(57)【要約】  従来のシグナル増幅法（パルサー法）測定法と比較して、より特異性及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの検出及び定量方法を提供する。  本発明は、検出対象である標的オリゴヌクレオチドを相補的な核酸プローブ(3'-標的配列の相補的配列-5')とハイブリダイズさせ、あるいは、検出対象である標的オリゴヌクレオチドに任意の塩基（ポリＡなど）を付加してこれと相補的な核酸プローブ(3'-標的配列の相補的配列+任意の塩基の相補配列-5')とハイブリダイズさせ、一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いて不完全なハイブリダイゼーション生成物を分解及び除去し、残存する完全なハイブリダイゼーション生成物に含まれる核酸プローブをパルサー法により測定することにより、上記の課題を解決した。
2020054700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法:
(i)前記試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーと、
を含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む
(ii)前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程、
（iii）前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料中の前記捕捉プローブを一本鎖にする工程、
(iv) 前記捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った前記試料に、第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕捉プローブと、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成させる工程、
（v）前記複合体を検出する工程。
【請求項２】
第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブのうち少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列を含む、請求項１に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項３】
前記(iv)の複合体形成工程が、
標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列、並びに、第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列、の両方を含むアシストプローブと接触させる工程を含む、請求項1に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法: 
（i）前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程
(ii)標的オリゴヌクレオチドに、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む
(iii)前記第1のポリヌクレオチドの付加及び前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程、
（iv）前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料中の前記捕捉プローブを一本鎖にする工程、
（v） 前記捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った前記試料に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕捉プローブと、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する工程
（vi）前記複合体を検出する工程。
【請求項５】
（i）前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加する工程が、捕捉プローブとの接触工程を行う前の前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加する工程である、請求項４に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項６】
（i）前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程が、
捕捉プローブとの接触工程を行った後の前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加する工程である、請求項４に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項７】
第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブのうち少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む、請求項４〜６のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項８】
前記（v）の複合体形成工程が、アシストプローブを接触させる工程を含み、
前記アシストプローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び/又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列、並びに第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち一方の全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む、請求項４〜６のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項９】
前記第１のポリヌクレオチドが、ポリＡ配列、ポリＴ配列、ポリＵ配列、ポリ（Ｔ／Ｕ）配列、ポリＧ配列、又はポリＣ配列である請求項４〜８のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１０】
前記第１のポリヌクレオチドが、ポリＡ配列である請求項９に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。  
【請求項１１】
第１のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及び核酸領域Ｚを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ'、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ'、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ'を含むオリゴヌクレオチドである請求項１〜１０のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１２】
前記核酸領域ＺがポリＡ配列を含み、かつ、前記核酸領域Ｚ'がポリＴ配列を含む、請求項１１に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１３】
前記一本鎖特異的ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１〜１２のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
【請求項１４】
以下を含む試料中の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
（１）一本鎖特異的ヌクレアーゼ
（２）標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブ
（３）第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ
【請求項１５】
更に、標的オリゴヌクレオチドに付加する第１のポリヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
【請求項１６】
更に、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドとしてのポリＡを付加するポリアデニル化酵素を含む、請求項１４に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
【請求項１７】
前記（２）の捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含み、
（３）の前記自己凝集可能な一対のプローブは、第１または第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、第１のポリヌクレオチドの全配列又は部分配列を含む、
請求項１５又は１６に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
【請求項１８】
（２）の前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、
（３）の前記自己凝集可能な一対のプローブは、第１又は第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列を含む、請求項１４に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
【請求項１９】
（１）一本鎖特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである請求項１４〜１８のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
【請求項２０】
更に、アシストプローブを含み、前記アシストプローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列、並びに第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む、請求項１４〜１６のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
【請求項２１】
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドの量に対応した捕捉プローブを回収する方法:
(i)前記試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む
(ii)前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程;
(iii)前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料に含まれる、一本鎖特異的ヌクレアーゼに切断されていない捕捉プローブを回収する工程。
【請求項２２】
試料に、前記一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる前記（ii）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、
前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む請求項２１に記載の捕捉プローブを回収する方法。
【請求項２３】
試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる前記（i）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、
前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む請求項２１に記載の捕捉プローブを回収する方法。
【請求項２４】
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを定量する方法:
(i)前記試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、
(ii)前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程;
(iii)前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料に含まれる、一本鎖特異的ヌクレアーゼに切断されていない捕捉プローブを回収する工程
(iv)回収された捕捉プローブを検出し、試料中の標的オリゴヌクレオチドを定量する工程。
【請求項２５】
試料に、前記一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる前記（ii）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む請求項２４に記載の標的オリゴヌクレオチドを定量する方法。
【請求項２６】
試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる前記（i）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む請求項２４に記載の標的オリゴヌクレオチドを定量する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高感度かつ特異性及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの検出、または定量方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬は、配列特異的な遺伝子サイレンシングを引き起こすことから、遺伝子疾患や難治性疾患を始めとする、今まで治療が困難であった様々な疾患に対する新規治療薬として、近年大きな注目を集めている(非特許文献１、Ando 2012)。【０００３】
医薬品開発の探索段階における薬物動態・薬力学(PK/PD)スクリーニング試験、非臨床段階における安全性試験、薬理試験及び薬物動態試験、臨床段階において、薬物が投与された動物あるいはヒト生体試料中の薬物濃度が測定される。また、新医薬品として承認を受ける際、厚生労働省令で定められたガイドラインに従い、生体試料中の薬物濃度に関するデータを取得し、安全性及び薬物動態に関する資料を提出する必要がある。【０００４】
Andoらは、核酸医薬をポジトロン放出核種で標識することで、生体内での挙動を非侵襲的かつリアルタイムに3次元解析することを報告している(非特許文献１、Ando 2012)。また、Healeyらは、stem-loop RT-PCR法(非特許文献３、Chen 2005)を用いて、0.01pg/μLの定量下限を達成したことを報告している(非特許文献２、Healey 2014)。【０００５】
しかし、近年、人工核酸及びデリバリー材料の開発により、低用量での治療が可能になってきた。その結果、生体試料中の薬物濃度が以前より低値になり、これらの低濃度の薬物を検出するために、より高感度な測定系が必要とされるようになってきた。更に、厚生労働省令で定められたガイドラインに従うためには、測定系は、操作者に依存しない高い定量性を有する必要があることから、半定量法であるPCR法での測定には、不向きであった。  【０００６】
また、従来の測定系は、核酸医薬に使用されるオリゴヌクレオチドが代謝され、5'又は3'末端から分解された場合、測定対象である無傷のオリゴヌクレオチドと区別できず、正確な薬物濃度を測定できないという問題があった。【０００７】
測定対象である無傷のオリゴヌクレオチドとその代謝物を区別し、生物活性を有する核酸医薬を特異的に測定するために、Yuらはハイブリダイゼーション・ライゲーションELISA法を開発した(非特許文献４、Yu 2002)。当該方法においては、測定対象であるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を含む「鋳型」オリゴヌクレオチドと「ライゲーション・プローブ」を使用する。当該「鋳型」オリゴヌクレオチドは、前記相補的な配列の5'末端のヌクレオチドに隣接する9merの追加ヌクレオチドを有し、3'末端にビオチンを有する。前記「ライゲーション・プローブ」は、当該9merの追加ヌクレオチドに相補的な配列を有する9merのオリゴヌクレオチドであり、5'末端にリン酸を有し、3'末端にジゴキシゲニンを有する。従って、測定対象であるオリゴヌクレオチドが無傷の場合には、鋳型オリゴヌクレオチドの上で、無傷のオリゴヌクレオチドとライゲーション・プローブとが、間隙なくハイブリダイズすることになる。このハイブリダイゼーションの生成物をリガーゼで処理することにより、無傷のオリゴヌクレオチドとライゲーション・プローブが連結される。一方で、測定対象であるオリゴヌクレオチドが代謝されて3'末端側のヌクレオチドが欠損している場合には、この連結は起こらない。前記のライゲーション生成物をビオチンを利用して固相に結合し、未反応のライゲーション・プローブを洗浄して除去し、固定された当該ライゲーション生成物の3'末端のジゴキシゲニンをELISA法により検出する(非特許文献４、Yu 2002の図1参照)。
Weiらは、ハイブリダイゼーション・ライゲーションELISA法の特異性を向上させるために、リガーゼ処理の後にS1ヌクレアーゼ処理を行うことを開示している(非特許文献５、Wei 2006)。
しかし、ハイブリダイゼーション・ライゲーションELISA法は、測定対象であるオリゴヌクレオチドの配列を考慮して、最適なライゲーション・プローブの配列を設計する必要があるので、煩雑かつマルチプレックス化には不向きであった。【０００８】
医薬品開発における、上記の高い要求を満たし、かつ、汎用性の高いオリゴヌクレオチドの検出又は定量方法を開発するために、本発明者らは、全く新しい発想により、高感度かつ特異性及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの検出又は定量方法を開発し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開WO2013/172305号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ando H, Yonenaga N, Asai T, Hatanaka K, Koide H, Tsuzuku T, Harada N, Tsukada H, Oku N. [In vivo imaging of liposomal small interfering RNA (siRNA) trafficking by positron emission tomography]. Yakugaku Zasshi. 2012;132(12):1373-81. Review.
【非特許文献２】Healey GD, Lockridge JA, Zinnen S, Hopkin JM, Richards I, Walker W. Development of pre-clinical models for evaluating the therapeutic potential of candidate siRNA targeting STAT6. PLoS One. 2014 Feb 27;9(2):e90338.
【非特許文献３】Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, Barbisin M, Xu NL, Mahuvakar VR, Andersen MR, Lao KQ, Livak KJ, Guegler KJ. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005 Nov 27;33(20):e179.
【非特許文献４】Yu RZ, Baker B, Chappell A, Geary RS, Cheung E, Levin AA. Development of an ultrasensitive noncompetitive hybridization-ligation enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of phosphorothioate oligodeoxynucleotide in plasma. Anal Biochem. 2002 May 1;304(1):19-25.
