(57)【要約】  イノシトールとデキストリンとをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で反応させて前記イノシトールに糖が結合したイノシトール誘導体を生成させ、前記イノシトール誘導体と前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼとを含む溶液を得る工程と、前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを、限外ろ過膜を用いて除去する工程と、を含み、前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの失活処理を行わない、ことを特徴とするイノシトール誘導体の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イノシトールとデキストリンとをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で反応させて前記イノシトールに糖が結合したイノシトール誘導体を生成させ、前記イノシトール誘導体と前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼとを含む溶液を得る工程と、
前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを、限外ろ過膜を用いて除去する工程と、を含み、
前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの失活処理を行わない、
イノシトール誘導体の製造方法。
【請求項２】
前記限外ろ過膜の分画分子量が１０００〜１０００００である、請求項１に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
【請求項３】
前記限外ろ過膜を用いた前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの除去を、０〜６０℃の温度条件下で行う、請求項１又は２に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
【請求項４】
前記限外ろ過膜を用いた前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの除去を、クロスフロー型の限外ろ過で行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
【請求項５】
前記イノシトールと前記デキストリンとを反応させる反応を、温度が２０〜８０℃であり、且つｐＨが３〜９である条件下で行う、請求項１〜４のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
【請求項６】
前記デキストリンがβ−シクロデキストリンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
【請求項７】
前記イノシトールがｍｙｏ−イノシトールである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イノシトール誘導体の製造方法に関する。
本願は、２０１７年９月４日に、日本に出願された特願２０１７−１６９７７３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
イノシトールに糖類が結合したイノシトール誘導体は、肌に潤いを与え、皮膚を健やかに保つ効果があることが知られている（特許文献１）。このようなイノシトール誘導体の合成方法としては、イノシトールとオリゴ糖の一種であるシクロデキストリンとをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下、「ＣＧＴａｓｅ」ともいう。）の存在下で反応させ、イノシトール残基が結合した糖あるいはオリゴ糖を得る方法が知られている（特許文献２）。
ＣＧＴａｓｅを用いた酵素反応において、反応終了後に酵素を失活させる方法としては、反応液を加熱する方法や、酸、アルカリなどの薬剤を添加する方法が一般的である。たとえば、特許文献１と特許文献２では、イノシトールとシクロデキストリンをＣＧＴａｓｅ存在下で反応させた後、反応液を沸騰させることで酵素を失活させている。
一方、ＣＧＴａｓｅを用いた酵素反応で、酵素を失活させずに生成物を回収する方法も知られている。たとえば、特許文献３では、デンプンにＣＧＴａｓｅを作用させてサイクロデキストリンを製造する方法において、反応系から限外濾過法によりサイクロデキストリンを分離することが記載されている。また、特許文献４では、デンプンとショ糖との混液からなる基質にＣＧＴａｓｅを作用させ、生成したマルトオリゴスクロースを限外濾過膜にて分離することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第４６２４８３１号公報
