(57)【要約】  本願は、多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から尿管芽細胞へ分化誘導する方法を提供することを目的とする。本願の別の目的は、多能性幹細胞から尿管芽様組織への各分化段階、前方原始線条細胞、前方中間中胚葉細胞、ウォルフ管細胞を経て尿管芽様組織を作成する系を提供することである。本願のさらに別の目的は、尿管芽様オルガノイドを維持する方法を提供することである。また本願は、尿管芽様先端組織を拡大培養する方法を提供することを目的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）前方原始線条細胞を線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、TGFβ阻害剤、およびBMP阻害剤の存在下で二次元培養して、前方中間中胚葉細胞培養物を得る工程、および
（２）前方中間中胚葉細胞培養物をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子およびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で二次元培養する工程を含む、初期ウォルフ管細胞を誘導する方法。
【請求項２】
（１）の工程において、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBであり、TGFβ阻害剤がA83-01であり、BMP阻害剤がLDN193189である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（２）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（２）の工程においてさらにレチノイン酸受容体アゴニストが存在している、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
（２）の工程において、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞を、アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤、GSK3β阻害剤、およびBMP4の存在下で二次元培養して、前方原始線条細胞を得る工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前方原始線条細胞を得る工程において、アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤がアクチビンAであり、GSK3β阻害剤がCHIR99021である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって初期ウォルフ管細胞を得、さらに初期ウォルフ管細胞を凍結保存する工程を含む、凍結初期ウォルフ管細胞を製造する方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって初期ウォルフ管細胞を得、さらに
（３）初期ウォルフ管細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
（４）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法。
【請求項１０】
（３）および（４）の工程において、線維芽細胞増殖因子がFGF1であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBであり、GSK３β阻害剤がCHIR99021であり、Yes-associated protein(YAP)活性阻害剤がThiazovivinである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって初期ウォルフ管細胞を得、さらに
（３’）初期ウォルフ管細胞を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
（４’）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法。
【請求項１２】
（３’）および（４’）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれかに記載の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
（５−１）尿管芽様組織を単離する工程、および
（５−２）単離した尿管芽様組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法。
【請求項１４】
（５−２）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法で尿管芽様オルガノイド培養物を得、さらに
（６−１）尿管芽様オルガノイドの先端領域を切り取り、尿管芽様先端組織を得る工程、
（６−２）尿管芽様先端組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、尿管芽様オルガノイドを誘導する工程、および
（６−３）工程（６−１）および工程（６−２）を繰り返す工程を含む、尿管芽様オルガノイドを維持する方法。
【請求項１６】
（６−２）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項９〜１２のいずれかに記載の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
（５’−１）尿管芽様組織培養物中の組織を単一細胞に分離する工程、および
（５’−２）前記単一細胞をグリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様先端組織を拡大培養する方法。
【請求項１８】
（５’−２）の工程において、線維芽細胞増殖因子がFGF1であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBであり、GSK３β阻害剤がCHIR99021であり、Yes-associated protein(YAP)活性阻害剤がThiazovivinである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
（６’）尿管芽様先端組織をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法。
【請求項２０】
（６’）の工程において、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、BMP阻害剤がLDN193189であり、線維芽細胞増殖因子がFGF8であり、レチノイン酸受容体アゴニストがTTNPBである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
請求項１７または１８に記載の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
（６’’−１）尿管芽様先端組織を単一細胞に分離する工程、および
（６’’−２）前記単一細胞をWntシグナル阻害剤およびTGFβシグナル阻害剤の存在下で接着培養する工程を含む、集合管前駆細胞を誘導する方法。
【請求項２２】
（６’’−２）の工程において、Wntシグナル阻害剤がIWR-1であり、TGFβシグナル阻害剤がA83-01である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は尿管芽様組織を誘導する方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞、特にヒト多能性幹細胞から尿管芽様組織を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在本邦において慢性腎臓病(CKD)の患者数は、約1,300万人と推計されており、新たな国民病と呼ばれている。慢性腎臓病に対する根治的治療法は少なく、その進行によって透析療法を必要とする末期慢性腎不全患者は32万人以上であり、医学的のみならず医療経済的にも大きな問題となっている。末期慢性腎不全を含む慢性腎臓病の根治療法として腎移植が挙げられるが、深刻なドナー臓器不足のため需要に対し供給が全く追いついていない状態である。【０００３】
腎移植におけるドナー臓器不足の解決や慢性腎臓病に対する新規の細胞療法を開発するために、iPS細胞から高効率に腎細胞や腎組織を作製する方法の確立が必要とされている。【０００４】
腎臓は、胎生初期の組織である中間中胚葉に由来し、脊椎動物では中間中胚葉から前腎、中腎、後腎の3つの腎臓が形成され、哺乳類では後腎が成体の腎臓となる。後腎は、間葉と呼ばれる成体腎のネフロンと間質に将来分化する組織と、尿管芽と呼ばれる成体腎の集合管から下部の腎盂、尿管、膀胱の一部に将来分化する組織の2つの組織の相互作用で発生する（非特許文献１および２）。さらに、近年、中間中胚葉は、前方と後方の2つの部位に分かれており、前方中間中胚葉から尿管芽、後方中間中胚葉から間葉が発生することが報告された(非特許文献３)。【０００５】
ヒトiPS細胞やヒトES細胞から尿管芽細胞・組織を高効率に分化誘導する方法が確立されれば、将来的に三次元の腎臓の再構築による腎移植のドナー不足の解決や集合管細胞や下部尿路細胞の供給源として細胞療法に使用することが期待される。さらに、集合管細胞や下部尿路細胞やそれらを含む腎組織を用いた薬剤腎毒性評価系や疾患特異的iPS細胞から作製される腎細胞と腎組織を用いた疾患モデル作製や治療薬開発などの研究への発展が期待される。【０００６】
また尿管芽は、最初にウォルフ管細胞の尾方端から突起として出現し、その後分枝を繰り返し、腎集合管および尿路上皮に分化する。分枝構造を形成する尿管芽組織を作製できれば、腎臓発生および腎臓疾患の機構を解明するのに有用となることが期待される。【０００７】
本発明者らは、多能性幹細胞から膵ホルモン産生細胞、膵芽細胞、胆管上皮前駆細胞、肝細胞等、様々な細胞への分化誘導方法を確立した（特許文献１〜５）。ヒトiPS細胞やヒトES細胞から尿管芽細胞を選択的に分化誘導する方法は、現在までのところ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2015/020113
【特許文献２】WO2015/178431
【特許文献３】WO2017/047797
【特許文献４】WO2018/097127
【特許文献５】WO2016/104717
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Osafune K., et al., Development 2006; 133: 151-61.
【非特許文献２】Kobayashi A., et al., Cell Stem Cell 2008; 3: 169-81.
【非特許文献３】Taguchi A., et al., Cell Stem Cell. 2014; 14: 53-67.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願は、多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞やＥＳ細胞から尿管芽細胞へ分化誘導する方法を提供することを目的とする。本願の別の目的は、多能性幹細胞から尿管芽様組織への各分化段階、前方原始線条細胞、前方中間中胚葉細胞、ウォルフ管細胞を経て尿管芽様組織を作成する系を提供することである。本願のさらに別の目的は、尿管芽様オルガノイドを維持する方法を提供することである。また本願は、尿管芽様オルガノイドを拡大培養する方法を提供することを目的とする。本願はまた、多能性幹細胞から集合管前駆細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願は、
（１）前方原始線条細胞を線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、TGFβ阻害剤、およびBMP阻害剤の存在下で二次元培養して、前方中間中胚葉細胞培養物を得る工程、および
（２）前方中間中胚葉細胞培養物をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子およびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で二次元培養する工程を含む、初期ウォルフ管細胞を誘導する方法を提供する。本態様の（２）の工程において、培地にはさらにレチノイン酸受容体アゴニストを含んでもよい。【００１２】
