(57)【要約】  本発明によれば、簡便に得られ、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を有する、キャリアと生理活性物質とが一体化した複合体が提供される。本発明に係る複合体は、酸性下で凝集してなるｐＨ感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性下で凝集してなるｐＨ感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる、複合体。
【請求項２】
前記酸性下は、ｐＨ６．４未満である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ｐＨ感受性担体は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質と、を含む、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
前記生理活性物質は、タンパク質、ペプチドまたは核酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体およびアルミニウム化合物を含む、ｐＨ感受性組成物。
【請求項６】
ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含むｐＨ感受性担体を調製し、前記ｐＨ感受性担体と生理活性物質とを混合して混合液を調製し、前記混合液のｐＨを６．４未満に調整することを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＤＳ（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）として有用な、複合体、ならびに当該複合体を含むｐＨ感受性組成物および当該複合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生理活性物質を送達するためのＤＤＳキャリア（担体）の研究が盛んに行われている。弱酸性のｐＨに感受性をもつキャリアは、腫瘍や炎症など生体内においてｐＨが低下している部位への送達や、エンドソームエスケープを通じた細胞のサイトゾルへの送達を実現するものとして期待されている。【０００３】
特に、サイトゾルへの送達は、種々の分野に活用可能であることから、実現の要望が極めて高い。例えば、核酸のサイトゾルへの送達は遺伝子治療を可能にするものであり、抗原のサイトゾルへの送達は免疫療法等に有用な抗原特異的ＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の誘導や、アレルギーの治療等に有用な抗原特異的Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の誘導の鍵となる技術である。また、細胞内をドラッグターゲットとした新規薬剤への適用も検討されている。【０００４】
前記を実現するｐＨ感受性のキャリアとして、国際公開第２０１３／１８０２５３号公報（米国特許出願公開第２０１３／３２３３２０号明細書、米国特許出願公開第２０１６／１５１４９７号明細書、米国特許出願公開第２０１８／１０４３４３号明細書に対応）では、特定の両親媒性物質および特定のｐＨ感受性化合物を含むｐＨ感受性担体が開示されている。当該ｐＨ感受性担体は、中性のｐＨからエンドソームやリソソームの到達ｐＨであるｐＨ４．０のｐＨ領域で生体膜を破壊し、モデルの生理活性物質を細胞のサイトゾルへ送達する能力を有するとされている。また、国際公開第２０１５／０７９９５２号公報（米国特許出願公開第２０１６／２７１２４６号明細書に対応）および国際公開第２０１６／１９４６８５号公報（欧州特許出願公開第３３０５３２０号明細書に対応）では、自然免疫を刺激する物質であるＬｉｐｉｄ  Ａ、ＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチド、アルミニウム化合物等と共に使用することにより、抗原特異的なＣＴＬの誘導に有用であることが開示されている。【０００５】
一方、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８、Ｖｏｌ：２９、Ｉｓｓ：２９、ＰＰ：４０２９−４０３６およびＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１３、Ｖｏｌ：３４、Ｉｓｓ：１２、ＰＰ３０４２−３０５２では、多量の生理活性物質をサイトゾルへ送達するほど、より高い遺伝子発現や、より多数のＣＴＬを誘導できることが報告されている。そのため、サイトゾルへの送達をより効率良くすることが求められている。【０００６】
エンドソームエスケープを実現するｐＨ感受性のキャリアは、送達する生理活性物質とキャリアと一体化することにより、同一のエンドソームに内に捕捉される確率が向上し、より効率良く生理活性物物質をサイトゾルへ送達できることが知られている。国際公開第２０１３／１８０２５３号公報および国際公開第２０１５／０７９９５２号公報には、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質で構成され、膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体と、タンパク質やペプチド等の生理活性物質とを一体化できることが示唆されている。
【発明の概要】
【０００７】
しかしながら、国際公開第２０１５／０７９９５２号公報に記載の技術の場合、ｐＨ感受性担体と抗原とを一体化するのに凍結乾燥を行わなければならず、煩雑な工程を必要とする。また、国際公開第２０１３／１８０２５３号公報に記載の技術の場合、ｐＨ感受性担体に担持できる生理活性物質の量が限られるため、生理活性物質のエンドソーム内への取り込み、サイトゾルへの送達効率、ひいてはその後の機能発現が十分でないことが示唆される。したがって、より簡便に、かつ、より効率良く生理活性物質をキャリアと一体化できる技術が求められている。
【０００８】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであって、簡便に得られ、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を有する、キャリアと生理活性物質とが一体化した複合体を提供することを目的とする。
【０００９】
上記目的を達成するための本発明は、酸性下で凝集してなるｐＨ感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる、複合体である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１Ａは、ｐＨ感受性担体の分散液を種々のｐＨに設定したときの外観を示す写真である。図１Ｂは、ｐＨ感受性担体の分散液のｐＨを４．５に設定したときの経時変化を示す写真である。図１Ｃは、種々のｐＨで凝集させたｐＨ感受性担体の凝集体のｐＨ７．４およびｐＨ５．０での溶出率を示すグラフである。図１Ｄは、ＤＬＰＣ単独またはデオキシコール酸単独のｐＨ７．４およびｐＨ５．０での溶出率を示すグラフである。
【図２】図２Ａは、ｐＨ感受性担体およびＯＶＡを含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後での外観を示す写真である。図２Ｂは、ｐＨ感受性担体およびＯＶＡを含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後での吸光度（リン脂質濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、ＯＶＡを含む溶液のフィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。図３Ｂは、図３Ａの縦軸をタンパク質濃度に変換したグラフである。
【図４】図４Ａは、ＯＶＡおよびｐＨ感受性担体を含む混合液（ｐＨ３．５）のフィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。図４Ｂは、ＯＶＡおよびｐＨ感受性担体を含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、ＯＶＡおよびｐＨ感受性担体を含む混合液を種々のｐＨに設定したときの外観を示す写真である。図５Ｂは、ＯＶＡおよびｐＨ感受性担体を含む混合液を種々のｐＨに設定して１時間静置した後、フィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。図５Ｃは、ＯＶＡおよびｐＨ感受性担体を含む混合液を種々のｐＨに設定して１日静置した後、フィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図６】図６は、種々の濃度のＯＶＡおよびｐＨ感受性担体を含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、ＯＶＡおよび種々の濃度のｐＨ感受性担体を含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。図７Ｂは、ＯＶＡおよび１０００ｎｍｏｌ／ｍＬまたは１００ｎｍｏｌ／ｍＬのｐＨ感受性担体を含む混合液を酸性化させたときの外観を示す写真である。
【図８】種々の配合量のデオキシコール酸を含むｐＨ感受性担体およびＯＶＡを含む混合液のフィルター処理前後の吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、ＯＶＡが担持されたｐＨ感受性担体の凝集体の膜破壊機能促進効果を示すグラフである。図９Ｂは、水酸化アルミニウム存在下での複合体の膜破壊機能促進効果に対する影響を示すグラフであり、縦軸は溶出率（％）を示す。
【図１０】図１０Ａは、種々の両親媒性物質を含むｐＨ感受性担体およびＯＶＡを含む溶液を酸性化させた後、フィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。図１０Ｂは、種々のｐＨ感受性化合物を含むｐＨ感受性担体およびＯＶＡを含む溶液を酸性化させた後、フィルター処理前後での吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ｐＨ感受性担体およびデオキシリボ核酸（図中、ＤＮＡと表記）を含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後の吸光度（ＤＮＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａは、ｐＨ感受性担体およびＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後の吸光度（ペプチド濃度に対応）の変化を示すグラフである。図１２Ｂは、ｐＨ感受性担体およびＲＧＰＥＳＲＬＬペプチドを含む混合液を酸性化させた後、フィルター処理前後の吸光度（ペプチド濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図１３】図１３Ａは、ＯＶＡが担持されたｐＨ感受性担体の凝集体をｐＨ７．４で静置直後の外観を示す写真である。図１３Ｂは、ＯＶＡが担持されたｐＨ感受性担体の凝集体をｐＨ７．４で１日静置後の外観を示す写真である。図１３Ｃは、ＯＶＡが担持されたｐＨ感受性担体の凝集体を含む液のｐＨを中性に変化させたときの溶出率を示すグラフである。図１３Ｄは、ＯＶＡが担持されたｐＨ感受性担体の凝集体を含む液のｐＨを中性に変化させる前後の吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａは、ＯＶＡが担持されたｐＨ感受性担体の凝集体を含む液のｐＨを中性に設定したときの外観の経時変化を示す写真である。図１４Ｂは、ＯＶＡが担持されたｐＨ感受性担体の凝集体を含む液のｐＨを中性に設定したときの吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の経時変化を示すグラフである。
【図１５】図１５Ａは、ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体およびローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体の凝集体の外観を示す写真である。図１５Ｂは、ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体を皮内注射した後のマウスの写真である。図１５Ｃは、ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体を皮内注射した後のマウスに励起光を当てた写真である。図１５Ｄは、ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体の凝集体を皮内注射した後のマウスの写真である。図１５Ｅは、ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体の凝集体を皮内注射した後のマウスに励起光を当てた写真である。図１５Ｆは、ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体の凝集体を、複数回皮内注射した後のマウスの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一実施形態によれば、酸性下で凝集してなるｐＨ感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなる、複合体（以下、単に「複合体」とも称する）が提供される。当該実施形態によれば、簡便に得られ、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を有する、キャリアと生理活性物質とが一体化した複合体が提供される。
