(57)【要約】  本発明は、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法を提供する。  より具体的には、本発明は、  １コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備し；  各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けし；  ハイブリダイズ複合体を得；  該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し；  一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出することを含んでなる、方法を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法であって、
１コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備し、
ここで、第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており；
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けし、；
前記関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得；
該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し；
該増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、
前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）〜（ｃ）の少なくともいずれか１つの特徴を有する、請求項１また２に記載の方法：
（ａ）１コンパートメント当たりの第一ビーズの数が複数である、
（ｂ）１コンパートメント当たりの第二ビーズの数が１つである、
（ｃ）前記コンパートメントが、ウェル、液滴またはゲル粒子の形態である。
【請求項４】
前記ゲノム関連核酸が、前記一細胞ゲノムＤＮＡ、前記一細胞ゲノムに由来するＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡ、または前記一細胞で発現する蛋白質に特異的な核酸プローブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記非破壊的計測情報が、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、ラマンおよび吸収スペクトルから選択される少なくとも１つの測定情報に基づくものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第一ビーズにおける第一バーコード核酸が各々、同一のイメージング情報に対応する第一ビーズにおいて共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一共通バーコード領域の配列情報が、一細胞の非破壊的計測情報を特定する指標となる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第二共通バーコード領域の配列情報が、コンパートメント中に存在する一細胞またはその由来物を特定する指標となる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
第二バーコード核酸が、ＰＣＲプライマー領域をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
第二ハイブリダイズ領域が、前記第一ハイブリダイズ領域または前記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含んでなる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するシステムであって、  １コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する、コンパートメント準備部であって、
第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、コンパートメント準備部と、
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に測定して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする、非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部と、
該関連付けした第一ビーズから各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る、ハイブリダイズ複合体形成部と、
前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する、増幅物製造部と、
前記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部と
を含んでなる、システム。
【請求項１４】
前記非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部が顕微鏡、フローサイトメトリー装置から選択される少なくとも一つを含んでなる、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズおよび第二ビーズの組み合わせ物であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組み合わせ物。
【請求項１６】
一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第二ビーズと共に用いる、第一ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
【請求項１７】
一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズと共に用いる、第二ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により一体的に検出された、非破壊的計測情報とゲノム関連情報に基づいて取得された分類モデルを用い、被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該被検細胞を分類する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法を用いて、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法であって、
一細胞またはその由来物、前記第一ビーズ、および前記第二ビーズと共存させることを含むこと
を含んでなる、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法で得られた被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報を用いて、被検物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本特許出願は、２０１７年５月２日に出願された日本国特許出願２０１７−０９１９６１号に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞は生物を構成する最小単位である。従来、生物の機能、構造、形態等について解明が試みられているのは、細胞集団のみであった。しかしながら、最近の研究では癌組織等の類似した細胞タイプにおいても、細胞毎に遺伝子発現が異なり多様であることが明らかになっており、細胞一つ一つの遺伝子発現等を解明する必要が生じている。【０００４】
そこで、現在、一つの細胞由来の転写産物を検出する方法として、バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドが結合したビーズを用い、シークエンシング技術を用い、細胞の遺伝情報のデータを得る方法が知られている。（特許文献１、非特許文献１）【０００５】
一方、細胞の形態学情報を特定するため、顕微鏡をはじめとするイメージング技術が用いられることが知られている。顕微鏡またはイメージングサイトメトリー等のイメージング技術を用いることにより、一つ一つの細胞の非破壊的計測情報を得ることができる。【０００６】
しかしながら、上述のイメージング技術とシークエンシング技術によって計測される細胞のデータは、選択的で物理的な細胞分取によってしか関連づけすることができない。例えば、イメージングした細胞のゲノムの情報を得るためには、物理的に一細胞を捉え、区画化し、細胞を溶解させ、核酸増幅するプロセスを、個々の細胞で独立に行う必要がある。このような方法は、低スループットで高コストである。そのため、一細胞の非破壊的計測情報と遺伝情報を関連づけるのは困難であった。
さらに、現在、イメージング技術により撮影された細胞形態情報は、目視により評価されている。今後、機械学習技術により判別が進むとしても、その判別の妥当性を評価する必要がある。現状では、目視等により観察した一細胞は物理的に分取して遺伝子や他の診断技術との比較を行うしか無い。【０００７】
このような技術状況下、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報との相互利用および各情報間での価値を高めるために、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する手段が求められているといえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／１６６７６８
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出することを目的としている。
【００１１】
本発明者らは、今般、一細胞またはその由来物と共に、バーコード核酸と連結している複数のビーズを１つのコンパートメントに含有させ、一細胞の非破壊的計測情報およびビーズのイメージング情報を関連付けした上でゲノム関連情報を測定し、関連付けすると、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的かつ効率的に検出しうることを見出した。また、一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報との関連付けは、コンパートメントに含有する前の一細胞と前記ビーズとの間で行ってもよい。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１２】
本発明には、以下の発明が包含される。
（１）  一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法であって、
１コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備し、
ここで、第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており；
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けし；
該関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得；
該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し；
該増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
を含んでなる、方法。
（２）  前記複数のコンパートメントが、細胞群またはその由来物、複数の第一ビーズ、および複数の第二ビーズを分配処理することにより得られたものである、（１）に記載の方法。
（３）  第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、
前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出する、（１）または（２）に記載の方法。
（４）  １コンパートメント当たりの第一ビーズの数が複数である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  １コンパートメント当たりの第二ビーズの数が１つである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）  前記コンパートメントが、ウェル、液滴またはゲル粒子の形態である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）  前記ゲノム関連核酸が、前記一細胞ゲノムＤＮＡ、前記一細胞ゲノムに由来するＲＮＡもしくはそのcＤＮＡ、または前記一細胞で発現する蛋白質に特異的な核酸プローブである、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  前記非破壊的計測情報が、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、ラマンおよび吸収スペクトルから選択される少なくとも１つの測定情報に基づくものである、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  第一ビーズにおける第一バーコード核酸が各々、同一のイメージング情報に対応する第一ビーズにおいて共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域とを含んでいる、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）  第一共通バーコード領域の配列情報が、一細胞の非破壊的計測情報を特定する指標となる、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）  前記第二ビーズに連結した複数の第二バーコード核酸が各々、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、ゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第二ハイブリダイズ領域とを含んでなる、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）  前記第二共通バーコード領域の配列情報が、コンパートメント中に存在する一細胞またはその由来物を特定する指標となる、（１１）に記載の方法。
