(57)【要約】  フローサイトメトリー法を用いたエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含むコントロール試料を測定し、コントロール試料の測定結果に基づき、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料の測定において用いる基準値として取得し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料を測定し、生体試料の測定結果に基づき、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリー法を用いたエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法であって、
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含むコントロール試料を測定し、
前記コントロール試料の測定結果に基づき、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料の測定において用いる基準値として取得し、
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料を測定し、
前記生体試料の測定結果に基づき、前記基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する、エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項２】
一の前記生体試料の測定ごとに前記コントロール試料の測定を行って前記基準値を取得し、取得した前記基準値を、前記一の生体試料の測定における前記エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に用いる、請求項１に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項３】
複数の前記生体試料の測定ごとに前記コントロール試料の測定を行って前記基準値を取得し、取得した前記基準値を、前記複数の生体試料の各測定における前記エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に用いる、請求項１に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項４】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全体に前記比を適用して前記基準値を取得する、請求項２または３に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項５】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全細胞数におけるＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の割合が、５７％以上７２％以下となるように、前記比が設定される、請求項４に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項６】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団においてＦＯＸＰ３の量が少ない方の細胞の数に対するＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の比率が１．３５以上２．４８以下となるように、前記比が設定される、請求項４に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項７】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラムに展開した場合に、前記ヒストグラムにおけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定する、請求項４ないし６の何れか一項に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項８】
前記ヒストグラムにおける前記ＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、前記近似曲線が前記軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を前記終了点に設定する、請求項７に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項９】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団のうちＣＤ４５ＲＡ陰性の集団に対し前記比を適用して前記基準値を取得する、請求項２または３に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１０】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全細胞数におけるＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の割合が、６２％以上７２％以下となるように、前記比が設定される、請求項９に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１１】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団においてＦＯＸＰ３の量が少ない方の細胞の数に対するＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の比率が１．６２以上２．４７以下となるように、前記比が設定される、請求項９に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１２】
前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラムに展開した場合に、前記ヒストグラムにおけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定する、請求項９ないし１１の何れか一項に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１３】
前記ヒストグラムにおける前記ＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、前記近似曲線が前記軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を前記終了点に設定する、請求項１２に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１４】
前記生体試料の前記測定結果に基づき、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、前記基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する、請求項１ないし１３の何れか一項に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１５】
前記生体試料の前記測定結果に基づいて、単一の生きたリンパ球の集団を抽出し、
抽出した前記リンパ球の集団からＣＤ３陽性細胞の集団を抽出し、
抽出した前記ＣＤ３陽性細胞の集団からＣＤ４陽性細胞の集団を抽出し、
抽出した前記ＣＤ４陽性細胞の集団のうち、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、前記基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する、請求項１４に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１６】
前記コントロール試料は、健康人の末梢血または健康人の末梢血から精製された末梢血単核球細胞を含む試料である、請求項１ないし１５の何れか一項に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法。
【請求項１７】
フローサイトメトリー法を用いたエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置であって、
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料を測定するための測定部と、
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含むコントロール試料を前記測定部が測定した測定結果に基づき、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料の測定において用いる基準値として取得し、
前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料を前記測定部が測定した測定結果に基づき、前記基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する制御部と、を備える、エフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項１８】
前記測定部は、一の前記生体試料の測定ごとに前記コントロール試料の測定を行い、
前記制御部は、前記基準値を前記一の生体試料の分析における前記エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に適用する、請求項１７に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項１９】
前記測定部は、複数の前記生体試料の測定ごとに前記コントロール試料の測定を行い、
前記制御部は、前記基準値を前記複数の生体試料の各分析における前記エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に適用する、請求項１７に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２０】
前記制御部は、前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全体に前記比を適用して前記基準値を取得する、請求項１８または１９に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２１】
前記制御部は、前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラムに展開した場合に、前記ヒストグラムにおけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定する、請求項２０に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２２】
前記制御部は、前記ヒストグラムにおける前記ＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、前記近似曲線が前記軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を前記終了点に設定する、請求項２１に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２３】
前記制御部は、前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団からＣＤ４５ＲＡ陰性の集団を抽出し、抽出した前記ＣＤ４５ＲＡ陰性の集団に対し前記比を適用して前記基準値を取得する、請求項１８または１９に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２４】
前記制御部は、前記コントロール試料の前記測定結果に基づいて得られた前記ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラムに展開した場合に、前記ヒストグラムにおけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、前記ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定する、請求項２３に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２５】
前記制御部は、前記ヒストグラムにおける前記ＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、前記近似曲線が前記軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を前記終了点に設定する、請求項２４に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２６】
前記制御部は、前記生体試料の前記測定結果に基づき、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、前記基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する、請求項１７ないし２５の何れか一項に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２７】
