(57)【要約】  本発明は、十分な強度を有する腱／靱帯様人工組織を提供することに関する。より具体的には、コラーゲン分泌性の細胞を張力負荷に耐えうる強度を有するゲル中に包埋し、ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養して、腱／靱帯様人工組織を製造することによって、十分な強度を有する腱／靱帯様人工組織を提供する。コラーゲン分泌性の細胞には、Ｍｋｘ遺伝子を定常発現する細胞を使用できる。ゲルには、アプロチニンを含有するフィブリンゲルを使用できる。
2019013279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腱／靱帯様人工組織の製造方法であって、（ａ）コラーゲン分泌性の細胞を張力負荷に耐えうる強度を有するゲル中に包埋する工程、（ｂ）ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項２】
コラーゲン分泌性の細胞がＭｋｘ遺伝子を定常発現する細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
コラーゲン分泌性の細胞がＭｋｘ遺伝子をベクターを用いて導入した細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細胞がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、細胞株、正常細胞、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
細胞がＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ゲルがフィブリンゲルである、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ゲルがプラスミン阻害剤を含有する、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ゲルがアプロチニンを含有する、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
張力負荷が少なくとも１日あたり２％の伸展率である、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
さらに（ｃ）脱細胞化処理を行う工程を含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
脱細胞化処理がマイクロ波照射を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
長手方向に平行なコラーゲン線維の配向を有する、腱／靱帯様人工組織。
【請求項１４】
少なくとも５０ｋＰａの引っ張り強さを有する、腱／靱帯様人工組織。
【請求項１５】
少なくとも５０ｋＰａの引っ張り強さを有する、請求項１３記載の腱／靱帯様人工組織。
【請求項１６】
Ｉ型コラーゲンを含む、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の腱／靱帯様人工組織。
【請求項１７】
Ｍｋｘ遺伝子をベクターを用いて導入した細胞を含む、請求項１３〜１６のいずれか一項記載の腱／靱帯様人工組織。
【請求項１８】
上記請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法を用いて製造される、腱／靱帯様人工組織。
【請求項１９】
上記請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法を用いて製造される、請求項１３〜１７のいずれか一項記載の腱／靱帯様人工組織。
【請求項２０】
フィブリノゲンとアプロチニンを含有する、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法に用いるための三次元細胞培養用培地組成物。
【請求項２１】
腱／靱帯様人工組織の製造方法であって、（ａ）ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞をゲル中に包埋する工程、（ｂ）ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項２２】
細胞が、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
細胞を中胚葉系幹細胞へ分化誘導する工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞を単離する工程をさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である中胚葉系幹細胞を含む、細胞組成物。
【請求項２６】
ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である中胚葉系幹細胞の純度が少なくとも８５％である、請求項２５記載の細胞組成物。
【請求項２７】
少なくとも５×１０５個の細胞を含む、請求項２５または２６記載の細胞組成物。
【請求項２８】
中胚葉系幹細胞がｉＰＳ細胞に由来する細胞である、請求項２５〜２７のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項２９】
中胚葉系幹細胞がヒトの細胞である、請求項２５〜２８のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項３０】
中胚葉系幹細胞が遺伝子改変細胞である、請求項２５〜２９のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項３１】
凍結されている、請求項２５〜３０のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項３２】
１つの容器に納められている、請求項２５〜３１のいずれか一項記載の細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、特願２０１７−１３６８２３号（出願日：２０１７年７月１３日）の優先権を主張する出願であり、これは引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、腱／靱帯様人工組織およびその製造方法に関する。より詳細には、三次元メカノシグナル細胞培養系を用いて作製した腱／靱帯様人工組織に関する。また、本発明は、三次元メカノシグナル細胞培養系を用いた腱／靱帯様人工組織の製造方法、およびそれに用いる組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
腱／靱帯は、筋と骨を正確かつ強靭に結ぶことで機能を発揮する組織であり、その障害、疾病は患者に日常生活の著しい低下を強いる。また現在、運動器障害は健康寿命の主要な阻害要因であり、認知症や脳卒中に匹敵する高齢者の介護要因の約２割を占めるという事実からも、腱／靱帯の再生、再建は今後の超高齢者社会において急務とされている。【０００４】
さらに、腱／靱帯の損傷はアスリートの選手生命を脅かす主要な要因である。そのため腱／靱帯の再生、再建はスポーツ医学の分野においても切望されている。【０００５】
しかしながら、組織特異的マスター遺伝子が長らく不明であったため腱／靱帯の発生研究および、再生医療は現在に至るまで十分に進展していない。【０００６】
腱／靱帯組織特異的な遺伝子発現パターンの解析により、転写因子Ｍｏｈａｗｋ（Ｍｋｘ）が同定され、Ｍｋｘが腱／靱帯の形成に必須であることがＭｋｘノックアウトマウスを用いた解析により明らかとされた（特許文献１）。レトロウイルスによりＭｋｘ遺伝子を導入したマウス中胚葉系幹細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、腱／靱帯細胞遺伝子マーカーであるＳｃｌｅｒａｘｉｓ、デコリン、Ｉ型コラーゲンなどを対照群に比較して強力に発現する（非特許文献１）。【０００７】
腱の主成分はＩ型コラーゲンとプロテオグリカンから成る細胞外基質である。しかしながら、生体における構造的に意味のある腱組織の形成には、コラーゲン線維と腱細胞が正しく配向することが必要であり、単にＭｋｘ発現細胞を生体に移植するだけでは、再生医療のための組織再生には不十分であると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−２０５９６４
