(57)【要約】  未分化のｉＰＳ細胞の段階での、ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法を提供する。未分化のｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測するための遺伝子マーカーを提供する。未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該ｉＰＳ細胞の神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化能を予測し、それにより該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。
2018225868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。
【請求項２】
未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該ｉＰＳ細胞の神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化能を予測し、それにより該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。
【請求項３】
対象とする未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルデータを取得し、各遺伝子の発現量を得て、
基準となる分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）の前記各遺伝子の発現量に対する発現量の比率：
［発現量の比率］＝［対象とする未分化ｉＰＳ細胞の各遺伝子発現量］／［基準となる分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）の各遺伝子発現量］
を算出し、
算出された前記発現量の比率が、発現減少の遺伝子については、０．９よりも小さい場合に、発現亢進の遺伝子については、１．１よりも大きい場合に、前記対象とする未分化ｉＰＳ細胞は軟骨細胞への分化能が高いと判断する、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
前記遺伝子が、遺伝子ID (Unique Sorted Transcript Cluster ID)で表して、
前記発現減少の遺伝子として、16713399、16984394、17121974、17122170、16860191、16999432、17121970、17065663、17028547、17022610、17035441、16825196、16946689、16906788、16700250、17048704、16729023、16938761、16885703、17000077、16917881、16809811、16684087、17092402、16826158、17038957、16684995、17103991、16897399、及び16696918；  及び
前記発現亢進の遺伝子として、16788743、16788693、16788572、17118804、16662749、17100659、16747661、17083911、16788727、16692589、16729321、16976012、16697219、16798158、16990845、17118850、16830980、16778675、17110283、16851422、16797049、16838105、16831379、16875952、17117410、17103230、16999147、16688792、16718764、17072022、及び16679331；
からなる群から少なくとも１つ選ばれる、請求項１〜３のうちのいずれかの方法。
【請求項５】
対象とする未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルデータを取得し、各遺伝子の発現量を得て、識別モデルを構築し、その識別モデルと各遺伝子プロファイルから算出した予測スコアを用いて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。
【請求項６】
前記未分化のｉＰＳ細胞は、フィーダーフリー化状態のものである、請求項１〜５のうちのいずれかの方法。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれかの方法により、未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測し、
軟骨細胞への分化能が高いと判断された未分化のｉＰＳ細胞を、軟骨細胞へと分化誘導する方法。
【請求項８】
遺伝子ID (Unique Sorted Transcript Cluster ID)で表して、
発現減少の遺伝子として、16713399、16984394、17121974、17122170、16860191、16999432、17121970、17065663、17028547、17022610、17035441、16825196、16946689、16906788、16700250、17048704、16729023、16938761、16885703、17000077、16917881、16809811、16684087、17092402、16826158、17038957、16684995、17103991、16897399、及び16696918；  及び
