(57)【要約】多能性幹細胞から腎前駆細胞を製造する方法であって、以下の工程（ｉ）〜（ｖｉ）を含む、方法。（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ（Rho-kinase）阻害剤を含む培地で培養する工程；（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程；および（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた細胞を、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を含む培地で培養し、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を誘導する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
中間中胚葉細胞をＧＳＫ（グリコーゲン合成酵素キナーゼ）−３β阻害剤およびＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）９を含む培地で接着培養し、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を誘導する工程を含む、腎前駆細胞の製造方法。
【請求項２】
前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中間中胚葉細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＧＳＫ−３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記培地はさらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記接着培養は細胞外基質でコートされた培養容器を用いて行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細胞外基質はラミニン５１１のＥ８フラグメントである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記中間中胚葉細胞が、多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記中間中胚葉細胞が、以下の工程（ｉ）〜（ｖ）を含む方法で製造された中間中胚葉細胞である、請求項８に記載の方法。
（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；および
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程。
【請求項１０】
工程（ｖ）の培地はさらにＢＭＰ阻害剤を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞から腎前駆細胞を製造する方法であって、以下の工程（ｉ）〜（ｖｉ）を含む、方法。
（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ（Rho-kinase）阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程；および
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた細胞を、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を含む培地で培養し、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を誘導する工程。
【請求項１４】
工程（ｖ）の培地はさらにＢＭＰ阻害剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｖ）で得られた細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＳＫ−３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｖｉ）の培地はさらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、請求項１３〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記培養は細胞外基質でコートされた培養容器を用いて行われる、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞外基質はラミニン５１１のＥ８フラグメントである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１３〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法で製造された、腎前駆細胞。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞を用いて得られる、腎臓オルガノイド。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞またはそれを用いて得られる腎臓オルガノイドを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞またはそれを用いて得られる腎臓オルガノイドを含む、腎疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を分化誘導する方法に関する。本発明はまた、多能性幹細胞から腎前駆細胞を分化誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、本邦において慢性腎臓病(CKD)の患者数は、約1,300万人と推計されており、新たな国民病と呼ばれている。慢性腎臓病に対する根治的治療法は少なく、その進行によって透析療法を必要とする末期慢性腎不全患者は30万人以上であり、医学的のみならず医療経済的にも大きな問題となっている。末期慢性腎不全を含む慢性腎臓病の根治療法として腎移植が挙げられるが、深刻なドナー臓器不足のため需要に対し供給が全く追いついていない状態である。【０００３】
腎臓は、胎生初期の組織である中間中胚葉に由来し、脊椎動物では中間中胚葉から前腎、中腎、後腎の3つの腎臓が形成され、哺乳類では後腎が成体の腎臓となる。後腎は、間葉と呼ばれる成体腎のネフロンと間質に将来分化する組織と尿管芽と呼ばれる成体腎の集合管から下部の腎盂、尿管、膀胱の一部に将来分化する組織の2つの組織の相互作用で発生する。さらに、後腎間葉の中にネフロンを構成する糸球体と数種類の尿細管上皮細胞に分化する多分化能を有するネフロン前駆細胞の存在が示されている（非特許文献1, 2）。【０００４】
ヒト人工多能性幹（iPS）細胞やヒト胚性幹（ES）細胞からネフロン前駆細胞を高効率に分化誘導する方法が確立されれば、将来的に三次元の腎臓の再構築による腎移植のドナー不足の解決や糸球体や尿細管細胞の供給源として細胞療法に使用することが期待される。さらに、糸球体や尿細管細胞やそれらを含む腎組織を用いた薬剤腎毒性評価系や疾患特異的iPS細胞から作製される腎細胞と腎組織を用いた疾患モデル作製や治療薬開発などの研究への発展が期待される。【０００５】
ヒトiPS細胞やヒトES細胞からネフロン前駆細胞を分化誘導する方法が数報報告されているが(非特許文献3〜6)、胚様体（embryoid body; EB）を用いているため分化誘導効率が低いことや(非特許文献3)、発生の各段階を正確に再現しているかどうかが不明であることが問題であった(非特許文献4〜6)。
また、本発明者らのグループは、中間中胚葉細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞の製造方法について開示しているが（特許文献1）、より効率よく腎前駆細胞を分化誘導できる方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2014/200115
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Osafune K., et al., Development 2006; 133: 151-61.
