(57)【要約】  本発明の目的は、簡便に且つ効率的にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。  前記課題は、本発明の（１）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、（２）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、又はＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸に置換している、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素によって解決することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、
（２）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、又はＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸に置換している、
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素であって、
（ａ）前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして
（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項２】
ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さない、請求項１に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項３】
前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸の置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である、請求項１又は２に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項４】
前記ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸から、システイン又はグリシンに置換しており、前記（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシンからアラニン若しくはグリシンに置換しているか、又は前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシンからアラニン若しくはフェニルアラニンに置換している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項５】
ＤＸＤＤモチーフを有し、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシン、グリシン、及びプロリン以外のアミノ酸である、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素であって、
（ａ）前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして
（ｃ）３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示す、
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項６】
ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さない、請求項５に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項７】
前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸の置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド
である、請求項５又は６に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項８】
前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がアラニン若しくはフェニルアラニンである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを有する微生物。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターを有する形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法。
【請求項１４】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の微生物、又は請求項１２に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアンブレインの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素及びそれを用いたアンブレインの製造方法に関する。本発明によれば、スクアレン又は３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレインを効率的に合成することができる。
【背景技術】
【０００２】
龍涎香（ambergris）は、７世紀ごろから世界各地で使用されてきた高級香料であり、漢方薬としても使用されている。龍涎香は、マッコウクジラが食物（タコ、イカ等）の不消化物を消化管分泌物により結石化させ、排泄したものと考えられているが、詳細な生成メカニズムは不明である。龍涎香の主成分はアンブレインであり、龍涎香が海上を浮遊する間に日光と酸素によって酸化分解を受け、各種の香りを持つ化合物を生成すると考えられている。
龍涎香の主成分アンブレインは、香料又は薬剤として用いられているが、自然界から大量に入手することは不可能である。このため、種々の有機合成法が提案されている。
例えば、特許文献１には、（＋）−アンブレインを簡便かつ安価に効率よく製造する方法として、アンブレノリドから、新規なスルホン酸誘導体を製造し、これにγ−シクロゲラニルハライドの光学活性体をカップリングさせる工程を含む方法が開示されている。
また、非特許文献１には、（±）（５，５，８ａ−トリメチルオクタヒドロ−１Ｈ−スピロ［ナフタレン−２，２’−オキシラン］−１−イル）メタノールから合成した２−（（１Ｒ，２Ｒ，４ａＳ，８ａＳ）−２−（メトキシメトキシ）−２，５，５，８ａ−テトラメチルデカヒドロナフタレン−１−イル）アセトアルデヒドと、（±）メチル  ６−ヒドロキシ−２，２−ジメチルシクロヘキサンカルボキシレートから合成した５−（（４−（（Ｓ）−２，２−ジメチル−６−メチレンシクロヘキシル）ブタン−２−イル）スルホニル）−１−フェニル−１Ｈ−テトラゾールとを、Ｊｕｌｉａカップリング反応によって収束的合成して、アンブレインを得る方法が開示されている。
しかしながら、従来のアンブレインの有機合成法は、多くの合成段階を必要とすることから、反応系が複雑であり、事業化には至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−２３６９９６号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１５／０３３７４６号パンフレット
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Tetrahedron Asymmetry, (2006) Vol.17, pp.3037-3045
【非特許文献２】Biosci. Biotechnol. Biochem., (1999) Vol.63, pp.2189-2198
【非特許文献３】Biosci. Biotechnol. Biochem., (2001) Vol.65, pp.2233-2242
【非特許文献４】Biosci. Biotechnol. Biochem., (2002) Vol.66, pp.1660-1670
【非特許文献５】J. Am. Chem. Soc., (2011) Vol.133, pp.17540-17543
【非特許文献６】J. Am. Chem. Soc., (2013) Vol.135, pp.18335-18338
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方、スクアレン−ホペン環化酵素の変異型酵素（D377C、D377N、Y420H、Y420W等）を用いることによって、スクアレンから、単環性トリテルペンである３−デオキシアキレオールＡを得る方法が知られている（非特許文献２〜４）。
本発明者らは、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成可能な変異型スクアレン−ホペン環化酵素をスクアレンに反応させることによって、３−デオキシアキレオールＡを得、さらにテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を反応させることによって、アンブレインの製造ができることを見出した（特許文献２)。
しかしながら、２段階目の反応である３−デオキシアキレオールＡからアンブレインへ変換させる反応は副生成物が生じたり、スケールアップが困難等の課題があった。更に、特許文献２の方法は多段階反応であり、また収率についても改善の余地があった。
従って、本発明の目的は、簡便に且つ効率的にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、簡便にアンブレインを得ることができるアンブレインの製造方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、わずかな特定の変異を有する変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素がスクアレンからアンブレインを生成する活性を有することを見出した。本発明者らは、前記の変異に加えて、更なる変異を有する変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素がスクアレンからアンブレインを更に効率的に生成する活性を有することを見出した。