(57)【要約】  本発明の課題は、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することである。本発明によれば、Ｒ１’−Ｒ１Ｘ−Ｒ２Ｘ−（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）L−（Ｒ５Ｘ−Ｒ６Ｙ）M−（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）N−  Ｒ７Ｘ−Ｒ８Ｘ−  Ｒ８’で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、各記号は本明細書に記載のアミノ酸配列を示す）が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ１’−Ｒ１Ｘ−Ｒ２Ｘ−（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）L−（Ｒ５Ｘ−Ｒ６Ｙ）M−（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）N−  Ｒ７Ｘ−Ｒ８Ｘ−  Ｒ８’で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：
式中、
Ｒ１Ｘは、Ｒ１、Ｒ１（Ｓ１２Ｎ）、Ｒ１（Ｓ１２Ｃ）、Ｒ１（Ｑ１６Ｅ）、又はＲ１（Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ２Ｘは、Ｒ２、Ｒ２（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ５Ｘは、Ｒ５、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｎ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ６ＹはＲ６、Ｒ６（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ７Ｘは、Ｒ７、Ｒ７（Ｓ１２Ｃ，  Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｓ１２Ｎ，  Ｅ１６Ｑ）、又はＲ７（Ｅ１６Ｒ）を示し、
Ｒ８Ｘは、Ｒ８、Ｒ８（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ，  Ｑ１６Ｅ）、又はＲ８（Ｎ１２Ｓ，  Ｑ１６Ｒ）を示す。
Ｓ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＳがＮに置換されていることを示し、
Ｓ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＳがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＮがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＮがＳに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＣがＮに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＣがＳに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｅは、１６番目のアミノ酸ＱがＥに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｒは、１６番目のアミノ酸ＱがＲに置換されていることを示し
Ｌ及びＮはそれぞれ独立に０又は１を示し、Ｍは２以上の整数を示す。
各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
【請求項２】
Ｒ１Ｘ、Ｒ２Ｘ、Ｒ５Ｘ、Ｒ６Ｙ、Ｒ７Ｘ及びＲ８Ｘの何れか一以上のリピートにおいて、
前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ−Ａである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒ又はＨｉｓであり、
前記の組み合わせが、Ｇ−Ａ、Ｕ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｕ−Ｃ又はＣ−Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒであり、
前記組み合わせが、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｕ、Ｕ−Ｇ、Ｃ−Ｇ又はＧ−Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇであり、
前記組み合わせが、Ａ−Ｕ又はＧ−Ｇである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇ又はＨｉｓであり、
前記組み合わせが、Ｕ−Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は
前記組み合わせが、Ｃ−Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＰｈｅであり、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
EIRG-(R5X-R6Y)nで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、ｎ個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４〜１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
【請求項４】
AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、（ｎ−１）個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４〜１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 (AFKG) ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12C) (AFKG)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
【請求項５】
さらにＮ末端にR1'を有し、及び／又はＣ末端にR8'を有する、請求項３は４に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
【請求項６】
さらにＮ末端にR1'-R1-R2を有し、及び／又はＣ末端にR8-R8'を有する、請求項３又は４に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
【請求項７】
請求項１から６の何れか一項に記載のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
高い結合能と選択性を有するＲＮＡ結合タンパク質の一つとして、human Pumilio and FBF homology （hPUF)タンパク質が知られている（例えば、非特許文献１参照）。hPUFタンパク質は、アミノ酸配列と長さが異なる、８つのリピートモチーフを有しており、１つのリピート内の３つのアミノ酸残基が１塩基を認識することが知られている。８つのリピートモチーフをN末端側から、R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8と呼ぶこととする。各リピートモチーフのアミノ酸配列は以下の通りである。図１６３は、野生型スタッキングアミノ酸の規則性を分子モデルにより示す図である。
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG（配列番号３）
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG（配列番号４）
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】X. Wang, et. al. Cell, Vol. 110, 501-512, August 23, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、R1〜R8の８つのリピートモチーフの構成又はアミノ酸残基を改変することにより、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を、標的ＲＮＡ配列に応じて設計できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によれば、以下の発明が提供される。【０００６】
＜１＞  Ｒ１’−Ｒ１Ｘ−Ｒ２Ｘ−（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）L−（Ｒ５Ｘ−Ｒ６Ｙ）M−（Ｒ５Ｘ又はＲ６Ｙ）N−  Ｒ７Ｘ−Ｒ８Ｘ−  Ｒ８’で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：
式中、
Ｒ１Ｘは、Ｒ１、Ｒ１（Ｓ１２Ｎ）、Ｒ１（Ｓ１２Ｃ）、Ｒ１（Ｑ１６Ｅ）、又はＲ１（Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ２Ｘは、Ｒ２、Ｒ２（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ２（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）を示し、
Ｒ５Ｘは、Ｒ５、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｎ）、Ｒ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ５（Ｃ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ６ＹはＲ６、Ｒ６（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｅ）、又はＲ６（Ｎ１２Ｓ，Ｑ１６Ｒ）の何れかを示し、
Ｒ７Ｘは、Ｒ７、Ｒ７（Ｓ１２Ｃ，  Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｅ１６Ｑ）、Ｒ７（Ｓ１２Ｎ，  Ｅ１６Ｑ）、又はＲ７（Ｅ１６Ｒ）を示し、
Ｒ８Ｘは、Ｒ８、Ｒ８（Ｎ１２Ｃ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ）、Ｒ８（Ｎ１２Ｓ，  Ｑ１６Ｅ）、又はＲ８（Ｎ１２Ｓ，  Ｑ１６Ｒ）を示す。
Ｓ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＳがＮに置換されていることを示し、
Ｓ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＳがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｃは、１２番目のアミノ酸ＮがＣに置換されていることを示し、
Ｎ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＮがＳに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｎは、１２番目のアミノ酸ＣがＮに置換されていることを示し、
Ｃ１２Ｓは、１２番目のアミノ酸ＣがＳに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｅは、１６番目のアミノ酸ＱがＥに置換されていることを示し、
Ｑ１６Ｒは、１６番目のアミノ酸ＱがＲに置換されていることを示し
Ｌ及びＮはそれぞれ独立に０又は１を示し、Ｍは２以上の整数を示す。Ｍは好ましくは２〜２０の整数を示し、より好ましくは２〜１０の整数を示し、さらに好ましくは２〜５の整数を示す。
各リピートは以下のアミノ酸配列を示す。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜２＞  Ｒ１Ｘ、Ｒ２Ｘ、Ｒ５Ｘ、Ｒ６Ｙ、Ｒ７Ｘ及びＲ８Ｘの何れか一以上のリピートにおいて、
前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ−Ａである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒ又はＨｉｓであり、
前記の組み合わせが、Ｇ−Ａ、Ｕ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｕ−Ｃ又はＣ−Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｙｒであり、
前記組み合わせが、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｕ、Ｕ−Ｇ、Ｃ−Ｇ又はＧ−Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇであり、
前記組み合わせが、Ａ−Ｕ又はＧ−Ｇである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＡｒｇ又はＨｉｓであり、
前記組み合わせが、Ｕ−Ｕである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は
前記組み合わせが、Ｃ−Ｃである場合には、対応するリピートの13番目のアミノ酸（即ち、前記の２塩基の間にスタッキングするアミノ酸）がＰｈｅであり、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞  EIRG-(R5X-R6Y)nで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、ｎ個のR6Yはそれぞれ独立に、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４〜１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜４＞  AFKG-(R5X-R6YZ)n-1 R5X-R6Yで示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質：式中、ｎ個のR5Xはそれぞれ独立に、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16E)の何れかを示し、（ｎ−１）個のR6YZはそれぞれ独立に、R6(AFKG)、R6(N12C) (AFKG)、R6(N12S,Q16E) (AFKG)又はR6(N12S,Q16R) (AFKG)の何れかを示し、R6Yは、R6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示し、ｎは４〜１５の整数を示す。
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 (AFKG) ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12C) (AFKG)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16E) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6(N12S,Q16R) (AFKG): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAAFKG
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
＜５＞  さらにＮ末端にR1'を有し、及び／又はＣ末端にR8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜６＞  さらにＮ末端にR1'-R1-R2を有し、及び／又はＣ末端にR8-R8'を有する、＜３＞又は＜４＞に記載のタンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ａ＞
