(57)【要約】  本発明はヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する方法であって、（１）未分化ヒトｉＰＳ細胞を非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程、（２）上記工程（１）で得られたヒトｉＰＳ細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び（３）上記工程（２）で得られたヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する方法であって、
（１）未分化ヒトｉＰＳ細胞を非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程、
（２）上記工程（１）で得られたヒトｉＰＳ細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られたヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（２）において中胚葉への分化を誘導するための成分としてレチノイン酸のみを配合した培地を用いる方法を除く、方法。
【請求項３】
前記工程（１）における培養時間が０．５〜３．５日間である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（２）における培養が、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びヘッジホッグシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｗｎｔシグナル活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、６−ブロモインディルビン−３’−オキシム、ケンパウロン、ＳＢ−２１６７６３、ＳＫＬ２００１、デオキシコール酸、ＷＡＹ−３１６６０６、ＮＳＣ−６９３８６８、リシニン、７−ｏｘｏ−β−シトステロール、ＩＭ−１２及びＨＬＹ７８からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘッジホッグシグナル阻害剤が、シクロパミン、ＡＹ９９４４、ＧＡＮＴ５８、ＧＡＮＴ６１、ジェルビン、ＳＡＮＴ−１、ＳＡＮＴ−２、Ｕ１８６６６Ａ、ベラトラミン、ビスモデギブ、Ｃｕｒ−６１４１４、ロボトニキニン、ＪＫ１８４及びＨＰＩ−４からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（３）における培養が、低酸素模倣化合物及びスタチン化合物からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により、ヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する工程、及び
当該骨芽細胞塊を不活化処理する工程
を含む、骨再生剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞を用いた骨芽細胞塊の作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨腫瘍摘出、粉砕骨折、関節リウマチの固定に伴う骨欠損、顎堤吸収等により失われた骨の欠損部等に対して、これらを補うための人工骨・骨補填材料の需要は非常に高まっている。【０００３】
現在、臨床で人工骨・骨補填材料として使用されている、ハイドロキシアパタイト等の非吸収性材料、及びβ−第３リン酸カルシウム等の吸収性材料は、自家骨と比較して骨誘導性に欠ける等の問題があり、外科的処置の予後が必ずしも良くなかった。また、次世代型として開発推進が望まれている人工骨とＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の成長因子タンパク質とを組み合わせたハイブリッド人工骨・骨補填材は、骨組織再生に重要な「細胞外基質」がないため、十分な骨再生効果を得ることができなかった。【０００４】
かかる状況の下、本発明者は、幹細胞を原料とし、不活化細胞塊を含み、前記不活化細胞塊が少なくとも石灰化物及び細胞外基質を含むことを特徴とする骨再生剤を作製することに成功している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１５／０６４７０５
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Stem Cell Reports Vol. 2, 751-760, June 3, 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトｉＰＳ細胞を原料として、立体的かつ中実の骨芽細胞塊を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記状況の下、ヒトｉＰＳ細胞を原料に用い、特許文献１に記載の方法に従い、ＥＳ培地での２日間の培養、さらにレチノイン酸を加えて２日間の培養を行い、骨芽細胞分化誘導培地で培養する方法により骨芽細胞塊を作製すると、マウスｉＰＳ細胞を用いた場合と異なり、細胞塊は得られるものの、当該細胞塊の形状は中空の袋状（嚢状）となってしまった。また、上記方法において、レチノイン酸の添加を省略しても、同様に当該細胞塊の形状は中空の袋状となってしまった。一方、非特許文献１には、胚様体の形成を誘導する工程を行わず、ヒトｉＰＳ細胞を中胚葉系細胞分化誘導培地で接着培養し、骨芽細胞分化誘導培地で接着培養することにより、骨芽細胞塊を製造した旨の記載がされている。しかし、非特許文献１に記載の方法で得られる細胞は、培養容器の壁面に沿って平面的に増殖しているため、人工骨・骨補填材料の原料となる立体的な細胞塊として回収することができない。そのため、本発明者らは、非接着培養とする以外、非特許文献１に記載の方法に従い、培養を行ったところ、非接着培養だと、細胞死が引き起こされてしまい、必要となる細胞塊を得ることができなかった。これらの新たに見出された結果に基づき、本発明者らはさらに、鋭意研究した結果、胚様体の形成を誘導する工程、当該工程で得られた胚様体の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び当該工程で得られた中胚葉系細胞の骨芽細胞への分化を誘導する工程という３工程を経ることにより、非接着培養であっても、ヒトｉＰＳ細胞から袋状でない骨芽細胞塊を得ることができることを見出した。本発明者らは、当該新たな知見に基づき、培養条件等をさらに精査し、本発明を完成させた。【０００９】
従って、本発明は以下の項に示す方法を提供する：
項１.ヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する方法であって、
（１）未分化ヒトｉＰＳ細胞を非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程、
（２）上記工程（１）で得られたヒトｉＰＳ細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られたヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程
を含む方法。【００１０】
項２．項１に記載の方法であって、前記工程（２）において中胚葉への分化を誘導するための成分としてレチノイン酸のみを配合した培地を用いる方法を除く、方法。【００１１】
項３．前記工程（１）における培養時間が０．５〜３．５日間である、項１又は２に記載の方法。【００１２】
項４．前記工程（２）における培養が、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びヘッジホッグシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。【００１３】
項５．前記Ｗｎｔシグナル活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、６−ブロモインディルビン−３’−オキシム（６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ）（ＢＩＯ）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ−２１６７６３、ＳＫＬ２００１、デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＷＡＹ−３１６６０６、ＮＳＣ−６９３８６８、リシニン（ｒｉｃｉｎｉｎ）、７−ｏｘｏ−β−シトステロール（７−ｏｘｏ−β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）、ＩＭ−１２、ＨＬＹ７８等からなる群より選択される少なくとも一種である、項４に記載の方法。【００１４】
