(57)【要約】  生産性に優れ、高い免疫賦活活性を有する免疫誘導体として、１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に抗原性を有するペプチドが共有結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤が開示されている。また、それを含む医薬組成物が開示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に抗原性を有するペプチドが共有結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤。
【請求項２】
前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が５以上３０以下であることを特徴とする、請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基長が２０以上８０以下であることを特徴とする、請求項１記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体がポリデオキシアデニンであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体がポリデオキシシトシン又はポリデオキシチミジン又はポリデオキシグアニンであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の免疫誘導剤。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
前記ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、ホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていることを特徴とする請求項６記載の免疫誘導剤。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、アルキンとアジド誘導体との付加環化反応、マレイミド基とチオール基との反応のいずれかにより生成した共有結合を介して結合していることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の免疫誘導剤。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、ペプチドＣ末端のシステイン残基のチオール基とチオール修飾核酸のチオール基との反応により生成した共有結合を介して結合していることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の免疫誘導剤。
【請求項１０】
アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の免疫誘導剤。
【請求項１１】
前記アジュバントが、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体であることを特徴とする請求項１０記載の免疫誘導剤。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項記載の免疫誘導剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原ペプチド特異的免疫応答を誘導するための新規な免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチンによる感染予防の基本的な原理は、人為的な擬似感染により、獲得免疫を誘導し、特定の病原体に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導することにある。獲得免疫においては、免疫の「記憶」を担当するＴ細胞やＢ細胞が中心的な役割を果たし、ＤＮＡの再構成による抗体の可変領域の多様性が、無数の抗原への特異的な免疫反応を可能にしていることが知られている。一方、白血球、マクロファージ、樹状細胞等の食細胞が中心的な役割を果たしている自然免疫は、従来、病原体や異物を貪食する非特異的なプロセスであり、獲得免疫成立までの「一時しのぎ」としての役割のみを果たしていると考えられていたが、自然免疫の分子機構に関する研究の進展により、自然免疫においても、自己・非自己の特異的な認識が行われていることや、自然免疫が獲得免疫の成立に必須であることが明らかにされた。より具体的には、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等の抗原提示細胞に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーが、様々な病原体と反応し、サイトカインの産生を誘導し、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化の促進、キラーＴ細胞の活性化等を通して、獲得免疫を誘導することが、最近の研究により明らかにされた。【０００３】
一連のＴＬＲファミリーにより認識される病原体の構成成分は多岐にわたるが、その中の１つに、ＴＬＲ９のリガンドである、ＣｐＧ配列を有するＤＮＡ（ＣｐＧ  ＤＮＡ）がある。ＣｐＧ配列は、中心部にシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）が並ぶ６個の塩基を基本とする配列で、ほ乳類には少なく、微生物には多く見られる塩基配列である。また、ほ乳類においては、少数存在するＣｐＧ配列の殆どがメチル化を受けている。ほ乳類中に殆ど存在しない非メチル化ＣｐＧ配列は、強力な免疫賦活活性を有している（例えば、非特許文献１〜３参照）。エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたＣｐＧ  ＤＮＡは、ファゴソーム様小胞体に存在するＴＬＲ９により認識され、Ｔｈ１反応を強く誘導する。Ｔｈ１反応は、Ｔｈ２反応が優位なアレルギー反応を抑制すると共に、強い抗腫瘍活性を有する。そのため、ＣｐＧ  ＤＮＡは、感染予防に加え、アレルギー疾患、腫瘍性疾患に対するアジュバントとしても期待されている（例えば非特許文献４参照）。【０００４】
しかし、ＣｐＧ  ＤＮＡを免疫療法のアジュバントとして使用する場合、細胞質や血漿中のヌクレアーゼによる分解や、タンパク質との非特異的な結合を回避しつつ、いかに標的細胞の内部にＣｐＧ  ＤＮＡを到達させるかが問題となる。【０００５】
