(57)【要約】  本発明は、MASP2の発現抑制活性を有する核酸、該核酸を含む医薬組成物ならびに該核酸を含むAPS、SLEなどの自己免疫疾患ならびに血液透析における血栓症の予防または治療薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖から成り、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表１−１〜表１−２２に記載された群から選択される標的MASP2 mRNA配列と相補的である、MASP2遺伝子の発現を減少させる二本鎖核酸。
【請求項２】
前記二重鎖領域が11〜27個の塩基対であり、表１−１〜表１−２２に記載された群から選択される標的MASP2 mRNA配列と相補的である前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドが、該標的MASP2 mRNA配列の3’末端から2番目のリボヌクレオチドと相補する、請求項１に記載の二本鎖核酸。
【請求項３】
前記センス鎖の3’末端および前記アンチセンス鎖の5’末端が、平滑末端を形成する、請求項１または２に記載の二本鎖核酸。
【請求項４】
前記センス鎖が、21ヌクレオチド長であり、かつ前記アンチセンス鎖が、23ヌクレオチド長である、請求項3に記載の二本鎖核酸。
【請求項５】
前記センス鎖が、21ヌクレオチド長であり、かつ前記アンチセンス鎖が、21ヌクレオチド長である、請求項１または２に記載の二本鎖核酸。
【請求項６】
前記センス鎖の3’末端および前記アンチセンス鎖の3’末端が突出部分を有する、請求項５に記載の二本鎖核酸。
【請求項７】
前記アンチセンス鎖は、表１−１〜表１−２２、および表２の「アンチセンス鎖」に記載された群から選択される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項８】
前記センス鎖は、表１−１〜表１−２２、および表２の「センス鎖」に記載された群から選択される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項９】
表１−１〜表１−２２、および表２に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項１０】
2’-修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項１１】
二重鎖領域内のヌクレオチドの50〜100％が2’-修飾ヌクレオチドである、請求項１０に記載の二本鎖核酸。
【請求項１２】
リガンドを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の二本鎖核酸の、アンチセンス鎖のみからなる一本鎖核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
補体レクチン経路の異常により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸又は請求項１４に記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
【請求項１６】
前記障害が、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎症、C3腎症、血栓性血小板減少性紫斑病、血栓性微小血管障害症、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、または虚血時の腎臓障害や脳梗塞時の組織傷害である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MASP2の発現抑制に用いるための核酸または該核酸を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Mannan-binding lectin serine protease 2（MASP2）は686アミノ酸から構成される蛋白質であり、N末端側からCUBドメイン−EGFドメイン−CUBドメイン−CCP1-CCP2−セリンプロテアーゼドメインという構成になっている。MASP2は肝臓で産生される補体蛋白質の１つであり、補体経路の中でもレクチン経路の活性化に関わっている（非特許文献１）。【０００３】
疾患との関連について、MASP2はIgA腎症や膜性腎症、ループス腎症、C3腎症、血栓性血小板減少性紫斑病、血栓性微小血管障害症、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)といった補体の関わる自己免疫疾患において重要な疾患関連蛋白質であると考えられている（非特許文献２、３）。またMASP2は虚血再灌流障害時に組織傷害の原因の１つである事が報告されており、MASP2を阻害する事で虚血時の腎臓障害や脳梗塞時の組織傷害を軽減できる事が動物モデルを用いた研究ならびに臨床研究より強く示唆されている（非特許文献４、５）。MASP2を特異的に阻害することにより、上記の疾患を予防あるいは治療できると期待できるが、MASP2の発現を特異的に阻害する医薬品はこれまでに報告が無い。【０００４】
遺伝子の発現自体を抑制する方法として、例えばRNA干渉(RNA interference、以下、RNAiと呼ぶ)を利用した方法等が知られている。具体的には、標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖RNAを導入することにより、該標的遺伝子の発現が特異的に抑制されることが見出され、short interfering RNA(siRNA)と名づけられている(特許文献１)。また、RNA干渉以外の遺伝子の発現を抑制する方法として、アンチセンス法が知られている（特許文献２）。しかし、ヒトのMASP2遺伝子を効果的に抑制することを示したsiRNA配列は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2001/75164号パンフレット
【特許文献２】国際公開第98/56905号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Immunobiology, 205, 455-466 (2002)
【非特許文献２】Nat Rev Nephrol., 12, 383-401 (2016)
【非特許文献３】Nephrol Dial Transplant., 13, 1984-1990 (1998)
【非特許文献４】FASEB J., 28, 3996-4003 (2014)
【非特許文献５】J Neuroinflammation., 13, 213 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、MASP2の発現を抑制することが可能な核酸を提供することを目的とする。また本発明はMASP2の発現に関連する疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の(1)〜(16)に関する。
