(57)【要約】  臨床上の要求を満足することができるコレステロール引き抜き能の測定方法。（１）細胞を含む培養液に安定同位体標識されたコレステロールを添加して培養し、該細胞に該安定同位体標識されたコレステロールを取り込ませる工程、（２）該コレステロールを取り込ませた細胞を、被験物質存在下で培養する工程、（３）該細胞から引き抜かれた安定同位体標識されたコレステロールの量を測定する工程、を含む被験物質のコレステロール引き抜き能の測定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）細胞を含む培養液に安定同位体標識されたコレステロールを添加して培養し、該細胞に該安定同位体標識されたコレステロールを取り込ませる工程、
（２）該コレステロールを取り込ませた細胞を、被験物質存在下で培養する工程、
（３）該細胞から引き抜かれた安定同位体標識されたコレステロールの量を測定する工程、
を含む、被験物質のコレステロール引き抜き能の測定方法。
【請求項２】
前記（１）において、前記細胞を含む培養液中における前記安定同位体標識されたコレステロールの濃度が、２μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記（１）において、前記培養の時間が４８時間より短い、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記（１）において、前記培養液における細胞の濃度が２．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬより高い、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記（２）で得られた培養物に、前記安定同位体とは別の安定同位体で標識されたコレステロールを所定の濃度で添加してその量を測定し、検量線を作成することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記安定同位体標識されたコレステロールの量の測定が質量分析による定量である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール引き抜き能の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）について、含有するコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の濃度よりも機能（コレステロール引き抜き能）が、臨床上、重要であるとする報告がなされ、新規なバイオマーカーとなりうることが示唆されている（非特許文献１）。コレステロール引き抜き能の測定は、放射性同位体で標識されたコレステロールをマクロファージに取り込ませた後、被験者血清より分離したＨＤＬやアポＡ−ＩなどＨＤＬ関連成分（以下、被験物質ということがある）を前記マクロファージと共存させ、前記マクロファージから引き抜かれた培養上清中のコレステロールに由来する放射活性の強さを測定する方法が普及している。しかしこの方法は、放射性同位体を使用するため実施できる施設に制限があり、ルーチン化が困難である。一方、放射性同位体に代えて安定同位体で標識したコレステロールを使用し、質量分析によりコレステロール量の増減を測定する方法の報告もあるが、臨床上の要求を満足できるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒｏｈａｔｇｉ  Ａ、ｅｔ  ａｌ、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３７１；２３８３−２３９３，２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
以上より、臨床上の要求を満足することができる、安定同位体標識したコレステロールを使用し、質量分析によりコレステロール量の増減を測定することによる、コレステロール引き抜き能の測定方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下に記載されるものを含む。
［１］（１）細胞を含む培養液に安定同位体標識されたコレステロールを添加して培養し、該細胞に該安定同位体標識されたコレステロールを取り込ませる工程、
（２）該コレステロールを取り込ませた細胞を、被験物質存在下で培養する工程、
（３）該細胞から引き抜かれた安定同位体標識されたコレステロールの量を測定する工程、
を含む、被験物質のコレステロール引き抜き能の測定方法。
［２］前記（１）において、前記細胞を含む培養液中における前記安定同位体標識されたコレステロールの濃度が、２μｇ／ｍＬ〜３０μｇ／ｍＬである、［１］に記載の方法。
［３］前記（１）において、前記培養の時間が４８時間より短い、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記（１）において、前記培養液における細胞の濃度が２．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬより高い、［１］〜［３］のいずれか１に記載の方法。
［５］前記（２）で得られた培養物に、前記安定同位体とは別の安定同位体で標識されたコレステロールを所定の濃度で添加してその量を測定し、検量線を作成することをさらに含む、［１］〜［４］のいずれか１に記載の方法。
［６］前記安定同位体標識されたコレステロールの量の測定が質量分析による定量である、［１］〜［５］のいずれか１に記載の方法。
［７］前記被験物質が、血清、血清より分離した高比重リポ蛋白もしくはアポリポ蛋白Ａ−１、又はアポリポ蛋白Ｂを除去した血清試料である、［１］〜［６］のいずれか１に記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、臨床上の要求を満足できる、安定同位体標識したコレステロールを使用し、質量分析によりコレステロール量の増減を測定することによるコレステロール引き抜き能の測定方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】細胞数の計測結果。
【図２】コレステロール取り込み能。
【図３】細胞生存率の計測結果。
【図４】質量分析による培養上清中コレステロール量の測定結果。
【図５】加水分解サンプルと加水分解しないサンプルの間でのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の相関。
【図６】加水分解サンプルと加水分解しないサンプルの間でのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の比較。
【図７】アポＡ−１濃度とｃ−ｅｆｆｌｕｘ値との関係。
【図８】アポＢ除去血清検体濃度とｃ−ｅｆｆｌｕｘ値との関係。
【図９】ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の日差再現性。
【図１０】放射性同位体標識を用いたコレステロール測定値との相関（ｎ＝８）。
【図１１】蛍光標識を用いたコレステロール測定値との相関（ｎ＝８）。
【図１２】（Ａ）放射性同位体標識を用いたコレステロール測定値との相関（ｎ＝４１）。（Ｂ）蛍光標識を用いたコレステロール測定値との相関（ｎ＝４１）。（Ｃ）放射性同位体標識を用いたコレステロール測定値と蛍光標識を用いたコレステロール測定値の相関（ｎ＝４１）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下に実施形態を挙げて本発明の説明を行うが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【０００９】
多くの疫学研究により冠動脈疾患（ＣＡＤ）の発症率は、血清ＬＤＬ−Ｃ値と関係することが明らかになっている。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（スタチン）を用いたＬＤＬ−Ｃ低下療法によりＣＡＤのイベントリスクを３０％程度下げることが可能となった。しかし、スタチンによるＬＤＬ−Ｃ低下療法には限界があることから、近年、コレステロール逆転送系（ＲＣＴ）の活性化によるＣＡＤの予防及び治療の試みが注目されている。ＲＣＴは抹消組織に過剰に蓄積したコレステロールを肝臓へと戻す経路であり、ＨＤＬ及びＨＤＬを構成するアポリポ蛋白Ａ−１（アポＡ−１）がその中心的な役割を果たしている。コレステロール逆転送系の最初のステップは細胞からのコレステロール引き抜き（ｃ−ｅｆｆｌｕｘ）であり、ＨＤＬの最も重要な機能と言われている。血清ＨＤＬによるｃ−ｅｆｆｌｕｘ能とＣＡＤ発症率は、負の相関があることが報告されている（Ｋｈｅｒａ，  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１  ３６４  １２７）。
【００１０】
