(57)【要約】  多数の前処理済みの培地試料に対して希釈をしたあとにLC/MS分析を行うという処理を繰り返す（Ｓ１６〜Ｓ１９）前に、培地試料分析時と同じグラジエントプロファイルに従って移動相をLC-MSに供給して試料なしの分析を行うLC-MS安定化処理（Ｓ１１）と標準試料をLC-MSに供給して検量線作成用のデータを取得する標準試料分析（Ｓ１３）とを実行する。LC-MS安定化処理の前及び標準試料分析の前にはそれぞれ、試料希釈の所要時間に相当する待機時間を設ける（Ｓ１０、Ｓ１２）。それにより、LC-MS安定化処理を含むサイクル、及び標準試料分析を含むサイクルの時間を培地試料に対する希釈及び分析のサイクルの時間と同じにする。その結果、グラジエントプロファイルに従った移動相送給前の移動相の停止時間が各サイクルで同じとなり、脱気装置に移動相が滞留する時間が揃うことでカラム中の移動相の組成の変化を回避して高い定量性を達成することができる。
2019106833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に対し所定の前処理を実行する前処理装置と、前処理済みの試料を希釈したあとに液体クロマトグラフィ分析を行う分析装置と、を具備し、多数の目的試料に対する前処理及び液体クロマトグラフィ分析を実施してその結果から試料中の化合物を定量する液体クロマトグラフ分析システムであって、
a)一つの目的試料に対する前記分析装置における試料の希釈及び液体クロマトグラフィ分析を実行している期間中に、次の目的試料に対する前記前処理装置における前処理を実行するように、複数の目的試料についての同一の時間長の分析サイクルを繰り返すシーケンスを定め、該シーケンスに従って各部を制御する目的試料分析制御部と、
b)前記目的試料分析制御部の制御の下での繰り返し分析の分析サイクルの時間長と同じ時間長になるように、該目的試料分析制御部の制御の下で実行される１番目の目的試料に対する前記前処理装置における前処理と少なくとも一部並行して、目的試料に対する移動相条件と同じ移動相条件で標準試料を液体クロマトグラフィ分析するように各部を制御する標準試料分析制御部と、
c)前記標準試料分析制御部の制御の下での分析に先立って、前記目的試料分析制御部の制御の下での繰り返し分析の分析サイクルの時間長と同じ時間長になるように、前記分析装置における試料流路を定常状態にするための安定化処理を実行するように各部を制御する安定化処理実行制御部と、
を備えることを特徴とする液体クロマトグラフ分析システム。
【請求項２】
請求項１に記載の液体クロマトグラフ分析システムであって、
前記安定化処理は、目的試料に対する移動相条件と同じ移動相条件で試料を導入することなく液体クロマトグラフィ分析を行うバックグラウンド測定処理を含むことを特徴とする液体クロマトグラフ分析システム。
【請求項３】
請求項１に記載の液体クロマトグラフ分析システムであって、
前記標準試料分析制御部及び前記安定化処理実行制御部はそれぞれ、所定時間だけ待機することで当該サイクルの時間を調整するものであり、前記分析装置における試料の希釈のための希釈率に応じて該所定時間を変更することを特徴とする液体クロマトグラフ分析システム。
【請求項４】
請求項１に記載の液体クロマトグラフ分析システムであって、
前記移動相条件はグラジエントプロファイルであることを特徴とする液体クロマトグラフ分析システム。
【請求項５】
請求項１に記載の液体クロマトグラフ分析システムであって、
複数の目的試料についての一連の繰り返し分析における分析サイクルの実行時間を示す情報を目的試料群毎に記憶しておく記憶部と、ユーザが分析対象の目的試料群を指定する条件指定部と、をさらに備え、
前記目的試料分析制御部は、前記条件指定部による指定に応じた実行時間の情報を前記記憶部から取得して繰り返し分析のシーケンスを定め、前記標準試料分析制御部及び前記安定化処理実行制御部は前記記憶部から取得された実行時間の情報に応じてそれぞれのサイクルの時間長を調整することを特徴とする液体クロマトグラフ分析システム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフ分析システムであって、
前記分析装置は前処理済みの試料を希釈したあとに液体クロマトグラフ質量分析を行うものであり、該分析装置で収集されたデータに基づいて目的試料に含まれる化合物毎の定量分析を行うことを特徴とする液体クロマトグラフ分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に対して所定成分の除去や希釈などの前処理を行ったあとに液体クロマトグラフィ分析を実行する液体クロマトグラフ分析システムに関する。ここでいう液体クロマトグラフ分析システムは、検出器として質量分析装置を用いた液体クロマトグラフ質量分析システムも含むものとする。
【背景技術】
【０００２】
再生医療分野では、近年、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞を用いた研究や技術開発が盛んに行われている。こうした研究や技術開発においては、多能性を維持した状態の未分化の細胞を大量に培養する必要がある。そのため、適切な培養環境の選択と環境の安定的な制御が必要であるとともに、培養中の細胞の状態を高い頻度で以て確認する必要がある。【０００３】
例えば細胞コロニー内の細胞が未分化状態から逸脱すると、細胞コロニー内にある全ての細胞は分化する能力を有しているために、最終的にはコロニー内の細胞全てが未分化逸脱状態に遷移してしまう。そのため、作業者は培養している細胞中に未分化状態を逸脱した細胞（すでに分化した細胞や分化しそうな細胞）が発生していないかどうか、つまりは細胞の分化状態を、日々確認する必要がある。【０００４】
