(57)【要約】ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩を含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解剤：2019013181.tif 000056［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子等を示す。］。
2019013181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩を含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解剤：
【化１】
2019013181.tif 000044
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、
【化２】
2019013181.tif 000045
であってはならない。］。
【請求項２】
ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩を含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患を予防又は治療するための医薬：
【化３】
2019013181.tif 000046
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、
【化４】
2019013181.tif 000047
であってはならない。］
【請求項３】
傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患が、神経変性疾患、癌、炎症性疾患、加齢性疾患、代謝性疾患、ミトコンドリア病又はダウン症である、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
ミトコンドリア表面に結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩であって：
【化５】
2019013181.tif 000048
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。（ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、
【化６】
2019013181.tif 000049
であってはならない。）］
傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解を誘導する化合物又はその塩。
【請求項５】
傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患を予防又は治療するための請求項４に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
前記リガンドが、下記に示す化合物のいずれかから水素を１個取り除いた一価の置換基である、請求項１に記載の分解剤、請求項２に記載の医薬、又は請求項４に記載の化合物若しくはその塩：
【化７】
2019013181.tif 000050
【化８】
2019013181.tif 000051
【請求項７】
前記リガンドが、タグ分子に結合する置換基と、当該置換基に結合するタグ分子で修飾されたミトコンドリアに集積するタンパク質とが結合してなる、請求項１に記載の分解剤、請求項２に記載の医薬、又は請求項４に記載の化合物若しくはその塩。
【請求項８】
前記ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物が下記一般式（２）で表される化合物である、請求項１に記載の分解剤、請求項２に記載の医薬、請求項４に記載の化合物若しくはその塩：
【化９】
2019013181.tif 000052
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前述の通り。
Ｒ４は、ミトコンドリア表面に結合又は集積するリガンドを示す。
Ｌａ及びＬｂは、同一又は異なって結合又はリンカーを示す。
ｎは、１〜１０の自然数を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、
【化１０】
2019013181.tif 000053
であってはならない。］。
【請求項９】
哺乳動物に、ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩の有効量を投与することを含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患を予防又は治療する方法：
【化１１】
2019013181.tif 000054
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、
【化１２】
2019013181.tif 000055
であってはならない。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジー機構を利用した、細胞小器官の分解に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、細胞の生存に必須の細胞小器官であり、ATP産生機能に加えて、カルシウム恒常性の維持、炎症や細胞増殖の制御、アポトーシスなどに関わっている。【０００３】
ミトコンドリアの機能が損なわれると、単にエネルギー産生が低下するのみならず、上に例示した機能に傷害をもたらす。また、傷害を受けたミトコンドリアは活性酸素（ROS)を過剰産生し、細胞にダメージを与えることによって細胞死を誘導する。例えば、染色体異常症であるダウン症や、ミトコンドリア病と総称される遺伝子疾患においては、ミトコンドリア膜電位低下などの機能不全が見られる。【０００４】
一方、細胞は傷害を受けたミトコンドリアを選択し、オートファジー機構（ミトファジーとも呼ばれる）によって分解排除している。しかし、オートファジーの活性は加齢等によって低下するため、傷害ミトコンドリアの蓄積にもとづく加齢関連疾患が存在する。たとえば、パーキンソン病や癌などが例示される。【０００５】
これらの背景から、医薬などの化合物をもちいてミトファジーを制御する試みがなされている。Sirolimus（ラパマイシン）はmTORC1複合体の阻害によってオートファジーを誘導し、ミトコンドリア分解を促進する。しかしながら、sirolimusによるオートファジーには分解対象の選択性が乏しく、ミトコンドリアは数ある分解対象のひとつに過ぎないため効率が悪い。また、ミトコンドリア以外の広範な細胞内分子が同時に分解されるため、正常な生理機能に影響を与えるという問題を抱えている。【０００６】
一方、脱共役剤と呼ばれる化合物群も、人工的なミトファジー促進に広く用いられている。脱共役剤は、ミトコンドリア膜に傷害を与える分子であり、人為的にミトコンドリア機能不全状態を作成できる。生じた機能不全ミトコンドリアを除去する必要性から、細胞内ではミトファジーが活性化する。つまり脱共役剤は、疾患によるミトコンドリア傷害をさらに悪化させる働きを持つことから、治療用途には適さないという課題を有している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】"Importing Mitochondrial Proteins: Machineries and Mechanisms", A. Chacinska, C. M. Koehler, D. Milenkovic, T. Lithgow, N. Pfanne, Cell, 138, 628-644 (2009)
【非特許文献２】Y. Kawazoe, H. Shimogawa, A. Sato, M. Uesugi, Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5478-5481 (2011)
【非特許文献３】Kaizuka et al., Molecular Cell, 64, 835 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、オートファジー機構を利用した新規のミトコンドリア分解剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる状況の下、本発明者らは、鋭意研究した結果、ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び特定の1,9-ジヒドロ-6H-プリン-6-オン環構造を有する特定の置換基を有する化合物又はその塩を用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。【００１０】
従って、本発明は、下記の項に示す、分解剤、医薬、及び化合物若しくはその塩を提供する：
項１．ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩を含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解剤：【００１１】
【化１】
2019013181.tif 000003
【００１２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、【００１３】
【化２】
2019013181.tif 000004
【００１４】
であってはならない。］。【００１５】
項２．ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩を含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患を予防又は治療するための医薬：【００１６】
【化３】
2019013181.tif 000005
【００１７】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、【００１８】
【化４】
2019013181.tif 000006
【００１９】
であってはならない。］
項３．傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺、レビー小体型認知症、黒質線状体変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、ピック病等の神経変性疾患、癌、炎症性疾患、加齢性疾患、ミトコンドリア病（例えば、MELAS、MERRF、慢性進行性外眼筋麻痺症、リー脳症等）、代謝性疾患又はダウン症である、項２に記載の医薬。【００２０】
項４．ミトコンドリア表面に結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩であって：【００２１】
【化５】
2019013181.tif 000007
【００２２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。（ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、【００２３】
【化６】
2019013181.tif 000008
【００２４】
