(57)【要約】  本発明は、基材表面に吸着機能を有するペプチドを、標的細胞外小胞を認識するタンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に有するタンパク質−ペプチド融合体、該融合体をコードする塩基配列を含む核酸、該核酸を含むベクター、該融合体が固定化された基材、標的細胞外小胞の測定又は単離方法、標的細胞外小胞を測定又は単離するためのキット又は装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材表面に固定化される機能を有するペプチドを、標的細胞外小胞の膜上にある分子を認識するタンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に有する、タンパク質−ペプチド融合体。
【請求項２】
標的細胞外小胞の膜上にある分子が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＧＭ１又はホスファチジルセリンである、請求項１に記載の融合体。
【請求項３】
上記分子を認識するタンパク質が、原核生物または菌類によって発現可能なタンパク質である、請求項１又は２に記載の融合体。
【請求項４】
当該ペプチドが、ＰＳペプチド、ＰＭＭＡ／ＰＣペプチド、ＳｉＮペプチド及びＰＤＭＳペプチドからなる群から選択される、請求項１〜３いずれか１項に記載の融合体。
【請求項５】
ペプチドが、配列番号１〜２３及び３６に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド群から選択されたペプチドである、請求項１〜４いずれか１項に記載の融合体。
【請求項６】
ペプチドが、ＰＳＩタグ（配列番号２）、ＰＳＳタグ（配列番号９）、ＰＭＭＡタグ（配列番号２１又は３６）を含むペプチドである、請求項１〜５いずれか１項に記載の融合体。
【請求項７】
前記タンパク質−ペプチド融合体を構成するタンパク質及び／又はペプチドのアミノ酸配列が、それぞれの全アミノ酸配列に対し１０％未満のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合体。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の融合体をコードする塩基配列を含む、核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合体が固定化された、基材。
【請求項１１】
請求項１０に記載の基材を用いることを特徴とする、標的細胞外小胞の測定又は単離方法。
【請求項１２】
前記標的細胞外小胞が、体液中に含まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の基材を含む、標的細胞外小胞を測定又は単離するための、キット又は装置。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合体を基材に接触させる工程を含む、タンパク質−ペプチド融合体が固定化された基材の製造方法。
【請求項１５】
標的細胞外小胞を認識するタンパク質が、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＴＢ又はＴＩＭタンパク質（ＴＩＭ１〜４）である請求項１又は２に記載の融合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材への親和性を有するペプチド融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞は、細胞から分泌される直径約１００ｎｍの小胞であり、その膜構造は細胞自身や細胞内小器官と同様に脂質二重層からなっている。唾液、血液、尿、羊水など、あらゆる体液中や細胞培養液中に安定して存在する。近年、がんのバイオマーカーとして注目されており、体液中の細胞外小胞を集めてｍｉＲＮＡを調べることで、がんの早期診断が可能になると期待されている。
細胞外小胞の例としては、Exosomes（エクソソーム）、Microvesicles（MV; 微小小胞体）、Apoptotic Bodies（アポトーシス小体）が挙げられる。
Exosomes（エクソソーム）とは、エンドサイト−シス・パスウエイに由来する、40-120nmの小胞である。構成成分としては、タンパク質、核酸(mRNA、miRNA、ノン・コーティングRNA)から成る。細胞間コミュニケーションを司る機能を有する。マーカー分子としてはAlix, Tsg101, tetraspanins （CD81, CD63, CD9）, flotillin，phosphatidylserine（ホスファチジルセリン）,  ganglioside（GM1, GM2, GM3）等が挙げられる。
Microvesicles（MV; 微小小胞体）は細胞質膜に由来する、50-1,000nmの小胞であり、構成成分としては、タンパク質、核酸(mRNA、miRNA、ノン・コーティングRNA)から成る。
細胞間コミュニケーションを司る機能を有する。マーカー分子としてはIntegrins, selectins, CD40，CD154が挙げられる。
