(57)【要約】  改善された治療又は予防の効果を有すると共に低減された副作用を有するアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物を提供する。  本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、第１の有効成分としてのグリセロホスホコリン（Ｇ）及びその薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物と、第２の有効成分としてのヘスペリジン（Ｈ）、ナリルチン（Ｎ）、及びこれらの薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物とを含有する。この組成物は、再ミエリン化を促進し、α−セクレターゼの活性を促進すると共に、β−セクレターゼの発現をも抑制する。
2018190146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の有効成分としての、グリセロホスホコリン及びその薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物と、
第２の有効成分としての、ヘスペリジン、ナリルチン、及びこれらの薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物と
を含み、再ミエリン化を促進し、α−セクレターゼの活性を促進し、且つβ−セクレターゼの発現を抑制する、アルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項２】
成人一人当たりの一日当たりの投与量として、１０〜１２０ｍｇの第１の有効成分と、３０〜１００ｍｇの第２の有効成分とを含む、請求項１に記載のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項３】
第２の有効成分としてヘスペリジとナリルチンとを含む、請求項１又は２に記載のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項４】
ヘスペリジンとナリルチンとを、ウンシュウミカン由来の陳皮或いは該陳皮の抽出物の形態で含む、請求項３に記載のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項５】
第１の有効成分と第２の有効成分の両方を含む配合剤として製剤化される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項６】
第１の有効成分を含む剤と第２の有効成分を含む剤とから成るキットとして製剤化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物。
【請求項７】
健康食品として投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会を迎えつつある現在、医療機関を受診する認知症患者の数は急激に増加しており、２０１５年の世界アルツハイマー報告によると、２０１５年に全世界で４，６８０万人の認知症患者が生存し、２０５０年までに１億３，１５０万人に増加すると予想されている。この数値は２０年ごとに約２倍になる数値であり、認知症が世界規模で危機をもたらす疾患であると警告されている。このため、認知症に対する効果的な治療法と予防法とを確立することが急務となっている。【０００３】
認知症の原因の最も多くを占めるアルツハイマー病は、進行性の痴呆を主症状としているが、病理学的特徴として、老人斑、神経原線維変化が脳内に多数認められ、ニューロンの脱落による脳の萎縮も認められることから、灰白質部位の神経細胞の変性や脱落がアルツハイマー病発症の原因と考えられてきた。すなわち、アミロイド前駆体タンパク質の代謝異常に伴う脳内アミロイドβタンパク質の凝集沈着（以下、アミロイド前駆体タンパク質を「ＡＰＰ」と表し、アミロイドβタンパク質を「Ａβ」と表す。）によって老人班が形成されるが、このＡβの凝集沈着が引き金となって、神経原線維変化の形成、ニューロンの消失、ひいては認知知能の低下が引き起こされると考えられてきた。また、Ａβの凝集の過程で形成される可溶性Ａβオリゴマーが、認知症の重症度と密接に関係する神経シナプスの減少と相関を示すことが明らかとなっている。そこで、Ａβ、特に可溶性Ａβオリゴマーの発現量の低減を目的としたアルツハイマー病の治療法及び／又は予防法が広く検討されてきた。【０００４】
一方、近年、アルツハイマー病患者の脳において白質異常が認められ、特にミエリンの減少が著しく、初期ミエリン形成部位である脳梁膨大部や後期ミエリン形成部位である脳梁膝状部だけでなく、海馬ＣＡＩ下部領域でも白質異常が見られることが報告され、軽度認知機能障害やアルツハイマー病において白質部位の軸索変性や脱髄が重要な因子である可能性が示唆されたことから、脱髄の回復を目的としたアルツハイマー病の治療法及び／又は予防法が検討されてきた。【０００５】
非特許文献１（Ｊ  ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ８５：９５４−９６６，２００７）には、リン酸化ミエリン塩基性タンパク質、特にリン酸化した分子質量２１．５ｋＤａのミエリン塩基性タンパク質（以下、ミエリン塩基性タンパク質を「ＭＢＰ」と表し、リン酸化ＭＢＰを「ｐ−ＭＢＰ」と表し、分子質量ＸｋＤａのＭＢＰを「ＸｋＤａＭＢＰ」と表し、リン酸化したＸｋＤａＭＢＰを「ｐ−ＸｋＤａＭＢＰ」と表す。）の量が、老化及び脱髄誘導薬であるカプリゾンの適用により誘発された脱髄の間に顕著に減少すること、及び、ミエリン形成のトリガー分子が免疫グロブリンＦｃ受容体であり、Ｆｃ受容体とＦｙｎのトリガー分子がシグナルとなり、ｓｍａｌｌ  Ｇタンパク（Ｒｈｏ）のオン・オフを調節し、さらにそのエフェクターであるＭＡＰＫを活性化してＭＢＰのリン酸化を促し、ミエリン膜を重層化し、ミエリンの圧縮を維持していることが報告されており、さらに、カプリゾン処理マウス及び老齢マウスにおける脱髄の回復が人参養栄湯の投与によって達成され、人参養栄湯がＦｃＲγ／Ｆｙｎ−Ｒｈｏ（Ｒａｃ１）−ＭＡＰＫ（Ｐ３８  ＭＡＰＫ）−ｐ−ＭＢＰシグナル伝達系を標的とした有効な治療となることが報告されている。この文献には、３１ヶ月齢の老齢マウスに人参養栄湯を２ヶ月間投与すると、脱髄進行の尺度であるＧ−レシオ（軸索及び軸索周囲のミエリン鞘の直径に対する軸索の直径の割合）の値が、投与前の約０．８２から約０．７３にまで低下し、３ヶ月齢のマウス（Ｇ−レシオの値が約０．７５）に匹敵するまでの脱髄の回復が認められたことが報告されている（この文献の図１Ｃ参照）。また、非特許文献２（Ｐｓｙｃｈｏｇｅｒｉａｔｉｃｓ  ２０１５．［ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｓｙｇ．１２１２５］）には、ドネペジルで効果不十分な軽症〜中等症のアルツハイマー病患者に人参養栄湯を２４時間併用投与した結果、ドネペジル単独群と比較して、認知機能維持と抑うつ状態の有意な改善が認められたことが報告されている。【０００６】
非特許文献３（Ｅｖｉｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄ．２０１１．［ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｃａｍ／ｎｅｑ００１］）には、人参養栄湯を構成する１２種の生薬のうち、ウンシュウミカン由来の陳皮が老齢による脱髄状態を回復する主要な成分であること、及び、脱髄状態の回復が脱髄の抑制ではなく再ミエリン化によってもたらされることが報告されており、さらに、上記陳皮の主成分であるヘスペリジン及び／又はナリルチンの存在下でミエリンへと発展するオリゴデンドロサイト前駆細胞を培養すると、陳皮の存在下で培養したのと同じく、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの生成が亢進され、急速にオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖・分化が進行することが報告されている。そして、特許文献１（特開２００８−１２７３２５号公報）では、ヘスペリジン及び／又はナリルチンを有効成分として含有するｐ−ＭＢＰ産生促進剤及びこれを用いた認知症の治療及び／又は予防が提案されている。なお、ウンシュウミカン由来の陳皮は、ヘスペリジンとナリルチンの両方の含有量が多い点で、マンダリンオレンジ或いは他の柑橘類に由来する陳皮とは異なっている。【０００７】