更に、特定の変異を有する変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを効率よく生成する活性を有することを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（１）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、（２）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、又はＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸に置換している、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［２］ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さない、［１］に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［３］前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸の置換しているポリペプチド、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである、［１］又は［２］に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［４］前記ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸から、システイン又はグリシンに置換しており、前記（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシンからアラニン若しくはグリシンに置換しているか、又は前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシンからアラニン若しくはフェニルアラニンに置換している、［１］〜［３］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［５］ＤＸＤＤモチーフを有し、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシン、グリシン、及びプロリン以外のアミノ酸である、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示す、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［６］ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｃ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有さない、［５］に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［７］前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸の置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである、［５］又は［６］に記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［８］前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がアラニン若しくはフェニルアラニンである、［５］〜［７］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチド、
［１０］［９］に記載のポリヌクレオチドを有する微生物、
［１１］［９］に記載のポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクター、
［１２］［１１］に記載のベクターを有する形質転換体、
［１３］［１］〜［４］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法、
［１４］［５］〜［８］のいずれかに記載の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とする、アンブレインの製造方法、及び
［１５］［１０］に記載の微生物、又は［１２］に記載の形質転換体を培養することを特徴とするアンブレインの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の１つの態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素によれば、変異型スクアレン−ホペン環化酵素を併用しなくとも、スクアレンを基質としてアンブレインを１ステップで合成することができる。また、微生物発酵により培養液に含まれる炭素源から効率的にアンブレインを合成することができる。
本発明に用いる変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成することができる。また、本発明に用いる変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、２環性トリテルペン（８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエン）からアンブレインを生成することができる。
本発明に用いる変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換したのみのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素と比較して、効率的に前記効果を示すことができる。
また、本発明の別の態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素によれば、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを効率的に生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】変異型スクアレン−ホペン環化酵素及びテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を使用する、スクアレンを基質とした従来のアンブレイン合成経路（Ａ）並びに本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を使用する、３−デオキシアキレオールＡを基質としたアンブレイン合成経路（Ｂ）を示した図である。
【図２】本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いたスクアレンからアンブレインを生成する２つの経路を示した図である。
【図３】Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体（実施例１）、Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ変異体（実施例２）、Ｄ３７３Ｃ変異体（比較例１）、Ｙ１６７Ａ変異体（比較例２）、及びＬ５９６Ａ（比較例３）を用いて、スクアレンを基質としてアンブレインの生成効率を調べたグラフである。
【図４】Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体（実施例１）、Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ変異体（実施例２）、Ｄ３７３Ｃ変異体（比較例１）を用いて、スクアレンを基質として酵素反応させた際のアンブレイン及びその他反応生成物（副生成物）の比率を調べたグラフである。
【図５】Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体（実施例１）を用いて、スクアレンを基質とし、基質濃度を変化させて、アンブレインの生産性を検討したグラフである。
【図６】Ｌ５９６Ａ変異体（実施例５）、Ｌ５９６Ｆ変異体（実施例６）、野生型（比較例５）、Ｌ５９６Ｖ変異体（実施例７）、Ｌ５９６Ｐ変異体（比較例６）を用いて、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレインの生成効率を調べたグラフである。
【図７】野生型（比較例５）、Ｌ５９６Ａ変異体（実施例５）を用いて、３−デオキシアキレオールＡを基質として酵素反応させた際のアンブレイン及びその他反応生成物（副生成物）の比率を調べたグラフである。
【図８】野生型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換し、そして１６７番目のチロシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、及び３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換し、そして５９６番目のロイシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示した図である。
【図９】野生型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、５９６番目のロイシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、５９６番目のロイシンがフェニルアラニンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、及び５９６番目のロイシンがバリンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示した図である。
【図１０】バチルス・メガテリウム、バチルス・サブチリス、及びバチルス・リケニフォルミスのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列、並びにアリシクロバチルス・アシドカルダリウスのスクアレン−ホペン環化酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素）
野生型のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素（以下、ＴＣと称することがある）は、片末端に単環を有する３−デオキシアキレオールＡを基質として利用し、アンブレインを生成することができる。すなわち、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、３−デオキシアキレオールＡを基質として利用すると、３−デオキシアキレオールＡの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物を生成することができる。
また、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、スクアレンを基質とし、２環性の８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンを生成することができる（非特許文献５）。更に、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、２環性の８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンの環状化されていない端を選択的に環化させて、両末端環化化合物のオノセランオキサイドと１４β−ヒドロキシオノセラ−８（２６）−エンを生成することができる（非特許文献６）。
【００１０】
すなわち、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＥＣ４．２．１．１２９に分類され、水とテトラプレニル−β−クルクメンからバチテルペノールＡを生成する反応、又は、スクアレンから８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンを生成する反応を触媒し得る酵素である。
テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、例えばバチルス属、ブレビバチルス属、パエニバチルス属、又はジオバチルス属などの細菌が有している。バチルス属の細菌としては、枯草菌（バチルス・サブチルス）、バチルス・メガテリウム、又はバチルス・リケニフォルミスを挙げることができる。テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、及びＣ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフを有している。スクアレン−ホペン環化酵素も、前記のモチーフを有しているが、更にＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有している。一方、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記ＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有していない。また、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、好ましくはＤＸＤＤモチーフから、Ｎ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフを有しているが、スクアレン−ホペン環化酵素は（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフを有していない。更に、スクアレン−ホペン環化酵素は、ＱＸＸＸＧＸＷモチーフのＣ末側にＧＸＧＦＰ配列を有し、その４番目のアミノ酸がフェニルアラニン（Ｆ）であるという特徴を有する。テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素もＧＸＧＦＰモチーフに似たＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有するが、４番目のアミノ酸がフェニルアラニンではなく、基本的には、ロイシン（Ｌ）である。
