(57)【要約】  本発明の一実施形態は、親水化色素含有粒子、色素含有粒子、親水化色素含有粒子の製造方法および生体内を観察する方法に関し、該親水化色素含有粒子は、親水性ポリマーおよび波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素を含む、イメージング用の親水化色素含有粒子である。
2019111952.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性ポリマーおよび波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素を含む、イメージング用の親水化色素含有粒子。
【請求項２】
ベース粒子および前記蛍光色素を含む、請求項１に記載の親水化色素含有粒子。
【請求項３】
前記親水性ポリマーを表面の少なくとも一部に有する、請求項１または２に記載の親水化色素含有粒子。
【請求項４】
前記蛍光色素がカチオン性化合物である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項５】
前記蛍光色素がポリメチン骨格を有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項６】
ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項７】
ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子であり、酸性基を有する構造単位を含む、請求項１〜６のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項８】
前記酸性基の含有量が、有機ポリマー粒子１ｇあたり、０．４０ミリモル以上である、請求項７に記載の親水化色素含有粒子。
【請求項９】
前記酸性基を有する構造単位が、有機ポリマー粒子を構成する全構造単位１００質量％に対し３質量％以上である、請求項７または８に記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１０】
ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子の表面荷電量が０．０５〜６．０ｍｍｏｌ／ｇである、請求項１〜９のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１１】
ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子であり、疎水性構造単位を含む、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１２】
体積平均粒径が１〜３００ｎｍである、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１３】
前記親水性ポリマーがポリアルキレングリコール構造を少なくとも一部に含むポリマーである、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１４】
前記親水性ポリマーが共有結合を介して粒子の少なくとも一部に結合されている、請求項１〜１３のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１５】
前記親水性ポリマーが、ポリアルキレングリコール構造と少なくとも１つのアミン構造とを有する、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１６】
前記親水性ポリマーが式（８）で表されるポリマー由来の構造を有する、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【化１】
2019111952.tif 000010
［式（８）中、ｎは５〜３００の整数である。］
【請求項１７】
ベース粒子および前記蛍光色素を含む色素含有粒子と、該色素含有粒子の少なくとも一部の表面に親水性ポリマーを有し、
前記親水性ポリマーが前記色素含有粒子表面を占有する密度が、０．０１本／ｎｍ2以上である、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１８】
ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子であり、該有機ポリマー粒子中に含まれる前記蛍光色素量が有機ポリマー粒子１ｇあたり、０．０１〜３０ｍｍｏｌである、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項１９】
有機ポリマー粒子および前記蛍光色素を含み、
前記有機ポリマー粒子１００質量部に対する前記蛍光色素の量が０．００１〜３．０質量部である、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子。
【請求項２０】
ベース粒子および波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が酸性基を有する構造単位を含む、
イメージング用の色素含有粒子。
【請求項２１】
下記製造方法Ｉまたは製造方法ＩＩである、イメージング用の親水化色素含有粒子の製造方法：
ベース粒子と波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素とを含む色素含有粒子を得る工程１、および、
工程１で得られた色素含有粒子と親水性ポリマーとを接触させ、色素含有粒子と親水性ポリマーとを有する親水化色素含有粒子を得る工程２、
を含む製造方法Ｉ、
ベース粒子と親水性ポリマーとを接触させる工程３、および、
工程３で得られた粒子と波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素とを接触させて親水化色素含有粒子を得る工程４、
を含む製造方法ＩＩ。
【請求項２２】
前記製造方法Ｉである、請求項２１に記載の製造方法。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１つに記載の親水化色素含有粒子または請求項２０に記載の色素含有粒子を体内に含む被検体に、前記蛍光色素の励起光を照射する工程Ａ、および、
被検体から発せられる波長９００〜１７００ｎｍの範囲の蛍光を検出する工程Ｂ、
を含む、生体内を観察する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の一実施形態は、親水化色素含有粒子、色素含有粒子、親水化色素含有粒子の製造方法および生体内を観察する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光イメージングは、顕微鏡による細胞、組織切片等の観察や、生体（ｉｎ  ｖｉｖｏ）イメージング等に頻繁に用いられており、その簡便性や、放射性物質の取り扱いに関する規制を受けないなど、場所を選ばず使用可能であることから、臨床での利用も広がりつつある。【０００３】
蛍光イメージングでは、体の深部の血管や組織・臓器等を明瞭に観察するため、可視光より生体透過性の高い波長７００〜８９９ｎｍの近赤外領域（第１の生体の窓）を利用することが注目されており、中でも波長８００〜８９９ｎｍの蛍光を発するインドシアニングリーンを用いた臨床応用が進められている。しかしこの波長領域では、光の散乱が依然として大きいため、結果として観察される像に、ｈａｚｅ（かすみ）が生じる。このため、生体組織の光損失を考慮すると、より明瞭に深部を観察するためには波長９００〜１７００ｎｍの近赤外領域（第２の生体の窓）を利用することが望ましく、この波長領域で蛍光を発するプローブが切望されている。【０００４】
第２の生体の窓で蛍光を発するプローブとして、半導体ナノ粒子やカーボンナノチューブ等の金属・無機ナノ物質が知られているが（特許文献１）、これらの物質を生体に用いた場合には、生体毒性が懸念される。そこで、第２の生体の窓で蛍光を発する蛍光色素（有機分子）を用いたプローブの開発が行われている。しかしながら、一般にこれらの蛍光色素は水に不溶であり、また水中で蛍光を発することができないために、ポリマーミセル等に含有させるアプローチが試みられている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１７８１５５号公報
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／００５６１４２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ポリマーミセルは疎水性相互作用やイオン性相互作用を利用した自己集合体であり、構造が強固でないため、イオン強度が高く、様々な夾雑物が存在するｉｎ  ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｔｒｏ、特に体液中や生体組織内では、ミセル中への水の侵入や、色素の流出、ミセルの崩壊等により、長期間蛍光強度を維持することは困難であった。【０００７】
本発明の一実施形態は、体液中や生体組織内などで長期間蛍光強度を維持できるイメージング用の親水化色素含有粒子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記構成例によれば前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明の構成例は以下の通りである。【０００９】
＜１＞  親水性ポリマーおよび波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素を含む、イメージング用の親水化色素含有粒子。【００１０】
＜２＞  ベース粒子および前記蛍光色素を含む、＜１＞に記載の親水化色素含有粒子。【００１１】
＜３＞  前記親水性ポリマーを表面の少なくとも一部に有する、＜１＞または＜２＞に記載の親水化色素含有粒子。【００１２】
＜４＞  前記蛍光色素がカチオン性化合物である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。
