(57)【要約】本開示は、（１）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー、および（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマーを同一容器中で用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、（２）（ｂ）のプライマーによる逆転写産物に対する（ａ）のプライマーによる逆転写産物の割合に基づいて、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを算出する工程、を含む方法およびそのためのキットを提供する。
2018199136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定する方法であって、
（１）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー、および（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマーを同一容器中で用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、および、
（２）（ｂ）のプライマーによる逆転写産物に対する（ａ）のプライマーによる逆転写産物の割合に基づいて、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを算出する工程、
を含む方法。
【請求項２】
工程（２）が、
工程（２−１）（ａ）のプライマーによる逆転写産物を定量的ＰＣＲにより定量する工程、および、
工程（２−２）（ｂ）のプライマーによる逆転写産物を定量的ＰＣＲにより定量する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（２−１）の定量的ＰＣＲが、
（Ｘ）ＡＢＬ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドで置き換えられている、または、
（Ｙ）ＡＢＬ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域の塩基配列を有する、
フォワードプライマーを用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
フォワードプライマーが、３’末端にブロッキング領域を有する（Ｘ）のフォワードプライマーである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
工程（２−１）の定量的ＰＣＲが、Ｔ３１５Ｉ変異に特異的なＲＮａｓｅＨ依存的定量的ＰＣＲである、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
工程（２−１）において配列番号６の塩基配列を含むフォワードプライマーを用いる、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（２−１）において配列番号６の塩基配列からなるフォワードプライマーを用いる、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
修飾核酸の一部と（Ｘ）のフォワードプライマーの一部が相補的であり、相補的な領域は修飾核酸の全長の５０％より少ないものである、請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
修飾核酸におけるＴ３１５Ｉ変異位置に相当するヌクレオチドが、修飾核酸の中央よりも３’側に位置する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
修飾核酸が配列番号５の塩基配列を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
修飾核酸が配列番号５の塩基配列からなる、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
修飾核酸がＰＮＡを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
工程（１）の（ａ）のリバースプライマーが配列番号７の配列を含み、（ｂ）のリバースプライマーが配列番号１０の配列を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定するためのキットであって、
（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー；
（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマー；および、
（ｃ）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸；
を含むキット。
【請求項１５】
（ａ）および（ｂ）のリバースプライマーによるＡＢＬ ｍＲＮＡの逆転写産物をＰＣＲで増幅するためのフォワードプライマーをさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
フォワードプライマーが、
（Ｘ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドで置き換えられている、または、
（Ｙ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域の塩基配列を有する、
フォワードプライマーである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
フォワードプライマーが、３’末端にブロッキング領域を有する（Ｘ）のフォワードプライマーである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
修飾核酸の一部と（Ｘ）のフォワードプライマーの一部が相補的であり、相補的な領域は修飾核酸の全長の５０％より少ないものである、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
修飾核酸におけるＴ３１５Ｉ変異位置に相当するヌクレオチドが、修飾核酸の中央よりも３’側に位置する、請求項１４〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
定量的ＰＣＲ用のプローブをさらに含む、請求項１４〜１９のいずれかに記載のキット。
【請求項２１】
野生型ＡＢＬ ｍＲＮＡおよびＴ３１５Ｉ変異を有するＡＢＬ ｍＲＮＡの少なくとも１つをさらに含む、請求項１４〜２０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１７−０８７５７８号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本願は、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定する方法、または、そのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子は、慢性骨髄性白血病（Chronic Myelogenous Leukemia: CML）およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Philadelphia chromosome positive Acute Lymphocytic Leukemia: Ph陽性ALL）にみられる染色体異常である。９番染色体と２２番染色体の間での転座ｔ（９；２２）によって、９番染色体のｑ３４バンドに局在するＡＢＬ１遺伝子と２２番染色体のｑ１１バンドに局在するＢＣＲ遺伝子が融合して形成される。ＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子でコードされるキメラタンパクＢＣＲ−ＡＢＬ１はチロシンキナーゼ（tyrosine kinase）活性を有し、恒常的に細胞増殖シグナルを刺激し、アポトーシス抑制の働きをすることで、造血幹細胞を無制限に増殖させて異常を引き起こす。【０００３】
上記のように、キメラタンパクＢＣＲ−ＡＢＬ１はＣＭＬおよびＰｈ陽性ＡＬＬの原因タンパクの１つであるため、ＢＣＲ−ＡＢＬ１を標的分子として作用するチロシンキナーゼ阻害剤（tyrosine kinase inhibitor：ＴＫＩ）が治療薬として開発されてきた。代表的なＴＫＩであるイマチニブは、ＣＭＬおよびＰｈ陽性ＡＬＬの症例に対して画期的な治療効果を発揮した。しかし、ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子に変異を生じた症例では、その効果が低下し、治療上の課題となった。その後イマチニブに抵抗性を持つＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子変異の多くに対して有効なＴＫＩとして、ニロチニブおよびダサチニブが開発された。ところが、ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子が、ＢＣＲ−ＡＢＬ１のＡＢＬ１領域３１５番目のアミノ酸であるスレオニンがイソロイシンに置換されるように変異（Ｔ３１５Ｉ変異）した症例に対しては、著しく効果が低下した（非特許文献１〜３）。従来、Ｔ３１５Ｉ変異を生じた場合は、ＴＫＩ治療による予後は不良で、同種幹細胞移植が第一選択とされており、血液学的再発に至る前の早期のＴ３１５Ｉ変異の検出が望まれていた。【０００４】
このＴ３１５Ｉ変異を有するＢＣＲ−ＡＢＬ１に対してもチロシンキナーゼ阻害作用を示す薬剤としてポナチニブが開発された。ポナチニブは既存のＴＫＩに抵抗性又は不耐容のＣＭＬおよびＰｈ陽性ＡＬＬに有用で、特にＴ３１５Ｉ変異を有する場合に高い効果を示した（非特許文献４および５）。【０００５】
このようなことから患者がＴ３１５Ｉ変異を有する場合、既存のＴＫＩから速やかにポナチニブによる治療に切り替える必要がある。しかし、これまでＢＣＲ−ＡＢＬ１の変異解析に用いられているダイレクトシークエンス法、パイロシークエンス法、ＤＨＰＬＣ法、高解像度融解曲線分析法、特異的プライマーによるＰＣＲ法などの方法は、感度が十分ではなく、早期にＴ３１５Ｉ変異を確認することは難しかった（非特許文献６〜８）。Ｔ３１５Ｉ変異の発見が遅れ、病期が進行すると、Ｔ３１５Ｉ変異に有効なポナチニブを用いた場合でも寛解を達成できなくなる可能性が高まる。そのため、Ｔ３１５Ｉ変異をより早期に検出することは、医療上の重要な課題と考えられた。【０００６】
また、ＢＣＲ−ＡＢＬ１を対象としたＴＫＩ治療では、ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ発現量を測定することにより、治療効果のモニタリングが可能である。Ｔ３１５Ｉ変異は、多くのＴＫＩに対して耐性を持ち予後が不良であるため、Ｔ３１５Ｉ変異を有するＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの発現量を、ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ量と同様にモニタリングすることは、臨床上有用と考えられる。また、ポナチニブの効果を評価するためにも有用と考えられる。しかし、これまでに開発されたＴ３１５Ｉ変異検出法は、十分な定量性を欠き、これらの目的には不十分である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Druker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, Gathmann I, Kantarjian H, Gattermann N, et al. Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 2006;355:2408-17.
