(57)【要約】  アンドロゲンの測定に有用な新規の内部標準物質、前処理を簡略化し得る液体クロマトグラフィー質量分析法を用いた高選択性かつ高感度（正確）なアンドロゲンの測定方法、及び当該アンドロゲンの測定方法を用いる疾患の鑑別法を提供する。  特定の溶媒で還元反応を行うことにより新規な安定同位体標識化合物を合成する。この新規の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用することにより、アンドロゲンを測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学構造式（Ｉ）〜（III）：
【化６】
2019098179.tif 000026
（前記式中、Ｄは重水素を示す）
からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される安定同位体標識化合物。
【請求項２】
試料中のアンドロゲンを液体クロマトグラフィー質量分析により測定するための方法であって、請求項１に記載の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する方法。
【請求項３】
以下の手順：
（手順１）測定対象物質のアンドロゲンを溶媒に溶解して、測定対象標準溶液を作製する手順；
（手順２）請求項１に記載の安定同位体標識化合物を溶媒に溶解して、内標標準溶液を作製する手順；
（手順３）測定すべき試料と、前記手順２で作製された内標標準溶液及び溶媒とを合わせて、測定対象物質濃度測定用試料を作製する手順；
（手順４）測定すべき試料と、前記手順１で作製された測定対象標準溶液及び前記手順２で作製された内標標準溶液とを合わせて、添加回収試験用試料を作製する手順；及び
（手順５）前記手順３で作製された測定対象物質濃度測定用試料及び前記手順４で作製された添加回収試験用試料を、それぞれ、液体クロマトグラフィー質量分析で分析する手順
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンドロゲンが、１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、１１β−ヒドロキシテストステロン、１１−ケトジヒドロテストステロン、テストステロン、及びジヒドロテストステロンからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記手順１に記載の測定対象標準溶液中のアンドロゲンの濃度が０．０１〜２０ｎｇ／ｍＬである、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記手順２に記載の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度が１０ｎｇ／ｍＬである、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、及び１１β−ヒドロキシテストステロンの少なくとも一つを測定することを含む、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つの鑑別法。
【請求項８】
請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の１１−ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別法。
【請求項９】
１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、及び１１β−ヒドロキシテストステロンのいずれかであることを特徴とする、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つを鑑別するためのバイオマーカー。
【請求項１０】
１１−ケトアンドロステンジオンであることを特徴とする、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカー。
【請求項１１】
請求項１に記載の安定同位体標識化合物を製造するための方法であって、以下の工程：
（工程１）以下の式（IV）：
【化７】
2019098179.tif 000027
で表される化合物を、酸化反応に付して、以下の式（Ｉ）：
【化８】
2019098179.tif 000028
で表される化合物を得る工程；
（工程２）前記式（Ｉ）の化合物を、超脱水溶媒に溶解させてから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式（II）：
【化９】
2019098179.tif 000029
で表される化合物を得る工程；及び
（工程３）前記式（IV）の化合物を、超脱水溶媒に溶解してから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式（III）：
【化１０】
2019098179.tif 000030
で表される化合物を得る工程
からなる群から選択されるいずれか一つの工程を含む方法（前記式中、Ｄは重水素を示す）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規安定同位体標識化合物、当該化合物を内部標準物質として使用するアンドロゲンの測定方法、当該測定方法を用いる疾患の鑑別法、当該鑑別法のためのバイオマーカー、及び当該化合物の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アンドロゲンは、男性ホルモン及びこれと同じ生理作用をもつ物質の総称であり、生殖器官の機能維持、胎生期の性分化、雄の第二次性徴の発現、及びタンパク質同化作用の促進などの作用を持つとされている。
化学構造としては、ステロイド誘導体であり、天然にある主なアンドロゲンとして、デヒドロエピアンドロステロン（DHEA）、その硫酸抱合体（DHEAS）、テストステロン（T）、及びアンドロステンジオン（A4）などがあるが、アンドロゲン作用の最も強いのはTの代謝物であるジヒドロテストステロン（DHT）である。
ステロイドホルモンの合成・分泌は視床下部−下垂体−副腎（生殖腺）系の内分泌系で調節され、副腎、精巣、及び卵巣などの器官でステロイド生合成酵素によって厳密に調節されている。【０００３】
しかし、なぜ特定臓器で特定のステロイドホルモンが産生・分泌されるのか、また触媒酵素がどのようにして発現・調節されているかについては不明な点が多く残されている。
特に、内因性のアンドロゲンである１１−ケトテストステロン（11-KT）は、その存在意義については不明な点が多い。近年、11-KTがユニークな性質を持っており、ヒトでも検出される。また前立腺がん等種々の疾患のバイオマーカーになる可能性が示唆されている（非特許文献１〜５)。【０００４】
アンドロゲンの生体内濃度の評価には、液体クロマトグラフィー質量分析法、例えば、高速液体クロマトグラフ（HPLC）とタンデム四重極型質量分析計（MS/MS）とを組み合わせたLC-MS/MSが広く利用されているが、その際、検量線試料と実試料との間のマトリックスの違いに起因するレスポンスの差を補正することを目的に、内部標準物質が使用されている。このような内部標準物質として、例えば、外因性の化合物である安定同位体標識化合物のプロゲステロン−２，２，４，６，６，１７α，２１，２１，２１−ｄ９（PROG-d9）、４−プレグネン−１７α−オール−３，２０−ジオン−２，２，４，６，６，２１，２１，２１−ｄ８（17OHPROG-d８）、テストステロン−１，２−ｄ２（T-d2）、コルチゾール−９，１１，１２，１２−ｄ４（Cortisol-d4）、ドロスピレノン（Drospirenone）、及びゲストデン（Gestodene）が使用されている（非特許文献６)。【０００５】
