(57)【要約】  プラスミドフリーでかつ生産性が向上した微生物の提供。  本開示は、一態様において、形質転換されたエシェリキア属に属する微生物であって、少なくとも下記５つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている微生物に関する。（１）ａｒｏＡ（２）ａｒｏＢ（３）ａｒｏＣ（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr（５）ｐｈｅＡfbr又はｔｙｒＡfbr  本開示は、その他の態様において、上記微生物を培地で培養することを含む、芳香族化合物の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換されたエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物であって、
少なくとも下記５つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている微生物。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｐｈｅＡfbr又はｔｙｒＡfbr
【請求項２】
さらに、下記２つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている、請求項１に記載の微生物。
（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
【請求項３】
さらに、下記３つの遺伝子の少なくとも１つが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている、請求項１又は２に記載の微生物。
（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
【請求項４】
染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入される遺伝子にｔｙｒＢが含まれない、請求項１から３のいずれかに記載の微生物。
【請求項５】
前記（５）の遺伝子が、ｐｈｅＡfbrであり、フェニルアラニン生産能を有する、請求項１から４のいずれかに記載の微生物。
【請求項６】
前記（５）の遺伝子が、ｔｙｒＡfbrであり、チロシン生産能を有する、請求項１から４のいずれかに記載の微生物。
【請求項７】
さらに、フェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニルアラニン、又はチロシンを基質とする酵素をコードする同種又は異種起源の遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入された、請求項１から４のいずれかに記載の微生物。
【請求項８】
さらに、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする異種起源の遺伝子ｉｐｄＣが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入され、２−フェニルエタノール又は２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノールの生産能を有する、請求項１から４のいずれかに記載の微生物。
【請求項９】
さらに、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種起源の遺伝子ｌｄｈＡが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入され、フェニル乳酸又は４−ヒドロキシフェニル乳酸の生産能を有する、請求項１から４のいずれかに記載の微生物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の微生物を培地で培養することを含む、芳香族化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、芳香族化合物を産生する微生物に関し、より具体的には、フェニルアラニンの生産菌、チロシンの生産菌、その他の芳香族化合物の生産菌、並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フェニルアラニンやチロシンは、家畜肥料への添加物、サプリメント、医薬品原料などに用いられる。フェニルアラニンやチロシンは、微生物を用いた発酵法により生産されることが一般的になっている。【０００３】
従来は、合成経路上のキーとなる遺伝子をプラスミドで発現させることで、合成経路のボトルネックを解消して生産量の向上を図ろうとするのが一般的である（例えば、非特許文献１）。また、プラスミドを用いずに染色体に直接導入した生産菌が報告されている（例えば、非特許文献２）。フェニルアラニンやチロシンの生産菌にさらなる酵素を導入することでその他の芳香族化合物を産生できることも報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Juminaga et al. Appl. Environ. Microbiol. 78: 89-98, 2012
【非特許文献２】Koma et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93:815-829, 2012
【非特許文献３】Koma et al. Appl. Environ. Microbiol. 78:6203-6216, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プラスミドを保持するためには抗生物質を添加する必要があるが、大規模な発酵生産においては、大幅なコスト増や、環境中への薬剤流出のリスク、薬剤耐性菌の出現などが問題になる。この問題を解決するため、キーとなる遺伝子を微生物の染色体へ直接導入して「プラスミドフリーな生産微生物」とすることが提案された。しかし、プラスミドを用いない微生物は、生産量が低い傾向がある。【０００６】
そこで、本開示は、一態様において、プラスミドフリーでかつ生産性が向上した微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一態様において、形質転換されたエシェリキア属に属する微生物であって、少なくとも下記５つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている微生物に関する。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｐｈｅＡfbr又はｔｙｒＡfbr【０００８】
本開示は、その他の態様において、本開示に係る微生物を培地で培養することを含む、芳香族化合物の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、フェニルアラニン、チロシン等の芳香族化合物について、プラスミドフリーでかつ生産性が向上した菌株を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本開示に係る微生物の作製スキームの概略を示す図である。
【図２】図２は、本開示に係る微生物の作製スキームの概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示に係る微生物は、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物の形質転換体であるが、一又は複数の実施形態において、大腸菌（Escherichia coli）の形質転換体である。
【００１２】
本開示において、遺伝子は、特に言及がない場合、大腸菌の遺伝子を意味する。本開示において、遺伝子は、大腸菌の当該遺伝子のオーソログ（他生物種由来のホモログ）を含みうる。大腸菌の遺伝子の配列は、特に言及がない場合、Ｋ―12株（野生型）のものあるいはデータベース（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫなど）に本願出願時において登録されているものを指すが、野生型と同等の機能を果たす範囲、又は、野生型と同等の蛋白質をコードする範囲で配列が異なっていてもよく、上述のとおりオーソログの配列であってもよい。また、遺伝子は、宿主微生物での発現のため、コドンが最適化されてもよい。
【００１３】
本開示において、発現誘導可能なプロモーターともに染色体に導入される遺伝子は、単独の遺伝子であってもよく、複数遺伝子が発現可能なオペロンであってもよい。
【００１４】
本開示において、発現誘導可能なプロモーターは、特に限定されない。一又は複数の実施形態において、野生型の（本来の）プロモーターよりも高い発現量の発現誘導が可能なプロモーターであって、例えば、Ｔ７プロモーターが挙げられる。発現誘導にＴ７プロモーターを用いる場合、宿主微生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する株であることが好ましい。宿主微生物としては、例えば、λＤＥ３ファージを溶原化したＤＥ３株が挙げられる。
【００１５】
本開示において、遺伝子を発現誘導可能なプロモーターともに染色体に導入する方法は、特に限定されないが、一又は複数の実施形態において、実施例に記載の方法（非特許文献２に記載の方法）が挙げられる。
【００１６】
本開示において、プラスミドフリーとは、フェニルアラニン、チロシン等の芳香族化合物の生産性向上に寄与する遺伝子が染色体上で過剰発現されることをいい、本開示に係る微生物はプラスミドを保有していてもよく、プラスミドを保有していなくてもよい。
本開示において、フェニルアラニン及びチロシンは、特に言及のない場合、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシンを意味しうる。
【００１７】
本開示において、「ａｒｏＡ」遺伝子は、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：945528である。
【００１８】
本開示において、「ａｒｏＢ」遺伝子は、３−デヒドロキナ酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：947927である。
【００１９】
本開示において、「ａｒｏＣ」遺伝子は、コリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：946814である。
【００２０】
本開示において、「ａｒｏＧ」遺伝子は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：645605である。
本開示において、「ａｒｏＧfbr」遺伝子は、ａｒｏＧのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ａｒｏＧfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平05-236947に開示のものを使用できる。
【００２１】
本開示において、「ａｒｏＦ」遺伝子は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：947084である。
本開示において、「ａｒｏＦfbr」遺伝子は、ａｒｏＦのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ａｒｏＦfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平05-236947に開示のものを使用できる。
【００２２】
本開示において、「ｐｈｅＡ」遺伝子は、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：947081である。
本開示において、「ｐｈｅＡfbr」遺伝子は、ｐｈｅＡのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ｐｈｅＡfbrは、一又は複数の実施形態において、特開2006-311833及び特開平05-344881に開示のものを使用できる。
【００２３】
本開示において、「ｔｙｒＡ」遺伝子は、コリスミ酸ムターゼ及びプレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：947115である。
本開示において、「ｔｙｒＡfbr」遺伝子は、ｔｙｒＡのフィードバック阻害の脱感作変異型を意味する。ｔｙｒＡfbrは、一又は複数の実施形態において、特開平05-076352に開示のものを使用できる。
【００２４】
本開示において、「ｐｐｓＡ」遺伝子は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：946209である。
【００２５】
本開示において、「ｔｋｔＡ」遺伝子は、トランスケトラーゼ１をコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：947420である。
【００２６】
本開示において、「ａｒｏＤ」遺伝子は、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：946210である。
【００２７】
本開示において、「ａｒｏＥ」遺伝子は、デヒドロシキミ酸レダクターゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：947776である。
【００２８】
本開示において、「ｙｄｉＢ」遺伝子は、キナ酸／シキミ酸５−デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：946200である。