血清ＨＤＬによるｃ−ｅｆｆｌｕｘ能は、現在、3Ｈなどの放射性同位体で標識したコレステロールを用いて測定されている。我々は、臨床検査の現場でｃ−ｅｆｆｌｕｘ能を評価するには放射性同位体を使用しないアッセイ系が必要と考え、安定同位体を用いたｃ−ｅｆｆｌｕｘ能評価系を検討した。今回、安定同位体の種類、細胞へのコレステロール取り込み条件、上清からのコレステロール抽出条件等の設定を行った。マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４を２４穴プレートに３ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種し、５μｇ／ｗｅｌｌの2Ｈ6−コレステロール共存下で２４時間インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ2）。０．３ｍｍｏｌ／ＬのｃＡＭＰと１８時間インキュベートしＡＢＣＡ１を活性化後、０．２５％から２％のアポＢ除去血清を添加し２時間インキュベートした。上清からＦｏｌｃｈ法にてコレステロールを抽出し、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｍａｘｉｓ３Ｇ；Ｂｒｕｋｅｒ）を用い2Ｈ6−コレステロールを定量した。その結果、アポＢ除去血清濃度依存的な2Ｈ6−コレステロール量の上昇が確認された。
【００１１】
本発明の方法は、従来の放射性同位体を使用する測定方法の結果との相関性が良好である。また本発明の方法は、同時再現性、日差再現性に優れる。さらに測定範囲もワイドである。
【００１２】
以下、さらに詳細に本発明の方法の特徴を説明する。コレステロール引き抜き能測定におけるコレステロールの標識物質として、これまでは放射性同位体や蛍光色素が使用され、放射活性や蛍光強度の測定値を利用して引き抜き能の評価を行っていた。しかしながら、放射性同位体や蛍光色素は、当該標識物質がコレステロールから離脱した状態（標識物質単独）であっても、コレステロールを標識した状態のものと区別されずに測定されてしまう。そのため、従来の方法は、離脱した放射性同位元素や蛍光色素を測りこむ可能性を否定することができないため、正確性及び信頼性の高いコレステロール測定方法ではなかった。また、細胞に取り込ませるコレステロールとして、標識する放射性同位体や蛍光色素の種類を変えてフリーコレステロールとコレステロールエステルを区別した場合であっても、従来の方法では、引き抜かれたフリーコレステロールが代謝されコレステロールエステルとなった場合などを識別して追跡することができなかった。またさらに、標識物質の放射活性や蛍光強度の強さと標識されたコレステロールの量との関係（比活性などと称される）は、試験に使用する標識されたコレステロール毎に異なるので、測定されたコレステロール引き抜き能の評価は相対的な評価しかすることができなかった。
なお、本明細書において、放射性同位体、蛍光色素、又は安定同位体によりコレステロールを標識することを、単に放射性同位体標識、蛍光標識、安定同位体標識ということがある。
【００１３】
本発明の方法によれば、安定同位体標識されたコレステロールを質量分析により測定するため、構造情報に基づき正確にコレステロールを測定することができる。またフリーコレステロールとコレステロールエステルを識別して測定することもできるため、細胞から引き抜かれた後のコレステロールの代謝状態を追跡することも可能である。
【００１４】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】
［実施例１］コレステロール取込みにおける培養条件の選択（１）
（１−１）コレステロールの取込み（１）
１０％の濃度になるようＦＢＳ（ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ社製，０４−００１−１Ａ）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）（以下、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭという）、１％の濃度になるようＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（以下、１％ＦＢＳ−ＤＭＥＭという）、０．２％の濃度になるようＢＳＡを添加したＤＭＥＭ（以下、０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭという）の各培養液に、Ｊ７７４細胞を０．３×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、６．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるよう播種した。次いで、コレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６（関東化学社製，４９１２３−８７）をエタノールで１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解したものを添加し、コレステロール終濃度５０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬの細胞希釈液を調製した。更に、全てのサンプルにＡＣＡＴ（ａｃｙｌ−ＣｏＡ：ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）阻害剤であるＳａｎｄｏｚ ５８−０３５（Ｓｉｇｍａ社製，Ｓ９３１８）を２μｇ／ｍＬの濃度になるよう添加した。各条件で調製した細胞希釈液を２４ｗｅｌｌ培養プレートに０．５ｍＬずつ播き、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間培養したのち、細胞の培養上清を全て除去してＰＢＳで２回洗浄した。各培養条件を表１に示した。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
（１−２）細胞数の計測
上記（１−１）“コレステロールの取込み（１）”で得られたＰＢＳ洗浄後に残存する細胞について、１ｗｅｌｌあたりに残存する細胞数を計測した。
【００１８】
（１−３）ヘキサン−イソプロパノールによる細胞からのコレステロール抽出（１）
上記（１−１）“コレステロールの取込み（１）”で得られたＰＢＳ洗浄後に残存する細胞に、ヘキサンとイソプロパノールを２：１で混合した液（以下、ヘキサン−イソプロパノール抽出液という）を２５０μＬずつ添加し、室温で３０分間静置したのち、細胞をピペッティングして回収した（回収細胞液１）。各ｗｅｌｌに残った細胞にヘキサン−イソプロパノール抽出液を追加で２５０μＬずつ添加して３０分間静置したのち、ピペッティングして回収した（回収細胞液２）。回収細胞液１、回収細胞液２を各々プールして合計５００μＬとした。続いて１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、各サンプルから上清２５μＬずつを回収したものを遠心エバポレーターで乾燥して乾燥サンプルを得た。
【００１９】
（１−４）質量分析による細胞中コレステロール量の測定
上記乾燥サンプルに２０μＬのイソプロパノールを添加して溶解し、そのうち５μＬをＬＣ−ＭＳシステムに注入した。ＬＣ−ＭＳシステムには、ＬａＣｈｒｏｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）、ＵＨＲＳ Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ Ｍａｘｉｓ３Ｇ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）、ＣＯＲＴＥＣＳ ＵＰＬＣ Ｃ１８（１．６μｍ，２．１×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用した。この際、流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度を４０℃とし、アセトニトリルとメタノールを４：１で混合した溶液を移動相に使用してアイソクラティック溶出を行った。質量分析には、ＡＰＣＩ法を用いた。各サンプルの測定値は、１０、５、２、１ｎｇ／ｍＬの濃度にそれぞれ希釈したコレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６のピーク面積から検量線を作成し、１ｗｅｌｌあたりに含まれる細胞中コレステロール量として算出した。なお、上記（１−１）で作製した培養物のうち、細胞生育が不良又はオーバーグロースと判断されたものについては、上記（１−２）〜（１−４）の測定は行わなかった。
【００２０】
（１−５）試験結果（１）
上記（１−２）の“細胞数の計測”の結果を図１に、上記（１−４）の“質量分析による細胞中コレステロール量の測定”の結果を図２にそれぞれ示した。図１によれば、Ｊ７７４細胞の希釈濃度を６．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養液を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ、培養時間を２４時間とすることで、コレステロール取込み後の細胞数が最も多く、細胞生育が良好であることが示された。０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭでは細胞が生育しなかった（データ示さず）。また図２によれば、これと同様の条件において、コレステロール取込み量が最も良好であることが示された。以上より、Ｊ７７４細胞の希釈濃度を６．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養液を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ、培養時間を２４時間とすることが、コレステロール取込み量を高めるうえで望ましいことが明らかとなった。