【非特許文献５】Wei X, Dai G, Marcucci G, Liu Z, Hoyt D, Blum W, Chan KK. A specific picomolar hybridization-based ELISA assay for the determination of phosphorothioate oligonucleotides in plasma and cellular matrices. Pharm Res. 2006 Jun;23(6):1251-64.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者は、従来のシグナル増幅法（パルサー法など）では、測定対象となる標的オリゴヌクレオチドの配列の一部が欠失したオリゴヌクレオチド、特に５’側または３’側が欠失したオリゴヌクレオチド（代謝産物など）と無傷の標的オリゴヌクレオチド（未変化体）の区別がつかず、代謝産物と未変化体の両方を測ってしまうという問題点を見つけた。
本発明が解決しようとする課題は、従来の測定法と比較して、より高感度かつ特異性及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの測定法を提供することである。
また、本発明が解決しようとする課題は、前記の未変化体と代謝産物との区別をし、未変化体のみを検出可能な特異性及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、測定対象である標的オリゴヌクレオチドを相補的な核酸プローブ(3'-標的配列の相補的配列-5')とハイブリダイズさせ、あるいは、測定対象である標的オリゴヌクレオチドにポリＡなどの任意の塩基（第1のポリヌクレオチド）を付加してこれと相補的な核酸プローブ(3'-標的オリゴヌクレオチドの相補的配列+第1のポリヌクレオチドの相補的配列-5')とハイブリダイズさせ、Ｓ１ヌクレアーゼなどの一本鎖特異的ヌクレアーゼを用いて不完全なハイブリダイゼーション生成物を分解及び除去し、残存する完全なハイブリダイゼーション生成物に含まれる核酸プローブを測定することにより、上記の課題を解決した。
即ち、5'側又は3'側が欠失した標的オリゴヌクレオチドの代謝物や標的オリゴヌクレオチドの変異体は、核酸プローブと不完全なハイブリダイゼーション生成物を形成するため、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより分解される。一本鎖ヌクレアーゼによる分解産物は、除去する方が好ましく、例えば、核酸プローブの3'末端を固相に固定して洗浄することにより除去することができる。残存する完全なハイブリダイゼーション生成物に含まれる核酸プローブは、WO 2013/172305の技術を改良した本明細書に開示する方法（いわゆるパルサー法）を用いて、核酸プローブ、または核酸プローブの付加塩基の部分を検出することにより測定対象である標的オリゴヌクレオチドを定量することができる。
あるいは、残存する完全なハイブリダイゼーション生成物に含まれる核酸プローブは、核酸プローブの5'末端に付加した標識物質などの化学的部分を検出することにより測定対象である標的オリゴヌクレオチドを定量することができる。
また、核酸プローブの5'末端に付加した標識物質などの化学的部分を検出するためには、Yuら及びWeiらと同様に、当業者に周知のELISA法を用いることができる。【００１３】
このようにして回収された残存する完全なハイブリダイゼーション生成物に含まれる核酸プローブは、試料中の標的オリゴヌクレオチドの量に対応する。従って、本発明者らは、試料中の特定の配列を有する標的オリゴヌクレオチドの量に対応した核酸プローブを回収する方法も提供する。【００１４】
以上より、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法:
(i)前記試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーと、
を含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む
(ii)前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程、
（iii）前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料中の前記捕捉プローブを一本鎖にする工程、
(iv) 前記捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った前記試料に、第1及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕捉プローブと、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなる前記オリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成させる工程、
（v）前記複合体を検出する工程。
＜２＞
第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブのうち少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列を含む、＜１＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜３＞
前記(iv)の複合体形成工程が、
標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列、並びに、第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列、の両方を含むアシストプローブと接触させる工程を含む、＜1＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜４＞
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法: 
（i）前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程
(ii)標的オリゴヌクレオチドに、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む
(iii)前記第1のポリヌクレオチドの付加及び前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程、
（iv)前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料中の前記捕捉プローブを一本鎖にする工程、
（v） 前記捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った前記試料に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕捉プローブと、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する工程
（vi）前記複合体を検出する工程。
＜５＞
（i）前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程が、捕捉プローブとの接触工程を行う前の前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程である、＜４＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜６＞
（i）前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程が、
捕捉プローブとの接触工程を行った後の前記試料中の標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程である、＜４＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜７＞
第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブのうち少なくとも一方のオリゴヌクレオチドが、第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含む、＜４＞〜＜７＞のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜８＞
前記（v）の複合体形成工程が、アシストプローブを接触させる工程を含み、
前記アシストプローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び/又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列、並びに第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む、＜４＞〜＜７＞のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜９＞
前記第１のポリヌクレオチドが、ポリＡ配列、ポリＴ配列、ポリＵ配列、ポリ（Ｔ／Ｕ）配列、ポリＧ配列、又はポリＣ配列である＜４＞〜＜８＞のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜１０＞
前記第１のポリヌクレオチドが、ポリＡ配列である＜９＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。  
＜１１＞
第１のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及び核酸領域Ｚを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ'、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ'、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ'を含むオリゴヌクレオチドである＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜１２＞
前記核酸領域ＺがポリＡ配列を含み、かつ、前記核酸領域Ｚ'がポリＴ配列を含む、＜１１＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜１３＞
前記一本鎖特異的ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法。
＜１４＞
以下を含む試料中の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
（１）一本鎖特異的ヌクレアーゼ
（２）標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブ
（３）第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ
＜１５＞
更に、標的オリゴヌクレオチドに付加する第１のポリヌクレオチドを含む、＜１４＞に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
＜１６＞
更に、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドとしてのポリＡを付加するポリアデニル化酵素を含む、＜１４＞に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
＜１７＞
前記（２）の捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含み、
（３）の前記自己凝集可能な一対のプローブは、第１または第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、第１のポリヌクレオチドの全配列又は部分配列を含む、
＜１５＞又は＜１６＞に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
＜１８＞
前記（２）の捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、
（３）の前記自己凝集可能な一対のプローブは、第１又は第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方が、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列を含む、＜１４＞に記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
＜１９＞
（１）一本鎖特異的ヌクレアーゼが、エンドヌクレアーゼである＜１４＞〜＜１８＞のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
＜２０＞
更に、アシストプローブを含み、前記アシストプローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列、並びに第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む、＜１４＞〜＜１６＞のいずれかに記載の標的オリゴヌクレオチドの検出キット。
＜２１＞
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドの量に対応した捕捉プローブを回収する方法:
(i)前記試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む
(ii)前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程;
(iii)前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料に含まれる、一本鎖特異的ヌクレアーゼに切断されていない捕捉プローブを回収する工程。
＜２２＞
試料に、前記一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる前記（ii）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、
前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む＜２１＞に記載の捕捉プローブを回収する方法。
＜２３＞
試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる前記（i）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、