であってはならない。）］
傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解を誘導する化合物又はその塩。【００２５】
項５．傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患を予防又は治療するための項４に記載の化合物又はその塩。【００２６】
項６．哺乳動物に、ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩の有効量を投与することを含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患を予防又は治療する方法：【００２７】
【化７】
2019013181.tif 000009
【００２８】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、【００２９】
【化８】
2019013181.tif 000010
【００３０】
であってはならない。］。【００３１】
項７．傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解により処置され得る疾患の予防又は治療剤を製造するための、ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩の使用。【００３２】
【化９】
2019013181.tif 000011
【００３３】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、【００３４】
【化１０】
2019013181.tif 000012
【００３５】
であってはならない。］。【００３６】
項８．前記リガンドが、下記に示す化合物のいずれかから水素を１個取り除いた一価の置換基である、項１に記載の分解剤、項２若しくは３に記載の医薬、項４若しくは５に記載の化合物若しくはその塩、項６に記載の方法又は項７に記載の使用：【００３７】
【化１１】
2019013181.tif 000013
【００３８】
【化１２】
2019013181.tif 000014
【００３９】
項９．前記リガンドが、タグ分子に結合する置換基と、当該置換基に結合するタグ分子で修飾されたミトコンドリアに集積するタンパク質とが結合してなる、項１に記載の分解剤、項２若しくは３に記載の医薬、項４若しくは５に記載の化合物若しくはその塩、項６に記載の方法、項７に記載の使用、あるいは項８に記載の分解剤、医薬、化合物若しくはその塩、方法又は使用。【００４０】
項１０．前記ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物が下記一般式（２）で表される化合物である、項１に記載の分解剤、項２若しくは３に記載の医薬、項４若しくは５に記載の化合物若しくはその塩、、項６に記載の方法、項７に記載の使用、あるいは項８若しくは９に記載の分解剤、医薬、化合物若しくはその塩、方法又は使用：【００４１】
【化１３】
2019013181.tif 000015
【００４２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前述の通り。
Ｒ４は、ミトコンドリア表面に結合又は集積するリガンドを示す。
Ｌａ及びＬｂは、同一又は異なって結合又はリンカーを示す。
ｎは、１〜１０の自然数を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、【００４３】
【化１４】
2019013181.tif 000016
【００４４】
であってはならない。］。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によれば、オートファジー機構による新規のミトコンドリア分解剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】pEmGFP-HaloTag-Omp25の配列情報を示す。
【図２】pEmGFP-HaloTag-Omp25の配列情報を示す。
【図３】実施例６の試験結果を示す。
【図４】実施例７の試験結果を示す。
【図５】実施例８の試験結果を示す。
【図６】実施例１３の試験結果を示す。
【図７】実施例１３の試験結果を示す。
【図８】実施例１４の試験結果を示す。
【図９】実施例１５の試験結果を示す。
【図１０】実施例１６の試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解を誘導する化合物又はその塩
本発明は、ミトコンドリア表面に結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物又はその塩：
【００４８】
【化１５】
2019013181.tif 000017
【００４９】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、水素原子又は置換基を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、
【００５０】
【化１６】
2019013181.tif 000018
【００５１】
であってはならない。］
を提供する。本発明において、ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び上記一般式（１）で表される置換基を有する化合物を単に化合物Ａと示すこともある。
【００５２】
以下、本明細書中、そうでないことを明記しない限り、各置換基は以下を意味する。
【００５３】
本発明において、「置換基」としては、例えば、置換されていてもよい炭化水素基、置換されていてもよいアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、置換されていてもよい複素環基、アシル基、置換されていてもよいカルバモイル基、置換されていてもよいチオカルバモイル基、置換されていてもよいスルファモイル基、置換されていてもよいヒドロキシ基、置換されていてもよいスルファニル基、置換されていてもよいシリル基等が挙げられる。
【００５４】
「炭化水素基」としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基、Ｃ３−１０シクロアルケニル基、Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基等が挙げられる。
【００５５】
「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６の直鎖又は分枝鎖状の飽和炭化水素基を示し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルフロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、２−エチルプチル等が挙げられる。
【００５６】
「Ｃ２−６アルケニル基」とは、２重結合を有する炭素数２〜６の直鎖又は分枝鎖状の炭化水素基を示し、例えば、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−プテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ぺンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、５−ヘキセニル等が挙げられる。
【００５７】
「Ｃ２−６アルキニル基」とは、３重結合を有する炭素数２〜６の直鎖又は分枝鎖状の炭化水素基を示し、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−プチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、４−メチル−２−ペンチニル等が挙げられる。
【００５８】
「Ｃ３−１０シクロアルキル基」とは、炭素数３〜１０の環状のアルキル基を示し、例えば、シクロプロピル、シクロブプチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．１］オクチル、アダマンチル等が挙げられる。
【００５９】
「Ｃ３−１０シクロアルケニル基」とは、２重結合を有する炭素数３〜１０の環状炭化水素基を示し、例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル等が挙げられる。
【００６０】
「Ｃ６−１４アリール基」としては、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、１−アントリル、２−アントリル、９−アントリル等が挙げられる。
【００６１】
「Ｃ７−１６アラルキル基」としては、例えば、ベンジル、フエネチル、ナフチルメチル、フェニルプロピル等が挙げられる。
【００６２】
「置換されていてもよい炭化水素基」、「置換されていてもよいアミノ基」、「置換されていてもよい複素環基」、「置換されていてもよいカルバモイル基」、「置換されていてもよいチオカルバモイル基」、「置換されていてもよいスルファモイル基」、「置換されていてもよいヒドロキシ基」、「置換されていてもよいスルファニル基」、「置換されていてもよいシリル基」における、置換基としては、例えば、炭化水素基で置換されていてもよいアミノ基、ハロゲン原子、シアノ基、ニトロ基、炭化水素基で置換されていてもよい複素環基、アシル基、炭化水素基で置換されていてもよいカルバモイル基、炭化水素基で置換されていてもよいチオカルバモイル基、スルファモイル基、炭化水素基で置換されていてもよいヒドロキシ基、炭化水素基で置換されていてもよいスルファニル基、炭化水素基で置換されていてもよい置換されていてもよいシリル基等が挙げられる。「置換されていてもよい炭化水素基」、「置換されていてもよいアミノ基」、「置換されていてもよい複素環基」、「置換されていてもよいカルバモイル基」、「置換されていてもよいチオカルバモイル基」、「置換されていてもよいスルファモイル基」、「置換されていてもよいヒドロキシ基」、「置換されていてもよいスルファニル基」、「置換されていてもよいシリル基」が置換基を有する場合、置換基の数は特に限定されないが、例えば、１〜５個、１〜３個、１個等適宜設定できる。
【００６３】
「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
【００６４】
「複素環基」としては、例えば、窒素原子、硫黄原子および酸素原子からなる群より選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、７〜１０員環の飽和又は不飽和の複素環基等が挙げられる。より具体的には、例えば、チエニル基、チアゾリル基、フリル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、ピリジニル基、ピロリニル基、モルホリニル基、イミダゾリル基、インドリル基、ピリミジニル基、オキサゾリル基、ピロリジニル基、インドリジニル基、ベンゾフラニル基等が挙げられる。
【００６５】
「アシル基」としては、例えば、ホルミル基、アルキル部分が前述したＣ１−６アルキル基であるアルキルカルボニル基等が挙げられる。
【００６６】
