(57)【要約】  本開示は、雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを脊椎動物の精巣に注入することを含む方法等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の精巣内の雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入するための、アデノ随伴ウイルスベクターを含む組成物。
【請求項２】
雄性不妊症を治療するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脊椎動物がヒトである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを非ヒト脊椎動物の精巣に注入することを含む方法。
【請求項６】
雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドが導入された非ヒト脊椎動物を製造する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを非ヒト脊椎動物の精巣に注入することを含む方法。
【請求項７】
アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
雄性生殖細胞が精子幹細胞である、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
脊椎動物が血液精巣関門を有する、請求項５〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
アデノ随伴ウイルスベクターを精巣間質に注入する、請求項５〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子改変非ヒト脊椎動物の製造方法であって、
非ヒト脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させること、および
前記遺伝子改変精子と卵とを受精させ、遺伝子改変個体を得ること
を含む方法。
【請求項１２】
遺伝子改変精子の製造方法であって、
非ヒト脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させることを含む方法。
【請求項１３】
アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
脊椎動物が血液精巣関門を有する、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
アデノ随伴ウイルスベクターを精巣間質に注入する、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、日本国特許出願第２０１７−０９２３８４号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本出願は、遺伝子改変および遺伝子治療の分野に関し、具体的には、雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入する方法および遺伝子改変動物の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
精子幹細胞は、自己複製能を有する唯一の雄性生殖細胞であり、当該細胞への形質導入は、遺伝子改変動物作製の効率を大幅に改善する可能性がある。精子形成の場である精細管は、セルトリ細胞が形成する血液精巣関門により基底膜側の区画と内腔側の区画にわけられており、精子幹細胞を含む未分化な雄性生殖細胞は、基底膜側の区画に存在し保護されている。レトロウイルスベクターを用いた精子幹細胞への遺伝子導入が報告されているが、精子幹細胞にベクターを到達させるためには、血液精巣関門が形成されていない幼若な精細管にベクターを注入する必要があった。極めて細い幼若な精細管への顕微注入は高い技術を要し、また、注入可能な時期も限定的であった。【０００３】
セルトリ細胞は、精子形成を支持する細胞であり、雄性不妊症への関与が示唆されている。レンチウイルスまたはアデノウイルスベクターを精細管に顕微注入することによるセルトリ細胞への遺伝子導入が報告されているが、レンチウイルスは生殖細胞に導入遺伝子による挿入変異をもたらす恐れがあり、また、アデノウイルスベクターは炎症反応を誘発するという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際出願公開第２００５−１１５１３３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ikawa M, Tergaonkar V, Ogura A, Ogonuki N, Inoue K, Verma IM. Restoration of spermatogenesis by lentiviral gene transfer: offspring from infertile mice. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 7524-7529.
【非特許文献２】Kanatsu-Shinohara M, Ogura A, Ikegawa M, Inoue K, Ogonuki N, Tashiro K, Toyokuni S, Honjo T, Shinohara T. Adenovirus-mediated gene delivery and in vitro microinsemination produce offspring from infertile male mice. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 1383-1388.
【非特許文献３】Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Inoue K, Miki H, Ogura A, Toyokuni S, Shinohara T. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol Reprod 2003; 69: 612-616.
【非特許文献４】Kanatsu-Shinohara M, Toyokuni S, Shinohara T. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ line stem cells in vivo. Biol Reprod 2004;71:1202-1207.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入するための改良方法およびその応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ある態様において、雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを脊椎動物の精巣に注入することを含む方法を提供する。【０００８】
本発明は、別の態様において、雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドが導入された脊椎動物を製造する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを脊椎動物の精巣に注入することを含む方法を提供する。【０００９】
本発明は、別の態様において、遺伝子改変脊椎動物の製造方法であって、
脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させること、および
前記遺伝子改変精子と卵とを受精させ、遺伝子改変個体を得ること
を含む方法を提供する。【００１０】
本発明は、別の態様において、遺伝子改変精子の製造方法であって、
脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させることを含む方法を提供する。【００１１】
本発明は、別の態様において、脊椎動物の精巣内の雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入するための、アデノ随伴ウイルスベクターを含む組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、雄性生殖細胞またはセルトリ細胞に簡便にポリヌクレオチドを導入することが可能となった。アデノ随伴ウイルス（本明細書中、ＡＡＶとも記載する）ベクターは、既に遺伝子治療で用いられている安全で取扱い容易なベクターであり、広い応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、アデノウイルス（adenovirus）またはレンチウイルス（lentivirus）ベクターによるＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウス精巣への形質導入（Ａ）を示す。顕微注入の経路を示す模式図。ガラスキャピラリー（glass capillary）により、ウイルス粒子（virus particles）を、精細管注入（tubular injection）では精巣輸出管（efferent duct）を経由して精細管（seminiferous tubule）に、間質注入（interstitial injection）では精巣（testis）の間質領域に顕微注入した。精細管の周囲には間質細胞（interstitial cells）が存在する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターによるＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウス精巣への形質導入（Ｂ）を示す。ＡｘＣＡＮＣｒｅおよびＣＳＩＩ−ＥＦ１−Ｃｒｅの顕微注入の７日（１週間）後の、Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウス精巣の巨視的外観。