＜５＞  前記蛍光色素がポリメチン骨格を有する、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００１３】
＜６＞  ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子である、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００１４】
＜７＞  ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子であり、酸性基を有する構造単位を含む、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。
＜８＞  前記酸性基の含有量が、有機ポリマー粒子１ｇあたり、０．４０ミリモル以上である、＜７＞に記載の親水化色素含有粒子。
＜９＞  前記酸性基を有する構造単位が、有機ポリマー粒子を構成する全構造単位１００質量％に対し３質量％以上である、＜７＞または＜８＞に記載の親水化色素含有粒子。【００１５】
＜１０＞  ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子の表面荷電量が０．０５〜６．０ｍｍｏｌ／ｇである、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００１６】
＜１１＞  ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子であり、疎水性構造単位を含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００１７】
＜１２＞  体積平均粒径が１〜３００ｎｍである、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００１８】
＜１３＞  前記親水性ポリマーがポリアルキレングリコール構造を少なくとも一部に含むポリマーである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００１９】
＜１４＞  前記親水性ポリマーが共有結合を介して粒子の少なくとも一部に結合されている、＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００２０】
＜１５＞  前記親水性ポリマーが、ポリアルキレングリコール構造と少なくとも１つのアミン構造とを有する、＜１＞〜＜１４＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００２１】
＜１６＞  前記親水性ポリマーが式（８）で表されるポリマー由来の構造を有する、＜１＞〜＜１５＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００２２】
【化１】
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［式（８）中、ｎは５〜３００の整数である。］【００２３】
＜１７＞  ベース粒子および前記蛍光色素を含む色素含有粒子と、該色素含有粒子の少なくとも一部の表面に親水性ポリマーを有し、
前記親水性ポリマーが前記色素含有粒子表面を占有する密度が、０．０１本／ｎｍ2以上である、＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００２４】
＜１８＞  ベース粒子および前記蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が有機ポリマー粒子であり、該有機ポリマー粒子中に含まれる前記蛍光色素量が有機ポリマー粒子１ｇあたり、０．０１〜３０ｍｍｏｌである、＜１＞〜＜１７＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００２５】
＜１９＞  有機ポリマー粒子および前記蛍光色素を含み、
前記有機ポリマー粒子１００質量部に対する前記蛍光色素の量が０．００１〜３．０質量部である、＜１＞〜＜１８＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子。【００２６】
＜２０＞  ベース粒子および波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素を含み、
前記ベース粒子が酸性基を有する構造単位を含む、
イメージング用の色素含有粒子。
＜２１＞  下記製造方法Ｉまたは製造方法ＩＩである、イメージング用の親水化色素含有粒子の製造方法。
製造方法Ｉ：ベース粒子と波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素とを含む色素含有粒子を得る工程１、および、
工程１で得られた色素含有粒子と親水性ポリマーとを接触させ、色素含有粒子と親水性ポリマーとを有する親水化色素含有粒子を得る工程２、
を含む
製造方法ＩＩ：ベース粒子と親水性ポリマーとを接触させる工程３、および、
工程３で得られた粒子と波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素とを接触させて親水化色素含有粒子を得る工程４、
を含む
＜２２＞  前記製造方法Ｉである、＜２１＞に記載の製造方法。【００２７】
＜２３＞  ＜１＞〜＜１９＞のいずれかに記載の親水化色素含有粒子または＜２０＞に記載の色素含有粒子を体内に含む被検体に、前記蛍光色素の励起光を照射する工程Ａ、および、
被検体から発せられる波長９００〜１７００ｎｍの範囲の蛍光を検出する工程Ｂ、
を含む、生体内を観察する方法。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の一実施形態によれば、体液中や生体組織内などで長期間蛍光強度を維持できるイメージング用蛍光ポリマー粒子を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、色素含有粒子の製造に用いた有機ポリマー粒子量に対する蛍光色素量の割合（蛍光色素量×１００／有機ポリマー粒子量）（質量％）と、得られた色素含有粒子の蛍光強度との関係を示す図である。
【図２】図２は、ベース粒子（有機ポリマー粒子）１ｇあたりの酸性基の含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）と、得られた色素含有粒子の蛍光強度との関係を示す図である。
【図３】図３は、合成例で得られた色素含有粒子の吸収スペクトルを示す。
【図４】図４は、実施例のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングで観察されたマウスの蛍光写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係る好適な実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下に記載された実施形態のみに限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形例も含むものとして理解されるべきである。なお、本明細書において、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」等の記載は、「Ａ以上、Ｂ以下」と同義であり、ＡおよびＢをその数値範囲内に含む。
また、本明細書において、「〜（メタ）アクリレート」とは、「〜アクリレート」および「〜メタクリレート」の双方を包括する概念である。同様の記載は、同様の意味を有する。
【００３１】
≪イメージング用の親水化色素含有粒子≫
本発明の一実施形態に係るイメージング用の親水化色素含有粒子（以下「本親水化粒子」ともいう。）は、親水性ポリマーおよび波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する蛍光色素（以下この蛍光色素を「蛍光色素Ａ」ともいう。）を含む。
なお、本明細書では、粒子であって、該粒子における蛍光色素Ａや親水性ポリマー以外の部分の粒子を「ベース粒子」といい、蛍光色素Ａおよびベース粒子を含む粒子を「色素含有粒子」といい、蛍光色素Ａと親水性ポリマーとを有する粒子を「親水化色素含有粒子」という。例えば、以下の（手法１−１）や（手法１−３）において、蛍光色素Ａと接触させる前の粒子はベース粒子であり、下記（手法１−２）のように、造粒の際に蛍光色素Ａを用いて形成された粒子は、蛍光色素Ａとベース粒子とを含む色素含有粒子（該色素含有粒子の蛍光色素Ａ以外の成分からなる粒子がベース粒子）である。
また、本明細書における「粒子」には、ミセルやリポソームは含まれない。
【００３２】
このような本親水化粒子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏを含め、体液中や生体組織内などで長期間蛍光強度を維持でき、生体毒性が低く、体液や生体組織内などでの安定性および分散性に優れ、体液や生体組織などの中でも蛍光を発することができ、生体適合性を有する。また、本発明の一実施形態によれば、蛍光強度の高い粒子を作製することができる。本親水化粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用されることが好ましい。
また、本親水化粒子を用いることで、生体組織の自家蛍光によるノイズが抑えられ、より明瞭に深部の血管や組織・臓器等を観察することができる。
【００３３】
本親水化粒子は、生体毒性が低く、体液や生体組織内などでも蛍光を発することができる粒子を容易に得ることができる等の点から、前記蛍光色素Ａおよびベース粒子を含むことがより好ましい。
また、前記親水性ポリマーは、前記本親水化粒子の効果がより発揮される等の点から、本親水化粒子の少なくとも一部の表面に存在していることが好ましく、前記蛍光色素Ａおよびベース粒子を含む色素含有粒子の少なくとも一部の表面に存在していることがより好ましい。なお、前記色素含有粒子と親水性ポリマーとを接触させて、これらを有する本親水化粒子を得る場合、通常、該親水性ポリマーは、色素含有粒子の少なくとも一部の表面に存在するといえる。
