(57)【要約】現在、有効な治療法が普及していない非アルコール性脂肪性肝疾患 (ＮＡＦＬＤ)のうち、脂肪肝（ＮＡＦＬ）および初期の非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を改善できる予防・治療薬を提供することにある。本発明によれば、第一にアルデヒドオキシダーゼ阻害剤を有効成分とすること、第二にアルデヒドオキシダーゼ阻害剤及びニコチン酸及び／又はニコチン酸誘導体を有効成分とすることにより、非アルコール性脂肪性肝疾患、特にnicotinamide N1-methyl transferase (ＮＮＭＴ)とアルデヒドオキシダーゼが機能する代謝経路に起因して発症する非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を有効に予防・治療改善することができる（図３）。
2018198842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒドオキシダーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
【請求項２】
アルデヒドオキシダーゼ阻害剤が、塩酸ヒドララジン及びその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
【請求項３】
前記有効成分として、ニコチン酸及び／又はニコチン酸誘導体を併用することを特徴とする請求項１乃至２に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
【請求項４】
ニコチン酸誘導体がニコチン酸アミドまたはN1-メチルニコチン酸アミドであることを特徴とする請求項１乃至３に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
【請求項５】
非アルコール性脂肪性肝疾患が、nicotinamide N1-methyl transferase (ＮＮＭＴ)とアルデヒドオキシダーゼが機能する代謝経路に起因して発症する非アルコール性脂肪肝炎であることを特徴とする請求項１乃至４に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、現在、有効な治療法が普及していない非アルコール性脂肪肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis: NASH)に対し、新しい理論に基づいた有効な治療剤を提供するものである。
さらに詳細には、アルデヒドオキシダーゼ阻害剤若しくはアルデヒドオキシダーゼ阻害剤とニコチン酸及び／又はニコチン酸誘導体の組成物を有効成分とすることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎用治療剤を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、飲酒を原因としない非アルコール性脂肪性肝疾患
(nonalcoholic fatty liver disease: 以下、「NAFLD」と略することがある。) が増加しており、日本における患者数は１０００万人以上とも推定されている (例えば、Eguchi et al., 2012，J Gastroenterol., 47, 586-595; Hashimoto and Tokushige, 2011，J Gastroenterol., 46, 63-69; Jimba et al., 2005，Diabet Med., 22, 1141-1145)。【０００３】
NAFLDは肝臓への中性脂肪 (triglyceride:以下、「TG」と略すことがある。) 蓄積が起点となる病態であるが、その多くは肥満、脂質異常症、糖尿病といった生活習慣病が基盤となって発症することから、メタボリックシンドロームの肝臓での一表現型と称されることもある (例えば、Ekstedt et al., 2006，Hepatology., 44, 865-873; Lonardo et al., 2013，Curr Pharm Des., 19, 5177-5192)。 【０００４】
