(57)【要約】タンパク質及び反応性化合物とこれらが溶解している溶媒とを含有するタンパク質溶液であって、反応性化合物が第１の官能基及び第２の官能基を有する化合物であり、第１の官能基がタンパク質との反応によってタンパク質と反応性化合物とを結合させ得る基で、第２の官能基が２以上の第２の官能基の反応によって２以上の反応性化合物を互いに結合させ得る基である、タンパク質溶液を準備する工程と、タンパク質溶液を成形用原液として用いた成形によって、タンパク質を含有する成形体を得る工程と、成形体を２以上の反応性化合物を互いに結合させるための後処理に供する工程と、を備える、タンパク質成形体を製造する方法が開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質及び反応性化合物とこれらが溶解している溶媒とを含有するタンパク質溶液であって、前記反応性化合物が第１の官能基及び該第１の官能基とは異なる第２の官能基を有する化合物であり、前記第１の官能基が前記タンパク質との反応によって前記タンパク質と前記反応性化合物とを結合させ得る基で、前記第２の官能基が２以上の前記第２の官能基の反応によって２以上の前記反応性化合物を互いに結合させ得る基である、タンパク質溶液を準備する工程と、
前記タンパク質溶液を成形用原液として用いた成形によって、前記タンパク質を含有する成形体を得る工程と、
前記成形体を、２以上の前記第２の官能基の反応によって２以上の前記反応性化合物を互いに結合させるための後処理に供する工程と、
を備える、タンパク質成形体を製造する方法。
【請求項２】
前記成形体を前記後処理に供する工程の前に、前記成形体を延伸する工程を更に備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成形体がタンパク質繊維である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が構造タンパク質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の官能基がイソシアネート基で、前記第２の官能基がラジカル重合性不飽和基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記後処理が、前記成形体の加熱処理である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記加熱処理が、前記成形体を１４０℃を超える温度に加熱することである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記成形体が前記加熱処理に供される時間が３０秒以上である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質溶液における前記反応性化合物の量が、前記タンパク質１当量に対して１００当量以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
反応性化合物によって架橋されたタンパク質を含有するタンパク質成形体であって、
前記反応性化合物が第１の官能基及び該第１の官能基とは異なる第２の官能基を有する化合物であり、前記第１の官能基と前記タンパク質との反応により前記タンパク質と前記反応性化合物とが結合し、２以上の前記第２の官能基の反応により２以上の前記反応性化合物が互いに結合し、それによって前記タンパク質が架橋されている、タンパク質成形体。
【請求項１２】
タンパク質繊維である、請求項１１に記載のタンパク質成形体。
【請求項１３】
前記タンパク質が構造タンパク質を含む、請求項１１又は１２に記載のタンパク質成形体。
【請求項１４】
前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項１３に記載のタンパク質成形体。
【請求項１５】
前記第１の官能基がイソシアネート基で、前記第２の官能基がラジカル重合性不飽和基である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のタンパク質成形体。
【請求項１６】
タンパク質及び反応性化合物とこれらが溶解している溶媒とを含有するタンパク質溶液であって、
前記反応性化合物が第１の官能基及び該第１の官能基とは異なる第２の官能基を有する化合物であり、前記第１の官能基が前記タンパク質との反応によって前記タンパク質と前記反応性化合物とを結合させ得る基で、前記第２の官能基が２以上の前記第２の官能基の反応によって２以上の前記反応性化合物を互いに結合させ得る基である、タンパク質溶液。
【請求項１７】
タンパク質繊維を紡糸するための紡糸原液である、請求項１６に記載のタンパク質溶液。
【請求項１８】
前記タンパク質が構造タンパク質を含む、請求項１６又は１７に記載のタンパク質溶液。
【請求項１９】
前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項１８に記載のタンパク質溶液。
【請求項２０】
前記第１の官能基がイソシアネート基で、前記第２の官能基がラジカル重合性不飽和である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質成形体及びこれを製造する方法、並びにタンパク質溶液に関する。
【背景技術】
【０００２】
繊維及びフィルム等のタンパク質成形体は、収縮し易い特性を有することがある。タンパク質成形体の収縮が、その製造工程又は使用時に様々な問題を発生させ得る。タンパク質成形体の収縮を抑える方法として、成形によって得られた成形体に架橋剤を付与し、成形体中でタンパク質を架橋する方法がいくつか提案されている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１０−３１０９７７号公報
【特許文献２】特許第５５４０１５４号公報
【特許文献３】特開２００９−２２１６１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
タンパク質成形体の収縮は、出来るだけ小さく抑制されることが望ましい。特に、タンパク質成形体は、製造後の最初の水分との接触によって比較的大きく収縮し、その後の乾燥によって更に収縮する性質を有することが多く、これらの収縮を抑制することが望まれる。【０００５】
そこで、本発明の一側面の目的は、タンパク質成形体に関して、製造直後の水分との接触による収縮、及びその後の乾燥にともなう収縮を抑制することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一側面は、タンパク質成形体を製造する方法を提供する。この方法は、
タンパク質及び反応性化合物とこれらが溶解している溶媒とを含有するタンパク質溶液であって、反応性化合物が第１の官能基及び該第１の官能基とは異なる第２の官能基を有する化合物であり、第１の官能基がタンパク質との反応によってタンパク質と反応性化合物とを結合させ得る基で、第２の官能基が２以上の第２の官能基の反応によって２以上の反応性化合物を互いに結合させ得る基である、タンパク質溶液を準備する工程と、
タンパク質溶液を成形用原液として用いた成形によって、タンパク質を含有する成形体を得る工程と、
成形体を、２以上の前記第２の官能基の反応によって２以上の反応性化合物を互いに結合させるための後処理に供する工程と、を備える。【０００７】
この方法によれば、成形直後の水分との接触による成形体の収縮、及びその後の乾燥にともなう成形体の収縮を抑制することができる。【０００８】
本発明の別の側面は、反応性化合物によって架橋されたタンパク質を含有するタンパク質成形体を提供する。反応性化合物は第１の官能基及び該第１の官能基とは異なる第２の官能基を有する化合物である。第１の官能基とタンパク質との反応によりタンパク質と反応性化合物とが結合し、２以上の第２の官能基の反応により２以上の反応性化合物が互いに結合し、それによってタンパク質が架橋されている。【０００９】
このタンパク質成形体は、製造直後の水分との接触による収縮、及びその後の乾燥にともなう収縮を生じ難い。【００１０】
本発明の更に別の側面は、タンパク質及び反応性化合物とこれらが溶解している溶媒とを含有する、タンパク質溶液を提供する。反応性化合物は、第１の官能基及び該第１の官能基とは異なる第２の官能基を有する化合物である。第１の官能基はタンパク質との反応によってタンパク質と反応性化合物とを結合させ得る基で、第２の官能基は２以上の第２の官能基の反応によって２以上の反応性化合物を互いに結合させ得る基である。【００１１】
このタンパク質溶液を成形用原液として用いることにより、製造直後の水分との接触による成形体の収縮、及びその後の乾燥にともなう成形体の収縮を抑制することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一側面に係る方法によれば、製造直後の水分との接触によるタンパク質成形体の収縮、及びその後の乾燥にともなうタンパク質成形体の収縮を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図２】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。
【図３】タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す概略図である。
【図４】タンパク質繊維を加熱処理に供するための加熱装置の一例を示す概略図である。
【図５】反応性化合物の溶液によって処理されたクモ糸フィブロインの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図６】反応性化合物の溶液によって処理されたクモ糸フィブロインのＤＯＳＹ法による１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図７】図６の領域Ｂを示す拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
タンパク質成形体を製造する方法の一実施形態は、タンパク質及び反応性化合物とこれらが溶解している溶媒とを含有するタンパク質溶液を準備する工程と、タンパク質溶液を成形用原液として用いた成形によって、タンパク質を含有する成形体を得る工程と、成形体を加熱処理等の後処理に供する工程とを含み得る。
【００１６】
反応性化合物は、反応性化合物とタンパク質とを結合させ得る第１の官能基、及び、反応性化合物同士を結合させ得る第２の官能基を有する化合物であってもよい。この場合、後処理は、２以上の第２の官能基の反応によって２以上の反応性化合物を互いに結合させるための処理であることができる。
【００１７】
＜タンパク質＞
タンパク質成形体を構成するタンパク質は、特に限定されるものではなく、遺伝子組換え技術により微生物等で製造したものであってもよいし、合成により製造されたものであってもよい。あるいは、タンパク質は、天然由来のタンパク質を精製したものであってもよい。
【００１８】
