(57)【要約】  本発明の目的は、光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸の製造を可能にする新規酵素タンパク質を提供することにある。本発明は、２種類のヘテロな（異なる）サブユニットにより構成されていることを特徴とする、モノオキシゲナーゼを提供することにより、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種類のヘテロなサブユニットにより構成されていることを特徴とする、モノオキシゲナーゼ。
【請求項２】
α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を、β−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応を触媒することを特徴とする、請求項１に記載のモノオキシゲナーゼ。
【請求項３】
上記α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸が、以下の式（１）：
【化１】
2018181774.tif 000019
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはＣＨ３である。）
で示される化合物であり、
上記β−ヒドロキシアミノ酸が、以下の式（２）：
【化２】
2018181774.tif 000020
（式中、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素またはＣＨ３である。）
で示される化合物であることを特徴とする、請求項２に記載のモノオキシゲナーゼ。
【請求項４】
以下の式（３）〜（７）で示される、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸をβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応の少なくとも一つ以上の反応を触媒することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノオキシゲナーゼ：
式（３）
【化３】
2018181774.tif 000021
；式（４）
【化４】
2018181774.tif 000022
；式（５）
【化５】
2018181774.tif 000023
；式（６）
【化６】
2018181774.tif 000024
；式（７）
【化７】
2018181774.tif 000025
【請求項５】
上記２種類のヘテロなサブユニットを、それぞれαサブユニット、βサブユニットとすると、
αサブユニットが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質を含み、
βサブユニットが、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノオキシゲナーゼ：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｇ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号７に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノオキシゲナーゼと、電子伝達系タンパク質とを含むことを特徴とする、β−ヒドロキシアミノ酸を製造するためのモノオキシゲナーゼ反応システム。
【請求項７】
上記電子伝達系タンパク質が、以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質、および以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることを特徴とする、請求項６に記載のモノオキシゲナーゼ反応システム：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｌ）配列番号８に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｍ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｎ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｏ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｐ）配列番号９に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするモノオキシゲナーゼ遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の遺伝子または請求項９に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
さらに、以下に示す遺伝子を含む、請求項１０に記載の形質転換体：
（１）電子伝達系タンパク質をコードする遺伝子、および／または
（２）トランスポータータンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
上記電子伝達系タンパク質が、以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質、および
以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることを特徴とする、請求項１１に記載の形質転換体：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｌ）配列番号８に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｍ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｎ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｏ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｐ）配列番号９に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。
【請求項１３】
上記トランスポータータンパク質が、以下の（ｑ）〜（ｔ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の形質転換体：
（ｑ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｒ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トランスポーター活性を有するタンパク質；
（ｓ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、トランスポーター活性を有するタンパク質；
（ｔ）配列番号１０に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。
【請求項１４】
上記形質転換体が、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌であることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の形質転換体を、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を含む培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、β‐ヒドロキシアミノ酸の製造方法。
【請求項１６】
上記形質転換体に含まれる請求項８に記載の遺伝子が、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属由来であることを特徴とする、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）  Ｃ３１−０６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３７０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規モノオキシゲナーゼ、およびそれをコードする遺伝子、ならびにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なα，α−２置換アミノ酸は、ペプチダーゼに対する安定性を高めるため、ペプチド医薬品のビルディングブロックとして期待されている（非特許文献１）。【０００３】
光学活性なα，α−２置換アミノ酸の製造方法として、例えば、非特許文献２には、不斉相関移動触媒を用いた不斉アルキル化反応による光学活性なα，α−２置換アミノ酸の製造方法が記載されている。また、特許文献１には、Ｌ−アラニンとホルムアルデヒドとを原料とした酵素反応により、α−メチル−Ｌ−セリンを合成する反応が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４８７７２２７号公報（２０１２年２月１５日公開）
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Claudio Mapelli et al., J. Med. Chem., 2009, 52, 7788-7799.
【非特許文献２】Takashi Ooi et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 5139-5151
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献２の方法では、光学活性なα，α−２置換アミノ酸が得られるものの、保護基の導入、反応後の脱保護の工程等の複雑な工程を要するという問題がある。また、特許文献１の方法では、保護基を要しない製法であるものの、Ｌ体であるα−メチル−Ｌ−セリンしか合成できず、その光学異性体であるα−メチル−Ｄ−セリンを合成することはできない。【０００７】
したがって、光学活性なα，α−２置換アミノ酸、例えば、光学活性α−メチル−Ｄ−セリンを簡便かつ効率的に製造するための改良された方法が求められていた。【０００８】
上記の事情に鑑み、本発明の目的は、光学活性なα，α−２置換アミノ酸を含むβ−ヒドロキシアミノ酸、例えば、α−メチル−Ｄ−セリンの製造を可能にする新規酵素タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、自然界において、２−アミノイソ酪酸を光学活性なα−メチル−Ｄ−セリンに変換する能力を有する微生物を見出し、単離することに成功した。また、上記微生物のプロテオーム解析およびそれに関連する各種解析により、２−アミノイソ酪酸をα−メチル−Ｄ−セリンに変換する新規モノオキシゲナーゼの同定に成功した。さらに、同定した新規モノオキシゲナーゼについて詳細な解析を進めたところ、上記モノオキシゲナーゼが、Ｌ−イソバリン、Ｄ−イソバリン、Ｌ−アミノブチレート、Ｄ−アミノブチレート等を基質として用いた場合にも、光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明の一態様は、以下の発明を包含するものである。【００１０】
〔１〕２種類のヘテロなサブユニットにより構成されていることを特徴とする、モノオキシゲナーゼ。【００１１】
〔２〕α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を、β−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応を触媒することを特徴とする、〔１〕に記載のモノオキシゲナーゼ。【００１２】
〔３〕上記α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸が、以下の式（１）：【００１３】
【化１】
2018181774.tif 000002
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはＣＨ３である。）
で示される化合物であり、
上記β−ヒドロキシアミノ酸が、以下の式（２）：【００１４】
【化２】
2018181774.tif 000003
（式中、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素またはＣＨ３である。）