項６．前記ヘッジホッグシグナル阻害剤が、シクロパミン、ＡＹ９９４４、ＧＡＮＴ５８、ＧＡＮＴ６１、ジェルビン、ＳＡＮＴ−１、ＳＡＮＴ−２、Ｕ１８６６６Ａ、ベラトラミン、ビスモデギブ（Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ）、Ｃｕｒ−６１４１４、ロボトニキニン（Ｒｏｂｏｔｎｉｋｉｎｉｎ）、ＪＫ１８４、ＨＰＩ−４等からなる群より選択される少なくとも一種である、項４又は５に記載の方法。【００１５】
項７．前記工程（３）における培養が、低酸素模倣化合物及びスタチン化合物からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、項１〜６のいずれか１項に記載の方法。【００１６】
項８．項１〜７のいずれか１項に記載の方法により、ヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する工程、及び
当該骨芽細胞塊を不活化処理する工程
を含む、骨再生剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、非接着培養を用いることによりヒトｉＰＳ細胞から立体的な骨芽細胞塊を得ることができる。また、本発明によれば、袋状でない中実の骨芽細胞塊を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本願実施例における中胚葉細胞塊の形成を評価するための免疫蛍光染色の結果を示す。
【図２】本願実施例における各試験の培養手順の概要と得られた細胞塊の写真を示す。
【図３】本願実施例における段階的分化誘導法の各試験により得られた骨芽細胞塊のH&E染色、von Kossa染色、又はOsteocalcinの免疫蛍光染色の結果を示す。Ａ  非接着＋振盪培養。Ｂ  非接着培養。Ｃ  低酸素模倣化合物（Desferrioxamine）を添加。Ｄ  スタチン化合物（Simvastatin）を添加
【図４】本願実施例で用いたシーソー型バイオリアクターの概要を示す。
【図５】本願実施例で用いた培養フラスコの概略図を示す。
【図６】胚様体誘導期間がその後の中胚葉誘導に及ぼす影響（（Brachyuryタンパク質発現））。本願実施例における中胚葉細胞塊の形成を評価するための免疫蛍光染色の結果を示す。
【図７】胚様体誘導期間がその後の中胚葉誘導に及ぼす影響（Brachyury遺伝子発現）。本願実施例において種々の日数で胚様体誘導し、中胚葉誘導した場合のBrachyury遺伝子の発現量のグラフを示す。
【図８】1日間の胚様体誘導による中胚葉誘導前後の中胚葉マーカー遺伝子発現に及ぼす影響。本願実施例における中胚葉誘導前後のBrachyury遺伝子の発現量のグラフを示す。
【図９】CHIR99021およびCyclopamineが中胚葉誘導に及ぼす影響。本願実施例におけるBrachyury遺伝子の発現量に対するCHIR99021及びcyclopamine非存在下の影響に関するグラフを示す。
【図１０】ヒトiPS細胞由来骨芽細胞塊とヒト凍結乾燥骨の成分比較。本願実施例における骨芽細胞分化誘導した細胞塊とヒト凍結乾燥骨とのFTIR解析結果を示す。実線：乾燥不活化iPS細胞由来細胞塊。点線：ヒト凍結乾燥骨（FDBA）。
【図１１】ヒトiPS細胞由来凍結乾燥骨芽細胞塊を用いた骨形成促進。本願実施例における三次元骨芽細胞塊の骨再生能の評価結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
骨芽細胞塊の製造方法
本発明は、ヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する方法であって、
（１）未分化ヒトｉＰＳ細胞を非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程、
（２）上記工程（１）で得られたヒトｉＰＳ細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られたヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程
を含む方法を提供する。
【００２０】
（１）胚様体形成の誘導
本発明の方法は、未分化ヒトｉＰＳ細胞を非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程を含む。
【００２１】
原料として用いるヒトｉＰＳ細胞としては、体細胞に核初期化物質を導入することにより作製されたものを用いることができる。 
【００２２】
ｉＰＳ細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、ヒト由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、口腔粘膜細胞（例、歯肉線維芽細胞、頬粘膜線維芽細胞、歯肉上皮細胞、頬粘膜上皮細胞等）、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞等）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞等）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞等）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞等）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞等）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞等）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞等）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞等）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞等）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞等）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球等）、感覚に関する細胞（例、桿細胞等）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン等）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞等）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞等）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞等）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞等）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００２３】
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
[1] Oct3/4, Klf4, c-Myc
[2] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2（ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c-MycはT58A（活性型変異体）, N-Myc, L-Mycで置換可能である。）
[3] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-catenin (活性型変異体S33Y)
[4] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
[5] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
[6] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
[7] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