タンパク質は、例えば、構造タンパク質を含んでいてもよい。構造タンパク質とは、生体内で構造及び形態等を形成又は保持するタンパク質を意味する。構造タンパク質は、天然の構造タンパク質に由来する人造構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質としては、例えば、フィブロイン、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン及びレシリンを挙げることができる。
【００１９】
構造タンパク質は、フィブロインであってもよい。フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってよい。特に、構造タンパク質は、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってよい。
【００２０】
絹糸は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維（繭糸）である。一般に、１本の繭糸は、２本の絹フィブロインと、これらを外側から覆うニカワ質（セリシン）とから構成される。絹フィブロインは、多数のフィブリルで構成される。絹フィブロインは、４層のセリシンで覆われる。実用的には、精錬により外側のセリシンを溶解してこれを取り除くことにより得られる絹フィラメントが、衣料用途に使用されている。一般的な絹糸は、１．３３の比重、平均３．３ｄｅｃｉｔｅｘの繊度、及び１３００〜１５００ｍ程度の繊維長を有する。絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料として得られる。
【００２１】
絹フィブロインは、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製したものである。このようにして精製した絹フィブロインは、凍結乾燥粉末であってもよい。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製の絹フィブロインである。
【００２２】
クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（人造クモ糸タンパク質）からなる群より選ばれる１種以上のクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
【００２３】
天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域ともいう。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。
【００２４】
大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状線で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ＡＤＦ３に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
【００２５】
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００２６】
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、組換えクモ糸タンパク質であってよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質（「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう。）である。
【００２７】
フィブロイン様タンパク質である大吐糸管しおり糸由来のタンパク質あるいはカイコシルク由来のタンパク質としては、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式２：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、主としてアラニン残基を含むアミノ酸配列であり、ｎは２〜２７の整数である。ｎは、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は、４０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（（Ａ）ｎモチーフがアラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。式１又は２で表されるドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフのうち少なくとも７つが、アラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。式１又は２で表されるドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。式１又は２で表されるドメイン配列中に複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。大吐糸管しおり糸由来のタンパク質の具体例としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
【００２８】
クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるアミノ酸配列（ドメイン配列）の単位を含み、Ｃ末端配列として、配列番号１４、１５若しくは１６のいずれかで示されるアミノ酸配列、又は配列番号１４、１５若しくは１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する、ポリペプチドであってもよい。
【００２９】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一である。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。配列番号１６で示されるアミノ酸配列は、配列番号１４で示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
【００３０】
クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロインのより具体的な例として、（１−ｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列、又は（１−ｉｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。ここでの配列同一性は、９５％以上であってもよい。
【００３１】
配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号１８）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列を、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍まで増やすとともに、翻訳が第１１５４番目のアミノ酸残基で終止するように変異させた配列に相当する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列と同一である。
【００３２】
（１−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３３】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列において、天然由来のフィブロインと比較してグリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。当該改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたものに相当するアミノ酸配列を有することができる。
【００３４】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたものに相当するアミノ酸配列であってもよい。
【００３５】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインにおいて、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。
【００３６】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインが、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、式１で表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフから当該ドメイン配列のＣ末端までの部分以外の配列において、全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数がｚで、総アミノ酸残基数がｗであるときに、ｗに対するｚの割合（ｚ／ｗ、％）が３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は８３％以上、８６％以上、９０％以上、又は９５％以上であってもよい。該割合が１００％（（Ａ）ｎモチーフがアラニン残基のみで構成されることを意味する）であってもよい。
【００３７】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより。ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであってもよい。グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下、２０％以下、１０％以下、６％以下、４％以下、又は２％以下であってもよい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。
【００３８】
ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの部分以外の配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。抽出されたＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が重複なく５０個抽出された場合、ｚは５０×３＝１５０と算出される。例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列における中央のＸのように、２つのＸＧＸに含まれるＸが存在する場合、重複しているＸの数が控除される。すなわち、ＸＧＸＧＸは、ＸＧＸを構成するアミノ酸残基を５つ含む配列とみなされる。ｗは、ドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの部分以外の配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０と計算される。この計算において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフにおけるアミノ酸残基数の４は除かれている。ｚ及びｗから、ｗに対するｚの割合（ｚ／ｗ、％）が算出される。