非特許文献４（新薬と臨床２０１５；６４；１０７２−１０８３）には、ＭＢＰを与える遺伝子のエクソン３−７が欠落しているためミエリン形成不全を起こしているシバラーマウスの脳では、非Ａβ産生経路が阻害されていて、α−セクレターゼがＡＰＰを切断することにより発生するｓＡＰＰαといわれるＮ末端断片が発現しないこと、及び、人参養栄湯を２ヶ月間投与した老齢マウスの脳では、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰが増加すると共に、Ａβ産生経路において生成するＡβから誘導された可溶性Ａβオリゴマーが有意に減少することが報告されており、上述の実験結果から、ＭＢＰの働きにより、Ａβ産生経路が抑制され、よって非Ａβ産生経路が促進されて、可溶性Ａβオリゴマーの産生が抑制されると同時にｓＡＰＰαが生成するようになると推察されている。なお、Ａβ産生経路とは、βセクレターゼがＡＰＰを切断してｓＡＰＰβといわれるＮ末端断片とＣＴＦ−βといわれるＣ末端断片を生じ、この断片をγ−セクレターゼが切断してＡβとＡＰＰ細胞内ドメイン（ＡＩＣＤ）を生じる経路であり、非Ａβ産生経路とは、α−セクレターゼがＡＰＰを切断してｓＡＰＰαといわれるＮ末端断片とＣＴＦ−αといわれるＣ末端断片を生じ、この断片をγ−セクレターゼが切断し、ｐ３とＡＩＣＤを生じる経路である。【０００８】
一方、ミエリン化に関与する物質として、Ｌ−α−グリセリルホスホリルコリン或いはα−ＧＰＣともいわれるグリセロホスホコリン（以下、グリセロホスホコリンを「α−ＧＰＣ」と表す。）がある。α−ＧＰＣは、脳および乳にみられる天然化合物であり、コリン代謝系においてミエリン形成担当細胞であるオリゴデンドロサイトの細胞膜上に存在するＥＮＰＰ６（コリン特異的ホスホジエステラーゼ）によってコリンに代謝され、生成したコリンがオリゴデンドロサイトの脂質合成に利用されてミエリン化が進行する（非特許文献５（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ｜６：２０９９５｜Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ２０９９５）参照）。そして、このα−ＧＰＣが認知機能改善効果を有することが知られている。例えば、非特許文献６（Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９４  Ｊｕｎ  ３０；７１７：２５３−６９）には、２，０４４人の脳卒中患者に対して１，０００ｍｇ／ｄａｙの量のα−ＧＰＣを２８日間投与し、続いて４００ｍｇ／ｄａｙの量を５ヶ月間経口で投与した結果、患者の認知能力が回復したことが報告されており、非特許文献７（Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ．２００３  Ｊａｎ；２５（１）：１７８−９３）には、α−ＧＰＣを４００ｍｇカプセル×１日３回の量で軽度から中程度のアルツハイマー型認知症発症者に１８０日間投与したところ、認知機能の改善効果が認められたことが報告されている。また、特許文献２（ＥＰ１２０３５８４Ａ１）では、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤とα−ＧＰＣとの併用が提案されている。【０００９】
α−ＧＰＣには、認知機能改善効果の他に、成長ホルモン分泌促進、肝機能障害改善、血圧低下、コリン濃度低下改善などの有用な効果が認められているが、有害な副作用も報告されている。例えば、非特許文献６には、２．１４％の患者に有害な副作用が認められ、０．７％が胸やけ、０．５％が吐き気・嘔吐、０．４％が不眠・興奮、０．２％が頭痛であったこと、及び、０．７％の患者が治療の中止を希望したことが報告されている。したがって、α−ＧＰＣが体内にみられる天然化合物であってもなお、多量のα−ＧＰＣの摂取は回避されるべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−１２７３２５号公報
【特許文献２】ＥＰ１２０３５８４Ａ１
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ  ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ８５：９５４−９６６，２００７
【非特許文献２】Ｐｓｙｃｈｏｇｅｒｉａｔｉｃｓ  ２０１５．［ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｓｙｇ．１２１２５］
【非特許文献３】Ｅｖｉｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｍｅｄ．２０１１．［ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｃａｍ／ｎｅｑ００１］
【非特許文献４】新薬と臨床２０１５；６４；１０７２−１０８３
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ｜６：２０９９５｜Ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ２０９９５
【非特許文献６】Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９４  Ｊｕｎ  ３０；７１７：２５３−６９
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ  Ｔｈｅｒ．  ２００３  Ｊａｎ；２５（１）：１７８−９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、人参養栄湯或いはウンシュウミカン由来の陳皮の有効成分であるヘスペリジン及び／又はナリルチンは、有用なｐ−ＭＢＰ産生促進作用を有し、再ミエリン化を促し、有毒な可溶性Ａβオリゴマーの産生を抑制するため、これらの利用によりアルツハイマー病の効果的な治療及び／又は予防が期待される。しかし、治療及び／又は予防の効果のさらなる向上は常に要請されており、同時に有害な副作用は回避されるべきである。【００１３】
そこで、本発明の目的は、上述の要請に答えることができるアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、まず、非特許文献４に示されている、ＭＢＰ産生とｓＡＰＰα産生との関係をより詳細に検討した。アルツハイマー病の病態モデルマウスとして、ヒトのスウェーデン変位型ＡＰＰ（ＡＰＰＫ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）遺伝子を導入した遺伝子改変マウスＴｇ２５７６（以下、「Ｔｇ２５７６マウス」という。）を用いて、３ヶ月齢の若齢マウスの脳とＡβの多量の蓄積が認められる２８ヶ月齢の老齢マウスの脳との間の、ｐ−ＭＢＰの発現量の相違を調査し、さらに、Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＤＡＭｓ）の中でもα−セクレターゼ活性を示すことが知られているＡＤＡＭ９とｐ−ＭＢＰとの結合状態の相違について調査したところ、以下に調査結果を示すが、老齢マウスの脳では、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現が認められず、ＡＤＡＭ９とｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰとの結合も認められなかった。この結果から、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰとＡＤＡＭ９とが結合すると、ＡＤＡＭ９がα−セクレターゼ活性を示すようになり、ｓＡＰＰαの産生が促進されると判断された。【００１５】
また、オリゴデンドロサイト前駆細胞を、α−ＧＰＣのみを含む培養液、ヘスペリジン及び／又はナリルチンのみを含む培養液、及び、α−ＧＰＣに加えてヘスペリジン及び／又はナリルチンを含む培養液を用いて培養したところ、α−ＧＰＣに加えてヘスペリジン及び／又はナリルチンを含む培養液を用いた場合に、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖・分化が顕著になることが分かった。このことは、非特許文献５に示されているＥＮＰＰ６がヘスペリジン及び／又はナリルチンにより活性化され、α−ＧＰＣが活性化されたＥＮＰＰ６により迅速にコリンに代謝されてオリゴデンドロサイトの分化・成熟に利用されたことを意味しており、今までに知られていなかった作用である。このことから、α−ＧＰＣとヘスペリジン及び／又はナリルチンとの併用により、再ミエリン化を迅速に進行させて脱髄を回復させることができることが期待される。【００１６】