（１３）  前記第二固有バーコード領域の配列情報が、ゲノム関連核酸を特定する指標となる、（１１）または（１２）に記載の方法。
（１４）  第二バーコード核酸が、ＰＣＲプライマー領域をさらに含んでなる、（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）  第二バーコード核酸が、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域、第二共通バーコード領域、第二固有バーコード領域および第二ハイブリダイズ領域を含んでなる、（１４）に記載の方法。
（１６）  第二ハイブリダイズ領域が、前記第一ハイブリダイズ領域または前記ゲノム関連核酸と相補的な核酸を含んでなる、（１１）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）  第一バーコード核酸および第二バーコード核酸が、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組み合わせである、（１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８）  非破壊的計測情報の測定がフローサイトメトリーまたは顕微鏡により行われる、（１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）  前記非破壊的計測情報が、イメージング情報である、（１）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２０）  前記非破壊的計測情報が、細胞の形態情報である、（１）〜（１８）のいずれかに記載の方法。
（２１）  一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するシステムであって、
１コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する、コンパートメント準備部であって、
第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、コンパートメント準備部と、
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に測定して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする非破壊的計測情報測定部と、
前記関連付けした第一ビーズから各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る、ハイブリダイズ複合体形成部と、  前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する、増幅物製造部と、
前記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部と
を含んでなる、システム。
（２２）  前記非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部が顕微鏡、フローサイトメトリー装置から選択される少なくとも一つを含んでなる、（２１）に記載のシステム。
（２３）  一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズおよび第二ビーズの組み合わせ物であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、組み合わせ物。
（２４）  一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するため、第二ビーズと共に用いる、第一ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
（２５）  一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するため、第一ビーズと共に用いる、第二ビーズを含んでなる検出剤であって、
第一ビーズは、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であり、
第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、
第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができる、検出剤。
（２６）  （１）〜（２０）のいずれかに記載の方法により一体的に検出された、非破壊的計測情報とゲノム関連情報に基づいて取得された分類モデルを用い、被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該被検細胞を分類する方法。
（２７）  （１）〜（２０）のいずれかに記載の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法を用いて、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法であって、
前記被検物質を、一細胞またはその由来物、前記第一ビーズ、および前記第二ビーズと共存させることを含むこと
を含んでなる、方法。
（２８）  （２７）に記載の方法で得られた被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報を用いて、被検物質をスクリーニングする方法。
【００１３】
本発明によれば、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的かつ効率的に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の、検出方法に関する模式図である。
【図２】本発明の、第一バーコード核酸と切断可能に連結される第一ビーズに関する模式図である。
【図３】本発明の、第二バーコード核酸と連結している第二ビーズに関する模式図である。
【図４】本発明の、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズおよび第二バーコード核酸と連結している第二ビーズの別の態様を示す模式図である。
【図５】本発明の、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズおよび第二バーコード核酸と連結している第二ビーズのさらに別の態様を示す模式図である。
【図６】本発明の、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズの別の態様を示す模式図である。
【図７】本発明の、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズおよび第二バーコード核酸と連結している第二ビーズの別の態様を示す模式図である。
【図８】本発明の、コンパートメントの製造方法を示す模式図である。
【図９】本発明の、コンパートメントの製造方法の別の態様を示す模式図である。
【図１０】本発明の、コンパートメントの製造方法の別の態様を示す模式図である。
【図１１】本発明の、コンパートメントの製造方法の別の態様を示す模式図である。
【図１２】本発明のシステムのフローチャートである。
【図１３】第一ビーズ、第二ビーズおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む油中水型コンパートメントの写真である。
【図１４】Ａは緑色蛍光ビーズ担持ＮＩＨ３Ｔ３細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真である。Ｂは赤色蛍光ビーズ担持Ｋ５６２細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真である。Ｃは緑色蛍光ビーズと赤色蛍光ビーズを担持するＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真である。
【図１５】Ａは細胞を含む第一ビーズの位相差顕微鏡写真である。Ｂは細胞を含む第一ビーズの蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真 である。
【図１６】コンパートメント内の遺伝子転写産物の個数について測定結果である。
【図１７】Ａは第一バーコード核酸を含むバクテリアの混合物の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真である。ＢはＥＧＦＰタンパク質遺伝子領域、第一共通バーコード領域を有するプラスミドの配列のシーケンシングの結果である。Ｃは第一バーコード核酸を含むバクテリアおよび細胞を含む油中水型コンパートメントの写真である。Ｄは第三固有バーコード領域の配列とＥＧＦＰに対応した第一共通バーコード領域を含む増幅物の電気泳動写真である。
【発明の具体的説明】
【００１５】
定義
本明細書において「ゲノム関連情報」とは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸に由来する核酸配列情報をいう。ここで、「ゲノム関連核酸」とは、好ましくは一細胞のゲノムＤＮＡ、一細胞ゲノムに由来するｍＲＮＡ等のＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡ、または一細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブをいう。前記核酸プローブは、標的とする蛋白質等の分子に特異的に結合する分子（以下、結合分子ともいう）に切断可能に連結された互いに峻別しうるバーコード核酸を含むことが好ましい。また、核酸がゲノムＤＮＡである場合には、当該ＤＮＡは制限酵素等で切断された断片でも良いし、ＤＮＡタグが導入されていても良い。
【００１６】
本明細書において「バーコード領域」とは、Ｔ（チミン）またはＵ（ウラシル）、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、およびＣ（シトシン）からなるランダムな塩基配列の領域である。また、バーコード核酸はバーコード領域を含む核酸であり、細胞のゲノム関連情報やビーズ由来のイメージング情報を識別可能とするものである。
バーコード領域としては、共通バーコード領域、固有バーコード領域の二つが存在する。
共通バーコード領域とは、同一の識別の対象において共通するバーコード領域である。識別の対象が細胞のゲノム関連情報である場合には、細胞毎に異なるバーコード領域、すなわち、一つの細胞において共通するバーコード領域である。共通バーコード領域で標識することにより、同一細胞由来のゲノム関連情報が識別可能とされる。また、識別の対象がビーズのイメージング情報の場合には、同一のイメージング情報を有するビーズ毎に異なるバーコード領域、すなわち、同一のイメージング情報を有するビーズにおいて共通するバーコード領域である。共通バーコード領域で標識することにより、同一のイメージング情報を有するビーズ由来のイメージング情報を識別可能とするものである。
さらに、一細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブにおいて、該核酸プローブは該蛋白質等の分子に特異的に結合する分子（結合分子）を含むものである。ここで、前記核酸プローブにおける、前記結合分子毎に異なるバーコード領域、すなわち、同一の結合分子において共通するバーコード領域も共通バーコード領域とされる。
また、固有バーコード領域とは、バーコード核酸毎に異なるバーコード領域で標識することにより、各バーコード核酸を各々峻別可能とするものであり、各バーコード核酸に連結したビーズ、各バーコード核酸とハイブリダイズしたゲノム関連核酸を識別できる。バーコード領域の長さは、特に限定されるものでないが、好ましくは１０〜４０塩基長の配列であり、例えばバーコード領域が１２塩基長である場合は、４１２種類の多様性のあるバーコード配列を一度に核酸増幅することができ、４１２種類のビーズを作製することができる。
【００１７】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、バーコード核酸のハイブリダイズ領域がストリンジェントな条件下で細胞ゲノムもしくはその発現物に対応するゲノム関連核酸または別のバーコード核酸と二本鎖の複合体を形成することを意味する。ここでストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的な複合体が形成され、非特異的な複合体が形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばMolecular Cloning（ThirdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)やCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）を参照して設定することができる。
したがって、「ハイブリダイズ領域」とは、細胞ゲノムもしくはその発現物に対応するゲノム関連核酸または別のバーコード核酸に結合し得る（ハイブリダイズし得る）領域である。
例えば、ゲノム関連核酸がｍＲＮＡである場合は、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域はＴにより構成されるポリチミンであることが好ましい。ポリチミンの長さはｍＲＮＡのポリアデニン（Ａ）テールとアニーリングし得る（ハイブリダイズし得る）長さであればよい。上記の場合、第一ハイブリダイズ領域はポリチミンに相補的な配列、例えば、ポリアデニン（ポリＡ）であることが好ましい。
ゲノム関連核酸がゲノムＤＮＡ等のＤＮＡである場合、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域は当該ＤＮＡの特定の配列または当該ＤＮＡに導入されたＤＮＡタグの配列と相補的な配列を含んでなることが好ましい。上記の場合、第一ハイブリダイズ領域は第二ハイブリダイズ領域に相補的な配列であることが好ましい。
