(57)【要約】  本発明は、（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド、から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷修復促進剤を提供する。
2018230535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷修復促進剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
【請求項２】
筋衛星細胞の活性化および／または分化を促進する作用を有する請求項１に記載の修復促進剤。
【請求項３】
骨格筋の損傷が、筋断裂、筋委縮または筋変性である請求項１または２に記載の修復促進剤。
【請求項４】
骨格筋の損傷部位における瘢痕形成を抑制する作用を有する請求項１〜３のいずれかに記載の修復促進剤。
【請求項５】
以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞活性化促進剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
【請求項６】
以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞分化促進剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
【請求項７】
以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷部位における瘢痕形成抑制剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格筋の損傷修復促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋は心筋と同様の横紋筋であるが、心筋と異なり内部に筋衛星細胞と呼ばれる前駆細胞が多数存在している。そのため、筋損傷後に筋衛星細胞による組織の修復・再生が行われ、そのほとんどが機能不全なく治癒する。筋線維の断裂が起こると、筋線維の基底膜上にプールされている筋衛星細胞が活性化し、筋損傷部位での増殖および筋芽細胞への分化が起こる。筋芽細胞は互いに融合し、多核の細胞（筋管細胞）となる。損傷した筋線維の間を埋めるようにさらに融合し、筋線維の連続性を得、約１か月程度で成熟した筋線維となる。【０００３】
骨格筋は、筋衛星細胞が存在するので修復力の高い組織といえるが、加齢に伴い筋衛星細胞の数および質が低下することが知られており、昨今の超高齢化社会においては、筋機能低下は決して稀な病態とは言えない。また、鰓弓由来筋は筋衛星細胞が少ないことが報告されており、頭頚部領域の手術においては、術後の筋機能低下が問題となることも多い。【０００４】
近年、組織再生に関しては、サイトカインや血管新生因子を用いた新たな治療法の研究が進められている。しかし、従来から研究・治療に用いられているＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＨＧＦ（hepatocyte growth factor）、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）などの増殖因子は、数百個のアミノ酸からなる抽出タンパク質や組み換えタンパク質であり、感染症や副作用の点で想像し得ない問題をはらんでいる。一方、アミノ酸が１０個前後結合したペプチドは、種々の増殖因子と比較して抗原性の点から副作用が起こりにくく、安全性が高く、代謝が容易であり、ペプチドのデザインが簡単で高効率な合成法や検定法が確立されているといった利点を有している。【０００５】
本発明者らは、細胞外基質の一種であるオステオポンチン（ＯＰＮ）内に存在する７アミノ酸（ＳＶＶＹＧＬＲ：配列番号１）からなるペプチド（以下「ＳＶペプチド」と称する）が、血管新生作用を有していることを明らかにし、その血管新生作用は、血管新生因子の中心的役割を担うＶＥＧＦと同等に高いものであることを見出している（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２）。また、本発明者らは、ＳＶペプチドが間葉系細胞の増殖促進作用を有すること（特許文献２）、心機能改善能を有すること（特許文献３）、繊維芽細胞のＩＩＩ型コラーゲン産生を促進すること（特許文献４）を見出している。しかし、ＳＶペプチドが損傷骨格筋の修復を促進することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００３／０３０９２５号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００８／０２６６３４号
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１２／１７２８８７号
【特許文献４】国際公開ＷＯ２０１６／０８４９３５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hamada Y, Norihara Y, Okazaki M, Fujitani W, Matsumoto T, Matsuura N and Takahashi J. Angiogenic activity of osteopontin-derived peptide SVVYGLR. Biochem Biophys Res Commun 2003; 310: 153-157.
【非特許文献２】Hamada Y, Yuki K, Okazaki M, Fujitani W, Matsumoto T, Hashida K, Kobashi M, Matsuura N and Takahashi J. Osteopontin-derived peptide SVVYGLR induces angiogenesis in vivo. Dent Mater J 2004; 23: 650-655.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、骨格筋の損傷修復促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷修復促進剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
［２］筋衛星細胞の活性化および／または分化を促進する作用を有する前記［１］に記載の修復促進剤。
［３］骨格筋の損傷が、筋断裂、筋委縮または筋変性である前記［１］または［２］に記載の修復促進剤。
［４］骨格筋の損傷部位における瘢痕形成を抑制する作用を有する前記［１］〜［３］のいずれかに記載の修復促進剤。
［５］以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞活性化促進剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
