(57)【要約】【課題】より抗腫瘍効果の高い薬剤の組み合わせを提供する。【解決手段】免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物。
【請求項２】
前記免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与される、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
前記ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、
前記ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、
前記両親媒性物質が、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
膜破壊機能促進効果を発現する、請求項４に記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
前記自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
【請求項８】
ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キット。
【請求項９】
前記アジュバント組成物を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与する、請求項８に記載の薬剤キット。
【請求項１０】
癌治療または予防のための薬剤キットである、請求項８または９に記載の薬剤キット。
【請求項１１】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項１２】
前記ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、
前記ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、
前記両親媒性物質が、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の薬剤キット。
【請求項１３】
前記アジュバント組成物が、膜破壊機能促進効果を発現する、請求項１２に記載の薬剤キット。
【請求項１４】
前記自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の薬剤キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫系を疾患の治療に応用する、免疫療法が注目を集めている。特に、がんを対象とした、がん免疫療法は大きな期待を集めており、より効果の高いがん免疫療法の実現が求められている。【０００３】
免疫系の機能は、一般に、液性免疫および細胞性免疫という２種の機構を介して発現する。細胞性免疫は、がん細胞の殺傷・排除を行う能力を有しているため、がん免疫療法において重要な働きとなることが判明している。細胞性免疫を構成する細胞の中でも、細胞傷害性Ｔ細胞（以下、単にＣＴＬとも称する）は、がん細胞を殺傷する主な働きを担っている。そのため、多量のＣＴＬの誘導は、効果の高いがん免疫療法に必要な要因となっている。【０００４】
ＣＴＬの誘導は、通常、以下のように発現する。すなわち、ウイルス感染細胞やがん細胞で産生されるタンパク質等の内因性抗原が、ユビキチン化された後、プロテアソームによってペプチドにまで分解される。分解されたペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子と結合し、得られた複合体が抗原提示細胞の表面でＣＤ８陽性Ｔ細胞に提示されて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化される。そして、活性化されたＣＤ８陽性Ｔ細胞が、ＣＴＬへと分化する。【０００５】
しかしながら、ＭＨＣクラスＩ分子での抗原提示は、内因性抗原に対して発生するプロセスであるため、細胞の外にある外因性抗原に対しては、発生しない。なお、外因性抗原は、エンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、エンドソーム内でタンパク分解酵素により消化されて、ペプチド断片に分解される。当該ペプチド断片は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示され、抗体の産生に利用される。そのため、外因性抗原を用いてＣＴＬを誘導することは困難であることがよく知られている。【０００６】
そこで近年では、外因性抗原を用いて積極的にＣＴＬを誘導させるクロスプレゼンテーションの検討が多くなされている。【０００７】
外因性抗原は、上述のように、抗原提示細胞内のエンドソーム内で分解されて、ＭＨＣクラスＩ分子の抗原提示には利用されない。クロスプレゼンテーションでは、外因性抗原を細胞内のサイトゾルへ送達し、外因性抗原を内因性抗原のように作用させることで、外因性抗原をＭＨＣクラスＩ分子と結合させて抗原提示を行う。これにより、外因性抗原であってもＣＴＬを誘導させることができる。【０００８】
また、自然免疫を活性化する刺激を有する物質（以下、単に自然免疫を活性化する物質とも称する）は、抗原提示細胞に対して成熟化を誘起し、共刺激分子やＭＨＣクラスＩ分子の産生を増強させる。これにより、抗原提示細胞をＣＴＬの誘導が可能な状態へと誘起することができる。そのため、外因性抗原をサイトゾルへ送達する技術と、自然免疫を活性化する物質とを合わせ、多量のＣＴＬを誘導することが期待される。【０００９】
例えば、国際公開第２０１５／０７９９５２号において、膜破壊機能促進効果を通じて抗原をサイトゾルへ送達することができるｐＨ感受性担体と、自然免疫を刺激する物質とを合わせた、アジュバント組成物が、ＣＴＬへの誘導を多量に発生させることが開示されている。【００１０】
さらに、ＣＴＬは、ターゲットとなる細胞を殺傷する働きを担っているため、多量のＣＴＬの誘導が効果の高いがん免疫療法につながることが報告されている（例えば、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３  １９（８）２２２４−３１）。【００１１】
一方、異なる免疫システムを利用することで、薬剤の組み合わせによる抗腫瘍効果の増大を期待して、２つの薬剤を組み合わせるがん免疫療法についても検討がなされている。例えば、Ｍａｎｇｓｂｏ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１０；３３（３）：２２５−３５では、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストである、ＣｐＧモチーフを含む短鎖ＤＮＡおよび免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１抗体を組み合わせて投与することで、担癌マウスの生存期間が延びることが示されている。
【発明の概要】
【００１２】
免疫療法において作用機序の異なる薬剤の併用は、有用であると考えられる。しかしながら、作用機序の異なる薬剤を併用したとしても必ずしも抗腫瘍効果の増強が得られるとは限らず、より抗腫瘍効果の高い薬剤の組み合わせが求められている。
【００１３】
このため、本発明は、より抗腫瘍効果の高い薬剤の組み合わせを提供することを目的とする。
【００１４】
本発明者は、ＣＴＬを誘導する薬剤として、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する物質を加えたアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤との組み合わせにより、特に高い抗腫瘍効果を得られることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
本発明の好適な形態は以下のとおりである。
【００１６】
（１）免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物。
【００１７】
（２）免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与される、（１）に記載のアジュバント組成物。
【００１８】
（３）免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、（１）または（２）に記載のアジュバント組成物。
【００１９】
（４）ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、両親媒性物質が、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、（１）〜（３）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【００２０】
なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。アシル基が２以上存在する場合には、合計数ではなく、１のアシル基の炭素数を指す。
【００２１】
（５）膜破壊機能促進効果を発現する、（４）に記載のアジュバント組成物。
【００２２】
（６）自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、（１）〜（５）のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【００２３】
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載のアジュバント組成物および抗原を含む、ワクチン組成物。
【００２４】
（８）ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キット。
【００２５】
（９）アジュバント組成物を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与する、（８）に記載の薬剤キット。
【００２６】
（１０）癌治療または予防のための薬剤キットである、（８）または（９）に記載の薬剤キット。
【００２７】
（１１）免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される少なくとも１種である、（８）〜（１０）のいずれかに記載の薬剤キット。
【００２８】
（１２）ｐＨ感受性担体が、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、両親媒性物質が、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である、（８）〜（１１）のいずれかに記載の薬剤キット。
【００２９】
（１３）アジュバント組成物が、膜破壊機能促進効果を発現する、（１２）に記載の薬剤キット。
【００３０】
（１４）自然免疫を活性化する物質がＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドである、請求項（８）〜（１３）のいずれかに記載の薬剤キット。
【００３１】
（１５）治療または予防を必要とする対象者に、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含むワクチン組成物の有効量を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤の有効量を投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
【００３２】
（１６）疾患が癌である、（１５）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、アジュバント組成物およびこれを含むワクチン組成物の模式図である。
【図２】図２は、ワクチン組成物によって、ＣＴＬの誘導が増大する、想定されるメカニズムを示す模式図である。
【図３】図３は、ＥＬＩｓｐｏｔ法によるＣＴＬの誘導評価を示す図である。（Ａ）はオボアルブミン（以下、単にＯＶＡとも称する）およびＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを投与した群であり、（Ｂ）はＯＶＡ、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドおよびｐＨ感受性担体を投与した群であり、（Ｃ）はＯＶＡとｐＨ感受性担体を投与した群の結果である。
【図４】図４は、マウス担癌実験系における抗腫瘍効果の評価を示す。（Ａ）はアジュバント組成物の抗腫瘍効果、およびアジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤との併用効果を調べた結果であり、（Ｂ）は併用効果の詳細を検証した結果である。
【図５】図５は、がん細胞接種２１日後における各群マウスの腫瘍の様子を示す。（Ａ）は３群のマウスであり、（Ｂ）は６群のマウスであり、（Ｃ）は７群のマウスである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００３５】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０℃以上２５℃以下）／相対湿度４０％ＲＨ以上５０％ＲＨ以下の条件で行う。
【００３６】
以下、図面を参照しながら、アジュバント組成物およびワクチン組成物について説明するが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載に基づいて定められるべきであり、以下の形態のみに制限されない。なお、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
【００３７】
図１によれば、アジュバント組成物４は、両親媒性物質１と、ｐＨ感受性化合物２と、自然免疫を活性化する物質３と、を含む。また、図１において、ｐＨ感受性担体７は、両親媒性物質１およびｐＨ感受性化合物２から構成される。
【００３８】
図１に示すように、一実施形態によれば、自然免疫を活性化する物質３は、両親媒性物質１の構成する疎水性部分に、ｐＨ感受性化合物２とともに会合する。この場合、アジュバント組成物４は、アジュバント複合体ともいうことができる。また、別の一実施形態によれば、自然免疫を活性化する物質３は、両親媒性物質１およびｐＨ感受性化合物２を含むｐＨ感受性担体と独立して存在する。
【００３９】
また、ワクチン組成物６は、アジュバント組成物４と、抗原５とを含む。図１に示されるように、抗原５は、上記２つの形態に係るアジュバント組成物４に包含されてもよいし、独立に存在してもよい。このうち、特にアジュバント複合体４に抗原５が包含されるワクチン組成物６については、ワクチン複合体ともいうことができる。
【００４０】
本明細書において、「アジュバント組成物」とは、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むものを意味し、その形態について特に制限はない。すなわち、「アジュバント組成物」は、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合したものであってもよいし、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する物質を担持または包含したもの（アジュバント複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「アジュバント組成物」と称する。