(1)センス鎖およびアンチセンス鎖から成り、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であって、前記アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表１−１〜表１−２２に記載された群から選択される標的MASP2 mRNA配列と相補的である、MASP2遺伝子の発現を減少させる二本鎖核酸。
(2)前記二重鎖領域が11〜27個の塩基対であり、表１−１〜表１−２２に記載された群から選択される標的MASP2 mRNA配列と相補的である前記アンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドが、該標的MASP2 mRNA配列の3’末端から2番目のリボヌクレオチドと相補する、(1)に記載の二本鎖核酸。
(3)前記センス鎖の3’末端および前記アンチセンス鎖の5’末端が、平滑末端を形成する、(1)または(2)に記載の二本鎖核酸。
(4)前記センス鎖が、21ヌクレオチド長であり、かつ前記アンチセンス鎖が、23ヌクレオチド長である、(3)に記載の二本鎖核酸。
(5)前記センス鎖が、21ヌクレオチド長であり、かつ前記アンチセンス鎖が、21ヌクレオチド長である、(1)または(2)に記載の二本鎖核酸。
(6)前記センス鎖の3’末端および前記アンチセンス鎖の3’末端が突出部分を有する、(5)に記載の二本鎖核酸。
(7)前記アンチセンス鎖は、表１−１〜表１−２２、および表2の「アンチセンス鎖」に記載された群から選択される配列を含む、(1)〜(6)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
(8)前記センス鎖は、表１−１〜表１−２２、および表2の「センス鎖」に記載された群から選択される配列を含む、(1)〜(6)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
(9)表１−１〜表１−２２、および表2に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む、(1)〜(6)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
(10)2’-修飾ヌクレオチドを含む、前記(1)〜(9)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
(11)二重鎖領域内のヌクレオチドの50〜100％が2’-修飾ヌクレオチドである、前記(10)記載の二本鎖核酸。
(12)リガンドを含む、(1)〜(11)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸。
(13)(1)〜(12)のいずれか一項に記載の二本鎖核酸の、アンチセンス鎖のみからなる一本鎖核酸。
(14)(1)〜(13)のいずれか一項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
(15) 補体レクチン経路の異常により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、(1)〜(13)のいずれか一項に記載の核酸又は(14)に記載の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法。
(16)前記障害が、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎症、C3腎症、血栓性血小板減少性紫斑病、血栓性微小血管障害症、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、または虚血時の腎臓障害や脳梗塞時の組織傷害である、(15)に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の核酸、または該核酸含む医薬組成物を投与することによって、MASP2の発現を抑制することが可能となる。特に、MASP2の発現に関連する疾患の治療・予防に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の核酸が標的とするMASP2遺伝子(MASP2をコードする遺伝子)としては、Genbank Accession No.NM_006610.3として登録されているMASP2 cDNA(配列番号２８２７)に対応する、MASP2の完全長mRNAを産生する遺伝子があげられる。
また、ヒト以外の生物種のMASP2遺伝子のmRNAも、本発明の核酸の標的遺伝子になり得る。例えば、マウスMASP2遺伝子の完全長mRNAに対応するcDNA塩基配列としてGenbank Accession No.NM_001003893.2が、ラットMASP2遺伝子の完全長mRNAに対応するcDNA塩基配列としてGenbank Accession No.NM_172043.1が、カニクイザルCFB遺伝子の完全長mRNAに対応するcDNA塩基配列としてGenbank Accession No.XM_005544812.2が、アカゲザルCFB遺伝子の完全長mRNAに対応するcDNA塩基配列としてGenbank Accession No.XM_001118827.3等が挙げられる。
【００１１】
1. 本発明の核酸
本発明において、MASP2 mRNAに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸と称し、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸とも称する。本明細書において「本発明の核酸」という場合、特にことわらない限り、アンチセンス鎖核酸、センス鎖核酸、並びにセンス鎖及びアンチセンス鎖核酸が対形成した二本鎖核酸を包含する意味で用いられる。
【００１２】
本発明の核酸としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体があげられる。また、これらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明の核酸に含まれる。またウラシル（U）は、チミン（T）に一義的に読み替えることができる。
【００１３】
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
【００１４】
ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
【００１５】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
【００１６】
