(57)【要約】  生体内フェノール化合物低減剤及びこれを含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物を提供することを課題とすし、下記（Ａ）乃至（Ｃ）の特徴を有する分岐α−グルカン混合物を有効成分とする生体内フェノール化合物低減剤及びこれを含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物を提供することによって上記課題を解決する：（Ａ）グルコースを構成糖とし、（Ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、（Ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを生成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）乃至（Ｃ）の特徴を有する分岐α−グルカン混合物を有効成分とする生体内フェノール化合物低減剤：
（Ａ）グルコースを構成糖とし、
（Ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（Ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを生成する。
【請求項２】
生体内フェノール化合物が、フェノール及び／又はｐ−クレゾールである請求項１記載の生体内フェノール化合物低減剤。
【請求項３】
前記分岐α−グルカン混合物が、イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり５質量％以上７０質量％以下生成する分岐α−グルカン混合物であることを特徴とする請求項１又は２記載の生体内フェノール化合物低減剤。
【請求項４】
前記分岐α−グルカン混合物が、下記（Ｄ）の特徴を有する分岐α−グルカン混合物である請求項１乃至３のいずれかに記載の生体内フェノール化合物低減剤：
（Ｄ）高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）により求めた水溶性食物繊維含量が４０質量％以上である。
【請求項５】
前記分岐α−グルカン混合物が、下記（Ｅ）及び（Ｆ）の特徴を有する分岐α−グルカン混合物である請求項１乃至４のいずれかに記載の生体内フェノール化合物低減剤：
（Ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：０．６乃至１：４の範囲にある；及び
（Ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の５５％以上を占める。
【請求項６】
前記分岐α−グルカン混合物の平均グルコース重合度が、８乃至５００であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の生体内フェノール化合物低減剤。
【請求項７】
腸内菌叢を改善する作用を有する請求項１乃至６のいずれかに記載の生体内フェノール化合物低減剤。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の生体内フェノール化合物低減剤を含有してなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物。
【請求項９】
皮膚性状の改善に用いられる請求項１乃至７のいずれかに記載の生体内フェノール化合物低減剤又は請求項８記載の生体内フェノール化合物低減用の飲食物。
【請求項１０】
皮膚性状の改善が、皮膚ターンオーバーの改善である請求項９記載の生体内フェノール化合物低減剤又は生体内フェノール化合物低減用の飲食物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内フェノール化合物低減剤に関し、詳細には、ヒトが摂取したとき、腸内菌叢を改善するとともに、生体内のフェノール化合物を低減する生体内フェノール化合物低減剤と、これを含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内（特に大腸）には、多種多様な細菌（腸内細菌）が定住しており、腸内菌叢（腸内フローラ）と呼ばれる細菌群を形成している。腸内菌叢は、１００種類以上、１００兆個の腸内細菌から構成されていると言われており、ヒト（宿主）の健康と密接な関係があることが知られている。腸内細菌は、ヒトが消化できなかった食物残渣や消化管からの分泌物等を餌として増殖し、便となって体外に排出される。【０００３】
腸内菌叢を構成する細菌として、ビフィドバクテリウム（ビフィズス菌）、バクテロイデス、ユウバクテリウム、クロストリジウム、大腸菌、乳酸桿菌、腸球菌などが知られている。腸内菌叢における細菌のバランスは個人差はあってもその人自身のバランスは新生児の頃から成年に至るまで健康時ではほとんど変わらないと言われている。しかし、ストレス、過労、暴飲・暴食、偏食、気候・温度、薬、感染、加齢等の様々な要因によって、そのバランスが崩れ、ビフィズス菌等の善玉菌が減少してウエルシュ菌や大腸菌等の悪玉菌が増えると、下痢、便秘、免疫力の低下による感染症、腸内腐敗産物の増加による発ガンなどの様々な疾患の原因になることが指摘されている。【０００４】
腸内環境は様々な疾患のみでなく老化にも関与していると考えられている。高齢者では、ビフィズス菌の細菌数が減少して、腸内菌叢が乱れていると言われており、腸内菌叢が悪化すると老化が促進される可能性が指摘されている。腸管内の悪玉菌は有害な腐敗産物（アンモニア、アミン化合物、フェノール化合物、インドール化合物など）を産生する。これらの腐敗産物は腸管に直接的に障害を与えるとともに、部分的に血中に吸収され、体内を巡って各種疾患の発症、肌荒れなどにも関わっていると言われている。【０００５】
腸内菌叢を改善する方法としてプロバイオティクス（Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）やプレバイオティクス（Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）を摂取する方法が良く知られている。プロバイオティクスは、腸内環境を改善し、整腸作用や免疫調節作用などをもたらす、生きた微生物群やそうした微生物群を生きた状態で含む食品を意味し、ヒトに有益な作用をもたらす、乳製品などによって摂取する生菌剤である。一方、プレバイオティクス（Ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）は、消化管上部で分解・吸収されず、大腸に共生する有益な細菌の選択的な栄養源となり、それらの増殖を促進し、腸内フローラの構成を健康的なバランスに改善し、人の健康の増進維持に役立つ食品成分を意味する。現在までに、オリゴ糖（ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、乳果オリゴ糖、キシロオリゴ糖、イソマルオリゴ糖、ラフィノース、ラクチュロース、コーヒー豆マンノオリゴ糖、グルコン酸など）や食物繊維（ポリデキストロース、イヌリン等）がプレバイオティクスとしての要件を満たす食品成分として知られている。【０００６】
プロバイオティクスやプレバイオティクスを摂取して腸内菌叢が改善されると、前述した有害な腸内腐敗産物（アンモニア、アミン化合物、フェノール化合物、インドール化合物など）の量を低減できると考えられる。非特許文献１、４及び５などには、腸内腐敗産物としてのフェノール、ｐ−クレゾールの原料となるチロシンを含有する飼料を用いてラット／マウスを飼育する際、ガラクトオリゴ糖及び／又は乳酸菌・ビフィズス菌発酵乳を摂取させると血清中のフェノール及びｐ−クレゾールが低減されることが報告されている。また、非特許文献２には、腸内細菌によって産生されるフェノール類がヘアレスマウスの皮膚に悪影響を及ぼすことが、非特許文献３には、腸内細菌によって産生されるフェノール類はヒトの皮膚における繊維芽細胞の分化を阻害することが、それぞれ報告されている。また、非特許文献６では、チロシン含有飼料で飼育したラットに高アミロース澱粉を併せて摂取させると生体内のｐ−クレゾールの増加が抑制されたとされ、さらに、非特許文献７には、ビフィズス菌発酵乳がヒトの腸内環境を改善し、血中フェノール化合物を低減するとともに、皮膚の角質水分含量を維持するなどの美容効果を奏することが報告されている。【０００７】
しかしながら、非特許文献６には、食物繊維及びプレバイオティクスの１つとして知られているイヌリンをラットに摂取させた試験において、イヌリンがｐ−クレゾールの低減効果を示さなかったことが報告されていることから、腸内菌叢を改善することのできるプロバイオティクスやプレバイオティクスであるからといって、必ずしも生体内の有害代謝産物であるフェノール化合物を低減できるというわけではない。このような状況下、低甘味ないし無味で利用範囲が広く、日常的に手軽かつ安全に継続摂取できるプレバイオティクスとして機能する水溶性食物繊維素材であって、腸内菌叢を改善するだけでなく、腸内腐敗産物として産生されるフェノール、ｐ−クレゾールなどの生体内フェノール化合物を低減することのできる新たな素材が提供されれば極めて有用である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】カワカミら、「ジャーナル・ニュートリューション・サイエンス・ビタミノロジー（Ｊ．Ｎｕｔｒ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．」、第５１巻、１８２−１８６頁（２００５年）
【非特許文献２】イイズカら、「ミクロバイアル・エコロジー・イン・ヘルス・アンド・ディジーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ），第２１巻、５０−５６頁（２００９年）
【非特許文献３】イイズカら、「ミクロバイアル・エコロジー・イン・ヘルス・アンド・ディジーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ），第２１巻、２２１−２２７頁（２００９年）
【非特許文献４】川上ら、「ヤクルト研究所研究報告集」、第２９号、１５−２６頁（２０１０年）
【非特許文献５】石井ら、「フレグランスジャーナル（ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ）」、第５号（２０１４年）
【非特許文献６】チェン（Ｃｈｅｎ）ら、「ルミナコイド研究」、第２０巻、１号、３１−３８頁、（２０１６年）
【非特許文献７】株式会社ヤクルト本社、ニュース・リリース、「ビフィズス菌発酵乳が肌荒れを改善」、２０１３年２月４日
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒトが摂取したとき、腸内菌叢を改善するとともに、生体内フェノール化合物を低減する効果を奏し、それ自体が低甘味ないし無味で利用範囲が広く、日常的に手軽かつ安全に継続摂取できる物質を有効成分とする生体内フェノール化合物低減剤と、これを含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決すべく鋭意研究努力を重ねた結果、本発明者らは、本出願人が、先に国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットにおいて開示した分岐α−グルカン混合物、具体的には、グルコースを構成糖とし、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、イソマルトデキストラナーゼ消化によりイソマルトースを生成する分岐α−グルカン混合物が、これを摂取したとき、腸内菌叢を改善するだけでなく、生体内のフェノール化合物を顕著に低減させる効果を奏することを見出した。この新たな知見に基づき、本発明者らは、それ自体が低甘味ないし無味で利用範囲が広い当該分岐α−グルカン混合物を有効成分とする生体内フェノール化合物低減剤と、これを含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物を確立し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、下記（Ａ）乃至（Ｃ）の特徴を有する分岐α−グルカン混合物を有効成分とする生体内フェノール化合物低減剤を提供することによって上記の課題を解決するものである。