【非特許文献２】Kobayashi A., et al., Cell Stem Cell 2008; 3: 169-81.
【非特許文献３】Taguchi A., et al., Cell Stem Cell. 2014; 14: 53-67.
【非特許文献４】Takasato M., et al., Nat Cell Biol. 2014; 16: 118-26.
【非特許文献５】Takasato M., et al., Nature. 2015; 526: 564-568.
【非特許文献６】Morizane R., et al., Nat. Biotechnol. 2015; 33: 1193-1200.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を効率よく分化誘導する方法を提供することにある。より具体的には、多能性幹細胞から誘導した中間中胚葉細胞をさらに腎前駆細胞へ分化誘導する工程を含む、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を分化誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を含む培地で接着培養を行うことにより、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を分化誘導できることを見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。【００１０】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］中間中胚葉細胞をＧＳＫ（グリコーゲン合成酵素キナーゼ）−３β阻害剤およびＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）９を含む培地で接着培養し、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を誘導する工程を含む、腎前駆細胞の製造方法。
［２］前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、［１］に記載の方法。
［３］前記中間中胚葉細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＧＳＫ−３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記培地はさらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記接着培養は細胞外基質でコートされた培養容器を用いて行われる、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記細胞外基質はラミニン５１１のＥ８フラグメントである、［６］に記載の方法。
［８］前記中間中胚葉細胞が、多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記中間中胚葉細胞が、以下の工程（ｉ）〜（ｖ）を含む方法で製造された中間中胚葉細胞である、［８］に記載の方法。
（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；および
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程。
［１０］工程（ｖ）の培地はさらにＢＭＰ阻害剤を含む、［９］に記載の方法。
［１１］前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、［８］または［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［１１］に記載の方法。
［１３］多能性幹細胞から腎前駆細胞を製造する方法であって、以下の工程（ｉ）〜（ｖｉ）を含む、方法。
（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ（Rho-kinase）阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程；および
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた細胞を、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を含む培地で培養し、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を誘導する工程。
［１４］工程（ｖ）の培地はさらにＢＭＰ阻害剤を含む、［１３］に記載の方法。
［１５］前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、［１３］または［１４］に記載の方法。
［１６］前記工程（ｖ）で得られた細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、［１３］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］前記ＧＳＫ−３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、［１３］〜［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］前記工程（ｖｉ）の培地はさらにＲＯＣＫ阻害剤を含む、［１３］〜［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］前記培養は細胞外基質でコートされた培養容器を用いて行われる、［１３］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記細胞外基質はラミニン５１１のＥ８フラグメントである、［１９］に記載の方法。
［２１］前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、［１３］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［２１］に記載の方法。
［２３］［１］〜［２２］のいずれかに記載の方法で製造された、腎前駆細胞。
［２４］［１］〜［２２］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞を用いて得られる、腎臓オルガノイド。
［２５］［１］〜［２２］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞またはそれを用いて得られる腎臓オルガノイドを含む、医薬組成物。
