(57)【要約】  安定性を高めたＰＡＣＡＰペプチドの提供を目的とする。ＰＡＣＡＰの配列中の３位及び/又は８位のアスパラギン酸のカルボキシ基をテトラゾールで置換することにより、安定性が有意に亢進することを見いだしたことにより課題が解決される。
2019098254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）
｛式中、Ｘ1は中性アミノ酸、Ｘ2は中性アミノ酸、Ｘ3は中性アミノ酸、Ｘ4は塩基性アミノ酸、Ｘ5は中性アミノ酸またはｅｇＴｚ、Ｘ6は非極性アミノ酸、Ｘ7は非極性アミノ酸、Ｘ8は塩基性アミノ酸、Ｘ9は塩基性アミノ酸、Ｘ10は中性アミノ酸である｝
で表される配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列又はその改変配列からなるペプチドであって、前記ペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１ＲおよびＶＰＡＣＲ２への結合性を有し、前記改変配列が、配列番号３の配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である、前記ペプチド。
【請求項２】
X1、X2、及びX3における中性アミノ酸が、アラニン又はセリンである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
X4、X8、及びX9における塩基性アミノ酸が、リジン又はアルギニンである、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
X5が、グルタミン、アラニン、又は、eｇTzである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
さらにX6がメチオニン、ノルロイシン、アラニン又はロイシンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
X7が、バリン又はアラニンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
X10が、ロイシン又はアラニンである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号３の３位及び８位のアスパラギン酸のカルボキシ基が、テトラゾールに置換される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化又はメシル化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
１又は２個のアミノ酸が、欠失される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
以下の：
GKRYKQRVKNK（配列番号３７）；
GKRYKQRVKN（配列番号３８）；
GKRYKQRVK（配列番号３９）；
GKRYKQRV（配列番号４０）；
GKRYKQR（配列番号４１）；
GKRYKQ（配列番号４２）；
GKRYK（配列番号４３）；
GKRY（配列番号４４）；
GKR；
GRR；
GK；及び
GR
G；
からなる群から選択される１の配列が、前記ペプチドのＣ末端に付加される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、神経保護剤。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、涙液分泌促進剤。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、抗炎症剤。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、血管内皮機能改善剤。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、角膜上皮障害治療剤又は角膜内皮障害治療剤。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、ドライアイ治療剤。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＰＡＣＡＰの生理活性を有する安定化ペプチド、当該ペプチドを含む神経保護剤、角膜神経突起形成促進剤、涙液分泌促進剤、ドライアイ治療剤、角膜上皮障害治療剤、角膜内皮障害治療剤、血管内皮機能改善剤、抗炎症剤、又は医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、中枢神経系と末梢神経系に大別される神経系を構成する細胞である。神経細胞は、脳卒中、脳梗塞などの脳血管障害などの外的要因や、異常タンパク質の蓄積、酸化ストレス、炎症などの内的要因などにより障害を受けやすい一方で、その再生能が低いことから、ひとたび障害が生じると、その患者のＱＯＬを著しく低下させる要因となる。中枢神経系の神経変性および脱落を伴う神経変性疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症などの神経変性疾患の他に、緑内障などの視神経の変性疾患や、神経性難聴などの感覚神経変性疾患が挙げられる。【０００３】
神経科学の発展により、各種の神経保護因子が発見されてきており、神経障害の予防又は治療薬としての開発が期待される。神経変性を引き起こすフリーラジカルや興奮性アミノ酸を減少させる薬剤や、神経細胞を保護及び/又は修復することができる薬剤（例えば神経栄養因子や免疫抑制剤などのイムノフィリンリガンドなど）が神経保護作用を有することが見いだされている一方で、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ＣＤ４４やヒト脳カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＢＣＰＢ）などの生体内タンパク質が、神経保護作用を有することが見いだされてきている（特許文献１及び２）。【０００４】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、ヒツジ視床下部抽出物から発見された神経ペプチドである。ＰＡＣＡＰは、下垂体前葉細胞においてｃＡＭＰ形成を刺激する活性を有しうる。ＰＡＣＡＰとしては、３８個のアミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ３８と、２７個のアミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ２７が存在しており、両者とも同等の作用を有する（非特許文献１及び２）。ＰＡＣＡＰは、血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）／セクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属しており、ヒトＰＡＣＡＰ２７の配列は、血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）と６８％の同一性を有する。ＰＡＣＡＰとＶＩＰは、ＰＡＣ１受容体（ＰＡＣ１Ｒ）、ＶＰＡＣ１受容体（ＶＰＡＣ１Ｒ）及びＶＰＡＣ２受容体（ＶＰＡＣ２Ｒ）に結合するがその親和性が異なっている。ＰＡＣ１Ｒは、ＰＡＣＡＰに対して高い選択性を持って結合し、ＰＡＣＡＰに対する親和性は、ＶＩＰに対する親和性と比較して１０００倍以上である。一方で、ＶＰＡＣ１Ｒ及びＶＰＡＣ２Ｒは共に、ＰＡＣＡＰとＶＩＰに対して同程度の親和性を有する。ＰＡＣＡＰは、多様な生理作用を有しており、神経保護物質、免疫抑制因子、血管拡張因子、外分泌線分泌促進因子（特許文献３）、神経突起形成促進因子（特許文献４）としての生理作用が知られている。【０００５】
ＰＡＣＡＰの有する多様な生理活性を利用して、医薬品の開発が行われてきている。しかしながら、ＰＡＣＡＰのような比較的短いペプチドは、水溶液中において不安定であることが多く、またプロテアーゼ耐性を欠如することに起因して生体内での半減期が短いといった問題が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１４−５１０１０１号公報