【００３９】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上、５６．１％以上、５８．７％以上、７０％以上、又は８０％以上であってもよい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。
【００４０】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を、別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、ｚ／ｗが５０．９％以上になるように、グリシン残基をコードする塩基配列を置換してもよい。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインを得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００４１】
上記の別のアミノ酸残基は、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、又は、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基であってもよく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基又はグルタミン（Ｑ）残基であってもよく、グルタミン（Ｑ）残基であってもよい。
【００４２】
グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００４３】
（２−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号３で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号９で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００４４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号３で示されるアミノ酸配列、配列番号４で示されるアミノ酸配列、配列番号１０で示されるアミノ酸配列、及び配列番号１２で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。配列番号１、３、４、１０及び１２でそれぞれ示されるアミノ酸配列のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．３％である。ギザ比率及びｘ／ｙの詳細については後述される。
【００４５】
（２−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４６】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｉ）の改変フィブロインも、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であってもよい。
【００４７】
（２−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数がｚで、式１で表されるドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数がｗであるときに、ｗに対するｚの割合（ｚ／ｗ、％）が５０．９％以上であってもよい。
【００４８】
上述の改変フィブロインは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００４９】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
【００５０】
グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００５１】
抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグの例として、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグを挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。
【００５２】
タグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せる配列も使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。
【００５３】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２−ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号８、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００５４】
配列番号６、７、８、９、１１及び１３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、１０及び１２でそれぞれ示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【００５５】
（２−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５６】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２−ｉｖ）の改変フィブロインも、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であってもよい。
【００５７】
（２−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号８、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数がｚで、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数がｗであるときに、ｗに対するｚの割合（ｚ／ｗ、％）が５０．９％以上であってもよい。
【００５８】
上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００５９】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有することができる。
【００６０】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）ｎモチーフを１０〜４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。
【００６１】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１〜３つの（Ａ）ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列であってもよい。
【００６２】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列であってもよい。
【００６３】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列であってもよい。
【００６４】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインが、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含んでいてもよい。その場合に、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８〜１１．３となるような隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値がｘで、式１で表されるドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｙに対するｘの割合（ｘ／ｙ、％）が２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であってもよい。（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上、８６％以上、９０％以上、又は９５％以上であってもよく、１００％（（Ａ）ｎモチーフがアラニン残基のみで構成されることを意味する）であってもよい。
【００６５】
ｘ／ｙの算出方法を図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）ｎモチーフ−第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフ−第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）−（Ａ）ｎモチーフという配列を有する。
【００６６】
隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。選択方法はこれらに限られない。
【００６７】
次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較し、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求める。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２と算出される。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５と算出される。
【００６８】
図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比（以下、「ギザ比率」ということがある。）が、１．８〜１１．３となるような［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。ギザ比率が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。
【００６９】