【００２１】
［実施例２］コレステロール取込みにおける培養条件の選択（２）
（２−１）コレステロールの取込み（２）
Ｊ７７４細胞を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで６．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈したものに、コレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６をエタノールで１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解したものを添加し、コレステロール終濃度５０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬの細胞希釈液をそれぞれ調製した。更に、全てのサンプルにＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬの濃度になるよう添加した。各条件の細胞希釈液を２４ｗｅｌｌ培養プレートに０．５ｍＬずつ播き、２４時間培養した。
【００２２】
（２−２）細胞生存率の計測１回目
上記（２−１）“コレステロールの取込み（２）”で得られた細胞について、トリパンブルーで染色される細胞数と染色されない細胞数の比率から、細胞生存率を計測した。
【００２３】
（２−３）細胞生存率の計測２回目
上記（２−１）“コレステロールの取込み（２）”で得られた細胞の培養上清を全て除去してＰＢＳで２回洗浄したのち、０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭにｃＡＭＰを０．３ｍＭの濃度になるよう希釈したものを０．２５ｍＬずつ添加し、１８時間培養した。次いで、トリパンブルーで染色される細胞数と染色されない細胞数の比率から、細胞生存率を計測した。
【００２４】
（２−４）試験結果（２）
上記（２−２）“細胞生存率の計測１回目”、及び上記（２−３）“細胞生存率の計測２回目”の結果を図３に示す。図３によれば、コレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６を２０μｇ／ｍＬ以上の濃度で添加すると、ｃＡＭＰを添加してから１８時間後には、細胞生存率が５０％以下まで低下することを示している。一方で、コレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６の添加濃度を１０μｇ／ｍＬ以下にすると、ｃＡＭＰ添加１８時間後も、細胞生存率は７０％以上と良好であることを示している。以上より、コレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６の添加濃度を１０μｇ／ｍＬとすることが、細胞状態を良好に保つうえで望ましいことが明らかとなった。
【００２５】
［実施例３］血清検体によるコレステロール引抜き能の測定
（３−１）アポＢ除去血清検体の調製（１）
ＰＥＧ６０００（和光純薬工業社製，１６９−０９１２５）を２００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｐＨ７．４に２０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解したものを、血清検体（３種；検体１、２、３）２００μＬに８０μＬずつ加えて室温で２０分間インキュベートした。次いで、４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上清を回収し、アポＢ除去血清検体を調製した。
【００２６】
（３−２）コレステロールの取込み（３）
Ｊ７７４細胞を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで６．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈したものに、コレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６をエタノールで１０ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解したものを添加して、コレステロール終濃度１０μｇ／ｍＬの細胞希釈液を調製した。更に、全てのサンプルにＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬの濃度になるよう添加した。各条件の細胞希釈液を２４ｗｅｌｌ培養プレートに０．５ｍＬずつ播き、２４時間培養した。
【００２７】
（３−３）血清検体によるコレステロールの引抜き
上記（３−２）“コレステロールの取込み（３）”で得られた培養物から培養上清を全て除去した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄したのち、０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭにｃＡＭＰを０．３ｍＭの濃度になるよう希釈したものを０．２５ｍＬずつ添加し、１８時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”で得られたアポＢ除去血清検体３種（検体１、２、３）のいずれかを０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭでそれぞれ２．０％、１．０％、０．５％、０．２５％の濃度に希釈したものを０．２５ｍＬずつ添加し、２時間培養した。この培養上清を回収した。
【００２８】
（３−４）培養上清からのコレステロール抽出
上記（３−３）“血清検体によるコレステロールの引抜き”で得られた細胞の培養上清各７０μＬに、内部標準試料としてコレステロール（３，４）−13Ｃ2（太陽日酸社製，４８８５８５）をＤＭＥＭで８μｇ／ｍＬに調製したものを１０μＬ（即ちコレステロール（３，４）−13Ｃ2を８０ｎｇ）添加した。次いで、メタノールとクロロホルムを１：２で混合した液を３００μＬ添加し、混合しながら室温で１．５時間インキュベートした。続いて１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離したのち、下層２００μＬの１／８量（２５μＬ）を回収して遠心エバポレーターで乾燥し、乾燥サンプルを得た。
【００２９】
（３−５）質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定
上記（３−４）“培養上清からのコレステロール抽出”で得られた乾燥サンプルに、それぞれ２０μＬのイソプロパノールを添加して溶解した。以降の操作は、上記（１−４）“質量分析による細胞中コレステロール量の測定”と同様にして実施した。なお、培養上清から得られた各サンプルの測定値（培養上清サンプル中（７０μＬ：上記（３−４））における引き抜かれたコレステロールの総量）は、内部標準試料の測定値を用いて下記の補正式から算出した。内部標準試料の測定値は、２０、１０、５、２、１ｎｇ量のコレステロール（３，４）−13Ｃ2のピーク面積から検量線を作成して算出した。下記補正式は、（３−４）で調製した下層１／８量からの乾燥サンプル中に内部標準試料（コレステロール（３，４）−13Ｃ2）が１０ｎｇ（８０ｎｇ×１／８）含まれているという仮定に基づく。
〔補正式〕
培養上清サンプル７０μＬ中における引き抜かれたコレステロールの総量（ｎｇ）
＝Ａ×［１０（ｎｇ）／Ｂ］×８
Ａ：コレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６の測定値（ｎｇ）
Ｂ：内部標準試料（コレステロール（３，４）−13Ｃ2）の測定値（ｎｇ）
【００３０】
（３−６）試験結果（３）
上記（３−５）“質量分析による培養上清中コレステロール量の測定”の結果を図４に示す。図４によれば、３種いずれのアポＢ除去血清検体についても、その添加濃度に依存してコレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６の測定値が上昇している。これは、添加したアポＢ除去血清検体に含まれるＨＤＬ量に依存して、培養上清中に引き抜かれるコレステロール（２，２，３，４，４，６）−Ｄ６の量が増加していることを示している。すなわち、本試験方法によって、ＨＤＬによるコレステロール引抜き能の定量的な評価が可能であることが明らかとなった。
【００３１】
［実施例４］コレステロール測定に対する加水分解処理の効果
（４−１）血清検体によるコレステロールの引抜き（２）