本発明において、Ｒ１としては、水素原子、炭化水素基等が好ましく、水素原子、Ｃ１−６（好ましくはＣ１−３）アルキル基等がより好ましく、水素原子がより好ましい。
【００６７】
本発明において、Ｒ２としては、水素原子、置換されていてもよい炭化水素（好ましくは、アミノ基及びカルバモイル基からなる群より選択される少なくとも一種で置換されていてもよい炭化水素基であり、より好ましくはアミノ基及びカルバモイル基からなる群より選択される少なくとも一種で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基）基、置換されていてもよいアミノ基、置換されていてもよいカルバモイル基等が好ましく；置換された炭化水素（好ましくは、アミノ基及びカルバモイル基からなる群より選択される少なくとも一種で置換された炭化水素基、より好ましくはアミノ基及びカルバモイル基からなる群より選択される少なくとも一種で置換されたＣ１−６アルキル基）基、アミノ基、カルバモイル基等がより好ましく；アミノ基で置換された炭化水素基（好ましくはアミノ基で置換されたＣ１−６アルキル基）基、アミノ基等がより好ましい。
【００６８】
本発明において、Ｒ３としては、特に限定されないが、例えば、水素原子、置換されていてもよい炭化水素基等が好ましく；水素原子、ハロゲンで置換されていてもよい炭化水素（Ｃ６−１４アリール基、Ｃ７−１６アラルキル基等）がより好ましく；ハロゲン（好ましくはフッ素）で置換された炭化水素（Ｃ６−１４アリール基（フェニル、ナフチルが好ましく、フェニルがより好ましい）、Ｃ７−１６アラルキル基（Ｃ７−１２フェニルアルキル、Ｃ１１−１７ナフチルアルキルが好ましく、Ｃ７−１２フェニルアルキルがより好ましい）がより好ましい。
【００６９】
ミトコンドリアに結合又は集積するリガンドとは、ミトコンドリアに共有結合、水素結合等により結合するか又はミトコンドリア（ミトコンドリアの内部又は表面）に集積するリガンドを意味する。かかるリガンドとしては、本発明が属する技術分野において知られているものを広く使用することができる。例えば、ミトコンドリアに集積する化合物は多く知られており、例えば、ミトコンドリア外膜上のタンパク質8 kDa translocator protein (TSPO)やVoltage-dependent anion channel (VDAC)などに結合する低分子リガンド群がある。また、ローダミン色素、トリフェニルホスホニウム塩に代表されるように、正電荷を有する化合物がミトコンドリアに集積することも知られている。Y. Kawazoe, H. Shimogawa, A. Sato, M. Uesugi, Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5478-5481 (2011)にも、ミトコンドリア表面に集積する分子について記載されている。
【００７０】
リガンドとしては、例えば、下記に示す化合物のいずれかから水素を１個取り除いた一価の置換基が挙げられる：
【００７１】
【化１７】
2019013181.tif 000019
【００７２】
【化１８】
2019013181.tif 000020
【００７３】
また、本発明の好ましい実施形態において、リガンドとしては、上記に加えて、下記式で示される化合物から水素を１個取り除いてなる一価の基において、当該式中のフェニル基における１〜５個（例えば、１〜３個、１〜２個、１個等）の水素原子が、置換基（例えば、直鎖又は分枝鎖状のＣ１〜Ｃ６アルキル基、ハロゲン及び直鎖又は分枝鎖状のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基からなる群より選択される少なくとも１種の基）により置換された構造を有する基も挙げられる：
【００７４】
【化１９】
2019013181.tif 000021
【００７５】
本発明において、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。また、本発明の好ましい実施形態において、リガンドとして上記に挙げた化合物から１個の水素を取り除いた一価の基としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる：
【００７６】
【化２０】
2019013181.tif 000022
【００７７】
【化２１】
2019013181.tif 000023
【００７８】
また、リガンドとしては、上記に加えて、下記式において、当該式中のフェニル基における１〜５個（例えば、１〜３個、１〜２個、１個等）の水素原子が、置換基（例えば、直鎖又は分枝鎖状のＣ１〜Ｃ６アルキル基、ハロゲン及び直鎖又は分枝鎖状のＣ１〜Ｃ６アルコキシ基からなる群より選択される少なくとも１個の基）により置換された構造を有する置換基も挙げられる
【００７９】
【化２２】
2019013181.tif 000024
【００８０】
また、リガンドとしては、ミトコンドリア内部又は表面に集積するタンパク質を利用してもよい。かかるタンパク質としては、シグナル配列（ミトコンドリア移行配列）が付加されたタンパク質等が挙げられる。ミトコンドリア移行シグナル配列としては、本発明が属する技術分野において知られているものを広く使用することができる（例えば、"Importing Mitochondrial Proteins: Machineries and Mechanisms", A. Chacinska, C. M. Koehler, D. Milenkovic, T. Lithgow, N. Pfanne, Cell, 138, 628-644 (2009)）。リガンドとしてかかるタンパク質を用いる場合、一般式（１）で表される置換基に当該リガンドを結合させるため、タグ技術を使用してもよい。具体的には、ミトコンドリア内部又は表面に集積するタンパク質として、タグタンパク質とミトコンドリア移行シグナル配列とを組み合わせた融合タンパク質を使用してもよい。タグタンパク質としては、例えば、ハロタグ(HT)、SNAPタグ、CLIPタグ、Ashタグ（assembly helper tag）等が挙げられる。かかる融合タンパク質としては、例えば、さらに蛍光タンパク質（EmGFP等）を融合したものであってもよい。
【００８１】
かかる実施形態においては、リガンドとしては、タグ分子に結合する置換基（例えば、ハロタグを用いる場合、ハロゲン原子、又はハロゲン原子で置換された炭化水素基）と、置換基に結合するタグ分子で修飾されたミトコンドリアに集積するタンパク質とが結合してなるもの等を挙げることができる。
【００８２】
また、本発明の典型的な実施形態においては、前記ミトコンドリアに結合又は集積するリガンド及び下記一般式（１）で表される置換基を有する化合物としては、下記一般式（２）で表される化合物又はその塩を挙げることができる：
【００８３】
【化２３】
2019013181.tif 000025
【００８４】
［式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前述の通り。
Ｒ４は、ミトコンドリア表面に結合又は集積するリガンドを示す。
Ｌａ及びＬｂは、同一又は異なって結合又はリンカーを示す。
ｎは、１〜１０の自然数を示す。ただし、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がアミノ基である場合、Ｒ３は、
【００８５】
【化２４】
2019013181.tif 000026
【００８６】
であってはならない。］。
【００８７】
本明細書において、上記一般式（２）で示される化合物を単に化合物Ａ’と示すこともある。
【００８８】
当該実施形態において、−Ｌａ−Ｏ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｌｂ−部分は、ミトコンドリアに結合又は集積するリガンドと前記一般式（１）で表される置換基とを連結するリンカーの役割を果たす。
【００８９】
Ｌａがリンカーである場合、かかるリンカーとしては、例えば、主鎖が１〜１５原子、好ましくは１〜１０原子からなる鎖状リンカー等が挙げられる。かかる鎖状リンカーとしては、−ＣＨ２−、−ＣＨ２＝ＣＨ２−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−からなる群より選択される少なくとも１種から構成されるもの等を挙げることができる（従って、例えば、上記群より選択される１個をリンカーとしてもよいし、上記群より選択される２個以上（１種類でも２種類以上でもよい）組み合わせたものをリンカーとしてもよい。）。また、かかるリンカーとしては、アミド結合［−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−］、エーテル結合（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、エステル結合［−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−］及びウレタン結合［−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ＝）−ＮＨ−］からなる群より選択される少なくとも一種の構造を含むものが好ましい。
【００９０】
また、かかるリンカーは、主鎖に二価の環状構造（例えば、５員又は６員の不飽和炭化水素環基；窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子を（好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個）有する５員又は６員の複素環基等）を、１〜２個（好ましくは１個）含んでいてもよい。
【００９１】
５員又は６員の二価不飽和炭化水素環基としては、例えば、
【００９２】
【化２５】
2019013181.tif 000027
【００９３】
等が挙げられ、好ましくはフェニレン基等が挙げられる。
【００９４】
窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子を（好ましくは１〜４個、より好ましくは２〜３個）有する５員又は６員の二価複素環としては、ピロール、ピロリジン、ピラゾール、トリアゾール、ピリジン、フラン、ピラン、チオフェン、モルホリン等から水素を２個取り除いた二価の基が挙げられる。これらの複素環のうち、ヘテロ原子として窒素を１〜３個（好ましくは２〜３個）有する５員又は６員の二価複素環基（例えば、ピラゾール環、トリアゾール環から水素を２個取り除いた二価の基、より具体的には、例えば、
【００９５】
【化２６】
2019013181.tif 000028
【００９６】
等）が挙げられる。
【００９７】
これらの二価の環状構造のうち、好ましいものとしては、二価の芳香族環（芳香族炭化水素環基及び芳香族複素環基を含む）等が挙げられる。かかる二価の芳香族環としては、フラン、ピロール、ベンゼン等の５〜６員環から水素を２個取り除いた二価の基等を挙げることができ、より具体的には、例えば、
【００９８】
【化２７】
2019013181.tif 000029
【００９９】
等が挙げられる。
【０１００】