各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数（（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数も含む）を足し合わせる。各パターンにおいて足し合わせたアミノ酸残基数の合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンにおける足し合わせたアミノ酸残基数の合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。
【００７０】
ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｙに対するｘの割合（ｘ／ｙ、％）を算出することができる。
【００７１】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、又は８０％以上であってもよい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９〜１１．３で、ｘ／ｙが８９．６％以上であってもよく、ギザ比率が１：１．８〜３．４で、ｘ／ｙが７７．１％以上であってもよく、ギザ比率が１：１．９〜８．４で、ｘ／ｙが７５．９％以上であってもよく、ギザ比率が１：１．９〜４．１で、ｘ／ｙが６４．２％以上であってもよい。
【００７２】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインにおいて、ドメイン配列中に存在する少なくとも７つの（Ａ）ｎモチーフがアラニン残基のみで構成される場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、又は８０％以上であってもよい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であってもよい。
【００７３】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインを得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００７４】
（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、又は（３−ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００７５】
（３−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端にＨｉｓタグが付加されたものである。
【００７６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８〜１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号２で示されるアミノ酸配列、及び配列番号４で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号１０で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号１２で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．３％である。配列番号１、２、４、１０及び１２で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。
【００７７】
（３−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７８】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｉ）の改変フィブロインも、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であってもよい。
【００７９】
（３−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２、配列番号４、配列番号１０又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、ギザ比率が１：１．８〜１１．３となるような隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値がｘで、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｙに対するｘの割合（ｘ／ｙ、％）が６４．２％以上であってもよい。
【００８０】
上述の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。
【００８１】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３−ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列、又は（２−ｉｖ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１若しく配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【００８２】
配列番号６、７、８、９、１１及び１３で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４、１０及び１２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。
【００８３】
（３−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００８４】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３−ｉｖ）の改変フィブロインも、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であってもよい。
【００８５】
（３−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、ギザ比率が１．８〜１１．３となるような隣合う２つの［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値がｘで、ドメイン配列の総アミノ酸残基数がｙであるときに、ｙに対するｘの割合（ｘ／ｙ、％）が６４．２％以上であってもよい。
【００８６】
上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【００８７】
グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。当該改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有する。この改変フィブロインは、上述したグリシン残基の含有量が低減された改変フィブロインと、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、グリシン残基の含有量が低減された改変フィブロイン、及び、（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインで説明したとおりである。
【００８８】
グリシン残基の含有量、及び（Ａ）ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロインのより具体的な例として、（４−ｉ）配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列、（４−ｉｉ）配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号４、配列番号１０若しくは配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。
【００８９】
他の実施形態に係る改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有していてもよい。
【００９０】
局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２〜４アミノ酸残基で構成されていてもよい。
【００９１】
上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。
【００９２】
本実施形態に係る改変フィブロインにおいて、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。
【００９３】
本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより改変フィブロインを得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。
【００９４】
さらに他の実施形態に係る改変フィブロインは、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含み、該ドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの部分以外の配列において、全てのＲＥＰにおける連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐで、アミノ酸残基の総数がｑであるときに、ｑに対するｐの割合（ｐ／ｑ）が６．２％以上であってもよい。
【００９５】
アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ  Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ（１９８２）“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。
【００９６】
【表１】
2018164189.tif 000003
【００９７】
ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの部分以外の配列（以下、「配列Ａ」という。）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める。各アミノ酸残基は、１〜４回平均値の算出に用いられる。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。
【００９８】
例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複なく２０カ所抽出された場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになる。ｐは２０×４＝８０と算出される。例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４−１＝７。「−１」は重複分の控除である。）。例えば、図２に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８と算出される。図２に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０と算出される。この計算において、Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）ｎモチーフにおけるアミノ酸残基数は含まれない。ｐをｑで除すことによって、ｑに対するｐの割合（ｐ／ｑ、％）を算出することができる。図２の場合、ｐ／ｑは２８／１７０＝１６．４７％と算出される。
