(57)【要約】【課題】測定対象のタンパク質性アミノ酸（タンパク質を構成する２０種のＬ型のアミノ酸）、また、Ｄ型アミノ酸、修飾アミノ酸、及びオルニチン等の非タンパク質性アミノ酸を特異的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供すること。【解決手段】  非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）を用いて、試料中のアミノ酸量を定量する方法に於いて、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体からＮＲＰＳ及びアミノ酸を遊離させ、それらを再度、アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体の形成に利用することによって、最終的に、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるＮＲＰＳ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生させることを特徴とする、前記アミノ酸定量方法、及び、該方法を実施するためのアミノ酸定量用キット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
［１］以下の各工程を含む工程（Ｉ）：
（工程Ｉ−１）二価陽イオンの存在下、試料中のアミノ酸（ＡＡ）、該ＡＡに対応する非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＮＲＰＳから成る複合体（アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
（工程Ｉ−２）反応１及び／又は反応３で形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体にアミノ酸再生試薬が作用して、該複合体からＮＲＰＳ及びＡＡが遊離する反応（反応２）を含む工程； 
（工程Ｉ−３）反応２で遊離されたＡＡ及び/又はＮＲＰＳを反応１において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体反応を形成させる反応（反応３）を含む工程；及び、
（工程Ｉ−４）工程Ｉ−２及び工程Ｉ−３を繰り返す工程、並びに、
工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）、
を含み、前記ＮＲＰＳは少なくともＡドメインを含む、試料中のアミノ酸定量方法。
【請求項２】
ＮＲＰＳがＡドメインから構成されるもの、並びに/又は、Ａドメイン及びＴドメインから構成されるものである、請求項１に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項３】
工程（Ｉ）で用いるアミノ酸再生試薬が、ヌクレオチド及び／又はアルカリ性化合物であることを特徴とする、［１］に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項４】
吸光度法により吸光度変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定する、請求項１〜３の何れか一項に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項５】
工程（Ｉ）で生じる反応産生物として、ピロリン酸又は水素イオンの少なくとも何れか１つを測定する、請求項１〜４の何れか一項に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項６】
工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が試料中のＮＲＰＳ及び／又はアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
【請求項７】
請求項１〜６に記載のアミノ酸定量法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、ヌクレオチド及び該アミノ酸に対応するＮＲＰＳを含む、アミノ酸定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸定量方法及びアミノ酸定量用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は、生体内のタンパク質の構成成分として重要な役割を担っている。アミノ酸の機能性に関し多くの研究がなされ、アミノ酸は、医薬品、加工食品、健康食品など様々な産業で使用されている。例えば、食品中の遊離アミノ酸は、味、加熱後の香り、保存性、摂取後の生体調節機能等に関係しており、食品科学や栄養科学分野における重要な要素として注目されている。また、近年、疾病により血液中のアミノ酸濃度が変化することが見いだされ、血液中のアミノ酸濃度を測定することで、肺がん、胃がん、大腸がんなどのがん診断を可能とするバイオマーカーとしても活用されている。その為、アミノ酸定量技術は、アミノ酸を使用する製品開発、品質管理、診断などの様々な分野で必要不可欠な技術となっている。【０００３】
アミノ酸定量技術として、アミノ酸を液体クロマトグラフィーで分離し、ニンヒドリンやオルトフタルアルデヒドによる呈色反応で検出する方法が知られている（非特許文献１）。しかし、該方法は、１検体の分析時間が２時間程度必要なため分析時間がかかり、多数の検体を測定するには不向きであるという問題点があった。【０００４】
別のアミノ酸定量技術として、アミノ酸に作用する酵素を利用するアミノ酸の測定方法が知られている（特許文献１）。しかし、該方法は目的基質とするアミノ酸に対する選択性が低く、目的以外のアミノ酸にも反応する問題点があった。【０００５】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）は、生体内のタンパク質合成に係る酵素であり、２０種類のアミノ酸に対し特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在する。その為、標的とするアミノ酸に対する選択性が極めて高い酵素であるとされ、ＡＡＲＳが関与する反応（ＡＡＲＳ反応）を利用したアミノ酸定量技術がこれまで開発されてきた。例えば、ＡＡＲＳを用いたアミノ酸の分析方法が特許文献２に記載されている。該方法では、ＡＡＲＳが触媒として機能してＡＴＰ、アミノ酸が1分子ずつ反応することでアミノアシルＡＭＰとピロリン酸が産生され、産生するピロリン酸を指標とすることによりアミノ酸を分析する。しかしながら、該方法ではＡＡＲＳが1分子のアミノ酸とＡＴＰと反応し、1分子のアミノアシルＡＭＰを産生するため、試料中のアミノ酸と同量かそれ以下のピロリン酸しか産生されない（非特許文献２、３、４）。【０００６】