［６］以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞分化促進剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
［７］以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷部位における瘢痕形成抑制剤：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、および
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、骨格筋の損傷修復促進剤を提供することができる。本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、骨格筋の損傷部位において筋衛星細胞の活性化および／または分化を促進できるので、外科手術や外傷による筋損傷に対して自然治癒に要する期間より短期間で損傷した骨格筋を修復することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】筋損傷モデルラットの咬筋の切断位置を示す図である。
【図２】ＳＶペプチドを投与した筋損傷モデルラット（ＳＶ群）とＰＢＳを投与した筋損傷モデルラット（ＰＢＳ群）の摂食行動および体重変化を測定した結果を示す図であり、（Ａ）は摂食効率（咀嚼時間あたりの摂食量）、（Ｂ）は体重変化率である。
【図３】両側咬筋を切断し、左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋にＰＢＳを投与した筋損傷モデルラットを用いて、両側咬筋の筋電図を取得し、術前および術後１週間目における右咬みまたは左咬みの変化を検討した結果を示す図である。
【図４】両側咬筋を切断し、左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋に何も投与しない筋損傷モデルラットから、術後１週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のＨＥ染色標本を作製して、ＳＶ側および非投与（コントロール）側の血管数をカウントした結果を示す図である。
【図５】両側咬筋を切断し、左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋に何も投与しない筋損傷モデルラットから、術後１週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のＨＥ染色標本を作製して、中心核を有する筋線維数をカウントした結果を示す図であり、（Ａ）はＨＥ染色像、（Ｂ）はＳＶ側および非投与（コントロール）側の中心核を有する筋線維数を示すグラフである。
【図６】両側咬筋を切断し、左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋に何も投与しない筋損傷モデルラットから、術後１週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のシリウスレッド染色標本を作製して、切断面に形成された肉芽組織の面積を計測した結果を示す図であり、（Ａ）はＳＶペプチド側のシリウスレッド染色像、（Ｂ）はコントロール側のシリウスレッド染色像、（Ｃ）はＳＶ側および非投与（コントロール）側の肉芽組織の面積を示すグラフである。
【図７】両側咬筋を切断し、左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋に何も投与しない筋損傷モデルラットから、術後１週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のＭｙｏｇｅｎｉｎ免疫染色標本を作製し、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数をカウントした結果を示す図であり、（Ａ）はＭｙｏｇｅｎｉｎの免疫染色像、（Ｂ）はＳＶ側および非投与（コントロール）側のＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数を示すグラフである。
【図８】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）の術後１、２、４、６および８週間目の摂食効率（咀嚼時間あたりの摂食量）を示す図である。
【図９】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）の術後１、２、４、６および８週間目における左側咬筋の筋電図を取得し、バースト積分値の経時変化を示す図である。
【図１０】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）の術後１および８週間目における両側咬筋の筋電図を取得し、右咬みまたは左咬みの変化を検討した結果を示す図である。
【図１１】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）の術後８週間目におけるＣＴ画像を取得し、咬筋切断部を含む咬合平面の高さでの筋横断面積（ＣＳＡ）を示す図である。
【図１２】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）の術後８週間目におけるＣＴ画像を取得し、％ＣＳＡ（関心領域における筋ＣＴ値を有する面積割合）を示す図であり、（Ａ）がＳＶ群、（Ｂ）がＰＢＳ群の結果である。
【図１３】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）から、術後８週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のシリウスレッド染色標本を作製して、筋損傷部位における痕跡形成量を評価した結果を示す図であり、（Ａ）はＳＶ群およびＰＢＳ群のシリウスレッド染色像、（Ｂ）は切断面（図中の破線）の痕跡形成量を、画像解析ソフトを用いて計測した結果である。
【図１４】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）から、術後８週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のシリウスレッド染色標本を作製して、筋線維径を計測した結果を示す図である。
【図１５】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）の筋線維径を計測するためのシリウスレッド染色標本像であり、（Ａ）はＳＶペプチド投与側（ＳＶ側）、（Ｂ）は非投与（コントロール）側のシリウスレッド染色標本像である。
【図１６】ヒト筋衛生細胞およびヒト骨格筋筋芽細胞の細胞増殖能に対するＳＶペプチドの効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）はヒト筋衛生細胞、（Ｂ）はヒト骨格筋筋芽細胞の結果である。