【００９９】
本実施形態に係る改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上、７％以上、１０％以上、２０％以上、又は３０％以上であってもよい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。
【０１００】
本実施形態に係る改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより改変フィブロインを得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。
【０１０１】
疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であってもよく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。
【０１０２】
改変フィブロインの別の具体的な例として、（５−ｉ）配列番号１９、配列番号２１若しくは配列番号２２で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｉ）配列番号１９、配列番号２１若しくは配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【０１０３】
（５−ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインの（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数を５つになるよう欠失したものである。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号１９で示されるアミノ酸配列に対し、各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつ配列番号４で示されるアミノ酸配列の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。
【０１０４】
（５−ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１０５】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｉ）の改変フィブロインも、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であってもよい。
【０１０６】
（５−ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ、ドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの部分以外の配列に関して、全てＲＥＰにおいて連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐで、アミノ酸残基の総数がｑであるときに、ｑに対するｐの割合（ｐ／ｑ、％）が６．２％以上であってもよい。
【０１０７】
上述の改変フィブロインは、Ｎ末端又はＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。
【０１０８】
タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５−ｉｉｉ）配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列、又は（５−ｉｖ）配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。
【０１０９】
配列番号２３、２４及び２５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、２１及び２２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。
【０１１０】
（５−ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１１１】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５−ｉｖ）の改変フィブロインも、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であってもよい。
【０１１２】
（５−ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２３、配列番号２４若しくは配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、ドメイン配列のうち、最もＣ末端側に位置する（Ａ）ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの部分以外の配列において、全てのＲＥＰにおける連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐで、アミノ酸残基の総数がｑであるときに、ｑに対するｐの割合（ｐ／ｑ、％）が６．２％以上であってもよい。
【０１１３】
上述の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。
【０１１４】
横糸タンパク質に由来するタンパク質としては、例えば、式３：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式３中、ＲＥＰ２はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を示す。ｏは８〜３００の整数を示す。）を挙げることができる。横糸タンパク質に由来するタンパク質の具体例としては、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１１５】
コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式４：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式４中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。コラーゲン由来のタンパク質の具体例としては、配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１１６】
レシリン由来のタンパク質として、例えば、式５：［ＲＥＰ４］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（式５中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ４はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であってもよい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。レシリン由来のタンパク質の具体例としては、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１１７】
エラスチン由来のタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。エラスチン由来のタンパク質の具体例としては、配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【０１１８】
以上説明した構造タンパク質及び当該構造タンパク質に由来するタンパク質は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１１９】
タンパク質溶液及びタンパク質成形体に含まれるタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【０１２０】
タンパク質をコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸を合成してもよい。
【０１２１】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【０１２２】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターは、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有していてもよい。
【０１２３】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも用いることができる。
【０１２４】
原核生物の宿主の例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属又はシュードモナス属に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリを挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリを挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンスを挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラスを挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラムを挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタムを挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスを挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダを挙げることができる。
【０１２５】
原核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）を挙げることができる。
【０１２６】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【０１２７】
真核生物を宿主とする場合、目的タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法を挙げることができる。