R1'- R1-R2-R5X-R4-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(ILQ)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6Y-R7(IRG)-R8-R8'
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R5X-R6-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
R1'- R1-R2-R3-R4-R5(R13K)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R3-R4-R5X-R6(Y13W)-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13H)-R5(R13H)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13F)-R5(R13F)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13Y)-R5(R13Y)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5(R13W)-R5(R13W)-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'、又は
R1'- R1-R2-R5X-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R5X-R6Y-R7-R8-R8'
で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R5Xは、R5、R5(C12N)、R5(C12S,Q16E)、又はR5(C12S,Q16R)の何れかを示し、R6YはR6、R6(N12C)、R6(N12S,Q16E)又はR6(N12S,Q16R)の何れかを示す。各リピートは以下のアミノ酸配列を示す）。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13H)：QVFALSTHPYGCHVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12N)：QVFALSTHPYGNRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13K)：QVFALSTHPYGCKVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13F)：QVFALSTHPYGCFVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13Y)：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(R13W)：QVFALSTHPYGCWVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16E)： QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R5(C12S,Q16R) ：QVFALSTHPYGSRVIRRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12C)：HTEQLVQDQYGCYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16E): HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(N12S,Q16R): HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R6(Y13W)：HTEQLVQDQYGNWVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R7(ILQ)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEILQ
R7(IRG)：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEIRG
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG
＜Ｂ＞  R1'- （Rｘ）n-R8'で示されるアミノ酸配列（式中、ｎは８〜３０を示し、Rｘはそれぞれ独立に、R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7又はR8の何れかのリピートを示し、R1'、 R1、R2、R3、R4、R5X、R6X、R7、R8、R8'の定義は＜Ａ＞に記載の通りである）を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、何れか一以上のリピートにおいて、前記リピートが認識する塩基とそれに隣接する下流の塩基の組み合わせが、Ａ−Ａである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒ又はＨｉｓであり、前記の組み合わせが、Ｇ−Ａ、Ｕ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｕ−Ｃ又はＣ−Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｙｒであり、前記組み合わせが、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｕ、Ｕ−Ｇ、Ｃ−Ｇ又はＧ−Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇであり、前記組み合わせが、Ａ−Ｕ又はＧ−Ｇである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＡｒｇ又はＨｉｓであり、前記組み合わせが、Ｕ−Ｕである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＴｒｐ又はＡｒｇであり、及び／又は前記組み合わせが、Ｃ−Ｃである場合には、前記リピートの少なくとも一つの13番目のアミノ酸がＰｈｅであり、前記タンパク質。
＜Ｃ＞    R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6-R5-R6-R7-R8-R8'で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質（式中、R1'は、GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAGを示し、R8'はHIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLGを示し、R1,R2,R5〜R8、R1'及びR8'は以下の（１）〜（９）の何れかを示す）。
（１）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（２）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（３）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIRHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（４）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（５）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSRVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（６）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGCYVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGSYVIEHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（７）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（８）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSRVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNRVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
（９）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R5 ：QVFALSTHPYGSYVIERILEHCLPDQTLPILEELHQ
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP
＜Ｄ＞R1'- R1-R2-R5-R6-R5-R6- R7-R8-R8'（式中、R1'、R8'、R1〜R8は下記に示すアミノ酸配列である）で示されるアミノ酸配列を有する、ＲＮＡ結合タンパク質であって、
R1(S12N)、R1(Q16E)、R1(Q16R)、R2(N12C)、R2(N12S)、R2(N12S, Q16E)、R2(N12S, Q16R)、R7(S12C, E16Q)、R7(E16Q)、R7(S12N, E16Q)、R7(E16R)、R8(N12C)、R8(N12S)、R8(N12S, Q16E)及びR8(N12S, Q16R)のいずれかの置換を有する、タンパク質。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
＜７＞    ＜１＞から＜６＞及び＜Ａ＞から＜Ｄ＞の何れか一に記載のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸。
＜８＞    ＜７＞に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
＜９＞    ＜８＞に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、可溶性及び高い結合性を有するＲＮＡ結合タンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５】図５は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。
【図６】図６は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。
【図７】図７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図８】図８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９】図９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。
【図１４】図１４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１５】図１５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１６】図１６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１７】図１７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１９】図１９は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。
【図２０】図２０は、ＲＮＡタンパク質の可溶性を測定した結果を示す。
【図２１】図２１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図２２】図２２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２４】図２４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図２５】図２５は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図２６】図２６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２７】図２７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図２８】図２８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２９】図２９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図３０】図３０は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図３１】図３１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３２】図３２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図３３】図３３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３４】図３４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３５】図３５は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図３６】図３６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３７】図３７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３８】図３８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図３９】図３９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図４０】図４０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４１】図４１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４２】図４２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図４３】図４３は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図４４】図４４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４５】図４５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４６】図４６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図４７】図４７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４８】図４８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４９】図４９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５０】図５０は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図５１】図５１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５２】図５２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図５３】図５３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５４】図５４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５５】図５５は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