【非特許文献２】Modugno M. New resistance mechanisms for small molecule kinase inhibitors of Abl kinase. Drug Discov Today Technol. 2014;11:5-10.
【非特許文献３】Zabriskie MS, Eide CA, Tantravahi SK, Vellore NA, Estrada J, Nicolini FE, et al. BCR-ABL1 Compound Mutations Combining Key Kinase Domain Positions Confer Clinical Resistance to Ponatinib in Ph Chromosome-Positive Leukemia. Cancer Cell. 2014;26:428-42.
【非特許文献４】Goldman JM. Ponatinib for chronic myeloid leukemia. N Engl J Med. 2012; 367: 2148-2149.
【非特許文献５】Cortes JE, Kantarjian H, Shah NP, et al. Ponatinib in refractory Philadelphia chromosome-positive leukemias. N Engl J Med. 2012; 367: 2075-2088.
【非特許文献６】Hofmann WK、 Jones LC, Lemp NA, de Vos S, Gschaidmeier H、 Hoelzer D, et al. Ph(+) acute lymphoblastic leukemia resistant to the tyrosine kinase inhibitor STI571 has a unique BCR-ABL gene mutation. Blood. 2002;99:1860-2.
【非特許文献７】Yamamoto M, Kakihana K, Ohashi K, Yamaguchi T, Tadokoro K, Akiyama H, et al. Serial monitoring of T315I BCR-ABL mutation by Invader assay combined with RT-PCR. Int J Hematol. 2009;89:482-8.
【非特許文献８】Yin L, Dittman D, Chenn A. Rapid quantitative detection of the T315I mutation in patients with chronic myelogenous leukemia. Diagn Mol Pathol. 2012;21:34-39.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本願の目的は、対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定する方法、または、そのためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、対象のＲＮＡ試料を、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異部位の上流と下流に結合する２種のリバースプライマーを用いて、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ遺伝子に特異的に結合する修飾核酸の存在下で逆転写し、当該２種のプライマーによる逆転写産物の量を比較することにより、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定できることを見出した。【００１０】
従って、ある態様では、本願は、対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定する方法であって、
（１）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー、および（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマーを同一容器中で用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、および、
（２）（ｂ）のプライマーによる逆転写産物に対する（ａ）のプライマーによる逆転写産物の割合に基づいて、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを算出する工程、
を含む方法を提供する。【００１１】
別の態様では、本願は、対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定するためのキットであって、
（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー；
（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマー；および、
（ｃ）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸；
を含むキットを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定できる。これにより、Ｔ３１５Ｉ変異を有する患者の処置に有用な情報が得られることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】配列番号１の塩基配列を示す。９４７番目のシトシン塩基を太字および下線で示す。
【図１−２】配列番号１の塩基配列（続き）を示す。
【図２−１】配列番号３の塩基配列を示す。９４７番目のチミン塩基を太字および下線で示す。
【図２−２】配列番号３の塩基配列（続き）を示す。
【図３】２つのリバースプライマーを用いる野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの逆転写反応の模式図である。
【図４】２つのリバースプライマーを用いるＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの逆転写反応の模式図である。
【図５】逆転写反応の模式図である。
【図６】ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲの模式図である。
【図７】Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲの模式図である。
【図８】Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの増幅の増幅曲線を示す。
【図９】ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの増幅の増幅曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
【００１５】
本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８〜２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０〜３０」は、「１８〜３３」を含むものとする。
【００１６】
ＡＢＬ１遺伝子は、９番染色体のｑ３４バンドに局在する遺伝子である。９番染色体と２２番染色体の間での転座ｔ（９；２２）によって、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１、エクソン１〜１３または１〜１４と、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２〜４が融合すると、慢性骨髄性白血病およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病にみられるＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を生じる。
【００１７】
ＡＢＬ１遺伝子は、典型的には配列番号１の塩基配列を有するが、多数の変異体が知られている。本願に関して、ＡＢＬ１遺伝子には、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドに相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。
【００１８】
さらに、ＡＢＬ１遺伝子には、配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。配列同一性とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
【００１９】
本明細書において、ＡＢＬ１遺伝子のうち、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドがシトシンを有するＡＢＬ１遺伝子を、「野生型ＡＢＬ１遺伝子」と称し、そのｍＲＮＡを「野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ」と称する。野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡは、典型的には、配列番号１のヌクレオチド配列を有し、それにコードされるタンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を有する。本願に関して、「Ｔ３１５Ｉ変異位置」は、あるＡＢＬ１遺伝子のヌクレオチド配列を配列番号１のヌクレオチド配列と最適にアラインメントしたときに、配列番号１の９４７番目に相当する位置を意味する。
【００２０】
野生型ＡＢＬ１遺伝子の上記シトシンがチミンに置換されると、それにコードされるタンパク質において、ＢＣＲ−ＡＢＬ１タンパク質のＡＢＬ１領域の３１５番目のアミノ酸に相当するスレオニンがイソロイシンに置換される。ＡＢＬ１遺伝子またはＡＢＬ１タンパク質における当該置換を本明細書において「Ｔ３１５Ｉ変異」と称する。Ｔ３１５Ｉ変異を有するＡＢＬ１遺伝子を「Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１遺伝子」と称し、そのｍＲＮＡを「Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ」と称する。Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡは、典型的には、配列番号３のヌクレオチド配列を有し、それにコードされるタンパク質は配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
