(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンに結合性を示し、アルカリ溶液に対する化学的安定性に優れた、新規なアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いた免疫グロブリンの製造方法を提供することを目的とする。本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、プロテインＧの免疫グロブリン結合性ドメインとアミノ酸配列の同一性が高いが、物性・機能に関するプロテインＧとの違いが不明であったタンパク質のアミノ酸配列をベースとした新規なペプチドをリガンドに用いていることを特徴とする。
2018180205.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で規定されるアミノ酸配列、または、配列番号１で規定されるアミノ酸配列と９４％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性ペプチドと水不溶性担体を含み、免疫グロブリン結合性ペプチドがリガンドとして水不溶性担体に固定化されていることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
【請求項２】
上記配列番号１で規定されるアミノ酸配列が配列番号２〜１６のいずれかによって規定されているアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のアフィニティー分離マトリックス。
【請求項３】
上記免疫グロブリン結合性ペプチドが、上記配列番号１で規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／またはＣ末端に位置する１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフィニティー分離マトリックス。
【請求項４】
２以上の上記免疫グロブリン結合性ペプチドが連結した免疫グロブリン結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
【請求項５】
免疫グロブリンのＦｃ領域および／またはＦａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
請求項１〜４のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、該タンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と
アフィニティー分離マトリックスに結合した該タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ溶液に対する化学的安定性が改良された免疫グロブリン結合性ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる抗体または抗体断片の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用される、プロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と省略する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。【０００３】
グループＧの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）より見出されたプロテインＧと呼ばれるタンパク質（以下、プロテインＧを「ＳｐＧ」と略記する場合がある）も、ＩｇＧに結合する性質を有し、このＳｐＧをリガンドとして固定化したＳｐＧアフィニティー分離マトリックス製品もある（ＧＥヘルスケア社製，製品名「Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ」，特許文献１）。ＳｐＧはＩｇＧのＦｃ領域に強く結合し、かつ、ＳｐＡよりも広い動物種のＩｇＧに強く結合するという特徴を示す。さらに、Ｆａｂ領域にも弱いながら結合することが分かっており（非特許文献３，４）、Ｆａｂ領域への結合力を向上する取組みもなされている（特許文献２〜４，非特許文献５）。【０００４】
しかし、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスの方が、抗体医薬の精製に広く利用されており、その理由の１つとして、アルカリ溶液に対する安定性が、ＳｐＡの方がＳｐＧよりも高いことが挙げられる（非特許文献１）。アルカリに対する安定性が高いと、アフィニティ分離マトリックスを、洗浄・殺菌効果が高く安価な水酸化ナトリウム水溶液で洗浄することで再生し、繰り返し利用することができる。アフィニティ分離マトリックスのタンパク質性リガンドのアルカリに対する安定性を上げる方法としては、アミノ酸変異を導入するなどのタンパク質工学の手法などがある。具体的には、アルカリ性条件下で脱アミド化反応を受け易いことが知られるアスパラギン残基、および、アスパラギン残基の後ろのグリシン残基へのアミノ酸置換変異が化学的安定性の向上に効果がある（非特許文献１）。しかし、ＳｐＡ中の全てのアスパラギン残基に関し、このような変異が向上効果を示すわけではない（非特許文献１、６）。同じように、ＳｐＧについても、アスパラギン残基に変異を導入する検討がなされてきたが（特許文献５、非特許文献７，８）、ＳｐＡの場合と同様に全ての変異に効果があるわけではなく、また、ＳｐＡに匹敵するようなアルカリに対する安定性には達していないため、改良の余地が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−５０３０３２号公報
【特許文献２】特開２００９−１９５１８４号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／０３００９４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０１６／０６１４２７号パンフレット
【特許文献５】特開２０１６−０７９１５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｏｂｅｒ  Ｓ．ら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，２００７，８４８巻，４０−４７頁
【非特許文献２】Ｓｈｕｋｌａ  Ａ．Ａ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，２８巻，２５３−２６１頁