【特許文献２】特開２０１２−２３２９５２号公報
【特許文献３】特開２００９−２６９８１８号公報
【特許文献４】ＷＯ２００５／１０２３７５号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. Bourgault (2009) Current Medicinal Chemistry 16, 4462-4480
【非特許文献２】Louise Dickson (2009) Pharmacology & Therapeutics, 12, 294−316
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、水溶液中で安定性の高いＰＡＣＡＰの安定化ペプチド、当該ペプチドを含む神経保護剤、神経突起形成促進剤、涙腺分泌促進剤、ドライアイ治療又は予防用医薬組成物、角膜上皮障害治療又は予防用医薬組成物、神経障害治療又は予防用医薬組成物、角膜内皮障害治療又は予防用医薬組成物、血管内皮機能改善剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが、ＰＡＣＡＰの水溶液中での安定性を高めるために鋭意研究を行った結果、ＰＡＣＡＰペプチド中に存在するアスパラギン酸のカルボキシ基をテトラゾールに置換することで、水溶液中での安定性を大幅に高めることができることを見いだし、本発明に至った。【００１０】
そこで、本発明は以下のものに関する：
［１］下記の式：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）
｛式中、Ｘ1は中性アミノ酸、Ｘ2は中性アミノ酸、Ｘ3は中性アミノ酸、Ｘ4は塩基性アミノ酸、Ｘ5は中性アミノ酸またはｅｇＴｚ、Ｘ6は非極性アミノ酸、Ｘ7は非極性アミノ酸、Ｘ8は塩基性アミノ酸、Ｘ9は塩基性アミノ酸、Ｘ10は非極性アミノ酸である｝
で表される配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列又はその改変配列からなるペプチドであって、前記ペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１ＲおよびＶＰＡＣＲ２への結合性を有し、前記改変配列が、配列番号３の配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である、前記ペプチド。
［２］  X1、X2、及びX3における中性アミノ酸が、アラニン又はセリンである、項目１に記載のペプチド。
［３］  X4、X8、及びX9における塩基性アミノ酸が、リジン又はアルギニンである、項目１又は２に記載のペプチド。
［４］  X5が、グルタミン、アラニン、又はegTzである、項目１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
［５］  さらにX6がメチオニン、ノルロイシン、ロイシン又はアラニンである、項目１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
［６］  X7が、バリン又はアラニンである、項目１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
［７］  X10が、ロイシン又はアラニンである、項目１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
［８］  配列番号３の３位及び８位のアスパラギン酸のカルボキシ基が、テトラゾールに置換される、項目１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
［９］  前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化又はメシル化されている、項目１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。
［１０］  前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化されている、項目１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
［１１］  １又は２個のアミノ酸が、欠失される、項目１〜１０のいずれか一項に記載のペプチド。
［１２］  以下の：
GKRYKQRVKNK（配列番号３７）；
GKRYKQRVKN（配列番号３８）；
GKRYKQRVK（配列番号３９）；
GKRYKQRV（配列番号４０）；
GKRYKQR（配列番号４１）；
GKRYKQ（配列番号４２）；
GKRYK（配列番号４３）；
GKRY（配列番号４４）
GKR；
GRR；
GK；及び
GR
G；
からなる群から選択される１の配列が、前記ペプチドのC末端に付加される、項目１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
［１３］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、神経保護剤。
［１４］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、涙液分泌促進剤。
［１５］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、抗炎症剤。
［１６］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、血管内皮機能改善剤。
［１７］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、角膜上皮障害治療剤又は角膜内皮障害治療剤。
［１８］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、ドライアイ治療剤。
［１９］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを含む、医薬組成物。
［２０］  項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、神経保護、涙液分泌促進、血管内皮機能改善又は炎症抑制のための方法。
［２１］  神経障害、涙液減少疾患、角膜上皮障害又は角膜内皮障害、炎症疾患又はドライアイの治療又は予防において使用するための、項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチド。
［２２］  神経保護剤、涙液分泌促進剤、角膜上皮障害治療剤、角膜内皮障害治療剤、抗炎症剤又はドライアイ治療剤の製造における、項目１〜１２のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、水溶液中で不安定であったＰＡＣＡＰを、大幅に安定化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ＰＡＣ１Ｒ高発現細胞株における、各ペプチド（ペプチド１、２、６〜９）によるｃＡＭＰ誘導作用を示す。
【図２】図２は、ＶＰＡＣ１Ｒ高発現細胞株における、各ペプチド（ペプチド１、２、６〜９）によるｃＡＭＰ誘導作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＰＡＣＡＰの３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列又はその改変配列とからなるペプチドに関し、かかるペプチドは、ＰＡＣＡＰと比較して、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの同程度の結合性を有する。それぞれの受容体へのＥＣ５０はＰＡＣＡＰと比較して、１０倍以内であればよく、好ましくは５倍以内、より好ましくは３倍以内である。ＰＡＣＡＰは、３８の残基からなるＰＡＣＡＰ３８、又は２７残基からなるＰＡＣＡＰ２７のいずれであってもよい。ＰＡＣＡＰ３８及びＰＡＣＡＰ２７は、下記の配列を有する：
