(57)【要約】  本発明は、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養し、単胞性脂肪細胞への分化を誘導することを含む、単胞性脂肪細胞の製造方法、該高分子化合物が多糖類、好ましくはグルクロン酸部位を含む多糖類、より好ましくは脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩である、当該方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養し、単胞性脂肪細胞への分化を誘導することを含む、単胞性脂肪細胞の製造方法。
【請求項２】
該間葉系細胞が、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞、又は線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
該高分子化合物が多糖類である、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
該多糖類がグルクロン酸部位を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
該多糖類が脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
該多糖類が脱アシル化ジェランガム又はその塩であり、該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が0.01〜0.05％（w/v）である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
該多糖類がダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩であり、該培地組成物中のダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩の濃度が0.01〜0.5％（w/v）である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
該培地組成物が、2価金属カチオンを含有する、請求項1〜7の何れか1項記載の方法。
【請求項９】
2価金属カチオンがカルシウムイオンである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
該培地組成物が脂肪細胞分化誘導因子を含有する、請求項1〜9の何れか1項記載の方法。
【請求項１１】
脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、プロスタグランジン、長鎖脂肪酸、トリヨードチロニン、及びPPARγ作動剤からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
シクロオキシゲナーゼ阻害剤がインドメタシンである、請求項12又は13記載の方法。
【請求項１５】
脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンである、請求項15又は16記載の方法。
【請求項１８】
単胞性脂肪細胞がUCP-1陽性である、請求項1〜17の何れか1項記載の方法。
【請求項１９】
浮遊培養により得られた細胞懸濁液中の該高分子化合物濃度を、該間葉系細胞を浮遊させることができない濃度にまで低下させ、浮遊状態を維持する単胞性脂肪細胞を回収することを更に含む、請求項1〜18の何れか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞から白色脂肪細胞及びベージュ脂肪細胞への分化を誘導する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命科学の分野では、iPS細胞やES細胞等の多能性幹細胞や間葉系幹細胞等を培養して目的の臓器細胞へ分化誘導を行い、得られた細胞を移植する研究が盛んである。脂肪細胞を移植することも研究されている。脂肪細胞の移植は、例えば、乳癌治療後の乳房再形成や美容のための顔のしわ取りなど多岐にわたり検討されている。また最近では、遺伝子変異患者に対し、正常遺伝子産物を産生できる遺伝子ベクターを前駆脂肪細胞に組み込み、遺伝子治療として移植する方法も検討が開始されている。この背景として、脂肪細胞の移植は、iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞と比較して、脂肪細胞自身が低増殖能であるために癌化しにくく、かつ皮下などに移植するため移植手術が容易であるなどのメリットがある。そのため、脂肪細胞の移植に対するハードルは他の細胞治療と比較して低いと考えられている。【０００３】
一方、最近の検討から、脂肪細胞はトリグリセライドなどの脂質を多く含んでいるだけでなく、生体に対し重要な内分泌臓器としての役割を有する点が着目されている。例えば、食欲を抑制するレプチンや抗糖尿病作用を有するアディポネクチン、また炎症をつかさどるTNF-alpha等が、脂肪細胞が分泌する因子として挙げられる。そのため脂肪細胞は、メタボリックシンドロームに対する研究、糖尿病や脂質などに対する創薬研究、健康食品の開発等に多く用いられている。最近では、脂質をため込む白色脂肪細胞だけでなく、脂肪細胞自身が熱を産生することで体内の過剰な栄養を効率的に熱に変えるベージュ脂肪細胞の研究も着目されている。ベージュ脂肪細胞は、白色脂肪細胞からの変化、又は前駆脂肪細胞からの分化により、生体内で存在するものと考えられる。このベージュ脂肪細胞の研究は、最近特に着目されており、ベージュ脂肪細胞への分化誘導を促す医薬や健康食品の研究が盛んである。またこのベージュ脂肪細胞を工業的に生産し移植治療に用いることで、糖尿病や肥満などの代謝性疾患を治療する試みが検討されている。【０００４】
そのような中で、これまで実験的に用いられてきた脂肪細胞は、ヒト前駆脂肪細胞や3T3-L1細胞をシャーレやプレート中で単層的に培養し、培地を分化誘導培地に交換して更に培養することにより、脂肪細胞様に分化させる方法で作製されていた。この方法で分化させた細胞は、シャーレやプレートに接着した状態であり、スピンドル様の形状を示す。また、多数の小さな脂肪滴が細胞内に蓄積する多胞性の形状を示す。一方、生体から分離した脂肪細胞は、球状を呈し、1つの細胞内に大きな脂肪滴を一つ含む単胞性であり、さらに培地中に浮遊する性質を有する。そのため、インビトロで分化させた脂肪細胞と生体由来の脂肪細胞は明らかにいろいろな点で異なっており、先述した研究を発展させる上で大きな障害となっている。【０００５】
さらにこの単層培養における制約は、生体様の白色脂肪細胞の調製のみならず、ベージュ脂肪細胞の調製、研究および生産をも阻害している。【０００６】
本発明者らは、液体培地中の粘度を実質的に高めることなく、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能な培地組成物の開発に成功している（特許文献1、2）。また、この培地組成物を用いた赤血球の製造方法（特許文献3）、血管平滑筋細胞の培養方法（特許文献4）、担癌哺乳動物モデルの作成方法（特許文献5）、癌細胞と癌周囲細胞を共培養する方法（特許文献6）等が報告されている。更に、細胞回収性が改善された培地組成物が報告されている（特許文献7）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2014/017513号
【特許文献２】米国特許出願公開第2014/0106348号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第2016/0060601号明細書
【特許文献４】国際公開第2016/121896号
【特許文献５】国際公開第2016/125884号
【特許文献６】国際公開第2017/057599号
【特許文献７】国際公開第2017/154952号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体から分離した脂肪細胞と同様の形質を有する白色脂肪細胞をインビトロで分化誘導する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ベージュ脂肪細胞をインビトロで分化誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意工夫を重ねた結果、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞等の脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、脱アシル化ジェランガム等の、アニオン性の官能基を有し、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する高分子化合物を含有する脂肪細胞分化誘導培地中で浮遊培養すると、該間葉系細胞が、生体から分離した脂肪細胞と同様に、球状を呈し、1つの細胞内に大きな脂肪滴を1つ含む単胞性の脂肪細胞（白色脂肪細胞）へと分化することを見出した。この脂肪細胞は、細胞内脂肪滴のため、培地中に自立で浮遊したため、脱アシル化ジェランガムの濃度を徐々に低下させることで、浮遊してくる白色脂肪細胞を容易に単離することができた。この白色脂肪細胞を、更に長期間培養すると、熱産生を促すことでエネルギー消費を司るベージュ脂肪細胞マーカー UCP-1の発現が亢進し、ベージュ脂肪細胞様の形質を呈した。本発明者らは、以上の知見に基づき、更に検討を加え、本発明を完成した。【００１０】
即ち、本発明は、以下に関する。
［1］脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物を含有する、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物中で浮遊培養し、単胞性脂肪細胞への分化を誘導することを含む、単胞性脂肪細胞の製造方法。
［2］該間葉系細胞が、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞、又は線維芽細胞である、［1］記載の方法。
［3］該高分子化合物が多糖類である、［1］又は［2］記載の方法。
［4］該多糖類がグルクロン酸部位を含む、［3］記載の方法。
［5］該多糖類が脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩である、［4］記載の方法。
［6］該多糖類が脱アシル化ジェランガム又はその塩であり、該培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度が0.01〜0.05％（w/v）である、［5］記載の方法。
［7］該多糖類がダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩であり、該培地組成物中のダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩の濃度が0.01〜0.5％（w/v）である、［5］記載の方法。
［8］該培地組成物が、2価金属カチオンを含有する、［1］〜［7］の何れかに記載の方法。
［9］2価金属カチオンがカルシウムイオンである、［8］記載の方法。
［10］該培地組成物が脂肪細胞分化誘導因子を含有する、［1］〜［9］の何れかに記載の方法。
［11］脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、プロスタグランジン、長鎖脂肪酸、トリヨードチロニン、及びPPARγ作動剤からなる群から選択される少なくとも1つの因子である、［10］記載の方法。
［12］脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤を含む、［11］記載の方法。
［13］グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、［12］記載の方法。
［14］シクロオキシゲナーゼ阻害剤がインドメタシンである、［12］又は［13］記載の方法。
［15］脂肪細胞分化誘導因子が、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤を含む、［11］記載の方法。
［16］グルココルチコイド受容体作動剤がデキサメタゾンである、［15］記載の方法。
［17］cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤が3-イソブチル-1-メチルキサンチンである、［15］又は［16］記載の方法。
［18］単胞性脂肪細胞がUCP-1陽性である、［1］〜［17］の何れかに記載の方法。
［19］浮遊培養により得られた細胞懸濁液中の該高分子化合物濃度を、該間葉系細胞を浮遊させることができない濃度にまで低下させ、浮遊状態を維持する単胞性脂肪細胞を回収することを更に含む、［1］〜［18］の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、生体から分離した脂肪細胞と同様に、1つの細胞内に大きな脂肪滴を1つ含む単胞性の白色脂肪細胞をインビトロで製造することができる。また、本発明によれば、創薬研究のみならず、移植による糖尿病や肥満に対する治療への用途が期待できるベージュ様脂肪細胞をインビトロで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】培養開始後12日目における各細胞の形態を示す。
【図２】培養開始後30日目における分化脂肪細胞のoil Red染色像を示す。
【図３】培養開始後36日目における分化脂肪細胞のoil Red染色像を示す。