前記制御部は、前記生体試料の前記測定結果に基づいて、単一の生きたリンパ球の集団を抽出し、
抽出した前記リンパ球の集団からＣＤ３陽性細胞の集団を抽出し、
抽出した前記ＣＤ３陽性細胞の集団からＣＤ４陽性細胞の集団を抽出し、
抽出した前記ＣＤ４陽性細胞の集団のうち、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、前記基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する、請求項２６に記載のエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置。
【請求項２８】
請求項１７ないし２７の何れか一項に記載の分析装置と、
前記コントロール試料および前記生体試料の被検物質を蛍光標識する標識装置と、を備える、エフェクター型制御性Ｔ細胞の分析システム。
【請求項２９】
エフェクター型制御性Ｔ細胞を分析するフローサイトメータのコンピュータに、
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含むコントロール試料の測定結果に基づき、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料の測定において用いる基準値として取得する機能と、
ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料の測定結果に基づき、前記基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する機能と、を付与するプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法、エフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置、エフェクター型制御性Ｔ細胞の分析システム、および、プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４陽性の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫応答抑制の中心的役割を担うＴ細胞である。ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうち、ＩＬ−２レセプターα鎖であるＣＤ２５と、制御性Ｔ細胞の転写因子ＦＯＸＰ３とを発現したＴ細胞が、制御性Ｔ細胞として定義されている。さらに、制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡの発現量とＦＯＸＰ３の発現量とによって、ナイーブ型、エフェクター型および免疫抑制活性を持たないタイプ（非活性型）に分類される。このうち、エフェクター型制御性Ｔ細胞（ｅＴｒｅｇ）は、強い免疫抑制活性を有し、抗がん免疫の誘導に深く関与していることが知られている。このため、自己免疫や抗がん免疫等の分野において、エフェクター型制御性Ｔ細胞のさらなる分析が期待されている。【０００３】
以下の非特許文献１には、フローサイトメータを用いた解析によって、制御性Ｔ細胞を、ナイーブ型、エフェクター型および非活性型に分類可能であることが記載されている。ここでは、ＣＤ４５ＲＡとＦＯＸＰ３とがそれぞれ蛍光標識され、フローサイトメータによる検出結果から、図２１に示すスキャッタグラムが構成される。このスキャッタグラムにおいて、領域４０１、４０２、４０３に含まれる制御性Ｔ細胞が、それぞれ、ナイーブ型、エフェクター型および非活性型に分類される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hiroyoshi Nishikawa、外１名、"RegulatoryT cells in cancer immunotherapy"、Current Opinion in Immunology、2014年、Volume 27、p. 1―7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、試料によっては、ナイーブ型、エフェクター型および非活性型の領域が不明確となっており、これら領域の境界を適正に設定できない場合がある。したがって、このような試料については、エフェクター型制御性Ｔ細胞を精度良く検出できなかった。【０００６】
かかる課題に鑑み、本発明は、エフェクター型制御性Ｔ細胞を精度良く検出可能なエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法、エフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置、エフェクター型制御性Ｔ細胞の分析システム、および、プログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、フローサイトメトリー法を用いたエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法に関する。本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含むコントロール試料を測定し、コントロール試料の測定結果に基き、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料の測定において用いる基準値として取得し（Ｓ１３）、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料を測定し（Ｓ２２）、生体試料の測定結果に基づき、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する（Ｓ２３）。【０００８】
コントロール試料とは、生体試料の測定に用いる基準値を取得するために測定される試料であって、たとえば、健康人と同等の末梢血単核球細胞の集団を含む。コントロール試料とは、健康人の末梢血そのものや、健康人の末梢血から密度勾配法により精製した末梢血単核球細胞を含む試料などを広く含むものである。ＦＯＸＰ３量とは、細胞にＦＯＸＰ３がどの程度含まれているかを示す値のことである。健康人とは、特定の慢性疾患に罹患しておらず、日常生活に支障のない人のことである。【０００９】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法によれば、コントロール試料を測定して得たＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割することにより基準値が設定されるため、基準値を画一的に設定できる。また、コントロール試料を用いることにより、以下の実施形態に示すように、測定環境が変化しても基準値を適正に設定できる。さらに、予めコントロール試料を測定して基準値が取得されるため、測定環境に応じた基準値を生体試料の測定時の基準値として設定できる。このように、本態様に係る検出方法によれば、生体試料の測定時に用いる基準値を、画一的かつ適正に設定できるため、エフェクター型制御性Ｔ細胞を高精度かつ安定的に検出できる。【００１０】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、一の生体試料の測定ごとにコントロール試料の測定を行って基準値を取得し、取得した基準値を、一の生体試料の測定におけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に用いる。こうすると、生体試料の測定ごとに基準値が設定されるため、生体試料測定時の測定環境に適合した基準値を設定できる。よって、エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出精度を高めることができる。【００１１】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、複数の生体試料の測定ごとにコントロール試料の測定を行って基準値を取得し、取得した基準値を、複数の生体試料の各測定におけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に用いる。こうすると、コントロール試料の測定頻度を減らすことができるため、生体試料の測定効率を高めることができる。この方法は、生体試料が装置によって自動で調製および測定される場合のように、複数の生体試料が均一な条件で調製および測定され得る場合に特に有効なものである。なお、試薬のロットが変わるタイミングにおいては、試薬の状態が変わり得るため、生体試料が装置によって自動で調製および測定される場合であっても、再度、コントロール試料によって基準値を設定することが好ましい。【００１２】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全体に比を適用して基準値を取得する（Ｓ１０８）。【００１３】
この場合に、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全細胞数におけるＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の割合が、５７％以上７２％以下となるように、比が設定される。このように比を設定することにより、以下の実施形態に示すように、基準値を適正に設定できる。【００１４】
また、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団においてＦＯＸＰ３の量が少ない方の細胞の数に対するＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の比率が１．３５以上２．４８以下となるように、比が設定されてもよい。このように比を設定することにより、以下の実施形態に示すように、基準値を適正に設定できる。【００１５】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラム（７１）に展開した場合に、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定する（Ｓ１０７）。こうすると、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を適正に特定できる。【００１６】
この場合に、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、近似曲線が軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を終了点に設定する。こうすると、終了点を画一的に設定できる。【００１７】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団のうちＣＤ４５ＲＡ陰性の集団に対し比を適用して基準値を取得する（Ｓ１０８）。こうすると、基準値の取得においてノイズとなる細胞が除去されるため、基準値の精度をより高めることができる。【００１８】
この場合に、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全細胞数におけるＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の割合が、６２％以上７２％以下となるように、比が設定される。このように比を設定することにより、以下の実施形態に示すように、基準値を適正に設定できる。【００１９】
また、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団においてＦＯＸＰ３の量が少ない方の細胞の数に対するＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数の比率が１．６２以上２．４７以下となるように、比が設定されてもよい。このように比を設定することにより、以下の実施形態に示すように、基準値を適正に設定できる。【００２０】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、コントロール試料の測定結果に基づいて得られたＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラム（７１）に展開した場合に、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定する（Ｓ１０７）。こうすると、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を適正に特定できる。【００２１】
この場合に、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、近似曲線が軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を終了点に設定する。こうすると、終了点を画一的に設定できる。【００２２】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、生体試料の測定結果に基づき、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する。こうすると、エフェクター型制御性Ｔ細胞を高精度に検出できる。【００２３】