【化１】
2019098254.tif 000003
【００１４】
本発明において、改変配列とは、元の配列に対して１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加された配列のことをいう。より好ましくは、改変配列とは、元の配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列のことをいう。
【００１５】
アミノ酸の置換は、改変配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。改変配列からなるペプチドにおいて、結合性を維持する観点から、ＰＡＣＡＰ２７の、２位、９位、１１位、１５位〜１７位、１９位〜２１位、及び２７位の位置において、アミノ酸置換が生じうる。特に好ましい態様では、下記の配列：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）
において、X1〜X10で示される位置のアミノ酸が置換されうる。
【００１６】
アミノ酸置換は、１又は複数個のアミノ酸が置換されていてもよいが、活性を維持する観点から、１〜１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が置換されうる。なかでも、１〜４個のアミノ酸の置換が特に好ましく、より好ましくは３個のアミノ酸が置換され、さらにより好ましくは２個のアミノ酸が置換され、特に好ましくは１のアミノ酸が置換される。
【００１７】
アミノ酸の欠失は、改変配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。欠失されるアミノ酸の数は、１〜１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０から選ばれる。結合性を変化させない観点から、１又は２個のアミノ酸の欠失が特に好ましい。アミノ酸の欠失は、元の配列のＮ末端側又はＣ末端側から欠失されてもよいし、配列の内部から欠失されてもよい。ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ３８のＣ末端側に存在するアミノ酸は欠失されても結合性に影響が少ないと考えられる。
【００１８】
アミノ酸の付加は、改変配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。付加されるアミノ酸の数は、１〜１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０から選ばれる。アミノ酸は、元の配列のＮ末端側又はＣ末端側に付加されてもよいし、配列の内部に付加されてもよい。ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ２７のＣ末端に任意のアミノ酸を付加されても結合性に影響が少ないと考えられる。
【００１９】
本発明の１の態様は、下記の式：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）
｛式中、X1は中性アミノ酸、X2は中性アミノ酸、X3は中性アミノ酸、X4は塩基性アミノ酸、X5は中性アミノ酸またはegTz、X6は非極性アミノ酸、X7は非極性アミノ酸、X8は塩基性アミノ酸、X9は塩基性アミノ酸、X10は非極性アミノ酸である｝
の配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列、又はその改変配列からなるペプチドであって、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有するペプチドに関する。
【００２０】
X1〜X10で表されるアミノ酸は、同じ属性を有するアミノ酸によって、保存的に置換されうる。一例として、保存的置換は、下記のグループの内のアミノ酸の置換をいう：
１非極性アミノ酸：Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、Ala
２中性アミノ酸：Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、Gly
３塩基性アミノ酸：Lys、Arg、His
４酸性アミノ酸：Asp、Glu
【００２１】
X1、X2、及びX3における中性アミノ酸は、Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、又はGlyであり、より好ましくは、Ala又はSerである。
【００２２】
X4、X8、及びX9における塩基性アミノ酸は、Lys、Arg、又はHisであり、より好ましくはLys又はArgである。
【００２３】
X5における中性アミノ酸は、Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、又はGlyであり、より好ましくは、Ala、又はGlnである。X5は、さらにグルタミンのアミドがテトラゾールに置換されたアミノ酸（egTz）であってもよい。
【００２４】
X6における非極性アミノ酸は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、又はAlaであり、より好ましくは、Met、Nle、Leu、又はAlaである。
【００２５】
X7における非極性アミノ酸は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、又はAlaであり、より好ましくは、Val、又はAlaである。
【００２６】
X10非極性アミノ酸は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、又はAlaであり、より好ましくは、Leu又はAlaである。
【００２７】
配列番号３の配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列の改変配列とは、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である。より好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は２個のアミノ酸が欠失されうるし、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して下記のＣ末端付加配列が付加されうる。
【００２８】
理論によって限定されることを意図するものではないが、ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ２７においてＣ末端側へのアミノ酸付加は、ＰＡＣ１Ｒへの結合性に影響しない。したがって、本発明がＰＡＣＡＰ２７に関する場合、さらにとＣ末端付加配列を含むことができるし、Ｃ末端付加配列は存在しなくてもよい。Ｃ末端付加配列は、１〜１１の任意のアミノ酸からなる配列をいう。Ｃ末端付加配列は、ＰＡＣＡＰ３８の２８位〜３８位のアミノ酸に対応することが好ましい。したがって、Ｃ末端配列としては下記の配列が挙げられる：
GKRYKQRVKNK（配列番号３７）；
GKRYKQRVKN（配列番号３８）；
GKRYKQRVK（配列番号３９）；
GKRYKQRV（配列番号４０）；
GKRYKQR（配列番号４１）；
GKRYKQ（配列番号４２）；
GKRYK（配列番号４３）；
GKRY（配列番号４４）
GKR；
GRR；
GK；及び
GR；
G。
【００２９】
