(57)【要約】  試料観察装置１は、第１の蛍光物質で染色された試料Ｓ及び第２の蛍光物質を含む溶液Ｗを保持する試料容器２と、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２を照射する照射部１１と、試料容器２を一方向に走査する走査部１２と、試料Ｓからの第１の蛍光Ｊ１及び溶液Ｗからの第２の蛍光Ｊ２を結像する結像部１７と、第１の蛍光Ｊ１に基づく第１の画像データＧ１及び第２の蛍光Ｊ２に基づく第２の画像データＧ２を出力する撮像部１３と、複数の第１の画像データＧ１に基づく第１の蛍光画像Ｆ１及び複数の第２の画像データＧ２に基づく第２の蛍光画像Ｆ２を生成する画像処理部３２と、第２の蛍光画像Ｆ２に基づいて試料Ｓの存在領域Ｎ４を特定し、第１の蛍光画像Ｆ１における解析領域Ｎ５を設定する解析部３３とを備える。
2019012771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光を用いて試料を観察する試料観察装置であって、
第１の蛍光物質によって染色された前記試料を第２の蛍光物質を含む溶液が注入されたウェル内に保持する試料容器と、
前記第１の蛍光物質を励起する第１の励起光、及び前記第２の蛍光物質を励起する第２の励起光を前記ウェルに向けて照射する照射部と、
前記試料容器を前記第１の励起光及び前記第２の励起光の光軸と交差する一方向に相対的に走査する走査部と、
前記第１の励起光によって前記試料で発生した第１の蛍光、及び前記第２の励起光によって前記溶液で発生した第２の蛍光をそれぞれ結像する結像部と、
前記結像部によって結像された前記第１の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、前記結像部によって結像された前記第２の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像部と、
前記一方向について得られた複数の前記第１の画像データに基づいて第１の蛍光画像を生成し、前記一方向について得られた複数の前記第２の画像データに基づいて第２の蛍光画像を生成する画像処理部と、
前記第２の蛍光画像に基づいて前記試料の存在領域を特定し、前記試料の存在領域に基づいて前記第１の蛍光画像における解析領域を設定し、前記解析領域における蛍光の強度を解析する解析部と、を備える試料観察装置。
【請求項２】
前記結像部は、前記第１の蛍光を透過する第１の蛍光フィルタと、前記第２の蛍光を透過する第２の蛍光フィルタとを結像光路上で切り替える切替部を有する請求項１記載の試料観察装置。
【請求項３】
前記結像部は、前記第１の蛍光と前記第２の蛍光とを分割する光分割素子を有し、
前記撮像部は、前記光分割素子によって分割された前記第１の蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の光検出器と、前記光分割素子によって分割された前記第２の蛍光の少なくとも一部を撮像する第２の光検出器とを有する請求項１記載の試料観察装置。
【請求項４】
前記結像部は、前記第１の蛍光と前記第２の蛍光とを分割する光分割素子を有し、
前記撮像部は、前記光分割素子によって分割された前記第１の蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の撮像領域、及び前記光分割素子によって分割された前記第２の蛍光の少なくとも一部を撮像する第２の撮像領域を有する光検出器を備える請求項１記載の試料観察装置。
【請求項５】
前記第１の励起光及び前記第２の励起光は、面状光である請求項１〜４のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項６】
前記結像部は、前記第１の励起光及び前記第２の励起光の照射面に対して傾斜する観察軸を有する請求項５記載の試料観察装置。
【請求項７】
前記解析部は、前記第２の蛍光画像を二値化することにより、前記試料の存在領域を抽出する請求項１〜６のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項８】
前記第１の励起光の波長及び前記第２の励起光の波長は、異なる波長である請求項１〜７記載のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項９】
前記第１の励起光の波長及び前記第２の励起光の波長は、同じ波長である請求項１〜７記載のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項１０】
前記第１の蛍光の波長及び前記第２の蛍光の波長は、異なる波長である請求項１〜９記載のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項１１】
前記第１の蛍光の波長及び前記第２の蛍光の波長は、同じ波長である請求項１〜９記載のいずれか一項記載の試料観察装置。
【請求項１２】
蛍光を用いて試料を観察する試料観察方法であって、
第１の蛍光物質によって染色された前記試料を第２の蛍光物質を含む溶液が注入された試料容器のウェル内に保持する準備ステップと、
前記第１の蛍光物質を励起する第１の励起光、及び前記第２の蛍光物質を励起する第２の励起光を前記ウェルに向けて照射する照射ステップと、
前記試料容器を前記第１の励起光及び前記第２の励起光の光軸と交差する一方向に相対的に走査する走査ステップと、
前記第１の励起光によって前記試料で発生した第１の蛍光、及び前記第２の励起光によって前記溶液で発生した第２の蛍光をそれぞれ結像する結像ステップと、
前記結像ステップによって結像された前記第１の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、前記結像ステップによって結像された前記第２の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像ステップと、
前記一方向について得られた複数の前記第１の画像データに基づいて第１の蛍光画像を生成し、前記一方向について得られた複数の前記第２の画像データに基づいて第２の蛍光画像を生成する画像処理ステップと、