【図１７】ヒト筋衛生細胞およびヒト骨格筋筋芽細胞の細胞遊走能に対するＳＶペプチドの効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）はヒト筋衛生細胞、（Ｂ）はヒト骨格筋筋芽細胞の結果である。
【図１８】ヒト骨格筋筋芽細胞の細胞移動能に対するＳＶペプチドの効果を検討した結果を示す図である。
【図１９】ヒト骨格筋筋芽細胞をＳＶペプチドまたは対照物質を含む培地で４８時間培養後、免疫蛍光染色によりＭｙｏｇｅｎｉｎの発現を観察し、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞率を算出した結果を示す図である。
【図２０】ヒト骨格筋筋芽細胞をＳＶペプチドまたは対照物質を含む培地で７２時間培養後、免疫蛍光染色によりＭｙｏｇｅｎｉｎの発現を観察し、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞率を算出した結果を示す図である。
【図２１】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）から、術後１週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のＨＥ染色標本を作製して、筋損傷部位における肉芽組織面積を測定し、肉芽組織形成面積比を算出した結果を示す図である。
【図２２】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）から、術後１週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のＭｙｏＤ免疫染色標本を作製して、ＭｙｏＤ陽性核数を計測し、ＭｙｏＤ陽性比を算出した結果を示す図である。
【図２３】両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラット（ＳＶ群）および両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラット（ＰＢＳ群）から、術後１週間目に両側の咬筋を採取し、組織切片のＭｙｏｇｅｎｉｎ免疫染色標本を作製して、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数を計測し、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性比を算出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、以下の（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を有効成分として含有する骨格筋の損傷修復促進剤を提供する。
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド
（４）ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１，２または３に示されるアミノ酸配列であるペプチド
【００１３】
配列番号１〜３で示されるアミノ酸配列は以下のとおりである。
配列番号１：ＳＶＶＹＧＬＲ
配列番号２：ＳＶＶＹＧＬ
配列番号３：ＶＶＹＧＬＲ
【００１４】
本発明者らは、ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）の血管新生作用が、ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）のＣ末端のＲが欠失したペプチド（配列番号２）およびＮ末端のＳが欠失したペプチド（配列番号３）でも維持されることを確認している。また、本発明者らは、ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）の線維芽細胞に対するＩＩＩ型コラーゲン産生促進作用と同等の作用をＣ末端にＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）を有するオステオポンチンのフラグメントが有することを確認している（特許文献４参照）。それゆえ、上記（１）〜（４）のペプチドは、いずれも骨格筋の損傷修復促進作用を有することが合理的に類推できる。
【００１５】
ヒトオステオポンチンのアミノ酸配列としては、例えば配列番号４で示されるアミノ酸配列が挙げられる。ヒトオステオポンチンにはＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）が含まれ、トロンビンは、ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）の直後でヒトオステオポンチンを切断することが知られている。例えば配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるヒトオステオポンチンをトロンビンで切断すると、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるフラグメント、すなわち、ヒトオステオポンチンのフラグメントであって、Ｃ末端のアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列であるペプチドが生成する。
【００１６】
ヒトオステオポンチンのアミノ酸配列としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列などが挙げられる。「１〜数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個、４個、３個、２個、１個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。「少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列」としては、少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列が挙げられる。なお、ヒトオステオポンチンと同等の構造および機能を有するタンパク質はヒトオステオポンチンと称することができ、そのアミノ酸配列はヒトオステオポンチンのアミノ酸配列である。
【００１７】
ヒトオステオポンチンのフラグメントの長さは特に限定されないが、総アミノ酸残基数が約１７０以下であることが好ましく、約１５０以下であることがより好ましく、約１００以下であることがさらに好ましい。さらに、取り扱いの簡便さ、製造効率、抗原性等の副作用の観点から、総アミノ酸残基数が約５０以下であることが好ましく、約３０残基以下であることがより好ましく、約２０残基以下であることがさらに好ましく、約１０残基以下であることが特に好ましい。
【００１８】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤の有効成分となるペプチドを構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されたものでもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基などが挙げられる。好ましくは、トリプトファンまたはフェニルアラニンのベンゼン環が置換基で修飾されていることである。
