(57)【要約】  本発明の課題は、巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離する方法、並びに巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離するための器具を提供することである。本発明によれば、少なくとも巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、上記接触工程の前および／または後において巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、および上記接触工程および上記培養工程後の培養液を回収する回収工程を含む、巨核球と血小板とを分離する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、
前記接触工程の前および／または後において巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、および
前記接触工程および前記培養工程後の培養液を回収する回収工程を含む、
巨核球と血小板とを分離する方法。
【請求項２】
巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた培養液を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた巨核球を培養して血小板を産生させ、その後に培養液を回収する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子が、フィブロネクチン、フィブロネクチンのＲＧＤ配列であるＧＲＧＤＳもしくはＣＳ−１配列であるＥＩＬＤＶを有するペプチド、またはＶＣＡＭ−１と表記されるＶａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１もしくはＶＣＡＭ−１のＱＩＤＳＰＬ配列を有するペプチドである、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記の接触工程、培養工程および回収工程を２回以上反復する、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材を含む、巨核球と血小板とを分離するための器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球と、巨核球から生産された血小板とを分離する方法に関する。本発明はさらに、巨核球と血小板とを分離するための器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は血小板製剤として、輸血治療に用いられている。血小板製剤は、一般に献血によって得た血液から調製されるが、血小板製剤の供給量は献血者の減少等の外的要因の影響を受けやすい。そのため、献血に代替される血小板ソースの開発が着目されている。近年、多能性幹細胞や、造血前駆細胞、間葉系細胞をソースとして、巨核球を培養することによって血小板を体外で大量に生産する技術が報告されている(特許文献１)。巨核球の細胞質が千切れることによって、血小板が生産されるため、血小板生産後の培養液には、多数の巨核球が含まれる。巨核球が混入していることで血小板製剤は、免疫原性を示す可能性が有る。そのため、巨核球と巨核球から生産された血小板を分離する技術の開発が必要である。【０００３】
細胞を分離する手法として、細胞の比重差に基づいて分離する遠心分離法が一般的に用いられている。例えば、特許文献２には、内部に流入口および流出口に連通する貯血空間を有する遠心分離器と、遠心分離器の流入口と採血手段とに接続する第１のラインと、遠心分離器の流出口に接続された第２のラインと、第１のラインの途中に接続された第１のチューブおよび第２のラインに接続された第２のチューブを有する血漿採取バッグと、第２のラインに接続された血小板採取バッグとを備える血小板採取回路と、第１のラインに設けられた送血ポンプとを備え、遠心分離器により採血された血液を複数の血液成分に分離するとともに分離された血液成分のうち少なくとも血小板を血小板バッグに採取する血小板採取装置が記載されている。【０００４】
また、血小板製剤から免疫原性を示す可能性のある白血球を除去する際には、白血球と血小板のサイズの違いを利用して、血小板が透過でき、白血球が透過できない程度の孔径を有する多孔質膜に血小板と白血球を含む液体を透過することで、血小板を分離する方法が知られている（特許文献３）。【０００５】
さらに、血液から血小板製剤を製造する場合には、白血球を選択的に吸着する吸着分離材料を用いて、血小板製剤中に含まれる白血球を除去し、血小板を分離することが行われている(特許文献４)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ０９／１２２７４７
【特許文献２】特開２００３−０９３４９９号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ９３／２４１５７
【特許文献４】特開２０００−２４５８３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
血液成分から血小板成分を分離する場合と異なり、生体外で生産された血小板を分離回収するためには、血小板と密度が近い巨核球を除去する必要がある。そのため、特許文献２に記載されているような遠心分離法を用いて血小板を分離する際には大きな遠心加速度が必要となり、その遠心力により血小板が活性化するという問題がある。【０００８】
また、巨核球を除去する場合においては、巨核球は血小板を産生することによって、自身のサイズが小さくなるために、血小板を産生した後の巨核球には、血小板と大きなサイズの違いが見られないものが存在する。そのため、特許文献３に記載の方法のように細胞のサイズ差を利用した方法では、巨核球の除去率が低下する問題があり、また、その一方で膜を透過する際に血小板が損傷を受けることも問題となる。【０００９】
