(57)【要約】  構造タンパク質を含む組成物を成形する工程１と、前記工程１で得られる成形組成物を圧縮して延伸する工程２と、を含む成形体の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造タンパク質を含む組成物を成形する工程１と、
前記工程１で得られる成形組成物を圧縮して延伸する工程２と、を含む成形体の製造方法。
【請求項２】
前記工程１が、前記組成物を加熱および加圧することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程２が、前記成形組成物を加熱することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程２を複数回繰り返す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程２の前および前記工程２の後の少なくともいずれかにおいて、前記成形組成物を乾燥する工程３を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、曲げ弾性率が８．４７ＧＰａを超える成形体。
【請求項８】
構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、曲げ強度が１４１ＭＰａを超える成形体。
【請求項９】
構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、配向度が０．２２以上である成形体。
【請求項１０】
前記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の成形体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成形体の製造方法および成形体に関する。
【背景技術】
【０００２】
軽量化、コストダウン、成形加工の容易化等を目的として、金属材料を有機材料で代替する試みがなされている。このような有機材料としては、硬度の高いフェノール樹脂が用いられることが多く、曲げ弾性率や曲げ強度を更に上昇させるため、フェノール樹脂を含有するマトリックス樹脂に、フェノール樹脂繊維を添加する手法が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、環境保全意識の高まりから、非石油系材料であるバイオプラスチックが注目されており、例えば、シルク粉末を樹脂化することで曲げ弾性率４．５ＧＰａの成形体を得られることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−８０４９１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】平井伸治、月刊機能材料誌、２０１４年６月、「廃棄物由来動物タンパク質を用いた環境調和型シルクおよび羊毛樹脂」
【非特許文献２】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２年，２９５巻，ｐｐ．４７２−４７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に開示されるような材料は、マトリックス樹脂に繊維（強化繊維）を含有することにより補強効果を発揮するものであり、マトリックス樹脂自体で高強度を達成することは困難であった。また、生分解性材料により曲げ弾性率４．５ＧＰａを超える成形体を得ることはできなかった。【０００６】
そこで、本発明の目的は、高強度を有する生分解性の成形体の製造方法、および、高強度を有する生分解性の成形体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の［１］〜［１０］を提供する。
［１］  構造タンパク質を含む組成物を成形する工程１と、上記工程１で得られる成形組成物を圧縮して延伸する工程２と、を含む成形体の製造方法。
［２］  上記工程１が、上記組成物を加熱および加圧することを含む、［１］に記載の方法。
［３］  上記工程２が、上記成形組成物を加熱することを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  上記工程２を複数回繰り返す、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  上記工程２の前および上記工程２の後の少なくともいずれかにおいて、上記成形組成物を乾燥する工程３を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］  構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、曲げ弾性率が８．４７ＧＰａを超える成形体。
［８］  構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、曲げ強度が１４１ＭＰａを超える成形体。
［９］  構造タンパク質を含む組成物の成形体であって、配向度が０．２２以上である成形体。
［１０］  上記構造タンパク質がクモ糸フィブロインである、［７］〜［９］のいずれかに記載の方法。【０００８】
上記成形体は、生分解性を有しており、また構造タンパク質を原料とすること、そして当該原料を成形し、更に圧縮して延伸したものであることを特徴としており、これらの特徴に起因して、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、高強度を有する成形体が得られる。高強度を有する成形体とは、たとえば、曲げ弾性率が８．４７ＧＰａを超える成形体、または、曲げ強度が１４１ＭＰａを超える成形体である。高強度を有する成形体とは、たとえば、配向度が０．２２以上である成形体である。【０００９】
組成物を成形する工程において加熱および加圧を行うことにより、更に高強度を有する成形体が得られる。成形組成物を圧縮して延伸する工程において加熱を行うことにより、更に高強度を有する成形体が得られる。成形組成物を圧縮して延伸する工程を複数回繰り返すことにより、更に高強度を有する成形体が得られる。【００１０】
