(57)【要約】  第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質とは異なる４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入し、前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点又は蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象のシグナルを検出することによって、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を形成させる工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
【請求項２】
第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質のいずれか一方がドナー蛍光タンパク質であり、他方がアクセプター蛍光タンパク質であり、工程（３）において、前記蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方が該特定のタンパク質であり、他方が被検タンパク質であり、前記蛍光輝点の検出又は前記ＦＲＥＴ現象の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質を用い、前記蛍光輝点又は前記ＦＲＥＴ現象の強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を調節する物質をスクリーニングするための方法であって、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）被検化合物の存在下で、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる若しくは細胞に導入する工程、又は、
第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた若しくは細胞に導入した後、該細胞を被検化合物の存在下におく工程、
（２）前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程、
（３）前記蛍光輝点の強度が、前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程。
【請求項６】
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を調節する物質をスクリーニングするための方法であって、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質とは異なるタンパク質であり、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質のいずれか一方がドナー蛍光タンパク質であり、他方がアクセプター蛍光タンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）被検化合物の存在下で、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる若しくは細胞に導入する工程、又は、
第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた若しくは細胞に導入した後、該細胞を被検化合物の存在下におく工程、
（２）前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を検出する工程、
（３）前記ＦＲＥＴ現象の強度が、前記被検化合物の非存在下において生じるＦＲＥＴ現象の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記ＦＲＥＴ現象の強度が、前記被検化合物の非存在下において生じるＦＲＥＴ現象の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程。
【請求項７】
前記細胞が固定化された細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
下記（ａ）〜（ｋ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、請求項１〜７のうちのいずれか一項に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の４量体蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、第１の４量体蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｂ）第２の４量体蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、第２の４量体蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｃ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）（ａ）又は（ｃ）に記載のベクター及び（ｂ）又は（ｄ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｇ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｈ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
（ｉ）第１の融合タンパク質
（ｊ）第２の融合タンパク質
（ｋ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むタンパク質セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質間相互作用の判定方法及びその応用、並びに当該方法に用いられるためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのタンパク質の機能は、他のタンパク質等との相互作用によって発揮され、シグナル伝達、輸送、代謝といった生命の根本をなす多種多様なシステムの制御に深く関与している。そのため、タンパク質間相互作用を分析することは、タンパク質機能や生物学的機能を解明することのみならず、疾患メカニズムの解明を通した医薬品の開発等においても極めて重要である。【０００３】
タンパク質間相互作用を分析する手法は多々開発されており、ツーハイブリッド法、共免疫沈降法、表面プラズモン共鳴法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法といった様々な方法が利用されている。【０００４】
本発明者らも、従前、多量化能を有するタンパク質を利用したタンパク質間相互作用の判定方法を開発している（特許文献１）。具体的には、所望のタンパク質（第１のタンパク質及び第２のタンパク質）に、多量化能を有するタンパク質（会合誘導タンパク質及び多量化能を有する蛍光タンパク質）を各々融合させて細胞内に発現させた場合において、第１のタンパク質と第２のタンパク質とが相互作用すれば、多量化能を有するタンパク質同士の会合作用が誘導され、これにより自立的に会合体（蛍光輝点）が形成されるということを見出し、該蛍光輝点の形成を指標としたタンパク質間相互作用の判定方法の開発に、本発明者らは成功している。【０００５】
しかしながら、前記会合誘導タンパク質として好適に用いられるＰＢ１、ＳＡＭ等は、オートファジー制御に関するｐ６２タンパク質、転写抑制因子であるＴＥＬタンパク質等が有する機能ドメインであり、細胞内における各タンパク質の機能発揮に深く関与する。そのため、かかる機能ドメインを含む前記融合タンパク質を細胞内において発現させた場合には、当該細胞の内在性ｐ６２タンパク質、ＴＥＬタンパク質等の機能を乱すことになり、ひいては所望のタンパク質間相互作用の判定及びそれらの機能解析に影響を与えることが懸念される。【０００６】
そこで、本発明者らは、所望のタンパク質に融合させる双方の多量化能を有するタンパク質を共に、発現させる細胞にとって外来タンパク質となる蛍光タンパク質とすることで、内在性のタンパク質にある機能ドメイン（ＰＢ１ドメイン、ＳＡＭドメイン等）を用いずに、タンパク質間相互作用を判定することを着想した。【０００７】
しかしながら、所望のタンパク質の双方に、同一の４量体蛍光タンパク質（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（アザミグリーン、ＡＧ）タンパク質）を前記多量化能を有するタンパク質として融合させ、細胞内に発現させた場合には、蛍光輝点が形成されず、タンパク質間相互作用の判定に利用できないことを、本発明者らは昨今見出している（非特許文献１  補足図５のｄ）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０８４９５０号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】渡部  拓ら、Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１７年４月１３日公開、７：４６３８０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、対象とするタンパク質の双方に蛍光タンパク質を融合させ、細胞内に発現させ又は導入した場合に、形成される蛍光輝点を指標に、対象タンパク質間の相互作用を判定できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、様々な蛍光タンパク質の組み合わせを用いて検討した。その結果、非特許文献１において開示しているように、対象とするタンパク質の双方に同一の４量体蛍光タンパク質を融合させ、細胞内に発現させても、蛍光輝点は形成されず、対象タンパク質間の相互作用を判定することができなかった。さらに、対象とするタンパク質のいずれか一方に、単量体蛍光タンパク質又は２量体蛍光タンパク質を融合させて細胞内に発現させた場合においても、対象タンパク質間の相互作用を示す蛍光輝点は形成されなかった。【００１２】
しかしながら、対象とするタンパク質に各々異なる４量体蛍光タンパク質を融合させ、細胞内に発現させた場合においては、蛍光輝点が形成され、該蛍光輝点を指標として、対象タンパク質間の相互作用を判定することができた。【００１３】
また、前記４量体蛍光タンパク質の一方をドナー蛍光タンパク質に、他方をアクセプター蛍光タンパク質とした場合においても、タンパク質間相互作用依存的に蛍光輝点が形成され、さらに当該蛍光輝点において蛍光共鳴エネルギー移動等（ＦＲＥＴ現象）が生じることを見出した。【００１４】
また、前述の異なる４量体蛍光タンパク質の組み合わせを用いた場合においては、対象がタンパク質間相互作用した際に蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせを用いた場合と比較して、得られるＦＲＥＴ現象の強度（ＦＲＥＴ現象のシグナル、ＦＲＥＴ現象の効率）が高くなることも明らかにした。【００１５】
さらに、前述の蛍光輝点を形成できない蛍光タンパク質の組み合わせを用いた場合には、細胞を固定化するとＦＲＥＴ現象のシグナルを検出することすらできなくなる一方で、上述の異なる４量体蛍光タンパク質の組み合わせを用いた場合には、固定化した細胞においてもＦＲＥＴ現象のシグナルを検出でき、かつ、検出対象のタンパク質間相互作用の度合いを感度よく解析できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
したがって、本発明は、タンパク質間相互作用の判定方法及びその応用、並びに当該方法に用いられるためのキットに関し、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
＜１＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）  第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞内における第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程。
＜２＞  第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質のいずれか一方がドナー蛍光タンパク質であり、他方がアクセプター蛍光タンパク質であり、工程（３）において、前記蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方が該特定のタンパク質であり、他方が被検タンパク質であり、前記蛍光輝点又は前記ＦＲＥＴ現象の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞  前記相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質を用い、前記蛍光輝点又は前記ＦＲＥＴ現象の強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜５＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を調節する物質をスクリーニングするための方法であって、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）被検化合物の存在下で、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる若しくは細胞に導入する工程、又は、
第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた若しくは細胞に導入した後、該細胞を被検化合物の存在下におく工程、
（２）前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程、
（３）前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程。
＜６＞  第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を調節する物質をスクリーニングするための方法であって、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質のいずれか一方がドナー蛍光タンパク質であり、他方がアクセプター蛍光タンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む方法
（１）被検化合物の存在下で、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる若しくは細胞に導入する工程、又は、
第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた若しくは細胞に導入した後、該細胞を被検化合物の存在下におく工程、
（２）前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を検出する工程、
（３）前記ＦＲＥＴ現象の強度が、前記被検化合物の非存在下において生じるＦＲＥＴ現象の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記ＦＲＥＴ現象の強度が、前記被検化合物の非存在下において生じるＦＲＥＴ現象の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程。
＜７＞  前記細胞が固定化された細胞である、＜１＞〜＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞  下記（ａ）〜（ｋ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含む、＜１＞〜＜７＞のうちのいずれか一に記載の方法に用いられるためのキット
（ａ）第１の４量体蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、第１の４量体蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｂ）第２の４量体蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、第２の４量体蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｃ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）（ａ）又は（ｃ）に記載のベクター及び（ｂ）又は（ｄ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｇ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｈ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
（ｉ）第１の融合タンパク質
（ｊ）第２の融合タンパク質
（ｋ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むタンパク質セット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、対象とするタンパク質の双方に蛍光タンパク質を融合させ、細胞内に発現させ又は導入した場合において、形成される蛍光輝点を指標に、対象タンパク質間の相互作用を判定することが可能となる。さらに、融合させる蛍光タンパク質は、発現させる又は導入する細胞が生来内在するものではない。そのため、当該細胞の機能を乱すおそれが少なく、タンパク質間相互作用の判定を行なうことができる。【００１８】
また、対象とするタンパク質の一方にドナー４量体蛍光タンパク質を融合させ、他方にアクセプター４量体蛍光タンパク質を融合させて細胞内に発現させ又は導入した場合には、蛍光輝点の形成を介し、ＦＲＥＴ現象を効率よく発生させることができ、そのＦＲＥＴ現象を検出することにより、対象タンパク質間の相互作用を判定することもできる。さらに、本発明によれば、固定化した細胞においてもＦＲＥＴ現象を生じさせることができるため、当該ＦＲＥＴ現象のシグナルによるタンパク質間相互作用の判定も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】検出対象（ｐ５３及びＭＤＭ２）の一方に単量体蛍光タンパク質であるｍＡＧ１又はｍＥＧＦＰを融合させ、他方に４量体蛍光タンパク質を融合させて発現させたＣＯＳ７細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図１Ｂ】検出対象（ｐ５３及びＭＤＭ２）の双方に同一の４量体蛍光タンパク質であるＡＧ又はＭｍｊを融合させて発現させたＣＯＳ７細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図１Ｃ】検出対象（ｐ５３及びＭＤＭ２）に異なる４量体蛍光タンパク質（ＡＧ及びＭｍｊ）を各々融合させて発現させたＣＯＳ７細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図１Ｄ】ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の阻害剤であるＮｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ｐ５３及びＭＤＭ２に異なる４量体蛍光タンパク質（ＡＧ及びＭｍｊ）を各々融合させて発現させたＣＯＳ７細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図２】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ｐ５３及びＭＤＭ２に異なる４量体蛍光タンパク質（ＡＧ、Ｍｍｊ又はＭＲ）を融合させて発現させたＨＥＫ２９３細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図３Ａ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ＭＤＭ２のＮ末に４量体蛍光タンパク質ＡＧを融合させてなるタンパク質（ＡＧ−ＭＤＭ２）と、ｐ５３のＣ末にＡＧとは異なる４量体蛍光タンパク質ＭＲを融合させてなるタンパク質（ｐ５３−ＭＲ）とを発現させたＨＥＫ２９３細胞を解析した結果を示す、ＡＧ及びＭＲの各蛍光画像、並びにＭＲ／ＡＧのＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図３Ｂ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ＡＧ−ＭＤＭ２及びｐ５３−ＭＲを発現させたＨＥＫ２９３細胞を解析した結果を示す、グラフである。なお、グラフは蛍光強度の時間経過を示し、グラフ中、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図３Ｃ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ＭＤＭ２のＮ末に４量体蛍光タンパク質ＡＧを融合させてなるタンパク質（ＡＧ−ＭＤＭ２）と、ｐ５３のＮ末にＡＧとは異なる４量体蛍光タンパク質ＭＲを融合させてなるタンパク質（ＭＲ−ｐ５３）とを発現させたＨＥＫ２９３細胞を解析した結果を示す、ＡＧ及びＭＲの各蛍光画像、並びにＭＲ／ＡＧのＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図３Ｄ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ＡＧ−ＭＤＭ２及びＭＲ−ｐ５３を発現させたＨＥＫ２９３細胞を解析した結果を示す、グラフである。なお、グラフは蛍光強度の時間経過を示し、グラフ中、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図３Ｅ】ｐ５３及びＭＤＭ２に異なる４量体蛍光タンパク質（ＡＧ又はＭＲ）を融合させて発現させたＨＥＫ２９３細胞におけるＦＲＥＴ現象の効率を、アクセプターフォトブリーチング法によって解析した結果を示す、疑似カラー画像、各蛍光輝点の拡大図、及びグラフである。