【特許文献２】特開昭６３−１９６５９６号公報
【特許文献３】特開昭６３−１３３９９８号公報
【特許文献４】特開平１−１７９６９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、加熱や薬剤添加により酵素を失活させた場合、酵素成分の変成物の混入や、生成物であるイノシトール誘導体の着色、変質が起こることがあった。また、特許文献３及び特許文献４のように、活性酵素を限外ろ過膜により分離する方法は、単に反応液中から酵素を除去する目的で行われており、生成物の精製度の向上までは考慮されていなかった。さらに、活性酵素による過反応が起こるリスクもあった。
そこで、本発明は、生成物であるイノシトール誘導体を変質させずに活性酵素を除去してイノシトール誘導体の精製度を向上させ、高品質のイノシトール誘導体を得ることのできる、イノシトール誘導体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の態様を含む。
（１）イノシトールとデキストリンとをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で反応させて前記イノシトールに糖が結合したイノシトール誘導体を生成させ、前記イノシトール誘導体と前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼとを含む溶液を得る工程と、前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを、限外ろ過膜を用いて除去する工程と、を含み、前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの失活処理を行わない、イノシトール誘導体の製造方法。
（２）前記限外ろ過膜の分画分子量が１０００〜１０００００である、（１）に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
（３）前記限外ろ過膜を用いた前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの除去を、０〜６０℃の温度条件下で行う、（１）又は（２）に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
（４）前記限外ろ過膜を用いた前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの除去を、クロスフロー型の限外ろ過で行う、（１）〜（３）のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
（５）前記イノシトールと前記デキストリンとを反応させる反応を、温度が２０〜８０℃であり、且つｐＨが３〜９である条件下で行う、（１）〜（４）のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
（６）前記デキストリンがβ−シクロデキストリンである、（１）〜（５）のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
（７）前記イノシトールがｍｙｏ−イノシトールである、（１）〜（６）のいずれか一項に記載のイノシトール誘導体の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、精製度が高く且つ高品質のイノシトール誘導体を得ることのできる、イノシトール誘導体の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
一実施形態において、本発明は、イノシトールとデキストリンとをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの存在下で反応させて前記イノシトールに糖が結合したイノシトール誘導体を生成させ、前記イノシトール誘導体と前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼとを含む溶液を得る工程（以下、「工程Ｉ」という。）と、前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを、限外ろ過膜を用いて除去する工程（以下、「工程ＩＩ」という。）と、を含み、前記溶液中の前記シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼの失活処理を行わない、ことを特徴とするイノシトール誘導体の製造方法を提供する。以下、各工程について説明する。