本発明に係るペプチドは、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び／又はＶＰＡＣ２Ｒに対する結合性が失われない限りにおいて、Ｄ体またはＬ体のアミノ酸、２−アミノイソ酪酸やＬ−２−アミノイソ酪酸のような非天然アミノ酸で構成されていてもよく、Ｎ末端のアミノ基、Ｃ末端のカルボキシ基又はアミノ酸側鎖の官能基が任意に修飾された誘導体が含まれる。修飾の例としては、アミノ基への保護基の付加（例えば、アセチル化、メシル化、ウレア化、カルバメート化、ホルミル化、Ｂｏｃ化、Ｆｍｏｃ化）、カルボキシ基のエステル化（エチル化など）などが挙げられる。また、通常生体内で生じうる修飾、例えばリン酸化、アミド化、メチル化、エステル化、アセチル化などの他、合成過程で生じるか、又は精製を容易にする修飾、例えばビオチン化が含まれてもよい。また、ペプチドの生体内半減期を延長する目的で、ＰＥＧ化などの修飾が行われてもよい。特に、安定性を高める観点から、Ｎ末端のアミノ酸の遊離アミノ基がアセチル化またはメシル化されうる。ＰＡＣＡＰの３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列からなるペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化またはメシル化されることにより、安定性が更に向上する。Ｃ末端はカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよく、さらには、糖鎖付加されていてもよい（例えば、ＷＯ２０１７／０２７８４８を参照）。
【００３０】
本発明の具体的な態様では、本発明は下記表１に示される配列を有するペプチド３〜３４に関する：
【表１】
2019098254.tif 000004
【００３１】
アスパラギン酸のカルボキシ基が、テトラゾールに置換されたアミノ酸は下記の構造を有する：
【化２】
2019098254.tif 000005
また、本明細書中において、配列中の表記として「Tz」を用いるものとする。
【００３２】
さらに、グルタミンのアミドがテトラゾールに置換されたアミノ酸は下記の構造を有する：
【化３】
2019098254.tif 000006
また、本明細書中において、配列中の表記として「egTz」を用いるものとする。
【００３３】
本発明に係るペプチドは、任意の製造方法により製造することができる。例えば、Ｂｏｃ法又はＦｍｏｃ法等を用いて固相合成又は液相合成を行うことにより製造することができる。また、別法では、本発明のペプチドをコードする核酸を遺伝子導入法により、宿主細胞に導入し、宿主細胞により合成させることにより製造することができる。この場合ペプチドの末端にポリヒスチジンタグ等のタグペプチドを付加するように設計することで、発現後に精製を容易にすることができる。
【００３４】
本発明に係るペプチドは、医薬上許容される塩が含まれる。医薬上許容される塩としては、無機酸との塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機酸との塩（例えば、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩等）、又は塩基との塩（例えば、アンモニウム塩、メチルピリジニウム塩、アセチルピリジニウム塩等）が挙げられる。本発明に係るペプチドは、水和物、又は溶媒和物も含まれる。
【００３５】
Ｎ末端がメシル化されたヒスチジンは反応式１に示される方法又はこれに準じた方法により製造することができる。
【化４】
2019098254.tif 000007
｛式中、Ｔｒｔはトリチル基、Ｍｅはメチル基を表す。｝
【００３６】
反応式１の方法では、一般式化合物（Ｉ）で表される化合物を塩基存在下、塩化メタンスルホニルを反応させることにより、化合物（ＩＩ）を製造し、次いで、化合物（ＩＩ）をメタノール中、塩基を用いた加水分解により化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。
【００３７】
化合物（ＩＩ）の製造において、塩基は化合物（Ｉ）に対して０．２〜５当量、好ましくは１〜３当量使用される。用いる塩基はトリエチルアミン、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジンが挙げられ、好ましくはトリエチルアミンを挙げることができる。塩化メタンスルホニルは０．１〜５当量、好ましくは１〜２当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トルエン等が挙げられ、好ましくはジクロロメタンを挙げることができる。反応温度は、通常１℃〜３０℃、好ましくは１５℃〜２５℃であり、反応時間は、通常０．５時間〜１２時間、好ましくは０．５時間〜２時間である。
【００３８】
化合物（ＩＩＩ）の製造において、塩基は化合物（ＩＩ）に対して、０．１〜１０当量、好ましくは１〜３当量使用される。塩基として、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げることができるが、好ましくは水酸化カリウムを挙げることができる。溶媒は有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、１、４−ジオキサンおよびテトラヒドロフラン）と水との混合溶媒が挙げられ、好ましくはメタノールおよび水との混合溶媒を挙げることができる。反応時間は、用いる試薬又は溶媒により異なるが、通常０．５時間〜１２時間、好ましくは０．５時間〜３時間である。反応温度は、用いる試薬又は溶媒により異なるが、通常０℃〜１００℃、好ましくは６０℃〜１００℃である。
【００３９】
本発明にかかるペプチドは、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへ結合することで、ＰＡＣＡＰと同様の生理活性を発揮することができる。すなわち本発明にかかるペプチドは、一例として、神経保護物質、神経再生因子、創傷治癒促進因子、炎症抑制因子、外分泌線分泌促進因子としての生理作用を発揮することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明にかかるペプチドを含む、神経保護剤、神経再生剤、創傷治癒剤、抗炎症剤、角膜上皮障害治療剤、角膜内皮障害治療剤、血管内皮機能改善剤、ドライアイ治療剤又は外分泌線分泌促進剤に関してもよい。さらに別の態様では、本発明にかかるペプチドを含む医薬組成物にも関する。
【００４０】
本発明にかかる神経保護剤は、神経保護作用を有する薬剤のことをいう。したがって、神経保護剤は、神経細胞の損傷、変性及び／又は細胞死を伴う障害から神経を保護することができ、神経細胞死（アポトーシス及び/又はネクローシス）抑制剤、神経細胞変性抑制剤、神経細胞ストレス軽減剤、神経細胞毒性抵抗性の改善剤、神経細胞の生存性の改善剤、異常タンパク質蓄積抑制剤ということもできる。
【００４１】
本明細書において、神経保護作用とは、神経細胞をその損傷、変性、及び／又は細胞死から保護する作用のことをいい、好ましくは神経細胞死から保護する作用をいう。より具体的には、神経保護作用には、神経細胞死（アポトーシス及び/又はネクローシス）の抑制、神経細胞変性の抑制、神経細胞ストレスの軽減、神経細胞毒性の抵抗性の向上、神経細胞の生存性の向上、異常タンパク質蓄積抑制などが含まれてもよい。神経細胞は、物理的な損傷の他、神経毒性物質に対する暴露、酸素や栄養物質の欠乏により損傷を受け、損傷が一定のレベルを超えると細胞死が引き起こされる。また、神経細胞は、神経毒性物質を蓄積することで変性を受け、最終的に細胞死が引き起こされる。神経毒性物質は、外因性の毒性物質と内因性の毒性物質に大別される。外因性の毒性物質として、重金属や、アルコール、ボツリヌス毒素などの化学物質が挙げられる。内因性の毒性物質としては、活性酸素種、グルタミン酸などの神経伝達物質、異常タンパク質などが知られている。神経保護作用は、当業者であれば容易に測定することができる。一例として、各種ストレス、例えば低酸素負荷、神経毒性物質への暴露、栄養枯渇、紫外線照射などの条件下で、被験物質を含む培地（薬物群）又は被験物質を含まない培地（対照群）で神経細胞を培養し、培地中の生存細胞数と死細胞数を測定し、全細胞数に対する生存細胞数の割合を算出し、薬物群の生細胞数の割合が対照群の生細胞数の割合より高い場合に、被験物質が神経保護作用を有すると判断することができる。より好ましい態様では、神経保護作用を有することが知られている物質、例えばＩＧＦ−１やＮＧＦなどを添加した陽性対照群と比較し、陽性対照群と同等又はそれ以上の保護作用を有するか否かにより測定することができる。別の例としてはin vivoの動物実験を行うことで神経保護作用を測定してもよい。
【００４２】