成形組成物を圧縮して延伸する工程の前に、または、成形組成物を圧縮して延伸する工程の後に、その成形組成物の乾燥を行うことにより、更に高強度を有する成形体が得られる。その成形組成物の乾燥を、成形組成物を圧縮して延伸する工程の前後に行ってもよい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、高強度を有する生分解性の成形体の製造方法、および、高強度を有する生分解性の成形体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】加圧成形機を模式的に示す断面図である。
【図２】（ａ）は組成物の導入前の状態、（ｂ）は組成物の導入直後の状態、（ｃ）は組成物を加熱及び加圧している状態の加圧成形機をそれぞれ模式的に示す断面図である。
【図３】（ａ）は１回目の延伸工程を模式的に示す図、（ｂ）は２回目の延伸工程を模式的に示す図である。
【図４】（ａ）は延伸工程の他の例を模式的に示す図、（ｂ）は延伸工程の更に他の例を模式的に示す図である。
【図５】実施例に係る成形体の作製工程を示すフロー図である。
【図６】（ａ）は、比較例に係る成形体の写真であり、（ｂ）〜（ｄ）は、実施例１〜３に係る各成形体の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は下記実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１４】
本実施形態に係る成形体は、構造タンパク質を含む組成物を成形し、この成形工程で得られた成形組成物を圧縮して延伸する工程等により得られるものである。
【００１５】
［構造タンパク質］
構造タンパク質とは、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質はスパイダーシルクタンパク質を含むことが好ましい。
【００１６】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００１７】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
【００１８】
クモには最大７種類の絹糸腺が存在し、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。
【００１９】
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
【００２０】
クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｎｇｕ１１ａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｎｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
【００２１】
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ  ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
【００２２】
構造タンパク質は、上記天然型構造タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。例えば、組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている（非特許文献２参照）。
【００２３】
組換えフィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から（Ａ）ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から１又は複数の（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２４】
大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）として表すことができる。具体的には配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。
【００２５】
コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１３で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２６】
レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１４で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１７で示されるアミノ酸配列（タグ配列）が付加されたものである。
【００２７】
エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。
【００２８】
ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号１６で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００２９】
組換えポリペプチドは、（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
【００３０】
（ｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号４で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号４の分子量とほぼ同じとなるようにＮ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。なお、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。
