(57)【要約】【課題】  本発明は、治療効果の高いＭＳＣを含む細胞製剤を提供することを目的とする。【解決手段】  ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて、哺乳動物胎児付属物由来の賦活化剤を含む培地中でＭＳＣを培養する工程を含む、賦活化されたＭＳＣの製造方法が提供される。また、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択されるＭＳＣの治療効果マーカー、同マーカーを用いた治療効果判定方法、治療効果を高めるための処理に対するＭＳＣの適応性判定方法、ＭＳＣを含む細胞製剤及びその製造方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で間葉系幹細胞を処理する賦活化工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する工程である、前記製造方法。
【請求項２】
細胞培養担体が、ナノメートル〜マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
開口部の平均径が５００ｎｍ〜１０００μｍである、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
培地中の賦活化剤の濃度が、ファイバーからなる３次元構造を有さない細胞培養担体を用いて間葉系幹細胞を培養する賦活化工程における培地中の賦活化剤濃度の１／１０〜１／１０００００である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
培地中の賦活化剤の濃度が、タンパク質換算で０．０１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
賦活化工程における細胞の継代回数が２回以下である、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
ＣＤ４７陽性細胞の割合が２％以下である、間葉系幹細胞を含む細胞製剤。
【請求項１１】
間葉系幹細胞が、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により製造される賦活化された間葉系幹細胞である、請求項１０に記載の細胞製剤。
【請求項１２】
間葉系幹細胞集団の中からＣＤ４７陰性の間葉系幹細胞を濃縮する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞製剤の製造方法。
【請求項１３】
ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される、間葉系幹細胞の治療効果と正に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカー。
【請求項１４】
ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される、間葉系幹細胞の治療効果と負に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカー。
【請求項１５】
被験間葉系幹細胞におけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を対照間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。
【請求項１６】
測定工程が、被験間葉系幹細胞における
（Ａ）ＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ−６及びＴＥＲＴよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに／又は
（Ｂ）ｐ５３及びα−ＳＭＡよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多いこと並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記（Ａ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合及び／又は前記（Ｂ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する工程である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の方法の測定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において低い場合に被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。
【請求項１８】
被験間葉系幹細胞が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で培養された間葉系幹細胞である、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
被験間葉系幹細胞が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて培養された間葉系幹細胞である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
被験間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
被験間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
処理された間葉系幹細胞におけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていない間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を高めるための処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。
【請求項２３】
測定工程が、処理された間葉系幹細胞と処理されていない間葉系幹細胞のそれぞれにおける
（Ａ）ＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ−６及びＴＥＲＴよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに／又は
（Ｂ）ｐ５３及びα−ＳＭＡよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多いこと並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記（Ａ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合及び／又は前記（Ｂ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する工程である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の方法の測定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において低い場合にその間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する、処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。
【請求項２５】
処理が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
処理が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の製造方法、間葉系幹細胞の治療効果を評価するためのマーカー、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法、治療効果を高めるための処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法及び間葉系幹細胞を含む細胞製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下ＭＳＣともいう）は、多分化能及び自己複製能を有する幹細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞といった間葉系に属する細胞に分化するだけでなく、神経細胞や肝細胞等にも胚葉を超えて分化する能力を有する。またＭＳＣは、自身が産生する液性因子によるパラクライン効果及び細胞接着相互作用も有することが知られている。ＭＳＣは、これらの作用に基づいて、標的組織や細胞の修復・再生能、及び抗炎症等の免疫制御能を発揮し、その結果、様々な疾患への治療効果を示すと考えられている。【０００３】
ＭＳＣは、単離培養が容易かつ増殖力が旺盛で、短期間で移植可能な細胞数を確保できること、免疫拒絶のない自家移植が可能であること、倫理的問題も少ないこと、低免疫原性により前処置を要せず同種移植が現実的であること等から、理想的な細胞移植療法の材料として、多様な疾患に対する治療への応用の検討が進められている。【０００４】
本発明者らは、ＭＳＣを用いた細胞移植療法を確立する過程において、患者例えば糖尿病患者のＭＳＣが異常なＭＳＣであること、具体的には前述のような多様な能力を失った又はこれらの能力が正常なＭＳＣと比べて低減した結果として、疾患治療効果を失った又は治療効果が正常なＭＳＣと比べて低減したＭＳＣであること、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物が前記異常なＭＳＣを賦活化して治療効果を回復させることができること、及びかかる賦活化されたＭＳＣを用いた自家移植治療が可能となること等を見出し、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する異常なＭＳＣに対する賦活化剤を発明し、特許出願した（特許文献１）。この賦活化剤は、特に、治療が必要となった段階の患者に対してもＭＳＣの自家移植を可能とする点において、重要な意義を有する。【０００５】
特許文献１に記載の異常なＭＳＣに対する賦活化剤は、哺乳動物の胎児付属物、例えばヒトの臍帯組織や胎盤組織からの抽出物として製造することができる。幸いにも、ヒトを含む哺乳動物の胎児付属物は、比較的入手が容易で一定の供給量も期待し得る生物学的試料ではある。しかしながら、ＭＳＣを用いた細胞移植療法の適用が望ましい患者、例えば世界的に増加の一途を辿っている多数の糖尿病患者に対してＭＳＣの自家移植を可能とするには、哺乳動物の胎児付属物及びこれから抽出される賦活化剤の供給量は、十分であるとは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／１３７４１９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らの研究により、賦活化剤は異常なＭＳＣのみならず、健常者のＭＳＣの治療効果をも高めることができること、一方で賦活化剤で処理しても治療効果の上昇がほとんど認められないＭＳＣがあること、等が明らかにされた。前述のように、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤は有効利用が求められる貴重な物質であり、治療効果の上昇が殆ど認められないＭＳＣに使用することは、結果的なことであっても好ましくない。さらに、賦活化剤で処理しても治療効果の上昇が認められないＭＳＣは、患者に投与してもその効果が期待できないため、投与前にその活性を確認することが望まれる。【０００８】
したがって、本発明は、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を用いた賦活化されたＭＳＣの製造において、より効率的にＭＳＣを賦活化する手段を提供することを目的とする。本発明はまた、ＭＳＣの治療効果を評価する方法を提供すること、対象から分離されたＭＳＣが賦活化剤での処理等の治療効果を高めることを意図した処理への適応性があるか否かを判定する方法を提供すること、及び治療効果の高いＭＳＣを含む細胞製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体上で異常なＭＳＣを賦活化することで、より少量の賦活化剤でより治療効果の高い賦活化されたＭＳＣを製造することができること、及び前記細胞培養担体上で賦活化剤の存在下で培養することで正常なＭＳＣも賦活化されることを見出した。さらに本発明者らは、治療効果の高いＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを解析し、特定の遺伝子発現変動を見出した。下記の各発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。【００１０】
（１）哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤でＭＳＣを処理する賦活化工程を含む、賦活化されたＭＳＣの製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中でＭＳＣを培養する工程である、前記製造方法。
（２）細胞培養担体が、ナノメートル〜マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、（１）に記載の製造方法。
（３）開口部の平均径が５００ｎｍ〜１０００μｍである、（２）に記載の製造方法。
（４）細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の製造方法。
（５）培地中の賦活化剤の濃度が、ファイバーからなる３次元構造を有さない細胞培養担体を用いてＭＳＣを培養する賦活化工程における培地中の賦活化剤濃度の１／１０〜１／１０００００である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の製造方法。
（６）培地中の賦活化剤の濃度が、タンパク質換算で０．０１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、（１）から（５）のいずれか一項に記載の製造方法。
（７）賦活化工程における細胞の継代回数が２回以下である、（１）から（６）のいずれか一項に記載の製造方法。
（８）ＭＳＣが骨髄由来のＭＳＣである、（１）から（７）のいずれか一項に記載の製造方法。
（９）ＭＳＣが疾患を有する対象から分離されたＭＳＣである、（１）から（８）のいずれか一項に記載の製造方法。
（１０）ＣＤ４７陽性細胞の割合が２％以下である、ＭＳＣを含む細胞製剤。
（１１）ＭＳＣが、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法により製造される賦活化されたＭＳＣである、（１０）に記載の細胞製剤。
（１２）ＭＳＣ集団の中からＣＤ４７陰性のＭＳＣを濃縮する工程を含む、ＭＳＣを含む細胞製剤の製造方法。
（１３）ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される、ＭＳＣの治療効果と正に相関するＭＳＣの治療効果評価のためのマーカー。
（１４）ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される、ＭＳＣの治療効果と負に相関するＭＳＣの治療効果評価のためのマーカー。
（１５）被験ＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を対照ＭＳＣにおける発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ない場合に、被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定する判定工程を含む、ＭＳＣの治療効果を判定する方法。
（１６）測定工程が、被験ＭＳＣにおける
（Ａ）ＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ−６及びＴＥＲＴよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに／又は
（Ｂ）ｐ５３及びα−ＳＭＡよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多いこと並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ないことに加えて、前記（Ａ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多い場合及び／又は前記（Ｂ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ない場合に、被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定する工程である、（１５）に記載の方法。
（１７）（１５）又は（１６）に記載の方法の測定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えてＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ないことに代えてＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて低い場合に被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定する、ＭＳＣの治療効果を判定する方法。
（１８）被験ＭＳＣが、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で培養されたＭＳＣである、（１５）から（１７）のいずれか一項に記載の方法。
（１９）被験ＭＳＣが、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて培養されたＭＳＣである、（１５）から（１８）のいずれか一項に記載の方法。
（２０）被験ＭＳＣが、ＭＳＣの自家移植療法を受けようとする対象から分離されたＭＳＣである、（１５）から（１９）のいずれか一項に記載の方法。
（２１）被験ＭＳＣが骨髄由来のＭＳＣである、（１５）から（２０）のいずれか一項に記載の方法。
（２２）処理されたＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていないＭＳＣにおける発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない場合に、そのＭＳＣは当該処理に適していると判定する判定工程を含む、ＭＳＣの治療効果を高めるための処理に対するＭＳＣの適応性を判定する方法。
（２３）測定工程が、処理されたＭＳＣと処理されていないＭＳＣのそれぞれにおける
（Ａ）ＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ−６及びＴＥＲＴよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに／又は
（Ｂ）ｐ５３及びα−ＳＭＡよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多いこと並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ないことに加えて、前記（Ａ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い場合及び／又は前記（Ｂ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない場合に、そのＭＳＣは当該処理に適していると判定する工程である、（２２）に記載の方法。
