(57)【要約】  本発明は、D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む寿命延長剤を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む寿命延長剤。
【請求項２】
D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む寿命延長用化粧料。
【請求項３】
D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む寿命延長用飲食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寿命延長剤及び抗老化剤に関する。【０００２】
また、本発明は、寿命延長用化粧料、寿命延長用飲食品組成物、抗老化化粧料、抗老化用飲食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
近年の分析技術の進展に伴い、微生物、植物を始め、哺乳動物にも様々なD-アミノ酸が存在し、多様な生理機能を果たしていることが明らかになり、注目されている。【０００４】
特許文献1は、肌の老化抑制作用、肌質改善作用を有する化粧料として、ヒドロキシプロリン（またはヒドロキシプロリンのＮ−アシル化誘導体）を開示する。【０００５】
特許文献2は、特定のアミノ酸のL体/D体の濃度比を、腎不全の早期診断マーカーとすることを開示する。【０００６】
特許文献3は、コラーゲン産生を促進し、光老化やシワ等の皮膚状態を改善する組成物として、Ｄ−アスパラギン酸またはＤ−アラニンを含む組成物を開示する。【０００７】
特許文献４は、ヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシプロリンのＮ−アシル誘導体を含有する肌の老化抑制、肌質改善用化粧料に関する記載が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2002-080321
【特許文献２】特開2015-132598
【特許文献３】WO2011/040363
【特許文献４】特許第4714071号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、寿命延長剤、抗老化剤、或いはそれらを含む化粧料及び飲食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の寿命延長剤、化粧料及び飲食品組成物を提供するものである。
項１．  D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む寿命延長剤。
項２．  D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む寿命延長用化粧料。
項３．  D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む寿命延長用飲食品組成物。【００１１】
さらに、本発明は、以下の抗老化剤、化粧料及び飲食品組成物を提供するものである。
項Ａ．  D-プロリンを含む抗老化剤。
項Ｂ．  D-プロリンを含む抗老化化粧料。
項Ｃ．  D-プロリンを含む抗老化用飲食品組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む寿命延長剤並びに寿命延長作用を有する化粧料及び飲食品組成物が提供できる。【００１３】
また、本発明によれば、D-プロリンを含む新規な抗老化剤／アンチエージング剤、抗老化作用／アンチエージング作用を有する化粧料及び飲食品組成物が提供される。【００１４】
D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸、特にD-プロリンはMenin-Bach2系を介してT細胞の老化を抑制し、それにより全身の老化を抑制することができる。【００１５】
本発明において、D-プロリンは、ショウジョウバエなどの動物の寿命延長作用を有することが実証された。したがって、本発明の有効成分は、寿命の延長に必要な脳、免疫などの機能の賦活、例えば老化に伴う中枢神経、末梢神経、自律神経、心血管系、呼吸器、消化器、肝胆膵、骨軟骨、筋肉靭帯、運動器、皮膚、結合織、脂肪、褐色脂肪、内分泌、外分泌、乳腺、腎泌尿器、生殖器、感覚器、咽頭喉頭、頭頚部、歯牙歯周組織、舌、代謝、造血器、および免疫系の機能低下の改善が期待でき、特に記憶力の低下の改善、免疫能の低下の改善などの作用が期待できる。【００１６】
