(57)【要約】［課題］  細胞内で分解される構造を有する生分解性化合物と、それを含む脂質粒子、ならびにその脂質粒子を含む医薬組成物の提供。［解決手段］  実施形態による化合物は、下記式（１）：  Ｐ−［Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｒ’−Ｑ］２        （１）（式中、Ｐは、エーテル結合を含むアルキレンオキシであり、Ｘは、三級アミン構造を含む２価連結基であり、Ｒは、２価連結基であり、Ｒ’は、単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、Ｑは、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）で表され、  構造中に生分解性基を少なくとも一つ含むことを特徴とする化合物。で表されるものである。この化合物は、その他の脂質、凝集を低減できる脂質と組わせて脂質粒子とすることができる。さらにこの脂質粒子は、細胞に活性剤を送達する医薬組成物に適用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
Ｐ−［Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｒ’−Ｑ］２        （１）
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｒ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｑは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
で表され、
構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含むことを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記Ｐが、３〜８個の炭素および１〜２個の酸素を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｐが、炭素および酸素のみからなる、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｘが、それぞれ独立に、メチルイミノ、１，２−ピロリジンジイル、および１，３−ピロリジンジイルからなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記Ｑが、脂溶性ビタミン残基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記脂溶性ビタミン残基が、レチノール、レチナール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、およびトコトリエノール、ならびにそれらのヒドロキシがチオヒドロキシ、カルボキシ、チオカルボキシ、またはジチオカルボキシに置換された化合物からなる群から選ばれる脂溶性ビタミンに由来する基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記Ｑが、ステロール残基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ステロール残基が、コレステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、およびエルゴステロールならびにそれらのヒドロキシがチオヒドロキシ、カルボキシ、チオカルボキシ、またはジチオカルボキシに置換された化合物からなる群から選ばれる脂溶性ビタミンに由来する基である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記Ｑが、シクロヘキセン構造を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
下記式（１−０１）〜（１−１２）で表される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１−１】
2019176079.tif 000008
【化１−２】
2019176079.tif 000009
【化１−３】
2019176079.tif 000010
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載された化合物を含む脂質粒子。
【請求項１２】
膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含む請求項１１記載の脂質粒子。
【請求項１３】
前記の膜を形成する脂質が、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０  ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール、からなる群から選択され、
前記凝集を低減できる脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質である、請求項１２に記載の脂質粒子。
【請求項１４】
活性剤をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項１５】
前記活性剤が、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸である、請求項１４に記載の脂質粒子。
【請求項１６】
核酸と結合する化合物をさらに含む、請求項１５に記載の脂質粒子。
【請求項１７】
前記核酸と結合する化合物が、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドである、請求項１６に記載の脂質粒子。
【請求項１８】
前記核酸と結合する化合物が、プロタミンまたはヒストンである、請求項１６または１７に記載の脂質粒子。
【請求項１９】
細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１１または１２に記載の脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含む組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内で分解される構造を有する生分解性化合物と、それを含む脂質粒子に関する。また、本発明はその脂質粒子を含む、核酸のような活性剤の送達のために使用される組成物およびキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の疾病治療を目的としたリポソームの検討が進められている。リポソームは、脂質で構成されるナノメーターオーダーの粒径を有する微小なカプセルであり、その内部に種々の化合物等を内包でき、また生体適合性などにも優れていることから、治療薬や活性剤を、生体内の標的部位に選択的に送達するのに理想的な材料である。このような目的には、一般的に平均粒子径が１００ｎｍ以上の、巨大な一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）が用いられるが、その膜を構成する材料については、種々の材料が開発されている。【０００３】