従来、細胞の分化状態を評価する方法として、免疫染色を利用した方法やマーカー遺伝子の発現レベルを定量する方法が広く用いられている。しかしながら、こうした方法ではいずれも細胞に対して侵襲的な処理を行う必要がある。そのため、分化状態を評価した後にその評価に供された細胞を別の目的に利用すること、例えば再生医療の細胞源とすることはできなかった。また、完全に同一であるサンプルについて時間経過に伴う変化を評価することも不可能であった。【０００５】
これに対し、特許文献１〜３には、細胞そのものではなく細胞を培養している培地の培養上清中の特定の化合物の存在量を液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）を用いて分析し、その結果に基づいて細胞の分化状態を評価する方法が開示されている。また、こうした方法を実施するために、細胞を培養する培地由来の試料についての多成分一斉分析を行うためのＬＣ−ＭＳ用のソフトウェアも実用化されている（非特許文献１参照）。こうした方法によれば、細胞の分化状態を細胞に対して非侵襲的に評価することができるという大きな利点がある。【０００６】
上述した、培養上清中の特定の化合物の分析結果に基づいて細胞の分化状態を評価する際には、被検細胞が培地において培養された後、その培養に用いられた培地由来の試料（培地試料）が培養装置からＬＣ−ＭＳ等の分析装置に導入される。ただし、培地試料にはＬＣ／ＭＳ分析における一種の夾雑物であるとともに、時間経過に伴って培地試料中で代謝を進行させることで代謝物の量を変化させるおそれがあるタンパク質なども含まれる。そのため、通常、前処理装置においてタンパク質を除去する等の前処理が行われた後の培地試料がＬＣ−ＭＳに導入される。つまり、培地試料は培養装置から前処理装置を経てＬＣ−ＭＳに導入される。前処理装置としては、例えば特許文献４、非特許文献２などに開示されている、試料容器に収容された多数の試料を自動的に順次処理することが可能な装置が有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】再公表第ＷＯ２０１５／１６６８４５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１７／０６８７２７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１７／０６８８０１号パンフレット
【特許文献４】特開２０１７−１７００７９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】「LC/MS/MSメソッドパッケージ 細胞培養プロファイリング」、[online]、［平成２９年１１月２１日検索］、株式会社島津製作所、インターネット＜URL：  http://www.an.shimadzu.co.jp/lcms/tq-option/mp_profiling_cell-culture.htm＞
【非特許文献２】「SCLAM-2000 全自動LCMS前処理装置」、[online]、［平成２９年１１月２１日検索］、株式会社島津製作所、インターネット＜URL：  http://www.an.shimadzu.co.jp/lcms/sclam2000-2.htm＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記培地試料中での代謝作用の進行は、上述したタンパク質除去の前処理を行うことにより停止させることができる。そのため、分析対象の試料数が多く、一つずつ試料の前処理と分析とを順次実行していくと前処理実行までの待ち時間が長くなる可能性が高い場合には、全試料に対してまず前処理を順次行い、そのあとに前処理済みの試料の分析を順次行うというバッチ的な処理を行うことが望ましい。一方、分析対象の試料の数が多くなく、ＬＣ−ＭＳでの分析中に前処理が済んでいない培地試料中での代謝の進行の懸念が小さい場合には、一つずつ試料の前処理と分析とを連続的に行う逐次的な分析のほうが都合がよい。何故なら、こうした逐次分析では、前処理済みの試料をＬＣ−ＭＳにおいて分析している間に並行して、前処理装置において次の試料に対する前処理を行うことができ、それによって総合的な分析時間を短縮することが可能であるからである。【００１０】
バッチ処理、逐次処理に拘わらず、複数の培地試料に対してＬＣ／ＭＳ分析を実行してその結果を利用した定量演算を行う場合、検量線を作成するための標準試料をそれら培地試料の分析に先立って分析する必要がある。また、暫く分析が行われていなかったＬＣ−ＭＳの試料流路には空気中の各種の浮遊物や不所望の成分が付着しているおそれがある。そこで、ＬＣ−ＭＳにおける試料流路に純水を流す処理（以下「水打ち」と称す）や培地試料を注入することなく通常の分析時と同じ移動相条件（つまりはグラジエントプロファイル）で以て移動相を供給しながらバックグラウンド測定を実行する処理（以下「空打ち」と称す）といった、ＬＣ−ＭＳの状態を定常的な状態にするための安定化処理が標準試料の分析に先立って行われることが多い。【００１１】
即ち、例えば複数の培地試料に対する前処理及びＬＣ／ＭＳ分析を逐次的に実行する際には、まずＬＣ−ＭＳの安定化処理が実行され、引き続いて標準試料のＬＣ／ＭＳ分析が実行され、そのあとに複数の培地試料の前処理及びＬＣ／ＭＳ分析が順次実行される。上述したように、安定化処理によってＬＣ−ＭＳにおける試料流路の状態は培地試料の繰り返し分析時とほぼ同様の定常状態になり、培地試料に含まれる化合物の定量性が向上することが期待される。【００１２】
しかしながら、本発明者らの実験によれば、非特許文献１に開示されているような細胞培養における培地試料中の多成分一斉分析の場合、ＬＣ−ＭＳの安定化処理を行ったにも拘わらず、特に１番目の培地試料に含まれる化合物の中で抽出イオンクロマトグラムにおけるピークの面積値のばらつきが大きく、そのために定量精度が低い化合物があることが判明した。【００１３】