（２４）（２２）又は（２３）に記載の方法の測定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えてＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ないことに代えてＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて低い場合にそのＭＳＣは当該処理に適していると判定する、処理に対するＭＳＣの適応性を判定する方法。
（２５）処理が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中でＭＳＣを培養する処理である、（２２）から（２４）のいずれか一項に記載の方法。
（２６）処理が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いてＭＳＣを培養する処理である、（２２）から（２５）のいずれか一項に記載の方法。
（２７）ＭＳＣが、ＭＳＣの自家移植療法を受けようとする対象から分離されたＭＳＣである、（２２）から（２６）のいずれか一項に記載の方法。
（２８）ＭＳＣが骨髄由来のＭＳＣである、（２２）から（２７）のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＭＳＣ製造方法によれば、ＭＳＣの賦活化を従来よりも遥かに少ない量の賦活化剤を用いて行うことができ、貴重な賦活化剤の消費量を節約することが可能となる。また、当該製造方法により製造することができる本発明の細胞製剤は高い治療効果を有しており、治療等に必要な細胞数を減らすことが可能となる。投与細胞数の低減は、細胞培養の継代回数の低減につながり、細胞製剤の製造に必要とされる期間の短縮及びコストの削減といった効果をもたらす。さらに、本発明の治療効果マーカー及び判定方法によれば、ＭＳＣの治療効果を対象への投与の前に判定することができる。加えて、本発明の適応性判定方法によれば、賦活化処理等の処理に対するＭＳＣの適応性を、治療に必要とされる量のＭＳＣを調製する前に判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体（以下、３次元培養担体ともいう）上で賦活化剤の存在下で培養した変形性股関節症患者ＭＳＣ（以下、ＯＡ−ＭＳＣという）の遺伝子発現プロファイルをクラスター解析した結果を示す図である。
【図２】従来型の２次元構造の細胞培養担体（以下、２次元培養担体という）上で賦活化剤の存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ、及び３次元培養担体上で賦活化剤の存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣにおけるマーカー遺伝子の相対的発現量を、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣのそれと比較して表したグラフである。
【図３】３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ及び２次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣの外観を示す電子顕微鏡観察写真である。左上が賦活化剤を加えずに３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率６００倍）、右上が賦活化剤を加えて３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率２００倍）、左下が賦活化剤を加えずに２次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率７００倍）、右下が賦活化剤を加えて２次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率５００倍）に対応する。
【図４】３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ及び２次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣの外観を示す強拡大の電子顕微鏡観察写真である。左上が賦活化剤を加えずに３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率３５００倍）、右上が賦活化剤を加えて３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率２５００倍）、左下が賦活化剤を加えずに２次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率７０００倍）、右下が賦活化剤を加えて２次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ（倍率８０００倍）に対応する。
【図５】比較例の細胞培養担体上で、又は別の３次元培養担体上で賦活化剤の存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを、３次元培養担体のそれと合わせてクラスター解析した結果を示す図である。
【図６】別の３次元培養担体上で、賦活化剤を加えて培養したＯＡ−ＭＳＣの外観を示す電子顕微鏡観察写真（倍率３５００倍）である。
【図７】２次元培養担体上で賦活化剤の存在下で培養した健常者ＭＳＣ及び３次元培養担体上で賦活化剤の存在下で培養した健常者ＭＳＣにおけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＴＳＧ−６遺伝子の相対的発現量を、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養した健常者ＭＳＣのそれと比較して表したグラフである。
【図８】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣを投与した皮膚欠損モデルラットの、皮膚切除後３日目及び７日目の残存欠損面積を示すグラフである。
【図９】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣを投与した皮膚欠損モデルラットの、皮膚切除７日後の皮膚欠損部を示す写真である。
【図１０】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣを投与した皮膚欠損モデルラットの、皮膚切除２１日後の皮膚組織の破断応力を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣを投与したアルツハイマー病モデルマウスの、モリス水迷路での学習テストの結果を示すグラフである。縦軸のＥｓｃａｐｅ  ｌａｔｅｎｃｙはマウスがプール内に置かれたプラットホームにたどり着くまでの時間を、横軸は学習テスト開始からの日数を示す。
【図１２】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣを投与したアルツハイマー病モデルマウスの、モリス水迷路での記憶テストの結果を示すグラフである。縦軸のＴｉｍｅ  ｉｎ  ｑｕａｄｒａｎｔは、総遊泳時間に対する、学習過程でプラットフォームのあった４分割エリア内で遊泳する時間の割合を示す。
【図１３】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの血清クレアチニンの推移を示すグラフである。
【図１４】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣを移植した、抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットの移植後１１週までの生存率の推移を示すグラフである。太線は各群の平均値を、細線は各群の９５％ＣＩ（信頼区間）を示す。
【図１５】ＯＡ−ＭＳＣ（ｎ＝１０）の遺伝子発現プロファイルをクラスター解析した結果を示す図である。
【図１６】ＯＡ−ＭＳＣ（ｎ＝１０）の遺伝子発現プロファイルをクラスター解析した結果を示す図である。
【図１７】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣにおける遺伝子発現量を処理されていないＭＳＣのそれと比較して算出した、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＩＤＯ及びＴＳＧ６のそれぞれの相対的発現量とｐ１６ｉｎｋ４ａの相対的発現量との相関を示す図である。
【図１８】賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣにおける遺伝子発現量を処理されていないＭＳＣのそれと比較して算出した、ｐ１４ＡＲＦの相対的発現量とｐ１６ｉｎｋ４ａの相対的発現量との相関を示す図である。
【図１９】ＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０２１、ＢＭ−０２２、ＢＭ−０２３）におけるＯＣＴ４、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びＲＢ遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。図中、賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣをＰＥ＋又はＰＥ＋ＭＳＣと、処理されていないＯＡ−ＭＳＣをＰＥ−又はＰＥ−ＭＳＣと表す（以下の図についても同様）。
【図２０】３次元培養担体上で賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０１０）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。
【図２１】３次元培養担体上で賦活化剤で処理された関節リウマチ患者ＭＳＣ（ＲＡ）、高齢者ＭＳＣ（Ａｇｅｄ）、肝硬変患者ＭＳＣ及び若年者ＭＳＣ（Ｙｏｕｎｇ）のそれぞれにおけるＣＤ４７遺伝子の相対的発現量を、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＭＳＣのそれと比較して表したグラフである。
【図２２】未処理の若年者ＭＳＣ及び高齢者ＭＳＣのそれぞれにおける細胞表面のＣＤ４７発現量を示すヒストグラムである。
【図２３】３次元培養担体上で賦活化剤で処理された若年者ＭＳＣ及び高齢者ＭＳＣのそれぞれにおける細胞表面のＣＤ４７発現量を示すヒストグラムである。
【図２４】ＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８、ＢＭ−０２１、ＢＭ−００５）におけるｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。
【図２５】ＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８、ＢＭ−０２１、ＢＭ−００５）と共培養したＲＡＷ２６４．７細胞の貪食能を示すグラフである。
【図２６】ＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８、ＢＭ−０２１、ＢＭ−００５）と共培養したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＦｐｒ２（Ｆｏｒｍｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。
【図２７】ＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０２１）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。
【図２８】賦活化剤で処理された若しくは処理されていないＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０２１）又はＰＢＳを局所投与した多発性筋炎モデルマウスにおける、死細胞を除いた単核細胞の総数に対する総マクロファージ（ＭΦ）、Ｍ１マクロファージ及びＭ２マクロファージの割合を示すグラフである。
【図２９】賦活化剤で処理された若しくは処理されていないＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０２１）を局所投与した多発性筋炎モデルマウスの後肢筋機能を示すグラフである。
【図３０】ＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。
【図３１】賦活化剤で処理された若しくは処理されていないＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８）又はＰＢＳを全身投与した多発性筋炎モデルマウスの筋機能を示すグラフである。
【図３２】賦活化剤で処理された若しくは処理されていないＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８）又はＰＢＳを全身投与した多発性筋炎モデルマウスの筋組織のＨＥ染色像である。
【図３３】賦活化剤で処理された若しくは処理されていないＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８）又はＰＢＳを全身投与した多発性筋炎モデルマウスの筋断面積を示す図である。
【図３４】２次元培養担体又は３次元培養担体上で賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０２１）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を示すグラフである。
【図３５】抗がん剤処置後の糖尿病性腎症ラットに移植された賦活化剤で処理されたＯＡ−ＭＳＣにおけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＩＤＯ、α−ＳＭＡ及びＴＥＲＴそれぞれの遺伝子の相対的発現量を、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＭＳＣのそれと比較して表したグラフである。
【図３６】３次元培養担体上で賦活化剤で処理したＣＤＫＮ２ＡノックアウトＯＡ−ＭＳＣのｐ１６ｉｎｋ４ａの発現を示す画像である。
【図３７】３次元培養担体上で賦活化剤で処理したＣＤＫＮ２ＡノックアウトＯＡ−ＭＳＣを下腿三頭筋に局所投与した多発性筋炎モデルマウスの筋組織のラミニン染色像（左）及び筋断面積を示す図（右）である。
【図３８】ＣＤ４７を過剰発現させたＯＡ−ＭＳＣを投与した皮膚欠損モデルマウスの、皮膚切除後３日目から９日目の創傷面積変化量を示すグラフ（左）及び皮膚切除後９日目の皮膚欠損部の代表例の写真（右）である。
【図３９】ＣＤ４７陽性細胞率の異なる２種類のＯＡ−ＭＳＣを投与したアルツハイマー病モデルマウスの、モリス水迷路での学習テストの結果を示すグラフである。
【図４０】ＣＤ４７陽性細胞率の異なる２種類のＯＡ−ＭＳＣを投与したアルツハイマー病モデルマウスの、モリス水迷路での記憶テストの結果を示すグラフである。
【図４１】抽出方法の異なる別の賦活化剤の存在下で２次元培養担体又は３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ及び賦活化剤の不存在下で３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣにおけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＴＳＧ−６遺伝子の相対的発現量を、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養した健常者ＭＳＣのそれと比較して表したグラフである。
【図４２】抽出方法の異なる別の賦活化剤の存在下で２次元培養担体又は３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣ及び賦活化剤の不存在下で３次元培養担体上で培養したＯＡ−ＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養した健常者ＭＳＣのそれと比較して表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
賦活化されたＭＳＣの製造方法
本発明の第１の態様は、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤でＭＳＣを処理する賦活化工程を含む、賦活化されたＭＳＣの製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中でＭＳＣを培養する工程である、前記製造方法に関する。
【００１４】
本発明において使用されるＭＳＣは、健常な対象から分離されたＭＳＣであっても、疾患を有する対象から分離されたＭＳＣであってもよい。また、本発明において使用されるＭＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）等の多能性幹細胞から分化誘導して得られたものであってもよい。
【００１５】
本明細書における用語「対象」、「疾患を有する対象から分離されたＭＳＣ」及び「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物」は、いずれも特許文献１である国際公開ＷＯ２０１５／１３７４１９号パンフレット及びこれに対応する米国出願である米国特許出願公開ＵＳ２０１７／００７１９８４号公報に記載された各用語と同じ意味をもつものとして解釈される。これらの文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるが、これらの文献及び本明細書における各用語の意味の概略を以下に示す。
【００１６】
「対象」とは、ＭＳＣを有する任意の動物を意味し、好ましくは哺乳動物の個体、例えば、ヒト、チンパンジー等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等の齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の偶蹄目、ウマ等の奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコ等の個体であり、さらに好ましくはヒトの個体である。
【００１７】
特許文献１にも記載があるように、ある種の疾患を有する対象及び老化した対象のＭＳＣは、健常者のＭＳＣと比べて治療効果が低いことが知られており、これらの対象に自己ＭＳＣをそのまま移植しても高い治療効果は期待できない。一方、第１の態様の製造方法によると、そのような治療効果が低いＭＳＣであっても賦活化して治療効果を高めることができる。治療効果が低いＭＳＣを有する対象が罹患している疾患は慢性疾患であり、その例は特許文献１にＭＳＣが異常化する疾患として記載されている。
【００１８】
ＭＳＣは、その後の細胞移植療法における安全性を考慮した場合、細胞を投与する個体と同種又は近縁種の個体から採取するのが好ましい。例えば、ヒトの個体に細胞移植を行う場合、好ましくは同種であるヒトから採取された細胞が、より好ましくは投与を受ける同一のヒト個体から採取された細胞、すなわち自己ＭＳＣが用いられる。
【００１９】
本発明において使用されるＭＳＣは、対象の骨髄液、脂肪組織、胎児付属組織、歯髄等の試料から、一般的な方法で採取することができる。例えば、試料として骨髄液を用いる場合、密度勾配遠心法、骨髄播種法等の公知の手法により、ＭＳＣを分離することが可能である。本発明の好ましい実施形態の一つにおいて、ＭＳＣは、骨髄由来のＭＳＣである。
【００２０】
「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物」は、哺乳動物、好ましくはヒトの胎児娩出後に後産として母体から娩出されるか又は帝王切開により母体から摘出された胎児付属物、好ましくは臍帯組織、胎盤組織又は卵膜を、そのまま又は切断若しくは破砕して、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養において通常用いられる培地等の抽出媒体中に浸漬する等して調製される抽出物である。抽出物は、特に、ドナーである哺乳動物由来の増殖能を有する細胞を含まないものであることが好ましい。具体的な抽出操作及び条件は、特許文献１に記載された操作及び条件に従えばよい。
