(57)【要約】  本発明はマリンノートを呈する香料素材のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、マリンノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、（ｉ）ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ２Ｊ２、および配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、（ｉｉ）被験化合物の非存在下で工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物をマリンノートを呈する候補化合物として選択する工程とを含む。
2018163800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マリンノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ２Ｊ２、および配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、マリンノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
マリンノートを呈する香料が、次式：
【化１】
2018163800.tif 000006
で示される化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上または嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
嗅覚受容体の応答をレポーターアッセイにより測定する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が２以上であるときに、工程（ｉｉｉ）においてマリンノートを呈する候補化合物として選択する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マリンノートを呈する香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マリンノートと呼ばれる香調は、瑞々しさや爽やかな海を想わせる香りであり、ＣＡＬＯＮＥ（登録商標）などの限られた化合物によってのみ引き起こされるため、マリンノートを呈する新しい香料素材の開発が望まれている。
しかし、新しい香料素材を開発するために多数の候補化合物の匂いを人間の嗅覚のみで評価することは、嗅覚疲労や個人差の問題があり、適切に候補化合物を選択することに困難を伴う場合がある。
近年、新しい香料素材の候補物質を選択するために嗅覚受容体（Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）を発現する培養細胞を利用する方法が提案されている（例えば、特許第５５２０１７３号公報（特許文献１）、特許第５９２１２２６号公報（特許文献２）など）。
嗅覚受容体は、脊椎動物では主に鼻腔内の嗅上皮の嗅毛に発現し、様々な香気化合物に応答するセンサータンパク質である。香気化合物が嗅覚受容体へ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換する。ｃＡＭＰはＣＮＧチャネルを開口し、それによってナトリウムイオン（Ｎａ＋）やカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が細胞内へと流入して受容器電位を発生させ、脳へと情報を送る。嗅覚受容体を発現する培養細胞に香気化合物を接触させたときの細胞内のｃＡＭＰ増加量やカチオン増加量を測定することにより、匂いを判別することが可能であると考えられる。
ヒトの嗅覚受容体は４００種弱あることが知られており、一種の香気化合物は一種あるいは複数種の嗅覚受容体に応答し、一種の嗅覚受容体は複数種の香気化合物に応答することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５５２０１７３号公報
【特許文献２】特許第５９２１２２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
マリンノートを呈する既知の香気化合物に応答する嗅覚受容体を探索し、その嗅覚受容体を用いることでマリンノートを呈する候補化合物をスクリーニングできる可能性がある。しかし、マリンノートを呈する香料素材に応答する嗅覚受容体はこれまでに知られていなかった。
このような状況の下、マリンノートを呈する香料素材に応答する嗅覚受容体を探索し、マリンノートを呈する新しい香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法を提供することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行ったところ、マリンノートを代表するＣＡＬＯＮＥに特異的に応答する嗅覚受容体を特定することに成功した。本発明者はさらに検討を進め、これらの嗅覚受容体を用いることにより、マリンノートを呈する香料素材の候補化合物を適切にスクリーニングできることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、以下に示すマリンノートを呈する香料素材の候補化合物をスクリーニングする方法を提供するものである。
［１］マリンノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ２Ｊ２、および配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、マリンノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含む、方法。
［２］マリンノートを呈する香料が、次式：
【化１】
2018163800.tif 000003
で示される化合物からなる群より選択される、［１］に記載の方法。