本発明者らは、新規な遺伝子キャリアとしてβ−１，３−グルカン骨格を有する多糖（以下、「β−１，３−グルカン」と略称する場合がある。）に着目し、これまでに、β−１，３−グルカンが核酸医薬（アンチセンスＤＮＡ、ＣｐＧ  ＤＮＡ）をはじめとする種々の核酸と新しいタイプの複合体を形成することを見出してきた（例えば、特許文献１、２、非特許文献５〜７参照）。【０００６】
天然では３重らせんで存在するβ−１，３−グルカンを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン性極性有機溶媒、或いは０．１Ｎ以上のアルカリ溶液に溶解して１本鎖に解離させた後に、１本鎖の核酸を加え、溶媒を水或いは中性に戻すことによって、核酸１分子とβ−１，３−グルカン２分子とからなる３重らせん複合体が形成することを見出した。この場合、３重らせん複合体におけるβ−１，３−グルカン分子と核酸分子とは、主として水素結合と疎水性相互作用により分子間結合を形成しているものと考えられている（非特許文献８参照）。【０００７】
上述のように、核酸をβ−１，３−グルカンと複合化することにより、ヌクレアーゼによる核酸分子の加水分解や、血漿タンパク質と核酸との非特異的な結合等の、核酸分子と生体内タンパク質との望ましくない相互作用を抑制しつつ、核酸を細胞の内部に到達させることが可能になった。β−１，３−グルカンと核酸との複合体、さらには抗原性を有するタンパク質を含む３元複合体を利用して、ＣｐＧ  ＤＮＡの細胞内へのデリバリーに成功した（例えば、特許文献３、４、非特許文献９〜１１参照）。【０００８】
しかしながら、上記従来の技術は、以下のような課題を有していた。例えば、非特許文献１１記載のβ−１，３−グルカン／抗原性を有するタンパク質／ＣｐＧ  ＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、過ヨウ素酸酸化により、β−１，３−グルカンの側鎖のグルコース残基上にホルミル基を生成させ、還元的アミノ化反応により、ホルミル基と抗原性を有するペプチド（以下、「抗原性ペプチド」と略称する場合がある。）のアミノ基とを反応させ、β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドとが共有結合した複合体を形成するが、収率がきわめて低いという課題を有していた。かかる事情に鑑みて、例えば、特許文献４記載のβ−１，３−グルカン／抗原性タンパク質（抗原性ペプチド）／ＣｐＧ  ＤＮＡの３元複合体の製造方法においては、側鎖にホルミル基を有するβ−１，３−グルカンと抗原性ペプチドとを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行う、或いはアルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行うことにより、β−１，３−グルカンの側鎖上のホルミル基と抗原性ペプチドのアミノ基との反応性及び収率を向上させている。しかしながら、ペプチドには複数のアミノ基が存在するため、反応点の制御が困難である。したがって、抗原性ペプチドの反応位置による免疫原性の違いや、β−１，３−グルカンとの反応生成物が複雑な混合物となることに起因する分離精製の困難性等の問題の発生が懸念される。また、水素結合による複合体形成を利用したβ−１，３−グルカンとＤＮＡとの複合体の形成に比べ、β−１，３−グルカンと抗原性ペプチドの共有結合の形成に基づく複合体の形成は煩雑である。これらの点において、特許文献４記載のβ−１，３−グルカン／抗原性ペプチド／ＣｐＧ  ＤＮＡの３元複合体の製造方法は、生産性等の点で依然として課題を有している。【０００９】
かかる課題に鑑みて、本発明者らは、生産性に優れ、高い免疫賦活活性を有するペプチド／β−１，３−グルカン複合体として、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、抗原性を有するペプチドが、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と共有結合を介して結合したペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートとを含み、前記ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートのポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖と、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有する複合体を形成していることを特徴とするペプチド／β−１，３−グルカン複合体を提案した（特許文献５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０１／３４２０７号
【特許文献２】国際公開第０２／０７２１５２号
【特許文献３】特開２００７−７０３０７号公報
【特許文献４】特開２０１０−１７４１０７号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／１１８７８９号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bacterial  CpG  DNA  Activates  Immune  Cells  to  Signal  Infectious  Danger,  H.  Wagner,  Adv.  Immunol.,  73,  329-368  (1999).
【非特許文献２】CpG  Motifs  in  Bacterial  DNA  and  Their  Immune  Effects,  M.  Krieg,  Annu.  Rev.  Immunol.,  20,  709-760  (2002).
【非特許文献３】The  discovery  of  immunostimulatory  DNA  sequence,    S.  Yamamoto,  T.  Yamamoto,  and  T.  Tokunaga,  Springer  Seminars  in  Immunopathology,  22,  11-19  (2000).