この場合に、生体試料の測定結果に基づいて、単一の生きたリンパ球の集団を抽出し（Ｓ２０１〜Ｓ２０３）、抽出したリンパ球の集団からＣＤ３陽性細胞の集団を抽出し（Ｓ２０４）、抽出したＣＤ３陽性細胞の集団からＣＤ４陽性細胞の集団を抽出し（Ｓ２０５）、抽出したＣＤ４陽性細胞の集団のうち、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する（Ｓ２０６）。【００２４】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出方法において、コントロール試料は、健康人の末梢血または健康人の末梢血から精製された末梢血単核球細胞を含む試料である。【００２５】
本発明の第２の態様は、フローサイトメトリー法を用いたエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置に関する。本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置（１２０）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料（１０２）を測定するための測定部（２００）と、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含むコントロール試料（１０１）を測定部（２００）が測定した測定結果に基づき、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料（１０２）の測定において用いる基準値として取得し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料（１０２）を測定部（２００）が測定した測定結果に基づき、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団から、エフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する制御部（３１０）と、を備える。【００２６】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置（１２０）によれば、第１の態様と同様の効果が奏される。【００２７】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置（１２０）において、測定部（２００）は、一の生体試料（１０２）の測定ごとにコントロール試料（１０１）の測定を行い、制御部（３１０）は、基準値を一の生体試料（１０２）の分析におけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に適用するよう構成され得る。【００２８】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置（１２０）において、測定部（２００）は、複数の生体試料（１０２）の測定ごとにコントロール試料（１０１）の測定を行い、制御部（３１０）は、基準値を複数の生体試料（１０２）の各分析におけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に適用するよう構成され得る。【００２９】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置（１２０）において、制御部（３１０）は、コントロール試料（１０１）の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全体に比を適用して基準値を取得するよう構成され得る。【００３０】
この場合に、制御部（３１０）は、コントロール試料（１０１）の測定結果に基づいて得られたＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラム（７１）に展開した場合に、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定するよう構成され得る。【００３１】
また、制御部（３１０）は、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、近似曲線が軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を終了点に設定するよう構成され得る。【００３２】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置（１２０）において、制御部（３１０）は、コントロール試料（１０１）の測定結果に基づいて得られたＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団からＣＤ４５ＲＡ陰性の集団を抽出し、抽出したＣＤ４５ＲＡ陰性の集団に対し比を適用して基準値を取得するよう構成され得る。【００３３】
この場合に、制御部（３１０）は、コントロール試料（１０１）の測定結果に基づいて得られたＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の集団をＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラム（７１）に展開した場合に、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定するよう構成され得る。【００３４】
また、制御部（３１０）は、ヒストグラム（７１）におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に近似曲線を適用した場合に、近似曲線が軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点を終了点に設定するよう構成され得る。【００３５】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析装置（１２０）において、制御部（３１０）は、生体試料（１０２）の測定結果に基づき、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出するよう構成され得る。【００３６】
この場合に、制御部（３１０）は、生体試料（１０２）の測定結果に基づいて、単一の生きたリンパ球の集団を抽出し、抽出したリンパ球の集団からＣＤ３陽性細胞の集団を抽出し、抽出したＣＤ３陽性細胞の集団からＣＤ４陽性細胞の集団を抽出し、抽出したＣＤ４陽性細胞の集団のうち、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団を、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出するよう構成され得る。【００３７】
本発明の第３の態様は、エフェクター型制御性Ｔ細胞の分析システムに関する。本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析システム（１００）は、第２の態様に係る分析装置（１２０）と、コントロール試料（１０１）および生体試料（１０２）の被検物質を蛍光標識する標識装置（１１０）と、を備える。【００３８】
本態様に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞の分析システムによれば、第１および第２の態様と同様の効果が奏されるとともに、コントロール試料および生体試料の被検物質を蛍光標識する処理を自動で行うことができる。これにより、複数の試料を均一な条件で調製できる。【００３９】
本発明の第４の態様は、プログラムに関する。本態様に係るプログラム（３２１）は、エフェクター型制御性Ｔ細胞を分析するフローサイトメータのコンピュータに、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含むコントロール試料（１０１）の測定結果に基づき、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料（１０２）の測定において用いる基準値として取得する機能と、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団を含む生体試料（１０２）の測定結果に基づき、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する機能と、を付与する。【００４０】
本態様に係るプログラムによれば、第１および第２の態様と同様の効果が奏される。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によれば、エフェクター型制御性Ｔ細胞を高精度かつ安定的に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１（ａ）は、実施形態１に係るコントロール試料を測定して基準値を取得する処理を示すフローチャートである。図１（ｂ）は、実施形態１に係る基準値を取得する処理において展開されるヒストグラムを示す模式図である。図１（ｃ）は、実施形態１に係る生体試料に含まれるエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する処理を示すフローチャートである。
【図２】図２は、実施形態１に係る基準値を取得する処理を詳細に示すフローチャートである。
【図３】図３（ａ）は、実施形態１に係る全粒子を含むスキャッタグラムの例示図である。図３（ｂ）〜（ｆ）は、それぞれ、実施形態１に係る抽出された単一細胞、生きた細胞、リンパ球、ＣＤ３陽性Ｔ細胞、およびＣＤ４陽性Ｔ細胞を含むスキャッタグラムの例示図である。
【図４】図４は、実施形態１に係る抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞がＦＯＸＰ３量を軸として展開されたヒストグラムの例示図である。
【図５】図５は、実施形態１に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する処理を詳細に示すフローチャートである。
【図６】図６（ａ）は、実施形態１に係る生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合に生成されたスキャッタグラムである。図６（ｂ）は、実施形態１に係る抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ量を軸として展開されたヒストグラムの模式図である。図６（ｃ）は、実施形態１に係る生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合に抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞がＦＯＸＰ３量を軸として展開されたヒストグラムである。
【図７】図７（ａ）は、実施形態１の検証に係る生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合にスキャッタグラムにおいて目視により設定された境界値を示す図である。図７（ｂ）は、実施形態１の検証に係る生体試料が健康人の末梢血単核球細胞である場合に境界値が設定されたスキャッタグラムである。図７（ｃ）は、実施形態１の検証に係る生体試料が健康人の末梢血単核球細胞である場合に境界値が設定されたヒストグラムを例示する図である。
【図８】図８（ａ）〜（ｃ）は、実施形態１の検証に係る生体試料が健康人の末梢血単核球細胞である場合に境界値が設定されたヒストグラムである。
【図９】図９（ａ）は、実施形態１の検証に係るコントロール試料に基づいて得られたヒストグラムに比率が適用された状態を示す図である。図９（ｂ）は、実施形態１の検証に係る生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合に基準値が設定されたスキャッタグラムである。
【図１０】図１０（ａ）〜（ｆ）は、実施形態１の検証に係る比較例のマニュアルによる分画を説明するためのスキャッタグラムである。
【図１１】図１１は、実施形態２に係る基準値を取得する処理を詳細に示すフローチャートである。
【図１２】図１２（ａ）は、実施形態２に係るコントロール試料に基づいて抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を含むスキャッタグラムである。図１２（ｂ）は、実施形態２に係るコントロール試料に基づいて抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ量を軸として展開されたヒストグラムである。図１２（ｃ）は、実施形態２に係るコントロール試料に基づいて抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞を含むスキャッタグラムにおいて等高線を示す図である。
【図１３】図１３（ａ）は、実施形態２に係る生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合にスキャッタグラムにおいて設定された基準値および分画値を示す図である。図１３（ｂ）は、実施形態２に係る生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合に抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞がＦＯＸＰ３量を軸として展開されたヒストグラムである。
【図１４】図１４（ａ）〜（ｃ）は、実施形態２の検証に係る生体試料が健康人の末梢血単核球細胞である場合に境界値が設定されたヒストグラムである。