【００１１】
［１］変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素
（第１態様）
本発明の第１の態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、（１）ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、（２）（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、又はＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸に置換している、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素であって、（ａ）前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示す。
ここで、各モチーフや配列を定義しているアルファベットはアミノ酸の一文字略号を表しており、「Ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。すなわち、ＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの場合、Ｎ末端側からＣ末端側に向かってグルタミン（Ｑ）、任意のアミノ酸（Ｘ）が３つ、グリシン（Ｇ）、任意のアミノ酸（Ｘ）、さらにトリプトファン（Ｗ）又はフェニルアラニン（Ｆ）のいずれか、が配列することを示す。また、「ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフを有する」とは、ＤＸＤＤモチーフとＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフの間に１００アミノ酸残基以上存在することを意味するものとし、その他モチーフの特定についても同様である。
また、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸とは、Ｎ末端側から数えて４番目であることを示し、他の配列についても同様である。以下、特に記載のない限り同様である。
なお、アミノ酸配列の同一性は、比較する配列のアミノ酸残基が一致するように適宜ギャップを挿入して整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。同一性は、周知のプログラム（例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等）を用いて行うことができる。
【００１２】
本発明の第１態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の好ましい態様としては、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸の置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７３番目のアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換しており、そしてＮ末端側から１６７番目のチロシンがチロシン以外のアミノ酸に置換しているか、若しくは５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
である。
【００１３】
また、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の最も好ましい態様としては、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、配列番号５又は６で表されるアミノ酸配列からなるBacillus megaterium由来のポリペプチド、を挙げることができる。この変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がシステインに置換しており、（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がアラニンに置換しているか、又はＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がアラニンに置換している。
【００１４】
（ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基の置換）
本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素（以下、変異型ＴＣと称することがある）においては、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換している。アスパラギン酸以外のアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されるものではなく、アラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシンを挙げることができるが、好ましくはシステイン又はグリシンであり、より好ましくはシステインである。
ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基がアスパラギン酸以外のアミノ酸（特には、システイン又はグリシン）に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンからアンブレインを生成することができる。
ＤＸＤＤモチーフは、例えば配列番号１で表されるバチルス・メガテリウムのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から３７０〜３７３番目に存在する。また、配列番号２で表されるバチルス・サブチルスのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から３７５〜３７８番目に位置する。ＤＸＤＤモチーフのアスパラギン酸は極めて保存性が高く、通常Ｎ末端側から４番目のアミノ酸残基はアスパラギン酸である（図１０）。
【００１５】
（（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基の置換）
本発明の変異型ＴＣにおいては、（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸に置換している。チロシン以外のアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されるものではなく、アラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はアスパラギン酸を挙げることができるが、好ましくは疎水性アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、及びトリプトファン）、セリン、トレオニン又はシステインを挙げることができる。特に好ましくは、アラニン又はグリシンであり、より好ましくはアラニンである。
（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基がチロシン以外のアミノ酸（特には、アラニン又はグリシン）に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能、そして８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンからアンブレインを生成する機能が向上している。
（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフは、例えば配列番号１で表されるバチルス・メガテリウムのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から１６８〜１７４番目に存在する。また、配列番号２で表されるバチルス・サブチルスのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から１７０〜１７６番目に位置する。（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸残基は極めて保存性が高く、野生型では基本的にはチロシンである（図１０）。本発明は、この保存性の高い特定のアミノ酸を変異させることで、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を向上できることを見出したものである。
【００１６】
（ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸残基の置換）
本発明の変異型ＴＣにおいては、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸に置換している。ロイシン以外のアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されるものではなく、アラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、又はアスパラギン酸を挙げることができるが、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファンを挙げることができる。特に好ましくは、アラニン又はフェニルアラニンであり、より好ましくはアラニンである。
ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸残基がロイシン以外のアミノ酸（特には、アラニン又はフェニルアラニン）に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成する機能、そして８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンからアンブレインを生成する機能が向上している。
ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフは、例えば配列番号１で表されるバチルス・メガテリウムのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から５９３〜５９７番目に存在する。また、配列番号２で表されるバチルス・サブチルスのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から５９４〜５９８番目に位置する。ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸残基は、機能を確認できている野生型では、発明者らの知る限りロイシンである（図１０）。本発明は、このロイシンを変異させることで、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、スクアレンを基質としてアンブレイン生成活性を向上できることを見出したものである。
【００１７】
図８にバチルス・メガテリウムの野生型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換し、そして１６７番目のチロシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、及び３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換し、そして５９６番目のロイシンがアラニンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示す。
