(57)【要約】  本発明は、しみ、そばかす、くすみといったメラニン色素沈着の予防、抑制に有効な美白剤を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−バリン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リシン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、及びＤ−チロシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を含有する美白剤、及び、Ｄ−アミノ酸による肌の評価方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−アスパラギン、Ｄ−バリン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リシン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、及びＤ−チロシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とする美白剤。
【請求項２】
分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる又はＬ＊値を上げる請求項１に記載の美白剤。
【請求項３】
Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、及びＤ−トリプトファンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸、並びに
Ｄ−チロシン及び／又はＤ−リシンであるＤ−アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とする請求項１又は２に記載の美白剤。
【請求項４】
Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−セリン、及びＤ−チロシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とするか、或いは
Ｄ−ヒスチジンと、Ｄ−グルタミン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−バリン、Ｄ−アロスレオニン、及びＤ−リシンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸と、の少なくともいずれかを有効成分とする請求項１又は２に記載の美白剤。
【請求項５】
Ｄ−アスパラギン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−トリプトファン、及びＤ−ヒスチジンからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とする、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の美白剤、又は請求項５に記載のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含む皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
【請求項７】
ポリオール化合物、界面活性剤、高級アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、キレート剤、防腐剤及びシリコーンからなる群より選択される少なくとも１種の基剤を更に含む請求項６に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
【請求項８】
剤形が、乳液、クリーム、化粧水、又はジェルである請求項６又は７に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
【請求項９】
被検者の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかを測定して前記被検者の肌の外観を確認すること、
前記被検者の肌の色素沈着部位から角層を採取すること、
前記角層に含まれる少なくとも１種のＤ−アミノ酸量を特定すること、
前記肌の外観と前記Ｄ−アミノ酸量との関係を、被検者の結果の間で比較すること
を含む、Ｄ−アミノ酸による肌の評価方法。
【請求項１０】
前記Ｄ−アミノ酸量の特定が、
前記角層に含まれるタンパク質量あたりのＤ−アミノ酸含有量の測定である請求項９に記載の評価方法。
【請求項１１】
前記Ｄ−アミノ酸の含有量の測定を、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計により行う請求項９又は１０に記載の評価方法。
【請求項１２】
前記タンパク質量の測定をＢＣＡ法により行う請求項１０又は１１に記載の評価方法。
【請求項１３】
前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−バリン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リシン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、及びＤ−チロシンからなる群から選択される少なくとも１種を含む請求項９〜１２のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１４】
前記被検者が、２０代又は３０代の女性であり、
前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−リシン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−プロリン、Ｄ−トリプトファン、及びＤ−チロシンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１３に記載の評価方法。
【請求項１５】
前記被検者が、４０代又は５０代の女性であり、
前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−バリン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リシン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、及びＤ−チロシンからなる群から選択される少なくとも１種である請求項１３に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肌のしみ、そばかす、くすみは、紫外線の照射等の原因により色素細胞（メラノサイト）から黒色のメラニン色素が産生及び沈着することで発生する。メラニン色素は、アミノ酸物質であるチロシンを出発物質としてチロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質により生成することが知られている。そのため、メラニンの沈着を抑制するために、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）の阻害作用を有する技術が提案されている（特許文献１）。【０００３】
可食経験のある植物由来の抽出物を用いて、単回摂取により、紫外線により誘発される皮膚の炎症とそれに伴う皮膚の劣化を予防又は軽減することを目的として、カロテノイド色素の１種であるクロセチンを用いる経口皮膚保護剤が提案されている（特許文献２）。【０００４】
表皮と真皮とを隔てる基底膜に多量に存在するタンパク質へ影響を与えるＤ−アミノ酸として、Ｄ−アラニン及びＤ−ヒドロキシプロリンが報告されている（特許文献３）。【０００５】
美白効果を著しく改善し、かつ肌荒れ改善作用を目的とした、ハイドロキノン配糖体、アルコキシサリチル酸及び／又はその塩、α−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸から選ばれる美白薬剤と、１種又は２種以上のベタイン誘導体と、高級脂肪酸と、Ｌ−セリン、Ｄ−セリン、ＤＬ−セリン、アラニン、及びアミノメチルプロパンジオールから選ばれる１種又は２種以上と、を含有する皮膚外用剤が開示されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１１８８８７号
【特許文献２】特開２０１３−６７５９２号公報
【特許文献３】国際公開第２０１１／０４００８２号
【特許文献４】特開２００２−０６０３１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に開示されたチロシナーゼの抑制作用を有する生理活性物質は、ヨブスマソウ及び／又はイヌドウナをアルコール抽出して得られるものである。しかしながら、メラニン色素は、ＭＩＴＦ抑制作用に加えて、チロシナーゼ阻害成分及び抗酸化成分により抑制されていることが開示されている。即ち、特許文献１に開示されたチロシナーゼの抑制作用を有する生理活性物質は、それ単独ではチロシナーゼの遺伝子発現抑制作用が不十分であることが認められる。【０００８】
特許文献２に開示されたクロセチンは、紅班強度（即ち、紫外線による炎症）に効果があることは実施例で開示されている。しかしながら、しみ及びそばかす等のメラニンが沈着した状態に対しても効果が得られることは実証されていない。【０００９】
特許文献３には、Ｄ−アスパラギン酸等のＤ−アミノ酸化合物を用いた場合、ラミニン３３２の産生促進効果は発現しないことが開示されている。また、皮膚におけるラミニン３３２の産生促進を開示するものであり、ラミニン３３２以外のタンパク質の産生を抑制する技術については記載も示唆もされていない。【００１０】
