(57)【要約】［課題］免疫組織化学染色におけるスライドガラスの着色を防止する効果の高いブロッキング剤の提供。［解決手段］有効成分としてサクシニル化ＢＳＡを含んでなる、免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてサクシニル化ＢＳＡを含んでなる、免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
【請求項２】
前記有効成分が、ｐＨ６．２〜６．７の緩衝液に溶解されている、請求項１に記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
【請求項３】
前記有効成分が、ＭＯＰＳ緩衝液に溶解されている、請求項１または２に記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬を用いることを特徴とする、免疫組織化学染色のための方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
技術分野
本発明は、免疫組織化学染色に用いるブロッキング試薬に関する。
【０００２】
背景技術
免疫組織化学染色は、組織切片上で抗原抗体反応を利用して特定の抗原を可視化する染色方法であり、生物組織の形態学的研究の有効な手段として汎用されている。免疫組織化学染色では、一般に、病理組織標本や免疫組織化学標本をスライドガラスに貼り付けて、各種染色を行い、顕微鏡で観察するという手順が採用される。ここで使用されるスライドガラスは、ポリ−Ｌ−リジン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、ＭＡＳコート（松波硝子工業株式会社）等を用いてその表面がコーティングされており、スライドガラスと細胞や組織切片が剥離するのを防止するように工夫されている。このような切片の剥離防止効果は、コート剤のアミノ基によってガラス表面に正電荷が付与されることにより、基本的に負電荷を帯びている細胞表面と接着することによるものである。
【０００３】
免疫組織化学染色方法には、一般に、脱パラフィン、第一抗体の反応、検出系試薬の反応、および発色試薬の反応という工程が含まれる。そして、発色試薬を適用した際に、スライドガラスが試薬中の発色色素によって着色されてしまうという現象が観察されることがあり、特に、自動免疫染色装置を用いたときに多く観察される。このようなスライドガラスの着色が生じると、検体の一部、特に観察対象の周辺部分が着色されたように観察され、本来であれば着色すべきでない部分が着色しているように見えてしまうという問題がある。
【０００４】
これまで、第一抗体および検出系試薬中に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に代表されるブロッキング剤を添加する等の対策がなされており、さらにその改良技術も考案されているが（特許文献１および２）、スライドガラスの着色は完全に防ぐことはできておらず、さらなる改善が望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２１９１１１号公報
【特許文献２】特開平７−２１８５０８号公報
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ブロッキング剤として従来から用いられているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に代えて、サクシニル化ＢＳＡを用いることにより、免疫組織化学染色におけるスライドガラスの着色を低減できることを見出した。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００７】
従って、本発明の目的は、免疫組織化学染色におけるスライドガラスの着色を防止する効果の高いブロッキング剤を提供することにある。
【０００８】
本発明は、以下の発明を包含する。
（１）有効成分としてサクシニル化ＢＳＡを含んでなる、免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
（２）前記有効成分が、ｐＨ６．２〜６．７の緩衝液に溶解されている、前記（１）に記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