【００２９】
本開示において、「ａｒｏＬ」遺伝子は、シキミ酸キナーゼＩＩをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：945031である。
【００３０】
本開示において、「ａｒｏＫ」遺伝子は、シキミ酸キナーゼＩをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：2847759である。
【００３１】
本開示において、「ｔｙｒＢ」遺伝子は、チロシンアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：945031である。
本開示に係る微生物では、一又は複数の実施形態において、フェニルアラニン、チロシン等の芳香族化合物の産生量を向上させる観点から、ｔｙｒＢは発現誘導可能なプロモーターともに染色体に導入されないことが好ましい。従来、フェニルアラニンやチロシンを産生させる場合、ｔｙｒＢは過剰発現される場合が多かった。しかし、本発明者らは、ｔｙｒＢの過剰発現は代謝負荷によるネガティブな影響が大きく、ｔｙｒＢを過剰発現させないほうが、フェニルアラニンやチロシンの生産を向上できることを見出した。
【００３２】
本開示において、「ｌｄｈＡ」遺伝子は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードするＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ ＪＣＭ２０６４４由来の遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＰｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：CAJ91827をコードする遺伝子である。
【００３３】
本開示において、「ｉｐｄＣ」遺伝子は、インドール−３−ピルビン酸／フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードするＡｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ ＮＢＲＣ１０２２８９由来の遺伝子であって、一又は複数の実施形態において、ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＰｒｏｔｅｉｎ ＩＤ：CAA67899をコードする遺伝子である。
【００３４】
本開示に係る微生物の第１の実施形態は、下記５つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されているエシェリキア属に属する微生物である。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｐｈｅＡfbr又はｔｙｒＡfbr
本実施形態において、上記（５）の遺伝子がｐｈｅＡfbrの場合、本開示に係る微生物は、フェニルアラニンの生産能を有し、本開示に係る微生物を用いた発酵法によりフェニルアラニンの製造が可能になる。
本実施形態において、上記（５）の遺伝子がｔｙｒＡfbrの場合、本開示に係る微生物は、チロシンの生産能を有し、本開示に係る微生物を用いた発酵法によりチロシンの製造が可能になる。
本実施形態において、上記（４）のａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbrは同じ酵素をコードしており、相互に代替可能である。なお、ａｒｏＧfbr及びａｒｏＦfbrの代わりにａｒｏＨ（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：946229）のフィードバック阻害の脱感作変異型を使用することもできる。
本発明者らは、上記（４）及び（５）に加え、上記（１）〜（３）のすべて過剰発現させることで、導入した遺伝子（例えば、上記（４）及び（５））の過剰発現による代謝負荷を低減しうることを見出した。
【００３５】
本開示に係る微生物の第２の実施形態は、第１の実施形態の上記５つの遺伝子に加え、下記２つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されているエシェリキア属に属する微生物である。
（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
ここで、発現誘導可能なプロモーターとしてＴ７プロモーターを使用する場合、目的の芳香族化合物の生産性向上の点から、上記（７）ｔｋｔＡのプロモーターは発現誘導能が低減した変異型Ｔ７プロモーターであることが好ましい。
【００３６】
本開示に係る微生物の第３の実施形態は、第１及び第２の実施形態の上記（１）〜（７）の７つの遺伝子に加え、さらに、下記３つの遺伝子の少なくとも１つが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されているエシェリキア属に属する微生物である。
（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
（８）〜（１０）の中で、２つ又は全部が導入されていることが好ましい。
本実施形態において、上記（９）のａｒｏＥ又はｙｄｉＢは相互に代替可能であるが、上記（９）の遺伝子としては、ａｒｏＥが好ましい。
本実施形態において、上記（１０）のａｒｏＬ又はａｒｏＫは相互に代替可能であるが、上記（１０）の遺伝子としては、ａｒｏＬが好ましい。
【００３７】
本開示に係る微生物の第４の実施形態は、第１、第２、又は第３の実施形態にさらに、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニルアラニン、又はチロシンを基質とする酵素をコードする同種又は異種起源の遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入された微生物である。
例えば、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする異種起源の遺伝子ｉｐｄＣが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されると、本開示に係る微生物は、２−フェニルエタノール又は２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノールの生産能を有するから、これらの芳香族化合物の製造に使用できる。
また、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種起源の遺伝子ｌｄｈＡが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されると、フェニル乳酸又は４−ヒドロキシフェニル乳酸の生産能を有する微生物となり、これらの芳香族化合物の製造に使用できる。
すなわち、フェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニルアラニン、又はチロシンを基質とする酵素をコードする遺伝子をさらに導入すると、その遺伝子に応じて芳香族化合物が製造できる。
また、非特許文献２に記載されているように、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓのチロシンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：4413406）やＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＮＢＲＣ１００６５０の芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：1045854）又はそれらのオーソログ遺伝子を導入することで、フェニルエチルアミンやチラミンを製造することが可能となる。一方、非特許文献３に記載されているように、例えば、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子と共に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのフェニルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＮＣＢＩ ＧＥＮＢＡＮＫのＧｅｎｅ ＩＤ：945933）又はそのオーソログ遺伝子を導入することで、フェニル酢酸や４−ヒドロキシフェニル酢酸を製造することが可能となる。
【００３８】
本開示に係る微生物を用いた芳香族化合物（フェニルアラニン、チロシンを含む）の製造方法は、特に制限されず、通常の培養方法及び／又は発酵法の条件で培養することで、芳香族化合物を製造できる。培養・発酵の培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、ミネラル、ビタミンなどのその他の成分を含むもので、当該微生物が生育できるものなら特に限定されない。本開示に係る微生物を用いた芳香族化合物の産生方法は、例えば、実施例の方法を参照できる。簡単には、２７℃で前培養を行い、１％の濃度で最小培地（例えば、Ｍ９Ｍ２培地）に植菌し、３７℃で４−５時間培養し（ＯＤ６６０が０．３〜０．４）、発現誘導して（Ｔ７プロモーターであれば、例えば１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加して）、２７℃で４３〜４４時間培養し、培養液及び／又は菌内に目的の芳香族化合物を得る。但し、培養・発酵条件は、これらに限定されない。
なお、本開示に係る微生物を用いたフェニルアラニン、チロシンを含む芳香族化合物の製造方法では、一又は複数の実施形態において、導入した遺伝子の過剰発現による代謝負荷が低減されているから、前培養にグルコースを添加してカタボライトリプレッションを引き起こさなくても芳香族化合物を産生させることができる。
【００３９】
本開示は、一又は複数の実施形態において、以下に関しうる；
＜１＞  形質転換されたエシェリキア属に属する微生物であって、
少なくとも下記５つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている微生物。
（１）ａｒｏＡ
（２）ａｒｏＢ
（３）ａｒｏＣ
（４）ａｒｏＧfbr又はａｒｏＦfbr
（５）ｐｈｅＡfbr又はｔｙｒＡfbr
＜２＞  さらに、下記２つの遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている、＜１＞に記載の微生物。
（６）ｐｐｓＡ
（７）ｔｋｔＡ
＜３＞  さらに、下記３つの遺伝子の少なくとも１つが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入されている、＜１＞又は＜２＞に記載の微生物。
（８）ａｒｏＤ
（９）ａｒｏＥ又はｙｄｉＢ
（１０）ａｒｏＬ又はａｒｏＫ
＜４＞  染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入される遺伝子にｔｙｒＢが含まれない、＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の微生物。
＜５＞  前記（５）の遺伝子が、ｐｈｅＡfbrであり、フェニルアラニン生産能を有する＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微生物。
＜６＞  前記（５）の遺伝子が、ｔｙｒＡfbrであり、チロシン生産能を有する、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微生物。
＜７＞  さらに、フェニルピルビン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、フェニルアラニン、又はチロシンを基質とする酵素をコードする同種又は異種起源の遺伝子が染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入された、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微生物。
＜８＞  さらに、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする異種起源の遺伝子ｉｐｄＣが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入され、２−フェニルエタノール又は２−（４−ヒドロキシフェニル）エタノールの生産能を有する、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微生物。
＜９＞  さらに、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする異種起源の遺伝子ｌｄｈＡが染色体上に発現誘導可能なプロモーターとともに導入され、フェニル乳酸又は４−ヒドロキシフェニル乳酸の生産能を有する、＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微生物。
＜１０＞  ＜１＞から＜９＞のいずれかに記載の微生物を培地で培養することを含む、芳香族化合物の製造方法。
【００４０】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００４１】
［大腸菌の染色体に部位特異的に複数の遺伝子を導入した菌の作製］