本願に関して、「ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベル」は、Ｔ３１５Ｉ変異を有するすべての遺伝子、即ち、Ｔ３１５Ｉ変異を有する、転座していないＡＢＬ１遺伝子およびＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を含む転座したＡＢＬ１遺伝子の発現レベルを意味する。
【００２２】
本願に関して、典型的には、対象はヒトである。対象は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）に罹患しているか、または、罹患している疑いのある対象であってもよい。対象は、ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を有してもよい。
【００２３】
本願に関して、「ＲＮＡ試料」とは、対象に由来する造血幹細胞、白血球または白血病細胞を含む試料から抽出されたＲＮＡであり、例えば、血液、骨髄液、リンパ液から抽出されたＲＮＡであり得る。単離された造血幹細胞、血液細胞、白血球または白血病細胞から抽出されたＲＮＡを用いてもよい。ある実施態様では、ＲＮＡ試料は末梢血白血球または骨髄液有核細胞から抽出されたＲＮＡである。ある実施態様では、ＲＮＡ試料は末梢血白血球から抽出されたＲＮＡである。
【００２４】
試料からのＲＮＡの抽出には、公知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、ＰＣＩ（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出）法において溶液を酸性にして水層から抽出する方法、市販のＲＮＡ抽出キットを用いる方法、その他の公知の方法によることができる。ＲＮＡは、ｔｏｔａｌＲＮＡであってもよく、精製されたｍＲＮＡであってもよい。
【００２５】
工程（１）において、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸を用いる。本明細書において、当該修飾核酸を「Ｔ３１５Ｉクランプ」と称する。修飾核酸は、１個以上の人工ヌクレオチドを含み、ある配列を有するｍＲＮＡに対して、修飾核酸と同じ塩基配列を有するＤＮＡよりも強く相補鎖を形成し、逆転写酵素のエキソヌクレアーゼ活性により分解されない。逆転写酵素は、鋳型であるｍＲＮＡに修飾核酸が結合していると、結合部位で伸長反応を停止する。
【００２６】
Ｔ３１５Ｉクランプは、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドがシトシンを有する野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡと結合し、当該ヌクレオチドがチミンを有するＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡとは結合しないように、従って、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの逆転写を抑制するが、Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの逆転写は抑制しないように設計する。具体的には、Ｔ３１５Ｉクランプは、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドを含む約１０〜２２個、約１２〜２０個、約１４〜１８個または約１５〜１７個、例えば約１６個のヌクレオチドからなる領域に相補的な修飾核酸であり得る。ある実施態様では、Ｔ３１５Ｉクランプは、５’−ＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＡＴＧＡ−３’（配列番号５）のヌクレオチド配列を含む。ある実施態様では、Ｔ３１５Ｉクランプは、配列番号５の塩基配列からなる。
【００２７】
Ｔ３１５Ｉクランプは、１個またはそれ以上の人工ヌクレオチドを含む。人工ヌクレオチドとは、ヌクレオシド（塩基部分または糖部分）が修飾されており、天然のヌクレオチドと異なる構造を有するものを意味する。人工ヌクレオチドとしては、ヌクレアーゼ耐性や標的配列との結合親和性を高めるものを選択し得る。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Deleavey, G. F., & Damha, M. J. (2012). Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chemistry & biology, 19(8), 937-954 に記載の人工ヌクレオチドを使用し得る。人工ヌクレオチドの例には、例えば、無塩基（abasic）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２'−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型人工核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ,４'−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、拘束エチル（ｃＥｔ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。糖修飾を有するヌクレオシドには、２'−Ｏ−メチルリボース、２'−Ｏ−メトキシエチルリボース、２'−デオキシ−２'−フルオロリボース、３'−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１'，２'−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。修飾された塩基としては、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−メチルシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。Ｔ３１５Ｉクランプ中の人工ヌクレオチドは、すべて同じ種類のものであってもよく、２種類以上の異なる人工ヌクレオチドが存在してもよい。
【００２８】
ある実施態様では、Ｔ３１５Ｉクランプは、人工ヌクレオチドとして、１個またはそれ以上のＰＮＡを含む。ＰＮＡは、一般に、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンがペプチド結合することにより、ＤＮＡのリン酸結合がペプチド結合で置き換えられた構造を生じる（Nielsen et al. 1991 Science 254、 1457-1500）。ＰＮＡは、各種核酸分解酵素に対して耐性であり、ＤＮＡまたはＲＮＡと同様の分子認識によりＤＮＡまたはＲＮＡと相補鎖を形成する。ＰＮＡとＤＮＡの親和性は、ＤＮＡとＤＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの親和性よりも高い。ある実施態様では、Ｔ３１５Ｉクランプ中のヌクレオチドは、すべてＰＮＡである。
【００２９】
Ｔ３１５Ｉクランプの添加量は、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの逆転写を抑制し得る量であればよく、例えば、逆転写反応液の最終体積モル濃度で、約０．１μＭ〜１０μＭまたは約０．５μＭ〜５μＭ、例えば、約２μＭとすることができる。
【００３０】
工程（１）では、逆転写のために、２種のリバースプライマー、即ち、（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー、および（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマーを使用する。（ａ）のリバースプライマーは、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉクランプが結合する領域を含む部分を逆転写する。本明細書において、当該リバースプライマーを「Ｔ３１５Ｉリバースプライマー」と称する。（ｂ）のリバースプライマーは、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの、Ｔ３１５Ｉクランプが結合する領域よりも上流の部分を逆転写する。本明細書において、（ｂ）のリバースプライマーを「ＡＢＬリバースプライマー」と称する。逆転写に適するプライマーの設計方法は当業者に周知である。
【００３１】
工程（１）では、Ｔ３１５ＩリバースプライマーとＡＢＬリバースプライマーによる逆転写を、ワンステップで、即ち、同一容器内で、同時または連続して行う。ある実施態様では、Ｔ３１５ＩリバースプライマーとＡＢＬリバースプライマーによる逆転写を、同一容器内で同時に行う。これらの逆転写用プライマーとＴ３１５Ｉクランプを用いる野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの逆転写反応の模式図を、それぞれ図３および４に示す。
【００３２】
逆転写酵素、ｄＮＴＰ、バッファーなどの試薬は、当分野で通常用いられるものを用いることができ、各種試薬の量、反応時間、温度などの条件は、逆転写酵素に添付されている説明書の記載や通常用いられるプロトコール等の公知の手法により、適宜決定することができる。例えば、逆転写酵素は分子生物学実験等に使用可能な公知の任意の逆転写酵素、例えば、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素等、またはそれらの誘導体を使用し得る。
【００３３】
工程（２）では、（ｂ）のＡＢＬリバースプライマーによる逆転写産物に対する（ａ）のＴ３１５Ｉリバースプライマーによる逆転写産物の割合に基づいて、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを算出する。例えば、（ａ）のＴ３１５Ｉリバースプライマーによる逆転写産物を定量した値を、（ｂ）のＡＢＬリバースプライマーによる逆転写産物を定量した値で除した値を、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルの測定値とする。逆転写産物の定量は、当分野で知られているいかなる方法で実施してもよい。例えば、定量的ＰＣＲ、増幅後の核酸の電気泳動、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法、インターカレーター性蛍光色素による二本鎖ＤＮＡの染色、蛍光プローブ法などが挙げられる。