前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む＜２１＞に記載の捕捉プローブを回収する方法。
＜２４＞
以下の工程を含む、試料中の標的オリゴヌクレオチドを定量する方法:
(i)前記試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、
ここで、前記捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端又は５'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含み、
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、
(ii)前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる工程;
(iii)前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程を行った後、前記試料に含まれる、一本鎖特異的ヌクレアーゼに切断されていない捕捉プローブを回収する工程
(iv)回収された捕捉プローブを検出し、試料中の標的オリゴヌクレオチドを定量する工程。
＜２５＞
試料に、前記一本鎖特異的ヌクレアーゼを接触させる前記（ii）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む＜２４＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを定量する方法。
＜２６＞
試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる前記（i）の工程の前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドを付加する工程を含み、前記核酸プローブが、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む＜２４＞に記載の標的オリゴヌクレオチドを定量する方法。【００１５】
さらに、本発明は、上記構成のうち、一本鎖特異的ヌクレアーゼを試料と接触させる前に、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドとしてポリＡを付加する工程を有する実施態様について、より具体的に以下に示す（実施態様１〜実施態様１５）。
［実施態様１］
以下の工程を以下に記載した順で含む、試料中の特定の配列を有する標的オリゴヌクレオチドの量に比例した核酸プローブを回収する方法:
（i）当該標的オリゴヌクレオチドを含む又は含むことが疑われる試料にポリＡポリメラーゼ（ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をポリＡポリメラーゼの活性条件下で接触させることによって、前記試料中の標的オリゴヌクレオチドをポリアデニル化する工程；
（ii）随意により、前記試料を熱処理することによりポリＡポリメラーゼを熱失活させる工程；
（iii）前記試料に、当該標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、ここで、当該捕捉プローブは、当該標的オリゴヌクレオチドに特異的に結合する核酸プローブと、当該核酸プローブの３'末端のヌクレオチドに隣接する固相又は固相に固定可能なアダプター若しくはリンカーとを含み、当該核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全長に対して又は前記標的オリゴヌクレオチドの３'末端を含む連続する少なくとも15merの部分に対して完全に相補的な配列と、当該相補的な配列の５'末端のヌクレオチドに隣接する連続する少なくとも15merのポリ(T/U)配列と、随意により当該ポリ(T/U)配列の５'末端のヌクレオチドに隣接する化学的部分とを含み、当該接触は、ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドと当該核酸プローブの完全に相補的な配列の対応する塩基の全てがワトソン・クリック塩基対を形成できる条件下で行われる;
(iv) 前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼを接触させる工程;
(v) 前記一本鎖特異的エンドヌクレアーゼとの接触工程を行った前記試料に含まれる前記固相を洗浄する工程、ここで、前記アダプター若しくはリンカーは当該洗浄工程の前に固相に固定されている;
(vi) 前記洗浄後の固相に結合した核酸プローブを、試料中の標的オリゴヌクレオチドの量に比例した核酸プローブとして回収する工程。
［実施態様２］
以下の工程を以下に記載した順で含む、核酸プローブに含まれる化学的部分を検出することにより、試料中の特定の配列を有する標的オリゴヌクレオチドを定量する方法:
(vii) 当該標的オリゴヌクレオチドを含む又は含むことが疑われる試料にポリAポリメラーゼ（ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をポリＡポリメラーゼの活性条件下で接触させることによって、前記試料中の標的オリゴヌクレオチドをポリアデニル化する工程;
(viii) 随意により、前記試料を熱処理することによりポリＡポリメラーゼを熱失活させる工程；
(ix) 前記試料に、当該標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、ここで、当該捕捉プローブは、当該標的オリゴヌクレオチドに特異的に結合する核酸プローブと、当該核酸プローブの３'末端のヌクレオチドに隣接する固相又は固相に固定可能なアダプター若しくはリンカーとを含み、当該核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全長に対して又は前記標的オリゴヌクレオチドの３'末端を含む連続する少なくとも15merの部分に対して完全に相補的な配列と、当該相補的な配列の５'末端のヌクレオチドに隣接する連続する少なくとも15merのポリ(T/U)配列と、当該ポリ(T/U)配列の５'末端のヌクレオチドに隣接する化学的部分（標識物質）とを含み、当該接触は、ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドと当該核酸プローブの完全に相補的な配列の対応する塩基の全てがワトソン・クリック塩基対を形成できる条件下で行われる；
(x) 前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼを接触させる工程;
(xi) 前記一本鎖特異的エンドヌクレアーゼとの接触工程を行った前記試料に含まれる前記固相を洗浄する工程、ここで、前記アダプター若しくはリンカーは当該洗浄工程の前に固相に固定されている;
(xii) 前記核酸プローブを介して前記固相に連結している前記化学的部分を、当該化学的部分が発する光を検出することにより、又は、当該化学的部分に対して特異的に結合する標識抗体を用いて検出することにより、前記一本鎖特異的エンドヌクレアーゼに切断されていない捕捉プローブを定量する工程;
(xiii) 前記定量された捕捉プローブの量を、試料中の標的オリゴヌクレオチドの量と相関させる工程。
［実施態様３］
以下の工程を以下に記載した順で含む、核酸プローブに含まれるポリ(T/U)配列を検出することにより、試料中の特定の配列を有する標的オリゴヌクレオチドを定量する方法:
(xiv) 当該標的オリゴヌクレオチドを含む又は含むことが疑われる試料にポリＡポリメラーゼ（ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をポリＡポリメラーゼの活性条件下で接触させることによって、前記試料中の標的オリゴヌクレオチドをポリアデニル化する工程；
(xv) 随意により、前記試料を熱処理することによりポリＡポリメラーゼを熱失活させる工程;
(xvi) 前記試料に、当該標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる工程、ここで、当該捕捉プローブは、当該標的オリゴヌクレオチドに特異的に結合する核酸プローブと、当該核酸プローブの3'末端のヌクレオチドに隣接する表面に第1の蛍光物質を有する微粒子とを含み、当該核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全長に対して又は前記標的オリゴヌクレオチドの3'末端を含む連続する少なくとも15merの部分に対して完全に相補的な配列と、当該相補的な配列の5'末端のヌクレオチドに隣接する連続する少なくとも15merのポリ(T/U)配列と、随意により当該ポリ(T/U)配列の5'末端のヌクレオチドに隣接する化学的部分とを含み、当該接触は、ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドと当該核酸プローブの完全に相補的な配列の対応する塩基の全てがワトソン・クリック塩基対を形成できる条件下で行われる;
(xvii) 前記捕捉プローブとの接触工程を行った前記試料に、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼを接触させる工程、
(xviii) 前記一本鎖特異的エンドヌクレアーゼとの接触工程を行った前記試料を、前記核酸プローブが熱変性する温度で熱処理する工程、
(xix) 前記熱変性工程を行った前記試料に、第1のオリゴヌクレオチド及び第2のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させる工程、ここで、第1及び第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも一方は標識物質により標識されている;
(xx) 前記捕捉プローブ及び自己凝集した第１及び第２のオリゴヌクレオチドの３成分複合体を遠心分離法により沈殿させる又は吸引ろ過法により分離する工程;
(xxi) 随意により、前記沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離法により沈殿させる又は吸引ろ過法により分離する工程;
(xxii) 前記(xx)又は(xxi)工程の沈殿に第２の蛍光物質と前記標識物質に特異的に結合する物質との抱合体を緩衝液中で接触させ、蛍光物質反応液を得る工程;
(xxiii) 前記捕捉プローブ及び自己凝集した第1及び第2のオリゴヌクレオチド及び前記抱合体の4成分複合体を遠心分離法により沈殿させる又は吸引ろ過法により分離する工程;
(xxiv) 随意により、前記沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、再度遠心分離法により沈殿させる又は吸引ろ過法により分離する工程;
(xxv) 前記(xxiii)又は(xxiv)工程の沈殿を洗浄緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー法を用いて、第1の蛍光物質が発する第1の蛍光と第2の蛍光物質が発する第2の蛍光を検出する工程。
［実施態様４］
実施態様３記載の工程(xxv)の後に、
(xxvi) 第１の蛍光と第２の蛍光が同時に検出される場合における第２の蛍光の強度を、当該オリゴヌクレオチドを既知の濃度で含む対照試料において第１の蛍光と第２の蛍光が同時に検出される場合における第２の蛍光の強度と比較することにより、前記試料中の当該オリゴヌクレオチドの濃度を決定する工程を含む、実施態様３記載の方法。
［実施態様５］
第１のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及び核酸領域Ｚを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ'、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ'、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ'を含むオリゴヌクレオチドである実施態様３又は４に記載の方法。
［実施態様６］
前記核酸領域ＺがポリＴ配列を含み、かつ、前記核酸領域Ｚ'がポリＡ配列を含む、実施態様５に記載の方法。
［実施態様７］
第１のオリゴヌクレオチドが配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドである実施態様３〜６の何れかに記載の方法。
［実施態様８］
第２のオリゴヌクレオチドが配列番号１０で表されるオリゴヌクレオチドである実施態様３〜７の何れかに記載の方法。
［実施態様９］
前記固相が微粒子である、実施態様１又は２に記載の方法。
［実施態様１０］
前記微粒子は、直径が１〜１０μｍの磁性または非磁性ポリスチレン製ビーズである、実施態様３〜９の何れかに記載の方法。
［実施態様１１］
前記核酸プローブが、前記ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドと特異的に結合した場合に、完全に適合した２本鎖核酸の構造、又は、完全に適合した２本鎖核酸の部分と一方又は両方の鎖における５'突出末端の部分とからなる構造、又は、完全に適合した２本鎖核酸の部分と前記ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドの鎖における３'突出末端の部分とからなる構造、又は、完全に適合した２本鎖核酸の部分と前記ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドの鎖における５'突出末端及び３'突出末端の部分とからなる構造を形成する配列を有する、実施態様１〜１０の何れかに記載の方法。
［実施態様１２］
試料は、ヒト、げっ歯類動物(ラット、マウス、モルモット)又は非げっ歯類動物(サル、イヌ、ブタ)の体液(全血、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、涙液、汗、胃液、膵液、胆汁、胸水、関節腔液、脳脊髄液、髄液、骨髄液)又は組織(肝臓、腎臓、肺、心臓)である、実施態様1〜11の何れかに記載の方法。
［実施態様１３］
前記固相に固定可能なアダプター又はリンカーが、ビオチンである実施態様１又は２に記載の方法。
［実施態様１４］
前記化学的部分がジゴキシゲニンである、実施態様１〜１３の何れかに記載の方法。
［実施態様１５］
前記一本鎖特異的エンドヌクレアーゼがＳ１ヌクレアーゼである、実施態様１〜１４の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、高感度かつ特異性及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの検出または定量を行うことができる。