【００３４】
≪イメージング用の色素含有粒子≫
本発明の一実施形態に係るイメージング用の色素含有粒子（以下「本色素含有粒子」ともいう。）は、前記蛍光色素Ａおよびベース粒子を含み、該ベース粒子は、好ましくは酸性基を有する構造単位を含み、本色素含有粒子は、好ましくは波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する粒子である。
このような本色素含有粒子は、生体毒性が低く、体液や生体組織内などでも蛍光を発することができる。本色素含有粒子は、蛍光強度の高い粒子とすることもできる。また、負電荷を有することにより、電荷反発による粒子の分散性が向上する。さらに、一般的に負電荷を帯びている細胞との静電反発により、体内に存在する細胞への非特異的な吸着や、細胞内への侵入を抑制することができる。
なお、以下では、本親水化粒子および本色素含有粒子をまとめて本粒子ともいう。
【００３５】
本粒子は、その発光する蛍光の波長の一部が、９００〜１７００ｎｍの範囲にあることが好ましく、生体透過性が高く、より明瞭に深部の血管や組織・臓器等を観察することができるなどの点から、１０００〜１７００ｎｍの範囲にあることが好ましく、１０００〜１５００ｎｍの範囲にあることがより好ましく、１０００〜１２００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。
また、生体透過性が高く、より明瞭に深部の血管や組織・臓器等を観察することができるなどの点から、本粒子は、前記波長範囲に、発光する蛍光の極大（蛍光のピークトップ）があることが好ましい。
前記蛍光は実施例に記載の方法で測定することができる。
【００３６】
本粒子をＩｎ  ｖｉｖｏイメージングに用いる場合、体内を透過する範囲内で励起する必要があり、相対的に蛍光のピークとなる波長よりも短い範囲で励起する。励起波長は、具体的には、７００〜１７００ｎｍが好ましく、７５０〜１７００ｎｍがより好ましく、８００〜１２００ｎｍがさらに好ましい。
【００３７】
本粒子は、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏイメージング用粒子であり、血管、生体組織、臓器、腫瘍などの病巣の造影に使用される。結果として、疾患の発見や進行過程、細胞活動や薬物の影響、病気の進行、治癒状態などの生体内プロセスを体外からモニタリングする、非侵襲的なイメージングに活用することができる。また、疾患研究、創薬、治験開発等に用いることもできる。
なお、前記イメージングは、多重イメージングであってもよい。
【００３８】
＜蛍光色素Ａ＞
蛍光色素Ａは、波長が９００〜１７００ｎｍの範囲にある蛍光を発する色素であれば特に制限されない。前記蛍光色素Ａは、前記本粒子の発光波長が蛍光色素Ａ自体の発光波長と同様の波長範囲となるような蛍光を発することができる蛍光色素であることがより好ましい。
本粒子に用いられる蛍光色素Ａは、２種以上であってもよいが、通常は１種である。
【００３９】
蛍光色素Ａは、その発光する蛍光の波長の一部が、９００〜１７００ｎｍの範囲にあればよいが、生体透過性が高く、より明瞭に深部の血管や組織・臓器等を観察する場合に容易に用いることができるなどの点から、１０００〜１７００ｎｍの範囲にあることが好ましく、１０００〜１５００ｎｍの範囲にあることがより好ましく、１０００〜１２００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。
また、生体透過性が高く、より明瞭に深部の血管や組織・臓器等を観察することができるなどの点から、蛍光色素Ａは、前記波長範囲に、発光する蛍光の極大（蛍光のピークトップ）があることが好ましい。
蛍光色素Ａの発光する蛍光の波長は、（株）堀場製作所製のＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−ＮＩＲ等の近赤外蛍光分光光度計等で測定することができる。
【００４０】
蛍光色素Ａは、非水溶性の蛍光色素であることが好ましい。
ここで、非水溶性であるとは、２５℃の水１００ｇに対する蛍光色素の溶解度が１ｇ未満であることをいう。
溶解度が前記範囲内にあると、蛍光色素Ａの含有量が多い本粒子を容易に得ることができ、水中に色素含有粒子および親水化色素含有粒子を分散させても蛍光色素Ａの浸出（脱落）が少なく、安定した高い蛍光強度を示す親水化色素含有粒子（分散液）および色素含有粒子（分散液）を容易に得ることができる。
【００４１】
蛍光色素Ａは、有機ポリマー粒子、特に酸性基を有する構造単位を含む有機ポリマー粒子との結合力を高め、蛍光色素Ａの水中への浸出（脱落）をより抑制できる等の点から、カチオン性化合物であることが好ましい。
このようなカチオン性化合物としては、例えば、チオピリリウムイオン、ベンゾ［ｃｄ］インドリニウムカチオンなどを含む化合物が挙げられる。
【００４２】
蛍光色素Ａとしては、高い蛍光強度を示す等の点から、ポリメチン骨格を有する化合物が好ましく、ポリメチン骨格の両末端に複素環を含む基を有する化合物がより好ましく、下記式（Ａ）で表される化合物が特に好ましい。
【００４３】
【化２】
2019111952.tif 000004
【００４４】
前記Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、複素環を含む炭素数１〜３０の有機基である。該有機基としては、Ｒ1およびＲ2の結合する炭素原子に複素環が結合した基が好ましく、Ｒ1またはＲ2の一方の複素環を構成するヘテロ原子が正電荷を帯びていることが好ましい。複素環としては、チオピラン環、ベンゾ［ｃｄ］インドール環等が挙げられる。
前記Ｒ3は独立して、ハロゲン原子または炭素数１〜１２の炭化水素基であり、好ましくはハロゲン原子または炭素数１〜６の炭化水素基である。
前記ｎは１〜４の整数であり、好ましくは１または２である。
【００４５】
蛍光色素Ａとしては、４−［２−［２−クロロ−３−［（２，６−ジフェニル−４Ｈ−チオピラン−４−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−２，６−ジフェニルチオピリリウムテトラフルオロボレート（ＩＲ−１０６１、シグマアルドリッチ社製）、１−ブチル−２−［２−［３−［（１−ブチル−６−クロロベンゾ［ｃｄ］インドール−２（１Ｈ）−イリデン）エチリデン］−２−クロロ−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−６−クロロベンゾ［ｃｄ］インドリウムテトラフルオロボレート（ＩＲ−１０４８、シグマアルドリッチ社製）、４−［２−［３−［（２，６−ジフェニル−４Ｈ−チオピラン−４−イリデン）エチリデン］−２−フェニル−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−２，６−ジフェニルチオピリリウムテトラフルオロボレート（ＩＲ−１０４０、シグマアルドリッチ社製）、１−ブチル−２−［２−［３−［（１−ブチル−６−クロロベンゾ［ｃｄ］インドール−２（１Ｈ）−イリデン）エチリデン］−２−クロロ−５−メチル−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−６−クロロベンゾ［ｃｄ］インドリウムテトラフルオロボレート（ＩＲ−１０５０、シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
【００４６】
本色素含有粒子中に含まれる蛍光色素Ａの含有量は、ベース粒子１００質量部に対し、好ましくは０．００１〜３．０質量部、より好ましくは０．０１〜１．０質量部、さらに好ましくは０．０５〜０．５質量部である。
また、本親水化粒子中に含まれる蛍光色素Ａの含有量は、本親水化粒子１００質量％に対し、好ましくは０．０００９〜２．７質量％、より好ましくは０．００９〜０．９質量％、さらに好ましくは０．０４９〜０．４９質量％である。
蛍光色素Ａの含有量が多くなれば、本粒子の蛍光強度が増加する傾向にあるが、蛍光色素Ａの含有量があまりに多くなると、消光現象によって、得られる本粒子の蛍光強度が飽和・低下する場合がある。このため、蛍光強度の点やコストの点などを考慮すると、蛍光色素Ａの含有量は前記範囲にあることが好ましい。
【００４７】
＜ベース粒子＞
ベース粒子としては、蛍光色素Ａおよび下記親水性ポリマー以外の成分を有すれば特に限定されないが、比較的疎水性であり、有機溶剤で膨潤可能であり、蛍光色素Ａを含む色素含有粒子を容易に調製することができ、かつ、蛍光色素Ａの浸出（脱落）を容易に抑制できる等の点から、有機ポリマー粒子であることが好ましい。ベース粒子としては、下記親水性ポリマー以外のポリマーからなる粒子、特に、常温（２５℃）、１気圧において純水１００ｇに対して１ｇ未満しか溶解しないポリマーからなる粒子であることが好ましい。
本粒子に用いられるベース粒子は、２種以上であってもよいが、通常は１種である。
【００４８】
有機ポリマー粒子としては、公知の粒子を用いることができ特に限定されないが、重合性不飽和芳香族化合物、重合性不飽和カルボン酸化合物、重合性不飽和スルホン酸化合物もしくはその塩、重合性カルボン酸エステル化合物、重合性不飽和カルボン酸アミド化合物、重合性不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、および、共役ジエン化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種のモノマーを用いて（共）重合して得られる粒子であることが好ましく、重合性不飽和芳香族化合物、重合性不飽和カルボン酸化合物、重合性不飽和スルホン酸化合物もしくはその塩、および、重合性カルボン酸エステル化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種のモノマーを（共）重合して得られる粒子であることがより好ましい。
【００４９】