本態様において、多能性幹細胞を、アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤、GSK3β阻害剤、およびBMP4の存在下で二次元培養して、前方原始線条細胞を得る工程をさらに含んでもよい。また、前方原始線条細胞は他の公知の方法で得られたものであってもよい。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から初期ウォルフ管細胞を誘導する方法が提供される。【００１３】
本願はまた、誘導された初期ウォルフ管細胞を凍結保存する方法を提供する。本願の方法で凍結保存させ、起眠させた初期ウォルフ管細胞は、以下の態様における初期ウォルフ管細胞として使用され得る。【００１４】
本願はまた、
（３）初期ウォルフ管細胞を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
（４）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法を提供する。本態様において、初期ウォルフ管細胞は本願の方法により誘導されたものであっても、本願の方法による凍結保存後に起眠させたものであってもよい。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から尿管芽様組織を誘導する方法が提供される。【００１５】
本願の別の態様において、
（３’）初期ウォルフ管細胞を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、成熟ウォルフ管細胞凝集体を得る工程、および
（４’）成熟ウォルフ管細胞凝集体を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様組織を誘導する方法を提供する。本態様において、初期ウォルフ管細胞は本願の方法により誘導されたものであっても、本願の方法による凍結保存後に起眠させたものであってもよい。【００１６】
本願はまた、本願の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
（５−１）尿管芽様組織を単離する工程、および
（５−２）単離した尿管芽様組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法を提供する。【００１７】
本願はまた、本願の方法で尿管芽様オルガノイド培養物を得、さらに
（６−１）尿管芽様オルガノイドの先端領域を切り取り、尿管芽様先端組織を得る工程、
（６−２）尿管芽様先端組織を、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養して、尿管芽様オルガノイドを誘導する工程、および
（６−３）工程（６−１）および工程（６−２）を繰り返す工程を含む、尿管芽様オルガノイドを維持する方法を提供する。【００１８】
本願はまた、本願の方法で尿管芽様組織培養物を得、さらに
（５’−１）尿管芽様組織培養物中の組織を単一細胞に分離する工程、および
（５’−２）前記単一細胞をグリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する工程を含む、尿管芽様先端組織を拡大培養する方法を提供する。【００１９】
本願はまた、本願の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
（６’）尿管芽様先端組織をGSK3β阻害剤、BMP阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子の存在下で浮遊培養する工程を含む、尿管芽様オルガノイドを誘導する方法を提供する。【００２０】
本願はまた、本願の方法で尿管芽様先端組織を得、さらに
（６’’−１）尿管芽様先端組織を単一細胞に分離する工程、および
（６’’−２）前記単一細胞をWntシグナル阻害剤およびTGFβシグナル阻害剤の存在下で接着培養する工程を含む、集合管前駆細胞を誘導する方法を提供する。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から集合管前駆細胞を誘導する方法が提供される。
【発明の効果】
【００２１】
本願は特許請求の範囲に記載した方法を提供する。本願の方法によって、比較的簡便かつ高効率で尿管芽様組織を製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】前方原始線条細胞（APS）から尿管芽（UB）およびネフロン前駆細胞（NP）への分化の図。
【図１Ｂ】OSR1（GFP、緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。FGF8とTTNPBでの処理は前方原始線条細胞（APS）を前方中間中胚葉様細胞（Anterior IM）に誘導するが、前体節中胚葉細胞（PSM）を誘導しない。スケールバーは100μmである。
【図１Ｃ】前方中間中胚葉マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
【図１Ｄ】フローサイトメトリー分析による、前方中間中胚葉マーカー（OSR1、GATA3、LHX1およびHOXB4）を発現する細胞への分化の定量化。4回の独立した実験から得たデータを平均値±s.d.（n=4）として表す。
【図１Ｅ】BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。hiPSCを10ng/ml BMP4を含む、または含まない100ng/mlアクチビンAおよび3μM CHIR99021で処理した。前方原始線条細胞を10ng/ml BMP4または0.1μM LDN193189を含む、0.1μM TTNPB、1μM A83-01および200ng/ml FGF8で処理した。
【図１Ｆ】BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。OSR1（GFP、緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。BMP4を前方原始線条誘導段階に添加すると、OSR1＋GATA3＋細胞誘導が促進された。スケールバーは100μmである。
【図１Ｇ】BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。OSR1（GFP、緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。LDN193189を前方中間中胚葉誘導段階に添加してもOSR1＋GATA3＋細胞の誘導効率は変化せず、BMP4の添加は分化を阻害した。スケールバーは100μmである。
【図１Ｈ】BMP4およびLDN193189を前方原始線条（APS）および前方中間中胚葉（Anterior IM）の誘導段階に添加することによる、OSR1＋GATA3＋細胞の分化への効果。前方原始線条誘導段階にBMP4を含まず、または中間中胚葉誘導段階にLDN193189を含まない処理によるGATA3＋細胞の誘導率は46.3±14.8%であった。前方原始線条段階にBMP4を含み、前方中間中胚葉段階にLDN193189を含まない処理によるGATA3＋細胞の誘導率は69.1±13.9%であった。前方原始線条段階にBMP4を含み、前方中間中胚葉段階にLDN193189を含む処理によるGATA3＋細胞の誘導率は69.6±5.7%であった。4回の独立した実験から得たデータを平均値±s.d.（n=4）として表す。
【００２３】
【図２Ａ】E8.5-9マウス胚における背腹軸に沿ったWntシグナルおよびBMPシグナルの濃度勾配の図。WntおよびBMPタンパク質は表層外胚葉（背側）から分泌され、BMPは側板中胚葉（腹側）からも分泌される。ウォルフ管（WD；OSR1−GATA3＋）は前方中間中胚葉（IM；OSR1＋GATA3＋）に対して背側に形成される。
【図２Ｂ】OSR1（GFP、緑色）、GATA3（赤色）およびPAX2（紫色）の免疫染色分析。CHIR99021を前方中間中胚葉細胞に添加することでOSR1−GATA3＋PAX2＋ウォルフ管細胞の分化は増強されたが（左）、IWR-1の添加によってウォルフ管誘導は阻害された（右）。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
【図２Ｃ】OSR1（GFP、緑色）、GATA3（赤色）およびPAX2（紫色）の免疫染色分析。BMP4を前方中間中胚葉細胞に添加することでウォルフ管細胞の分化は阻害されたが（左）、LDN193189の添加によってウォルフ管誘導は増強された（右）。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
【図２Ｄ】OSR1（GFP、緑色）、GATA3（赤色）およびPAX2（紫色）の免疫染色分析。前方中間中胚葉細胞をCHIR99021およびLDN193189で処理することで、ウォルフ管細胞が誘導された（左）。この処理にFGF8を追加すると、ウォルフ管誘導が増強した（右）。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
【図２Ｅ】処理前の全細胞数、FGF8単独での処理後の全細胞数、GDNF単独での処理後の全細胞数、およびFGF8とGDNFの併用での処理後の全細胞数は、それぞれ1.44±0.29×105/cm2、4.69±0.65×105/cm2、2.37±0.56×105/cm2および5.44±0.54×105/cm2である。3回の独立した実験から得たデータを平均値±s.d.（n=3）として表す。3D45細胞を使用した。
【図２Ｆ】Ki67およびGATA3の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。KhES3細胞を使用した。
【図２Ｇ】Ki67、GATA3およびRETの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
【図２Ｈ】ウォルフ管マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
【００２４】
【図３Ａ】1×104個の分離された細胞から形成された凝集体の最初の2日間における形態変化。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。
【図３Ｂ】2日目における凝集体のGATA3（赤色）およびE-CADHERIN（緑色）の免疫染色分析。成熟ウォルフ管マーカーに陰性の細胞は、凝集体においてウォルフ管細胞から分離されている。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。
【図３Ｃ】非ウォルフ管細胞を除去するピペット操作をする前および後における2日目の凝集体の形態。中央のパネルにおける矢および矢頭は、それぞれ分離されたウォルフ管細胞および非ウォルフ管細胞を示す。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。
【図３Ｄ】非ウォルフ管細胞を除去した後の2日目の凝集体におけるウォルフ管マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。511-3E細胞を使用した。
【図３Ｅ】ピペット操作し、マトリゲルに埋め込んだ後の成熟ウォルフ管凝集体における最初の7日間の形態変化。スケールバーは300μｍである。511-3E細胞を使用した。
【図３Ｆ】511-3E細胞から作製された7日目の構造体の三次元画像。511-3E細胞を使用した。
【図３Ｇ】9日目の構造体における尿管芽マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
【図３Ｈ】15日目の構造体における、尿管芽の幹のマーカーであるCK19（赤色）、UPの先端のマーカーであるRET（緑色）、ならびに共通の尿管芽マーカーであるPAX2およびGATA3（青色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。3D45細胞を使用した。
【００２５】
【図４】hPSCから、分枝する尿管芽組織への分化誘導プロトコル。APS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；WD、ウォルフ管；UB、尿管芽。Y、10μM Y-27632；A、100ng/mlアクチビンA；C3、3μM CHIR99021；B、10ng/ml BMP4；F8、200ng/ml FGF8；TT、0.1μM TTNPB；A83、1μM A83-01；LDN、0.1μM LDN193189；C1、1μM CHIR99021；G、100ng/ml GDNF；F1、200ng/ml FGF1；Tzv、10μM Thiazovivin。
【００２６】