Apoptotic Bodies（アポトーシス小体）は細胞質膜に由来する、500-2,000nmの小胞であり、構成成分としては、断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）から成る。ファゴサイトーシスの誘導する機能を有する。マーカー分子としては、Annexin V, phosphatidylserineが挙げられる。【０００３】
細胞外小胞を回収する方法としては、超遠心、粒子のサイズによる分画、免疫沈降を利用する方法が知られている。【０００４】
近年、ＨｉｓタグをＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子４（Ｔｉｍ４）タンパク質の末端に有する、タンパク質−ペプチド融合体を用いる細胞外小胞の取得方法が報告されている（特許文献１）。しかし、Ｈｉｓタグは、基材表面に対する吸着機能を有していないことから、このタンパク質−ペプチド融合体を基材に直接固定化することは容易ではない。【０００５】
また、がん抗原である上皮細胞接着因子（ＥｐＣＡＭ：Epithelial cell adhesion molecule）に対して結合能を有するペプチドを含む複合素材を用いる、ＥｐＣＡＭ発現エクソソームを分離するための装置が報告されている（特許文献２）。【０００６】
さらに近年、エクソソームへの結合活性を有する、Ｍａｓｔｏｐａｒａｎ−Ｘと呼ばれるキイロスズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）由来の１４アミノ酸残基からなるペプチド、Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎと呼ばれるｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ由来の１６アミノ酸残基からなるペプチド、又はｈＣＡＰ-１８のＣ末端領域がタンパク質切断により遊離した、ＬＬ３７と呼ばれるヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来の３７アミノ酸残基からなるペプチドを用いるエクソソームの回収方法が報告されている（特許文献３）。しかし、このペプチドも、基材に直接固定化することは容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１６／０８８６８９
【特許文献２】ＷＯ２０１４／１６８２３０
【特許文献３】特開２０１７−３８５６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、細胞外小胞の捕捉に有用な、ペプチド融合タンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、膜タンパク質ＣＤ９、phosphatidylserine、GM1等に結合する特定のタンパク質と基材に親和性を持つペプチドを結合したペプチド融合タンパク質が、細胞外小胞の捕捉に最適であることを初めて見出し本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］基材表面に固定化される機能を有するペプチドを、標的細胞外小胞の膜上にある分子を認識するタンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に有する、タンパク質−ペプチド融合体、
［２］標的細胞外小胞の膜上にある分子が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＧＭ１又はホスファチジルセリンである、［１］に記載の融合体、
［３］上記分子を認識するタンパク質が、原核生物または菌類よって発現可能なタンパク質である、［１］又は［２］に記載の融合体、
［４］当該ペプチドが、ＰＳペプチド、ＰＭＭＡ／ＰＣペプチド、ＳｉＮペプチド及びＰＤＭＳペプチドからなる群から選択される、［１］〜［３］のいずれかに記載の融合体、
［５］ペプチドが配列番号１〜２３及び３６に示されるいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド群から選択されたペプチドである、［１］又は［２］に記載の融合体、
［６］ペプチドが、ＰＳＩタグ（配列番号２）、ＰＳＳタグ（配列番号９）、ＰＭＭＡタグ（配列番号２１又は３６）を含むペプチドである、［１］〜［６］のいずれかに記載の融合体、
［７］前記タンパク質−ペプチド融合体を構成するタンパク質及び／又はペプチドのアミノ酸配列が、それぞれの全アミノ酸配列に対し１０％未満のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の融合体、
［８］  ［１］〜［７］に記載の融合体をコードする塩基配列を含む、核酸、
［９］  ［８］に記載の核酸を含む、ベクター、
［１０］  ［１］〜［７］のいずれかに記載の融合体が固定化された、基材、
［１１］  ［１０］に記載の基材を用いることを特徴とする、標的細胞外小胞の測定又は単離方法、
［１２］前記標的細胞外小胞が、体液中に含まれる、［１１］に記載の方法、
［１３］  ［１０］に記載の基材を含む、標的細胞外小胞を測定又は単離するための、キット又は装置、
［１４］  ［１］〜［７］のいずれかに記載の融合体を基材に接触させる工程を含む、タンパク質−ペプチド融合体が固定化された基材の製造方法。