（３）前記有効成分が、ＭＯＰＳ緩衝液に溶解されている、前記（１）または（２）に記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬。
（４）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の免疫組織化学染色用ブロッキング試薬を用いることを特徴とする、免疫組織化学染色のための方法。
【０００９】
本発明によれば、正電荷を帯びたスライドガラス表面に検出系試薬が結合するのを防ぐことにより、スライドガラスの着色を顕著に抑制することが可能となる。また、スライドガラスの着色は、検出系試薬が直接スライドガラス表面に結合する場合以外に、スライドガラスに第一抗体が結合した場合にも発生し得るところ、本発明によれば、スライドガラスに非特異的に結合した第一抗体を乖離させる効果が高いことも確認されており、本発明は、第一抗体の非特異的結合によるスライドガラスの着色も顕著に抑制できる点で有利である。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明のブロッキング試薬は、サクシニル化ＢＳＡ（サクシニル化ウシ血清アルブミン）を有効成分として含む。
【００１１】
本発明に用いられる有効成分は、ＢＳＡをサクシニル化することにより、アミノ基上にカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を有しており、具体的には、−ＮＨ２（アミノ基）が−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨの構造に変換されている。特定の理論に限定するわけではないが、カルボキシル基は緩衝液中で解離して負電荷を帯びるため、前記有効成分を検出系試薬と一緒に用いることにより、正電荷を帯びたスライドガラス表面に対して検出系試薬よりも高い親和性を示し、その結果、検出系試薬がスライドガラス表面に結合するのを防ぐものと考えられる。また、前記有効成分のスライドガラス表面への高い親和性により、該有効成分は、スライドガラスに一旦結合した第一抗体を乖離させることも可能になるものと考えられる。
【００１２】
ＢＳＡのサクシニル化は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、ＢＳＡのサクシニル化は、これらの水溶液に無水コハク酸を添加し、アルカリ条件下（例えばｐＨ８．０）において室温で攪拌することにより行うことができる。
【００１３】
ＢＳＡのサクシニル化の確認は、残存するアミノ基を定量することにより行うことができる。このような定量は、タンパク質中のアミノ基の定量法として当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム二水和物（ＴＮＢＳ）は、アミノ基と特異的に反応し、３４０〜３５０ｎｍに極大吸収を有するトリニトロフェニル（ＴＮＰ）誘導体を生成させるため、３４０〜３５０ｎｍにおける吸光度を測定することによりアミノ基の定量が可能である。その際、グリシンなどの１つのアミノ基を有するアミノ酸を標準物質として使用し、様々な濃度の標準物質を含む試料を用いて検量線を作成し、この検量線と測定値とを比較することにより、正確にアミノ基を定量することができる。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる有効成分をＴＮＢＳを用いた上記の方法により分析したときのアミノ酸濃度は、ほぼ０μg/mlと換算され、従って、本発明に用いられる有効成分におけるアミノ基数は、同方法において１未満とされる。
【００１４】
本発明における有効成分は、液体中に溶解された形で組織やスライドガラスに接触させることができる。その際の液体中における有効成分の濃度は、従来から用いられているＢＳＡの濃度と同程度であってよく、特に限定されるものではない。例えば、本発明における有効成分は、組織やスライドガラスに適用される液体中に０．１ｗ／ｖ％以上の濃度で溶解されていれば十分にブロッキング効果を発揮することができるが、好ましくは０．１５ｗ／ｖ％以上、より好ましくは０．３５ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上とされる。本発明における有効成分は、その使用量が多ければ多いほど良好なブロッキング効果が得られるため、使用量（濃度）の上限は特に限定されないが、通常の免疫組織化学染色に用いられるＢＳＡの量に鑑み、３．０ｗ／ｖ％程度とするのが適切であろう。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のブロッキング試薬は、有効成分であるサクシニル化ＢＳＡを上記の濃度で含んでなるものとされる。