本発明のペプチドは、ＰＡＣＡＰが有する外分泌腺分泌促進作用を有する。外分泌腺として、涙腺、唾液腺などが挙げられることから、外分泌腺分泌促進剤、例えば涙液分泌促進剤や唾液分泌促進剤として使用することができる。理論に限定されることを意図するものではないが、ＰＡＣＡＰ、及び本発明のペプチドは、外分泌腺の腺房細胞において発現する受容体（ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ２Ｒ）に結合することで、唾液や涙液の分泌を促進する。涙液は角結膜の表面を覆い、その湿潤性を保つとともに、角膜表面の微絨毛による陥凹を涙液が満たして表面を平滑にするので鮮明な像を得ることが可能となる。また、角結膜の上皮細胞は活発に代謝を行ない、その最表面から不要となった細胞や代謝産物が脱落排出されているが、涙液はそれらを洗い流す一方で、必要な酸素や栄養分を供給している。さらに、涙液は角結膜表面に混入した異物を洗い流し、外界から進入したウイルス、細菌、真菌などに対しては涙液の静菌作用によって感染防御の役割を担っている。また、眼瞼と角結膜との間の滑液として瞬目や眼球運動がスムーズに行われるにように働いている。このように涙液は角結膜表面にわずかな薄膜を形成する微量の液体であるが、さまざまの精巧な仕組みにより角膜の透明性や恒常性の維持に欠かすことができないものである。涙液の分泌障害により角結膜表面に異常を生じた状態を一般にドライアイというが、ドライアイによる角結膜障害が起こった場合、涙液分泌を促進する化合物を創製することは、ドライアイおよびドライアイを伴う疾病に対して有用な予防治療薬となる。本発明にかかるペプチドは、涙液分泌促進剤として目薬などの点眼剤に配合することができる。
【００４３】
本発明のペプチドは、ＰＡＣＡＰが有する炎症抑制作用を有することから、抗炎症剤として使用することができる。理論に限定されることを意図するものではないが、ＰＡＣＡＰ、及び本発明のペプチドは、ＶＥＧＦならびに炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２等）の産生を抑制することができる。特に、ＰＡＣＡＰの受容体であるＶＰＡＣ１ＲとＶＰＡＣ２Ｒは、消化管に広く分布し、さらに炎症抑制作用を示すことから、特に炎症性腸疾患などの治療に使用しうる。
【００４４】
別の局面において、本発明は、上記のペプチドの治療有効量を含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、ＰＡＣＡＰの生理作用により改善される疾患の治療又は予防に使用されうる。ＰＡＣＡＰの生理作用により改善される疾患としては、神経障害、涙液減少に関連する疾患、炎症性疾患などが挙げられる。本発明の医薬組成物は、患者に対して投与することで、ＰＡＣＡＰの生理作用により改善される疾患を治療することができるし、或いはこのような疾患を患う可能性のある患者に対し投与することで、疾患を予防することができる。また、「治療」とは、障害又は疾患が発症した際にそれらの状態の悪化を防止し、進行を遅らせ、それらの状態を現状維持、軽減又は消退させることをいい、「予防」とは障害又は疾患の発症をその発症前に防止することをいう。
【００４５】
神経障害とは、神経細胞の変性・細胞死に起因して、その機能が損なわれる病態をいい、脳および網膜血管障害及び神経変性疾患が含まれる。
【００４６】
血管障害としては、出血性の障害、例えば脳出血、くも膜下出血と、脳血管の閉塞による障害、例えば脳血栓、脳梗塞、脳循環不全症などが挙げられる。出血性障害及び閉塞性障害のいずれの障害であっても、脳内の神経細胞は低酸素状態に置かれ、細胞死を生じる。また、網膜での血管障害としては、高血圧性網膜症や糖尿病性網膜症、網膜中心動脈閉塞、網膜中心静脈閉塞などがあり、網膜内の神経細胞は、低酸素状態に置かれ、細胞死を生じる。したがって、こうした血管障害に対して、本発明に係るペプチド、神経保護剤、血管内皮機能改善剤、又は医薬組成物は、治療又は予防の目的で投与することができる。
【００４７】
神経変性疾患としては、非限定的に、認知症、パーキンソン病、脊髄小脳変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、狂牛病、てんかんなどの脳・中枢神経変性疾患、脊椎性進行性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、球脊椎性筋萎縮症などの運動神経変性疾患、知覚神経変性疾患などが挙げられる。知覚神経変性疾患としては、非限定的に、視覚、聴覚、触覚、味覚及び嗅覚神経の変性疾患が挙げられ、視覚変性疾患としては、緑内障、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症などが挙げられ、聴覚神経変性疾患としては、難聴などが挙げられる。
【００４８】
涙液減少に関連する疾患としては、非限定的に、ドライアイ、乾性角結膜炎、涙液減少症、などが挙げられる。
【００４９】
角膜上皮障害とは、角膜上皮細胞増殖能が抑制されたり、上皮脱落が亢進すると上皮恒常性のバランスが崩れ発症する疾患である。また、角膜上皮障害とは、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、糖尿病性角膜症、乾性角結膜炎、慢性表層角膜炎、点状表層角膜症、角膜糜爛、遷延性角膜上皮欠損などの内因性疾患、薬剤性、外傷、コンタクトレンズ装着等による外因性疾患、または物理的もしくは化学的障害によって、角膜上皮が損傷を受けることを意味する。
【００５０】
ドライアイとは、様々な要因による涙液および角結膜上皮の慢性疾患であり、眼不快感や視機能異常を伴う疾患である。涙液の異常としては、涙液量が減少する量的異常と涙液の性質や涙液を保持する能力が変化する質的異常とがある。また、ドライアイとしては、例えば涙液減少症、涙液蒸発亢進型ドライアイおよびシェーグレン症候群、スティーブンス−ジョンソン症候群、角膜上皮糜爛、眼瞼縁炎、眼類天疱瘡、春季カタル、アレルギー性結膜炎、ビタミンＡ欠乏症などに伴うドライアイなどが挙げられる。
【００５１】
炎症性疾患としては、非限定的に、喘息、アトピー性皮膚炎、じんま疹、花粉症、アナフィラキシーショック、副鼻腔炎（好酸球性副鼻腔炎を含む）、リウマチ、多発性硬化症、関節炎、全身性エリトマトーデス、乾癬、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、グルテン感受性腸疾患等）、シェーグレン症候群、慢性移植片対宿主病（GVHD）、角膜感染症、アレルギ-性結膜炎、角膜外傷、多発性筋炎、皮膚筋炎、重症筋無力症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、強皮症などが挙げられる。
【００５２】
角膜内皮障害とは、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後の持続する角膜内皮密度減少、外傷、眼科手術、加齢、および角膜内皮炎に関連する障害が挙げられる。
【００５３】
血管内皮細胞の障害が認められる疾患としては、非限定的に、糖尿病、高血圧症、動脈硬化症などが挙げられる。
【００５４】
本発明にかかるペプチド、又は当該ペプチドを含む、神経保護剤、神経再生剤、抗炎症剤、創傷治癒促進剤又は外分泌線分泌促進剤、或いは医薬組成物は、治療対象疾患に応じて非経口投与又は経口投与されうる。経口投与としては、舌下、口腔内、内服投与が挙げられる。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、局所、腹腔内、筋肉内、経鼻、経皮、経粘膜、髄膜内、経直腸、筋肉内、脳内、髄膜内、くも膜下、硬膜内、硬膜外、点眼、点耳、点鼻、眼内の経路で投与することができる。眼内経路としては、さらに具体的に、結膜下、テノン嚢下、硝子体内の経路が挙げられる。本発明にかかるペプチドを含む医薬組成物は、その投与経路に応じて適宜剤形することができ、例えば点眼剤、注射剤、粉末剤、輸液製剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよいが、非経口投与する観点では、点眼剤、注射剤、輸液製剤、用時調製用の粉末剤等が好ましい。眼内投与用の製剤として、例えば硝子体内注射剤、結膜下注射剤、及びテノン嚢下注射剤が挙げられる。また、これらの製剤は製薬上許容される種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。また、神経保護効果、炎症抑制効果又は外分泌線分泌効果を有する別の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