【図１Ｃ】図１Ｃは、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターによるＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウス精巣への形質導入（Ｃ）を示す。顕微注入の７日後の未分化精原細胞（ＧＦＲＡ１）、セルトリ細胞（ＶＩＭ）、精細管周囲筋様細胞（ＡＣＴＡ２）、およびライディッヒ細胞（ＳＴＡＲ）マーカーによるＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウス精巣の免疫染色。
【図２Ａ】図２Ａは、ＡＡＶ血清型のスクリーニング（Ａ）を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ発現ＡＡＶの顕微注入の７日後の、野生型マウス精巣の巨視的外観。上の写真は、精細管注入(tubular injection)の注入１週間後（1 week postinjection）、下の写真は、間質注入（interstitial injection）の注入１週間後の結果を示す
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＡＡＶ血清型のスクリーニング（Ｂ）を示す。未分化精原細胞（ＧＦＲＡ１）およびセルトリ細胞（ＷＴ１）マーカーによる、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙを注入した精巣の注入７日後の免疫染色。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＡＡＶ血清型のスクリーニング（Ｃ）を示す。免疫染色の定量化。精細管注入および間質注入について、それぞれ少なくとも３つの精細管を数えた。ＷＴ１＋セルトリ細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の割合（％）（mCherry+ cells/WT1+ sertoli cells (%)）、およびマーカー陽性細胞中のｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の割合（％）（mCherry+ cells/ marker+ cells (%)）を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＡＡＶ血清型のスクリーニング（Ｄ）を示す。未分化精原細胞（ＧＦＲＡ１）マーカーによる、ＡＡＶ７Ｍ８−ｍＣｈｅｒｒｙを注入した精巣の注入７日後の免疫染色。
【図３Ａ】図３Ａは、ＡＡＶ９−ＣｒｅをＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスに顕微注入することにより解析した、形質導入の動態（Ａ）を示す。ＡＡＶ９−Ｃｒｅ顕微注入後の、各時点でのＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウス精巣の巨視的外観。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＡＡＶ９−ＣｒｅをＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスに顕微注入することにより解析した、形質導入の動態（Ｂ）を示す。未分化精原細胞（ＧＦＲＡ１）およびセルトリ細胞（ＷＴ１）マーカーによる、Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウス精巣の免疫染色。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＡＡＶ１−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙの野生型マウスへの顕微注入の２日後の、Ｇｄｎｆ、Ｆｇｆ２、およびＫｉｔｌ発現のリアルタイムＰＣＲ解析（ｎ＝３）を示す。相対的発現レベル（relative expression levels）を示す。カラムは、左から、対照（Control）（ビヒクル）、ＡＡＶ１−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙの結果を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ビヒクル（Vehicle）、ＡＡＶ１−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙの野生型マウスへの顕微注入７日後の、ＣＬＤＮ１１の免疫染色を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、血液精巣関門（ＢＴＢ）の機能解析を示す。野生型およびＣｌｄｎ１１ノックアウトマウスへのＡＡＶ８−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＡＡＶ１−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙの精細管または間質への注入の３日後、精巣間質にビオチン（biotin）を顕微注入した。試料は顕微注入の３０分後に回収した。
【図４Ａ】図４Ａは、ＡＡＶによる精子幹細胞（ＳＳＣ）形質導入の機能解析（Ａ）を示す。ＡＡＶ１−ＣｒｅまたはＡＡＶ９−Ｃｒｅを（精細管または間質）注入した精巣 (AAV1 or 9-Cre injected testis (tubular or interstitial))からの細胞の分離（dissociation）、ブスルファン処理マウスの精巣への顕微注入（microinjection）、コロニーカウント（colony count）、顕微授精（microinsemination）、子孫の遺伝子型決定（genotyping of offspring）、ＡＡＶ導入遺伝子の検出（detection of AAV transgene）のスキームを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＡＡＶによるＳＳＣ形質導入の機能解析（Ｂ）を示す。ドナー細胞回収時のＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰ精巣の巨視的外観。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＡＡＶによるＳＳＣ形質導入の機能解析（Ｃ）を示す。レシピエント精巣の巨視的外観。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＡＡＶによるＳＳＣ形質導入の機能解析（Ｄ）を示す。正常な外観のドナー由来精子形成を示す、精子形成マーカー（ピーナッツアグルチニン、ＰＮＡ）による、レシピエント精巣の染色。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＡＡＶによるＳＳＣ形質導入の機能解析（Ｅ）を示す。コロニーカウント（ｎ=１８−１９）。１０５細胞あたりのコロニー数（Colonies/105 cells）を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＡＡＶによるＳＳＣ形質導入の機能解析（Ｆ）を示す。ＡＡＶ９感染Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰドナー精巣細胞を用いた顕微授精後に生まれた子孫。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＡＡＶによるＳＳＣ形質導入の機能解析（Ｇ）を示す。子孫におけるＥＹＦＰ蛍光。野生型（wild type）マウス、および精細管（tubular）または間質（interstitial）注入したマウスの、精巣（testis）、腎臓（kidney）、肝臓（liver）、脳（brain）のＥＹＦＰ蛍光を、明視野（bright field）の観察結果とともに示す。
【図４Ｈ】図４Ｈは、ＡＡＶによるＳＳＣ形質導入の機能解析（Ｈ）を示す。Ｃｒｅによる欠失のＰＣＲ解析。精細管または間質注入後に生まれた子孫（offspring）の尻尾ＤＮＡ試料を図中のプライマーで解析した。