［２６］［１］〜［２２］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞またはそれを用いて得られる腎臓オルガノイドを含む、腎疾患治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、接着培養で培養が行えるため、80%以上の高効率でヒトiPS細胞から腎前駆細胞への分化誘導を可能である。さらに、後腎間葉ネフロン前駆細胞を派生させる後方胚盤葉上層、後期体節中胚葉細胞、後方中間中胚葉細胞の各発生分化段階を正確に再現した方法であるため、各段階での細胞の解析も可能である。
後腎は成体腎を形成する胎児腎組織の一つであり、腎臓再生において必須のコンポーネントである。また、後腎ネフロン前駆細胞やそこから派生する糸球体、尿細管に発生する腎疾患は多いため、腎疾患モデル作製においても本発明の方法は有用である。従って、本発明の方法は、腎疾患に対する治療方法や治療薬探索の観点においても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトiPS細胞から分化誘導された後期後方エピブラスト、中胚葉系譜後期原始線条、後腎系譜後期原始線条、後期後方中間中胚葉、およびネフロン前駆細胞（腎前駆細胞）を示す免疫細胞染色の結果を示す図（写真）。後期後方中間中胚葉、およびネフロン前駆細胞については、マーカー陽性細胞の割合もFACSで示した。
【図２】ヒトiPS細胞由来腎前駆細胞をマウス胎仔腎と共培養して得られた腎臓オルガノイドの染色結果を示す写真。図中、Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎは糸球体のマーカーを、ＬＴＬは近位尿細管のマーカーを、ＣＤＨ１は遠位尿細管のマーカーを、ＣＤＨ６は近位尿細管のマーカーを、Ｎｅｐｈｒｉｎは糸球体のマーカーを示し、またスケールバーは、５０μｍを示す。
【図３】ヒトiPS細胞由来腎前駆細胞を培養して得られた腎臓オルガノイドの明視野像および免疫染色像を示す写真。図中、Ｐｏｄｏｃａｌｙｘｉｎは糸球体のマーカーを、ＬＴＬは近位尿細管のマーカーを、ＣＤＨ１およびＢＲＮ１は遠位尿細管とヘンレのループのマーカーを示す。Dolicos biflorus agglutinin（ＤＢＡ）は遠位尿細管マーカーである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明を以下に詳細に説明する。
【００１４】
＜中間中胚葉細胞から腎前駆細胞への分化誘導＞
本発明は、中間中胚葉細胞をＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程（腎前駆細胞分化誘導工程ともいう）を含む、腎前駆細胞を製造する方法を提供する。
【００１５】
本発明において、中間中胚葉細胞とは、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を含む培地で培養することによって腎前駆細胞へ誘導される任意の細胞を意味する。中間中胚葉細胞を取得する方法としては、例えば、マウスおよびヒトの多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導方法が公知である（Biochem Biophys Res Commun.393:877-82 (2010)、Nat Commun．4:1367 (2013)、WO2012／011610および特許文献１）。中間中胚葉細胞を特徴づけるマーカーとしてＯＳＲ１が知られており、本発明の方法で使用される中間中胚葉細胞の例として、ＯＳＲ１陽性の中間中胚葉細胞が挙げられる。例えば、ＯＳＲ１プロモーター制御下に導入されたレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を有する多能性幹細胞（例えば、後記実施例記載のＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞）を培養し、当該レポーター遺伝子の発現を指標に当該分野で公知の方法（例えば、細胞ソーターを用いる方法）によって、ＯＳＲ１陽性の中間中胚葉細胞を単離することができる。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４，１３６７，（２０１３））等の遺伝子発現を分析する方法によって、中間中胚葉細胞におけるＯＳＲ１の発現を確認することもできる。本発明において、ＯＳＲ１陽性の中間中胚葉細胞には、ＯＳＲ１タンパク質を発現している細胞、およびＯＳＲ１プロモーター制御下にある遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する細胞が包含される。本発明において、ＯＳＲ１には、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿１４５２６０．２、マウスの場合、ＮＭ＿０１１８５９．３に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。好ましくは、本発明の方法で使用される中間中胚葉細胞は、ＳＩＸ２が陰性であり、ＯＳＲ１、ＨＯＸ１１、ＷＴ１が陽性である細胞である。
【００１６】
本発明において、腎前駆細胞は、ネフロン前駆細胞と同等の細胞として取り扱われ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化し得る細胞であり、器官構造への分化能は、例えば、Ｏｓａｆｕｎｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３３：１５１−６１に記載の方法によって評価し得る。腎前駆細胞としての状態を維持するための特徴的な因子としてＳＩＸ２が知られており（Cell Stem Cell 3:169−181 (2008)）、本発明の方法で誘導される腎前駆細胞の例として、ＳＩＸ２陽性の腎前駆細胞が挙げられる。例えば、ＳＩＸ２プロモーター制御下に導入されたレポーター遺伝子（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ）を有する多能性幹細胞（例えば、後記実施例記載のＯＳＲ１−ＧＦＰ／ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞）を培養し、当該レポーター遺伝子の発現を指標に当該分野で公知の方法（例えば、細胞ソーターを用いる方法）によって、ＳＩＸ２陽性の腎前駆細胞を単離することができる。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＮａｔＣｏｍｍｕｎ ４，１３６７，（２０１３））等の遺伝子発現を分析する方法によって、腎前駆細胞におけるＳＩＸ２の発現を確認することもできる。本発明において、ＳＩＸ２陽性の腎前駆細胞には、ＳＩＸ２タンパク質を発現している細胞、およびＳＩＸ２プロモーター制御下にある遺伝子にコードされるタンパク質を発現する細胞が包含される。本発明において、ＳＩＸ２には、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿０１６９３２．４、マウスの場合、ＮＭ＿０１１３８０．２に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。好ましくは、本発明の方法で誘導される腎前駆細胞は、ＯＳＲ１が陽性であり、かつＨＯＸ１１、ＷＴ１、ＳＩＸ２およびＳＡＬＬ１が陽性である細胞である。