【００１８】
本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の由来は、特に限定されるものではなく、全てのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いることができる。すなわち、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換しており、かつＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフにおける４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸（好ましくはアラニン又はフェニルアラニン）に置換しているか、若しくは（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸（好ましくはアラニン又はグリシン）へ置換している変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。より具体的には、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置にＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有しており、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸がアスパラギン酸以外のアミノ酸（好ましくはシステイン又はグリシン）に置換しており、かつＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフにおける４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸（好ましくはアラニン又はフェニルアラニン）に置換しているか、若しくは（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸（好ましくはアラニン又はグリシン）へ置換している変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。また、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有していないものが好ましい。例えば、バチルス・サブチルスとバチルス・メガテリウムとのポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は５０％程度であるが、本発明の特徴を有することにより、いずれの酵素もスクアレンから３−デオキシアキレオールＡを生成することができ、そして８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンからアンブレインを生成することができる。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列はバチルス・サブチルスのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列である。
【００１９】
（第２態様）
本発明の第２の態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフを有し、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がロイシン以外のアミノ酸に置換している、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素であって、
（ａ）前記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有し、（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との同一性が４０％以上であり、そして（ｃ）３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示す。
なお、各モチーフ又は配列のアルファベット等の定義は、第１態様と同様である。
【００２０】
本発明の第２態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の好ましい態様としては、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているポリペプチド、
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸に置換しているアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、又は
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列におけるＮ末端側から５９６番目のロイシンがロイシン以外のアミノ酸の置換しているアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチド、
である。
【００２１】
また、本発明の第２態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の最も好ましい態様としては、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を構成するポリペプチドが、配列番号９、１０、又は１３で表されるアミノ酸配列からなるBacillus megaterium由来のポリペプチド、を挙げることができる。この変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸がアラニン、フェニルアラニン、又はバリンに置換している。
【００２２】
（ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸残基の置換）
本発明の変異型ＴＣにおいては、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸がロイシン、グリシン、及びプロリン以外のアミノ酸である。第４番目のアミノ酸のアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、限定されるものではなく、アラニン、システイン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はアスパラギン酸を挙げることができるが、好ましくはアラニン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、を挙げることができる。特に好ましくは、アラニン、フェニルアラニンであり、より好ましくはアラニンである。
ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸残基がロイシン以外のアミノ酸（特には、アラニン又はフェニルアラニン）に置換することによって、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを効率的に生成する機能が向上している。
ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフは、例えば配列番号１で表されるバチルス・メガテリウムのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から５９３〜５９７番目に存在する。また、配列番号２で表されるバチルス・サブチルスのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列のＮ末端側から５９４〜５９８番目に位置する。ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの第４番目のアミノ酸残基は、機能を確認できている野生型では、発明者らの知る限りロイシンである。本発明は、このロイシンを変異させ、ロイシン、グリシン、及びプロリン以外のアミノ酸とすることで、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを効率的に生成できることを見出したものである。
【００２３】
図７にバチルス・メガテリウムの野生型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、及び５９６番目のロイシンがアラニン又はフェニルアラニンに置換した変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列を示す。
【００２４】
本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の由来は、特に限定されるものではなく、全てのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いることができる。すなわち、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフにおける４番目のアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸（好ましくはアラニン又はフェニルアラニン）に置換している変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。より具体的には、ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側に１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフ、Ｎ末端側に１０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＸ（Ｇ／Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に２０〜５０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ／Ｙ）モチーフ、Ｃ末端側に５０〜１２０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフ、Ｃ末端側に１２０〜１７０アミノ酸残基離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｆ／Ｗ）モチーフ、及びＣ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に前記ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフを有しており、ＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフにおける４番目のアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸（好ましくはアラニン又はフェニルアラニン）に置換している変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、本発明の効果を示すことができる。また、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、ＤＸＤＤモチーフのＣ末端側に１７０アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸＷモチーフを有していないものが好ましい。例えば、バチルス・サブチルスとバチルス・メガテリウムとのポリペプチドのアミノ酸配列の同一性は５０％程度であるが、本発明の特徴を有することにより、いずれの酵素も３−デオキシアキレオールＡからアンブレインの生成効率を向上させることができる。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、バチルス・メガテリウムのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列はバチルス・サブチルスのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のアミノ酸配列である。更に、本発明の第２態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、好ましくはＤＸＤＤモチーフから、Ｎ末端側に１８０〜２５０アミノ酸残基離れた位置に（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフを有する。