【図４】培養開始後39日目における細胞の形態を示す。
【図５】培養開始後30日目における細胞の形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（I）本発明に用いる培地組成物
本発明に用いられる培地組成物は、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な液状の培地組成物である。当該培地組成物は、浮遊状態を維持したまま、培養対象の細胞（即ち、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞）を培養することを可能にする。当該培地組成物は、WO2014/017513 A1及びUS2014/0106348 A1の記載に従い、調製することが可能である。以下、当該培地組成物を培地組成物Iと称することがある。
【００１４】
本発明における細胞又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞又は組織が接着しない状態（非接着）であることをいう。本発明において、細胞又は組織を培養する際、液状の培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該培地組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞又は組織が当該培地組成物中で均一に分散しかつ浮遊状態にあることを「浮遊静置」といい、当該状態で細胞又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、5分以上、1時間以上、24時間以上、48時間以上、7日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。
【００１５】
培地組成物Iは、細胞又は組織の培養が可能な温度範囲（例えば、0〜40℃）の少なくとも1点において、細胞又は組織の浮遊静置が可能である。本発明に用いる培地組成物は、好ましくは25〜37℃の温度範囲の少なくとも1点において、最も好ましくは37℃において、細胞又は組織の浮遊静置が可能である。
【００１６】
浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞（即ち、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞）を、2×104 cells/mlの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、15mlコニカルチューブ中に10ml注入し、少なくとも5分以上（例、1時間以上、24時間以上、48時間以上、7日以上）、37℃にて静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。本明細書においては、全細胞のうちの70％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと定義することとする。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Size 500-600μm、Polysciences Inc.製）に代替して評価してもよい。
【００１７】
培地組成物Iは、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することができる、アニオン性の官能基を有する高分子化合物又はその塩を含有する。本発明に用いる培地組成物においては、該高分子化合物が2価金属カチオンを介して結びつくことにより、水中で分散した三次元ネットワーク（不定型な構造体）を形成する。この三次元ネットワークを含む液体培地中で細胞を培養すると、この三次元ネットワークが細胞を浮遊させる担体として機能し、培地中の細胞は、この三次元ネットワークにトラップされ、沈まないため、振とう、回転操作等を要することなく、細胞を浮遊状態で均一に分散させたまま、培養する（浮遊静置培養する）ことが可能となる。
【００１８】
一態様において、培地組成物Iの粘度は、37℃において、8mPa・s以下であり、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下である。培地組成物の粘度は、例えば、37℃条件下でE型粘度計（東機産業株式会社製、TV-22型粘度計、機種：TVE -22L、コーンロータ：標準ロータ 1°34'×R24、回転数100rpm）を用いて測定することができる。培地組成物Iは、このように低い粘度で、細胞や組織の浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）を実施し得るので、継代などにおける操作性に優れている。
【００１９】
アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される1種又は2種以上を有するものを使用できる。
【００２０】
本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が10個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、DAGという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸、アルギン酸及びそれらの塩からなる群より1種又は2種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、グルクロン酸部位を含むもの（例えば、ヒアルロン酸、DAG、ダイユータンガム、キサンタンガム又はそれらの塩等）である。別の好ましい実施態様においては、多糖類は、カラギーナン、アルギン酸又はそれらの塩であり得る。より好ましくは、多糖類は、DAG、ダイユータンガム、キサンタンガム又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができることを考慮すると、最も好ましくは、DAGである。
【００２１】
ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
【００２２】
これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは10,000乃至50,000,000であり、より好ましくは100,000乃至20,000,000、更に好ましくは1,000,000乃至10,000,000である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によるプルラン換算で測定できる。
【００２３】
更に、DAGはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。
【００２４】
本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは2種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものであれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともDAG又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、DAG又はその塩、及びDAG又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、DAGとラムザンガム、DAGとダイユータンガム、DAGとキサンタンガム、DAGとカラギーナン、DAGとザンタンガム、DAGとローカストビーンガム、DAGとκ−カラギーナン、DAGとアルギン酸ナトリウム、DAGとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
脱アシル化ジェランガムとは、1-3結合したグルコース、1-4結合したグルクロン酸、1-4結合したグルコース及び1-4結合したラムノースの4分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（I）において、R1、R2が共に水素原子であり、nは2以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、R1がグリセリル基を、R2がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは10％以下であり、より好ましくは1％以下である。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
培地中の上記高分子化合物の濃度は、高分子化合物の種類に依存し、高分子化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができるが、通常0.0005％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.001％乃至0.4％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.1％（w/v）、更に好ましくは0.005％乃至0.05％（w/v）となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、0.001％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.003％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.3％（w/v）、更に好ましくは0.01％乃至0.05％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.03％（w/v）培地中に添加すれば良い。ダイユータンガムおよびキサンタンガムの場合、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.01％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.01％乃至0.5％（w/v）、最も好ましくは、0.02％乃至0.2％（w/v）培地中に添加すれば良い。κ−カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、0.001％乃至5.0％（w/v）、好ましくは0.005％乃至1.0％（w/v）、より好ましくは0.01％乃至0.1％（w/v）、最も好ましくは、0.03％乃至0.05％（w/v）培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、0.05％乃至1.0％(w/v)、好ましくは、0.05％乃至0.1％(w/v)培地中に添加すれば良い。
【００２８】
上記多糖類を複数種（好ましくは2種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、DAG又はその塩と、DAG又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、DAG又はその塩の濃度としては0.005〜0.02％（w/v）、好ましくは0.01〜0.02％（w/v）が例示され、DAG又はその塩以外の多糖類の濃度としては、0.0001〜0.4％（w/v）、好ましくは0.005〜0.4％（w/v）、より好ましくは0.01〜0.4％（w/v）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
DAG又はその塩：0.005〜0.02％（好ましくは0.01〜0.02％）（w/v）
DAG以外の多糖類
キサンタンガム：0.01〜0.4％（w/v）
アルギン酸ナトリウム：0.0001〜0.4％（w/v）（好ましくは、0.1〜0.4％（w/v））
ネイティブジェランガム：0.0001〜0.4％（w/v）
ローカストビーンガム：0.1〜0.4％（w/v）
メチルセルロース：0.1〜0.4％（w/v）（好ましくは0.2〜0.4％（w/v））
カラギーナン：0.05〜0.1％（w/v）
ダイユータンガム：0.01〜0.1％（w/v）
【００２９】
一態様において、DAG又はその塩と、アルギン酸又はその塩（例、アルギン酸ナトリウム）とを組み合わせて用いる。本態様の培地組成物は、細胞や組織の浮遊状態を維持する効果を有すると共に、必要に応じてキレート剤を添加し、ピペッティングやフィルター濾過等でせん断力を加えることによりこの効果が速やかに喪失するという特性を有する（WO 2017/154952 A1）。
本態様の培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、例えば0.002〜0.01 (w/v)%、好ましくは0.002〜0.009 (w/v)%、より好ましくは0.003〜0.009 (w/v)%である。本態様の培地組成物中のアルギン酸又はその塩の濃度は、例えば、0.004〜0.1 (w/v)%、好ましくは0.004〜0.02 (w/v)%、より好ましくは0.004〜0.015 (w/v)%であり、更に好ましくは0.005〜0.015 (w/v)%である。
本態様の培地組成物中に含まれる、脱アシル化ジェランガム又はその塩と、アルギン酸又はその塩の質量比は、脱アシル化ジェランガム又はその塩 1質量部に対して、アルギン酸又はその塩を1質量部以上、好ましくは2質量部以上とする。一態様において、脱アシル化ジェランガム又はその塩 1質量部に対して、アルギン酸又はその塩を例えば1〜4質量部、好ましくは1〜3質量部、より好ましくは1〜2質量部とする。
【００３０】
なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度［％（w/v）］＝特定化合物の重量（g）/培地組成物の容量（ml）×100