前記第２の蛍光画像に基づいて前記試料の存在領域を特定し、前記試料の存在領域に基づいて前記第１の蛍光画像における解析領域を設定し、前記解析領域における蛍光の強度を解析する解析ステップと、を備える試料観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、試料観察装置及び試料観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞などの試料を観察する技術として例えば非特許文献１に記載の手法がある。この従来の手法では、細胞核を蛍光物質で染色し、蛍光物質を励起して得られた蛍光画像に基づいて細胞核の位置を特定している。そして、特定された細胞核の位置に基づいて試料の存在領域を推定し、解析領域を設定している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Perkin Elmer APPLICATION NOTE, “Image-based Quantification of Apoptosisusing the Operetta”
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述した従来の手法では、細胞核の位置に基づいて試料の存在領域を推定しているに過ぎず、解析領域を特定する精度が十分であるとは言い難い。蛍光強度に基づいて試料の分析を精度良く実施するためには、解析領域を十分な精度で特定できる技術が必要となる。【０００５】
本開示は、上記課題の解決のためになされたものであり、解析領域を十分な精度で特定できる試料観察装置及び試料観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一側面に係る試料観察装置は、蛍光を用いて試料を観察する試料観察装置であって、第１の蛍光物質によって染色された試料を第２の蛍光物質を含む溶液が注入されたウェル内に保持する試料容器と、第１の蛍光物質を励起する第１の励起光、及び第２の蛍光物質を励起する第２の励起光をウェルに向けて照射する照射部と、試料容器を第１の励起光及び第２の励起光の光軸と交差する一方向に相対的に走査する走査部と、第１の励起光によって試料で発生した第１の蛍光、及び第２の励起光によって溶液で発生した第２の蛍光をそれぞれ結像する結像部と、結像部によって結像された第１の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、結像部によって結像された第２の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像部と、一方向について得られた複数の第１の画像データに基づいて第１の蛍光画像を生成し、一方向について得られた複数の第２の画像データに基づいて第２の蛍光画像を生成する画像処理部と、第２の蛍光画像に基づいて試料の存在領域を特定し、試料の存在領域に基づいて第１の蛍光画像における解析領域を設定し、解析領域における蛍光の強度を解析する解析部と、を備える。【０００７】
この試料観察装置では、試料を染色する第１の蛍光物質からの第１の蛍光に基づいて第１の蛍光画像を生成し、溶液に含まれる第２の蛍光物質からの第２の蛍光に基づいて第２の蛍光画像を生成する。この第２の蛍光画像により、試料の存在領域を把握できる。したがって、第２の蛍光画像に基づいて試料の存在領域を特定し、当該存在領域に基づいて第１の蛍光画像における解析領域を設定することで、第１の蛍光画像における解析領域の蛍光強度に基づいて、試料の分析を精度良く実施することができる。【０００８】
また、結像部は、第１の蛍光を透過する第１の蛍光フィルタと、第２の蛍光を透過する第２の蛍光フィルタとを結像光路上で切り替える切替部を有していてもよい。この場合、第１の蛍光と第２の蛍光との分割を簡単な構成で実現できる。【０００９】
また、結像部は、第１の蛍光と第２の蛍光とを分割する光分割素子を有し、撮像部は、光分割素子によって分割された第１の蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の光検出器と、光分割素子によって分割された第２の蛍光の少なくとも一部を撮像する第２の光検出器とを有していてもよい。この場合、第１の蛍光と第２の蛍光との分割を簡単な構成で実現できる。【００１０】
また、結像部は、第１の蛍光と第２の蛍光とを分割する光分割素子を有し、撮像部は、光分割素子によって分割された第１の蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の撮像領域、及び光分割素子によって分割された第２の蛍光の少なくとも一部を撮像する第２の撮像領域を有する光検出器を備えていてもよい。この場合、第１の蛍光と第２の蛍光との分割を簡単な構成で実現できる。【００１１】
また、第１の励起光及び第２の励起光は、面状光であってもよい。この場合、撮像部において、第１の画像データ及び第２の画像データを２次元データとして取得することが可能となる。【００１２】
また、結像部は、第１の励起光及び第２の励起光の照射面に対して傾斜する観察軸を有していてもよい。この場合、視野選択動作が不要となり、試料の走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、第１の蛍光画像及び第２の蛍光画像を得るまでのスループットの向上が図られる。【００１３】
また、解析部は、第２の蛍光画像を二値化することにより、試料の存在領域を抽出してもよい。この場合、二値化によって試料の存在領域を精度良く抽出することができる。【００１４】
また、第１の励起光の波長及び第２の励起光の波長は、異なる波長であってもよく、同じ波長であってもよい。第１の励起光の波長及び第２の励起光の波長が異なる場合には、異なる蛍光物質の励起が容易となる。第１の励起光の波長及び第２の励起光の波長が同じ場合でも、第１の蛍光の波長及び第２の蛍光の波長が異なる場合には、第１の蛍光画像及び第２の蛍光画像の取得が可能である。【００１５】
また、第１の蛍光の波長及び第２の蛍光の波長は、異なる波長であってもよく、同じ波長であってもよい。第１の蛍光の波長及び第２の蛍光の波長が異なる場合には、第２の蛍光画像による試料の存在領域の把握が容易となる。第１の蛍光の波長及び第２の蛍光の波長が同じ場合でも、第１の蛍光物質の励起波長及び第２の蛍光物質の励起波長が異なる場合には、第１の励起光による励起と第２の励起光による励起とを別々のタイミングで行うことにより、第１の蛍光画像及び第２の蛍光画像の取得が可能である。【００１６】