【図１５】図１５（ａ）は、実施形態２の検証に係るコントロール試料に基づいて得られたヒストグラムに比率が適用された状態を示す図である。図１５（ｂ）は、実施形態２の検証に係る生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合に基準値が設定されたスキャッタグラムである。
【図１６】図１６（ａ）は、実施形態３に係るエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する処理を詳細に示すフローチャートである。図１６（ｂ）は、実施形態３に係るスキャッタグラムにおけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の領域、ナイーブ型制御性Ｔ細胞の領域、および非活性型制御性Ｔ細胞の領域を示す図である。
【図１７】図１７は、実施形態１〜３に係る分析を行うための分析システムの構成を示すブロック図である。
【図１８】図１８は、実施形態１〜３に係る分析を行うための分析システムにおいて実行される処理を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、実施形態１〜３に係る分析を行うための分析システムにおいて実行される処理を示すフローチャートである。
【図２０】図２０は、実施形態１〜３に係る分析を行うための分析システムにおいて表示部に表示される画面の構成を示す図である。
【図２１】図２１は、関連技術を説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下の実施形態では、コントロール試料を測定して基準値を取得し、取得した基準値を用いて生体試料に含まれるエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する。
【００４４】
コントロール試料とは、生体試料の測定に用いる基準値を取得するために測定される試料であって、たとえば、健康人と同等の末梢血単核球細胞の集団を含む。コントロール試料とは、健康人の末梢血そのものや、健康人の末梢血から密度勾配法などにより精製した末梢血単核球細胞を含む試料などを広く含むものである。なお、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）は、単球とリンパ球を含む。健康人とは、特定の慢性疾患に罹患しておらず、日常生活に支障のない人のことである。生体試料とは、被検者の末梢血単核球細胞からなる試料であり、たとえば、被検者のがん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）を含む試料である。
【００４５】
また、以下の実施形態では、便宜上、スキャッタグラムおよびヒストグラムが実際に生成されるものとして説明が行われているが、スキャッタグラムおよびヒストグラムは必ずしも生成されなくてもよい。たとえば、生成されたスキャッタグラムおよびヒストグラムに基づいて処理が行われることに代えて、同等の手順がデータ処理により行われてもよい。
【００４６】
＜実施形態１＞
図１（ａ）に示すように、コントロール試料を測定して基準値を取得する方法は、ステップＳ１１〜Ｓ１３のステップを含む。図１（ａ）の説明において、適宜、図１（ｂ）に示すグラフを参照する。図１（ｃ）に示すように、図１（ａ）の方法で取得した基準値を用いて生体試料に含まれるエフェクター型制御性Ｔ細胞（ｅＴｒｅｇ）を検出する方法は、ステップＳ２１〜Ｓ２３のステップを含む。以下には、オペレータが、装置を用いて、図１（ａ）、（ｃ）の方法を実行する場合について説明する。なお、図１（ａ）、（ｃ）の各ステップが、装置により自動で実行されてもよい。図１（ａ）、（ｃ）の各ステップを行う装置の構成については、図１７を参照して説明する。
【００４７】
図１（ａ）を参照して、コントロール試料を測定して基準値を取得する処理について説明する。
【００４８】
ステップＳ１１において、オペレータは、コントロール試料の被検物質を蛍光標識する。具体的には、生細胞に比べて死細胞を強く染色する蛍光色素と、表面抗原ＣＤ３を染色するための蛍光色素と、表面抗原ＣＤ４を染色するための蛍光色素と、表面抗原ＣＤ８を染色するための蛍光色素と、表面抗原ＣＤ４５ＲＡを染色するための蛍光色素と、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の転写因子ＦＯＸＰ３を染色するための蛍光色素とにより、それぞれ、コントロール試料に含まれる細胞の対応する被検物質が蛍光標識される。
【００４９】
被検物質の蛍光染色は、各蛍光色素をそれぞれ有する標識抗体を被検物質に結合させることにより行われる。たとえば、生細胞に比べて死細胞を強く染色する蛍光色素を有する標識抗体として、Fixable Viability Dye（FVD-eFluor（登録商標） 506）（affymetrix eBioscence）が用いられる。表面抗原ＣＤ３を染色するための蛍光色素を有する標識抗体として、anti-human CD3 Alexa Fluor（登録商標） 700（affymetrix eBioscence）が用いられる。表面抗原ＣＤ４を染色するための蛍光色素を有する標識抗体として、anti-human CD4 APC-eFluor（登録商標） 780（affymetrix eBioscence）が用いられる。表面抗原ＣＤ８を染色するための蛍光色素を有する標識抗体として、anti-human CD8a PE-Cy7（affymetrix eBioscence）が用いられる。表面抗原ＣＤ４５ＲＡを染色するための蛍光色素を有する標識抗体として、anti-human CD45RA FITC（affymetrix eBioscence）が用いられる。ＦＯＸＰ３を染色するための蛍光色素を有する標識抗体として、anti-human FoxP3 PE（affymetrix eBioscence）が用いられる。
【００５０】
ステップＳ１２において、オペレータは、蛍光標識されたコントロール試料を測定する。ステップＳ１２では、フローサイトメトリー法に基づいて、コントロール試料から生じた前方散乱光、側方散乱光、および蛍光に基づく信号が取得される。
【００５１】
具体的には、オペレータは、ステップＳ１１において蛍光標識したコントロール試料を、分析装置（フローサイトメータ）の検出部に供給する。検出部は、供給されたコントロール試料をフローセルに流す。検出部は、フローセルを流れるコントロール試料に光を照射する。これにより、コントロール試料に含まれる細胞などの粒子に光が照射され、粒子から前方散乱光と側方散乱光が生じ、各蛍光色素から互いに異なる波長の蛍光が生じる。検出部は、前方散乱光、側方散乱光、および蛍光に基づく信号を出力する。そして、検出部から出力される信号が、粒子ごとの波形状の信号に処理され、波形状の信号から波形のピーク値、面積、幅などの特徴パラメータが取得され、取得された特徴パラメータが測定結果として分析装置の記憶部に記憶される。
【００５２】
ステップＳ１３において、オペレータは、ステップＳ１２のコントロール試料の測定結果に基づき、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の集団に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、生体試料の測定の際に用いる基準値として取得する。
【００５３】
具体的には、分析装置は、ステップＳ１２で取得した信号に基づいて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を抽出し、抽出したＣＤ４陽性Ｔ細胞を、図１（ｂ）に示すように、ＦＯＸＰ３の量を軸とするヒストグラムに展開する。このヒストグラムにおいて、横軸はＦＯＸＰ３量を示し、縦軸は頻度を示す。ＦＯＸＰ３量とは、細胞にＦＯＸＰ３がどの程度含まれているかを示す値であり、具体的にはＦＯＸＰ３を染色する蛍光色素から生じた蛍光の強度のことである。分析装置は、ヒストグラムにおけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の高値側の終了点以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団を、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団として特定する。
【００５４】
続いて、分析装置は、特定したＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を、あらかじめ記憶部に記憶された比で分割する。すなわち、図１（ｂ）に示すように、分割線の左側および右側に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の数を、それぞれＡ、Ｂとすると、Ａ：Ｂがあらかじめ記憶部に記憶された比となるように、分割線が設定される。そして、分析装置は、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団が所定の比で分割されるときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を、基準値として取得し、記憶部に記憶する。
【００５５】
なお、Ａ、Ｂは、細胞の個数に限らず、図１（ｂ）に示すようなＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を示す波形部分において、それぞれ、分割線の左側および右側における波形部分の下側の面積であってもよい。この場合、分割線の左側および右側に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の面積比Ａ：Ｂが所定の比となるように、分割線が設定される。
【００５６】
こうして、コントロール試料を測定して基準値が取得される。このような基準値の取得処理は、被検者から採取された生体試料からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する前に行われる。ステップＳ１３の基準値を取得する工程については、追って図２を参照して詳細に説明する。
【００５７】
図１（ｃ）を参照して、取得した基準値を用いて生体試料に含まれるエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する処理について説明する。
【００５８】
ステップＳ２１において、オペレータは、生体試料の被検物質を蛍光標識する。ステップＳ２１では、図１（ａ）のステップＳ１１と同様の蛍光色素により、生体試料に含まれる細胞の被検物質が蛍光標識される。ステップＳ２２において、オペレータは、蛍光標識された生体試料を測定する。ステップＳ２２では、図１（ａ）のステップＳ１２と同様に、分析装置（フローサイトメータ）の検出部により、生体試料から生じた前方散乱光、側方散乱光、および蛍光に基づく信号が取得される。そして、検出部から出力される信号が、粒子ごとの波形状の信号に処理され、波形状の信号から波形のピーク値、面積、幅などの特徴パラメータが取得され、取得された特徴パラメータが測定結果として分析装置の記憶部に記憶される。
【００５９】
ステップＳ２３において、オペレータは、ステップＳ２２の生体試料の測定結果に基づき、基準値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞の集団に基づいてエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する。
【００６０】
具体的には、分析装置は、ステップＳ２２で取得した信号に基づいて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を抽出する。分析装置は、図１（ａ）のステップＳ１３で取得した基準値を記憶部から読み出し、抽出したＣＤ４陽性Ｔ細胞から、ＦＯＸＰ３量が基準値よりも多い細胞を抽出する。分析装置は、抽出したＦＯＸＰ３量が基準値よりも多い細胞のうち、ＣＤ４５ＲＡ陰性の細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する。ステップＳ２３のエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する工程については、追って図５を参照して詳細に説明する。なお、抽出したＦＯＸＰ３量が基準値よりも多い細胞のうち、ＣＤ４５ＲＡ陽性の細胞は一般的に少ないため、ＣＤ４５ＲＡ量による抽出を行わずに、ＦＯＸＰ３量が基準値よりも多い細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞として検出してもよい。
【００６１】
以上のように、コントロール試料を測定して得たＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を所定の比で分割することにより基準値が設定されるため、基準値を画一的に設定できる。また、健康人と同等の末梢血単核球細胞の集団を含む試料をコントロール試料として用いることにより、測定環境が変化しても基準値を適正に設定できる。すなわち、試薬の交換、試薬の劣化、環境温度の変化、試薬や試料の調製量の変化といった測定環境の変化が生じても、実施形態１によれば適正な基準値を設定できる。さらに、予めコントロール試料を測定して基準値が取得されるため、測定環境に応じた基準値を生体試料の測定時の基準値として設定できる。このように、生体試料の測定時に用いる基準値を、画一的かつ適正に設定できるため、エフェクター型制御性Ｔ細胞を高精度かつ安定的に検出できる。
【００６２】