なお、内部標準物質を用いた内因性のアンドロゲンの測定においては、前処理において固相抽出や誘導体化が必要であった。また、固相抽出にはコストがかかるといった問題があった（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Steroid Biochem Mol. Biol. 166 (2017) 54-67
【非特許文献２】J Clin Endocrinol Metab. 101 (10) (2016) 3582-3591
【非特許文献３】PLoS One 11(7): e0159867. Doi:10.1371/journal.pone.0159867
【非特許文献４】J. Steroid Biochem Mol. Biol. 138 (2013) 312-142
【非特許文献５】Molecular and Cellular Endocrinology 441 (2017) 76-85
【非特許文献６】J. Chromatography B, 1013, 131-138(2016)
【非特許文献７】J. Clin. Endocrinol Metab. 98:1182-1188(2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来は、アンドロゲンについては、テストステロン及びジヒドロテストステロンを測定することで十分であると考えられてきた。しかし、本発明者らは、これらの測定に加えて、アンドロゲン活性を有する代謝物１１−ケトジヒドロテストステロン（11-KDHT）、その前駆体である１１−ケトアンドロステンジオン（11-KA4）及び１１−ケトテストステロン（11-KT）、ならびに一過性代謝物（中間代謝物）である１１β−ヒドロキシテストステロン（11-OHT）の生体内濃度の評価も、アンドロゲンに関連する疾患の解明や薬剤の薬理効果のより正確な判定につながることを見出し、これらの測定方法の開発を試みた。【０００８】
前記の11-KDHT、11-KA4、及び11-KTなどの11-oxyganated C19 steroid（11-ox C19）は、11位が酸化されたアンドロゲンの総称であるが、これまで魚類において研究され、近年ヒトを含む哺乳類の生体内での存在が確認され、その役割が注目されている。しかしながら、これまでにLC-MS/MS及びUPLC-MS/MSを用いた測定法が報告されているが、これらの測定法は内部標準物質に安定同位体標識体を使用していないため、11-ox C19を正確に定量していない懸念があった。
また、内部標準物質として安定同位体標識化合物を使用する場合、前述のPROG-d9、17OHPROG-d8、T-d2、Cortisol-d4、Drospirenone、及びGestodeneは、測定対象物質との保持時間が異なるため、内因性の測定対象物質に対するマトリックス効果を十分に補正することができていなかった。【０００９】
また、11-KA4、11-KT、及び11-OHTについては、それらの測定に有用な内部標準物質が存在しておらず、それらの安定同位体標識化合物の入手が困難であった。そのため、それらの製造を本発明者らは試みたが、非常に困難であった。すなわち、本発明者らは、測定すべきアンドロゲンを重水素化して、当該アンドロゲンの安定同位体標識化合物を製造しようと試みたが、アンドロゲンの特定の位置を重水素化するのが困難であった。また、あらかじめ重水素化した化合物を出発物質として、当該アンドロゲンの安定同位体標識化合物を製造することも試みたが、途中で、重水素が脱落したり、立体異性体が生じたりして、容易に合成することはできなかった。特に、［２，２，４，６，６，１６，１６−Ｄ７］１１−ケトアンドロステンジオン（11-KA4-d7）から［２，２，４，６，６，１６，１６−Ｄ７］１１−ケトテストステロン（11-KT-d7）を得る還元反応では、通常の条件では立体異性体が現れ、所望の収率で11-KT-d7を得ることができなかった。本発明者らは、立体異性体を生じさせない方法として、ラット精巣ミクロソームを利用した生合成も試みたが、前記の方法に比べて収率は低く、一回の反応に使用できる量も少量であった（化学合成の1/10000程度）。【００１０】
安定同位体標識した誘導体化試薬を用いて、誘導体化反応により測定対象物質の安定同位体標識誘導体を作製する方法もあるが、前処理操作が煩雑になること、また全ての測定対象物質の構造に共通するカルボニル基に対するオキシム誘導体化は、立体異性を持つ誘導体を生じさせ、生成するピークが複数に分裂するため、ｍ／ｚや構造が近い測定対象物質の場合、オキシム誘導体化により他の測定対象物質やマトリックス中のその他の内因性ステロイドとのスペクトルグラム上でのピーク分離が複雑化することで解析が煩雑又は不可能であった。【００１１】
本発明の課題は、アンドロゲンの測定に有用な新規の内部標準物質を提供することにある。
本発明の課題は、また、前処理を簡略化し得る、液体クロマトグラフィー質量分析法、特にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた、高選択性かつ高感度（正確）なアンドロゲンの測定方法を提供することにもある。
本発明の課題は、さらに、上記アンドロゲンの測定方法を用いる疾患の鑑別法を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、アンドロゲンを測定するための内部標準物質として使用し得る新規な安定同位体標識化合物を、特定の溶媒で還元反応を行うことで、効率よく合成することに成功した。本発明者らは、この新規の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用することにより、前処理を簡略化することや、高選択的にかつ高感度（正確）にアンドロゲンを測定することが可能となることを見出した。また、本発明者らは、この測定方法を用いて、健常者、ならびに前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、又は糖尿病性腎症の患者のアンドロゲンを測定したところ、健常者と比較して、これら患者において１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、１１β−ヒドロキシテストステロン、及び１１β−ヒドロキシアンドロステンジオンが低値又は高値（特に、高値）を示すことも見出した。
以上の知見をもとに、本発明者らは本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１３】
〔１〕
以下の化学構造式（Ｉ）〜（III）：
【化１】
2019098179.tif 000002
（前記式中、Ｄは重水素を示す）
からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される安定同位体標識化合物。
〔２〕
試料中のアンドロゲンを液体クロマトグラフィー質量分析により測定するための方法であって、前記項目〔１〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔１１〕に記載の式（IV）で表される安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する方法。
〔３〕
以下の手順：