【００４１】
また、本明細書において、「ワクチン組成物」とは、アジュバント組成物および抗原を含むものを意味し、その形態については特に制限はない。すなわち、「ワクチン組成物」には、アジュバント組成物の構成要素および抗原からなる群から選択される２種以上が混合されたものでもあってもよいし、アジュバント複合体に抗原を担持または包含したもの（ワクチン複合体）であってもよく、本明細書においては両者をまとめて「ワクチン組成物」と称する。
【００４２】
ワクチン組成物６によって、ＣＴＬの誘導が増大する（図３（Ｂ））。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
【００４３】
まず、自然免疫を活性化する物質により、抗原提示細胞（図２においては、樹状細胞）が成熟化する（図示せず）。また、抗原５とｐＨ感受性担体７が、エンドサイトーシスにより樹状細胞８内に取り込まれた後、エンドソーム９内に移行する。ｐＨ感受性担体によって、抗原がエンドソーム内からサイトゾルへ送達され、樹状細胞のプロセシングを受ける。その後、断片化された抗原がＭＨＣクラスＩ分子と結合し、細胞表面に抗原提示される。成熟化した樹状細胞においては、共刺激分子やＭＨＣクラスＩ分子の産生が増強されているため、ＣＴＬの誘導が増大すると考えられる。樹状細胞の成熟化と抗原のサイトゾルへの送達は、必ずしも同時に発生させる必要はないため、自然免疫を活性化する物質およびｐＨ感受性担体は、必ずしも複合体の形態でなくてもよく、アジュバント組成物内で別々に存在していてもよい。また、ワクチン組成物において、抗原は、自然免疫を活性化する物質およびｐＨ感受性担体と別々に存在していてもよい。
【００４４】
なお、ｐＨ感受性担体によって、抗原がエンドソーム内からサイトゾルへ送達される機構については後述する。
【００４５】
＜アジュバント組成物＞
アジュバント組成物は、ｐＨ感受性担体（以下、単に「担体」、「会合体」、または「複合体」と称することがある）と、自然免疫を活性化する物質と、を含む。本発明のアジュバント組成物によれば、高い抗腫瘍効果を得ることができる。
【００４６】
［ｐＨ感受性担体］
ｐＨ感受性担体は、ｐＨに感受性を有し、ｐＨが酸性になると細胞内の抗原をサイトゾルに輸送できる機能を有する。ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含む。
【００４７】
以下、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含む、ｐＨ感受性担体について詳細に説明する。
【００４８】
（ｐＨ感受性担体の構造）
ｐＨ感受性担体は、生理的ｐＨ以上において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合して形成されているものと考えられる。より詳細には、ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物が、両親媒性物質の構成する疎水性部分に会合して形成されているものと考えられる。なお、ｐＨ感受性担体の当該会合形式は推測であり、ｐＨ感受性担体は、当該会合形式には限定されない。
【００４９】
（膜破壊機能促進効果）
ｐＨ感受性担体は、膜破壊機能を有することが好ましい。
【００５０】
「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で９０分間あるいは３０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量が測定することができ、ｐＨ感受性担体のリポソームの膜破壊機能を確認することができる。なお、溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【００５１】
また、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質がｐＨ感受性担体を形成したときの溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率および両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０またはｐＨ４．５との溶出性試験において、ｐＨ感受性担体の溶出率Ｌｃ、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率Ｌａ、および両親媒性物質単独の溶出率Ｌｂが、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。
【００５２】
【数１】
2018181542.tif 000002
【００５３】
上記式（１）において、Δは、０を超えていればよいが、５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、３０以上であることがさらに好ましい。なお、Δは大きければ大きいほど好ましく、その上限は特に限定されないが、通常１００未満である。また、上記式（２）において、Δ’は、０を超えていればよいが、５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、１５以上であることがさらに好ましい。なお、Δ’は大きければ大きいほど好ましく、その上限は特に限定されないが、通常１００未満である。
【００５４】
本発明の一実施形態において、上記式（１）および上記式（２）におけるΔおよびΔ’が、それぞれ５以上であり、かつ、胆汁酸および脂質を含むｐＨ感受性担体が好ましい。
【００５５】
ここで、本明細書において「生理的ｐＨ」とは、正常組織や正常体液におけるｐＨを意味する。生理的ｐＨは、通常、７．４であるが、正常組織や正常体液によって若干（±０．１）異なる。また、「生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ」とは、ｐＨ７．４未満であればよく、好ましくはｐＨ３．０以上、ｐＨ７．４未満、より好ましくはｐＨ４．０以上、ｐＨ７．３未満、さらに好ましくはｐＨ４．５以上、ｐＨ７．０未満である。
【００５６】
ｐＨ感受性担体が膜破壊機能促進効果を発現するメカニズムは明らかではないが、下記のように推測される。なお、本発明は、下記推測によって限定されるものではない。
【００５７】
ｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、その結果、膜破壊機能促進効果を有するものと考えられる。例えば、ｐＨ感受性担体と、生体膜（例えば、細胞膜、小胞膜など）とが存在している系で、ｐＨが生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性担体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じるものと推測される。すなわち、ｐＨ感受性担体が生体膜の膜構造変化を誘起する。これは、ｐＨが弱酸性に変化することで、ｐＨ感受性担体中のｐＨ感受性化合物が該担体の構造中で不安定化し、その結果、ｐＨ感受性担体が、系内に存在する生体膜と再配列し、膜破壊機能促進効果が発現すると考えられる。また、換言すれば、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨが弱酸性に変化すると、プロトン化により疎水的な会合への溶解性を変化させる分子であると考えられる。つまり、ｐＨ感受性化合物を含む疎水的な会合は、弱酸性環境に応答し、機能を発現することが可能であるといえる。なお、「膜破壊」とは、このような膜構造の変化を称するものであり、膜構成成分が全て分離または分解しなくてもよい。このような「膜破壊」が生じることにより、生体膜（例えば、エンドソーム）の膜内部に含有されうる成分が生体膜の外部（例えば、サイトゾル）に溶出等する。
【００５８】
ｐＨ感受性担体は、溶出性試験における溶出率がｐＨ７．４で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることが好ましい。また、溶出性試験における溶出率がｐＨ６．５で２０％未満であり、かつ、ｐＨ４．０で２０％より大きいものであることがより好ましい。また、上記においてｐＨ７．４またはｐＨ６．５での溶出率が、１５％以下であることがより好ましく、１０％以下であることがさらに好ましい。また、ｐＨ４．０での溶出率が、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることがさらに好ましい。ｐＨ感受性担体の溶出率が、上記のようになることで、弱酸性ｐＨにおける膜破壊機能促進効果の発現がより発揮される。
【００５９】
また、ｐＨ感受性担体は、膜破壊機能促進効果とともに、膜融合機能促進効果を発現しうる。
【００６０】
本発明において、「膜融合機能」とは、膜融合試験において膜融合を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における膜融合試験とは、２種類の蛍光物質を二分子膜に組み込んだリポソーム（分散液）と、評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調整した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で６０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソーム中に組み込まれた２種類の蛍光物質のエネルギー共鳴移動の変化を測定することができ、ｐＨ感受性担体の膜融合機能を確認することができる。なお、膜融合試験については、国際公開第２０１５／０７９９５２号の［０１８９］〜［０１９４］（米国特許出願公開第２０１６／０２７１２４６号明細書、［０３０７］〜［０３１２］）に記載の方法を採用する。
【００６１】
また、「膜融合機能促進効果を発現する」とは、膜融合試験において、生理的ｐＨにおける融合率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける融合率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、を満たすことを意味する。より具体的には、膜融合機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０との膜融合試験において、ｐＨ感受性担体（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との複合体）の融合率Ｒｃ（％）が、ｐＨ感受性化合物単独の融合率Ｒａ（％）と、下記式（３）の関係を満たすものをいう。なお、下記式中、ｐＨ７．４の融合率を、それぞれ、Ｒｃ７．４、Ｒａ７．４と表し、ｐＨ５．０の融合率を、それぞれ、Ｒｃｘ、Ｒａｘと表す。
【００６２】
【数２】
2018181542.tif 000003
【００６３】
上記式（３）においてΔＲは、０を超えていればよいが、２以上であることが好ましく、５以上であることがより好ましく、１０以上であることがさらに好ましい。
【００６４】
上記式（３）においてΔＲが２以上であるｐＨ感受性担体であって、該担体は胆汁酸と脂質を含むものが好ましい。
【００６５】
ｐＨ感受性担体は、弱酸性ｐＨ（生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ）において、膜融合機能促進効果を発現する。これらのメカニズムは明らかではないが、上記の膜破壊機能促進効果と同様のメカニズムであると考えられる。なお、本発明は、当該推測によって限定されるものではない。
【００６６】
すなわち、本発明のｐＨ感受性担体は、周辺環境が生理的ｐＨ未満となった場合、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態が変化し、系内に存在する生体膜と再配列することで、膜融合するものと推測される。この際、膜融合は互いに親和性のある成分どうしで再配列するため、生体膜と親和性がない、または低い成分（例えば、抗原）は、再配列される膜から排除、放出される。
【００６７】
上述のように、通常、抗原は、生体膜の一種であるエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）に取り囲まれ、細胞（抗原提示細胞等）に取り込まれる。その後、プロトンポンプの作用によってエンドソーム内部のｐＨが低下する。さらに、エンドソームは、加水分解酵素を含むリソソームと融合して、抗原は分解される（その後、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に抗原提示されうる）。このため、ほとんどの抗原はサイトゾル内にデリバリーされない。
【００６８】
これに対して、ｐＨ感受性担体を使用すると、抗原（例えば、外因性抗原）をサイトゾルにデリバリーすることができる。より詳細には、抗原がｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り囲まれ、細胞に取り込まれると、同様にして、ｐＨが低下した環境に導かれる。そして、ｐＨの低下（酸性化）に伴い、ｐＨ感受性化合物がｐＨ感受性担体を不安定化させ、エンドソームとｐＨ感受性担体との間で膜の再配列が起こる。その結果、ｐＨ感受性担体による膜破壊機能（場合によっては膜融合機能とともに発現する膜破壊機能）が生じる。この膜破壊機能（または膜融合機能および膜破壊機能）に伴い、抗原がエンドソームからサイトゾルにデリバリーされうる。なお、上記メカニズムによれば、原則として抗原はｐＨ感受性担体とともにエンドソームに取り込まれさえすればサイトゾルへの輸送が可能となりうることから、抗原とｐＨ感受性担体とを混合した組成物の形態で使用されても、抗原がｐＨ感受性担体に担持または包含された形態で使用されてもよいことが理解される。
【００６９】
（ｐＨ感受性化合物）
ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。ｐＨ感受性化合物の塩としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩などが挙げられる。これらのｐＨ感受性化合物は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
【００７０】
本発明の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、およびそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００７１】
また、本発明の別の一実施形態によれば、ｐＨ感受性化合物は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸またはそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種であることがより好ましい。
【００７２】
ｐＨ感受性化合物として好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として１９２０年代以前から知られており、細菌学の分野において利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム（別名デスオキシコール酸ナトリウム）とウルソデオキシコール酸（別名ウルソデスオキシコール酸）はヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、ｐＨ感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることがさらに好ましく、デオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることが特に好ましい。
