(57)【要約】  （Ａ）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬で共有結合架橋された架橋体、並びに（Ｂ）生体内吸収性高分子を含む、脳の損傷部に被覆および／または充填して用いられる、非管状の脳損傷修復材料。  Ｒ１ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ２    （Ｉ）［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素原子または式：−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２で表される基を示し、ｎは２〜１８の整数を示す。］  これにより、脳の損傷部を修復しうる医療用材料が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬で共有結合架橋された架橋体、並びに（Ｂ）生体内吸収性高分子を含む、脳の損傷部に被覆および／または充填して用いられる、非管状の脳損傷修復材料。
Ｒ１ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ２    （Ｉ）
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素原子または式：−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２で表される基を示し、ｎは２〜１８の整数を示す。］
【請求項２】
分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、アルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の脳損傷修復材料。
【請求項３】
架橋性試薬が、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩である請求項１または２のいずれかに記載の脳損傷修復材料。
【請求項４】
上記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩が、ジアミノエタンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタンの４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、および、Ｎ−（リジル）−ジアミノヘキサンの３Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩からなる群から選択される少なくとも１種である請求項３記載の脳損傷修復材料。
【請求項５】
キセロゲルの形態である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項６】
生体内吸収高分子が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびそれらの共重合体、ポリカプロラクトン、並びに、ポリジオキサノンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項７】
電子線及び／又はγ線が照射された、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項８】
前記材料を、縦２ｃｍ×横２ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断し、その裁断面の１つから５ｍｍ離れた位置で該材料を挟むようにダブルクリップで把持し（把持部Ａ）、該材料の把持部Ａに相対する裁断面（Ｂ）から１０ｍｍまでの領域を生理食塩水に１５分間浸漬した後、該材料の該裁断面（Ｂ）から５ｍｍ離れた位置の中央部に、針付き縫合糸を貫通させて、縫合糸の両端を器具に固定し、該把持部Ａを材料の正方形面に水平に、速度１０ｍｍ／分で引っ張る引き裂き試験を行ったときの最大試験力（荷重）が、０．１０（Ｎ）〜１０．０（Ｎ）である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項９】
前記材料を縦１ｃｍ×横１ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断した該材料４個と生理食塩水２５ｍＬを５０ｍＬの容遠沈管に入れて、恒温振とう水槽で、振とう幅を２０ｍｍ、振とう数を往復１２０回／分、温度５０℃で振とうする分解性試験を行うとき、振とう開始から７２時間後の材料の残存率が１０％〜８０％である、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項１０】
前記材料中のアルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種の含量が、アルギン酸ナトリウムに換算して、０．２ｍｇ／ｃｍ２〜１２ｍｇ／ｃｍ２である、請求項２ないし９のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項１１】
前記材料中の生体内吸収性高分子の含量が、０．０５ｍｇ／ｃｍ２〜３０ｍｇ／ｃｍ２である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項１２】
前記脳損傷部が、外傷性損傷、疾患による損傷、および手術時の損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の脳損傷修復材料。
【請求項１３】
前記手術時の損傷が、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）手術時の損傷、腫瘍摘出による損傷、脳動脈瘤治療におけるクリッピングによる損傷、脳損傷部の処置に伴う損傷、および脳手術時に用いられる器具による損傷からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１２に記載の脳損傷修復材料。
【請求項１４】
少なくとも以下の工程を含む脳損傷修復材料を製造する方法。
（１）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を含む溶液と、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬とを混合する工程、
（２）（１）で得られた混合物と、生体内吸収性高分子とを型に入れて一定時間静置し、架橋体とする工程、
（３）（２）で得られた架橋体を洗浄し、その後、凍結乾燥する工程、
（４）（３）で得られた架橋体に対して、電子線および／またはγ線を照射する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳の損傷部を修復するための脳損傷修復材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は、中枢神経系の主要部であり、硬膜、くも膜および軟膜からなる３層の髄膜に包まれて頭蓋腔内にある。くも膜と軟膜の間には髄液が流れ、この髄液が脳を守るクッションの役割を果たす。脳は、大脳、間脳、中脳、小脳、橋および延髄に区分できる。脳を構成する細胞は、神経細胞とグリア細胞であり、これに血管が加わる。グリア細胞は、アストログリア、オリゴデンドログリア、上衣細胞およびミクログリアの４種からなり、神経細胞に栄養を渡したり、神経細胞を支持したり、神経細胞を電気的に遮蔽したり、神経細胞を外部環境から隔絶したりして、神経細胞の機能を補助する。【０００３】
このような脳は、柔らかく傷つきやすい組織であるため、様々な要因で損傷を受け得る。脳損傷としては、例えば、外傷性損傷、疾患による損傷、手術時の損傷などである。しかしながら、脳はいったん損傷が生じると修復が起こりにくいという問題がある。【０００４】
脳の損傷部の修復が起こりにくい理由として、次の３つが考えられる。１つは、障害部位にアストログリアの増殖が起こり、これを越えて再生軸索が伸長できないからである。２つ目は、オリゴデンドログリアから軸索の伸長を抑制する因子が分泌されるからである。３つ目は、末梢神経系の髄鞘には基底膜があり再生軸索はこの基底膜によるトンネル構造によりその伸長をガイドされるものの、脳などの中枢神経系の髄鞘には基底膜がなく、そのために再生軸索をガイドする構造がないためである。【０００５】
脳損傷は、損傷を受けた部位や範囲に応じて、麻痺や感覚障害、手足の震えなどの症状、失語、失行、失認および記憶障害を含む高次脳機能障害など、様々な症状を引き起こす。【０００６】
このため、脳の損傷部を修復することが可能な材料が求められていた。しかしながら、従来、脳損傷部に適用し、脳損傷を修復する、臨床で使用可能な材料はなかった。【０００７】
例えば、手術により生じた脳の損傷部には止血の目的でフィブリン糊が使用されていた。しかしながら、フィブリン糊には脳損傷部を修復する目的で使用されるものではない。また、脳の損傷部ではなく脳硬膜欠損部の補綴材として、医療機器（シームデュラ（登録商標）、ゴアテックス（登録商標）人工硬膜MVPなど）が販売されている。しかしながら、それらは脳硬膜の代替えとして脳脊髄液の滲出を防止できる人工硬膜であり（例えば、特許文献１〜３）、脳損傷部の修復には至らない。【０００８】
また、エチレンジアミン共有結合架橋した凍結乾燥アルギン酸スポンジ材料やカルシウム架橋アルギネートハイドロゲルを用いて中枢神経である脊髄神経路を再生させる試みがなされている（例えば、特許文献４、非特許文献１〜５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００４／０８０３４３号
【特許文献２】国際公開第２００５／１０２４０４号
【特許文献３】米国特許出願公開２０１２／００２９６５４号明細書
【特許文献４】特許第４５３１８８７号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Neuro Report (1999) 10, p.2891-2894
【非特許文献２】人工臓器 (2000) 29(1), p.228-232
【非特許文献３】Journal of Biomedical Materials Research (2001) 54, p.373-384
【非特許文献４】J. Jpn. Orthop. Assoc. (2003) 77(8), S1064, 2-2-S7-4
【非特許文献５】Journal of Biomedical Materials Research (2016) 104A, p.611-619
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このような状況の下、脳損傷を修復可能な、臨床上有用な生体適合性材料が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従来、脳の損傷部には止血の目的でフィブリン糊が使用される。しかしながら、脳の欠損部にフィブリン糊を充填したところ、アストロサイトの突起が、欠損部の境界に密に分布し、これが障害（バリア）となって、神経軸索の伸長を阻害していると考えられた。本発明者らは、脳の欠損部に、フィブリン糊ではなく、後述の一般式（Ｉ）で表される化合物および／またはその塩で架橋したアルギン酸架橋体とポリグリコール酸（ＰＧＡ）を含む平板のキセロゲル状材料を充填するように適用した。その結果、該材料を充填した脳の欠損部で神経軸索伸長が観察された。この観察結果は、アルギン酸架橋体を含む材料には、アストロサイトによるバリア形成を抑制し、神経軸索を伸長させ得る作用があることを示唆するものである。本発明者は、これらの知見に基づき鋭意検討を重ね、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１３】
（１−１）（Ａ）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬で共有結合架橋された架橋体を含む、脳の損傷部に被覆および／または充填して用いられる、非管状の脳損傷修復材料。
Ｒ１ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ２    （Ｉ）
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素原子または式：−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２で表される基を示し、ｎは２〜１８の整数を示す。］
（１−２）さらに（Ｂ）生体内吸収性高分子を含む、（１−１）に記載の脳損傷修復材料。
（１−３）分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、アルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種である、（１−１）または（１−２）のいずれかに記載の脳損傷修復材料。
（１−４）架橋性試薬が、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩である（１−１）ないし（１−３）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−５）上記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩が、ジアミノエタンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタンの４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、および、Ｎ−（リジル）−ジアミノヘキサンの３Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩からなる群から選択される少なくとも１種である（１−４）に記載の脳損傷修復材料。
（１−６）キセロゲルの形態である、（１−１）ないし（１−５）のいずか１つの記載の脳損傷修復材料。
（１−７）生体内吸収高分子が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびそれらの共重合体、ポリカプロラクトン、並びに、ポリジオキサノンからなる群から選択される少なくとも１種である、（１−２）ないし（１−６）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−８）７日〜２７０日で適用部位から消失する、（１−１）ないし（１−７）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−９）電子線及び／又はγ線が照射された、（１−１）ないし（１−８）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１０）電子線及び／又はγ線が、吸収線量１kGy〜１００kGyで照射された、（１−１）ないし（１−９）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１１）前記材料を、縦２ｃｍ×横２ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断し、その裁断面の１つから５ｍｍ離れた位置で該材料を挟むようにダブルクリップで把持し（把持部Ａ）、該材料の把持部Ａに相対する裁断面（Ｂ）から１０ｍｍまでの領域を生理食塩水に１５分間浸漬した後、該材料の該裁断面（Ｂ）から５ｍｍ離れた位置の中央部に、針付き縫合糸を貫通させて、縫合糸の両端を器具に固定し、該把持部Ａを材料の正方形面に水平に、速度１０ｍｍ／分で引っ張る引き裂き試験を行ったときの最大試験力（荷重）が、０．１０（Ｎ）〜１０．０（Ｎ）である、（１−１）ないし（１−１０）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１２）前記材料中のアルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種の含量が、アルギン酸ナトリウムに換算して、０．２ｍｇ／ｃｍ２〜１２ｍｇ／ｃｍ２である、（１−３）ないし（１−１１）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１３）前記材料中の生体内吸収性高分子の含量が、０．０５ｍｇ／ｃｍ２〜３０ｍｇ／ｃｍ２である、（１−２）ないし（１−１２）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１４）前記材料を縦１ｃｍ×横１ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断した該材料４個と生理食塩水２５ｍＬを５０ｍＬの容遠沈管に入れて、恒温振とう水槽で、振とう幅を２０ｍｍ、振とう数を往復１２０回／分、温度５０℃で振とうする分解性試験を行うとき、振とう開始から７２時間後の材料の残存率が１０％〜８０％である、（１−１）ないし（１−１３）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１５）前記分解性試験において、開始から７２時間後の残存率が、開始から４時間後の残存率と比較して低下を示す、（１−１４）に記載の脳損傷修復材料。
（１−１６）前記分解性試験において、開始から４時間後の残存率が５５％以上である、（１−１４）または（１−１５）のいずれかに記載の脳損傷修復材料。