【００１２】
国際公開第２０１５／０７９９５２号公報では、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質で構成され、膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体と、生理活性物質として抗原とを一体化させる技術が開示されているが、当該技術は凍結乾燥を要するため、工業的に十分適しているとは言えなかった。
【００１３】
また、国際公開第２０１３／１８０２５３号公報では、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質で構成され、膜破壊機能促進効果を有するｐＨ感受性担体と、生理活性物質のモデルタンパク質とを一体化させる技術が開示されている。しかし、当該技術では、特にサイズの大きい生理活性物質を用いる場合、ｐＨ感受性担体に担持できる生理活性物質の量が限られるため、生理活性物質のエンドソーム内への取り込み、サイトゾルへの送達効率、ひいてはその後の機能発現が十分でないことが示唆される。
【００１４】
そこで、本発明者は、一体化技術の改良を検討した。その結果、ｐＨ感受性担体と生理活性物質とを混合し、当該混合物を酸性環境に晒すことで、両者が一体化した複合体を簡便に得ることができること、さらには、当該複合体は生理活性物質の一体化効率に優れ、かつ良好な膜破壊機能促進効果を発現できることを見出した。
【００１５】
上記効果が得られるメカニズムは不明であるが、以下のように推測される。なお、本発明は、以下の推測によって限定されるものではない。
【００１６】
ｐＨ感受性担体（以下、担体とも称する）は、酸性下で凝集体を形成するが、これには疎水性相互作用が主に寄与していると考えられる。すなわち、ｐＨ感受性担体は、両親媒性物質が構成する疎水性部分にｐＨ感受性化合物が会合するようにして形成されており、かようなｐＨ感受性担体を酸性環境に晒すと、ｐＨ感受性化合物のチャージが減少して、会合構造が不安定化する。これにより、ｐＨ感受性担体の構造変化が誘起され、疎水性相互作用をドライビングフォースとして、より安定な状態に移ろうとする。その結果として、多数のｐＨ感受性担体が関与する凝集体を形成すると考えられる。ゆえに、疎水性の生理活性物質を当該担体と混合し、酸性環境に晒すと、生理活性物質は疎水性相互作用により担体と共凝集し、担体が形成する凝集体内に取り込まれると考えられる。また、上述したように、酸性下では、ｐＨ感受性担体の会合形態が不安定化するため、他の担体と接触すると、互いの担体間で両親媒性物質の再配列が起こり、担体同士が融合しやすくなると考えられる。これにより、ｐＨ感受性担体は、他の担体と架橋構造を形成しながら凝集すると考えられる。ゆえに、担体と生理活性物質を混合し、酸性環境に晒した際、生理活性物質は、その親疎水性にかかわらず、担体の凝集体の架橋構造に物理的に捕捉される。この際、タンパク質のようにサイズが大きい生理活性物質は、担体の凝集体の架橋構造を通り抜けにくいため、凝集体内に捕捉されやすい。
【００１７】
上記のようにして、ｐＨ感受性担体と生理活性物質とを混合し、酸性環境に晒すことで、両者が一体化した複合体を簡便に得ることができると考えられる。また、当該複合体は、生理活性物質（特に、疎水性の生理活性物質や、サイズの大きい生理活性物質）の一体化効率に優れると考えられる。
【００１８】
また、ｐＨ感受性担体は、凝集しても、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との会合形態をある程度保持していると推察される。そのため、本発明の複合体と、生体膜（例えば、細胞膜、小胞膜など）とが存在している系で、ｐＨが生理的ｐＨ未満となった場合、複合体を構成するｐＨ感受性担体の凝集体の会合形態が変化し、生体膜と接触した後、当該変化に誘起されて、生体膜の膜構造変化も生じる。ゆえに、本発明の複合体は、良好な膜破壊機能促進効果を発現することができる。
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。
【００２０】
本明細書において、「凝集体」とは、複数のｐＨ感受性担体が集合してなる構造であれば特に制限されず、不定形であっても定形であってもよい。この際、個々のｐＨ感受性担体の構造は保持されていてもよいし、複数の担体が融合していてもよい。凝集体の形態は、たとえば透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）等の公知の観察手段によって確認することができる。本明細書では、ｐＨ感受性担体を含有する溶液をポアサイズ０．２２μｍのフィルターで処理し、フィルターを通過した液のリン脂質濃度が、フィルターを通過する前のリン脂質濃度未満であれば、ｐＨ感受性担体の凝集体が形成されているとする。なお、当該リン脂質濃度は、テストワコーなどの公知のリン脂質定量手段を用いて決定することができる。テストワコーを用いてリン脂質定量を行う場合、販売元のプロトコルに準拠するものとする。
【００２１】
本明細書において、「担持」とは、ｐＨ感受性担体が酸性下で凝集してなる凝集体の内部に、生理活性物質が、物理的な捕捉（たとえば、架橋構造への引っ掛かり）や化学的な結合（たとえば、疎水的相互作用、イオン結合、水素結合など）を介して保持されることをいう。この際、凝集体内での生理活性物質の存在状態は特に制限されず、凝集体を形成するｐＨ感受性担体の膜と他方の担体の膜との間に存在していてもよいし、担体の膜内に挿入されていてもよい。
【００２２】
本明細書において、「膜破壊機能」とは、溶出性試験において溶出を起こす機能を意味する。ここで、本明細書における溶出性試験とは、消光物質と蛍光物質とを含む水溶液を内包したリポソーム（分散液）と、複合体（生理活性物質が担持されたｐＨ感受性担体の凝集体）を含む液などの評価サンプル分散液とを、所定のｐＨに調製した水溶液に添加し、当該水溶液を３７℃で９０分間あるいは３０分間インキュベーションした後、当該水溶液の蛍光を測定する試験である。当該方法により、リポソームから溶出した蛍光物質量が測定することができ、複合体のリポソームの膜破壊機能を確認することができる。かような膜破壊機能を有することにより、生体膜（たとえばエンドソーム）の膜内部に含有されうる成分を生体膜の外部（たとえば細胞質基質）に溶出させうる。なお、上記の溶出性試験については、後述する実施例で詳細に説明する。
【００２３】
本明細書において、「膜破壊機能促進効果を発現する」とは、（１）溶出性試験において、生理的ｐＨにおける溶出率よりも生理的ｐＨ未満の所定のｐＨにおける溶出率が上昇し、なおかつその上昇幅がｐＨ感受性化合物単独で実験した場合の上昇幅よりも大きいこと、および、（２）当該生理的ｐＨ未満の所定のｐＨでの溶出性試験において、複合体の溶出率が、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率と両親媒性物質単独の溶出率の和より大きいこと、の両者を満たすことを意味する。より具体的には、膜破壊機能促進効果を発現するとは、ｐＨ７．４とｐＨ５．０またはｐＨ４．５との溶出性試験において、複合体の溶出率Ｌｃが、ｐＨ感受性化合物単独の溶出率Ｌａと両親媒性物質単独の溶出率Ｌｂと、下記の関係を双方満たすものをいう。すなわち、上記（１）が、下記式（１）で表され、上記（２）が下記式（２）で表される。なお、下記式中、ｐＨ７．４の溶出率を、それぞれ、Ｌｃ７．４、Ｌａ７．４、Ｌｂ７．４と表し、ｐＨ５．０または４．５の溶出率を、それぞれ、Ｌｃｘ、Ｌａｘ、Ｌｂｘと表す。
【００２４】
【数１】
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【００２５】
上記式（１）において、Δは、０を超えていればよいが、５以上であるのが好ましく、１０以上であるのがより好ましく、３０以上であるのがさらに好ましい。また、上記式（２）において、Δ’は、０を超えていればよいが、５以上であるのが好ましく、１０以上であるのがより好ましく、１５以上であるのがさらに好ましい。
【００２６】
本明細書において、「酸性下」とは、ｐＨ７．０未満、好ましくはｐＨ６．４未満を意味する。
【００２７】
本明細書において、「生理的ｐＨ」とは、正常組織や正常体液におけるｐＨを意味する。生理的ｐＨは、通常、７．４であるが、正常組織や正常体液によって若干（±０．１）異なる。また、「生理的ｐＨ未満の所定のｐＨ」とは、ｐＨ７．４未満であればよく、好ましくはｐＨ３．０以上ｐＨ７．４未満、より好ましくはｐＨ４．０以上ｐＨ７．３未満、さらに好ましくはｐＨ４．５以上ｐＨ７．０未満である。
【００２８】
本明細書において、「中性のｐＨ」とは、ｐＨ６以上ｐＨ８以下（具体的にはｐＨ６．０以上ｐＨ８．０以下）を意味する。
【００２９】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は、ＸおよびＹを含み、「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、本明細書において、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０℃以上２５℃以下）／相対湿度４０％ＲＨ以上５０％ＲＨ以下の条件で行う。
【００３０】
＜複合体の構成成分＞
［ｐＨ感受性担体］
本発明の複合体は、酸性下で凝集してなるｐＨ感受性担体の凝集体に、生理活性物質が担持されてなるものであり、当該ｐＨ感受性担体は、主にｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とで構成される。
【００３１】
（ｐＨ感受性化合物）
ｐＨ感受性化合物としては、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種である。中でも、ｐＨ感受性化合物としては、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種であることがより好ましい。ｐＨ感受性化合物の塩としては、特に制限されないが、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム、バリウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、などが挙げられる。これらのｐＨ感受性化合物は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。
【００３２】
本発明で好ましく用いられるデオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸およびグリコデオキシコール酸は、胆汁酸と総称される。胆汁酸は、代表的なステロイド誘導体として古くから知られており、細菌学の分野においても利用されている。胆汁酸はヒトの生体内においてコレステロールや脂質、脂溶性ビタミンと複合体を形成し、その吸収を補助する働きを有している。また、物理化学的な性質から脂質やタンパク質、疎水的な材料との複合体を形成することができるため、タンパク質の分離精製や可溶化剤、乳化剤として古くから利用されている。最近ではワクチンの製造工程の用途、胆汁酸トランスポーターを介在させることによる薬剤の吸収促進剤としても注目されている。特に、デオキシコール酸ナトリウム（別名デスオキシコール酸ナトリウム）とウルソデオキシコール酸（別名ウルソデスオキシコール酸）は、ヒトへの注射が可能な医薬品添加物として実績を有しており、優れた安全性が認められている。そのため、本発明のｐＨ感受性化合物として、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸またはその塩（例えば、ナトリウム塩）を用いることがさらに好ましい。中でも、優れたｐＨ応答性の観点から、デオキシコール酸が特に好ましい。
【００３３】
ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００モルに対して１０モル以上の割合で含有されるのが好ましい。より好ましくは、両親媒性物質１００モルに対して１０〜６４０モル、さらに好ましくは２０〜３２０モル、特に好ましくは２０〜１６０モルである。
【００３４】
（両親媒性物質）
