(57)【要約】 細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を有効成分として含有する、脱分化誘導剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を有効成分として含有する、体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項２】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、又は、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせである、請求項１に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項３】
細胞骨格因子の発現を調節する前記転写調節因子がＭｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  （Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）１（ＭＫＬ１）である、請求項２に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項４】
前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、請求項２又は３に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項５】
前記アクチンファミリーが、Ａｃｔｉｎ，  Ａｌｐｈａ  １，  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ（ＡＣＴＡ１）、Ａｃｔｉｎ，  Ａｌｐｈａ  ２，  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ，  Ａｏｒｔａ（ＡＣＴＡ２）、Ａｃｔｉｎ  Ｂｅｔａ（ＡＣＴＢ）又はＡｃｔｉｎ  Ｇａｍｍａ  １（ＡＣＴＧ）である、請求項４に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項６】
前記活性型ＲＨＯファミリーが、活性型Ｒａｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ａ（ＲＨＯＡ）、活性型Ｒａｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ（ＲＨＯＢ）又は活性型Ｒａｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｃ（ＲＨＯＣ）である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項７】
前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記活性型ＲＨＯファミリーが活性型ＲＨＯＡである、請求項４〜６のいずれか一項に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項８】
前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項９】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子を発現可能に保持するベクターである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
【請求項１０】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させることを含む、前記体細胞の脱分化方法。
【請求項１１】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格タンパク質の発現を調節する転写調節因子、又は、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせである、請求項１０に記載の体細胞の脱分化方法。
【請求項１２】
細胞骨格タンパク質の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１である、請求項１１に記載の体細胞の脱分化方法。
【請求項１３】
前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１１又は１２に記載の体細胞の脱分化方法。
【請求項１４】
前記アクチンファミリーが、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ又はＡＣＴＧである、請求項１３に記載の体細胞の脱分化方法。
【請求項１５】
前記活性型ＲＨＯファミリーが、活性型ＲＨＯＡ、活性型ＲＨＯＢ又は活性型ＲＨＯＣである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の体細胞の脱分化方法。
【請求項１６】
前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記活性型ＲＨＯファミリーが活性型ＲＨＯＡである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の体細胞の脱分化方法。
【請求項１７】
前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の体細胞の脱分化方法。
【請求項１８】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させることを含む、誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ：ｉＦＰ細胞）の製造方法。
【請求項１９】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、又は、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせである、請求項１８に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
【請求項２０】
細胞骨格因子の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１である、請求項１９に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
【請求項２１】
前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、請求項１９又は２０に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
【請求項２２】
前記アクチンファミリーが、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ又はＡＣＴＧである、請求項２１に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
【請求項２３】
前記活性型ＲＨＯファミリーが、活性型ＲＨＯＡ、活性型ＲＨＯＢ又は活性型ＲＨＯＣである、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
【請求項２４】
前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記活性型ＲＨＯファミリーが活性型ＲＨＯＡである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
【請求項２５】
前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたｉＦＰ細胞。
【請求項２７】
アクチンストレスファイバーを有する、請求項２６に記載のｉＦＰ細胞。
【請求項２８】
請求項２６又は２７に記載のｉＦＰ細胞を分化させることを含む、体細胞の製造方法。
【請求項２９】
前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、請求項２８に記載の体細胞の製造方法。
【請求項３０】
脱分化誘導剤のスクリーニング方法であって、
被験物質の存在下で体細胞を培養することと、
前記体細胞における細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の発現量を定量することと、を含み、
前記因子の発現量が、被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇することが、前記被験物質が脱分化誘導剤であることを示す、スクリーニング方法。
【請求項３１】
前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、請求項３０に記載のスクリーニング方法。
【請求項３２】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、細胞骨格因子又はＲＨＯファミリーである、請求項３０又は３１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３３】
細胞骨格因子の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１である、請求項３２に記載のスクリーニング方法。
【請求項３４】
前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、請求項３２又は３３に記載のスクリーニング方法。
【請求項３５】
前記アクチンファミリーが、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ又はＡＣＴＧである、請求項３４に記載のスクリーニング方法。
【請求項３６】
前記ＲＨＯファミリーが、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ又はＲＨＯＣである、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項３７】
前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記ＲＨＯファミリーがＲＨＯＡである、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱分化誘導剤及びその使用に関する。より具体的には、分化した体細胞の脱分化誘導剤、分化した体細胞の脱分化方法、誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ：ｉＦＰ細胞）の製造方法、ｉＦＰ細胞、体細胞の製造方法、脱分化誘導剤のスクリーニング方法に関する。本願は、２０１７年７月７日に、日本に出願された特願２０１７−１３３９３０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
現在、再生医療等の目的から、多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞や多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞への関心が高まっている。多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ｉＰＳ細胞）等が知られている。また、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞としては、間葉系幹細胞等が知られている。【０００３】
しかしながら、ＥＳ細胞は、受精卵を使用して作製しなければならず、倫理的な問題からその採取、製造には多くの課題がある。【０００４】
また、体細胞に、数種類の遺伝子を導入してｉＰＳ細胞を製造する技術が知られている。例えば、特許文献１には、（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、（２）Ｋｌｆ２遺伝子及びＫｌｆ４遺伝子から選択される遺伝子、（３）ｃ−Ｍｙｃ遺伝子、Ｎ−Ｍｙｃ遺伝子、Ｌ−Ｍｙｃ遺伝子及びｃ−Ｍｙｃ遺伝子の変異体であるＴ５８Ａ遺伝子から選択される遺伝子、及び（４）Ｓｏｘ１遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｓｏｘ３遺伝子、Ｓｏｘ１５遺伝子及びＳｏｘ１７遺伝子から選択される遺伝子を体細胞に導入する工程を含む誘導多能性幹細胞の製造方法が記載されている。【０００５】
しかしながら、ｉＰＳ細胞の作製方法は、上述のように４種の遺伝子を導入し、いくつかの培養工程を経て作製する方法であることから、煩雑で熟練を要するものである。また、４種の遺伝子を導入した細胞から目的の細胞を選別、クローニングする手順を必要とし、多くの試薬も必要である。さらに、クローン化したｉＰＳ細胞の取得には約４週間を要し、生じたコロニーからのｉＰＳ細胞クローンの樹立効率も低く、手間と時間がかかるものである。【０００６】
一方、間葉系幹細胞は、ｉＰＳ細胞に比較すると未分化性が低く癌化のリスクが少ないとされ、骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血、歯髄、毛包等から培養によって取得されている（例えば特許文献２、３を参照。）。しかしながら、間葉系幹細胞を得るためには、組織から細胞を採取することが必要であり、間葉系幹細胞の単離には一定期間培養し選別する必要がある。【０００７】
本発明者らは、脂肪細胞を天井培養してその後天井部を底面とすることによって接着性の線維芽様細胞を取得する方法を見出している（非特許文献１）。しかしながら、この方法は脂肪細胞のような天井培養可能な細胞に適用が限られる。また、フラスコ等の天井を有する培養器が必要であり、線維芽様細胞を取得するまでに約２週間を要することから、大量に種々の体細胞から線維芽細胞様細胞を取得するためには問題がある。なお、非特許文献１には、本発明につながる転写因子の記載はない。【０００８】
分化した体細胞の初期化による脱分化方法は、上述のように本願発明の遺伝子とは異なる４種の転写因子遺伝子を導入し、いくつかの培養・選別工程を経て行われている。一方、転写因子ＳＲＦのコファクターであるＭＫＬ１は、細胞骨格タンパク質の動態変化によって転写を調節されることが知られており（非特許文献２）、ＲＨＯＡ−ＲＯＣＫシグナルの抑制によってアクチンファイバーが脱重合し、Ｇ−アクチンが増加すると、Ｇ−アクチンが転写調節因子ＭＫＬ１と結合することにより、ＭＫＬ１の核移行及び転写活性が阻害されることも報告されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第５０９８０２８号公報
【特許文献２】特開２０１５−１６４４３０号公報
【特許文献３】特開２０１６−７３３０３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Matsumoto T., et al., Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential., J. Cellular Physiol., 215 (1), 210-222, 2008.
【非特許文献２】Olson E. N., Linking actin dynamics and gene transcription to drive cellular motile functions., Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 11 (5), 353-365, 2010.