【００７３】
ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１０ｍｏｌ以上の割合で含有されることが好ましく、１０〜６４０ｍｏｌの割合で含有されることがより好ましく、２０〜３２０ｍｏｌの割合で含有されることがさらに好ましく、２０〜１６０ｍｏｌの割合で含有されることが特に好ましい。
【００７４】
（両親媒性物質）
両親媒性物質は、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
【００７５】
なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。アシル基が２以上存在する場合には、合計数ではなく、１のアシル基の炭素数を指す。例えば、ジラウロイルホスファチジルコリンの場合、２つのラウリン酸成分を含むが、ジラウロイルホスファチジルコリンの炭素数とは、そのうちの１のラウリン酸成分の炭素数、すなわち１２を指す。ホスファチジルコリンの疎水部を構成する炭素数は１０〜１２と適当な長さであることで、両親媒性脂質がミセル形成能を有するとともに膜に融合しやすくなる（国際公開第２０１３／１８０２５３号、図８）。
【００７６】
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンであることが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）が挙げられる。これらのうち、ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。ホスファチジルコリンの疎水部を構成する炭素数は１０〜１２と適当な長さであることで、両親媒性脂質がミセル形成能を有するとともに膜の再配列を誘起しやすくなる。
【００７７】
炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加したポリオキシエチレン鎖の合計した重合度が、１０〜２００であることが好ましく、１５〜１００であることがより好ましく、２０〜５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ４０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０）を用いることが好ましい。
【００７８】
炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル（ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ソルビタンモノステアレート）、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ソルビタンモノオレート）等のソルビタンモノ脂肪酸エステル；ソルビタントリパルミチン酸エステル（ソルビタントリパルミテート）、ソルビタントリステアリン酸エステル（ソルビタントリステアレート）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ソルビタントリオレート）等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、ＳＰＡＮ４０（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ＳＰＡＮ６０（ソルビタンステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８０（ソルビタンオレイン酸エステル）、ＳＰＡＮ６５（ソルビタントリステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、ＳＰＡＮ８０、ＳＰＡＮ６５、ＳＰＡＮ８５を用いることが好ましい。
【００７９】
モノオレイン酸グリセロール（モノオレイン酸グリセリル）、ジラウリン酸グリセロール（ジラウリン酸グリセリル）、ジステアリン酸グリセロール（ジステアリン酸グリセリル）、ジオレイン酸グリセロール（ジオレイン酸グリセリル）は、グリセリンに１または２分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位またはＣ２位に脂肪酸がエステル結合していてよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位およびＣ２位、またはＣ１位およびＣ３位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ３位が置換された、α、α’−ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ２位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【００８０】
ポリオキシエチレンヒマシ油は、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、３〜２００であることが好ましく、５〜１００であることがより好ましく、１０〜５０であることがさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【００８１】
α−トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものを用いても、市販のものを用いてもよい。
【００８２】
上述の両親媒性物質のうち、両親媒性物質は、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレオレート、ソルビタンモノオレオレート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジデカノイルホスファチジルコリン、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレオレート、ソルビタンモノオレオレート、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリンおよび／またはジデカノイルホスファチジルコリンであることがさらに好ましく、ジラウロイルホスファチジルコリンであることが特に好ましい。
【００８３】
（ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ）
ｐＨ感受性化合物が、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であり、両親媒性物質が、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００８４】
ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のｐＨにおいて、膜破壊機能促進効果を発現させることができる。この際、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるｐＨは異なる。これはｐＨ感受性化合物によってｐＫａが異なること、さらには両親媒性物質との会合形成の様式が、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するｐＨを選択することが可能であり、デリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
【００８５】
ｐＨ感受性担体において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ２０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油が好ましい。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
【００８６】
より好ましくは、コール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油である。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
【００８７】
特に好ましくは、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣであり、最も好ましくは、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣである。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
【００８８】
［自然免疫を活性化する物質］
自然免疫を活性化する物質とは、構造パターン認識受容体に認識され、免疫担当細胞を活性化に導く物質を意味する。
【００８９】
自然免疫を活性化する物質としては、特に制限されないが、Ｔｏｌｌ様受容体に対するアゴニストであることが好ましい。
【００９０】
自然免疫を活性化する物質の具体例としては、特に制限されないが、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド；ミョウバン等の鉱物塩；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント；免疫刺激性ＲＮＡ分子、内毒素（リポ多糖（ＬＰＳ；内毒素）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：登録商標））、外毒素（コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素、百日咳毒素）、ムラミルジペプチド、フラジェリン等の微生物アジュバント；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）等の油性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン等の油性アジュバント生分解性ミクロスフェア、サポニン（ＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａ等）、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似物、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド（非ＣｐＧ合成ポリヌクレオチド等）、イミダゾキノリン等の合成アジュバント；ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡ等のカチオン性脂質；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。これらのうち、自然免疫を活性化する物質は、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド；鉱物塩；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント；免疫刺激性ＲＮＡ分子、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：登録商標））、外毒素（コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素、百日咳毒素）、フラジェリン等の微生物アジュバント、サポニン（ＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａ等）、合成ポリヌクレオチド（非ＣｐＧ合成ポリヌクレオチド等）、イミダゾキノリン等の合成アジュバント、一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ等であることが好ましく、モノホスホリルリピドＡ、ＣｐＧモチーフ、水酸化アルミニウムを含むオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、免疫チェックポイント阻害剤との併用効果に非常に優れることから、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドであることが特に好ましい。
【００９１】
自然免疫を活性化する物質は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９２】
自然免疫を活性化する物質の含有量は、使用する自然免疫を活性化する物質の種類によっても異なるが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、０．０２２７〜２２．７ｍｏｌであることが好ましい。自然免疫を活性化する物質の含有量が０．０２２７ｍｏｌ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、自然免疫を活性化する物質の含有量が２２．７ｍｏｌ以下であると、コストが低減できることから好ましい。
【００９３】
ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であることが好ましく、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）のリガンドである非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であることがより好ましい。オリゴデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオシド（デオキシアデノシン（塩基部分は、アデニン（Ａ））、デオキシグアノシン（塩基部分は、グアニン（Ｇ））、チミジン（塩基部分は、チミン（Ｔ））、デオキシシチジン（塩基部分は、シトシン（Ｃ）））が、リン酸を介在したホスホジエステル結合によって多量体化した化合物を指す。オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の部分は、その全部または一部が、酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート修飾されたものであってもよい。ホスホロチオエート修飾されたホスホジエステル結合を、ホスホロチオエート結合と換言することもできる。
【００９４】
非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）とは、単一又は複数の非メチル化ＣｐＧモチーフを核酸分子内（５’末端または３’末端でない）に有する、オリゴデオキシヌクレオチドである。ここで、非メチル化ＣｐＧモチーフとは、シトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）（５’−ＣｐＧ−３’）ジヌクレオチド配列であって、当該のシトシンの５位がメチル化されていないジヌクレオチド配列をいう。一般に、真核生物においては５’−ＣｐＧ−３’配列はＣＧメチラーゼによってシトシンがメチル化されているため、メチル化されていない５’−ＣｐＧ−３’配列のゲノム中での出現頻度は小さい。
【００９５】