【０００８】
［工程Ｉ］
工程Ｉは、イノシトールとデキストリンとをシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）の存在下で反応させて前記イノシトールに糖が結合したイノシトール誘導体を生成させ、前記イノシトール誘導体と前記ＣＧＴａｓｅとを含む溶液を得る工程である。
【０００９】
（イノシトール）
イノシトールとは、Ｃ６Ｈ６（ＯＨ）６で表される環状六価アルコールである。イノシトールには、ｃｉｓ−イノシトール、ｅｐｉ−イノシトール、ａｌｌｏ−イノシトール、ｍｙｏ−イノシトール、ｍｕｃｏ−イノシトール、ｎｅｏ−イノシトール、ｃｈｉｒｏ−イノシトール（Ｄ体及びＬ体が存在する。）、ｓｃｙｌｌｏ−イノシトールの、９つの立体異性体が存在する。
【００１０】
本工程において用いるイノシトールは、上記の異性体のうち、生理活性を有するｍｙｏ−イノシトールであることが好ましい。イノシトールは、米糠から抽出する方法、化学合成法、及び発酵法等により合成することができる。また、市販のものを用いてもよい。ｍｙｏ−イノシトールの構造式を以下に示す。
【００１１】
【化１】
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【００１２】
（デキストリン）
デキストリンは、デンプンを化学的又は酵素的方法で低分子化したものの総称である。
本工程において用いるデキストリンは、特に限定されないが、イノシトール誘導体の生成効率の観点から、例えば、重合度７以上のデキストリンの含有率が８５質量％以上、好ましくは９０質量％以上、より好ましくは９８質量％以上であるものを用いることができる。
また、デキストリンは、イノシトール誘導体の生成効率の観点から、シクロデキストリンであることが好ましい。シクロデキストリンは、Ｄ−グルコースがα−１，４−グリコシド結合により結合して環状構造をとった環状オリゴ糖である。シクロデキストリンとしては、特に限定されないが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等を挙げることができる。これらの中でも、工業的に安価で安定供給可能なことから、β−シクロデキストリンを用いることが好ましい。
【００１３】
デキストリンは、デンプンを化学的又は酵素的方法で低分子化することにより得ることができる。また、シクロデキストリンは、デンプンにシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させることで得ることができる。デキストリン又はシクロデキストリンは、市販のものを用いてもよい。
【００１４】
（イノシトール誘導体）
本実施形態の製造方法により製造されるイノシトール誘導体は、イノシトールに糖が結合したイノシトール誘導体である。イノシトール誘導体において、糖は、イノシトールの水酸基に結合している。糖は、イノシトール分子内に６つ存在する水酸基のいずれか１つに結合していてもよく、いずれか２つ以上に結合していてもよい。
【００１５】
本実施形態の製造方法により製造されるイノシトール誘導体において、イノシトールに結合する糖は、グルコース又はグルコースを構成単位として含むオリゴ糖である。例えば、１分子のイノシトールに１又は複数のグルコースが結合していてもよく、１分子のイノシトールに１又は複数のオリゴ糖が結合していてもよく、１分子のイノシトールに１又は複数のグルコース及び１又は複数のオリゴ糖が結合していてもよい。イノシトール誘導体において、１分子のイノシトールに結合したグルコース又はオリゴ糖の合計は、単糖単位に換算して１以上であり、例えば２以上であってもよく、例えば３以上であってもよく、例えば４以上であってもよい。
【００１６】
本明細書において、単糖とは、それ以上加水分解されない糖類を意味し、多糖を形成する際の構成要素となる化合物を意味する。単糖は、糖類の最小構成単位であるということもできる。また、本明細書において、「単糖単位」とは、単糖に相当する化学構造を意味する。「単糖単位」は、単糖に由来する化学構造であるということもできる。例えば二糖を単糖単位に換算すると２であり、三糖を単糖単位に換算すると３である。例えば、α−シクロデキストリンを単糖単位に換算すると６であり、β−シクロデキストリンを単糖単位に換算すると７であり、γ−シクロデキストリンを単糖単位に換算すると８である。
【００１７】
本実施形態の製造方法により製造されるイノシトール誘導体は、単糖単位に換算して異なる数の糖が結合したイノシトール誘導体の混合物であってもよい。例えば、イノシトール誘導体は、イノシトール１分子あたり、１の単糖単位の糖が結合したものと、２の単糖単位の糖が結合したものと、３の単糖単位の糖が結合したものと、４の単糖単位の糖が結合したものと、５以上の単糖単位の糖が結合したものと、の混合物であってもよい。