【００５５】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００５６】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００５７】
実施例１：ペプチド合成１
Ms-His(Trt)-OMeの合成
【化５】
2019098254.tif 000008
N-im-トリチル-L-ヒスチジンメチルエステル塩酸塩（2.02 g、 4.5 mmol）のジクロロメタン溶液（15 mL）にトリエチルアミン（1.0 mL、 7.2 mmol）およびメタンスルホニルクロライド（326.8 mg、 2.9 mmol）のジクロロメタン溶液（1.0 mL）を加え、室温下で1時間撹拌した。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、淡黄色の固体を得た（2.35 g, >100%）。得られた固体はさらに精製することなく次の反応に用いた。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 (1H, d, J = 1.2 Hz), 7.34-7.31 (9H, m), 7.12-7.08 (6H, m), 6.57 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.30 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.40 (1H, dt, J = 8.4, 5.2 Hz), 3.65 (3H, s), 3.05 (2H, d, J = 5.2 Hz), 2.97 (3H, s).【００５８】
Ms-His(Trt)-OHの合成
【化６】
2019098254.tif 000009
Ms-His-OMe（2.21 g, 4.5 mmol）のメタノール溶液（15 mL）に、1 Mの水酸化カリウム水溶液（9.0 mL, 9.0 mmol）を加え、１．５時間還流した。反応溶液を室温まで冷却し、１０％クエン酸水溶液でｐＨ５まで酸性にし、ジクロロメタンで抽出をした。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶液を減圧留去した後、残渣にジクロロメタンとヘキサンを加え、白色固体を析出させ、ろ取した（2.32 g, >100%）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84 (1H, s), 7.31-7.33 (9H, m), 7.12-7.09 (6H, m), 6.82 (1H, s), 4.13 (1H, m), 3.34 (1H, dd, J = 14.8, 3.6 Hz), 3.17 (1H, dd, J = 14.8, 6.8 Hz), 2.90 (3H, s).【００５９】
実施例２：ペプチド合成２
ペプチドシンセサイザー（モデル：PSSM-8  島津製作所製）を用いてＦｍｏｃ法による固相合成法により試験に用いたペプチドを合成した。固相合成で用いる非天然アミノ酸であるＦｍｏｃ−ＴＺ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ-ＴＺ（ｔｒｔ）-ＯＨ、およびＦｍｏｃ−ｅｇＴＺ（ｔｒｔ）−ＯＨはAstatech社より購入した。下記の配列を有するペプチド１〜３４を合成し、合成ペプチドの分子量は質量分析（MALDI TOF）を実施した。下記表２に示すように、いずれの測定値も理論値によく一致した。
【表２】
2019098254.tif 000010
【００６０】
実施例３：ペプチドの安定性試験１
［測定サンプルの調製］
実施例２で合成したペプチド１および３〜５を秤量し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。さらに、１．０ｍＭのペプチド溶液をリン酸緩衝液で１００μＭに希釈をした。クロマトディスク（Merck  millipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過し、ろ液をＬＣバイアル（Waters Deactivated Qsert Vial）に分注した。調製したペプチド溶液について、４０℃の恒温槽内で１か月または２か月間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで−３０℃で保存した。【００６１】
［水分透過率］
ペプチド水溶液と保存容器の合計重量を検体重量とし、保存前の検体重量を秤量し、各条件の保存後にも同様に保存後の検体重量を秤量した。また、保存容器の空重量を秤量し、下記の式に基づいて水分透過率を求めた。
【数１】
2019098254.tif 000011
【００６２】
標準サンプル及び保存後サンプルをボルテックスミキサーで撹拌後、ＨＰＬＣバイアル（Waters社製  Deactivated Qsert vial）にペプチド溶液を移した。逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣシステム：島津製作所製 Prominence）を下記表３の条件で作動して、ペプチド溶液の分析を行い、クロマトグラムを得た。
[HPLC分析条件１]
カラム：Waters社製  XSelect CSH C18、5 μm、4.6×250 mm
ガードカラム：Waters社製  XSelect CSH C18、5 μm、4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：３０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプルクーラー：４℃
カラム温度４０℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表３のように変えて直線濃度勾配制御した。
【表３】
2019098254.tif 000012
【００６３】
クロマトグラムにおいて、ペプチドのピーク面積値を求め、式（２）により残存率（水分補正前残存率）を算出した。また、水分補正前残存率に対し、式（３）にしたがって、容器の水分透過率を考慮に入れることで水分補正後残存率を算出した。
【数２】
2019098254.tif 000013
【数３】
2019098254.tif 000014
【００６４】
保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表４に示した。
【表４】
2019098254.tif 000015
ペプチド１（ＰＡＣＡＰ）は４０℃で１か月保存後において、３７．４％、４０℃で２か月保存後において、２１．３％と安定性が低かった。ペプチド１に対し、ペプチド１の３残基目のアスパラギン酸側鎖のカルボキシ基のみをテトラゾールに置換したペプチド３においては、ペプチド１よりも高い安定性を示し、また、８残基目のアスパラギン酸側鎖のカルボキシ基のみをテトラゾールに置換したペプチド４でも、ペプチド１に比べて安定性が向上していた。しかしながら、ペプチド１の３および８残基目のアスパラギン酸側鎖のカルボキシ基のみをテトラゾールに置換したペプチド５では、ペプチド３およびペプチド４よりも安定性がさらに向上し、ＰＡＣＡＰの安定性向上に、一つのテトラゾール置換よりも二つのテトラゾール置換がより有効であることを示した。【００６５】
実施例４：ペプチドの安定性試験２
実施例２で合成したペプチド１、２および６〜９を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで−３０℃で保存した。【００６６】