また、NAFLDは単純性の非アルコール性脂肪肝 (nonalcoholic fatty liver: 以下、「NAFL」と略すことがある) と、肝硬変や肝がんに進展する非アルコール性脂肪肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis:以下、「NASH」と略すことがあることがある。) の大きく２つに分類される。このうち、より重篤な疾患であるNASH患者の割合はNAFLD全体の１〜２割である (例えば、Williams et al., 2011，Gastroenterology., 140, 124-131)。 【０００５】
従来、NAFLに病的意義はないとされてきたが、近年では病態が改善されないまま放置しておくと、一定の割合でNASHを発症すると考えられている (例えば、Vernon et al., 2011，Aliment Pharmacol Ther., 34, 274-285)。【０００６】
したがって、NAFLD は必ずしも予後良好の疾患であるとは言えず、場合によっては薬物療法を含めた適切な治療が施される必要がある。【０００７】
NAFLからNASHへの成因論としては、これまでDayらが提唱した2 hit theory (例えば、Day and James, 1998，Gastroenterology., 114, 842-845) が広く受け入れられてきた。すなわち、生活習慣病の主因とされる肥満、過食などが1st hitとなってNAFLが形成され、引き続き炎症惹起に関わる酸化ストレスや小胞体ストレス、ミトコンドリア機能異常などの二次的ストレス (2nd hit) が加わることによってNASHに至るという考え方である (図１)。【０００８】
さらに、最近の新たな考え方として、1st および2nd hitの各要因が並行して肝臓に作用し、肝臓の脂肪化と炎症が多重並行的に進むことでNASHを発症するというmultiple parallel hits hypothesis が提唱されている (例えば、Tilg et al., 2010，Hepatology., 52, 1836-1846)。【０００９】
また、肥満などを原因とした、腸内細菌叢の変化に伴う自然免疫系の賦活や腸管膜透過性の亢進がNASH発症に寄与している、という説も注目されてきている (例えば、Amir and Czaja, 2011; Imajo et al., 2012，Expert Rev Gastroenterol Hepatol., 5, 159-166)。【００１０】
肝臓に蓄積するTGの量は、増加要因 (肝臓への脂肪酸流入、肝臓における脂肪酸合成)と減少要因 (肝臓における脂肪酸代謝、肝臓からの脂肪酸排出) のバランスによって規定され、そのバランスが増加要因側に大きく傾いた時に脂肪肝が形成されると考えられる (例えば、Antony and Landau, 1968，J Lipid Res., 9, 267-269; Donnelly et al., 2005，J Clin Invest., 115, 1343-1351; Wetterau and Zilversmit, 1984，J Biol Chem., 259, 10863-10866)。【００１１】
NAFLD病態下では、インスリン抵抗性が原因となって脂肪組織から肝臓への脂肪酸の供給量が上昇し、且つ肝細胞における脂肪酸のde novo合成が亢進した状態となるため、肝臓内で過剰に増加した脂肪酸を処理し切れない状況にあると考えられる (例えば、Gastadeli et al., 2007，Gastroenterology., 133, 496-507)。【００１２】
通常、肝臓における脂肪酸の代謝にはミトコンドリアにおけるβ酸化が主に機能しており、それ以外にも、ペルオキシソームにおけるβ酸化、ミクロゾームにおけるω酸化が寄与している (例えば、Lu and Coon, 1968，J Biol Chem., 243, 1331-1332)。【００１３】
NAFLD 或いは NASH患者では、ミトコンドリア障害により脂肪酸の代謝能（β酸化）が低下し (例えば、Caldwell et al., 1999，J Hepatol., 31, 430-434; Sanyal et al., 2001，Gastroenterology., 120, 1183-1192)、また、脂肪酸をvery low-density lipoprotein (VLDL) として肝臓外に排出する機能が抑制されるとの報告があることから (例えば、Fujita et al., 2009，Hepatology., 50, 772-780)、こうした脂肪酸収支のインバランスが肝臓内TG蓄積の主因になっているものと予想される (図２)。【００１４】