［１５］標的細胞外小胞を認識するタンパク質が、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、ＣＴＢ又はＴＩＭタンパク質（ＴＩＭ１〜４）である［１］又は［２］に記載の融合体。
本発明のタンパク質-ペプチド融合体の基材表面上に対する吸着密度（μmol/ｍ2）は特に制限が無いが、公知の方法（例えば特開2011-168505号公報）に記載の方法で求められる。例えば１．０μmol/ｍ2以上であり、例えば１．５μmol/ｍ2以上であり、例えば２．０μmol/ｍ2以上であり、例えば３．０μmol/ｍ2以上である。【００１０】
本発明において細胞外小胞は、生体内の細胞又は培養細胞から分泌される、脂質二重膜で構成される小型膜小胞である。当該小胞の直径は、通常２０ｎｍから１０００ｎｍ、又は通常５０ｎｍから５００ｎｍ、又は通常５０ｎｍから２００ｎｍである。その膜表面には、ＣＤ６３やＣＤ９等のテトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ）等の膜タンパク質、ＧＭ１等のガングリオシドおよびホスファチジルセリンを含むことが知られている。【００１１】
本発明においてペプチドとは、２〜４９個のアミノ酸がペプチド結合したものである。【００１２】
本発明においてタンパク質とは、５０個以上のアミノ酸がペプチド結合したものである。【００１３】
本発明においてタンパク質のＮ末端側とは、フリーなアミノ基で終端している側の末端であり、タンパク質のＣ末端側とは、フリーなカルボキシル基で終端している側の末端である。【００１４】
本発明においてタンパク質−ペプチド融合体とは、上記のタンパク質とペプチドを結合させたものである。この結合は直接結合されていてもよい。或いはタンパク質とペプチドの間に特定の標的抗原の認識能及び基材吸着能を損なわないような適切なリンカーを介して結合してもよい。【００１５】
タンパク質−ペプチド融合体のアミノ酸配列についても、特定の標的抗原の認識能及び基材吸着能を損なわない範囲内で、アミノ酸配列において10％未満、好ましくは8％未満、より好ましくは5％未満、さらに好ましくは3％未満、もっと好ましくは2％未満、特に好ましくは1％未満であればアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。上記をアミノ酸残基数で言えば、例えば20個以下、例えば10個以下、例えば5個以下、例えば3個以下、例えば2個以下、例えば1個であれば、アミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入が許容される。左記の欠失、置換、付加又は挿入は、当該融合体のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列のC末端又はN末端のみであることが好ましい。【００１６】
タンパク質−ペプチド融合体はペプチド融合タンパク質とも言い換えることができる。また、例えば、ペプチド部分がＰＳタグ、タンパク質部分が抗ＣＤ９単鎖抗体である場合、抗ＣＤ９単鎖抗体−ＰＳタグ融合体またはＰＳタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体と表すことができる。【００１７】
本発明においてＰＳペプチドとは、特許第５５５３３３６号公報に記載された、親水性の樹脂表面を有する基材表面に対して特異的吸着機能を発揮するペプチド群に含まれるペプチドを指し、特に表面の親水性を高めたポリスチレン樹脂又はポリカーボネート樹脂を基材とする場合に適している。レクチンアレイやELISA、イムノアッセイ法などの抗体とのサンドイッチアッセイ用の基材として一般的なポリスチレン樹脂又はポリカーボネート樹脂全般に適用できる。【００１８】
具体的には、主としてアミノ酸配列「ＲＸＸＸＲＲＸＲＲ（ここで、Ｘ＝Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｍ、Ｓ又はＴの一つ又は複数のアミノ酸残基の組合わせ）：配列番号１」を含むペプチドとして示されるペプチド群であり、例えば、「ＲＩＩＩＲＲＩＲＲ（配列番号２）」「ＲＡＩＡＲＲＩＲＲ（配列番号３）」、「ＲＬＬＬＲＲＬＲＲ（配列番号４）」、「ＲＶＶＶＲＲＶＲＲ（配列番号５）」、「ＲＡＡＡＲＲＡＲＲ（配列番号６）」「ＲＧＧＧＲＲＧＲＲ（配列番号７）」、「ＲＭＭＭＲＲＭＲＲ（配列番号８）」、「ＲＳＳＳＲＲＳＲＲ（配列番号９）」、又は「ＲＴＴＴＲＲＴＲＲ（配列番号１０）」を含むペプチドである。【００１９】
その他、「ＫＧＬＲＧＷＲＥＭＩＳＬ（配列番号１１）」、「ＡＤＹＬＳＲＷＧＳＩＲＮ（配列番号１２）」、「ＳＲＶＨＲＡＶＬＮＧＶＳ（配列番号１３）」、「ＲＰＰＧＶＶＲＲＹＡＬＧ（配列番号１４）」、「ＶＲＳＷＥＥＱＡＲＶＴＴ（配列番号１５）」「ＲＡＦＩＡＳＲＲＩＫＲＰ（配列番号１６）」、「ＲＥＳＴＬＫＧＴＳＲＡＶ（配列番号１７）」、「ＡＧＬＲＬＫＫＡＡＩＨＲ（配列番号１８）」、「ＳＳＬＬＲＡＶＰＥＰＴＧ（配列番号１９）」又は「ＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰ（配列番号２０）」を含むペプチドも同様に親水性の樹脂表面を有する固相に特異的な吸着能を有するため、本発明の「ＰＳペプチド」として同様に用いることができる。