【非特許文献３】Nobusue H., et al., Regulation of MKL1 via actin cytoskeleton dynamics drives adipocyte differentiation., Nat. Commun. 5:3368., doi:10.1038/ncomms4368, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、分化した体細胞を脱分化し、誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉＦＰ細胞）を簡便に短期間で製造する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、種々の体細胞に脱分化を誘導しうる方法について鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに、上述の非特許文献３の記載から、分化した細胞ではＭＫＬ１遺伝子のみを導入しても核への移行は生じず、分化状態が維持されることが予想されるにもかかわらず、ＭＫＬ１遺伝子のみの導入で分化した体細胞を脱分化させることができること、さらに、ＭＫＬ１の標的遺伝子のみの導入では脱分化は生じないがＭＫＬ１の標的遺伝子と標的ではない遺伝子の２種類の遺伝子を導入することよっても脱分化させることができること、この脱分化方法は２〜４日間という短期間で高効率に多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞に脱分化させることができることを明らかにし、本発明を完成させた。さらに、本発明の方法で製造した脱分化細胞は、成長因子等の添加なしに多分化能を維持して増殖させることができ、再度、種々の体細胞に分化させることができることも明らかにした。【００１３】
本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を有効成分として含有する、体細胞の脱分化誘導剤。
［２］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、又は、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせである、［１］に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［３］細胞骨格因子の発現を調節する前記転写調節因子がＭｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  （Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）１（ＭＫＬ１）である、［２］に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［４］前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、［２］又は［３］に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［５］前記アクチンファミリーが、Ａｃｔｉｎ，  Ａｌｐｈａ  １，  Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ（ＡＣＴＡ１）、Ａｃｔｉｎ，  Ａｌｐｈａ  ２，  Ｓｍｏｏｔｈ  Ｍｕｓｃｌｅ，  Ａｏｒｔａ（ＡＣＴＡ２）、Ａｃｔｉｎ  Ｂｅｔａ（ＡＣＴＢ）又はＡｃｔｉｎ  Ｇａｍｍａ  １（ＡＣＴＧ）である、［４］に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［６］前記活性型ＲＨＯファミリーが、活性型Ｒａｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ａ（ＲＨＯＡ）、活性型Ｒａｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ（ＲＨＯＢ）又は活性型Ｒａｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ｃ（ＲＨＯＣ）である、［２］〜［５］のいずれかに記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［７］前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記活性型ＲＨＯファミリーが活性型ＲＨＯＡである、［４］〜［６］のいずれかに記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［８］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、［１］〜［７］のいずれかに記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［９］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子を発現可能に保持するベクターである、［１］〜［８］のいずれかに記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［１０］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させることを含む、前記体細胞の脱分化方法。
［１１］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格タンパク質の発現を調節する転写調節因子、又は、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせである、［１０］に記載の体細胞の脱分化方法。
［１２］細胞骨格タンパク質の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１である、［１１］に記載の体細胞の脱分化方法。
［１３］前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、［１１］又は［１２］に記載の体細胞の脱分化方法。
［１４］前記アクチンファミリーが、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ又はＡＣＴＧである、［１３］に記載の体細胞の脱分化方法。
［１５］前記活性型ＲＨＯファミリーが、活性型ＲＨＯＡ、活性型ＲＨＯＢ又は活性型ＲＨＯＣである、［１１］〜［１４］のいずれかに記載の体細胞の脱分化方法。
［１６］前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記活性型ＲＨＯファミリーが活性型ＲＨＯＡである、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の体細胞の脱分化方法。
［１７］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、［１０］〜［１６］のいずれかに記載の体細胞の脱分化方法。
［１８］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させることを含む、誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ：ｉＦＰ細胞）の製造方法。
［１９］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、又は、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせである、［１８］に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［２０］細胞骨格因子の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１である、［１９］に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［２１］前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、［１９］又は［２０］に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［２２］前記アクチンファミリーが、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ又はＡＣＴＧである、［２１］に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［２３］前記活性型ＲＨＯファミリーが、活性型ＲＨＯＡ、活性型ＲＨＯＢ又は活性型ＲＨＯＣである、［１９］〜［２２］のいずれかに記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［２４］前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記活性型ＲＨＯファミリーが活性型ＲＨＯＡである、［２１］〜［２３］のいずれかに記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［２５］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、［１８］〜［２４］のいずれかに記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［２６］［１８］〜［２５］のいずれかに記載の製造方法により製造されたｉＦＰ細胞。
［２７］アクチンストレスファイバーを有する、［２６］に記載のｉＦＰ細胞。
［２８］［２６］又は［２７］に記載のｉＦＰ細胞を分化させることを含む、体細胞の製造方法。
［２９］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、［２８］に記載の体細胞の製造方法。
［３０］脱分化誘導剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で体細胞を培養することと、前記体細胞における細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の発現量を定量することと、を含み、前記因子の発現量が、被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇することが、前記被験物質が脱分化誘導剤であることを示す、スクリーニング方法。
［３１］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞又は膵臓細胞である、［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３２］細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、細胞骨格因子又はＲＨＯファミリーである、［３０］又は［３１］に記載のスクリーニング方法。
［３３］細胞骨格因子の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１である、［３２］に記載のスクリーニング方法。
［３４］前記細胞骨格因子が、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー及びミオシン調節軽鎖よりなる群から選択された少なくとも１つである、［３２］又は［３３］に記載のスクリーニング方法。
［３５］前記アクチンファミリーが、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ又はＡＣＴＧである、［３４］に記載のスクリーニング方法。
［３６］前記ＲＨＯファミリーが、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ又はＲＨＯＣである、［３２］〜［３５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［３７］前記アクチンファミリーがＡＣＴＡ２であり、前記ＲＨＯファミリーがＲＨＯＡである、［３４］〜［３６］のいずれかに記載のスクリーニング方法。【００１４】
本発明は以下の態様を含むものであるということもできる。
［Ｐ１］細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる因子からなる体細胞の脱分化誘導剤。
［Ｐ２］細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格タンパク質の発現を調節する転写調節因子、又はアクチンファミリー遺伝子及び活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子の組み合わせである、［Ｐ１］に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［Ｐ３］細胞骨格タンパク質の発現を調節する前記転写調節因子が、Ｍｅｇａｋａｒｙｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  （Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）１（ＭＫＬ１）遺伝子である、［Ｐ２］に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［Ｐ４］前記アクチンファミリー遺伝子が、ＡＣＴＡ遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子又はＡＣＴＧ遺伝子である、［Ｐ２］又は［Ｐ３］に記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［Ｐ５］前記活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子が、ＲｈｏＡ遺伝子、ＲｈｏＢ遺伝子又はＲｈｏＣ遺伝子の構成的活性型変異体である、［Ｐ２］〜［Ｐ４］のいずれかに記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［Ｐ６］前記アクチンファミリー遺伝子がＡＣＴＡ２遺伝子であり、前記活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子が活性型ＲｈｏＡ遺伝子である、［Ｐ２］〜［Ｐ５］のいずれかに記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［Ｐ７］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、上皮細胞又は神経細胞である、［Ｐ１］〜［Ｐ６］のいずれかに記載の体細胞の脱分化誘導剤。
［Ｐ８］細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させる工程を備える、前記体細胞の脱分化方法。
［Ｐ９］細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格タンパク質の発現を調節する転写調節因子、又はアクチンファミリー遺伝子及び活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子の組み合わせである、［Ｐ８］に記載の体細胞の脱分化方法。
［Ｐ１０］細胞骨格タンパク質の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１遺伝子である、［Ｐ８］又は［Ｐ９］に記載の体細胞の脱分化方法。
［Ｐ１１］前記アクチンファミリー遺伝子が、ＡＣＴＡ遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子又はＡＣＴＧ遺伝子である、［Ｐ９］又は［Ｐ１０］に記載の体細胞の脱分化方法。
［Ｐ１２］前記活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子が、ＲｈｏＡ遺伝子、ＲｈｏＢ遺伝子又はＲｈｏＣ遺伝子の構成的活性型変異体である、［Ｐ９］〜［Ｐ１１］のいずれかに記載の体細胞の脱分化方法。
［Ｐ１３］前記アクチンファミリー遺伝子がＡＣＴＡ２遺伝子であり、前記活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子が活性型ＲｈｏＡ遺伝子である、［Ｐ９］〜［Ｐ１２］のいずれかに記載の体細胞の脱分化方法。