【非特許文献３】Ｂｏｕｖｅｔ  Ｐ．Ｊ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ．，１９９４，１６巻，４１９−４２４頁
【非特許文献４】Ｄｅｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５９巻，７５２−７５４頁
【非特許文献５】Ｂａｉｌｅｙ  Ｌ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１４，４１５巻，２４−３０頁
【非特許文献６】Ｌｉｎｈｕｌｔ  Ｍ．ら，ＰＲＯＴＥＩＮＳ，２００４，５５巻，４０７−４１６頁
【非特許文献７】Ｇｕｌｉｃｈ  Ｓ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，２００２，１５巻，８３５−８４２頁
【非特許文献８】Ｐａｌｍｅｒ  Ｂ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，１３４巻，２２２−２３０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫グロブリンのＦｃ領域やＦａｂ領域に結合性を示し、アルカリ溶液に対する化学的安定性に優れたアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いた抗体または抗体断片の製造方法を提供することが、本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために、ＳｐＧの免疫グロブリン結合ドメインとアミノ酸配列の同一性が高いが、物性・機能に関するＳｐＧとの違いが不明であったタンパク質のアミノ酸配列（Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｈ，Ｌｉｎｄｍａｒｋ  Ｈ，Ｇｕｓｓ  Ｂ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，１９９５，ｖｏｌ．８，２９６８−７５）に関し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いてそれらのアミノ酸配列が示す物性・機能を評価することによって、本発明の完成に至った。
以下、本発明を示す。【０００９】
［１］  配列番号１で規定されるアミノ酸配列、または、配列番号１で規定されるアミノ酸配列と９４％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性ペプチドと水不溶性担体を含み、免疫グロブリン結合性ペプチドがリガンドとして水不溶性担体に固定化されていることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。【００１０】
［２］  上記配列番号１で規定されるアミノ酸配列が配列番号２〜１６のいずれかによって規定されているアミノ酸配列であることを特徴とする、上記［１］に記載のアフィニティー分離マトリックス。【００１１】
［３］  上記免疫グロブリン結合性ペプチドが、上記配列番号１で規定されるアミノ酸配列において、Ｎ末端および／またはＣ末端に位置する１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記［１］に記載のアフィニティー分離マトリックス。【００１２】
［４］  ２以上の上記免疫グロブリン結合性ペプチドが連結した免疫グロブリン結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする、上記［１］〜［３］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。【００１３】
［５］  免疫グロブリンのＦｃ領域および／またはＦａｂ領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
上記［１］〜［４］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、該タンパク質を含む液体試料とを接触させる工程と
アフィニティー分離マトリックスに結合した該タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明で得られたペプチドを固定化したアフィニティ精製用クロマトグラフィ担体は、アルカリ処理のダメージによる免疫グロブリン結合活性の低下が少ない。よって、繰返し使用に際して、高濃度または長時間での水酸化ナトリウム水溶液を用いた洗浄が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例２に係る、各種免疫グロブリン結合性ペプチドのＩｇＧに対する結合パラメータに関するグラフである。
【図２】本発明の実施例２に係る、各種免疫グロブリン結合性ペプチドのＦａｂに対する結合パラメータに関するグラフである。
【図３】本発明の実施例３に係る、各種免疫グロブリン結合性ペプチドのアルカリ耐性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、配列番号１で規定されるアミノ酸配列、または、配列番号１で規定されるアミノ酸配列と９４％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性ペプチドと水不溶性担体を含み、免疫グロブリン結合性ペプチドがリガンドとして水不溶性担体に固定化されていることを特徴とする。配列番号１の配列を以下に示す。
配列番号１：  Ｘａａ01−Ｘａａ02−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｘａａ06−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｘａａ12−Ｘａａ13−Ｇｌｙ−Ｘａａ15−Ｔｈｒ−Ｘａａ17−Ｔｈｒ−Ｘａａ19−Ａｌａ−Ｘａａ21−Ａｓｐ−Ｘａａ23−Ｘａａ24−Ｘａａ25−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｘａａ30−Ｘａａ31−Ｘａａ32−Ｘａａ33−Ａｌａ−Ｘａａ35−Ｘａａ36−Ａｓｎ−Ｘａａ38−Ｘａａ39−Ｘａａ40−Ｇｌｙ−Ｘａａ42−Ｔｒｐ−Ｘａａ44−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ47−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ
Ｘａａ01＝Ａｓｐ／Ｔｈｒ，Ｘａａ02＝Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ｘａａ06＝Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ｘａａ10＝Ａｌａ／Ｖａｌ／Ａｓｎ，Ｘａａ12＝Ｐｈｅ／Ｌｅｕ，Ｘａａ13＝Ｓｅｒ／Ｔｈｒ，Ｘａａ15＝Ｇｌｕ／Ｔｙｒ，Ｘａａ17＝Ｔｈｒ／Ａｌａ，Ｘａａ19＝Ｌｙｓ／Ｉｌｅ，Ｘａａ21＝Ｖａｌ／Ａｌａ，Ｘａａ23＝Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｘａａ24＝Ａｌａ／Ｇｌｕ，Ｘａａ25＝Ｔｈｒ／Ｖａｌ，Ｘａａ28＝Ｌｙｓ／Ｇｌｎ，Ｘａａ29＝Ａｌａ／Ｇｌｕ／Ｔｈｒ，Ｘａａ30＝Ｐｈｅ／Ｌｅｕ，Ｘａａ31＝Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ｘａａ32＝Ｇｌｎ／Ａｓｐ，Ｘａａ33＝Ｔｙｒ／Ｐｈｅ，Ｘａａ35＝Ｔｈｒ／Ａｓｎ／Ｐｈｅ，Ｘａａ36＝Ａｌａ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ／Ｌｙｓ，Ｘａａ38＝Ａｓｎ／Ｇｌｙ，Ｘａａ39＝Ｖａｌ／Ｔｈｒ，Ｘａａ40＝Ａｓｐ／Ｔｙｒ／Ｔｈｒ，Ｘａａ42＝Ｇｌｕ／Ｖａｌ，Ｘａａ44＝Ｓｅｒ／Ａｌａ，Ｘａａ47＝Ａｓｐ／Ａｌａ／Ｔｈｒ
上記定義中、「／」は「または」を示す。また、上記配列同一性は９５％以上または９６％以上がより好ましく、９８％以上または９９％以上が更に好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００１７】
「免疫グロブリン（ＩｇＧ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、抗原と呼ばれる特定の分子に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、それぞれ２本ずつの軽鎖と重鎖のポリペプチドから構成されている４本鎖“Ｙ”字型構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
【００１８】
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分のドメインは、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
【００１９】
本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。
【００２０】
例えばＮ末端にペプチドが付加されたような場合であっても、配列同一性を基準に、配列番号１のアミノ酸配列の各残基に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。例えば、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）のアライメント機能を使って位置を特定することが可能である。上記位置の同定のために必要な配列同一性としては、９４％以上が好ましく、９５％以上または９６％以上がより好ましく、９８％以上または９９％以上が更に好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００２１】
「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合して捕集する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、「アフィニティーリガンド」と表記した場合も、「リガンド」と同義である。
【００２２】
本発明で用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。有機担体としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子担体や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類担体を挙げることができる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００２３】
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００２４】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００２５】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るアフィニティー分離マトリックスに用いられる免疫グロブリン結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与した免疫グロブリン結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
本発明におけるアフィニティー分離マトリックスは、配列番号２〜１６、または、それらのアミノ酸配列と９４％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性ペプチドがリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることがより好ましい。上記配列同一性は、９５％以上または９６％以上がより好ましく、９８％以上または９９％以上が更に好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００２７】
Ｆｃ領域を含まずにＦａｂ領域のみを含む改変型免疫グロブリンを精製対象とするアフィニティー分離マトリックスは、配列番号８〜１３、または、それらのアミノ酸配列と９４％以上の配列同一性を示す免疫グロブリン結合性ペプチドがリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることがより好ましい。上記配列同一性は、９５％以上または９６％以上がより好ましく、９８％以上または９９％以上が更に好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上がより更に好ましい。
【００２８】
本発明に係るアフィニティー分離マトリックスの免疫グロブリン結合性ペプチドに関し、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を含む場合も、本発明に含有される。
【００２９】
「１個から数個」の範囲とは、欠失などを有する免疫グロブリン結合性ペプチドが免疫グロブリンへの高い結合力を有する限り特に限定されるものではない。上記「１個から数個」の範囲は、例えば３０個以下とすることができ、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは７個以下、一層好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下、１個以上または２個以下、１個程度であることができる。