【図４Ａ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ｐ５３−ＭＲ及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞について、解析した結果を示す、ＡＧ及びＭＲの各蛍光強度を示す画像、及びＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図４Ｂ】ｐ５３−ＭＲ及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞について、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後におけるＦＲＥＴ現象の効率を解析した結果を示す、グラフである。なお、グラフは蛍光強度の時間経過を示し、グラフ中、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図４Ｃ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ｐ５３−ＭＲと、ＭＤＭ２のＮ末にｍＡＧ１を融合させてなるタンパク質（ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを発現させたＨＥＫ２９３細胞を、解析した結果を示す、ＡＧ及びＭＲの各蛍光強度を示す画像、及びＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図４Ｄ】ｐ５３−ＭＲ及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞について、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後におけるＦＲＥＴ現象の効率を、解析した結果を示す、グラフである。なお、グラフは蛍光強度の時間経過を示し、グラフ中、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図４Ｅ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ＭＲ−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞を、解析した結果を示す、ＡＧ及びＭＲの各蛍光強度を示す画像、及びＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図４Ｆ】ＭＲ−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞について、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後におけるＦＲＥＴ現象の効率を、解析した結果を示す、グラフである。なお、グラフは蛍光強度の時間経過を示し、グラフ中、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図４Ｇ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ＭＲ−ｐ５３及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞を、解析した結果を示す、ｍＡＧ１及びＭＲの各蛍光強度を示す画像、及びＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図４Ｈ】ＭＲ−ｐ５３とｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現させたＨＥＫ２９３細胞について、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後におけるＦＲＥＴ現象の効率を、解析した結果を示す、グラフである。なお、グラフは蛍光強度の時間経過を示し、グラフ中、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図４Ｉ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ｐ５３−ＭＲ及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞と、ｐ５３−ＭＲ及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞とにおける、ＦＲＥＴ現象のシグナル（ＭＲ／ＡＧ又はｍＡＧ１（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０））及びｍＡＧ１／ＡＧを、解析した結果を示すグラフである。
【図４Ｊ】Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前後において、ＭＲ−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞と、ＭＲ−ｐ５３及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞とにおける、ＦＲＥＴ現象のシグナル及びｍＡＧ１／ＡＧを、解析した結果を示すグラフである。
【図４Ｋ】ｐ５３−ＭＲ及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞と、ｐ５３−ＭＲ及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞とにおいて、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前のＦＲＥＴ現象のシグナルを、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加後のそれに対する比率として表すグラフである。
【図４Ｌ】ＭＲ−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞と、ＭＲ−ｐ５３及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞とにおいて、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加前のＦＲＥＴ現象のシグナルを、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加後のそれに対する比率として表すグラフである。
【図５Ａ】Ｎｕｔｌｉｎ−３非存在下又は存在下において、ｐ５３−ＭＲ及びＡＧ−ＭＤＭ２が発現しているＨＥＫ２９３細胞（ｐ５３−ＭＲ／ＡＧ−ＭＤＭ２）と、ｐ５３−ＭＲ及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞（ｐ５３−ＭＲ／ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを各々パラホルムアルデヒドにより固定化した後の、ＡＧ又はｍＡＧ１とＭＲとの蛍光強度を示す画像、及びＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図５Ｂ】Ｎｕｔｌｉｎ−３非存在下又は存在下において、ＭＲ−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２が発現しているＨＥＫ２９３細胞（ＭＲ−ｐ５３／ＡＧ−ＭＤＭ２）と、ＭＲ−ｐ５３及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＭＲ−ｐ５３／ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）とを各々パラホルムアルデヒドにより固定化した後の、ＡＧ又はｍＡＧ１とＭＲとの蛍光強度を示す画像、及びＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図５Ｃ】Ｎｕｔｌｉｎ−３非存在下又は存在下において、ｐ５３−ＭＲ／ＡＧ−ＭＤＭ２、ｐ５３−ＭＲ／ｍＡＧ１−ＭＤＭ２、ＭＲ−ｐ５３／ＡＧ−ＭＤＭ２及びＭＲ−ｐ５３／ｍＡＧ１−ＭＤＭ２における、パラホルムアルデヒドにより固定化した後のＦＲＥＴ現象の効率を解析した結果を示す、グラフである。
【図６Ａ】検出対象（ＭＡＸ及びＭｙｃ）に異なる４量体蛍光タンパク質（ＡＧ及びＭＲ）を各々融合させて発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図６Ｂ】検出対象（ＭＡＸ及びＭｙｃ）に異なる４量体蛍光タンパク質（ＡＧ及びＭＲ）を各々融合させて発現させた細胞を、アクセプターフォトブリーチング法によって解析した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図７Ａ】ＢＡＫ及びＭＣＬ１間相互作用阻害剤（Ａ−１２１０４７７）添加前と添加５分後において、ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。なお、「ＭＲ−ＢＡＫ」は、ＢＡＫのＮ末に４量体蛍光タンパク質ＭＲを融合させてなるタンパク質を表し、「ＡＧ−ＭＣＬ１」は、ＭＣＬ１のＮ末に４量体蛍光タンパク質ＡＧを融合させてなるタンパク質を表す。
【図７Ｂ】Ａ−１２１０４７７の添加前後において、ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＭＲ及びＡＧに由来する各蛍光強度の時間経過（図中、上段）、並びにＭＲ／ＡＧ比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過（図中、下段）を示す、グラフである。上段のグラフにおいて、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。なお、それぞれＡ−１２１０４７７の添加６０秒前の蛍光強度又は蛍光強度の比率を１として標準化した値の推移を示している。
【図７Ｃ】Ａ−１２１０４７７添加前と添加５分後において、ＭＲ−ＢＡＫ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。なお、「ｍＡＧ１−ＭＣＬ１」は、ＭＣＬ１のＮ末に単量体蛍光タンパク質ｍＡＧ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図７Ｄ】Ａ−１２１０４７７の添加前後において、ＭＲ−ＢＡＫ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＭＲ及びｍＡＧ１に由来する各蛍光強度の時間経過（図中、上段）、並びにＭＲ／ｍＡＧ１比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過（図中、下段）を示す、グラフである。上段のグラフにおいて、上に位置する点線はｍＡＧ１由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図７Ｅ】ＭＲ−ＢＡＫ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた細胞におけるＥｍ：６１０／Ｅｍ：５１０と、ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞におけるそれとを比較した結果を示す、グラフである。
【図７Ｆ】ＢＡＸ及びＭＣＬ１間相互作用阻害剤（Ａ−１２１０４７７）添加前と添加５分後において、ＭＲ−ＢＡＸ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。なお、「ＭＲ−ＢＡＸ」は、ＢＡＸのＮ末に４量体蛍光タンパク質ＭＲを融合させてなるタンパク質を表す。
【図７Ｇ】Ａ−１２１０４７７の添加前後において、ＭＲ−ＢＡＸ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＭＲ及びＡＧに由来する各蛍光強度の時間経過（図中、上段）、並びにＭＲ／ＡＧ比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過（図中、下段）を示す、グラフである。上段のグラフにおいて、上に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図７Ｈ】Ａ−１２１０４７７添加前と添加５分後において、ＭＲ−ＢＡＸ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。
【図７Ｉ】Ａ−１２１０４７７の添加前後において、ＭＲ−ＢＡＸ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、ＭＲ及びｍＡＧ１に由来する各蛍光強度の時間経過（図中、上段）、並びにＭＲ／ｍＡＧ１比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過（図中、下段）を示す、グラフである。上段のグラフにおいて、上に位置する点線はｍＡＧ１由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示し、下に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示す。
【図７Ｊ】ＭＲ−ＢＡＸ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた細胞におけるＥｍ：６１０／Ｅｍ：５１０と、ＭＲ−ＢＡＸ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞におけるそれとを比較した結果を示す、グラフである。
【図８Ａ】ｍＴＯＲ及びＦＫＢＰ１２間相互作用誘導剤（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）添加前と添加５分後において、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。なお、「ＭＲ−ｍＴＯＲ」は、ｍＴＯＲのＮ末に４量体蛍光タンパク質ＭＲを融合させてなるタンパク質を表し、「ＡＧ−ＦＫＢＰ１２」は、ＦＫＢＰ１２のＮ末に４量体蛍光タンパク質ＡＧを融合させてなるタンパク質を表す。
【図８Ｂ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎの添加前後において、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞における、ＭＲ及びＡＧに由来する各蛍光強度の時間経過（図中、上段）、並びにＭＲ／ＡＧ比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過（図中、下段）を示す、グラフである。上段のグラフにおいて、上に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示し、下に位置する点線はＡＧ由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示す。
【図８Ｃ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前と添加５分後において、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像である。なお、「ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２」は、ＦＫＢＰ１２のＮ末に単量体蛍光タンパク質ｍＡＧ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図８Ｄ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎの添加前後において、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞における、ＭＲ及びｍＡＧ１に由来する各蛍光強度の時間経過（図中、上段）、並びにＭＲ／ｍＡＧ１比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過（図中、下段）を示す、グラフである。上段のグラフにおいて、上に位置する点線はＭＲ由来の蛍光強度（Ｅｍ：６１０）を示し、下に位置する点線はｍＡＧ１由来の蛍光強度（Ｅｍ：５１０）を示す。
【図８Ｅ】ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞におけるＥｍ：６１０／Ｅｍ：５１０と、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞におけるそれとを比較した結果を示す、グラフである。
【図９Ａ】ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた生細胞（図中、左側の（Ａ））と、ＭＲ−ＢＡＫ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた生細胞（図中、右側の（Ｂ））とにおける、ＦＲＥＴ現象のシグナル（各グラフ縦軸）と、Ａ−１２１０４７７の濃度（各グラフ横軸）との関係を示す、グラフである。
【図９Ｂ】ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させ固定化した細胞（図中、左側の（Ａ））と、ＭＲ−ＢＡＫ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させ固定化した細胞（図中、右側の（Ｂ））とにおける、ＦＲＥＴ現象のシグナル（各グラフ縦軸）と、Ａ−１２１０４７７の濃度（各グラフ横軸）との関係を示す、グラフである。
【図９Ｃ】ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現させた生細胞（図中、左側の（Ａ））と、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現させた生細胞（図中、右側の（Ｂ））とにおける、ＦＲＥＴ現象のシグナル（各グラフ縦軸）と、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの濃度（各グラフ横軸）との関係を示す、グラフである。
【図９Ｄ】ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現させ固定化した細胞（図中、左側の（Ａ））と、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現させ固定化した細胞（図中、右側の（Ｂ））とにおける、ＦＲＥＴ現象のシグナル（各グラフ縦軸）と、Ｒａｐａｍｙｃｉｎの濃度（各グラフ横軸）との関係を示す、グラフである。
【図１０Ａ】ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、Ａ−１２１０４７７の濃度と、「視野中の蛍光輝点におけるＡＧの蛍光強度の総和／視野中のＡＧを発現している総細胞数」（図中、左側）及び「視野中の蛍光輝点におけるＭＲの蛍光強度の総和／視野中のＭＲを発現している総細胞数」（図中、右側）との関係を示す、グラフである。
【図１０Ｂ】ＭＲ−ＢＡＸ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞における、Ａ−１２１０４７７の濃度と、「視野中の蛍光輝点におけるＡＧの蛍光強度の総和／視野中のＡＧを発現している総細胞数」（図中、左側）及び「視野中の蛍光輝点におけるＭＲの蛍光強度の総和／視野中のＭＲを発現している総細胞数」（図中、右側）との関係を示す、グラフである。
【図１１Ａ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前と添加１０分後において、ｍＴＯＲ−ＤｓＲｅｄ２及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像（上段）と、ＦＲＥＴ現象のシグナルを示すグラフ（下段）とを示す。なお、「ｍＴＯＲ−ＤｓＲｅｄ２」は、ｍＴＯＲのＣ末に４量体蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄ２を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１１Ｂ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前と添加１０分後において、ＦＫＢＰ１２−ＡＧ及びｍＴＯＲ−ＣＯＲ５を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像（上段）と、ＦＲＥＴ現象のシグナルを示すグラフ（下段）とを示す。なお、「ｍＴＯＲ−ＣＯＲ５」は、ｍＴＯＲのＣ末に４量体蛍光タンパク質ＣＯＲ５を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１１Ｃ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前と添加１０分後において、ＭＲ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像（上段）と、ＦＲＥＴ現象のシグナルを示すグラフ（下段）とを示す。なお、「ＭＲ−ＦＫＢＰ１２」は、ＦＫＢＰ１２のＮ末に４量体蛍光タンパク質ＭＲを融合させてなるタンパク質を表し、「ｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１」は、ｍＴＯＲのＣ末に４量体蛍光タンパク質ＫｉｋＧＲ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１１Ｄ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前と添加１０分後において、ＦＫＢＰ１２−ＤｓＲｅｄ２及びｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像（上段）と、ＦＲＥＴ現象のシグナルを示すグラフ（下段）とを示す。
【図１１Ｅ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前と添加１０分後において、ＦＫＢＰ１２−ＣＯＲ５及びｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像（上段）と、ＦＲＥＴ現象のシグナルを示すグラフ（下段）とを示す。