かかる鎖状リンカーは、置換基により置換されていてもよく、好ましくは、例えば、ハロゲン、水酸基及びＣ１−６アルキル基からなる群より選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。かかる鎖状リンカーが置換されている場合、置換基の数は特に限定されないが、例えば、１〜３個、１〜２個、１個等の範囲で適宜設計できる。
【０１０１】
本発明において、「主鎖が１〜１０原子からなる」とは、主鎖を構成する原子のうち水素原子を除いたものの数が１〜０であることを意味する。
【０１０２】
従って、Ｌａが下記構造を示す場合、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
主鎖が７原子からなる鎖状リンカーと表すことができる。
【０１０３】
また、Ｌａが下記構造を示す場合も、
【０１０４】
【化２８】
2019013181.tif 000030
【０１０５】
主鎖が７原子からなる鎖状リンカーと表すことができる。
【０１０６】
また、Ｌａが下記構造を示す場合、
【０１０７】
【化２９】
2019013181.tif 000031
【０１０８】
主鎖が９原子からなる鎖状リンカーと表すことができる。
【０１０９】
Ｌｂがリンカーである場合、かかるリンカーとしては、例えば、主鎖が１〜１５原子、好ましくは１〜１０原子からなる鎖状リンカー等が挙げられる。かかる鎖状リンカーとしては、−ＣＨ２−、−ＣＨ２＝ＣＨ２−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝ＮＨ）−からなる群より選択される少なくとも１種から構成されるもの等を挙げることができる（従って、例えば、上記群より選択される１個をリンカーとしてもよいし、上記群より選択される２個以上（１種類でも２種類以上でもよい）組み合わせたものをリンカーとしてもよい。）。かかるリンカーとしては、アミド結合［−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−又は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−］、エーテル結合（−Ｏ−）、チオエーテル結合（−Ｓ−）、エステル結合［−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−］及びウレタン結合［−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ＝）−ＮＨ−］からなる群より選択される少なくとも一種の構造を含むものが好ましい。これらのリンカーは、置換基により置換されていてもよく、好ましくは、例えば、ハロゲン、水酸基、Ｃ１−６アルキル基、ならびに置換基としてアルキル基及び／又はアシル基を有してもよいアミノ基からなる群より選択される少なくとも一種で置換されていてもよい。かかる鎖状リンカーが置換されている場合、置換基の数は特に限定されないが、例えば、１〜３個、１〜２個、１個等の範囲で適宜設計できる。
【０１１０】
Ｌｂがリンカーである場合も、当該リンカーは、主鎖に二価の環状構造（例えば、５員又は６員の不飽和炭化水素環基；窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子を（好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個）有する５員又は６員の複素環基等）を、１〜２個（好ましくは１個）含んでいてもよい。当該５員又は６員の不飽和炭化水素環基；窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種のヘテロ原子を有する５員又は６員の複素環基等の例としては、Ｌａについて前述したもの等が挙げられる。また、Ｌｂにおいても、二価の環状構造の好ましい例として、二価の芳香族環（芳香族炭化水素環基及び芳香族複素環基を含む）等が挙げられ、より具体的には、フラン、ピロール、ベンゼン等の５〜６員環から水素を２個取り除いた二価の基等を挙げることができ、さらに具体的には、例えば、
【０１１１】
【化３０】
2019013181.tif 000032
【０１１２】
等が挙げられる。
【０１１３】
ｎは、１〜１０の自然数を示し、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜５がより好ましい。
【０１１４】
本発明にかかる化合物は、例えば、下記反応式−１に示すようにして製造される：
反応式−１
【０１１５】
【化３１】
2019013181.tif 000033
【０１１６】
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｌａ、Ｌｂ及びｎは前記に同じ。Ｒ５及びＲ６は、これらが反応して結合し、−Ｌｂ−を形成するような基を示す。Ｒ７及びＲ８は、これらが反応して結合し、−Ｌａ−を形成するような基を示す。］
工程１において、化合物Ａ−１と水とを反応させることにより、化合物Ａ−２を得ることができる。
【０１１７】
当該置換反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。
【０１１８】
工程２において、化合物Ａ−２をＮ−アルキル化することにより、化合物Ａ−３を得ることができる。当該Ｎ−アルキル化反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。
【０１１９】
工程３において、化合物Ａ−３を臭素化することにより、化合物Ａ−４を得ることができる。当該反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。
【０１２０】
工程４において、化合物Ａ−４と化合物Ａ−５とを反応させることにより、化合物Ａ−６を得ることができる。当該反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。化合物Ａ−５の使用割合は、化合物Ａ−４  １モルに対し、例えば、０．１〜１０モルの範囲で適宜設定し得る。
【０１２１】
工程５において、化合物Ａ−６と化合物Ａ−７とを反応させることにより、化合物Ａ−８を得ることができる。当該反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。化合物Ａ−７の使用割合は、化合物Ａ−６  １モルに対し、例えば、０．１〜１０モルの範囲で適宜設定し得る。
【０１２２】
工程６において、化合物Ａ−８と化合物Ａ−９とを反応させることにより、化合物Ａ’を得ることができる。当該反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。化合物Ａ−９の使用割合は、化合物Ａ−８  １モルに対し、例えば、０．１〜１０モルの範囲で適宜設定し得る。
【０１２３】
また、本発明にかかる化合物は、下記反応式ＩＩに示すようにして製造することもできる：
反応式−２
【０１２４】
【化３２】
2019013181.tif 000034
【０１２５】
［式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｌａ、Ｌｂ及びｎは前記に同じ。］
工程７において、化合物Ａ−９と化合物Ａ−７とを反応させることにより、化合物Ａ−１０を得ることができる。当該反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。化合物Ａ−７の使用割合は、化合物Ａ−９  １モルに対し、例えば、０．１〜１０モルの範囲で適宜設定し得る。
【０１２６】
工程８において、化合物Ａ−１０と化合物Ａ−６とを反応させることにより、化合物Ａ’を得ることができる。当該反応は、適当な溶媒中又は無溶媒下で、自体公知の方法、又はそれに準じる方法により行うことができる。反応時間は、０．１〜１００時間であり、好ましくは０．１〜２４時間である。反応温度は、例えば、０℃〜溶媒の沸点、好ましくは０℃〜１００℃で適宜設定できる。化合物Ａ−６の使用割合は、化合物Ａ−１０  １モルに対し、例えば、０．１〜１０モルの範囲で適宜設定し得る。
【０１２７】
上記製造法の各工程で得られる各々の化合物は、公知の分離精製手段、例えば、濃縮、減圧濃縮、結晶化、溶媒抽出、再沈殿、クロマトグラフィー等により単離精製するか又は単離精製することなく、次工程に付すことができる。
【０１２８】
本発明において、化合物Ａの塩は、酸付加塩と塩基との塩を包含する。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、化合物Ａがカチオンである場合、化合物Ａの塩には、ハロゲン化物（塩化物等）等も包含される。
【０１２９】
また、本発明において、化合物Ａ又はその塩が、光学異性体、立体異性体、位置異性体等の異性体を有する場合には、いずれの異性体であるか明記がない限り、いずれの異性体を用いた発明も、種々の異性体の混合物を用いた発明も本発明に包含され得る。
【０１３０】
本発明において、化合物Ａは、水和物又は溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物及び溶媒和物もまた本発明の化合物に包含される。
【０１３１】
溶媒和物を形成する溶媒としては、エタノール、プロパノール等のアルコール、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ＤＭＳＯ等が例示される。
【０１３２】
医薬
本発明の化合物Ａ又はその塩は、オートファジー機構によって、傷害を受けたミトコンドリアの分解を誘導することができる。従って、本発明は、化合物Ａ又はその塩を含む、傷害を受けたミトコンドリアの分解により処置され得る疾患を予防又は治療するための医薬を提供する。
【０１３３】
傷害を受けたミトコンドリアの分解により処置され得る疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、ハンチントン舞踏病、進行性核上性麻痺、レビー小体型認知症、黒質線状体変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、脊髄小脳変性症、ピック病等の神経変性疾患、癌、炎症性疾患、加齢性疾患、代謝性疾患、ミトコンドリア病（例えば、MELAS、MERRF、慢性進行性外眼筋麻痺症、リー脳症等）、ダウン症等が挙げられる。
【０１３４】
本発明においては、本発明の有効成分である化合物Ａ又はその塩そのものを医薬として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、例えば等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
【０１３５】
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。これらの等張化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１３６】
キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、エデト酸カルシウム等のエデト酸塩類、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢酸又はその塩、ヘキサメタリン酸ソーダ、クエン酸等が挙げられる。これらのキレート剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１３７】