【０００９】
【非特許文献１】Nakamichi R et al. 2016 Nat Commun. 16(7) 12503
【非特許文献２】Kapacee Z et al. 2010 Matrix Biol. 29(8) 668-77
【非特許文献３】Liu H et al. 2015 Stem Cells. 33(2) 443-55
【非特許文献４】Chen X et al. 2012 Sci Rep. 2:977.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、腱／靱帯様人工組織およびその製造方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、腱／靱帯様人工組織の製造方法において用いる組成物を提供することを別の目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、例えば、レトロウイルスによってＭｋｘ遺伝子が導入された細胞をアプロチニンを加えたフィブリンゲル中に包埋し、張力負荷をかけながら培養することにより、伸長方向（長手方向）に対して平行なコラーゲン線維と細胞の配向を呈する人工組織を形成可能なことを見出した。また、本発明者らは、予想外なことに、ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性分画の細胞が、他の分画の細胞に比較して強く腱靭帯の遺伝子発現パターンを示すことを見出した。【００１２】
本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の態様を包含する：
［１］腱／靱帯様人工組織の製造方法であって、（ａ）コラーゲン分泌性の細胞を張力負荷に耐えうる強度を有するゲル中に包埋する工程、（ｂ）ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養する工程を含む方法。
［２］コラーゲン分泌性の細胞がＭｋｘ遺伝子を定常発現する細胞である、［１］記載の方法。
［３］コラーゲン分泌性の細胞がＭｋｘ遺伝子をベクターを用いて導入した細胞である、［１］または［２］記載の方法。
［４］細胞がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、細胞株、正常細胞、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞である、［１］〜［３］のいずれか記載の方法。
［５］細胞がＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である、［１］〜［４］のいずれか記載の方法。
［６］ベクターがレトロウイルスベクターである、［３］〜［５］のいずれか記載の方法。
［７］ゲルがフィブリンゲルである、［１］〜［６］のいずれか記載の方法。
［８］ゲルがプラスミン阻害剤を含有する、［１］〜［７］のいずれか記載の方法。
［９］ゲルがアプロチニンを含有する、［１］〜［８］のいずれか記載の方法。
［１０］張力負荷が少なくとも１日あたり２％の伸展率である、［１］〜［９］のいずれか記載の方法。
［１１］さらに（ｃ）脱細胞化処理を行う工程を含む、［１］〜［１０］のいずれか記載の方法。
［１２］脱細胞化処理がマイクロ波照射を含む、［１１］記載の方法。
［１３］長手方向に平行なコラーゲン線維の配向を有する、腱／靱帯様人工組織。
［１４］少なくとも５０ｋＰａの引っ張り強さを有する、腱／靱帯様人工組織。
［１５］少なくとも５０ｋＰａの引っ張り強さを有する、［１３］記載の腱／靱帯様人工組織。
［１６］Ｉ型コラーゲンを含む、［１３］〜［１５］のいずれか記載の腱／靱帯様人工組織。
［１７］Ｍｋｘ遺伝子をベクターを用いて導入した細胞を含む、［１３］〜［１６］のいずれか記載の腱／靱帯様人工組織。
［１８］上記［１］〜［１２］のいずれか記載の方法を用いて製造される、腱／靱帯様人工組織。
［１９］上記［１］〜［１２］のいずれか記載の方法を用いて製造される、上記［１３］〜［１７］のいずれか記載の腱／靱帯様人工組織。
［２０］フィブリノゲンとアプロチニンを含有する、［１］〜［１０］のいずれか記載の方法に用いるための三次元細胞培養用培地組成物。【００１３】
［２１］腱／靱帯様人工組織の製造方法であって、（ａ）ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞をゲル中に包埋する工程、（ｂ）ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養する工程を含む方法。
［２２］細胞が、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞である、［２１］記載の方法。
［２３］細胞を中胚葉系幹細胞へ分化誘導する工程をさらに含む、［２２］記載の方法。
［２４］ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞を単離する工程をさらに含む、［２１］〜［２３］のいずれか記載の方法。
［２５］ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である中胚葉系幹細胞を含む、細胞組成物。
［２６］ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である中胚葉系幹細胞の純度が少なくとも８５％である、［２５］記載の細胞組成物。
［２７］少なくとも５×１０５個の細胞を含む、［２５］または［２６］記載の細胞組成物。
［２８］中胚葉系幹細胞がｉＰＳ細胞に由来する細胞である、［２５］〜［２７］のいずれか記載の細胞組成物。
［２９］中胚葉系幹細胞がヒトの細胞である、［２５］〜［２８］のいずれか記載の細胞組成物。
［３０］中胚葉系幹細胞が遺伝子改変細胞である、［２５］〜［２９］のいずれか記載の細胞組成物。
［３１］凍結されている、［２５］〜［３０］のいずれか記載の細胞組成物。
［３２］１つの容器に納められている［２５］〜［３１］のいずれか記載の細胞組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】三次元メカノシグナル細胞培養系において作製したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２由来の人工腱靭帯様組織を示す写真である。上段は張力負荷あり、下段は張力負荷なし。左列は対照、右列はＭｋｘを導入した細胞。
【図２】Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２由来の人工腱靭帯様組織の縦断面図を示した写真である。上段は張力負荷なし、下段は張力負荷あり。左列は対照、右列はＭｋｘを導入した細胞。
【図３】Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２由来の人工腱靭帯様組織の強度負荷試験試験時の応力−歪み曲線を示す。縦軸は応力（Stress）、横軸は歪み（Strain）。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織（Ｍｋｘ）においては破断荷重が５２ｋＰａであった一方、コントロール群（Ｍｏｃｋ）では３１ｋＰａであったことが示されている。
【図４】図４は、三次元メカノシグナル細胞培養系においてコラーゲンゲルを用いて作製したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２由来の人工腱靭帯様組織を示す写真である。上段は張力負荷あり、下段は張力負荷なし。左列は対照、右列はＭｋｘを導入した細胞。
【図５】図５は、脱細胞架橋処理を実施したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２由来の人工腱靭帯様組織を示している。
【図６】図６は、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２由来の脱細胞架橋人工腱靭帯様組織の強度負荷試験試験時の応力−歪み曲線（Stress-strain curve）を示している。縦軸は応力（Ｓｔｒｅｓｓ）、横軸は歪み（Ｓｔｒａｉｎ）。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織においては破断荷重が１１３ｋＰａであった一方、伸展負荷を実施したコントロール群では８４ｋＰａであった。また、伸展負荷を実施しないＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いた人工腱靭帯様組織においては破断荷重が１０３ｋＰａであった一方、伸展負荷を実施したコントロール群では破断荷重が８４ｋＰａであった。