そして、水にヘスペリジンとナリルチンとα−ＧＰＣとを添加した飲料、水にヘスペリジンとナリルチンとを添加した飲料、及び水にα−ＧＰＣを添加した飲料を２６ヶ月齢の老齢Ｔｇ２５７６マウスに与えると、ヘスペリジンとナリルチンとα−ＧＰＣとを含む飲料を与えた老齢マウスの脳では、ヘスペリジンとナリルチンとを含む飲料を与えた老齢マウスの脳及びα−ＧＰＣを含む飲料を与えた老齢マウスの脳に比較して、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量が顕著に増加することがわかった。この顕著に増加した発現量は、ヘスペリジンとナリルチンとを含む飲料の投与により増加した発現量とα−ＧＰＣを含む飲料の投与により増加した発現量とを加算した量と比較しても顕著であり、したがってヘスペリジン及び／又はナリルチンとα−ＧＰＣとの相乗効果が認められた。そして、ヘスペリジンとナリルチンとα−ＧＰＣとを含む飲料を与えた老齢マウスの脳では、このｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量の顕著な増加により、一方では、上述したｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験結果から期待される通り、顕著に再ミエリン化が進行して脱髄が回復し、他方では、この顕著に増加したｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰがＡＤＡＭ９に結合してα−セクレターゼ活性が促進され、非Ａβ産生経路におけるｓＡＰＰαの産生が顕著に亢進された。【００１７】
その上、ヘスペリジンとナリルチンとα−ＧＰＣとを含む飲料を与えた老齢マウスの脳では、ヘスペリジンとナリルチンとを含む飲料を与えた老齢マウスの脳及びα−ＧＰＣを含む飲料を与えた老齢マウスの脳に比較して、β−セクレターゼの１種であるＢＡＳＥ１の発現量が顕著に減少し、これに伴い有毒な可溶性Ａβオリゴマーの発現量が顕著に減少することがわかった。この顕著に減少したＢＡＳＥ１及び可溶性Ａβオリゴマーの発現量は、ヘスペリジンとナリルチンとを含む飲料の投与により減少した発現量とα−ＧＰＣを含む飲料の投与により減少した発現量とを加算した量と比較しても顕著であった。α−ＧＰＣとヘスペリジン及び／又はナリルチンとの相乗効果により、迅速に再ミエリン化が進行して脳のダメージが回復するため、ＢＡＳＥ１の発現量が顕著に減少し、可溶性Ａβオリゴマーの発現量も顕著に減少したと考えられる。【００１８】
したがって、本発明は、
第１の有効成分としての、グリセロホスホコリン及びその薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物と、
第２の有効成分としての、ヘスペリジン、ナリルチン、及びこれらの薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物と
を含み、再ミエリン化を促進し、α−セクレターゼの活性を促進し、且つβ−セクレターゼの発現を抑制する、アルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物に関する。【００１９】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物においては、α−ＧＰＣとヘスペリジン及び／又はナリルチンとの相乗効果のため、例えば非特許文献６において有害な副作用が報告されているα−ＧＰＣの１日当たりの投与量を大幅に減らすことができる。本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、好ましくは、成人一人当たりの一日当たりの投与量として、１０〜１２０ｍｇの第１の有効成分と、３０〜１００ｍｇの第２の有効成分とを含む。１日当たり１０〜１２０ｍｇのα−ＧＰＣの使用量は、非特許文献６における初期使用量の１／８以下、後期使用量の１／３以下の量であり、非特許文献７における使用量の１／１０以下の量である。【００２０】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物では、第２の有効成分として、ヘスペリジンとナリルチンの両方を含むのが好ましく、ヘスペリジンとナリルチンとを別々にα−ＧＰＣと組み合わせても良いが、ヘスペリジンとナリルチンとをウンシュウミカン由来の陳皮或いは該陳皮の抽出物の形態で添加しても良い。ウンシュウミカン由来の陳皮はヘスペリジンとナリルチンの両方を多く含み、両者を簡便に添加することができる。【００２１】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物を製剤化する場合には、第１の有効成分と第２の有効成分の両方を含む配合剤の形態であっても良く、第１の有効成分を含む剤と第２の有効成分を含む剤とから成るキットの形態であっても良い。配合剤及びキットを構成する各剤には、本発明の効果に悪影響を及ぼさない限りにおいて、第１の有効成分及び第２の有効成分以外の成分が含まれていても良い。キットの形態である場合には、投与される順番に制限はなく、いずれの剤が先に投与されても良い。【００２２】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、経口及び非経口のいずれの形態でも投与することができ、医薬品、医薬部外品、健康食品（サプリメントを含む。）等の形態で投与することができる。本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、有害な副作用が懸念されないため継続的に投与することができ、簡便さの点から健康食品として経口投与されるのが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明では、第１の有効成分と第２の有効成分との相乗効果により、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量が顕著に増加し、この顕著な増加により、再ミエリン化が顕著に亢進されて脱髄が回復し、またα−セクレターゼ活性が促進されてｓＡＰＰαの産生が顕著に亢進され、その上、脱髄の回復に伴ってβ−セクレターゼの発現量が減少してＡβの産生が顕著に抑制される。したがって、アルツハイマー病の効果的な治療及び／又は予防が達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】アルツハイマー病の病態モデルマウスの脳におけるｐ−ＭＢＰ及びＡＤＡＭ９の発現を調査した結果であり、（ａ）はイムノブロッティングによるｐ−ＭＢＰ及びＡＤＡＭ９の検出結果を示しており、（ｂ）はｐ−ＭＢＰ及びＡＤＡＭ９の存在量を示している。
【図２】オリゴデンドロサイト前駆細胞を、α−ＧＰＣ、ヘスペリジン、ナリルチン、或いはこれらの組み合わせを含む培養容器中で培養し、オリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖・分化の状態を観察した倍率４００倍の位相差顕微鏡写真である。
【図３】オリゴデンドロサイト前駆細胞を、α−ＧＰＣ或いはα−ＧＰＣとヘスペリジンとを含む培養液中で培養した後、オリゴデンドロサイトの分化マーカーであるＯ１抗体を用いて免疫染色を施し、Ｏ１陽性オリゴデンドロサイトの数の全細胞数に対する割合を算出した結果を示した図である。
【図４】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ（Ｇ飲料）、陳皮乾燥エキス（ＨＮ飲料）、及び両者（ＧＨＮ飲料）を投与したときの、脳におけるｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの存在量を調査した結果を示した図である。
【図５】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ、陳皮乾燥エキス、及び両者を投与したときの、脳における成熟型ＡＤＡＭ９の存在量を調査した結果を示した図である。
【図６】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ、陳皮乾燥エキス、及び両者を投与したときの、脳におけるｓＡＰＰαの存在量を調査した結果を示した図である。
【図７】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ、陳皮乾燥エキス、及び両者を投与したときの、脳におけるＣＴＦ−αの存在量を調査した結果を示した図である。
【図８】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ、陳皮乾燥エキス、及び両者を投与したときの、脳におけるＢＡＳＥ１の存在量を調査した結果を示した図である。