【非特許文献４】「標準免疫学」第２版、医学書院、２００２年、３３３頁
【非特許文献５】Molecular  Recognition  of  Adenine,  Cytosine,  and  Uracil  in  a  Single-Stranded  RNA  by  a  Natural  Polysaccharide:  Schizophyllan.  K.  Sakurai  and  S.  Shinkai,  J.  Am.  Chem.  Soc.,  122,  4520-4521  (2000).
【非特許文献６】Polysaccharide-Polynucleotide  Complexes.  2.  Complementary  Polynucleotide  Mimic  Behavior  of  the  Natural  Polysaccharide  Schizophyllan  in  the  Macromolecular  Complex  with  Single-Stranded  RNA  and  DNA.  K.  Sakurai,  M.  Mizu  and  S.  Shinkai,  Biomacromolecules,  2,  641-650  (2001).
【非特許文献７】Dectin-1  targeting  delivery  of  TNF-α  antisense  ODNs  complexed  with  β-1,3-glucan  protects  mice  from  LPS-induced  hepatitis.  S.  Mochizuki  and  K.  Sakurai,  J.  Control.  Release,  151  (2011)  155-161.
【非特許文献８】Structural  Analysis  of  the  Curdlan/Poly  (cytidylic  acid)  Complex  with  Semiempirical  Molecular  Orbital  Calculations.  K.  Miyoshi,  K.  Uezu,  K.  Sakurai  and  S.  Shinkai,  Biomacromolecules,  6,  1540-1546  (2005).
【非特許文献９】A  Polysaccharide  Carrier  for  Immunostimulatory  CpG  DNAs  to  Enhance  Cytokine  Secretion,  M.  Mizu,  K.  Koumoto,  T.  Anada,  T.  Matsumoto,  M.  Numata,  S.  Shinkai,  T.  Nagasaki  and  K.  Sakurai，  J.  Am.  Chem.  Soc.,  126,  8372-8373  (2004).
【非特許文献１０】Protection  of  Polynucleotides  against  Nuclease-mediated  Hydrolysis  by  Complexation  with  Schizophyllan,  M.  Mizu,  K.  Koumoto,  T.  Kimura,  K.  Sakurai  and  S.  Shinkai,  Biomaterials,  25,  15,  3109-3116  (2004).
【非特許文献１１】Synthesis  and  in  Vitro  Characterization  of  Antigen-Conjugated  Polysaccharide  as  a  CpG  DNA  Carrier,  N.  Shimada,  K.  J.  Ishii,  Y.  Takeda,  C.  Coban,  Y.  Torii,  S.  Shinkai,  S.  Akira  and  K.  Sakurai,  Bioconjugate  Chem.,  17  1136-1140  (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、特許文献５に記載のペプチド／β−１，３−グルカン複合体を構成するペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート自体の免疫誘導活性については知られていなかった。【００１３】
本発明者らは、β−１，３−グルカンと複合体を形成していないペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲート自体が、単独で高い免疫誘導活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。かくして、本発明は、生産性に優れ、高い免疫賦活活性を有する免疫誘導剤及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に抗原性を有するペプチドが共有結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含む免疫誘導剤を提供することにより上記課題を解決するものである。【００１５】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記抗原性を有するペプチドのアミノ酸長が５以上３０以下であってもよい。【００１６】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の塩基長が２０以上８０以下であってもよい。【００１７】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体がポリデオキシアデニンであってもよい。【００１８】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体がポリデオキシシトシン又はポリデオキシチミジン又はポリデオキシグアニンであってもよい。