[8] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil（以上、ＷＯ２００７／０６９６６６を参照（但し、上記[2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf2（又はKlf5）, c-Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009)も参照。「Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
[9] Oct3/4, Klf4, Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）
[10] Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）
[11] Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）
[12] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28（Cell Research (2008) 600-603を参照）
[13] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40LT（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）
[14] Oct3/4, Klf4（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照）
[15] Oct3/4, c-Myc（Nature 454:646-650 (2008)を参照）
[16] Oct3/4, Sox2 (Nature, 451, 141-146 (2008), ＷＯ２００８／１１８８２０を参照)
[17] Oct3/4, Sox2, Nanog (ＷＯ２００８／１１８８２０を参照)
[18] Oct3/4, Sox2, Lin28 (ＷＯ２００８／１１８８２０を参照)
[19] Oct3/4, Sox2, c-Myc, Esrrb (ここで、EssrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
[20] Oct3/4, Sox2, Esrrb (Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
[21] Oct3/4, Klf4, L-Myc
[22] Oct3/4, Nanog
[23] Oct3/4
[24] Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）
[25] Oct3/4, Klf4, Sox2, GLISファミリーのメンバー（例えば、GLIS1、GLIS2、GLIS3等が挙げられ、好適には、GLIS1（GLIS family zinc finger 1）が挙げられる。 ＷＯ２０１０／０９８４１９, ＷＯ２０１１／１０２５３１を参照)
[26] Oct3/4, Klf4, Sox2, IRXファミリーのメンバー（例えば、IRX1、IRX2、IRX3、IRX4、IRX5、IRX6等が挙げられ、好適には、IRX6（iroquois homeobox protein 6）が挙げられる。 ＷＯ２０１０／０９８４１９を参照)
[27] Oct3/4, Klf4, Sox2, PTXファミリーのメンバー（例えば、PITX1、PITX2、PITX3等が挙げられ、好適には、PITX2（paired-like homeodomain transcription factor 2）が挙げられ、PITX2には３つのアイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ａ，  ｂ及びｃ）が知られており、いずれのアイソフォームも用いられ得るが、ｉｓｏｆｏｒｍ  ｂが特に好ましい。ＷＯ２０１０／０９８４１９を参照)
[28] Oct3/4, Klf4, Sox2, DMRTB1(DMRT-like family B with proline-rich C-terminal 1, ＷＯ２０１０／０９８４１９を参照)
上記[1]-[28]において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6等を用いることもできる。また、Sox2（又はSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7等を用いることもできる。さらに、Lin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28b等を用いることもできる。
【００２４】
また、上記[1]-[28]には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記[1]-[28]のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。 
【００２５】
これらの組み合わせの中で、Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin28及びSV40LTから選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。 
【００２６】
上記の各核初期化物質のヒトｃＤＮＡ配列情報は、ＷＯ２００７／０６９６６６又はＷＯ２０１０／０９８４１９に記載のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。なお、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg及びL-MycのヒトｃＤＮＡ配列情報は、それぞれ下記表１記載のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。 
【００２７】
【表１】
2018181960.tif 000002
【００２８】
また、GLISファミリーのメンバー、IRXファミリーのメンバー、PTXファミリーのメンバー、DMRTB1のヒトｃＤＮＡ配列情報は、それぞれ下記表２に記載のＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓを参照することにより取得できる。 
【００２９】
【表２】
2018181960.tif 000003
【００３０】
また、上記の各アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、且つKlf4の代替因子として野生型タンパク質と同等の核初期化能力を有する天然もしくは人工の変異タンパク質及びそれをコードする核酸も、本発明のKlf4を代替する核初期化物質として利用することができる。
【００３１】
核初期化物質としてタンパク性因子自体を用いる場合には、得られたｃＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該細胞を培養して得られる培養物から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたｃＤＮＡを、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピゾーマルベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００３２】
核初期化物質の体細胞への導入は、特許文献１（ＷＯ２０１５／６４７０５）等、本発明の属する技術分野において用いられている方法を適宜使用することができる。
【００３３】
また、ｉＰＳ細胞は、分化抵抗性の指標としてＣ４ＯＲＦ５１、ＨＨＬＡ１、ＡＢＨＤ１２Ｂ、ＺＮＦ５４１等の因子を用い、これらの因子が有意に発現しない株を選抜したものであってもよい（ＷＯ２０１３／０１４９２９参照）。
【００３４】
また、ｉＰＳ細胞としては、例えば、細胞の生存、増殖、未分化性維持等に必要な液性因子を供給し、かつ細胞接着の足場となるフィーダー細胞と共に培養しておき、胚様体形成誘導の前に適宜、フィーダー細胞を適宜除去したものを用いることができる。
【００３５】
本工程は、これらの未分化ｉＰＳ細胞を、胚様体の形成を誘導するために用いられる液体培地中で非接着培養することにより行うことができる。
【００３６】