（Ａ）グルコースを構成糖とし、
（Ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（Ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを生成する。【００１２】
上記特徴を有する分岐α−グルカン混合物は、澱粉などを原料として得られるα−グルカンであって安全な可食性素材であるだけでなく、低甘味ないし無味であり、これを摂取すると、腸内菌叢を改善するとともに、生体内フェノール化合物を顕著に低減させる効果を奏する。したがって、上記特徴（Ａ）乃至（Ｃ）を有する分岐α−グルカン混合物は生体内フェノール化合物低減剤の有効成分として極めて有用である。【００１３】
さらに、本発明は、上記生体内フェノール化合物低減剤を含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物を提供することによって上記の課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、その有効成分である分岐α−グルカン混合物が低甘味ないし無味であるため利用範囲が広く、ヒトが摂取した場合、腸内菌叢を改善するだけでなく、腸内腐敗産物として知られているフェノール化合物を生体内において低減できることから、皮膚の健康、美容の維持、さらには生体の健康維持に有用である。また、本発明の生体内フェノール化合物低減剤を含んでなる飲食物は、これを摂取することによって、簡便かつ安全に効果的に生体内のフェノール化合物を低減することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、下記（Ａ）乃至（Ｃ）の特徴を有する分岐α−グルカン混合物を有効成分とする生体内フェノール化合物低減剤に係る発明である。
（Ａ）グルコースを構成糖とし、
（Ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（Ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを生成する。
【００１６】
本明細書でいう生体内フェノール化合物低減剤とは、ヒトが経口又は経管摂取した場合に腸内のいわゆる善玉菌を増加させて腸内菌叢を改善するとともに、生体内に含まれるフェノール化合物の量を当該剤を摂取しない場合と比べて低減する剤を意味し、例えば、盲腸内容物、血清、尿、糞便、皮膚などの生体試料に含まれるフェノール化合物の量を、当該剤を摂取した場合としない場合とで比べることによって確認することができる。なお、ここでいう「フェノール化合物」とは、フェノール、ｐ−クレゾール（ｐ−メチルフェノール）などを意味する。なお、これら「フェノール化合物」は、ヒトが摂取した蛋白質由来のアミノ酸であるチロシンが腸内細菌などによって代謝され腸内腐敗産物として生成すると言われている。
【００１７】
非特許文献７に示唆されているように、生体内のフェノール化合物、とりわけ血中や皮膚におけるフェノール化合物を低減することができれば、皮膚において、角質水分含量の維持や表皮の角化の正常化などが期待され、さらには皮膚の健康、美容の維持につながると期待される。加えて、生体内のフェノール化合物は大腸の発ガンと関連することが報告されており（非特許文献６を参照）、これを低減できれば、発ガンや各種疾患リスクの低減にもつながると期待される。
【００１８】
本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、有効成分として前記分岐α−グルカン混合物（以下、「本分岐α−グルカン混合物」という。）を含有してなるものである。本分岐α−グルカン混合物は、後述のとおり種々の製造方法により得ることができ、得られる本分岐α−グルカン混合物は、通常、様々な分岐構造並びにグルコース重合度（分子量）を有する多数の分岐α−グルカンの混合物の形態にあり、現行の技術では、一つ一つの分岐α−グルカンの単離や定量を行うことは不可能である。このため、個々の分岐α−グルカンの構造、すなわち、構成単位であるグルコース残基の結合様式及び結合順序を分岐α−グルカンの分子ごとに決定することはできないものの、本分岐α−グルカン混合物の構造は、斯界で一般に用いられる種々の物理的手法、化学的手法又は酵素的手法により、混合物全体として特徴付けることができる。
【００１９】
具体的には、本分岐α−グルカン混合物の構造は、混合物全体として、上記（Ａ）乃至（Ｃ）の特徴によって特徴付けられる。すなわち、本分岐α−グルカン混合物は、グルコースを構成糖とするグルカン（特徴（Ａ））であり、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有している（特徴（Ｂ））。なお、特徴（Ｂ）でいう「非還元末端グルコース残基」とは、α−１，４結合を介して連結したグルカン鎖のうち、還元性を示さない末端に位置するグルコース残基を意味し、「α−１，４結合以外の結合」とは、文字どおりα−１，４結合以外の結合を意味する。
【００２０】
さらに、本分岐α−グルカン混合物は、イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを生成する（特徴（Ｃ））。特徴（Ｃ）でいうイソマルトデキストラナーゼ消化とは、本分岐α−グルカン混合物にイソマルトデキストラナーゼを作用させ、加水分解することを意味する。イソマルトデキストラナーゼは、酵素番号（ＥＣ）３．２．１．９４が付与される酵素であり、α−グルカンにおけるイソマルトース構造の還元末端側に隣接するα−１，２、α−１，３、α−１，４、及びα−１，６結合のいずれの結合様式であっても加水分解する特徴を有する酵素である。好適には、アルスロバクター・グロビホルミス由来のイソマルトデキストラナーゼ（例えば、サワイ（Ｓａｗａｉ）ら、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５２巻、第２号、第４９５頁−５０１頁（１９８８）参照）が用いられる。
【００２１】
イソマルトデキストラナーゼ消化によりイソマルトースが生成するということは、分岐α−グルカン混合物を構成する分岐α−グルカン分子がイソマルトデキストラナーゼで加水分解され得るイソマルトース構造を有していることを示すものであり、特徴（Ｃ）によって、本分岐α−グルカン混合物が、混合物全体としてみた場合、イソマルトデキストラナーゼで加水分解され得るイソマルトース構造を含んでいるという構造的特徴を有していることを、酵素的手法によって特徴付けることができる。
【００２２】
本分岐α−グルカン混合物としては、イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり、通常、５質量％以上７０質量％以下、好ましくは、１０質量％以上６０質量％以下、より好ましくは２０質量％以上５０質量％以下生成するものが、腸内菌叢の改善により好適であり、生体内のフェノール化合物濃度を低減する効果により優れていると考えられることから好適に用いられる。
【００２３】
すなわち、後述するとおり、本分岐α−グルカン混合物による腸内菌叢の改善効果、生体内のフェノール化合物濃度を低減する効果には、本分岐α−グルカン混合物がイソマルトデキストラナーゼ消化によりイソマルトースを生成するという構造的特徴を有していることが深く関与していると考えられる。すなわち、イソマルトデキストラナーゼ消化におけるイソマルトース生成量が５質量％未満の分岐α−グルカン混合物は、分岐構造の少ないマルトデキストリンに近い構造的特徴を有するものとなり、逆に、イソマルトデキストラナーゼ消化におけるイソマルトース生成量が７０質量％超の分岐α−グルカン混合物はα−１，６結合で連なったグルコースポリマーであるデキストランに近い構造的特徴を有するものとなって、上述した特徴（Ｂ）で規定される分岐構造が少なくなるため、いずれの場合も腸内菌叢の改善、ひいては生体内フェノール化合物低減に関与すると考えられる構造的特徴が薄れることとなり、イソマルトデキストラナーゼ消化によるイソマルトースの量には好適範囲が存在する。
【００２４】
また、本分岐α−グルカン混合物のより好適な一態様としては、高速液体クロマトグラフ（酵素−ＨＰＬＣ法）により求めた水溶性食物繊維含量が４０質量％以上であるという特徴（Ｄ）を有しているものが挙げられる。
【００２５】
水溶性食物繊維含量を求める「高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）」（以下、単に「酵素−ＨＰＬＣ法」という。）とは、平成８年５月厚生省告示第１４６号の栄養表示基準、「栄養成分等の分析方法等（栄養表示基準別表第１の第３欄に掲げる方法）」における第８項、「食物繊維」に記載されている方法であり、その概略を説明すると以下のとおりである。すなわち、試料を熱安定α−アミラーゼ、プロテアーゼ及びグルコアミラーゼによる一連の酵素処理により分解処理し、イオン交換樹脂により処理液から蛋白質、有機酸、無機塩類を除去することによりゲル濾過クロマトグラフィー用の試料溶液を調製する。次いで、ゲル濾過クロマトグラフィーに供し、クロマトグラムにおける、未消化グルカンとグルコースのピーク面積を求め、それぞれのピーク面積と、別途、常法により、グルコース・オキシダーゼ法により求めておいた試料溶液中のグルコース量を用いて、試料の水溶性食物繊維含量を算出する。なお、本明細書を通じて「水溶性食物繊維含量」とは、特に説明がない限り、前記「酵素−ＨＰＬＣ法」で求めた水溶性食物繊維含量を意味する。
【００２６】
水溶性食物繊維含量は、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼによって分解されないα−グルカンの含量を示すものであり、特徴（Ｄ）は、本分岐α−グルカン混合物の構造を、混合物全体として、酵素的手法により特徴付ける指標の一つである。
【００２７】
なお、上述したとおり、本分岐α−グルカン混合物による腸内菌叢の改善効果、生体内フェノール化合物を低減する効果には、イソマルトデキストラナーゼ消化によりイソマルトースを生成するという構造的特徴が深く関与していると考えられるところ、この特徴的な構造部分は、当然のことながら、本分岐α−グルカン混合物の水溶性食物繊維含量が高まれば高まるほど、換言すれば、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼで分解されない分岐α−グルカンの含量が多いほど、より多く、消化されずに大腸に到達し、腸内菌叢改善効果を示すと考えられる。したがって、本発明の生体内フェノール化合物低減剤の有効成分である本分岐α−グルカン混合物としては、水溶性食物繊維含量が高いものほど好ましく、好適な水溶性食物繊維含量は、通常、４０質量％以上であるが、６０質量％以上のものがより好ましく、さらに好ましくは７５質量％以上である。好適な水溶性食物繊維含量の上限は特になく、技術的に可能な限り高いほどよく、好ましくは１００質量％以下又は１００質量％未満である。
【００２８】
さらに、本分岐α−グルカン混合物のより好適な一態様としては、下記特徴（Ｅ）及び（Ｆ）を有する分岐α−グルカン混合物が挙げられる。
（Ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：０．６乃至１：４の範囲にあり、
（Ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の５５％以上を占める。
【００２９】