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、複数の試料に対するＬＣ／ＭＳ分析を繰り返し実行する際に特にその１番目の試料のＬＣ／ＭＳ分析における化合物の定量性を向上させることができるＬＣ分析システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために成された本発明は、試料に対し所定の前処理を実行する前処理装置と、前処理済みの試料を希釈したあとに液体クロマトグラフィ分析を行う分析装置と、を具備し、多数の目的試料に対する前処理及び液体クロマトグラフィ分析を実施してその結果から試料中の化合物を定量する液体クロマトグラフ分析システムであって、
a)一つの目的試料に対する前記分析装置における試料の希釈及び液体クロマトグラフィ分析を実行している期間中に、次の目的試料に対する前記前処理装置における前処理を実行するように、複数の目的試料についての同一の時間長の分析サイクルを繰り返すシーケンスを定め、該シーケンスに従って各部を制御する目的試料分析制御部と、
b)前記目的試料分析制御部の制御の下での繰り返し分析の分析サイクルの時間長と同じ時間長になるように、該目的試料分析制御部の制御の下で実行される１番目の目的試料に対する前記前処理装置における前処理と少なくとも一部並行して、目的試料に対する移動相条件と同じ移動相条件で標準試料を液体クロマトグラフィ分析するように各部を制御する標準試料分析制御部と、
c)前記標準試料分析制御部の制御の下での分析に先立って、前記目的試料分析制御部の制御の下での繰り返し分析の分析サイクルの時間長と同じ時間長になるように、前記分析装置における試料流路を定常状態にするための安定化処理を実行するように各部を制御する安定化処理実行制御部と、
を備えることを特徴としている。【００１５】
本発明において前記安定化処理は、例えば、目的試料に対する移動相条件と同じ移動相条件で、試料を導入することなくＬＣ分析を行うバックグラウンド測定処理を含む構成とすることができる。さらにまた、バックグラウンド測定処理の前にカラム等の試料流路に水を流して該流路内壁に付着している不要成分を除去する工程を加えてもよい。【００１６】
本発明では、目的試料分析制御部による制御の下でＬＣ分析と前処理との少なくとも一部が並行的に繰り返し実施される直前に、標準試料分析制御部による制御の下で標準試料に対するＬＣ分析と１番目の目的試料に対する前処理の少なくとも一部が並行的に実施される。さらにその直前に、安定化処理実行制御部による制御の下で安定化処理が実行される。目的試料は分析装置において希釈されたあとに分析されるのに対し、標準試料は分析装置において希釈されることなく直ぐに分析に供される。また、安定化処理の際には例えば上述したようにバックグラウンド測定処理が実施されるが、その際には試料の注入自体が行われず、当然、試料の希釈も行われない。こうしたことから、仮に標準試料分析のサイクルや安定化処理のサイクルにおいて直ぐに各処理の動作を実行したとすると、それらサイクルの時間長は目的試料の繰り返し分析のサイクルに比べて短くなる。【００１７】
一般にＬＣでは移動相に含まれる気泡を除去するために脱気装置が用いられるが、分析装置で試料の希釈が実施されている間は移動相の無用な消費を抑えるために移動相の送液が一旦停止され、一部の移動相が脱気装置に滞留する。そのため、試料の希釈が実施されず、その分だけ時間が短いサイクルでは脱気装置に移動相が滞留する時間が短くなり、移動相の組成が繰り返し分析時とは異なるおそれがある。本発明者は実験的にこの現象を確認し、１番目の試料中の一部の化合物の定量値のばらつきがこの現象に起因するとの知見を得た。そこで、この現象を回避するために、本発明では、例えば標準試料分析のサイクルや安定化処理のサイクルにおいて所定の待機時間を加えることで、全てのサイクルの時間長を揃え、脱気装置に移動相が滞留する時間を略同一にする。これにより、サイクル毎の移動相の組成の変動が抑えられ、実際の移動相条件が揃うことによって、化合物の定量値のばらつきを軽減することができる。【００１８】
ただし、一般に試料を希釈する希釈動作の所要時間は希釈率によって異なる。通常、繰り返し分析の対象である複数の試料の希釈率は同一であるが、異なる繰り返し分析の対象の試料群同士の希釈率は同じとは限らない。【００１９】
そこで、本発明において好ましくは、前記標準試料分析制御部及び前記安定化処理実行制御部はそれぞれ、所定時間だけ待機することで当該サイクルの時間を調整するものであり、前記分析装置における試料の希釈のための希釈率に応じて該所定時間を変更する構成とするとよい。【００２０】
この構成によれば、希釈動作の所要時間の長短に拘わらず、各サイクルの時間長を揃えて試料中の化合物の定量性を向上させることができる。また、サイクルの時間長を希釈動作の所要時間が最も長い状態に合わせる必要がないので、希釈動作の所要時間が短くて済む場合にはサイクル時間を短くして分析を効率的に遂行することができる。【００２１】
また本発明に係るＬＣ分析システムにおいて、前記移動相条件は複数種の移動相の混合比を時間経過に伴って変化させるグラジエントプロファイルであるものとすることができる。グラジエント溶離の場合にも、移動相が脱気装置に滞留する時間を揃えることで混合後の移動相の組成をサイクル毎に揃えることができる。【００２２】
また本発明に係るＬＣ分析システムでは、
複数の目的試料についての一連の繰り返し分析における分析サイクルの実行時間を示す情報を目的試料群毎に記憶しておく記憶部と、ユーザが分析対象の目的試料群を指定する条件指定部と、をさらに備え、