また、本開示の一側面に係る試料観察方法は、蛍光を用いて試料を観察する試料観察方法であって、第１の蛍光物質によって染色された試料を第２の蛍光物質を含む溶液が注入された試料容器のウェル内に保持する準備ステップと、第１の蛍光物質を励起する第１の励起光、及び第２の蛍光物質を励起する第２の励起光をウェルに向けて照射する照射ステップと、試料容器を第１の励起光及び第２の励起光の光軸と交差する一方向に相対的に走査する走査ステップと、第１の励起光によって試料で発生した第１の蛍光、及び第２の励起光によって溶液で発生した第２の蛍光をそれぞれ結像する結像ステップと、結像ステップによって結像された第１の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第１の画像データを出力し、結像ステップによって結像された第２の蛍光の光像の少なくとも一部を撮像して第２の画像データを出力する撮像ステップと、一方向について得られた複数の第１の画像データに基づいて第１の蛍光画像を生成し、一方向について得られた複数の第２の画像データに基づいて第２の蛍光画像を生成する画像処理ステップと、第２の蛍光画像に基づいて試料の存在領域を特定し、存在領域に基づいて第１の蛍光画像における解析領域を設定し、解析領域における蛍光の強度を解析する解析ステップと、を備える。【００１７】
この試料観察方法では、試料を染色する第１の蛍光物質からの第１の蛍光に基づいて第１の蛍光画像を生成し、溶液に含まれる第２の蛍光物質からの第２の蛍光に基づいて第２の蛍光画像を生成する。この第２の蛍光画像により、試料の存在領域を把握できる。したがって、第２の蛍光画像に基づいて試料の存在領域を特定し、当該存在領域に基づいて第１の蛍光画像における解析領域を設定することで、第１の蛍光画像における解析領域の蛍光強度に基づいて、試料の分析を精度良く実施することができる。【００１８】
また、第１の蛍光を透過する第１の蛍光フィルタと、第２の蛍光を透過する第２の蛍光フィルタとを結像光路上で切り替える切替ステップをさらに有していてもよい。この場合、第１の蛍光と第２の蛍光との分割を簡単な構成で実現できる。【００１９】
また、光分割素子によって、第１の蛍光と第２の蛍光を分割する光分割ステップをさらに有し、撮像ステップは、光分割素子によって分割された第１の蛍光の少なくとも一部を撮像する第１の撮像ステップと、光分割素子によって分割された第２の蛍光の少なくとも一部を撮像する第２の撮像ステップとを有していてもよい。この場合、第１の蛍光と第２の蛍光との分割を簡単な構成で実現できる。【００２０】
また、光分割素子によって、第１の蛍光と第２の蛍光とを分割する光分割ステップをさらに有し、撮像ステップでは、第１の撮像領域及び第２の撮像領域を含む受光面を有する光検出器によって、光分割素子によって分割された第１の蛍光の少なくとも一部を第１の撮像領域で撮像し、光分割素子によって分割された第２の蛍光の少なくとも一部を第２の撮像領域で撮像してもよい。この場合、第１の蛍光と第２の蛍光との分割を簡単な構成で実現できる。【００２１】
また、結像ステップでは、照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像部を用い、面状光の照射によって発生した第１の蛍光及び第２の蛍光をそれぞれ結像していてもよい。この場合、視野選択動作が不要となり、試料の走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、蛍光画像及び散乱光画像を得るまでのスループットの向上が図られる。【００２２】
また、解析ステップでは、第２の蛍光画像を二値化することにより、試料の存在領域を抽出してもよい。この場合、二値化によって試料の存在領域を精度良く抽出することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本開示によれば、解析領域を十分な精度で特定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】試料観察装置の一実施形態を示すブロック図である。
【図２】図１に示した試料観察装置における照射部、試料容器、及び結像部の構成例を示す概略図である。
【図３】撮像部の構成例を示す図である。
【図４】試料観察装置を構成するコンピュータの機能的な構成要素の一例を示すブロック図である。
【図５】（ａ）は第１の画像データの一例を示す図であり、（ｂ）は第２の画像データの一例を示す図である。
【図６】（ａ）は第１の蛍光画像の一例を示す図であり、（ｂ）は第２の蛍光画像の一例を示す図である。
【図７】（ａ）は、第２の蛍光画像における試料の存在領域の抽出の様子を示す図であり、（ｂ）は、第１の蛍光画像における解析領域の設定の様子を示す図である。
【図８】図１に示した試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。
【図９】結像部の変形例を示す概略図である。
【図１０】結像部の更なる変形例を示す概略図である。
【図１１】第１の蛍光画像における解析領域の設定の様子の変形例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図面を参照しながら、本開示の一側面に係る試料観察装置及び試料観察方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００２６】
図１は、試料観察装置の一実施形態を示すブロック図である。この試料観察装置１は、試料Ｓ等からの蛍光を結像面に結像させて試料Ｓの観察画像データを取得し、当該観察画像データに基づいて試料Ｓの解析及び評価を行う装置である。
【００２７】
この種の試料観察装置としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。観察対象となる試料Ｓとしては、例えばヒト或いは動物の細胞、組織などが挙げられる。試料Ｓは、第１の励起光Ｌ１（図２参照）によって励起される第１の蛍光物質によって染色されている。第１の蛍光物質としては、例えばテトラメチルローダミン（励起波長：５５５ｎｍ／蛍光波長：５８０ｎｍ）が挙げられる。なお、試料Ｓは、複数の蛍光物質によって染色されてもよい。
【００２８】
試料Ｓは、図２に示すように、試料容器２内に配置されている。本実施形態では、試料容器２は、マイクロプレートである。試料容器２は、試料Ｓが配置される複数のウェル３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部４と、本体部４の一面側においてウェル３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材５とを有している。