前記モノマーとして具体的には、スチレン、クロロスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン、ジビニルナフタレン、（メタ）アクリル酸α−ナフチル、（メタ）アクリル酸β−ナフチルなどの重合性不飽和芳香族化合物；（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの重合性不飽和カルボン酸化合物；スチレンスルホン酸ソーダなどの重合性不飽和スルホン酸化合物もしくはその塩；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、酢酸ビニルなどの重合性カルボン酸エステル化合物；等が挙げられる。
【００５０】
また、前記重合性不飽和カルボン酸アミド化合物、重合性不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合物、共役ジエン化合物などとしては、アクリロニトリル、メタアクリロニトリル、アクロレイン、メタアクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニル等が挙げられる。
【００５１】
有機ポリマー粒子は、架橋されていてもよい。このような架橋された粒子は、例えば、架橋モノマーを用いて作成することができる。該架橋モノマーとしては、前記モノマーのうち、重合性基を２つ以上有する化合物が挙げられ、具体的には、ジビニルベンゼンなどの多官能重合性不飽和芳香族化合物やエチレングリコールジ（メタ）アクリレートなどの多官能重合性カルボン酸エステル化合物等が挙げられる。
【００５２】
有機ポリマー粒子は、酸性基を有する構造単位を含む粒子であることが好ましい。酸性基を有する構造単位を含む粒子を用いることで、特に、カチオン性化合物である蛍光色素Ａとともに用いることで、さらには、疎水性であり、カチオン性化合物である蛍光色素Ａとともに用いることで、蛍光強度の高い本粒子を容易に得ることができる。
【００５３】
酸性基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基またはこれらの塩などが挙げられる。なお、塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；有機アンモニウム塩等が挙げられる。これらの中でも、アミノ基を含む化合物などを容易に共有結合でき、特に、アミノ基を含む化合物などで表面修飾された粒子を容易に得ることができる等の点から、カルボキシ基が好ましい。
有機ポリマー粒子は、１分子中に酸性基を１個有していてもよく、２個以上有していてもよい。
【００５４】
酸性基の含有量は、有機ポリマー粒子１ｇあたり、好ましくは０．４０ミリモル以上、より好ましくは０．７０ミリモル以上、さらに好ましくは１．４０ミリモル以上である。
酸性基の含有量が前記範囲にあると、より蛍光強度が高い本粒子を容易に得ることができる。蛍光強度を増大できる理由は必ずしも明らかではないが、酸性基の存在により、本粒子中で蛍光色素Ａを均一に分散できるため、蛍光色素Ａの消光等をより抑制できるためであると考えられる。
【００５５】
酸性基の含有量は、有機ポリマー粒子１ｇあたり、好ましくは７．０ミリモル以下、より好ましくは５．６ミリモル以下、さらに好ましくは４．０ミリモル以下である。
有機ポリマー粒子中の酸性基の含有量が過剰となると、親水性が高まり、粒子形状を保てなくなる傾向にあるため、前記範囲にあることが好ましい。
【００５６】
酸性基の含有量は、例えば、酸性基を有するモノマーを用いる場合、有機ポリマーの合成に用いる全モノマーに対する酸性基を有するモノマーの使用量から算出することができる。
【００５７】
酸性基を有する構造単位の含有量は、有機ポリマー粒子を構成する全構造単位１００質量％に対し、好ましくは３質量％以上、より好ましくは５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上である。
酸性基を有する構造単位の含有量が前記範囲にあると、より蛍光強度が高い本粒子を容易に得ることができる。蛍光強度を増大できる理由は必ずしも明らかではないが、酸性基の存在により、色素含有粒子中で蛍光色素Ａを均一に分散できるため、蛍光色素Ａの消光等を抑制できるためであると考えられる。
【００５８】
また、酸性基を有する構造単位の含有量は、有機ポリマー粒子を構成する全構造単位１００質量％に対し、好ましくは５０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、さらに好ましくは３０質量％以下である。
有機ポリマー粒子中の酸性基の含有量が過剰となると、親水性が高まり、粒子形状を保てなくなる傾向にあるため、前記範囲にあることが好ましい。
【００５９】
酸性基を有する構造単位の含有量は、例えば、酸性基を有するモノマーを用いる場合、有機ポリマーの合成に用いる全モノマーに対する酸性基を有するモノマーの使用量から算出することができる。
【００６０】
酸性基を有する構造単位を含む有機ポリマー粒子は、酸性基を有するモノマーを用いて製造してもよく、得られた粒子が酸性基を有するように従来公知の方法で変性することで製造してもよい。
【００６１】
カルボキシ基を有するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、フマル酸、マレイン酸、イタコン酸等の重合性不飽和カルボン酸化合物等が挙げられる。スルホ基を有するモノマーとしては、エチレンスルホン酸、アリルスルホン酸、メタリルスルホン酸、２−スルホエチル（メタ）アクリレート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸等のスルホ基含有重合性不飽和モノマー等が挙げられる。リン酸基を有するモノマーとしては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルアシッドホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルアシッドホスフェート等のリン酸基含有重合性不飽和モノマー等が挙げられる。これらのモノマーは、単独でまたは２種以上を用いてもよい。
これらの中でも、酸性基の導入の容易さ、反応性等の点から、アクリル酸、イタコン酸が好ましい。
【００６２】
ベース粒子の表面荷電量は、より蛍光強度が高い本粒子を得ることができる等の点から、好ましくは０．０５〜６．０ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．２０〜６．０ｍｍｏｌ／ｇ、さらに好ましくは０．２８〜３．８ｍｍｏｌ／ｇ、特に好ましくは０．６０〜２．４ｍｍｏｌ／ｇである。
本明細書中における表面荷電量は、電位差滴定装置で測定した際、得られた電導度曲線の接線を利用して滴定した硫酸量を求め、算出した値であり、粒子１ｇあたりの表面荷電の量を表す。Ｔｉｔｒｉｎｏシリーズ（メトローム社製）の電位差滴定装置を用いて測定できる。
【００６３】
有機ポリマー粒子は、蛍光色素Ａ、特に疎水性である蛍光色素Ａを容易に取り込むことができ、蛍光色素Ａの浸出（脱落）を容易に抑制できる等の点から、１種または２種以上の疎水性構造単位を含む粒子であることが好ましい。
疎水性構造単位を含む粒子は、例えば、有機ポリマー粒子の合成に用いるモノマーとして、１種または２種以上の前記重合性不飽和芳香族化合物や重合性カルボン酸エステル化合物を用いることで製造することができる。
【００６４】
疎水性構造単位の含有量は、蛍光色素Ａ、特に疎水性である蛍光色素Ａをより容易に取り込むことができ、蛍光色素Ａの浸出（脱落）をより容易に抑制できる等の点から、有機ポリマー粒子を構成する全構造単位１００質量％に対し、好ましくは５０〜９７質量％、より好ましくは６０〜９５質量％、さらに好ましくは７０〜９０質量％である。
疎水性構造単位の含有量は、例えば、有機ポリマーの合成に用いる全モノマーに対する疎水性モノマーの使用量から算出することができる。
【００６５】
有機ポリマー粒子は、市販品を用いてもよく、従来公知の方法で合成したものを用いてもよい。
有機ポリマー粒子を製造する方法としては、乳化重合法、シード重合法、ソープフリー重合法、懸濁重合法、沈殿重合法などが挙げられる。これらの中でも、ナノサイズの粒子を簡便に製造できる等の点から、乳化重合法が好ましい。
【００６６】
ベース粒子の体積平均粒径は特に制限されないが、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏイメージングにより好適に用いることができる等の点から、好ましくは１〜３００ｎｍ、より好ましくは５〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１０〜１００ｎｍである。
体積平均粒径が１００ｎｍ以下であると、脾臓や肝臓等における本粒子の蓄積を低減でき、またＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）による腫瘍のイメージングも容易に行うことができる。また、体積平均粒径が１０ｎｍ以上であると、腎臓によるクリアランスを低減でき、体内における滞留時間を伸ばすことができるために、長期における体内イメージングを容易に行うことができる。
体積平均粒径は、実施例に記載の方法で測定できる。
なお、ベース粒子が蛍光色素を含んでも、また、ベース粒子表面に親水性ポリマーを有しても、体積平均粒径はベース粒子の体積平均粒径から大きく変化しない。従って、本粒子の体積平均粒径も前記範囲にあることが好ましい。
【００６７】
＜親水性ポリマー＞
本親水化粒子は、親水性ポリマーを有すれば特に制限されないが、色素含有粒子表面に親水性ポリマーを有することが好ましい。
このように、親水性ポリマーを有することで、生体適合性を有し、体液や生体組織内中やｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分散性に優れ、さらには、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期間蛍光強度を維持できる親水化色素含有粒子を得ることができる。
なお、以下では、親水化色素含有粒子の原料としての親水性ポリマー、具体的には、色素含有粒子表面に物理吸着または化学結合する前の親水性ポリマーについて説明するが、色素含有粒子表面に存在する親水性ポリマーは、色素含有粒子表面に物理吸着または化学結合するその末端が下記説明のポリマーと異なる可能性がある他は下記説明のポリマーとほぼ同様である。