本発明で用いられる両親媒性物質としては、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種である。これらの両親媒性物質は、単独で用いても、２種以上を併用して用いてもよい。なお、本明細書において、両親媒性物質における「炭素数」とは、両親媒性物質の疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００３５】
炭素数１０〜１２のホスファチジルコリンとしては、飽和のアシル基を有するジアシルホスファチジルコリンが好ましく、例えば、ジデカノイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ；１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン）が挙げられる。ホスファチジルコリンとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
【００３６】
炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、ポリオキシエチレンソルビタンミリスチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノミリステート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンパルミテート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）等が挙げられる。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、ソルビタンに付加したポリオキシエチレン鎖の合計した重合度が、１０〜２００が好ましく、１５〜１００がより好ましく、２０〜５０がさらに好ましい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミチン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸エステル）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。
【００３７】
炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノパルミチン酸エステル（ソルビタンモノパルミテート）、ソルビタンモノステアリン酸エステル（ソルビタンモノステアレート）、ソルビタンモノオレイン酸エステル（ソルビタンモノオレート）等のソルビタンモノ脂肪酸エステル、ソルビタントリパルミチン酸エステル（ソルビタントリパルミテート）、ソルビタントリステアリン酸エステル（ソルビタントリステアレート）、ソルビタントリオレイン酸エステル（ソルビタントリオレート）等のソルビタントリ脂肪酸エステル等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルは、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。ソルビタン脂肪酸エステルの市販品としては、例えば、ＳＰＡＮ４０（ソルビタンパルミチン酸エステル）、ＳＰＡＮ６０（ソルビタンステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８０（ソルビタンオレイン酸エステル）、ＳＰＡＮ６５（ソルビタントリステアリン酸エステル）、ＳＰＡＮ８５（ソルビタントリオレイン酸エステル）として販売されているものを好ましく用いることができる。これらのなかでも、ＳＰＡＮ８０、ＳＰＡＮ６５、ＳＰＡＮ８５が好ましい。
【００３８】
モノオレイン酸グリセロール（モノオレイン酸グリセリル）、ジラウリン酸グリセロール（ジラウリン酸グリセリル）、ジステアリン酸グリセロール（ジステアリン酸グリセリル）、ジオレイン酸グリセロール（ジオレイン酸グリセリル）としては、グリセリンに１または２分子の脂肪酸がエステル結合したアシルグリセロールであり、脂肪酸が結合する部位は特に制限されない。例えば、モノアシルグリセロールであるモノオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位またはＣ２位に脂肪酸がエステル結合していてもよい。また、ジアシルグリセロールであるジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールであれば、グリセリンのＣ１位およびＣ２位、またはＣ１位およびＣ３位に脂肪酸がエステル結合していればよい。例えば、ジラウリン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ３位が置換された、α、α’−ジラウリンが好ましい。ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロールとしては、Ｃ１位およびＣ２位が置換されたジアシルグリセロールが好ましい。これらのグリセロール誘導体としては、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【００３９】
ポリオキシエチレンヒマシ油としては、ヒマシ油にポリオキシエチレンが付加したものである。ポリオキシエチレンの重合度としては、特に制限されないが、３〜２００が好ましく、５〜１００がより好ましく、１０〜５０がさらに好ましい。ポリオキシエチレンヒマシ油は、合成品を用いてもよいし市販品を用いてもよい。
【００４０】
α−トコフェロールとしては、天然由来または公知の方法で合成したものでもよく、また市販のものを用いることができる。
【００４１】
本発明の一実施形態において、両親媒性物質は、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリンが好ましく、炭素数１２のジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）が特に好ましい。
【００４２】
（ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質の組み合わせ）
ｐＨ感受性担体は、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、所望のｐＨにおいて、膜破壊機能促進効果を発現することができ、凝集体を形成してもその効果を維持することができる。この際、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより、ｐＨ感受性担体の膜破壊機能促進効果を発現し始めるｐＨは異なる。これはｐＨ感受性化合物によってｐＫａが異なること、さらには両親媒性物質との会合様式が、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせにより異なることに由来するものと考えられる。したがって、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせを適宜変更することによって、機能を発現するｐＨを選択することが可能であり、生体内のデリバリー、および細胞内のデリバリーを詳細に設定することが可能であるといえる。
【００４３】
本発明のｐＨ感受性担体において、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との組み合わせとしては、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、デオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油（好ましくはＰＥＧ１０ヒマシ油）、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジステアリン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジオレイン酸グリセロール、ウルソデオキシコール酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、コール酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ２０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジステアリン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジオレイン酸グリセロール、グリチルリチン酸およびジラウリン酸グリセロール（α、α’−ジラウリン）、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣが好ましい。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
【００４４】
より好ましくは、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、デオキシコール酸およびＰＥＧ１０ヒマシ油、デオキシコール酸およびα−トコフェロール、デオキシコール酸およびモノオレイン、デオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ウルソデオキシコール酸およびＤＤＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ４０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ６０、ウルソデオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ４０、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ６５、ウルソデオキシコール酸およびＳＰＡＮ８５、ウルソデオキシコール酸およびα−トコフェロール、ウルソデオキシコール酸およびモノオレイン、ウルソデオキシコール酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、コール酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＤＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ４０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ６０、グリチルリチン酸およびＴｗｅｅｎ８０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ４０、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ６５、グリチルリチン酸およびＳＰＡＮ８５、グリチルリチン酸およびα−トコフェロール、グリチルリチン酸およびモノオレイン、グリチルリチン酸およびポリオキシエチレンヒマシ油、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣである。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
【００４５】
中でも、デオキシコール酸およびＤＤＰＣ、デオキシコール酸およびＤＬＰＣ、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ２０、デオキシコール酸およびＴｗｅｅｎ８０、デオキシコール酸およびＳＰＡＮ８０、デオキシコール酸およびＰＥＧ１０ヒマシ油、ウルソデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ケノデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、ヒオデオキシコール酸およびＤＬＰＣ、コール酸およびＤＬＰＣ、グリチルリチン酸およびＤＬＰＣ、グリコデオキシコール酸およびＤＬＰＣの組み合わせが好ましい。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
【００４６】
すなわち、本発明の好ましい一実施形態において、ｐＨ感受性担体は、デオキシコール酸、コール酸、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、高級胆汁酸、グリコデオキシコール酸、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種のｐＨ感受性化合物と、炭素数１０〜１２のホスファチジルコリン、炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル、炭素数１６〜１８のソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、ジオレイン酸グリセロール、ポリオキシエチレンヒマシ油およびα−トコフェロールからなる群より選択される少なくとも１種の両親媒性物質を含む。上記においてｐＨ感受性化合物は塩であってもよい。
【００４７】
［生理活性物質］
本発明の複合体は、生理活性物質の一体化効率に優れ、かつｐＨの低下した部位で膜破壊機能促進効果を発現するため、炎症等の治療部位に生理活性物質を選択的に送達することができる。また、本発明の複合体は、生理活性物質を細胞のサイトゾルへ送達することができる。