発現亢進の遺伝子として、16788743、16788693、16788572、17118804、16662749、17100659、16747661、17083911、16788727、16692589、16729321、16976012、16697219、16798158、16990845、17118850、16830980、16778675、17110283、16851422、16797049、16838105、16831379、16875952、17117410、17103230、16999147、16688792、16718764、17072022、及び16679331；
からなる群から少なくとも１つ選ばれる、未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測するための遺伝子マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療分野、細胞培養分野、及びそれらの基礎研究分野に属し、未分化のｉＰＳ細胞の段階での、ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法に関する。また、未分化のｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測するための遺伝子マーカーに関する。本発明は、再生医療分野、細胞培養分野や基礎研究分野を問わず、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞を作製する必要があるユーザーに利用され得る。
【背景技術】
【０００２】
最近において、マウス及びヒトの人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が樹立されている。ｉＰＳ細胞は、その株によって、軟骨細胞への分化能が異なっている。【０００３】
ｉＰＳ細胞から軟骨細胞を作製するには、ｉＰＳ細胞から神経堤細胞（ＮＣ細胞）を経て軟骨細胞に分化させる分化誘導経路がある（図１）。図１は、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導の経路を模式的に示す図である。図１を参照して、フィーダー細胞上でのｉＰＳ細胞培養が行なわれ（この終了時点を０日目とする）、その後、マトリゲル上でのｉＰＳ細胞培養（フィーダーフリー化状態で）が行なわれる（この終了時点は例えば約７日目である）。培養された未分化状態のｉＰＳ細胞をＮＣ細胞へと分化誘導する（この終了時点は例えば約１５日目である）。ＮＣ細胞をさらに軟骨前駆細胞用培地（フィブロネクチンコート）上で軟骨前駆細胞へと分化誘導する（継代１，継代２を経て、この終了時点は例えば約２４日目である）。軟骨前駆細胞を軟骨分化培地上で軟骨細胞へと誘導する（この終了時点は例えば約５５日目である）。【０００４】
ｉＰＳ細胞からＮＣ細胞へと分化させた際には、ＮＣ細胞の細胞表面マーカータンパクであるCD271に対する抗体と蛍光フローサイトメトリー(FACS)を用いた分析を行うと、CD271の発現量が低いＮＣ細胞集団（CD271low+ NC細胞）と発現量が多いＮＣ細胞集団（CD271high+ NC細胞）とに分かれる（図２）。図２は、神経堤細胞（ＮＣ細胞）におけるＮＣマーカーCD271の発現量を示す図であり、横軸は、CD271の発現量（蛍光強度）であり、縦軸は、細胞数である。図２において、CD271の発現量が低いＮＣ細胞集団（CD271low+ NC細胞）はＰ４フラクションとして示され、発現量が多いＮＣ細胞集団（CD271high+ NC細胞）はＰ５フラクションとして示されている。【０００５】
さらには、これらのＮＣ細胞をそれぞれ軟骨細胞へと分化誘導すると、CD271high+ NC細胞集団から分化させた軟骨細胞は、CD271low+ NC細胞集団から分化させたものと比較して、軟骨関連遺伝子の発現量が高いことがわかっている（非特許文献１，２）。以上のことから、ユーザーはｉＰＳ細胞から分化誘導させたＮＣ細胞におけるCD271の発現量を指標として、CD271high+ NC細胞の割合が多い（分化能が高い）ｉＰＳ細胞株を選定する。結果として、軟骨への分化能の高いｉＰＳ細胞を選別することになる。【０００６】
また、ｉＰＳ細胞を神経堤細胞（ＮＣ細胞）へと分化誘導する方法や、神経堤細胞（ＮＣ細胞）を軟骨前駆細胞、さらに軟骨細胞へと分化誘導する方法については、例えば、特開２０１６−８８９０９号公報を参照することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１６−８８９０９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Umeda K. et al., Long-Term Expandable SOX9+ Chondrogenic Ectomesenchymal Cells from Human Pluripotent Stem Cells, Stem Cell Reports. 2015 Apr 14;4(4):712-726
【非特許文献２】Fukuta M. et al., Derivation of Mesenchymal Stromal Cells from Pluripotent Stem Cells through a Neural Crest Lineage using Small Molecule Compounds with Defined Media, PLoS One. 2014 2;9(12)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ｉＰＳ細胞は、その株によって、軟骨細胞への分化能が異なっている。そのため、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞を作製するユーザーは、軟骨細胞への分化能が高いｉＰＳ細胞を選ぶ必要がある。【００１０】