【００３１】
培地組成物Iは、2価金属カチオンを含有する。2価金属カチオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、鉄イオン、銅イオン等が挙げられる。2価金属カチオンの種類は、上記高分子化合物が、当該2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成することが可能であれば特に限定されないが、好ましくは、培地組成物Iはカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンのうちの少なくとも一方を含み、より好ましくはカルシウムイオンを含む。培地組成物I中の2価金属カチオン濃度は、上記高分子化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、細胞又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、培地組成物中のカルシウムイオン濃度は、0.1mM及至300mMで、好ましくは、0.5mM及至100mMであるが、これらに限定されない。哺乳動物培養に使用する一般的な液状培地には、上記高分子化合物が上述の構造体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオンが含まれる。
【００３２】
培地組成物Iは、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる基礎培地と、上述の高分子化合物を混合することにより調製することができる。細胞又は組織が哺乳動物由来である場合、哺乳動物細胞の培養に用いられる基礎培地であればいずれも用いることができる。このような基礎培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM）、ハムF12培地（Ham’s Nutrient Mixture F12）、DMEM/F12培地、マッコイ5A培地（McCoy’s 5A medium）、イーグルMEM（Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM）、αMEM（alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；αMEM）、MEM（Minimum Essential Medium）、RPMI1640培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM）、MCDB131培地、ウィリアム培地E、IPL41培地、Fischer’s培地、StemPro34（インビトロジェン社製）、X-VIVO 10（ケンブレックス社製）、X-VIVO 15（ケンブレックス社製）、HPGM（ケンブレックス社製）、StemSpan H3000（ステムセルテクノロジー社製）、StemSpanSFEM（ステムセルテクノロジー社製）、StemlineII（シグマアルドリッチ社製）、QBSF-60（クオリティバイオロジカル社製）、StemProhESCSFM（インビトロジェン社製）、Essential8（登録商標）培地（ギブコ社製）、mTeSR1或いは2培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロFF或いはリプロFF2（リプロセル社製）、PSGro hESC/iPSC培地（システムバイオサイエンス社製）、NutriStem（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、CSTI-7培地（細胞科学研究所社製）、MesenPRO RS培地（ギブコ社製）、MF-Medium（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Sf-900II（インビトロジェン社製）、Opti-Pro（インビトロジェン社製）、ヒト脂肪細胞分化培地（東洋紡株式会社製）、ヒト前駆脂肪細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）などが挙げられる。
【００３３】
培地組成物Iには、ナトリウム、カリウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清（又はその代替物）、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。哺乳動物由来の細胞又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。
哺乳動物由来の細胞（又は組織）の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、2−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。
【００３４】
培地組成物Iは、WO2014/017513 A1、US2014/0106348 A1、WO 2017/154952 A1等の記載に従い、調製することが可能である。
【００３５】
好ましい態様において、培地組成物Iは、脱アシル化ジェランガム又はその塩を含有する。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、0.001％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.003％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.3％（w/v）、更に好ましくは0.01％乃至0.05％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.03％（w/v）である。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガム又はその塩以外の多糖類を含有し得る。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオンを含有する。該濃度は、例えば、0.1mM及至300mM、好ましくは、0.5mM及至100mMである。該培地組成物の粘度は、37℃において、8mPa・s以下、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下であり得る。
【００３６】
別の好ましい態様において、培地組成物Iは、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩（例、アルギン酸ナトリウム）を組み合わせて含有する。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、例えば0.002〜0.01 (w/v)%、好ましくは0.002〜0.009 (w/v)%、より好ましくは0.003〜0.009 (w/v)%である。本態様の培地組成物中のアルギン酸又はその塩の濃度は、例えば、0.004〜0.1 (w/v)%、好ましくは0.004〜0.02 (w/v)%、より好ましくは0.004〜0.015 (w/v)%であり、更に好ましくは0.005〜0.015 (w/v)%である。本態様の培地組成物中に含まれる、脱アシル化ジェランガム又はその塩と、アルギン酸又はその塩の質量比は、脱アシル化ジェランガム又はその塩 1質量部に対して、アルギン酸又はその塩を1質量部以上、例えば1〜4質量部、好ましくは1〜3質量部、より好ましくは1〜2質量部である。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガム又はその塩及びアルギン酸又はその塩が細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオンを含有する。該濃度は、例えば、0.1mM及至300mM、好ましくは、0.5mM及至100mMである。該培地組成物の粘度は、37℃において、8mPa・s以下、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下であり得る。
【００３７】
（II）単胞性脂肪細胞の製造方法
本発明は、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、上記培地組成物I中で浮遊培養し、単胞性脂肪細胞への分化を誘導することを含む、単胞性脂肪細胞の製造方法（以下、本発明の製造方法1と称する）を提供するものである。
【００３８】
本発明に用いる間葉系細胞は、哺乳動物の生体から分離した初代細胞、該初代細胞を継代培養することにより樹立した細胞株、又は腫瘍細胞である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類であり、より好ましくはヒトである。
【００３９】
間葉系細胞とは、骨、軟骨、脂肪、骨格筋、靭帯、腱等の結合織を構成する細胞、或いはその幹細胞又は前駆細胞を意味し、発生学的に中胚葉由来の細胞である。脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞としては、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞、線維芽細胞、脱分化脂肪細胞等を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明に用いる脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞は、好ましくは、前駆脂肪細胞又は間葉系幹細胞である。一態様において、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞は細胞内に脂肪滴の蓄積を含まない。
【００４０】
前駆脂肪細胞とは、脂肪細胞へ分化する能力を有する脂肪組織由来の細胞をいう。成熟した脂肪細胞とは異なり、前駆脂肪細胞は細胞内に脂肪滴の蓄積が見られず、増殖性を有する線維芽細胞様の細胞である。一般的に、前駆脂肪細胞においては、少なくとも一部の脂肪細胞マーカー遺伝子の発現量が、成熟した脂肪細胞と比較して極めて低い。例えば、前駆脂肪細胞におけるFABP4 mRNA発現量は、成熟した脂肪細胞の1/10以下、好ましくは1/100以下であり得る。前駆脂肪細胞におけるPPAR gamma mRNA発現量は、成熟した脂肪細胞の1/10以下であり得る。前駆脂肪細胞におけるリポプロテインリパーゼ（LPL） mRNA発現量は、成熟した脂肪細胞の1/10以下、好ましくは1/100以下であり得る。前駆脂肪細胞は、哺乳動物から摘出した脂肪組織（皮下脂肪組織、内臓脂肪組織等）を、コラゲナーゼなどの組織分解性酵素で消化して細胞懸濁液を得て、得られた細胞懸濁液をInt J Obes Relat Metab Disord. 1996 Mar;20 Suppl 3:S77-83などに記載される方法に準じて、例えば遠心分離などにより分画し、沈殿を前駆脂肪細胞に富む画分として回収することにより単離することができる。市販された前駆脂肪細胞を用いてもよい。また、株化された前駆脂肪細胞（例、3T3-L1）を用いてもよい。
【００４１】
間葉系幹細胞とは、脂肪細胞、骨芽細胞、及び軟骨細胞へ分化する能力を有する体性幹細胞で、さらに血小板や肝臓などにも分化し得る。間葉系幹細胞は、主に脂肪組織由来、骨髄由来、又は歯髄由来の細胞である。成熟した脂肪細胞とは異なり、間葉系幹細胞は細胞内に脂肪滴の蓄積が見られず、増殖性を有する線維芽細胞様の細胞である。一般的に、間葉系幹細胞においては、先述した前駆脂肪細胞と同様に少なくとも一部の脂肪細胞マーカー遺伝子の発現量が、成熟した脂肪細胞と比較して極めて低い。例えば、脂肪由来間葉系幹細胞は、前駆脂肪細胞と同様に、哺乳動物から摘出した脂肪組織（皮下脂肪組織、内臓脂肪組織等）を、コラゲナーゼなどの組織分解性酵素で消化して細胞懸濁液を得て、得られた細胞懸濁液をInt J Obes Relat Metab Disord. 1996 Mar;20 Suppl 3:S77-83などに記載される方法に準じて、例えば遠心分離などにより分画し、沈殿を間葉系幹細胞に富む画分として回収することにより単離することができる。市販された間葉系幹細胞を用いてもよい。
【００４２】
単胞性脂肪細胞とは、1つの細胞内に大きな脂肪滴を一つのみ含む脂肪細胞であり、白色脂肪細胞とも呼ばれる。これらの細胞は、前駆脂肪細胞、間葉系幹細胞、他臓器由来の細胞とは違い、唯一培地や生理食塩水などに浮かぶ性質を有する。この浮遊する性質は生体内の脂肪組織を形成する脂肪細胞と同じである。単胞性脂肪細胞は、FABP4陽性、PPAR gamma陽性、且つLPL陽性であり得る。