血清検体（１３種）を使用して、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”と同様の手順で、アポＢ除去血清検体を調製した。上記（３−２）“コレステロールの取込み（３）”及び（３−３）“血清検体によるコレステロールの引抜き”と同様の手順で、ただし血清検体を２．８％の濃度に希釈したものを使用して、またコレステロールとしてコレステロール（２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７）−Ｄ７（関東化学社製，４９１２３−８９）を用いて、細胞培養物を得た。該培養物から培養上清を全て回収した。
【００３２】
（４−２）細胞溶解液の調製（１）
培養上清を回収した後残った細胞にＤＮａｓｅ（１０Ｕ／ｍＬ）含有の１％コール酸ナトリウムを２００μＬずつ添加して室温で１時間インキュベートした。
【００３３】
（４−３）コレステロール抽出（加水分解あり）（１）
上記（４−１）“血清検体によるコレステロールの引抜き（２）”で得られた細胞の培養上清、及び（４−２）“細胞溶解液の調製（１）”で得られた細胞溶解液各３０μＬに、８．９ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨ−エタノール（１：９）を３３０μＬずつ加え、５０℃で２時間インキュベートした。次いで、２７０μＬの水、６００μＬのヘキサン、内部標準試料としてコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４（関東化学社製，４９３１７−８６）をＤＭＥＭで３μｇ／ｍＬに調製したものを１０μＬ（即ちコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４を３０ｎｇ）添加した。これを１５分間ボルテックスし、１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心分離して４００μＬのヘキサン層（上層の２／３量）をマイクロチューブに回収して遠心エバポレーターで乾燥し、乾燥サンプルを得た。
【００３４】
（４−４）コレステロール抽出（加水分解なし）（１）
上記（４−１）“血清検体によるコレステロールの引抜き（２）”で得られた細胞の培養上清、及び（４−２）“細胞溶解液の調製（１）”で得られた細胞溶解液各３０μＬに、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＫＯＨ−エタノール（１：１）を６００μＬずつ加えた。次いで、６００μＬのヘキサン、内部標準試料としてコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４をＤＭＥＭで３μｇ／ｍＬに調製したものを１０μＬ（即ちコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４を３０ｎｇ）添加した。これを１０分間ボルテックスし、１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心分離して４００μＬのヘキサン層（上層の２／３量）をマイクロチューブに回収して遠心エバポレーターで乾燥し、乾燥サンプルを得た。
【００３５】
（４−５）質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（２）
上記（４−３）“コレステロール抽出（加水分解あり）（１）”、及び上記（４−４）“コレステロール抽出（加水分解なし）（１）”で得られた各乾燥サンプルに、それぞれ２０μＬのイソプロパノールを添加して溶解した。以降の操作は、上記（１−４）“質量分析による細胞中コレステロール量の測定”と同様にして、コレステロール量の測定を実施した。なお、培養上清及び細胞溶解液よりコレステロール抽出に供した各サンプル３０μＬ中（上記（４−３）及び（４−４））のコレステロール量は、内部標準試料の測定値を用いて下記の補正式から算出した。内部標準試料の測定値は、２０、１０、５、２、１ｎｇ量のコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４のピーク面積から検量線を作成して算出した。下記補正式は、上記（４−３）及び（４−４）で調製したヘキサン層（上層）の２／３量からの乾燥サンプル中に内部標準試料（コレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４）が２０ｎｇ（３０ｎｇ×２／３）含まれているという仮定に基づく。
〔補正式〕
培養上清（又は細胞溶解液）サンプル３０μＬ中のコレステロール量（ｎｇ）
＝Ｃ×［２０（ｎｇ）／Ｄ］×３／２
Ｃ：培養上清（又は細胞溶解液）から得られた乾燥サンプル中のコレステロール（２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７）−Ｄ７の測定値（ｎｇ）
Ｄ：内部標準試料（コレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４）の測定値（ｎｇ）
【００３６】
続いて、上記の補正式によって算出した各サンプル３０μＬ中に含まれるコレステロール量から、１ｗｅｌｌあたりの培養上清中に引き抜かれたコレステロール総量（培養上清測定値Ｇ）、及びコレステロール引き抜き後の１ｗｅｌｌあたりの細胞中に残存するコレステロール総量（細胞測定値Ｈ）を、それぞれ下記の式によって算出した。下記の式は、１ｗｅｌｌあたりの細胞の培養上清（上記（４−１））が２５０μＬ、そして１ｗｅｌｌあたりに添加した１％コール酸ナトリウム（上記（４−２））が２００μＬであることに基づく。
〔培養上清測定値〕Ｇ＝Ｅ×２５０（μＬ）／３０（μＬ）
〔細胞測定値〕Ｈ＝Ｆ×２００（μＬ）／３０（μＬ）
Ｅ：培養上清サンプル３０μＬ中のコレステロール量（ｎｇ）
Ｆ：細胞溶解液サンプル３０μＬ中のコレステロール量（ｎｇ）
【００３７】
次いで、細胞に取り込まれたコレステロール量に対する培養上清中に引き抜かれたコレステロール量の割合（ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値）を以下の式によって算出した。
ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（％）
＝（Ｇ：培養上清測定値）／{（Ｇ：培養上清測定値）＋（Ｈ：細胞測定値）}
【００３８】
（４−６）試験結果（４）
上記（４−５）“質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（２）”で求めたｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の結果を、図５及び図６に示す。図５は、上記（４−３）“コレステロール抽出（加水分解あり）（１）”で得たサンプルのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値をＸ、上記（４−４）“コレステロール抽出（加水分解なし）（１）”で得たサンプルのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値をＹとした、各検体の測定値のプロットを示している。最小二乗法による回帰式：ｙ＝１．０１ｘ、相関係数（ｒ）：０．９０と、両方法間のｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の相関性は良好であった。図６は、調べた１３検体のうちの４検体（検体４、５、６、７）について“加水分解あり”と“加水分解なし”で得られた各ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の比較を示している。図６のとおり、加水分解ありとなしの間でｃ−ｅｆｆｌｕｘ値は同等であった（図中のｐ値はｔ検定の結果を示す（ｎ＝３）。ｐ＜０．０５で有意差なし）。引き抜かれたコレステロールが血清中ＬＣＡＴによりエステル型に転換されることによる測定への影響が懸念されたため、本試験では、サンプル中のコレステロールの加水分解処理の効果を調べた。その結果、加水分解処理をせずとも加水分解処理を施した試験と同等の結果が得られたことから、本試験方法では加水分解処理を省略することができることが明らかとなった。
【００３９】
［実施例５］コレステロール測定に対する内部標準による補正効果
（５−１）血清検体によるコレステロールの引抜き（３）
血清検体（３種；検体５−１、５−２、５−３）を使用して、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”と同様の手順で、アポＢ除去血清検体を調製した。この血清検体を用いて、上記（４−１）と同様の手順で、細胞培養物を得た。該培養物から培養上清を全て回収した。残った細胞を、上記（４−２）“細胞溶解液の調製（１）”と同様に処理して、細胞溶解液を調製した。
【００４０】
（５−２）コレステロール抽出
上記得られた培養上清及び細胞溶解液から、上記（４−４）“コレステロール抽出（加水分解なし）（１）”と同様にしてコレステロールを抽出し、乾燥サンプルを得た。
【００４１】
（５−３）質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（３）
上記（５−２）で得られた各検体について、培養上清及び細胞溶解液中のコレステロール量を、下記の（i）内部標準による補正あり、及び（ii）内部標準による補正なし、のそれぞれの方法で同時測定（ｎ＝５）した。得られたｃ−ｅｆｆｌｕｘ値のＣ．Ｖ．値を（i）及び（ii）の方法毎に算出した。