本発明において、非接着培養とは、培養容器の底面等（例えば、底面及び壁面）への細胞の接着が抑制された状態での培養を意味する。本発明において、非接着培養には、振盪培養、培養容器の底面等への細胞の接着が抑制された非接着性培養容器（例えば、非接着性培養皿、非接着性ウェル、非接着性フラスコ、三次元培養プレート、細胞塊作製容器等）を用いた静置培養等が含まれる。非接着性培養容器としては、リン脂質ゲル、ハイドロゲル、微細加工等で低接着表面処理を行った容器等を用いることができる。また、本発明において、振盪培養には、上記非接着性培養容器を用いてもよいし、非接着性でない培養容器を用いてもよい。振盪培養をする場合、その方法は特に限定されないが、例えば、図４に示されるようなシーソー型バイオリアクターを用いて行うことができる。また、振盪培養の傾斜角は、特に限定されないが、水平方向に対して、１°〜４０°が好ましく、５°〜３５°がより好ましく、１０°〜３０°がさらに好ましい。振盪培養の振幅は、特に限定されないが、例えば、０．１〜２０ｃｍ程度であってもよい。振盪の周期は、特に限定されないが、例えば、０．０１〜１．００Hz程度であってもよい。図４では、傾斜角は１０°であり、振幅は５．５ｃｍである。培養フラスコをのせるテーブル（シーソー型バイオリアクターの部材）の横幅は特に限定されず、例えば、２０〜５０ｃｍ、３０〜４０ｃｍ等の範囲のものを使用することができる。テーブル培養フラスコとしては、特に限定されないが、培養面積（ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｅａ）が、例えば、５〜２００ｃｍ２、１０〜６０ｃｍ２、１５〜３５ｃｍ２等の範囲のものを用いることができる。振盪培養を行う場合、培養開始時の細胞濃度は、特に限定されないが、ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｅａ２５  ｃｍ２培養フラスコを用いた場合には、１×１０２〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／フラスコ程度が好ましく、１×１０６〜７×１０６ｃｅｌｌｓ／フラスコ程度がより好ましい。
【００３７】
培地としては、霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培養用の培地を適宜使用することができる。本発明においてＥＳ細胞培養用の培地を単にＥＳ培地と示すこともある。霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞培養用の培地としては、例えば、ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ社製、ＲＣＨＥＭＤ００１；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ；ＴｈｅｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６  ＭｅｄｉｕｍあるいはＳｔｅｍＦｌｅｘ培地等が挙げられる。かかる培地には、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）等の成長因子を配合してもよい。これらの成長因子は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。また、培地には、必要に応じて、幹細胞等の細胞培養の際に用い得る添加剤を配合してもよい。かかる添加剤の具体例としては、例えば、牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ等）が挙げられる。
【００３８】
本工程における培養時間としては、例えば、約０．５〜３．５日間が好ましく、０．６２５〜２．５日間がより好ましく、０．８７５〜１．２５日間がより好ましい。また、本工程における培養時間としては、例えば、約１２〜８４時間が好ましく、約１５〜６０時間がより好ましく、約２１〜３０時間がより好ましい。本工程の培養時間を上記範囲とすることにより、最終的な骨芽細胞塊を袋状でない中実な形状で得ることができるため好ましい。本工程における培養温度は特に限定されず、例えば、３０〜４２℃が好ましく、３５〜３９℃がより好ましい。本工程における培養は、３〜１０％ＣＯ２の雰囲気下で行うことが好ましい。
【００３９】
本工程により、非特許文献１のように未分化のヒトｉＰＳ細胞を直接、中胚葉系細胞誘導培地で培養するのではなく、未分化のヒトｉＰＳ細胞を一旦、胚様体に成長させておくことにより、次の中胚葉系細胞に誘導する段階での細胞死を大幅に抑制することができる。
【００４０】
従って、本発明の方法においては、工程（１）の胚様体形成工程は、中胚葉系細胞誘導を実質的に生じさせずに、胚様体の形成まででとどめることを意図する。従って、典型的には、工程（１）で用いる培地として、中胚葉系細胞への誘導剤を含まない培地が用いられる。
【００４１】
（２）中胚葉系細胞への分化誘導
本発明の方法は、上記工程（１）で得られたヒトｉＰＳ細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程を含む。
【００４２】
当該工程に用いる培地としては、中胚葉系細胞の分化誘導に適した培地を適宜使用することができる。かかる培地としては、例えば、ＤＭＥＭ培地；ナカライテスク社製、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ培地；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、ＲＰＭＩ  １６４０培地；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ(R)ＩＩ造血幹細胞増殖培地；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製等が挙げられる。これらの培地は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４３】
本工程に用いる培地には、中胚葉への分化誘導を促進する観点から、Ｗｎｔシグナル活性化剤を配合することが好ましい。Ｗｎｔシグナル活性化剤としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、６−ブロモインディルビン−３’−オキシム［６−ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）］、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ−２１６７６３、ＳＫＬ２００１、デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ    ａｃｉｄ）、ＷＡＹ−３１６６０６、ＮＳＣ−６９３８６８、リシニン（ｒｉｃｉｎｉｎｅ）、７−ｏｘｏ−β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ  （７−ｏｘｏ−β−ｓｉｔｏｓｔｅｒｏｌ）、ＩＭ−１２、ＨＬＹ７８等が挙げられ、ＣＨＩＲ９９０２１等が好ましい。これらのＷｎｔシグナル活性化剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４４】
Ｗｎｔシグナル活性化剤を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、１〜１００μＭが好ましく、１０〜５０μＭがより好ましい。
【００４５】
本工程に用いる培地には、中胚葉への分化誘導を促進する観点から、ヘッジホッグシグナル阻害剤を配合することが好ましい。ヘッジホッグシグナル阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、シクロパミン、ＡＹ９９４４、ＧＡＮＴ５８、ＧＡＮＴ６１、ジェルビン、ＳＡＮＴ−１、ＳＡＮＴ−２、Ｕ１８６６６Ａ、ベラトラミン、ビスモデギブ（Ｖｉｓｍｏｄｅｇｉｂ）、Ｃｕｒ−６１４１４、ロボトニキニン（Ｒｏｂｏｔｎｉｋｉｎｉｎ）、ＪＫ１８４、ＨＰＩ−４等が挙げられ、シクロパミン等が好ましい。これらのヘッジホッグシグナル阻害剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４６】
ヘッジホッグシグナル阻害剤を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、１〜１００μＭが好ましく、１〜１０μＭがより好ましい。
【００４７】
本発明においては、これらのＷｎｔシグナル活性化剤及び、ヘッジホッグシグナル阻害剤を両方用いることが好ましい。
【００４８】
尚、前述の「課題を解決するための手段」に記載したように、本発明は、特許文献１に記載の方法に従い、ＥＳ培地での２日間の培養、さらにレチノイン酸を加えて２日間の培養を行い、骨芽細胞分化誘導培地で培養する方法では、細胞塊の形状は中空の袋状となってしまうという新たな知見に基づき、かかる課題を解決すべくさらに改良することにより完成されたものである。従って、胚様体形成の誘導工程の後に、中胚葉への分化を誘導し得る成分としてレチノイン酸のみを配合した培地を用いた培養工程を行う方法は、本発明の方法から除かれる。
【００４９】