なお、分岐α−グルカン混合物が上記特徴（Ｅ）及び（Ｆ）を有しているか否かはメチル化分析によって確認することができる。メチル化分析とは、周知のとおり、多糖又はオリゴ糖において、これを構成する単糖の結合様式を決定する方法として一般的に汎用されている方法である（シューカヌ（Ｃｉｕｃａｎｕ）ら、カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第１３１巻、第２号、第２０９−２１７頁（１９８４））。メチル化分析をグルカンにおけるグルコースの結合様式の分析に適用する場合、まず、グルカンを構成するグルコース残基における全ての遊離の水酸基をメチル化し、次いで、完全メチル化したグルカンを加水分解する。次いで、加水分解により得られたメチル化グルコースを還元してアノマー型を消去したメチル化グルシトールとし、更に、このメチル化グルシトールにおける遊離の水酸基をアセチル化することにより部分メチル化グルシトールアセテート（なお、「部分メチル化グルシトールアセテート」を単に「部分メチル化物」と総称する場合がある。）を得る。得られる部分メチル化物を、ガスクロマトグラフィーで分析することにより、グルカンにおいて結合様式がそれぞれ異なるグルコース残基に由来する各種部分メチル化物は、ガスクロマトグラムにおける全ての部分メチル化物のピーク面積に占めるピーク面積の百分率（％）で表すことができる。そして、このピーク面積％から当該グルカンにおける結合様式の異なるグルコース残基の存在比、すなわち、各グルコシド結合の存在比率を決定することができる。部分メチル化物についての「比」は、メチル化分析のガスクロマトグラムにおけるピーク面積の「比」を意味し、部分メチル化物についての「％」はメチル化分析のガスクロマトグラムにおける「面積％」を意味するものとする。
【００３０】
上記特徴（Ｅ）及び（Ｆ）における「α−１，４結合したグルコース残基」とは、１位及び４位の炭素原子に結合した水酸基のみを介して他のグルコース残基に結合したグルコース残基であり、メチル化分析において、２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールとして検出される。また、上記特徴（Ｅ）及び（Ｆ）における「α−１，６結合したグルコース残基」とは、１位及び６位の炭素原子に結合した水酸基のみを介して他のグルコース残基に結合したグルコース残基であり、メチル化分析において、２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとして検出される。
【００３１】
メチル化分析により得られる、α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比率（特徴（Ｅ））、及び、α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の全グルコース残基に対する割合（特徴（Ｆ））は、本分岐α−グルカン混合物の構造を、混合物全体として、化学的手法によって特徴付ける指標の一つとして用いることができる。
【００３２】
上記特徴（Ｅ）の「α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：０．６乃至１：４の範囲にある」との規定は、本分岐α−グルカン混合物をメチル化分析に供したとき、検出される２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールの比が１：０．６乃至１：４の範囲にあることを意味する。また、上記特徴（Ｆ）の「α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の５５％以上を占める」との規定は、本分岐α−グルカン混合物が、メチル化分析において、２，３，６−トリメチル−１，４，５−トリアセチルグルシトールと２，３，４−トリメチル−１，５，６−トリアセチルグルシトールとの合計が部分メチル化グルシトールアセテートの５５％以上を占めることを意味する。通常、澱粉は１位と６位でのみ結合したグルコース残基を有しておらず、かつα−１，４結合したグルコース残基が全グルコース残基中の大半を占めているので、本分岐α−グルカン混合物が上記特徴（Ｅ）及び特徴（Ｆ）を有しているということは本分岐α−グルカン混合物が澱粉とは全く異なる構造を有することを意味するものである。
【００３３】
上記特徴（Ｅ）及び（Ｆ）で規定されるとおり、本分岐α−グルカン混合物は、好ましい一態様において、通常、澱粉には存在しない「α−１，６結合したグルコース残基」を相当程度有するものであるが、より複雑な分岐構造を有するものの方が高い効果を期待できることから、α−１，４結合及びα−１，６結合に加えてα−１，３結合及び／又はα−１，３，６結合を有するのが好ましい。ここで、「α−１，３，６結合」とは、「１位、３位及び６位の水酸基の３箇所で他のグルコースと結合した（α−１，３，６結合した）グルコース残基」を意味する。α−１，４結合及びα−１，６結合に加えてα−１，３結合及び／又はα−１，３，６結合を有していれば、より複雑な分岐構造を有することになるので、基本的には、本分岐α−グルカン混合物中にα−１，３結合及び／又はα−１，３，６結合が含まれていればよく、その割合に特段の制限はないが、例えば、α−１，３結合したグルコース残基は全グルコース残基の０．５％以上１０％未満であることが好ましく、α−１，３，６結合したグルコース残基は全グルコース残基の０．５％以上であることが好ましい。
【００３４】
上記「α−１，３結合したグルコース残基が全グルコース残基の０．５％以上１０％未満である」ことは、本分岐α−グルカン混合物をメチル化分析に供し、２，４，６−トリメチル−１，３，５−トリアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満存在することによって確認することができる。また、上記「α−１，３，６結合したグルコース残基が全グルコース残基の０．５％以上である」ことは、本分岐α−グルカン混合物をメチル化分析に供し、２，４−ジメチル−１，３，５，６−テトラアセチルグルシトールが部分メチル化グルシトールアセテートの０．５％以上１０％未満存在することによって確認することができる。
【００３５】
本分岐α−グルカン混合物は、重量平均分子量（Ｍｗ）、及び、重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値（Ｍｗ／Ｍｎ）によっても特徴づけることができる。重量平均分子量（Ｍｗ）及び数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー等を用いて求めることができる。また、重量平均分子量（Ｍｗ）に基づいて本分岐α−グルカン混合物を構成する分岐α−グルカンの平均グルコース重合度を算出することができるため、本分岐α−グルカン混合物は平均グルコース重合度で特徴づけることもできる。平均グルコース重合度は、重量平均分子量（Ｍｗ）から１８を減じ、グルコース残基量の分子量に相当する１６２で除して求めることができる。生体内フェノール化合物低減剤の有効成分として用いる本分岐α−グルカン混合物は、その平均グルコース重合が、通常、８乃至５００、好ましくは１５乃至４００、より好ましくは２０乃至３００のものが好適である。なお、分岐α−グルカン混合物は、平均グルコース重合度が大きいほど粘度が増し、平均グルコース重合度が小さいほど粘度が小さくなる点で、通常のグルカンと同様の性質を示す。そのため、本発明の生体内フェノール化合物低減剤の実施態様に応じ、要求される粘度に適合する平均グルコース重合度を有する本分岐α−グルカン混合物を適宜選択して用いることができる。
【００３６】
重量平均分子量（Ｍｗ）を数平均分子量（Ｍｎ）で除した値であるＭｗ／Ｍｎは、１に近いものほど構成する分岐α−グルカン混合物を構成する分岐α−グルカン分子のグルコース重合度のばらつきが小さいことを意味する。生体内フェノール化合物低減剤の有効成分として用いる本分岐α−グルカン混合物は、Ｍｗ／Ｍｎが、通常、２０以下のものであれば問題なく使用できるものの、好ましくは１０以下、より好ましくは５以下のものが好適である。なお、グルコース重合度が比較的均一な本分岐α−グルカン混合物が本発明に係る生体内フェノール化合物低減剤の有効成分として求められる場合には、Ｍｗ／Ｍｎが１により近く、グルコース重合度のばらつきが小さいものほど好ましい。
【００３７】
本分岐α−グルカン混合物は、上記（Ａ）乃至（Ｃ）の特徴を有する限り、如何なる方法で製造されたものであっても良い。例えば、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの非還元末端グルコース残基にα−１，６結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を導入する作用を有する酵素を澱粉質に作用させて得られる分岐α−グルカン混合物は、本発明の実施において好適に利用することができ、より好適な一例としては、国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットにおいて開示されているα−グルコシル転移酵素を澱粉質に作用させて得られる分岐α−グルカン混合物が挙げられる。また、前記α−グルコシル転移酵素に加え、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６０）などのアミラーゼや、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）などの澱粉枝切り酵素を併用すれば、分岐α−グルカン混合物を低分子化することができるので、分子量、グルコース重合度などを所望の範囲に調整することができる。さらには、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）や、澱粉枝作り酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）、特開２０１４−０５４２２１号公報に開示されている重合度２以上のα−１，４グルカンを澱粉質の内部のグルコース残基にα−１，６転移する活性を有する酵素を併用することにより、分岐α−グルカン混合物を構成する分岐α−グルカンをさらに高度に分岐させ、分岐α−グルカン混合物の水溶性食物繊維含量を高めることもできる。かくして得られる分岐α−グルカン混合物に、さらにグルコアミラーゼ等の糖質加水分解酵素を作用させ、さらに水溶性食物繊維含量を高めた分岐α−グルカン混合物とすることも随意であり、グリコシルトレハロース生成酵素（ＥＣ  ５．４．９９．１５）を作用させることにより分岐α−グルカン混合物を構成する分岐α−グルカンの還元末端にトレハロース構造を導入したり、水素添加により分岐α−グルカンの還元末端を還元するなどして分岐α−グルカン混合物の還元力を低下させてもよく、また、サイズ排除クロマトグラフィー等による分画を行なうことにより、所望の分子量を有する分岐α−グルカン混合物を取得することも随意である。
【００３８】
本発明の生体内フェノール化合物低減剤に含有される本分岐α−グルカン混合物の量は、所期の生体内フェノール化合物低減効果を発揮する限り、特に限定はないが、本分岐α−グルカン混合物を１乃至１００質量％、好ましくは、３乃至１００質量％、より好ましくは５乃至１００質量％の範囲で含有していれば良い。また、本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、本分岐α−グルカン混合物に加えて、必要に応じて、水、ミネラル、着香料、安定化剤、賦形剤、増量剤、ｐＨ調整剤などから選ばれる１種又は２種以上の成分を、０．０１乃至５０質量％、好ましくは、０．１乃至４０質量％の割合で適宜配合して利用することもできる。
【００３９】
本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、生体内のフェノール化合物の量を低減する効果を発揮する量摂取すればよく、摂取量に特段の制限はないが、例えば、有効成分である本分岐α−グルカン混合物の摂取量として、通常、成人（体重６０ｋｇ）1回当たり、０．５乃至１００ｇの範囲、好ましくは１乃至５０ｇの範囲、より好ましくは１．５乃至１０ｇの範囲、さらに好ましくは３乃至８ｇの範囲となるように、本発明の生体内フェノール化合物低減剤を、そのまま、或いは、水、お茶、コーヒーなどの飲料に溶解して摂取するか、食品又は飲料に添加して摂取すればよい。なお、本発明の生体内フェノール化合物低減剤を食品又は飲料の摂取中はもとより、摂取の前又は後に摂取してもよいことは勿論である。
【００４０】
本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、粉末状、粒状、顆粒状、液状、ペースト状、クリーム状、タブレット状、カプセル状、カプレット状、ソフトカプセル状、錠剤状、棒状、板状、ブロック状、丸薬状、固形状、ゲル状、ゼリー状、グミ状、ウエハース状、ビスケット状、飴状、チュアブル状、シロップ状、スティック状などの適宜の形態とすることができる。また、本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、飲食物に含有せしめることにより、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養補助食品、又は健康食品などの生活習慣病を予防又は改善することを目的に摂取される飲食物の形態とすることができる。