【００１７】
本発明において、中間中胚葉細胞または腎前駆細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％、２０％、２８％または３０％以上当該細胞が含まれた細胞集団である。純化は上記マーカーを指標にＦＡＣＳなどの方法にて行うことができる。
【００１８】
本発明において、接着培養とは細胞が培養基材に接着した状態で培養されることを意味し、例えば、コーティング処理された培養皿にて培養することを意味する。コーティング剤としては、細胞外基質が好ましく、例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリンおよびラミニンといった物質またはこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、BD Matrigel(商標)などの細胞からの調製物であってもよい。細胞外基質は好ましくは、ラミニンまたはその断片である。本発明においてラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ1本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、サブユニット鎖の組成が異なるアイソフォームが存在する細胞外マトリックスタンパク質である。ラミニンは、5種のα鎖、4種のβ鎖および3種のγ鎖のヘテロ三量体の組合せで約15種類のアイソフォームを有する。特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４またはα５であり、β鎖は、β１、β２、β３またはβ４であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２またはγ３が例示される。ラミニンは、より好ましくは、α５、β１およびγ１からなるラミニン511である（Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)）。ラミニンは断片であってもよく、インテグリン結合活性を有している断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるE8フラグメント（ラミニン511E8）（EMBO J., 3:1463-1468, 1984、J. Cell Biol., 105:589-598, 1987、WO2011/043405）であってもよい。ラミニン511E8は市販されており、例えばニッピ株式会社等から購入可能である。
【００１９】
腎前駆細胞分化誘導工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。ＲｅｐｒｏＦＦ２（リプロセル）など、あらかじめ幹細胞培養用に最適化された培地を使用してもよい。また、腎前駆細胞分化誘導工程に使用される培地には後述のＹ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤が含まれてもよい。
【００２０】
腎前駆細胞分化誘導工程において使用されるＧＳＫ−３β阻害剤は、ＧＳＫ−３βの機能、例えば、キナーゼ活性を阻害できるものである限り特に限定されず、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＸ；６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニル−α−ブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（α，４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2）および高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５３：５１９−５２３）が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂｉｏｍｏｌ社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。本工程で用いる好ましいＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。本工程で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ−３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから３μＭであり、特に好ましくは０．５μＭから１．５μＭである。
【００２１】
腎前駆細胞分化誘導工程において使用されるＦＧＦ９はヒトＦＧＦ９が好ましく、ヒトＦＧＦ９としては、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号：NP_002001.1のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ９は分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含される。ＦＧＦ９は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるＦＧＦ９の濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、または５ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌである。
【００２２】
腎前駆細胞分化誘導工程の培養日数は、長期間培養することで腎前駆細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上が挙げられる。腎前駆細胞分化誘導工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ2濃度は、好ましくは約２〜５％である。
【００２３】
本発明の１つの実施形態において、中間中胚葉細胞は、多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞である。この場合、誘導された中間中胚葉細胞を一旦単離し、単離された中間中胚葉細胞を本発明の培養工程によって腎前駆細胞へ誘導しても良い。または、多能性幹細胞から中間中胚葉細胞を誘導し、中間中胚葉細胞を単離せずにそのまま本発明の培養工程に供することによって腎前駆細胞へ誘導しても良い。
【００２４】