（手順１）測定対象物質のアンドロゲンを溶媒に溶解して、測定対象標準溶液を作製する手順；
（手順２）前記項目〔１〕に記載の安定同位体標識化合物又は後記項目〔１１〕に記載の式（IV）で表される安定同位体標識化合物を溶媒に溶解して、内標標準溶液を作製する手順；
（手順３）測定すべき試料と、前記手順２で作製された内標標準溶液及び溶媒とを合わせて、測定対象物質濃度測定用試料を作製する手順；
（手順４）測定すべき試料と、前記手順１で作製された測定対象標準溶液及び前記手順２で作製された内標標準溶液とを合わせて、添加回収試験用試料を作製する手順；及び
（手順５）前記手順３で作製された測定対象物質濃度測定用試料及び前記手順４で作製された添加回収試験用試料を、それぞれ、液体クロマトグラフィー質量分析で分析する手順
を含む、前記項目〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記アンドロゲンが、１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、１１β−ヒドロキシテストステロン、１１−ケトジヒドロテストステロン、テストステロン、ジヒドロテストステロン、及び１１β−ヒドロキシアンドロステンジオンからなる群から選択される少なくとも一つである、前記項目〔２〕又は〔３〕に記載の方法。
〔５〕
前記手順１に記載の測定対象標準溶液中のアンドロゲンの濃度が０．０１〜２０ｎｇ／ｍＬである、前記項目〔３〕又は〔４〕に記載の方法。
〔６〕
前記手順２に記載の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度が１０ｎｇ／ｍＬである、前記項目〔３〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕
前記項目〔２〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、１１β−ヒドロキシテストステロン、及び１１β−ヒドロキシアンドロステンジオンの少なくとも一つを測定することを含む、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つの鑑別法。
〔８〕
前記項目〔２〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、試料中の１１−ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別法。
〔９〕
１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、１１β−ヒドロキシテストステロン、及び１１β−ヒドロキシアンドロステンジオンのいずれかであることを特徴とする、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症の少なくとも一つを鑑別するためのバイオマーカー。
〔１０〕
１１−ケトアンドロステンジオンであることを特徴とする、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカー。
〔１１〕
前記項目〔１〕に記載の安定同位体標識化合物を製造するための方法であって、以下の工程：
（工程１）以下の式（IV）：
【化２】
2019098179.tif 000003
で表される化合物を、酸化反応に付して、以下の式（Ｉ）：
【化３】
2019098179.tif 000004
で表される化合物を得る工程；
（工程２）前記式（Ｉ）の化合物を、超脱水溶媒に溶解させてから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式（II）：
【化４】
2019098179.tif 000005
で表される化合物を得る工程；及び
（工程３）前記式（IV）の化合物を、超脱水溶媒に溶解してから、超脱水溶媒に溶解させた還元剤を用いる還元反応に付して、以下の式（III）：
【化５】
2019098179.tif 000006
で表される化合物を得る工程
からなる群から選択されるいずれか一つの工程を含む方法（前記式中、Ｄは重水素を示す）。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用する液体クロマトグラフィー質量分析により、アンドロゲン、特に１１−ケトアンドロステンジオン（11-KA4）、１１−ケトテストステロン（11-KT）、１１β−ヒドロキシテストステロン（11-OHT）、及び１１β−ヒドロキシアンドロステンジオン（11-OHA4）の高選択性かつ高感度な測定を可能にする。本発明の安定同位体標識化合物によれば、アンドロゲンの生体内での代謝の流れ（産生速度及び消失速度）を明らかにすることができる。特に、本発明の安定同位体標識化合物は、重水素化された位置、すなわち標識位置が明確であるので、代謝物の構造予想に有利に働く。また、本発明の安定同位体標識化合物を内部標準物質として使用することで、簡便な前処理での測定も可能となった。
また、本発明によれば、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症、特に前立腺がん及び去勢抵抗性前立腺がんの鑑別も可能となった。
さらに、本発明の製造方法によれば、還元反応において超脱水の有機溶媒を用いることで、原料の重水素化化合物から重水素が脱離したり、立体異性体が生じたりすることが抑えられ、良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】健常ヒト血漿及び疾患別患者血漿中11-OHT濃度を示す図である。
【図２】健常ヒト血漿及び疾患別患者血漿中11-KA4濃度を示す図である。
【図３】健常ヒト血漿及び疾患別患者血漿中11-KT濃度を示す図である。
【図４】健常ヒト血漿及び疾患別患者血漿中は11-OHA4濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の安定同位体標識化合物は、前記項目〔１〕の化学構造式からなる群から選択されるいずれか一つの式で表される。前記の化学構造式で表される化合物の名称及び略称を以下の表に示す。
【００１７】
【表１】
2019098179.tif 000007
【００１８】
本発明の安定同位体標識化合物は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）による試料中のアンドロゲンの測定に内部標準物質として使用することができる。
本発明の安定同位体標識化合物は、液体クロマトグラフィー質量分析において、慣用の手順、例えば、前記項目〔３〕の手順で使用することができる。
【００１９】
本発明の測定方法において測定対象物質となるアンドロゲンは、特に制限されず、内因性のものでも外因性のものでもよく、１１−ケトアンドロステンジオン（11-KA4）、１１−ケトテストステロン（11-KT）、１１β−ヒドロキシテストステロン（11-OHT）、１１−ケトジヒドロテストステロン（11-KDHT）、テストステロン（T）、ジヒドロテストステロン（DHT）、１１β−ヒドロキシアンドロステンジオン（11-OHA4）などが例示される。
特に、高選択的にかつ高感度（正確）な測定が行える点から、測定対象物質は、好ましくは１１−ケトアンドロステンジオン（11-KA4）、１１−ケトテストステロン（11-KT）、１１β−ヒドロキシテストステロン（11-OHT）、１１−ケトジヒドロテストステロン（11-KDHT）、テストステロン（T）、及びジヒドロテストステロン（DHT）であり、より好ましくは１１−ケトアンドロステンジオン（11-KA4）、１１−ケトテストステロン（11-KT）、及び１１β−ヒドロキシテストステロン（11-OHT）である。