【００４１】
本発明の生体内フェノール化合物低減剤を含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物の具体例としては、炭酸飲料、乳飲料、ゼリー飲料、スポーツドリンク、酢飲料、豆乳飲料、鉄含有飲料、乳酸菌飲料、緑茶、紅茶、ココア、コーヒーなどの飲料、米飯、粥、パン、麺類、スープ、味噌汁、ヨーグルトなどの食品、ソフトキャンディー、ハードキャンディ、グミ、ゼリー、クッキー、ソフトクッキー、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、わらび餅、まんじゅう、ういろう、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、ペクチンゼリー、カステラ、ビスケット、クラッカー、パイ、プリン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ホットケーキ、マフィン、ドーナツ、チョコレート、ガナッシュ、シリアルバー、チューインガム、キャラメル、ヌガー、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、ジャム、マーマレードなどの菓子、アイスクリーム、シャーベット、ジェラートなどの氷菓、更には、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、トマトソース、ケチャップ、焼き肉のタレ、焼き鳥のタレ、から揚げ粉、天ぷら粉、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料や調理加工品が挙げられる。さらに、本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、生活習慣病を予防又は改善（治療）するための液剤、シロップ剤、経管栄養剤、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、舌下剤、顆粒剤、散剤、粉剤、乳剤、噴霧剤などの形態にある薬剤に配合することもできる。さらに、本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、ヒト以外の動物が摂取するペットフードや飼料、餌料に配合することもできる。
【００４２】
本発明の生体内フェノール化合物低減剤及びこれを含んでなる生体内フェノール化合物低減用の飲食物は、必要に応じて、経管投与などの非経口的投与方法により胃又は消化管へ投与することもできる。
【００４３】
また、本発明の生体内フェノール化合物低減剤は、後述する実験の項で示すとおり、飲食物に起因し、生体内で生成するフェノール化合物の量を低減することができるので、フェノール化合物が及ぼす皮膚への悪影響の低減、皮膚の健康状態の維持又は改善、具体的には、皮膚のターンオーバーの適正化、改善につながる効果を奏する。
【００４４】
以下、実験に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【００４５】
以下の実験では、国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの実施例５記載の方法に従い製造した分岐α−グルカン混合物を使用した。すなわち、前記実施例５記載の方法に順じて、２７．１質量％トウモロコシ澱粉液化液（加水分解率３．６％）に、最終濃度０．３質量％となるように亜硫酸水素ナトリウムを、また最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加えた後、５０℃に冷却し、これに、国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの実施例１に記載された方法で調製したバチルス・サーキュランス  ＰＰ７１０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７７１）由来のα−グルコシル転移酵素の濃縮粗酵素液を固形物１グラム当たり１１．１単位加え、５０℃、ｐＨ６．０で６８時間作用させた。その反応液を８０℃で６０分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮、噴霧乾燥して製造した分岐α−グルカン混合物を以下の実験１に使用した。なお、得られた分岐α−グルカン混合物を、国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの段落００７９、００８０に記載されたイソマルトデキストラナーゼ消化試験法、α−グルコシダーゼ及びグルコアミラーゼ消化試験法、段落００７６乃至００７８に記載されたメチル化分析法により分析したところ、以下の（ａ）乃至（ｃ）の特徴を有していた。
（ａ）グルコースを構成糖とし、
（ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり３５質量％生成した。
【００４６】
また、得られた分岐α−グルカン混合物を前記酵素−ＨＰＬＣ法により分析したところ、前記分岐α−グルカン混合物は、上記特徴に加えて、下記（ｄ）の特徴を有しており、さらには、上記メチル化分析法による分析結果から、下記（ｅ）乃至（ｈ）の特徴を有することが判明した。
（ｄ）水溶性食物繊維含量が８２．９質量％であり、
（ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：２．１であり、
（ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の７３．８％であった。
（ｇ）α−１，３結合したグルコース残基が全グルコース残基の２．１％であった。
（ｈ）α−１，３，６結合したグルコース残基が全グルコース残基の５．６％であった。
【００４７】
さらに、当該分岐α−グルカン混合物を、国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの段落００８１に記載されたゲル濾過ＨＰＬＣによる分子量分布分析にしたところ、その重量平均分子量（Ｍｗ）は５，０００ダルトン（平均グルコース重合度に換算すると約３０）、Ｍｗ／Ｍｎは２．１であった。
【００４８】
上記のとおり、本実験で使用した分岐α−グルカン混合物は、グルコースを構成糖とし、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、イソマルトデキストラナーゼ消化によりイソマルトースを生成するという前記（Ａ）乃至（Ｃ）の特徴を有するものであった。また、本実験で使用した分岐α−グルカン混合物は、イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり５質量％以上７０質量％以下生成するという特徴、水溶性食物繊維含量が４０質量％以上であるという前記（Ｄ）の特徴、及び、α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：０．６乃至１：４の範囲にあり、α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の５５％以上を占めるという前記（Ｅ）、（Ｆ）の特徴を満たすものであった。
【００４９】
さらに、前記分岐α−グルカン混合物は、α−１，３結合したグルコース残基が全グルコース残基の０．５％以上１０％未満の範囲にあり、α−１，３，６結合したグルコース残基が全グルコース残基の０．５％以上の範囲にあるものであった。
【００５０】
なお、以下の実験では、実験動物としてラットを用い、飼料として、生体内フェノール化合物の原料となるアミノ酸であるチロシンを強化・配合した飼料（以下、「チロシン飼料」という。）を与え、また、飲用水として、水、又は水に上記分岐α−グルカン混合物を特定濃度になるよう溶解した分岐α−グルカン混合物水溶液を与えつつ一定期間飼育した後、ラットから採取した各種生体試料におけるフェノール化合物の量を測定した。
【００５１】
＜実験１：チロシン飼料の給餌と分岐α−グルカン混合物の飲水投与によるラットの飼育＞
Ｗｉｓｔａｒラット（雄、６週齢、日本エスエルシー株式会社販売）２４匹を購入し、通常飼料（「ＣＥ−２」、飼育繁殖用、日本クレア株式会社販売）を与えつつ５日間飼育し馴化させた。次いで、馴化させたラットを６匹ずつ４群に分け、各群のラットには下記表１に示す飼料、すなわち、後述するＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料及びチロシン飼料のいずれか、及び、同じく表１に示す飲用水、すなわち、水、又は水に上記で得た分岐α−グルカン混合物を２％（ｗ／ｖ）又は５％（ｗ／ｖ）になるよう溶解した水溶液（以下、それぞれ「２％分岐α−グルカン混合物液」、「５％分岐α−グルカン混合物液」という。）のいずれかを与えそれぞれ３週間飼育した。
【００５２】
【表１】
2018193897.tif 000002
【００５３】
なお、表１に示す「ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料」及び「チロシン飼料」は、それぞれ下記表２に示す組成を有する飼料であり、日本クレア株式会社に外注し入手した。なお、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料は、日本クレア株式会社が販売する標準飼料『ＡＩＮ−９３Ｇ』において、コーンスターチの組成が３９．７４８６質量％であるところを５１．９４８６質量％に改変し、且つ、α−コーンスターチの組成が１３．２質量％であるところを１質量％に改変した以外はＡＩＮ−９３Ｇと同じ組成のものである。また、表２に見られるとおり、チロシン飼料はＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料のコーンスターチの５質量％をチロシンに置換したものである。
【００５４】
【表２】
2018193897.tif 000003
【００５５】
飼育期間中の各群のラットの体重、摂餌量、飲水量を表３に示した。さらに、飼育１９〜２０日の時点で代謝ゲージを用いて各ラット１匹からそれぞれ採取した１日分の糞便と尿の量を測定し、各群６匹の平均値と標準偏差として表４に示した。
【００５６】
【表３】
2018193897.tif 000004
【００５７】
【表４】
2018193897.tif 000005
【００５８】
表３に示すとおり、試験した４群のラットは、体重、摂餌量、飲水量とも同程度の値を示し、各群間で有意な差は認められなかった。このことは、餌料としてＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料を、飲用水として水を与えて飼育した通常食群のラットと、餌料としてチロシン飼料を摂取させた対照群のラット、さらに、飲用水として特定濃度の分岐α−グルカン混合物液を摂取させた試験群のラットが、各群間で大きく差が生じることのない安定した試験系で飼育されたことを物語っている。なお、摂餌量から計算すると、チロシン飼料を摂取したラットにおけるチロシンの１日当たりの摂取量は約４ｇ／ｋｇ−体重となった。また、分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させたラットに関していえば、飲水量から計算すると、分岐α−グルカン混合物の１日当たりの摂取量は、２％分岐α−グルカン混合物群では１．９ｇ／ｋｇ−体重、５％分岐α−グルカン混合物群では５．１ｇ／ｋｇ−体重であった。
【００５９】
また、飼育中の糞便量と尿量に関しては、表４に示すとおり、チロシン飼料を与え、飲用水として水を与えて飼育した対照群が、他の群よりも糞便量で高い値を示したものの、各群間で有意な差は認められなかった。この結果は、表３で示した体重、摂餌量、飲水量の場合と同様に、ラットが、各群間で大きく差が生じることのない安定な試験系で飼育されたことを物語っている。
【００６０】