【００３４】
ある実施態様では、上記方法の工程（２）は、工程（２−１）（ａ）のＴ３１５Ｉリバースプライマーによる逆転写産物を定量的ＰＣＲにより定量する工程、および工程（２−２）（ｂ）のＡＢＬリバースプライマーによる逆転写産物を定量的ＰＣＲにより定量する工程、をさらに含む。定量的ＰＣＲは、例えば定量リアルタイムＰＣＲであってもよい。定量リアルタイムＰＣＲには、各種の蛍光ＰＣＲ技術を用い得る。蛍光ＰＣＲ技術としては、例えば、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉなどの蛍光性核酸標識剤を用いるインターカレーター法（例えば、ライトサイクラー（登録商標）（ロシュ社）、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System（登録商標）（パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ社）を用いる）、ＤＮＡポリメラーゼの５'エキソヌクレアーゼ活性を利用して増幅をリアルタイムでモニターするＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＮａｓｅＨ酵素のＲＮａｓｅ活性および専用のキメラＲＮＡプローブを利用するサイクリングプローブ法などが挙げられるが、これに限定されない。
【００３５】
ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブ法により定量リアルタイムＰＣＲを行う。一般的に、ＴａｑＭａｎプローブ法では、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加える。ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリング段階で鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。伸長反応段階でＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がクエンチャーから離れ、蛍光が発せられる。ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲ産物のどこに結合してもよく、当分野で周知の方法により設計し得る。また、任意の蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせを使用し得る。
【００３６】
定量リアルタイムＰＣＲにおいて、既知濃度のｃＤＮＡを含む標準液と未知濃度のｃＤＮＡ（検体）を同時に増幅し、横軸に増幅サイクル数、縦軸にレポーター色素の蛍光強度（対数変換値）をプロットした蛍光増幅曲線を作成してもよい。増幅曲線が直線状となる蛍光強度の中央値付近で横軸と平行な線を引き、その線と各増幅曲線が交わるときの増幅サイクル数を求め得る。さらに、横軸に各標準液の濃度（対数変換値）、縦軸に標準液の増幅サイクル数をプロットした標準曲線を作成し、この標準曲線上に検体の増幅サイクル数を当てはめることにより、検体の濃度を算出し得る。
【００３７】
工程（２−１）および（２−２）で用いるプライマー対は、工程（１）の逆転写産物を増幅できるようにそれぞれ設計する。ＰＣＲに適するプライマーの設計方法は当業者に周知である。プライマー対は、増幅された核酸が定量に適する長さ、例えば、約１０〜１０００、約２０〜５００、約５０〜３００、約１００〜２００ヌクレオチド、例えば、約１５０ヌクレオチド長を有するように設計し得る。
【００３８】
工程（２−１）で用いるプライマー対は、逆転写産物のＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域を増幅できるように設計する。即ち、ＡＢＬ遺伝子のＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域またはそれより上流の領域の塩基配列を有するフォワードプライマーと、ＡＢＬ１遺伝子のＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域またはそれより下流の領域の塩基配列に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを使用する。工程（２−１）で用いるフォワードプライマーは、ＡＢＬ遺伝子のＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドで置き換えられているものであってもよい。ある実施態様では、工程（２−１）において、工程（１）の（ａ）と同じＴ３１５Ｉリバースプライマーを用いる。ある実施態様では、工程（２−２）において、工程（１）の（ｂ）と同じＡＢＬリバースプライマーを用いる。
【００３９】
工程（２−１）では、Ｔ３１５Ｉリバースプライマーによる逆転写産物を、Ｔ３１５Ｉ変異に特異的なＲＮａｓｅＨ依存的定量的ＰＣＲにより定量してもよい。ＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲは、ＲＮａｓｅＨを利用する配列特異的ＰＣＲ法である（Boucard AA, et. al. J Biol Chem, 289(1):387-402; Dobosy JR, et al., BMC Biotechnol, 11(80):1-18）。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を認識し、ＲＮＡの５’末端側ＤＮＡとのホスホジエステル結合を切断する。ＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲでは、プライマーの少なくとも１塩基をＲＮＡとすることにより鋳型ＤＮＡとＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を形成させ、さらにＲＮＡの３’側にＤＮＡポリメラーゼが結合できない領域（ブロッキング領域）を設けることにより、ＲＮａｓｅＨがＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を認識し、切断したときにのみ、ＰＣＲが進行するようにする。ＲＮａｓｅＨがＲＮＡとＤＮＡのホスホジエステル結合を切断するには、プライマー内のＲＮＡが鋳型ＤＮＡと相補的であり、ミスマッチでないことが必要である。
【００４０】
工程（２−１）におけるＲＮａｓｅＨ依存的定量的ＰＣＲには、ＡＢＬ１遺伝子のＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドで置き換えられており、３’末端にブロッキング領域を有するフォワードプライマーを用いる。本明細書において、当該フォワードプライマーを「Ｔ３１５Ｉフォワードプライマー」と称する。Ｔ３１５Ｉフォワードプライマー中のウラシルリボヌクレオチドは、野性型ＡＢＬ ｃＤＮＡのＰＣＲにおいて鋳型のヌクレオチドとミスマッチを生じるので、ブロッキング領域が切断されず、ＰＣＲは進行しない。一方、Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ ｃＤＮＡのＰＣＲではミスマッチは生じないので、ブロッキング領域は切断され、ＰＣＲが進行する。従って、Ｔ３１５Ｉフォワードプライマーを用いるＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲにより、Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ ｃＤＮＡを特異的に増幅することができる。
【００４１】
ＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲに用いるプライマーは、例えば、Integrated DNA technologies社により提供されるプロトコールを参照して、当業者が適宜設計し得る。Ｔ３１５Ｉフォワードプライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のＴ３１５Ｉ変異位置よりも上流の領域の配列を含み、ＲＮＡとブロッキング領域が切り離された後に、残りのオリゴヌクレオチドがＰＣＲ反応のフォワードプライマーとして機能するように設計する。Ｔ３１５Ｉフォワードプライマーは、例えば、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置の上流約８〜６０、１０〜３０、１５〜２５または１９〜２３ヌクレオチド、例えば、約２０、２１または２２ヌクレオチドの配列を含む。Ｔ３１５Ｉフォワードプライマー中のＴ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドに相当するヌクレオチドは、ウラシルリボヌクレオチドである。３’側のブロッキング領域には、ミスマッチＤＮＡおよびＣ３スペーサーなどのブロッキング基が含まれる。例えば、ブロッキング領域は、ＡＢＬ１遺伝子の９４５〜９４８番目のヌクレオチドと同じ塩基を有する４個のデオキシリボヌクレオチド、９４９番目のヌクレオチドと異なる塩基を有する１個のデオキシリボヌクレオチドおよび１個のブロッキング基からなる。別の例では、ブロッキング領域は、ＡＢＬ１遺伝子の９４５番目のヌクレオチドと同じ塩基を有する１個のデオキシリボヌクレオチド、２個のブロッキング基、９４６番目のヌクレオチドと同じ塩基を有する１個のデオキシリボヌクレオチド、９４７番目のヌクレオチドと異なる塩基を有する１個のデオキシリボヌクレオチドからなる。
【００４２】
ある実施態様では、Ｔ３１５Ｉフォワードプライマーは、５’−ＧＡＧＣＣＣＣＣＧＴＴＣＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡｒＵＴ／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／ＧＣ−３’（配列番号６、ここで、ｒＵはウラシルＲＮＡであり、ｉＳｐＣ３はスペーサーＣ３である）である。
【００４３】
工程（２−１）および（２−２）は、Ｔ３１５Ｉクランプの存在下で行われてもよい。従って、工程（１）の産物の全部または一部に、工程（２−１）または（２−２）に必要な試薬を添加して反応を行うことができる。例えば、工程（１）と（２−１）、または、工程（１）と（２−２）を、ワンステップで、即ち、同一容器内で、同時または連続して行うことができる。