【図５Ａ】hiPSCから前方原始線条（APS）および前体節中胚葉細胞（PSM）を介した初期体節（Early somite）への分化の図。
【図５Ｂ】hiPSCから前方原始線条細胞（APS）への分化を示すBRACHYURY（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
【図５Ｃ】前方原始線条（APS）から前体節中胚葉細胞（PSM）への分化を示すTBX6（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
【図５Ｄ】前体節中胚葉（PSM）から初期体節細胞（Early somite）への分化を示すPAX3（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
【図５Ｅ】10ng/mlアクチビンA、3ng/ml BMP4、3μM CHIR99021、0.1μM TTNPBおよび10μM Y-27632での処理、ならびにその後の5ng/ml FGF9、1μM CHIR99021および10μM Y-27632での処理を用いた、前体節中胚葉（PSM）のネフロン前駆細胞（NP）への誘導。前体節中胚葉からネフロン前駆細胞への分化を示す、OSR1（GFP、緑色）およびSIX2（赤色）の免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
【図５Ｆ】1μM A83-01での処理が前方中間中胚葉様細胞の誘導を阻害することなく、胚体内胚葉細胞への分化を減少させることを示す、OSR1（GFP、緑色）およびSOX17（紫色）の二重免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
【００２７】
【図６】複数のhiPSC/ESC株からの前方中間中胚葉細胞の誘導。OSR1-GFPノックインhiPSC株（3D45）（OSR1-GFP、緑色；GATA3、赤色；PAX2、紫色）、mCherryを構成的に発現するhiPSC株（511-3E）（GATA3、緑色；mCherry、赤色；PAX2、紫色）、ADPKD患者から確立されたhiPSC株（CiRA00009）（GATA3、緑色；PAX2、紫色）およびhESC株（KhES3）（GATA3、赤色；PAX2、緑色）由来の4日目の分化細胞に対する、前方中間中胚葉マーカーの免疫染色分析。
【００２８】
【図７Ａ】KhES3細胞由来の7日目の分化細胞に対するウォルフ管マーカー（LHX1、GATA3、RET、CK8およびPAX2）の免疫染色分析。スケールバーは100μｍである。
【図７Ｂ】3D45細胞由来の7日目の分化細胞に対する、FOXF1＋側板中胚葉、OSR1＋PAX2−後方中間中胚葉、PAX3＋初期体節およびPAX6＋神経外胚葉細胞の免疫染色分析は、前方中間中胚葉以外の後方中間中胚葉および神経外胚葉の部分的な分化を示した。スケールバーは100μｍである。
【００２９】
【図８Ａ】hPSCから初期ウォルフ管細胞への分化誘導プロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管。
【図８Ｂ】前方中間中胚葉細胞にTTNPB（左）またはAGN193109（右）を添加した場合におけるRET（緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。AGN193109の添加によってウォルフ管細胞のマーカーであるRET発現が低下した。スケールバーは100μmである。
【００３０】
【図９Ａ】前方中間中胚葉細胞からウォルフ管細胞への誘導の開始後、6日目、8日目および10日目におけるウォルフ管細胞マーカーの免疫染色分析。スケールバーは100μmである。
【図９Ｂ】hPSCから成熟ウォルフ管凝集体への改良された分化誘導プロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管。
【図９Ｃ】非ウォルフ管細胞を除去する前および後の2日目の凝集体におけるウォルフ管細胞マーカーの免疫染色分析。スケールバーは300μmである。
【００３１】
【図１０Ａ】hPSCから尿管芽組織への改良された分化誘導プロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。
【図１０Ｂ】ウォルフ管上皮細胞塊からの、極性を有する尿管芽の出芽。
【図１０Ｃ】マトリゲル含有培地中の成熟ウォルフ管細胞凝集体における最初の4日間の形態変化。
【図１０Ｄ】極性を有する尿管芽の作製を示す、PAX2（緑色）、LAMININ（赤色）、EZRIN（白色）の免疫染色分析。
【００３２】
【図１１Ａ】hPSCから分化誘導した初期ウォルフ管細胞を凍結保存するプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管。
【図１１Ｂ】凍結保存した後、起眠し、細胞塊を作製し、非ウォルフ管細胞を除去した凝集体におけるウォルフ管細胞マーカーの免疫染色分析。スケールバーは300μmである。
【００３３】
【図１２Ａ】hPSCから尿管芽組織を分化誘導し、単離した尿管芽組織から尿管芽オルガノイドを作製するプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。
【図１２Ｂ】成熟ウォルフ管細胞凝集体から単離された尿管芽組織の分枝の進行を示す模式図。
【図１２Ｃ】成熟ウォルフ管細胞凝集体から機械的に単離し、マトリゲル含有培地で浮遊培養した尿管芽組織における最初の10日間の形態変化。
【図１２Ｄ】14日目の構造体における、PAX2（緑色）およびCK8（赤色）の免疫染色分析。
【図１２Ｅ】14日目の構造体における、PAX2（青色）、RET（緑色）およびCK8（赤色）の免疫染色分析。
【図１２Ｆ】14日目の構造体における、PAX2（紫色）、EZRIN（緑色）、およびLAMININ（赤色）の免疫染色分析。
【００３４】
【図１３Ａ】hPSCから尿管芽組織を分化誘導し、尿管芽オルガノイドを維持するためのプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。
【図１３Ｂ】尿管芽オルガノイドの先端領域を切り取り、さらに培養することによって尿管芽オルガノイドを維持できることを示す模式図。
【図１３Ｃ】作製された尿管芽オルガノイドから1回、2回または3回切り取られた、尿管芽組織の先端領域（尿管芽先端組織）における最初の7日間の形態変化。
【００３５】
【図１４Ａ】hPSCから分化誘導した尿管芽組織を用いて、尿管芽先端組織を拡大培養するためのプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。
【図１４Ｂ】尿管芽組織を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共に単一の細胞に分離し、ハイドロゲル上で三次元培養することを示す模式図。
【図１４Ｃ】7日目の構造体の顕微鏡画像。
【図１４Ｄ】7日目の構造体におけるRET（緑色）およびGATA3（赤色）の免疫染色分析。
【００３６】
【図１５Ａ】拡大培養した尿管芽先端組織から尿管芽オルガノイドを作製するためのプロトコル。Anterior PS、前方原始線条；Anterior IM、前方中間中胚葉；ND、ウォルフ管；UB、尿管芽。
【図１５Ｂ】尿管芽組織を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共に単一の細胞に分離してハイドロゲル上で三次元培養し、その後マトリゲル含有培地中で浮遊培養することを示す模式図。
【図１５Ｃ】14日目における作製された構造体の顕微鏡画像。
【図１５Ｄ】14日目の構造体における、EZRIN（緑色）、LAMININ（赤色）、CK8（緑色）、GATA3（赤色）の免疫染色分析。
【００３７】
【図１６Ａ】集合管前駆細胞を分化誘導するためのプロトコル。
【図１６Ｂ】集合管前駆細胞への分化を示す、アクアポリン2（AQP2；赤色）の免疫染色分析。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本願明細書および請求の範囲において、数値に付随して「約」という場合、数値の±３０％、または±２０％、もしくは±１０％の値まで含むものとする。
【００３９】
本願明細書および請求の範囲において、「ある特定種類の細胞」の表現は、特に断りがなければ当該種類の細胞が含まれている細胞群を意味し、当該細胞群には特定された種類の細胞以外の種類の細胞が含まれていてもよい。例えば「ある特定種類の細胞の培養物」は、当該種類の細胞が含まれる細胞群の培養物を意味し、特定された種類の細胞以外の細胞が含まれていても良い。同様に、「ある特定種類の細胞凝集体」の表現は、特に断りがなければ当該種類の細胞が含まれている細胞凝集体を意味し、当該細胞凝集体には特定された種類の細胞以外の細胞が含まれていても良い。
【００４０】
本願明細書および請求の範囲において「多能性幹細胞」とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹（ES）細胞（J.A. Thomson et al. （1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. （1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. （1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall （1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞（T. Wakayama et al. （2001）, Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. （2005）, Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. （2007）, Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）（M. Kanatsu-Shinohara et al. （2003） Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. （2004）, Cell, 119:1001-1012）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）（Y. Matsui et al. （1992）, Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. （1992）, Nature, 359:550-551）、人工多能性幹（iPS）細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka （2006） Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. （2007）, Cell, 131:861-872; J. Yu et al. （2007）, Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら、Nat. Biotechnol. 26:101-106 （2008）；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。特にマウスやヒトの多能性幹細胞、特にＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞が好適に用いられる。
【００４１】
「ROCK阻害剤」とは、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、SR3677（例、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)参照）、GSK269962（例、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007)またはWO2005/037197参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本願でROCK阻害剤という場合、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962およびH-1152が挙げられる。
【００４２】
「アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤」とは、ＡＬＫ−４および／又はＡＬＫ−７に対し活性化作用を有する物質であり、好ましくは、アクチビン、特にアクチビンＡが用いられる。
【００４３】