さらに、特許文献４に記載の方法は、血小板から分離する対象が白血球であり、巨核球から血小板を分離する方法ではない。【００１０】
本発明の課題は、巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離する方法、並びに巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離するための器具を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、巨核球を選択的に吸着する材料を用いることによって巨核球と血小板とを分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  少なくとも巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、
上記接触工程の前および／または後において巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、および
上記接触工程および上記培養工程後の培養液を回収する回収工程を含む、
巨核球と血小板とを分離する方法。
［２］  巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた培養液を回収する、［１］に記載の方法。
［３］  巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた巨核球を培養して血小板を産生させ、その後に培養液を回収する、［１］に記載の方法。
［４］  ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子が、フィブロネクチン、フィブロネクチンのＲＧＤ配列であるＧＲＧＤＳもしくはＣＳ−１配列であるＥＩＬＤＶを有するペプチド、またはＶＣＡＭ−１と表記されるＶａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１もしくはＶＣＡＭ−１のＱＩＤＳＰＬ配列を有するペプチドである、［１］から［３］の何れか一に記載の方法。
［５］  上記の接触工程、培養工程および回収工程を２回以上反復する、［１］から［４］の何れか一に記載の方法。
［６］  ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材を含む、巨核球と血小板とを分離するための器具。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法および器具によれば、巨核球と、巨核球から生産される血小板とを効率よく分離することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による巨核球と血小板とを分離する方法は、
少なくとも巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、
上記接触工程の前および／または後において巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、および
上記接触工程および上記培養工程後の培養液を回収する回収工程を含む。
【００１５】
本発明の方法は、輸血治療等に用いる血小板製剤を製造する上で、体外で血小板を大量に生産する際の血小板の分離方法として利用可能である。
【００１６】
＜巨核球および血小板について＞
巨核球は造血幹細胞に由来する細胞であり、巨核球系前駆細胞、巨核芽球細胞、および前巨核球を経て形成される多形核を有する細胞である。巨核球は、骨髄の中に存在し直径３５〜１６０μｍの骨髄中で最大の造血系細胞である。巨核球は、血小板を産出する。１個の巨核球から数千個の血小板が産出される。なお、巨核球の細胞質が分解して血小板になった後、巨核球は細胞質を失い裸核となり、裸核はマクロファージにより分解される。本発明で言う巨核球とは、成熟した巨核球のほか、巨核球系前駆細胞、巨核芽球細胞、前巨核球等を含んでいてもよい。
【００１７】
血小板は、血液に含まれる細胞成分の一種である。血小板は、血栓の形成に中心的な役割を果たし、血管壁が損傷した際には血小板凝集によって止血する作用を有する。
【００１８】
巨核球および血小板は、成体組織から採取した巨核球および血小板でもよいし、多能性幹細胞、造血前駆細胞または間葉系細胞等の分化能を有する細胞から分化させた巨核球および血小板でもよいし、通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで作製された巨核球および血小板でもよいし、上記を組み合わせたものでもよい。
【００１９】
巨核球および血小板が由来する生物種は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、羊、ブタ、サルなど）であり、より好ましくはヒトである。
【００２０】
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。
造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員（Ｇ−ＣＳＦ）末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞または末梢血由来細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの造血前駆細胞としては、例えば、ＣＤ３４陽性のもの（例えばＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞あるいはＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−およびＣＤ３４＋細胞のもの）が挙げられる（国際公開ＷＯ２００４／１１０１３９）。
