(57)【要約】  本発明は神経機能の維持または回復に用いるための組成物の提供を目的とする。本発明によれば、１〜３量体のポリフェノール成分およびその代謝物からなる群から選択される１種または２種以上の成分、あるいはカカオポリフェノールを有効成分として含んでなる、神経機能の維持および／または回復に用いるための組成物が提供される。本発明の組成物は油脂加工食品の形態で提供することができる。本発明の組成物はまた、神経変性疾患の治療、予防または改善に用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化１】
2019054461.tif 000028
（上記式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、水素原子、メチル基またはグルクロン酸残基を表し、Ｒ１およびＲ２は同一または異なっていてもよく、Ｒ３は水素原子またはグルクロン酸残基を表し、
Ｘは、水素原子、下記基（II）：
【化２】
2019054461.tif 000029
、下記基（III）：
【化３】
2019054461.tif 000030
または下記基（IV）：
【化４】
2019054461.tif 000031
を表し、波状の結合はＲ配置またはＳ配置を表す。）
を有効成分として含んでなる、神経機能の維持および／または回復に用いるための組成物。
【請求項２】
カカオポリフェノールを有効成分として含んでなる、神経機能の維持および／または回復に用いるための組成物。
【請求項３】
カカオポリフェノールが、１〜３量体のポリフェノール類を少なくとも８質量％含むものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
カカオポリフェノールが、エピカテキンおよびプロシアニジンＢ２を少なくとも５質量％含むものである、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
プロシアニジンＢ２に対するエピカテキンの含有量比率が１〜３である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
油脂加工組成物の形態である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記疾患または症状が、神経変性疾患または認知機能の低下である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１において定義された有効量の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいは有効量のカカオポリフェノールを、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、神経機能の維持および／または回復方法。
【請求項１０】
請求項１において定義された有効量の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいは有効量のカカオポリフェノールを、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善方法。
【請求項１１】
神経機能の維持および／または回復に用いるための、請求項１において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノール。
【請求項１２】
神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、請求項１において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノール。
【請求項１３】
神経機能の維持または回復剤の製造のための、あるいは、神経機能の維持または回復剤としての、請求項１において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノールの使用。
【請求項１４】
神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤の製造のための、あるいは、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤としての、請求項１において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノールの使用。
【請求項１５】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を２〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含有する神経細胞培養培地において、被験試料存在下および被験試料非存在下で神経細胞を培養する工程を含んでなる、神経機能を維持および／または回復しうる物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本願は、先行する日本国出願である特願２０１７−１７７３７６（出願日：２０１７年９月１５日）の優先権の利益を享受するものであり、その開示内容全体は引用することにより本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、神経機能の維持または回復用組成物に関し、詳細には、カカオポリフェノールまたはポリフェノール成分を有効成分として含んでなる、神経機能維持または回復用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
加齢に伴い脳神経細胞ではシナプス密度の減少、神経突起の退縮、神経細胞の脱落がおこり、記憶障害などが認められるようになる。また、アルツハイマー病やパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患は、病理学的には脳内への異常タンパク質の蓄積と神経細胞死を特徴としている。さらに、神経細胞死に先立ち、神経突起の変性・減少が多くの疾患で観察されている。神経突起の変性は、神経変性疾患症状の引き金になることが知られており、神経突起の変性を抑止することが神経変性疾患の症状改善と、病気の進行の抑制につながると期待されている。【０００４】
しかし、現在、これらの疾患に対する治療法としては対症療法のみであり、神経細胞死を抑制し、機能を維持できるような根幹的な治療法は確立されていない。特許文献１には、プロシアニジンＢ２、プロシアニジンＢ４、プロシアニジンＣ１などのポリフェノール成分により２型糖尿病アミロイド原線維を破壊することが開示されているが、神経突起の変性や減少の抑制などは示唆されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５０５４９７号公報
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、神経機能の維持または回復に用いるための組成物と、神経機能の維持または回復剤を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、カカオポリフェノールが豊富なカカオ豆抽出物に神経機能を維持または回復する効果があり、特に、カカオ豆抽出物の低分子画分においてその効果が顕著であることを見出した。本発明者らはまた、ポリフェノール成分のうち、特に、カテキン、エピカテキン、プロシアニジンＢ２に神経機能を維持または回復する効果が認められることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【０００８】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］下記式（Ｉ）で表される化合物またはその塩（本明細書において、「本発明のポリフェノール成分」ということがある）：
【化１】
2019054461.tif 000002
（上記式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、水素原子、メチル基またはグルクロン酸残基を表し、Ｒ１およびＲ２は同一または異なっていてもよく、Ｒ３は水素原子またはグルクロン酸残基を表し、Ｘは、水素原子、下記基（II）：
【化２】
2019054461.tif 000003
、下記基（III）：
【化３】
2019054461.tif 000004
または下記基（IV）：
【化４】