（１−１７）低エンドトキシンのアルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種のＧＰＣ−ＭＡＬＳにより測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、（１−３）ないし（１−１６）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１８）低エンドトキシンのアルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種のＭ／Ｇ比が０．４〜３．０である、（１−３）ないし（１−１７）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−１９）分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、１００ＥＵ／ｇ以下のエンドトキシン含有量である、（１−１）ないし（１−１８）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−２０）前記脳損傷部が、外傷性損傷、疾患による損傷、および手術時の損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、（１−１）ないし（１−１９）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（１−２１）前記手術時の損傷が、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）手術時の損傷、腫瘍摘出による損傷、脳動脈瘤治療におけるクリッピングによる損傷、脳損傷部の処置に伴う損傷、および脳手術時に用いられる器具による損傷からなる群から選択される少なくとも１種である（１−２０）に記載の脳損傷修復材料。
（１−２２）脳の損傷部が欠損部である、（１−１）ないし（１−２１）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。【００１４】
（１−２３）（Ａ）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬で共有結合架橋された架橋体、並びに（Ｂ）生体内吸収性高分子を含む、脳の損傷部に被覆および／または充填して用いられる、非管状の脳損傷部被覆材料。【００１５】
（１−２４）（１−１）ないし（１−２２）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料を、脳の損傷部に被覆および／または充填する工程を含む、脳の損傷部の修復を必要とする対象において、脳の損傷部を修復する方法。
（１−２５）（１−１）ないし（１−２２）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料、または、（１−２３）に記載の脳損傷部被覆材料を、脳の損傷部に被覆および／または充填する工程を含む、脳の損傷部の治療を必要とする対象において、脳の損傷部を治療する方法。
（１−２６）（１−１）ないし（１−２２）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料を用いる、脳損傷部の修復において使用されるための、前記低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類。
（１−２７）（１−１）ないし（１−２２）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料、または、（１−２３）に記載の脳損傷部被覆材料を用いる、脳損傷部の治療において使用されるための、前記低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類。
（１−２８）（１−１）ないし（１−２２）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料を製造するための、前記低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類及び／又は前記一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬の使用であって、前記脳損傷修復材料が脳の損傷部を被覆および／または充填するように用いられる、前記使用。
（１−２９）少なくとも以下の工程を含む脳損傷修復材料を製造する方法。
（１）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を含む溶液と、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬とを混合する工程、
（２）（１）で得られた混合物と、生体内吸収性高分子とを型に入れて一定時間静置し、架橋体とする工程、
（３）（２）で得られた架橋体を洗浄し、その後、凍結乾燥する工程、
（４）（３）で得られた架橋体に対して、電子線および／またはγ線を照射する工程。【００１６】
本発明はまた、以下の態様の脳損傷修復材料を提供する。
（２−１）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を含む、脳の損傷部に被覆および／または充填して用いられる、脳損傷部への適用時に流動性を有し、適用後に硬化する、脳損傷修復材料。
（２−２）分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、アルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種である、（２−１）に記載の脳損傷修復材料。
（２−３）架橋性試薬により硬化する、（２−１）または（２−２）に記載の脳損傷修復材料。
（２−４）架橋性試薬が２価以上の金属イオン化合物である、（２−３）に記載の脳損傷修復材料。
（２−５）前記脳損傷部が、外傷性損傷、疾患による損傷、および手術時の損傷からなる群から選択される少なくとも１種である、（２−１）ないし（２−４）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。【００１７】
本発明はまた、以下の態様の神経再生誘導用材料を提供する。
（３−１）（Ａ）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬で共有結合架橋された架橋体を含む、神経の損傷部の再生のために用いられる神経再生誘導用材料。
Ｒ１ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ２    （Ｉ）
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素原子または式：−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２で表される基を示し、ｎは２〜１８の整数を示す。］
（３−２）分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、アルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種である、（３−１）に記載の神経再生誘導用材料。
（３−３）架橋性試薬が、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩である、（３−１）または（３−２）のいずれかに記載の神経再生誘導用材料。
（３−４）上記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド塩が、ジアミノエタンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタンの４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、および、Ｎ−（リジル）−ジアミノヘキサンの３Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩からなる群から選択される少なくとも１種である、（３−３）に記載の神経再生誘導用材料。
（３−５）キセロゲルの形態である、（３−１）ないし（３−４）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−６）非管状である、（３−１）ないし（３−５）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−７）さらに、（Ｂ）生体内吸収性高分子を含む、（３−１）ないし（３−６）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−８）生体内吸収性高分子が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびそれらの共重合体、ポリカプロラクトン、並びに、ポリジオキサノンからなる群から選択される少なくとも１種である、（３−７）に記載の神経再生誘導用材料。
（３−９）前記材料を、縦２ｃｍ×横２ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断し、その裁断面の１つから５ｍｍ離れた位置で該材料を挟むようにダブルクリップで把持し（把持部Ａ）、該材料の把持部Ａに相対する裁断面（Ｂ）から１０ｍｍまでの領域を生理食塩水に１５分間浸漬した後、該材料の該裁断面（Ｂ）から５ｍｍ離れた位置の中央部に、針付き縫合糸を貫通させて、縫合糸の両端を器具に固定し、該把持部Ａを材料の正方形面に水平に、速度１０ｍｍ／分で引っ張る引き裂き試験を行ったときの最大試験力（荷重）が、０．１０（Ｎ）〜１０．０（Ｎ）である、（３−１）ないし（３−８）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１０）前記材料中のアルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種の含量が、アルギン酸ナトリウムに換算して、０．２ｍｇ／ｃｍ２〜１２ｍｇ／ｃｍ２である、（３−２）ないし（３−９）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１１）前記材料中の生体内吸収性高分子の含量が、０．０５ｍｇ／ｃｍ２〜３０ｍｇ／ｃｍ２である、（３−７）ないし（３−１０）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１２）前記材料を縦１ｃｍ×横１ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断した該材料４個と生理食塩水２５ｍＬを５０ｍＬの容遠沈管に入れて、恒温振とう水槽で、振とう幅を２０ｍｍ、振とう数を往復１２０回／分、温度５０℃で振とうする分解性試験を行うとき、振とう開始から７２時間後の材料の残存率が１０％〜８０％である、（３−１）ないし（３−１１）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１３）前記分解性試験において、開始から７２時間後の残存率が、開始から４時間後の残存率と比較して低下を示す、（３−１２）に記載の神経再生誘導用材料。
（３−１４）前記分解性試験において、開始から４時間後の残存率が５５％以上である、（３−１２）または（３−１３）のいずれかに１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１５）低エンドトキシンのアルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種のＧＰＣ−ＭＡＬＳにより測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、（３−２）ないし（３−１４）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１６）低エンドトキシンのアルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種のＭ／Ｇ比が０．４〜３．０である、（３−２）ないし（３−１５）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１７）分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、１００ＥＵ／ｇ以下のエンドトキシン含有量である、（３−１）ないし（３−１６）のいずれか１つに記載の脳損傷修復材料。
（３−１８）末梢神経および／または中枢神経の損傷部の再生のために用いられる、（３−１）ないし（３−１７）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−１９）神経の分岐部および／または神経叢部の損傷部の再生のために用いられる、（３−１）ないし（３−１８）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。
（３−２０）神経の分岐部および／または神経叢部の損傷部が、前立腺、膀胱、陰茎海綿体、腕、四肢、顔面、頸、腰、仙骨、腰仙骨、陰部、心臓、腹腔、下下腹、骨盤、胸腔内及び腸壁内からなる群から選択される少なくとも１種に存在する、（３−１９）に記載の神経再生誘導用材料。
（３−２１）腫瘍切除、リンパ節の郭清、および／または外傷に伴う神経損傷部の再生、並びに、組織再建に伴う神経損傷部の再生、からなる群から選択される少なくとも１種の神経損傷部の再生のために用いられる、（３−１）ないし（３−２０）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料。【００１８】
（３−２２）（３−１）ないし（３−２１）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料を神経の損傷部に適用する工程を含む、神経の損傷部の再生を必要とする対象において神経の損傷部の再生を誘導する方法。
（３−２３）（３−１）ないし（３−２１）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料を神経の損傷部に適用する工程を含む、神経の損傷部の治療を必要とする対象において、神経の損傷部を治療する方法。
（３−２４）（３−１）ないし（３−２１）のいずれか１つに記載の神経再生誘導用材料を用いる、神経の損傷部の再生において使用されるための前記低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類。
（３−２５）（３−１）ないし（３−２１）のいずれか１つの記載の神経再生誘導用材料を製造するための、前記低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類および／または前記一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬の使用であって、前記神経再生誘導用材料が神経の損傷部に適用され、神経を再生するように用いられる、前記使用。
（３−２６）少なくとも以下の工程を含む神経再生誘導用材料を製造する方法。
（１）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を含む溶液と、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬とを混合する工程、
（２）（１）で得られた混合物と、生体内吸収性高分子とを型に入れて一定時間静置し、架橋体とする工程、
（３）（２）で得られた架橋体を洗浄し、その後、凍結乾燥する工程、
（４）（３）で得られた架橋体に対して、電子線および／またはγ線を照射する工程。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、脳損傷を修復可能な、臨床上有用な生体適合性材料を提供する。
いくつかの態様の脳損傷修復材料は、体内消失時間がコントロールされており、脳損傷修復効果に優れる。
いくつかの態様の脳損傷修復材料は、キセロゲル状及び／又はシート状であるため、使用する患部に適した大きさに、その場で切断して使用できるため、予め脳損傷の部位や範囲に応じた規格を複数用意する必要が無い。また、内視鏡下、腹腔鏡下等で脳損傷修復材料を神経の損傷部へ適用することも可能である。
いくつかの態様の脳損傷修復材料は、生体内吸収性高分子を含むことにより、適度な強度を備え、患部への適用時に縫合糸で縫合して用いることも可能である。一方で、本発明の材料は縫合しなくても使用でき、縫合しない場合には、比較的簡易に施術を行うことができるという利点がある。
いくつかの態様の脳損傷修復材料は、生体内吸収性高分子を含むことにより、適度な強度を有し、患部への適用時に操作性に優れる。また、製造過程で、形状が変形しにくく、取扱い性に優れ、製造効率も高いという利点を有する。
いくつかの態様の脳損傷修復材料は、一定期間経過後は体内から消失するため、安全性及び生体適合性に優れる。
本発明の脳損傷修復材料は、上記のいずれか１以上の効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】坐骨神経の分岐部欠損部に対してＡ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ５０を適用した術後８週の写真である。
【図２】坐骨神経の分岐部欠損部に対してＡ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００を適用した術後８週の写真である。