【００２９】
ウェル３への試料Ｓの配置にあたっては、ウェル３内に第２の蛍光物質を含む溶液Ｗが注入される。第２の蛍光物質は、試料Ｓの染色に用いられる第１の蛍光物質を励起する第１の励起光Ｌ１とは異なる波長の第２の励起光Ｌ２によって励起される蛍光物質である。第２の蛍光物質としては、例えばフルオレセインーデキストラン（励起波長：４９４ｎｍ／蛍光波長：５２１ｎｍ）が挙げられる。なお、溶液Ｗには、複数の蛍光物質が含まれていてもよい。
【００３０】
透明部材５は、ウェル３内に配置された試料Ｓに対する第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の入力面５ａを有している。透明部材５の材質は、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の波長に対して透過率が高い（例えば透過率が７０％以上）部材であれば特に限定はされないが、例えばガラス、石英、或いは合成樹脂である。なお、ウェル３の他端側は、外部に開放された状態となっている。
【００３１】
試料観察装置１は、図１に示すように、照射部１１と、走査部１２と、撮像部１３と、コンピュータ１４とを備えて構成されている。照射部１１は、面状光である第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２を試料Ｓが配置されたウェル３に照射する。照射部１１は、図２に示すように、光源１５と、面状光形成部１６とによって構成されている。光源１５は、例えばレーザ光源であり、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の出力を切り替えが可能な波長選択レーザ光源である。光源１５から出力された第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２は、面状光形成部１６に同軸で導光される。照射部１１は、第１の励起光Ｌ１を出力する光源と、第２の励起光Ｌ２を出力する光源とを別個に備えていてもよい。この場合、第２の励起光Ｌ２を光学系によって第１の励起光Ｌ１と同軸で面状光形成部１６に導光する構成としてもよい。なお、光源１５は、レーザ光源に限らず、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、或いはランプ光源などであってもよい。
【００３２】
面状光形成部１６は、光源１５から出力された第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２を面状光に整形し、光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する。本実施形態では、面状光形成部１６の光軸が第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の光軸Ｐ１となっている。面状光形成部１６は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源１５に対して光学的に結合されている。面状光形成部１６は、対物レンズ、光シャッタなどを含んで構成されていてもよい。
【００３３】
照射部１１によって形成された第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２は、ウェル３内の試料Ｓ及び溶液Ｗに照射される。第１の励起光Ｌ１が照射された試料Ｓでは、試料Ｓを染色する第１の蛍光物質の励起によって第１の蛍光Ｊ１が発生する。また、第２の励起光Ｌ２が照射された溶液Ｗでは、溶液Ｗ中の第２の蛍光物質の励起によって第２の蛍光Ｊ２が発生する。試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、Ｚ方向解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光の厚さは分解能に影響しない。この場合には、厚さ２ｍｍを超える面状光を用いてもよい。
【００３４】
走査部（スキャナ）１２は、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを相対的に走査する機構である。走査部１２は、例えば試料Ｓを保持する試料容器２を移動させる移動ステージを含んで構成されている。移動ステージは、コンピュータ１４からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器２を走査する。本実施形態では、移動ステージは、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内の一方向に試料容器２を走査する。
【００３５】
以下の説明では、図２に示すように、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の光軸Ｐ１方向をＺ軸、移動ステージによる試料容器２の走査方向をＹ軸、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する方向をＸ軸と称する。試料Ｓに対する第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面となる。
【００３６】
本実施形態では、図２に示すように、第１の励起光Ｌ１によって試料Ｓで発生した第１の蛍光Ｊ１、及び第２の励起光Ｌ２によって溶液Ｗで発生した第２の蛍光Ｊ２をそれぞれ結像する結像部１７が設けられている。結像部１７は、例えばコリメータレンズ１８と、結像レンズ１９と、第１の蛍光フィルタ２０Ａと、第２の蛍光フィルタ２０Ｂと、切替部Ｙとによって構成されている。
【００３７】
コリメータレンズ１８は、照射面Ｒで生じた第１の蛍光Ｊ１或いは第２の蛍光Ｊ２を平行光化するレンズである。また、結像レンズ１９は、コリメータレンズ１８によって平行光化された第１の蛍光Ｊ１或いは第２の蛍光Ｊ２を結像するレンズである。第１の蛍光フィルタ２０Ａは、第１の蛍光Ｊ１を透過し、それ以外の波長の光をカットする光フィルタである。第２の蛍光フィルタ２０Ｂは、第２の蛍光Ｊ２を透過し、それ以外の波長の光をカットする光フィルタである。
【００３８】