中間中胚葉細胞を単離する場合、内在性のＯＳＲ１プロモーターによって発現が制御されるレポーター遺伝子を有する多能性幹細胞を使用してもよい。多能性幹細胞のＯＳＲ１プロモーター制御下にレポーター遺伝子を導入する方法としては、例えば、ＢＡＣベクター等を用いた相同組換えが挙げられ、ＷＯ２０１２／０１１６１０等に記載されている。また、誘導された腎前駆細胞を単離するために、ＳＩＸ２プロモーターによって発現が制御されるレポーター遺伝子を有する多能性幹細胞を使用してもよく、前記と同様の方法を使用して作製することができる。使用されるレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ、細胞表面タンパク質などの公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。これらの多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞または腎前駆細胞は、当該レポータータンパク質の発現を指標として細胞ソーターを用いる方法、当該細胞表面タンパク質に対する抗体を使用して、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法（例えば、ＭＡＣＳ）、当該抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等、当該分野で公知の方法を用いて単離され得る。
【００２５】
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、ｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
【００２６】
ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４���３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
【００２７】
体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００２８】
また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一または実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座またはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
【００２９】
＜多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導＞
本発明において、多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導に際して、以下の工程を含む方法を用いることができる。
（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を含む培地で培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；および
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程。
【００３０】
以下に各工程についてさらに説明する。
【００３１】
（ｉ）多能性幹細胞を、ＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を含む培地で培養する工程
この工程では、多能性幹細胞から後期後方エピブラストが誘導される。後期後方エピブラストは、ＣＤＸ１、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｅ−ＣＤＨ（ＣＤＨ１）の少なくとも１つ以上のマーカーが陽性である細胞として特徴づけられ、好ましくはこれらすべてのマーカーが陽性である細胞として特徴づけられる。後期後方エピブラストはさらに、ＥＯＭＥＳおよびＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陰性であることが好ましい。
【００３２】
工程（ｉ）では、多能性幹細胞を当該分野で公知の任意の方法で分離し、好ましくは接着培養により培養する。
多能性幹細胞の分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液を用いて解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法である。工程（ｉ）で用いるヒト多能性幹細胞としては、使用したディッシュに対して７０％〜８０％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを用いることが好ましい。
【００３３】
工程（ｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＦＧＦ２、ＢＭＰ４、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸またはその誘導体を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
【００３４】
工程（ｉ）において使用されるＧＳＫ−３β阻害剤は、前述の腎前駆細胞分化誘導工程において例示したＧＳＫ−３β阻害剤を使用することができ、好ましいＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。工程（ｉ）で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ−３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから３μＭであり、特に好ましくは０．５μＭから１．５μＭである。
【００３５】
工程（ｉ）で使用されるＦＧＦ２（塩基性ＦＧＦ：ｂＦＧＦ）はヒトＦＧＦ２が好ましく、ヒトＦＧＦ２としては、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号：ABO43041.1のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＦＧＦ２は分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含されるＦＧＦ２は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるＦＧＦ２の濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍｌである。
【００３６】
工程（ｉ）で使用されるＢＭＰ４はヒトＢＭＰ４が好ましく、ヒトＢＭＰ４としては、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号：AAH20546.1のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＢＭＰ４は分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含されるＢＭＰ４は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるＢＭＰ４の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌである。
【００３７】
