(57)【要約】本開示は、（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、（２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、
を含む方法。
【請求項２】
修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
修飾核酸が約１０個〜約３０個のヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
修飾核酸が配列番号８の塩基配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
修飾核酸がＰＮＡを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
核酸試料が、対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
核酸試料が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
逆転写で用いる修飾核酸とＰＣＲで用いる修飾核酸が同一である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
逆転写で用いるリバースプライマーとＰＣＲで用いるリバースプライマーが同一である、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
逆転写とＰＣＲを同じ容器中で行う、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣＲが定量的ＰＣＲである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣＲが定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
対象がヒトである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
核酸試料が末梢血白血球または骨髄液有核細胞から抽出されたものである、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出するためのキット。
【請求項１７】
対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第２のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１７−０８７６６６号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）に見られる染色体異常である。９番染色体と２２番染色体の間での転座ｔ（９；２２）によって、９番染色体のｑ３４バンドに局在するｃ−ＡＢＬ１遺伝子と２２番染色体のｑ１１バンドに局在するｂｃｒ遺伝子が融合して形成される。ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子でコードされるキメラタンパク質であるＢＣＲ−ＡＢＬ１は、チロシンキナーゼ活性を有し、恒常的に細胞増殖シグナルを刺激し、アポトーシスを抑制することで、造血幹細胞を無制限に増殖させる。近年、イマチニブなどのＢＣＲ−ＡＢＬ１を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤が開発され、ＣＭＬおよびＰｈ＋ＡＬＬの治療成績は向上している。【０００３】
ＢＣＲ−ＡＢＬ１は、ＢＣＲの切断点の違いにより主にＭａｊｏｒ型（Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１）とｍｉｎｏｒ型（ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１）に分類される。Ｍ−ＢＣＲはＣＭＬ患者の約９５％に見られ、ｍ−ＢＣＲはＰｈ＋ＡＬＬ患者の約２０〜３０％に見られる。従って、それぞれのＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現量を測定することにより、ＣＭＬとＰｈ＋ＡＬＬの診断を補助することや、治療効果をモニタリングすることができる。Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１の発現量を測定するためのキットは、出願人により「Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ測定キット」として販売されている。このキットは、ワンステップ定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１の発現量を測定する。ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１の発現量を測定する方法としては、非特許文献１に記載の方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６３９１５９２号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gabert J et al. Leukemia.2003;17:2318-2357
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願は、従来法よりも精度の高いｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある態様では、本願は、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、
を含む方法を提供する。【０００８】
ある態様では、本願は、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を検出するためのキットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を従来法よりも高精度に検出できる。これにより、対象のＣＭＬまたはＰｈ＋ＡＬＬの診断または処置に有用な情報が得られることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｍ−ＢＣＲ遺伝子およびＭ−ＢＣＲ遺伝子の構造並びに本明細書に記載の方法の模式図である。
【図２−１】配列番号１の塩基配列を示す。
【図２−２】配列番号１の塩基配列（続き）を示す。
【図２−３】配列番号１の塩基配列（続き）を示す。
【図３−１】配列番号２の塩基配列を示す。
【図３−２】配列番号２の塩基配列（続き）を示す。
【図３−３】配列番号２の塩基配列（続き）を示す。
【図３−４】配列番号２の塩基配列（続き）を示す。
【図４−１】配列番号３の塩基配列を示す。
【図４−２】配列番号３の塩基配列（続き）を示す。
【図４−３】配列番号３の塩基配列（続き）を示す。
【図４−４】配列番号３の塩基配列（続き）を示す。