【図５Ａ】図５Ａは、ＡＡＶ形質導入の改善（Ａ）を示す。ＡＡＶ９−２ＹＦ−ｍＣｈｅｒｒｙを注入した野生型精巣の巨視的外観。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＡＶ形質導入の改善（Ｂ）を示す。ノイラミニダーゼ（neuraminidase）と共にＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙを注入した野生型精巣の巨視的外観。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＡＡＶ形質導入の改善（Ｃ）を示す。未分化精原細胞（ＧＦＲＡ１）およびセルトリ細胞（ＷＴ１）マーカーによる、野生型精巣の免疫染色。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＡＡＶ形質導入の改善（Ｄ）を示す。免疫染色の定量化。精細管注入および間質注入について、それぞれ少なくとも３つの精細管を数えた。ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞中のＷＴ１＋細胞の割合（％）（WT1+ cells / mCherry+ cells (%)）、およびｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞中のＧＦＲＡ１＋細胞の割合（％）（GFRA1+ cells / mCherry+ cells (%)）を示す。カラムは、左がビヒクル、右がノイラミニダーゼ添加の結果を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌ感染による、ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスの不妊症の治療（Ａ）を示す。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌの顕微注入後の、ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウス精巣の巨視的、組織学的、およびレクチン組織化学的外観。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌ感染による、ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスの不妊症の治療（Ｂ）を示す。Ｋｉｔｌ発現ＡＡＶ９の精細管注入後に形成された精子を用いた顕微授精後に生まれた子孫。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌ感染による、ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスの不妊症の治療（Ｃ）を示す。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌの間質注入後に形成された精子を用いた顕微授精後に生まれた子孫。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌ感染による、ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスの不妊症の治療（Ｄ）を示す。Ｋｉｔｌ  ｃＤＮＡプローブを用いたＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザンブロット解析。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌの精細管注入後に形成された精子の顕微授精後に生まれた代表的子孫から回収したＤＮＡ試料を用いた。野生型の遺伝子座は４．３ｋｂおよび１３ｋｂに、ＫｉｔｌＳｌ−ｄの遺伝子座は４．３ｋｂおよび７ｋｂにバンドを示し、ＫｉｔｌＳｌの遺伝子座はバンドを示さなかった（図６Ｅにおいて同じ）。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌ感染による、ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスの不妊症の治療（Ｅ）を示す。Ｋｉｔｌ  ｃＤＮＡプローブを用いたＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのサザンブロット解析。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌの間質注入後に形成された精子の顕微授精後に生まれた代表的子孫から回収したＤＮＡ試料を用いた。
【図７Ａ】図７Ａは、子孫へのＡＡＶ９組み込みの解析（Ａ）を示す。ＡＡＶ９−Ｃｒｅの精細管または間質注入後に生まれた子孫由来の尻尾ＤＮＡ試料を、Ｃｒｅ特異的プライマーを用いて解析した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、子孫へのＡＡＶ９組み込みの解析（Ｂ）を示す。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌの精細管または間質注入後に生まれた子孫由来の尻尾ＤＮＡ試料を、ＡＡＶ９特異的プライマーを用いて解析した。
【図８】図８は、ＡＡＶによるウサギ精巣細胞への形質導入を示す。mCherry: 抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体による染色結果。Merge: 抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体による染色結果とHoechst 33342による染色結果の重ね合わせ。
【図９】図９は、ＡＡＶによるマーモセット精巣細胞への形質導入を示す。Merge: 抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体、Hoechst 33342、および抗ＳＳＥＡ３抗体または抗ＷＴ１抗体による染色結果の重ね合わせ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１５】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「２０±１０％〜３０±１０％」を含むものとする。
【００１６】
脊椎動物としては、例えば、哺乳動物、鳥、魚、両生動物および爬虫類動物が挙げられる。哺乳動物としては、限定はされないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク、イヌ、ネコ、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー、ヒトなどが挙げられる。鳥類としては、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、オーストリッチ、エミュ、ダチョウ、ホロホロ鳥、ハトなどが挙げられる。好ましい実施形態において、脊椎動物は、哺乳動物である。ある実施形態において、哺乳動物は、齧歯目、ウサギ目、または霊長目の動物である。さらなる実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー、またはヒトである。さらなる実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。
【００１７】
脊椎動物は、いずれの発達段階にある動物であってもよい。ある実施形態において、脊椎動物は、血液精巣関門（本明細書中、ＢＴＢとも記載する）を有する動物である。血液精巣関門を有する動物としては、血液精巣関門が形成された後の発達段階にある動物が挙げられる。血液精巣関門が形成される時期は、脊椎動物の種類により異なるが、例えば、マウスでは２週齢、ラットでは２〜３週齢、ウサギでは１０週齢、ウシでは２０〜３２週齢、アカゲザルでは１０〜１５月齢、マーモセット（Ｍａｒｍｏｓｅｔ  ｍｏｎｋｅｙ）では５〜６月齢などである。ある実施形態において、血液精巣関門を有する動物は、成体動物である。別の実施形態において、脊椎動物は、血液精巣関門を有さない動物である。血液精巣関門を有さない動物としては、例えば、血液精巣関門が形成される前の発達段階にある動物が挙げられ、かかる動物を本明細書において「幼若動物」と称する。好ましい実施形態において、脊椎動物は、血液精巣関門を有する動物である。
【００１８】
本明細書におけるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターには、雄性生殖細胞（好ましくは、精子幹細胞）またはセルトリ細胞への指向性を有し、精細管の基底膜または血液精巣関門を通過しうる任意のＡＡＶベクターが含まれる。ＡＡＶベクターは、天然のカプシドタンパク質を有していても、人為的に改変されたカプシドタンパク質を有していてもよい。好ましくは、ＡＡＶベクターは、精細管の基底膜を通過しうるものである。好適なＡＡＶベクターは、実施例の記載に準じて脊椎動物の精巣に注入した場合に目的の細胞に感染するか否かを調べることにより、選択することができる。好ましい実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ７Ｍ８、より好ましくはＡＡＶ１もしくはＡＡＶ９、またはその標的指向性と基底膜または血液精巣関門の透過性とを保持する変異体である。所望の変異体を得る方法は、当業界において公知である。例えば、カプシドタンパク質を改変し、その性質を実施例の記載に準じて確認することにより、所望の変異体を得ることができる。ＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲ等によりカプシドタンパク質を変異させたＡＡＶのライブラリーを作製し、スクリーニングしてもよい。
【００１９】
