(57)【要約】本発明の目的は、核酸医薬の効果を向上させる新規の複合体を提供することにある。標的遺伝子の発現抑制活性を有する核酸医薬を含むオリゴヌクレオチドの鎖に多分岐脂質がリンカーを介して結合している複合体。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに
式：
【化１】
2018181428.tif 000132
（式中、
Ａ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式：
【化２】
2018181428.tif 000133
で示される基であり、
Ａ１〜Ａ１０及びＡ１６〜Ａ１９は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
Ａ１及びＡ２又はＡ１６及びＡ１７は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、Ａ１を構成するいずれかの炭素原子とＡ２を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、Ａ１６を構成するいずれかの炭素原子とＡ１７を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Ｙ１〜Ｙ７は、それぞれ独立して単結合又はＯであり、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ６は、それぞれ独立してＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ1、Ｒ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１又はＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２であり、
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５及びＸ７は、それぞれ独立して単結合、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４又はＳ−Ｓであり、
Ｒ２及びＲ４は、それぞれ独立してＯ又はＮＲ５であり、
Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ａ１２及びＡ１４は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は脂溶性物質を含む基であり、
Ａ１３、Ａ１５、Ａ２０及びＡ２１は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ独立して１又は２である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。）
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体。
【請求項２】
該脂質が、
Ａ１〜Ａ５及びＹ１〜Ｙ５が、単結合であり、
Ａ６〜Ａ１０が、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
Ｘ１〜Ｘ５が、ＮＨＣ（＝Ｏ）であり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒが、１である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
Ａ１１及びＡ１３が、炭素数が６〜３０のアルキルである請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
該脂質が、オリゴヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に結合している、請求項１〜３いずれかに記載の複合体。
【請求項５】
該リンカーが、
式：
【化３】
2018181428.tif 000134
（式中、
Ｌ０はオリゴヌクレオチドに結合し、Ｌ６は脂質に結合する。
Ｌ０は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
Ｌ１は、式：
【化４】
2018181428.tif 000135
（式中、
Ｚは、それぞれ独立してＯ又はＳであり、
Ｒ６は、それぞれ独立してヒドロキシ、アルキル又はアルキルオキシである）で示される基であり、
Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して単結合又は置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレンであり、
Ｌ３は、それぞれ独立して単結合、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ７（Ｒ７は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）、ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ８は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はＲ８はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）又はＳ−Ｓであり、
Ｌ５は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレン、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９、ＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）、ＮＲ９、Ｏ又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
Ｒ９は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｕは、１又は２であり、
Ｌ６は、単結合又はアミノ酸リンカーである）
で示される基である、請求項１〜５いずれかに記載の複合体。
【請求項６】
式（Ｃ−１）〜（Ｃ−７）のいずれかで示される複合体。
【化５】
2018181428.tif 000136
（式中、
ＯＬは、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドであり、
５’は、該オリゴヌクレオチドの５’末端に結合することを意味し、
３’は、該オリゴヌクレオチドの３’末端に結合することを意味し、
Ｚ１−１は、Ｏ又はＳであり、
Ｌ０−１は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
Ｌ５−１は、単結合、ＮＨ又はＯであり、
Ｌ６−１は、単結合又はアミノ酸リンカーであり、
ＬＩは、式（ＬＩ−１）〜（ＬＩ−９）のいずれかで示される脂質である。
【化６】
2018181428.tif 000137
（式中、
Ａ１−１は、単結合又はメチレンであり、
Ａ２−１は、炭素数が１〜４の直鎖状のアルキレンであり、
Ａ１１−１は、炭素数が７〜２３の直鎖又は分枝状のアルキルであり、
Ａ１２−１は、炭素数が３〜２３の直鎖若しくは分枝状のアルキル若しくはアルケニル、脂溶性物質を含む基又は式：
【化７】
2018181428.tif 000138
で示される基である。）、
【化８】
2018181428.tif 000139
（式中、Ａ１３−１、Ａ１４−１及びＡ１５−１は、炭素数が９〜１３の直鎖状のアルキルである。）、
【化９】
2018181428.tif 000140
（式中、
Ａ２０−１及びＡ２１−１は、炭素数が１３の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−２は、炭素数が１５の直鎖状アルキル又は脂溶性物質を含む基である。）
【化１０】
2018181428.tif 000141
（式中、
Ａ１１−２は、炭素数が１５の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−３は、アミノで置換されている炭素数が１〜４の直鎖状アルキルである。）
【化１１】
2018181428.tif 000142
（式中、
Ａ２０−２及びＡ２１−２は、炭素数が１３の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−４は、アミノで置換されている炭素数が４の直鎖状アルキルである。）
【化１２】
2018181428.tif 000143
（式中、Ａ１１−３及びＡ１２−５は、炭素数が１５の直鎖状アルキルである。）
【化１３】
2018181428.tif 000144
【化１４】
2018181428.tif 000145
（式中、
Ａ１１−４は、炭素数が１４の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−６は、炭素数が６〜１２の直鎖状アルキルである。）
【請求項７】
請求項１〜６いずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の発現抑制活性を有する核酸医薬及び多分岐脂質の複合体に関する。より詳細には、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに多分岐脂質がリンカーを介して結合している複合体（以下、「本発明の複合体」とも称する）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｍＲＮＡを標的とする核酸医薬として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（以下、「ｍｉＲＮＡ」と称する。）等が知られている。【０００３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はリボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等のｎｃＲＮＡ（ノンコーディングＲＮＡ）に対して相補的なオリゴヌクレオチドであり、約８〜３０塩基からなる１本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はそれらの構造類似体である。該アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とするｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体、又はｎｃＲＮＡと二本鎖を形成することによりｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体又はｎｃＲＮＡの働きを抑制する。【０００４】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と相同な約１９〜２５塩基対からなる低分子二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に取り込まれ、１本鎖ｓｉＲＮＡ（ガイド鎖）となり、より不安定な１本鎖（パッセンジャー鎖）は分解される。ガイド鎖が相補的な塩基配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡに結合することで、塩基配列特異的にｍＲＮＡを切断することによって、遺伝子の発現を抑制する。【０００５】
ｍｉＲＮＡは、ゲノム上にコードされた内在性の２０〜２５塩基程度の非コード（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡ、Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写され、次にプロセッシングを受けて約６０〜１１０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅｃｕｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ）となる。その後、核から細胞質内へ移動し、スプライシングによって、２０〜２５塩基程度の二本鎖ｍｉＲＮＡとなる。二本鎖ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に取り込まれ、１本鎖ｍｉＲＮＡ（ガイド鎖）となり、より不安定な１本鎖（パッセンジャー鎖）は分解される。１本鎖ｍｉＲＮＡが、部分相補的な塩基配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡに結合することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをする。【０００６】
しかし、これらの核酸医薬は、生体内のヌクレアーゼにより分解されやすく、標的細胞への取り込み効率が低いため、実用化が難しい。２つの大きな問題点を克服するために、有効成分である核酸自体の化学修飾と、核酸を標的細胞内へ送達させるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の研究が長年行われている。【０００７】
核酸自体の化学修飾の例としては、リン酸部分が修飾されているＳ−オリゴ（ホスホロチオエート）、糖部分が修飾されている２’，４’−ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）／ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（特許文献１〜５参照）等がある。【０００８】
ＤＤＳの例としては、カチオン性リポソームや高分子ミセル等のキャリアを利用する方法の他、核酸にペプチド、糖、コレステロール等の疎水性分子を付加する方法等が知られている。例えば、非特許文献１や２には３’末端に一本鎖脂質を結合させたｓｉＲＮＡが記載されている。特許文献６及び７等にはＧａｌＮａｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体を含む脂質を結合させたｓｉＲＮＡが記載されている。また、特許文献８は、ホスファチジルエタノールアミンが結合したｓｉＲＮＡが記載されている。【０００９】
また、特許文献９には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドにトコフェノールを結合させることにより、マウスにおいて、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、効率よく肝臓に送達、集積され、肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されたことが記載されている。特許文献１０には、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的なＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドにＧａｌＮａｃ誘導体を結合させることにより、静脈注射だけでなく皮下投与であっても、効率よく肝臓に送達、集積され、肝臓での標的遺伝子の発現が抑制されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９８／３９３５２号
【特許文献２】国際公開第２００５／０２１５７０号
【特許文献３】国際公開第２００３／０６８７９５号
【特許文献４】国際公開第２０１１／０５２４３６号
【特許文献５】国際公開第２０１１／１５６２０２号
【特許文献６】国際公開第２００９／１２６９３３号
【特許文献７】国際公開第２０１２／０３７２５４号
【特許文献８】国際公開第２００９／１２３１８５号
【特許文献９】国際公開第２０１３／０８９２８３号
【特許文献１０】国際公開第２０１５／１０５０８３号
【特許文献１１】国際公開第２０１７／０５７５４０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２００７，  ｖｏｌ．２５，  ｎｏ．１０，  １１４９−１１５７
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００８，  ｖｏｌ．１６，  ７６９８−７７０４
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ２０１５，  ｖｏｌ．  ２２０，  ４４−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、包含する核酸医薬の標的遺伝子の発現抑制活性を向上させることが可能な新規の複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究の結果、核酸医薬を含むオリゴヌクレオチドに多分岐脂質が結合している複合体を合成した。核酸医薬としてｓｉＲＮＡを含む該複合体が遺伝子導入試薬を併用せずとも標的遺伝子の発現抑制活性が向上すること、肝臓だけでなく、骨格筋、心臓、脂肪等においても標的遺伝子の発現抑制活性が向上することを見出した。また、核酸医薬としてｍｉＲＮＡを含む該複合体は、ｍｉＲＮＡと比較して抗腫瘍効果が向上することを見出した。また、該複合体は脂質分解酵素耐性があることも見出した。【００１４】
本発明は、核酸医薬を含むオリゴヌクレオチドにリンカーを介して多分岐脂質が結合している複合体に関する。多分岐脂質としては、特に、アミドを介するアルキルからなる鎖を末端に１〜３つ含有する多分岐脂質が好ましい。本発明者らは、アミドを介するアルキルからなる鎖を末端に４つ含有する多分岐脂質が結合している複合体（比較例：ｓｉＲＮＡ−１０１）では標的遺伝子の発現抑制活性が低下することを確認している。【００１５】
本発明は、具体的には、以下に関する。
（１−１）標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに
式：
【化１】
2018181428.tif 000002
（式中、
Ａ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式：
【化２】
2018181428.tif 000003
で示される基であり、
Ａ１〜Ａ１０及びＡ１６〜Ａ１９は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
Ａ１及びＡ２又はＡ１６及びＡ１７は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、Ａ１を構成するいずれかの炭素原子とＡ２を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、Ａ１６を構成するいずれかの炭素原子とＡ１７を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Ｙ１〜Ｙ７は、それぞれ独立して単結合又はＯであり、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ６は、それぞれ独立してＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ1、Ｒ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１又はＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２であり、
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５及びＸ７は、それぞれ独立して単結合、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４又はＳ−Ｓであり、
Ｒ２及びＲ４は、それぞれ独立してＯ又はＮＲ５であり、
Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ａ１２は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は脂溶性物質を含む基であり、
Ａ１３〜Ａ１５、Ａ２０及びＡ２１は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ独立して１又は２である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。）
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体。
（１−２）該脂質が、
Ａ１〜Ａ５及びＹ１〜Ｙ５が、単結合であり、
Ａ６〜Ａ１０が、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
Ｘ１〜Ｘ５が、ＮＨＣ（＝Ｏ）であり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒが、１である、（１−１）記載の複合体。
（１−３）Ａ１１及びＡ１３が、炭素数が６〜３０のアルキルである（１−１）又は（１−２）記載の複合体。
（１−４）該脂質が、オリゴヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に結合している、（１−１）〜（１−３）いずれかに記載の複合体。
（１−５）該リンカーが、
式：
【化３】
2018181428.tif 000004
（式中、
Ｌ０はオリゴヌクレオチドに結合し、Ｌ６は脂質に結合する。
Ｌ０は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
Ｌ１は、式：
【化４】
2018181428.tif 000005
（式中、
Ｚは、それぞれ独立してＯ又はＳであり、
Ｒ６は、それぞれ独立してヒドロキシ、アルキル又はアルキルオキシである）で示される基であり、
Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して単結合又は置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレンであり、
Ｌ３は、それぞれ独立して単結合、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ７（Ｒ７は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）、ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ８は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はＲ８はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）又はＳ−Ｓであり、
Ｌ５は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレン、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９、ＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）、ＮＲ９、Ｏ又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
Ｒ９は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｕは、１又は２であり、
Ｌ６は、単結合又はアミノ酸リンカーである）
で示される基である、（１−１）〜（１−５）いずれかに記載の複合体。
（１−６）式（Ｃ−１）〜（Ｃ−７）のいずれかで示される複合体。
【化５】
2018181428.tif 000006
（式中、
ＯＬは、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドであり、
５’は、該オリゴヌクレオチドの５’末端に結合することを意味し、
３’は、該オリゴヌクレオチドの３’末端に結合することを意味し、
Ｚ１−１は、Ｏ又はＳであり、
Ｌ０−１は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
Ｌ５−１は、単結合、ＮＨ又はＯであり、
Ｌ６−１は、単結合又はアミノ酸リンカーであり、
ＬＩは、式（ＬＩ−１）〜（ＬＩ−９）のいずれかで示される脂質である。
【化６】
2018181428.tif 000007
（式中、
Ａ１−１は、単結合又はメチレンであり、
Ａ２−１は、炭素数が１〜４の直鎖状のアルキレンであり、
Ａ１１−１は、炭素数が７〜２３の直鎖又は分枝状のアルキルであり、
Ａ１２−１は、炭素数が３〜２３の直鎖若しくは分枝状のアルキル若しくはアルケニル、脂溶性物質を含む基又は式：
【化７】
2018181428.tif 000008
で示される基である。）、
【化８】
2018181428.tif 000009
（式中、Ａ１３−１、Ａ１４−１及びＡ１５−１は、炭素数が９〜１３の直鎖状のアルキルである。）、
【化９】
2018181428.tif 000010
（式中、
Ａ２０−１及びＡ２１−１は、炭素数が１３の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−２は、炭素数が１５の直鎖状アルキル又は脂溶性物質を含む基である。）
【化１０】
2018181428.tif 000011
（式中、
Ａ１１−２は、炭素数が１５の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−３は、アミノで置換されている炭素数が１〜４の直鎖状アルキルである。）
【化１１】
2018181428.tif 000012
（式中、
Ａ２０−２及びＡ２１−２は、炭素数が１３の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−４は、アミノで置換されている炭素数が４の直鎖状アルキルである。）
【化１２】
2018181428.tif 000013
（式中、Ａ１１−３及びＡ１２−５は、炭素数が１５の直鎖状アルキルである。）
【化１３】
2018181428.tif 000014
【化１４】
2018181428.tif 000015
（式中、
Ａ１１−４は、炭素数が１４の直鎖状アルキルであり、
Ａ１２−６は、炭素数が６〜１２の直鎖状アルキルである。）
（１−７）（１−１）〜（１−６）いずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。【００１６】
（１−８）該リンカーが、
Ｌ２が、置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレンであり、
Ｌ３が、ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ８は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）であり、
Ｌ４が、単結合であり、
Ｌ５が、単結合、ＮＲ９又はOであり、
ｕが、１であり、
Ｌ６が、単結合である、（１−５）記載の複合体。
（１−９）該リンカーが、
Ｌ０が、単結合であり、
Ｌ２〜Ｌ５が、単結合であり、
Ｌ６が、単結合である、
ｕが１である、（１−５）記載の複合体。
（１−１０）該リンカーが、
Ｌ０が、単結合であり、
Ｌ３が、ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ８はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成している）であり、
Ｌ５が、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９又はＯであり、
ｕが、１であり、
Ｌ６が、単結合である、（１−５）記載の複合体。
（１−１１）リンカーが、
Ｌ０が単結合又はヌクレオチドリンカーであり、
Ｌ２及びＬ４が、置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレンであり、
Ｌ３が、ＮＨＣ（＝Ｏ）又はＳ−Ｓであり、
Ｌ５がＯであり、
ｕが、１である、（１−５）記載の複合体。
（１−１２）リンカーが、
Ｌ２及びＬ４が、置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレンであり、
Ｌ３が、ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ８は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）であり、
Ｌ５が、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
ｕが、１であり、
Ｌ６が、アミノ酸リンカーである、（１−５）記載の複合体。【００１７】
また、本発明は、以下も包含する。
（２−１）第１の鎖が、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第２の鎖が、該第１の鎖にハイブリダイズ可能な配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
かつ、前記標的遺伝子の発現抑制活性を有する二本鎖オリゴヌクレオチドであって、
第１の鎖及び／又は第２の鎖に
式：
【化１５】
2018181428.tif 000016
（式中、
Ｘ１’又はＸ２’は、それぞれ独立して単結合、ＮＲ１’Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ1’、Ｒ２’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１’又はＮＲ１’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２’であり、
Ｒ２’は、Ｏ又はＮＲ３’であり、
Ｒ１’又はＲ３’は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ａ１’又はＡ２’は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｐ’又はｑ’は、それぞれ独立して０〜４の整数である。
ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルの置換基は、ハロゲン、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基又は非芳香族複素環式基であり、該置換基はα’群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α’群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。）
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体。
（２−２）該脂質が、
式：
【化１６】
2018181428.tif 000017
（式中、Ａ１’、Ａ２’、ｐ’又はｑ’は、請求項１と同意義である。）
で示される基である、（２−１）記載の複合体。