このようなリポソームは、単一の脂質で構成することが可能である。このような場合、例えば脂質は頭部とそれに結合した疎水性部とを有するリン脂質が用いられ、この脂質が会合して膜を形成して、活性剤等を内包できる微小なカプセルを構成する。しかしながら、リポソームに優れた特性を付与するために、それを構成するために脂質混合物が用いられるのが一般的である。そして、この脂質混合物は、生分解性に優れた脂質、形成されるリポソームの凝集を抑制する脂質、内包物の漏出抑制効果を有する脂質、膜融合効果を有する脂質などの組み合わせを含んでいる。【０００４】
そして、リポソームの特性をより向上させるために、それぞれの脂質について検討がなされている。例えば、遺伝子導入に特化された医療向けリポソームには、高い生分解性、高い生体適合性、高い活性剤導入性、および低い細胞毒性を満たすことが好ましく、そのようなリポソームを構成できる脂質が望ましい。【０００５】
このような脂質として種々の化合物が開発されているが、適用する生体の状態や治療しようとする疾病は多岐にわたっている。これらの条件に応じて、選択できる脂質の種類を増やすことが望ましい。さらには、従来のリポソームを超える特性を有するリポソームを構成できる脂質が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第６０９３７１０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の課題に対して、本実施形態は、リポソームを構成することができる脂質として、新規な化合物と、それを用いた脂質粒子ならびに組成物およびキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本実施形態による化合物は、下記式（１）：
Ｐ−［Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｒ’−Ｑ］２        （１）
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｒ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｑは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
で表され、
構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含むことを特徴とするものである。【０００９】
また、実施形態による脂質粒子は、前記の化合物を含むことを特徴とするものである。【００１０】
また、実施形態による組成物は、前記脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とするものである。【００１１】
また、実施形態によるキットは、前記脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含む組成物を含むものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［定義］
本実施形態において、〜を用いて数値範囲を示した場合、特に限定されない限り、これらは両方の端点を含み、単位は共通である。例えば、１０〜２５モル％は、１０モル％以上２５モル％以下を意味する。
【００１３】
本実施形態において、「Ｃｘ〜Ｃｙ」および「Ｃｘ」などの記載は、分子または置換基中の炭素の数を意味する。例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキルは、１以上６以下の炭素を有するアルキルを意味する。また、本実施形態においてハロゲン化アルキルとは、アルキル中の１つ以上の水素がフッ素などのハロゲンに置き換えられたものをいい、例えばフルオロアリールとは、アリール中の１つ以上の水素がフッ素に置き換えられたものをいう。
【００１４】
本実施形態において、特に限定されない限り、アルキルとはアルカンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。そしてアルキルとの用語は直鎖状または分岐鎖状アルキルを包含する。さらに、シクロアルキルとは環状構造を含むアルキルを意味する。環状構造に直鎖状または分岐鎖状アルキルが置換したものもシクロアルキルと称する。
【００１５】
また、アルケルとはアルケンの任意の炭素から一個の水素を除去した一価基を意味する。
【００１６】
また、炭化水素基とは、１価または２価以上の、炭素および水素を含み、必要に応じて、酸素または窒素を含む基を意味する。そして、脂肪族基とは、芳香環を含まない炭化水素基であって、鎖状、分岐鎖状、または環状のいずれの構造をとってもよく、またそれらの組み合わせであってもよい。また、特に限定されない限り、脂肪族記は不飽和結合を含んでいてもよい。さらに、特に限定されない限り、脂肪族基は、窒素、酸素、硫黄、セレン、フッ素、塩素、臭素などのヘテロ原子を含んでいてもよい。また、脂肪族基は、１価基であっても、多価基であってもよい。また、芳香族炭化水素基とは、芳香環を含み、必要に応じて脂肪族炭化水素基を置換基として有する。
【００１７】
［生分解性脂質化合物］
実施形態による化合物は、リポソームを構成する脂質として適切な化合物である。そして、その疎水部に生分解性基を有しており、生分解性脂質化合物として機能するものである。そして、生体に適用した場合には細胞内でのタンパク質の結合が抑制され、毒性が低いという特徴を有している。また、リポソームがこの脂質化合物によって構成されると、リポソームの表面が非カチオン性となるため、細胞への障害性が低くなり、核酸等の活性剤の導入率が高くなる。
【００１８】
このような脂質化合物は、下記一般式（１）で表されるものである。
Ｐ−［Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｒ’−Ｑ］２        （１）
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立にメチルイミノ、１，２−ピロリジンジイル、および１，３−ピロリジンジイルからなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｒ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｑは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である）
【００１９】
そして、構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含む。
【００２０】
実施形態による化合物のひとつの特徴は、式（１）中のＰがエーテル結合を含むことである。すなわち、Ｐは少なくとも一つの酸素を含み、その酸素は二つの炭素と結合している。Ｐが含む酸素の数は特に限定されないが、好ましくは１〜２個の酸素を含む。また、Ｐが含む炭素の数も特に限定されないが、Ｐに含まれる炭化水素鎖は炭素数が１〜３であることが好ましく、Ｐに含まれる炭素の総数が３〜８個であることが好ましい。好ましいＰとして、以下のものが挙げられる。
−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−