2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がH、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換されたヌクレオチド、好ましくは2’-OH基がH、Fまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチド、より好ましくは2’-OH基がFまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドがあげられる。また、2’-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)etoxy 基および2-cyanoetoxy 基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等もあげられる。
2’-修飾ヌクレオチドは、二本鎖核酸領域内のヌクレオチドに対して、50〜100％含まれることが好ましく、70〜100％含まれることがより好ましく、90〜100％含まれることがさらに好ましい。
2’-修飾ヌクレオチドが施された二本鎖核酸として、例えば、表２に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖からなる成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列からなる二本鎖核酸が挙げられる。なお、表２において、N(M)は2’-O-methyl-RNAを、N(F)は2’-F-RNAを示す。ここで、NはA、C、G又はUを示す。
【００１７】
また、糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)があげられ、具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]、Constrained Ethyl (cEt)[The Journal of Organic Chemistry 75, 1569 (2010)]、Amido-Bridged Nucleic Acid (AmNA)[Chem Bio Chem 13, 2513 (2012)]及び2’-O,4’-C-Spirocyclopropylene bridged nucleic acid (scpBNA)[Chem. Commun., 51, 9737 (2015)]等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等もあげられる。
【００１８】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。
【００１９】
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものがあげられる。なお、シトシン（C）の代わりに5-メチルシトシン（5-mC）を塩基修飾ヌクレオチドとして用いることも、本発明の好ましい形態の一つである。
【００２０】
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチド又は糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、リガンド、例えば、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイドなどの脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)などの糖類、フル抗体、Fab、scFv、VHHなどのフラグメント抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、RGD、NGR、R9、CPPなどのペプチド類、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、葉酸などの低分子、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマー、核酸アプタマー、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンなどの色素、Cy3シリーズ、Alexaシリーズ、ブラックホールクエンチャーなどの蛍光団等の別の化学物質を、直接又はリンカーを介して付加したものも挙げられる。具体的にはポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、GalNAc付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、脂肪酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体及びビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられ、好ましくはGalNAc付加ヌクレオチド誘導体が挙げられる。これらは、固相上での伸長反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5’末端、3’末端及び／又は配列内部に修飾を施すことができる。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基または３重結合などの官能基を導入した核酸をあらかじめ合成および精製しておき、それらに修飾剤を作用させることで得ることもできる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
【００２１】
本発明の核酸は、核酸の分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）で置換されたものも包含する。
【００２２】
本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として２重螺旋構造をとるものをいう。
【００２３】
本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、該ヌクレオチド配列間で0〜30％、0〜20％または0〜10％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、MASP2 mRNAに対して相補的なアンチセンス鎖は、該mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列に対して1〜8個、好ましくは1〜6個、1〜4個、1〜3個、特に2個または1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。例えば、アンチセンス鎖が21塩基長の場合には、標的遺伝子の標的配列に対して6個、5個、4個、3個、2個または1個のミスマッチ塩基を有してもよく、そのミスマッチの位置は、それぞれの配列の5’末端または3’末端であってもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基が付加および／または欠失した配列である場合を包含する。例えば、MASP2 mRNAと本発明のアンチセンス鎖核酸とは、アンチセンス鎖における塩基の付加および／または欠失により、アンチセンス鎖および／または標的MASP2 mRNA領域に1個または2個のバルジ塩基を有してもよい。 
【００２４】