【００１９】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体が、ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合の少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体であってもよい。【００２０】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ＤＮＡ又はＲＮＡのホスホジエステル結合のうち少なくとも一部がホスホロチオエート基で置換されたポリヌクレオチド誘導体において、ホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていてもよい。【００２１】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、アルキンとアジド誘導体との付加環化反応、マレイミド基とチオール基との反応のいずれかにより生成した共有結合を介して結合していてもよい。【００２２】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記ポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを構成する前記抗原性を有するペプチドと前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、ペプチドＣ末端のシステイン残基のチオール基とチオール修飾核酸のチオール基との反応のいずれかにより生成した共有結合を介して結合していてもよい。【００２３】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、アジュバントとして、免疫賦活活性を有する物質をさらに含んでいてもよい。【００２４】
本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤において、前記アジュバントが、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体であってもよい。【００２５】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係る免疫誘導剤を含む医薬組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００２６】
本発明のペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートは、β−１，３−グルカンと複合体を形成することなく、免疫誘導剤として用いることができる。そのため、ペプチド／β−１，３−グルカン複合体を有効成分とする従来の免疫誘導剤よりも更に生産性に優れている。また、抗原性を有するペプチド及びポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体を適宜組み合わせることにより、多様な抗原に対し免疫誘導活性を有する免疫誘導剤を容易に設計することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＳＰＤＰ修飾ｄＡ４０（Ｓ）と、抗原性を有するペプチドとの反応後の溶液をＨＰＬＣにより分取した結果を示すクロマトグラムである。
【図２】実施例２におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【図３】実施例３におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【図４】実施例４におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【図５】実施例５におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【図６】実施例６におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【図７】実施例７におけるフローサイトメトリーの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の第一の実施の形態に係る免疫誘導剤（以下、「免疫誘導剤」と略称する場合がある。）は、１本鎖ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に抗原性を有するペプチドが共有結合したポリヌクレオチド／ペプチドコンジュゲートを有効成分として含んでいる。
【００２９】
ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートは、抗原性ペプチドと、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体とが、共有結合を介して結合した複合体である。「抗原性を有するペプチド」としては、抗原性を有するもの、すなわち、生体の免疫系において異物であると認識され、特異的な抗体産生を引き起こす（免疫応答を誘導する）ものであれば、任意のアミノ酸配列及びアミノ酸残基数を有するものを、特に制限なく用いることができる。本実施の形態に係るペプチド／β−１，３−グルカン複合体の製造に用いられる抗原性ペプチドとしては、食物アレルギー等のアレルギーの原因となるタンパク質、細菌、ウィルス等の病原体、腫瘍細胞等を起源とするタンパク質のうち、エピトープとして作用しうる部分アミノ酸配列を有するものが挙げられる。抗原性ペプチドを構成するアミノ酸残基数は、エピトープとして作用しうる限りにおいて特に制限されないが、多くの場合、５〜３０の範囲内であり、大部分は、８〜１７程度の範囲内にある。
【００３０】
抗原性ペプチドは、起源となるタンパク質の酵素分解、ペプチド合成等の任意の公知の方法を用いて得ることができる。また、抗原性ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドアレイを用いたエピトープ解析等の任意の公知の方法を用いて決定することができる。
【００３１】