【００３０】
さらに、アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。付加するアミノ酸配列の実施形態としては、該ペプチドをマトリックスに固定化する際に有用な、ＬｙｓやＣｙｓを含むアミノ酸配列をＣ末端側に付加することが挙げられる。
【００３１】
上記配列相同性および上記変異（欠失、置換および／または付加）を有する免疫グロブリン結合性ペプチドも、化学的安定性に優れる。具体的には、上記配列相同性および上記変異を有する免疫グロブリン結合性ペプチドのアルカリ性水溶液に対する化学的安定性は、野生型ＳｐＧの化学的安定性より優れていることが好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチドの化学的安定性と同等またはより優れていることがより好ましい。また、上記配列相同性および上記変異を有する免疫グロブリン結合性ペプチドのＦｃ領域および／またはＦａｂ領域に対する結合活性も、野生型ＳｐＧの結合活性より優れていることが好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン結合性ペプチドの結合活性と同等またはより優れていることがより好ましい。
【００３２】
なお、上記の欠失や付加が加わってアミノ酸数が変化した場合であっても、変異導入前におけるアミノ酸残基の位置に対応する変異導入後におけるアミノ酸残基の位置は、変異導入前後のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば容易に検索可能である。このようなアライメント解析の手法は、当業者に広く知られている。
【００３３】
本発明によって得られたアフィニティー分離マトリックスは、アルカリ性水溶液に対する化学的安定性が高いことを特徴とする。すなわち、アルカリ性水溶液で処理してもアルカリによるダメージがより少なく、免疫グロブリン結合性能を高いレベルで維持している。
【００３４】
「アルカリ性水溶液」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、０．０１Ｍ以上１．０Ｍ以下または０．０１Ｎ以上１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、１０ｍＭが好ましく、１５ｍＭがより好ましく、２０ｍＭがより好ましく、２５ｍＭがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、１２．０以上が好ましく、１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、１４以下が好ましく、１３．５以下がさらにより好ましく、１３．０以下がさらにより好ましい。
【００３５】
「化学的安定性」とは、ペプチドがアミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、ペプチドの機能を保持する性質を指す。本発明においては、ペプチドの機能保持とは、免疫グロブリンへの結合活性を指す。本発明において「免疫グロブリンへの結合活性」とは、化学変性を受けずに免疫グロブリンに対する親和性を保持しているポリペプチドの割合をいう。すなわち、「化学的安定性」が高い程、アルカリ性水溶液への浸漬処理の後も、免疫グロブリンへの結合活性が低下する度合いが小さい。なお、本明細書中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
【００３６】
ペプチドをアルカリに浸漬する時間は、アルカリの濃度や浸漬時の温度によってペプチドの受けるダメージは大きく異なるので、特に限定はされない。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が１５ｍＭで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリに浸漬する時間の下限は、３０分が好ましく、１時間がより好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、２０時間がより好ましいが、特に限定はされない。
【００３７】
抗体またはその断片に対する結合活性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）、および、バイオレイヤー干渉法を用いたＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のペプチドが抗体またはその断片に結合した時の結合シグナルが検出できればよい。測定条件としては、温度は２０℃以上４０℃以下の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨは５以上８以下程度の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、特に限定はされないが、０Ｍ以上０．１５Ｍ以下程度が好ましい。
【００３８】
抗体またはその断片に結合していることを示すパラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田他  著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明のペプチドの抗体またはその断片に対する親和定数は、例えば、Ｏｃｔｅｔシステムを利用して、バイオセンサーにヒトＩｇＧまたはその断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るアフィニティー分離マトリックスに用いられる免疫グロブリン結合性ペプチドについて、ヒト免疫グロブリンへの親和定数（ＫA）が１×１０5（Ｍ-1）以上、より好ましくは１×１０6（Ｍ-1）以上であることが好ましい。しかし、親和定数は、免疫グロブリンの種類や、免疫グロブリン結合性ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
【００３９】
ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫAやＫDは不適切である。アルカリ処理によって、抗体またはその断片に結合できる分子の比率が変化しても、ペプチド１分子の抗体またはその断片に対する結合能は変化しない場合には、パラメータとしては変化が見られないからである。ペプチドの残存結合活性を求める場合には、例えば、抗体またはその断片をバイオセンサーに固定化し、ペプチドを化学処理する前と後で、同一濃度の抗体またはその断片を添加したときの、結合シグナルの大きさ、または、理論的最大結合容量（Ｒmax）という、結合レスポンス（ｎｍ）を単位とする結合パラメータを用いるのが好ましいが、これに限定されるものではない。例えば、ペプチドを固定化し、固定化したチップをアルカリ処理する前と後で同じ濃度の抗体またはその断片を添加して結合シグナルの大きさを比較してもよい。