本発明の核酸は、MASP2 mRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸および／または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であれば、いずれのヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。本発明の二本鎖核酸は、標的MASP2 mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常11〜35塩基であり、15〜30塩基が好ましく、17〜25塩基がより好ましく、17〜23塩基がさらに好ましく、19〜23塩基が特に好ましい。21〜23塩基からなることもまた好ましい。
【００２５】
本発明のアンチセンス鎖核酸としては、標的MASP2 mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸が用いられるが、該核酸のうち1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。
【００２６】
MASP2の発現を抑制する核酸としては、標的MASP2 mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつMASP2の発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的MASP2 mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつMASP2の発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
【００２７】
本発明において二本鎖核酸とは、二本のヌクレオチド鎖が対合し二重鎖領域を有する核酸をいう。二重鎖領域とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖領域は、通常11〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、17〜21塩基対がさらに好ましく、17〜19塩基対が特に好ましい。
【００２８】
二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることが特に好ましく、19〜23塩基からなることが最も好ましい。21〜23塩基からなることもまた好ましい。
【００２９】
本発明の二本鎖核酸において、二重鎖領域に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部(オーバーハング)と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
【００３０】
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜6塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えばdTdTまたはUUからなる突出部を有するものがあげられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、本発明において、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。なお、アンチセンス鎖は、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド鎖において、表１−１〜表１−２２および表2に記載された群から選択される標的MASP2 mRNA配列と十分に相補的である。さらに、本発明の二本鎖核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により上記の二本鎖核酸を生成する核酸分子(WO2005/089287)や、3’末端や5’末端の突出部を有さず平滑末端を形成する二本鎖核酸、センス鎖又はアンチセンス鎖のみが突出した二本鎖核酸（US2012/0040459）などを用いることもできる。
【００３１】
本発明の二本鎖核酸としては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の5’末端または3’末端が1〜4塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
【００３２】
本発明の二本鎖核酸は、RNA同士が二重鎖を形成した二本鎖RNA（dsRNA）、DNA同士が二重鎖を形成した二本鎖DNA（dsDNA）、またはRNAとDNAが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がDNAとRNAとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖RNA（dsRNA）である。
【００３３】
本発明のアンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドは、標的MASP2 mRNA配列の3’末端から2番目のリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2〜7番目のヌクレオチドが、標的MASP2 mRNA配列の3’末端から2〜7番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2〜11番目のヌクレオチドが、標的MASP2 mRNA配列の3’末端から2〜11番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、本発明の核酸におけるアンチセンス鎖の5’末端から11番目のヌクレオチドが、標的MASP2 mRNA配列の3’末端から11番目のリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から9〜13番目のヌクレオチドが、標的MASP2 mRNA配列の3’末端から9〜13番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から7〜15番目のヌクレオチドが、標的MASP2 mRNA配列の3’末端から7〜15番目のリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
【００３４】