また、シグナル増幅法（パルサー法など）により測定対象である標的オリゴヌクレオチドの５’側または３’側が欠失したオリゴヌクレオチド代謝産物と未変化体との区別をし、未変化体のみを検出可能な特異性及び定量性に優れたオリゴヌクレオチドの検出方法または定量方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は本発明の方法による標的オリゴヌクレオチドの定量結果を示す（実施例１）。
【図２】図２は本発明の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法における各工程を示す概略説明図である（実施例１、ポリＡの付加あり）。（（Ａ）は標的オリゴヌクレオチドの場合、（Ｂ）は５’末端が欠失した標的オリゴヌクレオチドの場合）
【図３】図３は本発明の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法における各工程を示す概略説明図である（実施例２、ポリヌクレオチドの付加なし、アシストプローブ使用）。
【図４】図４は本発明の標的オリゴヌクレオチドを検出する方法における各工程を示す概略説明図である（ポリヌクレオチドの付加なし）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（標的オリゴヌクレオチド）
本明細書において、「標的オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸プローブと特異的なハイブリッドを形成できるものであれば、DNA又はRNAの何れでも良く、一本鎖又は二本鎖の何れでも良く、化学修飾されていても良い。化学修飾としては、ホスホロチオエート修飾(S化)、2'-F修飾、2'-O-Methyl(2'-OMe)修飾、2'-O-Methoxyethyl(2'-MOE)修飾、モルフォリノ修飾、LNA修飾、BNACOC修飾、BNANC修飾、ENA修飾、cEt BNA修飾などが挙げられる。
上記、標的オリゴヌクレオチドが二本鎖の場合は、一本鎖にして本発明に使用される。
【００１９】
（捕捉プローブ）
本発明において「捕捉プローブ」とは、標的オリゴヌクレオチドを捕捉するためのプローブであり、(A)核酸プローブと、(B)前記核酸プローブの3'末端又は5'末端のヌクレオチドに隣接する固相又はアダプター若しくはリンカーとを含む。
【００２０】
（核酸プローブ）
本発明に使用する「核酸プローブ」の第１の態様は、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列に対して相補的な配列を含む。具体的には、前記標的オリゴヌクレオチドの全長に対して又は前記標的オリゴヌクレオチドの３'末端又は５’末端を含む部分に対して相補的な配列を含み、以下の（ａ−１）と（ａ−２）の場合が挙げられる。
(a-1)固相又はアダプター若しくはリンカーが３'末端のヌクレオチドに隣接する場合には、核酸プローブは、当該３'末端のヌクレオチドを含む部分において、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。
(a-2)前記固相又はアダプター若しくはリンカーが５'末端のヌクレオチドに隣接する場合には、核酸プローブは、当該5'末端のヌクレオチドを含む部分において、前記標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。
上記核酸プローブにおいて、標的オリゴヌクレオチドの３'末端又は５’末端を含む部分に対して相補的な配列は、標的オリゴヌクレオチドの少なくとも4merの部分に対して相補的な配列を含むことが好ましく、少なくとも10merの部分に対して相補的な配列を含むことが更に好ましく、少なくとも15merの部分に対して相補的な配列を含むことが最も好ましい。
また、前記標的オリゴヌクレオチドの全長に対して相補的な配列は、全長に対してハイブリダイズできる程度の同一性があれば良く、同全長に対して完全に相補的な配列であることがより好ましい。
【００２１】
本発明の核酸プローブの別の態様について説明する。
標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドが付加される場合は、前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しく部分配列に対して相補的な配列を含む。
具体的には、以下の（b-1）又は（b-2）の場合が挙げられる。
(b-1)前記固相又はアダプター若しくはリンカーが３'末端のヌクレオチドに隣接する場合には、当該３'末端のヌクレオチドを含む部分において、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む。
(b-2)前記固相又はアダプター若しくはリンカーが５'末端のヌクレオチドに隣接する場合には、当該５'末端のヌクレオチドを含む部分において、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第1のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列に対して相補的な配列を含む。
上記標的オリゴヌクレオチドの３’末端に付加されている第１のポリヌクレオチドの塩基は、非特異的反応を抑えるため測定対象の試料に含まれない塩基配列であることが好ましい。
【００２２】
標的オリゴヌクレオチドの３’末端に第１のポリヌクレオチドとして、ポリ塩基（Ａ、Ｔ／Ｕ，Ｇ，又はＣ）が付加されている場合、核酸プローブは、標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５'末端のヌクレオチドに隣接するポリ塩基（Ｔ/Ｕ，Ａ、Ｃ，又はＧ）を含む。
標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡが付加されている場合は、核酸プローブは、標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列の５'末端のヌクレオチドに隣接するポリＴ／Ｕを含む。
【００２３】
前記核酸プローブは、前記ポリアデニル化された（ポリＡが付加されたと同義である）当該標的オリゴヌクレオチドと特異的に結合した場合には、完全に適合した２本鎖核酸の構造、又は、完全に適合した２本鎖核酸の部分と一方又は両方の鎖における５'突出末端の部分とからなる構造、又は、完全に適合した2本鎖核酸の部分と前記ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドの鎖における３'突出末端の部分とからなる構造、又は、完全に適合した２本鎖核酸の部分と前記ポリアデニル化された当該標的オリゴヌクレオチドの鎖における５'突出末端及び３'突出末端の部分とからなる構造を形成する配列を有することが望ましい。
【００２４】
上記相補的な配列の長さ（塩基数）は、少なくとも４merの塩基が好ましく、少なくとも10merの塩基が更に好ましく、少なくとも15merの塩基が更により好ましい。少なくとも4merとは、4mer以上、10mer以上、15mer以上、20mer以上、25mer以上、30mer以上、35mer以上、40mer以上、45mer以上、又は50mer以上、好ましくは、15mer、16mer、17mer、18mer、19mer、20mer、21mer、22mer、23mer、24mer、25mer、26mer、27mer、28mer、29mer、又は30merを意味する。また、相補的な配列の長さの上限は100mer以下が好ましい。
【００２５】
本発明に使用する「核酸プローブ」は、好ましくは、少なくとも連続する4merの部分、少なくとも連続する10merの部分、少なくとも連続する15merの部分、少なくとも連続する16merの部分、少なくとも連続する17merの部分、少なくとも連続する18merの部分、少なくとも連続する19merの部分、少なくとも連続する20merの部分、少なくとも連続する21merの部分、少なくとも連続する22merの部分、少なくとも連続する23merの部分、少なくとも連続する24merの部分、少なくとも連続する25merの部分、少なくとも連続する26merの部分、少なくとも連続する27merの部分、少なくとも連続する28merの部分、少なくとも連続する29merの部分、少なくとも連続する30merの部分、少なくとも連続する31merの部分、少なくとも連続する32merの部分、少なくとも連続する33merの部分、少なくとも連続する34merの部分、少なくとも連続する35merの部分、少なくとも連続する36merの部分、少なくとも連続する37merの部分、少なくとも連続する38merの部分、少なくとも連続する39merの部分、少なくとも連続する40merの部分、少なくとも連続する41merの部分、少なくとも連続する42merの部分、少なくとも連続する43merの部分、少なくとも連続する44merの部分、少なくとも連続する45merの部分、少なくとも連続する46merの部分、少なくとも連続する47merの部分、少なくとも連続する48merの部分、少なくとも連続する49merの部分、あるいは、少なくとも連続する50merの部分、が標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、好ましくは少なくとも連続する15merの部分、少なくとも連続する16merの部分、少なくとも連続する17merの部分、少なくとも連続する18merの部分、少なくとも連続する19merの部分、少なくとも連続する20merの部分、少なくとも連続する21merの部分、少なくとも連続する22merの部分、少なくとも連続する23merの部分、少なくとも連続する24merの部分、少なくとも連続する25merの部分、少なくとも連続する26merの部分、少なくとも連続する27merの部分、少なくとも連続する28merの部分、少なくとも連続する29merの部分、あるいは、少なくとも連続する30merの部分、が標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、より好ましくは、少なくとも連続する18merの部分、少なくとも連続する19merの部分、少なくとも連続する20merの部分、少なくとも連続する21merの部分、あるいは、少なくとも連続する22merの部分、が標的オリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含む。
【００２６】
（固相）
本明細書において、「固相」という用語は、不溶性の微粒子、マイクロビーズ、蛍光微粒子、磁気粒子、マイクロタイタープレート、マイクロアレイ、スライドガラス、電気伝導性基板等の基板等が挙げられ、好ましくは蛍光微粒子であり、更に好ましくは蛍光ビーズであり、特に好ましくは、表面に蛍光物質を有するビーズである。本発明に使用する、「表面に蛍光物質を有するビーズ」としては、蛍光物質を有するビーズであれば、特に限定されず、例えば、Luminex社のMicroPlexTM Microspheresが好適に使用することができる。1種類のビーズを用いることも、多種類のビーズを用いることもできる。カラーコード化された複数種類のビーズを使用すれば、本発明のオリゴヌクレオチドの定量方法も容易にマルチプレックス化できる。
【００２７】
上記固相と上記核酸プローブは、直接結合していてもよく、アダプター又はリンカーを介して結合してもよく、好ましくは、アダプター又はリンカーを介して結合していることが好ましい。また、本発明の核酸プローブは、標識物質を結合させてもよい。
本発明において「核酸プローブの3'末端又は5'末端のヌクレオチドに隣接する固相」の「隣接」とは、前記ヌクレオチドに直接結合しているか、あるいはアダプターやリンカー等を介して結合していることを意味し、結合の意味については後述する。
【００２８】
（アダプター又はリンカー）
本発明に使用する「アダプター又はリンカー」としては、例えば、ビオチン、Spacer 9、Spacer 12、Spacer18、Spacer C3等のスペーサー等のアミノ基若しくはカルボキシル基を有する化合物等が挙げられ、好ましくは5'-Amino-Modifier C12 (12-(4-Monomethoxytritylamino)dodecyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite)、ビオチン等である。
例えば、ビーズ表面にカルボキシル基を有し、アミノ基の化合物を付加した核酸プローブが、アミノ基を介してビーズ表面のカルボキシル基と結合する態様は、アミノ基を有する化合物がリンカーの例となる。
【００２９】
（標識物質）
本発明における標識物質は、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。
具体的には、125Ｉや32Ｐ等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン等の発光物質や４-メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、アビジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。
【００３０】
（核酸プローブの固相への結合）
核酸プローブの固相への結合は、化学結合による方法、生物学的相互作用による方法、物理吸着による方法などが挙げられる。化学結合による方法では、例えば、カルボキシル基でコートされた担体を用いる場合、オリゴヌクレオチドに標識したアミノ基との間でカップリング反応をさせることができる。生物学的相互作用による方法では、例えば、担体にコートしたストレプトアビジンと、核酸プローブに修飾したビオチンとの間の結合力を利用することができる。また、物理吸着による方法では、例えば、負の電荷を有する固相を用いた場合、オリゴヌクレオチドにアミノ基など正の電荷を有する物質を標識することで、静電気的に担体に吸着させることができる。
【００３１】
（第1のポリヌクレオチド付加反応）
本発明の第1のポリヌクレオチド付加反応は、標的オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端にポリヌクレオチドを付加する反応であり、予め核酸合成で作製したポリヌクレオチドをリガーゼ等の酵素で標的オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に結合する方法、又はポリＡポリメラーゼ等の酵素によりヌクレオチド（塩基）を付加する方法等が挙げられる。
上記リガーゼ等の酵素としては、例えば、ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ、DNAリガーゼ等が挙げられる。また、５’末端にポリ塩基を付加する場合には、５’末端をあらかじめリン酸化することによりリガーゼを作用させることができる。
上記第1のポリヌクレオチドの配列の長さの下限としては、4mer以上が好ましく、10mer以上が更に好ましく、15mer以上がよりいっそう好ましい。また長さの上限としては、100mer以下が好ましい。また、長さの好ましい範囲としては15mer以上100mer以下である。