間葉系細胞としては、例えば、間葉系幹細胞および脂肪前駆細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞としては、例えば、繊維芽細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
多能性幹細胞、造血前駆細胞または間葉系細胞等の分化能を有する細胞を分化させることによって巨核球および血小板を産生する方法は、当業者に一般的に知られた方法に従って行えばよく、特に限定されない。分化能を有する細胞を、巨核球に分化させるのに適した分化誘導培地を用いて適切な培養条件下において培養することにより、分化能を有する細胞を巨核球へと分化させることができ、巨核球からさらに血小板が産生されるようになる。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで巨核球および血小板を産生する方法としては、巨核球への誘導遺伝子を発現するように遺伝子導入するか、または、特定の核酸、タンパク質もしくは低分子化合物等を培養液中に添加することで、通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞を巨核球に分化することで巨核球へと分化させることができる。
【００２２】
＜接触工程＞
接触工程は、少なくとも巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる工程である。
【００２３】
「ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子」の種類は、本発明の目的を達成できる限り特に限定されないが、その具体例としては、以下のものを挙げることができる。
【００２４】
フィブロネクチン；
フィブロネクチンのＲＧＤ配列（ＧＲＧＤＳ：配列番号１）またはＣＳ−１配列（ＥＩＬＤＶ：配列番号２）（フィブロネクチンのＶＬＡ−４インテグリンまたはＶＬＡ−５インテグリン接着ドメイン）を有するペプチド；
ＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）；
ＶＣＡＭ−１のＱＩＤＳＰＬ配列（配列番号３)（ＶＣＡＭ−１のＶＬＡ−４インテグリンまたはＶＬＡ−５インテグリン接着ドメイン）を有するペプチド；
ＭａｄＣＡＭ−１（Ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｒｅｓｓｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）；
ＴＳＰ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）；
ＯＰＮ（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）；
ＡＤＡＭ（ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）；ＩＣＡＭ−４（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）；
ＣＯＭＰ（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｍａｔｒｉｘ）、および
Ｌ１（ＣＤ１７１）
【００２５】
上記の中でも、フィブロネクチン；フィブロネクチンのＲＧＤ配列（ＧＲＧＤＳ）またはＣＳ−１配列（ＥＩＬＤＶ）を有するペプチド；ＶＣＡＭ−１；またはＶＣＡＭ−１のＱＩＤＳＰＬ配列を有するペプチドが好ましい。
【００２６】
上記の中でも、フィブロネクチンまたはＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）がより好ましい。
【００２７】
ペプチドを使用する場合、ペプチドの長さは特に限定されないが、一般的には５アミノ酸〜２００アミノ酸からなるペプチドを使用することができ、好ましくは５アミノ酸〜５０アミノ酸からなるペプチドを使用することができる。
【００２８】
上記した生体親和性高分子は、天然タンパク質、遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチド（リコンビナントタンパク質またはリコンビナントペプチド）、または化学合成タンパク質または化学合成ペプチドの何れでもよい。
【００２９】
天然タンパク質としては、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するタンパク質を使用することができる。
遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所望のアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドが産生されるので、産生された遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドを培養物から回収することにより、遺伝子組み換えタンパク質または遺伝子組み換えペプチドを得ることができる。
【００３０】
化学合成タンパク質または化学合成ペプチドは、人工的に合成したタンパク質またはペプチドを意味する。タンパク質またはペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ−Ｍｅｔｈｏｘｙ−Ｃａｒｂｏｎｙｌ基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｏｘｙ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。
【００３１】
基材としては、プレート、ディッシュ、シャーレ、培養フラスコ、粒子、不織布または膜等が挙げられる。プレートとしては、マルチウェルプレート（例えば、６ウエルプレート、２４ウエルプレートなど）を使用してもよい。
【００３２】