本発明の核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等があげられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法[Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)]等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度90%以上、好ましくは95%以上の核酸を得るのが望ましい。二本鎖核酸の場合には、合成および精製したセンス鎖、アンチセンス鎖を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖1当量に対して、センス鎖0.1〜10当量、好ましくは0.5〜2当量、より好ましくは0.9〜1.1当量、さらに好ましくは等モル量で混合した後、アニーリングを行って用いてもよいし、または、混合したものをアニーリングする工程を省いて直接用いてもよい。アニーリングは、二本鎖核酸を形成できる条件であればいかなる条件で行ってもよいが、通常、センス鎖、アンチセンス鎖をほぼ等モル量で混合した後、94℃程度で5分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行われる。本発明の核酸を製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法があげられる。
【００３５】
本発明の核酸は、トランスフェクション用の担体、好ましくはカチオン性リポソーム等のカチオン性担体を用いて細胞内に導入することができる。また、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法またはマイクロインジェクション法などにより、直接細胞内に導入することもできる。
【００３６】
本発明の核酸は、5'末端、3'末端または／および配列内部が１つ以上のリガンドや蛍光団により修飾されていてもよく、リガンドや蛍光団により修飾された核酸をコンジュゲート核酸とも呼ぶ。固相上での伸張反応時に、固相上で反応可能な修飾剤を反応させることで、5'末端、3'末端または／および配列内部に修飾を施すことができる。また、アミノ基、メルカプト基、アジド基または３重結合などの官能基を導入した核酸をあらかじめ合成および精製しておき、それらに修飾化剤を作用させることでコンジュゲート核酸を得ることもできる。リガンドとしては、生体分子と親和性のある分子であれば良いが、例えば、コレステロール、脂肪酸、トコフェロール、レチノイドなどの脂質類、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)などの糖類、フル抗体、Fab、VHHなどの抗体、低密度リポタンパク質（LDL）、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質、RGD、NGR、R9、CPPなどのペプチド類、葉酸などの低分子、合成ポリアミノ酸などの合成ポリマー、あるいは核酸アプタマーなどがあげられ、これらを組み合わせて用いることもできる。蛍光団としてはCy3シリーズ, Alexaシリーズ、ブラックホールクエンチャーなどがあげられる。
【００３７】
本発明の核酸の代わりに、細胞内に導入してこれらが発現されるようなベクターを用いてもよい。具体的には、本発明の核酸をコードする配列を発現ベクター内のプロモーター下流に挿入して発現ベクターを構築し、細胞に導入することにより該核酸等を発現させることができる。発現ベクターとしては、pCDNA6.2-GW/miR(Invitrogen社製)、pSilencer 4.1-CMV(Ambion社製)、pSINsi-hH1 DNA(タカラバイオ社製)、pSINsi-hU6 DNA(タカラバイオ社製)、pENTR/U6(Invitrogen社製)等をあげることができる。
【００３８】
また、本発明の核酸をコードする配列をウイルスベクター内のプロモーター下流に挿入し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して生産した組換えウイルスベクターを用いることもできる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどがあげられる。
【００３９】
2. MASP2の発現抑制活性を有する核酸
本発明のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、例えば、Genbank  Accession  No.NM_006610.3として登録されているヒトMASP2の完全長mRNAのcDNA（センス鎖）の塩基配列（配列番号２８２７)に基づいて設計することができる。また、ヒトMASP2の完全長mRNAのcDNAの塩基配列と他生物種のMASP2の完全長mRNAのcDNAの塩基配列とを比較することにより、複数の生物種でMASP2 mRNAの発現を抑制するアンチセンス鎖、センス鎖を設計することもできる。
【００４０】
MASP2の発現抑制活性を有する核酸としては、MASP2 mRNAに対して相補的な塩基配列を含む本発明のアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む本発明のセンス鎖核酸とからなり、かつMASP2の発現抑制活性を有する二本鎖核酸があげられる。該二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることが特に好ましく、19〜21塩基からなることが最も好ましい。19〜23塩基、好ましくは21〜23塩基からなってもよい。該二本鎖核酸は通常15〜27塩基対、好ましくは15〜25塩基対、より好ましくは15〜23塩基対、さらに好ましくは15〜21塩基対からなる二重鎖領域を有している。
【００４１】
これらの二本鎖核酸を細胞に導入することにより、MASP2の発現を抑制することができる。例えば本発明の二本鎖核酸は、数pM〜数nMの濃度で、細胞に導入した後、24時間以上、例えば48時間培養した段階でMASP2のmRNAの発現を抑制することができる。
【００４２】
また、本発明の二本鎖核酸のMASP2 mRNAの発現抑制活性の評価は、該核酸等をヒト細胞株などにカチオン性リポソームなどを用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるMASP2のmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。
【００４３】
MASP2の発現抑制活性を有する核酸としては、上記二本鎖核酸以外にも、MASP2 mRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつMASP2の発現を抑制する一本鎖核酸があげられる。該核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常8〜30塩基からなるが、12〜30塩基からなることが好ましく、12〜20塩基からなることがより好ましい。19〜23塩基、好ましくは21〜23塩基からなってもよい。
【００４４】
これらの一本鎖核酸も細胞に導入することにより、MASP2の発現を抑制することができる。例えば本発明の一本鎖核酸は、数pM〜数nMの濃度で、細胞に導入した後、24時間以上、例えば48時間培養した段階でMASP2のmRNAの発現を抑制することができる。
【００４５】
また、本発明の一本鎖核酸のMASP2のmRNAの発現抑制活性の評価は、該核酸等をヒト細胞株などにカチオン性リポソームなどを用いてトランスフェクションし、一定時間培養した後、当該ヒト細胞株におけるMASP2のmRNAの発現量を定量することにより行うことができる。