とりわけ、内部標準物質として11-KA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は１１−ケトアンドロステンジオン（11-KA4）が好ましく；内部標準物質として11-KT-d7が使用される場合は、測定対象物質は１１−ケトテストステロン（11-KT）が好ましく；内部標準物質として11-OHT-d7が使用される場合は、測定対象物質は１１β−ヒドロキシテストステロン（11-OHT）が好ましく；内部標準物質としては11-OHA4-d7が使用される場合は、測定対象物質は１１β−ヒドロキシアンドロステンジオン（11-OHA4）が好ましく；内部標準物質としてはT-d3が使用される場合は、測定対象物質はテストステロン（T）が好ましく；内部標準物質としてはDHT-d3が使用される場合は、測定対象物質はジヒドロテストステロン（DHT）が好ましい。
本発明においては、測定対象物質となるアンドロゲンは１種でもいいし、２種以上であってもよい。本発明においては、一度に、２種以上のアンドロゲンを測定することができる。また、このような際には、本発明の安定同位体標識化合物は、２種以上組み合わせて内部標準物質として使用してもよく、ならびに／あるいは他の内部標準物質、例えば、T-d3、DHT-d3、又は11-OHA4-d7と併用してもよい。
【００２０】
前記手順１〜３で使用される溶媒は、液体クロマトグラフィー質量分析用の試料作製に慣用されるものであれば、特に制限されず、アセトニトリル、アセトン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、１−プロパノール、２−プロパノールなどの有機溶媒が例示される。高選択的にかつ高感度（正確）な測定が行える点からアセトニトリルが好ましい。
【００２１】
前記手順１の測定対象物質標準溶液中のアンドロゲンの濃度は、特に限定されないが、高選択的にかつ高感度（正確）な測定が行える点から、好ましくは０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０１〜５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．０１〜２０ｎｇ／ｍＬである。
【００２２】
前記手順２の内標標準溶液中の安定同位体標識化合物の濃度は、特に限定されないが、高選択的にかつ高感度（正確）な測定が行える点から、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬである。
【００２３】
本発明において、液体クロマトグラフィー質量分析によるアンドロゲンの測定には、アンドロゲンの検出及び／又は定量が含まれる。
【００２４】
本発明で使用される液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）とは、液体クロマトグラフと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表し、ＬＣ−ＭＳ/ＭＳ、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ/ＭＳ、ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ/ＭＳ等が例示され、好ましくはＬＣ−ＭＳ/ＭＳである。これらの測定自体は一般的な方法によることができる。
【００２５】
ＬＣ−ＭＳにおけるイオン化は、例えば、大気圧化学イオン化法（Atmospheric Pressure Chemical Ionization）、ＥＳＩ、ＡＰＰＩ等が挙げられるが、中でも、正イオン検出ＥＳＩを用いることが望ましい。
【００２６】
また、質量分析部には、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、本発明では、定量性が良く、ダイナミックレンジも広く直線性も良好な四重極型を使用することが好ましい。
【００２７】
さらに、定量におけるイオンの検出としては、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリング（Selected Ion Monitoring）や、１つ目の質量分析部で生成したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（Selected Reaction Monitoring：ＳＲＭ）等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル／ノイズ比が向上するＳＲＭによる測定が好ましい。
【００２８】
さらに、本発明の測定方法において、「測定すべき試料」とは、特に限定はなく、生物、環境、又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、汗、尿、糞、胆汁、組織、生体細胞、組織又は細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、食料品、医薬品等が挙げられる。中でも、生体由来試料として、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、組織及び生体細胞等が、環境由来試料としては、廃水、河川水等が、工業製品由来試料としては、医薬品等が好ましい。
【００２９】
本発明の測定方法は、試料中の１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、１１β−ヒドロキシテストステロン、及び１１β−ヒドロキシアンドロステンジオン（以下、総称して「本発明バイオマーカー」ともいう）の少なくとも一つ、好ましくは１１−ケトアンドロステンジオンを測定することにより、前立腺肥大症、前立腺がん、去勢抵抗性前立腺がん、多嚢胞性卵胞症候群、糖尿病、及び糖尿病性腎症（以下、総称して「鑑別対象疾患」ともいう）の少なくとも一つ、好ましくは前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの鑑別のために使用することができる。
【００３０】
具体的には、本発明の測定方法を用いて、被検体及び対照体からのそれぞれの試料中の本発明バイオマーカーの少なくとも一つを測定し、得られた被検体の測定値と対照体の測定値とを対比することにより、鑑別対象疾患の罹患の有無を鑑別することができる。例えば、被検体の測定値が対照体の測定値よりも、統計学的手法により有意に差があれば、例えば低いか又は高ければ、特に高ければ、当該被検体は鑑別対象疾患に罹患していると鑑別することができる。
【００３１】
本発明の鑑別法において、「被検体」とはヒトを含む動物をいい、また「対照体」とは鑑別対象疾患に罹患していないと診断されたヒトを含む動物をいう。「試料」としては、例えば、血液、唾液、涙液、汗、尿、糞、胆汁、組織、生体細胞、組織又は細胞培養液又は臓器から得られる調製物を挙げることができる。
【００３２】
本発明では、１１−ケトアンドロステンジオン、１１−ケトテストステロン、１１β−ヒドロキシテストステロン、及び１１β−ヒドロキシアンドロステンジオン、特に１１−ケトアンドロステンジオンは、鑑別対象疾患の少なくとも一つ、特に前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんを鑑別するためのバイオマーカーとして使用することができる。