【０１２８】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【０１２９】
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【０１３０】
宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【０１３１】
炭素源としては、形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【０１３２】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持されてもよい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【０１３３】
培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【０１３４】
発現させたタンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【０１３５】
タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてタンパク質の不溶体を回収する。回収したタンパク質の不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法によりタンパク質の精製標品を得ることができる。当該タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【０１３６】
＜反応性化合物＞
一実施形態に係る反応性化合物は、反応性化合物とタンパク質とを結合させ得る第１の官能基、及び、反応性化合物同士を結合させ得る第２の官能基を有する化合物であってもよい。この反応性化合物は、第１の官能基及び第２の官能基の反応によって、タンパク質の分子鎖を架橋する架橋剤として機能し得る。
【０１３７】
反応性化合物が有する第１の官能基は、タンパク質が有する、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール基等の官能基と反応して結合を生じ得る官能基であればよい。第１の官能基は、例えば、イソシアネート基、ブロックイソシアネート基、チオール基、アルデヒド基、エステル基、エポキシ基、アジリジン基、クロロ基、ブロモ基、ヨード基、カルボン酸無水物基、クロロホルミル基、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基、マレイミド基、及び塩化シアヌル基からなる群より選ばれる少なくとも１種の基であってもよい。反応性化合物が有する第１の官能基の数は、１個であっても、２個以上であってもよい。
【０１３８】
反応性化合物が有する第２の官能基は、第２の官能基同士の反応によって結合を生じ得る官能基であればよく、通常、第１の官能基とは異なる。第２の官能基は、ビニル基（例えばアクリロイル基、メタクリロイル基）、及びアルキニル基（例えばエチニル基）等のラジカル重合性不飽和基であってもよい。反応性化合物が有する第１の官能基の数は、１個であっても、２個以上であってもよい。
【０１３９】
反応性化合物の具体例としては、１，１−（ビスアクリロイルオキシメチル）エチルイソシアネート（ＢＥＩ）、２−メタクリロイルオキシエチルイソシアネート（ＭＯＩ）、及び２−アクリロイルオキシエチルイソシアナート（ＡＯＩ）が挙げられる。ＢＥＩは、第１の官能基としての１個のイソシアネート基と、第２の官能基としての２個のアクリロイル基とを有する。ＭＯＩ及びＡＯＩは、第１の官能基としての１個のイソシアネート基と、第２の官能基としての１個の（メタ）アクリロイル基とを有する。
【０１４０】
第１段階として、タンパク質及び反応性化合物を含有するタンパク質溶液中で、少なくとも一部の反応性化合物が、第１の官能基とタンパク質中の官能基との反応により、タンパク質と結合してもよい。例えば、第１の官能基としてのイソシアネート基とタンパク質中のヒドロキシ基との反応によりウレタン結合が生成し、それによって反応性化合物がタンパク質と結合してもよい。その後、第２段階として、タンパク質溶液を成形用原液として用いた成形により得られた成形体を後処理（架橋処理）に供したときに、タンパク質に結合した反応性化合物のうち少なくとも一部が、第２の官能基同士の反応によって互いに結合すると考えられる。例えば、第２の官能基としてのラジカル重合性不飽和基の重合反応によって、反応性化合物同士が結合し得る。その結果、タンパク質の分子鎖が反応性化合物によって架橋すると考えられる。ただし、成形に供される前のタンパク質溶液中等、後処理の工程の前の段階で第２の官能基の一部が反応していることもあり得る。また、後処理の工程の段階で、第２の官能基同士が反応するとともに、第１の官能基がタンパク質と反応することもあり得る。
【０１４１】
このように、２種以上の官能基を有する反応性化合物を用いて、タンパク質の架橋を段階的に進める方法によれば、反応性化合物が成形体内部に深く侵入できるため、例えば、成形後に成形体の表面に架橋剤を付与してタンパク質を架橋する方法と比較して、タンパク質同士の架橋が、成形体内部までより確実且つ効率的に進行すると考えられる。この段階的な架橋により、成形体内部に特異的な架橋構造が形成されると考えられるが、その構造を定量的に特定することは、多くの試行錯誤を重ねることが必要であり、実際的ではない。しかし、段階的な架橋を経て形成される架橋構造が、成形直後のタンパク質成形体の水分との接触による収縮だけでなく、その後の乾燥にともなう収縮も顕著に抑制される一因であると推察される。
【０１４２】
＜タンパク質溶液＞
一実施形態に係るタンパク質溶液は、タンパク質及び反応性化合物とこれらが溶解している溶媒とを含有する。
【０１４３】
タンパク質溶液におけるタンパク質の濃度は、特に限定されず、例えば、タンパク質溶液の質量を基準として、１０〜３０質量％であってもよい。
【０１４４】
タンパク質溶液に含まれる反応性化合物の量は、特に限定されず、反応性化合物の種類等に応じて適宜に決定される。例えば、反応性化合物の量は、タンパク質１当量に対して１００当量以上、２００当量以上、又は３００当量以上であってもよい。これによって、より優れた防縮効果が得られる。反応性化合物の量の上限は特に制限されないが、通常、３００当量以下程度で十分である。ここで、反応性化合物の当量は、タンパク質１当量（１モル）に対する反応性化合物の量（モル）の比率を意味する。
【０１４５】
タンパク質溶液を構成する溶媒の種類は、特に限定されず、タンパク質の種類等によって適宜に決定される。溶媒は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロイソプロノール（ＨＦＩＰ）、ギ酸又はこれらの組み合わせであってもよい。これら溶媒は、例えばクモ糸フィブロインを溶解するために適している。
【０１４６】
タンパク質溶液は、無機塩を更に含有してもよい。無機塩は、タンパク質の溶解促進剤として機能し得る。無機塩としては、例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、及びチオシアン酸塩が挙げられる。無機塩の具体例としては、リン酸アルミニウム、炭酸リチウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、フッ化アルミニウム、酢酸第二鉄、酢酸アルミニウム、水酸化亜鉛、水酸化マグネシウム、水酸化第一鉄、水酸化マンガン、水酸化クロム、水酸化第二鉄、水酸化アルミニウム、塩化ニッケル、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化第一鉄、塩化マンガン、塩化クロム、塩化第二鉄、塩化アルミニウム、硝酸リチウム、硝酸ストロンチウム、硝酸ニッケル、硝酸カルシウム、硝酸コバルト、硝酸亜鉛、硝酸マグネシウム、硝酸第一鉄、硝酸マンガン、硝酸クロム、硝酸第二鉄、硝酸アルミニウム、臭化リチウム、臭化バリウム、臭化ストロンチウム、臭化ニッケル、臭化カルシウム、臭化コバルト、臭化亜鉛、臭化マグネシウム、臭化第一鉄、臭化マンガン、臭化クロム、臭化第二鉄、臭化アルミニウム、塩素酸バリウム、塩素酸ストロンチウム、塩素酸ニッケル、塩素酸カルシウム、塩素酸コバルト、塩素酸亜鉛、塩素酸マグネシウム、塩素酸第一鉄、塩素酸マンガン、塩素酸クロム、塩素酸第二鉄、塩素酸アルミニウム、ヨウ化ルビジウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化銅、ヨウ化リチウム、ヨウ化バリウム、ヨウ化ストロンチウム、ヨウ化ニッケル、ヨウ化カルシウム、ヨウ化コバルト、ヨウ化亜鉛、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化第一鉄、ヨウ化マンガン、ヨウ化クロム、ヨウ化第二鉄、ヨウ化アルミニウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸鉛、過塩素酸銅、過塩素酸リチウム、過塩素酸バリウム、過塩素酸ストロンチウム、過塩素酸ニッケル、過塩素酸カルシウム、過塩素酸コバルト、過塩素酸亜鉛、過塩素酸マグネシウム、過塩素酸第一鉄、過塩素酸マンガン、過塩素酸クロム、過塩素酸第二鉄、過塩素酸アルミニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸鉛、チオシアン酸銅、チオシアン酸リチウム、チオシアン酸バリウム、チオシアン酸ストロンチウム、チオシアン酸ニッケル、チオシアン酸カルシウム、チオシアン酸コバルト、チオシアン酸亜鉛、チオシアン酸マグネシウム、チオシアン酸第一鉄、チオシアン酸マンガン、チオシアン酸クロム、チオシアン酸第二鉄、チオシアン酸アルミニウム、シアン酸アンモニウム、シアン酸セシウム、シアン酸ルビジウム、シアン酸カリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸鉛、シアン酸銅、シアン酸リチウム、シアン酸バリウム、シアン酸ストロンチウム、シアン酸ニッケル、シアン酸カルシウム、シアン酸コバルト、シアン酸亜鉛、シアン酸マグネシウム、シアン酸第一鉄、シアン酸マンガン、シアン酸クロム、シアン酸第二鉄、及びシアン酸アルミニウムが挙げられる。これらのうちの少なくとも１種類の無機塩を溶媒に添加してもよい。
【０１４７】
タンパク質溶液に含まれる無機塩の量は、特に限定されず、無機塩の種類、タンパク質の量等に応じて適宜に決定される。無機塩の量は、例えば、タンパク質の全量１００質量部に対して、１．０質量部以上、５．０質量部以上、９．０質量部以上、１５質量部以上、２０質量部以上であってもよい。無機塩の量は、例えば、タンパク質の全量１００質量部に対して、４０質量部以下、３５質量部以下、３０質量部以下であってもよい。
【０１４８】