特許文献４に記載の皮膚外用剤は、Ｄ−Ｓｅｒとは異なる特定の美白薬剤を必須成分として使用しており、Ｄ−Ｓｅｒ自体に美白作用があることは記載も示唆もされていない。【００１１】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたもので、メラニン産生関連タンパク質の産生を十分に抑制し、十分な美白効果を発揮することができる美白剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた。その結果、被検者の肌状態（例えば、メラニンインデックス）と、角層内に含まれる特定のＤ−アミノ酸に相関関係があることを見出した。斯かる知見に基づき、特定のＤ−アミノ酸が、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、メラノコルチン１レセプター等のメラニン産生関連タンパク質の産生を抑制し得ると考え、本発明に到達した。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕Ｄ−アスパラギン、Ｄ−バリン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リシン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、、Ｄ−セリン、Ｄ−トリプトファン、及びＤ−チロシン（以下、本明細書中、それぞれ「Ｄ−Ａｓｎ」、「Ｄ−Ｖａｌ」、「Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ」、「Ｄ−Ｌｙｓ」、「Ｄ−Ｇｌｎ」、「Ｄ−Ｈｉｓ」、「Ｄ−Ｌｅｕ」、「Ｄ−Ｐｈｅ」、「Ｄ−Ｓｅｒ」、「Ｄ−Ｔｒｐ」、及び「Ｄ−Ｔｙｒ」と略記する）からなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とする美白剤。
〔２〕分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる又はＬ＊値を上げる上記〔１〕に記載の美白剤。
〔３〕Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、及びＤ−Ｔｒｐからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸、並びにＤ−Ｔｙｒ及び／又はＤ−ＬｙｓであるＤ−アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の美白剤。
〔４〕Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｓｅｒ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とするか、或いはＤ−Ｈｉｓと、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ―Ｔｈｒ、及びＤ−Ｌｙｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸と、の少なくともいずれかを有効成分とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の美白剤。
〔５〕Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｈｉｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とする、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤。
〔６〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の美白剤、又は上記〔５〕に記載のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含む皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
〔７〕ポリオール化合物、界面活性剤、高級アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、キレート剤、防腐剤及びシリコーンからなる群より選択される少なくとも１種の基剤を更に含む上記〔６〕に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
〔８〕剤形が、乳液、クリーム、化粧水、又はジェルである上記〔６〕又は〔７〕に記載の皮膚化粧料又は皮膚外用剤。
〔９〕被検者の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかを測定して前記被検者の肌の外観を確認すること、前記被検者の肌の色素沈着部位から角層を採取すること、前記角層に含まれる少なくとも１種のＤ−アミノ酸量を特定すること、前記肌の外観と前記Ｄ−アミノ酸量との関係を、被検者の結果の間で比較すること、を含む、Ｄ−アミノ酸による肌の評価方法。
〔１０〕前記Ｄ−アミノ酸量の特定が、前記角層に含まれるタンパク質量あたりのＤ−アミノ酸含有量の測定である上記〔９〕に記載の評価方法。
〔１１〕前記Ｄ−アミノ酸の含有量の測定を、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計により行う上記〔９〕又は〔１０〕に記載の評価方法。
〔１２〕前記タンパク質量の測定をＢＣＡ法により行う上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の評価方法。
〔１３〕前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種を含む上記〔９〕〜〔１２〕のいずれかに記載の評価方法。
〔１４〕前記被検者が、２０代又は３０代の女性であり、前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種である上記〔１３〕に記載の評価方法。
〔１５〕前記被検者が、４０代又は５０代の女性であり、前記Ｄ−アミノ酸が、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種である上記〔１３〕に記載の評価方法。
〔１６〕前記比較の結果、肌の外観とＤ−アミノ酸量との間に相関関係が確認された場合に、肌の外観とそのＤ−アミノ酸との相関関係を被検者の肌の評価の指標として選抜することを更に含む、〔９〕〜〔１５〕のいずれかに記載の評価方法。
〔１７〕皮膚化粧料、皮膚外用剤、又はそれらの有効成分候補物質の投与前後の被検者の肌の色素沈着部位の角層に含まれる、〔１６〕に記載の評価方法で選抜された相関関係を構成するＤ−アミノ酸量を測定すること、及び、
前記Ｄ−アミノ酸量から前記相関関係に基づき投与前後の肌の外観を特定し、比較すること
を含む、皮膚化粧料又は皮膚外用剤の評価方法。
〔１８〕皮膚化粧料又は皮膚外用剤の投与前後の被検者の肌の色素沈着部位の角層に含まれる、〔１６〕に記載の評価方法で選抜された相関関係を構成するＤ−アミノ酸量を測定すること、及び、
前記Ｄ−アミノ酸量から前記相関関係に基づき投与前後の肌の外観を特定し、比較すること
を含む、被検者への皮膚化粧料又は皮膚外用剤の有効性の評価方法。
本明細書中、アミノ酸を、慣用の３文字表記（例えば、「Ａｓｎ」、「Ｇｌｎ」）に「Ｌ−」、「Ｄ−」、「Ｄ，Ｌ−」等の立体配置の接頭詞を付けて表すことがある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の美白剤は、十分な美白効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、２０代又は３０代の女性において、角層中のＤ−Ｐｒｏ量と肌のメラニンインデックスとの相関を示す図である。
【図２】図２は、４０代又は５０代の女性において、角層中のＤ−Ｈｉｓ量と肌のメラニンインデックスとの相関を示す図である。
【図３】図３は、２０代又は３０代の女性において、角層中のＤ−Ｌｙｓ量と肌のＬ＊値との相関を示す図である。
【図４】図４は、４０代又は５０代の女性において、角層中のＤ−Ｔｙｒ量と肌のＬ＊値との相関を示す図である。
【図５】図５は、Ｄ−Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。
【図６】図６は、Ｄ−Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。
【図７】図７は、Ｄ−Ａｓｎ（実施例１）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（メラノコルチン１レセプター）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。
【図８】図８は、Ｄ−Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。
【図９】図９は、Ｄ−Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。
【図１０】図１０は、Ｄ−Ｔｒｐ（実施例４）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｈｅ及びＤ−Ｔｒｐ添加時の細胞生存率を示すグラフである。
【図１２】図１２は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ａｓｐ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。
【図１３】図１３は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ｇｌｕ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。
【図１４】図１４は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ｃｙｓ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。
【図１５】図１５は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ｔｒｐ添加時の黒色メラニン産生率を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ａｓｐ添加時の細胞生存率を示すグラフである。
【図１７】図１７は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ｇｌｕ添加時の細胞生存率を示すグラフである。