【００４３】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞から単胞性脂肪細胞への分化を誘導するため、浮遊培養に用いる培地組成物Iは脂肪細胞分化誘導因子を含む。脂肪細胞分化誘導因子としては、公知のものを使用することができ、例えば、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、プロスタグランジン、長鎖脂肪酸、トリヨードチロニン、及びPPARγ作動剤からなる群から選択される少なくとも1種の因子、好ましくは前記群から選択される2種以上の因子を組み合わせて使用する。グルココルチコイド受容体作動剤としては、特に限定されないが、例えばデキサメタゾン、コルチゾール、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド等を挙げることができ、好ましくはデキサメタゾンである。cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、3-イソブチル-1-メチルキサンチン等のメチルキサンチン類を挙げることができる。シクロオキシゲナーゼ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、インドメタシン、アスピリン等を挙げることができ、好ましくはインドメタシンである。プロスタグランジンとしては、特に限定されないが、例えば、PGD2、PGF2a、PGI2、PGJ2等を挙げることができ、好ましくはPGJ2である。長鎖脂肪酸は、炭素数11以上の脂肪酸の総称であり、具体的には、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、アラキドン酸等が好適に使用できる。PPARγ作動剤としては、特に限定されないが、ピオグリタゾン、トログリタゾン、ロシグリタゾン等のチアゾリジン誘導体を挙げることができる。好適な脂肪細胞分化誘導因子の組み合わせとしては、
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）；
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤（3-イソブチル-1-メチルキサンチン等）；
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（コルチゾール等）、及びトリヨードチロニン（T3）（DIABETES, 45, 1435-1438, 1996）；
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）、及びトリヨードチロニン（T3）
等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４４】
培地組成物I中に添加する脂肪細胞分化誘導因子の濃度は、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞から単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む）への分化を誘導する濃度であり、当該技術分野において脂肪細胞分化を誘導する際に一般的に使用される濃度を、本発明に適用することができる。
インスリンは、例えば、1〜100μg/mlの濃度で添加する。
グルココルチコイド受容体作動剤（例、デキサメタゾン）は、種類により異なるが、例えば、0.1〜100μMの濃度で添加する。
cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤（例、3-イソブチル-1-メチルキサンチン）は、種類により異なるが、例えば、0.1〜10mMの濃度で添加する。
シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例、インドメタシン）は、種類により異なるが、例えば、0.01〜1000μMの濃度で添加する。
プロスタグランジン（例、PGJ2）は、種類により異なるが、例えば、1〜100μMの濃度で添加する。
長鎖脂肪酸（例、アラキドン酸）は、種類により異なるが、例えば、0.5〜500μMの濃度で添加する。
PPARγ作動剤（例、ピオグリタゾン）は、種類により異なるが、例えば、1〜100μMの濃度で添加する。
【００４５】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞から単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む）への分化を促進するため、培地組成物Iは上皮成長因子（EGF）を含有していてもよい。EGFは、例えば、0.1〜10ng/mlの濃度で添加する。
【００４６】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞から単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む）への分化を促進するため、培地組成物Iはトランスフェリンを含有していてもよい。トランスフェリンには、セロトランスフェリン及びオホトランスフェリンが包含される。トランスフェリンは、例えば、1〜100μg/mlの濃度で添加する。
【００４７】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞から単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む）への分化を促進するため、培地組成物Iはトリヨードチロニン（T3）を含有していてもよい。T3は、例えば、0.01〜100nMの濃度で添加する。
【００４８】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞から単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞および又はベージュ脂肪細胞を含む）への分化を促進するため、培地組成物Iは血清（例、牛胎仔血清、ヒト血清）やその代替物を含有していてもよい。血清又はその代替物は、例えば、0.1〜20％（v/v）の濃度で添加する。
【００４９】
好ましい一態様において、培地組成物Iは、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）、及びEGFを含有する。好ましい一態様において、培地組成物Iは、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）、EGF、トランスフェリン、及びトリヨードチロニンを含有する。
【００５０】
好ましい一態様において、培地組成物Iは、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤（3-イソブチル-1-メチルキサンチン等）を含有する。
【００５１】
本発明の製造方法1においては、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、上記脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物I中で浮遊培養（好ましくは、静置浮遊培養）に付す。
【００５２】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を浮遊培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるフラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて培養することが可能である。これらの培養容器は細胞低接着性であることが望ましい。細胞非接着性の培養容器としては、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないもの、あるいは培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものを使用できる。
【００５３】
機械的な制御のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、pH、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。
【００５４】
培養する脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞が単一細胞の状態で培地組成物I中に分散した状態、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞が担体表面上に接着した状態、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞が担体内部に包埋した状態、複数個の前駆脂肪細胞が集合し細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成した状態等が挙げられる。脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞は、好ましくは、単一細胞の状態で培地組成物I中に分散した状態、又は複数個の細胞が集合し細胞凝集塊（スフェア（スフェロイド））を形成した状態で、培地組成物I中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。即ち、好ましくは、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を接着や包埋するための担体を用いない。
【００５５】
本発明の製造方法1において脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を培養する際には、上記脂肪細胞分化誘導因子を含有する培養組成物Iに対して、別途調製した脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を添加し、均一に分散する様に懸濁すればよい。懸濁方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での懸濁、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた懸濁が挙げられる。得られた脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の懸濁液を培養容器に播種し、浮遊培養に付す。浮遊培養は、静置で行ってもよいし、必要に応じて培養液の回転、振とう又は撹拌を伴ってもよい。その回転数や頻度は、目的に合わせて適宜設定することができる。好ましくは浮遊静置培養に付す。培養の途中で培地組成物の交換が必要となった際には、遠心分離やろ過処理等により細胞と培地を分離し、新鮮な脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物Iで細胞を再懸濁し、浮遊培養に付せばよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞を適宜濃縮した後、新鮮な脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物Iをこの濃縮液に添加し、再度浮遊培養に付せばよい。
【００５６】
一態様において、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を維持培養（例、単層培養、浮遊培養）から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。分散された脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物I中に懸濁し、これを浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）に付す。培養物中、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞は、単一細胞の状態で、又はスフェアの状態であり得る。この培養においては、細胞非接着性培養器を用いることが好ましいが、その限りではない。
【００５７】
培養開始時の、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の濃度は、本発明の方法により、単胞性脂肪細胞への分化が誘導される限り、特に限定されないが、通常1.0×102〜1.0×107個/ml、好ましくは1.0×103〜1.0×106個/ml、より好ましくは1.0×104〜1.0×105個/ml（例、3.0×104〜9.0×104個/ml）である。
【００５８】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を培養する際の温度は、通常25乃至39℃、好ましくは37℃である。CO2濃度は、通常、培養の雰囲気中、4乃至10体積％であり、好ましくは5体積％である。酸素濃度は、培養の雰囲気中、15〜50体積％であり、好ましくは20体積％である。
【００５９】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物I中で浮遊培養することにより、単胞性脂肪細胞への分化が誘導される。従来法では、プレート上に接着した状態の前駆脂肪細胞に脂肪細胞分化誘導因子を作用させることにより、プレートに接着した、スピンドル様の形状の、多数の小さな脂肪滴が細胞内に蓄積した多胞性脂肪細胞しか得ることができなかった。これに対し、本発明の方法では、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を、脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物I中で浮遊培養することにより、培地中に浮遊し、球状を呈し、1つの細胞内に大きな脂肪滴を一つ含む、生理的状態により近似した単胞性脂肪細胞を得ることができる。単胞性脂肪細胞への分化が誘導されたことは、細胞質内に大きな脂肪滴を一つのみ含む細胞の出現を光学顕微鏡で観察することにより確認することができる。また、細胞質内の脂肪滴の有無の確認は、例えば、オイルレッド0染色法等を用いて行うことができる。或いは、単胞性脂肪細胞への分化が誘導されたことは、脂肪細胞マーカータンパク質又はそれをコードするmRNAの発現を検出することにより確認してもよい。脂肪細胞マーカータンパク質の発現は、該マーカーに対する抗体を用いた免疫学的手法（例、フローサイトメトリー、免疫組織化学等）により実施することができる。脂肪細胞マーカーをコードするmRNAの発現は、RT-PCR等の周知の遺伝子工学的手法により実施することができる。脂肪細胞マーカーとしては、FABP4、PPAR gamma、LPL等を挙げることができるが、これらに限定されない。一態様において、本発明の製造方法1は、培養物中に単胞性脂肪細胞が出現したことを確認する工程を含む。一態様において、培養物中に単胞性脂肪細胞が出現するまで、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物I中での浮遊培養が行われる。