【００１８】
（シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ：ＣＧＴａｓｅ）
ＣＧＴａｓｅは、α−１，４−グルコシド結合の形成により、α−１，４−グルカン鎖を環状化する反応を触媒する酵素である。ＣＧＴａｓｅは、デンプン等のα−１，４−グルカン鎖を有する基質に作用して、シクロデキストリンを生成する。ＣＧＴａｓｅとしては、これまでに、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、クロストリジウム(Clostridium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、クレブシエラ（Klebsiella）属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）属、サーモアナエロバクテリウム(Thermoanaerobacterium)属等の細菌に由来するものが知られている。
【００１９】
イノシトールとデキストリンとを、ＣＧＴａｓｅの存在下で反応させると、ＣＧＴａｓｅがデキストリンに作用し、イノシトールを受容体としてグルコース残基の転移が起こり、イノシトール誘導体を生成する。
【００２０】
本工程において用いるＣＧＴａｓｅは、イノシトール及びデキストリンから上述のイノシトール誘導体を生成できるものであれば、特に限定されない。上記のような細菌に由来するＣＧＴａｓｅを用いてもよく、それらの天然ＣＧＴａｓｅを改変したものを用いてもよい。ＣＧＴａｓｅとしては、例えば、特開昭６３−１９６５９６号公報、及び国際公開公報第９６／３３２６７号に記載のもの等を例示することができるが、これらに限定されない。ＣＧＴａｓｅは、市販のものを用いてもよい。
【００２１】
（イノシトール誘導体生成反応）
イノシトールとデキストリンとをＣＧＴａｓｅの存在下で反応させて、イノシトールに糖が結合したイノシトール誘導体を生成させる反応（以下、「イノシトール誘導体生成反応」という。）は、一般的な酵素反応において用いられる方法を特に制限なく用いて行うことができる。具体的には、イノシトール、デキストリン及びＣＧＴａｓｅを、適切な溶媒下で混合し、一定時間経過させることにより、イノシトール誘導体生成反応を行うことができる。
【００２２】
イノシトール誘導体生成反応において、基質及びＣＧＴａｓｅを混合するための溶媒は、一般的な酵素反応に用いられる緩衝液等を特に制限なく用いることができる。そのような緩衝液としては、例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２３】
イノシトールとデキストリンとの混合比率は、特に限定されず、製造したいイノシトール誘導体の種類に応じて適宜設定すればよい。イノシトールの比率を高くするほど、イノシトール１分子あたりに結合する糖の単糖単位数は小さくなる。逆に、デキストリンの比率を高くするほど、イノシトール１分子あたりに結合する糖の単糖単位数は大きくなる。
例えば、イノシトールに対するデキストリンの質量比（デキストリン／イノシトール）としては、１〜１２、好ましくは２〜６、より好ましくは３〜５を例示できる。
【００２４】
イノシトールの反応溶液中での濃度は、特に限定されないが、バッチ生産量の向上及び反応の長時間化の回避の観点から、１〜４００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜３００ｇ／Ｌ、より好ましくは５０〜２００ｇ／Ｌを例示できる。
デキストリンの反応溶液中での濃度は、特に限定されないが、反応効率の保持及び生産コストの抑制の観点から、１０〜１５００ｇ／Ｌ、好ましくは１００〜１０００ｇ／Ｌ、より好ましくは２００〜８００ｇ／Ｌを例示できる。
デキストリンの投入方法は、一括投入でもよく、初発投入後に追添してもよい。デキストリンを追添する場合、追添のタイミングは、特に限定されないが、例えば反応開始から４時間後、８時間後、１１時間後等を例示できる。好ましくは、デキストリンを一括投入するのがよい。
【００２５】
ＣＧＴａｓｅの反応溶液中での濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１００ｇ−ＳＳ／Ｌ、好ましくは０．０５〜５０ｇ−ＳＳ／Ｌ、より好ましくは０．１〜１０ｇ−ＳＳ／Ｌを例示できる。
【００２６】
イノシトール誘導体生成反応時の反応条件は、ＣＧＴａｓｅの種類に応じて、適宜設定すればよい。市販のＣＧＴａｓｅを用いる場合には、製造者の推奨条件に従って、反応条件を設定することができる。例えば、反応温度として、２０〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、より好ましくは４０〜６０℃を例示できる。また、反応ｐＨとして、ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ４〜８、より好ましくはｐＨ５〜７を例示できる。反応温度及びｐＨがこの範囲内であると、ＣＧＴａｓｅの酵素活性が高い状態で維持され得る。