【図１８】図１８は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ｃｙｓ添加時の細胞生存率を示すグラフである。
【図１９】図１９は、Ｂ１６メラノーマ細胞におけるＤ−Ｔｒｐ添加時の細胞生存率を示すグラフである。
【図２０】図２０は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｃｙｓ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。
【図２１】図２１は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ａｓｐ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。
【図２２】図２２は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｈｉｓ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。
【図２３】図２３は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｐｈｅ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。
【図２４】図２４は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｔｒｐ添加時のメラニン産生速度率を示すグラフである。
【図２５】図２５は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｃｙｓ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。
【図２６】図２６は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ａｓｐ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。
【図２７】図２７は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｈｉｓ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。
【図２８】図２８は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｐｈｅ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。
【図２９】図２９は、正常ヒト色素細胞におけるＤ−Ｔｒｐ添加時のタンパク質量の相対比を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［１．美白剤］
本発明の美白剤は、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、及びＤ−Ｃｙｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とする。有効成分は、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸であることが好ましい。Ｄ−Ｃｙｓは、Ｌ−Ｃｙｓと同様に安定性が低い場合がある（特開２００９−２２７６６０号公報）。また、Ｄ−Ａｓｐ及びＤ−Ｇｌｕは、溶解性を向上させるためにｐＨを高めに調整する必要が生じる場合がある。
本発明者らは、生体中にごく微量にしか含まれていないＤ−アミノ酸の含有量と肌のメラニンインデックス及びＬ＊値に相関関係があることを見出した。そして、相関関係を見出したＤ−アミノ酸を用いて、メラニン産生に関連するタンパク質の遺伝子発現量を検討したところ、タンパク質の遺伝子発現量に有意な減少がみられるものを見出した。
従って、従来、ラセミ体としてのアミノ酸そのものが有効成分とみなされていたアミノ酸のうち、生体中にごく微量にしか含まれていないＤ−アミノ酸が、肌のメラニンインデックス及びＬ＊値に関連するタンパク質の産生を強く抑制し、有効成分として作用するという新規な知見を見出した。本発明の美白剤は、このような新規な知見に基づき、生体中にごく微量にしか含まれていないＤ−アミノ酸が有する顕著な効果を利用するものである。
本明細書中、「美白」とは、肌の過剰なメラニンの発生を抑制し、しみ、そばかす、くすみを改善することを意味する。
【００１６】
アミノ酸には、光学異性体としてＤ体及びＬ体が存在する。このうち、天然のタンパク質は、Ｌ−アミノ酸がペプチド結合して構成されている。例えば、リモネンは、光学異性体で生理活性が異なるものが存在することが知られている。しかし、Ｄ−アミノ酸がＬ−アミノ酸で構成されるタンパク質に及ぼす影響について、現在のところ研究段階であり、体系的な理解はなされていない。
【００１７】
Ｄ−アミノ酸は、それらの塩であってもよい。塩としては薬学上許容される塩であればよい。例えば、カリウム塩、ナトリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、バリウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、トリシクロヘキシルアンモニウム塩等のアンモニウム塩；モノエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、モノイソプロピルアルコールアミン塩、ジイソプロピルアルコールアミン塩、トリイソプロピルアルコールアミン塩等のアルカノールアミン塩が挙げられる。
【００１８】
Ｄ−アミノ酸の製法は特に限定されない。例えば、合成法、抽出法、酵素法、発酵法が挙げられる。Ｄ，Ｌ―アミノ酸のラセミ混合物を光学分割して製造する方法も挙げられる。光学分割は特に限定されなく、従来公知の方法（例えば、カンファースルホン酸等の光学分割剤を用いてジアステレオマー塩を調製し、溶解性の差を利用して分割する）で行えばよい。
本発明の美白剤は、必要に応じて上記のＤ−アミノ酸以外の美白成分を含有し、美白剤組成物を形成していてもよい。
【００１９】
本発明の美白剤は、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｐｒｏ、及びＤ−Ｔｒｐからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸、並びにＤ−Ｔｙｒ及び／又はＤ−ＬｙｓであるＤ−アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とするものであることが好ましく、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、及びＤ−Ｔｒｐからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸、並びにＤ−Ｔｙｒ及び／又はＤ−ＬｙｓであるＤ−アミノ酸、の少なくともいずれかを有効成分とするものであることがより好ましい。これらのＤ−アミノ酸は後述する本発明の評価方法において、若い年代の女性のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと相関が認められたものである。
本発明の美白剤は、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｓｅｒ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とするか、或いはＤ−Ｈｉｓと、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、及びＤ−Ｌｙｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸と、の少なくともいずれかを有効成分とするものであることも好ましい。これらのＤ−アミノ酸は後述する本発明の評価方法において、年配の女性のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと相関が認められたものである。
【００２０】
本発明の美白剤の効能は、例えば、日本香粧品学会誌，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．４，ｐｐ．３３３−３３７（２００６）に記載の新規効能取得のための医薬部外品美白機能評価試験ガイドラインに記載の方法で判断し得る。より詳細には、目視又は写真による色素沈着評価において色素沈着が抑制されることを確認する方法、若しくは、分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる、又はＬ＊値を上げることを確認する方法で判断し得る。中でも、分光測色計測定値より算出したメラニンインデックスを下げる、又はＬ＊値を上げる方法が好ましい。
【００２１】
［１−１．メラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤］
本発明のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤は、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｃｙｓ及びＤ−Ｈｉｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸を有効成分とする。有効成分は、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｈｉｓからなる群から選択される少なくとも１種のＤ−アミノ酸であることが好ましい。メラニン産生関連タンパク質は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種である。そのため、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種のメラニン産生関連タンパク質の産生を抑制するので、しみ、そばかす、くすみを改善又は抑制することができる。上記Ｄ−アミノ酸は、それらの塩であってもよく、美白剤に関して上述したとおりである。