図５６】図５６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５７】図５７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図５８】図５８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図５９】図５９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６０】図６０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６１】図６１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図６２】図６２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６３】図６３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６４】図６４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図６５】図６５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６６】図６６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６７】図６７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図６８】図６８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図６９】図６９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７０】図７０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７１】図７１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７２】図７２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図７３】図７３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７４】図７４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７５】図７５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７６】図７６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図７７】図７７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図７８】図７８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図７９】図７９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８０】図８０は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図８１】図８１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８２】図８２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８３】図８３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８４】図８４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８５】図８５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８６】図８６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図８７】図８７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８８】図８８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図８９】図８９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９０】図９０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９１】図９１は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図９２】図９２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９３】図９３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９４】図９４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９５】図９５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９６】図９６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９７】図９７は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図９８】図９８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図９９】図９９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１００】図１００は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０１】図１０１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０２】図１０２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１０３】図１０３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０４】図１０４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０５】図１０５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０６】図１０６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０７】図１０７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１０８】図１０８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１０９】図１０９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１０】図１１０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１１】図１１１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１２】図１１２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１３】図１１３は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１１４】図１１４は、スタッキングアミノ酸の検証に関する説明図を示す。
【図１１５】図１１５は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。
【図１１６】図１１６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１７】図１１７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１８】図１１８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１１９】図１１９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１２０】図１２０は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。
【図１２１】図１２１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２２】図１２２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２３】図１２３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２４】図１２４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１２５】図１２５は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。
【図１２６】図１２６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２７】図１２７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２８】図１２８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１２９】図１２９は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１３０】図１３０は、スタッキングアミノ酸の検証に関する説明図を示す。
【図１３１】図１３１は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。
【図１３２】図１３２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１３３】図１３３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１３４】図１３４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１３５】図１３５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１３６】図１３６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１３７】図１３７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１３８】図１３８は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１３９】図１３９は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。
【図１４０】図１４０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１４１】図１４１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１４２】図１４２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１４３】図１４３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１４４】図１４４は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１４５】図１４５は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１４６】図１４６は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１４７】図１４７は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。
【図１４８】図１４８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１４９】図１４９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５０】図１５０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５１】図１５１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５２】図１５２は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５３】図１５３は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５４】図１５４は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１５５】図１５５は、アミノ酸の最適化に関する説明図を示す。
【図１５６】図１５６は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５７】図１５７は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５８】図１５８は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１５９】図１５９は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１６０】図１６０は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１６１】図１６１は、ＲＮＡタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図１６２】図１６２は、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図１６３】図１６３は、野生型スタッキングアミノ酸の規則性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のＲＮＡ結合タンパク質では、複数のリピートモチーフを有し、この複数のリピートモチーフのN末端に結合したN末端側ドメインと、C末端に結合したC末端ドメインとを有するＲＮＡ結合タンパク質である。
【００１０】
N末端のドメインをR1'ドメインと呼び、C末端のドメインをR8'ドメインと呼ぶこととする。なお、R1'ドメインとR8'ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG（配列番号９）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG（配列番号１０）
【００１１】
本発明の実施例においては以下の知見が得られた。
実施例１では、R1の５番目又は１４番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換すると結合力が低下すること、並びにR2の１８番目のアミノ酸残基であるPheをAlaに置換しても結合力に影響しないことが判明した。即ち、R1の５番目及び１４番目のアミノ酸残基であるPheがＲＮＡとタンパク質との相互作用に関与していることが示唆された。
【００１２】
実施例２においては、認識リピートを置換したＲＮＡ結合タンパク質の可溶性と結合性を調べた。
その結果、R3をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性、並びにR4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は何れも可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR5に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、結合性も有していた。R3をR5に置換し、さらにR4から置換されたR5において、１３番目のアミノ酸残基であるArgをHisに置換したＲＮＡ結合タンパク質も上記と同等の結合性を有していた。