2019054461.tif 000005
を表し、波状の結合はＲ配置またはＳ配置を表す。）
を有効成分として含んでなる、神経機能の維持および／または回復に用いるための組成物ならびに神経機能の維持および／または回復剤。
［２］カカオポリフェノールを有効成分として含んでなる、神経機能の維持および／または回復に用いるための組成物および用剤。
［３］カカオポリフェノールが、１〜３量体のポリフェノール類を少なくとも８質量％含むものである、上記［２］に記載の組成物および用剤。
［４］カカオポリフェノールが、エピカテキンおよびプロシアニジンＢ２を少なくとも５質量％含むものである、上記［２］または［３］に記載の組成物および用剤。
［５］プロシアニジンＢ２に対するエピカテキンの含有量比率が１〜３である、上記［４］に記載の組成物および用剤。
［６］油脂加工組成物の形態である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［７］神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の組成物および用剤。
［８］前記疾患または症状が、神経変性疾患または認知機能の低下である、上記［７］に記載の組成物および用剤。
［９］上記［１］において定義された有効量の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいは有効量のカカオポリフェノールを、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、神経機能の維持および／または回復方法。
［１０］上記［１］において定義された有効量の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいは有効量のカカオポリフェノールを、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善方法。
［１１］神経機能の維持および／または回復に用いるための、上記［１］において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノール。
［１２］神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための、上記［１］において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノール。
［１３］神経機能の維持または回復剤の製造のための、あるいは、神経機能の維持または回復剤としての、上記［１］において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノールの使用。
［１４］神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤の製造のための、あるいは、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤としての、上記［１］において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノールの使用。
［１５］脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を２〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含有する神経細胞培養培地において、被験試料存在下および被験試料非存在下で神経細胞を培養する工程を含んでなる、神経機能を維持および／または回復しうる物質のスクリーニング方法。
［１６］上記［１］において定義された有効量の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいは有効量のカカオポリフェノールを有効成分として含んでなる、神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減用組成物および神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減剤。
［１７］上記［１］において定義された有効量の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいは有効量のカカオポリフェノールを、それを必要とする対象に投与することを含んでなる、神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減方法。
［１８］神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減に用いるための、上記［１］において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノール。
［１９］神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減剤の製造のための、あるいは、神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減剤としての、上記［１］において定義された式（Ｉ）で表される化合物またはその塩あるいはカカオポリフェノールの使用。
【０００９】
上記［１］および［１６］の組成物を本明細書において「本発明の組成物」と、上記［１］および［１６］の用剤を本明細書において「本発明の用剤」と、それぞれいうことがある。
【００１０】
本発明の組成物および用剤は、長年食品の原料として用いられてきたカカオに含まれるポリフェノールを利用するものであることから、神経機能の維持または回復等を期待して長期間にわたって服用しても副作用が少なく、安全性が高い点において有利である。
【発明の具体的説明】
【００１１】
本発明の有効成分である上記式（Ｉ）で表される化合物およびその塩は、ポリフェノール成分に対応する。式（Ｉ）中、Ｘが水素原子を表すときは、式（Ｉ）の化合物は単量体である。式（Ｉ）中、Ｘが基（II）または基（IV）を表すときは、式（Ｉ）の化合物は２量体であり、Ｘが基（III）を表すときは、式（Ｉ）の化合物は３量体である。
【００１２】
Ｘが水素原子である式（Ｉ）の化合物（単量体）としては下記のものが挙げられる。
【００１３】
（＋）−エピカテキンおよびその代謝物
【化５】
2019054461.tif 000006
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉ）で定義された内容と同義である。）
【００１４】
（−）−エピカテキンおよびその代謝物
【化６】
2019054461.tif 000007
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉ）で定義された内容と同義である。）
【００１５】
（＋）−カテキンおよびその代謝物
【化７】
2019054461.tif 000008
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉ）で定義された内容と同義である。）
【００１６】
（−）−カテキンおよびその代謝物
【化８】
2019054461.tif 000009
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、式（Ｉ）で定義された内容と同義である。）
【００１７】
Ｘが水素原子以外の基である式（Ｉ）の化合物（２量体または３量体）としては下記のものが挙げられる。
【００１８】
プロシアニジンＢ２およびその代謝物
【化９】
2019054461.tif 000010
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）で定義された内容と同義である。）
【００１９】
プロシアニジンＣ１およびその代謝物
【化１０】
2019054461.tif 000011
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）で定義された内容と同義である。）
【００２０】
プロシアニジンＢ５およびその代謝物
【化１１】
2019054461.tif 000012
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は、式（Ｉ）で定義された内容と同義である。）
【００２１】