【図３】坐骨神経の分岐部欠損部に対してＡ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００を適用した術後８週の脛骨神経側の再生軸索の染色写真である。
【図４】坐骨神経の分岐部欠損部に対してＡ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００を適用した術後８週の腓骨神経側の再生軸索の染色写真である。
【図５】坐骨神経の分岐部の欠損部にアルギン酸架橋体を適用して再生誘導効果をみる試験の模式図を示す。円筒形は神経を表し、長方形はアルギン酸架橋体を表す。実施例では、２枚のアルギン酸架橋体で神経切断部を挟むように、該架橋体を設置した。
【図６】坐骨神経の分岐部欠損部に対してアルギン酸架橋体Ａ−２ＥＤＡ(試料番号１)を適用した術後８週の写真である。矢印は、再生された神経軸索が細く、十分に再生していないと考えられる箇所を示す。
【図７】アルギン酸架橋体の分解性をin vitro試験で評価した結果を示すグラフである。
【図８】アルギン酸架橋体の分解性をin vitro試験で評価した結果を示すグラフである。
【図９】アルギン酸架橋体の分解性をin vitro試験で評価した結果を示すグラフである。
【図１０】皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の細胞接着性および細胞増殖性を評価した結果を示すグラフである。
【図１１】実施例１０のアルギン酸架橋体の引き裂き試験の試験方法を示す模式図である。
【図１２】６種のアルギン酸架橋体に対して引き裂き試験を行ったときの最大試験力（Ｎ）の平均値を示すグラフである。
【図１３】側頭葉の欠損部にアルギン酸架橋体を適用した術後４週の再生軸索の染色写真である（ＧＦＡＰ免疫染色）。
【図１４】側頭葉の欠損部にアルギン酸架橋体を適用した術後４週の再生軸索の染色写真である（Neuro Filament免疫染色）。
【図１５】側頭葉の欠損部にアルギン酸架橋体を適用した術後４週の再生軸索の染色写真である（β-Tubulin免疫染色）。
【図１６】側頭葉の欠損部にアルギン酸架橋体を適用した術後８週の再生軸索の染色写真である（ＧＦＡＰ免疫染色）。
【図１７】側頭葉の欠損部にアルギン酸架橋体を適用した術後８週の再生軸索の染色写真である（Neuro Filament免疫染色）
【図１８】側頭葉の欠損部にアルギン酸架橋体を適用した術後８週の再生軸索の染色写真である（β-Tubulin免疫染色）。
【図１９】側頭葉の欠損部にフィブリン糊を適用した術後４週の再生軸索の染色写真である（ＧＦＡＰ免疫染色）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類
いくつかの態様では、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を１種又は２種以上用いて脳損傷修復材料を作製することができる。分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類は、例えば、アルギン酸、カルボキシメチルデンプン、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース等の多糖類、そのエステルおよびその塩が挙げられる。生体内吸収性多糖類は、生体内で分解され吸収されることが好ましい。また、多糖類は、細胞接着性のない生体内吸収性の多糖類であることが好ましい。好ましくは、アルギン酸、そのエステル及びその塩から選択される少なくとも１種である。なお、本明細書において、「脳損傷修復材料」は「本発明の材料」という場合がある。
【００２２】
２．アルギン酸、そのエステルおよびその塩
用いられる「アルギン酸」「アルギン酸エステル」「アルギン酸塩」は、天然由来でも合成物であってもよく、天然由来であるのが好ましい。本明細書において「アルギン酸、そのエステルおよびその塩から選択される少なくとも１種」を「アルギン酸類」と記載する場合がある。好ましく用いられるアルギン酸類は、レッソニア、マクロシスティス、ラミナリア、アスコフィラム、ダービリア、カジカ、アラメ、コンブなどの褐藻類から抽出される生体内吸収性の多糖類であって、Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とＬ−グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸がランダムに配列した画分（Ｍ／Ｇ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。
【００２３】
アルギン酸類のＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．２の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。アルギン酸類のゲル化能力は生成したゲルの性質は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受け、一般的に、Ｇ比率が高い場合にはゲル強度が高くなることが知られている。Ｍ／Ｇ比は、その他にも、ゲルの硬さ、もろさ、吸水性、柔軟性などにも影響を与える。用いるアルギン酸類および／またはその塩のＭ／Ｇ比は、通常、０．２〜４．０であり、より好ましくは、０．４〜３．０、さらに好ましくは０．５〜３．０である。本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
【００２４】
用いられる「アルギン酸エステル」「アルギン酸塩」とは、特に限定されないが、架橋剤と反応させるため、架橋反応を阻害しない官能基を有していないことが必要である。アルギン酸エステルとしては、好ましくは、アルギン酸プロピレングリコールが挙げられる。
【００２５】
アルギン酸塩としては、例えば、アルギン酸の１価の塩、アルギン酸の２価の塩が挙げられる。
【００２６】
アルギン酸の１価の塩は、好ましくは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウムなどが挙げられ、より好ましくは、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムであり、とりわけ好ましくは、アルギン酸ナトリウムである。
【００２７】
アルギン酸の２価の塩は、好ましくは、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸ストロンチウムなどが挙げられる。
【００２８】
アルギン酸類は、高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、一般的に重量平均分子量で１０００〜１０００万、好ましくは１万〜８００万、より好ましくは２万〜３００万の範囲である。天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。
【００２９】
例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定した重量平均分子量は、好ましくは１０万以上、より好ましくは５０万以上であり、また好ましくは、５００万以下、より好ましくは３００万以下である。その好ましい範囲は、１０万〜５００万であり、より好ましくは５０万〜３５０万である。
【００３０】
また、例えば、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量(絶対分子量)は、好ましくは１万以上、より好ましくは８万以上、さらに好ましくは９万以上であり、また好ましくは、１００万以下、より好ましくは８０万以下、さらに好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは５０万以下である。その好ましい範囲は、１万〜１００万であり、より好ましくは８万〜８０万であり、さらに好ましくは９万〜７０万、とりわけ好ましくは９万〜５０万である。
【００３１】
通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０〜２０％の測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２〜４８万、５０万であれば４０〜６０万、１００万であれば８０〜１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。
【００３２】
アルギン酸類の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。
分子量測定にゲル浸透クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例１に記載のとおりである。カラムは、例えば、ＧＭＰＷ−ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ−ＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）を用いることができ、溶離液は、例えば、２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液とすることができ、分子量標準としてプルランを用いることができる。
【００３３】
分子量測定にＧＰＣ−ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例１に記載のとおりである。検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用いることができる。
【００３４】
用いられるアルギン酸類の粘度は、特に限定されないが、１ｗ／ｗ％のアルギン酸類の水溶液として粘度を測定した場合、好ましくは、１０ｍＰａ・ｓ〜１０００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは、５０ｍＰａ・ｓ〜８００ｍＰａ・ｓである。
アルギン酸類の水溶液の粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法の、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい−平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。本発明においては、より好ましくは、コーンプレート型粘度計を用いることが好ましい。この場合の代表的な測定条件は、実施例１に記載のとおりである。
【００３５】
アルギン酸類は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高めだが、熱による乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸類を製造することができる。さらに、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸類と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸類とすることも可能である。
【００３６】
用いられる分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類は、好ましくは低エンドトキシンの生体内吸収性多糖類である。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエンドトキシンレベルが低いことをいう。より好ましくは、低エンドトキシン処理された生体内吸収性多糖類であることが望ましい。
【００３７】
低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができる。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９−３２４００１号公報など参照）、β１，３−グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特開平８−２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２−５３０４４０号公報など参照）、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）４０：６３８−６４３など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エンドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルターや帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５−０３６０３６号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施することができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。アルギン酸の種類に合わせて適宜選択するのが望ましい。
【００３８】
エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（ＬＡＬ）による方法、エントスペシー（登録商標）ＥＳ−２４Ｓセット（生化学工業株式会社）を用いる方法などによって測定することができる。
【００３９】
用いられる生体内吸収性多糖類のエンドトキシンの処理方法は特に限定されないが、その結果として、生体内吸収性多糖類のエンドトキシン含有量が、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以下、とりわけ好ましくは、５０ＥＵ／ｇ以下、特に好ましくは、３０ＥＵ／ｇ以下である。低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭ  ＵＰ  ＬＶＧ（ＦＭＣＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ）など市販品により入手可能である。
【００４０】
３．架橋性試薬
好ましく用いられる架橋性試薬は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物に包含されるアミン系化合物およびその塩から選択される少なくとも１種である。本明細書において、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物は、アミン系化合物（Ｉ）という場合がある。
Ｒ１ＨＮ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ２    （Ｉ）
［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して水素原子または式：−ＣＯＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−ＮＨ２で表される基を示し、ｎは２〜１８の整数を示す。］
具体例としては、ジアミノエタン、ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、ジアミノヘキサン、ジアミノヘプタン、ジアミノオクタン、ジアミノノナン、ジアミノデカン、ジアミノドデカン、ジアミノオクタデカンなどのジアミノアルカン類および／またはそれらの塩、Ｎ−（リジル）−ジアミノエタン、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタン、Ｎ−（リジル）−ジアミノヘキサン、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノヘキサンなどのモノまたはジ（リジル）ジアミノアルカン類および／またはそれらの塩などを挙げることができ、これらのジアミンおよびその塩の１種または２種以上を用いることができる。
【００４１】
そのうちでも、アミン系化合物（Ｉ）および／またはその塩としては、上記の一般式（Ｉ）においてｎが２〜８である化合物および／またはその塩が好ましく用いられる。架橋性試薬がアミン系化合物（Ｉ）の塩からなる場合は、塩を形成する成分としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドが好ましく用いられる。
【００４２】
アミン系化合物（Ｉ）および／またはその塩からなる架橋性試薬としては、特にジアミノエタンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、ジアミノヘキサンの２Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ，Ｎ’−ジ（リジル）−ジアミノエタンの４Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩、Ｎ−（リジル）−ジアミノヘキサンの３Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド塩などが、安全性、生体適合性などが一層高く、且つ該架橋性試薬で共有結合架橋して得られる酸架橋体の脳損傷修復作用が一層良好であることから好ましく用いられる。
【００４３】
４．脳損傷修復材料の作製
以下に、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類の例として、アルギン酸類を用いたアルギン酸架橋体を含む脳損傷修復材料の作製を説明するが、他の多糖類についても下記に準じて作製することができる。