また、培地には、必要に応じて、細胞培養の際に用い得る添加剤を配合してもよい。かかる添加剤の具体例としては、例えば、牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ等）が挙げられる。
【００５０】
また、培地には、細胞培養に用いる添加剤として、市販の細胞培養用サプリメント等を添加しても良い。かかるサプリメントとしては、Ｎ−２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｂ−２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｉｎｓｕｌｉｎ，  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，  Ｓｅｌｅｎｉｕｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｗｎｔ３ａ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、ＢＭＰ４；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製が挙げられる。これらのサプリメントは、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００５１】
本発明の方法は、骨芽細胞の細胞塊を製造するための方法である。従って、本中胚葉系細胞分化誘導工程も、非接着培養により行われる。非接着培養の具体的な態様としては、前述したものが挙げられる。本工程においては、非接着性培養容器（例えば、非接着性培養皿、非接着性ウェル、非接着性フラスコ等）を用いた静置培養等が好ましい。
【００５２】
本工程における培養時間としては、例えば、０．１２５〜１０日間が好ましく、１〜８日間がより好ましく、３〜６日間がより好ましい。また、本工程における培養時間としては、例えば、約３〜２４０時間が好ましく、約２４〜１９２時間がより好ましく、約７２〜１４４時間がより好ましい。本工程における培養温度は特に限定されず、例えば、３０〜４２℃が好ましく、３５〜３９℃がより好ましい。本工程における培養は、３〜１０％ＣＯ２の雰囲気下で行うことが好ましい。
【００５３】
本発明においては、前述した（１）胚様体形成の誘導工程と後述する（３）骨芽細胞の分化誘導工程との間に、上記中胚葉系細胞の分化誘導工程を行うことが、ヒトｉＰＳ細胞を原料として中実な細胞塊を得るために重要である。
【００５４】
（３）骨芽細胞への分化誘導
本発明の方法は、上記工程（２）で得られたヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程を含む。
【００５５】
当該工程に用いる培地としては、骨芽細胞への分化誘導に適した培地を適宜使用することができる。かかる培地としては、例えば、DMEM培地（例えば、ナカライテスク社製、sodium pyruvate非含有DMEM培地等）；αMEM培地（例えば、ナカライテスク社製αMEM培地）等が挙げられる。これらの培地は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００５６】
本工程において、培地には、骨芽細胞への分化誘導促進剤等を配合してもよい。骨芽細胞への分化誘導促進剤としては、例えば、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸、デキサメタゾン、BMP-2、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、レチノイン酸等が挙げられる。アスコルビン酸は、アスコルビン酸-2-リン酸又はその塩であってもよい。また、分化誘導剤として、デキサメタゾンに代えて、又はこれに加えて、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾンを用いてもよい。これらの骨芽細胞への分化誘導促進剤は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００５７】
アスコルビン酸を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、５０〜３００μＭが好ましく、１５０〜２００μＭがより好ましい。β-グリセロリン酸を配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、１〜１００ｍＭが好ましく、５〜１５ｍＭがより好ましい。デキサメタゾンを配合する場合、その配合量は特に限定されないが、本工程で用いる培地中での最終濃度として、例えば、０．００１〜１０μＭが好ましく、０．０１〜１．０μＭがより好ましい。
【００５８】
骨芽細胞の石灰化の観点から、本工程における培地には、低酸素模倣化合物をさらに配合することが好ましい。低酸素模倣化合物としては、例えば、ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ（ＤＦＸ）、ｃｏｂａｌｔ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣｏＣｌ２）等が挙げられる。これらの低酸素模倣化合物は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００５９】
骨芽細胞の石灰化の観点から、本工程における培地には、スタチン化合物をさらに配合することが好ましい。スタチン化合物としては、例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、シンバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン及びロスバスタチン等が挙げられる。これらのスタチン化合物は、１種単独で用いても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００６０】
また、培地には、必要に応じて、細胞培養の際に用い得る添加剤を配合してもよい。かかる添加剤の具体例としては、例えば、牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン等）、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、アムホテリシンＢ等）が挙げられる。
【００６１】
本発明の方法は、骨芽細胞の細胞塊を製造するための方法である。従って、本中胚葉系細胞分化誘導工程も、非接着培養により行われる。非接着培養の具体的な態様としては、前述したものが挙げられる。本工程においては、振盪培養等が好ましい。
【００６２】
本工程における培養時間としては、例えば、約１〜９０日間が好ましく、約７〜６０日間がより好ましく、約２１〜５０日間がより好ましい。また、本工程における培養時間としては、例えば、約２４〜２１６０時間が好ましく、約１６８〜１４４０時間がより好ましく、約５０４〜１２００時間がより好ましい。本工程における培養温度は特に限定されず、例えば、３０〜４２℃が好ましく、３５〜３９℃がより好ましい。本工程における培養は、３〜１０％ＣＯ２の雰囲気下で行うことが好ましい。
【００６３】
骨再生剤の製造方法
本発明は、前述した方法によりヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する工程、及び当該骨芽細胞塊を不活化処理する工程
を含む、骨再生剤の製造方法も提供する。
【００６４】
骨芽細胞塊を製造する工程に用いる原料のヒトｉＰＳ細胞について、及び骨芽細胞塊を製造する工程において必要な処理等については前述した通りである。
【００６５】
本発明の方法は、上記工程により得られた骨芽細胞塊を不活化処理する工程を含む。
【００６６】
不活性化の方法は、特に限定されないが、例えば、凍結乾燥、加熱処理、高圧処理、酸又はアルカリ溶液処理、高圧蒸気滅菌、放射線滅菌、ガス滅菌、電磁波処理等が挙げられる。凍結乾燥について、条件は特に限定されず、公知の方法を使用できる。また、例えば、凍結乾燥の前に、予備凍結を行ってもよい。予備凍結の温度は、特に限定されないが、例えば、約−１２〜−２０℃が好ましい。凍結乾燥温度は、特に限定されないが、約−１００〜−５℃が好ましい。また、凍結乾燥圧力は、特に限定されず、例えば、６００Ｐａ以下が好ましく、５０Ｐａ以下がより好ましい。具体的な凍結乾燥条件としては、例えば、温度を−１０℃に固定して凍結乾燥開始と同時に気圧を徐々に５〜２０Ｐａまで下げていく方法が挙げられる。
【００６７】
以下に、実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００６８】
(１−１)ヒトｉＰＳ細胞の培養