肝臓内のTG蓄積を主な特徴とする単純性脂肪肝モデル動物を用いた脂肪肝研究の成果として、既に、発明者らの共同研究者である後藤らによって、オロチン酸含有高ショ糖食誘発の脂肪肝モデルラットにペルオキシソーム増生剤のdehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) やシトクロムP450 (CYP) 誘導剤の phenobarbital (PB) を一定期間投与すると、脂肪肝の肝臓から脂肪滴が顕著に減少することが明らかにされている (例えば、Goto et al., 1997, J Vet Med Sci., 60, 513-517；Goto et al., 1998，J Basic Microbiol., 33, 59-72)。しかし、その脂肪肝改善メカニズムの詳細に関しては、不明な点が多く残されている。【００１５】
そこで、本発明者は、これらの事情に鑑み、特に非アルコール性脂肪性肝疾患 (nonalcoholic fatty liver disease: NAFLD) の予防・治療、ひいては非アルコール性脂肪肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis: NASH)の治療に有効な薬剤を開発することを目的として、脂肪肝を形成した肝臓内の脂肪酸動態、中でも脂肪酸代謝過程に焦点を当てた研究を重ねてきた。【００１６】
その結果、ニコチンアミド(ビタミンB3)とメチル化ニコチンアミドの代謝経路おいて、ニコチンアミドのメチル化酵素であるnicotinamide N1-methyl transferase (NNMT) とメチル化アミドの代謝酵素であるAldehyde Oxidaseの作用機序の一端が、脂肪肝病態の予防・改善に関わっているという新たな知見を得て、本発明を完成させたものである。【００１７】
すなわち、本発明によれば、第一にアルデヒドオキシダーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎用治療剤が提供される。【００１８】
また、本発明によれば、第二にアルデヒドオキシダーゼ阻害剤及びニコチン酸及び／又はニコチン酸誘導体を有効成分とすることを特徴とする非アルコール性脂肪肝炎用治療剤が提供される。【００１９】
本発明で構成されるアルデヒドオキシダーゼ阻害剤については、その化合物は多く知られている（例えば、Obach, R.S., et al., 2004，J Clin Pharmacol., 44, 7-19）。しかしながら、本発明のような非アルコール性脂肪肝炎用治療剤として、特に、ニコチンアミドの代謝経路におけるドラッグリポジショニングによるNASH治療剤としての着想と治療理論はこれまでに知られていない。【００２０】
一方、本発明の構成におけるニコチン酸及びニコチン酸誘導体については医薬、化粧品用素材として公知であり、種々の用途に使用されているところ、肝疾患の治療剤としても公知である。【００２１】
例えば、特許文献１によれば、特定の医薬組成物において、ニコチン酸誘導体を非アルコール性脂肪肝疾患の治療のために含むことが開示されている。しかしながら、本発明の特定の作用・構成を開示・示唆する記載はない。また、当該特許文献には、異常脂質血症の治療に使用されてきたニコチン酸の副作用と解決の技術思想が開示されているが、本発明の作用メカニズムについては全く言及・示唆もなく、治療理論を異にする。【００２２】
また、特許文献２によれば、特定の徐放製剤が非アルコール性脂肪性肝疾患に適用できること、及び当該徐放製剤において、活性薬剤としてニコチン酸を使用しうる旨の開示がある。しかしながら、ニコチン酸は単に脂質制御用の薬剤として使用し得る開示にとどまるものであり、本発明の構成を開示・示唆する記載はない。【００２３】
さらに、特許文献３によれば、腸内微生物叢および血中脂質レベルに有益に影響を及ぼすための、ニコチン酸および／またはニコチンアミドおよび／または関連化合物を含む、新規な医薬組成物が開示されているところ、治療対象の一つに非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等が挙げられている。配合には高用量を範囲外とすること及び活性本体をニコチン酸又はニコチン酸アミドとすることに加え、いわゆるプロドラッグ的発想の記載がある。ニコチン酸とニコチンアミド等は単独で、あるいはそれらの可変用量の組合せもしくは固定用量の組合せでの治療に供することが開示されている他、他薬剤（アトルバスタチン、セリバスタチン等）との可変用量の組合せにおいて所望の効果を得る旨の記載がある。しかしながら、本発明の作用メカニズムについては全く言及・示唆もなく、治療理論・着想を全く異にしている。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】特表２００９−５２５９６１号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２１３３２号公報