【００６０】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の分化誘導に要する培養期間は、脂肪細胞誘導因子の種類によるが、前駆脂肪細胞の浮遊培養開始から、通常8日以上、好ましくは10日以上、より好ましくは18日以上、更に好ましくは21日以上、より更に好ましくは30日以上である。
【００６１】
一態様において、本発明の製造方法1により得られる単胞性脂肪細胞は、UCP-1陽性である。UCP-1は、熱産生を促すことでエネルギー消費を司る、ベージュ脂肪細胞のマーカーである。従って、UCP-1陽性単胞性脂肪細胞は、ベージュ脂肪細胞の形質を有する脂肪細胞（ベージュ様脂肪細胞）であり得る。ベージュ脂肪細胞は、活発に熱を産生し、エネルギーを消費することから、本態様の製造方法により得られた、UCP-1陽性単胞性脂肪細胞を、糖尿病、肥満等の代謝性疾患の患者に移植することにより、該代謝性疾患に対する予防及び／又は治療効果が期待できる。UCP-1陽性単胞性脂肪細胞への分化が誘導されたことは、UCP-1タンパク質又はそれをコードするmRNAの発現を検出することにより確認することができる。UCP-1タンパク質の発現は、UCP-1に対する抗体を用いた免疫学的手法（例、フローサイトメトリー、免疫組織化学等）により実施することができる。UCP-1 mRNAの発現は、RT-PCR等の周知の遺伝子工学的手法により実施することができる。一態様において、本発明の製造方法1は、培養物中にUCP-1陽性単胞性脂肪細胞が出現したことを確認する工程を含む。一態様において、UCP-1陽性単胞性脂肪細胞が出現するまで、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の脂肪細胞分化誘導因子を含有する培地組成物I中での浮遊培養を継続し、UCP-1陽性単胞性脂肪細胞を得る。
【００６２】
UCP-1陽性単胞性脂肪細胞の分化誘導に要する培養期間は、脂肪細胞誘導因子の種類によるが、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の浮遊培養開始から、通常21日以上、好ましくは30日以上、より好ましくは36日以上である。
【００６３】
単胞性脂肪細胞は、細胞質内に大きな脂肪滴を含むので、液状の培地組成物中に、上述の2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物が含まれていなくても、該液状の培地組成物中に自立して浮遊する。従って、培養物中に単胞性脂肪細胞の出現が確認された後、得られた単胞性脂肪細胞を引き続き浮遊培養して、より成熟した単胞性脂肪細胞への分化を誘導する場合、培地組成物I中の該高分子化合物濃度を低下させても、目的とする浮遊培養を継続することができる。例えば、単胞性脂肪細胞の出現が確認された段階（例えば、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の浮遊培養開始から、例えば8〜30日、好ましくは18〜30日経過した段階）で、浮遊培養により得られた細胞懸濁液中の該高分子化合物濃度を、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を浮遊させることができない濃度にまで低下させてもよい。例えば、脱アシル化ジェランガム又はその塩を、単独で、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物として使用する場合、培養物中に単胞性脂肪細胞の出現が確認された段階（例えば、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の浮遊培養開始から、例えば8〜30日、好ましくは18〜30日経過した段階）で、培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度を、例えば0.0075% (w/v)以下、好ましくは0.00375% (w/v)以下とする。該高分子化合物として、ダイユータンガムもしくはキサンタンガム又はその塩を使用する場合は、培養物中に単胞性脂肪細胞の出現が確認された段階で、その濃度を、例えば0.015% (w/v)以下、好ましくは0.0075% (w/v)以下とすることができる。培地組成物中の該高分子化合物濃度を段階的に低下させてもよい。例えば、該高分子化合物として、脱アシル化ジェランガム又はその塩を使用する場合、例えば脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の浮遊培養開始から18〜20日経過した段階で、培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度を、0.0075% (w/v)以下とし、更に、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞の浮遊培養開始から30〜36日経過した段階で、該濃度を0.00375% (w/v)以下とする。
【００６４】
誘導された単胞性脂肪細胞の回収は、周知の方法により行うことができる。単胞性脂肪細胞は、細胞質内に大きな脂肪滴を含むので、液状の培地組成物中に、上述の2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物が含まれていなくても、該液状の培地組成物中に自立して浮遊する。また、単胞性脂肪細胞は、遠心分離によっても沈降せず、液状の培地組成物中に浮遊した状態を維持する。そのため、浮遊培養により得られた細胞懸濁液を、上記高分子化合物を含まない液状の培地組成物での希釈及び／又は遠心分離に付し、浮遊状態を維持する単胞性脂肪細胞を回収することにより、誘導された単胞性脂肪細胞を単離することができる。
【００６５】
一態様において、浮遊培養により得られた細胞懸濁液中の該高分子化合物濃度を、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞を浮遊させることができない濃度にまで低下させ、浮遊状態を維持する単胞性脂肪細胞を回収する。例えば、脱アシル化ジェランガム又はその塩を、単独で、2価金属カチオンを介して結びつくことにより細胞又は組織を浮遊させることができる構造体を形成する、アニオン性の官能基を有する高分子化合物として使用する場合、培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度を、例えば0.0075% (w/v)以下、好ましくは0.00375% (w/v)以下とする。該高分子化合物濃度を低下させた後、細胞懸濁液を遠心分離に付してもよい。このような操作を行うことにより、浮遊培養後に残存する脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞や、細胞内に脂肪滴を含まない脂肪細胞以外の細胞は沈降し、成功裏に分化した単胞性脂肪細胞は沈降せずに浮遊状態を維持するので、分化した単胞性脂肪細胞を、残存する脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞や、細胞内に脂肪滴を含まない脂肪細胞以外の細胞から容易に分離することができる。
【００６６】
（III）培養調製物
本発明は、
（1）脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞及び／又は単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む）、及び
（2）培地組成物I
を含む、培養調製物を提供する。本発明の培養調製物において、脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞及び／又は単胞性脂肪細胞（白色脂肪細胞又はベージュ脂肪細胞を含む）は、培地組成物I中に浮遊した状態で存在し得る。
【００６７】
脂肪細胞への分化能を有する間葉系細胞は、好ましくは前駆脂肪細胞又は間葉系幹細胞である。
【００６８】
単胞性脂肪細胞は、UCP-1陽性であり得る。
【００６９】
好ましい態様において、培地組成物Iは、脱アシル化ジェランガム又はその塩を含有する。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、0.001％乃至1.0％（w/v）、好ましくは0.003％乃至0.5％（w/v）、より好ましくは0.005％乃至0.3％（w/v）、更に好ましくは0.01％乃至0.05％（w/v）、最も好ましくは、0.01％乃至0.03％（w/v）である。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガム又はその塩以外の多糖類を含有し得る。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオンを含有する。該濃度は、例えば、0.1mM及至300mM、好ましくは、0.5mM及至100mMである。該培地組成物の粘度は、37℃において、8mPa・s以下、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下であり得る。
【００７０】
別の好ましい態様において、培地組成物Iは、脱アシル化ジェランガム又はその塩、及びアルギン酸又はその塩（例、アルギン酸ナトリウム）を組み合わせて含有する。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガム又はその塩の濃度は、例えば0.002〜0.01 (w/v)%、好ましくは0.002〜0.009 (w/v)%、より好ましくは0.003〜0.009 (w/v)%である。本態様の培地組成物中のアルギン酸又はその塩の濃度は、例えば、0.004〜0.1 (w/v)%、好ましくは0.004〜0.02 (w/v)%、より好ましくは0.004〜0.015 (w/v)%であり、更に好ましくは0.005〜0.015 (w/v)%である。本態様の培地組成物中に含まれる、脱アシル化ジェランガム又はその塩と、アルギン酸又はその塩の質量比は、脱アシル化ジェランガム又はその塩 1質量部に対して、アルギン酸又はその塩を1質量部以上、例えば1〜4質量部、好ましくは1〜3質量部、より好ましくは1〜2質量部である。該培地組成物は、脱アシル化ジェランガム又はその塩及びアルギン酸又はその塩が細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度のカルシウムイオンを含有する。該濃度は、例えば、0.1mM及至300mM、好ましくは、0.5mM及至100mMである。該培地組成物の粘度は、37℃において、8mPa・s以下、好ましくは4mPa・s以下であり、より好ましくは2mPa・s以下であり得る。
【００７１】
好ましい態様において、培地組成物Iは、脂肪細胞分化誘導因子を含有する。
【００７２】
脂肪細胞分化誘導因子は、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（例、デキサメタゾン）、cAMPホスホジエステラーゼ阻害剤（例、3-イソブチル-1-メチルキサンチン）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例、インドメタシン）、プロスタグランジン（例、PGJ2）、長鎖脂肪酸（例、アラキドン酸）、トリヨードチロニン及びPPARγ作動剤（例、ピオグリタゾン）からなる群から選択される少なくとも1種の因子であり得る。
【００７３】
好ましくは、脂肪細胞分化誘導因子は、以下のいずれかの組み合わせを含む：
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）；
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤（3-イソブチル-1-メチルキサンチン等）； 
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（コルチゾール等）、及びトリヨードチロニン；並びに
・インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）、及びトリヨードチロニン。
【００７４】
脂肪細胞分化誘導因子に加え、培地組成物Iは上皮成長因子（EGF）を含有していてもよい。
【００７５】
培地組成物Iはトランスフェリンを含有していてもよい。
【００７６】
培地組成物Iはトリヨードチロニンを含有していてもよい。
【００７７】
培地組成物Iは血清又はその代替物を含有していてもよい。
【００７８】
好ましい一態様において、培地組成物Iは、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）、及びEGFを含有する。好ましい一態様において、培地組成物Iは、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（インドメタシン等）、EGF、トランスフェリン、及びトリヨードチロニンを含有する。
【００７９】
好ましい一態様において、培地組成物Iは、インスリン、グルココルチコイド受容体作動剤（デキサメタゾン等）、及びcAMPホスホジエステラーゼ阻害剤（3-イソブチル-1-メチルキサンチン等）を含有する。
【００８０】