【００４４】
工程（２−１）でＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲを実施し、工程（１）と（２−１）をワンステップで実施する場合、Ｔ３１５Ｉクランプの一部とＴ３１５Ｉフォワードプライマーの一部が相補的に結合し得る場合がある。一般的に、オリゴヌクレオチドが１塩基の変異を識別する能力は、変異部位がオリゴヌクレオチドの中央にある場合に最大になると考えられるが、この相補的結合を低減するために、Ｔ３１５Ｉクランプは、Ｔ３１５Ｉ変異位置に相当するヌクレオチドが、Ｔ３１５Ｉクランプの中央よりも３’側に位置するように設計してもよい。即ち、Ｔ３１５ＩクランプとＴ３１５Ｉフォワードプライマーの相補的な領域がＴ３１５Ｉクランプの全長の５０％より少ないように、Ｔ３１５Ｉクランプを設計し得る。例えば、配列番号５の塩基配列からなるＴ３１５Ｉクランプは、ＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲに用いるフォワードプライマーとの相補的結合が少なく、かつ、変異を識別する能力を有するように至適化されている。なお、このような修飾核酸配列の調整は、Ｔ３１５Ｉ変異の検出に限らず他の変異の検出にも適用できる。すなわち、野生型ｍＲＮＡの逆転写反応を修飾核酸により阻害し、その後のＰＣＲ反応をＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲにより阻害する場合には、修飾核酸の全長の５０％より少ない部分がＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲのフォワードプライマーと相補的に結合するように調整したほうが良い。
【００４５】
ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ｄＮＴＰ、バッファーなどの試薬は、当分野で通常用いられるものを用いることができ、各種試薬の量、反応時間、温度などの条件は、酵素に添付されている説明書の記載や通常用いられるプロトコール等の公知の手法により、適宜決定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは分子生物学実験等に使用可能な公知の任意のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼおよびその誘導体を使用し得る。例えば、ＲＮａｓｅＨは分子生物学実験等に使用可能な公知の任意のＲＮａｓｅＨ、例えば、ＲＮａｓｅＨ２を使用し得る。
【００４６】
ある実施態様では、下表のプライマー、クランプおよびプローブを使用する。これらのすべてを組み合わせて使用してもよく、少なくとも１つを使用してもよい。
【表１】
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【００４７】
ある態様では、本願は、上記の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、少なくとも、
（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー；
（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマー；および、
（ｃ）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸；
を含む。
【００４８】
キットは、さらに、（ａ）および（ｂ）のリバースプライマーによるＡＢＬ１ ｍＲＮＡの逆転写産物をＰＣＲで増幅するためのフォワードプライマーおよびＰＣＲ用のさらなるリバースプライマーの少なくとも１つを含んでもよい。プライマーは、ＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲ用であってもよい。キットは、さらに、定量的ＰＣＲ用のプローブを含んでもよい。キットは、さらに、標準品、例えば、既知量の野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの少なくとも１つを含み得る。
【００４９】
キットは、さらに、上記の方法の実施に必要な試薬、例えば、逆転写、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲまたはＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲ用の、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ｄＮＴＰ、バッファーなどを含んでもよい。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書（例えば、書面または記憶媒体等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の構成要素を含んでもよい。
【００５０】
キットに含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水または適当な緩衝液中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、試験管、チューブ、プレート、マルチウェルプレート等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック、金属などの少なくとも１つの材料から形成されていてよい。容器は、ラベルを有していてもよい。
【００５１】
以下に、本願の方法およびキットの実施態様の一例について、模式図を用いて測定原理を説明するが、本願発明はいかなる理論にも限定されない。
【００５２】
１  測定原理概略
末梢血白血球または骨髄液有核細胞より抽出したＲＮＡ中のＡＢＬ１ ｍＲＮＡの９４４番目の塩基がシトシンからチミンに変異したＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの発現量を測定する。測定原理は、ＲＮＡを鋳型として相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する逆転写反応（ＲＴ）と、蛍光標識プローブを用いてｃＤＮＡを定量するリアルタイムＰＣＲの、２段階からなる２ステップ定量ＲＴ−ＰＣＲ法である。Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域と、すべてのＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含まない領域をそれぞれ増幅し、前者の定量値を後者の定量値で除した比を報告値とする。
【００５３】
１．１  逆転写反応
逆転写反応の概略を図５に示す。９４４番目の塩基がシトシンであるＡＢＬ１ ｍＲＮＡを野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ、チミンであるＡＢＬ１ ｍＲＮＡをＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡと定義する。すべてのＡＢＬ１ ｍＲＮＡを定量するための領域およびＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡを定量するための領域を、それぞれ逆転写するために、ＡＢＬリバースプライマーおよびＴ３１５Ｉリバースプライマーの２種類のプライマーを用いる。
【００５４】
まずＡＢＬリバースプライマーおよびＴ３１５Ｉリバースプライマーが測定試料に含まれる相補的な配列に結合する（図５（１ａ）および（１ｂ））。これらのリバースプライマーを起点として、反応液に含まれるＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性により、第１鎖ｃＤＮＡを合成する（図５（２ａ）または（２ｂ））。反応液には野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡと相補的な配列をもつＴ３１５Ｉクランプが含まれ、第１鎖ｃＤＮＡを合成する際に、鋳型が野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡである場合、Ｔ３１５Ｉクランプが特異的に結合し、逆転写反応は阻害されるため（図５（２ａ））、Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの合成量が減少する（図５（３ａ））。一方、鋳型がＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡである場合、Ｔ３１５Ｉクランプは結合せず、逆転写反応は阻害されない（図５（２ｂ）および（３ｂ））。またＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの合成はＴ３１５Ｉクランプの影響を受けないため、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡとＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに対して同様にｃＤＮＡが合成される。
【００５５】
１．２  ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲ
ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ定量リアルタイムＰＣＲの概略を図６に示す。リアルタイムＰＣＲによって、逆転写反応により合成されたＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する（図６）。この増幅過程において、２本鎖ｃＤＮＡの片方に結合した蛍光標識プローブ（ＡＢＬプローブ）が、反応液中のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、レポーター色素が遊離する。遊離した色素の蛍光強度をサイクル毎に測定することにより、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ量の増加をリアルタイムに測定する（図６（６））。
【００５６】
１．３  Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲ
Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅する際、反応特異性を高めるためにＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲ（ｒｈＰＣＲ）の原理を用いる。ｒｈＰＣＲに用いる核酸分解酵素であるＲＮａｓｅＨ２は、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を認識し、ＲＮＡの５’末端側ＤＮＡとのホスホジエステル結合を切断する特性をもつ。ｒｈＰＣＲでは、プライマーの１つのデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに変更することで鋳型ＤＮＡとＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を形成させ、さらにＲＮＡの３’側にＤＮＡポリメラーゼが結合できない領域（ブロッキング領域）を設け、ＲＮａｓｅＨ２がＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を認識して切断した場合のみＰＣＲが進行する。この原理を利用して、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの９４４番目の塩基がチミンであるＴ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡのみを増幅する。Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの定量リアルタイムＰＣＲの概略を図７に示す。
【００５７】
Ｔ３１５Ｉフォワードプライマーでは、Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの９４４番目の塩基に相当する部分がＤＮＡ（チミン）からＲＮＡ（ウラシル）に置換されている（図７（１ａ））。Ｔ３１５ＩフォワードプライマーのＲＮＡ置換塩基は、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡに対してはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を形成しないため、ＲＮａｓｅＨ２によるブロッキング領域の切断が起こらず、ＰＣＲ反応は起こらない（図７（２ａ））。
【００５８】
一方、Ｔ３１５ＩフォワードプライマーのＲＮＡ置換塩基は、Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来ｃＤＮＡに対してはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ２本鎖を形成、ＲＮａｓｅＨ２によりブロッキング領域が切断され、Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの特異的な増幅が進行する（図７（１ｂ）、（２ｂ））。Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡの特異的な増幅が、ＰＣＲにより繰り返される（図７（３）〜（９））。この増幅過程において、２本鎖ｃＤＮＡの片方に結合した蛍光標識プローブ（ＡＢＬＴ３１５Ｉプローブ）が、反応液中のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により分解され、レポーター色素が遊離する。遊離した色素の蛍光強度をサイクル毎に測定することにより、Ｔ３１５Ｉ変異型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ量の増加をリアルタイムに測定する（図７（６））。
【００５９】
別の態様では、本願は、対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異を検出する方法であって、
（１）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドであり、３’末端にブロッキング領域を有するフォワードプライマーを用いて、（１）の逆転写産物を、ＲＮａｓｅＨ依存的ＰＣＲにより増幅する工程、
（３）工程（２）において核酸が増幅された場合に、対象がＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異を発現していると判定する工程、
を含む方法を提供する。
【００６０】
別の態様では、本願は、上記の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドで置き換えられており、３’末端にブロッキング領域を有するフォワードプライマー；
（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー；および、
（ｃ）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸；
を含むキットを提供する。
【００６１】
この方法およびキットの詳細は、上記の対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定する方法およびキットの説明に準じる。
【００６２】
本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定する方法であって、
（１）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー、および（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマーを同一容器中で用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、および、
（２）（ｂ）のプライマーによる逆転写産物に対する（ａ）のプライマーによる逆転写産物の割合に基づいて、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを算出する工程、
を含む方法。
［２］工程（２）が、
工程（２−１）（ａ）のプライマーによる逆転写産物を定量的ＰＣＲにより定量する工程、および、
工程（２−２）（ｂ）のプライマーによる逆転写産物を定量的ＰＣＲにより定量する工程、
をさらに含む、第１項に記載の方法。
［３］工程（２−１）の定量的ＰＣＲが、
（Ｘ）ＡＢＬ遺伝子のＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異位置のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドで置き換えられている、または、
（Ｙ）ＡＢＬ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域の塩基配列を有する、
フォワードプライマーを用いる、第２項に記載の方法。
【００６３】
［４］フォワードプライマーが（Ｘ）のフォワードプライマーである、第３項に記載の方法。
［５］フォワードプライマーが、３’末端にブロッキング領域を有する、第４項に記載の方法。
［６］工程（２−１）の定量的ＰＣＲが、Ｔ３１５Ｉ変異に特異的なＲＮａｓｅＨ依存的定量的ＰＣＲである、第２項〜第５項のいずれかに記載の方法。
［７］工程（２−１）において配列番号６の塩基配列を含むフォワードプライマーを用いる、第２項〜第６項のいずれかに記載の方法。
［８］工程（２−１）において配列番号６の塩基配列からなるフォワードプライマーを用いる、第２項〜第７項のいずれかに記載の方法。
［９］修飾核酸の一部と（Ｘ）のフォワードプライマーの一部が相補的であり、相補的な領域は修飾核酸の全長の５０％より少ないものである、第３項〜第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］修飾核酸におけるＴ３１５Ｉ変異位置に相当するヌクレオチドが、修飾核酸の中央よりも３’側に位置する、第１項〜第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］修飾核酸が配列番号５の塩基配列を含む、第１項〜第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］修飾核酸が配列番号５の塩基配列からなる、第１項〜第１１項のいずれかに記載の方法。
［１３］修飾核酸がＰＮＡを含む、第１項〜第１２項のいずれかに記載の方法。
【００６４】
［１４］工程（１）の（ａ）のリバースプライマーが配列番号７の配列を含む、第１項〜第１２項のいずれかに記載の方法。
［１５］工程（１）の（ｂ）のリバースプライマーが配列番号１０の配列を含む、第１項〜第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］工程（１）の（ａ）のリバースプライマーが配列番号７の配列からなる、第１項〜第１５項のいずれかに記載の方法。
［１７］工程（１）の（ｂ）のリバースプライマーが配列番号１０の配列からなる、第１項〜第１６項のいずれかに記載の方法。
［１８］工程（２−１）が、工程（１）で使用される修飾核酸の存在下で行われる、第２項〜第１７項のいずれかに記載の方法。
［１９］対象がヒトである、第１項〜第１８項のいずれかのいずれかに記載の方法。
［２０］ＲＮＡ試料が末梢血白血球または骨髄液有核細胞から抽出されたＲＮＡである、第１項〜第１９項のいずれかに記載の方法。
［２１］ＲＮＡ試料が末梢血白血球から抽出されたＲＮＡである、第１項〜第１９項のいずれかに記載の方法。
［２２］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブの少なくとも１つを使用する、第１項〜第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブを使用する、第１項〜第２２項のいずれかに記載の方法。
【００６５】
［２４］対象におけるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを測定するためのキットであって、
（ａ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より下流の領域に結合するリバースプライマー；
（ｂ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域に結合するリバースプライマー；および、
（ｃ）野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域に相補的な塩基配列を有する修飾核酸；
を含むキット。