本発明のポリフェノール成分には、ポリフェノールの代謝物が含まれる。このような代謝物としては、メチル化体やグルクロン酸抱合体が挙げられ、具体的には、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のいずれか１つがグルクロン酸残基：
【化１２】
2019054461.tif 000013
であり、残りが同一または異なっていてもよく、グルクロン酸残基以外の基（すなわち、水素原子あるいはメチル基）である式（Ｉ）の化合物、Ｒ１およびＲ２のいずれか１つがメチル基であり、他方が水素原子であり、Ｒ３が水素原子である式（Ｉ）の化合物、Ｒ１およびＲ２の両方がメチル基であり、Ｒ３が水素原子である式（Ｉ）の化合物が挙げられる。
【００２２】
本発明のポリフェノール成分には、式（Ｉ）の化合物の塩が含まれる。このような塩としては、食品として許容される塩または薬学的に許容される塩が挙げられ、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩のようなアルカリ金属塩や、カルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩が挙げられる。
【００２３】
本発明においては、カカオの植物体またはその加工品から抽出あるいは精製した成分や、ポリフェノールを摂取したヒトまたは非ヒト動物の排泄物（例えば、尿）から抽出あるいは精製した成分を本発明のポリフェノール成分として使用することができる。抽出方法や精製方法は公知であり、当業者であれば市販の試薬および装置や適切な方法を選択して実施することができる。本発明のポリフェノール成分のうち代謝物やその誘導体については、Free Rad Biol Med (2003)34:840-849を参照することができる。本発明においてはまた、化学合成法によって調製した成分や市販品を本発明のポリフェノール成分として使用することができる。
【００２４】
本発明において「カカオポリフェノール」は、カカオに含まれるポリフェノールを意味する。従って、典型的には、カカオの植物体またはその加工品から抽出（粗抽出を含む）あるいは精製（粗精製を含む）したカカオのポリフェノールを、本発明の有効成分として使用することができるが、化学合成法によって調製したポリフェノールをカカオポリフェノールの一部または全部として使用してもよい。ここで、カカオポリフェノールとしては、例えば、カテキン、エピカテキン、クロバミド等の単量体や、カテキン等が重合してなるプロシアニジン、タンニン等のオリゴマー（二量体以上）が挙げられる。
【００２５】
本発明において、カカオポリフェノールの原料となりうるカカオの植物体またはその加工品としては、カカオ樹皮、カカオ葉、カカオ豆、カカオシェル、カカオマス、脱脂カカオマス、ココアパウダー等、植物体の各種部位またはカカオ豆加工品を挙げることができる。カカオマスは、カカオ豆を磨砕したものであり、脱脂カカオマスは、カカオマスから油脂を除去することにより得ることができる。油脂の除去方法は特に制限されず、圧搾などの公知の方法に従って行うことができる。脱脂カカオマスを粉砕すればココアパウダーとなる。また、カカオの植物体またはその加工品を原料として抽出を行う場合は、抽出効率の観点から、磨砕、粉砕等の微粒化処理が施されているカカオマスやココアパウダーを用いるのが好ましい。なお、カカオの植物体には、意図してないしは意図せずに、カカオの植物体以外の物も含めることができる。また、カカオの植物体またはその加工品を原料として抽出を行う際にも、意図してないしは意図せずに、カカオの植物体以外の物も含めることができる。さらに、カカオマスまたはココアパウダーにも、意図してないしは意図せずに、カカオの植物体以外の物も含めることができる。
【００２６】
カカオの植物体またはその加工品を原料とする抽出方法は公知であり、例えば、特開２００９−１８３２２９号公報や特開２０１１−９３８０７号公報の記載に従ってカカオポリフェノール含有組成物を調製することができる。抽出溶媒は、特に限定されるものではないが、水またはエタノール等のアルコールを用いることが好ましい。また、カカオの植物体またはその加工品を原料とする精製方法は、合成吸着剤、イオン交換樹脂、限外ろ過、活性白土処理等の公知の方法を使用することができ、特に限定されるものではない。
【００２７】
本発明において、カカオポリフェノールは、カカオポリフェノールの総質量に対し１〜３量体のポリフェノールを８質量％以上（例えば、８〜９９質量％）含むことができ、好ましくは９質量％以上（例えば、９〜９９質量％）、より好ましくは１０質量％以上（例えば、１０〜９９質量％）含むことができる。
【００２８】
本発明において、カカオポリフェノールは、カカオポリフェノールの総質量に対し１〜２量体のポリフェノールを７質量％以上（例えば、７〜９９質量％）含むことができ、好ましくは８質量％以上（例えば、８〜９９質量％）、より好ましくは９質量％以上（例えば、９〜９９質量％）含むことができる。
【００２９】
本発明において、カカオポリフェノールは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などの手段を用いて分画した分画物を用いてもよく、低分子画分が好ましい。カカオポリフェノールの低分子画分は、カカオポリフェノールの総質量に対し１〜３量体のポリフェノールを３０質量％以上（例えば、３０〜９９質量％）含むことができ、好ましくは４０質量％以上（例えば、４０〜９９質量％）、より好ましくは５０質量％以上（例えば、５０〜９９質量％）含むことができる。カカオポリフェノールの低分子画分はまた、カカオポリフェノールの総質量に対し１〜２量体のポリフェノールを３０質量％以上（例えば、３０〜９９質量％）含むことができ、好ましくは、４０質量％以上（例えば、４０〜９９質量％）含むことができる。
【００３０】
本発明において、カカオポリフェノールは、エピカテキンおよびプロシアニジンＢ２を少なくとも含むものとすることができる。この場合、カカオポリフェノール中のエピカテキンおよびプロシアニジンＢ２の含有量は少なくとも５質量％（好ましくは少なくとも７質量％、より好ましくは少なくとも９質量％）とすることができる。
【００３１】
本発明の好ましい態様において、カカオポリフェノールは、エピカテキンとプロシアニジンＢ２を特定の比率で含有していてもよい。この場合、カカオポリフェノール中のプロシアニジンＢ２に対するエピカテキンの含有量比率は１〜３とすることができ、好ましくは１．５〜２．５である。
【００３２】
本発明においてポリフェノール総質量は、プルシアンブルー法により測定することができる。例えば、Martin L. Price and Larry G. Butler, J. Agric Food Chem., (1977)25(6):1268-1273に記載の方法に従い、市販のエピカテキンを標準物質として算出することができる。本発明においてはまた、各ポリフェノール成分の含有量は市販のエピカテキンを標準物質として用いて、ＨＰＬＣ法により測定することができる。
【００３３】
カカオポリフェノールを効率よく摂取させる（投与する）ためには、カカオポリフェノールが濃縮された組成物を本発明に用いることが好ましく、この場合には、公知の方法（例えば、特開２００９−１８３２２９号公報に記載の方法）に従って得られたカカオポリフェノール濃縮組成物を本発明に使用することができる。
【００３４】
カカオポリフェノールは、カカオの植物体を原料にして調製することができるため、本発明の組成物および用剤には、カカオポリフェノール以外のカカオ豆由来の成分が含まれていてもよい。そのような成分としては、アミノ酸類、ペプチド、脂肪酸等が挙げられる。また、本発明の組成物および用剤には、本発明による効果を妨げない範囲内で、カカオ豆に由来しない成分を含有させてもよい。
【００３５】