で示される化合物であることを特徴とする、〔２〕に記載のモノオキシゲナーゼ。【００１５】
〔４〕以下の式（３）〜（７）で示される、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸をβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応の少なくとも一つ以上の反応を触媒することを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のモノオキシゲナーゼ：
式（３）
【化３】
2018181774.tif 000004
；式（４）
【化４】
2018181774.tif 000005
；式（５）
【化５】
2018181774.tif 000006
；式（６）
【化６】
2018181774.tif 000007
；式（７）【００１６】
【化７】
2018181774.tif 000008
〔５〕上記２種類のヘテロなサブユニットを、それぞれαサブユニット、βサブユニットとすると、
αサブユニットが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質を含み、
βサブユニットが、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質を含むことを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のモノオキシゲナーゼ：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｇ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号７に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。【００１７】
〔６〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のモノオキシゲナーゼと、電子伝達系タンパク質とを含むことを特徴とする、β−ヒドロキシアミノ酸を製造するためのモノオキシゲナーゼ反応システム。【００１８】
〔７〕上記電子伝達系タンパク質が、以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質、および以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることを特徴とする、〔６〕に記載のモノオキシゲナーゼ反応システム：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｌ）配列番号８に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｍ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｎ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｏ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｐ）配列番号９に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。【００１９】
〔８〕〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のタンパク質をコードするモノオキシゲナーゼ遺伝子。【００２０】
〔９〕〔８〕に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター。【００２１】
〔１０〕〔８〕に記載の遺伝子または〔９〕に記載の組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換体。【００２２】
〔１１〕
さらに、以下に示す遺伝子を含む、〔１０〕に記載の形質転換体：
（１）電子伝達系タンパク質をコードする遺伝子、および／または
（２）トランスポータータンパク質をコードする遺伝子。【００２３】
〔１２〕上記電子伝達系タンパク質が、以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質、および
以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることを特徴とする、〔１１〕に記載の形質転換体：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｌ）配列番号８に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｍ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｎ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｏ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｐ）配列番号９に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。【００２４】
〔１３〕上記トランスポータータンパク質が、以下の（ｑ）〜（ｔ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることを特徴とする、〔１１〕または〔１２〕に記載の形質転換体：
（ｑ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｒ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トランスポーター活性を有するタンパク質；
（ｓ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、トランスポーター活性を有するタンパク質；
（ｔ）配列番号１０に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。【００２５】
〔１４〕上記形質転換体が、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌であることを特徴とする、〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の形質転換体。【００２６】
〔１５〕〔１０〕〜〔１４〕のいずれかに記載の形質転換体を、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を含む培地中で培養する工程を含むことを特徴とする、β‐ヒドロキシアミノ酸の製造方法。【００２７】
〔１６〕上記形質転換体に含まれる〔８〕に記載の遺伝子が、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属由来であることを特徴とする、〔１５〕に記載の製造方法。【００２８】
〔１７〕ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）  Ｃ３１−０６株（受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３７０）。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の一態様によれば、保護基の導入や脱保護の工程を要することなく、簡便かつ効率的に、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸をβ−ヒドロキシアミノ酸に変換することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態にて存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は化学的に合成してもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）を変更してもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。
【００３２】
また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００３３】
＜１．モノオキシゲナーゼ＞
本発明の一実施形態において、少なくとも２種類のヘテロな（異なる）サブユニットにより構成されているモノオキシゲナーゼ（換言すれば、２種類以上の異なるサブユニットより構成されるヘテロモノオキシゲナーゼ）を提供する。
【００３４】
モノオキシゲナーゼは、酸化酵素の一種であり、酸素１原子を基質へ導入する酵素である。従来知られていたモノオキシゲナーゼは、その大部分が、構造の観点から単一の酵素として機能するものであり、本発明の一実施形態におけるような複合体（ヘテロなサブユニット）により構成されるモノオキシゲナーゼは、知られていなかった。したがって、上記構造を有する本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼの発見は、驚くべきことであり、従来のモノオキシゲナーゼでは不可能あるいは反応性の低かった反応をも触媒することが可能となる。それ故、本発明の一実施形態では、従来にはなかった新規かつ有用なモノオキシゲナーゼを提供するものである。
【００３５】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、２種類のヘテロな（異なる）サブユニットにより構成されていることが好ましい。サブユニットの数は、他のサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有する限り特段限定されず、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ等であり得る。
【００３６】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼの各サブユニットの構造は、他のサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有する限り特段限定されず、例えば、モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー等で構成されていてもよい。また、本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、モノオキシゲナーゼ活性が生じる限りにおいて、上記のようなサブユニットを含むヘテロダイマー、ヘテロトリマー、ヘテロテトラマー、ヘテロペンタマー、ヘテロヘキサマー等で構成されていてもよい。
【００３７】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、上記で示される特徴的な構成を有している限り、その細部においては、適宜変更が可能である。当然ながら、そのような細部を変更したモノオキシゲナーゼも、本願発明の範囲に含まれる。
【００３８】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼの由来は、菌類、例えば、放線菌であり、例えば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属等が挙げられる。好ましくは、上記モノオキシゲナーゼは、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア  グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）由来であり、より好ましくはロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）由来である。