［３］嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上または嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］嗅覚受容体の応答をレポーターアッセイにより測定する、［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が２以上であるときに、工程（ｉｉｉ）においてマリンノートを呈する候補化合物として選択する、［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法を用いることにより、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物をスクリーニングすることができる。本発明のスクリーニング方法は、マリンノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献できるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＣＡＬＯＮＥ（登録商標）に対する各種嗅覚受容体の応答の測定結果を示す図である。
【図２Ａ】様々な濃度のＣＡＬＯＮＥ（登録商標）に対する嗅覚受容体ＯＲ１０Ｈ５の応答の測定結果を示す図である。
【図２Ｂ】様々な濃度のＣＡＬＯＮＥ（登録商標）に対する嗅覚受容体ＯＲ１０Ｈ４の応答の測定結果を示す図である。
【図２Ｃ】様々な濃度のＣＡＬＯＮＥ（登録商標）に対する嗅覚受容体ＯＲ１０Ｋ１の応答の測定結果を示す図である。
【図２Ｄ】様々な濃度のＣＡＬＯＮＥ（登録商標）に対する嗅覚受容体ＯＲ２Ｊ２の応答の測定結果を示す図である。
【図３Ａ】ＣＡＳＣＡＬＯＮＥ（登録商標）に対する嗅覚受容体ＯＲ１０Ｈ５の応答の測定結果を示す図である。
【図３Ｂ】Ｔｒａｎｓｌｕｚｏｎｅ（登録商標）に対する嗅覚受容体ＯＲ１０Ｈ５の応答の測定結果を示す図である。
【図４】各種化合物に対する嗅覚受容体ＯＲ１０Ｈ５の応答の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明のスクリーニング方法について具体的に説明する。
【００１０】
本発明は、マリンノートを呈する香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を用いて、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ２Ｊ２、および配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉ）被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、マリンノートを呈する候補化合物として選択する工程と
を含むことを特徴としている。
【００１１】
本発明のスクリーニング方法は、ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ２Ｊ２、および配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体に対する被験化合物の応答性を指標として、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物を選択するものである。
一種の嗅覚受容体は類似構造を有する複数種の香気化合物に応答することが知られていることから、マリンノートを呈する既知の香料に対して応答性を示す嗅覚受容体を特定し、その嗅覚受容体に対する被験化合物の応答性を評価することによって、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物を選択することができる。なお、本明細書において「マリンノートを呈する香料素材」とは、マリンノートを呈する香料の素材となる化合物、組成物または混合物をいうものとする。以下、本発明のスクリーニング方法の各工程について説明する。
【００１２】
＜工程（ｉ）＞
工程（ｉ）では、ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ２Ｊ２、および配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する。
【００１３】
嗅覚受容体としては、ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１、ＯＲ２Ｊ２、および配列番号２、４、６または８で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体が用いられる。
ＯＲ１０Ｈ５は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００４４６６として登録されており、配列番号１で示される塩基配列の第１番目から第９４８番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質である。
ＯＲ１０Ｈ４は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００４４６５として登録されており、配列番号３で示される塩基配列の第１番目から第９５１番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号４）からなるタンパク質である。
ＯＲ１０Ｋ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００４４７３として登録されており、配列番号５で示される塩基配列の第１番目から第９４２番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号６）からなるタンパク質である。
ＯＲ２Ｊ２は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿０３０９０５として登録されており、配列番号７で示される塩基配列の第１０３番目から第１０４１番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号８）からなるタンパク質である。
これらの中でも、ＯＲ１０Ｈ５は、ＣＡＬＯＮＥ（登録商標）に強く応答し、またＣＡＳＣＡＬＯＮＥ（登録商標）およびＴｒａｎｓｌｕｚｏｎｅ（登録商標）などのＣＡＬＯＮＥ（登録商標）ファミリーへの選択性も高いことから、ＯＲ１０Ｈ５を用いたスクリーニング方法は、マリンノートを呈する香料素材の開発に貢献できるものと期待される。
【００１４】
嗅覚受容体としてこれらの嗅覚受容体が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつマリンノートを呈する香料に対して応答性を示すタンパク質からなる群より選択される嗅覚受容体を用いてもよい。なお、本明細書においてアミノ酸配列の配列同一性は、ＢＬＡＳＴ検索アルゴリズム（ＮＣＢＩより公に入手できる）によって算出される。
【００１５】
本発明において、マリンノートを呈する香料としては、次式で示される化合物からなる群より選択される一種以上が好ましく挙げられる。
