(57)【要約】  本発明は、エネルギー生産に関与するＰＧＣ−１αの生合成を促進したり、運動不足などによる遅筋速筋化を抑制したりすることができ、且つ安全な薬剤を提供することを目的とする。本発明に係るＰＧＣ−１α生合成促進剤と遅筋速筋化抑制剤は、エンテロコッカス属細菌を有効成分として含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）を有効成分として含むことを特徴とするＰＧＣ−１α生合成促進剤。
【請求項２】
上記Ｒ３０株が死菌である請求項１に記載のＰＧＣ−１α生合成促進剤。
【請求項３】
経口投与するものである請求項１または２に記載のＰＧＣ−１α生合成促進剤。
【請求項４】
エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）を有効成分として含むことを特徴とする遅筋速筋化抑制剤。
【請求項５】
上記Ｒ３０株が死菌である請求項４に記載の遅筋速筋化抑制剤。
【請求項６】
経口投与するものである請求項４または５に記載の遅筋速筋化抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＧＣ−１α生合成促進剤または請求項４〜６のいずれかに記載の遅筋速筋化抑制剤を含むことを特徴とする飲食品。
【請求項８】
更にパッケージを含み、当該パッケージに遅筋速筋化抑制機能またはそれに関連する機能が表示されている請求項７に記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エネルギー生産に関与するＰＧＣ−１αの生合成を促進したり、運動不足などによる遅筋速筋化を抑制することができる安全な薬剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
筋肉の衰えは、高齢者の自立した日常生活動作（ＡＤＬ）を阻害するため、入院患者のリハビリテーション等で問題となっている。よって、運動不足による筋肉減少、加齢や疾患による筋肉減少（サルコペニア）や、寝たきり等で筋肉を長期間使わないことによる筋肉萎縮（廃用性筋萎縮）への対策が求められている。【０００３】
筋肉には大きく分けて、姿勢の維持や持久力などに使われる遅筋（タイプＩ筋線維）と瞬間的に大きな力を出す速筋（タイプＩＩ筋線維）の２種類がある。筋肉量や筋力向上が望まれるのはいずれのタイプの筋肉においても同様だが、特に日常生活の動作に主として使われる遅筋は、筋肉を使わない場合に速筋化して減少することが知られている。特に高齢者や運動に制限がある対象者の場合には、単に筋肉の総量を維持するだけでなく、遅筋の速筋化を抑制して筋肉の質を維持することが望まれている。これまでに、分岐鎖アミノ酸による腓腹筋の重量減少抑制（非特許文献１）、ヌクレオプロテインによる廃用性筋萎縮に伴う速筋化の予防（非特許文献２）、発酵茶高分子ポリフェノールによる速筋の遅筋化（特許文献１）、果実ポリフェノールによる遅筋の速筋移行抑制（特許文献２）等が報告されている。【０００４】
また、近年の健康志向を背景にして、ヒトや動物に有益な生理活性作用を発揮する有効成分として乳酸菌が注目されている。これまでに、ヒトや動物への経口投与による整腸作用や抗アレルギー作用、コレステロール低減作用、血圧降下作用など様々な生理活性が知られており（非特許文献３）、乳酸菌の筋肉に対する作用については、ラクトバシルス属乳酸菌によるＡｔｒｏｇｉｎ−１発現抑制作用と筋肉の分解抑制が報告されている（特許文献３）。また、本願出願人は、疲労改善や血流改善効果を持つ乳酸菌としてエンテロコッカス・フェシウムを報告している（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０３７３２３号公報
【特許文献２】特開２００６−３２８０３１号公報
【特許文献３】特開２０１６−２１６４０８号公報
【特許文献４】国際公開第２０１４／０２１２０５号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２０１１，１３，１７０
【非特許文献２】稲元健太ら，理学療法学，第３９巻，Ｓｕｐｐｌ．Ｎｏ．２，Ａｂ１１０９（２０１２）
【非特許文献３】Ｆｕｌｌｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８９，６６，３６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したように、遅筋速筋化抑制作用を有する成分は見出されているが、原料の入手や原料からの精製に手間がかかる等の問題があった。一方、乳酸菌は培養により容易に増やすことができる。しかし、例えば特許文献３に記載の乳酸菌は、筋肉の分解抑制作用を有することから筋肉量の維持は期待できるものの、筋肉の質を維持または向上し得る様な遅筋速筋化抑制作用を有する乳酸菌の報告は見当たらない。
そこで本発明は、エネルギー生産に関与するＰＧＣ−１αの生合成を促進したり、運動不足などによる遅筋速筋化を抑制したりすることができ、且つ安全な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、安全な乳酸菌であるエンテロコッカスに属する特定の細菌が、ＰＧＣ−１α生合成促進作用と遅筋速筋化抑制作用を示すことを見出して、本発明を完成した。
以下、本発明を示す。【０００９】
［１］  エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）を有効成分として含むことを特徴とするＰＧＣ−１α生合成促進剤。【００１０】
［２］  上記Ｒ３０株が死菌である上記［１］に記載のＰＧＣ−１α生合成促進剤。【００１１】