ＡＡＶベクターに含まれるポリヌクレオチドは、特に限定されず、タンパク質またはペプチドをコードするポリヌクレオチド、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、リボザイム、デコイ核酸などの核酸分子をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰ、ｄｓＲｅｄ、およびｍＣｈｅｒｒｙ等の蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド（本明細書中、マーカー遺伝子とも称する）でありうる。
【００２０】
ポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、またはＺＦＮなどによるゲノム編集のためのタンパク質または核酸分子をコードするポリヌクレオチドであってもよい。通常、ＡＡＶベクターは細胞のゲノムに挿入されないが、ゲノム編集技術と組み合わせることにより、雄性生殖細胞またはセルトリ細胞のゲノムを改変することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集のためのタンパク質および核酸分子としては、エンドヌクレアーゼであるＣａｓ９タンパク質、およびＣａｓ９タンパク質を標的配列へ動員するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ゲノムの二本鎖切断部位に導入されるドナーベクターなどが例示される。
【００２１】
ポリヌクレオチドは、プロモーター、エンハンサー等の調節要素を含んでも良い。プロモーターは、細胞内でポリヌクレオチドの発現を調節できるものであれば特に限定されない。プロモーターとしては、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｕ６プロモーター、およびｔＲＮＡプロモーター等の組織非特異的プロモーター；肝臓特異的α１ＡＴプロモーター、骨格筋特異的α−アクチンプロモーター、神経特異的エノラーゼプロモーター、および血管内皮細胞特異的ｔｉｅプロモーター等の組織特異的プロモーターが挙げられ、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２２】
ＡＡＶベクターに含まれるポリヌクレオチドのサイズは、特に限定はされないが、通常４．７ｋｂｐ程度までである。１つのＡＡＶベクターが２種以上のポリヌクレオチドを含んでもよく、あるいは、２種以上のＡＡＶベクターを組み合わせて注入してもよい。
【００２３】
ＡＡＶベクターは、当業界において知られる如何なる方法により作製してもよい。例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはその改変体であるＡＡＶ−２９３細胞などのパッケージング細胞に、１）両端にＡＡＶの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を有し、その間に目的のポリヌクレオチドを挿入したＡＡＶベクタープラスミド、２）ＡＡＶの複製や粒子形成に必要とされるＲｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を有するＡＡＶヘルパープラスミド、および３）ＡＡＶの増殖に必要とされるアデノウイルスのヘルパー遺伝子を有するアデノウイルスヘルパープラスミドをトランスフェクションすることにより、作製することができる。かかるＡＡＶベクターの作製は、AAV Helper-Free System（Agilent Technologies）などの市販のキットを用いて行うことができる。
【００２４】
ＡＡＶベクターは、その導入効率を高めるための試薬とともに、精巣に注入することができる。かかる試薬としては、ノイラミニダーゼ、ＭＧ１３２などのプロテアソーム阻害剤、Eeyarestatin I、トリチウムチミジン、シスプラチン、エトポシド、カルパイン阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤などが挙げられる。
【００２５】
本明細書において、ＡＡＶベクターは、インビボで脊椎動物の精巣に注入される。ＡＡＶベクターは、精巣のいずれの部位に注入してもよい。注入部位としては、精巣間質、精細管、輸出管、および精巣網が挙げられる。ある実施形態において、ＡＡＶベクターは、精巣間質に注入される。
【００２６】
本明細書におけるＡＡＶベクターは、精細管の基底膜または血液精巣関門を通過して、基底膜側の区画に存在する雄性生殖細胞またはセルトリ細胞に感染することができる。よって、本明細書におけるＡＡＶベクターは、血液精巣関門を有さない動物の精細管、輸出管、または精巣網に注入する必要がなく、精巣への注入時期や注入部位が限定されない。また、ＡＡＶベクターを用いれば、国際出願公開第９９／０３８９９１号公報に記載のように精巣内細胞を減少させる処理を行う必要はなく、本発明の方法はかかる工程を含まない。
【００２７】
ＡＡＶベクターの注入量は、対象に応じて適宜変更されるが、例えば、体重２０ｇ当たり約１×１０１０〜１．０×１０１１個のウイルス粒子である。
【００２８】
本明細書において、雄性生殖細胞には、あらゆる発達段階の生殖細胞が含まれる。雄性生殖細胞としては、精子幹細胞（本明細書中、ＳＳＣとも記載する）、精原細胞、精母細胞、精娘細胞、精細胞、精子が挙げられる。ある実施形態において、雄性生殖細胞は、精子幹細胞である。
【００２９】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドが導入された雄性生殖細胞から精子を形成させることにより、遺伝子改変精子を得ることができる。精子幹細胞は自己複製能を有することから、精子幹細胞が遺伝子改変された場合、遺伝子改変精子が継続的に産生されうる。一方、精子幹細胞以外の生殖細胞は自己複製能を有さないことから、これら生殖細胞から産生された精子は、精子形成の１サイクルに要する期間（マウスにおいては約３５日）後には消失すると考えられる。よって、ＡＡＶベクターの注入後、当該期間が経過した後に遺伝子改変精子の存在が確認される場合は、ポリヌクレオチドが精子幹細胞へ導入されたと判断することができる。遺伝子改変精子は、公知の方法により確認または選択することができる。例えば、マーカー遺伝子を（他のポリヌクレオチドと共に、または単独で）導入した場合、マーカー遺伝子の発現を指標に確認または選択することができる。
【００３０】
上記のようにして得られる遺伝子改変精子を卵と受精させ、動物個体を発生させることにより、遺伝子改変動物を得ることができる。本明細書において卵とは、精子が受精可能な雌性配偶子を意味し、例えば、卵細胞、卵母細胞等が挙げられる。卵は、通常、精子と同種の脊椎動物の卵である。精子と卵の受精は、自然交配、あるいは顕微受精（ＩＣＳＩ）、体外受精（ＩＶＦ）等による人工授精など、周知の方法により行うことができる。例えば、ＡＡＶベクターを注入した雄を雌と交配すればよい。交配前にＡＡＶベクターを注入した雄が遺伝子改変精子を有することを確認する工程は必須ではない。あるいは、ＡＡＶベクターを注入した動物から得た精子を卵と人工受精し、偽妊娠動物の子宮に移入してもよい。
【００３１】
遺伝子改変動物が得られたか否かは、公知の方法により確認することができる。例えば、マーカー遺伝子の発現を調べてもよく、ゲノムＤＮＡを回収してＰＣＲまたはサザンブロッティング等を行ってもよく、導入したポリヌクレオチドの発現産物（例えば、タンパク質）の存在を調べてもよい。
【００３２】
雄性生殖細胞またはセルトリ細胞へポリヌクレオチドを導入することにより、これら細胞の遺伝子異常に起因する疾患を治療することができる。例えば、セルトリ細胞は雄性不妊症に関与することが示唆されており、セルトリ細胞の遺伝子改変により雄性不妊症を治療できる可能性がある。ポリヌクレオチドは、遺伝子異常によって低下または欠失したタンパク質の機能を補う、または亢進したタンパク質の機能を抑制する、タンパク質、ペプチド、または核酸分子をコードしうる。
【００３３】
ＡＡＶベクターを含む組成物は、有効成分であるＡＡＶベクターに加えて、医薬上許容される担体および／または添加剤を含みうる。医薬上許容される担体としては、生理食塩水または他の生理学的に許容される緩衝液が例示される。添加剤としては、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、保存剤、安定化剤などが例示される。剤型は、限定はされないが、例えば注射剤であり、液状の注射剤、および用時溶解して用いる固形注射剤（例えば、凍結乾燥注射剤）が例示される。ＡＡＶベクターを含む組成物は、キットとして提供されてもよく、キットは、用時溶解に用いる緩衝液や使用説明書などをさらに含んでもよい。
【００３４】
ＡＡＶベクターの投与量は、対象に応じて適宜変更されるが、例えば、体重１ｋｇ当たり約１０９〜１０１５ｖｇ（vector genome）、好ましくは１０１０〜１０１４ｖｇ、または１０１０〜１０１３ｖｇである。
【００３５】
本開示の実施形態を例示する。
１．雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを脊椎動物の精巣に注入することを含む方法。
２．雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドが導入された脊椎動物を製造する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを脊椎動物の精巣に注入することを含む方法。