【００１６】
【化２】
2018163800.tif 000004
【００１７】
化合物（ａ）（７−Ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏ［ｂ］［１，４］ｄｉｏｘｅｐｉｎ−３−ｏｎｅ）は、ＣＡＬＯＮＥ（登録商標）という名称で知られており、Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社より入手可能である。
化合物（ｂ）（７−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１，５−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｅｐａｎ−３−ｏｎｅ）は、ＣＡＳＣＡＬＯＮＥ（登録商標）という名称で知られており、米国特許第３７９９８９２号明細書に記載の方法に従って製造することができる。
化合物（ｃ）（７−ｔ−ｂｕｔｙｌ−１，５−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｅｐａｎ−３−ｏｎｅ）は、Ｔｒａｎｓｌｕｚｏｎｅ（登録商標）という名称で知られており、米国特許第３７９９８９２号明細書に記載の方法に従って製造することができる。
化合物（ｄ）（ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−４，７−ｍｅｔｈａｎｏ−１Ｈ−ｉｎｄｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）は、ＳＣＥＮＴＥＮＡＬ（登録商標）という名称で知られており、Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社より入手可能である。
化合物（ｅ）（２−（４−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ）は、Ｃｕｒｇｉｘという名称で知られており、Ｋｅｒｒｙ  Ｆｌａｖｏｕｒｓ  Ｆｒａｎｓ  ＳＡＳ社より入手可能である。
化合物（ｆ）（ａｌｐｈａ−Ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌｅ−５−ｐｒｏｐａｎａｌ）は、Ｈｅｌｉｏｆｒｅｓｈ（登録商標）、ＨＥＬＩＯＮＡＬ（登録商標）またはＨＥＬＩＯＢＯＵＱＵＥＴという名称で知られており、宇部興産株式会社、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｌａｖｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅまたは高砂香料工業株式会社よりそれぞれ入手可能である。
【００１８】
これらの中でも、マリンノートを呈する香料としては、ＣＡＬＯＮＥ（登録商標）、ＣＡＳＣＡＬＯＮＥ（登録商標）およびＴｒａｎｓｌｕｚｏｎｅ（登録商標）がより好ましく、ＣＡＬＯＮＥが特に好ましい。なお、本明細書において「応答性を示す」とは、嗅覚受容体発現細胞において、香料非存在下と比較して何らかの変化が見られることを意味する。
【００１９】
嗅覚受容体は、一種で用いても、二種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
本発明において嗅覚受容体と被験化合物を接触させ、被験化合物に対する嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されない。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で被験化合物と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で被験化合物と接触させ、嗅覚受容体の応答を測定してもよい。嗅覚受容体と被験化合物を接触させる時間は、被験化合物の濃度にも依存するため一概には言えないが、通常、２〜４時間である。
【００２１】
嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
【００２２】
本発明の好ましい態様では、嗅覚受容体と共に、ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込んでもよい。ウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込むことにより、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができる。
ウシロドプシンは、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１０１４８９０として登録されている。ウシロドプシンは、配列番号１１で示される塩基配列の第１番目から第１０４７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）からなるタンパク質である。
また、ウシロドプシンに代えて、配列番号１２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ嗅覚受容体の細胞膜発現を促進することができるタンパク質を用いてもよい。
なお、嗅覚受容体の細胞膜発現を促進できるものであれば、ウシロドプシンに限らず、他のタンパク質のアミノ酸残基を用いてもよい。
【００２３】
嗅覚受容体の応答を測定する方法は特に制限されなく、当分野で用いられている任意の方法を用いることができる。例えば、香気化合物が嗅覚受容体へ結合すると、細胞内のＧタンパク質を活性化し、Ｇタンパク質がアデニル酸シクラーゼを活性化して、ＡＴＰを環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）へと変換し、細胞内のｃＡＭＰ量を増加させることが知られている。したがって、ｃＡＭＰ量を測定することで嗅覚受容体の応答を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ法やレポータージーンアッセイ法等が用いられる。中でも、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定することが好ましい。
【００２４】
＜工程（ｉｉ）＞
工程（ｉｉ）では、被験化合物の非存在下で、工程（ｉ）で用いた嗅覚受容体の応答を測定する。