【００６８】
本明細書において親水性ポリマーとは、水との親和力が強い性質を持つことを意味する。具体的には、常温（２５℃）、１気圧において純水１００ｇに対して１ｇ以上溶解するポリマーを、親水性ポリマーという。
【００６９】
親水性ポリマーは、通常、親水性繰り返し単位を有し、主鎖に親水性繰り返し単位を有していてもよいし、側鎖に親水性繰り返し単位を有していてもよい。本明細書において、親水性繰り返し単位は、１種の繰り返し単位のみからなるホモポリマー（数平均分子量が１０００〜１０万程度のもの）とした場合に、常温（２５℃）、１気圧において純水１００ｇに対して１ｇ以上溶解する場合、その繰り返し単位は親水性繰り返し単位であるという。親水性ポリマーは物理的に色素含有粒子に吸着しているか、化学的に結合されていることが好ましいが、親水化色素含有粒子からの浸出（脱落）をより抑制できる等の点から、化学的に結合されていることが好ましい。化学結合としては、共有結合等が挙げられるが、色素含有粒子からの脱離の恐れがより低く、タンパク質等の生体関連物質の付着をより抑制でき、親水化色素含有粒子の分散性をより高めることができる等の点で共有結合が好ましい。
【００７０】
親水性ポリマーが色素含有粒子に化学的に結合している親水化色素含有粒子を得るには、親水性ポリマーとして、色素含有粒子表面（の官能基）と共有結合できる官能基を有するポリマーを用いることが好ましい。このような官能基としては、色素含有粒子表面が酸性基を有する場合はアミノ基等が挙げられ、粒子表面がアミノ基を有する場合はカルボキシ基等が挙げられる。前述の通り、蛍光強度の高い親水化色素含有粒子を容易に得ることができる等の点から、酸性基を有する有機ポリマー粒子が好ましいため、該酸性基を有効に利用できる等の点から、アミノ基を有する親水性ポリマーが好ましい。
【００７１】
主鎖に親水性繰り返し単位を有するポリマーとしては、主鎖にポリアルキレングリコール構造やポリビニルアルコール構造を有するポリマーなどが挙げられる。タンパク質等の生体関連物質の付着をより抑制し、親水化色素含有粒子の分散性をより高める等の点から、ポリアルキレングリコール構造を有するポリマーが好ましく、ポリエチレングリコール構造を有するポリマーがより好ましい。
また、ポリアルキレングリコールの片方の末端が水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であり、もう片方の末端が色素含有粒子表面に物理的に吸着できる基、または、化学的に結合できる官能基を有する基であるポリマーが好ましい。
【００７２】
前記親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール構造と少なくとも１つのアミン構造とを有するポリマーが好ましい。該アミン構造としては特に制限されないが、オリゴアミン構造が好ましく、ポリエチレンイミン構造がより好ましい。
このような親水性ポリマーとして、下記式（８）で表されるポリマーが挙げられ、具体的には、ＪＳＲライフサイエンス（株）製、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０やＣＥ２１０が好適に使用できる。
【００７３】
【化３】
2019111952.tif 000005
［式（８）中、ｎは５〜３００の整数である。］
【００７４】
側鎖に親水性基を有する親水性繰り返し単位を有するポリマーとしては、側鎖にポリアルキレングリコール構造を有し、その側鎖の末端が水素原子または炭素数１〜４のアルキル基で構成される繰り返し単位（Ａ−１）を有するポリマー、側鎖末端にアンモニオアルキルホスフェート基を有する繰り返し単位（Ａ−２）を有するポリマー、側鎖末端にアミド基を有する繰り返し単位（Ａ−３）を有するポリマー、側鎖末端に窒素および酸素を含むヘテロ環を有する繰り返し単位（Ａ−４）を有するポリマー、側鎖末端にラクタムを有する繰り返し単位（Ａ−５）を有するポリマー、および、側鎖末端にベタイン性基を有する繰り返し単位（Ａ−６）を有するポリマーから選ばれる１種以上であるのが好ましい。
【００７５】
前記繰り返し単位（Ａ−１）〜（Ａ−６）のいずれか１種以上を有するポリマーは、さらに粒子表面の官能基と反応させ、親水性ポリマーを色素含有粒子表面に共有結合により固定化することができる末端構造や繰り返し単位（Ｂ）を有することが好ましい。繰り返し単位（Ｂ）としては、例えば色素含有粒子表面のカルボキシ基と反応して共有結合を形成する官能基を側鎖に有する繰り返し単位が好ましい。カルボキシ基と反応して共有結合を形成する官能基としては、アミノ基、メルカプト基等が挙げられる。
【００７６】
親水性ポリマーとしては、さらに天然物である親水性ポリマーでもよく、ブロッキング剤として使用されているＢＳＡ、カゼインなどのタンパク質、キトサンなどの糖類などでもよく、ベース粒子や色素含有粒子表面のカルボキシ基と縮合剤などにより共有結合を形成できる化合物が好ましい。
【００７７】
繰り返し単位（Ａ−１）を誘導するモノマーとしては、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールポリテトラメチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられ、これらの中でも、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが好ましい。
繰り返し単位（Ａ−１）としては、これらを単独でまたは２種以上を用いて得られた繰り返し単位等が挙げられる。
【００７８】
繰り返し単位（Ａ−２）を誘導するモノマーとしては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート（２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシジエトキシエチル−２’−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−２’−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート等が挙げられる。
繰り返し単位（Ａ−２）としては、これらを単独でまたは２種以上を用いて得られた繰り返し単位等が挙げられる。
【００７９】
繰り返し単位（Ａ−３）を誘導するモノマーとしては、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）（メタ）アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。
繰り返し単位（Ａ−３）としては、これらを単独でまたは２種以上を用いて得られた繰り返し単位等が挙げられる。
【００８０】
繰り返し単位（Ａ−４）を誘導するモノマーとしては、４−（メタ）アクリロイルモルホリン等が挙げられる。
繰り返し単位（Ａ−４）としては、前記モノマーを単独でまたは２種以上を用いて得られた繰り返し単位等が挙げられる。
【００８１】
繰り返し単位（Ａ−５）を誘導するモノマーとしては、１−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−ビニル−ε−カプロラクタム等が挙げられる。
繰り返し単位（Ａ−５）としては、これらを単独でまたは２種以上を用いて得られた繰り返し単位等が挙げられる。
【００８２】
繰り返し単位（Ａ−６）を誘導するモノマーとしては、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン、Ｎ−（メタ）アクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−プロピルスルホベタイン等の（メタ）アクリレート系モノマー等が挙げられる。
繰り返し単位（Ａ−６）としては、これらを単独でまたは２種以上用いて得られた繰り返し単位等が挙げられる。
【００８３】
親水性ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）としては、好ましくは５００〜１００，０００、より好ましくは１０００〜１０，０００である。
数平均分子量が前記範囲にあることで、親水性ポリマーの含有量が多い親水化色素含有粒子を容易に得ることができ、特に色素含有粒子表面への親水性ポリマーの修飾量をより高めることができ、タンパク質等の生体関連物質の付着をより抑制でき、分散性のより高い親水化色素含有粒子を容易に得ることができる。
数平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定できる。
【００８４】
親水性ポリマーが色素含有粒子表面を占有する密度は、タンパク質等の生体関連物質の付着を抑制することができ、分散性のより高い親水化色素含有粒子を容易に得ることができる等の点で、好ましくは０．０１本／ｎｍ2以上、より好ましくは０．０５本／ｎｍ2以上、さらに好ましくは０．１本／ｎｍ2以上であり、上限は好ましくは２．０本／ｎｍ2である。
該密度は、色素含有粒子に対する親水性ポリマーの割合、色素含有粒子の粒径および比重から算出され、具体的には、実施例に記載の方法で測定できる。
【００８５】
≪親水化色素含有粒子の製造方法≫
親水化色素含有粒子の製造方法（以下「本製造方法」ともいう。）としては、例えば、下記製造方法Ｉまたは製造方法ＩＩが挙げられる。
・製造方法Ｉ：ベース粒子と前記蛍光色素Ａとを含む色素含有粒子を得る工程１、および、
工程１で得られた色素含有粒子と親水性ポリマーとを接触させ、色素含有粒子と親水性ポリマーとを有する親水化色素含有粒子を得る工程２、
を含む製造方法
・製造方法ＩＩ：ベース粒子と親水性ポリマーとを接触させる工程３、および、
工程３で得られた粒子と前記蛍光色素Ａとを接触させて親水化色素含有粒子を得る工程４、
を含む製造方法
これらの方法の中でも、蛍光色素Ａを効率よく導入でき、特に、蛍光色素Ａの含有量を飛躍的に高めることができる等の点から、製造方法Ｉがより好ましい。
【００８６】
＜工程１＞