前記目的試料分析制御部は、前記条件指定部による指定に応じた実行時間の情報を前記記憶部から取得して繰り返し分析のシーケンスを定め、前記標準試料分析制御部及び前記安定化処理実行制御部は前記記憶部から取得された実行時間の情報に応じてそれぞれのサイクルの時間長を調整する構成とすることができる。【００２３】
この構成によれば、ＬＣ／ＭＳ分析の所要時間に拘わらず、各サイクルの時間を容易に揃えることができる。【００２４】
なお、本発明において、液体クロマトグラフの検出器は例えばフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器などであってもよいが、好ましくは、液体クロマトグラフの検出器は質量分析装置とするとよい。ここでいう質量分析装置は、液体クロマトグラフと接続可能な質量分析装置であればその方式を問わない。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、複数の試料に対するＬＣ分析を繰り返し実行する際に特にその１番目の試料中の化合物の定量性を向上させることができる。また、一つの試料に対するＬＣ分析とその次の試料に対する前処理とを並行して行うので、複数の試料に対する総合的な分析の所要時間を短縮して高いスループットを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施例である培地試料自動分析システムの概略ブロック構成図。
【図２】本実施例の培地試料自動分析システムにおいて多試料の逐次分析の際の処理の流れを示すフロー図。
【図３】本実施例の培地試料自動分析システムにおいて多試料の逐次分析の際の各部の動作状況と移動相中の成分の変化を示す説明図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明に係る生体試料自動分析システムの一実施例である培地試料自動分析システムについて、添付図面を参照して詳細に説明する。
図１は本実施例の培地試料自動分析システムの概略ブロック構成図である。本実施例のシステムは、多能性細胞などの被検細胞が培養される培地の培養上清におけるバイオマーカー（細胞による代謝物）の存在量に基づいて、その被検細胞の分化状態を評価するために用いられる、培養細胞評価システムである。ここでは、培地の培養上清が培地試料である。
【００２８】
本実施例のシステムは、前処理装置２、液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）３、データ処理部４、制御部５、主制御部６、操作部７、表示部８などを備える。図１中に点線で記載したブロックの培養装置１は本システムには含まれず、本システムで分析の対象となる培地試料を提供するものである。
【００２９】
概略的にいうと、本システムでは、培養装置１において得られる多数の培地試料が前処理装置２に提供され、前処理装置２では多数の培地試料に対して所定の前処理が順次行われる。そして、前処理装置２により前処理が行われたあとの各培地試料（前処理済み試料）がＬＣ−ＭＳ３に送られ、該ＬＣ−ＭＳ３において各培地試料中の成分が順次分析される。その分析により得られたデータはデータ処理部４に送られ、データ処理部４は所定のデータ処理を実施してその結果を主制御部６を通して表示部８に出力してユーザ（オペレータ）に提示する。制御部５は上記のような処理のために、前処理装置２、ＬＣ−ＭＳ３及びデータ処理部４を制御する。主制御部６は主として操作部７や表示部８を通したユーザインターフェイスの機能を有する。
各部の構成について詳しく説明する。
【００３０】
培養装置１は被検細胞を培養するための装置である。ここでは被検細胞は例えば幹細胞、典型的にはＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞である。また、幹細胞から分化誘導を行った細胞も被検細胞として用いることができる。こうした被検細胞の培養に使用される培地としては、幹細胞の培養に一般的に使用される様々な培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２や、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を主成分とする培地（ｍＴｅＳＲ１など）を用いることができる。こうした培地上で細胞を培養する際に、細胞による各種の代謝物が培養上清中に混じる。オペレータは手作業で培養上清の一部を採取して所定のバイアル（試料容器）に注入することで培地試料を調製する。もちろん、培養上清の一部が毎日決まった時刻に自動的に採取される、つまりは、培地試料が自動的に調製されるようにしてもよい。
【００３１】
前処理装置２は、多数のバイアルが載置されるサンプルラックを含む試料載置部２０と、該試料載置部２０に載置されている多数のバイアルの中から選択した一つのバイアル中の培地試料に対し、試料分注、試薬分注、撹拌、濾過等の工程を通して例えばタンパク質などの不要な成分を除去する前処理を実行する前処理実行部２１と、前処理が終了した培地試料が一時的に収容される容器をＬＣ−ＭＳ３の所定位置まで移送する前処理済み試料送出部２２と、を備える。
【００３２】
本例では、タンパク質を除去する前処理は、具体的には、培地試料に内部標準試料としてのイソプロピルリンゴ酸を試薬として添加し、例えばメタノール、クロロホルム及び水を２．５：１：１の比率で混合した抽出溶液で処理するものとすることができる。ただし、前処理はタンパク質除去に限られるものではなく、培地試料に対して他の前処理が行われてもよい。なお、前処理装置２としては例えば特許文献４、非特許文献２などに開示されている装置を利用することができるが、本発明はこれに限るものでもない。
【００３３】