なお、図１（ａ）に示す基準値の取得処理は、一の生体試料の測定ごとに行われてもよく、複数の生体試料の測定ごとに行われてもよい。
【００６３】
すなわち、一の生体試料の測定ごとにコントロール試料の測定を行って基準値を取得し、取得した基準値を一の生体試料の測定におけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に用いてもよい。この場合、生体試料の測定ごとに基準値が設定されるため、生体試料測定時の測定環境に適合した基準値を設定でき、エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出精度を高めることができる。
【００６４】
また、複数の生体試料の測定ごとにコントロール試料の測定を行って基準値を取得し、取得した基準値を複数の生体試料の各測定におけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に用いてもよい。この場合、コントロール試料の測定頻度を減らすことができるため、生体試料の測定効率を高めることができる。この方法は、生体試料が装置によって自動で調製および測定される場合のように、複数の生体試料が均一な条件で調製および測定され得る場合に特に有効なものである。なお、試薬のロットが変わるタイミングにおいては、試薬の状態が変わり得るため、生体試料が装置によって自動で調製および測定される場合であっても、再度、コントロール試料によって基準値を設定することが好ましい。
【００６５】
図２を参照して、基準値を取得する処理について詳細に説明する。以下に示す各ステップでは、図１（ａ）のステップＳ１２で取得したコントロール試料の測定結果に基づいて処理が行われる。
【００６６】
ステップＳ１０１において、分析装置は、測定結果に基づいて、図３（ａ）に示すように、全ての粒子をスキャッタグラム１０にプロットし、領域１１に含まれる粒子を単一細胞として抽出する。スキャッタグラム１０において、横軸は、前方散乱光に基づく信号波形の面積であり、縦軸は、前方散乱光に基づく信号波形の幅である。
【００６７】
ステップＳ１０２において、分析装置は、図３（ｂ）に示すように、ステップＳ１０１で抽出した単一細胞をスキャッタグラム２０にプロットし、領域２１に含まれる粒子を生きた細胞として抽出する。スキャッタグラム２０において、横軸は、前方散乱光に基づく信号波形の面積であり、縦軸は、生細胞に比べて死細胞を強く染色する蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値である。
【００６８】
ステップＳ１０３において、分析装置は、図３（ｃ）に示すように、ステップＳ１０２で抽出した生きた細胞をスキャッタグラム３０にプロットし、領域３１に含まれる粒子をリンパ球として抽出する。スキャッタグラム３０において、横軸は、前方散乱光に基づく信号波形の面積であり、縦軸は、側方散乱光に基づく信号波形の面積である。
【００６９】
なお、ステップＳ１０１〜Ｓ１０３が実行される順序は、図２に示す順に限らない。ステップＳ１０１〜Ｓ１０３の各ステップは、どのような順序で実行されてもよい。
【００７０】
ステップＳ１０４において、分析装置は、図３（ｄ）に示すように、ステップＳ１０３で抽出したリンパ球をスキャッタグラム４０にプロットし、領域４１に含まれる粒子をＣＤ３陽性Ｔ細胞として抽出する。スキャッタグラム４０において、横軸は、表面抗原ＣＤ３を染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値であり、縦軸は、側方散乱光に基づく信号波形の面積である。
【００７１】
ステップＳ１０５において、分析装置は、図３（ｅ）に示すように、ステップＳ１０４で抽出したＣＤ３陽性Ｔ細胞をスキャッタグラム５０にプロットし、領域５１に含まれる粒子をＣＤ４陽性Ｔ細胞として抽出する。スキャッタグラム５０において、横軸は、表面抗原ＣＤ４を染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値であり、縦軸は、表面抗原ＣＤ８を染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値である。なお、領域５２は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を含む領域である。
【００７２】
ステップＳ１０５で抽出したＣＤ４陽性Ｔ細胞をスキャッタグラム６０にプロットすると、たとえば、図３（ｆ）のように粒子が分布する。スキャッタグラム６０において、横軸は、ＦＯＸＰ３を染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値であり、縦軸は、表面抗原ＣＤ４５ＲＡを染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値である。
【００７３】
ステップＳ１０６において、分析装置は、図４に示すように、ステップＳ１０５で抽出したＣＤ４陽性Ｔ細胞をヒストグラム７１に展開する。ヒストグラム７１において、横軸は、ＦＯＸＰ３を染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値であり、縦軸は、頻度である。ヒストグラム７１の横軸は、図３（ｆ）のスキャッタグラム６０の横軸と同じである。
【００７４】
なお、図４に示すヒストグラム７１では、約１００を上回る頻度については、便宜上省略されている。以降の図に示すヒストグラム７１、７２においても、同様に、所定の値を上回る頻度については適宜省略される。
【００７５】
ステップＳ１０７において、分析装置は、ステップＳ１０６で展開したヒストグラム７１に基づいて、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞を特定する。
【００７６】
具体的には、ヒストグラム７１におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の高値側の終了点のＦＯＸＰ３量以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団が、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞として特定される。これにより、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団を適正に特定できる。
【００７７】
この場合の終了点は、ヒストグラム７１におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形、すなわち左側の山状の波形に対して近似曲線が適用された場合に、近似曲線がＦＯＸＰ３量の軸とＦＯＸＰ３量の高値側で交差する点に設定される。より詳細には、左側の山状の波形の正規分布に対する近似曲線がガウシアンフィッティングにより取得され、近似曲線がＦＯＸＰ３量の軸と高値側で交差する点が、終了点として設定される。こうすると、終了点を画一的に設定できる。図４には、終了点付近の近似曲線が太い点線により図示されている。
【００７８】
ステップＳ１０８において、分析装置は、ステップＳ１０７で特定したＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全体に所定の比を適用し、この比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を基準値として取得する。所定の比は、あらかじめ記憶部に記憶されており、生体試料の測定ごとに記憶部から読み出される。
【００７９】
ここで、図１（ｂ）を参照して説明した場合と同様、分割線の左側および右側に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の数を、それぞれＡ、Ｂとする。Ａは、ＦＯＸＰ３の量が少ない方の細胞の数であり、Ｂは、ＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数である。分析装置は、Ａ：Ｂがあらかじめ記憶部に記憶された比となるように分割線を設定し、分割線が横軸と交差するＦＯＸＰ３量を、基準値として取得する。
【００８０】
実施形態１では、ＦＯＸＰ３の量が少ない方の細胞の数Ａに対するＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数Ｂの比率Ｂ／Ａが、１．３５以上２．４８以下となるように、比が設定されている。この比は、後述するように、発明者らにより見いだされた普遍的な比である。すなわち、発明者らは、この比に基づけば測定環境等によらず基準値を適正に設定でき、エフェクター型制御性Ｔ細胞を精度よく検出できるようになることを見いだした。発明者らが、この比を普遍的なものであると判断した理由については、追って実施形態１の検証において説明する。実施形態１では、比率Ｂ／Ａは、１．９６に設定される。
【００８１】
なお、ＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数Ｂの、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全細胞数（Ａ＋Ｂ）に対する割合Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が、５７％以上７２％以下となるように、比が設定されてもよい。この場合のＢ／Ａの範囲は、Ｂ／Ａが１．３５以上２．４８以下に設定される場合とほぼ同じであるため、この場合も基準値を適正に設定できる。
【００８２】
図５を参照して、エフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する処理について詳細に説明する。以下に示す各ステップでは、図１（ｃ）のステップＳ２２で取得した生体試料の測定結果に基づいて処理が行われる。
【００８３】
ステップＳ２０１において、分析装置は、測定結果に基づいて、図２のステップＳ１０１と同様に、全ての粒子をスキャッタグラム１０にプロットし、領域１１に含まれる粒子を単一細胞として抽出する。ステップＳ２０２において、分析装置は、ステップＳ２０１で抽出した単一細胞を、図２のステップＳ１０２と同様に、スキャッタグラム２０にプロットし、領域２１に含まれる粒子を生きた細胞として抽出する。ステップＳ２０３において、分析装置は、ステップＳ２０２で抽出した生きた細胞を、図２のステップＳ１０３と同様に、スキャッタグラム３０にプロットし、領域３１に含まれる粒子をリンパ球として抽出する。
【００８４】
なお、ステップＳ２０１〜Ｓ２０３が実行される順序は、図５に示す順に限らない。ステップＳ２０１〜Ｓ２０３の各ステップは、どのような順序で実行されてもよい。
【００８５】
ステップＳ２０４において、分析装置は、ステップＳ２０３において抽出したリンパ球を、図２のステップＳ１０４と同様に、スキャッタグラム４０にプロットし、領域４１に含まれる粒子をＣＤ３陽性Ｔ細胞として抽出する。ステップＳ２０５において、分析装置は、ステップＳ２０４において抽出したＣＤ３陽性Ｔ細胞を、図２のステップＳ１０５と同様に、スキャッタグラム５０にプロットし、領域５１に含まれる粒子をＣＤ４陽性Ｔ細胞として抽出する。
【００８６】
ステップＳ２０６において、分析装置は、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ、基準値よりもＦＯＸＰ３量が大きい細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する。
【００８７】
具体的には、分析装置は、図６（ａ）に示すように、ステップＳ２０５において抽出したＣＤ４陽性Ｔ細胞をスキャッタグラム６０に展開する。スキャッタグラム６０の軸は、図３（ｆ）に示したスキャッタグラム６０と同様に設定されている。すなわち、横軸は、ＦＯＸＰ３を染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値であり、縦軸は、表面抗原ＣＤ４５ＲＡを染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値である。なお、図６（ａ）のスキャッタグラム６０は、生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）である場合に生成されたスキャッタグラムである。
【００８８】
分析装置は、スキャッタグラム６０において、横軸の値が基準値となる縦方向に延びる直線と、縦軸の値が分画値となる横方向に延びる直線とを設定する。ここで用いる基準値は、図２のステップＳ１０８で取得した基準値である。分画値は、図６（ｂ）に示すヒストグラム７２に基づいて取得される。
【００８９】
図６（ｂ）のヒストグラム７２は、図６（ａ）のスキャッタグラム６０の全細胞を展開したヒストグラムの模式図である。ヒストグラム７２において、横軸は、表面抗原ＣＤ４５ＲＡを染色するための蛍光色素から生じた蛍光に基づく信号波形のピーク値であり、縦軸は、頻度である。ヒストグラム７２の横軸は、スキャッタグラム６０の縦軸に対応する。分析装置は、ＣＤ４５ＲＡ陰性側のピーク波形とＣＤ４５ＲＡ陽性側のピーク波形との間で頻度が最小となるときのＣＤ４５ＲＡ量を分画値として設定する。分画値よりもＣＤ４５ＲＡ量が小さい細胞は、ＣＤ４５ＲＡ陰性の細胞であり、分画値よりもＣＤ４５ＲＡ量が大きい細胞は、ＣＤ４５ＲＡ陽性の細胞である。
【００９０】