【００３９】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、後述する実施例で示した通り、ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）Ｃ３１−０６株より取得された。ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）Ｃ３１−０６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、寄託者：国立大学法人京都大学大学院農学研究科  日比 慎（６０６−８５０２ 京都府京都市左京区北白川追分町）、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３７０（寄託日（国内寄託日）：２０１６年１０月６日、移管日：２０１８年３月１２日、国内寄託受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２３７０より移管）として寄託されている。よって、本発明は、当該ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）Ｃ３１−０６株をも提供する。
【００４０】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応を触媒することができる。すなわち、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応を触媒することができるモノオキシゲナーゼ、好ましくは、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応を触媒することができるロドコッカス属由来のモノオキシゲナーゼも、本発明の別の好ましい一実施形態である。
【００４１】
本明細書において「α−アミノ酸」は、アミノ酸のα位が一置換されたアミノ酸を意味する。本実施形態におけるα−アミノ酸としては、例えば、Ｌ−アミノブチレート、Ｄ−アミノブチレート等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書において「α，α−２置換アミノ酸」は、アミノ酸のα位が二置換されたアミノ酸を意味する。本実施形態におけるα，α−２置換アミノ酸としては、例えば、２−アミノイソ酪酸、Ｌ−イソバリン、Ｄ−イソバリン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書において「β−ヒドロキシアミノ酸」は、アミノ酸のβ位が水酸化されたアミノ酸を意味し、本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼにより、α−アミノ酸、α，α−２置換アミノ酸等の基質が光学的な活性を有するに至ったアミノ酸であれば特段限定されない。本実施形態におけるβ−ヒドロキシアミノ酸としては、例えば、α−メチル−Ｄ−セリン、（２Ｓ，３Ｓ）−２−メチルスレオニン、（２Ｒ，３Ｒ）−２−メチルスレオニン、Ｌ−アロ−スレオニン、Ｄ−アロ−スレオニン等が挙げられる。本明細書において「光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸」なる用語は、「β−ヒドロキシアミノ酸」と同義として用いられる。
【００４４】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸のβ位の水酸化を触媒することにより、β−ヒドロキシアミノ酸に変換すると想定される。このような作用機序により、上記モノオキシゲナーゼによって光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸に変換されるものであれば、α−アミノ酸、α，α−２置換アミノ酸およびβ−ヒドロキシアミノ酸は任意のものであってよい。
【００４５】
本発明の一実施形態において、モノオキシゲナーゼにより、β−ヒドロキシアミノ酸に変換されるα−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸は、以下の式（１）で示される化合物であることが好ましい：
【００４６】
【化８】
2018181774.tif 000009
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素またはアルキル基である。）。
【００４７】
上記Ｒ１がアルキル基である場合、その炭素数は、１〜５個であってもよく、好ましくは、１〜３個であり、より好ましくは、１個である。また、上記Ｒ１がアルキル基である場合、アルキル基は、直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれであってもよく、好ましくは、直鎖状であり得る。
【００４８】
上記Ｒ２がアルキル基である場合、上記Ｒ１と同様である。
【００４９】
なお、式中＊は、不斉炭素原子であっても、不斉炭素原子でなくてもよい。
【００５０】
また、本発明の一実施形態において、モノオキシゲナーゼにより、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸から変換されるβ−ヒドロキシアミノ酸は、以下の式（２）で示される化合物であることが好ましい：
【００５１】
【化９】
2018181774.tif 000010
（式中、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、水素またはアルキル基である。）。
【００５２】
上記Ｒ３がアルキル基である場合、その炭素数は、１〜５個であってもよく、好ましくは、１〜３個であり、より好ましくは、１個である。また、上記Ｒ３がアルキル基である場合、アルキル基は、直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれであってもよく、好ましくは、直鎖状であり得る。
【００５３】
上記Ｒ４がアルキル基である場合、上記Ｒ３と同様である。
【００５４】
なお、式中＊は、不斉炭素原子であっても、不斉炭素原子でなくてもよく、好ましくは＊のいずれか、より好ましくは＊の両方は、不斉炭素原子であり得る。
【００５５】
本発明の一実施形態において、以下の式（３）〜（７）で示される、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応の少なくとも一つ以上の反応を触媒するモノオキシゲナーゼが好ましい：
式（３）
【化１０】
2018181774.tif 000011
；式（４）
【化１１】
2018181774.tif 000012
；式（５）
【化１２】
2018181774.tif 000013
；式（６）
【化１３】
2018181774.tif 000014
；式（７）
【００５６】
【化１４】
2018181774.tif 000015
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、上記式で示される、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を光学活性なβ−ヒドロキシアミノ酸に変換する反応において、得られるβ−ヒドロキシアミノ酸の光学純度が６０％以上となるように変換しうるものであるのが好ましく、８０％以上となるように変換しうるものであるのがより好ましく、８５％以上となるように変換しうるものであるのがさらに好ましく、８７％以上となるように変換しうるものであるのがとりわけ好ましい。
【００５７】
本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼは、上記２種類のヘテロなサブユニットを、それぞれαサブユニット、βサブユニットとすると、αサブユニットが、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質を含み、βサブユニットが、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質を含むことが好ましい：
（ａ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号６に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｆ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｇ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質で、かつ、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｈ）配列番号７に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。
【００５８】
上記（ａ）および（ｅ）のタンパク質は、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、いずれも、ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）に由来する。配列番号１は、全長３７８ミノ酸残基から構成されるポリペプチドであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Thermo Scientific社）において、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤがｐｅｇ．８０３と標識されている。また、配列番号２は、全長３７３アミノ酸残基から構成されるポリペプチドであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Thermo Scientific社）において、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤがｐｅｇ．８０４と標識されている。
【００５９】
上記（ｂ）および（ｆ）のタンパク質は、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、（ｂ）のタンパク質の場合には、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有する限りにおいて、（ｆ）のタンパク質の場合には、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有する限りにおいて、その具体的な配列については限定されない。ここで欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数は、上記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって欠失、置換または付加できる程度の数をいい、好ましくは５アミノ酸以内であり、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば、３、２または１アミノ酸）である。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００６０】
置換されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されていることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、変異後のアミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異していることがより好ましい。
【００６１】
本明細書において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、目的とするタンパク質と同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれ得る。変異を導入したタンパク質が所望の機能を有するかどうかは、そのタンパク質をサブユニットの一部として用いた場合に、モノオキシゲナーゼ活性を有するかどうか調べることにより判断できる。
【００６２】
上記（ｃ）および（ｇ）のタンパク質も、配列番号１および２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、（ｃ）のタンパク質の場合には、当該タンパク質を含むサブユニットがβサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有する限りにおいて、（ｇ）のタンパク質の場合には、当該タンパク質を含むサブユニットがαサブユニットと複合体を形成したときにモノオキシゲナーゼ活性を有する限りにおいて、その具体的な配列については限定されない。
【００６３】
アミノ酸配列の相同性とは、アミノ酸配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
【００６４】