【００４４】
キセロゲル状のアルギン酸架橋体は、例えば、アルギン酸類の水性溶液と、前記架橋性試薬と、水溶性カルボジイミド等の脱水縮合剤とを混合して溶解し、型に流し入れてゲル化させ、ゲルを洗浄後、凍結乾燥して得ることができる。
【００４５】
架橋反応の温度は、通常４℃〜３７℃の範囲で行いうるが、反応効率の点から２０℃〜３０℃の範囲で行うことが好ましい。
【００４６】
脳損傷修復材料が、アルギン酸架橋体の他に他の成分を含む場合には、他の成分を含有させる工程の順は特に限定されず、例えば、他の成分を含有させる工程は、凍結乾燥前でも凍結乾燥後であってもよい。
【００４７】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、望ましくは、キセロゲルの形態である。キセロゲルとは、ゲルが乾燥した状態ものをいう。ゲルは立体的な網目構造の中に水などの溶媒を含んだものであるが、キセロゲルは、溶媒を失って網目だけになったものをいう。本明細書において、キセロゲルは「スポンジ」という場合もある。
【００４８】
アルギン酸類の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができる。溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、好ましくは水性溶媒であり、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ＤＭＳＯなどが好ましい。これらは、滅菌されていることが好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。
【００４９】
架橋率は、用いる架橋性試薬のモル比および架橋反応時間で制御することができる。架橋率を低くすると柔軟で含水率の高い架橋体が得られ、架橋率を高くすると強固で含水率が低くなる。架橋率は、架橋体の用途により適宜選択されうる。
【００５０】
用いられる架橋性試薬のモル比は、特に限定されないが、好ましくは、アルギン酸類が有するカルボキシル基の総和に対して１モル％〜５０モル％の範囲であり、より好ましくは５モル％〜４０モル％の範囲である。
【００５１】
架橋反応時間については、架橋反応は時間とともに進行するので、高い架橋率が必要な場合は反応時間を長くすることができる。反応時間は、通常６時間〜９６時間の範囲であり、反応効率の点で２４時間〜７２時間の範囲であることが好ましい。
【００５２】
また、架橋反応は、アルギン酸類の溶液濃度が低すぎると、十分な機械的強度を有する架橋体が得られず、また濃度が高すぎるとアルギン酸類の溶解に時間がかかり、かつ得られる架橋体の含水率が低くかつ硬くなり好ましくない。従って、アルギン酸類の溶液の濃度は、０．１％〜５％の範囲にあることが好ましく、０．５％〜３％の範囲にあることがさらに好ましい。
【００５３】
架橋反応によって得られた架橋体は、それ自身でも実用的な強度と安定性を示すが、用途によりさらにイオン結合架橋、疎水結合架橋などの他のゲル化方法と併用してもよい。
【００５４】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料が、アルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種（アルギン酸類）を含む場合、該材料１ｃｍ２あたりのアルギン酸類の含量は、アルギン酸ナトリウムに換算して、０．２ｍｇ／ｃｍ２〜１２ｍｇ／ｃｍ２であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｇ／ｃｍ２〜７ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、１ｍｇ／ｃｍ２〜６ｍｇ／ｃｍ２であり、とりわけ好ましくは、１ｍｇ／ｃｍ２〜５ｍｇ／ｃｍ２である。本明細書において、「アルギン酸含量」の語は、該材料に含まれるアルギン酸類の量をアルギン酸ナトリウムの量に換算した値を表す。
【００５５】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類の他に、例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびそれらの共重合体、ポリカプロラクトン、並びにポリジオキサノンなどの生体内吸収性高分子を１種又は２種以上含んでいてもよい。「ポリグリコール酸、ポリ乳酸、およびそれらの共重合体、ポリカプロラクトン、並びにポリジオキサノンからなる群から選択される少なくとも１種を含む」とは、これらの各成分を共重合体の一成分として含んでいてもよく、例えば、乳酸とカプロラクトンの共重合体、グリコール酸とカプロラクトンの共重合体、グリコール酸と乳酸ポリエステルの共重合体などであってもよい。ポリグリコール酸とポリ乳酸との共重合体（本明細書において「ＰＬＧＡ」ともいう）は、例えばポリグラクチン等として知られている。これらの高分子は、縫合糸の材料等として使用されており、生体吸収性を有し、生体適合性に優れる。これらの生体内吸収性高分子の形態は、特に限定されないが、好ましくは、不織布、織布、メッシュ、又はニードルパンチなどを用いることができ、より好ましくは不織布、メッシュ、又はニードルパンチの形態で用いられる。例えば、シート状の不織布の生体内吸収性高分子をトレイに敷き、生体内吸収性多糖類と架橋剤等を溶解した溶液をそのトレイに充填し、ゲル化させてもよい。脳損傷修復材料における、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類と生体内吸収性高分子との配置は特に限定されない。分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類の層と生体内吸収性高分子の層とを積層したり、生体内吸収性高分子の２層の間に分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類の層を挟んだり、あるいは、１層に両者が混在していてもよい。本明細書の実施例５−（４）において、アルギン酸架橋体がＰＧＡ含有の有無に関わらず、神経再生誘導作用を発揮したことから、ＰＧＡ以外の材料もＰＧＡに替えて同様に使用することが可能である。これらの生体内吸収性高分子は、架橋体の強度を高め、脳損傷修復材料の取扱性を向上させることができる。本明細書の実施例７では、ＰＧＡを用いて作製された架橋体と同程度の含量のＰＬＧＡを用いて作製された架橋体とは同様の分解性を示したことから、これらの生体内吸収性高分子は、同様に使用できることが示唆された。好ましくは、脳損傷修復材料に用いる生体内吸収性高分子は、ポリグリコール酸を含有する高分子であり、あるいは、ポリグリコール酸および／またはポリグリコール酸とポリ乳酸との共重合体（ＰＬＧＡ）であることも望ましい。
【００５６】
好ましい態様では、脳損傷修復材料は、０．０５ｍｇ／ｃｍ２〜３０ｍｇ／ｃｍ２の生体内吸収性高分子を含有してもよく、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｃｍ２〜１０ｍｇ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは、０．５ｍｇ／ｃｍ２〜７ｍｇ／ｃｍ２であり、とりわけ好ましくは、１ｍｇ／ｃｍ２〜５ｍｇ／ｃｍ２であってもよい。脳損傷修復材料がこれらの生体内吸収性高分子を含有することにより、縫合もできる強度を備え、凍結乾燥による材料の変形を防ぎ、製造効率も高めることができる。また、本明細書の実施例において、これらの生体内吸収性高分子を含有した材料が、生体内吸収性高分子を含有しない材料と比較して、神経損傷の再生不十分な例が少ない傾向がみられたことから、生体内吸収性高分子を含有させることにより架橋体の強度が高まり、膝などの可動部においても架橋体が破断しにくく、安定的に軸索を再生させ得る可能性が示唆された。生体内吸収性高分子を含まないキセロゲル状の脳損傷修復材料を脳欠損部に適用すると、該材料が患部の水分を吸収して接着し、該材料の位置の調整ができない。一方、脳損傷修復材料が生体吸収性高分子を含有することにより、該材料が適度な強度を有し、患部に設置した後も該材料の位置を調整することが可能であり、手術時の操作性、取扱性に優れることが分かった。
【００５７】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、その他の多糖類や高分子を、脳損傷修復材料の効果を妨げない範囲で含有してもよい。中でも、ヘパリンは、ヘパリン結合性の成長因子の徐放などの効果が確認されているため、脳損傷修復材料はヘパリンを含有することもできる。別のいくつかの態様では、脳損傷修復材料はヘパリンを含まない。
【００５８】
また、いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、神経の成長に有用な因子を含んでいてもよい。神経の成長に有用な因子とは、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）等が挙げられるがこれらに限定されない。しかしながら、脳損傷修復材料は、神経の成長に有用な因子を含まない場合でも神経再生の誘導効果を発揮することができる。別のいくつかの態様では、脳損傷修復材料はこれらの因子を含まない。
【００５９】
架橋反応により得られたアルギン酸架橋体を含む材料は、通常、洗浄液により未反応の試薬や脱水縮合剤を除去し、精製することができる。洗浄液は、特に限定されないが、例えば、水、ＥＣＦ（Ｅｘｔｒａ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｉｄ）等を用いることができる。ＥＣＦは、精製水にＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）とＮａＣｌ（１４３ｍＭ）を溶解して作製しうる。ＥＣＦは、必要に応じて滅菌用のフィルターを通じた後に用いられてもよい。アルギン酸架橋体を含む材料をＥＣＦで洗浄した後は、残存するカルシウムを除去するため、水で洗浄することが好ましい。脳損傷修復材料は、凍結乾燥する前のゲル状の状態で用いられてもよい。
【００６０】
アルギン酸架橋体の凍結乾燥は、当業者に知られた技術常識を用いて実施しうる。凍結乾燥の条件は適宜調節可能であり、一次乾燥工程、二次乾燥工程等を設けてもよい。
【００６１】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料の形状は特に限定されず、適用する神経の損傷部の範囲などを考慮し適宜選択することができる。例えば、キセロゲル状の形態のとき、非管状（例えば、平板状、湾曲状、凹凸のある平板状など）、および管状の形状をとることができるが、好ましくは非管状であり、より好ましくは、平板状である。脳損傷修復材料が平板状のとき、脳の損傷部の範囲に合わせて脳損傷修復材料をさらに切断して損傷部に適用することができるため、平板のサイズは特に限定されない。例えば、平板状の形状を、縦×横×高さ（厚さ）で表すと、縦と横の長さは特に限定されず、高さ（厚さ）は、好ましくは０．２ｍｍ〜３０ｍｍであり、より好ましくは０．３ｍｍ〜１５ｍｍ、さらに好ましくは０．５ｍｍ〜１０ｍｍであり、とりわけ好ましくは１ｍｍ〜１０ｍｍである。さらに好ましくは、そのような高さ（厚さ）であることに加えて、縦と横の長さは、それぞれ、１ｍｍ〜３００ｍｍｘ１ｍｍ〜３００ｍｍであり、特に好ましくは、３ｍｍ〜２００ｍｍｘ３ｍｍ〜２００ｍｍであり、さらに好ましくは、５ｍｍ〜１５０ｍｍｘ５ｍｍ〜１５０ｍｍである。なお、厚さは均一でなくても良く、一方が厚くて他方が薄い、傾斜構造であってもよい。
【００６２】
脳損傷修復材料は、滅菌処理がなされていることが好ましい。滅菌は、γ線滅菌、電子線滅菌、エチレンオキシドガス滅菌、エタノール滅菌等が挙げられ、これらに限定されない。いくつかの態様では、架橋体に電子線やγ線が照射されるため、滅菌効果も得ることができる。
【００６３】
５．電子線及び／又はγ線照射された脳損傷修復材料
いくつかの態様では、低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、上述のアミン系化合物（Ｉ）および／またはその塩で共有結合架橋され、電子線及び／又はγ線が照射された架橋体を含む、脳損傷修復材料を提供する。この態様において、電子線及び／又はγ線を照射する対象は、生体吸収性多糖類が前記架橋剤で共有結合された架橋体のみでもよいし、脳損傷修復材料が生体内吸収性高分子や神経成長因子など他の成分を含む場合には、他の成分を含む架橋体であってもよい。また、他の成分は、電子線及び／又はγ線を照射した後の架橋体に含ませることもできる。
【００６４】
電子線は、放射線の中の電荷を持った粒子線のひとつであり、滅菌などの目的で使用される。電子線は電子加速器などを用いて照射可能である。電子線は、物質を透過するので複雑な形状や閉塞部の滅菌処理も可能であり、処理後の残留物等の心配がないのが特徴である。電子線の線量には、電圧、電流、照射時間（被照射物の搬送速度）等のファクターが関係する。電子線は、γ線と比較して浸透力が弱いため、必要な浸透力をコントロールすることが可能である。線量率（時間当りの線量）はγ線に比べ5,000〜10,000倍と高く、短時間（数秒〜分）での処理が可能となる。
【００６５】
γ線は、放射線の中の電磁波のひとつであり、滅菌などの目的で使用される。γ線は放射線源の露出装置などを用いて照射可能である。γ線は透過性が強く、γ線の線量は、熱源強度、熱源からの距離及び照射時間等のファクターが関係し、処理時間は数時間かかるため、被照射物の劣化が比較的大きい。
【００６６】
電子線とγ線をいずれも使用可能であるが、照射線量を一定に制御しやすいこと、被照射物に均一な線量を照射しやすいこと、γ線の放射線源コバルト６０の廃棄物処理等の観点から、より好ましくは電子線を用いることが望ましい。
【００６７】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、電子線及び／又はγ線が１ｋＧｙ〜１００ｋＧｙの吸収線量で照射されていることが好ましく、より好ましくは、３ｋＧｙ〜６０ｋＧｙであり、さらに好ましくは、５ｋＧｙ〜４０ｋＧｙであり、とりわけ好ましくは、５ｋＧｙ〜２５ｋＧｙ、またさらに好ましくは、１０ｋＧｙ〜２４ｋＧｙである。
【００６８】
いくつかの態様の、電子線及び／又はγ線が照射された脳損傷修復材料は、照射されていない材料と比較して、体内の適用部位から消失するまでの時間が短い、言い換えると、体内残存時間が短いという特徴を有する。「適用部位からの消失」とは、適用部位に架橋体を置き、一定時間後に適用部位を観察したとき、肉眼による観察で架橋体が視認できないことをいう。このときの体内の適用部位は、脳損傷部位であることが好ましいが、例えば、ラット等の動物で皮下又は筋肉内での埋植試験等を行い、適用部位からの消失を確認してもよい。
【００６９】
このような電子線及び／又はγ線が照射された脳損傷修復材料は、照射されていない材料と比較して、脳損傷部における神経再生誘導効果が高いという特徴を有する。
【００７０】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、適用部位からの消失が７日〜２７０日であることが好ましく、より好ましくは１４日〜１８０日であり、さらに好ましくは１４日〜１５０日であり、とりわけ好ましくは１４日〜１２０日である。また、いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、本明細書の実施例６の記載に従い、該材料を縦０．７ｃｍ×横１．５ｃｍ（厚さは問わない）のサイズとしてラット皮下埋植試験を行い、埋植から４週後に、埋植部位の組織染色による評価を行ったとき、材料の少なくとも一部の残存がみられることが望ましい。
【００７１】
別のいくつかの態様では、脳損傷修復材料は、本明細書の実施例７の記載に従い、該材料を縦１ｃｍ×横１ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断した該材料４個と生理食塩水２５ｍＬを、５０ｍＬの容遠沈管に入れて、恒温振とう水槽で、振とう幅２０ｍｍ、振とう数を往復１２０回／分、温度５０℃で振とうする、該材料の分解性試験を行うとき、振とう開始から７２時間後の材料の残存率が１０％〜８０％であることが望ましく、より好ましくは、２０％〜８０％である。ここでの「残存率」とは、分解性試験を開始する前の材料の質量に対する、一定時間の分解性試験実施後の材料を恒量になるまで減圧乾燥（６０℃）した後の材料の質量の割合をいう。また、材料の裁断面の縦と横とは垂直に交わるものとする。このとき材料の厚さは、試験対象とする材料の厚さのまま用いるが、標準的には約１ｍｍ〜約１０ｍｍの厚さであることが望ましい。恒温振とう水槽は、実施例７で用いたトーマス科学器械製のＴ−Ｎ２２Ｓ型を用いることが望ましいが、入手不可能な場合には、これとサイズや性能が同一または類似の恒温振とう水槽を用いることが望ましい。
【００７２】
また、いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、前記分解性試験において、開始から７２時間後の残存率が、開始から４時間後の残存率と比較して低下を示すことが好ましい。本発明の実施例では、エタノール滅菌したアルギン酸架橋体が神経再生誘導効果が十分ではないことが分かったが、これと同組成の架橋体は、実施例７の分解性試験では、開始から７２時間後も残存率は１００％を超えていた。