工程（ｉ）において使用されるレチノイン酸は、レチノイン酸そのものでもよいし、天然のレチノイン酸が有する分化誘導機能を保持するレチノイン酸誘導体でもよい。レチノイン酸誘導体として、例えば、３−デヒドロレチノイン酸、４−［［（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＡＭ５８０）（Ｔａｍｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３２：１７−２６（１９９０））、４−［（１Ｅ）−２−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）−１−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｙｌ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ＴＴＮＰＢ）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４３：５２６８−５２７２（１９８３））、およびＴａｎｅｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４０：９１４−９１９（１９８０）に記載されている化合物、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール等が挙げられる。
工程（ｉ）で用いるレチノイン酸またはその誘導体の濃度は、例えば、１ｎＭから１００ｎＭ、好ましくは、５ｎＭから５０ｎＭ、より好ましくは、５ｎＭから２５ｎＭである。
【００３８】
工程（ｉ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。工程（ｉ）の培養時間は後期後方エピブラストが分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１〜２日の培養であり、好ましくは１日である。
【００３９】
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を含む培地で培養する工程
この工程では、後期後方エピブラストから中胚葉系譜原始線条が誘導される。中胚葉系譜原始線条は、ＣＤＸ１およびＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陽性である細胞として特徴づけられる。中胚葉系譜原始線条はさらに、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧおよびＥ−ＣＤＨが陰性であることが好ましい。
【００４０】
工程（ｉｉ）では、前述の工程（ｉ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養皿にて接着培養してもよいし、工程（ｉ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
【００４１】
工程（ｉｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＢＭＰ７を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
【００４２】
工程（ｉｉ）で使用されるＦＧＦ２は工程（ｉ）で説明したものと同様であり、その好ましい濃度範囲も同様である。
【００４３】
工程（ｉｉ）において使用されるＧＳＫ−３β阻害剤は、前述の工程（ｉ）において例示したＧＳＫ−３β阻害剤を使用することができ、好ましいＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。工程（ｉｉ）で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ−３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから７．５μＭであり、特に好ましくは２から５μＭである。工程（ｉｉ）で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は工程（ｉ）における濃度より増加させることが好ましい。
【００４４】
工程（ｉｉ）で使用されるＢＭＰ７はヒトＢＭＰ７が好ましく、ヒトＢＭＰ７としては、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のアクセッション番号：NM_001719.2のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＢＭＰ７は分化誘導活性を有する限りその断片及び機能的改変体が包含されるＢＭＰ７は市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。この工程で用いられるＢＭＰ７の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、０．５ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍｌである。
【００４５】
工程（ｉｉ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｉ）の培養時間は中胚葉系譜原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば、１０時間〜２日、または１〜２日の培養であり、好ましくは０．５〜１日である。
【００４６】
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を含む培地で培養する工程
この工程では、中胚葉系譜原始線条から中胚葉系譜後期原始線条が誘導される。中胚葉系譜後期原始線条は、ＣＤＸ２およびＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陽性である細胞として特徴づけられる。
【００４７】
工程（ｉｉｉ）では、前述の工程（ｉｉ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養皿にて接着培養してもよいし、工程（ｉｉ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
【００４８】
工程（ｉｉｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７およびＴＧＦβ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
【００４９】
工程（ｉｉｉ）において使用されるＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７は工程（ｉｉ）と同様であり、その好ましい濃度範囲も同様であるが、ＧＳＫ−３β阻害剤の濃度範囲は０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから７．５μＭであり、特に好ましくは２から５μＭである。