【特許文献３】特表２０１７−５００３１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の目的は、上記の従来からの問題点に鑑みて、現在、有効な治療法が普及していない非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD)のうち、脂肪肝（NAFL）および初期の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）を改善できる予防・治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、先ず、次の点に着目し、これらの着眼点を中心に鋭意検討を重ねた。
（１）非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）のうち、脂肪肝（NAFL）および初期の非アルコール性脂肪肝炎（NASH）を改善できる可能性のある物質として、サーチュインタンパク質の安定化作用のあるN1-methylnicotinamide (ＭＮＡ)が知られていること（Hong et al., 2015，Nat Med., 21, 887-894）。
（２）ＭＮＡは、肝臓のサイトソール画分に局在するＮＮＭＴ（ビタミンB3のメチル化代謝酵素である、nicotinamide N-methyltransferase ） によって、ビタミンB3の1種であるニコチンアミドのピリジン環のＮ原子がメチル化反応を受けることにより生成すること。
（３）ＭＮＡは代謝されやすく、その効果を得るために高用量を用いる必要があること。
（４）ＭＮＡの主代謝酵素は、アルデヒドオキシダーゼ (aldehyde oxidase；AO)であること。
（５）ＭＮＡのアルデヒドオキシダーゼによる代謝を抑制しＭＮＡの肝臓内濃度を維持することによって、脂肪肝改善の作用を引き出すことができる可能性があること（仮説；図３）【００２７】
特に本発明に係る一連の研究では、NAFLDの予防・治療の糸口を掴むことを目的として、脂肪肝を形成した肝臓内の脂肪酸動態、中でも脂肪酸代謝過程に焦点を当てた以下の検討を行った。【００２８】
まず、単純性脂肪肝に対する DHEASおよびPB の脂肪軽減作用を再検証し、単純性脂肪肝の改善機序を探った。この検討を通じ、ペルオキシソーム増生剤やCYP誘導剤（図４）の投与により脂肪肝を形成した肝臓内の脂肪酸代謝反応を亢進させることで、脂肪肝改善に繋がる可能性が示唆された (Takeuchi et al., 2015，J Toxicol Sci., 40, 181-191)。【００２９】
次に、肝臓に炎症と線維化を伴う、より重篤な脂肪肝モデルであるコリン欠乏アミノ酸置換飼料 (CDAA) 食誘発の脂肪肝モデルラットを用いて、DHEASおよび PBの脂肪肝改善作用を検証した。【００３０】
さらに引き続き、in vitro で脂肪軽減作用を評価する試験系として、オレイン酸添加により脂肪化を誘発させたHepaRG細胞を用いて、ヒト肝細胞におけるDHEASおよび PBの脂肪軽減作用を確認し、上記のin vivo 脂肪肝モデル動物試験で観察された脂肪肝改善作用と関連付けて考察した。【００３１】
最後に、脂肪肝改善の分子メカニズムの一端を解明すべく、単純性脂肪肝モデルラットを用いて、ニコチンアミド (ビタミンB3) のメチル化酵素であるnicotinamide N1-methyl transferase (ＮＮＭＴ) に着目した研究を行ったところ、脂肪肝病態の予防・改善に関わる分子メカニズムの一端について、新たな知見を得ることができた。【００３２】
発明者らの研究によれば、肝臓におけるニコチンアミドおよびメチルニコチンアミド（ＭＮＡ）の代謝経路（図３）において、ＭＮＡのアルデヒドオキシダーゼによる代謝を抑制し、ＭＮＡの肝臓内濃度を維持することによって、脂肪肝改善の作用が得られることが明かとなった。【００３３】