実験には、ヒト皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞株（４０９Ｂ２：ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ社）を用いた。フィーダー細胞には、ＳＮＬＰ７６．７−４細胞（英国Ｓａｎｇｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＤｒ．Ａｌｌａｎ  Ｂｒａｄｌｅｙより供与）を用いた。【００６９】
ＳＮＬＰ７６．７−４フィーダー細胞を、１０ｃｍ細胞培養プレート（０．１％ゼラチンコート処理）に播種し、７％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ジャパンバイオシーラム，Ｌｏｔ  ＃  ＪＢＳ−０１１５０１）、２ｍＭ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃２５０３０−０８１）、５０Ｕ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、５０μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃１５１４０−１２２）含有ＤＭＥＭ培地（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ非含有：ナカライテスク，Ｃａｔ．＃０８４５９−３５）〕を用いて培養した。培地交換は２日おきに行った。ｉＰＳ細胞の培養前にＳＮＬＰ７６．７−４フィーダー細胞を１２μｇ／ｍｌのＭｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ（ナカライテスク，Ｃａｔ．＃２０８９８−２１）で２．５時間処理し、１０ｃｍ細胞培養プレート（０．１％ゼラチンコート処理）に１．５×１０６個／ｄｉｓｈの濃度で播種した。【００７０】
このＳＮＬＰ７６．７−４フィーダー細胞上にｉＰＳ細胞を播種し、４ｎｇ／ｍｌ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ，ＲＣＨＥＯＴ００２，００３）含有のＰｒｉｍａｔｅｓ  ＥＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＳ培地：ＲＥＰＲＯＣＥＬＬ，ＲＣＨＥＭＤ００１）を用いて培養した。培地交換は１日おきに行った。【００７１】
（１−２）胚様体の形成
ｉＰＳ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１ｍｌのＣＴＫ溶液（０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ，０．１ｍｇ／ｍｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ，１０ｍＭＣａＣｌ２，２０％ＫＳＲ）を添加して３７℃で１分間処理した後に、ＣＴＫ溶液を吸引除去し、ＰＢＳを１ｍｌ添加した。ＰＢＳを除去し、培養プレートから剥離したフィーダー細胞のみを可及的に吸引除去した。その後、培養プレートに残存している接着ｉＰＳ細胞を、４ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ添加ＥＳ培地（ＲＣＨＥＭＤ００１）５ｍｌを用いて回収した。この細胞懸濁液を、低接着性培養皿（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃１５０２３９）に移し、１日間静置培養することにより胚様体の形成を誘導した。対照として、胚様体の形成を０日または４日間行った。【００７２】
（１−３）中胚葉細胞への分化誘導
静置培養を１日間行った後に、ｉＰＳ細胞胚様体を回収した。回収したｉＰＳ細胞胚様体を５ｍｌの中胚葉分化誘導培地〔２％Ｂ−２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃１７５０４−０４４）、１％Ｎ−２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃１７５０２−０４８）、３０μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（和光純薬，Ｃａｔ．＃０３８−２３１０３）、５μＭ  ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．＃ＢＭＬ−ＧＲ３３４）含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃１１３３０−０３２）とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃２１１０３−０４９）の１：１混合培地〕を用いて、あらたな低接着性培養皿上に播種し、５日間の静置培養を行った。対照として、中胚葉分化誘導を行わずに、（１−２）で示した胚様体形成後に、（１−４）に示す骨芽細胞分化誘導を行った。中胚葉分化誘導の評価には、中胚葉のマーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙを用いた免疫蛍光染色を行った。また、ＣＨＩＲ９９０２１あるいはｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅを含有しない中胚葉分化誘導培地で胚様体を培養し、両化合物の効果を検討した。【００７３】
（１−４）骨芽細胞への分化誘導
中胚葉分化誘導後、培地を骨芽細胞分化誘導培地〔１５％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃４９００８２）、０．１μＭ  デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．＃Ｄ２９１５）、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．＃  Ｇ９４２２）および１７２．７μＭ  アスコルビン酸−２−リン酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．＃Ａ８９６０）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン，１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．＃１５２４０）含有ＤＭＥＭ培地（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ非含有：ナカライテスク，京都，Ｃａｔ．＃０８４５９−３５）〕に交換し、細胞濃度が約１×１０５〜７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの懸濁液とした。当該細胞懸濁液を、図５に概略を示す形状の低接着性フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｃａｔ．＃６９０１９５、ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｅａ：２５ｃｍ２）を用いて、シーソー型バイオリアクター（１０°傾斜，周期０．３３Ｈｚ，テーブルの横幅３２ｃｍ、振幅５．５ｃｍ）（ＢＣ−７００：ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ）上で振盪しながら、最大６０日間非接着培養した。対照として、振盪させずに非接着培養を行った。培地交換は、７日おきに行った。得られた試料にヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色、もしくはＯｓｔｅｏｃａｌｃｉｎの免疫蛍光染色を施し、組織化学観察を行った。【００７４】
また、低酸素模倣化合物（１０μＭ  ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）あるいはスタチン化合物（１μＭ  ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）を骨芽細胞分化誘導培地に添加して非接着振盪培養した場合の効果を検討した。【００７５】
（１−５）結果
中胚葉細胞塊の形成
上記（１−２）、（１−３）に記載の方法によって得られた中胚葉細胞塊において、中胚葉のマーカー（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）の著明な発現を認めた（図１Ａ）。また、ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ非存在下でも同様にＢｒａｃｈｙｕｒｙの著明な発現を認め、中胚葉細胞塊に誘導することができた（図１Ｂ）。一方、ＣＨＩＲ９９０２１非存在下では（図１Ｃおよび１Ｄ）、ＣＨＩＲ９９０２１存在下ほど著明ではなかったものの、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの発現は認められた。【００７６】