【図５】試験１における、ＰＮＡ存在下でのｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線を示す。
【図６】試験１における、ＰＮＡ存在下でのＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線を示す。
【図７】試験２における、ＰＮＡ存在下での１．０×１０７コピーのＭａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線を示す。
【図８】試験２における、ＰＮＡ存在下での１．０×１０６コピーのＭａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線を示す。
【図９】試験２における、ＰＮＡ存在下でのＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲの増幅曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１２】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８〜２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「１８〜３３」を含むものとする。
【００１３】
ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子は、慢性骨髄性白血病およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病にみられるＡＢＬ１遺伝子とＢＣＲ遺伝子の融合遺伝子である。９番染色体と２２番染色体の間での転座ｔ（９；２２）によって生じる。ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子は、ＢＣＲの切断点の違いにより主にｍｉｎｏｒ型とＭａｊｏｒ型に分類される。「ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１（ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１）遺伝子」は、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１とＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１が融合した遺伝子である。「Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１（Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１）遺伝子」は、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１〜１３または１〜１４とＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１が融合した遺伝子である。ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子およびＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の構造を図１に示す。
【００１４】
本願発明者らは、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの測定方法の開発を進める中で、既存のｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの測定キットと同様の方法で試験したところ、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのみならず、Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡも検出され、正確なｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの測定ができない場合があることを見出した（実施例の試験２参照）。当該試験では、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｃＤＮＡを増幅するために、ＢＣＲ遺伝子エクソン１の塩基配列に基づいて設計されたフォワードプライマーとＡＢＬ１遺伝子エクソン２の塩基配列に基づいて設計されたリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。図１に示す通り、Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｃＤＮＡには、ＢＣＲ遺伝子エクソン１とＡＢＬ１遺伝子エクソン２の間にＢＣＲ遺伝子エクソン２〜１３（約１４２８塩基長）または２〜１４（約１５０３塩基長）の領域が存在するため、従来は、これより大幅に短いｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ条件下では、Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｃＤＮＡは増幅されないと考えられてきた。しかしながら、試験２に示す通り、従来法では実際にはＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｃＤＮＡが増幅されることがあり、誤測定の可能性という重大な欠点があることが判明した。本願は、この欠点を解消し、正確なｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子もしくはその発現の検出またはｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１の発現量の測定を可能にする方法およびそのためのキットを提供するものである。
【００１５】
ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の塩基配列は、代表的には配列番号１で表されるが、多数の変異体が知られている。Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の塩基配列は、代表的には配列番号２および３で表されるが、多数の変異体が知られている。
【００１６】
本願に関して、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子およびＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子には、各々配列番号１および配列番号２または３で表される配列を有するポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列を有する遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。
【００１７】