作製したｉＰＳ細胞株の中から軟骨細胞への分化能が高いものを選ぶ手段としては、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞へ分化誘導させた細胞における軟骨遺伝子発現や免疫組織化学染色等を指標とするものがある。また、代替手段として、上述したように、ｉＰＳ細胞から分化誘導させたＮＣ細胞の段階におけるFACS解析においてCD271high+ NC細胞集団の割合を指標としたものが用いられてきた。【００１１】
しかしながら、未分化ｉＰＳ細胞の段階でｉＰＳ細胞の分化能を予測するマーカーや手法は現時点では全く存在しない。未分化ｉＰＳ細胞の段階でｉＰＳ細胞の分化能を予測することができれば、分化能が低いｉＰＳ細胞株のＮＣ細胞やさらに軟骨細胞への分化誘導を省略できるので、結果として効率的細胞培養やランニングコストの削減が達成できるため、再生医療分野や基礎研究分野のいずれにおいても、非常に有用である。【００１２】
本発明の目的は、未分化のｉＰＳ細胞の段階での、ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、未分化のｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測するための遺伝子マーカーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討の結果、未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測することができることを見出した。【００１４】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。【００１５】
（２）  未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該ｉＰＳ細胞の神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化能を予測し、それにより該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。【００１６】
（３）  対象とする未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルデータを取得し、各遺伝子の発現量を得て、
基準となる分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）の前記各遺伝子の発現量に対する発現量の比率：
［発現量の比率］＝［対象とする未分化ｉＰＳ細胞の各遺伝子発現量］／［基準となる分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）の各遺伝子発現量］
を算出し、
算出された前記発現量の比率が、発現減少の遺伝子については、０．９よりも小さい場合に、発現亢進の遺伝子については、１．１よりも大きい場合に、前記対象とする未分化ｉＰＳ細胞は軟骨細胞への分化能が高いと判断する、上記（１）又は（２）の方法。【００１７】
（４）  前記遺伝子が、遺伝子ID (Unique Sorted Transcript Cluster ID)で表して、
前記発現減少の遺伝子として、16713399、16984394、17121974、17122170、16860191、16999432、17121970、17065663、17028547、17022610、17035441、16825196、16946689、16906788、16700250、17048704、16729023、16938761、16885703、17000077、16917881、16809811、16684087、17092402、16826158、17038957、16684995、17103991、16897399、及び16696918；  及び
前記発現亢進の遺伝子として、16788743、16788693、16788572、17118804、16662749、17100659、16747661、17083911、16788727、16692589、16729321、16976012、16697219、16798158、16990845、17118850、16830980、16778675、17110283、16851422、16797049、16838105、16831379、16875952、17117410、17103230、16999147、16688792、16718764、17072022、及び16679331；
からなる群から少なくとも１つ選ばれる、上記（１）〜（３）のうちのいずれかの方法。【００１８】
（５）  対象とする未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルデータを取得し、各遺伝子の発現量を得て、識別モデルを構築し、その識別モデルと各遺伝子プロファイルから算出した予測スコアを用いて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法。【００１９】
（６）  前記未分化のｉＰＳ細胞は、フィーダーフリー化状態のものである、上記（１）〜（５）のうちのいずれかの方法。【００２０】
（７）  上記（１）〜（６）のうちのいずれかの方法により、未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測し、
軟骨細胞への分化能が高いと判断された未分化のｉＰＳ細胞を、軟骨細胞へと分化誘導する方法。【００２１】
（８）  遺伝子ID (Unique Sorted Transcript Cluster ID)で表して、