［３］  経口投与するものである上記［１］または［２］に記載のＰＧＣ−１α生合成促進剤。【００１２】
［４］  エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）を有効成分として含むことを特徴とする遅筋速筋化抑制剤。【００１３】
［５］  上記Ｒ３０株が死菌である上記［４］に記載の遅筋速筋化抑制剤。【００１４】
［６］  経口投与するものである上記［４］または［５］に記載の遅筋速筋化抑制剤。【００１５】
［７］  上記［１］〜［３］のいずれかに記載のＰＧＣ−１α生合成促進剤または上記［４］〜［６］のいずれかに記載の遅筋速筋化抑制剤を含むことを特徴とする飲食品。【００１６】
［８］  更にパッケージを含み、当該パッケージに遅筋速筋化抑制機能またはそれに関連する機能が表示されている上記［７］に記載の飲食品。【００１７】
［９］  エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）またはその処理物を対象者に投与する工程を含むことを特徴とするＰＧＣ−１α生合成の促進方法。【００１８】
［１０］  上記Ｒ３０株が死菌である上記［９］に記載の方法。【００１９】
［１１］  上記Ｒ３０株を経口投与する上記［９］または［１０］に記載の方法。【００２０】
［１２］  遅筋速筋化を抑制する上記［９］〜［１１］のいずれかに記載の方法。【００２１】
［１３］  エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２）またはその処理物を対象者に投与する工程を含むことを特徴とする遅筋速筋化の抑制方法。【００２２】
［１４］  上記Ｒ３０株が死菌である上記［１３］に記載の方法。【００２３】
［１５］  上記Ｒ３０株を経口投与する上記［１３］または［１４］に記載の方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係るエンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株は、乳酸菌の中でも善玉菌であり、長年、食に利用されてきたエンテロコッカス・フェシウム種に分類されるものであり、乳酸菌は腸内にも存在することから、安全なものであるといえる。また、本発明に係るエンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株は、優れたＰＧＣ−１α生合成促進作用と遅筋速筋化抑制作用を示す。しかも、培養により大量生産することも可能である。よって本発明は、疾患、怪我、加齢などを原因とする運動不足から、日常生活に必要な遅筋の減少に陥った病人や高齢者に対して、遅筋の減少を安全に抑制して筋肉の質を維持できるものとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、廃用性筋萎縮モデルラットへの本発明に係るエンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株投与によるＰＧＣ−１α生合成促進効果を示すグラフである。
【図２】図２は、廃用性筋萎縮モデルラットへの本発明に係るエンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株投与による遅筋速筋化の抑制効果を示すグラフである。
【図３】図３は、廃用性筋萎縮モデルラットへの本発明に係るエンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株投与による酸化的代謝酵素活性促進効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明に係るＰＧＣ−１α生合成促進剤および遅筋速筋化抑制剤は、有効成分として、エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株を含有することを特徴とする。以下、エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株を単に「Ｒ３０株」と略記する場合がある。
【００２７】
エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株は、下記の通り寄託機関に寄託されている。
（ｉ）  寄託機関の名称およびあて名
名称：  独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター
あて名：  日本国  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
（ｉｉ）  国内受託日：  ２０１２年５月１６日
（ｉｉｉ）  国際寄託への移管請求受領日：  ２０１３年４月２４日
（ｉｖ）  受託番号：  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１３６２
【００２８】
エンテロコッカス・フェシウム  Ｒ３０株は、以下の菌学的性質を有する。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
本発明で用いるＲ３０株の培養方法は、Ｒ３０株を有効に培養できるものである限り特に制限されない。例えば、試験管培養、フラスコ培養、発酵槽による培養などにより培養することができる。培地についても特に制限されず、Ｒ３０株を有効に培養できるものである限りいかなる培地を使用してもよく、例えば、乳酸菌培養に一般的に使用されているＭＲＳ培地などを用いることができる。
【００３１】