上記の生体親和性高分子で基材をコートする方法は特に限定されず、常法により生体親和性高分子で基材をコートすることができる。例えば、生体親和性高分子の溶液をコーティング溶液として適当な濃度(例えば、０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００μｇ／ｍｌ)に調製し、このコーティング溶液を、基材に添加し、基材を適当な温度（例えば、室温〜５０℃、一例としては３７℃）で一定の時間（例えば、１０分から２４時間、好ましくは３０分〜６時間）インキュベートすることにより、生体親和性高分子でコートされた基材を調製することができる。上記したインキュベーション後には、生体親和性高分子でコートされた基材は適当な緩衝液で洗浄してもよい。
【００３３】
少なくとも巨核球を含む培養液を、生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる方法は特に限定されず、常法により行うことができる。例えば、少なくとも巨核球を含む培養液を、生体親和性高分子でコートされた基材に添加し、基材を適当な温度（例えば、室温〜５０℃、一例としては３７℃）で一定の時間（接触工程の前において巨核球を培養して血小板を産生させる場合には例えば、２４時間以下、好ましくは６時間以下、接触工程の後において巨核球を培養して血小板を産生させる場合には例えば、１日〜７日、好ましくは１日〜４日）接触させることができる。
【００３４】
＜巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程＞
本発明においては、上記の接触工程の前および／または後において、巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程を行う。即ち、本発明においては、巨核球と血小板の分離は、巨核球を培養して、あらかじめ血小板を産生させた後に、巨核球と血小板の混合液に対して適用することもできる。あるいは、巨核球を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、巨核球と該基材が接着した状態で、巨核球に血小板を産生させながら適用することもできる。
【００３５】
従って、本発明は、以下の態様の何れでもよい。
（態様１）巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた培養液を回収する。
（態様２）巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた巨核球を培養して血小板を産生させ、その後に培養液を回収する。
（態様３）巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた巨核球をさらに培養して血小板を産生させ、その後に培養液を回収する。
【００３６】
上記の中でも好ましくは態様１または態様２であり、より好ましくは態様１である。
【００３７】
巨核球を培養液中で培養して血小板を産生させる培養工程は、通常の細胞培養の方法に従って行うことができる。培養期間は特に限定されないが、一般的には３時間〜３０日であり、好ましくは２４時間〜２０日であり、より好ましくは３日〜１４日程度である。
【００３８】
＜接触工程および培養工程後の培養液を回収する回収工程＞
血小板は、巨核球よりもＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材への接着性が低いため、基材と接触させた培養液を回収する工程によって、血小板を効率的に回収することができる。
【００３９】
回収液中における巨核球および血小板の存在量（細胞数）を確認するためには、回収液を標識した抗ＣＤ４１ａ抗体と反応させ、次いで核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２と反応させ、フローサイトメトリーを行うことができる。巨核球分画および血小板分画を決定し、血小板分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陰性細胞を血小板とし、巨核球分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陽性細胞を巨核球とすることにより、回収液中の血小板数および巨核球数を算出することができる。
【００４０】
本発明においては、接触工程、培養工程および回収工程を２回以上反復することもできる。接触工程、培養工程および回収工程を２回以上反復することにより、血小板の回収率をさらに高めることができる。反復回数は特に限定されないが、例えば、２回から１０回程度反復することができる。
【００４１】
＜巨核球と血小板とを分離するための器具＞
本発明によれば、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材を含む、巨核球と血小板とを分離するための器具が提供される。ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材としては、本明細書中で上記したものを使用することができる。本発明の上記器具を用いて巨核球と血小板とを分離する方法も、本明細書中に上記した通りである。
【００４２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
下記略号は以下の意味を示す。
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＤＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）
ＰＥ：フィコエリシン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）
７−ＡＡＤ：７−アミノ−７−アクチノマイシンＤ
【実施例】
【００４３】
＜実施例１＞
（１）基材へのコーティング