【００５０】
工程（ｉｉｉ）において使用されるＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、またはＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質が挙げられ、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A83-01(WO2009146408) およびこれらの誘導体などが例示される。TGFβ阻害剤は、好ましくは、A83-01であり得る。
培養液中におけるＴＧＦβ阻害剤の濃度は、ALKを阻害する濃度であれば特に限定されないが、０．５μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２５μＭである。
【００５１】
工程（ｉｉｉ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｉｉ）の培養時間は中胚葉系譜後期原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１〜３日の培養であり、好ましくは１．５〜２日である。
【００５２】
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られた細胞を、ＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で培養する工程
この工程では、中胚葉系譜後期原始線条から後腎系譜後期原始線条が誘導される。後腎系譜後期原始線条は、ＨＯＸ１１およびＢＲＡＣＨＹＵＲＹが陽性である細胞として特徴づけられる。
【００５３】
工程（ｉｖ）では、前述の工程（ｉｉｉ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養皿にて接着培養してもよいし、工程（ｉｉｉ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
【００５４】
工程（ｉｖ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７、アクチビンおよびＲＯＣＫ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
【００５５】
工程（ｉｖ）において使用されるＦＧＦ２、ＧＳＫ−３β阻害剤、ＢＭＰ７は工程（ｉｉ）と同様であり、その好ましい濃度範囲も同様であるが、ＧＳＫ−３β阻害剤の濃度範囲は０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから７．５μＭであり、特に好ましくは２から５μＭである。
【００５６】
工程（ｉｖ）において使用されるアクチビンには、ヒトおよび他の動物由来のアクチビンならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社等の市販されているものを使用することができる。工程（ｉｖ）で用いるアクチビンの濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌである。
【００５７】
工程（ｉｖ）において使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例、Ｉｓｈｉｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例、Ｕｅｎａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例、Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例、Ｎａｋａｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。好ましいＲＯＣＫ阻害剤としてはＹ−２７６３２が挙げられる。工程（ｉｖ）において使用されるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、使用するＲＯＣＫ阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから７５μＭ、さらに好ましくは、５μＭから５０μＭである。
【００５８】
工程（ｉｖ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。工程（ｉｖ）の培養時間は後腎系譜後期原始線条が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１〜５日の培養であり、好ましくは３日である。
【００５９】
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られた細胞を、レチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を含む培地で培養する工程
この工程では、後腎系譜後期原始線条から後期後方中間中胚葉が誘導される。中間中胚葉は、ＯＳＲ１、ＨＯＸ１１およびＷＴ１が陽性である細胞として特徴づけられる。
【００６０】
工程（ｖ）では、前述の工程（ｉｖ）で得られた細胞集団を単離し、別途用意したコーティング処理された培養皿にて接着培養してもよいし、工程（ｉｖ）で接着培養により得られた細胞をそのまま培地の交換により培養を続けてもよい。
【００６１】
工程（ｖ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へレチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９を添加して調製することができる。基礎培地としては、上述したような基礎培地を使用することができ、血清が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、血清代替物、脂質、アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などを含有してもよい。
【００６２】
工程（ｖ）において使用されるレチノイン酸またはその誘導体およびＦＧＦ９はそれぞれ工程（ｉ）および腎前駆細胞誘導工程で説明したとおりであり、その好ましい濃度範囲も同様である。
【００６３】
工程（ｖ）において使用される培地は、さらに、ＢＭＰ阻害剤を含んでもよい。
ＢＭＰ阻害剤としては、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN193189（すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が例示される。
ＢＭＰ阻害剤としてより好ましくはＮＯＧＧＩＮであり、その濃度は、例えば、１〜１００ｎｇ／ｍｌとすることができる。
【００６４】