【図１１Ｆ】Ｎｕｔｌｉｎ−３添加前と添加１０分後において、Ｍｍｊ−ｐ５３及びＭＲ−ＭＤＭ２を発現させた細胞における、ＦＲＥＴ現象の効率を示すＲａｔｉｏ画像（上段）と、ＦＲＥＴ現象のシグナルを示すグラフ（下段）とを示す。なお、「Ｍｍｊ−ｐ５３」は、ｐ５３のＮ末に４量体蛍光タンパク質Ｍｏｍｉｊｉ（Ｍｍｊ）を融合させてなるタンパク質を表し、「ＭＲ−ＭＤＭ２」は、ＭＤＭ２のＮ末に４量体蛍光タンパク質ＭＲを融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ａ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＡＧ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＫＯ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＡＧ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＫＯ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｍＫＯ１」は、ｍＴＯＲのＣ末に単量体蛍光タンパク質ｍＫＯ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｂ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＡＧ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＫＯ２を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＡＧ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＫＯ２由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｍＫＯ２」は、ｍＴＯＲのＣ末に単量体蛍光タンパク質ｍＫＯ２を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｃ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＡＧ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ＫＯ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＡＧ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ＫＯ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ＫＯ１」は、ｍＴＯＲのＣ末に２量体蛍光タンパク質ＫＯ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｄ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＡＧ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａを発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＡＧ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＫｅｉｍａ由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａ」は、ｍＴＯＲのＣ末に単量体蛍光タンパク質ｍＫｅｉｍａを融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｅ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＡＧ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａを発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＡＧ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｄＫｅｉｍａ由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａ」は、ｍＴＯＲのＣ末に２量体蛍光タンパク質ｄＫｅｉｍａを融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｆ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＫＯ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ｍＡＧ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＫＯ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。
【図１２Ｇ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＫＯ２を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ｍＡＧ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＫＯ２由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。
【図１２Ｈ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ＫＯ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ｍＡＧ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ＫＯ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。
【図１２Ｉ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａを発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ｍＡＧ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＫｅｉｍａ由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。
【図１２Ｊ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａを発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ｍＡＧ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｄＫｅｉｍａ由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。
【図１２Ｋ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＭＲ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＢ）を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＭＲ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｄＡＧ（ＡＢ）由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＢ）」は、ｍＴＯＲのＣ末に２量体蛍光タンパク質ｄＡＧ（ＡＢ）を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｌ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＭＲ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＣ）を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＭＲ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｄＡＧ（ＡＣ）由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＣ）」は、ｍＴＯＲのＣ末に２量体蛍光タンパク質ｄＡＧ（ＡＣ）を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｍ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＭＲ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＵｋＧ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＭＲ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＵｋＧ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｍＵｋＧ１」は、ｍＴＯＲのＣ末に単量体蛍光タンパク質ｍＵｋＧ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｎ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＭＲ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ｍＭｉＣｙ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＭＲ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ｍＭｉＣｙ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ｍＭｉＣｙ１」は、ｍＴＯＲのＣ末に単量体蛍光タンパク質ｍＭｉＣｙ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｏ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＭＲ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ＭｉＣｙ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＭＲ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ＭｉＣｙ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ＭｉＣｙ１」は、ｍＴＯＲのＣ末に２量体蛍光タンパク質ＭｉＣｙ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【図１２Ｐ】Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加３０分後において、ＭＲ−ＦＫＢＰ１２及びｍＴＯＲ−ＫＣｙ１を発現させた細胞を、観察した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。左側は、ＭＲ由来の蛍光を検出して観察した結果を示し、右側は、ＫＣｙ１由来の蛍光を検出して観察した結果を示す。なお、「ｍＴＯＲ−ＫＣｙ１」は、ｍＴＯＲのＣ末に２量体蛍光タンパク質ＫＣｙ１を融合させてなるタンパク質を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。また、下記各項目において説明する事項に関しては、当然のことながら特に断りがない限り、本発明全体を通し、他の項目等においても同様に解釈される。
【００２１】
＜タンパク質間相互作用を判定するための方法＞
本発明のタンパク質間相互作用を判定するための方法は、
第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定するための方法であって、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質とは異なるタンパク質であり、かつ下記工程（１）〜（３）を含む
（１）  第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させる又は細胞に導入する工程
（２）  前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程
（３）  前記蛍光輝点の検出により、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用を判定する工程
を含む方法である。
【００２２】
本発明において「タンパク質」とは２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した分子及びその修飾体を意味する。したがって、完全長のタンパク質のみならず、いわゆるオリゴペプチドやポリペプチドをも含む概念である。タンパク質の修飾としては、例えば、リン酸化、グリコシル化、パルミトイル化、プレニル化（例えば、ゲラニルゲラニル化）、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ヒドロキシル化、アミド化が挙げられる。
【００２３】
本発明にかかる「第１のタンパク質」及び「第２のタンパク質」としては、相互作用を検出したい所望のタンパク質を用いることができる。また、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは異なっていてもよく、同一であってもよい。
【００２４】
本発明にかかる「第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用」には、直接的な相互作用のみならず、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間に他の分子（タンパク質、核酸、糖、脂質、低分子化合物等）を介して複合体を形成するような、間接的な相互作用も含まれる。
【００２５】
本発明にかかる「４量体蛍光タンパク質」は、蛍光を発することができ、かつ細胞内においてホモ４量体を形成することができるタンパク質であればよく、例えば、下記表１〜４に示す蛍光タンパク質が挙げられる。
【００２６】
【表１】
2018235787.tif 000002
【００２７】
【表２】
2018235787.tif 000003
【００２８】
【表３】
2018235787.tif 000004
【００２９】
【表４】
2018235787.tif 000005
【００３０】
なお、表１〜４においては、各蛍光タンパク質の、励起波長及び蛍光波長、並びに典型的な配列（配列番号によって特定される配列）も併せて示す。
【００３１】
また、これら蛍光タンパク質のアミノ酸配列は、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。また、人為的に変異を導入することもできる。そのため、表１〜４に示した典型的なアミノ酸配列からなる蛍光タンパク質に限らず、このような変異体も、蛍光を発することができ、かつ、細胞内にてホモ４量体を形成することができる限り、本発明において用いることができる。
【００３２】
かかる変異体としては、例えば、表１〜４に示した典型的なアミノ酸配列と９０％以上（例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなる４量体蛍光タンパク質が挙げられる。
【００３３】
配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０，１９９０）を利用して決定することができる。ＢＬＡＳＴＰによってアミノ酸配列を解析する方法の具体的な手法は公知であり、当業者であれば、例えば、当該プログラムのデフォルトパラメーターを用いて解析を行なうことができる。
【００３４】
本発明において、「第１の４量体蛍光タンパク質」及び「第２の４量体蛍光タンパク質」は、異なるタンパク質である。ここで「異なる」とは、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質とが互いに会合することがなく、多量体を形成することができない関係を意味する。
【００３５】
また、本発明においては、後述のとおり、タンパク質間相互作用の判定を、蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の検出によって行なうことができる。かかる観点から、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質のいずれか一方がドナー蛍光タンパク質であり、他方がアクセプター蛍光タンパク質であることが好ましい。
【００３６】
「ドナー蛍光タンパク質」及び「アクセプター蛍光タンパク質」は、ＦＲＥＴ現象を生じさせるために、前者の蛍光スペクトルと後者の励起スペクトルとが重なり合う関係にあればよく、当業者であれば、例えば、表１〜４に示すような、各蛍光タンパク質の励起波長及び蛍光波長に基づき、これらタンパク質の組み合わせを選択することができる。
【００３７】
本発明にかかる「第１の融合タンパク質」又は「第２の融合タンパク質」においては、第１又は第２の４量体蛍光タンパク質は、第１又は第２のタンパク質のＮ末側、Ｃ末側のいずれに融合させてもよい。さらに、直接的に第１又は第２のタンパク質に融合させてもよく、スペーサータンパク質を介して間接的に融合させてもよい。また、本発明にかかる「第１の融合タンパク質」又は「第２の融合タンパク質」には、他の機能性タンパク質が融合されていてもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、融合タンパク質のＮ末側、Ｃ末側のどちらか一方若しくは両側、又は第１若しくは第２の４量体蛍光タンパク質と第１若しくは第２のタンパク質との間に、直接的に又は間接的に融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、本発明にかかる融合タンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、融合タンパク質の精製を容易にする目的で用いる機能性タンパク質としては、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。
【００３８】
本発明にかかる「細胞」としては特に制限はなく、真核細胞であってもよく、原核細胞であってもよく、例えば、動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞等）、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞等）、植物細胞、酵母、大腸菌が挙げられる。また、かかる細胞は、生体外で培養した状態（例えば、培地中又は培地上にて生育している細胞）であってもよく、生体内に存在する状態（例えば、第１の融合タンパク質をコードするＤＮＡと第２の融合タンパク質をコードするＤＮＡとが導入されているトランスジェニック動物内の細胞）であってもよい。また、本発明にかかる融合タンパク質は、通常同一の細胞に導入又は発現させることになるが、異なる細胞であってもよい。そして、このような場合、サイトカインと受容体との相互作用、受容体間の相互作用等の、異なる細胞間のタンパク質間相互作用も判定することが可能となる。
【００３９】
また、後述の実施例において示すとおり、本発明によれば、固定化された細胞であっても、タンパク質間相互作用を検出できる。本発明において「固定化」とは、細胞内の構造の全体又は一部において通常生じる動的な変化を停止させることを意味する。また、固定化の方法としては、特に制限はないが、例えば、タンパク質凝固剤、タンパク質架橋剤によって、細胞を処理する方法が挙げられる。さらに、かかる薬剤としても特に制限はないが、例えば、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタルアルデヒド、アルコール（エタノール、メタノール）、ホルマリンアルコール、ピクリン酸、Ｂｏｕｉｎ、Ｚｅｎｋｅｒ、Ｈｅｌｙ、オスミウム、カルノアが挙げられる。
【００４０】
本発明にかかる融合タンパク質の前記細胞内における発現は、目的に応じて、一過性の発現であってもよく、恒常的な発現であってもよい。融合タンパク質の細胞における発現は、後述の本発明にかかるベクターを前記細胞に導入することにより行うことができる。細胞にベクターを導入する公知の手法としては、動物細胞に対しては、リポフェクション法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、ウィルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス等）を利用した方法が挙げられる。また、昆虫細胞に対しては、バキュロウィルスを利用した方法が挙げられる。さらに、植物細胞に対しては、アグロバクテリウム法、電気穿孔法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、酵母に対しては、酢酸リチウム法、電気穿孔法、スフェロプラスト法が挙げられる。さらに、大腸菌に対しては、熱ショック法（例えば、塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）、電気穿孔法等が挙げられる。
【００４１】
また、本発明において、融合タンパク質の前記細胞内への導入は、当業者であれば細胞の種類に合わせて適宜公知の手法を選択して行うことができる。タンパク質を細胞に導入する公知の手法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法が挙げられる。
【００４２】
本発明において検出する「蛍光輝点」は、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合によって生じるものであり、典型的には、拡散状態で存在している第１又は第２の蛍光タンパク質の蛍光強度よりも高い蛍光強度を有する、０．２〜５０μｍ（通常、０．２〜１０μｍ）の領域であり、好ましくは、第１及び第２の蛍光タンパク質の蛍光強度が各々拡散状態で存在しているよりも共に高い蛍光強度を有する、０．２〜５０μｍ（通常、０．２〜１０μｍ）の領域である。
【００４３】
「蛍光輝点の検出」は、例えば、後述の実施例において示すように、市販の蛍光検出装置を用いて行うことができる。かかる蛍光装置としては、例えば、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナ、ＣＣＤカメラタイプイメージャー、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＥヘルスケア社製）等のイメージングサイトメーター、マイクロタイタープレートリーダー（蛍光プレートリーダー）、フローサイトメータ等の検出装置を用いることができる。
【００４４】
また、得られた画像を画像解析プログラム（例えば、後述のｉｃｙスポット検出プログラム）により処理することによっても、蛍光輝点を検出することができる。なお、かかる蛍光輝点の検出において、検出する蛍光輝点の特性（蛍光輝点が発する蛍光の波長、強度等）、並びに用いる装置及びプログラム等に合わせて、フィルター、検出器、各種パラメーター等の選択、設定は、当業者であれば適宜行うことができる。
【００４５】
例えば、スポット検出解析プログム  Ｉｃｙ（Ｊ．−Ｃ．Ｏｌｉｖｏ−Ｍａｒｉｎ「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｔｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍａｇｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ」  Ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，ｖｏｌ．３５−９，１９８９〜１９９６ページ，２００２年、ｈｔｔｐ：／／ｉｃｙ．ｂｉｏｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ．ｏｒｇ  参照）における、設定値  Ｓｐｏｔ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒプラグイン（Ｓｃａｌｅ１，Ｓｃａｌｅ２，Ｓｃａｌｅ３  全てにチェックを入れ、感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を全て１００に設定した際の条件）にて検出可能な「解析プログラムで算出された単位当たりの蛍光強度値」が、バックグランド（例えば、陰性対照となる細胞における同蛍光強度値）の少なくとも２．０倍以上、より好ましくは２．５倍以上、さらにより好ましくは５．０倍以上、特に好ましくは１０倍以上であれば、蛍光輝点を検出できたと判定できる。