更に、ＡＡＲＳ反応に基づくアミノ酸の定量方法が上記の特許文献３に記載されている。即ち、前述の通りアミノアシルＡＭＰは、通常、ＡＡＲＳに強く結合してアミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体を形成している。そこで、この方法では、アミノアシルＡＭＰ-ＡＡＲＳ複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンなどのアミン類（求核剤）を添加することで、ＡＡＲＳを再び反応可能な状態とし、その結果、少量のＡＡＲＳでアミノ酸を定量することを特徴とする。しかしながら、特許文献３に記載の方法は、該複合体分解試薬が複合体のアミノ酸と反応して化合物が産生される（例えば、特許文献３の段落番号００３７に示されるように、該複合体分解試薬としてヒドロキシルアミンを使用した場合は、「アミノ酸ヒドロキサム酸」が産生される）ため、アミノ酸は再利用することが出来ず、その結果、試料中のアミノ酸と同等量の産生物であるピロリン酸しか得られない（特許文献３の段落番号００２３）。【０００７】
このように、ＡＡＲＳが関与する該方法は、ピロリン酸産生量が少ないため、高感度分析を行う問題点があった。さらにＡＡＲＳは、２０種類のアミノ酸に対する特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在するが、オルニチンなどの２０種類のアミノ酸以外に反応するＡＡＲＳは存在しない課題もある。【０００８】
非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）は、複合ペプチド合成に関与する酵素であり、抗生物質などの合成に利用されている。ＮＲＰＳは、タンパク質性アミノ酸（タンパク質を構成する２０種のＬ型のアミノ酸）に作用すると共に、異性体であるＤ型のアミノ酸、さらにはメチル化、アシル化、グリコシル化などの修飾アミノ酸及びオルニチン等の非タンパク質性アミノ酸（タンパク質の構成単位ではないアミノ酸）にも作用し、更に、選択性（特異性）が極めて高い酵素であるとされている。ＮＲＰＳは、アデニレーション・ドメイン（Ａドメイン）、チオレーション・ドメイン（Ｔドメイン）、コンデンセーション・ドメイン（Ｃドメイン）の３つのドメインから構成される。ＮＲＰＳ反応は、図１に示す通りで、Ａドメインでは、ＮＲＰＳにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アミノ酸（ＡＡ）が１分子ずつ作用することで、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とピロリン酸（ＰＰｉ）が産生される。次いでＴドメインでは、アミノアシルＡＭＰとＴドメインのアミノアシル４’ホスホパンテテイン基（４’ＰＰ）が反応し、アミノアシル-Ｔドメイン複合体を形成する。続いてＣドメインでは、アミノアシル-Ｔドメイン複合体に結合しているアミノ酸同士を結合させるペプチド縮合反応を起こさせることで、ペプチドが産生する。ＮＲＰＳは、このような反応を繰り返すことでアミノ酸が３〜１５量体の直線状或いは環状に連なったペプチドを合成する（非特許文献５、非特許文献６）。【０００９】
ＮＲＰＳに関する公知文献（特許文献４、５、非特許文献５、６）に記載された技術は、Ａ、Ｔ及びＣドメインから成るＮＲＰＳによるペプチド合成に関するものであって、Ａドメイン、又は、Ａドメイン及びＴドメインから成るＮＲＰＳによるアミノ酸の定量に関する技術的課題を解決することを目的とするものではない。また、ＮＲＰＳの公知文献（非特許文献７）では、バイオポリマー合成のために使用するＮＲＰＳの活性測定法の記載があるが、１分子のＮＲＰＳに対し１分子のアミノ酸とＡＴＰが反応し、アミノアシルＡＭＰ-Ａドメイン複合体を形成するため、試料中のＮＲＰＳ濃度までしか反応しないことから、アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体分解試薬としてヒドロキシルアミン（アミン類の求核剤）を添加することで、ＮＲＰＳを再び反応可能な状態とし、ＮＲＰＳの活性確認をしている。しかしながら、本方法は、該複合体分解試薬が複合体のアミノ酸と反応して化合物が産生されるため、アミノ酸は再利用することが出来ず、その結果、試料中のアミノ酸と同等量の産生物であるピロリン酸しか生成されない。これら公知文献には、ＮＲＰＳ反応を活用したアミノ酸の定量、及び、アミノ酸の定量にＡドメイン、又は、Ａドメイン及びＴドメインから成るＮＲＰＳを用いることについては何ら言及されておらず、更に、アミノ酸とＮＲＰＳとの反応におけるアミノ酸及びＮＲＰＳの再利用に関しても一切触れられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−１４６２６４号公報
【特許文献２】特開２０１１−５０３５７号公報
【特許文献３】特許５３０５２０８号明細書
【特許文献４】ＷＯ２００６／００１３８２
【特許文献５】特許５３６７２７２号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】“化学と生物”、（日本）、２０１５年、Ｖｏｌ.５３、ｐ．１９２−１９７
【非特許文献２】“広島市立大学情報科学研究科創造科学専攻  釘宮章光”[online]、 広島市立大ホームページ、［2016/01/13検索］、インターネット（URL:http://rsw.office.hiroshima-cu.ac.jp/Profiles/2/000129/profile.html）
【非特許文献３】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ., ４４３, ２２−２６, ２０１３
【非特許文献４】Ａｐｐl.   Ｂｉｏｃｈｅｍ.   Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏl.,  １７４,  ２５２７−２５３６,  ２０１４
【非特許文献５】“社団法人日本化学会  ＮＥＷＳ  ＬＥＴＴＥＲ”、（日本）、２０１５年、Ｖｏｌ.２９、ｐ．３−６
【非特許文献６】“化学と生物”、（日本）、２００６年、Ｖｏｌ.４４、ｐ．８５−９２
【非特許文献７】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｊａｎｕａｒｙ, ３０, １７−２４, ２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記のアミノ酸定量法に関する従来技術に於ける様々な問題点を解決し、測定対象のタンパク質性アミノ酸（タンパク質を構成する２０種のＬ型のアミノ酸）、また、Ｄ型アミノ酸、修飾アミノ酸及びオルニチン等の非タンパク質性アミノ酸を特異的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＮＲＰＳを用いて試料中のアミノ酸量を定量する方法に於いて、従来のＡ、Ｔ及びＣドメインから成るＮＲＰＳ反応では、ＮＲＰＳに対しアミノ酸とＡＴＰが反応し、ペプチドを産生するため、試料中のアミノ酸を再利用できないと共に、アミノ酸と同量かそれ以下のピロリン酸しか産生されない、と考えられる。また、Ａ及びＴドメインから成るＮＲＰＳ反応では、１分子のＮＲＰＳに対し１分子のアミノ酸とＡＴＰが反応するが、アミノアシル-Ｔドメイン複合体を形成するため、試料中のアミノ酸を再利用できないと共に、試料中のＮＲＰＳと同量かそれ以下のピロリン酸しか産生されない、と考えられる。さらにＡドメインから成るＮＲＰＳ反応では、１分子のＮＲＰＳに対し１分子のアミノ酸とＡＴＰが反応するが、アミノアシルＡＭＰ-Ａドメイン複合体を形成するため、試料中のＮＲＰＳと同量かそれ以下のピロリン酸しか産生されない、と考えられる。そこで発明者らは、種々の検討を行った結果、図２に示すように、一度形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体からＮＲＰＳ及びアミノ酸（ＡＡ）を遊離させ、それらを再度、アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体の形成に利用することによって、最終的に、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物が、試料中に含まれるＮＲＰＳ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生され得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