【００２５】
図１０にバチルス・メガテリウム（配列番号１）、バチルス・サブチリス（配列番号２）、及びバチルス・リケニフォルミス（配列番号３）のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素、並びにアリシクロバチルス・アシドカリダリウスのスクアレン−ホペン環化酵素（配列番号４）のアラインメントを示した。本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の第１態様及び第２態様においては、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にＱＸＸＸＧＸ（Ｗ／Ｆ）モチーフを有するが、好ましくは、前記ＤＸＤＤモチーフを基準として、Ｎ末端側１００アミノ酸残基以上離れた位置にモチーフＡを２個有する。
【００２６】
従来、図１（Ａ）に記載のように、スクアレンからアンブレインを生成する場合、スクアレンを変異型スクアレン−ホペン環化酵素（以下、変異型ＳＨＣと称することがある）によって、３−デオキシアキレオールＡに変換し、そして３−デオキシアキレオールＡを野生型のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素によって、アンブレインに変換することによって製造されていた（特許文献２）。図１（Ｂ）に記載のように、本発明の第２態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いることにより、３−デオキシアキレオールＡをアンブレインに変換する効率が顕著に向上した。
また、本発明の第１態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いて、スクアレンからアンブレインを生成する場合、図２に示すように単環性の３−デオキシアキレオールＡを中間体とする経路（以下、単環性経路と称することがある）と、８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンを中間体とする経路（以下、２環性経路と称することがある）によって製造される。
【００２７】
（単環性経路）
前記単環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから単環性の３−デオキシアキレオールＡが生成される。そして変異型ＴＣによって、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、３−デオキシアキレオールＡをアンブレインに変換することができたが、スクアレンを単環性の３−デオキシアキレオールＡに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、スクアレンを単環性の３−デオキシアキレオールＡに変換することが可能であり、従って図２に示すように、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡへの変換（図２の反応（ａ））及び３−デオキシアキレオールＡからアンブレインへの変換（図２の反応（ｂ））の２つの反応を１つの酵素によって、効率的に行うことが可能になった。
【００２８】
（２環性経路）
一方、２環性経路においては、変異型ＴＣによって、スクアレンから８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンが生成される。そして変異型ＴＣによって、８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンからアンブレインが生成される。従来の野生型ＴＣは、スクアレンを８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンに変換することができたが、８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンをアンブレインに変換することはできなかった。本発明の変異型ＴＣは、８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンをアンブレインに変換することが可能であり、従って図２に示すようにスクアレンから８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンへの変換（図２の反応（ｃ））及び８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンからアンブレインへの変換（図２の反応（ｄ））の２つの反応を１つの酵素によって、効率的に行うことが可能になった。
【００２９】
本発明の変異型ＴＣは、スクアレンからアンブレインを製造する工程において、スクアレンから３−デオキシアキレオールＡへの変換（反応（ａ））、３−デオキシアキレオールＡからアンブレインへの変換（反応（ｂ））、スクアレンから８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンへの変換（反応（ｃ））、及び８α−ヒドロキシポリポダ−１３，１７，２１−トリエンからアンブレインへの変換（反応（ｄ））の４つの反応を１つの酵素で行うことができる。前記４つの反応を可能とする重要な変異は、ＤＸＤＤモチーフの第４番目のアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸に置換する変異（例えば、Ｄ３７３Ｃ）である。本発明の第１態様の変異型ＴＣは、前記の変異に加え、（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸のチロシン以外のアミノ酸への置換（例えば、Ｙ１６７Ａ）、又はＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸のロイシン以外のアミノ酸への置換（例えば、Ｌ５９６Ａ）を有することにより、更に効率的に単環性経路及び２環性経路の反応を１つの酵素で実施できる。
【００３０】
（１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列）
本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記第１態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドは、スクアレンを基質として、そして第２態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドは、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、それぞれスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、例えば１〜３３０個、１〜３００個、１〜２５０個、１〜２００個、１〜１５０個、１〜１００個、又は１〜５０個であることができ、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。本発明に用いることのできる変異ペプチドの改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は数個（好ましくは、１、２、３又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
【００３１】
（アミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列）
本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸配列との同一性が４０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。そして、前記第１態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドは、スクアレンを基質として、そして第２態様の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドは、３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示すポリペプチドである。すなわち、それぞれスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を示さないポリペプチドは、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドに含まれない。より好ましくは該同一性が４５％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは５０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは６０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは７０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは８０％以上であるアミノ酸配列、より好ましくは９０％以上であるアミノ酸配列、最も好ましくは該同一性が９５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、且つスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡからアンブレインを生成する活性を有するポリペプチドからなる変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素である。
【００３２】
前記配列番号１のアミノ酸配列において「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」又は「同一性が４０％以上であるアミノ酸配列」は、配列番号１のアミノ酸配列が置換されたものであるが、このアミノ酸配列の置換は、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の機能を維持する保存的置換である。換言すると「保存的置換」とは、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の優れた効果が失われない置換を意味する。すなわち、前記挿入、置換、又は欠失、若しくは付加された場合であっても、スクアレン又は３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレイン生成活性を向上できる置換である。具体的には、アミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことでできる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。非極性（疎水性）アミノ酸としては、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００３３】
本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素におけるＤＸＤＤモチーフの第４番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸をアスパラギン酸以外のアミノ酸へ変異（置換）させること、（Ａ／Ｓ／Ｇ）ＲＸ（Ｈ／Ｎ）ＸＸＰモチーフのＮ末に隣接するアミノ酸をチロシン以外のアミノ酸に置換させること、又はＧＸＧＸ（Ｇ／Ａ／Ｐ）モチーフの４番目のアミノ酸をロイシン以外のアミノ酸に置換させることは、スクアレン又は３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレインを生成する活性を付与するための、積極的な置換（変異）であるが、前記保存的置換はスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡを基質としてアンブレインを生成する活性を維持するための置換であり、当業者であれば容易に実施することのできるものである。