また、一細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブがバーコード核酸を含み、当該バーコード核酸がハイブリダイズ領域を含む場合には、第二バーコード核酸における第二ハイブリダイズ領域は当該ハイブリダイズ領域と相補的な配列を含んでなることが好ましい。上記の場合、上記核酸プローブに連結したバーコード核酸におけるハイブリダイズ領域は第二ハイブリダイズ領域に相補的な配列であることが好ましい。
【００１８】
本明細書において「コンパートメント」とは、他の液体または周囲の媒体から隔離された状態にある空間である。好ましくは、上記空間に保持されている一定容量の液体またはゲルである。また、上記コンパートメントは、微小区画ともいう。コンパートメントと周囲との隔離は、コンパートメントの周囲の固体バリアから、または相分離から得ることができる。例えば、疎水性担体液中に懸濁された水性液滴はコンパートメントを構成し得る。上記コンパートメントは、例えば、ウェル、液滴、ゲル粒子の形態であってよく、具体的には、水性液滴、油滴、ハイドロゲル（例えば、アガロース、コラーゲン、アルギン酸）のゲル粒子、エマルション等の複数の非混合界面の重なった水・油の構造体、マルチウェルプレートのウェル等が挙げられる。
【００１９】
検出方法
本発明の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法は、
１コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備し、
ここで、第一ビーズは、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、
各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、
かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、
前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており；
各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けし；
前記関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得；
該ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造し；
該増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出すること
を含んでなることを特徴としている。
【００２０】
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の検出方法を、好ましい実施態様に基づき説明する。
【００２１】
コンパートメント準備工程
本発明のコンパートメント準備工程は、１コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する工程である。ここで、第一ビーズは各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能である。前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している。
【００２２】
ここで、各コンパートメントにおける細胞と第一ビーズとの位置関係は、細胞の非破壊計測情報および第一ビーズのイメージング情報の取得を妨げない限り特に限定されず、細胞や第一ビーズの種類、サイズ、性質に応じて、適宜設定できる。すなわち、本発明においては、細胞と第一ビーズとはイメージング情報を共に取得しうる限り、同一コンパートメント内において第一ビーズと細胞とが接するかもしくは接さずに共に存在していてもよく、第一ビーズが細胞の内部に導入されていてもよい。第一ビーズと細胞が接する態様の好適な例としては、例えば、細胞表面と第一ビーズとが直接接着されるかまたは市販の細胞膜修飾剤を用いることにより第一ビーズを細胞に担持させる態様等が挙げられる。また、第一ビーズと細胞が接しない態様の好適な例としては、同一コンパートメント内で第一ビーズが細胞と接合することなく存在している態様や、細胞を含まないが第一ビーズを包含するサブコンパートメントと細胞とを接合させることによりサブコンパートメントを細胞に担持させる態様等が挙げられる。また、第一ビーズが細胞の内部に導入される態様の好適な例としては、第一ビーズが細胞に捕食されている態様等が挙げられる。
【００２３】
検出の対象となる細胞の種類、形態は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、目的に応じて細胞を選択することができる。また、上記コンパートメントに含まれる細胞は、細胞の由来物であってもよい。かかる由来物としては、細胞の破砕物、細胞の内容物、細胞の溶解物、細胞から構成されるユニット（例えば、細胞塊、スフェロイド、オルガノイド）が挙げられる。
【００２４】
細胞の由来物は、細胞と細胞溶解バッファー等とを共存させる等の公知手法を用いることにより取得することができる。細胞からその由来物を取得する工程は、細胞の非破壊計測情報と第一ビーズのイメージ情報とを共に取得して関連付けした後に第二ビーズと共にコンパートメント化する前に行ってもよく、細胞、第一および第二ビーズおよび細胞溶解バッファーと共に封入してコンパートメント中で生成させてもよい。
【００２５】
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明のコンパートメント準備工程の一態様を図１ａに従って説明する。
まず、組織または複数の細胞等検出対象となる細胞群１０１、複数の第一ビーズ１０２、複数の第二ビーズ１０３をそれぞれ準備する。なお、図１ａでは、第一バーコード核酸はＲＮＡであり、第一共通バーコード領域およびポリアデニンを含み、ＵＶ切断可能なリンカーを介して第一ビーズに連結している。また、第二バーコード核酸はＤＮＡであり、ＰＣＲプライマー領域、第二共通バーコード領域、第二固有バーコード領域およびポリチミンを含む。
【００２６】
その後、細胞群１０１、複数の第一ビーズ１０２、および複数の第二ビーズ１０３を分配処理することにより複数のコンパートメント１０４を得る。上記分配処理により、上記細胞群１０１のうちの一細胞１０５、第一ビーズ１０２、第二ビーズ１０３の組み合わせを複数のコンパートメント１０４に分配する。
分配処理の方法は後述する。
【００２７】
上記第一ビーズの１コンパートメント当たりの数は、特に限定されず、１つでも良いが、互いに峻別しうるコンパートメントの種類数を増やすために、複数であることが好ましく、２〜１００がより好ましく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０がさらに好ましい。複数の第一ビーズを同時にコンパートメントに閉じ込めることにより、少ない種類の第一ビーズのイメージング情報の組み合わせにより、コンパートメント内の第一ビーズのイメージング情報の組み合わせのバリエーションの数を急激に増加することができ、大量のコンパートメントを互いに峻別することができる。ここで、第一ビーズは同一のイメージング情報を有するものも存在するが、異なる種類のイメージング情報を有する第一ビーズがコンパートメント中に複数存在することが好ましい。
例えば、第一ビーズのイメージング情報として、ビーズのサイズ、蛍光の色、蛍光の濃度を選択した例を以下に示す。ビーズのサイズが３種類（３、７、１１μｍ）、蛍光色素の色が３色（青、緑、赤）、蛍光色素の濃度による強度レベルが６種類（０、１、２、３、４、５）とする。その場合、ビーズの種類としては、（強度レベルサイズ種類−１）×サイズ種類＝（６３−１）×３＝６４５となる。
ここで、コンパートメント中に、第一ビーズが３個存在する場合、第一ビーズの各組み合わせの種類としては６４５Ｃ３＞１０７通りと非常に多くの種類の組み合わせを得ることができる。
【００２８】
上記第二ビーズの１コンパートメント当たりの数は、特に限定されないが、同一細胞由来のゲノム関連情報の識別の観点から、１コンパートメント当たり１つが好ましい。
【００２９】
さらに、分配処理時に、後の工程で必要な試薬、例えば、細胞溶解バッファー、ＰＣＲリアクション・ミックス等のＰＣＲ用試薬を同時に封入しても良い。
【００３０】
一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程
本発明の一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程は、各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおいて、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする工程を含む。
以下、本発明を特に限定するものではないが、本発明の非破壊的計測情報の関連付け工程の一態様を図１ｂに従って説明する。
【００３１】
コンパートメント１０４の細胞１０５の非破壊的計測情報と、第一ビーズ１０２のイメージング情報とを共に測定する。さらに、得られた測定結果に基づき、コンパートメント１０４における細胞１０５の非破壊的計測情報と、第一ビーズ１０２のイメージング情報とを関連付けをする。
上記一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に検出または測定する方法としては、フローサイトメトリー（例えば、流路を流れるコンパートメントを観察するイメージングフローサイトメトリー法等）、顕微鏡測定（一般的な光学顕微鏡を用いたマイクロウェル内のコンパートメント観察法等）等が挙げられる。
また、本発明の別の態様によれば、コンパートメント１０４は、ビーズのイメージング情報により特定することができることから、例えば、インキュベーション、化学アッセイ、イメージング情報、または細胞の非破壊的計測情報の取得後の所定の時間の経過後、例えば、１０分後に、細胞の非破壊的計測情報等を再度測定することも可能である。
【００３２】
ここで、上記第一ビーズのイメージング情報としては、各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報が互いに峻別しうるものであれば、特に限定されないが、ビーズ自体が有するイメージング情報であっても標識されることにより付与されるイメージング情報であってもよい。ここで、「イメージング」とは、空間情報に基づき時間的に重なっている、ビーズ等の被検対象の計測情報を分離測定しうる方法を包含する。上記イメージングにより取得される被検対象の計測情報をイメージング情報という。上記イメージング情報としては、例えば、色（カラー）、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、赤外分光、ラマン分光、吸収スペクトル、第一ビーズの数から選択される少なくとも１つの測定情報が挙げられる。イメージング情報としては、好ましくは、赤外分光イメージング、ラマン分光イメージング、カラーイメージング、蛍光イメージングである。
蛍光としては、有機系蛍光分子、生体由来蛍光分子、量子ドット、重金属等の無機物質、またはそれらの組み合わせにより得ることができる。
透過、位相、散乱、反射等の測定情報は、濃度によって屈折率や色の異なる有機物質、無機物質、またはそれらの組み合わせにより得ることができる。また、これら情報は明視野観察法等により得ることができる。
吸収スペクトル、ラマンは、吸収、ラマン散乱スペクトルを有する吸収波長帯（分子フットプリント）の異なる有機分子、無機物質、それら組み合わせにより得ることができ、例えば、細胞信号と重ならない波長帯を有するアルキン系化合物が挙げられる。
また、コヒーレントラマンに関しては、例えば、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）法、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）法により測定することができる。
ビーズのサイズ、色、形状に関しても、第一ビーズのイメージング情報となり、これらサイズ、色、形状はビーズを例えばフローリソグラフィにより形成することにより、多種多様なものとなりうる。また、これら情報は明視野観察法等により得ることができる。
また、ビーズのイメージング情報は、細胞と空間的に分離されるため、細胞の非破壊的計測情報と干渉する事なく、分離することができる。
【００３３】
さらに、上記細胞の非破壊的計測情報としては、細胞の特徴を認識できるものであれば、特に限定されず、イメージング情報、細胞から得られる形態情報、細胞から得られる物理波（例えば、音、超音波）の測定情報、細胞から得られる電磁波（例えば、光、テラヘルツ）の測定情報が挙げられる。ここで、上記イメージング情報は第一ビーズのイメージング情報と同様に得ることができる。上記非破壊的計測情報としては、例えば、色、蛍光、サイズ、形状、電磁波、透過、位相、散乱、反射、コヒーレントラマン、赤外分光、ラマン、もしくは吸収スペクトル等の測定情報に基づくイメージング情報、または、核、細胞質の大きさ、細胞骨格の粗密さ、内部構造の特徴量、膜の一様さ、各構造の蛍光強度、分子局在、分子もしくは観察対象の位置関係等の細胞の形態情報が挙げられ、好ましくは、細胞から得られる形態情報である。
【００３４】
図１ｆおよび図１ｇでは、一例としてイメージング情報の解析スキームをより具体的に説明する。
図１ｆは、サイズ、ＲＧＢ、蛍光輝度やその他の光学特性をコントロールして作製されたｎ種類（ＩＤ）のビーズのイメージング情報を指標とする場合の第一ビーズのデータベースの模式図である。図１ｆでは、第一ビーズのイメージング情報を計測し、得られた第一ビーズのイメージング情報に光学的ビーズＩＤを紐付けしている。
さらに、図１ｇでは、細胞および第一ビーズの組合せの測定を行い、細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報を関連付けしている。まず、各第一ビーズの光学バーコードＩＤが読み出される（ここで、光学的なキャリブレーションが行われる）。また、各第一ビーズには、第一ビーズに連結する第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域に基づいて核酸バーコードＩＤが付与されている。したがって、上記第一ビーズの核酸バーコードＩＤの組合せと上記光学的ビーズＩＤの組合せとを照合し、細胞が特定される。この後、細胞の非破壊的計測情報と細胞のゲノム関連情報とを紐付けることができる。