また、第１のポリヌクレオチドの配列は、測定対象の試料に含まれない配列が好ましく、このような配列は、標的オリゴヌクレオチドの検出の際、非特異反応を抑制することが可能である。
【００３２】
上記第１のポリヌクレオチドの付加反応がポリＡの付加反応である場合は、標的オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端にポリＡを付加する反応であり、予め核酸合成で作製したポリＡを、リガーゼで標的オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に結合する方法、又は標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡポリメラーゼ(ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ)でアデニル残基を付加する方法等が挙げられる。
上記ポリＡポリメラーゼとしては、一本鎖ＲＮＡの３'末端にアデニン残基を導入する酵素活性を有するタンパク質を意味する。より具体的には、大腸菌由来のポリＡポリメラーゼが好適に使用される。
ポリＡポリメラーゼ及びアデノシン三リン酸(ATP)をポリＡポリメラーゼの活性条件下で接触させることによって、標的オリゴヌクレオチドをポリアデニル化することができ、本明細書中、標的オリゴヌクレオチドのポリＡ付加とポリアデニル化は同義で用いられる。
上記ポリＡの長さの下限としては、4mer以上が好ましく、10mer以上が更に好ましく、15mer以上がよりいっそう好ましい。また、長さの上限としては、100mer以下である。また、長さの好ましい範囲としては15mer以上100mer以下である。
【００３３】
上記ポリ塩基付加反応がポリＴ付加反応である場合は、標的オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端にポリＴを付加する反応であり、予め核酸合成で作製したポリＴをリガーゼ等で標的オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に結合する方法等が挙げられる。
上記リガーゼ等としては、例えば、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ等が挙げられる。
上記ポリＴの長さの下限としては、４mer以上が好ましく、10mer以上が更に好ましく、15mer以上がよりいっそう好ましい。また、長さの上限としては、100mer以下が好ましい。また、長さの好ましい範囲としては15mer以上100mer以下である。
また、ポリＴの配列は、測定対象の試料に含まれない配列であるので、このような配列は、標的オリゴヌクレオチドの検出の際、非特異反応を抑制する。
ポリＣの付加、ポリＧの付加も同様に行われる。
【００３４】
上記ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ポリＡポリメラーゼは、付加反応の後に、熱等で失活させることが好ましい。
【００３５】
上記第１のポリヌクレオチド付加反応は、前記一本鎖特異的ヌクレアーゼとの接触工程の前に行えばよく、前記試料に、前記標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを接触させる前、又は捕捉プローブを接触させた後に行うことができる。
【００３６】
上記試料に、前記捕捉プローブを接触させる前に、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加する場合は、試料に第１のポリヌクレオチドを付加して標的オリゴヌクレオチドと第１のポリヌクレオチドの付加物（以下、単に標的オリゴヌクレオチド−第１のポリヌクレオチドと記載することがある）を形成し、その後当該付加物と捕捉プローブのハイブリダイゼーションにより標的オリゴヌクレオチド−第１のポリヌクレオチドと捕捉プローブの二本鎖を形成する。
【００３７】
上記試料に、前記捕捉プローブを接触させた後に、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加する場合は、試料と捕捉プローブの接触により、標的オリゴヌクレオチドと捕捉プローブのハイブリダイゼーション後に、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加することによって、標的オリゴヌクレオチド−第１のポリヌクレオチドと捕捉プローブの二本鎖を形成する。
【００３８】
（一本鎖特異的ヌクレアーゼ）  
本発明に使用する一本鎖特異的ヌクレアーゼとは、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ又は一本鎖特異的エキソヌクレアーゼをいう。
「一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ」としては、一本鎖の核酸配列の内部で核酸を切断する酵素であれば、特に限定されず、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、Mung Bean ヌクレアーゼ等が挙げられ、Ｓ１ヌクレアーゼが好ましい。また、標的オリゴヌクレオチド及び核酸プローブがＲＮＡの場合、本発明に使用する「一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ」として、一本鎖ＲＮＡ（ssＲＮＡ）を特異的に分解するRNase ONE(登録商標) Ribonuclease (Promega、カタログ番号:M4261) 等が挙げられる。
「一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ」としては、一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡを５’末端または３’末端から切断する酵素であれば、特に限定されず、例えば、exonucleaseＩ等が挙げられる。
【００３９】
（捕捉プローブを一本鎖にする工程）
本明細書において、「捕捉プローブを一本鎖にする工程」は、ハイブリダイズしている標的オリゴヌクレオチドと捕捉プローブの二本鎖又は標的オリゴヌクレオチドと第１のポリヌクレオチドの付加物と捕捉プローブの二本鎖を一本鎖の捕捉プローブにすることである。
前記一本鎖の捕捉プローブにする方法は、二本鎖を一本鎖にする方法であればよく、例えば、熱処理、アルカリ処理、カオトロープ処理等が挙げられ、好ましくは熱処理により行われる。熱処理としては、例えば、９５℃で３分間、５０℃で３分間処理する方法等である。
【００４０】
（接触）
本明細書において、「接触させる」、あるいは、「接触工程」という用語は、ある物質と他の物質との間で、共有結合、イオン結合、金属結合、非共有結合などの化学結合を形成できるように、これらの物質を互いに近傍に置くことを意味する。本発明の一態様においては、ある物質と他の物質を「接触させる」とは、ある物質を含む溶液と他の物質を含む溶液を混合することを意味する。例えば、試料にリガーゼを接触させる工程は４〜８０℃で０．１〜３０時間保温すること、好ましくは１５〜３０℃で１〜２４時間保温することで行われる。試料にポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰを接触させる工程は、３０〜４２℃で５〜６０分間保温すること、好ましくは、３７℃で１５分間保温することで行われる。試料と捕捉プローブの接触工程は、３０〜７０℃で０．２〜３０時間保温すること、３５〜６５℃で８〜２４時間保温すること、好ましくは、５０℃で１３．５時間保温することで行われる。試料と一本鎖特異的エンドヌクレアーゼの接触工程は、３０〜４２℃で０．２〜３時間保温すること、３３〜４０℃で０．３〜２時間保温すること、好ましくは、３７℃で０．５時間保温することで行われる。試料と第１及び第２のオリゴヌクレオチドとの接触工程は、２８〜７０℃で０．２〜３時間保温すること、３０〜４５℃で０．５〜２時間保温すること、好ましくは、３０℃で１時間保温することで行われる。
また、標的オリゴヌクレオチドと捕捉プローブとの接触は、標的オリゴヌクレオチドと核酸プローブの相補的な配列の対応する塩基がハイブリダイゼーションできる条件下で行われることを意味する。同様に、自己凝集可能な一対のプローブと一本鎖工程を経た捕捉プローブとの接触、あるいは当該捕捉プローブとアシストプローブとの接触、自己凝集可能な一対のプローブ同士の接触も対応する塩基がハイブリダイゼーションできる条件下で行われることを意味する。
【００４１】
（自己凝集）
本明細書において、「自己凝集」という用語は、複数の第１のオリゴヌクレオチドが、第２のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより複合体を形成した状態、及び、複数の第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより複合体を形成した状態を意味する。
【００４２】
（自己凝集な一対のプローブ）
本発明の方法に使用する「自己凝集可能」な一対のプローブは、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズ可能な相補的塩基配列領域を有し、自己凝集反応によるプローブポリマーの形成が可能なオリゴヌクレオチドをいう。好ましくは、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方は、標識物質により標識されている。ここで、「ハイブリダイズ可能」とは、一態様においては、当該相補的塩基配列領域において完全に相補的であることを意味し、別の一態様においては、１つ又は２つのミスマッチを除いて、当該相補的塩基配列領域において相補的であることを意味する。
【００４３】
自己凝集可能な一対のプローブにはあらかじめ検出のための標識物質で標識しておくことも可能である。そのような標識物質として、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光物質、発光物質又は色素等が好適な例として挙げられる。具体的には、125Ｉや32Ｐ等のラジオアイソトープ、ジゴキシゲニンやアクリジニウム・エステル等の発光・発色物質、ジオキセタン等の発光物質や４-メチルウンベリフェリルリン酸等の蛍光物質を利用するためのアルカリフォスファターゼ、アビジンに結合した蛍光・発光・発色物質等を利用するためのビオチン等、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用するためのドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素を付加させておき、標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。
好ましくは、当該標識物質はビオチンであり、当該オリゴヌクレオチドの標識は、好ましくは５’末端又は３'末端をビオチン化することにより行われる。当該標識物質はビオチンの場合、標識物質に特異的に結合する物質はストレプトアビジン又はアビジンである。
【００４４】
「自己凝集可能」な一対のプローブをより具体的に説明すると、第１のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及び核酸領域Ｚを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に少なくとも前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ'、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ'、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ'を含むオリゴヌクレオチドということになる。
ここで、第１のポリヌクレオチドがポリＡの場合、前記核酸領域ＺがポリＡ配列を含み、かつ、前記核酸領域Ｚ'がポリＴ配列を含む態様が例示される。
【００４５】
本発明における捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った試料に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕捉プローブと、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成させる工程は、アシストプローブを介さずに複合体を形成する場合と、アシストプローブを介して複合体を形成する場合がある。
【００４６】
上記アシストプローブとは、前記一本鎖工程により一本鎖となった捕捉プローブと前記オリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成するためにアシストする役割を有するプローブである。アシストプローブの第一の態様は前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列及び標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含むプローブである。
例えば、自己凝集可能な一対のプローブの片方がＸＹＺの場合、（標的オリゴヌクレオチド）−Ｘ’Ｙ’Ｘ’、（標的オリゴヌクレオチド）−Ｚ’Ｙ’Ｚ’、（標的オリゴヌクレオチド）−Ｘ’Ｙ’Ｚ’等が挙げられる。
上記アシストプローブは、標識物質で標識されていても、標識されていなくてもよい。
また、別の態様として、標的オリゴヌクレオチドに第1のポリヌクレオチドが付加される場合は、第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列及び第１のポリヌクレオチドの全配列又は部分配列を含むプローブである。
例えば、第1のポリヌクレオチドが付加される場合で、自己凝集可能な一対のプローブの片方の配列がＸＹＺの場合、（付加塩基）−Ｘ’Ｙ’Ｘ’、（付加塩基）−Ｚ’Ｙ’Ｚ’、標的オリゴヌクレオチド（付加したものは、付加塩基）−Ｘ’Ｙ’Ｚ’等が挙げられる。
標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドの付加がある場合と無い場合、アシストプローブがある場合と無い場合のそれぞれの組み合わせについて以下場合分けして説明する。
【００４７】
上記アシストプローブを介さずに自己凝集可能な一対のプローブと一本鎖捕捉プローブとの複合体を形成する場合について説明する。
第一の態様は、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方は、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含めばよい。