【００１５】
本発明における有効成分は、緩衝液に溶解されたものとすることができる。緩衝液は、前記有効成分におけるカルボキシル基が負電荷を帯びることを可能とするものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ｐＨ６．２〜６．７の緩衝液とすることができる。また、緩衝液の種類も特に限定されるものではなく、免疫組織化学染色に用いられる緩衝液であればいかなるものであってもよいが、好ましくはＭＯＰＳ緩衝液とされる。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明における有効成分は、ｐＨ６．２〜６．７のＭＯＰＳ緩衝液に溶解されたものとされる。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、本発明における有効成分は、StabilZyme(登録商標) HRP Conjugate Stabilizer（SurModics社製）に溶解されたものとされる。StabilZyme(登録商標) HRP Conjugate Stabilizerは、ｐＨ６．２〜６．７のＭＯＰＳ緩衝液を含有し、そこにＢＳＡが溶解されている。
【００１７】
本発明のブロッキング剤は、免疫組織化学染色において好適に用いることができる。本発明のブロッキング剤が適用可能な免疫組織化学染色は特に限定されるものではなく、いかなる態様の免疫組織化学染色であってもよい。特に、本発明のブロッキング剤は、正電荷を帯びた表面を有する担体（スライドガラスなど）を用いる免疫組織化学染色において好適に用いることができる。
【００１８】
免疫組織化学染色の方法に用いられる発色系もまた特に限定されるものではなく、いかなる発色系も用いることができる。例えば、免疫組織化学染色によく用いられるペルオキシダーゼ（西洋ワサビペルオキシダーゼなど）とその発色性基質の組合せを用いる場合にも、本発明のブロッキング剤は好適に用いられる。
【００１９】
免疫組織化学染色するための組織片としては、パラフィン切片、凍結切片のいずれでもよく、いかなる組織でも使用することができる。特に、非特異的反応を抑制しにくい複雑な成分から構成される器官・組織のブロッキングに、本発明のブロッキング試薬を用いることは有効である。
【実施例】
【００２０】
以下の実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２１】
実施例においては、次のプロトコールを用いた。【００２２】
１．サクシニル化
(1)30 gのBSA (Sigma-Aldrich社)を300 mlの蒸留水に溶解する。
(2)(1)のBSA溶液にpH電極をセットする。
(3)7.5 gの無水コハク酸（粉末）を少量ずつ加える。この際、水酸化ナトリウム溶液にて反応溶液のpHを8.0に保つ。
(4)全量添加後、室温で30分間攪拌する。
(5)透析膜 (Thermo Fisher Scientific社, Dialysis Membrane)へ(4)のサクシニル化BSA溶液を半量ずつ入れ、蒸留水で一晩透析する。
(6)新しく蒸留水を入れ替え、一晩透析する。
(7)透析したサクシニル化BSA溶液を、5.0 μmフィルター、0.45μｍフィルターの順にろ過する。
(8)5日間凍結乾燥する。
(9)残存するアミノ基を定量する。【００２３】
２．残存するアミノ基の測定
(1)スタンダード（STD）およびサンプル溶液を調製する。
STD : Glycine 30, 20, 10, 5, 0 μg/ml
Sample : サクシニル化BSA 20, 10 mg/ml
Buffer : 4％ 炭酸水素ナトリウムバッファー（pH8.5）
(2)1 mlのSTDおよびサンプルに1 mlの0.1％ TNBS溶液を加え、40℃で2時間反応させる。
(3)続いて、1 mlの10％ SDS溶液および0.5 mlの1N HClを加え、335 nmの吸光度を測定する。