本発明は、以下の［１］〜［６］の態様に関する。
［１］以下の各工程を含む工程（Ｉ）：
（工程Ｉ−１）二価陽イオンの存在下、試料中のアミノ酸（ＡＡ）、該ＡＡに対応する非リボソーム型ペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）、及び、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を反応させて、アミノアシルアデニル酸（アミノアシルＡＭＰ）とＮＲＰＳから成る複合体（アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体）を形成させる反応（反応１）を含む工程；
（工程Ｉ−２）反応１及び／又は反応３で形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体にアミノ酸再生試薬が作用して、該複合体からＮＲＰＳ及びＡＡが遊離する反応（反応２）を含む工程； 
（工程Ｉ−３）反応２で遊離されたＡＡ及び/又はＮＲＰＳを反応１において再利用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体反応を形成させる反応（反応３）を含む工程；及び、
（工程Ｉ−４）工程Ｉ−２及び工程Ｉ−３を繰り返す工程、並びに、
工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定することを含む工程（ＩＩ）、
を含み、前記ＮＲＰＳは少なくともＡドメインを含む、試料中のアミノ酸定量方法。
［２］ＮＲＰＳがＡドメインから構成されるもの、並びに/又は、Ａドメイン及びＴドメインから構成されるものである、［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［３］工程（Ｉ）で用いるアミノ酸再生試薬が、ヌクレオチド及び／又はアルカリ性化合物であることを特徴とする、［１］に記載のアミノ酸定量方法。
［４］吸光度法により吸光度変化を測定することによって、工程（Ｉ）で生じた反応産生物の量を測定する、［１］〜［３］の何れか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［５］工程（Ｉ）で生じる反応産生物として、ピロリン酸又は水素イオンの少なくとも何れか１つを測定する、［１］〜［４］の何れか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［６］工程（Ｉ）で生じた反応産生物のモル数が試料中のＮＲＰＳ及び／又はアミノ酸のモル数より多いことを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のアミノ酸定量方法。
［７］［１］〜［６］に記載のアミノ酸定量法を実施するためのアミノ酸定量用キットであって、ＡＴＰ、ヌクレオチド及び該アミノ酸に対応するＮＲＰＳを含む、アミノ酸定量用キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係るアミノ酸定量方法に於いては、タンパク質性アミノ酸（タンパク質を構成する２０種のＬ型のアミノ酸）が特異的に測定できると共に、異性体であるＤ型のアミノ酸、さらにはメチル化、アシル化、グリコシル化などの修飾アミノ酸及びオルニチン等の非タンパク質性アミノ酸も特異的に測定できる。また、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体からＮＲＰＳ及びアミノ酸を遊離させ、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるＮＲＰＳ及び／又は、アミノ酸より多くのモル数まで産生させることができる。その結果、従来技術に比べてより簡便な手段でこれら反応産生物を測定する場合であっても、従来技術の多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析のアミノ酸定量法のアミノ酸定量範囲と同等の範囲での定量が可能となる。更に、同じ測定手段を用いる場合には、より低濃度範囲のアミノ酸の定量が可能である。【００１６】
更に、本発明によって、ＮＲＰＳを用いた、測定対象のタンパク質性アミノ酸、また、Ｄ型アミノ酸、修飾アミノ酸及びオルニチン等の非タンパク質性アミノ酸を特異的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＮＲＰＳ反応を示す図である。
【図２】本発明の反応工程を示す図である。
【図３】各種ＮＲＰＳ反応により生じるピロリン酸産生量を示す図である。
【図４】各種ＡＴＰ及び酵素濃度によるピロリン酸産生量を示す図である。
【図５】二価陽イオンの種類によるピロリン酸産生量を示す図である。
【図６】各種二価陽イオン濃度によるピロリン酸産生量を示す図である。
【図７】各ｐＨにおけるピロリン酸産生量を示す図である。
【図８】各温度におけるピロリン酸産生量を示す図である。
【図９】本発明と公知文献（非特許文献７）のＮＲＰＳ反応におけるピロリン酸産生量を示す図である。
【図１０】モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるアミノ酸検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明方法の反応１及び反応３では、アミノ酸、該アミノ酸に対応するＮＲＰＳ、及びＡＴＰを反応させて、アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体を形成させる。本発明方法に使用するＮＲＰＳは、各アミノ酸に対し特異的に作用する当業者に公知の任意のＮＲＰＳを用いることができる。例えば、オルニチン（Ｏｒｎ）であれば、オルニチンに特異的に作用するＮＲＰＳ、リジン（Ｌｙｓ）であれば、リジンに特異的に作用するＮＲＰＳなどが挙げられる。また、本発明に使用するＮＲＰＳは、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属、及びＬｅｃａｎｉｃｉｌｌｕｍ属などの微生物由来など、各種生物由来のＮＲＰＳであれば、いずれのＮＲＰＳでも良く、特に取扱及び生産性の面の観点から、微生物由来のＮＲＰＳが好ましい。ＮＲＰＳは、Ａドメイン、Ｔドメイン及びＣドメインから構成されるが、好ましくは、Ａドメインのみから構成されるもの、並びに/又は、ＡドメインとＴドメインから構成されるものが良い。また、組換え型ＮＲＰＳでも良く、合成したＮＲＰＳでも良い。可溶性酵素が好ましいが、不溶性酵素に界面活性剤を組み合わせても良く、可溶化タンパクとの融合又は膜結合部分の削除等により不溶性酵素を可溶化させた酵素でも良い。ＮＲＰＳの公知のアミノ酸配列を利用でき、Ａドメインから構成される組換え型のＮＲＰＳは、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％以上の同一性を有する配列を有し、また、ＡドメインとＴドメインから構成される組換え型のＮＲＰＳは、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％以上の同一性を有する配列を有し、ＮＲＰＳ活性を有する蛋白質を使用しても良い。