【図７】図７は、Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣの抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ３４抗体を用いたフローサイトメトリーの結果を示している。Ｖｅｎｕｓ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣをコントロールとして用いた。
【図８】図８は、フローサイトメトリーにより単離した各分画におけるＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣの光学顕微鏡像を示している。
【図９】図９は、フローサイトメトリーにより単離した各分画におけるＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣの腱・靭帯関連遺伝子発現パターンをｑＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示している。横軸は発現を検討した腱靭帯関連遺伝子を示す。縦軸はｑＲＴ−ＰＣＲにおけるΔΔｃＴ定量法の比較対象遺伝子Ｕｂｂ比の遺伝子発現量を示す。
【図１０】図１０は、三次元メカノシグナル細胞培養系においてコラーゲンゲルを用いて作製したＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ由来の人工腱靭帯様組織を示す写真である。左列は対照群であるゲルのみにおける結果を示す。右列はＭｋｘを導入したＣＤ２４，ＣＤ３４陽性細胞を用いた人工腱靭帯様組織である。
【図１１】図１１は、脱細胞架橋処理を実施したＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来の人工腱靭帯様組織を示している。左列は対照群であるゲルのみにおける結果を示す。右列はＭｋｘを導入したＣＤ２４，ＣＤ３４陽性細胞を用いた人工腱靭帯様組織である。
【図１２】図１２は、腓腹筋側アキレス腱全切除ラット損傷モデルに対して脱細胞化処理、核洗浄を実施したＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織を腓腹筋側アキレス腱全切除部への移植時の術中の写真を示す。黒の矢印で移植したＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織を示す。
【図１３】図１３は、左後肢腓腹筋側アキレス腱中心部５ｍｍを全切除したラット損傷モデルに対して、生体移植実験後１週間にてラットを全身麻酔下とし、マイクロフォーカスＸ線装置（Ｓｈｉｍａｚｕ社，ｉｎｓｐｅＸｉｏ  ＳＭＸ−１００ＣＴ）を用いて実施した損傷部の非侵襲性画像解析像である。ｓｈａｍ群（損傷モデル群）の両方向の矢印はアキレス腱におけるＸ線の透過が低吸収となっている部位を示す。ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織移植群の矢印は、移植部においてＸ線の透過が均一となっていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上述のとおり、本発明者らは、例えば、レトロウイルスによってＭｋｘ遺伝子が導入された細胞をアプロチニンを加えたフィブリンゲル中に包埋し、張力負荷をかけながら培養することにより、伸長方向（長手方向）に対して平行なコラーゲン線維と細胞の配向を呈する人工組織を形成可能なことを見出した。また、本発明者らは、予想外なことに、ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性分画の細胞が、他の分画の細胞に比較して強く腱靭帯の遺伝子発現パターンを示すことを見出した。
【００１６】
腱／靱帯様人工組織
腱／靭帯様組織とは、生体内において配向性を有するＩ型コラーゲンを主体とした、強度を有する結合組織を指すものである。例えば腱、靭帯、椎間板繊維輪、歯根膜などが挙げられる。
【００１７】
腱は、骨と筋肉を繋ぎ、筋肉の収縮を骨に伝達する組織である。腱の損傷は、外傷や加齢などにより生じるが、腱は栄養血管が乏しく、再生が困難な組織であり、再生医療など新たな腱損傷治療法の開発が望まれている。腱の構成成分は、主に細胞外基質と腱細胞である。細胞外基質は、腱細胞によって産生され、コラーゲン（主成分であるＩ型コラーゲン、マイナーコラーゲンとしてＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンなど）、プロテオグリカン（デコリン、フィブロモジュリン、ビグリカン、ルミカンなど）が含まれる。
【００１８】
靭帯は、強靭な結合組織の短い束で、骨と骨を繋ぎ関節を形作る。主成分はＩ型コラーゲンを主体とする長いコラーゲンの線維である。靭帯には関節の可動域を制限する働きもある。靭帯は、結合組織からできている点で、腱や筋膜と同様であるが、結合の仕方が異なり、靭帯は１本の骨を別の骨に繋ぎ、腱は筋肉を骨に繋ぎ、筋膜は筋肉を他の筋肉に繋ぐ。これらはすべて、人体の骨格系において見られる。靭帯は通常、自然に再生することはない。
【００１９】
椎間板線維輪は、脊椎において椎体と椎体を接合する靭帯様組織である。主成分は配向性を有するＩ型コラーゲンとプロテオグリカンであり、腱／靭帯と同様である。人間は直立二足歩行を行うため、椎間板は定常的に自重による荷重負荷を課されている。加齢や過剰な圧力を主要因とする椎間板の変形は椎間板ヘルニアとして知られている。治療法は抗炎症薬による消炎や手術による変形部位の摘出といった対処療法が実施されるのみで、現在までに椎間板を再生する方法は発見されていない。
【００２０】
歯根膜とは、歯根と歯槽骨を繋ぐ結合組織である。歯根膜には歯牙を歯槽骨に留め、咀嚼時に歯牙に課される圧力緩和する役割を有する。その主成分は腱／靭帯と同様のＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンである。歯根膜には多様な歯周組織細胞に分化能を有する未分化間葉系幹細胞が生着していることが知られており、抜歯や歯周病により歯根膜を喪失した場合の再生医療が検討されている。
【００２１】
本発明に係る腱／靱帯様人工組織は、コラーゲン分泌性の細胞を張力負荷の下で三次元培養することによって調製することができる。一つの態様において、本発明に係る腱／靱帯様人工組織は、長手方向に平行なコラーゲン線維の配向を有する。このようなコラーゲン線維の配向は、腱／靱帯様人工組織の強度にとって重要である。なお、コラーゲン線維の配向は、すべてのコラーゲン線維が厳密に長手方向に平行であることまでは要求されない。また、一つの態様において、本発明に係る腱／靱帯様人工組織は、例えば、２５ｋＰａ以上、３０ｋＰａ以上、または３５ｋＰａ以上、好ましくは少なくとも５０ｋＰａの引っ張り強さを有する。引っ張り強さの測定は、例えば、クリープメーターを用いた破断試験により行うことができる。作製した腱／靱帯様人工組織を生体に移植して機能させるには、十分な強度が必要である。本発明に係る腱／靱帯様人工組織は、ヒトまたは非ヒトに対して、作製した腱／靱帯様人工組織を移植する工程を含む、処置方法に用いられうる。本発明の方法により作製した複数の腱／靱帯様人工組織を束ねるなどすることにより、さらに強度を高めることもできる。なお、コラーゲン分泌性の細胞としては、例えば、Ｍｋｘ遺伝子を定常発現する細胞を使用することができる。このような細胞は、例えば、中胚葉系幹細胞にベクターを用いてＭｋｘ遺伝子を導入することにより調製することができる。
【００２２】
Ｍｏｈａｗｋ（Ｍｋｘ）遺伝子
Ｍｋｘ（Ｍｏｈａｗｋ、別名Ｉｒｘｌ１）は、胎生期において、腱に発現するホメオボックス型の転写因子である。Ｍｋｘは近年新たに発見された転写因子であり、非典型ホメオボックス遺伝子のＴＡＬＥスーパークラスに分類される（Anderson DM et al. (2006). Dev Dyn 235(3) p.792-801）。Ｍｋｘは、腱、筋肉、軟骨の前駆細胞、オスの生殖腺、及び腎臓の尿管芽先端で発現することが報告されている。また、Ｅ９．５、Ｅ１０．５及びＥ１１．５のマウス胚を用いた１５２０個の転写因子及び転写コファクターのホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションデータベース（ＥＭＢＲＹＳ）の構築過程で、腱で発現する転写因子としても報告されている（Yokoyama S et al. 2009 Dev Cell 17(6) p836-848）。Ｍｋｘ遺伝子を過剰発現させると、腱の主要な構成要素であるＩ型コラーゲン、コラーゲンの線維束化を促進するプロテオグリカンの発現が上昇することから、Ｍｋｘは腱の成熟過程において重要であることが示唆される。