【００２２】
本発明のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤により産生が抑制されるタンパク質は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、及びメラノコルチン１レセプターからなる群から選択される少なくとも１種である。
チロシナーゼは、しみに強く関連するタンパク質であり、メラニン産生の最初の反応を触媒する。
チロシナーゼ関連タンパク質１は、しみに強く関連するタンパク質であり、メラニン産生のなかで、チロシナーゼの次の段階を触媒する。
メラノコルチン１レセプターは、しみに強く関連するタンパク質であり、α−ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）受容体である。
【００２３】
本発明のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤は、必要に応じてＤ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｃｙｓ及びＤ−Ｈｉｓ以外のメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含有し、メラニン産生関連タンパク質の産生抑制組成物を形成していてもよい。
【００２４】
［２．皮膚化粧料及び皮膚外用剤（皮膚化粧料組成物及び皮膚外用剤組成物）］
本発明の皮膚化粧料及び皮膚外用剤は、上記の美白剤又はメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤を含む。上記の美白剤又はメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤の含有量は、皮膚化粧料及び皮膚外用剤の種類に応じて適宜調整すればよい。Ｄ−アミノ酸の合計量で換算した場合の好適な含有量の下限は、通常、０．０１質量％以上であり、好ましくは０．１質量％以上であり、さらに好ましくは１質量％以上である。上限は、通常、３０質量％以下であり、好ましくは１０質量％以下である。
【００２５】
本発明の皮膚化粧料及び皮膚外用剤は、ポリオール化合物、界面活性剤、高級アルコール、増粘剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、キレート剤、防腐剤及びシリコーンからなる群より選択される少なくとも１種の基剤を更に含んでもよく、含むことが好ましい。
【００２６】
（ポリオール化合物）
ポリオール化合物としては、例えば、エチレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ブチルエチルプロパンジオール、ポリプロピレングリコール共重合体、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、ジグリセリン、ソルビトールが挙げられる。中でも、ブチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、及びソルビトールからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００２７】
（界面活性剤）
界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル、高級脂肪酸石けん、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキルエーテルリン酸エステル塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、アシルＮ−メチルタウリン塩等のアニオン界面活性剤；塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム等のカチオン界面活性剤；コカミドプロピルベタイン、アルキルジメチルアミノ酢酸ベタイン、アルキルアミドジメチルアミノ酢酸ベタイン、２−アルキル−Ｎ−カルボキシ−Ｎ−ヒドロキシイミダゾリニウムベタイン等の両性界面活性剤；グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン誘導体（リゾレシチン）、ポリオキシエチレン型（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル等）、多価アルコールエステル型、エチレンオキシド・プロピレンオキシドブロック共重合体等の非イオン界面活性剤が挙げられる。中でも、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、レシチン誘導体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２８】
（高級アルコール）
高級アルコールとしては、例えば、セタノール、ベヘニルアルコール、イソヘキサデシルアルコールが挙げられる。中でも、ベヘニルアルコールが好ましい。
【００２９】
（増粘剤）
増粘剤は、例えば、ポリアクリル酸、カラギーナン、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレングリコールジステアリン酸エステル、アクリル酸系ポリマー、セルロース系天然ポリマー、エタノール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ミリスチン酸カリウムが挙げられる。中でも、アクリル酸系ポリマー、キサンタンガム、及びセルロース系天然ポリマーからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
【００３０】
（紫外線吸収剤）
紫外線吸収剤としては、例えば、ブチルメトキシベンゾイルメタン、パラジメチルアミノ安息香酸オクチル、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル等の桂皮酸誘導体、ジメトキシベンジリデンジオキソイミダゾリジンプロピオン酸エチルヘキシルが挙げられる。中でも、桂皮酸誘導体が好ましい。
【００３１】
（紫外線散乱剤）
紫外線散乱剤としては、酸化チタン及び酸化亜鉛の少なくともいずれかが好ましい。
【００３２】
（キレート剤）
キレート剤としては、例えば、エチドロン酸、エデト酸三ナトリウム等のエチレンジアミン四酢酸（又はその誘導体）が挙げられる。中でも、エチレンジアミン四酢酸が好ましい。
【００３３】
（防腐剤）
防腐剤としては、パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれかが好ましい。パラベンとしては例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等が挙げられる。
【００３４】
（シリコーン）
シリコーンとしては、例えば、メチルポリシロキサン、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、シクロヘキサシロキサン、シクロペンタシロキサン、トリメチルシロキシケイ酸、ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体、シリコンフルイド、シリコーンゴム、シリコーン油が挙げられる。
【００３５】
本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤は、上記以外の１又は２以上の他の基剤を含んでもよい。他の基剤は、通常の皮膚化粧料又は皮膚外用剤に用いられる基剤であればよく、例えば、油性基剤、水溶性基剤、乳化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、保存剤、他の機能性成分（生理活性成分）、トリエチルヘキサノイン等の香料、色素、溶剤、天然物抽出物、上記のＤ−アミノ酸以外のアミノ酸（誘導体）が挙げられる。
【００３６】
油性基剤としては、例えば、ヒマシ油、綿実油、胡麻油、ホホバ油、オリーブ油、カカオ脂等の植物油脂；モクロウ、液状ラノリン等のラノリン、キャンデリラロウ、ミツロウ、カルナウバロウ等のロウ；ワセリン、流動パラフィン、固形パラフィン等のパラフィン、スクワラン、オレフィンオリゴマー、プラスチベース等の高級炭化水素；ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸等の脂肪酸及びそれらのエステル；白灯油等のベースワックス；天然高分子、水添ポリイソブテンが挙げられる。
【００３７】
水溶性基剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、セルロース誘導体（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カチオン化セルロース）、カルボキシビニルポリマー、エステル（例えば、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、ステアリルステアレート、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、２−エチルヘキサン酸トリグリセリド）が挙げられる。
【００３８】
乳化剤としては、例えば、ステアリルアルコール、グリセリルモノステアレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ジグリセリンモノステアリン酸エステル、ポリソルベート６０、ミリストイルメチル−β−アラニン（フィトステリル／デシルテトラデシル）が挙げられる。
【００３９】
安定化剤としては、例えば、球状ポリアクリル酸アルキル粉末、ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライト、アスコルビン酸、ピロ亜硫酸ナトリウム、ジェランガム、ペクチンが挙げられる。
ｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸塩緩衝剤、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミンが挙げられる。