工程１としては色素含有粒子が得られれば特に制限されず、（手法１−１）共有結合によりベース粒子表面に蛍光色素Ａを固定化する方法、（手法１−２）蛍光色素Ａの存在下で造粒し、粒子化する過程で蛍光色素Ａを該粒子に取り込ませる方法、（手法１−３）ベース粒子、好ましくは有機ポリマー粒子と、蛍光色素Ａとを含む液体を用い、蛍光色素Ａを、ベース粒子、好ましくは有機ポリマー粒子中に取り込ませる方法等が挙げられる。つまり、前記色素含有粒子は、蛍光色素Ａをベース粒子の表面に有する粒子であってもよく、蛍光色素Ａをベース粒子の内部に有する粒子であってもよく、蛍光色素Ａをベース粒子の表面および内部に有する粒子であってもよい。
これらの中でも、高蛍光強度の本粒子を容易に製造できる等の点で（手法１−３）の製造方法が好ましい。
【００８７】
以下、工程１の好ましい一例を挙げる。
まず、有機ポリマー粒子を用意する。好ましい組成、粒径等は前記の通りである。有機ポリマー粒子は、市販品を用いてもよく、前述の方法などの従来公知の方法で合成したものを用いてもよい。
【００８８】
次に、この有機ポリマー粒子を水系媒体中に分散させ、水系分散液を調製する。水系分散液は、界面活性剤などの添加剤を含有していてもよい。界面活性剤としては、ノニオン系界面活性剤が挙げられ、中でも粒子分散安定性に優れる分散液を容易に得ることができる等の点から高分子系界面活性剤が好ましく、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７（ＢＡＳＦ社製）がより好ましい。
【００８９】
得られた有機ポリマー粒子の水系分散液に、蛍光色素Ａを有機溶媒に溶解した色素溶液を加えて撹拌しながら染色する（染色工程）。有機ポリマー粒子の水系分散液に色素溶液を加えると、有機ポリマー粒子が膨潤し、溶媒中に存在する色素が徐々に有機ポリマー粒子内に吸収されていく。
【００９０】
蛍光色素Ａを溶解する有機溶媒としては特に制限されず、非極性、極性のいずれの有機溶媒であってもよいが、水と任意の割合で混和する極性溶媒が好ましい。例えば、メチルアルコール、エチルアルコールなどのアルコール類；テトラヒドロフラン、１，３−ジオキソラン、ジオキサンなどのエーテル類、アセトンなどのケトン類、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられ、用いる蛍光色素Ａの種類等に応じて１種類または２種類以上が用いられる。これらの中でも、蛍光色素Ａの溶解度が高いことから、ジメチルスルホキシドが好ましい。
【００９１】
色素溶液における蛍光色素Ａの濃度は、好ましくは０．００１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１〜３ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．０１〜１ｇ／Ｌである。
【００９２】
染色工程における、有機ポリマー粒子の濃度（前記水系分散液および色素溶液の合計中の有機ポリマー粒子の濃度）は、好ましくは０．０１〜１０質量％、より好ましくは０．０５〜５質量％、さらに好ましくは０．１〜３質量％である。
前記濃度で有機ポリマー粒子を用いることで、凝集の抑制された色素含有粒子を高い生産性で容易に得ることができる。
【００９３】
染色工程における、界面活性剤の濃度（前記水系分散液および色素溶液の合計中の界面活性剤の濃度）は、好ましくは０．００５〜１０質量％、より好ましくは０．０１〜５質量％、さらに好ましくは０．０５〜１質量％である。
前記濃度で界面活性剤を用いることで、凝集がより抑制された色素含有粒子を容易に得ることができる。
【００９４】
染色工程における、有機溶媒濃度（前記水系分散液および色素溶液の合計中の有機溶媒の濃度）は、好ましくは０．１〜５０質量％、より好ましくは１〜２５質量％、さらに好ましくは２〜１０質量％である。
前記濃度で有機溶媒を用いることで、有機ポリマー粒子を十分に膨潤させることができ、ベース粒子に蛍光色素Ａがより取り込まれ易くなるため好ましく、また、得られる本粒子からの蛍光色素Ａの浸出（脱落）が低減され、本粒子の状態変化による凝集や形状の変化を抑制できる。
【００９５】
染色工程における、有機ポリマー粒子に対する蛍光色素Ａの添加量は、得られる本粒子における有機ポリマー粒子１ｇあたりの蛍光色素Ａの含有量が、好ましくは０．０１〜３０ｍｍｏｌ、より好ましくは０．１〜１５ｍｍｏｌ、さらに好ましくは０．５〜７ｍｍｏｌとなる量である。
蛍光色素Ａの使用量が多くなれば、得られる本粒子の蛍光強度が増加する傾向にあるが、蛍光色素Ａの使用量があまりに多くなると、消光現象によって、得られる本粒子の蛍光強度が飽和・低下する傾向にある。このため、蛍光強度の点やコストの点などを考慮すると、蛍光色素Ａの使用量は前記範囲にあることが好ましい。
【００９６】
染色工程の温度は特に制限されないが、好ましくは０〜５０℃、より好ましくは１０〜４０℃、さらに好ましくは２０〜３０℃である。
温度を前記範囲とすることで、蛍光色素Ａを効率よく有機ポリマー粒子に含ませることができ、凝集がより抑制された色素含有粒子を容易に得ることができる。
【００９７】
蛍光色素Ａを有機ポリマー粒子に吸収させる時間（有機ポリマー粒子の水系分散液と色素溶液とを撹拌する時間）は、用いる蛍光色素Ａの種類、有機ポリマー粒子の組成、粒子径などにより適宜決定すればよいが、好ましくは１〜６０分、より好ましくは２〜３０分、さらに好ましくは３〜１０分である。
【００９８】
なお、工程１は、染色工程後の分散液を水系分散液に置換する工程を含んでもよい。このように置換する方法としては、遠心分離、透析、限外濾過等が挙げられる。これらの中でも、簡便かつ短時間で置換できる等の点で限外濾過が好ましい。
【００９９】
工程１では、基本的には、用いた蛍光色素Ａのほぼ全てを含む色素含有粒子を得ることができ、用いる蛍光色素量を調整してもよいが、本製造方法は、染色工程で得られた分散液中の遊離の蛍光色素Ａを、フィルターなどを用いて除去する工程を含んでもよい。
【０１００】
＜工程２＞
工程２としては特に制限されず、（手法２−１）疎水性相互作用またはイオン性相互作用により親水性ポリマーを色素含有粒子、特に該粒子表面に物理吸着させる方法、（手法２−２）親水性ポリマーに含まれる官能基と、色素含有粒子表面が有する官能基とを共有結合により結合し、親水性ポリマーを色素含有粒子、特に該粒子表面に共有結合する方法等が挙げられる。これらの中でも、親水性ポリマーがｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで脱離しにくく、分散性に優れ、高い蛍光強度を維持できる親水化色素含有粒子を容易に得ることができる等の点で、（手法２−２）の製造方法が好ましい。
【０１０１】
以下、工程２の好ましい一例を挙げる。
工程１で得られた色素含有粒子を水系媒体中に分散させ、水系分散液を調製する。または、工程１で得られた色素含有粒子の水系分散液をそのまま用いてもよい。これらの水系分散液は、界面活性剤などの添加剤を含有していてもよい。
【０１０２】
次に、親水性ポリマー水溶液と、必要に応じて縮合剤を前記水系分散液に添加し、親水性ポリマーで色素含有粒子、特に該粒子表面を修飾する（修飾工程）。
【０１０３】
縮合剤は、親水性ポリマーと色素含有粒子の官能基に応じて選択すればよい。例えば、親水性ポリマーがアミノ基を含み、色素含有粒子がカルボキシ基を含む場合、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などのカルボジイミド系化合物；Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールなどのイミダゾール系化合物；４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物などのトリアジン系化合物；１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩などのホスホニウム系化合物；Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル)−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸などのウロニウム系化合物を用いることができる。これらの中でも、簡便に扱える等の点で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩が好ましい。
【０１０４】
修飾工程における、色素含有粒子の濃度は、好ましくは０．０５〜１０質量％、より好ましくは０．１〜５質量％、さらに好ましくは０．３〜３質量％である。
前記濃度で色素含有粒子を用いることで、凝集が抑制された親水化色素含有粒子を高い生産性で容易に得ることができる。
【０１０５】
修飾工程における、色素含有粒子１ｇに対する親水性ポリマーの添加量は、好ましくは０．００１〜１０ｇ／ｇ、より好ましくは０．０１〜５．０ｇ／ｇ、さらに好ましくは０．１〜１．０ｇ／ｇである。
親水性ポリマーの添加量が前記範囲にあることで、十分に表面修飾された親水化色素含有粒子を低コストで容易に得ることができる。
【０１０６】
表面修飾工程における、色素含有粒子１ｇに対する縮合剤の添加量は、好ましくは０．０００１〜１ｇ／ｇ、より好ましくは０．００１〜０．５ｇ／ｇ、さらに好ましくは０．０１〜０．３ｇ／ｇである。
親水性ポリマーの添加量が前記範囲にあることで、凝集が抑制され、かつ、親水性ポリマーで十分に表面修飾された親水化色素含有粒子を容易に得ることができる。
【０１０７】
なお、修飾工程は緩衝液中で行ってもよい。該緩衝液としては、修飾反応を阻害しないものであれば特に制限されないが、例えば、親水性ポリマーがアミノ基を含み、色素含有粒子がカルボキシ基を含む場合、ｐＨ４〜７のＭＥＳ緩衝液が好ましい。
【０１０８】
＜工程３＞
工程３としては特に制限されず、ベース粒子と親水性ポリマーとを接触させればよいが、（手法３−１）疎水性相互作用またはイオン性相互作用により親水性ポリマーをベース粒子、特に該粒子表面に物理吸着させる方法、（手法３−２）親水性ポリマーに含まれる官能基と、ベース粒子表面が有する官能基とを共有結合により結合し、親水性ポリマーをベース粒子、特に該粒子表面に共有結合する方法等が挙げられる。これらの中でも、親水性ポリマーがｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで脱離しにくく、分散性に優れる粒子を容易に得ることができる等の点で、（手法３−２）の製造方法が好ましい。