＜実験２：ラットからの各種試料の採取、試料の前処理及びフェノール化合物の定量＞
実験１で飼育した各群のラットから、種々の生体試料をそれぞれ採取し、それぞれに含まれるフェノール化合物の量を測定した。
【００６１】
＜実験２−１．ラットからの各種試料の採取＞
実験１で飼育した４群、計２４匹のラットは、それぞれペントバルビタール麻酔下で後大静脈より全血を採取し安楽死させた。安楽死させた後、解剖し盲腸及び肝臓を摘出、採取しそれぞれ重量を測定した。また、脇腹を剃毛した後、１ｃｍ角の大きさで２箇所から皮膚を採取し、皮下組織を除去して皮膚試料とした。採取した肝臓、盲腸組織及び盲腸内容物のそれぞれの重量、及び、盲腸内容物のｐＨを表５にまとめた。なお、盲腸内容物のｐＨは直接ｐＨメーターにて測定した。
【００６２】
【表５】
2018193897.tif 000006
【００６３】
表５に示すとおり、盲腸組織及び盲腸内容物の重量は、対照群に比較して２％分岐α−グルカン混合物群、５％分岐α−グルカン混合物群が有意に重かった。通常食群と対照群の盲腸内容物は緑色がかった色調を示し、一方、５％分岐α−グルカン混合物群の盲腸内容物は黄色がかった色調を示した。また、２％分岐α−グルカン混合物群では、盲腸内容物は、黄色がかった色調のものが４匹、緑色がかった色調のものが２匹の比率を示したことから、分岐α−グルカン混合物を摂取した群では腸内菌叢が変化していることが示唆された。また、分岐α−グルカン混合物を摂取させた群の盲腸内容物のｐＨは、対照群のそれよりも有意に低い値を示した。
【００６４】
＜実験２−２．生体内フェノール化合物測定のための各採取試料の前処理＞
実験１で採取した尿、糞便に加え、実験２−１で採取した各試料、すなわち、盲腸内容物、血液（血清）、皮膚、肝臓について、フェノール化合物測定のための前処理として、それぞれ以下に示す処理を行った。
【００６５】
＜盲腸内容物＞：採取後−８０℃で凍結保存したものを解凍し、０．３ｇを秤取し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を３ｍＬ加えて１０倍希釈し、ポリテトラフルオロエチレン製ホモジナイザー（５ｍＬ容）を用いてホモジナイズし、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、８００×ｇ、１０分）して粗抽出液を調製し、−８０℃で凍結保存した。
＜血清＞：採取した血液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、８００×ｇ、１０分間）して血清を分離し、−８０℃で凍結保存した。
＜尿＞：遠心分離（３，０００ｒｐｍ、８００×ｇ、１０分間）して沈殿（飼料など）を除去した後、−８０℃で凍結保存した。
＜糞便＞：採取後−８０℃で凍結保存したものを解凍し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で１０倍希釈し、５分間程度撹拌した後、ポリテトラフルオロエチレン製ホモジナイザー（１０ｍＬ容）を用いてホモジナイズし、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、８００×ｇ、１０分間）して粗抽出液を調製し、−８０℃で凍結保存した。
＜皮膚＞：採取後−８０℃で凍結保存したものを解凍し、０．２ｇを秤取し、ハサミで裁断した後、プラスチックチューブに取りリン酸緩衝液２ｍＬを加えてホモジナイザー（「Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＴ１０−３５」型）を使用しホモジナイズした。その後、ＸＩＶプロテアーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）２０ｍｇを加えて５５℃で３時間保持した。ＸＩＶプロテアーゼ処理液を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、８００×ｇ、１０分間）して上清を採取し、−８０℃で凍結保存した。
＜肝臓＞：採取後−８０℃で凍結保存したものを解凍し、肝臓の左外側葉０．２ｇを秤取し、１．５ｍＬプラスチックチューブに取りリン酸緩衝液１ｍＬを加えてポリテトラフルオロエチレン製ホモジナイザーにてホモジナイズし遠心分離（３，０００ｒｐｍ、８００×ｇ、１０分間）して粗抽出液を調製し、−８０℃で凍結保存した。
【００６６】
＜実験２−３．各試料におけるフェノール化合物の定量＞
実験２−２で調製した前処理試料中のフェノール化合物は大半が配糖体の形態にあるため、前処理試料を塩酸で処理することにより、配糖体の形態にあるフェノール化合物を加水分解し、遊離型の形態に変えてフェノール化合物として測定した。すなわち、本測定においては、フェノールとｐ−クレゾールの２つのフェノール化合物を測定対象とし、生体内において配糖体の形態で存在するフェノール及びｐ−クレゾールと、遊離型の形態で存在するそれらを、酸処理を行うことにより、それぞれ遊離型のフェノール及びｐ−クレゾールとしてまとめて定量した。具体的な操作としては、上述した前処理試料を、遠心分離（４，７００ｒｐｍ、１０分間)して上清を採取した後、ネジ付きのチューブに０．８ｍＬとり（但し、尿の場合は２２０倍希釈液）、１００μｇ／ｍＬの濃度に調製した内部標準物質である４−エチルフェノール３２μＬと２Ｎ塩酸０．８ｍＬを加え、６０分間煮沸した。煮沸処理した液を室温で放冷した後に２Ｎ水酸化ナトリウムを約０．７５ｍＬ加えて中和した。中和液０．８ｍＬをプラスチックチューブに取り、アセトニトリル０．８ｍＬを加えて撹拌し、遠心分離（１２，０００×ｇ、５分間）して不溶物を除去し、０．３ｍＬを０．４５μｍのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ試料とした。
【００６７】
各種試料におけるフェノール及びｐ−クレゾールは、下記条件によるＨＰＬＣにて定量した。
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＤＳｐａｋ  Ｆ−４１１（φ４．６×１５０ｍｍ、昭和電工株式会社製）；
装置：『Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ』システム（株式会社島津製作所製）
解析ソフトウェアとして「ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ」を使用；
ポンプ：ＬＣ−２０ＡＤ  ２台；
カラムヒーター：『ＣＴＯ−２０ＡＣ』；
デガッサー：『ＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ』；
オートサンプラー：『ＳＩＬ−２０ＡＣ』；
検出器：蛍光検出器  ＲＦ−２０Ａ（励起波長：２６０ｎｍ，蛍光波長：３０５ｎｍ）
移動相：水／アセトニトリル（７０／３０）にてイソクラティック溶出
カラム温度：３０℃
試料注入量：１０μＬ
なお、フェノール及びｐ−クレゾールの定量においては、いずれもフェノール及びｐ−クレゾールの試薬（シグマ・アルドリッチ製）を標準品とし、ＨＰＬＣにおけるそれぞれについての検量線を作成し定量した。
【００６８】
各種試料におけるフェノール化合物（フェノール及びｐ−クレゾール）の定量値を表６及び表７にそれぞれ示す。
【００６９】
【表６】
2018193897.tif 000007
【００７０】
【表７】
2018193897.tif 000008
【００７１】
表６及び表７に示すとおり、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料と水とで飼育した通常食群のラットでは、盲腸内容物、血清、尿、糞便、皮膚及び肝臓のいずれにおいてもフェノールは検出されず、また、ｐ−クレゾールも盲腸内容物、尿、糞便において僅かに検出される程度であった。これに対し、チロシン飼料で飼育したラットでは、皮膚と肝臓以外ですべてフェノールが検出され、また、通常食群に比べｐ−クレゾールが多量に検出された。
【００７２】
表６に示すとおり、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料と水を摂取させて飼育した通常食群のラットでは、盲腸内容物にフェノールは検出されず、盲腸内容物１ｇ当たりのｐ−クレゾール量も４０±２８ｎｍｏｌとわずかであったのに対し、チロシン飼料と水を摂取させて飼育した対照群のラットの場合、盲腸内容物１ｇ当たり、フェノール量は８１２±４４３ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は４５２２±１２６１ｎｍｏｌと多量のフェノール化合物の生成が認められた。一方、チロシン飼料と２％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した２％分岐α−グルカン混合物群の場合、盲腸内容物１ｇ当たりフェノール量は３３４±４３５ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は２８６６±１６５２ｎｍｏｌと、対照群に比べ顕著に低いフェノール化合物量を示した。また、チロシン飼料と５％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した５％分岐α−グルカン混合物群の場合、盲腸内容物１ｇ当たりフェノール量は１２±３ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は３９７±１２８ｎｍｏｌと、対照群に比べ顕著に低いフェノール化合物量を示した。この結果は、チロシン飼料の摂取により盲腸内容物にフェノール化合物が産生されること、及び、フェノール化合物が産生されやすいチロシン飼料を摂取したとしても、一定量以上の分岐α−グルカン混合物を併せて摂取すれば、盲腸内容物中のフェノール化合物の量を顕著に低減できることを物語っている。
【００７３】
また、表６に示すとおり、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料と水を摂取させて飼育した通常食群のラットでは、血清中にフェノール、ｐ−クレゾールともに検出されなかったのに対し、チロシン飼料と水を摂取させて飼育した対照群のラットの場合、血清１ｍＬ当たり、フェノール量は２７±３０ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は１３６±３５ｎｍｏｌとフェノール化合物の生成が認められた。一方、チロシン飼料と２％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した２％分岐α−グルカン混合物群の場合、血清１ｍＬ当たりのフェノール量は１６±１５ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は１０１±５０ｎｍｏｌと、対照群に比べ大差ない結果となったものの、チロシン飼料と５％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した５％分岐α−グルカン混合物群の場合では、血清１ｍＬ当たりのフェノール量は５±０ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は１５±４ｎｍｏｌと、対照群に比べ顕著に低いフェノール化合物量を示した。この結果は、チロシン飼料の摂取により血清中にフェノール化合物が検出されること、及び、フェノール化合物が産生されやすいチロシン飼料を摂取したとしても、一定量以上の分岐α−グルカン混合物を併せて摂取すれば、血清中のフェノール化合物の量を顕著に低減できることを物語っている。
【００７４】
さらに、各群において、ラット１匹から採取した１日分の尿を分析し、フェノール化合物の尿への１日当たりの排泄量としてμｍｏｌ／日で示した。表６に示すとおり、通常食群のラットでは、尿中にフェノールは検出されず、ｐ−クレゾール量も５±４μｍｏｌ／日と僅かであったのに対し、対照群のラットの場合、フェノール量は４２±１５μｍｏｌ／日、ｐ−クレゾール量は２０８±４１μｍｏｌ／日と、多量のフェノール化合物が認められた。一方、２％分岐α−グルカン混合物群の場合、フェノール量は４０±４１μｍｏｌ／日、ｐ−クレゾール量は１９６±８７μｍｏｌ／日と、対照群に比べ大差ない結果となったものの、５％分岐α−グルカン混合物群の場合では、フェノール量は４±７μｍｏｌ／日、ｐ−クレゾール量は５８±４８μｍｏｌ／日と、対照群に比べ顕著に少ない量を示した。この結果は、チロシン飼料の摂取により尿中にフェノール化合物が検出されること、及び、フェノール化合物が産生されやすいチロシン飼料を摂取したとしても、一定量以上の分岐α−グルカン混合物を併せて摂取すれば、尿中に認められるフェノール化合物の量が顕著に低減されることを物語っている。