フィブロネクチン溶液（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ヒト血漿由来、和光純薬工業社製）をＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で５０μｇ／ｍｌに希釈し、コーティング溶液とした。コーティング溶液を、プラズマ処理済ポリスチレン製６ウエルプレート（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｔｒｅａｔｅｄ、  Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１ｍｌ添加した。上記プレートを３７℃、１時間インキュベートした後、ＤＰＢＳで１回洗浄し、フィブロネクチン被覆基材を得た。【００４４】
（２）細胞液の調製
ヒト巨核球および血小板を調製するための分化誘導培地として、Ｓｔｅｍｓｐａｎ  ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（×１００）（和光純薬工業社製）を添加したＳｔｅｍｓｐａｎ  ＳＦＥＭ  ＩＩ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用した。上記の分化誘導培地を使用して、ＢＭ−ＣＤ３４＋Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌｌｃｅｌｌ社）を低接着ポリスチレン製６ウエルプレート（Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）上で１４日培養した。培養中の浮遊細胞を１５ｍＬチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に回収し、１７００×ｇ、室温で５分遠心した。上清を捨て１％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）入りのＤＰＢＳ（１００μｌ）で懸濁した。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（登録商標）標識抗ＣＤ４１ａ抗体（日本ベクトンディッキンソン社製）１０μｌ、ＰＥ標識抗ＣＤ４２ｂ抗体（日本ベクトンディッキンソン社製）１０μｌを加え、遮光で３０分反応した。１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１ｍＬ）を加えて、１７００×ｇ、室温で５分遠心し、上清を捨てた。７−ＡＡＤを加えた１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１００μｌ）で懸濁し、遮光で１５分反応した後に、１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（３００μｌ）を加えて、フローサイトメトリー（ＢＤ（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）社製、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）により測定した。巨核球系細胞株であるＭＥＧ−０１（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入）をコントロールとして、ＦＳＣ（前方散乱光：  ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）、ＳＳＣ（側方散乱光  ：ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）ゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。各抗体のアイソタイプコントロール抗体で染色したサンプルとの比較から、ＣＤ４１ａ陽性およびＣＤ４２ｂ陽性細胞の存在を確認し、ＢＭ−ＣＤ３４＋  Ｓｔｅｍ／Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓからの巨核球分化および巨核球からの血小板産生を確認した。【００４５】
（３）血小板接触試験
上記（２）の方法で得たヒト巨核球および血小板の培養液を４０μｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ社製）へ通した後に、上記（１）で作製したフィブロネクチン被覆基材に培養液を１ウエル当たり２ｍｌ添加し、３７℃で１時間接触させた。１時間経過した後に、クエン酸−デキストロース溶液（ＡＣＤ）（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）が入った１５ｍｌ遠心分離用コニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に培養液上清を全回収した。また、ＤＰＢＳで２回洗浄し、洗浄液をコニカルチューブに回収することで、フィブロネクチン被覆基材に吸着していない浮遊細胞を回収した。【００４６】
（４）回収細胞数のカウント
回収液を１５ｍＬチューブに回収し、１７００×ｇ、室温で１０分遠心した。上清を捨て１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１００μｌ）で懸濁した。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（登録商標）標識抗ＣＤ４１ａ抗体１０μｌを加え、遮光で３０分反応した。１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１ｍＬ）を加えて、１７００×ｇ、室温で１０分遠心し、上清を捨てた。核染色剤であるＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（同仁化学研究所社製）を加えた１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（１００μＬ）で懸濁し、遮光環境で１５分反応した。１％ＦＢＳ入りのＤＰＢＳ（３００μＬ）を加え、ＢＤ  Ｔｒｕｃｏｕｎｔ  ｔｕｂｅｓ（日本ベクトンディッキンソン社製）を用いてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）により測定した。巨核球系細胞株であるＭＥＧ−０１をコントロールとして、ＦＳＣ、ＳＳＣゲートから巨核球分画および血小板分画を決定した。血小板分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陰性細胞を血小板とし、巨核球分画におけるＣＤ４１陽性細胞、核染色陽性細胞を巨核球とすることで、回収液中の血小板数および巨核球数を算出した。以下の式から得た血小板回収率および巨核球回収率を表１に示す。【００４７】