【００３５】
本発明の一細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報の関連付け工程は、各コンパートメントを準備する前であっても、各コンパートメント準備後であっても実施することができる。特に各コンパートメントを準備する前に一細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して関連付けする態様においては、当該関連付け後に細胞を溶解・破砕等して細胞の由来物を得、当該由来物と第一ビーズとの混合物を第二のビーズと共にコンパートメント内に封入し、後続するハイブリダイズ複合体取得工程を実施することが好ましい。
【００３６】
ここで、各コンパートメントを準備する前に一細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報とを共に検出して関連付けする態様における細胞と第一ビーズとの位置関係は、上述の各コンパートメントにおける細胞と第一ビーズの位置関係と同様であり、細胞の非破壊計測情報および第一ビーズのイメージング情報の取得を妨げない限り特に限定されず、細胞や第一ビーズの種類、サイズ、性質に応じて、適宜設定できる。すなわち、本発明においては、細胞の非破壊計測情報と第一ビーズのイメージング情報とを共に取得しうる限り、同一コンパートメント内において第一ビーズと細胞とが接するかもしくは接さずに共に存在していてもよく、第一ビーズが細胞の内部に導入されていてもよい。好適な例としては、例えば、第一ビーズを細胞に担持させる態様、細胞を含まないが第一ビーズを包含するサブコンパートメントと細胞とを接合させることによりサブコンパートメントを細胞に担持させる態様、第一ビーズが細胞に捕食されている態様等が挙げられる。
【００３７】
ハイブリダイズ複合体取得工程
ハイブリダイズ複合体取得工程は、前記関連付けした第一ビーズから第一バーコード核酸を切断した後、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る工程を含む。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法により行うことができる。
以下、特に限定するものではないが、ハイブリダイズ複合体取得工程の一態様を図１ｃに従って説明する。
上述の一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報の関連付け工程に続き、切断可能なリンカーを切断（例えば、ＵＶ照射によりＵＶ切断可能なリンカーを切断）し、第一バーコード核酸１０６を切り離し、その後、細胞を溶解する。その後、コンパートメント内で、細胞由来ｍＲＮＡ１０７および第一ビーズ由来の第一バーコード核酸１０６をそれぞれ、第二バーコード核酸１０８にハイブリダイズさせ、ハイブリダイズ複合体１２０を得る。その後に、液滴を破壊する。
【００３８】
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程
ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程は、上記ハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する工程を含む。
上記工程は、公知の手法により行うことができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法により行うことができる。
以下、特に限定するものではないが、ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程の一態様を図１ｄに従って説明する。
上述のハイブリダイズ複合体取得工程で得られたハイブリダイズ複合体に対して、逆転写反応を行う。この逆転写反応により、細胞由来ｍＲＮＡ１０７に対するｃＤＮＡ１１０が合成され、第一バーコード核酸１０６に対するｃＤＮＡ１０９が合成される。その後、鋳型切り替え（テンプレートスイッチング）を行ってもよい。
その後、ＰＣＲ反応を行う。このＰＣＲ反応により、第一バーコード核酸１０６と第二バーコード核酸１０８とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物１１２、および、細胞由来ｍＲＮＡ１０７と第二バーコード核酸１０８とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物１１３の２種類の増幅物１１１が生じる。なお、ゲノム関連核酸がＤＮＡである場合には、上記ＰＣＲ反応としてエクステンションＰＣＲ法を行うことができる。
その後、得られた増幅物に基づいて、１〜ｎの各コンパートメントに由来する、第一増幅物および第二増幅物を含む増幅物のライブラリーを調製する。
【００３９】
一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報との一体的検出工程
一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する工程は、上記ハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する工程を含む。上記増幅物の発現パターンとしては、例えば、シークエンシングにより得られた、増幅物の配列情報、または、該配列情報中の第一バーコード核酸の配列情報、第一共通バーコード領域の配列情報、第一固有バーコード領域の配列情報、第二バーコード核酸の配列情報、第二共通バーコード領域の配列情報、もしくは第二固有バーコード領域の配列情報等が挙げられる。
以下、特に限定するものではないが、一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する工程の一態様を図１ｅに従って説明する。
上述のハイブリダイズ複合体由来の増幅物の製造工程で得られた増幅物（第一増幅物、第二増幅物）の配列をシーケンサーにより決定し、増幅物の配列情報の解析を行う。第二増幅物の解析では、第二共通バーコード領域の配列情報を指標として、各増幅物の由来する細胞を割り当てる。また、第二固有バーコード領域の配列情報により、各ｍＲＮＡ分子を識別できることから、該配列情報を指標として、細胞毎のｍＲＮＡの配列およびその発現量等の情報を得ることができる。上記第二増幅物の解析で得られた情報に基づき、細胞毎のトランスクリプトーム情報１１５を得ることができる。
次に、細胞の非破壊的計測情報１１４の解析を行う。ここで、上述のように、一細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報とが関連付けられており、該第一ビーズには、各イメージング情報に対応している第一バーコード核酸が連結している。したがって、上記解析では、第一バーコード核酸の第一共通バーコード領域の配列情報に基づいて、各第一増幅物に対し、由来する細胞の非破壊的計測情報１１４を割り当てることができる。
次に、細胞の非破壊的計測情報１１４と、トランスクリプトーム情報１１５のマッチングを行う。したがって、各コンパートメント中の一細胞のゲノム関連情報と非破壊的計測情報を、１対１で結びつけることができる。
【００４０】
さらに、上記で得られた一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報に基づいて取得された分類モデルを用い、被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該被検細胞を解析、判別または分類する方法を提供することができる。
上記方法において、まず、一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報のデータベースを作成することができる。さらに、上記データベースを用いて、上記の一細胞の非破壊的計測情報と該細胞のトランスクリプトーム等のゲノム関連情報のマッチングの結果に基づき、ゲノム関連情報をクラスタリング１１６することにより、各細胞をいくつかのタイプ１１７（細胞タイプＡ、Ｂ、Ｃ、・・・Ｎ）にラベル付けし、分類することができる。また、得られた上記の一細胞の非破壊的計測情報と細胞分類結果とを教師データとして用い、一細胞における非破壊的計測情報に関して機械学習して分類モデルを取得することができる（教師あり機械学習）。
さらに、上記で取得された分類モデルを用いて、被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該被検細胞を解析、判別または分類することができる。例えば、上記被検細胞における非破壊的計測情報に基づいて、該細胞に関し、ゲノム関連情報によりクラスタリングされた細胞タイプを同定することができる。
また、上記被検細胞を解析、判別または分類する方法の別の態様として、以下の方法も挙げられる。
まず、一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報のデータベースを作成することができる。上記データベースを用いて、上記の一細胞の非破壊的計測情報と該細胞のトランスクリプトーム等のゲノム関連情報のマッチングの結果に基づき、非破壊的計測情報をクラスタリングすることにより、各細胞をいくつかのタイプ（細胞タイプＡ、Ｂ、Ｃ、・・・Ｎ）にラベル付けし、分類することができる。また、得られた上記の一細胞の非破壊的計測情報と細胞分類結果とを教師データとして用い、一細胞におけるゲノム関連情報に関して機械学習して分類モデルを取得することができる（教師あり機械学習）。
さらに、上記で取得された分類モデルを用いて、被検細胞におけるゲノム関連情報に基づいて、該被検細胞を解析、判別または分類することができる。
【００４１】
以下に本明細書で用いる第一ビーズ、第二ビーズ等に関して記載する。
【００４２】
第一バーコード核酸と切断可能に連結されかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ
図２では、第一バーコード核酸と切断可能に連結されかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ（以下、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ、ともいう）の一態様として、第一バーコード核酸がＲＮＡである態様を示す。
第一バーコード核酸２０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ２０１に連結している。第一バーコード核酸２０２は第一共通バーコード領域２０３および第一ハイブリダイズ領域２０４を含む。第一バーコード核酸２０２は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域２０３および第一ハイブリダイズ領域２０４を含む。ここで、第一ハイブリダイズ領域２０４としてポリアデニンが挙げられる。さらに、第一バーコード核酸２０２は、切断可能なリンカー２０５を介して切断可能に、第一ビーズ２０１に連結している。
【００４３】
第一バーコード核酸を含む生物
本発明の第一ビーズは、第一バーコード核酸を含みかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する生物（以下、第一バーコード核酸を含む生物、ともいう）であってもよい。
かかる生物は、第一バーコード核酸を有するプラスミドを含むことが好ましい。また、かかる生物におけるイメージング情報は、本発明のイメージング情報であれば特に限定されないが、好ましくは、生物の個数、蛍光であり、蛍光としては各色のスペクトルのみならずその輝度情報も含む。さらに、蛍光はプラスミド中に存在する蛍光タンパク質遺伝子から発現する蛍光タンパク質により得られることが好ましい。したがって、本発明の生物は、例えば、第一バーコード核酸と蛍光タンパク質遺伝子とを有するプラスミドを含むことが好ましい。ここで、第一バーコード核酸は第一共通バーコード領域（例えば、蛍光タンパク質毎に共通した共通バーコード領域）および第一ハイブリダイズ領域を含み、第一ハイブリダイズ領域としてポリアデニンが挙げられる。さらに、第一バーコード核酸は第三固有バーコード領域を含んでいてもよい。かかる第三固有バーコード領域は生物の各クローンを峻別可能とするものである。したがって、本発明の生物におけるプラスミドの構成は、例えば、順に、蛍光タンパク質遺伝子領域、第三固有バーコード領域、第一共通バーコード領域、および第一ハイブリダイズ領域とされる。
【００４４】
第一ビーズ
本発明の第一ビーズは、イメージング情報により互いに峻別しうるビーズである。
本明細書において、ビーズとは、バーコード核酸が連結できる粒子またはバーコード核酸を含むことができる生物であれば特に限定されず、形状も限定されない。
第一ビーズが粒子である場合、その材質は、特に限定されないが、セレン化カドミウム（CdSe）、硫化亜鉛（ZnS）、硫化カドミウム（CdS）、セレン化亜鉛（ZnSe）、酸化亜鉛（ZnO）等の半導体材料でできた量子ドット（半導体ナノ粒子）等の半導体、金等の重金属等の無機物質、アクリルアミド、アガロース、コラーゲン、アルギン酸、ＰＥＧ系等のハイドロゲル、ポリスチレン、ポリプロピレン、親水性ビニルポリマー（例えば、Toyopearl HW-65S(東ソー株式会社)）等の樹脂、または、ＰＥＧまたはその誘導体が結合した親水性ビニルポリマー等が挙げられ、好ましくは、ハイドロゲルであり、より好ましくは、アクリルアミド、アルギン酸である。
第一ビーズが生物である場合、生物の種類、形態は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、目的に応じて生物を選択することができる。かかる生物としては、真核生物もしくは原核生物またはその細胞が挙げられ、例えば微生物等であり、具体的には、大腸菌等のバクテリア、酵母等の真菌が挙げられる。かかる生物は第一バーコード核酸を有するプラスミドを増幅できることが好ましい。
【００４５】
第一バーコード核酸
本発明の第一バーコード核酸は、各イメージング情報に対応するバーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸はＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれら組み合わせである。