非メチル化ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、公知の核酸合成方法を用いて容易に作製することが可能であり、また、市販品を用いてもよい。
【００９６】
ＣｐＧ  ＯＤＮは、好ましくは、１８〜２５のデオキシヌクレオチド、より好ましくは２０〜２２のデオキシヌクレオチドからなる。
【００９７】
ＣｐＧ  ＯＤＮとしては、クラスＡ（Ｃｌａｓｓ  Ａ；タイプＤ（ｔｙｐｅ  Ｄ）ともいう）、クラスＢ（Ｃｌａｓｓ  Ｂ；タイプＫ（ｔｙｐｅ  Ｋ）ともいう）およびクラスＣ（Ｃｌａｓｓ  Ｃ）のＣｐＧ  ＯＤＮが例示される。
【００９８】
クラスＡのＣｐＧ  ＯＤＮは、配列が１以上の非メチル化ＣｐＧ配列を含むパリンドローム配列であって、骨格がホスホジエステル結合である部分と、該パリンドローム配列の５’側及び／又は３’側に結合したポリＧ配列（ｐｏｌｙ（Ｇ）、デオキシグアノシンが２個以上連結した配列）であって骨格がホスホロチオエート結合である部分とからなるＣｐＧ  ＯＤＮを指す。なお、パリンドローム配列とは、配列と相補鎖の配列とが一致する回文構造を有する配列を指す。
【００９９】
クラスＡのＣｐＧ  ＯＤＮの具体例として、ＯＤＮ２２１６、ＯＤＮ２３３６、ＯＤＮ１５８５が例示される。これらはいずれもＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入可能である。
【０１００】
クラスＢのＣｐＧ  ＯＤＮは、配列中に１以上の非メチル化ＣｐＧ配列を含み、かつ、骨格がオリゴヌクレオチド全長にわたりホスホロチオエート結合であるＣｐＧ  ＯＤＮを指す。クラスＢのＣｐＧ  ＯＤＮの具体例として、ＯＤＮ２００６、ＯＤＮ１６６８、ＯＤＮ１８２６が例示される。これらはいずれもＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入可能である。
【０１０１】
タイプＣのＣｐＧ  ＯＤＮは、配列中に１以上の非メチル化ＣｐＧ配列含む５’側部分、および非メチル化ＣｐＧ配列を含むパリンドローム配列を含む３’側部分からなり、骨格がオリゴヌクレオチド全長にわたりホスホロチオエート結合であるＣｐＧ  ＯＤＮを指す。クラスＣのＣｐＧ  ＯＤＮの具体例として、ＯＤＮ２３９５、ＯＤＮ  Ｍ３６２が例示される。ＯＤＮ２３９５、ＯＤＮ  Ｍ３６２は、ヒトおよびマウスにおいて顕著に免疫賦活活性が認められる。これらはいずれもＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社から購入可能である。
【０１０２】
［水性溶媒］
アジュバント組成物は、水性溶媒を含んでいてもよい。
【０１０３】
アジュバント組成物が水性溶媒を含む場合、ｐＨ感受性担体、自然免疫を活性化する物質は、水性溶媒中で分散した分散液となりうる。
【０１０４】
この際、ｐＨ感受性担体は、好ましくは、水性溶媒中で、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む複合体を形成する。これらの複合体の形態は特に制限されず、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが膜を形成してもよいし、両親媒性物質が形成する構造にｐＨ感受性化合物の一部分もしくは全体が会合などにより埋め込まれていてもよい。また、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とがミセル状の粒子（ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが疎水性相互作用により粒状に会合した粒子であり、典型的には単分子膜構造の粒子である）を形成するのが好ましい。また、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスによる取り込みは、一定以上の大きさの粒子に対して活発に行われることから、ミセル状の粒子は、粒子径が１０〜２００ｎｍであることが好ましく、１０〜１００ｎｍであることがより好ましい。なお、上記ミセル状の粒子には、脂質二分子膜構造（例えば、リポソーム）を形成するものは含まない。また、本明細書中、ｐＨ感受性担体の粒子径は、動的光散乱法（ＭＡＬＶＥＲＮ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製、ＮａｎｏＺＳ９０）により測定することができる。
【０１０５】
また、アジュバント組成物は、水性溶媒中で、複合体を形成したｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する物質と、を含む複合体（アジュバント複合体）を形成することが好ましい。複合体の形態は特に制限されないが、ｐＨ感受性担体を構成するｐＨ感受性物質および両親媒性物質と、自然免疫を活性化する物質とがミセル状の粒子を形成することが好ましい。当該ミセル状の粒子の粒子径は、１０〜２００ｎｍであることが好ましく、１０〜１００ｎｍであることがより好ましい。
【０１０６】
なお、アジュバント組成物を含む水性溶媒中、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、自然免疫を刺激する活性を有する物質の少なくとも１つが、会合体を形成せず、遊離の状態で存在していてもよい。
【０１０７】
水性溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液であることが好ましい。
【０１０８】
緩衝剤としては、アジュバント組成物のｐＨを生理的ｐＨ以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＥＤＴＡ緩衝剤（トリスＥＤＴＡ緩衝剤、ＴＥ緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤；トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤；またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）などのリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、トリスＥＤＴＡ緩衝剤（ＴＥ緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤を用いることが好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであることが好ましく、１〜１００ｍＭであることがより好ましい。なお、本明細書において「緩衝剤の濃度」とは、水性溶媒中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。
【０１０９】
ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであることが好ましく、１〜１５０ｍＭであることがより好ましい。
【０１１０】
水性溶媒を用いた場合のアジュバント組成物中のｐＨ感受性担体の濃度としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、好ましくは０．７３μｍｏｌ／Ｌ〜７．４ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは７．３μｍｏｌ／Ｌ〜６．５ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは８．０μｍｏｌ／Ｌ〜４．２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１１１】
また、水性溶媒を用いた場合のアジュバント組成物中の自然免疫を活性化する物質のモル濃度は、特に制限されないが、好ましくは０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．２２７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．１９ｍｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは１．６ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．１２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１１２】
［他の成分］
アジュバント組成物は、他の成分を含んでいてもよい。当該他の成分としては、特に制限されないが、安定化剤等が挙げられる。
【０１１３】
安定化剤としては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質に悪影響を与えなければ特に制限されず、例えば、１−オクタノール、１−ドデカノール、１−ヘキサドデカノール、１−エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数４〜２０のアルコール；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数１２〜１８の脂肪酸；カプリル酸メチル（オクタン酸メチル）、カプリル酸エチル（オクタン酸エチル）、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８の脂肪酸アルキルエステル（炭素数１〜３のアルキル）；Ｄ（Ｌ）−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン、グルタミン酸等のＤ（Ｌ）−アミノ酸；トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド；ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５）；ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンアルキルエステル（例えば、ＰＥＧ２０ステアリルエーテル、ＰＥＧ２３ラウリルエーテル）；ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ１０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ６０硬化ヒマシ油）；カプリリン（オクタン酸グリセロール）、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８のモノ脂肪酸グリセロールエステル；ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数８〜１６のジ脂肪酸グリセロール；α−トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、安定化剤における「炭素数」とは、疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【０１１４】
これら他の成分の含有量としては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質に悪影響を与えなければ特に制限されないが、両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、１５０ｍｏｌ以下であることが好ましく、０ｍｏｌを超えて６６．４ｍｏｌ以下であることがより好ましい。
【０１１５】
ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物は、抗原とともに投与することにより、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
【０１１６】
すなわち、上記アジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体に、自然免疫を活性化する物質を併用しても、ｐＨ感受性担体の機能、例えば、膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）を好適に発揮することができる。また、ｐＨ感受性担体とともに自然免疫を活性化する物質を用いると、自然免疫を活性化する物質の機能も好適に発揮することができる。この理由は必ずしも明らかではないが、以下のような理由によるものと推察される。
【０１１７】
すなわち、ｐＨ感受性担体は、好ましい形態において、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含み、膜破壊機能促進効果（場合によっては、膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果）を有する。この際、膜破壊機能促進効果（および膜融合機能促進効果）は、上述のように、酸性環境下におけるｐＨ感受性化合物によるｐＨ感受性担体の会合状態の変化の惹起、およびこの場合における両親媒性物質によるエンドソーム等の細胞膜との再配列に基づくものである。ここで、ｐＨ感受性担体に自然免疫を活性化する物質を併用しても、ｐＨ感受性化合物のｐＨ感受性は変動しないため、ｐＨ感受性化合物は、ｐＨ感受性担体の会合状態の変化を惹起することができる。また、自然免疫を活性化する物質が、例えば、両親媒性物質に組み込まれていても、ｐＨ感受性担体と独立に存在していても、両親媒性物質による細胞膜との再配列には影響を与えない。そうすると、自然免疫を活性化する物質をｐＨ感受性担体と併用しても、ｐＨ感受性担体の機能は損なわれない。そして、自然免疫を活性化する物質は、例えば、疎水的な相互作用によりｐＨ感受性担体の両親媒性物質に組み込まれているだけであり、または、単にｐＨ感受性担体と独立して存在しているだけであり、その機能も損なわれない。その結果、本形態に係るアジュバント組成物は、抗原とともに投与した場合、ｐＨ感受性担体の機能により抗原をサイトゾルに導入することができるとともに、自然免疫を活性化する物質が作用することにより、サイトゾルに導入された抗原に基づくクロスプレゼンテーションを好適に誘導することができ、効果的にＣＴＬを誘導することができる。
【０１１８】
なお、上記理由は推定のものであり、これ以外の理由によって本発明の効果がもたらされたとしても、本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１１９】
また、上記アジュバント組成物は、液性免疫をも好適に誘導することができる。
【０１２０】
上述のように、外因性抗原は、通常であれば、抗原提示細胞内のエンドソームでペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示される。
【０１２１】
本形態に係るアジュバント組成物が、共に投与された抗原をクロスプレゼンテーションすることにより、ＣＴＬを誘導する場合には、ｐＨ感受性担体が、エンドソームの細胞膜の再配列を起こす際に抗原や自然免疫を活性化する物質がサイトゾルに導入されうる。しかし、一実施形態においては、再配列が起きたとしても、抗原および自然免疫を活性化する物質の一部または全部がエンドソーム内に残存する場合がありうる。また、一実施形態において、抗原とアジュバント組成物とが独立して存在する場合には、一部のエンドソームにおいては、抗原のみが取り込まれる場合がありうる。そうすると、エンドソームで抗原がペプチド断片まで分解され、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合体を形成して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示されて液性免疫が誘導される。この際、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫的に活性化された状態にあることから、当該液性免疫の誘導は好適に発現することとなる。あるいは、クロスプレゼンテーションを好適に誘導している樹状細胞は、免疫を活性化するサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ）を盛んに産生し、周りの環境を、免疫誘導に適した環境に導くこととなる。