「GSK3β阻害剤」とは、GSK3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK−3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-（2,4-ジクロロフェニル）-4-（1-メチル-1H-インドール-3-イル）-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK−3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK−3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021 （6-[2-[4-（2,4-Dichlorophenyl）-5-（4-methyl-1H-imidazol-2-yl）pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile） が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。本発明で使用されるGSK3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
【００４４】
「線維芽細胞増殖因子」としては、ＦＧＦ１から２３までが知られており、これら公知のものから適宜選択すればよい。以下に述べる第２、第３、第４’、第５’、第６、第７および第７’ステージではＦＧＦ８が、ウォルフ管細胞誘導後、ウォルフ管の成熟化あるいは凝集物の誘導並びに尿管芽組織への誘導段階である第４、第５および第６’ステージではＦＧＦ１が好適に用いられる。
【００４５】
「レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）アゴニスト」としては、天然に存在するレチノイドであっても、化学的に合成されたレチノイド、レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物やレチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物であってもよい。ＲＡＲアゴニストとしての活性をもつ天然レチノイドの例としては、レチノイン酸（立体異性体の全トランス−レチノイン酸（全トランスＲＡ）と９−シス−レチノイン酸（９−シスＲＡ）が知られている）が挙げられる。化学的に合成されたレチノイドは当技術分野で公知である（米国特許第５，２３４，９２６号、米国特許第４，３２６，０５５号等）。レチノイド骨格を持たないレチノイン酸受容体アゴニスト化合物の例としては、Ａｍ８０、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＡＣ５５６４９が挙げられる。レチノイン酸受容体アゴニスト活性を有する天然物の例としては、ホノキオール、マグノロールが挙げられる（生物機能開発研究所紀要  ９：５５−６１、２００９年）。工程２で用いるＲＡＲアゴニストは、好ましくはレチノイン酸、ＡＭ５８０（４−［［５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル］カルボキシアミド］ベンゾイックアシッド）、ＴＴＮＰＢ（４−［［Ｅ］−２−［５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル］−１−プロペニル］ベンゾイックアシッド）、ＡＣ５５６４９（４’−オクチル−［１，１’−ビフェニル］−４−カルボキシリックアシッド）であり、さらに好ましくはＴＴＮＰＢである。
【００４６】
「TGFβ阻害剤」は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01((3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide), WO 2009146408) ALK5阻害剤II（２−［３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］−１，５−ナフチリジン）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［６−メチル−ピリジン−２−イル］−１Ｈ−イミダゾル−４−イル］−キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。好ましくは、A-83-01であり得る。
【００４７】
「BMP阻害剤」は、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin 6-[4-（2-piperidin-1-yl-ethoxy）phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine、その誘導体 （P. B. Yu et al. （2007）, Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. （2008）, Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. （2008）, PLoS ONE, 3（8）:e2904）およびLDN-193189（4-（6-（4-（piperazin-1-yl）phenyl）pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl）quinoline）が例示され、好適にはLDN-193189が用いられる。
【００４８】
「Ｗｎｔシグナル阻害剤」は、Ｗｎｔを介したシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定されず、例えば、ＩＷＲ−１、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ−４、２−（４−トリフルオロメチルフェニル）−７，８−ジヒドロ−５Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（ＸＡＶ９３９）、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＧＦＢＰ４、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、抗Ｗｎｔ抗体、Ｗｎｔアゴニスト（Ｗｎｔ受容体阻害剤）、可溶型Ｗｎｔ受容体タンパク（Ｆｒｚｂ−１等）、ドミナントネガティブ体などが例示され、好適にはIWR-1が用いられる。
【００４９】
本願の方法の各工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30から40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2から5％である。
【００５０】
多能性幹細胞は、本願の方法に提供する前に、好適には多能性幹細胞培養用コーティング、例えばラミニンコーティング、市販品ではｉＭaｔｒｉｘ  ｓｉｌｋのコーティングを施した培養容器内、ＲＯＣＫ阻害剤を添加した多能性幹細胞用維持培地中で１２時間から４８時間、例えば約２４時間培養する。多能性幹細胞用維持培地としては、市販のものを適宜用いることができ、例えばＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標） ＡＫ０２Ｎ培地（味の素（株））が例示される。ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を用いる場合の培地中の濃度は、０．１μＭから１ｍＭ、好ましくは、１μＭから１００μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２０μＭ、例えば約１０μＭである。
【００５１】
次いで、本願の方法により多能性幹細胞の分化誘導を行う。培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へそれぞれのステージに必要な因子を適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、DMEM/F12培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Thermo Fisher Scientific）、N2サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、B27サプリメント（Thermo Fisher Scientific）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質、あるいはその他の通常動物培養用培地に添加される１つ以上の物質を含有しうる。
【００５２】
１つの実施形態において、第６’ステージを除く各態様では、基礎培地としてDMEM/F12培地にL-ascorbic acid-2-phosphate magnesium、sodium selenium、insulin、NaHCO3およびトランスフェリンが添加された無血清培地であるEssential 6(TM)培地（Thermo Fisher Scientific Inc）を用いて本願の方法を実施することが例示される。１つの実施形態において、第６’ステージでは、基礎培地としてDMEM/F12 B27 vitA free培地を用いて本願の方法を実施することが例示される。
以下、本願の方法の各ステージを説明する。各ステージにおいて、目的とする細胞が誘導されていることは、細胞上のマーカーの発現により確認することができる。マーカーの発現は、免疫染色法やＦＡＣＳなど公知の方法で確認することができる。
【００５３】
第1ステージ
本願の第1ステージは、多能性幹細胞から前方原始線条細胞を誘導する工程である。本工程では、多能性幹細胞をアクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤、GSK3阻害剤の存在下、二次元培養する。好ましくはさらに、ＢＭＰ４を存在させる。
【００５４】
アクチビン受容体キナーゼ４，７の活性化剤としてアクチビンＡを用いる場合、アクチビンＡの培地中の濃度は、通常１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。
【００５５】
ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０３μＭから３００μＭ、好ましくは０．３μＭから３０μＭ、より好ましくは１．５μＭから６μＭ、例えば約３μＭである。
【００５６】
ＢＭＰ４の培地中の濃度は、０．１ｎｇ/ｍｌから１μｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍｌから２０ｎｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌである。
【００５７】
本願の第１ステージは、好適には多能性幹細胞培養用のプレートにて、培地のみ交換して培養を行えば良い。培養期間は１２時間から４８時間、例えば約２４時間培養する。前方原始線条（APS)細胞の生成は、細胞へのBRACHYURYの発現にて確認できる。
【００５８】
第２ステージ
本願の第２ステージは、前方原始線条細胞から前方中間中胚葉（Anterior Intermediate Mesoderm, Anterior IM）を誘導する工程である。前方原始線条細胞は、第１ステージで得られた細胞でも良いし、公知の別の方法によって得られた細胞を用いてもよい。
【００５９】
本工程では、前方原始線条細胞を、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、TGFβ阻害剤、およびBMP阻害剤の存在下、二次元培養する。
【００６０】
線維芽細胞増殖因子としてFGF8を用いる場合、その培地中の濃度は通常２ｎｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌ、より好ましく１００ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約２００ｎｇ／ｍｌである。
【００６１】
レチノイン酸受容体アゴニストとして、ＴＴＮＰＢを用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
【００６２】
ＴＧＦβ阻害剤としてＡ８３−０１を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
【００６３】
ＢＭＰ阻害剤としてＬＤＮ１９３１８９を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
【００６４】