【００２７】
イノシトール誘導体生成反応の反応時間は、特に限定されず、ＣＧＴａｓｅの種類、反応液の量等に応じて、適宜設定すればよい。イノシトール誘導体の生成効率及び未反応物の残存抑制の観点から、反応時間は、５〜３００時間、好ましくは３０〜７０時間、より好ましくは４０〜６０時間を例示できる。また、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ等で反応液中のデキストリン濃度を測定し、デキストリンの消失を確認できるようになるまで反応を行うようにしてもよい。
【００２８】
このようにしてイノシトール誘導体生成反応を行うことにより、反応液中にイノシトール誘導体が生成し、イノシトール誘導体とＣＧＴａｓｅとを含む溶液（以下、「イノシトール誘導体／ＣＧＴａｓｅ溶液」ともいう。）を得ることができる。本工程により生成するイノシトール誘導体は、通常、単糖単位に換算して互いに異なる数の糖が結合したイノシトール誘導体の混合物である。
【００２９】
［工程ＩＩ］
工程ＩＩは、上記工程Ｉで得られたイノシトール誘導体とＣＧＴａｓｅとを含む溶液中の前記ＣＧＴａｓｅを、限外ろ過膜を用いて除去する工程である。
【００３０】
本工程では、上記工程Ｉで得られたイノシトール誘導体／ＣＧＴａｓｅ溶液を供給液として、限外ろ過を行う。また、本実施形態の製造方法では、工程Ｉの後に、ＣＧＴａｓｅの失活処理を行わない。イノシトール誘導体生成反応後に、ＣＧＴａｓｅの失活処理を行わずに、限外ろ過膜を用いて濃縮液中にＣＧＴａｓｅを除去することにより、ろ液中に回収されるイノシトール誘導体を変質させることなく、精製度の高い高品質のイノシトール誘導体を得ることができる。本明細書において、「供給液」とは限外ろ過に供する液体を意味し、「ろ液」とは限外ろ過膜を通過した液体を意味し、「濃縮液」とは限外ろ過膜を通過しなかった液体を意味する。
【００３１】
本工程で用いる限外ろ過膜は、特に限定されないが、クロスフロー型の限外ろ過に使用可能なものが好ましい。クロスフロー型の限外ろ過では、ろ過対象の供給液を限外ろ過膜の膜表面に対して平行に流す。これにより、限外ろ過膜の孔径よりも小さい溶質分子や供給液の一部がろ液となり、膜の孔径よりも大きな分子が濃縮される。クロスフロー型の限外ろ過に使用可能な限外ろ過膜は、各種市販されているため、それらを適宜選択して用いればよい。
【００３２】
本工程で用いる限外ろ過膜の分画分子量は、１０００〜１０００００の範囲内とすることができる。分画分子量が１０００未満であると、ろ過速度が遅くなりイノシトール誘導体の精製効率及び生産性が低下する。また、分画分子量が１０００００を超えると、ろ液中にＣＧＴａｓｅ由来の不純物が混入する可能性が高くなる。限外ろ過膜の分画分子量は、好ましくは１０００〜１０００００であり、より好ましくは１０００〜７００００であり、さらに好ましくは３０００〜２００００であり、特に好ましくは４０００〜１５０００である。
【００３３】
本工程における限外ろ過の方法は、特に限定されないが、クロスフロー型の限外ろ過とすることが好ましい。クロスフロー型で限外ろ過を行うことにより、限外ろ過膜表面への不純物の付着を低減し、目詰まりの発生を抑制することができる。
【００３４】
限外ろ過時の温度条件は、例えば、０〜６０℃とすることができ、工程Ｉの反応温度よりも低い温度であることが好ましい。前記温度条件の下限以上であると、供給液の流動性が保たれ、ろ過を効率よく行うことができる。また、前記温度条件の上限以下であると、供給液中のＣＧＴａｓｅによる過反応を抑制できる。限外ろ過時の温度条件は、好ましくは０〜５０℃、より好ましくは０〜４０℃である。
【００３５】
本実施形態の製造方法では、上記工程Ｉの後、ＣＧＴａｓｅの失活処理を行わないため、反応後の溶液に酸やアルカリ等の薬剤を添加する必要がない。そのため、限外ろ過時の供給液のｐＨは、上記工程Ｉにおける反応液のｐＨと大きく異なることはない。例えば、限外ろ過時の供給液のｐＨとしては、ｐＨ３〜９を例示できる。
【００３６】
上記のように限外ろ過膜を用いて、上記工程Ｉにより得られたイノシトール誘導体とＣＧＴａｓｅとを含む溶液を供給液として限外ろ過を行うことにより、ＣＧＴａｓｅ及びこれに由来する不純物は濃縮液中に留まる一方、イノシトール誘導体はろ液中に移動する。
そのため、ろ液を回収することにより、ＣＧＴａｓｅ及びこれに由来する不純物を含まない精製度の高いイノシトール誘導体を得ることができる。
【００３７】