【００４８】
複合体に含まれる生理活性物質の種類は特に限定されず、核酸、低分子化合物、タンパク質、ペプチドが挙げられる。中でも、細胞内にて優れた薬効を発現する観点から、生理活性物質は、タンパク質、ペプチドまたは核酸であることが好ましい。
【００４９】
核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ（オリゴデオキシヌクレオチド）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等の治療効果を有する核酸が挙げられる。核酸の長さとしては、５００ｂｐ以上であることが好ましい。
【００５０】
低分子化合物としては、マイトマイシン、ドセタキセル、メトトレキサート等の細胞毒性剤；５−アミノレブリン酸、プロトポルフィリンＩＸ等のプロドラッグ；ガンシクロビル、デキサメタゾン、リバビリン、ビダラビン等の抗炎剤；ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ＤＴＰＡ（１，４，７，１０−ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）等の造影剤；エダラボン等の神経保護剤が挙げられる。
【００５１】
タンパク質としては、ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、インドフェノールオキシダーゼ等の酸化還元酵素；ＩＬ−１０等のサイトカイン、ｂ−ＦＧＦ等の増殖因子、ｔ−ＰＡ等の血栓溶解薬、エリスロポエチン等のホルモン、ＰＳＤ（Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）やＦＮＫ（Ａｎｔｉ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）等の細胞死抑制タンパク質；Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、ＩｇＧ、ＩｇＥ等の抗体が挙げられる。タンパク質の分子量としては、５〜２００ｋＤａであることが好ましい。
【００５２】
ペプチドとしては、シクロスポリンＡ、ＪＩＰ−１（ＪＮＫ−ｉｎｔｅｒｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）等のペプチド医薬が挙げられる。また、腫瘍抗原ペプチド等が挙げられる。ペプチドの分子量としては、５，０００〜４５，０００であることが好ましく、さらに６，０００〜２０，０００であることがより好ましい。
【００５３】
生理活性物質のサイズは、特に制限されないが、サイズが大きいほどｐＨ感受性担体の凝集体が形成する架橋構造に捕捉されやすいため、好ましい。
【００５４】
生理活性物質は、親水性物質であってもよいし、疎水性物質であってもよい。このうち、疎水性物質であれば、疎水的相互作用によりｐＨ感受性担体の凝集体内に取り込まれやすくなるため、好ましい。
【００５５】
本発明の複合体における生理活性物質の好適な担持量は、例えば、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質１０００ｎｍｏｌに対して、０．００１〜１０ｍｇである。なお、より好適な担持量は、生理活性物質の種類に応じて適宜選択されうる。
【００５６】
＜複合体の製造方法＞
本発明に係る複合体は、上記のｐＨ感受性担体と生理活性物質とを混合し、当該混合物を酸性環境に晒すことで、得ることができる。したがって、たとえば、ｐＨ感受性担体と生理活性物質とを含む混合液を調製し、その混合液のｐＨを酸性化することで、本発明の複合体を液体媒体中に得ることができる。したがって、本発明は、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質を含むｐＨ感受性担体を調製し（工程１）、前記ｐＨ感受性担体と生理活性物質とを混合して混合液を調製し（工程２）、前記混合液のｐＨを６．４未満に調整する（工程３）ことを有する、複合体の製造方法についても提供する。
【００５７】
以下、本発明に係る複合体の製造方法の各工程について説明する。
【００５８】
［工程１：ｐＨ感受性担体の調製工程］
当該工程では、上記のｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを会合させて、ｐＨ感受性担体を調製する。
【００５９】
ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを会合させる方法としては、ｐＨ感受性化合物と、両親媒性物質とが、水性溶液中で接触すればよい。具体的には、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とを含む水性溶液を作製し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散することで、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質とが会合したｐＨ感受性担体の分散液を得ることができる。
【００６０】
より具体的には、（１）ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液と、両親媒性物質を含む水性溶液とを別々に調製し、それら水性溶液を混合し、当該溶液を、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波などを用いて強く攪拌し分散させてｐＨ感受性担体を得る方法；（２）リポソームの製造法として公知であるバンガム法にて調製する方法；が挙げられる。バンガム法としては、具体的には、ガラス容器中で、ｐＨ感受性化合物および両親媒性物質等のｐＨ感受性担体の構成成分を有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム）に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによって有機溶媒を除去して、ガラス容器の壁に薄膜を形成させる。次いで、水性溶液を、薄膜を形成したガラス容器に加えて、常温（５〜３５℃）で薄膜を膨潤させた後、常温（５〜３５℃）でガラス容器を振盪する。この際、乳化機、ボルテックスミキサー、超音波を用いて強く攪拌し、薄膜を十分に水性溶液中に分散させることができる。また、上記の（１）製造方法において、両親媒性物質を含む水性溶液に、ｐＨ感受性化合物を混合させてもよい。なお、水性溶液の溶媒としては、上述した水性溶液の溶媒を使用することができる。
【００６１】
なお、バンガム法の詳細は、公知のリポソームの製造方法を参考にすることができ、「リポソーム」（野島庄七、砂本順三、井上圭三編、南江堂）および「ライフサイエンスにおけるリポソーム」（寺田弘、吉村哲郎編、シュプリンガー・フェアラーク東京）に記載されている。
【００６２】
ｐＨ感受性化合物は、両親媒性物質１００モルに対して１０モル以上の割合で配合するのが好ましい。中でも、生理活性物質の一体化効率のさらなる向上の観点から、ｐＨ感受性化合物の配合量は、両親媒性物質１００モルに対して、好ましくは４０モル以上６４０モル以下であり、より好ましくは１６０モル以上６４０モル以下であり、さらにより好ましくは３２０モル以上６４０モル以下である。
【００６３】
水性溶液中の両親媒性物質の濃度は、６〜２０００ｎｍｏｌ／ｍＬとすることが好ましく、さらに１０〜１０００ｎｍｏｌ／ｍＬとすることがより好ましい。
【００６４】
水性溶液中のｐＨ感受性化合物の濃度は、４００〜６４００ｎｍｏｌ／ｍＬとすることが好ましい。
【００６５】
（溶媒）
上記の水性溶液に用いられる溶媒としては、緩衝剤、ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類を含む水溶液が好ましい。
【００６６】
緩衝剤としては、ｐＨ感受性担体を含む水性溶液のｐＨを生理的ｐＨ以上に維持するものであれば公知の緩衝剤が適宜使用でき、特に限定されるものではない。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリスヒドロキシメチルアミノメタン−ＨＣｌ緩衝剤（トリス塩酸緩衝剤）、ＭＥＳ緩衝剤（２−モルホリノエタンスルホン酸緩衝剤）、ＴＥＳ緩衝剤（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸緩衝剤）、酢酸緩衝剤、ＭＯＰＳ緩衝剤（３−モルホリノプロパンスルホン酸緩衝剤）、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝剤）、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤などのＧＯＯＤ緩衝剤、グリシン−塩酸緩衝剤、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、グリシルグリシン−ＫＯＨ緩衝剤などのアミノ酸系緩衝剤、トリス−ホウ酸緩衝剤、ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤などのホウ酸系緩衝剤、またはイミダゾール緩衝剤などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、クエン酸−リン酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、ＭＥＳ緩衝剤、酢酸緩衝剤、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝剤が好ましい。緩衝剤の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであるのが好ましく、１〜１００ｍＭであるのがより好ましい。なお、本発明において緩衝剤の濃度とは、水性溶液中に含まれる緩衝剤の濃度（ｍＭ）をいう。
【００６７】
ＮａＣｌ、グルコース、ショ糖などの糖類の濃度としては、特に制限されず、０．１〜２００ｍＭであるのが好ましく、１〜１５０ｍＭであるのがより好ましい。
【００６８】
当該工程では、安定化剤等の添加剤を水性溶液に添加してもよい。添加剤の含有量としては、ｐＨ感受性担体を破壊しなければ特に制限されないが、両親媒性物質１００モルに対して、１５０モル以下であるのが好ましく、６６．４モル以下であるのがより好ましい。
【００６９】
（安定化剤）
安定化剤としては、ｐＨ感受性担体を破壊しないものであれば特に制限されず、例えば、１−オクタノール、１−ドデカノール、１−ヘキサドデカノール、１−エイコサノール等の飽和および不飽和の炭素数４〜２０のアルコール；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の飽和および不飽和の炭素数１２〜１８の脂肪酸；カプリル酸メチル（オクタン酸メチル）、カプリル酸メチル（オクタン酸エチル）、ラウリン酸メチル、ラウリン酸エチル、ミリスチン酸エチル、パルミチン酸エチル、ステアリン酸エチル、オレイン酸メチル、オレイン酸エチル等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８の脂肪酸アルキルエステル（炭素数１〜３のアルキル）；Ｄ（Ｌ）−アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、フェニルアラニン等のＤ（Ｌ）−アミノ酸；トリカプロイン、トリカプリリン等のアミノ酸トリグリセライド；ポリオキシエチレンソルビタントリパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリオレイン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸エステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ６５、Ｔｗｅｅｎ８５）；ポリオキシエチレンラウリン酸エステル、ポリオキシエチレンミリスチン酸エステル、ポリオキシエチレンパルミチン酸エステル、ポリオキシエチレンステアリン酸エステル等の炭素数１２〜１８のポリオキシエチレンアルキルエステル（例えば、ＰＥＧ２０ステアリルエーテル、ＰＥＧ２３ラウリルエーテル）；ポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油（例えば、ＰＥＧ１０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０硬化ヒマシ油、ＰＥＧ６０硬化ヒマシ油）；カプリリン（オクタン酸グリセロール）、モノカプリン酸グリセロール、モノラウリン酸グリセロール、モノミリスチン酸グリセロール、モノパルミチン酸グリセロール、モノステアリン酸グリセロール、モノオレイン酸グリセロール等の飽和および不飽和の炭素数８〜１８のモノ脂肪酸グリセロールエステル；ジオクタン酸グリセロール、ジカプリン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロールエステル、ジパルミチン酸グリセロール等の炭素数８〜１６のジ脂肪酸グリセロール；α−トコフェロール酢酸エステル、ヒマシ油、大豆油、コレステロール、スクアレン、スクアラン、ラクトース、パルミチン酸アスコルビル、安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、等の公知の安定化剤が用いられうる。なお、「炭素数」とは疎水部を構成する脂肪酸成分（アシル基）の炭素数を意味する。