ＬＣ−ＭＳ３は、図示しないものの脱気装置、送液ポンプ、混合器、インジェクタ、カラム等を含む液体クロマトグラフ（ＬＣ）部３１と、多数の培地試料のうちの一つを選択してＬＣ部３１に導入するオートサンプラ３０と、ＬＣ部３１のカラムで時間方向に分離された試料中の成分に対し質量分析を行う質量分析（ＭＳ）部３２と、を含む。オートサンプラ３０は、前処理装置２で用いられたものとは異なる多数のバイアルが載置されるサンプルラックを含む試料載置部３０２と、前処理装置２の前処理済み試料送出部２２により所定位置まで移送された容器中の前処理済み培地試料を吸引して超純水を加えて所定倍率に希釈したあとに、試料載置部３０２に載置されているバイアルに分注する試料希釈部３０１と、試料載置部３０２に載置されている多数のバイアルの中の一つのバイアルから前処理及び希釈済みの培地試料を所定量採取してＬＣ部３１のインジェクタに導入する試料採取部３０３と、を含む。
【００３４】
本例においてＬＣ部３１では、培地試料に含まれる多数の化合物を良好に分離するために、二種類の移動相の混合比を時間経過に伴って変化させるグラジエント溶離を行う。
【００３５】
また、被検細胞の分化状態を評価するために、ＭＳ部３２では、バイオマーカーとしての、例えばプトレシン、キヌレニン、シスタチオニン、アスコルビン酸、リボフラビン、ピルビン酸、セリン、システイン、トレオン酸、クエン酸及びオロト酸からなる群から選ばれる少なくとも一つの化合物をターゲットとした質量分析が行われる。ＭＳ部３２として用いられる質量分析装置の方式は大気圧イオン源を備えたものであれば特に限定されず、例えば四重極型質量分析装置、タンデム四重極型質量分析装置、四重極−飛行時間型質量分析装置などを用いることができる。
【００３６】
データ処理部４は、サンプル情報記憶部４０、データ記憶部４１、検量線作成部４２、定量分析部４３、分析結果記憶部４４、結果表示処理部４５などの機能ブロックを含む。サンプル情報記憶部４０は、前処理装置２において培地試料が収容されているバイアル毎に入力設定されるサンプル情報を記憶するものである。データ記憶部４１はＬＣ−ＭＳ３において分析が行われることで収集されたデータを記憶するものである。検量線作成部４２は標準試料をＬＣ−ＭＳ３で分析することで得られたデータに基づいて化合物毎に検量線を作成して記憶する。定量分析部４３は特定の化合物をターゲットとして得られたデータ毎に抽出イオンクロマトグラムを作成し、予め作成された上記検量線を利用し、該クロマトグラムにおいて観測されるピークの面積値や高さ値に基づいてその化合物の濃度値などを計算する。分析結果記憶部４４は定量分析部４３などによる計算結果を記憶するものである。結果表示処理部４５は計算された分析結果などに基づくグラフを作成するとともに該グラフを配置した所定形式の画面を作成し、これを主制御部６を介して表示部８に出力するものである。
【００３７】
制御部５は、前処理実行制御部５０、分析実行制御部５１、安定化処理実行制御部５２、標準試料分析制御部５３、表示制御部５４、入力処理部５５、設定情報記憶部５６などの機能ブロックを含む。
【００３８】
前処理実行制御部５０は前処理装置２における培地試料に対する前処理の動作を制御するとともに、前処理済みの試料が収容された容器の移送も制御する。分析実行制御部５１はＬＣ−ＭＳ３における培地試料に対する分析動作を制御するものである。ＬＣ部３１でグラジエント溶離を行うために、分析実行制御部５１は予め用意されたグラジエントプロファイルに従って送液ポンプや混合器を制御する。安定化処理実行制御部５２は、後述するように実質的な分析の直前にＬＣ部３１及びＭＳ部３２を定常的な分析が実行可能である状態にするべく所定の安定化処理を実行するための制御を行うものである。この安定化処理には、例えばＬＣ部３１及びＭＳ部３２において培地試料が流通する流路（典型的にはカラム）に水を流す処理（水打ち）、及び、ＬＣ部３１に培地試料を注入することなくＬＣ／ＭＳ分析を行うことによりバックグラウンドを取得する処理（空打ち）の少なくとも一方の処理が含まれる。標準試料分析制御部５３は、ＬＣ部３１に培地試料の代わりに標準試料を注入し、該標準試料をＬＣ／ＭＳ分析するための制御を実行する。この標準試料は定量対象である複数の化合物を既知の濃度で含むものである。
【００３９】
表示制御部５４は後述するように、前処理装置２及びＬＣ−ＭＳ３での動作状態を表示する画面や、前処理装置２に供される培地試料の情報（サンプル情報）或いは各サンプルについての分析条件などをオペレータが設定するための画面を作成し、これを主制御部６を介して表示部８に出力するものである。入力処理部５５はオペレータによる操作部７の入力操作に応じて所定の処理を実行するものである。また、設定情報記憶部５６はオペレータの入力操作等によって入力設定された、各培地試料についてのサンプル情報や分析条件などを記憶しておくものである。
【００４０】
なお、データ処理部４、制御部５、及び主制御部６の実体はパーソナルコンピュータ（又はより高性能なワークステーション）であり、該コンピュータにインストールされた専用の一又は複数のソフトウェアを該コンピュータ上で動作させることにより、上記各ブロックの機能が達成される構成とすることができる。この構成では、操作部７はパーソナルコンピュータ等に付設されているキーボードやマウス等のポインティングデバイスであり、表示部８はディスプレイモニタである。
【００４１】
本実施例の培地試料自動分析システムでは、分析モードとして、予め用意された多数の培地試料に対し全て前処理を実行したあとに、その前処理済みの培地試料を順次ＬＣ／ＭＳ分析するバッチモードと、一つの培地試料に対する前処理を実行したあとに引き続き該試料に対するＬＣ／ＭＳ分析を実行するという処理を多数の培地試料に対し順次行う逐次モードとの、いずれかを選択的に行うことができる。図２は本実施例の培地試料自動分析システムにおいて逐次モードによる分析を行う際の処理の流れを示すフロー図である。図３はこの逐次モードによる分析の際の各部の動作状況と移動相中の成分の変化を示す説明図である。