ＰＳペプチドはＰＳタグとも言い換えることができる。【００２０】
本発明においてＰＭＭＡ／ＰＣペプチドとは、主として基材表面がポリカーボネート又はポリメタクリル酸メチル樹脂である基材の場合に基材親和性が高い。ポリカーボネートはエンジニアリングプラスチックとして広範に使用されており、ポリメタクリル酸メチル樹脂はプロテインチップなどの基材として用いられている（特許第５６５５２５４号公報）。【００２１】
具体的には、例えば、PMMAペプチドのうち、特許第５６５５２５４号公報でPMOMP25ペプチドと呼ばれている「配列番号２１（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK）」や「配列番号３６（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これには限定されず特許第５６５５２５４号公報に示されたいずれのペプチドも使用できる。
ＰＭＭＡ／ＰＣペプチドはＰＭＭＡ／ＰＣタグとも言い換えることができる。【００２２】
本発明においてＳｉＮペプチドとは、基材表面が窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）である基材の場合に基材親和性が高い。窒化ケイ素は、半導体材料として広範に用いられている（国際公開ＷＯ２０１３／１２２０６１）。【００２３】
具体的には、ＳｉＮタグのうち、国際公開ＷＯ２０１３／１２２０６１でV821ペプチドと呼ばれている「配列番号２２（GGRHTPFFKGYRPQFYFRTTDVTGTIELPE）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これに限定されず国際公開ＷＯ２０１３／１２２０６１に示されたいずれのペプチドも使用できる。
ＳｉＮペプチドはＳｉＮタグとも言い換えることができる。【００２４】
本発明においてＰＤＭＳペプチドとは、基材表面がシリコーンゴムの一種であるポリジメチルシロキサンである基材の場合に基材親和性が高い。ポリジメチルシロキサンは、マイクロ流路などマイクロチップ基材の一つとして知られている（国際公開ＷＯ２０１６／１２９６９５）。【００２５】
具体的には、PDMSタグのうち、国際公開ＷＯ２０１６／１２９６９５でELN-V81ペプチドと呼ばれている「配列番号２３（MVMPGDNIKMVVTLIHPIAMDDGLRFAIRE）」を含むペプチドタグ等があげられるが、これに限定されず国際公開ＷＯ２０１６／１２９６９５に示されたいずれのペプチドも使用できる。
ＰＤＭＳペプチドはＰＤＭＳタグとも言い換えることができる。【００２６】
本発明において抗ＣＤ９抗体とは、テトラスパニンに分類される膜タンパク質であるＣＤ９を認識する抗体または抗体様分子である。【００２７】
本発明において抗ＣＤ６３抗体とは、テトラスパニンに分類される膜タンパク質であるＣＤ６３を認識する抗体または抗体様分子である。【００２８】
本発明において抗ＣＤ８１抗体とは、テトラスパニンに分類される膜タンパク質であるＣＤ８１を認識する抗体または抗体様分子である。【００２９】
本発明においてＣＴＢとは、コレラトキシンＢサブユニットを表し、これはガングリオシドＧＭ１を認識するタンパク質で、コレラトキシンのバインディングユニットである。【００３０】
本発明においてＴＩＭタンパク質（ＴＩＭ１〜４）とは、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子またはphosphatidylserineへの認識能を損なわない範囲内で、アミノ酸配列において10％未満、好ましくは8％未満、より好ましくは5％未満、さらに好ましくは3％未満、もっと好ましくは2％未満、特に好ましくは1％未満であればアミノ酸残基の欠失、置換、付加又は挿入がなされたＴ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子改変体である。phosphatidylserineへの認識能を損なわない範囲内としては、例えばIgVドメインのアミノ酸配列を有しているものであればよい。ＴＩＭタンパク質は動物に由来するＴＩＭタンパク質が好ましい。なかでも、ヒト、又はマウスが有するＴＩＭタンパク質が好ましい。Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子にはＴＩＭ１〜４までが知られている。【００３１】
本発明においてＰＭＭＡタグとは、ＰＭＭＡ／ＰＣペプチドのうち、「配列番号２１（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYYFNK）」や「配列番号３６（DVEGIGDVDLVNYFEVGATYTFNK）」のペプチド等があげられるが、これには限定されず特許第５６５５２５４号公報文献に示されたいずれのペプチドも使用できる。【００３２】
本発明においてブロッキング剤とは、抗原抗体反応などの特異的な結合を促進したいときに、非特異的な結合を抑制するために添加されるものである。【００３３】
本発明において、接触とは、本発明の融合体と目的物とを同一の反応系に存在させることを意味し、たとえば、本発明の融合体と試料とを混合すること、試料に本発明の融合体を添加すること、本発明の融合体を基材に添加すること等が含まれる。【００３４】