血小板回収率（％）＝
（基材接触後に得た回収液中の血小板数／元の液中の血小板数）×１００【００４８】
巨核球回収率（％）＝
（基材接触後に得た回収液中の巨核球数／元の液中の巨核球数）×１００【００４９】
基材へ接触させることで得られる血小板の分離性能は以下の指標を基に分類した。
指標値＝血小板回収率（％）／巨核球回収率（％）【００５０】
分離性能Ａ：          指標値＞１０．０
分離性能Ｂ：１０．０≧指標値＞５．０
分離性能Ｃ：  ５．０≧指標値＞２．５
分離性能Ｄ：  ２．５≧指標値【００５１】
＜実施例２および３＞
フィブロネクチン（ｒｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ヒト、組み換え体、Ｒ＆Ｄ社製）をＤＰＢＳで５０μｇ／ｍｌに希釈してコーティング溶液としたこと（実施例２）、並びにＶＣＡＭ−１（ヒト、組み換え体、和光純薬工業社製）をＤＰＢＳで５μｇ／ｍｌに希釈し、コーティング溶液としたこと（実施例３）以外は、実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示す。【００５２】
＜比較例１〜６＞
比較例として、ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ（ヒト血漿由来、和光純薬工業社製、比較例１）、ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ（ラット尾由来、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、比較例２）、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ（ヒト胎盤由来、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製、比較例３）、Ｌａｍｉｎｉｎ（ヒト臍帯由来、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製、比較例４）、ｖｗｆ（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｆ  Ｆａｃｔｏｒ、ヒト血漿由来、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、比較例５）をそれぞれコーティング溶液とし、実験に用いた。また、比較例６として、コーティング溶液の代わりにＤＰＢＳを用いた。その他は実施例１と同様の操作を実施した。結果を表１に示す。【００５３】
【表１】
2018169061.tif 000002
【００５４】
実施例１〜３の結果に示されているように、本発明の分離方法を用いれば、巨核球の回収率に対する血小板の回収率が高くなるため、効率的に血小板を分離回収することができた。【００５５】
＜実施例４および５＞
実施例１でフィブロネクチン被覆基材に１時間接触した後の浮遊細胞培養液を、別のフィブロネクチン被覆基材に１時間接触させる工程を複数回繰り返した。その他は実施例１と同様の操作を実施した。結果を表２に示す。【００５６】
【表２】
2018169061.tif 000003
【００５７】
実施例４および５の結果に示されているように、本発明の分離方法を複数回繰り返すことで、血小板の分離性能を高めることができた。
【配列表】
2018169061000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月18日(2019.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも巨核球を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させる接触工程、
前記接触工程の前および／または後において巨核球を培養して血小板を産生させる培養工程、および
前記接触工程および前記培養工程後の培養液を回収する回収工程を含む、
巨核球と血小板とを分離する方法であって、
巨核球を培養して血小板を産生させ、得られた巨核球および血小板を含む培養液を、ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材と接触させ、基材と接触させた培養液を回収する方法。
【請求項２】
ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方のインテグリンを介して巨核球と接着する生体親和性高分子が、フィブロネクチン、フィブロネクチンのＲＧＤ配列であるＧＲＧＤＳもしくはＣＳ−１配列であるＥＩＬＤＶを有するペプチド、またはＶＣＡＭ−１と表記されるＶａｓｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１もしくはＶＣＡＭ−１のＱＩＤＳＰＬ配列を有するペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の接触工程、培養工程および回収工程を２回以上反復する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＶＬＡ−４インテグリンおよびＶＬＡ−５インテグリンの少なくとも一方を介して巨核球と接着する生体親和性高分子でコートされた基材を含む、巨核球と血小板とを分離するための器具。
【国際調査報告】
2018169061.tif 000004
2018169061.tif 000005