【００４２】
図２、図３を参照して逐次モードの分析の手順を説明する。逐次モードの際には、分析に先立って試料載置部２０に多数の培地試料を用意する必要はなく、分析の進行に応じて順次培地試料を用意するようにしてもよい。もちろん、前処理前の培地試料における代謝の進行などの問題がない場合、つまりは前処理を実施していない培地試料を或る程度の時間放置しておいても該試料中の成分の変化が問題ない場合には、試料載置部２０に多数の培地試料を予め用意しておいてもよい。
【００４３】
逐次分析が開始されると、安定化処理実行制御部５２はＬＣ部３１及びＭＳ部３２における安定化処理を実行するが、それに先立ち、所定の待機時間が経過するまで待機する（ステップＳ１０）。この待機時間は図３中に示す希釈時間相当分追加ダミー時間Ｍであり、オートサンプラ３０の試料希釈部３０１での実施される試料希釈の希釈率に応じて定められる。
【００４４】
即ち、分析に先立ってオペレータは操作部７から繰り返し分析対象である培地試料を特定する情報（例えば培養名など）を入力するとともに、分析条件の一つとして希釈率を入力する。設定情報記憶部５６には培地試料を特定する情報に対応してＬＣ／ＭＳ分析の所要時間が予め格納されている。このＬＣ／ＭＳ分析の所要時間はグラジエントプロファイルなどの分析条件から得ることができる。ＬＣ／ＭＳ分析の所要時間及び入力された希釈率は分析実行制御部５１のほか、安定化処理実行制御部５２及び標準試料分析制御部５３に設定される。そして、安定化処理実行制御部５２ではその希釈率とＬＣ／ＭＳ分析の所要時間とに基づいて待機時間を算出して、その時間だけ安定化処理の開始を待つよう各部を制御する。そして、所定の待機時間が経過するとＬＣ部３１及びＭＳ部３２に安定化処理を実行させる（ステップＳ１１）。ここでは、一例として待機時間は３分であるとする。
【００４５】
安定化処理の際には、ＬＣ部３１では後述する培地試料のＬＣ／ＭＳ分析時と同様に、グラジエントプロファイルに従って移動相がカラムに供給される。また、ＭＳ部３２はこの間に繰り返しマススペクトルデータを取得する。ただし、このときにはインジェクタから移動相中に試料が注入されないので、試料なしのバックグラウンド測定を実施していることになる。安定化処理の所要時間は後述する培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析の所要時間と同じであり、ここでは１７分であるとする。
【００４６】
安定化処理が終了すると、標準試料分析制御部５３は予め用意された標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析をＬＣ部３１及びＭＳ部３２を実行させるが、それに先立ち、所定の待機時間が経過するまで待機する（ステップＳ１２）。この待機時間はステップＳ１０における待機時間と同じ長さであり、培地試料の希釈率とＬＣ／ＭＳ分析の所要時間とに依存する。そして、所定の待機時間が経過すると、ＬＣ部３１におけるインジェクタから移動相中に標準試料を注入し、ＬＣ部３１及びＭＳ部３２にＬＣ／ＭＳ分析を実行させる（ステップＳ１３）。このときにも、ＬＣ部３１では培地試料のＬＣ／ＭＳ分析時と同様に、グラジエントプロファイルに従って移動相がカラムに供給される。
【００４７】
ＭＳ部３２は標準試料分析制御部５３の制御の下で、時間経過に応じて異なる質量電荷比（又はＭＲＭトランジション）をターゲットとする信号強度値データを取得する。即ち、標準試料に含まれる各化合物の保持時間に対応するタイミングで当該化合物に対応する信号強度値データを取得する。検量線作成部４２は得られたデータに基づいて各化合物に対応する検量線をそれぞれ作成する。具体的には、収集されたデータに基づいて化合物毎に抽出イオンクロマトグラムを作成し、化合物に対応するピークの面積値又は高さ値を求める。そして、既知である濃度のそのピーク面積値又は高さ値との関係から検量線を作成する。
【００４８】
なお、ここでは、目的化合物を一種類の濃度で含む標準試料に対する分析結果から一点検量線を作成しているが、一点検量線でなく例えば三点、五点などの多点検量線を作成する場合には、異なる濃度で目的化合物を含む複数の標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析を繰り返せばよい。
【００４９】
ステップＳ１３で標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析が開始された時点から所定時間が経過した時点で前処理実行制御部５０は１番目の培地試料に対する前処理を実行するように前処理装置２における前処理実行部２１及び前処理済み試料送出部２２を制御する（ステップＳ１４）。前処理実行部２１において１番目の培地試料に対する前処理が完了すると、前処理済み試料送出部２２により前処理後の培地試料がＬＣ−ＭＳ３における試料希釈部３０１で吸引可能な位置に移送される。標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析の所要時間、及び、培地試料に対する前処理の所要時間は共に決まっているから、標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析が終了する前に前処理が終了するように、その前処理の開始のタイミングは定められる。標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析の所要時間は後述する培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析の所要時間と同じであり、ここでは１７分である。