本発明の標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）を測定又は単離するためのキットは、融合体が固定化された基材に加えて、測定キットにおいては、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤、洗浄溶液、タンパク質変性剤含有溶液、その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、本発明に係るタンパク質−ペプチド融合体と基材、本発明に係る基材に結合した本発明に係るタンパク質−ペプチド融合体と試料中の標的細胞外小胞との反応又は結合を阻害したりしないものを有していてもよく、単離キットにおいては、本発明の融合体が固定化された基材を用いた分離用ビーズ、分離用カラム、分離用フィルターなどを含めた器具、装置などをキットに含めることもできる。さらにまた、本発明のキットには、本発明の測定又は単離するための方法の説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）を測定又は単離する工程は、本発明に係る融合体と標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）の複合体の有無及び／又は量を測定又は単離可能な方法であればいずれでもよく、自体公知の免疫学的測定又は単離に用いられる方法はいずれも利用できる。中でも測定法としては固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はフローサイトメトリー法が好ましく、単離法としては磁気ビーズ法、カラムクロマトグラフィー法、フィルター濾過法が好ましい。【００３５】
本発明の標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）を測定又は単離するための装置は、融合体が固定化された基材に加えて、検出器、圧力調整器、動力源、温度調節器、増幅器、変換器、計算機、コンピューター、オートサンプラー、試薬リザーバー、廃液タンク、光源、凍結乾燥器、その他この分野で通常用いられる機器を含むことができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明の融合体は、基材に固定化することができ、エクソソームを捕捉することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体のＰＳラテックスビーズへの固定化のフローサイトメトリーによる確認である。
【図２】ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体固定化ラテックスビーズを用いたエクソソームの回収のフローサイトメトリーによる確認である。
【図３】ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９単鎖抗体固定化ラテックスビーズを用いたエクソソームの回収のウェスタンブロティングによる確認である。
【図４】ＰＭＭＡタグ融合ＴＩＭタンパク質固定化ラテックスビーズを用いたエクソソームの回収のフローサイトメトリーによる確認である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明のペプチド又はタンパク質は、化学的か、又は原核生物（具体例としては、大腸菌（E. coli）、グラム陽性菌（Corynebacterium glutamicum、Brevibacillus choshinensisなど））や酵母（S. cerevisiae）などの菌類、昆虫細胞（Sf9、High Five）、動物細胞（CHO細胞、HEK293T）等）などを用いる遺伝子工学的手法によって合成することができる。
これらの中でも、コスト面、生産効率の観点から原核生物が好ましく、その中でも特に大腸菌（E. coli）が好ましい。
【００３９】
ペプチドの化学合成を行う場合は、周知のペプチドの合成方法によって合成することができる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置（例えば、島津製作所製：ＰＳＳＭ−８など）を使用してもよい。
【００４０】
ペプチド又はタンパク質を遺伝子工学的に合成する場合は、まず、当該ペプチドをコードするＤＮＡを設計し合成する。当該設計及び合成は、目的タンパク質をコードする核酸を含むベクター等を鋳型とし、所望のＤＮＡ領域を合成し得るように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲ法により行うことができる。そして、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結することによってタンパク質発現用組換えベクターを得て、この組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによって形質転換体を得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
【００４１】