【００２３】
ヒトＭｋｘタンパク質に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＰ＿７７５８４７として入手することができる。Ｍｋｘタンパク質は、３５２個のアミノ酸で構成されるタンパク質である。また、ヒトＭｋｘ遺伝子に関する情報は、ＮＣＢＩからアクセッション番号ＮＭ＿１７３５７６として入手可能である。ヒトＭｋｘ遺伝子は、ヒト第１０染色体上に存在し、全長で約３６５８の塩基対よりなり、７個のエキソンで構成される。マウスＭｋｘ遺伝子は、ＮＣＢＩから、アクセッション番号ＮＭ＿１７７５９５として入手することができる。
【００２４】
コラーゲン分泌性の細胞
コラーゲン分泌性の細胞としては、例えば、Ｍｋｘ遺伝子を定常発現する細胞や、内在性Ｍｋｘ遺伝子の発現が高い細胞を使用することができる。分泌されるコラーゲンには少なくともＩ型コラーゲンが含まれる。このような細胞は、例えば、中胚葉系幹細胞にベクターを用いてＭｋｘ遺伝子を導入することにより調製することができる。中胚葉系幹細胞はｉＰＳ細胞に由来するものでもよい。ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミドベクター、ファージベクターを利用することができるが、これらに限定はされず、当業者に公知の任意のベクターを適宜選択して使用することができる。細胞としては、例えば、株化された中胚葉系幹細胞（マウスＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞など）、生体由来の中胚葉系幹細胞（ヒト骨髄由来中胚葉系幹細胞など）、ｉＰＳ細胞（好ましくはヒトｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞由来の中胚葉系幹細胞を使用することができ、また、生体腱・靭帯組織より単離した細胞（ＣＤ２４、ＣＤ３４陽性腱靭帯由来細胞）などがＭｋｘ遺伝子の発現が高い細胞の一例として想定されるが、これらに限定はされず、当業者に公知の任意の細胞を適宜選択して使用することができる。細胞は例えば、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、細胞株、正常細胞、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞でありうる。本明細書において「細胞由来の細胞」と言う場合は、元の細胞自体も含まれ、例えば、「組織幹細胞由来の細胞」には「組織幹細胞」自体も含まれるものと解される。一つの実施態様においては、例えば、細胞はｉＰＳ細胞由来のＣＤ２４＋ＣＤ３４＋細胞が用いられる。ＣＤ２４＋ＣＤ３４＋細胞は、ＦＡＣＳなどの任意の手法により単離したものを使用してもよい。なお、本発明において使用されるＭｋｘ遺伝子は必ずしも野生型の配列を有している必要はなく、許容される変異（例えば、１から数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入）を有していてもよい。
【００２５】
本発明の一つの態様は、腱／靱帯様人工組織の製造方法であって、（ａ）ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞をゲル中に包埋する工程、（ｂ）ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養する工程を含む方法に関する。細胞は、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞でありうる。本発明者らは、予想外なことに、ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性分画の細胞が、他の分画の細胞に比較して強く腱靭帯の遺伝子発現パターンを示すことを見出した。ＣＤ２４は、ほとんどのＢリンパ球および分化中の神経芽細胞の表面に発現しているシアロ糖タンパク質である。このタンパク質はまた、好中球および好中球前駆細胞においても発現している。ＣＤ３４タンパク質は、一回膜貫通型シアロムチンタンパク質ファミリーのメンバーであり、初期の造血組織および血管関連組織において発現を示す。
【００２６】
また、本発明の一つの態様では、腱／靱帯様人工組織の製造過程において、細胞を中胚葉系幹細胞へ分化誘導することがさらに行われる。中胚葉系幹細胞への分化誘導は、例えば、文献（Takashima Y et al. 2007 Cell. 129(7) 1377-88）記載の方法を参考にして、レチノイン酸を用いて行うことができる。
【００２７】
また、本発明の一つの態様では、ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞を単離することがさらに行われる。単離は例えば、ＦＡＣＳを用いて行うことができるが、これに限定はされない。フローサイトメトリーには、例えば、ベックマン・コールター社のＭｏＦｌｏ  ＸＤＰを使用することができる。なお、ＦＡＣＳのゲート条件は、必要とする細胞の数、純度に応じて適当に調整することができる。
【００２８】
細胞組成物
本発明の一つの態様は、ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である中胚葉系幹細胞を含む、細胞組成物に関する。このような細胞は、本発明に従う腱／靱帯様人工組織の製造方法において好適に使用することができる。本細胞組成物は、少なくとも１０５個、例えば、１０６個以上、好ましくは１０７個以上、より好ましくは１０８個以上、さらに好ましくは１０９個以上の中胚葉系幹細胞を含む。なお、本細胞組成物には中胚葉系幹細胞以外の細胞が混入していても良いが、中胚葉系幹細胞の純度が高いことが好ましい。本細胞組成物における中胚葉系幹細胞の純度は、少なくとも５０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、９０％以上、または９５％以上である。本細胞組成物に含まれる細胞は、好ましくはヒトの細胞であるが、特に限定はされない。本発明の一つの態様では、中胚葉系幹細胞を含む細胞組成物は１つの容器に納められている。
【００２９】
本細胞組成物中に含まれる中胚葉系幹細胞は、レトロウイルスベクターなどのベクターを用いた遺伝子の導入や、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのゲノム編集技術等によって遺伝子を改変した細胞であってもよい。中胚葉系幹細胞はｉＰＳ細胞由来の細胞であってもよい。例えば、本細胞組成物に含まれる中胚葉系幹細胞は、Ｍｋｘ遺伝子の発現が増強されていてもよい。
【００３０】
また、本発明の一つの態様は、少なくとも５×１０５個、例えば、１０６個以上、好ましくは１０７個以上、より好ましくは１０８個以上、さらに好ましくは１０９個以上の中胚葉系幹細胞の封入されたバイアルまたは容器に関する。バイアルまたは容器は、ガラス製またはプラチック製でありうる。バイアルまたは容器中の細胞は、凍結状態または半凍結状態であってもよい。
【００３１】
細胞培養
本発明に係る腱／靱帯様人工組織を製造する際には、細胞をゲル中に包埋して三次元培養することができる。ゲルにはフィブリンゲルを使用することができる。フィブリンゲルは、好ましくはプロテアーゼ阻害剤を含有する。プロテアーゼ阻害剤の一例としてはプラスミン阻害剤やエラスチン阻害剤が挙げられる。プラスミン阻害剤としては、例えば、アプロチニン、α2-antiplasmin、ε-アミノカプロン酸などを使用することができる。エラスチン阻害剤としては、例えば、Elastatinalなどを使用することができる。アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤をゲル中に含有させることにより、細胞培養時・生体移植時におけるゲルの強度を維持することができる。アプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤の濃度は例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．３ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【００３２】