保存後サンプルを下記のHPLC分析条件２にて測定し、実施例３と同様に保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を算出した。その結果を表６に示した。【００６７】
[HPLC分析条件２]
カラム：Waters社製  XSelect CSH C18、5 μm、4.6×250 mm
ガードカラム：Waters社製  XSelect CSH C18、5 μm、4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：２０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度４０℃
サンプルクーラー：２５℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表５のように変えて直線濃度勾配制御した。
【表５】
2019098254.tif 000016
【表６】
2019098254.tif 000017
ペプチド１（ＰＡＣＡＰ）は、６０℃で１週間保存後には、２６．６％、２週間保存後には１５．８％と極めて安定性が悪く、またＰＡＣＡＰのＮ末端をアセチル化したペプチド２も同等の安定性でしかなかった。一方で、３位と８位のアスパラギン酸のカルボキシ基をテトラゾールに置換したペプチド６及び７（ペプチド６では、さらに１７位のメチオニンがノルロイシン（配列中の表記として「Nl」を用いるものとする）に置換されており、ペプチド７では１７位のメチオニンがさらにロイシンに置換されている）では、６０℃で１週間保存後には、９１．３％及び９１．７％、２週間保存後には８２．４％及び８４．８％と安定性が大幅に向上した。さらにペプチド６及び７のＮ末端をアセチル化されたペプチド８及び９では、６０℃で１週間保存後には、９８．１％及び９８．４％、２週間保存後には９２．９％及び９２．８％とさらに安定性が向上した。ここで、６０℃における１週間および２週間の加速試験は、室温（２５℃）における、約１年および約２年に相当する。したがって、ペプチド８及び９は、室温で２年間（９０％以上の残存率）安定であると期待される。【００６８】
実施例５：ペプチドの安定性試験３
実施例２で合成したペプチド１２〜２５、２７および２８を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間の間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。試料分析まで標準サンプルおよび保存後サンプルは−３０℃で保存した。【００６９】
保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を実施例４と同様に算出し、その結果を表７に示した。
【表７】
2019098254.tif 000018
ペプチド１２（ペプチド９のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド９と同等の安定性を示し、Ｎ末端メシル基置換でも高い安定性を示した。ペプチド１３（ペプチド９の１６残基目のグルタミン側鎖をテトラゾールに置換したペプチド）はペプチド９と同等の安定性を示し、グルタミン側鎖をテトラゾールに置換したペプチドも高い安定性を維持することを示した。ペプチド９の任意の残基にアラニン又はアルギニンで置換又は付加したペプチド１４−２５、ペプチド２７およびペプチド２８においても、高い安定性を維持した。【００７０】
実施例５−２：ペプチドの安定性試験３
実施例２で合成したペプチド２９〜３４を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で２週間の間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。試料分析まで標準サンプルおよび保存後サンプルは−３０℃で保存した。【００７１】
保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を実施例４と同様に算出し、その結果を表７−２に示した。
【表７−２】
2019098254.tif 000019
ペプチド２９（ペプチド１５のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド１５と同等の安定性を示し、Ｎ末端メシル基置換でも高い安定性を示した。ペプチド３０（ペプチド２３のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド２３と同等の安定性を示し、Ｎ末端メシル基置換でも高い安定性を示した。ペプチド３２−３４は、ペプチド９の任意の残基にアラニンで置換したペプチド３２−３４においても、高い安定性を維持した。ペプチド３１（ペプチド３２のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド３２と同等の安定性を示した。【００７２】
実施例６：ペプチドの安定性試験４
実施例２で合成したペプチド１０および１１を秤量し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で100 μMに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチドについて、４０℃の恒温槽内で１か月または２か月間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで−３０℃で保存した。
保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を実施例４と同様に測定し、その結果を表８に示した。
【表８】
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Ｎ末端がアセチル基のペプチド１０とＮメシル基のペプチド１１の結果より、Ｎ末端置換基がアセチル基およびＮメシル基のいずれの場合であってもペプチドは同程度に安定化されることが明らかとなった。【００７３】
実施例７：ペプチドの安定性試験５
実施例２で合成したペプチド２６を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間の間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。試料分析まで標準サンプルおよび保存後サンプルは−３０℃で保存した。【００７４】
保存後サンプルを下記のHPLC分析条件３で測定し、実施例３と同様に保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を算出した。その結果を表１０に示した。【００７５】
[HPLC分析条件３]
カラム：Waters社製  XSelect CSH C18、5 μm、4.6×250 mm
ガードカラム：Waters社製  XSelect CSH C18、5 μm、4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：２０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度４０℃
サンプルクーラー：２５℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表９のように変えて直線濃度勾配制御した。
【表９】
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【表１０】
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ペプチド２６も同様に高い安定性を示した。【００７６】
実施例７：ＰＡＣＡＰ２７及びその改変ペプチドのｃＡＭＰアッセイ
[細胞培養]
マイトマイシン処理済みの凍結したＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＰＡＣ１またはＶＰＡＣ１レセプター高発現細胞株：DiscoveRx社から購入）を、１．３５×１０4ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェルになるようCell plating reagent（DiscoveRx社製）で調製後、９６ウェル培養プレートに播種した。細胞を、５％ＣＯ2インキュベーター内で１８〜２４時間、３７℃で培養して、プレートに細胞を接着させた。【００７７】