大腸菌の染色体に部位特異的に複数の遺伝子を導入する方法は、非特許文献２（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３：８１５−８２９，２０１２）に従った。簡単には、同文献Ｆｉｇ．１（図１）に記載のように、Ｒｅｄ相同組み換え、ＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組み換え、及びＰ１トランスダクションを利用して作製した。
図１は、３つの遺伝子（Ａ，Ｂ，Ｃ）を染色体に導入する場合のスキームを示す。まず、Ｒｅｄ相同組み換えにより、ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−Ａ、ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−Ｂ、ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−Ｃを染色体の所望の位置に有する３つの株（株Ａ，株Ｂ，株Ｃ）を作製する。株Ａ内でＦＬＰ／ＦＲＴ組み換えによりＫｍカセットが切り出されたものをアクセプター株Ａとして得る。次にドナー株ＢをＰ１ｖｉｒファージに感染させて得た溶菌液Ｂをアクセプター株Ａに感染させてＰ１トランスダクションを行う。得られた株からＦＬＰ／ＦＲＴ組み換えによりＫｍカセットが切り出されたものをアクセプター株ＡＢとして得る。ドナー株ＣをＰ１ｖｉｒファージに感染させて得た溶菌液Ｃをアクセプター株ＡＢに感染させてＰ１トランスダクションを行う。最後に、ＦＬＰ／ＦＲＴ組み換えによりＫｍカセットが切り出されたものを選択すれば、３つの遺伝子（Ａ，Ｂ，Ｃ）が染色体に導入された株を得ることができる。【００４２】
所望の遺伝子を大腸菌の染色体に部位特異的に導入する方法も、非特許文献２（Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３：８１５−８２９，２０１２）に従った。簡単には、そのスキームを図２に示す（同文献のＦｉｇ．２）。
Ｒｅｄ相同組み換えで導入する遺伝子断片を作製するために、ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴカセットをマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の上流に備える２つのプラスミドを利用した。ｐＥＴ−２１ａ−ＦＲＴは、ＭＣＳが１つ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ＦＲＴは、ＭＣＳが２つである。これらのプラスミドはＴ７プロモーターによって遺伝子発現を誘導できる。次に、直鎖ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅する。プライマーには、ターゲット部位の外側の５０塩基の配列（Ｈ１又はＨ２）と、プラスミド由来の２０塩基の配列（Ｐ１又はＰ２）を有する。そして、増幅断片を、ｐＫＤ４６を有する大腸菌細胞にエレクトロポレートする。得られる組み替え体は、染色体のターゲット部位に所望の遺伝子が導入される。この組み替え体にプラスミドｐＣＰ２０を導入することで、ＦＬＰ／ＦＲＴ組み換えによりＫｍカセットを除去できる。【００４３】
［プラスミドの作製］
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＧfbrの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥｃＡｒｏＧ−Ｆ（ＡＴＧＡＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＴＴＴＡＣＧ，配列番号０１）とＡｒｏＧ−ＲＭ−Ｎｄｅ（ＧＣＴＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＣＧＧＡＴＣＧ，配列番号０２）プライマーペア及びＡｒｏＧ−ＦＭ−Ｎｄｅ（ＣＧＡＴＣＣＧＣＡＣＡＴＧＧＡＴＡＡＴＡＧＣ，配列番号０３）とＥｃＡｒｏＧ−Ｒ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＧＣＧＡＣＧＣＧＣＴＴＴＴＡＣ，配列番号０４）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、以下同じ）により２つのＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。つぎに、２つの増幅断片を鋳型として、ＥｃＡｒｏＧ−ＦとＥｃＡｒｏＧ−Ｒのプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、配列中のＮｄｅＩサイトを消失させたａｒｏＧ遺伝子のＤＮＡを得た。さらに、増幅されたＤＮＡ断片を鋳型として、ＥｃＡｒｏＧ−ＦとＥｃＡｒｏＧ−Ｄ１４６Ｎ−ＲＭ（ＧＧＧＧＴＧＡＴＣＡＴＡＴＴＧＡＧＡＡＡＣＴＣ，配列番号０５）及びＥｃＡｒｏＧ−Ｄ１４６Ｎ−ＦＭ（ＧＡＧＴＴＴＣＴＣＡＡＴＡＴＧＡＴＣＡＣＣＣＣ，配列番号０６）とＥｃＡｒｏＧ−Ｒ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＧＣＧＡＣＧＣＧＣＴＴＴＴＡＣ，配列番号０７）のプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより２つのＤＮＡ断片を得た。最後に、２つの増幅断片を鋳型として、ＥｃＡｒｏＧ−Ｎｄｅ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＣＡＧＡＡＣＧＡＣＧＡＴＴＴＡＣＧ，配列番号０８）とＥｃＡｒｏＧ−Ｒのプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、１４６番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されたＡｒｏＧをコードするＤＮＡ（ａｒｏＧfbr）を得た。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクター（非特許文献２、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３：８１５−８２９，２０１２、以下同じ）をそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、以下同じ）を用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ，配列番号０９、以下同じ）とＴ７ターミネータープライマー（ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ，配列番号１０、以下同じ）を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅ（ＭＡＣＨＥＲＹ−ＮＡＧＥＬ、以下同じ）を用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。ＬＢ寒天培地は、純水１Ｌに対して、１０ｇポリペプトン（日本製薬株式会社）、５ｇ乾燥酵母エキス（日本製薬株式会社）、１０ｇ塩化ナトリウム、２０ｇ寒天、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整したもの。ＬＢ液体培地は、純水１Ｌに対して、１０ｇポリペプトン（日本製薬株式会社）、５ｇ乾燥酵母エキス（日本製薬株式会社）、１０ｇ塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整したもの。以下同じ。【００４４】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｐｈｅＡfbrの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥｃＰｈｅＡ−Ｆ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＧＴＴＡＣ，配列番号１１）とＥｃＰｈｅＡ−Ｓ３３０Ｐ−ＲＭ（ＧＡＡＴＣＧＧＧＣＧＴＧＧＴＴＣＣＡＧＡＣ，配列番号１２）プライマーペア及びＥｃＰｈｅＡ−Ｓ３３０Ｐ−ＦＭ（ＧＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＧＣＣＣＧＡＴＴＣ，配列番号１３）とＥｃＰｈｅＡ−Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣ，配列番号１４）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより２つのＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。つぎに、２つの増幅断片を鋳型として、ＥｃＰｈｅＡ−ＦとＥｃＰｈｅＡ−Ｒのプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、３３０番目のセリンがプロリンに置換されたＰｈｅＡをコードするＤＮＡ（ＰｈｅＡfbr）を得た。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００４５】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｐｐｓＡの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｐｐｓ−Ｆ（ＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＣＧＴＣ，配列番号１５）とｐｐｓ−ＲＭ−Ｎｃｏ（ＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＡＧＴＧＣＧＧＣＧＣ，配列番号１６）プライマーペア及びｐｐｓ−ＦＭ−Ｎｃｏ（ＧＣＧＣＣＧＣＡＣＴＡＴＧＧＧＧＴＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣ，配列番号１７）とｐｐｓ−Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＧＧ，配列番号１８）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより２つのＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。つぎに、２つの増幅断片を鋳型としてｐｐｓ−Ｆとｐｐｓ−Ｒのプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、配列中のＮｃｏＩサイトを消失させたｐｐｓＡ遺伝子のＤＮＡを得た。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００４６】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｋｔＡの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｔｋｔＡ−Ｎｄｅ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＴＣＣＴＣＡＣＧＴＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＣＣ，配列番号１９）とｔｋｔＡ−Ｘｈｏ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＣＴＴＴＣ，配列番号２０）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりｔｋｔＡ遺伝子のＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００４７】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−Ｔ７(-8TC)−ｔｋｔＡの作製］
ｐＥＴＤｕｅｔ−ＦＲＴ（非特許文献２、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３：８１５−８２９，２０１２）を鋳型としてＦ−Ｂｇｌ（ＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号２１）と−８ＴＣ−ＲＭ１（ＣＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＧＧＴＣＧＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＧ，配列番号２２）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。一方、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｋｔＡを鋳型として−８ＴＣ−ＦＭ１（ＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＣＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧ，配列番号２３）とＴ７ターミネータープライマーのペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ断片を増幅した。つぎに、２つの増幅断片を鋳型としてＦ−ＢｇｌとＴ７ターミネータープライマーのペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーターの転写開始起点から８塩基上流の配列がＴからＣに置換された変異型Ｔ７プロモーター配列を含むＤＮＡ断片を得た。