【００４６】
また、後述の実施例において示すとおり、本発明において、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質のいずれか一方をドナー蛍光タンパク質とし、他方をアクセプター蛍光タンパク質とした場合に、これら蛍光タンパク質によって形成される蛍光輝点を介して発生する、ＦＲＥＴ現象を効率よく検出することが可能となる。したがって、本発明において、タンパク質間相互作用の判定は、「蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の検出」によって行うこともできる。
【００４７】
なお、本発明において検出される「ＦＲＥＴ現象」は、光励起されたドナー蛍光タンパク質から、励起されていないアクセプター蛍光タンパク質へ、ドナー蛍光放出を経ずに、励起エネルギーが遷移、移動し,ドナーからの蛍光強度が減少し、アクセプター蛍光タンパク質からの蛍光強度が増加する現象（所謂、通常の「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）」）であってもよく、また、ドナー蛍光タンパク質から一旦蛍光が発せられたことにより、アクセプター蛍光タンパク質が励起し、アクセプター蛍光タンパク質からの蛍光強度が増加する現象（再吸収、偽ＦＲＥＴ）であってもよいが、本発明においては、その双方を区別することなく、検出することが望ましい（再吸収、偽ＦＲＥＴについては、講義と実習  生細胞蛍光イメージング  阪大・北大  顕微鏡コースブック  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｕｒｓｅ：  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  （１２７ページ）２００７年１０月２５日  初版１刷発行発行者  南条光章  発行所  共立出版株式会社  参照）。
【００４８】
ＦＲＥＴ現象の検出は常法により行うことができ、例えば、上述の蛍光検出装置を用いて行うことができる。さらにバックグラウンンドの影響を除くため、時間分解蛍光検出機能がついた装置を用いて行なうこともできる。
【００４９】
そして、本発明の方法においては、細胞において前記蛍光輝点又は該蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象が検出されれば、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していると判定することができ、前記蛍光輝点が検出されなければ、第１のタンパク質と第２のタンパク質とは相互作用していないと判定することができる。
【００５０】
＜タンパク質間相互作用の時間情報等を得るための方法＞
本発明の方法は、本発明にかかる蛍光輝点の存在又は非存在を指標として、タンパク質間相互作用の発生のみならず、タンパク質間相互作用の消失を検出することができる。また、かかるタンパク質間相互作用の発生等を経時的に追跡することもできる。さらに、ＰＢ１、ＳＡＭ等といった会合誘導タンパク質の局在、シグナル等に影響を受けることなく、本発明においては細胞内の任意の領域においてタンパク質間相互作用を検出することもできる。
【００５１】
したがって、本発明は、本発明にかかる蛍光輝点又は該蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を検出することによって、タンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出する方法を提供することができる。
【００５２】
このような「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の検出に関して、本発明においては、タンパク質間相互作用が生じる細胞内の領域をも特定することもできる。
【００５３】
また、本発明によれば、かかる「タンパク質間相互作用の発生若しくは消失」の検出を通して、当該タンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達の発生及び消失、該シグナル伝達の発生若しくは消失するまでの時間並びに該シグナル伝達の持続時間を検出することができ、さらに該シグナル伝達が生じている細胞内の領域をも特定することもできる。
【００５４】
また、第１のタンパク質と第２のタンパク質との相互作用が特定の刺激に応答して発生又は消失するものであっても、本発明において検出することができる。したがって、本発明は、本発明にかかる蛍光輝点又は該蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を検出することによって、特定の刺激に応答するタンパク質間相互作用の発生若しくは消失、該相互作用の発生若しくは消失するまでの時間、又は該相互作用の持続時間を検出する方法も提供することができる。
【００５５】
本発明にかかる「特定の刺激」とは、タンパク質間相互作用を直接的に又は間接的に誘導又は阻害できる刺激であればよく、また細胞内で生じる内在性因子による刺激（例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の増減、酵素の活性化又は不活性化）であってよく、細胞に与えられる外部からの刺激（例えば、受容体に対するリガンド（アゴニスト又はアンタゴニスト）の細胞への投与）であってもよい。
【００５６】
また、かかる本発明の方法においては、本発明にかかる蛍光輝点又は該蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を検出することによって、特定の刺激の発生若しくは消失、該刺激の発生若しくは消失するまでの時間、又は該刺激の持続時間を検出することもできる。
【００５７】
さらに、本発明の方法においては、特定の刺激の程度（例えば、特定の刺激が薬剤である場合には、その濃度）に応じたタンパク質間相互作用の増減も検出することができる。従って、特定の刺激が薬剤である場合には、タンパク質間相互作用に対する、その薬剤の５０％効果濃度（ＥＣ５０）及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、本発明によって決定することができる。
【００５８】
また、本発明の方法においては、同一の細胞において、多種類のタンパク質間相互作用、特定の刺激に各々依存的な多種類のタンパク質間相互作用、ひいてはこれらタンパク質間相互作用が関与するシグナル伝達を、判別し、検出することができる。
【００５９】
＜特定のタンパク質と相互作用するタンパク質のスクリーニング方法＞
本発明においては、任意のタンパク質間相互作用を検出することができる。したがって、本発明は、特定のタンパク質と相互作用するタンパク質をスクリーニングするための方法であって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方を該特定のタンパク質とし、他方を被検タンパク質とすることにより、本発明にかかる蛍光輝点又は該蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の検出により、該特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択する方法を提供することができる。
【００６０】
本発明にかかる「被検タンパク質」としては特に制限はない。網羅的に効率良く特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を選択できるという観点から、ｃＤＮＡライブラリーがコードするタンパク質群を好適に用いることができる。
【００６１】
＜タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸残基の同定方法＞
本発明において、蛍光輝点の蛍光強度とタンパク質間相互作用の強弱とは相関するものである。したがって、本発明によれば、タンパク質間相互作用に関与する第１のタンパク質中のアミノ酸残基又は第２のタンパク質中のアミノ酸残基を同定するための方法であって、該第１のタンパク質及び該第２のタンパク質のいずれかに変異が導入されたタンパク質を用い、前記蛍光輝点の強度及び／又は該蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の強度が、変異が導入されていないタンパク質を用いた場合と比較して減弱した場合は、該変異が導入されたアミノ酸残基を前記相互作用に関与すると判定する方法を提供することができる。
【００６２】
本発明にかかる「蛍光輝点の強度」には、一蛍光輝点の蛍光強度のみならず、一定領域内（例えば、一細胞内、蛍光顕微鏡観察における一視野内、一蛍光画像内、プレートリーダーでの検出における一ウェル内）に存在する蛍光輝点の総蛍光強度も含まれる。
【００６３】
また、本発明において、第１の４量体蛍光タンパク質と第２の４量体蛍光タンパク質のいずれか一方をドナー蛍光タンパク質とし、他方をアクセプター蛍光タンパク質とした場合には、「蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の強度」を指標として前記判定を行うことができる。この場合、蛍光輝点の蛍光強度を指標とする判定の結果を、ＦＲＥＴ現象の強度を指標とする判定を行なうことにより、確認することができる。また同様に、ＦＲＥＴ現象の強度を指標とする判定の結果を、蛍光輝点の蛍光強度を指標とする判定を行なうことにより、確認することもできる。
【００６４】
「ＦＲＥＴ現象の強度」としては、特に制限はなく、ＦＲＥＴ現象が起こることによって生じる、ドナー蛍光タンパク質の蛍光強度の減少の程度、アクセプター蛍光タンパク質の蛍光強度の増加の程度、ドナー蛍光タンパク質の蛍光寿命の減少の程度が挙げられ、より具体的には、ＦＲＥＴ現象の効率、ＦＲＥＴ現象のシグナルが挙げられる。
【００６５】
「ＦＲＥＴ現象の効率」として、通常、Ｅ＝１−（ＦＤ’／ＦＤ）によって算出される値を用いることができる。ここで、ＦＤは、アクセプター蛍光タンパク質非存在下のドナー蛍光タンパク質の蛍光強度を示し、ＦＤ’は、アクセプター蛍光タンパク質存在下のドナー蛍光タンパク質の蛍光強度を示す。
【００６６】
「ＦＲＥＴ現象の効率」として、後述の実施例において示すとおり、アクセプターフォトブリーチング法を用いた場合には、Ｅ＝（（Ｄｏｎｏｒｐｏｓｔ−Ｂａｃｋｐｏｓｔ）−（Ｄｏｎｏｒｐｒｅ−Ｂａｃｋｐｒｅ））／（Ｄｏｎｏｒｐｏｓｔ−Ｂａｃｋｐｏｓｔ）によって算出される値を用いることができる。ここで、Ｄｏｎｏｒｐｏｓｔはアクセプター蛍光タンパク質褪色後のドナー蛍光タンパク質の蛍光強度、Ｂａｃｋｐｏｓｔは前記褪色後のバックグラウンドの蛍光強度、Ｄｏｎｏｒｐｒｅは前記褪色前のドナー蛍光タンパク質の蛍光強度、Ｂａｃｋｐｒｅは前記褪色前のバックグラウンドの蛍光強度を示す。
【００６７】
「ＦＲＥＴ現象のシグナル」は、後述の実施例に示すように、ドナー蛍光タンパク質の蛍光強度に対するアクセプター蛍光タンパク質の蛍光強度の比率として表すことができる。
【００６８】
なお、本発明にかかる「ドナー蛍光タンパク質の蛍光強度」及び「アクセプター蛍光タンパク質の蛍光強度」には各々、一蛍光輝点におけるドナー蛍光タンパク質の蛍光強度及びアクセプター蛍光タンパク質の蛍光強度のみならず、一定領域内（例えば、一細胞内、蛍光顕微鏡観察における一視野間又は一蛍光画像内、プレートリーダーでの検出における一ウェル内）あたりのドナー蛍光タンパク質の総蛍光強度及びアクセプター蛍光タンパク質の総蛍光強度も含まれる。
【００６９】
「第１のタンパク質等に変異が導入されたタンパク質」の調製は、当業者であれば適宜公知の手法を選択して行うことができる。かかる公知の手法としては、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法が挙げられる。
【００７０】
＜タンパク質間相互作用を調節する物質のスクリーニング方法＞
本発明の方法において、蛍光輝点の強度を指標として、タンパク質間相互作用の強弱を把握することができる。したがって、本発明によれば、（１）被検化合物の存在下で、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び及２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる若しくは細胞に導入する工程、又は、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた若しくは細胞に導入した後、該細胞を被検化合物の存在下におく工程と、（２）前記細胞内において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点を検出する工程と、（３）前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記蛍光輝点の強度が前記被検化合物の非存在下において生じる蛍光輝点の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法を提供することができる。
【００７１】
また、本発明においては、上述のとおり、蛍光輝点の強度のみならず、蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を指標としても、タンパク質間相互作用を判定することができる。したがって、本発明によれば、（１）被検化合物存在下で、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを細胞内に発現させる若しくは細胞に導入する工程、又は、第１のタンパク質及び第１の４量体蛍光タンパク質を含む第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質及び第２の４量体蛍光タンパク質を含む第２の融合タンパク質とを、細胞内に発現させた若しくは細胞に導入した後、該細胞を被検化合物の存在下におく工程と、（２）前記細胞において第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質との会合により生じる蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を検出する工程と、（３）前記ＦＲＥＴ現象の強度が前記被検化合物の非存在下において生じるＦＲＥＴ現象の強度より増大する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の誘導物質として選択し、前記ＦＲＥＴ現象の強度が前記被検化合物の非存在下において生じるＦＲＥＴ現象の強度より減弱する場合は、前記被検化合物を前記相互作用の抑制物質として選択する工程と、を含む方法も提供することができる。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法において使用する被検化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００７３】
また、被検化合物存在下の状態とは、例えば、被検化合物の培地への添加等による被検化合物と本発明にかかる細胞とが接触している状態や、被検化合物が本発明にかかる細胞内に導入された状態が挙げられる。
【００７４】
＜本発明の方法に用いられるためのキット＞
本発明は、上記方法に用いられるためのキットを提供することができる。本発明のキットは、下記（ａ）〜（ｋ）からなる群から選択される少なくとも一の物質及び使用説明書を含むキットである。
【００７５】
（ａ）第１の４量体蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、第１の４量体蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｂ）第２の４量体蛍光タンパク質をコードするＤＮＡと、第２の４量体蛍光タンパク質と融合して発現されるように、任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位とを含むベクター
（ｃ）第１の融合タンパク質をコードするベクター
（ｄ）第２の融合タンパク質をコードするベクター
（ｅ）（ａ）又は（ｃ）に記載のベクター及び（ｂ）又は（ｄ）に記載のベクターを含むベクターセット
（ｆ）第１の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｇ）第２の融合タンパク質をコードするベクターを保持する形質転換細胞
（ｈ）第１の融合タンパク質をコードするベクターと第２の融合タンパク質をコードするベクターとを保持する形質転換細胞
（ｉ）第１の融合タンパク質
（ｊ）第２の融合タンパク質
（ｋ）第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質を含むタンパク質セット。
【００７６】
本発明にかかるベクターとしては、本発明にかかる細胞において、挿入されたＤＮＡを発現（転写及び翻訳）するのに必要な制御配列を含むものであればよい。かかる制御配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ターミネーター、ポリＡテール、リボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列）が挙げられる。さらに、本発明にかかるベクターにおいては、選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子等）を含んでいてもよい。また、このような本発明にかかるベクターの態様としては、例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、ウィルスベクターが挙げられる。
【００７７】
本発明にかかるベクターにおいてコードされるタンパク質は前述の通り、第１の４量体、第２の４量体蛍光タンパク質、及びこれらタンパク質との融合タンパク質であるが、かかるタンパク質をコードするＤＮＡの発現の効率をより向上させるという観点から、当該タンパク質を発現させる細胞の種に合わせてコドンを最適化したＤＮＡ（例えば、コドンがヒト化されたＤＮＡ）が、本発明にかかるベクターには、挿入されていてもよい。
【００７８】
「任意のタンパク質をコードするＤＮＡの挿入を可能にするクローニング部位」としては、例えば、１又は複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニング部位、ＴＡクローニング部位、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）クローニング部位が挙げられる。
【００７９】
本発明にかかるベクターの標品においては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。
【００８０】
本発明にかかる形質転換細胞は、前述の通り、本発明にかかるベクターを細胞に導入することにより調製することができる。また、本発明にかかる形質転換細胞の標品には、当該細胞の保存、培養に必要な培地、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加又は付属してあってもよい。
【００８１】
本発明にかかる「使用説明書」は、前記ベクターや形質転換細胞を本発明の方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の方法の実験手法や実験条件、及び本発明の標品に関する情報（例えば、ベクターの塩基配列やクローニングサイト等が示されているベクターマップ等の情報、形質転換細胞の由来、性質、当該細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８３】
（実施例１）  タンパク質間相互作用の検出１
本発明者らは、従前、所望のタンパク質（第１のタンパク質と第２のタンパク質）に多量化能を有するタンパク質（会合誘導タンパク質と多量化能を有する蛍光タンパク質）を各々融合させて細胞内に発現させた場合に、これら融合タンパク質の会合によって生じる蛍光輝点を検出することにより、前記所望のタンパク質間の相互作用を検出できることを、見出している（特許文献１）。【００８４】
しかしながら、かかるタンパク質間相互作用の検出方法において、前記所望のタンパク質の各々に、前記多量化能を有するタンパク質として同一の４量体蛍光タンパク質を融合させて細胞内に発現させた場合には、蛍光輝点は形成されず、これらタンパク質間の相互作用を検出できないということも、本発明者らは見出している（非特許文献１）。【００８５】
そこで、かかる多量化能を有するタンパク質を利用したタンパク質間相互作用の検出方法において、前記所望のタンパク質の双方に蛍光タンパク質を融合させて発現させた場合でも、これらタンパク質間の相互作用を検出できる条件につき、以下に示す方法にて、スクリーニングを試みた。【００８６】
なお、このスクリーニングにおいて検出対象としたのは、ｐ５３タンパク質とＭＤＭ２タンパク質との相互作用である。また、該相互作用の阻害剤として知られているナトリン−３（Ｎｕｔｌｉｎ−３）も、このスクリーニングにおいて後述のとおり用いた（Ｖａｓｓｉｌｅｖ  ＬＴ  ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００４年２月６日、３０３号、５６５９巻、８４４〜８４８ページ  参照）。【００８７】
また、検出対象に融合させて発現させる蛍光タンパク質としては、４量体蛍光タンパク質（Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ（ＡＧ）、Ｍｏｍｉｊｉ（Ｍｍｊ））、２量体蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、単量体蛍光タンパク質（ｍＡＧ１、ｍＥＧＦＰ）を評価対象とし、後述のとおり適宜組み合わせて用いた。【００８８】
＜ｐｍＡＧ１−ｐ５３の調製＞
タンパク質間相互作用解析用キット  Ｆｌｕｏｐｐｉ：Ａｓｈ−ｈＡＧ［ｐ５３−ＭＤＭ２］（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−８２０１Ｍ）に含まれるプラスミドベクター  ｐＡｓｈ−ｐ５３を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理することによって、ｐ５３をコードする領域を切り出した。次いで、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ００３９Ｍ）に挿入することによって、ｍＡＧ１をＮ末に融合させたｐ５３（ｍＡＧ１−ｐ５３）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＡＧ１−ｐ５３）を作製した。【００８９】
＜ｐＡＧ−ＭＤＭ２の調製＞
ＡＧをＮ末に融合させたＭＤＭ２（ＡＧ−ＭＤＭ２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＡＧ−ＭＤＭ２）は、前記キットに含まれているものを使用した。【００９０】
＜ｐＡＧ−ｐ５３の調製＞