【０１２２】
したがって、アジュバント組成物は、クロスプレゼンテーションとともに、またはクロスプレゼンテーションに代えて、液性免疫を誘導することができる。
【０１２３】
［免疫チェックポイント阻害剤］
アジュバント組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる。
【０１２４】
Ｔ細胞上には免疫チェックポイント受容体が存在し、抗原提示細胞上に発現しているリガンドと相互作用する。Ｔ細胞はＭＨＣ分子上に提示された抗原を認識して活性化し、免疫反応を起こすが、並行して生じる免疫チェックポイント受容体−リガンドの相互作用によりＴ細胞の活性化が調節を受ける。免疫チェックポイント受容体には共刺激性のものと抑制性のものがあり、両者のバランスによってＴ細胞の活性化及び免疫反応が調節を受けている。
【０１２５】
がん細胞は、抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドを発現し、該受容体を利用して細胞傷害性Ｔ細胞による破壊から逃避している。
【０１２６】
免疫チェックポイント阻害剤は、受容体またはリガンドの免疫チェックポイントの働きを阻害するものであり、例えば、抑制性の受容体に対するアンタゴニストや、共刺激性の免疫チェックポイント受容体に対するアゴニストが挙げられる。
【０１２７】
「アンタゴニスト」という語には、受容体とリガンドとの結合による受容体の活性化を妨害する各種の物質が包含される。例えば、受容体に結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質、及びリガンドに結合して受容体−リガンド間の結合を妨害する物質を挙げることができる。
【０１２８】
抑制性の免疫チェックポイントに対するアンタゴニストとしては、抑制性の免疫チェックポイント分子（抑制性の受容体又は該受容体のリガンド）と結合するアンタゴニスト性抗体、抑制性の免疫チェックポイントリガンドに基づいて設計された、受容体を活性化しない可溶性のポリペプチド、又は該ポリペプチドを発現可能なベクター等が挙げられる。
【０１２９】
抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するアンタゴニストとしては、具体的には、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＴＩＭ−３抗体、抗ＢＴＬＡ抗体などが挙げられる。
【０１３０】
抑制性の免疫チェックポイント受容体に対するリガンドに対するアンタゴニストとしては、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＧＡＬ９抗体、抗ＨＶＥＭ抗体などが挙げられる。
【０１３１】
中でも、アジュバント組成物との併用による抗腫瘍効果が高いことから、免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体および抗ＣＴＬＡ−４抗体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、抗ＰＤ−１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体であることがより好ましく、抗ＰＤ−１抗体であることがさらに好ましい。
【０１３２】
抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２などの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、改変抗体（例えば抗原認識部位のみヒト化した「ヒト化抗体」など）、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体、断片抗体（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦｖ断片）などが挙げられる。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなど、いずれのクラスのものであってもよい。抗原への特異的結合性の観点からはモノクローナル抗体を用いることがより好ましい。
【０１３３】
モノクローナル抗体やポリクローナル抗体は従来公知の方法を参酌して作製することができる。
【０１３４】
抗体は市販品を用いてもよい。
【０１３５】
＜アジュバント組成物の製造方法＞
ｐＨ感受性担体の製造方法は、国際公開第２０１３／１８０２５３号（米国特許出願公開第２０１３／３２３３２０号明細書）に記載の方法などを適宜参酌することができる。
【０１３６】
具体的には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質とが、水性溶液中で接触すればよい。よって、ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質とを、水性溶液中で接触させることにより製造することができる。具体的には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を作製し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散することで、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合したｐＨ感受性担体を得ることができる。
【０１３７】
ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を調製する方法としては、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液とを別々に調製し、それら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散させてｐＨ感受性担体を得る方法；（２）リポソーム／ミセルの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法；が挙げられる。
【０１３８】
バンガム法としては、以下の手順が具体的に挙げられる。
【０１３９】
まず、ガラス容器中で、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質等のｐＨ感受性担体の構成成分を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解する。
【０１４０】
具体的には、ｐＨ感受性化合物を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解したｐＨ感受性化合物を含む溶液、および両親媒性物質を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解した自然免疫を活性化する物質を含む溶液を準備して、ｐＨ感受性化合物を含む溶液および両親媒性物質を含む溶液を混合することが好ましい。この際の混合順序は特に限定されず、ｐＨ感受性担体を含む溶液および両親媒性物質を一括で混合してもよいし、どちらか一方に他方を添加してもよい。
【０１４１】
ｐＨ感受性化合物を含む溶液におけるｐＨ感受性担体の濃度および両親媒性物質を含む溶液における両親媒性物質の濃度は、特に限定されず、適宜設定される。両親媒性物質を含む溶液は、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。
【０１４２】
次いで、ロータリーエバポレーターなどによって混合液の有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶媒を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、常温（５〜３５℃）で薄膜を膨潤させた後、常温（５〜３５℃）でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く攪拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。なお、水性溶媒としては、上述したアジュバント組成物に含まれる水性溶媒を使用することができる。
【０１４３】
このようにしてｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を得ることができる。ｐＨ感受性担体の分散液はこのままアジュバント組成物の製造に用いてもよいし、分散液からｐＨ感受性担体を分離してもよい。
【０１４４】
なお、バンガム法の方法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
【０１４５】
また、アジュバント組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。具体的には、国際公開第２０１５／０７９９５２号（米国特許出願公開第２０１６／２７１２４６号明細書）に記載の方法などを適宜参酌することができる。
【０１４６】
例えば、ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する物質とが独立に存在するアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合することにより製造することができる。
【０１４７】
ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合する方法としては、例えばバンガム法により得られたｐＨ感受性担体の分散液および自然免疫を活性化する物質を含む溶液を混合する方法が挙げられる。この際の混合順序は特に限定されず、ｐＨ感受性担体を含む溶液および自然免疫を活性化する物質を含む溶液を一括で混合してもよいし、どちらか一方に他方を添加してもよい。
【０１４８】
自然免疫を活性化する物質を含む溶液は、自然免疫を活性化する物質および水性溶媒を含む。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。なお、水性溶媒としては、上述したアジュバント組成物に含まれる水性溶媒を使用することができる。
【０１４９】
自然免疫を活性化する物質を含む溶液における自然免疫を活性化する物質の濃度は、自然免疫を活性化する物質のモル濃度が、好ましくは０．１４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．２２７ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１．４ｎｍｏｌ／Ｌ〜０．１９ｍｍｏｌ／Ｌである。
【０１５０】
自然免疫を活性化する物質が、ｐＨ感受性担体に担持または包含されるアジュバント組成物においては、ｐＨ感受性担体と、自然免疫を活性化する物質とを会合させることにより製造することができる。
【０１５１】
ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、および自然免疫を活性化する物質を会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質、および自然免疫を活性化する物質が、水性溶液中で接触すればよい。
【０１５２】
ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、自然免疫を活性化する物質とを、水性溶液中で接触させる方法としては、これらが会合体を形成すれば特に制限されない。例えば、（１）ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液と、自然免疫を活性化する物質を含む水性溶液とを別々に調製し、これら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く撹拌し分散させてアジュバント組成物を得る方法；（２）リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法等が挙げられる。バンガム法の具体的手順は、上記ｐＨ感受性担体の製造方法の欄に記載したものと同様である。
【０１５３】
なお、水性溶媒を成分として含むアジュバント組成物に含有されうる安定化剤等の他の成分の添加方法は、特に制限されない。例えば、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、両親媒性物質を含む水性溶液、および／または自然免疫を活性化する物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、バンガム法により薄膜を調製する際に、ｐＨ感受性担体またはアジュバント組成物の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、アジュバント組成物を含む水性溶液を得てもよい。
【０１５４】
＜ワクチン組成物＞
ワクチン組成物は、アジュバント組成物および抗原を含む。
【０１５５】
［アジュバント組成物］
アジュバント組成物としては、上述したものが用いられうることからここでは説明を省略する。
【０１５６】
［抗原］
抗原としては、免疫応答を生じさせるものであれば特に制限されないが、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
【０１５７】
ペプチドまたはタンパク質としては、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫性または寄生虫性抗原、がん抗原等が挙げられる。
【０１５８】
ウイルス抗原としては、特に制限されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、並びに他のＨＩＶコンポーネント等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのｐｒｅ−Ｓ抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ、並びにＡ、Ｂ、およびＣ型肝炎のウイルスコンポーネント等の肝炎ウイルス抗原；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼ、並びに他のインフルエンザウイルスコンポーネント等のインフルエンザウイルス抗原；麻疹ウイルス抗原；風疹ウイルス抗原；ロタウイルス抗原；サイトメガロウイルス抗原；呼吸器合胞体ウイルス抗原；単純ヘルペスウイルス抗原；水痘帯状疱疹ウイルス抗原；日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病ウイルス抗原が挙げられる。その他、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコルナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルソミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス（ｐａｐｉｌｏｍａｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス又は海綿状ウイルス由来のペプチドが挙げられる。