図６（ａ）に示すスキャッタグラム６０において、領域６１は、図２のステップＳ１０８で取得した基準値よりも大きく、図６（ｂ）のヒストグラム７２に基づいて取得した分画値よりも小さい領域である。ステップＳ２０６において、分析装置は、スキャッタグラム６０の領域６１に含まれる細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞として検出する。このように、領域６１の細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞として検出すると、エフェクター型制御性Ｔ細胞を高精度に検出できる。
【００９１】
図６（ｃ）のヒストグラム７１は、図６（ａ）のスキャッタグラム６０に分布する全細胞を展開したものである。図６（ｃ）のヒストグラム７１の軸は、図４に示すヒストグラム７１と同様に設定されている。図６（ａ）、（ｃ）に示す例では、基準値よりもＦＯＸＰ３量の大きい細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞全体に占める割合は、１２．４％である。図６（ａ）、（ｃ）に示すように、生体試料が胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）である場合でも、領域６１内の細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞として精度よく検出できることが分かる。
【００９２】
なお、図６（ａ）に示すように、領域６１の真上に存在するＣＤ４５ＲＡ陽性細胞の数は少ない。したがって、ステップＳ２０６において、分析装置は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうち、基準値よりもＦＯＸＰ３量が大きい細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞として検出してもよい。この場合、生体試料の測定において、表面抗原ＣＤ４５ＲＡを染色するための蛍光色素から生じる蛍光の測定を省略できる。
【００９３】
ステップＳ２０７において、分析装置は、ステップＳ２０６で検出したエフェクター型制御性Ｔ細胞に関する情報を表示部に表示する。ステップＳ２０７では、たとえば、エフェクター型制御性Ｔ細胞の数、エフェクター型制御性Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞全体に占める割合や、エフェクター型制御性Ｔ細胞が基準値よりもＦＯＸＰ３量の大きい細胞に占める割合、などが表示される。
【００９４】
＜実施形態１の検証＞
次に、発明者らが、測定環境等によらず普遍的な比率Ｂ／Ａを見いだした経緯について説明する。
【００９５】
以下に示す検証において、発明者らは、胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）に基づく試料、および、健康人の末梢血単核球細胞に基づく試料を、以下に示す手順で調製した。
【００９６】
発明者らは、最初に死細胞を除去するために、FVD（Fixable Viability Dye）にて１０〜１５分間染色反応を行った。その後、発明者らは、洗浄することなしに、次に加える抗体の非特異結合を最小限にするために、Fc block（BD Fc Block（登録商標） Reagent for human）（BD Bioscience）を加え、４℃にて１０〜２０分間反応させた。その後、発明者らは、細胞表面の抗原染色のために、抗ヒトCD3、CD4、CD8a、CD45RA抗体を加え、さらに抗体反応を３０分間行った。これらの抗体は、それぞれ、anti-humanCD3 Alexa Fluor（登録商標） 700（affymetrixe Bioscence）、anti-human CD4 APC-eFluor（登録商標） 780（affymetrix eBioscence）、anti-human CD8a PE-Cy7（affymetrix eBioscence）、anti-human CD45RA FITC（affymetrix eBioscence）である。
【００９７】
続いて、発明者らは、２％FBSを含むPBS(-)にて洗浄後、細胞内を染色するために、FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set（affymetrix eBioscience）を用いて、細胞固定および膜透過処理を３０〜６０分間行った。さらに洗浄後、発明者らは、細胞内を染色するために、抗FoxP3抗体反応を３０〜６０分間行った。そして、洗浄後、発明者らは、フローサイトメータ「CyFlow Space」（シスメックス株式会社製）によりマルチカラー測定を行った。
【００９８】
発明者らは、胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）に基づく試料を測定し、図５のステップＳ２０１〜Ｓ２０５と同様の手順を行って、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の抽出を行った。図７（ａ）は、ＴＩＬから抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞が展開されたスキャッタグラム６０を示す図である。発明者らは、図７（ａ）に示すスキャッタグラム６０において、エフェクター型制御性Ｔ細胞とそれ以外の細胞とを区分する境界値を、目視により取得した。このとき、発明者らは、図７（ａ）に例示するようにエフェクター型制御性Ｔ細胞とそれ以外の細胞とを容易に区別できるＴＩＬを用いて、境界値の取得を行った。
【００９９】
続いて、発明者らは、同じバッチにおいて、健康人の末梢血単核球細胞に基づく試料を測定し、図５のステップＳ２０１〜Ｓ２０５と同様の手順を行って、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の抽出およびヒストグラム７１の生成を行った。なお、複数の測定が同一のバッチで行われる場合、各測定における測定環境はほぼ同じとなる。同一のバッチにおいては、たとえば、試薬のロット、試薬の劣化状況、環境温度、試薬や試料の調製量などが、各測定において互いにほぼ同じとなる。
【０１００】
図７（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、健康人の末梢血単核球細胞から抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞が展開されたスキャッタグラム６０およびヒストグラム７１を示す図である。図７（ｂ）、（ｃ）には、図７（ａ）で取得した境界値が適用された状態が示されている。
【０１０１】
図７（ｃ）において、発明者らは、図４を参照して説明した手順と同様にして、ＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形に基づいて終了点を設定した。そして、発明者らは、終了点と境界値との間の細胞の数をＡとし、境界値よりもＦＯＸＰ３量が大きい細胞の数をＢとして、比率Ｂ／Ａを取得した。
【０１０２】
発明者らは、上記のようにＴＩＬおよび健康人の末梢血単核球細胞に基づいて比率Ｂ／Ａを取得する手順を、異なるＴＩＬおよび健康人の末梢血単核球細胞に基づいて１３回繰り返した。図８（ａ）〜（ｃ）は、これら１３回の手順のうち、３つの手順において生成されたヒストグラム７１を示す図である。
【０１０３】
１３回の手順により１３個の生体試料（サンプル１〜１３）に基づいて取得された比率Ｂ／Ａ、平均値、および標準偏差ＳＤは、以下の表１に示すとおりである。なお、図８（ａ）〜（ｃ）に示す生体試料は、それぞれ、サンプル２、３、６に該当する。
【０１０４】
【表１】
2018190340.tif 000003
【０１０５】
表１に示すように、１３個の生体試料から取得した比率Ｂ／Ａにおいて、最小値は１．３５であり、最大値は２．４８となった。また、１３個の生体試料から取得した比率Ｂ／Ａの平均は１．９６となり、標準偏差は０．３１と極めて小さい値となった。このように、発明者らは、胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）から取得した境界値を、健康人の末梢血単核球細胞に適用して比率Ｂ／Ａを取得した場合、取得される比率Ｂ／Ａのばらつきが小さくなること、すなわちほぼ同じ比率Ｂ／Ａが得られることを見いだした。また、比率Ｂ／Ａが最小値の１．３５以上最大値の２．４８以下となるように境界値を設定すれば、境界値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞と判定できることが示唆された。
【０１０６】
次に、発明者らは、比率Ｂ／Ａを表１から得られた平均値１．９６に設定した場合に、健康人の末梢血単核球細胞からなる生体試料に基づいて、図２と同様の工程により基準値を取得した。
【０１０７】
図９（ａ）は、この手順により得られたヒストグラム７１である。発明者らは、図９（ａ）に示すように、比率Ｂ／Ａが１．９６となるように基準値を取得した。発明者らは、こうして得た基準値を、図９（ｂ）に示すように、胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球に基づいて得られたスキャッタグラム６０に適用した。図９（ｂ）に示すように、こうして得られた基準値によれば、生体試料が胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合でも、ＦＯＸＰ３陰性の細胞の集団とＦＯＸＰ３陽性の細胞の集団とを適正に分画できる。すなわち、上記のように設定した比率Ｂ／Ａに基づいて基準値を取得すれば、がん患者から採取される生体試料からエフェクター型制御性Ｔ細胞を適正に検出できることが分かった。
【０１０８】
以上のような理由により、実施形態１では、１．３５以上２．４８以下、特に１．９６となる比率Ｂ／Ａが、あらかじめ記憶部に記憶され、コントロール試料に基づいて基準値を取得する工程において用いられる。
【０１０９】
次に、発明者らは、比率Ｂ／Ａを１．９６として、被検者の末梢血単核球細胞からなる８個の生体試料に対して、実施形態１の手法および比較例の手法に基づいて、エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出精度を比較した。比較例では、スキャッタグラム６０において、発明者らがマニュアルによりエフェクター型制御性Ｔ細胞の領域を分画して検出を行った。以下、図１０（ａ）〜（ｆ）を参照して、比較例において発明者らが行ったマニュアルによる分画について説明する。
【０１１０】
図１０（ａ）に示すように、まず、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を展開したスキャッタグラム６０において、右上領域の少数の細胞を省くための領域８１が設定される。そして、図１０（ｂ）に示すように、領域８１の左端から下方向に境界線８２が設定される。次に、図１０（ｃ）に示すように、右下に分布する細胞群の左端付近に境界線８３が設定される。そして、図１０（ｄ）に示すように、境界線８３が上方向に延長される。次に、図１０（ｅ）に示すように、ＣＤ４５ＲＡ陰性とＣＤ４５ＲＡ陽性とを分画するために、横方向に延びた境界線８４が設定される。最後に、図１０（ｆ）に示すように、境界線８２、８３、８４に基づいて、領域６０ａ、６０ｂ、６０ｃが設定される。領域６０ａ、６０ｂ、６０ｃは、それぞれ、ナイーブ型、エフェクター型および非活性型の制御性Ｔ細胞に対応する領域となる。比較例では、領域６０ｂに含まれる細胞が、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出される。
【０１１１】
以下の表２には、実施形態１および比較例の場合に、それぞれ検出されたエフェクター型制御性Ｔ細胞のＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する割合が示されている。被検者の末梢血単核球細胞からなる８つの生体試料は、サンプル１４〜２１である。また、表２には、実施形態１の場合の平均および標準偏差ＳＤと、比較例の場合の平均および標準偏差ＳＤとが示されている。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
表２に示すように、エフェクター型制御性Ｔ細胞の割合については、実施形態１および比較例において、ほぼ同じ値となった。一方、標準偏差については、実施形態１のほうが比較例に比べて小さい値となった。以上のことから、実施形態１によれば、比較例と同等にエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出でき、さらに比較例よりもエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出割合のばらつきが抑制されることが分かった。
【０１１４】
＜実施形態２＞
基準値の取得処理において、実施形態１では、抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞が全てヒストグラム７１に展開されたが、実施形態２では、抽出されたＣＤ４陽性Ｔ細胞のうちＣＤ４５ＲＡ陰性細胞がヒストグラム７１に展開される。
【０１１５】
図１１に示すように、実施形態２では、図２に示した基準値の取得工程において、ステップＳ１０６とステップＳ１０７の間に、ステップＳ１１１が追加されている。実施形態２のその他のステップについては、実施形態１と同様である。以下、実施形態１と異なるステップについて説明する。
【０１１６】
ステップＳ１１１において、分析装置は、ステップＳ１０５で抽出したＣＤ４陽性Ｔ細胞から、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞を抽出する。