別の態様は、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドが付加されている場合に用いられる態様であって、前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方は、第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列を含めばよい。
【００４８】
上記アシストプローブを介して複合体を形成する場合は、前記第第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、自己凝集反応によるプローブポリマーの形成が可能なオリゴヌクレオチドであればよい。この場合、アシストプローブは、標的オリゴヌクレオチドの全配列又は部分配列、並びに、第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列、の両方を含めばよい。
また、別の態様は、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドが付加されている場合に用いられる態様であって、この場合、アシストプローブは、標的オリゴヌクレオチドの全配列若しくは部分配列及び／又は第１のポリヌクレオチドの全配列若しくは部分配列、並びに、第１又は第２のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方の全配列又は部分配列に対して相補的な配列、を含むものであればよい。
第１又は第２のオリゴヌクレオチドは少なくとも一方は標識物質により標識されていることが好ましい。
【００４９】
本発明の標的オリゴヌクレオチドの検出方法の第１の態様として、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドとしてポリＡを付加して検出する方法について図２（Ａ）にもとづいて以下説明する。
まず、標的オリゴヌクレオチドが含まれうる試料と標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを準備する。
本発明の捕捉プローブは、
（Ａ）核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端のヌクレオチド部分に固定化されたビーズを含む。
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列及び第１のポリヌクレオチドの部分（この場合ポリＡ）に対して相補的な配列（ポリＴ）を含む。
次に、前記試料中の標的オリゴヌクレオチドの３’末端にポリＡポリメラーゼを作用させてポリＡを付加する（図２（Ａ）ア）。続いて、ポリＡを付加した標的オリゴヌクレオチドに、前記捕捉プローブを接触させる。これにより、ポリＡが付加された標的オリゴヌクレオチドと、捕捉プローブ中の核酸プローブのハイブリダイゼーションが行われ２本鎖が形成される（図２（Ａ）イ）。
次に、一本鎖特異的ヌクレアーゼであるエンドヌクレーゼを接触させる。これにより一本鎖部分が分解される（図２（Ａ）ウ）。破線の矢印はエンドヌクレアーゼの作用する箇所を示す。
ここで、試料中に標的オリゴヌクレオチドの類似物質（５'側又は３'側が欠失した標的オリゴヌクレオチドの代謝物や標的オリゴヌクレオチドの変異体）が存在した場合は、本発明の核酸プローブと不完全なハイブリダイゼーション生成物を形成する。５’側が欠失した標的オリゴヌクレオチドの作用について図２（Ｂ）にもとづき説明する。標的オリゴヌクレオチドの５‘末端の白抜きのひし形は欠失箇所を示す。当該オリゴヌクレオチドにポリＡを付加し（図２（Ｂ）ア）、核酸プローブとハイブリダイゼーションを行い（図２（Ｂ）イ）、エンドヌクレアーゼ処理を行う（図２（Ｂ）ウ）。当該エンドヌクレアーゼは破線矢印部位に作用して、当該箇所で分解されることになる。
前記試料中で分解されずに残存する捕捉プローブと標的オリゴヌクレオチドにより形成された完全な２本鎖のハイブリダイゼーション生成物を一本鎖にする（図２（Ａ）エ）。一本鎖への変性は熱処理などにより行う。前記エンドヌクレアーゼによる分解産物は、ビーズに固定化されていないことから洗浄してビーズを回収することにより除去することができる。
残存する完全なハイブリダイゼーション生成物に含まれる核酸プローブは、以下のパルサー法により定量することができる。
【００５０】
前記捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った前記試料に、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブを接触させて、前記捕捉プローブと、第１及び第２のオリゴヌクレオチドが自己凝集してなるオリゴヌクレオチドポリマーとの複合体を形成する（いわゆるパルサー反応）。
ここで、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブは、第１のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ、及び核酸領域Ｚを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順に前記核酸領域Ｘに相補的な核酸領域Ｘ'、前記核酸領域Ｙに相補的な核酸領域Ｙ'、及び前記核酸領域Ｚに相補的な核酸領域Ｚ'を含んでいる（以下、当該核酸領域を単に、Ｘ，Ｙ，Ｚ，Ｘ’、Ｙ’、Ｚ’ということがある）。本態様では、第１のポリヌクレオチドがポリＡであるから、ＺがポリＡ配列を含み、かつ、Ｚ'がポリＴ配列を含んでいる。また、第１と第２のオリゴヌクレオチドの５’末端には標識物質が付与されている。
一本鎖の捕捉プローブのＺ’（ポリＴ）に第１のオリゴヌクレオチドのＺ（ポリＡ）がハイブリダイズし、第１のオリゴヌクレオチドのＸ、Ｙに第２のオリゴヌクレオチドのＸ’、Ｙ’がそれぞれハイブリダイズする。そして次々とＸとＸ’、ＹとＹ’、Ｚ（ポリＡ）とＺ’（ポリＴ）がハイブリダイズを繰り返すことで、自己凝集プローブのオリゴヌクレオチドポリマーが形成される（図２（Ａ）オ）。
【００５１】
前記捕捉プローブ及び自己凝集した第１及び第２のオリゴヌクレオチドの複合体を遠心分離法により沈殿させるなどして分離し、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの標識物質等を検出することにより標的オリゴヌクレオチドの濃度等を測定することができる。
なお、熱処理による一本鎖工程及びその後のパルサー反応を行う前の捕捉プローブと標的オリゴヌクレオチドにより形成された完全な２本鎖のハイブリダイゼーション生成物を検出することにより標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。例えば５’末端が予め標識物質で付与された捕捉プローブの標識物質を検出することで、標的オリゴヌクレオチドを検出することができる。
また、３’末端が予め標識物質で付与された第１のポリヌクレオチドの標識物質を検出することで、標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。
【００５２】
本発明の標的オリゴヌクレオチドの検出方法の第２の態様として、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加せずに、また、自己凝集反応ではアシストプローブを介して行う検出する方法について図３にもとづいて以下説明する。
まず、標的オリゴヌクレオチドが含まれうる試料と標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブを準備する。本実施態様では第１のポリヌクレオチドの付加を行わないことから、標的オリゴヌクレオチドを捕捉するためのプローブは、
（Ａ）  核酸プローブと、
（Ｂ）前記核酸プローブの３'末端のヌクレオチド部分に固定化されたビーズを含む。
前記核酸プローブは、前記標的オリゴヌクレオチドの全配列に対して相補的な配列を含む。
第１の実施態様の工程との違いは、（図２（Ａ）ア）の第１のポリヌクレオチドを付加する工程が無いこと、及び捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った試料にアシストプローブをハイブリダイズする工程（図３ケ）が追加されていること以外は同じである。
アシストプローブは、標的オリゴヌクレオチドの部分配列、並びに、第２のオリゴヌクレオチドと相補的な配列Ｚ、Ｙ、Ｚを含み、３’末端が標識物質で標識されている。
また、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブは、第１のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順にＸ、Ｙ、及びＺを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５'末端側からＸ'、Ｙ'、及びＺ'を含んでいる。
捕捉プローブを一本鎖にする工程を行った試料にアシストプローブを接触させると、捕捉プローブに含まれる標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列とアシストプローブの標的オリゴヌクレオチドの配列との間でハイブリダイゼーションが起こる（図３ケ）。次に自己凝集可能な一対のプローブを接触させると、アシストプローブのＹ、Ｚと第２のオリゴヌクレオチドのＹ’、Ｚ’がハイブリダイズし、そして次々とＸとＸ’、ＹとＹ’ＺとＺ’がハイブリダイズを繰り返すことで、自己凝集プローブのオリゴヌクレオチドポリマーが形成される（図３コ）。捕捉プローブ、アシストプローブ、及び自己凝集した第１及び第２のオリゴヌクレオチドの複合体を分離し、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの標識物質等を検出することにより標的オリゴヌクレオチドの濃度等を測定することができる。なお、パルサー反応を行う前のビーズを伴う完全な２本鎖のハイブリダイゼーション生成物を検出することにより標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。例えば、3’末端が予め標識物質で付与されたアシストプローブの標識物質を検出することで、標的オリゴヌクレオチドを検出することも可能である。
【００５３】
本発明の標的オリゴヌクレオチドの検出方法の第３の態様として、標的オリゴヌクレオチドに第１のポリヌクレオチドを付加せずに、また、アシストプローブを介さずに自己凝集反応を行い検出する方法について図４にもとづいて以下説明する。
第２の実施態様との違いは、捕捉プローブとアシストプローブを接触する工程（図３ケ）が無いことである。また、第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブは、第１のオリゴヌクレオチドが、５'末端側から順にＸ、Ｙ、及びＺを含むオリゴヌクレオチドであり、第２のオリゴヌクレオチドが、５'末端側からＸ'、Ｙ'、及びＺ'を含んでいる。ここで、Ｚは標的オリゴヌクレオチドの全配列であり、標的オリゴヌクレオチドの類似物質の完全相補配列とはハイブリダイズしない配列であり、Ｚ'はＺと相補的な配列である。
一本鎖となった捕捉プローブの核酸プローブである標的オリゴヌクレオチドに相補的な配列部分は、第１のオリゴヌクレオチドのＺ領域である標的オリゴヌクレオチドの全配列とハイブリダイズする。そして、次々とＸとＸ’、ＹとＹ’、Ｚ（標的オリゴヌクレオチド）とＺ’（標的オリゴヌクレオチドの相補鎖）がハイブリダイズを繰り返すことで、自己凝集プローブのオリゴヌクレオチドポリマーが形成される（図４セ）。捕捉プローブ及び自己凝集した第１及び第２のオリゴヌクレオチドの複合体を分離し、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの標識物質等を検出することにより標的オリゴヌクレオチドの濃度等を測定することができる。
【００５４】
標的オリゴヌクレオチドに相補的な一本鎖の捕捉プローブを定量するための自己凝集を利用した方法は、いわゆるパルサー法として知られている公知の方法である。パルサー法の具体例は、国際公開2013/172305号の図４〜図１４などに示されており、ダイマー形成用プローブ等を用いて当業者常識にもとづき適宜変形して本発明の自己凝集反応に応用することが可能である。
【００５５】
本発明の捕捉プローブ並びに、自己凝集した第１及び第２のオリゴヌクレオチドポリマー（シグナルプローブポリマー）は、好ましくは分離したほうがよく、複合体の分離方法は、特に限定されず、好ましくは、遠心分離法、吸引ろ過法が挙げられる。
捕捉プローブ及びその複合体を「遠心分離法」により沈殿させる工程は、通常、２０〜３０℃で０．２〜５分間、５００〜３０００×ｇの遠心、２３〜２８℃で０．５〜２分間、８００〜１５００×ｇの遠心、好ましくは、２５℃で１分間、１０００×ｇの遠心にて行う。より具体的には、ビーズの製造会社の取扱説明書に従えばよい。
【００５６】
捕捉プローブ及びその複合体を「吸引ろ過法」により分離させる工程は、Biochem Biophys Res Commun. 2015 Nov 27;467(4):1012-8.に記載の方法にて実施できる。具体的には、捕捉プローブ及びその複合体を含む溶液をフィルタープレートへ移し変え、通常、２０〜３０℃で陰圧範囲１〜１０in.Hgの吸引、２３〜２８℃で１〜１０in.Hgの吸引、好ましくは、２５℃で１〜５in.Hgの吸引にて行う。吸引時間は、フィルター上から目視で液体が除去されていればよく、例えば１秒〜５分間、好ましくは５秒間〜１分間が挙げられる。フィルタープレートのポアサイズは、捕捉プローブの直径より小さいものが好適に用いられ、例えば１．２μｍ又は１．０μｍが好ましい。具体的な部材の例として、フィルタープレート:MultiScreen(登録商標) HTS-BV plate (Merck Millipore、製品番号:MSBVN1250)、マニフォールド:MultiScreen(登録商標) HTS Vacuum Manifold (Merck Millipore)、吸引ポンプ:Chemical duty pump (Merck Millipore、カタログ番号:WP6110060) が挙げられる。
【００５７】
（試料）
本発明の方法に使用する「試料」は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ラット、モルモット、又はマウスの全血、血清、血漿、リンパ液、尿、唾液、涙液、汗、胃液、膵液、胆汁、胸水、関節腔液、脳脊髄液、髄液、骨髄液などの体液若しくは肝臓、腎臓、肺、心臓などの組織等である。好ましくは、試料は、ヒトの全血、血清、血漿、又は尿である。更に好ましくは、試料は、標的オリゴヌクレオチドを含む医薬を投与されたヒトの全血、血清、血漿、又は尿である。
【００５８】