本発明の第一バーコード核酸は、各々同一のイメージング情報に対応する第一ビーズにおいて共通する第一共通バーコード領域と、第二バーコード核酸とハイブリダイズ可能な第一ハイブリダイズ領域を含んでなることが好ましい。ここで、第一共通バーコード領域の配列情報を用いることにより、各コンパートメントにおける同一のイメージング情報を有する第一ビーズのイメージング情報に一対一に対応できる。したがって、関連付けにより、同一コンパートメント中に存在する一細胞の非破壊的計測情報を特定する指標とすることができる。
上記第一バーコード核酸は第一ビーズ一つあたり複数連結していることが好ましい。
また、本発明の第一ビーズは一種類の第一バーコード核酸を連結していることが好ましい。
【００４６】
第一バーコード核酸は第一ビーズと直接的または間接的に連結することができる。第一バーコード核酸は第一ビーズと切断可能に連結されることが好ましく、例えば、切断可能なリンカーにより連結することができる。本発明において、切断可能なリンカーとは、化学的に切断可能なリンカー、ＵＶ等の光切断可能なリンカー、熱学的に切断可能なリンカー、酵素学的に切断可能なリンカー等が挙げられる。上記リンカーを用いることで、連結された核酸をビーズから切断し、分離または遊離できることを示す。このようなリンカーとしては、例えは、光により切断可能なリンカーとして、ＰＣ−ビオチン、ｉＳｐＰＣ等、化学的に切断可能なリンカーとして、ジスルフィド結合等が挙げられる。
【００４７】
本発明の第一ビーズの好ましい別の態様としては、各々互いに峻別しうる第一固有バーコード領域、プライマー領域をさらに含んでいてもよい。本発明の第一ビーズの好ましいさらに別の態様としては、切断可能なリンカーを介してアクリルホスホロアミダイド部分（Acrydite（商標））等のアクリルアミド部分を有していてもよい。
【００４８】
第一バーコード核酸と切断可能に連結されかつ互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズの製造方法
第一バーコード核酸と連結している第一ビーズの製造方法は、公知の手法に準じて製造することができる。例えば、A. M. Klein et al., Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell. 161, 1187-1201 (2015) に記載の方法に準じて製造することができる。
上記方法の一例としては、マイクロ流体エマルジョン技術により、第一バーコード核酸含有アクリルアミド：ビスアクリルアミド水溶液を有機溶媒層中でアクリルアミド重合体とし、第一ビーズとして用いる。ここで、第一バーコード核酸に結合した切断可能なリンカーのビーズ連結側はアクリルホスホロアミダイド部分（Acrydite（商標））等のアクリルアミド部分で修飾することができる。上記修飾によりアクリルアミドの重合時に、第一バーコード核酸もアクリルアミド重合体に共に重合される。このエマルション化の前に、例えば、上記水溶液に、蛍光標識されたアクリルアミドモノマーを溶解させておくことにより、各色での種々の蛍光強度を有する第一ビーズを作成することができる。具体的には、第一ビーズはフローフォーカシング・デバイス(flow focusing device)、またはマイクロウェル等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法を用いて製造することができる。ビーズのサイズは、フローフォーカシング・デバイスでは流体条件を変えることにより、マイクロウェルではそれぞれのチャンバーのサイズを変更することにより制御することができる。重合化した後、得られた第一ビーズを液滴から取り出し、何回か洗浄し、第一ビーズとして用いる。
第一バーコード核酸と連結している第一ビーズの製造方法は、公知の手法でも製造することができる。例えば、特表２００９−５１３９４８号公報、特表２０１７−５０６８７７号公報に記載の方法により製造することができる。
上記方法の一例を述べる。まず、第一バーコード核酸は特定の核酸配列を固相合成法または酵素合成法により調製される。その後、切断可能なリンカーを介して第一ビーズに結合する。バーコード核酸がＲＮＡである場合は、一本鎖バーコード核酸の相補鎖となるＤＮＡ鋳型を合成した後、線形増幅反応にて、ＤＮＡ鋳型上のプロモーター配列に結合して一本鎖バーコード領域を含むＲＮＡを合成する、Ｔ７等のＲＮＡポリメラーゼにより合成してもよい。
【００４９】
複数の第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
図３では、ゲノム関連核酸、および第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、第二ビーズ（以下、第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ、ともいう）の一態様を示す。
図３では、第二バーコード核酸３０２が第二ビーズ３０１に連結している。第二バーコード核酸３０２は、第二共通バーコード領域３０３、第二固有バーコード領域３０４および第二ハイブリダイズ領域３０５を含む。第二バーコード核酸３０２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域３０６、第二共通バーコード領域３０３、第二固有バーコード領域３０４および第二ハイブリダイズ領域３０５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域３０５はポリチミンである。
第二ビーズは、多数のゲノム関連核酸とハイブリダイズできる観点から、１，０００〜１００，０００の第二バーコード核酸と連結していることが好ましい。
【００５０】
第二ビーズ
本発明の第二ビーズの材質は、第一ビーズ粒子と同様の材質を用いることができる。
本発明の第二ビーズの材質は、好ましくは、ハイドロゲル、樹脂であり、より好ましくは、アクリルアミド、ポリスチレン、親水性ビニルポリマー、ＰＥＧまたはその誘導体が結合した親水性ビニルポリマーである。
【００５１】
第二バーコード核酸
本発明の第二バーコード核酸は、バーコード領域を含んでいれば、特に限定されず、例えば、該核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれら組み合わせである。第二バーコード核酸は第二ビーズに直接的または間接的に連結することができる。
本発明の第二バーコード核酸は、互いに共通する第二共通バーコード領域と、互いに峻別しうる第二固有バーコード領域と、第二ハイブリダイズ領域とを含むことが好ましい。ここで、上記第二共通バーコード領域の配列情報は、コンパートメント中に第二バーコード核酸と共に存在する細胞を特定する指標として用いることができる。さらに、上記第二固有バーコード領域の配列情報は、ゲノム関連核酸を特定する指標として用いることができる。また、上記第二ハイブリダイズ領域は、ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸のそれぞれとハイブリダイズすることができる。したがって、第二ハイブリダイズ領域がポリチミン、またはゲノム関連核酸と相補的な核酸を含むことが好ましい。
上述のように、ゲノム関連核酸は上記第二共通バーコード領域の配列情報に関連づけられるため、該ゲノム関連核酸が由来する細胞を特定することができる。さらに、上記第二バーコード核酸は第一バーコード核酸とハイブリダイズするため、第一ビーズの第一共通バーコード領域等の配列情報も上記第二共通バーコード領域の配列情報に関連づけられることとなる。なお、第一共通バーコード領域の配列情報は各第一ビーズのイメージング情報に関連づけられている。また、細胞の非破壊的計測情報も各第一ビーズのイメージング情報に関連づけられている。したがって、ゲノム関連核酸情報と細胞の非破壊的計測情報に一対一に対応できる。
【００５２】
さらに、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズおよび第二バーコード核酸と連結している第二ビーズの別の態様を図４に示す。図４では、別の態様として、第一バーコード核酸および第二バーコード核酸がそれぞれＤＮＡである態様を示す。
図４Ａの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ４００では、第一バーコード核酸４０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ４０１に連結している。第一バーコード核酸４０２は第一共通バーコード領域４０３および第一ハイブリダイズ領域４０４を含む。第一バーコード核酸４０２は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域４０３および第一ハイブリダイズ領域４０４を含む。さらに、第一バーコード核酸４０２は、切断可能なリンカー４０５を介して切断可能に、第一ビーズ４０１に連結している。さらに、第一ハイブリダイズ領域４０４は下記第二ハイブリダイズ領域４１５に相補的な配列である。
また、図４Ａの第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ４１０では、第二バーコード核酸４１２が第二ビーズ４１１に連結している。第二バーコード核酸４１２は、第二共通バーコード領域４１３、第二固有バーコード領域４１４および第二ハイブリダイズ領域４１５を含む。第二バーコード核酸４１２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域４１６、第二共通バーコード領域４１３、第二固有バーコード領域４１４および第二ハイブリダイズ領域４１５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域４１５はゲノム関連核酸４２２の特定の配列とハイブリダイズする、当該配列に相補的な配列である。
さらに、図４Ａには、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ４００および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ４１０とともに、細胞４２０を含むコンパートメント４３０を示す。
また、図４Ｂでは、ハイブリダイズ複合体を示す。ここで、第二バーコード核酸４１２は第二ハイブリダイズ領域４１５にて、第一バーコード核酸４０２の第一ハイブリダイズ領域４０４とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸４１２は第二ハイブリダイズ領域４１５にて、ゲノム関連核酸４２２の特定の配列４２１とハイブリダイズしている。
【００５３】
さらに、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズおよび第二バーコード核酸と連結している第二ビーズのさらに別の態様を図５に示す。図５では、第一バーコード核酸および第二バーコード核酸がそれぞれＤＮＡであり、一細胞で発現する蛋白質等の分子に特異的な核酸プローブ５２０（以下、核酸プローブ５２０ともいう）を含む態様を示す。
図５Ａの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ５００では、第一バーコード核酸５０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ５０１に連結している。第一バーコード核酸５０２は第一共通バーコード領域５０３および第一ハイブリダイズ領域５０４を含む。第一バーコード核酸５０２は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域５０３および第一ハイブリダイズ領域５０４を含む。さらに、第一バーコード核酸５０２は、切断可能なリンカー５０５を介して切断可能に第一ビーズ５０１に連結している。さらに、第一ハイブリダイズ領域５０４は下記第二ハイブリダイズ領域５１５に相補的な配列である。
また、図５Ａの第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ５１０では、第二バーコード核酸５１２が第二ビーズ５１１に連結している。第二バーコード核酸５１２は、第二共通バーコード領域５１３、第二固有バーコード領域５１４および第二ハイブリダイズ領域５１５を含む。第二バーコード核酸５１２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域５１６、第二共通バーコード領域５１３、第二固有バーコード領域５１４および第二ハイブリダイズ領域５１５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域５１５は核酸プローブ５２０のハイブリダイズ領域５２４に相補的な配列である。
図５Ｂ（１）では、核酸プローブ５２０を示す。図５Ｂ（２）では、上記核酸プローブ５２０を細胞５３０と混合し洗浄することにより得られた、上記核酸プローブ５２０が細胞５３０で発現する蛋白質に結合する態様を示す。さらに、図５Ｂ（３）では、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ５００および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ５１０とともに、上記核酸プローブ５２０が結合した細胞５３０を含むコンパートメント５４０を示す。
図５Ｂ（１）の核酸プローブ５２０では、第三バーコード核酸５２２が、一細胞で発現する目的蛋白質等の分子に特異的に結合する分子５２１（以下、結合分子５２１ともいう）に連結している。第三バーコード核酸５２２は第三共通バーコード領域５２３および第三ハイブリダイズ領域５２４を含む。第三バーコード核酸５２２は、結合分子５２１から順に、第三共通バーコード領域５２３および第三ハイブリダイズ領域５２４を含む。さらに、第三バーコード核酸５２２は、切断可能なリンカー５２５を介して切断可能に、結合分子５２１に連結している。さらに、第三ハイブリダイズ領域５２４は第二ハイブリダイズ領域５１５に相補的な配列である。上記核酸プローブ５２０は、結合分子５２１毎に異なる第三バーコード核酸５２２を含む複数種類のプローブであって良い。