抗原性ペプチドに結合させるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、任意の塩基配列及び塩基数を有するポリヌクレオチド又はその誘導体を特に制限なく用いることができる。ポリヌクレオチドの具体例としては、ポリリボアデニル酸（ｐｏｌｙＡ）、ポリリボシチジル酸（ｐｏｌｙＣ）、ポリデオキシリボアデニル酸（ｐｏｌｙ（ｄＡ））、ポリデオキシリボチミジル酸（ｐｏｌｙ（ｄＴ））、ポリデオキシリボグアニル酸（ｐｏｌｙ（ｄＧ））が挙げられる。ポリヌクレオチドの塩基数は特に制限されないが、ポリヌクレオチドは、β−１，３−グルカンと結合能が高いポリリボアデニル酸（ｐｏｌｙＡ）、ポリリボシチジル酸（ｐｏｌｙＣ）、ポリデオキシリボアデニル酸（ｐｏｌｙ（ｄＡ））、ポリデオキシリボチミジル酸（ｐｏｌｙ（ｄＴ））、ポリデオキシリボグアニル酸（ｐｏｌｙ（ｄＧ））のいずれかの繰り返し配列を有していることが好ましい。塩基数は、１０以上であることが好ましく、２０〜８０であることがより好ましく、３０〜８０であることが更に好ましい。
【００３２】
ポリヌクレオチドは、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、生体内での安定性を向上させるために、ポリヌクレオチドの代わりにポリヌクレオチド誘導体を用いてもよい。ポリヌクレオチド誘導体の例としては、リボヌクレオチドの２’位のヒドロキシル基の全部又は一部がフッ素又はメトキシ基で置換されているもの、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）のホスホジエステル基の全部又は一部がホスホロチオエート基で置換されているもの等が挙げられる。ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのホスホジエステル基の一部がホスホロチオエート基で置換されている場合、ホスホジエステル結合の５０％以上がホスホロチオエート基で置換されていることが好ましい。ホスホロチオエート基で置換されるホスホジエステル基の位置は特に制限されず、連続した複数のホスホジエステル基が置換されていてもよく、或いはホスホロチオエート基が互いに隣り合わないように置換されていてもよい。
【００３３】
ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、抗原性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、或いは側鎖のいずれに結合していてもよいが、抗原性ペプチドのＮ末端側に結合していることが好ましい。両者は、適当な反応性官能基同士の反応により直接結合していてもよく、適当なスペーサーを介して結合していてもよい。反応性官能基としては、抗原性ペプチド及びポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体に存在する官能基をそのまま、或いは化学修飾により活性化したものを用いてもよいが、適当な反応性官能基を導入してもよい。また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体は、５’末端側が抗原性ペプチドと結合していてもよく、３’末端側が結合していてもよい。
【００３４】
好ましいペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートの一例は、下記の式（Ａ）に示すように、ペプチドのＮ末端側に、ホスホロチオエート化ポリデオキシアデニル酸（ｐｏｌｙＡのホスホジエステル基がホスホロチオエート基に置換されたポリヌクレオチド誘導体）の５’末端側が結合した構造を有している。
［抗原性ペプチド］−Ｘ−（ｄＡ（Ｓ））ｘ      （Ａ）
【００３５】
なお、式（Ａ）において、ｄＡ（Ｓ）は、ホスホロチオエート化デオキシアデニル酸を表し、ｘは、例えば２０以上８０以下の整数である。Ｘは、スペーサー又は反応性官能基同士の反応により形成された官能基を表す。スペーサーの一例としては、アルキル基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。反応性官能基の組み合わせの例としては、例えば、バイオチップ表面への生体分子の固定に用いられる反応性官能基同士の組み合わせが挙げられ、より具体的には、下記に示すものが挙げられる。
【００３６】
（ａ）アルキンとアジド化合物
アルキンとアジド化合物（アジ化物）は、下記に示すような付加環化反応（フイスゲン反応）により、１，２，３−トリアゾール環を形成する。両者は、生体分子を含む多くの有機化合物に導入可能な安定な官能基であり、水を含む溶媒中でも迅速かつほぼ定量的に反応し、殆ど副反応を伴わず、余分な廃棄物を生成しないため、いわゆる「クリックケミストリー」の中心的な反応として、生化学の分野で広く用いられている。アルキン誘導体及びアジド基は、任意の公知の方法を用いて、抗原性ペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。アルキン誘導体としては、プロパルギルアルコール、プロパルギルアミン等の反応性官能基を有するものが容易に入手でき、これらをカルボキシル基やヒドロキシル基等の反応性官能基と直接反応させ、或いはカルボニルジイミダゾール等と共に反応させ、生成するアミド結合、エステル結合、ウレタン結合等を介してアルキン誘導体を導入することができる。アジド基についても、任意の公知の方法を用いて、抗原性ペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体に導入することができる。なお、フイスゲン反応は銅触媒の存在下で行われるが、抗原性ペプチド及びリン酸ジエステル基がホスホロチオエート基等の含硫黄官能基で置換されたポリヌクレオチド誘導体には、銅イオンに配位する硫黄原子が存在するため、銅の触媒活性が低下するおそれがある。反応率を向上させるために過剰量の銅を添加することが好ましい。
【００３７】
【化１】
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【００３８】
（ｂ）マレイミド又はビニルスルホンとチオール基