保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸エチル、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、ソルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、フェノキシエタノールが挙げられる。
溶剤としては、例えば、アルギニン水溶液、精製水が挙げられる。
色素としては、例えば、赤２０２、黄色４、青色１、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄が挙げられる。
【００４０】
他の機能性成分としては、例えば、コウジ酸、リン酸トリオレイル、スクワラン、エチルヘキサン酸セチル、トコフェロール、マイカ、ビス（Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸・Ｎ−ラウロイル−サルコシン）ダイマージリノレイル、酢酸トコフェロール、チオタウリン、ハチミツ、ラウロイルサルコシンイソプロピル、ラウロイルリシン、タルク、ジブチルエチルヘキサノイルグルタミド、ジブチルラウロイルグルタミド、ベントナイト、タウリン、アルブチン、パンテノール、ナイアシンアミド、ピリドキシン塩酸塩、レチノール、カロチン、リボフラビン、ユビキノン、ヒアルロン酸ナトリウム、水溶性コラーゲン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、乳酸稈菌、乳発酵液、ホエイ、ヨーグルトエキス、加水分解カゼインナトリウム、ダイズ発酵エキス、塩化ベンザルコニウム、トリクロサン、サリチル酸、クエン酸、ビサボロール、塩化カルシウム、カプリル酸グリセリル、ミネラルオイル、ラウロイルグルタミン酸ナトリウム、コカミドＭＥＡ、コカミドメチルＭＥＡ、ポリビニルピロリドン、ココアンホ酢酸ナトリウム、ポリクオタニウム、グアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドが挙げられる。
天然物抽出物としては、例えば、ラベンダーエキス、ペパーミントエキス、セージエキス、アニスエキス、バラエキス、ヒノキ水、ルイボスエキス、ラベンダー抽出物、クララエキスが挙げられる。
アミノ酸（誘導体）としては、例えば、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ−リシン（塩酸塩）、Ｌ−アルギニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、グリシン、アセチルグルタミン、Ｌ−ヒスチジン、ピリドキシルセリン、カルノシン、アセチルメチオニン、アセチルシステイン、ポリアスパラギン酸ナトリウム、シトルリン、オルニチン、ベタイン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−メチオニンが挙げられる。
上記の他の基剤の含有量は、適宣設定すればよく、特に限定されるものではない。
【００４１】
本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の剤形は特に限定されないが、例えば、液体、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、プラスター、テープ製剤、粉末、化粧水、ジェルが挙げられる。中でも、乳液、クリーム、化粧水、又はジェルが挙げられ、これらのいずれかであることが好ましい。  
【００４２】
本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の使用部位は特に限定されなく、通常、皮膚、粘膜に適用される。中でも、好ましくは皮膚に使用される。そのため、本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の使用形態としては、例えば、水溶液、乳化物、粉末分散体、エマルジョン（水中油型、油中水型等）が挙げられる。より詳細には、液剤、油剤、ローション、ゲル、ゾル、乳液、懸濁液、クリーム、軟膏、貼付剤、スティック等が挙げられる。いわゆる化粧料としては、例えば、ローション、美容液等の化粧水；エモリエント乳液、ミルキーローション、ナリシング乳液、クレンジング乳液等の乳液；エモリエントクリーム、マッサージクリーム、クレンジングクリーム、メイクアップクリーム等のクリーム；スプレー；パック、ファンデーション、口紅、リップスティック、アイシャドウ、チーク、おしろい、カラーパウダー等のメイクアップ用化粧料、洗顔料、メイク落とし、ボディシャンプー、石鹸等の皮膚洗浄用化粧料が挙げられる。化粧料の他、医薬部外品、医薬品、食品（サプリメント、及び飲料を含む）として使用してもよい。
【００４３】
本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の乳液又はクリームとしての構成は、例えば、本発明の剤と、ポリオール群（ブチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、及びジプロピレングリコールからなる群から選択される少なくとも１種）と、界面活性剤群（グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、及びレシチン誘導体からなる群から選択される少なくとも１種）と、高級アルコール群（ベヘニルアルコール）と、増粘剤群（アクリル酸系ポリマー及びキサンタンガムの少なくともいずれか）と、紫外線吸収剤群（桂皮酸誘導体）と、紫外線散乱剤群（酸化チタン及び酸化亜鉛の少なくともいずれか）と、キレート剤群（エチレンジアミン四酢酸）と、防腐剤群（パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれか）と、シリコーンと、を含有する構成が挙げられる。
【００４４】
本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤の化粧水としての構成は、例えば、本発明の剤と、ポリオール群（ブチレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、及びソルビトールからなる群から選択される少なくとも１種）と、界面活性剤群（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種）と、増粘剤群（アクリル酸系ポリマー、キサンタンガム、及びセルロース系天然ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種）と、紫外線吸収剤群（桂皮酸誘導体）と、キレート剤群（エチレンジアミン四酢酸）と、防腐剤群（パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれか）と、シリコーンと、を含有する構成が挙げられる。
【００４５】
本発明の皮膚化粧料又は皮膚外用剤のジェルとしての構成は、例えば、本発明の剤と、ポリオール群（ブチレングリコール、グリセリン、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される少なくとも１種）と、界面活性剤群（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、及びポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルからなる群から選択される少なくとも１種）、増粘剤群（アクリル酸系ポリマー、キサンタンガム、及びセルロース系天然ポリマーからなる群から選択される少なくとも１種）と、紫外線吸収剤群（桂皮酸誘導体）と、キレート剤群（エチレンジアミン四酢酸）と、防腐剤群（パラベン及びフェノキシエタノールの少なくともいずれか）と、シリコーンと、を含有する構成が挙げられる。
【００４６】
本発明の美白剤及びメラニン産生関連タンパク質の産生抑制剤は、美白作用を通じて、加齢、紫外線、炎症等の原因によるしみ、そばかす、くすみの予防、抑制、治療に優れた効果を発揮することができる。
【００４７】
［３．評価方法］
本発明の評価方法は、被検者の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかを測定して被検者の肌の外観を確認すること、前記被検者の肌の色素沈着部位から角層を採取すること、角層に含まれる少なくとも１種のＤ−アミノ酸量を特定すること、前記肌の外観と前記Ｄ−アミノ酸量との関係を、被検者の結果の間で比較することを含む、Ｄ−アミノ酸による肌の評価方法である。
本発明の評価方法は、大別すると、次の２つの実施態様がある。一実施態様は、肌の外観と各成分との関係を、被検者（予備被検者）の結果の間で比較（同じ被検者の複数の結果の間での比較でもよいし、複数の異なる被検者の結果の間での比較でもよい）し、相関関係があるか否かを確認し、相関関係が確認された場合に、肌の外観とそのＤ−アミノ酸量との相関関係を被検者（予備被検者と同一でもよいし別でもよい）の肌の評価の指標として選抜する実施態様である。他の実施態様は、被検者に皮膚化粧料、皮膚外用剤、これらの候補物質等のサンプルを投与した前後の角質中のＤ−アミノ酸量を特定し、上記の相関関係に照らして得られた投与前後の肌の評価を比較して、サンプルの評価、又は、被検者の肌に対する有効性の評価を行う実施態様である。
【００４８】
被検者は、男性及び女性のいずれであってもよい。但し、美白に敏感であることから女性であることが好ましく、加齢によるしみ又はくすみに関心を持ちはじめる２０代若しくは３０代の女性、又は加齢によるしみ又はくすみのケアを行うことが多い４０代若しくは５０代の女性が更に好ましい。
【００４９】
本発明の評価方法において、肌の外観は、メラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかで確認してもよい。
しみ又はくすみのある人は、皮膚細胞の機能低下、中でも、紫外線暴露等の外部刺激によるメラノサイトのメラニン産生亢進、それに続くケラチノサイトへのメラニンの過剰輸送、蓄積を原因とする細胞機能（細胞分化増殖機能）の低下により、ケラチノサイトにおけるメラニン量が増加し易い。そのため、メラニンインデックスは、しみ及びくすみの無さ、すなわち肌の美白を評価する指標として用いられている。