【００２１】
また、「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物」は、胎児付属物、典型的には胎盤から生理活性物質を抽出する際に当業者が通常用いる処理、例えば酸や酵素を用いた加水分解等の処理を胎児付属物に施すことによっても調製することができる。かかる抽出物の例は、メルスモン製薬株式会社から販売されているヒト胎盤抽出物「メルスモン」、株式会社日本生物製剤から販売されているヒト胎盤抽出物「ラエンネック」その他の市販胎盤製剤及びプラセンタエキスと呼ばれる様々な市販品である。
【００２２】
本発明における「哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤」とは、前述の抽出物を有効成分として含有する、ＭＳＣの治療効果を増大させるための剤をいい、以下これを「賦活化剤」と表す。ここで「賦活化」とは、何らかの処理を受けたＭＳＣが、未処理の場合と比較してより高い治療効果を示すようになることを意味する。
【００２３】
第１の態様の製造方法において、賦活化工程は、インビトロで、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中でＭＳＣを培養することにより行われる。具体的には、３次元培養担体を足場として使用し、賦活化剤の存在下でＭＳＣを培養することにより行われる。
【００２４】
好ましい実施形態において、３次元培養担体は、ナノメートル（ｎｍ）〜マイクロメートル（μｍ）単位の平均繊維径を有するファイバーからなる。ここで「平均繊維径」は、培養担体を細胞接着面の側から、典型的には上から観察したときにファイバーの長さ方向に対して直交する方向における長さとして測定されるファイバー径の算術平均値をいう。さらに好ましい実施形態において、３次元培養担体は、ナノメートル（ｎｍ）〜マイクロメートル（μｍ）単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞と接触する面上に形成された開口部を有する。ここで「開口部」は、上記ファイバーにより形成される、担体の細胞との接触面上に存在するくぼみをいう。なお、特に指定がないかぎり、本明細書における平均とは数平均を意味する。
【００２５】
開口部の平均径は、ファイバー同士が接している場合は、培養担体を上から観察したときに認められる、ファイバーを輪郭とした図形の径の平均値をいう。図形の径とは、図形が多角形の場合は各頂点からの対角線の長さの算術平均値に、図形が円形の場合はその直径に、図形が楕円形又はそれに類似した形状の場合はその長径に相当する。
【００２６】
また、ファイバー同士が接していない場合、開口部の平均径は、ＡＳＴＭ−Ｆ３１６に規定されている方法により得られる平均流量孔径をいい、これは、例えばポロメーター（コールター社製等）を用いてミーンフローポイント法により測定することができる。
【００２７】
３次元培養担体を構成するファイバーの平均繊維径は、ｎｍ〜μｍ単位の範囲内に、好ましくは１０ｎｍ〜５００μｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜３００μｍの範囲内にあり得る。特定の実施形態において、平均繊維径は、例えば１０ｎｍ〜１μｍ、１００ｎｍ〜１μｍ、５００ｎｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ、１μｍ〜１００μｍ、１μｍ〜３００μｍ、又は１μｍ〜５００μｍの範囲内に、好ましくは１０ｎｍ〜１μｍ、１μｍ〜１０μｍ又は１０μｍ〜３００μｍのいずれかの範囲内にあればよい。本発明においては、一般にナノファイバーと呼ばれるファイバーを用いることもできる。
【００２８】
細胞との接着面上に開口部を有する３次元培養担体において、開口部の平均径は、５００ｎｍ〜１０００μｍであればよく、好ましくは７００ｎｍ〜６００μｍ、より好ましくは９００ｎｍ〜４００μｍの範囲内にあり得る。特定の実施形態において、開口部の平均径は、例えば５００ｎｍ〜１００μｍ、５μｍ〜１００μｍ、１０μｍ〜１００μｍ、２０μｍ〜１００μｍ、１００μｍ〜２００μｍ、１００μｍ〜４００μｍ、又は１００μｍ〜６００μｍの範囲内に、好ましくは５００ｎｍ〜１００μｍ又は１００μｍ〜４００μｍの範囲内にあればよい。
【００２９】
特定の実施形態において、３次元培養担体は、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、特に好ましくは８０％以上の空隙率を有する。
【００３０】
別の実施形態において、３次元培養担体の開口部の平均面積は、０．１〜１００μｍ２、好ましくは０．２〜６０μｍ２、より好ましくは０．５〜３０μｍ２である。開口部が孔である場合、開口部面積は孔面積に相当する。
【００３１】
３次元培養担体は、ファイバーが３次元的に集積した、すなわちファイバーが３次元方向に積み重なった構造を持つものであり、ファイバーの配置が規則的であってもなくてもよく、またファイバー同士が結合していても結合していなくてもよい。
【００３２】
３次元培養担体は、細胞接着面にファイバーからなる３次元構造を有するものであればよく、細胞と接着しない部分、典型的にはファイバーからなる３次元構造の下にベースとなる部材を有していてもよい。ベース部材は、前記３次元構造を支持できるものであればどのような構造体であってもよく、例えば、不織布、編物、織物、多孔質足場材料等であり得る。
【００３３】
３次元培養担体における細胞接着面は、その主たる部分がファイバーからなる３次元構造を有する部分であればよく、具体的には、培養担体を細胞接着面の側から、典型的には上から観察したときの培養担体の面積の５０％以上がファイバーからなる３次元構造を有する部分で占められていればよい。したがって、３次元培養担体は、細胞接着面の一部に「ファイバーからなる３次元構造」ではない部分、例えば３次元構造を持たない平坦な膜状の部分等を、接着面における当該部分の面積が５０％に満たない範囲で、好ましくは４０％に満たない範囲で、さらに好ましくは３０％に満たない範囲で含むことができる。
【００３４】
ファイバーを形成する素材としては特に制限はなく、ポリフッ化エチレン、ポリスチレン等のポリマー化合物、シリカ等の無機化合物、生分解性ポリマー等を挙げることができる。生分解性ポリマーとしては、生体適合性を有し、所望の期間にわたって培養担体上で３次元構造を維持することができるものであればよく、例えば合成高分子材料ではポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレングリコール、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、その他乳酸−グリコール酸共重合体等の上記の共重合体；無機材料ではβ−りん酸三カルシウム、炭酸カルシウム等；天然高分子材料ではコラーゲン、ゼラチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、アガロース、キトサン、フィブリン、フィブロイン、キチン、セルロース、シルク等が挙げられる。
【００３５】
３次元培養担体は、培養時に細胞がファイバーからなる３次元構造に接触できるものであるかぎり形状に制限はない。３次元培養担体は、細胞培養容器内に設置されて使用されるインサート状の形状であってもよく、あるいは細胞培養容器の内面、例えばウェルの底面等にファイバーからなる３次元構造が一体的に成形された形状であってもよい。
【００３６】
本発明において利用可能な３次元培養担体の例としては、ベセル株式会社のＶＥＣＥＬＬ（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン、平均繊維径：＜１μｍ、平均孔面積：１〜２０μｍ２、開口部の平均径：２０〜１００μｍ、空隙率：８０〜９０％）、日本バイリーン株式会社のＣｅｌｌｂｅｄ（登録商標）（高純度シリカファイバー、平均繊維径：１μｍ、平均流量孔径：７〜８μｍ、空隙率：＞９５％）、３Ｄ  Ｂｉｏｔｅｋの３Ｄ  Ｉｎｓｅｒｔ−ＰＳシリーズ（ポリスチレンファイバー、平均繊維径：ＰＳ−２００は〜１５０μｍ、ＰＳ−４００は〜３００μｍ、開口部の平均径：ＰＳ−２００は２００μｍ、ＰＳ−４００は４００μｍ）、国際公開ＷＯ２０１４／１９６５４９号パンフレットに記載された細胞培養基材、国際公開ＷＯ２０１６／０６８２６６号パンフレット及びこれに対応する米国出願である米国特許出願公開ＵＳ２０１７／３１９７４７号公報に記載された細胞培養基材（生分解性ポリマー、平均繊維径５０ｎｍ〜５μｍ）、Ｌｉｕ  Ｌ，Ｋａｍｅｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １２４（２０１７）  ４７−５４に記載された細胞培養基材（ポリグリコール酸、平均繊維径：３４５±９１ｎｍ、平均孔面積：０．６８±０．０２μｍ２、平均孔面積から算出される開口部の平均径：０．９３μｍ（（０．６８μｍ２／π）１／２）×２）、ネオベール及びネオベールナノ（グンゼ株式会社）といった市販の組織補強材等を挙げることができる。上記の各文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００３７】
３次元培養担体上でのＭＳＣの培養は、２４時間〜１４４時間、好ましくは２４時間〜９６時間、より好ましくは４８〜９６時間行われる。賦活化工程における培養温度及びガス濃度は、ＭＳＣの培養に通常用いる温度及びガス濃度の範囲内であればよく、温度は例えば２５℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３７℃、より好ましくは３７℃であり、酸素濃度は例えば２％〜３０％、好ましくは２％〜２０％である。賦活化処理は、十分な賦活化が達成されるまで、複数回行うことができる。
【００３８】
賦活化工程における培地中の賦活化剤の濃度は、タンパク質換算の最終濃度で０．０１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬであれば足りるが、好ましくは０．０２μｇ／ｍＬ〜３００μｇ／ｍＬ、０．０３μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０４μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであり、特定の実施形態においては０．０５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬであり得る。特許文献１において例示されている賦活化剤のより好ましい濃度０．１ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）〜５ｍｇ／ｍＬ（５０００μｇ／ｍＬ）と上記特定の実施形態における賦活化剤の濃度とを比較することで示されるように、３次元培養担体を用いることによって、賦活化剤の濃度を従来の１／１０〜１／１０００００にまで低減することができる。賦活化剤の濃度範囲の下限は、例えば従来の２次元培養担体を用いる場合に使用される濃度の１／１０００００、１／５００００、１／２００００、１／１００００、１／５０００又は１／２０００であり、賦活化剤の濃度範囲の上限は、例えば従来の２次元培養担体を用いる場合に使用される濃度の１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／２００、１／５００又は１／１０００である。
【００３９】
培地は、ＭＳＣの培養に通常用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等を利用することができる。これら培地は、賦活化を妨げない限り、ＭＳＣの増殖に必要な各種成分、例えば血清成分等を含有していてもよい。
【００４０】
後の実施例において示すように、３次元培養担体上で賦活化剤の存在下で培養したＭＳＣは、ファイバーからなる３次元構造を有さない培養担体、例えばＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）等のポリスチレン等からなる２次元培養担体上で賦活化剤の存在下で培養したＭＳＣと比較して、より高い治療効果を有する。治療効果がより高いＭＳＣであればより少ない細胞数でも効果を期待することができることから、本発明における賦活化工程のＭＳＣの継代回数は、ファイバーからなる３次元構造を有さない細胞培養担体を用いてＭＳＣを培養する賦活化工程におけるそれよりも少なくすることが可能となる。賦活化工程におけるＭＳＣの継代回数は好ましくは２回以下であり、１回、さらには０回であってもよい。また第１の態様の製造方法により製造される賦活化されたＭＳＣは、好ましくは継代数が３、すなわちＰ３以下であり、Ｐ２、さらにはＰ１であってもよい。
【００４１】
ＭＳＣが賦活化されたか否かの判定は、特許文献１に記載された方法及び基準に従って行うことができる。例えば、疾患モデル動物や疾患モデル動物由来細胞等の疾患を反映した評価系において、３次元培養担体上で賦活化剤の存在下で培養したＭＳＣ（以下、「３Ｄ賦活化処理ＭＳＣ」ともいう）の治療効果が、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＭＳＣ（以下、「比較対象ＭＳＣ」ともいう）と比べて高い場合、その３Ｄ賦活化処理ＭＳＣは賦活化されたと判定される。
【００４２】
また、細胞及び細胞内小器官の形態、細胞増殖能、分化能、並びに治療効果のあるＭＳＣのマーカーとして公知の増殖因子、分化関連因子及びサイトカイン・ケモカインといった各種因子のタンパク質発現量、遺伝子発現量、細胞外分泌量等の評価指標を用いることによっても賦活化を判定することができる。
【００４３】
例えば、３Ｄ賦活化処理ＭＳＣの細胞増殖能又は分化能が比較対象ＭＳＣと比べて高い場合、その３Ｄ賦活化処理ＭＳＣの治療効果が高い、すなわち賦活化されたと判定することもできる。
【００４４】
さらに、幹細胞性に関与する因子（例えばＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４等）、免疫制御・抗炎症機能に関与する因子（例えばＩＤＯ、ＴＳＧ６及びＩＬ−６等）若しくはテロメアーゼ活性に関与する因子（例えばＴＥＲＴ等）の遺伝子若しくはタンパク質発現量が３Ｄ賦活化処理ＭＳＣにおいて比較対象ＭＳＣよりも多い場合に、又は細胞老化に関与する因子（例えばＰ５３等）若しくは細胞骨格に関与する因子（例えばα−ＳＭＡ等）の遺伝子若しくはタンパク質発現量が３Ｄ賦活化処理ＭＳＣにおいて比較対象ＭＳＣよりも少ない場合に、その３Ｄ賦活化処理ＭＳＣの治療効果が高い、すなわち賦活化されたと判定することもできる。
【００４５】
さらには、３Ｄ賦活化処理後のＭＳＣの細胞の厚みの増加、突起数の増加、ネットワーク構造の形成亢進、分泌小胞の形成亢進等が観察された場合に、その３Ｄ賦活化処理ＭＳＣの治療効果が高い、すなわち賦活化されたと判定することもできる。
【００４６】
加えて、後に説明するように、本発明者らが新たに見出したＭＳＣの治療効果との正の相関性が高いｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦ、並びに同じく本発明者らが新たに見出したＭＳＣの治療効果との負の相関性が高いＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７の遺伝子又はタンパク質発現を指標として、３Ｄ賦活化処理ＭＳＣの治療効果が比較対象ＭＳＣのそれより高いか否か、すなわち３Ｄ賦活化処理ＭＳＣが賦活化されたか否かと判定することもできる。
【００４７】
賦活化されたＭＳＣは、未分化な状態で維持してもよく、あるいは所望の細胞に分化させてもよい。ＭＳＣの未分化状態での維持は、未分化状態の維持に好適な培地、例えばＨｙＣｌｏｎｅ  ＡｄｖａｎｃｅＳＴＥＭ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）ＭＳＣ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｕｔｉｏｎｓ（商標）Ｍｅｄｉａ（ＤＶ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＭＳＣ専用培地キット（ＭＳＣＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、Ｌｏｎｚａ）等を用いて、ＭＳＣを培養することにより行うことができる。また、ＭＳＣの分化は、所望の細胞への分化誘導作用を持つ因子を加えた分化誘導培地中での培養等の一般に知られる方法で行うことができる。例えば、骨芽細胞への分化においてはＢｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＢＭＰ）４、ＢＭＰ２等が、脂肪細胞への分化においてはデキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリン等が分化誘導因子として用いられる。
【００４８】
またＭＳＣは、賦活化、増殖培養、分化誘導培養等の処理の前後において、凍結保存等の一般的な手法により保存することができる。例えば、賦活化されたＭＳＣを培養により増殖させた後に、一定の細胞数となるように分けて保存しておき、投与の度に必要量を解凍して用いることが可能である。
【００４９】
ＭＳＣの治療効果マーカー、及びＭＳＣの治療効果の判定方法
本発明の別の態様は、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される、ＭＳＣの治療効果と正に相関するＭＳＣの治療効果評価のためのマーカーに関する。また、本発明のさらなる別の態様は、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される、ＭＳＣの治療効果と負に相関するＭＳＣの治療効果評価のためのマーカーに関する。
【００５０】
ｐ１６ｉｎｋ４ａは、アンキリンリピートを有するサイクリン依存性キナーゼ阻害因子である。ｐ１６ｉｎｋ４ａは、癌抑制因子の１つとして知られ、また細胞が分裂寿命に達する、発癌ストレスに曝される等でＤＮＡ損傷が生じたときに発現量が上昇する老化関連遺伝子としても知られている（Ｅ．Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，Ｖｏｌ．１６，ｐ．８５９−８６７；Ｂ．Ｇ．Ｃｈｉｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，ｖｏｌ．２１，ｐ．１４２４−１４３５）。
【００５１】
ｐ１６ｉｎｋ４ａは、サイクリン依存性キナーゼであるＣＤＫ４及びＣＤＫ６、細胞周期の制御因子であるＲＢ（レチノブラストーマタンパク質、ＲＢをコードする遺伝子はＲｂとも呼ばれる）と共に、ｐ１６ｉｎｋ４ａ−ＲＢ経路と呼ばれるシグナル伝達経路を形成する。同経路において、ｐ１６ｉｎｋ４ａはＣＤＫ４／６と特異的に結合してその作用を阻害する。ＣＤＫ４／６の阻害は、活性型の脱リン酸化ＲＢを増加させ、細胞周期の進行を停止させる。以下、これらの因子をまとめてｐ１６ｉｎｋ４ａ−ＲＢ経路因子とも呼ぶ。
【００５２】
ヒトのｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子及びタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡの塩基配列はデータベース名ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿００００７７及びＮＭ＿００１１９５１３２として、タンパク質のアミノ酸配列はデータベース名ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッション番号ＮＰ＿００００６８として、それぞれ登録されている。
【００５３】