（２−３）Ａ１’又はＡ２’が、それぞれ独立して炭素数が６〜３０のアルキルである（２−１）又は（２−２）記載の複合体。
（２−４）該脂質が、第２の鎖に結合している、（２−１）〜（２−３）いずれかに記載の複合体。
（２−５）該脂質が、オリゴヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に結合している、（２−４）記載の複合体。
（２−６）該リンカーが、
【化１７】
2018181428.tif 000018
（式中、
Ｌ１’はオリゴヌクレオチドに結合し、Ｌ５’は脂質に結合する。
Ｌ１’は、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ、
【化１８】
2018181428.tif 000019
（式中、Ｚ’はＯ又はＳであり、Ｒ４’は、アルキル又はアルキルオキシである）であり、
Ｌ２’は、それぞれ独立して芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレン又は芳香族環であり、
Ｌ３’は、それぞれ独立して単結合、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ５’（Ｒ５’は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）又はＮＲ６’Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ６’は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はＲ６’はＬ２’のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）であり、
Ｌ４’は、それぞれ独立して単結合又は芳香族環を介していてもよい置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレン若しくは芳香族環であり、
Ｌ５’は、単結合、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）、ＮＨ又はＯであり、
ｒ’は、０〜２の整数である）
である、（２−１）〜（２−５）記載の複合体。
（２−７）（２−１）〜（２−６）いずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の複合体は、遺伝子導入試薬を使うことなく、包含される核酸医薬の標的遺伝子の発現抑制活性を発揮させることが可能である。また、肝臓のみならず、骨格筋、心臓、脂肪等へも包含される核酸医薬を送達、集積し、効果を発揮させることから、骨格筋、心臓、脂肪等において標的遺伝子の発現抑制をすることが望まれる疾患に、適切な核酸医薬を包含した本発明の複合体を投与することにより、該疾患の治療又は予防効果を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
本発明においては、当該分野で公知の遺伝子操作方法の使用が可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｆｏｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （２０１２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （２０１２）に記載された方法等が挙げられる。
【００２０】
以下に本明細書中で使用する各用語を説明する。なお、本明細書中、各用語は単独で使用されている場合も、又は他の用語と一緒になって使用されている場合も、特に記載の無い限り、同一の意義を有する。
【００２１】
「ヌクレオシド」とは、核酸塩基と糖とがＮ−グリコシド結合をした化合物を意味する。
「オリゴヌクレオチド」とは、同一又は異なるヌクレオシドが複数個結合したヌクレオチドを意味する。
【００２２】
オリゴヌクレオチドにおける糖と糖の間の結合（ヌクレオシド間結合）は、天然の核酸が有する結合、ホスホジエステル（Ｄ−オリゴ）でもよいし、人工的に修飾がなされた結合又はリン原子を有していない結合であってもよい。当該分野で公知の結合であれば、いずれも利用可能である。人工的に修飾がなされた結合としては、ホスホロチオエート（Ｓ−オリゴ）、メチルホスホネート（Ｍ−オリゴ）、ボラノホスホネート等が挙げられる。また、国際公開第２０１３／０２２９６６号、国際公開第２０１１／００５７６１号、国際公開第２０１４／０１２０８１号、国際公開第２０１５／１２５８４５号等に記載の結合も利用可能である。リン原子を有していない結合としては、アルキル、非芳香族炭素環式基、ハロアルキル、ハロゲンで置換された非芳香族炭素環式基等から誘導される二価の置換基が挙げられる。例えば、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、メチレンギ酸アセチル、チオギ酸アセチル、アルケニル、スルファマート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホナート、スルホンアミド、アミド等から誘導される二価の置換基である。オリゴヌクレオチド中、全て同じ結合でもよいし、異なる結合を含んでいてもよい。
【００２３】
本明細書において、「ＤＮＡヌクレオシド」又は「ＲＮＡヌクレオシド」とは、天然のＤＮＡヌクレオシド又は天然のＲＮＡヌクレオシドであり、オリゴヌクレオチドを構成する１単位であるヌクレオチドの一部を意味する。「天然のＤＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
【化１９】
2018181428.tif 000020
(式中、ＢＸ１は、アデニン、グアニン、シトシン又はチミンである。)
「天然のＲＮＡヌクレオシド」とは、以下を意味する。
【化２０】
2018181428.tif 000021
（式中、ＢＸ２は、アデニン、グアニン、シトシン又はウラシルである。）
【００２４】
「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡヌクレオシドが複数個結合したオリゴヌクレオチドであり、「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、ＲＮＡヌクレオシドが複数個結合したオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
本明細書において、「ヌクレオシド誘導体」とは、ＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドの核酸塩基及び／又は糖部位に人工的な修飾がなされたヌクレオシドを意味する。また、核酸塩基が欠失した非塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシドである。当該分野で公知のヌクレオシドの修飾であれば、いずれも利用可能である。
【００２６】
核酸塩基の修飾としては、例えば、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−プロピニルシトシン等が挙げられる。
【００２７】
糖部位の修飾としては、例えば、糖の２’位の置換が挙げられる。具体的には、２’-Ｆ、２’-ＯＣＨ３（２’-ＯＭｅ）、２’-ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’-ＭＯＥ）等である。
また、例えば、以下の糖の４’位と２’位との間の架橋構造が挙げられる。
４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ’−Ｏ−２’、４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ’−Ｓ−２’、４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ’−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−２’、４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ’−ＮＲ９’−Ｏ−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ１’−２’、４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ１’-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９’−２’、４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ２’-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９’−Ｙ４’−２’、４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ１−ＳＯ２−ＮＲ９’−２’、又は
【化２１】
2018181428.tif 000022
であり、
ここで、
Ｙ４’は、Ｏ、Ｓ、ＮＨ又はＣＨ２であり、
Ｒ７’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ８’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ９’は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基、置換若しくは非置換の芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基、置換若しくは非置換の芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の非芳香族炭素環アルキル、置換若しくは非置換の芳香族複素環アルキル又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環アルキルであり、
Ｙ１’はＣＲ１０’又はＮであり、
Ｙ２’はＣＲ１１’又はＮであり、
Ｙ３’はＣＲ１２’又はＮであり、
Ｒ１０’、Ｒ１１’及びＲ１２’はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換のアミノ、置換若しくは非置換のアルキルオキシ、置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ、置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル、置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル又は置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイルであり、
ｍ’は、１〜４の整数であり、
ｍ１’は、０〜３の整数であり、
ｍ２’は、０又は１である。
【００２８】
Ｒ７’及びＲ８’は、好ましくは、水素原子である。
【００２９】
Ｒ９’は、好ましくは、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル又は非芳香族複素環アルキルであり、α’群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α’群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。
【００３０】
該架橋構造として、好ましくは、４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ’−Ｏ−２’又は４’−（ＣＲ７’Ｒ８’）ｍ１’-Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９’−２’（ＡｍＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）であり、
ここで、
Ｒ７’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ８’は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、シアノ、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ｒ９’は、水素原子、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍ’は、１〜４の整数であり、
ｍ１’は、０〜２の整数である。
【００３１】
該架橋構造として、特に好ましくは、４’−（ＣＨ２）ｍ’−Ｏ−２’（ｍ’は１〜４の整数）又は、４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９’−２’（Ｒ９’は、水素原子又はアルキルである）である。
４’−（ＣＨ２）ｍ’−Ｏ−２’（ｍ’は１〜４の整数）の中で、特に好ましくは４’−ＣＨ２−Ｏ−２’（ＬＮＡ、Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）である。具体例及びその調製方法は、国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２００５／０２１５７０号等に記載されている。
４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９’−２’（Ｒ９’は、水素原子又はアルキルである）の中で、特に好ましくは４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＣＨ３−２’である。具体例及びその調製方法は、国際公開第２０１１／０５２４３６号に記載されている。
【００３２】
当該分野で公知のヌクレオチドの修飾及び修飾方法については、例えば、以下の特許文献にも開示されている。
国際公開第９８／３９３５２号、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開２０００／０５６７４８、国際公開第２００５／０２１５７０号、国際公開第２００３／０６８７９５号、国際公開第２０１１／０５２４３６号、国際公開第２００４／０１６７４９号、国際公開第２００５／０８３１２４号、国際公開２００７／１４３３１５号、国際公開第２００９／０７１６８０号、国際公開２０１４／１１２４６３号、国際公開２０１４／１２６２２９号等。
【００３３】
「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子を包含する。特にフッ素原子、及び塩素原子が好ましい。
【００３４】
「アルキル」とは、炭素数１〜１５、好ましくは炭素数１〜１０、より好ましくは炭素数１〜６、さらに好ましくは炭素数１〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−へプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル等が挙げられる。好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチルである。さらに好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチルである。
【００３５】
「アルケニル」とは、任意の位置に１以上の二重結合を有する、炭素数２〜１５、好ましくは炭素数２〜１０、より好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、プレニル、ブタジエニル、ペンテニル、イソペンテニル、ペンタジエニル、ヘキセニル、イソヘキセニル、ヘキサジエニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル等が挙げられる。好ましくは、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニルである。
【００３６】
「アルキニル」とは、任意の位置に１以上の三重結合を有する、炭素数２〜１０、好ましくは炭素数２〜８、さらに好ましくは炭素数２〜６、さらに好ましくは炭素数２〜４の直鎖又は分枝状の炭化水素基を包含する。例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニル等を包含する。これらはさらに任意の位置に二重結合を有していてもよい。好ましくは、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニルである。
【００３７】
「芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル等が挙げられる。好ましくは、フェニルである。
【００３８】
「非芳香族炭素環式基」とは、単環又は２環以上の、環状飽和炭化水素基又は環状非芳香族不飽和炭化水素基を意味する。２環以上の非芳香族炭素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族炭素環式基に、「芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族炭素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
【化２２】
2018181428.tif 000023
単環の非芳香族炭素環式基としては、炭素数３〜１６が好ましく、より好ましくは炭素数３〜１２、さらに好ましくは炭素数４〜８である。例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル等が挙げられる。
２環以上の非芳香族炭素環式基としては、例えば、インダニル、インデニル、アセナフチル、テトラヒドロナフチル、フルオレニル等が挙げられる。
【００３９】
「芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、芳香族環式基を意味する。
２環以上の芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の芳香族複素環式基に、「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」における環が縮合したものも包含する。
単環の芳香族複素環式基としては、５〜８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアゾリル、トリアジニル、テトラゾリル、フリル、チエニル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル等が挙げられる。
２環の芳香族複素環式基としては、例えば、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、インドリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、プリニル、プテリジニル、ベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジル、トリアゾロピリジル、イミダゾチアゾリル、ピラジノピリダジニル、オキサゾロピリジル、チアゾロピリジル等が挙げられる。
３環以上の芳香族複素環式基としては、例えば、カルバゾリル、アクリジニル、キサンテニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、ジベンゾフリル等が挙げられる。
【００４０】
「非芳香族複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ及びＮから任意に選択される同一又は異なるヘテロ原子を環内に１以上有する、単環又は２環以上の、環状非芳香族環式基を意味する。
２環以上の非芳香族複素環式基は、単環又は２環以上の非芳香族複素環式基に、「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」におけるそれぞれの環が縮合したものも包含する。
さらに、「非芳香族複素環式基」は、以下のように架橋している基、又はスピロ環を形成する基も包含する。
【化２３】
2018181428.tif 000024
単環の非芳香族複素環式基としては、３〜８員が好ましく、より好ましくは５員又は６員である。例えば、ジオキサニル、チイラニル、オキシラニル、オキセタニル、オキサチオラニル、アゼチジニル、チアニル、チアゾリジニル、ピロリジニル、ピロリニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、モルホリノ、チオモルホリニル、チオモルホリノ、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロチアゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジニル、ヘキサヒドロアゼピニル、テトラヒドロジアゼピニル、テトラヒドロピリダジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキソラニル、ジオキサジニル、アジリジニル、ジオキソリニル、オキセパニル、チオラニル、チイニル、チアジニル等が挙げられる。
２環以上の非芳香族複素環式基としては、例えば、インドリニル、イソインドリニル、クロマニル、イソクロマニル等が挙げられる。
【００４１】
「ハロアルキル」とは、１以上の「ハロゲン」が「アルキル」に結合した基を意味する。例えば、モノフルオロメチル、モノフルオロエチル、モノフルオロプロピル、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル、モノクロロメチル、トリフルオロメチル、トリクロロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、１，２−ジブロモエチル、１，１，１−トリフルオロプロパン−２−イル等が挙げられる。好ましくは、トリフルオロメチル、トリクロロメチルである。
【００４２】
「アルキルアミノ」には、モノアルキルアミノとジアルキルアミノが含まれる。
「モノアルキルアミノ」とは、「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個と置き換わった基を意味する。例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ等が挙げられる。好ましくは、メチルアミノ、エチルアミノが挙げられる。
「ジアルキルアミノ」とは、「アルキル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子２個と置き換わった基を意味する。２個のアルキルは、同一でも異なっていてもよい。例えば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミノ、Ｎ−イソプロピル−Ｎ−エチルアミノ等が挙げられる。好ましくは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノが挙げられる。
【００４３】
「アルキルカルボニルアミノ」、「アルケニルカルボニルアミノ」、「アルキニルカルボニルアミノ」とは、それぞれ、「アルキルカルボニル」、「アルケニルカルボニル」、「アルキニルカルボニル」がアミノ基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれの基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、「アルキルカルボニルアミノ」としては、メチルカルボニルアミノ、エチルカルボニルアミノ等が挙げられる。「アルケニルカルボニルアミノ」としては、ビニルカルボニルアミノ、プロペニルカルボニルアミノ等が挙げられる。「アルキニルカルボニルアミノ」としては、エチニルカルボニルアミノ、プロピニルカルボニルアミノ等が挙げられる。
【００４４】
「アルキルカルバモイル」、「アルケニルカルバモイル」、「アルキニルカルバモイル」とは、それぞれ、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」がカルバモイル基の窒素原子と結合している水素原子１個又は２個と置き換わった基を意味する。２個の場合、それぞれの基は、同一でも異なっていてもよい。例えば、「アルキルカルバモイル」としては、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル等が挙げられる。「アルケニルカルバモイル」としては、ビニルカルバモイル、プロペニルカルバモイル等が挙げられる。「アルキニルカルバモイル」としては、エチニルカルバモイル、プロピニルカルバモイル等が挙げられる。
【００４５】
「芳香族炭素環アルキル」とは、１以上の「芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルを意味する。例えば、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、以下に示される基
【化２４】
2018181428.tif 000025
等が挙げられる。
「芳香族炭素環アルキル」の好ましい態様としては、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルが挙げられる。
【００４６】
「非芳香族炭素環アルキル」とは、１以上の「非芳香族炭素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「非芳香族炭素環アルキル」は、アルキル部分が「芳香族炭素環式基」で置換されている「非芳香族炭素環アルキル」も包含する。例えば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロへキシルメチル、以下に示される基
【化２５】
2018181428.tif 000026
等が挙げられる。
【００４７】
「芳香族複素環アルキル」とは、１以上の「芳香族複素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「芳香族複素環アルキル」は、アルキル部分が「芳香族炭素環式基」及び／又は「非芳香族炭素環式基」で置換されている「芳香族複素環アルキル」も包含する。例えば、ピリジルメチル、フラニルメチル、イミダゾリルメチル、インドリルメチル、ベンゾチオフェニルメチル、オキサゾリルメチル、イソキサゾリルメチル、チアゾリルメチル、イソチアゾリルメチル、ピラゾリルメチル、イソピラゾリルメチル、ピロリジニルメチル、ベンズオキサゾリルメチル、以下に示される基
【化２６】
2018181428.tif 000027
等が挙げられる。
【００４８】
「非芳香族複素環アルキル」とは、１以上の「非芳香族複素環式基」で置換されているアルキルを意味する。また、「非芳香族複素環アルキル」は、アルキル部分が「芳香族炭素環式基」、「非芳香族炭素環式基」及び／又は「芳香族複素環式基」で置換されている「非芳香族複素環アルキル」も包含する。例えば、テトラヒドロピラニルメチル、モルホリニルエチル、ピペリジニルメチル、ピペラジニルメチル、以下に示される基
【化２７】
2018181428.tif 000028
等が挙げられる。
【００４９】
「置換若しくは非置換のアルキル」、「置換若しくは非置換のアルケニル」、「置換若しくは非置換のアルキニル」、「置換若しくは非置換のアルキルオキシ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキニルカルボニルアミノ」、「置換若しくは非置換のアルキルカルバモイル」、「置換若しくは非置換のアルケニルカルバモイル」又は「置換若しくは非置換のアルキニルカルバモイル」の置換基としては、次の置換基が挙げられる。任意の位置の炭素原子が次のβ群から選択される１以上の基と結合していてもよい。
β群：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００５０】
「置換若しくは非置換の芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」、「置換若しくは非置換の芳香族複素環式基」、及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」の「芳香族炭素環」、「非芳香族炭素環」、「芳香族複素環」及び
「非芳香族複素環」の環上の置換基としては、次の置換基が挙げられる。環上の任意の位置の原子が次のγ群から選択される１以上の基と結合していてもよい。
γ群：ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ヒドロキシイミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アルキルオキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、ハロアルキルオキシ、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシアルキルオキシ、アルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、モノアルキルカルボニルアミノ、ジアルキルカルボニルアミノ、モノアルキルスルホニルアミノ、ジアルキルスルホニルアミノ、アルキルイミノ、アルケニルイミノ、アルキニルイミノ、アルキルカルボニルイミノ、アルケニルカルボニルイミノ、アルキニルカルボニルイミノ、アルキルオキシイミノ、アルケニルオキシイミノ、アルキニルオキシイミノ、アルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アルキルスルファニル、アルケニルスルファニル、アルキニルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、モノアルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、モノアルキルスルファモイル、ジアルキルスルファモイル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環オキシ、非芳香族炭素環オキシ、芳香族複素環オキシ、非芳香族複素環オキシ、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル、非芳香族複素環カルボニル、芳香族炭素環オキシカルボニル、非芳香族炭素環オキシカルボニル、芳香族複素環オキシカルボニル、非芳香族複素環オキシカルボニル、芳香族炭素環アルキル、非芳香族炭素環アルキル、芳香族複素環アルキル、非芳香族複素環アルキル、芳香族炭素環アルキルオキシ、非芳香族炭素環アルキルオキシ、芳香族複素環アルキルオキシ、非芳香族複素環アルキルオキシ、芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族炭素環アルキルオキシカルボニル、芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、非芳香族複素環アルキルオキシカルボニル、芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、非芳香族炭素環アルキルオキシアルキル、芳香族複素環アルキルオキシアルキル、非芳香族複素環アルキルオキシアルキル、芳香族炭素環アルキルアミノ、非芳香族炭素環アルキルアミノ、芳香族複素環アルキルアミノ、非芳香族複素環アルキルアミノ、芳香族炭素環スルファニル、非芳香族炭素環スルファニル、芳香族複素環スルファニル、非芳香族複素環スルファニル、非芳香族炭素環スルホニル、芳香族炭素環スルホニル、芳香族複素環スルホニル、及び非芳香族複素環スルホニル。なお、上記α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００５１】