(4)STD 0μg/mlをブランクとして、検量線を作成する。サクシニル化BSAのアミノ基数を計算する。（Glycineのアミノ基数を1とする）
サクシニル化BSAの測定値から、検量線を用いることによりアミノ酸濃度はほぼ0μg/mlと換算され、サクシニル化後のアミノ基数が1未満となることを確認することで、完全にアミノ基がカルボキシル基に置換されたことを確認する。【００２４】
３．脱パラフィン処理と抗原賦活化処理（胃正常組織）
(1)胃の正常組織のパラフィン包埋切片（薄切厚3μm）を貼り付けたスライドガラス（松波硝子工業社製、MASコートスライドグラス）を、キシレン層に3分間×3回静置し、脱パラフィンを行った。
(2)その後、エタノール層に3分間×4回静置し、親水化を行った。
(3)最後のエタノール層中での静置後、リン酸緩衝液(pH7.6)にて3分間×3回の洗浄を行った。
(4)EDTA含有Tris-HCl緩衝液(pH9.0)の入ったプラスチックドーゼに脱パラフィン処理を行ったスライドガラスをセットし、卓上オートクレーブ（アルプ株式会社製）の中に入れ、121℃で20分間抗原賦活化処理を行った。
(5)オートクレーブでの抗原賦活化処理後、機械内の圧力が下がっていることを確認し、プラスチックドーゼを取り出し、20分間室温静置を行った。
(6)20分間経過後、スライドガラスをリン酸緩衝液(pH7.6)中に移動し、5分間×3回の静置により洗浄を行った。【００２５】
４．脱パラフィン処理と抗原賦活化処理（乳癌組織）
胃正常組織と同様の方法で脱パラフィン処理と抗原賦活化処理を行った。【００２６】
５．自動免疫染色装置を使用した免疫組織化学染色
(1)抗原賦活のための加熱処理後、リン酸緩衝液(pH7.6)で洗浄を行ったスライドガラスを、自動免疫染色装置（ヒストステイナー 36A、ニチレイバイオサイエンス）のスライドラックにセットし、組織が乾燥しないようにリン酸緩衝液(pH7.6)等で組織上を覆った。
(2)PBS（ヒストステイナー用）（ニチレイバイオサイエンス社）でセットしたスライドガラスを洗浄した。
(3)風乾燥後、3%過酸化水素水（ニチレイバイオサイエンス社）をセットしたスライドガラスに滴下し、5分間反応させた。
(4)5分間の反応終了後、PBS（ヒストステイナー用）（ニチレイバイオサイエンス社）で洗浄した。
(5)風乾燥後、乳癌組織についてはER(1D5)マウスモノクローナル希釈済抗体（ヒストステイナー用）（ニチレイバイオサイエンス社）をスライドガラスに滴下し、胃正常組織についてはリン酸緩衝液(pH7.6)をスライドガラスに滴下し、室温で30分間反応させた。
(6)風乾燥後、以下の各実施例に記載の各希釈液にて調製したHRP標識ヤギ抗マウスポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社）をスライドガラスに滴下し、室温で30分間反応させた。
(7)30分間の反応終了後、PBS（ヒストステイナー用）（ニチレイバイオサイエンス社）で2回洗浄した。
(8)染色のためのHRPの基質であるDAB基質キット（ヒストステイナー用）（ニチレイバイオサイエンス社）を用いて調製したDAB溶液をスライドガラスに滴下し、室温で10分間反応させた。
(9)10分間の反応後、PBS（ヒストステイナー用）（ニチレイバイオサイエンス社）で1回洗浄し、その後、水で1回洗浄した。
(10)染色したスライドガラスを自動免疫染色装置から取り出し、5分間流水洗浄を行った。
(11)流水洗浄後、水気を切り、マイヤーヘマトキシリンと30秒間反応させた。
(12)30秒間の反応後、5分間流水洗浄を行った。
(13)流水洗浄後、水気を切り、エタノール層通過×3回、エタノール層静置3分間×1回、キシレン層通過1回、キシレン層静置5分間×2回を行い、脱水・透徹を行った。
(14)非水溶性封入剤（ニチレイバイオサイエンス社）により、封入を行った。【００２７】
実施例１：ブロッキング剤の製造
プロトコール１の手順に従い、サクシニル化ＢＳＡを作製した。作製したサクシニル化ＢＳＡについて、プロトコール２に従って残存するアミノ基数を測定した結果、アミノ基数が１未満であり、全てのアミノ基が完全にカルボキシル基に置換されていることを確認した。【００２８】
また、作製したサクシニル化ＢＳＡの等電点を測定したところ、以下のような結果であった。
ＢＳＡ：約4.8
サクシニル化ＢＳＡ：約4.7【００２９】