また、図５Ｃはハイブリダイズ複合体を示す。第二バーコード核酸５１２は第二ハイブリダイズ領域５１５にて、第一バーコード核酸５０２の第一ハイブリダイズ領域５０４とハイブリダイズしている。さらに、第二バーコード核酸５１２は第二ハイブリダイズ領域５１５にて、第三バーコード核酸５２２の第三ハイブリダイズ領域５２４とハイブリダイズしている。
上記核酸プローブ５２０の第三共通バーコード領域５２３の配列に由来する増幅物の配列情報の解析を行うことにより、目的とする分子の細胞での発現の有無や量を確認することができる。
したがって、一細胞で発現する分子に特異的な核酸プローブを用いることにより、大量プロテオミクスと細胞の非破壊的計測情報とが一対一に対応できる。
【００５４】
さらに、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズの別の態様を図６に示す。図６では、別の態様として、第一バーコード核酸がＤＮＡであり、特定の配列を含む態様を示す。
図６Ａの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ６００では、第一バーコード核酸６０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ６０１に連結している。第一バーコード核酸６０２は第一共通バーコード領域６０３および第一ハイブリダイズ領域６０４を含む。第一バーコード核酸６０２は、第一ビーズ側から順に、第一共通バーコード領域６０３および第一ハイブリダイズ領域６０４を含む。さらに、第一バーコード核酸６０２は、切断可能なリンカー６０５を介して切断可能に、第一ビーズ６０１に連結している。さらに、第一バーコード核酸６０３と切断可能なリンカー６０５の間に、特定の配列６０６を含む。さらに、第一ハイブリダイズ領域６０４は第二ハイブリダイズ領域６１５に相補的な配列である。
また、図６Ｂ（１）では、ハイブリダイズ複合体を示す。６１０は第二バーコード核酸と連結している第二ビーズを示す。ここで、第二バーコード核酸６１２は第二ハイブリダイズ領域６１５にて、第一バーコード核酸６０２の第一ハイブリダイズ領域６０４とハイブリダイズしている。さらに、図６Ｂ（２）に示すように、特定の配列６０６に相補的な配列のプライマー６０７を用いることにより、第一バーコード核酸６０２および第二バーコード核酸６１２と相補的なＤＮＡが合成され、さらに、第二バーコード核酸６１２の相補的なＤＮＡの合成はテンプレートスイッチングにより行われる。
【００５５】
さらに、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズおよび第二バーコード核酸と連結している第二ビーズの別の態様を図７に示す。図７では、別の態様として、第一バーコード核酸および第二バーコード核酸がそれぞれＤＮＡである態様を示す。
図７Ａはコンパートメントの準備工程を示す。図７Ａの第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ７００では、第一バーコード核酸７０２が、互いに峻別しうるイメージング情報を有する第一ビーズ７０１に連結している。第一バーコード核酸７０２は第一共通バーコード領域７０３および第一ハイブリダイズ領域７０５を含む。第一バーコード核酸７０２は、第一ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域７０８、第一共通バーコード領域７０３、第一固有バーコード領域７０４および第一ハイブリダイズ領域７０５を含む。さらに、第一バーコード核酸７０２は、切断可能なリンカー７０６を介して切断可能に、第一ビーズ７０１に結合したアクリルホスホロアミダイド部分（Acrydite（商標））等のアクリルアミド部分７０７に連結している。さらに、第一ハイブリダイズ領域７０５はポリアデニンである。
また、図７Ａの第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ７１０では、第二バーコード核酸７１２が第二ビーズ７１１に連結している。第二バーコード核酸７１２は、第二共通バーコード領域７１３、第二固有バーコード領域７１４および第二ハイブリダイズ領域７１５を含む。第二バーコード核酸７１２は、第二ビーズ側から順に、ＰＣＲプライマー領域４１６、第二共通バーコード領域７１３、第二固有バーコード領域７１４および第二ハイブリダイズ領域７１５を含む。上記第二ハイブリダイズ領域７１５はポリチミンである。７２０は細胞を示す。
図７Ｂ〜Ｅは、一細胞の非破壊的計測情報とビーズのイメージング情報との関連づけ工程を経た後の、ハイブリダイズ複合体取得工程を示す。
図７Ｂでは、光切断可能なリンカーを切断し、細胞を溶解している。図７Ｂでは、第一バーコード核酸７０２が切断された第一ビーズ７０１、第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ７１０、および細胞由来ｍＲＮＡ７２１を示す。
また、図７Ｃでは、ハイブリダイズ複合体を示す。ここで、第二バーコード核酸７１２は第二ハイブリダイズ領域７１５にて、第一バーコード核酸７０２の第一ハイブリダイズ領域７０５とハイブリダイズしている。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ７２２により相補鎖ＤＮＡ７２３が合成される。さらに、第二バーコード核酸７１２は第二ハイブリダイズ領域７１５にて、細胞由来ｍＲＮＡ７２１のポリアデニンとハイブリダイズしている。
図７Ｄでは、ハイブリダイズ複合体において、逆転写反応が行われ、細胞由来ｍＲＮＡ７２１に対するｃＤＮＡ７２４が合成される。
図７Ｅでは、合成されたｃＤＮＡの３’末端がＤＮＡタグ７２５によりタグ化されている。上記ＤＮＡタグは、ＰＣＲのプライマーサイトとして用いることができ、例えば、トランスポゾンMosaic End(ME)配列が挙げられる。
【００５６】
複数の第二バーコード核酸と連結している第二ビーズの製造方法
複数の第二バーコード核酸と連結している第二ビーズの製造方法は、公知の手法により製造することができる。例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法により製造することができる。
上記方法を簡単に述べると、第二バーコード核酸における第二共通バーコード領域は分割プール合成 (split-and-pool synthesis) により製造することができる。例えば、分割プール合成工程をｎラウンド行うことにより製造できる。各ラウンドは、ｉ）ビーズの集団を４個に分割する工程、ｉｉ）各ビーズ集団毎にＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔのいずれかを合成する工程、ｉｉｉ）４つのビーズ集団を合わせてプールする工程からなる。ラウンド数ｎは、製造するバーコード配列の長さにより適宜設定できる。例えば、ｎ＝６〜４０が挙げられる。
上記第二共通バーコードを製造した後に、第二固有バーコード領域を合成する。第二共通バーコード領域に連結した全てのビーズに対してＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの全ての塩基の存在下での合成をｍラウンド行う。ラウンド数ｍは、製造するバーコード配列の長さにより適宜設定できる。例えば、ｍ＝３〜１５が挙げられる。
【００５７】
分配処理
分配処理、すなわち、コンパートメントの製造方法の一態様を図８、９に基づき、具体的に説明する。
図８ａ、ｂは、シングルステップでコンパートメントを製造し、一細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報とを共に検出および／または測定する方法を示す。具体的には、細胞８０１、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ８０２、および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ８０３を含む溶液を油８０６中に入れ、コンパートメント８０７としての液滴を作成し、出口８０８で放出する。非破壊的計測情報の測定は、図８ａではコンパートメントの形成の前および後に行われ、図８ｂではコンパートメントの形成の後に行われる。図８ａでは、コンパートメントの形成の前と後に各１種類の測定、例えば蛍光イメージング測定８０４、明視野イメージング８０５を行うことができる。ここで、コンパートメントの作成前の測定では、細胞および第一ビーズの正確なイメージング情報を得ることができ、コンパートメントの作成後の測定では、コンパートメント中の細胞および第一ビーズの組み合わせを確認することができる。また、図８ａ、ｂの方法によれば、細胞および第一ビーズの自然な状態が撮影可能になる。上記方法において、具体的に使用する機器としては、コンパートメントの製造にはフローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器、非破壊的計測情報の測定には、イメージングフローサイトメトリー等が挙げられる。上記機器としては、本発明を妨げない限り、公知の機器を用いることができる。フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器として、例えば、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015)、Microfluid Nanofluid(2008)5:585-594, Applied Physics Letters、Vol.85, No.13, 27, September 2004, p2649-2651、T. M. Gierahn et al., Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput, Nature Methods, 14, 395-398 (2017)、特表２０１３−５０８１５６等に記載の機器が挙げられる。上記フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法に用いられる機器によれば、色、形、サイズをはじめとするイメージング情報を有するビーズを効率よく大量に製造することができる。
【００５８】
また、図９では、２ステップでのコンパートメントの製造方法を示す。まず、ステップＡでは、細胞９０１、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ９０２、および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ９０３を含む溶液を油９０４に入れコンパートメント９０５を形成した後に出口９０６で放出し、ゲル化９０７する。その後、ステップＢでは、ゲル化した粒子９０７を、細胞溶解バッファー９０８を含む水性溶媒に放出し、蛍光イメージング測定９０９を行い、油９１０にて封入し更なるコンパートメント９１１を形成する方法を示す。図９の方法によれば、液滴等のコンパートメント中の細胞を撮影しようとすると回転したりする可能性があるが、水相内に存在するゲル粒子内に閉じ込められた細胞やビーズは、回転する事がなく、安定な撮影が可能となる。
【００５９】
また、図１０では、２ステップでのコンパートメントの製造方法の別の態様を示す。まず、ステップＡでは、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ１００２、および第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ１００３を含む溶液を油１００４に入れコンパートメント１００５を形成した後に出口１００６で放出し、ゲル化１００７する。その後、ステップＢでは、ゲル化した粒子１００７と細胞１００１を、細胞溶解バッファー１００８を含む水性溶媒に放出し、蛍光イメージング測定１００９を行い、油１００４にて封入し更なるコンパートメント１０１０を形成する方法を示す。細胞、細胞溶解バッファー、第一ビーズおよび第二ビーズを閉じ込めたコンパートメント内では、最終的に該溶解バッファーが細胞およびゲル化した粒子を溶解し、ハイブリダイズ複合体を取得することができる。
【００６０】
また、図１１では、２ステップでのコンパートメントの製造方法のさらに別の態様を示す。まず、ステップＡでは、第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ１１０２と細胞１１０１とを含む溶液を作成し混合する。その後、例えば、流路中で第一ビーズを担持した細胞が得られる。得られた細胞の蛍光イメージング測定１１０３を行う。その後、ステップＢでは、第一ビーズを担持した細胞１１０４を含む溶液、第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ１１０５、および細胞溶解バッファー１１０６を含む水性溶媒は流路中で混合される。得られた混合液は油１１０８の充填された流路に放出され、コンパートメント１１０７としての液滴を作成し、出口１１０９で放出される。上記方法は、コンパートメント中に細胞の由来物を含む態様でも利用できる。
【００６１】
システム
本発明の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するシステムは、１コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントを準備する、コンパートメント準備部であって、第一ビーズは、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能であり、前記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している、コンパートメント準備部と、各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを共に測定して、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とを関連付けする、非破壊的計測情報の測定部と、前記関連付けした第一ビーズから各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を切断し、前記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体を得る、ハイブリダイズ複合体形成部と、前記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物を製造する、増幅物製造部と、前記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する、非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部とを含んでなることを特徴としている。