−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−
−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｏ−（ＣＨ２）２−
−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−
−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）２−
このような構造を有することによって。立体構造の自由度が高くなる。この化合物をリポソームの構成に用いた場合、エーテル結合に含まれる酸素が、組み合わされる核酸等と水素結合を形成するため、核酸等の内包量が多くなる。
【００２１】
また、Ｘは三級アミン構造を含む２価連結基であり、好ましくはメチルイミノ、１，２−ピロリジンジイル、および１，３−ピロリジンジイルからなる群から選ばれる。この化合物をリポソームの構成に用いた場合、三級アミン構造によって、高い細胞膜透過性が発揮される。
【００２２】
式（１）中、−Ｒ−Ｙ−Ｒ’−Ｑは、疎水部を構成している。この疎水部には生分解性基を含んでいる。ここで、生分解性基は、カルボン酸エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオカルボン酸エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）、ジチオカルボン酸エステル結合（−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−）、アミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、カルバメート結合（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキシジオキシ結合（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、および尿素結合（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）からなる群から選ばれる。
【００２３】
この生分解性基は、Ｙとして構造中に存在する場合の他、Ｑに含まれている場合もある。すなわち、Ｑが脂溶性ビタミンやステロールに由来する基であり、その構造中にカルボン酸エステル基などが含まれていてもよい。また生分解性基は、ＱとＹとの両方に含まれていてもよいし、またいずれかが２つ以上の生分解性基を含んでいてもよい。
【００２４】
ＹおよびＲ’は、ＲとＱとを連結する２価基である。
【００２５】
Ｙは、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基である。またＲ’は、単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンである。
【００２６】
これらは元素を含まない単結合であってもよい。一方で、Ｑが生分解性基を含まない場合には、Ｙは生分解性基を含む。
【００２７】
Ｑは、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基である。これらのうち、脂溶性ビタミン残基またはステロール残基が好ましく、脂溶性ビタミン残基がより好ましい。
【００２８】
脂溶性ビタミン残基は、脂溶性ビタミンから誘導される基である。脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノール、レチナール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、およびトコトリエノールが挙げられる。これらの脂溶性ビタミンは末端にヒドロキシを有する。脂溶性ビタミン残基の一例は、これらのヒドロキシから水素が脱離したものである。また、脂溶性ビタミン誘導体に由来する基を用いることもできる。この脂溶性ビタミン誘導体とは、脂溶性ビタミンに含まれるヒドロキシが、チオヒドロキシ、カルボキシ、チオカルボキシ、またはジチオカルボキシに置換された化合物である。これらの脂溶性ビタミン残基は、末端に−Ｓ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−、または−Ｃ（＝Ｓ）−Ｓ−を有する。脂溶性ビタミン残基のうち、特に好ましいものは、レチノール（ビタミンＡ）、トコフェロール（ビタミンＥ）、またはそれらのカルボン酸誘導体に由来する基である。
【００２９】
ステロール残基は、ステロールから誘導される基である。ステロールとしては、例えば、コレステロール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、およびエルゴステロールが挙げられる。ステロール残基の一例は、これらステロールのヒドロキシから水素が脱離したものである。また、ステロール残基は、前記した脂溶性ビタミン誘導体に由来する基と同様の末端基を有していてもよい。特に好ましいステロール残基は、ステロール、コレステロール、またはそれらのカルボン酸誘導体に由来する基である。
【００３０】
Ｃ１２〜Ｃ２２脂肪族炭化水素基は、直鎖状、分岐鎖状のいずれであってもよく、また環状構造を有していてもよい。また、脂肪族炭化水素基は、不飽和結合を含んでいてもよく、含む場合には一般に６個以下、好ましくは３個以下の不飽和結合を含む。脂肪族炭化水素基の炭素数は、好ましくは１２〜１８であり、より好ましくは１３〜１７である。
【００３１】
これらのＱのうち、紫外線を吸収する構造を含むものが好ましい。具体的にはシクロヘキセン構造を含むことが好ましい。このように紫外線を吸収する構造を含むことによって、この化合物を成分として含有する脂質粒子の光による劣化の軽減することができ、また脂質粒子の挙動解析が必要な場合に、その解析を容易にすることが可能となる。
【００３２】
なお、式（１）の化合物は、二つの［Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｒ’−Ｑ］を含み、それぞれのＸ、Ｒ、Ｙ、Ｒ’、Ｑは独立であって、同一であっても異なっていてもよいが、同一であって化合物の構造が対象であることが好ましい。
【００３３】
実施形態による化合物の各部位は、上記したとおりの構造を有するものであるが、実施形態による化合物は、下記式（１−０１）〜（１−１２）で表される構造を有するものが好ましい。
【００３４】
【化１−１】
2019176079.tif 000002
【００３５】
【化１−２】
2019176079.tif 000003
【００３６】
【化１−３】
2019176079.tif 000004
【００３７】
これらのうち、（１−０１）〜（１−０４）はリポソームに用いた場合に優れた特性を発揮することができるので特に好ましい。
【００３８】
［化合物の製造方法］
このような化合物は、例えば下記の工程図に従って製造することができる。
【化２】
2019176079.tif 000005
【００３９】
このような化合物の合成方法は、従来知られている脂質化合物の合成プロセスに比較すると工程数が少なく、より効率の高い製造が可能となる。
【００４０】
［脂質粒子］
実施形態に寄れば脂質粒子が提供される。この脂質粒子の代表例はリポソームであるが、それに限定されず、核酸等と複合したリポプレックスなども包含される。またリポソームは、一枚膜リポソーム、多重層膜リポソームのいずれであってもよい。