安定化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【０１３８】
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。これらのｐＨ調節剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１３９】
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。これらの防腐剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１４０】
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１４１】
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。これらの溶解補助剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１４２】
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。これらの粘稠化剤は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１４３】
また、上記医薬組成物は、化合物Ａ又はその塩以外に、傷害を受けたミトコンドリアの分解により処置され得る疾患の予防又は治療作用を有するとされている化合物をさらに含んでいてもよい。また、上記医薬組成物は、化合物Ａ又はその塩以外に、オートファジー誘導作用が知られているか、もしくは示唆されている化合物をさらに含んでいてもよい。かかる化合物としては、sirolimus（ラパマイシン）等が挙げられる。また、Kaizuka et al., Molecular Cell, 64, 835 (2016)に記載の化合物等も挙げられる。これらの化合物は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１４４】
医薬組成物の実施形態において、組成物中の化合物Ａ又はその塩の含有量は特に限定されず、化合物Ａの含有量換算で、例えば、90質量%以上、70質量%以上、50質量%以上、30質量%以上、10質量%以上、5質量%以上、1質量％以上等の条件から適宜設定できる。
【０１４５】
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤；注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）、座剤等の非経口投与剤等の各種製剤形態を挙げることができる。上記製剤形態のうち、好ましいものとしては、例えば、経口投与剤（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等）、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）等が挙げられる。
【０１４６】
本発明において、化合物Ａ又はその塩の投与量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、化合物Ａの投与量として、成人に対する１日投与量が通常、約5000mg以下、好ましくは約1000mg以下、より好ましくは500mg以下になる量とすればよい。化合物Ａ又はその塩の投与量の下限も特に限定されず、例えば、化合物Ａの投与量として、成人に対する1日投与量が通常、1mg以上、好ましくは10mg以上、より好ましくは100mg以上の範囲で適宜設定できる。1日1回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、1日3回投与する場合は、1製剤中にこの3分の1量が含まれていればよい。
【０１４７】
本発明の医薬は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
【０１４８】
傷害を受けたミトコンドリアの分解剤
本発明は、また、化合物Ａ又はその塩を含む、傷害を受けたミトコンドリアのオートファジー機構による分解剤も提供する。当該分解剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、本発明の医薬について前述したと同様である。
【実施例】
【０１４９】
本発明は、更に以下の実施例、試験例および製剤例によって詳しく説明されるが、これらは本発明を限定するものではない。【０１５０】
以下の実施例において室温は約10°Cから35°Cを示す。終夜とは通常１０時間から１５時間を示す。水、或いは、酸素に不安定な試薬や化合物を用いる反応においては、予め加熱乾燥したフラスコ、注射器、カニュラ等を用い、窒素雰囲気下、もしくは、アルゴン雰囲気下で反応を行った。減圧濃縮は、ダイアフラム真空ポンプとロータリーエバポレーターを用いて行った。高速液体クロマトグラフィーには、ポンプとして日本分光JASCO PU-980、UV検出器として日本分光JASCO UV-4075、インテグレーダーとして日本分光JASCO 807-IT、分析用カラムとしてナカライテスクCOSMOCIL 5C18-AR-II[Φ5μm, 4.6mm I.D.x150 mm]、分取用カラムとしてナカライテスクCOSMOCIL 5C18-AR-IIPacked column [Φ5μm, 20 mm I.D.x250 mm]を用いた。核磁気共鳴スペクトルは、日本電子製JNM-ECA600 (600MHz) を用いて測定した。1H NMRスペクトルは、ジメチルスルホキシド(2.50 ppm）、メタノール(3.30 ppm）を内部標準とした。多重度はs (単一線), d (二重線), t (三重線),q (四重線), quin(五重線）,m (多重線)と略記し、また幅の広いシグナルはbrs と付記した。カップリング定数(J) は、Hz で記載した。アルコール、アミノ基、カルボン酸などのプロトンピークは非常に幅広く検出できない場合は記載していないことがある。高分解能質量スペクトル(HRMS)はBruker製 micro Tof focus(ESI-TOF)を用いた。通常はプロトン化された分子イオンが検出されるが、塩の場合は陽イオン部のみが検出される。【０１５１】
以下の実施例においては、以下の略号を使用する。
methanol-d4：重メタノール
DIPEA: N,N-ジイソプロピルエチルアミン
Indole-FBnPYR:N-(3-{2-[2-(3-{4-[2-アミノ-9-(4-フルオロ-ベンジル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-8-イル]-ピラゾール-1-イル}-プロポキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピル)-2-オキソ-2-(2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-アセトアミド
CCCP: カルボニルシアニド m-クロロフェニルヒドラゾン
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO-d6: 重ジメチルスルホキシド
ESI: electrospray ionization、エレクトロスプレーイオン化Et3N: トリエチルアミン
FBnNAC: (R) -2-アミノ-3-(2-アミノ-9-(4-フルオロベンジル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-8-イルチオ)プロパン酸
FBnNAC-linker: (R)-2-アセトアミド-3-(2-アミノ-9-(4-フルオロベンジル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-8-イルチオ)-N-(3-(2-(2-(3-アミノプロポキシ)エトキシ)エトキシ)プロピル)プロパンアミド
Indole-FBn:(R)-2-アセトアミド-3-[2-アミノ-9-(4-フルオロベンジル)-6-オキソ-6,9-ジヒドロ-1H-プリン-8-イルスルファンニル]-N-{3-[2-(2-{3-[2-オキソ-2-(2-フェニル-1H-インドール-3-イル)-アセチルアミノ]-プロポキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピル}プロパンアミド
MS: マススペクトル
N.S.: 有意差なし（not significant)
HRMS: 高分解能質量スペクトル
1H NMR: プロトン核磁気共鳴
PBS: リン酸緩衝生理食塩水
PyBOP: ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム
TFA: トリフルオロ酢酸。【０１５２】
実施例１
4-(4-(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propylcarbamoyl)phenyl)-1-methylpyridinium trifluoroacetateの合成
フラスコに4-(4-carboxy-phenyl)-1-methyl-pyridinium iodide (4.8 mg)を入れ、40℃、アルゴン雰囲気下でDMF (95 μL)、PyBOP (15.1 mg)、TEA (4.1 μL)、diethylene glycol bis(3-aminopropyl) ether (6.4 μL)を加えて終夜撹拌した。反応混合物をHPLC（5C18-AR-II, 移動相：水/アセトニトリル(0.1％TFA含有））で精製し、標題化合物(1.6 mg)を得た。【０１５３】
【化３３】
2019013181.tif 000035
【０１５４】
HRMS: 
Calcd for C23H34N3O4[M]+:416.2544, found 416.25181H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ1.16 (1H, t, J = 7.3 Hz), 1.23-1.25 (1H, m), 1.73-1.79 (4H, m), 2.84 (2H, quin, J = 5.5 Hz), 3.44-3.53 (12H, m), 4.33 (3H, s), 7.65 (2H, brs), 8.05 (2H, d, J = 8.7 Hz), 8.16 (2H, d, J = 8.7 Hz), 8.54 (2H, d, J = 6.8 Hz), 8.70 (1H, t, 5.5 Hz), 9.04 (2H, d, J = 6.8 Hz)。【０１５５】
実施例２