［２５］（ａ）および（ｂ）のリバースプライマーによるＡＢＬ ｍＲＮＡの逆転写産物をＰＣＲで増幅するためのフォワードプライマーをさらに含む、第２４項に記載のキット。
［２６］フォワードプライマーが、
（Ｘ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置を含む領域の塩基配列を有し、Ｔ３１５Ｉ変異のヌクレオチドに相当するヌクレオチドがウラシルリボヌクレオチドで置き換えられている、または、
（Ｙ）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＴ３１５Ｉ変異位置より上流の領域の塩基配列を有する、
フォワードプライマーである、第２５項に記載のキット。
［２７］フォワードプライマーが（Ｘ）のフォワードプライマーである、第２６項に記載のキット。
［２８］フォワードプライマーが、３’末端にブロッキング領域を有する、第２７項に記載のキット。
［２９］フォワードプライマーが配列番号６の配列を含む、第２５項〜第２８項のいずれかに記載のキット。
［３０］フォワードプライマーが配列番号６の配列からなる、第２５項〜第２９項のいずれかに記載のキット。
【００６６】
［３１］修飾核酸の一部と（Ｘ）のフォワードプライマーの一部が相補的であり、相補的な領域は修飾核酸の全長の５０％より少ないものである、第２５項〜第３０項のいずれかに記載のキット。
［３２］修飾核酸におけるＴ３１５Ｉ変異位置に相当するヌクレオチドが、修飾核酸の中央よりも３’側に位置する、第２４項〜第３１項のいずれかに記載のキット。
［３３］修飾核酸が配列番号５の配列を含む、第２４項〜第３２項のいずれかに記載のキット。
［３４］修飾核酸が配列番号５の配列からなる、第２４項〜第３３項のいずれかに記載のキット。
［３５］修飾核酸がＰＮＡを含む、第２４項〜第３４項のいずれかに記載のキット。
［３５］（ａ）のリバースプライマーが配列番号７の配列を含む第２４項〜第３５項のいずれかに記載のキット。
［３６］（ｂ）のリバースプライマーが配列番号１０の配列を含む、第２４項〜第３５項のいずれかに記載のキット。
［３７］（ａ）のリバースプライマーが配列番号７の配列からなる、第２４項〜第３６項のいずれかに記載のキット。
［３８］（ｂ）のリバースプライマーが配列番号１０の配列からなる、第２４項〜第３７項のいずれかに記載のキット。
［３９］定量的ＰＣＲ用のプローブをさらに含む、第２４項〜第３８項のいずれかに記載のキット。
［４０］野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＴ３１５Ｉ変異を有するＡＢＬ１ ｍＲＮＡの少なくとも１つをさらに含む、第２４項〜第３９項のいずれかに記載のキット。
［４１］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブの少なくとも１つを含む、第２４項〜第４０項のいずれかに記載のキット。
［４２］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブを含む、第２４項〜第４１項のいずれかに記載のキット。
【００６７】
本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
【実施例】
【００６８】
プライマーとプローブの設計
以下のプライマーセットおよびプローブを設計し、合成した。
蛍光標識プローブは、プローブの５’末端をＨＥＸ（６−カルボキシフルオレセイン）で標識し、プローブの３’末端を消光色素としてIowa Black FQ（Integrated DNA technologies社）で標識した。
本実施例におけるプライマーおよびプローブの詳細を表２に示す。
【表２】
2018199136.tif 000004
【００６９】
［試験１］
（１）標準品（ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡ）の調製
標準品として、Ｔ３１５Ｉ変異を有するＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含む合成ＲＮＡを用いた。合成ＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ断片を作製するために、野生型ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ中の上記プライマーによるＰＣＲの増幅領域と、ＲＮＡ合成の起点となるＴ７プロモーターの配列を含むプラスミドベクターを作製した。このプラスミドベクターに含まれるＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来配列のＴ３１５Ｉ変異に相当する部分に、部位特異的変異導入法にて一塩基変異を導入した。この変異を導入したプラスミドベクターを大腸菌に形質転換した。大腸菌を培養して大量のプラスミドベクターを調製し、制限酵素により１箇所切断することにより、Ｔ３１５Ｉ変異を有するＡＢＬ１ ｍＲＮＡをコードする配列をもつ直鎖状のＤＮＡ断片を作製した。【００７０】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて、上記ＤＮＡ断片を鋳型として、Ｔ３１５Ｉ変異を有するＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含むＲＮＡ（ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡ）を合成した。合成したＲＮＡを、１００ｎｇ／μＬの大腸菌トランスファーＲＮＡを含むＴＥバッファーで希釈し、ＲＮＡ標準品を調製した。かくして調製したＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡ標準品を、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１．０×１０６、１×１０７コピー／試験の濃度に調整した。また、陰性対照品として、１００ｎｇ／μＬの大腸菌トランスファーＲＮＡを含むＴＥバッファーを用いた。【００７１】
（２）逆転写反応
（２−１）反応液の調整
反応液の容量を５０μＬとし、Ｔ３１５ＩリバースプライマーおよびＡＢＬリバースプライマー（Integrated DNA technologies社）をそれぞれ終濃度０．２μＭ、ｄＮＴＰｓ（東洋紡社）を終濃度０．１ｍＭ、ＭｎＯＡｃ（東洋紡社）を終濃度２．４ｍＭ、ＰＮＡクランプ（パナジーン社）を終濃度２μＭ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を１反応当たり２．５Ｕ、被験ＲＮＡを１反応当たり１μｇとなるように調製した。各濃度につき１サンプルの標準品を反応に用いた。ＰＮＡクランプは、ATGAACTCAGTGATGA（配列番号５）の塩基配列を有し、すべてのヌクレオチドがペプチド結合しているものであった。
（２−２）反応条件：
６０℃で６０分間かけて逆転写反応を行った。【００７２】
（３）ＰＣＲ
ＰＣＲ反応は、Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡと、ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡ（対照）の増幅を、別のチューブで行った。
（３−１）Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定
（ａ）反応液の調製
反応液の容量を３０μＬとし、Ｔ３１５ＩフォワードプライマーおよびＴ３１５Ｉリバースプライマー（Integrated DNA technologies社）をそれぞれ終濃度０．３μＭ、Ｔ３１５Ｉ蛍光標識プローブ（Integrated DNA technologies社）を終濃度０．１５μＭ、ｄＮＴＰｓ（東洋紡社）を終濃度０．２ｍＭ、ＭｎＯＡｃ（東洋紡社）を終濃度２．４ｍＭ、ＲＮａｓｅＨ２（Integrated DNA technologies社）を１反応当たり１００ｍＵ、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社）を１反応当たり１．２５Ｕ、逆転写反応産物を２５μＬとなるように調製した。（２）の逆転写反応産物を精製せずに使用した。各濃度の逆転写反応産物を単測定した。
（ｂ）ＰＣＲ反応
Applied Biosystems 7500 Fast Realtime PCR system（ライフテクノロジーズ社）を用いて、９５℃１０秒間反応した後、９５℃１０秒間→６０℃６０秒間の反応を４０回繰り返し行った。【００７３】
（３−２）ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定
（ａ）反応液の調製
反応液の容量を３０μＬとし、ＡＢＬフォワードプライマーおよびＡＢＬリバースプライマー（Integrated DNA technologies社）をそれぞれ終濃度０．３μＭ、ＡＢＬ蛍光標識プローブ（Integrated DNA technologies社）を終濃度０．２μＭ、ｄＮＴＰｓ（東洋紡社）を終濃度０．４ｍＭ、ＭｎＯＡｃ（東洋紡社）を終濃度２．０ｍＭ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼを１反応当たり１．１２５Ｕ、逆転写反応産物を１反応当たり５μＬとなるように調製した。各濃度の逆転写反応産物を単測定した。
（ｂ）ＰＣＲ反応
Applied Biosystems 7500 Fast Realtime PCR system（ライフテクノロジーズ社）を用いて、９５℃１０秒間反応した後、９５℃１０秒間→６０℃６０秒間の反応を４０回繰り返し行った。【００７４】
（４）結果
（ａ）Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの増幅を行った場合、（ｂ）ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの増幅を行った場合、それぞれについて標準品と陰性対照品の蛍光増幅曲線と増幅サイクル数を確認した。