【図９】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ、陳皮乾燥エキス、及び両者を投与したときの、脳におけるＡβオリゴマーの存在量を調査した結果を示した図である。
【図１０】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ、陳皮乾燥エキス、及び両者を投与したときの、脱髄回復の様子を示す倍率１９０００倍での電子顕微鏡写真である。
【図１１】アルツハイマー病の病態モデルマウスに、α−ＧＰＣ、陳皮乾燥エキス、及び両者を投与したときの、脱髄回復の様子をＧ−レシオの値で評価した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、
第１の有効成分としての、グリセロホスホコリン及びその薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物と、
第２の有効成分としての、ヘスペリジン、ナリルチン、及びこれらの薬理的に許容された塩から成る群から選択された少なくとも一種の化合物と
を含有する。第１の有効成分と第２の有効成分との併用により、第１の有効成分のみの使用、或いは、第２の有効成分のみの使用と比較して、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量が顕著に増加する。この増加した発現量は、第１の有効成分のみを使用したときの発現量と、第２の有効成分のみを使用したときの発現量とを加算した量と比較しても顕著である。そして、この顕著なｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量の増加により、一方では、再ミエリン化が顕著に亢進されて脱髄が回復し、他方では、この顕著に増加したｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰとＡＤＡＭ９とが結合してα−セクレターゼ活性が促進され、非Ａβ産生経路におけるｓＡＰＰαの産生が顕著に亢進される。また、脱髄の回復に伴って、β−セクレターゼの発現が抑制され、Ａβ産生経路におけるＡβの産生が顕著に抑制される。
【００２６】
第１の有効成分であるα−ＧＰＣは、例えば大豆の搾油・精製により得られるホスファチジルコリンをリパーゼにより加水分解することにより合成することができるが、市販のものを入手することもできる。α−ＧＰＣは、薬理的に許容された塩、例えば、塩酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩の形態で使用されても良く、溶媒和物の形態で使用されても良い。第２の有効成分であるヘスペリジン及びナリルチンも、市販のものを入手することができ、薬理的に許容された塩、例えば、塩酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩の形態で使用されても良く、溶媒和物の形態で使用されても良く、さらには水溶性を向上させるために糖転移体の形態で使用されても良い。糖転移体は体内でヘスペリジン或いはナリルチンに加水分解される。また、ヘスペリジン及びナリルチンを有効成分として含むウンシュウミカン由来の陳皮或いは該陳皮に熱水抽出等の抽出処理を施して得た抽出物を使用することもできる。熱水抽出液を乾燥したものが乾燥エキスとして市販されているため、乾燥エキスを使用するのが簡便である。ウンシュウミカン以外の柑橘類の乾燥物或いはその抽出物も利用することができる。
【００２７】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物では、第１の有効成分と第２の有効成分とが所望量で組み合わせられるが、これらは経口及び非経口のいずれの形態でも投与することができ、医薬品、医薬部外品、健康食品（サプリメントを含む。）等の形態で投与することができる。本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、有害な副作用を有さないため、継続的に投与することができ、簡便さの点からサプリメントとして経口投与されるのが好ましい。
【００２８】
製剤化する場合には、第１の有効成分と第２の有効成分との配合剤の形態であっても良く、第１の有効成分を含む剤と第２の有効成分を含む剤とから成るキットの形態であっても良い。キットの形態である場合には、投与される順番に制限はなく、いずれの剤が先に投与されても良く、各剤が連続的に投与されても良く時間を空けて投与されても良い。
【００２９】
配合剤の場合も、キットを構成する各剤の場合も、使用目的に応じて、カプセル剤、チュアブル剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与用製剤、又は、注射剤、点滴剤、坐剤等の非経口投与用製剤の形態に製剤化することができる。キットの形態の場合には、各剤の剤型は同一であっても異なっていてもよい。
【００３０】
これらの製剤の製造において、第１の有効成分と第２の有効成分とが、通常、使用目的に応じて選択される薬理的に許容される賦形剤、即ち、デキストリン、ラクトース等の固体賦形剤、水、塩水、グリセリン等の液体賦形剤と混合され、所定形状に剤型化される。これらの製剤には、本発明の効果に悪影響を与えない限り、他の成分、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン類、鉄、亜鉛等のミネラル類、イチョウ葉エキス、ドコサヘキサエン酸等の機能性成分の他、結合剤、増粘剤、潤滑剤、香料、甘味料、緩衝剤、保存剤、抗菌剤等の慣用の添加物が含まれていても良い。
【００３１】
さらに、本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、ミネラルウェーター、清涼飲料水等の飲料、チーズ、ヨーグルト等の乳製品、ゼリー、ビスケット、キャンディー等の菓子類等の、各種飲食品に配合することもできる。
【００３２】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物の投与量は、アルツハイマー病患者の症状、年齢、体重等や、投与形態、投与回数、他剤の併用等に応じて適宜決定することができるが、成人一人当たりの一日当たりの投与量として、一般的には、第１の有効成分が１０〜１２０ｍｇ、第２の有効成分が３０〜１００ｍｇの範囲で組み合わせられるのが好ましい。第２の有効成分としてヘスペリジンとナリルチンとの両方が用いられる場合には、α−ＧＰＣが１０〜１２０ｍｇ、ヘスペリジンが２０〜７５ｍｇ、ナリルチンが４〜３５ｍｇの範囲で組み合わせられるのが好ましい。本発明では、このような少量の投与でも十分な改善効果が期待され、また有害な副作用が回避される。
【００３３】
本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物は、再ミエリン化を促進し、α−セクレターゼの活性を促進し、且つβ−セクレターゼの発現を抑制するため、迅速なアルツハイマー病の治療及び／又は予防の効果が期待される。また、再ミエリン化を促進するため、本発明のアルツハイマー病の治療及び／又は予防のための組成物を多発性硬化症、軽度認知機能障害、アルツハイマー病以外の認知症、統合性失調症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性広汎性硬化症、急性若しくは亜急性壊死性脳脊髄炎などの脱髄疾患の治療及び／又は予防のためにも有効に利用することができる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下の実施例を用いて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。【００３５】
（Ａ）動物・飼育環境
以下の実験において使用したヒトのスウェーデン変位型ＡＰＰ（ＡＰＰＫ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）遺伝子を導入した遺伝子改変マウスＴｇ２５７６は、米国のＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。このマウスについては、ＡＰＰが過剰発現するため脳にＡβが９ヶ月齢以降多量に蓄積することに加えて、２４ヶ月齢以降では加齢による脱髄が起こることが知られている。入手したＴｇ２５７６マウスを、室温２５±１℃、相対湿度５５±１％の飼育施設で、１２時間／１２時間の明暗の照明サイクル（７：００点灯、１９：００消灯）の環境下で飼育した。なお、この動物実験は、実験動物の適正な使用及び管理を定めたＮＩＨガイドラインに基づき作成された慶應義塾大学動物実験ガイドラインに則り、同大学内動物実験施設で行った。【００３６】