【００３４】
本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、公知の遺伝子組換え技術などを用いて取得することができる。例えば、バチルス・メガテリウムの染色体ＤＮＡを取得し、適当なプライマーを用いて、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を、ＰＣＲなどによって増幅する。得られた遺伝子を、適当なベクターに組み込み、遺伝子配列を決定する。そして上記の変異を導入することによって、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードする遺伝子を取得することができる。その遺伝子を、酵母等の宿主に組み込み、発現させることによって、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を得ることが可能である。
またテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、バチルス・メガテリウムの他に、バチルス属等の細菌に存在することが知られており、バチルス・サブチリス由来酵素（アクセッション番号：ＡＢ６１８２０６）、バチルス・リケニフォルミス由来酵素（アクセッション番号：ＡＡＵ４１１３４）等を取得することも可能である。
【００３５】
また、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードする遺伝子は、公知の合成遺伝子の合成方法、例えば、Ｋｈｏｒａｎａらの方法（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８）、Ｎａｒａｎｇらの方法（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）、又はＲｏｓｓｉらの方法（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）によって合成することも可能である。そして、合成された遺伝子を発現させることにより、本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を得ることができる。
【００３６】
［２］ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドである限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、配列番号５で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号７）、配列番号６で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、配列番号９で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）、配列番号１０で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）、又は配列番号１３で表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）を挙げることができる。
更には、配列番号７、８、１１、１２、又は１４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、しかも、スクアレンからアンブレインを生成する活性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
また、本発明のポリヌクレオチドは、それを導入する微生物又は宿主細胞に合わせて、最適なコドンの塩基配列に変更することが好ましい。
【００３７】
［３］微生物
本発明の微生物は、本発明のポリヌクレオチドを有する微生物である。すなわち、本発明のポリヌクレオチドを細胞内に含む限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、放線菌、パン酵母、麹菌、又はアカパンカビを挙げることができる。
【００３８】
［４］ベクター
本発明のベクターは、上記変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを持つＤＮＡを含むベクターである。すなわち、本発明のベクターは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、本発明による前記ポリヌクレオチドを挿入することにより得られるベクターを挙げることができる。
発現ベクターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、外来タンパク質の発現効率の高いものが好ましい。前記ポリヌクレオチドを発現させるための発現ベクターは、微生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、前記ＤＮＡ及び転写終結配列より構成された組換えベクターであることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００３９】
より具体的には、発現ベクターとして、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）、ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＳＴＶ２９（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８号公報）、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＣｏｌｄＩ、ｐＣｏｌｄII、ｐＣｏｌｄIII、ｐＣｏｌｄIV、ｐＮＩＤＮＡ、ｐＮＩ−ＨｉｓＤＮＡ（タカラバイオ社製）等を例示することができる。
【００４０】
プロモーターとしては、宿主である大腸菌、パン酵母等の細胞中で発現することができるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌｅｔＩプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。酵素法による生産（スクアレンを基質とした酵素反応による生体外での合成）に用いる酵素を生産するには、強いプロモーターとして機能し、目的タンパク質の大量生産が可能なプロモーターが好ましく、誘導型プロモーターがより好ましい。誘導型プロモーターとしては、例えば低温で発現誘導されるコールドショック遺伝子cspAのプロモーター、誘導剤であるＩＰＴＧの添加により誘導されるＴ７プロモーター等をあげることができる。また発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）においては、上記プロモーターの中でも組織を問わず常時目的遺伝子を発現させるプロモーター、すなわち構成的プロモーターであることがより好ましい。構成的プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（ＡＤＨ１）、翻訳伸長因子ＴＦ−１α遺伝子（ＴＥＦ１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子（ＴＰＩ１）、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＴＤＨ３）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（ＰＹＫ１）のプロモーターが挙げられる。
【００４１】
［５］形質転換体
本発明の形質転換体も、本発明による前記ポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、本発明による前記ポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色体に組み込まれた形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドを含むベクターの形で含有する形質転換体であることもできる。また、本発明によるポリペプチドを発現している形質転換体であることもできるし、あるいは、本発明によるポリペプチドを発現していない形質転換体であることもできる。本発明の形質転換体は、例えば、本発明による前記ベクターにより、あるいは、本発明による前記ポリヌクレオチドそれ自体により、所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
【００４２】
宿主細胞は、特に限定されないが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、放線菌、酵母、麹菌、アカパンカビ等取り扱いが容易な菌株が好ましいが、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などを用いることも可能である。しかしながら、酵素法による生産（スクアレンを基質とした酵素反応による生体外での合成）に用いる酵素を生産するには、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属菌、麹菌が好ましく、大腸菌が最も好ましい。また発酵生産（グルコースなどを炭素源とした宿主による生体内での生合成）で最も好ましくは酵母である。最も好ましい酵母株としては、清酒酵母が挙げられる。特に好ましくは、清酒酵母協会７号又は７０１号が挙げられる。協会７０１号酵母は、協会７号から育種された泡なし酵母で高泡を形成しない特長があるが、他の性質は同じである。
【００４３】
［６］アンブレインの製造方法
本発明のアンブレインの製造方法の第１の態様は、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をスクアレンに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とするものである。本発明のアンブレインの製造方法の第２の態様は、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を３−デオキシアキレオールＡに反応させて、アンブレインを得ることを特徴とするものである。
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、酵素発現用ベクターを細菌等に導入することによって得られた形質転換体を培養することにより生成できる。形質転換体の培養に用いられる培地は、通常用いられる培地でよく、宿主の種類に応じて適宜選択される。例えば、大腸菌を培養する場合には、ＬＢ培地等が用いられる。培地には、選択マーカーの種類に応じた抗生物質が添加されていてもよい。
【００４４】
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、前記酵素を発現可能な形質転換体を培養することにより得られた培養液から酵素を抽出し精製したものであってもよい。また、あらかじめ本発明の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のポリペプチドのＮ末側又はＣ末側にトリガーファクター（TF）又はＨｉｓタグなどを融合させた融合タンパク質として発現させ、精製などを容易にしてもよい。また、培養液中の形質転換体から抽出された酵素を含む抽出液をそのまま用いてもよい。形質転換体からの酵素の抽出方法は、公知の方法を適用してよい。酵素の抽出工程は、例えば、形質転換体を抽出溶媒中で破砕し、細胞内容物を形質転換体の破砕片と分離することを含んでよい。得られた細胞内容物には、目的とする変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素が含まれている。