本明細書において「相同性」とは、性質が類似のアミノ酸残基数の割合（ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ等）を意図しているが、より好ましくは、同一のアミノ酸残基数の割合、すなわち同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）である。なお、アミノ酸の性質については上述したとおりである。
【００６５】
上記（ｄ）および（ｈ）のタンパク質について、配列番号６および７は、それぞれ配列番号１および２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を示す。
【００６６】
上記遺伝子・タンパク質を得る方法としては、通常行われるポリヌクレオチド改変方法を用いてもよい。すなわち、タンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドの特定の塩基を置換、欠失、挿入および／または付加することで、所望の組換えタンパク質の遺伝情報を有するポリヌクレオチドを作製することができる。ポリヌクレオチドの塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Clontech）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Stratagene）等）の使用、またはポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）の利用が挙げられる。これらの方法は当業者に公知である。
【００６７】
また、上記遺伝子は、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドのみからなるものであってもよいが、その他の塩基配列が付加されていてもよい。付加される塩基配列としては、特に限定されないが、標識（例えば、ヒスチジンタグ、ＭｙｃタグまたはＦＬＡＧタグなど）、融合タンパク質（例えば、ストレプトアビジン、シトクロム、ＧＳＴ、ＧＦＰまたはＭＢＰなど）、プロモーター配列、およびシグナル配列（例えば、小胞体移行シグナル配列、および分泌配列など）をコードする塩基配列などが挙げられる。これらの塩基配列が付加される部位は特に限定されるものではなく、例えば、翻訳されるタンパク質のＮ末端であっても、Ｃ末端でもあってもよい。
【００６８】
＜２．モノオキシゲナーゼ反応システム＞
本発明の一実施形態において、上記モノオキシゲナーゼと、電子伝達系タンパク質とを含む、β−ヒドロキシアミノ酸を製造するためのモノオキシゲナーゼ反応システムを提供する。
【００６９】
本モノオキシゲナーゼ反応システムは、電子伝達系タンパク質を介した酸化還元力の供給により、上記モノオキシゲナーゼがβ−ヒドロキシアミノ酸を製造するシステムであり、上記モノオキシゲナーゼと、電子伝達系タンパク質とを含み、かつ、β−ヒドロキシアミノ酸を製造できるシステムであれば、特段限定されない。
【００７０】
本モノオキシゲナーゼ反応システムは、生物体内で構築されたシステムであってもよく、生物体外で人工的に構築されたシステムであってもよい。本モノオキシゲナーゼ反応システムは、モノオキシゲナーゼタンパク質の安定性および活性の観点から、生物体内で構築されたシステムであることが好ましい。
【００７１】
本モノオキシゲナーゼ反応システムの生物体内での構築は、生物が当該システムを元々有しているものであってもよく、当該システムを有しない生物に人工的に当該システムを導入することであってもよい。
【００７２】
本モノオキシゲナーゼ反応システムを人工的に導入する方法および導入対象は、特段限定されないが、例えば、後述する＜４．ベクター＞および＜５．形質転換体＞の項に記載の方法により行われ得る。
【００７３】
本モノオキシゲナーゼ反応システムにおける電子伝達系タンパク質は、上記モノオキシゲナーゼがモノオキシゲナーゼ活性を生じるための酸化還元力を供給するタンパク質であれば特段限定されない。
【００７４】
電子伝達系タンパク質としては、例えば、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの組み合わせ（フェレドキシンは、例えば、リスケタンパク質、プチダレドキシン、アドレノドキシン等であり、フェレドキシンレダクターゼは、例えば、フラボタンパク質レダクターゼ、プチダレドキシンレダクターゼ、アドレノドキシンレダクターゼ等である）、フラボドキシンおよびフラボドキシンレダクターゼの組み合わせ、Ｐ４５０レダクターゼ等が挙げられる。
【００７５】
本発明の一実施形態において、電子伝達系タンパク質は、以下の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質、および以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることが好ましい：
（ｉ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｊ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｋ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、以下の（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｌ）配列番号８に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質；
（ｍ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｎ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｏ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記の（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有するタンパク質；
（ｐ）配列番号９に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。
【００７６】
上記（ｉ）および（ｍ）のタンパク質は、配列番号３および４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、いずれも、ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）に由来する。配列番号３は、全長３２２ミノ酸残基から構成されるポリペプチドであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Thermo Scientific社）において、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤがｐｅｇ．８０１と標識されている。また、配列番号４は、全長１６９ミノ酸残基から構成されるポリペプチドであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Thermo Scientific社）において、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤがｐｅｇ．８０２と標識されている。
【００７７】
上記（ｊ）および（ｎ）のタンパク質は、配列番号３および４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、（ｊ）のタンパク質の場合には、（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有する限りにおいて、（ｎ）のタンパク質の場合には、（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有する限りにおいて、その具体的な配列については限定されない。
【００７８】
上記（ｋ）および（ｏ）のタンパク質も、配列番号３および４で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、（ｋ）のタンパク質の場合には、（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有する限りにおいて、（ｏ）のタンパク質の場合には、（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質と組み合わせたときに電子伝達活性を有する限りにおいて、その具体的な配列については限定されない。
【００７９】
上記（ｌ）および（ｐ）のタンパク質について、配列番号８および９は、それぞれ配列番号３および４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を示す。
【００８０】
なお、本実施形態において、電子伝達系タンパク質は、上記（ｉ）〜（ｌ）からなる群より選択されるタンパク質、および上記（ｍ）〜（ｐ）からなる群より選択されるタンパク質に限定されるものではなく、電子伝達系に関与するその他のタンパク質を含み得ることを意図する。
【００８１】
遺伝子・タンパク質に関する一般的な記載（例えば、用語の定義等）については、＜１．モノオキシゲナーゼ＞の項の記載を援用するものとする。
【００８２】
＜３．遺伝子＞
本発明の一実施形態において、上記タンパク質をコードするモノオキシゲナーゼ遺伝子を提供する。
【００８３】
本実施形態において、上記タンパク質は、＜１．モノオキシゲナーゼ＞の項に記載した本発明の一実施形態におけるモノオキシゲナーゼを構成するタンパク質であり得る。
【００８４】
＜４．ベクター＞
本発明の一実施形態において、＜３．遺伝子＞の項に記載の遺伝子を含むベクターを提供する。本ベクターとしては、形質転換体作製のために宿主細胞内で、上記遺伝子を発現させるための発現ベクターのほか、組換えタンパク質の生産に用いるものも含まれる。
【００８５】
上記ベクターの母体となる基材ベクターとしては、一般的に使用される種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージまたはコスミド等を用いることができ、導入される細胞または導入方法に応じて適宜選択できる。つまり、ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。宿主細胞の種類に応じて、確実に上記遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと上記遺伝子とを各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメントおよびウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルス））ならびにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）を利用可能である。
【００８６】
細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０およびｐＱＥ９（Qiagenから入手可能）；ｐＴｉｐＱＣ１（Qiagenまたは北海道システムサイエンスから入手可能）、ｐＴｉｐＲＴ２（北海道システムサイエンスから入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８ＡおよびｐＮＨ４６Ａ（Stratageneから入手可能）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０およびｐＲＩＴ５（Addgeneから入手可能）；ｐＲＳＦ（MERCKから入手可能）；ならびにｐＡＣ（（株）ニッポンジーンから入手可能）が含まれる。また、好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥ０、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Stratageneから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Addgeneから入手可能）が含まれる。
【００８７】
また、上記遺伝子のインサートは、適切なプロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。他の適切なプロモーターとしては、当業者に知られたものを利用可能であり、特に限定されないが、例えば、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター、ｌａｃＩプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。