後記実施例に示されるように、本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、疲弊状態に誘導した神経細胞において、細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の数値を改善した。疲弊状態の神経細胞における細胞生存性回復率の改善は、細胞生存率の低下または悪化の抑制と、低下または悪化した細胞生存率の回復を示していると考えられることから、疲弊状態の神経細胞における細胞生存性回復率の改善は、神経機能の維持または回復を示している。また、疲弊状態の神経細胞における神経突起伸長回復率の改善は、神経突起伸長の低下または悪化の抑制と、低下または悪化した神経突起伸長の回復を示していると考えられることから、疲弊状態の神経細胞における神経突起伸長回復率の改善は、神経機能の維持または回復を示している。従って、本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、神経機能の維持および／または回復のために用いることができる。ここで、「神経機能の維持」とは、神経細胞（特に、脳神経細胞）の機能の低下または悪化を抑制または緩和することを意味する。また、「神経機能の回復」とは、低下または悪化した神経細胞（特に、脳神経細胞）の機能を、より良い状態に戻すことを意味し、神経機能の改善を含む意味で用いられるものとする。神経機能の維持および／または回復は、神経細胞死の抑制、神経突起の変性または減少の抑制および神経突起伸長抑制の緩和を含む意味で用いられるものとする。
【００３６】
これまでに、脳内におけるＢＤＮＦの濃度低下が神経細胞の死や神経突起の変性・減少に関与し、ひいては神経機能の低下ないし悪化に関与していることが知られている。脳内におけるＢＤＮＦの濃度低下はまた、アルツハイマー病などの神経変性疾患の発症および進行に関与していることが知られている（例えば、Jing-Hui Song et al., Mol. Neurobiol. (2015)52:1477-1493; Shelley J. Allen et al., Pharmacology & Therapeutics (2013)138:155-175; Christoph Hock et al., Arch Neurol. (2000)57:846-851参照）。本発明では、神経細胞においてＢＤＮＦ濃度が低下した状態を「疲弊状態」または「老化状態」と定義し、この状態の神経細胞を、神経機能が低下ないし悪化した神経変性疾患の病態モデルとして用いた。すなわち、本発明においては、神経機能の維持および回復の程度は、例えば、疲弊状態または老化状態の神経細胞の細胞生存率や神経突起伸長を指標にして評価することができる。具体的には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）濃度を通常の濃度（例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）よりも低下させた培養培地（例えば、ＢＤＮＦ濃度が１０ｎｇ／ｍＬの培養培地）で神経細胞（例えば、ヒト神経芽細胞）を培養した場合に、被験試料存在下での細胞生存性回復率または神経突起伸長回復率が１０％以上、２０％以上または３０％以上のときに、被験試料により神経機能が維持されたと、あるいは神経機能が回復したと判定することができる。
【００３７】
本発明の別の面によれば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を２〜５０ｎｇ／ｍＬ（好ましくは３〜３０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍＬ）の濃度で含有する神経細胞培養培地において、被験試料存在下で神経細胞を培養する工程を含んでなる、神経機能を維持および／または回復しうる物質のスクリーニング方法が提供される。本発明のスクリーニング方法では、神経細胞培養培地における細胞生存率および／または神経突起伸長を指標に神経機能を維持および／または回復しうる物質をスクリーニングすることができる。具体的には、被験試料存在下での細胞生存率または神経突起伸長が、被験試料非存在下での細胞生存率または神経突起伸長を上回るときに（例えば、被験試料存在下での細胞生存率または神経突起伸長が、被験試料非存在下での細胞生存率または神経突起伸長の１．１倍以上または１．２倍以上のときに）、被験試料が、神経機能を維持および／または回復しうる物質であると判定することができる。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、被験試料存在下での細胞生存率または神経突起伸長と、被験試料非存在下での細胞生存率または神経突起伸長とを対比する工程をさらに含むものとすることができる。あるいは、本発明のスクリーニング方法においては、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）濃度を通常の濃度（例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）よりも低下させた培養培地（例えば、ＢＤＮＦ濃度が１０ｎｇ／ｍＬの培養培地）で神経細胞（例えば、ヒト神経芽細胞）を培養した場合に、被験試料存在下での細胞生存性回復率または神経突起伸長回復率が１０％以上、２０％以上または３０％以上のときに、被験試料が、神経機能を維持および／または回復しうる物質であると判定することができる。本発明のスクリーニング方法おいて、神経細胞は、ヒト神経芽細胞（例えば、ヒト神経芽細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）を用いることができる。本発明のスクリーニング方法おいて、神経細胞培養培地は、ＢＤＮＦ濃度を所定値で含有する点を除いては、神経芽細胞の培養に通常用いられる培養培地を使用することができる。本発明のスクリーニング方法においてはまた、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状（特に、神経変性疾患）の治療、予防または改善に有用な物質のスクリーニング方法とすることができる。
【００３８】
後記実施例に示されるように、本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは神経機能を維持および回復させることができるところ、これまでに神経機能の維持または回復（特に、神経細胞死の抑制や、神経突起の変性または減少の抑制）により神経疾患の症状が改善しうることや、神経疾患の進行が抑制されうることが知られている（例えば、Lu B et al., Nat Rev Neurosci. (2013)14(6):401-416参照）。従って、本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いることができる。すなわち、本発明によれば、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを有効成分として含んでなる、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための組成物と、該疾患または症状の治療、予防または改善剤が提供される。神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状としては、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ））や、認知機能（例えば、記憶機能、判断機能、集中機能）の低下が挙げられる。
【００３９】
本発明の組成物および用剤はまた、神経変性疾患の発症リスクがある対象または認知機能の低下リスクがある対象に摂取させるか、あるいは投与することができ、それにより、神経変性疾患の発症リスクまたは認知機能の低下リスクを低減することができる。すなわち、本発明の別の面によれば、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを有効成分として含んでなる、神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減用組成物および神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減剤が提供される。ここで、「神経変性疾患の発症リスクがある対象」は、神経変性疾患の自覚症状がないが、将来において神経変性疾患発症の恐れがある対象を意味し、「認知機能の低下リスクがある対象」は、認知機能低下の自覚症状がないが、将来において認知機能の低下の恐れがある対象を意味する。また、「神経変性疾患の発症リスクの低減」は、神経変性疾患の発症確率が低減されることを意味し、「認知機能の低下リスクの低減」は、認知機能低下の確率が低減されることを意味する。
【００４０】