【００３３】
本発明は、本発明の安定同位体標識化合物を含む、本発明の測定方法に使用するための測定用キットにも関する。
また、本発明は、本発明の安定同位体標識化合物を含む、本発明の鑑別法に使用するための鑑別用キットにも関する。
【００３４】
本発明の方法のために用いるキットは、本発明の安定同位体標識化合物を含むが、それ以外に、緩衝液、酸、塩基、アルコール、本発明のバイオマーカーなどのアンドロゲン、注射器、及び測定手順を記載した文書から選択される少なくとも１つを含むことができる。これらに加えて、本発明の鑑別法のために用いるキットは、さらに、判定基準を記載した文書を含むことができる。
【００３５】
より、詳細には、本発明の「鑑別用キット」には、被検体からの試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値と、対照体及び鑑別対象疾患患者の試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値とを対比して、鑑別対象疾患を鑑別するために必要な手段が含まれ、例えば、被検体からの試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定手段として、試料の採取用具、カラムカートリッジ等、及び、被検体からの試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値と対照体及び鑑別対象疾患患者の試料中に存在する本発明バイオマーカーの少なくとも一つの測定値とを対比する手段として、対照体及び鑑別対象疾患患者のそれぞれの測定値の対比表が挙げられる。中でも、当該対比表は、医師の判断によらなくとも鑑別対象疾患を鑑別することが可能となるものであり、特に有用である。
【００３６】
本発明は、本発明の測定方法を用いて、試料中の本発明バイオマーカーの少なくとも一つ、特に１１−ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、鑑別対象疾患、特に前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの治療又は予防剤のスクリーニング方法にも関する。
本発明は、特に、本発明の測定方法を用いて、試料中の１１−ケトアンドロステンジオンを測定することを含む、前立腺がん又は去勢抵抗性前立腺がんの治療又は予防剤のスクリーニング方法にも関する。
【００３７】
本発明の安定同位体標識化合物は、前記項目〔１１〕の方法で効率よく合成することができる。すなわち、前記項目〔１１〕の方法では、還元反応において超脱水の有機溶媒を用いることにより、原料の重水素化化合物から重水素が脱離したり、立体異性体が生じたりすることが抑えられ、良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物を得ることができる。
【００３８】
前記項目〔１１〕の工程１での酸化反応は、ヒドロキシル基をカルボニル基に変換させる酸化反応であれば、特に制限されず、デス・マーチン酸化、ジョーンズ酸化、スワン酸化が例示される。好ましくはデス・マーチン酸化である。
デス・マーチン酸化は慣用の手法で行い得るが、例えば以下の方法で行ってもよい。
先ず、式（IV）の化合物：［２，２，４，６，６，１６，１６−Ｄ７］１１β−ヒドロキシアンドロステンジオン（11-OHA4-d7）を溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。この11-OHA4-d7溶液にデス・マーチン酸化用試薬を添加して、例えば室温にて、適切な時間、例えば約１０〜約６０分間、好ましくは約３０分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式（Ｉ）の化合物（11-KA4-d7）を単離する。
上記のデス・マーチン酸化用試薬は、慣用の試薬を使用してもよく、例えば、デス・マーチン過ヨウ素酸と呼ばれる１，１，１−トリアセトキシ−１，１−ジヒドロ−１，２−ベンズヨードキソール−３（１Ｈ）−オンを使用することができる。
また、上記の溶媒は、デス・マーチン酸化に慣用されるものであれば特に制限されず、例えば、有機溶媒、好ましくはジクロロメタンを使用することができる。
【００３９】
前記項目〔１１〕の工程２及び３での還元反応は、カルボニル基をヒドロキシル基に変換させる還元反応であれば、特に制限されず、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を還元剤として用いる還元、接触還元、水素化アルミニウムリチウム（ＬiＡｌＨ４）が例示される。好ましくは水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として用いる還元である。
これらの工程で使用される超脱水溶媒は、水分含有量が０．００１％（１０ｐｐｍ）以下まで抑えられた溶媒であれば特に制限されず、メタノール、エタノールなどのアルコール；ならびにベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレンなどの芳香族炭化水素から選択された有機溶媒を超脱水したものが例示される。良好な収率で本発明の安定同位体標識化合物が得られることから、超脱水メタノール及び超脱水ベンゼンが好ましく、特に原料の重水素化化合物を超脱水芳香族炭化水素、とりわけ超脱水ベンゼンに溶解させるのが好ましく、還元剤を超脱水アルコール、とりわけ超脱水メタノールに溶解させるのも好ましい。
【００４０】
また、前記の工程２及び３での還元反応では、超脱水していない溶媒を超脱水溶媒と併用してもよい。特に、超脱水していない溶媒は、原料の重水素化化合物を超脱水溶媒で溶解する際に併用されるのが好ましい。
超脱水していない溶媒としては、ピリジンが挙げられる。
【００４１】
前記項目〔１１〕の工程２及び３において水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として用いる還元は、慣用の手法で行い得るが、以下の方法によって行ってもよい。
すなわち、工程２は、先ず、式（Ｉ）の化合物（11-KA4-d7）を超脱水溶媒に溶解して11-KA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してＮａＢＨ４溶液を得る。そして、11-KA4-d7溶液にＮａＢＨ４溶液を、例えば約１〜約１０分間、好ましくは約５分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約１０〜約６０分間、好ましくは約３０分間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式（II）の化合物（11-KT-d7）を単離する。
工程３は、先ず、式（IV）の化合物（11-OHA4-d7）を超脱水溶媒に溶解して11-OHA4-d7溶液を得る。一方、水素化ホウ素ナトリウムを超脱水溶媒に溶解してＮａＢＨ４溶液を得る。そして、11-OHA4-d7溶液にＮａＢＨ４溶液を、例えば約５〜約３０分間、好ましくは約１５分間かけて滴下し、続けて、例えば氷冷下で、適切な時間、例えば約１０〜約１００分間、好ましくは約１時間撹拌して反応させる。反応終了後、反応液から慣用の手法にて反応生成物である式（III）の化合物（11-OHT-d7）を単離する。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、実施例に用いた装置及び材料は以下の通りである。【００４３】