［Ｐ１４］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、上皮細胞又は神経細胞である、［Ｐ８］〜［Ｐ１３］のいずれかに記載の体細胞の脱分化方法。
［Ｐ１５］細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させる工程を備える、誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ：ｉＦＰ細胞）の製造方法。
［Ｐ１６］細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格タンパク質の発現を調節する転写調節因子、又はアクチンファミリー遺伝子及び活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子の組み合わせである、［Ｐ１５］に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［Ｐ１７］細胞骨格タンパク質の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１遺伝子である、［Ｐ１６］に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［Ｐ１８］前記アクチンファミリー遺伝子が、ＡＣＴＡ遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子又はＡＣＴＧ遺伝子である、［Ｐ１６］又は［Ｐ１７］に記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［Ｐ１９］前記活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子が、ＲｈｏＡ遺伝子、ＲｈｏＢ遺伝子又はＲｈｏＣ遺伝子の構成的活性型変異体である、［Ｐ１６］〜［Ｐ１８］のいずれかに記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［Ｐ２０］前記アクチンファミリー遺伝子がＡＣＴＡ２遺伝子であり、前記活性型Ｒｈｏファミリー遺伝子が活性型ＲｈｏＡ遺伝子である、［Ｐ１６］〜［Ｐ１９］のいずれかに記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［Ｐ２１］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、上皮細胞又は神経細胞である、［Ｐ１５］〜［Ｐ２０］のいずれかに記載のｉＦＰ細胞の製造方法。
［Ｐ２２］［Ｐ１５］〜［Ｐ２１］のいずれかに記載の製造方法により製造されたｉＦＰ細胞。
［Ｐ２３］アクチンストレスファイバーを有する、［Ｐ２２］に記載のｉＦＰ細胞。
［Ｐ２４］［Ｐ２２］又は［Ｐ２３］に記載のｉＦＰ細胞を分化させる工程を備える、体細胞の製造方法。
［Ｐ２５］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、上皮細胞又は神経細胞である、［Ｐ２４］に記載の体細胞の製造方法。
［Ｐ２６］脱分化誘導剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で体細胞を培養する工程と、前記体細胞における細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる因子又は細胞内張力を高める因子の発現量を定量する工程と、を含み、前記因子の発現量が、被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇することが、前記被験物質が脱分化誘導剤であることを示す、スクリーニング方法。
［Ｐ２７］前記体細胞が、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、上皮細胞又は神経細胞である、［Ｐ２６］に記載のスクリーニング方法。
［Ｐ２８］細胞内骨格タンパク質の重合体を増加させる前記因子が、細胞骨格タンパク質の発現を調節する転写調節因子、アクチンファミリー遺伝子又はＲｈｏファミリー遺伝子である、［Ｐ２６］又は［Ｐ２７］に記載のスクリーニング方法。
［Ｐ２９］細胞骨格タンパク質の発現を調節する前記転写調節因子がＭＫＬ１遺伝子である、［Ｐ２８］に記載のスクリーニング方法。
［Ｐ３０］前記アクチンファミリー遺伝子が、ＡＣＴＡ遺伝子、ＡＣＴＢ遺伝子又はＡＣＴＧ遺伝子である、［Ｐ２８］又は［Ｐ２９］に記載のスクリーニング方法。
［Ｐ３１］前記Ｒｈｏファミリー遺伝子が、ＲｈｏＡ遺伝子、ＲｈｏＢ遺伝子又はＲｈｏＣ遺伝子である、［Ｐ２８］〜［Ｐ３０］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［Ｐ３２］前記アクチンファミリー遺伝子がＡＣＴＡ２遺伝子であり、前記Ｒｈｏファミリー遺伝子がＲｈｏＡ遺伝子である、［Ｐ２８］〜［Ｐ３１］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［Ｐ３３］細胞内張力を高める前記因子が、Ｆｈｌ２遺伝子又はＭｌｙ９遺伝子である、［Ｐ２６］〜［Ｐ３２］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、分化した種々の体細胞を脱分化し、誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉＦＰ細胞）を簡便に短期間で製造する技術を提供することができる。また、製造された誘導型人工線維芽前駆細胞は多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、通常の血清含有培地で成長因子等の添加なしに多分化能を維持して増殖させることができ、さらに公知の分化誘導方法によって種々の体細胞に分化させることができる。したがって、本発明により提供される技術は、再生医療への臨床応用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実験例１における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図２】実験例２における免疫組織染色の結果を示す写真である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、実験例３における定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）の結果を示すグラフである。
【図４】実験例４における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図５】実験例５におけるＱＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図６】実験例６におけるマイクロアレイ解析の結果を示すグラフである。
【図７】実験例７における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図８】実験例８における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図９】実験例９における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図１０】（ａ）及び（ｂ）は実験例１０におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１１】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１１におけるＱＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１２】（ａ）及び（ｂ）は、実験例１２におけるコラーゲンゲルアッセイの結果を示す写真である。
【図１３】実験例１３における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図１４】実験例１４における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図１５】実験例１６における蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図１６】実験例１７の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１７】実験例１７の結果を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
本明細書では、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。また、マウス遺伝子は、先頭文字を大文字のアルファベットで、それ以降を小文字のアルファベットで表すものとする。また、マウスタンパク質は大文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、マウス遺伝子、その他の種の遺伝子を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。また、ヒトタンパク質、マウスタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。
【００１８】
［脱分化誘導剤］
１実施形態において、本発明は、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を有効成分として含有する、体細胞の脱分化誘導剤を提供する。
【００１９】
実施例において後述するように、発明者らは、驚くべきことに、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を体細胞中で発現させることにより、分化した体細胞を脱分化させることができることを明らかにした。したがって、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子は、脱分化誘導剤として利用することができる。
【００２０】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子としては、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、前記転写調節因子の標的因子、及び、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせ等が挙げられる。前記転写調節因子は、細胞骨格因子の発現を増加させるものであることが好ましい。
【００２１】
細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子としては、ＭＫＬ１が挙げられる。また、ＭＫＬ１の標的因子としては、アクチンファミリーが挙げられる。
【００２２】
また、細胞骨格因子としては、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー、ミオシン調節軽鎖、チューブリンファミリー、ビメンチン等が挙げられ、中でもアクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー、ミオシン調節軽鎖が好ましく、アクチンファミリーが最も好ましい。アクチンファミリーとしては、例えば、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ等が挙げられ、中でもＡＣＴＡ２が好ましい。ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリーとしては、Ｆｏｕｒ  Ａｎｄ  Ａ  Ｈａｌｆ  ＬＩＭ  Ｄｏｍａｉｎｓ  １（ＦＨＬ１）、ＦＨＬ２、ＦＨＬ３、ＦＨＬ４及びＦＨＬ５を含むＦｏｕｒ−ａｎｄ−ａ−ｈａｌｆ  ＬＩＭ（ＦＨＬ）−ｏｎｌｙプロテインサブファミリーが好ましく、中でもＦＨＬ２がより好ましい。ミオシン調節軽鎖としては、Ｍｙｏｓｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ  １（ＭＹＬ１）、ＭＹＬ２、ＭＹＬ３、ＭＹＬ４、ＭＹＬ５、ＭＹＬ６、ＭＹＬ６Ｂ、ＭＹＬ７、ＭＹＬ９、ＭＹＬＩＰ、ＭＹＬＫ、ＭＹＬＫ２、及び、ＭＹＬＬ１が挙げられ、中でもＭＹＬ９が好ましい。
【００２３】
また、ＲＨＯファミリーとしては、例えば、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＨＯＣ等が挙げられる。また、活性型ＲＨＯファミリーとしては、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が結合して活性化されたＲＨＯファミリータンパク質、ＲＨＯファミリーの構成的活性型変異体等が挙げられる。より具体的なＲＨＯファミリーの構成的活性型変異体としては、例えば、ＲＨＯＡＶ１４、ＲＨＯＢＶ１４、ＲＨＯＣＶ１４等が挙げられる。
【００２４】
本実施形態の脱分化誘導剤は、細胞骨格因子及び活性型ＲＨＯファミリーの組み合わせであってもよい。この場合、細胞内において、細胞骨格タンパク質及び活性型ＲＨＯファミリータンパク質が増加することとなる。その結果、活性型ＲＨＯファミリータンパク質が細胞骨格タンパク質に作用して細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる。また、この結果、細胞内張力が高まる。その結果、体細胞の脱分化が誘導される。
【００２５】
本実施形態の脱分化誘導剤において、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子は、タンパク質であってもよいし、前記タンパク質をコードする核酸であってもよいし、タンパク質又は核酸以外の物質であってもよい。また、核酸は、ｍＲＮＡ等のＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡであってもよい。これらの因子は、例えばヒト由来であってもよく、マウス由来であってもよく、その他の種由来であってもよい。
【００２６】
本明細書において、例えば「ＭＫＬ１」との表記は、ＭＫＬ１タンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。また、例えば「細胞骨格因子」との表記は、細胞骨格タンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。また、例えば「アクチンファミリー」との表記は、アクチンファミリータンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。また、例えば「活性型ＲＨＯファミリー」との表記は、活性型ＲＨＯファミリータンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味し、以下同様である。
【００２７】
ヒト及びマウスの、ＭＫＬ１、ＦＨＬ２、ＭＹＬ９、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＨＯＣのタンパク質及びｍＲＮＡのＮＣＢＩアクセッション番号の例を下記表１及び表２に示す。
【００２８】
【表１】
2019009419.tif 000002
【００２９】
【表２】
2019009419.tif 000003
【００３０】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子は、体細胞を脱分化させる活性を有する限り変異を有していてもよい。細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子が変異を有する場合、当該因子は、表１又は表２に例示されるＮＣＢＩアクセッション番号により特定されるタンパク質又はｍＲＮＡに対して、８０％以上の配列同一性を有することが好ましく、９０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが更に好ましい。
【００３１】
ここで、アミノ酸配列の配列同一性は、対象のアミノ酸配列（対象アミノ酸配列）が、基準となるアミノ酸配列（基準アミノ酸配列）に対して一致している割合を示す値である。基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致したアミノ酸の数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００  …（１）