【００６２】
図１２のフローチャートにしたがって、本システムを説明する。
（Ａ）コンパートメント準備部において、１コンパートメント当たり、一細胞またはその由来物と、第一ビーズと、第二ビーズとを含む複数のコンパートメントが準備される。上記複数のコンパートメントは、細胞群、複数の第一ビーズ、および複数の第二ビーズを分配処理することにより得ることが好ましい。ここで、上記第一ビーズは各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、かつ各コンパートメントにおける第一ビーズのイメージング情報は互いに峻別可能である。さらに、上記第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸または第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結している。上記コンパートメント準備部として使用する機器としては、フローフォーカシング・デバイス等のマイクロ流体技術を用いた液滴製造法で用いる装置が挙げられる。
（Ｂ）非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部において、各コンパートメントを準備する前または各コンパートメントにおける、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とが共に測定され、一細胞の非破壊的計測情報と、第一ビーズのイメージング情報とが関連付けされる。非破壊的計測情報の測定に用いる機器としては、フローサイトメトリー装置または顕微鏡が挙げられる。なお、コンパートメントが、液滴またはゲル粒子等の非破壊的計測情報、イメージング情報測定により破壊されない形態である場合には、細胞の非破壊的計測情報と第一ビーズのイメージング情報は、一度測定した後に、再度測定することができる。再度測定することは、細胞の非破壊的計測情報の変化を時系列で取得できる点で有利である。
また、コンパートメントに細胞の由来物が含まれる場合、一細胞の非破壊的計測情報および第一ビーズのイメージング情報の測定および関連付けはコンパートメントの準備前に行われることが好ましい。したがって、（Ａ）コンパートメント準備部においてコンパートメントが準備される前に、（Ｂ）非破壊的計測情報およびイメージング情報の測定部において、一細胞の非破壊的計測情報および第一ビーズのイメージング情報との測定および関連付けが行われてもよい。
（Ｃ）ハイブリダイズ複合体形成部において、上記関連付けした第一ビーズから固有の第一バーコード核酸が切断され、上記ゲノム関連核酸および第一バーコード核酸をそれぞれ、第二バーコード核酸とハイブリダイズさせてハイブリダイズ複合体が得られる。ハイブリダイズ複合体の形成に用いる機器や試薬としては、第一バーコード核酸に連結している切断可能リンカーの切断装置およびハイブリダイズ複合体形成のための試薬や装置が挙げられる。上記切断可能リンカーの切断装置は、切断可能リンカーの種類により適宜選択することができ、例えば、該切断可能リンカーがＵＶ切断可能リンカー（例えば、ｉＳｐＰＣ（Integrated DNA Technologies社））である場合には、ＵＶ照射装置（例えば、BlackRayキセノンランプ装着装置）が挙げられる。また、ハイブリダイズ複合体形成の試薬としては、通常の核酸のハイブリダイズに用いられる試薬、装置としては、ウォーターバス等が挙げられる。
（Ｄ）増幅物製造部において、上記ハイブリダイズ複合体に由来する増幅物が製造される。増幅物の製造としては、例えば、ゲノム関連核酸がＲＮＡの場合には、逆転写およびＰＣＲが挙げられ、ゲノム関連核酸がＤＮＡの場合には、エクステンションＰＣＲが挙げられる。増幅物製造に用いる試薬としては、通常の逆転写またはＰＣＲ反応に用いられる試薬、機器としては、ＰＣＲ装置が挙げられる。
（Ｅ）非破壊的計測情報およびゲノム関連情報の検出部において、上記増幅物の発現パターンを指標として一細胞における非破壊的計測情報とゲノム関連情報とが一体的に検出される。ゲノム関連情報は、ゲノム関連核酸の配列情報をシークエンサーに決定することにより得られる。得られたゲノム関連情報と一細胞における非破壊的計測情報を、コンピューターにより関連づけることができる。
なお、上記システムの態様は、本発明の検出方法に関する記載に準じて実施することができる。
【００６３】
組み合わせ物
本発明の別の実施態様としては、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズおよび第二ビーズの組み合わせ物であって、第一ビーズは、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出することができることを特徴としている。また、本発明の組み合わせ物は、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するために用いる限り、特に制限されず、１つの組成物または試薬等の剤の形態であってもよく、複数の組成物または試薬等の剤の組み合わせから構成されていてもよい。また、上記組み合わせ物は一体的にまたは別体として構成されていてもよい。上記複数または別体としての組成物の組み合わせとしては、例えば、第一ビーズを含んでなる組成物と、第二ビーズを含んでなる組成物との組み合わせが挙げられる。ここで、上記組み合わせ物は、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法に用いるための試薬キットであってもよい。かかる試薬キットは、緩衝液、逆転写反応またはＰＣＲ反応に必要な試薬、細胞溶解バッファー等の必要な試薬、使用説明書等を備えていてもよい。
【００６４】
第一ビーズを含んでなる検出剤
本発明の別の実施態様としては、一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第二ビーズと共に用いる、第一ビーズを含んでなる検出剤であって、第一ビーズは、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出できることを特徴としている。
【００６５】
第二ビーズを含んでなる検出剤
一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出するための、第一ビーズと共に用いる、第二ビーズを含んでなる検出剤であって、第一ビーズは、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸と切断可能に連結されている粒子、または、各々、各イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物であって、第二ビーズは、細胞ゲノムまたはその発現物に対応するゲノム関連核酸あるいは第一バーコード核酸とハイブリダイズ可能な複数の第二バーコード核酸と連結しており、第一バーコード核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第一増幅物の発現パターンを指標として一細胞の非破壊的計測情報を検出し、かつ前記ゲノム関連核酸と第二バーコード核酸とのハイブリダイズ複合体に由来する第二増幅物の発現パターンを指標として一細胞のゲノム関連情報を検出できることを特徴としている。
【００６６】
被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法
また、本発明の別の態様として、本発明の一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを一体的に検出する方法を用いて、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法を提供できる。上述の、被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報とを取得する方法は、コンパートメント中に、一細胞またはその由来物、上記第一ビーズ、および上記第二ビーズとともに、上記被検物質を共存させることを特徴とする。被検物質を共存させるタイミング（例えば、添加のタイミング）は、コンパートメントの形成前、形成時、または形成後が挙げられる。また、被検物質としては、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、ウイルス等の薬剤等が挙げられる。各コンパートメント中の被検物質は、同一であっても異なっていてもよい。また、被検物質の濃度も、各コンパートメントにおいて同一であっても異なっていてもよい。
さらに、上記方法で得られた被検物質に対する一細胞の非破壊的計測情報とゲノム関連情報を用いて、被検物質のスクリーニング等のアッセイを行うことができる。得られた細胞のゲノム関連情報および／または非破壊的計測情報から、被検物質に対する該細胞の応答（例えば、分子発現・局在、形態、分化の変化等）を計測し、その応答の計測結果に基づいて被検物質のスクリーニング等のアッセイを行うことができる。
【００６７】
上記の組み合わせ物、第一ビーズを含んでなる検出剤、第二ビーズを含んでなる検出剤、取得方法の態様はいずれも、本発明の検出方法に関する記載に準じて実施することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されない。また、特に言及しない限り、本発明の測定方法および単位は日本工業規格（JIS）の規定に従う。【００６９】
例１：第一ビーズの作成
第一ビーズの作成
まず、蛍光標識アルギン酸ナトリウム溶液を作成した。具体的には、２質量％アルギン酸ナトリウム溶液に所望の濃度で蛍光色素を添加し、緑色、赤色または青色の蛍光アルギン酸ナトリウム溶液を作成した。なお、緑色の蛍光色素としては５ＦＴＳＣ（フルオレセイン−５−チオセミカルバジド）、赤色の蛍光色素としてはＡＦ５５５ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ、青色の蛍光色素としてはＣａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ Ｈｙｄｒａｚｉｄｅを用いた。  【００７０】
次に、第一バーコード核酸連結アルギン酸ナトリウム溶液を作成した。具体的には、アルギン酸ナトリウム溶液にＮ−β−マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ＢＭＰＨ）を添加し、ＢＭＰＨ−アルギン酸ナトリウム溶液を作成した。得られたＢＭＰＨ−アルギン酸ナトリウム溶液に、５’末端がチオール修飾された第一バーコード核酸を添加し、第一バーコード核酸連結アルギン酸ナトリウム溶液を作成した。【００７１】
蛍光アルギン酸ナトリウム溶液と第一バーコード核酸連結アルギン酸ナトリウム溶液との２質量％アルギン酸ナトリウム混合液と、Ｃａ−ＥＤＴＡ溶液（５０ｍＭ−ＥＤＴＡ／５０ｍＭ塩化ナトリウム  ｐＨ７．２）とを等量混合した分散相溶液を得た。ここで、第一バーコード核酸は、同色の蛍光に共通する第一共通バーコード領域を有するものとした。次に、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法に準じて分散相溶液を連続相溶液（界面活性剤を含有するフッ素系オイル）中に加え、得られた混合液中に液滴を形成させた。次に、当該混合液に０．０５％となるように酢酸を加え、Ｃａ−ＥＤＴＡからＣａを遊離させ、液滴をゲル化させて第一バーコード核酸連結蛍光アルギン酸ビーズ（以下、第一ビーズ、または、緑色、赤色もしくは青色蛍光第一ビーズともいう）を生成した。混合液中の第一ビーズは、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈパーフルオロオクタノールを用いて洗浄して単離した。【００７２】
ビーズの蛍光安定性の確認
５ｍＬのＴＥＢＳＴバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）に約  １０，０００，０００個の第一ビーズ（緑色、赤色または青色蛍光第一ビーズ）を加えて懸濁した。バッファー添加から０時間および７２時間の時点でフローサイトメトリーにより第一ビーズの輝度を確認した。その結果、０時間および７２時間の時点で蛍光スペクトルの変化は確認されなかった。【００７３】
例２：コンパートメント（第一ビーズ、第二ビーズおよび細胞を含む油中水型液滴）の作成
E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法に準じて、例１で得られた第一ビーズ、第二ビーズ（Chemgenes）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む油中水型コンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。ここで、第二ビーズにおける第二バーコード核酸は、リンカーを介して第二ビーズに連結していた。かかる第二バーコード核酸は、第二ビーズ側から順に、７塩基のポリチミン、２５塩基のＰＣＲプライマー領域、１２塩基の第二共通バーコード領域、８塩基の第二固有バーコード領域、および３０塩基のポリチミン（第二ハイブリダイズ領域）であった。得られたコンパートメントの写真を図１３に示す。【００７４】
例３：第一ビーズ担持細胞の調製
（ａ）緑色蛍光第一ビーズ担持ＮＩＨ３Ｔ３細胞
培養プレートから剥がし、ＣｅｌｌＣｏｖｅｒ固定したＮＩＨ３Ｔ３細胞５ｘ１０５個と例１で得られた緑色蛍光第一ビーズ５ｘ１０５とを４℃、４０時間インキュベート後、さらに４℃、１５０Ｇ、１時間遠心し接着を促し、緑色蛍光第一ビーズ担持ＮＩＨ３Ｔ３細胞を得た。緑色蛍光第一ビーズを構成するアルギン酸はＢＡＭ試薬（細胞膜修飾剤）で修飾したアルギン酸を５０％含んだ。得られた細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図１４Ａに示す。
（ｂ）赤色蛍光第一ビーズ担持Ｋ５６２細胞
細胞をＫ５６２細胞とし、第一ビーズを赤色蛍光第一ビーズとする以外は、（ａ）と同様の方法により、赤色蛍光第一ビーズ担持Ｋ５６２細胞を得た。得られた細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図１４Ｂに示す。