また、「置換若しくは非置換の非芳香族炭素環式基」及び「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」は「オキソ」で置換されていてもよい。この場合、以下のように炭素原子上の２個の水素原子が置換されている基を意味する。
【化２８】
2018181428.tif 000029
【００５２】
以下に本発明について詳細に説明する。
本発明の複合体は、
標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに
式：
【化２９】
2018181428.tif 000030
（式中、
Ａ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式：
【化３０】
2018181428.tif 000031
で示される基であり、
Ａ１〜Ａ１０及びＡ１６〜Ａ１９は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
Ａ１及びＡ２又はＡ１６及びＡ１７は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、Ａ１を構成するいずれかの炭素原子とＡ２を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、Ａ１６を構成するいずれかの炭素原子とＡ１７を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Ｙ１〜Ｙ７は、それぞれ独立して単結合又はＯであり、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ６は、それぞれ独立してＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ1、Ｒ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１又はＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２であり、
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５及びＸ７は、それぞれ独立して単結合、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４又はＳ−Ｓであり、
Ｒ２及びＲ４は、それぞれ独立してＯ又はＮＲ５であり、
Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ａ１２及びＡ１４は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は脂溶性物質を含む基であり、
Ａ１３、Ａ１５、Ａ２０及びＡ２１は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ独立して１又は２である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。）
で示される脂質が
リンカーを介して結合している複合体である。
【００５３】
本発明の複合体の「標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチド」は、「標的遺伝子の発現抑制活性を有する」ことが知られているオリゴヌクレオチドであれば、いずれも利用可能であり、該オリゴヌクレオチドには核酸医薬が含まれる。「核酸医薬」としては、例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等、一本鎖オリゴヌクレオチドであるアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。「核酸医薬」がアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ハイブリダイズ可能な配列と共に二本鎖オリゴヌクレオチドを形成していてもよい。
【００５４】
本発明の複合体のオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなる８〜５０塩基のオリゴヌクレオチドである。例えば、８〜５０塩基、８〜４０塩基、８〜３０塩基、１０〜２５塩基、１５〜２５塩基である。
【００５５】
本発明の複合体のオリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、第２の鎖は、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなる第１の鎖であるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列からなる８〜６０塩基のオリゴヌクレオチドである。例えば、８〜６０塩基、８〜５０塩基、８〜４０塩基、８〜３０塩基、１０〜２５塩基、１５〜２５塩基である。第２の鎖の長さは、第１の鎖と同じ長さであってもよいし、第１の鎖とハイブリダイズする限りにおいて、第１の鎖より１又は数個の塩基の分短くてもよい。また、第１の鎖とハイブリダイズする部位の片側又は両側に１又は数個の塩基が付加することにより、第２の鎖の長さは第１の鎖より長くてもよい。
「１又は数個の塩基」とは、１〜１０個、１〜５個、１〜３個又は１若しくは２個の塩基を意味している。
第２の鎖の好ましい長さは第１の鎖の長さに依存する。例えば、第１の鎖の長さに対して５０％以上の長さ、６０％以上の長さ、７０％以上の長さ、５０〜１００％の長さ、６０〜１００％の長さ、７０〜１００％の長さである。特に好ましくは第１の鎖の長さに対して５０〜１００％の長さである。
【００５６】
本発明の複合体のオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子中の標的配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、ハイブリダイズする部位において、１又は数個のミスマッチが存在するものも含まれる。例えば、ハイブリダイズする部位が、標的配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明の複合体のオリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、第２の鎖のオリゴヌクレオチドは、標的遺伝子中の標的配列にハイブリダイズ可能な配列からなる第１の鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる限り、ハイブリダイズする部位において、１又は数個のミスマッチが存在するものも含まれる。例えば、ハイブリダイズする部位が、第１の鎖の相補配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の相同性を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ここで、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０）．）の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
【００５７】
「ストリンジェントな条件」とは、ある塩基配列が特定配列とハイブリット（いわゆる特異的ハイブリット）を形成し、同等の機能を有しない塩基配列は該特定配列とハイブリット（いわゆる非特異的ハイブリット）を形成しない条件を意味する。当業者は、ハイブリダイゼーション反応及び洗浄時の温度や、ハイブリダイゼーション反応液及び洗浄液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。具体的には、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイゼーション方法としては、当該分野において周知慣用な手法、例えば、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることができる。具体的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５８】
「１又は数個のミスマッチ」とは、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のミスマッチを意味している。
【００５９】
本発明の複合体の「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド及びヌクレオシド誘導体からなる群から選ばれるヌクレオシドが結合したオリゴヌクレオチドである。全てのヌクレオシドが同じ種類でもよいし、２種以上のヌクレオシドを含んでいてもよい。
【００６０】
本発明の複合体の「オリゴヌクレオチド」中のヌクレオシド誘導体としては、上記に例示した通り、当該分野で公知のヌクレオシドの修飾であれば、いずれも利用可能である。
好ましくは、糖の２’位に置換基を有するヌクレオシド及び／又は糖の４’位と２’位との間に架橋構造を有するヌクレオシドである。
糖の２’位の置換基として好ましくは、Ｆ、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。特に、ＯＣＨ３が好ましい。
糖の４’位と２’位との間の架橋構造として好ましくは、４’−（ＣＨ２）ｍ’−Ｏ−２’（ｍ’は１〜４の整数）、４’−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ９’−２’（Ｒ９’は、水素原子又はアルキルである）である。
【００６１】
本発明の複合体の「オリゴヌクレオチド」においてヌクレオシド間結合としては、上記に例示した通り、当該分野で公知のヌクレオシド間結合であればいずれも利用可能である。全てのヌクレオシド間結合が同じ種類でもよいし、２種以上の結合を含んでいてもよい。好ましくは、Ｄ−オリゴ及び／又はＳ−オリゴである。
【００６２】
本発明の複合体中のオリゴヌクレオチドは、当該分野の常法によって合成することができ、例えば、市販の核酸自動合成装置（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、（株）大日本精機製等）によって容易に合成することができる。合成法はホスホロアミダイトを用いた固相合成法、ハイドロジェンホスホネートを用いた固相合成法等がある。例えば、下記実施例１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２，  １８５９−１８６２  （１９８１）等に開示されている。
【００６３】
本発明の複合体のオリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、合成された第１の鎖及び第２の鎖は公知の方法でハイブリダイズさせることにより二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する。例えば、下記実施例１、国際公開第２０１３／０８９２８３号の実施例１等に開示されている。
【００６４】
本発明の複合体は、オリゴヌクレオチドに脂質がリンカーを介して結合している。
【００６５】
本発明の複合体の「脂質」は、
式：
【化３１】
2018181428.tif 000032
（式中、
Ａ１１は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は
式：
【化３２】
2018181428.tif 000033
で示される基であり、
Ａ１〜Ａ１０及びＡ１６〜Ａ１９は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、
Ａ１及びＡ２又はＡ１６及びＡ１７は、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンの場合、Ａ１を構成するいずれかの炭素原子とＡ２を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、又は、Ａ１６を構成するいずれかの炭素原子とＡ１７を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成していてもよく、
Ｙ１〜Ｙ７は、それぞれ独立して単結合又はＯであり、
Ｘ１、Ｘ３及びＸ６は、それぞれ独立してＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ1、Ｒ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１又はＮＲ１Ｃ（＝Ｏ）Ｒ２であり、
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５及びＸ７は、それぞれ独立して単結合、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、Ｒ４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ３、ＮＲ３Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４又はＳ−Ｓであり、
Ｒ２及びＲ４は、それぞれ独立してＯ又はＮＲ５であり、
Ｒ１、Ｒ３及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
Ａ１２及びＡ１４は、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル又は脂溶性物質を含む基であり、
Ａ１３、Ａ１５、Ａ２０及びＡ２１は、それぞれ独立して置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ独立して１又は２である。
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレンの置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、カルボキシ、アミノ、イミノ、ホルミル、ホルミルオキシ、カルバモイル、スルファモイル、スルファニル、スルフィノ、スルホ、チオホルミル、チオカルボキシ、ジチオカルボキシ、チオカルバモイル、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、ヒドラジノ、ウレイド、アミジノ、グアニジノ、トリアルキルシリル、芳香族炭素環式基、非芳香族炭素環式基、芳香族複素環式基、非芳香族複素環式基、芳香族炭素環カルボニル、非芳香族炭素環カルボニル、芳香族複素環カルボニル又は非芳香族複素環カルボニルであり、該置換基はα群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
α群は、ヒドロキシ、アルキル、アルキルオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ又はハロゲンである。）
で示される脂質である。
【００６６】
Ａ１及びＡ２が、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、「Ａ１を構成するいずれかの炭素原子とＡ２を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成している」とは、以下の左の式で表される基を意味する。
同様に、Ａ１６及びＡ１７が、置換若しくは非置換のアルキレン、置換若しくは非置換のアルケニレン又は置換若しくは非置換のアルキニレンであり、「Ａ１６を構成するいずれかの炭素原子とＡ１７を構成するいずれかの炭素原子が一緒になって、置換芳香族炭素環又は置換非芳香族炭素環を形成している」とは、以下の右の式で表される基を意味する。
【化３３】
2018181428.tif 000034
（式中、環Ｂ１又は環Ｂ２は、置換若しくは非置換の芳香族炭素環又は置換若しくは非置換の非芳香族炭素環であり、その他記号は上記と同様である。式：Ｙ１-［Ａ６−Ｘ１］ｍ−Ａ１１で示される基及び式：Ｙ２-［Ａ７−Ｘ２］ｎ−Ａ１２で示される基は環Ｂ１上の異なる炭素原子に結合し、さらにその他の環Ｂ１上の炭素原子に上記γ群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。式：Ｙ６-［Ａ１８−Ｘ６］ｓ−Ａ２０で示される基及び式：Ｙ７-［Ａ１９−Ｘ７］ｔ−Ａ２１で示される基は環Ｂ２上の異なる炭素原子に結合し、さらにその他の環Ｂ１上の炭素原子に上記γ群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。）
環Ｂ１又は環Ｂ２として特に好ましくは、フェニルである。
【００６７】
Ａ１〜Ａ１０及びＡ１６〜Ａ１９として、特に好ましくは、単結合又は非置換のアルキレンである。
【００６８】
Ｘ１、Ｘ３及びＸ６として特に好ましくは、ＮＨＣ（＝Ｏ）又はＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨである。
Ｘ２、Ｘ４、Ｘ５及びＸ７として特に好ましくは、単結合又はＮＨＣ（＝Ｏ）である。
【００６９】
「脂溶性物質」とは、当該分野で公知の脂溶性物質であればよく、特に限定されない。例えば、特に限定されず、例えば、ビタミンＥ類、ビタミンＡ類、ビタミンB類、βーカロチン、ビタミンＤ類及び／又はビタミンＫ類等の脂溶性ビタミン（例えば、トコフェロール、葉酸等）、クロタミトン、テプレノン、インドメタシン、プレドニゾロン、タンニン酸等が挙げられる。
脂溶性物質を含む基として好ましくは、トコフェロール、葉酸又はｃＲＧＤを含む基が挙げられる。
トコフェロールを含む基とは、以下を意味する。
【化３４】
2018181428.tif 000035
葉酸を含む基とは、以下を意味する。
【化３５】
2018181428.tif 000036
ｃＲＧＤを含む基とは、以下を意味する。
【化３６】
2018181428.tif 000037
【００７０】
Ａ１１〜Ａ１５、Ａ２０及びＡ２１が、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニル又は置換若しくは非置換アルキニルの場合、アルキル、アルケニル又はアルキニルは、好ましくは、６〜３０個、より好ましくは６〜２４個の炭素原子を含み、分岐していてもよい。なお、Ａ１１及びＡ１２、Ａ１３〜Ａ１５又はＡ２０及びＡ２１はそれぞれ鎖長が同じであっても異なっていてもよい。
Ａ１１及びＡ１３として特に好ましくは、非置換のアルキルである。
Ａ１２及びＡ１４として特に好ましくは、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は脂溶性物質を含む基である。
【００７１】
ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔとして特に好ましくは１である。
【００７２】
「脂質」として、特に好ましくは、以下が挙げられる。
【化３７】
2018181428.tif 000038
（式中、
Ａ１―Ｘ、Ａ２−Ｘ、Ａ１８―Ｘ及びＡ１９―Ｘは、アルキレンであり、
Ａ１１―Ｘ、Ａ１３―Ｘ、Ａ１５―Ｘ、Ａ２０―Ｘ及びＡ２１―Ｘは、アルキルであり、
Ａ１２―Ｘ及びＡ１４―Ｘは、置換若しくは非置換のアルキル又は脂溶性物質を含む基である。）
【００７３】
本発明の複合体において、脂質はオリゴヌクレオチドの３’末端、５’末端及び鎖中から選ばれる少なくとも１以上の位置にリンカーを介して結合し得る。脂質はオリゴヌクレオチドの１又は２か所に結合していることが好ましい。本発明の複合体のオリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、好ましくは、第２の鎖に脂質が結合する。特に好ましくは、第２の鎖の３’末端及び／又は５’末端に脂質が結合する。
【００７４】
脂質がオリゴヌクレオチドの５’末端に結合する場合、例えば、以下のように結合し得る。
【化３８】
2018181428.tif 000039
（式中、Ｂ１は、オリゴヌクレオチドの３’末端の塩基であり、Ｚａは、Ｏ又はＳであり、ｎ１又はｎ２は、それぞれ独立して５〜２９の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１０〜１８である。）
【００７５】
脂質がオリゴヌクレオチドの３’末端に結合する場合、例えば、以下のように結合し得る。
【化３９】
2018181428.tif 000040
（式中、Ｂ１は、オリゴヌクレオチドの５’末端の塩基であり、Ｚａは、Ｏ又はＳであり、ｎ１又はｎ２は、それぞれ独立して５〜２９の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１０〜１８である。）
【００７６】
脂質がオリゴヌクレオチドの鎖中に結合する場合、例えば、以下のように結合し得る。
【化４０】
2018181428.tif 000041
（式中、Ｂ１及びＢ２は、オリゴヌクレオチド中隣接する塩基であり、Ｚａ又はＺｂは、それぞれ独立してＯ又はＳであり、ｎ１又はｎ２は、それぞれ独立して５〜２９の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１０〜１８である。）
【００７７】
脂質の具体例と調製方法は、当該分野において公知の手法を参考にしながら合成することができる。例えば、下記実施例１、非特許文献３等に開示している。
【００７８】
本発明の複合体において脂質はリンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合している。「リンカー」としては、当該分野で用いられるリンカーであれば、いずれでも利用可能である。
【００７９】
例えば、以下が挙げられる。
式：
【化４１】
2018181428.tif 000042
（式中、
Ｌ０はオリゴヌクレオチドに結合し、Ｌ６は脂質に結合する。
Ｌ０は、単結合、ヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり、
Ｌ１は、式：
【化４２】
2018181428.tif 000043
（式中、
Ｚは、それぞれ独立してＯ又はＳであり、
Ｒ６は、それぞれ独立してヒドロキシ、アルキル又はアルキルオキシである）で示される基であり、
Ｌ２及びＬ４は、それぞれ独立して単結合又は置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレンであり、
Ｌ３は、それぞれ独立して単結合、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ７（Ｒ７は水素又は置換若しくは非置換のアルキルである）、ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ８は水素、置換若しくは非置換のアルキル又はＲ８はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい）又はＳ−Ｓであり、
Ｌ５は、それぞれ独立して単結合、置換若しくは非置換の炭素数が１〜２０のアルキレン、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ９、ＮＲ９Ｃ（＝Ｏ）、ＮＲ９、Ｏ又は置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基であり、
Ｒ９は、それぞれ独立して水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル又は置換若しくは非置換のアルキニルであり、
ｕは、１又は２であり、
Ｌ６は、単結合又はアミノ酸リンカーである）
で示される基。
【００８０】
「ヌクレオチドリンカー」とは、ＤＮＡヌクレオシド、ＲＮＡヌクレオシド及びヌクレオシド誘導体からなる群から選ばれるヌクレオシドが結合したオリゴヌクレオチドからなるリンカーである。全てのヌクレオシドが同じ種類でもよいし、２種以上のヌクレオシドを含んでいてもよい。
ヌクレオチドリンカーの長さは、１〜１０塩基、２〜８塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基である。例えば、以下に記載のリンカーが挙げられる。
【化４３】
2018181428.tif 000044
（式中、Ｂ３は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、５−メチルシトシン（５−Ｍｅ−Ｃ）、チミン（Ｔ）、又はウラシル（Ｕ）である。また、Ｂ３は欠失（Ａｂ）していてもよい。Ｗは、それぞれ独立してＨ又はＯＨであり、好ましくはＨである。Ｚｃは、それぞれ独立してＯ又はＳである。ｖは１〜１０の整数である。）
特に好ましくは、Ｂ３がアデニン又はチミンであり、ＺｃがＯであり、ｖが１〜９である。
【００８１】
「非ヌクレオチドリンカー」としては、１〜数個のアルカンジオール（例えば、ブタンジオール）が結合したリンカー、１〜数個のエチレングリコールが結合したリンカー（例えば、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）等が挙げられる。
ここで、１〜数個とは１〜１０個、１〜８個、５個、６個、７個である。
好ましくは、３〜９個のブタンジオールが結合したリンカーが挙げられる。
【００８２】
Ｌ３が、ＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）の場合、「Ｒ８はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成してもよい」とは、以下を意味する。
【化４４】
2018181428.tif 000045
（式中、ａは０〜１８の整数であり、ｂは１〜５の整数である。アルキレンは上記β群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。含窒素環は上記γ群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。）
具体的には、以下が挙げられる。
【化４５】
2018181428.tif 000046
【００８３】
Ｌ５が、「置換若しくは非置換の非芳香族複素環式基」の場合、好ましくは、スクシンイミドである。上記γ群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００８４】
「アミノ酸リンカー」とは、１以上のアミノ酸から誘導されるリンカーを意味する。アミノ酸は当該分野で公知のアミノ酸であればいずれも利用可能である。好ましくは２〜１０のアミノ酸からなるリンカーである。例えば、下記実施例１のＡ）で合成したＬｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ（配列番号：１４、化合物１０１）、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ（配列番号：１５、化合物１０２）等から誘導されるリンカーが挙げられる。
【００８５】
Ｌ１として好ましくは、
【化４６】
2018181428.tif 000047
（式中、Ｚは、Ｏ又はＳである）
である。
Ｌ２として好ましくは、１〜２０の置換又は非置換のアルキレンである。
Ｌ３として好ましくは、単結合、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ又はＮＲ８Ｃ（＝Ｏ）（Ｒ８はＬ２のアルキレン中の炭素と一緒になって置換若しくは非置換の含窒素環を形成している）である。
Ｌ５として好ましくは、単結合、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ、ＮＨ又はＯである。
【００８６】
【化４７】
2018181428.tif 000048
として、特に好ましくは、以下が挙げられる。
【化４８】
2018181428.tif 000049
【００８７】
【化４９】
2018181428.tif 000050
（式中、
ＯＬは、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチドに結合することを意味し、ＬＩは、脂質に結合することを意味する。
Ｚｄ及びＺｅは、それぞれ独立してＯ又はＳであり、ｖ１又はｖ２は、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して０〜５であり、より好ましくはそれぞれ独立して０〜３である。ｖ３〜ｖ６は、それぞれ独立して１〜４の整数であり、好ましくはそれぞれ独立して１〜３、より好ましくはそれぞれ独立して２又は３である。Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｄｅｒ（ヌクレオチドリンカー）及びＡｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  Ｌｉｎｋｅｒ（アミノ酸リンカー）は、上記と同意義である。）
【００８８】
「リンカー」の具体例と調整方法は、例えば、上記特許文献６、１０等にも開示されている。
「脂質」とリンカーは、下記実施例１に記載の通り脂質とリンカーの一部を含む化合物として合成し、該化合物を樹脂に固相化し、オリゴヌクレオチドに導入することにより、本発明の「複合体」が得られる。本発明の複合体のオリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、その後、他のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、本発明の「複合体」が得られる。「脂質とリンカーの一部を含む化合物」の具体例としては、下記実施例１に記載の化合物等が挙げられる。
【００８９】
本発明の「複合体」に関し、脂質が結合していないオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端、あるいはリンカーはさらに修飾されていてもよい。オリゴヌクレオチドの追跡を可能にするため、オリゴヌクレオチドの薬物動態又は薬力学を改善するため、あるいはオリゴヌクレオチドの安定性又は結合親和性を向上させるために、当該分野で公知の修飾基を利用することができる。例えば、水酸基の保護基、レポーター分子、コレステロール、リン脂質、色素、蛍光分子等が挙げられる。