ベクターには、宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミドが使用される。さらに、動物ウイルス、昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。組換えベクターの作製は、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位等に挿入してベクターに連結すればよい。形質転換に使用する宿主としては、目的の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞又は昆虫が挙げられる。ヤギ等の哺乳動物を宿主として使用することも可能である。宿主への組換えベクターの導入方法は公知である。
【００４２】
そして、前記形質転換体を培養し、その培養物から抗原として使用されるペプチドを採取する。「培養物」とは、（ａ）培養上清、（ｂ）培養細胞若しくは培養菌体又はその破砕物のいずれをも意味するものである。
【００４３】
単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の作製
抗体の重鎖可変領域（Ｈ鎖Ｖ領域）及び軽鎖可変領域（Ｌ鎖Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築する。このＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、ｓｃＦｖを製造することができる。
【００４４】
結合親和性
結合親和性は、結合速度定数（Ｋon）及び解離速度定数（Ｋoff）により決定することができる。親和性平衡定数（Ｋa）はＫon／Ｋoffの比で表され、解離定数（Ｋd）はその逆数である。結合速度定数（Ｋon）及び解離速度定数（Ｋoff）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）、ＰｒｏｔｅＯＮ  ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）等）。
【実施例】
【００４５】
抗ＣＤ９ｓｃＦｖの調製
抗原として、CD9の細胞外ドメイン2(EC2)の部分ペプチドにキャリアタンパク質を結合させたタンパク質あるいはEC2にヒトFc領域をEC2のC末端側に融合したタンパク質（EC2-ｈFc）あるいは細胞膜上にCD9 を発現させた細胞（CD9強制発現細胞）を用い、ウサギにこれらの抗原を免疫し、脾臓からRNAを抽出し、cDNAを合成し、それを鋳型にPCRを行い、ウサギ抗体遺伝子を増幅し、それらをもとにｓｃFvファージライブラリを作製した。このｓｃFvファージライブラリに対して上記の抗原を用いてバイオパンニングを行い、scFv の選別を行った。その結果、EC2-hFc に対して強い結合活性を有する4 つのクローンが得られた。それぞれのクローン（02a004, 02a018, 02a039及び02a045）の全アミノ酸配列を配列番号２４〜２７に示した。また、それぞれのクローンの重鎖可変領域(HV)及び軽鎖可変領域(LV)のアミノ酸配列を配列番号２８〜３５に示した。【００４６】
【表１】
2018207906.tif 000002
【００４７】
抗ＣＤ９  ｓｃＦｖ−ＰＭ及びＣＤ９  ｓｃＦｖ−ＥＬＮ  発現ベクターの調製【００４８】
ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９  ｓｃＦｖの生産
（１）大腸菌  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に対して、抗ＣＤ９  ｓｃＦｖ−ＰＭ及び抗ＣＤ９  ｓｃＦｖ−ＥＬＮ  発現ベクターを加えて大腸菌を形質転換し、Ａｍｐ、Ｃｍ含有２×ＹＴ培地１０ｍＬに大腸菌を植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩前々培養した。
（２）Ａｍｐ、Ｃｍ含有２×ＹＴ培地１００ｍＬの入ったバッフル付き５００ｍＬ三角フラスコに前々培養液をＯＤ６００＝０．１になるように加え、３７℃、２００ｒｐｍでＯＤ６００＝１になるまで培養した。
（３）１ＬのＯＥ培地を入れたジャーファーメンターを１２０℃で１５分オートクレーブ滅菌した後、Ａｍｐ、Ｃｍ、及び（２）の全培養液を全量植菌し、３０℃、８００ｒｐｍ、ｐＨ７．０で２４時間本培養した。
（４）遠沈管に５０ｍＬずつ培養液を移して１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収した。
（５）培養上清に１％のＴｒｉｔｏｎＸを加え、フィルターろ過後、アフィニティークロマトグラフィーによりｓｃＦｖを精製した。この時、バインディングバッファーでカラムに吸着させた後、１×ＰＢＳでカラムを洗浄し、エリューションバッファーで溶出した。
（６）１×ＰＢＳで２日間透析し（液交換１回）、ＤＣプロテインアッセイによる濃度測定とＳＤＳ−ＰＡＧＥによる発現確認を行った。【００４９】
ＰＭＭＡタグ融合抗CD9ｓｃＦｖ固定化ＰＳラテックスビーズの作製