本発明で用いるＲ３０株は、生菌であっても死菌であってもよい。ここで生菌とは、生きたままのＲ３０株であり、増殖可能なものの他、増殖しておらず休眠状態のものであっても、水の存在などにより再び増殖できるものも含まれるものとする。
【００３２】
死菌とは、加熱、加圧、薬物処理などにより殺菌処理を施した菌体のことである。殺菌処理手段は特に制限されず、例えば、乾熱殺菌、蒸気殺菌、高圧蒸気殺菌、化学的殺菌、超音波殺菌、電磁波殺菌、紫外線殺菌などを挙げることができる。また、殺菌処理は、集菌した菌体を乾燥した後に行ってもよい。また、死菌は、死菌体そのものでも、処理物であってもよい。「処理物」としては、菌の磨砕や破砕、濃縮、ペースト化、乾燥、希釈から選ばれる少なくとも１つの処理を施した処理物が挙げられる。菌の乾燥手段は特に制限されず、スプレードライ、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥などを挙げることができる。
【００３３】
本発明に係るＰＧＣ−１α生合成促進剤および遅筋速筋化抑制剤の剤形は特に問わない。例えば、Ｒ３０株の生菌または死菌の乾燥物または懸濁液自体であってもよいが、摂取し易い剤形にすることが好ましい。例えば、本発明剤は主に筋肉に作用するものであるので外用剤とすることも考えられるが、後記の実施例のとおり本発明剤は経口投与で高い効果を示し、また、摂取や服用のし易さからも、経口剤とすることが好ましい。以下、本発明に係る「ＰＧＣ−１α生合成促進剤および遅筋速筋化抑制剤」を、単に「組成物」という場合がある。
【００３４】
剤形としては、特に制限されないが、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、糖衣錠、顆粒剤、エキス剤、エリキシル剤、シロップ剤、チンキ剤、リモナーデ剤などを挙げることができる。本発明に係る組成物には、剤形に合わせ、薬学上許容される添加剤を用いてもよい。かかる添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、酸化防止剤、香料、調味料、甘味料、着色料、増粘安定剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、結合剤、等張化剤、緩衝剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、凝集防止剤、吸収促進剤、凝固剤などを挙げることができる。賦形剤としては、例えば、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド性二酸化ケイ素などを挙げることができる。本発明に係る組成物は、剤形などに応じて常法により製造することができる。
【００３５】
例えば、Ｒ３０株の生菌を含有するＰＧＣ−１α生合成促進剤および遅筋速筋化抑制剤は、常法で培養した培養液中の菌体を集菌し、集菌した菌体に保護剤を溶解した溶液を添加し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することで得ることができる。
【００３６】
上記保護剤とは、外的環境から菌体を保護し、生菌数を維持したり或いは生菌数の減少を抑制したりする成分をいう。保護剤としては、例えば、トレハロース、ウシ血清アルブミン、脱脂粉乳、グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、ヒスチジン、リンゴ酸、ホエー、グルコース、アスパラギン酸、メチオニン、デンプン、デキストリン、ショ糖、乳糖、塩化ナトリウム、リン酸塩など、菌体へ与えるダメージを軽減できる物質であればよい。これらの保護剤は、単独または組み合わせて使用することができる。各保護剤の配合割合は限定されないが、保護剤総量の下限は、乾燥菌体重量に対して１質量％以上が好ましい。上記割合が１質量％以上であれば、菌体が被るダメージをより確実に軽減することができる。一方、上記割合の上限は特に制限されないが、例えば５００００質量％以下とすることができる。上記割合としては１０質量％以上がより好ましく、５０質量％以上がよりさらに好ましく、１００質量％以上がよりさらに好ましく、また、２００００質量％以下がより好ましく、１００００質量％以下がよりさらに好ましい。
【００３７】
Ｒ３０株の死菌を含有する組成物は、例えば、常法で培養した培養液中の菌体を集菌し、集菌した菌体を殺菌処理し、乾燥した後、適当な賦形剤と混合することで得ることができる。
【００３８】
後記の実施例の通り、本発明に係る組成物は、経口投与により優れたＰＧＣ−１α生合成促進作用や遅筋速筋化抑制作用を示す。よって、本発明に係るＰＧＣ−１α生合成促進剤と遅筋速筋化抑制剤は、例えば、飲食品、機能性食品、サプリメント、医薬品、医薬部外品、飼料、ペットフード、動物用医薬品などとして用いることもできる。
【００３９】
本発明の組成物は、一般的な飲食品に添加することもできる。飲食品として日常的に摂取する場合、本発明の組成物を含有する飲食品の形態は特に限定されず、例えば、乳飲料、清涼飲料、スポーツドリンク、栄養ドリンク、美容ドリンク、液体栄養剤などの飲料；チューインガム、チョコレート、キャンディー、ゼリー、ケーキ、パイ、クッキー、和菓子、スナック菓子、油菓子、米菓、ビスケット、クラッカーなどの菓子類；アイスクリーム、氷菓などの冷菓類；うどん、中華麺、スパゲティー、即席麺などの麺類；蒲鉾、竹輪、半片などの練り製品；ドレッシング、マヨネーズ、たれ、ソースなどの調味料；パン、ハム、雑炊、米飯、スープ、レトルト食品、冷凍食品、さらに、食用油脂組成物、調理油類、スプレー油類、バター類、マーガリン類、ショートニング類、ホイップクリーム類、濃縮乳類、ホワイトナー類、ドレッシング類、ピックル液類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、加工肉製品類、豆腐・こんにゃくなど、その他加工品；ジャム類、発酵乳類、缶詰類など、一般飲食品形態が挙げられる。なお、本発明の乳酸菌を用いて一般飲食品を発酵した発酵物であってもよい。