これら（手法３−１）や（手法３−２）としては、前記（手法２−１）や（手法２−２）において、色素含有粒子の代わりにベース粒子を用いる以外は同様の方法が挙げられる。
【０１０９】
＜工程４＞
工程４は、工程３で得られた粒子と前記蛍光色素Ａとを接触させて親水化色素含有粒子を得る工程である。
工程４としては、親水化色素含有粒子を得ることができれば特に制限されないが、（手法４−１）共有結合により工程３で得られた粒子表面に蛍光色素Ａを固定化する方法、（手法４−３）工程３で得られた粒子と、蛍光色素Ａとを含む液体を用い、蛍光色素Ａを、工程３で得られた粒子中に取り込ませる方法等が挙げられる。
これらの中でも、高蛍光強度の本粒子を容易に製造できる等の点で（手法４−３）の製造方法が好ましい。
これら（手法４−１）や（手法４−３）としては、前記（手法１−１）や（手法１−３）において、ベース粒子の代わりに工程３で得られた粒子を用いる以外は同様の方法が挙げられる。
【０１１０】
≪生体内を観察する方法≫
生体内を観察する方法（以下「本観察方法」ともいう。）は、
本親水化粒子または本色素含有粒子を体内に含む被検体に、蛍光色素Ａの励起光を照射する工程Ａ、および、
被検体から発せられる波長９００〜１７００ｎｍの範囲の蛍光を検出する工程Ｂ、
を含む。
【０１１１】
＜工程Ａ＞
工程Ａは、具体的には、本親水化粒子または本色素含有粒子、好ましくは本親水化粒子を体内に投与する工程Ａ１、および、被検体に蛍光色素Ａの励起光を照射する工程Ａ２を含む工程が挙げられる。
【０１１２】
〈工程Ａ１〉
工程Ａ１における投与方法は、対象に応じて、任意の好適な手段を採用すればよい。例えば、（ａ）経口投与、（ｂ）非経口投与が挙げられる。
なお、これらの投与は、局部・局所投与であってもよく、注射器、注入ポンプ、チューブ等を用いた投与、皮膚上投与、経粘膜投与、吸入投与、バッカル投与であってもよい。
【０１１３】
（ａ）経口投与としては、本粒子の分散液を直接経口投与してもよいし、本粒子と、当該技術分野で周知の薬学的に許容し得る担体等とを含む混合物を投与してもよい。該混合物の剤形は特に限定されず、例えば、ピル、糖衣剤、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤が挙げられる。
【０１１４】
本粒子を経口投与する際には賦形剤を用いてもよい。好適に用いられる賦形剤としては特に限定されないが、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース調製物、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられる。
【０１１５】
また、本粒子を経口投与する際には崩壊剤を用いてもよい。前記崩壊剤としては特に限定されないが、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸もしくはその塩（例：アルギン酸ナトリウム）が挙げられる。
【０１１６】
前記カプセルとしては、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルや、ゼラチンおよび可塑剤（例：グリセロールまたはソルビトール）で作製されたシールされたソフトカプセルであってもよい。
前記プッシュフィットカプセルは、充填剤（例：ラクトース）、結合剤（例：デンプン）、滑沢剤（例：タルク、ステアリン酸マグネシウム）、安定化剤等を含んでもよい。
前記ソフトカプセルにおいて本粒子は、好適な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、液体ポリエチレングリコールなどに溶解または懸濁していてもよい。
【０１１７】
経口投与する際の本粒子の使用量は、かかる投与に適した投薬量であることが好ましい。
【０１１８】
（ｂ）非経口投与としては、経口以外の投与、例えば、直腸投与、膣内投与、尿道内投与、眼内投与、鼻腔内投与または点耳が挙げられる。
【０１１９】
非経口投与では、本粒子を、直腸組成物、例えば、坐剤または保持浣腸等の形態としてもよい。この場合、例えば、慣用の坐剤基剤（例：ココアバター、他のグリセリド）を用いてもよい。
【０１２０】
局部・局所投与としては、例えば、腎臓又は心臓領域における直接注射やデポ移植が挙げられる。
【０１２１】
注射器や注入ポンプ等を用いた投与としては、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射、眼窩内注射、テノン氏嚢内注射、脊髄内注射、胸骨内注射等（注入ポンプ送達を含む）が挙げられる。これらの投与の際には、必要により賦形剤等を用い、本粒子を懸濁液として用いればよい。好適な賦形剤としては特に限定されないが、例えば、水、食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システインが挙げられる。さらに、所望により、少量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤、緩衝液、吸収増強剤等を用いてもよい。
【０１２２】
経粘膜投与の際には、透過すべき障壁に適した浸透剤を用いてもよい。
バッカル投与の際には、慣用の手法で製剤された、本粒子を含む、錠剤またはロゼンジ剤の形態をとってもよい。
【０１２３】
吸入投与の際には、本粒子は、加圧パック（pressurized pack）またはネブライザーから、好適なプロペラント、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスとともに投与してもよい。
加圧エアゾールとして投与する場合、投薬量は、計量された量を放出するためのバルブを用いて制御してもよい。
吸入器やインサフレーター等を用いて投与する場合には、粉末基剤（例：ラクトース、デンプン等の粉末（混合物））を用いてもよい。
【０１２４】
〈工程Ａ２〉
励起光を被検体に照射する方法は特に限定されず、光源を用いて被検体の外側から照射してもよく、本粒子とは別に被検体に投与した発光物質を発光させることにより本粒子に照射してもよいが、励起光の強度を調整できる等の点から、被検体の外側から照射することが好ましい。
【０１２５】
被検体の外から励起光を照射するための、光源としては特に限定されず、種々のレーザー（例：イオンレーザー、色素レーザー：半導体レーザー）、ハロゲン光源、キセノン光源などの通常の励起光光源を用いてもよい。
励起光は、所望により、種々の光学フィルターを使用して最適な励起波長のみを照射してもよい。
【０１２６】
励起光の波長としては、生体透過性が高く、深部を鮮明に観察できる点から、７００〜１７００ｎｍが好ましく、７５０〜１７００ｎｍがより好ましく、８００〜１２００ｎｍがさらに好ましい。
【０１２７】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂでは、被検体から発せられる、具体的には、本粒子から発せられる波長９００〜１７００ｎｍの範囲の蛍光を検出すれば特に制限されない。この検出の際には、種々の光学フィルターを使用して、所望の波長の光のみを検出してもよい。
【０１２８】
蛍光を検出するための検出器は特に限定されないが、例えば、ＣＣＤカメラを用いることができる。より具体的には、ＩｎＧａＡｓ−ＣＣＤカメラを用いることができる。また、光学ＣＴ装置、内視鏡、眼底カメラ等を使用してもよい。
【０１２９】
本観察方法では、前記蛍光を検出した後、検出した蛍光を蛍光情報としてデータ処理し、このデータを元に記録可能な蛍光イメージを作成してもよい。
前記蛍光イメージは、具体的には、標的組織を含む広い領域に励起光を照射して、ＣＣＤカメラで蛍光を検出し、得られた蛍光情報をイメージ処理することにより作成してもよい。
【０１３０】
工程Ａ２および工程Ｂは専用装置で連続的に行ってもよい。このような装置としては特に限定されないが、（株）島津製作所製、ＳＡＩ−１０００を好適に使用できる。
【実施例】
【０１３１】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。【０１３２】
［粒径の測定］
各粒子の粒径（体積平均粒径）は、動的光散乱式ナノトラック粒度分析計（日機装（株）製）を用い、粒子透過性：透過、粒子形状：真球形、粒子屈折率：１．５９、粒子密度：１．００、溶媒：水、溶媒屈折率：１．３３３の条件で測定した。【０１３３】
［蛍光測定］
０．３質量％の粒子分散液２ｍＬを含む石英セルを、２５℃で管理されたファイバー接続型温調機能付キュベットホルダ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｎｏｒｔｈ  Ｗｅｓｔ社製、ｑｐｏｄ２ｅ）に設置した。次に、温度コントローラー付精密ＬＤドライバー（ＹＡＭＡＫＩ製、ＫＬＤ−６．５ＡＬＴ）で制御された９８０ｎｍの励起光をレーザーダイオード（ＬＡＳＥＲ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ．ＬＴｄ．製、ハイパワーファイバーレーザーダイオード，ＳＰ−９７６−５−１０１５−７）で照射し、光ファイバースペクトロメーター（ＡＶＡＮＴＥＳ社製、ＡｖａＳｐｅｃ−ＮＩＲ２５６−１．７）により、波長１０００〜１７００ｎｍにおける各粒子の蛍光スペクトルを測定した。【０１３４】
［吸光度の測定］
０．３質量％の粒子分散液２ｍＬを含む石英セルを紫外可視近赤外分光光度計（日本分光（株）製、Ｖ−７７０）に設置し、波長７００〜１３００ｎｍにおける各粒子の吸収スペクトルを測定した。【０１３５】
［親水性ポリマーが色素含有粒子表面を占有する密度の算出］