【００３２】
同様に、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の数を算出し、下記式（２）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基の数／対象塩基配列の総塩基数×１００  …（２）
【００３３】
本実施形態の脱分化誘導剤は、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を有効成分として含有する。本明細書において、「有効成分として含有する」とは、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞を脱分化させる効果が得られる程度の量含有することを意味し、その含有量は特に限定されない。
【００３４】
本実施形態の脱分化誘導剤において、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子はタンパク質であってもよく、当該タンパク質をコードする核酸であってもよい。また、核酸はｍＲＮＡであってもよいし、ＤＮＡであってもよい。上記の因子がＤＮＡである場合、当該ＤＮＡは、発現ベクターに含まれていてもよい。すなわち、本実施形態の脱分化誘導剤は、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を発現可能に保持する発現ベクターであってもよい。
【００３５】
発現ベクターとしては、体細胞中でこれらの遺伝子を発現させることができる限り特に制限されず、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよく、トランスポゾンベクターであってもよい。ウイルスベクターは遺伝子の導入効率が高く使いやすい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター等が挙げられる。また、トランスポゾンベクターは、必要に応じて細胞から完全に除去することができる。このようなトランスポゾンベクターとしては、例えばｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンベクター等が挙げられる。
【００３６】
あるいは、本実施形態の脱分化誘導剤は、細胞骨格因子の発現を誘導するか、細胞内張力を高めるか、又は細胞骨格タンパク質を重合させる低分子化合物等であってもよい。脱分化誘導剤が低分子化合物である場合、体細胞に遺伝子操作を行うことなく脱分化させることができる。
【００３７】
本実施形態の脱分化誘導剤を体細胞に導入することにより、体細胞を脱分化させることができる。本実施形態の脱分化誘導剤がタンパク質、ＲＮＡ、低分子化合物等である場合、脱分化誘導剤を細胞に導入する方法としては、例えば、細胞への接触、マイクロインジェクション、ウイルス様粒子を用いる方法、リポフェクション法、これらの組み合わせ等が挙げられる。
【００３８】
また、本実施形態の脱分化誘導剤がベクター等である場合、脱分化誘導剤を細胞に導入する方法としては、例えば、細胞への接触、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、リン酸カルシウム法、これらの組み合わせ等が挙げられる。また、ベクターがウイルスベクターである場合には、細胞に感染させることにより細胞に導入することもできる。
【００３９】
脱分化誘導剤の体細胞への導入は、インビトロで行われてもよいし、インビボで行われてもよい。また、体細胞の脱分化誘導剤は、１種類を単独で用いてもよいし、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００４０】
本明細書において、「体細胞」とは、生殖細胞以外の細胞を意味する。体細胞は、分化した細胞であり、多分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）も多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）も有しない。また、体細胞は、インビトロで培養された細胞であってもよいし、インビボの細胞であってもよい。また、体細胞は、初代培養細胞であってもよいし、株化された細胞であってもよい。株化された細胞は、一般的には不死化した細胞であり、癌細胞であってもよい。
【００４１】
本実施形態の脱分化誘導剤が脱分化させる対象とする体細胞としては、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞、膵臓細胞等が挙げられる。
【００４２】
また、本実施形態の脱分化誘導剤が脱分化させる対象とする体細胞の種としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ヒツジ等が挙げられる。
【００４３】
［体細胞の脱分化方法］
１実施形態において、本発明は、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させる工程を備える、前記体細胞の脱分化方法を提供する。本実施形態の体細胞の脱分化方法は、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内に導入する工程を備えるものであるということもできる。
【００４４】
実施例において後述するように、本実施形態の脱分化方法により、分化した体細胞を脱分化させることができる。発明者らは、体細胞内で細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を発現させることにより、細胞内張力が上昇することを明らかにした。体細胞の細胞内張力が上昇した結果、体細胞が脱分化する。したがって、本実施形態の脱分化方法は、体細胞の細胞内張力を上昇させる工程を備える、体細胞の脱分化方法であるということもできる。
【００４５】
実施例において後述するように、本実施形態の脱分化方法により得られた脱分化細胞は、例えば、誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ：ｉＦＰ細胞）であり、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有している。
【００４６】
本実施形態の脱分化方法において、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子としては、上述したものと同様のものを用いることができる。また、本実施形態の脱分化方法において、脱分化させる対象とする体細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００４７】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を体細胞内で発現させる工程は、例えば、上述した細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の遺伝子の発現ベクターを、インビトロ又はインビボで細胞に導入することにより実施することができる。
【００４８】
あるいは、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子が化学物質である場合には、当該化学物質をインビトロで細胞に投与するか、又はインビボで生体に投与することにより実施することができる。
【００４９】
実施例において後述するように、本実施形態の脱分化方法はインビボでも実施することができる。本実施形態の脱分化方法により製造したｉＦＰ細胞は、成長因子等を添加することなく、血清含有培地で培養することにより、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を維持して増殖することができる。
【００５０】
［誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉＦＰ細胞）の製造方法］
１実施形態において、本発明は、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を、体細胞内で発現させる工程を備える、ｉＦＰ細胞の製造方法を提供する。
【００５１】
本実施形態の製造方法により、分化した体細胞を脱分化させて、ｉＦＰ細胞を製造することができる。体細胞は、例えば、患者本人由来の細胞であってもよいし、患者と免疫学的に適合した第３者由来の細胞であってもよい。また、遺伝子工学的手法を用いて免疫原性を低減させたＨＬＡ改変細胞であってもよい。本明細書において、本実施形態の製造方法により製造される間葉系幹細胞様の人工幹細胞を、ｉＦＰ細胞という場合がある。
【００５２】
本実施形態の製造方法において、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子としては、上述したものと同様のものを用いることができる。また、本実施形態の製造方法において、脱分化させる対象とする体細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００５３】
［誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉＦＰ細胞）］
１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造されたｉＦＰ細胞を提供する。実施例において後述するように、本実施形態のｉＦＰ細胞は、アクチンストレスファイバーを有していてもよい。アクチンストレスファイバーの存在は、例えば、標識されたファロイジンを用いて細胞を染色すること等により検出することができる。本実施形態のｉＦＰ細胞は、増殖能及び多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有している。したがって、例えば再生医療等に利用することができる。
【００５４】
本実施形態のｉＦＰ細胞は、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子を体細胞内で発現させることにより製造されている。このため、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子として、上述した遺伝子が導入されている場合がある。
【００５５】
しかしながら、例えばトランスポゾンベクター等を用いて遺伝子が導入され、脱分化後に当該遺伝子が除去された場合や、細胞骨格タンパク質を重合させる因子が低分子化合物等の化学物質であった場合等には、脱分化に用いられた、細胞骨格タンパク質を重合させる因子を検出することは不可能である。
【００５６】
本実施形態のｉＦＰ細胞と、例えば生体内に天然に存在する間葉系幹細胞とは、遺伝子発現パターン等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違が存在するか否かは定かではなく、また、そのような相違を特定して、遺伝子発現パターン等により本実施形態のｉＦＰ細胞を特定するためには、著しく多くの試行錯誤を重ねることが必要であり、実質的に不可能である。したがって、本実施形態のｉＦＰ細胞は、上述した製造方法により製造されたことにより特定することが実際的であるといえる。
【００５７】
［分化した体細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、上述したｉＦＰ細胞を分化させる工程を備える、分化した体細胞の製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、ｉＦＰ細胞を分化させて体細胞を製造することができる。また、公知の分化誘導方法によって種々の体細胞に分化させることができる。本実施形態の製造方法により製造された体細胞は、例えば再生医療等に利用することができる。
【００５８】
本実施形態の製造方法により製造する体細胞としては、主に間葉系の体細胞が挙げられ、より具体的には、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、血管細胞、心筋細胞等が挙げられる。間葉系以外にも、外胚葉系の上皮細胞や神経細胞、内胚葉系の肝細胞や膵臓細胞等が挙げられる。製造する体細胞は、上述したｉＦＰ細胞が由来した体細胞と同じ種類の細胞であってもよく、異なる種類の細胞であってもよい。
【００５９】
ｉＦＰ細胞を分化させる工程は、例えば、ｉＦＰ細胞を、対象とする体細胞に分化させることができる既知の条件で培養すること等により実施することができる。分化誘導剤及び分化誘導培地としては、公知のものを使うことができる。また、細胞内ストレスファイバーを減少させることによっても実施することができる。ストレスファイバーを減少させる方法としては、例えば、ＭＫＬ１遺伝子をノックダウンする方法、ＡＣＴＡ２遺伝子等の細胞骨格遺伝子をノックダウンする方法等が挙げられる。
【００６０】
［脱分化誘導剤のスクリーニング方法］
１実施形態において、本発明は、脱分化誘導剤のスクリーニング方法であって、被験物質の存在下で体細胞を培養する工程と、前記体細胞における細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の発現量を定量する工程と、を含み、前記因子の発現量が、被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇することが、前記被験物質が脱分化誘導剤であることを示す、スクリーニング方法を提供する。本実施形態のスクリーニング方法により、体細胞を脱分化させることができる脱分化誘導剤をスクリーニングすることができる。
【００６１】
本実施形態のスクリーニング方法において、被験物質は、例えば、化合物ライブラリ由来の化合物であってもよいし、発現ライブラリ由来の遺伝子であってもよい。また、体細胞としては、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞、膵臓細胞等が挙げられる。
【００６２】
本実施形態のスクリーニング方法において、発現量を定量する対象となる因子としては、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子、細胞骨格因子、ＲＨＯファミリー等が挙げられる。より具体的には、細胞骨格因子の発現を調節する転写調節因子としては、ＭＫＬ１等が挙げられる。
【００６３】
また、細胞骨格因子としては、アクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー、ミオシン調節軽鎖、チューブリンファミリー、ビメンチン等が挙げられ、中でもアクチンファミリー、ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリー、ミオシン調節軽鎖が好ましく、アクチンファミリーが最も好ましい。アクチンファミリーとしては、例えば、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＡ２、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ等が挙げられ、中でもＡＣＴＡ２が好ましい。ＬＩＭ−ｏｎｌｙプロテインファミリーとしては、ＦＨＬ１、ＦＨＬ２、ＦＨＬ３、ＦＨＬ４及びＦＨＬ５を含むＦＨＬ−ｏｎｌｙプロテインサブファミリーが好ましく、中でもＦＨＬ２がより好ましい。ミオシン調節軽鎖としては、ＭＹＬ１、ＭＹＬ２、ＭＹＬ３、ＭＹＬ４、ＭＹＬ５、ＭＹＬ６、ＭＹＬ６Ｂ、ＭＹＬ７、ＭＹＬ９、ＭＹＬＩＰ、ＭＹＬＫ、ＭＹＬＫ２、及び、ＭＹＬＬ１が挙げられ、中でもＭＹＬ９が好ましい。
【００６４】
また、ＲＨＯファミリーとしては、ＲＨＯＡ、ＲＨＯＢ、ＲＨＯＣ等が挙げられる。ＲＨＯファミリーとしては、活性型ＲＨＯファミリーを定量してもよいし、不活性型ＲＨＯファミリーを定量してもよい。
【００６５】
細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の発現量の定量は、例えば、ＱＰＣＲ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ法、免疫組織染色等により行うことができる。また、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の発現量が、被験物質の非存在下における発現量と比較して上昇したか否かは、被験物質の非存在下で細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の発現量を定量し、その発現量と比較することにより判定してもよいし、予め被験物質の非存在下における、細胞骨格タンパク質の重合体を増加させる因子の発現量を基準値として測定しておき、当該基準値との比較により判定してもよい。