【００４０】
本発明の組成物は、いわゆる健康食品、サプリメント、機能性食品、機能性表示食品、栄養補助食品、特定保健用食品、栄養機能食品、介護食品、スマイルケア食、咀嚼・嚥下補助食品、濃厚流動食品、病者用食品、ダイエタリーサプリメントなどの用途にも用いることができる。また、本発明の組成物は、ペットフードや家畜飼料などへも利用することができる。
【００４１】
特定保健用食品、機能性表示食品、ダイエタリーサプリメントの場合には、本発明に係るＰＧＣ−１α生合成促進剤または遅筋速筋化抑制剤をパッケージに包み、当該パッケージに、ＰＧＣ−１α生合成促進や遅筋速筋化抑制に関連する機能を表示してもよい。パッケージとしては、特に制限されないが、例えば、箱、容器、包装フィルム、包装紙などを挙げることができる。また、パッケージに表示する機能としては、ＰＧＣ−１α生合成促進や遅筋速筋化抑制の他に、それらに関連する機能として、持久的運動能の向上や維持；筋肉や筋力の低下や分解の抑制；筋肉量や質の維持または向上；運動機能、歩行機能、姿勢の改善、維持またはサポート；高齢者の日常生活での動きのサポートといった表現の他、本明細書にＰＧＣ−１α生合成促進作用や遅筋速筋化抑制作用の目的や効果として記載されたものが挙げられる。勿論、これらに類する機能であれば、表現は異なっていても差し支えない。
【００４２】
本発明に係るＰＧＣ−１α生合成促進剤は、優れたＰＧＣ−１α生合成促進作用を有する。ＰＧＣ−１αは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１αであり、主に骨格筋で生合成され、ミトコンドリアを活性化させる作用を有し、運動により生合成量が増加することが知られている。ミトコンドリアは脂肪や糖などからＡＴＰを生産することから、ＰＧＣ−１αは生体内でのエネルギー生産を向上させるものであるといえる。また、ＰＧＣ−１αは遅筋であるタイプＩ筋線維で主に発現していることから、筋線維タイプの決定因子であり、ＰＧＣ−１αの生合成を促進することで持続的運動能の向上や維持が期待できる。
【００４３】
ＰＧＣ−１α生合成促進効果は、例えば後記の実施例のように、後肢懸垂モデル動物のヒラメ筋のＰＧＣ−１α生合成量を、抗ＰＧＣ−１α抗体を使ったウエスタンブロット法で定量することなどで評価できる。被検物質を投与していないラットと比べ、被検物質を投与したラットのヒラメ筋のＰＧＣ−１α生合成量が大きければ、当該被検物質はＰＧＣ−１α生合成量促進効果を有すると評価することができる。
【００４４】
本発明に係る遅筋速筋化抑制剤は、優れた遅筋速筋化抑制効果を有する。本発明に係る遅筋速筋化抑制剤は、筋肉を動かす機会の少ない高齢者や要介護者、病気などで床に臥す時間の長いヒトなどの対象者に対し、自立した活動の継続や、日常生活動作（ＡＤＬ）および生活の質（ＱＯＬ）の維持や回復、改善に有用である。また、遅筋が姿勢保持や歩行に重要な役割を持つことから、リハビリテーションやストレッチ運動などと組合せての健康増進にも有用である。さらに、主に遅筋を使うスポーツであるジョギングやマラソンなど、持久力を必要とする運動と組合わせることも効果的である。
【００４５】
「遅筋」は赤筋またはインナーマッスルとも呼ばれることがあり、収縮速度が遅い一方で持久力があり、姿勢の維持や歩行時など日常生活で常に使われている筋肉である。一方、「速筋」は白筋とも呼ばれ、収縮速度が速く瞬発力のある筋肉である。また、筋線維の種類は、ミトコンドリア量が多く主に酸素を使ったエネルギー生産を行う遅筋タイプＩと、ミトコンドリア量が少なく主に解糖系によるエネルギー生産を行う速筋タイプＩＩの２種類に大きく分かれる。遅筋線維および速筋線維は、場合によってはそれぞれ遅筋および速筋と呼ばれることもある。筋肉は、タイプＩとタイプＩＩの筋線維が様々な割合で混在しており、遅筋にはタイプＩ筋線維が多く、速筋にはタイプＩＩ筋線維が多い。遅筋の例としてはヒラメ筋が、速筋の例としては長趾伸筋が知られている。
【００４６】
「筋萎縮」とは筋肉がやせ細ることであり、筋力低下の原因となる。筋萎縮は、筋肉自体の疾病による筋原性筋萎縮、運動ニューロンに障害のある神経原性筋萎縮、筋肉を使わないことによる廃用性筋萎縮に分類される。廃用性筋萎縮は、怪我や病気による入院や高齢などで活動が低下した場合に起こりやすい。
【００４７】
遅筋の速筋化は筋肉の質的な変化であり、遅筋の筋線維組成において遅筋線維であるタイプＩ筋線維の割合が減少し、速筋線維であるタイプＩＩ筋線維の割合が増加することである。また、タイプＩ筋線維とタイプＩＩ筋線維の含まれる割合をタイプ組成比ということもある。筋萎縮においてタイプＩ筋線維とタイプＩＩ筋線維のいずれも筋線維径が減少するが、廃用性筋萎縮など低活動に起因する場合は、タイプＩＩ筋線維よりもタイプＩ筋線維に顕著な萎縮が認められ、タイプＩＩ筋線維の割合が増加することを特徴としている。高齢者の廃用性筋萎縮においては、姿勢保持や歩行に重要な役割を持つ遅筋であるヒラメ筋の筋萎縮が顕著であり、また、宇宙の無重量環境での動物試験においても、遅筋であるヒラメ筋に顕著な萎縮と速筋化が観察されている。
【００４８】
廃用性筋萎縮の動物モデルとしては、後肢懸垂モデルや除神経モデルなどがある。他の筋萎縮モデルとしては、デキサメサゾンによるステロイド筋萎縮の動物モデルがあり、速筋線維に特異的な横断面積縮小と、遅筋線維が多いヒラメ筋の重量変化を伴わず、速筋線維が多い腓腹筋の重量減少を特徴とする。
【００４９】