【００４５】
形質転換体の破砕方法としては、形質転換体を破砕して、酵素液を回収可能な公知の方法を適用してよく、例えば、超音波破砕、ガラスビーズ破砕等が挙げられる。破砕の条件は、特に制限はなく、１０℃以下及び１５分間などの、酵素が失活しない条件であればよい。
細胞内容物と微生物体の破砕片との分離方法としては、沈降分離、遠心分離、濾過分離及びこれらの２つ以上の分離方法の組み合わせ等が挙げられる。これらの方法を用いた分離条件は当業者には公知であり、遠心分離の場合には例えば、８，０００×ｇ〜１５，０００×ｇ及び１０分間〜２０分間である。
【００４６】
抽出溶媒としては、酵素抽出の溶媒として通常用いられるものでよく、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が挙げられる。抽出溶媒のｐＨは、酵素の安定性の点で、３〜１０が好ましく、６〜８がより好ましい。
【００４７】
抽出溶媒には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、両性イオン界面活性等が挙げられる。非イオン界面活性剤としては、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノオレイン酸エステル（Tween 80）等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ｎ−オクチルβ−Ｄ−グルコシド等のアルキルグルコシド、ショ糖ステアリン酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリンステアリン酸エステル等のポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。両性イオン界面活性剤としては、アルキルベタインであるＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ドデシルグリシンベタイン等が挙げられる。これら以外にも、トライトンＸ−１００（Triton X-100）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Brij-58）、ノニルフェノールエトキシレート（Tergitol NP-40）等の当技術分野で一般的に用いられる界面活性剤が利用可能である。
抽出溶媒中の界面活性剤の濃度は、酵素の安定性の観点から、０．００１質量％〜１０質量％が好ましく、０．１０質量％〜３．０質量％がより好ましく、０．１０質量％〜１．０質量％が更に好ましい。
【００４８】
抽出溶媒には、酵素活性の観点から、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール等の還元剤が含まれていることが好ましい。還元剤としては、ジチオスレイトールが好ましい。抽出溶媒中のジチオスレイトールの濃度は、０．１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、１ｍＭ〜１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にジチオスレイトールが存在することによって、酵素におけるジスルフィド結合等の構造が保持されやすくなり、酵素活性がより上昇する傾向がある。
【００４９】
抽出溶媒には、酵素活性の観点から、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤が含まれていることが好ましい。抽出溶媒中のＥＤＴＡの濃度は、０．０１ｍＭ〜１Ｍが好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭがより好ましい。抽出溶媒中にＥＤＴＡが存在することによって、酵素活性を低下させ得る金属イオンがキレートされるため、酵素活性がより上昇する傾向がある。
【００５０】
抽出溶媒には、上記の成分以外に、酵素抽出溶媒に添加可能な公知の成分が含まれていてよい。
【００５１】
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素とスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡとの反応の条件は、酵素反応が進行可能な条件であれば特に制限はない。例えば、反応温度及び反応時間は、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の活性等に基づいて適宜選択することができる。反応温度及び反応時間は、反応効率の観点から、例えば４℃〜１００℃及び１時間〜３０日であり、３０℃〜６０℃及び１６時間〜２０日が好ましい。ｐＨ条件は、反応効率の観点から、例えば３〜１０であり、６〜８が好ましい。
【００５２】
反応溶媒は、酵素反応を阻害しないものであれば特に制限はなく、通常用いられる緩衝液等を用いることができる。また、例えば、酵素の抽出工程で使用する抽出溶媒と同一のものを用いることができる。また、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を含む抽出液（例えば、無細胞抽出液）を酵素液としてそのまま反応に用いてもよい。
【００５３】
アンブレイン生成反応における変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素と、その基質であるスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡとの濃度比は、反応効率の観点から、酵素に対する基質のモル濃度比（基質／酵素）として、１〜１００００が好ましく、１０〜５０００がより好ましく、１００〜３０００がより好ましく、１０００〜２０００が更に好ましい。
酵素反応に用いるスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡの濃度は、反応効率の観点から、反応溶媒の全質量に対して０．０００００１質量％〜１０質量％が好ましく、０．００００１質量％〜１質量％がより好ましい。
【００５４】
変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素とスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡとが反応する反応工程は、複数回繰り返してもよい。これにより、アンブレインの収率を高めることができる。反応工程を複数回繰り返す場合には、基質となるスクアレン又は３−デオキシアキレオールＡを反応系に再投入する工程、公知の方法により酵素を失活させた後、反応液中の反応生成物を回収及び精製する工程等を含むものであってもよい。スクアレンの再投入を行う場合には、反応液中の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の濃度、反応液中に残存する基質量等によって、投入する時期、投入量を適宜設定することができる。
【００５５】
本発明のアンブレインの製造方法の別の実施態様においては、本発明の微生物又は形質転換体を培養することを特徴とする。
前記微生物又は発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、アンブレインを製造することができる。例えば、酵母について記載すると、酵母は通常用いられるＹＰＤ培地などで培養すればよい。相同組換えにより遺伝子導入された酵母、又は発現ベクターを有する酵母を前培養し、更にＹＰＤ培地などに植菌し、そして２４〜２４０時間、好ましくは７２〜１２０時間程度培養する。培地中に分泌されたアンブレインは、そのまま、又は公知の方法により精製して用いることができる。精製方法としては、具体的には、溶媒抽出、再結晶、蒸留、カラムクロマトグラフィー、及びＨＰＬＣ等が挙げられる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。本文中又は図表において、バチルス・メガテリウムを「Ｂｍｅ」と略す場合があり、バチルス・メガテリウム由来のテトラプレニル-β-クルクメン環化酵素を「ＢｍｅＴＣ」と略す場合がある。【００５７】
《実施例１》
本実施例では、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のクローニング及び発現ベクター構築を行った。
バチルス・メガテリウム染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲにより野生型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素をコードするポリヌクレオチドを取得し、当該野生型酵素のアミノ酸配列を決定した。（以下、特に記載のない限り、テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素はバチルス・メガテリウム由来の配列であり、単に「野生型」ということもある。）
変異型テトラプレニル-β-クルクメン環化酵素遺伝子は、当該野生型酵素のアミノ酸配列をもとに、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換されるように、また１６７番目のチロシンがアラニンに置換されるように設計し、宿主である大腸菌にコドンを最適化して合成した。合成した遺伝子は、ベクターｐＣｏｌｄＴＦ（タカラバイオ社）のクローニングサイト（制限酵素ＥｃｏＲＶサイト）に挿入し、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体（配列番号５）の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターを得た。
続いて、得られた変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。【００５８】
《実施例２》
本実施例では、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換され、そして５９６番目のロイシンがアラニンに置換された変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子の構築を行った。
変異型テトラプレニル-β-クルクメン環化酵素遺伝子は、当該野生型酵素のアミノ酸配列をもとに、３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換され、そして５９６番目のロイシンがアラニンに置換されるように設計し、宿主である大腸菌にコドンを最適化して合成した。合成した遺伝子は、ベクターｐＣｏｌｄＴＦ（タカラバイオ社）のクローニングサイト（制限酵素ＥｃｏＲＶサイト）に挿入し、Ｄ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ変異体（配列番号６）の発現ベクターを得た。
続いて、得られた変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。【００５９】
《比較例１〜３》
本比較例では、３７３番目、１６７番目及び５９６番目のうちいずれか一方のみ変異させた、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の発現ベクター構築を行った。
３７３番目のアスパラギン酸がシステインに置換されるようにクイックチェンジ法により部位特異的変異を導入したこと、１６７番目のチロシンがアラニンに置換されるようにクイックチェンジ法により部位特異的変異を導入したこと、又は５９６番目のロイシンがアラニンに置換されるようにクイックチェンジ法により部位特異的変異を導入したことを除いては、実施例１の操作を繰り返し、Ｄ３７３Ｃ変異体（比較例１）、Ｙ１６７Ａ変異体（比較例２）又はＬ５９６Ａ変異体（比較例３）の発現ベクター及び形質転換体を得た。
なお、コドンは宿主である大腸菌に最適化したものを利用した。【００６０】
《実施例３及び比較例４》
本実施例及び比較例では、スクアレンを基質として、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の酵素活性を検討した。