【００４０】
残存結合活性は、アルカリ処理前後の比較なので、基本的には、アルカリ処理前の結合活性を分母とし、アルカリ処理後の結合活性を分子とする比率（パーセンテージ）で表すことができる。その数値は、同じ条件でアルカリ処理した本発明の変異が導入されていないペプチドと比較して高ければ、特に限定はされないが、その比率が１０％以上であるのが好ましく、２０％以上であるのがより好ましく、３０％以上であるのがさらにより好ましく、４０％以上であるのがさらにより好ましく、５０％以上であるのがさらにより好ましい。
【００４１】
本発明のアフィニティー分離マトリックスに用いられる免疫グロブリン結合性ペプチドは、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該免疫グロブリン結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限は、例えば１０個、好ましくは８個、より好ましくは６個である。これらの多量体は、単一の免疫グロブリン結合性ペプチドの連結体であるホモダイマーやホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類の免疫グロブリン結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマーやヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
【００４２】
上記免疫グロブリン結合性ペプチドの連結のされ方としては、１個または複数個のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは１残基以上２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。連結する際には、単量体免疫グロブリン結合性ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
【００４３】
また、上記免疫グロブリン結合性ペプチドは、他のペプチドや化合物などが結合していてもよいものとする。例えば、本発明の実施形態の１つとして、上記免疫グロブリン結合性ペプチド、または、当該ペプチドが２個以上連結された多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドを用いたアフィニティ分離マトリックスが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明のアフィニティー分離マトリクスに用いられるペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
【００４４】
本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦｃ領域および／またはＦａｂ領域を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィー精製法により分離精製することが可能となる。これらのタンパク質精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィー精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、上記タンパク質を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させるなどして接触させ、上記タンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の上記タンパク質は、カラム内の本発明に係るアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明ペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とする上記タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の上記タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に用いる酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。なお、上記タンパク質は、免疫グロブリン自体であってもよいし、Ｆｃ断片およびＦａｂ断片などの抗体断片であってもよい。
【００４５】
本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。本発明のアフィニティ分離マトリックスは、特にアルカリ性水溶液に対する化学的安定性に優れるので、強アルカリの純粋な緩衝液を通過させて洗浄することで再利用することが好ましい。しかし、強アルカリの純粋な緩衝液で再生する操作をするタイミングは、使用後に毎回である必要は無く、例えば、５回に１回や１０回に１回でも構わない。
【００４６】
本発明のアフィニティー分離マトリックスで用いられるペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が上記ペプチドを構成するものであればいかなるものでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含むプラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換体、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、および、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
【００４７】
また、本発明に係るアフィニティー分離マトリックスで用いられる免疫グロブリン結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、上記融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物または細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
【００４８】