【００７５】
さらに、各群においては、ラット１匹から採取した１日分の糞便を分析し、フェノール化合物の糞便への１日当たりの排泄量としてｎｍｏｌ／日で示した。表７に示すとおり、通常食群のラットでは、糞便中にフェノールは検出されず、ｐ−クレゾール量も１３０±６４ｎｍｏｌ／日と僅かであったのに対し、対照群のラットの場合、フェノール量は２４０±２４７ｎｍｏｌ／日、ｐ−クレゾール量は５６８±２１８ｎｍｏｌ／日と、多量のフェノール化合物が認められた。一方、２％分岐α−グルカン混合物群の場合、フェノール量は８０±１１３ｎｍｏｌ／日、ｐ−クレゾール量は８４４±９４７ｎｍｏｌ／日と、対照群に比べ大差ない結果となったものの、５％分岐α−グルカン混合物群の場合では、フェノール量は３２±１７ｎｍｏｌ／日、ｐ−クレゾール量は５３３±３２６ｎｍｏｌ／日と、対照群に比べｐ−クレゾール量は違いがないものの、フェノールについては有意に低い値を示した。この結果は、チロシン飼料の摂取により糞便中にフェノール化合物が検出されること、及び、フェノール化合物が産生されやすいチロシン飼料を摂取したとしても、一定量以上の分岐α−グルカン混合物を併せて摂取すれば、糞便中に認められるフェノール化合物の量が低減されることを物語っている。
【００７６】
また、表７に示すとおり、皮膚試料からはいずれの場合もフェノールは検出されなかった。これに対し、ｐ−クレゾールについては、通常食群の皮膚試料からは検出されず、対照群及び２％分岐α−グルカン混合物群の皮膚試料からは、皮膚１ｇ当たりに換算して、それぞれ２９ｎｍｏｌ／ｇ及び２７ｎｍｏｌ／ｇとほぼ同程度のｐ−クレゾールが検出された。しかし、５％分岐α−グルカン混合物群の皮膚試料からはｐ−クレゾールは検出されず（皮膚１ｇ当たりに換算して０ｎｍｏｌ／ｇ）、分岐α−グルカン混合物摂取によるｐ−クレゾールの低減効果が認められた。
【００７７】
さらに、表７に示すとおり、肝臓試料からはいずれの場合もフェノールは検出されなかった。これに対し、ｐ−クレゾールについては、通常食群の肝臓試料からは検出されず、対照群及び２％分岐α−グルカン混合物群の肝臓試料からは、肝臓１ｇ当たりに換算して、それぞれ２６ｎｍｏｌ／ｇ及び２０ｎｍｏｌ／ｇとほぼ同程度のｐ−クレゾールが検出された。しかし、５％分岐α−グルカン混合物群の肝臓試料からはｐ−クレゾールは検出されず（肝臓１ｇ当たりに換算して０ｎｍｏｌ／ｇ）、分岐α−グルカン混合物摂取によるｐ−クレゾールの低減効果が認められた。
【００７８】
以上の実験結果に示されるとおり、通常飼料を摂取させて飼育した通常食群のラットの生体からはフェノール、ｐ−クレゾールなどのフェノール化合物はあまり検出されなかったのに対し、チロシンを強化・配合したチロシン飼料を摂取させて飼育した対照群のラットの生体からは、フェノール化合物が顕著に検出されたが、分岐α−グルカン混合物を５％濃度になるよう溶解した水溶液を摂取させた５％分岐α−グルカン混合物摂取群のラットの生体からは、顕著に少ない量のフェノール化合物が検出された。このことは、ヒトが高蛋白食を摂取し、当該蛋白の構成アミノ酸であるチロシンから有害代謝産物であるフェノール化合物が生成し易い場合であっても、一定量の分岐α−グルカン混合物を摂取することにより、生体内のフェノール化合物を顕著に、効果的に低減することができることを物語っている。
【００７９】
＜実験３：ラットの腸内菌叢に及ぼす分岐α−グルカン混合物摂取の影響＞
本実験では、善玉菌としてのビフィドバクテリウム属細菌、バクテロイデス−プレボテラーポルフィロモナス属細菌、及び、バクテロイデス門細菌３種類の菌群をターゲットとして、分岐α−グルカン混合物の摂取が、腸内におけるこれら菌種・菌群の菌数に及ぼす影響を調べた。
【００８０】
実験１において飼育した通常食群、対照群、２％分岐α−グルカン混合物群、及び５％分岐α−グルカン混合物群のラットからそれぞれ採取した盲腸内容物よりＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡを鋳型として、菌種・菌群のｒＲＮＡ遺伝子に含まれる特異的な配列部分を標的とするプライマーを用いてＰＣＲを行った後、その増幅産物を検出する定量的ＰＣＲ法（例えば、マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）ら、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第６８巻、第１１号、第５４４５頁−５４５１頁（２００２年）参照）により、ビフィドバクテリウム属細菌、バクテロイデス−プレボテラーポルフィロモナス属細菌、及び、バクテロイデス門細菌のそれぞれの細菌数を測定した。
【００８１】
上記の方法で求めた通常食群、対照群、２％分岐α−グルカン混合物群及び５％分岐α−グルカン混合物群の盲腸内容物におけるそれぞれの菌数（ｌｏｇ（個／ｇ−盲腸内容物））を表８に示した。
【００８２】
【表８】
2018193897.tif 000009
【００８３】
表８に見られるとおり、通常食群、対照群及び２％分岐α−グルカン混合物群のラットの盲腸内容物における腸内菌叢は、ビフィドバクテリウム属細菌、バクテロイデス−プレボテラーポルフィロモナス属細菌、及び、バクテロイデス門細菌の１０を底とする対数で表した菌数（ｌｏｇ（個／ｇ−盲腸内容物））が、それぞれ、６．４〜６．７、１０．３〜１０．４、及び、１０．６〜１０．７の範囲（すなわち、１０６．４〜６．７、１０１０．３〜１０．４、及び、１０１０．６〜１０．７の範囲）に分布し、各群間で大差が認められなかったのに対し、５％分岐α−グルカン混合物群のラットの１０を底とする対数で表した菌数（ｌｏｇ（個／ｇ−盲腸内容物））は８．０、１１．１及び１１．４（すなわち、１０８．０、１０１１．１、及び、１０１１．４）と、それぞれ約１０倍以上に顕著に増加した。
【００８４】
このように、５％分岐α−グルカン混合物群のラットでは、盲腸内のビフィドバクテリウム属細菌、バクテロイデス−プレボテラーポルフィロモナス属細菌、及び、バクテロイデス門細菌の菌数が顕著に増加しており、腸内菌叢が顕著に改善されたことが判明した。このことから、実験２における生体内フェノール化合物低減効果は、分岐α−グルカン混合物の摂取によるラットの盲腸内でのビフィドバクテリウム属細菌、バクテロイデス−プレボテラーポルフィロモナス属細菌、及び、バクテロイデス門細菌の菌数の増加、すなわち、腸内菌叢の改善に起因する作用効果であると推測された。ラットを用いた上記結果から、分岐α−グルカン混合物の摂取により、ヒトにおいても同様な作用が発揮されるものと考えられる。
【００８５】
本分岐α−グルカン混合物が、どのように作用し腸内菌叢が改善され、生体内フェノール化合物が低減しているのかその詳細は不明であるが、本分岐α−グルカン混合物の、α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、イソマルトデキストラナーゼ消化によりイソマルトースを生成する構造的特徴を有すること、より好ましくはイソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり５質量％以上７０質量％以下生成する構造的特徴を有することがその機能を発揮する上で重要な役割を果たしているのではないかと推定される。
【００８６】
なお、イソマルトデキストラナーゼ消化におけるイソマルトース生成量が５質量％未満の分岐α−グルカン混合物は、分岐構造の少ないマルトデキストリンに近い構造であるため腸内菌叢改善効果は小さいと推定される。一方、イソマルトデキストラナーゼ消化におけるイソマルトース生成量が７０質量％超の分岐α−グルカン混合物は、α−１，６結合で連なったグルコースポリマーであるデキストランに近い構造となり、逆に分岐構造が単調になるため腸内菌叢改善効果が小さくなると推定される。また、本分岐α−グルカン混合物のうち高速液体クロマトグラフ法（酵素−ＨＰＬＣ法）により求めた水溶性食物繊維含量が４０質量％以上であるものはそれ自体が消化され難く、大腸により到達し易いため、より好ましいと推定される。
【００８７】
＜実験４：チロシン飼料の給餌と分岐α−グルカン混合物の飲水投与によるヘアレスラットの飼育＞
生体内でのフェノール化合物の生成が、皮膚の性状に及ぼす影響と分岐α−グルカン混合物の効果をより詳細に調べる目的で、実験１で用いたＷｉｓｔａｒラットをヘアレスラットに代えた以外は実験１とほぼ同様にしてヘアレスラットの飼育を行った。
【００８８】
ヘアレスラット（雄、６週齢、日本エスエルシー株式会社販売）２４匹を購入し、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料を与えつつ５日間飼育し馴化させた。次いで、馴化させたラットを６匹ずつ４群に分け、実験１の表１に示したと同じ４つの試験群、すなわち、通常食群、対照群、２％分岐α−グルカン混合物群、及び５％分岐α−グルカン混合物群として、それぞれ３週間飼育した。
【００８９】
飼育期間中の各群のヘアレスラットの体重、摂餌量、飲水量を表９に示した。さらに、飼育１９〜２０日の時点で代謝ゲージを用いて各ラット１匹からそれぞれ採取した１日分の糞便と尿の量を測定し、各群６匹の平均値と標準偏差として表１０に示した。
【００９０】
【表９】
2018193897.tif 000010
【００９１】
【表１０】
2018193897.tif 000011
【００９２】
表９に示すとおり、試験した４群のヘアレスラットは、体重、飲水量では同程度の値を示し、各群間で有意な差は認められなかった。しかしながら、２％分岐α−グルカン混合物群及び５％分岐α−グルカン混合物群の一日当たりの摂餌量は、対照群の一日当たりの摂餌量に対してそれぞれ約９５％及び約９０％と有意に少なかった。摂餌量から計算すると、対照群のヘアレスラットにおけるチロシンの１日当たりの摂取量は約４．４ｇ／ｋｇ−体重となった。また、分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させたラットに関していえば、飲水量から計算すると、分岐α−グルカン混合物の１日当たりの摂取量は、２％分岐α−グルカン混合物群では２．０ｇ／ｋｇ−体重、５％分岐α−グルカン混合物群では５．１ｇ／ｋｇ−体重であった。
【００９３】
また、飼育中の糞便量と尿量に関しては、表１０に示すとおり、チロシン飼料を与え、飲用水として分岐α−グルカン混合物水溶液を与えて飼育した２％分岐α−グルカン混合物群及び５％分岐α−グルカン混合物群が、他の群よりも糞便量が少なく、尿量が多い傾向を示したものの、各群間での有意な差は認められなかった。
【００９４】
表９及び表１０の結果は、ヘアレスラットでは実験１のＷｉｓｔａｒラットの場合と異なり、飲用水として分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取した群で摂餌量が若干少なくなったものの、飼育終了時の体重、飲水量、糞便量及び尿量に有意な差はなく、ヘアレスラットが、各群間で大きく差が生じることのない安定な試験系で飼育されたことを物語っている。
【００９５】
＜実験５：ヘアレスラットから採取した各種生体試料におけるフェノール化合物の量＞
本実験では、糞便と肝臓を測定対象としなかった以外は実験２と同様に生体から採取した各種試料におけるフェノール化合物の生成量を調べた。すなわち、実験１及び実験２−１の場合と同様に、４群のヘアレスラットから盲腸内容物、血液（血清）、尿、及び、皮膚をそれぞれ採取した。盲腸組織及び盲腸内容物のそれぞれの重量、及び、盲腸内容物のｐＨを表１１にまとめた。
【００９６】
【表１１】
2018193897.tif 000012
【００９７】
表１１に示すとおり、盲腸内容物の重量は、対照群に比較して２％分岐α−グルカン混合物群、５％分岐α−グルカン混合物群が有意に重かった。また、盲腸内容物のｐＨは２％分岐α−グルカン混合物群、５％分岐α−グルカン混合物群で有意に低かった。
【００９８】