また、いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、前記分解性試験において、開始から４時間後の残存率が５５％以上であり、より望ましくは６０％以上であることが望ましい。本明細書の実施例において、電子線を４０ｋＧｙ、６０ｋＧｙと高い線量で照射した架橋体は神経再生効果が十分ではないことが分かったが、これは、高い電子線量を照射した架橋体が分解性試験の開始直後（４時間後）に残存率が低下したことに示されるように、架橋体を損傷部に設置した当初から架橋体が消失してしまい、神経の足場としての役目を果たせなかったことに起因すると考えられた。
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、前記分解性試験において、開始から４時間後の残存率は５５％以上であり、その後残存率が低下し、開始から７２時間後には残存率が１０％〜８０％を示すことが望ましい。
【００７３】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、以下に記載の引き裂き試験（実施例１０に記載の引き裂き試験）を行ったとき、最大試験力が０．１０（Ｎ）〜１０．０（Ｎ）であることが好ましく、より好ましくは０．１０（Ｎ）〜５．０（Ｎ）である。
引き裂き試験は、次のように実施する。対象とする材料は、縦２ｃｍ×横２ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断する。ここで縦と横の裁断面は垂直に交わるものとする。このとき材料の厚さは、材料自体の引き裂き強度をみる試験であるため、試験対象とする材料の厚さのまま用いるが、標準的には約１ｍｍ〜約１０ｍｍの厚さであることが望ましい。該材料の裁断面の１つから５ｍｍ離れた位置で該材料を挟むようにダブルクリップで把持する（把持部Ａ）。該材料の把持部Ａに相対する裁断面（Ｂ）から１０ｍｍまでの領域を生理食塩水に１５分間浸漬する。該材料の裁断面（Ｂ）から５ｍｍ離れた位置の中央部に針付き縫合糸を貫通させて、縫合糸の両端を器具に固定する。把持部Ａを、材料の正方形面に水平に、速度１０ｍｍ／分で、該材料が裂けるまで引っ張り、この引っ張る荷重を試験力（Ｎ）として測定する。試験力の最大点を最大試験力（Ｎ）とする。引っ張り荷重の測定は、小型物性試験機（EZ-graph,島津製作所製）を用いて行うことが望ましいが、入手できない場合には、これに類する荷重測定機械を用いてもよい。
把持部Ａに使用するダブルクリップの大きさは、把持部の幅が１５ｍｍ〜１９ｍｍであることが望ましい。試験に用いる縫合糸は「バイクリル（登録商標）」、糸の太さは「４−０」を用いることが好ましいが、入手できない場合には、材質が、ポリグラクチン９１０（グリコール酸／乳酸ポリエステル：９０／１０）であり、糸の太さが４−０である縫合糸を用いてもよい。針は、丸針ＳＨ−１を用いることが好ましいが、入手できない場合には、これと類似の縫合糸に合う針を用いてもよい。
好ましくは、材料の最大試験力を求める場合には、材料を裁断し、ｎ＝３〜１０で試験力を測定し、その最大試験力の平均値を求め、該材料の最大試験力とすることが望ましい。
【００７４】
また、低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、上述のアミン系化合物（Ｉ）および／またはその塩で共有結合架橋された架橋体を含む脳損傷修復材料に対して、電子線及び／又はγ線を照射する工程を少なくとも含む、脳損傷修復材料の体内残存時間を調節する方法を提供する。また、（Ａ）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬で共有結合架橋された架橋体、並びに（Ｂ）生体内吸収性高分子を含む架橋体に対して、電子線および／またはγ線を照射する工程を少なくとも含む脳損傷修復材料の体内残存時間を調節する方法を提供する。本発明の材料の体内残存時間を短くするには、電子線及び／又はγ線の照射線量を高くする、逆に、体内残存時間を長くするには電子線及び／又はγ線の照射線量を低くすることにより、脳損傷修復材料の体内残存時間を調節することができる。
【００７５】
また、低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類と、アミン系化合物（Ｉ）及び／又はその塩とを用いて共有結合架橋した架橋体を含む材料に対して電子線及び／又はγ線を照射する工程を少なくとも含む、脳損傷修復材料を製造する方法を提供する。「架橋体を含む材料」は、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類で作製された架橋体の他に、任意で、前述の生体内吸収性高分子や神経の成長に有用な因子などの他の成分を含んでいてもよい。具体的な好ましい態様は前述のとおりである。
【００７６】
また、少なくとも以下の工程を含む脳損傷修復材料を製造する方法を提供する。
（１）低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を含む溶液と、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬とを混合する工程、
（２）（１）で得られた混合物と、生体内吸収性高分子とを型に入れて一定時間静置し、架橋体とする工程、
（３）（２）で得られた架橋体を洗浄し、その後、凍結乾燥する工程、
（４）（３）で得られた架橋体に対して、電子線および／またはγ線を照射する工程。
この製造方法の好ましい態様は、本明細書に記載のとおりである。
【００７７】
６．患部で硬化させて用いる脳損傷修復材料
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を含み、脳損傷部への適用時に流動性を有し、適用後に硬化する材料であってもよい。
この態様において、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類は、好ましくは、アルギン酸、そのエステルおよびその塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが望ましい。
本明細書において、「流動性を有する」とは、その形態を不定形に変化させる性質を持つことを意味し、例えば、溶液にように、常に流れ動く性質を持つことを必要としない。好ましくは、シリンジ等に封入し、患部へ注入することができるような流動性を有することが望ましい。
また、この態様において「適用後に硬化する」とは、架橋剤などを用いることにより、分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を患部へ適用した後に流動性を失った状態にすることをいう。
例えば、アルギン酸ナトリウム溶液（例えば、０．５％〜５％程度）を、脳損傷部に被覆および／または充填し、その適用した溶液の表面に架橋性試薬を接触させて硬化させ、ゲル状の材料とすることが可能である。あるいは、脳損傷部への適用前にアルギン酸ナトリウム溶液と架橋性試薬を混合し、適用時には流動性を有するが、適用後に硬化する材料としてもよい。この態様で用いられる架橋性試薬は、好ましくは、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋などの２価以上の金属イオン化合物であってもよい。いくつかの態様では、架橋性試薬は、前述の一般式（Ｉ）で表される化合物に包含されるアミン系化合物またはその塩ではない。
この態様において、用いられるアルギン酸類の好ましい分子量、Ｍ／Ｇ比、粘度、エンドトキシン量などは、前述のとおりである。
【００７８】
７．使用方法
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、外傷や腫瘍切除等により生じた脳の損傷部に適用して、脳における神経の再生および／または再建を誘導する。本発明の脳損傷修復材料は、通常神経再生に必要な数ヶ月後に吸収分解され、最終的には代謝・排出されてなくなるため、安全性に優れる。
【００７９】
「脳の損傷部」とは、外傷や疾患、腫瘍切除等の手術時の損傷により脳の一部が損傷を受けるものである。脳の損傷部は、例えば、大脳、間脳、中脳、小脳、橋および延髄の一部の損傷である。いくつかの態様では、脳の損傷部は、好ましくは大脳の一部の損傷である。脳の損傷には、「欠損」や「断裂」なども含まれる。ここで、脳の一部の損傷は、例えば、大脳の損傷の場合には、大脳の表面積全体に対して、例えば０．１％〜５０％、好ましくは例えば０．５％〜４０％、より好ましくは例えば０．５％〜３０％の面積の脳の損傷である。大脳の体積全体に対しては、例えば、０．１％〜５０％、好ましくは０．５％〜４０％、より好ましくは０．５％〜３０％の体積の脳の損傷である。大脳以外の脳の部位（間脳、中脳など）についてもそれぞれの部位について同様である。
脳損傷としては、例えば、外傷性損傷、疾患による損傷、手術時の損傷などが挙げられる。
外傷性損傷としては、例えば、びまん性軸索損傷、急性硬膜外血腫（または外傷性硬膜外血腫）、急性硬膜下血腫（または外傷性硬膜下血腫）、（外傷性）脳内出血、脳挫傷などが挙げられる。疾患による損傷としては、例えば、脳梗塞、脳出血、クモ膜下出血、脳腫瘍などが挙げられる。
手術時の損傷としては、例えば、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）手術時の損傷、腫瘍摘出による損傷、脳動脈瘤治療におけるクリッピングによる損傷、脳損傷部の処置に伴う損傷、脳手術時に用いられる器具による損傷などが挙げられる。より具体的には、例えば、腫瘍摘出による損傷とは、脳の深層にある脳腫瘍摘出の手術を行う際に、腫瘍摘出のために作製される脳の切断部や脳腫瘍摘出後の空洞部などであってもよい。その他の脳の病変の場合も同様である。脳損傷部の処置に伴う損傷とは、例えば、脳損傷部の一部除去、あるいは病変部や血液の除去等の処置に伴う損傷であってもよい。また、脳手術時に用いられる器具とは、例えば、脳の病変を露出するため脳を固定する器具（ヘラ等）等であってもよい。いくつかの態様では、脳損傷は、外傷性損傷、疾患による損傷、手術時の損傷からなる群から選択される少なくとも１種である。
脳の欠損は、脳の損傷のうち脳の一部が欠損しているものをいう。いくつかの態様では、修復する脳の欠損の大きさは、縦×横×高さ（厚さ）で表すと、例えば０．５ｍｍ〜２００ｍｍ×０．５ｍｍ〜２００ｍｍ×０．５ｍｍ〜１００ｍｍであり、好ましくは１ｍｍ〜１５０ｍｍ×１ｍｍ〜１５０ｍｍ×１ｍｍ〜１００ｍｍであり、より好ましくは１ｍｍ〜１００ｍｍ×１ｍｍ〜１００ｍｍ×１ｍｍ〜５０ｍｍである。
これらの脳損傷部や脳欠損部の測定は、常法を用いて、例えば、脳血管造影またはCT血管撮影、ＭＲＩ、などによる画像診断などが用いられてもよい。
脳の欠損は、例えば、しばしば脳動静脈奇形（ＡＶＭ）の手術時に生じる。重症例や再発の危険が高い症例は外科的治療を行うことが推奨されており、その目的は，出血予防，痙攣コントロール，進行性神経障害回避などであり，最も重要視されるのは血管の破たんによる出血予防である。ＡＶＭの摘出後の周辺部には脳の欠損が生じるが、従来、止血目的でフィブリン糊などを使用する以外に処置する方法はない。
【００８０】
脳の損傷部では、神経が損傷している。「神経の損傷」とは、神経軸索の連続性が失われた状態（欠損）及び、神経の連続性は保たれているが神経機能が損なわれている状態を含み、断裂等も含む。本明細書において、「（神経の）欠損部」は、「（神経の）ギャップ」、「（神経の）切断部」などという場合があり、また「（神経の）断裂」も含む。
【００８１】
本明細書において「適用する」とは、脳損傷修復材料を脳の損傷部に被覆および／または充填することをいう。脳の損傷部が欠損部である場合には、脳損傷修復材料を、例えば、脳の損傷部を充填することが好ましい。
いくつかの態様では、脳損傷修復材料を脳の損傷部に被覆および／または充填した後に、その表面にフィブリン糊を適用してもよい。別のいくつかの態様では、脳損傷修復材料を脳の損傷部に被覆および／または充填した後に、その表面にフィブリン糊を適用しない。
また、いくつかの態様では、硬膜の損傷を伴う場合には、脳損傷修復材料を脳の損傷部に被覆および／または充填した後に、人工硬膜により硬膜の損傷を補填してもよい。用いられる人工硬膜は、特に限定されないが、例えば、延伸ポリテトラフルオロエチレン（Expanded Polytetrafluoroethylene）を含む人工硬膜（製品名：ゴアテックス(R)人工硬膜ＭＶＰ、日本ゴア株式会社、メディカルプロダクツディビジョン）、Ｌ-ラクチドとε-カプロラクトンとから成る共重合体フィルムをグリコール酸重合体不織布で強化した人工硬膜（製品名：シームデュラ(R)、グンゼ株式会社）などが市販により利用可能である。
また、いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、脳損傷修復効果があるため、人工硬膜の脳損傷部に接する側の材料として使用してもよい。この態様における人工硬膜は、脳損傷修復材料の他にも人工硬膜として使用可能な材料を含んでいてもよく、また脳損傷修復材料の層と他の層とで構成されてもよい。人工硬膜として使用可能な材料は、特に限定されないが、例えば、延伸ポリテトラフルオロエチレン、Ｌ-ラクチドとε-カプロラクトンとから成る共重合体などであってもよい。
【００８２】
脳損傷修復材料は、好ましくは非管状であり、より好ましくは平板状である。組織修復に働く線維組織は瘢痕化によって、中枢神経の正常な組織修復を損なうものである。本明細書の実施例８において、本発明のアルギン酸架橋体は、コラーゲンスポンジと比較して、線維芽細胞の接着、増殖を抑制する効果が示されており、脳損傷修復材料として好ましい性能を備えることが見出された。
【００８３】
本明細書において「神経の再生の誘導」とは、神経細胞の増殖及び／又は神経軸索の伸長を促すことをいう。神経の損傷部が欠損部である場合には、神経の連続性を回復するように神経軸索の伸長を促すことをいう。神経に損傷や挫滅などによる欠損が生じると、欠損部から末梢側（切断端部から遠位）の神経軸索は神経細胞体からの連続性が断たれるため変性（末梢神経ではＷａｌｌｅｒ変性という）が生じ、神経機能が失われる。欠損部から以遠の変性した神経軸索は遺残物としてミクログリアなどに貪食される。その後、中枢側断端から発芽した多数の神経軸索が末梢断端側まで伸長する。好ましくは、中枢側から伸長した軸索が末梢側の断端部につながることが望ましい。あるいは、神経の再生の誘導は、失われた神経機能や知覚を少なくとも一部回復することにより示すこともできる。本発明における神経の再生の誘導とは、必ずしも損傷前の状態に完全に回復することを意味するものではない。本発明の脳損傷修復材料は、前記のいずれか１以上の効果を達成することが好ましい。
【００８４】
脳損傷修復材料の使用方法は、対象の再建すべき脳損傷部を露出させ、再建すべき脳損傷の長さや幅に応じて、適当な大きさの脳損傷修復材料とし、再建すべき神経の損傷部に適用する。「対象」は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、およびウマ）である。
【００８５】
管状の材料は、脳損傷部への適用は不可能であるが、平板状であれば、損傷部の大きさに合わせて材料を切断して適用することができる。
【００８６】
脳損傷修復材料がキセロゲル状のときは、そのまま乾燥状態で適用してもよいし、生理食塩水あるいは精製水等を含ませた後にゲル状の状態で適用してもよい。すなわち、本発明の脳損傷修復材料はゲル状の形態であってもよい。
【００８７】
脳損傷修復材料を脳損傷部に適用した後、脳損傷修復材料と脳の損傷部の縫合は必要ないが、必要に応じて、脳損傷修復材料と脳の損傷部を縫合してもよい。
【００８８】
本発明のいくつかの態様では、本発明の「脳損傷修復材料」は「神経再生誘導用材料」でもあり、その適用可能な部位は、神経の損傷部であれば特に限定されない。末梢神経及び／又は中枢神経の損傷部の再生誘導のために用いることができ、直線状の神経、神経の分岐部及び／又は神経叢部の損傷部などに適用可能である。神経の分岐部及び／又は神経叢部の損傷部は、例えば、前立腺、膀胱、陰茎海綿体、腕、四肢、顔面、頸、腰、仙骨、腰仙骨、陰部、心臓、腹腔、下下腹、骨盤、胸腔内、腸壁内などに存在するものでもよい。中枢神経であれば、例えば、脳や脊髄の損傷部が挙げられる。また、神経再生誘導用材料は、例えば、腫瘍切除、リンパ節の郭清、外傷、又は組織再建などに伴う神経損傷部の再生に用いられてもよい。
【００８９】
本発明のいくつかの態様では、本発明の脳損傷修復材料は、脳の損傷部に被覆および／または充填して用いられるため、本明細書における「脳損傷修復材料」は「脳損傷部被覆材料」「脳損傷部充填材料」などと言い換えられてもよい。
【００９０】
いくつかの態様では、脳損傷修復材料は、神経の再生あるいは成長に有用な因子、生理活性物質などの液性因子、あるいは細胞と併用して用いられてもよい。併用する方法は特に限定されないが、例えば、本発明の脳損傷修復材料に、これらの因子や細胞を含有させてもよい。液性因子としては、再生組織に対して補助的に用いることができる因子であれば特に限定されないが、例えば、ｂＦＧＦ、ＮＧＦ、肝細胞増殖因子、免疫抑制剤、抗炎症剤などが挙げられる。細胞としては、例えば、自家または他家培養による間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞、神経幹細胞、骨髄由来単核球細胞、脂肪由来幹細胞、生体内多能性幹細胞、ES細胞、神経系前駆細胞、iPS細胞、ＣＤ１３３＋細胞、羊膜由来幹細胞などが挙げられるがこれらに限定されない。別のいくつかの態様では、脳損傷修復材料は、これらの細胞や因子と併用されない態様も好ましく、より好ましくは、ＣＤ１３３＋細胞と併用されない。