【００８８】
上記ベクターは、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。ベクター構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。
【００８９】
ベクターが導入される宿主としては、特に限定されないが、各種細胞を好適に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞等が挙げられるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で公知ものを利用可能である。
【００９０】
上記ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入または感染等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このような方法は、DavisらによるBasic Methods In Molecular Biology (1986)のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
【００９１】
＜５．形質転換体＞
本発明の一実施形態において、＜３．遺伝子＞の項に記載の遺伝子または＜４．ベクター＞の項に記載の組換えベクターを含む形質転換体を提供する。ここで、「遺伝子またはベクターを含む」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されていることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。
【００９２】
本形質転換体の作製方法（生産方法）としては、上述したベクターを形質転換する方法が挙げられる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種生物を挙げることができる。
【００９３】
本発明の一実施形態において使用される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞等が挙げられるが、導入および発現効率の観点から、放線菌が好ましい。
【００９４】
放線菌としては、例えば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属細菌等が挙げられ、好ましくは、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）、ノカルディア  グロベルラ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｇｌｏｂｅｒｕｌａ）等が用いられる。後述する実施例でも使用されているように、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）が宿主細胞として特に好ましく用いられる。
【００９５】
本発明の一実施形態において、上記形質転換体は、以下に示す遺伝子をさらに含むことが好ましい：
（１）電子伝達系タンパク質をコードする遺伝子、および／または
（２）トランスポータータンパク質をコードする遺伝子。
【００９６】
本電子伝達系タンパク質としては、特段限定されないが、例えば、＜２．モノオキシゲナーゼ反応システム＞の項で記載した電子伝達系タンパク質であり得る。
【００９７】
本トランスポータータンパク質は、上記モノオキシゲナーゼの基質となる物質を形質転換体の内部に取り込む機能を有するタンパク質であれば特段限定されない。
【００９８】
トランスポータータンパク質としては、例えば、パーミアーゼ（例えば、シンポーター、アンチポーター、ユニポーター等）、ＡＢＣトランスポーター等が挙げられる。
【００９９】
本発明の一実施形態において、トランスポータータンパク質は、以下の（ｑ）〜（ｔ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質であることが好ましい：
（ｑ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｒ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トランスポーター活性を有するタンパク質；
（ｓ）配列番号５に記載されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、トランスポーター活性を有するタンパク質；
（ｔ）配列番号１０に記載される塩基配列からなる遺伝子にコードされるタンパク質。
【０１００】
上記（ｑ）のタンパク質は、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、ロドコッカス  ラティスラビエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ）に由来する。配列番号５は、全長４８０ミノ酸残基から構成されるポリペプチドであり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Thermo Scientific社）において、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤがｐｅｇ．８００と標識されている。
【０１０１】
上記（ｒ）のタンパク質は、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、トランスポーター活性を有する限りにおいて、その具体的な配列については限定されない。
【０１０２】
上記（ｓ）のタンパク質も、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、トランスポーター活性を有する限りにおいて、その具体的な配列については限定されない。
【０１０３】
上記（ｔ）のタンパク質について、配列番号１０は、それぞれ配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）を示す。
【０１０４】
なお、本実施形態において、トランスポータータンパク質は、上記（ｑ）〜（ｔ）からなる群より選択されるタンパク質に限定されるものではなく、細胞膜上での物質輸送（トランスポート）に関与するその他のタンパク質を含み得ることを意図する。
【０１０５】
遺伝子・タンパク質に関する一般的な記載（例えば、用語の定義等）については、＜１．モノオキシゲナーゼ＞の項の記載を援用するものとする。
【０１０６】
形質転換体が上記（１）電子伝達系タンパク質をコードする遺伝子を含むことにより、上記モノオキシゲナーゼへの酸化還元力の供給が促進され、その結果として、β−ヒドロキシアミノ酸の製造が効率的に行われるという利点を有する。
【０１０７】
上記（１）電子伝達系タンパク質をコードする遺伝子は、導入先の宿主／形質転換体が、上記モノオキシゲナーゼへの酸化還元力の供給を行う電子伝達系タンパク質を有していないときは、それを補償するものとして機能し、上記モノオキシゲナーゼへの酸化還元力の供給を行う電子伝達系タンパク質を有しているときは、酸化還元力の供給を強化するものとして機能し得る。
【０１０８】
また、形質転換体が（２）トランスポータータンパク質をコードする遺伝子を含むことにより、形質転換体内部へのモノオキシゲナーゼ基質の取り込みが促進され、その結果として、β−ヒドロキシアミノ酸の製造が効率的に行われるという利点を有する。
【０１０９】
＜６．β‐ヒドロキシアミノ酸の製造方法＞
本発明の一実施形態において、＜５．形質転換体＞の項に記載の形質転換体を、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を含む培地中で培養する工程を含む、β‐ヒドロキシアミノ酸の製造方法を提供する。本実施形態におけるβ‐ヒドロキシアミノ酸の製造は、＜５．形質転換体＞の項に記載の形質転換体を用いるものであればよく、その他の具体的な構成、条件、材料、および使用設備等については、特段限定されない。
【０１１０】
上記形質転換体としては、放線菌が好ましく、特に、ロドコッカス属細菌、とりわけ、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）が好ましく用いられる。このような細菌を用いることで、β‐ヒドロキシアミノ酸を高効率で製造することができる。
【０１１１】
本実施形態において、上記形質転換体によるβ‐ヒドロキシアミノ酸の製造は、培地中に、形質転換体と、基質となるα−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸が同時に存在していることにより成立する。α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸の培地への添加時期は、特に限定されることはないが、例えば、形質転換体内で導入した遺伝子を発現させるのと同時に、または形質転換体内で導入した遺伝子を発現させる前後のいずれか、もしくは両方において、添加され得る。本実施形態は、形質転換体がすでに含まれている培地へ、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸を添加する態様であってもよく、α−アミノ酸またはα，α−２置換アミノ酸がすでに含まれている培地へ、形質転換体を投入することにより行われてもよい。このような条件は、上記に限らず、効率的なβ‐ヒドロキシアミノ酸の製造が可能なように、当業者により適宜設定され得る。
【０１１２】
本実施形態において、α−アミノ酸、α，α−２置換アミノ酸およびβ‐ヒドロキシアミノ酸は、＜１．モノオキシゲナーゼ＞の項に記載されたものであり得る。
【０１１３】
上記形質転換体を培養する工程に関しては、形質転換体の宿主菌株の培養方法として従来公知の手法を好適に利用でき、特に限定されない。例えば、培養時の温度であれば、常法にしたがい、２０〜４５℃とするのが好ましく、２５〜３５℃とするのがより好ましい。反応時間も特に限定されないが、導入遺伝子発現から１〜１２０時間培養することが好ましく、２４〜７２時間培養することがより好ましい。
【０１１４】
培養物または菌体からのβ‐ヒドロキシアミノ酸の採取方法についても、微生物生産物を得るのに常用される方法に従って行うことができ、特に限定されない。
【０１１５】
その他、上記＜１＞〜＜６＞の各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できることを付言する。また、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【０１１６】
〔実施例１〕２−アミノイソ酪酸資化性微生物の単離および水酸化活性の評価
０．１％  ２−アミノイソ酪酸、０．１％  塩化アンモニウム、０．１％  リン酸２水素カリウム、０．１％  リン酸水素２カリウム、０．０３％  硫酸マグネシウム７水和物、０．０１％  Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍｕ  Ｓｕｌｆａｔｅで構成される２ｍｌの集積用液体培地を用いて、自然界から採取した土壌サンプル各種を、２８℃で５日間、振とう培養した（濃度はすべて（ｗ／ｖ）％で示す（以下、実施例全体に渡って同様））。微生物が生育してきた培養液を、２ｍｌの新しい集積用液体培地に接種した。この操作を数回繰り返した後、同成分で調製した１．５％  寒天プレート培地にて、２−アミノイソ酪酸資化性微生物を単離した。単離した各微生物を再び２ｍｌの集積用液体培地に播種し、２８℃で５日間、振とう培養した。その後、８０００ｇで１０分間の遠心操作で集菌し、０．８５％食塩水で２回洗浄した湿菌体を、以下の休止菌体反応に用いた。休止菌体反応は、１０ｍＭ  ２−アミノイソ酪酸、１０ｍＭ  グルコース、１ｍＭ  アミノオキシ酢酸、５％  湿菌体を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）中、３００ｒｐｍで４時間振とうすることにより行った。【０１１７】
結果を表１に示す。表１に示す通り、３種類の微生物において、α−メチル−Ｄ−セリンの生成が確認された。【０１１８】
【表１】
2018181774.tif 000016
＜分析条件＞
・測定機器：ＬＣＭＳ−２０１０Ａ（島津製作所）
・カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  カラム（５μｍ：２．１×１５０ｍｍ）（日本ウォーターズ）
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相Ａ：１０ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）
・移動相Ｂ：メタノール
・流速：０．３ｍｌ／分
・グラジエント設定：０〜０．５分  ０〜１％  移動相Ｂ、０．５〜１８分  １〜５％  移動相Ｂ、１８〜１９分  ５〜９％  移動相Ｂ、１９〜２９．５分  ９〜１７％  移動相Ｂ、２９．５〜４０分  １７〜６０％  移動相Ｂ
・ＭＳ条件：ブロック温度  ２００℃、Ｃｕｒｖｅｄ  ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅ温度  ２５０℃、Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｖｏｌｔａｇｅ  １．５ｋＶ、ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ  ｇａｓ  ｆｌｏｗ  １．５１／分
ＡｃｃＱ−Ｔａｇ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（日本ウォーターズ）を用いて、分析溶液中のアミノ酸を誘導化した後に、ＬＣＭＳ分析に供した。【０１１９】
〔実施例２〕Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のプロテオーム解析
Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株を、２５０ｍｌの２−アミノイソ酪酸誘導液体培地（０．１％  ２−アミノイソ酪酸、０．１％  塩化アンモニウム、０．１％  リン酸２水素カリウム、０．１％  リン酸水素２カリウム、０．０３％  硫酸マグネシウム７水和物、０．０１％  Ｄｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍｕ  Ｓｕｌｆａｔｅ）、または２５０ｍｌの非誘導培地（２−アミノイソ酪酸誘導液体培地において、０．１％  ２−アミノイソ酪酸の代わりに０．０５％グルコースを使用）を用いて、２８℃で３８．５時間培養した（各々、ｎ＝３）。それぞれの培養菌体を、４℃、８０００ｇで１０分間の遠心分離で集菌し、７Ｍ尿素、２．０ｍＭチオウレア、２％ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｔａｂｌｅｔ／１０ｍｌ  プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ，ロシュ）を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファーに懸濁した。０．１０ｍｍビーズを添加し、マルチビーズショッカーで菌体を破砕した後、４℃、２００００ｇで１５分間、遠心分離を行った。得られた遠心上清を細胞溶解液として使用した。２００ｍＭ  ＴＥＡＢバッファー（ｐＨ８．０）を最小量用いて沈殿物を洗浄し、細胞溶解液と合わせて、０．４５μmのフィルターでろ過した。次いで、２００ｍＭ  ＴＥＡＢバッファーを用いてろ液を置換した。置換したろ液に９．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅを添加し、５５℃で６０分間、処理した。その後、ヨードアセトアミドを１７．９ｍＭとなるように添加し、室温で３０分間、処理した。最後に、２〜４倍量の冷アセトンを添加し、−２０℃で３時間、処理した。４℃、１３０００ｇで１０分間の遠心分離により、タンパク質を回収した。残存アセトンは、３７℃で２分間処理することにより、除去した。【０１２０】
次いで、タンパク質のトリプシン消化を行った。具体的には、回収したタンパク質を２００ｍＭ  ＴＥＡＢバッファーで懸濁した後、４７．６ｎｇ／μｌのトリプシンを用いて、３７℃で終夜、消化処理した。その後、得られた消化物を、ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｔａｇ（ＴＭＴ）６−ｐｌｅｘ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific）を用いて、４１μｌの アセトニトリル中でラベル化した。室温で６０分間の反応後、８μｌの５％ヒドロキシルアミンを添加して１５分間混合した。次いで、真空下で液体を蒸発させた後、１００μｌの０．１％  トリフルオロ酢酸に溶解した。【０１２１】
上記により得られたトリプシン消化タンパク質を、ＬＣＭＳ分析（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｎａｎｏ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所））に供した。得られた質量分析のデータと、Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム情報（北海道システムサイエンスで取得）を基に作成したタンパク質データベースを備えたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Thermo Scientific社）を用いて、誘導タンパク質の同定を行った。結果を表２に示す。【０１２２】
【表２】
2018181774.tif 000017
＜分析条件＞
・測定機器：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｎａｎｏ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所）
・カラム：Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙカラム  （５００ｃｍ長、０．１ｍｍ  ＩＤ）（京都モノテック）
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相Ａ：０．１％  ギ酸水溶液
・移動相Ｂ：０．１％  ギ酸アセトニトリル
・流速：５００ｍｌ／分
・グラジエント設定：０〜６００分  ５〜４５％  移動相Ｂ
・ＭＳ条件：ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ  ｌｉｎｅａｒ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Thermo Scientific）、２．３ｋＶのＥＳＩ  ｖｏｌｔａｇｅ、ＬＴＱ  Ｖｅｌｏｓ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ上のイオントランスファーチューブ温度＝２８０℃
〔実施例３〕２−アミノイソ酪酸水酸化酵素および電子伝達系タンパク質の同定
実施例２で得られたＰｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ｐｅｇ．８０１−８０４が２−アミノイソ酪酸水酸化反応を触媒する複合体であると予想されたことから、これらをコードする遺伝子の取得を試みた。【０１２３】
具体的には、以下のＰＣＲ条件の下でＰＣＲを行い、ｐｅｇ．８０１−８０４のＰＣＲ産物を得た。【０１２４】
＜ＰＣＲ条件＞
・鋳型：Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム  （１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）
・ポリメラーゼ：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（タカラバイオ）（２５μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＱＣ１＿５’  Ｈｙｄ）：TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTTGCACCAACCTCGAA（配列番号１１）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＱＣ１＿３’  Ｈｙｄ）：TGGTGATGGTGATGCTCGAGAGATCTACTAGAGATCGAGGACGAGCC（配列番号１２）（１０μM、１μｌ）
・増幅条件：９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃  １分を３０サイクル。【０１２５】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（New England BioLabs）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで制限酵素処理したベクターｐＴｉｐＱＣ１（北海道システムサイエンス）に挿入した。次いで、本プラスミドｐＱＡＨ１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含）中、２８℃で終夜培養した。本菌体からｐＱＡＨ１を取得後、本プラスミドを用いて、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８（北海道システムサイエンス）を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）中、２８℃で終夜培養した。培養液の一部を新しい２ｍｌのＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）へ添加し、２８℃で振とう培養を行った。培養液濁度が０．８（吸収波長:６００ｎｍ）となった後に、タンパク質の発現を誘導する目的で、チオストレプトンを０．２μｇ／ｍｌの濃度となるように添加した。次いで、反応基質として、２−アミノイソ酪酸を１０ｍＭの濃度となるように添加し、振とう反応を開始した。【０１２６】
その結果、４８時間の反応後において、２．７ｍＭのα−メチル−Ｄ−セリンの生成が確認された。【０１２７】
以上より、ｐｅｇ．８０１−８０４が２−アミノイソ酪酸水酸化反応を触媒する複合体であることが分かった。【０１２８】
＜分析条件＞
・測定機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−ＶＰ（島津製作所）
・カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  カラム（５μｍ：２．１×１５０ｍｍ）（日本ウォーターズ）
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相Ａ：Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ−Ｔａｇ  Ｅｌｕｅｎｔ  Ａ
・移動相Ｂ：メタノール
・流速：０．３ｍｌ／分
・グラジエント設定：０〜０．１分  ０％  移動相Ｂ、０．１〜０．５分  ０〜１％  移動相Ｂ、０．５〜１８分  １〜５％  移動相Ｂ、１８〜１９分  ５〜９％  移動相Ｂ、１９〜２９．５分  ９〜１７％  移動相Ｂ、２９．５〜４０分  １７〜６０％  移動相Ｂ、４０〜４３分  ６０〜０％  移動相Ｂ、４３〜５５分  ０％  移動相Ｂ
・検出：蛍光検出器（励起波長２５０ｎｍ  発光波長３９５ｎｍ）
ＡｃｃＱ−Ｔａｇ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（日本ウォーターズ）を用いて、分析溶液中のアミノ酸を誘導化した後に、ＬＣ分析に供した。【０１２９】
〔実施例４〕ｐｅｇ．８０３、８０４の機能解析
〔４．１〕
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ｐｅｇ．８０１、８０２、８０３を発現する形質転換放線菌の構築を試みた。【０１３０】
具体的には、以下のＰＣＲ条件の下でＰＣＲを行い、ｐｅｇ．８０１、８０２、８０３のＰＣＲ産物を得た。【０１３１】
＜ＰＣＲ条件＞
・鋳型：Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム  （１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）