上記ペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法などを用いて行うことができる。即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成などによって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００４９】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、上記ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。また、上記単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法に関して、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
【００５０】
上記ベクターは、前述したペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、上記ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
【００５１】
上記形質転換体は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、上記得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
【００５２】
上記免疫グロブリン結合性ペプチドは、前記した形質転換体を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、上記ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）または培養液中（細胞外）に、上記ペプチドを含む融合タンパク質を生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
【００５３】
上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、上記ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩などの無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００５４】
さらに、形質転換体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、即ち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００５５】
さらに、上記免疫グロブリン結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現または融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、上記ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える手法や低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより、上記ペプチドを培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）または培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
【００５７】
上記ペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００５８】
本願は、２０１７年３月３１日に出願された日本国特許出願第２０１７−７１９０９号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年３月３１日に出願された日本国特許出願第２０１７−７１９０９号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、比較対象として、公知の野生型ＳｐＧの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列３種（配列番号１７〜１９）、および、特許文献２〜４を参考に、Ｆａｂ領域への結合を強化したＳｐＧ変異体のアミノ酸配列１種（配列番号２０）を用いた。【００６０】
実施例１：各種免疫グロブリン結合性ペプチドの調製
（１）  各種免疫グロブリン結合性ペプチドの発現プラスミド調製
各種免疫グロブリン結合性ペプチドのアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードするＤＮＡ配列を設計した。コードＤＮＡは、３種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ３１／ｆ３２／ｆ３３）を用いたＰＣＲを行い、その後制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化して、同じ制限酵素で処理した発現ベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のマルチクローニングサイトに組み込んだ。コードＤＮＡ調製時のＰＣＲでは、まず少量のｆ３２（０．２μＭ、リーディング）とｆ３３（１０μＭ、ラギング）とがオーバーラップＰＣＲで伸張され、次に、ｆ３１（１０μＭ、リーディング）と先の反応で伸張したｆ３３（ラギング）とのオーバーラップＰＣＲによって形成される二本鎖ＤＮＡが、制限酵素サイトを両端に有したコードＤＮＡ配列となる。各々のＰＧ類縁体のｆ３１〜ｆ３３に該当する各種オリゴＤＮＡ配列をこのような反応が進むよう設計し、ユーロフィン社への外注によって合成した。具体的な実験操作については、ポリメラーゼとしてＢｌｅｎｄＴａｑ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＰＣＲ反応を行い、アガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）も、同様にＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ処理し、次に脱リン酸化酵素ＣＩＡＰ（タカラバイオ社）による脱リン酸化処理を行った後で、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたライゲーション反応を行った。【００６１】
各種免疫グロブリン結合性ペプチドのアミノ酸配列に対応したコードＤＮＡ配列、および、発現プラスミド調製に用いたオリゴＤＮＡ配列（ｆ３１〜ｆ３３）の配列番号の組合せを表１に示す。【００６２】
【表１】
2018180205.tif 000003
【００６３】