ｐＡＧ−ＭＤＭ２を制限酵素ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理することによって、ＡＧをコードする領域を切り出した。次いで、同じ制限酵素の組合せにて処理してｐ５３をコードする領域を除いたｐｍＡＧ１−ｐ５３に挿入することによって、ＡＧをＮ末に融合させたｐ５３（ＡＧ−ｐ５３）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＡＧ−ｐ５３）を作製した。【００９１】
＜ｐＭｍｊ−ＭＤＭ２の調製＞
ｐＡＧ−ＭＤＭ２を、制限酵素ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理することによって、ＡＧをコードする領域を切断除去した。また、Ｍｍｊをコードし、その末端にＮｈｅＩ及びＡｇｅＩの認識配列を各々備えたＤＮＡ（ＮｈｅＩ−Ｍｍｊ−ＡｇｅＩ、配列番号：４４）を人工合成により調製した。次いで、そのＤＮＡを同じ制限酵素の組合せにて処理した後、前記ＡＧをコードする領域を除去したプラスミドベクターに挿入することにより、ＭｍｊをＮ末に融合させたＭＤＭ２（Ｍｍｊ−ＭＤＭ２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭｍｊ−ＭＤＭ２）を作製した。【００９２】
＜ｐＭｍｊ−ｐ５３の調製＞
ｐＡＧ−ｐ５３を、制限酵素ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理することによってＡＧをコードする領域を切断除去した後、同じ制限酵素の組合せにて処理した前記ＮｈｅＩ−Ｍｍｊ−ＡｇｅＩを挿入することにより、ＭｍｊをＮ末に融合させたｐ５３（Ｍｍｊ−ｐ５３）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭｍｊ−ｐ５３）を作製した。【００９３】
＜ｐＥＧＦＰ−ｐ５３の調製＞
ｐＡＧ−ｐ５３を、制限酵素ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理することによって、ＡＧをコードする領域を切断除去した。また、ＥＧＦＰをコードし、その末端にＮｈｅＩ及びＡｇｅＩの認識配列を各々備えたＤＮＡ（ＮｈｅＩ−ＥＧＦＰ−ＡｇｅＩ、配列番号：４５）を人工合成により調製した。次いで、そのＤＮＡを同じ制限酵素の組合せにて処理した後、前記ＡＧをコードする領域を除去したプラスミドベクターに挿入することにより、ＥＧＦＰをＮ末に融合させたｐ５３（ＥＧＦＰ−ｐ５３）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ−ｐ５３）を作製した。【００９４】
＜ｐｍＥＧＦＰ−ｐ５３の調製＞
ｐＡＧ−ｐ５３を、制限酵素ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理することによって、ＡＧをコードする領域を切断除去した。また、ｍＥＧＦＰをコードし、その末端にＮｈｅＩ及びＡｇｅＩの認識配列を各々備えたＤＮＡ（ＮｈｅＩ−ｍＥＧＦＰ−ＡｇｅＩ、配列番号：４６）を人工合成により調製した。次いで、そのＤＮＡを同じ制限酵素の組合せにて処理した後、前記ＡＧをコードする領域を除去したプラスミドベクターに挿入することにより、ｍＥＧＦＰをＮ末に融合させたｐ５３（ｍＥＧＦＰ−ｐ５３）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＥＧＦＰ−ｐ５３）を作製した。【００９５】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
上記のとおりにして調製したプラスミドベクターを導入するために、先ず、ＣＯＳ７細胞を培養液［ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）］にて培養した。次に、同細胞を遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。【００９６】
そして、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０μＬに、上記プラスミドベクターを１００ｎｇずつ以下に示す（Ａ）〜（Ｉ）の組み合わせにて混合し、ＤＮＡ溶液を調製した。該ＤＮＡ溶液に遺伝子導入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、製品名：Ｆｕｇｅｎｅ（登録商標）  ＨＤ）を０．８μＬ添加して攪拌し、更に培養液９０μＬと混合した後、前記ＣＯＳ７細胞に添加し、２８時間培養した。
（Ａ）ｐｍＡＧ１−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐｍＥＧＦＰ−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２
（Ｃ）ｐｍＥＧＦＰ−ｐ５３＋ｐＭｍｊ−ＭＤＭ２
（Ｄ）ｐＥＧＦＰ−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２
（Ｅ）ｐＥＧＦＰ−ｐ５３＋ｐＭｍｊ−ＭＤＭ２
（Ｆ）ｐＡＧ−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２
（Ｇ）ｐＭｍｊ−ｐ５３＋ｐＭｍｊ−ＭＤＭ２
（Ｈ）ｐＡＧ−ｐ５３＋ｐＭｍｊ−ＭＤＭ２
（Ｉ）ｐＭｍｊ−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２。【００９７】
＜細胞の観察＞
上記のとおりにして遺伝子導入処理を施したＣＯＳ７細胞は、ＩＸ−８１倒立顕微鏡（オリンパス社製）、Ｕ−ＭＮＩＢＡ３フィルター（オリンパス社製）、ＵＰｌａｎＡｐｏｘ２０（Ｎ．Ａ．＝０．７）（オリンパス社製）及びＯＲＣＡ−Ｆｌａｓｈ４．０デジタルカメラ（浜松ホトニクス製）を用いて観察した（励起波長：４７０〜４９５ｎｍ、蛍光観察波長：５１０〜５５０ｎｍ）。得られた結果を図１Ａ〜１Ｃに示す。また、ｐ５３とＭＤＭ２の相互作用阻害剤  Ｎｕｔｌｉｎ−３を最終濃度２０μＭになるよう培養液に添加し、室温にて１５分間静置した後の細胞も観察した。薬剤の添加前と添加１５分後の画像を図１Ｄに示す。【００９８】
図１Ａに示した結果から明らかなとおり、検出対象（ｐ５３及びＭＤＭ２）の一方に、単量体蛍光タンパク質であるｍＡＧ１又はｍＥＧＦＰを融合させて発現させたＣＯＳ７細胞においては、タンパク質間相互作用を示す蛍光輝点は確認されなかった。また、図には示していないが、検出対象の一方に、２量体蛍光タンパク質であるＥＧＦＰを融合させて発現させたＣＯＳ７細胞においても、タンパク質間相互作用を示す蛍光輝点は確認されなかった。さらに、検出対象の双方に、同一の４量体蛍光タンパク質であるＡＧ又はＭｍｊを融合させて発現させたＣＯＳ７細胞においても、非特許文献１の補足図５のｄにおいて示されている結果同様に、タンパク質間相互作用を示す蛍光輝点は確認されなかった（図１Ｂ参照）。【００９９】
しかしながら、図１Ｃに示した結果から明らかなように、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質を融合させて発現させたＣＯＳ７細胞においては、タンパク質間相互作用を示す明確な蛍光輝点が観察された。一方、図１Ｄに示すとおり、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の阻害剤であるＮｕｔｌｉｎ−３存在下において、これらタンパク質間相互作用を示す蛍光輝点は解消されたことから、当該輝点は前記タンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された。【０１００】
以上のとおり、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質を融合させて細胞内に発現させた場合には、検出対象間のタンパク質間相互作用依存的に、蛍光輝点が形成されることが明らかになった。【０１０１】
（実施例２）  タンパク質間相互作用の検出２
以下に示すとおり、ＣＯＳ７細胞の代わりにＨＥＫ２９３細胞を用いて実施例１と同様の検討を行なった。さらに、４量体タンパク質であるＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ（ＭＲ）を用いてもタンパク質間相互作用を検出できるかを検討した。【０１０２】
＜ｐｍＡＧ１−ＭＤＭ２の調製＞
前記タンパク質間相互作用解析用キットに含まれるプラスミドベクター  ｐｈＡＧ−ＭＤＭ２を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理することによって、ＭＤＭ２をコードする領域を切り出した。次いで、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬに挿入することによって、ｍＡＧ１をＮ末に融合させたＭＤＭ２（ｍＡＧ１−ＭＤＭ２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＡＧ１−ＭＤＭ２）を作製した。【０１０３】
＜ｐＭＲ‐ＭＤＭ２の調製＞
ｐＡＧ−ＭＤＭ２を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理することによって、ＭＤＭ２をコードする領域を切り出した。次いで、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０２Ｍ）に挿入することによって、ＭＲをＮ末に融合させたＭＤＭ２（ＭＲ‐ＭＤＭ２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭＲ‐ＭＤＭ２）を作製した。【０１０４】
＜ｐＭＲ‐ｐ５３の調製＞
ｐＡＧ−ｐ５３を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて処理することによって、ｐ５３をコードする領域を切り出した。次いで、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＣＬに挿入することによって、ＭＲをＮ末に融合させたｐ５３（ＭＲ‐ｐ５３）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭＲ‐ｐ５３）を作製した。【０１０５】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
上記のとおりにして調製したプラスミドベクターを導入するために、先ず、ＨＥＫ２９３細胞を培養液［ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）］にて培養した。次に、同細胞を遺伝子導入前日に８ウェルチャンバースライド（Ｎｕｎｃ社製）に播種し、１ウェルあたり、２００μＬの培養液で培養した。【０１０６】
そして、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０μＬに、上記プラスミドベクターを２００ｎｇずつ以下に示す（Ａ）〜（Ｇ）の組み合わせにて混合し、ＤＮＡ溶液を調製した。該ＤＮＡ溶液に遺伝子導入試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ）を０．８μＬ添加して攪拌し、更に培養液９０μＬと混合した後、前記ＨＥＫ２９３細胞に添加し、４８時間培養した。
（Ａ）ｐＡＧ−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐＡＧ−ｐ５３＋ｐｍＡＧ１−ＭＤＭ２
（Ｃ）ｐＭｍｊ−ｐ５３＋ｐＭｍｊ−ＭＤＭ２
（Ｄ）ｐＭｍｊ−ｐ５３＋ｐｍＡＧ１−ＭＤＭ２
（Ｅ）ｐＭｍｊ−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２
（Ｆ）ｐＭｍｊ−ｐ５３＋ｐＭＲ−ＭＤＭ２
（Ｇ）ｐＭＲ−ｐ５３＋ｐＡＧ−ＭＤＭ２。【０１０７】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞の観察は、上記ＣＯＳ７細胞の場合と同様にして行なった。Ｎｕｔｌｉｎ‐３の添加前と添加１５分後の画像を図２に示す。【０１０８】
図には示していないが、検出対象（ｐ５３及びＭＤＭ２）の双方に同一の４量体蛍光タンパク質（ＡＧ又はＭｍｊ）を融合させて発現させたＨＥＫ２９３細胞、並びに、検出対象の一方に単量体蛍光タンパク質（ｍＡＧ１）を融合させて発現させたＨＥＫ２９３細胞においては、上述のＣＯＳ７細胞の場合同様に、タンパク質間相互作用を示す明確な蛍光輝点は観察されなかった。また、これら細胞にＮｕｔｌｉｎ‐３を添加しても、変化は生じなかった。【０１０９】
一方、図２に示した結果から明らかなように、上述のＣＯＳ７細胞の場合同様に、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質を融合させて発現させたＨＥＫ２９３細胞においては、タンパク質間相互作用を示す明確な蛍光輝点が観察された。また、ｐ５３とＭＤＭ２とのタンパク質間相互作用の阻害剤であるＮｕｔｌｉｎ−３存在下において、これらタンパク質間相互作用を示す蛍光輝点は解消されたことから、当該輝点は前記タンパク質間相互作用に依存して形成されたことが確認された（図２の下部３画像  参照）。【０１１０】
以上の結果から、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質を融合させ、細胞内において発現させた場合には、その細胞の種類を問わず、蛍光輝点の形成の有無を指標として、タンパク質間相互作用を判定できることが明らかになった。【０１１１】
また、実施例１及び２に示した結果から、検出対象に融合させる４量体蛍光タンパク質は異なっていれば、これら蛍光タンパク質の蛍光波長（緑色領域の波長、赤色領域の波長、変換型の蛍光波長）を問わず、検出対象間の相互作用依存的に蛍光輝点が形成されることも判明した。【０１１２】
（実施例３）  ＦＲＥＴ現象を利用したタンパク質間相互作用の判定方法への適用
上述のとおり、本発明のタンパク質間相互作用の判定方法は、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質を融合させ細胞内において発現させることを特徴とする。そこで、一方の４量体蛍光タンパク質をアクセプターとし、他方の４量体蛍光タンパク質をドナーとすることにより、ＦＲＥＴ現象（蛍光共鳴エネルギー移動、再吸収）を生じさせることができるかについて、以下に示すとおり分析した。【０１１３】
＜ｐｐ５３−ＭＲの調製＞
先ずｐ５３の一部（ｐ５３タンパク質の１〜７０アミノ酸からなる領域）をコードするＤＮＡの５’末端及び３’末端にそれぞれＢａｍＨＩ認識配列とＮｏｔＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０２Ｍ）に挿入することにより、ＭＲをＣ末に融合させたｐ５３（ｐ５３−ＭＲ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｐ５３−ＭＲ）を作製した。【０１１４】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
上記実施例２に記載の方法によって、以下に示す（Ａ）〜（Ｂ）の組み合わせにてプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ｐｐ５３‐ＭＲ＋ｐＡＧ‐ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐＭＲ−ｐ５３＋ｐＡＧ‐ＭＤＭ２。【０１１５】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞のＦＲＥＴ現象の検出において、ＩＸ−８１倒立顕微鏡（オリンパス社製）、励起フィルター４４０ＡＦ２１（Ｏｍｅｇａ社製、型番：ＸＦ１０７１）、ダイクロイックミラー４５５ＤＲＬＰ（Ｏｍｅｇａ社製、型番：ＸＦ２０３４）、並びに蛍光フィルター５１０ＷＢ４０（Ｏｍｅｇａ社製、型番：ＸＦ３０４３）及び６１０ＡＬＰ（Ｏｍｅｇａ社製、型番：ＸＦ３０９４）を使用した。また、ＵＰｌａｎＦＬＮ  ４０ｘＯｉｌ（Ｎ．Ａ．＝１．３）（オリンパス社製）、ＯＲＣＡ‐Ｆｌａｓｈ４．０デジタルカメラ（浜松ホトニクス社製）も用いて、前記ＨＥＫ２９３細胞を観察した。【０１１６】
＜ＦＲＥＴ現象の検出＞
４４０ＡＦ２１を用いて励起させ、ドナー側（ＡＧ）の蛍光を５１０ＷＢ４０（Ｅｍ：５１０）によって、アクセプター側（ＭＲ）の蛍光を６１０ＡＬＰ（Ｅｍ：６１０）によって検出した。また、ｐ５３とＭＤＭ２の相互作用阻害剤としてＮｕｔｌｉｎ‐３を最終濃度２０μＭになるよう、ＨＥＫ２９３細胞の培養液に添加し、当該薬剤添加の前後において、１０秒間隔にて画像データを取得した。また、得られた画像データは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｖｅｒ８．９．０（モレキュラーデバイス社製）で解析し、細胞エリア全体のＭＲ（Ｅｍ：６１０）、ＡＧ（Ｅｍ：５１０）の各蛍光強度を算出した。さらに、ドナー側（ＡＧ）の蛍光強度に対するアクセプター側の蛍光強度の比率（ＭＲ／ＡＧ比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０））を、ＦＲＥＴ現象のシグナルとして算出し、Ｒａｔｉｏ画像を取得した。Ｎｕｔｌｉｎ‐３添加前と添加１５分後のＡＧとＭＲの蛍光画像、及びＭＲ／ＡＧのＲａｔｉｏ画像を、図３Ａ及びＣに示す。さらに、各蛍光強度の時間経過グラフを、図３Ｂ及びＤに示す。【０１１７】
また、遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞におけるＦＲＥＴ現象の効率を、アクセプターフォトブリーチング法（ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｐｈｏｔｏ−ｂｌｅａｃｈｉｎｇ法）によって測定した。より具体的には、前記薬剤添加前の細胞に、蛍光ミラーユニットＵ−ＭＷＩＧ３（オリンパス社製）を用いて５３０〜５５０ｎｍの励起光を５分間照射することによって、ＭＲを褪色（ｂｌｅａｃｈ、ブリーチ）させ、蛍光ミラーユニットＵ−ＭＮＩＢＡ３（励起波長：４７０〜４９５ｎｍ、蛍光波長：５１０〜５５０ｎｍ、オリンパス社製）を用いてＡＧの蛍光強度の変化を観察することにより、ＦＲＥＴ現象の効率を得た。なお、５３０〜５５０ｎｍ励起光照射前（Ｐｒｅ−ｂｌｅａｃｈ、褪色前）後（Ｐｏｓｔ−ｂｌｅａｃｈ、褪色後）のＡＧ蛍光強度画像、及びＦＲＥＴ現象の効率は、下記計算式を用いて求めた。
（（Ｄｏｎｏｒｐｏｓｔ−Ｂａｃｋｐｏｓｔ）−（Ｄｏｎｏｒｐｒｅ−Ｂａｃｋｐｒｅ））／（Ｄｏｎｏｒｐｏｓｔ−Ｂａｃｋｐｏｓｔ）
Ｄｏｎｏｒｐｏｓｔは褪色後のＡＧの蛍光強度、Ｂａｃｋｐｏｓｔは褪色後のバックグラウンドの蛍光強度、Ｄｏｎｏｒｐｒｅは褪色前のＡＧの蛍光強度、Ｂａｃｋｐｒｅは褪色前のバックグラウンドの蛍光強度を表す。このようにして得られた結果を、図３Ｅに示す。【０１１８】
図３Ａ〜３Ｄに示した結果から明らかなように、ｐ５３−ＭＲ又はＭＲ−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とを発現する細胞において、ＭＲ／ＡＧ比は蛍光輝点を中心に高く、Ｎｕｔｌｉｎ‐３添加後は細胞全体に拡散しながら低下した。Ｎｕｔｌｉｎ−３添加後の各蛍光強度の変化として、ＭＲ（Ｅｍ：６１０）は低下し、ＡＧ（Ｅｍ：５１０）は上昇した。これは、タンパク質間相互作用の阻害剤（Ｎｕｔｌｉｎ−３）の添加により、ドナー側の蛍光強度が増加し、アクセプター側の蛍光強度が減少したこと、すなわちＦＲＥＴ現象のシグナルが低下したことを示している。【０１１９】
また、図３Ｅに示すとおり、ｐ５３−ＭＲとＡＧ−ＭＤＭ２を発現する細胞において、褪色後（５３０〜５５０ｎｍ励起光照射後）は、蛍光輝点におけるＭＲの蛍光強度が平均２８％にまで低下した（Ｎ＝７）。一方、ＡＧの蛍光強度は平均１２８％に上昇した。また、各蛍光強度から２２．１％のＦＲＥＴ現象の効率が算出された。【０１２０】
このように、アクセプター側（ＭＲ）を褪色させたことによって、ＡＧの蛍光強度が上昇することが明らかとなった。さらに、２２．１％のＦＲＥＴ現象の効率が認められたことから、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質（ＭＲ及びＡＧ）を融合させ発現させることにより、蛍光輝点が形成された場合において、ＦＲＥＴ現象が生じ得ることが明らかになった。【０１２１】
（実施例４）  ＦＲＥＴ現象の効率の比較
検出対象に蛍光タンパク質を融合させて細胞内に発現させた場合において、検出対象間の相互作用依存的な蛍光輝点の形成を介することにより、発生するＦＲＥＴ現象の効率が向上するかについて検証した。より具体的には、以下に示すとおり、検出対象がタンパク質間相互作用した場合に、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせ（ＡＧ及びＭＲ）を用いた場合と、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ｍＡＧ１及びＭＲ）を用いた場合とにおいて、得られるＦＲＥＴ現象の効率を比較した。【０１２２】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
上記実施例２に記載の方法によって、以下に示す（Ａ）〜（Ｄ）の組み合わせにてプラスミドベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入した。
（Ａ）ｐｐ５３‐ＭＲ＋ｐＡＧ‐ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐｐ５３‐ＭＲ＋ｐｍＡＧ１‐ＭＤＭ２
（Ｃ）ｐＭＲ−ｐ５３＋ｐＡＧ‐ＭＤＭ２
（Ｄ）ｐＭＲ−ｐ５３＋ｐｍＡＧ１‐ＭＤＭ２。【０１２３】
＜細胞の観察とＦＲＥＴ現象の検出＞
上記実施例３に記載の方法によって、遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞の観察及びＦＲＥＴ現象の検出を行った。Ｎｕｔｌｉｎ‐３添加前と添加１５分後のＡＧとＭＲの蛍光画像及びＭＲ／ＡＧのＲａｔｉｏ画像を、図４Ａ、４Ｃ、４Ｅ及び４Ｇに示す。さらに、各蛍光強度の時間経過グラフを、図４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ及び４Ｈに示す。また、Ｎｕｔｌｉｎ‐３添加によるＭＲ／ＡＧ比、ＭＲ／ｍＡＧ１比、ｍＡＧ１／ＡＧ比の時間経過グラフを、図４Ｉ及び４Ｊに示す。ＦＲＥＴ現象のシグナル（ＭＲ／ＡＧ比とＭＲ／ｍＡＧ１比）を比較した結果を、図４Ｋに示す。なお、図４Ｂ、４Ｄ、４Ｆ及び４Ｈにて、ｐ５３‐ＭＲ及びＡＧ‐ＭＤＭ２とｐ５３‐ＭＲ及びｍＡＧ１‐ＭＤＭ２とにおいては１１個の各細胞におけるＭＲ／ＡＧ比とＭＲ／ｍＡＧ１比の各平均値をプロットし、ＭＲ−ｐ５３及びＡＧ‐ＭＤＭ２とＭＲ−ｐ５３及びｍＡＧ１‐ＭＤＭ２とにおいては８個の各細胞におけるＭＲ／ＡＧ比とＭＲ／ｍＡＧ１比の各平均値をプロットした。また、エラーバーは標準誤差を表している。【０１２４】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｅ及び４Ｆに示すとおり、図３Ａ〜３Ｄに示した結果同様に、ｐ５３−ＭＲ又はＭＲ−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とを発現する細胞において、ＭＲ／ＡＧ比は蛍光輝点を中心に高く、Ｎｕｔｌｉｎ‐３添加後は細胞全体に拡散しながら低下した。Ｎｕｔｌｉｎ−３添加後の各蛍光強度の変化としては、ＭＲ（Ｅｍ：６１０）は低下し、ＡＧ（Ｅｍ：５１０）は上昇し、タンパク質間相互作用の阻害によるＦＲＥＴ現象のシグナルの低下が認められた。【０１２５】