このＤＮＡ断片とｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをそれぞれＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００４８】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＡfbrの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＥｃＴｙｒＡ−Ｆ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣ，配列番号２４）とＥｃＴｙｒＡ−ＲＭ１（ＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＡＴＡＧＡＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣ，配列番号２５）プライマーペア、ＥｃＴｙｒＡ−ＦＭ１（ＧＣＧＣＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＴＣＴＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧ，配列番号２６）とＥｃＴｙｒＡ−ＲＭ２（ＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＴＡＣＧＴＡＡＴＣＧＣＣＧＡＡＣ，配列番号２７）プライマーペア、及びＥｃＴｙｒＡ−ＦＭ２（ＧＴＴＣＧＧＣＧＡＴＴＡＣＧＴＡＣＡＧＣＧＴＴＴＴＣＡＧＡＧ，配列番号２８）とＥｃＴｙｒＡ−Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＧＧＣＧＡＴＴＧＴＣＡＴＴＣＧＣＣ，配列番号２９）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより３つのＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。つぎに、３つの増幅断片を鋳型としてＥｃＴｙｒＡ−ＦとＥｃＴｙｒＡ−Ｒのプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、５３番目のメチオニンがイソロイシンに置換され、かつ３５４番目のアラニンがバリンに置換されたＴｙｒＡをコードするＤＮＡ（ｔｙｒＡfbr）を得た。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００４９】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ｔｙｒＢの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｔｙｒＢ−Ｎｄｅ（ＣＡＡＣＡＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＣ，配列番号３０）とｔｙｒＢ−Ｘｈｏ（ＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＡＣ，配列番号３１）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりｔｙｒＢ遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。
増幅されたＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをそれぞれＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたＤＮＡを常法によりＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００５０】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＢの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＡｒｏＢ−ｏｐｔ−ｇｉｂ−Ｆ（ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＣＧＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＡＣＴＣ，配列番号３２）とＡｒｏＢ−ｇｉｂ−Ｒ（ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣ，配列番号３３）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＢ遺伝子のＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。
ＤｐｎＩで処理したａｒｏＢ遺伝子のＤＮＡとＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴをギブソン・アッセンブリー・システム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、以下同じ）を用いて反応させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００５１】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＬＣの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＥｃＡｒｏＡ−Ｆ（ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＡＣＡＡＣ，配列番号３４）とＥｃＡｒｏＡ−Ｒ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＡＡＴＣＣ，配列番号３５）プライマーペア、ＥｃＡｒｏＬ−Ｆ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣ，配列番号３６）とＥｃＡｒｏＬ−Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣ，配列番号３７）プライマーペア、及びＥｃＡｒｏＣ−Ｆ（ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＴＧＧＡＣ，配列番号３８）とＥｃＡｒｏＣ−Ｒ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＴＣ，配列番号３９）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＡ、ａｒｏＬ、及びａｒｏＣ遺伝子のＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。ａｒｏＡ遺伝子とａｒｏＣ遺伝子のＤＮＡをＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、一方、ａｒｏＬ遺伝子のＤＮＡをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてそれぞれのＤＮＡをゲルから抽出・精製した。ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴベクター（非特許文献２、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９３：８１５−８２９，２０１２）をＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたａｒｏＡ遺伝子のＤＮＡとｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ、精製されたａｒｏＣ遺伝子のＤＮＡとｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ、及び精製されたａｒｏＬ遺伝子のＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴを常法によりそれぞれＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて抽出し精製することで、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＡ、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＣ、及びｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＬを得た。
ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＡを鋳型としてＡＬＣ−Ｆ（ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧ，配列番号４０）とＡＬＣ−ａｒｏＡ−Ｒ（ＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＡＡＴＣ，配列番号４１）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。また、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＬを鋳型として、ＡＬＣ−ａｒｏＬ−Ｆ（ＧＡＴＴＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣ，配列番号４２）とＡＬＣ−ａｒｏＬ−Ｒ（ＧＧＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＧＣ，配列番号４３）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。さらに、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＣを鋳型としてＡＬＣ−ａｒｏＣ−Ｆ（ＧＧＡＴＣＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＡＡＴＴＧＧ，配列番号４４）とＡＬＣｏｒＥＤＢ−Ｒ（ＧＧＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＧＣ，配列番号４５）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。つぎに、３つの増幅断片を鋳型としてａｒｏＡＬＣ−Ｆ１（ＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＡＣＡＡＣ，配列番号４６）とａｒｏＡＬＣ−Ｒ１（ＴＴＡＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣ，配列番号４７）のプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ａｒｏＡＬＣを含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、以下同じ）を含むＴＯＰＯクローニングの試薬と反応させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。ａｒｏＡＬＣ−Ｆ１とａｒｏＡＬＣ−Ｒ１を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ａｒｏＡＬＣを抽出し精製した。
一方、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴを鋳型として、ｐＥＴ２１ａ−ＡＬＣ−Ｒ（ＧＴＡＡＣＧＴＣＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ，配列番号４８）とｐＥＴ２１ａ−ＡＬＣ−Ｆ（ＣＴＧＡＴＡＴＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ，配列番号４９）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより、プラスミドバックボーンとなるＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTMを含むＴＯＰＯクローニングの試薬と反応させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。ｐＥＴ２１ａ−ＡＬＣ−ＲとｐＥＴ２１ａ−ＡＬＣ−Ｆを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ＢＢ−ａｒｏＡＬＣを抽出し精製した。
つぎに、ｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ａｒｏＡＬＣを鋳型として、ａｒｏＡＬＣ−Ｆ１とａｒｏＡＬＣ−Ｒ１プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＡＬＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。一方、ｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ＢＢ−ａｒｏＡＬＣを鋳型として、ｐＥＴ２１ａ−ＡＬＣ−ＲとｐＥＴ２１ａ−ＡＬＣ−Ｆプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりプラスミドバックボーンを含むＤＮＡ断片を得た。得られた両ＤＮＡ断片をギブソン・アッセンブリー・システムを用いて反応させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。ａｒｏＡＬＣ−Ｆ１とａｒｏＡＬＣ−Ｒ１プライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００５２】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＤＢの作製］