【００４２】
（i）内部標準による補正あり
上記（４−５）“質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（２）”と同様に補正式を用いてサンプル中のコレステロール量を測定し、培養上清測定値Ｇ、細胞測定値Ｈ、及びｃ−ｅｆｆｌｕｘ値を算出した。
【００４３】
（ii）内部標準による補正なし
上記（４−５）“質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（２）”の手順で、ただし補正式を使用せずにサンプル中のコレステロール量を測定した。次いで、以下のように培養上清測定値Ｋと細胞測定値Ｌをそれぞれ算出した。
〔培養上清測定値〕Ｋ＝Ｉ×３／２×２５０（μＬ）／３０（μＬ）
〔細胞測定値〕Ｌ＝Ｊ×３／２×２００（μＬ）／３０（μＬ）
Ｉ：培養上清から得られた乾燥サンプルのコレステロール（２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７）−Ｄ７の測定値（ｎｇ）
Ｊ：細胞溶解液から得られた乾燥サンプルのコレステロール（２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７）−Ｄ７の測定値（ｎｇ）
※上記Ｉ及びＪは、内部標準試料コレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４の測定値（ｎｇ）による補正を実施していない数値
ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（％）
＝（Ｋ：培養上清測定値）／{（Ｋ：培養上清測定値）＋（Ｌ：細胞測定値）}
【００４４】
（５−４）試験結果（５）
上記（５−３）“質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（３）”で得られた（i）内部標準による補正あり、と（ii）内部標準による補正なし、によるｃ−ｅｆｆｌｕｘ値のＣ．Ｖ．値（ｎ＝５）の結果を、表２に示す。表２によれば、“補正あり”のほうが“補正なし”と比較してＣ．Ｖ．値が明らかに良好であった。すなわち、内部標準による補正を実施することで、より正確なコレステロール量測定が可能なことが明らかとなった。
【００４５】
【表２】
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【００４６】
［実施例６］アポＡ−１及びアポＢ除去血清の添加濃度がコレステロール測定に及ぼす影響
（６−１）血清検体によるコレステロールの引抜き（４）
血清検体（１種）を使用して、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”と同様の手順で、アポＢ除去血清検体を調製した。上記（４−１）と同様の手順で、ただしｃＡＭＰ添加培地と、ｃＡＭＰ非添加の培地の２種を使用して、更に、コレステロール引抜き時のアクセプターとして、アポＢ除去血清検体を０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭで５．６％、２．８％、１．４％、０．７％の４濃度に希釈したものと、精製アポＡ−１（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｊ６４５０６）を１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬの４濃度に希釈したものをそれぞれ使用して、細胞培養物を得た。該培養物から培養上清を全て回収した。残った細胞を用いて、上記（４−２）“細胞溶解液の調製（１）”と同様の手順で、細胞溶解液を調製した。
【００４７】
（６−２）コレステロール抽出（２）
上記で得られた培養上清及び細胞溶解液から、上記（４−４）“コレステロール抽出（加水分解なし）（１）”と同様にしてコレステロールを抽出し、乾燥サンプルを得た。
【００４８】
（６−３）質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（４）
上記（６−２）“コレステロール抽出（２）”で得られた各乾燥サンプルに、それぞれ２０μＬのイソプロパノールを添加して溶解したものを使用して、上記（４−５）“質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（２）”と同様にしてコレステロール測定を実施した。
【００４９】
（６−４）試験結果（６）
測定された各ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の結果を、図７及び図８に示す。図７及び図８によれば、アポＡ−１又はアポＢ除去血清検体の濃度に依存してｃ−ｅｆｆｌｕｘ値が上昇した。アポＡ−１はＨＤＬを構成する成分であり、細胞膜に発現するＡＢＣＡ−１を介してコレステロールを引抜く中心的役割を果たす。したがって本測定方法によってＨＤＬによるコレステロール引抜き能を正しく評価できることが裏付けられた。また、ＡＢＣＡ−１発現を促進する機能を持つｃＡＭＰを添加することでコレステロール引抜き量が増加したことから、本試験で確認したコレステロールの引抜きは、ＡＢＣＡ−１を介した経路を含むことが証明された。
【００５０】
［実施例７］日差再現性
（７−１）血清検体によるコレステロールの引抜き（５）
血清検体（２種;検体７−１、７−２）を使用して、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”と同様の手順で、アポＢ除去血清検体を調製した。この血清検体を用いて、上記（４−１）と同様の手順で、細胞培養物を得た。該培養物から培養上清を全て回収した。残った細胞を、上記（４−２）“細胞溶解液の調製（１）”と同様に処理して、細胞溶解液を調製した。
【００５１】
（７−２）コレステロール抽出（３）
上記で得られた培養上清、及び細胞溶解液を使用して、上記（４−４）“コレステロール抽出（加水分解なし）（１）”と同様にしてコレステロールを抽出し、乾燥サンプルを得た。
【００５２】
（７−３）質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（５）
上記（７−２）“コレステロール抽出（３）”で得られた各乾燥サンプルに、それぞれ２０μＬのイソプロパノールを添加して溶解したものを使用して、上記（４−５）“質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（２）”と同様にしてコレステロール測定を実施した。
【００５３】
（７−４）日差再現性の確認
上記（７−１）〜（７−３）までの試験を、同一検体を使用して試験日を変えて再度実施した。
【００５４】
（７−５）試験結果（７）
上記（７−３）“質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（５）”で得られた各ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の結果（試験２日分）を図９に示す。図９中、ｐ値はt検定の結果を示す（実験１日目：ｎ＝３，  実験２日目：ｎ＝８、ｐ＜０．０５で有意差なし）。本測定方法によって日差再現性が良好なｃ−ｅｆｆｌｕｘ値が得られた。本測定方法によってＨＤＬによるコレステロール引抜き能を正確に評価できることが判明した。
【００５５】
［実施例８］放射性同位体標識されたコレステロールを用いた測定法と本発明の方法との相関性
（８−１）アポＢ除去血清検体の調製
脂質値正常の血清検体（８種）を使用して、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”と同様の手順で、アポＢ除去血清検体を調製した。
【００５６】
（８−２）コレステロールの取込み
Ｊ７７４細胞を１％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで６．０×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈したものに、コレステロール（１，２）−3Ｈ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＮＥＴ１３９）を添加して、コレステロール終濃度２μＣｉ／ｍＬの細胞希釈液を調製した。更に、全てのサンプルにＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬの濃度になるよう添加した。得られた細胞希釈液を２４ｗｅｌｌ培養プレートの各ｗｅｌｌに０．５ｍＬずつ播き、２４時間培養した。
【００５７】
（８−３）血清検体によるコレステロールの引抜き（６）
上記（８−２）で得られた細胞培養物から培養上清を全て除去した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄したのち、ｃＡＭＰを０．３ｍＭ及びＳａ・BR>獅р盾・５８−０３５を２μｇ／ｍＬ含む０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭを０．５ｍＬずつ添加し、１８時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、上記アポＢ除去血清検体８種を０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭでそれぞれ２．８％の濃度に希釈したものを０．５ｍＬずつ添加し、４時間培養した。この培養上清を回収した。