さらに、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子およびＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子には、各々の配列番号１および配列番号２または３で表される塩基配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子が含まれる。配列同一性とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
【００１８】
本願に関して、典型的には、対象はヒトである。対象は、白血病、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）に罹患しているか、または、罹患している疑いのある対象であってもよい。
【００１９】
本願に関して、「核酸試料」は、対象から得られたＤＮＡ、または、対象から得られたＲＮＡを逆転写することにより得られたｃＤＮＡを意味する。ＲＮＡは、ｔｏｔａｌＲＮＡであってもよく、精製されたｍＲＮＡであってもよい。核酸試料は、対象に由来する造血幹細胞、白血球または白血病細胞を含む試料、例えば、血液、骨髄液、リンパ液から得られる。単離された造血幹細胞、血液細胞、白血球または白血病細胞から核酸試料を得てもよい。ある実施態様では、核酸試料は末梢血白血球または骨髄液有核細胞から得られる。ある実施態様では、核酸試料は末梢血白血球から得られる。
【００２０】
試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの抽出には、公知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、ＰＣＩ（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出）法において溶液を酸性にして水層から抽出する方法、市販のＤＮＡ抽出キットまたはＲＮＡ抽出キットを用いる方法、その他の公知の方法によることができる。
【００２１】
上記方法の工程（１）において、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸を用いる。これは、Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物において、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４に相当する領域に結合し得る。本明細書において、当該修飾核酸を、「Ｍ−ＢＣＲクランプ」と称する。
【００２２】
「修飾核酸」は、１個以上の人工ヌクレオチドを含む核酸であって、ある配列を有するｍＲＮＡまたはＤＮＡに対して、修飾核酸と同じ塩基配列を有するＤＮＡよりも強く相補鎖を形成し、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されない核酸である。逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼは、鋳型であるｍＲＮＡまたはＤＮＡに修飾核酸が結合していると、結合部位で伸長反応を停止する。Ｍ−ＢＣＲクランプは、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４に相当する塩基配列を含むＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子由来のポリヌクレオチドと結合し、これを鋳型とする伸長反応を抑制するが、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４に相当する塩基配列を含まないｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子由来のポリヌクレオチドとは結合せず、これを鋳型とする伸長反応を抑制しない。
【００２３】
Ｍ−ＢＣＲクランプは、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４、好ましくは２〜１３に含まれる約１０〜３０個、約１５〜２５個、約１９〜２３個または約２０〜２２個、例えば約２１個の連続するヌクレオチドの塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸として設計し得る。ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４は、例えば、配列番号４の塩基配列を有する。ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１３は、例えば、配列番号５の塩基配列を有する。ある実施態様では、Ｍ−ＢＣＲクランプは、工程（１）のＰＣＲ増幅産物において、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの結合領域に近い領域に結合するように設計する。具体的には、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの結合領域から約３００、約２００、約１５０または約１００ヌクレオチド以内の領域に結合するように設計する。ある実施態様では、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３に相当する領域（例えば、配列番号６）、例えばエクソン１３に相当する領域（例えば、配列番号７）に結合するように設計する。ある実施態様では、Ｍ−ＢＣＲクランプは、ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣ（配列番号８）の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を含む。ある実施態様では、Ｍ−ＢＣＲクランプは、配列番号８の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなる。
【００２４】