次いで、上記で採取した盲腸内容物、血液（血清）、尿、及び、皮膚の各試料について、実験２−２と同様に各種試料におけるフェノール化合物（フェノール及びｐ−クレゾール）を定量した。測定結果を表１２に纏めた。
【００９９】
【表１２】
2018193897.tif 000013
【０１００】
表１２に示すとおり、ヘアレスラットでは、通常食群、対照群、２％分岐α−グルカン混合物群及び５％分岐α−グルカン混合物群のいずれの群においても、盲腸内容物、血清、尿、皮膚においてフェノールとｐ−クレゾールの両方が検出された。
【０１０１】
表１２に示すとおり、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料と水を摂取させて飼育した通常食群のラットでは、盲腸内容物の１ｇ当たりのフェノール量が７６±３３ｎｍｏｌ、同ｐ−クレゾール量も１４±１１ｎｍｏｌとわずかであったのに対し、チロシン飼料と水を摂取させて飼育した対照群のヘアレスラットの場合、盲腸内容物１ｇ当たり、フェノール量は６２９±２３０ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は１６５±１６４ｎｍｏｌと、それぞれ８倍以上及び１１倍以上の多量のフェノール化合物の生成が認められた。一方、チロシン飼料と２％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した２％分岐α−グルカン混合物群の場合、盲腸内容物１ｇ当たりフェノール量は２２２±１０９ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は７０±９２ｎｍｏｌと、対照群に比べ顕著に低いフェノール化合物量を示した。また、チロシン飼料と５％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した５％分岐α−グルカン混合物群の場合、盲腸内容物１ｇ当たりフェノール量は１０９±６６ｎｍｏｌ、ｐ−クレゾール量は８９±５５ｎｍｏｌと、対照群に比べ顕著に低いフェノール化合物量を示した。この結果は、実験２のＷｉｓｔａｒラットの場合と同様にヘアレスラットの場合でも、チロシン飼料の摂取により盲腸内容物にフェノール化合物が多量に産生されること、及び、フェノール化合物が産生されやすいチロシン飼料を摂取したとしても、一定量以上の分岐α−グルカン混合物を併せて摂取すれば、盲腸内容物中のフェノール化合物の量を顕著に低減できることを物語っている。
【０１０２】
また、表１２に示すとおり、ヘアレスラットでは、血清、尿、皮膚においても、通常食群に比べ対照群でフェノール量、ｐ−クレゾール量がともに増加し、２％分岐α−グルカン混合物群、５％分岐α−グルカン混合物群でともに低下する結果若しくは傾向が認められた。この結果は、チロシン飼料を摂取したとしても、盲腸内容物の場合と同様に、一定量以上の分岐α−グルカン混合物を併せて摂取すれば、血清中、尿中及び皮膚中のフェノール化合物の量を顕著に低減できることを物語っている。
【０１０３】
なお、実験１及び２のＷｉｓｔａｒラットにおいては、フェノール化合物としてフェノールよりもｐ−クレゾールの方が多量に生成されていたのに対し、ヘアレスラットではフェノールの方がｐ−クレゾールよりも多量に生成されていた。この結果は、Ｗｉｓｔａｒラットとヘアレスラットとでは腸内細菌叢が異なっており、そのためフェノール化合物の生成に差が生じたものと考えられる。
【０１０４】
＜実験６：ヘアレスラットの皮膚性状の分析＞
皮膚では、外界に接した外側の細胞が垢となってはがれ、内側の細胞が増殖し新しい細胞を供給するターンオーバー(皮膚の新陳代謝）を繰り返すことで恒常性が維持されている。皮膚のターンオーバーが速すぎると、角層細胞は十分に分化が進まず小さいまま皮膚表面に現れることから、化粧品分野では、角層細胞面積が皮膚の健康度の指標として用いられている。非特許文献２では、フェノール化合物がヘアレスマウスの皮膚に及ぼす悪影響の指標として、皮膚の角層細胞面積が測定されており、フェノールやｐ−クレゾールを投与したヘアレスマウスでは角層細胞面積が有意に低下したことが報告されている。本実験では、実験４で飼育したヘアレスラットについて、皮膚の角層細胞面積を測定した。
【０１０５】
また、皮膚のターンオーバーにおいて、皮膚表皮の下にある基底膜に接している基底細胞と呼ばれる未分化の細胞群の分裂が亢進されると、角化細胞への分化が遅れ未成熟な角化細胞となることから、実験４で飼育したヘアレスラットについて、皮膚の基底細胞の分裂についても調べた。
【０１０６】
＜実験６−１：ヘアレスラットの皮膚の角層細胞面積の測定＞
実験４で飼育した４群、計２４匹のヘアレスラットについて、安楽死させる前のペントバルビタール麻酔下において、皮膚の角層を採取した。ヘアレスラットの右背中に角質採取用の粘着性テープ（商品名「角質チェッカー  ＡＳＴ−０１」、２５×２５ｍｍ、日本アッシュ株式会社販売）を数秒間押し付けて剥がすことによりテープ上に角質を採取し、ホルマリン蒸気にあてて固定した後、ヘマトキシリン・エオシン染色した。次いで、ヘマトキシリン・エオシン染色した角層細胞を顕微鏡下で観察し、ヘアレスラット１個体当たり３０個以上の角層細胞について、顕微鏡用イメージングソフトウェア（商品名『ｃｅｌｌＳｅｎｓ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ』、オリンパス株式会社製）を用いて細胞面積を測定し、その平均値を算出した。結果を表１３に示した。
【０１０７】
【表１３】
2018193897.tif 000014
【０１０８】
表１３に見られるとおり、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料と水を摂取させて飼育した通常食群のヘアレスラットでは、角層細胞面積が１３０３±９６μｍ２であったのに対し、チロシン飼料と水を摂取させて飼育した対照群のヘアレスラットでは、１１５９±９７μｍ２と有意に低い値を示した。一方、チロシン飼料と２％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した２％分岐α−グルカン混合物群の場合、角層細胞面積は１２８６±８６μｍ２と対照群に比べ増加傾向を示し、チロシン飼料と５％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した５％分岐α−グルカン混合物群の場合、１３３１±７２μｍ２と対照群に比べ有意に高い値を示し、通常食群と同等の値を示した。この結果は、チロシン飼料を摂取したヘアレスラットでは生体内で生成したフェノール化合物が皮膚において角層細胞の分化を阻害するものの、分岐α−グルカン混合物を摂取することにより、生体内でのフェノール化合物の生成量が低下し、角層細胞の分化に影響を及ぼさなくなり、皮膚性状を改善できることを示している。
【０１０９】
＜実験６−２：皮膚の基底細胞の分裂像の測定＞
実験４で飼育した４群、計２４匹のヘアレスラットについて、安楽死させた後に左背中皮膚を採取し、１５％（ｖ／ｖ）ホルマリン液に浸漬して保存し、組織分析に供した。常法によりパラフィン包埋した組織切片をヘマトキシリン・エオシン染色し、顕微鏡下にて基底細胞層の分裂像をカウントした。結果を表１４に示した。
【０１１０】
【表１４】
2018193897.tif 000015
【０１１１】
表１４に見られるとおり、ＡＩＮ−９３Ｇ改変飼料と水を摂取させて飼育した通常食群のヘアレスラットでは、基底細胞の分裂像が２．８±１．１個／ｃｍであったのに対し、チロシン飼料と水を摂取させて飼育した対照群のヘアレスラットでは、５．７±１．８個／ｃｍと有意に大きい値を示し、チロシン飼料の摂取により基底細胞の分裂が亢進したことが判明した。一方、チロシン飼料と２％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した２％分岐α−グルカン混合物群の場合、４．８±１．８個／ｃｍと対照群に比べ低下傾向を示し、チロシン飼料と５％分岐α−グルカン混合物水溶液を摂取させて飼育した５％分岐α−グルカン混合物群の場合、３．２±０．８と対照群に比べ有意に低い値を示し、通常食群と同等の値であった。この結果は、チロシン飼料を摂取したヘアレスラットでは生体内で生成したフェノール化合物が皮膚において基底細胞の分裂を亢進、すなわち、角化細胞への分化を阻害したものの、チロシン飼料を摂取したヘアレスラットであっても、分岐α−グルカン混合物を摂取することにより、生体内でのフェノール化合物の生成量が低下し、その結果として角層細胞の分化に影響を及ぼさなくなり、皮膚性状を改善できることを示している。
【０１１２】
実験１乃至５の結果から、本分岐α−グルカン混合物は、摂取すると腸内菌叢を改善するとともに、腸内腐敗産物として知られる生体内のフェノール、ｐ−クレゾールなどのフェノール化合物を顕著に低減できることが判明した。これら実験は、本分岐α−グルカン混合物が生体内フェノール低減剤の有効成分として顕著な作用効果を奏することを物語るものである。
【０１１３】
また、実験６の結果から、本分岐α−グルカン混合物を摂取すると、フェノール化合物の皮膚への悪影響として報告されている角層細胞面積の低下が認められなくなり、また、基底細胞の分裂の亢進も見られなくなることが判明した。その理由として、本分岐α−グルカン混合物の摂取が生体内でのフェノール化合物の生成を抑制したため、吸収され皮膚に移行し悪影響を与えるフェノール化合物の量が低減されたためと考えられる。
【０１１４】
上記の結果は、本分岐α−グルカン混合物が、生体内フェノール化合物低減剤の有効成分として有利に利用できること、また、この生体内フェノール化合物低減剤を配合した飲食物は、生体内フェノール化合物低減用の飲食物として有利に利用できることを物語っている。加えて、実験６の結果は、上記の生体内フェノール化合物低減剤が、飲食物に起因し、生体内で生成するフェノール化合物の量を低減することにより、フェノール化合物の影響により起こる皮膚への悪影響、すなわち、角質細胞の成熟阻害を低減し、角質細胞を成熟化（角層細胞の細胞面積を増加）させることができるので、皮膚の健康状態を維持又は改善し、皮膚性状を改善する用途、より具体的には、皮膚ターンオーバーの改善用途に利用できることを示している。
【０１１５】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかしながら、本発明は、これら実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１６】
＜生体内フェノール化合物低減剤＞
国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの実施例５に記載された方法に従い、分岐α−グルカン混合物粉末を調製し、生体内フェノール化合物低減剤とした。なお、得られた分岐α−グルカン混合物粉末は、以下の（ａ）乃至（ｇ）の特徴を有していた。
（ａ）グルコースを構成糖とし、
（ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり３５質量％生成し、
（ｄ）水溶性食物繊維含量が８０．８質量％であり、
（ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：２．２であり、
（ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の７２．９％であり、
（ｇ）平均グルコース重合度が３１であり、Ｍｗ／Ｍｎが２．０である。【０１１７】
本品は、有効成分である分岐α−グルカン混合物の含量が１００質量％の生体内フェノール化合物低減剤である。本品は、それ自体が低甘味ないし無味であり、異臭がなく、室温下でも吸湿、変色することなく、１年以上に亘って安定である。本品は、そのまま、或いは、水、お茶、コーヒーなどの飲料に溶解して摂取するか、食品又は飲料に添加して摂取すればよく、本品を摂取することにより、生体内フェノール化合物を低減することができる。また、本品に、必要に応じて、水、ミネラル、着香料、安定化剤、賦形剤、増量剤、ｐＨ調整剤などから選ばれる１種又は２種以上の成分を配合することも有利に実施できる。
【実施例２】
【０１１８】
＜生体内フェノール化合物低減剤＞