タンパク質溶液は、タンパク質、反応性化合物、及び必要によりその他の成分を溶媒に溶解させることを含む方法により、作製される。タンパク質溶液中で、反応性化合物の第１の官能基とタンパク質との反応が進行するように、タンパク質溶液を、ある程度の時間、撹拌又は振とうしてもよい。その際、タンパク質溶液は必要により加熱してもよい。例えば、タンパク質溶液を５０℃以上、９０℃以上、又は１２０℃以上に加熱してもよい。加熱温度の上限は特に制限されないが、通常、１３０℃以下、又は８５℃程度で十分である。
【０１４９】
＜タンパク質成形体＞
一実施形態に係る方法によって製造されるタンパク質成形体は、タンパク質溶液を用いた成形によって得られるものであれば特に限定されないが、例えば繊維（タンパク質繊維）又はフィルム（タンパク質フィルム）であってもよい。タンパク質繊維は、例えば、タンパク質溶液を紡糸原液として用いた湿式紡糸、乾式紡糸、又は乾湿式紡糸によって得ることができる。タンパク質フィルムは、例えば、タンパク質溶液をキャスト液として用いたキャスト成形によって得ることができる。
【０１５０】
成形によって得られたタンパク質成形体を、後処理の前に延伸してもよい。タンパク質繊維を製造する場合、紡糸によって形成されたタンパク質繊維を、巻き取ることなくそのまま連続的に延伸してもよい。延伸によって成形体内に歪みが生じ、これが収縮の原因となる場合があるが、延伸後の成形体を後処理に供することで、延伸によって生じた歪みに起因する収縮を効果的に低減することができる。これは、後処理によって生じ得るタンパク質の架橋構造が、歪みを含む状態でタンパク質分子を固定化するためであると考えられる。延伸倍率は、特に限定されないが、例えば３〜１０倍であってもよい。
【０１５１】
成形によって得られたタンパク質成形体を、後処理の前に乾燥してもよい。この乾燥は、例えば、第２の官能基の反応が実質的に進行しない温度に加熱することによって行われる。具体的には、乾燥のための加熱温度は、６０〜９０℃であってもよい。あるいは、より高温での加熱によって、乾燥及び後処理を同時並行的に行ってもよい。
【０１５２】
成形によって得られたタンパク質成形体は、タンパク質に結合している２以上の反応性化合物を互いに結合させるための後処理に供される。この後処理によって第２の官能基の反応が進行し、その結果、成形体中のタンパク質分子が反応性化合物を介して架橋されると考えられる。後処理の手段は、第２の官能基の種類等によって適宜に決定される。例えば、後処理は、加熱処理、ＵＶ照射、放射線照射、架橋促進剤の添加、又はこれらの組み合わせであることができる。例えば、第２の官能基としてのラジカル重合性不飽和基は、後処理としての加熱処理、ＵＶ照射、又は放射線照射によって、特に効率的に反応することができる。
【０１５３】
後処理としての加熱処理は、乾熱処理であってもよい。乾熱処理によれば、水分との接触による成形体の収縮が、より有利に回避され得る。加熱処理のための加熱温度及び加熱時間は、特に限定されないが、例えば、加熱温度が１４０℃を超える温度であってもよく、加熱時間が３０秒以上であってもよい。これによって、最終的に得られる後処理後の成形体の防縮効果がより一層高められ得る。同様の観点から、後処理のための加熱温度は２００℃以上、又は２４０℃以上であってもよく、後処理のための加熱時間は３０秒以上、又は１２０秒以上であってもよい。加熱温度の上限は、特に制限されないが、例えば２８０℃以下であってもよい。加熱時間の上限は、特に制限されないが、例えば１３０秒以下であってもよい。
【０１５４】
タンパク質成形体としてのタンパク質繊維を、後処理としての加熱処理を経て製造する方法の一例について、以下に説明する。
【０１５５】
図３は、タンパク質繊維を製造するための紡糸装置の一例を示す概略図である。図３に示す紡糸装置１０は、乾湿式紡糸用の紡糸装置の一例であり、押出し装置１と、凝固浴槽２０を有する凝固装置２と、洗浄浴槽２１を有する洗浄装置３と、加熱装置１７を有する乾燥装置４とを上流側から順に有している。
【０１５６】
押出し装置１は貯槽７を有しており、ここに紡糸原液６が貯留される。紡糸原液６として、上述の実施形態に係るタンパク質溶液が用いられる。凝固浴槽２０に凝固液１１（例えば、メタノール）が貯留される。紡糸原液６は、貯槽７の下端部に取り付けられたギヤポンプ８により、凝固液１１との間にエアギャップ１９を開けて設けられたノズル９から押し出される。押し出された紡糸原液６は、エアギャップ１９を経て凝固液１１内に供給される。凝固液１１内で紡糸原液６から溶媒が除去されてタンパク質が凝固し、タンパク質繊維が形成される。形成されたタンパク質繊維は、糸ガイド１８ａ、１８ｂ、１８ｃ及び１８ｄを経て洗浄浴槽２１に導かれ、洗浄浴槽２１内の洗浄液１２により洗浄される。洗浄されたタンパク質繊維は、洗浄浴槽２１内に設置された第一ニップローラ１３と第二ニップローラ１４により送られ、糸ガイド１８ｅ、１８ｆ及び１８ｇを経て加熱装置１７へと導入される。このとき、例えば、第二ニップローラ１４の回転速度を第一ニップローラ１３の回転速度よりも速く設定すると、回転速度比に応じた倍率で延伸された、成形体としてのタンパク質繊維３６が得られる。洗浄液１２中で延伸されたタンパク質繊維３６は、洗浄浴槽２１を離脱してから、加熱装置１７内の経路２２を通過する際に乾燥され、その後、ワインダー２３にて巻き取られる。このようにして、タンパク質繊維３６が、紡糸装置１０により、最終的にワインダー２３に巻き取られた巻回物５として得られる。
【０１５７】
凝固液は、紡糸原液を脱溶媒できる溶液であればよい。凝固液としては、例えば、メタノール、エタノール及び２−プロパノール等の炭素数１〜５の低級アルコール、並びにアセトンを挙げることができる。凝固液は、水を含んでいてもよい。凝固液の温度は、０〜３０℃であってもよい。凝固液槽の長さは、脱溶媒が効率的に行える長さであればよく、例えば、２００〜５００ｍｍである。凝固によって形成されたたタンパク質繊維の凝固液中の滞留時間は、例えば、０．０１〜３分であってよく、０．０５〜０．１５分であってもよい。タンパク質繊維を凝固液中で延伸（又は前延伸）してもよい。前延伸によって前延伸糸が形成される。
【０１５８】
タンパク質繊維の延伸は、洗浄浴槽２１内で洗浄液を加温しながら行う。洗浄液は、例えば、水、又は、水と有機溶剤との混合溶媒でっあてもよい。加温した洗浄液（又は溶媒）中で行う延伸は、湿熱延伸と当業者に称されることがある。湿熱延伸の温度（洗浄液の温度）は、例えば、５０〜９０℃、又は７５〜８５℃であってもよい。湿熱延伸では、未延伸糸（又は前延伸糸）を、例えば、１倍〜１０倍、又は２〜８倍に延伸してもよい。
【０１５９】
タンパク質繊維の最終的な延伸倍率の下限値は、未延伸糸（又は前延伸糸）に対して、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍のうちの何れかであってもよい。タンパク質繊維の最終的な延伸倍率の上限値は、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１４倍、１３倍、１２倍、１１倍、又は１０倍のうちの何れかであってもよい。
【０１６０】
図４は、上述のようにして得られたタンパク質繊維を、後処理としての加熱処理に供するための加熱装置の一例を示す概略図である。図４に示す加熱装置６２は、フィードローラ４２及びワインダー４４と、これらの間に設けられた乾熱板６４とを有している。乾熱板６４は、フィードローラ４２からワインダー４４に向かう方向に延在する乾熱面６６を有する。
【０１６１】
タンパク質繊維３６がフィードローラ４２から連続的に送り出され、送り出されたタンパク質繊維３６が乾熱面６６に沿って移動しながら加熱される。この加熱処理の条件は、タンパク質繊維３６内で、反応性化合物の第２の官能基の反応が進行するように設定される。これにより、架橋されたタンパク質を含有する後処理後のタンパク質繊維３８が形成される。図３の紡糸装置１０と図４の加熱装置６２とを組み合わせて、タンパク質溶液から後処理後のタンパク質繊維を連続的に製造することも可能である。この場合、紡糸後のタンパク質繊維をワインダーに巻き取らず、そのまま加熱処理に供してもよく、また、紡糸後のタンパク質繊維３６に対して、乾燥を経ることなく、そのまま加熱による後処理を行ってもよい。
【０１６２】
タンパク質成形体を製造する方法は、後処理の工程の後、タンパク質繊維を水に浸漬し、浸漬後のタンパク質繊維を乾燥する工程を更に有していてもよい。これにより、より高い寸法安定性を有する成形体が製造され得る。
【実施例】
【０１６３】
１．クモ糸タンパク質（クモ糸フィブロイン：ＰＲＴ７９９）の製造
（クモ糸タンパク質をコードする遺伝子の合成、及び発現ベクターの構築）
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ７９９」ともいう。）を設計した。【０１６４】
配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のフィブロインのアミノ酸配列に対して、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施したアミノ酸配列と、そのＮ末端に付加された配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）とを有する。【０１６５】
設計したＰＲＴ７９９をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。【０１６６】
得られたｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターによって、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表２）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまで約１５時間、フラスコ培養を行って、シード培養液を得た。【０１６７】
【表２】
2018164189.tif 000004
【０１６８】
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表３）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して形質転換大腸菌を培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。【０１６９】
【表３】
2018164189.tif 000005
【０１７０】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して形質転換大腸菌を培養した。培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持しながら、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるように添加し、ＰＲＴ７９９を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存したＰＲＴ７９９に相当するサイズのバンドの出現により、ＰＲＴ７９９の発現を確認した。【０１７１】