親水化色素含有粒子をＤＭＳＯ−ｄ６に溶解させ、ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ社製、ＡＶＡＮＣＥＩＩＩＨＤ、７００ＭＨｚ−ｃｒｙｏ−ＤＣＨ−ＮＭＲ、核種：１３Ｃ（ＮＳ＝５１２，Ｄ１＝１５）、温度：１２０℃）で、有機ポリマー粒子のスチレン由来の炭素ピークと、親水性ポリマーのポリエチレングリコール由来の炭素ピークとの積分比から、親水化色素含有粒子１ｇあたりに修飾された親水性ポリマーの質量（α）を求めた。
次に、親水性ポリマーの数平均分子量から親水化色素含有粒子１ｇあたりに修飾された親水性ポリマーの本数（β）を求めた。次いで、親水化色素含有粒子の粒径および比重から、親水化色素含有粒子１ｇあたりの表面積（γ）を求め、（β）／（γ）により、親水性ポリマーが親水化色素含有粒子表面を占有する密度を算出した。【０１３６】
［合成例１−１］
重合容器に水３３０質量部およびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム０．７質量部を仕込み、窒素雰囲気下で８０℃まで昇温した。そこに、過硫酸カリウム０．３質量部を加えた後、水８０質量部、ドデシル硫酸ナトリウム１．１質量部、スチレン９６質量部、アクリル酸３．８質量部およびイタコン酸０．２質量部からなるモノマーエマルションを８０℃下で、２時間かけて滴下し、続いて過硫酸カリウム０．１質量部を加え、さらに８０℃で３時間重合することで、有機ポリマー粒子（Ａ−１）を得た。得られた粒子（Ａ−１）の表面荷電量は、０．２４ｍｍｏｌ／ｇであった。【０１３７】
［合成例１−２〜１−６］
スチレン、アクリル酸およびイタコン酸の仕込み量を表１に記載の通りとした以外は合成例１−１と同様の操作を行い、有機ポリマー粒子（Ａ−２）〜（Ａ−６）を得た。
なお、表１中の「部」は、「質量部」を示す。【０１３８】
【表１】
2019111952.tif 000006
【０１３９】
［合成例２−１］
１００ｍＬビーカー内で、有機ポリマー粒子（Ａ−１）５０ｍｇを、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ４０７（ＢＡＳＦ社製）２０ｍｇを溶解させた水溶液２８．５ｇに分散させ、０．００１質量％のＩＲ−１０６１（４−［２−［２−クロロ−３−［（２，６−ジフェニル−４Ｈ−チオピラン−４−イリデン）エチリデン］−１−シクロヘキセン−１−イル］エテニル］−２，６−ジフェニルチオピリリウムテトラフルオロボラート、シグマアルドリッチ社製）のジメチルスルホキシド溶液１．５ｍＬを加えて、室温でマグネティックスターラー（アズワン（株）製、ＨＳ−３０Ｄ、１００ｒｐｍ）で５分間撹拌した。撹拌後、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、１００，０００ＮＭＷＬ）により分散媒を水に置換し、色素含有粒子（Ｂ−１）を得た。【０１４０】
［合成例２−２〜２−６］
ＩＲ−１０６１の濃度を表２に記載の通りに変更した以外は、合成例２−１と同様の操作を行い、色素含有粒子（Ｂ−２）〜（Ｂ−６）を得た。
なお、表２中の「ＩＲ−１０６１／有機ポリマー粒子［質量％］」の値は、仕込み量から算出した値である。【０１４１】
色素含有粒子（Ｂ−１）〜（Ｂ−６）の蛍光測定を行い、波長１０９６ｎｍにおける蛍光強度の結果を表２に示す。
また、色素含有粒子（Ｂ−１）〜（Ｂ−６）の蛍光測定を行い、有機ポリマー粒子中に含まれる蛍光色素Ａの質量割合（ＩＲ−１０６１／有機ポリマー粒子［質量％］）を横軸（対数目盛）、波長１０９６ｎｍにおける蛍光強度を縦軸として、片対数グラフを作成した。結果を図１に示す。【０１４２】
【表２】
2019111952.tif 000007
【０１４３】
［合成例２−８〜２−１２］
粒子（Ａ−２）〜（Ａ−６）を用いた以外は合成例２−４と同様の操作を行い、色素含有粒子（Ｂ−８）〜（Ｂ−１２）を得た。【０１４４】
色素含有粒子（Ｂ−４）および（Ｂ−８）〜（Ｂ−１２）の蛍光測定を行い、波長１０９６ｎｍにおける蛍光強度の結果を表３に示す。
色素含有粒子（Ｂ−４）および（Ｂ−８）〜（Ｂ−１２）の蛍光測定を行い、有機ポリマー粒子（ベース粒子）１ｇあたりの酸性基の含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）を横軸、波長１０９６ｎｍにおける蛍光強度を縦軸としてプロットした。結果を図２に示す。
なお、有機ポリマー粒子（ベース粒子）１ｇあたりの酸性基の含有量は、有機ポリマー粒子の合成に用いる全モノマーに対する酸性基を有するモノマーの使用量から算出した。具体的には、有機ポリマー粒子（Ａ−１）１ｇあたりの酸性基の含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）は、（３．８／７２＋２×０．２／１３０）／１００×１０００で求めることができる。なお、３．８／７２は全モノマーを１００ｇとした際のアクリル酸由来の酸性基の物質量、２×０．２／１３０はイタコン酸由来の酸性基の物質量を表す。【０１４５】
【表３】
2019111952.tif 000008
【０１４６】
色素含有粒子（Ｂ−４）および（Ｂ−８）〜（Ｂ−１２）の吸光度を測定した。結果を図３に示す。【０１４７】
図２および３から、有機ポリマー粒子の酸性基の割合に応じて蛍光強度および吸収特性が変化することが分かった。このことから、有機ポリマー粒子の酸性基が、該粒子に内包された蛍光色素Ａの状態を変化させていると推察される。本発明者は、酸性基の存在により、カチオン性である蛍光色素Ａが粒子内で均一に分布できることがこれらの変化の理由であると推察している。
用いる有機ポリマー粒子、色素の種類および色素の量を変化させることで、より強い蛍光を発する色素含有粒子を得ることができると考えられる。【０１４８】
［実施例１］
反応容器中に、色素含有粒子（Ｂ−４）１５０ｍｇを含む水分散液３ｍＬ、２．０質量％の片末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＪＳＲライフサイエンス（株）製、ブロックマスターＣＥ５１０）水溶液３．７５ｍＬ、および、１．０質量％の１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（（株）同仁化学研究所製）のＭＥＳ緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）１．５ｍＬを加え、室温で２時間撹拌した。
その後、透析により、過剰の原料を除去し、溶媒を水に置換することで、表面にポリエチレングリコール鎖を有する親水化色素含有粒子（Ｃ−１）を得た。粒径は７０ｎｍ、親水性ポリマーが色素含有粒子表面を占有する密度は０．２０本／ｎｍ2であった。【０１４９】
［実施例２］
色素含有粒子（Ｂ−９）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行い、親水化色素含有粒子（Ｃ−２）を得た。粒径は８２ｎｍ、親水性ポリマーが色素含有粒子表面を占有する密度は０．２０本／ｎｍ2であった。【０１５０】
［実施例３］
ブロックマスターＣＥ５１０の代わりに、ポリエチレングリコール（ＪＳＲライフサイエンス（株）製、ブロックマスターＣＥ２１０）を使用した以外は実施例１と同様の操作を行い、親水化色素含有粒子（Ｃ−３）を得た。粒径は６７ｎｍ、親水性ポリマーが色素含有粒子表面を占有する密度は０．２９本／ｎｍ2であった。【０１５１】
［実施例４］
ブロックマスターＣＥ５１０の代わりに、ブロックマスターＣＥ２１０を使用した以外は実施例２と同様の操作を行い、親水化色素含有粒子（Ｃ−４）を得た。粒径は７９ｎｍ、親水性ポリマーが色素含有粒子表面を占有する密度は０．２９本／ｎｍ2であった。【０１５２】
［比較例１］
ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＬ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ社製）のアセトニトリル溶液（０．４ｍＭ，１ｍＬ）とＩＲ−１０６１のアセトニトリル溶液（１３０ｍＭ ，１１００μＬ）の混合溶液を撹拌しながら、水１ｍＬを加えた。アセトニトリルをエバポレートすることで、近赤外蛍光を有するポリマーミセルを得た。【０１５３】
［試験例１］
２ｍＬのエッペンドルフチューブに、実施例で得られた粒子１ｍｇを含む水分散液１０μＬを入れ、それぞれのチューブにヒト血漿（コージンバイオ（株）製、正常ヒト血漿・プール、ＥＤＴＡ）２００μＬを入れ、１０秒間ボルテックス撹拌した後、遠心処理（２０００ｇ、１０秒間）を行った。目視にて粒子の沈殿が確認されない場合を○、粒子の沈殿が確認された場合を×と評価した。結果を表４に示す。【０１５４】
［試験例２］
実施例または比較例で得られた粒子またはポリマーミセル６ｍｇをヒト血漿（コージンバイオ（株）製、正常ヒト血漿・プール、ＥＤＴＡ）２ｍＬに分散させた直後の分散液と３日静置後の分散液に、励起光を照射することで発せられた、波長１０９６ｎｍにおける蛍光を測定し、蛍光強度の維持率（３日後の蛍光強度／分散直後の蛍光強度［％］）を算出した。結果を表４に示す。
なお、この試験例２で蛍光強度の維持率が高い親水化色素含有粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでも同様に、長期間蛍光強度を維持できるといえる。【０１５５】
［試験例３］
６．０質量％の実施例で得られた粒子を含む水分散液２００μＬを、マウスに尾静脈注射投与し、（株）島津製作所製、ＳＡＩ−１０００（Ｆｉｌｔｅｒ：１０５０ｎｍ  ｌｏｎｇ  ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ）を用いて、投与から５分後のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを行った。血管および臓器が明瞭に観察された場合を○、非常に明瞭に観察された場合を◎、明瞭に観察されず粒子の凝集物が見られた場合を×と評価した。結果を表４および図４に示す。【０１５６】
【表４】
2019111952.tif 000009
【図１】
2019111952.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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