【００４６】
3. 本発明の医薬組成物
本発明はまた、上記の二本鎖核酸、一本鎖核酸等の核酸を有効成分として含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、抗リン脂質抗体症候群(APS)、全身性エリテマトーデス（SLE）といった自己免疫疾患および血液透析における血栓症の治療剤または予防剤として用いることができる。
【００４７】
また、本発明の医薬組成物は、MASP2の発現に関連する疾患、特に補体レクチン経路の異常により媒介される障害の治療又は予防用に好適に用いることができる。本明細書中、補体レクチン経路の異常により媒介される障害は、上記の自己免疫疾患（例：APS、SLE）、血液透析における血栓症のほか、例えば、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎症、C3腎症、血栓性血小板減少性紫斑病、血栓性微小血管障害症、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、虚血時の腎臓障害や脳梗塞時の組織傷害などを指す。従って、本発明の医薬組成物は、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎症、C3腎症、血栓性血小板減少性紫斑病、血栓性微小血管障害症、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、虚血時の腎臓障害や脳梗塞時の組織傷害などの治療剤又は予防剤として用いることができる。
【００４８】
該医薬組成物は、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体をさらに含むことができる。核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体としては、例えばカチオン性担体があげられる。カチオン性担体としては、カチオン性リポソームおよびカチオン性ポリマーなどがあげられる。また、核酸を細胞内に移行させるのに有効な担体として、ウイルスエンベロープを利用した担体を用いてもよい。カチオン性ポリマーとしては、JetSI(Qbiogene社)、Jet-PEI(ポリエチレンイミン;Qbiogene社)などが好ましく用いられる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、GenomeOne（登録商標）(HVJ-Eリポソーム;石原産業社)などが好ましく用いられる。
【００４９】
本発明の核酸と上記担体を含む組成物は、当業者に既知の方法により調製することができる。例えば、適当な濃度の担体分散液と核酸溶液とを混合して調製することができる。カチオン性担体を用いる場合、核酸は通常、水溶液中で負電荷を帯びているため、常法により水溶液中で混合することによって容易に調製することができる。該組成物を調製するために用いる水性溶媒としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、マルトース液などの糖液などがあげられる。また、該組成物を調製する際のpHおよび温度などの条件は当業者が適宜選択できる。該組成物は、必要ならば超音波分散装置や高圧乳化装置などを用いて分散処理を行うことにより、均一な組成物とすることもできる。担体と核酸とを含む組成物の調製に最適な方法および条件は、用いる担体に依存するので、上記の方法にとらわれることなく、当業者であれば用いる担体に最適な方法を選択できる。
【００５０】
また、本発明の医薬組成物としては、例えば核酸とリード粒子とを構成成分とする複合粒子および該複合粒子を被覆する脂質膜から構成される組成物も、好適に用いられる。リード粒子としては、例えば、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等があげられ、好ましくはカチオン性リポソームが用いられる。本発明におけるリード粒子は、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を2つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物(例えば糖、脂質、無機化合物等)とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。
該複合粒子を被覆する脂質膜としては、例えば非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻止する脂質およびカチオン性脂質等を構成成分とするものがあげられる。
【００５１】
該組成物は、例えば国際公開公報2006/080118号パンフレット等に記載の方法に従って調製することができる。
【００５２】
本発明の医薬組成物に含まれる核酸と担体との配合比は、核酸の1重量部に対して担体1〜200重量部が適当である。好ましくは、核酸の1重量部に対して担体2.5〜100重量部、さらに好ましくは担体7〜25重量部である。
【００５３】
本発明の医薬組成物の大きさは、平均粒子径が約10nm〜300nmであるのが好ましく、約30nm〜200nmであるのがより好ましく、約50nm〜150nmであるのがさらに好ましい。
【００５４】
本発明の医薬組成物には、上記担体の他に、医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などを含んでいてもよい。医薬的に許容できるキャリアーまたは希釈剤などは、本質的に化学的に不活性および無害な組成物であり、本発明の医薬組成物の生物学的活性に全く影響を与えないものである。そのようなキャリアーまたは希釈剤の例は、塩溶液、糖溶液、グリセロール溶液、エタノールなどがあるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、疾患の治療または予防に有効な量の該複合体を含み、かつ、患者に適切に投与できるような形態で提供される。本発明の医薬組成物の製剤形態は、例えば注射剤、点眼剤、吸入用などの液剤、例えば軟膏、ローション剤などの外用剤等であってもよい。
【００５６】
液剤の場合、本発明の医薬組成物中の有効成分の濃度範囲は通常、0.001〜25%(w／v)であり、好ましくは0.1〜10%(w／v)であり、より好ましくは0.5〜5%(w／v)である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、pH調整剤等を適当量含有していてもよい。医薬的に許容される任意の添加剤は、該複合体の分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
【００５７】