また、図４Ｃ、４Ｄ、４Ｇ及び４Ｈに示すとおり、ｐ５３−ＭＲ又はＭＲ−ｐ５３とｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現する細胞においても、ＭＲ／ｍＡＧ１比はＮｕｔｌｉｎ−３添加前に比して添加後は細胞全体で低下した。各蛍光強度の変化としては、ＭＲ（Ｅｍ：６１０）は低下し、ＡＧ（Ｅｍ：５１０）は上昇し、タンパク質間相互作用の阻害によるＦＲＥＴ現象のシグナルの低下が認められた。このように、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ｍＡＧ１及びＭＲ）を用いた場合においても、ＦＲＥＴ現象の検出によってタンパク質間相互作用を検出できることが確認された。【０１２６】
しかしながら、図４Ｉに示した結果から明らかなように、ｐ５３−ＭＲ及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させた細胞におけるＭＲ／ＡＧ比と、ｐ５３−ＭＲ及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させた細胞におけるＭＲ／ｍＡＧ１比とを比較した結果、Ｎｕｔｌｉｎ−３添加後０秒から６００秒の間では、６００秒時点での差が最も高く、ＭＲ／ＡＧ比のほうが阻害剤添加後に１．２倍低下した。【０１２７】
また、図４Ｊに示すとおり、ＭＲ−ｐ５３及びＡＧ−ＭＤＭ２を発現させた細胞におけるＭＲ／ＡＧ比と、ＭＲ−ｐ５３及びｍＡＧ１−ＭＤＭ２を発現させた細胞におけるＭＲ／ｍＡＧ１比とを比較した結果、Ｎｕｔｌｉｎ−３添加後０秒から６００秒の間では、１６０秒時点での差が最も高く、ＭＲ／ＡＧ比のほうが１．５２倍低下した。また、添加後６００秒時点では１．４倍低下した。【０１２８】
さらに、図４Ｋ及び４Ｌに示すとおり、阻害剤添加後６００秒の時点（ＦＲＥＴ現象が生じていない場合）の各比率を１として、阻害剤添加前（ＦＲＥＴ現象が生じている場合）のＭＲ／ＡＧ比及びＭＲ／ｍＡＧ１比を各々算出した結果、ＭＲ／ＡＧ比がＭＲ／ｍＡＧ１比と比して１．２〜１．４倍高くなることが明らかになった。【０１２９】
以上のとおり、検出対象がタンパク質間相互作用した場合に、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせの方が、蛍光輝点を形成できない蛍光タンパク質の組み合わせよりも、ＦＲＥＴ現象の効率が高くなること（１．２〜１．５２倍に向上すること）が明らかになった。このようにＦＲＥＴ現象の効率が向上する理由は必ずしも定かではないが、異なる４量体蛍光タンパク質を用いることによって形成された会合体（蛍光輝点）において、これら蛍光タンパク質の凝集密度が上昇したことによるものと推察される。【０１３０】
（実施例５）  固定後の細胞におけるＦＲＥＴ現象の効率の比較
上記実施例３及び４において示したとおり、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質を融合させ、細胞内において発現させることによって、蛍光輝点が形成された場合において、ＦＲＥＴ現象が生じ得ることが明らかになった。【０１３１】
次に、前記細胞を固定化しても、検出対象間の相互作用を示す蛍光輝点が生じたまま、維持され、さらにＦＲＥＴ現象も検出できるかについて、以下に示すとおり検証した。また、検出対象が相互作用した場合に、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせ（ＡＧ及びＭＲ）を用いた場合のみならず、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ｍＡＧ１及びＭＲ）を用いた場合についても検証した。【０１３２】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
上記実施例２に記載の方法によって、以下に示す（Ａ）〜（Ｄ）の組み合わせにてプラスミドベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞を、各２ウェルずつ調製した。
（Ａ）ｐｐ５３‐ＭＲ＋ｐＡＧ‐ＭＤＭ２
（Ｂ）ｐｐ５３‐ＭＲ＋ｐｍＡＧ１‐ＭＤＭ２
（Ｃ）ｐＭＲ−ｐ５３＋ｐＡＧ‐ＭＤＭ２
（Ｄ）ｐＭＲ−ｐ５３＋ｐｍＡＧ１‐ＭＤＭ２。【０１３３】
＜細胞の固定＞
遺伝子導入処理を施してから４８時間培養した後、（Ａ）〜（Ｄ）各２ウェルのうち１ウェルから培養液全量を除き、４％パラホルムアルデヒドを２００μＬ添加した。室温で１５分静置した後、パラホルムアルデヒド全量を除き、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳを２００μＬ添加した。一方、残りの各１ウェルには、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用の阻害剤としてＮｕｔｌｉｎ‐３を最終濃度２０μＭとなるように添加した。その１５分後、培養液全量を除き、４％パラホルムアルデヒドを２００μＬ添加した。室温で１５分静置した後、パラホルムアルデヒド全量を除き、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳを２００μＬ添加した。【０１３４】
＜細胞の観察及びＦＲＥＴ現象の検出＞
遺伝子導入及び固定処理を施したＨＥＫ２９３細胞は、実施例３に記載の方法にて観察し、またＦＲＥＴ現象を検出した。Ｎｕｔｌｉｎ‐３添加又は非添加において得られたＡＧとＭＲの蛍光画像、及びＭＲ／ＡＧのＲａｔｉｏ画像を図５Ａ及び５Ｂに示す。各ＦＲＥＴ現象のシグナル（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０、ＭＲ／ＡＧ比、ＭＲ／ｍＡＧ１比）のグラフを図５Ｃに示す。なお、図５Ｃにおいて示すデータは、それぞれ視野全体における蛍光強度比の３視野の平均値であり、エラーバーは標準誤差を表している。【０１３５】
図５Ａの（Ａ）及び図５Ｂの（Ｃ）において示すとおり、ｐ５３−ＭＲ又はＭＲ−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とを発現する細胞において、ＭＲ／ＡＧ比は蛍光輝点を中心に高くなった。一方、Ｎｕｔｌｉｎ‐３を添加した細胞においては低下しており、細胞を固定化した場合においても、図４Ａ及びＣと同様の結果が得られた。【０１３６】
一方、図５Ａの（Ｂ）及び図５の（Ｄ）においては、図４Ｃ、４Ｄ、４Ｇ及び４Ｈに示した結果とは異なり、ｐ５３−ＭＲ又はＭＲ−ｐ５３とｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現する細胞においては、当該細胞を固定化することによって、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加・非添加において、ＭＲ／ｍＡＧ１比に大きな差は生じられなくなった。【０１３７】
また、図５Ｃに示した結果から明らかなように、ｐ５３−ＭＲ又はＭＲ−ｐ５３とＡＧ−ＭＤＭ２とを発現する細胞において、Ｎｕｔｌｉｎ−３を添加した場合と比較して、Ｎｕｔｌｉｎ−３を添加していない場合におけるＦＲＥＴ現象のシグナルは高値にて検出された。【０１３８】
一方、ｐ５３−ＭＲ又はＭＲ−ｐ５３とｍＡＧ１−ＭＤＭ２とを発現する細胞においては、Ｎｕｔｌｉｎ−３の添加有無によるＦＲＥＴ現象のシグナルの差は認められなかった。【０１３９】
以上のとおり、検出対象がタンパク質間相互作用した際に蛍光輝点を形成できない蛍光タンパク質の組み合わせを用いた場合には、細胞を固定化するとＦＲＥＴ現象を検出することができなくなる。その一方で、検出対象が相互作用した際に蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせを用いた場合には、固定化した細胞においてもＦＲＥＴ現象が維持され、検出できることが明らかになった。【０１４０】
（実施例６）  タンパク質間相互作用の検出３
上記実施例３における検出対象を、ｐ５３及びＭＤＭ２から、ＭＡＸ及びＭｙｃに変更して、これらタンパク質間の相互作用も検出できるか検証した。【０１４１】
＜ｐＭＲ−Ｍｙｃの調製＞
先ず、ｃ−ＭｙｃのＮ末端（ｃ−Ｍｙｃタンパク質の３８３〜４５４アミノ酸からなる領域）をコードするＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩ認識配列、３’末端に停止コドンＴＡＡ及びＮｏｔＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：４７）を設計した。【０１４２】
そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０２Ｍ）に挿入することにより、ＭＲをＮ末に融合させたＭｙｃ（ＭＲ−Ｍｙｃ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭＲ−Ｍｙｃ）を作製した。【０１４３】
＜ｐＡＧ−Ｍａｘの調製＞
先ず、Ｍａｘの全長から、核移行シグナル（Ｍａｘタンパク質の１５３と１５４番のアミノ酸）及びＤＮＡ結合領域（Ｍａｘタンパク質の１〜３５アミノ酸からなる領域）を外したアミノ酸領域のＮ末端に４アミノ酸配列（配列番号：４８）を挿入し、得られたアミノ酸配列をコードするＤＮＡの５’末端にＢａｍＨＩ認識配列、３’末端に停止コドンＴＡＡ及びＸｈｏＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：４９）を設計した。【０１４４】
そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈＡＧ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０１Ｍ）に挿入することにより、ＡＧをＮ末に融合させたＭａｘ（ＡＧ−Ｍａｘ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＡＧ−Ｍａｘ）を作製した。【０１４５】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
上記のとおりにして調製したプラスミドベクターを導入するために、先ず上記実施例２に記載の方法によって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。そして、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１０μＬに、上記プラスミドベクター（ｐＭＲ−ＭｙｃとｐＡＧ−Ｍａｘ）を２００ｎｇずつ混合し、ＤＮＡ溶液を調製した。また、別にＯｐｔｉＭＥＭ  １０μＬに遺伝子導入試薬Ｔｒａｎｓｆｉｃｉｅｎｔ（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を０．２μＬ添加して攪拌し、Ｔｒａｎｓｆｉｃｉｅｎｔ溶液を調製した。そして、前記ＤＮＡ溶液１０μＬと混合し、２０分室温で反応させ、前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に添加し、すぐに３００Ｇで遠心し、上清を実施例２に記載の培地に交換し、４８時間培養した。【０１４６】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の観察は、Ｉｎｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２２００（ＧＥ社製）を用いて行ない、同じ視野のＡＧ由来の緑色蛍光及びＭＲ由来の赤色蛍光を検出した。得られた結果を図６Ａに示す。また、蛍光顕微鏡ＥＣＬＩＰＳ  ＴＳ１００（ＮＩＫＯＮ社製）を用いても、前記細胞の観察を行なった。得られた結果を図６Ｂに示す。【０１４７】
図６Ａに示した結果から明らかなように、ＭＡＸのＮ末にＡＧを融合させてなるタンパク質（ＡＧ−ＭＡＸ）及びＭｙｃのＮ末にＭＲを融合させてなるタンパク質（ＭＲ−Ｍｙｃ）を、細胞内に発現させた場合においても、蛍光輝点が検出された。すなわち、検出対象に異なる４量体蛍光タンパク質を融合させて発現させた場合には、その検出対象の種類によらず、蛍光輝点を指標としてタンパク質間相互作用の有無を判定できることが確認できた。【０１４８】
また、ＡＧ−ＭＡＸ及びＭＲ−Ｍｙｃを発現させた細胞の顕微鏡像において、その一部の領域におけるＭＲの蛍光を褪色させた結果、図６Ｂに示すとおり、アクセプター側（ＭＲ）を褪色させたことによって、ＡＧの蛍光強度の上昇が認められた。すなわち、ＦＲＥＴ現象が生じていることが確認された。【０１４９】
（実施例７）  タンパク質間相互作用の検出４
上記実施例３における検出対象を、ｐ５３とＭＤＭ２から他のタンパク質に変更して、これらタンパク質間の相互作用を検出した。より具体的には、以下に示す方法にて、ｐ５３及びＭＤＭ２以外のタンパク質間相互作用でも蛍光輝点が形成されること、及び該蛍光輝点形成によってＦＲＥＴ現象の効率の上昇が起こることを確認した。さらに、当該タンパク質間相互作用について、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせ（ＡＧ及びＭＲ）を用いて検出した場合と、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ｍＡＧ１及びＭＲ）を用いて検出した場合とを比較した。【０１５０】
なお、本実施例７において、対象としたタンパク質間相互作用は、ＭＣＬ１とＢＡＸ又はＢＡＫとの相互作用との相互作用である。ＢＡＸ及びＢＡＫは共にＢＨ３ドメインを介して、ＭＣＬ１と相互作用することが明らかになっている（Ｋｕ  Ｂら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２００９年４月、２１巻４号、６２７〜６４１ページ  参照）。また、Ａ−１２１０４７７（ＢＨ３模倣薬）はＭＣＬ１のＢＨ３結合溝に結合し、ＢＨ３との相互作用を阻害する化合物として知られている（Ｘｉａｏ  Ｙら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、２０１５年８月、１４巻８号、１８３７〜１８４７ページ  参照）。【０１５１】
＜ｐＡＧ−ＭＣＬ１の調製＞
先ず、ＭＣＬ１の一部（ＭＣＬ１タンパク質の１７３〜３２７アミノ酸からなる領域）をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端にそれぞれＢａｍＨＩ認識配列、ストップコドンとＮｏｔＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５０）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈＡＧ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０１Ｍ）に挿入することにより、ＡＧをＮ末に融合させたＭＣＬ１（ＡＧ−ＭＣＬ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＡＧ−ＭＣＬ１）を作製した。【０１５２】
＜ｐｍＡＧ１−ＭＣＬ１の調製＞
ＢａｍＨＩ認識配列及びＮｏｔＩ認識配列を付加したＭＣＬ１の一部を含むヌクレオチド配列を、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ００３９Ｍ）に挿入することにより、ｍＡＧ１をＮ末に融合させたＭＣＬ１（ｍＡＧ１−ＭＣＬ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＡＧ１−ＭＣＬ１）を作製した。【０１５３】
＜ｐＭＲ−ＢＡＫの調製＞
先ず、ＢＡＫの一部（ＢＡＫタンパク質の７２〜８７アミノ酸からなる領域）をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端にそれぞれＢａｍＨＩ認識配列、ストップコドンとＮｏｔＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５１）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０２Ｍ）に挿入することにより、ＭＲをＮ末に融合させたＢＡＫ（ＭＲ−ＢＡＫ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭＲ−ＢＡＫ）を作製した。【０１５４】
＜ｐＭＲ−ＢＡＸの作製＞
先ず、ＢＡＸの一部（ＢＡＸタンパク質の３５〜５５アミノ酸からなる領域）をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端にそれぞれＢａｍＨＩ認識配列、ストップコドンとＮｏｔＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５２）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０２Ｍ）に挿入することにより、ＭＲをＮ末に融合させたＢＡＸ（ＭＲ−ＢＡＸ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭＲ−ＢＡＸ）を作製した。【０１５５】
＜細胞培養、遺伝子導入及び細胞の観察＞
上述の実施例２に記載の方法にて、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、当該細胞に、上記にて調製したプラスミドベクターを、２００ｎｇずつ以下に示す（Ａ）〜（Ｄ）の組み合わせにて導入した。
（Ａ）ｐＭＲ−ＢＡＫ＋ｐＡＧ−ＭＣＬ１
（Ｂ）ｐＭＲ−ＢＡＫ＋ｐｍＡＧ１−ＭＣＬ１
（Ｃ）ｐＭＲ−ＢＡＸ＋ｐＡＧ−ＭＣＬ１
（Ｄ）ｐＭＲ−ＢＡＸ＋ｐｍＡＧ１−ＭＣＬ１
そして、観察前に各ウェルから培養液全量を除き、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳを２００μＬ添加し、実施例１の＜細胞の観察＞に記載の方法にて、遺伝子導入処理を施したＨＥＫ２９３細胞を観察した。【０１５６】
＜ＦＲＥＴ現象の検出＞
ＦＲＥＴ現象の検出は、Ｎｕｔｌｉｎ‐３の代わりに、ＭＣＬ１とＢＡＫとの、又はＭＣＬ１とＢＡＸとの相互作用阻害剤として、Ａ−１２１０４７７を最終濃度２５μＭになるよう、ＨＥＫ２９３細胞の培養液に添加した以外は、実施例３に記載の方法にて行なった。【０１５７】
得られた結果について、ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１を発現させた細胞に関し、薬剤添加前と添加５分後のＲａｔｉｏ画像を図７Ａに示し、各蛍光強度の時間経過グラフ及びＭＲ／ＡＧ比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過グラフを図７Ｂに示す。ＭＲ−ＢＡＫ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１を発現させた細胞に関し、薬剤添加前と添加５分後のＲａｔｉｏ画像を図７Ｃに示し、各蛍光強度の時間経過グラフ及びＭＲ／ＡＧ比の時間経過グラフを図７Ｄに示す。また、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせ（ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１）を用いてＦＲＥＴ現象を検出した場合と、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ＭＲ−ＢＡＫ及びｍＡＧ１−ＭＣＬ１）を用いて検出した場合とを比較した結果を、図７Ｅに示す。また前記ＢＡＫ及びＭＣＬ１同様に、ＢＡＸ及びＭＣＬ１に関し、得られた結果を図７Ｆ〜７Ｊに示す。【０１５８】
図７Ａ、７Ｂ、７Ｆ及び７Ｇに示すとおり、ＭＲ−ＢＡＫ又はＭＲ−ＢＡＸとＡＧ−ＭＣＬ１とを発現する細胞のＭＲ／ＡＧ比は、蛍光輝点を中心に高く、Ａ−１２１０４７７添加後は細胞全体に拡散しながら低下した。Ａ−１２１０４７７添加後の各蛍光強度の変化としては、ＭＲ（Ｅｍ：６１０）は低下し、ＡＧ（Ｅｍ：５１０）は上昇した。このことは、当該タンパク質間相互作用阻害剤の添加によって、ＦＲＥＴ現象のシグナルが低下したことを示している。【０１５９】
一方、ＭＲ−ＢＡＫ又はＭＲ−ＢＡＸとｍＡＧ１−ＭＣＬ１とを発現する細胞に関しても、図７Ｃ、７Ｄ、７Ｈ及び７Ｉに示すとおり、前記同様の傾向は見られたが、Ａ−１２１０４７７添加有無によるＦＲＥＴ現象のシグナルの顕著な差は認められなかった。実際、前記ＭＲ／ＡＧ比とＲ／ｍＡＧ１比とを比較した結果、図７Ｅ及び７Ｊに示すとおり、Ａ−１２１０４７７添加後０秒から６００秒の間では、６００秒時点での差が最も高く、ＭＲ／ＡＧ比のほうが阻害剤添加後顕著に低下した（ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１の場合は４倍低下し、ＭＲ−ＢＡＸ及びＡＧ−ＭＣＬ１の場合は２．８倍低下した）。すなわち、ＭＲ／ＡＧの組み合わせの方が、ＦＲＥＴによるエネルギー移動効率が高いことを示しており、４量体蛍光タンパク質を用いて凝集密度を上昇させることで、ＦＲＥＴ現象の効率が向上することを示唆している。【０１６０】
（実施例８）  タンパク質間相互作用の検出５
上記実施例７同様に、以下に示す方法にて、ｐ５３及びＭＤＭ２以外の、薬剤によって誘導されるタンパク質間相互作用でも蛍光輝点が形成されること、及び該蛍光輝点形成によってＦＲＥＴ現象の効率の上昇が起こることを確認した。さらに、当該タンパク質間相互作用について、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせ（ＡＧ及びＭＲ）を用いて検出した場合と、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ｍＡＧ１及びＭＲ）を用いて検出した場合とを比較した。【０１６１】
なお、本実施例８において、対象としたタンパク質間相互作用は、ｍＴＯＲタンパク質のＦＲＢドメインとＦＫＢＰ１２タンパク質との相互作用であり、これらは、ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の存在下において相互作用することが知られている（Ｃｈｅｎ  Ｊら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．、１９９５年５月２３日、９２巻１１号、４９４７〜４９５１ページ  参照）。【０１６２】
＜ｐＡＧ−ＦＫＢＰ１２の調製＞
Ｆｌｕｏｐｐｉ：Ａｓｈ−ｈＡＧ［ｍＴＯＲ−ＦＫＢＰ１２］（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−８２０２Ｍ）に含まれるプラスミドベクター  ｐＡｓｈ−ＦＫＢＰ１２を、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩで処理し、当該プラスミドベクターからＡｓｈペプチドをコードする領域を除去した。また、ｐｈＡＧ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０１Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＡＧタンパク質をコードする領域を切り出した。そして、当該領域を前記プラスミドベクターに挿入することにより、ＡＧをＮ末に融合させたＦＫＢＰ１２（ＡＧ−ＦＫＢＰ１２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＡＧ−ＦＫＢＰ１２）を作製した。【０１６３】