また、本発明の「複合体」に関し、脂質が結合していないオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端はリン酸エステル部分を含んでいてもよい。「リン酸エステル部分」とは、リン酸エステル並びに修飾リン酸エステルが含まれる、末端リン酸基を意味する。リン酸エステル部分は、いずれの末端に位置してもよいが、５’−末端ヌクレオシドであることが好ましい。具体的には、式：−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨで示される基又はその修飾基である。つまり、Ｏ及びＯＨの１以上が、Ｈ、Ｏ、ＯＲ’、Ｓ、Ｎ（Ｒ’）（ここでＲ’は、Ｈ、アミノ保護基又は置換若しくは非置換のアルキルである）又はアルキルで置換されていてもよい。５’又は３’末端は、それぞれ独立して置換又は非置換の１〜３のリン酸エステル部分を含んでいてもよい。
【００９０】
本発明は、本発明の複合体又は下記実施例に具体的に記載された本発明の複合体である化合物を含む、医薬組成物を包含する。
【００９１】
例えば下記実施例に記載の通り、本発明の医薬組成物は、下記いずれか、あるいは全ての優れた特徴を有している。
ａ）本発明の複合体に包含されている核酸医薬の標的遺伝子に対する発現抑制活性を向上させる。
ｂ）代謝安定性が高い。
ｃ）ＣＹＰ酵素（例えば、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４等）に対する阻害作用が弱い。
ｄ）高いバイオアベイラビリティー、適度なクリアランス等良好な薬物動態を示す。
ｅ）変異原性を有さない。
ｆ）心血管系のリスクが低い。
ｇ）高い溶解性を示す。
ｈ）急性毒性のリスクが低い。
【００９２】
本発明の複合体に包含されているオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオシドやヌクレオシド間結合は修飾されていてもよい。適切な修飾を施したオリゴヌクレオチドは、無修飾のオリゴヌクレオチドと比較し、下記いずれか、あるいは全ての特徴を有している。
ａ）本発明の複合体に包含されている核酸医薬の標的遺伝子との親和性が高い。
ｂ）ヌクレアーゼに対する抵抗性が高い。
ｃ）薬物動態が改善する。
ｄ）組織移行性が高くなる。
【００９３】
本発明の医薬組成物の投与方法及び製剤は、当該分野で公知の投与方法及び製剤であれば、いずれも利用可能である。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、局所的あるいは全身的な治療のいずれが望まれるのか、又は治療すべき領域に応じて、様々な方法により投与することができる。投与方法としては、例えば、局所的（点眼、膣内、直腸内、鼻腔内、経皮を含む）、経口的、又は、非経口的であってもよい。非経口的投与としては、静脈内注射若しくは点滴、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注入、吸引若しくは吸入による肺投与、硬膜下腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は皮下投与である。
【００９５】
本発明の医薬組成物を局所投与する場合、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、噴霧剤、液剤、散剤等の製剤を用いることができる。
経口投与用組成物としては、散剤、顆粒剤、水若しくは非水性媒体に溶解させた懸濁液又は溶液、カプセル、粉末剤、錠剤等が挙げられる。
非経口、硬膜下腔、又は、脳室内投与用組成物としては、バッファー、希釈剤及びその他の適当な添加剤を含む無菌水溶液等が挙げられる。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、有効量にその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤等の各種医薬用添加剤を必要に応じて混合して得ることができる。注射剤の場合には適当な担体と共に滅菌処理を行なって製剤とすればよい。
【００９７】
賦形剤としては乳糖、白糖、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム又は結晶セルロース等が挙げられる。
結合剤としてはメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
崩壊剤としてはカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末又はラウリル硫酸ナトリウム等が挙げられる。
滑沢剤としてはタルク、ステアリン酸マグネシウム又はマクロゴール等が挙げられる。坐剤の基剤としてはカカオ脂、マクロゴール又はメチルセルロース等を用いることができる。
また、液剤又は乳濁性、懸濁性の注射剤として調製する場合には通常使用されている溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、等張剤等を適宜添加しても良い。経口投与の場合には嬌味剤、芳香剤等を加えても良い。
【００９８】
投与は、治療される病態の重度と反応度に依存し、治療コースは、数日から数ヶ月、あるいは、治癒が実現されるまで、又は、病状の減退が達成されるまで持続する。最適投与スケジュールは、生体における医薬組成物蓄積の測定から計算が可能である。当該分野の当業者であれば、最適用量、投与法、及び、繰り返し頻度を定めることができる。最適用量は、本発明の複合体に包含される核酸医薬の相対的効力に応じて変動するが、一般に、インビトロ及びインビボの動物実験におけるＩＣ５０又はＥＣ５０に基づいて計算することが可能である。例えば、核酸医薬の分子量（配列及び化学構造から導かれる）と、例えば、ＩＣ５０のような効果的用量（実験的に導かれる）が与えられたならば、ｍｇ／ｋｇで表される用量が通例に従って計算される。
【００９９】
本発明の医薬組成物は、包含される核酸医薬の標的遺伝子の発現抑制活性を向上させるため、適切な核酸医薬と共に、核酸医薬の効果が見込まれる様々な疾患の予防又は治療のために用いることができる。
【０１００】
なお、本明細書中で用いる略語は以下の意味を表す。
ＣＰＧ：コントロールドポーラーガラス
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＭＴｒ：ジメトキシトリチル
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＢＴＵ：Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスフェート
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＢＳ：ｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル
ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
【実施例】
【０１０１】
以下に本発明の実施例及び参考例並びに試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
実施例で得られた化合物のＮＭＲ分析は３００ＭＨｚ、４００ＭＨｚで行い、ＣＤ３ＯＤ、ＣＤＣｌ３、ＤＭＳＯ−ｄ６を用いて測定した。【０１０２】
ＵＰＬＣ分析は以下の条件を用いた。
１）ＯＤＳ酸性分析
移動相：［Ａ］は０．１％ギ酸含有水溶液［Ｂ］は０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジエント：３．５分間で５％−１００％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行った後、０．５分間、１００％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．８  ｍＬ／分
ＰＤＡ検出波長：２５４ｎｍ（検出範囲２１０−５００ｎｍ）
２）ＯＤＳ塩基性分析
移動相：［Ａ］は１０ｍＭ炭酸アンモニウム含有水溶液、［Ｂ］はアセトニトリル
グラジェント：３．５分間で５％−１００％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、０．５分間、１００％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８（１．７μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．８  ｍＬ／分
ＰＤＡ検出波長：２５４ｎｍ（検出範囲２１０−５００ｎｍ）
３）Ｃ４塩基性分析
移動相：［Ａ］は１０ｍＭ炭酸アンモニウム含有水溶液、［Ｂ］はアセトニトリル
グラジェント：３．５分間で６０％−１００％溶媒［Ｂ］のリニアグラジエントを行い、０．５分間、１００％溶媒［Ｂ］を維持した。
カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ  Ｃ４（３．５μｍ、ｉ．ｄ．２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）
流速：０．８  ｍＬ／分
ＰＤＡ検出波長：２５４ｎｍ（検出範囲２１０−５００ｎｍ）【０１０３】
実施例１  本発明の複合体の合成
Ａ）脂質の合成
１）５−ｎ’の合成
【化５０】
2018181428.tif 000051
（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１０４】
１−１）化合物５−１２の合成
工程１
化合物２−１２（５．０７ｇ、２２．１９ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＤＭＦ（５１．８ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（２８．６ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（５．８１ｍＬ、３３．３ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（９．２６ｇ、２４．４ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物１（１．０ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）を加えて激しく撹拌した。その後、４０℃に昇温しさらに２時間撹拌した。反応液に飽和重そう水（１０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（５０ｍＬ）、アセトニトリル（５０ｍＬ）、ジクロロメタン（５０ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物３−１２（４．８ｇ、９．４ｍｍｏｌ）を得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.20 (2H, brs), 3.96 (1H, d, J = 4.0 Hz), 3.75 (1H, m), 3.40 (2H, dd, J=4.0, 12.0 Hz), 3.25 (2H, dd, J = 4.0, 12.0 Hz), 2.22 (4H, t, J = 12.0 Hz), 1.62 (4H, d, J = 8.0 Hz), 1.29-1.25 (40H, m), 0.90-0.86 (6, m)
ESI-MS(m/z) : 512 (M+1). 
工程２
化合物３−１２（５．１０ｇ、９．９８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２５７ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（６．９７ｍＬ、３９．９ｍｍｏｌ）を加えた。その後室温にて、化合物４（４．４６ｍＬ、２０．０ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温へ放冷後、反応溶液を分液漏斗へ移し、有機層を飽和重そう水（１００ｍＬ）で二回、水（１００ｍＬ）で二回、食塩水（１００ｍＬ）で一回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。褐色オイルである化合物５−１２（４．８０ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）を粗生成物として得た。化合物の生成は３１Ｐ−ＮＭＲにより３価のリンが導入されたことをもって判断した。
31P-NMR（CDCl3）δ：148.2 (s)【０１０５】
２）化合物８の合成
【化５１】
2018181428.tif 000052
化合物６（米国特許出願公開第２０１４／０１４２２５３号明細書参照、２９２ｍｇ、０．４３５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（２．０ｍＬ）にイミダゾール（７１ｍｇ、１．０４４ｍｍｏｌ）とｔ−ブチルジメチルクロロシラン（７９ｍｇ、０．５２２ｍｍｏｌ）加え、室温で１６時間撹拌した。反応液へ水を加えてシクロペンチルメチルエーテルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、化合物７の粗製物（３５２ｍｇ）を得た。
化合物７の粗製物（３５２ｍｇ）のジクロロメタン溶液（２．４ｍＬ）にジエチルアミン（０．６ｍＬ、５．７４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液にエタノールを加えて撹拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣をエタノールで２回共沸し、得られた粗製物をアミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一（クロロホルム）で精製し、無色油状物質として化合物８（１９０ｍｇ、７８％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.45-7.43 (2H, m), 7.32 (4H, d, J = 8.8 Hz), 7.29-7.25 (2H, m), 7.22-7.18 (1H, m), 6.81 (4H, d, J = 8.8 Hz), 3.79 (6H, s), 3.68-3.61 (2H, m), 3.08-3.02 (2H, m), 2.63 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.75-1.69 (1H, m), 1.41-1.30 (6H, m), 1.27-1.15 (2H, m), 0.84 (9H, s), 0.01 (6H, s).【０１０６】
３）化合物１３−ｎ’の合成
【化５２】
2018181428.tif 000053
（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１０７】
３−１）化合物１３−６の合成
工程１
化合物３−６（１．０ｇ、２．９２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）―クロロホルム（２０ｍＬ）溶液にＤＩＥＡ（１．５３ｍＬ、８．７６ｍｍｏｌ）、ビス（ニトロフェニル）カーボネート（１．３３ｇ、４．３８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１７８ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で１時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６０：４０→２０：８０）で精製し、化合物９−６（９８２ｍｇ、６６％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.32-8.26 (2H, m), 7.42 (2H, dt, J = 9.9, 2.5 Hz), 6.36 (2H, t, J = 6.4 Hz), 4.80 (1H, ddd, J = 10.7, 5.6, 3.3 Hz), 3.65-3.50 (4H, m), 2.26 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.69-1.62 (4H, m), 1.28 (16H, dt, J = 19.1, 4.7 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程２
化合物８（５００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０．０ｍＬ）に化合物９−６（４５０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、アミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝６５：３５→１０：９０）で精製し、化合物１０−６（６２５ｍｇ、７６％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.31 (4H, t, J = 6.2 Hz), 7.26 (3H, t, J = 3.9 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, t, J = 6.0 Hz), 6.25 (2H, t, J = 5.8 Hz), 4.70 (2H, dd, J = 10.3, 5.3 Hz), 3.79 (6H, d, J = 4.4 Hz), 3.62 (2H, dd, J = 10.1, 5.1 Hz), 3.51 (2H, dd, J = 13.3, 6.4 Hz), 3.32-3.26 (2H, m), 3.08 (4H, dt, J = 20.2, 6.6 Hz), 2.19 (4H, t, J = 7.7 Hz), 1.70 (1H, t, J = 5.7 Hz), 1.61 (8H, t, J = 9.3 Hz), 1.42 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.26 (20H, tt, J = 26.0, 10.5 Hz), 0.88 (6H, dd, J = 12.0, 5.3 Hz), 0.83 (9H, s).
工程３
化合物１０−６（６２５ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）にＴＢＡＦ（１Ｍ  ＴＨＦ溶液、１．３４ｍＬ、１．３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、得られた粗製物をジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０→１０：９０）で精製し、化合物１１−６（５４１ｍｇ、９９％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, t, J = 4.3 Hz), 7.26 (9H, ddt, J = 31.6, 12.0, 4.9 Hz), 6.83 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.38 (2H, q, J = 6.1 Hz), 4.88 (1H, t, J = 5.6 Hz), 4.67 (1H, t, J = 5.0 Hz), 3.79 (6H, t, J = 7.5 Hz), 3.69-3.61 (2H, m), 3.50-3.44 (2H, m), 3.30 (3H, tt, J = 20.6, 6.5 Hz), 3.15-3.06 (3H, m), 2.63 (1H, s), 2.21-2.17 (4H, m), 1.78 (1H, s), 1.62 (4H, t, J = 6.9 Hz), 1.43 (2H, t, J = 5.4 Hz), 1.30 (20H, dt, J = 29.2, 11.0 Hz), 0.87 (6H, t, J = 6.9 Hz).【０１０８】
工程４
化合物１１−６（５４１ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（２ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．３５ｍＬ、１．９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（８．０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１３２ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗精製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝４０：１→１０：１）で精製し、化合物１２−６（５９１ｍｇ、９７％）を無色液体物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.31-7.25 (8H, m), 7.20 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.82 (4H, d, J = 8.5 Hz), 6.62 (1H, t, J = 6.3 Hz), 6.48 (1H, t, J = 6.5 Hz), 5.91 (1H, t, J = 5.5 Hz), 4.71 (1H, t, J = 5.3 Hz), 4.42 (1H, dd, J = 11.0, 3.2 Hz), 4.14 (1H, dd, J = 10.9, 5.9 Hz), 3.79 (6H, s), 3.40 (4H, tt, J = 20.4, 7.0 Hz), 3.08 (4H, dq, J = 33.3, 8.0 Hz), 2.69-2.49 (4H, m), 2.20 (4H, dd, J = 15.6, 8.2 Hz), 1.95 (1H, s), 1.61 (4H, d, J = 7.0 Hz), 1.27 (22H, d, J = 5.0 Hz), 0.87 (6H, dd, J = 6.8, 5.1 Hz).
工程５
化合物１２−６（３１２ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル／塩化メチレン混合溶液（４：１、２５ｍＬ）にＤＩＥＡ（０．３０ｍＬ、１．７０ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（１４２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間振とう撹拌した。反応液へＨｙｂｒｉｄＣＰＧ  ａｍｉｎｏ  ｆｏｒｍ  ２０００Å（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社）（２．８ｇ）を加え、２４時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＨｙｂｒｉｄＣＰＧをアセトニトリルで３回、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、減圧下で乾燥した。乾燥したＨｙｂｒｉｄＣＰＧにＴＨＦ／無水酢酸／ピリジン混液（８：１：１、３０ｍＬ）を加えて３時間振とう撹拌した。反応液をろ過後、ＨｙｂｒｉｄＣＰＧをピリジンで２回、イソプロパノールで２回、ジエチルエーテルで２回洗浄した後、減圧乾燥した。化合物１２−６の担持量はＤＭＴｒカチオンの比色定量により算出し、担持量が１１４μｍｏｌ／ｇの化合物１３−６を得た。【０１０９】
３−２）３−１）と同様の方法により、以下の化合物を合成した。
化合物１２−８の担持量が１０７μｍｏｌ／ｇの化合物１３−８
化合物１２−１０の担持量が６９μｍｏｌ／ｇの化合物１３−１０
化合物１２−１２の担持量が３１μｍｏｌ／ｇの化合物１３−１２
化合物１２−１４の担持量が４０μｍｏｌ／ｇの化合物１３−１４
化合物１２−１８の担持量が１５μｍｏｌ／ｇの化合物１３−１８
化合物１２−２０の担持量が４８μｍｏｌ／ｇの化合物１３−２０
化合物１２−２２の担持量が４７μｍｏｌ／ｇの化合物１３−２２【０１１０】
４）化合物１４−ｎ’の合成
【化５３】
2018181428.tif 000054
（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）
４−１）化合物１４−１６の合成
化合物３−１６（３．０ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（８０ｍＬ）溶液にＰｙｒｉｄｉｎｅ（０．７８ｍＬ、９．６３ｍｍｏｌ）、クロロぎ酸４−ニトロフェニル（１．９４ｇ、９．６３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５９ｍｇ、０．４８１ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で３時間撹拌した。反応液を濾過し母液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０）で精製し、化合物１４−１６（１ｇ、２６％）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.29 (2H, dt, J = 9.7, 2.6 Hz),7.43 (2H, dt, J = 9.9, 2.7 Hz),6.28 (2H, t, J = 6.4 Hz),4.80-4.77 (1H, m),3.62 (2H, ddd, J = 14.5, 7.0,),3.51 (2H, dt, J = 14.5, 6.3 Hz),2.25 (4H, t, J = 7.7 Hz),1.65 (4H, td, J = 12.4, 5.3 Hz),1.36-1.20 (56H, m),0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).【０１１１】
５）化合物１８の合成
【化５４】
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【０１１２】
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，４２，８７９６―８８０７（２０１４）に記載の方法に従って、化合物１５より化合物１７を合成した。
化合物１７（３．００ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１５ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（１．９８ｍｌ、１４．３ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）、無水コハク酸（７５１ｍｇ、７．５１ｍｍｏｌ、１．０５ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：１２０ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝９５：５：１→７５：２５：１）により精製し、化合物１８（３．３７ｇ、収率９１％）を無色粉末として得た。１Ｈ−ＮＭＲでは６３：３７のロータマー混合物として観測された。
ESI-MS (m/z) : 530 (M+H). HPLC Peak RT = 1.86 min.
1H-NMR（CDCl3）δ：(Major) 7.39-7.33 (2H, m), 7.30-7.22 (6H, m), 7.22-7.16 (1H, m), 6.85-6.77 (4H, m), 4.50 (1H, brs), 4.41 (1H, m), 3.88 (1H, d, J = 11.0 Hz), 3.775 (6H, s), 3.65 (1H, dd, J = 11.0, 4.0 Hz), 3.43 (1H, dd, J = 9.2, 4.5 Hz),3.14 (1H, dd, J = 9.2, 2.7 Hz), 2.85-1.97 (6H, m).  (Minor) 7.39-7.33 (2H, m), 7.30-7.22 (6H, m), 7.22-7.16 (1H, m), 6.85-6.77 (4H, m), 4.41 (1H, m), 4.31 (1H, brs), 4.11 (1H, d, J = 12.3 Hz), 3.783 (6H, s), 3.25 (1H, dd, J = 12.3, 3.5 Hz), 3.18 (1H, dd, J = 9.5, 4.8 Hz),3.10 (1H, dd, J = 9.5, 4.8 Hz), 2.85-1.97 (6H, m).【０１１３】
６）化合物２７−ｎ’の合成
【化５５】
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（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１１４】
６−１）化合物２７−１２の合成
工程１
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，７７８１（２００５）に記載の方法に従って、化合物１より化合物１９を合成した。
工程２
化合物１９（３．００ｇ、７．１５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ−水（９：１）の混合溶液（３０ｍｌ）に室温でトリフェニルホスフィン（１．９８ｍｌ、１４．３ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、７０℃に昇温し、４時間撹拌した。室温へ放冷後、反応液を減圧下濃縮することにより、化合物２０の粗生成物を無色油状物として得た。
工程３
化合物２０（７．１５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（２．１０ｍｌ、１５．１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ．）、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（３．５９ｇ、１３．９ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）を加え、室温で１時間撹拌した後、反応液をクロロホルムで希釈し、飽和食塩水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた固体をｎ−ヘキサン及び少量のクロロホルムにて洗浄した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：１２０ｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝７５：２５→０：１００）により精製し、化合物２１（４．１８ｇ、化合物１９からの収率６５％）を無色泡状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 512 (M+H). HPLC Peak RT = 2.71 min.