本発明の組成物および用剤は、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを単独で使用することができ、あるいは、他の成分と混合して使用することもできる。本発明の組成物および用剤はまた、本発明のポリフェノール成分を有効成分として含む場合に、さらにカカオポリフェノールを含んでいてもよい。本発明の組成物および用剤はまた、カカオポリフェノールを有効成分として含む場合に、さらに本発明のポリフェノール成分を含んでいてもよい。本発明の組成物および用剤における本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールの配合量は、その目的、用途、形態、剤型、症状、体重などに応じて任意に定めることができ、本発明はこれに限定されないがその含量としては、全体量に対して、０．０５〜９０％（ｗ／ｗ）の含量で配合することができ、さらに好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｗ）の含量で配合することができる。本発明においては、本発明の用剤を本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールからなるものとし、本発明の組成物を本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールと他の成分とを含んでなるものとすることができる。
【００４１】
本発明の組成物および用剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料などの形態で提供することができ、後記の記載に従い、実施することができる。
【００４２】
本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、ヒトおよび非ヒト動物に経口投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学上許容される担体を用いて製剤化することができる。薬学上許容される担体としては、賦形剤、結合剤、希釈剤、添加剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。
【００４３】
本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、本発明の組成物および用剤の形状に応じて、経口投与以外の投与経路（例えば、経管投与、経鼻管投与、点滴、座薬等）でヒトおよび非ヒト動物に投与することができる。例えば、本発明の組成物および用剤を、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを含む粘性を有する液状の組成物、あるいは、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを含む半固形状の組成物とすることで、咀嚼や嚥下の機能が低下し、経口摂取ないしは経口投与ができないヒトおよび非ヒト動物に対しても投与することができる。本発明の組成物および用剤を経口以外の経路で摂取させるか、あるいは投与することにより、咀嚼や嚥下の機能が加齢などにより低下したとしても、これらのヒトおよび非ヒト動物に対する治療、予防および改善効果が期待できる。
【００４４】
本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、ヒトおよび非ヒト動物に経口摂取させることができる。本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールを経口摂取させる場合には、これらは単離、精製または粗精製された形態のものであっても、これらを含む食品あるいは食品の原料の形態であってもよい。また、本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、ヒトおよび非ヒト動物に経口摂取させるにあたり、常温の状態、温かい状態、冷たい状態等から任意に選択することができる。例えば、ココア飲料のような、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを含む粘性を有する液状の組成物、あるいは、チョコレートのような、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを含む半固形状の組成物とすることで、咀嚼や嚥下の機能が低下し、経口摂取ないしは経口投与ができないヒトおよび非ヒト動物に対しても摂取させることができる。
【００４５】
本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールを食品として提供する場合には、これらをそのまま食品に含有させることができ、該食品は本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを有効量含有した食品である。ここで、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に後述するような範囲で本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールが摂取されるような含有量をいう。また「食品」とは、健康食品、機能性食品、保健機能食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、特別用途食品（例えば、幼児用食品、妊産婦用食品、病者用食品）を含む意味で用いられる。「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であっても、半液体やゲル状の形態であっても、固形状の形態であってもよい。例えば、ココア飲料のような、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを含む粘性を有する液状の組成物、あるいは、チョコレートのような、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを含む半固形状の組成物とすることで、咀嚼や嚥下の機能が低下し、経口摂取ないしは経口投与ができないヒトおよび非ヒト動物に対しても摂取させることができる。
【００４６】
本発明のポリフェノール成分およびカカオポリフェノールは、神経機能を維持および／または回復させる効果を有するため、日常摂取する食品や、サプリメントとして摂取する食品に含有させて提供することができる。本発明で提供される食品としては、その形態や形状に特に制限はないが、好ましくは、カカオ豆を主原料とする食品が挙げられ、より好ましくは、油脂加工組成物であり、より一層好ましくはチョコレートおよびココアなどの油脂加工食品である。例えば、ココア飲料のような、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを含む粘性を有する液状の組成物、あるいは、チョコレートのような、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを含む半固形状の組成物とすることで、咀嚼や嚥下の機能が低下し、経口摂取ないしは経口投与ができないヒトおよび非ヒト動物に対しても摂取させることができる。
【００４７】
前記の通り、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを効率よく摂取させるためにはカカオポリフェノールが濃縮された組成物を本発明に使用することができる。従って、カカオ豆を主原料とする食品およびサプリメントは、例えば、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを高濃度で含むものであることが好ましく、より好ましくは本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを高濃度で含む油脂加工組成物であり、より一層好ましくは本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを高濃度で含むチョコレートおよびココアである。
【００４８】
ここで、食品およびサプリメント中のカカオポリフェノールの含有量はカカオポリフェノールやそれに含まれる本発明のポリフェノール成分の摂取が可能である限り特に限定されるものではないが、カカオポリフェノールの効率的な摂取の観点から、油脂加工組成物中の含有量は組成物の固形分当たり、例えば、１〜１０質量％とすることができ、好ましくは１．２〜８質量％、より好ましくは１．４〜７質量％、より一層好ましくは１．６〜６質量％、さらに好ましくは１．８〜５質量％、特に好ましくは２〜４．５質量％である。
【００４９】