＜ｐｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２の調製＞
ｐＡＧ−ＦＫＢＰ１２を、ＮｈｅＩ及びＡｇｅＩで処理し、当該プラスミドベクターからＡＧをコードする領域を除去した。また、ｐｈｍＡＧ１−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ００３９Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｍＡＧ１をコードする領域を切り出した。そして、当該領域を前記プラスミドベクターに挿入することにより、ｍＡＧ１をＮ末に融合させたＦＫＢＰ１２（ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）を作製した。【０１６４】
＜ｐＭＲ−ｍＴＯＲの調製＞
先ず、ｍＴＯＲの一部（ｍＴＯＲタンパク質の２０２５〜２１１４アミノ酸からなる領域）をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端にそれぞれＥｃｏＲＩ認識配列とＸｈｏＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５３）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０２Ｍ）に挿入することにより、ＭＲをＮ末に融合させたｍＴＯＲの一部（ＭＲ−ｍＴＯＲ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭＲ−ｍＴＯＲ）を作製した。【０１６５】
＜細胞培養、遺伝子導入、細胞の観察及びＦＲＥＴ現象の検出＞
上述の実施例７同様に、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、当該細胞に、上記にて調製したプラスミドベクターを、２００ｎｇずつ以下に示す（Ｅ）及び（Ｆ）の組み合わせにて導入した。
（Ｅ）ｐＭＲ−ｍＴＯＲ＋ｐＡＧ−ＦＫＢＰ１２
（Ｆ）ｐＭＲ−ｍＴＯＲ＋ｐｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２
また、Ａ−１２１０４７７の代わりに、ｍＴＯＲ及びＦＫＢＰ１２の相互作用に必要なＲａｐａｍｙｃｉｎを最終濃度１μＭになるよう、ＨＥＫ２９３細胞の培養液に添加した以外は、実施例７同様に、細胞の観察及びＦＲＥＴ現象の検出を行った。【０１６６】
得られた結果について、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞に関し、薬剤添加前と添加５分後のＲａｔｉｏ画像を図８Ａに示し、各蛍光強度の時間経過グラフ及びＭＲ／ＡＧ比（Ｅｍ：６１０／Ｅｍ：５１０）の時間経過グラフを図８Ｂに示す。ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現させた細胞に関し、薬剤添加前と添加５分後のＲａｔｉｏ画像を図８Ｃに示し、各蛍光強度の時間経過グラフ及びＭＲ／ＡＧ比の時間経過グラフを図８Ｄに示す。また、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせ（ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２）を用いてＦＲＥＴ現象を検出した場合と、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２）を用いて検出した場合とを比較した結果を、図８Ｅに示す。【０１６７】
図８Ａ及び８Ｂに示すとおり、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２を発現する細胞のＭＲ／ＡＧ比は、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後に形成された蛍光輝点を中心に上昇した。各蛍光強度の変化としては、ＭＲ（Ｅｍ：６１０）は上昇し、ＡＧ（Ｅｍ：５１０）は低下した。このことは、当該タンパク質間相互作用誘導剤の添加によって、ＦＲＥＴ現象のシグナルが上昇したことを示している。【０１６８】
一方、ＭＲ−ｍＴＯＲ及びｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２を発現する細胞に関しては、図８Ｃ及び８Ｄに示すとおり、ＭＲ／ｍＡＧ１比は、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後、細胞全体で上昇した。各蛍光強度の変化としては、前記ＭＲ−ｍＴＯＲ及びＡＧ−ＦＫＢＰ１２同様に、ＦＲＥＴ現象シグナルの上昇が認められた。しかしながら、タンパク質間相互作用誘導剤添加の有無によるシグナルの顕著な差は認められなかった。実際、前記ＭＲ／ＡＧ比とＲ／ｍＡＧ１比とを比較した結果、図８Ｅに示すとおり、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加後０秒から４３０秒の間では、３２０秒時点での差が最も高く、ＭＲ／ＡＧ比のほうが誘導剤添加後に２．７倍増加した。すなわち、上述の実施例７の結果同様に、ＭＲ／ＡＧの組み合わせの方が、ＦＲＥＴによるエネルギー移動効率が高いことを示しており、４量体蛍光タンパク質を用いて凝集密度を上昇させることで蛍光輝点が形成され、蛍光輝点を介することにより、ＦＲＥＴ現象の効率が向上することを示唆している。【０１６９】
以上、実施例７及び８に示した結果から、実施例６に示した結果同様に、本願発明によれば対象を問わず、蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象の検出を通して、タンパク質間相互作用を検出できることが確認された。また、実施例４に示した結果同様に、検出対象がタンパク質間相互作用した場合に、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせの方が、蛍光輝点を形成できない蛍光タンパク質の組み合わせよりも、ＦＲＥＴ現象の効率が高くなること（２．７〜４倍に向上すること）が確認された。【０１７０】
（実施例９）  プレートリーダーを用いたＦＲＥＴ現象の検出
本発明において蛍光顕微鏡で検出された蛍光輝点の形成を介したＦＲＥＴ現象を、プレートリーダーでも検出できることを、以下に示す方法にて確認した。また、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせ（ＡＧ及びＭＲ）を用いて検出した場合と、蛍光輝点を形成しない蛍光タンパク質の組み合わせ（ｍＡＧ１及びＭＲ）を用いて検出した場合とを比較することで、ＦＲＥＴ現象の効率上昇における、蛍光輝点形成による効果についても確認した。さらに、固定化した細胞においてもＦＲＥＴ現象が維持され、検出できることも、本実施例において確認した。【０１７１】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
（Ａ）ＭＲ−ＢＡＫ＋ＡＧ−ＭＣＬ１
（Ｂ）ＭＲ−ＢＡＫ＋ｍＡＧ１−ＭＣＬ１
（Ｃ）ＭＲ−ｍＴＯＲ＋ＡＧ−ＦＫＢＰ１２
（Ｄ）ＭＲ−ｍＴＯＲ＋ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２
上記（Ａ）〜（Ｄ）に記載のタンパク質の組み合わせを、細胞にて各々発現させるために、以下に示す方法にて、上記にて調製したプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に導入した。【０１７２】
先ずＨＥＫ２９３細胞を、培養液［ＤＭＥＭ  Ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）、１０％ＦＢＳ（ＥＱＵＩＴＥＣＨ社製）、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）］にて培養した。次に、同細胞を遺伝子導入前日に６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製，＃１４０６７５）に播種し、１ウェルあたり３ｍＬの培養液で培養した。そして、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）３００μＬに各プラスミド３μｇずつを混合したＤＮＡ溶液を希釈し、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を２０μＬ添加した後、攪拌した。２５℃で１０分静置した後、培養細胞に添加し、２４時間培養した。また、バックグラウンド算出用に、遺伝子導入していない細胞を同様に培養した。細胞をトリプシン処理で回収し、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製，＃１３７１０１）２４ウェルに継代した。そして、１ウェルあたり１００μＬの培養液で２４時間培養した。【０１７３】
＜相互作用調整剤（阻害剤又は誘導剤）の添加＞
各ウェルから培養液全量を除き、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳに置換した。ＭＣＬ１及びＢＡＫ間相互作用の阻害剤であるＡ−１２１０４７７を、最終濃度１６．６７μＭを最大濃度とし、３倍希釈系列で８点調整した後、各濃度の阻害剤希釈液を３ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分静置した。【０１７４】
ｍＴＯＲ及びＦＫＢＰ１２間相互作用の誘導剤であるＲａｐａｍｙｃｉｎを、最終濃度１μＭを最大濃度とし、３倍希釈系列で８点調整した後、各濃度の誘導剤希釈液を３ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分静置した。【０１７５】
＜ＦＲＥＴ現象の検出＞
９６ウェルプレートを、マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、製品名：ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ２１０２  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ）にセットし、励起  ４３０／８  フィルター（２１００−５２５０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）、Ｄ４８０（特注ダイクロイックミラー）及び光学フィルター  Ｆｕｒａ２  ５１０／１０  フィルター（２１００−５３２０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、ドナーの蛍光値を測定した。また、励起  ４３０／８  フィルター、Ｄ４８０、Ｃｙ５  ６２０／４０  フィルター（２１００−５７６０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）を用い、アクセプターの蛍光値を測定した。【０１７６】
＜細胞の固定＞
各ウェルから、前記阻害剤希釈液又は誘導剤希釈液  全量を除き、４％パラホルムアルデヒドを１００μＬ添加した。室温で１５分静置した後、全量を除き、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳを１００μＬ添加した。このようにして細胞を固定した後、上記と同様の方法でＦＲＥＴ現象を検出した。【０１７７】
＜データ解析＞
遺伝子導入していない細胞を４４０ｎｍで励起した時の６２０ｎｍ及び５１０ｎｍにおける各蛍光値（Ｅｍ．６２０及びＥｍ．５１０）をバックグランドの値として差し引いた、アクセプターの蛍光値／ドナーの蛍光値（［Ｅｘ．４４０−Ｅｍ．６２０］／［Ｅｘ．４４０−Ｅｍ．５１０］）を、ＦＲＥＴ現象のシグナルとして算出した。また、得られたシグナル値は、添加した各相互作用調整剤の最低濃度の平均値（ｎ＝３）を１として標準化した。そして、カレイダグラフ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて用量反応曲線を描き、ＩＣ５０を算出した。得られた結果を、生細胞に関しては図９Ａ及び９Ｃに示し、固定細胞に関しては図９Ｂ及び９Ｄに示す。なお、各図において、エラーバーは標準誤差を表している。【０１７８】
図９Ａ及び９Ｃに示すとおり、相互作用調整剤の濃度依存的に、ＦＲＥＴ現象のシグナルは変化し、プレートリーダーでも検出できることが確認された。さらに、用量反応曲線の最大値をＦＲＥＴ＋、最小値をＦＲＥＴ−として、ＦＲＥＴ比（ＦＲＥＴ＋／ＦＲＥＴ−）を算出し、４量体蛍光タンパク質を用いた場合と、単量体蛍光タンパク質を用いた場合とを比較した結果、前者の方が、ＭＣＬ１及びＢＡＫ間相互作用では１．６倍、ｍＴＯＲ及びＦＫＢＰ１２間相互作用では２．０倍、ＦＲＥＴ比が高くなった。【０１７９】
また図９Ｂ及び９Ｄに示すとおり、４量体蛍光タンパク質を用いた場合は、固定した細胞でもプレートリーダーにてＦＲＥＴ現象を検出できることが確認された。一方、単量体蛍光タンパク質を用いた場合においては、固定した細胞ではＩＣ５０が算出されない場合や生細胞で測定したＩＣ５０と大きく値がずれる場合があり、正確な評価ができなかった。また、前記同様に、４量体蛍光タンパク質を用いた場合と、単量体蛍光タンパク質を用いた場合とを比較した結果、前者の方が、ＭＣＬ１及びＢＡＫ間相互作用では１．５倍、ｍＴＯＲ及びＦＫＢＰ１２間相互作用では１．９倍、ＦＲＥＴ比が高くなった。【０１８０】
以上のとおり、検出対象がタンパク質間相互作用した場合に、蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせの方が、蛍光輝点を形成できない蛍光タンパク質の組み合わせよりも、ＦＲＥＴ現象の効率が高くなったため、プレートリーダーにて当該現象を検出でき、かつ、検出対象のタンパク質間相互作用の度合いを感度よく解析できることが確認された。また実施例５に示した結果同様に、検出対象が相互作用した際に蛍光輝点を形成する４量体蛍光タンパク質の組み合わせを用いた場合には、固定化した細胞においてもＦＲＥＴ現象が維持され、検出できることも確認された。【０１８１】
（実施例１０）  イメージングシステムを用いた画像解析による相互作用の検出
本発明において形成される蛍光輝点の蛍光強度を、イメージングシステムを用い測定することによっても、タンパク質間相互作用の判定を行なうことができることを、確認した。【０１８２】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
（Ａ）ＭＲ−ＢＡＫ＋ＡＧ−ＭＣＬ１
（Ｂ）ＭＲ−ＢＡＸ＋ＡＧ−ＭＣＬ１
前記（Ａ）及び（Ｂ）に記載のタンパク質の組み合わせを、細胞にて各々発現させるために、実施例９に記載の方法にて、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、上記にて調製したプラスミドを該細胞に導入した。そして、プラスミドＤＮＡ溶液及びＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを添加して２４時間培養後の細胞を、トリプシン処理で回収し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５６６４０）の２４ウェルに継代し、１ウェルあたり１００μＬの培養液で２４時間培養した。【０１８３】
＜相互作用阻害剤の添加、及び細胞の固定＞
各ウェルから培養液全量を除き、ＨＢＳＳ／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに置換した。ＭＣＬ１とＢＡＫ又はＢＡＸとの相互作用の阻害剤であるＡ−１２１０４７７を、最終濃度１６．６７μＭを最大濃度として３倍希釈系列で８点調整した後、各濃度の阻害剤希釈液を３ウェルずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分静置した。その後、培地を除き、４％パラホルムアルデヒドを１００μＬ添加した。室温で１５分静置した後、全量を除き、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳを１００μＬ添加した。【０１８４】
＜イメージングと解析＞
イメージングシステム（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、製品名：オペレッタＣＬＳ）に、対物レンズ２０ｘＡｉｒ，ＮＡ０．４をセットし、ＡＧ（時間：１００ｍｓ，パワー：１０％，励起波長：４６０〜４９０ｎｍ，蛍光波長：５００〜５５０ｎｍ）、ＭＲ（時間：１００ｍｓ，パワー：１０％，励起波長：５３０〜５６０ｎｍ，蛍光波長：５７０〜６５０ｎｍ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（時間：１００ｍｓ，パワー：１０％，励起波長：３５５〜３８５ｎｍ，蛍光波長：４３０〜５００ｎｍ）に関し、各蛍光画像を１ウェルあたり４９視野取得した。【０１８５】
得られた画像は、ソフトウェアＨａｒｍｏｎｙ（ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて解析した。蛍光輝点は、Ｈａｒｍｏｎｙの解析アルゴリズムであるＦｉｎｄ  Ｓｐｏｔｓ  Ｍｅｔｈｏｄ  ＣのＲａｄｉｕｓ  ２μｍ、Ｃｏｎｔｒａｓｔ  ０．３以上、Ｕｎｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ｓｐｏｔ  ｔｏ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ０．５以上、Ｄｉｓｔａｎｃｅ  ０．９μｍ、Ｓｐｏｔ  Ｐｅａｋ  Ｒａｄｉｕｓ  ０μｍの設定で検出した。また、「視野中の蛍光輝点におけるＡＧの蛍光強度の総和／視野中のＡＧを発現している総細胞数」及び「視野中の蛍光輝点におけるＭＲの蛍光強度の総和／視野中のＭＲを発現している総細胞数」を算出した。そして、これら値を、阻害剤Ａ−１２１０４７７  ０．０１μＭ添加時の平均値（ｎ＝３）で標準化し、グラフにプロットした。また、カレイダグラフ（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）を用いて用量反応曲線を描き、ＩＣ５０を算出した。ＭＲ−ＢＡＫ及びＡＧ−ＭＣＬ１について解析した結果を図１０Ａに示し、ＭＲ−ＢＡＸ及びＡＧ−ＭＣＬ１について解析した結果を図１０Ｂに示す。【０１８６】
図１０Ａ及び１０Ｂに示すとおり、蛍光輝点におけるＡＧ由来及びＭＲ由来の蛍光強度は共に、阻害剤濃度依存的に変化した。よって、イメージングシステムを用いて得られた蛍光顕微鏡画像を解析することによっても、タンパク質間相互作用を判定できることが確認された。【０１８７】
（実施例１１）  ＡＧ及びＭＲ以外の４量体蛍光タンパク質を用いた、蛍光輝点形成とＦＲＥＴ現象の検出
ＡＧ及びＭＲ以外の４量体蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ２、ＣＯＲ５、ＫｉｋＧＲ１）を用いても、蛍光輝点形成とＦＲＥＴ現象の検出ができることを、以下に示す方法にて確認した。【０１８８】
＜ｐｍＴＯＲ−ＤｓＲｅｄ２の調製＞
ＤｓＲｅｄ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２７）の５’末端及び３’末端にそれぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した。また、ｐｍＴＯＲ−ＡＧ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−８２０２Ｍ）を同じ制限酵素の組合せにて処理し、該プラスミドＤＮＡからＡＧをコードする領域を除去した後、前記ＤｓＲｅｄ２をコードするＤＮＡを挿入し、ＤｓＲｅｄ２をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ＤｓＲｅｄ２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ＤｓＲｅｄ２）を作製した。【０１８９】
＜ｐｍＴＯＲ−ＣＯＲ５の調製＞
ＣＯＲ５をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２３）の５’末端及び３’末端に、それぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した。また、ｐｍＴＯＲ−ＡＧを同じ制限酵素の組合せにて処理し、該プラスミドＤＮＡからＡＧをコードする領域を除去した後、前記ＣＯＲ５をコードするＤＮＡを挿入し、ＣＯＲ５をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ＣＯＲ５）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ＣＯＲ５）を作製した。【０１９０】
＜ｐｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１の調製＞
前記ｐｍＴＯＲ−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、ｐｍＫｉｋＧＲ１１−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ０１５０Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＫｉｋＧＲ１をコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入し、ＫｉｋＧＲ１をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１）を作製した。【０１９１】
＜ｐＦＫＢＰ１２−ＡＧの調製＞
先ず、ＦＫＢＰ１２の全長をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端にそれぞれＥｃｏＲＩ認識配列とＸｈｏＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５４）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理したｐｈＡＧ−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０１Ｍ）に挿入、ＡＧをＣ末に融合させたＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１２−ＡＧ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＦＫＢＰ１２−ＡＧ）を作製した。【０１９２】
＜ｐＦＫＢＰ１２−ＤｓＲｅｄ２の調製＞