Ｌ＊値は、色の明度を表す指標であり、０〜１００の数値で評価される指標として用いられている。０は黒色、１００は白の拡散色を示し、数値が高いほど美白効果に優れると言える。
【００５０】
メラニンインデックス及びＬ＊値の測定は、従来公知の方法で行えばよい。例えば、パルスキセノンランプを光源に用い４００〜７００ｎｍの範囲において反射光を測定できる分光測色計ＣＭ−７００ｄ（コニカミノルタ社製）及びデータ解析に肌解析ソフトウェアＣＭ−ＳＡの組み合わせを用いる測定が挙げられる。メラニンインデックスは少ない方が美白効果に優れているといえる。肌の外観は、Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社のＭｅｘａｍｅｔｅｒＭＸ１８を用いて、肌に６６０ｎｍ又は８８０ｎｍの波長の光を照射した際の反射された光から測定できるメラニンの濃さで評価してもよい。
【００５１】
肌の外観の測定部位は特に限定されるものではない。但し、紫外線等の外部刺激による過剰なメラニン産生を原因とするしみ、そばかす、くすみを評価する観点から、日常生活で外部にさらされる部位であることが好ましい。例えば、頬や腕が挙げられる。
測定箇所は、１か所であってもよく、２か所以上であってもよい。
【００５２】
角層は、肌の外観の色素沈着部位から、テープストリッピング法等の従来公知の方法で採取すればよい。テープストリッピング法とは皮膚に粘着テープを貼り付けて、粘着テープを剥がすことにより、粘着面に付着した角層を採取する方法である。
角層の採取方法としては、例えば、測定部位に市販の粘着テープを押し付けてはがした際に、粘着テープに付着した角層を採取する方法が挙げられる。市販の粘着テープとしては、例えば、アサヒバイオメッド社製角質チェッカー、モリテックス社製角層シール、ＰＲＯＭＯＴＯＯＬ社製角質チェッカー（ディスクタイプＷ、ディスクタイプＧ、ＰＲＯタイプ）、Ｉｎｔｅｇｒａｌ社製Ｃｏｒｎｅｏｆｉｘ、３Ｍ社製透明テープ、３Ｍ社製透明両面テープ、ニチバン社製セロテープ（登録商標）が挙げられる。
【００５３】
Ｄ−アミノ酸量を特定する方法は、特に限定されず、例えば、直接法（プレカラム誘導体化した後、キラル固定相カラムを用いるクロマトグラフィーで分離する方法）、又は間接法（キラルな誘導体化試薬でジアステレオマーに誘導体化した後、逆相カラムを用いるクロマトグラフィーで分離する方法）が挙げられる。
直接法としては、例えば、ＮＢＤ−Ｆでプレカラム蛍光誘導体化をした後、キラルカラムで分離して蛍光検出する方法が挙げられる。詳細には、“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ａｌｉｐｈａｔｉｃ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉ−ｌｏｏｐ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｏｌｕｍｎ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｌｕｍｎｓ．”  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ．  ２００７  Ｍａｒ  ２；１１４３（１−２）：１０５−１１．  Ｈａｍａｓｅ  Ｋ，  Ｍｏｒｉｋａｗａ  Ａ，  Ｏｈｇｕｓｕ  Ｔ，  Ｌｉｎｄｎｅｒ  Ｗ，  Ｚａｉｔｓｕ  Ｋ．を参照し得る。
間接法として、例えば、ＯＰＡとキラルチオールで誘導体化して逆相カラムで分離し、蛍光検出する方法、及びＤＢＤ−ＰｙＮＣＳで誘導体化して逆相カラムで分離して、質量分析計で検出する方法が挙げられる。詳細には、“Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｓａｋｅ．”  Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２０１１  Ｎｏｖ  １；８７９（２９）：３２５９−６７．  Ｇｏｇａｍｉ  Ｙ，  Ｏｋａｄａ  Ｋ，  Ｏｉｋａｗａ  Ｔ．“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＬ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，  ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒ（−）−４−（３−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ）−７−（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−２，１，３−ｂｅｎｚ  ｏｘａｄｉａｚｏｌｅ，  ｉｎ  ｎａｉｌ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｙ  ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ”  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ，  ８７９，  ３２２０−３２２８  （２０１１）．  Ｊ．Ｚ．  Ｍｉｎ，  Ｓ．  Ｈａｔａｎａｋａ，  Ｈ．Ｆ．  Ｙｕ，  Ｔ．  Ｈｉｇａｓｈｉ，  Ｓ．  Ｉｎａｇａｋｉ，  Ｔ．  Ｔｏｙｏ’ｏｋａを参照し得る。
【００５４】
特定対象であるＤ−アミノ酸は、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種を含むことが好ましい。
上記のより好ましいＤ−アミノ酸は、２０代から３０代、及び４０代から５０代の少なくともいずれかの年代の女性の肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと相関関係を有する成分であることが、本発明の評価方法から確認し得る。
本発明のＤ−アミノ酸による肌の評価方法の一実施態様により、特定のＤ−アミノ酸と肌の外観との相関について新たな知見がもたらされる。そのため本発明の評価方法は、天然物に由来する美白剤等の皮膚化粧料、又は皮膚外用剤の開発へ応用し得る。
【００５５】
より詳細に、被検者の年代とＤ−アミノ酸の種類として以下のことが言える。被検者が、２０代又は３０代の女性である場合、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００５６】
被検者が、４０代又は５０代の女性である場合、Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−Ｔｙｒからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００５７】
Ｄ−アミノ酸量の特定方法は、特に限定されない。例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）又はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いる質量分析法、定量用酵素を用いる酵素法、バイオアッセイ法が挙げられる。
上述した中でも、Ｄ−アミノ酸の特定と含有量の測定を同時に行うことができるので、液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析計が好ましい。
【００５８】
Ｄ−アミノ酸量は、角層に含まれるタンパク質量あたりのＤ−アミノ酸含有量であることが好ましい。これにより、角層の採取方法に由来する実験誤差を低減することができる。
タンパク質量の測定方法は、特に限定されず、例えば、紫外吸収法、ＢＣＡ法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビューレット法等の分光光度計を用いた測定方法、電気泳動による測定方法が挙げられる。中でも、ＢＣＡ法が好ましい。
【００５９】
本発明のＤ−アミノ酸による肌の外観の評価方法によれば、肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の少なくともいずれかと、Ｄ−アミノ酸量との関係が、複数の被検者から得られ、これらを比較することで、肌の外観と相関するＤ−アミノ酸を特定し得る。
【００６０】
本発明のＤ−アミノ酸による肌の外観の評価方法を用いることで、Ｄ−アミノ酸の含有量により肌の外観を評価し得る。そのため、同一被検者を対象として、皮膚化粧料又は皮膚外用剤等のサンプルを投与した前後において、相関関係が認められたＤ−アミノ酸の含有量を比較することで、対象者へのサンプルの有効性を確認できる。そのため、対象者に適切な皮膚化粧料又は皮膚外用剤であるか否かを確認する方法としても利用し得る。
本発明のＤ−アミノ酸による肌の外観の評価方法の他の実施態様により、皮膚化粧料又は皮膚外用剤を投与する前後で、従来の測定方法のようにメラニンインデックスの低下又はＬ＊値の増加による短期的な評価のみならず、投与直後にはメラニンインデックスの低下又はＬ＊値の増加が観測されなくても、Ｄ−アミノ酸の含有量により長期的にメラニンインデックスの低下又はＬ＊値の増加を予想し、美白効果の可能性があるか否かを評価することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本実施例により本発明が限定されるものではない。【００６２】
（メラニンインデックス及びＬ＊値の測定）
被検者は洗顔した後、恒温恒湿室（湿度４０％、室温２０℃）にて２０分間馴化した。【００６３】
馴化後、分光測色計ＣＭ−７００ｄ（コニカミノルタ社製）及びデータ解析に肌解析ソフトウェアＣＭ−ＳＡを用いて、被検者の頬中央部を測定した。【００６４】
（テープストリッピング法による角層採取）
上記測定終了後、被検者の頬中央部に３ｃｍ×３ｃｍにカットしたテープを貼付し、角層を採取した。１回目に採取した最表層の角層は分析には利用せず、２回目以降に採取した角層を分析に利用した。【００６５】
（Ｄ−アミノ酸抽出操作）