本発明に係る遅筋速筋化抑制剤の効果は、例えば後記の実施例のように、後肢懸垂モデル動物のヒラメ筋の横断切片を作製し、ＡＴＰａｓｅ染色やＳＤＨ（コハク酸脱水素酵素）染色などにより、タイプＩ筋線維とタイプＩＩ筋線維を区別することでその割合を数値化することにより判定できる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与した実験動物のヒラメ筋のタイプＩ筋線維組成比が大きければ、当該被検物質は遅筋の速筋化を抑制する効果を有すると評価することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、優れた酸化的代謝酵素活性促進作用を有する。酸化的代謝とは、ミトコンドリアのＴＣＡ回路や電子伝達系により、糖などの炭水化物からエネルギーを得る過程である。酸化的代謝酵素とは、酸化的代謝に関与する酵素のことであり、その中でもＴＣＡ回路の律速酵素であるクエン酸合成酵素（ＣＳ酵素）や、ＴＣＡ回路と電子伝達系の複合体ＩＩの両方で働くコハク酸脱水素酵素（ＳＤＨ酵素）は特に重要な酵素である。また、遅筋線維（タイプＩ筋線維）は速筋線維（タイプＩＩ筋繊維）よりもミトコンドリア量が多く酸化的代謝に依存したエネルギー生産をしている。
【００５１】
本発明に係る組成物の酸化的代謝酵素活性促進効果は、例えば後記の実施例のように、後肢懸垂モデル動物のヒラメ筋のクエン酸合成酵素やコハク酸脱水素酵素の活性を測定することで判定できる。被検物質を投与していない実験動物と比べ、被検物質を投与した実験動物のヒラメ筋のクエン酸合成酵素やコハク酸脱水素酵素の活性が大きければ、当該被検物質は酸化的代謝酵素活性促進効果を有すると評価することができる。
【００５２】
本発明は、Ｒ３０株またはその処理物を対象者に投与する工程を含むことを特徴とするＰＧＣ−１α生合成の促進方法および遅筋速筋化の抑制方法にも関する。対象者は特に限定されず、遅筋速筋化の抑制が望まれる対象者であればよく、更に好ましくは、筋肉を動かす機会の少ない高齢者や要介護者、病気やけがなどで床に臥す時間の長い患者や長期療養者などが挙げられる。Ｒ３０株は、上記組成物、即ち本発明に係るＰＧＣ−１α生合成促進剤および遅筋速筋化抑制剤の形態で投与すればよい。
【００５３】
本発明に係る組成物の投与頻度や投与量は、投与対象者の年齢、性別、状態などに応じて適宜調整すればよい。一日あたりのＲ３０株の投与量は適宜調整すればよいが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重以上、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下とすることができる。当該投与量としては、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上が好ましく、０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上がより好ましく、または、５００ｍｇ／ｋｇ体重以下が好ましい。一日あたりの投与回数も適宜調整すればよいが、例えば、１回以上、５回以下とすることができる。投与対象者としては、上記と同じく遅筋速筋化の抑制が求められている対象者であれば特に制限されないが、例えば、疾病、怪我、老化などにより活動量が低下し、筋肉量や筋力が低下している、或いは筋肉量や筋力の低下が予測される対象者を挙げることができる。
【００５４】
本発明の組成物は、ヒトに加えて、ヒト以外の動物にも投与可能である。即ち、本発明は、本発明に係る組成物を動物に投与する工程を含むことを特徴とする遅筋速筋化の抑制方法にも関する。ヒト以外の動物としては、例えば、養殖動物、愛玩動物、競技動物などが挙げられる。養殖動物としては特に限定されないが、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜；マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物；ニワトリ、アヒル、七面鳥、駝鳥などの家禽；魚類、甲殻類および貝類が挙げられる。愛玩動物としては特に限定されないが、イヌ、ネコなどが挙げられる。競技動物としては特に限定されないが、競走馬などが挙げられる。
【００５５】
本発明の組成物は、筋肉量や筋力を増加または維持する効果の向上を目的に、適宜、レジスタンス運動、理学療法、リハビリテーション、ストレッチ、インナーマッスルトレーニングなどと併用することができる。また、日常的な運動と組み合わせて用いることもできる。ここでいう日常的な運動とは、柔軟体操、エステ体操、その他、趣味のスポーツへの参加だけでなく、通勤、仕事や家事などにおける軽作業も含まれる。
【００５６】
本発明の組成物は、筋肉量や筋力を増加または維持する効果の向上を目的に、他の医薬品や筋肉増強作用を有する食品などと併用して使用することも可能である。上記筋肉増強作用を有する食品としては特に制限されないが、例えば、乳タンパク、ホエイタンパク、カゼイン、大豆タンパク、大豆ペプチド、小麦タンパク、コラーゲン、ゼラチンなどのタンパク質類；ホエイペプチド、カゼインペプチド、カゼインホスホペプチド、小麦ペプチド、大豆ペプチドなどのペプチド類；バリン、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、シトルリン、オルニチン、スレオニン、リジン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどのアミノ酸類；ビタミンＤやビタミンＫなどのビタミン類；グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ヒアルロン酸、コラーゲン、プロテオグリカン、メチルスルフォニルメタン（ＭＳＭ）、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、関節や骨の維持などに有効といわれている成分；クレアチン、β−ヒドロキシβ−メチル酪酸（ＨＭＢ）などが挙げられる。