本発明で提供される食品としては、チョコレートやココアのようにカカオ豆を主原料とする食品はもちろんのこと、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを含有させることができる食品であれば特に限定されない。例えば、パン類、ビスケット類、麺類、クラッカー、栄養補給バー等の澱粉系食品；キャンディー類、ガム類、グミ、スナック等の各種菓子類；牛乳、加工乳、アイスクリーム類、発酵乳（ヨーグルト等）、乳飲料、チーズ類、バター類、クリーム類等の乳および乳製品；プリン、ゼリー、ババロア、ムース等のデザート類；非アルコール飲料、アルコール飲料等の飲料類；ハム、ソーセージ等の畜肉加工品；カマボコ、竹輪、魚肉ソーセージ等の魚肉加工品；ジャム、ピューレ等の果実加工品；ルウ、ソース等の調味料類等が挙げられる。本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールは、各食品の特性、目的に応じ、適当な製造工程の段階で適宜配合することができる。
【００５０】
本発明の医薬品および食品は、食品として古くから重用されていたカカオ豆に含まれるポリフェノールを利用することから、それを必要とする哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いることができる。カカオポリフェノールと本発明のポリフェノール成分の投与量または摂取量は、受容者の性別、年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与経路ならびに組み合わせる薬剤等に依存して決定できる。
【００５１】
例えば、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを医薬として経口投与する場合、成人１日当たり、好ましくは、１０〜２０００ｍｇ、より好ましくは５０〜１８００ｍｇ、より一層好ましくは１００〜１５００ｍｇ、さらに好ましくは１２５〜１４００ｍｇ、特に好ましくは２００〜１２００ｍｇ、さらに特に好ましくは２２０〜１１００ｍｇ、最も好ましくは５００〜１０００ｍｇの範囲となるように、投与することができる。１日に医薬として投与するカカオポリフェノールの成分としては、１〜３量体のポリフェノールが、好ましくは１〜５００ｍｇ、より好ましくは３〜３００ｍｇ、より一層好ましくは５〜２４０ｍｇ、さらに好ましくは９〜２００ｍｇ、特に好ましくは２０〜２００ｍｇ、さらに特に好ましくは４０〜２００ｍｇ、最も好ましくは５０〜２００ｍｇの範囲となるように投与することができ、１〜２量体のポリフェノールが、好ましくは１〜５００ｍｇ、より好ましくは３〜３００ｍｇ、より一層好ましくは５〜２４０ｍｇ、さらに好ましくは８〜１８０ｍｇ、特に好ましくは２０〜１５０ｍｇ、さらに特に好ましくは３０〜１５０ｍｇ、最も好ましくは３５〜１５０ｍｇの範囲となるように、投与することができる。
【００５２】
例えば、本発明のポリフェノール成分やカカオポリフェノールを食品として摂取させる場合、成人１日当たり、好ましくは、１０〜２０００ｍｇ、より好ましくは５０〜１８００ｍｇ、より一層好ましくは１００〜１５００ｍｇ、さらに好ましくは１２５〜１４００ｍｇ、特に好ましくは２００〜１２００ｍｇ、さらに特に好ましくは２２０〜１１００ｍｇ、最も好ましくは５００〜１０００ｍｇの範囲となるように、摂取させることができる。１日に食品として摂取させるカカオポリフェノールの成分としては、１〜３量体のポリフェノールが、好ましくは１〜５００ｍｇ、より好ましくは３〜３００ｍｇ、より一層好ましくは５〜２４０ｍｇ、さらに好ましくは９〜２００ｍｇ、特に好ましくは２０〜２００ｍｇ、さらに特に好ましくは４０〜２００ｍｇ、最も好ましくは５０〜２００ｍｇの範囲となるように摂取させることができ、１〜２量体のポリフェノールが、好ましくは１〜５００ｍｇ、より好ましくは３〜３００ｍｇ、より一層好ましくは５〜２４０ｍｇ、さらに好ましくは８〜１８０ｍｇ、特に好ましくは２０〜１５０ｍｇ、さらに特に好ましくは３０〜１５０ｍｇ、最も好ましくは３５〜１５０ｍｇの範囲となるように、摂取させることができる。
【００５３】
例えば、前記のエピカテキンの摂取（投与）量は、好ましくは１〜４０ｍｇ、より好ましくは５〜３０ｍｇである。
【００５４】
例えば、前記のプロシアニジンＢ２の摂取（投与）量は、好ましく２〜８０ｍｇ、より好ましくは１０〜６０ｍｇである。
【００５５】
本発明の組成物および用剤は、他の経口摂取できる組成物や用剤と併用することに、制限はない。例えば、神経機能の維持および回復や、神経変性疾患の予防、治療および改善が期待できる素材や組成物と併用することで、神経機能の維持および／または回復の効果や神経変性疾患の治療等の効果をさらに高めることができる。
【００５６】
本発明の組成物および用剤は、神経機能の維持および／または回復に有効な１日分または２日分の摂取量の本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを含んでなる組成物で提供することができる。この場合、本発明の組成物および用剤は、１日分または２日分の有効摂取量を摂取できるように包装されていてもよく、１日分または２日分の有効摂取量が摂取できる限り、包装形態は一包装であっても、複数包装であってもよい。包装形態で提供する場合、１日分または２日分の有効摂取量が摂取できるように摂取量に関する記載が包装になされているか、または当該記載がなされた文書を一緒に提供することが望ましい。また、１日分または２日分の有効摂取量を複数包装で提供する場合には、摂取の便宜上、１日分または２日分の有効摂取量の複数包装をセットで提供することもできる。
【００５７】
このとき、１日分の摂取量の本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールを含んでなる組成物は１日に１回摂取することが好ましく、２日分の摂取量のカカオポリフェノールを含んでなる組成物は２日に１回摂取することが好ましい。
【００５８】
本発明の組成物および用剤を提供するための包装形態は一定量を規定する形態であれば特に限定されず、例えば、包装紙、袋、ソフトバック、紙容器、缶、ボトル、カプセルなどの収容可能な容器などが挙げられる。
【００５９】
本発明の組成物および用剤はその効果をよりよく発揮させるために、投与および摂取期間は、好ましくは６週間以上の継続的な投与または摂取であり、より好ましくは６〜１８週間の継続的な投与または摂取であり、特に好ましくは９〜１５週間の継続的な投与または摂取である。ここで、「継続的に」とは、毎日投与あるいは２日に１回の投与を続けることを意味する。本発明の組成物および用剤を包装形態で提供する場合には、継続的摂取のために一定期間（例えば、１週間）の有効摂取量をセットで提供してもよい。
【００６０】
本発明の食品には神経機能の維持または回復作用を有する旨の表示が付されてもよい。この場合、消費者に理解しやすい表示とするため本発明の食品には、例えば、以下の一部または全部の表示が付されてもよい。
・物忘れが気になる方に適した食品
・認知機能（例えば、記憶力、判断力、集中力）の維持、回復、向上または改善
【００６１】
本発明の別の面によれば、有効量の本発明のポリフェノール成分または有効量のカカオポリフェノールを、それを必要とする対象（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、神経機能の維持および／または回復方法が提供される。本発明の神経機能の維持および／または回復方法は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【００６２】
本発明のさらに別の面によれば、有効量の本発明のポリフェノール成分または有効量のカカオポリフェノールを、それを必要とする対象（例えば、ヒトまたは非ヒト動物）に摂取させるか、あるいは投与することを含んでなる、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療、予防または改善方法ならびに神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減方法が提供される。本発明の治療、予防または改善方法ならびに本発明のリスク低減方法は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【００６３】