【０１５９】
細菌性抗原としては、特に制限されないが、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼ、他の百日咳細菌性抗原コンポーネント等の細菌性抗原；ジフテリア毒素またはトキソイド、他のジフテリア細菌性抗原コンポーネント等のジフテリア細菌性抗原；破傷風毒素又はトキソイド、他の破傷風細菌性抗原コンポーネント等の破傷風細菌性抗原連鎖球菌細菌性抗原；リポ多糖、他のグラム陰性細菌性抗原コンポーネント等のグラム陰性桿菌細菌性抗原；ミコール酸、マイコバクテリア抗原コンポーネント等の結核菌細菌性抗原；ヘリコバクター・ピロリ細菌性抗原コンポーネント；肺炎球菌細菌性抗原；インフルエンザ菌細菌性抗原；炭疽菌細菌性抗原；リケッチア細菌性抗原等が挙げられる。
【０１６０】
真菌性抗原としては、特に制限されないが、カンジダ真菌性抗原コンポーネント；ヒストプラズマ真菌性抗原；クリプトコッカス真菌性抗原；コクシジオイデス真菌性抗原；白癬真菌性抗原等が挙げられる。
【０１６１】
原虫性または寄生虫性抗原としては、特に制限されないが、熱帯熱マラリア原虫抗原；トキソプラズマ抗原；住血吸虫抗原；リーシュマニア抗原；トリパノソーマ・クルージ抗原等が挙げられる。
【０１６２】
がん抗原としては、特に制限されず、腫瘍組織の細胞の細胞表面、細胞質、核、細胞小器官等に由来するがん抗原が挙げられる。当該がんとしては、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等が挙げられる。なお、がん抗原の具体例を挙げると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｈｕｍａｎ  ＥＧＦＲ  ｒｅｌａｔｅｄ  ２）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭＡＧＥ（Ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＸＡＧＥ（Ｘ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ／ｍａｒｔ−１、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、ＰＳＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＡＰ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＭＵＣ−１（Ｍｕｃｉｎ−１）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＷＴ−１（Ｗｉｌｍｓｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  １）、ＡＦＰ（ＡｌｐｈａＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＰＣ（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等が挙げられる。
【０１６３】
上述の抗原は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１６４】
抗原の含有量は、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質１００ｎｍｏｌに対して、３．２μｇ〜１．０ｍｇであることが好ましい。
【０１６５】
抗原の組込率は、特に制限されず、抗原とアジュバント組成物が独立して存在してもよいが、３％以上であることが好ましく、５〜８０％であることがより好ましく、１０〜６０％であることがより好ましい。組込率が３％以上であると、例えば、ワクチン組成物が細胞にエンドサイトーシスされる際に、抗原がアジュバント組成物と同じエンドソームに導入される可能性が高くなり、発明の効果を好適に得られうることから好ましい。なお、「抗原の組込率」は、主として抗原がアジュバント組成物に担持または包含された割合を意味し、その値は、国際公開第２０１５／０７９９５２号の［０１９５］〜［０１９８］（米国特許出願公開第２０１６／２７１２４６号明細書［０３１２］〜［０３１５］）に記載の方法によって測定された値を採用するものとする。
【０１６６】
［添加剤］
ワクチン組成物は、他の医薬品添加剤を含んでいてもよい。
【０１６７】
使用されうる添加剤は、ワクチン組成物の剤型によって異なりうる。この際、ワクチン組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であっても、注射製剤のような液体製剤の形態であってもよいが、液体製剤であることが好ましい。なお、液体製剤の場合には、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供されてもよい。
【０１６８】
ワクチン組成物が液体製剤である場合には、溶媒（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロルブタノール、パラベンなど）などを含みうる。なお、溶媒は、ワクチン組成物の製造に用いる溶媒であってもよい。
【０１６９】
本発明の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、抗原をクロスプレゼンテーションさせることにより、効率良く細胞性免疫を誘導することができる。これにより、例えば、多量のＣＴＬを誘導することができる。なお、本明細書において、「ＣＴＬを誘導する」とは、本明細書に記載のＥＬＩｓｐｏｔ法にて、ワクチン組成物未処置のコントロール（すなわち、抗原と自然免疫を活性化する物質との混合物）と対比して、多くのｓｐｏｔ形成が得られることを意味する。
【０１７０】
また、本発明の別の一実施形態によれば、ワクチン組成物は、液性免疫を誘導することができる。これにより、ＩｇＧ等の抗体を産生することができる。この際、「液性免疫を誘導する」とは、抗原を投与したコントロールと対比して高いＩｇＧ抗体価となることを意味する。
【０１７１】
本形態のワクチン組成物は、対象者に投与して、ワクチン組成物の外部環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．５）となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、抗原を効率よくサイトゾルに放出させることが可能になる。そして、好適に細胞性免疫とＣＴＬを誘導することができ、免疫を付与することができる。
【０１７２】
＜ワクチン組成物の製造方法＞
本実施形態に係るワクチン組成物は、特に制限されず、種々の方法により製造することができる。具体的なワクチン組成物の製造方法としては、分散調製法、混合調製法、および凍結融解−凍結乾燥調製法等が挙げられる。具体的には、国際公開第２０１５／０７９９５２号（米国特許出願公開第２０１６／２７１２４６号明細書）に記載の方法などを適宜参酌することができる。
【０１７３】
（分散調製法）
分散調製法は、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質と、自然免疫を活性化する物質と、抗原と、を混合する工程を含む。具体的には、ガラス容器の壁に、アジュバント組成物の構成成分を含む薄膜を形成させる。次いで、抗原を含む溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５〜３５℃で薄膜を膨潤させた後、ガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌し、分散させる方法で、ワクチン組成物を調製する。または、ガラス容器の壁に、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質を含む薄膜を形成させ、次いで、抗原と自然免疫を活性化する物質とを、含む溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、５〜３５℃で薄膜を膨潤させた後、ガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く撹拌させる方法で、ワクチン組成物を調製する。
【０１７４】
抗原を含む溶液、および抗原と自然免疫を活性化する物質とを含む溶液は、下記混合調製法と同様のものまたは参考にして調製したものが用いられうる。
【０１７５】
（混合調製法）
混合調製法は、ｐＨ感受性化合物を含む溶液と、両親媒性物質を含む溶液と、自然免疫を活性化する物質を含む溶液と、抗原を含む溶液と、を混合する工程を含む。
【０１７６】
具体的には、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を混合してアジュバント組成物を得た後、アジュバント組成物の分散液と、抗原または抗原を含む溶液とを混合することでワクチン組成物を得ることができる。
【０１７７】
抗原を含む溶液は、抗原および水性溶媒を含むことが好ましい。また、必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。なお、水性溶媒としては、上述したアジュバント組成物に含まれる水性溶媒を使用することができる。
【０１７８】
抗原を含む溶液における抗原の濃度は、抗原種により適宜設定されるが、抗原のモル濃度が、例えば、３２ｍｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。
【０１７９】
上述のアジュバント組成物の分散液、および抗原を含む溶液の混合方法は特に制限されない。得られた混合液は分散させることが好ましく、当該分散は、例えば、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて行うことができる。
【０１８０】
（凍結融解−凍結乾燥調製法）
凍結融解−凍結乾燥調製法は、分散調製法または混合調製法により得られた溶液を凍結融解して融解液を調製する工程、当該融解液を凍結乾燥する工程を含む。
【０１８１】
融解液を調製する工程
融解液は、分散調製法または混合調製法により得られた溶液を凍結融解することにより調製することができる。
【０１８２】
凍結融解とは、溶液を凍結乾燥した後、得られた乾燥物を融解させることを意味する。
【０１８３】
凍結乾燥の方法としては、特に制限されないが、液体窒素、冷却したメタノール等を用いた水分を昇華させる方法が好ましい。
【０１８４】
また、乾燥物の融解方法としては、特に制限されないが、冷却して得られた乾燥物を昇温する方法、溶媒を添加する方法が好ましい。
【０１８５】
凍結乾燥する工程
本工程は、上記で得られた融解液を、凍結乾燥する工程である。
【０１８６】
凍結乾燥の方法は、上記と同様に特に制限されないが、液体窒素、冷却したメタノール等を用いた水分を昇華させる方法が好ましい。
【０１８７】
＜アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤の併用＞
アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤は組み合わせて用いられる。
【０１８８】
このため、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる。
【０１８９】
アジュバント組成物、および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、アジュバント組成物を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にアジュバント組成物を投与してもよい。
【０１９０】
免疫チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞上の免疫チェックポイント受容体−リガンドに作用し、効果を得るものである。Ｔ細胞を誘導した後に免疫チェックポイント阻害剤を投与することで、抗腫瘍効果の増大がより発揮されると考えられることから、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。このため、当該アジュバント組成物は、免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与されることが好ましい。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。
【０１９１】
さらには、本実施形態の好適な形態は、免疫チェックポイント阻害剤と、組み合わせて投与されるように用いられる、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含む、ワクチン組成物である。
【０１９２】
ワクチン組成物、および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、ワクチン組成物および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、ワクチン組成物を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にワクチン組成物を投与してもよい。
【０１９３】
抗腫瘍効果の増大がより発揮されることから、ワクチン組成物を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。このため、当該ワクチン組成物は、免疫チェックポイント阻害剤が投与される前に投与されることが好ましい。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。
【０１９４】
アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤の製剤としては、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を含有する組成物（単一の製剤）、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化しての組み合わせ（薬剤キット）などが挙げられる。好適な形態は、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化しての組み合わせである。すなわち、本形態においては、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キットであることが好ましい。ｐＨ感受性担体、自然免疫を活性化する物質、免疫チェックポイント阻害剤については上述したとおりである。また、当該薬剤キットにおいては、アジュバント組成物、および免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、アジュバント組成物を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にアジュバント組成物を投与してもよい。抗腫瘍効果の増大がより発揮されることから、アジュバント組成物を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。かような態様により、顕著な抗腫瘍効果を得ることができる。なお、時間差をおいての投与態様においては、時間差をおいての投与であれば、投与経路は同一であっても異なるものであってもよい。