【００１９】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤の有効成分となるペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−)、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。アミド体としては、アミド、Ｃ１−６アルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換されたＣ１−６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドに含まれる。
【００２０】
さらに、本発明の骨格筋の損傷修復促進剤の有効成分となるペプチドには、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ２−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。
【００２１】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤の有効成分となるペプチドは塩を形成していてもよく、その塩としては、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属との塩、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。
【００２２】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤の有効成分となるペプチドまたはその塩は、公知の一般的なペプチド合成のプロトコールに従って、固相合成法（Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法）または液相合成法により製造することができる。また、目的のペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを導入した形質転換体を用いて製造することができる。また、インビトロ転写・翻訳系を用いる方法により製造することができる。
【００２３】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤により修復が促進される骨格筋の損傷としては、例えば、筋断裂、筋委縮、筋変性等が挙げられる。具体的には、外科手術に伴う筋断裂、骨折・打撲・肉離れ等の外傷に伴う筋断裂、長期閉口状態を要する頭頸部手術後の運動単位減少による廃用性筋萎縮、がん悪液質に伴う筋萎縮、サルコペニアおよび／または加齢に伴う筋萎縮、筋ジストロフィー症等の遺伝性神経筋疾患における進行性筋萎縮、広範囲筋切除を伴う外科手術後の線維化・瘢痕拘縮、口蓋裂等の先天性筋形態異常に対する形成手術後の運動機能不全を伴う瘢痕拘縮、サルコペニアおよび／または加齢に伴う再生能力低下による筋変性などが挙げられる。
【００２４】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、長期の安静を要することで生じる廃用性筋萎縮に対して筋再生および修復を促進し、運動機能の早期回復を図ることができるので、非常に有用である。また、筋の形態や機能に異常を有する先天性疾患（口蓋裂等）の機能改善、特に従来の手術・治療のみで筋機能回復が十分に得られない症例の機能改善に有効であると考えられる。また、後天性難治性神経筋疾患（筋ジストロフィー症等）に対しても機能改善、病状改善に有効と考えられる。さらに、加齢やサルコペニアによる筋萎縮および変性の進行を抑止するとともに、ＡＤＬ（Activities of Daily Living）低下による認知機能異常を予防する観点からも効果が期待される。
【００２５】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、骨格筋の損傷部位における瘢痕形成を抑制する作用を有することが確認されている。それゆえ、本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、「骨格筋の損傷部位における瘢痕形成抑制剤」と称することができる。瘢痕形成が抑制される骨格筋の損傷としては、上記例示した筋断裂または筋変性が挙げられる。
【００２６】
骨格筋は多核の筋線維（筋細胞）より構成されており、その筋線維の基底膜上に多数の筋衛星細胞が存在している。筋衛星細胞は通常静止期の状態にあり、筋損傷等で発生するシグナルにより活性化状態となり、細胞増殖および筋芽細胞への分化が起こる。元々、筋衛星細胞は多分化能を有するが、活性化しＭｙｏＤ遺伝子を発現することで、筋芽細胞への分化が決定付けられる。また同時に下流遺伝子であるＭｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子の発現が誘導され、そのＭｙｏｇｅｎｉｎ遺伝子は筋芽細胞の筋管細胞への分化・維持に関わり、成熟した筋細胞が形成される。本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞の活性化および／または分化を促進する作用を有するので、「骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞活性化促進剤」または「骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞分化促進剤」と称することができる。
【００２７】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、骨格筋の損傷部位を修復するための医薬として実施することができる。医薬として実施する場合、本発明の骨格筋の損傷修復促進剤に、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００２８】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
【００２９】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、損傷した骨格筋の周囲の筋肉に直接投与するための注射剤として実施してもよく、損傷した骨格筋の周囲の筋肉に塗布または貼付するための軟膏またはパッチ剤として実施してもよい。また、本発明の骨格筋の損傷修復促進剤は、有効成分であるペプチドをキャリアに結合した形態としてもよい。キャリアとしては、特に限定されるものではなく、人工臓器等に用いられる樹脂、タンパク質等の生体高分子などが挙げられる。なかでも、有効成分であるペプチドを含有する生体吸収性ゲルの形態で実施することが好ましい。
【００３０】