【００７０】
安定化剤等の添加剤の添加方法としては、特に制限されない。例えば、ｐＨ感受性化合物を含む水性溶液、または両親媒性物質を含む水性溶液に添加していてもよいし、薄膜を調製する際に、ｐＨ感受性担体の構成成分と一緒に溶解させて、これらの成分を含む薄膜を用いて、ｐＨ感受性担体を含む水性溶液を得てもよい。
【００７１】
［工程２：混合液調製工程］
当該工程では、上記工程１で得られたｐＨ感受性担体と、生理活性物質とを混合して、混合液を調製する。
【００７２】
ｐＨ感受性担体と生理活性物質とを混合する方法としては、生理活性物質の種類に応じて公知の方法を適宜選択することができる。該方法としては特に制限されないが、例えば、ｐＨ感受性担体および生理活性物質を、水性溶媒、賦形剤等の媒体に混合する方法等が挙げられる。たとえば、工程１で得られたｐＨ感受性担体の分散液に対して、生理活性物質を添加してもよい。その際、生理活性物質は、そのまま添加してもよいし、予め溶媒に溶解または分散させてから添加してもよい。ここで、生理活性物質を溶解または分散させるための溶媒としては、たとえば上記工程１で挙げた溶媒を使用することができる。
【００７３】
混合液中のｐＨ感受性担体の濃度は、好ましくは５０ｎｍｏｌ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１００ｎｍｏｌ／ｍＬ以上であり、さらにより好ましくは２００ｎｍｏｌ／ｍＬ以上であり、特に好ましくは５００ｎｍｏｌ／ｍＬ以上である。上記範囲であれば、後述のｐＨ調整工程でｐＨ感受性担体が緻密な凝集体を形成するため、生理活性物質をより良好に捕捉することができる。また、安全性の観点から、ｐＨ感受性担体の濃度は、１０００ｎｍｏｌ／ｍＬ以下であることが好ましい。
【００７４】
混合液中の生理活性物質の好ましい含有量は、例えば、ｐＨ感受性担体を構成する両親媒性物質１０００ｎｍｏｌに対して、０．００１〜１０ｍｇである。なお、より好適な含有量は、生理活性物質の種類に応じて適宜選択されうる。
【００７５】
当該工程において、混合液には、後述する自然免疫を活性化する刺激を有する物質や、公知の添加剤をさらに添加してもよい。すなわち、本発明の複合体は、かような物質も含みうる。
【００７６】
［工程３：ｐＨ調整工程］
当該工程では、工程２で得られた混合液のｐＨを６．４未満に調整する。これにより、生理活性物質を取り込みながら、ｐＨ感受性担体は凝集体を形成しうる。
【００７７】
ｐＨを調整する方法としては特に制限されず、塩酸、硫酸、硝酸等の公知の酸を混合液に添加する方法が挙げられる。酸の添加量は、目標とするｐＨによって適宜調節することができる。
【００７８】
当該工程において目標とするｐＨは、６．４未満であれば特に制限されないが、凝集体の架橋構造がより緻密になり、生理活性物質をより捕捉できる観点では、ｐＨが低いほど好ましい。ただし、あまりにｐＨが低い場合、生理活性物質が変性するおそれがある。よって、当該工程では、溶液のｐＨを２．０以上５．０以下に調整することが好ましく、２．０以上４．０以下に調整することがより好ましい。
【００７９】
混合液を所望の酸性ｐＨに調整した後、静置することで、より緻密なｐＨ感受性担体の凝集体を得ることができる。この際、静置時間の下限は、特に制限されないが、１０分以上であることが好ましく、３０分以上であることがより好ましく、１時間以上であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、緻密な凝集体が形成されるため、生理活性物質を凝集体内に良好に保持することができる。また、静置時間の上限は、特に制限されない。静置温度も、特に制限されないが、好ましくは室温（２５℃）〜４０℃程度である。
【００８０】
上記の工程１〜３により、ｐＨ感受性担体の凝集体と生理活性物質とが一体化した複合体を得ることができる。工程３の後、ろ過などの公知の手段により溶媒を除去して、複合体を単離してもよい。
【００８１】
上記で得られた複合体を含む液を、（例えばポアサイズ０．２２μｍの）フィルターで処理し、フィルター処理前後の生理活性物質の濃度を測定することで、生理活性物質の一体化率（添加した生理活性物質全量に対するｐＨ感受性担体の凝集体に取り込まれた生理活性物質量の割合）を確認することができる。ここで、生理活性物質の濃度は、公知の方法により測定することができる。なお、本明細書では、生理活性物質の一体化効率は、フィルター処理前後の吸光度測定に基づき、下記式３により算出される値とする。この際、生理活性物質の吸収波長領域に対応する波長（例えば、タンパク質やペプチドの場合は２８０ｎｍ、核酸の場合は２６０ｎｍ）で吸光度を測定してもよい。あるいは、市販の定量キットを用いて液を呈色した後、当該キットのプロトコルで推奨されている波長で吸光度を測定してもよい。
【００８２】
【数２】
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【００８３】
＜用途＞
本発明に係る複合体は、それ単独で、あるいは、他の成分と混合してなる組成物（以下、ｐＨ感受性組成物とも称する）として、対象者の治療に用いることができる。
【００８４】
ｐＨ感受性組成物は、錠剤、粉末、カプセルなどの固形製剤の形態であってもよいが、注射製剤のような液体製剤の形態が好ましい。該液体製剤は、用時に水または他の適切な賦形剤で再生する乾燥製品として提供してもよい。
【００８５】
錠剤およびカプセルは、通常の方法により腸溶コーティングを施すことが望ましい。腸溶コーティングとしては、当該分野において通常用いられるものを利用できる。また、カプセルは粉末または液体のいずれを含有することもできる。
【００８６】
［他の成分］
ｐＨ感受性組成物に含まれうる他の成分としては、自然免疫を活性化する刺激を有する物質、医薬添加剤等が挙げられる。
【００８７】
（自然免疫を活性化する刺激を有する物質）
自然免疫を活性化する刺激を有する物質とは、構造パターン認識受容体に認識され、免疫担当細胞を活性化に導く物質を意味する。なお、当該物質は、上記の生理活性物質と重複していてもよい。
【００８８】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質としては、特に制限されないが、Ｔｏｌｌ様受容体に対するアゴニストであることが好ましい。
【００８９】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質の具体例としては、特に制限されないが、ミョウバン等の鉱物塩；水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等のゲルタイプアジュバント；ＣｐＧモチーフを含む免疫調節性ＤＮＡ配列、免疫刺激性ＲＮＡ分子、内毒素（リポ多糖（ＬＰＳ；内毒素）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ：登録商標））、外毒素（コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素、百日咳毒素）、ムラミルジペプチド、フラジェリン等の微生物アジュバント；不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）等の油性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン等の油性アジュバント生分解性ミクロスフェア、サポニン（ＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａ等）、非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチド類似物、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド（非ＣｐＧ合成ポリヌクレオチド等）、イミダゾキノリン等の合成アジュバント；ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡ等のカチオン性脂質；一本鎖ＲＮＡ；二本鎖ＲＮＡ等が挙げられる。中でも、安全性の観点から、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のアルミニウム化合物であることが好ましい。すなわち、本発明の好ましい一実施形態は、上記の複合体およびアルミニウム化合物を含む、ｐＨ感受性組成物である。
【００９０】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９１】
自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量は、当該物質の種類によっても異なるが、複合体を構成する両親媒性物質１００ｍｏｌに対して、０．０２２７〜１２８０ｍｏｌであることが好ましく、０．０２２７〜２２．７ｍｏｌであることがより好ましく、０．２〜２．２７ｍｏｌであることがさらに好ましい。自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量が０．０２２７ｍｏｌ以上であると、免疫応答を好適に誘導させることができることから好ましい。一方、自然免疫を活性化する刺激を有する物質の含有量が１２８０ｍｏｌ以下であると、コストが低減できることから好ましい。なお、自然免疫を活性化する刺激を有する物質としてアルミニウム化合物を使用する場合、上記含有量はアルミニウム元素の含有量を指す。
【００９２】
（医薬添加剤）
ｐＨ感受性組成物が液体製剤である場合、医薬添加剤は、溶媒（例えば生理食塩水、滅菌水、緩衝液など）、膜安定剤（例えばコレステロールなど）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、グルコース、グリセリンなど）、抗酸化剤（例えばトコフェロール、アスコルビン酸、グルタチオンなど）、防腐剤（例えばクロロブタノール、パラベンなど）などを含み得る。上記の溶媒は、複合体を製造する際に用いる溶媒であってもよい。その際、ｐＨ感受性担体の凝集が解離して、生理活性物質が放出されることを防止するため、用いる溶媒のｐＨは７．０未満であることが好ましく、６．４未満であることがより好ましい。
【００９３】
ｐＨ感受性組成物が固形製剤である場合、医薬添加剤は、賦形剤（例えば乳糖、ショ糖のような糖類、トウモロコシデンプンのようなデンプン類、結晶セルロースのようなセルロース類、アラビアゴム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、リン酸カルシウムなど）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコールなど）、結合剤（例えばマンニトール、ショ糖のような糖類、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉のようなデンプン類、カルボキシメチルセルロースのようなセルロース類、架橋ポリビニルピロリドンなど）、着色剤、矯味矯臭剤などを含み得る。
【００９４】
［治療方法］
本発明の複合体またはこれを含むｐＨ感受性組成物を対象者の治療に用いる場合の投与形態は特に制限されず、例えば、経口投与、および静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、経皮投与または経皮的吸収等の非経口的投与等が挙げられる。例えば、生理活性物質としてペプチドおよびタンパク質を用いる場合は、非経口投与、特に皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈注射による投与が好ましい。
【００９５】
本発明の複合体またはこれを含むｐＨ感受性組成物を投与する際、複合体が注射針を通過し、所望の部位まで送達されるよう、予めピペッティングやホモジナイザーなどを用いた機械的撹拌を行うこともできる。
【００９６】
本発明の複合体またはこれを含むｐＨ感受性組成物は、対象者に投与して、複合体またはこれを含むｐＨ感受性組成物の外部環境が生理的ｐＨ未満（例えば、ｐＨ６．４未満）となったときに、膜破壊機能促進効果、または膜破壊機能促進効果および膜融合機能促進効果を発現し、生理活性物質を特異的に効率よく放出させることが可能になる。
【００９７】
よって、本発明により、治療または予防を必要とする対象者に、上記の複合体またはこれを含むｐＨ感受性組成物の有効量を経口または非経口的に投与することを含む、疾患の治療または予防方法が提供される。
【００９８】
上記の対象者は、哺乳動物が好ましく、特に好ましくはヒトである。
【００９９】
上記疾患としては、例えば、前立腺癌、肺癌、大腸癌、腎臓癌、胃癌、脳腫瘍、乳癌等の癌；ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎等の感染症疾患；アルツハイマー病、パーキンソン病等の中枢神経疾患が挙げられる。