【００４１】
実施形態による脂質粒子は、上記した式（１）で表される化合物を含むものである。また、望ましくは膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含むものである。上記式（１）で表される化合物も、膜を形成する脂質として機能するが、実施形態においては、「膜を形成する脂質」は、上記式（１）の化合物を包含しないものとする。
【００４２】
膜を形成する脂質とは、一般的にリポソームに用いられる脂質であれば、任意に用いることができる。この脂質は生分解性に優れた脂質であることが好ましい。
【００４３】
このような膜を形成する脂質の具体例は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドなどである。実施形態において脂質粒子に用いる膜を形成する脂質は目的とするリポソームのサイズや生体中におけるリポソームの安定性などを考慮して適切に選択される。これらのうち、ジアシルホスファチジルコリン、およびジアシルホスファチジルエタノールアミンは好ましいものである。ここで脂質に含まれるアシル基の炭化水素鎖の長さは１０〜２０であることが好ましい。この炭化水素鎖は飽和炭化水素基であっても、不飽和炭化水素基であってもよい。
【００４４】
このような膜を形成する脂質は種々のものが知られており、例えば、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０  ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール
などを好ましいものとして挙げることができる。これらは、リポソーム等の膜を形成する機能に加えて、膜の融合効果も発揮することができる。
【００４５】
実施形態に用いられる、凝集を低減できる脂質は、脂質粒子の調合中に粒子同士の凝集を含む機能を発揮するものである。このような脂質としては種々のものが知られており、実施形態による脂質粒子には任意のものを選択して用いることができる。このような脂質の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質、オメガ−アミノ（オリゴエチレングリコール）アルカン酸モノマーから誘導されるポリアミドオリゴマー（米国特許第６，３２０，０１７号）、モノシアロガングリオシドなどが挙げられる。より具体的には、米国特許第６，３２０，０１７号に挙げられている、ＡＴＴＡ８−ＤＰＳＥなどのＡＴＴＡ脂質や、米国特許第５，８２０，８７３号、同第５，５３４，４９９号、および同第５，８８５，６１３号に記載されているポリエチレングリコール脂質コンジュゲートを用いることができる。
【００４６】
ＰＥＧ修飾脂質は、脂質粒子が形成されたときに、脂質粒子の表面にアンカリング脂質部分を形成することができる。このようなＰＥＧ修飾脂質の例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば特許第３９２０３３０号明細書に記載されているＣ１４  ＰＥＧ−ＣｅｒまたはＣ２０  ＰＥＧ−Ｃｅｒ）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール（例えばト１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール−メトキシポリエチレングリコール；ＰＥＧ−ＤＭＧ）およびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが挙げられる。このうち、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールが特に好ましい。
【００４７】
ＰＥＧなどの嵩高い修飾基を脂質表面に結合させる場合、修飾基と脂質粒子との結合が脂質粒子ないしリポソームの安定性に影響する。例えば米国特許第５，８２０，８７３号には、ＰＥＧ修飾脂質におけるアシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、および立体障害頭部基のサイズなどの特性が、脂質粒子の安定性に影響を及ぼすことを示している。したがってこれらの特性を調整することで、目的に応じた脂質粒子を得ることができる。例えば、ＰＥＧ修飾脂質における修飾基を短くすることによってより早く脂質粒子を喪失させたり、修飾基を長くすることによって、血漿中の滞留時間を長くすることなどが可能である。その結果、脂質粒子の標的組織への送達を改善できる場合もある。
【００４８】
脂質粒子は、さらにその他の脂質を含むこともできる。このようなその他の脂質は、脂質粒子において一般的に用いられている物から任意に選択して用いることができる。例えば、毒性を調整するために、相対的に毒性の低い脂質を組み合わせることができる。また、脂質粒子に配位子を結合させるための官能基を導入するために、特定の構造を有する脂質を組み合わせることもできる。
【００４９】
さらには脂質粒子をリポソームとして用いる場合には、その内包物の漏出を抑制するための脂質としてステロール、例えばコレステロールを含むこともできる。さらに脂質粒子に標的作用物質をカップリングさせることもできる。このような場合のカップリング方法は、従来知られている任意の方法を採用することができる。
【００５０】
これらの脂質を組み合わせて脂質粒子が構成されるが、その脂質粒子を構成する各脂質の配合比は目的に応じて調整されるので、限定されるものではない。しかし、脂質粒子に用いられる脂質の総モル数を基準として、一般に、
式（１）で表される脂質化合物を１０〜７５モル％、
膜を形成する脂質を２５〜８０モル％、
凝集を低減できる脂質を、１〜１０モル％
で配合されるのが一般的であり、好ましくは
式（１）で表される脂質化合物を１０〜５０モル％、
膜を形成する脂質を４７．５〜８０モル％、
凝集を低減できる脂質を、１〜１０モル％、例えば２．５モル％
である。ここで、式（１）の化合物と、膜を形成する脂質とのバランスが重要であり、一方だけが存在しても活性剤の導入率が十分高くならない。このため、式（１）の化合物と、膜を形成する脂質との配合比は、モル数基準で１：０．５〜１：９であることが好ましく、１：１〜１：２であることがより好ましい。
【００５１】
実施形態による脂質粒子は、さらに活性剤を含むことができる。実施形態において活性剤とは、細胞、組織、器官、または被検体に特定効果を与えることのできる物質である。特定効果は、生物学的、生理学的、または美容的効果のいずれであってもよい。実施形態による脂質粒子を用いることで、さまざまな活性剤を生体内の目的部位に送達することができる。この活性剤は、脂質粒子の内部に封入されていても、外側または内側の脂質表面に結合していても、また脂質層の内部に配置されていてもよい。
【００５２】
活性剤の典型的な例は核酸であり、例えばプラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ、アプタマー、およびリボザイムからなる群から選択された核酸が挙げられる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴｍｉｒ、ａＤＮＡ、プラスミド、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、ｍＲＮＡなどを用いることもできる。