実施例１、実施例２、及び比較例１〜３で作製した形質転換体をそれぞれアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ培地（１Ｌ）に植菌し、３７℃で３時間振とう培養した。培養後、０．１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、１５℃で２４時間振とうを行い、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の発現を誘導した。
その後、遠心（６，０００×ｇ、１０分間）によって集菌した菌体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、５ｇの菌体に対して１５ｍＬの緩衝液Ａ［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０、０．１ｗ／ｖ％のアスコルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有。］で懸濁し、ＵＰ２００５  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany）を用いて超音波破砕（４℃、２０分間）した。破砕処理後の試料を遠心（１２，３００×ｇ、２０分間）し、遠心後に得られた上清を無細胞抽出液Ａ〜Ｅとした。（以下、実施例１又は２で作成した形質転換体を用いた無細胞抽出液をそれぞれ無細胞抽出液Ａ，Ｂとし、比較例１〜３で作成した形質転換体を用いた無細胞抽出液をそれぞれ無細胞抽出液Ｃ〜Ｅとする。）
スクアレン（１００μｇ）をＴｗｅｅｎ８０（５ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ａ（１ｍＬ）に添加してスクアレン液を調製した。このスクアレン液の全量を無細胞抽出液Ａ（４ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で６４時間インキュベートした。反応液において、スクアレン（基質）と変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約２００であった。
インキュベート後に、１５％水酸化カリウム・メタノール（６ｍＬ）を反応液へ添加し、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ−ヘキサン（５ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。
得られた抽出物のアンブレイン産生率を図３に示す。Ｄ３７３変異体と比較して、実施例１で得られたＹ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体、及び実施例２で得られたＤ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ変異体は、アンブレインの産生量が向上した。一方、比較例２及び３で得られたＹ１６７Ａ変異体及びＬ５９６Ａ変異体は、アンブレインを産生することができなかった。
また、アンブレインおよび副生物の生成比率を図４に示した。スクアレン（基質）からアンブレインへの反応選択性が向上しており、Ｙ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体、及びＤ３７３Ｃ／Ｌ５９６Ａ変異体により効率的にアンブレインを生産することができる。なお、アンブレインの同定及び産生率の算出は、ＧＣ／ＭＳ及びＮＭＲにより行った。【００６１】
《実施例４》
本実施例では、実施例１で得られたＹ１６７Ａ／Ｄ３７３Ｃ変異体を用い、スクアレンを基質として、基質濃度を変化させて変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素によるアンブレインの生産性を検討した。基質濃度を変化させた他は、実施例３と同様な方法を繰り返した。図５に結果を示す。１０００μｇのスクアレンから４２７マイクログラムのアンブレイン生産が可能であり、この時の反応効率は４３％であった。【００６２】
《実施例５》
本実施例では、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のクローニング及び発現ベクター構築を行った。変異型テトラプレニル-β-クルクメン環化酵素遺伝子は、当該野生型酵素のアミノ酸配列をもとに、５９６番目のロイシンがアラニンに置換されるように設計し、宿主である大腸菌にコドンを最適化して合成した。合成した遺伝子は、ベクターｐＣｏｌｄＴＦ（タカラバイオ社）のクローニングサイト（制限酵素ＥｃｏＲＶサイト）に挿入し、Ｌ５９６Ａ変異体（配列番号９）の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターを得た。
続いて、得られた変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。（Ｌ５９６Ａ変異酵素を生産する形質転換体）【００６３】
《実施例６》
本実施例では、５９６番目のロイシンがフェニルアラニンに置換された変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子の構築を行った。５９６番目のロイシンをフェニルアラニンに置換する部位特異的変異を導入したことを除いては、実施例５の操作を繰り返し、Ｌ５９６Ｆ変異体（配列番号１０）の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子（宿主である大腸菌にコドンを最適化）を含む発現ベクターを得た。続いて、得られた変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。（Ｌ５９６Ｆ変異酵素を生産する形質転換体）【００６４】
《比較例５》
本比較例では野生型のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素のクローニング及び発現ベクター構築を行った。
５９６番目のロイシンをアラニンに置換する部位特異的変異を導入しなかったことを除いては、実施例５の操作を繰り返し、５９６番目がロイシンのテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子（宿主である大腸菌にコドンを最適化）を含む発現ベクターを得た。続いて、得られた変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。（ＷＴ酵素を生産する形質転換体）【００６５】
《実施例７》
本実施例では、５９６番目のロイシンがバリンに置換された変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子の構築を行った。
５９６番目のロイシンをバリンに置換する部位特異的変異を導入したことを除いては、実施例５の操作を繰り返し、Ｌ５９６Ｖ変異体の変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子（宿主である大腸菌にコドンを最適化）を含む発現ベクターを得た。続いて、得られた変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。（Ｌ５９６Ｖ変異酵素を生産する形質転換体）【００６６】
《比較例６》
本比較例では、５９６番目のロイシンがプロリンに置換された変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子の構築を行った。
５９６番目のロイシンをプロリンに置換する部位特異的変異を導入したことを除いては、実施例５の操作を繰り返し、Ｌ５９６Ｐ変異体のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子（宿主である大腸菌にコドンを最適化）を含む発現ベクターを得た。続いて、得られた変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素遺伝子を含む発現ベクターにより、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換体を作製した。（Ｌ５９６Ｐ変異酵素を生産する形質転換体）【００６７】
《実施例８及び比較例７》
本実施例及び比較例では、３−デオキシアキレオールＡを基質として、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の酵素活性を検討した。
実施例５〜７、及び比較例５〜６で作製した形質転換体をそれぞれアンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢ培地（１Ｌ）に植菌し、３７℃で３時間振とう培養した。培養後、０．１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、１５℃で２４時間振とうを行い、変異型及び野生型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素の発現を誘導した。
その後、遠心（６，０００×ｇ、１０分間）によって集菌した菌体を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、５ｇの菌体に対して１５ｍＬの緩衝液Ａ［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｖ／ｖ％のＴｗｅｅｎ８０、０．１ｗ／ｖ％のアスコルビン酸ナトリウム、２．５ｍＭのジチオスレイトール、１ｍＭのＥＤＴＡを含有。］で懸濁し、ＵＰ２００５  ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany）を用いて超音波破砕（４℃、２０分間）した。破砕処理後の試料を遠心（１２，３００×ｇ、２０分間）し、遠心後に得られた上清を無細胞抽出液Ｆ〜Ｊとした。（以下、実施例５〜７で作成した形質転換体を用いた無細胞抽出液をそれぞれ無細胞抽出液Ｆ〜Ｈとし、比較例５〜６で作成した形質転換体を用いた無細胞抽出液を無細胞抽出液Ｉ〜Ｊとする。）
３−デオキシアキレオールＡ（１００μｇ）をＴｗｅｅｎ８０（２ｍｇ）に混合して可溶化した後に緩衝液Ａ（１ｍＬ）に添加して３−デオキシアキレオールＡ液を調製した。この３−デオキシアキレオールＡ液の全量を無細胞抽出液Ｆ〜Ｊのいずれか（４ｍＬ）に加えて反応液とし、３０℃で１１２時間インキュベートした。反応液において、３−デオキシアキレオールＡ（基質）と変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素（酵素）とのモル比（基質／酵素）は、約２００であった。
インキュベート後に、１５％水酸化カリウム・メタノール（６ｍＬ）を反応液へ添加し、酵素反応を停止させた。その後、反応液へｎ−ヘキサン（５ｍＬ）を添加して、反応生成物の抽出を３回行った。
得られた抽出物のアンブレイン産生率を図６に示す。その結果、Ｌ５９６Ａ変異体、Ｌ５９６Ｆ変異体およびＬ５９６Ｖ変異体は、高い変換効率でアンブレインが得られた。特にＬ５９６Ａ変異体は、副生成物は少なく、生成物の９４％がアンブレインであった。一方、野生型のテトラプレニル−β−クルクメン環化酵素ではアンブレインの生成が少なく、さらに副生成物の割合も高いものであった。
また、アンブレインおよび副生物の生成比率を図７に示した。３−デオキシアキレオールＡ（基質）からアンブレインの反応選択性が向上しており、Ｌ５９６Ａ変異体により効率的にアンブレインを生産することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によれば、アンブレインの生産において、変異型テトラプレニル−β−クルクメン環化酵素を用いることにより、スクアレンを基質として用いて１ステップでアンブレインを効率的に製造することができる。本発明によって得られる、アンブレインは、例えば医薬品などの生産の原料として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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