また、たまねぎ、ショウガ、唐辛子、にんにく、イチョウ葉、ブラックジンジャー、甘草、それらの抽出物、ケルセチン、ポリフェノール、カプサイシン、カルニチン、アリシンなどのサプリメント素材；ω−３脂肪酸などの不飽和脂肪酸類；乳酸菌や酵母等の微生物類；海藻；食物繊維など、体脂肪燃焼や体を整える効果のある食品や素材類と組み合わせることも可能である。また、他の成分は、栄養強化などを目的とした機能性の成分であってもよい。機能性成分の例としては、ビタミン類、微量金属類、アミノ酸類、コエンザイムＱ１０、オリゴ糖、食物繊維、コンドロイチン硫酸類、フコイダン、フコキサンチン、アスタキサンチン、カテキン類、不飽和脂肪酸類、ポリフェノール類、セサミン、プラセンタ、酵母エキス、黒酢濃縮物、ニンニク抽出物、イチョウ葉抽出物、ビルベリー抽出物、ブルーベリー抽出物、人参抽出物、マカ抽出物、豆種皮抽出物、セントジョーンズワート抽出物、松樹皮抽出物、アサイー抽出物、ノニ抽出物、卵黄抽出物、はちみつ加工品、黒糖などが挙げられる。アミノ酸類としては、分岐鎖アミノ酸類やオルニチンを挙げることができる。コエンザイムＱ１０は、還元型であっても酸化型であってもよい。不飽和脂肪酸類としては、例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＨＡ、αリノレン酸、オメリノール酸、オレイン酸を挙げることができる。例えば、グラブリジンを有効成分とする甘草疎水性抽出物は、筋肉量を増加する作用を有していることから、本発明のＲ３０株と組み合わせることで、筋肉量の増加または維持だけでなく筋肉の質も維持または改善できる有用な組成物とすることができる。また、他の有用な乳酸菌と組み合わせてもよい。
【００５７】
本発明の組成物を飲食品とする場合のＲ３０株の含有量は特に限定されず、適宜調整すればよいが、例えば、食品中の含有量としては０．００００１質量％以上、５０質量％以下とすることができる。当該割合としては、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましく、また、３０質量％以下が好ましい。
【００５８】
本発明の組成物は、カプセル剤や錠剤などのサプリメント形態で、特定保健用食品、栄養機能食品などの保健機能食品や、機能性表示食品、健康食品、栄養補助食品、ダイエタリーサプリメントなどの機能性食品とすることができる。また、Ｒ３０株は、疲労状態の予防や改善；運動能力や持久力の向上；冷え性、肩こり、肌荒れ、腰痛の予防や改善；便臭の軽減や緩和；成長促進の作用も有していることから、これらの機能や用途のために用いるものであるとの表示をすることもできる。その場合は、本発明の組成物の投与量としては、Ｒ３０株として、成人一日あたりの下限は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重以上、成人一日あたりの投与量としては、１０００ｍｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは３００ｍｇ／ｋｇ体重以下を摂取できるように１回ないし数回に分けて投与すればよい。
【００５９】
本発明の組成物を機能性食品またはサプリメントとして用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。
【００６０】
また、本発明の組成物を、ペットフード、飼料または動物用医薬品として用いる場合は、Ｒ３０株を有効成分とする製剤として用いるか、或いは、動物の種類、発育ステージ、地域などの飼育環境に応じて、Ｒ３０株を一般的な飼料に適宜配合してもよい。一般的な飼料の原料としては、例えば、穀物類または加工穀物類、糟糠類、植物性油粕類、動物性原料、ミネラル類、ビタミン類、アミノ酸、ビール酵母などの酵母類、無機物質の微粉末などが挙げられる。穀物類または加工穀物類としては、とうもろこし、マイロ、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、キビ、小麦粉、小麦胚芽粉などが挙げられる。糟糠類としては、ふすま、米糠、コーングルテンフィードなどが挙げられる。植物性油粕類としては、大豆油粕、ごま油粕、綿実油粕、落花生粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕などが挙げられる。動物性原料としては、脱脂粉乳、魚粉、肉骨粉などが挙げられる。ミネラル類としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、食塩、無水ケイ酸などが挙げられる。ビタミン類としては、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸などが挙げられる。アミノ酸としては、グリシンやメチオニンなどが挙げられる。無機物質の微粉末としては、結晶性セルロース、タルク、シリカ、白雲母、ゼオライトなどが挙げられる。
【００６１】
本発明の飼料は、上記の飼料原料に、配合飼料に通常使用される賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などの飼料用添加剤や、所望によりその他の成分を配合してもよい。飼料用添加剤以外の成分としては、抗生物質、殺菌剤、駆虫剤、防腐剤などが挙げられる。
【００６２】