（１）精製した１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ９  ｓｃＦｖ  ０２ａ０３９−ＰＭ、または抗ヒトＩｇＧ  ｓｃＦｖ（コントロール）１００μＬ、ＰＳビーズ１００μＬ（４．８５×１０７個）、及び５００ｍＭ  ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）２０μＬを混合し、４℃で一晩、ローテーターにより転倒混和した。
（２）  フラッシングによりＰＳビーズを沈殿させ、上清を除去し、５０ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ  ８．５）２００μＬで懸濁し、４℃で保存した。【００５０】
ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９ｓｃＦｖ固定化ＰＳラテックスビーズを用いたエクソソームの回収
ＰＭＭＡタグ融合抗ＣＤ９  ｓｃＦｖのＰＳビーズへの固定化の確認
（１）作製したｓｃＦｖ固定化ビーズ１０μＬ（２．５×１０６個）をエッペンドルフチューブにとり、フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（２）２％ＢＳＡ、５０ｍＭ  ＴＡＰＳ（ｐＨ８．５）１０μＬを加え、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（４）０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ５０μＬで懸濁し、フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。この操作を２回繰り返した（洗浄）。
（５）抗６×Ｈｉｓ全ＩｇＧ（マウス）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（６）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、（４）と同様も洗浄した。
（７）ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ヤギ）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（８）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、（４）と同様に洗浄し、最後は２５０μＬの１×ＰＢＳで懸濁し、フローサイトメーターで測定した。
【表２】
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結果を図１に示す。【００５１】
フローサイトメトリーによるｓｃＦｖ固定化ビーズのエクソソームに対する活性評価
（１）前記固定化の確認の（１）〜（４）の操作を行った。
（２）Ｈｅｌａ細胞培養上清（Hela細胞を５％FBS含有MEM培地で3日間培養した際の培養上清）２５０μＬ、または精製したエクソソーム（上記培養上清20mlを和光純薬のMag CaptureTM Exosome Isolation Kit PSを用いて精製したエクソソーム）１０μＬをそれぞれのエッペンドルフチューブに加えて室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（４）抗ＣＤ９全ＩｇＧ（マウス）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（５）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（６）ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ヤギ）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（７）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄し、最後は２５０μＬの１×ＰＢＳで懸濁し、フローサイトメーターで測定した。
【表３】
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【表４】
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結果を図２に示す。【００５２】
ウェスタンブロッティングによる回収したエクソソーム中の分析
エクソソームサンプルの準備
（１）精製したエクソソーム５μＬをサンプル１とした。
（２）前記固定化の確認の（１）〜（４）の操作を行った後、で精製したエクソソーム５μＬを混合し、２５℃で２時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。これをサンプル２とした。
（４）サンプル１及び２にＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）１０μＬをそれぞれ加えて懸濁させ、超音波を２０秒程度かけた。
（５）氷上で１５分間インキュベーションした。
（６）２×サンプルバッファーとサンプル１または２を１：１で混合し、９８℃で１０分加熱した。
（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを電気泳動装置にセットし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用泳動バッファーを加えた。