（Ｂ）実験１：ｐ−ＭＢＰとＡＤＡＭ９との関係
非特許文献４にミエリン形成不全を起こしているシバラーマウスの脳では非Ａβ産生経路が阻害されていてｓＡＰＰαが発現しないことが示されているものの、詳細は不明であるため、以下の実験により、α−セクレターゼ活性を示すことが知られているＡＤＡＭ９とｐ−ＭＢＰとの関係を、抗ＭＢＰモノクロナール抗体を用いた免疫沈降法と抗ｐ−ＭＢＰモノクロナール抗体又は抗ＡＤＡＭ９ポリクロナール抗体を用いたイムノブロッティングとの組み合わせを介して調査した。【００３７】
（１）実験手順
（ａ）界面活性剤による脳の可溶化
脳にＡβがほとんど蓄積しておらず脱髄も起こしていない３ヶ月齢のＴｇ２５７６マウス、及び、脳にＡβが多量に蓄積しており且つ脱髄を起こしている２８ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスを、それぞれイソフルラン（和光純薬工業株式会社）により吸収麻酔下で安楽死させ、直ちに開頭して全脳を摘出した。摘出した脳の重量を測定し、脳重量１ｇにつき、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を１０ｍＬ添加し、さらに、１００ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（メルク株式会社）の１００倍希釈液に１％濃度のポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル（商品名；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００：シグマアルドリッチジャパン株式会社）を添加した液を１０ｍＬ添加した後、ホモジナイザーを用いて脳を可溶化した。得られた脳ホモジネート懸濁液を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに回収し、４℃、１０００００ｒｐｍの条件下で３０分間遠心分離した。【００３８】
（ｂ）免疫沈降法
上記（ａ）工程において得られた遠心分離後の上澄み液（タンパク質濃度１ｍｇ／チューブ）の２００μＬに、濃度２００μｇ／ｍＬの抗ＭＢＰモノクロナール抗体ＳＭＩ−９９（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）の２０μＬを加え、４℃で一晩撹拌しながら反応させ、抗原−抗体複合体を形成させた。さらに、プロテインＡを固相化したセファロースビーズ（商品名；プロテインＡ−セファロース（登録商標）：シグマアルドリッチジャパン株式会社）の５０μＬを加え、４℃で一晩撹拌しながら反応させて、上記セファロースビーズに上記抗原−抗体複合体を吸着させた。次いで、得られた懸濁液を４℃、１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離し、上澄み液を廃棄した後、沈渣に８００μＬの洗浄液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名：Ｔｗｅｅｎ−２０）：全てシグマアルドリッチジャパン株式会社）を添加し、ゆっくりとピペッティングした後、４℃、１２０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離した。上述した洗浄液添加〜遠心分離までの手順をさらに２回繰り返した後、沈渣に２ｘドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプルバッファー（０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）（和光純薬株式会社）、２０％  グリセロール（和光純薬工業株式会社）、４％  ＳＤＳ（和光純薬工業株式会社）、１０％  ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク株式会社）、０．００４％  ブロモフェノールブルー（シグマアルドリッチジャパン株式会社））の５０μＬを添加し、１００℃で５分間加温し、次いで４℃、１４０００ｒｐｍの条件下で１５分間遠心分離して、上記抗原−抗体複合体を含む上澄み液を得た。【００３９】
（ｃ）電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは４〜２０％グラジエントゲル（テフコ株式会社）を使用して行った。ゲル板を電気泳動装置にセットし、泳動バッファーを導入した。次に、上記（ｂ）工程にて得られた抗原−抗体複合体を含む上澄み液の２５μＬをゲル板のウェルに導入し、室温にて５ｍＡの条件下で約３０分間泳動し、さらに２５ｍＡの条件下で約９０分間泳動した。【００４０】
（ｄ）イムノブロッティング
ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（商品名；Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ：孔径０．４５μｍ：Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を転写液（３１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ナカライテスク株式会社）、０．２４Ｍ  グリシン（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、２０％  メタノール（和光純薬工業株式会社））中に導入して１５分間振とうし、回収したＰＶＤＦ膜と上記（ｃ）工程にて得られた電気泳動後のゲルとを接触させ、室温にて２０ｍＡ/ｃｍ２の条件下で電流を流し、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写後クマシーブリリアントブルー（和光純薬工業株式会社）で染色して乾燥させたＰＶＤＦ膜に、１０倍希釈した１０ｘトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１）（ナカライテスク株式会社）、１．５Ｍ  ＮａＣｌ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、１Ｎ  塩酸（和光純薬株式会社））に５％のスキムミルク（株式会社Ｄｅｆｃｏ）を溶解させたブロッキングバッファーを用いて、１時間室温にてブロッキング処理を施した。【００４１】
ブロッキング処理後のＰＶＤＦ膜に、一次抗体として、内部標準のβアクチンに対するマウスモノクロナール抗体（シグマアルドリッチジャパン株式会社、１／１０００希釈）と共に、抗ｐ−ＭＢＰモノクロナール抗体ＰＣ１２（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、１／５００希釈）又は抗ＡＤＡＭ９ポリクロナール抗体Ｃ−１５（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、１／５００希釈）を使用して、４℃で一晩、一次抗体反応を施した。希釈には上記ブロッキングバッファーを使用した。一次抗体反応後のＰＶＤＦ膜を、１０倍希釈した１０ｘＴＢＳに１％のスキムミルクを溶解させたブロッキングバッファーを用いて３回洗浄した。続いて、ブロッキングバッファーで８００〜１０００倍に希釈したＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）又はＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、室温にて２時間二次抗体反応を行い、１０倍希釈した１０ｘＴＢＳに１％のスキムミルクを溶解させたブロッキングバッファーを用いて１０分間ずつ３回洗浄した後、アルカリホスファターゼ反応による抗原の検出を行った。アルカリホスファターゼ反応は、アルカリホスファターゼの基質としての５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（和光純薬工業株式会社）と、発色剤としてのニトロブルーテトラゾリウム（和光純薬工業株式会社）と、緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ナカライテスク株式会社）、０．１Ｍ  ＮａＣｌ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、０．０５Ｍ  ＭｇＣｌ２（シグマアルドリッチジャパン株式会社））とを用いて、遮光下３０分〜１時間反応させることにより行った。また、抗原の検出結果は、３回の独立した実験における平均値±標準誤差で評価した。【００４２】