実施例で使用した老化促進ショウジョウバエは有用な実験動物であり、Cu/Zn-SODの欠損により活性酸素の消去が不十分になり老化促進作用を示し、寿命が短縮される。本発明の寿命を延長する有効成分は活性酸素の蓄積による老化、さらにそれに伴う寿命の短縮を抑制できるので、寿命延長作用だけでなく活性酸素による老化を遅らせることができる。例えば、本発明の寿命延長用化粧料は肌に塗ることで、肌の細胞寿命を延長することができ、若々しい肌状態を長く保つことができる。本発明の寿命延長用飲食品組成物を摂取することで、体内の活性酸素による影響を軽減することができ、内面的にも若い状態を保持することができ、健康寿命を延長することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】D-プロリンの濃度依存的なショウジョウバエ成虫の寿命延長効果。検定系統：ショウジョウバエ早期老化系統雄20、60、200、400 mg/ml濃度で飼料にまぜて摂食。D-プロリンが用量依存的に老化促進ショウジョウバエ成虫の寿命を延長することを示す。L-プロリンには効果はない。
【図２】プロリン類似D-アミノ酸によるショウジョウバエ成虫の寿命延長効果検定系統：ショウジョウバエ早期老化系統雄60、200、400 mg/ml濃度で飼料にまぜて摂食。D-アスパラギン酸が400μg/mlで老化促進ショウジョウバエ成虫の寿命を延長することを示す（log-rank test p<0.05)。
【図３】プロリン類似D-アミノ酸によるショウジョウバエ成虫の寿命延長効果検定系統：ショウジョウバエ早期老化系統雄60、200、400 mg/ml濃度で飼料にまぜて摂食。D-ヒドロキシプロリンが400μg/mlで老化促進ショウジョウバエ成虫の寿命を延長することを示す（log-rank test p<0.05)。
【図４】実施例4〜6の手順を示すプロトコール。
【図５】脾臓由来単核球における、CD27/CD62Lの発現解析（フローサイトメトリー）(Day 495)。CD27(-)/CD62L(-)細胞は老化の指標になる。
【図６】脾臓由来単核球における、MeninとBach2の発現（Real time RT-PCR）(Day 495)。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の寿命延長剤の有効成分として、D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸が挙げられ、これらを１種単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。これらのD-化合物は、純粋なD-化合物であってもよく、D-化合物とL-化合物の任意の割合の混合物(ラセミ体を含む)を使用してもよい。
【００１９】
D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸の構造式を以下に示す。
【００２０】
【化１】
2019026993.tif 000002
【００２１】
本発明の抗老化剤の有効成分として、D-プロリンが挙げられる。これらのD-化合物は、純粋なD-化合物であってもよく、D-化合物とL-化合物の任意の割合の混合物(ラセミ体を含む)を使用してもよい。
【００２２】
寿命延長及び抗老化の有効成分はD-化合物のみであり、L-化合物は寿命延長作用及び抗老化作用を示さない。
【００２３】
本発明の寿命延長剤、抗老化剤、或いはそれらを含む化粧料及び飲食品組成物は、ヒト、イヌ、ネコなどのペットに適用することができ、ヒトに適用することが好ましい。
【００２４】
本発明の寿命延長剤を経口で摂取する場合、成人1日あたり1 mg〜25 g程度、好ましくは10 mg〜20 g程度、より好ましくは100 mg〜15 g程度の摂取量が望ましい。本発明の寿命延長用飲食品組成物は、D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種を含み、これらは、経口で摂取する場合、成人1日あたり1 mg〜25 g程度、好ましくは10 mg〜20 g程度、より好ましくは100 mg〜15 g程度の摂取量が望ましい。
【００２５】
本発明の抗老化剤を経口で摂取する場合、成人1日あたり1 mg〜25 g程度、好ましくは10 mg〜20 g程度、より好ましくは100 mg〜15 g程度の摂取量が望ましい。本発明の抗老化用飲食品組成物は、D-プロリンを含み、これらは、経口で摂取する場合、成人1日あたり1 mg〜25 g程度、好ましくは10 mg〜20 g程度、より好ましくは100 mg〜15 g程度の摂取量が望ましい。