大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてＥｃＡｒｏＥ−Ｆ（ＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧ，配列番号５０）とＥｃＡｒｏＥ−Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＧＣＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＴＣＣ，配列番号５１）プライマーペア、ＥｃＡｒｏＤ−Ｆ（ＣＣＡＡＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＴＣ，配列番号５２）とＥｃＡｒｏＤ−Ｒ（ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＣ，配列番号５３）プライマーペア、及びＥｃＡｒｏＢ−Ｆ（ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＣＧＴＴＡＣＴＣ，配列番号５４）とＥｃＡｒｏＢ−Ｒ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣ，配列番号５５）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＥ、ａｒｏＤ、及びａｒｏＢ遺伝子のＤＮＡを増幅した。なお、ＰＣＲ反応の条件は、説明書に記載の基本的な条件に基づいて行った。ａｒｏＥ遺伝子とａｒｏＤ遺伝子のＤＮＡをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、一方、ａｒｏＢ遺伝子のＤＮＡをＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてそれぞれのＤＮＡをゲルから抽出・精製した。ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴベクターをＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴベクターをＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡを分離した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて該当のＤＮＡをゲルから抽出・精製した。精製されたａｒｏＥ遺伝子のＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ、精製されたａｒｏＤ遺伝子のＤＮＡとｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ、及び精製されたａｒｏＢ遺伝子のＤＮＡとｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴを常法によりそれぞれＬｉｇａｔｉｏｎし、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて抽出し精製することで、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＥ、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＤ、及びｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＢを得た。
ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＥを鋳型としてＥＤＢ−Ｆ（ＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧ，配列番号５６）とＥＤＢ−ａｒｏＥ−Ｒ（ＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＣＡＣＧＣＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＴＣＣ，配列番号５７）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。また、ｐＥＴ２１ｄ−ＦＲＴ−ａｒｏＤを鋳型として、ＥＤＢ−ａｒｏＤ−Ｆ（ＣＧＴＧＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＣＣ，配列番号５８）とＥＤＢ−ａｒｏＤ−Ｒ（ＧＧＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＣ，配列番号５９）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。さらに、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＢを鋳型としてＥＤＢ−ａｒｏＢ−Ｆ２（ＧＧＡＴＣＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＴＡＴＴＧＴＣＧＴＴＡＣＴＣ，配列番号６０）とＡＬＣｏｒＥＤＢ−Ｒプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。つぎに、３つの増幅断片を鋳型としてａｒｏＥＤＢ−Ｆ１（ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＧＧ，配列番号６１）とａｒｏＥＤＢ−Ｒ１（ＴＴＡＣＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣ，配列番号６２）のプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、ａｒｏＥＤＢを含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTMを含むＴＯＰＯクローニングの試薬と反応させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。ａｒｏＥＤＢ−Ｆ１とａｒｏＥＤＢ−Ｒ１を用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ａｒｏＥＤＢを抽出し精製した。
一方、ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴを鋳型として、ｐＥＴ２１ａ−ＥＤＢ−Ｒ（ＣＡＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＧＴＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣ，配列番号６３）とｐＥＴ２１ａ−ＥＤＢ−Ｆ（ＣＧＡＴＴＧＴＣＡＡＴＣＡＧＣＧＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣ，配列番号６４）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼにより、プラスミドバックボーンとなるＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTMを含むＴＯＰＯクローニングの試薬と反応させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。ｐＥＴ２１ａ−ＥＤＢ−ＲとｐＥＴ２１ａ−ＥＤＢ−Ｆを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ＢＢ−ａｒｏＥＤＢを抽出し精製した。
つぎに、ｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ａｒｏＥＤＢを鋳型として、ａｒｏＥＤＢ−Ｆ１とａｒｏＥＤＢ−Ｒ１プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＥＤＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。一方、ｐＣＲTMＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯTM−ＢＢ−ａｒｏＥＤＢを鋳型として、ｐＥＴ２１ａ−ＥＤＢ−ＲとｐＥＴ２１ａ−ＥＤＢ−Ｆプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりプラスミドバックボーンを含むＤＮＡ断片を得た。得られた両ＤＮＡ断片をギブソン・アッセンブリー・システムを用いて反応させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。ａｒｏＥＤＢ−Ｆ１とａｒｏＥＤＢ−Ｒ１プライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いて目的のプラスミドを抽出し精製した。【００５３】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＬＣの作製］
ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＬＣを鋳型としてａｒｏＬＣ−ＤＢ−Ｆ（ＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧ，配列番号６５）とａｒｏＬＣ−Ｒ（ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣＴＣ，配列番号６６）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＬＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、以下同じ）で精製した後にＤｐｎＩで消化し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、Ｔ４キナーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてリン酸化した。リン酸化されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、ＤＮＡライゲーションキット（Ｔａｋａｒａ、以下同じ）を用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出し精製することでｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＬＣを得た。【００５４】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＣの作製］
ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＬＣを鋳型としてａｒｏＡＣ−Ｆ（ＣＴＴＡＡＡＧＴＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣ，配列番号６７）とａｒｏＡＣ−Ｒ（ＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＡＡＡＣ，配列番号６８）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＡＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後にＤｐｎＩで消化し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、Ｔ４キナーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてリン酸化した。リン酸化されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、ＤＮＡライゲーションキットを用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出し精製することでｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＣを得た。【００５５】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＬの作製］
ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＬＣを鋳型としてａｒｏＡＬ−Ｆ（ＴＣＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＧＴＧＣＣ，配列番号６９）とａｒｏＡＬ−ＥＤ−Ｒ（ＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣ，配列番号７０）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＡＬ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後にＤｐｎＩで消化し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、Ｔ４キナーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてリン酸化した。リン酸化されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、ＤＮＡライゲーションキットを用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出し精製することでｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＡＬを得た。【００５６】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＤＢの作製］
ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＤＢを鋳型としてａｒｏＬＣ−ＤＢ−ＦとａｒｏＤＢ−Ｒ（ＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＡＣ，配列番号７１）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＤＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後にＤｐｎＩで消化し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、Ｔ４キナーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてリン酸化した。リン酸化されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、ＤＮＡライゲーションキットを用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出し精製することでｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＤＢを得た。【００５７】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＢの作製］
ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＤＢを鋳型としてａｒｏＥＢ−Ｆ（ＴＣＡＣＧＣＧＧＡＣＡＡＴＴＣＣＴＣＣ，配列番号７２）とａｒｏＥＢ−Ｒ（ＧＧＡＴＣＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＴＧ，配列番号７３）プライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＥＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後にＤｐｎＩで消化し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、Ｔ４キナーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてリン酸化した。リン酸化されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、ＤＮＡライゲーションキットを用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出し精製することでｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＢを得た。【００５８】
［ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＤの作製］
ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＤＢを鋳型としてａｒｏＥＤ−Ｆ（ＴＴＡＴＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣ，配列番号７４）とａｒｏＡＬ−ＥＤ−Ｒプライマーペアを用いて、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼによりａｒｏＥＤ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後にＤｐｎＩで消化し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、Ｔ４キナーゼ（Ｔａｋａｒａ）を用いてリン酸化した。リン酸化されたＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後に、ＤＮＡライゲーションキットを用いてセルフライゲーションさせ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換して、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｔ７プロモータープライマーとＴ７ターミネータープライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、目的のプラスミドを持つ菌株を選別した。最終的に目的プラスミドを有する菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅを用いてプラスミドを抽出し精製することでｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＤを得た。【００５９】
［染色体に１遺伝子を導入した菌株の作製］
表１に示す鋳型ＤＮＡとプライマーペアを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）により、表１に示すように、大腸菌の染色体に導入するためのＤＮＡカセットを増幅した。プライマーの配列は表２に示す。【００６０】
【表１】
2019030808.tif 000002
【００６１】
【表２】
2019030808.tif 000003
【００６２】
大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＫＤ４６を１０ｍＭのアラビノースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地でＯＤ660の値が０．５程度になるまで培養した。培養液を氷冷した後、３ｍｌの培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を捨てた。菌体を氷冷した１ｍｌの滅菌水に懸濁し、１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を捨てた。この操作をもう一度繰り返した後、菌体を５０μｌの滅菌水に懸濁し、約１００ｎｇのＤＮＡカセットを含む溶液を加えた後に、エレクトロポレーションを行った。１ｍｌのＬＢ培地を用いてエレクトロポレーションキュベットから菌体を回収し、３７℃で２．５時間振とうした後に２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｋ２（ＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣ，配列番号８７、以下同じ）と表１に示した染色体上の挿入座位から約５００ｂｐ下流に設計したプライマーのペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、染色体上の目的座位に目的のＤＮＡカセットが挿入された菌株を選別した。下流に設計したプライマーの配列は、ｌｄｈＡ座位はＤ−ｌｄｈＡ（ＣＡＧＣＧＴＴＡＡＣＴＧＧＴＴＣＧＣＧＧＴＣ，配列番号８８）、ａｄｈＥ座位はＤ−ａｄｈＥ（ＴＧＣＡＧＧＣＣＧＴＧＣＣＡＧＴＣＡＴＣＣ，配列番号８９）、ｐｆｌＤＣ座位はＤ−ｐｆｌＤＣ（ＣＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＡＡＧ，配列番号９０）、ｐｙｋＦ座位はＤ−ｐｙｋＦ（ＧＡＧＣＴＧＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＡＧ，配列番号９１）、ａｓｃＦ座位はＤ−ａｓｃＦ（ＣＧＴＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣ，配列番号９２）、ａｃｋＡ−ｐｔａ座位はＤ−ａｃｋＡ−ｐｔａ（ＣＣＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＧ，配列番号９３）とした。なお、作製した菌株（染色体に１遺伝子が導入された菌株）の関連する遺伝子型を表３に示す。【００６３】
【表３】
2019030808.tif 000004
【００６４】
［Ｐ１ファージライセートの調製］
染色体に１遺伝子を導入した菌株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ液体培地に植菌し、３７℃でＯＤ660が０．１程度になるまで培養した。１Ｍの塩化カルシウムを５０μｌ添加し、さらに１００μｌのＰ１ファージ溶液（＞１０8ｐｆｕ／ｍｌ）を添加して３７℃で３〜４時間程度培養した。１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを０．２μｍのポアサイズの滅菌フィルターでろ過することで、Ｐ１ファージライセートを得た。【００６５】
［Ｐｈｅ１株の作製］
ｐＥＴ２１ａ−ＦＲＴ−ａｒｏＧfbrを鋳型としてｄｅｌｔａ−ｔｙｒＲ（ＧＴＧＴＣＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣ，配列番号９４）とｄｅｌｔａ−ｔｙｒＲ−ＦＲＴ−Ｒ（ＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＣＣＡＴＣＡＧＧＣＡＴＡＴＴＣＧＣＧＣＴＴＡＣＴＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣＧ，配列番号９５）プライマーペアを用いて、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）によりＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＧfbrのＤＮＡを増幅した。得られたＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した後にＤｐｎＩで消化し、再びＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製した。
大腸菌ＭＧ１６５５（ＤＥ３）／ｐＫＤ４６を１０ｍＭのアラビノースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地でＯＤ660の値が０．５程度になるまで培養した。培養液を氷冷した後、３ｍｌの培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を捨てた。菌体を氷冷した１ｍｌの滅菌水に懸濁し、１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を捨てた。この操作をもう一度繰り返した後、菌体を５０μｌの滅菌水に懸濁し、約１００ｎｇのＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＧfbrを含むＤＮＡ溶液を加えた後に、エレクトロポレーションを行った。１ｍｌのＬＢ培地を用いてエレクトロポレーションキュベットから菌体を回収し、３７℃で２．５時間振とうした後に２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地を用いて３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｔｙｒＲ（ＣＧＴＡＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧ，配列番号９６）プライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、ｔｙｒＲ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＧfbrが挿入された菌株を選別した。
つぎにこの株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、ＯＤ660の値が０．５程度になるまで培養した。培養液を氷冷した後、１ｍｌの培養液を１０，０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離し、上清を捨てた。菌体を１００μｌのＴＳＳ溶液（１０％ポリエチレングリコール３３５０、５％ジメチルスルホキシド、７０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１Ｍ塩化カリウム、３０ｍＭ塩化カルシウム）に懸濁し、５０ｎｇ／μｌのｐＣＰ２０を１μｌ添加し、氷中で３０分間静置した。４２℃で９０秒間ヒートショックした後に氷中で２分間静置し、９００μｌのＬＢ培地を加え、１００μｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布した。３０℃で一晩培養し、出現したコロニーをＬＢ寒天培地にストリークして、４２℃で一晩培養した。つぎに、出現したコロニーを新たなＬＢ寒天培地にストリークして、３７℃で一晩培養した。Ｕ−ｔｙｒＲ（ＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＧＣＡＴＣＧＣＣＡＣＧＣ，配列番号９７）とＤ−ｔｙｒＲプライマーペアを用いて、ｔｙｒＲ座位に挿入されたＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＧfbrからカナマイシン耐性遺伝子が除去されたことを確認し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr株を得た。