（２）実験結果
図１は、上述の（ａ）〜（ｄ）の工程を介して３ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳と２８ケ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳におけるｐ−ＭＢＰとＡＤＡＭ９の存在量を調査した結果を示した図である。図１（ａ）はアルカリホスファターゼ反応によりｐ−ＭＢＰ及びＡＤＡＭ９を検出したＰＶＤＦ膜の画像を示しており、図１（ｂ）は、図１（ａ）の画像から得られた、内部標準のβアクチンにて正規化されたｐ−ＭＢＰ及びＡＤＡＭ９の存在量を示している。【００４３】
Ｔｇ２５７６マウスは、分子質量が１４ｋＤａ、１７．５ｋＤａ、１８．５ｋＤａ及び２１．５ｋＤａの４つのＭＢＰアイソフォームを有している。図１（ｂ）から、３ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳では、これら４つのアイソフォームの全てが発現しているのに対し、２８ケ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳では、高分子質量のアイソフォームほど発現量が少なく、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現は全く認められなかったことがわかる。また、３ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳を用いた実験において検出されたＡＤＡＭ９の存在量に比較して、２８ケ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳を用いた実験において検出されたＡＤＡＭ９の存在量が顕著に少なく、ＡＤＡＭ９がほとんど検出されなかったことが分かる。これらの結果から、Ｔｇ２５７６マウスの脳において、ｐ−ＭＢＰ、特にｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰがＡＤＡＭ９に結合していることがわかった。ＡＤＡＭ９の細胞質ドメインにアダプタータンパク質が結合することにより酵素活性が調節されることが知られていることから、ｐ−ＭＢＰ、特にｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰがＡＤＡＭ９の細胞質ドメインに結合することにより、ＡＤＡＭ９が成熟型に転換してα−セクレターゼ活性を示すようになり、ｓＡＰＰαの産生が促進されると考えられた。【００４４】
（Ｃ）実験２：ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるα−ＧＰＣとヘスペリジン／ナリルチンとの併用効果の確認
胎生１８日のマウスの大脳を０．３％のディスパーゼＩＩと０.０５％のデオキシリボヌクレアーゼ（いずれもＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）との混合溶液（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により希釈）で酵素的に分散し、得られた分散細胞をＤＭＥＭで洗浄した後、解離した細胞を孔径７０μｍのナイロンメッシュに通した。次に、細胞を１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中に懸濁した後、ポリ−Ｌ−リシン被覆培養皿（直径１０ｃｍ）上に一皿当たり２．０×１０７個の細胞密度で播種し、５日間培養した。次に、培養後の細胞を０．２％のトリプシンを含むＰＢＳを用いて剥離し、４℃、１０００回転の条件下で１０分間遠心分離し、沈査を１０ｍＬの無血清培地（ＤＭＥＭに、グルコース（５.６ｍｇ／ｍｌ）、カナマイシン（６０ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０.５μｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（０.０６ｎｇ／ｍｌ）、プトレスシン（１６μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（４０ｎｇ／ｍｌ）、チロキシン（Ｔ４）（４０ｎｇ／ｍｌ）及びトリヨードサイロニン（Ｔ３）（３０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地）に１ｍＬ当たり２．５×１０６個の細胞密度で懸濁し、ＣＯ２インキュベータ中、３７℃で２時間培養し、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を得た。【００４５】
次に、得られたＯＰＣを、上記無血清培地が導入された無被覆培養皿（直径１０ｃｍ）上に１皿当たり２．５×１０６個の細胞密度で播種し、さらにＰＢＳのみ（対照）、ヘスペリジン（Ｈ）を含むＰＢＳ、ナリルチン（Ｎ）を含むＰＢＳ、ヘスペリジンとナリルチンとを含むＰＢＳ、α−ＧＰＣ（Ｇ）を含むＰＢＳ、ヘスペリジンとナリルチンとα−ＧＰＣとを含むＰＢＳのいずれかを添加して、４８時間培養した。培地中のヘスペリジン、ナリルチン、及びα−ＧＰＣの量はそれぞれの最終濃度が１０μＭになるように調整された。【００４６】
図２に、４８時間後の細胞の状態を撮影した倍率４００倍の位相差顕微鏡写真を示す。１０μＭのヘスペリジン、１０μＭのナリルチン、或いは１０μＭのα−ＧＰＣを含む培地で培養した場合には、対照と比較すると、細胞数が増加すると共に矢印で示した突起が発生し、ＯＰＣの増殖・分化が進行したことが分かる。そして、ヘスペリジンとナリルチンとを各１０μＭで含む培地を用いて培養した場合には、ＯＰＣの増殖・分化が亢進されていた。この効果は、第２の有効成分（ヘスペリジン／ナリルチン）が合計で２０μＭの濃度で含まれた培地を用いたためであると考えられる。そして、ヘスペリジンとナリルチンとα−ＧＰＣとを各１０μＭで含む培地を用いて培養した場合には、矢印で示したように、ＯＰＣの分化・成熟が著しく亢進されていた。このことは、ＥＮＰＰ６がヘスペリジン及び／又はナリルチンにより活性化され、α−ＧＰＣが活性化されたＥＮＰＰ６により迅速にコリンに代謝されてオリゴデンドロサイトの分化・成熟に利用されたことを意味している。【００４７】
併用効果をさらに確認するために、上記無血清培地が導入された無被覆培養皿（直径１０ｃｍ）上に上記ＯＰＣを１皿当たり２．５×１０６個の細胞密度で播種し、さらにＰＢＳのみ（対照）、α−ＧＰＣを含むＰＢＳ或いはα−ＧＰＣとヘスペリジンとを含むＰＢＳを添加して、４８時間培養した。培地中のヘスペリジン及びα−ＧＰＣの量はそれぞれの最終濃度が０．１ｍＭ或いは１ｍＭになるように調整された。次いで、オリゴデンドロサイトの分化マーカーであるＯ１抗体を用いて免疫染色し、顕微鏡下で一視野中の全細胞の数とＯ１陽性オリゴデンドロサイトの数とをそれぞれカウントして、全細胞の数に対するＯ１陽性オリゴデンドロサイトの数の割合を算出した。その結果を図３に示す。【００４８】
図３から把握されるように、α−ＧＰＣを０．１ｍＭで含む培地を用いて培養した場合には、対照と比較しても、Ｏ１陽性オリゴデンドロサイトはほとんど増加していないが、培地にヘスペリジンを０．１ｍＭ添加することにより、Ｏ１陽性オリゴデンドロサイトの割合が急激に増加し、α−ＧＰＣを１ｍＭで含む培地を用いて培養した場合の増加量の半分を超えるまでに増加した。α−ＧＰＣを１ｍＭで含む培地にさらにヘスペリジンを１ｍＭ添加した場合にも、Ｏ１陽性オリゴデンドロサイトの顕著な増加が認められた。したがって、α−ＧＰＣとヘスペリジン及び／又はナリルチンとの併用により、迅速にオリゴデンドロサイトまで分化・成熟させることができることが確認された。これらの結果から、α−ＧＰＣとヘスペリジン及び／又はナリルチンとの併用が再ミエリン化を迅速に進行させて脱髄を回復させることが期待される。【００４９】
（Ｄ）実験３：α−ＧＰＣ／陳皮の投与とｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰ／成熟型ＡＤＡＭ９／ｓＡＰＰα／ＣＴＦ−α／ＢＡＳＥ１／Ａβオリゴマーの発現量との関係
上述した実験１の結果から、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量が増加すれば、ＡＤＡＭ９のα−セクレターゼ活性が促進され、したがって非Ａβ産生経路におけるｓＡＰＰαの産生が亢進され、Ａβ産生経路におけるＡβの産生が抑制されて有毒な可溶性Ａβオリゴマーの産生が抑制されると期待されるため、以下の実験により、α−ＧＰＣ／陳皮の投与とｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰ／成熟型ＡＤＡＭ９／ｓＡＰＰα／ＣＴＦ−α／ＢＡＳＥ１／Ａβオリゴマーの発現量との関係を調査した。【００５０】