（III）項における各用語の定義は、特にことわりのない限り、上記（I）項及び（II）項において記載したものと同一である。
【００８１】
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００８２】
以下に本発明の製造方法及び本発明の評価方法の実施例を具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【実施例】
【００８３】
（試験例1：脱アシル化ジェランガムを用いた3D培養によるヒト前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導）
脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL  CG−LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli−Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（＃CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.010％あるいは0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞（皮下由来、＃CAS02s05a、東洋紡社製）を、33333細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したあるいは添加しないヒト脂肪細胞分化培地組成物（未添加、0.010％、0.015％）にそれぞれ播種した後、96ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3474）のウェルに1ウェル当たり150μLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、12日間継続した。ヒト前駆脂肪細胞が接着できる通常のプレートを用いた単層培養法として、5000細胞/mLとなるようにヒト脂肪細胞分化培地あるいはヒト前駆脂肪細胞増殖培地（＃CAS11K500、東洋紡社製）にそれぞれ播種した後、96ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃3585）のウェルに1ウェル当たり150μLになるように分注した。ヒト脂肪細胞分化培地で播種した細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、12日間継続した。一方、ヒト前駆脂肪細胞増殖培地で播種した細胞を、CO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、4日間継続した後、培地をヒト脂肪細胞分化培地に交換し、さらに12日間培養を継続した。培養完了後にそれぞれ写真撮影を実施した。【００８４】
その結果、単層培養で分化誘導を行うと、スピンドル様の形態を呈し、プレート底面に接着した、小さい脂肪滴からなる多胞性の脂肪細胞が認められた。一方、3D条件で培養した条件では、脱アシル化ジェランガムが未添加の条件では、細胞同士の凝集により大きな凝集塊が認められた。一方、脱アシル化ジェランガムを添加した3D条件では、細胞同士の凝集化は抑制され、かつ脂肪滴を含んだ単胞性の脂肪細胞様の細胞の存在が確認された。各培養条件での細胞形態を図1に示す。【００８５】
（試験例2：脱アシル化ジェランガムを用いた3D培養による脂肪細胞への分化誘導）
脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL  CG−LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli−Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（＃CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物を調製した。低接着プレートを用いた3D培養として、ヒト前駆脂肪細胞（皮下由来、＃CAS02s05a、東洋紡社製）を、30000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物（0.015％）に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3471）のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、8日間継続した。mRNA解析に用いたウェルを除いて、残りのウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ15mLチューブに移し、遠心操作（400g、3分間）を行い、上清部分2.5mLと沈降部分2.5mLに分けて、それぞれに脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、それぞれのウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から18日目まで、つまり再播種後10日間継続した。上清部分を継続して培養したサンプル名をsup (10⇒18)に、沈降部分を継続して培養したサンプル名をbottom(10⇒18)とした。培養開始から18日目に、mRNA解析に用いたウェルを除いて、残りのウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ15mLチューブに移し、遠心操作（400g、3分間）を行い、上清部分2.5mLと沈降部分2.5mLに分けて、それぞれに脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、それぞれのウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から26日目まで、つまり再々播種後8日間継続した。すでに上清部分に存在した脂肪様細胞・sup (10⇒18)を継続して浮遊状態で培養したサンプル名をsup(10⇒26)に；bottom(10⇒18)サンプルを培養し、遠心にて上清部分を分取し、継続して培養したサンプル名はsup (18⇒26)に、沈降部分を分取し継続して培養したサンプル名はbottom(10⇒26)とした。【００８６】
mRNA解析において、沈降部分およびbottom(10⇒18)およびbottom(10⇒26)のサンプルについては、培養物を回収し、遠心分離（400g、3分間）することで細胞を回収した。細胞からRNeasy  Mini  kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。上清部分およびsup (10⇒18)、sup(10⇒26)、sup (18⇒26)のサンプルについては、培養液に浮遊する細胞をピペットで回収し、培地を含んだ状態でRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScriptTMRT Master Mix（タカラバイオ社製）を使用し、GeneAmp PCR System 9700（Applied  Biosystems社製）を用いて逆転写反応を行い,cDNAを合成した。各cDNAサンプルを分注し、滅菌水で1/10に希釈し、PCRに用いた。また検量線に用いるサンプルとして、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCRは、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex TaqTM（タカラバイオ社製）と各種Taqmanプローブ（Applied Biosystems社製）を使用し、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。PPIA（cyclophilin B）のmRNAを内在性コントロールとし、PPAR gamma  mRNAあるいはFABP4 mRNAの発現をPPIAの値で補正した。用いた各プローブ（Applied  Biosystems社製）を以下に示す。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
FABP4：HS01086177【００８７】
その結果、本発明の培地組成物を用いてヒト前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を行うと、細胞中の脂肪細胞マーカーであるPPAR gammaおよびFABP4のmRNA発現量が増加した。また多糖類濃度を低下させることで、遠心操作後に上清中に浮遊してくる細胞を回収できた。浮遊してくる細胞群は、特にPPAR gamma mRNAの発現量が高く、高度に分化した脂肪細胞であることが示唆された。PPAR gammaおよびFABP4 のmRNA発現値を表1に示す。【００８８】
【表１】
2019098310.tif 000003
【００８９】
（試験例3：脱アシル化ジェランガムを用いた3D培養による脂肪細胞への分化誘導）
脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL  CG−LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli−Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（＃CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。低接着プレートを用いた3D培養として、ヒト前駆脂肪細胞（皮下由来、＃CAS02s05a、東洋紡社製）を、30000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物（0.015％）にそれぞれ播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3471）のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、10日間継続した。mRNA解析に用いたウェルを除いて、残りのウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ15mLチューブに移し、遠心操作（400g、3分間）を行い、沈降部分2.5mLのみを分取して脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、15mLチューブに細胞懸濁液を移し、遠心操作（400g、3分間）を行い、上清部分2.5mLと沈降部分2.5mLに分けて、それぞれmRNA解析に用いた（サンプル名はsup20とbottom20）。また別のウェルの細胞懸濁液を、遠心操作（400g、3分間）に付し、上清部分2.5mLを分取して、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物2.5mLを添加し、ウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再々播種から10日間継続した。すでに上清部分に存在したsup20を継続して培養したサンプル名をsup(20⇒30)とした。【００９０】
mRNA解析において、沈降部分およびbottom20のサンプルについては、培養物を遠心分離（400g、3分間）に付すことで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。上清部分、sup20、及びsup(20⇒30)のサンプルについては、培養液中に浮遊する細胞をピペットで回収し、培地を含んだ状態でRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScriptTMRT Master Mix（タカラバイオ社製）を使用し、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製）を用いて逆転写反応を行い,cDNAを合成した。各cDNAサンプルを、分注し、滅菌水で1/10に希釈し、PCRに用いた。また検量線に用いるサンプルとして、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCRは、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex TaqTM（タカラバイオ社製）と各種Taqmanプローブ（Applied Biosystems社製）を使用し、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。PPIA（cyclophilin B）のmRNAを内在性コントロールとし、PPAR gamma mRNAあるいはリポプロテインリパーゼ（LPL） mRNAの発現をPPIAの値で補正した。用いた各プローブ（Applied Biosystems社製）を以下に示す。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
LPL：HS00173425【００９１】
［oil-Red法による細胞内の脂肪滴染色］