電子求引性のカルボニル基又はスルホン基に隣接する二重結合を有するマレイミド又はビニルスルホンは、中性付近のｐＨで、下記に示すように、チオール基との付加反応（マイケル付加反応）により、安定なチオエーテル誘導体を生成する。適当なスペーサーを有するマレイミド及びビニルスルホン誘導体が市販されているため、抗原性ペプチド又はポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド誘導体にこれらの官能基を導入することは容易である。抗原性ペプチドにチオール基を導入する場合、システインを含む抗原性ペプチドの場合には、システイン残基側鎖のチオール基を利用できる。ただし、システインは、存在比が低いアミノ酸であるため、抗原性ペプチドのＮ末端側にシステインを導入したものを用いる。チオール基を含むポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体としては、これらの５’末端のヒドロキシル基をチオール基に変換したチオール化ポリヌクレオチドが用いられる。
【００３９】
【化２】
2018180819.tif 000004
【００４０】
（ｃ）システイン側鎖のチオール基とチオール化ポリヌクレオチドのチオール基
上述のとおり、Ｎ末端側にシステインを導入した抗原性ペプチドのシステイン残基側鎖のチオール基と、チオール化ポリヌクレオチドのチオール基とを反応させ、ジスルフィド基を形成させる。ジスルフィド結合は、還元剤の存在下で切断されるため、上両者に比べ、安定性の点で劣る。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体へのチオール基の導入は、任意の公知の方法を用いて行うことができるが、具体例としては、下式に示すような、アミノ化ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、ω−（２−ピリジルジチオ）脂肪酸のＮ−スクシイミジルエステルとの反応が挙げられる。
【００４１】
【化３】
2018180819.tif 000005
【００４２】
免疫誘導剤を含む医薬組成物の製造には、有効成分としてのペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートに加え、任意の公知の成分（医薬用途に許容される任意の担体、賦形剤及び添加物）及び製剤方法を用いることができる。例えば、医薬組成物は、錠剤、座剤、カプセル剤、シロップ剤、ナノゲル等のマイクロカプセル剤、滅菌液剤、懸濁液剤等の注射剤、エアゾール剤、スプレー剤等の形態を取ることができる。
【００４３】
医薬組成物は、免疫賦活活性を有する物質としてアジュバントを更に含んでいてもよい。アジュバントとしては、ペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートに導入された抗原性を有するペプチド等に応じて適宜選択されるが、例えば、ＣｐＧ  ＤＮＡ等であってもよく、国際公開第２０１５／１１８７８９号に記載の、免疫賦活活性を有する部分塩基配列を有するポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体と、β−１，３−グルカン骨格を有する多糖とが、水素結合を介して結合し、前記ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の分子鎖１本と前記β−１，３−グルカン骨格を有する多糖の分子鎖２本とからなる三重螺旋構造を有するポリヌクレオチド／β−１，３−グルカン複合体であってもよい。
【００４４】
医薬組成物は、ヒトまたは温血動物（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、サル等）に対し、経口及び非経口経路のいずれによっても投与可能である。非経口投与経路としては、皮下、皮内及び筋中注射、腹腔内投与、点滴、鼻粘膜や咽頭部への噴霧等が挙げられる。
【００４５】
活性成分であるペプチド／ポリヌクレオチドコンジュゲートの用量は、活性、治療対象となる疾患、投与対象となる動物の種類、体重、性別、年齢、疾患の重篤度、投与方法等に応じて異なる。体重６０ｋｇの成人を例に取ると、経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜約２０ｍｇであり、非経口投与の場合、１日当たりの用量は通常約０．０１〜約３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜約２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜約１０ｍｇである。他の動物に投与する場合には、上記用量を単位体重当たりの用量に換算後、投与対象となる動物の体重を乗じて得られた用量を用いる。
【００４６】
医薬組成物は、免疫を活性化することによる細菌、ウィルス等の病原体の感染に起因する感染症、ガン等の腫瘍の治療及び予防のためのワクチン等として用いることができる。
【実施例】
【００４７】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
実施例１：ｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの調製
アミノ基修飾ｄＡ４０（Ｓ）（リン酸ジエステル基をホスホロチオエート基に置換したデオキシアデノシンの４０量体）１ｍｏｌと、スクシイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）３０ｍｏｌをリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で混合させた。４０℃で３時間静置させた後、ＮＡＰ−５カラムを用いてＳＰＤＰ修飾ｄＡ４０（Ｓ）を精製した。【００４８】
ＳＰＤＰ修飾ｄＡ４０（Ｓ）１ｍｏｌに対し、２５ｍｏｌの割合で、オボアルブミン（ＯＶＡ）由来の抗原性を有するペプチド（アミノ酸配列：ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を、３０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で混合させた。４０℃で３時間静置させた後、ＨＰＬＣでｄＡ−ペプチドコンジュゲートを分取した。ＨＰＬＣの条件はＡ液を０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ；ｐＨ  ７．０）、Ｂ液をアセトニトリルとし、カラムはＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８を用いて以下のグラジェント条件で行った。