発現減少の遺伝子として、16713399、16984394、17121974、17122170、16860191、16999432、17121970、17065663、17028547、17022610、17035441、16825196、16946689、16906788、16700250、17048704、16729023、16938761、16885703、17000077、16917881、16809811、16684087、17092402、16826158、17038957、16684995、17103991、16897399、及び16696918；  及び
発現亢進の遺伝子として、16788743、16788693、16788572、17118804、16662749、17100659、16747661、17083911、16788727、16692589、16729321、16976012、16697219、16798158、16990845、17118850、16830980、16778675、17110283、16851422、16797049、16838105、16831379、16875952、17117410、17103230、16999147、16688792、16718764、17072022、及び16679331；
からなる群から少なくとも１つ選ばれる、未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測するための遺伝子マーカー。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、未分化のｉＰＳ細胞の段階での、ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法が提供される。【００２３】
ｉＰＳ細胞は、その株によって、軟骨細胞への分化能が異なっている。そのため、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞を作製するユーザーは、軟骨細胞への分化能が高いｉＰＳ細胞を選ぶ必要がある。しかしながら、未分化ｉＰＳ細胞の段階でｉＰＳ細胞の分化能を予測するマーカーや手法はこれまで存在しなかった。本発明によって、未分化ｉＰＳ細胞の段階でｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測することができ、ｉＰＳ細胞株をＮＣ細胞やさらに軟骨細胞へ分化誘導することなく、軟骨細胞への分化能の高いｉＰＳ細胞株と分化能の低いｉＰＳ細胞株とを、未分化ｉＰＳ細胞の段階で識別することができる。これにより、軟骨細胞への分化能の高い選別されたｉＰＳ細胞株を用いて、該ｉＰＳ細胞株からの効率的な軟骨細胞への分化誘導を行うことができる。このように、本発明は、再生医療分野や基礎研究分野のいずれにおいても、非常に有用である。さらには、各遺伝子の発現量からｉＰＳ細胞の分化能の良否予測（CD271high+ NC細胞の割合が例えば２０％より高いかどうか）を数値化すること（スコアリング）が可能となった。これによって、分化能が未知である他のｉＰＳ細胞株に、本発明を適用してｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測することが可能となる。【００２４】
また、本発明によれば、未分化のｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測するための遺伝子マーカーが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ｉＰＳ細胞から軟骨細胞への分化誘導の経路を模式的に示す図である。
【図２】図２は、神経堤細胞（ＮＣ細胞）におけるＮＣマーカーCD271の発現量を示す図であり、横軸は、CD271の発現量（蛍光強度）であり、縦軸は、細胞数である。
【図３】図３は、各ｉＰＳ細胞株における神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率［NC induction efficiency (CD271high+ (%))］を示す図である。
【図４】図４は、神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率が前記高い細胞群(High)と前記低い細胞群(Low)の分化効率［Induction efficiency (CD271high+ (%))］のt-検定による比較を示す図である。
【図５】図５は、遺伝子発現プロファイルによるｉＰＳ細胞の識別を示す図である。
【図６】図６は、神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率が前記低い細胞群(Low)及び前記高い細胞群(High)それぞれについての、識別モデルの評価を示す図である。
【図７】図７は、データ入れ替え検証(Permutation test)結果を示す図である。
【図８】図８は、遺伝子発現プロファイルによる分化能の予測スコアを示す図である。予測スコアが大きいほど、そのｉＰＳ細胞はCD271high+ NC細胞の産生効率が高いと予想されることを意味する。
【図９】図９は、実験例２において、遺伝子発現プロファイルによる分化能の予測スコアを示す図である。
【図１０】図１０は、実験例２において、各ｉＰＳ細胞株における神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率［NC induction efficiency (CD271high+ (%))］を示す図である。
【図１１】図１１は、実験例２において、分化効率が高いｉＰＳ細胞群（Good clone）と分化効率が低いｉＰＳ細胞群（Poor clone）の間での予測スコアの比較を示す図である。