【実施例】
【００６６】
次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。【００６７】
［材料及び方法］
（細胞）
マウス脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）、マウス繊維芽細胞株３Ｔ３−Ｌ１およびマウス軟骨前駆細胞株ＡＴＤＣ５（理研ＢＲＣ）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ナカライテスク社）を増殖培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）として用い、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相下の炭酸ガス培養装置内に静置して培養した。【００６８】
なお、脱分化脂肪細胞とは、終末分化した成熟脂肪細胞を、天井培養という方法で培養することにより得られる、脱分化した線維芽細胞様の細胞である。【００６９】
（ＤＦＡＴ及び３Ｔ３−Ｌ１の脂肪細胞への分化誘導）
ＤＦＡＴ及び３Ｔ３−Ｌ１を、プレコンフルエント（コンフルエントの８割くらいの細胞密度）に達するまで培養した。続いて、培地を、０．２５μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ、和光純薬）、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、和光純薬）及びインスリン−トランスフェリン−セレニウム−Ｘサプリメント（ＩＴＳ−Ｘ、１：２００、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭに交換し、脂肪細胞へ分化誘導した。分化誘導開始から３日後に、培地を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）及びＩＴＳ−Ｘ（１：１００）を添加したＤＭＥＭに交換し、更に３日間分化誘導した。【００７０】
（ＡＴＤＣ５の軟骨への分化誘導）
ＡＴＤＣ５を、プレコンフルエントに達するまで培養した。続いて、培地を、５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００）及び１００μＭアスコルビン酸（シグマ社）を添加したＤＭＥＭに交換し、１０日間分化誘導した。【００７１】
（レトロウイルスによる遺伝子導入）
ＰＬＡＴ−Ｅパッケージング細胞（東京大学医科学研究所  北村俊雄教授より入手）を１０ｃｍディッシュに４×１０６個の細胞密度で播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地でプレコンフルエントに達するまで培養した。その後、３００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に２７μＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（プロメガ社）を混合し、室温で５分間静置した。続いて、反応液にＴｅｔ−Ｏｎ発現プラスミドを９μｇずつ添加し、室温で１５分間静置した。【００７２】
Ｔｅｔ−Ｏｎ発現プラスミドとしては、ｐＲｅｔｒｏＸ−Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（クロンテック社）に目的の遺伝子を組み込んだものを用いた。具体的には、ＭＫＬ１遺伝子を組み込んだｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒ、ＡＣＴＡ２遺伝子を組み込んだｐＲｅｔｒｏＸ−ＡＣＴＡ２−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒ、又はＲＨＯＡの構成的活性化型変異体であるＲＨＯＡＶ１４の遺伝子を組み込んだｐＲｅｔｒｏＸ−ＲＨＯＡＶ１４−Ｔｉｇｈｔ−ＢＳＤの各発現プラスミドを用いた。【００７３】
続いて、培地交換したＰＬＡＴ−Ｅ細胞にトランスフェクション溶液を全量添加し、２４時間培養した。２４時間後、培地を捨てて、新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ添加し、４８時間培養し、レトロウイルスベクターを産生させた。【００７４】
４８時間後、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞の培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過滅菌したのち、４℃、１３，０００ｒｐｍ（２２，７００×ｇ）、３時間超遠心することでウイルスの濃縮を行った。遠心終了後、遠沈管にウイルスペレットを確認した。続いて、６μｇ／ｍＬプロタミンを添加した２ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地でウイルスペレットを溶かし、ウイルス液をＤＦＡＴ、３Ｔ３−Ｌ１及びＡＴＤＣ５細胞にそれぞれ添加し、感染させた。２４時間後、新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、培養した。ウイルス感染から７日後、各プラスミドにコードされる耐性遺伝子に対応する抗生物質（２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ、１０μｇ／ｍＬピューロマイシン又は１０μｇ／ｍＬブラスチジンＳ）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、薬剤セレクションを行い、発現安定株をそれぞれ取得した。【００７５】
（ｓｉＲＮＡの導入）
１ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ培地に１０μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉ  ＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて混合し、室温で５分間静置した。続いて、上記混合液に２０μＭの二本鎖ｓｉＲＮＡを１０μＬ加えて、室温で１５分間静置した。二本鎖ｓｉＲＮＡとしては、下記表３に記載の塩基配列を標的とする二本鎖ｓｉＲＮＡを使用した。表３中、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照として使用したスクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ｓｉＲＮＡを意味する。【００７６】
【表３】
2019009419.tif 000004
【００７７】
プレコンフルエントに達した細胞（ＤＦＡＴ、３Ｔ３−Ｌ１又はＡＴＤＣ５）の培地を２ｍＬの新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、１５分後にｓｉＲＮＡ混合液を全量添加し、２日間静置して培養した。２日後に新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、更に２日間培養した後、サンプリングを行い解析した。【００７８】
（遺伝子発現解析）
ＴＲＩＺＯＬ  Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、常法によりＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡはＤＮａｓｅＩ（タカラ社）でＤＮＡを除去したのち、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて、逆転写しｃＤＮＡ合成した。【００７９】
逆転写したｃＤＮＡは、Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）と種々の特異的なＴａｑｍａｎプローブ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、定量ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）解析を行った。表４に使用したＴａｑｍａｎプローブの製品番号を示す。【００８０】
【表４】
2019009419.tif 000005
【００８１】
（タンパク質発現解析−ウェスタンブロット解析）
細胞をＰＢＳで洗浄し、セルスクレーパーで回収し、４℃、１，２００ｒｐｍ（１３０×ｇ）、３分間の遠心処理を行った。５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク社）及びフォスファターゼ阻害剤カクテル（ナカライテスク社）を超純水（ＭｉｌｌｉＱ）に添加したＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを遠心後の細胞ペレットに加えて、ボルテックスにより溶解したのち、氷中にて３０分間静置した。【００８２】
続いて、４℃、１４，０００ｒｐｍ（１７，９７０×ｇ）、１５分間の遠心処理を行い、上清を新しいチューブに回収した。続いて、ＢＣＡ法にてタンパク質定量を行い、タンパク質量を調整した後に、還元剤含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用試料緩衝液（ナカライテスク社）を加えて、９５℃、５分間静置し、ＳＤＳ変性させた。【００８３】
ＳＤＳ変性したタンパク質サンプルは、ＴＧＸ  ＦａｓｔＣａｓｔアクリルアミドゲル（バイオラッド社）にてＳＤＳ電気泳動を行ったのち、トランスブロットＴｕｒｂｏブロッティングシステム（バイオラッド社）を用いて、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。【００８４】
転写したメンブレンは、５質量％スキムミルク、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＴＢＳで１時間ブロッキングした。ブロッキング終了後、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳに種々の特異的抗体を添加し、４℃でローテーターにて一晩反応させた。下記表５に、使用した抗体を示す。【００８５】
【表５】
2019009419.tif 000006
【００８６】
翌日、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳで洗浄した後、二次抗体（バイオラッド社）を加えた０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳで室温にて１時間反応させた。続いて、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳ及びＴＢＳで洗浄した後、ケミルミワンＬ（ナカライテスク社）にて化学発色させ、ルミノイメージアナライザＬＡＳ−３０００（富士フィルム社）にて検出した。【００８７】
（タンパク質発現解析−免疫蛍光染色）
細胞をＰＢＳで洗浄し、４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液（ナカライテスク社）で固定した。続いて、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を加えたＰＢＳで洗浄及び細胞膜透過性処理を行った。その後、１０％（ｖ／ｖ）ヒツジ血清、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加したＰＢＳにて１時間、振とうさせることによりブロッキングした。【００８８】
続いて、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳに種々の特異的抗体を添加し、４℃にて一晩インキュベートした。下記表６に使用した抗体を示す。【００８９】
【表６】
2019009419.tif 000007
【００９０】
一次抗体反応後、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００−ＰＢＳで洗浄した後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ二次抗体（１：２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えて、遮光下にて室温で１時間インキュベートした。二次抗体反応後、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００−ＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてアクチン細胞骨格を染色した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（シグマ社）にて核染色を行い、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（サウザンバイオテック社）にて封入し、簡易型共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ１０ｉ（オリンパス社）あるいはオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（キーエンス社）にて観察した。【００９１】
（Ｔｅｔ−ＯＮシステムによる脂肪細胞及び軟骨細胞の脱分化誘導）
ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒ、又は、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＡＣＴＡ２−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒ及びｐＲｅｔｒｏＸ−ＲＨＯＡＶ１４−Ｔｉｇｈｔ−ＢＳＤを導入したＤＦＡＴ、３Ｔ３−Ｌ１及びＡＴＤＣ５細胞を、上述した方法で脂肪細胞又は軟骨細胞に分化誘導した。【００９２】
分化誘導６日後の終末分化した脂肪細胞の培地を、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００）を添加したＤＭＥＭ培地に１μｇ／ｍＬドキシサイクリン（ＤＯＸ）を加えた培地に交換した。ＤＯＸ添加から４８時間後にサンプリングを行い、得られたｉＦＰ細胞の細胞特性を解析した。また、一部のｉＦＰ細胞はＰＢＳで洗浄した後、種々の分化誘導培地に交換して分化能を検討した。【００９３】
また、分化誘導１０日後の分化した軟骨細胞の培地を、５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００）を添加したＤＭＥＭ培地に１μｇ／ｍＬのＤＯＸを加えた培地に交換し、９６時間後にサンプリングを行い、解析した。【００９４】
分化脂肪細胞及び軟骨細胞の脱分化は、分化特異的マーカーの遺伝子又はタンパク質発現の減少、ＡＣＴＡ２の発現とアクチンストレスファイバーの形成、マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析結果を指標として評価した。【００９５】
（Ｔｅｔ−Ｏｎシステムによる生体内での脂肪細胞の脱分化誘導）
ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒ、又は、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＡＣＴＡ２−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒ及びｐＲｅｔｒｏＸ−ＲＨＯＡＶ１４−Ｔｉｇｈｔ−ＢＳＤを導入したＤＦＡＴ細胞をセルスクレーパーにて回収し、１×１０５個を１００μＬのマトリゲル（コーニング社）に懸濁した後、レシピエントの同系雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（８週齢）の胸部皮下（脂肪組織のない部位）へと２５Ｇ針注射器を用いて注入した。【００９６】
移植７日後に、移植細胞を回収し、移植細胞が脂肪細胞へと分化し、組織形成していることを確認した。続いて、ドキシサイクリン含有飼料（日本エスエルシー社）を給餌し、４８時間後に移植部位の細胞をサンプリングした。【００９７】