（クモ糸フィブロインの精製）
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍ  グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）中に懸濁し、懸濁液を６０℃で３０分間、スターラーで撹拌して、沈殿物を溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質（ＰＲＴ７９９）を遠心分離により回収した。回収した凝集タンパク質から凍結乾燥機で水分を除き、ＰＲＴ７９９の凍結乾燥粉末を得た。【０１７２】
２．タンパク質繊維の製造
実施例１
＜タンパク質溶液の調製＞
ＬｉＣｌを、溶媒としてのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に濃度４．０質量％となるように溶解させた。得られた溶液に、クモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）の乾燥粉末を、濃度２４質量％となるように添加した。続いて、反応性化合物としての１，１−（ビスアクリロイルオキシメチル）エチルイソシアネート（ＢＥＩ）を新たに加え、シェーカーで均一になるように撹拌した。ＢＥＩの量は、クモ糸フィブロイン(ＰＲＴ７９９)の１当量（１モル）に対して３００当量（３００モル）とした。得られた混合物を、メカニカルスターラーを使用して５時間撹拌して、タンパク質を溶媒に溶解させるとともに、タンパク質をＢＥＩと反応させた。その後、不溶物と泡を取り除き、タンパク質溶液を得た。タンパク質溶液の粘度は９０℃において１１０００ｃＰ（センチポアズ）であった。【０１７３】
＜紡糸＞
得られたタンパク質溶液を紡糸原液とし、図３に示される紡糸装置１０を用いた乾湿式紡糸によって、紡糸及び延伸されたタンパク質繊維を形成させた。形成されたタンパク質繊維を乾燥してから巻き取った。乾湿式紡糸の条件は以下のとおりである。
押出しノズル直径：０．２ｍｍ
凝固液（メタノール）の温度：５℃
水洗浄浴延伸倍率：５倍
乾燥温度：６０℃【０１７４】
（乾熱処理）
得られたタンパク質繊維を、図４に示される加熱装置６２を用いて後処理としての乾熱処理に供し、乾熱処理後のタンパク質繊維を巻き取った。乾熱処理の条件は以下のとおりである。
送り出し速度：２５ｃｍ／ｍｉｎ
巻取り速度：２５ｃｍ／ｍｉｎ
乾熱板長さ：５０ｃｍ
乾熱板温度：２４０℃【０１７５】
比較例１
紡糸及び延伸後のタンパク質繊維を、乾熱処理に供することなく、比較例１のタンパク質繊維として評価した。【０１７６】
比較例２
タンパク質溶液にＢＥＩを加えなかったこと以外は実施例１と同様にして、タンパク質溶液を作製した。得られたタンパク質溶液を紡糸原液として、実施例１と同様の紡糸及び延伸によってタンパク質繊維を得た。これを乾熱処理に供することなく、比較例２のタンパク質繊維として評価した。【０１７７】
３．収縮性評価
実施例及び比較例の各タンパク質繊維について、製造直後の水分との接触による収縮（「一次収縮」ということがある）と、その後の乾燥にともなう収縮（「二次収縮」ということがある）の程度を評価した。【０１７８】
＜一次収縮＞
実施例及び比較例のタンパク質繊維の巻回物から、それぞれ、長さ３０ｃｍの複数本の試験用のタンパク質繊維を切り出した。それら複数本のタンパク質繊維を束ねて、繊度１５０デニールのタンパク質繊維束を得た。各タンパク質繊維束に０．８ｇの鉛錘を取り付け、その状態で各タンパク質繊維束を室温の水に１５時間以上、浸漬した。その後、水中で各タンパク質繊維束の長さを測定した。水中でのタンパク質繊維の長さ測定は、タンパク質繊維の湯中での縮れを無くすために、タンパク質繊維に０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま実施した。次いで、各タンパク質繊維束の水への浸漬時の収縮率（％、一次収縮率）を、下記式Ｉに従って算出した。式Ｉ中、Ｌ０は浸漬前のタンパク質繊維束の初期長さ（ここでは３０ｃｍ）を示し、Ｌｗ１は浸漬後のタンパク質繊維束の長さを示す。一次収縮率は、製造後、最初の水分との接触にともなうタンパク質繊維の長さの変化に相当する。
一次収縮率＝｛（Ｌ０−Ｌｗ１）／Ｌｗ１｝×１００    ・・・（式Ｉ）【０１７９】
＜二次収縮＞
一次収縮の評価のための１回目の浸漬の後、タンパク質繊維束を水中から取り出した。取り出したタンパク質繊維束を、０．８ｇの鉛錘を取り付けたまま、室温で５時間以上の加熱により乾燥させた（１回目の乾燥）。乾燥後、各タンパク質繊維束の長さを測定した。その後、各タンパク質繊維束を再び、室温の水中に１５時間以上、浸漬し、水中で各タンパク質繊維束の長さを測定した。これらの浸漬及び乾燥の操作を、浸漬３回、乾燥３回となるまで繰り返した。そして、タンパク質繊維束の、水への浸漬後の乾燥にともなう二次収縮の収縮率（％、二次収縮率）を、下記式ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに従って算出した。これら式中、ｎは浸漬又は乾燥の回数を示し、Ｌｗｎはｎ回目の浸漬後のタンパク質繊維束の長さを示し、Ｌｄｎはｎ回目の乾燥後のタンパク質繊維束の長さを示す。ここではｎは３である。二次収縮率は、製造後、水分との接触により収縮した後、乾燥した後のタンパク質繊維の可逆的な長さの変化に相当する。
Ｌｗｅｔ＝（Ｌｗ１＋Ｌｗ２＋・・・＋Ｌｗｎ）／ｎ      ・・・（式ＩＩ）
Ｌｄｒｙ＝（Ｌｄ１＋Ｌｄ２＋・・・＋Ｌｄｎ）／ｎ      ・・・（式ＩＩＩ）
二次収縮率＝｛（Ｌｗｅｔ−Ｌｄｒｙ）／Ｌｗｅｔ｝×１００  ・・・（式ＩＶ）【０１８０】
【表４】
2018164189.tif 000006
【０１８１】
表４に示されるように、実施例１のタンパク質繊維は、水への浸漬時の一次収縮率が８．１％、浸漬後の乾燥にともなう二次収縮率が７％で、両者とも十分に低かった。実施例１のタンパク質繊維の浸漬後の外観を目視により確認したところ、縮れは認められなかった。これに対して、比較例１、２のタンパク質繊維は、一次収縮率及び二次収縮率ともに大きい値を示した。【０１８２】
これらの実験結果からも、本発明に係る方法によって製造されたタンパク質繊維は、製造後の最初の水分との接触にともなう収縮、及び、その後の乾燥にともなう収縮が極めて効果的に抑制され得ることが確認された。【０１８３】
熱処理による繊維の溶解性変化
ＬｉＣｌを４．０質量％の濃度で含む２ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液に、熱処理後のタンパク質繊維をごく少量加えた。ＤＭＳＯ溶液を９０℃で２４時間加熱した後、内容物の状態を確認したところ、本来、クモ糸フィブロイン（ＰＲＴ７９９）はＤＭＳＯに可溶であるが、タンパク質繊維が溶解せず繊維形状を保ったまま残っていた。これは、熱処理によって第二の官能基同士が反応し、タンパク質の架橋が進行して、その結果タンパク質繊維の溶解性が低下したためであると考えられる。【０１８４】
４．クモ糸フィブロインとＢＥＩの反応確認
４−１．クモ糸タンパク質（クモ糸フィブロイン：ＰＲＴ４１０）の製造
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。ＰＲＴ７９９と同様の方法で、ＰＲＴ４１０の凍結乾燥粉末を得た。【０１８５】
４−２．クモ糸タンパク質のＢＥＩ溶液による処理
ＰＲＴ４１０の凍結乾燥粉末を、５．０質量％のＬｉＣｌを含むＤＭＳＯに濃度２４質量％となるよう添加した。そこに反応性化合物としてのＢＥＩとを加えた。ＢＥＩの量は、ＰＲＴ４１０の１当量（１モル）に対して１００当量（１００モル）とした。得られた混合物を、マグネティックスターラーを使用して５時間撹拌し、ＬｉＣｌ及びＢＥＩをＤＭＳＯに溶解させた。その後、エタノールを加え白色沈殿を析出させた。この析出物を粉砕しながら水中で３回洗浄した後、凍結乾燥させた。得られた白色凍結乾燥粉末をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。その結果、ＰＲＴ４１０に相当するバンドのやや上部に新たなバンドが出現したことが確認された。このバンドは、ＰＲＴ４１０とＢＥＩの反応に由来する成分であると考えられる。【０１８６】
４−３．ＮＭＲによる分析
上記の方法でＢＥＩ溶液によって処理されたクモ糸フィブロインの凍結乾燥粉末を重ＤＭＳＯに溶解させ、ＮＭＲ測定用試料を得た。得られた試料の１Ｈ  ＮＭＲを、核磁気共鳴装置（４００ＭＨｚ、ＪＥＯＬ社製）で測定した。図５は、ＢＥＩ溶液による処理後のクモ糸フィブロインの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。図５の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルと、未処理のＰＲＴ４１０の凍結乾燥粉末又はＢＥＩの重ＤＭＳＯ溶液を用いて得られた１Ｈ  ＮＭＲスペクトルとを比較した。その結果、ＢＥＩ溶液による処理後、クモ糸フィブロイン（ＰＲＴ４１０）に由来するブロードなシグナルの他に、５．８９〜６．４２ｐｐｍ付近にＢＥＩに由来する特徴的なシグナルが出現したことが確認された。このことから、測定用サンプルがクモ糸フィブロインとＢＥＩの両方を含んでることが確認された。【０１８７】
４−４．ＤＯＳＹ
「４−３．ＮＭＲによる分析」で準備した試料を、ＤＯＳＹ法による１Ｈ  ＮＭＲによって分析した。図６は、ＢＥＩ溶液によって処理されたクモ糸フィブロインのＤＯＳＹ法による１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。図６において、（ａ）が磁場勾配の印加無し、（ｂ）磁場勾配の印加有りのスペクトルである。図７は、図６の領域Ｂを示す拡大図である。図中の領域Ａに観測される水（３．３５ｐｐｍ）及びＤＭＳＯ（２．４９ｐｐｍ）のシグナルが消失するまで磁場勾配を印加した。この状態で、領域ＢにおけるＢＥＩのシグナルの減衰挙動は、ＰＲＴ４１０のシグナルと同程度であった。仮にＢＥＩがＰＲＴ４１０と反応せず低分子量の状態で存在していたとすると、そのシグナルは低分子量成分である水及びＤＭＳＯに近い減衰挙動を示し、消失するはずである。したがって、ＰＲＴ４１０のシグナルと同程度に減衰したＢＥＩのシグナルの減衰挙動から、ＢＥＩが高分子量のＰＲＴ４１０と反応して結合していることが強く示唆される。
【符号の説明】
【０１８８】
１…押出し装置、２…凝固装置、３…洗浄装置、４…乾燥装置、６…紡糸原液、１０…紡糸装置、１２…洗浄液、１３…第一ニップローラ、１４…第二ニップローラ、１９…エアギャップ、２０…凝固浴槽、６４…乾熱板、３６…タンパク質繊維、４２…フィードローラ、４４…ワインダー、６２…加熱装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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