【図１２】図１２は、実験例２において、遺伝子発現プロファイルから算出した予測スコア値に対するＲＯＣ曲線であり、横軸は、１００−特異度（Specificity）（％）を表し、縦軸は、感度（Sensitivity）（％）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法である。以下に説明する。
【００２７】
１０種の未分化の各ｉＰＳ細胞株（201B2, 201B7, 414C2, 409B2, TIG118-4f1, 604A1, 606A1, 610B1, 451F3, TIG107-4f1）から神経堤細胞（ＮＣ細胞）に分化誘導した。分化されたＮＣ細胞とCD271に対する抗体とを反応させたサンプル(細胞)を蛍光フローサイトメトリー(FACS)により解析し、その際のCD271high+ NC細胞の割合をＮＣ分化効率として算出した。図３は、各ｉＰＳ細胞株における神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率［NC induction efficiency (CD271high+ (%))］を示す図である。縦軸は、ＮＣ細胞中に占めるCD271high+ NC細胞の割合を示す。図３に示すように、結果として、ＮＣ細胞への分化効率が高い細胞群（６株：201B2, 201B7, 414C2, 451F3, 604A1, 606B1）と、低い細胞群（４株：409B2, 610B1, TIG118-4f1, TIG107-4f1）とに分かれることを確認した。
【００２８】
さらに、これらの分化効率が高い細胞群（６株：201B2, 201B7, 414C2, 451F3, 604A1, 606B1）と低い細胞群（４株：409B2, 610B1, TIG118-4f1, TIG107-4f1）の分化効率をt-検定により比較解析すると、統計学的有意（p<0.001）に分化効率の差が見られることを確認した（図４）。図４は、神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率が前記高い細胞群(High)と前記低い細胞群(Low)の分化効率［Induction efficiency (CD271high+ (%))］のt-検定による比較を示す図である。
【００２９】
図３及び図４の結果から、神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率が高いとは、神経堤細胞（ＮＣ細胞）中に含まれるCD271high+ NC細胞の割合が、例えば、１５％以上、１８％以上、２０％以上、２５％以上、又は３０％以上である場合が該当し得る。
【００３０】
次に、各ｉＰＳ細胞からＲＮＡを抽出し、GeneChip(R)Human Gene 2.0 ST Array (Thermo Fisher SCIENTIFIC 社製)を用いて遺伝子発現プロファイル（全遺伝子48145種類）を取得した。取得した遺伝子プロファイルを神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化効率が前記高い群と前記低い群（コントロール）とで比較した結果、６１種類の遺伝子が統計学的有意（t-検定による有意差検定でp<0.05）に１．５倍以上変動していた。すなわち、ＮＣ細胞への分化効率が低い細胞群（４株：409B2, 610B1, TIG118-4f1, TIG107-4f1）の前記各遺伝子の発現量の平均値に対する、ＮＣ細胞への分化効率が高い細胞群（６株：201B2, 201B7, 414C2, 451F3, 604A1, 606B1）の前記各遺伝子の発現量の平均値の比率：
［発現量の比率］＝［前記高い群の各遺伝子発現量］／［前記低い群の各遺伝子発現量］
を求めたところ、６１種類の遺伝子が統計学的有意（t-検定による有意差検定でp<0.05）に１．５倍以上変動していた（後で定義するFold Change（発現変動量）として）。
【００３１】
６１種類の遺伝子のうち、遺伝子ID (Unique Sorted Transcript Cluster ID)で表して、
発現減少の遺伝子として、16713399、16984394、17121974、17122170、16860191、16999432、17121970、17065663、17028547、17022610、17035441、16825196、16946689、16906788、16700250、17048704、16729023、16938761、16885703、17000077、16917881、16809811、16684087、17092402、16826158、17038957、16684995、17103991、16897399、及び16696918の３０種類が挙げられ（表１）、
発現亢進の遺伝子として、16788743、16788693、16788572、17118804、16662749、17100659、16747661、17083911、16788727、16692589、16729321、16976012、16697219、16798158、16990845、17118850、16830980、16778675、17110283、16851422、16797049、16838105、16831379、16875952、17117410、17103230、16999147、16688792、16718764、17072022、及び16679331の３１種類が挙げられる（表２）。
【００３２】