嗅覚受容体の応答を測定する方法は、嗅覚受容体と被験化合物を接触させないことを除いて、工程（ｉ）で示した方法と同様の方法を用いることができる。例えば、嗅覚受容体を発現している生体から単離された細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよいし、嗅覚受容体を遺伝子操作により人為的に発現させた細胞上で嗅覚受容体の応答を測定してもよい。工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定結果を適切に比較するために、工程（ｉ）と（ｉｉ）における測定条件は、被験化合物の接触の有無を除いて、同じであることが好ましい。
【００２５】
＜工程（ｉｉｉ）＞
工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して、応答性が変化した被験化合物を、マリンノートを呈する候補化合物として選択する。
本発明では、工程（ｉ）および（ｉｉ）における測定結果を比較して応答性に変化が見られた場合、工程（ｉ）で用いた被験化合物を、マリンノートを呈する候補化合物として評価することができる。
本発明の一実施態様によれば、応答性の変化は、工程（ｉ）における測定結果を、工程（ｉｉ）における測定結果で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値を指標として評価してもよい。例えば、ルシフェラーゼなどの発光物質を用いたレポータージーンアッセイ法により嗅覚受容体の応答を測定する場合、Ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値が好ましくは２以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは１０以上の被験化合物を、マリンノートを呈する候補化合物として評価することができる。
【００２６】
上記のようにして、被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物をスクリーニングすることができる。本発明によれば、人間の嗅覚によって行う官能評価による嗅覚疲労や個人差などによる問題を生じることなく、多数の被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物を選択することができる。
選択された化合物は、マリンノートを呈する香料素材の候補化合物として用いることができる。選択された化合物を基に必要に応じて改変等を行い、最適な匂いのする化合物を開発することもできる。さらには、選択された化合物を他の香料素材とブレンドして最適な匂いのする香料素材を開発することも可能である。本発明のスクリーニング方法を用いることにより、マリンノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。【００２８】
［実施例１］
マリンノートを呈する香料ＣＡＬＯＮＥに応答する嗅覚受容体の探索
（１）嗅覚受容体遺伝子クローニング
ヒト嗅覚受容体ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１およびＯＲ２Ｊ２遺伝子はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ：  Ｆｅｍａｌｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）よりＰＣＲ法にてクローニングすることで得た。ｐＭＥ１８ＳベクターにウシロドプシンのＮ末端２０アミノ酸残基を組み込み、さらにその下流に、得られたヒト嗅覚受容体遺伝子を組み込むことで、ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクターを得た。【００２９】
（２）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での嗅覚受容体遺伝子の発現
ヒト嗅覚受容体遺伝子発現ベクター０．０５μｇ、ＲＴＰ１Ｓベクター０．０１μｇ、ｃＡＭＰ応答配列プロモーターを含むホタルルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．２９（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．０１μｇ、およびチミジンキナーゼプロモーターを含むウミシイタケルシフェラーゼベクターｐＧＬ４．７４（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．００５μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）１０μＬに溶解して遺伝子溶液（１穴分）とした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４時間後にコンフルエントに達する細胞数で９６穴プレート（Ｂｉｏｃｏａｔ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に１００μＬずつ播種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００の使用法に従ってリポフェクション法によって遺伝子溶液を各穴に添加して、細胞に遺伝子導入を行い、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で２４時間培養した。【００３０】
（３）ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ
培養液を除去した後に、検体となる香料化合物を測定する濃度になる様にＣＤ２９３（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）培地（２０μＭ  Ｌ−グルタミン添加）で調製したものを５０μＬずつ添加し、３時間の刺激を行った後に、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の使用方法に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。嗅覚受容体の応答強度は、香料化合物の刺激によって生じたルシフェラーゼ活性を、香料化合物を含まない試験系で生じたルシフェラーゼ活性で割ることで求められるＦｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値で表現した。【００３１】
（４）ＣＡＬＯＮＥに対する嗅覚受容体応答の測定
ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１およびＯＲ２Ｊ２を発現させた細胞で、ＣＡＬＯＮＥ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社）３００μＭに対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図１に示す。４種の嗅覚受容体はいずれもＣＡＬＯＮＥに対して、Ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値２以上の応答を示した。一方で、嗅覚受容体を発現させなかった細胞を用いたＭｏｃｋ試験、および米国特許出願公開第２０１５／０２６０７０７号明細書にＣＡＬＯＮＥへの応答が記載されているＯＲ１Ｂ１は、Ｆｏｌｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ値２以上の応答を示さなかった。なお、ＯＲ１Ｂ１は、ＧｅｎＢａｎｋにＮＭ＿００１００４４５０として登録されており、配列番号９で示される塩基配列の第１番目から第９５７番目のＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列（配列番号１０）からなるタンパク質である。【００３２】
また、ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１およびＯＲ２Ｊ２の、様々な濃度のＣＡＬＯＮＥに対する受容体応答を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図２Ａ、Ｂ、ＣおよびＤにそれぞれ示す。４種の受容体はいずれもＣＡＬＯＮＥに対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ１０Ｈ５、ＯＲ１０Ｈ４、ＯＲ１０Ｋ１およびＯＲ２Ｊ２は特異的にＣＡＬＯＮＥに応答することが示された。【００３３】
［実施例２］
ＣＡＬＯＮＥ類縁化合物に対するＯＲ１０Ｈ５の応答強度の評価
ＣＡＬＯＮＥに対して特に強い応答を示したＯＲ１０Ｈ５を用いて、ＣＡＬＯＮＥと類似した構造を持ち、マリンノートを呈するＣＡＳＣＡＬＯＮＥおよびＴｒａｎｓｌｕｚｏｎｅ（いずれも米国特許第３７９９８９２号明細書に記載の方法で合成した）に対する応答強度を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。結果を図３ＡおよびＢにそれぞれ示す。ＯＲ１０Ｈ５はＣＡＳＣＡＬＯＮＥおよびＴｒａｎｓｌｕｚｏｎｅに対して濃度依存的な応答を示した。一方で、Ｍｏｃｋ試験では応答が見られなかった。すなわち、ＯＲ１０Ｈ５は特異的にＣＡＳＣＡＬＯＮＥおよびＴｒａｎｓｌｕｚｏｎｅに応答することが示された。【００３４】
［実施例３］
様々な香調の香料化合物に対するＯＲ１０Ｈ５の応答強度の評価
前出のマリンノート香料化合物ＣＡＬＯＮＥ、ＣＡＳＣＡＬＯＮＥおよびＴｒａｎｓｌｕｚｏｎｅに加えて、主香調ではないがマリンノートの要素を併せ持つＳＣＥＮＴＥＮＡＬ（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ社）、Ｃｕｒｇｉｘ（Ｋｅｒｒｙ Ｆｌａｖｏｕｒｓ Ｆｒａｎｓ ＳＡＳ社）、Ｈｅｌｉｏｆｒｅｓｈ（宇部興産株式会社）、さらに比較として様々な香調の表１に記載の非マリンノート香料化合物３００μＭに対する、ＯＲ１０Ｈ５の応答強度を、ルシフェラーゼレポータージーンアッセイによって測定した。【００３５】
【表１】
2018163800.tif 000005
【００３６】
なお、表１に記載の非マリンノート香料化合物は、以下のものを使用した。
Ｄ−Ｌｉｍｏｎｅｎｅ（ナカライテスク株式会社）
Ｃｉｓ−３−Ｈｅｘｅｎｏｌ（日本ゼオン株式会社）
Ｍｅｌｏｎａｌ（Ｇｉｖａｕｄａｎ社）
Ｌ−Ｍｅｎｔｈｏｌ（高砂香料工業株式会社）
Ｌｉｎａｌｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ（東京化成工業株式会社）
Ｆｌｏｒａｌｏｚｏｎｅ、３−（ｏ−（ａｎｄ  ｐ−）Ｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２，２−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｌｄｅｈｙｄｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｌａｖｏｒｓ  ａｎｄ  ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ社）
Ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌ（Ｒｅｎｅｓｓｅｎｚ社）
ＴＨＥＳＡＲＯＮ（登録商標）、（１Ｒ，６Ｓ）−Ｅｔｈｙｌ  ２，２，６−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（高砂香料工業株式会社）
Ｖａｎｉｌｌｉｎ（東京化成工業株式会社）
ＨＩＮＤＩＮＯＬ（登録商標）、（Ｒ，Ｅ）−２−Ｍｅｔｈｙｌ−４−（２，２，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｐｅｎｔ−３−ｅｎｙｌ）ｂｕｔ−２−ｅｎ−１−ｏｌ）（高砂香料工業株式会社）【００３７】
結果を図４に示す。ＯＲ１０Ｈ５はマリンノートを呈する６種の化合物にのみ応答し、その他の香調の化合物に対しては応答しなかった。すなわち、ＯＲ１０Ｈ５はマリンノート香料化合物に特異的に応答することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、多数の被験化合物の中からマリンノートを呈する候補化合物を選択することができる。本発明のスクリーニング方法は、マリンノートを呈する新しい香料素材の開発に貢献できるものと期待される。
【図１】
2018163800.tif 000007
【図２Ａ】
2018163800.tif 000008
【図２Ｂ】
2018163800.tif 000009
【図２Ｃ】
2018163800.tif 000010
【図２Ｄ】
2018163800.tif 000011
【図３Ａ】
2018163800.tif 000012
【図３Ｂ】
2018163800.tif 000013
【図４】
2018163800.tif 000014
【配列表】
2018163800000001.app
【国際調査報告】
2018163800.tif 000015
2018163800.tif 000016
2018163800.tif 000017
2018163800.tif 000018