Ｍ−ＢＣＲクランプは、１個またはそれ以上の人工ヌクレオチドを含む。人工ヌクレオチドは、天然のヌクレオチドと異なる構造を有し、ヌクレアーゼ耐性や標的配列との結合親和性を高めるものを選択し得る。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Deleavey, G. F., & Damha, M. J. (2012). Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chemistry & biology, 19(8), 937-954 に記載の人工ヌクレオチドを使用し得る。人工ヌクレオチドの例には、例えば、無塩基（abasic）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２'−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型人工核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ,４'−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、拘束エチル（ｃＥｔ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。糖修飾を有する人工ヌクレオチドには、２'−Ｏ−メチルリボース、２'−Ｏ−メトキシエチルリボース、２'−デオキシ−２'−フルオロリボース、３'−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１'，２'−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するものが含まれる。修飾された塩基を有する人工ヌクレオチドとしては、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等を有するものが挙げられる。Ｍ−ＢＣＲクランプ中の人工ヌクレオチドは、すべて同じ種類のものであってもよく、２種類以上の異なる人工ヌクレオチドが存在してもよい。
【００２５】
ある実施態様では、Ｍ−ＢＣＲクランプは、人工ヌクレオチドとして、１個またはそれ以上のＰＮＡを含む。ＰＮＡは、一般に、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがペプチド結合することにより、ＤＮＡのリン酸結合がペプチド結合で置き換えられた構造を生じる（Nielsen et al. 1991 Science 254, 1457-1500）。ＰＮＡは、各種核酸分解酵素に対して耐性であり、ＤＮＡまたはＲＮＡと同様の分子認識によりＤＮＡまたはＲＮＡと相補鎖を形成する。ＰＮＡとＤＮＡの親和性は、ＤＮＡとＤＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの親和性よりも高い。ある実施態様では、Ｍ−ＢＣＲクランプ中のヌクレオチドは、すべてＰＮＡである。
【００２６】
ある実施態様では、核酸試料は、対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡであり、この場合、上記方法により対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現が検出される。ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸（Ｍ−ＢＣＲクランプ）の存在下で逆転写を行ってもよい。これは、Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡにおけるＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４に相当する領域に結合し得る。逆転写で用いるＭ−ＢＣＲクランプは、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４、好ましくは２〜１３に含まれる約１０〜３０個、約１５〜２５個、約１９〜２３個または約２０〜２２個、例えば約２１個の連続するヌクレオチドに相補的な塩基配列を有する修飾核酸として設計し得る。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ−ＢＣＲクランプは、Ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡにおいて、逆転写用のリバースプライマーの結合領域に近い領域に結合するように、即ち、ＢＣＲのエクソン２〜１４に相当する領域中の３’末端に近い領域に結合するように設計する。具体的には、ＢＣＲ由来領域とＡＢＬ１由来領域との結合点から約３００、約２００、約１５０または約１００ヌクレオチド以内の領域に結合するように設計する。例えば、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３に相当する領域（例えば、配列番号６）、例えばエクソン１３に相当する領域（例えば、配列番号７）に結合するように設計する。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ−ＢＣＲクランプは、ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣ（配列番号８）の塩基配列を含む。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ−ＢＣＲクランプは、配列番号８の塩基配列からなる。逆転写で用いるＭ−ＢＣＲクランプは、上記のＰＣＲで用いるＭ−ＢＣＲクランプと同様に製造および使用し得る。
【００２７】
逆転写で用いるＭ−ＢＣＲクランプは、ＰＣＲで用いるＭ−ＢＣＲクランプと同一であっても異なっていてもよい。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ−ＢＣＲクランプは、ＰＣＲで用いるＭ−ＢＣＲクランプと同一である。
【００２８】
逆転写またはＰＣＲにおけるＭ−ＢＣＲクランプの添加量は、逆転写またはＰＣＲをそれぞれ抑制し得る量であればよく、例えば、反応液の最終体積モル濃度で、約０．０１μＭ〜１０μＭ、約０．０１μＭ〜５μＭ、約０．０１μＭ〜１μＭまたは約０．０１μＭ〜０．１μＭ、例えば、約０．０２５、約０．０５０または約０．０７５μＭとすることができる。
【００２９】
逆転写のために、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを使用する。これは、逆転写反応において、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに結合し、伸長反応を引き起こし得る。ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１は、例えば、配列番号９の塩基配列を有し、逆転写用のリバースプライマーは、当該塩基配列に基づいて設計し得る。例えば、逆転写用のリバースプライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２の塩基配列（例えば、配列番号１０）に基づいて設計し得る。ある実施態様では、逆転写用のリバースプライマーは、ＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＡＣ（配列番号１１）の塩基配列を含む。ある実施態様では、逆転写用のリバースプライマーは、配列番号１１の塩基配列からなる。逆転写に適するプライマーの設計方法は当業者に周知である。
【００３０】
逆転写反応において、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、バッファーなどの試薬は、当分野で通常用いられるものを用いることができ、各種試薬の量、反応時間、温度などの条件は、逆転写酵素に添付されている説明書の記載や通常用いられるプロトコール等の公知の手法により、適宜決定することができる。例えば、逆転写酵素は分子生物学実験等に使用可能な公知の任意の逆転写酵素、例えば、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素等、またはそれらの誘導体を使用し得る。