また、R3をR5に置換し、R4をR6に置換したＲＮＡ結合タンパク質は可溶性であり、野生型と同等の結合性を有していた。
また、R7-R8を連結する際には、R7の末端配列は、ILQ又はIRGであることが好ましく、ILQがより好ましいことが示された。
【００１３】
実施例３においては認識リピートを延長したＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。その結果、R5-R6のリピートを繰り返すことにより、高い結合性を発揮できることが示唆された。
【００１４】
実施例４においては、R5について認識特異性を改変したＲＮＡ結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、C12N（U認識）＞C12S,Q16E（G認識）＞C12S,Q16R（C認識）＞MT(R3→R5,R4→R5)（A認識）の順に結合力が強いことが分かった。
また、R6について、認識特異性を改変したＲＮＡ結合タンパク質を作製し、結合性を調べた。その結果、G認識及びC認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度の結合力を有することが示された。
【００１５】
実施例５においては、Ｕ−Ａ、Ａ−Ｕ間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、Ａ−Ｕ間のカチオン性アミノ酸はArg、Ｕ−Ａ間の芳香族アミノ酸はTrp、Tyr、Phe、Hisが使用できることが示された。
また、Ａ−Ｃ、Ｃ−Ａ間スタッキングアミノ酸を改変することによって最適アミノ酸について調べた。その結果、Ｃ−Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ−Ｃ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ｇ−Ａ間には芳香族アミノ酸であるTyr、Ａ−Ｇ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ｕ−Ｇ間にはカチオン性アミノ酸であるArg、Ｇ−Ｕ間にはカチオ性アミノ酸であるArgが適していることが示された。
また、Ａ−Ａ間には、カチオン性アミノ酸よりも芳香族系アミノ酸の方が結合力が高く、芳香族系アミノ酸の中では、Tyr、Hisの結合力が高かった。
【表１】
2018169058.tif 000002
【００１６】
実施例７においては、認識リピートをさらに延長したＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。結合能の優劣について、実施例３の結果と合わせて考察すると、下記の上から順に結合力が高いことが分かった。
（１）  １２，１３リピート
（２）  １０，１１，１４リピート
（３）  ９，１５リピート
（４）  ＷＴ，８，１６リピート
【００１７】
実施例８においては、実施例４と同様に。認識特異性の変更を行ってＲＮＡ結合タンパク質の結合性を調べた。特にＲ１、Ｒ２、Ｒ７、Ｒ８について認識特性の変更を行い、その影響を実験により確認した。実験結果を通じて、各アミノ酸配列を有するタンパク質のＲＮＡに対する認識特異性を明らかにし、さらに結合力の序列を明らかにした。
【００１８】
実施例９においては、実施例５と同様に、各スタッキングアミノ酸を改変することによって最適にアミノ酸について確認した。その結果を、実施例５で得られた結果と合わせて表にすると、下記表２のとおりとなる。
【００１９】
【表２】
2018169058.tif 000003
【００２０】
本発明の知見を利用することによって、RNA ウイルスのゲノム配列を高い親和性で特異的に認識する人工RNA 結合タンパク質をデザインすることが可能である。
【００２１】
＜ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子＞
本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の調製方法は特に限定されないが、本明細書に開示したアミノ酸配列に基づいて核酸の化学合成により調製することができる。
【００２２】
＜ＲＮＡ結合タンパク質の可溶化＞
ＲＮＡ結合タンパク質の可溶化を改善するために、可溶化を促進することが知られているタグタンパク質の融合を行うことができる。タグタンパク質としては、マルトース結合タンパク質（MBP）等を使用することができる。
【００２３】
＜ＲＮＡ結合タンパク質の精製＞
MBPタグ化したＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込むことにより組み換え発現ベクターを調製することができる。組み換え発現ベクターを発現用の宿主に導入し、各タンパク質を宿主で発現させることができる。
【００２４】
（１）組換え発現ベクターの作製
本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージ  ＤＮＡ等が挙げられる。
【００２５】
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８，  ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００２６】
ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、ベクター中の制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸をベクター中に挿入することができる。
【００２７】
ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。即ち、本発明のベクターには、プロモーター、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸のほかに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などを含有していてもよい。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２８】
（２）形質転換体の作製
本発明は、上記した組換え発現ベクターを含む宿主細胞（形質転換体）にも関する。形質転換体は、組換え発現ベクターを、目的遺伝子（即ち、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸）が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主としては、本発明の核酸を発現できるものであれば特に限定されるものではない。
【００２９】
宿主としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌などが挙げられる。宿主としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母でもよい。宿主としてはさらに、COS細胞、CHO細胞等の動物細胞でもよいし、Sf9、Sf21等の昆虫細胞でもよい。
【００３０】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換え発現ベクターが細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３１】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12、DH1などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。プロモーターとしては、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３２】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３３】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞などが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３４】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００３５】
（３）ＲＮＡ結合タンパク質の生産
本発明のＲＮＡ結合タンパク質は、上記の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われる。
【００３６】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３７】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で６〜２４時間行う。培養期間中、ｐＨは７．０〜７．５に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３８】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）等を培地に添加してもよい。
【００３９】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。培養は、通常、５％ＣＯ2存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４０】
培養後、ＲＮＡ結合タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりＲＮＡ結合タンパク質を抽出する。また、本発明のＲＮＡ結合タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のＲＮＡ結合タンパク質を単離精製することができる
【００４１】
＜ゲルシフトアッセイによる結合能の比較・評価＞
本発明のＲＮＡ結合タンパク質が標的配列に結合するかどうかは、ゲルシフトアッセイにより評価することができる。
【００４２】
反応緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、10% Glycerol、0.05% BSA、0.2 U RNase inhibitor）の中に、遠赤外の680nmに吸収のあるAlexa680でラベルした標的RNAプローブ（終濃度：0.5 nM）と、ＲＮＡ結合タンパク質（終濃度：10〜1000 nM）を4℃で１時間混合した後、0.5×TBE緩衝液で平衡化ずみの6%非変性ポリアクリルアミドゲル（大きさ：16×16 cm、厚さ：1 mm）にアプライして、コールドルーム（4℃）内で泳動する。色素マーカーが3cm流れたところで泳動を止め、装置から取り出したゲル内の蛍光を、遠赤外検出器を用いてスキャンしながら検知することにより、RNAの各バンドを視覚化することができる。
【実施例】
【００４３】
実施例１：Ｐｈｅを介した相互作用の検証
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)のアミノ酸配列を図１及び図２に示す。hPUF＿MT(F856A), MT(F865A), MT(F856A/F865A), MT(905A)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断し、pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。pET24-MBP(-B)-R1'-MSC-R8'は、pET24ベクター中に、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードする遺伝子、R1'をコードする遺伝子、マルチクローニングサイト、及びR8'をコードする遺伝子を含むベクターである。【００４４】
（２）タンパク質の発現および精製
得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)に形質導入した。2%グルコースを含むLB-Kan培地でOD600が0.6〜0.75程度になるまで振とう培養した後、1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl）で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で10 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。【００４５】
（３）ゲルシフトアッセイ
両末端をAlexa680で蛍光標識した標的配列を含むRNA probe(OTS-1511)を合成した。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
精製タンパク質をBinding Bufferで目的濃度まで希釈し、Binding Buffer およびRibonuclease Inhibitor, Cloned (Invitrogen)と混合した後、RNA probeを終濃度0.5 nMで混合した。結合反応におけるBufferの組成は、10%グリセロール, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.05% BSA, Ribonuclease Inhibitor (0.2 U), 1 mM DTT, 1 mM EDTAである。4℃で30 min結合反応を行った後、溶液をピペッティングにより穏やかに混合し、再度4℃で30 min結合反応を行った。【００４６】
結合反応後の溶液を6% 非変性ポリアクリルアミドゲルにアプライして4℃, 200 Vで泳動した。泳動マーカー(6×Dye 2 μL + 1×Binding Buffer 10 μL)が0.5 cm移動したところで100 Vに変更し、泳動マーカーが3 cm移動するまで泳動を行った。最後にOdysseyでRNAを検出した。
結果を図３に示す。
Phe856およびPhe865をそれぞれAlaに置換すると、結合力が落ちた（1/10程度）。Phe905をAlaに置換しても、結合力にはあまり影響はなかった。
結合力への寄与は、Phe856>Phe865>>Phe905であることが分かった。【００４７】
実施例２：認識リピートの確認
実施例２−１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)のアミノ酸配列を図４に示す。
hPUF＿MT(R3→R5), MT(R4→R6)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をBsaIで切断し、同じくBsaIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。【００４８】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１の（２）と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。可溶性を調べた結果を図５及び図６に示す。【００４９】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１の（３）と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図７に示す。MT(R3→R5)とMT(R4→R6)は、どちらも野生型と同等の結合力を示した【００５０】
実施例２−２：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H)、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)、及びhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)のアミノ酸配列を図８及び図９に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００５１】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図１０に示す。【００５２】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R3→R5,R4→R5),
MT(R3→R5,R4→R5＿R13H)用のProbe）
結果を図１１に示す。【００５３】