第２ステージでは、合計で２日間から６日間、好ましくは約３日間から約４日間培養を行う。第２ステージの前半、例えば約２日間は第１ステージ、または他の方法で得られた細胞培養物の培地を第２ステージ用培地に交換して培養すればよい。第２ステージの後半、例えば約１日間は、培養プレートを細胞外マトリックスタンパク質、例えばマトリゲルを薄層コーティングした細胞培養用プレートへ移して培養する。細胞培養用プレートを交換した後は、好ましくは培地中に更にROCK阻害剤、例えばY-27632を添加して培養を続ける。Y-27632の培地中の濃度は、第１ステージ開始前に多能性幹細胞を培養する際の濃度と同じでよい。
【００６５】
前方中間中胚葉細胞の生成は、例えば細胞へのＯＳＲ１とＧＡＴＡ３の発現により確認できる。その他の中間中胚葉細胞のマーカーであるＰＡＸ２、ＬＨＸ１およびＨＯＸＢ４の発現を単独で、あるいは組み合わせて確認してもよい。
【００６６】
第３ステージ
本願の第３ステージは、前方中間中胚葉細胞から初期ウォルフ管細胞を誘導する工程である。前方中間中胚葉細胞は、第２ステージで得られた細胞である。
【００６７】
本工程では、前方中間中胚葉細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下で二次元培養する。本工程において、培地にはさらにレチノイン酸受容体アゴニストを含んでもよい。
【００６８】
ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
【００６９】
ＢＭＰ阻害剤としてＬＤＮ１９３１８９を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
【００７０】
線維芽細胞増殖因子としてＦＧＦ８を用いる場合、その培地中の濃度は通常２ｎｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌから２μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約２００ｎｇ／ｍｌである。
【００７１】
グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の培地中の濃度は通常１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。
【００７２】
レチノイン酸受容体アゴニストとしてＴＴＮＰＢを用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
【００７３】
第３ステージにおいて、細胞は第２ステージの後半と同じく細胞外マトリックスタンパク質、例えばマトリゲル（ＴＭ）でコートされた細胞培養用プレートを用いて行えば良い。培養期間は２４時間から約４日、例えば約４８時間とすればよい。
【００７４】
初期ウォルフ管細胞の生成は、細胞がＧＡＴＡ３を発現し、ＯＳＲ１を発現しないことにより確認することができる。その他のウォルフ管のマーカーであるＰＡＸ２、ＬＨＸ１およびCytokeratin 8の発現を更に調べてもよい。
【００７５】
本工程で得られた初期ウォルフ管細胞は凍結保存することができる。細胞の凍結および起眠方法は公知の方法を使用することができる。例えば細胞を凍結する方法として、第3ステージで得られた初期ウォルフ管細胞をPBSで洗浄後、細胞分離溶液（例えばAccutase）により細胞培養用プレートから解離させ、遠心分離により上清を除去した後、凍結保存液（例えばstem cell banker）に懸濁し、-80℃で24時間緩慢凍結後、-196℃（液体窒素中）で保存することができる。凍結保存液としてはＤＭＳＯ入りの凍結液などを利用できる。具体的にはセルバンカー（日本全薬工業株式会社）やバンバンカー（日本ジェネティクス株式会社）、ＴＣプロテクター（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＣＰ−１（極東製薬工業株式会社）などが例示される。凍結細胞を起眠する方法として、凍結初期ウォルフ管細胞を37℃の温浴などで迅速に融解し、凍結保存液を遠心洗浄後、培地に懸濁させて用いる方法が例示される。本願の方法で凍結保存させ、起眠させた初期ウォルフ管細胞は、以下の態様における初期ウォルフ管細胞として使用され得る。
【００７６】
第4ステージ
第4ステージは、第3ステージで得られた初期ウォルフ管細胞から成熟ウォルフ管細胞凝集体を誘導する工程である。初期ウォルフ管細胞は本願の方法により凍結保存し、その後起眠したものであってもよい。第４ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞をグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で浮遊培養する。
【００７７】
第４ステージにおけるグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の濃度は通常１ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌである。
【００７８】
線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ１である場合、培地中のその濃度は通常２ｎｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌ、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌ、例えば約２００ｎｇ／ｍｌである。
【００７９】
レチノイン酸受容体アゴニストとして、ＴＴＮＰＢを用いる場合、その培地中の濃度は通常０．００１μＭから１０μＭ、好ましくは０．０１μＭから１μＭ、より好ましくは０．０５μＭから０．２μＭ、例えば約０．１μＭである。
【００８０】
ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０３μＭから３００μＭ、好ましくは０．３μＭから３０μＭ、より好ましくは１．５μＭから６μＭ、例えば約３μＭである。
【００８１】
Yes-associated protein(YAP)活性阻害剤としては、公知のものを適宜用いれば良いが、例えばYAP阻害活性とROCK阻害活性の両方の活性を有するThiazovivinが例示される。Thiazovivinを用いる場合、その培地中の濃度は０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２０μＭ、例えば約１０μＭである。
【００８２】
第４ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞は細胞非接着性の培養プレート中で培養する。細胞非接着性の細胞培養プレートとは、細胞培養プレートと細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
【００８３】
第４ステージの培養期間は２４時間から７２時間、例えば約４８時間とすればよい。第４ステージにおいては、成熟ウォルフ管細胞の凝集体が誘導される。成熟ウォルフ管細胞凝集体のサイズは通常100〜1000μm、好ましくは約300μmである。成熟ウォルフ管細胞の生成は、CK8、PAX2およびE-CADHERINの発現により確認できる。
【００８４】
多能性幹細胞から第１ステージから第３ステージを経て得られた初期ウォルフ管細胞を用いて第４ステージの培養を行った場合、得られる細胞全体に対して約５０％以上、好ましくは約６０％、例えば約７０％程度の割合で、成熟ウォルフ管細胞を得ることができる。また、成熟ウォルフ管細胞は浮遊培養において主に成熟ウォルフ管細胞のみが集積した凝集塊を形成することから、成熟ウォルフ管細胞塊を顕微鏡下でピペットマン等を用いて容易に物理的に単離することができる。
【００８５】
第４’ステージ
第４’ステージは、第3ステージで得られた初期ウォルフ管細胞から成熟ウォルフ管細胞凝集体を誘導する工程である。初期ウォルフ管細胞は本願の方法により凍結保存し、その後起眠したものであってもよい。第４’ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および好ましくはROCK阻害剤の存在下で浮遊培養する。用いる培地は第3ステージで用いた培地、または第3ステージで用いた培地にROCK阻害剤を加えたものである。ROCK阻害剤はアポトーシス抑制のために使用される。
【００８６】
ROCK阻害剤としてY27632を用いる場合、培地中の濃度は０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは５μＭから２０μＭ、例えば約１０μＭである。
【００８７】
第４’ステージにおいて、初期ウォルフ管細胞は第４ステージと同じく細胞非接着性の培養プレート中で培養する。第４’ステージの培養期間は２４時間から７２時間、例えば約４８時間とすればよい。第４’ステージにおいては、成熟ウォルフ管細胞の凝集体が誘導される。成熟ウォルフ管細胞の生成は、CK8、PAX2およびE-CADHERINの発現により確認できる。
【００８８】
生成した成熟ウォルフ管細胞は浮遊培養において主に成熟ウォルフ管細胞のみが集積した凝集塊を形成することから、成熟ウォルフ管細胞塊を顕微鏡下でピペットマン等を用いて容易に物理的に単離することができる。
【００８９】
第５ステージ
第５ステージは第4ステージで得られた成熟ウォルフ管細胞凝集塊を尿管芽様組織に誘導する工程である。第5ステージにおいて、成熟ウォルフ管細胞凝集体を、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下で三次元培養する。本工程においては、第４ステージで得られる成熟ウォルフ管細胞凝集体を単離し、培地で希釈した三次元スキャホールド材に埋め込み、三次元培養する。用いる培地は第４ステージで用いたものと同じである。
【００９０】
三次元スキャホールド材としては、培養細胞の三次元立体構造構築用のものが種々知られており、また販売されており、特に限定されない。例えばコラーゲンベースの材料やポリカプロラクトンやポリグリコール酸等のポリマー系の材料、又はそれらの複合体を使用することができる。また、その形態についても特に限定されないが、例えばスポンジ状構造物などが挙げられる。また、三次元スキャホールド材は、生体由来の試料を材料（例えば細胞外マトリックスや基底膜など）とするものであってもよい。具体的には、マトリゲルTM（ベクトン・ディッキンソン社）、typeIコラーゲンゲル、typeIＶコラーゲンゲルなどを挙げることができる。
【００９１】
マトリゲルTM基底膜マトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含むEngelbreth-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫から抽出した可溶性基底膜調製品であり、主にラミニン、コラーゲンIV、エンタクチン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンから構成される。さらに、TGF-β、線維芽細胞増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、EHSなどの他の増殖因子を含む。本願の第５ステージにおいて用いられる三次元スキャホールド材としては、マトリゲルTM基底膜マトリックス（マトリゲル）が好適に用いられる。
【００９２】
三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、マトリゲルは培地で通常１：０．５〜１：２、例えば約１：１希釈される。
【００９３】
第５ステージの培養期間は５から３０日、好ましくは７から２０日、例えば約１５日間とすればよい。第５ステージにおいて、尿管芽様細胞の誘導は、ＧＡＴＡ３、ＲＥＴ、ＰＡＸ、ＣＡＬＢ１などのマーカーの発現によって確認することができる。得られる尿管芽様組織のサイズは通常30〜200μm、好ましくは約50μmである。また、１つの尿管芽様組織は通常２〜３回分枝する。
分枝構造を有する尿管芽様組織が形成されたことは、顕微鏡下で確認することができる。
【００９４】
第５’ステージ
第５’ステージは第４’ステージで得られた成熟ウォルフ管細胞凝集塊を尿管芽様組織に誘導する工程である。第５’ステージにおいて、成熟ウォルフ管細胞凝集体をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下で浮遊培養する。本工程においては、第４’ステージで得られる成熟ウォルフ管細胞の凝集体を単離し、低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する。用いる培地は第3ステージで用いたものに三次元スキャホールド材を加えたものである。用いる三次元スキャホールド材は第５ステージで用いたものと同じである。