１．安定同位体標識化合物の製造
11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を合成した。
(1)  材料
以下の材料を使用した。
【表２】
2019098179.tif 000008
【表３】
2019098179.tif 000009
【表４】
2019098179.tif 000010
【００４４】
試薬は特級又はＨＰＬＣ用規格品もしくはそれと同等以上のものを用いた。また、水には精製水を「超純水製造装置（M/EQM/717）」で処理したものを用いた。【００４５】
(2)  設備・機器
以下の設備・機器を使用した。
【表５】
2019098179.tif 000011
【００４６】
(3)  製造
実施例１  11-KA4-d7の製造
11-OHA4-d7を１５ｍｇ秤取し、ジクロロメタン５ｍＬに溶解した。得られた溶液にデス−マーチン過よう素酸１ｍＬを加えて、室温で３０分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和ＮａＨＣＯ３を３ｍＬ加えた。次に、この溶液にジクロロメタン５ｍＬを加えて抽出し有機層を得た。ジクロロメタン５ｍＬの抽出をさらに２回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を窒素気流下溶媒留去し残渣を得た。得られた残渣をクロロホルム：アセトン（１０：１）のＴＬＣで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣１０．７５ｍｇを得た（11-KA4-d7として収率７１．２％）。これをＮＭＲ分析に供した。【００４７】
実施例２  11-KT-d7の製造
11-OHA4-d7を４０ｍｇ秤取し、ジクロロメタン１０ｍＬに溶解した。得られた溶液にデス−マーチン過よう素酸１ｍＬを加えて、室温で３０分間撹拌した。撹拌後、得られた溶液に飽和ＮａＨＣＯ３を６ｍＬ加えた。次に、この溶液にジクロロメタン６ｍＬを加えて有機層を得た。ジクロロメタン１０ｍＬを用いてさらに抽出し、有機層を得た。ジクロロメタン１０ｍＬを用いた抽出をさらに２回繰り返した。有機層を合せて無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過し、得られた濾液を減圧下溶媒留去し残渣６３．２ｍｇを得た。得られた残渣をクロロホルム：アセトン（１０：１）のＴＬＣで精製し、11-KA4相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を窒素気流下溶媒留去し残渣３７．５ｍｇを得た（11-KA4-d7として収率９４．６９％）。
このようにして得られた残渣を３ｍＬのベンゼン（超脱水）と２ｍＬのピリジンに溶解し11-KA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方で、５ｍｇのＮａＢＨ４を５ｍＬのメタノール（超脱水）に溶解し、得られた溶液を上記の11-KA4-d7溶液に５分間かけて滴下し、続けて氷冷下３０分間撹拌して反応させた。反応終了後、反応液に氷酢酸２ｍＬを加えて過剰のＮａＢＨ４を分解した。減圧下、反応液の溶媒を留去し残渣６３．２ｍｇを得た。得られた残渣をクロロホルム：アセトン（１０：１）のＴＬＣで精製し、11-KT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出した。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下、溶媒留去し残渣３７．１ｍｇを得た（11-KA4-d7を原料とし、11-KT-d7として収率９８．４％）。これをＮＭＲ分析に供した。【００４８】
実施例３  11-OHT-d7の製造
11-OHA4-d7の１５ｍｇを１．５ｍＬのベンゼン（超脱水）と１ｍＬのピリジンに溶解し11-OHA4-d7溶液を得、これを氷冷した。一方、５ｍｇのＮａＢＨ４を５ｍＬのメタノール（超脱水）に溶解し、得られた溶液を上記の11-OHA4-d7溶液に１５分間かけて滴下した。１時間氷冷下で撹拌して反応させ、反応終了後、氷酢酸２ｍＬを加えて過剰のＮａＢＨ４を分解した。減圧下、溶媒を留去した。得られた残渣をベンゼン：アセトン（３：１）のＴＬＣで精製し、11-OHT相当画分を剥離して酢酸エチルで溶出させた。得られた酢酸エチル溶出液を減圧下溶媒留去し残渣１６．７ｍｇを得た（11-OHT-d7として収率１１０．６％）。これをＮＭＲ分析に供した。【００４９】
(4)  ＮＭＲ分析
実施例１〜３で製造された化合物について、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ測定ならびに精密質量測定を行った。その結果を以下の表に示す。【００５０】
【表６】
2019098179.tif 000012
【００５１】
【表７】
2019098179.tif 000013
【００５２】
表６及び７に示した結果から、実施例１〜３で製造された化合物の構造、標識位置、及び標識化率を確認した。その結果、実施例１〜３において、目的とする安定同位体標識化合物11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7が製造されたことを確認することができた。いずれもＤ０体の混入はみられなかった。【００５３】
２．アンドロゲンの測定（１）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1)  試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1  測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン（T）、ジヒドロテストステロン（DHT）、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン（11-OHA4）、11β-ヒドロキシテストステロン（11-OHT）、11-ケトアンドロステンジオン（11-KA4）、11-ケトテストステロン（11-KT）、及び11-ケトジヒドロテストステロン（11-KDHT）を使用した。
(1)-2  内部標準物質
内部標準物質（ＩＳ）として、市販のT-d3（CDN ISOTOPES製）、DHT-d3（CDN ISOTOPES製）、及び11-OHA4-d7（CDN ISOTOPES製）；ならびに前記実施例１〜３で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3  測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ＩＳをそれぞれアセトニトリルに溶解して１ｍｇ／ｍＬ保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して１０μｇ／ｍＬ測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ＩＳの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して１０μｇ／ｍＬ  ＩＳ混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を０．０１〜２０ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した。また、上記のＩＳ混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を１０ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した。