回収した組織は、４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定した後、常法によりパラフィン包埋切片を作製した。組織切片は脱パラフィンした後、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うとともに、免疫組織染色にて種々の特異的タンパク質の発現を検出した。【００９８】
脱パラフィンした組織切片は、１０ｍＭクエン酸緩衝液に浸して電子レンジでマイクロウェーブ法によって抗原賦活処理を行った。続いて、３質量％過酸化水素水−ＴＢＳ溶液に浸して、内因性ペルオキシダーゼを失活させた後、１０％（ｖ／ｖ）ヒツジ血清、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加したＴＢＳにてブロッキングを行った。【００９９】
続いて、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＴＢＳ溶液に希釈した、細胞追跡マーカーである抗ＧＦＰ抗体（型式「５９８」、１：１００、ＭＢＬ社）、外来遺伝子発現マーカーである抗ＦＬＡＧ抗体（型式「Ｆ１８０４」、１：５００、シグマ社）、脂肪分化マーカーである抗ＦＡＢＰ４抗体（型式「ａｂ１３９７９」、１：５００、アブカム社）及び抗ＰＬＩＮ１抗体（型式「Ｐ１８７３」、１：５００、シグマ社）を組織切片に添加し、４℃で一晩インキュベートした。【０１００】
一次抗体反応後、ＴＢＳで洗浄した後、二次抗体（ベクターラボラトリーズ社）を希釈した１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＴＢＳ溶液で室温、１時間インキュベートした。続いて、ＴＢＳで洗浄した後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ  ＡＢＣ試薬（ベクターラボラトリーズ社）を添加して、室温で反応させた。続いて、ＴＢＳで洗浄した後、酵素基質溶液ＩｍｍＰＡＣＴ  ＤＡＢ（ベクターラボラトリーズ社）を添加し、発色させた。ヘマトキシリン溶液でカウンター染色を行った後、アルコール上昇系列にて透徹処理をし、封入したのち、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００で観察した。【０１０１】
（脱分化細胞であるｉＦＰ細胞の多分化能の検討）
分化した脂肪細胞及び軟骨細胞において、ＭＫＬ１、又は、ＡＣＴＡ２及び活性型ＲＨＯＡ（ＲＨＯＡＶ１４）の発現により得られた脱分化細胞であるｉＦＰ細胞の多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）について検討した。【０１０２】
《脂肪細胞への分化誘導》
ＤＯＸを除去した脱分化細胞の培地を、０．２５μＭ  ＤＥＸ、０．５ｍＭ  ＩＢＭＸ及びＩＴＳ−Ｘ（１：２００）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭに交換し、脂肪細胞へと分化誘導した。【０１０３】
分化誘導３日後に、培地を１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及びＩＴＳ−Ｘ（１：１００）を添加したＤＭＥＭに交換し、更に３日間分化誘導した。分化誘導６日後、４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定した後、脂肪滴を赤色で染色するオイルレッドＯ（ＯＲＯ）染色を行った。また、一部の細胞からＲＮＡを抽出した後、ＱＰＣＲにより種々の脂肪分化マーカーの発現解析を行った。【０１０４】
《骨芽細胞への分化誘導》
骨芽細胞への分化誘導は、１０μＭレチノイン酸（ＲＡ、シグマ社）及び１００μＭグリセロリン酸（ＧＰ、シグマ社）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ培地で４日間分化誘導した後、１００μＭ  ＧＰ添加１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、１０日間インキュベートすることにより行った。この間、培地交換は４日毎に行った。【０１０５】
分化誘導１４日後、４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定した後、骨分化初期マーカーの指標としてアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行い、骨分化後期マーカーとして石灰化の指標であるフォンコッサ染色を行った。また、一部の細胞からＲＮＡを抽出した後、ＱＰＣＲにより種々の骨分化マーカーの発現解析を行った。【０１０６】
《軟骨細胞への分化誘導》
軟骨細胞への分化誘導は、トリプシンで剥離した脱分化細胞を１５ｍＬの遠沈管に１×１０５個入れ、１，５００ｒｐｍ（２１０×ｇ）、３分間の遠心処理により細胞ペレットを形成させた。続いて、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β、ＩＴＳ−Ｘ（１：１００）、１００ｎＭ  ＤＥＸ及び１００μＭアスコルビン酸を添加した５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を添加し、２１日間ペレット培養を行った。この間、培地交換は４日毎に行った。【０１０７】
ペレット培養２１日後、細胞ペレットを４質量％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定した後、常法にてパラフィン包埋切片を作製し、軟骨結節の形成の指標として、アルシアンブルー染色及び抗ＣＯＬＩＩ抗体による免疫組織染色を行った。また、ペレット培養した一部の細胞からＲＮＡを抽出した後、ＱＰＣＲにより種々の軟骨分化マーカーの発現解析を行った。【０１０８】
［実験例１］
（ＭＫＬ１の発現による脂肪細胞の脱分化）
終末分化した脂肪細胞にＭＫＬ１を発現させ、その影響を検討した。具体的には、まず、上述した方法により、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞を、脂肪細胞に６日間分化誘導した。その結果、脂肪滴を赤色に染色するオイルレッドＯ染色、脂肪分化マーカーであるＰｐａｒｇ、Ｓｌｃ２ａ４、Ｐｌｉｎ１のＱＰＣＲの結果等から脂肪細胞に終末分化したことが確認された。【０１０９】
続いて、終末分化した脂肪細胞の培地にドキシサイクリンを添加し、ＭＫＬ１を発現させた。その後細胞を固定して免疫染色によりＡＣＴＡ２及びＰＬＩＮ１を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１１０】
図１は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図１中、「ＤＯＸ」はドキシサイクリンを示し、「Ｃ」は対照である分化誘導前のＤＦＡＴ細胞の染色結果を示し、「Ｄ６」は６日間分化誘導後のＤＦＡＴ細胞の染色結果を示し、「Ｄ８」は６日間分化誘導した後、２日間ドキシサイクリン処理を行ったＤＦＡＴ細胞の染色結果を示す。【０１１１】
その結果、終末分化した脂肪細胞においてＭＫＬ１遺伝子を発現させると、ＡＣＴＡ２ストレスファイバーの形成が誘導され、脂肪分化マーカーの発現が著しく減少し、線維芽様細胞であるｉＦＰ細胞へと脱分化することが明らかとなった。【０１１２】
また、タイムラプス観察した結果、ＭＫＬ１の発現誘導開始後４８時間以内に線維芽様細胞であるｉＦＰ細胞に変化することが確認され、その変化の効率は８０％以上の高効率であった。また、これらの細胞はＤＯＸを除いて通常の血清培地で培養すると、脂肪細胞に戻ることなく、安定的に増殖することが確認された。【０１１３】
［実験例２］
（インビボにおけるＭＫＬ１の発現による脂肪細胞の脱分化）
続いて、上述した方法により、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞をマウスの体内に移植し、脂肪細胞へと分化させた後、ドキシサイクリン含有飼料を給餌した。ドキシサイクリン含有飼料を与えてから２日後に移植した細胞をサンプリングして、免疫組織染色により解析した。【０１１４】
図２は、免疫組織染色の結果を示す写真である。図２中、「−ＤＯＸ」は、ドキシサイクリンを投与していない対照マウスの結果を示し、「＋ＤＯＸ」はドキシサイクリンを投与したマウスの結果を示し、「ＨＥ」はヘマトキシリン−エオシン染色の結果を示し、「ＧＦＰ」は移植した細胞に導入されているＧＦＰを検出した結果を示し、「ＦＬＡＧ」は、ＭＫＬ１遺伝子に融合させたＦＬＡＧタグを検出した結果を示し、「ＦＡＢＰ４」は脂肪分化マーカーであるＦＡＢＰ４を検出した結果を示し、「ＡＣＴＡ２」はＡＣＴＡ２を検出した結果を示す。【０１１５】
その結果、終末した脂肪細胞にドキシサイクリンを投与すると、ＭＫＬ１が発現し（ＦＬＡＧ）、脂肪分化マーカーが消失し（ＦＡＢＰ４）、ＡＣＴＡ２陽性のｉＦＰ細胞へと脱分化したことが明らかとなった。【０１１６】
この結果から、インビボにおいても、終末分化した脂肪細胞にＭＫＬ１遺伝子を発現させると脱分化することが明らかとなった。【０１１７】
［実験例３］
（ＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞の多分化能の検討）
《脂肪細胞への分化》
ＤＦＡＴ細胞及びＭＫＬ１の発現によって脂肪細胞より脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）を、上述した方法により脂肪細胞へと分化させ、脂肪分化マーカーであるＰｐａｒｇ、Ｓｌｃ２ａ４、Ｐｌｉｎ１の発現をＱＰＣＲにより測定した。【０１１８】
図３（ａ）は、ＱＰＣＲの結果を示すグラフである。図３（ａ）中、「ＧＭ」は分化誘導していない細胞の結果を示し、「ＡＭ」は分化誘導した細胞の結果を示す。【０１１９】
その結果、ＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）は脂肪細胞に再分化することが明らかとなった。また、ＭＫＬ１−ｉＦＰの脂肪細胞への分化は、オイルレッドＯ染色の結果からも確認された。【０１２０】
《骨芽細胞への分化》
ＤＦＡＴ細胞及びＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）を、上述した方法により骨芽細胞へと分化させ、骨分化マーカーであるＲｕｎｘ２、Ｓｐ７の発現をＱＰＣＲにより測定した。【０１２１】
図３（ｂ）は、ＱＰＣＲの結果を示すグラフである。図３（ｂ）中、「ＧＭ」は分化誘導していない細胞の結果を示し、「ＯＭ」は分化誘導した細胞の結果を示す。【０１２２】
その結果、ＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）は骨芽細胞に再分化することが明らかとなった。また、ＭＫＬ１−ｉＦＰの骨芽細胞への分化は、アルカリフォスファターゼ染色、フォンコッサ染色の結果からも確認された。【０１２３】
《軟骨細胞への分化》
ＤＦＡＴ細胞及びＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）を、上述した方法により軟骨細胞へと分化させ、軟骨分化マーカーであるＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１の発現をＱＰＣＲにより測定した。【０１２４】
図３（ｃ）は、ＱＰＣＲの結果を示すグラフである。図３（ｃ）中、「ＧＭ」は分化誘導していない細胞の結果を示し、「ＣＭ」は分化誘導した細胞の結果を示す。【０１２５】
その結果、ＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）は軟骨細胞に再分化することが明らかとなった。また、ＭＫＬ１−ｉＦＰの軟骨細胞への分化は、アルシアンブルー染色、抗ＣＯＬ２抗体による免疫染色の結果からも確認された。【０１２６】
以上の結果から、ＭＫＬ１の発現により脱分化させて得られたｉＦＰ細胞が多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有することが明らかとなった。【０１２７】
［実験例４］
（ＭＫＬ１の発現による軟骨細胞の脱分化）
分化した軟骨細胞にＭＫＬ１を発現させ、その影響を検討した。具体的には、まず、上述した方法により、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＡＴＤＣ５細胞を軟骨細胞に１０日間分化誘導した。その結果、軟骨分化マーカーであるＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１のＱＰＣＲの結果等から軟骨細胞に分化したことが確認された。【０１２８】
続いて、分化した軟骨細胞の培地にドキシサイクリンを添加し、ＭＫＬ１を発現させた。その後細胞を固定して免疫染色によりＡＣＴＡ２及びＣＯＬ２を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１２９】
図４は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図４中、「ＤＯＸ」はドキシサイクリンを示し、「１０−１４」は分化誘導開始後１０〜１４日目にドキシサイクリンを添加したことを示す。【０１３０】
その結果、軟骨細胞においてＭＫＬ１遺伝子を発現させると、ＡＣＴＡ２ストレスファイバーの形成が誘導され、軟骨分化マーカーの発現が有意に減少し、脱分化することが明らかとなった。【０１３１】
［実験例５］
（ＭＫＬ１の発現により軟骨細胞を脱分化させた細胞の再分化能の検討）
ＡＴＤＣ５細胞及びＭＫＬ１の発現によって軟骨細胞より脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）を、上述した方法により軟骨細胞へと分化させ、軟骨分化マーカーであるＳｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１の発現をＱＰＣＲにより測定した。【０１３２】
図５は、ＱＰＣＲの結果を示すグラフである。図５中、「ＧＭ」は分化誘導していない細胞の結果を示し、「ＣＭ」は分化誘導した細胞の結果を示す。【０１３３】
その結果、ＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞（ＭＫＬ１−ｉＦＰ）は軟骨細胞に再分化することが明らかとなった。また、ＭＫＬ１−ｉＦＰの軟骨細胞への分化は、抗ＣＯＬ２抗体による免疫染色の結果からも確認された。【０１３４】
以上の結果から、ＭＫＬ１の発現により軟骨細胞を脱分化して得られたｉＦＰ細胞が再分化能を有することが明らかとなった。【０１３５】
［実験例６］
（ＭＫＬ１の発現により脱分化させた細胞の特性の検討）
ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞を、上述した方法により脂肪細胞へと６日間分化誘導した。続いて、分化した脂肪細胞の培地にドキシサイクリン（ＤＯＸ）を添加し、２日間ＭＫＬ１を発現させた。その結果、脂肪細胞が脱分化し、線維芽様細胞であるｉＦＰ細胞へと脱分化した。続いて、得られたｉＦＰ細胞の培地を、ＤＯＸを含まない１０％（ｖ／ｖ）血清含有培地に交換し、更に２日間培養した。【０１３６】
続いて、上記のＤＦＡＴ細胞、脂肪細胞へと６日間分化誘導したＤＦＡＴ細胞、ＭＫＬ１の発現誘導により脱分化したｉＦＰ細胞、及びＤＯＸを除いて１０％（ｖ／ｖ）血清培地で培養したｉＦＰ細胞から、それぞれＲＮＡを抽出し、マイクロアレイ解析を行った。【０１３７】
図６は、マイクロアレイ解析の結果を示すグラフである。図６中、「Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ」は、脂肪細胞へと６日間分化誘導したＤＦＡＴ細胞の遺伝子発現量から、ＤＦＡＴ細胞の遺伝子発現量を差し引いた結果を示し、「ＭＫＬ１  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ」は、ＭＫＬ１の発現誘導により脱分化したｉＦＰ細胞の遺伝子発現量から、脂肪細胞へと６日間分化誘導したＤＦＡＴ細胞の遺伝子発現量を差し引いた結果を示し、「ＤＯＸ  ｗｉｔｈｄｒａｗ」は、ＤＯＸを除いて１０％（ｖ／ｖ）血清培地で培養したｉＦＰ細胞の遺伝子発現量から、ＭＫＬ１の発現誘導により脱分化したｉＦＰ細胞の遺伝子発現量を差し引いた結果を示す。【０１３８】