生体吸収性ゲルとしては、例えば公知の生体吸収性ハイドロゲルを好適に用いることができる。具体的には、例えば株式会社メドジェル製の徐放用ハイドロゲル「メドジェル（商品名）」などが挙げられる。この製品は、ゼラチンを架橋して水不溶化させたもので、ゼラチンとの静電的相互作用力などを中心とする分子間相互作用によりペプチドを保持することができる。このようなゼラチンハイドロゲルに有効成分であるペプチドを保持させて生体に適用すると、細胞から分泌されるコラゲナーゼなどの分解酵素によってゼラチンハイドロゲルが分解される。分解とともにペプチドが徐放され、分解物は生体に吸収される。生体吸収性ゲルの形状は特に限定されず、例えば、シート状、ディスク状、チューブ状、粒子状等の種々の形状で実施することができる。生体吸収性ゲルは、骨格筋の損傷部位に塗布または貼付して使用することができる。
【００３１】
本発明の骨格筋の損傷修復促進剤の有効成分であるペプチドまたはその塩は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
投与量は、損傷部位、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、成人の損傷した骨格筋の周囲の筋肉内に注射する場合、有効成分の１日当たりの投与量は、約０．００００１〜１００ｍｇであってもよく、約０．００００２〜９０ｍｇであってもよく、約０．００００５〜８０ｍｇであってもよく、約０．０００１〜５０ｍｇであってもよく、約０．０１〜３０ｍｇであってもよく、約０．１〜２０ｍｇであってもよく、約０．１〜１０ｍｇであってもよい。
【００３２】
本発明は、さらに以下の発明を包含する。
（ａ１）哺乳動物に対して、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とする骨格筋の損傷修復促進方法。
（ａ２）哺乳動物に対して、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とする骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞活性化促進方法。
（ａ３）哺乳動物に対して、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とする骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞分化促進方法。
（ａ４）哺乳動物に対して、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩を投与することを特徴とする骨格筋の損傷部位における瘢痕形成抑制方法。
（ｂ１）骨格筋の損傷修復促進に使用するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩。
（ｂ２）骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞活性化促進に使用するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩。
（ｂ３）骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞分化促進に使用するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩。
（ｂ４）骨格筋の損傷部位における瘢痕形成抑制に使用するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩。
（ｃ１）骨格筋の損傷修復促進剤を製造するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩の使用。
（ｃ２）骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞活性化促進剤を製造するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩の使用。
（ｃ３）骨格筋の損傷部位における筋衛星細胞分化促進剤を製造するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩の使用。
（ｃ４）骨格筋の損傷部位における瘢痕形成抑制剤を製造するための、上記（１）〜（４）から選択される少なくとも一種のペプチドまたはその塩の使用。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３４】
〔実施例１：筋損傷モデルラットを用いた修復促進効果の検討（１）〕
１−１  使用ペプチド
被験ペプチドとして、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下「ＳＶペプチド」と記す）を用いた。ＳＶペプチドは、多種品目固相法自動ペプチド合成装置（PSSM-8; 島津製作所）を用いてＦｍｏｃ法により合成した。【００３５】
１−２  筋損傷モデルの作製
Ｊｃｌ：ＳＤ系ラット（１０週齢）の両側咬筋を切断した。切断直後にＳＶペプチド（20ng/ml）１ｍｌを、切断面周囲の複数箇所に筋肉内投与した。切断は外眼角から下顎角を結んだ直線上で、皮膚側の筋膜から深部は下顎枝外側面骨膜に至るまで行い、切断面は電気メスにて凝固止血を行った（図１参照）。【００３６】
１−３  行動生理学的実験
（１）実験方法
術前、術後１週間目および術後２週間目に、ラットの摂食行動および体重を測定した。具体的には、ラットを縦３０ｃｍ×横３０ｃｍ×高さ３０ｃｍの透明プラスチックケージに収容し、ラットの活動時間である１８時から２２時の行動をビデオカメラで記録した。摂食量および咀嚼時間を測定し、咀嚼時間当たりの摂食量（摂食効率）を算出した。この実験には、両側咬筋切断後、両側咬筋にＳＶペプチドを投与した筋損傷モデル（ＳＶ群）と、両側咬筋にＰＢＳを投与した筋損傷モデル（ＰＢＳ群）を用いた。【００３７】
（２）結果
結果を図２に示した。（Ａ）は摂食効率、（Ｂ）は体重変化率である。（Ａ）および（Ｂ）とも術前の測定値を１として表示した。ＳＶ群の摂食効率は、術後１週間目には低下したが、２週間目には術前と同等程度に回復した。それに対してＰＢＳ群の摂食効率は、術後１週間目に著しく低下し、２週間目には回復傾向が認められたが、ＳＶ群より低値であった。体重の変化率については、ＳＶ群とＰＢＳ群の間に差がなく、両者の摂食量は同程度と考えられた。【００３８】
１−４  電気生理学的実験
（１）実験方法
この実験には、両側咬筋切断後、左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋にＰＢＳを投与したラットを用いた。両側咬筋内に双極針電極を留置し、頭頂部頭蓋骨に固定したコネクターより筋電位信号を観測した。筋電図データは術前および術後１週間目に取得した。摂食時の咬筋筋電図に関しては、咀嚼運動時の裁断相および臼磨相で、異なる筋電図波形を示し、裁断相は電位変化の少ない波形で、臼磨相は電位変化が大きな波形となる。【００３９】
（２）結果