実施例２−３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図１２に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００５４】
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)とhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは、 hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6) は10 h、hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)は14 h行った。【００５５】
hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)は以下の手順で行った。得られた各発現ベクターをそれぞれ大腸菌BL21(DE3)/pKJE7に形質導入した。0.5 mg/mLアラビノースを含むLB-Cm-Kan培地でOD600が0.4〜0.8程度になるまで振とう培養した後、培地に終濃度0.1 mMになるようIPTGを添加し30℃、7 h振とう培養することでタンパク質の発現誘導を行った。大腸菌をペレット化し、Lysis Buffer (25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl）で懸濁した。凍結融解・ソニケーションを行った後、遠心上清をProfinityTM IMAC Ni-Charged Resin (Biorad)と混合し、4℃で14 hロータリングすることで目的タンパク質を吸着させた。25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaClのBufferおよび25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 20 mM imidazoleのBufferで洗浄した後、25 mM Tris-HCl (pH8.0), 500 mM NaCl, 150 mM imidazoleのBufferで溶出を行った。限外濾過によって、50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaClへのBuffer交換および濃縮を行った。99.5%グリセロールおよび1 M DTTと混合し、25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 50% グリセロール, 5 mM DTTの組成で-20℃保存した。
可溶性を調べた結果を図１３に示す。【００５６】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。ただし、hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6)およびhPUF＿MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)はタンパク質濃度を測定できなかったため、精製サンプルを希釈せず原液を用いた。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R6), MT(1-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1760: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R4→R6, R5→R6),
MT(R4→R6, R5→R6＿Y13R)用のProbe ）【００５７】
結果を図１４に示す。hPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-7-8)の結合力は、野生型の約1/10程度（Kdは50〜10 nMの間）であった。R6×3変異体は、ウェルに詰まってうまく泳動できなかった。【００５８】
実施例２−４：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)及びhPUF＿MT(1-6-5-6-5-6-5-6＿IRP)のアミノ酸配列を図１５に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００５９】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。【００６０】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8), 
MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)用のProbe）
結果を図１６に示す。
MT(1-2-5-6-5-6-5＿ILQ-8)、MT(1-2-5-6-5-6-5-6＿IRP)はWTよりも結合能が弱いことが考えられる【００６１】
実施例２−５：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)、hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-5-5-5-5-5-7-8)のアミノ酸配列を図１７及び図１８に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００６２】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
可溶性を調べた結果を図１９及び図２０に示す。【００６３】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1818: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （hPUF＿MT(1-5-5-5-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿ MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8) 用のProbe）
結果を図２１に示す。MT(1-5-5-5-5-6-7-8)はWTと比べて結合能が低く、MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTとほぼ同等の結合力を持つことが分かった。【００６４】
実施例２−６：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R7→R5)、hPUF＿MT(R7＿ILQ)及びhPUF＿MT(R7＿IRG)のアミノ酸配列を図２２及び図２３に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００６５】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R7→R5)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿IRG)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、16 h
hPUF＿MT(R7＿ILQ)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、13 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13  h行った。【００６６】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
結果を図２４に示す。MT(R7→R5)はWTに比べて結合力が弱く、またシフトしたバンドの位置が予想より高い。・MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)はWTとほぼ同等の結合力であった。【００６７】
実施例２−７：
（１）ベクターのクローニング
実施例２−６と同じベクターを使用した。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例２−６と同じである。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図２５に示す。R7-R8を連結する場合、末端配列はILQが適していることが分かる。【００６８】
実施例２−８：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R7→R5)及びhPUF＿MT(R8→R5)のアミノ酸配列を図２６に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００６９】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。【００７０】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型、hPUF＿MT(R7＿ILQ)、 MT(R7＿IRG)用のProbe）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（hPUF＿MT(R7→R5)用のProbe）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（ hPUF＿MT(R8→R5)用のProbe ）
結果を図２７に示す。MT(R7→R5) はWTと比べて非常に弱く、MT(R8→R5)はほとんど結合能を持たないと考えられる。【００７１】
実施例２−９：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→RC, R4→RC, R5→RC)及びhPUF＿MT(R3→RC2, R4→RC2, R5→RC2)のアミノ酸配列を図２８に示す、
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００７２】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは9 h行った。【００７３】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図２９に示す。
MT(R3→RC,R4→RC, R5→RC), MT(R3→RC2,R4→RC2,R5→RC2)はMT(R3→R5,  R4→R5)と比べて結合力が低い可能性がある。【００７４】
実施例３：認識リピートの延長
実施例３−１：
ベクターのクローニング、タンパク質の発現および精製は、実施例２−５と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３０に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)はWTより約10倍強い結合力を持つことが分かる。【００７５】
実施例３−２
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列は図３１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００７６】
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)について、実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。【００７７】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型用のProbe）
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1924: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (23 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３２に示す。MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びMT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)は、MT(R3→R5,R4→R6)よりも強い結合能を持つことが分かる。【００７８】
実施例３−３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)及びhPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)のアミノ酸配列を図３３及び図３４に示す。【００７９】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。【００８０】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1925: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (25 mer) （hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
OTS-1926: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (27 mer) 
（hPUF＿MT(1-2-5-6-5-6-5-6-5-6-5-6-7-8)用のProbe）
結果を図３５に示す。【００８１】
実施例４：認識特異性の変更
実施例４−１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)のアミノ酸配列を図３６及び図３７に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００８２】
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5) は上記した通りである。
hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12S,Q16E, R5＿C12S,Q16E)、hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12S,Q16R, R5＿C12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R3→R5＿C12N, R4→R5＿C12N, R5＿C12N)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16E, R4→R5＿C12N,Q16E, R5＿C12S,Q16E)：0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R3→R5＿C12S,Q16R, R4→R5＿C12N,Q16R, R5＿C12S,Q16R)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。【００８３】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果を図３８に示す。C12N・C12S,Q16E・C12S,Q16RはMT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持つことが分かった。C12N（U認識）>C12S,Q16E（G認識）>C12S,Q16R（C認識）>MT(R3→R5,R4→R5)（A認識）の順に結合力が強いことが分かる。【００８４】
実施例４−２：
実施例４−１と同じタンパク質を使用した。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果を図３９に示す。各タンパク質は標的配列に対してのみ結合しており、特異性を持つことが考えられる。【００８５】
実施例４−３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R4→R6)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)のアミノ酸配列を、図４０及び図４１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００８６】
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R4→R6) は上記した通りである。
hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)、hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R4→R6＿N12C, R6＿N12C)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16E, R6＿N12S,Q16E)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で25℃、22 h
hPUF＿MT(R4→R6＿N12S,Q16R, R6＿N12S,Q16R)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12  h行った。【００８７】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
結果を図４２に示す。G, C認識の場合、野生型のU認識の場合と同程度〜少し弱い結合力でであった。A認識の場合、結合力が著しく低下（1/100程度）した。【００８８】
実施例４−４：
タンパク質は、実施例４−３と同じである。
ゲルシフトアッセイは、実施例１と同じ手順で行った。RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1819: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGAAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-1978: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→G配列）
OTS-1979: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→C配列）
結果を図４３に示す。実施例４−３と同じ結果になった（再現性が確認できた）。【００８９】
実施例５：スタッキングアミノ酸の最適化
実施例５−１：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5＿R13K)、hPUF＿MT(R6＿Y13F)、hPUF＿MT(R6＿Y13H)及びhPUF＿MT(R6＿Y13W)のアミノ酸配列を図４４及び図４５に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００９０】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF＿MT(R5＿13K)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13F)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13H)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(R6＿13W)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。【００９１】
（２）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図４６に示す。A-U間のカチオンはArg, U-A間の芳香族はTyrが最適アミノ酸であった。【００９２】
実施例５−２：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)のアミノ酸配列を図４７〜４９に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。【００９３】
（２）タンパク質の発現および精製
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5)に関しては上記した通りである。hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13H, R5＿R13H)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13Y, R5＿R13Y)、及びhPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13W, R5＿R13W)については、実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。【００９４】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図５０に示す。Ａ−Ａ間のスタッキングアミノ酸の結合力は、Trp>Tyr>>Phe>Hisであるように見える【００９５】
実施例５−３：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R3→R5, R4→R5＿R13K, R5＿R13K)のアミノ酸配列を図５１に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００９６】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 hで行った。
また、Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。【００９７】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図５２に示す。Ａ−Ａ間のスタッキングアミノ酸としてはカチオン系よりも芳香族の方が結合力が高く、芳香族の中では、His, Tyrが結合力が高い。【００９８】
実施例５−４：
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:C＿13R)3、及びhPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:C＿13Y)3のアミノ酸配列を図５３及び図５４に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【００９９】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。【０１００】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCACACAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図５５に示す。
丸数字１と２を比較すると、丸数字１の方が3倍程度結合力が高い（Tyr>Arg）
丸数字１と３を比較すると、丸数字１の方が10倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）
C-A間には芳香族のTyr、A-C間にはカチオン系のArgが適している。【０１０１】
実施例５−５
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)3(R6:G＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列を図５６及び図５７に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【０１０２】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。【０１０３】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2008: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGGAGAGAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図５８に示す。
丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字１の方が30倍以上結合力が高い（Tyr>Arg）。
G-A間には芳香族のTyr適している。
丸数字１と丸数字３を比較すると、わずかに丸数字１の方が結合力が高い（Arg>Tyr）。A-G間にはカチオン系のArgが適している。【０１０４】
実施例５−６
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13Y)3、hPUF＿MT(R5:G＿13R)3(R6:U＿13R)3、hPUF＿MT(R5:A＿13R)(R5:A＿13Y)2(R6:G＿13Y)3のアミノ酸配列は、図５９及び図６０に示す。
ベクターのクローニングは、実施例２−１と同じ手順で行った。【０１０５】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。【０１０６】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2004: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGUGUGUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図６１に示す。丸数字１と丸数字２を比較すると、丸数字２の方が3倍程度結合力が高い（Tyr<Arg）。丸数字１と丸数字３を比較すると、丸数字１の方が30倍程度結合力が高い（Arg>Tyr）。U-G間にはカチオン系のArg、G-U間にはカチオン系のArgが適している。【０１０７】
実施例６：Ｐｕｍｂｙとの比較
（１）ベクターのクローニング
hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)のアミノ酸配列を図６２及び図６３に示す。
hPUF＿MT(5＿(6)8), MT(6＿(56)4), MT(4＿(56)4)をコードする遺伝子を全合成した。合成遺伝子をEcoRIおよびHindIIIで切断し、同じくEcoRIおよびHindIIIで切断したpET24-R1'-MSC-R8'とライゲーションすることで発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターにおいては、 R1'及びR8'は除去されている。【０１０８】
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。ただし、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。
hPUF＿MT(5＿(5)8)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、21 h
hPUF＿MT(6＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF＿MT(4＿(56)4)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。【０１０９】
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図６４に示す。【０１１０】
実施例７：認識リピートの延長［２］
実施例７−１
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8)のアミノ酸配列を図６５〜６７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
結果を図６８に示す。認識リピートを延長したものは、ＷＴよりも約3倍高い結合能を示した。認識リピートを延長したものどうしでは（図６７の９リピート丸数字の２〜４）はほぼ同等の結合能を示した。【０１１１】
実施例７−２
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8)、hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8)及びhPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8) のアミノ酸配列を図６９〜７１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例７−１と同じ手順で行った。
ただし、hPUF_MT(1-2-6-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-5-6-5-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。hPUF_MT(1-2-5-6-5-6-6-7-8))については、タンパク質発現誘導は0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 hで行った。また、Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例７−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （野生型配列）
OTS-2080: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（２））
OTS-2081: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（３））
OTS-2082: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (20 mer) （9リピート（４））
結果を図７２に示す。１３リピートが最も高い結合能を示した。次に、１１リピートが結合能が高く、ＷＴよりも約３倍高い結合能を示した。１５リピートはＷＴよりも若干高い結合能を示した。【０１１２】
実施例８：認識特異性の変更［２］
実施例８−１
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図７３〜７６に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、各タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R1_S12N, R3→R5, R4→R6)：0.001 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R1_Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）【０１１３】
結果は図７７のとおりである。同図から分かるとおり、認識リピートを延長したものは、ＷＴよりも約3倍高い結合能を示した。結合力については、Q16R（C認識）>Q16E（G認識）= MT(R3→R5,R4→R5)（A認識)>S12N(U認識)の順に結合力が強い結果となった。
さらに認識の特異性の結果としては（図７８）、下記の特異性が確認された。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)：U=C>A>Gの順に結合力が高い
（２）MT(R1_S12N,R3→R5,R4→R5)（U認識）：U>C>>G=Aの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（G認識）：G>>U=Cの順に結合力が高い
（３）MT(R1_Q16E,R3→R5,R4→R5)（C認識）：C>U>>G>Aの順に結合力が高い
なお、上記の（  ）の数字が図中の丸数字に対応する。【０１１４】
実施例８−２
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)  （＝ 新規バックボーン）のアミノ酸配列を図７９に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８−１と同じ手順とした。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2022: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUUUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（A→U配列）
OTS-2020: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUGUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→G配列）
