とautoMACS Pro Separatorを用いて、CD11c陽性細胞とCD11c陰性細胞に分離した。得られたCD11c陽性細胞とCD11c陰性細胞から、それぞれRNAを回収した。次いで、定量RT-PCRでMIRTXの各腸管での取り込み量を測定した。なお、MIRTXの定量は、RNU6Bを内部標準として使用し、RNU6B量に対するMIRTX量の相対値として求めた。【０１０４】
また、比較のために、MIRTX/sCA複合体を投与せずに、前記と同条件でMIRTXの定量を行った。【０１０５】
得られた結果を図１４に示す。この結果、MIRTX/sCA複合体を皮下脈投与した場合に、CD11c陽性細胞においてMIRTX量が多く確認されたが、CD11c陰性細胞ではMIRTX量が少なかった。即ち、この結果からも、miRNA/sCA複合体を皮下投与すると、効率的に樹状細胞に取り込まれて、炎症を起こしている腸管に局在化することが確認された。【０１０６】
参考試験例５
7週齢のBALB/cマウス（日本クレア株式会社）を表６に示す４つの群(各群n=5)に分けた。各群のマウスに表６に示す条件でDSSとmiRNA/sCA複合体の投与を行った。【０１０７】
【表６】
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【０１０８】
試験開始から終了時までにマウスの体重を計測した。また、マウスから大腸を回収し、大腸の長さを測定すると共に、Hematoxylin-Eosin(HE)染色を行い、炎症の状態を顕微鏡にて観察した。更に、炎症が一番強く現れる直腸部位について、炎症の程度を前記試験例１と同様の方法でスコア化し、組織学的炎症スコア（Histological inflammation score）を求めた。【０１０９】
マウスの体重を経時的に測定した結果を図１５のａに示し、試験終了時（miRNA/sCA複合体投与開始から９日目）のマウスの体重を測定した結果を図１５のｂに示す。また、大腸の長さを測定した結果を図１５のｃ、及び組織学的炎症スコアの結果を図１５のｄに示す。この結果、DSS+sCA-miR-29b群は、DSS群及びDSS+sCA-NC-miR群と同様に、マウスの体重の減少の抑制、大腸の短縮化の抑制、及び組織学的炎症スコアの低値化が、殆ど認められなかった【０１１０】
また、DSS+sCA-miR-29b群について直腸をHE染色して観察した結果を図１５のｅに示す。この結果でも、DSS+sCA-miR-29b群は、結腸の炎症が殆ど改善されていないことが確認された。【０１１１】
即ち、本結果から、miR-29b/sCA複合体は、炎症性腸疾患に対して局所投与しても、改善効果は殆ど認められないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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