本工程で得られる限外ろ過のろ液は、ＣＧＴａｓｅ活性が検出されないことが好ましい。前記ろ液におけるＣＧＴａｓｅ活性の検出は、例えば、前記ろ液の一部を採取してイノシトール（例、ｍｙｏ−イノシトール）を最終濃度１０ｇ／Ｌとなるように添加し、５０℃で１時間以上反応させ、その後、液中のイノシトール含量を測定することにより、行うことができる。
イノシトール含量の測定には、例えば、高速液体クロマトグラフィーを用いることができる。前記反応の前後で、イノシトール含量に実質的な差がない場合には、ＣＧＴａｓｅ活性が検出されない、と判定することができる。なお、「実質的な差がない」とは、例えば、前記反応前後に検出されたイノシトール含量の差が、前記反応前に検出されたイノシトール含量（１００％）に対して５％以下程度であることを意味する。好ましくは３％以下であり、より好ましくは２％以下であり、さらに好ましくは１％以下である。
【００３８】
本工程の後に得られるイノシトール誘導体精製物におけるＣＧＴａｓｅ及びこれに由来する不純物（可溶ペプチド）の合計含有量は、例えば、３質量％以下であり得る。好ましくは１質量％以下であり得、より好ましくは０．５質量％以下であり得る。
【００３９】
本実施形態の製造方法では、上記工程Ｉで得られたイノシトール誘導体／ＣＧＴａｓｅ溶液中のＣＧＴａｓｅの失活処理を行わないことを特徴としている。本明細書において、「失活処理」とは、加熱又は薬剤処理により、ＣＧＴａｓｅを変性させ、ＣＧＴａｓｅの酵素活性を失わせる処理を意味する。失活処理後の酵素活性は、失活処理前の酵素活性の３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましく、５％以下であることが特に好ましい。失活処理としては、加熱処理（例、７０℃以上）、酸処理（例、ｐＨ２以下）、アルカリ処理（例、ｐＨ１０以上）、有機溶媒処理（例、フェノール、クロロホルム）が挙げられる。本実施形態の製造方法では、ＣＧＴａｓｅの失活処理を行わないことにより、イノシトール誘導体／ＣＧＴａｓｅ溶液中のイノシトール誘導体の変質を抑制することができる。
【００４０】
ＣＧＴａｓｅの失活処理を行うことなく、イノシトール誘導体／ＣＧＴａｓｅ溶液を供給液として限外ろ過を行うことにより、本工程では、濁り及び着色のほとんどない透明なろ液を得ることができる。例えば、ろ液のＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０は、それぞれ、濁り、着色、及び可溶ペプチド含量の指標となり得る。本工程における限外ろ過のろ液のＯＤ６６０は、ろ液中の固形分１ｇあたり、０．０１以下であり得、好ましくは０．００８以下である。また、前記ろ液のＯＤ４４０は、ろ液中の固形分１ｇあたり、０．０２以下であり得、好ましくは０．０１９以下であり、より好ましくは０．０１６以下であり、さらに好ましくは０．０１５以下である。また、前記ろ液のＯＤ２８０は、ろ液中の固形分１ｇあたり、４．０以下であり得、好ましくは３．８以下であり、より好ましくは３．７以下であり、さらに好ましくは３．６以下である。
【００４１】
ろ液の固形分１ｇあたりの各ＯＤ値は、６６０ｎｍ、４４０ｎｍ、及び２８０ｎｍにおけるろ液の各吸光度を測定し、当該測定値をろ液の固形分濃度で割ることにより求めることができる。なお、ＯＤ４４０及びＯＤ２８０については、限外ろ過のろ液を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、得られたろ液の吸光度を測定する。限外ろ過のろ液の固形分濃度は、例えば、ケット式水分計を用いて、１０５℃、６０分の条件で、前記ろ液の蒸発残分を測定することにより、求めることができる。
【００４２】
［他の工程］
本実施形態の製造方法は、上記工程Ｉ及び工程ＩＩに加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、化学物質の精製手段として一般的に用いられる各種工程、イノシトール誘導体の種類を分析する工程、結合する糖の単糖単位の数毎にイノシトール誘導体を分離する工程等が挙げられる。これらの他の工程は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、上記工程ＩＩの後に、得られたろ液の凍結乾燥や噴霧乾燥を行うことにより、イノシトール誘導体の白色粉末を得ることができる。
【００４３】
なお、本実施形態の製造方法では、上記工程Ｉ及び工程ＩＩの間にその他の工程を含んでもよいが、ＣＧＴａｓｅの過反応を防ぐ観点から、工程Ｉの後すぐに工程ＩＩを行うことが好ましい。また、本実施形態の製造方法は、他の工程を含む場合であっても、当該他の工程としてＣＧＴａｓｅの失活処理を行う工程は含まない。
【００４４】