(1)-4  ヒト血漿
ヒト血漿として、KAC（BIOPREDIC）より購入した個体別ヒト血漿（男女各３検体）を等量混合したプール血漿を使用した。
(1)-5  試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は特級又はＨＰＬＣ用規格品もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。【００５４】
(2)  試験方法
(2)-1  ブランク試料
アセトニトリル１００μＬの入った１．５ｍＬ  ＰＰチューブに水５０μＬを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2  ゼロ試料
アセトニトリル５０μＬ及び内標標準溶液５０μＬの入った１．５ｍＬ  ＰＰチューブに水５０μＬを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3  検量線用標準試料
アセトニトリル５０μＬ、測定対象標準溶液５０μＬ及び内標標準溶液５０μＬの入った１．５ｍＬ  ＰＰチューブに水５０μＬを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4  ヒト血漿試料
ヒト血漿を５０μＬずつ分取し、内標標準溶液５０μＬ及びアセトニトリル５０μＬを加えて測定対象物質濃度測定用試料（測定対象物質濃度ＱＣ、ｎ＝３）を調製した。
また、ヒト血漿を５０μＬずつ分取し、内標標準溶液５０μＬ及び測定対象標準溶液５０μＬを加えて添加回収試験用試料（低濃度ＱＣ：０．１ｎｇ／ｍＬ及び中濃度ＱＣ：１ｎｇ／ｍＬ、高濃度ＱＣ：１０ｎｇ／ｍＬ、各ｎ＝３）を調製した。
(2)-5  液／液抽出（Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction）
前記の調製した各試料に５ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム５０μＬを加えて攪拌したのち毎分１２，０００回転で２分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は以下に示す。【００５５】
(2)-6  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
(a)  ＬＣ部
装置：Nexera X2（島津製作所）
分析カラム：Kinetex  ２．６μｍ  EVO  Ｃ１８  （２．６μｍ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）、（Phenomenex）
カラム温度：４５°Ｃ
移動相：Ａ  ０．０５ｖｏｌ％酢酸水溶液、Ｂ  アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）（Wako）
【表８】
2019098179.tif 000014
【００５６】
(b)  ＬＣ部
【表９】
2019098179.tif 000015
【表１０】
2019098179.tif 000016
【００５７】
(c)  データ解析部
制御コンピュータ：OPTIPLEX 9010 (J3LPQ02 DELL)
解析コンピュータ：OPTIPLEX 9010 (3XKPQ02 DELL)
解析ソフトウエア：Analyst1.6.2 (AB SCIEX)【００５８】
(2)-7  解析
検量線はピーク面積比（測定対象物質／ＩＳ）を添加濃度に対してプロットし、重み付け１／ｘ２の回帰直線を求めた。
検量線用標準試料の添加濃度に対する真度は以下の式から算出した。
添加濃度に対する真度（％）＝検量線用標準試料の逆回帰濃度／添加濃度×１００
精度は以下の式から算出した。
精度（％）＝標準偏差／平均値×１００
添加回収試験における理論値及び真度は以下の式から算出した。
理論値（ｎｇ／ｍＬ）＝測定対象物質濃度の平均値＋添加濃度
真度（％）＝平均値／理論値×１００【００５９】
(3)  結果
実施例１〜３で製造された安定同位体標識化合物を内部標準物質として用いて測定した結果を以下の表１１〜１４に示す。【００６０】
【表１１】
2019098179.tif 000017
【００６１】
【表１２】
2019098179.tif 000018
【００６２】
【表１３】
2019098179.tif 000019
【００６３】
【表１４】
2019098179.tif 000020
【００６４】
前記の表１１〜１４から、実施例１〜３の安定同位体標識化合物を内部標準物質として用いると、前処理を簡略化し得る手法にて、高選択性かつ高感度なアンドロゲンの測定が可能であることが認められた。特に、再現性：Precision（精度）及びAccuracy（真度）をT-d3と比較すると、11-OHT-d7が高精度で高感度に測定可能であることが示された（表１３及び１４）。【００６５】
３．アンドロゲンの測定（２）
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いてヒト血漿中のアンドロゲン濃度を測定した。
(1)  試験材料
以下の材料を使用した。
(1)-1  測定対象標準物質
測定対象標準物質として、市販のテストステロン（T）、ジヒドロテストステロン（DHT）、11β-ヒドロキシアンドロステンジオン（11-OHA4）、11β-ヒドロキシテストステロン（11-OHT）、11-ケトアンドロステンジオン（11-KA4）、11-ケトテストステロン（11-KT）、及び11-ケトジヒドロテストステロン（11-KDHT）を使用した。
(1)-2  内部標準物質
内部標準物質（ＩＳ）として、市販のT-d3（Sigma-Aldrich製）、DHT-d3（Sigma-Aldrich製）、及び11-OHA4-d7（C/D/N ISOTOPES製）；ならびに前記実施例１〜３で得られた11-KA4-d7、11-KT-d7、及び11-OHT-d7を使用した。
(1)-3  測定対象標準溶液及び内標標準溶液
各測定対象標準物質及び各ＩＳをそれぞれアセトニトリルに溶解して１ｍｇ／ｍＬ保存原液を調製した。次いで、各測定対象標準物質の保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して１０μｇ／ｍＬ測定対象混合保存溶液を調製した。同様に各ＩＳの保存原液を混合し、アセトニトリルで希釈して１０μｇ／ｍＬ  ＩＳ混合保存溶液を調製した。これら各混合保存溶液は冷蔵庫に保存した。
次に、上記の測定対象混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、測定対象標準溶液を０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した。また、上記のＩＳ混合保存溶液をアセトニトリルで希釈して、内標標準溶液を２ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した。
(1)-4  ヒト血漿
健常ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー（BIOPREDIC）より購入した個体別ヒト血漿（男女各６検体）を使用した。
患者由来ヒト血漿として、株式会社ケー・エー・シー（ProteoGenex）より購入した、前立腺肥大症患者（男性６検体）、前立腺がん患者（男性６検体）、去勢抵抗性前立腺がん患者（男性２検体）、多嚢胞性卵胞症候群患者（女性６検体）、糖尿病患者（男性５検体）、及び糖尿病性腎症患者（男性７検体）を使用した。