切替部Ｙは、例えば第１の蛍光フィルタ２０Ａ及び第２の蛍光フィルタ２０Ｂが載置される切替ステージを有している。切替ステージは、コリメータレンズ１８と結像レンズ１９との間の結像光路上に配置されている。切替部Ｙは、コンピュータ１４からの制御信号に従って、光源１５の駆動に同期して結像部１７の光軸と交差する方向に切替ステージを駆動し、第１の蛍光Ｊ１を透過する第１の蛍光フィルタ２０Ａと、第２の蛍光Ｊ２を透過する第２の蛍光フィルタ２０Ｂとを結像光路上で切り替える。照射部１１から第１の励起光Ｌ１が出力されているときには、第１の蛍光フィルタ２０Ａが結像光路上に進出し、第１の蛍光Ｊ１のみが結像部１７によって結像する。一方、照射部１１から第２の励起光Ｌ２が出力されているときには、第２の蛍光フィルタ２０Ｂが結像光路上に進出し、第２の蛍光Ｊ２のみが結像部１７によって結像する。なお、切替部Ｙは、第１の蛍光フィルタ２０Ａ及び第２の蛍光フィルタ２０Ｂが載置されるフィルタホイールを有してもよい。
【００３９】
結像部１７の光軸は、第１の蛍光Ｊ１及び第２の蛍光Ｊ２の観察軸Ｐ２となっている。この観察軸Ｐ２は、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜角度θをもって傾斜している。傾斜角度θは、試料Ｓに向かう第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の光軸Ｐ１と観察軸Ｐ２とがなす角とも一致する。傾斜角度θは、例えば１０°〜８０°となっている。観察画像の解像度を向上させる観点から、傾斜角度θは、２０°〜７０°であることが好ましい。また、観察画像の解像度の向上及び視野の安定性の観点から、傾斜角度θは、３０°〜６５°であることが更に好ましい。
【００４０】
撮像部１３は、結像部１７によって結像された第１の蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部及び第２の蛍光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像する。撮像部１３を構成する光検出器としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像部１７による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像データを生成する。
【００４１】
撮像部１３は、第１の蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部に基づく第１の画像データ、及び第２の蛍光Ｊ２の光像の少なくとも一部に基づく第２の画像データをコンピュータ１４にそれぞれ出力する。上述したように、試料観察装置１では、照射面Ｒに対して試料容器２がＹ軸方向（一方向）に走査されると共に、照射面Ｒからの第１の蛍光Ｊ１の光像及び第２の蛍光Ｊ２の光像が撮像部１３によって撮像される。すなわち、撮像部１３では、Ｙ軸方向について複数の第１の画像データ（ＸＺ画像）及び複数の第２の画像データ（ＸＺ画像）が生成される。
【００４２】
撮像部１３では、光検出器にラインスキャン方式を適用し、照射面Ｒからの第１の蛍光Ｊ１及び第２の蛍光Ｊ２を部分的に撮像してもよい。例えば図３（ａ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の撮像面においてサブアレイを設定してもよい。この場合、サブアレイに含まれる画素列２１ａのみを読み出すことができるので、第１の蛍光Ｊ１或いは第２の蛍光Ｊ２による光像を部分的に撮像できる。また、図３（ｂ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の全ての画素列を読み出しエリアとし、その後の画像処理によって二次元画像の一部を抽出してもよい。
【００４３】
さらに、図３（ｃ）に示すように、エリアイメージセンサ２１に代えてラインセンサ２２などの光検出器を用い、撮像面自体を一の画素列に限定して部分的な撮像を行ってもよい。図３（ｄ）に示すように、第１の蛍光Ｊ１或いは第２の蛍光Ｊ２の一部のみを透過させるスリット２３をエリアイメージセンサ２１の前面に配置し、スリット２３に対応する画素列２１ａの画像データを取得してもよい。スリット２３を用いる場合、エリアイメージセンサに代えて光電子増倍管などのポイントセンサなどの光検出器を用いてもよい。
【００４４】
コンピュータ１４は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ１４としては、例えばパーソナルコンピュータ、マイクロコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータ１４は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源１５、走査部１２、切替部Ｙ、及び撮像部１３の動作を制御するコントローラとして機能する。
【００４５】
コントローラとしてのコンピュータ１４は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源１５、走査部１２、及び撮像部１３を同期させて駆動する。これにより、第１の励起光Ｌ１の照射面Ｒに対して試料容器２がＹ方向に走査され、照射面Ｒにおける第１の蛍光Ｊ１の複数のＸＺ画像が撮像部１３によって撮像される。また、第２の励起光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料容器２がＹ方向に走査され、照射面Ｒにおける第２の蛍光Ｊ２の複数のＸＺ画像が撮像部１３によって撮像される。
【００４６】
コンピュータ１４は、走査部１２による試料容器２の移動中に、光源１５が第１の励起光Ｌ１或いは第２の励起光Ｌ２を連続的に出力するように光源１５を制御してもよく、撮像部１３による撮像に合わせて光源１５による第１の励起光Ｌ１或いは第２の励起光Ｌ２の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射部１１が光シャッタを備えている場合、コンピュータ１４は、当該光シャッタの制御によって第１の励起光Ｌ１或いは第２の励起光Ｌ２の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。
【００４７】