【００３１】
ＰＣＲ用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物が増幅と定量に適する長さ、例えば、約１０〜１０００、約２０〜５００、約５０〜３００、約１００〜２００ヌクレオチド、約１３０〜１８０ヌクレオチド、約１５０〜１６０ヌクレオチド、例えば、約１５５ヌクレオチド長を有するように設計し得る。ＰＣＲに適するプライマーの設計方法は当業者に周知である。
【００３２】
ＰＣＲには、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを用いる。これは、ＰＣＲ反応において、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの相補鎖である一本鎖ＤＮＡのＢＣＲ遺伝子エクソン１に相当する領域に結合し、伸長反応を引き起こし得る。ＢＣＲ遺伝子のエクソン１は、例えば、配列番号１２の塩基配列を有し、フォワードプライマーは、当該塩基配列に基づいて設計し得る。ある実施態様では、フォワードプライマーは、ＴＣＧＣＡＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧ（配列番号１３）の塩基配列を含む。ある実施態様では、フォワードプライマーは、配列番号１３の塩基配列からなる。
【００３３】
ＰＣＲで用いるリバースプライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有し、逆転写で用いるリバースプライマーに準じて設計し得る。ＰＣＲで用いるリバースプライマーは、逆転写で用いるリバースプライマーと同一であっても異なっていてもよい。ある実施態様では、逆転写で用いるリバースプライマーとＰＣＲで用いるリバースプライマーは同一である。
【００３４】
ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ、例えば定量リアルタイムＰＣＲであってもよい。定量リアルタイムＰＣＲには、各種の蛍光ＰＣＲ技術を用い得る。蛍光ＰＣＲ技術としては、例えば、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉなどの蛍光性核酸標識剤を用いるインターカレーター法（例えば、ライトサイクラー（登録商標）（ロシュ社）、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System（登録商標）（パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ社）を用いる）、ＤＮＡポリメラーゼの５'エキソヌクレアーゼ活性を利用して増幅をリアルタイムでモニターするＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＮａｓｅＨ酵素のＲＮａｓｅ活性および専用のキメラＲＮＡプローブを利用するサイクリングプローブ法などが挙げられるが、これに限定されない。
【００３５】
ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブ法により定量リアルタイムＰＣＲを行う。一般的に、ＴａｑＭａｎプローブ法では、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加える。ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリング段階で鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。伸長反応段階でＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がクエンチャーから離れ、蛍光が発せられる。ＴａｑＭａｎプローブは、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物のどちらの鎖に結合してもよく、どこに結合してもよく、当分野で周知の方法により設計し得る。また、任意の蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせを使用し得る。ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブは、ＡＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣ（配列番号１４）の塩基配列を含む。ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブは、配列番号１４の塩基配列からなる。
【００３６】
定量リアルタイムＰＣＲにおいて、既知濃度のｃＤＮＡを含む標準液と未知濃度のｃＤＮＡ（検体）を同時に増幅し、横軸に増幅サイクル数、縦軸にレポーター色素の蛍光強度（対数変換値）をプロットした蛍光増幅曲線を作成してもよい。増幅曲線が直線状となる蛍光強度の中央値付近で横軸と平行な線を引き、その線と各増幅曲線が交わるときの増幅サイクル数を求め得る。さらに、横軸に各標準液の濃度（対数変換値）、縦軸に標準液の増幅サイクル数をプロットした標準曲線を作成し、この標準曲線上に検体の増幅サイクル数を当てはめることにより、検体の濃度を算出し得る。
【００３７】
逆転写とＰＣＲにおいて、同じＭ−ＢＣＲクランプおよびリバースプライマーを使用し得る。従って、逆転写産物の全部または一部に、ＰＣＲに必要な試薬を添加して反応を行うことができる。例えば、逆転写とＰＣＲを、ワンステップで、即ち、同一容器内で、同時または連続して行うことができる。例えば、工程（１）を、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとして実施し得る。
【００３８】
ＰＣＲのために、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファーなどの試薬は、当分野で通常用いられるものを用いることができ、各種試薬の量、反応時間、温度などの条件は、酵素に添付されている説明書の記載や通常用いられるプロトコール等の公知の手法により、適宜決定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは分子生物学実験等に使用可能な公知の任意のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼおよびその誘導体を使用し得る。
【００３９】
上記方法の工程（２）では、工程（１）においてＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する。核酸が増幅されたことは、核酸を検出するための方法として公知のものならば、何れの方法を用いて判定してもよい。例えば、増幅後の核酸の電気泳動、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法、インターカレーター性蛍光色素による二本鎖ＤＮＡの染色、蛍光プローブ法などにより、判定し得る。上記の通り、核酸の増幅を定量的ＰＣＲにおいて検出してもよい。