【００５８】
（８−４）ヘキサン−イソプロパノールによる細胞からのコレステロール抽出（３）
上記（８−３）“血清検体によるコレステロールの引抜き（６）”で得られた細胞培養物に、培養上清を全て除去した後、ヘキサン−イソプロパノール抽出液を２５０μＬずつ添加して室温で３０分間静置したのち、細胞をピペッティングして回収した（回収細胞液１）。各ｗｅｌｌに残った細胞にヘキサン−イソプロパノール抽出液を追加で２５０μＬずつ添加して３０分間静置したのち、ピペッティングして回収した（回収細胞液２）。回収細胞液１、回収細胞液２を各々プールして合計５００μＬとし、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、各サンプルから上清１００μＬずつを回収して細胞抽出サンプルとした。
【００５９】
（８−５）培養上清及び細胞中の放射線量の測定
上記（８−３）“血清検体によるコレステロールの引抜き（６）”で得られた培養上清、及び上記（８−４）“ヘキサン−イソプロパノールによる細胞からのコレステロール抽出（３）”で得られた細胞抽出サンプル各１００μＬに、Ｐｉｃо−Ｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，６０１３６９１）を５ｍＬずつ添加し、よく攪拌した後、液体シンチレーションカウンターＴｒｉ−Ｃａｒｂ３１００ＴＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して各サンプル中の放射線量を測定した。得られたＤＰＭ値から、以下の式によって１ｗｅｌｌあたりの培養上清中に引き抜かれたコレステロール分のＤＰＭ値（培養上清測定値Ｏ）、及びコレステロール引き抜き後の１ｗｅｌｌあたりの細胞中に残存するコレステロール分のＤＰＭ値（細胞測定値Ｐ）をそれぞれ算出した。
〔培養上清測定値〕Ｏ＝Ｍ×５００（μＬ）／１００（μＬ）
〔細胞測定値〕Ｐ＝Ｎ×５００（μＬ）／１００（μＬ）
Ｍ：培養上清サンプルから得られた測定値（ＤＰＭ）
Ｎ：細胞抽出サンプルから得られた測定値（ＤＰＭ）
【００６０】
次に、細胞に取り込まれたコレステロール量に対する培養上清中に引き抜かれたコレステロール量の割合（ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値）を以下の式によって算出した。
ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（％）
＝（Ｏ：培養上清測定値）／{（Ｏ：培養上清測定値）＋（Ｐ：細胞測定値）}
【００６１】
（８−６）安定同位体標識されたコレステロールの引抜き能の測定（１）
上記［実施例４］の（４−１）〜（４−５）と同様の方法を実施し、上記（８−１）で調製したアポＢ除去血清検体８種について、ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値を得た。但し本試験では、（４−３）“コレステロール抽出（加水分解あり）（１）”を実施せず、“加水分解なし”で得られた乾燥サンプルのみ測定を行った。
【００６２】
（８−７）試験結果（８）
上記（８−５）及び（８−６）の各試験で得られたｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の関係を、図１０に示す。図１０は、上記（８−５）で得た各検体サンプルのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値をＸ、上記（８−６）で得た各検体サンプルのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値をＹとして、各検体をプロットしている。最小二乗法による回帰式はｙ＝０．７４ｘ＋２．８、相関係数（ｒ）は０．７５で、両方法間のｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の相関性は良好であった。すなわち、本発明によるコレステロール引抜き能の測定方法では、放射性同位体標識されたコレステロールを用いた測定法と良好に相関が得られることが判明した。
【００６３】
［実施例９］蛍光標識されたコレステロールを用いた測定法と本発明の方法との相関性
（９−１）アポＢ除去血清検体の調製
脂質値正常の血清検体（８種）を使用して、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”と同様の手順で、アポＢ除去血清検体を調製した。
【００６４】
（９−２）コレステロールの取込み
Ｊ７７４細胞を１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈したものを４８ｗｅｌｌ培養プレートに０．５ｍＬずつ播き、２４時間培養した。次いで、培養上清を全て除去して、残った細胞を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＭＥＭ（ｐＨ７．４）で洗浄したのち、超音波処理でエタノールに溶解したＴｏｐＦｌｕｏｒ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ（ＣＡＳ番号８７８５５７−１９−８、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製，８１０２５５）を、Ｓａｎｄｏｚ ５８−０３５を含む０．２％ＢＳＡ，１％ＦＣＳ−ＤＭＥＭに濃度２５μｍｏｌ／Ｌとなるよう希釈したものを、０．２５ｍＬずつ添加して、１時間培養した。
【００６５】
（９−３）血清検体によるコレステロールの引抜き（７）
上記（９−２）で得られた細胞培養物から培養上清を全て除去した。残った細胞を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＭＥＭ（ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ｃＡＭＰを０．３ｍＭ及びＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬ含む０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭを２５０μＬずつ添加し、１６時間培養した。次いで、細胞を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＭＥＭ（ｐＨ７．４）で２回洗浄後、上記アポＢ除去血清検体８種を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＭＥＭ（ｐＨ７．４）でそれぞれ２．８％の濃度に希釈したものを２５０μＬずつ添加し、４時間培養した。この培養上清を回収した。
【００６６】
（９−４）細胞溶解液の調製（５）
上記（９−３）で得られた細胞培養物から上清を全て除き、残存する細胞に１％コール酸ナトリウム水溶液を２００μＬずつ添加して室温で４時間インキュベートし、細胞溶解液を調製した。
【００６７】
（９−５）培養上清及び細胞中の蛍光強度の測定
上記（９−３）“血清検体によるコレステロールの引抜き（７）”で得られた培養上清、及び上記（９−４）“細胞溶解液の調製（５）”で得られた細胞溶解液をサンプルとし、それぞれ９６ｗｅｌｌ蛍光測定用プレートの各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した後、蛍光プレートリーダーＩＮＦＩＮＩＴＥ  Ｆ  ＰＬＥＸ（ＴＥＣＡＮ）を使用して各サンプル中の蛍光強度を測定した（励起波長４８５ｎｍ、検出波長５３５ｎｍ）。得られた蛍光強度から、以下の式によって１ｗｅｌｌあたりの培養上清中に引き抜かれたコレステロール分の蛍光強度（培養上清測定値Ｓ）、及びコレステロール引き抜き後の１ｗｅｌｌあたりの細胞中に残存するコレステロール分の蛍光強度（細胞測定値Ｔ）をそれぞれ算出した。
〔培養上清測定値〕Ｓ＝Ｑ×２５０（μＬ）／１００（μＬ）
〔細胞測定値〕Ｔ＝Ｒ×２００（μＬ）／１００（μＬ）
Ｑ：培養上清サンプルから得られた測定値（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）
Ｒ：細胞溶解液サンプルから得られた測定値（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）
【００６８】
次に、細胞に取り込まれたコレステロール量に対する培養上清中に引き抜かれたコレステロール量の割合（ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値）を以下の式によって算出した。
ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（％）
＝（Ｓ：培養上清測定値）／{（Ｓ：培養上清測定値）＋（Ｔ：細胞測定値）}
【００６９】
（９−６）安定同位体標識されたコレステロールの引抜き能の測定（２）