該液剤のpHは、通常、約5.0〜約8.5、好ましくは約6.0〜約8.0に調整され、好ましくは、メンブレンフィルター等を用いた濾過滅菌などの滅菌処理を行う。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、凍結乾燥製剤として調製することもできる。凍結乾燥製剤は、核酸と担体とを分散処理した後、凍結乾燥処理することにより調製することができる。凍結乾燥処理は、常法により行うことができる。例えば、上記の分散処理後の複合体溶液を無菌状態にて所定量をバイアル瓶に分注し、約-40〜-20℃の条件で予備乾燥を約2時間程度行い、約0〜10℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約15〜25℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、例えばバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓することにより、本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００５９】
凍結乾燥製剤は、任意の適当な溶液の添加によって再溶解し、使用することができる。このような溶液としては、注射用水、生理食塩水などの電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液などをあげることができる。この溶液の液量は、用途などによって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の0.5〜2倍量、または500ml以下が好ましい。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、ヒトを含む動物に対し、例えば静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与または経直腸投与することができるが、患者の症状に合わせた適切な方法により投与することが好ましい。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が好ましく用いられる。また、癌内局所投与など、局所投与をすることもできる。これらの投与方法に適した剤型としては、例えば各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸収剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等があげられる。
【００６１】
本発明の医薬組成物の用量は、核酸、剤型、年齢や体重などの患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度などを考慮した上で決定することが望ましいが、通常は核酸の質量として、成人に対して1日当たり、0.1mg〜10g／日、好ましくは1mg〜500mg／日である。場合によっては、これ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また1日1回〜数回投与することもでき、1日〜数日の間隔をおいて投与することもできる。
【００６２】
4. 治療方法
本発明はさらに、補体レクチン経路の異常により媒介される障害を治療する方法であって、治療上有効量の、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を、そのような治療を必要とするヒトに投与するステップを含む方法（本発明の治療方法）を提供する。
【００６３】
本発明の治療方法は、好ましくは、IgA腎症、膜性腎症、ループス腎症、C3腎症、血栓性血小板減少性紫斑病、血栓性微小血管障害症、非典型溶血性尿毒症症候群(aHUS)、虚血時の腎臓障害や脳梗塞時の組織傷害などの疾患を治療する方法であって、治療上有効量の本発明の核酸または本発明の医薬組成物を、該治療を必要とするヒトに投与することが特徴である。その他の工程および条件は、何ら制限されない。
【００６４】
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の医薬組成物の投与方法、用量、調製方法等を援用できる。
【００６５】
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６６】
ヒト細胞におけるMASP2 mRNAのノックダウン活性の測定
96ウェルの培養プレートにヒト肝臓癌由来の細胞株であるHepG2/C3A細胞（ATCCより入手、ATCC番号: CRL-10741）を、10,000細胞/80μL/ウェルとなるよう播種した。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS) 、1 mM ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製、カタログ番号: 06977-34）、1%MEM Non-Essential Amino Acids（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号: 11140-050）を含むMEM培地(ナカライテスク社製、カタログ番号:21442-25)を用いた。二本鎖核酸は、表１−１〜表１−２２に記載のものをシグマアルドリッチにて合成して利用した。具体的には配列番号１〜９４２に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖、配列番号９４３〜１８８４に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖をアニーリングさせた二本鎖核酸で構成される（配列番号ｎ（ｎ＝１〜９４２）に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋９４２］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）。この表１−１〜表１−２２に記載の二本鎖核酸とRNAiMaxトランスフェクション試薬(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:13778-150)をOpti-MEM 培地(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:31985-070)で希釈して、二本鎖核酸の終濃度が10nMとなるように20μLのsiRNA/RNAiMax混合液を各々96ウェルの培養プレートに添加し、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。その後、細胞をPBS（Phosphate buffered saline）で洗浄し、各々のプレートからSuperPrep（登録商標） Cell Lysis & RT Kit for qPCRキット（東洋紡社製、カタログ番号: SCQ-101）を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従いcDNAを合成した。