前記ｐＦＫＢＰ１２−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、前記ｐｍＴＯＲ−ＤｓＲｅｄ２を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＤｓＲｅｄ２をコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐＦＫＢＰ１２−ＡＧに挿入し、ＤｓＲｅｄ２をＣ末に融合させたＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１２−ＤｓＲｅｄ２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＦＫＢＰ１２−ＤｓＲｅｄ２）を作製した。【０１９３】
＜ｐＦＫＢＰ１２−ＣＯＲ５の調製＞
前記ｐＦＫＢＰ１２−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、前記ｐｍＴＯＲ−ＣＯＲ５を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＣＯＲ５をコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐＦＫＢＰ１２−ＡＧに挿入し、ＣＯＲ５をＣ末に融合させたＦＫＢＰ１２（ＦＫＢＰ１２−ＣＯＲ５）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＦＫＢＰ１２−ＣＯＲ５）を作製した。【０１９４】
＜ｐＭＲ−ＦＫＢＰ１２の調製＞
実施例８にて調製したｐＡＧ−ＦＫＢＰ１２より、ＡＧをコードする領域をＮｈｅＩ及びＡｇｅＩにて処理することにより除去した。また、ｐＭｏｎｔｉ−Ｒｅｄ−ＭＣＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−ＶＳ０８０２Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、Ｍｏｎｔｉ−Ｒｅｄ（ＭＲ）をコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐＡＧ−ＦＫＢＰ１２に挿入し、ＭＲをＮ末に融合させたＦＫＢＰ１２（ＭＲ−ＦＫＢＰ１２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐＭＲ−ＦＫＢＰ１２）を作製した。【０１９５】
＜細胞培養と遺伝子導入＞
（Ａ）ＡＧ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ＤｓＲｅｄ２
（Ｂ）ＦＫＢＰ１２−ＡＧ＋ｍＴＯＲ−ＣＯＲ５
（Ｃ）ＭＲ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１
（Ｄ）ＦＫＢＰ１２−ＤｓＲｅｄ２＋ｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１
（Ｅ）ＦＫＢＰ１２−ＣＯＲ５＋ｍＴＯＲ−ＫｉｋＧＲ１
（Ｆ）Ｍｍｊ−ｐ５３＋ＭＲ−ＭＤＭ２
前記（Ａ）〜（Ｆ）に記載のタンパク質の組み合わせを、細胞にて各々発現させるために、実施例７に記載の方法にて、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、上記にて調製したプラスミドを該細胞に導入した。なお、（Ｆ）の調整、細胞への導入については実施例２参照。【０１９６】
＜細胞の観察、及び細胞の固定＞
遺伝子導入を施したＨＥＫ２９３細胞の観察及び固定は、ＵＰｌａｎＦＬＮ  ４０ｘＯｉｌ（Ｎ．Ａ．＝１．３）の代わりに、ＵＰｌａｎＡｐｏ  ２０ｘ（Ｎ．Ａ．＝０．７）（オリンパス社製）を用いたこと以外は、実施例３に記載の方法にて行った。【０１９７】
＜ＦＲＥＴ現象の検出、及びデータ解析＞
ドナー側を、ＡＧ、ＫｉｋＧＲ１又はＭｍｊとし、アクセプター側を、ＭＲ、ＤｓＲｅｄ２又はＣＯＲ５とした。さらに、ｍＴＯＲ及びＦＫＢＰ１２においては、その相互作用誘導剤として、Ｒａｐａｍｙｃｉｎを最終濃度１μＭになるようＨＥＫ２９３細胞の培養液に添加し、またはｐ５３及びＭＤＭ２においては、その相互作用阻害剤として、Ｎｕｔｌｉｎ−３を最終濃度２０μＭになるようＨＥＫ２９３細胞の培養液に添加し、薬剤添加前後１０分の各蛍光強度の変化を測定した。そして、以上の事項以外は、実施例３に記載の方法にて行なった。【０１９８】
前記（Ａ）〜（Ｅ）に関し、Ｒａｐａｍｙｃｉｎ添加前後のＲａｔｉｏ画像とＦＲＥＴ現象のシグナル値に関するグラフとを、各々図１１Ａ〜１１Ｅに示す。また、前記（Ｆ）に関し、Ｎｕｔｌｉｎ−３添加前後のＲａｔｉｏ画像とＦＲＥＴ現象のシグナル値に関するグラフとを、各々図１１Ｆに示す。【０１９９】
図１１Ａ〜１１Ｅに示すとおり、Ｒａｐａｍｙｃｉｎを添加した後、ＦＲＥＴ現象のシグナル値（ＭＲ／ＡＧ比）は、形成された蛍光輝点を中心に上昇した。すなわち、ｍＴＯＲ及びＦＫＢＰ１２が相互作用をすることによって、各４量体蛍光タンパク質間のエネルギー移動効率が上昇し、ＦＲＥＴ現象が生じたことが確認された。【０２００】
また、図１１Ｆに示すとおり、Ｎｕｔｌｉｎ−３を添加する前のＦＲＥＴ現象のシグナル値（ＭＲ／ＡＧ比）は蛍光輝点を中心に高く、添加後は、細胞全体に拡散しながら低下した。すなわち、ｐ５３及びＭＤＭ２間の相互作用が阻害されたことによって、４量体蛍光タンパク質（Ｍｍｊ及びＭＲ）間のエネルギー移動効率が低下し、ＦＲＥＴ現象が低減したことが確認された。【０２０１】
以上のとおり、ＡＧ及びＭＲ以外の４量体タンパク質を用いても、蛍光輝点は形成され、また当該形成を介したＦＲＥＴ現象も検出することができ、これらを指標としてタンパク質間相互作用を判定できることが、確認された。【０２０２】
（比較例）  ２量体・単量体蛍光タンパク質を用いた、タンパク質間相互作用の検出
ｍＡＧ１及びｍＥＧＦＰ以外の、単量体蛍光タンパク質（ｍＫＯ１、ｍＵｋＧ１、ｍＭｉＣｙ１、ｍＫＯ２、ｍＫｅｉｍａ）及び２量体蛍光タンパク質（ＫＯ１、ｄＫｅｉｍａ、ｄＡＧ（ＡＢ）、ｄＡＧ（ＡＣ）、ＭｉＣｙ１、ＫＣｙ１）を用いても、蛍光輝点は形成されず、タンパク質間相互作用は判定できないことを、以下に示す方法にて確認した。【０２０３】
＜ｐｍＴＯＲ−ｍＫＯ１の調製＞
前記ｐｍＴＯＲ−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、ｐｈｍＫＯ１−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ００５０Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｍＫＯ１をコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入し、ｍＫＯ１をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｍＫＯ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｍＫＯ１）を作製した。【０２０４】
＜ｐｍＴＯＲ−ｍＫＯ２の調製＞
前記ｐｍＴＯＲ−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、ｐｈｍＫＯ２−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ０１４０Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｍＫＯ２をコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入し、ｍＫＯ２をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｍＫＯ２）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｍＫＯ２）を作製した。【０２０５】
＜ｐｍＴＯＲ−ＫＯ１の調製＞
ＫＯ１をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に、それぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５５）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＡＧをコードする領域を除去したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入することにより、ＫＯ１をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ＫＯ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ＫＯ１）を作製した。【０２０６】
＜ｐｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａの調製＞
ｐｍＴＯＲ−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、ｐｈｍＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ００９０Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｍＫｅｉｍａをコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入し、ｍＫｅｉｍａをＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａ）を作製した。【０２０７】
＜ｐｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａの調製＞
ｐｍＴＯＲ−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、ｐｈｄＫｅｉｍａ−Ｒｅｄ−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ０１００Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｄＫｅｉｍａをコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入し、ｄＫｅｉｍａをＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａ）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａ）を作製した。【０２０８】
＜ｐｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＢ）の調製＞
ｄＡＧ（ＡＢ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号：５６）の５’末端及び３’末端に、それぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＡＧをコードする領域を除去したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入することにより、ｄＡＧ（ＡＢ）をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＢ））を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＢ））を作製した。【０２０９】
＜ｐｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＣ）の調製＞
ｄＡＧ（ＡＣ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号：５７）の５’末端及び３’末端に、それぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＡＧをコードする領域を除去したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入することにより、ｄＡＧ（ＡＣ）をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＣ））を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＣ））を作製した。【０２１０】
＜ｐｍＴＯＲ−ｍＵｋＧ１の調製＞
ｍＵｋＧ１をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に、それぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５８）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＡＧをコードする領域を除去したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入することにより、ｍＵｋＧ１をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｍＵｋＧ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｍＵｋＧ１）を作製した。【０２１１】
＜ｐｍＴＯＲ−ｍＭｉＣｙ１の調製＞
ｐｍＴＯＲ−ＡＧより、ＡＧをコードする領域をＡｇｅＩ及びＸｂａＩにて処理することにより除去した。また、ｐｈｍＭｉＣｙ１−ＭＮＬ（株式会社医学生物学研究所製、コード番号：ＡＭ−Ｖ０１１０Ｍ）を、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ｍＭｉＣｙ１をコードするＤＮＡを切り出した。そして、当該ＤＮＡを、前記制限酵素処理したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入し、ｍＭｉＣｙ１をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ｍＭｉＣｙ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ｍＭｉＣｙ１）を作製した。【０２１２】
＜ｐｍＴＯＲ−ＭｉＣｙ１の調製＞
ＭｉＣｙ１をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に、それぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：５９）を設計した。そして、当該ヌクレオチド配列からなるＤＮＡを人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＡＧをコードする領域を除去したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入することにより、ＭｉＣｙ１をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ＭｉＣｙ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ＭｉＣｙ１）を作製した。【０２１３】
＜ｐｍＴＯＲ−ＫＣｙ１の調製＞
ＫＣｙ１をコードするヌクレオチド配列の５’末端及び３’末端に、それぞれＡｇｅＩ認識配列、ストップコドンとＸｂａＩ認識配列を付加したヌクレオチド配列（配列番号：６０）を人工合成し、ＡｇｅＩとＸｂａＩで切断した後、同じ制限酵素の組合せにて処理し、ＡＧをコードする領域を除去したｐｍＴＯＲ−ＡＧに挿入することにより、ＫＣｙ１をＣ末に融合させたｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ−ＫＣｙ１）を発現させるためのプラスミドベクター（ｐｍＴＯＲ−ＫＣｙ１）を作製した。【０２１４】
＜細胞培養、遺伝子導入及び相互作用誘導剤の添加＞
（Ａ）ＡＧ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＫＯ１
（Ｂ）ＡＧ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＫＯ２
（Ｃ）ＡＧ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ＫＯ１
（Ｄ）ＡＧ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａ
（Ｅ）ＡＧ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａ
（Ｆ）ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＫＯ１
（Ｇ）ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＫＯ２
（Ｈ）ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ＫＯ１
（Ｉ）ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＫｅｉｍａ
（Ｊ）ｍＡＧ１−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｄＫｅｉｍａ
（Ｋ）ＭＲ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＢ）
（Ｌ）ＭＲ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｄＡＧ（ＡＣ）
（Ｍ）ＭＲ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＵｋＧ１
（Ｎ）ＭＲ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ｍＭｉＣｙ１
（Ｏ）ＭＲ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ＭｉＣｙ１
（Ｐ）ＭＲ−ＦＫＢＰ１２＋ｍＴＯＲ−ＫＣｙ１
前記（Ａ）〜（Ｐ）に記載のタンパク質の組み合わせを、細胞にて各々発現させるために、実施例８に記載の方法にて、ＨＥＫ２９３細胞を培養し、上記にて調製したプラスミドを該細胞に導入した。【０２１５】
そして、プラスミドＤＮＡ溶液及びＦｕｇｅｎｅ  ＨＤを添加してから４８時間培養後に、各ウェルから培養液全量を除き、１μＭ  Ｒａｐａｍｙｃｉｎ及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳを、２００μＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分静置した。【０２１６】
＜細胞の観察＞
遺伝子導入を施したＨＥＫ２９３細胞は、ＩＸ−８１倒立顕微鏡（オリンパス社製）を用いて観察した。フィルター及びダイクロイックミラーは、ＡＧ、ｍＡＧ１、ｄＡＧ（ＡＢ）、ｄＡＧ（ＡＣ）、ｍＵｋＧ１、ｍＭｉＣｙ１、ＭｉＣｙ１及びＫＣｙ１に関しては、ＢＰ４６０−４８０ＨＱ、ＢＡ４９５及びＤＭ４８５ＨＱ（Ｕ−ＭＧＦＰＨＱ、オリンパス社製）を用い、ｍＫＯ１、ｍＫＯ２及びＫＯ１に関しては、ＢＰ５２０−５４０ＨＱ、ＢＡ５５５−６００ＨＱ、ＤＭ５４５ＨＱ（ＦＳＥＴ−ＫＯＨＱ、オリンパス社製）を用い、ｍＫｅｉｍａ及びｄＫｅｉｍａに関しては、４４０ＡＦ２１、６１０ＡＬＰ、５９０ＤＲＬＰ（オリンパス社製）を用い、ＭＲに関しては、ＢＰ５３０−５５０、ＢＡ５７５ＩＦ及びＤＭ５７０（Ｕ−ＭＷＩＧ３、オリンパス社製）を用いた。対物レンズは、ＵＰｌａｎＡｐｏ  ２０ｘ（Ｎ．Ａ．＝０．７）（オリンパス社製）、カメラは、ＯＲＣＡ‐Ｆｌａｓｈ４．０デジタルカメラ（浜松ホトニクス製）を用いた。【０２１７】
＜データ解析＞
得られた画像データはＭｅｔａＭｏｒｐｈ  ｖｅｒ８．９．０（モレキュラーデバイス社）で解析し、視野全体の各蛍光画像を取得した。得られた結果を、図１２Ａ〜１２Ｐに示す。【０２１８】
図１２Ａ〜１２Ｐに示すとおり、単量体蛍光タンパク質又は２量体蛍光タンパク質を用いた場合には、対象タンパク質間の相互作用を示す蛍光輝点は形成されなかった。したがって、対象とするタンパク質に各々異なる４量体蛍光タンパク質を融合させ、細胞内に発現させた場合において、蛍光輝点が形成され、該蛍光輝点を指標として、対象タンパク質間の相互作用を判定できることが、確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２１９】
以上説明したように、本発明によれば、対象とするタンパク質の双方に蛍光タンパク質を融合させ、細胞内に発現させ又は導入した場合において、形成される蛍光輝点を指標に、対象タンパク質間の相互作用を判定することが可能となる。さらに、融合させる蛍光タンパク質は、発現させる又は導入する細胞が生来内在するものではないので、当該細胞の機能を乱すおそれが少なく、タンパク質間相互作用の判定を行なうことができる。【０２２０】
また、対象とするタンパク質の一方にドナー４量体蛍光タンパク質を融合させ、他方にアクセプター４量体蛍光タンパク質を融合させて細胞内に発現させ又は導入した場合には、蛍光輝点が形成され、それを介して増加したＦＲＥＴ現象のシグナルを効率よく検出することにより、対象タンパク質間の相互作用を判定することもできる。【０２２１】
特に、本発明によれば、固定化した細胞においてもＦＲＥＴ現象を生じたままにさせることができ、該ＦＲＥＴ現象又はＦＲＥＴ現象のシグナル検出によりタンパク質間相互作用を判定することができる。そのため、検出条件を揃えるためにサンプル（細胞）の固定化を要する、ハイスループットスクリーニング等において、本発明は好適に用いられ得る。【０２２２】
なお、このように、ＦＲＥＴ現象を検出することによって、蛍光輝点等の画像解析の工程を減らすことができる。すなわち、ＦＲＥＴ現象の検出でなく、蛍光輝点検出の場合、蛍光輝点の領域をコンピュータ等の画像上で手動若しくは領域指定するプログラム等で指定し、その領域中の蛍光強度を測定、算出（画像解析）する必要があるが、他方ＦＲＥＴ現象の検出の場合、画像解析の段階を経ることなく、相互作用の有無を判定できる。【０２２３】
したがって、本発明のタンパク質間相互作用の判定方法等、並びにこれらの方法に用いられるためのベクター又はキットは、生体内における様々なシグナル伝達や、様々な生体反応の制御等の解明、ひいては疾患メカニズムの解明を通した医薬品等の開発において有用である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１２Ｋ】
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【図１２Ｌ】
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【図１２Ｍ】
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【図１２Ｎ】
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【図１２Ｏ】
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【図１２Ｐ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018235787.tif 000077
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