【００５３】
ｍｉＲＮＡとしては、ヌクレオチド単位が１７〜２５個連結したｍｉＲＮＡを用いることができる。）。１つのより好ましい実施形態では、核酸はヌクレオチド単位が１５〜５０個または２０〜３０個連結したオリゴヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡは、例えば、ヌクレオチド単位を１６〜３０個を含み、二本鎖領域を有するものあることができる。別の実施形態では、核酸は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、スーパーｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣体、またはｍｉＲＮＡインヒビターである。スーパーｍｉｒとは、ＲＮＡもしくはデオキシリボ核酸ＤＮＡ、またはこれらの両方、あるいは、これらの変性体の一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーであって、ｍｉＲＮＡと実質的に同一のヌクレオチド配列を有するとともに、その標的に対してアンチセンスであるオリゴマーまたはポリマーを指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣する目的で用いることのできる分子群を表す。したがって、「ｍｉＲＮＡ模倣体」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入れるとともに、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの供給源から精製することによっては得られない）。
【００５４】
核酸を脂質粒子に組み合わせる場合、核酸の形態は特に限定されない。この核酸は、例えば、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであることができる。二本鎖ＲＮＡの例としてはｓｉＲＮＡが挙げられる。一本鎖核酸としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボ酵素、ｍｉＲＮＡ、および三本鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００５５】
実施形態による脂質粒子は、核酸を含む場合には、核酸と結合する化合物をさらに含むことができる。このような化合物としては、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドが挙げられ、好ましくはプロタミン、ヒストン、およびそれらの塩が挙げられる。たとえばヒストンおよびその塩は、核酸と結合し、核酸分子を畳み込む性質をもっている。またプロタミンは、核酸と結合し、さらにその核酸を巻き込む性質を持っている。このため、これらの化合物は脂質粒子に核酸を封入するのに有効である。
【００５６】
また、実施形態による脂質粒子は、細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含むことができる。細胞内での核酸の発現を調整することによりリポソームが送達された細胞に対して、可視化や細胞死の効果が得られるので、好ましい。このような化合物としてはレチノイン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００５７】
また、実施形態による脂質粒子は、リポタンパク、アポリポタンパクなどを含んでいてもよい。
【００５８】
活性剤として、その他の治療剤を用いることもできる。用いることのできる治療剤の具体例は、ペプチド、ポリペプチド、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘発因子、細胞表面受容体およびそのリガンド、ホルモンなどが挙げられる。より具体的には、治療剤は、抗炎症化合物、抗うつ薬、興奮薬、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張薬、血管新生阻害剤、細胞血管作動薬（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅｎｔｓ）、シグナル伝達阻害剤、心臓血管薬、腫瘍薬、ホルモン、およびステロイドが挙げられる。
【００５９】
脂質粒子に活性剤を組み合わせる場合、活性剤がより高い導入率で脂質粒子に導入されることが好ましい。また、脂質の特性に依存する細胞毒性による細胞死が低いことも好ましい。従来知られている脂質粒子を用いて核酸を導入した場合、一般的には導入率が低く、細胞毒性による細胞死の割合も高かった。これに対して、本実施形態による脂質粒子を用いた場合には、核酸の導入率が高く、細胞死も低減することができる。具体的には、従来の脂質粒子においては、導入率が１０％程度、エレクトロポレーションによる細胞死が６０〜７０％であるのに対して、実施形態による脂質粒子を用いた場合には、それぞれ７０％以上、３０％以下に低減される。
【００６０】
実施形態による脂質粒子は、目的に応じて任意の大きさに形成させることができる。しかしながら、実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いようとする場合には、脂質粒子はナノオーダーサイズの粒子とされるのが一般的である。具体的には、実施形態による脂質粒子の平均粒子径は、一般に５０ｎｍ〜３００ｎｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜２００ｎｍである。脂質粒子のサイズは、任意の方法で調整することができる。例えば、超音波処理によって脂質粒子を小さくすることができる。また、ポリカーボネート膜やセラミック膜を透過させて、脂質粒子を分別することでサイズ調整をすることもできる。なお、実施形態において、脂質粒子の平均粒子径は、例えば動的光散乱法を用いたゼータサイザーによって測定することができる。
【００６１】
また実施形態による脂質粒子のインビボ半減期（ｔ１／２）は、一般に３時間未満であり、好ましくは２時間未満、特に好ましくは１時間未満である。ここで、インビボ半減期とは、例えば肝臓中、脾臓中、または血漿中の半減期を意味する。実施形態においては、脂質を構成する式（１）の化合物が生分解性基を有することによって、生分解性基を含まない脂質からなる脂質粒子に比較して、半減期が例えば１０％未満となっている。
【００６２】
［脂質粒子の製造方法］
実施形態による脂質粒子は、従来知られている任意の方法で製造することができる。脂質粒子やリポソームを製造する方法としては、バンガム法、有機溶媒抽出法、界面活性剤除去法、凍結融解法などが知られており、それらを採用することもできる。また、例えば、式（１）で表される化合物、さらには膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とを、アルコールなどの有機溶媒に導入し、水性緩衝液を添加することで自然発生的に脂質粒子を形成させることもできる。この水性緩衝液に活性剤を組み合わせておくことで、脂質粒子に活性剤を導入することが可能である。
【００６３】