ヒトのＣＤＫ４及びＣＤＫ６の遺伝子及びタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡの塩基配列はデータベース名ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿００００７５及びＮＭ＿００１２５９として、タンパク質のアミノ酸配列はデータベース名ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッション番号ＮＰ＿００００６６及びＮＰ＿００１１３８７７８（又はＮＰ＿００１２５０）として、それぞれ登録されている。
【００５４】
ヒトのＲＢの遺伝子及びタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡの塩基配列はデータベース名ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿０００３２１として、タンパク質のアミノ酸配列はデータベース名ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッション番号ＮＰ＿０００３１２として、それぞれ登録されている。
【００５５】
ｐ１４ＡＲＦは、ｐ１６ｉｎｋ４ａのスプライシングバリアントであり、両者はＣＤＫＮ２Ａ遺伝子によりコードされている。ｐ１４ＡＲＦは、ｐ５３安定化タンパク質であるＭＤＭ２に結合することでｐ５３の分解を抑制する機能を有しており、ｐ１６ｉｎｋ４ａ同様に癌抑制因子の１つとして知られている。
【００５６】
ヒトのｐ１４ＡＲＦ遺伝子及びタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡの塩基配列はデータベース名ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿０５８１９５として、タンパク質のアミノ酸配列はデータベース名ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッション番号ＮＰ＿４７８１０２として、それぞれ登録されている。
【００５７】
ＣＤ４７（インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）とも呼ばれる）は、イムノグロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通型タンパク質である。正常細胞の細胞膜上に発現したＣＤ４７はマクロファージ細胞膜上のシグナル制御タンパク質α（ＳＩＲＰα）と結合し、これによりマクロファージの貪食作用を抑制することが知られている。細胞移植療法において用いられる細胞は、マクロファージによる貪食を回避するため、ＣＤ４７を発現していることが好ましいと考えられている。またＣＤ４７は、ＭＳＣのホーミング及び組織修復効果を増大させることが報告されており（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１５；８（９）：１０５５５−１０５６４）、ＭＳＣの疾患治療効果を高める機能を有すると推測されている。
【００５８】
ヒトのＣＤ４７遺伝子及びタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡの塩基配列はデータベース名ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩにアクセッション番号ＮＭ＿００１７７７及びＮＭ＿１９８７９３として、タンパク質のアミノ酸配列はデータベース名ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッション番号ＮＰ＿００１７６８として、それぞれ登録されている。
【００５９】
意外なことに、賦活化されたＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを解析した結果、賦活化処理によるｐ１６ｉｎｋ４ａ−ＲＢ経路因子の発現変動、具体的にはｐ１６ｉｎｋ４ａの遺伝子発現量の増加、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａの下流因子であるＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＲＢの遺伝子発現量の減少等が見出された。また、ｐ１４ＡＲＦの遺伝子発現量は、ｐ１６ｉｎｋ４ａと同じく増加を示し、一方、ＣＤ４７遺伝子の発現量は減少を示した。さらに、賦活化処理しても治療効果が上昇したとは認められないＭＳＣでは上記のようなｐ１６ｉｎｋ４ａ−ＲＢ経路因子、ｐ１４ＡＲＦ及びＣＤ４７の発現変動は起こらないことも実験的に確認された。
【００６０】
加えて、賦活化されたＭＳＣでは、幹細胞性に関与する因子であるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＮａｎｏｇ、免疫制御・抗炎症機能に関与する因子であるＩＤＯ及びＴＳＧ−６といったＭＳＣの治療効果と関連した遺伝子の発現量が増加することを本発明者らは確認しているが、ｐ１６ｉｎｋ４ａの遺伝子発現は、これらの遺伝子の発現と非常に高い正の相関性を有することが確認された。ｐ１６ｉｎｋ４ａの遺伝子発現はまた、ｐ１４ＡＲＦの遺伝子発現とも正に相関していた。
【００６１】
また、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦは、上記の治療効果と関連した遺伝子と同様に、治療効果が高いＭＳＣにおいて発現量の増加が認められ、またＣＤ４７は治療効果が高いＭＳＣにおいて発現量の減少が認められた。さらに、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦを欠損させたＭＳＣ、ＣＤ４７を強制発現させたＭＳＣのいずれも、治療効果が低減することが実験的に確認された。
【００６２】
これらの結果に基づくと、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦは、ＭＳＣの疾患治療効果と正に相関するＭＳＣの治療効果評価のためのマーカーとして、またｐ１６ｉｎｋ４ａの下流因子ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＲＢ、並びにＣＤ４７は、ＭＳＣの疾患治療効果と負に相関するＭＳＣの治療効果評価のためのマーカーとして利用することができる。また、これらのマーカーを利用して、ＭＳＣの治療効果を評価することができる。
【００６３】
本発明のまた別の態様は、被験ＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を対照ＭＳＣにおける発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ない場合に、被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定する判定工程を含む、ＭＳＣの治療効果を判定する方法に関する。
【００６４】
上記態様の治療効果判定方法は、被験ＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７（以下、治療効果マーカーともいう）よりなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは２、３又は全ての遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程を含む。
【００６５】
被験ＭＳＣは、治療効果の判定が望まれるＭＳＣであればよい。被験ＭＳＣの例は、細胞移植療法において使用が予定されるＭＳＣである。自家移植療法における使用が予定されている場合、被験ＭＳＣは、自家移植療法を受けようとする対象から分離された、好ましくは骨髄由来のＭＳＣである。これらのＭＳＣの治療効果を移植前に判定することによって、患者への不要な細胞移植を避けることができ、細胞移植療法の成功率を高めることができる。特定の実施形態において、被験ＭＳＣは治療効果を高める処理を施されたＭＳＣであってよく、かかるＭＳＣの例は、賦活化剤を含む培地中で培養された、すなわち賦活化処理されたＭＳＣや、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて培養されたＭＳＣである。
【００６６】
ＭＳＣにおける治療効果マーカーの遺伝子又はタンパク質発現量の測定は、塩基配列又はアミノ酸配列が公知である遺伝子又はタンパク質の発現量を測定することが可能な、当業者に公知の各種方法を採用して行うことができる。
【００６７】
マーカータンパク質の発現量の測定は、これに特異的な抗体を用いて、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析及び組織アレイ解析等の周知の方法によって行うことができる。この場合、特異抗体は由来する動物種により制限されず、またポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよく、免疫グロブリン全長からなる抗体又はＦａｂ断片若しくはＦ（ａｂ’）２断片などの部分断片などでもよい。特異抗体は、蛍光物質（例えばＦＩＴＣ、ローダミン、ファロイジン等）、金等のコロイド粒子、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標、ルミネックス社）等の蛍光マイクロビーズ、重金属（例えば金、白金等）、色素タンパク質（例えばフィコエリトリン、フィコシアニン等）、放射性同位体（例えば３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等）、酵素（例えばペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００６８】
マーカー遺伝子の発現量の測定は、その塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いたＰＣＲ法、特にリアルタイムＰＣＲ法及び核酸の絶対定量が可能なデジタルＰＣＲ法、そのｍＲＮＡの塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、そのｍＲＮＡの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸が固定化されたチップを用いたマイクロアレイ法、ＲＮＡシーケンシング法その他の、当該マーカー遺伝子の発現を検出することができる公知の方法により行うことができる。プライマー核酸又はプローブ核酸は、用いられる方法に応じて、蛍光物質、放射性同位体、酵素、ビオチン、ストレプトアビジンその他の標識化合物によって標識されていてもよい。
【００６９】
上記態様の治療効果判定方法はまた、測定された発現量を対照ＭＳＣにおける発現量と比較する比較工程を含む。ここで対照ＭＳＣは、治療効果判定の基準となるＭＳＣである。例えば、被験ＭＳＣが細胞移植療法において使用が予定されるＭＳＣである場合には、対照ＭＳＣとしては、細胞移植療法において使用可能な最低レベルの治療効果を有するＭＳＣを用いることができる。対照ＭＳＣにおける治療効果マーカーの遺伝子又はタンパク質発現量は、被験ＭＳＣと同時に測定されたものであっても、予め用意されたものであってもよい。
【００７０】
上記態様の治療効果判定方法は、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ない場合に、被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定する判定工程をさらに含む。
【００７１】
判定工程においては、測定工程において測定した治療効果マーカーがｐ１６ｉｎｋ４ａ又はｐ１４ＡＲＦであった場合、ｐ１６ｉｎｋ４ａ又はｐ１４ＡＲＦの遺伝子又はタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多いときに、被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定することができる。また、測定工程において測定した治療効果マーカーがＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ又はＣＤ４７であった場合、これらの遺伝子又はタンパク質発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ないときに、被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定することができる。
【００７２】
複数の治療効果マーカーを用いてＭＳＣの治療効果を判定する場合、クラスター解析を利用することも可能である。具体的には、被験ＭＳＣにおいて測定した各治療効果マーカーの相対的発現データを、治療効果が高いポジティブコントロールのＭＳＣ、すなわち細胞移植療法において使用するのに十分なレベルの治療効果を有するＭＳＣ及び治療効果が低いネガティブコントロールのＭＳＣ、すなわち細胞移植療法において使用するには不十分なレベルの治療効果しか有さないＭＳＣにおける各治療効果マーカーの相対的発現データと共にクラスター解析に供し、被験ＭＳＣがポジティブコントロールＭＳＣと同じクラスターに属した場合は治療効果が高いと、ネガティブコントロールＭＳＣと同じクラスターに属した場合は治療効果が低いと判定することができる。
【００７３】
クラスター解析は、Ｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．１（Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｒ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｌｏｔｔｉｎｇ  ｄａｔａ；ｇｐｌｏｔｓ等の統計ソフトにより、適切なクラスタリング手法、例えばウォード法や群平均法等の階層的手法を用いて行うことができる。
【００７４】
また、治療効果が高いＭＳＣでは、上記治療効果マーカーの他に、幹細胞性の指標となるＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４遺伝子、テロメアーゼ活性に関与する遺伝子とされるＴＥＲＴ遺伝子等も未処理ＭＳＣにおける発現レベルより高いことが、さらに、細胞老化に関与する遺伝子とされるｐ５３及び細胞骨格に関与する遺伝子とされるα−ＳＭＡの発現量が未処理ＭＳＣにおける発現レベルより低いことが本発明者らにより確認されている。したがって、測定工程において上記治療効果マーカーの遺伝子又はタンパク質発現量の測定に加えて、
（Ａ）ＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ−６及びＴＥＲＴよりなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは２、３、４、５、６、７個若しくは全ての遺伝子若しくはタンパク質、並びに／又は
（Ｂ）ｐ５３及びα−ＳＭＡよりなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは全ての遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定し、判定工程においてその結果を上記治療効果マーカーの遺伝子又はタンパク質発現量の変化と組み合わせること、具体的には
ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多いこと並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ないことに加えて、前記（Ａ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて多い場合及び／又は前記（Ｂ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ない場合に、そのＭＳＣは治療効果が高いと判定することも可能である。
【００７５】
さらに、上記態様の治療効果判定方法の測定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えてＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて少ないことに代えてＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合が対照ＭＳＣよりも被験ＭＳＣにおいて低い場合に被験ＭＳＣは対照ＭＳＣより治療効果が高いと判定する方法も、本発明に包含される。
【００７６】
ＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合は、ＭＳＣをＣＤ４７に対する標識化抗体で標識し、アイソタイプコントロール等をネガティブコントールとしてフローサイトメトリー法等で解析することにより、決定することができる。
【００７７】
治療効果を高めるための処理に対するＭＳＣの適応性判定方法
本発明のさらなる態様は、処理されたＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていないＭＳＣにおける発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない場合に、そのＭＳＣは当該処理に適していると判定する判定工程を含む、ＭＳＣの治療効果を高めるための処理に対するＭＳＣの適応性を判定する方法に関する。
【００７８】
また、本発明のなおさらなる態様は、処理されたＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていないＭＳＣにおける発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない若しくは同等である場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い若しくは同等である場合に、そのＭＳＣは当該処理に適していないと判定する除外判定工程を含む、ＭＳＣの治療効果を高めるための処理に対するＭＳＣの適応性を判定する方法に関する。
【００７９】
上記態様の適応性判定方法における「処理されたＭＳＣ」とは、ＭＳＣの治療効果を高めるための何らかの処理を受けたＭＳＣをいう。また「処理されていないＭＳＣ」とは、かかる処理を受けていないＭＳＣ又はかかる処理の対照となる処理を受けたＭＳＣをいう。このような処理とその対照処理の例としては、賦活化剤存在下での培養／賦活化剤不存在下での培養、３次元培養担体上での培養／２次元培養担体上での培養、低酸素濃度下又は低栄養下での培養／通常酸素濃度下又は通常栄養下での培養、微小重力環境又は過重力環境での培養／通常重力環境の培養、ｂＦＧＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＴＧＦ−β又はＰＤＧＦといった増殖因子、サイトカイン・ケモカイン等の存在下での培養／不存在下での培養、遺伝子の導入による形質転換処理／未処理等が挙げられる。
【００８０】
上で述べたように、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦはＭＳＣの治療効果と正に相関し、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７はＭＳＣの治療効果と負に相関することから、ＭＳＣの治療効果を高めるための処理をされたＭＳＣ及び処理されていないＭＳＣにおけるこれらの発現量を比較することで、そのＭＳＣが当該処理に応答性であるか否か、当該処理に対する適応性があるか否かを判定することができる。
【００８１】
上記態様の適応性判定方法における測定工程及び比較工程は、前述の治療効果判定方法の対応する工程に説明されるとおりである。また、処理されていないＭＳＣにおける治療効果マーカーの遺伝子又はタンパク質発現量は、処理されたＭＳＣと同時に測定されたものであっても、予め用意されたものであってもよい。
【００８２】