また、脂肪肝改善・治療効果としては、アルデヒドオキシダーゼ阻害剤単味成分よりも、さらに、ニコチン酸およびニコチン誘導体を併用することによって低用量での治療効果が得られることが明らかとなった。本発明は、これらの検討経緯を踏まえて完成するに至ったものである。【００３４】
すなわち、本発明によれば、以下の（１）乃至（５）に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤が提供される。【００３５】
（１）アルデヒドオキシダーゼ阻害剤を有効成分とすることを特徴とする非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
（２）アルデヒドオキシダーゼ阻害剤が、塩酸ヒドララジン及びその誘導体であることを特徴とする（１）に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
（３）前記有効成分として、ニコチン酸及び／又はニコチン酸誘導体を併用することを特徴とする（１）乃至（２）に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
（４）ニコチン酸誘導体がニコチン酸アミドまたはN1-メチルニコチン酸アミドであることを特徴とする（１）乃至（３）に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
（５）非アルコール性脂肪性肝疾患が、nicotinamide N1-methyl transferase (ＮＮＭＴ)とアルデヒドオキシダーゼが機能する代謝経路に起因して発症する非アルコール性脂肪肝炎であることを特徴とする（１）乃至（４）に記載の非アルコール性脂肪性肝疾患用治療剤。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、現在、有効な治療法が普及していない非アルコール性脂肪性肝疾患、特にnicotinamide N1-methyl transferase (ＮＮＭＴ)とアルデヒドオキシダーゼが機能する代謝経路に起因して発症する非アルコール性脂肪肝炎に対して有効な予防・治療薬剤が提供されるものである。有効成分として、アルデヒドオキシダーゼ阻害剤もしくはアルデヒドオキシダーゼ阻害剤とニコチンアミド等のニコチン関連物質との併用により、ＭＮＡの代謝経路において、ニコチンアミドからメチル化ニコチンアミドが産生され、尿中排泄される代謝バランスを正常に保ちつつ、脂肪肝改善の作用を奏するものである。また、後者の併用薬剤では、相乗効果が発揮されるため、低用量での適用が可能であり、安全性も高く長期投与による予防・治療効果も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の病態進行。
【図２】脂肪肝の形成機序を模式的に示したものである。
【図３】肝臓におけるニコチンアミド及びメチル化ニコチンアミドの代謝経路（仮説）を示したものである。
【図４】ペルオキシソーム増生剤のDHEAS，CYP誘導剤のPB, phenytoin及びbilobalide等の構造式である。
【図５】ＮＡＦＬモデル動物による脂肪肝改善作用確認試験の群分け。
【図６】肝臓内ＴＧ量測定の結果。
【図７】肝臓内ＭＮＡ，ニコチンアミド濃度の測定結果。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を実施するための具体的な形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下に開示する具体的な形態のみに限定されるものではない。    
【００３９】
本発明では、アルデヒドオキシダーゼ阻害剤もしくはアルデヒドオキシダーゼ阻害剤及びニコチン酸及び／又はニコチン酸誘導体で構成される成分を有効成分として使用することがきる。
【００４０】
アルデヒドオキシダーゼは、主に肝臓に分布するモリブデン含有フラビンタンパクであり、その基質特異性が広く、近年の研究により薬物代謝酵素として重要な役割を担っていることがわかってきている。本発明におけるアルデヒドオキシダーゼ阻害剤としては、ニコチンアミドのメチル化代謝によって生成したメチル化ニコチンアミドが