(R)-4-[4-(3-{2-[2-(3-{2-acetylamino-3-[2-amino-9-(4-fluoro-benzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylsulfanyl]-propionylamino}-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propylcarbamoyl)-phenyl]-1-methyl-pyridinium trifluoroacetateの合成  フラスコに4-(4-(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propylcarbamoyl)phenyl)-1-methylpyridinium trifluoroacetate (1.6 mg)を入れ、アルゴン雰囲気下でDMF (20 μL)、PyBOP (3.1 mg)、TEA (0.84 μL)、 (R)-2-amino-3-(2-amino-9-(4-fluorobenzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylthio)propanoic acid (FBnNAC) (2.6 mg)を加え、室温で7時間撹拌した。反応混合物をHPLC（5C18-AR-II, 移動相：水/アセトニトリル(0.1％TFA含有））で精製し、標題化合物(1.89 mg)を得た。【０１５６】
【化３４】
2019013181.tif 000036
【０１５７】
HRMS: 
Calcd for C40H49FN9O7S [M]+: 818.3454, found 818.34871H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ1.83 (3H, s), 3.3-3.5 (12H, m), 1.58 (2H, quin, J = 6.8 Hz), 1.74-1.77 (2H, m), 3.06-3.08 (6H, m), 4.32 (3H, s), 4.41-4.45 (1H, m), 5.06 (2H, s), 6.54 (2H, brs), 7.12-7.15 (4H, m), 8.02 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.05 (2H, d, J = 8.3 Hz), 8.15 (2H, d, J = 8.3 Hz), 8.41 (1H, d, J = 8.3 Hz), 8.53 (2H, d, J = 6.4 Hz), 8.67 (1H, t, J = 5.5 Hz), 9.03 (2H, d, J = 6.4 Hz), 10.7 (1H, s)。【０１５８】
実施例３
(R)-2-Acetylamino-3-[2-amino-9-(4-fluoro-benzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylsulfanyl]-N-{3-[2-(2-{3-[2-oxo-2-(2-phenyl-1H-indol-3-yl)-acetylamino]-propoxy}-ethoxy)-ethoxy]-propyl}-propionamide (Indole-FBn)の合成  フラスコにoxo-(2-phenyl-1H-indol-3-yl)-acetyl chloride (0.57 mg)を入れ、0℃、アルゴン雰囲気下にてDMF (6.8 μL)、TEA (0.45 μL)、 FBnNAC-linker (1.7 mg)を加えた。室温に昇温し7時間撹拌した。反応混合物をHPLC（5C18-AR-II, 移動相：水/アセトニトリル(0.1％TFA含有））で精製し、標題化合物(1.9 mg)を得た。【０１５９】
【化３５】
2019013181.tif 000037
【０１６０】
HRMS: 
Calcd for C43H48FN9O8S [M+H]+: 870.3409, found 870.33961H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ 1.42 (2H, quin, J = 6.9 Hz), 1.59 (2H, quin, J = 6.9 Hz), 1.83 (3H, s), 2.37-2.38 (2H, m), 2.52-2.60 (2H, m), 3.3-3.5 (16H, m), 4.42-4.44 (1H, m), 5.06 (2H, s), 7.13-7.16 (2H, m), 7.19 (2H, m), 7.21-7.27 (2H, m), 7.46-7.48 (4H, m), 7.54-7.55 (2H, m), 8.02 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.06 (1H, d, J = 7.8 Hz), 8.40 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.43 (1H, t, J = 5.5 Hz), 10.6 (1H, s), 12.4 (1H, s)。【０１６１】
実施例４
(R)-N-(9-(4-(4-((2-amino-9-(4-fluorobenzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylthio)methyl)-2,5-dioxo-10,13,16-trioxa-3,6-diazanonadecan-19-ylcarbamoyl)-2-carboxyphenyl)-6-(dimethylamino)-3H-xanthen-3-ylidene)-N-methylmethanaminium trifluoroacetate
フラスコに3-carboxy-4-(6-(dimethylamino)-3-(dimethyliminio)-3H-xanthen-9-yl)benzoate (2.0 mg)を入れ、アルゴン雰囲気下でDMF (35.2 μL)、PyBOP (1.9 mg)、TEA (1.0 μL)、 FBnNAC-linker (2.3 mg)を加え、室温で6時間撹拌した。つづいて40℃に昇温し、さらに4時間撹拌した。反応混合物をHPLC（5C18-AR-II, 移動相：水/アセトニトリル(0.1％TFA含有））で精製し、標題化合物(2.1 mg)を得た。【０１６２】
【化３６】
2019013181.tif 000038
【０１６３】
HRMS: 
Calcd for C52H60FN10O10S [M]+: 1035.4193, found 1035.41861H NMR (600 MHz, DMSO-d6)    δ 1.59 (2H, quin, J = 7.1 Hz) 1.80-1.82 (5H, m), 2.89-2.90 (4H, m), 3.06-3.09 (14H, m), 3.27-3.50 (12H, m), 4.41-4.45 (1H, m), 5.06 (2H, s), 6.54 (2H, brs), 7.12-7.17 (4H, m), 7.58-7.60 (4H, m), 7.97-7.98 (1H, m), 8.02 (1H, t, J = 5.5 Hz), 8.29 (1H, d, J = 1.8 Hz) 8.35 (1H, dd, J = 1.8, 8.2 Hz), 8.42 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.71 (2H, s), 8.87(1H, t, J = 5.5 Hz), 10.66 (1H, s)【０１６４】
実施例５
ミトコンドリアに集積するタンパク質リガンドとFBnNACを結合した分子（下図）の合成法【０１６５】
【化３７】
2019013181.tif 000039
【０１６６】
Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）で培養したHeLa細胞に、EmGFP-HaloTag-Omp25をコードするプラスミドpEmGFP-HaloTag-Omp25をトランスフェクションし、タンパク質を安定発現させた。ここに終濃度15 μMになるよう(R)-2-acetamido-3-(2-amino-9-(4-fluorobenzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylthio)-N-(21-chloro-3,6,9,12,15-pentaoxahenicosyl)propanamideを添加し，37°C / 5％CO2条件でEmGFP-HaloTag-Omp25と4時間反応させて標記化合物を合成した。
pEmGFP-HaloTag-Omp25  配列情報（配列番号１）を図１〜２に示す。【０１６７】
実施例６
実施例５で合成した化合物によるミトコンドリア分解効果（ミトファジー促進効果）の評価法
EmGFP-HaloTag-Omp25安定発現HeLa細胞をDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に播種し24時間培養した。細胞を２群にわけ、実験群に終濃度15 μMになるように(R)-2-acetamido-3-(2-amino-9-(4-fluorobenzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylthio)-N-(21-chloro-3,6,9,12,15-pentaoxahenicosyl)propanamideを添加し，37°C / 5％CO2条件で4時間インキュベートして実施例５の分子を合成した。このときコントロール群には薬剤を添加せず、実施例５の分子を含まない細胞群とした。次にコントロール群、実験群の双方に対して終濃度10 μMで脱共役剤CCCPを加え4時間インキュベートしてミトコンドリア傷害を誘導した。細胞をPBSで洗浄し，タンパク質分解酵素阻害剤を含む細胞溶解溶液で処理して細胞抽出液を得た。細胞抽出液をSDS-PAGEに供し，ミトコンドリアのマトリックスに存在するタンパク質UQCRC1のレベルをウェスタンブロットによって検出した。コントロール群に対して，実験群の細胞におけるUQCRC1レベルの相対値を活性値とした。内部標準としてアクチンのレベルを用いた。結果を図３に示す。値が1以下となる場合はミトコンドリアタンパク質の分解が促進したことを表す。なお、棒グラフに示すデータは3回の独立した実験における平均±SEM，また，スチューデントt検定におけるP値に関して，p<0.05を*，p<0.01を**，p<0.001を***と示した。【０１６８】
実施例７
ミトコンドリア傷害を発生させるため、ここでは代表的な実験条件として脱共役剤CCCPを用いた。CCCPは、ミトコンドリア膜電位の異常を誘導する。
ミトコンドリア傷害に対する実施例５で合成した化合物の細胞保護効果評価法
EmGFP-HaloTag-Omp25安定発現HeLa細胞をDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に播種し24時間培養した。細胞を２群にわけ、実験群に終濃度15 μMになるように(R)-2-acetamido-3-(2-amino-9-(4-fluorobenzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylthio)-N-(21-chloro-3,6,9,12,15-pentaoxahenicosyl)propanamideを添加し，37°C / 5％CO2条件で4時間インキュベートして実施例５の分子を合成した。このときコントロール群には薬剤を添加せず、実施例５の分子を含まない細胞群とした。次にコントロール群、実験群の双方に対して終濃度10 μMで脱共役剤CCCPを加え4時間インキュベートしてミトコンドリア傷害を誘導した。各群の細胞をPBSで洗浄し，4％パラホルムアルデヒドで固定処理をしたのち，市販のTUNELアポトーシス解析キット(AAT Bioquest, Inc.) を使用して細胞生存率を算出した。コントロール群の細胞生存率を100 (%)としたときの各条件での生存率(%)を図４に棒グラフで示した。グラフのレジェンドにおいては、簡便のため実施例５の分子をリガンドと表記した。【０１６９】