本発明に係る腱／靱帯様人工組織を製造する際には、細胞の三次元培養を張力負荷をかけながら行うことができるが、そのため、細胞培養に用いるゲルには、張力負荷に耐えうる強度を有していることが要求される。張力負荷に耐えうる強度を有するゲルは、例えば、本願の実施例に記載のように、フィブリノゲン、トロンビン、およびアプロチニンを混合して、アプロチニンを含有するフィブリンゲルを調製することにより得ることができるが、これに限定はされない。一つの実施態様においては、例えば、コラーゲンゲルが使用される。本明細書においては、張力負荷（伸展張力）をかけながら細胞を（例えばハイドロゲル内において）三次元培養する系を「三次元メカノシグナル細胞培養系」を呼ぶ。張力負荷は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができるが、例えば、シェルパプロ（メニコンライフサイエンス）、ＳＴＢ−１４０（株式会社ストレックス）を使用して行うことができる。張力は例えば、１日あたり０．２〜２０％の伸展率、好ましくは少なくとも２％の伸展率とすることができる。伸展率は三次元培養チャンバーの伸展前状態に比較した伸展後のチャンバー幅の伸び率として定義される。より具体的には、伸展率（％）＝（伸展後チャンバー幅−伸展前チャンバー幅）／（伸展前チャンバー幅×１００）により算出される。細胞のメカノシグナル培養時間は例えば、少なくとも８ｈｏｕｒ／ｄａｙであり、好ましくは１６ｈｏｕｒ／ｄａｙである。細胞の培養期間は、典型的には７〜３０日である。伸展負荷は伸展率を１日ごとに徐々に高めながら実施するのが好ましい。
【００３３】
脱細胞化処理
三次元メカノシグナル細胞培養により作製した腱／靱帯様人工組織には、それに含まれる生きた細胞を排除するために脱細胞化処理を行うことができる。脱細胞化処理は、当業者に公知の任意の手法により行うことができるが、例えば、高静水圧処理、界面活性剤処理、マイクロ波照射などにより行うことができる。
【００３４】
培地組成物
本発明の一つの態様は、フィブリノゲンとアプロチニンを含有する、腱／靱帯様人工組織の製造に用いるための三次元細胞培養用培地組成物に関する。例示的な製造方法の詳細は上述のとおりである。三次元細胞培養用の培地組成としては、少なくともフィブリノゲン、トロンビンを含有するものであり、好ましくはプロテアーゼ阻害剤を含有するものである。三次元細胞培養用培地組成物は、例えば、１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、および／または０．０１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌのトロンビン、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのフィブリノゲン、０．３ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、および／または０．１ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのトロンビンを含有しうる。本発明の三次元細胞培養用培地組成物は、ゲルの強度を高めるための追加の成分を含んでいてもよい。また、本発明の三次元細胞培養用培地組成物は、細胞の培養に用いられる一般的な培地成分をさらに含んでいてもよい。本発明の一つの態様は、フィブリノゲンとアプロチニン、場合によりさらにプロテアーゼ阻害剤を含有する、腱／靱帯様人工組織の製造に用いるためのキットを含む。
【００３５】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００３６】
例１：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を用いた人工腱靭帯様組織作製
レトロウイルスベクターを用いて、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ融合遺伝子を強制発現させた。薬剤選択によりＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞のみを濃縮した後、フィブリノゲン（ＳＩＧＭＡ，Ｆ３８７９−１Ｇ）、トロンビン（ＳＩＧＭＡ，Ｔ６８８４−２５０ＵＮ）、アプロチニン（Ｗａｋｏ，０１０−２３５８１）をそれぞれ８．３ｍｇ／ｍｌ、３３Ｕ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるよう調整し、これらの混合液を用いてＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞（１×１０７ｃｅｌｌｓ）を懸濁した。比較対象としては、レトロウイルスベクターを用いてＣ３Ｈ１０Ｔ１／２においてＶｅｎｕｓを強制発現させ、薬剤選択した細胞を用いた。【００３７】
ゲル、細胞の混合液を三次元伸展培養用チャンバー（ストレックス，ＳＴＢ−３．５ＧＳ）に注入し、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分インキュベートし、ゲル化させた。ゲル化後、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ、１ｖ／ｖ％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＭＥＭα培地をチャンバーに加えた。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で１８時間インキュベートし、ゲルの強度を高めた後、細胞伸展装置（ストレックス，ＳＴＢ−１４０）を用いて伸展負荷を課した。伸展負荷は伸展率を徐々に高めながら一週間実施した。具体的には２％（ｄａｙ１）、４％（ｄａｙ２）、５％（ｄａｙ３）、８％（ｄａｙ４）、１０％（ｄａｙ５−７）であり、伸展時間は１８時間／ｄａｙである。【００３８】
作製した人工腱靭帯様組織を図１に示す（矢印参照）。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において、人工腱靭帯様組織が作製される（図１）。【００３９】
人工腱靭帯様組織の縦断面を電子顕微鏡（日立，Ｓ−４５００）において観察した。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において伸展方向に水平なコラーゲン線維束が確認された（図２、矢印参照）。【００４０】
クリープメーター（山電，ＲＥ−３３００５Ｂ）を用いて人工腱靭帯様組織の強度負荷試験を実施した。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織においては破断荷重が５２ｋＰａであった一方、コントロール群では３１ｋＰａであった（図３）。【００４１】
例２：コラーゲンゲルを用いたＭｋｘ＋メカノストレスによる人工腱組織形成
レトロウイルスベクターを用いて、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ融合遺伝子を強制発現させた。薬剤選択によりＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞のみを濃縮した後、コラーゲンゲル（新田ゼラチン，Cellmatrix Type1-A）に対し、１０ｖ／ｖ％Collagen neutralize buffer（新田ゼラチン，Cellmatrix Type1-A）、１０ｖ／ｖ％  １０×ＭＥＭα（gibco 12000-063を規定濃度の１０倍となるようＤＤＷに懸濁し作製）、１０ｖ／ｖ％  ＦＢＳ、１ｖ／ｖ％  １００×ＮＥＡＡ（gibco 11140-050）、１ｖ／ｖ％  １００×ＧｌｕｔａＭＡＸ（gibco 35050-061）、１ｖ／ｖ％  １００×Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（gibco 15140-122）をそれぞれ上記の最終濃度となるよう添加した。さらに文献（Laflamme,MA. et al. 2007 Nat Biotechnol. 25(9) 1015-24）を参考とし、三次元培養時の細胞の生存能を高める目的で以下、Z-VAD-FMK（G723A, PROMEGA）、Bcl-Xl BH4 4-23（197217-1MG, Calbiochem）、Ciclosporin A（039-16301, wako）、Murine IGF-1（250-19, PeoroTech）、Pinacidil monohydrate（sc-203198, ChemCruz）をそれぞれ１００ｍＭ、５０ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｍＭの最終濃度となるよう調整した。これらの混合液を用いてＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ）を懸濁した。比較対象としては、レトロウイルスベクターを用いてＣ３Ｈ１０Ｔ１／２においてＶｅｎｕｓを強制発現させ、薬剤選択した細胞を用いた。【００４２】