処理されたＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない場合には、そのＭＳＣは当該処理により治療効果が高められるＭＳＣであると予測され、当該処理に適しているＭＳＣである、言い換えればそのＭＳＣは当該処理への適応性がある、と判定することができる。上記態様の適応性判定方法はまた、前記測定工程及び比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない場合にそのＭＳＣの治療効果が当該処理により上昇したと判定する工程を含む、ＭＳＣの治療効果を高めるための処理によるＭＳＣの治療効果の上昇を判定する方法と表すこともできる。
【００８３】
一方、処理されたＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない若しくは同等である場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い若しくは同等である場合には、そのＭＳＣは治療効果を高めるための処理をしても治療効果が高められる可能性が低いＭＳＣであると予測され、そのＭＳＣは当該処理への適応性が低い又はないと判定することができる。上記態様の適応性判定方法はまた、前記測定工程及び比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない若しくは同等である場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い若しくは同等である場合にそのＭＳＣの治療効果が当該処理により上昇していないと判定する工程を含む、ＭＳＣの治療効果を高めるための処理によるＭＳＣの治療効果の上昇の不存在を判定する方法と表すこともできる。
【００８４】
上記態様の適応性判定方法においては、前述の治療効果判定方法と同じく、複数の治療効果マーカーを用いた適応性判定の際のクラスター解析の利用、幹細胞性に関与する因子、免疫制御・抗炎症機能に関与する因子及びテロメアーゼ活性に関与する因子と組み合わせての判定、並びにＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えたＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合の使用も可能であり、その詳細は前述の治療効果判定方法に説明されるとおりである。
【００８５】
なお、上記態様の適応性判定方法におけるＭＳＣの治療効果を高めるための処理に代えてＭＳＣの治療効果を高めるか否か不明である処理を行い、そのＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていないＭＳＣよりも処理されたＭＳＣにおいて少ない場合に、当該処理がＭＳＣの治療効果を高めるのに適していると判定することもできる。本発明は、このような判定方法も提供する。
【００８６】
上記の治療効果判定方法及び適応性判定方法によって、治療効果が高い、治療効果を高めるための処理への適応性が高い又は治療効果が上昇したと判定されたＭＳＣについては当該処理による移植用ＭＳＣの製造又はその検討をさらに進めればよい。一方、治療効果が低い、適応性が低い若しくはない又は治療効果が上昇していないと判定されたＭＳＣについては当該処理による移植用ＭＳＣの製造を行わず、ＭＳＣ及び処理に必要とされる賦活化剤等の薬剤の消費を抑制することができる。
【００８７】
細胞製剤
本発明の別の態様は、ＣＤ４７陽性細胞の割合が２％以下である、ＭＳＣを含む細胞製剤に関する。
【００８８】
前述のとおり、ＣＤ４７はＭＳＣの治療効果と負に相関する治療効果マーカーであることが確認されている。本発明者らは、第１の態様の製造方法によって、ＣＤ４７陽性細胞の割合が極めて低いＭＳＣを製造することができることを見出した。かかるＭＳＣは治療効果が極めて高いものと期待されることから、これを含む細胞製剤は、ＭＳＣを用いた細胞移植療法が有効な疾患の治療及び／又は予防のための医薬として利用することができる。
【００８９】
細胞製剤は、第１の態様の製造方法により製造したＭＳＣを用いて製造することができる。細胞製剤に含まれるＭＳＣは、ＣＤ４７陽性細胞の割合が２％以下であるという特徴を有する。後の実施例において示すように、治療効果が高いと考えられる若年者から採取したＭＳＣにおいてすらＣＤ４７陽性細胞の割合は２％を超えていたことからすると、このようにＣＤ４７陽性細胞の割合が極めて低いＭＳＣは従来にない高い治療効果を有するものと期待される。
【００９０】
細胞製剤に含まれるＭＳＣにおけるＣＤ４７陽性細胞の割合は２％以下、好ましくは１．５％以下である。ＭＳＣ中のＣＤ４７陽性細胞の割合は、前述の治療効果判定方法において既に述べた手法により、確認することができる。
【００９１】
細胞製剤は、対象から分離されたＭＳＣ等のＭＳＣ集団の中からＣＤ４７陰性のＭＳＣを濃縮することによっても、製造することができる。したがって、本発明は、ＭＳＣ集団の中からＣＤ４７陰性のＭＳＣを濃縮する工程を含む、ＭＳＣを含む細胞製剤の製造方法も提供するものである。
【００９２】
ＣＤ４７陰性ＭＳＣの濃縮は、特定の細胞表面マーカーを有さない細胞の濃縮に用いられる周知の技術、例えばＣＤ４７のネガティブセレクションにより行うことができる。ＣＤ４７のネガティブセレクションにおいて、ＭＳＣ集団はＣＤ４７特異抗体が結合したビーズやＣＤ４７特異抗体を用いたフローサイトメトリーに供され、抗体と結合しないＭＳＣが回収される。
【００９３】
細胞製剤は、有効量のＭＳＣを含む。「有効量」とは、疾患を治療及び／又は予防するのに効果的な量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、投与経路、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。好ましい実施形態において、ＭＳＣの有効量は、全身投与の場合で投与される個体の体重１ｋｇあたり１０４細胞〜１０９細胞、好ましくは１０５細胞〜１０８細胞であり、局所投与の場合で投与される個体の体重１ｋｇあたり１０２細胞〜１０９細胞、好ましくは１０４細胞〜１０６細胞である。前述の通り、本発明の第１の態様に係る製造方法により製造されるＭＳＣは、ファイバーからなる３次元構造を有さない培養担体上で、典型的には２次元培養担体上で賦活化剤を用いて賦活化されたＭＳＣと比較してより高い治療効果を有することから、細胞製剤中のＭＳＣの有効量は、ファイバーからなる３次元構造を有さない細胞培養担体を用いて製造される賦活化されたＭＳＣの有効量の１／２０〜１／２の量、好ましくは１／１０〜１／４の量であり得る。これら有効量の細胞製剤は、１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００９４】
またＭＳＣの培養物には、ＭＳＣが産生する様々な液性因子が含まれており、やはり疾患治療効果を有することが知られている。したがって、上記態様の細胞製剤に含まれるＭＳＣを培養して得られる培養物もまた、疾患の治療及び／又は予防のための医薬として利用することができる。培養物は、好適には培養上清であり、ＭＳＣの培養に通常用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ等の中で、賦活化剤の存在下でＭＳＣを培養することにより、又は賦活化された後のＭＳＣを培養することにより、得ることができる。ＭＳＣ培養物を含む医薬における培養物の有効量は、投与される個体の体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０２ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは０．０５ｍｇ〜２０ｍｇであり、これを１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００９５】
上記の細胞製剤、及び培養物を含む医薬（以下まとめて本発明の医薬という）は、通常、注射剤等の非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。また本発明の医薬は、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含む医薬組成物であってもよい。
【００９６】
本発明の医薬の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与、被膜下投与等の局所投与（被膜は各種臓器を被う膜組織を意味する）を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の医薬は、静脈内投与により生体に投与される。また、本発明の医薬は、治療及び／又は予防される疾患に応じて、その他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
【００９７】
細胞製剤は、３次元培養担体に接着した形態で、生体内で疾患が生じている部位、生じるおそれがある部位若しくは疾患の原因となる部位、又はそれらの近傍に貼付することにより、生体に局所投与することもできる。本実施形態においては、３次元培養担体のファイバーを形成する素材は、生体適合性材料、特に生分解性ポリマーであることが好ましい。
【００９８】
本発明の医薬は、ＭＳＣを用いた細胞移植療法が有効な疾患、例えば糖尿病及びその合併症、脳血管疾患、脳変性疾患、脱髄性疾患、機能性発作性疾患、認知症性疾患、末梢神経疾患、心血管疾患、自己免疫疾患、肝・胆道・膵疾患、胃・十二指腸疾患、小腸・大腸疾患、甲状腺疾患、血液・造血器疾患、肺疾患、急性腎障害及び慢性腎臓病、眼疾患、皮膚疾患、筋・骨疾患、外傷及びＧＶＨＤ（移植片対宿主病）の治療及び／又は予防のために用いることができる。これらの疾患としては、具体的に、１型糖尿病及び２型糖尿病並びにこれらの合併症、例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性壊疽など；脳卒中（脳梗塞及び脳出血）などの脳血管疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、大脳基底核変性症、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、筋委縮性側索硬化症などの脳変性疾患；多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、視神経脊髄炎などの脱髄性疾患；てんかんや脳性麻痺などの機能性発作性疾患；血管性認知症、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、糖尿病性認知症などの認知症性疾患；ギランバレー症候群、末梢神経障害、顔面神経麻痺、三叉神経痛、排尿障害、勃起障害、自律神経失調症などの末梢神経疾患；心筋梗塞、狭心症、閉塞性動脈硬化症、心筋症などの心血管疾患；関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、混合性結合組織病、リウマチ性多発筋痛症、好酸球増多症、ベーチェット病、サルコイドーシス、Ｓｔｉｌｌ病、脊椎関節炎、川崎病等の自己免疫疾患；急・慢性肝炎、肝硬変、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、急・慢性膵炎、自己免疫性膵炎などの肝・胆道・膵疾患；急性・慢性胃炎、胃・十二指腸潰瘍などの胃・十二指腸疾患；クローン病、潰瘍性大腸炎、虚血性大腸炎、過敏性腸症候群などの小腸・大腸疾患；バセドー病、急性・慢性甲状腺炎などの甲状腺疾患；自己免疫性溶血性貧血、真性多血症、特発性血小板減少性紫斑病などの血液・造血器疾患；慢性閉塞性肺疾患、間質性肺炎、肺線維症、塵肺、気管支喘息、好酸球性肺炎、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）などの肺疾患；体液量減少や虚血に伴う急性腎障害、ＡＮＣＡ関連腎炎、顕微鏡的多発血管炎、多発血管炎性肉芽種症、好酸球性多発血管炎性肉芽種症、悪性高血圧、クリオグロブリン血症、感染後糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、急性間質性腎炎、薬剤性腎障害、骨髄腫腎、痛風腎、横紋筋融解症、急性尿細管壊死などの急性腎障害；膜性腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、微小変化型ネフローゼ症候群、巣状糸球体硬化症、ループス腎炎、アミロイド―シス、腎硬化症、紫斑病性腎炎、ＩｇＧ４関連腎疾患、シェーグレン症候群、強皮症腎、慢性間質性腎炎、多発性嚢胞腎などの慢性腎臓病；黄班変性症、視神経炎、ブドウ膜炎などの眼疾患；アトピー性皮膚炎、水泡性疾患、Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群などの皮膚疾患；重症筋無力症、筋ジストロフィー、変形性股関節症、大腿骨頭壊死、骨粗鬆症、手根管症候群などの筋・骨疾患；脊髄損傷、脳挫傷などの外傷；褥瘡等の創傷、口腔内潰瘍、ＧＶＨＤ（移植片対宿主病）、縫合不全、臓器の損傷を挙げることができる。本発明の医薬が適応される疾患は、好適には、糖尿病性腎症、急性腎障害、慢性腎臓病、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、糖尿病性壊疽、アルツハイマー病、糖尿病性認知症、関節リウマチ、多発性筋炎及び創傷である。
【００９９】
本明細書において用いられる治療及び／又は予防は、疾患又は症状の治癒、一時的寛解、予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的及び／又は予防的介入を包含する。すなわち、疾患又は症状の治療及び／又は予防は、疾患又は症状の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【０１００】
本発明はまた、有効量の本発明の医薬をその必要がある対象に投与することを含む、ＭＳＣを用いた細胞移植療法が有効な疾患を治療及び／又は予防する方法も、別の態様として包含する。本態様における各用語の意味は、上で説明したとおりである。
【０１０１】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０２】
実施例１  ３次元培養担体上で賦活化処理されたＭＳＣの調製
１）賦活化剤の調製
特許文献１の記載にしたがって、ヒト胎盤組織から賦活化剤を調製した。簡潔には、細切したヒト胎盤組織を湿重量５０ｇに対して、１００ｍＬの割合で無血清培地（ａｌｐｈａ−ＭＥＭ）に入れ、４℃で７２時間、振とうした。遠心分離により上清を回収し、胎盤組織抽出物である賦活化剤を得た。【０１０３】
２）賦活化処理
変形性股関節症患者の人工関節置換術時に採取した骨髄由来のＭＳＣ（ＯＡ−ＭＳＣ）を、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン及び１００ｍｇ／ｄＬグルコースを含有するＤＭＥＭ）で培養を行った。細胞を回収して、それぞれ３次元培養担体であるＰｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ  ６ｗｅｌｌ（登録商標）（ベセル株式会社）に８×１０４細胞／ｗｅｌｌ、Ｃｅｌｌｂｅｄ  ２４ｗｅｌｌ（登録商標）（日本バイリーン株式会社）に２×１０４細胞／ｗｅｌｌ、３Ｄ−ｉｎｓｅｒｔ  ＰＳ−２００  １２ｗｅｌｌ及び３Ｄ−ｉｎｓｅｒｔ  ＰＳ−４００  １２ｗｅｌｌ（３ＤＢｉｏｔｅｋ社）に３．８×１０４細胞／ｗｅｌｌを播種し、ＭＳＣ培養培地を用いて３７℃で７２時間培養した。培地を除去した後、タンパク質換算で１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ若しくは０．１μｇ／ｍＬの上記賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を、それぞれＰｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ  ６ｗｅｌｌに２ｍＬ、Ｃｅｌｌｂｅｄ  ２４ｗｅｌｌに０．６ｍＬ、３Ｄ−ｉｎｓｅｒｔ  ＰＳ−２００  １２ｗｅｌｌ及び３Ｄ−ｉｎｓｅｒｔ  ＰＳ−４００  １２ｗｅｌｌに１ｍＬを加えて３７℃で４日間培養を行った。この培養を１〜３回行った後、細胞を回収して、継代数１〜３のＯＡ−ＭＳＣを調製した。【０１０４】
また、平板状の２次元細胞培養担体であるＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養  ６ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に６×１０４細胞／ｗｅｌｌを播種し、１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下又は不存在下で培養を行った。この培養をさらに１回繰り返すことで、継代数２の対照のＯＡ−ＭＳＣを調製した。【０１０５】
実施例２  ３次元培養担体上で賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣの遺伝子発現解析及び形態観察
１）遺伝子発現解析
実施例１の２）で調製した各ＯＡ−ＭＳＣからＴｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。逆転写反応によりｃｌｏｎｅ  ＤＮＡを合成し、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＤＮＭＴ１、ＴＥＲＴ、ＩＬ−６、ＩＤＯ、ＴＳＧ−６、ｐ２１、ｐ５３、α−ＳＭＡ及び１８ｓＲＮＡについて、表１に示した塩基配列からなるプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。
表中の（Ｆ）はフォワードプライマーを、（Ｒ）はリバースプライマーを意味する。
【表１】
2018199194.tif 000003
【０１０６】
１８ｓＲＮＡをハウスキーピング遺伝子として、２次元培養担体上で１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養した対照のＯＡ−ＭＳＣをもとにΔΔＣＴ値を算出し、遺伝子発現プロファイルを解析して、クラスター化した。Ｐｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ上で０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ（ＶＥＣＥＬＬ＿０．１）、Ｃｅｌｌｂｅｄ上で０．１、１又は１０μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ（それぞれＣｅｌｌＢｅｄ＿０．１、ＣｅｌｌＢｅｄ＿１、ＣｅｌｌＢｅｄ＿１０）、３Ｄ−ｉｎｓｅｒｔ  ＰＳ−２００上で０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ（３Ｄ．ｉｎｓｅｒｔ２００＿０．１）、３Ｄ−ｉｎｓｅｒｔ  ＰＳ−４００上で１０μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ（３Ｄ．ｉｎｓｅｒｔ４００＿１０）、及び２次元培養担体上で１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下で培養した対照のＯＡ−ＭＳＣ（２Ｄ＿１００）の結果を図１に示す。また、２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ（２Ｄ＿０）に対する２Ｄ＿１００及びＶＥＣＥＬＬ＿０．１のＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＴＥＲＴの相対的遺伝子発現量を図２に示す。【０１０７】
２Ｄ＿１００及び２Ｄ＿０と比較して、３次元培養担体上で賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣはいずれも、幹細胞性に関与する遺伝子とされるＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２及びＯＣＴ４、免疫制御・抗炎症機能に関与する遺伝子とされるＩＤＯ、ＴＳＧ６及びＩＬ−６、テロメアーゼ活性に関与する遺伝子とされるＴＥＲＴの発現量が増加しており、細胞老化に関与する遺伝子とされるＰ５３、細胞骨格に関与する遺伝子とされるα−ＳＭＡの発現量が減少していることが確認された。この結果は、治療効果のあるＭＳＣのマーカーとして知られる遺伝子群の発現の傾向が、２次元培養担体上で賦活化処理されたＭＳＣよりも、３次元培養担体上で賦活化処理されたＭＳＣにおいて強く表れることを示すものである。【０１０８】