筋電図データより、右側咬筋（コントロール側）の筋電位を縦軸、左側咬筋（ＳＶペプチド側）の筋電位を横軸に、０．０２秒ごとの電位をグラフ上にプロットし、リサージュパターングラフを作成した（図３）。臼磨相において、下顎は片側に偏ったグラインド運動を行うことが知られており、筋電図においても同様に開閉口運動時に片側に振幅の高い波形がみられる。リサージュパターンにて傾き１以上のものを右咬み、１より小さいものを左咬みとし、その割合を計測した結果、術前には右咬み傾向であったが、術後に左咬みの割合が多くなっていた。また左咬み時の左側咬筋の筋電位平均値は術後には低下するものの、右側咬筋より低下率は少なかった。【００４０】
１−５  組織染色
（１）実験方法
この実験には、両側咬筋切断後、左側咬筋にＳＶペプチドを投与し、右側咬筋（コントロール）には何も投与しないラットを用いた。術後１週間目にラットを安楽死させ、両側の咬筋を採取した。定法に従い組織切片を作製し、各種染色を施した。ＨＥ染色標本にて血管数および修復筋線維である中心核をもった幼若な筋線維数をカウントした。咬筋を冠状断面にて上下中央で分割し、上下２スライスにてそれぞれ５視野でカウントを行った。シリウスレッド染色標本（Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲンを染色）にて、切断面に形成された肉芽組織の領域を、画像解析ソフトを用いて計測した。さらに、筋管細胞のマーカーであるＭｙｏｇｅｎｉｎの免疫染色を行い、画像解析ソフトを用いてＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞をカウントした。【００４１】
（２）結果
（2-1）血管数
１視野あたりの血管数の結果を図４に示した。血管数は、ＳＶペプチド側がコントロール側より有意に多かった（P<0.05、ｔ検定）。【００４２】
（2-2）中心核を有する筋線維数
結果を図５に示した。（Ａ）はＨＥ染色像であり、矢印は中心核を有する幼若筋線維を示す。（Ｂ）は各群の中心核を有する筋線維数を示すグラフである。中心核を持つ筋線維は、ＳＶペプチド側がコントロール側より有意に多かった（P<0.05、ｔ検定）。【００４３】
（2-3）切断面に形成された肉芽組織の面積
結果を図６に示した。（Ａ）はＳＶペプチド側のシリウスレッド染色像、（Ｂ）はコントロール側のシリウスレッド染色像、（Ｃ）は各群の肉芽組織の面積を示すグラフである。ＳＶペプチド側はコントロール側より肉芽組織の面積が有意に小さかった（P<0.05、ｔ検定）。【００４４】
（2-4）Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数
結果を図７に示した。（Ａ）はＭｙｏｇｅｎｉｎの免疫染色像であり、矢印は濃染された核を持つ筋線維（筋管細胞）を示す。（Ｂ）は各群の１視野あたりのＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数を示すグラフである。Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数は、ＳＶペプチド側がコントロール側より有意に多かった（P<0.05、ｔ検定）。【００４５】
以上の結果より、骨格筋の損傷部位の周囲にＳＶペプチドを投与することにより、損傷部位の修復が顕著に促進されることが明らかになった。この修復促進は、ＳＶペプチドが筋衛星細胞に作用して筋衛星細胞を活性化し、筋衛星細胞の分化が促進されることに起因すると考えられる。【００４６】
〔実施例２：筋損傷モデルラットを用いた修復促進効果の検討（２）〕
２−１  使用ペプチド
実施例１と同じ合成装置を用いて合成したＳＶペプチドを使用した。
２−２  筋損傷モデルの作製
実施例１と同様に、Ｊｃｌ：ＳＤ系ラット（１０週齢）の両側咬筋を麻酔下で切断した。切断直後にＳＶペプチド（20ng/ml）１ｍｌまたはＰＢＳ１ｍｌを、切断面周囲の複数箇所に筋肉内投与した。切断は外眼角から下顎角を結んだ直線上で、皮膚側の筋膜から深部は下顎枝外側面骨膜に至るまで行い、切断面は電気メスにて凝固止血を行った（図１参照）。実施例２では、両側咬筋切断後左側咬筋にＳＶペプチド、右側咬筋には何も投与していないラットをＳＶ群、両側咬筋切断後左側咬筋にＰＢＳ、右側咬筋には何も投与していないラットをＰＢＳ群として実験を行った。【００４７】
２−３  行動生理学的実験
（１）実験方法
術後１、２、４、６および８週間目に、実施例１と同様に、ラットを縦３０ｃｍ×横３０ｃｍ×高さ３０ｃｍの透明プラスチックケージに収容し、ラットの活動時間である１８時から２２時の行動をビデオカメラで記録した。摂食量および咀嚼時間を測定し、咀嚼時間あたりの摂食量（摂食効率）を算出した。【００４８】
（２）結果
結果を図８に示した。摂食効率は術後１週間目の測定値を１として表示した。ＰＢＳ群では術後４週間目以降は摂食効率の大きな改善が見られなかったが、ＳＶ群では経時的に摂食効率が向上した。術後８週間目においてＳＶ群がＰＢＳ群より有意に高値を示した。【００４９】
２−４  電気生理学的実験
（１）実験方法
実施例１と同様に、両側咬筋内に双極針電極を留置し、頭頂部頭蓋骨に固定したコネクターより筋電位信号を観測した。筋電図データは術後１、２、４、６および８週間目に取得した。【００５０】
（２）結果
筋活動量の指標としてＳＶ群およびＰＢＳ群の左側（投与側）咬筋のバースト積分値を算出し、術後１週間目のバースト積分値を１としてその変化率を図９に示した。４、６および８週間目においてＳＶ群はＰＢＳ群より有意に高値を示した。
筋電図データより、右側咬筋（コントロール側：切断のみ）の筋電位を縦軸、左側咬筋（ＳＶ側またはＰＢＳ側）の筋電位を横軸に、０．０２秒ごとの電位をグラフ上にプロットしたリサージュパターングラフを作成し、図１０に示した。リサージュパターンにて傾き１以上のものを右咬み、１より小さいものを左咬みとし、その割合を計測した結果、ＳＶ群は術後の時間経過に伴い左咬みの割合が多くなっていたが、ＰＢＳ群ではそのような傾向は認められなかった。【００５１】
２−５  ＣＴ画像解析
（１）実験方法
実験動物用マイクロＣＴ（Rigaku、管電圧：90kV、管電流：160μA、ボクセルサイズ：118μｍ）を用いて術後８週間目に撮影を行い、得られたＤＩＣＯＭデータより、前鼻棘先端・両側下顎頭上縁を通る平面を基準平面としたＭＰＲ像を作製した。咬筋切断部を含む咬合平面の高さでの筋横断面積（ＣＳＡ）、平均ＣＴ値、％ＣＳＡ（関心領域における筋ＣＴ値を有する面積割合）を算出して比較検討した。【００５２】
（２）結果
ＣＳＡの結果を図１１に示した。ＳＶ群はＰＢＳ群と比較して、筋切断部を含む領域でのＣＳＡは有意に高かった。
％ＣＳＡの結果を図１２に示した。（Ａ）がＳＶ群の結果、（Ｂ）がＰＢＳ群の結果である。ＳＶ群では、ＳＶを投与した左側（ＳＶ側）の％ＣＳＡが非投与の右側（コントロール側）と比較して有意に高かった。一方、ＰＢＳ群では左側（ＰＢＳ側）と右側（コントロール側）の間に差がなかった。【００５３】
２−６  組織染色
（１）実験方法