【００９５】
三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、培地中のマトリゲルの濃度は通常１〜５％、例えば約２％である。
【００９６】
第５’ステージの培養期間は１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約６日間とすればよい。第５’ステージにおいて、尿管芽様細胞の誘導は、ＧＡＴＡ３、ＲＥＴ、ＰＡＸ、ＣＡＬＢ１などのマーカーの発現によって確認することができる。分枝構造を有する尿管芽様組織が形成されたことは、顕微鏡下で確認することができる。
【００９７】
第６ステージ
第６ステージは尿管芽様組織から尿管芽様オルガノイドを誘導する工程である。尿管芽様組織を単離し、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下において低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する。尿管芽様組織は本願の方法で得られたものでも、公知の別の方法によって得られたものであってもよい。用いる培地および三次元スキャホールド材は第５’ステージで用いたものと同じである。
【００９８】
本願の明細書および請求の範囲において、「尿管芽様オルガノイド」は単離培養して得られた分枝構造を有する尿管芽様の自己組織化構造物を意味する。尿管芽様オルガノイドのサイズは通常約100〜約1000μｍである。また、１つの尿管芽様オルガノイドは通常３〜５回分枝する。尿管芽様組織の誘導は、ＧＡＴＡ３、ＲＥＴ、ＰＡＸ、ＣＡＬＢ１などのマーカーの発現によって確認することができる。尿管芽様組織が分枝構造を有することは、顕微鏡下で確認することができる。
【００９９】
三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、培地中のマトリゲルの濃度は通常１〜５％、例えば約２％である。
【０１００】
培養は、５から３０日、好ましくは７から２０日、例えば約１４日間行う。第６ステージにおいて、尿管芽様オルガノイドが形成されたことは顕微鏡下で確認することができる。尿管芽様オルガノイドが極性を有していることは、LAMININおよびEZRINの発現によって確認することができる。
【０１０１】
第７ステージ
第７ステージは、尿管芽様オルガノイドを維持する工程である。尿管芽様オルガノイドの先端領域を切り取り、尿管芽様先端組織を得る工程と、得られた尿管芽様先端組織をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下において低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する工程を繰り返すことにより、尿管芽様オルガノイドを維持する。尿管芽様オルガノイドは本願の方法で得られたものでも、公知の別の方法によって得られたものであってもよい。第7ステージの工程は少なくとも3回以上繰り返すことが可能であり、繰り返しの回数は特に制限されず、所望の回数を繰り返してよい。用いる培地および三次元スキャホールド材は第５’ステージで用いたものと同じである。
【０１０２】
本願の明細書および請求の範囲において、「尿管芽様先端組織」は、尿管芽様オルガノイドの分枝の先端部分を切り取った組織を意味する。尿管芽様先端組織のサイズは通常30〜200μｍであり、好ましくは約50μｍである。尿管芽様先端組織を適当に培養することにより、分枝構造が形成され、尿管芽様オルガノイドが作製され得る。
【０１０３】
培養は１回の工程において、１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約７日間行う。第７ステージにおいて、分枝した尿管芽様組織が形成されたことは顕微鏡下で確認することができる。尿管芽様組織が極性を有していることは、LAMININおよびEZRINの発現によって確認することができる。
【０１０４】
第６’ステージ
第６’ステージは、尿管芽様先端組織を拡大培養する工程である。尿管芽様組織培養物中の組織を単一の細胞ごとに分離し、グリア細胞株由来神経栄養因子、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤およびYes-associated protein(YAP)活性阻害剤の存在下において三次元培養する。本工程においては、尿管芽様組織培養物を単一の細胞ごとに分離し、三次元スキャホールド材を培地で希釈することにより得られたハイドロゲル上に播種し、三次元培養する。尿管芽様組織培養物は本願の方法で得られたものでも、公知の別の方法によって得られたものであってもよい。用いる培地は第4ステージで用いたものと同じである。
【０１０５】
細胞の分離方法としては、従来公知の細胞凝集塊の分離方法を適宜採用すればよく、例えば、力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、AccutaseおよびAccumaxなど）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（特に好ましくは、Accutase）を用いて細胞凝集塊を解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法が用いられる。
【０１０６】
三次元スキャホールド材としてマトリゲルを用いる場合、ハイドロゲル中のマトリゲルの濃度は、通常３０％〜７０％、例えば約５０％である。
【０１０７】
培養は、１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約６日間または約７日間行う。第６’ステージにおいて、尿管芽様先端組織が誘導されたことはCK8、GATA3およびRETなどのマーカーの発現によって確認することができる。
【０１０８】
第７’ステージ
第７’ステージは、第６’ステージで得られた尿管芽様先端組織から尿管芽様オルガノイドを誘導する工程である。第６’ステージで得られた尿管芽様先端組織をＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、線維芽細胞増殖因子、レチノイン酸受容体アゴニストおよびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の存在下において低濃度の三次元スキャホールド材を含む培地中で浮遊培養する。用いる培地および三次元スキャホールド材は第５’ステージで用いたものと同じである。
【０１０９】
培養は、５から３０日、好ましくは７から２０日、例えば約１４日間行う。第７’ステージにおいて、尿管芽様オルガノイドが形成されたことは顕微鏡下で確認することができる。尿管芽様オルガノイドが極性を有していることは、LAMININおよびEZRINの発現によって確認することができる。
【０１１０】
第７’’ステージ
第７’’ステージは、尿管芽様先端組織を集合管前駆細胞に誘導する工程である。第６’ステージで得られた尿管芽様先端組織を単離し、Wntシグナル阻害剤およびTGFβシグナル阻害剤の存在下で接着培養する。
【０１１１】
Ｗｎｔシグナル阻害剤としてＩＷＲ−１を用いる場合、その培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
【０１１２】
ＴＧＦβ阻害剤としてＡ８３−０１を用いる場合、その培地中の濃度は通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは０．５μＭから２μＭ、例えば約１μＭである。
【０１１３】
第７’’ステージにおいて、尿管芽様組織は細胞外マトリックスタンパク質、例えばラミニンでコートされた細胞培養プレート中で培養する。培養は１から１５日、好ましくは３から１０日、例えば約７日間行う。集合管前駆細胞の生成は、細胞へのアクアポリン2（AQP2）の発現にて確認できる。
【実施例】
【０１１４】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。【０１１５】
［材料と方法］
細胞培養
ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）およびヒト胚性幹細胞（hESC）を用いた実験は、京都大学医学科および医学研究科の倫理委員会によって承認された。施設内倫理委員会に従い、hiPSCの由来となったドナー対象からインフォームドコンセントを得た。
hiPSC/ESCを、Stem Fit AK02N培地（Takara）を用いたフィーダーフリー培養によって、iMatrix-511 silk（Nippi）をコートした細胞培養プレート上に維持した。細胞を0.5mM EDTA/PBS（Thermo Fisher Scientific）を用いて4日ごとに継代し、マイコプラズマ汚染について定期的に検査した。【０１１６】
分化誘導
本実施例で使用した増殖因子および小分子の詳細を表１に示す。
【表１】
2019098349.tif 000002
【０１１７】
前方原始線条（APS）誘導
未分化hiPSC/ESCを、組織培養プレート上の10μM Y-27632およびiMatrix-511 silkを含む維持培地に2.5x104細胞/cm2の密度で播種した。細胞を24時間後にPBSで洗浄し、10ng/ml骨形成タンパク質（BMP）4（PeproTech）を含む、または含まない100ng/mlアクチビンA（R&D Systems）および3μM CHIR99021（Stem RD）を含むEssential 6培地（Thermo Fisher Scientific）で24時間処理した。【０１１８】
中胚葉誘導
前方原始線条細胞を、0.1μM LDN193189（Axon Medchem）、1μM A83-01（WAKO）および3μM CHIR99021を含むEssential 6培地で24時間処理し、前体節中胚葉細胞を誘導した。培地を1μg/mlレチノイン酸（RA; MERCK）および0.5μM PD0325901（WAKO）を含むEssential 6培地に24時間交換し、初期体節を誘導した。【０１１９】
前方中間中胚葉を誘導するために、前方原始線条細胞を、200ng/ml線維芽細胞増殖因子（FGF）8（Peprotech）、0.1μM 4-[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフタレニル)-1-プロペニル]-安息香酸（TTNPB; Santa Cruz Biotechnology）、1μM A83-01および0.1μM LDN193189で2日間処理した。次に細胞を、マトリゲルをコートしたプレート上の10μM Y-27632を含む前方中間中胚葉誘導培地に1x105細胞/cm2の密度で再播種し、さらに24時間インキュベートした。【０１２０】
ウォルフ管誘導
前方中間中胚葉細胞を、0.1μM TTNPBを含む、または含まない、1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200 ng/ml FGF8および100 ng/mlグリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF; R&D Systems）を含むEssential 6培地で2日間処理することで、ウォルフ管の最先端の細胞の誘導を増強した。次に細胞をAccutase（Innovative Cell Technologies）で処理した後、穏やかなピペット操作によって単一の細胞に分離した。この細胞を低接着96ウェルプレート（Sumitomo Bakelite）上の100ng/ml GDNF、200ng/ml FGF1（R&D Systems）、0.1μM TTNPB、3μM CHIR99021および10μM Thiazovivin（Santa Cruz Biotechnology）を含むEssential 6培地に1x104細胞/ウェルの密度で播種し、2日間インキュベートして成熟ウォルフ管凝集体を誘導した。【０１２１】
尿管芽の分枝
得られた成熟ウォルフ管凝集体を低接着96ウェルプレートにおいてEssential 6培地で（1:1）希釈した30μlマトリゲル（BD Biosciences）中に埋め込み、30分間インキュベートした。マトリゲルの凝固後、100ng/ml GDNF、200ng/ml FGF1、0.1μM TTNPB、3μM CHIR99021および10μM Thiazovivinを添加したEssential 6培地を加えた。【０１２２】
成熟ウォルフ管凝集体および尿管芽の誘導の改良法