【００９１】
脳の損傷部位の神経の再生の評価方法は、特に限定されないが、例えば、本明細書の実施例１１及び１２に記載のとおり、常法に従い、凍結薄切切片を作成し、抗ニューロフィラメント抗体、抗ＧＦＡＰ抗体、または抗β−Ｔｕｂｕｌｉｎ抗体などの試薬で免疫染色する等して、脳の損傷部位のアストロサイトや神経軸索の再生を確認することができる。エポン樹脂など適切な方法で包埋したあと、透過電子顕微鏡(TEM)または走査電子顕微鏡(SEM)で再生軸索の状態を観察して評価することも可能である。
【００９２】
また例えば、電気生理学的測定（electrophysiological measurement）、組織病理学的評価（histopathological evaluation）、歩行パターン（walking pattern）、 軸索輸送を調べるためのトレーサー試験（tracer detective study for axoplasmic transport）、二点識別覚検査（Two−point discrimination）などにより評価されてもよい。
【００９３】
電気生理学的測定は、例えば、運動神経機能の回復の指標としてＣＭＡＰ（compound muscle action potentials）、感覚神経機能の回復の指標として、ＳＥＰ（somatosensory evoked potentials）などを用いることができる（例えば、Journal of Materials Science: Materials in medicine 16 (2005) p.503-509参照）。
【００９４】
本発明は、また、前述の脳損傷修復材料を脳の損傷部に被覆および／または充填する工程を含む、脳の損傷部の修復を必要とする対象において脳の損傷部を修復する方法を提供する。本発明はまた、前述の脳損傷修復材料を脳の損傷部に被覆および／または充填する工程を含む、脳の損傷部の修復を必要とする対象において、脳の損傷部の修復を誘導する方法を提供する。本発明は、また、前述の脳損傷修復材料を脳の損傷部に被覆および／または充填する工程を含む、脳の損傷部の治療を必要とする対象において、脳の損傷部を治療する方法を提供する。具体的な方法は、前述の記載のとおりである。
【００９５】
本発明は、さらに、前述の脳損傷修復材料を製造するための、低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類及び／又は上記の一般式（Ｉ）で表される化合物およびその塩から選択される少なくとも１種の架橋性試薬の使用であって、前記脳損傷修復材料が脳の損傷部に被覆および／または充填するように用いられる、前記使用を提供する。具体的な使用は、前述の通りである。
【００９６】
本発明は、さらに、低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類が、上記の一般式（Ｉ）で表される化合物及びその塩から選択される架橋性試薬で共有結合架橋された架橋体を含む脳損傷修復材料を用いる、脳の損傷部の修復において使用されるための前記低エンドトキシンの分子内にカルボキシル基を有する生体内吸収性多糖類を提供する。
【００９７】
次に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
尚、以下の実施例において、実施例１２は、比較例である。
【実施例】
【００９８】
実施例１  アルギン酸架橋体の作製と性状の評価
アルギン酸ナトリウムと、架橋剤として（ｉ）塩化カルシウム、（ｉｉ）塩化カルシウムと塩化ナトリウムの混合物、（ｉｉｉ）エチレンジアミンをそれぞれ用いて、キセロゲルの形態のアルギン酸架橋体を作製し、性状を評価した。【００９９】
１−（１）アルギン酸ナトリウム
アルギン酸ナトリウムは、いずれもエンドトキシン含量は５０ＥＵ／ｇ未満の低エンドトキシンのアルギン酸ナトリウム（Ｓｅａ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）発売元  持田製薬株式会社）６種を用いた。【０１００】
Ａ−１、Ａ−２およびＡ−３は、アルギン酸ナトリウムのＭ／Ｇ比が０．４〜１．８の範囲であり、Ｂ−１、Ｂ−２およびＢ−３は、アルギン酸ナトリウムのＭ／Ｇ比が０．１〜０．４の範囲であった。【０１０１】
各アルギン酸ナトリウムの１ｗ／ｗ％の水溶液の粘度および重量平均分子量を表１に示した。【０１０２】
アルギン酸ナトリウムの粘度測定は、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従い、回転粘度計法（コーンプレート型回転粘度計）を用いて測定した。具体的な測定条件は以下のとおりである。試料溶液の調製は、MilliQ水を用いて行った。測定機器は、コーンプレート型回転粘度計（粘度粘弾性測定装置レオストレスRS600（Thermo Haake GmbH）センサー：３５／１）を用いた。回転数は、１ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液測定時は１ｒｐｍとした。読み取り時間は、２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とした。３回の測定の平均値を測定値とした。測定温度は２０℃とした。【０１０３】
各アルギン酸ナトリウムの重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と、ＧＰＣ−ＭＡＬＳの２種類の測定法で測定した。測定条件は以下のとおりである。【０１０４】
［前処理方法］
試料に溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルターろ過したものを測定溶液とした。
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定
［測定条件（相対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷ−ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ−ＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
分子量標準：標準プルラン、グルコース【０１０５】
（２）ＧＰＣ−ＭＡＬＳ測定
［屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）測定（測定条件）］
示唆屈折率計：Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ
測定波長：６５８ｎｍ
測定温度：４０℃
溶媒：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
試料濃度：０．５〜２．５ｍｇ／ｍＬ（５濃度）【０１０６】
［測定条件（絶対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷ−ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ−ＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器、光散乱検出器（ＭＡＬＳ）
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ【０１０７】
【表１】
2019053822.tif 000002
【０１０８】
１−（２）塩化カルシウムを架橋剤としたアルギン酸架橋体の作製
以下の作業は、特に断らない限り、室温環境下（２０〜３０℃）で実施した。表１中の各低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム凍結乾燥品をミリQ水で溶解して１ｗ／vol％アルギン酸ナトリウム水溶液とした。塩化カルシウム無水物をミリQ水で溶解して５０ｍＭ塩化カルシウム水溶液とした。アルギン酸ナトリウム水溶液1mLを入れたチューブ（Falcon2054）に50mM塩化カルシウム水溶液1mLを重層して終夜静置した後、ゲル化したものについてはミリQ水で3回洗浄し、凍結乾燥して、キセロゲル状のアルギン酸架橋体を得た。【０１０９】
１−（３）塩化カルシウムと塩化ナトリウムを架橋剤としたアルギン酸架橋体の作製
表１中の各低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム凍結乾燥品をミリQ水で溶解して１ｗ／vol％アルギン酸ナトリウム水溶液とした。塩化カルシウム無水物と塩化ナトリウムをミリQ水で溶解し、カルシウムイオン４ｍＭとナトリウムイオン３００ｍＭ含む水溶液を作製した（カルシウム−ナトリウム架橋剤水溶液）。アルギン酸ナトリウム水溶液1mLを入れたチューブ（Falcon2054）にカルシウム-ナトリウム架橋剤水溶液1mLを重層して終夜静置した後、ゲル化したものについてはミリQ水で3回洗浄し、凍結乾燥し、キセロゲル状のアルギン酸架橋体を得た。【０１１０】
別途、カルシウム−ナトリウム架橋剤水溶液のカルシウムイオンを１０ｍＭ、２０ｍＭ、又は５０ｍＭとした架橋剤水溶液を作製し、Ａ−１又はＡ−２のアルギン酸ナトリウムを用いて、同様の手順でアルギン酸架橋体を得た。【０１１１】
１−（４）エチレンジアミンを架橋剤として用いたアルギン酸架橋体の作製
N-ヒドロキシコハク酸イミド２３ｇをメタノール１０００ｍｌに溶解した。エチレンジアミン６．７ｍｌを１００ｍｌのメタノールに溶解して、N-ヒドロキシコハク酸イミドの溶液へ添加し混合した。生じた結晶をグラスフィルター上に濾取し、乾燥させて、約２７．０ｇのエチレンジアミン２N-ヒドロキシコハク酸イミド塩（EDA・2HOSu）を得た。【０１１２】
表１中の各低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムをミリQ水に溶解して得た、１ｗ／vol％のアルギン酸ナトリウム水溶液1ｍｌに、EDA・2HOSu2.2ｍｇと、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（EDC・HCl）16mｇを加えて溶解した。【０１１３】
混合物をFalcon2054チューブ中で、室温で2日間静置し、ゲル化させた。ゲルをECFで3回/日×約7日間、次いでミリQ水で3回洗浄後、凍結乾燥し、キセロゲル状のアルギン酸架橋体を得た。ECF(Extra Cellular Fluid)は、精製水にCaCl2(2.5mM)とNaCl(143mM)を溶解し、滅菌フィルター及びエンドトキシン除去フィルターを通じたものを用いた。【０１１４】
１−（５）アルギン酸架橋体の評価
上記１−（２）〜１−（４）で得られたアルギン酸架橋体をゲル化、多孔性、及びＰＢＳ（Phosphate buffered saline）中の残存性の観点から評価した。
ゲル化は、転倒法にて目視観察し、全ての溶液がゲル化した場合を３点、約半分の溶液がゲル化した場合を２点、ほとんどの溶液がゲル化しなかった場合を１点とした。
多孔性は、アルギン酸架橋体の断面を走査型電子顕微鏡を用いて、金コーティング後に、100倍で（加速電圧15kV）測定し、100μm〜500μmの均一な細孔を有している場合を３点、不規則な大きさの細孔を有している場合を２点、細孔を有していない場合を１点とした。
ＰＢＳ中のゲル残存性試験は、各ゲル約5mm角をＰＢＳ５ｍｌ中に入れ、３７℃、１週間後のゲルの状態を観察し、ほとんど全てが残存している場合を３点、およそ半分程度が残存している場合を２点、ほとんど全てが溶解した場合を１点とした。【０１１５】
その結果、（ｉ）塩化カルシウムを架橋剤とした架橋体、及び、（ｉｉ）塩化カルシウムと塩化ナトリウムの混合物を架橋剤とした架橋体は、ゲル化の評価は一部３点もあったが、多孔性の評価、及び、ＰＢＳ中のゲル残存性評価では、そのほとんどが２点又は１点であった。【０１１６】
（ｉｉｉ）エチレンジアミンを架橋剤としたアルギン酸架橋体の評価結果を表２に示す。【０１１７】
ゲル化の評価では、Ａ−２、Ａ−３、Ｂ−２、及びＢ−３はゲル化したが、Ａ−１とＢ−１のゲル化は不十分であった。【０１１８】
多孔性の評価は、Ａ−１、Ａ−２及びＡ−３については、孔の大きさが３００μｍ〜５００μｍの多孔体が得られたことが分かった。一方、Ｂ−１、Ｂ−２及びＢ−３については、細孔は認められず砕片状であった。【０１１９】
ＰＢＳ中のゲル残存性評価は、Ａ−１は、１週間後に約１／２が残存していたのに対し、Ａ−２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３は、１週間後も透明な含水ゲルのほとんど全てが残存した。【０１２０】
以上より、多孔性の点から、Ｂ−１、Ｂ−２及びＢ−３のアルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ比が０．１〜０．４）と比較して、Ａ−１、Ａ−２及びＡ−３のアルギン酸ナトリウム（Ｍ／Ｇ比が０．６〜１．８）を用いることが好ましいことが分かった。【０１２１】
また、Ａ−１、Ａ−２及びＡ−３のアルギン酸ナトリウムの中では、ゲル化、及びＰＢＳ中のゲル残存性の点から、Ａ−２及びＡ−３のアルギン酸ナトリウム、すなわち、ＧＰＳ−ＭＡＬＳによる重量平均分子量が９万以上のアルギン酸ナトリウムを用いることが好ましいことが分かった。【０１２２】
【表２】
2019053822.tif 000003
【０１２３】
実施例２  神経様細胞の生存率の評価
実施例１において作製したアルギン酸架橋体（約1.0 cm ｘ 1.0 cm）に、ＰＣ１２細胞（50,000 cells/mL）1 mLを、含浸した。神経成長因子（ＮＧＦ）(final 100 ng/mL)を加えて7日間培養（3日目に0.5mLの培地追加）後、WST-8試薬（DOJINDO）を150 μL/well添加し、37℃で3時間静置した。上清100 μLずつ96穴プレートに分注し、プレートリーダー（Tecan）を用いて450 nmの吸光度を測定した。【０１２４】
アルギン酸架橋体は、Ａ−２を（ｉ）塩化カルシウム（ｉｉｉ）エチレンジアミンによりそれぞれ架橋した架橋体（それぞれＡ−２Ｃａ，Ａ−２ＥＤＡという）、Ａ−３を（ｉ）塩化カルシウム（ｉｉｉ）エチレンジアミンによりそれぞれ架橋した架橋体（それぞれＡ−３Ｃａ，Ａ−３ＥＤＡという）の４種とした。組織培養用プレートをコントロールとして用いた。【０１２５】
その結果、コントロールにおける神経様細胞の生存率を１００％としたときの、Ａ−２ＥＤＡ、Ａ−３Ｃａ、及びＡ−３ＥＤＡにおける生存率はいずれも９８％以上であった。一方、Ａ−２Ｃａのみ低い生存率（６３％）を示した。【０１２６】
Ａ−２Ｃａについて、神経様細胞の生存率が低かった理由は、溶出したカルシウムの毒性、溶解したアルギン酸による培地中の粘度増大に起因する酸素の供給不足が原因と推察された。【０１２７】
実施例３  電子線照射したアルギン酸架橋体の評価
３−（１）アルギン酸架橋体に対する電子線照射
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムのＡ−２とＡ−３を用いて、塩化カルシウムと塩化ナトリウムを架橋剤としたアルギン酸架橋体（それぞれＡ−２ＣａＮａ、Ａ−３ＣａＮａという）、実施例１−（４）に従い、エチレンジアミンを架橋剤としたアルギン酸架橋体（それぞれＡ−２ＥＤＡ、Ａ−３ＥＤＡという）を作製した。塩化カルシウムと塩化ナトリウムを架橋剤としたアルギン酸架橋体は、１％アルギン酸ナトリウム水溶液を３．１５ｍｌずつ充填したプレートを２５ｍｌのカルシウム−ナトリウム架橋剤水溶液（塩化カルシウム無水和物５０ｍＭ、塩化ナトリウム３００ｍＭ）に浸漬してゲル化させ、洗浄後凍結乾燥して作製した。【０１２８】
各アルギン酸架橋体に対して、電子線の２０ｋＧｙ、４０ｋＧｙ、６０ｋＧｙをそれぞれ照射した。【０１２９】
電子線照射装置としてＲＤＩ社製ダイナミトロン型電子加速器を、線量測定装置としてＣＴＡ線量計用島津ＵＶ１８００分光光度計を用いた。線量計としてＣＴＡ線量計（富士写真フィルム社製ＦＴＲ-１２５）Ｌｏｔ  Ｎｏ．４５９を用いた。電子線は、加速電圧４．８ＭＶ、電流２０．０ｍＡの条件で、目的の照射線量となるように照射時間を調節して照射した。【０１３０】
３−（２）電子線照射したアルギン酸架橋体の崩壊時間の評価
実施例３−（１）で作製した、電子線照射されたアルギン酸架橋体、及び、電子線照射されていないアルギン酸架橋体について、生理食塩液中での崩壊時間を測定した。【０１３１】
具体的には、各架橋体を約７ｍｍ×約７ｍｍにカットし、生理食塩液２５ｍｌを入れた５０ｍｌの遠沈管に入れ、３７℃の恒温器内で、遠沈管を横に寝かせた状態で、６０ｒｐｍで振とうし、架橋体が完全に崩壊するまでの時間を測定した。【０１３２】
結果を表３に示す。【０１３３】
塩化カルシウムと塩化ナトリウムを架橋剤としたアルギン酸架橋体（Ａ−２ＣａＮａ、Ａ−３ＣａＮａ）は、電子線量と溶解時間までの時間に一定の関係は見られなかった。一方、エチレンジアミンを架橋剤としたアルギン酸架橋体（Ａ−２ＥＤＡ、Ａ−３ＥＤＡ）については、電子線量が高くなるに従い、溶解終了までの時間は短くなった。Ａ−３ＥＤＡの電子線照射量が０ｋＧｙと２０ｋＧｙの架橋体は、いずれも２０日後も溶解しなかったが、未照射の架橋体は２０日後も形状を保っていたのに対して、２０ｋＧｙ照射の架橋体は、スポンジの形状は保っておらず、ピンセットで掴むことはできない硬さであった。また、Ａ−２ＥＤＡは、全体として、Ａ−３ＥＤＡと比較して、溶解終了までの時間が短い傾向がみられた。【０１３４】
【表３】
2019053822.tif 000004
【０１３５】