・ポリメラーゼ：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（タカラバイオ）（２５μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＱＣ１＿５’  ８０３）：TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCATCATCGAACACGG（配列番号１３）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＱＣ１＿３’  Ｈｙｄ）：TGGTGATGGTGATGCTCGAGAGATCTACTAGAGATCGAGGACGAGCC（配列番号１２）（１０μM、１μｌ）
・増幅条件：９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃  １分を３０サイクル。【０１３２】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（New England BioLabs）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで制限酵素処理したベクターｐＴｉｐＱＣ１（Qiagen）に挿入した。次いで、本プラスミドｐＱＡＨ−ｄ８０４を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含）中、２８℃で終夜培養した。本菌体からｐＱＡＨ−ｄ８０４を取得後、本プラスミドを用いて、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８（北海道システムサイエンス）を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）中、２８℃で終夜培養した。培養液の一部を新しい２ｍｌのＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）へ添加し、２８℃で振とう培養を行った。培養液濁度が０．８（吸収波長:６００ｎｍ）となった後に、タンパク質の発現を誘導する目的で、チオストレプトンを０．２μｇ／ｍｌの濃度となるように添加した。次いで、反応基質として、２−アミノイソ酪酸を１０ｍＭの濃度となるように添加し、振とう反応を開始した。【０１３３】
その結果、４８時間の反応後において、培養上清には、α−メチル−Ｄ−セリンの生成は確認できなかった。【０１３４】
実施例３の結果と本結果より、水酸化活性発現にはｐｅｇ．８０４タンパク質が必要であることが分かった。【０１３５】
〔４．２〕
続いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ｐｅｇ．８０１、８０２、８０４を発現する形質転換放線菌の構築を試みた。【０１３６】
具体的には、以下のＰＣＲ条件の下でＰＣＲを行い、ｐｅｇ．８０１、８０２、８０４のＰＣＲ産物を得た。【０１３７】
＜ＰＣＲ条件＞
・鋳型：Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム  （１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）
・ポリメラーゼ：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（タカラバイオ）（２５μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＱＣ１＿５’  Ｈｙｄ）：TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTTGCACCAACCTCGAA（配列番号１１）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｊｏｉｎｔ８０２−４＿３’）：CGCTACCGATTACAAACTTGGACATTCTTAACCAACCTTTCCTGGGC（配列番号１４）（１０μM、１μｌ）
または
・プライマー（ｊｏｉｎｔ８０４−２＿５’）：CCCGAGCCCAGGAAAGGTTGGTTAAGAATGTCCAAGTTTGTAATCGG（配列番号１５）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＱＣ１＿３’  Ｈｙｄ）：TGGTGATGGTGATGCTCGAGAGATCTACTAGAGATCGAGGACGAGCC（配列番号１２）（１０μM、１μｌ）
・増幅条件：９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃  １分を３０サイクル。【０１３８】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（New England BioLabs）を用いて、２種類のＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで制限酵素処理したベクターｐＴｉｐＱＣ１（Qiagen）に挿入した。次いで、本プラスミドｐＱＡＨ−ｄ８０３を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含）中、２８℃で終夜培養した。本菌体からｐＱＡＨ−ｄ８０３を取得後、本プラスミドを用いて、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８（北海道システムサイエンス）を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）中、２８℃で終夜培養した。培養液の一部を新しい２ｍｌのＬＢ培地（２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）へ添加し、２８℃で振とう培養を行った。培養液濁度が０．８（吸収波長:６００ｎｍ）となった後に、タンパク質の発現を誘導する目的で、チオストレプトンを０．２μｇ／ｍｌの濃度となるように添加した。次いで、反応基質として、２−アミノイソ酪酸を１０ｍＭの濃度となるように添加し、振とう反応を開始した。【０１３９】
その結果、４８時間の反応後において、培養上清には、α−メチル−Ｄ−セリンの生成は確認できなかった。【０１４０】
実施例３の結果と本結果より、水酸化活性発現にはｐｅｇ．８０３タンパク質が必要であることが分かった。【０１４１】
〔比較例１〕形質転換大腸菌についての反応性評価
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ｐｅｇ．８０１−８０４を発現する形質転換大腸菌の構築を試みた。【０１４２】
具体的には、以下のＰＣＲ条件の下でＰＣＲを行い、ｐｅｇ．８０３、８０４のＰＣＲ産物を得た。【０１４３】
＜ＰＣＲ条件＞
・鋳型：Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム  （１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）
・ポリメラーゼ：Ｔｓｋ  Ｇｆｌｅｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）（１．２５ユニット／μｌ、1μｌ）
・プライマー（ｐＱＥ６０＿５’  Ｈｙｄ）：GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGGTTGCACCAACCTCGAA（配列番号１６）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｐＱＥ６０＿３’  Ｈｙｄ）：CAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTACTAGAGATCGAGGACGAGCC（配列番号１７）（１０μM、１μｌ）
・増幅条件：９８℃  １０秒、５８℃  １５秒、６８℃  １分を３０サイクル。【０１４４】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（New England BioLabs）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで制限酵素処理したベクターｐＱＥ６０（Qiagen）に挿入した。次いで、本プラスミドｐＱＥＨｙｄを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含）中、２８℃で終夜培養した。次いで、培養液の一部を、２５０ｍｌのＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含）へ添加し、２８℃で振とう培養を行った。培養液濁度が０．６（吸収波長:６００ｎｍ）となった後に、タンパク質の発現を誘導する目的で、ＩＰＴＧを１ｍＭの濃度となるように添加した。１６時間の培養後、反応基質として、２−アミノイソ酪酸を１０ｍＭの濃度となるように添加し、振とう反応を開始した。【０１４５】
その結果、４８時間の反応後において、０．２ｍＭのα−メチル−Ｄ−セリンの生成が確認された。これは、実施例３と比較して、α−メチル−Ｄ−セリンの生成量が少ない結果であった。【０１４６】
以上より、本反応系の宿主としては、大腸菌よりもロドコッカス属細菌において、反応性がより高まることが分かった。【０１４７】
〔実施例５〕ｐｅｇ．８００導入による反応性評価
相同性検索の結果に基づき、実施例２で得られたＰｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ｐｅｇ．８００が、２−アミノイソ酪酸のトランスポーターであると予想されたことから、ｐｅｇ．８００をコードする遺伝子の取得を試みた。【０１４８】
具体的には、以下のＰＣＲ条件の下でＰＣＲを行い、ｐｅｇ．８００のＰＣＲ産物を得た。【０１４９】
＜ＰＣＲ条件＞
・鋳型：Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム（１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）
・ポリメラーゼ： ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（タカラバイオ）（２５μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＲＴ２＿ＮｄｅＩ＿５’  ８００）：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACAGTGAATCATTCCCA（配列番号１８）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｐＴｉｐＲＴ２＿ＨｉｎｄＩＩＩ＿３’  ８００）：TGGTGATGGTGATGCTCGAGAGATCTATCAGATTCTGGGCTGCAGAA（配列番号１９）（１０μM、１μｌ）
・増幅条件：９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃  １分を３０サイクル。【０１５０】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（New England BioLabs）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩとで制限酵素処理したベクターｐＴｉｐＲＴ２（北海道システムサイエンス）に挿入した。次いで、本プラスミドｐＲＡＴ１を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン含）中、２８℃で終夜培養した。本菌体からｐＲＡＴ１を取得後、本プラスミドを用いて、実施例３で作製したｐＱＡＨ１  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８を形質転換した。本形質転換体（ｐＱＡＨ１／ｐＲＡＴ１  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８）を、２ｍｌのＬＢ培地（５μｇ／ｍｌ  テトラサイクリン、２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）中、２８℃で終夜培養した。培養液の一部を新しい２ｍｌのＬＢ培地（５μｇ／ｍｌ  テトラサイクリン、２０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）へ添加し、２８℃で振とう培養を行った。培養液濁度が０．８（吸収波長:６００ｎｍ）となった後に、タンパク質の発現を誘導する目的で、チオストレプトンを０．２μｇ／ｍｌの濃度となるように添加した。次いで、反応基質として、２−アミノイソ酪酸を１０ｍＭの濃度となるように添加し、振とう反応を開始した。【０１５１】