本実施形態の製造方法では、ＣＧＴａｓｅの失活処理を行っていないため、失活処理に起因するイノシトール誘導体の変質を防ぐことができる。また、イノシトール誘導体生成反応後に、限外ろ過膜を用いて濃縮液中にＣＧＴａｓｅを除去することにより、ろ液中にＣＧＴａｓｅ及びこれに由来する不純物を含まない精製度の高いイノシトール誘導体を得ることができる。
【００４５】
本実施形態の製造方法により製造されたイノシトール誘導体は、精製度が高く且つ高品質であるため、化粧料、医薬品、食品等の様々な用途に用いることができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。【００４７】
［分析方法］
（吸光度）
試料の固形分１ｇあたりのＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０の測定は以下の方法で行った。なお、ＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０は、それぞれ、試料の濁り、着色、及び可溶ペプチド含量の指標となる。【００４８】
ケット式水分計（ハロゲン水分計ＨＧ６３−Ｐ、メトラートレド社製）を用いて、１０５℃、６０分の条件で、試料の蒸発残分（＝１００％−含水率％）を測定した。これを、試料の固形分濃度（ｗ／ｗ％）とした。
ＯＤ６６０については、１ｃｍ角石英セルに、試料を３ｍＬ以上入れて、分光光度計（型番Ｕ−１８００、日立製作所製）で６６０ｎｍの吸光度を測定することにより求めた。
ＯＤ４４０及びＯＤ２８０については、試料を０．４５μｍのメンブレンフィルターでろ過し、得られたろ液を１ｃｍ角石英セルに３ｍＬ入れて、分光光度計（型番Ｕ−１８００、日立製作所製）で４４０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定することにより求めた。
上記のように求めた各吸光度を、試料の固形分濃度で割ることにより、試料の固形分あたりのＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０をそれぞれ算出した。【００４９】
（残存ＣＧＴａｓｅ活性）
試料に、ｍｙｏ−イノシトールを終濃度１０ｇ／Ｌとなるように添加し、５０℃で１時間以上反応させて、ｍｙｏ−イノシトール添加後の反応前後（反応前：ｍｙｏ−イノシトール添加直後；反応後：５０℃で１時間反応後）の生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。分析は、Ｓｈｏｄｅｘ高速液体クロマトグラフィーを用いて、以下の分析条件で行った。反応後のｍｙｏ−イノシトールのピークが、反応前と比較して、変化がなかった場合にはＣＧＴａｓｅ残存活性を「なし」と判定し、ピークが減少していた場合にはＣＧＴａｓｅ残存活性を「あり」と判定した。
＜分析条件＞
カラム：ＳｈｏｄｅｘＫＳ８０２
溶離液：水
流速：０．５ｍＬ／分
オーブン温度：７５℃
検出：ＲＩ（示差屈折率）【００５０】
（主成分分析）
Ｓｈｏｄｅｘ高速液体クロマトグラフィーを用いて、以下の分析条件で、試料の主成分分析を行った。
＜分析条件＞
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＨＩＬＩＣＰａｋ  ＶＮ−５０  ４Ｄ  ×１
溶離液：ＣＨ３ＣＮ：水＝６０：４０（Ｖ：Ｖ）
流速：０．３ｍＬ／分
オーブン温度：４０℃
検出：ＲＩ（示差屈折率）【００５１】
［実施例１〜７］
表１に示す条件で、５Ｌ培養槽（型番ＭＤ−３００、株式会社丸菱バイオエンジ製）を用い、ｍｙｏ−イノシトール（築野ライスファインケミカルズ製）とβ−シクロデキストリン（塩水港精糖製）とをＣＧＴａｓｅ（ノボザイム社製）の存在下で反応させ、イノシトール誘導体を生成させた。表１中の「反応液組成」は終濃度を示す。【００５２】
【表１】
2019045112.tif 000003
【００５３】
反応終了後、ＣＧＴａｓｅの失活処理は行わず、限外ろ過膜（分画分子量6000：SIP-1013、分画分子量13000:ACP-1010D、分画分子量50000：AHP-1010、旭化成株式会社製）を用いて、表２に示す各条件でクロスフロー型の限外ろ過を行った。限外ろ過の方法は以下のとおりである。反応液２．２Ｌに水を３．０Ｌ加えた希釈液を、限外ろ過膜をセットした膜装置の原液タンクに加えた。循環ポンプを稼働して原液を循環させながら１．１Ｌになるまで濃縮し、ろ液を回収した。その後、原液タンクに１Ｌの水を添加してさらにろ液を回収する工程を５回繰り返した。全ろ液を混合し、９．１Ｌの回収ろ液を得た。これによりろ液中にイノシトール誘導体を回収し、ＣＧＴａｓｅは濃縮液側に残ることで分離除去された。【００５４】
限外ろ過後、ろ液中のＣＧＴａｓｅの残存活性を確認した。