表１は、ＮＣ細胞への分化効率が高い細胞群で発現が減少する遺伝子群について示したものである。発現減少の遺伝子については、Fold Change（発現変動量）は、前記式の［発現量の比率］の値の逆数にマイナスの符号を付して示されている。すなわち、このFold Change（発現変動量）の値が小さくなるほど、ＮＣ細胞への分化効率が低い細胞群（409B2, 610B1, TIG118-4f1, TIG107-4f1）の前記各遺伝子の発現量の平均値に対して、ＮＣ細胞への分化効率が高い細胞群（201B2, 201B7, 414C2, 451F3, 604A1, 606B1）の前記各遺伝子の発現量の平均値が、より小さいことを意味している。
【００３３】
表２は、ＮＣ細胞への分化効率が高い細胞群で発現が亢進する遺伝子群について示したものである。発現亢進の遺伝子については、Fold Change（発現変動量）は、前記式の［発現量の比率］の値として示されている。すなわち、このFold Change（発現変動量）の値が大きくなるほど、ＮＣ細胞への分化効率が低い細胞群（409B2, 610B1, TIG118-4f1, TIG107-4f1）の前記各遺伝子の発現量の平均値に対して、ＮＣ細胞への分化効率が高い細胞群（201B2, 201B7, 414C2, 451F3, 604A1, 606B1）の前記各遺伝子の発現量の平均値が、より大きいことを意味している。
【００３４】
【表１】
2018225868.tif 000003
【００３５】
【表２】
2018225868.tif 000004
【００３６】
そこで、これら６１種類の遺伝子発現プロファイルを用いてOPLS(orthogonal partial least square)法による多変量解析(SIMCA13、Umetrics社製)を行うと、ＮＣ細胞への分化効率が高い群と低い群とを明確に識別できるモデル(識別モデル)を構築できることが示された（図５）。図５は、遺伝子発現プロファイルによるｉＰＳ細胞の識別を示す図であり、横軸は、群間（今回の場合は、HighとLow細胞群）のバラつきであり、縦軸は、群内での各細胞のバラつきを示している。図５において、ＮＣ細胞への分化効率が前記高い細胞群(High；●)と前記低い細胞群(Low；■)とが、横軸方向に大きく離れており、これら両群が明確に判別される。
【００３７】
さらには、識別モデルのデータへの適合性（説明能力, R2値）、およびクロスバリデーション解析による未知サンプル（データ）への適合性予測性（予測能力、Q2値）を求めると、ともに高い値であることを確認した（図６）。図６は、ＮＣ細胞への分化効率が前記低い細胞群(Low)及び前記高い細胞群(High)それぞれについての、識別モデルの評価を示す図である。縦軸は、R2値、Q2値を示す。
【００３８】
さらには、データ入れ替え実験(Permutation test)により、識別モデルを検証した結果、Q2直線のy切片が負であったことから、このモデルはオリジナルデータのみにオーバーフィットしたものではないことも確認できた（図７）。図７は、データ入れ替え検証(Permutation test)結果を示す図であり、横軸(x軸)は、オリジナルデータに対するデータ入れ替えの頻度を表す(200 Permutations 1 components)。縦軸(y軸)は、R2値、もしくはQ2値を示している。x=1の時のR2値、Q2値がオリジナルデータでの値を示しており、x軸の値が小さいほど、データの入れ替え頻度が大きいことを示している。
【００３９】
以上のことから、遺伝子発現データを用いて、信頼性の高いｉＰＳ細胞の識別評価モデルが構築できることを確認した。
【００４０】
さらには、構築した識別モデルを用いて各ｉＰＳ細胞株における６１種類の遺伝子発現プロファイルから分化効率予測のスコアリングを行うと、実際に分化効率が高かった株と低かった株で明確に差があることも確認した（図８）。図８は、遺伝子発現プロファイルによる分化能の予測スコアを示す図であり、縦軸は予測スコア(Prediction Score)を示している。予測スコアが大きいほど、分化能が高い（分化効率が例えば、２０％以上である）ことが予想されることを意味する。
【００４１】
以上説明したように、本発明は、未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法である。
【００４２】
また、本発明は、未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現データに基づいて、該ｉＰＳ細胞の神経堤細胞（ＮＣ細胞）への分化能を予測し、それにより該未分化ｉＰＳ細胞の軟骨細胞への分化能を予測する方法である。
【００４３】
前記未分化のｉＰＳ細胞は、フィーダーフリー化状態のものであり得る。前記未分化のｉＰＳ細胞は、神経堤細胞（ＮＣ細胞）に分化する前の未分化状態のものである。
【００４４】
前記遺伝子が、遺伝子ID (Unique Sorted Transcript Cluster ID)で表して、
発現減少の遺伝子として、16713399、16984394、17121974、17122170、16860191、16999432、17121970、17065663、17028547、17022610、17035441、16825196、16946689、16906788、16700250、17048704、16729023、16938761、16885703、17000077、16917881、16809811、16684087、17092402、16826158、17038957、16684995、17103991、16897399、及び16696918；  及び