(1)-5  試薬等
水は蒸留水を超純水製造装置で処理して用いた。その他の試薬は、特級、又はＨＰＬＣ用規格、分子生物学用規格、もしくはそれと同等以上の市販品を用いた。【００６６】
(2)  試験方法
(2)-1  ブランク試料
アセトニトリル１００μＬの入った１．５ｍＬ  ＰＰチューブに水５０μＬを加えて攪拌し、ブランク試料を調製した。
(2)-2  ゼロ試料
アセトニトリル５０μＬ及び内標標準溶液５０μＬの入った１．５ｍＬ  ＰＰチューブに水５０μＬを加えて攪拌し、ゼロ試料を調製した。
(2)-3  検量線用標準試料
前記の０．０１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で調製した各測定対象標準溶液５０μＬ及び内標標準溶液５０μＬの入った１．５ｍＬ  ＰＰチューブに水５０μＬを加えて攪拌し、検量線用標準試料を調製した。
(2)-4  ヒト血漿試料
健常ヒト血漿及び患者由来ヒト血漿５０μＬにアセトニトリル５０μＬ及び内標標準溶液５０μＬを添加して調製した。
(2)-5  液／液抽出（Salting-out Assisted Liquid/Liquid Extraction）
前記の調製した各試料に５ｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム５０μＬを加えて攪拌した後、４℃、毎分１３，０００回転で５分間遠心分離した。得られた上清をサンプル瓶に分取してＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの条件は以下に示す。【００６７】
(2)-6  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
(a)  ＬＣ部
装置：Nexera X2（島津製作所）
分析カラム：Kinetex  ２．６μｍ  EVO  Ｃ１８  （２．６μｍ、４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）、（Phenomenex）
カラム温度：４５°Ｃ
移動相：Ａ  ０．０５ｖｏｌ％酢酸水溶液、Ｂ  アセトニトリル（ＬＣ／ＭＳ用）（Wako）【００６８】
【表１５】
2019098179.tif 000021
【００６９】
(b)  ＬＣ部
【表１６】
2019098179.tif 000022
【表１７】
2019098179.tif 000023
【００７０】
(c)  データ解析部
解析コンピュータ：OPTIPLEX 9010 (DELL)
解析ソフトウエア：Analyst1.6.2 (AB SCIEX)【００７１】
(2)-7  解析
(a)  アンドロゲン濃度の算出
検量線はピーク面積比（測定対象物質／ＩＳ）を添加濃度に対してプロットし、重み付け１／ｘ２の回帰直線を求めた。
(b)  検量線及び定量下限の評価
作成した検量線（各濃度ｎ＝１）の判断基準は、個々の検量線用標準試料の真度が定量下限において８０．０〜１２０．０％、それ以外で８５．０〜１１５．０％である試料が、全検量線用標準試料の３／４以上、定量下限及び上限を含む試料とした。【００７２】
(3)  結果
検討した測定対象の検量線は良好な直線性を示し、また、定量下限は、T、DHT、11-OHT、11-KA4、及び11-KTが0.01ng/mL、11-OHA4が0.02ng/mL、11-KDHTが0.1ng/mLだった（表１８）。
ISに各測定対象の安定同位体標識体を使用した場合、ISにT-d3を使用した場合と比較して、前記項目「２．アンドロゲンの測定（１）」と同様に、精度及び真度の改善がみられた（但し、11-KDHTは安定同位体標識体がないため、11-KT-d7をISに使用して解析した）。血漿中アンドロゲン濃度を、各測定対象の安定同位体標識体をISに使用して求めた。
血漿中アンドロゲン濃度の平均値及び標準偏差は、Microsoft Excel 2016（Microsoft Corporation）により算出し、以下の表１９に表示した。個体別値に定量下限未満（Lower limit of quantification, LLOQ）を含む場合は、以下のように平均値及び標準偏差を算出又は表示した。
・半数例未満がLLOQの場合には、LLOQを０として平均値のみを算出した。
・半数例以上がLLOQの場合には、平均値及び標準偏差を算出せずNC（not calculated）として表示した。【００７３】
【表１８】
2019098179.tif 000024
【００７４】
【表１９】
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【００７５】
本測定法を用いて、健常男女の血漿、ならびに前立腺肥大症（BPH）、前立腺がん（PCa）、去勢抵抗性前立腺がん（CRPC）、多嚢胞性卵胞症候群（PCOS）、糖尿病（DM）及び糖尿病性腎症（DMN）の患者血漿中アンドロゲン濃度を測定した（表１９及び図１〜４）。健常者の血漿と比較して、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中では11-KA4が高濃度に検出され、特にCRPCで高かった。また、11-OHA4濃度も健常者の血漿と比較して、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中で高かった。
BPH、PCa、及びCRPC患者の血漿中11-KT濃度は健常男性の1.6〜2.1倍高かった。PCOS患者の血漿中T及び11-KT濃度はそれぞれ健常女性の2.0倍及び1.8倍高く、PCOSのアンドロゲン過剰症状を反映した結果が得られた。DM及びDMN男性患者の血漿中T濃度は健常男性と比較して低値を示した。
以上の結果から、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMN患者の血漿中では11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が上昇しており、これらの疾患のバイオマーカーとして11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が利用できる可能性が示唆された。特に、11-KA4がバイオマーカーとして有効であり、とりわけ、CRPC（去勢抵抗性前立腺癌）とPCa（前立腺癌）を差別化することが可能と考えられた。【００７６】
各測定対象の安定同位体標識体をISに使用することで、より正確な定量を可能とする血漿中アンドロゲン測定法が開発できたことが示された。本測定法を用いて健常ヒト血漿及び疾患別患者血漿を測定した結果、11-OHT、11-KA4、11-KT、及び11-OHA4が、BPH、PCa、CRPC、PCOS、DM、及びDMNのバイオマーカーとして利用できる可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の測定方法によれば、試料中のアンドロゲンの有無を検出したり、その量を定量したりすることができる。それによって、特定の疾患の診断又は鑑別のためのバイオマーカーとして使用できる。
本発明は、例えば、医学、薬学、生化学、公衆衛生、食品検査等の分野で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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