段階的分化誘導法による三次元骨芽細胞塊の形成
前記（１−１）に記載の方法で１日間の胚様体形成を経た後、中胚葉分化誘導を行わずに直接骨芽細胞分化誘導した結果、細胞は袋状の石灰化を示さない細胞構造体となった（図２Ａ）。【００７７】
そこで、ｉＰＳ細胞を骨芽細胞誘導する前に中胚葉誘導する方法の有効性を検討した。ｉＰＳ細胞から直接（ＥＳ培地での胚様体形成を行わずに）中胚葉への分化誘導を試みた結果、中胚葉誘導１日後に全てのｉＰＳ細胞が細胞死を起こした（図２Ｂ）。【００７８】
一方、胚様体形成を１日間行い、５日間中胚葉分化誘導した後に骨芽細胞分化誘導した場合には、骨芽細胞分化誘導６０日以内に球状の細胞塊を得ることができた（図２Ｃ）。この細胞塊の組織学的観察の結果、骨芽細胞分化誘導６０日後では、この細胞塊の内部には、部分的な石灰化像を認めた（図３Ａの＊印周辺）。また、骨芽細胞分化誘導の工程で、細胞塊を振盪させずに非接着培養を行った場合でも、細胞塊の内部に部分的な石灰化像を認めた（図３Ｂの＊印周辺）。【００７９】
小分子化合物による骨芽細胞分化の促進
Ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅまたはｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ含有骨芽細胞分化誘導培地中で分化誘導した結果、著明に石灰化した骨芽細胞塊を得ることができた（図３Ｃおよび３Ｄ）。特に、Ｄｅｓｆｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅを用いた場合には、骨芽細胞分化誘導３０日目には著明に石灰化した細胞塊への誘導を認めた。【００８０】
（１−６）  中胚葉系細胞への分化誘導をしない方法及び結果（比較例）
上記（１−１）に記載の方法に従いｉＰＳ細胞を得、上記（１−２）に相当するＥＳ培地での培養を２日間行い、得られたｉＰＳ細胞の胚様体を回収し、１μＭレチノイン酸（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ：Ｓｉｇｍａ）を配合した上記ＥＳ培地を用いてさらに２日間培養し、そして上記（１−３）に記載の中胚葉細胞への分化誘導工程を行うことなく、上記（１−４）に記載の骨芽細胞への分化誘導工程を行った。その結果、得られた骨芽細胞様の細胞は、中実の細胞塊ではなく、袋状となった。【００８１】
（１−７）まとめ
以上より、ヒトｉＰＳ細胞から三次元的な骨芽細胞塊を作製するためには、胚様体と中胚葉細胞へ分化する工程を含む段階的分化誘導法が必要であることが明らかとなった。また、段階的分化誘導法における胚様体培養の期間は、１〜３日が適していることが明らかとなった。さらに、ヒトｉＰＳ細胞由来骨芽細胞塊の石灰化誘導には、低酸素模倣化合物及びスタチン化合物が有効であることが示された。【００８２】
(２−１)ヒトiPS細胞の培養
実験には、ヒト皮膚線維芽細胞由来iPS細胞株（409B2：RIKEN BRC CELL BANK社）を用いた。フィーダー細胞には、SNLP76.7-4細胞を用いた。
SNLP76.7-4フィーダー細胞を、10 cm細胞培養プレート（0.1%ゼラチンコート処理）に播種し、7% ウシ胎仔血清（FBS：ジャパンバイオシーラム，Lot # JBS-011501）、2 mM L-Glutamine（Thermo Fisher Scientific，Cat.# 25030-081）、50 U penicillin、50 μg/ml streptomycin（Thermo Fisher Scientific，Cat.#15140-122）含有DMEM培地（sodium pyruvate非含有：ナカライテスク，Cat.# 08459-35）〕を用いて培養した。培地交換は2日おきに行った。iPS細胞の培養前にSNLP76.7-4フィーダー細胞を12 μg/mlのMitomycin C（ナカライテスク，Cat.#20898-21）で2.5時間処理し、10 cm細胞培養プレート（0.1% ゼラチンコート処理）に1.5 × 106個/ dishの濃度で播種した。【００８３】
このSNLP76.7-4フィーダー細胞上にiPS細胞を播種し、4 ng/ml human basic FGF（REPROCELL，RCHEMD001）含有のPrimates ES Medium（ES培地：REPROCELL，RCHEOT002，003）を用いて培養した。培地交換は1日おきに行った。【００８４】
(２−２)胚様体の形成
iPS細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、1 mlのCTK溶液（0.25% trypsin，0.1 mg/ml collagenase IV，10 mMCaCl2，20% KSR）を添加して37℃で1分間処理した後に、CTK溶液を吸引除去し、PBSを1 ml添加した。PBSを除去し、培養プレートから剥離したフィーダー細胞のみを可及的に吸引除去した。その後、培養プレートに残存している接着iPS細胞を、5 mlのES培地を用いて回収した。この細胞懸濁液を、低接着性培養皿（Thermo Fisher Scientific，Cat.# 150239）に移し、0〜4日間非接着培養することにより胚様体の形成を誘導した。【００８５】
(２−３)中胚葉細胞への分化誘導
非接着培養を0〜4日間行った後に、iPS細胞胚様体を回収した。回収したiPS細胞胚様体を5 mlの中胚葉分化誘導培地〔2% B-27 Supplement（Thermo Fisher Scientific，Cat.# 17504-044）、1% N-2 Supplement（Thermo Fisher Scientific，Cat.# 17502-048）、30 μM CHIR99021（和光純薬, Cat.# 038-23103）、5 μM cyclopamine（Enzo Life science, Cat.# BML-GR334）含有DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific，Cat.# 11330-032）とNeurobasal medium（Thermo Fisher Scientific，Cat.# 21103-049）の1：1混合培地〕を用いて、あらたな低接着性培養皿上に播種し、5日間の非接着培養を行った。
中胚葉分化誘導の評価には、中胚葉のマーカーであるBrachyuryのタンパク質の発現を免疫蛍光染色で、遺伝子の発現をSYBR Green リアルタイム RT−PCR法を用いて検討した。【００８６】
免疫染色には１次抗体に抗Brachyuryポリクローナル抗体（AF2085, R＆D SYSTEMS社）、２次抗体にAlexa Fluor594標識抗Goat IgG抗体（Thermo Fisher Scientific社）、核染色にHoechst 33258（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。
SYBR Green リアルタイム RT−PCR法に用いたプライマーの塩基配列は以下の通りである。内部標準にはGAPDHを利用した。
Brachury forward primer: 5’-CAGTCAGTACCCCAGCCTGT-3’
Brachury reverse primer: 5’-ACTGGCTGTCCACGATGTCT-3’
GAPDH forward primer: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’
GAPDH reverse primer: 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’
また、中胚葉分化誘導培地にCHIR99021あるいはcyclopamineを含有せずに１日間胚様体を培養した場合の中胚葉誘導率について、Brachyuryの免疫蛍光染色を用いて検討した。中胚葉誘導率は、免疫染色写真画像中に存在する全胚様体のうち、Brachyury陽性の胚様体が占める割合から求めた。【００８７】
(２−４)骨芽細胞への分化誘導