【００２６】
本発明の寿命延長剤を医薬又は化粧料の皮膚外用剤としてヒトに適用する場合、D-プロリン、D-ヒドロキシプロリン及びD-アスパラギン酸からなる群から選ばれる少なくとも1種の濃度は、0.001〜10質量％程度、好ましくは0.01〜5質量％程度が挙げられる。
【００２７】
本発明の抗老化剤を医薬又は化粧料の皮膚外用剤としてヒトに適用する場合、D-プロリンの濃度は、0.001〜10質量％程度、好ましくは0.01〜5質量％程度が挙げられる。
【００２８】
本発明の寿命延長剤、抗老化剤は医薬製剤として摂取することができる。製剤としては、錠剤(タブレット)、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤、丸剤、トローチ、液剤、注射剤、点滴剤、吸入剤、ドリンク剤、シロップ剤、坐剤、経皮吸収剤、パッチ剤、サシェ、硬膏剤、軟膏剤などが挙げられる。
【００２９】
本発明の化粧料としては、ファンデーション、乳液、ローション、化粧水、口紅、頬紅、化粧下地などが挙げられる。
【００３０】
飲食品としては、乳飲料、発酵乳飲料、炭酸飲料、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、栄養補助飲料等の飲料、飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、アイスクリーム、ヨーグルト、バター、パン類、サプリメント、栄養補助食品、流動食等が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。【００３２】
実施例１
アミノ酸置換により活性が低下したCu/Zn-SODをもつショウジョウバエ雄の突然変異体（sod1[n1]）を用い、直径25mmプラスチックチューブに成虫を入れて飼育し、D-プロリン(D-Pro)を20、60、200、400 μg/ml、或いはL-プロリン(L-Pro)を400 μg/ml濃度で含むショウジョウバエの簡易培地(Instant medium)の餌を摂取させて、寿命を測定した。結果を試験に用いたキイロショウジョウバエの数（ｎ）とともに図１に示す。コントロール(Control)は追加の  D-Pro／L-Proを添加していない簡易培地を用いた。【００３３】
図１に示すように、ショウジョウバエの寿命は、濃度依存的に増加した。【００３４】
実施例２
アミノ酸置換により活性が低下したCu/Zn-SODをもつショウジョウバエ雄の突然変異体（sod1[n1]）を用い、直径25mmプラスチックチューブに成虫を入れて飼育し、D-プロリン(D-Pro)を400 μg/ml、或いはD-アスパラギン酸(D-Asp)を60、200、400μg/ml濃度で含むショウジョウバエの簡易培地(Instant medium)の餌を摂取させて、寿命を測定した。結果を試験に用いたキイロショウジョウバエの数（ｎ）とともに図２に示す。コントロール(Control)は追加のD-Pro／D-Aspを添加していない簡易培地を用いた。【００３５】
図２に示すように、D-Aspはショウジョウバエの寿命を濃度依存的に延長したが、その効果はD-Proの方が有意に高かった。【００３６】
実施例３
アミノ酸置換により活性が低下したCu/Zn-SODをもつショウジョウバエ雄の突然変異体（sod1[n1]）を用い、直径25mmプラスチックチューブに成虫を入れて飼育し、D-プロリン(D-Pro)を400 μg/ml、或いはD-ヒドロキシプロリン(D-HP)を60、200、400μg/ml濃度で含むショウジョウバエの簡易培地(Instant medium)の餌を摂取させて、寿命を測定した。結果を試験に用いたキイロショウジョウバエの数（ｎ）とともに図３に示す。コントロール(Control)は追加のD-Pro／D-HPを添加していない簡易培地を用いた。【００３７】
図３に示すように、D-HPはショウジョウバエの寿命を濃度依存的に延長したが、その効果はD-Proの方が有意に高かった。【００３８】
実施例４