ゲル、細胞の混合液を三次元伸展培養用チャンバー（ストレックス，ＳＴＢ−３．５ＧＳ）に注入し、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分インキュベートし、ゲル化させた。ゲル化後、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ、１ｖ／ｖ％ペニシリン／ストレプトマイシン、１ｖ／ｖ％  １００×ＧｌｕｔａＭＡＸ（gibco 35050-061）、１ｖ／ｖ％  １００×ＮＥＡＡ（gibco 11140-050）、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（gibco 21985-023）含有ＭＥＭα培地をチャンバーに加えた。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で１８時間インキュベートし、ゲルの強度を高めた後、細胞伸展装置（メニコンライフサイエンス，Shellpa Pro）を用いて伸展負荷を課した。伸展負荷は伸展率を徐々に高めながら一週間実施した。具体的には２％（ｄａｙ１）、４％（ｄａｙ２）、５％（ｄａｙ３）、８％（ｄａｙ４）、１０％（ｄａｙ５−７）であり、伸展時間は１８時間／ｄａｙである。【００４３】
作製した人工腱靭帯様組織を示す。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において、人工腱靭帯様組織が作製される（図４）。【００４４】
人工腱靭帯様組織に対し、高静水圧法を用いて脱細胞化を実施した。具体的には冷間等方圧加工装置（神戸鉄鋼，Ｄｒ．ＣＨＥＦ）を用いて１００００気圧、１５分、１０℃にて加圧した。加圧後、ＤＮａｓｅ溶液（１ｖ／ｖ％  １０×DNase I Buffer（タカラバイオ，２２７０Ａ），１０Ｕ／ｍｌ  Recombinant DNase I（RNase-free）（タカラバイオ，２２７０Ａ），１ｖ／ｖ％ペニシリン／ストレプトマイシン）にて３日間洗浄し細胞核を除去した。その後、生理食塩水にてさらに３日間洗浄しＤＮａｓｅ溶液を除去した。【００４５】
人工腱靭帯様組織に対し、文献（Nam,K. et al. 2009 J Artif Organs.12(1) 47-54）を参考とし生体内での人工組織の安定性を高める目的で脱細胞人工組織の架橋を実施した。架橋反応液は３０％ｖ／ｖ  ｅｔｈａｎｏｌ／ＤＤＷ，７０ｍＭ  ＥＤＣ（wako 348-03631），７０ｍＭ  ＮＨＳ（wako 089-04032）にて２４ｈ（４℃ローテーターにて）反応を実施した。その後、ＤＤＷにて１日間洗浄し反応液を除去した。【００４６】
作製した脱細胞架橋人工腱靭帯様組織を図５に示す。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において、脱細胞架橋人工腱靭帯様組織が作製される（図５）。【００４７】
クリープメーター（山電，ＲＥ−３３００５Ｂ）を用いて人工腱靭帯様組織の強度負荷試験を実施した。陽性対照サンプルとしてマウス新生児１５日目由来のアキレス腱（P15 mouse Achilles tendon）を用いた。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織（Venus-Mkx stretch+）においては破断荷重（ultimate tensile strength）が１１３ｋＰａであった一方、伸展負荷を実施したコントロール群（Venus stretch+）では８４ｋＰａであった。また、伸展負荷を実施しないＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いた人工腱靭帯様組織（Venus-Mkx stretch-）においては破断荷重が１０３ｋＰａであった一方、伸展負荷を実施したコントロール群（Venus stretch-）では破断荷重が８４ｋＰａであった（図６および表１）。【００４８】
【表１】
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【００４９】
例３：マウスｉＰＳ細胞の利用
マウス胚性線維芽細胞に対し、文献（Nakagawa M et al. 2008 Nat Biotechnol. 26(1) 101-6）記載の方法を参考にしＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４をレトロウイルスにて導入しマウスｉＰＳ細胞を樹立した。樹立したｉＰＳ細胞に対し、文献（Takashima Y et al. 2007 Cell. 129(7) 1377-88）記載の方法を参考にし、レチノイン酸を用いて中胚葉系幹細胞への分化誘導を行った。分化誘導により作製したｉＰＳ細胞由来の中胚葉系幹細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣ）に対し、レトロウイルスベクターを用いて、Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ融合遺伝子を強制発現させ、薬剤選択によりＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣのみを濃縮した。樹立したＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣに対し、文献（Rodeheffer,MS. et al. 2008 Cell.135(17) 240-249）を参考としフローサイトメトリー（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ，ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ）を用いて抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ３４抗体を用いてＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性分画を濃縮し、組織幹細胞の単離を行った（図７）。【００５０】
Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣより単離したＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性分画は他の分画に比較して均一な紡錘形の形態を示す（図８）。また、ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性分画は他の分画に比較して強く腱靭帯の遺伝子発現パターンを示すことをｑＲＴ−ＰＣＲ法により明らかとした（図９）。【００５１】