【００３１】
（ｉｉ）配列番号２、配列番号４若しくは配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインについて説明する。（ｉｉ）組換えフィブロインは、配列番号２、配列番号４又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（ｉｉ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００３２】
上述の組換えフィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００３３】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
【００３４】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００３５】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
【００３６】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
【００３７】
タグ配列を含む組換えフィブロインのより具体的な例として、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９若しくは配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインを挙げることができる。
【００３８】
組換えポリペプチドは、（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列、又は（ｉｖ）配列番号７、配列番号９又は配列番号１１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
【００３９】
配列番号６、７、８、９及び１１で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、２、３、４及び１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含む）を付加したものである。（ｉｖ）組換えフィブロインもまた、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００４０】
構造タンパク質は、組換えポリペプチドを含むことが好ましい。構造タンパク質として組換えポリペプチドを含むことにより、得られる成形体の曲げ弾性率、曲げ強度及び硬度を所望の数値に調整することが可能である。また、得られる成形体の配向度を所望の数値に調整することが可能である。
【００４１】
［構造タンパク質を発現する組換え細胞］
組換えポリペプチドの製造方法について、以下に詳述する。目的とする組換えポリペプチドは、例えば、構造タンパク質をコードする遺伝子配列と、当該遺伝子配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該遺伝子を発現させることにより生産することができる。
【００４２】
目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子を合成してもよい。
【００４３】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００４４】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００４５】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【００４６】
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
【００４７】
目的とする組換えポリペプチドをコードする遺伝子を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００４８】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
【００４９】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【００５０】
ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
【００５１】
上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【００５２】
発現ベクターで形質転換された宿主による遺伝子の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００５３】
目的とする組換えポリペプチドは、例えば、本発明に係る発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。本発明に係る宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００５４】
本発明に係る宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、本発明に係る宿主の培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５５】
炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【００５６】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【００５７】
無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００５８】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００５９】
また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６０】