本発明の飼料の形態は特に限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、ペースト状、ペレット状、カプセル剤、錠剤などが挙げられる。カプセルは、ハードカプセルでもソフトカプセルでもよい。本発明の飼料の給与対象となる動物は特に限定されるものではないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜類；ニワトリ、七面鳥、合鴨などの家禽類；マウス、ラット、モルモット等の実験動物；イヌ、ネコなどのペットなどが挙げられる。ニワトリには、ブロイラーと採卵鶏の両方が含まれる。
【００６３】
本願は、２０１７年５月８日に出願された日本国特許出願第２０１７−９２２６３号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年５月８日に出願された日本国特許出願第２０１７−９２２６３号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００６５】
実施例１：  エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の凍結乾燥菌体の調製
ＭＲＳブイヨン（関東化学社製）（０．５２ｇ）を水（１０ｍＬ）に溶解した後、オートクレーブ中、１２１℃で１５分間加熱滅菌することにより、ＭＲＳ液体培地を調製した。当該培地（１０ｍＬ）に、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株のグリセロールストック懸濁液（１００μＬ）を植菌し、３７℃で２４時間培養することにより前培養液を得た。当該前培養液（１ｍＬ）を上記ＭＲＳ液体培地（１００ｍＬ）に加え、さらに３７℃で２４時間培養した。培養終了後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、培養液と菌体を分離させた。菌体を滅菌水（１００ｍＬ）で洗浄後、再度遠心分離することにより、滅菌水と菌体を分離した。菌体に滅菌水（２ｍＬ）を加え、９０℃で３０分加熱殺菌した後、凍結乾燥して、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の凍結乾燥菌体を得た。【００６６】
実施例２：  エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株のＰＧＣ−１α生合成促進作用確認試験
１１週齢の雄性ＳＤラット１５匹を、コントロール群（ＣＯＮ群）、後肢非荷重群（ＨＵ群）、後肢非荷重＋エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株投与群（ＨＵ＋Ｒ３０群）の３群に任意に５匹ずつ分けた。各群には通常飼料（「ＣＥ−２」日本クレア社製）に加えて水を自由摂取させつつ１週間予備飼育した。その後、上記実施例１で調製したエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の凍結乾燥菌体を生理食塩水に分散させ、ＨＵ＋Ｒ３０群には当該菌体の投与量が体重１ｋｇあたり５００ｍｇになるように、ゾンデを用い、１日１回経口投与した。ＣＯＮ群とＨＵ群には、同様のストレスが付加されるように、同量の生理食塩水を１日１回経口投与した。さらに、ＨＵ群とＨＵ＋Ｒ３０群には、Ｍｏｒｅｙらの変法を用いて尾部懸垂処置を施し、後肢を非荷重の状態とすることにより、廃用性筋萎縮を誘導した。なお、後肢非荷重期間中においてラットは前肢にて飼育ケージ内を移動可能であり、予備飼育と同様に通常飼料と水は自由摂取させた。各群ラットを２週間飼育した後、ペントバルビタール麻酔下で後肢のヒラメ筋を摘出し、液体窒素を用いて急速凍結した。【００６７】
プロテアーゼ阻害剤を追加したＨＥＰＥＳバッファー中で、凍結保存したヒラメ筋をホモジナイズした後、遠心分離することにより上清を回収した。上清中の総タンパク質量を測定し、サンプル間の総タンパク質量が同一となるように濃度を調整した上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動により展開されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ブロッキング後、抗ＰＧＣ−１α抗体（「ｓｃ−１３０６７」Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）の２００倍希釈液または抗ＧＡＰＤＨ抗体（「Ｙ３３２２ＧＡＰＤＨ」Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製）の１００００倍希釈液を加え、インキュベート後、さらにＨＲＰ標識した二次抗体を添加し、ＨＲＰ用検出試薬（「イージーウエストルミワン」アトー社製）を用いて発色させた。ルミノ・イメージアナライザー（「ＬＡＳ−１０００」富士フィルム社製）で画像を取り込み、画像解析ソフト（「Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ」富士フィルム社製）を用いて光学密度を測定することにより、ＰＧＣ−１αの生合成量を評価した。測定値に関して、一元配置分散分析とＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒの多重比較検定を行った。結果を図１に示す。図１中、「＊」はＣＯＮ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」はＨＵ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００６８】