【００１９】
本発明に使用するＮＲＰＳの調製方法としては、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、ＮＲＰＳを含む対象物に加水し、粉砕機、超音波破砕機などで粉砕後、破砕した破砕物を遠心分離、濾過などで固形物を取り除いた抽出物、さらに当該抽出物をカラムクロマトグラフィーなどにより精製、単離したＮＲＰＳなどを用いることができる。即ち、本発明の主な技術的特徴は、ＮＲＰＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体中からＮＲＰＳ及びアミノ酸を遊離させて、それらをアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるＮＲＰＳ及び／又はアミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、ＮＲＰＳの調製方法は何ら限定されるものではない。
【００２０】
本発明の測定対象となるアミノ酸は、Ｌ-リジン、Ｌ-ロイシン及びＬ-イソロイシンなどのＬ型の２０種類のタンパク質性アミノ酸、Ｌ型アミノ酸の異性体であるＤ-リジン、Ｄ-ロイシン及びＤ-イソロイシンなどのＤ型のアミノ酸、オルニチン、β-リジン及びα-メチル-Ｌセリンなど非タンパク質性アミノ酸でも良い。
【００２１】
また、本発明に使用する試料に特に制限はなく、例えば、血液、生鮮食品、加工食品及び飲料などがあげられる。各試料中のアミノ酸濃度は、各アミノ酸により異なる。例えば、血液中のアミノ酸濃度は、イソロイシンは、４１〜８５ｎｍｏｌ／ｍＬ、ロイシンは、８１〜１５４ｎｍｏｌ／ｍＬ、バリンは、１５８〜２８８ｎｍｏｌ／ｍＬ、リジンは、１１９〜２５７ｎｍｏｌ／ｍＬ、オルニチンは、４３〜９６ｎｍｏｌ／ｍＬなどである。生鮮食品中の遊離アミノ酸含量は、例えば、ニンニクでは、リジンは、５ｍｇ／１００ｇ、アルギニンは、１３６ｍｇ／１００ｇなどである。加工食品や飲料中の遊離アミノ酸含量は、例えば、醤油では、リジンは、２１３ｍｇ／１００ｇ、アラニンは、３４８ｍｇ／１００ｇ、ロイシンは、４５０ｍｇ／１００ｇなどである。コーヒー生豆ロブスタ種の完熟では、アスパラギン酸は、７６ｍｇ／１００ｇ、ロイシンは、６ｍｇ／１００ｇ、バリンは、１０ｍｇ／１００ｇなどである。これら各試料中の予想されるアミノ酸濃度によって、適宜、希釈調製し、本発明の試料として使用できる。
【００２２】
本発明に使用する試料中のアミノ酸には、Ｌ体及びＤ体が混在してもよい。そのような場合には、例えば、本発明方法における前処理として、Ｌ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去するのが好ましい。Ｌ体又はＤ体の何れか一方を除去する方法として、カラムクロマトグラフィー又は適当な酵素によるＬ体又はＤ体のアミノ酸の何れか一方を除去する等、当業者に公知の任意の方法が挙げられる。尚、生体試料には、Ｌ体及びＤ体が混在するが、哺乳類体内中の殆どのＤ体アミノ酸は、Ｌ体アミノ酸の０.１〜１.０％程度、果物では、Ｄ体アミノ酸は、Ｌ体アミノ酸の３.０％以下であり、生体試料中のＤ体アミノ酸含量は、Ｌ体アミノ酸の定量に影響を与えるほど含有していない。
【００２３】
当該反応に使用される反応液中のＮＲＰＳ濃度は、試料の種類、推定される試料中のアミノ酸濃度、ＡＴＰ濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められる。ＮＲＰＳ濃度を高濃度することによって反応を短時間に完了させることが出来、逆に反応時間が長時間でも良い場合は、ＮＲＰＳ濃度は低濃度で良い。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などの放線菌由来のＮＲＰＳの濃度は、０．１μＭ以上、より好ましくは０．５μＭ以上、さらに好ましくは１．０μＭ以上、特に好ましくは５．０μＭ以上、最も好ましくは１０.０μＭ以上とすることができる。いずれにしても、本発明方法では、ＮＲＰＳを繰り返し使用されるので、予想される試料中のアミノ酸量に対して、過剰量のＮＲＰＳを添加する必要はない、という利点を有する。従って、ＮＲＰＳ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。
【００２４】
本発明方法の反応１又は反応３ではＮＲＰＳと共にＡＴＰ、二価陽イオンを用いる。本発明に使用するＡＴＰは、ナトリウム塩、リチウム塩などが使用できる。当該反応に使用される反応液中のＡＴＰの濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＮＲＰＳ濃度、ヌクレオチド濃度、及び、反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、予想される試料中のアミノ酸濃度に対して過剰となるように添加するのが好ましい。例えば試料が血液の場合、ＡＴＰ濃度は、０.０１ｍＭ以上、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは１.０ｍＭ以上、特に好ましくは１０.０ｍＭ以上、最も好ましくは４０.０ｍＭ以上とすることができる。ＡＴＰ濃度の上限は、経済性なども考慮して当業者が適宜設定することが出来る。また、本発明に使用する二価陽イオンは、マグネシウム、マンガン、コバルト、カルシウムなどが使用できる。二価陽イオンは、ＮＲＰＳにより要求性が異なるため、使用するＮＲＰＳに適した二価陽イオンを適宜使用すれば良い。当該反応に使用される反応液中の二価陽イオンの濃度は、適宜決められるが、ＡＴＰ濃度に対して同等以上に添加するのが好ましい。例えば、ＮＲＰＳにおけるＡＴＰ：二価陽イオンの比率は、少なくとも１：１０、より好ましくは少なくとも１：７、さらに好ましくは少なくとも１：５、特に好ましくは少なくとも１：３、最も好ましくは少なくとも１：１とすることができる。
【００２５】