[試薬調製]
実施例２で合成したペプチド１、２および６〜９の粉末を０．１ｍＭになるように水に溶解した後、２０μＭになるようにCell assay buffer（DiscoveRx社製）（０．５ｍＭのＩＢＭＸ、０．００１％ＢＳＡを含む）で希釈した。そこから同じCell assay bufferで５倍希釈系列を作製し、アッセイに使用した。【００７８】
[ｃＡＭＰアッセイ]
ｃＡＭＰアッセイは、Hit Hunter cAMP assay for Biologicsキット（DiscoveRx社製、Cat. No.90-0075LM25）を用いて、キット付属の説明書に従って行った。ｃＡＭＰ抗体溶液と希釈した各濃度のペプチド１、２、６〜９溶液を混合し、ペプチド−ｃＡＭＰ抗体混合液を作製した。続いて、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の培養プレートから培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、ペプチド−ｃＡＭＰ抗体混合液を細胞に添加し、３７℃の５％ＣＯ2雰囲気下で３０分間インキュベートした。次にWorking detection solutionを添加し、培養プレートをアルミホイルで遮光後、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、Solution Aを添加し、培養プレートをアルミホイルで遮光後、２５℃で３時間インキュベートした。最後に、化学発光シグナルを、ＧｌｏＭａｘ検出器（Promega社製）を用いて、Luminescence, Integration time(1 sec)の条件で検出した。得られたRelative luminescence unit（ＲＬＵ）値をGraphPad Prism Ver 6.05（Graph Pad社製）にて解析し、各ペプチドにおけるＥＣ50値を算出した。各ペプチドのＰＡＣ１ＲまたはＶＰＡＣ１Ｒ高発現細胞株でのｃＡＭＰ誘導作用のＥＣ50値の結果を図１、図２及び表１１に示す。
【表１１】
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【００７９】
合成したペプチド１、２および６〜９は、ＰＡＣ１ＲとＶＰＡＣ１Ｒのそれぞれの高発現細胞に対して、ｃＡＭＰ誘導能を示し、それらのＥＣ50値は、ネイティブペプチド（ペプチド１：ＰＡＣＡＰ２７）と同程度であった。【００８０】
表６及び表１１の結果をまとめると、本発明にかかるペプチド（ペプチド６〜９）は、ＰＡＣＡＰと比較して、水溶液中での極めて改善された安定性を有するとともに、ＰＡＣＡＰと同等の生理活性を維持する。特に、室温において２年を超える貯蔵寿命を有することにより、液体製剤、例えばバイアル、アンプル、点眼剤などの製品として開発が可能となる。【００８１】
実施例８：ＰＡＣＡＰ２７改変ペプチドのｃＡＭＰアッセイ２
[試薬調製]
実施例２で合成したペプチド３〜５および１０〜２８の粉末をそれぞれ０．１ｍＭになるように水に溶解した後、２０μＭになるようにCell assay buffer（DiscoveRx社製）(０．５ｍＭのＩＢＭＸ、０．００１％ＢＳＡを含む）で希釈した。そこから同じCell assay bufferで５倍希釈系列を作製し、アッセイに使用した。
実施例７と同様の方法でペプチド３〜５および１０〜２８におけるＥＣ50値を算出した。各ペプチドのＰＡＣ１又はＶＰＡＣ１高発現細胞株でのｃＡＭＰ誘導作用のＥＣ50値の結果を表１２に示す。
【表１２】
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本発明にかかるペプチド（ペプチド３〜５、１０〜２８）は、ＰＡＣＡＰと比較して、水溶液中での極めて改善された安定性を有するとともに、ＰＡＣＡＰと同等の生理活性を維持する。【００８２】
実施例８−２：ＰＡＣＡＰ２７改変ペプチドのｃＡＭＰアッセイ２
[試薬調製]
実施例２で合成したペプチド２９〜３４の粉末をそれぞれ０．１ｍＭになるように水に溶解した後、２０μＭになるようにCell assay buffer（DiscoveRx社製）（０．５ｍＭのＩＢＭＸ、０．００１％ＢＳＡを含む）で希釈した。そこから同じCell assay bufferで５倍希釈系列を作製し、アッセイに使用した。
実施例７と同様の方法でペプチド２７〜３４におけるＥＣ50値を算出した。各ペプチドのＰＡＣ１又はＶＰＡＣ１高発現細胞株でのｃＡＭＰ誘導作用のＥＣ50値の結果を表１２−２に示す。
【表１２−２】
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本発明にかかるペプチド（ペプチド２９〜３４）は、ＰＡＣＡＰと比較して、水溶液中での極めて改善された安定性を有するとともに、ＰＡＣＡＰと同等の生理活性を維持する。【００８３】
製剤例
本発明のペプチドを有効成分として含有する医薬は、例えば、次のような処方によって製造することができる。製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。 【００８４】
１．カプセル剤
（１）ペプチド５                         ４０ｍｇ
（２）ラクトース                         ７０ｍｇ
（３）微結晶セルロース                     ９ｍｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム             １ｍｇ
１カプセル                             １２０ｍｇ
（１）、（２）、（３）の全量、および（４）の１／２を混和した後、顆粒化する。これに残りの（４）を加えて全体をゼラチンカプセルに封入する。【００８５】
２．錠剤
（１）ペプチド６                         ４０ｍｇ
（２）ラクトース                         ５８ｍｇ
（３）コーンスターチ                     １８ｍｇ
（４）微結晶セルロース                 ３．５ｍｇ
（５）ステアリン酸マグネシウム         ０．５ｍｇ
１錠                                   １２０ｍｇ
（１）、（２）、（３）の全量、（４）の２／３および（５）の１／２を混和した後、顆粒化する。残りの（４）および（５）をこの顆粒に加えて錠剤に加圧成型する。【００８６】
３．硝子体注射液
１ｍｌ中
（１）ペプチド５                          ４０ｍｇ
（２）精製白糖                            ５０ｍｇ
（３）塩化ナトリウム                  ２．３４ｍｇ
（４）ポリソルベート８０                  適量
（５）リン酸水素二ナトリウム              適量
（６）リン酸二水素ナトリウム              適量
（７）滅菌精製水                          適量
（１）〜（６）を、（７）滅菌精製水に溶解して硝子体注射液を調製する。 【００８７】
４．目薬
１００ｍL中
（１）ペプチド６                        １００ｍｇ
（２）トロメタモール                    ３００ｍｇ
（３）塩化ナトリウム                    ９００ｍｇ
（４）塩化ベンザルコニウム                  適量
（５）滅菌精製水                            適量
（１）〜（４）を、（５）滅菌精製水に溶解して、pHを調整し、点眼液を調製する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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