つぎにこの株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｌｄｈＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｌｄｈＡ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｐｈｅＡfbrが挿入されていることを確認した。
つぎにこの株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養し、ＯＤ660の値が０．５程度になるまで培養し、前述のｐＣＰ２０を用いた方法によりカナマイシン耐性遺伝子を除去することにより、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr株を得た。この株をＰｈｅ１株と命名した。【００６６】
［Ｐｈｅ２株の作製］
Ｐｈｅ１株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ２株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｄｈＥのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｄｈＥ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｐｐｓＡが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ株を得た。この株をＰｈｅ２株と命名した。【００６７】
［Ｐｈｅ３株の作製］
Ｐｈｅ２株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ３株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｆｌＤＣのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｆｌＤＣ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｔｋｔＡが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7−ｔｋｔＡ株を得た。この株をＰｈｅ３株と命名した。【００６８】
［Ｐｈｅ４株の作製］
Ｐｈｅ２株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ４株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｆｌＤＣのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｆｌＤＣ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ株を得た。この株をＰｈｅ４株と命名した。【００６９】
［Ｐｈｅ５株の作製］
Ｐｈｅ１株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ８株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＥＤＢが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ株を得た。この株をＰｈｅ５株と命名した。【００７０】
［Ｐｈｅ６株の作製］
Ｐｈｅ３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ８株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＥＤＢが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ株を得た。この株をＰｈｅ６株と命名した。【００７１】
［Ｐｈｅ７株の作製］
Ｐｈｅ４株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ８株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＥＤＢが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ株を得た。この株をＰｈｅ７株と命名した。【００７２】
［Ｐｈｅ８株の作製］
Ｐｈｅ１株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ９株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＬＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ８株と命名した。【００７３】
［Ｐｈｅ９株の作製］
Ｐｈｅ３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ９株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＬＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ９株と命名した。【００７４】
［Ｐｈｅ１０株の作製］
Ｐｈｅ４株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ９株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＬＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ１０株と命名した。【００７５】
［Ｐｈｅ１１株の作製］
Ｐｈｅ５株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ９株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＬＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ１１株と命名した。【００７６】
［Ｐｈｅ１２株の作製］
Ｐｈｅ６株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ９株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＬＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ１２株と命名した。【００７７】
［Ｐｈｅ１３株の作製］
Ｐｈｅ７株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ９株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＬＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ１３と命名した。Ｐｈｅ１３は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（＃１２２，２−５−８  Ｋａｚｕｓａｋａｍａｔａｒｉ，Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ  ２９２−０８１８，Ｊａｐａｎ）に寄託した（受託日２０１７年７月２０日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５１４）。【００７８】
［Ｐｈｅ１４株の作製］
Ｐｈｅ１０株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ６株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＢが挿入されていることを確認した。作製したＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＢ株をＰｈｅ１４株と命名した。【００７９】
［Ｐｈｅ１５株の作製］
Ｐｈｅ１９株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１４株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＥＢが挿入されていることを確認した。作製したＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＣ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＥＢ株をＰｈｅ１５株と命名した。【００８０】
［Ｐｈｅ１６株の作製］
Ｐｈｅ１９株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１５株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＤＢが挿入されていることを確認した。作製したＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＣ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＤＢ株をＰｈｅ１６株と命名した。【００８１】
［Ｐｈｅ１７株の作製］
Ｐｈｅ１９株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ６株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＢが挿入されていることを確認した。作製したＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＣ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ａｒｏＢ株をＰｈｅ１７株と命名した。【００８２】
［Ｐｈｅ１８株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１０株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＬが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬ株を得た。この株をＰｈｅ１８株と命名した。【００８３】
［Ｐｈｅ１９株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１１株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＡＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＣ株を得た。この株をＰｈｅ１９株と命名した。【００８４】
［Ｐｈｅ２０株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１２株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｐｙｋＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｐｙｋＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＬＣが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ２０株と命名した。【００８５】
［Ｐｈｅ２１株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１３株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＥＤが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ２１株と命名した。【００８６】
［Ｐｈｅ２２株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１４株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＥＢが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ２２株と命名した。【００８７】
［Ｐｈｅ２３株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ１５株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｓｃＦのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｓｃＦ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ａｒｏＤＢが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＰｈｅ２３株と命名した。【００８８】