【００４０】
上記の工程（１）と並行して、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１に相当する塩基配列（例えば、配列番号９）を含む核酸を定量し、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１の測定値と比較してもよい。ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１に相当する塩基配列を含む核酸は、ＡＢＬ１遺伝子、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子およびＭ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子に由来し得る。例えば、工程（１）でｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬの核酸を定量し、その測定値をＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１に相当する塩基配列を含む核酸の測定値で除した値を、標準化されたｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１の測定値とし得る。同様に、一般的なハウスキーピング遺伝子の測定値を用いて、ｍ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１の測定値を標準化してもよい。
【００４１】
ある実施態様では、下表１のプライマー、クランプおよびプローブを使用する。これらのすべてを組み合わせて使用してもよく、少なくとも１つを使用してもよい。
【表１】
2018199137.tif 000002
【００４２】
ある態様では、本願は、上記の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、少なくとも、
（ａ）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸；
（ｂ）ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマー；および、
（ｃ）ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマー；
を含む。
【００４３】
キットは、さらに、第２の修飾核酸、第２のリバースプライマーおよび定量的ＰＣＲ用のプローブの少なくとも１つを含み得る。キットは、さらに、標準品、例えば、既知量のｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡを含み得る。キットは、さらに、対照遺伝子のｍＲＮＡ（例えばＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１に相当する塩基配列の少なくとも一部を含むｍＲＮＡ）を定量するためのプライマーを含み得る。キットは、さらに、上記の方法の実施に必要な試薬、例えば、逆転写、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ用の、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファーなどを含んでもよい。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書（例えば、書面または記憶媒体等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の構成要素を含んでもよい。
【００４４】
キットに含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水または適当な緩衝液中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、試験管、チューブ、プレート、マルチウェルプレート等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック、金属などの少なくとも１つの材料から形成されていてよい。容器は、ラベルを有していてもよい。
【００４５】
ある態様では、本願は、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第２のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法を提供する。この方法の詳細は、先に記載した方法に準じる。
【００４６】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、
を含む方法。
［２］核酸試料が、対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、第１項に記載の方法。
［３］核酸試料が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、第１項または第２項に記載の方法。
【００４７】
［４］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、工程（１）で得られた逆転写産物を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法。
【００４８】
［５］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）工程（１）で得られた逆転写産物を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第２のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法。
【００４９】
［６］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、工程（１）で得られた逆転写産物を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法。
【００５０】
［７］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第１項〜第６項のいずれかに記載の方法。
［８］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第１項〜第７項のいずれかに記載の方法。