本実施形態による脂質粒子は、活性剤を細胞へ送達するために使用することができる。特に核酸等の活性剤の細胞への送達は、遺伝子工学、組み換えタンパク質の生産、及び遺伝子治療や細胞診断として知られている医療技術など、あらゆる分野で用いられる。
［組成物］
本実施形態による脂質粒子は、組成物として用いることができる。例えば、本実施形態の脂質粒子と担体とを含む組成物が提供される。このような組成物は医薬用途にも適用できるものである。
【００６４】
担体としては、従来知られているものから任意に選択して用いることができるが、例えば、水、生理食塩水のような食塩水、グリシン水溶液、緩衝液などが挙げられる。さらにこれらの担体に加え、安定性を改良するなどの目的で、アルブミン、リポタンパク、アポリポタンパク、グロブリンなどの糖タンパクを組合せてもよい。
【００６５】
実施形態による組成物は、標準的な方法により調製することができる。担体としては、生理食塩水が用いられることが一般的である。食塩水またはその他の塩含有担体を含む組成物中では、担体は好ましくは、脂質粒子の形成の後に加える。したがって、脂質粒子と核酸などの活性剤を組み合わせた後に、その組成物を生理食塩水のような製薬学的に許容可能な担体で希釈することが一般的である。
【００６６】
実施形態による組成物は、必要に応じて補助剤を含んでもよい。たとえば、医薬用途の場合、製薬学的に許容可能な補助剤、例えばｐＨ調整剤、緩衝化剤、張度調整剤などを補助剤として含めることで、医薬組成物を生理的状態に近づけることができる。このような機能を奏する補助剤としては、ナトリウムアセテート、ナトリウムラクテート、ナトリウムクロリド、カリウムクロリド、カルシウムクロリドなどが挙げられる。また、実施形態による組成物は、貯蔵安定性を改良するための脂質保護剤を含むこともできる。このような保護剤としては、フリーラジカルによるダメージを抑制する、α−トコフェロールのような脂肪親和性フリーラジカルクエンチャーや、脂質の過酸化損傷を抑制するフェリオキサミンのような水溶性キレーターが挙げられる。
【００６７】
その他、前記した活性剤などを組成物に添加することもできる。この活性剤は、脂質粒子に組み合わせた活性剤と同一のものであっても、異なったものであってもよい。また、核酸と結合する化合物や核酸の発現を調整する化合物を組成物に添加することもできる。
【００６８】
実施形態による組成物中に含まれる脂質粒子の濃度は、特に限定されず、組成物中に含まれる脂質粒子の含有率は、一般に０．０１〜３０質量％、好ましくは０．０５〜１０質量％である。脂質粒子の濃度は、目的に応じて適切に選択することができる。
【００６９】
実施形態による組成物は、従来の周知の方法によって滅菌することができる。滅菌された組成物は、そのまま投与可能な製剤として包装することのほか、乾燥させて包装することもできる。乾燥した組成物は、投与の直前に滅菌水溶液と組み合わせることで投与可能な調製物とすることができる。
【００７０】
実施形態による組成物は、キット形態とすることもできる。実施形態によるキットは、前記した脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含むが、その形態は任意である。例えば活性剤を含まない脂質粒子を担体に分散させた分散物と活性剤とを個別容器に収容したキットや、乾燥させた脂質粒子と、活性剤と、担体とを個別容器に収容したキットなどが挙げられる。さらに、乾燥させた脂質粒子または脂質粒子分散物と、活性剤とを個別の製品とし、利用者が各製品を目的に応じて選択できるようにすることもできる。
該キットには、核酸導入の際に使用する試薬を組み合わせることができる。
【００７１】
［医薬組成物の利用方法］
実施形態による脂質粒子を医薬用途に用いた場合、組成物は、ヒトまたは動物の各種疾病の治療に用いることができる。脂質粒子と組み合わせる活性剤として治療剤を適用することで治療剤を目的細胞に送達することで治療が可能となる。
【００７２】
例えば、各種の核酸を細胞に送達して接触させて疾患の予防又は治療をすることが可能である。このような核酸としては、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、アンチセンス、またはリボザイムが挙げられる。また、核酸の送達は、インビトロまたはインビボのいずれで行うことができる。
【００７３】
インビボ投与の方法としては、医薬組成物は、好ましくは非経口投与、すなわち、関節内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与が採用される。医薬組成物の静脈内投与または腹腔内投与を、ボーラス注入によって行うこともできる。
【００７４】
また、実施形態による医薬調製物を標的組織に直接塗布して、医薬組成物を標的組織に接触させることもできる。また、点滴による髄膜等への投与、内視鏡器具による投与も可能である。
【００７５】
特定の実施形態では、医薬組成物による処理は、一般に、生理学的温度（約３７℃）で、１〜２４時間、好ましくは２〜８時間の期間で行われる。インビトロによる適用において、対象となる細胞は特に限定されない。例えば、脊椎動物の細胞であっても、非脊椎動物の細胞であっても、あるいは植物の細胞であってもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、細胞は動物細胞であり、より好ましくは哺乳類細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
【実施例】
【００７６】
［合成例１］  化合物（１−０１）の合成
前記した製造プロセスに従って、化合物（１−０１）の合成を行った。具体的には、下記の通りの操作を行った。【００７７】
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬフラスコ中ニトリエチレングリコール５．００ｇ（３３ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン１４．３９ｍＬ（１１２ｍｍｏｌ）、およびアセトニトリル（５０ｍＬ）を導入した。０℃でメタンスルホニルクロライド７．９７ｍＬ（１０３ｍｍｏｌ）を滴下後、室温で１時間撹拌した。続いて、エタノール１０ｍＬを滴下し、未反応のメタンスルホニルクロライドを処理した後、濾過した。濾過後の反応液を５０ｍＬのジクロロメタンで４回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。乾燥後の反応液を濾過した後、濃縮して、橙色オイル状の中間生成物１を８．２１ｇ得た（収率８１％）。【００７８】
次に、１００ｍＬフラスコに中間生成物１を８４２ｍｇ（２．７５ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３を９５０ｍｇ（６．８７ｍｍｏｌ）およびアセトニトロル１５ｍＬを導入した。室温で１５分撹拌後、３−（メチルアミノ）−１−プロパノール７３５ｍｇ（８．２５８ｍｍｏｌ）を滴下した。７０℃に保温しながら一晩撹拌した。反応液を放冷後、不溶物を濾過により除去した。濾液を濃縮して粗製物７２０ｍｇを得た。この粗製物を、カラムクロマトグラフィー（ＮＨシリカゲル１５ｇ、展開液５０％ヘキサン／クロロホルム）により精製して、微黄色透明オイル状の中間生成物２を３４８ｍｇ得た（収率４３％）。【００７９】