（１）実験手順
（ａａ）α−ＧＰＣ／陳皮の投与
陳皮乾燥エキス（１ｇ当たりヘスペリジンを２０．８ｍｇ、ナリルチンを３．３８ｍｇ含有：株式会社ウチダ和漢薬）と、α−ＧＰＣ８５％含有粉末（ニチユＧＰＣ８５Ｒ：日油株式会社）とを使用し、α−ＧＰＣを０．０１７ｗ／ｖ％の濃度で且つ陳皮乾燥エキスを０．５ｗ／ｖ％の濃度（ヘスペリジン；０．０１０４ｗ／ｖ％：ナリルチン０．００１７ｗ／ｖ％）で蒸留水に溶解したＧＨＮ飲料（実施例）、陳皮乾燥エキスを０．５ｗ／ｖ％の濃度で蒸留水に溶解したＨＮ飲料（比較例１）、及び、α−ＧＰＣを０．０１７ｗ／ｖ％の濃度で蒸留水に溶解したＧ飲料（比較例２）を準備した。２６ヶ月齢の老齢Ｔｇ２５７６マウス（平均体重３０ｇ）を４つの群に分け、それぞれの群に、ＧＨＮ飲料、ＨＮ飲料、Ｇ飲料或いは対照としての水を、２か月間自由飲水により与えた(平均飲水量４ｍＬ／ｄａｙ)。この投与実験におけるα−ＧＰＣ、ヘスペリジン及びナリルチンの投与量を、ヒトとマウスの間の種差を換算する係数「１０」（“Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４，１０８−１２０”参照）を用いてヒト５０ｋｇ成人の投与量に換算すると、α−ＧＰＣが１１３．３ｍｇ／ｄａｙ、ヘスペリジンが６９．３ｍｇ／ｄａｙ、及びナリルチンが１１．３ｍｇ／ｄａｙの投与量になる。２か月自由飲水後に、ＧＨＮ飲料を投与したマウス、ＨＮ飲料を投与したマウス、Ｇ飲料を投与したマウス、及び対照マウスをイソフルラン（和光純薬工業株式会社）を用いた吸引麻酔下で安楽死させ、直ちに開頭した後、全脳を摘出し、使用時まで−８０℃で保存した。【００５１】
（ｂｂ）界面活性剤による脳の可溶化
保存しておいたＧＨＮ飲料投与マウス、ＨＮ飲料投与マウス、Ｇ飲料投与マウス、及び対照マウスの脳を用いて、実験１の（ａ）工程にて示した手順と同じ手順で脳ホモジネート懸濁液の調製及び遠心分離を行い、遠心分離後、上澄み液を可溶性画分、沈渣を不溶性画分として分離し、−８０℃で保存した。【００５２】
（ｃｃ）電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記（ｂｂ）工程にて得られた可溶性画分を４ｘＳＤＳサンプルバッファー（０．０６２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）（和光純薬工業株式会社）、１０％  グリセロール（和光純薬工業株式会社）、２％  ＳＤＳ（和光純薬工業株式会社）、５％  ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク株式会社）、０．００２％  ブロモフェノールブルー（シグマアルドリッチジャパン株式会社））で４倍に希釈し、１００℃の恒温槽中に１０分間放置して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを得た。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルを用いて、実験１の（ｃ）工程にて示した手順と同じ手順でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【００５３】
（ｄｄ）イムノブロッティング
上記（ｃｃ）工程にて得られた電気泳動後のゲルを用いて、実験１の（ｄ）工程にて示した手順と同じ手順で、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、続く一次抗体反応前のブロッキング処理を行った。次に、ブロッキング処理後のＰＶＤＦ膜の一次抗体反応を４℃で一晩行った。用いた抗体は、ＡＰＰのＮ末端を認識するマウスモノクロナール抗体２２Ｃ１１（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、１／６００希釈）、Ａβ１−１６を認識するマウスモノクロナール抗体６Ｅ１０（Ｃｏｖａｎｃｅ社、１／１０００希釈）、Ａβ１７−２４を認識するマウスモノクロナール抗体４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ社、１／５００希釈）、ＢＡＳＥ１のＣ末端を認識する抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、１／５００希釈）、ＡＤＡＭ９のメタロペプチダーゼドメインを認識する抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１／５００希釈）、内部標準のβアクチンに対するマウスモノクロナール抗体（シグマアルドリッチジャパン株式会社、１／１０００希釈）、及び、抗ｐ−ＭＢＰモノクロナール抗体ＰＣ１２（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、各１／５００希釈）である。各抗体の希釈には、１０倍希釈した１０ｘＴＢＳに５％のスキムミルクを溶解させたブロッキングバッファーを用いた。一次抗体反応後、１０倍希釈した１０ｘＴＢＳに１％のスキムミルクを溶解させたブロッキングバッファーを用いて１０分間ずつ３回洗浄した。続いてブロッキングバッファーで８００倍に希釈したＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、室温にて２時間二次抗体反応を行い、１０倍希釈した１０ｘＴＢＳに１％のスキムミルクを溶解させたブロッキングバッファーを用いて１０分間ずつ３回洗浄した後、実験１の（ｄ）工程で示した手順と同じ手順でアルカリホスファターゼ反応による抗原の検出を行った。抗原の検出結果は、３回の独立した実験における平均値±標準誤差で評価した。【００５４】
（２）実験結果
図４は、内部標準のβアクチンにて正規化されたｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの存在量を、対照マウスの脳における存在量を１とした存在量比の形式で示した図である。図４から把握されるように、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量が、Ｇ飲料（比較例２）の投与によって約６倍に増加し、ＨＮ飲料（比較例１）の投与によって約１０倍に増加するものの、ＧＨＮ飲料（実施例）の投与による増加量は顕著であり約２５倍であった。すなわち、ＧＨＮ飲料の投与により増加した発現量は、ＨＮ飲料の投与により増加した発現量と、Ｇ飲料の投与により増加した発現量とを加算した量と比較しても顕著であり、α−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの相乗的作用が認められた。【００５５】
図５は、内部標準のβアクチンにて正規化された成熟型ＡＤＡＭ９の存在量を、対照マウスの脳における存在量を１とした存在量比の形式で示した図である。実験１の結果から理解されるように、ｐ−ＭＢＰ、特にｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰがＡＤＡＭ９の細胞質ドメインに結合すると、ＡＤＡＭ９が成熟型になり、α−セクレターゼ活性を示すようになる。そして、成熟型ＡＤＡＭ９の発現量が、Ｇ飲料（比較例２）の投与によって約１．４５倍に増加し、ＨＮ飲料（比較例１）の投与によって約１．６０倍に増加し、ＧＨＮ飲料（実施例）の投与によって約１．７３倍に増加した。これば、図４から把握されるように、α−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの相乗的作用により、ｐ−ＭＢＰ、特にｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰが顕著に増加したことを反映した結果である。図６は、内部標準のβアクチンにて正規化されたｓＡＰＰαの存在量を、対照マウスの脳における存在量を１とした存在量比の形式で示した図であり、図７は、内部標準のβアクチンにて正規化されたＣＴＦ−αの存在量を、対照マウスの脳における存在量を１とした存在量比の形式で示した図である。ｓＡＰＰα及びＣＴＦ−αは、非Ａβ産生経路において、α−セクレターゼがＡＰＰを切断することにより発現する。図６から把握されるように、ｓＡＰＰαの発現量は、Ｇ飲料（比較例２）の投与によって約５．２倍に増加し、ＨＮ飲料（比較例１）の投与によって約６．４倍に増加するが、ＧＨＮ飲料（実施例）の投与によって約１１．４倍にも増加し、図７から把握されるように、ＣＴＦ−αの発現量は、Ｇ飲料（比較例２）の投与によって約４．