図８に（ａ）Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの増幅を行った場合の増幅曲線、図９に（ｂ）ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの増幅を行った場合の増幅曲線を示す。表３に、Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡおよびＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡを増幅した場合の増幅サイクルを示す。Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡ、ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡともに、１×１０２から１×１０７コピー／試験の広い範囲で測定可能であった。【００７５】
【表３】
2018199136.tif 000005
【００７６】
［試験２］検出限界の検討
本試験では、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異測定系の検出下限を求めるために、ヒト白血病由来細胞ＨＬ６０より抽出したＲＮＡに、試験１の標準品に用いたＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを種々の濃度で添加した試料を用いて、Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡおよびＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡを測定し、前者の測定値を後者の測定値で除した比を求めた。【００７７】
（１）標準品（ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡ）の調製
標準品は、試験１と同様の方法で調製した。【００７８】
（２）被験試料
被験試料として、ＢＣＲ−ＡＢＬ１陰性であるヒト白血病細胞株ＨＬ６０より抽出したＲＮＡに、標準品に用いたＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを種々の濃度で添加した試料を用いた。具体的には、ＨＬ６０より抽出したＴｏｔａｌ ＲＮＡに、標準品に用いたＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを２５、５０、１００コピー／試験の濃度で添加し、ＴＥバッファーを用いてＲＮＡの終濃度を１００ｎｇ／μＬに調製した。また、対照品として、ＨＬ６０より抽出し、ＴＥバッファーを用いて１００ｎｇ／μＬに調製したＴｏｔａｌ ＲＮＡを用いた。【００７９】
（３）逆転写反応
逆転写反応は、試験１と同様の方法で行った。標準品は各濃度１サンプル反応に用いた。被験試料は各濃度につき１２サンプルを反応に用いた。
（４）ＰＣＲ
ＰＣＲは、試験１と同様の方法で行った。標準品は逆転写反応産物を単測定した。被験試料は、各濃度１２サンプルの逆転写産物をそれぞれ単測定した。【００８０】
（５）結果
Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値を表４、ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値を表５、Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値をリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値で除した比（ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異／ＡＢＬ１比）を表６に示す。１００、５０および２５コピー／試験のＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを添加した試料におけるＴ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値は、それぞれ平均値で１０９．４、４７．４および２７．３となり、理論値と一致した。一方、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを含まないＨＬ６０（対照）のＴ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定では、すべて蛍光増幅が検出されなかった。【００８１】
ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値は、希釈に用いたＨＬ６０がＡＢＬ１ ｍＲＮＡを一定量発現していることから、平均２．０８×１０５となり、すべての測定試料でほぼ同等の値を示した。このように、野生型ＡＢＬを１０５コピー以上発現しているＨＬ６０細胞より抽出したＲＮＡを測定した場合においても、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを含まないＨＬ６０のＴ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡは検出されなかったことから、この測定系はＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡに対する非常に高い特異性を持つと考えられる。【００８２】
１００、５０および２５コピー／試験のＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを添加した試料のＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異／ＡＢＬ１比は、それぞれ平均値で、０．０５２％、０．０２３％および０．０１３％となった。このことから、この測定系の変異検出率は０．０１％程度と非常に高感度であった。【００８３】
【表４】
2018199136.tif 000006
【００８４】
【表５】
2018199136.tif 000007
【００８５】
【表６】
2018199136.tif 000008
【００８６】
［試験３］ＰＮＡクランプによる反応阻害効果
本試験は、逆転写反応におけるＰＮＡクランプの効果を確認することを目的として行った。
（１）標準品（ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡ）の調製
標準品は、試験１と同様の方法で調製した。
（２）被験試料
被験試料は、試験２と同様の方法で調整した。
（３）逆転写反応
逆転写反応は、試験２と同様の方法で、ただし、ＰＮＡクランプを添加せずに行った。
（４）ＰＣＲ
ＰＣＲは、試験２と同様の方法で行った。【００８７】
（５）結果
Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値を表７、ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値を表８、Ｔ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値をリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値で除した比（ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異／ＡＢＬ１比）を表９に示す。１００、５０および２５コピー／試験のＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを添加した試料におけるＴ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値は、それぞれ平均値で３３３．７、２３５．３、２０２．３コピー／試験であった。ＨＬ６０より抽出したＲＮＡ（対照）のＴ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値は１８６．９コピー／試験となった。【００８８】
ＡＢＬリバースプライマー由来ｃＤＮＡの測定値は、希釈に用いたＨＬ６０がＡＢＬ１ ｍＲＮＡを一定量発現していることから、平均２．２９×１０５となり、すべての測定試料でほぼ同等の値を示した。１００、５０および２５コピー／試験のＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを添加した試料のＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異／ＡＢＬ１比は、それぞれ平均値で、０．１４７％、０．１０７％および０．０９０％となった。ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを含まないＨＬ６０（対照）のＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異／ＡＢＬ１比は、平均値で０．０７７％となった。【００８９】
試験２と異なり、ＰＮＡクランプが存在しない状態では、ＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを添加しない試料のＴ３１５Ｉリバースプライマー由来ｃＤＮＡが１８６．９コピー／試験と測定され、またＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異ＲＮＡを添加した試料との差も十分に取れなかった。従って、逆転写反応にＰＮＡクランプを用いることは、高感度にＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異を検出するために重要と考えられる。【００９０】
【表７】
2018199136.tif 000009
【００９１】
【表８】
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【００９２】
【表９】
2018199136.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本願は、従来法と比較して高感度なＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の検出または定量方法を提供し得る。即ち、上記の方法またはキットを用いることで、感度よくＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルを定量することが可能になる。かくして定量されるＡＢＬ１ Ｔ３１５Ｉ変異の発現レベルは、白血病の発症および再発の診断、予後判断、並びに骨髄移植の時期決定などにおいて有用な指標となることが期待される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2018199136.tif 000024
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