【００５０】
１番目の培地試料に対する前処理の終了後、標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析の終了が確認できると（ステップＳ１５でＹｅｓ）、分析実行制御部５１はその直前に前処理された培地試料に対する希釈が実施されるように試料希釈部３０１を制御する（ステップＳ１６）。このとき、上述したように設定された希釈率によって試料は希釈される。
ここでは、希釈の所要時間は上記待機時間と同じで３分である。そして、希釈が終了すると引き続いて、分析実行制御部５１の制御の下で、希釈された前処理済みの培地試料が試料採取部３０３により吸引されてＬＣ部３１のインジェクタから移動相中に注入され、該培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析が開始される（ステップＳ１７）。このとき、ＬＣ部３１ではグラジエントプロファイルに従って移動相がカラムに供給される。
【００５１】
ＭＳ部３２は標準試料のＬＣ／ＭＳ分析時と同様に、時間経過に応じて異なる質量電荷比（又はＭＲＭトランジション）をターゲットとする信号強度値データを取得する。即ち、培地試料中の定量対象である各化合物の保持時間に対応するタイミングで当該化合物に対応する信号強度値データを取得する。このときに取得されたデータはデータ記憶部４１に一旦保存される。
【００５２】
ステップＳ１７で培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析が開始された時点から所定時間が経過した時点で前処理実行制御部５０は次に分析する培地試料に対する前処理を実行するように前処理装置２における前処理実行部２１及び前処理済み試料送出部２２を制御する（ステップＳ１８）。これはステップＳ１４の処理と実質的に同じである。そして、前処理実行部２１において次の分析対象の培地試料に対する前処理が完了すると、前処理済み試料送出部２２により前処理後の培地試料がＬＣ−ＭＳ３における試料希釈部３０１で吸引可能な位置に移送される。この場合にも、培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析が終了する前に次の試料に対する前処理が終了するように、その前処理の開始のタイミングが定められる。
【００５３】
次に分析すべき培地試料に対する前処理の終了後、培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析の終了が確認できると（ステップＳ１９でＹｅｓ）、分析実行制御部５１は分析すべき培地試料について全て分析が終了したか否か判定する（ステップＳ２０）。そして、未だ分析すべき培地試料が残っていればステップＳ２０からＳ１６へと戻り、ステップＳ１６〜Ｓ１９の処理を繰り返す。なお、ステップＳ２０でＹｅｓと判定されるときには、次に分析すべき培地試料はないから、その直前のステップＳ１８の処理は省略される。上述したように、培地試料の希釈の所要時間は３分、培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析の所要時間は１７分であるから、ステップＳ１６〜Ｓ１９までの１サイクルの所要時間は２０分である。このサイクルが培地試料の数だけ繰り返される。
【００５４】
そして、全ての培地試料に対する分析が終了するとステップＳ２０でＹｅｓと判定され、安定化処理実行制御部５２はステップＳ１１と同様に、ＬＣ部３１及びＭＳ部３２における安定化処理を実行する（ステップＳ２１）。安定化処理の終了後、標準試料分析制御部５３はステップＳ１３と同様に、標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析をＬＣ部３１及びＭＳ部３２を実行させる（ステップＳ２２）。
【００５５】
ステップＳ２２において標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析によるデータが得られると、データ処理部４において検量線作成部４２は得られたデータに基づいて各化合物に対応する検量線を作成する。そして、複数の培地試料に対する繰り返し分析の実行前に得られた検量線と、該繰り返し分析の実行後に得られた検量線との平均を計算し、それを定量分析に使用する検量線として記憶する。以上のような一連の処理の終了後、分析実行制御部５１はＬＣ部３１及びＭＳ部３２において移動相やガスの供給を停止させることによりクールダウンを実行する（ステップＳ２３）。
【００５６】
上述したように、多数の培地試料についてのＬＣ／ＭＳ分析により収集されたデータはデータ記憶部４１に保存される。また、検量線作成部４２には標準試料を分析した結果に基づく検量線が保存されている。そこで、定量分析部４３は培地試料に対するデータを用いて化合物毎に抽出イオンクロマトグラムを作成し、当該化合物に対応するピークの面積値又は高さ値を計算する。そして、上記検量線を参照してピーク面積値又は高さ値から濃度を算出する。こうして培地試料毎に一又は複数の化合物についてのピーク面積値と濃度とが求まるから、それらを一つのファイルとして分析結果記憶部４４に保存する。
【００５７】
図３にも示したように、本システムでは、ＬＣ−ＭＳ３において一つの培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析を実行している期間中に前処理装置２において次の培地試料に対する前処理を並行して実行している。そのため、多数の培地試料に対する逐次的な分析を効率良く行うことができる。また、上述したように一つの培地試料に対する希釈及びＬＣ／ＭＳ分析に要する時間、つまりは培地試料の繰り返し分析の１サイクルの時間は２０分であるが、安定化処理が実行される最初のサイクルの時間、及びその次の標準試料に対する分析が実行されるサイクルの時間も、待機時間（希釈時間相当分追加ダミー時間）がそれぞれ設けられているために同じ２０分となっている。