６倍に増加し、ＨＮ飲料（比較例１）の投与によって約６．０倍に増加するが、ＧＨＮ飲料（実施例）の投与によって約８．４倍にも増加した。そして、図６に示したｓＡＰＰαの発現量は、図４に示したｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量と、良く相関しており、α−セクレターゼ活性の促進に関し、α−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの相乗的作用が認められた。図５に示したα−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの併用による成熟型ＡＤＡＭ９の発現量の増加は、図６に示したα−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの併用によるｓＡＰＰαの発現量の増加或いは図７に示したα−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの併用によるＣＴＦ−αの発現量の増加と比較すると少ない。α−セクレターゼ活性を示すＡＤＡＭｓはＡＤＡＭ９以外にも多く存在(例えば、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７)するが、これらのＡＤＡＭｓ全体の発現量が顕著に増加したため、ｓＡＰＰα及びＣＴＦ−αの発現量が顕著に増加したと考えられる。【００５６】
図８は、内部標準のβアクチンにて正規化されたβセクレターゼの１種であるＢＡＳＥ１の存在量を、対照マウスの脳における存在量を１とした存在量比の形式で示した図であり、図９は、内部標準のβアクチンにて正規化されたＡβ６量体（「６−ｍｅｒ」と表す。）の存在量を、対照マウスの脳における存在量を１とした存在量比の形式で示した図である。６−ｍｅｒはＡβ凝集開始のコアペプチドであり、認知機能障害との関連性が強く示唆されている可溶性Ａβオリゴマーの一種であり、６−ｍｅｒをコアにして重合がさらに進行すると毒性の高い可溶性１２−ｍｅｒや老人斑が生成する。図８から把握されるように、ＢＡＳＥ１の発現量は、Ｇ飲料（比較例２）の投与によって約０．９６倍に減少し、ＨＮ飲料（比較例１）の投与によって約０．８７倍に減少するだけであるが、ＧＨＮ飲料（実施例）の投与によって約０．５３倍にまで減少し、図９から把握されるように、６−ｍｅｒの発現量は、Ｇ飲料（比較例２）の投与によって約０．７３倍に減少し、ＨＮ飲料（比較例１）の投与によって約０．８２倍に減少するたけであるが、ＧＨＮ飲料（実施例）の投与によって約０．３４倍にまで減少しており、α−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの相乗的作用が認められた。特に、α−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとの併用によるＢＡＳＥ１の減少効果が顕著であるが、これは脱髄の回復を反映したものであると考えられる。すなわち、ＢＡＳＥ１はニューロンに特異的な酵素ではなくむしろアストロサイトに多く発現しており、アルツハイマー病患者の脳では反応性アストロサイトにＢＡＳＥ１の発現が認められることが分かっているが、この反応性アストロサイトは脳がダメージを受けたときに発現する。以下に示すが、α−ＧＰＣとヘスペリジン及び／又はナリルチンとの相乗効果により、迅速に再ミエリン化が進行して脱髄が回復するため、反応性アストロサイトの発現が抑制され、これに伴いＢＡＳＥ１の発現量が顕著に減少し、さらには可溶性Ａβオリゴマーの発現量も顕著に減少したと考えられる。【００５７】
以上の結果より、本発明のα−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとを含む組成物によると、これらの有効成分が相乗的に作用して、ｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰの発現量が顕著に増加し、一方では、この顕著に増加したｐ−２１．５ｋＤａＭＢＰとの結合によりＡＤＡＭ９のα−セクレターゼ活性が促進され、ｓＡＰＰα及びＣＴＦ−αの産生が顕著に促進され、他方では、ＢＡＳＥ１の発現が抑制され、Ａβの産生経路、ひいては認知機能障害との関連性が強く示唆されている可溶性Ａβオリゴマーの産生が顕著に抑制されることがわかった。したがって、本発明の組成物はアルツハイマー病の治療及び／又は予防のために極めて有効である。【００５８】
（Ｅ）実験４：α−ＧＰＣ／陳皮の投与と再ミエリン化との関係
以下の実験により、α−ＧＰＣ及び陳皮の投与による再ミエリン化への影響を調査した。【００５９】
（１）実験手順
実験２の（ａａ）工程において保存しておいたＧＨＮ飲料投与マウス、ＨＮ飲料投与マウス、Ｇ飲料投与マウス、及び対照マウスの大脳を電子顕微鏡により観察した。各マウスの大脳を２％グルタルアルデヒドで前固定し、さらに１％ＯｓＯ４で後固定した。標本をエタノール中で脱水した後、エポキシ樹脂（商品名；Ｑｕｅｔｏｌ  ８１２：日新ＥＮ株式会社）に埋め込み、２％酢酸ウラニル及び鉛溶液で染色した極薄片を得、これを電子顕微鏡により倍率１９０００倍で観察した。Ｇ−レシオ（軸索及び軸索周囲のミエリン鞘の直径に対する軸索の直径の割合：図１１参照）の測定のためには、群毎に少なくとも３体のマウスを使用して各マウス当たり８〜１０枚の電子顕微鏡写真を撮影し、少なくとも９０個の軸索に関してＧ−レシオを測定し、平均値と標準偏差とを算出した。【００６０】
（２）実験結果
図１０は、各マウスの脳の電子顕微鏡写真を示している。ｐ−ＭＢＰは、軸索の周囲のミエリン膜を重層化し、ミエリンの圧縮を維持する作用を有するが、図１０より、対照マウスの脳では、矢印で示したミエリン膜の圧縮が不十分であり、脱髄が進行しているのに対し、Ｇ飲料（比較例２）の投与及びＨＮ飲料（比較例１）の投与によって再ミエリン化が進行して脱髄状態が回復する傾向が認められ、ＧＨＮ飲料（実施例）の投与によって再ミエリン化がさらに進行して脱髄の回復が顕著に認められることが分かる。図１１には、電子顕微鏡写真から求めたＧ−レシオの値が示されている。軸索の周囲にミエリン膜が重層化して圧縮されると、Ｇ−レシオの値は小さくなるため、Ｇ−レシオの値の減少は脱髄回復の尺度となる。図１１から把握されるように、対照マウスの大脳におけるＧ−レシオの値は約０．８３であり、Ｇ飲料投与マウス及びＨＮ飲料投与マウスの大脳におけるＧ−レシオの値は約０．７４であり、非特許文献１における人参養栄湯の投与により得られたＧ−レシオの値と類似しているが、ＧＨＮ飲料投与マウスの大脳におけるＧ−レシオの値は、さらに減少し、約０．６９にまで減少している。この値はもはや正常マウスの大脳におけるＧ−レシオの値と同等であり、驚くべき結果が得られた。このことが、上述したようにＢＡＳＥ１の顕著な減少へと導き、ひいては可溶性Ａβオリゴマーの顕著な減少へと導いたと考えられる。【００６１】
以上の結果より、本発明のα−ＧＰＣとヘスペリジン及びナリルチンとを含む組成物によると、これらの有効成分が相乗的に作用して、再ミエリン化が顕著に亢進されて、脱髄の回復が認められることがわかった。したがって、本発明の組成物はアルツハイマー病の治療及び／又は予防のために極めて有効である。【００６２】
（Ｆ）認知機能改善効果の確認
一日の投与量として、ヘスペリジンとナリルチンとを合計で７０ｍｇ、α−ＧＰＣを４０ｍｇ含む錠剤を製造し、被験者に２．５〜４ヶ月投与し、長谷川式認知症スケール（ＨＤＳ−Ｒ）の点数を評価した。ＨＤＳ−Ｒは３０点満点で評価され、２０点以下であると認知症が疑われ、認知症であることが確定している場合には、２０点以下で軽度、１１〜１９点で中等度、１０点以下で高度であると判定される尺度である。以下に、その結果を示す。
【表１】
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【００６３】
表１から把握されるように、ばらつきはあるものの、２．５〜４ヶ月の短期間の間に、１〜８点の点数の上昇が確認された。このような短期間でも改善効果が表れたのは、本発明の組成物が、再ミエリン化を促進し、α−セクレターゼの活性を促進し、且つβ−セクレターゼの発現を抑制し、総合的に作用するためであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明により、安全且つ迅速なアルツハイマー病の治療及び／又は予防が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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