【０１００】
すなわち、本発明の好ましい一実施形態によれば、疾患の治療または予防方法が提供される。このような知見は出願時の技術常識を適宜参照することができる。
【０１０１】
また、本発明の一実施形態において、本発明の複合体は、培養により、細胞に直接生理活性物質を輸送することもできる。すなわち、本発明の一形態によれば、細胞に生理活性物質に輸送するための培養方法が提供される。
【０１０２】
培養方法は、細胞を、本発明の複合体を含む培地で培養する工程を含む。
【０１０３】
培地としては、特に制限されず、公知のものを使用することができる。具体的には、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等が挙げられる。
【０１０４】
培地への複合体の添加量としては、特に制限されないが、ｐＨ感受性化合物と両親媒性物質との合計モル濃度が、０．７３μｍｏｌ／Ｌ〜７．４ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、７．３μｍｏｌ／Ｌ〜６．５ｍｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、８．０μｍｏｌ／Ｌ〜４．２ｍｍｏｌ／Ｌであることがさらに好ましい。
【０１０５】
また、培地のｐＨは、複合体の形態を保持しつつ、ｐＨ感受性化合物の不安定化を防止する観点から、８．０〜６．５であることが好ましい。
【０１０６】
生理活性物質が輸送される細胞としては、特に制限されないが、対象者から採取された細胞、株化された培養細胞等が挙げられる。
【０１０７】
この際、対象者から採取された細胞または株化された培養細胞の具体例としては、樹状細胞、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ）細胞、Ｔリンパ細胞、Ｂリンパ球細胞、リンパ球細胞等が挙げられる。
【０１０８】
上記細胞のうち、対象者から採取された細胞を用いることが好ましく、対象者から採取された樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、リンパ細胞等を用いることがより好ましい。
【０１０９】
対象者から採取された細胞を用いる場合には、対象者を採血、生検等により当該細胞を採取することができる。すなわち、一実施形態において、前記培養方法は、対象者から細胞を採取する工程を含みうる。
【０１１０】
なお、培養した細胞は、対象者に投与してもよい。これにより、対象者の疾患の治療または予防をすることができる。すなわち、本発明の一実施形態において、疾患の治療または予防方法が提供される。
【０１１１】
好ましい一実施形態において、治療または予防方法は、対象者から細胞を採取する工程と、本発明の複合体を含む培地で前記採取した細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記対象者に投与する工程と、を含む。
【０１１２】
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、疾患の具体例は上述のとおりである。
【０１１３】
また、本発明に係る複合体は、生理的ｐＨ環境に晒されても、凝集状態を一定時間維持することができる。したがって、本発明の複合体は、生体内の所望の部位まで送達された後、凝集形態を保持した状態で部位に留まり、生理活性物質を徐放することができる。言い換えれば、ｐＨ感受性担体が酸性下で凝集してなる凝集体は、生理活性物質の徐放デバイスとして機能しうる。したがって、本発明の好ましい一実施形態は、上記複合体を含む徐放剤である。投与形態および剤型は、上記と同様である。
【０１１４】
これにより、疾患の治療または予防をすることができる。なお、疾患の具体例は上述のとおりである。
【実施例】
【０１１５】
本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いる場合があるが、特に断りがない限り、「重量部」あるいは「重量％」を表す。また、特記しない限り、各操作は、室温（２５℃）で行われる。【０１１６】
＜原料＞
実施例では、下記の化合物を用いた。試薬名と製品名が同一の場合は製品名を省略した。【０１１７】
［ｐＨ感受性化合物］
・デオキシコール酸（ファーマグレード、シグマ社製）
・ウルソデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・ケノデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・ヒオデオキシコール酸（東京化成工業社製）
・コール酸（東京化成工業社製）
・グリチルリチン酸（東京化成工業社製）
・グリコデオキシコール酸（東京化成工業社製）
［両親媒性物質］
・ＤＬＰＣ（１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−１２１２）
・ＤＤＰＣ（１，２−ジデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン：日油社製、ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−１０１０）
・ポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ２０（炭素数１２）、Ｔｗｅｅｎ８０（炭素数１８）：東京化成工業社製）
・ソルビタン脂肪酸エステル（ＳＰＡＮ８０（炭素数１８）、ナカライテスク社製）
・ポリオキシエチレンヒマシ油（ＰＥＧ１０ヒマシ油、ポリオキシエチレン１０ヒマシ油、和光純薬工業社製）
［生理活性物質］
・モデルタンパク質：ＯＶＡ（分子量４５ｋＤａ、シグマ−アルドリッチ社製）
・モデルＤＮＡ：Ｓａｌｍｏｎ由来ＤＮＡ（分子量５００〜１０００ｂｐ、和光純薬工業社製）
・モデルペプチド：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（委託合成）
・モデルペプチド：ＲＧＰＥＳＲＬＬ（委託合成）
［その他］
・塩酸
・メタノール（ナカライテスク社製）
・クロロホルム（和光純薬工業社製）
・酢酸（和光純薬工業社製）
・酢酸ナトリウム（関東化学社製）
・ＭＥＳ−Ｎａ（メルク社製）
・Ｈｅｐｅｓ−Ｎａ（ナカライテスク社製）
・塩化ナトリウム（関東化学社製）
・Ｐｙｒａｎｉｎｅ（東京化成工業社製）
・ＤＰＸ（ｐ−ｘｙｌｅｎｅ−ｂｉｓ−ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社製）
・ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔｓ：タカラバイオ社製、ＰＢＳ  Ｔａｂｌｅｔｓ）
・水酸化ナトリウム水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・塩酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、１ｍｏｌ／Ｌ：ナカライテスク社製）
・Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（和光純薬工業社製、トリトンＸ１００）
・ＤＭＥＭ（ナカライテスク社製、ダルベッコ変法イーグル培地）。【０１１８】
＜ｐＨ感受性担体溶液の調製＞
クロロホルムに溶解した両親媒性物質と、メタノールあるいはクロロホルムに溶解したｐＨ感受性化合物と、を１０ｍＬナスフラスコで混合し、ロータリーエバポレーター（ＢｕＣＨＩ）により薄膜とした。なお、両親媒性物質とｐＨ感受性化合物との比率は、所望の比率（モル比１００：１０、１００：２０、１００：６４０等）となるよう調整した。【０１１９】
作製した薄膜にＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）１ｍＬを添加し、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて常温で１分間超音波を照射して分散させ、ｐＨ感受性担体の分散液を得た。【０１２０】
＜溶出性試験：Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）の測定＞
Ｌｅａｋａｇｅ（溶出率）は、Ｋ．Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８  １９  １０４０−１０４８に記載の方法に従い、蛍光物質であるＰｙｒａｎｉｎｅと消光剤であるＤＰＸとを内包したＥＹＰＣリポソームを用いて評価した。【０１２１】
クロロホルムに溶解させた３０００ｎｍｏｌのＥＹＰＣ（卵黄ホスファチジルコリン）を１０ｍＬナスフラスコに測り入れ、ロータリーエバポレーター（ＢｕＣＨＩ）を用いて薄膜とした。Ｐｙｒａｎｉｎｅ溶液（Ｐｙｒａｉｎｅ：３５ｍＭ、ＤＰＸ：５０ｍＭ、ＭＥＳ：２５ｍＭ、ｐＨ７．４）５００μＬを加え、超音波照射装置（ＵＳＣ−Ｊ）を用いて分散させた後、エクストルーダーを用いて孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通し、粒子径を揃えた。ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）とＧ１００カラムを用いて外水層の置換を行い、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液を得た。リン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いてリン脂質（コリン基）の濃度を求め、リン脂質濃度が１．０ｍｍｏｌ／ＬとなるようにＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ  ｐＨ７．４）を用いて濃度を調整した。【０１２２】
濃度を調整したＥＹＰＣリポソーム分散液２０μＬと、評価サンプル分散液２０μＬを、種々のｐＨに調整したＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ＭＥＳ：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ）２９６０μＬ中に投与し、３７℃にて９０あるいは３０分間インキュベーションした後（実施例において、特別な記載のない限り、９０分間の結果である）、分光光度計ＦＰ−６５００を用いてＥｘ４１６ｎｍ、Ｅｍ５１２ｎｍの蛍光を観察することにより、Ｌｅａｋａｇｅをモニターした。ｐＨ４．０〜ｐＨ３．０の測定は酢酸ｂｕｆｆｅｒ（酢酸：２５ｍＭ、ＮａＣｌ：１２５ｍＭ）を用いて実施した。【０１２３】
なお、ＥＹＰＣリポソーム分散液のみの場合を０％とし、１０倍希釈したＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を３０μＬ加えた場合の値を１００％として、溶出率を算出した。【０１２４】
具体的には、溶出率は、下記式４に従って計算した。なお、下記式中において、測定した蛍光強度をＬとし、蛍光物質を内包したＥＹＰＣリポソーム分散液のみの蛍光強度をＬ０、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた場合の蛍光強度をＬ１００と表す。【０１２５】
【数３】
2018207841.tif 000005
【０１２６】
＜実験１．ｐＨ感受性担体の凝集体の機能評価＞
ｐＨ感受性担体の凝集体の膜破壊機能促進効果を評価した。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して調整した。【０１２７】
ｐＨ感受性担体の分散液のｐＨを種々に設定したところ、ｐＨの低下に伴い、沈殿が生じた（図１Ａ）。沈殿は低ｐＨとした直後に発生し、ゲルのような状態から時間と共に小さくなる挙動を示した（図１Ｂ）。低ｐＨの環境において、ｐＨ感受性担体が互いに融合し、沈殿となったものと考えられる。以下、この沈殿物を「ｐＨ感受性担体の凝集体」とも称する。各ｐＨにおいて生じたｐＨ感受性担体の凝集体について膜破壊機能促進効果を測定したところ、驚くべきことに、いずれのｐＨ感受性担体の凝集体も膜破壊機能促進効果を有していた。ｐＨ感受性担体は膜破壊機能促進効果を有するが、凝集体となってもその効果を維持することが明らかとなった（図１Ｃ、Ｄ）。なお、図１Ｃに対応するデータを下記表１に、図１Ｄに対応するデータを下記表２に、それぞれ示す。【０１２８】
【表１】
2018207841.tif 000006
【０１２９】
【表２】
2018207841.tif 000007
【０１３０】
＜実験２．ｐＨ感受性担体の凝集体およびタンパク質の一体化＞
ｐＨ感受性担体が凝集体を形成する際に、生理活性物質を巻き込み、複合体を形成することが期待された。そこで、まず評価系の確認を行った。タンパク質としてはＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨは０．１Ｎの塩酸を使用して調整した。【０１３１】