aldehyde oxidaseによってさらに２種類の代謝物(N1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-pyr), N1-methyl-4-pyridone-3-carboxamide (4-pyr)) に酸化される工程を阻害するものが該当し、具体的には、ラロキシフェン，ペルフェナジン，チオリダジン，メナジオン，トリフロペラジン，アミトリプチリン，エストラジオール，フェロジピン，クロミプラミン，ロラタジン，プロメタジン，クロルプロマジン,エチニルエストラジオール，ノルクロミプラミン，アモジアキン，ノルトリプチリン，マプロチリン，クエチアピン，プロマジン，オンダンセトロン，タモキシフェン，ロキサピン，プロパフェノン，ドンペリドン，シクロベンザプリン，キナクリン，ケトコナゾール，ベラパミル，クロザピン，タクリン，アムロジピン，オランザピン，サルメテロール，ロペラミド，エリスロマイシン，メトクロプラミド，ヒドララジン及びデヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（DHEAS）が例示できる。このうち好適には、塩酸ヒドララジン，ＤＨＥＡＳおよびそれらの誘導体が挙げられ、誘導体としては、塩酸ヒドララジンまたはＤＨＥＡＳを活性本体とするいわゆるプロドラッグを包含するものである。
【００４１】
ＮＡＦＬＤの患者は高血圧の有病率が高く、高血圧はＮＡＦＬＤの独立した危険因子であると考えられているところ (Huh et al., 2015，PLoS One., 10, e0143560; Lopez et al., 2011，Eur J Gastroenterol Hepatol., 23, 1011-1017) 、塩酸ヒドララジン（HYD）は高血圧の治療薬として現在も広く使用されていることから、例えば、服薬時にビタミンB3を同時に処方すれば、高血圧に対する作用と脂肪肝に対する改善作用を同時に見込めるデュアル効果型の製剤適用の可能性も十分に期待し得るものである。
【００４２】
本発明においては、前記アルデヒドオキシダーゼ阻害剤と併用する薬剤として、ニコチン酸又はニコチン酸誘導体の組合せ薬剤による非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の予防・治療が挙げられる。ニコチンアミドとＭＮＡの代謝経路（図３）における作用機序の詳細は明らかでないが、当該アルデヒドオキシダーゼ阻害剤との併用薬剤による相乗効果が本発明において、見いだされている。対象患者の症状により、可変用量も可能であり、特に長期投与による副作用が懸念される場合には、少量の配合で安定な予防・改善効果が期待できるため、非常に有用である。
【００４３】
本発明におけるニコチン酸誘導体としては、ニコチンアミドおよびその関連物質、いわゆるプロドラッグを含むものである。
【００４４】
本発明にける適用の形態は経口、非経口いずれも許容される。経口の形態としては、例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉剤、シロップ剤、液剤などの医薬的に許容し得る形態に製剤化して自由に使用できる。
【００４５】
本発明の非経口の製剤は、医薬品のカテゴリーとして許容しうる形態を含むものであり、その剤型としては、本発明の目的を損なわない範囲であれば特に制約されない。例えば、注射剤、坐剤、クリーム、軟膏、乳剤、リニメント剤、ペースト剤、ローション、乳液、エッセンス、ゲル剤及びトニックなどの形態があげられる。
【００４６】
非経口（経皮）での適用に際して、公知の経皮吸収促進剤の併用は任意であり、使用部位に応じて最適に製剤設計する。  
【００４７】
経口および非経口の製剤設計時の配合基剤（賦形剤）については、施用上許容し得る任意の液状及び固形状の原料を幅広く使用できる。その際、必要に応じて保湿剤、防腐剤、酸化防止剤など種々の汎用の添加剤を加えることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は当該実施例に限定されるものではない。【００４９】
＜試験例１＞ ＨＹＤのアルデヒドオキシダーゼ阻害活性 (IC50) の算出 
１）試験方法
Sprague-Dawley 系雄性ラットの肝臓サイトソール画分 (市販 pooled 試料)、およびヒトの肝臓サイトソール画分 (市販 pooled 試料、同意および倫理委員会承認取得済) を酵素源として N1-methylnicotinamide (MNA) のアルデヒドオキシダーゼによる代謝反応を行い、典型的なアルデヒドオキシダーゼ阻害剤として報告 (Obach, R.S., et al., 2004, J Clin Pharmacol., 44, 7-19) されている下表の化合物を用いて、各々，阻害定数 (IC50) を算出した。