上記［実施例４］の（４−１）〜（４−５）と同様の方法を実施し、上記（９−１）で調製したアポＢ除去血清検体８種について、ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値を得た。但し本試験では、（４−３）“コレステロール抽出（加水分解あり）（１）”を実施せず、“加水分解なし”で得られた乾燥サンプルのみ測定を行った。
【００７０】
（９−７）試験結果（９）
上記（９−５）及び（９−６）の各試験で得られたｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の関係を、図１１に示す。図１１は、上記（９−５）で得た各サンプルのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値をＸ、上記（９−６）で得た各サンプルのｃ−ｅｆｆｌｕｘ値をＹとして、各検体をプロットしている。最小二乗法による回帰式はｙ＝０．２３ｘ＋２．３、相関係数（ｒ）は０．７２で、両方法間のｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の相関性は良好であった。すなわち、本発明によるコレステロール引抜き能の測定方法では、蛍光標識されたコレステロールを用いた測定法と良好に相関が得られることが確認された。また、本発明の方法であれば、コレステロールの加水分解処理なしで信頼性あるｃ−ｅｆｆｌｕｘ値を得ることが可能であることが再確認された。
【００７１】
［実施例１０］４１検体測定による各測定法間の相関性
（１０−１）アポＢ除去血清検体の調製
脂質値正常の血清検体（４１種）を使用して、上記（３−１）“アポＢ除去血清検体の調製（１）”と同様の手順で、アポＢ除去血清検体を調製した。
【００７２】
（１０−２）安定同位体標識されたコレステロールの引抜き能の測定（３）
（１０−２−１）コレステロールの取込み
上記（３−２）“コレステロールの取込み（３）”と同様の手順で、ただしコレステロールとしてコレステロール（２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７）−Ｄ７（関東化学社製，４９１２３−８９）を用いて、細胞培養物を得た。
【００７３】
（１０−２−２）血清検体によるコレステロールの引抜き（８）
上記（１０−２−１）“コレステロールの取込み”で得られた細胞培養物から培養上清を全て除去した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄したのち、ｃＡＭＰを０．３ｍＭ及びＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬ含む０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭを０．５ｍＬずつ添加し、１８時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、上記アポＢ除去血清検体４１種のいずれかを２．８％含む０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭを２５０μＬ添加し、４時間培養した。
【００７４】
（１０−２−３）細胞溶解液の調製（６）
上記（１０−２−１）“コレステロールの取込み”で得られた細胞培養物から培養上清を全て除去した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄したのち、ｃＡＭＰを０．３ｍＭ及びＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬ含む０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭを０．５ｍＬずつ添加し、１８時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄後、ＤＮａｓｅ（１０Ｕ／ｍＬ）含有の１％コール酸ナトリウムを２００μＬずつ添加して室温で１時間インキュベートした（すなわち、アクプター非添加の細胞を用いて細胞溶解液を調製した）。
【００７５】
（１０−２−４）コレステロール抽出
上記（１０−２−２）“血清検体によるコレステロールの引抜き（８）”で得られた細胞の培養上清、及び（１０−２−３）“細胞溶解液の調製（６）”で得られた細胞溶解液各３０μＬに、水−メタノール（５：１８）を２３０μＬずつ加えた。次いで、３６０μＬのクロロホルム、内部標準試料としてコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４をＤＭＥＭで１２μｇ／ｍＬに調製したものを１０μＬ（即ちコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４を１２０ｎｇ）添加した。これを５分間ボルテックスし、１２，０００ｒｐｍ、４℃で５分遠心分離して１２０μＬのクロロホルム層（下層の２／７量）をマイクロチューブに回収して遠心エバポレーターで乾燥し、乾燥サンプルを得た。
【００７６】
（１０−２−５）質量分析による培養上清及び細胞中コレステロール量の測定（６）
上記（１０−２−４）“コレステロール抽出”で得られた各乾燥サンプルに、それぞれ２０μＬのイソプロパノールを添加して溶解した。以降の操作は、上記（１−４）“質量分析による細胞中コレステロール量の測定”と同様にして実施した。なお、培養上清及び細胞溶解液よりコレステロール抽出に供した各サンプル３０μＬ中（上記（１０−２−４））のコレステロール量は、内部標準試料の測定値を用いて下記の補正式から算出した。内部標準試料の測定値は、２０、１０、５、２、１ｎｇ量のコレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４のピーク面積から検量線を作成して算出した。下記補正式は、上記（１０−２−４）で調製したクロロホルム層（下層）の２／７量からの乾燥サンプル中に内部標準試料（コレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４）が３４ｎｇ（１２０ｎｇ×２／７）含まれているという仮定に基づく。
〔補正式〕
培養上清（又は細胞溶解液）サンプル３０μＬ中のコレステロール量（ｎｇ）
＝Ｕ×［３４（ｎｇ）／Ｖ］×７／２
Ｕ：培養上清（又は細胞溶解液）から得られた乾燥サンプルのコレステロール（２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７）−Ｄ７の測定値（ｎｇ）
Ｖ：内部標準試料コレステロール（２５，２６，２６，２６）−Ｄ４の測定値（ｎｇ）
【００７７】
続いて、上記の補正式によって算出した各サンプル３０μＬ中に含まれるコレステロール量から、１ｗｅｌｌあたりの培養上清中に引き抜かれたコレステロール総量（培養上清測定値）、及びコレステロール引き抜き前の１ｗｅｌｌあたりの細胞中に取り込まれているコレステロール総量（細胞測定値）を、それぞれ下記の式によって算出した。下記の式は、１ｗｅｌｌあたりの細胞の培養上清が２５０μＬ（上記（１０−２−２））、そして１ｗｅｌｌあたりに添加した１％コール酸ナトリウムが２００μＬ（上記（１０−２−３））であることに基づく。
〔培養上清測定値〕
Ｙ＝Ｗ×２５０（μＬ）／３０（μＬ）
〔細胞測定値〕
Ｚ＝Ｘ×２００（μＬ）／３０（μＬ）
Ｗ：培養上清サンプル３０μＬ中のコレステロール量（ｎｇ）
Ｘ：細胞溶解液サンプル３０μＬ中のコレステロール量（ｎｇ）
最後に、細胞に取り込まれたコレステロール量に対する培養上清中に引き抜かれたコレステロール量の割合を、ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値として以下の式によって算出した。
〔ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（％）〕
＝（Ｙ：培養上清測定値）／（Ｚ：細胞測定値）
【００７８】
（１０−３）放射性同位体標識されたコレステロールの引抜き能の測定
（１０−３−１）コレステロールの取込み
上記（８−２）“コレステロールの取込み”と同様の手順を実施した。
【００７９】
（１０−３−２）血清検体によるコレステロールの引抜き（９）
上記（１０−１）“アポＢ除去血清検体の調製”で調製したアポＢ除去血清検体を使用して、上記（８−３）“血清検体によるコレステロールの引抜き（６）”と同様の手順を実施した。
【００８０】
（１０−３−３）ヘキサン−イソプロパノールによる細胞からのコレステロール抽出（４）
（１０−３−１）“コレステロールの取込み”で得られた細胞培養物から培養上清を全て除去した。残った細胞をＰＢＳで２回洗浄したのち、ｃＡＭＰを０．３ｍＭ及びＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬ含む０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭを０．５ｍＬずつ添加し、１８時間培養した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄してヘキサン−イソプロパノール抽出液を２５０μＬずつ添加した。次いで室温で３０分間静置したのち、細胞をピペッティングして回収した（回収細胞液１）。各ｗｅｌｌに残った細胞にヘキサン−イソプロパノール抽出液を追加で２５０μＬずつ添加して３０分間静置したのち、ピペッティングして回収した（回収細胞液２）。回収細胞液１、回収細胞液２を各々プールして合計５００μＬとし、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、各サンプルから上清１００μＬずつを回収して細胞抽出サンプルとした（すなわち、アクプター非添加の細胞を用いて細胞抽出サンプルを調製した）。