３０ｍＬナスフラスコに中間生成物２を３００ｍｇ（１．０３ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン１０ｍＬを導入し、レチノイン酸７７０ｍｇ（２．５６ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン５０ｍｇ（０．４１ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド５９０ｍｇ（３．０８ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩撹拌した。続いて反応液を１０ｍＬの水で２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。乾燥後の反応液を濾過した後、濃縮して、粗製物２．１ｇを得た。この粗製物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル４０ｇ、展開液５０％ヘキサン／クロロホルムおよびクロロホルム）により精製して、濃橙色オイル状の化合物１−０１を２６２ｍｇ得た（収率２９％）。【００８０】
［実施例１］
ベクターＤＮＡ溶液とＤＮＡ凝縮ペプチドを用いて、ベクターＤＮＡ−ＤＮＡ凝縮ペプチドからなるコア複合体を調整した。ベクターＤＮＡは、サイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサー、ナノルック遺伝子、転写終結シグナルを組込んだプラスミドを使用した。ＤＮＡ凝縮ペプチドは、ヒト・プロタミン由来のオリゴペプチドを使用した。マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ  １．５ｍｌ、住友ベークライト）に、ＤＮＡ凝縮ペプチド溶液（０．２４  ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ５．４）１００  μｌを分注した。分注したペプチド溶液をボルテックスミキサー（１，５００ｒｐｍ）（ＭＳＶ−３５００、ＢＩＯＳＡＮ）で撹拌しながら、ベクターＤＮＡ溶液（０．１５  ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ５．４）を２００  μＬを滴下して混合した。【００８１】
コア複合体を内包するリポソームは、エタノール注入法で調整した。マイクロチューブ（プロテオセーブＳＳ  １．５  ｍｌ、住友ベークライト）に、５０μｌの脂質溶液（化合物１−０１：ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ＝５：３：１：０．３ｍｏｌ）を分注した。分注した脂質溶液をボルテックスミキサーで撹拌しながら、コア複合体５０  μｌを滴下して混合した。滴下後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）を４００μｌを穏やかに添加して、ベクターＤＮＡ内包リポソームを調製した。更に１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ５．４）を４００μｌ加え、穏やかに混合した後、限外濾過スピンカラム（ＰＴ−１０１４、ＡｐｒｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて、遠心によるバッファー交換と濃縮をおこない、１００μＬのコア複合体内包リポソーム（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３）を調整した。【００８２】
［実施例２］
実施例１に対して、脂質溶液を、化合物１−０１：ＰＤＭＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ＝５：３：１：０．３ｍｏｌに変更したほかは同様にして、実施例２のリポソームを調製した。【００８３】
［比較例１］
実施例１に対して、脂質溶液を、化合物Ｒ−０１：ＤＯＴＡＰ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ＝５：３：１：０．３ｍｏｌに変更したほかは同様にして、比較例１のリポソームを調製した。
【化３】
2019176079.tif 000006
【００８４】
［比較例２］
実施例１に対して、脂質溶液を、化合物Ｒ−０１：ＰＤＭＥ：コレステロール：ＤＭＧ−ＰＥＧ＝５：３：１：０．３ｍｏｌに変更したほかは同様にして、比較例１のリポソームを調製した。【００８５】
［評価］  リポソームの内包ＤＮＡ量の測定
リポソームＤＮＡ内包量の測定は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でおこなった。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００  を含むＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液  ９５μＬに、実施例１のリポソーム溶液５．０μＬを加えて穏やかに縣濁した。室温に３０分間静置した後、溶液にＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液で２００倍希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液１００μＬを加えてよく混合した。室温に５分間静置した後、溶液の蛍光強度（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）をマイクロタイタープレートリーダー：Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定した。ＤＮＡ濃度は、既知濃度のλＤＮＡで作成した検量線を用いて定量した。得られた数値から、リポソーム内包ＤＮＡ量を、溶液１ｍＬあたりのＤＮＡ量（μｇＤＮＡ／ｍＬ）として算出した。得られた結果は表１に示した通りであった。化合物１−０１を含むリポソームは、化合物Ｒ−０１を含むリポソームより、内包ＤＮＡ量が高いことが明らかとなった。【００８６】
［評価］リポソームによるベクターＤＮＡ導入率の測定
リポソームによる細胞へのベクターＤＮＡの導入（内包量）は、ベクターＤＮＡ上のＮｌｕｃ遺伝子の発現により定量化した。ＮＬｕｃの発現は、その発光量をマイクロタイタープレートリーダー：Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で測定することで評価した。細胞は、ヒトＴ細胞性白血病細胞：Ｊｕｒｋａｔ  （ＡＴＣＣより購入）を使用した。９６穴培養プレートに、１×１０６細胞／ｍＬの細胞縣濁液を１００μＬ播種した後、実施例１で調整したリポソーム溶液を５μＬ  添加した。添加後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で４８時間培養した後、ＮＬｕｃの酵素活性を測定した。ＮＬｕｃの酵素活性は、ＮａｎｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、キット添付のマニュアルに従い、ルミノメーターで測定した。表１に示したように、リポソームにより細胞内に取り込まれたＮｌｕｃ遺伝子発現効率は、化合物Ｒ−０１を含むリポソームよりも、化合物１−０１を含むリポソームが高いことが明らかとなった。【００８７】
【表１】