国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの実験２−２に記載された方法に従い、固形分濃度３０質量％の分岐α−グルカン混合物溶液を調製し、その後、常法に従って噴霧乾燥して分岐α−グルカン混合物粉末を得、これを生体内フェノール化合物低減剤とした。なお、得られた分岐α−グルカン混合物粉末は、以下の（ａ）乃至（ｇ）の特徴を有していた。
（ａ）グルコースを構成糖とし、
（ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり２７．２質量％生成し、
（ｄ）水溶性食物繊維含量が４１．８質量％であり、
（ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：０．６であり、
（ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の８３．０％であり、
（ｇ）平均グルコース重合度が４０５であり、Ｍｗ／Ｍｎが１６．２である。【０１１９】
本品は、有効成分である分岐α−グルカン混合物の含量が１００質量％の生体内フェノール化合物低減剤である。本品は、それ自体が低甘味ないし無味であり、異臭がなく、室温下でも吸湿、変色することなく、１年以上に亘って安定である。本品は、そのまま、或いは、水、お茶、コーヒーなどの飲料に溶解して摂取するか、食品又は飲料に添加して摂取すればよく、本品を摂取することにより、生体内フェノール化合物を低減することができる。また、本品に、必要に応じて、水、ミネラル、着香料、安定化剤、賦形剤、増量剤、ｐＨ調整剤などから選ばれる１種又は２種以上の成分を配合することも有利に実施できる。
【実施例３】
【０１２０】
＜生体内フェノール化合物低減剤＞
国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの実施例６に記載された方法に従い、分岐α−グルカン混合物粉末を調製し、生体内フェノール化合物低減剤とした。なお、得られた分岐α−グルカン混合物粉末は、（ａ）乃至（ｇ）の特徴を有していた。
（ａ）グルコースを構成糖とし、
（ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり４０．６質量％生成し、
（ｄ）水溶性食物繊維含量が７７．０質量％であり、
（ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：４であり、
（ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の６７．９％であり、
（ｇ）平均グルコース重合度が１８であり、Ｍｗ／Ｍｎが２．０である。【０１２１】
本品は、有効成分である分岐α−グルカン混合物の含量が１００質量％の生体内フェノール化合物低減剤である。本品は、それ自体が低甘味ないし無味であり、異臭がなく、室温下でも吸湿、変色することなく、１年以上に亘って安定である。本品は、そのまま、或いは、水、お茶、コーヒーなどの飲料に溶解して摂取するか、食品又は飲料に添加して摂取すればよく、本品を摂取することにより、生体内フェノール化合物を低減することができる。また、本品に、必要に応じて、水、ミネラル、着香料、安定化剤、賦形剤、増量剤、ｐＨ調整剤などから選ばれる１種又は２種以上の成分を配合することも有利に実施できる。
【実施例４】
【０１２２】
＜生体内フェノール化合物低減剤＞
トウモロコシ澱粉液化液に、さらにマルトテトラオース生成アミラーゼを固形物１グラム当たり２単位添加した以外は、国際公開第ＷＯ２００８／１３６３３１号パンフレットの実施例５に記載された方法に従い、分岐α−グルカン混合物粉末を調製し、生体内フェノール化合物低減剤とした。なお、得られた分岐α−グルカン混合物粉末は、（ａ）乃至（ｇ）の特徴を有していた。
（ａ）グルコースを構成糖とし、
（ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり４１．９質量％生成し、
（ｄ）水溶性食物繊維含量が６９．１質量％であり、
（ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：２．４であり、
（ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の６４．２％であり、
（ｇ）平均グルコース重合度が１３であり、Ｍｗ／Ｍｎが２．０である。【０１２３】
本品は、有効成分である分岐α−グルカン混合物の含量が１００質量％の生体内フェノール化合物低減剤である。本品は、それ自体が低甘味ないし無味であり、異臭がなく、室温下でも吸湿、変色することなく、１年以上に亘って安定である。本品は、そのまま、或いは、水、お茶、コーヒーなどの飲料に溶解して摂取するか、食品又は飲料に添加して摂取すればよく、本品を摂取することにより、生体内フェノール化合物を低減することができる。また、本品に、必要に応じて、水、ミネラル、着香料、安定化剤、賦形剤、増量剤、ｐＨ調整剤などから選ばれる１種又は２種以上の成分を配合することも有利に実施できる。
【実施例５】
【０１２４】
＜生体内フェノール化合物低減剤＞
実施例１に記載された方法で得られた分岐α−グルカン混合物にアミログルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）を作用させ、分解されなかった成分をゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分取した。その後、常法に従って精製及び噴霧乾燥して分岐α−グルカン混合物粉末を調製し、生体内フェノール化合物低減剤とした。なお、得られた分岐α−グルカン混合物は、（ａ）乃至（ｇ）の特徴を有していた。
（ａ）グルコースを構成糖とし、
（ｂ）α−１，４結合を介して連結したグルコース重合度３以上の直鎖状グルカンの一端に位置する非還元末端グルコース残基にα−１，４結合以外の結合を介して連結したグルコース重合度１以上の分岐構造を有し、
（ｃ）イソマルトデキストラナーゼ消化により、イソマルトースを消化物の固形物当たり２１質量％生成し、
（ｄ）水溶性食物繊維含量が９４．４質量％であり、
（ｅ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基の比が１：１．９であり、
（ｆ）α−１，４結合したグルコース残基とα−１，６結合したグルコース残基との合計が全グルコース残基の６４％であり、
（ｇ）グルコース重合度が２２であり、Ｍｗ／Ｍｎが１．７である。【０１２５】
本品は、有効成分である分岐α−グルカン混合物の含量が１００質量％の生体内フェノール化合物低減剤である。本品は、それ自体が低甘味ないし無味であり、異臭がなく、室温下でも吸湿、変色することなく、１年以上に亘って安定である。本品は、そのまま、或いは、水、お茶、コーヒーなどの飲料に溶解して摂取するか、食品又は飲料に添加して摂取すればよく、本品を摂取することにより、生体内フェノール化合物を低減することができる。また、本品に、必要に応じて、水、ミネラル、着香料、安定化剤、賦形剤、増量剤、ｐＨ調整剤などから選ばれる１種又は２種以上の成分を配合することも有利に実施できる。
【実施例６】
【０１２６】
＜経口組成物（粉末ジュース）＞
噴霧乾燥により製造したオレンジ果汁粉末３３質量部に対して、実施例５に記載された方法で得られた生体内フェノール化合物低減剤１０質量部、グルコース２０質量部、無水結晶マルチトール２０質量部、無水クエン酸０．６５質量部、リンゴ酸０．１質量部、２−Ｏ−α−グルコシル−Ｌ−アスコルビン酸０．２質量部、クエン酸ソーダ０．１質量部、及び粉末香料の適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にして、これを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃とし、これに実施例１の方法で得た分岐α−グルカン粉末を水に溶解して得た溶液をバインダーとして適量スプレーし、３０分間造粒し、計量し、包装して製品を得た。本品は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースである。本品は、生体内フェノール化合物低減剤を含有しているので、腸内菌叢を改善するとともに、生体内フェノール化合物を低減できる粉末ジュースである。また、本品は、異味、異臭がなく、ジュースとして商品価値の高いものである。
【実施例７】
【０１２７】
＜経口組成物（カスタードクリーム）＞
コーンスターチ１００質量部、実施例４に記載された方法で得られた生体内フェノール化合物低減剤３０質量部、トレハロース含水結晶７０質量部、グルコース４０質量部、および食塩１質量部を充分に混合し、鶏卵２８０質量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１、０００質量部を徐々に加え、更に火にかけて攪拌を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、生体内フェノール化合物低減剤を含有しているので、腸内菌叢を改善するとともに、生体内フェノール化合物を低減できるカスタードクリームである。また、本品は、なめらかな光沢を有し、風味良好で、高品質のカスタードクリームである。
【実施例８】
【０１２８】
＜経口組成物（栄養補助食品）＞
グルコース２４７ｇ、実施例３に記載された方法で得られた生体内フェノール化合物低減剤２１７ｇ、ピロリン酸鉄懸濁液（太陽化学社製商品名サンアクティブＦｅＭ）８g、ビタミンプレミックス１５g、アスコルビン酸ナトリウム３ｇ、亜鉛酵母０.５ｇ、クロム酵母０.３ｇ、スクラロース０.２ｇを造粒原末として造粒装置に投入した。一方、造粒調整用水１００ｍＬ中にコーヒー抽出粉末１５ｇ、硫酸マグネシウム１０ｇを溶解させた。造粒原末を装置内で混合させているところに造粒調整液をノズルの先から少しずつ噴霧して顆粒化し、１パック５.１５gもしくは１パック１０.３ｇとなるようアルミ袋に窒素ガス充填した。本品は生体内フェノール化合物低減剤を含有する栄養補助食品であり、腸内菌叢を改善するとともに、生体内フェノール化合物を低減することができる。また、本品は、異味、異臭がなく、栄養補助食品として商品価値の高いものである。
【実施例９】
【０１２９】
＜経口組成物（紅茶飲料）＞
実施例１に記載された方法で得られた生体内フェノール化合物低減剤を用いて紅茶を製造した。茶葉１５ｇに対して沸騰水１Ｌを加え、茶葉を濾過して紅茶抽出液１Ｌを得た。紅茶抽出液１Ｌに異性化糖を６０ｇ加え、さらに生体内フェノール化合物低減剤を重量比で２％、３％、４％添加した紅茶を、それぞれ紅茶飲料Ａ、Ｂ、Ｃとした。また、生体内フェノール化合物低減剤を添加しない点以外は、上記と同様の方法で得た紅茶飲料を対照とした。２０〜５０代の男女１０名で官能評価を行ったところ、紅茶飲料に含有するポリフェノール特有の苦みや渋みをマスキングする効果があることが分かった。さらに、紅茶飲料Ａ、Ｂ、Ｃは、室温に保存しても、対照と比較してクリームダウン現象（紅茶を徐々に冷やすと白く濁る現象）が抑制されることが分かった。【０１３０】
本品は、生体内フェノール化合物低減剤を含有しているので、腸内菌叢を改善するとともに、生体内フェノール化合物を低減できる紅茶飲料である。また、本品は、異味、異臭がなく、紅茶飲料として商品価値の高いものである。
【産業上の利用可能性】
【０１３１】
以上説明したとおり、本分岐α−グルカン混合物を有効成分とする本発明の生体内フェノール化合物低減剤によれば、有効成分である本分岐α−グルカン混合物それ自体が低甘味ないし無味であるため、利用範囲が広く、また、摂取することにより、腸内菌叢を改善するとともに、腸内腐敗産物として知られている生体内のフェノール化合物を顕著に低減することができるので、皮膚の健康、美容の維持、さらには生体の健康維持に有用である。また、本発明の生体内フェノール化合物低減剤を含んでなる飲食物は、日常的な食生活において摂取することにより、腸内菌叢を改善し、効果的に生体内のフェノール化合物を低減することができるという利点を有している。本発明は、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【国際調査報告】
2018193897.tif 000016
2018193897.tif 000017
2018193897.tif 000018
2018193897.tif 000019