【０１９５】
さらには、本実施形態の好適な形態は、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含む、ワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キットである。さらに他の態様は、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物と、抗原と、免疫チェックポイント阻害剤と、を組み合わせた薬剤キットである。本発明の薬剤キットによれば、高い抗腫瘍効果を得ることができる。当該薬剤キットにおいては、ワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原、ならびに免疫チェックポイント阻害剤の投与順序は特に制限がなく、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、時間差をおいて投与する場合には、ワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原を投与後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤投与後にワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原を投与してもよい。抗腫瘍効果の増大がより発揮されることから、ワクチン組成物、または、アジュバント組成物および抗原を投与し、その後免疫チェックポイント阻害剤を投与することが好ましい。
【０１９６】
また、当該薬剤キットは、癌治療または予防のための薬剤キットであることが好ましい。具体的には、白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等の癌が挙げられる。
【０１９７】
アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を併用投与する場合の投与形態としては、それぞれに適した投与経路、投与頻度及び投与量を採用する限りは特に限定されず、例えば、（１）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を含有する組成物、即ち、単一の製剤としての投与、（２）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与等が挙げられる。
【０１９８】
併用投与における好ましい投与形態としては、アジュバント組成物またはワクチン組成物を投与した後に、免疫チェックポイント阻害剤を投与する方法である。
【０１９９】
本発明の他の態様は、治療または予防を必要とする対象者に、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物の有効量と、免疫チェックポイント阻害剤の有効量と、を投与することを含む、疾患の治療または予防方法である。また、他の態様は、治療または予防を必要とする対象者に、ｐＨ感受性担体および自然免疫を活性化する物質を含むアジュバント組成物ならびに抗原を含むワクチン組成物の有効量と、免疫チェックポイント阻害剤の有効量と、を投与することを含む、疾患の治療または予防方法である。特に疾患が癌であることが好ましい。
【０２００】
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
【０２０１】
また、アジュバント組成物またはワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤と、を時間差をおいて投与する場合、抗腫瘍効果を増強するに足る間隔で免疫チェックポイント阻害剤を投与することが必要である。具体的な投与間隔は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【０２０２】
また、ワクチン組成物および免疫チェックポイント阻害剤は、一定のサイクルで投与することが好ましい。投与サイクルとしては、併用に適するように投与サイクルを適宜調整することが好ましい。具体的な、投与頻度、投与量、点滴投与時間、投与サイクル等は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【０２０３】
免疫チェックポイント阻害剤の単独投与については、従来公知であり、例えば、２〜３ｍｇ／ｋｇ／Ｄａｙの範囲で、１日１回から数回投与される。
【０２０４】
アジュバント組成物および免疫チェックポイント阻害剤を併用して用いる場合は、通常投与される投与経路により、通常単独で投与される場合と同じ投与量若しくはそれより低用量（例えば、単独で投与した場合の最高投与量の０．１０〜０．９９倍）に設定することができる。
【０２０５】
アジュバント組成物の投与量は、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【０２０６】
また、免疫チェックポイント阻害剤およびアジュバント組成物の投与量の質量（ｍｇ／ｋｇ／Ｄａｙ）比についても、患者の症状、年令、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
【０２０７】
アジュバント組成物、ワクチン組成物および免疫チェックポイント阻害剤の投与方法としては、特に制限はなく、経口投与；静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、腹腔内、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、抗原としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口経路、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射による投与が好ましい。なお、抗原がアジュバント組成物に担持または包含されずに独立に混合されてなるワクチン組成物については、局所投与、具体的には、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与の形態で投与することが好ましい。また、免疫チェックポイント阻害剤は、腹腔内投与であることが好ましい。
【実施例】
【０２０８】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いる場合があるが、特に断りがない限り、「重量部」あるいは「重量％」を表す。また、特記しない限り、各操作は、室温（２５℃）で行われる。【０２０９】
１．試薬
・デオキシコール酸ナトリウム（ファーマグレード、シグマ社より購入）
・ＤＬＰＣ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社より購入、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−１２１２）
・ＥＹＰＣ（未水添卵黄ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＮＣ−５０）
・ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ：ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社より購入、ＯＤＮ−２３９５、配列番号；５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃｇ−３’（配列番号１）（配列中、下線部は、パリンドローム配列を示す。）
・ＰＢＳ（ナカライテスク社より購入、リン酸緩衝生理食塩水（ＫＣｌ不含）（ｐＨ  ７．４））
・ＭＥＳ−Ｎａ（メルク社より購入）
・塩化ナトリウム（関東化学社より購入）
・ＰＢＳ  Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：タカラバイオ社より購入）
・水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社より購入）
・塩酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社より購入）
・リン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬工業株式会社より購入）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業社より購入）
・ＤＰＸ（ｐ−ｘｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ−ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社より購入）
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（和光純薬工業社より購入）
・抗ＰＤ−１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社より購入、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＰＤ−１（ＣＤ２７９）ＦＧ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＲＭＰ１−１４（ＢｉｏＸｃｅｌｌ社））
・メタノール（ナカライテスク社より購入）
・クロロホルム（和光純薬工業社より購入）
・ＯＶＡタンパク質（ＯＶＡｌｂｕｍｉｎ：和光純薬工業社より購入、オボアルブミン低エンドトキシン）（以下、単に「ＯＶＡ」とも称する。）
・ＯＶＡペプチド：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ピーエイチジャパン委託合成）（以下、単に「ペプチド」とも称する。）
・ＲＰＭＩ（ナカライテスク社より購入、ＲＰＭＩ  １６４０培地（液体））
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔａｍｙｃｉｎ  Ｍｉｘｅｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社より購入）
・ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，Ｃｅｎｔｉｆｉｅｄ，Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｅｄ，ＵＳ  Ｏｒｉｇｉｎ：Ｇｉｂｃｏ社より購入）
・ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入）：赤血球溶血バッファー
・Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社より購入）・ＡＥＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社より購入）
「動物」
雌、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（６週齢）は日本エスエルシーより購入した。実験はテルモ株式会社における動物実験に関する指針に従って実施した。【０２１０】
「細胞」
Ｅ・Ｇ７−ＯＶＡ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２１１３、以下、単にＥＧ７細胞とも表記）は、ＡＴＣＣ社より購入したものを培養し、使用した。【０２１１】
「細胞の培養」
細胞の培養は、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター（ＭＣＯ２０ＡＩＣ）を用いて実施した。【０２１２】
「試料の調製等」
・ＲＰＭＩメディウム
抗生物質としてペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。また、必要に応じてＦＢＳを追加で添加し、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムとした。【０２１３】
２．投与液の調製
（ｐＨ感受性担体の調製）
クロロホルムに溶解した１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質であるＤＬＰＣと、メタノールに溶解した１６００ｎｍｏｌのｐＨ感受性化合物であるデオキシコール酸ナトリウムを、１０ｍＬナスフラスコ混合し、ロータリーエバポレーターによって溶媒を揮発させて薄膜とした。作製した薄膜に０．５ｍＬのＰＢＳを添加し、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ、井内盛栄堂社製）を用いて分散させ、ｐＨ感受性担体の分散液（溶液）を調製した（ＤＬＰＣおよびデオキシコール酸ナトリウムの濃度：５．２ｍｍｏｌ／Ｌ）。【０２１４】
（ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドの一時溶液の作製）
ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを、付属の溶解液である滅菌水（エンドトキシンフリー）を用いて１μｇ／μＬとなるように溶解し、一時溶液とした。【０２１５】
（アジュバント組成物の調製）
上記で調製したｐＨ感受性担体の分散液（溶液）に、自然免疫を活性化する物質の一時溶液を添加し、混合した。濃度を調製するために追加のＰＢＳを添加し、混合することで、アジュバント組成物を調製した。【０２１６】
（ＯＶＡの一時溶液）
２ｍｇのＯＶＡ（モデル抗原）を１．０ｍＬのＰＢＳに溶解させ、ＯＶＡの一時溶液とした。【０２１７】
（抗ＰＤ−１抗体の投与液）
抗ＰＤ−１抗体の投与液は、購入した抗体の原液をＰＢＳにて１０倍希釈して、投与液とした（抗ＰＤ−１抗体０．１ｇ／Ｌ）。【０２１８】
３．溶出性試験：Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）の測定
Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００８  １９  １０４０−１０４８に記載の方法に従い、蛍光物質であるＰｙｒａｎｉｎｅと消光剤であるＤＰＸとを内包したＥＹＰＣリポソームを用いて評価した。【０２１９】
クロロホルムに溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣを１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーターを用いて薄膜とした。Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｎｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ−Ｎａ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ  ＢｕｆｆｅｒとＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。リン脂質Ｃ−テストワコーを用いてリン脂質の濃度を求め、リン脂質が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて濃度を調整した。【０２２０】