本発明の方法に使用する「洗浄緩衝液」は、好ましくは、0.01〜0.05%の界面活性剤を含み、更に好ましくは、0.02%のTween20等の非イオン性界面活性剤を含む。好ましくは、非イオン性界面活性剤はTween20である。更に好ましくは、「洗浄緩衝液」は、1×PBS((10×PBS(ニッポンジーン、製品番号：314-90185を10倍希釈)137mM塩化ナトリウム,8.1mMリン酸水素二ナトリウム,2.68mM塩化カリウム,1.47mMリン酸二水素カリウム,pH 7.4 ± 0.2))、及び0.02%Tween20を含む。より更に好ましくは、「洗浄緩衝液」は、1×PBS、0.02%Tween20、及び1.5ppmProClin300を含む。「洗浄緩衝液」は、0.01〜1%、0.02〜0.5%、0.05〜0.2%、あるいは、0.1%のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んでいてもよい。
【００５９】
本発明の第１及び第２オリゴヌクレオチドポリマーを検出する方法は、例えば、濁度法、アガロース電気泳動法、吸光度法、蛍光測定法、フローサイトメトリー法が挙げられ、好ましくは、フローサイトメトリー法が挙げられる。
フローサイトメトリー法としては、例えば、「フローサイトメトリー法を用いて、第１の蛍光物質が発する第１の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を検出する工程」で行われ、「フローサイトメトリー法を用いて、第１の蛍光物質が発する第１の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を検出する工程」は、第１の蛍光物質が発する第１の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を、同時に又は同一機会に検出することが好ましい。ここで、「同時又は同一機会に検出する」とは、１つの複合体（３成分複合体又は４成分複合体）に含まれる第１の蛍光物質と第２の蛍光物質が、フローサイトメーターの流路内で同時に又は順次に励起され、発せられた第１の蛍光と第２の蛍光が、当該１つの複合体から発せられた蛍光として検出されることを意味する。
より具体的には、第1の蛍光物質としては、捕捉プローブの固相が含む蛍光物質等が挙げられ、第２の蛍光物質としては、第1及び第２のオリゴヌクレオチドに付与された標識物質に特異的に結合する物質に予め結合された蛍光物質が挙げられる。これらの第1及び第２の蛍光物質が含まれる反応液をフローサイトメトリー法を用いて、第1の蛍光物質が発する第1の蛍光と第２の蛍光物質が発する第２の蛍光を検出することができる。            
【００６０】
本発明において標的オリゴヌクレオチドの検出キットは、少なくとも以下の構成を含むキットをいう。
（１）一本鎖特異的ヌクレアーゼ
（２）標的オリゴヌクレオチドを捕捉するための捕捉プローブ
（３）第１及び第２のオリゴヌクレオチドからなる自己凝集可能な一対のプローブ
また、必要に応じて、第１のポリヌクレオチド、リガーゼ、ポリＡポリメラーゼ、アシストプローブ等が含まれている。各構成については、上述のとおりである。
【実施例】
【００６１】
〔実施例１〕
1. 材料及び方法
(ア) 標的オリゴヌクレオチド
測定対象の標的オリゴヌクレオチドとしては、Weiらが使用したGTI-2040を用いた(Wei 2006参照)。GTI-2040の配列は、5'-GGCTAAATCGCTCCACCAAG-3'(配列番号1)である。標的オリゴヌクレオチドの代謝物のモデル(本明細書において、「類似物質」と呼ぶことがある。)として、Weiらが使用した3'N-1、3'N-2、5'N-1、Mismatched GTI-2040、及びScrambled GTI-2040を用いた。3'N-1及び3'N-2(配列番号2及び配列番号3)は3'末端が1〜2塩基欠損したオリゴヌクレオチドであり、5'N-1(配列番号4)は5'末端が1塩基欠損したオリゴヌクレオチドであり、Mismatched GTI-2040(5'-GGCTAAACTCGTCCACCAAG-3')(配列番号5)は内部に4つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドであり、Scrambled GTI-2040(5'-ACGCACTCAGCTAGTGACAC-3')(配列番号6)はGTI-2040と同じGC含量のまま塩基の順番を入れ替えたオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは全て日本遺伝子研究所社に合成を依頼した(HPLC精製グレード)。上記の標的オリゴヌクレオチド及び標的オリゴヌクレオチドの代謝物のモデルは、Weiらと同様に、完全S化(Phosphorothioate)されている。【００６２】
（イ）核酸プローブ、捕捉プローブ
Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、GTI-2040に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（核酸プローブ）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させ、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(Thermo Fisher Scientific, 製品番号: EK0032)を用いて5'末端をリン酸化し、これに20merのポリ(T)オリゴヌクレオチドをT4 DNAリガーゼ(Thermo Fisher Scientific, 製品番号: 15224-025)を用いてライゲーションすることにより調製した。結合方法はLuminex社のマニュアル集(xMAP(登録商標) Cookbook, 3rd Edition)に従った。キナーゼ処理及びリガーゼ処理は、添付の使用説明書に従った。GTI-2040に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（核酸プローブ）の配列は5'-CTTGGTGGAGCGATTTAGCC-3'(配列番号7)であり、ポリ(T)オリゴヌクレオチドの配列は5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(配列番号8)である。【００６３】
本発明の方法に使用する自己凝集可能な一対のプローブの配列は、５’末端がビオチンで標識されており、
5’-(Biotin)-CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’
(塩基部分は配列番号9。Ccb4530-1-XY-20T-Bと呼ぶ)及び
5’-(Biotin)-GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’
(塩基部分は配列番号10。Ccb4530-2-XY-20A-B と呼ぶ)である。【００６４】
(ウ) 本発明の方法による標的オリゴヌクレオチドの定量
(1) 緩衝液、希釈液、及び反応液の調製
「PAP Mix」：市販キット（A-PlusTM Poly(A) Polymerase Tailing Kit、CELLSCRIPT社、製品番号: C-PAP5104H）の添付試薬を用いて、10x 反応バッファー（キット添付；0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl, and 100mM MgCl2）を2μL、10mM ATP（キット添付）を2μL、poly(A) polymerase（キット添付）を0.5μL、Nuclease-Free Waterを5.5μLを混合して、合計10μLのPAP Mixを調製した。サンプル数に応じて必要な量のPAP Mixを調製した。【００６５】
「オリゴヌクレオチド溶液」: 測定対象の標的オリゴヌクレオチド及びその代謝物のモデルを、以下の濃度でTE (10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0))に溶解し、オリゴヌクレオチド溶液を調製した: GTI-2040については1,000、500、250、125、62.5、31.25pM; その他については125pM。オリゴヌクレオチドを含まないブランクサンプルも用意した。【００６６】
「1st Hybridization反応液」: 捕捉プローブを0.33μL(1500個/μL)、5M 塩化テトラメチルアンモニウム(Tetramethylammonium chloride, TMAC)を7.7μL、10×補充液を5.6μL、Nuclease-Free Water を1.37μLを混合し、合計15μLの1st Hybridization反応液を調製した。10×補充液の組成は、500mM Tris-HCl(pH8.0)、40mM EDTA(pH8.0)、8%N-ラウロイルサルコシンナトリウムである。サンプル数に応じて必要な量の1st Hybridization反応液を調製した。【００６７】
「10×S1 Nuclease Buffer」: 8mLの3M酢酸ナトリウム溶液(pH 5.2、富士フイルム和光純薬,製品番号: 316-90081)、13.0906gの塩化ナトリウム(関東化学, 製品番号:37144-00)、8mLの0.1M酢酸亜鉛溶液(富士フイルム和光純薬, 製品番号:267-01575)をよく混合した。pH4.5に調整し、Nuclease-Free Waterにて総量を80mL にメスアップした。0.22μmフィルターで滅菌し、使用まで冷凍 (-20℃) 保存した。【００６８】
「S1 Nuclease Buffer-T」: 40mLの10×S1 Nuclease Buffer、2mLの10% Tween20溶液(Merck  Millipore,製品番号:655206)をよく混合した。pH4.5に調整し、Nuclease-Free Waterにて総量を400mL にメスアップした。0.22μmフィルターで滅菌し、室温で保存した。【００６９】
「S1 Nuclease Master Mix」: 7.5μLの10×S1 Nuclease Buffer(pH4.5)、0.056μLのS1 Nuclease(180 U/μL、タカラバイオ、製品番号：2410A)、及び67.44μLのNuclease-Free Waterを混合し、合計75μLのS1 Nuclease Master Mixを調製した。サンプル数に応じて必要な量のS1 Nuclease Master Mixを調製した。【００７０】
「自己凝集開始Mix」: 5M TMACを15μL、10×補充液を8μL、20 pmol/μLのCcb4530-2-XY-20A-B を0.05μL、Nuclease-Free Waterを26.95μL添加し、混合して自己凝集開始Mixを調製した(合計50μL)。サンプル数に応じて必要な量の自己凝集開始Mixを調製した。【００７１】
「自己凝集Mix」: 5M TMACを4.5μL、10×補充液を2.4μL、20 pmol/μLのCcb4530-1-XY-20T-B を1.75μL、20pmol/μLのCcb4530-2-XY-20A-B を1.4μL、Nuclease-Free Waterを5.0μL添加し、混合して自己凝集Mixを調製した(合計15μL)。サンプル数に応じて必要な量の自己凝集Mixを調製した。【００７２】
「1×PBS-TP」: 最終濃度が1×PBS(10×PBS(ニッポンジーン、製品番号:314-90185)を10倍希釈)、0.02% Tween20、1.5ppm ProClin300(Merck,製品番号:48912-U)となるように、1×PBS-TPを調製した。【００７３】
「SAPE溶液」: PhycoLink(登録商標) Streptavidin-R-Phycoerythrin(ProZyme社、製品番号: PJ31S)を、1×PBS-TPで希釈して、5μg/mLのSAPE溶液を調製した。【００７４】
(2) Poly(A)付加反応
PCRプレートにPAP Mixを10μL、及び、オリゴヌクレオチド溶液を10μL添加し、混合した(合計20μL)。サーマルサイクラーを用いて、反応液を37℃で15分間保温した後、65℃で10分間熱処理し、次の処理まで4℃で保持した。【００７５】
(3) 捕捉プローブへのpoly(A)付加オリゴヌクレオチドの捕捉（ハイブリダイゼーション）
poly(A)付加反応後のオリゴヌクレオチド溶液に、15μLの1st Hybridization反応液を添加し、混合した(合計35μL)。当該混合液を50℃で13.5時間保温した後、次の処理まで4℃で保持した。【００７６】
(4) 洗浄工程
保温後に、40μLのNuclease-Free Waterを添加し、25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。75μLのS1 Nuclease Buffer-Tを添加し、25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。【００７７】
(5) S1ヌクレアーゼ処理
上記の洗浄工程後のビーズに、75μLのS1 Nuclease Master Mixを添加し、混合してビーズを再懸濁した。当該ビーズを37℃で30分間保温した。【００７８】
(6) 洗浄工程
保温後に、25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。75μLの0.05% Tween20を添加し、25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。【００７９】
(7) 自己凝集反応
上記洗浄工程後のビーズに、50μLの自己凝集開始Mixを添加し、混合してビーズを再懸濁した。当該ビーズを50℃で3分間保温（一本鎖工程）した後、30℃で30分間保温し、保温後に、当該混合液に自己凝集Mixを15μL添加し、混合して(合計65μL)、30℃で1時間保温した(自己凝集反応)。【００８０】
(8) 洗浄工程
保温後に、25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。室温の1×PBS-TPを各ウェルに75μL添加し、再度、25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。【００８１】
(9) SAPE処理
PCRプレートの各ウェルに、SAPE溶液を50μLずつ添加し、混合した。遮光下、PCRプレートを25℃で10分間静置し、SAPEをビオチンと反応させた。【００８２】
(10) 過剰なSAPEの洗浄
SAPE反応液を含むPCRプレートを25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。ビーズのペレットに1×PBS-TPを75μL添加して、再び25℃で1分間、1000×gの遠心にかけて、ビーズを沈殿させ、上清をスナッピングにて除去した。この再懸濁、遠心、及び上清除去の操作を更に1回繰り返した。ビーズのペレットに1×PBS-TPを75μL添加して、混合してビーズを再懸濁した。【００８３】
(11) 蛍光検出