上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を用いれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したペプチドを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ．１．１  ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ」）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ  ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。【００６４】
（２）  各種免疫グロブリン結合性ペプチドの調製
上記（１）で得られた、各種免疫グロブリン結合性ペプチドを導入した各形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約１時間、その後２５℃で約１時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに２５℃にて約１８時間培養した。【００６５】
培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。なお、分子量はほぼ同様であるが、免疫グロブリン結合性ペプチドの種類によってバンドの位置は違った。【００６６】
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ  ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。後の実施例で、ＧＳＴを融合したままでアッセイに利用したサンプルは、この溶出液を遠心式フィルターユニットであるアミコン（メルクミリポア社）を用いて、濃縮しつつ溶出用緩衝液を標準緩衝液に置換したペプチド溶液を用いた。【００６７】
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的ペプチドの間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドを精製した。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のペプチドは、Ｎ末端側にベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１由来のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＳｅｒがＮ末端側に付加されたアミノ酸配列を有する。【００６８】
実施例２：各種免疫グロブリン結合性ペプチドの結合能評価
（１）  各種免疫グロブリンの調製
ヒト血液由来のＩｇＧ製剤を原料としてＩｇＧ溶液を調製し、さらにこれをパパインによってＦａｂフラグメント（以下単にＦａｂと略す）とＦｃフラグメント（以下単にＦｃと略す）に断片化し、ＦａｂとＦｃを分離精製することで、Ｆａｂ溶液およびＦｃ溶液を調製した。具体的には、血漿分画製剤ガンマグロブリン筋注１５００ｍｇ／１０ｍＬ（ニチヤク）を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ  ＡｃＯＨ−ＡｃＯＮａ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐａｐａｙａ  ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂとＦｃが混在）から、ＫａｎＣａｐＡ（カネカ）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＦａｂを回収することでＦｃと分離精製した。カラムに吸着したＦｃは、０．０５Ｍ  酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出し、即座に０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で中和した。またＩｇＧを含む溶液は、パパイン消化処理しなかった血漿分画製剤ガンマグロブリンを、ＫａｎＣａｐＡを利用した同様のクロマトグラフィー操作によって、Ｆｃと同様の手法にて回収することで調製した。ＩｇＧ、Ｆａｂ、および、Ｆｃを含む各々の溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いた、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）し、各種免疫グロブリン類の溶液を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるペプチド精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。【００６９】
（２）  各種ペプチドの免疫グロブリン類結合レスポンスの観測
バイオセンサーＯｃｔｅｔ（日本ポール社）を用い、本装置で最も標準的な評価システムとして推奨されている、ストレプトアビジン−ビオチン結合を利用してリガンドを固定化するＳＡバイオセンサーを用いた評価系にて、各種免疫グロブリン結合性ペプチドと免疫グロブリン類との結合力を測定した。【００７０】
上記（１）で得られたＩｇＧを３ｍｇ／ｍＬに、ＦａｂおよびＦｃを１ｍｇ／ｍＬに濃度調整した各溶液１ｍＬに対し、アミノ基ビオチン標識試薬ＥＺ−ｌｉｎｋ−ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）の１ｍＭ水溶液を２０μＬ添加し、室温で終夜インキュベ―トしてビオチン化ＩｇＧ、ビオチン化Ｆａｂおよびビオチン化Ｆｃを調製した。ビオチン化したＩｇＧ、ＦａｂおよびＦｃを、ランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で最終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ程度となる様に希釈し、ＳＡバイオセンサー８本に同じように６００秒間接触させた。接触時の回転速度は全て１０００ｒｐｍに調整した。その後、５０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ，ｐＨ２．４に１０秒間接触→ランニング緩衝液に１０秒間接触というサイクルを３回繰り返した。これを洗浄・再生ステップとする。この条件では、ストレプトアビジン−ビオチン結合は解離しないことは確認済みである。免疫グロブリン１種に対しては、同じＳＡバイオセンサーを用いるように測定系を組み、各種ペプチド溶液に１２０秒間接触する結合相、続いて標準緩衝液に１２０秒間接触する解離相のデータを取得した。各種ペプチドの濃度が１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭの３通りのデータについて、同じ種類のペプチドには同じＳＡバイオセンサーを用いて、先述の洗浄・再生ステップを介して、繰り返し測定した。表２に以上の測定結果を示す。【００７１】