［９］修飾核酸が約１０個〜約３０個のヌクレオチドを含む、第１項〜第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］修飾核酸が約２１個のヌクレオチドを含む、第１項〜第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］修飾核酸が配列番号８の塩基配列を含む、第１項〜第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］修飾核酸が配列番号８の塩基配列からなる、第１項〜第１１項のいずれかに記載の方法。
［１３］修飾核酸がＰＮＡを含む、第１項〜第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］逆転写で用いる修飾核酸とＰＣＲで用いる修飾核酸が同一である、第３項または第６項〜第１３項のいずれかに記載の方法。
【００５１】
［１５］逆転写で用いるリバースプライマーまたはＰＣＲで用いるリバースプライマーが配列番号１１の塩基配列を含む、第１項〜第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］逆転写で用いるリバースプライマーまたはＰＣＲで用いるリバースプライマーが配列番号１１の塩基配列からなる、第１項〜第１５項のいずれかに記載の方法。
［１７］逆転写で用いるリバースプライマーとＰＣＲで用いるリバースプライマーが同一である、第２項〜第１６項のいずれかに記載の方法。
［１８］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列を含む、第１項〜第１７項のいずれかに記載の方法。
［１９］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列からなる、第１項〜第１８項のいずれかに記載の方法。
［２０］逆転写とＰＣＲを同じ容器中で行う、第２項〜第１９項のいずれかに記載の方法。
［２１］ＰＣＲが定量的ＰＣＲである、第１項〜第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］ＰＣＲが定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、第１項〜第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］対象がヒトである、第１項〜第２２項のいずれかに記載の方法。
［２４］核酸試料が末梢血白血球または骨髄液有核細胞から抽出されたものである、第１項〜第２３項のいずれかに記載の方法。
［２５］核酸試料が末梢血白血球から抽出されたものである、第１項〜第２４項のいずれかに記載の方法。
［２６］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブの少なくとも１つを使用する、第１項〜第２５項のいずれかに記載の方法。
［２７］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブを使用する、第１項〜第２６項のいずれかに記載の方法。
【００５２】
［２８］ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を検出するためのキット。
［２９］ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出するためのキット。
［３０］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２〜１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第２８項または第２９項に記載のキット。
［３１］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第２８項〜第３０項のいずれかに記載のキット。
［３２］修飾核酸が約１０個〜約３０個のヌクレオチドを含む、第２８項〜第３１項のいずれかに記載のキット。
［３３］修飾核酸が２１個のヌクレオチドを含む、第２８項〜第３２項のいずれかに記載のキット。
［３４］修飾核酸が配列番号８の塩基配列を含む、第２８項〜第３３項のいずれかに記載のキット。
［３５］修飾核酸が配列番号８の塩基配列からなる、第２８項〜第３４項のいずれかに記載のキット。
［３６］修飾核酸がＰＮＡを含む、第２８項〜第３５項のいずれかに記載のキット。
【００５３】
［３７］リバースプライマーが配列番号１１の塩基配列を含む、第２８項〜第３６項のいずれかに記載のキット。
［３８］リバースプライマーが配列番号１１の塩基配列からなる、第２８項〜第３７項のいずれかに記載のキット。
［３９］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列を含む、第２８項〜第３８項のいずれかに記載のキット。
［４０］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列からなる、第２８項〜第３９項のいずれかに記載のキット。
［４１］定量的ＰＣＲ用のプローブをさらに含む、第２８項〜第４０項のいずれかに記載のキット。
［４２］第２の修飾核酸をさらに含む、第２８項〜第４１項のいずれかに記載のキット。
［４３］第２のリバースプライマーをさらに含む、第２８項〜第４２項のいずれかに記載のキット。
［４４］ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡをさらに含む、第２８項〜第４３項のいずれかに記載のキット。
［４５］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブの少なくとも１つを含む、第２８項〜第４４項のいずれかに記載のキット。
［４６］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブを含む、第２８項〜第４５項のいずれかに記載のキット。
【００５４】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例１】
【００５５】
ＲＴ−ＰＣＲ反応液の調製
下表の分量で試薬を調製した。
【表２】
2018199137.tif 000003
ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ ｍＲＮＡ蛍光標識プローブはレポーター色素として６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、クエンチャー色素としてＡＴＴＯ５４０Ｑを用いて標識し、ＡＢＬ 蛍光標識プローブはレポーター色素としてＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、クエンチャー色素としてＡＴＴＯ５４０Ｑを用いて標識した。
このＲＴ−ＰＣＲ反応液に、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２の一部をコードするｍＲＮＡに特異的に結合するＰＮＡクランプ（パナジーン社）を終濃度０、０．０２５、０．０５または０．０７５μＭとなるように添加した。【００５６】
使用したプライマー等の塩基配列は、下表の通りであった。
【表３】
2018199137.tif 000004
【００５７】