実施例４  アルギン酸架橋体を用いたラット坐骨神経損傷部の再生誘導
ラットの坐骨神経（末梢神経）の切断部位にエチレンジアミン架橋のアルギン酸架橋体を設置し、神経再生誘導の効果を評価した。【０１３６】
４−（１）エチレンジアミン架橋アルギン酸架橋体の作製
実施例１−（４）に従い、Ａ−２とＡ−３の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いて、エチレンジアミンで共有結合架橋したキセロゲル状のアルギン酸架橋体（それぞれＡ−２ＥＤＡ、Ａ−３ＥＤＡという）を作製した。このとき架橋体におけるアルギン酸含量は３．０ｍｇ／ｃｍ２とした。架橋体の厚さは約２ｍｍ〜約８ｍｍであった。【０１３７】
４−（２）直線状の坐骨神経の切断とエチレンジアミン架橋アルギン酸架橋体による再生誘導
上記４−（１）で作製したＡ−２ＥＤＡとＡ−３ＥＤＡをエタノール滅菌して下記実験に用いた。
４週齢の雄性Ｗｉｓtａｒラットを麻酔下で、分岐していない直線状の坐骨神経の周囲の皮膜を剥離して、神経を露出させた。神経の裏側へ糸を入れて神経を糸で結んで神経を上部へ持ちあげ、神経の下の空間に１枚のアルギン酸架橋体を置いた。アルギン酸架橋体の上に位置する神経を切断して、７〜８ｍｍの幅のギャップを作製した。その後、神経の切断部位の上にもう１枚のアルギン酸架橋体を置くことにより、２枚のアルギン酸架橋体で神経の切断部を挟むように設置した。２枚のアルギン酸架橋体は、中枢側及び末梢側の両神経断端をカバーできる大きさにして用いた。アルギン酸架橋体は縫合による固定は行わなかった。開いた筋肉を縫合し、皮膚も縫合した。【０１３８】
４−（３）アルギン酸架橋体の回収と再生した神経軸索の評価
上記４−（２）の施術から８週目に手術部位からアルギン酸架橋体と神経を回収し、架橋体より末梢側の神経を取り出した。取り出した神経は、２．５％グルタールアルデヒドのＰＢＳ液で１次固定し、２．０％四酸化オスミウムのＰＢＳ液で２次固定を行った。脱水、置換後、エポン樹脂に包埋した。１μｍの厚さで薄切して、０．５％トルイジンブルーで染色した。光学顕微鏡下に観察し、有髄軸索の数をカウントした。
その結果、８週目の末梢側神経において、Ａ−２ＥＤＡでは平均４９３本、Ａ−３ＥＤＡでは平均５２４本の有髄軸索が確認され、アルギン酸架橋体の神経再生誘導効果が確認された。しかし、８週時に回収したアルギン酸架橋体と神経の部分は、アルギン酸架橋体はほとんど吸収されておらず、組織が増大し塊となっていた。
比較例として実施した、神経の切断のみ行い、アルギン酸架橋体を設置しなかった群では、軸索本数は平均１５６本 であった。また、神経を切断していない無処置のコントロール群の軸索本数は平均８９１８本 であった。【０１３９】
４−（４）坐骨神経の分岐部の切断とエチレンジアミン架橋アルギン酸架橋体による再生誘導
上記４−（１）で作製したＡ−２ＥＤＡを下記実験に用いた。
４週齢の雄性Ｗｉｓtａｒラットを麻酔下で、坐骨神経から総腓骨神経と脛骨神経とにＹ字状に分岐している神経部位を確認し、周囲の皮膜を剥離して神経を露出させた。坐骨神経に糸を結んで神経を上に持ち上げ、神経の下の空間に１枚のアルギン酸架橋体を置いた。神経分岐部を含んで７〜８ｍｍのギャップが生じるように、坐骨神経と総腓骨神経と脛骨神経を切断した。その後、神経の切断部位の上にもう１枚のアルギン酸架橋体を置くことにより、２枚のアルギン酸架橋体で神経の切断部を挟むように設置した。２枚のアルギン酸架橋体は、中枢側及び末梢側の神経断端をカバーできる大きさにして用いた。アルギン酸架橋体は縫合による固定は行わなかった。開いた筋肉を縫合し、皮膚も縫合した。【０１４０】
４−（５）アルギン酸架橋体の回収と再生した神経軸索の評価
４−（４）の施術から４週目に手術部位からアルギン酸架橋体と神経を回収し、架橋体より末梢側の神経を取り出した。抗ベータチューブリンクラス３抗体を軸索に対する抗体として、抗Ｓ１００抗体（ａｂｃａｍ社製）をシュワン細胞に対する抗体として用いて染色を行った。【０１４１】
その結果、脛骨側断端部及び腓骨側断端部のいずれにおいても軸索の再生が認められた。架橋体を移植した部位では、ゲル表層部に再生軸索を認めた。【０１４２】
実施例５  電子線が照射されたポリグリコール酸を含むアルギン酸架橋体を用いたラット坐骨神経損傷部の再生誘導
５−（１）電子線が照射されたポリグリコール酸を含むエチレンジアミン架橋アルギン酸架橋体の作製
実施例１−（４）に従い、Ａ−２の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム水溶液にＥＤＡ・２ＨＯＳｕとＥＤＣ・ＨＣｌを溶解させた。得られた溶液を、シート状の不織布のポリグリコール酸（ＰＧＡ）（１００ｍｇ／ｃｃ，３．０ｍｇ／ｃｍ２Non-woven PGA Biofelt ,Biomedical Structures (USA)）を敷いたトレイに充填し、凍結乾燥することによりＰＧＡを含むアルギン酸架橋体を作製し、Ａ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００とした。このとき架橋体におけるアルギン酸の含量は２．０ｍｇ／ｃｍ２とした。より詳細には、ＰＧＡを敷いたトレイにアルギン酸溶液を充填し、十分にゲル化が進んだ後、未反応の架橋剤および反応副生成物を除去するためにゲルの洗浄を行った。洗浄液は、ECF（Extra Cellular Fluid：精製水に CaCl2（2.5 mM、例えば0.28 g/1 L）とNaCl（143 mM、例えば8.36 g/1 L）を溶解し、0.22μmフィルター（ミリポア社製、ミリパック20等）とエンドトキシン除去フィルター（ミリポア社製、プレップスケールUFカートリッジPLGC CDUF 001 LG）を通じたものを用いた。洗浄液は適宜交換し、その後蒸留水で洗浄し、過剰の塩類を除いてから凍結乾燥した。得られた架橋体の厚さは約２ｍｍ〜約８ｍｍであった。【０１４３】
同様に、Ａ−３の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いて作製したアルギン酸架橋体を、Ａ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ１００とした。
得られた２種類の架橋体には、電子線を吸収線量２０ｋＧｙで照射した。【０１４４】
５−（２）直線状の坐骨神経に対する再生誘導効果
実施例５−（１）で得られた２種類の架橋体（Ａ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００、及びＡ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ１００）を、４−（２）、４−（３）に従い、直線状の坐骨神経のギャップに適用し、架橋体の適用から８週後に直線状の坐骨神経のギャップに対する再生誘導効果を評価した。【０１４５】
その結果、いずれの群でもギャップから末梢側の断端部に向けて有髄神経の再生がみられた。再生した有髄神経の本数は、Ａ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００では平均１２００１本、Ａ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ１００では平均７０１０本であった。本明細書において、再生した有髄神経の本数は、採取した組織標本中の再生部位と判断した神経束中の有髄神経を全てカウントした。健常ラットの軸索本数は、およそ６７００本程度であり、十分な数の有髄神経の再生が得られたことが分かった。【０１４６】
５−（３）坐骨神経の分岐部の欠損に対する再生誘導効果
実施例５−（１）に準じて、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム（Ａ−２又はＡ−３）と、シート状の不織布のポリグリコール酸（ＰＧＡ）（５０ｍｇ／ｃｃ，１．５ｍｇ／ｃｍ２）を用いて２種類のＰＧＡを含むアルギン酸架橋体を作製し、それぞれＡ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ５０、Ａ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ５０とした。架橋体におけるアルギン酸含量は２．０ｍｇ／ｃｍ２とした。得られた架橋体の厚さは約２ｍｍ〜約８ｍｍであった。得られた２種類の架橋体には電子線を吸収線量２０ｋＧｙで照射した。実施例５−（１）で得られた２種類の架橋体（Ａ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００、及びＡ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ１００）と合わせて計４種類のＰＧＡを含むアルギン酸架橋体について、実施例４−（４）に従い施術を行い、架橋体の適用から８週後に坐骨神経の分岐部のギャップに対する再生誘導効果を評価した。【０１４７】
８週後に外観観察したところ、いずれの群も、坐骨神経から脛骨神経と腓骨神経へと神経組織がつながっていることを認めた。その例として、Ａ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ５０とＡ−２ＥＤＡ・ＰＧＡ１００の術後８週の写真をそれぞれ図１、図２に示した。【０１４８】
また、実施例４−（３）に準じて末梢側断端部より遠位部の神経の横断切片をトルイジンブルーを用いて染色した結果を図３及び図４に示す。図３は、脛骨神経側の再生軸索、図４は腓骨神経側の再生軸索の写真を示す。その結果、脛骨神経側及び腓骨神経側において、有髄軸索の径は長く、数は多く、ミエリンは厚く、十分な再生が認められた。すなわち、本発明の神経再生誘導用材料は、神経分岐部の欠損部に使用した場合、分岐する両方の神経の再生を誘導することが示された。【０１４９】
５−（４）坐骨神経の直線状または分岐部の欠損に対する再生誘導効果（２）
以下の各試料について、実施例４に従い、ラットの坐骨神経の分岐部のギャップに対する再生誘導効果を、架橋体の適用から８週後に評価した。【０１５０】
実施例１−（４）に従い、Ａ−２の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いてエチレンジアミン架橋したアルギン酸架橋体（アルギン酸含量２．０ｍｇ／ｃｍ２）を作製し、電子線２０ｋＧｙ照射し、試料番号１とした。【０１５１】
実施例５−（３）で用いた、Ａ−２ＥＤＡ・ＰＤＡ５０と、Ａ−２ＥＤＡ・ＰＤＡ１００をそれぞれ試料番号２、３として、実施例５−（３）で得られた結果を示す。【０１５２】
実施例５−（１）に従い、Ａ−３の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムとＰＧＡ１００を用いて架橋体を作製した（Ａ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ１００）。アルギン酸含量を２．０ｍｇ／ｃｍ２とした架橋体を試料番号４、アルギン酸含量を４．０ｍｇ／ｃｍ２とした架橋体を試料番号５とし、これらの架橋体に対しては、電子線１５ｋＧｙで照射した。【０１５３】
ＰＧＡを含有しないアルギン酸架橋体は、凍結乾燥時に架橋体の形状が歪み、一定の形状の架橋体を得ることが困難であったが、ＰＧＡを含有するアルギン酸架橋体は、プレートに充填した形状を維持して凍結乾燥が可能であり、製造効率を高めることができた。【０１５４】
なお、神経の分岐部の切断のみ行った群を試料番号６として、神経の分岐部の切断を行っていない無処置群を試料番号７として評価した。
各群について、ギャップから末端の脛骨側と腓骨側の再生軸索本数を計数し、その平均値を算出した（ｎ＝６〜８）。神経の分岐部の欠損部にアルギン酸架橋体を適用する試験の模式図を図５に示す。また、神経の分岐部の切断のみ行った群の平均再生本数が脛骨側で２００本、腓骨側で１３８本であったことを参考に、各群において、脛骨および腓骨とも再生本数が４００本以下の軸索は再生不十分として、各群における再生不十分と判断した再生部位の割合を求めた。結果を表４に示す。【０１５５】
【表４】
2019053822.tif 000005
【０１５６】
その結果、試料番号１〜５では、いずれも脛骨側および腓骨側とも十分な神経軸索の再生を示し、試料番号６の分岐部の切断のみ行った群と比較して、再生軸索の本数が多かった。神経分岐部の切断を行わなかった無処置群（試料番号７）と比較しても、施術後８週の時点では十分な再生効果が得られたことが分かった。【０１５７】
また、ＰＧＡを含有しない架橋体（試料番号１）の再生軸索の本数は、ＰＧＡを含有する架橋体（試料番号２および３）の本数と比較して有意な差がみられなかった。このことから、架橋体中のＰＧＡの有無は神経再生効果には有意な影響を与えないことが示された。一方で、再生軸索本数が４００本以下の再生不十分の軸索の割合を各群で比較すると、ＰＧＡを含有しない架橋体（試料番号１）は３３％であったのに対し、試料番号２〜５のＰＧＡを含有する架橋体は０％〜１９％であった。すなわち、ＰＧＡを含有するアルギン酸架橋体では、ＰＧＡを含有しないアルギン酸架橋体と比較して、再生不十分の例が少ない傾向がみられた。再生不十分の例では、再生神経が、ラットの膝に近い部分で細くなっていた例もあった。これは膝の動きによって架橋体に圧力がかかってちぎれ（断裂し）、架橋体の連続性が失われ、再生が不十分となったと考えられる。ＰＧＡを含有するアルギン酸架橋体は、ＰＧＡを含有しない架橋体と比較して、強度が高く、膝などの可動部でもゲルがちぎれ(断裂し)にくく、安定的に軸索を再生させ得る可能性が示唆された。ＰＧＡを含有しない架橋体（試料番号１）を用いた場合の再生不十分の一例を図６に示す。【０１５８】
また、実施例１−（４）に従い、Ａ−２の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いて作製され、電子線４０ｋＧｙまたは６０ｋＧｙ照射したＰＧＡを含有しないアルギン酸架橋体（Ａ−２ＥＤＡ，アルギン酸含量２ｍｇ／ｃｍ２）について、術後８週時の直線状の神経のギャップに対する再生効果を、実施例５−（２）に準じて評価した。その結果、再生軸索の平均本数は、それぞれ平均２６７本 、平均２７５本 と少なかった。術後８週時に患部に架橋体の残存は見られなかった。このように再生軸索本数が少なかった要因を考察すると、これまでの試験から（i）実施例５−（２）で、電子線を２０ｋＧｙ照射したＰＧＡを含有する架橋体は、直線状の神経ギャップに対して十分な神経再生効果を示したこと、（ii）分岐部のギャップに対してではあるが、架橋体のＰＧＡの有無は神経再生効果に有意な影響を与えないこと（表４）が分かっており、これらを考慮すると、電子線量を４０ｋＧｙまたは６０ｋＧｙと上昇させたことが、神経再生効果に影響を与えた可能性が示唆された。【０１５９】
実施例６  アルギン酸架橋体の皮下埋植試験
６−（１）ラット長期間皮下埋植試験（１）
これまでの試験で、アルギン酸架橋体の体内消失速度（残存率）と神経再生効果の関連が示唆されたため、種々の架橋体について、ラット皮下埋植試験を行い、体内消失速度を検討した。【０１６０】
実施例１−（４）および実施例５−（１）に従い、Ａ−２またはＡ−３の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いて作製したアルギン酸架橋体（一部、ＰＧＡを含有する架橋体も含む）に対して、電子線量を変更して照射して、試料を作製した。試料の種類は表５のとおりである。試料番号４３と４４は、それぞれＰＧＡ（５０ｍｇ／ｃｃ，１．５ｍｇ／ｃｍ２）、ＰＬＧＡ（５０ｍｇ／ｃｃ，１．５ｍｇ／ｃｍ２）のみを試料とした。縦０．７ｃｍ×横１．５ｃｍ（厚さは問わない）のサイズの各試料を、ラット背面部の皮下に埋植し、４週間後に組織学的に評価した。組織学的評価は、次のように作製した標本により評価した。すなわち、常法に従ってパラフィン包埋ブロックを作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色、およびサフラニン−O染色を行った。試料の残存性を５段階のスコアで評価した。すなわち、各試料について、試料残存なしを０、ごくわずかに残存を１、わずかに残存を２、中等度に残存を３、顕著に残存を４として、各群ｎ＝３または６で評価しその平均値をその試料の残存スコアとした。【０１６１】
結果を表５に示す。その結果、Ａ−２の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いて作製したアルギン酸架橋体のＡ−２ＥＤＡは、同じアルギン酸含量の架橋体においては、電子線量が上昇するに従い、残存スコアは低下する傾向がみられた。また、アルギン酸含量が増加すると、残存スコアは上昇する傾向がみられた。Ａ−３の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いて作製したアルギン酸架橋体のＡ−３ＥＤＡについても同じ傾向がみられた。Ａ−２ＥＤＡとＡ−３ＥＤＡとを比較すると、アルギン酸含量と電子線量が同じであれば、Ａ−３ＥＤＡは、Ａ−２ＥＤＡと比較して、残存スコアが上昇する傾向がみられた。【０１６２】
【表５】
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【０１６３】
実施例６−（２）ラット長期間皮下埋植試験（２）