また、コンピュータ１４は、機能的な構成要素として、図４に示すように、撮像結果受信部３１と、画像処理部３２と、解析部３３とを備えている。撮像結果受信部３１は、撮像部１３から撮像データを受信する部分である。すなわち、撮像結果受信部３１は、撮像部１３から第１の蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部に基づく第１の画像データ、及び第２の蛍光Ｊ２の光像の少なくとも一部に基づく第２の画像データを受信し、画像処理部３２に出力する。
【００４８】
図５（ａ）は、第１の画像データの一例を示す図である。第１の画像データＧ１は、試料Ｓで生じた第１の蛍光Ｊ１のＸＺ像に対応する。第１の蛍光Ｊ１は、試料Ｓを染色する第１の蛍光物質が第１の励起光Ｌ１によって励起されて生じる。したがって、第１の画像データＧ１には、試料Ｓに対応する蛍光像Ｍ１が出現し得る。ウェル３内の溶液Ｗ中に含まれる第２の蛍光物質は、第１の励起光Ｌ１によって励起されず、第１の蛍光Ｊ１を除く光は、結像部１７において第１の蛍光フィルタ２０Ａでカットされる。このため、第１の画像データＧ１では、溶液Ｗに対応する領域の蛍光像は出現しない。
【００４９】
図５（ｂ）は、第２の画像データの一例を示す図である。第２の画像データＧ２は、溶液Ｗで生じた第２の蛍光Ｊ２のＸＺ画像に対応する。第２の蛍光Ｊ２は、溶液Ｗ中に含まれる第２の蛍光物質が第２の励起光Ｌ２によって励起されて生じる。したがって、第２の画像データＧ２には、溶液Ｗに対応する蛍光像Ｍ２が出現し得る。試料Ｓを染色する第１の蛍光物質は、第２の励起光Ｌ２によって励起されず、第２の蛍光Ｊ２を除く光は、結像部１７において第２の蛍光フィルタ２０Ｂでカットされる。このため、第２の画像データＧ２では、試料Ｓに対応する領域の蛍光像は出現しない。
【００５０】
画像処理部３２は、第１の蛍光画像及び第２の蛍光画像を生成する。画像処理部３２は、Ｙ軸方向について得られた複数の第１の画像データＧ１と、Ｙ軸方向について得られた複数の第２の画像データＧ２とを撮像結果受信部３１から受信する。画像処理部３２は、受信した複数の第１の画像データＧ１及び複数の第２の画像データＧ２をＺ方向に圧縮する。Ｚ軸方向に圧縮された画像データは、Ｘ軸方向についての蛍光輝度を示す。画像処理部３２は、第１の画像データＧ１及び第２の画像データＧ２のそれぞれについて、Ｚ軸方向に圧縮された複数の画像データをＹ軸方向に合成し、各画像データにおける蛍光輝度を積算することで、第１の蛍光画像及び第２の蛍光画像を生成する。画像処理部３２は、生成した第１の蛍光画像及び第２の蛍光画像を解析部３３に出力する。
【００５１】
図６（ａ）は、第１の蛍光画像の一例を示す図である。第１の蛍光画像Ｆ１は、Ｚ軸方向に圧縮された複数の第１の画像データＧ１をＹ軸方向に合成したものであり、第１の蛍光画像Ｆ１に出現する蛍光像Ｎ１は、試料Ｓに対応する蛍光のＸＹ像となる。また、図６（ｂ）は、第２の蛍光画像の一例を示す図である。第２の蛍光画像Ｆ２は、Ｚ軸方向に圧縮された複数の第２の画像データＧ２をＹ軸方向に合成したものであり、第２の蛍光画像Ｆ２に出現する蛍光像Ｎ２は、溶液Ｗに対応する蛍光のＸＹ像となる。
【００５２】
解析部３３は、第１の蛍光画像Ｆ１における解析領域Ｎ５の蛍光の強度を解析する。解析部３３は、画像処理部３２から第１の蛍光画像Ｆ１及び第２の蛍光画像Ｆ２を受信すると、まず、第２の蛍光画像Ｆ２を所定の閾値を用いて二値化する。二値化により、図７（ａ）に示すように、第２の蛍光画像Ｆ２において、溶液Ｗに対応する蛍光像Ｎ２と、当該蛍光像Ｎ２が存在しない領域Ｎ３との境界が鮮明となる。次に、解析部３３は、蛍光像Ｎ２が存在しない領域Ｎ３を試料Ｓの存在領域Ｎ４として抽出する。そして、解析部３３は、図７（ｂ）に示すように、抽出した試料Ｓの存在領域Ｎ４を解析領域Ｎ５として第１の蛍光画像Ｆ１に割り当てる。解析部３３は、解析領域Ｎ５の割り当てにより、解析領域Ｎ５における蛍光の強度を第１の蛍光画像Ｆ１に基づいて解析する。
【００５３】
次に、上述した試料観察装置１を用いた試料観察方法について説明する。図８は、図１に示した試料観察装置１を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。
【００５４】
この試料観察方法は、図８に示すように、準備ステップ（ステップＳ０１）と、照射ステップ（ステップＳ０２）と、走査ステップ（ステップＳ０３）と、結像ステップ（ステップＳ０４）、撮像ステップ（ステップＳ０５）と、画像処理ステップ（ステップＳ０６）と、解析ステップ（ステップＳ０７）とを備えて構成されている。
【００５５】
準備ステップでは、試料容器２への試料Ｓの保持を行う。ここでは、第１の蛍光物質によって試料Ｓを染色し、第２の蛍光物質を含む溶液Ｗを試料Ｓと共にウェル３に注入する。ウェル３への試料Ｓ及び溶液Ｗの保持の後、試料容器２を走査部１２にセットする。
【００５６】
照射ステップでは、試料容器２のウェル３に向けて第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２を照射する。ユーザによって測定開始の操作が試料観察装置１に入力されると、コンピュータ１４からの制御信号に基づいて光源１５が駆動し、第１の励起光Ｌ１或いは第２の励起光Ｌ２が照射される。第１の励起光Ｌ１或いは第２の励起光Ｌ２は、面状光形成部１６によって整形されて面状光となり、試料容器２に保持された試料Ｓ及び溶液Ｗに照射される。
【００５７】
走査ステップでは、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料容器２を走査する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ１４からの制御信号に基づいて、光源１５の駆動と同期して走査部１２が駆動する。これにより、試料容器２がＹ軸方向に一定の速度で直線的に駆動し、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の照射面Ｒに対してウェル３内の試料Ｓが走査される。
【００５８】
結像ステップでは、第１の励起光Ｌ１の照射によって試料Ｓで発生した第１の蛍光Ｊ１と、第２の励起光Ｌ２の照射によって溶液Ｗで発生した第２の蛍光Ｊ２とを結像する。結像ステップでは、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２により、第１の蛍光Ｊ１及び第２の蛍光Ｊ２を光検出器の受光面に対して結像する。