測定試料の調製
（１）Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品
Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含む、試験管内合成されたＲＮＡを調製した（配列番号１８）。濃度を１．０×１０７、１．０×１０６コピー／試験となるように調製した。
（２）ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品
ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含む、試験管内合成されたＲＮＡを調製した（配列番号１９）。濃度を１．０×１０７、１．０×１０５、１．０×１０３、１．０×１０２、１．０×１０１コピー／試験となるように調製した。
（３）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品
ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含む、試験管内合成されたＲＮＡを調製した（配列番号２０）。濃度を１．０×１０７、１．０×１０５、１．０×１０３、１．０×１０２コピー／試験となるように調製した。【００５８】
ＲＴ−ＰＣＲ反応条件
ＲＴ−ＰＣＲは下記の条件で行った。
・機器：Applied biosystems 7500 Fast realtime PCR system
・温度条件：３７℃５分間、６５℃１５分間、９４℃１分間反応後、９４℃５秒間、６７℃４０秒間の反応を４５回繰り返した。【００５９】
試験１：ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅に対するＰＮＡクランプの影響
（２）ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品を、上記の試薬と反応条件でＲＴ−ＰＣＲに付した。
ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（ｍｉｎｏｒ）およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（ＡＢＬ１）について、増幅曲線を各々図５および６に示す。また、ＲＴ−ＰＣＲの閾値のサイクル数（Cycle of threshold；Ｃｔ値）を下表に示す。これらの増幅においては、ＰＮＡクランプの添加による影響は見られなかった。
【表４】
2018199137.tif 000005
-：試験せず【００６０】
試験２：Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅に対するＰＮＡクランプの影響
（１）Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品を、上記の試薬と反応条件でＲＴ−ＰＣＲに付した。
Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（Ｍａｊｏｒ）およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（ＡＢＬ１）について、ＲＴ−ＰＣＲの閾値のサイクル数（Cycle of threshold；Ｃｔ値）を下表に示す。また、増幅曲線を図７〜９に示す。ＰＮＡクランプの非存在下では、増幅産物が１６３０ｂｐまたは１７０５ｂｐと非常に長いにも拘わらず、Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅が見られた。ＰＮＡクランプを添加するとＣｔ値が大きくなり、増幅が阻害された。一方ＡＢＬ１の増幅には、ＰＮＡクランプの添加による影響は見られなかった。
【表５】
2018199137.tif 000006
【００６１】
表５に示したＲＴ−ＰＣＲの閾値のサイクル数について、表４に示したｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ及びＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＮＡ濃度及び閾値のサイクル数から求めた標準曲線を基に、濃度を算出した結果を表６に示す。
ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡを増幅する系において検出されるＭａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの濃度は、ＰＮＡクランプを添加することでＰＮＡクランプ未添加の場合に比べて減少しており、ＰＮＡクランプによりＭａｊｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅反応が阻害されたことを示している。一方、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡを増幅する系においては、ＰＮＡクランプの添加による影響は見られなかった。
【表６】
2018199137.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本願は、従来法よりも精度の高いｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子の検出またはその発現量の測定方法を提供し得る。即ち、上記の方法またはキットを用いることで、ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を高精度に検出すること、または、その発現量を測定することが可能になる。よって、本願の方法は、白血病の発症および再発の診断、予後判断、並びに骨髄移植の時期決定などに有用である。
【図１】
2018199137.tif 000008
【図２−１】
2018199137.tif 000009
【図２−２】
2018199137.tif 000010
【図２−３】
2018199137.tif 000011
【図３−１】
2018199137.tif 000012
【図３−２】
2018199137.tif 000013
【図３−３】
2018199137.tif 000014
【図３−４】
2018199137.tif 000015
【図４−１】
2018199137.tif 000016
【図４−２】
2018199137.tif 000017
【図４−３】
2018199137.tif 000018
【図４−４】
2018199137.tif 000019
【図５】
2018199137.tif 000020
【図６】
2018199137.tif 000021
【図７】
2018199137.tif 000022
【図８】
2018199137.tif 000023
【図９】
2018199137.tif 000024
【配列表】
2018199137000001.app
【国際調査報告】
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