実施例８
ミトコンドリア傷害に対する実施例３の化合物(R)-2-Acetylamino-3-[2-amino-9-(4-fluoro-benzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-ylsulfanyl]-N-{3-[2-(2-{3-[2-oxo-2-(2-phenyl-1H-indol-3-yl)-acetylamino]-propoxy}-ethoxy)-ethoxy]-propyl}-propionamide（Indole-FBn)の細胞保護効果評価法、およびオートファジー阻害剤（バフィロマイシン A1: Baf A1)による細胞保護効果の阻害確認【０１７０】
Indole-FBnとCCCPで細胞を処理する条件（試験群）の細胞生存率：
96ウェルプレート内のDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に30000細胞ずつ播種したHeLa細胞を一晩37oC / 5％CO2条件でインキュベートした。最終濃度1 μMとなるようにIndole-FBnを培地に添加し、さらに10時間インキュベートした。この際、Indole-FBn添加後9時間30分〜10時間の30分間にHoechst33342染色による核染色を行った。【０１７１】
続いて、終濃度10 μMとなるように脱共役剤CCCPを添加し、さらに2時間インキュベートしてミトコンドリア傷害を誘導した。核にDNA断片化が認められる細胞を死細胞と判定し、次の式により細胞生存率を算出した。【０１７２】
細胞生存率(%)=100×（DNA断片化が観察される細胞数）/（全細胞数）
CCCP処理直前の細胞生存率とCCCP処理2時間の細胞生存率を比較できるように棒グラフとして示した。【０１７３】
Indole-FBnで細胞を処理しない条件（コントロール群）の細胞生存率：
96ウェルプレート内のDulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）に30000細胞ずつ播種したHeLa細胞を37oC / 5％CO2条件で1日インキュベートしたのちHoechst33342染色による核染色を行った。続いて、半分のウェルに終濃度10 μMとなるように脱共役剤CCCPを添加し、さらに2時間インキュベートしてミトコンドリア傷害を誘導した（Indole-FBn未処理, CCCP処理条件）。核にDNA断片化が認められる細胞を死細胞と判定し、細胞生存率を算出した。また、CCCP未処理のウェルについても細胞生存率を算出した(Indole-FBn, CCCPともに未処理の条件）。結果を図５に示す。【０１７４】
以上の実験結果より、Indole-FBn添加は、ミトコンドリア傷害による細胞死を有意に抑制することが明らかになった。【０１７５】
バフィロマイシンA1 (Baf A1)は、リソソーム機能阻害を介してオートファジーを阻害することが知られている。そこで、上述の実験操作においてBaf A1を共存させ、以下のようにオートファジー機構の関与を確認した。DMEM培地中で一晩インキュベートしたHeLa細胞に、Indole-FBn処理の2時間前に、Baf A1を最終濃度200 nMとなるようにあらかじめ添加した。Baf A1を洗浄除去することなくIndole-FBnを培地に添加し、以降は上述の操作にならって実験を行った(Indole-FBn, CCCP, Baf A1の全てで処理する条件）。その結果、CCCP処理条件下においてIndole-FBnが示す細胞保護効果を、オートファジー阻害剤Baf A1が有意に阻害することが明らかになった。【０１７６】
棒グラフのデータは3回の独立施行から得られた平均±SEMであり，スチューデントt検定におけるP値に関して，p<0.01を**，p<0.001を***と示した。【０１７７】
実施例９
4-[4-(3-{2-[2-(3-{4-[2-Amino-9-(4-fluoro-benzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-yl]-pyrazol-1-yl}-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propylcarbamoyl)-phenyl]-1-methyl-pyridinium trifluoroactateの合成【０１７８】
【化３８】
2019013181.tif 000040
【０１７９】
フラスコに4-(1-methylpyridinium-4-yl)benzoate（２．００  ｍｇ）を入れ、アルゴン雰囲気下でＤＭＦ（０．９５  ｍＬ）、ＰｙＢＯＰ（９．８４  ｍｇ）、ＤＩＰＥＡ（４．９０  μＬ）、2-amino-8-[1-(3-{2-[2-(3-amino-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propyl)-1H-pyrazol-4-yl]-9-(4-fluoro-benzyl)-1,9-dihydro-purin-6-one（４．９５  ｍｇ）を加え、室温で８時間攪拌した。反応混合物をＨＰＬＣ（５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ，  移動相：水／アセトニトリル（０．１％  ＴＦＡ含有系））で精製し、標題化合物  （１．７５  ｍｇ）を得た。
HRMS: 
Calcd for C38H43FN9O5 [M-CF3COO-]+: 724.3366, found 724.3366
1H NMR (600 MHz, methanol-d4) δ 1.89-1.85 (2H, quin, J = 6.42 Hz), 2.07-2.03 (2H, quin, J = 6.42 Hz), 3.35-3.33 (2H, t, J = 5.52 Hz), 3.50-3.47 (4H, m), 3.64-3.57 (8H, m), 4.29-4.26 (2H, t, J = 6.9 Hz), 4.42 (3H, s), 5.50 (2H, s), 7.09-7.04 (2H, t, J = 8.7 Hz), 7.18-7.16 (2H, d, J = 5.52 Hz), 7.84 (1H, s), 8.01-8.00 (2H, d, J = 6.9 Hz), 8.05-8.03 (2H, d, J = 6.9 Hz), 8.08 (1H, s), 8.40 (2H, d, J = 6.72 Hz), 8.90 (2H, d, J = 6.9 Hz)。【０１８０】
実施例１０
N-(3-{2-[2-(3-{4-[2-Amino-9-(4-fluoro-benzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-yl]-pyrazol-1-yl}-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propyl)-2-oxo-2-(2-phenyl-1H-indol-3-yl)-acetamideの合成【０１８１】
【化３９】
2019013181.tif 000041
【０１８２】
HRMS:
フラスコにoxo-(2-phenyl-1H-indol-3-yl)-acetic acid (7.5 mg)、2-amino-8-[1-(3-{2-[2-(3-amino-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propyl)-1H-pyrazol-4-yl]-9-(4-fluoro-benzyl)-1,9-dihydro-purin-6-one (15 mg)を入れ、アルゴン雰囲気下でDMF (2.8 mL)、PyBOP (22 mg)、DIPEA (15 μL)を加え、室温で13時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮して得られた残渣をHPLC (5C18-AR-II, 移動相:水/アセトニトリル (0.1%TFA含有))で精製し、標題化合物 (9.5 mg)を得た。
Calcd for C41H42FN9O6 [M+H]+: 776.3315, found 776.3315
1H NMR (600 MHz, methanol-d4) δ 1.51 (2H, quin, J = 6.4 Hz), 2.05 (2H, quin, J = 6.4 Hz), 2.92 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.32 (2H, t, J = 5.9 Hz), 3.41 (2H, t, J = 5.9 Hz), 3.44-3.46 (2H, m), 3.52-3.54 (4H, m), 3.55-3.57 (2H, m), 4.27 (2H, t, J = 6.8 Hz), 5.47 (2H, s), 7.02-7.07 (2H, m), 7.17-7.21 (3H, m), 7.23- 7.25 (1H, m), 7.42-7.49 (4H, m), 7.54-7.56 (2H, m), 7.88 (1H, s), 8.08-8.10 (1H, m), 8.19 (1H, s)。【０１８３】
実施例１１
{9-[4-(3-{2-[2-(3-{4-[2-amino-9-(4-fluoro-benzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-yl]-pyrazol-1-yl}-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propylcarbamoyl)-2-carboxy-phenyl]-6-dimethylamino-xanthen-3-ylidene}-dimethyl-ammonium trifluoroacetateの合成【０１８４】
【化４０】
2019013181.tif 000042
【０１８５】
フラスコに [9-(2,4-dicarboxy-phenyl)-6-dimethylamino-xanthen-3-ylidene]-dimethyl-ammonium trifluoroacetate (4.4 mg)、2-amino-8-[1-(3-{2-[2-(3-amino-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propyl)-1H-pyrazol-4-yl]-9-(4-fluoro-benzyl)-1,9-dihydro-purin-6-one (4.2 mg)を入れ、アルゴン雰囲気下でDMF (0.8 mL)、PyBOP (9.4 mg)、DIPEA (6.3 μL)を加え、室温で5時間撹拌した。反応混合物を減圧濃縮して得られた残渣をHPLC (5C18-AR-II, 移動相:水/アセトニトリル (0.1%TFA含有))で精製し、標題化合物 (1.6 mg)を得た。