本発明に係る組換えポリペプチドは、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法で単離及び精製することができる。例えば、当該組換えポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【００６１】
また、組換えポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として組換えポリペプチドの不溶体を回収する。回収した組換えポリペプチドの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により組換えポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【００６２】
組換えポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清から組換えポリペプチドを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００６３】
［成形体の製造方法］
一実施形態である成形体の製造方法は、構造タンパク質を含む組成物をたとえば鋳型（モールド）に導入して成形する工程１と、工程１で得られた成形組成物を圧縮して延伸し、成形体を得る工程２と、を含む。
【００６４】
工程１は、構造タンパク質を含む組成物を鋳型（モールド）に導入し、成形加工して、成形組成物（モールド成形体）を得る工程である。この成形加工において、組成物を加熱および／または加圧してもよい。
【００６５】
組成物は、構造タンパク質を含んでいればよい。組成物は、構造タンパク質のみであってもよく、構造タンパク質及び任意の添加成分（例えば、可塑剤、着色剤、フィラー、合成樹脂等）を含んでいてもよく、複数種類の構造タンパク質を含んでいてもよい。上記添加成分の含有量は、構造タンパク質の合計量の５０質量％以下にすることが好ましい。組成物は、典型的には粉末状（凍結乾燥粉末等）又は繊維状（紡糸して得られる繊維等）の形状を有している。成形組成物は、そのような形状の構造タンパク質を含む組成物の融着体であり得る。
【００６６】
組成物は、ＴｉＯ２またはモンモリロナイト等の無機添加成分を含んでいてもよい。
【００６７】
成形組成物は、例えば、加圧成形機を用いて成形することができる。図１は、成形組成物を製造するために用いることのできる加圧成形機の模式断面図である。図１に示す加圧成形機１０は、貫通孔が形成され加温可能な金型２と、金型２の貫通孔内で上下動が可能な上側ピン４及び下側ピン６とを備えるものである。加圧成形機１０では、金型２の貫通孔に上側ピン４又は下側ピン６を挿入して生じる空隙に、構造タンパク質を含む組成物を導入して、金型２を加温しつつ、上側ピン４及び下側ピン６で当該組成物を圧縮することで、成形組成物を得ることができる。
【００６８】
図２は、成形組成物を得る工程図を示すものであり、（ａ）は組成物の導入前、（ｂ）は組成物の導入直後、（ｃ）は組成物を加熱および加圧している状態の加圧成形機の模式断面図である。図２（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内に組成物を導入する。続いて図２（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、加熱加圧前の組成物８ａを貫通孔内で加熱加圧する。あらかじめ定めた加圧力に至るまで上側ピン４を下降させ、図２（ｃ）に示す状態で組成物が所定の温度に達するまで、加熱および加圧を継続して、加熱加圧後の組成物８ｂを得る。その後、冷却器（例えばスポットクーラー）を用いて金型２の温度を下降させ、成形組成物８ｂが所定の温度になったところで、上側ピン４又は下側ピン６を金型２から抜き取り、内容物を取り出す。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。取り出した内容物を乾燥させて、成形組成物を得る。加圧に関しては、下側ピン６を固定した状態で上側ピン４を下降させて実施してもよいが、上側ピン４の下降と下側ピン６の上昇の両方を実施してもよい。
【００６９】
工程１における加熱は、金型の温度が８０〜３００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１００〜１３０℃が更に好ましい。加圧は、５ｋＮ以上で行うことが好ましく、１０ｋＮ以上がより好ましく、２０ｋＮ以上が更に好ましい。また、所定の加熱加圧条件に達した後、その条件での処理を続ける時間（保温条件）は、０〜１００分が好ましく、１〜５０分がより好ましく５〜３０分が更に好ましい。
【００７０】
なお、工程１の前に、構造タンパク質を含む組成物に水を加える工程を行ってもよい。当該工程における水の添加量は、構造タンパク質の質量に対して１０〜４０ｗｔ％であることが好ましく、２０〜３０ｗｔ％であることがより好ましい。
【００７１】
その場合、図２（ａ）に示すように、金型２の貫通孔に下側ピン６のみを挿入した状態で貫通孔内に含水組成物を導入するが、導入前または導入後に水分を加えた上で撹拌する。続いて図２（ｂ）に示すように、金型２の貫通孔に上側ピン４を挿入して下降させ、金型２の加熱を開始して、加熱加圧前の含水組成物８ａを貫通孔内で加熱加圧する。その後の工程１の手順は、上記実施形態と同じであってよい。
【００７２】
水を加える工程に続く工程１の後に、工程１で得られる成形組成物を乾燥する工程を行ってもよい。乾燥は、真空中及び／又は１００℃の環境下に１分から１０日間静置することが好ましい。
【００７３】