２）形態観察
次に、Ｐｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ上で０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下又は不存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ（ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）及びＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤−））、並びに２次元培養担体上で１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下又は不存在下で培養したＯＡ−ＭＳＣ（ＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤＋）及びＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤−））を２．５％グルタールアルデヒド及び２％パラフォルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液で４℃で１時間固定し、その後１％オスミウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液で１時間、４℃で後固定した。その後、脱水・乾燥して、金属コーティングを行い、走査電子顕微鏡で観察した。【０１０９】
２次元培養担体上で培養した場合、賦活化剤の添加によりＭＳＣの突起数は増加し、細胞の厚みが増し（図３下段）、またエクソソームと推定される小胞がより多く形成された（図４下段）。３次元培養担体上で賦活化剤を添加せずに培養すると、ＭＳＣは、賦活化剤存在下での２次元培養と同等以上の形態変化を示した（図３左上及び右下、図４左上及び右下）。さらに、賦活化剤存在下での３次元培養担体上での培養は、ＭＳＣの突起数を飛躍的に増加させてネットワーク構造を形成させ（図３右上）、また小胞形成を増加させた（図４右上）。なお、図４右上のＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）では、多量に形成された小胞が放出された痕跡が多数の空洞として示されている。【０１１０】
３）別の培養担体上で賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣの遺伝子発現解析及び形態観察
比較例の培養担体として細胞培養基材Ａ（平均繊維径０．１〜０．５μｍ、空隙率７０％以下、平均孔面積０．２μｍ２、２４ｗｅｌｌ）を用いて、賦活化剤濃度１μｇ／ｍＬ又は０．１μｇ／ｍＬで、実施例１の２）のＣｅｌｌｂｅｄ  ２４ｗｅｌｌの場合と同様に、ＯＡ−ＭＳＣの賦活化処理を行った。基材Ａは、その一部にファイバーからなる３次元構造を有するが、３次元構造を持たない平坦な膜状の部分が細胞接着面の約５０％を占める基材である。【０１１１】
また、別の３次元培養担体として細胞培養基材Ｂを用いてＯＡ−ＭＳＣの賦活化処理を行った。細胞培養基材Ｂは、国際公開ＷＯ２０１６／０６８２６６号パンフレット及びＬｉｕ  Ｌ，Ｋａｍｅｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １２４（２０１７）  ４７−５４に記載の方法で製造される、ポリグリコール酸からなるベース部材上にポリグリコール酸からなるナノファイバーを含有する３次元培養担体である。【０１１２】
賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン及び１００ｍｇ／ｄＬグルコースを含有するＤＭＥＭ）でＯＡ−ＭＳＣを培養した。細胞を回収し、２次元培養担体（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養  ６ｗｅｌｌプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に２．５ｃｍ×２．５ｃｍの細胞培養基材Ｂを入れ、８×１０４細胞のＭＳＣを播種し、１μｇ／ｍＬの賦活化剤を含むＭＳＣ培養培地２ｍＬを加えて、３７℃で７２時間培養を行うことで、継代数１の賦活化処理されたＭＳＣシートを調製した。この方法で調製されたＭＳＣシートは、おおよそ８，５００細胞／ｃｍ２のＭＳＣを含む。【０１１３】
基材Ａ及びＢからＭＳＣを回収し、各遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲによって測定し、先のリアルタイムＰＣＲの結果と合わせてクラスター化した。結果を図５に示す。基材Ａ上で賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣは２Ｄ＿１００と類似した遺伝子発現プロファイルを示しており、基材Ａ上での賦活化処理は２次元培養担体上での賦活化処理と同程度の効果しかもたらさないことが確認された。また、基材Ｂ上で賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣは他の３次元培養担体と類似した遺伝子発現プロファイルを示しており、賦活化処理の効果は他の３次元培養担体と同様であると推測された。【０１１４】
また、基材Ｂ上で賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣの走査電子顕微鏡の観察像を図６に示す。上記Ｐｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ上で賦活化処理を行ったＯＡ−ＭＳＣと同様に数多くの小胞が観察された。【０１１５】
実施例３  ３次元培養担体上で賦活化処理された健常者由来ＭＳＣの遺伝子発現解析
前十字靭帯断裂以外に所見が認められない２２歳女性から採取した骨髄由来のＭＳＣ（健常者由来ＭＳＣ）を、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地で培養を行った。細胞を回収して、Ｐｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ  ６ｗｅｌｌ（登録商標）（ベセル株式会社）に８×１０４細胞／ｗｅｌｌを播種し、ＭＳＣ培養培地を用いて３７℃で７２時間培養した。培地を除去し、１μｇ／ｍＬの賦活化剤を含むＭＳＣ培養培地２ｍＬを加えて培養を行うことで、継代数１の賦活化処理された健常者由来ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）を調製した。【０１１６】
また、２次元培養担体（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養  ６ｗｅｌｌプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に６×１０４細胞／ｗｅｌｌの健常者由来ＭＳＣを播種し、１００μｇ／ｍＬの賦活化剤の存在下又は不存在下で培養を行った。この培養をさらに１回繰り返すことで、継代数２の賦活化処理された又は賦活化処理されていない健常者由来ＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤＋、２Ｄ・賦活剤−）を調製した。【０１１７】
上記３種類のＭＳＣにおける各遺伝子の発現量を、実施例２の１）と同様にリアルタイムＰＣＲによって測定した。賦活化処理されていないＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤−）に対する賦活化処理されたＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤＋及び３Ｄ・賦活剤＋）のＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びＴＳＧ−６の相対的遺伝子発現量を図７に示す。いずれの遺伝子の発現量も２Ｄ・賦活剤−、２Ｄ・賦活剤＋、３Ｄ・賦活剤＋の順に高くなっており、特にＯＣＴ４及びＴＳＧ−６の発現量は３Ｄ・賦活剤＋において顕著に高い値を示した。このことは、３次元培養担体上での賦活化処理が、疾患を有する患者由来のＭＳＣだけでなく健常者由来のＭＳＣをも賦活化してその治療効果を高めることができることを示唆する。【０１１８】
実施例４  ３次元培養担体上で賦活化処理されたＭＳＣの治療効果（皮膚欠損）
１０週齢のＬｅｗｉｓラットの背部に３ｃｍ×３ｃｍの皮膚を切除した部位を２箇所設けることで、皮膚欠損モデルラットを作製した。皮膚切除から１日後に、実施例１の２）で調製したＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤−）（５×１０５細胞／匹）、ＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤＋）（５×１０５細胞／匹）、ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）（１×１０５細胞／匹）又はＰＢＳ（ｖｅｈｉｃｌｅ）をラットに静脈内投与して、２１日間飼育した。【０１１９】
皮膚切除から３日後及び７日後に皮膚欠損部の残存欠損面積を測定することで創傷治癒の度合いを評価した。その結果を図８に示す。また７日後の皮膚欠損部を撮影した写真を図９に示す。ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）を投与したラットでは、ＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤＋）を投与したラットと比較して、投与した細胞数が１／５であるにもかかわらず、創傷治癒が早いことが確認された。【０１２０】
また、皮膚切除から２１日後に皮膚欠損部の周囲２ｃｍ×２ｃｍの皮膚をラットから摘出し、精密万能試験機（ＡＧ−１）（株式会社島津製作所）を用いて皮膚の破断応力を測定した。その結果を図１０に示す。ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）を投与したラットの皮膚組織は、ＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤＋）を投与したラットの皮膚組織と比較して、投与した細胞数が１／５であるにもかかわらず、より高い破断応力を獲得していることが確認された。【０１２１】
実施例１において賦活化に使用した賦活化剤の濃度を基に、ヒトの胎盤１個から製造される賦活化剤を用いて賦活化されたＭＳＣで治療等を行うことができるヒト患者数を算出すると、ファイバーからなる３次元構造を有さない細胞培養担体を用いた賦活化ではおよそ１０人であるのに対して、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いた賦活化ではおよそ１０，０００人となると推定された。【０１２２】
また、実施例４で確認されたファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて賦活化されたＭＳＣの高い治療効果は、投与細胞数がファイバーからなる３次元構造を有さない２次元培養担体を用いて賦活化されたＭＳＣの投与細胞数の１／５であることも考慮すると、治療及び／又は予防に必要な細胞数を大きく減らすことを可能とする。このことは、投与時間の短縮及び副作用の低減等の患者の治療負担の軽減という利点をもたらす。さらに、必要とされる細胞数を確保するための継代培養の継代回数を減らすことができ、細胞製造期間の短縮及びコスト削減等の利点ももたらす。【０１２３】
実施例５  ３次元培養担体上で賦活化されたＭＳＣの治療効果（認知機能）
Ｐｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ  ６ｗｅｌｌ（登録商標）（ベセル株式会社）に８×１０４細胞／ｗｅｌｌのＯＡ−ＭＳＣを播種し、ＭＳＣ培養培地を用いて３７℃で７２時間培養した。培地を除去し、０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤を含むＭＳＣ培養培地を２ｍＬ／ｗｅｌｌで加えて３７℃で４日間培養を行った後、細胞を回収して、継代数１の賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）を調製した。また、２次元培養担体（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養  ６ｗｅｌｌプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に６×１０４細胞／ｗｅｌｌのＯＡ−ＭＳＣを播種し、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を１．３ｍＬ／ｗｅｌｌで加えて３７℃で４日間培養を行い、継代数１の未処理ＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤−）を調製した。【０１２４】
１７月齢の雄性ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（チャールズリバー）に、上で調製したＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤−）（２．５×１０４細胞／匹）又はＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）（２．５×１０４細胞／匹）を髄腔内投与して、２８日間飼育した。髄腔内投与から２１日後から６日間、モリス水迷路試験を行った。モリス水迷路試験では、水（２５℃±１℃）を張った円形のプール（直径１．２ｍ）の端からマウスを入れ、水面直下に設置された、マウスの脚が接地可能なプラットフォーム（直径１０ｃｍ）に到達できる時間を測定した。プラットフォームの位置は一定として、マウスの入れる位置を変えながら、１日４回を５日間施行し、プラットフォームの位置を学習する能力を評価した（ｈｉｄｄｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｅｓｔｓ）。Ｈｉｄｄｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｅｓｔｓ終了の翌日にプラットフォームをプールから除去し、総遊泳時間（６０秒）に対し、先のｈｉｄｄｅｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｔｅｓｔｓでプラットフォームのあった４分割エリア内で遊泳する時間の割合を測定し、マウスの記憶能力を評価した（ｐｒｏｂｅ  ｔｅｓｔ）。【０１２５】
モリス水迷路での学習テストの結果を図１１に、記憶テストの結果を図１２に示す。ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）を投与したマウスは、ＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤−）を投与したマウスと比較して学習能力及び記憶能力が高く、ＭＳＣ（３Ｄ・賦活剤＋）の高い治療効果が確認された。【０１２６】
実施例６  ３次元培養担体上で賦活化されたＭＳＣの治療効果（糖尿病性腎症）【０１２７】
糖尿病性腎症を発症している１４月齢の雄性ＯＬＥＴＦラット（星野試験動物）に、リツキシマブ（中外製薬）５ｍｇ／匹を１日１回４日間、尾静脈投与した。リツキシマブ初回投与から１０〜１４日後、リツキシマブを投与したラットの腎臓に実施例２の３）で基材Ｂを用いて調製したＭＳＣシートを移植した（３Ｄ賦活剤＋ＭＳＣ群、ｎ＝６）。リツキシマブ投与のみをＶｅｈｉｃｌｅとした（Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ｎ＝７）。イソフルラン吸入麻酔下、側臥位のラットの最下位肋骨下より皮切を入れ、筋層を切開して一方の腎臓を体外に引き出した。ゲロータ筋膜、脂肪層及び線維被膜を、副腎を損傷しないように慎重に切開して腎表面から剥がし、腎門部に引き寄せた。２．５ｃｍ×２．５ｃｍのＭＳＣシート１枚及び１／３に切った同ＭＳＣシート１枚を、腎臓の全体を包むように貼付した。他方の腎臓にも同様にＭＳＣシートを貼付した。ＭＳＣシート移植日、移植後３週、及び６週時にラットから血液を採取し、酵素法（ＳＲＬ）を用いて血清クレアチニンを測定した。【０１２８】
移植後１１週間生存していた動物（Ｖｅｈｉｃｌｅ群、３Ｄ賦活剤＋ＭＳＣ群ともｎ＝２）の血清クレアチニンの推移を図１３に示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ群では血清クレアチニンの経時的な上昇が認められたのに対し、３Ｄ賦活剤＋ＭＳＣ群では血清クレアチニン値の上昇は認められなかった。また、移植後１１週までの生存率を表すカプランマイヤー曲線を図１４に示す。３Ｄ賦活剤＋ＭＳＣ群は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて高い生存率を示した。【０１２９】
本試験で用いたラットは、糖尿病性腎症に加えて抗がん剤処置によりさらに急性腎障害を誘導することで程度の揃った重篤な慢性腎臓病を発症するモデル動物であり、腎症第４期（腎不全期）に相当する非常に重篤な末期腎障害を呈していた。３次元培養担体上で賦活化されたＭＳＣシートは、このような重篤な疾患に対しても治療効果を示すことが確認された。
実施例７  賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣにおける治療効果マーカー遺伝子の発現解析
１）ＭＳＣの賦活化処理
変形性股関節症患者（ｎ＝１３）の人工関節置換術時に採取した骨髄由来のＭＳＣ（ＯＡ−ＭＳＣ）を、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン及び１００ｍｇ／ｄＬグルコースを含有するＤＭＥＭ）で培養した。細胞を回収して、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養  ６ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に６×１０４細胞／ｗｅｌｌを播種し、賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を１．３ｍＬ／ｗｅｌｌで加えて３７℃で４日間培養を行った。この培養をさらに１回繰り返すことで、継代数２の賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣ及び未処理のＯＡ−ＭＳＣを調製した。【０１３０】
また、前十字靭帯断裂以外に所見が認められない２２歳女性から採取した骨髄由来のＭＳＣ（健常者ＭＳＣ）を、上記ＯＡ−ＭＳＣと同様に培養、賦活化処理を行うことで、賦活化処理された健常者ＭＳＣ及び未処理の健常者ＭＳＣを調製した。【０１３１】
２）遺伝子発現解析
上記１）で調製した各ＯＡ−ＭＳＣにおける各遺伝子（ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＤＮＭＴ１、ＴＥＲＴ、ＩＬ−６、ＩＤＯ、ＴＳＧ−６、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ＲＢ、ｐ２１、ｐ５３、α−ＳＭＡ、１８ｓＲＮＡ）の発現量を、実施例２の１）と同様にリアルタイムＰＣＲによって測定した。【０１３２】
１８ｓＲＮＡをハウスキーピング遺伝子として、未処理ＯＡ−ＭＳＣをもとに賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣにおける各遺伝子発現のΔΔＣＴ値を算出し、遺伝子発現プロファイルを解析し、クラスター化した。１０症例のＯＡ−ＭＳＣについての解析結果を図１５に示す。【０１３３】