HRMS:
Calcd for C50H54FN10O8 [M-CF3COO-]+: 941.4105, found 941.4105
1H NMR (600 MHz, methanol-d4) δ 1.92 (2H, quin, J = 6.4 Hz), 2.06 (2H, quin, J = 6.4 Hz), 3.30-3.32 (12H, m), 3.34-3.36 (2H, m), 3.50-3.55 (4H, m), 3.60-3.66 (8H, m), 4.30 (2H, t, J = 6.4 Hz), 5.52 (2H, s), 6.97 (2H, d, J = 2.3 Hz), 7.02-7.12 (6H, m), 7.19-7.22 (2H, m), 7.52 (1H, d, J = 8.3 Hz), 7.88 (1H, s), 8.18 (1H, s), 8.23 (1H, dd, J = 1.8, 5.9 Hz), 8.73 (1H, d, J = 1.8 Hz)。【０１８６】
実施例１２
(R)-N1-(4-(3-amino-6-(thiophen-2-yl)-4-(trifluoromethyl)thieno[2,3-b]pyridine-2-carbonyl)phenyl)-N2-(4-(((2-amino-9-(4-fluorobenzyl)-6-oxo-6,9-dihydro-1H-purin-8-yl)thio)methyl)-2,5-dioxo-10,13,16-trioxa-3,6-diazanonadecan-19-yl)oxalamide の合成【０１８７】
【化４１】
2019013181.tif 000043
【０１８８】
フラスコに3-(3-{2-[2-(3-amino-propoxy)-ethoxy]-ethoxy}-propylamino)-N-[4-(3-amino-6-thiophen-2-yl-4-trifluoromethyl-thieno[2,3-b]pyridine-2-carbonyl)-phenyl]-2-oxo-propionamide（１．６  ｍｇ）を入れ、アルゴン雰囲気下にてＤＭＦ（４５  μＬ）、ＴＥＡ（０．７  μＬ）、ＦＢｎＮＡＣ（１．０  ｍｇ）を加えた。室温で５時間撹拌した後、ＰｙＢＯＰ（２．９  ｍｇ）、ＴＥＡ（０．７  μＬ）を追加し、終夜撹拌した。反応混合物をＨＰＬＣ（５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ，  移動相：水／アセトニトリル（０．１  ％ＴＦＡ含有））で精製し、表題化合物（１．１  ｍｇ）を得た。
HRMS:
Calcd for C48H49FN11O9S3 [M+H]+ : 1096.2891, found 1096.2892
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ1.57-1.62 (2H, quin, J = 6.9 Hz), 1.72-1.76 (2H, quin, J = 7.2 Hz), 1.82 (3H, s), 3.26-3.45 (18H, m), 4.42-4.46 (1H, m), 5.06 (2H, s), 6.52 (2H, brs), 7.12-7.15 (2H, m), 7.18-7.20 (2H, m), 7.26-7.27 (1H, dd, J = 3.67, 5.04 Hz), 7.73 (2H, brs), 7.86-7.87 (1H, dd, 0.92, 5.04 Hz), 7.82-7.84 (2H, d, J = 8.71 Hz), 8.00-8.01 (2H, d, J = 8.71 Hz), 8.03 (1H, t, J = 5.61 Hz), 8.26-8.27 (1H, dd, J = 0.91, 3.66 Hz), 8.33 (1H, s), 8.40-8.41 (1H, d, J = 8.25 Hz), 9.03 (1H, t, J = 6.00 Hz), 10.64 (1H, s), 10.94 (1H, s)。【０１８９】
実施例１３
Indole-FBnは傷害を受けたミトコンドリアの分解を促進する（生細胞イメージング法）
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)で培養したHeLa細胞に，ミトコンドリア外膜上に局在するEmGFP-HaloTag-Omp25融合タンパク質をコードする遺伝子配列を含んだプラスミドpEmGFP-HaloTag-Omp25をトランスフェクションし，タンパク質を安定発現させた。この結果、細胞内のミトコンドリアは緑色蛍光を指標に観察できた。【０１９０】
ここに，赤色蛍光色素MitoTracker Red CMXRos (Thermo Fisher Scientific, M7513)を添加し， 30分間インキュベートしてミトコンドリアを染色した。この段階で細胞内のミトコンドリアはEmGFP-HaloTag-Omp25とMitoTracker Red CMXRosにより2色で染色された。続いて培地中のMitoTracker Red CMXRosを培地交換によって除去した。この操作以降に生合成されるミトコンドリアは、緑色蛍光でのみ検出でき、赤色蛍光では検出されないことになる。この違いを利用して、ミトコンドリアの分解過程を生細胞イメージングによって観察した。【０１９１】
細胞を2群に分け，実験群に終濃度10 μMとなるようにIndole-FBnを添加した。コントロール群には、Indole-FBn を添加しなかった。長時間定点を生細胞観察するため，培養容器は，蛍光顕微鏡 (KEYENCE, BX9000) に設置したステージトップインキュベーター（37℃，5％CO2）に固定し，以後の操作はすべて顕微鏡上で行った。Indole-FBnを添加してから10時間後，実験群とコントロール群に同時に10 μMのCCCPを添加し，インキュベートを続けた。【０１９２】
Indole-FBnを添加した時刻 (-10 h)，CCCPを添加した時刻 (0 h)，CCCP添加後2時間 (+2 h)，4時間 (+8 h)，16時間 (+16 h) におけるEmGFP-HaloTag-Omp25とMitoTracker Red CMXRosのシグナルを図に示した。グラフは，図に示した写真におけるEmGFP-HaloTag-Omp25（緑色蛍光）とMitoTracker Red CMXRos（赤色蛍光）のシグナルの強度を，それぞれ-10 hの時点の強度を１として相対値で示したものである。画像解析はImageJ (National Institutes of Health) により行った。結果を図６及び図７に示す。【０１９３】
グラフよりIndole-FBn処理群の細胞において、CCCP添加後(2 h, 8 h)に緑色、赤色のシグナル強度が低下した。これはCCCP添加時に傷害を受けたミトコンドリアが分解されたことを示している。また、CCCP添加後8時間後と16時間後のグラフを比較すると、Indole-FBn処理群においてのみ、緑色蛍光強度が増加し、ミトコンドリアが新生していることが示された。【０１９４】
以上の生細胞イメージング実験より、Indole-FBnは傷害を受けたミトコンドリアの除去と、ミトコンドリア新生をともに促進することが示された。【０１９５】
実施例１４
JC-1染色
ダウン症患者包皮由来線維芽細胞であるDetroit532細胞をEagle’s Minimum Essential Mediumで培養した。細胞を2群に分け，実験群には終濃度10 μMの化合物（Indole-FBn）を添加し，コントロール群には添加せずに3日間インキュベートした (37℃，5％CO2) 。各群の細胞をJC-1 (abcam, 113850) でそれぞれ染色した。【０１９６】
JC-1色素は，正常な膜電位を有するミトコンドリアに集積して、赤色の蛍光を発する。一方，異常な膜電位ミトコンドリアからは局在が失われるとともに緑色蛍光を発する。すなわち，JC-1染色像において、「緑色/赤色の蛍光強度比」が小さいほど、ミトコンドリアの膜電位がより正常に保たれている。染色像をImageJ (National Institute of Health) により解析し，「緑色/赤色の蛍光強度比」を図示した。結果を図８に示す。エラーバーは3回の独立した実験データから得られた標準偏差を示した。
この結果は、ダウン症由来細胞など疾患により低下したミトコンドリア品質が、化合物の添加により有意に改善することを示す。【０１９７】
実施例１５
ダウン症患者由来Detroit532細胞における、Indole-FBnのミトファジー誘導評価
実施例１４におけるIndole-FBn化合物処理が、ミトコンドリアの分解（ミトファジー）を誘導することを確認するため、Mitophagy detection kitであるMtphagy dye (Dojindo, MD01)を用いて解析した。この試薬を用いると、蛍光顕微鏡下において、ミトファジー分解を受けているミトコンドリアを選択的に輝点として検出できる。細胞当たりの輝点数が多いほど、ミトファジーが活発に起きていることを示す。【０１９８】
Detroit532細胞にMtphagy dyeを添加した。添加30分後にMtphagy dyeを洗浄除去し，新しい培地に交換するとともに終濃度10 μMのIndole-FBnGを添加した。一方，DMSOを処理した細胞群をコントール群とした。Indole-FBn添加24時間後にMtphagy Dyeの輝点を蛍光顕微鏡で観察した（図９）。写真は，Indole-FBn処理直後(0時間）と24時間後にコントロール群と薬剤投与群の細胞を撮影したものである。両群の25細胞をそれぞれ観察し、細胞あたりのMtphagy Dye輝点（Mitophagy dot)の数を縦軸として白丸でプロットした。コントロール群と薬剤投与群について Wilcoxon検定を行いp<0.01を**と表記した。【０１９９】
実施例１６
ミトコンドリア傷害に対するIndole-FBnPYR（実施例１０）の細胞保護効果評価
HeLa細胞をDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）に播種し24時間培養した。細胞を2 群に分け、実験群に終濃度0.1 μMになるようにIndole-FBnPYRを添加し、37°C/ 5% CO2条件で4時間インキュベートした。このとき、コントロール群にはIndole-FBnPYRを添加せず、薬剤を含まない細胞群とした。次にコントロール群、実験群の双方に対して、終濃度１０μMの脱共役剤CCCPを加え10時間インキュベートしてミトコンドリア傷害を誘導した。各群の細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定処理したのち、TUNELアポトーシス解析キット（Promega, DeadEnd  Fluorometric TUNEL  System）を使用して細胞生存率（Cell viability)を算出した。結果を図１０に示す。
エラーバーは、標準誤差(n=3)を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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