本発明のさらにまた別の面によれば、神経機能の維持または回復剤の製造のための、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールの使用と、神経機能の維持または回復剤としての、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールの使用が提供される。本発明によればまた、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤の製造のための、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールの使用と、神経機能の維持および／または回復により治療、予防または改善しうる疾患または症状の治療剤、予防剤または改善剤としての、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールの使用が提供される。本発明によればまた、神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減剤の製造のための、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールの使用と、神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減剤としての、本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールの使用が提供される。本発明の使用は、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【００６４】
本発明のさらにまた別の面によれば、神経機能の維持および／または回復に用いるための本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールと、神経機能の維持および／または回復がその治療、予防または改善に有効である疾患または症状の治療、予防または改善に用いるための本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールが提供される。本発明によればまた、神経変性疾患の発症リスクおよび／または認知機能の低下リスクの低減に用いるための本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールが提供される。上記の本発明のポリフェノール成分またはカカオポリフェノールは、本発明の組成物および用剤に関する記載に従って実施することができる。
【００６５】
本発明の方法および使用はヒトを含む哺乳動物における使用であってもよく、治療的使用と非治療的使用のいずれもが意図される。本明細書において、「非治療的」とはヒトを手術、治療または診断する行為（すなわち、ヒトに対する医療行為）を含まないことを意味し、具体的には、医師または医師の指示を受けた者がヒトに対して手術、治療または診断を行う方法を含まないことを意味する。
【実施例】
【００６６】
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。【００６７】
例１：カカオ豆抽出物による神経機能の維持および回復効果
（１）カカオ豆抽出物の調製
まず、１５０ｋｇのカカオ豆を８０℃、１時間加熱した。次いで、エクスペラーを用いて、この加熱したカカオ豆を脱脂し、８０ｋｇのカカオパウダーを得た。この脱脂したカカオパウダーに８００ｋｇのエタノール（５０％）を加えてから加熱した。そして、これを５０℃に達温させた後に、１時間の攪拌抽出を行った後、この抽出液を４℃で一晩放置した。スクリューデカンタ、フィルタープレスを用いて、この抽出液を濾過し、この濾液を２７ｋｇに減圧濃縮してから、１３ｋｇのエタノール（９５％）を加えた。そして、この濃縮液を４０℃、１時間攪拌してから、一晩、冷蔵保存した。シャープレス遠心機を用いて、この濃縮液を遠心分離（２５℃、１２０００ｒｐｍ）した。そして、この遠心分離の上清液に３５ｋｇの酸性白土（ミズカエース＃２０、水澤化学工業社製）を加えてから１時間攪拌した。ヌッチェを用いて、これを濾過し、この濾過液を減圧濃縮してから凍結乾燥して、６．３ｋｇの粉末を得た。そして、０．５ｋｇのこの粉末に、２５Ｌの陰イオン交換樹脂、５０Ｌの水を投入し、３０分間以上攪拌した。この樹脂を回収してから、７５Ｌのエタノール（８０％）を投入し、２０〜３０分間攪拌した。ヌッチェを用いて、これを濾過し、この濾過液を減圧濃縮してから凍結乾燥して、カカオポリフェノールが豊富なカカオ豆抽出物（以下、「ＣＢＰ」（Cacao Bean Polyphenol Extract）ということがある）を得た。【００６８】
（２）カカオ豆抽出物の分画
上記（１）で得られたカカオ豆抽出物（ＣＢＰ）の濃度（固形分換算）が３０ｍｇ／ｍＬとなるように、ＣＢＰをメタノール水溶液（５０％）に溶解させた後に、このＣＢＰ溶液を、孔径が０．４５μｍの再生セルロース膜で濾過して、原料液を調製した。【００６９】
高速液体クロマトグラフィー（以下「ＨＰＬＣ」ともいう）システムの環境条件を、以下に示すように設定し、原料液のゲル濾過分画を行った。
＜ＨＰＬＣシステムの環境条件＞
装置：大量分取用液体クロマトグラフィーシステム（島津社製、システム構成：ＬＣ− ８Ａ，２台、ＦＣＶ−１３０ＡＬ、ＳＩＬ−１０ＡＰ、ＳＰＤ−２０ＡＶ、ＦＲＣ−１０ Ａ、ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア）
ガードカラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  １００  Ｄｉｏｌ−１０  ５０×１００ｍｍ
本カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ  １００  Ｄｉｏｌ−１０  ５０×３００ｍｍ
流速：２０．８ｍｌ／分
検出波長：ＵＶ２８０ｎｍ
溶離液：アセトニトリル（Ａ）およびメタノール水溶液（９７（ｖ／ｖ）％）（Ｂ）
グラジエント（移動相組成Ａ：Ｂ）：１００：０（０分）、８０：２０（２４〜５４分）、６０：４０（７８〜１０８分）、１００：０（１２０〜１８０分）【００７０】
次いで、上述の原料液を１９６０μＬでＨＰＬＣシステムに注入し、原料液の注入後の４５分から８５分の溶離画分をＣＢＰ低分子溶離画分とし、原料液の注入後の９０分から１３５分の溶離画分をＣＢＰ高分子溶離画分として、それぞれを分画採取した。ゲル濾過分画の結果を示すチャートから、３量体と４量体のポリフェノールのピークが完全に離れていることが確認された（データ示さず）。このため、ＣＢＰ低分子画分には、主にカテキン、エピカテキンならびにそれらの２量体および３量体が含まれ、ＣＢＰ高分子画分には、主に４量体以上のプロシアニジンが含まれる。なお、この分画点としては、ＣＢＰ高分子画分に可能な限り、カテキン、エピカテキンならびにそれらの２量体および３量体のプロシアニジンが含まれない時点を設定した。【００７１】
上述のＣＢＰ低分子画分およびＣＢＰ高分子画分の各溶離画分をそれぞれ２〜４ｍＬ採取し、遠心エバポレーターにて、それぞれを乾固することにより、ＣＢＰ低分子画分およびＣＢＰ高分子画分を得た。また、ＣＢＰ混合は、分画前の上記（１）で得られたＣＢＰをいう。次いで、その乾固した各画分を、１００μＬのメタノール水溶液（５０％）で、それぞれ再溶解させて、分析サンプルとした。【００７２】
上記の各分析サンプルのポリフェノール含有量およびプロシアニジン重合体含有量を分析した。具体的には、総ポリフェノールはプルシアンブルー比色法に従って、プロシアニジン類は逆相ＨＰＬＣ法に従って、プロシアニジン重合体はＫｅｌｍらの方法に準拠した順相ＨＰＬＣ法（Kelm, M.A. et al. J. Agric Food Chem (2006) 54(5):1571-1576参照）に従って、テオブロミンはＨＰＬＣ法に従って行った。各測定値はエピカテキン当量とした。【００７３】
結果を表１、表２および表３に示す。なお、カフェインおよびテオブロミンは検出限界以下であった。【００７４】
【表１】
2019054461.tif 000014
【００７５】
【表２】
2019054461.tif 000015
【００７６】
【表３】
2019054461.tif 000016
【００７７】
（３）ヒト神経芽細胞ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の分化誘導