また、「Ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」は、遺伝子を機能別に分けて表示していることを示し、「Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ（酸化還元）」、「Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ（補酵素代謝過程）」、「Ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ（脂肪酸代謝過程）」、「Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ（アセチル補酵素Ａ代謝過程）」、「Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ペルオキシソーム機構）」、「Ｌｉｐｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓ（脂質生合成過程）」、「Ｆａｔ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（脂肪細胞分化）」に関連する各群に分類した。【０１３９】
また、図６では、脂肪細胞へと６日間分化誘導したＤＦＡＴ細胞の遺伝子発現量から、ＤＦＡＴ細胞の遺伝子発現量を差し引いた結果、２倍以上発現量が増加した遺伝子を示した。【０１４０】
その結果、ＤＦＡＴ細胞から脂肪細胞への分化に伴って発現量が増加した遺伝子群の発現量がＤＯＸ添加に伴うＭＫＬ１の発現によって減少すること、また脂肪細胞分化関連遺伝子群の発現量はＤＯＸを除いてＭＫＬ１の発現を停止しても低発現のまま維持されることが明らかとなった。【０１４１】
［実験例７］
（脂肪細胞におけるＭＫＬ１の発現及びＡＣＴＡ２のノックダウンの検討）
終末分化した脂肪細胞にＭＫＬ１を発現誘導するとともに、上述した方法によりＡＣＴＡ２をノックダウンし、その影響を検討した。【０１４２】
具体的には、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ又はＡｃｔａ２に対するｓｉＲＮＡの存在下で、脂肪細胞に６日間分化誘導した。その後、細胞の培地にドキシサイクリンを添加し、ＭＫＬ１を発現させた。【０１４３】
その後、細胞を固定して免疫染色によりＡＣＴＡ２及びＰＬＩＮ１を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１４４】
図７は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図７中、「ＤＯＸ」はドキシサイクリンを示し、「６−８」は、６日間分化誘導した後、２日間ドキシサイクリン処理を行ったことを示し、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）を導入した結果を示し、「ｓｉＡｃｔａ２」はＡｃｔａ２に対するｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。「Ｄ６」は、脂肪細胞に６日間分化誘導したもの、「Ｄ８」は、細胞の培地にドキシサイクリンを添加し、ＭＫＬ１を発現させたものを示す。ｓｉＡｃｔａ２としては、上述した表３のＡｃｔａ２−ａ及びＡｃｔａ２−ｂを使用したが、いずれにおいても同様の結果が得られた。【０１４５】
その結果、終末分化した脂肪細胞においてＭＫＬ１遺伝子を発現させるとともに、ＡＣＴＡ２をｓｉＲＮＡでノックダウンすると、ＭＫＬ１による脱分化がキャンセルされることが明らかとなった。この結果は、ＭＫＬ１がＡＣＴＡ２ストレスファイバーの形成を制御することで、脂肪細胞からの脱分化を制御することを示す。【０１４６】
［実験例８］
（脂肪細胞におけるＭＫＬ１の発現及びミオシン阻害剤の検討）
終末分化した脂肪細胞にＭＫＬ１を発現誘導するとともに、細胞内張力レベルを直接制御するミオシン阻害剤（ＢＤＭ及びＢＢＳ）を添加し、その影響を検討した。【０１４７】
具体的には、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞を、脂肪細胞に６日間分化誘導した。その後、ＤＭＳＯ（対照）、ＢＤＭ又はＢＢＳの存在下で、細胞の培地にドキシサイクリンを添加し、ＭＫＬ１を発現させた。ＢＤＭ及びＢＢＳの濃度は、細胞の由来、種により、当業者が最適な濃度として選択した濃度を使用することができる。【０１４８】
その後、細胞を固定して免疫染色によりＡＣＴＡ２及びＰＬＩＮ１を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１４９】
図８は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図８中、「ＤＯＸ」はドキシサイクリンを示し、「６−８」は、６日間分化誘導した後、２日間ドキシサイクリン処理を行ったことを示し、「ＤＭＳＯ」はＤＭＳＯ（対照）を添加した結果を示し、「ＢＤＭ」はＢＤＭを添加した結果を示し、「ＢＢＳ」はＢＢＳを添加した結果を示す。【０１５０】
その結果、終末分化した脂肪細胞においてＭＫＬ１遺伝子を発現させるとともに、ミオシン阻害剤を添加すると、ＭＫＬ１による脱分化がキャンセルされることが明らかとなった。【０１５１】
［実験例９］
（軟骨細胞におけるＭＫＬ１の発現に対するＡＣＴＡ２のノックダウン又はミオシン阻害剤の検討）
分化した軟骨細胞にＭＫＬ１を発現誘導するとともに、細胞内張力レベルを直接制御するミオシン阻害剤（ＢＢＳ）を添加し、その影響を検討した。【０１５２】
具体的には、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＡＴＤＣ５細胞を、対照ｓｉＲＮＡ又はＡｃｔａ２に対するｓｉＲＮＡの存在下で１０日間培養し、軟骨細胞に分化誘導した。その後、ＤＭＳＯ（対照）、又はＢＢＳの存在下で、細胞の培地にドキシサイクリンを添加し、ＭＫＬ１を発現させた。【０１５３】
細胞を固定して免疫染色によりＡＣＴＡ２及びＣＯＬ２を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１５４】
図９は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図９中、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）を添加した結果を示し、「ｓｉＡｃｔａ２」は上述した表３のｓｉＡｃｔａ２−ａを導入した結果を示し、「ＤＭＳＯ」はＤＭＳＯ（対照）を添加した結果を示し、「ＢＢＳ」はＢＢＳを添加した結果を示す。【０１５５】
その結果、分化した軟骨細胞においてＭＫＬ１遺伝子を発現させるとともに、ＡＣＴＡ２をｓｉＲＮＡでノックダウンするとＭＫＬ１による脱分化がキャンセルされることが明らかとなった。また、分化した軟骨細胞においてＭＫＬ１遺伝子を発現させるとともに、ミオシン阻害剤を添加するとＭＫＬ１による脱分化がキャンセルされることが明らかとなった。この結果は、脂肪細胞だけでなく軟骨細胞においても、ＭＫＬ１がＡＣＴＡ２ストレスファイバーの形成を制御することで、分化細胞からの脱分化を制御することを示す。【０１５６】
［実験例１０］
（ＭＫＬ１の発現とＲＨＯＡの活性化の検討）
ＲＨＯＡはアクチンストレスファイバーの形成を直接制御する因子である。そこで、ＭＫＬ１の発現とＲＨＯＡの活性化との関連性を検討した。【０１５７】
具体的には、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞を、脂肪細胞に分化誘導した後、ドキシサイクリンの存在下又は非存在下において全ＲＨＯＡ及び活性型ＲＨＯＡを、Ｒｈｏ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（カタログ番号「１７−２９４」、メルク社）を用いて、ウエスタンブロッティングによりそれぞれ検出した。【０１５８】
図１０（ａ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１０（ａ）中、「ＤＯＸ」はドキシサイクリンを示し、「Ａｃｔｉｖｅ  ＲＨＯＡ」は活性型ＲＨＯＡを示し、「Ｔｏｔａｌ  ＲＨＯＡ」は全ＲＨＯＡを示す。その結果、ＭＫＬ１の発現により、ＲＨＯＡが活性化されることが明らかとなった。【０１５９】
続いて、ＤＦＡＴ細胞において、対照ｓｉＲＮＡ又はＭＫＬ１に対するｓｉＲＮＡの存在下での、全ＲＨＯＡ及び活性型ＲＨＯＡをウエスタンブロッティングによりそれぞれ検出した。【０１６０】
図１０（ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図１０（ｂ）中、「Ａｃｔｉｖｅ  ＲＨＯＡ」は活性型ＲＨＯＡを示し、「Ｔｏｔａｌ  ＲＨＯＡ」は全ＲＨＯＡを示し、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）を導入した結果を示し、「ｓｉＭｋｌ１−ａ」は上述した表３のｓｉＭｋｌ１−ａを導入した結果を示し、「ｓｉＭｋｌ１−ｂ」は上述した表３のｓｉＭｋｌ１−ｂを導入した結果を示す。その結果、ＭＫＬ１をノックダウンすると、ＲＨＯＡの活性化が抑制されることが明らかとなった。【０１６１】
以上の結果から、ＭＫＬ１の発現及びノックダウンによって、ＲＨＯＡの活性化が制御されることが明らかとなった。【０１６２】
［実験例１１］
（ＡＣＴＡ２及び活性型ＲＨＯＡの発現による脂肪細胞の脱分化）
ｐＲｅｔｒｏＸ−ＡＣＴＡ２−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞、ＲＨＯＡの構成的活性化型変異体であるＲＨＯＡＶ１４の発現プラスミドであるｐＲｅｔｒｏＸ−ＲＨＯＡＶ１４−Ｔｉｇｈｔ−ＢＳＤを導入したＤＦＡＴ細胞、及び、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＡＣＴＡ２−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒ及びｐＲｅｔｒｏＸ−ＲＨＯＡＶ１４−Ｔｉｇｈｔ−ＢＳＤを導入したＤＦＡＴ細胞を、上述した方法により６日間培養し脂肪細胞に分化誘導した後、ドキシサイクリンを培地に添加して３日間培養し、脂肪細胞の分化マーカーである、Ｓｌｃ２ａ４、Ｐｌｉｎ１の発現をＱＰＣＲにより測定した。【０１６３】
図１１（ａ）及び（ｂ）は、ＱＰＣＲの結果を示すグラフである。図１１（ａ）及び（ｂ）中、「ＤＯＸ」はドキシサイクリンを示し、「６−９」は分化誘導開始後６〜９日目にドキシサイクリンを添加したことを示し、「ＴＥＴ−ＯＮ−ＡＣＴＡ２」はＡＣＴＡ２を発現誘導した結果を示し、「ＴＥＴ−ＯＮ−ＲＨＯＡＶ１４」は活性型ＲＨＯＡを発現誘導した結果を示し、「ＴＥＴ−ＯＮ−ＡＣＴＡ２＋ＲＨＯＡＶ１４」はＡＣＴＡ２及びＲＨＯＡＶ１４を発現誘導した結果を示す。【０１６４】
その結果、ＡＣＴＡ２のみを発現誘導した場合は分化マーカーの減少は見られるものの線維芽様細胞の形態はみられなかった。また、ＡＣＴＡ２のみを発現誘導した場合又は活性型ＲＨＯＡのみを発現誘導した場合と比較して、ＡＣＴＡ２及び活性型ＲＨＯＡの双方を発現誘導した場合に、脂肪細胞の分化マーカーが有意に減少し、脱分化したことが明らかとなった。【０１６５】
この結果から、脂肪細胞において、ＭＫＬ１の標的分子であるＡＣＴＡ２及び標的分子ではない活性型ＲＨＯＡを発現させることによっても、ＭＫＬ１を発現させた場合と同様に、脂肪細胞の脱分化が誘導されることが明らかとなった。【０１６６】
［実験例１２］
（コラーゲンゲルアッセイ）
ＡＣＴＡ２ストレスファイバーの形成による細胞内張力を評価するためにコラーゲンゲルアッセイを行った。具体的には、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したＤＦＡＴ細胞に、対照ｓｉＲＮＡ又はＡＣＴＡ２に対するｓｉＲＮＡの存在下でドキシサイクリンを添加し、コラーゲンゲルを含む培地中で培養した。続いて、コラーゲンゲルを細胞培養プレートから遊離させ、コラーゲンゲルの収縮を測定した。【０１６７】
図１２（ａ）は、コラーゲンゲルアッセイの結果を示す写真である。図１２（ａ）中、「ＤＯＸ」はドキシサイクリンを示し、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）を導入した結果を示し、「ｓｉＡｃｔａ２」はＡｃｔａ２に対するｓｉＲＮＡを導入した結果を示す。【０１６８】
その結果、ＭＫＬ１の発現によりコラーゲンゲルの収縮性が増加したことが明らかとなった。この結果は、ＭＫＬ１の発現によりＡＣＴＡ２ストレスファイバーが形成され、細胞内張力が亢進したことを示す。また、ＡＣＴＡ２をノックダウンすると、ＭＫＬ１発現により形成されたＡＣＴＡ２ストレスファイバーが消失し、細胞内張力も低下したことが明らかとなった。【０１６９】
続いて、ＤＦＡＴ細胞において、対照ｓｉＲＮＡ、Ｍｋｌ１に対するｓｉＲＮＡ又はＡｃｔａ２に対するｓｉＲＮＡの存在下で、コラーゲンゲルを含む培地中で培養した。続いて、コラーゲンゲルを細胞培養プレートから遊離させ、コラーゲンゲルの収縮を測定した。【０１７０】
図１２（ｂ）は、コラーゲンゲルアッセイの結果を示す写真である。図１２（ｂ）中、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）を導入した結果を示し、「ｓｉＭｋｌ１」は上述した表３のｓｉＭｋｌ１−ａを導入した結果を示し、「ｓｉＡｃｔａ２」は上述した表３のｓｉＡｃｔａ２−ａを導入した結果を示す。【０１７１】
その結果、ＭＫＬ１をノックダウンすることによっても、ＡＣＴＡ２ストレスファイバーが消失し、細胞内張力が低下したことが明らかとなった。また、ＱＰＣＲによりＡＣＴＡ２の発現を定量した結果、ＭＫＬ１のノックダウンによりＡＣＴＡ２の発現量が低下することが確認された。【０１７２】
以上の結果から、ＭＫＬ１は、ＡＣＴＡ２の発現及びストレスファイバーの形成を制御し、細胞内張力レベルを調節することが明らかとなった。【０１７３】
［実験例１３］
（ＤＦＡＴ細胞におけるＭＫＬ１又はＡＣＴＡ２のノックダウン）
ＤＦＡＴ細胞において、ＭＫＬ１又はＡＣＴＡ２をノックダウンし、その影響を検討した。具体的には、ＤＦＡＴ細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、Ｍｋｌ１に対するｓｉＲＮＡ又はＡｃｔａ２に対するｓｉＲＮＡの存在下で培養した。その後、細胞を固定して免疫染色によりＡＣＴＡ２及びＰＬＩＮ１を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１７４】
図１３は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図１３中、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）を導入した結果を示し、「ｓｉＭｋｌ１」は上述した表３のｓｉＭｋｌ１−ａを導入した結果を示し、「ｓｉＡｃｔａ２」は上述した表３のｓｉＡｃｔａ２−ａを導入した結果を示す。【０１７５】
その結果、ＤＦＡＴ細胞において、ＭＫＬ１又はＡＣＴＡ２をノックダウンすると、ＡＣＴＡ２ストレスファイバーが消失し、脂肪細胞へと終末分化が誘導されることが明らかとなった。【０１７６】
［実験例１４］
（ＡＴＤＣ５細胞におけるＭＫＬ１又はＡＣＴＡ２のノックダウン）
ＡＴＤＣ５細胞において、ＭＫＬ１又はＡＣＴＡ２をノックダウンし、その影響を検討した。具体的には、ＡＴＤＣ５細胞を、対照ｓｉＲＮＡ、Ｍｋｌ１に対するｓｉＲＮＡ又はＡｃｔａ２に対するｓｉＲＮＡの存在下で培養した。その後、細胞を固定して免疫染色によりＡＣＴＡ２及びＣＯＬ２を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１７７】
図１４は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図１４中、「ｓｉＣｏｎｔ」は対照ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅ）を導入した結果を示し、「ｓｉＭｋｌ１」は上述した表３のｓｉＭｋｌ１−ａを導入した結果を示し、「ｓｉＡｃｔａ２」は上述した表３のｓｉＡｃｔａ２−ａを導入した結果を示す。【０１７８】
その結果、ＡＴＤＣ５細胞において、ＭＫＬ１又はＡＣＴＡ２をノックダウンすると、ＡＣＴＡ２ストレスファイバーが消失し、軟骨細胞への分化が誘導されることが明らかとなった。【０１７９】
［実験例１５］