再懸濁したビーズを含むPCRプレートをフローサイトメトリー(Luminex社製、Luminexシステム)にセットし、当該フローサイトメトリーを用いてビーズ及びSAPE抱合体からの蛍光を検出した。【００８４】
２．  試験結果
(ア) 本発明の方法による標的オリゴヌクレオチドの定量結果
本発明の方法による標的オリゴヌクレオチドの定量結果を図1に示す。試料中の標的オリゴヌクレオチドの濃度に依存した蛍光シグナルが得られた。試料中の標的オリゴヌクレオチドの濃度と蛍光シグナルの相関係数(r)は0.9995であり、高い相関性が認められた。【００８５】
(イ) 本発明の方法による標的オリゴヌクレオチドの定量の特異性の評価
本発明の方法を用いて標的オリゴヌクレオチドの代謝物のモデルを定量した場合の交差反応性を表1に示す。3'末端又は5'末端を欠損する代謝物のモデルについて、交差反応性を約14〜26%に抑制することができた。また、内部に4つのミスマッチを有する類似物質及び同じＧＣ含量のまま塩基の順番を入れ替えた類似物質についても、交差反応性を10%未満に抑制することができた。【００８６】
【表１】
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【００８７】
〔実施例２〕
実施例１においてはポリＡを付加した標的オリゴヌクレオチドを捕捉プローブにより捕捉したが、本実施例では、ポリＡを付加せずに、標的オリゴヌクレオチドの全部に対して相補的な配列を含む捕捉プローブにより標的オリゴヌクレオチドを捕捉して、当該標的オリゴヌクレオチドを特異的に検出できることを確認した。なお、自己凝集反応は、アシストプローブを介して行った。【００８８】
１．材料及び方法
（１）捕捉プローブの調製
Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、GTI-2040に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ（核酸プローブ）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した（捕捉プローブという）。GTI-2040に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの配列は5'-CTTGGTGGAGCGATTTAGCC-3'(配列番号7)である。【００８９】
（２）捕捉プローブへの標的オリゴヌクレオチドの捕捉（ハイブリダイゼーション）
測定対象物質10μLに、1st Hybridization反応液を20 μL加え、計30 μLとし、50℃で13.5時間反応させた。
（２−１）1st Hybridization反応液 の組成
上記（１）で調製した捕捉プローブ0.25 μL（500個）、5M TMAC 6.6 μL、10x supplement（補充液） [500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40 mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム] 4.8 μL、Nuclease-Free Water 8.35 μL
（２−２）測定対象物質、類似物質
測定対象物質（標的オリゴヌクレオチド）、類似物質として実施例１と同じ物質（3'N-1、3'N-2、 Mismatched GTI-2040、 Scrambled GTI-2040）及び3'N-3（GTI-2040の３’末端が３塩基欠失したオリゴヌクレオチド）を用い、TE (10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0))を用いて以下の濃度に調製して用いた。GTI-2040については1,000、125、50pM、その他については125pMに調製した。オリゴヌクレオチドを含まないブランクサンプルも用意した。【００９０】
（３）切断工程（Ｓ１ヌクレアーゼ処理）
捕捉工程後の反応液30 μLをNuclease-Free Waterで1回洗浄した後、S1 Nuclease Buffer-Tで1回洗浄した。その後、洗浄後のビーズにS1 Nuclease反応液を75 μL加え、計75 μLとし、37℃で30分間反応させた。【００９１】
（３−１）S1 Nuclease Buffer-Tの組成
30mM Sodium Acetate、280 mM Sodium Chloride、1mM Zinc Acetate、0.05% Tween20、pH4.5
（３−２）S1 Nuclease反応液の組成
10x S1 Nuclease Buffer [300mM Sodium Acetate、2800 mM Sodium Chloride、10mM Zinc Acetate、pH4.5] 7.5 μL、S1 Nuclease (180 U/μL、タカラハ゛イオ、製品番号:2410A) 0.056 μL、Nuclease-Free Water 67.4 μL【００９２】
（４）検出用複合体形成補助工程（アシストプローブハイブリダイゼーション）
切断工程後の反応液75 μLを0.05% Tween20で1回洗浄した後、洗浄後のビーズにAP Hybridization反応液を50 μL加え、計50 μLとし、95℃で3分間加温後（一本鎖工程）、50℃で30分間反応させた。
（４−１）AP Hybridization反応液の組成
5M TMAC 15 μL、10x supplement  [500mM Tris-HCl(pH8.0)、40mM EDTA(pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム] 8 μL、20 pmol/ μL Ccb4530-2-ZYZ-8-B 0.05μL、Nuclease-Free Water 26.95 μL
本発明の方法に使用するアシストプローブの配列は、
5’-(Biotin)- CCACCAAGCACTCCTTATATCCTTCATCGGTATCCACTCCTTATATC -3’
（塩基部分は配列番号１１。Ccb4530-2-ZYZ-8-Bと呼ぶ。）である。【００９３】
（５）検出用複合体形成工程（自己凝集反応／パルサー反応）
検出用複合体形成補助工程後の反応液50 μLに、PALSAR反応液を15μL加え、計65 μLとし、30℃で1時間反応させた。
本発明の方法に使用する自己凝集可能な一対のプローブの配列は、５’末端がビオチンで標識されており、
5’-(Biotin)- CAACAATCAGGACGATACCGATGAAGGATATAAGGAGTG -3’（塩基部分は配列番号１２。Ccb4530-1Bと呼ぶ）及び
5’-(Biotin)- GTCCTGATTGTTGCTTCATCGGTATCCACTCCTTATATC -3’（塩基部分は配列番号１３。Ccb4530-2Bと呼ぶ）である。【００９４】
（５−１）PALSAR反応液
5M TMAC 4.5 μL、10x supplement [500mM Tris-HCl(pH8.0)、40mM EDTA(pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム]2.4 μL、20 pmol/μL Ccb4530-1B 1.75 μL、20 pmol/μL Ccb4530-2B 1.4 μL 、Nuclease-Free Water 5.0 μL【００９５】
（６）検出工程(蛍光検出）
検出用複合体形成工程後の反応液を1xPBS-TP [1xPBS [137 mM Sodium Chloride、8.1 mM Disodium Phosphate、2.68 mM Potassium Chloride、1.47 mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5 ppm ProClin300]で1回洗浄した後、検出試薬[SAPE (Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで2 回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSAPE抱合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。      【００９６】
２．試験結果
本実施例２の方法を用いて標的オリゴヌクレオチドおよびその代謝物（類似物質）のモデルを定量した場合の交差反応性を表２に示す。3'末端を欠損する代謝物のモデルについて、交差反応性を２６％未満に抑制することができた。また、内部に4つのミスマッチを有する類似物質及び標的オリゴヌクレオチドと同じGC含量のまま塩基の順番を入れ替えた類似物質についても、交差反応性を３０〜４０％程度に抑制することができた。【００９７】
【表２】
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【００９８】
〔実施例３〕（任意塩基付加）
実施例１においては標的オリゴヌクレオチドにポリＡを付加してこれを捕捉プローブにより捕捉したが、本実施例では、ポリＡの代わりに任意の塩基を付加し、標的オリゴヌクレオチドを検出できることを確認した。【００９９】
１．材料及び方法
（１）捕捉プローブの調製
Luminex社のMicroPlexTM Microspheres(Region No.: 43、製品番号: LC10043-01)に、GTI-2040に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチドプローブ（核酸プローブ）を、3’末端のNH2修飾を介して結合させることにより調製した。結合方法はLuminex社のマニュアル集(xMAP(登録商標) Cookbook, 3rd Edition)に従った。GTI-2040に相補的な領域を含む核酸プローブの配列は5'-TCGCTATTCCTTGGTGGAGCGATTTAGCC-NH2-3'(配列番号１４)である。【０１００】
（２）測定対象物質
測定対象物質（標的オリゴヌクレオチド）として実施例１と同じ物質を0、1,000pMで用いた。【０１０１】
（３）捕捉工程
測定対象物質10 μLに、Hybridization反応液 [5M TMAC 6 μL、10x supplement [500 mM Tris-HCl (pH8.0)、40 mM EDTA (pH8.0)、8% N-ラウロイルサルコシンナトリウム] 3.2 μL、1 pmol/ μL P-AP2-B 0.2 μL、捕捉プローブ0.5 μL（1000個）、Nuclease-Free Water 0.1 μL] を10 μL加え、計20 μLとし、50℃で1時間反応させた。
（3-1）P-AP2-Bの配列（任意の塩基）
5’-リン酸化-GAATAGCGA-Biotin-3’【０１０２】
（4）ライゲーション工程
捕捉工程後の反応液20 μLをNuclease-Free Waterで1回洗浄した。その後、洗浄後のビーズにLigation反応液を50 μL加え、計50 μLとし、50℃で1時間反応させた。
（４−１）Ligation反応液の組成
10x 9°N DNA Ligase Reaction Buffer [100 mM Tris-HCl、6000 μM ATP、25 mM Magnesium Chloride、25 mM Dithiothreitol、1 % Triton X-100、pH 7.5] 5 μL、9°N DNA Ligase(*) (40 U/μL、New England Biolabs、製品番号：M0238S) 0.25 μL、Nuclease-Free Water 44.75 μL
(*）9°N DNA Ligaseは、DNAのニックを修復する酵素であり、標的オリゴヌクレオチドの３’ヒドロキシ末端とP-AP-Bの５’リン酸末端とのホスホジエステル結合を触媒する。【０１０３】
（５）切断工程（Ｓ１ヌクレーゼ処理）
ライゲーション工程後の反応液50 μLをS1 Nuclease Buffer-Tで２回洗浄した。その後、S1 Nuclease 反応液を加え、計50 μLとし、37℃で30分間反応させた。
（５−１）S1 Nuclease Buffer-T の組成
30mM Sodium Acetate、280 mM Sodium Chloride、1mM Zinc Acetate、0.05% Tween20、pH4.5
（５−２）S1 Nuclease反応液の組成
10x S1 Nuclease Buffer [300mM Sodium Acetate、2800 mM Sodium Chloride、10mM Zinc Acetate、pH4.5] 5 μL、S1 Nuclease (180 U/μL、タカラバイオ、製品番号：2410A) 0.056 μL、Nuclease-Free Water 44.94 μL【０１０４】
（6）検出工程(蛍光検出）
切断工程後の反応液を1xPBS-TP [1xPBS [137 mM Sodium Chloride、8.1 mM Disodium Phosphate、2.68 mM Potassium Chloride、1.47 mM Potassium Dihydrogenphosphate]、0.02% Tween20、1.5 ppm ProClin300]で1回洗浄した後、検出試薬[SAPE (Prozyme社製) 5 μg/mL]を50 μL加え、25℃の遮光下で10分間静置した後、1xPBS-TPで2 回洗浄した。その後1xPBS-TPを75 μL加え、Luminex System (Luminex社製)でビーズ及びSAPE抱合体からの蛍光を測定し、測定対象物質のシグナルを検出した。なお、本実施例では、熱変性処理(一本鎖工程)及びパルサー反応によるシグナル増幅を行うことなく、標的オリゴヌクレオチド-付加塩基の付加物と捕捉プローブとのハイブリダイゼーション反応物を直接検出した。【０１０５】
２．試験結果
標的オリゴヌクレオチドのモデルのシグナル (MFI, Median Fluorescent Intensity)を表３に示す。なお、数値はブランク値（標的オリゴヌクレオチド未添加（OpM）のシグナル）を引いた値を示した。標的オリゴヌクレオチド未添加 (0pM) と比較して標的オリゴヌクレオチド添加 (1,000 pM)においてシグナルの上昇が確認でき、標的オリゴヌクレオチドへの任意の塩基が付加された標的オリゴヌクレオチドを検出することができた。【０１０６】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明のオリゴヌクレオチドの検出又は定量方法を用いることにより、医薬品開発の探索段階における薬物動態・薬力学(PK/PD)スクリーニング試験、非臨床段階における安全性試験、薬理試験及び薬物動態試験、臨床段階において、薬物が投与された動物あるいはヒト生体試料中の薬物濃度を測定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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