（８）分子量マーカー及び、サンプルを１５μＬずつゲルにアプライした。この時、サンプル２はフラッシングによりＰＳビーズを沈殿させて、上清をアプライした。
（９）電圧を２００Ｖに設定し、約１時間電気泳動を行った。ＢＰＢのラインが下端に達した時点で泳動を終了させた。【００５３】
エクソソームサンプルのウェスタンブロッティング
（１）ゲルをガラス板から外し、Ｔｏｗｂｉｎ転写バッファーにより５分間、３５ｒｐｍで振とうした。
（２）膜転写用のろ紙（Ｅｘｔｒａ  Ｔｈｉｃｋ  Ｂｌｏｔ  Ｐａｐｅｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）２枚を、ゲルと同様の大きさに切断し、Ｔｏｗｂｉｎ転写バッファーをよく染み込ませた。
（３）転写膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＰＶＤＦ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を、ゲルと同様の大きさに切断し、１００％メタノールに１５分浸した。その後、Ｔｏｗｂｉｎ転写バッファーにより５分間浸して置換し、３５ｒｐｍで振とうした。
（４）トランスブロットＳＤセル（Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２２１ＢＲ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）上に、ゲル、ＰＶＤＦ膜及びろ紙をセットした。この際、間に気泡が入らないようにした。
（５）２５Ｖの定電圧で５０分間通電し、ゲルから膜にタンパクを転写した。
（６）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｏｎｅ原液中で、１時間、３５ｒｐｍで振とうした。
（７）ＴＢＳＴで洗浄後、ＴＢＳＴで３０００倍希釈した抗ＣＤ９全抗体中で、１時間、３５ｒｐｍで振とうした。
（８）ＴＢＳＴで洗浄後、ＴＢＳＴで３０００倍希釈したＡＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体中で、１時間、３５ｒｐｍで振とうした。
（９）ＴＢＳＴで洗浄後、発色液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を添加し、１０分間、３５ｒｐｍで振とうした。
結果を図３に示す。【００５４】
ＰＭＭＡタグ融合ＴＩＭタンパク質固定化ＰＳラテックスビーズの作製
（１）精製した500μLのTIM溶液（タグなし：109.6ug/ml、PMMAタグ付き：55.2ug/mlでPBS中に溶解）、ＰＳビーズ１００μＬ（４．８５×１０７個）を混合し、４℃で一晩、ローテーターにより転倒混和した。
（２）  フラッシングによりＰＳビーズを沈殿させ、上清を除去し、ＴＢＳ（ｐＨ  ７．２）２００μＬで懸濁し、４℃で保存した。【００５５】
ＰＭＭＡタグ融合ＴＩＭタンパク質固定化ＰＳラテックスビーズを用いたエクソソームの回収
（１）作製したＴＩＭ固定化ビーズ１０μＬ（２．５×１０６個）をエッペンドルフチューブにとり、フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（２）２％ＢＳＡ、ＴＢＳ（ｐＨ７．２）１０μＬを加え、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（３）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去した。
（４）Ｈｅｌａ細胞培養上清（上記と同じもの）２５０μＬ、または精製したエクソソーム１０μＬをそれぞれのエッペンドルフチューブに加えた。さらに、総体積の1/500量のＥｘｏｓｏｍｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを加えて、室温で１時間インキュベートした。
（５）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（６）抗ＣＤ９全ＩｇＧ（マウス）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ−ＴＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
（７）フラッシングによりＰＳビーズを沈め、上清を除去し、上記と同様に洗浄した。
（８）ＰＥ標識抗マウスＩｇＧ（ヤギ）５μｇ／ｍＬ（０．２％ＢＳＡ−ＴＢＳ中）を５０μＬ添加し、室温で１時間、ローテーターにより転倒混和した。
【表５】
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結果を図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明のペプチド融合タンパク質は、標的細胞外小胞（例えばエクソソーム）の捕捉のために有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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