実施例１−（４）および実施例５−（１）に従い、表６のとおり試料を作製し、６−（１）と同様にラット背面部の皮下に埋植し、８週間後と１２週間後に、試料の残存性について組織学的評価を行った。組織学的評価は、次のように作製した標本により評価した。すなわち、埋植した皮下組織を摘出し、１０％中性緩衝ホルマリン溶液で固定後、組織を切り出し、パラフィン包埋ブロックを作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色、およびサフラニン−O染色を行った。試料の残存性を５段階のスコアで評価した。すなわち、各試料について、試料残存なしを０、ごくわずかに残存を１、わずかに残存を２、中等度に残存を３、顕著に残存を４として、各群ｎ＝３で評価し、その平均値をその試料の残存スコアとした。【０１６４】
【表６】
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【０１６５】
その結果、各試料とも８週、１２週と次第に残存スコアが低下した。試料番号５１と５２との残存率の比較から、ＰＧＡ添加は残存率に大きな影響を与えないと考えられた。また、試料番号５２と５３との比較から、アルギン酸含量を増加させることにより、試料の残存率が上昇することが示された。試料番号５２、５３は、表４の試料番号４、５として、試料番号５４は、実施例５−（３）で神経再生効果が確認された架橋体である。このように、神経再生誘導用材料を用いてラット背面部に皮下埋植試験を行うとき、埋植から８週後〜１２週後の患部の組織学的評価により、試料の残存が確認されることも神経再生効果にとって望ましい要素のひとつと考えられた。【０１６６】
実施例７  アルギン酸架橋体の水中分解性試験
アルギン酸架橋体の分解性をin vitro試験で評価した。【０１６７】
縦１ｃｍ×横１ｃｍのサイズ（厚さは問わない）に裁断した試料４個を５０ｍＬの容遠沈管（ガラス製）に入れ、生理食塩液２５ｍＬを加えた後、恒温振とう水槽で振とうし、経時的に試料の変化を観察した。試料の縦横の裁断面は垂直に交わるように裁断した。各試料の厚さは、約２ｍｍ〜約８ｍｍであった。測定時点は開始から４時間時、１日（２４時間）、２日（４８時間）、３日（７２時間）、４日（９６時間）、５日（１２０時間）および６日（１４４時間）とした。試料は、試験開始前に秤量した。各測定時においては、測定後の液を孔径１０μｍのメンブランフィルター（メルク製、オムニポア）で減圧ろ過し、ろ取した残分の画像を取得した後、恒量になるまで減圧乾燥（６０℃）した。残存した試料を秤量し、試験開始前の試料量に対する割合を、残存率（％）として算出した。【０１６８】
恒温振とう水槽（トーマス科学器械製、Ｔ−Ｎ２２Ｓ型、温調；ヤマト科学製、ＣＴＡ４０１Ｓ）の振とう幅は２０ｍｍ、振とう数は、往復１２０回／分とした。溶媒温度は、恒温振とう水槽の設定温度として、５０℃とした。【０１６９】
実施例５−（３）（４）においてラット神経再生効果が確認された試料番号６１〜６４、および電子線を照射していない架橋体について評価した。評価した架橋体を表７に示す。試料番号６６は、実施例４−（２）でラットの試験でエタノール滅菌して用いた架橋体と同じ組成である。試料６８は、実施例５−（１）に準じて、ＰＧＡに替えてＰＬＧＡ（５０ｍｇ／ｃｃ，１．５ｍｇ／ｃｍ２）を用いて同様に作製された架橋体を試料とした。【０１７０】
【表７】
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【０１７１】
結果を図７に示す。その結果、試料番号６１〜６４の架橋体は、経時的に残存率が低下する傾向がみられ、試験開始から3日後（７２時間後）の残存率は約２０％〜約７０％の範囲を示した。一方、ＰＧＡを含有せず、電子線を照射していない架橋体である試料６５と６６は、残存率が上昇した。ＰＧＡまたはＰＬＧＡを含有する、電子線を照射していない架橋体である試料６７と６８は、残存率は経時的な低下がみられたが、試験開始から3日後（７２時間後）の残存率は８０％以上を示した。
以上より、当該試験において、試験開始から３日後（７２時間後）の架橋体の残存率が、約２０％〜約８０％を範囲とする架橋体が、神経再生にとって好ましいことが示唆された。【０１７２】
電子線とγ線とを線量を変更して照射した架橋体について同様に評価した。評価した架橋体は、表８のとおりである。試料番号７１は、実施例５−（４）でラット神経再生効果が確認された架橋体である。【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
結果を図８に示す。その結果、電子線を照射した架橋体である試料番号７１と７２は、同様に経時的に残存率が低下する傾向がみられたが、開始直後の４時間後の残存率を両者で比較すると、電子線量が１５ｋＧｙの試料７１と比較して、電子線量が３０ｋＧｙの試料７２の残存率が低かった。γ線を照射した架橋体である試料番号７３〜７５も、電子線照射した架橋体と同様に、経時的に残存率が低下する傾向がみられた。また、試料番号７３〜７５の中では、γ線線量が５０ｋＧｙの試料７５は、開始直後の４時間後の残存率が約５０％程度まで低下した。この結果から、電子線およびγ線は、照射線量を上昇させることにより、開始直後の残存率が低下することが示唆された。神経のギャップに架橋体を設置して神経の再生を促す場合、架橋体が設置後早い時期に消失すると、神経の再生の初期の足場となることができないと考えられる。実施例５−（４）に記載したとおり、電子線量４０ｋＧｙまたは６０ｋＧｙで照射した架橋体が、直線状の神経ギャップの再生効果が高くなかったのは、設置当初から架橋体が消失してしまい、神経の足場としての役目を果たせなかった可能性が考えられた。【０１７５】
実施例５−（１）に従い、ＰＧＡに替えてＰＬＧＡ（５０ｍｇ／ｃｃ，１．５ｍｇ／ｃｍ２）を用いて同様に作製した架橋体とＰＧＡを含有する架橋体とで同様に分解性を比較した。評価した架橋体は、表９のとおりである。試料番号８４は、実施例５−（３）において、試料番号８５は、実施例５−（４）において、神経再生効果が確認された架橋体である。【０１７６】
【表９】
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【０１７７】
結果を図９に示す。その結果、ＰＬＧＡを含有する試料は、ＰＧＡを含有する試料と同様に、残存率は経時的に低下した。ＰＬＧＡを含有する試料番号８１と８２と、ＰＧＡを含有する試料番号８３、８４、８５とでは、ともに電子線量が高い試料ほど開始から４時間後の残存率が低い傾向がみられ、その後は同様に残存率が低下することが示された。このように、ＰＬＧＡは架橋体の材料としてＰＧＡに替えて同様に使用できることが示唆された。【０１７８】
実施例８    正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する架橋体の効果【０１７９】
実施例１−（４）に従い作製されたエチレンジアミンで架橋されたアルギン酸架橋体と市販のコラーゲンスポンジについて、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：Normal Human Dermal Fibroblasts）の細胞接着性および細胞増殖性を評価し比較した。ＮＨＤＦなど線維芽細胞は神経再生のためのスペースに移動・増殖して神経再生を妨げると考えられる。【０１８０】
試料は、（１）Ａ−２ＥＤＡ、（２）Ａ−３ＥＤＡ、（３）ウシコラーゲンスポンジ（SpongeCol（登録商標）, Advanced BioMatrix社製）、（４）２Ｄコントロール（組織培養皿）の４群とした。各試料の大きさは、（１）および（２）は縦約5mm×横約5mm×厚さ約2mm〜約7mm、（３）は直径4mm円形×厚さ約1mmとした。各試料に細胞１０４個を播種し、培地中で１日、４日間培養後、試料に接着していない細胞を分離するため、各試料を新しいウエルに移動した後、各試料に接着している細胞数をＷＳＴ−８試薬を用いて、４５０ｎｍの吸光度で評価した。培地は、10％FCS／EMEMとした。【０１８１】
ＮＨＤＦの接着と増殖の結果を図１０に示す。その結果、培養１日後に、Ａ−２ＥＤＡおよびＡ−３ＥＤＡの架橋体には、ＮＨＤＦがコラーゲンスポンジと同程度接着したが、その後、細胞数は減少した。一方、コラーゲンスポンジでは、細胞数が増加したことが示された。このように、アルギン酸架橋体は、コラーゲンスポンジと比較して、神経再生を妨げる線維芽細胞の接着、増殖を抑制することが示された。【０１８２】
実施例９    ラット海綿体神経叢除去モデルに対する神経再生効果
９−（１）ラット海綿体神経叢除去モデルの作製
ラットを２％イソフルランの吸入による麻酔下にて、仰臥位に固定した。下腹部を正中切開し、顕微鏡下で骨盤内を展開し、骨盤神経叢および海綿体神経を露出させた。治療群と無治療群は、海綿体神経を確保した後、網目状に分岐している神経叢を横断するように海綿体神経を約２ｍｍ切除した。左右同様に処置した。治療群は、実施例５−（１）に準じて作製したＰＧＡを含有するアルギン酸架橋体（Ａ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ１００）を、神経切除断端を十分被覆するように置き、縫合固定した。無治療群は、神経切除のみ行った。正常コントロール群は、海綿体神経切除を行わなかった。その後、下腹部の筋層および皮膚を縫合した。手術前に、ベンジルペニシリンカリウムを20000units/kg用量で筋肉内注射した。また、鎮痛剤ブプレノルフィン0.01mg/kg用量を１日２回３日間1mL/kgの容量で皮下投与した。各群ｎ＝３で行った。【０１８３】
９−（２）  交尾行動の確認
９−（１）の処置から４週後、および７週後に、各群３匹は、発情を確認した雌と金網製の床網を敷いたケージで同居させた。翌日、メスの膣プラグ（copulatory plug）の有無により、交尾行動の有無を確認した。なお、プラグが確認できなかったラットは７日目まで観察を続けて判定した。
その結果、各群３匹中、交尾行動がみられた（メスの膣プラグ有り）ラットの割合を表１０に示す。その結果、海綿体神経切除を行っていない正常コントロールは１００％で交尾行動がみられたが、海綿体神経を切除した無治療群は、４週後および７週後とも交尾行動は全くみられなかった。一方、海綿体神経の切除後に前記アルギン酸架橋体を置いた治療群は、４週後および７週後とも２／３で交尾行動が見られた。このことから、アルギン酸を含有する架橋体は、海綿体神経における網目状構造の神経叢自体が切除された損傷部を、施術から４週後という早い時期に再生させ、正常な交尾行動を行うことができるまでに機能を回復させたことが示された。【０１８４】
【表１０】
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【０１８５】
実施例１０  アルギン酸架橋体の引き裂き試験
表１１の６種のアルギン酸架橋体について、手術で架橋体を縫合する場合を想定し、引き裂き試験を行い、各試料の強度を比較した。
試料番号１０１と１０４は、ＰＧＡを含有しないアルギン酸架橋体であり、その他の試料は、ＰＧＡを含有するアルギン酸架橋体であり、それぞれ、実施例１−（４）、実施例５−（１）の記載に従い作製した。試料番号１０１〜１０３は、電子線を照射しておらず、試料番号１０４〜１０６は、電子線を１５ｋＧｙで照射した。
試験方法は以下のとおりである。試験方法の模式図を図１１に示す。各試料を、縦２ｃｍ×横２ｃｍのサイズ（厚さは問わない）となるように裁断した。ここで縦と横の裁断面は垂直に交わるものとした。このとき各試料の厚さは約２ｍｍ〜約８ｍｍであった。その裁断面の１つから５ｍｍ離れた位置で該材料を挟むようにダブルクリップ（把持部の幅が約１５ｍｍ）で把持した（把持部Ａ）。該試料の把持部Ａに相対する裁断面（Ｂ）から１０ｍｍまでの部分全体を生理食塩水に15分間浸漬した。該試料の裁断面（Ｂ）から５ｍｍ離れた位置の中央部に、針付き縫合糸（バイクリル（登録商標）、４−０、丸針SH-1）を貫通させ、縫合糸の両端を器具に固定した。前記把持部Ａを、試料の正方形面に水平に、速度１０ｍｍ／分で引っ張った。縫合糸の付近で各試料が裂けるまで引っ張り続け、引っ張る荷重を試験力として測定した。引っ張り荷重の測定は、小型物性試験機（EZ-graph,島津製作所製）を用いて行った。各試料ともｎ＝５で測定し、試験力の最大点（最大試験力）の平均値を求めた。【０１８６】
【表１１】
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【０１８７】
結果を図１２に示す。その結果、電子線を照射していない架橋体（試料番号１０１〜１０３）と、電子線照射した架橋体（試料番号１０４〜１０６）のそれぞれにおいて、ＰＧＡを含有する架橋体は、ＰＧＡを含有しない架橋体と比較して、最大試験力（Ｎ）が高かった。また、電子線照射した架橋体（試料番号１０４〜１０６）は、電子線を照射していない架橋体（試料番号１０１〜１０３）と比較して、全体的に最大試験力はやや低下した。【０１８８】
別途、これらの架橋体について、手術での縫合手技、架橋体の設置部位への固定を想定した縫合試験を行ったところ、ＰＧＡを含有しない架橋体（試料番号１０１および１０４）は、縫合糸を固く結ぶと架橋体がちぎれてしまい、縫合が不可能であったが、ＰＧＡを含有する試料番号１０２、１０３、１０５、１０６は十分に縫合が可能な強度を有していた。引き裂き強度の結果、アルギン酸含量の2ｍｇ/ｃｍ2と4ｍｇ/ｃｍ2は含量による差は大きくなく、引き裂き試験および縫合試験の結果は、もっぱらＰＧＡの有る、無しの差に因ることが大きいと考えられた。これらのことから、縫合が可能な架橋体とするためには、上記試験において、試験力が０．１０（Ｎ）を超える架橋体が望ましいと考えられた。【０１８９】
実施例１１  ラットの脳欠損部へのアルギン酸架橋体充填の効果
４週齢のWistar系ラットの雄を使用し、頭蓋骨に電気ドリル（ストライカー社製）で穴を開け硬膜を切開し、側頭葉に１ｍｍｘ１ｍｍｘ１ｍｍの組織欠損を作製した。この欠損部にＰＧＡを含むアルギン酸架橋体（Ａ−３ＥＤＡ・ＰＧＡ１００、実施例５で作製した試料番号４）１ｍｍｘ１ｍｍｘ１ｍｍを充填し、４週後または８週後に固定を行った。【０１９０】
固定は、次のように行った。心臓の左心室に針を刺し、ＰＢＳで脱血後、４％パラホルムアルデヒドで灌流固定を行い、脳を取り出した。４％パラホルムアルデヒドで一晩浸した後、１５％スクロース置換した。【０１９１】
凍結薄切切片作成は次のように行った。クリオスタット（Leica CM3050 S、Leica Biosystems）を使用し、２０μｍの厚さの切片を作成した。【０１９２】
免疫染色は、表１２のそれぞれ対応する一次抗体、二次抗体を用いて、次の通り行った。
切片をＰＢＳで洗浄し、３０分〜１時間ブロッキングを行った。５％ＦＢＳを含むＰＢＳをサンプルの上にのせ、室温で静置した。その後一次抗体をのせた。各抗体は使用説明書に従い希釈して用いた。４℃一夜静置した。次の日、室温でＰＢＳに５分間浸して洗浄した。これを３回行った。その後二次抗体をのせた。室温で１〜２時間静置した。室温でＰＢＳに５分間浸して洗浄した。これを３回行った。乾燥後、ＭｉｌｌｉＱで洗浄し、さらに乾燥させて、ＤＡＰＩ入り封入剤（VECTASHIELD mounting medium with DAPI、（VECTOR））を使用して封入した。【０１９３】
【表１２】
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【０１９４】
その結果、アルギン酸架橋体を脳組織欠損部分に充填すると経時的に分解吸収が進んだことが分かった。【０１９５】
４週目には、アルギン酸架橋体の脳実質との接触面に、わずかにＧＦＡＰ陽性のアストロサイトの突起を認めた（図１３の矢印）。また、アルギン酸架橋体と脳実質との接触面に、非常にわずかにＮＦ陽性の神経軸索を認めた（図１４の矢印）。アルギン酸架橋体には、β−Ｔｕｂｕｌｉｎ陽性の神経軸索は認められなかった（図１５）。【０１９６】
また、８週目には、脳実質から２００μｍ離れたアルギン酸架橋体まで、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイトの突起を認めた（図１６の矢印）。また、脳実質から２００μｍ離れたアルギン酸架橋体まで、ＮＦ陽性の神経軸索を認めた（図１７の矢印）。さらに、脳実質から２００μｍ離れたアルギン酸架橋体まで、β−Ｔｕｂｕｌｉｎ陽性の神経軸索を認めた（図１８の矢印）。【０１９７】
以上のように、分解吸収過程のアルギン酸架橋体内へ、脳実質から神経軸索とアストロサイトの突起が進入し、脳組織が再生していることが観察された。すなわち、脳損傷部（欠損部）にアルギン酸架橋体を充填することにより、脳損傷部が修復されることが示唆された。【０１９８】
実施例１２  ラットの脳欠損部へのフィブリン糊充填試験（比較例）
実施例１１と同様に、４週齢のラットを使用し、側頭葉に１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍの欠損部を作成し１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍのフィブリン糊（ベリプラスト(Ｒ)（商品名））を充填した。
２週後、４週後に還流固定した。凍結薄切切片作成後、免疫染色した。免疫染色は、一次抗体、二次抗体を含めて、実施例１１と同様に行った。【０１９９】
その結果、４週目には、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイトの突起が損傷部とフィブリン充填部の境界に密に分布しており、神経軸索のフィブリン充填部側への伸長は観察できなかった（図１９）。これは、アストロサイトが、神経軸索のフィブリン充填部側への伸長を阻害しているためと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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