【００５９】
また、結像ステップでは、コンピュータ１４からの制御信号に従って、切替部Ｙを駆動し、結像光路上の第１の蛍光フィルタ２０Ａ及び第２の蛍光フィルタ２０Ｂの切り替えを行ってもよい（切替ステップ）。切替ステップにより、照射部１１から第１の励起光Ｌ１が出力されているときには、第１の蛍光フィルタ２０Ａが結像光路上に進出し、第１の蛍光Ｊ１のみが結像部１７によって結像する。一方、照射部１１から第２の励起光Ｌ２が出力されているときには、第２の蛍光フィルタ２０Ｂが結像光路上に進出し、第２の蛍光Ｊ２のみが結像部１７によって結像する。
【００６０】
撮像ステップでは、結像部１７によって結像された第１の蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部及び第２の蛍光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像する。撮像ステップでは、第１の蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部に基づく第１の画像データＧ１、及び第２の蛍光Ｊ２の光像の少なくとも一部に基づく第２の画像データＧ２をＹ軸方向についてそれぞれ複数生成し、コンピュータ１４にそれぞれ出力する。
【００６１】
画像処理ステップでは、第１の蛍光画像Ｆ１及び第２の蛍光画像Ｆ２を生成する。画像処理ステップでは、まず、撮像ステップで得られた複数の第１の画像データＧ１及び複数の第２の画像データＧ２をＺ方向に圧縮する。次に、第１の画像データＧ１及び第２の画像データＧ２のそれぞれについて、Ｚ軸方向に圧縮された複数の画像データをＹ軸方向に合成し、各画像データにおける蛍光輝度を積算する。これにより、試料Ｓに対応する蛍光のＸＹ像である第１の蛍光画像Ｆ１と、溶液Ｗに対応する蛍光のＸＹ像である第２の蛍光画像Ｆ２とが生成される。
【００６２】
解析ステップでは、第１の蛍光画像Ｆ１における解析領域Ｎ５の蛍光の強度を解析する。解析ステップでは、まず、第２の蛍光画像Ｆ２を所定の閾値を用いて二値化し、第２の蛍光画像Ｆ２において、溶液Ｗに対応する蛍光像Ｎ２と、当該蛍光像Ｎ２が存在しない領域Ｎ３との境界を鮮明化する。次に、解析ステップでは、蛍光像Ｎ２が存在しない領域Ｎ３を試料Ｓの存在領域Ｎ４として抽出した後、試料Ｓの存在領域Ｎ４を解析領域Ｎ５として設定し、設定した解析領域Ｎ５を第１の蛍光画像Ｆ１に割り当てる。そして、解析ステップでは、解析領域Ｎ５の割り当てにより、解析領域Ｎ５における蛍光の強度を第１の蛍光画像Ｆ１に基づいて解析する。
【００６３】
以上説明したように、試料観察装置１では、試料Ｓを染色する第１の蛍光物質からの第１の蛍光Ｊ１に基づいて第１の蛍光画像Ｆ１を生成し、溶液Ｗに含まれる第２の蛍光物質からの第２の蛍光Ｊ２に基づいて第２の蛍光画像Ｆ２を生成する。第２の蛍光画像Ｆ２では、第２の蛍光Ｊ２による蛍光像Ｎ２が表れていない領域が試料Ｓの存在領域である。したがって、第２の蛍光画像Ｆ２により、試料Ｓの存在領域Ｎ４を十分な精度で特定できる。従来では、溶液の発光はノイズとなるため、溶液に蛍光物質を含ませることは避けられていたが、本実施形態では、溶液Ｗに積極的に第２の蛍光物質を含ませることで、特定された試料Ｓの存在領域Ｎ４に基づいて解析領域Ｎ５を設定する。これにより、第１の蛍光画像Ｆ１における解析領域Ｎ５の蛍光強度に基づいて、試料Ｓの分析を精度良く実施することができる。
【００６４】
また、試料観察装置１では、結像部１７において、第１の蛍光Ｊ１を透過する第１の蛍光フィルタ２０Ａと、第２の蛍光Ｊ２を透過する第２の蛍光フィルタ２０Ｂとを結像光路上で切り替える切替部Ｙが設けられている。これにより、第１の蛍光Ｊ１と第２の蛍光Ｊ２との分割を簡単な構成で実現できる。
【００６５】
また、試料観察装置１では、第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２が面状光形成部１６によって面状光に整形される。これにより、撮像部１３において、第１の画像データＧ１及び第２の画像データＧ２を２次元データとして取得することが可能となる。さらに、試料観察装置１では、結像部１７が第１の励起光Ｌ１及び第２の励起光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有している。これにより、視野選択動作が不要となり、試料Ｓの走査と撮像とを同時進行することが可能となる。したがって、第１の蛍光画像Ｆ１及び第２の蛍光画像Ｆ２を得るまでのスループットの向上が図られる。
【００６６】
また、試料観察装置１では、解析部３３が第２の蛍光画像Ｆ２を二値化することにより、第２の蛍光画像Ｆ２における試料Ｓの存在領域Ｎ４を抽出している。このような処理によれば、二値化によって第２の蛍光画像Ｆ２における試料Ｓの存在領域Ｎ４を精度良く抽出することができる。したがって、試料Ｓの分析の精度を一層向上することが可能となる。
【００６７】
本開示は、上記実施形態に限られるものではない。例えば結像ステップでは、面状光の照射によって試料Ｓで発生した第１の蛍光Ｊ１及び第２の蛍光Ｊ２を光分割素子によって分割してもよい（光分割ステップ）。この場合、結像部１７は、図９に示すように、コリメータレンズ１８と、結像レンズ１９Ａ，１９Ｂと、ビームスプリッタ（光分割素子）４１と、ミラー４２と、第１の蛍光フィルタ２０Ａと、第２の蛍光フィルタ２０Ｂとによって構成されていてもよい。同図の例では、撮像部１３は、第１の光検出器４３Ａと、第２の光検出器４３Ｂとを備えている。ビームスプリッタ４１としては、例えばダイクロイックミラーを用いることができる。
【００６８】
ビームスプリッタ４１及び第１の蛍光フィルタ２０Ａは、コリメータレンズ１８と結像レンズ１９Ａとの間の結像光路上に配置されている。第１の蛍光Ｊ１は、コリメータレンズ１８によって平行光化され、ビームスプリッタ４１及び第１の蛍光フィルタ２０Ａを透過する。第１の蛍光フィルタ２０Ａを透過した第１の蛍光Ｊ１は、結像レンズ１９Ａによって第１の光検出器４３Ａの受光面に結像する。第１の光検出器４３Ａは、第１の蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部を撮像し、第１の画像データＧ１をコンピュータ１４に出力する。
【００６９】