３．アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８、好ましくはＡＡＶ１またはＡＡＶ９である、前記１または２に記載の方法。
４．雄性生殖細胞が精子幹細胞である、前記１〜３のいずれかに記載の方法。
５．脊椎動物が血液精巣関門を有する、前記１〜４のいずれかに記載の方法。
６．アデノ随伴ウイルスベクターを精巣間質に注入する、前記１〜５のいずれかに記載の方法。
７．脊椎動物が非ヒト脊椎動物である、前記１〜６のいずれかに記載の方法。
８．脊椎動物が哺乳動物である、前記１〜７のいずれかに記載の方法。
９．哺乳動物が齧歯目、ウサギ目、または霊長目の動物である、前記８に記載の方法。
１０．脊椎動物がヒトである、前記１〜６のいずれかに記載の方法。
【００３６】
１１．遺伝子改変脊椎動物の製造方法であって、
脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させること、および
前記遺伝子改変精子と卵とを受精させ、遺伝子改変個体を得ること
を含む方法。
１２．アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８、好ましくはＡＡＶ１またはＡＡＶ９である、前記１１に記載の方法。
１３．脊椎動物が血液精巣関門を有する、前記１１または１２に記載の方法。
１４．アデノ随伴ウイルスベクターを精巣間質に注入する、前記１１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．脊椎動物が非ヒト脊椎動物である、前記１１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．脊椎動物が哺乳動物である、前記１１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．哺乳動物が齧歯目、ウサギ目、または霊長目の動物である、前記１６に記載の方法。
【００３７】
１８．遺伝子改変精子の製造方法であって、
脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させることを含む方法。
１９．アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８、好ましくはＡＡＶ１またはＡＡＶ９である、前記１８に記載の方法。
２０．脊椎動物が血液精巣関門を有する、前記１８または１９に記載の方法。
２１．アデノ随伴ウイルスベクターを精巣間質に注入する、前記１８〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．脊椎動物が非ヒト脊椎動物である、前記１８〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．脊椎動物が哺乳動物である、前記１８〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．哺乳動物が齧歯目、ウサギ目、または霊長目の動物である、前記２３に記載の方法。
【００３８】
２５．脊椎動物の精巣内の雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入するための、アデノ随伴ウイルスベクターを含む組成物。
２６．疾患を治療するための、前記２５に記載の組成物。
２７．雄性生殖細胞またはセルトリ細胞の遺伝子異常に起因する疾患を治療するための、アデノ随伴ウイルスベクターを含む組成物。
２８．雄性不妊症を治療するための、前記２６または２７に記載の組成物。
２９．脊椎動物がヒトである、前記２５〜２８のいずれかに記載の組成物。
３０．アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８、好ましくはＡＡＶ１またはＡＡＶ９である、前記２５〜２９のいずれかに記載の組成物。
３１．脊椎動物が血液精巣関門を有する、前記２５〜３０のいずれかに記載の組成物。
３２．脊椎動物の精巣に注入される、前記２５〜３１のいずれかに記載の組成物。
３３．脊椎動物の精巣間質に注入される、前記２５〜３２のいずれかに記載の組成物。
【００３９】
３４．雄性生殖細胞またはセルトリ細胞の遺伝子異常に起因する疾患を治療する方法であって、脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入することを含む、方法。
３５．疾患が雄性不妊症である、前記３４に記載の方法。
３６．脊椎動物がヒトである、前記３４または３５に記載の方法。
３７．アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８、好ましくはＡＡＶ１またはＡＡＶ９である、前記３４〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．脊椎動物が血液精巣関門を有する、前記３４〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．脊椎動物の精巣間質にアデノ随伴ウイルスベクターを注入する、前記３４〜３８のいずれかに記載の方法。
【００４０】
以下、実施例により本発明を説明するが、如何なる意味においても本発明はこれら実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４１】
１．方法
（１）ウイルス産生
ＡＡＶベクターの産生のため、ＡＡＶベクタープラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｍＣｈｅｒｒｙまたはｐＡＡＶ−ＣＡＧ−Ｃｒｅ）、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ； Agilent Technologies, Santa Clara, CA）、およびＡＡＶヘルパープラスミド（ｐＡＡＶ１、ｐＡＡＶ−ＲＣ［Agilent Technologies］、ｐＸＲ５、ｐＡＡＶ６、ｐＡＡＶ６．２、ｐＡＡＶ７、ｐＡＡＶ７Ｍ８、ｐＡＡＶ８、ｐＡＡＶ９、ｐＡＡＶ１０、ｐＡＡＶ１１、ｐＡＡＶｈｕ１１、Ａｎｃ８０Ｌ６５、ｐＡＡＶ−ＤＪまたはｐＡＡＶ−ＤＪ８）を、ＡＡＶ−２９３細胞（Agilent Technologies）に一過性にトランスフェクトした。ウイルス力価は、FastStart Universal SYBR Green Master Mix （Roche, Penzberg, Germany）と特異的プライマーとを用いて、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により決定した。Ｃｒｅを発現するレンチウイルス（ＣＳＩＩ−ＥＦ−Ｃｒｅ−ＩＲＥＳ２−Ｐｕｒｏ）および一過性の２９３Ｔトランスフェクションによるその産生については、Morimoto H et al. (Biol Reprod 2015;92:147) に記載されている。ウイルス培養上清を、１９４，０００×ｇ、２時間の超遠心により濃縮し、ウイルス力価を、qPCR Lentivirus Titration Kit (Abm, BC, Canada)を用いて決定した。Ｃｒｅを発現するアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ； RIKEN BRC, Tsukuba, Japan）は、Takehashi et al. (Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 2596-2601)の記載にしたがい、２９３細胞により産生し、ＣｓＣｌ遠心法を用いて調製し、ウイルス力価を決定した。特に記載する場合を除き、ＡＡＶベクターは１×１０１２ウイルス粒子／ｍｌ、レンチウイルスは３×１０８ウイルス粒子／ｍｌ、アデノウイルスは１．７×１０９ｐｆｕ（plaque forming unit）／ｍｌで用いた。【００４２】
（２）動物および移植
インビボスクリーニング実験およびトレーサー実験のために、４−５週齢Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）×ＤＢＡ／２Ｆ１（ＢＤＦ１）マウスを用いた。トレーサー実験の陽性対照として、Ｃｌｄｎ１１ノックアウトマウス（３ヶ月齢）を用いた。一部の実験では、４−８週齢のトランスジェニックマウスＧｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＥＹＦＰ）Ｃｏｓ（本明細書中、Ｒ２６ＲまたはＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰとも記載する）（Srinivas et al, BMC Dev Biol 2001;1:4）を用いた。生殖能力（fertility）回復実験には、４−５週齢ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウス（Japan SLC, Shizuoka, Japan）を用いた。【００４３】
（３）ウイルス粒子の顕微注入および精原細胞移植
精細管注入では、ウイルス粒子を、精巣輸出管を経由して精細管へ導入した。ＢＤＦ１マウスへは約１０μｌ、ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスへは約４μｌを投与した。間質注入では、同量のウイルスを精巣の間質領域に顕微注入した。一部の実験で、感染力を高めるためにノイラミニダーゼ（Sigma, St. Lois, MO）を用いた。【００４４】