前方中間中胚葉細胞から誘導された初期ウォルフ管細胞をAccutaseで処理した後、穏やかなピペット操作によって単一の細胞に分離した。この細胞を低接着96ウェルプレート上の1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200 ng/ml FGF8、100 ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび10μM Y-27632を含むEssential 6培地に1x104細胞/ウェルの密度で播種し、成熟ウォルフ管凝集体を2日間誘導した。【０１２３】
次に、成熟ウォルフ管凝集体を1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養し、尿管芽組織を誘導した。【０１２４】
ウォルフ管細胞の凍結保存
24ウェルプレート中で前方中間中胚葉細胞から誘導された初期ウォルフ管細胞をPBS 0.5mlで一回洗浄した後、Accutase 0.3mlと共に37℃で3分間インキュベートした。ピペット操作をした後、細胞を回収し、2.7mlのDMEMおよび10 % FBS液を加え、900RPMで5分間遠心した。上清を除去した後、stem cell banker 3mlで懸濁し、3本のストックチューブに1mlずつ分注した。-80℃で24時間緩慢凍結した後、液体窒素タンクへ移動し、保存した。【０１２５】
尿管芽組織の分枝の進行
尿管芽組織を顕微鏡下で成熟ウォルフ管凝集体から機械的に単離し、1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養した。【０１２６】
さらに作製した構造体の先端領域を機械的に切り取り、1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養した。【０１２７】
尿管芽オルガノイドの拡大培養法
尿管芽組織を機械的単離せず、37℃で3分間Accutase処理し、分離させた。DMEM/F12+B27(vit A free)に各因子（3μM CHIR99021、10μM Thiazovivin、200ng/ml FGF1、0.1μM TTNPB、および100ng/ml GDNF）を加えた培地で懸濁した。5-6個の凝集体から得られた単一細胞を48ウェルプレート上に作製したハイドロゲル上に播種して培養した。ハイドロゲルは、50％マトリゲルを含むDMEM/F12+B27(vit A free)培地を37℃で30分インキュベートして凝固させることで作製した。【０１２８】
6日間培養した後、上記の培地にCell recovery solutionを1ml加え、4℃で1時間インキュベートした。ハイドロゲルを溶解し、チューブに移した後、さらに2ml Cell recovery solutionを加えて軽くピペット操作をした。500Gで5分間遠心し、上清を捨てEssential 6培地2mlで洗浄した。その後500Gで5分間遠心し、上清を捨て、Essential 6培地に各因子（1μM CHIR99021、0.1μM LDN193189、200ng/ml FGF8、100ng/ml GDNF、0.1μM TTNPBおよび2%マトリゲル）を加えて35mm非接着プレートで培養した。4日目に1つの凝集体ごとに96ウェルプレートの各ウェルに移動してさらに培養した。【０１２９】
集合管前駆細胞の誘導
尿管芽オルガノイドの拡大培養法において、ハイドロゲル上に播種した細胞を7日間培養後、Accutase処理により単一の細胞に解離した。この単一細胞をiMatrix-silkをコーティングしたプレート上の1μM IWR-1および1μM A83-01を含むEssential 6培地に播種し、さらに7日間培養した。【０１３０】
免疫染色
細胞を4% PFA/PBSを用いて4℃で20分間固定した。PBSで洗浄した後、細胞を1％正常ロバ血清（Millipore）および3％ウシ血清アルブミン（BSA; Nacalai Tesque）/PBST （PBS/0.25%トリトンX100）を用いて室温で1時間ブロックした。一次抗体をブロッキング溶液に希釈し、試料と共に4℃で一晩インキュベートした。二次抗体を室温で1時間インキュベートした。【０１３１】
細胞凝集体を4%PFA/PBSを用いて4℃で一晩固定した。固定した凝集体を30%ショ糖緩衝液で処理し、次にOCT化合物（Tissue-Tek）で凍結し、凍結切片法によって凍結切片を作製した。凍結切片を蒸留水で洗浄し、ブロッキング溶液を用いて室温で1時間インキュベートした。一次抗体をブロッキング溶液に希釈し、試料と共に室温で一晩インキュベートした。次いで、細胞を二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。本実施例で使用した抗体の詳細を表２および表３に示す。
【表２】
2019098349.tif 000003
【０１３２】
【表３】
2019098349.tif 000004
【０１３３】
フローサイトメトリー
細胞をAccutaseで分離した後、BD Cytofix/Cytopermキット（Becton Dickinson）で固定、透過処理、およびブロックした。次に細胞を、ブロッキング溶液で1:100に希釈した一次抗体と共に室温で30分インキュベートした。細胞を2回洗浄した後、ブロッキング溶液で1:500に希釈した二次抗体と共に室温で30分インキュベートした。その後、細胞をFACS AriaIIセルソーター（Becton Dickinson）を用いて分析した。【０１３４】
［結果］
hiPSCから前方中間中胚葉細胞への分化
hPSC由来の前方原始線条細胞をインビトロで前体節中胚葉に分化できることが公知であるため（K.M. Loh et al, Cell 166 (2016) 451-467）、本発明者らはまずhiPSCを前方原始線条に分化し、その後前体節中胚葉に誘導する方法を確立することを目的とした（図１Ａ、図５Ａ）。本発明者らは以前に、アクチビンAおよびGSK3β阻害剤であるCHIR99021を用いてhPSCから前方原始線条を誘導する方法を確立している（S.I. Mae et al, Nat. Commun. 4 (2013) 1367）。そこで以前に作製したOSR-GFPノックインhiPSC株（3D45）（S.I. Mae et al, Nat. Commun. 4 (2013) 1367）を100ng/mlアクチビンAおよび3μM CHIR99021を含むフィーダーフリー培養下で処理し、無血清二次元培養でBRACHYURY＋細胞を誘導した（図５Ｂ）。前方原始線条から前体節中胚葉を誘導するために、既報の方法（K.M. Loh et al, Cell 166 (2016) 451-467）を改変し、前体節中胚葉のマーカーであるTBX6の発現を観察した（図５Ｃ）。MEK阻害剤のPD0325901（これはFGFシグナル伝達の刺激を阻害する）およびRAを用いてhiPSC由来のTBX6＋細胞の発生能を評価した結果、PAX3＋初期体節細胞への分化が見出された（図５Ｄ）。これらの結果は、hiPSCを前方原始線条分化を介して前体節中胚葉に誘導する方法が確立されたことを支持している。【０１３５】
初期前体節中胚葉をFGF9とRAの処理によって前方中間中胚葉に誘導できることが報告されているが（M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564-568）、中間中胚葉の最も初期のマーカーの1つであるOsr1の発現はマウスの中間中胚葉発生においてFgf9よりも早くに検出される（J.S. Colvin et al, Dev. Dyn. 216 (1999) 72-88; P.L. So et al, Mech. Dev. 84 (1999) 157-160; Q. Wang et al, Dev. Biol. 288 (2005) 582-594）。そこで前体節中胚葉および中間中胚葉において発現するFGF8（B. Wilm et al, Dev. Biol. 271 (2004) 176-189）、およびRAアゴニストであるTTNPB（これはOSR1の発現を誘導できる; T. Araoka et al, PLoS One 9 (2014), e84881）を用いて、前方中間中胚葉の発生学的起源を特定した。OSR1（GFP）および前方中間中胚葉マーカーであるGATA3の免疫染色分析の結果、前体節中胚葉細胞は併用処理によってOSR1＋GATA3＋前方中間中胚葉細胞に誘導されず、OSR1＋GATA3−中間中胚葉様細胞に分化したことがわかった（図１Ｂ）。驚くべきことに、前方原始線条細胞が同じ処理でOSR1＋GATA3＋前方中間中胚葉様細胞に分化した（図１Ｂ）。従前の報告は、前方原始線条よりも長くWnt刺激に曝露された前体節中胚葉は後方中間中胚葉に誘導された後、ネフロン前駆（NP）細胞に分化し得ることを示している（M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564-568）。前体節中胚葉からネフロン前駆細胞を誘導するための従前報告されたプロトコル（A. Taguchi et al, Cell Stem Cell 14 (2014) 53-67; M. Takasato et al, Nature 526 (2015) 564-568; R. Morizane et al, Nat. Biotechnol. 33 (2015) 1193-1200）を改変することによって、前体節中胚葉をOSR1＋SIX2＋ネフロン前駆様細胞に分化させることに成功した（図５Ｅ）。これらのデータは前方中間中胚葉と後方中間中胚葉の発生学的起源が異なっていることを示している。【０１３６】
前方中間中胚葉細胞の頑強な誘導方法の確立
前方中間中胚葉細胞の誘導効率を改善するために、TGFβシグナル伝達阻害剤であるA83-01をFGF8およびTTNPBに追加することで、SOX17＋胚体内胚葉細胞の分化が減少した（図５Ｆ）。誘導されたOSR1＋GATA3＋中間中胚葉様細胞は他の前方中間中胚葉マーカー（PAX2、LHX1およびHOXB4を含む）を発現していた（図１Ｃ）。OSR1＋細胞、GATA3＋細胞、LHX1＋細胞およびHOXB4＋細胞は得られた全細胞数に対してそれぞれ46.6±13.6%、35.8±18.2%、69.6±16.5%および67.2±14.5%（n=4）であった（図１Ｄ）。この結果から、前方中間中胚葉細胞は3つの因子（FGF8、TTNPBおよびA83-01）を用いた処理によって前方原始線条から生成することが確認された。【０１３７】
BMPシグナルは腎臓発生の様々な面において重要な役割を担っているため（L. Oxburgh et al, Pediatr. Nephrol. 29 (2014) 531-536）、BMPシグナルの効果を前方原始線条誘導および前方中間中胚葉誘導の各段階において調べた。BMP4を前方原始線条誘導の段階で添加すると、OSR1＋GATA3＋細胞の割合が得られた全細胞数に対して約70%に増加した（図１Ｅ、ＦおよびＨ）。一方、BMPシグナル阻害剤であるLDN193189を前方中間中胚葉誘導段階で添加してもOSR1＋GATA3＋細胞の誘導効率は変化せず、またBMP4の添加は分化を阻害した。これらの結果はBMPシグナルが前方原始線条から前方中間中胚葉への分化に必要でないことを示唆する（図１Ｅ、ＧおよびＨ）。これはBmpシグナル伝達経路の下流の分子であるSmad1がニワトリの発生初期の前方中間中胚葉領域においてリン酸化されていないという知見と一貫している（S. Faure et al, Dev. Biol. 244 (2002) 44-65）。【０１３８】
次に、本願の前方中間中胚葉細胞分化プロトコルが、3D45に加えて、mCherryを構成的に発現するhiPSC株（511-3E; F. Oceguera-Yanez et al, Methods 101 (2016) 43-55）、常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）を患う患者から確立されたhiPSC株（CiRA00009; T. Ameku et al, Sci. Rep. 6 (2016) 30013）およびヒト胚性幹細胞（hESC）株（KhES3; H. Suemori et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 345 (2006) 926-932）を含む複数のhPSC株に適用可能であることを確認した。この結果は本願におけるhPSCから前方中間中胚葉細胞への分化方法の頑強性を支持する（図６）。【０１３９】
ウォルフ管細胞の誘導