続いて、本発明方法の反応２では、反応１及び／又は反応３で形成させたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体に対してアミノ酸再生試薬が作用し、該複合体からＮＲＰＳ及びアミノ酸が遊離する。当該反応のアミノ酸再生試薬としては、ＡＴＰ、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）などから任意に選択される一種又はそれらの組み合わせからなるヌクレオチドや、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム及び緩衝剤などの水酸化物イオンを発生するアルカリ性化合物を使用できる。反応２に於いては、アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体からのＮＲＰＳ及びアミノ酸の遊離と共に、使用するアミノ酸再生試薬に応じて、ＡＭＰ、Ａｐ４Ａ等が生成される。当該反応に使用される反応液中のアミノ酸再生試薬の濃度は、試料の種類、予想される試料中のアミノ酸濃度、ＮＲＰＳ濃度、ＡＴＰ濃度及び反応時間・温度等の各種反応条件に応じて、当業者が適宜決められるが、ＡＭＰ、Ａｐ４Ａ等の生成に於いて消費されるので、ヌクレオチドは試料中のアミノ酸濃度に対して過剰となるように添加するのが好ましい。例えば、試料が血液の場合、ヌクレオチド濃度は、０.０１ｍＭ以上、より好ましくは０.１ｍＭ以上、さらに好ましくは１.０ｍＭ以上、特に好ましくは１０.０ｍＭ以上、最も好ましくは４０.０ｍＭ以上とすることができる。また、アルカリ性化合物は、反応の場（反応系）をｐＨ７以上にできれば良い。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属などの放線菌由来のＮＲＰＳでは、好ましくはｐＨ７.０以上、より好ましくはｐＨ７.５以上、さらに好ましくは、ｐＨ８.０以上とする。尚、反応ｐＨは、当業者に公知の任意の当業者に公知の任意の緩衝剤である、ＨＥＰＥＳバッファー、ＣＨＥＳバッファー、ＴＲＩＳバッファー、ＭＯＰＳバッファーなどを使用して調整することが出来る。従って、本発明方法では、ＮＲＰＳを再び反応可能な状態とさせるために、特許文献３に記載されているようなアミン類等のアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体分解試薬を添加する必要がなく、更に、遊離したアミノ酸が該試薬と反応することがないので、遊離したアミノ酸をアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体の形成に再び利用することができる。
【００２６】
本発明方法の反応３では、反応２で遊離したアミノ酸及び/又はＮＲＰＳを反応１において再び使用することによってアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体反応を形成させる。更に、本発明方法の工程（Ｉ）において、当業者に公知の任意の方法によって、反応１又は３で生じたピロリン酸及び反応系中のＡＭＰにホスホエノールピルビン酸とピルビン酸ジキナーゼとを反応させることによって産生されるＡＴＰを、アミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体形成及び該複合体からのＮＲＰＳ及びアミノ酸の遊離に再利用すること、及び/又は、反応２でヌクレオチドから生成されるＡｐ４Ａに対しＡｐ４Ａピロホスホヒドラーゼを作用させることによって産生されるＡＤＰを、反応２におけるヌクレオチドとして再利用することもできる。
【００２７】
例えば、反応２で作用するヌクレオチドとしてＡＴＰを選択し、更に、上記のような反応を利用してＡＴＰの再産生をしない場合には、本明細書の実施例に示されるように、工程（Ｉ）の反応系全体で、上記に示したＡＴＰ及びヌクレオチドの夫々の濃度を合計した、より高濃度のＡＴＰを添加することが好ましい。
【００２８】
以上の結果、前述のアミノ酸再生試薬（ＡＴＰなどのヌクレオチド及び/又はアルカリ性化合物）及び該アミノ酸に対応するＮＲＰＳの組成等の反応条件において、工程（Ｉ）に於ける反応の結果、ピロリン酸及び/又は水素イオン等の夫々の反応産生物の各々について、試料中に含まれているＮＲＰＳ及び／又は、測定対象のアミノ酸のモル数より多いモル数の分子が産生され得る。その結果、本発明方法では、従来技術より極めて低いアミノ酸濃度から定量可能となる。従って、この点は従来技術と比較して本発明の顕著な効果といえる。
【００２９】
しかしながら、当該反応条件下で産生されるピロリン酸等の反応産生物が、試料中のアミノ酸のモル数以下の量であっても、該反応産生物に基づきアミノ酸の定量が可能であれば、ピロリン酸等の反応産生物が当該アミノ酸のモル数以上に産生される必要はない。従って、本発明の工程（Ｉ）に於いて産生されるピロリン酸や水素イオンの量は、工程（ＩＩ）に於ける該反応産生物の適当な測定方法によってアミノ酸の定量が可能となる限り、特に限定されない。また、本発明方法の（工程Ｉ−４）に於ける、反応２（工程Ｉ−２）及び反応３（工程Ｉ−３）の繰り返しの回数についても、工程（ＩＩ）に於ける該反応産生物の適当な測定方法によってアミノ酸の定量が可能となる限り、特に制限はない。
【００３０】
本発明方法の工程（Ｉ）における反応温度は、各反応が生じるような任意の温度で良い。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属，Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属等の放線菌由来のＮＲＰＳの場合、好ましくは４〜５０℃、より好ましくは１０〜４０℃、最も好ましくは２０〜３５℃とすることが適している。また、当該反応時間も試料中のアミノ酸とＮＲＰＳ反応が生じるような任意の時間で良いが、好ましくは５〜１２０分程度、より好ましくは１０〜９０分程度、さらに好ましくは、１５〜６０分程度であることが望ましい。
【００３１】
本発明方法の工程（Ｉ）に含まれる各工程で使用する試薬・酵素等の各反応成分は、ＮＲＰＳ反応が生じる添加方法である限り、当業者に公知の任意の手段・手順等で反応系に添加することができる。例えば、各成分を反応開始前に一度に反応系に予め添加するか、又は、ＮＲＰＳ又はアミノ酸を最後に添加し反応させても良い。
【００３２】
本発明方法の工程（ＩＩ）では、工程（Ｉ）で生じたピロリン酸及び水素イオン等の各反応産生物の夫々の量を測定し、該反応産生物の測定量に基づきアミノ酸の量を決定する。工程（ＩＩ）は、測定方法等に応じて、工程（Ｉ）に於ける試料中のアミノ酸とＮＲＰＳとの反応を、例えば、実施例に記載されているように、トリクロロ酢酸を反応系に添加する等の当業者に公知の任意の方法・手段で停止させた後、あるいは、工程（Ｉ）に於ける反応が進行中の任意の段階で適宜、実施することが出来る。
【００３３】
本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸量の測定には、当業者に公知の任意の方法・手段、例えば、モリブデン酸とピロリン酸を反応させ産生した青色の錯体の吸光度を測定するモリブデンブルー法、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ又はキサンチンデヒドロゲナーゼを組みわせる方法、ルミノールと無機ピロホスファターゼ、ピルビン酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼを組み合わせ産生物の発光を測定する方法などのピロリン酸を測定できる酵素法などが使用できる。また、酵素反応などで酸化還元反応を起こし、その酸化還元反応に由来する電流値を検出する多電極電位計測計により電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。さらに、当該反応で産生された水素イオンの測定には、水素イオンを検出するガラス電極やイオン感応性電界効果トランジスタにより電位変化を測定する測定方法などを使用することができる。本発明の工程（Ｉ）で生じたピロリン酸、水素イオンなどは、反応溶液から分離し、測定することができる。反応溶液からのピロリン酸、水素イオンなどの分離方法としては、測定に影響の無い方法であれば特に限定されないが、例えば、酸処理による除タンパク質、ペーパークロマトグラフィー分離、マイクロ流体デバイスでの分離などが挙げられる。本発明の主な技術的特徴は、ＮＲＰＳを用いるアミノ酸定量方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体中からＮＲＰＳ及びアミノ酸を遊離させて、これら化合物を、再度、該複合体の形成に繰り返し利用することにより、測定対象であるピロリン酸等の反応産生物を、試料中に含まれるＮＲＰＳ及び／又は、アミノ酸より多くのモル数まで産生させることであり、反応産生物の量の測定方法は何ら限定されるものではない。