【００８１】
（１０−３−４）培養上清及び細胞中の放射線量の測定（２）
上記（１０−３−２）“血清検体によるコレステロールの引抜き（９）”で得られた細胞培養物の培養上清、及び上記（１０−３−３）“ヘキサン−イソプロパノールによる細胞からのコレステロール抽出（４）”で得られた細胞抽出サンプル各１００μＬに、Ｐｉｃо−Ｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，６０１３６９１）を５ｍＬずつ添加し、よく攪拌した後、液体シンチレーションカウンターＴｒｉ−Ｃａｒｂ３１００ＴＲ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して各サンプル中の放射線量を測定した。得られたＤＰＭ値から、以下の式によって１ｗｅｌｌあたりの培養上清中に引き抜かれたコレステロール分のＤＰＭ値（培養上清測定値）、及びコレステロール引き抜き前の１ｗｅｌｌあたりの細胞中に取り込まれているコレステロール分のＤＰＭ値（細胞測定値）をそれぞれ算出した。
〔培養上清測定値〕
Ｃ２＝Ａ２×５００（μＬ）／１００（μＬ）
〔細胞測定値〕
Ｄ２＝Ｂ２×５００（μＬ）／１００（μＬ）
Ａ２：培養上清サンプルから得られた測定値（ＤＰＭ）
Ｂ２：細胞抽出サンプルから得られた測定値（ＤＰＭ）
次に、細胞に取り込まれたコレステロール量に対する培養上清中に引き抜かれたコレステロール量の割合を、ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値として以下の式によって算出した。
〔ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（％）〕
＝（Ｃ２：培養上清測定値）／（Ｄ２：細胞測定値）
【００８２】
（１０−４）蛍光標識されたコレステロールの引抜き能の測定
（１０−４−１）コレステロールの取込み
上記（９−２）“コレステロールの取込み”と同様の手順を実施した。
【００８３】
（１０−４−２）血清検体によるコレステロールの引抜き（１０）
上記（１０−１）“アポＢ除去血清検体の調製”で調製したアポＢ除去血清検体を使用して、上記（９−３）“血清検体によるコレステロールの引抜き（７）”と同様の手順を実施した。
【００８４】
（１０−４−３）細胞溶解液の調製（７）
（１０−４−１）“コレステロールの取込み”で得られた細胞培養物から培養上清を全て除去した。残った細胞を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＭＥＭ（ｐＨ７．４）で洗浄したのち、ｃＡＭＰを０．３ｍＭ及びＳａｎｄｏｚ ５８−０３５を２μｇ／ｍＬ含む０．２％ＢＳＡ−ＤＭＥＭを２５０μＬずつ添加し、１６時間培養した。次いで、細胞を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＭＥＭ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、１％コール酸ナトリウムを２００μＬずつ添加して室温で４時間インキュベートした（すなわち、アクプター非添加の細胞を用いて細胞溶解液を調製した）。
【００８５】
（１０−４−４）培養上清及び細胞中の蛍光強度の測定（２）
上記（１０−４−２）“血清検体によるコレステロールの引抜き（１０）”で得られた細胞培養物の培養上清、及び上記（１０−４−３）“細胞溶解液の調製（７）”で得られた細胞溶解液をサンプルとし、それぞれ９６ｗｅｌｌ蛍光測定用プレートの各ｗｅｌｌに１００μＬずつ添加した後、蛍光プレートリーダーＩＮＦＩＮＩＴＥ  Ｆ  ＰＬＥＸ（ＴＥＣＡＮ）を使用して各サンプル中の蛍光強度を測定した（励起波長４８５ｎｍ、検出波長５３５ｎｍ）。得られた蛍光強度から、以下の式によって１ｗｅｌｌあたりの培養上清中に引き抜かれたコレステロール分の蛍光強度（培養上清測定値）、及びコレステロール引き抜き前の１ｗｅｌｌあたりの細胞中に取り込まれているコレステロール分の蛍光強度（細胞測定値）をそれぞれ算出した。
〔培養上清測定値〕
Ｇ２＝Ｅ２×２５０（μＬ）／１００（μＬ）
〔細胞測定値〕
Ｈ２＝Ｆ２×２００（μＬ）／１００（μＬ）
Ｅ２：培養上清サンプルから得られた測定値（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）
Ｆ２：細胞溶解液サンプルから得られた測定値（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）
次に、細胞に取り込まれたコレステロール量に対する培養上清中に引き抜かれたコレステロール量の割合を、ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値として以下の式によって算出した。
〔ｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（％）〕
＝（Ｇ２：培養上清測定値）／（Ｈ２：細胞測定値）
【００８６】
（１０−５）試験結果（１０）
上記（１０−２）“安定同位体標識されたコレステロールの引抜き能の測定（３）”、（１０−３）“放射性同位体標識されたコレステロールの引抜き能の測定”、ならびに（１０−４）“蛍光標識されたコレステロールの引抜き能の測定”の各試験で得られたｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の相関を図１２に示す。４１検体について、図１２（Ａ）は、上記（１０−３）で得たｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（Ｘ軸）と、上記（１０−２）で得たｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（Ｙ軸）についてのプロットを示し、図１２（Ｂ）は、上記（１０−４）で得たｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（Ｘ軸）と、上記（１０−２）で得たｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（Ｙ軸）についてのプロットを示し、図１２（Ｃ）は、上記（１０−３）で得たｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（Ｘ軸）と、上記（１０−４）で得たｃ−ｅｆｆｌｕｘ値（Ｙ軸）についてのプロットを示す。（Ａ）では、最小二乗法による回帰式：ｙ＝０．９４ｘ＋１．２、相関係数（ｒ）：０．７３と、両方法間のｃ−ｅｆｆｌｕｘ値の相関性は良好であった。一方（Ｂ）では、回帰式：ｙ＝０．２８ｘ＋３．２、相関係数（ｒ）：０．４７、また（Ｃ）では、回帰式：ｙ＝１．２ｘ＋１３、相関係数（ｒ）：０．５５と、いずれの場合でも（Ａ）と比較して良好な相関性は得られなかった。この結果から、本発明の方法であれば、従来の蛍光色素を標識物質として使用した方法以上に、ゴールドスタンダートといわれている放射性同位体を標識物質として使用した方法との相関性が高い結果が得られることを確認した。
【００８７】
本試験では、上述の［実施例８］及び［実施例９］（検体数８）と比べてより多くの検体数（４１種）を使用したことから、統計学的な信頼性がより高い結果が得られたといえる。尚、蛍光色素を標識物質として使用した方法が、他法との相関性が比較的低かったのは、使用した標識コレステロール全体としての化学構造の違いに起因する可能性が考えられる。すなわち、蛍光標識コレステロールは、天然型コレステロールと化学構造が異なることから、細胞膜やアクセプター（血清検体中のＨＤＬ等）との親和性も天然型コレステロールとは異なると考えられる。その一方で、安定同位体で標識されたコレステロールは、放射性同位体で標識されたコレステロールと同様に、天然型コレステロールと同一の構造を有している。これにより、両者間で同等性の高いコレステロール引抜き能の評価をすることが可能となったと考えられる。従って、本発明の方法は、放射性同位体を使用できない臨床検査施設や研究施設においても使用可能な、放射性同位体を用いた方法の代替法として有用である。本発明の方法は、ＨＤＬの代謝や機能に関する研究に大いに役立つものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019045079.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
2019045079.tif 000015
【国際調査報告】
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2019045079.tif 000017
2019045079.tif 000018
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