ウォルフ管は表層外胚葉から分泌されるWntタンパク質の影響下において前方中間中胚葉から背側に形成されるため（T. Obara-Ishihara et al, Development 126 (1999) 1103-1108）、外因性WNTが前方中間中胚葉細胞からウォルフ管への分化に必要であり得ることが想定される（図２Ａ）。前方中間中胚葉細胞にCHIR99021を添加すると、OSR−GATA3＋PAX2＋細胞の分化が増強された（図２Ｂ）。Osr1発現の低下はウォルフ管誘導の重要なマーカーであるため（F. Costantini et al, Dev. Cell 18 (2010) 698-712）、この所見はウォルフ管分化の開始を示唆している。一方、WNTシグナル伝達阻害剤であるIWR-1を補充すると、OSR1発現が延長され、GATA3およびPAX2発現が減少した（図２Ｂ）。【０１４０】
表層外胚葉および側板中胚葉から分泌されたBmp4のウォルフ管誘導に対する効果に関して、矛盾した結果が報告されている（T. Obara-Ishihara et al, Development 126 (1999) 1103-1108; T. Yoshino et al, Nat. Commun. 7 (2016) 12561）。本発明者らは、BMP4の添加が前方中間中胚葉細胞からウォルフ管への分化を抑制し、LDN193189処理が誘導を増強したことを見出した（図２Ｃ）。これらの結果はWNT活性化とBMP阻害の両方がウォルフ管誘導を促進することを示唆している。【０１４１】
ウォルフ管の最先端の細胞は伸長している間、高用量のFGF8に引きつけられ、ウォルフ管の後部の細胞はFGFシグナルの減少によって上皮化が増強することが知られている（Y. Atsuta et al, Development 142 (2015) 2329-2337）。想定されるように、FGF8の補充はGATA3＋細胞の数を増加させた（図２Ｄ）。また、GDNFの添加はGATA3＋ウォルフ管細胞の数を増加させ（図２ＥおよびＦ）、この細胞は増殖マーカーKi67およびRETを発現していた（図２ＦおよびＧ）。さらにこのGATA3＋ウォルフ管細胞はE-CADHERINを発現していなかったが、PAX2、LHX1およびCytokeratin 8（CK8）を含む他のウォルフ管マーカーを発現していた（図２Ｈ）。この結果はウォルフ管の最先端の細胞に分化していることを示している。本願における分化プロトコルはまた、hESC由来の前方中間中胚葉細胞から伸長する間にウォルフ管細胞を効率的に作製し（図７Ａ）、ウォルフ管細胞に分化しなかった細胞は神経前駆細胞のマーカーであるPAX6またはOSR1を発現していた（図７Ｂ）。【０１４２】
また、ウォルフ管細胞マーカーであるRETの上流はレチノイン酸シグナルであることが知られている。前方中間中胚葉細胞にさらにTTNPBを添加すると初期ウォルフ管細胞が安定的に作製され（データ示さず）、レチノイン酸シグナル伝達阻害剤であるAGN193109を添加するとRET発現が低下した（図８Ａ、Ｂ）。【０１４３】
分枝する尿管芽組織の作製
最近の報告によると、単離されたマウス胚性尿管芽細胞を5つの因子（Gdnf、Fgf1、RA、CHIR99021およびY-27632）で併用処理すると、インビトロにおいて分枝構造の形成が誘導される（S. Yuri et al, Stem Cell Rep. 8 (2017) 401-416）。また、尿管芽の分枝にはYes-associated protein（YAP）活性の抑制が必要であり（A. Reginensi et al, Nat. Commun. 7 (2016) 12309）、ROCK阻害剤であるThiazovivinはYAP活性を阻害する（Y. Oku et al, FEBS Open Bio. 5 (2015) 542-549）。そこで、上記の組合せのRAとY-27632をそれぞれTTNPBとThiazovivinに交換し、この5つの因子の存在下でウォルフ管細胞凝集体を形成することを試みた。2日間浮遊培養した後、GATA3＋細胞は他の細胞種から自発的に分離し、集合してE-CADHENRIN＋上皮構造を形成した（図３ＡおよびＢ）。次いで不要な細胞をピペット操作で機械的に取り除いた（図３Ｃ）。単離された上皮構造は、成熟ウォルフ管マーカーであるRET、CALB1、CDH16およびSOX9を発現していた（図３Ｄ）。【０１４４】
次に尿管芽構造を誘導するため、ウォルフ管上皮凝集体を5つの因子の存在下でマトリゲルに埋め込んだ。その結果、GATA3、PAX2、RETおよびCALB1を発現する尿管芽様出芽構造（図３Ｇ）が形成された（図３ＥおよびＦ）。さらなる培養によって、これらの尿管芽様構造の拡大および分枝組織の形成が誘導された（図３Ｈ）。先端の細胞はRETを発現し（図３Ｈ）、幹の細胞はCK19染色に陽性であった（図３Ｈ）。この結果は極性を有する分枝する尿管芽様組織の発生を示している。【０１４５】
尿管芽組織作製の改良法
前方中間中胚葉細胞からウォルフ管細胞を誘導するための培養時間を延長することによりE-CADHERIN陽性細胞が増加したため（図９ＡおよびＢ）、前方中間中胚葉細胞からウォルフ管細胞を誘導する因子（CHIR99021、LDN193189、FGF8、TTNPBおよびGDNF）を用いてウォルフ管上皮凝集体を作製できることが想定された。ウォルフ管細胞をこれらの因子およびY-27632の存在下で2日間浮遊培養すると、上記の5つの因子（Gdnf、Fgf1、TTNPB、CHIR99021およびThiazovivin）での培養と同様にGATA3＋細胞が他の細胞種から自発的に分離し、集合してE-CADHENRIN＋上皮構造を形成した（図９Ｃ左）。また不要な細胞をピペット操作で機械的に取り除くことも可能であった（図９Ｃ右）。【０１４６】
次に、成熟ウォルフ管凝集体を各因子（CHIR99021、LDN193189、FGF8、TTNPBおよびGDNF）および2%マトリゲルを含むEssential 6培地中で浮遊培養し、尿管芽構造を誘導した（図１０ＡおよびＢ）。その結果、管腔側においてEZRIN、基底膜側においてマトリゲル由来のLAMININが染色された、極性を有する尿管芽が作製された（図１０ＣおよびＤ）。【０１４７】
ウォルフ管細胞の凍結保存
上記方法で前方中間中胚葉細胞から初期ウォルフ管細胞を誘導した後、stem cell bankerを用いてウォルフ管細胞を凍結保存した（図１１Ａ）。この細胞を起眠し、上記改良法と同じ因子（CHIR99021、LDN193189、FGF8、TTNPB、GDNFおよびY-27632）の存在下で浮遊培養することによって、GATA3＋細胞が他の細胞種から自発的に分離し、集合してE-CADHENRIN＋上皮構造を形成した。また、不要な細胞をピペット操作で機械的に取り除くことも可能であった（図１１Ｂ）。【０１４８】
尿管芽組織の分枝の進行
尿管芽組織作製の改良法で得られた極性を有する尿管芽組織を顕微鏡下で成熟ウォルフ管細胞凝集体から機械的に単離し、低濃度マトリゲル含有培地で浮遊培養した。その結果、尿管芽オルガノイドが作製された（図１２Ａ〜Ｃ）。この尿管芽オルガノイドは極性を維持しており（図１２Ｆ）、RET陽性の先端の細胞およびCK8陽性の幹の細胞を含んでいた（図１２ＤおよびＥ）。【０１４９】
次に、この尿管芽オルガノイドの分枝の先端領域を機械的に切り取り、単離した尿管芽先端組織を低濃度マトリゲル含有培地で浮遊培養した。その結果、再度分枝構造を形成する尿管芽オルガノイドを作製できることがわかった（図１３Ａ〜Ｃ）。作製した尿管芽オルガノイドの先端領域を切り取り、切り取った尿管芽先端組織を浮遊培養して尿管芽オルガノイドを作製することを繰り返すことで、尿管芽先端組織を維持できることが示された。【０１５０】
尿管芽オルガノイドの拡大培養法
尿管芽組織作製の改良法で得られた極性を有する尿管芽様組織を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共にAccutase処理によって単一細胞ごとに分離した。これらの細胞をハイドロゲル上で三次元培養した結果、GATA3/RET共陽性の尿管芽先端組織が多数作製された（図１４Ａ〜Ｄ）。また、作製された尿管芽先端組織を低濃度マトリゲル培地中で浮遊培養させると、尿管芽オルガノイドが作製された（図１５Ａ〜Ｄ）。これらの結果は、極性を有する尿管芽を成熟ウォルフ管細胞凝集体と共に単一細胞ごとに分離し、培養することによって、1つの凝集体から多数の尿管芽オルガノイドを作製できることを示している。【０１５１】
集合管前駆細胞の誘導
尿管芽オルガノイドの拡大培養法において、ハイドロゲル上で三次元培養することによって得られたGATA3/RET共陽性の尿管芽先端組織をAccutase処理によって単一細胞ごとに分離した。これらの細胞を接着培養した結果、細胞は集合管前駆細胞マーカーであるアクアポリン2（AQP2）を発現していた（図１６ＡおよびＢ）。
【図１Ａ】
2019098349.tif 000005
【図１Ｂ】
2019098349.tif 000006
【図１Ｃ】
2019098349.tif 000007
【図１Ｄ】
2019098349.tif 000008
【図１Ｅ】
2019098349.tif 000009
【図１Ｆ】
2019098349.tif 000010
【図１Ｇ】
2019098349.tif 000011
【図１Ｈ】
2019098349.tif 000012
【図２Ａ】
2019098349.tif 000013
【図２Ｂ】
2019098349.tif 000014
【図２Ｃ】
2019098349.tif 000015
【図２Ｄ】
2019098349.tif 000016
【図２Ｅ】
2019098349.tif 000017
【図２Ｆ】
2019098349.tif 000018
【図２Ｇ】
2019098349.tif 000019
【図２Ｈ】
2019098349.tif 000020
【図３Ａ】
2019098349.tif 000021
【図３Ｂ】
2019098349.tif 000022
【図３Ｃ】
2019098349.tif 000023
【図３Ｄ】
2019098349.tif 000024
【図３Ｅ】
2019098349.tif 000025
【図３Ｆ】
2019098349.tif 000026
【図３Ｇ】
2019098349.tif 000027
【図３Ｈ】
2019098349.tif 000028
【図４】
2019098349.tif 000029
【図５Ａ】
2019098349.tif 000030
【図５Ｂ】
2019098349.tif 000031
【図５Ｃ】
2019098349.tif 000032
【図５Ｄ】
2019098349.tif 000033
【図５Ｅ】
2019098349.tif 000034
【図５Ｆ】
2019098349.tif 000035
【図６】
2019098349.tif 000036
【図７Ａ】
2019098349.tif 000037
【図７Ｂ】
2019098349.tif 000038
【図８Ａ】
2019098349.tif 000039
【図８Ｂ】
2019098349.tif 000040
【図９Ａ】
2019098349.tif 000041
【図９Ｂ】
2019098349.tif 000042
【図９Ｃ】
2019098349.tif 000043
【図１０Ａ】
2019098349.tif 000044
【図１０Ｂ】
2019098349.tif 000045
【図１０Ｃ】
2019098349.tif 000046
【図１０Ｄ】
2019098349.tif 000047
【図１１Ａ】
2019098349.tif 000048
【図１１Ｂ】
2019098349.tif 000049
【図１２Ａ】
2019098349.tif 000050
【図１２Ｂ】
2019098349.tif 000051
【図１２Ｃ】
2019098349.tif 000052
【図１２Ｄ】
2019098349.tif 000053
【図１２Ｅ】
2019098349.tif 000054
【図１２Ｆ】
2019098349.tif 000055
【図１３Ａ】
2019098349.tif 000056
【図１３Ｂ】
2019098349.tif 000057
【図１３Ｃ】
2019098349.tif 000058
【図１４Ａ】
2019098349.tif 000059
【図１４Ｂ】
2019098349.tif 000060
【図１４Ｃ】
2019098349.tif 000061
【図１４Ｄ】
2019098349.tif 000062
【図１５Ａ】
2019098349.tif 000063
【図１５Ｂ】
2019098349.tif 000064
【図１５Ｃ】
2019098349.tif 000065
【図１５Ｄ】
2019098349.tif 000066
【図１６Ａ】
2019098349.tif 000067
【図１６Ｂ】
2019098349.tif 000068
【国際調査報告】
2019098349.tif 000069
2019098349.tif 000070
2019098349.tif 000071
2019098349.tif 000072