精原細胞移植のため、ドナー精巣細胞を、コラゲナーゼおよびトリプシン（共にSigma製）を用いた二段階の酵素処理により、単細胞に分離した。この細胞を、４週齢でブスルファン（４４ｍｇ／ｋｇ、Sigma）により処理したＢＤＦ１マウスの精巣輸出管に顕微注入した。各インジェクションにより、精細管の７５−８５％を満たした。ブスルファン処理レシピエントマウスはいずれも、ブスルファン処理後４−８週間で用いた。【００４５】
（４）トレーサー実験
Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（７．５ｍｇ／ｍｌ；５５７Ｄ； Thermo Fisher Scientific）を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。精巣の間質に、約２０μｌの溶液を顕微注入した。３０分後、マウスを屠殺し、その精巣を直ちに摘出して、４％パラホルムアルデヒド中で４℃で一晩固定した。試料は、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物に包埋し、加工して凍結切片にした。対比染色の前に、Alexa Fluor 488結合ストレプトアビジン（BD Biosciences）とインキュベートすることにより、Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを検出した。【００４６】
（５）レシピエント精巣の解析
ＳＳＣ活性の評価のため、レシピエントを移植後２ヵ月で屠殺して、ドナー細胞の定着を紫外光下で調べた。生殖細胞クラスターが精細管の基底面全体を占め、少なくとも０．１ｍｍの長さであるときに、コロニーと規定した。組織学的解析によりドナー細胞定着を評価するため、切片を×４００の倍率で観察して、精巣中の定着の程度を決定し、ＣＣＤカメラを備えた倒立顕微鏡（ＤＰ７０、 Olympus, Tokyo, Japan）で観察した切片の画像をPhotoshop software （Adobe, San Jose, CA）を用いて収集した。切片はいずれもHoechst 33342で染色した。【００４７】
（６）免疫組織化学的検査
免疫組織化学的検査のため、精巣試料を４％パラホルムアルデヒドで２時間固定した。その後、凍結切片作成のために、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Sakura Finetek, Tokyo, Japan）に包埋した。凍結切片の免疫染色は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−ＸのＰＢＳ溶液で試料を処理することにより行った。試料をブロッキングバッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ウシ血清アルブミンおよび１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液）に１時間以上浸漬した後、１次抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで三回洗浄した後、試料を２次抗体とインキュベートした。【００４８】
（７）遺伝子発現解析
全ＲＮＡをTRIzol（登録商標） (Invitrogen, Carlsbad, CA)により単離し、一本鎖ｃＤＮＡをVerso cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を用いて合成し、ＲＴ−ＰＣＲに使用した。リアルタイムＰＣＲのため、StepOnePlusTM Real-Time PCR systemおよびFastStart Universal SYBR Green PCR Master Mix (Roche, Basel, Switzerland) を、製造元 (Applied Biosystems, Warrington, UK)の説明にしたがい使用した。 転写産物のレベルは、Ｈｐｒｔのレベルに対して標準化した。【００４９】
（８）ＤＮＡ解析
子孫から、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いた標準的手順により、ゲノムＤＮＡを単離した。ｌｏｘＰが導入された（floxed）対立遺伝子の欠失およびウイルスの組み込みは、ＰＣＲにより検出した。【００５０】
サザンブロッティングによりウイルスＤＮＡを検出するため、２０μｇのＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断し、１．０％アガロースゲル中で分離した。ＤＮＡをナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋； Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK）上に移し、ブロットした。全長Ｓｌ  ｃＤＮＡの、４３４ｂｐのＮｃｉＩ−ＢｇｌＩフラグメントをプローブとして用いた標準的プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンは、３２Ｐ標識プローブと、６５℃で１６時間、ハイブリダイズさせた。【００５１】
（９）顕微授精
ＡＡＶを注入した精巣を一晩冷蔵し、翌日回収後に顕微授精に用いた。レシピエント精巣の精細管を切断し、精細管フラグメントを繰り返しピペッティングして分離した。Ｒ２６Ｒマウス精巣を用いた実験では、ＥＹＦＰ発現ドナー細胞を含有する精細管フラグメントを、ＵＶ照明下で分離した。顕微授精は、ＢＤＦ１卵母細胞への細胞質内注入により行った。インビトロでの培養後、二細胞期の胚を、偽妊娠１日目の雌ＩＣＲマウス（CLEA Japan, Inc., Tokyo, Japan）の卵管に移した。子孫は、帝王切開により１９．５日目に生まれた。【００５２】
（１０）統計解析
一対の比較における平均値間の有意差を、スチューデントｔ検定により決定した。多重比較解析は、ＡＶＯＮＡとそれに続くチューキーのＨＳＤ検定（Tukey’s honestly significant Difference test）を用いて行った。【００５３】
２．結果
（１）アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターによる生殖細胞への形質導入の欠如
これまでの研究で、アデノウイルスおよびレンチウイルスが生殖細胞に形質導入する能力は限定的であることが示されている（Ikawa et al., 2002; Kanatsu-Shinohara et al, 2002）。アデノウイルスおよびレンチウイルスベクターの生殖細胞への感染能を試験するため、ＥＹＦＰレポーター遺伝子の上流にｌｏｘＰが導入された転写停止因子を有し、ｌｏｘＰ配列が欠失するとＥＹＦＰ遺伝子を発現する、Ｒ２６Ｒマウスを用いた。Ｒ２６Ｒマウスの精細管に、ＡｘＣＡＮＣｒｅまたはＣＳＩＩ−ＥＦ１−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅを顕微注入した（図１Ａ）。また、同じウイルスを、対照として間質領域に注入した。顕微注入の１週間後に精巣を回収すると、精細管注入を受けた精巣は、ウイルスのタイプに関わらず、強いＥＹＦＰの蛍光を示した（図１Ｂ）。【００５４】
精巣の組織片を作成し、生殖細胞およびセルトリ細胞のマーカー（それぞれＧＦＲＡ１およびＶＩＭ）を用いた免疫組織化学的検査により、細胞タイプを調べた（図１Ｃ）。精細管注入を受けた精細管では多数の細胞がＥＹＦＰ発現を示したが、詳細な試験により、全てのＥＹＦＰ発現細胞がＶＩＭを発現するセルトリ細胞であったことが明らかとなった。対照的に、生殖細胞への感染の証拠は見られなかった。【００５５】
間質注入では、レンチウイルスとアデノウイルスとで異なる結果が得られた。レンチウイルスの間質注入ではＥＹＦＰ発現細胞は観察されなかったが、アデノウイルスでは弱いＥＹＦＰ発現が認められた。組織片の免疫染色により、アデノウイルスによりＳＴＡＲ発現ライディッヒ細胞とＡＣＴＡ２発現精細管周囲筋様細胞が標的となったことがわかった。生殖細胞およびセルトリ細胞の感染は見られなかった。これらの結果より、アデノウイルスおよびレンチウイルスベクターはインビボでの生殖細胞への形質導入に有用でないという以前の研究が確認された【００５６】
（２）精細管へのインビボ顕微注入によるＡＡＶ血清型のスクリーニング
次に、ＡＡＶによる遺伝子導入パターンを調べた。ＣＡＧプロモーター制御下でｍＣｈｅｒｒｙを発現する、１３種類のＡＡＶカプシド（ＡＡＶ１、２、５、６、６．２、７、８、９、１０、１１、ｈｕ１１、Ａｎｃ８０Ｌ６５、およびＤＪ８）をスクリーニングした。ウイルス粒子は、精細管または間質組織に顕微注入した。感染の１週間後、精巣を回収して、紫外光下で導入遺伝子の発現を調べた。試験した１３種類のうち、ＡＡＶ１、８、９、１１およびＤＪ８を精細管に顕微注入した精巣は、明らかなｍＣｈｅｒｒｙの蛍光を示した（図２Ａ）。繰り返し試験したところ、ＡＡＶ６．２およびＡＡＶ１０により局所的であるが安定した感染が見られた。ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９の間質注入を受けた精巣でも比較的強いシグナルが認められたが、ＡＡＶＤＪ８の間質注入では蛍光は見られなかった。【００５７】