被検者（全員女性、年齢構成：２０−３０代  ３１名、４０−６０代  ４０名：合計人数  ７１名）の肌状態（メラニンインデックス及びＬ＊値）を測定した同じ部位の顔面頬部にテープ（３×３ｃｍ２）を貼り、テープストリッピング法により角層を採取した。採取した１層目の角層は分析には使用せず、分析は２あるいは３層目を利用した。採取したテープは、コニカルチューブ（５０ｍｌ）に入れて密閉し、−８０℃にて保存した。【００６６】
採取した角層を、９５％メチルアルコール水溶液を用いて超音波処理を２回繰り返し、水溶成分を抽出した。抽出液には内部標準液（Ｄ−Ａｒｇ等複数種のＤ，Ｌ−アミノ酸安定同位体を含む）を添加して行った。得られたメチルアルコール水溶液は、遠心エバポレーターで乾固し、Ｄ−アミノ酸分析用のサンプルとした。【００６７】
（Ｄ−アミノ酸の定量分析）
濃縮乾固したサンプルに５０μＬの水を添加してボルテックスミキサーで撹拌して再溶解し、サンプル溶液とした。２０μＬのサンプル溶液に、濃度２００ｍＭのほう酸緩衝液（ｐＨ８．８）を１０μＬ加えて撹拌した後、５ｍｇ／ｍＬの（Ｒ）−Ｎ−（ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｃａｒｂａｍａｔｅ）−β−（３−ｐｙｒｉｄｙｌ）−ａｌａｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ／アセトニトリル溶液を２０μＬ加えて室温で１０分間反応させた。反応溶液に０．１Ｍ塩酸水溶液を６０μＬ添加して分析サンプルとした。分析にはＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用い、以下の条件で分析した。【００６８】
（ＨＰＬＣ条件）
装置          ：Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２（島津製作所製）
ガードカラム  ：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８  ＶａｎＧｕａｒｄ
（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ）
カラム        ：Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８
（２．１×１００ｍｍ、１．７μｍ）
移動相Ａ      ：１０ｍＭ重炭酸アンモニウム水溶液（ｐＨ９．５）
移動相Ｂ      ：８０％メタノール／水
流速          ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度    ：５０℃
サンプル注入量：１μＬ【００６９】
グラジエント条件を表１に示す。
【表１】
2018173816.tif 000002
【００７０】
（質量分析計条件）
装置          ：Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ６５００（ＳＣＩＥＸ）
イオン化法    ：ＥＳＩ、  Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード
スキャンタイプ：ＳＲＭ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）【００７１】
トランジッションを表２に示す。
【表２】
2018173816.tif 000003
【００７２】
（タンパク質抽出）
水溶成分を抽出した後の上記テープをマイクロチューブに入れ、ヘキサンを用いて不溶画分を溶出した。テープを除去した後、不溶画分をヘキサンにて洗浄し、タンパク質定量分析用サンプルとした。【００７３】
（タンパク質定量分析）
上記「Ｄ−アミノ酸抽出操作」にて利用したチューブ等に、ＮａＯＨ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）−ＳＬＳ（０．０５ｗｔ％）水溶液を加え、６０分間、９０℃で加熱した。これらの溶液に溶出されたタンパク質を定量した。【００７４】
タンパク質の定量には、Ｍｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を利用し、ＭｉｃｒｏＢＣＡ法を実施した。サンプル溶液とＭｉｃｒｏＢＣＡ溶液を同量加え、１時間、５０℃で加熱振とう（１１００ｒｐｍ）した。分光器にて、吸光度（５６２ｎｍ）を測定してタンパク質を定量した。【００７５】
評価方法の実施例及び比較例
表３に、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒの角層中の含有量と肌のメラニンインデックス及びＬ＊値の相関を示す。相関係数の絶対値が０．３以上を「中程度の相関」として「Ａ」と評価し、０．２以上を「弱い相関」として「Ｂ」と評価した。
【表３】
2018173816.tif 000004
【００７６】
表３からわかるように、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、及びＤ−ＴｙｒのＤ−アミノ酸の角層中の含有量は、若い女性及び年配女性の少なくともいずれかと肌のメラニンインデックスに相関が認められた。また、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ、及びＤ−ＬｙｓのＤ−アミノ酸の角層中の含有量は、若い女性及び年配女性の少なくともいずれかと肌のＬ＊値に相関が認められた。【００７７】
メラニンインデックスと、Ｄ−アミノ酸の含有量と、を比較したプロットを図１及び２に示し、Ｌ＊値と、Ｄ−アミノ酸の含有量と、を比較したプロットを図３及び４に示す。図１〜４において、アミノ酸含有量は、上記「Ｄ−アミノ酸の定量分析」にて求めたアミノ酸含有量を上記「タンパク質定量分析」にて求めたタンパク質量で除した値である。【００７８】
美白剤の実施例１〜４
（正常ヒト表皮色素細胞を用いた、Ｄ−アミノ酸の「美白」に関する遺伝子発現試験）
正常ヒト表皮色素細胞（ライフテクノロジーズ社）を、Ｍｅｄｉｕｍ  ２５４（ライフテクノロジーズ社）（ＨＭＧＳ特注増殖添加剤セット含有（クラボウ社））にて３７℃、５％ＣＯ２、飽和蒸気下で培養した。コンフルエント状態になった細胞を、６ウェルプレートに３．０×１０５（ｃｅｌｌｓ／ウェル）の播種密度で播種した。【００７９】
評価サンプルは、各Ｄ−アミノ酸を５００μＭになるように上記培地にて調整したものを利用した。播種翌日、各評価サンプルを５００μＭに調整し、各ウェル培地を交換した。２４時間培養し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（サーモフィッシャー社）を用いてｃＤＮＡに合成した。このｃＤＮＡを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲ法（７５００  ｆａｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社））により、サンプル添加群とコントロール群とを比較し遺伝子発現量の増減を評価した。チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質１の少なくともいずれかの遺伝子発現量を評価した。結果を表４に示す。表４中、ＴＹＲはチロシナーゼを、ＴＲＰ１はチロシナーゼ関連タンパク質１を、ＭＣ１Ｒはメラノコルチン１レセプターを示す。
【表４】
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【００８０】
表４から、Ｄ−Ａｓｎを用いた場合、１００μＭの濃度で、メラノコルチン１レセプター遺伝子、５００μＭの濃度で、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子の発現量の減少が認められた。また、Ｄ−Ｐｈｅを用いた場合、５００μＭの濃度で、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子の発現量の減少が認められた。さらに、Ｄ−Ｔｒｐを用いた場合、５００μＭの濃度でチロシナーゼ関連タンパク質１遺伝子の発現量の減少が認められた。【００８１】
図５は、Ｄ−Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図６は、Ｄ−Ａｓｎ（実施例２）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図７は、Ｄ−Ａｓｎ（実施例１）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（メラノコルチン１レセプター）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図８は、Ｄ−Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。図９は、Ｄ−Ｐｈｅ（実施例３）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。さらに、図１０は、Ｄ−Ｔｒｐ（実施例４）のメラニン産生関連タンパク質遺伝子（チロシナーゼ関連タンパク質１）の増幅量（コントロールの増幅量に対する相対値）を示すグラフである。【００８２】
これらの結果は、Ｄ−アミノ酸がメラニン産生関連タンパク質の産生を抑制し、美白剤の有効成分として有用であることを示している。【００８３】
実施例５
（細胞毒性試験：ニュートラルレッド法）
正常ヒト表皮色素細胞を６ウェルプレートに播種し、翌日、Ｄ−アミノ酸（５００μＭ）を、細胞の培養用培地にて調整したサンプルを添加した。２４時間後、プレートから評価サンプル溶液を取り除き、各ウェルを２ｍｌの細胞の培地を用いてリンスした。ＮＲ（ニュートラルレッド（クラボウ社））入り培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌで滴下し、２時間、３７℃、５％ＣＯ２、飽和蒸気下で静置した。【００８４】