（ヒト脂肪前駆細胞へのレトロウイルスによる遺伝子導入）
ＧＰ２−２９３パッケージング細胞（クロンテック社）を４×１０６個の細胞密度で１０ｃｍディッシュに播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地でプレコンフルエント（コンフルエントの８割くらいの細胞密度）に達するまで培養した。その後、３００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に２７μＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（プロメガ社）を混合し、室温で５分間静置した。続いて、反応液にＴｅｔ−Ｏｎ発現プラスミドを９μｇ添加し、室温で１５分間静置した。【０１８０】
Ｔｅｔ−Ｏｎ発現プラスミドとしては、ｐＲｅｔｒｏＸ−Ｔｅｔ−Ｏｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ（クロンテック社）に目的の遺伝子を組み込んだものを用いた。具体的には、ＭＫＬ１遺伝子を組み込んだｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒの発現プラスミドを用いた。【０１８１】
続いて、培地交換したＧＰ２−２９３細胞にトランスフェクション溶液を全量添加し、２４時間培養した。２４時間後、培地を捨てて、新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ添加し、４８時間培養し、レトロウイルスベクターを産生させた。【０１８２】
４８時間後、ＧＰ２−２９３細胞の培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過滅菌したのち、４℃、２２，７００×ｇ、３時間超遠心することでウイルスの濃縮を行った。遠心終了後、遠沈管にウイルスペレットを確認した。続いて、６μｇ／ｍＬプロタミンを添加した２ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地でウイルスペレットを溶かし、ウイルス液をヒト脂肪前駆細胞（ＨｐＡＤ、カタログ番号「ＣＡ８０２ｓＫ０５ａ」、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社）に添加し、感染させた。２４時間後、新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、培養した。ウイルス感染から７日後、プラスミドにコードされる耐性抗生物質（２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ又は１０μｇ／ｍＬピューロマイシン）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、薬剤セレクションを行い、発現安定株を取得した。【０１８３】
［実験例１６］
（ＭＫＬ１の発現によるヒト脂肪細胞の脱分化１）
終末分化した脂肪細胞にＭＫＬ１を発現させ、その影響を検討した。具体的には、まず、実験例１５と同様の方法により、ｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したヒト脂肪前駆細胞（ＨｐＡＤ、カタログ番号「ＣＡ８０２ｓＫ０５ａ」、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社）を、１７日間脂肪細胞に分化誘導した。【０１８４】
具体的には、ヒト脂肪前駆細胞を、プレコンフルエント（コンフルエントの８割くらいの細胞密度）に達するまで培養した。続いて、培地を、０．２５μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ、和光純薬）、１０μＭトログリタゾン（和光純薬）、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、和光純薬）及びインスリン−トランスフェリン−セレニウム−Ｘサプリメント（ＩＴＳ−Ｘ、１：２００、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭに交換し、脂肪細胞へ分化誘導した。分化誘導開始から７日後に、培地を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）及びＩＴＳ−Ｘ（１：１００）を添加したＤＭＥＭに交換し、更に１０日間分化誘導した。【０１８５】
分化誘導後、脂肪滴を赤色に染色するオイルレッドＯ染色、脂肪分化マーカーであるＰＰＡＲＧ、ＳＬＣ２Ａ４、ＰＬＩＮ１のＱＰＣＲの結果等から脂肪細胞に終末分化したことが確認された。【０１８６】
続いて、終末分化した脂肪細胞の培地にドキシサイクリンを添加し、ＭＫＬ１を発現させた。その後細胞を固定して、免疫染色により細胞核及び脂肪分化マーカーであるＰＬＩＮ１タンパク質を蛍光免疫染色した。また、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジンを用いてアクチン細胞骨格（Ｆ−ａｃｔｉｎ）の蛍光染色も行った。【０１８７】
図１５は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。図１５中、「ＨｐＡＤ−ＴＥＴ−ＯＮ−ＭＫＬ１」はｐＲｅｔｒｏＸ−ＭＫＬ１−Ｔｉｇｈｔ−Ｐｕｒを導入したヒト脂肪前駆細胞を示し、「Ｃ」は対照である分化誘導前のヒト脂肪前駆細胞の染色結果を示し、「Ｄ１７」は１７日間分化誘導後のヒト脂肪前駆細胞の染色結果を示し、「Ｄ２１」は、１７日間分化誘導した後、４日間ドキシサイクリン処理を行ったヒト脂肪前駆細胞の染色結果を示す。【０１８８】
その結果、終末分化した脂肪細胞においてＭＫＬ１遺伝子を発現させると、ＡＣＴＡ２ストレスファイバーの形成が誘導された。また、脂肪分化マーカーの発現が著しく減少し、線維芽様細胞であるｉＦＰ細胞へと脱分化したことが明らかとなった。【０１８９】
また、脱分化したｉＦＰ細胞は、ドキシサイクリンを除いて通常の血清培地で培養すると、脂肪細胞に戻ることなく、安定的に増殖することが確認された。【０１９０】
［実験例１７］
（ＭＫＬ１の発現によるヒト脂肪細胞の脱分化実験２）
《ヒト脂肪前駆細胞の脂肪細胞への分化誘導》
ヒト脂肪前駆細胞（ＨｐＡＤ、カタログ番号「ＫＷ−４２０９」、ＬＩＦＥＬＩＮＥ社）を、プレコンフルエントに達するまで培養した。続いて、培地を、０．２５μＭデキサメタゾン（ＤＥＸ、和光純薬）、１０μＭトログリタゾン（和光純薬）、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、和光純薬）及びインスリン−トランスフェリン−セレニウム−Ｘサプリメント（ＩＴＳ−Ｘ、１：２００、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加した１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭに交換し、脂肪細胞へ分化誘導した。分化誘導開始から７日後に、培地を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ社）及びＩＴＳ−Ｘ（１：１００）を添加したＤＭＥＭに交換し、更に７日間分化誘導した。【０１９１】
《レンチウイルスベクターの調製》
Ｌｅｎｔｉ−Ｘ２９３Ｔ細胞（クロンテック社）に、Ｖｅｎｕｓ発現レンチウイルスベクタープラスミドとパッケージングプラスミドをコトランスフェクトした。Ｖｅｎｕｓ発現レンチウイルスベクタープラスミドとしては、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓ（カタログ番号「ＲＤＢ０５５５３」、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＤＮＡ  ＢＡＮＫ）、又は、ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓに目的の遺伝子を組み込んだもの、具体的には、ＭＫＬ１遺伝子を組み込んだＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＫＬ１−Ｖｅｎｕｓの発現プラスミドを用いた。ＭＫＬ１遺伝子とＶｅｎｕｓ遺伝子との間にはｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ  （ＩＲＥＳ）が挿入されていた。【０１９２】
パッケージングプラスミドとしては、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（カタログ番号「＃８４５４」、アドジーン社）及びｐｓＰＡＸ２（カタログ番号「＃１２２６０」、アドジーン社）を使用した。【０１９３】
《ヒト脂肪前駆細胞へのレンチウイルスによる遺伝子導入》
Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔパッケージング細胞（クロンテック社）を４×１０６個の細胞密度で１０ｃｍディッシュに播種し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地でプレコンフルエントに達するまで培養した。その後、３００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に２７μＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（プロメガ社）を混合し、室温で５分間静置した。続いて、反応液に発現プラスミドとパッケージングプラスミドを９μｇずつ添加し、室温で１５分間静置した。【０１９４】
続いて、培地交換したＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞にトランスフェクション溶液を全量添加し、２４時間培養した。２４時間後、培地を捨てて、新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地を１０ｍＬ添加し、４８時間培養し、レトロウイルスベクターを産生させた。【０１９５】
４８時間後、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞の培地を回収し、０．４５μｍのフィルターでろ過滅菌したのち、４℃、２２，７００×ｇ、３時間超遠心することでウイルスの濃縮を行った。遠心終了後、遠沈管にウイルスペレットを確認した。続いて、６μｇ／ｍＬプロタミンを添加した２ｍＬの１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地でウイルスペレットを溶かし、ウイルス液を、上述したように脂肪細胞に終末分化させたヒト脂肪前駆細胞に添加して感染させ、ＭＫＬ１を発現させた。２４時間後、新しい１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ−ＤＭＥＭ培地に交換し、培養した。【０１９６】
ウイルス感染から７日後、細胞を固定して免疫染色により細胞核及び脂肪分化マーカーであるＰＬＩＮ１タンパク質を蛍光免疫染色した。また、発現ベクターに組み込まれていたＶｅｎｕｓの蛍光観察を行った。【０１９７】
《タンパク質発現解析−免疫蛍光染色》
細胞をＰＢＳで洗浄し、４質量％パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液（ナカライテスク社）で固定した。続いて、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を加えたＰＢＳで洗浄及び細胞膜透過性処理を行った。その後、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加したＰＢＳ中で１時間振とうさせることによりブロッキングした。続いて、種々の特異的抗体を添加した１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳ中、４℃で一晩インキュベートした。【０１９８】
一次抗体反応後、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を加えたＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ二次抗体（１：２０００、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を添加した１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ−ＰＢＳ中、遮光下にて室温で１時間インキュベートした。二次抗体反応後、０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を加えたＰＢＳで洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒファロイジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いてアクチン細胞骨格を染色した。その後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（シグマ社）にて核染色を行い、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇ（サウザンバイオテック社）にて封入し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（キーエンス社）にて観察した。【０１９９】
図１６及び図１７は、細胞の観察結果を示す顕微鏡写真である。図１６及び図１７中、「ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＩＶ」はＣＳＩＩ−ＣＭＶ−Ｖｅｎｕｓを導入した細胞であることを示し、「ＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＫＬ１−ＩＶ」はＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＫＬ１−Ｖｅｎｕｓを導入した細胞であることを示し、「Ｖｅｎｕｓ」はＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光を検出した結果であることを示す。また、図１６中、「ＰＣＩ」は位相差顕微鏡観察写真であることを示し、「Ｍｅｒｇｅｄ」は、位相差顕微鏡観察写真とＶｅｎｕｓタンパク質の蛍光を検出した蛍光顕微鏡写真の合成写真であることを示す。また、図１７中、「Ｖｅｎｕｓ／Ｎｕｃｌｅｕｓ」はＶｅｎｕｓタンパク質及び核を検出した結果であることを示し、「ＰＬＩＮ１／Ｎｕｃｌｅｕｓ」はＰＬＩＮ１タンパク質及び核を検出した結果であることを示す。【０２００】
その結果、Ｖｅｎｕｓ陽性、すなわちＭＫＬ１遺伝子が発現している、終末分化した脂肪細胞において、小さい脂肪滴を有する細胞（図１６及び図１７中、矢印で示す。）、又は脂肪滴を持たない細胞（図１６及び図１７中、矢頭で示す。）が多数観察され、ＡＣＴＡ２ストレスファイバーの形成が誘導されることで脂肪分化マーカーの発現が著しく減少し、線維芽様細胞であるｉＦＰ細胞へと脱分化することが明らかとなった。一方で、Ｖｅｎｕｓ陰性、すなわちＭＫＬ１遺伝子が発現していない、終末分化した脂肪細胞においては、細胞に変化は認められなかった。【０２０１】
実験例１６及び１７の結果から、終末分化させた２つの異なる株のヒト脂肪細胞が、ＭＫＬ１の発現によって、線維芽様細胞であるｉＦＰ細胞へと脱分化したことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２０２】
本発明によれば、分化した体細胞に細胞骨格タンパク質重合体を増加させる１種の遺伝子、又は２種の遺伝子を導入することにより、分化した体細胞を脱分化させて誘導型人工線維芽前駆細胞（ｉＦＰ細胞）を２〜４日という短期間に高効率で製造する技術を提供することができる。本発明の方法によって取得されるｉＦＰ細胞は、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有しており、短期間で大量に製造できることから、再生医療等への臨床応用可能な細胞を供給することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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