コラーゲンゲル（新田ゼラチン，Cellmatrix Type1-A）に対し、１０ｖ／ｖ％  Collagen neutralize buffer（新田ゼラチン，Cellmatrix Type1-A）、１０ｖ／ｖ％  １０×ＭＥＭα（gibco 12000-063を規定濃度の１０倍となるようＤＤＷに懸濁し作製）、１０ｖ／ｖ％  ＦＢＳ、１ｖ／ｖ％  １００×ＮＥＡＡ（gibco 11140-050）、１ｖ／ｖ％  １００×ＧｌｕｔａＭＡＸ（gibco 35050-061）、１ｖ／ｖ％  １００×Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（gibco 15140-122）をそれぞれ上記の最終濃度となるよう添加した。さらに文献（Laflamme,MA. et al. 2007 Nat Biotechnol. 25(9) 1015-24）を参考とし、三次元培養時の細胞の生存能を高める目的で以下、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（G723A, PROMEGA），Ｂｃｌ−Ｘｌ  ＢＨ４  ４−２３（197217-1MG, Calbiochem），Ciclosporin A（039-16301, wako），Ｍｕｒｉｎｅ  ＩＧＦ−１（250-19, PeoroTech），Pinacidil monohydrate（sc-203198, ChemCruz）をそれぞれ１００ｍＭ，５０ｎＭ，２００ｎＭ，１００ｎｇ／ｍｌ，５０ｍＭの最終濃度となるよう調整した。これらの混合液を用いてＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣより単離したＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性分画（５×１０５ｃｅｌｌｓ）を懸濁した。比較対象としては、Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣより単離したＣＤ２４，ＣＤ３４共陰性分画を用いた。【００５２】
ゲル、細胞の混合液を三次元伸展培養用チャンバー（ストレックス，ＳＴＢ−３．５ＧＳ）に注入し、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分インキュベートし、ゲル化させた。ゲル化後、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ、１ｖ／ｖ％ペニシリン／ストレプトマイシン１ｖ／ｖ％  １００×ＧｌｕｔａＭＡＸ（gibco 35050-061）、１ｖ／ｖ％  １００×ＮＥＡＡ（gibco 11140-050）５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（gibco 21985-023）含有ＭＥＭα培地をチャンバーに加えた。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で１８時間インキュベートし、ゲルの強度を高めた後、細胞伸展装置（メニコンライフサイエンス，Shellpa Pro）を用いて伸展負荷を課した。伸展負荷は伸展率を徐々に高めながら一週間実施した。具体的には２％（ｄａｙ１）、４％（ｄａｙ２）、５％（ｄａｙ３）、８％（ｄａｙ４）、１０％（ｄａｙ５−７）であり、伸展時間は１８時間／ｄａｙである。【００５３】
作製した人工腱靭帯様組織を図１０に示す。ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣを用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において、人工腱靭帯様組織が作製された（図１０）。【００５４】
ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣを用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において、人工腱靭帯様組織の縦断面を、例えば、電子顕微鏡（日立，Ｓ−４５００）によって観察することができる。【００５５】
ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織に対し、高静水圧法を用いて脱細胞化を実施した。具体的には冷間等方圧加工装置（神戸鉄鋼，Ｄｒ．ＣＨＥＦ）を用いて１００００気圧、１５分、１０℃にて加圧した。加圧後、ＤＮａｓｅ溶液（１ｖ／ｖ％  １０×DNase I Buffer（タカラバイオ，２２７０Ａ），１０Ｕ／ｍｌ  Recombinant DNase I（RNase-free）（タカラバイオ，２２７０Ａ），１ｖ／ｖ％ペニシリン／ストレプトマイシン）にて３日間洗浄し細胞核を除去した。その後、生理食塩水にてさらに３日間洗浄しＤＮａｓｅ溶液を除去した。【００５６】
ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織に対し、文献（Nam,K. et al. 2009 J Artif Organs.12(1) 47-54）を参考とし生体内での人工組織の安定性を高める目的で脱細胞人工組織の架橋を実施した。架橋反応液は３０％ｖ／ｖ  ｅｔｈａｎｏｌ／ＤＤＷ，７０ｍＭ  ＥＤＣ（wako 348-03631），７０ｍＭ  ＮＨＳ（wako 089-04032）にて２４ｈ（４℃ローテーターにて）反応を実施した。その後、ＤＤＷにて１日間洗浄し反応液を除去した。【００５７】
作製したＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来脱細胞架橋人工腱靭帯様組織を示す。Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において、脱細胞架橋人工腱靭帯様組織が作製された（図１２）。【００５８】
ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織の強度負荷試験は、例えば、クリープメーター（山電，ＲＥ−３３００５Ｂ）を用いて実施する。陽性対照サンプルとしてマウス新生児１５日目由来のアキレス腱を用いる。【００５９】
例４：人工腱靭帯様組織の成体ラットへの移植
ラットアキレス腱に対し、より質量が大きく運動における寄与が大きいと考えられる腓腹筋側のアキレス腱の中心部5mmほどを全切除し、損傷モデルを作成した。左後肢腓腹筋側アキレス腱損傷モデルに対して脱細胞化処理、核洗浄を実施したＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織を７−０縫合糸を用いて腓腹筋側アキレス腱全切除部に移植した（図１２）。生体移植実験後１週間にてラットを全身麻酔下とし、マイクロフォーカスＸ線装置（Ｓｈｉｍａｚｕ社，ｉｎｓｐｅＸｉｏ  ＳＭＸ−１００ＣＴ）を用いて管電圧１００ｋＶ，管電流１５０μＡの条件において損傷部の非侵襲性画像解析を実施した。ｓｈａｍ群（損傷モデル群）においてはアキレス腱におけるＸ線の透過が低吸収となっている部位が認められ、これは損傷部において腱組織とはＸ線の透過度が異なる間質組織が充填された結果であると推測できる。一方でＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織の移植群はコントロール群（侵襲なし群）同様の均一なＸ線の透過度を示し、このことはＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ由来人工腱靭帯様組織移植群においては修復過程においてＸ線に対してコントロール群と同様の物理的特性を有する組織構造が戻りつつある可能性を示唆するものであった（図１３）。【００６０】
成体ラットにおいて人工腱靭帯様組織が定着したことを、例えば、移植した脱細胞組織中のラット由来の遊走細胞の存在から確認する。さらに、トレッドミル装置を用いてラットに運動負荷を課し、人工腱靭帯様組織移植群と対照群においてハイスピードカメラ（ロジカルプロダクト社，Sports CoachingCAM）による歩行解析を行い、ラット後脚の可動範囲とラットの歩行距離を定量的に解析する。【００６１】
例５：ヒトｉＰＳ細胞の利用
理化学研究所バイオリソースセンターよりヒトｉＰＳ細胞２５３Ｇ１の分与を受ける。入手したｉＰＳ細胞に対し、文献(Menendez L et al. 2013 Nat Protoc. 8(1) 203-12) 記載の方法を参考にし、中胚葉系幹細胞への分化誘導を行う。分化誘導により作製したｉＰＳ細胞由来の中胚葉系幹細胞（ｉＰＳ−ＭＳＣ）に対し、レトロウイルスベクターを用いて、Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ融合遺伝子を強制発現させ、薬剤選択によりＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣのみを濃縮する。樹立したＶｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣに対し、フローサイトメトリー（BECKMAN COULTER, MoFlo XDP）を用いて抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ３４抗体によりＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性陽性分画を濃縮し、ｉＰＳ細胞の純化と均一化を行う。【００６２】