その結果、４８時間の反応後において、培養上清には、８．５ｍＭのα−メチル−Ｄ−セリンの生成が確認された。【０１５２】
本実施例では、実施例３よりも多くの生成物が確認されたことから、ｐｅｇ．８００タンパク質が反応性を向上させることが分かった。【０１５３】
なお、生成したα−メチル−Ｄ−セリンの光学純度は９３．５％ｅｅであった。【０１５４】
＜分析条件＞
・測定機器：ＬＣＭＳ−２０１０Ａ（島津製作所）
・カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  カラム（５μｍ：２．１×１５０ｍｍ）（日本ウォーターズ）
・カラムオーブン温度：４０℃
・移動相Ａ：５％酢酸
・移動相Ｂ：アセトニトリル／メタノール＝９０／１０
・流速：０．２５ｍｌ／分
・グラジエント設定：０〜０．１分  ５％  移動相Ｂ、０．１〜３０分  ５〜３５％  移動相Ｂ、３０〜４０分  ９０％  移動相Ｂ、４０〜５０分  ５％  移動相Ｂ
・ＭＳ条件：ブロック温度  ２００℃、Ｃｕｒｖｅｄ  ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅ温度  ２５０℃、Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｖｏｌｔａｇｅ  １．５ｋＶ、ｎｅｂｕｌｉｚｉｎｇ  ｇａｓ  ｆｌｏｗ  １．５１／分
２５μｌの反応溶液と２５μｌの０．８％トリエチルアミンアセトニトリル溶液とを混合し、５０μｌの２，３，４，６，−ｔｅｔｒａ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ  ｉｓｏｃｙａｎａｔｅで誘導化したものを用いて、光学純度分析を行った。【０１５５】
〔実施例６〕基質特異性評価
実施例５と同様の方法により、ｐＱＡＨ１／ｐＲＡＴ１  Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  Ｌ８８をＬＢ培地で培養した。０．２μｇ／ｍｌのチオストレプトンでタンパク質の発現を誘導した後、１０ｍＭのＬ−イソバリン、Ｄ−イソバリン、Ｌ−アミノブチレート、Ｄ−アミノブチレートのそれぞれを、５％  グルコースと共に添加した。２６時間の反応後、実施例１に示すＬＣＭＳ分析法にて、反応上清を分析した。【０１５６】
その結果、各基質について分子量が１６増加した生成物が確認されたことから、水酸化反応が進行していることが分かった。ＮＭＲ及び旋光度解析の結果から、Ｌ−イソバリンを基質とした際には（２Ｓ，３Ｓ）−２−メチルスレオニンが、Ｄ−イソバリンを基質とした際には（２Ｒ，３Ｒ）−２−メチルスレオニンが、Ｌ−アミノブチレートを基質とした際にはＬ−アロ−スレオニンが、Ｄ−アミノブチレートを基質とした際にはＤ−アロ−スレオニンが、それぞれ生成していることが確認された。【０１５７】
なお、（２Ｓ，３Ｓ）−２−メチルスレオニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−２−メチルスレオニンのＮＭＲの結果は、以下の通りである（表３）。【０１５８】
【表３】
2018181774.tif 000018
〔実施例７〕ｐｅｇ．８０３、８０４の構造解析
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ｐｅｇ．８０３、８０４を発現する形質転換大腸菌の構築を試みた。【０１５９】
具体的には、以下のＰＣＲ条件の下でＰＣＲを行い、ｐｅｇ．８０３、８０４のＰＣＲ産物を得た。【０１６０】
＜ＰＣＲ条件＞
・鋳型：Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム  （１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）
・ポリメラーゼ：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（タカラバイオ）（２５μｌ）
・プライマー（ｐＱＥ＿８０４＿５’）：TCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGGTTGCACCAACCTCGAA（配列番号２０）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｐＱＥ＿８０３＿３’）：CAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTATTAGTCCGCCTGATTCGTAA（配列番号２１）（１０μM、１μｌ）
・増幅条件：９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃  １分を３０サイクル。【０１６１】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（New England BioLabs）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとで制限酵素処理したベクターｐＱＥ８０（Qiagen）に挿入した。次いで、本プラスミドｐＱＥ８０4−８０３を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）中、２８℃で終夜培養した。培養液の一部を、２００ｍｌのＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）へ添加し、２０℃で振とう培養を行った。培養液濁度が０．６（吸収波長:６００ｎｍ）となった後に、タンパク質の発現を誘導する目的で、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの濃度となるように添加した。１６時間の培養後、菌体を遠心分離により回収し、０．８５％  ＮａＣｌで２回洗浄した。本菌体を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波破砕した。遠心分離した本破砕液の上清を、ＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（１．６×２．５ｃｍ）（タカラバイオ）に導入し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で溶出することにより、ｐｅｇ．８０３、８０４を含む酵素画分を回収した。本酵素画分を限外濾過により濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００ＧＬ  ｃｏｌｕｍｎ（１．０×３０ｃｍ）（GEヘルスケア）に導入し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、０．１４Ｍ  ＮａＣｌを用いてｐｅｇ．８０３、８０４の分子量を測定したところ、約１８０，０００であった。ｐｅｇ．８０３、８０４の推定分子量はそれぞれ４２,０００、４３,０００であることから、上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果と併せて、ｐｅｇ．８０３とｐｅｇ．８０４とが等モルで会合していることが分かった。【０１６２】
以上より、上記モノオキシゲナーゼは、ｐｅｇ．８０３およびｐｅｇ．８０４の各々で構成され、モノオキシゲナーゼ全体としてヘテロテトラマー構造を取ることが推定された。【０１６３】
〔実施例８〕ｐｅｇ．８０１の補酵素の同定
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ｐｅｇ．８０１を発現する形質転換大腸菌の構築を試みた。【０１６４】
具体的には、以下のＰＣＲ条件の下でＰＣＲを行い、ｐｅｇ．８０１のＰＣＲ産物を得た。【０１６５】
＜ＰＣＲ条件＞
・鋳型：Ｒ．  ｗｒａｔｉｓｌａｖｉｅｎｓｉｓ  Ｃ３１−０６株のゲノム  （１００ｎｇ／μｌ、１μｌ）
・ポリメラーゼ：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）（タカラバイオ）（２５μｌ）
・プライマー（ｐＱＥ＿８０1＿５’）：TCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGACCAATTCAGATAGTTC（配列番号２２）（１０μM、１μｌ）
・プライマー（ｐＱＥ＿８０１＿３’）：CAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTACTAGAGATCGAGGACGAGCC（配列番号２３）（１０μM、１μｌ）
・増幅条件：９８℃  １０秒、５５℃  ５秒、７２℃  １分を３０サイクル。【０１６６】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（New England BioLabs）を用いて、ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとで制限酵素処理したベクターｐＱＥ８０（Qiagen）に挿入した。次いで、本プラスミドｐＱＥ−８０1を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ  ２（ＤＥ３）を形質転換した。本形質転換体を、２ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）中、２８℃で終夜培養した。培養液の一部を、２００ｍｌのＴＢ培地（５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン、２５μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール含）へ添加し、２０℃で振とう培養を行った。培養液濁度が０．６（吸収波長:６００ｎｍ）となった後に、タンパク質の発現を誘導する目的で、ＩＰＴＧを０．５ｍＭの濃度となるように添加した。１６時間の培養後、菌体を遠心分離により回収し、０．８５％  ＮａＣｌで２回洗浄した。本菌体を、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁後、超音波破砕した。遠心分離した本破砕液の上清を、ＨｉｓＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（１．６×２．５ｃｍ）（タカラバイオ）に導入し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で溶出することにより、ｐｅｇ．８０１を含む酵素画分を回収した。本酵素画分を限外濾過により濃縮後、ＭｏｎｏＱ  １０／１００  ＧＬ  ｃｏｌｕｍｎ（１．０×１０ｃｍ）（GEヘルスケア）に導入し、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）で溶出することにより、ｐｅｇ．８０１の精製酵素を得た。０．７７μｇ／ｍｌのｐｅｇ．８０１を、１０−１５０μＭ  ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、２０−１００μＭ  ジクロロインドフェノール、１００ｍＭ  リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を含む反応液に添加して、ｐｅｇ．８０１の酵素活性を測定した。【０１６７】
本反応におけるＫｍ値を測定したところ、ＮＡＤＨに対しては、８．２μＭ、ＮＡＤＰＨに対しては、６．２ｍＭであった。したがって、ｐｅｇ．８０１は、ＮＡＤＨを補酵素として要求することが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明は、安定したタンパク質の供給が求められる分野、例えば、ペプチド医薬の製造等の分野において利用することができる。
【受託番号】
【０１６９】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２３７０
【配列表】
2018181774000001.app
【国際調査報告】
2018181774.tif 000026
2018181774.tif 000027
2018181774.tif 000028
2018181774.tif 000029