【００３４】
本発明は、上記の本発明方法を実施するための、試料中のアミノ酸定量に必要な前述の各成分を含む、アミノ酸定量用キットを提供する。当該キットは、安定化剤又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、前記酵素等試薬成分の安定性を高めても良い。測定に影響の無い成分であれば特に限定されないが、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、糖類、糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、酸化防止剤、界面活性剤、又は酵素と作用性のないアミノ酸類等を例示できる。また、当該キットの一例として前述のピロリン酸や水素イオンを測定するためのキットを挙げることが出来る。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（酵素の調製）
放線菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ属又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）由来のＮＲＰＳ配列（Ｐｌｓ-ｓｅ-Ａドメイン、Ｐｌｓ-ｃｇ-Ａドメイン又はＰｌｓ-ｃｇ-ＡＴドメイン）をもつプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、発現株として用いた。各発現株についてアンピシリンを終濃度２００μｇ/ｍＬを含むＬＢ培地により３７℃で培養後、ＯＤ６６０＝０．６-０．８に達したところで、培養液を氷水で冷却し、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。培養液を１８℃で終夜培養後、集菌を行い、得られた菌体を超音波破砕し、無細胞抽出液を調製した。さらに遠心分離を行い、得られた上清の一部を用いて電気泳動法により目的酵素の発現を確認した。次いで残りの上清をＨｉｓタグカラム（商品名：ＴＡＬＯＮ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ、ＧＥヘルスケア製）により夾雑タンパクを除去することにより、Ｌ-オルニチンに特異的に作用するＡドメインから成るＮＲＰＳのＰｌｓ-ｓｅ-Ａ、Ｌ-リジン及びＤ-リジンに特異的に作用するＡドメインから成るＮＲＰＳのＰｌｓ-ｃｇ-Ａ、Ｌ-リジン及びＤ-リジンに特異的に作用するＡドメイン及びＴドメイン（以下、ＡＴドメイン）から成るＮＲＰＳのＰｌｓ-ｃｇ-ＡＴを得た。
【実施例２】
【００３７】
（各種ＮＲＰＳ反応により生じるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１を調製した。
【実施例３】
【００３８】
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン又はＤ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）２、３を調製した。
【実施例４】
【００３９】
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン又はＤ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−ＡＴ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）４、５を調製した。
【実施例５】
【００４０】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
調製した実施品１〜５の反応溶液１５０μＬに１Ｍメルカプトエタノール１５μＬ、発色液（２．５％モリブデン酸アンモニウム／５Ｎ硫酸）６０μＬを混合し、室温で２０分間静置した後、５８０ｎｍの吸光度を測定した。なお、基質アミノ酸の代わりに水を添加したサンプルの吸光値を、ブランクとして各サンプルの吸光値から差し引いた値から、反応溶液中のピロリン酸量を求めた。その結果、図３に示す通り、Ａドメイン及びＡＴドメインから成るＮＲＰＳ共に、ＮＲＰＳの分子数以上、さらに各基質アミノ酸が酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。従って、本発明の方法によれば、試料中に含まれるＮＲＰＳ及びアミノ酸分子数より多くのモル数のピロリン酸が産生されることが示された。
【実施例６】
【００４１】
（各種ＡＴＰ濃度及び酵素濃度によるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＡＴＰ、２５ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−ＡＴ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）６、７を調製した。
【実施例７】
【００４２】
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、１．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）８を調製した。
【実施例８】
【００４３】
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭ  ＡＴＰ、２５ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭnＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）９、１０、１１を調製した。
【実施例９】
【００４４】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例６、７、８で調製した実施品６〜１１のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図４に示す通り、各種ＮＲＰＳにおいてＡＴＰ又は酵素濃度の増加と共にピロリン酸の増加が認められた。また、添加したアミノ酸が全て酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量である理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。
【実施例１０】
【００４５】
（二価陽イオンの種類の違いによるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１２、１３、１４を調製した。
【実施例１１】
【００４６】
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１５、１６、１７を調製した。
【実施例１２】