感染した細胞のタイプを明らかにするために、免疫組織化学染色を行った。精細管注入を受けた精巣の二重免疫組織化学検査により、ＡＡＶ８が選択的にセルトリ細胞に形質導入していることが明らかとなった（図２Ｂ）。生殖細胞の形質導入は見られなかった。対照的に、ＡＡＶ１およびＡＡＶ９はセルトリ細胞および生殖細胞の両方に感染した（図２Ｂ）。ＡＡＶ１およびＡＡＶ９は、内腔側の区画の精子形成細胞のみならず、基底膜上の精原細胞にも形質導入した。ＧＦＲＡ１＋（Ａｓｉｎｇｌｅ（Ａｓ），Ａｐａｉｒｅｄ（Ａｐｒ）精原細胞および一部のＡａｌｉｇｎｅｄ（Ａａｌ）精原細胞）および、ＣＤＨ１＋（未分化精原細胞）の定量化により、これらの細胞タイプの形質導入において、ＡＡＶ９がＡＡＶ１よりも優れていることが示された（図２Ｃ）。これらウイルスは、ＫＩＴ＋細胞（分化中の精原細胞）またはＳＹＣＰ３＋細胞（精母細胞）への形質導入効率はそれほど相違せず、ＩＺＵＭＯ１＋細胞（精子細胞から精子）ではほとんど形質導入が見られなかった。他のタイプのＡＡＶを注入した精巣では、シグナルは非常にまばらであった。セルトリ細胞への感染も、同程度の効率であった。これらの結果は、内腔側の区画に導入されたＡＡＶ１およびＡＡＶ９が、血液精巣関門（ＢＴＢ）を通過し、基底の区画の未分化の精原細胞に感染したことを示唆した。【００５８】
ＡＡＶ１またはＡＡＶ９の間質注入を受けた精巣の免疫組織化学的検査において、精細管注入と非常によく似たパターンが示された。ＳＴＡＲ＋（ライディッヒ）細胞およびＡＣＴＡ２＋（精細管周囲筋様）細胞に加えて、基底膜側および内腔側の両方の区画において、多数の生殖細胞が感染した（図２Ｂ）。生殖細胞区画のシグナルは、ＧＦＲＡ１＋未分化精原細胞から、少なくともＩＺＵＭＯ１＋精細胞−精子の段階まで見られた。感染細胞の定量化により、ＫＩＴ＋細胞は注入経路にかかわらずＡＡＶ９が常に高効率で感染するが、ＧＦＲＡ１＋およびＣＤＨ１＋精原細胞のＡＡＶ感染効率には違いが見られないことが示された。さらに、セルトリ細胞は、間質注入により、ＡＡＶ９によってＡＡＶ１より効率的に形質導入された。精細管注入と対照的に、ＡＡＶ８の間質注入によって感染したセルトリ細胞は見られなかった。【００５９】
同様に、ＡＡＶ７Ｍ８を精細管または間質に顕微注入したところ、ＧＦＲＡ１＋未分化精原細胞への感染が確認された（図２Ｄ）。【００６０】
この結果を確認するために、Ｃｒｅ発現ＡＡＶ９とＲ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスを用いた。注入の１、３および５日後に精巣を比較したところ、精細管注入が、より迅速で強いＥＹＦＰ発現を示した（図３Ａ）。免疫染色により、ＷＴ１＋セルトリ細胞はＧＦＲＡ１＋精原細胞が蛍光を示さない顕微注入後１日目に感染したことが示され（図３Ｂ）、このことからセルトリ細胞への感染が非常に迅速な過程であることが示唆された。リアルタイムＰＣＲより、ＡＡＶ１またはＡＡＶ９の形質導入は精原細胞の自己複製および分化に関連するサイトカインの発現レベルに影響しないことが示されたことから、ＡＡＶ感染はＳＳＣの微小環境にはそれほど影響しないようである（図３Ｃ）。さらに、免疫染色により、ＢＴＢの主要成分であるＣＬＤＮ１１はＡＡＶ１およびＡＡＶ９感染によって大きく変化しないことが示された（図３Ｄ）。【００６１】
ＡＡＶの顕微注入がＢＴＢの透過性を障害するかを試験するため、トレーサー実験を行った。ＡＡＶ１−ｍＣｈｅｒｒｙまたはＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙの精細管または間質への注入の３日後に、成体の精巣の間質に、ビオチン（５５７Ｄ）を顕微注入した。ＢＴＢを有さないＣｌｄｎ１１ノックアウトマウスの精巣を、陽性対照として用いた。Ｃｌｄｎ１１ノックアウトマウスでは精細管管腔への漏出が観察されたが（図３Ｅ）、ＡＡＶ注入では内腔側の区画への明らかなビオチンの漏出は見られず、このことは、ＡＡＶ感染がＢＴＢの完全性を損なわないことを示唆した。ＧＦＲＡ１はＳＳＣに発現していると考えられていることから、本結果は、ＡＡＶ１とＡＡＶ９が基底膜およびＢＴＢを透過し、セルトリ細胞と、精子幹細胞（ＳＳＣ）を含むであろう生殖細胞とに感染したことを示唆する。【００６２】
（３）ＡＡＶ１／９によるＳＳＣのインビボ形質導入
ＳＳＣの形質導入を確認するために、精原細胞移植を用いた（Brinster and Zimmermann, 1994）（図４Ａ）。本実験では、Ｃｒｅ発現ＡＡＶ１またはＡＡＶ９（ＡＡＶ１−ＣｒｅまたはＡＡＶ９−Ｃｒｅ）を、精細管注入および間質注入により、Ｒ２６Ｒ−ＥＹＦＰマウスの精巣に顕微注入した。顕微注入の１週間から２週間後に、マウスを屠殺し、精巣を回収した。精細管注入を受けたＲ２６Ｒマウスの精巣は、紫外光下で、強い蛍光を示した（図４Ｂ）。対照的に、間質注入を受けた精巣では、この時点では、ＥＹＦＰ発現は明らかではなかった。ドナー精巣を酵素消化により単細胞に分離し、内在性の精子形成を欠損するブスルファン処理したマウスの精細管に顕微注入した。【００６３】
移植後２ヵ月のレシピエントマウスの解析では、いずれのドナータイプもレシピエント精巣に生殖細胞コロニーを産生し、このことは、注入経路にかかわらず、ＳＳＣがＡＡＶ１／９により形質導入されたことを証明した（図４Ｃ）。組織学的解析により、ドナー細胞タイプおよび注入経路にかかわらず、レシピエント精巣において正常な外見の精子形成が示された（図４Ｄ）。しかしながら、コロニーの定量化により、コロニー形成の頻度はウイルスタイプおよび注入経路に依存することが示された。精細管注入によりＡＡＶ１およびＡＡＶ９を受けたＲ２６Ｒ精巣細胞は、それぞれ１０５個の移植細胞当たり、０．４および１．２のコロニーを産生した（図４Ｅ）。一方、ＡＡＶ１およびＡＡＶ９の間質注入により生じたコロニーの数は、それぞれ、１０５個の細胞当たり０．０４および０．２１であった。いずれの場合も、間質注入を受けたＲ２６Ｒ精巣をドナーとして用いた場合のコロニー数が顕著に少なかった。【００６４】
ＣｒｅがトランスフェクトされたＳＳＣの機能を確認するために、インビトロの顕微授精を行った。ＡＡＶ９の精細管注入または間質注入を受けた精巣由来の生殖細胞を移植したレシピエントマウスから伸長精子細胞を回収して、卵母細胞に顕微注入した（表１）。いずれのタイプの細胞も正常な子孫をもたらし、それぞれ合計で１０および１８の子孫が生まれた（図４Ｆ）。子孫はＵＶ光の下でＥＹＦＰ蛍光を示し（図４Ｇ）、ｌｏｘＰの欠失が確認された（図４Ｈ）。これらの結果は、インビボでＡＡＶ９により形質導入されたＳＳＣが、感染経路にかかわらず、機能的に正常であることを示した。【００６５】
【表１】
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【００６６】
（４）ノイラミニダーゼによるＡＡＶ９のトランスフェクションの改善
ＡＡＶによる遺伝形質導入の効率の改善のため、ＡＡＶ９変異体カプシドを用いた。ＡＡＶ９カプシド表面に露出するチロシンがチロシンキナーゼによるリン酸化を受け、それによりウイルス粒子のユビキチン化と分解が引き起こされることが示されている。７つのカプシド残基のうち位置４４６および７３１の２つのチロシンのフェニルアラニンへの部位特異的変異（ＡＡＶ９−２ＹＦ）がユビキチン化を遅らせることが知られており、トランスフェクション効率を改善するために用いられている。しかしながら、ＡＡＶ９−２ＹＦを用いても明らかな改善は見られなかった（図５Ａ）。【００６７】
次に、ＡＡＶ感染効率を改善するため、ノイラミニダーゼを用いた。細胞表面グリカンへの接触はＡＡＶ感染経路において重要なステップであり、ノイラミニダーゼにより末端シアル酸を取り除くと、肺でのＡＡＶ９取り込みが大きく上昇する。ＡＡＶ９−ｍＣｈｅｒｒｙを、ノイラミニダーゼと共に、野生型マウスの精細管および間質組織に注入した。注入１週間後に当該マウスを屠殺すると、ノイラミニダーゼの同時注入を受けた精巣は、注入経路にかかわらず、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の顕著な増強を示した（図５Ｂ）。二重免疫染色および精細管数の定量化により、ノイラミニダーゼが、精細管注入および間質注入により、それぞれ約２．２倍および約１．５倍、ＧＦＲＡ１＋未分化精原細胞の形質導入効率を増加させたことが示された（図５Ｃ、Ｄ）。セルトリ細胞の形質導入では顕著な違いは見られず、これはおそらく、セルトリ細胞が何ら処理をしなくとも既に高効率で感染しているためである。これらの結果は、ノイラミニダーゼ処理が、未分化の精原細胞においてＡＡＶ９形質導入効率を改善し得ることを示した。【００６８】
（５）セルトリ細胞のＡＡＶ９形質導入によるＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスにおける不妊症の治療
ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄ雄マウスの不妊症の回復によりＡＡＶの有用性および安全性を試験した。このマウスは、セルトリ細胞の膜結合Ｋｉｔｌの発現を欠損することから先天的に不妊であるが、その精巣は、生存が膜結合ＫＩＴＬに依存しない少数のＳＳＣを有する（野生型の５％以下と推定される）。ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスの精巣は野生型マウスよりも小さく、組織学的解析では明らかな生殖細胞は見られない（図６Ａ）。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌを、精細管または間質組織に顕微注入した。一部の実験では、形質導入効率の改善のためにノイラミニダーゼを添加した。【００６９】