工程２は、上記工程１で得られる成形組成物を圧縮して延伸する工程である。工程２では、たとえば２本の円筒状のロールを有する延伸機が用いられる。工程２では、たとえば２本のロールで成形組成物（モールド成形体）を挟み込んで圧力を加えつつ、２本のロールをそれぞれ回転させて送り出す。これにより、成形組成物の全体を圧縮延伸する。１回のみの圧縮延伸を行ってもよいが、複数回の圧縮延伸を行ってもよい。すなわち、工程２を複数回繰り返してもよい。工程２は、成形組成物を加熱することなく行われてもよい。一方、工程２において、成形組成物を加熱してもよい。その場合、加熱延伸機が用いられ得る。延伸機は、手動でローラを回転させる形式であってもよく、電動等の自動でローラを回転させる形式であってもよい。延伸機における送出し速度は、任意に調整可能である。加熱延伸機が用いられる場合、たとえばローラにヒータが内蔵される。ローラの温度は、任意に調整可能である。
【００７４】
図３は、成形体を得る工程を示すものであり、（ａ）は１回目の延伸工程を模式的に示す図、（ｂ）は２回目の延伸工程を模式的に示す図である。図３（ａ）に示す延伸機２０は、上ロール１０Ａと下ロール１０Ｂとを備えるものである。上ロール１０Ａおよび下ロール１０Ｂの位置（間隔）は、所定の板厚比すなわち圧下率で成形組成物８ｂを延伸するように設定され得る。延伸機２０では、成形組成物８ｂを上ロール１０Ａと下ロール１０Ｂとの間に送り込んで挟み込むことで、成形組成物８ｂを圧縮延伸することができる。１回のみの工程２を行う場合には、延伸されて、成形組成物８ｂの板厚よりも薄い板厚を有する成形体８ｃを得ることができる。複数回の工程２を行う場合には、図３（ｂ）に示すように、成形体８ｃを上ロール１０Ａと下ロール１０Ｂとの間に再度送り込む。上ロール１０Ａおよび下ロール１０Ｂの位置（間隔）は、所定の板厚比すなわち圧下率で成形体８ｃを延伸するように設定される。ここでの板厚比は、前回の延伸における板厚比と同じであってもよく、異なってもよい。その後、延伸されて、成形体８ｃの板厚よりも薄い板厚を有する成形体８ｄを得ることができる。
【００７５】
工程２において、圧下率および延伸回数は多い方がより高強度のものが得られるが、用途に応じて定めることができる。
【００７６】
工程２において加熱を行う場合、加熱は、８０〜２００℃で行うことが好ましく、１００〜１８０℃がより好ましく、１２０〜１６０℃が更に好ましい。
【００７７】
なお、工程２は、２本のロールを用いた形態に限られず、圧縮延伸を行い得る他の形態によって行われてもよい。たとえば、図４（ａ）に示すように、平板状の基盤とロール１１とを備える延伸機２０Ａを用い、基盤上に成形組成物を置き、その上からロール１１を転がしつつ押し当てることで、成形組成物を圧縮延伸してもよい。さらには、図４（ｂ）に示すように、平板状の上金型１２Ａおよび下金型１２Ｂを備える延伸機２０Ｂを用い、上金型１２Ａおよび下金型１２Ｂにより成形組成物を挟み込んで圧力を加えることで、成形組成物を圧縮延伸してもよい。
【００７８】
工程１と工程２の間（工程２の前）に、成形組成物を乾燥する工程３を行ってもよい。その場合、乾燥は、真空中及び／又は１００℃の環境下に３０分から３日間静置することが好ましい。工程２の後に、成形組成物を乾燥する工程３を行ってもよい。その場合、乾燥は、真空中及び／又は１００℃の環境下に３０分から３日間静置することが好ましい。これらの両方、すなわち工程２の前および後に、成形組成物を乾燥する工程３を行ってもよい。
【００７９】
本実施形態によって得られる成形体は、樹脂様成形体である。樹脂様成形体とは、外観が合成樹脂のような成形体である。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００８１】
図５は、実施例に係る成形体の作製工程を示すフロー図である。まず、以下の手順で、人工クモ糸粉末を用意した（ステップＳ０１）。【００８２】
（１）構造タンパク質発現株の作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋのウェブデータベースより取得した後、生産性の向上を目的としてアミノ酸残基の置換、挿入及び欠失を施し、さらにＮ末端に配列番号５で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加して、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する組換えフィブロイン（以下、「ＰＲＴ４１０」ともいう。）を設計した。【００８３】
次に、ＰＲＴ４１０をコードする遺伝子を合成委託した。その結果、遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅＩサイト、及び３’末端直下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した遺伝子を得た。当該遺伝子をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした後、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理し、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組み換えた。【００８４】
（２）タンパク質の発現
上記で得られたＰＲＴ４１０をコードする遺伝子を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液を、表１に示すシード培養用培地１００ｍＬに、ＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液の温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコにて、さらに約１５時間培養を行い、シード培養液を得た。
【表１】
2019117296.tif 000002
【００８５】
得られたシード培養液を、表２に示す生産培地５００ｍＬを添加したジャーファーメンターに、ＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液の温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定になるように制御し、培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにして培養した。なお、消泡剤として、アデカノールＬＧ−２９５Ｓ（（株）ＡＤＥＫＡ製）を使用した。【００８６】