肝臓サイトソール濃度： 2 mg/mL、基質 (MNA) 濃度： 1 μM、阻害剤濃度：0.0001〜100 μM、反応時間： 120 min の条件（線形性確認済）で反応 (n = 3) を行った後、反応液中の MNA 濃度の減衰を既報の方法 (Patel, M., et al., 2013, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 921-922, 87-95) に従って HPLC (Alliance, Waters) で測定した。ラット、ヒトIC50 の解析結果および各阻害剤の臨床血中 Cmaxを表１に示した。【００５０】
２）試験結果と考察
先述した Obach らの報告 (Obach, R.S., et al., 2004, J Clin Pharmacol., 44, 7-19) によると、phthalazine を基質としたアルデヒドオキシダーゼ阻害活性 (ヒト) は、検討した 239 化合物中 raloxifene が最も強いことが示されているが、本検討において基質を MNA とした場合にも、raloxifene のアルデヒドオキシダーゼ阻害活性 (ラット・ヒト) が、検討した 7 化合物の中で最も強い結果となった（表１）。しかしながら、臨床における raloxifene の血中 Cmax （表１）を考慮すると、通常の用法・用量下におけるヒト血中濃度は，MNA 代謝に対する阻害活性を充分に示す濃度に達していない可能性が示唆された。同様に、tamoxifen，clozapine，erythromycin に関しても、臨床血中濃度との比較において、MNA 代謝に対する充分に強い阻害活性は確認されなかった。
一方、hydralazine  (ＨＹＤ) は、ラット・ヒト共に数 μM の IC50 でMNA 代謝反応を阻害し、臨床血中 Cmaxとほぼ同濃度であったことから（表１）、通常の用法・用量でＨＹＤを服薬したときには、アルデヒドオキシダーゼによる MNA の代謝を抑制し、MNA の肝臓中濃度を維持する方向に働く可能性が考えられた。【００５１】
【表１】
2018198842.tif 000003
【００５２】
＜試験例２＞NAFLモデル動物による脂肪肝改善作用の確認
１）試験方法
日本チャールス・リバー(株) から4週齢のSprague-Dawley系雄性ラットを入手し、1週間の検疫期間終了後、層別無作為抽出法により1群3匹の計5群に割り付けた。群構成を図５に示した。
Control群には市販の粉末食 (CRF-1, オリエンタル酵母(株)) を、Fatty liver (FL) 群にはCRF-1粉末食にオロチン酸 (和光純薬工業(株)) とショ糖 (和光純薬工業(株)) を各々 1 および 50 % (w/w) となるように混和した混餌飼料を試験期間の4週間与えた。
「FL + MNA」群、「FL + MNA & Hydralazine (HYD) 」群、「FL + HYD 」群は、試験期間後半の2週間、それぞれMNA (30 mg/kg, SIGMA ALDRICH)、HYD (50 mg/kg, SIGMA ALDRICH) を1日1回単独あるいは併用にて経口投与した。
脂肪肝改善作用の評価については、（ａ）体重、肝重量および摘出肝臓の肉眼的所見、（ｂ）肝臓内ＴＧ量測定、及び（ｃ）肝臓内ＭＮＡ，ニコチンアミド濃度の測定結果に基づき行った。【００５３】
２）試験結果と考察
（ａ）体重、肝重量および摘出肝臓の肉眼的所見
体重 (g) は1週間毎に測定し、試験期間最終日 (剖検日) における最終体重および肝重量から相対肝重量 (%) を算出した。最終体重および肝重量の測定結果を表２に示した。
なお、測定結果については生物統計解析システム (SAS Release 9.3) を用いて一元配置分散分析 (Tukey) を行い、危険率５％水準（P < 0.05）のときに統計的に有意な差があると判断した。【００５４】
【表２】
2018198842.tif 000004
【００５５】
表２のとおり、「Fatty liver」群の動物は、Control群と比較して絶対肝重量および相対肝重量が有意に増加していた。
また，「ＭＮＡ」群、「ＭＮＡ＆ＨＹＤ」 群、「ＨＹＤ」群においても、Control群と比較して相対肝重量が有意に増加していた。【００５６】