さらに、同じ症例のＯＡ−ＭＳＣを用いて、表２に示した塩基配列からなるプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲによりｐ１４ＡＲＦ及びＣＤ４７の遺伝子発現量を測定し、先に測定した遺伝子発現量の結果と合わせてクラスター化した。結果を図１６に示す。
【表２】
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【０１３４】
これらの結果から、分離源の患者毎にＭＳＣの遺伝子発現プロファイルは異なっており、ＭＳＣが分離された患者毎に賦活化処理への反応性が異なることが明らかとなった。【０１３５】
また、ＭＳＣの治療効果の負のマーカーであると考えられていたｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦは、意外なことに、ＭＳＣの治療効果の正のマーカーとして知られているＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６及びＴＥＲＴと同じクラスターに属していた。９症例のＯＡ−ＭＳＣにおける、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＩＤＯ及びＴＳＧ６遺伝子の相対的発現量とｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量との相関を図１７に、ｐ１４ＡＲＦの相対的発現量とｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量との相関を図１８に示す。ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＩＤＯ及びＴＳＧ６とｐ１６ｉｎｋ４ａ、及びｐ１４ＡＲＦとｐ１６ｉｎｋ４ａには高い相関性が認められた。【０１３６】
さらに、ｐ１６ｉｎｋ４ａの下流因子であるＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＲＢ、並びに細胞療法に使用する細胞において発現することが望ましいと考えられていたＣＤ４７の遺伝子発現は、ｐ１６ｉｎｋ４ａとは逆傾向を示していた。リアルタイムＰＣＲにより測定した３症例のＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０２１、ＢＭ−０２２、ＢＭ−０２３）におけるＯＣＴ４、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びＲＢ遺伝子の相対的発現量を図１９に示す。いずれのＭＳＣにおいても賦活化処理によりＯＣＴ４及びｐ１６ｉｎｋ４ａ発現が亢進した一方、ＲＢ発現は低下していた。【０１３７】
この３症例のＯＡ−ＭＳＣのｔｏｔａｌ  ＲＮＡについて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃｌａｒｉｏｍ（登録商標）  Ｓ  Ａｒｒａｙを用いてマイクロアレイ解析を行った。データはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  （ＴＡＣ）  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。いずれのＭＳＣにおいても賦活化処理によりＣＤＫ６の発現量は約２．０４倍減少していた（データを図示せず）。【０１３８】
賦活化処理による上記因子の発現変動の傾向は健常者ＭＳＣにおいても認められ、例えばＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａの遺伝子発現量は賦活化処理により２倍強に増加していた（データを図示せず）。以上から、ｐ１６ｉｎｋ４ａは上記既知因子と同様にＭＳＣの治療効果の正のマーカーとして、またＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＲＢは治療効果の負のマーカーとして利用可能性があることが示唆された。【０１３９】
実施例８  ３次元培養担体上で賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣにおける治療効果マーカー遺伝子の発現解析
１）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ
ＯＡ−ＭＳＣを用いて、３次元培養担体上での賦活化処理による遺伝子発現の変動を解析した。Ｐｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ  ６ｗｅｌｌ（登録商標）（ベセル株式会社）に８×１０４細胞／ｗｅｌｌのＯＡ−ＭＳＣを播種し、ＭＳＣ培養培地を用いて３７℃で７２時間培養した。培地を除去し、０．１μｇ／ｍＬの賦活化剤を含む又は賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を２ｍＬ／ｗｅｌｌで加えて３７℃で４日間培養を行った後、細胞を回収して、継代数１の賦活化処理されたＯＡ−ＭＳＣ及び未処理のＯＡ−ＭＳＣを調製した。これらのＯＡ−ＭＳＣにおける各因子の発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。【０１４０】
１症例のＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０１０）におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を図２０に示す。実施例７の２次元培養担体上での賦活化処理と同様に、３次元培養担体上での賦活化処理によっても各因子の発現量が増加することが確認された。【０１４１】
２）ＣＤ４７
関節リウマチ患者、７２歳男性、肝硬変患者及び３８歳男性から採取した骨髄由来のＭＳＣ（それぞれＲＡ、Ａｇｅｄ、肝硬変、Ｙｏｕｎｇ）を用いて、２種類の賦活化剤濃度（１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ）で、上記１）と同様にして３次元培養担体上での賦活化処理を行い、継代数１の賦活化処理されたＭＳＣを調製した。また、２次元培養担体（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養  ６ｗｅｌｌプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に同じＭＳＣを６×１０４細胞／ｗｅｌｌの量で播種し、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を１．３ｍＬ／ｗｅｌｌで加えて３７℃で４日間培養を行い、継代数１の未処理ＭＳＣを調製した。【０１４２】
これらのＭＳＣにおけるＣＤ４７の遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。未処理ＭＳＣに対する３次元培養担体上で賦活化処理したＭＳＣにおけるＣＤ４７の相対的遺伝子発現量を図２１に示す。いずれのＭＳＣにおいても賦活化処理によりＣＤ４７の遺伝子発現量は減少し、その傾向は関節リウマチ患者、７２歳男性、肝硬変患者のＭＳＣでより顕著であった。疾患を有する対象及び高齢者のＭＳＣは一般に治療効果が低いことを考慮すると、ＣＤ４７は治療効果の負のマーカーとして利用可能性があることが示唆された。【０１４３】
実施例９  細胞表面マーカーＣＤ４７の発現解析
３８歳男性及び７２歳男性から採取した骨髄由来のＭＳＣ（それぞれ若年者ＭＳＣ、高齢者ＭＳＣ）を用いて、賦活化剤濃度０．１μｇ／ｍＬで、実施例８の２）と同様にして継代数１の賦活化処理されたＭＳＣ及び未処理のＭＳＣを調製した。これらのＭＳＣを死細胞染色のためＺｏｍｂｉｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（商標）  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で反応し、その後ＦＩＴＣ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ４７  抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリー解析を行なった。ネガティブコントロールは、ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌもしくは２次抗体のみを反応させたＭＳＣを用いた。データ解析は、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＫａｌｕｚａ  Ｖ１．５ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で行なった。【０１４４】
未処理ＭＳＣの結果を図２２に示す。シグナル強度がネガティブコントロールにおいて検出されたシグナル強度よりも高いＭＳＣをＣＤ４７陽性、ネガティブコントロールにおいて検出されたシグナル強度よりも低いＭＳＣをＣＤ４７陰性と判定した。若年者ＭＳＣにおけるＣＤ４７陽性細胞率、すなわち当該ＭＳＣ集団におけるＣＤ４７陽性ＭＳＣの割合は２．３４％という低値であったのに対し、高齢者ＭＳＣにおけるＣＤ４７陽性細胞率は９０．１０％という高い値を示した。【０１４５】
賦活化処理されたＭＳＣの結果を図２３に示す。若年者ＭＳＣ、高齢者ＭＳＣのいずれにおいても賦活化処理によりＣＤ４７陽性細胞率は低下し、特に高齢者ＭＳＣにおいて著しい低下を示した。高齢者ＭＳＣは一般に疾患治療効果が低いことを考慮すると、ＣＤ４７は治療効果の負のマーカーとして利用可能性があることが示唆された。【０１４６】
実施例１０  ｐ１６ｉｎｋ４ａ高発現ＭＳＣの機能評価（マクロファージに対する作用）
実施例７の１）で賦活化処理を行ったＯＡ−ＭＳＣのうち、発現変動の程度が異なる３症例のＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８、ＢＭ−０２１、ＢＭ−００５）について、機能評価を行った。これらのＯＡ−ＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を図２４に示す。ｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量は、ＢＭ−００８においては賦活化処理によって約１．４倍、ＢＭ−０２１においては約１．６倍増加した一方、ＢＭ−００５においては０．２倍程度に減少していた。【０１４７】
賦活化処理された上記３種のＯＡ−ＭＳＣ及びこれらに対応する未処理ＯＡ−ＭＳＣ、合計６種のＭＳＣを、マウスマクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４．７との共培養に供した。セルカルチャーインサート（Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））のインサートのメンブレン部分にＰＫＨ赤色素で染色したＭＳＣを２ｘ１０４細胞で播種し、プラスチックプレート部分にＰＫＨ緑色素で染色した２ｘ１０５細胞のＲＡＷ２６４．７細胞を播種して、ＤＭＥＭ培地を用いて３７℃で２４時間共培養を行った。【０１４８】
共培養終了後、インサートのメンブレンからＭＳＣをトリプシンで剥がし、ＲＡＷ２６４．７細胞の存在するプラスチックプレート部分に移して、接触共培養を２４時間行った。接触共培養後に、４％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリー解析を行った。【０１４９】
フローサイトメトリー解析によってＰＫＨ赤とＰＫＨ緑のダブルポジティブを示した細胞が死細胞を除いた単核細胞の総数に占める割合を図２５に示す。ダブルポジティブの細胞は、ＭＳＣ由来の死細胞デブリを貪食したマクロファージに相当する細胞であると考えられることから、これらの細胞数増加はマクロファージの貪食能の亢進を意味する。ダブルポジティブ細胞の割合は、ＢＭ−００８及びＢＭ−０２１においては賦活化処理によって増加した一方、ＢＭ−００５においては減少していた。【０１５０】
また、共培養後のＲＡＷ２６４．７細胞を回収し、Ｔｒｉ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。逆転写反応によりｃｌｏｎｅ  ＤＮＡを合成し、Ｍ１マクロファージのマーカーであるＦｐｒ２（Ｆｏｒｍｙｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２）の発現量を、以下のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲにより測定した。
Ｆｐｒ（Ｆ）：５’−ＴＣＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号３３）
Ｆｐｒ（Ｒ）：５’−ＴＴＡＣＡＴＣＴＡＣＣＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＡ−３’（配列番号３４）【０１５１】
ＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８、ＢＭ−０２１、ＢＭ−００５）と共培養したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＦｐｒの相対的発現量を図２６に示す。Ｆｐｒ発現量は、ＢＭ−００８及びＢＭ−０２１においては賦活化処理によって増加した一方、ＢＭ−００５においては変化が認められなかった。【０１５２】
近年、従来、慢性炎症性疾患と言われていた疾患以外の様々な疾患においても、慢性炎症の関与が確認されている。慢性炎症が関与する疾患としては、慢性炎症性疾患に加えて、アレルギー性疾患、自己免疫性疾患、がん、動脈硬化性疾患（虚血性心疾患、脳卒中等）、神経変性疾患（アルツハイマー病）、メタボリックシンドローム・生活習慣病（肥満、糖尿病、脂質異常症、慢性腎臓病、非アルコール性脂肪性肝炎等）、排尿障害等を挙げることができ、さらには老化においても慢性炎症の関与が知られている。【０１５３】
急性炎症においては炎症初期にＭ１マクロファージが増加し、役目を終えた老化細胞や損傷した細胞等の種々の細胞を貪食する。Ｍ１マクロファージの貪食によるクリアランスの後、組織にはＭ２マクロファージが出現し、サイトカイン等の刺激を受けて周辺細胞からのコラーゲン等の産生を促し、組織を修復に導くものと考えられている。一方、慢性炎症においてはＭ２マクロファージ優位な状態が継続し、線維芽細胞等の種々の細胞が貪食により除去されず存在し続けるため、組織修復が起こらず炎症が継続し、組織の線維化が助長されるものと考えられている（Ｊ．Ｇ．Ｔｉｄｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，ｖｏｌ．２１，ｐ．６６５−６６６；Ｘ．Ｍ．Ｍｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２０１４，ｖｏｌ．１０，ｐ．４９３−５０３；Ａ．Ｐｅｌｌｉｃｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，ｖｏｌ．１４，ｐ．１８１−１９４）。慢性炎症が関与する疾患の処置にはＭ１マクロファージ優位な状態を誘導することが重要であると推測されており、したがってＭ１マクロファージの増加は、これらの慢性炎症が関与する疾患において治療効果の指標として利用され得る。【０１５４】
実施例１０の試験によると、賦活化処理によりｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量が増加したＭＳＣは共培養したマクロファージの貪食能を高め、Ｍ１型へのシフトを誘導したが、賦活化処理によりｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量が減少したＭＳＣはマクロファージに対するそのような作用を示さないことが確認された。Ｍ１マクロファージの増加は慢性炎症が関与する疾患において治療効果の指標として利用され得ることから、賦活化処理によりｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量が増加したＭＳＣは賦活化処理により治療効果が高められた、すなわち賦活化された一方、賦活化処理によりｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量が減少したＭＳＣは賦活化処理により治療効果が高められていない、すなわち賦活化されていないものと考えられた。【０１５５】
実施例１１  ｐ１６ｉｎｋ４ａ高発現ＭＳＣの機能評価（多発性筋炎）
１）局所投与
賦活化処理によりｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量が増加したＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−０２１）を用いて、慢性炎症が関与する疾患である多発性筋炎に対する治療効果の確認を行った。ＢＭ−０２１におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を図２７に示す。いずれの因子も賦活化処理により発現量が増加していた。【０１５６】
８週齢のＢａｌｂ／ｃマウスのリンパ節近傍に、別のＢａｌｂ／ｃマウスの骨格筋から調製したミオシン画分（１ｍｇ／匹）と完全フロイトアジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ社、２００μｇ／匹）とのエマルジョンを投与し、同時に百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、５００ｎｇ／匹）を腹腔内投与して免疫を行った。初回免疫の１週間後及び２週間後に、上記エマルジョンをマウスリンパ節近傍に投与して追加免疫を行うことで、多発性筋炎モデルマウスを作製した。初回免疫から４週間後、マウスを３群（ｎ＝９）に分け、実施例７で調製した賦活化処理されたＭＳＣ（１ｘ１０５細胞／匹のＢＭ−０２１）、未処理のＭＳＣ（１ｘ１０５細胞／匹のＢＭ−０２１）又はＰＢＳ（ｖｅｈｉｃｌｅ）を後肢下腿三頭筋に局所投与した。【０１５７】
ＭＳＣ投与の２日後、下腿三頭筋を採取し、コラゲナーゼ酵素処理後に、ＲＢＣ  Ｌｙｓｉｓバッファーで赤血球を除去し、単細胞懸濁液を作成した。その後、死細胞マーカー（Ｚｏｎｂｉ  Ｄｙｅ）、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ１１ｂ抗体、ＡＰＣ−Ｆ４／８０抗体、ＦＩＴＣ−Ｌｙ６Ｃ抗体で抗原抗体反応を行い、フローサイトメトリー解析を行った。その結果を図２８に示す。賦活化処理されたＭＳＣを投与したマウス（ＰＥ＋）においては、未処理のＭＳＣを投与したマウス（ＰＥ−）と比較して、総マクロファージ及びＭ１マクロファージの割合が有意に増加していた。【０１５８】
ＭＳＣ投与の７日後及び１３日後に、以下のように後肢筋機能評価を実施した。マウスの頸部及び尾を保持し、直径１ｍｍの金属製ワイヤーに後肢を載せ、マウスが両後肢で金属製ワイヤーを把持したことを目視にて確認後、マウスが金属ワイヤーを把持できなくなるまでマウスをワイヤーから引き離した。把持できなくなった時点の牽引力（ｇｒａｍ）を後肢筋力として記録した。牽引力は電子天秤で計測し、その分解能は０．０１ｇであった（Ａ＆Ｄ社）。計測は各マウス３回実施し、その中央値を代表値として使用した。結果を図２９に示す。ＰＥ＋マウスでは、ＰＥ−マウスと比較して後肢筋機能がより向上していた。【０１５９】
２）全身投与
次に、賦活化処理によりｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量が増加したＯＡ−ＭＳＣ（ＢＭ−００８）を用いて、多発性筋炎に対する治療効果の確認を行った。ＢＭ−００８におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の相対的発現量を図３０に示す。ＢＭ−０２１と同じく、いずれの因子も賦活化処理により発現量が増加していた。【０１６０】