【００５８】
各サイクルにおいてＬＣ部３１では同じグラジエントプロファイルに従って移動相の成分変化があり、例えば希釈の実行時には移動相の送給は停止されている。移動相の送給停止時に脱気装置に移動相が滞留するため、この滞留時間に差異があると移動相の成分がばらつくことになる。本システムでは、最初及び２番目のサイクルでは試料の希釈は行われないもものの、上述したように待機時間が設けられていることで同じ時間だけ移動相の送給が停止される。そのため、移動相の送給条件、具体的には最初及び２番目のサイクルにおいて移動相が脱気装置に滞留する時間は、培地試料に対する分析のサイクルと全く同じとなる。それにより、特に１番目の培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析におけるカラム内の移動相の組成を２番目以降の培地試料に対するＬＣ／ＭＳ分析におけるカラム内の移動相の組成とほぼ同じにすることができる。それによって、各培地試料中の化合物について高い定量性を確保することができる。なお、希釈率が異なると希釈に要する時間が変化するが、待機時間も希釈率に応じて変化させることでサイクルの時間長を揃えることができる。
【００５９】
なお、上記実施例は本発明の一例であり、本発明の趣旨の範囲で適宜に変更、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【００６０】
例えば、試料の希釈以外の試料に対する処理（例えば一種の前処理）をＬＣ−ＭＳ３のオートサンプラ３０で実施してもよい。また、図２に示したフロー図においてステップＳ２１の処理は必須ではない。
【００６１】
また、上記実施例のシステムでは、ＬＣ部３１で分離した各化合物をＭＳ部３２で検出していたが、質量分析装置以外の他の検出器を用いてもよい。ただし、一般的には、上述したようなカラム中の移動相の組成のばらつきが分析結果に現れるのは検出器が高感度である場合であるから、高感度の検出器を用いた場合、即ち質量分析装置を検出器として用いた場合に本発明は特に有用である。
【符号の説明】
【００６２】
１…培養装置
２…前処理装置
２０…試料載置部
２１…前処理実行部
２２…試料送出部
３…ＬＣ−ＭＳ
３０…オートサンプラ
３０１…試料希釈部
３０２…試料載置部
３０３…試料採取部
３１…ＬＣ部
３２…ＭＳ部
４…データ処理部
４０…サンプル情報記憶部
４１…データ記憶部
４２…検量線作成部
４３…定量分析部
４４…分析結果記憶部
４５…結果表示処理部
５…制御部
５０…前処理実行制御部
５１…分析実行制御部
５２…安定化処理実行制御部
５３…標準試料分析制御部
５４…表示制御部
５５…入力処理部
５６…設定情報記憶部
６…主制御部
７…操作部
８…表示部
【図１】
2019106833.tif 000003
【図２】
2019106833.tif 000004
【図３】
2019106833.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月27日(2020.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
安定化処理が終了すると、標準試料分析制御部５３は予め用意された標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析をＬＣ部３１及びＭＳ部３２に実行させるが、それに先立ち、所定の待機時間が経過するまで待機する（ステップＳ１２）。この待機時間はステップＳ１０における待機時間と同じ長さであり、培地試料の希釈率とＬＣ／ＭＳ分析の所要時間とに依存する。そして、所定の待機時間が経過すると、ＬＣ部３１におけるインジェクタから移動相中に標準試料を注入し、ＬＣ部３１及びＭＳ部３２にＬＣ／ＭＳ分析を実行させる（ステップＳ１３）。このときにも、ＬＣ部３１では培地試料のＬＣ／ＭＳ分析時と同様に、グラジエントプロファイルに従って移動相がカラムに供給される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
ＭＳ部３２は標準試料分析制御部５３の制御の下で、時間経過に応じて異なる質量電荷比（又はＭＲＭトランジション）をターゲットとする信号強度値データを取得する。即ち、標準試料に含まれる各化合物の保持時間に対応するタイミングで当該化合物に対応する信号強度値データを取得する。検量線作成部４２は得られたデータに基づいて各化合物に対応する検量線をそれぞれ作成する。具体的には、収集されたデータに基づいて化合物毎に抽出イオンクロマトグラムを作成し、化合物に対応するピークの面積値又は高さ値を求める。そして、既知である濃度とそのピーク面積値又は高さ値との関係から検量線を作成する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
そして、全ての培地試料に対する分析が終了するとステップＳ２０でＹｅｓと判定され、安定化処理実行制御部５２はステップＳ１１と同様に、ＬＣ部３１及びＭＳ部３２における安定化処理を実行する（ステップＳ２１）。安定化処理の終了後、標準試料分析制御部５３はステップＳ１３と同様に、標準試料に対するＬＣ／ＭＳ分析をＬＣ部３１及びＭＳ部３２に実行させる（ステップＳ２２）。
【国際調査報告】
2019106833.tif 000006
2019106833.tif 000007
2019106833.tif 000008