先述したsup(20⇒30)細胞を用いて、oil-Red法による細胞内脂肪滴の染色を実施した。剥離防止処理済みスライドガラス（マツナミガラス社製、APSコート）に細胞懸濁液3μLを滴下し、試薬1液（Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製）を2μL添加しピペッティングした。次に試薬2液（Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製）を5μL加えて素早く2回ピペッティングし、そのままスライドガラスに塗り広げ、約2分間静置して固めた。次にDiluted Lipid Droplets Assay Fixative（adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）を75μL滴下し、15分間静置した。さらにWash Solution （adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）を100μL滴下し5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。次に、Oil Red O （adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）75μLを滴下し、約20分間静置した後、蒸留水で洗浄した。この洗浄操作は洗浄液がピンク色にならなくなるまで繰り返した。Wash Solution （adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）100μLを滴下し、約5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。その後、顕微鏡観察を実施した。【００９２】
その結果、本発明の培地組成物を用いてヒト前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を行うと、細胞中の脂肪細胞マーカーであるPPAR gammaおよびLPLのmRNA発現量が増加した。この方法で分化させた脂肪細胞は、oil Red染色により単胞性の脂肪滴を有しており、かつPPAR gamma mRNAやLPL mRNAの発現量が高いことから、高度に分化した脂肪細胞であることが示唆された。PPAR gammaおよびLPL のmRNA発現値を表2に、oil Red染色による脂肪細胞像を図2に示す。【００９３】
【表２】
2019098310.tif 000004
【００９４】
（試験例4：脱アシル化ジェランガムを用いた3D培養による脂肪細胞への分化誘導とUCP-1発現）
脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL  CG−LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli−Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（＃CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞（皮下由来、＃CAS02s05a、東洋紡社製）を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物（0.015％）に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3471）のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から21日目まで、つまり再播種から11日間継続した。培養開始から21日目に、15mLチューブに細胞懸濁液を移し、遠心操作（400g、3分間）を行い、上清部分5mLと沈降部分5mLに分けて、それぞれmRNA解析に用いた（サンプル名はsup21とbottom21）。また別のウェルの細胞懸濁液を50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から36日目まで、つまり再々播種から15日間継続した。培養開始から36日目に50mLチューブに細胞懸濁液を移し、遠心操作（400g、3分間）を行い、上清部分10mLと沈降部分10mLに分けて、それぞれmRNA解析に用いた（サンプル名はsup36とbottom36）。【００９５】
mRNA解析において、沈降部分およびbottom20のサンプルについては、培養物を遠心分離（400g、3分間）に付すことで細胞を回収した。細胞からRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。上清部分、sup20及びsup(20⇒30)のサンプルについては、培養液に浮遊する細胞をピペットで回収し、培地を含んだ状態でRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScriptTMRT Master Mix（タカラバイオ社製）を使用し、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。各cDNAサンプルを分注し、滅菌水で1/10に希釈し、PCRに用いた。検量線に用いるサンプルとして、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCRは、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex TaqTM（タカラバイオ社製）と各種Taqmanプローブ（Applied Biosystems社製）を使用し、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。PPIA（cyclophilin B）のmRNAを内在性コントロールとし、PPAR gamma mRNA又はUCP-1 mRNAの発現をPPIAの値で補正した。用いた各プローブ（Applied Biosystems社製）を以下に示す。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
UCP-1：HS00222453【００９６】
［oil-Red法による細胞内の脂肪滴染色］
先述したbottom36細胞を用いて、oil-Red法による細胞内脂肪滴の染色を実施した。剥離防止処理済みスライドガラス（マツナミガラス社製、APSコート）に細胞懸濁液3μLを滴下し、試薬1液（Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製）を2μL添加しピペッティングした。次に試薬2液（Smear Gell, #SG-01, フナコシ社製）を5μL加えて素早く2回ピペッティングし、そのままスライドガラスに塗り広げ、約2分間静置して固めた。次にDiluted Lipid Droplets Assay Fixative（adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）を75μL滴下し、15分間静置した。さらにWash Solution （adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）を100μL滴下し5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。次に、Oil Red O （adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）75μLを滴下し、約20分間静置した後、蒸留水で洗浄した。この洗浄操作は洗浄液がピンク色にならなくなるまで繰り返した。Wash Solution （adipogenesis assay kit, #10006908, Cayman Chemical Company社製）100μLを滴下し、約5分間静置した。この操作を2回繰り返した後、Wash Solutionを除去し、サンプルを室温下で乾燥させた。その後、顕微鏡観察を実施した。【００９７】
その結果、本発明の培地組成物を用いて、実施例2よりも3倍の細胞密度で播種した条件でヒト前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化誘導を行っても、細胞中の脂肪細胞マーカーであるPPAR gammaのmRNA発現量が増加した。本法で分化させた脂肪細胞は、oil Red染色により単胞性の脂肪滴を有しており、数個の分化した脂肪細胞が凝集していた。またベージュ脂肪細胞マーカーである熱産生を司るUCP-1 mRNAの発現は増大し、36日目で最大の値を示した。本法で脂肪細胞に分化誘導すると、単胞性でかつPPAR gamma mRNAの発現量が高く、さらに熱産生を司るUCP-1の発現が増大したベージュ様の脂肪細胞であることが示唆された。PPAR gammaおよびUCP-1のmRNA発現値を表3に、oil Red染色による脂肪細胞像を図3に示す。【００９８】
【表３】
2019098310.tif 000005
【００９９】
（試験例5：脱アシル化ジェランガムを用いた3D培養と各分化誘導培地を組み合わせた脂肪細胞への分化誘導とUCP-1発現）
脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli−Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（＃CAS11D250、東洋紡社製）あるいは10％（v／v）胎児ウシ血清（FBS）、1 μg/mLインスリン、2 μMデキサメサゾン、500 μM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IDI分化誘導材、Takara社、Takara-Bio AdipoInducer Reagent)を含むDMEM培地（WAKO社製）に終濃度0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞（皮下由来、＃CAS02s05a、東洋紡社製）を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物（0.015％）又は10％FBS含有IDI分化培地組成物（0.015%）に懸濁し、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3471）のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mL又は10％FBS含有IDI分化培地組成物5mLをそれぞれ添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mL又は10％FBS含有IDI分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から31日目および40日目まで、つまり再播種から11日間および20日間継続した。培養開始から10日目、20日目、31日目、40日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた。【０１００】
mRNA解析において、培地も含んだ細胞懸濁液をRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScriptTM RT Master Mix（タカラバイオ社製）を使用し、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製）を用いて逆転写反応を行い,cDNAを合成した。各cDNAサンプルを分注し、滅菌水で1/10に希釈し、PCRに用いた。検量線に用いるサンプルとして、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCRは、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex TaqTM（タカラバイオ社製）と各種Taqmanプローブ（Applied Biosystems社製）を使用し、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。PPIA（cyclophilin B）のmRNAを内在性コントロールとし、UCP-1 mRNA又はPPAR gamma mRNAの発現をPPIAの値で補正した。用いた各プローブ（Applied Biosystems社製）を以下に示す。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
UCP-1：HS00222453【０１０１】
その結果、一般的な脂肪細胞分化誘導剤であるIDI（インスリン、デキサメサゾン、3-イソブチル-1-メチルキサンチン）を組み合わせた培地組成物を用いても、単胞性の脂肪細胞出現を認め、また脂肪細胞マーカーであるPPAR gammaおよびFABP4のmRNA発現が増加した。またベージュ脂肪細胞マーカーである熱産生を司るUCP-1 mRNAの発現は増大し、40日目で最大の値を示した。これらの結果から、本発明の製造方法によれば、いろいろな脂肪細胞分化誘導条件において、単胞性でベージュ様である脂肪細胞に分化誘導できることが示唆された。PPAR gammaおよびUCP-1のmRNA発現値を表4に、分化誘導39日目の細胞形態を図4に示す。【０１０２】
【表４】
2019098310.tif 000006
【０１０３】
（試験例６：脱アシル化ジェランガムを用いた脂肪由来間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導）
脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli-Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（＃CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞（C-１２９７７、タカラバイオ社製）を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物（0.015％）に懸濁した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃3471）のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再播種から10日間および20日間継続した。培養開始から10日目、20日目、30日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた【０１０４】