上記１）と同様に多発性筋炎モデルマウスを作製し、初回免疫から４週間後に、実施例７で調製した賦活化処理されたＭＳＣ（１ｘ１０６細胞／匹のＢＭ−００８）、未処理のＭＳＣ（１ｘ１０６細胞／匹のＢＭ−００８）又はＰＢＳ（ｖｅｈｉｃｌｅ）を静脈内投与した。ＭＳＣ投与の０、７及び１４日後に、以下のようにｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｓｃｒｅｅｎ  ｔｅｓｔによる筋機能評価を実施した。直径１ｍｍ、網目５ｍｍの金属メッシュ上にマウスを乗せ、金属メッシュを逆さにし、前・後肢でぶら下がっていられる時間を計測した。マウスの体重（ｇｒａｍ）とぶらさがり時間（秒）の積を筋機能データとした。未処理ＭＳＣを投与したマウス（ＰＥ−ＭＳＣ）と比較して、賦活化処理されたＭＳＣを投与したマウス（ＰＥ＋ＭＳＣ）では、筋機能がより向上していた（図３１）。【０１６１】
ＭＳＣ投与の１４日後に採取したマウス筋組織のＨＥ染色像の一例を図３２に示す。ＰＥ＋ＭＳＣマウスでは、ＰＥ−ＭＳＣマウスと比較して筋組織への炎症細胞の浸潤が少なかった。また、ＭＳＣ投与の１４日後に採取したマウス筋組織（各群ｎ＝３）について、筋断面積を解析した。筋断面積は８μｍの凍結切片を作成し、１次抗体にウサギ抗ラミニン抗体（Ａｂｃａｍ社）、２次抗体に抗ウサギＣｙ３標識抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社）で画像データを取得した。ラミニンは筋基底膜を検出するため、ラミニンで囲まれた閉鎖域が筋断面積となる。閉鎖域の面積はＩｍａｇｅＪを用いて画像データから算出した。未処理ＭＳＣを投与したマウス（ＭＳＣ  ＰＥ−）と比較して、賦活化処理されたＭＳＣを投与したマウス（ＭＳＣ  ＰＥ＋）では、筋断面積がより大きかった（図３３）。【０１６２】
以上１）、２）に示すとおり、賦活化処理によりｐ１６ｉｎｋ４ａ発現量が増加したＭＳＣは、未処理のＭＳＣと比較して、総マクロファージ及びＭ１マクロファージの割合を増加させ、また炎症により損傷を受けた組織の修復を促すことが確認された。このことは、ＭＳＣにおけるｐ１６ｉｎｋ４ａ遺伝子の発現亢進が、ＭＳＣの賦活化、すなわち治療効果の上昇と相関性のある事象であることを指し示すものである。【０１６３】
実施例１２  ｐ１６ｉｎｋ４ａ高発現ＭＳＣの機能評価（皮膚欠損）
実施例４においてラットに投与した３種類のＭＳＣについて、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２及びｐ１６ｉｎｋ４ａの遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＭＳＣ（ＰＥ−（２Ｄ））に対する相対的発現量を図３４に示す。賦活化処理により各因子の発現量は増加し、特に３次元培養担体を用いたときに著しく増加していた。実施例４で確認された創傷治癒効果の傾向から、ｐ１６ｉｎｋ４ａの発現量が増加したＭＳＣは、未処理のＭＳＣと比較してより速やかに創傷治癒をもたらすこと、特にｐ１６ｉｎｋ４ａの発現量が著しく増加したＭＳＣは細胞数が少なくても極めて高い創傷治癒能力を有することが確認された。【０１６４】
実施例１３  ｐ１６ｉｎｋ４ａ高発現ＭＳＣの機能評価（糖尿病性腎症）
実施例６においてラットに投与したＭＳＣについて、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＩＤＯ、α−ＳＭＡ及びＴＥＲＴの発現量をリアルタイムＰＣＲによって測定した。２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＭＳＣに対する相対的発現量を図３５に示す。３次元培養担体上での賦活化処理により、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＩＤＯ及びＴＥＲＴの発現量は増加し、α−ＳＭＡの発現量は減少していた。実施例６で確認された腎症治療効果から、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦの発現量が増加したＭＳＣは高い腎症治療効果を奏することが確認された。【０１６５】
実施例１４  ｐ１６ｉｎｋ４欠損ＭＳＣの機能解析（多発性筋炎）
１）ｐ１６ｉｎｋ４ａノックアウトＭＳＣの調製
ＯＡ−ＭＳＣから採取した骨髄由来ＭＳＣに対して、ｐ１４  ＡＲＦ／ｐ１６  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＫＯ  ｐｌａｓｍｉｄｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦをコードするＣＤＫＮ２Ａ遺伝子のノックアウトを行った。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子ノックアウトのための標的ｇＲＮＡを組み込んだＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトプラスミド、又は対照としての標的ｇＲＮＡの代わりにスクランブルｇＲＮＡを組み込んだスクランブルプラスミドをＭＳＣにトランスフェクションした。これらのＭＳＣを、実施例８の２）と同様に賦活化処理に供した後、１次抗体として抗ｐ１６ｉｎｋ４ａ抗体（ａｎｔｉ−ｐ１６ＩＮＫ４Ａ  ｈｕｍａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）を反応させ、２次抗体としてＡｌｘａ  ６４７  Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて標識し、免疫染色した。【０１６６】
ＭＳＣの蛍光観察画像を図３６に示す。ノックアウトプラスミドを導入したＭＳＣ（ノックアウトＭＳＣ）においてのみｐ１６ｉｎｋ４ａの蛍光が観察されなかったことから、当該ＭＳＣはｐ１６ｉｎｋ４ａノックアウトであることが確認された。【０１６７】
２）多発性筋炎モデルマウスにおけるＭＳＣの治療効果
実施例１１の１）と同様にして、上記１）の賦活化処理後のノックアウトＭＳＣ、スクランブルＭＳＣ又はＰＢＳを多発性筋炎モデルマウスの下腿三頭筋に局所投与し、治療効果を評価した。ＭＳＣ投与の１１日後に採取したマウス筋組織のラミニン染色像の一例、及び筋断面積の解析結果を図３７に示す。ＰＢＳを投与したマウス（Ｖｅｈｉｃｌｅ）と比べて、スクランブルＭＳＣを投与したマウス（ＳＣ）の筋断面積は増加したが、ノックアウトＭＳＣを投与したマウス（ＣＤＫＮ２Ａ  ＫＯ）では筋断面積の増加は認められなかった。このように、ｐ１６ｉｎｋ４ａをノックアウトしたＭＳＣは治療効果が低減することが確認され、ｐ１６ｉｎｋ４ａは治療効果の正のマーカーとなることが示された。【０１６８】
実施例１５  ＣＤ４７高発現ＭＳＣの機能評価（皮膚欠損）
１）ＣＤ４７高発現ＭＳＣの調製
３８歳男性から採取した骨髄由来ＭＳＣに対して、ＣＤ４７  ＣＲＩＳＰＲ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＣＤ４７を活性化させるための標的ｇＲＮＡを組み込んだプラスミドをトランスフェクトし、ＣＤ４７を過剰発現させたＭＳＣを作成した。【０１６９】
２）皮膚欠損モデルマウスにおけるＭＳＣの治療効果
３５週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの背部に１．５ｃｍ×１．５ｃｍの皮膚を切除した部位を２箇所設けることで、皮膚欠損モデルラットを作製した。皮膚切除から１日後に、上記１）で調製したＭＳＣ（２．５×１０４細胞／匹）、プラスミドのトランスフェクトを行わない対照のＭＳＣ（２．５×１０４細胞／匹）又はＰＢＳ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）をマウスに静脈内投与して、９日間飼育した。【０１７０】
皮膚切除後３日目から９日目までの創傷面積の変化量、及び９日目の皮膚欠損部を撮影した写真を図３８に示す。ＣＤ４７過剰発現ＭＳＣを投与したマウス（ＣＤ４７ａｃｔｉｖａｔｅ）は、対照ＭＳＣを投与したマウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、創傷面積の変化量が小さい、すなわち創傷治癒が遅いことが確認され、ＣＤ４７は治療効果の負のマーカーとなることが示された。【０１７１】
実施例１６  ＣＤ４７発現量の異なるＭＳＣの機能評価（認知機能）
１）ＣＤ４７発現量の異なるＭＳＣの調製
ＯＡ−ＭＳＣから採取した骨髄由来のＭＳＣを用いて、賦活化剤濃度０．０００１ｍｇ／ｍＬで、実施例８の２）と同様にして３次元培養担体上での賦活化処理を行い、継代数１の賦活化処理されたＭＳＣを調製した。また、２次元培養担体（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）細胞培養  ６ｗｅｌｌプレート、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に同じＭＳＣを６×１０４細胞／ｗｅｌｌの量で播種し、賦活化剤を含まないＭＳＣ培養培地を１．３ｍＬ／ｗｅｌｌで加えて３７℃で４日間培養を行い、継代数１の未処理ＭＳＣを調製した。これらのＭＳＣにおけるＣＤ４７陽性細胞率を実施例９と同様にして測定したところ、賦活化処理されたＭＳＣで＜２０％、未処理ＭＳＣで＞９０％であった。【０１７２】
２）アルツハイマー病モデルマウスにおけるＭＳＣの治療効果
実施例５と同様にして、上記１）の２種類のＭＳＣをＡＰＰ／ＰＳ１マウスに髄腔内投与し、治療効果を評価した。モリス水迷路での学習テストの結果を図３９に、記憶テストの結果を図４０に示す。ＣＤ４７陽性細胞率の高いＭＳＣを投与したマウスは、ＣＤ４７陽性細胞率の低いＭＳＣを投与したマウスと比較して学習能力及び記憶能力が低く、ＣＤ４７は治療効果の負のマーカーとなることが示された。【０１７３】
実施例１７  抽出方法の異なる賦活化剤を用いたＭＳＣの賦活化処理
市販のヒト胎盤抽出物（「メルスモン」、メルスモン製薬株式会社）をエバポレーターで濃縮することで賦活化剤を調製し、これを用いてＰｒｅｓｅｔ  ＶＥＣＥＬＬ及び２次元培養担体上でのＯＡ−ＭＳＣの賦活化処理を実施例８の２）と同様に行った。これらのＯＡ−ＭＳＣにおける各遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲによって測定した。２次元培養担体上で賦活化剤の不存在下で培養したＭＳＣ（２Ｄ・賦活剤なし）に対する各ＭＳＣにおけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴ及びｐ１６ｉｎｋ４ａの相対的遺伝子発現量を図４１及び図４２に示す。ヒト胎盤抽出物から調製した賦活化剤は、実施例１の１）で調製した賦活化剤と同様に、３次元培養担体上でより強い賦活化効果を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月29日(2019.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の臍帯組織、胎盤組織又は卵膜からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で間葉系幹細胞を処理する賦活化工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する工程である、前記製造方法。
【請求項２】
哺乳動物の胎盤組織の加水分解物を有効成分として含有する賦活化剤で間葉系幹細胞を処理する賦活化工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する工程である、前記製造方法。
【請求項３】
細胞培養担体が、ナノメートル〜マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
開口部の平均径が５００ｎｍ〜１０００μｍである、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
培地中の賦活化剤の濃度が、タンパク質換算で０．０１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである、請求項１から５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
賦活化工程における細胞の継代回数が２回以下である、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項９】
間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
処理された間葉系幹細胞におけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていない間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を高めるための処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。
【請求項１１】
測定工程が、処理された間葉系幹細胞と処理されていない間葉系幹細胞のそれぞれにおける
（Ａ）ＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ−６及びＴＥＲＴよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに／又は
（Ｂ）ｐ５３及びα−ＳＭＡよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多いこと並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記（Ａ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合及び／又は前記（Ｂ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する工程である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の方法の測定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において低い場合にその間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する、処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。
【請求項１３】
処理が、哺乳動物の臍帯組織、胎盤組織又は卵膜からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
処理が、哺乳動物の胎盤組織の加水分解物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
処理が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
間葉系幹細胞の治療効果と正に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカーとしての、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される分子の使用。
【請求項１９】
間葉系幹細胞の治療効果と負に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカーとしての、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される分子の使用。
【請求項２０】
被験間葉系幹細胞におけるｐ１６ｉｎｋ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を対照間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。
【請求項２１】
測定工程が、被験間葉系幹細胞における
（Ａ）ＤＮＭＴ１、Ｎａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＩＤＯ、ＴＳＧ６、ＩＬ−６及びＴＥＲＴよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに／又は
（Ｂ）ｐ５３及びα−ＳＭＡよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、ｐ１６ｉｎｋ４ａ及びｐ１４ＡＲＦよりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多いこと並びに／又はＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＲＢ及びＣＤ４７よりなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記（Ａ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合及び／又は前記（Ｂ）の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する工程である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０又は２１に記載の方法の測定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてＣＤ４７遺伝子又はタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のＣＤ４７陽性細胞の割合が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において低い場合に被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。
【請求項２３】
被験間葉系幹細胞が、哺乳動物の臍帯組織、胎盤組織又は卵膜からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で培養された間葉系幹細胞である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
被験間葉系幹細胞が、哺乳動物の胎盤組織の加水分解物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で培養された間葉系幹細胞である、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
被験間葉系幹細胞が、ファイバーからなる３次元構造を有する細胞培養担体を用いて培養された間葉系幹細胞である、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
被験間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項２０から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
被験間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項２０から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＤ４７陽性細胞の割合が２％以下である、間葉系幹細胞を含む細胞製剤。
【請求項２９】
間葉系幹細胞が、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により製造される賦活化された間葉系幹細胞である、請求項２８に記載の細胞製剤。
【請求項３０】
間葉系幹細胞集団の中からＣＤ４７陰性の間葉系幹細胞を濃縮する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞製剤の製造方法。
【国際調査報告】
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