1H-NMR（CDCl3）δ：7.80 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.5Hz), 7.40 (2H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz), 7.30 (2H, dd, J = 7.5, 7.5 Hz), 6.02 (1H, brs), 5.21 (2H, brs), 4.46-4.27 (2H, m), 4.21 (1H, m), 3.59 (1H, m), 3.45-3.29 (2H, m), 3.27-3.13 (2H, m), 1.46 (18H, s).【０１１５】
工程４
化合物２１（１．５ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（１０ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した後、減圧下濃縮することにより、化合物２２の粗生成物を得た。 
ESI-MS (m/z) : 312 (M+H). HPLC Peak RT = 1.0６ min.
工程５
化合物２２のジクロロメタン溶液（１５ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（２．４３ｍｌ、１７．５９ｍｍｏｌ）、ミリストイルクロリド（１．５９ｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１晩撹拌した。生じた白色の析出物をろ取した後、ジクロロメタン、水、ｎ−ヘキサンにて洗浄、減圧下乾燥することにより、化合物２３−１２（２．４５ｇ）を固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：12.32 (1H, s), 7.76 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.60 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.35 (4H, dt, J = 33.7, 7.3 Hz), 6.56 (1H, s), 6.40 (1H, s), 4.32-4.19 (2H, m), 3.60 (2H, s), 3.20-3.09 (4H, m), 2.23 (4H, t, J = 7.1 Hz), 1.64 (4H, s), 1.37-1.25 (40H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程６
化合物２３−１２（１．９ｇ、２．６０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１５ｍｌ）にピペリジン（０．２９０ｍｌ、２．９３ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で２０分間撹拌した。室温まで冷却した後、生じた析出物をろ取し、ｎ−ヘキサンにて洗浄、減圧下乾燥することにより、化合物２４−１２（７４２ｍｇ、収率５０％）を固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.43 (1H, s), 3.43 (2H, t, J = 8.2 Hz), 3.03 (4H, m), 2.22 (4H, t, J = 7.6 Hz), 1.73 (4H, m), 1.38-1.25 (40H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.7 Hz).
工程７
化合物１８（５８５ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）の‘ＤＭＦ溶液（５ｍＬ）に室温でＤＩＥＡ（１．２０ｍｌ、１．７９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（６７７ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した後、４５℃で化合物２４−１２（７００ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３０ｍＬ）に加え、４５℃で３０分間撹拌した。不溶物が確認されたのでＤＭＦ（１．５ｍＬ）を加えることで完全妖怪させた．反応液の溶媒を減圧留去したのち，反応液を飽和重そう水にて洗浄、次いで硫酸マグネシウム乾燥後、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を酢酸エチルに溶解し、８０℃でｎ−ヘキサンを加えて、目的物を析出させ、ろ取することで化合物２５−１２（１．３１ｇ、収率８８％）を固体として得た。得られた生成物はそれ以上の精製を経ず、次反応に用いた。【０１１６】
工程８
化合物２５−１２（１．０ｇ、０．９１９ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍｌ）に室温でトリエチルアミン（０．５１０ｍｌ、３．６８ｍｍｏｌ、４ｅｑ．）、無水コハク酸（１８４ｍｇ、１．８３９ｍｍｏｌ、２ｅｑ．）、ジメチルアミノピリジン（１１ｍｇ）を順次加え、室温で２時間撹拌した後、原料が残っていたのでトリエチルアミン（０．２５５ｍｌ）、無水コハク酸（９０ｍｇ）を加え，室温で一晩撹拌した後、反応液を減圧下濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２：３０ｇ、クロロホルム：メタノール：トリエチルアミン＝１００：０：１→９０：１０：１）により精製することで化合物２６−１２（２６１ｍｇ、収率３５％）を固体として得た。
ESI-MS (m/z) : 1110 (M-H). HPLC Peak RT = 3.08 min.
工程９
３−１）工程５と同様の方法により、化合物２６−１２の担持量が３１．２ｕｍｏｌ／ｇの化合物２７−１２を得た。【０１１７】
７）化合物３３−ｓ’−ｔ’−ｕ’の合成
【化５６】
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（式中、ｓ’、ｔ’及びｕ’は、それぞれ独立して３〜２０の整数である。）【０１１８】
７−１）化合物３３−７−７−７の合成
工程１
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２２０，４４―５０（２０１５）に記載の方法に従って化合物２８−７−７−７を合成した。
工程２
化合物２８−７−７−７（１ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（５０ｍＬ）ビス（ニトロフェニル）カーボネート（２．２３ｇ、７．３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（８９７ｇ、７．３４ｍｍｏｌ）を加え、６５℃で２時間撹拌した。反応液を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：１０）で精製し、化合物２９−７−７−７（９３２ｍｇ、６６％）を無色固体として得た。
ESI-MS (m/z) : ５９１ (M＋H＋Ｈ２Ｏ). HPLC Peak RT = ２．４９ min.
工程３
化合物２９−７−７−７（６４４ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６．４ｍＬ）に６−アミノ−２−ヒドロキシメチルヘキサン−１−オール（５００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（６．４ｍＬ）及びＤＩＥＡ（０．３９ｍＬ、２．２４ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で２時間撹拌した。反応溶液に水を加え反応を停止後分液漏斗へ移し、有機層を水で二回、食塩水で一回洗浄した。得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をアミノシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０）で精製し、化合物３０−７−７−７（４２４ｍｇ、６５％）を無色油状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : ５８３ (M＋H). HPLC Peak RT = ２．０６ min.
工程４
化合物３０−７−７−７（４２４ｍｇ、０．７２９ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（６．４ｍＬ）にＤＭＴｒＣｌ（２７２ｍｇ、０．８０２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を減圧濃縮後、ジオールシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）で精製し、化合物３１−７−７−７（５１０ｍｇ、５１％）を無色油状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : ８８３ (M−H). HPLC Peak RT = ２．６０ min【０１１９】
工程５
化合物３１−７−７−７（５１０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の塩化メチレン溶液（６．４ｍＬ）にＤＭＡＰ（１３７ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（３３７ｍｇ、３．３７ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．５９ｍＬ、３．３７ｍｍｏｌ）を加え、室温で３日間撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、化合物３２−７−７−７（９４５ｍｇ）を無色液体物質として得た。
ESI-MS (m/z) : ９８３ (M−H). HPLC Peak RT = １．９７ min
工程６
３−１）工程５と同様の方法により、化合物３２−７−７−７の担持量が１６μｍｏｌ／ｇの化合物３３−７−７−７を得た。【０１２０】
８）化合物４２の合成
【化５７】
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【０１２１】
工程１
１−１）工程１及び３−１）の工程１~４と同様の方法により、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １３（６），  １０３７−１０４０；  ２００３に記載の化合物４０から化合物４１を合成した。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.42-7.18 (m, 5H), 6.81 (m, 2H), 6.55 (brs, 1H), 6.39 (brs, 1H), 5.91 (brs, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 4.15 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.45-3.37 (m, 4H), 3.05 (m, 4H), 2.58-2.52 (m, 4H), 2.19 (m, 4H), 1.95 (brs, 1H), 1.60-1.14 (m, 32H), 0.88 (m, 4H), 0.78-0.61 (m, 8H), -0.28 (m, 4H). 
工程２
３−１）工程５と同様の方法により、化合物４１の担持量が９２μｍｏｌ／ｇの化合物４２を得た。【０１２２】
９）化合物４８−ｎ’の合成
【化５８】
2018181428.tif 000059
（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１２３】
９−１）化合物４８―８の合成
工程１
デカン酸（１．１６ｇ、６．７５ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をＤＭＦ（１４ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（１４ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（３．１４ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２．８２ｇ、７．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく１時間撹拌した。得られた褐色溶液に対して、室温で化合物４３（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （２０１０），  １６，  （１５），  ４５１９−４５３２，  Ｓ４５１９参照、２．０ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後に、残渣を２５％含水アセトニトリルで処理し、生じた固体をろ取した。得られた固体を水で３回、２５％含水アセトニトリルで三回洗浄後、化合物４４−８（２．１９ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。
工程２
化合物４４−８（０．５ｇ、０．４７１ｍｍｏｌ）をエタノール（６ｍＬ）に溶解し、水酸化パラジウム（２２１ｍｇ、Ｐｄ２０％、含水）を加えて水素雰囲気下、室温で２時間激しく撹拌した。窒素で置換後、不溶物をセライトを用いて濾去した。残渣を減圧下で濃縮し、残渣に対してアセトニトリルを加えた。生じた白色固体をろ取し、化合物４５−８（０．４００ｇ、０．４７１ｍｍｏｌ）を白色泡状固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：6.44 (brs, 2H), 3.71 (m, 6H), 3.37 (m, 6H), 3.27 (m, 12H), 2.45 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.63 (m, 6H), 1.25 (m, 36H), 0.88 (t, 9H, J = 6.8 Hz). 【０１２４】
工程３
窒素気流下、化合物４５−８（０．４ｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１．７ｍＬ）―ジクロロメタン（１．４ｍＬ）―クロロホルム（１．０ｍＬ）溶液に、ビス−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（０．１３１ｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．２２６ｍＬ、１．３０ｍｍｏｌ）を加えた後、室温下１２時間撹拌した。次に、２）で得られた化合物８（０．２４３ｇ、０．４３２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で６時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで希釈後、水で有機層を３回、０．２Ｍ炭酸水素カリウム水溶液で２回、飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。固体をフィルター濾去したのちに、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：アセトン＝１：０→９：１）で精製し、化合物４６−８（０．３７５ｇ、０．２４７ｍｍｏｌ）を白色固体として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40 (m, 2H), 7.30-7.26 (m, 13H), 7.09 (m, 3H), 5.82 (brs, 1H), 5.51 (brm, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.68-3.65 (m, 13H), 3.25 (m, 12H), 3.03 (m, 2H), 2.44 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.63-1.60 (m, 6H), 1.27-1.25 (m, 28H), 0.89-0.72 (m, 18H). 
工程４
３−１）工程３及び工程４と同様の方法により、化合物４６−８から化合物４７−８を合成した。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.41-7.20 (m, 5H), 6.82 (m, 4H), 6.61 (brs, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.69-3.62 (m, 12H), 3.25 (m, 12H), 3.02 (m, 6H), 2.60 (m, 6H), 2.42 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.60 (m, 12H), 1.27 (m, 20H), 0.88 (m, 9H). 
工程５
３−１）工程５と同様の方法により、化合物４７−８の担持量が６８．６μｍｏｌ／ｇの化合物４８−８を得た。【０１２５】
９−２）化合物４８−１２の合成
９−１）と同様の方法により、以下の化合物を得た。
化合物４７−１２
1H-NMR（CDCl3）δ：7.40-7.26 (m, 5H), 6.81 (m, 4H), 6.56 (brs, 3H), 3.79 (s, 6H), 3.69-3.62 (m, 12H), 3.25 (m, 12H), 3.07 (m, 8H), 2.58 (m, 4H), 2.44 (m, 6H), 2.17 (m, 6H), 1.60 (m, 12H), 1.27-1.22 (m, 60H), 0.88 (m, 9H). 
化合物４７−１２の担持量が７０．０μｍｏｌ／ｇの化合物４８−１２【０１２６】
１０）化合物５５−ｍ’−ｎ’の合成
【化５９】
2018181428.tif 000060
（式中、ｍ’及びｎ’は、それぞれ独立して５〜２９の整数である。）【０１２７】
１０−１）化合物５５―５−７の合成
工程１
化合物４９（２０ｇ、７７ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解し、０℃においてＤＩＥＡ（１３．５ｍＬ、７７ｍｍｏｌ）を加え、室温まで昇温した。その後、室温で一晩撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後に、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝７：３→４：６）で精製し、化合物５０（２２．５ｇ、５９．４ｍｍｏｌ）を無色油状物として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：5.18 (brs, 2H), 4.11 (m, 4H), 3.74 (m, 1H), 3.45 (s, 1H), 3.39 (m, 1H), 3.29-3.20 (m, 4H), 0.93 (t, 4H, J = 8.4 Hz), 0.00 (s, 18H). 
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ＋］  ｍ／ｚ：  ３８０
工程２
窒素気流下、化合物５０（３．７９ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３３ｍＬ）溶液に、ビス−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（３．０４ｇ、１０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．７５ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を加えた後、室温下１２時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１）で精製し、化合物５１（４．４３ｇ、８．１４ｍｍｏｌ）を無色油状物として得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：8.26 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 7.38 (d, 2H, J = 9.2 Hz), 5.20 (brs, 2H), 4.77 (brs, 1H), 4.13 (t, 2H, J = 8.8 Hz), 3.51-3.46 (m, 4H), 0.93 (m, 4H), 0.00 (m, 18H). 
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ＋］  ｍ／ｚ：  ５４５
工程３
３−２）の工程２及び工程３と同様の方法により、化合物５１から化合物５２を合成した。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.41-7.20 (m, 5H), 6.82 (m, 4H), 3.79 (s, 6H), 3.72-3.62 (m, 4H), 3.22-3.01 (m, 6H), 1.29 (m, 6H). 【０１２８】
工程４
２−へキシルデカン酸（１１０ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２ｍＬ）−ＤＭＦ（２．５ｍＬ）溶液にＤＩＥＡ（０．１０２ｍＬ、０．５８３ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．１６２ｇ、０．４２８ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分撹拌した。得られた褐色溶液に対して、室温で化合物５２（０．１１０ｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を加えて室温で２４時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後に、残渣を酢酸エチルで希釈後、水で有機層を３回洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。固体をフィルター濾去したのちに、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−へキサン：酢酸エチル＝１：０→１：１）で精製し、化合物５３−５−７（９０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）を白色アモルファスとして得た。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.42-7.19 (m, 5H), 6.83 (m, 4H), 4.81 (brm, 1H), 4.65 (brs, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.67 (m, 2H), 3.46-3.39 (m, 3H), 3.25 (m, 1H), 3.11 (m, 3H), 2.05 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.55-1.24 (m, 48H), 0.84 (m, 12H). 
工程５
３−１）工程４と同様の方法により、化合物５３−５−７から化合物５４−５−７を合成した。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.42-7.19 (m, 5H), 6.83 (m, 4H), 6.65 (brs, 1H), 6.52 (brs, 1H), 5.86 (brs, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.38 (brs, 1H), 4.13 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.41 (m, 4H), 3.02 (m, 4H), 2.55 (m, 4H), 2.05 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.55-1.24 (m, 48H), 0.84 (m, 12H). 
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ−］  ｍ／ｚ：  １１４２
工程６
３−１）工程５と同様の方法により、化合物５４−５−７の担持量が７０．０μｍｏｌ／ｇの化合物５５−５−７を合成した。【０１２９】
１１）化合物５９の合成
【化６０】
2018181428.tif 000061
【０１３０】
工程１
３−１）工程１と同様の方法により、化合物５６（６．９４ｇ、２４．４ｍｍｏｌ、東京化成工業株式会社）から化合物５７を合成した。
1H-NMR（CDCl3）δ：8.30 (d, 2H, J =9.2 Hz), 7.45 (m, 2H), 6.32 (brs, 2H), 4.75 (brs, 1H), 4.55 (brs, 1H), 3.51 (m, 6H), 1.87 (m, 1H), 1.70 (m, 1H), 1.67 (m, 16H), 1.25 (m, 6H), 1.21 (m, 6H), 1.03 (m, 12H), 0.88 (m, 42H). 
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ＋］  ｍ／ｚ：  ７８９
工程２
３−１）工程２〜４と同様の方法により、化合物５７から化合物５８を合成した。
1H-NMR（CDCl3）δ：7.42-7.18 (m, 6H), 6.80 (d, 4H, J = 8.4 Hz), 5.89 (brs, 1H), 4.62 (brs, 1H), 4.38 (brs, 1H), 4.14 (brs, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.57-3.34 (m, 4H), 3.05 (m, 6H), 2.66-2.57 (m, 4H), 1.87 (m, 1H), 1.75 (m, 1H), 1.66 (m, 1H), 1.56 (m, 16H), 1.45 (m, 6H), 1.25 (m, 6H), 1.03 (m, 12H), 0.88 (m, 42H).
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ−］  ｍ／ｚ：  １１９８
工程３
３−１）工程５と同様の方法により、化合物５８の担持量が５３．４μｍｏｌ／ｇの化合物５９を合成した。【０１３１】
１２）化合物６２の合成
【化６１】
2018181428.tif 000062
【０１３２】
工程１
窒素気流下、化合物５２（３０７ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（０．１０２ｍＬ、０．５８３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（２３．８ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）、１１）の工程１で得られた化合物５７（１１０ｍｇ、０．１９４ｍｍｏｌ）を加えて、５５℃で５時間撹拌した。その後反応溶液を室温で一晩静置した。反応液を酢酸エチルで希釈後、水で有機層を３回洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。固体をフィルター濾去したのちに、ろ液を減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：０→１：１）で精製し、化合物６０（１００ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を白色アモルファスとして得た。
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ＋３Ｈ］３＋  ｍ／ｚ：  ６２２
工程２
３−１）工程４と同様の方法により、化合物６０から化合物６１を合成した。
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ｍ／ｚ：  ９８３
工程３
３−１）工程５と同様の方法により、化合物６１の担持量が４７．７μｍｏｌ／ｇの化合物６２を合成した。【０１３３】
１３）化合物６５―ｎ’の合成
【化６２】
2018181428.tif 000063
（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１３４】
１３−１）化合物６５−１２の合成
工程１
窒素気流下、化合物６３（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ４２，  Ｉｓｓｕｅ  １３，  ２９  Ｊｕｌｙ  ２０１４，  Ｐａｇｅｓ  ８７９６-８８０７参照、０．６２１ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２９ｍＬ）溶液に、ＤＭＡＰ（１８１ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（０．２５８ｍＬ、１．４８ｍｍｏｌ）、３−１）工程１と同様の方法により得られた化合物９−１２（１．０ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を加えて、加熱還流下で４時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１：０→９：１）で精製し、化合物６４−１２（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無色油状物として得た。
ＬＣ／ＭＳ：  ［Ｍ＋Ｈ］  ｍ／ｚ：  ９５５
工程２
１−１）工程２と同様の方法により、化合物６４−１２から化合物６５−１２を合成した。
31P-NMR（CDCl3）δ：147.9, 147.6, 147.4, 146.3【０１３５】
１４）化合物６９―ｎ’の合成
【化６３】
2018181428.tif 000064
（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１３６】
１４−１）化合物６９―１４の合成
工程１
９−フルオレニルメチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４．００ｇ、１１．８７ｍｍｏｌ、渡辺化学工業株式会社）のメタノール懸濁液（４０．０ｍＬ）に、室温で化合物１（１．０７ｇ、１１．８７ｍｍｏｌ）のメタノール溶液（１０．０ｍＬ）を加え、１．５時間撹拌した。反応液にピリジン塩酸塩（３．０２ｇ、２６．１ｍｍｏｌ）を加えて１０分間撹拌した後に、ろ過した。ろ液を濃縮後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一（クロロホルム：メタノール＝９０：１０→７５：２５）で精製し、白色固体物質として化合物６６（１．５３ｇ、３７％）を得た。
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.90 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.82 (2H, s), 7.70 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.44-7.41 (3H, m), 7.34 (2H, t, J = 7.4 Hz), 5.53 (1H, d, J = 5.0 Hz), 4.32 (2H, d, J = 7.0 Hz), 4.22 (1H, t, J = 6.7 Hz), 3.71 (1H, s), 3.12-3.06 (1H, m), 3.03-2.96 (1H, m), 2.87 (1H, dd, J = 12.9, 2.6 Hz), 2.60 (1H, dd, J = 12.9, 9.2 Hz).