［Ｐｈｅ２４株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ７株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｃｋＡ−ｐｔａのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のａｃｋＡ−ｐｔａ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｔｙｒＢが挿入されていることを確認した。作製したＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＣ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ａｃｋＡ−ｐｔａ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｔｙｒＢ株をＰｈｅ２４株と命名した。【００８９】
［Ｔｙｒ７株の作製］
Ｐｈｅ７株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ５株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｌｄｈＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｌｄｈＡ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｔｙｒＡfbrが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｔｙｒＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ株を得た。この株をＴｙｒ７と命名した。【００９０】
［Ｔｙｒ１０株の作製］
Ｐｈｅ１０株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ５株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｌｄｈＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｌｄｈＡ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｔｙｒＡfbrが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｔｙｒＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＴｙｒ１０と命名した。【００９１】
［Ｔｙｒ１３株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＳ５株のＰ１ファージライセートを２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｌｄｈＡのプライマーペアを用いたコロニーダイレクトＰＣＲを行い、得られた株のｌｄｈＡ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｔｙｒＡfbrが挿入されていることを確認した。つぎに、Ｐｈｅ１株の作製で記載した方法に基づいて、カナマイシン耐性遺伝子を除去し、ＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｔｙｒＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ株を得た。この株をＴｙｒ１３と命名した。Ｔｙｒ１３は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（＃１２２，２−５−８  Ｋａｚｕｓａｋａｍａｔａｒｉ，Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ  ２９２−０８１８，Ｊａｐａｎ）に寄託した（受託日２０１７年７月２０日、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５１３）。【００９２】
［２ＰＥ２株の作製］
Ｐｈｅ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＡＲ−Ｇ８４のＰ１ファージライセート（非特許文献３、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：６２０３−６２１６，２０１２）を２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ｍｔｌＡ（ＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣ，配列番号９８）のプライマーペアを用い、得られた株のｍｔｌＡ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｉｐｄＣが挿入されていることを確認した。作製したＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ｍｔｌＡ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｉｐｄＣ株を２ＰＥ２株と命名した。なお、２ＰＥ１株は既報（非特許文献３、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：６２０３−６２１６，２０１２）に記載されているＰＡＲ−６０株に相当する。【００９３】
［４ＨＬＡ２株の作製］
Ｔｙｒ１３株を５ｍｌのＬＢ液体培地を用いて３７℃で一晩培養した。５０μｌの１Ｍ塩化カルシウムを加えて良く撹拌した後、２００μｌを１．５ｍｌチューブに移した。そこにＡＲ−Ｇ３９のＰ１ファージライセート（非特許文献３、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：６２０３−６２１６，２０１２）を２０μｌ加えて混合し、３７℃で２０分間恒温した。１Ｍのクエン酸３ナトリウム溶液を１００μｌとＬＢ液体培地を７００μｌ加えて混合した後に、３７℃でさらに４０分間恒温した。２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に菌液を塗布し、３７℃で一晩培養した。Ｋ２とＤ−ａｃｓ（ＣＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＣＡＴＴＡＴＴＡＡＧＡＣＧＧＴＣ，配列番号９９）のプライマーペアを用い、得られた株のａｃｓ座位にＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｌｄｈＡが挿入されていることを確認した。作製したＭＧ１６５５（ＤＥ３）  ｔｙｒＲ：：ＰT7−ａｒｏＧfbr  ｌｄｈＡ：：ＰT7−ｐｈｅＡfbr  ａｄｈＥ：：ＰT7−ｐｐｓＡ  ｐｆｌＤＣ：：ＰT7(-8TC)−ｔｋｔＡ  ｐｙｋＦ：：ＰT7−ａｒｏＡＬＣ  ａｓｃＦ：：ＰT7−ａｒｏＥＤＢ  ａｃｓ：：ＦＲＴ−Ｋｍ−ＦＲＴ−ＰT7−ｌｄｈＡ株を４ＨＬＡ２株と命名した。なお、４ＨＬＡ１株は既報（非特許文献３、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：６２０３−６２１６，２０１２）に記載されているＰＡＲ−３株に相当する。【００９４】
［菌株の培養と生産物の定量］
菌株を５ｍｌのＬＢ液体培地または０．８％のグルコースを含むＬＢ液体培地を用いて２７℃で一晩前培養した。５０μｌの前培養液をＭ９Ｍ２液体培地に加えて植菌し、３７℃でＯＤ660の値が０．３程度になるまで振とう培養した。Ｍ９Ｍ２液体培地は、９００ｍｌの蒸留水に１０ｇのグルコース、６ｇのリン酸水素２ナトリウム、３ｇのリン酸２水素カリウム、０．５ｇの塩化ナトリウム、および４ｇの塩化アンモニウムを加え、さらに１Ｍ 塩化マグネシウムを１ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌチアミン塩酸塩を１ｍｌ、１００ｍＭ硫酸鉄（二価）を０．５ｍｌ、１Ｍ塩化カルシウムを１００μｌ、微量金属塩溶液を１０μｌ加え、１Ｌにメスアップしたものを０．２μｍのフィルターを用いてろ過除菌したものを用いた。微量金属塩溶液は１００ｍｌの蒸留水中に０．３７１ｇの（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ、２．４７３ｇのＨ3ＢＯ3、０．７１４ｇのＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．２３９ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ、１．５８３ｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．２８８ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏを含む。なお、２ＰＥ１株と２ＰＥ２株を培養する場合にはＭ９Ｍ２培地にフェニルアラニンを２ｍＭとなるように加えた。イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度が１ｍＭとなるように添加し、２７℃で４４時間振とう培養した。９５０μｌの蒸留水と２００μｌのメタノールと５０μｌの培養液を混合し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルターを用いてろ過したものをＨＰＬＣのサンプルとして用いた。ＨＰＬＣは既報（非特許文献３、Ｋｏｍａ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７８：６２０３−６２１６，２０１２）に記載されているとおりに行い、培養液中のフェニルアラニン、チロシン、２−フェニルエタノール、または４−ヒドロキシフェニル乳酸の生成量を定量した。
その結果を表４〜７に示す。これらの表において、Ｐｈｅはフェニルアラニンを、Ｔｙｒはチロシンを、２ＰＥは２−フェニルエタノールを、４ＨＰＬＡは４−ヒドロキシフェニル乳酸、Ｇｌｃはグルコースを表す。【００９５】
【表４】
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【００９６】
表４に示すとおり、Ｐｈｅ１１株〜Ｐｈｅ１７株、Ｐｈｅ１９株、Ｐｈｅ２２株、及びＰｈｅ２３株は、良好なフェニルアラニンの生成量を示した。また、これらの株は、前培養においてグルコースを添加していなくても良好なフェニルアラニンの生成量を示した。
Ｐｈｅ１３株とＰｈｅ２４株との比較から、ｔｙｒＢの過剰発現は、フェニルアラニン産生にネガティブな影響があることが認められた。
また、Ｐｈｅ１１株〜Ｐｈｅ１７株、Ｐｈｅ１９株、Ｐｈｅ２２株、及びＰｈｅ２３株の結果から、良好なフェニルアラニンの産生には、少なくともａｒｏＡ、ａｒｏＢ、ａｒｏＣ、ａｒｏＧfbr、及びｐｈｅＡfbrの過剰発現が必要であると認められる。
Ｐｈｅ１１株〜Ｐｈｅ１３株の比較から、ｐｐｓＡの過剰発現はフェニルアラニン産生に好ましく、ｔｋｔＡの過剰発現も好ましいが、ｔｋｔＡは誘導が弱まる変異の入ったＴ７プロモーターによって発現されることがより好ましいことが認められる。
Ｐｈｅ１３株〜Ｐｈｅ１７株、Ｐｈｅ１９株、Ｐｈｅ２２株、及びＰｈｅ２３株の結果から、ａｒｏＤ，ａｒｏＥ及びａｒｏＬは、これらのうち少なくとも１つが過剰発現することが好ましいと認められた。
表４に示すように、ａｒｏＧfbr及びｐｈｅＡfbrを過剰発現し、かつ、ａｒｏＡ、ａｒｏＢ、及びａｒｏＣの３つの遺伝子の少なくとも１つを過剰発現していないフェニルアラニン生産株では、導入した遺伝子の過剰発現による代謝負荷がかかっており、構築されたフェニルアラニンの合成経路が円滑に機能していないと考えられる。したがって、このような菌株では前培養にグルコースを添加してカタボライトリプレッションを引き起こすことにより、基底状態での遺伝子発現レベルを低下させる必要がある（例えば、Ｐｈｅ１、２、５、８、９、１０、１８、２０及び２１株）。一方、ａｒｏＧfbr及びｐｈｅＡfbrに加えてａｒｏＡ、ａｒｏＢ、及びａｒｏＣの３つの遺伝子を過剰発現している菌株では、構築されたフェニルアラニンの合成経路が円滑に機能していると考えられる。そのため、前培養でのグルコース添加の有無にかかわらず、フェニルアラニンの高生産が達成できる（例えば、Ｐｈｅ１１〜１７、１９、２２、及び２３株）。【００９７】
【表５】
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【００９８】
表５の結果から、チロシン産生に関しても表４のフェニルアラニン産生と同様の傾向があると認められた。【００９９】
【表６】
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【０１００】
【表７】
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【０１０１】
表６及び表７の結果から、Ｐｈｅ１１株〜Ｐｈｅ１７株、Ｐｈｅ１９株、Ｐｈｅ２２株、及びＰｈｅ２３株やＴｙｒ１３株に、さらに代謝酵素をコードする遺伝子を導入することで、その他の芳香族化合物の高生産が可能になることが認められた。
【受託番号】
【０１０２】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５１３
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２５１４
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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