mRNA解析において、培地も含んだ細胞懸濁液をRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScriptTM RT Master Mix（タカラバイオ社製）を使用し、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。各cDNAサンプルを分注し、滅菌水で1/10に希釈し、PCRに用いた。検量線に用いるサンプルとして、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCRは、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex TaqTM（タカラバイオ社製）と各種Taqmanプローブ（Applied Biosystems社製）を使用し、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。PPIA（cyclophilin B）のmRNAを内在性コントロールとし、PPAR gamma mRNA又はFABP4 mRNA mRNAの発現をPPIAの値で補正した。用いた各プローブ（Applied Biosystems社製）を以下に示す。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
FABP4：HS01086177【０１０５】
その結果、脱アシル化ジェランガムを含有するヒト脂肪細胞分化培地組成物を用いてヒト脂肪由来間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行うと、単胞性の脂肪細胞に分化し、細胞中の脂肪細胞マーカーであるPPAR gammaおよびFABP4のmRNA発現量が増加した。PPAR gammaおよびFABP4 のmRNA発現値を表5に、分化誘導30日目の細胞形態を図5に示す。【０１０６】
【表５】
2019098310.tif 000007
【０１０７】
（試験例７：多糖類を用いた3D培養による脂肪細胞への分化誘導とUCP-1発現）
ダイユータンガム（KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli-Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（#CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.03％（w/v）のダイユータンガムを添加した培地組成物を調製した。キサンタンガム（KELTROL CG、三晶株式会社製）を1％（w/v）となるように超純水（Milli-Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（#CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.03％（w/v）のキサンタンガムを添加した培地組成物を調製した。また脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli−Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（#CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞（皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製）を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムあるいはダイユータンガムを添加した各ヒト脂肪細胞分化培地組成物に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、#3471）のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、9日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムあるいはダイユータンガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始から20日目に、各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムあるいはダイユータンガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再播種から10日間および20日間継続した。培養開始から9日目、20日目、30日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた。【０１０８】
mRNA解析において、培地も含んだ細胞懸濁液をRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScriptTM RT Master Mix（タカラバイオ社製）を使用し、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。各cDNAサンプルを分注し、滅菌水で1/10に希釈し、PCRに用いた。検量線に用いるサンプルとして、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCRは、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex TaqTM（タカラバイオ社製）と各種Taqmanプローブ（Applied Biosystems社製）を使用し、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。PPIA（cyclophilin B）のmRNAを内在性コントロールとし、PPAR gamma mRNA又はFABP4 mRNA mRNAの発現をPPIAの値で補正した。用いた各プローブ（Applied Biosystems社製）を以下に示す。
PPIA：HS99999904
PPAR gamma：HS011155134
UCP-1：HS00222453【０１０９】
その結果、本発明の多糖類であるダイユータンガム又はキサンタンガムを含む培地組成物を用いて、ヒト前駆脂肪細胞を脂肪細胞に分化誘導を行うと、細胞中の脂肪細胞マーカーであるPPAR gammaのmRNA発現量は脱アシルジェランガムと同等レベルまで増加した。一方、ベージュ脂肪細胞マーカーである熱産生を司るUCP-1 mRNAの発現は、ダイユータンガム含有培地やキサンタンガム含有培地でさらに増大し、脱アシル化ジェランガム以上の効果を示した。PPAR gammaおよびUCP-1のmRNA発現値を表６および表７に示す。【０１１０】
【表６】
2019098310.tif 000008
【表７】
2019098310.tif 000009
【０１１１】
（試験例8：脱アシル化ジェランガムを用いた3D培養による脂肪細胞への分化誘導および白色脂肪細胞化）
脱アシル化ジェランガム（KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社製）を0.3％（w/v）となるように超純水（Milli−Q水）に懸濁した後、90℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、得られた水溶液を121℃で20分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてヒト脂肪細胞分化培地（#CAS11D250、東洋紡社製）に終濃度0.015％（w/v）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、低接着プレートを用いた3D培養法として、ヒト前駆脂肪細胞（皮下由来、#CAS02s05a、東洋紡社製）を、90000細胞/mLとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加したヒト脂肪細胞分化培地組成物（0.015％）に播種した後、6ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、#3471）のウェルに1ウェル当たり5mLになるように分注した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、10日間継続した。各ウェル中の細胞懸濁液をそれぞれ50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物5mLを添加し、ウェルに再播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から20日目まで、つまり再播種から10日間継続した。培養開始20日目に細胞懸濁液を50mLチューブに移し、培地蒸発分を滅菌水で補正し、脱アシル化ジェランガムを含んでいないヒト脂肪細胞分化培地組成物10mLを添加し、ウェルに再々播種した。細胞をCO2インキュベーター（37℃、5％CO2）内にて静置状態で培養し、培養開始から30日目まで、つまり再々播種から10日間継続した。
白色脂肪細胞の生産は、30日目の分化した脂肪細胞を含む細胞懸濁液を、6 well トランスウェルプレート（Preset VECELL(R) 30/6well(1) #PSVC30-1、べセル）の上部ウェル部分に播種した。トランスウェルの下部ウェル部分にフィルターを通し染み出てくる分化培地を取り除き、上記ウェルに10％（v/v）胎児ウシ血清（FBS）、1 μg/mLインスリン、2 μMデキサメサゾン（Takara社、Takara-Bio AdipoInducer Reagent)および1 nM T3 （3,3′,5-トリヨード-L-チロニン、#T2877、シグマアルドリッチ）および125 nM インドメタシン（#I7378、シグマアルドリッチ）を含むDMEM培地（WAKO社製）、以下（白色脂肪培地）に添加し、培地交換を実施し培養を培養開始59日目まで継続した。トランスウェル中の白色脂肪培地の交換は、39日目と50日目に実施した。培養開始から20日目、30日目、39日目、59日目において、一部の各ウェルから細胞懸濁液を回収し、それぞれmRNA解析に用いた。【０１１２】
mRNA解析において、培地も含んだ細胞懸濁液をRNeasy Mini kit（QIAGEN社製）を用いて総RNAを抽出した。総RNAとPrimeScriptTM RT Master Mix（タカラバイオ社製）を使用し、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems社製）を用いて逆転写反応を行い、cDNAを合成した。各cDNAサンプルを分注し、滅菌水で1/10に希釈し、PCRに用いた。検量線に用いるサンプルとして、分注し混合させたcDNAを使用し、3倍公比で1/3から1/243の希釈までの定量範囲で設定した。PCRは、各cDNAサンプル、検量サンプル、Premix Ex TaqTM（タカラバイオ社製）と各種Taqmanプローブ（Applied Biosystems社製）を使用し、7500 Real Time PCR System（Applied Biosystems社製）を用いて実施した。PPIA（cyclophilin B）のmRNAを内在性コントロールとし、PPAR gamma mRNA又はFABP4 mRNA mRNAの発現をPPIAの値で補正した。用いた各プローブ（Applied Biosystems社製）を以下に示す。
PPIA：HS99999904
UCP-1：HS00222453
Adiponectin : Hs00605917
Leptin : Hs00174877【０１１３】
その結果、本発明の培地組成物を用いて、UCP-1の発現が亢進している脂肪細胞に分化させた後、さらに白色脂肪化を促進する培地に交換すると、白色脂肪細胞マーカーであるLeptin mRNAの発現は増大した。一方、ベージュ脂肪細胞マーカーであるUCP-1の発現は逆に低下していた。さらに小型脂肪細胞マーカーとして知られるadiponectin mRNAの発現も白色化が進むにつれて低下した。本法で脂肪細胞に分化誘導する際、白色脂肪培地で培養すると、単胞性でかつLeptin mRNAの発現量が高く、白色脂肪細胞に成長することが示唆された。Adiponectin, LeptinおよびUCP-1のmRNA発現値を表８に示す。【０１１４】
【表８】
2019098310.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明によれば、生体から分離した脂肪細胞と同様に、1つの細胞内に大きな脂肪滴を1つ含む単胞性の白色脂肪細胞をインビトロで製造することができる。また、本発明によれば、創薬研究のみならず、移植による糖尿病や肥満に対する治療への用途が期待できるベージュ様脂肪細胞をインビトロで製造することができる。【０１１６】
本出願は、日本で出願された特願2017-221360（出願日：2017年11月16日）を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は全て本明細書に包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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