【表２】
2019117296.tif 000003
【００８７】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）水溶液を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。【００８８】
（３）構造タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。【００８９】
＜成形体の作製＞
次に、人工クモ糸粉末をステンレス製治具に充填し、ホットプレスを用いて温度１７０℃、圧力３０ＭＰａで加熱および加圧を行った（ステップＳ０２）。これにより、成形組成物（中間成形体）を得た（ステップＳ０３）。成形組成物のサイズは、直径２０ｍｍ、厚さ３ｍｍの円板状であり、質量は１．２ｇであった。【００９０】
次に、真空乾燥機（ＡＳ  ＯＮＥ株式会社製のＡＶＯ−２５０Ｎ）を用いて、温度１００℃、減圧真空下で６時間、成形組成物を乾燥させた（ステップＳ０４）。【００９１】
次に、手動式加熱延伸機（井元製作所株式会社製、ＩＭＣ−１９８９型）を用い、成形組成物を直接ロールに挟み込み、延伸させた（ステップＳ０５）。延伸条件としては、温度１５０℃、延伸回数１〜９回、最終圧下率を３０〜７２％とした。これにより、延伸された成形体を得た。各実施例における延伸条件の詳細については、後述する。【００９２】
延伸後、再び上記の真空乾燥機を用い、温度１００℃、減圧真空下で１２時間、成形体を乾燥させた（ステップＳ０６）。乾燥後、成形体をデシケータ内で１２時間保管し、その後、試験に用いる成形体を得た（ステップＳ０７）。その後、ダイヤモンドカッターを用いて、成形体の中央部を短冊状に切り出し、曲げ試験のための試験片を作製した。【００９３】
＜曲げ試験＞
切り出した試験片に対し、卓上形精密万能試験機（株式会社島津製作所製、オートグラフＡＧＳ−Ｘ  １ｋＮ）を用いて三点曲げ試験を行い、曲げ強度及び曲げ弾性率を測定した。測定条件は、支点間距離１４ｍｍ、試験速度１ｍｍ／ｍｉｎとした。試験片のサイズは、長さ１８ｍｍ、幅４ｍｍ、厚さ０．６〜２ｍｍとした。【００９４】
＜硬さの測定＞
切り出した試験片に対し、マイクロビッカース硬さ試験機（島津製作所株式会社製、商品名：ＨＭＶ−Ｇ）にてビッカース硬さを測定した。【００９５】
（試験例１）
試験例１では、実施例１〜３でそれぞれ１回のみの加熱延伸を行い、圧下率を変化させた。実施例１では圧下率を３０％とし、実施例２では圧下率を５０％とし、実施例３では圧下率を６８％とした。比較例では、加圧成形後に加熱延伸を行わなかったこと以外、実施例１〜３と同様にして成形体を得た。試験結果を表３に示す。表３に示されるように、圧下率を変化させたいずれの実施例でも、曲げ強度および曲げ弾性率の両方において、比較例よりも高い値が得られた。【００９６】
【表３】
2019117296.tif 000004
【００９７】
図６（ａ）は、比較例に係る成形体の写真であり、図６（ｂ）〜（ｄ）は、実施例１〜３に係る各成形体の写真である。実施例１〜３では、比較例よりも透明度が向上した。圧下率が大きいほど、高い透明度が得られた。【００９８】
（試験例２）
試験例２では、実施例３，４，５，６において、最終的な圧下率が７０％に近くなるようにし、加熱延伸をそれぞれ１，３，５，９回行った。試験結果を表４に示す。表４に示されるように、同程度の圧下率であれば、加熱延伸工程の回数が多い方が、曲げ強度が大きくなった。【００９９】
【表４】
2019117296.tif 000005
【０１００】
また実施例７，８では、加熱延伸の回数をそれぞれ５回とし、最終的な圧下率が７０％に近くなるようにしたところ、それぞれ６５％、７２％となった。試験結果を表５に示す。表５に示されるように、加熱延伸工程の回数が同じであれば、圧下率の大きい方が、曲げ強度および曲げ弾性率の両方が大きくなった。【０１０１】
【表５】
2019117296.tif 000006
【０１０２】
試験結果をまとめて表６に示す。
【表６】
2019117296.tif 000007
【０１０３】
（試験例３）
試験例３では、最初の真空乾燥機を用いた乾燥（ステップＳ０４）と、延伸後の真空乾燥機を用いた乾燥（ステップＳ０６）とを行わなかったこと以外、上記した方法と同様に成形体を作製した。すなわち、試験例３では、２つの乾燥工程が省略された。実施例９，１０では、それぞれ１回のみの加熱延伸を行い、圧下率を変化させた。実施例９では圧下率を４１％とし、実施例１０では圧下率を６０％とした。比較例では、加圧成形後に加熱延伸を行わなかったこと以外、実施例９，１０と同様にして成形体を得た。これらの試験片について、上記の曲げ試験を行った。さらに試験例３では、広角Ｘ線散乱装置（株式会社リガク製、ＸｔａＬＡＢ）を用いて、試験片の配向度を測定した。試験結果を表７に示す。表７に示されるように、加熱延伸工程の回数が同じであれば、圧下率の大きい方が、配向度が大きくなった。また実施例９，１０では、実施例１〜８に比して曲げ強度が低い。これは、乾燥工程が省略されたことに起因し、試験片が水分を多く含んでいたためと思われる。【０１０４】
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明によれば、強化繊維等の添加材料を用いなくとも、高強度を有する生分解性の成形体の製造方法、および、高強度を有する生分解性の成形体が提供される。
【符号の説明】
【０１０６】
８ａ…成形前の組成物、８ｂ…圧縮延伸前の成形組成物、８ｃ，８ｄ…圧縮延伸後の成形体、１０…加圧成形機、１０Ａ…上ロール、１０Ｂ…下ロール、１１…ロール、１２Ａ…上金型、１２Ｂ…下金型、２０…延伸機、２０Ａ，２０Ｂ…延伸機。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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