また、限外ろ過後のろ液について、反応生成物であるイノシトール誘導体の着色及び変質、並びにＣＧＴａｓｅ由来の可溶ペプチドの存在を評価するために、ろ液の固形分１ｇあたりのＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０を測定した。限外ろ過前の反応液についても、同様に、反応液の固形分１ｇあたりのＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０を測定した。
また、限外ろ過前の反応液及び限外ろ過後のろ液について、主成分分析を行い、主成分であるイノシトール誘導体の組成変化を評価した。液体クロマトグラフィーにより検出されたピーク数、各ピークのリテンションタイム、及び各ピークの面積比率を前記両試料間で比較し、ピーク数及び各ピークのリテンションタイムが両試料間で一致し、かつ、両試料間における各ピークの面積比率の差が、限外ろ過前の反応液で検出された値（１００％）に対して１０％以内であった場合に、主成分の組成変化を「変化なし」と判断した。【００５５】
結果を表２及び表３に示す。表２及び表３中、「反応液」は、イノシトール誘導体生成反応後限外ろ過前の反応液を示し、「ろ液」は限外ろ過後のろ液を示す。「処理時間」は、全ろ液を混合した回収ろ液を得るまでの時間を示す。【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
表２及び表３に示す結果より、イノシトール誘導体生成反応後に、限外ろ過を行うことにより、ろ液中のＣＧＴａｓｅ活性を消失できることが確認された。また、主成分分析、及び吸光度測定の結果から、イノシトール誘導体を変質させることなく、精製度の高いイノシトール誘導体が得られることが確認された。【００５９】
［比較例１〜８］
上記表１に示す条件で、ｍｙｏ−イノシトールとβ−シクロデキストリンとをＣＧＴａｓｅの存在下で反応させ、イノシトール誘導体を生成させた。【００６０】
反応終了後、表４及び表５に記載の各条件で、ＣＧＴａｓｅの失活処理／分離処理を行った。表４及び５中の各分離処理について、限外ろ過膜を用いた処理は、実施例１〜７と同様に行った。遠心ろ過は、ろ材にろ布を用いたバスケット型の遠心ろ過機（小型遠心分離機Ｈ−１１０Ａ、ろ布型番：コットン２６、株式会社コクサン社製）を用いて行った。精密ろ過は、旭化成社製の精密ろ過膜（PSP-113）を用いて行った。【００６１】
その後、実施例１〜７と同様に、失活処理／分離処理後のろ液中の残存ＣＧＴａｓｅ活性の測定を行った。
また、分離処理後のろ液の固形分あたりのＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０の測定を行った。失活処理／分離処理前の反応液についても、同様に、反応液の固形分１ｇあたりのＯＤ６６０、ＯＤ４４０、及びＯＤ２８０を測定した。
また、失活／分離処理前の反応液及び失活／分離処理後のろ液について、主成分分析を行い、主成分であるイノシトール誘導体の組成変化を評価した。主成分の組成変化を「変化なし」とする判断基準は、上記実施例１〜７と同様とした。
結果を表４及び表５に示す。表４及び表５中、「ＭＷ」は分画分子量を示す。「反応液」は、比較例１〜６については、失活処理後分離処理前の反応液を示し、比較例７及び８については、イノシトール誘導体生成反応後分離処理前の反応液を示す。「ろ液」は分離処理後のろ液を示す。【００６２】
【表４】
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【００６３】
【表５】
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【００６４】
表４及び表５に示すように、比較例１〜８では、いずれも、失活／分離処理後に主成分の組成変化が認められた。また、比較例１〜８では、実施例１〜７と比較して、いずれもＯＤ４４０の値(着色)が増大した。比較例２、４、６及び７ではＯＤ６６０の値（濁り）も、実施例１〜７と比較して増大し、比較例２、４〜８では、ＯＤ２８０の値（可溶ペプチド）も、実施例１〜７と比較して増大した。また、限外ろ過に替えて、遠心ろ過又は精密ろ過を行った場合（比較例７、８）には、ろ液中のＣＧＴａｓｅ活性が残存した。以上の結果より、限外ろ過以外のろ過方法では、ＣＧＴａｓｅを除去できないことが確認された。また、失活処理を行った場合には、イノシトール誘導体に変質が生じ、分離処理を行っても着色等を除去できないことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明により、精製度が高く且つ高品質のイノシトール誘導体を得ることのできる、イノシトール誘導体の製造方法が提供される。
【国際調査報告】
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