術後８週間目にラットを安楽死させ、両側の咬筋を採取した。定法に従い、パラフィン包埋後、筋横断組織切片を作製し、ＨＥ染色およびシリウスレッド染色を施した。ＨＥ染色により筋損傷部位の再生筋線維の組織学的性状を評価し、シリウスレッド染色により組織の線維化量および筋線維径を計測し、群間で比較検討した。【００５４】
（２）結果
ＨＥ染色標本の観察により、ＳＶペプチドを投与していない筋損傷部位においても横紋構造を有する成熟した筋線維形成が確認された。
図１３に筋損傷部位における痕跡形成量を評価した結果を示した。（Ａ）はＳＶ群およびＰＢＳ群のシリウスレッド染色像、（Ｂ）は切断面（図中の破線）に形成された瘢痕組織の領域を、画像解析ソフトを用いて計測した結果である。ＳＶ群のＳＶペプチド投与側の痕跡形成量は、ＰＢＳ群のＰＢＳ投与側の痕跡形成量より顕著に少なかった。【００５５】
図１４に筋線維径を測定した結果を示し、図１５にＳＶ群のシリウスレッド染色の強拡大像を示した。（Ａ）がＳＶペプチド投与側（ＳＶ側）、（Ｂ）が非投与側（コントロール側）である。図１４、１５から明らかなように、ＳＶ群のＳＶ側の筋線維径はコントロール側より有意に太く、より成熟した筋線維となっていることがわかった。【００５６】
以上の結果より、ラット咬筋に加えられた断裂損傷は、自然治癒によりある程度の組織再生修復が認められたが、ＳＶペプチドを投与することで損傷部位の修復が顕著に促進され、摂食効率のより大きな増加がもたらされることが明らかになった。また、ＳＶペプチドを投与することにより、損傷部位の瘢痕形成が抑制され、成熟した筋線維による再生修復が形態学的・組織学的に確認された。【００５７】
〔実施例３：インビトロにおけるＳＶペプチドの細胞生物学的検討〕
３−１  使用ペプチド
ＳＶペプチドおよびＳＶペプチドを構成するアミノ酸をランダムに配列して機能を失わせた非機能性ＳＶペプチド（以下、「ランダムＳＶ」と称する）を、実施例１と同じ合成装置を用いて合成し、使用した。ランダムＳＶのアミノ酸配列は、ＧＹＲＶＬＳＶ（配列番号６）である。
３−２  細胞
ヒト筋衛生細胞（Human Skeletal Muscle Satellite Cells：HskMSC）を購入し（ScienCell Research Laboratories社）、使用した。培地には、同社製の推奨培地（5％FBS、Skeletal Muscle Cell Growth Supplementおよびpenicillin／streptomycin solutionを含有するSkeletal Muscle Cell Medium）を使用した。
ヒト骨格筋筋芽細胞（Human Skeletal Muscle Myoblasts：HSMM）を購入し（Lonza社）、使用した。培地には、同社製の推奨培地（SingleQuots Kitを添加したSkeletal Muscle Growth Media-2）を使用した。【００５８】
３−３  細胞増殖能の検討
（１）実験方法
非処理ポリスチレン９６穴細胞培養プレート（Falcon）の各ウェルにヒト筋衛生細胞およびヒト骨格筋筋芽細胞を各１．０×１０４個／ｍｌで播種し、ＳＶペプチド（20ng/ml、ＳＶ群）、ランダムＳＶ（20ng/ml、ランダムＳＶ群）またはＰＢＳ（ＰＢＳ群）を培地に添加して３７℃、５％ＣＯ２気層下で培養した。０、１２、２４、４８、７２時間後の細胞増殖をＰｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Takara Bio, Japan）を用いて測定した。【００５９】
（２）結果
結果を図１６に示した。（Ａ）がヒト筋衛生細胞の結果、（Ｂ）がヒト骨格筋筋芽細胞の結果である。ヒト筋衛生細胞では、ＳＶペプチドによる細胞増殖能の活性化は認められなかった。ヒト骨格筋筋芽細胞では、ＳＶペプチド添加後２４時間で細胞増殖能が有意に上昇し、その後プラトーに達した。１２時間目以降、ＳＶ群はＰＢＳ群およびランダムＳＶ群より細胞増殖能が有意に高かった。【００６０】
３−４  細胞遊走能の検討
（１）実験方法
ポアサイズ８μｍのポリカーボネートメンブレン（Chemotaxicell：クラボウ）を１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン溶液に室温で３０分間浸漬し、コーティングを行った。ケモアトラクタントとしてＳＶペプチド（20ng/ml、ＳＶ群）、ランダムＳＶ（20ng/ml、ランダムＳＶ群）またはＰＢＳ（ＰＢＳ群）を添加した培地をチャンバーの下層に加えた。チャンバーの上層には０．１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭで２．０×１０４個／ｍｌに調整したヒト筋衛生細胞およびヒト骨格筋筋芽細胞をそれぞれ播種した。チャンバーを３７℃で１２時間インキュベートした後、メンブレンの上面の細胞を綿棒で剥がし、メンブレンを１０％中性緩衝ホルマリン溶液（和光純薬工業）で固定してヘマトキシリン染色し、メンブレンの下面へ遊走した細胞数を光学顕微鏡で計測した。【００６１】
（２）結果
結果を図１７に示した。（Ａ）がヒト筋衛生細胞の結果、（Ｂ）がヒト骨格筋筋芽細胞の結果である。ヒト筋衛生細胞では、ＳＶ群はＰＢＳ群およびランダムＳＶ群より遊走能が高い傾向を示したが、有意差は認められなかった。ヒト骨格筋筋芽細胞では、ＳＶ群はＰＢＳ群およびランダムＳＶ群より遊走能が有意に高かった。【００６２】
３−５  細胞移動能の検討
（１）実験方法
Φ６０ｍｍシャーレ（Iwaki）上でヒト筋衛生細胞およびヒト骨格筋筋芽細胞をそれぞれ１００％コンフルエント状態まで培養した。細胞を２ｍｍ幅で剥離し、ＳＶペプチド（20ng/ml、ＳＶ群）、ランダムＳＶ（20ng/ml、ランダムＳＶ群）またはＰＢＳ（ＰＢＳ群）を添加した培地に交換して培養を続けた。１２時間毎に位相差顕微鏡デジタルカメラにて撮影し、剥離部分の面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｊ（NIH，USA）を用いて測定した。剥離直後の剥離部分面積を基準として、剥離部分面積の減少率に基づいて細胞移動率を算出した。【００６３】
（２）結果
ヒト骨格筋筋芽細胞の結果を図１８に示した。ＳＶ群は、２４時間目以降ＰＢＳ群およびランダムＳＶ群より細胞移動能が高くなり、３６および４８時間目では、ＰＢＳ群およびランダムＳＶ群に対して有意差が認められた。ＳＶペプチドはヒト筋衛生細胞の細胞移動能に影響を及ぼさなかった。【００６４】
３−６  免疫蛍光染色によるＭｙｏｇｅｎｉｎの発現確認
筋芽細胞が筋管細胞へ分化する際にＭｙｏｇｅｎｉｎを発現することが知られている。そこで、Ｍｙｏｇｅｎｉｎの発現を指標に、ＳＶペプチドがヒト骨格筋筋芽細胞の分化に及ぼす影響を検討した。【００６５】
（１）実験方法
ヒト骨格筋筋芽細胞をＳＶペプチド（20ng/ml、ＳＶ群）、ランダムＳＶ（20ng/ml、ランダムＳＶ群）またはＰＢＳ（ＰＢＳ群）を添加した培地で４８時間または７２時間培養した。陽性対照として、筋芽細胞を筋管細胞へ分化させることが知られている２％馬血清含有Ｆ−１２／ＤＭＥＭ培地（Moira A. Lawson et.al: Cells Tissues Organs 2000;167:130-137）でヒト骨格筋筋芽細胞を培養した（ＨＳ群）。４８時間または７２時間培養後、定法に従い抗ヒトＭｙｏｇｅｎｉｎ抗体を用いて免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した。【００６６】