発現亢進の遺伝子として、16788743、16788693、16788572、17118804、16662749、17100659、16747661、17083911、16788727、16692589、16729321、16976012、16697219、16798158、16990845、17118850、16830980、16778675、17110283、16851422、16797049、16838105、16831379、16875952、17117410、17103230、16999147、16688792、16718764、17072022、及び16679331；
からなる群から少なくとも１つ選ばれ得る。
【００４５】
より具体的には、本発明において、
対象とする未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルデータを取得し、各遺伝子の発現量を得て、
基準となる分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）の前記各遺伝子の発現量に対する発現量の比率：
［発現量の比率］＝［対象とする未分化ｉＰＳ細胞の各遺伝子発現量］／［基準となる分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）の各遺伝子発現量］
を算出し、
算出された前記発現量の比率が、前記発現減少の遺伝子については、０．９より小さい場合に、前記発現亢進の遺伝子については、１．１より大きい場合に、前記対象とする未分化ｉＰＳ細胞は軟骨細胞への分化能が高いと判断する。この際、判断基準とする値については、当業者が適宜選択できるであろう。例えば、算出された前記発現量の比率が、前記発現減少の遺伝子については、０．８より小さい場合、０．７より小さい場合、あるいは０．６より小さい場合に、前記対象とする未分化ｉＰＳ細胞は軟骨細胞への分化能が高いと判断してもよい。また、算出された前記発現量の比率が、前記発現亢進の遺伝子については、１．２より大きい場合、１．３より大きい場合、あるいは１．５より大きい場合に、前記対象とする未分化ｉＰＳ細胞は軟骨細胞への分化能が高いと判断してもよい。
【００４６】
対象とする未分化のｉＰＳ細胞の遺伝子発現プロファイルデータを取得し、当業者が適宜選択した遺伝子セットの発現量を得て、前述のOPLS法による多変量解析をすることによって、識別モデルを構築し、モデルから算出した予測スコアを算出しても各ｉＰＳ細胞の分化能を判断することができる。その場合の判断基準としては、分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）から算出した予測スコアの平均値を算出し、例えば、
［平均値＋２×標準偏差］の値を基準値として設定するなどで当業者が適宜規定できるであろう。
【００４７】
基準となる分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）は、当業者が適宜選択できるであろう。本明細書においては、分化能の低い未分化のｉＰＳ細胞（コントロール）として、ＮＣ細胞への分化効率が低い細胞群（409B2, 610B1, TIG118-4f1, TIG107-4f1）の平均値を用いる例を示した。これら４株に限らず、この種のＮＣ細胞への分化効率が低く且つ未分化のｉＰＳ細胞であれば、コントロールとして用いることができるであろう。
【００４８】
未分化のｉＰＳ細胞を神経堤細胞（ＮＣ細胞）へと分化誘導する方法や、神経堤細胞（ＮＣ細胞）を軟骨前駆細胞、さらに軟骨細胞へと分化誘導する方法は知られており、例えば、特開２０１６−８８９０９号公報等を参照することができる。
【００４９】
例えば、ｉＰＳ細胞をマトリゲル(Becton Dickinson社製)上でmTeSR培地中(Stem-Cell Technologies社製)で９日間培養する。９日目に最初のＮＣ細胞への分化誘導培地中で６日間培養する。その後、0.05% trypsin-EDTAを用いて細胞を回収し、フィブロネクチンコートされたディッシュ上に再播種後、３日ごとに継代作業を３回行うことで軟骨前駆細胞へと分化誘導させる。これらの細胞を、成長因子であるPDGF-BB, TGFβ3, BMP4を含む軟骨分化誘導培地を用いて培養することで軟骨細胞が得られる。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に制限されるものではない。【００５１】
［実験例１］
この例では、ヒトの体細胞由来の１０種の未分化の各ｉＰＳ細胞株（201B2, 201B7, 414C2, 409B2, TIG118-4f1, 604A1, 606A1, 610B1, 451F3, TIG107-4f1）を用いた。【００５２】
フィーダー細胞上（オンフィーダー）で培養しているヒトの体細胞由来の上記各ｉＰＳ細胞をマトリゲル（マトリゲル グロースファクター リデュースト、コーニング社製）でコートした培養dishに再播種（継代比率1:5）し、フィーダーフリー用培地（mTeSR1, ベリタス社製）を用いて一週間培養した。【００５３】
一週間後に、培地を除去し、PBSで洗浄した後、培養細胞にRNA抽出バッファー(RLTバッファー（キアゲン社製）+5%メルカプトエタノール)を１ｍＬ添加してRNAを回収した。抽出RNAからcRNA, ssDNA(single-strand cDNA)の合成を行い、uracil DNA glycosylaseとapurinic/apyrimidinic endonuclease 1を用いて断片化した。次に、断片化されたssDNAをビオチン標識し、GeneChip(R) Human Gene 2.0 ST Array (Thermo Fisher SCIENTIFIC 社製)へ１７時間ハイブリダイゼーションさせた後、洗浄・染色後、スキャナーで蛍光を読み取ることで、遺伝子の発現データを得た。【００５４】