ＢＳＡをサクシニル化することにより、等電点がわずかに低いｐＨ側にシフトした。従って、以下の実施例で使用するStabilZyme(登録商標)-HRP (pH6.2〜6.7)に溶解すると、サクシニル化ＢＳＡは陰性に荷電すると推測された。【００３０】
実施例２：組織およびスライドガラスへの非特異染色のブロッキング効果
自動免疫染色装置における組織およびスライドガラスへの非特異染色防止効果について、従来品のＢＳＡと、官能基を修飾したサクシニル化ＢＳＡとを比較した。ここでは、第一抗体は使用せず、ポリマー試薬が直接的に組織およびスライドガラスに結合して着色されることへのブロッキング効果を確認した。【００３１】
この実験は、プロトコール３およびプロトコール５に従って行った。主要な免疫組織化学染色の条件は、以下の通りである。
自動免疫染色装置：ヒストステイナー（ニチレイバイオサイエンス社）
第一抗体：使用せず、代わりにリン酸緩衝液(pH7.6)を滴下
ポリマー試薬：StabilZyme(登録商標) HRP（SurModics社製）に、以下の表に示す濃度のＢＳＡまたはサクシニル化ＢＳＡを溶解した液体で、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社）を30μg/mLとなるように希釈し、室温で３０分間反応させた。非特異染色が起こりやすい状況を再現するため、抗マウス−ＨＲＰポリマーの濃度は通常の染色条件よりも高くした。
発色：ＤＡＢで５分間
着色観察方法：スライド着色は目視で観察した。組織上の非特異染色は、オリンパス社製光学顕微鏡BX53を使用し、倍率100〜400倍で観察した。【００３２】
結果を以下の表１に示す。
【表１】
2019130560.tif 000002
【００３３】
表１に示すように、StabilZyme(登録商標)のみでは組織上に強い非特異染色が観察されるが、ブロッキング剤を加えると抑制された。また、ブロッキング剤としてＢＳＡを添加しても非特異染色が確認されたが、サクシニル化ＢＳＡを添加した場合にはほぼ確認されなかった。【００３４】
また、スライドガラスについても、ブロッキング剤としてＢＳＡを用いた場合よりも、サクシニル化ＢＳＡを用いたサンプルの方が高いスライド着色防止効果が得られた。【００３５】
以上より、サクシニル化ＢＳＡは、非修飾のＢＳＡと比較して、組織上に検出系試薬が直接結合するのを防ぎ、非特異染色が検出されるのを防ぐ効果が優れていることが確認された。また、サクシニル化ＢＳＡは、非修飾のＢＳＡと比較して、検出系試薬が直接スライドガラスに結合するのを防ぎ、着色を防止する効果が高いことが確認された。【００３６】
実施例３：スライドガラスへの非特異染色のブロッキング効果
自動免疫染色装置におけるスライドガラスへの非特異染色防止効果について、従来品のＢＳＡと、官能基を修飾したサクシニル化ＢＳＡとを比較した。ここでは、第一抗体を使用し、第一抗体がスライドガラスに結合し、その第一抗体を検出することによって起こるスライド着色のブロッキング効果を確認した。【００３７】
この実験は、プロトコール４およびプロトコール５に従って行った。主要な免疫組織化学染色の条件は、以下の通りである。
自動免疫染色装置：ヒストステイナー（ニチレイバイオサイエンス社）
第一抗体：エストロゲンレセプター(1D5)マウスモノクローナル抗体（ニチレイバイオサイエンス社）
ポリマー試薬：StabilZyme(登録商標) HRP（SurModics社製）に、以下の表に示す濃度のＢＳＡまたはサクシニル化ＢＳＡを溶解した液体で、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスポリマー試薬（ニチレイバイオサイエンス社）を10μg/mLとなるように希釈し、室温で３０分間反応させた。
発色：ＤＡＢで５分間
着色観察方法：スライド着色は目視で観察した。【００３８】
結果を以下の表２に示す。
【表２】
2019130560.tif 000003
【００３９】
表２に示すように、サクシニルＢＳＡは、非修飾のＢＳＡと比較して、第一抗体を介したスライドガラスの非特異染色を防止する効果が高いことが確認された。
【国際調査報告】
2019130560.tif 000004
2019130560.tif 000005
2019130560.tif 000006
2019130560.tif 000007