【表２】
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【００７２】
解析は、付属の解析ソフトを利用して標準的な１：１結合モデルにてフィッティングを行った。各種ペプチドの免疫グロブリン類に対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）、結合速度定数（ｋon）、および、解離速度定数（ｋoff）を算出し、それらの常用対数Ｌｏｇ１０をグラフとして図示した。すなわち、数値が１違うと、パラメータが１オーダー（１０倍）違うことを意味する。解離速度定数は、小さい程結合が強くなるので、グラフの軸は反転させており、これによって、各種パラメータに関し、右側に大きい程結合が強いことを示すような表示方法とした。【００７３】
配列番号２〜７に示す各種免疫グロブリン結合性ペプチドのＩｇＧ結合パラメータに関するグラフを、配列番号１７〜１９に示すＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインからなるペプチド（比較例１）と比較する形で図１に示した。本発明で得られた各種免疫グロブリン結合性ペプチドは、全てＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインと同程度のＩｇＧ結合力を示すことを確認した。ＳｐＧよりも高い数値を示したペプチドをリガンドとすることで、ＩｇＧの保持性能が向上したアフィニティー分離マトリックスの創出に繋がる可能性がある。一方、ＳｐＧよりも低い数値を示したペプチドをリガンドとすることで、ＩｇＧを回収しやすいアフィニティー分離マトリックスの創出が可能となるかもしれない。したがって、ここでは、本発明のペプチドがＳｐＧと同オーダーの結合定数を示したという点が重要と言える。【００７４】
配列番号８〜１６に示す各種免疫グロブリン結合性ペプチドのＦａｂ結合パラメータに関するグラフを、配列番号２０に示すＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインのＦａｂ結合強化型変異体（比較例１）と比較する形で図２に示した。先と同様に、本発明で得られた全ての免疫グロブリン結合性ペプチドは、免疫グロブリンのＦａｂ結合性ペプチドとして、十分な結合力を示すことを確認した。配列番号８〜１６のペプチドは、特許文献２〜４を参考に、配列番号２〜７の一部を変異したアミノ酸配列を有する。これらは、配列番号１で示す様な様々なバリエーションのアミノ酸配列も、基本的に本発明に含有されることを示すデータと言える。【００７５】
実施例３：免疫グロブリン結合性ペプチドのアルカリ耐性評価
（１）  各種ペプチドのアルカリ処理
超純水を用いて透析した各種ペプチドを濃度調整し、４μＭ水溶液を得た。当該水溶液０．２ｍＬに半量の４５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬを添加し、２５℃で２時間インキュベ―トした後、５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）０．１ｍＬで中和した。中和されていることをｐＨ試験紙にて確認し、標準緩衝液で２０倍希釈して濃度を１００ｎＭに調整した。【００７６】
上記の水酸化ナトリウム水溶液０．１ｍＬと５０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）０．１ｍＬをあらかじめ混和してから添加し、上記の通りに調製したペプチド溶液を、アルカリ処理前（０ｈｒ）のサンプルとした。この溶液のペプチドの最終濃度は１００ｎＭである。【００７７】
（２）  各種ペプチドのアルカリ処理後の免疫グロブリン結合残存活性
上記（１）で調整したアルカリ処理前後の各種ペプチド溶液を用いて、実施例２（２）と同様の方法で、Ｏｃｔｅｔにて免疫グロブリンへの結合を測定した。本実験では、結合の様式を単純化するため、ＩｇＧの代わりにＦｃを用いた。また、結合定数が同じオーダーであることを確認したので、濃度変化に伴う結合シグナルの大きさの変化もほぼ同様と仮定できる。よって、アルカリ処理前の結合シグナル値に対する、アルカリ処理後（Ｎ＝３）の結合シグナル値の比率を結合残存活性として算出し、その値をグラフにした。【００７８】
配列番号２〜５に示す各種免疫グロブリン結合性ペプチドのアルカリ処理後のＦｃ結合残存活性に関するグラフを、配列番号１９に示すＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインからなるペプチド（比較例１）と比較する形で図３（１）に示した。グラフに示されている通り、本発明の各種ペプチドは、ＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインよりも有意に高いアルカリ耐性を示すことを確認した。【００７９】
Ｆａｂ結合強化型に関しても、配列番号１１、１３に示すペプチドを用い、アルカリ処理後のＦａｂ結合残存活性を評価し、配列番号２０に示すＳｐＧのＩｇＧ結合ドメインのＦａｂ結合強化型変異体（比較例１）と比較する形で図３（２）に示した。同様に、本発明で得られたＦａｂ結合強化型のペプチドについても、アルカリ耐性が強化されていることを確認した。【００８０】
なお、数値にバラつきは見られるが、アルカリによる非特異的なダメージを評価しており、かつ、そのダメージに鋭敏な評価系である為、この程度のバラつきが生じるのは自然であり、平均値において明確な有意差がある点から、結果の信頼度は高く、比較対照より有意に高いレベルを保っていると想定される。今回本実施例で評価したペプチドをリガンドとするアフィニティー分離マトリックスは、アルカリ洗浄によるダメージに強い特性を示すはずである。【００８１】
比較例１
本実施例の比較対照として用いた配列番号１７〜２０に示すタンパク質は、実施例１（１）と同様の方法で、表３に示す配列番号のオリゴＤＮＡを用いて、発現プラスミドを調製した。そして、実施例１（２）と同様の方法でタンパク質サンプルを調製し、実施例２、および、実施例３において、同様の方法で、本発明で得られた各種ペプチドと同時に評価を実施した。【００８２】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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