中胚葉分化誘導後、培地を骨芽細胞分化誘導培地〔15% FBS（Thermo Fisher Scientific, Cat # 490082）、0.1 μM デキサメタゾン（Sigma Aldrich, Cat.# D2915）、10 mM β-グリセロリン酸（Sigma Aldrich，Cat.# G9422）および50 μg/ml アスコルビン酸-2-リン酸（Sigma Aldrich，Cat.# A8920）、100 units/ml ペニシリン，100 μg/ml ストレプトマイシン、250 ng/ml アンホテリシンB（Thermo Fisher Scientific，Cat.# 15240）含有DMEM培地（sodium pyruvate非含有：ナカライテスク，京都，Cat.# 08459-35）〕に交換し、低接着性フラスコ（Greiner bio-one，Cat.# 690195、growth area: 25cm2）を用いて、シーソー型バイオリアクター（10°傾斜，周期0.33Hz，テーブルの横幅32ｃｍ、振幅5.5 cm）（BC-700：BIO CRAFT）上で振盪しながら、最大30日間非接着培養した。【００８８】
iPS細胞塊の成分解析をフーリエ変換型赤外分光（Fourier Transform- InfraRed：FT-IR）解析を用いて行った。iPS細胞塊をすべて回収し、10％中性緩衝ホルマリン液で固定し、蒸留水で洗浄した後、エタノール（30%，70%，90%，100%）で段階脱水を行った。再度新しいエタノール（100%）を交換した後に、乾燥機中に37℃で12時間静置した。乾燥した細胞試料に臭化カリウム（KBr）プレート法用いてFT-IR解析を行った。解析には、FT-IR測定装置：FT/IR-6300ST（日本分光）を用いて、スキャン範囲：650〜4000 cm−1、分解能：2 cm−1で積算1000回の赤外線吸収スペクトルパターンを解析した。対照として、ヒト凍結乾燥骨（FDBA；直径0.25〜1.0 mm：LifeNetHealth）を用いた。【００８９】
(２−５)iPS細胞由来骨補填材の作製
骨芽細胞分化誘導120日後の骨芽細胞塊をPBSで洗浄した後に、10 mlのPBSに4℃で一晩浸漬した。翌日，骨芽細胞塊を取り出して6 cm細胞培養皿に移し、-80℃の冷凍庫内で一晩の予備凍結を行った。その後、皿を凍結乾燥機（VD-250R；タイテック）に設置し、一晩の凍結乾燥を行うことで細胞を死滅させ（不活化）、iPS細胞由来骨補填材とした。骨補填材の入っている皿に蓋を被せてシールで密閉し、防湿庫（ガラス製デシケーター）内で保管した。【００９０】
(２−６)ラット頭蓋骨欠損モデルへの埋植
10週齢のSDラット（Slc:SD；日本エスエルシー株式会社）に全身麻酔を施した後、頭皮を剥離して骨膜弁を形成し、頭蓋骨矢状縫合の左右に直径5 mmの欠損を形成した。頭蓋骨欠損の形成には、動物手術用エンジンおよびトレフィンバー（インプラテックス，東京，Cat.#04949202）を用い、注水下にて行った。凍結乾燥を行ったiPS細胞塊を頭蓋骨欠損部に埋植し、骨膜で被覆して頭皮を縫合した。その後、ラットを特定病原体未感染の条件のもと、飲水および接触が自由な状態で飼育した。【００９１】
(２−７)結果
胚様体培養期間による中胚葉細胞塊の形成の違い
1〜４日間の胚様体形成を経た後、上記(２−3)に記載の方法によって得られた中胚葉細胞塊において、胚様体培養期間が4日になると、中胚葉のマーカーであるBrachyuryタンパク質の著明な発現低下を認めた（図６-（４））。一方、1〜3日間の胚様体形成を経た後の中胚葉細胞塊では、Brachyuryタンパク質の発現が上昇した（図６-（１）〜（３））。特に、胚様体培養期間が1日の場合にBrachyuryタンパク質の発現が著明に上昇した（図６-（１））。一方、胚様体形成誘導のための非接着培養を0日とした場合、細胞は死滅してしまった。【００９２】
また、0.5〜3日間の胚様体形成を経た後、上記(２−3)に記載の方法によって得られた中胚葉細胞塊では、Brachyury遺伝子の発現が上昇した（図７）。特に、胚様体培養期間が1〜３日の場合では0.5日の場合と比較して、Brachyury遺伝子の発現は有意に上昇し、特に１日の場合に最も高い発現を示した（図７）。【００９３】
中胚葉細胞塊の形成
上記(２−2)、(２−3)に記載の方法によって１日間胚様体形成を行った後に中胚葉細胞へ分化誘導した場合、分化誘導後の中胚葉細胞塊における中胚葉のマーカー(Brachyury)遺伝子の発現は、分化誘導前と比較して約1500倍増加した（図８）。この時、中胚葉への誘導率は83%であり、cyclopamine非存在下でも57％、CHIR99021非存在下でも40%の中胚葉誘導率を示した（図９）。CyclopamineおよびCHIR99021非存在下では中胚葉誘導率は17%に留まった。【００９４】
段階的分化誘導法による三次元骨芽細胞塊の形成
1日間の胚様体形成を経た後、中胚葉分化誘導を行ない、30日間骨芽細胞分化誘導した細胞塊のFTIR解析を行った結果、アミノ酸の豊富な基質（アミドＩおよびアミドＩＩ）の中にハイドロキシアパタイトに関連するリン酸基（P）および炭酸アパタイトに関連する炭酸基（C）の存在を示唆するピークが出現し（図１０：矢印）、ヒト凍結乾燥骨（FDBA）と同じ赤外線吸収スペクトルパターンを示した（図１０）。【００９５】
段階的分化誘導法を用いて作製した三次元骨芽細胞塊の骨再生能の評価
骨芽細胞分化誘導120日目の細胞塊を(２−5)に記載の方法によって凍結乾燥処理し、ラット頭蓋骨に作製した直径5 mmの骨欠損部に埋植した結果，4週間後の凍結乾燥骨芽細胞塊周囲には新生骨の形成を認めた（図１１-（１），（２））。また、埋植した凍結乾燥骨芽細胞塊周囲に炎症細胞の集積や腫瘍化を示す異常所見は認めなかった（図１１-（２））。【００９６】
(２−８)まとめ
以上より、ヒトiPS細胞から三次元的な骨芽細胞塊を作製するためには、胚様体と中胚葉細胞へ分化する工程を含む段階的分化誘導法が必要であることが明らかとなった。また、段階的分化誘導法における胚様体培養の期間は、0.5〜3日間が適しており、１日が最も適していることが明らかとなった。また、このように作成した骨芽細胞塊を、凍結乾燥することで細胞を死滅（不活化）させた『ヒトiPS細胞由来凍結乾燥骨芽細胞塊』は、ヒト凍結乾燥骨（FDBA）と同様の成分を有し、ラット頭蓋骨欠損モデルにおいて新生骨の形成を促進することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月18日(2019.3.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する方法であって、
（１）未分化ヒトｉＰＳ細胞を０．５〜３．５日間、非接着培養して、胚様体の形成を誘導する工程、
（２）上記工程（１）で得られたヒトｉＰＳ細胞の胚様体を非接着培養して、ヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導する工程、及び
（３）上記工程（２）で得られたヒトｉＰＳ細胞の中胚葉系細胞を非接着培養して、骨芽細胞への分化を誘導する工程
を含む方法であって、前記工程（２）における培養が、Ｗｎｔシグナル活性化剤及びヘッジホッグシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記工程（１）における、培養時間が０．６２５〜１．２５日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記Ｗｎｔシグナル活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、６−ブロモインディルビン−３’−オキシム、ケンパウロン、ＳＢ−２１６７６３、ＳＫＬ２００１、デオキシコール酸、ＷＡＹ−３１６６０６、ＮＳＣ−６９３８６８、リシニン、７−ｏｘｏ−β−シトステロール、ＩＭ−１２及びＨＬＹ７８からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記ヘッジホッグシグナル阻害剤が、シクロパミン、ＡＹ９９４４、ＧＡＮＴ５８、ＧＡＮＴ６１、ジェルビン、ＳＡＮＴ−１、ＳＡＮＴ−２、Ｕ１８６６６Ａ、ベラトラミン、ビスモデギブ、Ｃｕｒ−６１４１４、ロボトニキニン、ＪＫ１８４及びＨＰＩ−４からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１、３及び５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記工程（３）における培養が、低酸素模倣化合物及びスタチン化合物からなる群より選択される少なくとも一種の存在下で行われる、請求項１、３、５及び６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１、３、５〜７のいずれか１項に記載の方法により、ヒトｉＰＳ細胞から骨芽細胞塊を製造する工程、及び
当該骨芽細胞塊を不活化処理する工程
を含む、骨再生剤の製造方法。
【国際調査報告】
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