C57BL/6マウス8週齢（清水実験材料より購入）に普通水（Control群 ; N=3）、0.2mg/mlの濃度でL-プロリン(ナカライテスク社製)を溶解した水（ L-プロリン群 ; N3）或いは0.2mg/mlの濃度でD-プロリン(ナカライテスク社製)を溶解した水（ D-プロリン群 ; N3）を自由飲水で投与した。495日目に安楽死させたのち脾臓を摘出し、0.45μMのストレーナーを用いて脾臓をすり潰し、脾臓由来細胞の懸濁液を作成した(図４)。1000G  5分間、遠心分離後、上清を吸引除去したのち、細胞ペレットに2mlの塩化アンモニウム溶血剤(8.99mg/ml NH4Cl、1mg/ml KHCO3、37μg/ml EDTA4Naを含む蒸留水)を添加したのち懸濁して 2分間室温で静置処理した。その後10mlの10％FBSを含むRPMI 1640 培地を添加後、1000G  5分間、遠心分離したのち上清を吸引除去した。10％FBSを含むRPMI 1640 培地を5ml添加し細胞懸濁液（脾臓由来単核球）を作製した。この細胞懸濁液を、実施例５と実施例６に用いた。【００３９】
実施例５
実施例４の脾臓由来単核球1x106個を1.5mlエッペンチューブに入れたのち900G 5分  遠心分離後、上清を吸引除去し50μlのFACSバッファー（0.5% BSA、0.01％  NaNO, 1mM EDTAを溶解したPBS(-)）を添加したのち、FITC標識マウス抗CD27抗体（NOVUS；NPB-1-44021）及び、PE標識マウス抗CD62L抗体（ABGENT；ATB10190）で20分間  氷上でインキュベートしたのち、FACSバッファーで２回洗浄したのちフローサイトメトリー（Becton Dickinson  :FACS Caliber）を用いて解析した。【００４０】
その結果を図５に示す。D-プロリン投与群ではControl群およびL-プロリン投与群と比較して、CD62陰性CD27陰性の老化マーカーを有するT細胞が有意に少なく、D−プロリンの投与する事が免疫系の老化抑制に寄与したことが示された。【００４１】
実施例６ 
実施例４の脾臓由来単核球1x105個からQiagen社製 RNA easy Mini Kitを用いてtotal RNA を抽出した。このRNA から、Toyobo社製のRever Tra Ace qPCR RT Master Mix を用いてcDNA を合成した。このcDNA にReal-time PCR Master Mix と、Menin遺伝子、Bach2遺伝子またはβアクチン遺伝子に特異的なprimers とTaqman probe を、混和した。ABI社製のAB7300 Real-time PCR system を用いてqRT-PCR を行った。Menin 遺伝子およびBach2遺伝子のmRNA レベルをβ アクチン遺伝子ｍRNAレベルに対する比として定量し、Control群の脾臓由来単核球の値を１として算出した。【００４２】
その結果を図６に示す。D-プロリン投与群ではControl群およびL-プロリン投与群と比較して、Menin遺伝子およびBatch遺伝子のmRNA発現が高く、D-プロリン投与によるT細胞老化の抑制にMenin-Bach2系が関与していることが示唆された。
【図１】
2019026993.tif 000003
【図２】
2019026993.tif 000004
【図３】
2019026993.tif 000005
【図４】
2019026993.tif 000006
【図５】
2019026993.tif 000007
【図６】
2019026993.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月30日(2019.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−プロリンを含む抗老化剤。
【請求項２】
Ｄ−プロリンを含む抗老化化粧料。
【請求項３】
Ｄ−プロリンを含む抗老化用食品組成物。
【請求項４】
Ｄ−プロリン及びＤ−ヒドロキシプロリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む寿命延長剤。
【請求項５】
Ｄ−プロリン及びＤ−ヒドロキシプロリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む寿命延長用化粧料。
【請求項６】
Ｄ−プロリン及びＤ−ヒドロキシプロリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を含む寿命延長用飲食品組成物。
【請求項７】
Ｄ−プロリンを含む、請求項４に記載の寿命延長剤。
【請求項８】
Ｄ−プロリンを含む、請求項５に記載の寿命延長用化粧料。
【請求項９】
Ｄ−プロリンを含む、請求項６に記載の寿命延長用飲食品組成物。
【国際調査報告】
2019026993.tif 000009
2019026993.tif 000010
2019026993.tif 000011
2019026993.tif 000012