フィブリノゲン（ＳＩＧＭＡ，Ｆ３８７９−１Ｇ）、トロンビン（ＳＩＧＭＡ，Ｔ６８８４−２５０ＵＮ）、アプロチニン（Ｗａｋｏ，０１０−２３５８１）をそれぞれ８．３ｍｇ／ｍｌ、３３Ｕ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるよう調整し、これらの混合液を用いてＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣ（１×１０７ｃｅｌｌｓ）を懸濁する。比較対象としては、レトロウイルスベクターを用いてｉＰＳ−ＭＳＣにおいてＶｅｎｕｓを強制発現させ薬剤選択した細胞、もしくはＣＤ２４，ＣＤ３４共陰性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣを用いる。【００６３】
ゲル、細胞の混合液を三次元伸展培養用チャンバー（ストレックス，ＳＴＢ−３．５ＧＳ）に注入し、３７℃、５％ＣＯ２下で３０分インキュベートし、ゲル化させる。ゲル化後、１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ、１ｖ／ｖ％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＭＥＭα培地をチャンバーに加える。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で１８時間インキュベートし、ゲルの強度を高めた後、細胞伸展装置（メニコンライフサイエンス，シェルパプロ）を用いて伸展負荷を課す。伸展負荷は伸展率を徐々に高めながら一週間実施する。具体的には２％（ｄａｙ１）、４％（ｄａｙ２）、５％（ｄａｙ３）、８％（ｄａｙ４）、１０％（ｄａｙ５−７）であり、伸展時間は１８時間／ｄａｙとする。【００６４】
ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現ｉＰＳ−ＭＳＣを用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において、人工腱靭帯様組織が作製される。【００６５】
人工腱靭帯様組織の縦断面を電子顕微鏡（日立，Ｓ−４５００）において観察する。ＣＤ２４，ＣＤ３４共陽性Ｖｅｎｕｓ−Ｍｋｘ強制発現細胞を用いて伸展負荷を実施した人工腱靭帯様組織において伸展方向に水平なコラーゲン線維束が確認される。【００６６】
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明者らは、既存の培養系では観察されたことのない、伸展方向に水平な細胞とコラーゲン線維の配向をもつ人工組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製することに成功した。本件発明は、腱／靱帯の再生医療的なアプローチを可能とするものであり、腱／靱帯を損傷した患者の治療において極めて有用となりうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月16日(2019.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腱／靱帯様人工組織の製造方法であって、（ａ）コラーゲン分泌性の細胞を張力負荷に耐えうる強度を有するゲル中に包埋する工程、（ｂ）ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養する工程を含み、
コラーゲン分泌性の細胞がＭｋｘ遺伝子を定常発現する細胞であり、
張力負荷が少なくとも１日あたり２％の伸展率であり、伸展率を高めながら細胞を培養することを特徴とする、方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
コラーゲン分泌性の細胞がＭｋｘ遺伝子をベクターを用いて導入した細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、細胞株、正常細胞、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項１または３記載の方法。
【請求項５】
細胞がＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である、請求項１および３〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１および３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
ゲルがフィブリンゲルである、請求項１および３〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ゲルがプラスミン阻害剤を含有する、請求項１および３〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ゲルがアプロチニンを含有する、請求項１および３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
さらに（ｃ）脱細胞化処理を行う工程を含む、請求項１および３〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
脱細胞化処理がマイクロ波照射を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
腱／靱帯様人工組織の製造方法であって、（ａ）ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞をゲル中に包埋する工程、（ｂ）ゲルに張力負荷をかけながら細胞を培養する工程を    含み、
該細胞が、Ｍｋｘ遺伝子を定常発現する中胚葉系幹細胞である、方法。
【請求項２２】
細胞が、組織幹細胞由来の細胞、ＥＳ細胞由来の細胞、またはｉＰＳ細胞由来の細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
細胞を中胚葉系幹細胞へ分化誘導する工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である細胞を単離する工程をさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
Ｍｋｘ遺伝子を定常発現する、ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である中胚葉系幹細胞を含む、腱／靱帯様人工組織の製造に用いるための、細胞組成物。
【請求項２６】
ＣＤ２４陽性かつＣＤ３４陽性である中胚葉系幹細胞の純度が少なくとも８５％である、請求項２５記載の細胞組成物。
【請求項２７】
少なくとも５×１０５個の細胞を含む、請求項２５または２６記載の細胞組成物。
【請求項２８】
中胚葉系幹細胞がｉＰＳ細胞に由来する細胞である、請求項２５〜２７のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項２９】
中胚葉系幹細胞がヒトの細胞である、請求項２５〜２８のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項３０】
中胚葉系幹細胞が遺伝子改変細胞である、請求項２５〜２９のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項３１】
凍結されている、請求項２５〜３０のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項３２】
１つの容器に納められている、請求項２５〜３１のいずれか一項記載の細胞組成物。
【請求項３３】
細胞が、Ｍｋｘ遺伝子の発現が増強された中胚葉系幹細胞である、請求項２１〜２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、Ｍｋｘ遺伝子をベクターを用いて導入した細胞である、請求項２１〜２４および３３のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項３４記載の方法。
【国際調査報告】
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