１．最初に、ｐＨ感受性担体の分散液にＯＶＡを混合して混合液を調製した後、塩酸を添加し、混合液のｐＨを７．４から４．０へ低下させた。さらに、約２時間静置した後、０．２２μｍのフィルター（メルクミリポア社製ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を通した。沈殿を含む溶液はフィルターにより透明な外観となり、ｐＨ感受性担体の凝集体の分離が示唆された（図２Ａ）。さらに、フィルター処理前後の溶液をリン脂質Ｃ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて呈色し、波長６００ｎｍで吸光度測定を行ったところ、フィルター前の吸光度は０．２９５（リン脂質濃度１．５ｍｇ／ｍＬに相当）であったのに対して、フィルター後は０．００１（リン脂質濃度０．０ｍｇ／ｍＬに相当）であった（図２Ｂ）。ｐＨ感受性担体の凝集体は、本フィルターにより、ほぼ完全に分離できることが明らかとなった。【０１３２】
２．次に、タンパク質の分離を確認した。ＯＶＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳを、先ほどと同様に０．２２μｍのフィルターに通した。フィルター処理前後の液をタンパク質定量キット（プロテインアッセイＣＢＢ溶液、ナカライテスク社製）を用いて呈色し、波長５９５ｎｍで吸光度測定を行ったところ、フィルター前の吸光度は０．６１６であり、フィルター後の吸光度の０．６０１と同様の値を示した（図３Ａ）。なお、検定線を用いて吸光度を濃度に変換したところ、フィルター前のＯＶＡ濃度は０．８１ｍｇ／ｍＬであるのに対し、フィルター後のＯＶＡ濃度は０．７９ｍｇ／ｍＬであり、得られた濃度は仕込み濃度に一致した（図３Ｂ）。遊離しているＯＶＡは本フィルターに捕えられることなく、全て通り抜けることが確認された。したがって、ｐＨ感受性担体の凝集体およびタンパク質の一体化は、フィルター（孔径０．２２μｍ）を通す前後のタンパク質濃度を測定することにより評価可能であると判断した。【０１３３】
３．続いて、タンパク質とｐＨ感受性担体との一体化を評価した。タンパク質としてはＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨは０．１Ｎの塩酸を使用して調整した。静置する時間は約２時間とした。【０１３４】
ｐＨ感受性担体の分散液にＯＶＡを混合して混合液を調製した後、実験２の２．と同様の試験方法にて、フィルターに通し、フィルター処理前後の吸光度（ＯＶＡ濃度に対応）の変化を調べた。中性のｐＨの場合、フィルター前の吸光度は０．５９およびフィルター後の吸光度は０．５８であり、フィルターを通す前後で吸光度は変化せず、ｐＨ感受性担体はＯＶＡと一体化していないと示唆された（図４Ａ）。一方、ｐＨ３．５とした場合、フィルター前の吸光度は０．５７であるのに対し、フィルター後の吸光度は０．０１１であり、フィルター前のそれと比べて非常に小さな値となった（図４Ｂ）。この結果から、タンパク質を含むｐＨ感受性担体のｐＨを低下させることにより、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質との複合体が得られることが示唆された。【０１３５】
＜実験３．一体化を可能とするｐＨの検討＞
タンパク質とｐＨ感受性担体の凝集体との一体化を可能とするｐＨの範囲を調べた。タンパク質としてはＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨは０．１Ｎの塩酸を使用して調整した。静置する時間は１時間、および１日とした。【０１３６】
ｐＨ感受性担体の分散液にＯＶＡを混合して混合液を調製し、混合液を種々のｐＨに設定し、１時間または１日間静置した後、実験２の２．と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行い、一体化の評価を行った。その結果、ｐＨを７．４、６．８、６．４とした場合、吸光度はフィルター前後でほとんど変化しなかった（図５Ａ〜Ｃ）。一方、ｐＨを５．９〜１．９とした場合、フィルター後の吸光度は、フィルター前のそれに比べて小さな値となった（図５Ａ〜Ｃ）。本ｐＨの範囲（ｐＨ５．９〜１．９）において、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質の一体化が可能であることが示唆された。【０１３７】
なお、フィルター処理前後の吸光度の変動は、１時間静置した場合（図５Ｂ）と、１日間静置した場合（図５Ｃ）において、同様の傾向を示した。一体化を可能とするｐＨの範囲は、静置する時間に依存しないことが明らかとなった。なお、図５Ｂに対応するデータを下記表３に、図５Ｃに対応するデータを下記表４に、それぞれ示す。【０１３８】
【表３】
2018207841.tif 000008
【０１３９】
【表４】
2018207841.tif 000009
【０１４０】
＜実験４．一体化が可能なタンパク質量の検討＞
また、種々の濃度のＯＶＡにて一体化の操作を行い、一体化が可能なタンパク質の量を求めた。ＯＶＡの濃度は０．００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して２に調整した。静置する時間は１時間とした。また、実験２の２．と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行い、得られた吸光度をＯＶＡ濃度に変換した。【０１４１】
その結果、１０００ｎｍｏｌ／ｍＬのＤＬＰＣであるｐＨ感受性担体の分散液に対して、ＯＶＡが０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の範囲において、フィルター処理によるＯＶＡ濃度の減少が確認された（図６）。したがって、前記濃度範囲にて、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質の一体化が可能であると示唆された。なお、図６に対応するデータを下記表５に示す。【０１４２】
【表５】
2018207841.tif 000010
【０１４３】
＜５．一体化を可能とするｐＨ感受性担体の濃度の検討＞
次に、タンパク質との一体化を可能とするｐＨ感受性担体の濃度について調べた。タンパク質としてはＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸となるものを使用した。ｐＨは０．１Ｎの塩酸を使用して４に調整した。静置する時間は１時間とした。【０１４４】
種々のＤＬＰＣ濃度のｐＨ感受性担体の分散液を用意し、実験２の２．と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行い、タンパク質との一体化を評価した。低ＤＬＰＣ濃度のｐＨ感受性担体の分散液を使用した場合、フィルター処理前後の吸光度の変化が小さくなる傾向を示した（図７Ａ）。一体化するタンパク質の量が低下したものと考えられる。低ＤＬＰＣ濃度のｐＨ感受性担体の分散液は、低密度の凝集体を形成しており、前記結果になったものと考えられる（図７Ｂ）。【０１４５】
しかしながら、評価を行ったＤＬＰＣ  １０００〜５０ｎｍｏｌ／ｍＬのｐＨ感受性担体の濃度の範囲において、フィルター後の吸光度はフィルター前の吸光度に比べて小さな値であり、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質の一体化を示唆する結果であった。したがって、前記範囲の濃度において、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質は複合体を形成しているものと考えられる。なお、図７Ａに対応するデータを下記表６に示す。【０１４６】
【表６】
2018207841.tif 000011
【０１４７】
＜実験６．デオキシコール酸の配合量が及ぼす一体化への影響＞
デオキシコール酸の配合量が異なるｐＨ感受性担体を調製し、タンパク質の一体化に及ぼす影響を調べた。【０１４８】
タンパク質はＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣに対して種々の量のデオキシコール酸となるものを使用した。ｐＨは０．１Ｎの塩酸を使用して４に調整した。静置する時間は１時間とした。また、実験２の２．と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。【０１４９】
評価の結果、デオキシコール酸の配合量が少量である場合、フィルター前後の吸光度の変化が小さいものとなる傾向を示した（図８）。一体化するタンパク質の量は少量となることが示唆された。【０１５０】
しかしながら、評価を行った４００〜６４００ｎｍｏｌ／ｍＬのデオキシコール酸の配合量において、フィルター後の吸光度はフィルター前よりも低下しており、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質との一体化を示唆する結果であった。したがって、前記のデオキシコール酸の配合量において、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質が一体化しているものと考えられる。中でも、吸光度変化に基づくＯＶＡの一体化効率は、４００ｎｍｏｌ／ｍＬでは約４２％、１６００ｎｍｏｌ／ｍＬでは約６０％、６４００ｎｍｏｌ／ｍＬでは約６４％であり、デオキシコール酸の配合量が多いほど、タンパク質の一体化効率に優れることが示唆された。なお、図８に対応するデータを下記表７に示す。【０１５１】
【表７】
2018207841.tif 000012
【０１５２】
＜実験７．複合体の膜破壊機能促進効果＞
ｐＨ感受性担体の凝集体にタンパク質が担持された複合体の膜破壊機能促進効果を評価した。タンパク質としてはＯＶＡを使用し、濃度は０〜１０ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して３．５に調整した。静置する時間は１時間とした。【０１５３】
上記の方法にて溶出性試験を行ったところ、一体化するＯＶＡの量が増大するに従い、ｐＨ５．０における溶出率は僅かに低下する傾向を示した。しかしながら、いずれのＯＶＡ量においても、複合体は膜破壊機能促進効果の定義を満たした（図９Ａ）。ｐＨ感受性担体の凝集体にタンパク質が担持されてなる複合体は、膜破壊機能促進効果を有していることが明らかとなった。【０１５４】
また、水酸化アルミニウム存在下における、複合体の膜破壊機能促進効果を調べた。タンパク質はＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨ感受性担体の凝集体を調製する時のｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して１．０〜３．５に調整した。静置する時間は１時間とした。なお、ｐＨ感受性担体に水酸化アルミニウムを添加した後、タンパク質を添加し、最後にｐＨを調製した。水酸化アルミニウムの最終濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬとした。すなわち、アルミニウム元素の添加量としては、ＤＬＰＣ１００ｍｏｌに対して１２８０ｍｏｌであった。【０１５５】
上記の方法にて溶出性試験を行ったところ、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）存在下において、いずれのｐＨに調整した複合体も、通常のｐＨ感受性担体と同様の溶出率を示した（図９Ｂ）。複合体の膜破壊機能促進効果は、水酸化アルミニウムの影響を受けないことが明らかとなった。なお、図９Ａに対応するデータを下記表８に、図９Ｂに対応するデータを下記表９に、それぞれ示す。【０１５６】
【表８】
2018207841.tif 000013
【０１５７】
【表９】
2018207841.tif 000014
【０１５８】
＜実験８．タンパク質の一体化に及ぼすｐＨ感受性担体の両親媒性物質およびｐＨ感受性化合物の影響＞
まず、種々の両親媒性物質を用いて形成されたｐＨ感受性担体を用いて、タンパク質との一体化を試みた。タンパク質はＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌの両親媒性物質と１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨ感受性担体の凝集体を調製する時のｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して４に調整した。静置する時間は１時間とした。また、実験２の２．と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。【０１５９】
ＯＶＡのみの場合において、フィルター処理前後で吸光度はほとんど変化しなかった。一方、ＤＤＰＣ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＳＰＡＮ８０、ＰＥＧ１０ヒマシ油を用いたｐＨ感受性担体の場合においては、フィルター前に比べて、フィルター後の吸光度は非常に小さな値を示した（図１０Ａ）。この結果から、種々の両親媒性物質を用いて形成されたｐＨ感受性担体の凝集体とＯＶＡとの一体化が示唆された。両親媒性物質の種類は、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質との一体化に大きな影響を及ぼさないものと考えられる。【０１６０】