【００４７】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例１０、１１で調製した実施品１２〜１７のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図５に示す通り、各種二価陽イオンを用いた条件で、基質アミノ酸が酵素反応に使用された場合に産生されるピロリン酸量である理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、少なくとも上記実施例で使用したＮＲＰＳに関しては、Ｍｎが最適な二価陽イオンであることが示された。
【実施例１３】
【００４８】
（二価陽イオン濃度の違いによるピロリン酸の産生量：本発明方法の工程（Ｉ））
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃、６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品（本発明品）１８〜２１を調製した。
【実施例１４】
【００４９】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
実施例１３で調製した実施品１８〜２１のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図６に示す通り、二価陽イオンの濃度によって、酵素反応により産生されるピロリン酸量は異なることが示された。
【実施例１５】
【００５０】
（反応ｐHによるピロリン酸産生量）
２００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）と、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃で６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図７に示す通り、ｐＨがアルカリ側になるほどピロリン酸産生量が増加し、ｐＨ８．０において、良好なピロリン酸の産生が認められた。
【実施例１６】
【００５１】
（反応ｐHによるピロリン酸産生量）
２００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．０）、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．０）、又は２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）と、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-リジン、２．５μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、３０℃で６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図７に示す通り、ｐＨがアルカリ側になるほどピロリン酸産生量が増加し、ｐＨ８．０において、良好なピロリン酸の産生が認められた。
【実施例１７】
【００５２】
（反応温度によるピロリン酸産生量）
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液を１５０μＬ調製し、１０、又は２０、又は２５、又は３０、又は３５、又は４０℃で６０分間処理した。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図８に示す通り、１０〜４０℃の広い範囲において、良好なピロリン酸の産生が認められた。【００５３】
（本発明と公知文献記載のＮＲＰＳ反応におけるピロリン酸の産生量の比較：本発明方法の工程（Ｉ））
[比較例１]
非特許文献７記載の反応条件に従い、０．９μＭ  Ｐｌｓ-ｃｇ-Ａ(放線菌由来)、５０μＭ Ｌ-リジン、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３２ｍＭ  ヒドロキシルアミンを含む反応液３００μＬを調製し、３０℃で６０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品１を調製した。【００５４】
[比較例２]
非特許文献７記載の反応条件に従い、０．８μＭ  Ｐｌｓ-ｃｇ-ＡＴ(放線菌由来)、５０μＭ Ｌ-リジン、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３２ｍＭ  ヒドロキシルアミンを含む反応液３００μＬを調製し、３０℃で６０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、比較品２を調製した。
【実施例１８】
【００５５】
５．０μＭ  Ｐｌｓ-ｃｇ-Ａ(放線菌由来)、５０μＭ Ｌ-リジン、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）を含む反応液３００μＬを調製し、３０℃で６０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品２２を調製した。
【実施例１９】
【００５６】
５．０μＭ  Ｐｌｓ-ｃｇ-ＡＴ(放線菌由来)、５０μＭ Ｌ-リジン、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ ＭｎＣｌ２、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）を含む反応液３００μＬを調製し、３０℃で６０分間酵素反応を行った。酵素反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように６０μＬ添加し反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、実施品２３を調製した。
【実施例２０】
【００５７】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸の測定：本発明方法の工程（ＩＩ））
比較例１、２及び実施例１６、１７で得られた比較品１、２及び実施品２２、２３のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図９に示すように本発明の方法では、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量である理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。一方、比較品の産生したピロリン酸は、理論値以下であった。
【実施例２１】
【００５８】
（モリブデンブルー法によるピロリン酸測定におけるアミノ酸検量線）
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０、又は３０、又は５０、又は７０、又は１００μＭ  Ｌ-オルニチン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｓｅ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液１５０μＬを調製し、４０℃、６０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１０に示すように、添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０〜１００μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９９)が認められ、Ｌ-オルニチンの定量が可能であることが示された。