精子形成レベルを調べるため、顕微注入の３ヵ月後にマウスを屠殺した。ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスの精巣は小さいが（約１１ｍｇ）、ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌ注入を受けた精巣は注入経路にかかわらずより大きく成長しており（図６Ａ）、このことは精子形成の再生を示唆した。精巣の組織学的解析により、全ての試料において精子形成が明らかとなった。精子形成の回復の成功には、試料間で大きく差があったが、いずれの注入方法によっても、同等の数の精細管が精子形成を示した。最も成功したケースでは、精細管顕微注入または間質顕微注入により、それぞれ、約７７．１％および６４．１％の精細管が精子形成を示した（表２）。アデノウイルスによる遺伝子形質導入とは異なり、組織化学的解析において明らかな炎症反応は見られなかった（図６Ａ）。これらの結果は、セルトリ細胞が、投与経路にかかわらず、ＡＡＶベクターにより形質導入され精子形成を回復しうることを示唆した。【００７０】
【表２】
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【００７１】
ＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスから子孫を得るために、顕微授精を実施した。両タイプのマウス由来の精巣を一晩冷蔵し、翌日に顕微授精に用いた。ピペッティングを繰り返して精細管を分離し、円形または伸長精子細胞を卵母細胞への顕微注入に用いた。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌの精細管注入または間質注入を受けたＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄ精巣由来の精子を用いて、それぞれ、合計で１３５および１１８の胚が産生され、これらの胚の９８（７２．６％）および１００（８４．７％）が顕微授精の４８時間後に２細胞段階の胚に成長した。これらの２細胞段階の胚を全て、偽妊娠の母の子宮に移した。ＡＡＶ９−Ｋｉｔｌの精細管注入または間質注入を受けたＫｉｔｌＳｌ／ＫｉｔｌＳｌ−ｄマウスから、それぞれ、合計３１および２７の子孫が生まれた（図６Ｂ、Ｃ）。サザンブロット解析により、各子孫が突然変異遺伝子ＫｉｔｌＳｌまたはＫｉｔｌＳｌ−ｄを有することを示された（図６Ｄ、Ｅ）。【００７２】
（６）生殖系列へのＡＡＶ９組み込み欠損
ＳＳＣおよびセルトリ細胞への形質導入によりＡＡＶ９がこれら細胞に感染することが示されたため、これら方法により生じる子孫がＡＡＶ９ゲノムを含んでいる可能性がある。この可能性を調べるために、ＳＳＣまたはセルトリ細胞形質導入実験から生まれた全ての子孫から回収した尻尾ＤＮＡを用いてＰＣＲ解析を行った。解析により、いずれの子孫もＡＡＶ９ＤＮＡを含んでいないことが明らかとなった（図７ＡおよびＢ）。これらの結果は、ＡＡＶ９が、ゲノムに組み込まれることなく、ＳＳＣおよびセルトリ細胞の両方に形質導入できることを示す。
【実施例２】
【００７３】
ウサギ精巣断片をマウス精巣へ移植する実験系を用いて、ＡＡＶのウサギ精巣への感染実験を行った。初めに、雄のヌードマウス（ＫＳＮ／ｎｕ）にブスルファン（４４ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与し、内在の精子形成を欠損させた精巣を持つヌードマウスを作製した。この処理により精子形成を失った精巣は、精子幹細胞の増殖や維持および精子形成の進行に必要な環境は保ちつつも、精巣が小さくなるため、精巣断片の移植に適している。次に、ニュージーランドホワイト系統の１６週齢ウサギの精巣を摘出し、ハサミで約２ミリ角の精巣断片を作製した。この精巣断片をブスルファン処理したヌードマウス精巣に移植した。移植から１週間後に、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍＣｈｅｒｒｙ（１．０ｘ１０１４ウイルス粒子／ｍｌ）１０μｌを精巣間質に注入した。注入後１週間で精巣を回収し、組織切片を作製し、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体を用いて免疫染色を行った。丸い細胞の形態から、生殖細胞に感染していることが示唆され、間質注入したＡＡＶ９がウサギの精細管内の細胞に感染していることが示された（図８）。
【実施例３】
【００７４】
実施例２と同様にして、ヌードマウスへの移植実験をマーモセット精巣断片を用いて行った。マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）の精巣を摘出し、ハサミで約２ミリ角の精巣断片を作製して、ブスルファン処理したヌードマウス精巣に移植した。移植から１週間後に、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｍＣｈｅｒｒｙ（１．０ｘ１０１４ウイルス粒子／ｍｌ）１０μｌを精巣間質に注入した。注入後１週間で精巣を回収し、組織切片を作製し、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体、抗ＳＳＥＡ３抗体、および抗ＷＴ１抗体を用いて免疫染色を行った。精原細胞マーカーであるＳＳＥＡ３およびセルトリ細胞マーカーであるＷＴ１を発現する細胞でそれぞれｍＣｈｅｒｒｙの発現が確認され、間質注入したＡＡＶ９がマーモセットの精細管内の精原細胞およびセルトリ細胞に感染していることが示された（図９）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月15日(2019.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物の精巣内の雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にインビボでポリヌクレオチドを導入するための、アデノ随伴ウイルスベクターを含む組成物であって、アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、組成物。
【請求項２】
雄性不妊症を治療するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脊椎動物がヒトである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドを導入する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを非ヒト脊椎動物の精巣に注入することを含み、アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、方法。
【請求項６】
雄性生殖細胞またはセルトリ細胞にポリヌクレオチドが導入された非ヒト脊椎動物を製造する方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを非ヒト脊椎動物の精巣に注入することを含み、アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
雄性生殖細胞が精子幹細胞である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
脊椎動物が血液精巣関門を有する、請求項５、６および８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
アデノ随伴ウイルスベクターを精巣間質に注入する、請求項５、６、８および９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子改変非ヒト脊椎動物の製造方法であって、
非ヒト脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させること、および
前記遺伝子改変精子と卵とを受精させ、遺伝子改変個体を得ること
を含み、アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、方法。
【請求項１２】
遺伝子改変精子の製造方法であって、
非ヒト脊椎動物の精巣にアデノ随伴ウイルスベクターを注入して、遺伝子改変精子を形成させることを含み、アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ７Ｍ８である、方法。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
脊椎動物が血液精巣関門を有する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
アデノ随伴ウイルスベクターを精巣間質に注入する、請求項１１、１２および１４のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2018207736.tif 000037
2018207736.tif 000038
2018207736.tif 000039
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