工程（ｖ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ2含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ2濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。工程（ｖ）培養時間は後期後方中間中胚葉が分化誘導されるのに十分な期間であればよいが、例えば１〜３日の培養であり、好ましくは２日である。
【００６５】
工程（ｖ）で得られた中間中胚葉細胞を、腎前駆細胞誘導工程で説明したように、ＧＳＫ−３β阻害剤およびＦＧＦ９を含む培地で培養することにより腎前駆細胞を誘導することができる。
【００６６】
本発明はまた、上述した方法により得られた腎前駆細胞を用いて得られる腎臓オルガノイドを提供する。iPS細胞からの腎臓オルガノイドは例えば、Nature, 526, 564-568 (2015)で報告されている。本発明においては、例えば、上記方法で得られた腎前駆細胞を培養して細胞塊を作製し、それを、3T3-Wnt4細胞などのフィーダー細胞、マウス胎仔脊髄細胞、またはマウス胎仔腎細胞と共培養すること、またはCHIR99021などのＧＳＫ−３β阻害剤を含む基礎培地を使用した半気相培養（参考文献Nature, 526, 564-568 (2015)）によって得ることができる。培地は、ＧＳＫ−３β阻害剤に加えて、ＦＧＦ９やＦＧＦ２を含むことができる。
【００６７】
本発明は、上述した方法により得られた腎前駆細胞またはそれを用いて得られる腎臓オルガノイドを含む医薬組成物、該腎前駆細胞またはそれを用いて得られる腎臓オルガノイドを含む腎疾患治療剤、該腎前駆細胞またはそれを用いて得られる腎臓オルガノイドの治療有効量を投与する工程を包含する腎疾患を治療する方法をそれぞれ提供する。治療を必要とする患者への治療剤の投与方法としては、例えば、得られた腎前駆細胞をシート化して、患者の腎臓に貼付する方法、得られた腎前駆細胞を生理食塩水等に懸濁させた細胞懸濁液、あるいは三次元培養（例えば、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．Ｓｅｐ １１，２０１２；２３（３）：６３７−６５１）し、得られた細胞塊を患者の腎臓に直接移植する方法、マトリゲル等から構成されたスキャフォールド上で三次元培養し、得られた腎前駆細胞塊を移植する方法などが挙げられる。移植部位は、腎臓内であれば特に限定されないが、好ましくは、腎被膜下である。腎疾患としては、急性腎障害、慢性腎不全、慢性腎不全にまで至らない慢性腎臓病が例示される。
本発明において、腎疾患治療剤に含まれる腎前駆細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の態様には限定されない。【００６９】
＜１＞iPS細胞から腎前駆細胞への分化誘導
以下のプロトコールにてiPS細胞から腎前駆細胞を分化誘導した。なお、iPS細胞は201B7由来のOSR1-GFP/SIX2-tdTomatoレポーターヒトiPS細胞を使用した。【００７０】
１．未分化iPS細胞をaccutase処理にて単細胞化した後に10μMのY27632を添加したReproFF2培地（リプロセル）に懸濁し、Matrigel（BD Biosciences）でコーティングしたwellに1.0×104/well〜5.0×104/wellの密度で播種し24時間37℃でインキュベート。
２．24時間後（day1）にvitamin A free B27 supplement（Thermo Fisher Scientific Inc.）を添加したDMEM/F12 Glutamax（Thermo Fisher Scientific Inc.）を基礎培地とし、1μM CHIR99021, 10 nM Retinoic acid, 1 ng/ml BMP4, 100 ng/ml FGF2を添加した培地で培地交換。(後期後方エピブラストの作製・・・１)
３．Day2に同基礎培地に 3μMCHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2 を添加した培地に培地交換  (中胚葉系譜原始線条の作製・・・２)
４．Day3, Day4に同基礎培地に 3μMCHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2, 10μM A83-01 を添加した培地に培地交換(中胚葉系譜後期原始線条の作製・・・３)
５．Day5, Day6, Day7に同基礎培地に 3μMCHIR99021, 1 ng/ml BMP7, 100 ng/ml FGF2, 10 ng/ml ACTIVIN, 30μM Y27632を添加した培地に培地交換(後腎系譜後期原始線条の作製・・・４)
６．Day8, Day9に同基礎培地に100 ng/ml FGF9, 100 nM Retinoic acidを添加した培地に培地交換（後期後方中間中胚葉の作製・・・５）
７．Day10, Day11, Day12に同基礎培地に10 ng/ml FGF9, 1 μM CHIR99021を添加した培地に培地交換（腎前駆細胞の作製・・・６）【００７１】
各段階で分化誘導が進行していることは表１に記載のマーカーの発現により確認した。
陰性マーカーは発現していないことを確認した。図１に、各段階の細胞のマーカー染色結果を示す。後期後方中間中胚葉および腎前駆細胞については、８０％以上のマーカー陽性細胞を得ることができた。なお、上記５の工程における培地を、200 ng/ml FGF9, 100 nM Retinoic acid, 25 ng/ml NOGGINとした時も同様の結果が得られた。【００７２】
【表１】
2018216743.tif 000002
【００７３】
以上の結果から、iPS細胞から腎前駆細胞を分化誘導することができた。分化誘導効率は80%以上と顕著に高効率で腎前駆細胞を得ることができた。【００７４】
＜２＞マウス胎仔腎細胞との共培養による腎前駆細胞からの腎臓オルガノイドの作製
＜１＞で得られた腎前駆細胞を１．０×１０5の大きさの細胞塊とし、1 μM CHIR99021および10 ng/ml FGF9を添加した基礎培地で１日間培養した。そこに、Ｅ11.5のマウス胎仔脊髄と半気相培養で共培養した。その結果、図２に示すように、糸球体や尿細管が確認でき、腎臓オルガノイドの作製に成功した。【００７５】
＜３＞腎前駆細胞単独培養による腎臓オルガノイドの作製
＜１＞で得られた腎前駆細胞を１．０×１０5の大きさの細胞塊とし、1 μM CHIR99021および200 ng/ml FGF9を添加した基礎培地で１〜２日間培養した。その細胞塊を5 μM CHIR99021および200 ng/ml FGF2を添加した基礎培地で2日間半気相培養し、さらに、基礎培地のみで８日間半気相培養を行った。その結果、図３に示すように、糸球体や尿細管が確認でき、腎臓オルガノイドの作製に成功した。また、BRN1(+)CDH1(+)DBA(-)ヘンレのループを観察できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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