濃度を調製したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、ｐＨを調整した２９６０μＬのＭＥＳ  Ｂｕｆｆｅｒに投与し、３７℃にて９０あるいは３０分間インキュベーションした後（実施例において、特別な記載のない限り、９０分間の結果である）、分光光度計ＦＰ−６５００を用いてＥｘ４１６、Ｅｍ５１２ｎｍの蛍光を観察することにより、Ｌｅａｋａｇｅをモニターした。【０２２１】
なお、ＥＹＰＣリポソーム分散液のみの場合を０％とし、１０倍希釈したＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を３０μＬ加えた場合の値を１００％として、溶出率を算出した。具体的には、溶出率は、下記式に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をＬとし、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液のみの蛍光強度をＬ０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた場合の蛍光強度をＬ１００と表す。【０２２２】
【数３】
2018181542.tif 000004
【０２２３】
上記で調整したアジュバント組成物について、ｐＨ７．４およびｐＨ５．０における、ｐＨ感受性担体、ｐＨ感受性化合物、両親媒性物質の溶出率を測定し、下記式【０２２４】
【数４】
2018181542.tif 000005
【０２２５】
よりΔおよびΔ’を算出した結果、Δ＝４０．９、Δ’＝３９．８であった。よって、アジュバント組成物は膜破壊機能促進効果を有する。【０２２６】
［評価方法１：ＥＬＩｓｐｏｔ法を用いたＣＴＬ誘導の確認］
ＥＬＩｓｐｏｔ法を用いてＣＴＬの誘導を確認した。用いた被験物質は、ＯＶＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮ混合物（ＯＶＡ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物（ワクチン組成物）（ＯＶＡ＋ＣｐＧ−ＯＤＮ＋ｐＨ感受性担体）、およびＯＶＡおよびｐＨ感受性担体混合物（ＯＶＡ＋ｐＨ感受性担体）である。【０２２７】
なお、投与に使用した試料は、「投与液の調製」に従って調製した投与液を用いて調製した。また、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物は、アジュバント組成物に、ＯＶＡの一時溶液を添加し、超音波にて混合して得た。【０２２８】
（１）マウスへの免疫
投与は麻酔下にて実施した。背部１箇所に１００μＬ／ｈｅａｄにて皮下注射した。ｐＨ感受性担体は、両親媒性物質：１０ｎｍｏｌ／ｈｅａｄ、ｐＨ感受性化合物：１６ｎｍｏｌ／ｈｅａｄとした。自然免疫を活性化する物質は、ＣｐＧ−ＯＤＮの場合、１０μｇ（１．４２ｎｍｏｌ）／ｈｅａｄとした。抗原は、モデル抗原としてＯＶＡを使用し、８０μｇ／ｈｅａｄとした。投与は１回とし、投与から７日後にアッセイを実施した（ｎ＝１）。【０２２９】
（２）ＥＬＩｓｐｏｔ法
上記マウスへの免疫にて最終の投与から７日目においてマウスに安楽死を行い、脾臓を摘出した。３．０ｍＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加した後、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎセルストレーナーを用いて脾臓を処理し、細胞懸濁液とした。ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを用いて溶血操作を行った後、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて細胞を洗浄した。細胞を１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて分散した後、細胞数をカウントし、脾臓の細胞分散液を得た。【０２３０】
ＥＬＩｓｐｏｔ法は、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔを用いて実施した。脾臓の細胞分散液を播種する前日に、９６ｗｅｌｌ  ＥＬＩｓｐｏｔプレートに薬剤キットに付属のｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙを吸着させて、プレートを作製した。作製したプレートを１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにて洗浄した後、２００μＬの１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを添加し、３７℃にて２時間静置しブロッキングを行った。１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムにてプレートを洗浄した後、４０μｇ／ｍＬのＯＶＡペプチドを含む１０％血清含有ＲＰＭＩメディウム１００μＬをプレートに添加した。プレートに、脾臓の細胞分散液を２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、最後に、１０％血清含有ＲＰＭＩメディウムを用いて１穴あたりの全量が２００μＬとなるように、調整した。その後、二晩培養し、プレートの呈色を行った。【０２３１】
プレートの呈色は、Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ、およびＡＥＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔに記載のプロトコルに従って実施した。【０２３２】
得られた結果を図３に示す。【０２３３】
ＯＶＡとＣｐＧ−ＯＤＮの混合物（図３（Ａ））は、僅かな数のｓｐｏｔであり、少数のＣＴＬしか誘導できなかった。【０２３４】
一方、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物（図３（Ｂ））は、多くのｓｐｏｔを形成し、多数のＣＴＬを誘導することができた。ゆえに、アジュバント組成物の含有は、多数のＣＴＬの誘導に繋がることが示された。ｐＨ感受性担体が成熟した抗原提示細胞に対して、多数のＭＨＣクラスＩ分子による抗原提示を誘起した結果、多数のＣＴＬを誘導したものと考えられる。【０２３５】
また、自然免疫を活性化する物質であるＣｐＧ−ＯＤＮを使用していない、ＯＶＡおよびｐＨ感受性担体の混合物（図３（Ｃ））は、ｓｐｏｔを形成できず、ＣＴＬは誘導されなかった。自然免疫を活性化する物質を含まなければ、成熟した抗原提示細胞の数が増大しなかったため、ＣＴＬを誘導することができなかったものと考えられる。【０２３６】
［評価方法２：マウスの担癌実験系を用いた抗腫瘍効果の確認］
続いて、マウスの担癌実験系を用いて、抗腫瘍効果を確かめた。マウスは７つに群分けを行った。１群：処置なし、２群：ＯＶＡ投与、３群：ＯＶＡおよび抗ＰＤ−１抗体投与、４群：ＯＶＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮ投与、５群：ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体（図中、ミセルと表記）投与、６群：ＯＶＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮ、ならびに抗ＰＤ−１抗体投与、７群：ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体、ならびに抗ＰＤ−１抗体投与とした。投与に使用した試料は、「投与液の調製」に従って調製した投与液を用いて調製した。また、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物は、アジュバント組成物に、ＯＶＡの一時溶液を添加し、超音波にて混合して得たワクチン組成物を用いた。【０２３７】
（１）評価系の構築、およびマウスへの免疫
投与は、全て麻酔下にて実施した。Ｄａｙ０に、ＥＧ７細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｈｅａｄにてマウスの皮下に注射し、担癌を行った。比較試料（ＯＶＡのみ（２群、３群）、ＯＶＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮ（４群、６群））、ワクチン組成物（ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物）（５群、７群）を含む投与液は、２０μＬ／ｓｈｏｔにて、皮内に注射するものとし、Ｄａｙ５、Ｄａｙ１２、Ｄａｙ１９のスケジュールで、３回実施するものとした。抗ＰＤ−１抗体の投与（３群、６群、７群）は、抗ＰＤ−１抗体の投与液を５００μＬ／ｓｈｏｔにて、腹腔内に注射するものとし、Ｄａｙ８、Ｄａｙ１５、Ｄａｙ２２のスケジュールで、３回実施するものとした。個体差が大きいため、１群を５匹とした。１回あたりの投与において、ｐＨ感受性担体は、両親媒性物質：２ｎｍｏｌ／ｈｅａｄ、ｐＨ感受性化合物：３．２ｎｍｏｌ／ｈｅａｄとした。自然免疫を活性化する物質は、ＣｐＧ−ＯＤＮの場合、２μｇ（０．２８４ｎｍｏｌ）／ｈｅａｄとした。抗原は、モデル抗原としてＯＶＡを使用し、１６μｇ／ｈｅａｄとした。【０２３８】
（２）腫瘍サイズの測定
腫瘍（癌）のサイズは、腫瘍の長径ａと短径ｂを、デジタルノギスを用いて測定し、式１）の計算式を用いて、体積を求めた。エンドポイントに到達した個体は安楽死の処置を行った。【０２３９】
【数５】
2018181542.tif 000006
【０２４０】
得られた結果を図４に示す。結果は腫瘍サイズの平均値＋標準偏差（ＳＥＭ）で示した（ｎ＝５）。【０２４１】
図４（Ａ）は、１〜５および７群の結果を示す。【０２４２】
ＯＶＡ単独（図４（Ａ）：２群）やＯＶＡおよびＣｐＧ−ＯＤＮの混合物（図４（Ａ）：４群）と比較して、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物を投与した群（図４（Ａ）：５群）は、腫瘍の増大速度を遅く抑えることができた。ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物は、図３（Ｂ）で示すように生体において腫瘍を攻撃する機能を有したＣＴＬを多量に誘導することができたため、腫瘍の増大を遅らせることができたものと考えられる。したがって、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体を含むワクチン組成物の含有は、高い抗腫瘍効果を有することが示された。【０２４３】
一方、本実験系においては、腫瘍の増大速度が速いため、ＯＶＡおよび抗ＰＤ−１抗体投与群（図４（Ｂ）：３群）は、目立った抗腫瘍効果を得られなかった。なお、抗ＰＤ−１抗体の抗腫瘍効果を奏する作用機序を考慮すると、抗ＰＤ−１抗体は樹状細胞を成熟化する能力は有していないため、抗ＰＤ−１抗体およびｐＨ感受性担体の組み合わせを用いたとしても、ＣＴＬは惹起されず、抗腫瘍効果の増大は望めないものと推定される。【０２４４】
ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体の混合物（図４（Ａ）：５群）と比較して、さらに抗ＰＤ−１抗体の投与を行った群（図４（Ａ）：７群）は、より顕著に腫瘍の増大を抑えた。一部の個体は、腫瘍の消失にまで至っており、本群は特に高い抗腫瘍効果を有していた。抗ＰＤ−１抗体単独（図４（Ａ）：３群）では、目立った抗腫瘍効果を得られなかったことを鑑みると、併用によって腫瘍が著しく減少したことは、驚くべき結果である。単独では抗腫瘍効果が発揮されない程度の抗ＰＤ−１抗体の投与量であっても、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体を含むワクチン組成物および抗ＰＤ−１抗体の併用が強い抗腫瘍効果をもたらすことが示された。ゆえに、ＯＶＡ、ＣｐＧ−ＯＤＮおよびｐＨ感受性担体を含むワクチン組成物および抗ＰＤ−１抗体の併用が相乗的に作用して、強い抗腫瘍効果をもたらしたといえる。抗ＰＤ−１抗体が腫瘍の免疫回避能力を低下させたため、アジュバント組成物によって誘導された多量のＣＴＬが腫瘍を攻撃でき、特に高い抗腫瘍効果を得られたものと考えられる。【０２４５】
さらに、同じ実験系において、アジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤との併用効果を確かめた。【０２４６】
アジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤との併用効果を検証するため、より詳細な比較を行った。結果を図４（Ｂ）に示す。抗ＰＤ−１抗体と自然免疫を活性化する物質との併用（図４（Ｂ）：６群）は、Ｄａｙ１０から腫瘍の増大速度が遅くなって抗腫瘍効果を確認できたが、Ｄａｙ２０では、再び腫瘍容積が増大し、抗ＰＤ−１抗体とアジュバント組成物との併用（図４（Ｂ）：７群）と比べて、小さな効果しか有していなかった。自然免疫を活性化する物質単独では、少量のＣＴＬしか誘導できず、大きな抗腫瘍効果を得られなかったものと考えられる。なお、図５（Ａ）〜（Ｃ）に、各群マウスの腫瘍の様子を示している。図５（Ａ）は３群のマウスであり、図５（Ｂ）は６群のマウスであり、図５（Ｃ）は７群のマウスである。図５の写真からも、アジュバント組成物および抗ＰＤ−１抗体との併用が、非常に高い抗腫瘍効果を奏することがわかる。【０２４７】
以上より、抗ＰＤ−１抗体との併用において、本発明のアジュバント組成物は最も良い併用の効果を示した。【０２４８】
自然免疫を活性化する物質とｐＨ感受性担体のミセルを含むアジュバント組成物は、多量のＣＴＬを誘導することができるため、免疫チェックポイント阻害剤に対して大きな併用効果を有しており、特に高い抗腫瘍効果を実現できることが確認された。アジュバント組成物と免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせは良い相性であり、より効果の高いがん免疫療法の実現に資するものと期待される。【０２４９】
本出願は、２０１７年３月２９日に出願された日本特許出願番号２０１７−０６６１４２号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
【符号の説明】
【０２５０】
１  両親媒性物質、
２  ｐＨ感受性化合物、
３  自然免疫を活性化する物質、
４  アジュバント組成物、
５  抗原、
６  ワクチン組成物、
７  ｐＨ感受性担体、
８  樹状細胞、
９  エンドソーム。
【図１】
2018181542.tif 000007
【図２】
2018181542.tif 000008
【図３】
2018181542.tif 000009
【図４】
2018181542.tif 000010
【図５】
2018181542.tif 000011
【配列表】
2018181542000001.app
【国際調査報告】
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2018181542.tif 000013
2018181542.tif 000014
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