ESI-MS(m/z) : 313 (M+1). 
工程２
パルミチン酸（３００ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．０ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（２．０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（０．３１ｍＬ、１．７６ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（４８９ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）を加え、室温で激しく３０分間撹拌した。得られた白濁溶液に対して、室温で化合物６６（４０９ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ）を加えて３日間撹拌した。反応液に飽和重そう水（８．０ｍＬ）と水（２．０ｍＬ）を加え反応を停止した後に、白色固体をろ取した。得られた固体を水（４０ｍＬ）で洗浄後、白色固体として化合物６７−１４（７１９ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）を得た。
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.89 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.77 (1H, t, J = 5.6 Hz), 7.70 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.41 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.33 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.22 (1H, t, J = 5.8 Hz), 4.95 (1H, s), 4.28-4.19 (3H, m), 3.51 (2H, t, J = 5.6 Hz), 3.14-3.08 (2H, m), 3.02-2.89 (4H, m), 2.07 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.47 (2H, s), 1.22 (19H, s), 0.94 (2H, d, J = 6.5 Hz), 0.85 (3H, t, J = 6.8 Hz).
ESI-MS(m/z) : 552 (M+1).
工程３
３−１）工程１〜４と同様の方法により、化合物６７−１４から化合物６８−１４を合成した。
ESI-MS (m/z) : 1125 (M-H). HPLC Peak RT = １．０９ min
工程４
３−１）工程５と同様の方法により、化合物６８−１４の担持量が１０８μｍｏｌ／ｇの化合物６９−１４を合成した。【０１３７】
１５）化合物７４−ｋ―ｎ’の合成
【化６４】
2018181428.tif 000065
（式中、ｋは０〜４の整数であり、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１３８】
１５−１）化合物７４−３−１４の合成
工程１
パルミチン酸（２０９ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６．０ｍＬ）に溶解し、ＨＢＴＵ（３０９ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間撹拌した。反応液に化合物７０−３（３００ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ、渡辺化学工業株式会社）とＤＩＥＡ（０．１４ｍＬ、０．８１ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で５分間撹拌した後、室温で３時間撹拌した。反応液へ２Ｍ塩酸を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一（クロロホルム：メタノール＝１００：０→９０：１０）で精製し、白色固体物質として化合物７１−３−１４（４９１ｍｇ、９９％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.76 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.58 (2H, d, J = 6.9 Hz), 7.39 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.30 (2H, t, J = 7.4 Hz), 6.43 (1H, d, J = 7.3 Hz), 5.08 (1H, s), 4.58-4.18 (5H, m), 3.19-3.06 (3H, m), 2.21 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.90-1.24 (30H, m), 0.87 (3H, t, J = 6.5 Hz).
ESI-MS(m/z) : 608 (M+1).
工程２
化合物７１−３−１４（２４０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２．５ｍＬ）、ジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）に懸濁し、ＤＩＥＡ（０．２１ｍＬ、１．１９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１６５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を加え、室温で１５分間撹拌した。米国特許出願公開第２００９／２５９０３０号明細書を参照し、合成した６−アミノ−２−（（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）ヘキサンー１−オール（１７８ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．５ｍＬ）溶液を反応液に加えて室温で３時間撹拌した。反応液へ飽和重曹水を加えて酢酸エチルで抽出した。有機層を水、飽和食塩水で洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去し、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィ一（ヘキサン：酢酸エチル＝７０：３０→１０：９０）で精製し、白色固体物質として化合物７２−３−１４（１４６ｍｇ、３６％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.76 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.58 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.39 (4H, t, J = 7.4 Hz), 7.32-7.28 (8H, m), 7.20 (1H, t, J = 7.3 Hz), 6.82 (4H, d, J = 8.8 Hz), 6.21-6.15 (2H, m), 4.96 (1H, d, J = 6.1 Hz), 4.42-4.28 (3H, m), 4.20 (1H, t, J = 6.8 Hz), 3.78 (6H, s), 3.65-3.60 (2H, m), 3.24-3.18 (4H, m), 3.05 (1H, dd, J = 9.1, 7.3 Hz), 2.62 (1H, t, J = 5.6 Hz), 2.16 (2H, t, J = 7.0 Hz), 1.84-1.76 (2H, m), 1.55-1.23 (38H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
ESI-MS(m/z) : 1039 (M+1).
工程３
３−１）工程１〜４と同様の方法により、化合物７２−３−１４から化合物７３−３−１４を合成した。
ESI-MS (m/z) : 1137 (M-H). HPLC Peak RT = １．３４ min
工程４
３−１）工程５と同様の方法により、化合物７３−３−１４の担持量が１２０μｍｏｌ／ｇの化合物７４−３−１４を合成した。【０１３９】
１６）化合物７５―ｎ’’の合成
【化６５】
2018181428.tif 000066
（式中、ｎ’’は２〜２９の整数である。）
１６−１）化合物７５−２の合成
化合物２−２（３００ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４．５ｍＬ）にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（４３１ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）を加えた。続いて、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７７３ｍｇ、３．７５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１．５ｍＬ）加え、室温で２時間撹拌した。生成した固体をろ過で除いた後、ろ液を濃縮して化合物７５−２（４７６ｍｇ、７５％）を無色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.59 (2H, t, J = 7.3 Hz), 1.84-1.74 (2H, m), 1.05 (3H, t, J = 7.5 Hz).
ESI-MS(m/z) : 186 (M+1).【０１４０】
１６−２）１６−１）と同様の方法により、以下の化合物を合成した。
化合物７５−６（８０３ｍｇ、７７％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.71 (2H, m), 1.42-1.29 (8H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.5 Hz).
ESI-MS(m/z) : 242 (M+1).
化合物７５−１０（２３２ｍｇ、５２％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.71 (2H, m), 1.42-1.20 (16H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
ESI-MS(m/z) : 298 (M+1).
化合物７５−１２（４０２ｍｇ、５６％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.78-1.70 (2H, m), 1.40 (2H, t, J = 6.8 Hz), 1.26 (18H, s), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
化合物７５−１６（２５６ｍｇ、６２％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.70 (2H, m), 1.44-1.26 (24H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).
化合物７５−１８（３１０ｍｇ、７９％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.78-1.70 (2H, m), 1.42-1.25 (32H, m), 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz).【０１４１】
１６−３）１６−１）と同様の方法により、以下の化合物を合成した。
【化６６】
2018181428.tif 000067
【０１４２】
化合物７６（４２９ｍｇ、８２％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (4H, s), 2.59 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.79-1.71 (2H, m), 1.63-1.53 (1H, m), 1.32-1.26 (2H, m), 0.90 (6H, d, J = 6.7 Hz).
ESI-MS(m/z) : 228 (M+1).
化合物７７（３０２ｍｇ、６０％）、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, d, J = 4.0 Hz), 2.63-2.56 (1H, m), 1.82-1.56 (4H, m), 1.43-1.31 (4H, m), 1.03 (3H, t, J = 7.5 Hz), 0.92 (3H, t, J = 7.0 Hz).
ESI-MS(m/z) : 242 (M+1).
化合物７８（２２４ｍｇ、５４％）、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, d, J = 4.8 Hz), 2.68-2.61 (1H, m), 1.78-1.68 (2H, m), 1.63-1.54 (2H, m), 1.43-1.26 (20H, m), 0.89-0.86 (6H, m).
化合物７９（２９６ｍｇ、８４％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.82 (4H, s), 2.68-2.60 (1H, m), 1.74-1.68 (2H, m), 1.61-1.56 (2H, m), 1.40-1.25 (64H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.5 Hz).
化合物８０（３７３ｍｇ、８２％）、白色固体物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.83 (4H, s), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.76-1.67 (6H, m), 1.45-1.37 (2H, m), 1.26-1.11 (7H, m), 0.90-0.82 (2H, m).
ESI-MS(m/z) : 282 (M+1).
化合物８１（４７６ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）、白色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 3.68-3.63 (6H, m), 3.49-3.47 (2H, m), 3.01 (2H, t, J = 7.1 Hz), 2.87-2.82 (4H, m), 2.74 (2H, t, J = 7.1 Hz).
ESI-MS(m/z) : 285 (M+1).
化合物８２（４５９ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 5.40-5.33 (4H, m), 2.83 (4H, s), 2.77 (2H, t, J = 6.3 Hz), 2.60 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.05 (4H, q, J = 6.7 Hz), 1.78-1.71 (2H, m), 1.43-1.26 (14H, m), 0.89 (3H, t, J = 6.7 Hz).
ESI-MS(m/z) : 378 (M+1).
化合物８３（４３３ｍｇ、ｑｕａｎｔ．）、無色油状物質
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.01 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.88 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.77 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.58-7.49 (2H, m), 7.45-7.39 (2H, m), 3.53 (2H, t, J = 8.0 Hz), 3.06 (2H, t, J = 8.0 Hz), 2.86 (4H, s).
ESI-MS(m/z) : 298 (M+1).【０１４３】
１７）化合物８４の合成
【化６７】
2018181428.tif 000068
【０１４４】
化合物８４（２００ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、渡辺化学工業株式会社）のジクロロメタン溶液（４．０ｍＬ）に化合物８５（０．２２ｍＬ、１．２７ｍｍｏｌ、和光純薬株式会社）を加え、室温で６時間撹拌した。反応液を濃縮して化合物８６の粗生成物（５６３ｍｇ）を無色油状物質として得た。
ESI-MS (m/z) : 324 (M+H). HPLC Peak RT = １．２９ min【０１４５】
１８）化合物８８の合成
【化６８】
2018181428.tif 000069
【０１４６】
化合物８７（８００ｍｇ、１．８６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）にビス（ニトロフェニル）カーボネート（８４８ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．３９ｍＬ、２．７９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧留去した後、得られた粗製物をシリカゲルカラムクロマ卜グラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１００：０→９０：１０）で精製し、化合物８８（１．２１ｇ、ｑｕａｎｔ．）を黄色油状物質として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.31 (2H, d, J = 9.2 Hz), 7.48 (2H, d, J = 9.2 Hz), 2.62 (2H, t, J = 6.7 Hz), 2.16 (3H, s), 2.12 (6H, s), 1.87-1.74 (2H, m), 1.60-1.05 (24H, m), 0.87-0.83 (12H, m).
ESI-MS(m/z) : 596 (M+1).【０１４７】
１９）化合物９０−ｋ―ｎ’の合成
【化６９】
2018181428.tif 000070
（式中、ｋは０〜４の整数であり、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１４８】
１９−１）化合物９０−３−１２の合成
工程１
１５−１）工程１〜３と同様の方法により、化合物７０−３及び化合物９−１２から化合物８９−３−１２を合成した。
ＬＣ／ＭＳ：  Ｒｔ＝２．４８ｍｉｎ  ［Ｍ−］  ｍ／ｚ：  １４３５
工程２
３−１）工程５と同様の方法により、化合物８９−３−１２の担持量が６８μｍｏｌ／ｇの化合物９０−３−１２を合成した。【０１４９】
２０）化合物９５−ｋ−ｎ’の合成
【化７０】
2018181428.tif 000071
（式中、ｋは０〜４の整数であり、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１５０】
２０−１）化合物９５−３−１２の合成
工程１
１５−１）工程１と同様の方法により、化合物９１−３から化合物９２−３−１２を淡赤色固体（１．１１ｇ）として得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.16 (1H, d, J = 7.7 Hz), 5.64 (1H, m), 4.58 (1H, td, J = 8.1, 4.6 Hz), 3.74 (3H, s), 3.27-3.23 (2H, m), 2.23-2.16 (4H, m), 1.86-1.82 (2H, m), 1.74-1.28 (48H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程２
化合物９２−３−１２（１．１７ｇ）をＴＨＦ（１２ｍＬ）に溶解し、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）を加え一晩撹拌した。アセトニトリル（４０ｍＬ）を加えることで生成した沈殿物をろ取し、粗固体を得た。その後、酢酸エチル（５０ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  塩酸水溶液（４０ｍＬ）で有機相を洗った。有機層を水洗し、その後飽和食塩水で脱水して無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、減圧濃縮を行い、化合物９３−３−１２を無色個体（１９９ｍｇ）として得た（収率１８％）。
1H-NMR (CDCl3) δ: 6.82 (1H, d, J = 7.0 Hz), 5.81 (1H, t, J = 6.0 Hz), 4.51 (1H, td, J = 7.4, 4.6 Hz), 3.37 (1H, td, J = 13.8, 6.9 Hz), 3.18 (1H, dt, J = 19.4, 5.7 Hz), 2.33-2.25 (2H, m), 2.19 (2H, t, J = 7.7 Hz), 1.95-1.77 (2H, m), 1.63-1.25 (49H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
工程３
３−１）工程１と同様の方法により、化合物９３−３−１２から化合物９４−３−１２を合成した。
ｍ／ｚ  １０９７．８４［Ｍ−Ｈ］
工程４
３−１）工程５と同様の方法により、化合物９４−３−１２の担持量が８４μｍｏｌ／ｇの化合物９５−３−１２を合成した。【０１５１】
２０−２）２０−１）と同様の方法により、以下の化合物を合成した。
化合物９４−３−１４
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.35-6.82 (13H), 6.47 (1H, m), 6.20 (1H, t, 6 Hz), 6.02 (1H, t, 6 Hz), 4.51 (1H, q, J = 7.5 Hz), 4.42 (1H, dd, J = 8.1, 3.6 Hz), 4.18 (1H, d, J = 5.6 Hz), 4.09 (1H, dd, J = 11.0, 4.3 Hz), 3.77 (6H, s), 3.42-2.97 (8H, m), 2.72-1.74 (12H, m), 1.60-1.15 (58H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
化合物９４−３−１４の担持量が６０μｍｏｌ／ｇの化合物９５−３−１４
化合物９４−３−１６
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.02-6.81 (13H), 6.40 (1H, dd, J = 8.9, 4.4 Hz), 6.18 (1H, t, J = 6.4 Hz), 5.97 (1H, t, J = 6.5 Hz), 4.53 (1H, dd, J = 15.9, 7.4 Hz), 4.44 (1H, d, J = 11, 4 Hz), 4.20-4.15 (1H, m), 4.09 (1H, dd, J = 11.1, 4.0 Hz), 3.79 (6H, s), 3.45-3.00 (8H, m), 2.78-2.42 (4H, m), 2.20 (4H, m), 2.04-1.24 (62H, m), 0.88 (6H, t, J = 6.8 Hz).
化合物９４−３−１６の担持量が６５μｍｏｌ／ｇの化合物９５−３−１６
化合物９４−２−１４
ｍ／ｚ  １１３８．７４［Ｍ―Ｈ］
化合物９４−２−１４の担持量が７７μｍｏｌ／ｇの化合物９５−２−１４【０１５２】
２１）化合物９７の合成
【化７１】
2018181428.tif 000072
【０１５３】
工程１
２０−１）工程１〜３と同様の方法により、化合物７８から化合物９６を合成した。
ｍ／ｚ  １１５３．０４［Ｍ―Ｈ］
工程２
３−１）工程５と同様の方法により、化合物９６の担持量が５２μｍｏｌ／ｇの化合物９７を合成した。【０１５４】
２２）化合物１００−ｊ−ｎ’の合成
【化７２】
2018181428.tif 000073
（式中、ｊは１〜３の整数であり、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１５５】
２２−１）化合物１００−３−１８の合成
工程１
１５−１）工程１〜３と同様の方法により、化合物９８−３より化合物９９−３−１８を合成した。
1H-NMR (CDCl3) δ: 7.42 (2H, d, J = 7.4 Hz), 7.30 (5H, d, J = 8.7 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.2 Hz), 6.81 (5H, d, J = 8.7 Hz), 6.74 (1H, t, J = 5.8 Hz), 6.26 (1H, t, J = 5.9 Hz), 5.55 (1H, t, J = 5.9 Hz), 4.72-4.67 (1H, m), 3.79 (6H, s), 3.58-3.49 (17H, m), 3.32-3.27 (6H, m), 3.14 (2H, q, J = 6.5 Hz), 3.04 (2H, d, J = 5.4 Hz), 2.49-2.46 (4H, m), 2.20 (5H, t, J = 7.5 Hz), 1.76-1.72 (4H, m), 1.65-1.62 (10H, m), 1.42-1.41 (3H, m), 1.25 (68H, s), 0.88 (6H, t, J = 6.6 Hz).