０分          Ａ：９０％    Ｂ：１０％
〜  ２５分        ７０％        ３０％
〜  ３０分          ０％        １００％【００４９】
ＨＰＬＣを用いて、ＳＰＤＰ修飾ｄＡ４０（Ｓ）と、抗原性を有するペプチドとの反応後の溶液を分取した結果を図１に示す。検出はｄＡ４０（Ｓ）の２６０ｎｍの吸収をモニタすることにより行った。分取後のｄＡ４０（Ｓ）のピークの溶出時間が遅れていることが分かる。これは、疎水性のペプチドと結合することで溶出時間が遅くなったためと考えられる。また、分取後のクロマトグラムには未反応のｄＡ４０（Ｓ）のピークは見られず、ｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートのみのピークが検出されるため、目的のｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートが純度高く得られたことが分かる。【００５０】
実施例２：ｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートによる細胞傷害性Ｔ細胞誘導の評価
抗原としてｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートを、アジュバントとしてＣｐＧ−ｄＡ／ＳＰＧ複合体（国際公開第２０１５／１１８７８９号参照）を、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス（♂、７週齢））に皮内投与した（１回）。投与から１週間後、同系統のマウスのうち、投与を行っていない個体より脾細胞を取り出し、これを２つの群に分け、一方に、抗原として、オボアルブミン（卵白アルブミン、ＯＶＡ）由来の抗原性を有するペプチド（ペプチド配列；ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を添加し、９０分静置することにより抗原保持脾細胞を作製し、ペプチドを添加していない脾細胞を抗原未保持脾細胞とした。カルボキシフルオレセインスクシイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて、抗原保持脾細胞及び抗原未保持脾細胞の両者を蛍光修飾した。このとき、ＣＦＳＥの濃度を変えることにより、抗原保持脾細胞の方が、抗原未保持脾細胞よりも蛍光強度が高くなるようにした。投与抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞をそれぞれ同数混合し、抗原及びアジュバントを投与したマウス個体に、投与から１週間後に尾静脈投与した。ｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与量は、ペプチド換算で２０ｎｇ、アジュバントの投与量は、ＣｐＧ−ＤＮＡ換算で３０μｇであった。【００５１】
上記の尾静脈投与から２４時間経過後に、マウスから脾細胞を取り出し、抗原保持脾細胞と抗原未保持脾細胞の割合を、フローサイトメトリーで定量することにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を評価した。フローサイトメトリーの測定結果を図２に示す。比較のために、ｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの代わりに、対照群としてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）及びｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートをＳＰＧと複合化させたｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート／ＳＰＧ複合体を投与したマウス個体を用いて同様の条件で行った測定結果を併せて図２に示す。【００５２】
ＰＢＳを投与したマウス個体から採取した脾細胞には、抗原保持脾細胞と未保持脾細胞の割合が同数含まれていたが、ｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート投与マウスから採取された脾細胞からは、抗原保持脾細胞のみが消失していた。このことよりｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートと、アジュバントとしてのＣｐＧ−ｄＡ／ＳＰＧ複合体の投与により、ペプチド抗原特異的な免疫応答が誘導されていることが分かる。また、その効果はｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート／ＳＰＧ複合体を投与した個体よりも高いことが分かる（ｄＡ４０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート／ＳＰＧ複合体投与マウスから採取された脾細胞からは、抗原保持脾細胞が検出されている。）。【００５３】
実施例３：コンジュゲートに用いるｄＡ（Ｓ）の塩基長依存性
コンジュゲートさせるｄＡ（Ｓ）の長さを４０以外に、２０、３０に変えて、それぞれ、実施例１と同様の方法でコンジュゲートを作製した。ＤＮＡの長さの異なるコンジュゲート体をマウスに免疫し、前記実施例と同様に尾静脈投与した抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合をフローサイトメトリーで定量することにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を評価した。【００５４】
フローサイトメトリーの測定結果を図３に示す。ｄＡ（Ｓ）の塩基長を３０まで短くしても抗原保持脾細胞が完全に消失していることが分かった。ｄＡ（Ｓ）の塩基長を２０まで減少させると、その効果は少し弱くなっているが、ペプチド特異的な細胞障害性Ｔ細胞の活性が誘導されていることが分かる。【００５５】
実施例４：ｄＡ３０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与量依存性