図１に示す結果の通り、ＨＵ群においてはおそらく後肢への負荷が無いことによりＣＯＮ群に比べてＰＧＣ−１αの生合成量が有意に減少してしまっていた。それに対して、実施例１のエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を経口投与したＨＵ＋Ｒ３０群では、後肢にも負荷のかかった通常状態にあるＣＯＮ群と同等程度にＰＧＣ−１αが生合成されることが明らかとなった。【００６９】
実施例３：  遅筋速筋化抑制作用確認試験
上記実施例２において得たヒラメ筋試料から、クリオスタットを用いて１２μｍ厚の凍結切片を作製し、スライドグラスに貼り付けした。ｐＨ４．３のバルビタール溶液を用いてＡＴＰａｓｅを選択的に失活させた後、タイプＩ線維を染色した。光学顕微鏡を用いて染色切片を観察し、筋繊維全体に対するタイプＩ繊維の割合を算出した。結果を図２に示す。図２中、「＊」はＣＯＮ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」はＨＵ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【００７０】
図２に示す結果の通り、後肢への負荷が無いＨＵ群では遅筋に相当するタイプＩ線維の割合が有意に減少し、速筋の遅筋化が進行していた。それに対してＨＵ＋Ｒ３０群では、ＣＯＮ群と比較してタイプＩ線維の割合が有意に低下してはいたが、ＨＵ群と比較してタイプＩ線維の割合は有意に改善されていた。以上の結果から、廃用性筋萎縮により遅筋の速筋化が進行するが、本発明に係るエンテロコッカス・フェシウムＲ３０株を経口摂取することにより、遅筋速筋化の進行を有意に抑制できることが実証された。【００７１】
実施例４：  酸化的代謝酵素活性促進作用確認試験
上記実施例２と同様にしてヒラメ筋試料をホモジナイズした上清を回収し、酵素液とした。酵素液にＤＴＮＢとアセチルＣｏＡを含む混合液を加え、さらに最終濃度が０．５ｍＭとなるようオキサロ酢酸を添加して反応を開始させた。反応開始から８分間にわたり２分毎に４１２ｎｍにて吸光度を測定することにより、ヒラメ筋試料における酸化的代謝酵素であるクエン酸シンターゼの活性を測定した。なお、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により総タンパク質量を測定し、総タンパク質量の値を用いて測定された反応速度を標準化した。結果を図３に示す。図２中、「＊」はＣＯＮ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「†」はＨＵ群との間でｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「ＣＳ」はクエン酸シンターゼを示す。【００７２】
図３に示す結果の通り、負荷が付与されていないＨＵ群の後肢では、エネルギー生産に関与するＴＣＡサイクルの重要な酵素であるクエン酸シンターゼの活性が有意に低下しており、エネルギー代謝が低下しているのに対して、ＨＵ＋Ｒ３０群では、同じく負荷が付与されていないにも関わらずクエン酸シンターゼの活性が有意に改善されており、エネルギー代謝が維持されていることが実証された。【００７３】
比較例１：  ラクトバシラス・アシドフィルスＮＢＲＣ１３９５１株の凍結乾燥菌体の調製
エンテロコッカス・フェシウムＲ３０の代わりにラクトバシラス・アシドフィルスＮＢＲＣ１３９５１株を用いた以外は実施例１と同様にして、ラクトバシラス・アシドフィルスＮＢＲＣ１３９５１株の凍結乾燥菌体を得た。【００７４】
比較例２：  エンテロコッカス・フェシウムＮＢＲＣ１００４８６株の凍結乾燥菌体の調製
エンテロコッカス・フェシウムＲ３０の代わりにエンテロコッカス・フェシウムＮＢＲＣ１００４８６株を用いた以外は実施例１と同様にして、エンテロコッカス・フェシウムＮＢＲＣ１００４８６株の凍結乾燥菌体を得た。【００７５】
比較例３：  ラクトバシラス・アシドフィルスＮＢＲＣ１３９５１株およびエンテロコッカス・フェシウムＮＢＲＣ１００４８６株のＰＧＣ−１α生合成促進作用確認試験
ＳＤラットを６匹用い、エンテロコッカス・フェシウムＲ３０株の代わりに上記比較例１で調製したラクトバシラス・アシドフィラスＮＢＲＣ１３９５１株、または上記比較例２で調製したエンテロコッカス・フェシウムＮＢＲＣ１００４８６株を用いた以外は上記実施例２と同様にして、ＰＧＣ−１α生合成促進作用を測定した。結果を図１に示す。
図１のとおり、ＮＢＲＣ１３９５１株を摂取したＨＵ＋ＮＢＲＣ１３９５１群と、ＮＢＲＣ１００４８６株を摂取したＨＵ＋ＮＢＲＣ１００４８６群では、ＨＵ＋Ｒ３０群と等量の菌体を経口投与したにもかかわらず、ＨＵ群と同程度までＰＧＣ−１αの生合成量が減少しており、ＰＧＣ−１α生合成促進作用がＲ３０株特有のものであることが確認された。【００７６】
比較例４：  ラクトバシラス・アシドフィルスＮＢＲＣ１３９５１株およびエンテロコッカス・フェシウムＮＢＲＣ１００４８６株の遅筋速筋化抑制作用確認試験
上記比較例３において得たヒラメ筋試料から、実施例３と同じ方法で凍結切片を作製し、光学顕微鏡を用いて染色切片を観察した。
その結果、ＮＢＲＣ１３９５１株を摂取したＨＵ＋ＮＢＲＣ１３９５１群と、ＮＢＲＣ１００４８６株を摂取したＨＵ＋ＮＢＲＣ１００４８６群は、ＨＵ＋Ｒ３０群と比較して、等量の乳酸菌を経口投与したにもかかわらずタイプＩ繊維の割合が低かった。かかる結果より、遅筋速筋化抑制効果がＲ３０株特有のものであることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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