摘出肝臓の肉眼的所見において、Control群の肝臓が赤褐色を呈していたのに対し、「Fatty liver」群の肝臓は黄白色に退色していた。また、脂肪肝を誘発させると共にＭＮＡ，ＨＹＤを併用投与した動物では、肝臓の色調がControl群とほぼ同様の赤褐色に戻っていることが確認された。ＭＮＡ，ＨＹＤをそれぞれ単独投与した動物の肝臓においては、「Fatty liver」群との間に明確な違いは認められないものの、赤褐色の色調が回復する傾向にあった。【００５７】
（ｂ）肝臓内ＴＧ量測定
剖検日に、全例の動物についてイソフルラン麻酔下、放血安楽死させた後、肝臓のみを摘出した (最終投与後、約24時間)。既存の方法 (Omura and Sato, 1964a，J Biol Chem., 239, 2379-2385; Omura and Sato, 1964ｂ，J Biol Chem., 239, 2370-2378) に従って、肝臓ホモジネートを調製し、肝臓ホモジネート中に含まれるTG量を測定した結果を図６ に示した (各群 n = 3)。
なお、測定結果については生物統計解析システム (SAS Release 9.3) を用いて一元配置分散分析 (Tukey) を行い、危険率５％水準（P < 0.05）のときに統計的に有意な差があると判断した。【００５８】
肝臓内のＴＧ量は、「Fatty liver」群においてControl群の約５倍まで増加し、「ＭＮＡ＆ＨＹＤ」の併用投与によって「Fatty liver」群の約30%，Control群の約1.5倍のレベルまで低下していることが確認された (図６)。一方で、「ＭＮＡ」単独投与群の肝臓内TG量はFatty liver 群とほぼ同レベルのままで維持されており、「ＨＹＤ」単独投与群では肝臓内ＴＧ量の減少傾向はみられたものの、「Fatty liver」群の約60%，Control群の約3倍のレベルに留まった (図６)。【００５９】
（ｃ）肝臓内ＭＮＡ，ニコチンアミド濃度の測定
肝臓ホモジネート試料中のＭＮＡ，ニコチンアミド濃度を、前項「肝臓内ＴＧ量測定」と同じ方法で、HPLCにより測定した。肝臓重量当りのＭＮＡ，ニコチンアミド濃度の測定結果を、図７に示した。
なお、測定結果については生物統計解析システム (SAS Release 9.3) を用いて一元配置分散分析 (Tukey) を行い、危険率５％水準（P < 0.05）のときに統計的に有意な差があると判断した。【００６０】
肝臓内のＭＮＡ濃度は、「ＭＮＡ＆ＨＹＤ」併用投与群においてのみ、「Fatty liver」群と比較して有意な上昇 (約1.6倍) を示した (図７)。また肝臓内ニコチンアミド濃度は、「Fatty liver」群においてControl群の約60% まで低下しており、ＭＮＡ，ＨＹＤの単独あるいは併用投与群においても「Fatty liver」群と同様に、Control群の約50乃至70% まで低下した値を示した (図７)。【００６１】
ＭＮＡのaldehyde oxidaseによる代謝を抑制しＭＮＡの肝臓内濃度を維持することによって、脂肪肝改善の作用を引き出すことができるとの作業仮説を立て、試験を重ねてきた。その過程において、特に高血圧治療薬として公知であり、aldehyde oxidaseの強力な阻害剤として知られている塩酸ヒドララジン（ＨＹＤ）を選択し、これをＮＡＦＬモデルラットに経口投与することで、その検証を試みた。その結果、ＨＹＤ単独投与で肝臓内ＴＧに低下傾向がみられ、また、ＭＮＡ単独投与後の肝臓内ＴＧは「Fatty liver」群とほぼ同レベルに維持されたままであったのに対し、「ＭＮＡ  ＆  ＨＹＤ」の併用群で顕著な肝臓内ＴＧの低下が観察されたことから (図６)、ＭＮＡ (内因性および投与液由来) の代謝抑制による肝臓内ＭＮＡ濃度の維持が脂肪肝改善作用に結び付くものと思われる。
【図１】
2018198842.tif 000005
【図２】
2018198842.tif 000006
【図３】
2018198842.tif 000007
【図４】
2018198842.tif 000008
【図５】
2018198842.tif 000009
【図６】
2018198842.tif 000010
【図７】
2018198842.tif 000011
【国際調査報告】
2018198842.tif 000012
2018198842.tif 000013
2018198842.tif 000014
2018198842.tif 000015
2018198842.tif 000016
2018198842.tif 000017
2018198842.tif 000018
2018198842.tif 000019