第２の蛍光フィルタ２０Ｂ及びミラー４２は、コリメータレンズ１８と結像レンズ１９Ｂとの間の結像光路上に配置されている。第２の蛍光Ｊ２は、コリメータレンズ１８によって平行光化され、ビームスプリッタ４１で反射した後、第２の蛍光フィルタ２０Ｂを透過する。第２の蛍光フィルタ２０Ｂを透過した第２の蛍光Ｊ２は、ミラー４２で反射し、結像レンズ１９Ｂによって第２の光検出器４３Ｂの受光面に結像する。第２の光検出器４３Ｂは、第２の蛍光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像し、第２の画像データＧ２をコンピュータ１４に出力する。このような構成においても、第１の蛍光Ｊ１と第２の蛍光Ｊ２との分割を簡単な構成で実現できる。
【００７０】
また、結像部は、図１０に示すような光分割装置５１によって構成されていてもよい。この光分割装置５１は、筐体５２内に、コリメータレンズ５３と、結像レンズ５４と、ビームスプリッタ（光分割素子）５５と、ミラー５６と、第１の蛍光フィルタ２０Ａと、第２の蛍光フィルタ２０Ｂと、結像レンズ移動機構５７とを備えて構成されている。筐体５２における光の入射端には、視野絞り５８が設けられている。視野絞り５８は、観察軸Ｐ２に対して垂直な方向の幅が可変となっている。ビームスプリッタ５５としては、例えばダイクロイックミラーを用いることができる。
【００７１】
ビームスプリッタ５５及び第１の蛍光フィルタ２０Ａは、コリメータレンズ５３と結像レンズ５４との間の結像光路上に配置されている。視野絞り５８を通って筐体５２内に入射した第１の蛍光Ｊ１は、コリメータレンズ５３によって平行光化され、ビームスプリッタ５５及び第１の蛍光フィルタ２０Ａを透過して結像レンズ５４に導光される。また、第２の蛍光フィルタ２０Ｂ及びミラー５６は、コリメータレンズ５３と結像レンズ５４との間の結像光路上に配置されている。視野絞り５８を通って筐体５２内に入射した第２の蛍光Ｊ２は、コリメータレンズ５３によって平行光化され、ビームスプリッタ５５で反射した後、第２の蛍光フィルタ２０Ｂを透過する。第２の蛍光フィルタ２０Ｂを透過した第２の蛍光Ｊ２は、ミラー５６で反射して結像レンズ５４に導光される。
【００７２】
ここで、結像レンズ５４は、結像レンズ移動機構５７により、第１の蛍光Ｊ１の光軸に対して所定距離だけずれた状態となっている。また、撮像部１３における光検出器５９は、第１の撮像領域（図１０における光検出器５９の下半分領域）５９Ａ及び第２の撮像領域（図１０における光検出器５９の上半分領域）５９Ｂを含む受光面を有する。これにより、結像レンズ５４で結像した第１の蛍光Ｊ１は、撮像部１３における光検出器５９の第１の撮像領域５９Ａに結像するのに対し、結像レンズ５４で結像した第２の蛍光Ｊ２は、撮像部１３における光検出器５９の第２の撮像領域５９Ｂに結像する。光検出器５９は、第１の撮像領域５９Ａにおいて第１の蛍光Ｊ１の光像の少なくとも一部を撮像し、第２の撮像領域５９Ｂにおいて第２の蛍光Ｊ２の光像の少なくとも一部を撮像する。このような構成においても、第１の蛍光Ｊ１と第２の蛍光Ｊ２との分割を簡単な構成で実現できる。
【００７３】
また、例えば上記実施形態では、面状光を出力する照射部１１とラインスキャン方式を採用した撮像部１３とを組み合わせているが、試料容器２におけるウェル３の深さ方向の断面を一度に測定できるものであれば他の方式を採用してもよい。例えば米国特許第８５８２２０３号に記載のOblique Plane Microscopyの光学系を採用することも可能である。
【００７４】
また、第１の励起光Ｌ１の照射による第１の蛍光Ｊ１の撮像と第２の励起光Ｌ２の照射による第２の蛍光Ｊ２の撮像は、同時に行われてもよいし、異なるタイミングで行われてもよい。
【００７５】
第１の励起光Ｌ１の波長及び第２の励起光Ｌ２の波長は、異なる波長であってもよく、同じ波長であってもよい。第１の励起光Ｌ１の波長及び第２の励起光Ｌ２の波長が異なる場合には、異なる蛍光物質の励起が容易となる。第１の励起光Ｌ１の波長及び第２の励起光Ｌ２の波長が同じ場合でも、第１の蛍光Ｊ１の波長及び第２の蛍光Ｊ２の波長が異なる場合には、第１の蛍光画像Ｆ１及び第２の蛍光画像Ｆ２の取得が可能である。
【００７６】
また、第１の蛍光Ｊ１の波長及び第２の蛍光Ｊ２の波長は、異なる波長であってもよく、同じ波長であってもよい。第１の蛍光Ｊ１の波長及び第２の蛍光Ｊ２の波長が異なる場合には、第２の蛍光画像Ｆ２による試料の存在領域の把握が容易となる。第１の蛍光Ｊ１の波長及び第２の蛍光Ｊ２の波長が同じ場合でも、第１の蛍光物質の励起波長及び第２の蛍光物質の励起波長が異なる場合には、第１の励起光Ｌ１による励起と第２の励起光Ｌ２による励起とを別々のタイミングで行うことにより、第１の蛍光画像Ｆ１及び第２の蛍光画像Ｆ２の取得が可能である。
【００７７】
また、試料Ｓの存在領域Ｎ４と解析領域Ｎ５とは、必ずしも一致していなくてもよい。例えば図１１に示すように、第１の蛍光画像Ｆ１に出現する蛍光像Ｎ１の内側（試料Ｓの存在領域Ｎ４の内側）に部分的に解析領域Ｎ５が設定されていてもよい。試料Ｓの存在領域Ｎ４の内側の一部に蛍光像Ｎ１が存在する場合、当該蛍光像Ｎ１の全体を解析領域Ｎ５として設定してもよい。試料Ｓの存在領域Ｎ４の内側に複数の蛍光像Ｎ１が存在する場合、当該複数の蛍光像Ｎ１のそれぞれの全体を解析領域Ｎ５として設定してもよい。試料Ｓの存在領域Ｎ４の内側に第１の蛍光画像Ｆ１に出現する蛍光像Ｎ１が存在しない場合は、解析領域Ｎ５を設定しなくてもよい。
【符号の説明】
【００７８】
１…試料観察装置、２…試料容器、３…ウェル、１１…照射部、１２…走査部、１３…撮像部、１７…結像部、２０Ａ…第１の蛍光フィルタ、２０Ｂ…第２の蛍光フィルタ、３２…画像処理部、３３…解析部、４１…ビームスプリッタ（光分割素子）、４３Ａ…第１の光検出器、４３Ｂ…第２の光検出器、５１…光分割装置（結像部）、５５…ビームスプリッタ（光分割素子）、５９…光検出器、５９Ａ…第１の撮像領域、５９Ｂ…第２の撮像領域、Ｌ１…第１の励起光、Ｌ２…第２の励起光、Ｊ１…第１の蛍光、Ｊ２…第２の蛍光、Ｇ１…第１の画像データ、Ｇ２…第２の画像データ、Ｆ１…第１の蛍光画像、Ｆ２…第２の蛍光画像、Ｎ４…試料の存在領域、Ｎ５…解析領域、Ｓ…試料、Ｒ…照射面、Ｐ２…観察軸、Ｗ…溶液、Ｙ…切替部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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