得られた発現データから、表１及び２に示された遺伝子の発現量を抽出し、識別モデル（アルゴリズム）に適用することで分化効率の予測スコアを算出した（図８）。予測スコアが大きいほど、そのｉＰＳ細胞はCD271high+  NC細胞の産生効率（分化能）が高いと予想されることを意味する。【００５５】
［実験例２］
この例では、遺伝子発現プロファイルを用いた未分化ｉＰＳ細胞の分化能評価アルゴリズムの汎用性について確認した。【００５６】
ヒトの体細胞由来の１０種の未分化の各ｉＰＳ細胞株（201B6, 253G4, 404C2, 454E2, 585A1, 585B1, 604A3, 604B1, 606A1, 610A2）を用いた。【００５７】
フィーダー細胞上（オンフィーダー）で培養しているヒトの体細胞由来の上記各ｉＰＳ細胞をマトリゲル（マトリゲル グロースファクター リデュースト、コーニング社製）でコートした培養dishに再播種（継代比率1:5）し、フィーダーフリー用培地（mTeSR1, ベリタス社製）を用いて一週間培養した。【００５８】
一週間後に、培地を除去し、PBSで洗浄した後、培養細胞にRNA抽出バッファー(RLTバッファー（キアゲン社製）+5%メルカプトエタノール)を１ｍＬ添加してRNAを回収した。抽出RNAからcRNA, ssDNA(single-strand cDNA)の合成を行い、uracil DNA glycosylaseとapurinic/apyrimidinic endonuclease 1を用いて断片化した。次に、断片化されたssDNAをビオチン標識し、GeneChip(R) Human Gene 2.0 ST Array (Thermo Fisher SCIENTIFIC 社製)へ１７時間ハイブリダイゼーションさせた後、洗浄・染色後、スキャナーで蛍光を読み取ることで、遺伝子発現プロファイルデータを取得した。【００５９】
取得した遺伝子プロファイルデータより、細胞評価アルゴリズムを用いて分化効率の予測スコア（Prediction Score）を算出した（図９）。図９は、遺伝子発現プロファイルによる分化能の予測スコアを示す図であり、縦軸は予測スコア（Prediction Score）を示している。【００６０】
他方で、上記未分化の各ｉＰＳ細胞株から神経堤細胞（ＮＣ細胞）に分化誘導した。分化誘導させたＮＣ細胞におけるp75高発現ＮＣ細胞の割合を蛍光フローサイトメトリー(FACS)により解析し、その際のCD271high+ NC細胞の割合をＮＣ分化効率として算出した。p75は、低親和性神経成長因子受容体である。図１０は、各ｉＰＳ細胞株におけるＮＣ細胞への分化効率［NC induction efficiency (CD271high+ (%))］を示す図である。縦軸は、ＮＣ細胞中に占めるCD271high+ NC細胞の割合を示す。図１０に示すように、結果として、ＮＣ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞群（Good clone；６株：201B6, 253G4, 604A3, 604B1, 606A1, 610A2）と、ＮＣ細胞への分化効率が低いｉＰＳ細胞群（Poor clone；４株：404C2, 454E2, 585A1, 585B1）とに分かれることが分かった。なお、ここでは、ＮＣ細胞中に含まれるCD271high+ NC細胞の割合が２０％以上である場合に、ＮＣ細胞への分化効率が高いものとした。【００６１】
そこで、これら１０種の各ｉＰＳ細胞株に対して得られた予測スコアを、ＮＣ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞群（Good clone）とＮＣ細胞への分化効率が低いｉＰＳ細胞群（Poor clone）とで比較をすると、分化効率が高い群（Good clone）で予測スコアが有意に亢進していることを確認した（図１１）。p=2.1E-05（すなわち、p=2.1ｘ１０-5）であった。図１１は、分化効率が高いｉＰＳ細胞群（Good clone）と分化効率が低いｉＰＳ細胞群（Poor clone）の間での予測スコア（Prediction Score）の比較を示す図である。【００６２】
さらに、評価アルゴリズムから算出した予測スコア値を基にＲＯＣ曲線（Receiver operation characteristic曲線）を作成したところ、識別の性能を表す面積値（ＡＵＣ：Area under curve）が１であった。このことは、分化効率が未知の未分化ｉＰＳ細胞に対しても、本発明の評価アルゴリズムによる識別が可能であることを示している（図１２）。図１２は、遺伝子発現プロファイルから算出した予測スコア値に対するＲＯＣ曲線であり、横軸は、１００−特異度（Specificity）（％）を表し、縦軸は、感度（Sensitivity）（％）を表す。【００６３】
以上のことから、本発明による遺伝子発現プロファイルを用いることで、各ｉＰＳ細胞の分化能をｉＰＳ細胞の未分化の段階で予測できることが示された。
【図１】
2018225868.tif 000005
【図２】
2018225868.tif 000006
【図３】
2018225868.tif 000007
【図４】
2018225868.tif 000008
【図５】
2018225868.tif 000009
【図６】
2018225868.tif 000010
【図７】
2018225868.tif 000011
【図８】
2018225868.tif 000012
【図９】
2018225868.tif 000013
【図１０】
2018225868.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
2018225868.tif 000016
【国際調査報告】
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