OTS-2021: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUCUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （A→C配列）
結果は図８０とおりである。図から分かるとおり、元の野生型も塩基特異性がなかったことから、骨格の変更が理由ではないことを確認できた。
なお、試験においては、ＷＴの1，2回目のサンプルはMBPタグ付きであった。野生型でも特異性のない結果が得られたが、この点につき、3回目と4回目でＷＴ，新規バックボーンの再現性が確認された。【０１１５】
実施例８−３
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８１〜８５に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８−１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図８６のとおりである。図から分かるとおり、今回作成したアミノ酸配列を有する結合タンパク質は、先に作成したMT(R3→R5,R4→R5)（図面左）よりも高い結合能を持たない結果となった。序列を示すと、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識>N12S, Q16E（G認識）>N12S ,Q16R（C認識)>S12C(U認識)の順に結合力が強い結果となった。【０１１６】
実施例８−４
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R2_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R2_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図８７〜９０に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８−１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R2_N12C, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)：0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-2023: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAAAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2024: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAGAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2025: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUACAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図９１のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U >> C の順に結合力が高い
（２）MT(R2_S12C, R3→R5,R4→R5)（A認識）： A = U = C >> G の順に結合力が高い
（３）MT(R2_N12S, Q16E R3→R5,R4→R5)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R2_N12S, Q16R, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C のみに結合した。
図中の丸数字の１〜４は上記の（１）〜（４）に対応する。【０１１７】
実施例８−５
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９２〜９６に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８−１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
結果は図９７のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。
結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5 （G認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_ S12N, E16Q）（U認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R）（C認識）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q （A_E16Q）> MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q）（A_S12C, E16Q）の順に結合力が高い結果となった。【０１１８】
実施例８−６
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12C,E16Q, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R7_S12N,E16Q, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図９８〜１０１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８−１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R7_S12C, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_S12N, E16Q, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R7_E16R, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは3.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1754: 5'-Alexa680-CCAGAAUUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（G→A配列）
OTS-2032: 5'-Alexa680-CCAGAAUUUUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→U配列）
OTS-2033: 5'-Alexa680-CCAGAAUUCUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （G→C配列）
結果は図１０２のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： G のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12C, E16Q)（A認識）：U > C の順に結合力が高い
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R7_S12N, E16Q)（U認識）： Uのみに結合した。
（４）MT(R3→R5,R4→R5, R7_E16R)（C認識）： C, Uに結合した。
なお、（  ）は図中の丸数字と対応した説明となっている。【０１１９】
実施例８−７
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０３〜１０７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８−１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, R3→R5, R4→R6)：1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図１０８のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
今回作成した各アミノ酸配列を有する結合タンパク質は、MT(R3→R5,R4→R5)よりも高い結合能を持たなかった。結合力の序列については、MT(R3→R5,R4→R5)（U認識）>N12S, Q16R（C認識）>N12S ,Q16E（G認識)の順に結合力が強かった。S12C(A認識) = N12S（A認識）は結合していなかった。【０１２０】
実施例８−８
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)、hPUF_MT(R8_N12S,Q16E, R3→R5, R4→R6)及びhPUF_MT(R8_N12S,Q16R, R3→R5, R4→R6)のアミノ酸配列を図１０９〜１１２に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例８−１と同じ手順とした。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R8_N12C, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16E, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R8_N12S, Q16R, R3→R5, R4→R6)： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは11 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例８−１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1511: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（野生型配列）
OTS-1825: 5'-Alexa680-CCAGAAUAGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)（U→A配列）
OTS-2034: 5'-Alexa680-CCAGAAUGGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→G配列）
OTS-2035: 5'-Alexa680-CCAGAAUCGUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer) （U→C配列）
結果は図１１３のとおりである。図から分かるとおり、以下のことが言える。
（１）MT(R3→R5,R4→R5)： U のみに結合した。
（２）MT(R3→R5,R4→R5, R8_N12C)（A認識）： 結合なし
（３）MT(R3→R5,R4→R5, R8 N12S, Q16E)（G認識）： Gのみに結合した。
（４）MT(R1_Q16E, R3→R5,R4→R5)（C認識）： C >>  G > Cの順に結合力が高い
なお、（  ）は図中の丸数字と対応した説明となっている。【０１２１】
実施例９：スタッキングアミノ酸の最適化［２］
確認したスタッキングアミノ酸の最適化については、以下の１６種類の組合せが考えられる。本実施例では、＊をした水準について実験を行い、結果を確認した。
異なる塩基間のスタッキング（12種類）
A-C/C-A 間
A-U/U-A 間＊
G-A/A-G 間
U-G/G-U 間
C-G/G-C 間＊
U-C/C-U 間＊
同じ塩基間のスタッキング（4種類）
A-A 間＊
G-G 間＊
U-U 間＊
C-C 間＊【０１２２】
＜異なる塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証（図１１４）＞
実施例９−１：A-U/U-A 間（図１１５）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１１６〜１１８に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは9.5 h行った。
hPUF_MT(R5:A_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:A_13R)(R5:A_13Y)2(R6:U_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは8 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1844: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAUAUAUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図１１９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が30倍以上結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。丸数字の１と３の比較から、１,３ともに結合力は同程度であることが分かった（Arg=Tyr）。すなわち、U-A間には芳香族のTyr、A-U間はArg, Tyrで有意差がなかった。【０１２３】
実施例９−２：C-G/G-C 間（図１２０）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3、hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3及びhPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１２１〜１２３に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)3(R6:C_13R)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:G_13R)(R5:G_13Y)2(R6:C_13Y)3： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは12 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2007: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGCGCGCGUAUUCG-Alexa680-3' (24 mer)
結果を図１２４に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、２の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Tyr<Arg）。１と３の比較から、１の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg>Tyr）。すなわち、C-G間にはカチオン系のArg 、G-C間にもカチオン系のArgが適していた。【０１２４】
実施例９−３：U-C/C-U 間（図１２５）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3、hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3及びhPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１２６〜１２８に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)3(R6:U_13R)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:C_13R)(R5:C_13Y)2(R6:U_13Y)3： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