このcDNA 4μLをMicroAmpOptical 384ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号:4309849）に加え、更に10μLのTaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、4μLのUltraPure Distilled Water（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhuman MASP2プローブ（アプライドバイオシステムズ社製、Hs00198244_m1)、1μLのhuman GAPDHプローブ（アプライドバイオシステムズ社製、Hs02786624_g1)を添加した。QuantStudio（登録商標） 12K FlexリアルタイムPCRシステムを用いて、human MASP2遺伝子およびhuman GAPDH（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子のリアルタイムPCRをおこなった。GAPDHは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、MASP2発現量を補正した。siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでHepG2/C3A細胞を処理した時のMASP2mRNA量を1.0として、各二本鎖核酸を導入した時のMASP2 mRNA相対発現量を算出した。本実験を2または3回おこない、MASP2 mRNA相対発現量の平均値を表１−１〜表１−２２に示した。表１−１〜表１−２２中の備考欄において、*印は2回の実験の平均値、それ以外は3回の実験の平均値を示した。【００６７】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【実施例２】
【００６８】
修飾siRNAのヒト細胞におけるMASP2 mRNAのノックダウン活性の測定
96ウェルの培養プレートにヒト肝臓癌由来の細胞株であるHepG2/C3A細胞（ATCCより入手、ATCC番号: CRL-10741）を、10,000細胞/80μL/ウェルとなるよう播種した。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS) 、1 mM ピルビン酸ナトリウム（ナカライテスク社製、カタログ番号: 06977-34）、1%MEM Non-Essential Amino Acids（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号: 11140-050）を含むMEM培地(ナカライテスク社製、カタログ番号:21442-25)を用いた。二本鎖核酸は、表２に記載のものをジーンデザインにて合成して利用した。具体的には配列番号２８２８〜２８９９に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖、配列番号２９００〜２９７１に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖をアニーリングさせた二本鎖核酸で構成される（配列番号ｎ（ｎ＝２８２８〜２８９９）に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋７２］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）。この表２に記載の二本鎖核酸とRNAiMaxトランスフェクション試薬(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:13778-150)をOpti-MEM 培地(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:31985-070)で希釈して、二本鎖核酸の終濃度が10nMとなるように20μLのsiRNA/RNAiMax混合液を各々96ウェルの培養プレートに添加し、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。その後、細胞をPBS（Phosphate buffered saline）で洗浄し、各々のプレートからSuperPrep（登録商標） Cell Lysis & RT Kit for qPCRキット（東洋紡社製、カタログ番号: SCQ-101）を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従いcDNAを合成した。このcDNA 4μLをMicroAmpOptical 384ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号:4309849）に加え、更に10μLのTaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、4μLのUltraPure Distilled Water（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhuman MASP2プローブ（アプライドバイオシステムズ社製、Hs00198244_m1)、1μLのhuman GAPDHプローブ（アプライドバイオシステムズ社製、Hs02786624_g1)を添加した。QuantStudio（登録商標） 12K FlexリアルタイムPCRシステムを用いて、human MASP2遺伝子およびhuman GAPDH（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子のリアルタイムPCRをおこなった。GAPDHは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、MASP2発現量を補正した。siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでHepG2/C3A細胞を処理した時のMASP2 mRNA量を1.0として、各二本鎖核酸を導入した時のMASP2 mRNA相対発現量を算出した。本実験を2または4回おこない、MASP2 mRNA相対発現量の平均値を表２に示した。表２中の備考欄において、*印は4回の実験の平均値、それ以外は2回の実験の平均値を示した。【００６９】
【表２】
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【００７０】
本出願は、日本国で出願された特願２０１７−０４５２２６（出願日：２０１７年３月９日）を基礎としており、ここで言及することにより、その内容は本明細書に全て包含される。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明により、MASP2の発現抑制活性を有する核酸、該核酸を有効成分とする医薬組成物などが提供される。本発明の核酸および医薬組成物は、MASP2の発現を抑制し、APS、SLEなどの自己免疫疾患ならびに血液透析における血栓症の治療・予防に有用である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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