【実施例２２】
【００５９】
２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭ  ＡＴＰ、４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０、又は３０、又は５０、又は７０、又は１００μＭ  Ｌ-リジン、５．０μＭ  Ｐｌｓ−ｃｇ−Ａ（放線菌由来）を含む反応溶液１５０μＬを調製し、３０℃、６０分間反応させた。反応後、トリクロロ酢酸を終濃度４％となるように３０μＬ添加し、反応を停止した。反応停止後、遠心分離で沈殿を除去し、上清中のピロリン酸を実施例５に記載のモリブデンブルー法により測定した。その結果、図１０示すように添加したアミノ酸が全て反応に使用された場合に産生されると推測されるピロリン酸量の理論値より多くのピロリン酸が産生されていた。また、０〜１００μＭ のアミノ酸濃度範囲においてアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係(Ｒ＝０．９７)が認められ、Ｌ-リジンの定量が可能であることが示された。【００６０】
以上の結果から、本発明方法におけるＮＲＰＳ反応では、ＮＲＰＳ及びアミノ酸を繰り返し反応に使用することで、産生されるピロリン酸を増幅できることが示された。実施例２〜５に示されるように、Ｌ-オルニチン、Ｌ-リジン及びＤ-リジンの様々なアミノ酸のいずれにおいても当該反応で産生されるピロリン酸をＮＲＰＳ及びアミノ酸のモル数より多く産生させることができた。実施例６〜９に示されるように、ＡＴＰや酵素濃度、実施例１０〜１７に示されるように、二価陽イオンの種類や濃度、反応温度及び反応ｐＨによってもピロリン酸の産生量は変化することが分かった。また、比較例１、２及び実施例１８、１９、２０に示されるように、従来のＮＲＰＳ反応では、産生されるピロリン酸量が、アミノ酸分子数以下であったが、本発明の方法では、アミノ酸分子数以上のピロリン酸が産生されることが分かった。さらに、実施例２１、２２に示されるように、アミノ酸濃度に依存して直線的にピロリン酸が増加する、即ちアミノ酸濃度とピロリン酸量に相関関係があることが分かり、本発明のＮＲＰＳ反応により産生したピロリン酸について、簡便な方法であるモリブデンブルー法による各種アミノ酸の定量が可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
従来のＡＡＲＳを用いたアミノ酸定量法では、タンパク質性アミノ酸（タンパク質を構成する２０種のＬ型のアミノ酸）に対する特異的な２０種類のＡＡＲＳが存在するが、オルニチンなどの２０種類のアミノ酸以外に反応するＡＡＲＳは存在しないため、測定対象のアミノ酸の制限があった。これに対して、ＮＲＰＳは、上記２０種類のアミノ酸に特異的に作用すると共に、異性体であるＤ型のアミノ酸、さらにはメチル化、アシル化、グリコシル化などの修飾アミノ酸、及びオルニチン等の非タンパク質性アミノ酸にも特異的に作用することから、様々なアミノ酸の定量を可能とする。また、本発明方法に於いて、形成されたアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体からＮＲＰＳ及びアミノ酸を遊離し、再度それらをアミノアシルＡＭＰ-ＮＲＰＳ複合体の形成に繰り返し利用することによって、試料中に少ないアミノ酸しか含まれていない場合であっても、多量のピロリン酸や水素イオンを産生させることができるため、多段階酵素反応を用いた蛍光法などによる高感度分析は不必要である。従って、本発明によって、ＮＲＰＳを用いてタンパク質性アミノ酸、また、Ｄ型アミノ酸、修飾アミノ酸及びオルニチン等の非タンパク質性アミノ酸を特異的且つ簡便、高感度に定量する方法及びアミノ酸定量用キットを提供することが可能となった。【００６２】
実施例１で調製した各ＮＲＰＳは具体的には以下の通り取得した。
目的アミノ酸の活性化を触媒すると予想されるＮＲＰＳについて、推定されるアミノ酸配列をＰｆａｍ  ｓｅａｒｃｈ（http://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1）にてドメイン検索を行った。その結果から、ペプチド結合形成に必要な各ＮＲＰＳドメイン（Ａドメイン、Ｔドメインなど）に高く保存されている領域を推定し、下記、※１と※２において配列を決定した。
※１.  Ａドメインに高く保存されている配列
ＡＭＰ-ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（下線部)
ＡＭＰ-ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｃ-ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ（二重線部）
※２.  Ｔドメインに高く保存されている配列
ＬＧＧｘｘＳＬｘＡモチーフ（４´-ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）（四角枠内）を中心にもつＰＰ-ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ【００６３】
各ＮＲＰＳのアミノ酸配列は以下の通りである。
（１）Ｐｌｓ-ｃｇ-Ａ-ｄｏｍａｉｎ  
菌株名：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＮＢＲＣ１２１６９
アミノ酸配列（大腸菌発現用プラスミドにクローニングした領域）：
［配列番号１］
2019065211.tif 000003
アミノ酸配列（実際に活性測定に用いた組換え酵素）：
［配列番号２］
2019065211.tif 000004
【００６４】
（２）Ｐｌｓ-ｃｇ-ＡＴ-ｄｏｍａｉｎ
菌株名：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＮＢＲＣ１２１６９
アミノ酸配列（大腸菌発現用プラスミドにクローニングした領域）：
［配列番号３］
2019065211.tif 000005
アミノ酸配列（実際に活性測定に用いた組換え酵素）：
［配列番号４］
2019065211.tif 000006
【００６５】
（３）Ｐｌｓ-ｓｅ-Ａ-ｄｏｍａｉｎ   
菌株名：Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＢＲＣ１３４２６
アミノ酸配列（大腸菌発現用プラスミドにクローニングした領域）：
［配列番号５］
2019065211.tif 000007
アミノ酸配列（実際に活性測定に用いた組換え酵素）：
［配列番号６］
2019065211.tif 000008
【図１】
2019065211.tif 000009
【図２】
2019065211.tif 000010
【図３】
2019065211.tif 000011
【図４】
2019065211.tif 000012
【図５】
2019065211.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019065211.tif 000018
【配列表】
2019065211000001.app
【国際調査報告】
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