工程２
３−１）工程５と同様の方法により、化合物９９−３−１８の担持量が５６μｍｏｌ／ｇの化合物１００−３−１８を合成した。【０１５６】
２３）化合物１０１及び１０２の合成
【化７３】
2018181428.tif 000074
【０１５７】
フィルター付カラムに樹脂を入れ（Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ  ｒｅｓｉｎ、１００ｕｍｏｌ、渡辺化学工業株式会社）、脱保護反応（２０％  ピペリジン  ２ｍＬ／１００ｕｍｏｌ  ｒｅｓｉｎ）と縮合反応（３００ｕｍｏｌ  保護アミノ酸、３００ｕｍｏｌ  ＨＢＴＵ、３００ｕｍｏｌ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物、６００ｕｍｏｌ  ＤＩＥＡ、ＤＭＦ／ＮＭＰ（１：１）２ｍＬ／１００ｕｍｏｌ  ｒｅｓｉｎ）を繰り返すことによりペプチド鎖を伸長した。
ペプチドＮ末端の合成においては、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（渡辺化学工業株式会社）を用いて上記と同様にペプチド伸長・脱保護反応を行った後、ミリスチン酸を樹脂上のペプチドと縮合（３００ｕｍｏｌ  ミリスチン酸、３００ｕｍｏｌ  ＨＢＴＵ、６００ｕｍｏｌ  ＤＩＥＡ、クロロホルム／ＮＭＰ（１：１）  ２ｍＬ／１００ｕｍｏｌ  ｒｅｓｉｎ）することで、脂質ペプチドを合成した。切り出し溶液（ＴＦＡ  ９２．５％、Ｈ２Ｏ  ２．５％、ＴＩＳ  ２．５％、ＤＯＤＴ  ２．５％、２ｍＬ／１００ｕｍｏｌ  ｒｅｓｉｎ）を合成カラムに加えて室温で一時間反応させた後ろ過し、ろ液に溶媒（アセトニトリル又は水）を加え、沈殿物を回収した。該沈殿物をＤＭＳＯに溶解し、逆相精製（ＹＭＣ  Ｐａｃｋ  Ｃ４、１５０ｘ１０ｍｍＩ．Ｄ．、流速  ３−５ｍＬ／ｍｉｎ、１０ｍＭ  ＴＥＡＡ−アセトニトリル、イソクラティック溶出（５０％アセトニトリルで流した後、９５％アセトニトリルで溶出）、検出  ２６０ｎｍ、２８０ｎｍ）を行った。回収したフラクションを濃縮、凍結乾燥して脂質ペプチド（例えば化合物１０１及び１０２等）を白色固体として得た。
化合物１０１  [M+H]+, calc. 997.68824, obs. 997.4476
化合物１０２  [M+H]+, clac. 1082.77739, obs. 1082.7048【０１５８】
２４）化合物１０３の合成
【化７４】
2018181428.tif 000075
【０１５９】
１６−１）と同様の方法により、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（渡辺化学工業株式会社）から化合物１０３を合成した。
ESI-MS, [M+H]+ calc. 688.26534, obs. 688.4007【０１６０】
２４）化合物１０５−ｎ’の合成
【化７５】
2018181428.tif 000076
（式中、ｎ’は５〜２９の整数である。）【０１６１】
２４−１）化合物１０５−１４の合成
１−１）工程１及び３−１）工程１と同様の方法により、化合物１０４より化合物１０５−１４を合成した。
ESI-MS(m/z) : ７７９ (M-H).【０１６２】
２５）化合物１１２の合成
【化７６】
2018181428.tif 000077
【０１６３】
工程１
６−Ｎ−Ｂｏｃ―カプロン酸（１．０ｇ、Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＥＡ（２．３ｍＬ）とＨＢＴＵ（１．８ｇ）を加えて室温で１５分間撹拌した。化合物１０６（０．４５ｇ、東京化成株式会社）を加えて室温で一晩撹拌した。飽和重曹水（５０ｍＬ）に反応液を加えて酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出し、有機層を減圧濃縮してフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、Ａ溶媒  クロロホルム／Ｂ溶媒  ２５％メタノール―クロロホルム、１５分間で０→５％Ｂ溶媒のグラジエント）で精製を行い、化合物１０７を茶色油状物質（１．１２ｇ）として得た（収率４４％）。
ｍ／ｚ  ５８５．１９［Ｍ―Ｈ］―（ＥＳ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ５８６．３９４［Ｍ］
工程２
化合物１０７（１．１２ｇ）をジクロロメタン（５．６ｍＬ）に溶解し，ＴＦＡ（５．６ｍＬ）を加えて室温で３０分間撹拌した。その後、トルエン共沸操作を二回繰り返しＴＦＡを除き、乾燥することで化合物１０８を橙色オイル状物質（１．９ｇ）として得た。
ｍ／ｚ  ３８７．４４［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ３８６．２８９［Ｍ］
工程３
化合物１０８（１．９ｇ）を１，４−ジオキサン／水（１：１、１４．６ｍＬ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（１．５８ｇ）を加えた。クロロぎ酸９−フルオレニルメチル（１．０８ｇ）を加えて加熱しながら撹拌した。炭酸水素ナトリウム（０．７９ｇ）を加え、室温まで冷却し固体をろ取した。該固体を酢酸エチルに再溶解し、ｎ―ヘキサンを加えて析出した固体をろ取し、乾燥することで化合物１０９（１．９３ｇ）を白色固体を得た。
ｍ／ｚ  ８３１．４６［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ８３０．４２５［Ｍ］【０１６４】
工程４
化合物１０９（０．５０ｇ）をジクロロメタン（５ｍＬ）に懸濁し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（０．６１ｍＬ）と塩化アルミニウム（ＩＩＩ）（０．４０ｇ）を加えた。１時間還流しながら撹拌し、その後１Ｍ塩酸（２０ｍＬ）を滴下することで反応を停止した。酢酸エチル（２ｘ３０ｍＬ）を加えて抽出し、得られた有機層を水洗した（２ｘ３０ｍＬ）。その後飽和食塩水で脱水し、濃縮乾固し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカタイプ、Ａ溶媒  クロロホルム／Ｂ溶媒  ２５％  メタノール―クロロホルム、１２分間で０→５０％  Ｂ溶媒のグラジエント条件）で精製し、化合物１１０を無色固体（３２ｍｇ）として得た（収率７％）。
ｍ／ｚ  ８１５．３２［Ｍ―Ｈ］―（ＥＳ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ８１６．４１０［Ｍ］
工程５
３−１）工程４と同様の方法により、化合物１１０から化合物１１１を合成した。
ｍ／ｚ  １２４８．３８［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  １２４７．６５６［Ｍ］
工程６
３−１）工程５と同様の方法により、化合物１１１の担持量が４５μｍｏｌ／ｇの化合物１１２を合成した。【０１６５】
２６）化合物１２０の合成
【化７７】
2018181428.tif 000078
【０１６６】
工程１
化合物１１３（２ｇ、Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解し、１，２―ジ（ピリジン―２―イル）ジスルファン（１．９１ｇ）を加えて室温で一日撹拌した。１Ｍ  塩酸水溶液（５０ｍＬ）に滴下して反応を停止し、酢酸エチル（２ｘ５０ｍＬ）で抽出した。得られた有機層を濃縮して化合物１１４を黄色油状物質（２．４４ｇ）として得た（収率８３％）。
ｍ／ｚ  ３４０．３８［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ３３９．２０５［Ｍ］
工程２
化合物１１４（１．２２ｇ）をメタノール（２ｍＬ）に溶解し、Ｌ−エチルシステイン塩酸塩（０．５３ｇ）を加え室温で一晩撹拌した。アセトニトリル（５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。該固体をアセトニトリルで洗浄し、乾燥することで化合物１１５を無色固体（０．９８ｇ）として得た（収率７２％）。
ｍ／ｚ  ３７８．９６［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ３７７．２４２［Ｍ］
工程３
化合物１１５（４００ｍｇ）を１，４―ジオキサン（４ｍＬ）とテトラヒドロフラン（４ｍＬ）と水（１ｍＬ）に溶解し、炭酸水素ナトリウム（２２２ｍｇ）とＤＩＥＡ（４６２μＬ）とクロロぎ酸９−フルオレニルメチル（１７４ｍｇ）を加えて室温で３時間撹拌した。クロロぎ酸９−フルオレニルメチル（８０ｍｇ）を追加して更に室温で１時間撹拌し、反応を完結させた。反応液を水（５０ｍＬ）と酢酸エチル（５０ｍＬ）で分液し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカタイプ、Ａ溶媒  ｎ―ヘキサン／Ｂ溶媒  酢酸エチル、２０分間で０→２０％  Ｂ溶媒のグラジエント条件）で精製し、化合物１１６を無色アモルファス（５３４ｍｇ）として得た（収率８４％）。
ｍ／ｚ  ５９９．６４［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ５９９．３１０［Ｍ］【０１６７】
工程４
化合物１１６（５３４ｍｇ）をテトラヒドロフラン（５．３ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液（２ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌した。反応溶液を１Ｍ  塩酸水溶液（４０ｍＬ）と酢酸エチル（４０ｍＬ）で分液を行い、得られた有機層を二回水洗した。有機層を飽和食塩水で洗い、有機層を減圧濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカタイプ、Ａ溶媒  クロロホルム／Ｂ溶媒  ２５％メタノール―クロロホルム、１５分間で０→２０％  Ｂ溶媒のグラジエント条件）で精製し、目的の化合物１１７を無色オイル状物質（３０ｍｇ）として得た（単離収率６％）。
ｍ／ｚ  ５７２．３４［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ５７１．２７９［Ｍ］
工程５
１６−１）工程１と同様の方法により、化合物１１７から化合物１１８を合成した。
ｍ／ｚ  ５７２．３４［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  ５７１．２７９［Ｍ］
工程６
３−１）工程４と同様の方法により、化合物１１８から化合物１１９を合成した。
ｍ／ｚ  １０２４．３４［Ｍ＋Ｎａ］＋（ＥＳ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ）、理論値  １０２４．５２［Ｍ＋Ｎａ］＋
工程７
３−１）工程５と同様の方法により、化合物１１９の担持量が３２μｍｏｌ／ｇの化合物１２０を合成した。【０１６８】
２７）その他化合物について
【化７８】
2018181428.tif 000079
化合物１２１は米国特許第６１５３７３７号明細書を参考に合成した。【０１６９】
【化７９】
2018181428.tif 000080
化合物１２２は非特許文献Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ２００８，  １３０，  １１４６７−１１４７６を参考に合成した。【０１７０】
【化８０】
2018181428.tif 000081
化合物１２３はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。【０１７１】
【化８１】
2018181428.tif 000082
化合物１２４はＬｉｎｋ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から購入した。【０１７２】
Ｂ）オリゴヌクレオチドの合成
本明細書の実施例に利用したオリゴヌクレオチドはＡＫＴＡ  Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ１０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＮＳ−８−Ｉ（大日本精機)、ＮＳ−８−ＩＩ（大日本精機）を用いて、ホスホロアミダイト法により合成した。モノマーは上記アミダイト合成で得られたアミダイトを用いて、０．１Ｍアセトニトリル溶液に調製した。カップリング時間は３２秒〜１０分間とし、１つのモノマーの縮合に８〜１０当量のアミダイト体を用いた。ＰＯ酸化には０．０２Ｍ  Ｏｘｉｄｉｚｅｒ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、ヨウ素／ピリジン／水／＝１２．７／９／１（ｗ／ｖ／ｖ）を使用し、ＰＳ酸化には５０ｍＭ  ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾリン−３−チオン）のアセトニトリル／３−ピコリン１／１（ｖ／ｖ）、１／４（ｖ／ｖ）、アセトニトリル／ピリジン１／４（ｖ／ｖ）溶液を用いた。活性化剤はＥＴＴ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５−エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール）（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）、キャッピング試薬はＣａｐＡ、ＣａｐＢ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。脱トリチル化試薬はＤｅｂ（３ｗ／ｖ％ＴＣＡ  ＣＨ２Cｌ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（和光純薬）、Ｄｅｂ（３ｗ／ｖ％  Ｄｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｎ  ａｃｉｄ、Ｔｏｌｕｅｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を使用した。
なお、ＮＡ−６、ＮＡ−７、ＮＡ−２１、ＮＡ−２３は、ジーンデザイン社に核酸合成及びオリゴヌクレオチドの精製を委託することで得た。【０１７３】
Ｃ）脂質結合オリゴヌクレオチドの合成
１）合成アミダイト体からの合成−１
上記Ａ）で合成した合成アミダイト（例えば、化合物５−ｎ’等）を用いて、上記Ｂ）と同様の方法で望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
２）合成アミダイト体からの合成−２
Ｂｉｏｔａｇｅ社製マイクロウェーブチューブ（２−５ｍｌ、１０−２０ｍｌ）に撹拌子、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｅｖｅｓ  ４Ａ  １／１６及び上記Ａ）で合成した合成アミダイト（例えば、化合物５−ｎ’等。オリゴヌクレオチドの１０〜１００等量）を入れ、クロロホルム（安定化剤として２−メチル−２−ブテン添加）で０．２Ｍに調製する。５時間乾燥後、オリゴヌクレオチドが結合した固相（ＣＰＧ樹脂、ポリスチレン樹脂）、０．２５Ｍ  ＥＴＴ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（５−エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール）ジクロロメタン溶液（クロロホルムと同量）を加え密閉し、４０℃で１０分〜１時間加熱する。室温へ放冷後、反応溶液をクロロホルムで２倍希釈し、樹脂をろ取する。得られた樹脂をＮＳ−８−Ｉ（大日本精機)、ＮＳ−８−ＩＩ（大日本精機）上でＰＳ酸化する。その後乾燥した樹脂を下記Ｄ）の脱保護に付し、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成する。【０１７４】
３）脂質を担持した樹脂からの合成
上記Ａ）で合成した脂質を担持した樹脂（例えば、化合物１３−ｎ’、化合物２７−ｎ’、化合物３３−ｓ’−ｔ’−ｕ’等）を用いて、上記Ｂ）と同様の方法で望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
４）活性化体からの合成
エッペンチューブ（１．５ｍｌ）にアミノ基リンカーを有する１本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＡ−２３、ＮＡ−２４等）を入れ、ＤＭＳＯ（０．５％  ＤＩＥＡ添加）と重そう水（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３）を１：５で加え１ｍＭに調製し、上記Ａ）で合成した化合物（例えば、化合物１４−ｎ’等。ＤＭＳＯ溶液としてオリゴヌクレオチドの２〜１０等量）を入れ、室温〜７０℃で２時間静置することで、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
５）脂質アミノ酸からの合成
アミノ基リンカーを有する１本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＡ−２３、ＮＡ−２４等）（１．２ｕｍｏｌ）と６−マレイミドヘキサン酸  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（２６ｕｍｏｌ）とを混合し、０．１％  ＤＩＥＡ存在下、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中、２〜４時間、室温で反応させ、反応液を限外ろ過した後、凍結乾燥により白色固体を得た。
得られた白色固体と上記Ａ）で合成した化合物（例えば、化合物１００、１０１等。オリゴヌクレオチドの２〜５０等量）を４ｍＬの溶媒（ＤＭＳＯ／アセトニトリル（１：１）またはＤＭＳＯ）に溶かし、室温で反応させることで、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。
６）脂溶性ペプチドからの合成
アミノ基リンカーを有する１本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＮＡ−２３、ＮＡ−２４等）の２５ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に１０倍当量のＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ  （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加えて、室温下５時間振とう撹拌した。反応液から限外濾過キット（分子量カットオフ３，０００）を用いて、過剰のＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅを除去した。続いて、上記Ａ）で合成した化合物（例えば、化合物１２３。オリゴヌクレオチドの３〜１０等量）を加え、４０℃で１時間反応させることで、望みの脂質結合オリゴヌクレオチドを合成した。【０１７５】
Ｄ）切出し・脱保護
１）樹脂からの切り出し、塩基及びリン酸の脱保護
オリゴヌクレオチドの切り出しは２８％アンモニア水／４０％メチルアミン水溶液／ＥｔＯＨ＝４／４／１（ｖ／ｖ）を用いて、室温下で４時間振とうした。１μｍｏｌ合成の際は、アンモニア溶液を１ｍｌ用い、５μｍｏｌ又は１０μｍｏｌ合成の際は、５ｍｌ、１０ｍｌそれぞれ用いて切り出し反応を行った。樹脂を５０％エタノール水で洗浄後、ろ過液を減圧下で１〜５ｍＬ程度まで濃縮した。
２）樹脂上でのＦｍｏｃ及びリン酸の脱保護
Ｃ）の５）の合成終了後、樹脂を２０％ピぺリジン含有ＤＭＦ溶液で洗浄した。【０１７６】
Ｅ）精製
脂質を導入していないオリゴヌクレオチドは条件１の逆相ＨＰＬＣで精製を行った。 
逆相ＨＰＬＣの条件
条件１
移動相  Ａ液：１００ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ７．０）水溶液あるいは１００ｍＭ  ＡｃＯＮａ水溶液（ｐＨ５．４）
Ｂ液：アセトニトリル
Ｂ濃度グラジエント：１０−３０％
（条件１−１）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（ＹＭＣ社製）１００ｘ２０ｍｍI．Ｄ、Ｓ−５  μｍ、１２  ｎｍ
流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ
（条件１−２）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（ＹＭＣ社製）１５０ｘ１０ｍｍI．Ｄ、Ｓ−５  μｍ、１２  ｎｍ
流速：４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ【０１７７】
脂質を導入したオリゴヌクレオチドは条件２の逆相ＨＰＬＣで精製を行った。 
条件２
逆相ＨＰＬＣの条件
化合物の脂溶性に応じ、開始時のＢ濃度を２０％〜５０％まで調節した
移動相  Ａ液：１００ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ７．０）水溶液あるいは１００ｍＭ  ＡｃＯＮａ水溶液（ｐＨ５．４）
Ｂ液：アセトニトリル
Ｂ濃度グラジエント：２０−８０％
（条件２−１）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｃ４（ＹＭＣ社製）１００ｘ２０ｍｍｌ．Ｄ、Ｓ−５  μｍ、１２  ｎｍ
流速：１０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ
（条件２−２）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｃ４（ＹＭＣ社製）１５０ｘ１０ｍｍｌ．Ｄ、Ｓ−５  μｍ、１２  ｎｍ
流速：４ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：室温
検出ＵＶ：２６０ｎｍ【０１７８】
Ｆ）精製オリゴヌクレオチドの脱塩及び凍結乾燥
得られたオリゴヌクレオチドはＶｉｖａＳｐｉｎ２０（ＭＷＣＯ  ３０００）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製）、アミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）−４  遠心式フィルターユニット−３Ｋを用いて、限外濾過を繰り返すことでフラクションに含まれる塩成分を除去した。その後、凍結乾燥にて目的とするオリゴヌクレオチドを粉末として得た。なお、ＴＥＡＡ溶媒を用いて精製したオリゴヌクレオチドに対しては１００ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で塩フォームの変換を行った後に脱塩操作を行った。【０１７９】
Ｇ）オリゴヌクレオチドの構造確認
得られたオリゴヌクレオチドは、ＵＰＬＣ／ＭＳ測定による実測分子量が理論分子量と一致することで、目的の配列が合成できていることを確認した。
条件１（脂質を導入していないオリゴヌクレオチド）
Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｔｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
Ｃｏｌｕｍｎ：Ａｑｕｉｔｙ  ＯＳＴ  Ｃ１８（２．１ｘ５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相  Ａ液：２００ｍＭ  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／８ｍＭトリエチルアミン
Ｂ液：メタノール
Ｂ濃度グラジエント：１０−３０％（１０ｍｉｎ）
温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
条件２（脂質を導入したオリゴヌクレオチド）
Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｔｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｐｒｏｔａｉｎ  ＢＥＨ  Ｃ４  Ｃｏｌｕｍｎ、３００Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、１／ｐｋｇ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相  Ａ液：２００ｍＭ  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／８ｍＭトリエチルアミン
Ｂ液：メタノール
Ｂ濃度グラジエント：１０−９５％（１０ｍｉｎ）
温度：５０℃
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ【０１８０】
合成したオリゴヌクレオチドを表１〜１０に示す。
【表１】
2018181428.tif 000083
【０１８１】
【表２】
2018181428.tif 000084
【０１８２】
【表３】
2018181428.tif 000085
【０１８３】
【表４】
2018181428.tif 000086
【０１８４】
【表５】
2018181428.tif 000087
【０１８５】
【表６】
2018181428.tif 000088
【０１８６】
【表７】
2018181428.tif 000089
【０１８７】
【表８】
2018181428.tif 000090
【０１８８】
【表９】
2018181428.tif 000091
【０１８９】
【表１０】
2018181428.tif 000092
【０１９０】
表１〜１０において、ｎ（小文字）は２’−Ｆ−ＲＮＡ、Ｎ（大文字）は２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ、ｒＮはＲＮＡ、ｄＮはＤＮＡを示す。＾は−Ｐ（Ｓ）ＯＨ−を、＊は―Ｐ（Ｏ）ＯＨ−を意味する。
【化８２】
2018181428.tif 000093
また、Ａｂ（Ａｂａｓｉｃ）は、以下で示される基である。
【化８３】
2018181428.tif 000094
Ｂｕは以下で示される基である。
【化８４】
2018181428.tif 000095
【０１９１】
Ｌはオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドリンカーも含み得る）の５’末端に導入した化合物を意味し、オリゴヌクレオチドの５’末端の置換又は非置換のメチレンに対して各化合物が表記の結合で共有結合していることを示す。Ｍはオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドリンカーも含み得る）の３’末端に導入した化合物を意味し、オリゴヌクレオチドの末端の糖の３’位に対して各化合物が表記の結合で共有結合していることを示す。【０１９２】
具体的には、Ｌｘ−ｎ’は、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドリンカーも含み得る）の５’末端に以下のように結合する。下記式中、ＯＬ５’は、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドリンカーの５’末端に上記表中に記載の通り、「＾（−Ｐ（Ｓ）ＯＨ−）」又は「*（―Ｐ（Ｏ）ＯＨ−）」を介して結合することを意味する。
【化８５】
2018181428.tif 000096
（式中、ｎ’は、５〜２９の整数である。）
Ｌ５−ｎ’は、上記Ａ）で合成した化合物５−ｎ’から誘導される基であり、Ｌ６５−ｎ’は、化合物６５−ｎ’から誘導される基である。）【０１９３】
Ｍｘ−ｎ’は、オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドリンカーも含み得る）の３’末端に以下のように結合する。下記式中、ＯＬ３’は、標的遺伝子の発現抑制活性を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドリンカーの３’末端に上記表中に記載の通り、「＾（−Ｐ（Ｓ）ＯＨ−）」又は「*（―Ｐ（Ｏ）ＯＨ−）」を介して結合することを意味する。
【化８６】
2018181428.tif 000097
（式中、ｎ’は、５〜２９の整数である。）
Ｍ１３−ｎ’は上記Ａ）で合成した化合物１３-ｎ’から誘導される基である。
Ｍ１３a−ｎ’はオリゴヌクレオチド以外の基に結合する基である。例えば、上記Ａ）で合成した化合物１２４から誘導される基であるＭ１２４にＭ１３−ｎ’が結合することを意味する。
【化８７】
2018181428.tif 000098
【０１９４】
【化８８】
2018181428.tif 000099
（式中、ｒ１は以下の置換基（ａｎ’’）〜（ｇ）のいずれかで示される基である。）
【化８９】
2018181428.tif 000100
（式中、ｎ’’は、２〜２９の整数である。）
Ｍ１３ｂ−ｒ１は上記Ａ）の化合物１３-ｎ’と同様の方法により合成され、化合物７５−ｎ’’（置換基（ａｎ’’））、化合物７７（置換基（ｂ））、化合物７８（置換基（ｃ））、化合物８０（置換基（ｄ））、化合物８３（置換基（ｅ））、化合物８２（置換基（ｆ））又は化合物８６（置換基（ｇ））から誘導される基である。【０１９５】
【化９０】
2018181428.tif 000101
（式中、ｎ’は、５〜２９の整数、ｓ’、ｔ’又はｕ’は、それぞれ独立して３〜２０の整数である。）
なお、Ｍ２７−ｎ’は上記Ａ）で合成した化合物２７-ｎ’から誘導される基であり、Ｍ３３−ｓ’−ｔ’−ｕ’は化合物３３−ｓ’−ｔ’−ｕ’から誘導される基である。【０１９６】
【化９１】
2018181428.tif 000102
（式中、ｍ’及びｎ’は、それぞれ独立して５〜２９の整数である。）
なお、Ｍ４２は上記Ａ）で合成した化合物４２から誘導される基であり、Ｍ４８−ｎ’は化合物４８-ｎ’から誘導される基であり、Ｍ５５−ｍ’−ｎ’は化合物５５−ｍ’−ｎ’から誘導される基である。【０１９７】
【化９２】
2018181428.tif 000103
（式中、ｎ’は、５〜２９の整数である。）
なお、ＭＮＡ−１０２は以下に記載のＮＡ−２４と化合物１０３から上記Ｃ）４）に従い誘導される基である。ＭＮＡ―８９は該ＮＡ−１０２と化合物７５−１２から上記Ｃ）４）に従い誘導される基である。【０１９８】
【化９３】
2018181428.tif 000104
（式中、ｎ’は、５〜２９の整数である。）
なお、Ｍ１２０は上記Ａ）で合成した化合物１２０から誘導される基であり、Ｍ１２０−ｎ‘はＮＡ−１０４と化合物７５−ｎ’’から上記Ｃ）４）に従い誘導される基である。【０１９９】
【化９４】
2018181428.tif 000105
（式中、ｎ’は、５〜２９の整数である。）
なお、Ｍ１１２−ｎ’は上記Ａ）で合成した化合物１１２と同様の方法により合成し、誘導される基であり、Ｍ９７は化合物９７から誘導される基である。【０２００】
【化９５】
2018181428.tif 000106
（式中、ｊは１〜３の整数であり、ｎ’は、５〜２９の整数である。）
なお、Ｍ１００−ｊ−ｎ’は上記Ａ）で合成した化合物１００−ｊ−ｎ’と同様の方法により合成し、誘導される基である。【０２０１】
【化９６】
2018181428.tif 000107
（式中、ｒ２は、ｒ１の置換基（ａｎ’’）〜（ｅ）、（ｇ）及び以下の（ｈ）、（ｉ）のいずれかで示される基である。）
【化９７】
2018181428.tif 000108
Ｍ１１２ｂ−ｒ２は上記Ａ）の化合物１１２と同様の方法により合成され、化合物７５−ｎ’’（置換基（ａｎ’’））、化合物７７（置換基（ｂ））、化合物７８（置換基（ｃ））、化合物８０（置換基（ｄ））、化合物８３（置換基（ｅ））、化合物８６（置換基（ｇ））、化合物７６（置換基（ｈ））又は化合物８１（置換基（ｉ））から誘導される基である。【０２０２】
【化９８】
2018181428.tif 000109
（式中、ｋは０〜４の整数であり、ｎ’は、１〜４の整数である。）
なお、Ｍ６９−ｎ’は上記Ａ）で合成した化合物６９-ｎ’から誘導される基であり、Ｍ７４−ｋは化合物７４−ｋ−１４から誘導される基であり、ＭＮＡ−９５は上記Ａ）で合成した化合物９５−２−１４から誘導される基である。【０２０３】
【化９９】
2018181428.tif 000110
（式中、ｒ３は、以下の置換基（ｊ）〜（ｌ）のいずれかで示される基である。）
【化１００】
2018181428.tif 000111
なお、Ｍ９０a及びＭ９０ｂ−ｒ３は、上記Ａ）で合成した化合物９０-ｋ−ｎ’及び化合物１２１（置換基（ｊ））、化合物１２２（置換基（ｋ））又は上記Ｃ）６）に従い化合物１２３（置換基（ｌ））から誘導される基である。【０２０４】
【化１０１】
2018181428.tif 000112
（式中、ｎ’は、５〜２９の整数である。）
なお、Ｍ１０５−ｎ’は、上記Ａ）で合成した化合物１０５−ｎ’から誘導される基である。【０２０５】
【化１０２】
2018181428.tif 000113
（式中、ｋは０〜４の整数であり、ｒ４は、以下の置換基（ｍ）〜（o）のいずれかで示される基である。）
【化１０３】
2018181428.tif 000114
なお、Ｍ９５−ｒ４は、上記Ａ）で合成した化合物９５−ｋ−１４及び化合物８８（置換基（ｍ））、化合物３−１４（置換基（ｎ））又はヘキシルイソシアネイト（置換基（ｏ））から誘導される基である。【０２０６】
【化１０４】
2018181428.tif 000115
なお、ＭＮA−１００は、化合物１０１から上記Ｃ）５）に従い誘導される基であり、ＭＮA−１０１は、化合物１０２から上記Ｃ）５）に従い誘導される基である。【０２０７】
【化１０５】
2018181428.tif 000116
なお、Ｍ６２は、上記Ａ）で合成した化合物６２から誘導される基である。【０２０８】
また、比較例に用いる、ＮＡ−２２〜２４の置換基は以下のようにオリゴヌクレオチドと結合する。
【化１０６】
2018181428.tif 000117
なお、  ＬＮＡ−２２に用いる置換基については、特許文献８の記載を参考に合成した。
ＭＮＡ−２４に用いる置換基については、リンクテクノロジーから購入した。核酸合成樹脂（３’−アミノＣＰＧ）を用いて、上記Ｂ）と同様の方法でオリゴヌクレオチドを合成することで、３’末端にアミノリンカーを有する核酸誘導体を合成した。【０２０９】
合成した１本鎖オリゴヌクレオチドの純度分析の結果を表１１〜１３に示す。
【表１１】
2018181428.tif 000118
【０２１０】
【表１２】
2018181428.tif 000119
【０２１１】
【表１３】
2018181428.tif 000120
【０２１２】
Ｈ）二本鎖オリゴヌクレオチドの調製
各オリゴヌクレオチドの１００μＭ水溶液を等モル量混合した後、その後７５℃下で５分間加温後、室温まで自然冷却させることで二本鎖核酸を得た。二本鎖形成の確認は、サイズ排除クロマトグラフィーにより実施した。
Ｃｏｌｕｍｎ：ＹＭＣ−ＰＡＣ  Ｄｉｏｌ−１２０（４．６ｘ３００ｍｍ）（ＹＭＣ社製）
移動相：４０％アセトニトリル含有１ｘＰＢＳ溶液
流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：室温【０２１３】
合成したオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を表１４〜１５に示す。
【表１４】
2018181428.tif 000121
なお、ｓｉＲＮＡ−１、１８、１９及び２０は比較例である。【０２１４】
【表１５】
2018181428.tif 000122
なお、ｓｉＲＮＡ−１０１は比較例である。【０２１５】
実施例２：自然取り込みでの導入実験による評価
実験１
ヒト子宮頸ガン由来細胞株ＨｅＬａは、ＤＭＥＭ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）＋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ｕｇ／ｍＬ）で培養した。細胞は、３７℃、９５〜９８％湿度及び５％ＣＯ２で維持した。自然取り込みによる導入実験では、すべての細胞において、遺伝子導入試薬を用いずにｓｉＲＮＡを細胞へ導入した。ＨｅＬａ細胞の培養上清に最終濃度１μＭになるよう、核酸医薬としてｓｉＲＮＡを含む本発明の複合体又は比較例として脂質が結合していないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１）を添加し、７２時間後にＣｅｌｌＡｍｐ  ＲＮＡ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）にて細胞を回収し、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）により定量的ＰＣＲを行った。内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨを使用した。
ヒトＨＰＲＴ１の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＣＴＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＡＧＡＴＴＧＴＣＧ（配列番号：５）；
Ｒｖプライマー：ＴＣＧＡＧＡＧＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＧＴＣＴＡ（配列番号：６）
を用いた。ヒトＧＡＰＤＨの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ（配列番号：７）；
Ｒｖプライマー：ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ（配列番号：８）
を用いた。
結果を表１６に示す。表には、Ｇａｐｄｈで正規化したＨｐｒｔ１のｍＲＮＡ量について、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。【０２１６】
【表１６】
2018181428.tif 000123
【０２１７】
実験２
マウス肝臓ガン由来細胞株Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７は、ＭＥＭ  Ａｌｐｈａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）＋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ｕｇ／ｍＬ）で培養した。細胞は、３７℃、９５〜９８％湿度及び５％ＣＯ２で維持した。自然取り込みによる導入実験では、すべての細胞において、遺伝子導入試薬を用いずにｓｉＲＮＡを細胞へ導入した。Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞の培養上清に最終濃度２μＭになるよう、核酸医薬としてｓｉＲＮＡを含む本発明の複合体を添加し、７２時間後にＣｅｌｌＡｍｐ  ＲＮＡ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）にて細胞を回収し、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）により定量的ＰＣＲを行った。内在性コントロールとしてＧａｐｄｈを使用し、マウスＨｐｒｔ１の発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＴＡＴＧＣＣＣＴＴＧＡＣＴＡ（配列番号：９）；
Ｒｖプライマー：ＡＧＧＣＡＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＡ（配列番号：１０）
を用い、
マウスＧａｐｄｈの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、
Ｆｗプライマー：ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ（配列番号：１１）；
Ｒｖプライマー：ＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＣＡＧＧＡＧ（配列番号：１２）
を用いた。
結果を表１７に示す。表には、Ｇａｐｄｈで正規化したＨｐｒｔ１のｍＲＮＡ量について、未処理細胞に対する割合をノックダウン効率として示した。【０２１８】
【表１７】
2018181428.tif 000124
【０２１９】
上記の通り、本発明の複合体は、脂質が第２鎖の３’末端に結合している場合（ｓｉＲＮＡ−２、３等）、第２鎖の５’末端に結合している場合（ｓｉＲＮＡ−４、５等）の双方で、脂質が結合していない比較例（ｓｉＲＮＡ−１）や８分岐の脂質が結合している比較例（ｓｉＲＮＡ−１０１）と比べ、ＨＰＲＴ１に対して高いノックダウン活性を示した。遺伝子導入試薬を用いずに高いノックダウン活性を示した本発明の複合体は、包含される核酸医薬の効果を十分に発揮させることができると考えられ、創薬の上で非常に有用である。【０２２０】
実験３
実験１と同様に、本発明の複合体（ｓｉＲＮＡ−２、６又は７）又は比較例として脂質が結合していないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１）をＨｅＬａ細胞の培養上清に最終濃度０．５μＭになるよう添加し、７２時間後に細胞を回収し定量的ＰＣＲを行った。内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨを使用した。ＨＰＲＴ１及びＧＡＰＤＨの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、実験１と同一のものと使用した。結果を表１８に示す。
【表１８】
2018181428.tif 000125
【０２２１】
この結果、本発明の複合体は、包含する核酸医薬が修飾されている（第１鎖のオリゴヌクレオチドの内部にホスホロチオエート結合を有する）場合（ｓｉＲＮＡ−６及び７）もＨＰＲＴ１に対して高いノックダウン活性を示した。【０２２２】
実施例３：インビボ活性の評価
(動物)
Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス(オス８週齢及びメス８週齢)を日本クレアから導入した。担癌モデルマウスは次の通り作製した。ヒト上皮様細胞ガン由来細胞株Ａ４３１を、ＤＭＥＭ  Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）＋Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００ｕｇ／ｍＬ）で培養した。ヌードマウスＢａｌｂｃ−ｎｕ／ｎｕ（オス５週齢）の背部に約１０万個の細胞を移植した。約１０日後に腫瘍の直径が１ｃｍ程度に到達したため、実験に供した。
各種マウスへ、生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬工場）に溶解した本発明の複合体溶液（ｓｉＲＮＡ−８〜１７）、比較例として脂質が結合していないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１８）又はリンカーのみが第２鎖に結合しているｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−２１）約０．２ｍＬを、マウス個体あたり投与量が５０ｍｇ／ｋｇ若しくは２５ｍｇ／ｋｇとなるように静脈投与した。オスのマウスへ投与３日後にイソフルラン麻酔下で全血約０．５ｍＬ及び肝臓、腎臓、肺、脾臓、脂肪、筋肉、小腸、大腸、精巣、骨、骨髄、胸腺、気道、皮膚、後根神経節、脊髄、及び脳組織を採取した。メスのマウスへ投与３日後にイソフルラン麻酔下で子宮及び卵巣を摘出した。担癌モデルマウスへ投与３日後に腫瘍組織を摘出した。ＲＮＡ抽出は、摘出組織からはＲＮｅａｓｙ  ９６  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、また全血に含まれる血球からはＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてメーカー推奨プロトコル通りに行った。得られたＲＮＡのうち２０ｎｇ（後根神経節及び血球）又は１００ｎｇ（その他組織）を用いて、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）による定量的ＰＣＲを行った。内在性コントロールとしてＧａｐｄｈを使用し、マウスＨｐｒｔ１又はマウスＧａｐｄｈの発現量を測定するために使用したプライマー配列は、実験２と同じである。
結果を表１９〜２１（投与量：５０ｍｇ／ｋｇ）及び表２２及び２３（投与量：２５ｍｇ／ｋｇ）に示す。各表には、Ｇａｐｄｈで正規化したＨｐｒｔ１のｍＲＮＡ量について、生理食塩水投与群に対する割合をノックダウン効率として示した。【０２２３】
【表１９】
2018181428.tif 000126
【０２２４】
【表２０】
2018181428.tif 000127
【０２２５】
【表２１】
2018181428.tif 000128
【０２２６】
【表２２】
2018181428.tif 000129
【０２２７】
【表２３】
2018181428.tif 000130
【０２２８】
この結果、脂質が第２鎖の３’末端に結合している本発明の複合体は、脂質が結合していない比較例（ｓｉＲＮＡ−１８）や８分岐の脂質が結合している比較例（ｓｉＲＮＡ−１０１）と比べ、肝臓のみならず骨格筋や心臓、脂肪においても高効率な活性を示すことが示された。また肺、脾臓、小腸、大腸、骨、卵巣、子宮及び腫瘍でも４０％前後のノックダウンが認められた。
例えば、上記結果の「骨格筋で高効率なノックダウンが可能なこと」から、本発明の複合体は筋肉で病変を示す疾患、具体的には筋ジストロフィーや筋強直性ジストロフィー、ミオパチー、筋萎縮性側索硬化症、加齢性筋萎縮症、ガン性筋委縮症、脊髄性筋委縮症、重症筋無力症、ギランバレー症候群、多発性筋炎等の疾患に対する活性を示す核酸医薬を包含させることにより、該核酸医薬を骨格筋に送達させ、効果を発揮させることができると考えられ、非常に有用である。【０２２９】
実施例４：脂質分解酵素耐性の評価
本発明の複合体（ｓｉＲＮＡ-１１）、比較例として脂質が結合していないｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１８）又は特許文献８記載の化合物（ｓｉＲＮＡ-１９及び２０）２０ｎｍｏｌを０．２７ユニットのホスホリパーゼＡ２（和光純薬工業）と１０μｌの反応バッファー中で反応させた。反応バッファーは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ２（ｐＨ８．５）を用いた。反応開始５分後、１５分後、６０分後にサンプリングし、溶液中の遊離脂肪酸濃度（ｕＭ）を、ＮＥＦＡ測定キット ワコー（和光純薬工業）を用いて測定した。
結果を表２４に示す。
【表２４】
2018181428.tif 000131
【０２３０】
脂質が結合していないｓｉＲＮＡ-１８又は２０ではホスホリパーゼＡ２による脂肪酸の遊離は検出されなかった。ホスファチジルエタノールアミンが結合したｓｉＲＮＡ-１９では経時的に脂肪酸が分解され、脂肪酸が遊離するのに対し、脂質が第２鎖の３’末端に結合している本発明の複合体（ｓｉＲＮＡ-１１）では脂肪酸が遊離しなかった。以上の結果から、本発明の複合体が生体内に多く存在する脂質分解酵素への分解耐性を有していることが考えられ、これが本発明の複合体に包含される核酸医薬が生体内で高効率なノックダウン効果を示すことができる理由の一つと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０２３１】
以上の実施例から明らかなように、本発明の複合体は、非常に優れたノックダウン活性を示す。また、脂質分解酵素に対する分解耐性を有しており、代謝安定性があることが示唆されている。よって、核酸医薬を本発明の複合体に含めることにより、該核酸医薬の生体内における活性を向上させることができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2018181428.tif 000147
2018181428.tif 000148
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