【０１１７】
具体的には、図１２（ａ）に示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を展開したヒストグラム７１において、ＣＤ４５ＲＡ陰性の細胞とＣＤ４５ＲＡ陽性の細胞とを分画するための分画値が設定される。この場合の分画値の設定は、図６（ａ）、（ｂ）を参照して説明した分画値の設定と同様である。すなわち、図１２（ａ）のスキャッタグラム６０の全細胞が、図１２（ｂ）のヒストグラム７２に展開され、ヒストグラム７２において、ＣＤ４５ＲＡ陰性側のピーク波形とＣＤ４５ＲＡ陽性側のピーク波形との間で頻度が最小となるときのＣＤ４５ＲＡ量が分画値として設定される。こうして設定された分画値がスキャッタグラム６０に適用され、スキャッタグラム６０において分画値よりもＣＤ４５ＲＡ量が小さい領域６２が設定される。ステップＳ１１１では、領域６２の細胞が、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞として抽出される。
【０１１８】
なお、図１２（ｃ）に示すように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の分布密度が示された等高線に基づいて、ＣＤ４５ＲＡ陽性側の分布密度が高い領域と、ＣＤ４５ＲＡ陰性側の分布密度が低い領域との間に、分画値が設定されてもよい。
【０１１９】
ステップＳ１１１に続くステップＳ１０６〜Ｓ１０８は、実施形態１と同様に行われる。すなわち、ステップＳ１０６において、分析装置は、ステップＳ１１１で抽出したＣＤ４５ＲＡ陰性細胞をヒストグラム７１に展開する。そして、ステップＳ１０７において、分析装置は、実施形態１と同様にして、ヒストグラム７１に基づいてＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞を特定する。
【０１２０】
ここで、実施形態２のステップＳ１０７で特定されるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞は、図２のステップＳ１０７で抽出されるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団のうち、ＣＤ４５ＲＡ陰性の細胞を抽出したものである。したがって、実施形態２では、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の抽出と、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞の抽出とは、どちらが先に行われてもよい。そして、ステップＳ１０８において、分析装置は、ステップＳ１０７で特定したＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団に、記憶部に記憶された所定の比を適用し、この比で分割したときの分割基準となるＦＯＸＰ３量を基準値として取得する。
【０１２１】
このように、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団のうちＣＤ４５ＲＡ陰性の集団に対し比を適用して基準値を取得すると、ノイズとなるＣＤ４５ＲＡ陽性細胞が除去されるため、基準値の精度をより高めることができる。
【０１２２】
なお、実施形態２において、生体試料を測定してエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する工程については、図５に示す実施形態１の工程と同様に行われる。すなわち、実施形態２では、図５のステップＳ２０５においてＣＤ４陽性Ｔ細胞の抽出が行われ、ステップＳ２０６において、ＣＤ４５ＲＡ陰性、かつ基準値よりもＦＯＸＰ３量が大きい細胞がエフェクター型制御性Ｔ細胞として検出される。
【０１２３】
実施形態２では、ＦＯＸＰ３の量が少ない方の細胞の数Ａに対するＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数Ｂの比率Ｂ／Ａが、１．６２以上２．４７以下となるように、比が設定されている。この比は、実施形態１と同様、発明者らにより見いだされた普遍的な比である。発明者らが、この比を普遍的なものであると判断した理由については、追って実施形態２の検証において説明する。実施形態２では、比率Ｂ／Ａは、２．０１に設定される。
【０１２４】
なお、ＦＯＸＰ３の量が多い方の細胞の数Ｂの、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の集団の全細胞数（Ａ＋Ｂ）に対する割合Ｂ／（Ａ＋Ｂ）が、６２％以上７２％以下となるように、比が設定されてもよい。この場合のＢ／Ａの範囲は、Ｂ／Ａが１．６２以上２．４７以下に設定される場合とほぼ同じであるため、この場合も基準値を適正に設定される。
【０１２５】
実施形態２のエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出する工程においても、実施形態１と同様、図１３（ａ）に示すように、スキャッタグラム６０において基準値が適用され、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞とＣＤ４５ＲＡ陽性細胞とを分画する分画値が設定される。そして、領域６１の細胞が、エフェクター型制御性Ｔ細胞として検出される。
【０１２６】
実施形態２では、上述したように、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうちＣＤ４５ＲＡ陰性細胞に基づいて基準値が取得されるため、より適正な基準値を設定して、生体試料からエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出できる。
【０１２７】
図１３（ａ）のスキャッタグラム６０は、生体試料が胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）である場合に生成されるスキャッタグラムである。図１３（ａ）のスキャッタグラム６０の元となった生体試料は、図６（ａ）のスキャッタグラム６０の元となった生体試料と同じであるため、図１３（ａ）と図６（ａ）のスキャッタグラム６０における細胞の分布は同じである。図１３（ｂ）のヒストグラム７１は、図１３（ａ）のスキャッタグラム６０に分布する全細胞を展開したものである。図１３（ａ）、（ｂ）に示す例では、ＦＯＸＰ３量が基準値よりも大きい細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞全体に占める割合は、１２．３％である。この値は、実施形態１の手法に基づく場合の１２．４％とほぼ同じである。したがって、実施形態２においても、実施形態１と同様にエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出を行うことができる。
【０１２８】
＜実施形態２の検証＞
発明者らは、実施形態１の検証において取得した、胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）の測定結果、および、同じバッチにおける健康人の末梢血単核球細胞の測定結果を用いて、実施形態１と同様の検証を行った。
【０１２９】
発明者らは、実施形態１と同様、胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球（ＴＩＬ）の測定結果に基づいて、スキャッタグラム６０から目視により境界値を取得した。そして、発明者らは、図１１のステップＳ１０１〜Ｓ１０５、Ｓ１１１、Ｓ１０６と同様の手順を行って、ヒストグラム７１の生成を行った。ただし、実施形態２の検証では、ステップＳ１１１においてＣＤ４５ＲＡ陰性細胞が抽出されるため、ヒストグラム７１には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうち、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞が展開される。そして、発明者らは、ヒストグラム７１に取得した境界値を適用し、健康人の末梢血単核球細胞からなる１３個の異なる生体試料に基づいて比率Ｂ／Ａを算出した。
【０１３０】
図１４（ａ）〜（ｃ）は、これら１３個の生体試料のうち、３つの生体試料について生成されたヒストグラム７１を示す図であり、それぞれ、図８（ａ）〜（ｃ）と同様の生体試料である。図１４（ａ）〜（ｃ）のヒストグラム７１には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞全体ではなく、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のうちＣＤ４５ＲＡ陰性細胞が展開されているため、図１４（ａ）〜（ｃ）の形状は、それぞれ図８（ａ）〜（ｃ）の形状とは異なっている。
【０１３１】
１３個の生体試料（サンプル１〜１３）に基づいて取得された比率Ｂ／Ａ、平均値、および標準偏差ＳＤは、以下の表３に示すとおりである。なお、図１４（ａ）〜（ｃ）に示す生体試料は、それぞれ、サンプル２、３、６に該当する。サンプル１〜１３は、それぞれ、実施形態１の検証のサンプル１〜１３と同じである。
【０１３２】
【表３】
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【０１３３】
表３に示すように、１３個の生体試料から取得した比率Ｂ／Ａにおいて、最小値は１．６２であり、最大値は２．４７となった。また、１３個の生体試料から取得した比率Ｂ／Ａの平均は２．０１となり、標準偏差は０．２８と極めて小さい値となった。この場合も、実施形態１の検証と同様に、取得される比率Ｂ／Ａのばらつきが小さくなること、すなわちほぼ同じ比率Ｂ／Ａが得られることが分かった。また、比率Ｂ／Ａが最小値の１．６２以上最大値の２．４７以下となるように境界値を設定すれば、境界値よりもＦＯＸＰ３量が多い細胞をエフェクター型制御性Ｔ細胞と判定できることが示唆された。
【０１３４】
次に、発明者らは、比率Ｂ／Ａを表３から得られた平均値２．０１に設定した場合に、健康人の末梢血単核球細胞からなる生体試料に基づいて、図１１と同様の工程により基準値を取得した。
【０１３５】
図１５（ａ）は、この手順により得られたヒストグラム７１である。発明者らは、図１５（ａ）に示すように、比率Ｂ／Ａが２．０１となるように基準値を取得した。発明者らは、こうして得た基準値を、図１５（ｂ）に示すように、胃がん患者の胃がん組織中に浸潤するリンパ球に基づいて得られたスキャッタグラム６０に適用した。図１５（ｂ）に示すように、こうして得られた基準値によれば、生体試料が胃がん組織中に浸潤するリンパ球である場合でも、ＦＯＸＰ３陰性の細胞の集団とＦＯＸＰ３陽性の細胞の集団とを分画できる。すなわち、上記のように設定した比率Ｂ／Ａに基づいて基準値を取得すれば、がん患者から採取される生体試料からエフェクター型制御性Ｔ細胞を適正に検出できることが分かった。
【０１３６】
以上のような理由により、実施形態２では、１．６２以上２．４７以下、特に２．０１となる比率Ｂ／Ａが、あらかじめ記憶部に記憶され、コントロール試料に基づいて基準値を取得する工程において用いられる。
【０１３７】
次に、発明者らは、比率Ｂ／Ａを２．０１として、被検者の末梢血単核球細胞からなる８個の生体試料に対して、実施形態２の手法および比較例の手法に基づいて、それぞれエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出精度を比較した。比較例では、実施形態１の検証で説明したように、スキャッタグラム６０において、発明者らがマニュアルによりエフェクター型制御性Ｔ細胞の領域を分画して検出を行った。
【０１３８】
以下の表４には、実施形態２および比較例の場合に、それぞれ検出されたエフェクター型制御性Ｔ細胞のＣＤ４陽性Ｔ細胞に対する割合が示されている。被検者の末梢血単核球細胞からなる８つの生体試料は、サンプル２２〜２９である。また、表４には、実施形態２の場合の平均および標準偏差ＳＤと、比較例の場合の平均および標準偏差ＳＤとが示されている。
【０１３９】
【表４】
2018190340.tif 000006
【０１４０】
表４に示すように、エフェクター型制御性Ｔ細胞の割合については、実施形態２および比較例において、ほぼ同じ値となった。一方、標準偏差については、実施形態２のほうが比較例に比べて小さい値となった。以上のことから、実施形態２によれば、比較例と同等にエフェクター型制御性Ｔ細胞を検出でき、さらに比較例よりもエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出割合のばらつきが抑制されることが分かった。
【０１４１】
＜実施形態３＞
図１６（ａ）に示すように、実施形態３のエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出工程では、図５と比較して、ステップＳ２０６とステップＳ２０７の間に、ステップＳ２１１が追加されている。実施形態３のその他の構成は、実施形態１または２と同様である。
【０１４２】
ステップＳ２１１において、分析装置は、ナイーブ型制御性Ｔ細胞と非活性型制御性Ｔ細胞を検出する。
【０１４３】