（ｃ）緑色蛍光第一ビーズおよび赤色蛍光第一ビーズを担持するＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞
細胞をＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞とし、第一ビーズを緑色蛍光第一ビーズおよび赤色蛍光第一ビーズとする以外は、（ａ）と同様の方法により、緑色蛍光第一ビーズおよび赤色蛍光第一ビーズを担持するＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞を得た。得られた細胞の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図１４Ｃに示す。【００７５】
例４：第一ビーズからのイメージング情報およびそれに対応した第一共通バーコード領域が得られることの検証
コンパートメント（細胞を含む第一ビーズ、および第二ビーズを含むコンパートメント）の作成
分散相溶液に細胞（ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｋ５６２細胞またはＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞）を添加する以外は例１と同様の方法で、緑色、赤色または青色蛍光第一ビーズを作成した。したがって、上記第一ビーズは細胞を含むものであった。なお、同色の第一ビーズにはそれぞれ同じ種類の細胞を含ませた。結果を図１５に示す。図１５Ａは位相差顕微鏡での観察結果、図１５Ｂは蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真 を示す。
次に、E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法に準じて、上記細胞含有第一ビーズ、および例２に記載の第二ビーズ（Chemgenes）を含むコンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。また、第一ビーズを含まない以外は上記と同様のコンパートメントも作成した。ここで、第一ビーズを含まないコンパートメントは、上記第一ビーズを含むコンパートメントと同様に細胞を含む。【００７６】
上記で得られたコンパートメント中のハイブリダイズ複合体に由来する増幅物の全シーケンシングの塩基配列解析を行った。そのうち第一共通バーコード領域の配列を含む１５塩基を有するリード数をカウントした。その結果を表１に示す。
【表１】
2018203576.tif 000002
上記結果に示すように、第一ビーズのイメージング情報に対応した第一共通バーコード領域を読み取ることができた。【００７７】
例５：第一ビーズのイメージング情報と細胞のゲノム関連情報が関連付けられることの検証
E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) またはT. M. Gierahn et al., Seq-Well: portable, low-cost RNA sequencing of single cells at high throughput, Nature Methods, 14, 395-398 (2017)に記載の方法に準じて、例３で得られた第一ビーズを担持した細胞および例２に記載の第二ビーズを含むコンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。ここで、第一ビーズを担持した細胞としては、緑色蛍光第一ビーズ担持ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス由来細胞）および赤色蛍光第一ビーズ担持Ｋ５６２細胞（ヒト由来細胞）の混合物を用いた。コンパートメントの作成において、各コンパートメントに、緑色蛍光第一ビーズ担持ＮＩＨ３Ｔ３細胞、および赤色蛍光第一ビーズ担持Ｋ５６２細胞のいずれか一つが含まれるように調整した。
その後、得られたコンパートメントにおいてハイブリダイズ複合体に由来する増幅物の塩基配列解析を行った。具体的には、赤色蛍光第一ビーズが帰属したコンパートメントにおいて、赤色蛍光第一ビーズ（ここで、ビーズには複数の第一バーコード核酸が連結している）の第一共通バーコード領域１０塩基にマッチするリードの数で順位をつけ、順位の高い順に１００個を選別した。さらに、それらリードが帰属するコンパートメント内の遺伝子転写産物の個数を測定した。結果を図１６に示す。図中のプロットは縦軸がマウス遺伝子転写産物の数、横軸がヒト遺伝子転写産物の数を示す。図１６より第一ビーズのイメージング情報と細胞のゲノム関連情報が関連付けられることがわかった。【００７８】
例６：イメージング情報に対応する第一バーコード核酸を含む生物
蛍光タンパク質遺伝子領域および第一共通バーコード領域を有するプラスミドを含むバクテリアを作成した。具体的には、ＥＧＦＰタンパク質遺伝子領域およびＥＧＦＰに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミド、Ｖｅｎｕｓタンパク質遺伝子領域およびＶｅｎｕｓに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミド、または、ＥＢＦＰタンパク質遺伝子領域およびＥＢＦＰに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミドを含むバクテリアを作成した。得られたバクテリアの混合物の蛍光顕微鏡および明視野顕微鏡で撮影することにより得られた複合写真を図１７Ａに示す。
図１７Ｂには、ＥＧＦＰタンパク質遺伝子領域およびＥＧＦＰに対応した第一共通バーコード領域を有するプラスミドの配列のシーケンシングの結果を示す。ＥＧＦＰタンパク質遺伝子領域に続いてバクテリアのコロニー毎に特有の配列領域（第三固有バーコード領域）、ＥＧＦＰに対応した第一共通バーコード領域、およびポリＡ配列領域が確認された。
E. Z. Macosko et al., Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015) に記載の方法に準じて、第一バーコード核酸を含むバクテリアおよび細胞を含む油中水型コンパートメントを、マイクロ流体技術を用いた液滴製造法により作成した。得られたコンパートメントの写真を図１７Ｃに示す。その後、得られたコンパートメントにおいてハイブリダイズ複合体に由来する増幅物のサイズを測定した。その結果、第三固有バーコード領域の配列とＥＧＦＰに対応した第一共通バーコード領域を含む２８８塩基を検出できた。結果を図１７Ｄに示す。
【符号の説明】
【００７９】
１０１  細胞群
１０２  第一ビーズ
１０３  第二ビーズ
１０４  コンパートメント
１０５  一細胞
１０６  第一バーコード核酸
１０７  細胞由来ｍＲＮＡ
１０８  第二バーコード核酸
１０９  第一バーコード核酸に対するｃＤＮＡ
１１０  細胞由来ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
１１１  増幅物
１１２  第一増幅物
１１３  第二増幅物
１１４  細胞の非破壊的計測情報
１１５  細胞のトランスクリプトーム情報
１１６  クラスタリング
１１７  細胞タイプ
１２０  ハイブリダイズ複合体
２０１  第一ビーズ
２０２  第一バーコード核酸
２０３  第一共通バーコード領域
２０４  第一ハイブリダイズ領域
２０５  切断可能なリンカー
３０１  第二ビーズ
３０２  第二バーコード核酸
３０３  第二共通バーコード領域
３０４  第二固有バーコード領域
３０５  第二ハイブリダイズ領域
３０６  ＰＣＲプライマー領域
４００  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
４０１  第一ビーズ
４０２  第一バーコード核酸
４０３  第一共通バーコード領域
４０４  第一ハイブリダイズ領域
４０５  切断可能なリンカー
４１０  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
４１１  第二ビーズ
４１２  第二バーコード核酸
４１３  第二共通バーコード領域
４１４  第二固有バーコード領域
４１５  第二ハイブリダイズ領域
４１６  ＰＣＲプライマー領域
４２０  細胞
４２１  ゲノム関連核酸の特定の配列
４２２  ゲノム関連核酸
４３０  コンパートメント
５００  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
５０１  第一ビーズ
５０２  第一バーコード核酸
５０３  第一共通バーコード領域
５０４  第一ハイブリダイズ領域
５０５  切断可能なリンカー
５１０  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
５１１  第二ビーズ
５１２  第二バーコード核酸
５１３  第二共通バーコード領域
５１４  第二固有バーコード領域
５１５  第二ハイブリダイズ領域
５１６  ＰＣＲプライマー領域
５２０  核酸プローブ
５２１  一細胞で発現する目的蛋白質等の分子に特異的に結合する分子
５２２  第三バーコード核酸
５２３  第三共通バーコード領域
５２４  第三ハイブリダイズ領域
５２５  切断可能なリンカー
５３０  細胞
５４０  コンパートメント
６００  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
６０１  第一ビーズ
６０２  第一バーコード核酸
６０３  第一共通バーコード領域
６０４  第一ハイブリダイズ領域
６０５  切断可能なリンカー
６０６  特定の配列
６０７  特定の配列に相補的な配列のプライマー
６１０  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
６１２  第二バーコード核酸
６１５  第二ハイブリダイズ領域
７００  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
７０１  第一ビーズ
７０２  第一バーコード核酸
７０３  第一共通バーコード領域
７０４  第一固有バーコード領域
７０５  第一ハイブリダイズ領域
７０６  切断可能なリンカー
７０７  アクリルアミド部分
７０８  ＰＣＲプライマー領域
７１０  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
７１１  第二ビーズ
７１２  第二バーコード核酸
７１３  第二共通バーコード領域
７１４  第二固有バーコード領域
７１５  第二ハイブリダイズ領域
７１６  ＰＣＲプライマー領域
７２０  細胞
７２１  細胞由来ｍＲＮＡ
７２２  ＤＮＡポリメラーゼ
７２３  相補鎖ＤＮＡ
７２４  細胞由来ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ
８０１  細胞
８０２  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
８０３  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
８０４  蛍光イメージング測定
８０５  明視野イメージング
８０６  油
８０７  コンパートメント
８０８  出口
９０１  細胞
９０２  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
９０３  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
９０４  油
９０５  コンパートメント
９０６  出口
９０７  ゲル化した粒子
９０８  細胞溶解バッファー
９０９  蛍光イメージング測定
９１０  油
９１１  コンパートメント
１００１  細胞
１００２  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
１００３  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
１００４  油
１００５  コンパートメント
１００６  出口
１００７  ゲル化した粒子
１００８  細胞溶解バッファー
１００９  蛍光イメージング測定
１０１０  コンパートメント
１１０１  細胞
１１０２  第一バーコード核酸と連結している第一ビーズ
１１０３  蛍光イメージング測定
１１０４  第一ビーズを担持した細胞
１１０５  第二バーコード核酸と連結している第二ビーズ
１１０６  細胞溶解バッファー
１１０７  コンパートメント
１１０８  油
１１０９  出口
【図１ａ】
2018203576.tif 000003
【図１ｂ】
2018203576.tif 000004
【図１ｃ】
2018203576.tif 000005
【図１ｄ】
2018203576.tif 000006
【図１ｅ】
2018203576.tif 000007
【図１ｆ】
2018203576.tif 000008
【図１ｇ】
2018203576.tif 000009
【図２】
2018203576.tif 000010
【図３】
2018203576.tif 000011
【図４】
2018203576.tif 000012
【図５】
2018203576.tif 000013
【図６】
2018203576.tif 000014
【図７】
2018203576.tif 000015
【図８ａ】
2018203576.tif 000016
【図８ｂ】
2018203576.tif 000017
【図９】
2018203576.tif 000018
【図１０】
2018203576.tif 000019
【図１１】
2018203576.tif 000020
【図１２】
2018203576.tif 000021
【図１３】
2018203576.tif 000022
【図１４】
2018203576.tif 000023
【図１５】
2018203576.tif 000024
【図１６】
2018203576.tif 000025
【図１７】
2018203576.tif 000026
【国際調査報告】
2018203576.tif 000027
2018203576.tif 000028
2018203576.tif 000029
2018203576.tif 000030