培地（ニュートラルレッド入り）を捨て、洗浄固定液（２ｗｔ％塩化カルシウム溶液及び２ｗｔ％ホルマリン溶液を等量で混合）を２ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、１分間静置後、洗浄固定液を取り除いた。ＮＲ抽出液（５０容量％エチルアルコール、１容量％酢酸）２ｍｌ／ｗｅｌｌを添加し、プレートシェイカーにて１５分間震蕩した。生細胞へのＮＲの取り込みは、マイクロプレートリーダー（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でＮＲ抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定することにより調べた。コントロール（サンプル添加なし）のＮＲ抽出液の測定値（吸光度）を１００％と規定した場合の、所定濃度の各サンプル添加細胞のＮＲ抽出液の吸光度を相対％にすることにより、各サンプルの細胞毒性を算出した。評価結果を図１１に示す。【００８５】
図１１から、５００μＭの濃度では、各Ｄ−アミノ酸成分は、細胞毒性がないことがわかる。従って、細胞毒性の無い濃度において、Ｄ−アミノ酸が各種メラニン産生関連タンパク質の遺伝子発現量を低減し得ることを見出した。【００８６】
実施例６
（黒色メラニン産生抑制試験１）
Ｂ１６メラノーマ細胞をＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（高グルコース、血清１０％含有）にて培養した。コンフルエントになった細胞を、トリプシンにて剥がし、９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞がプレートに接着後、各評価サンプル（コントロール（サンプル添加なし）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｃｙｓ、Ｄ−Ｔｒｐのいずれか））を所定評価濃度（１ｍＭあるいは５ｍＭ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース、血清１０％含有、フェノールレッド不含）と培地交換し、３日間培養した。プレートシェーカーにて９６ウェルプレートを５分間震とうし、４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて測定した。コントロール（サンプル添加なし）の測定値（吸光度）を１００％と規定した場合の、各サンプル所定濃度添加３日後の吸光度を相対％にすることにより、コントロール中の黒色メラニン量を１００％とした場合の、各サンプルの黒色メラニン産生率を算出した。結果を図１２〜１５に示す。【００８７】
図１２〜１５から、各サンプルの１ｍＭ又は５ｍＭの評価濃度において添加により細胞の黒色メラニン産生率が低下することがわかる。【００８８】
実施例７
（細胞毒性試験（ニュートラルレッド法））
実施例６にて吸光度を測定した後、プレートから評価サンプル溶液を取り除き、各ウェルを２００μｌのＤＭＥＭ（高グルコース、血清１０％含有）を用いてリンスした。ＮＲ（ニュートラルレッド）（０．５％）入り培地を２００μｌ／ｗｅｌｌで滴下し、２時間、３７℃、５％ＣＯ２、飽和蒸気下で静置した。培地を捨て、洗浄固定液（２ｗｔ％塩化カルシウム溶液及び２ｗｔ％ホルマリン溶液を等量で混合）を２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、１ｍｉｎ静置後、洗浄固定液を取り除いた。ＮＲ抽出液（酢酸酸性エタノール）２００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、プレートシェイカーにて１５ｍｉｎ震とうした。生細胞へのＮＲの取り込みは、マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でＮＲ抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定することにより調べた。コントロール（サンプルなし）のＮＲ抽出液の測定値（吸光度）を１００％と規定した場合の、所定濃度の各サンプル添加細胞のＮＲ抽出液の吸光度を相対％にすることにより、各サンプルの細胞生存率を算出した。結果を図１６〜１９に示す。【００８９】
図１６〜１９から、１ｍＭ又は５ｍＭの評価濃度において各サンプルの細胞毒性はいずれも低いことがわかる。実施例６及び７の結果は、各サンプルがメラニン産生抑制活性を示し、かつ細胞毒性が低いことを示している。【００９０】
実施例８
（チロシナーゼ活性抑制試験）
正常ヒト色素細胞をＭｅｄｉｕｍ２５４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＨＭＧＳ特注増殖添加剤セット（倉敷紡績株式会社製）を添加した培地にて培養した。コンフルエントになった細胞を、トリプシンにて剥がし、６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞がプレートに接着後、前述の培地からホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）を除いた培地で培地交換した。さらに４８時間後、各評価サンプル（コントロール（サンプル添加なし）、Ｄ−アミノ酸）を所定濃度（１ｍＭあるいは５ｍＭ）で添加したＰＭＡを除いた培地と交換し、３日間培養した。培地を除き、１／１５に希釈したＰＢＳでリンスした。溶解液（１ｗｔ％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１／１５に希釈したＰＢＳ）を２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、プレートシェイカーにて５ｍｉｎ震とうした。ピペッティングにより細胞を溶解、撹拌した溶解液をマイクロチューブに回収し、２０μｌをタンパク質定量用に分注した。残りの溶解液を遠心分離（９１００ｇ、４℃、５ｍｉｎ）し、上清４０μｌを９６ウェルプレートに添加した。この９６ウェルプレートにＬ−ＤＯＰＡ溶液（２ｍｇ／ｍｌ、１／１５に希釈したＰＢＳ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃に加温しながら、１ｍｉｎ毎に４９０ｎｍの吸光度を測定した。測定中は定期的にプレートリーダーによって９６ウェルプレートを撹拌した。測定した吸光度から最大メラニン産生速度（単位時間当たりの吸光度の変化）を算出し、コントロール（サンプルなし）の最大メラニン産生速度を１００％と規定した場合の、所定濃度の各Ｄ−アミノ酸添加細胞の最大メラニン産生速度を相対％にすることにより、各Ｄ−アミノ酸のメラニン産生速度率を算出した。結果を図２０〜２４に示す。【００９１】
図２０〜２４から、各サンプルの添加により細胞のメラニン産生速度が低下することがわかる。【００９２】
実施例９
（タンパク質定量）
実施例８のチロシナーゼ活性抑制試験にて分注した細胞溶解液（２０μｌ）にＭｉｌｌｉＱ水（８０μｌ）を添加し、１００μｌとした。この溶液中のタンパク質量を、ＤＣプロテインアッセイ（バイオ・ラッド社製）を使用して定量した。測定は、サンプル溶液１００μｌに対して、Ａ液１００μｌ、Ｂ液８００μｌを混和して行った。コントロール（サンプルなし）のタンパク質量を１００％と規定した場合の、所定濃度の各Ｄ−アミノ酸添加でのタンパク質量の相対％を算出した。結果を図２５〜２９に示す。【００９３】
図２５〜２９から、各サンプルのタンパク質量はいずれも９５％以上であった。実施例８及び９の結果は、各サンプルがチロシナーゼ活性抑制効果を有し、かつ細胞毒性が低いことを示している。【００９４】
（処方例１；美容液）
【表５】
2018173816.tif 000006
【００９５】
（処方例２；クリーム）
【表６】
2018173816.tif 000007
【００９６】
（処方例３；乳液）
【表７】
2018173816.tif 000008
【００９７】
（処方例４；口紅）
【表８】
2018173816.tif 000009
【００９８】
（処方例５；軟膏）
【表９】
2018173816.tif 000010
【００９９】
（処方例６；日焼け止め）
【表１０】
2018173816.tif 000011
【０１００】
（処方例７；化粧水）
【表１１】
2018173816.tif 000012
【０１０１】
（処方例８；ジェリー状パック）
【表１２】
2018173816.tif 000013
【０１０２】
表１２中のＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の詳細を表１３に記す。
【表１３】
2018173816.tif 000014
【０１０３】
（処方例９；ｏ／ｗ型ファンデーション）
【表１４】
2018173816.tif 000015
【０１０４】
（処方例１０；メイククレンジング）
【表１５】
2018173816.tif 000016
【０１０５】
（処方例１１；洗顔フォーム）
【表１６】
2018173816.tif 000017
【０１０６】
（処方例１２；ボディシャンプー）
【表１７】
2018173816.tif 000018
【図１】
2018173816.tif 000019
【図２】
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【図３】
2018173816.tif 000021
【図４】
2018173816.tif 000022
【図５】
2018173816.tif 000023
【図６】
2018173816.tif 000024
【図７】
2018173816.tif 000025
【図８】
2018173816.tif 000026
【図９】
2018173816.tif 000027
【図１０】
2018173816.tif 000028
【図１１】
2018173816.tif 000029
【図１２】
2018173816.tif 000030
【図１３】
2018173816.tif 000031
【図１４】
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【図１５】
2018173816.tif 000033
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2018173816.tif 000039
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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