具体的には、分析装置は、図１６（ｂ）に示すように、ステップＳ２０６で展開したスキャッタグラム６０に、領域６３、６４を設定する。領域６３は、ＦＯＸＰ３量が基準値よりも小さく終了点よりも大きく、かつ、ＣＤ４５ＲＡ量が分画値よりも大きい領域である。領域６４は、ＦＯＸＰ３量が基準値よりも小さく終了点よりも大きく、かつ、ＣＤ４５ＲＡ量が分画値よりも小さい領域である。ここで、基準値は、ステップＳ２０６で用いられる基準値と同じである。終了点は、スキャッタグラム６０をヒストグラム７１に展開した場合に、図４で説明した手順と同様にして作成される点であり、ヒストグラム７１におけるＦＯＸＰ３陰性側のピーク波形の高値側の点である。分画値は、図６（ａ）で説明したように、ＣＤ４５ＲＡ陰性細胞とＣＤ４５ＲＡ陽性細胞とを分けるＣＤ４５ＲＡ量である。
【０１４４】
ステップＳ２１１において、分析装置は、スキャッタグラム６０の領域６３、６４に含まれる細胞を、それぞれ、ナイーブ型制御性Ｔ細胞および非活性型制御性Ｔ細胞として検出する。続いて、ステップＳ２０７において、分析装置は、ステップＳ２０６、Ｓ２０７で検出した、エフェクター型制御性Ｔ細胞、ナイーブ型制御性Ｔ細胞、および非活性型制御性Ｔ細胞に関する情報を表示部に表示する。ステップＳ２０７では、たとえば、各細胞の数や、各細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞全体に占める割合などが表示される。
【０１４５】
＜分析システム＞
図１７は、実施形態１〜３で説明した分析を行うための分析システム１００の構成を示すブロック図である。
【０１４６】
分析システム１００は、標識装置１１０と、フローサイトメータである分析装置１２０と、を備える。標識装置１１０は、コントロール試料１０１および生体試料１０２の被検物質を蛍光標識する。標識装置１１０によれば、コントロール試料１０１および生体試料１０２の被検物質を蛍光標識する処理を自動で行うことができる。これにより、複数の試料を均一な条件で調製できる。分析装置１２０は、コントロール試料１０１および生体試料１０２についての分析処理を行う。分析装置１２０は、測定を行う測定部として測定ユニット２００を備え、分析を行う分析部として分析ユニット３００を備える。
【０１４７】
なお、標識装置１１０と分析装置１２０は別体でなくてもよく、たとえば、分析装置１２０と標識装置１１０とが一体的に構成されてもよい。また、分析システム１００が、標識装置１１０の前段に、末梢血の全血から末梢血単核球細胞を精製するための装置を備える場合には、コントロール試料１０１および生体試料１０２は、末梢血の全血であってもよい。
【０１４８】
分析システム１００が図１（ａ）、（ｃ）に示す処理を行う場合、図１（ａ）のステップＳ１１と図１（ｃ）のステップＳ２１は、標識装置１１０により行われる。図１（ａ）のステップＳ１２と図１（ｃ）のステップＳ２２は、分析装置１２０の測定ユニット２００により行われる。図１（ａ）のステップＳ１３と図１（ｃ）のステップＳ２３は、分析装置１２０の分析ユニット３００により行われる。
【０１４９】
測定ユニット２００は、測定制御部２１０と、検出部２２０と、信号処理回路２３０と、を備える。測定制御部２１０は、たとえば、ＣＰＵ、ＭＰＵなどにより構成される。測定制御部２１０は、測定ユニット２００の各部が出力する信号を受信し、測定ユニット２００の各部を制御する。検出部２２０は、標識装置１１０において標識処理が行われたコントロール試料１０１および生体試料１０２をフローセルに流して、フローセルに光を照射し、試料から生じた光を受光部により受光して光の強度に応じた信号を出力する。
【０１５０】
信号処理回路２３０は、検出部２２０から出力された信号に対して信号処理を行う。具体的には、信号処理回路２３０は、検出部２２０の受光部から出力された信号に基づいて、粒子ごとの波形状の信号を抽出し、粒子ごとの波形状の信号からピーク値、面積、幅などの特徴パラメータを算出する。測定制御部２１０は、分析ユニット３００と通信を行う。測定制御部２１０は、信号処理回路２３０により算出された粒子ごとの特徴パラメータを、測定結果として分析ユニット３００に送信する。
【０１５１】
分析ユニット３００は、制御部３１０と、記憶部３２０と、表示部３３０と、入力部３４０と、を備える。制御部３１０は、たとえば、ＣＰＵにより構成される。制御部３１０は、分析ユニット３００の各部が出力する信号を受信し、分析ユニット３００の各部を制御する。制御部３１０は、測定ユニット２００と通信を行う。記憶部３２０は、たとえば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードディスクなどにより構成される。制御部３１０は、記憶部３２０に記憶されたプログラム３２１に基づいて処理を実行する。プログラム３２１は、図１（ａ）、（ｃ）に示す処理を実行するためのプログラムを含んでいる。
【０１５２】
表示部３３０は、たとえば、ディスプレイにより構成される。表示部３３０は、分析結果を示す画面を表示する。図５のステップＳ２０７の表示処理において、制御部３１０は、検出した制御性Ｔ細胞に関する情報を、表示部３３０に表示する。入力部３４０は、たとえば、マウス、キーボードなどにより構成される。入力部３４０は、オペレータによる入力を受け付ける。表示部３３０と入力部３４０は、タッチパネルなどにより一体的に構成されてもよい。
【０１５３】
図１８、１９は、分析装置１２０が行う処理を示すフローチャートである。
【０１５４】
図１８に示すように、ステップＳ３０１、Ｓ３０２において、制御部３１０は、入力部３４０を介してオペレータから、標識装置１１０による標識処理が行われたコントロール試料１０１または生体試料１０２の測定指示が入力されたか否かを判定する。コントロール試料１０１の測定指示が入力された場合、処理がステップＳ３０３に進められ、生体試料１０２の測定指示が入力された場合、処理がステップＳ３０５に進められる。いずれの測定指示も入力されていない場合は、処理が終了し、再度ステップＳ３０１から処理が開始される。
【０１５５】
コントロール試料１０１の測定指示が入力された場合、ステップＳ３０３において、測定制御部２１０は、図１（ａ）のステップＳ１２と同様に、コントロール試料１０１の測定を行う。測定制御部２１０は、コントロール試料１０１の測定結果を制御部３１０に送信する。制御部３１０は、測定制御部２１０から受信したコントロール試料１０１の測定結果を記憶部３２０に記憶する。続いて、ステップＳ３０４において、制御部３１０は、コントロール試料１０１の測定結果を記憶部３２０から読み出し、読み出した測定結果に基づいて基準値の取得を行う。このとき、制御部３１０は、取得した基準値を記憶部３２０に記憶する。この場合の基準値の取得処理については、追って図１９を参照して説明する。
【０１５６】
生体試料１０２の測定指示が入力された場合、ステップＳ３０５において、測定制御部２１０は、図１（ｃ）のステップＳ２２と同様に、生体試料１０２の測定を行う。この場合も、測定制御部２１０は、生体試料１０２の測定結果を制御部３１０に送信する。制御部３１０は、測定制御部２１０から受信した生体試料１０２の測定結果を記憶部３２０に記憶する。続いて、ステップＳ３０６において、制御部３１０は、生体試料１０２の測定結果を記憶部３２０から読み出し、読み出した測定結果に基づいて、図５または図１６（ａ）に示す処理と同様に、エフェクター型制御性Ｔ細胞の検出する処理を行う。このとき、制御部３１０は、ステップＳ３０４で記憶した基準値を記憶部３２０から読み出し、読み出した基準値を生体試料１０２の分析におけるエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出に適用する。ステップＳ３０６で行われる表示処理では、図２０に示す画面が表示される。図２０に示す画面については、追って説明する。
【０１５７】
図１９に示すように、ステップＳ４０１において、制御部３１０は、コントロール試料１０１に含まれるＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞を特定する処理を行う。ステップＳ４０１では、図２のステップＳ１０１〜Ｓ１０７と同様の処理が行われる。これにより、ＣＤ４陽性Ｔ細胞が展開されたヒストグラム７１において、終了点以上のＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団が、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞として特定される。なお、ステップＳ４０１において、図１１のステップＳ１０１〜Ｓ１０５、Ｓ１１１、Ｓ１０６、Ｓ１０７と同様の処理が行われてもよい。この場合、ＣＤ４陽性、かつ、ＣＤ４５ＲＡ陰性の細胞の集団が、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞として特定される。
【０１５８】
続いて、ステップＳ４０２において、制御部３１０は、コントロール試料１０１が所定の条件を満たすか否かを判定する。所定の条件は、あらかじめ記憶部３２０に記憶されている。所定の条件は、たとえば、ＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の数が所定範囲であることである。この場合、制御部３１０は、ステップＳ４０１で特定したＦＯＸＰ３陽性Ｔ細胞の数が所定範囲であると、コントロール試料１０１が所定の条件を満たすと判定する。
【０１５９】
なお、ステップＳ４０２の所定の条件は、上記内容に限らず、ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞の数が所定範囲であること、ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞とＣＤ４５ＲＡ陰性Ｔ細胞の比率が所定範囲であること、ナイーブ型制御性Ｔ細胞の数が所定範囲であること、であってもよい。所定の条件は、これら条件のうち複数の条件が満たされることであってもよい。ＦＯＸＰ３陰性Ｔ細胞の集団は、たとえば、ヒストグラム７１において終了点より小さいＦＯＸＰ３量を有する細胞の集団として特定される。ＣＤ４５ＲＡ陽性Ｔ細胞の集団は、たとえば、図１２（ａ）において領域６２内の細胞の集団として特定され、ＣＤ４５ＲＡ陰性Ｔ細胞の集団は、たとえば、図１２（ａ）においてＣＤ４５ＲＡ量が分画値よりも大きい細胞の集団として特定される。ナイーブ型制御性Ｔ細胞の集団は、たとえば、図１６（ｂ）に示す領域６３の細胞の集団として特定される。
【０１６０】
コントロール試料１０１が所定の条件を満たす場合、ステップＳ４０３において、制御部３１０は、図２または図１１のステップＳ１０８と同様に、コントロール試料１０１から得られるヒストグラム７１に基づいて基準値を取得する。そして、制御部３１０は、取得した基準値を記憶部３２０に記憶する。他方、コントロール試料１０１が所定の条件を満たさない場合、ステップＳ４０４において、制御部３１０は、ステップＳ４０２の判定の元となったコントロール試料１０１ではなく、別のコントロール試料１０１を測定するようオペレータに促す画面を、表示部３３０に表示する。これにより、オペレータは、当該コントロール試料１０１が、基準値を取得するための試料として適当でなかったことを知ることができる。そして、オペレータは、別のコントロール試料１０１を用いて、再度コントロール試料の測定指示を入力する。
【０１６１】
図２０は、図１８のステップＳ３０６に示すエフェクター型制御性Ｔ細胞の検出処理において表示部３３０に表示される画面３３１である。なお、図２０の画面３３１には、エフェクター型制御性Ｔ細胞に関する情報に加えて、ナイーブ型制御性Ｔ細胞および非活性型制御性Ｔ細胞に関する情報が表示されている。すなわち、図２０に例示される画面３３１は、図１８のステップＳ３０６として図１６（ａ）に示す実施形態３の検出処理が行われた場合の画面である。
【０１６２】
画面３３１は、生体試料１０２の分析結果を示す画面であり、分析値を示すリスト領域３３１ａと、図３（ａ）〜（ｆ）と同様の軸を有するスキャッタグラムと、を備える。リスト領域３３１ａには、抽出された細胞の個数および比率が表示される。Ｆｒ１は、図１６（ｂ）の領域６３内の細胞数、すなわちナイーブ型制御性Ｔ細胞の数を示す。Ｆｒ２は、図１６（ｂ）の領域６１内の細胞数、すなわちエフェクター型制御性Ｔ細胞の数を示す。Ｆｒ３は、図１６（ｂ）の領域６４内の細胞数、すなわち非活性型制御性Ｔ細胞の数を示す。Ｆｒ１％、Ｆｒ２％、Ｆｒ３％は、それぞれ、ナイーブ型制御性Ｔ細胞、エフェクター型制御性Ｔ細胞、および非活性型制御性Ｔ細胞がＣＤ４陽性Ｔ細胞に占める比率を示す。画面３３１が表示部３３０に表示されることにより、オペレータは、各細胞の個数および比率と、生成されたスキャッタグラムとを視覚的に把握できる。
【０１６３】
なお、制御部３１０は、生体試料１０２の分析においてがん治療薬の薬効があるか否かを判定し、がん治療薬の薬効があるか否かを示す情報を画面３３１に表示してもよい。
【０１６４】
また、制御部３１０は、オペレータからの表示指示に応じて、同じバッチにおいて測定されたコントロール試料１０１に関する情報を表示部３３０に表示してもよい。コントロール試料１０１に関する情報として、たとえば、コントロール試料１０１から得られたヒストグラム７１と、当該ヒストグラム７１から得られた基準値とが表示される。これにより、オペレータは、基準値が適正であったかを判断できる。
【符号の説明】
【０１６５】
７１  ヒストグラム
１００  分析システム
１０１  コントロール試料
１０２  生体試料
１１０  標識装置
１２０  分析装置、フローサイトメータ
２００  測定ユニット、測定部
２２０  フローサイトメータ
３１０  制御部
３２０  記憶部
３２１  プログラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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