ヒト神経芽細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＤ−ＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（ＦＢＳ  １０％）培地で培養し、３５ｍｍディッシュに１．２×１０５細胞／ディッシュとなるようにＤ−ＭＥＭ／Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＦＢＳ  １５％）培地へ播種した。播種後２日目と５日目に１０μＭとなるようにレチノイン酸を添加し分化誘導し、播種後７日目にＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１００ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を添加したＤ−ＭＥＭ／ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＦＢＳ  ０％）培地に移し、神経様細胞である分化型ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞へ分化させた。【００７８】
（４）カカオ豆抽出物による神経機能の維持および回復効果の評価
４−１：試験方法
上記（３）で得られた分化型ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、細胞疲弊（老化）状態とするため、播種後９日目において、ＢＤＮＦ濃度を１０ｎｇ／ｍＬに低下させ、併せて被験物質として上記（２）で得られた各ＣＢＰ画分（ＣＢＰ混合、ＣＢＰ低分子画分、ＣＢＰ高分子画分）を０．３、１、３、１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３日間（７２時間）処理した（実験区）。対照区として、ＢＤＮＦ  １０ｎｇ／ｍＬ存在下（細胞疲弊状態）と、ＢＤＮＦ  １００ｎｇ／ｍＬ存在下（細胞非疲弊状態）を設け、実験区と同様に処理した。被験物質処理開始前（０分）および処理開始後２４、４８、７２時間に写真撮影し、各区の細胞生存率および神経突起（軸索および樹状突起）の長さを測定した。【００７９】
細胞生存率（％）は、処理開始前（０分）の細胞生存率に対する各処理時間における細胞生存率（％）の比率として以下の算出式により求めた。【００８０】
【数１】
2019054461.tif 000017
【００８１】
神経突起の長さは、各区の各処理時間において神経突起の長さを測定し、測定値の平均を算出することにより求めた。【００８２】
細胞生存性回復率（cell viability recovery ratio）（％）は、ＢＤＮＦ  １００ｎｇ／ｍＬ処理時の細胞生存率を１００％とし、ＢＤＮＦ  １０ｎｇ／ｍＬ処理時の細胞生存率を０％とし、各ＣＢＰ画分処理による細胞生存率の回復を、以下の算出式において、各区の細胞生存率を当てはめて算出することにより求めた（表４）。【００８３】
【数２】
2019054461.tif 000018
【００８４】
また、神経突起伸長回復率（neurite outgrowth recovery ratio）（％）は、ＢＤＮＦ  １００ｎｇ／ｍＬ処理時の神経突起の長さを１００％とし、ＢＤＮＦ  １０ｎｇ／ｍＬ処理時の神経突起の長さを０％とし、各ＣＢＰ画分処理による神経突起伸長の回復を、以下の算出式において、各区の神経突起の長さを当てはめて算出することにより求めた（表５）。【００８５】
【数３】
2019054461.tif 000019
【００８６】
４−２：試験結果
試験結果を表４および表５に示す。【００８７】
【表４】
2019054461.tif 000020
【００８８】
【表５】
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【００８９】
表４と表５の結果から、細胞疲弊状態の神経様細胞（神経細胞疲弊（老化）モデル系）を各ＣＢＰ画分で処理することにより、細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の改善が確認され、カカオ豆抽出物は神経機能の維持および回復効果を有することが示された。また、各ＣＢＰ画分による神経機能の維持および回復効果は、ＣＢＰ高分子画分よりもＣＢＰ混合の方がより強い作用を示し、さらに、ＣＢＰ混合よりもＣＢＰ低分子画分の方がより強い作用を示すことが確認され、神経機能の維持および回復効果はＣＢＰ低分子画分に含まれる成分によるものだと考えられた。【００９０】
例２：ポリフェノール成分による神経機能の維持および回復効果
（１）ポリフェノール成分による神経機能の維持および回復効果の評価
１−１：試験方法
被験物質として、（＋）−カテキン、（−）−カテキン、（＋）−エピカテキン、（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ２、プロシアニジンＢ５、プロシアニジンＣ１またはシンナムタンニンＡ２を用いて１００ｎＭ、１μＭまたは１０μＭで処理した以外は、例１（４）の４−１：試験方法に記載の手順と同様に評価を行った。（＋）−カテキンはExtrasynthese社から、（−）−カテキン、（＋）−エピカテキンおよび（−）−エピカテキンは長良サイエンス社から、プロシアニジンＢ２およびプロシアニジンＣ１はナカライテスク社から、シンナムタンニンＡ２はPhytolab社から、それぞれ入手した。また、プロシアニジンＢ５はHatano T. et al., Phytochemistry (2002) 59:749-758の記載に従って、それぞれ調製した。【００９１】
１−２：試験結果
（＋）−エピカテキン、（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ２による結果を表６〜１１に示す。なお、表中の「−」の表記は効果が認められなかったことを意味する。【００９２】
【表６】
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【００９３】
【表７】
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【００９４】
【表８】
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【００９５】
【表９】
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【００９６】
【表１０】
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【００９７】
【表１１】
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【００９８】
表６〜８の結果から、細胞疲弊状態の神経様細胞（神経細胞疲弊（老化）モデル系）をプロシアニジンＢ２、（−）−エピカテキンで処理することにより、細胞生存性回復率の改善が確認され、これらの成分は神経機能の維持および回復効果を有することが示された。また、表９〜１１の結果から、細胞疲弊状態の神経様細胞をプロシアニジンＢ２、（−）−エピカテキンで処理することにより、神経突起伸長回復率の改善が確認され、これらの成分は神経機能の維持および回復効果を有することが示された。また、カカオ豆抽出物中には含有されていない（＋）−エピカテキンにも細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の改善が認められた。さらに、（＋）−カテキンおよび（−）−カテキンについては細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の改善効果が認められたが、細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率は最大で３０％であった（データ示さず）。また、プロシアニジンＢ５およびプロシアニジンＣ１については、特定の濃度において細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の改善効果が認められた（データ示さず）。一方、シンナムタンニンＡ２については、細胞生存性回復率および神経突起伸長回復率の改善効果が認められなかった（データ示さず）。
【国際調査報告】
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