（２）結果
４８時間目の結果を図１９に、７２時間目の結果を図２０に示した。いずれの図においても（Ａ）は蛍光顕微鏡観察像、（Ｂ）はＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞率である。（Ａ）の左列はＤＡＰＩ染色（核染色）、右列はＭｙｏｇｅｎｉｎ免疫染色である。培養４８時間目（図１９）では、ＳＶ群のＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞率はＰＢＳ群およびランダムＳＶ群と比較して有意に高かったが、ＨＳ群より有意に低かった。培養７２時間目（図２０）では、ＳＶ群のＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞率はＰＢＳ群およびランダムＳＶ群と比較して有意に高く、ＨＳ群と同等の陽性細胞率が認められた。【００６７】
以上の結果から、ＳＶペプチドは、ヒト骨格筋筋芽細胞の細胞増殖能、細胞遊走能および細胞移動能を顕著に向上させることが明らかになった。ＳＶペプチドは、ヒト筋衛生細胞に対して直接的な関与はないものの、筋芽細胞に分化した後に機能促進を誘発し、その結果、損傷した筋組織の再生修復を促進すると考えられた。また、ヒト骨格筋筋芽細胞においてＭｙｏｇｅｎｉｎの発現量が増加したことから、ＳＶペプチドは筋芽細胞から筋管細胞への分化促進に関与していると考えられた。【００６８】
〔実施例４：インビボにおける骨格筋形成能の検討〕
（１）実験方法
実施例２と同様に、Ｊｃｌ：ＳＤ系ラット（１０週齢）の両側咬筋を麻酔下で切断し、切断直後に左側咬筋にＳＶペプチド（20ng/ml）１ｍｌまたはＰＢＳ１ｍｌを投与し、右側咬筋には何も投与していないラットを、それぞれＳＶ群およびＰＢＳ群として用いた。術後１週間目にラットを安楽死させ、両側の咬筋を採取した。定法に従い、パラフィン包埋後、筋横断組織切片を作製し、ＨＥ染色、抗ＭｙｏＤ抗体を用いた免疫染色および抗Ｍｙｏｇｅｎｉｎ抗体を用いた免疫染色を施した。抗ＭｙｏＤ抗体として、抗マウスＭｙｏＤ抗体（abcam）を、抗Ｍｙｏｇｅｎｉｎ抗体として抗マウスＭｙｏｇｅｎｉｎ抗体（abcam）を使用した。二次抗体には、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体（DAKO）を用いた。【００６９】
（２）結果
ＨＥ染色標本を用いて、切断面に形成された肉芽組織の面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅ Ｊ（NIH，USA）を用いて解析した。ＳＶ群およびＰＢＳ群の肉芽組織形成面積比は、それぞれ次式を用いて算出した。
肉芽組織形成面積比＝投与側肉芽組織面積（pixel）／非投与側肉芽組織面積（pixel）
結果を図２１に示した。ＳＶ群では有意な肉芽組織形成の縮小が観察されたが、ＰＢＳ群では肉芽組織面積は縮小しなかった。【００７０】
顕微鏡デジタルカメラでＭｙｏＤ免疫染色標本を撮影し、筋切断部の左右２．５ｍｍを含む筋組織内に存在するＭｙｏＤ陽性核数を計測した。ＳＶ群およびＰＢＳ群のＭｙｏＤ陽性比は、それぞれ次式を用いて算出した。
ＭｙｏＤ陽性比＝投与側ＭｙｏＤ陽性核数／非投与側ＭｙｏＤ陽性核数
結果を図２２に示した。ＳＶ群はＰＢＳ群と比較して有意にＭｙｏＤ陽性細胞が増加していることが示された。【００７１】
顕微鏡デジタルカメラでＭｙｏｇｅｎｉｎ免疫染色標本を撮影し、筋切断部の左右２．５ｍｍを含む筋組織内に存在するＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数を計測した。ＳＶ群およびＰＢＳ群のＭｙｏＤ陽性比は、それぞれ次式を用いて算出した。
Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性比＝投与側Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数／非投与側Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性核数
結果を図２３に示した。ＳＶ群はＰＢＳ群と比較して有意にＭｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞が増加していることが示された。【００７２】
以上の結果より、ＳＶペプチドは、筋損傷部において筋衛星細胞から骨格筋細胞への分化を促進することにより、損傷修復を促進することが確認された。ＳＶペプチド投与側の筋損傷部においてＭｙｏＤ陽性細胞が増加したことから、ＳＶペプチドが筋損傷部における筋芽細胞の増殖、筋芽細胞の損傷部への遊走を促進させると考えられた。また、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ陽性細胞の増加から、筋損傷後の早い段階で筋芽細胞から筋管細胞への分化を促進していると考えられた。【００７３】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
2018230535.tif 000003
【図２】
2018230535.tif 000004
【図３】
2018230535.tif 000005
【図４】
2018230535.tif 000006
【図５】
2018230535.tif 000007
【図６】
2018230535.tif 000008
【図７】
2018230535.tif 000009
【図８】
2018230535.tif 000010
【図９】
2018230535.tif 000011
【図１０】
2018230535.tif 000012
【図１１】
2018230535.tif 000013
【図１２】
2018230535.tif 000014
【図１３】
2018230535.tif 000015
【図１４】
2018230535.tif 000016
【図１５】
2018230535.tif 000017
【図１６】
2018230535.tif 000018
【図１７】
2018230535.tif 000019
【図１８】
2018230535.tif 000020
【図１９】
2018230535.tif 000021
【図２０】
2018230535.tif 000022
【図２１】
2018230535.tif 000023
【図２２】
2018230535.tif 000024
【図２３】
2018230535.tif 000025
【配列表】
2018230535000001.app
【国際調査報告】
2018230535.tif 000026
2018230535.tif 000027
2018230535.tif 000028
2018230535.tif 000029