2019176079.tif 000007
【００８８】
以上の通り、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の組み合わせ、省略、置き換え、変更などを行うことが可能である。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月16日(2019.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）：
Ｐ−［Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｒ’−Ｑ］２        （１）
（式中、
Ｐは、１つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Ｘは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む２価連結基であり、
Ｒは、それぞれ独立にＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｙは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合、および尿素結合からなる群から選ばれる２価連結基であり、
Ｒ’は、それぞれ独立に単結合またはＣ１〜Ｃ６アルキレンであり、
Ｑは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基である）
で表され、
構造中に、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、ジチオカルボン酸結合、アミド結合、カルバメート結合、カルボキシジオキシ結合、および尿素結合からなる群から選ばれる生分解性基を少なくとも一つ含むことを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記Ｐが、３〜８個の炭素および１〜２個の酸素を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｐが、炭素および酸素のみからなる、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記Ｘが、それぞれ独立に、メチルイミノ、１，２−ピロリジンジイル、および１，３−ピロリジンジイルからなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記脂溶性ビタミン残基が、レチノール、レチナール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、およびトコトリエノール、ならびにそれらのヒドロキシがチオヒドロキシ、カルボキシ、チオカルボキシ、またはジチオカルボキシに置換された化合物からなる群から選ばれる脂溶性ビタミンに由来する基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記Ｑが、シクロヘキセン構造を含む、請求項１〜４および６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
下記式（１−０１）〜（１−１２）で表される、請求項１〜４，６および９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１−１】
2019176079.tif 000011
【化１−２】
2019176079.tif 000012
【化１−３】
2019176079.tif 000013
【請求項１１】
請求項１〜４，６，９および１０のいずれか１項に記載された化合物を含む脂質粒子。
【請求項１２】
膜を形成する脂質と、凝集を低減できる脂質とをさらに含む請求項１１記載の脂質粒子。
【請求項１３】
前記の膜を形成する脂質が、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、
１，２−ステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、
１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、
１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、
１，２−ジミリストイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１４：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジパルミトイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１６：０  ＤＡＰ）、
１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（１８：０  ＤＡＰ）、
Ｎ−（４−カルボキシベンジル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（オレオイロキシ）プロパン（ＤＯＢＡＱ）、
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＯＰＣ）、
１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホクロリン（ＤＬＰＣ）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）、および
コレステロール、からなる群から選択され、
前記凝集を低減できる脂質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質である、請求項１２に記載の脂質粒子。
【請求項１４】
活性剤をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項１５】
前記活性剤が、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アプタマー、およびリポザイムからなる群から選択された核酸である、請求項１４に記載の脂質粒子。
【請求項１６】
核酸と結合する化合物をさらに含む、請求項１５に記載の脂質粒子。
【請求項１７】
前記核酸と結合する化合物が、塩基性タンパク質、または塩基性ペプチドである、請求項１６に記載の脂質粒子。
【請求項１８】
前記核酸と結合する化合物が、プロタミンまたはヒストンである、請求項１６または１７に記載の脂質粒子。
【請求項１９】
細胞内での核酸の発現を調節する化合物をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の脂質粒子。
【請求項２０】
請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の脂質粒子と、担体とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２１】
請求項１１または１２に記載の脂質粒子と、細胞に前記脂質粒子を導入する導入剤を含む組成物を含むキット。
【国際調査報告】
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