コンジュゲートさせるｄＡ（Ｓ）の塩基長を３０に固定し、投与するペプチド量を変えてマウスに免疫し、実施例１と同様に、尾静脈投与したマウス個体から採取した脾細胞中の、抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合をフローサイトメトリーで定量することにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を評価した。【００５６】
フローサイトメトリーの測定結果を図４に示す。ペプチド換算でのｄＡ３０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲートの投与量を２０ｎｇより低減させると、徐々にその効果がなくなっていることが分かる。一般的なペプチド免疫では数マイクログラム、ｄＡ３０（Ｓ）−ペプチドコンジュゲート／ＳＰＧ複合体では、少なくとも１００ｎｇの投与量を必要とするが、本発明ではその投与量を１００分の１〜１０００分の１に減少させることに成功した。【００５７】
実施例５：ペプチド／ヌクレオチドコンジュゲートのＤＮＡの化学構造依存性
これまでの実施例において、コンジュゲートの作製に用いているｄＡは、ホスホロチオエート結合のＤＮＡを用いているが、この化学結合の一部又は全部をリン酸ジエステル結合に弛緩すると、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性がどのように変化するか、ホスホロチオエート基の含有率を変えて評価した。ｄＡ３０のうち、リン酸ジエステル基が全てホスホロチオエート基に置換されたｄＡ３０（Ａｌｌ  ＰＳ）、３分の１がホスホロチオエート基に置換されたｄＡ３０（１／３  ＰＳ）、ホスホロチオエート基を含まないｄＡ３０（Ａｌｌ  ＰＯ）の３種類を用意し、実施例１と同様の手順によりペプチド／コンジュゲートを作製し、マウスに免疫し、前記実施例２と同様に、尾静脈投与したマウス個体より採取した抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合を、フローサイトメトリーで定量することにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を評価した。【００５８】
フローサイトメトリーの測定結果を図５に示す。ホスホロチオエート結合の割合を減少させると、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性も同様に低下することが分かった。この結果より、細胞の取り込みにホスホロチオエート結合の性質が深く関わっていることが示唆される。【００５９】
実施例６：オボアルブミン以外の抗原ペプチドによる効果
これまでの実施例において、用いている抗原ペプチドはオボアルブミン由来のペプチドを用いているが、このペプチドを他の抗原ペプチド配列に変えて評価した。抗原ペプチドとしてマウスメラノーマ抗原ＴＲＰ２（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）を選択し、前記実施例１と同様の手順によりペプチド／コンジュゲート体を作製し、マウスに免疫し、前記実施例２と同様に、尾静脈投与したマウス個体より採取した抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合を、フローサイトメトリーで定量することにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を評価した。【００６０】
フローサイトメトリーの測定結果を図６に示す。ＴＲＰ２ペプチドに対しても同様に細胞傷害性Ｔ細胞誘導活性を示すことが分かった。抗原性の高いペプチドであれば、ペプチド／コンジュゲート体により効率よくペプチド特異的免疫応答を誘導できることが分かった。【００６１】
実施例７：ペプチド／ヌクレオチドコンジュゲートのＤＮＡの配列依存性
これまでの実施例において、コンジュゲートの作製に用いている核酸はｄＡを用いているが、この配列をポリデオキシシトシン（ｄＣ）又はポリデオキシチミジン（ｄＴ）に変えると、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性がどのように変化するか、核酸の配列を変えて評価した。核酸としてｄＡ４０、ｄＣ４０、ｄＴ４０の３種類を用意し、実施例１と同様の手順によりペプチド／コンジュゲートを作製し、マウスに免疫し、前記実施例２と同様に、尾静脈投与したマウス個体より採取した抗原保持脾細胞、抗原未保持脾細胞の割合を、フローサイトメトリーで定量することにより、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を評価した。【００６２】
フローサイトメトリーの測定結果を図７に示す。核酸の配列をｄＣ、ｄＴに変化させても、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導活性に影響を与えないことが分かった。この結果より、ペプチド／ヌクレオチドコンジュゲート体による細胞傷害性Ｔ細胞の誘導にはＤＮＡの配列は依存しないことが分かった。【００６３】
なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、請求の範囲によって示される。そして、請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。    【００６４】
本出願は、２０１７年３月３０日に出願された日本国特許出願２０１７−６８２７６号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。
【図１】
2018180819.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2018180819000001.app
【国際調査報告】
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2018180819.tif 000014
2018180819.tif 000015
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