また、Resinに吸着させる際のロータリングは13.5 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-2006: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCUCUCUAUUCG-Alexa680-3' (21 mer)
結果を図１２９に示す。図中の丸数字の１と２の比較から、１の方が10倍程度結合力が高いことが分かった（Tyr>Arg）。１と３の比較から、３の方がわずかに結合力が高いことが分かった（Arg<Tyr）。すなわち、U-C間には芳香族のTyr、C-U間にも芳香族のTyrが適していた。【０１２５】
＜同じ塩基間についてのスタッキングアミノ酸の検証（図１３０）＞
実施例９−４：A-A 間（図１３１）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H)、hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W)及びhPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y)のアミノ酸配列を図１３２〜１３７に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5) ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは10 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13K, R5_R13K)： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは16 h行った。
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13F, R5_R13F) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13H, R5_R13H) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13W, R5_R13W) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R3→R5, R4→R5_R13Y, R5_R13Y) ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは3 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1759: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUAAAUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１３８に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、 His, Tyrが最も結合力が高いことが分かった（H=Y>R>F=W>K）。【０１２６】
実施例９−５：G-G 間（図１３９）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:G_13R)3、hPUF_MT(R5:G_13K)3、hPUF_MT(R5:G_13F)3、hPUF_MT(R5:G_13H)3、hPUF_MT(R5:G_13W)3及びhPUF_MT(R5:G_13Y)3のアミノ酸配列を図１４０〜１４５に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:G_13R)3 ： 0.01 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:G_13K)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13F)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13H)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13W)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
hPUF_MT(R5:G_13Y)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1842: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUGGGUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１４６に示す。芳香族よりもカチオン系の方が結合力が高いことが分かった。カチオン系の中では、Argが最も結合力が高いことが分かった（R=H>K>W=Y>F）。【０１２７】
実施例９−６：U-U 間（図１４７）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:U_13R)3、hPUF_MT(R5:U_13K)3、hPUF_MT(R5:U_13F)3、hPUF_MT(R5:U_13H)3、hPUF_MT(R5:U_13W)3及びhPUF_MT(R5:U_13Y)3のアミノ酸配列を図１４８〜１５３に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:U_13R) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:U_13K) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13F) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13H) 3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13W) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
hPUF_MT(R5:U_13Y) 3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で37℃、3 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1841: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUUUUUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１５４に示す。カチオン系よりも芳香族の方が結合力が高いことが分かった。芳香族の中では、Trpが最も結合力が高いことが分かった（W=R>H>F=Y>K）。【０１２８】
実施例９−７：C-C 間（図１５５）
（１）ベクターのクローニング
hPUF_MT(R5:C_13R)3、hPUF_MT(R5:C_13K)3、hPUF_MT(R5:C_13F)3、hPUF_MT(R5:C_13H)3、hPUF_MT(R5:C_13W)3及びhPUF_MT(R5:C_13Y)3のアミノ酸配列を図１５６〜１６１に示す。
ベクターのクローニングは実施例２−１と同じ手順で行った。
（２）タンパク質の発現および精製
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、タンパク質発現誘導は以下の条件で行った。
hPUF_MT(R5:C_13R)3 ： 1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で20℃、24 h
Resinに吸着させる際のロータリングは12.5 h行った。
hPUF_MT(R5:C_13K)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13F)3  ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13H)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13W)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
hPUF_MT(R5:C_13Y)3 ： 0.1 mM IPTGを含むLB-Kan培地で30℃、7 h
Resinに吸着させる際のロータリングは14 h行った。
（３）ゲルシフトアッセイ
実施例１と同じ手順で行った。
ただし、RNA probeは以下のものを用いた。
OTS-1843: 5'-Alexa680-CCAGAAUUGUCCCUAUUCG-Alexa680-3' (19 mer)
結果を図１６２に示す。Fが最も適していることが分かった（F>H>W>R=K>Y）。
【図１】
2018169058.tif 000004
【図２】
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【図３】
2018169058.tif 000006
【図４】
2018169058.tif 000007
【図５】
2018169058.tif 000008
【図６】
2018169058.tif 000009
【図７】
2018169058.tif 000010
【図８】
2018169058.tif 000011
【図９】
2018169058.tif 000012
【図１０】
2018169058.tif 000013
【図１１】
2018169058.tif 000014
【図１２】
2018169058.tif 000015
【図１３】
2018169058.tif 000016
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2018169058.tif 000033
【図３１】
2018169058.tif 000034
【図３２】
2018169058.tif 000035
【図３３】
2018169058.tif 000036
【図３４】
2018169058.tif 000037
【図３５】
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【図３６】
2018169058.tif 000039
【図３７】
2018169058.tif 000040
【図３８】
2018169058.tif 000041
【図３９】
2018169058.tif 000042
【図４０】
2018169058.tif 000043
【図４１】
2018169058.tif 000044
【図４２】
2018169058.tif 000045
【図４３】
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【図４４】
2018169058.tif 000047
【図４５】
2018169058.tif 000048
【図４６】
2018169058.tif 000049
【図４７】
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【図４８】
2018169058.tif 000051
【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
2018169058.tif 000057
【図５５】
2018169058.tif 000058
【図５６】
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【図５７】
2018169058.tif 000060
【図５８】
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【図５９】
2018169058.tif 000062
【図６０】
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【図６１】
2018169058.tif 000064
【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
2018169058.tif 000069
【図６７】
2018169058.tif 000070
【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
2018169058.tif 000076
【図７４】
2018169058.tif 000077
【図７５】
2018169058.tif 000078
【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
2018169058.tif 000090
【図８８】
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【図８９】
2018169058.tif 000092
【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
2018169058.tif 000096
【図９４】
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【図９５】
2018169058.tif 000098
【図９６】
2018169058.tif 000099
【図９７】
2018169058.tif 000100
【図９８】
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【図９９】
2018169058.tif 000102
【図１００】
2018169058.tif 000103
【図１０１】
2018169058.tif 000104
【図１０２】
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【図１０３】
2018169058.tif 000106
【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
2018169058.tif 000109
【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３７】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４２】
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【図１４３】
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【図１４４】
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【図１４５】
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【図１４６】
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【図１４７】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５２】
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【図１５３】
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【図１５４】
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【図１５５】
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【図１５６】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９】
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【図１６０】
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【図１６１】
2018169058.tif 000164
【図１６２】
2018169058.tif 000165
【図１６３】
2018169058.tif 000166
【配列表】
2018169058000001.app
【国際調査報告】
2018169058.tif 000167
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