続いて、種々のｐＨ感受性化合物を用いて形成されたｐＨ感受性担体を用いて、タンパク質との一体化を調べた。タンパク質としてはＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌの種々のｐＨ感受性化合物を含むものを使用した。ｐＨ感受性担体の凝集体を調製する時のｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して４に調整した。静置する時間は１時間とした。また、実験２の２．と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。【０１６１】
ＯＶＡのみの場合およびデオキシコール酸のみの場合は、フィルターを通す前後にて吸光度の変化がほとんど生じなかった。一方、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリチルリチン酸、グリコデオキシコール酸を用いたｐＨ感受性担体の場合、フィルター前の吸光度に比べて、フィルター後の吸光度は非常に小さな値を示した（図１０Ｂ）。この結果から、種々のｐＨ感受性化合物を用いて形成されたｐＨ感受性担体の凝集体とＯＶＡとの一体化が示唆された。ｐＨ感受性化合物の種類は、ｐＨ感受性担体の凝集体とタンパク質との一体化に大きな影響を及ぼさないものと考えられる。なお、図１０Ａに対応するデータを下記表１０に、図１０Ｂに対応するデータを下記表１１に、それぞれ示す。【０１６２】
【表１０】
2018207841.tif 000015
【０１６３】
【表１１】
2018207841.tif 000016
【０１６４】
＜実験９．ｐＨ感受性担体の凝集体と核酸との一体化＞
タンパク質以外の生理活性物質に関しても、ｐＨ感受性担体の凝集体と一体化することが期待される。核酸は、遺伝子治療やＤＮＡワクチンを実現するものとして注目されており、サイトゾルへの送達を必要とする医薬品候補の１つである。核酸とｐＨ感受性担体の凝集体とを一体化することで、効率の良いエンドソームエスケープとサイトゾルへの送達が行われ、前記の実現に資するものと考えられる。そこで、ｐＨ感受性担体の凝集体と核酸との一体化について検討した。【０１６５】
核酸はｓａｌｍｏｎ由来のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を使用し、濃度は０．１ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨ感受性担体の凝集体を調製する時のｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して４に調整した。混合液を０．２２μｍフィルターに通し、フィルター処理前後の液について波長２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで、デオキシリボ核酸を検出した。静置する時間は２時間とした。【０１６６】
中性のｐＨでｐＨ感受性担体とデオキシリボ核酸を混合した場合、吸光度は２．０となり、デオキシリボ核酸単独の場合と同様の吸光度を示した（図１１）。中性のｐＨにおいて、デオキシリボ核酸とｐＨ感受性担体は一体化していないことが示唆された。一方、ｐＨを低下させてｐＨ感受性担体の凝集体とした場合、フィルター後の吸光度は０．９２となり、デオキシリボ核酸単独の場合の約１／２の値となった（図１１）。添加した約１／２量のデオキシリボ核酸がｐＨ感受性担体の凝集体と一体化していることが明らかになった（図１１）。すなわち、吸光度変化に基づくデオキシリボ核酸の一体化効率は、約５４％であった。なお、図１１に対応するデータを下記表１２に示す。【０１６７】
【表１２】
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【０１６８】
＜実験１０．ｐＨ感受性担体の凝集体とペプチドの一体化＞
続いて、ｐＨ感受性担体の凝集体とペプチドとの一体化を検討した。ペプチドは、がんワクチンの抗原や、細胞内のシグナル伝達阻害剤など、有力な医薬品の候補として盛んに研究されている。これらは、共にサイトゾルへの送達を必要とすることから、ｐＨ感受性担体、およびｐＨ感受性担体の凝集体との相乗効果が期待される。【０１６９】
ペプチドはＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＲＧＰＥＳＲＬＬを使用し、ペプチドの濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨ感受性担体の凝集体を調製する時のｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して４に調整した。静置する時間は２時間とした。混合液を０．２２μｍフィルターに通し、フィルター前後の液をペプチド定量キット（Ｌｏｗｒｙキット、ナカライテスク社製）を用いて呈色し、波長７５０ｎｍで吸光度測定を行った。【０１７０】
ｐＨ感受性担体とＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの混合液において、中性のｐＨでのペプチド由来の吸光度（Ｌｏｗｒｒｙ法による呈色）は０．４４であり、ペプチド単独と同様の吸光度を示した。ｐＨ感受性担体とペプチドは一体化していないことが示唆された（図１２Ａ）。一方、ｐＨを低下させてｐＨ感受性担体の凝集体とした場合、フィルター後の溶液の吸光度は０．３２となり、約１／４量のペプチドがｐＨ感受性担体の凝集体と一体化していることが明らかとなった（図１２Ａ）。すなわち、吸光度変化に基づくＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの一体化効率は、約２７％であった。また、ＲＧＰＥＳＲＬＬペプチドの場合、前記の値は１．４０と０．８２であり、約１／３量のペプチドがｐＨ感受性担体の凝集体と一体化していることが明らかとなった（図１２Ｂ）。すなわち、吸光度変化に基づくＲＧＰＥＳＲＬＬペプチドの一体化効率は、約４１％であった。【０１７１】
いずれの配列を有するペプチドにおいても、ｐＨ感受性担体の凝集体と一体化できることが示された。なお、図１２Ａに対応するデータを下記表１３に、図１２Ｂに対応するデータを下記表１４に、それぞれ示す。【０１７２】
【表１３】
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【０１７３】
【表１４】
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【０１７４】
＜実験１１．中性のｐＨにおけるｐＨ感受性担体の凝集体の状態、および一体化した生理活性物質の状態＞
血液や血漿のｐＨは中性である。そのため、ｐＨ感受性担体の凝集体の生体への投与を考慮すると、中性の環境におけるｐＨ感受性担体の凝集体の状態、および一体化した生理活性物質の状態を調べる必要があると考えた。【０１７５】
生理活性物質としてはＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨは、１Ｎの硫酸を用いて１に調製した（図１３Ｃ）。あるいは０．１Ｎの塩酸を使用して２．６に調整した（図１３Ａ、Ｂ、Ｄ）。中性のｐＨとする時は０．１Ｎの水酸化ナトリウムを用いた。静置する時間は２時間とした。【０１７６】
ｐＨ感受性担体の凝集体の溶液を中性のｐＨとした後、１日静置したところ、ｐＨ感受性担体の凝集体の沈殿は消失した（図１３Ａ、Ｂ）。得られた溶液を溶出性試験にて評価したところ、操作を加えていない通常のｐＨ感受性担体（図中ｎｏｒｍａｌ（ｐＨ７．４）と表記）と同様の溶出率を示し、膜破壊機能促進効果を有していることが確認された（図１３Ｃ  ｐＨ７．４→１．１５→７．４）。なお、中性以上のｐＨとした場合においても、同様の結果が得られた（図１３Ｃ）。ｐＨ感受性担体の凝集体は、中性以上のｐＨに移すことにより、沈殿を形成する凝集が解離し、ｐＨ感受性担体の粒子に戻ることが示唆された。なお、図１３Ｃに対応するデータを下記表１５に示す。【０１７７】
【表１５】
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【０１７８】
続いて、一体化した生理活性物質の状態を調べた。ＯＶＡを一体化させたｐＨ感受性担体の凝集体の溶液を中性のｐＨとした後、１日静置し、沈殿を消失させた。実験２の２．と同様にして、得られた溶液をフィルターに通し、溶液中に遊離しているＯＶＡの量を評価した。その結果、得られた吸光度は０．６１となり（図１３Ｄ  ｐＨ７．３とした後ｆｉｌｔｅｒ）、中性のｐＨにしなかった場合の吸光度（０．１０）と比べて大きな値を示した（図１３Ｄ  ｐＨ２．６ｆｉｌｔｅｒ）。また、本吸光度の値は、フィルターを通す前の吸光度（０．５７）と一致しており（図１３Ｄ  ｐＨ２．６ｆｉｌｔｅｒなし）、一体化したＯＶＡが全て解離した状態であることが示唆された。ｐＨ感受性担体の凝集体を中性のｐＨに移すことで、一体化した生理活性物質が解離し、ｐＨ感受性担体の凝集体から放出されたものと考えられる。【０１７９】
＜実験１２．ｐＨ感受性担体の凝集体の状態を維持する時間＞
中性のｐＨにおいて、一体化した生理活性物質は、ｐＨ感受性担体の凝集体から放出されることが明らかとなった。血液や血漿は中性のｐＨであることから、生理活性物質を一体化したｐＨ感受性担体の凝集体の生体への投与を考慮すると、中性のｐＨとなることでｐＨ感受性担体の凝集体が、直ちに生理活性物質を放出し、一体化の効果を喪失することが危惧された。そこで、中性のｐＨにおけるｐＨ感受性担体の凝集体の維持時間を調べた。【０１８０】
ＯＶＡを使用し、濃度は０．８ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。最終的な溶液の全量は、２ｍＬとした。ｐＨ感受性担体の凝集体を調製する時のｐＨは、０．１Ｎの塩酸を使用して２．６に調整し、中性のｐＨに戻す時は０．１Ｎの水酸化ナトリウムを用いた。また、実験２の２．と同様の方法にてフィルター処理前後の吸光度測定を行った。【０１８１】
中性のｐＨにおいて、ｐＨ感受性担体の凝集体は時間と共に消失する傾向を示した（図１４Ａ）。具体的には、０ｍｉｎから３ｈｏｕｒでは沈殿を確認できたが、５ｈｏｕｒでは、沈殿を確認できなかった。ｐＨ感受性担体の凝集体は、中性のｐＨにおいて３時間程度の間、沈殿の状態を維持できることが明らかとなった。また、吸光度変化の結果においても、０ｍｉｎから３ｈｏｕｒまではタンパク質を一体化したものが残存していることを確認できた（図１４Ｂ）。【０１８２】
＜実験１３．ｐＨ感受性担体の凝集体の体内動態＞
ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体、またはローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体の凝集体をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮内注射し、生体内における局所動態を比較した。ｐＨ感受性担体の分散液は、１ｍＬ中に１０００ｎｍｏｌのＤＬＰＣと１６００ｎｍｏｌのデオキシコール酸を含むものを使用した。ｐＨ感受性担体の凝集体を調製する時のｐＨは、１Ｎの硫酸を使用して４に調整した。静置する時間は１時間とした。【０１８３】
図１５Ａは、ローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体、およびローダミンＰＥで蛍光修飾したｐＨ感受性担体の凝集体の外観である。皮内注射した後、約５分後の局所動態を評価したところ、ｐＨ感受性担体は皮内注射した箇所を中心に広がった分布を示した（図１５Ｂ、Ｃ）。一方、ｐＨ感受性担体の凝集体は線状の分布を示した（図１５Ｄ、Ｅ）。再現のために、ｐＨ感受性担体の凝集体を複数箇所に皮内注射したところ、いずれ投与においても、線状の局所動態となり、再現が確認された（図１５Ｆ）。ｐＨ感受性担体と、ｐＨ感受性担体の凝集体とでは、異なる局所動態を示すことが確認された。ｐＨ感受性担体の凝集体は、非常に大きな粒子であることから、ｐＨ感受性担体と異なる局所動態を示したものと考えられる。なお、ｐＨ感受性担体の凝集体は投与の前にピペッティングによって懸濁液とした。【０１８４】
以上より、ｐＨ感受性担体とｐＨ感受性担体の凝集体とで、異なる局所動態を示したことから、ｐＨ感受性担体の凝集体は、生体内にて解離することなく存在し、生体に使用可能であることが明らかとなった。【０１８５】
本出願は、２０１７年５月１１日に出願された日本特許出願番号２０１７−０９４９５２号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2018207841.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
2018207841.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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